ES2252946T3

ES2252946T3 - Polinucleotidos y polipeptidos basb029 derivados de neisseria meningitis.

Info

Publication number: ES2252946T3
Application number: ES99924946T
Authority: ES
Inventors: Jean-Louis Ruelle
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1998-05-13
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2019-05-07
Also published as: IL139613A0; KR100897951B1; KR20080070073A; HK1036300A1; WO1999058683A3; DK1078063T3; GB9810276D0; TR200003347T2; JP2002514424A; KR20060076789A; HUP0102479A2; KR20010043571A; AU750032B2; CY1105676T1; JP2010166921A; EP1078063A2; KR100673674B1; AU4142099A; ATE311457T1; JP4707832B2

Abstract

La presente invención se refiere a BASB029, en particular a polipéptidos BASB029 y polinucleótidos BASB029, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluidos, entre otros, la prevención y el tratamiento de enfermedades microbianas. En otro aspecto, la invención se refiere a unas pruebas diagnósticas para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y trastornos asociados con tales infecciones, tales como pruebas para detectar la expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB029. Tras leer las siguientes descripciones y tras leer las demás partes de la presente memoria descriptiva, resultarán evidentes para los expertos en la materia diversos cambios y modificaciones incluidos en el espíritu y el alcance de la invención descrita.

Description

Polinucleótidos y polipéptidos BASB029 derivados de Neisseria meningitis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polinucleótidos, (descritos en la presente memoria descriptiva como "polinucleótido(s) BASB029"), polipéptidos codificados por ellos (descritos en la presente memoria descriptiva como "BASB029" o "polipéptido(s) BASB029"), materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la presente invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluidas vacunas contra infecciones bacterianas. En otro aspecto, la invención se refiere a pruebas diagnósticas para detectar la infección de ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria gram negativa aislada frecuentemente a partir del tracto respiratorio superior humano. En ocasiones causa enfermedades bacterianas invasivas tales como bacteremia y meningitis. La incidencia de la enfermedad meningocócica presenta diferencias geográficas estacionales y anuales (B. Schwartz, P. S. Moore, C. V. Broome; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18 a S24, 1989). La mayor parte de las enfermedades en los países de climas templados se debe a cepas del serogrupo B y su incidencia varía de 1 a 10/100.000/año alcanzando a veces la población total valores más elevados (E. B. Kaczmarski, (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55 a 59, 1995; R. J. P. M. Scholten, H. A. Bijlmer, J. T. Poolman, y col. Clin. Infect. Dis. 16: 237 a 246, 1993; C. Cruz, G. Pavez, E. Aguilar, y col. Epidemiol. Infect. 105: 119 a 126, 1990).

Se encuentran epidemias dominadas por meningococos del serogrupo A, principalmente en África central, alcanzando en ocasiones valores de hasta 1.000/100.000/año (B. Schwartz, P. S. Moore, C. V. Broome; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18 a S24, 1989). Casi todos los casos de la enfermedad meningocócica en su conjunto son causados por meningococos de los serogrupos A, B, C, W-135 e Y, y hay disponible una vacuna polisacárida tetravalente A, C, W-135, Y (J. Armand, F. Arminjon, M. C. Mynard, C. Lafaix, J. Biol. Stand. 10: 335 a 339, 1982).

Las vacunas polisacáridas se están mejorando en la actualidad por medio de su conjugación con proteínas portadoras (J. M. Lieberman, S. S. Chiu, V. K. Wong, y col. JAMA 275: 1499 a 1503, 1996).

No se encuentra disponible ninguna vacuna del serogrupo B, ya que el polisacárido capsular B resultó ser no inmunogénico, debido, lo más probable, a que comparte una similaridad estructural con componentes del huésped (F. A. Wyle, M. S. Artenstein, M. L. Brandt, y col. Infect. Dis. 126: 514 a 522. 1972; J. M. Finne, M. Leinonen, P. M. Mäkelä, Lancet ii: 355 a 357, 1983).

Durante muchos años se han iniciado y llevado a cabo esfuerzos para crear vacunas basadas en la membrana externa meningocócica (J. C. de Moraes, B. Perkins, M. C. Camargo, y col. Lancet 340: 1074 a 1078, 1992; G. Bjune, E. A. Hoiby, J. K. Gronnesby, y col. 338: 1093 a 1096, 1991). Tales vacunas han demostrado tener una eficacia entre 57% y 85% en niños mayores (> de 4 años) y adolescentes.

En estas vacunas se hallan presentes muchos componentes de la membrana externa bacteriana, tales como PorA, PorB, Rmp, Opc, Opa, FrpB, y aún es necesaria una definición más completa de la contribución de estos componentes a la protección observada. Se han definido otros componentes de la membrana externa bacteriana usando anticuerpos animales o humanos para ser potencialmente relevantes a la inducción de la inmunidad protectora, tales como TbpB y NspA (D. Martin, N. Cadieux, J. Hamel, B. R. Brodeux, J. Exp. Med. 185: 1173 a 1183, 1997; L. Lissolo, C. Maître-Wilmotte, P. Dumas, y col. Inf. Immun. 63: 884 a 890, 1995). Los mecanismos de la inmunidad protectora implicarán una actividad bactericida mediada por anticuerpos, y opsonofagocitosis.

Se ha usado un modelo animal de bacteremia para combinar todos los mecanismos mediados por anticuerpos (K. Saukkonen, M. Leinonen, H. Abdillahi, J. T. Poolman, Vaccine 7: 325 a 328, 1989). Generalmente se acepta que el mecanismo bactericida mediado por el componente terminal del complemento resulta crucial para la inmunidad contra la enfermedad meningocócica (S. C. Ross, P. J. Rosenthal, H. M. Berberic, P. J. Densen, Infect. Dis. 155: 1266 a 1275, 1987).

La frecuencia de las infecciones por Neisseria meningitidis ha aumentado de forma espectacular en las últimas décadas. Esto se ha atribuido a la aparición de múltiples cepas resistentes a los antibióticos y a un aumento de la población de personas con un sistema inmunitario debilitado. Ya no resulta fuera de lo común aislar cepas de Neisseria meningitidis que son resistentes a algunos o a todos los antibióticos estándar. Este fenómeno ha creado una necesidad médica y una demanda no satisfechas de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos, y pruebas diagnósticas para este organismo.

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Resumen de la invención

La presente invención se refiere a BASB029, en particular a polipéptidos BASB029 y polinucleótidos BASB029, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluidos, entre otros, la prevención y el tratamiento de enfermedades microbianas. En otro aspecto, la invención se refiere a unas pruebas diagnósticas para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y trastornos asociados con tales infecciones, tales como pruebas para detectar la expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB029.

Tras leer las siguientes descripciones y tras leer las demás partes de la presente memoria descriptiva, resultarán evidentes para los expertos en la materia diversos cambios y modificaciones incluidos en el espíritu y el alcance de la invención descrita.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB029 tal como se describe abajo más detalladamente. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos de BASB029 de Neisseria meningitidis, que está relacionada por homología de la secuencia de aminoácidos a la proteína de la fibrilla de la superficie de Haemophilus influenzae (HSF). La invención se refiere especialmente a un BASB029 que tiene las secuencias de nucleótidos y aminoácidos especificadas en SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:4 respectivamente. Se entiende que las secuencias enumeradas en la lista de secuencias que se proporciona más adelante como "ADN" representan un ejemplo de una forma de realización de la invención, ya que los expertos en la materia reconocerán que tales secuencias pueden emplearse de forma provechosa en polinucleótidos en general, incluidos ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos de Neisseria meningitidis denominados en la presente memoria descriptiva "BASB029" y "polipéptidos BASB029", así como variantes de los mismos con utilidad biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéutica, y composiciones en las que estén comprendidos.

La presente invención prevé además:

(a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 85%, más preferentemente al menos una identidad del 90%, aún más preferentemente al menos una identidad del 95%, siendo la más preferida una identidad de al menos 97 a 99% o exacta, con respecto a la de SEQ ID NO:4;

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos una identidad del 85%, más preferentemente al menos una identidad del 90%, aún más preferentemente al menos una identidad del 95%, o incluso más preferentemente una identidad de al menos 97 a 99% o exacta, con respecto a la SEQ ID NO:3 a lo largo de la totalidad de la SEQ ID NO:3 respectivamente; o

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos una identidad del 85%, más preferentemente al menos una identidad del 90%, aún más preferentemente al menos una identidad del 95%, o incluso más preferentemente una identidad de al menos 97 a 99% o exacta, con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4;

Los polipéptidos BASB029 que se proporcionan en SEQ ID NO: 4 en el polipéptido BASB029 a partir de una cepa H44/76 de Neisseria meningitidis.

La invención también proporciona un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB029, es decir, una parte contigua del polipéptido BASB029 que posee la misma o sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. Es decir, el fragmento (si fuera necesario cuando está acoplado a un portador) es capaz de producir una respuesta inmune que reconoce al polipéptido BASB029. Tal fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB029 carente de una secuencia líder N-terminal, y/o un dominio de transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferente, el fragmento inmunogénico de BASB029 según la invención comprende sustancialmente la totalidad del dominio extracelular de un polipéptido que tiene al menos una identidad del 85%, más preferentemente al menos una identidad del 90%, aún más preferentemente al menos una identidad del 95%, siendo la más preferida una identidad de al menos 97 a 99% o exacta, con respecto a la de SEQ ID NO:4 a lo largo de la totalidad de la SEQ ID NO:4.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por entero igual que parte, pero no la totalidad, de cualquier secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. Al igual que con los polipéptidos BASB029, los fragmentos pueden estar "sueltos" o comprendidos dentro de un polipéptido más grande del cual forman una parte o región, más preferentemente como una única región continua en un único polipéptido más grande.

Entre los fragmentos preferidos se incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que poseen una parte de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o de variantes de la misma, tal como una serie continua de residuos que incluye una secuencia de aminoácidos amino- y/o carboxi-terminal. También se prefieren las formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidas por o en una célula huésped. También se prefieren los fragmentos caracterizados por unos atributos estructurales o funcionales, tales como fragmentos que comprenden regiones de hélice alfa y formadoras de hélice alfa, regiones de hoja beta y formadoras de hoja beta, regiones de giro y formadoras de giro, regiones de ovillo y formadoras de ovillo, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones formadoras de superficie, regiones de unión al substrato, y regiones con un alto índice antigénico.

Entre otros fragmentos preferidos se incluye un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que posee al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que posee al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o suprimidos de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:4.

Se pueden emplear fragmentos de los polipéptidos de la invención para producir el correspondiente polipéptido completo mediante una síntesis peptídica; por lo tanto, se pueden emplear estos fragmentos como intermediarios para producir los polipéptidos de completos de la invención.

Se prefieren particularmente las variantes en las que se sustituyen, suprimen o añaden en cualquier combinación varios, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 1 a 2 ó 1 aminoácidos.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de la invención pueden estar en forma de proteína "madura" o pueden formar parte de una proteína más grande tal como una proteína precursora o de fusión. A menudo resulta ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contenga secuencias secretoras o líder, pro-secuencias, secuencias que ayudan en la purificación tales como residuos múltiples de histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante. Además, también se considera la adición de secuencias de polipéptidos o colas lipídicas exógenas o polinucleótidos para aumentar el potencial inmunogénico de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles manipuladas genéticamente que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas partes de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como inmunoglobulina, se prefiere la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región de bisagra. En una forma de realización particular, la parte Fc puede eliminarse simplemente mediante la incorporación de una secuencia de escisión que puede escindirse con un factor de coagulación de la sangre Xa.

Además, la presente invención se refiere a unos procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y al uso de las mismas para la selección de fármacos, el diagnóstico y la terapia. Otro aspecto de la invención se refiere también a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. En las solicitudes de patente internacional nº WO94/29458 y WO94/22914 se pueden encontrar ejemplos de la tecnología de proteínas de fusión.

Las proteínas pueden conjugarse químicamente, o expresarse como proteínas de fusión recombinantes que permiten la producción de unos niveles incrementados en un sistema de expresión en comparación con la proteína no fusionada. La pareja de fusión puede ayudar a proporcionar epitopos T ayudantes (pareja de fusión inmunológica), preferentemente epitopos T ayudantes reconocidos por humanos, o ayudar en la expresión de la proteína (potenciador de la expresión) a unos rendimientos más altos que la proteína recombinante nativa. Preferentemente, la pareja de fusión será tanto una pareja de fusión inmunológica como una pareja potenciadora de la expresión.

Entre las parejas de fusión se incluye la proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus influenzae, NS1 (hemaglutinina). Otra pareja de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferentemente, se usa la parte C-terminal de la molécula. LytA se deriva de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa, amidasa LytA, (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) págs. 265 a 272}) una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en el esqueleto del peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LytA es el responsable de la afinidad con la colina o con algunos análogos de colina tales como DEAE. Se ha explotado esta propiedad para el desarrollo de plásmidos de expresión de C-LytA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su extremo amino {Biotechnology: 10, (1992) págs. 795 a 798}. Es posible usar la parte repetida de la molécula de LytA hallada en el extremo C-terminal comenzando en el residuo 178, por ejemplo los residuos 188 a 305.

La presente invención incluye también variantes de los polipéptidos mencionados anteriormente, es decir, polipéptidos que varían con respecto a los referentes por sustituciones conservadoras de aminoácidos, mediante las que se sustituye un residuo por otro con similares características. Tales sustituciones se dan típicamente entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar de cualquier forma que resulte adecuada. Entre tales polipéptidos se incluyen polipéptidos de origen natural aislados, polipéptidos producidos de forma recombinante, polipéptidos producidos de forma sintética, o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales polipéptidos son bien entendidos en la técnica.

Se prefiere que un polipéptido de la invención se derive de Neisseria meningitidis, sin embargo, puede obtenerse preferentemente de otros organismos del mismo género taxonómico. También puede obtenerse un polipéptido de la invención, por ejemplo, de organismos del mismo orden o familia taxonómica.

Polinucleótidos

Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB029, particularmente polinucleótidos que codifican el polipéptido designado en la presente descripción como BASB029.

En una forma de realización particularmente preferida de la invención, el polinucleótido comprende una región que codifica polipéptidos BASB029 que comprenden una secuencia especificada en SEQ ID NO:3 que incluye un gen completo, o una variante del mismo.

El polinucleótido BASB029 que se proporciona en SEQ ID NO:3 es el polinucleótido BASB029 de la cepa H44/76 de Neisseria meningitidis.

Como otro aspecto de la invención se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB029, particularmente polipéptidos y polinucleótidos BASB029 de Neisseria meningitidis, que incluyen, por ejemplo, ARN sin procesar, ARN ribozímico, ARNm, ADNc, ADN genómico, B- y Z-ADN. En otras formas de realización de la invención se incluyen polinucleótidos y polipéptidos biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles, y variantes de los mismos, y composiciones que los comprenden.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, que incluyen al menos un gen completo, que codifica un polipéptido BASB029 que posee una secuencia de aminoácidos deducida de SEQ ID NO:4 y polinucleótidos relacionados estrechamente con estos y variantes de los mismos.

En otra forma de realización particularmente preferida de la invención existe un polipéptido BASB029 de Neisseria meningitidis que comprende o está constituido por una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o una variante de la misma.

Usando la información que se proporciona en la presente descripción, tal como una secuencia de polinucleótidos especificada en SEQ ID NO:3, se puede obtener un polinucleótido de la invención que codifica el polipéptido BASB029 usando procedimientos estándar de clonación y selección, tales como los usados para la clonación y secuenciación de fragmentos de ADN cromosómico de bacterias usando células de Neisseria meningitidis como material de partida, seguidos por la obtención de un clon completo. Por ejemplo, para obtener una secuencia de polinucleótidos de la presente invención, tal como una secuencia de polinucleótidos dada en SEQ ID NO:3, típicamente, se sondea una genoteca de clones de ADN cromosómico de Neisseria meningitidis en E. Coli o algún otro huésped adecuado con un oligonucleótido radiomarcado, preferentemente un 17-mero o mayor, derivado de una secuencia parcial. Los clones portadores de un ADN idéntico al de la sonda pueden distinguirse entonces usando unas condiciones restrictivas de hibridación. Mediante la secuenciación de los clones individuales así identificados mediante la hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir de la secuencia de polipéptidos o polinucleótidos original, resulta posible prolongar la secuencia de polinucleótidos en ambas direcciones para determinar la secuencia completa de un gen. Tal secuenciación se lleva a cabo convenientemente, por ejemplo, usando ADN bicatenario desnaturalizado preparado a partir de un clon de un plásmido. T. Maniatis, E. F. Fritsch y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), describen técnicas adecuadas (véase en particular Screening by Hibridization 1.90 y Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). También se puede llevar a cabo la secuenciación directa del ADN genómico para obtener una secuencia completa de un gen. Como ejemplo de la invención, cada polinucleótido especificado en SEQ ID NO:3 se descubrió en una genoteca de ADN derivada de Neisseria meningitidis.

Además, cada secuencia de ADN especificada en SEQ ID NO:3 contiene un marco abierto de lectura que codifica una proteína que posee aproximadamente el número de residuos de aminoácido que se expone en SEQ ID NO:4 con un peso molecular deducido que puede calcularse usando valores de peso molecular de residuos de aminoácido muy conocidos por los expertos en la materia.

El polinucleótido de SEQ ID NO:1, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de terminación que comienza en el nucleótido número 1783 de SEQ ID NO:1, codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2.

El polinucleótido de SEQ ID NO:3, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de terminación que comienza en el nucleótido número 1774 de SEQ ID NO:3, codifica el polipéptido de SEQ ID NO:4.

En otro aspecto, la presente invención prevé un polinucleótido aislado que comprende o está constituido por:

(a) una secuencia de polinucleótidos que posee al menos una identidad del 85%, más preferentemente al menos una identidad del 90%, aún más preferentemente al menos una identidad del 95%, prefiriéndose una identidad de al menos 97 a 99% o exacta, con respecto a SEQ ID NO:3; a lo largo de la totalidad de SEQ ID NO:3 respectivamente;
o

(b) una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que posee al menos una identidad del 85%, más preferentemente al menos una identidad del 90%, aún más preferentemente al menos una identidad del 95%, o incluso más preferentemente una identidad de al menos 97 a 99% o exacta, con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 a lo largo de la totalidad de la SEQ ID NO:4 respectivamente.

Se puede obtener un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluidos homólogos y ortólogos de especies distintas a la Neisseria meningitidis, mediante un procedimiento que comprende las etapas de selección de una genoteca apropiada bajo unas condiciones restrictivas de hibridación (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo entre 45 y 65ºC y una concentración SDS de 0,1 a 1%) con una sonda marcada o detectable que comprende o está constituida por la secuencia de SEQ ID NO:3 o un fragmento de la misma; y de aislamiento de un gen y/o clones genómicos completos que contengan dicha secuencia de polinucleótidos.

La invención proporciona una secuencia de polinucleótidos idéntica a lo largo de su totalidad a una secuencia codificante (marco abierto de lectura) de SEQ ID NO:3. La invención también proporciona una secuencia codificante para un polipéptido maduro o un fragmento de éste, por sí sola, así como una secuencia codificante para un polipéptido maduro o un fragmento en marco de lectura con otra secuencia codificante, tal como una secuencia que codifica una secuencia líder o secretora, una secuencia de pre-, o pro- o prepro-proteína. El polinucleótido de la invención puede contener también al menos una secuencia no codificante, incluida por ejemplo, pero sin limitarse a, al menos una secuencia no codificante 5' y 3', tales como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como las señales de terminación dependientes de rho e independientes de rho), sitios de unión de ribosomas, secuencias Kozak, secuencias que estabilizan el ARNm, intrones, y señales de poliadenilación.

La secuencia de polinucleótidos también puede comprender una secuencia codificante adicional que codifica otros aminoácidos. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas formas de realización de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 86: 821 a 824 (1989), o una cola peptídica HA (Wilson y col., Cell 37: 767 (1984), ambas de las cuales pueden resultar útiles para purificar la secuencia de polipéptidos fusionada a ellas. Entre los polinucleótidos de la invención también se incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas de forma natural que controlan la expresión del gen.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB029 de SEQ ID NO:4 puede ser idéntica a la secuencia que codifica el polipéptido contenida en los nucleótidos 1 a 1773 de SEQ ID NO:3. También puede ser una secuencia que, a consecuencia de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifique el polipéptido de SEQ ID NO:4.

La expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido", tal como se usa en la presente descripción, abarca los polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido del BASB029 de Neisseria meningitidis que posee una secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO:4. La expresión también abarca polinucleótidos que incluyen una única región continua o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrada, una secuencia de transposón integrada, o debido a la edición de ARN o reorganización de ADN genómico) junto con otras regiones más, que pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.

La invención también se refiere a variantes de los polinucleótidos descritos en la presente memoria descriptiva que codifican variantes de un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos deducida de SEQ ID NO:4.

Se pueden usar fragmentos de la invención, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos completos de la invención.

Otras formas de realización particularmente preferidas consisten en polinucleótidos que codifican variantes de BASB029, que poseen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB029 de SEQ ID NO:4 en la que varios, algunos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 o ningún residuo de aminoácido está sustituido, modificado, suprimido y/o añadido en cualquier combinación. Entre éstos se prefieren especialmente las sustituciones adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB029.

Otras formas de realización de la invención particularmente preferidas consisten en polinucleótidos que son idénticos al menos en el 85% a lo largo de su totalidad a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB029 que posee una secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO:4, y polinucleótidos que son complementarios a tales polinucleótidos. A este respecto, se prefieren particularmente los polinucleótidos que son idénticos a los mismos al menos en un 90% a lo largo de su totalidad, y entre estos polinucleótidos particularmente preferidos, se prefieren especialmente aquellos con al menos 95%. Además, aquellos con al menos 97% son muy preferidos entre aquellos con al menos 95%, y entre éstos, son particularmente muy preferidos aquellos con al menos 98% y al menos 99%, siendo los más preferidos los de al menos 99%.

Las formas de realización preferidas son polinucleótidos que codifican polipéptidos que conservan fundamentalmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por un ADN de SEQ ID NO:3.

De acuerdo con ciertas formas de realización preferidas de la presente invención, se proporcionan polinucleótidos que hibridan, particularmente bajo condiciones restrictivas, a secuencias de polinucleótidos BASB029, tales como los polinucleótidos de SEQ ID NO:3.

La invención se refiere también a polinucleótidos que hibridan a las secuencias de polinucleótidos que se proporcionan en la presente descripción. A este respecto, la invención se refiere especialmente a polinucleótidos que hibridan bajo condiciones restrictivas a los polinucleótidos descritos en la presente descripción. Tal como se usan en la misma, las expresiones "condiciones restrictivas" y "condiciones restrictivas de hibridación" quieren decir que la hibridación tiene lugar únicamente si existe una identidad de al menos 95% y preferentemente al menos 97% entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones restrictivas de hibridación lo constituye una incubación durante toda la noche a 42ºC en una solución que comprende: 50% de formamida, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 microgramos/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón fragmentado, seguida del lavado del soporte de la hibridación en 0,1x SSC a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de la hibridación y del lavado son muy conocidas y se ejemplifican en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente en su capítulo 11. También se puede usar la hibridación en solución con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la invención.

La invención también proporciona un polinucleótido que comprende o está constituido por una secuencia de polinucleótidos obtenida mediante la selección de una genoteca apropiada que contenga el gen completo para una secuencia de polinucleótidos expuesta en SEQ ID NO:3 bajo condiciones restrictivas de hibridación con una sonda que posee la secuencia de dicha secuencia de polinucleótidos expuesta en SEQ ID NO:3 o un fragmento de la misma; y el aislamiento de dicha secuencia de polinucleótidos. Entre los fragmentos útiles para obtener tal polinucleótido se incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores completamente descritos en otras partes de la presente descripción.

Tal como se explica en otras partes de la presente descripción al respecto de los ensayos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención se pueden usar como sondas para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar ADNc y clones genómicos completos que codifican BASB029 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que poseen una elevada identidad, particularmente una identidad de secuencia elevada, con respecto al gen BASB029. Tales sondas comprenderán generalmente al menos 15 residuos de nucleótido o pares de bases. Preferentemente, tales sondas tendrán al menos 30 residuos de nucleótido o pares de bases y pueden tener al menos 50 residuos de nucleótido o pares de bases. Las sondas particularmente preferidas tendrán al menos 20 residuos de nucleótido o pares de bases y tendrán menos de 30 residuos de nucleótido o pares de bases.

Se puede aislar una región codificante de un gen BASB029 seleccionando una secuencia de ADN proporcionada en SEQ ID NO:3 para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Después se usa un oligonucleótido marcado que posee una secuencia complementaria a la de un gen de la invención para seleccionar una genoteca de ADNc, ADN genómico o ARNm para determinar a que elementos de la biblioteca se hibrida la sonda.

Existen varios procedimientos disponibles y muy conocidos por los expertos en la materia para obtener un ADN completo, o prolongar un ADN corto, por ejemplo los basados en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman y col., PNAS USA 85: 8998 a 9002, 1988). Las recientes modificaciones de la técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.), por ejemplo, han simplificado considerablemente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología Marathon™ se ha preparado ADNc a partir de ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora" ligada sobre cada extremo. Después se lleva a cabo la amplificación de ácidos nucleicos (PCR) para amplificar el extremo 5' que falta del ADN usando una combinación de cebadores de oligonucleótido específica para el gen y específica para el adaptador. La reacción PCR se repite después usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para alinear dentro del producto amplificado (típicamente, un cebador específico para el adaptador que alinea más el 3' en la secuencia del adaptador y un cebador específico para el gen que alinea más el 5' en la secuencia del gen seleccionada). Después se pueden analizar los productos de esta reacción mediante la secuenciación de ADN y un ADN de completo construido mediante la unión del producto directamente al ADN existente para dar una secuencia completa, o llevando a cabo otro PCR completo distinto usando la información de la nueva secuencia para el diseño del cebador 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención se pueden emplear, por ejemplo, como reactivos y materiales de investigación para el descubrimiento de tratamientos y diagnósticos para enfermedades, particularmente enfermedades humanas, tal como se explica más detalladamente en la presente descripción con respecto a los ensayos de polinucleótidos.

En los procedimientos de la presente descripción se pueden usar los polinucleótidos de la invención que sean oligonucleótidos derivados de una secuencia de SEQ ID NOS: 3 y 4, pero preferentemente para la PCR, para determinar si los polinucleótidos identificados en la presente descripción en su totalidad o en parte se transcriben o no en las bacterias y el tejido infectado. Se reconoce que tales secuencias también serán de utilidad en el diagnóstico de la etapa de la infección y el tipo de infección que ha alcanzado el patógeno.

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura a la que se suman otros aminoácidos con terminaciones amino o carboxi, o aminoácidos interiores con respecto al polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Tales secuencias pueden desempeñar un papel en el procesamiento de una proteína a partir de un precursor para obtener una forma madura, pueden permitir el transporte de proteínas, pueden alargar o acortar la vida media de las proteínas o pueden facilitar la manipulación de una proteína para el ensayo o la producción, entre otras cosas. Los aminoácidos adicionales, tal como resulta ser el caso in vivo, pueden procesarse separados de la proteína madura mediante encimas celulares.

Para todos y cada uno de los polinucleótidos de la invención se proporciona un polinucleótido complementario al mismo. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean totalmente complementarios a cada polinucleótido al que sean complementarios.

Una proteína precursora que tenga una forma madura del polipéptido fusionada a una o más prosecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando se eliminan las prosecuencias, se activan generalmente tales precursores inactivos. Se pueden eliminar todas o parte de las prosecuencias antes de la activación. Generalmente, a tales precursores se les denomina proproteínas.

Además de las representaciones estándar A, G, C, T/U para los nucleótidos, también se puede usar el término "N" para describir ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos del ADN o ARN puede aparecer en tal posición designada en la secuencia de ADN o ARN, a no ser que se prefiera que N no sea un ácido nucleico que, cuando se toma en combinación con las posiciones de los nucleótidos contiguos, y cuando se lee en el marco de lectura correcto, tendría el efecto de generar un codón de terminación prematuro en tal marco de lectura.

En suma, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia líder (que puede denominarse preproteína), un precursor de una proteína madura que posea una o más prosecuencias que no sean secuencias líder de una preproteína, o una preproproteína, que es el precursor de una proproteína, que tiene una secuencia líder y una o más prosecuencias, que generalmente se eliminan durante las etapas del procesamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención con fines terapéuticos o profilácticos, en particular el de la inmunización genética.

En el uso de un polinucleótido de la invención en la inmunización genética se empleará preferentemente un procedimiento de administración adecuado tal como la inyección directa de plásmido de ADN en los músculos (Wolff y col., Hum. Mol. Genet. (1992) 1: 363, Manthorpe y col., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), administración de ADN formando complejos con proteínas portadoras específicas (Wu y col., J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985), coprecipitación de ADN con fosfato cálcico (Bevenisty & Reshef, PNAS, EE.UU., (1986) 83: 9551), encapsulamiento de ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243: 375), bombardeo de partículas (Tang y col., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun y col., DNA Cell Biol. (1993) 12: 791) e infección in vivo usando vectores retrovíricos clonados (Seeger y col., PNAS USA (1984) 81: 5849).

Vectores, células huésped y sistemas de expresión

La invención también se refiere a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células huésped que son manipuladas genéticamente con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. También se pueden emplear sistemas de traducción in vitro para producir tales proteínas usando ARN derivado de las construcciones de ADN de la invención.

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención se pueden preparar mediante procedimientos muy conocidos por los expertos en la materia a partir de células huésped manipuladas genéticamente que comprenden sistemas de expresión. Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células huésped que se manipulan genéticamente con tales sistemas de expresión, y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células huésped se pueden manipular genéticamente para incorporar sistemas de expresión o partes de éstos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en la célula huésped puede efectuarse mediante procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), tales como transfección de fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección catiónica mediada por lípidos, electroporación, transducción, raspado, introducción balística e infección.

Entre los ejemplos representativos de huéspedes apropiados se incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, estreptomicetos, cianobacterias, Bacilus subtilis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis; células micóticas, tales como las células de una levadura, Kluyveromyces, Saccharomyces, un basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insectos, tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y de melanoma de Bowles; y células de plantas, tales como células de una gimnosperma o angiosperma.

Se puede usar una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Entre tales vectores se incluyen, entre otros, vectores derivados de cromosomas, de episomas y de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófago, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, virus papova, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de pseudorrabia, picornavirus, retrovirus y alfavirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cosidos y fagémidos. Las construcciones del sistema de expresión pueden contener regiones de control que regulan, así como engendran, la expresión. Generalmente, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polipéptido en un huésped se puede usar para la expresión a este respecto. Se puede insertar la secuencia de ADN apropiada en el sistema de expresión mediante una cualquiera de las diversas técnicas muy conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las que se exponen en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL. (supra).

En los sistemas de expresión recombinantes de las eucariotas se pueden incorporar señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado para la secreción de una proteína traducida dentro del lumen del retículo endoplasmático, dentro del espacio periplasmático o dentro del entorno extracelular. Estas señales pueden ser endógenas con respecto al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos muy conocidos, entre los que se incluyen la precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. Más preferentemente, para la purificación se emplea la cromatografía de afinidad de ion metálico (IMAC). Se pueden emplear técnicas muy conocidas para volver a plegar las proteínas con el fin de regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis, aislamiento y/o purificación intracelular.

El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o una bacteria. El gen de interés puede insertarse en el genoma de un virus o bacteria vivo recombinante. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo darán lugar a la expresión in vivo del antígeno y a la inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias usados para este fin son, por ejemplo: virus de la viruela (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar, del canario), alfavirus (virus Sindbis, virus Semliki Forest, virus de la encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus adenoasociados, picornavirus (poliovirus, rinovirus), virus del herpes (virus varicela zoster), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos, o atenuados de diversos modos con el fin de obtener vacunas vivas. Tales vacunas vivas también forman parte de la invención.

Pruebas de diagnóstico, pronóstico, serotipia y mutación

La invención también se refiere al uso de polipéptidos y polinucleótidos BASB029 de la invención para su uso como reactivos para el diagnóstico. La detección de polipéptidos y/o polinucleótidos BASB029 en un eucariota, particularmente un mamífero y especialmente un humano, proporcionará un procedimiento de diagnóstico de enfermedad, etapa de la enfermedad o respuesta de un organismo infeccioso a los fármacos. Los eucariotas, particularmente los mamíferos, y especialmente los humanos, particularmente aquellos infectados o sospechosos de haber sido infectados con un organismo que comprende el gen o proteína BASB029, pueden detectarse en el nivel del ácido nucleico o aminoácido mediante diversas técnicas muy conocidas, así como mediante procedimientos que se proporcionan en la presente descripción.

Se pueden obtener polipéptidos y polinucleótidos para el pronóstico, diagnóstico u otros análisis a partir de materiales corporales supuestamente infectados y/o infectados de un individuo. Se pueden usar directamente polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente ADN o ARN, para la detección o pueden amplificarse enzimáticamente, usando PCR o cualquier otra técnica de amplificación previa al análisis. También se puede usar de modo similar ARN, particularmente ARNm, ADNc y ADN genómico. Usando la amplificación, puede efectuarse la caracterización de las especies y cepas del organismo infeccioso o residente en un individuo mediante un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Las deleciones e inserciones pueden detectarse mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo de una secuencia de referencia seleccionada a partir de un organismo relacionado, preferentemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Las mutaciones puntuales pueden identificarse mediante la hibridación de ADN amplificado a las secuencias del polinucleótido BASB029 marcado. Se pueden distinguir las secuencias perfectamente o considerablemente coincidentes de los dúplex imperfectamente coincidentes o considerablemente poco coincidentes mediante la digestión de ADNasa o ARNasa, para ADN o ARN respectivamente, o mediante la detección de diferencias en las temperaturas de fusión o en la cinética de la renaturalización. Las diferencias entre las secuencias de polinucleótidos también pueden detectarse mediante alteraciones en la movilidad electroforética de los fragmentos de polinucleótidos en geles en comparación con una secuencia de referencia. Esto puede llevarse a cabo con o sin agentes desnaturalizadores. Las diferencias entre polinucleótidos también pueden detectarse mediante la secuenciación directa de ADN o ARN. Véase, por ejemplo, Myers y col., Science, 230: 1242 (1985). También se pueden revelar cambios en la secuencia en sitios específicos mediante pruebas de protección de nucleasa, tales como la prueba de ARNasa, V1 y S1 o un procedimiento de escisión química. Véase, por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4397 a 4401 (1985).

En otra forma de realización, se puede construir un conjunto de sondas de polinucleótidos que comprenda la secuencia de nucleótidos BASB029 o fragmentos de la misma para llevar a cabo una selección eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación taxonómica o identificación. Los procedimientos de tecnología de matrices son muy conocidos y poseen una aplicabilidad general y pueden usarse para abordar diversas cuestiones en la genética molecular entre las que se incluyen la expresión genética, el ligamiento genético, y la variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y col., Science, 274: 610 (1996)).

Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:

(a) un polinucleótido de la presente invención, preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, o un fragmento de la misma;

(b) una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a);

(c) un polipéptido de la presente invención, preferentemente el polipéptido de SEQ ID NO: 4 o un fragmento del mismo; o

(d) un anticuerpo para un polipéptido de la presente invención, preferentemente para el polipéptido de SEQ ID NO: 4.

Se apreciará que cualquiera de tales kits, (a), (b), (c) o (d) puede comprender un componente sustancial. Tal kit se usará en el diagnóstico de una enfermedad o de la susceptibilidad a una enfermedad, entre otros usos.

La presente invención también se refiere al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos para el diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferentemente SEQ ID NO: 3, que está asociado a una enfermedad o patogenicidad proporcionará una herramienta para el diagnóstico que puede contribuir a, o definir, el diagnóstico de una enfermedad, el pronóstico del curso de una enfermedad, la determinación de la etapa de una enfermedad, o la susceptibilidad a una enfermedad, lo cual es la consecuencia de una subexpresión, sobreexpresión o expresión alterada del polinucleótido. Los organismos, particularmente los organismos infecciosos, portadores de mutaciones en tal polinucleótido, pueden detectarse en el nivel del polinucleótido mediante diversas técnicas, tales como las descritas en otras partes de la presente descripción.

También pueden detectarse las células de un organismo portador de mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención en el nivel del polinucleótido o polipéptido mediante diversas técnicas, para permitir la serotipia, por ejemplo. Se puede usar, por ejemplo, la RT-PCR para detectar mutaciones en el ARN. Se prefiere particularmente el uso de la RT-PCR junto con sistemas de detección automatizada, tales como, por ejemplo, GeneScan. También se puede usar ARN, ADNc o ADN genómico con idénticos fines, PCR. A modo de ejemplo se pueden usar cebadores PDR complementarios a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB029 para identificar y analizar mutaciones.

La invención también proporciona cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos eliminados de los extremos 5' y/o 3'. Estos cebadores se pueden usar, entre otras cosas, para amplificar el ADN y/o ARN del BASB029 aislado a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal. Los cebadores pueden usarse para amplificar un polinucleótido aislado a partir de un individuo infectado, de tal forma que el polinucleótido puede someterse después a diversas técnicas para la elucidación de la secuencia de polinucleótidos. De este modo, se pueden detectar mutaciones en la secuencia de polinucleótidos y usarlas para diagnosticar y/o pronosticar la infección o su etapa o curso, o para determinar el serotipo y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención también proporciona un procedimiento para el diagnóstico de enfermedades, preferentemente infecciones bacterianas, más preferentemente infecciones causadas por Neisseria meningitidis, que comprende la determinación a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal, de un nivel aumentado de expresión del polinucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 3. La expresión aumentada o disminuida de un polinucleótido BASB029 puede medirse usando uno cualquiera de los procedimientos muy conocidos por los expertos en la materia para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección de ARNasa, técnica de hibridación de tipo Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, para detectar la presencia de, por ejemplo, una infección, se puede usar una prueba diagnóstica de acuerdo con la invención para detectar la sobreexpresión de polipéptido BASB029 comparada con muestras de tejido de control normales. Las técnicas de análisis que se pueden usar para determinar los niveles de un polipéptido BASB029, en una muestra derivada de un huésped, tal como un material corporal, son muy conocidas por los expertos en la materia. Entre tales procedimientos de análisis se incluyen ensayos radioinmunológicos, ensayos de unión competitiva, análisis por técnicas de hibridación de tipo Western, ensayos de sándwich de anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos ELISA.

Los polinucleótidos de la invención pueden usarse como componentes de matrices de polinucleótidos, preferentemente matrices de alta densidad o mallas. Estas matrices de alta densidad resultan particularmente útiles para el diagnóstico y el pronóstico. Por ejemplo, se puede usar un conjunto de puntos comprendiendo cada uno un gen diferente y también comprendiendo un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, para sondear, como por ejemplo usando la hibridación o la amplificación de ácidos nucleicos, usando una sonda derivada u obtenida a partir de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia de polinucleótidos particular o una secuencia relacionada en un individuo. Tal presencia puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente Neisseria meningitidis, y puede resultar útil para diagnosticar y/o pronosticar una enfermedad o el curso de una enfermedad. Se prefiere una malla que comprenda varias variantes de la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 3. También se prefiere una malla que comprenda varias variantes de una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 4.

Anticuerpos

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención o variantes de los mismos, o células que los expresan se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para tales polipéptidos o polinucleótidos respectivamente.

En ciertas formas de realización preferidas de la invención se proporcionan anticuerpos contra polinucleótidos o polipéptidos BASB029.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención pueden obtenerse mediante la administración de los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos portadores de epitopos de uno de ellos o de ambos, análogos de uno de ellos o de ambos, o células que expresan uno de ellos o ambos, a un animal, preferentemente no humano, usando protocolos rutinarios. Para la preparación de anticuerpos monoclonales se puede usar cualquier técnica conocida en la técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos continuos de líneas celulares. Entre los ejemplos se incluyen diversas técnicas, tales como las que aparecen en G. Kohler y C. Milstein, Nature 256: 495 a 497 (1975); Kozbor y col., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole y col., págs. 77 a 96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena simple (patente de EE.UU. nº 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena simple para los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención. Además, se pueden usar ratones transgénicos, u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos para los polipéptidos o polinucleótidos de la invención.

Otra posibilidad consiste en utilizar la tecnología de exposición en fago para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de enlace hacia un polipéptido de la invención, a partir de un repertorio de v-genes amplificados mediante PCR de linfocitos procedentes de humanos seleccionados por poseer anti-BASB029 o a partir de genotecas nativas (McCafferty, y col., (1990) Nature 348: 552 a 554; Marks y col., Biotechnology 10, 779 a 783). La afinidad de estos anticuerpos también se puede mejorar mediante, por ejemplo, el barajado de la cadena (Clackson y col., (1991) Nature 352: 628).

Los anticuerpos descritos anteriormente pueden emplearse para aislar o para identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

Así, se pueden emplear, entre otros, anticuerpos contra el polipéptido BASB029 o el polinucleótido BASB029 para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Entre las variantes del polipéptido se incluyen variantes antigénica, epitópica o inmunológicamente equivalentes de un aspecto particular de la presente invención.

Preferentemente, el anticuerpo de la variante del mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénico en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es humano el anticuerpo puede, más preferentemente, "humanizarse", donde la región o regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo derivado del hibridoma se han transplantado a un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo tal como se describe en Jones y col.,(1986) Nature 321: 522 a 525 o Tempest y col., (1991) Biotechnology 9, 266 a 273).

Antagonistas y agonistas - ensayos y moléculas

Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención también pueden usarse para calcular la unión de pequeños substratos moleculares y ligandos en, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, genotecas químicas y mezclas de productos naturales. Estos substratos y ligandos pueden ser substratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan y col., Current Protocols in Immunology 1(2): capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de selección pueden simplemente medir la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas portadoras del polipéptido o polinucleótido, o a una proteína de fusión del polipéptido por medio de una etiqueta asociada directa o indirectamente con el compuesto candidato. Otra posibilidad consiste en que el procedimiento de selección implique la competición con un competidor marcado. Además, estos procedimientos de selección pueden analizar si el compuesto candidato da lugar a una señal generada mediante la activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Los inhibidores de la activación se someten a ensayo generalmente en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación por parte del agonista por la presencia del compuesto candidato. Se pueden emplear un polipéptido constitutivamente activo y/o polipéptidos y polinucleótidos constitutivamente expresados en procedimientos de selección para agonistas inversos o inhibidores, en ausencia de un agonista o inhibidor, analizando si el compuesto candidato da lugar a la inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido, según el caso. Además, los procedimientos de selección pueden comprender simplemente las etapas de mezcla de un compuesto candidato con una solución que contenga un polipéptido o un polinucleótido de la presente invención para formar una mezcla, medición de la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB029 en la mezcla, y comparación de la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB029 de la mezcla con un estándar. Las proteínas de fusión, tales como las creadas a partir de la parte Fc y el polipéptido BASB029, tal como se describe anteriormente, se pueden usar también para efectuar ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como de polipéptidos relacionados filogenética y/o funcionalmente (véase D. Bennet y col., J Mol Recognition. 8: 52 a 58 (1995); y K. Johanson y col., J Biol Chem, 270(16): 9459 a 9471(1995)).

También pueden usarse los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a y/o interaccionan con un polipéptido de la presente invención para configurar procedimientos de selección para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de ARNm y/o polipéptido en las células. Por ejemplo, se puede construir una prueba ELISA para medir niveles de polipéptido secretado o asociado a células usando anticuerpos monoclonales y policlonales mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica. Esto puede usarse para descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también llamados antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o tejidos manipulados de forma adecuada.

La invención también proporciona un procedimiento de selección de compuestos para identificar aquellos que potencian (agonista) o bloquean (antagonista) la acción de los polipéptidos o polinucleótidos BASB029, particularmente aquellos compuestos que tienen acción bacteriostática y/o bactericida. El procedimiento de selección puede implicar técnicas de alto rendimiento. Por ejemplo, para seleccionar agonistas o antagonistas, se incuba en ausencia o presencia de una molécula candidata que puede ser un agonista o antagonista de BASB029 una mezcla de reacción sintética, un compartimento celular, tal como una membrana, envoltorio celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de ellas, que comprenda polipéptido BASB029 y un ligando o substrato marcado de tal polipéptido. La capacidad de la molécula candidata para agonizar o antagonizar el polipéptido BASB029 se refleja en una disminución de la unión del ligando marcado o una disminución en la producción de producto a partir de tal substrato. Las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB029, tienen más probabilidades de ser buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien y, según el caso, aumentan el ritmo de producción del producto a partir del substrato, aumentan la transducción de la señal, o aumentan la actividad del canal químico son agonistas. La detección del ritmo o nivel de, según el caso, la producción de producto a partir del substrato, transducción de la señal, o actividad del canal químico puede potenciarse usando un sistema indicador. Entre los sistemas indicadores que pueden resultar útiles a este respecto se incluyen, pero no se limitan a ensayos colorimétricos, de substrato marcado convertido en producto, de un gen indicador que responda a los cambios en la actividad del polinucleótido o polipéptido BASB029, y de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de ensayo para agonistas de BASB029 es un ensayo competitivo que combina BASB029 y un agonista potencial con moléculas de unión de BASB029, moléculas de unión de BASB029 recombinante, substratos o ligandos naturales, o substratos o ligandos miméticos, bajo unas condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El BASB029 se puede marcar, como, por ejemplo, mediante radioactividad o un compuesto colorimétrico, de forma que se puede determinar con precisión el número de moléculas de BASB029 unidas a una molécula de unión o convertidas en producto para calcular la eficacia del antagonista potencial.

Entre los antagonistas potenciales se incluyen, entre otros, pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la invención y de ese modo inhiben o extinguen su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser pequeñas moléculas orgánicas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína o anticuerpo relacionado estrechamente que una los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir actividades inducidas por BASB029, evitando de ese modo la acción o expresión de los polipéptidos y/o polinucleótidos BASB029 excluyendo a los polipéptidos y/o polinucleótidos BASB029 de la unión.

Entre los antagonistas potenciales se incluye una molécula pequeña que se une al sitio de unión del polipéptido y lo ocupa, evitando de ese modo la unión con las moléculas de unión celular, de forma que se impide la actividad biológica normal. Entre los ejemplos de moléculas pequeñas se incluyen, pero no se limitan a, pequeñas moléculas orgánicas, péptidos o moléculas similares a péptidos. Entre otros antagonistas potenciales se incluyen moléculas antisentido (véase Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Entre los antagonistas potenciales se incluyen compuestos relacionados con BASB029 y sus variantes.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a proteínas de fusión solubles manipuladas genéticamente que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas partes de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como inmunoglobulina, se prefiere la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una forma de realización particular, la parte Fc puede eliminarse simplemente incorporando una secuencia de escisión que puede escindirse con un factor de coagulación de la sangra Xa. Además, la presente invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y al uso de las mismas para la selección de fármacos, el diagnóstico y la terapia. Otro aspecto de la invención se refiere además a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Se pueden encontrar ejemplos de la tecnología de las proteínas de fusión en las solicitudes de patente internacional nº WO94/29458 y WO94/22914.

Cada una de las secuencias de polinucleótidos que se proporcionan en la presente descripción se puede usar en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, tras la expresión, puede usarse como objetivo para la selección de fármacos antibacterianos. Además, las secuencias de polinucleótidos que codifican las regiones amino terminales de la proteína codificada, o las Shine-Delgarno u otras secuencias que facilitan la traducción del respectivo ARNm se pueden usar para construir secuencias antisentido para controlar la expresión de la secuencia codificante que reviste interés.

La invención también proporciona el uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un huésped eucariota, preferentemente mamífero, responsable de las secuelas de la infección. En particular, las moléculas de la presente invención se pueden usar en la prevención de la adhesión bacteriana, en particular bacterias gram positivas y/o gram negativas, a proteínas de matriz extracelular de eucariotas, preferentemente mamíferos, sobre dispositivos permanentes o a proteínas de matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de matriz extracelular de eucariotas, preferentemente mamíferos, y proteínas bacterianas de BASB029 que median el daño al tejido y/o para bloquear el curso normal de la patogénesis en infecciones iniciadas por medios distintos a la implantación de dispositivos permanentes u otras técnicas quirúrgicas.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporcionan agonistas y antagonistas de BASB029, preferentemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos y bactericidas.

Los antagonistas y agonistas de la invención pueden emplearse, por ejemplo, para evitar, inhibir y/o tratar enfermedades.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a mimotopos del polipéptido de la invención. Un mimotopo es una secuencia peptídica, suficientemente similar al péptido nativo (secuencial o estructuralmente), que es capaz de ser reconocida por anticuerpos que reconocen al péptido nativo; o es capaz de producir anticuerpos que reconocen al péptido nativo cuando se acoplan a un portador adecuado.

Los mimotopos peptídicos pueden diseñarse para un fin particular mediante la adición, deleción o sustitución de aminoácidos elegidos. Así, los péptidos pueden modificarse para una mayor facilidad de conjugación a una proteína portadora. Por ejemplo, para algunos procedimientos de conjugación química puede resultar deseable incluir una cisteína terminal. Además, puede resultar deseable para los péptidos conjugados a una proteína portadora que incluyan un extremo distal hidrófobo con respecto al extremo conjugado del péptido, de tal forma que el extremo libre no conjugado del péptido permanece asociado con la superficie de la proteína portadora; presentando de ese modo el péptido en una conformación que se asemeja lo más posible a la del péptido tal como se encuentra en el contexto global de la molécula nativa. Por ejemplo, los péptidos pueden alterarse para que tengan una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrófoba C-terminal. Otra posibilidad consiste en que se efectúe la adición o sustitución de una forma D-estereoisomérica de uno o más de los aminoácidos para crear un derivado beneficioso, por ejemplo para potenciar la estabilidad del péptido.

Otra posibilidad consiste en identificar mimotopos peptídicos usando anticuerpos que sean capaces de unirse ellos mismos a los polipéptidos de la presente invención usando técnicas tales como la tecnología de exposición en fago (EP 0552267 B1). Esta técnica genera un gran número de secuencias peptídicas que imitan la estructura de los péptidos nativos y son, por tanto, capaces de unirse a anticuerpos peptídicos antinativos, pero pueden no compartir necesariamente una homología ellos mismos con el polipéptido nativo.

Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferentemente humanos, que comprende la inoculación al individuo del polinucleótido y/o polipéptido BASB029, o un fragmento o variante del mismo, adecuado para producir una respuesta inmune de anticuerpos y/o células T para proteger a dicho individuo de la infección, particularmente la infección bacteriana y más particularmente de la infección por Neisseria meningitidis. También se proporcionan procedimientos mediante los cuales tal respuesta inmunológica disminuye el ritmo de la replicación bacteriana. Otro aspecto más de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, que comprende la administración a tal individuo de un vector, secuencia o ribozima de ácido nucleico para dirigir la expresión del polinucleótido y/o proteína BASB029, o un fragmento o una variante del mismo, para expresar el polinucleótido y/o polipéptido BASB029, o un fragmento o variante del mismo in vivo con el fin de inducir una respuesta inmunológica, como por ejemplo, producir una respuesta inmune de anticuerpos y/o células T, entre las que se incluyen, por ejemplo, células T productoras de citocina o células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo, preferentemente un humano, de la enfermedad, se haya o no establecido ya esa enfermedad en el individuo. Un ejemplo de la administración del gen consiste en acelerarlo en las células deseadas como un recubrimiento sobre las partículas o de cualquier otra forma. Tal vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido ADN/ARN, un complejo ADN-proteína o un complejo ARN-proteína.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición inmunológica que, cuando se introduce en un individuo, preferentemente un humano, capaz de tener una respuesta inmunológica inducida dentro de él, induce una respuesta inmunológica en tal individuo a un polinucleótido BASB029 y/o un polipéptido codificado a partir de éste, en la que la composición comprende un polinucleótido BASB029 recombinante y/o un polipéptido codificado a partir de éste y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido BASB029, polipéptido codificado a partir de éste, u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica puede usarse terapéutica o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad de anticuerpos y/o inmunidad celular, tal como una inmunidad celular originada por células T CTL o CD4+.

Se puede fusionar un polipéptido BASB029 o un fragmento del mismo con una coproteína o un radical químico que pueden producir o no anticuerpos por sí mismos, pero que son capaces de estabilizar la primera proteína y de producir una proteína fusionada o modificada que poseerá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferentemente propiedades protectoras. La proteína recombinante así fusionada comprende además preferentemente una coproteína antigénica, tal como una lipoproteína D procedente de Haemophilus influenzae, glutatión-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína relativamente grande que solubiliza la proteína y facilita la producción y purificación de la misma. Además, la coproteína puede actuar como adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que recibe la proteína. La coproteína puede fijarse al extremo amino o al carboxi de la primera proteína.

La presente invención proporciona composiciones, particularmente composiciones de vacunas, y procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimulantes, tales como las descritas en Y. Sato y col., Science 273: 352 (1996).

Además, la presente invención proporciona procedimientos que usan el polinucleótido descrito o fragmentos particulares del mismo, que han demostrado que codifican regiones no variables de las proteínas de la superficie celular bacteriana, en construcciones de polinucleótidos usadas en tales experimentos de inmunización genética en modelos animales de infección con Neisseria meningitidis. Tales experimentos resultarán particularmente útiles para identificar epitopos de proteínas capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se cree que este enfoque permitirá la posterior preparación de anticuerpos monoclonales con un valor particular, derivados de órgano requerido del animal que resiste o cura la infección con éxito, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana, particularmente una infección por Neisseria meningitidis, en mamíferos, particularmente humanos.

La invención incluye también una formulación de una vacuna que comprende un polipéptido y/o polinucleótido de la invención inmunogénicos y recombinantes junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Debido a que los polipéptidos y polinucleótidos pueden descomponerse en el estómago, ambos se administran preferentemente de forma parenteral, incluida, por ejemplo, una administración que sea subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intradérmica. Entre las formulaciones adecuadas para la administración parenteral se incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que aportan un carácter isotónico a la formulación con respecto a los fluidos corporales, preferentemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes monodosis o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales herméticos, y pueden almacenarse en un estado congelado en seco que requiere únicamente la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su uso.

La formulación de la vacuna de la invención puede incluir también sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente, el sistema adyuvante origina preferentemente una respuesta de tipo TH1.

Se pueden distinguir, en líneas generales, dos categorías extremas en las respuestas inmunes, que son las respuestas inmunes mediadas humoral o celularmente (caracterizadas tradicionalmente por unos mecanismos efectores de protección de anticuerpos y de células respectivamente). Estas categorías de respuesta han sido denominadas respuestas de tipo TH1 (respuesta por mediación celular), y respuestas inmunes de tipo TH2 (respuesta por mediación humoral).

Las respuestas inmunes de tipo TH1 pueden caracterizarse por la generación de linfocitos T citotóxicos de haplotipo restringido específicos para el antígeno y respuestas de células asesinas naturales. En ratones, las respuestas de tipo TH1 se caracterizan a menudo por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en humanos éstas corresponden a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunes de tipo TH2 se caracterizan por la generación de una amplia gama de isotipos de inmunoglobulina que incluyen en los ratones IgG1, IgA e IgM.

Puede considerarse que la fuerza motriz que se halla tras el desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son las citocinas. Unos niveles elevados de citocinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células al antígeno dado, mientras que unos niveles elevados de citocinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales al antígeno.

La distinción de las respuestas inmunes de tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad, un individuo producirá una respuesta inmune que se describe como predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo resulta conveniente considerar las familias de citocinas en términos de lo descrito para los clones de células T CD4 +ve de múridos por Mosmann y Coffman (T. R. Mosmann y R. L. Coffman (1989) Células TH1 y TH2: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7 págs. 145 a 173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH1 se asocian con la producción de las citocinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citocinas a menudo asociadas directamente con la inducción de respuestas inmunes de tipo TH1 no son producidas por células T, tales como IL-12. A diferencia de esto, las respuestas de tipo TH2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que ciertos adyuvantes de vacunas son apropiados para la estimulación de respuestas de citocina de tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune tras una vacunación o infección incluyen la medición directa de la producción de citocinas TH1 o TH2 por los linfocitos T in vitro tras la reestimulación con antígeno, y/o la medición de la proporción IgG1:IgG2 de respuestas de anticuerpo específicas para el antígeno.

Así, un adyuvante de tipo TH1 es uno que estimula preferentemente poblaciones de células T aisladas para producir niveles elevados de citocinas de tipo TH1 cuando se reestimulan con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo tanto de respuestas de los linfocitos T citotóxicos CD8+ como de inmunoglobulina específicas para el antígeno asociadas con el isotipo de tipo TH1.

En la solicitud de patente internacional nº WO 94/00153 y WO 95/17209 se describen adyuvantes que son capaces de realizar la estimulación preferente de la respuesta de célula TH1.

Uno de tales adyuvantes es el monofosforil lípido A 3 des-O-acilado (3D-MPL). Éste es conocido a partir del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente, es una mezcla de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado con cadenas 4, 5 ó 6 aciladas y la fabrica Ribi Immunochem, Montana. En la patente europea 0689454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA) se describe una forma preferida de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado.

Preferentemente, las partículas de 3D-MPL son lo bastante pequeñas como para filtrarlas de forma estéril a través de una membrana de 0,22 micrómetros (patente europea número 0689454).

El 3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug a 100 \mug, preferentemente de 25 a 50 \mug por dosis, en la que el antígeno estará presente típicamente en el intervalo de 2 a 50 \mug por dosis.

Otro adyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada por HPLC derivada a partir de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Éste puede mezclarse opcionalmente con monofosforil lípido A 3 des-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto a un vehículo.

El procedimiento de producción de QS21 se describe en la patente de EE.UU. nº 5.057.540.

Se han descrito con anterioridad (documento WO 96/33739) formulaciones de adyuvante no reactogénico que contienen QS21. Tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han demostrado ser adyuvantes estimulantes de TH1 cuando se formulan junto con un antígeno.

Entre otros adyuvantes que son estimulantes preferentes de la respuesta de la célula TH1 se incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias de CpG no metiladas tal como se describe en el documento WO 96/02555.

También se contempla que las combinaciones de diferentes adyuvantes estimulantes de TH1, tales como los mencionados anteriormente, proporcionan un adyuvante que constituye un estimulante preferente de la respuesta de la célula TH1. Por ejemplo, se puede formular QS21 junto con 3D-MPL. La proporción de QS21:3D-MPL será típicamente del orden de 1:10 a 10:1; preferentemente de 1:5 a 5:1 y a menudo sustancialmente 1:1. El intervalo preferido para una sinergia óptima es de 2,5:1 a 1:1 3D-MPL:QS21.

En la composición de la vacuna según la invención también está presente preferentemente un vehículo. El vehículo puede ser un aceite en emulsión acuosa, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido, los antígenos de la composición de la vacuna según la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en tal emulsión. Además, el aceite en emulsión acuosa puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Para la administración humana el QS21 y el 3D-MPL estarán presentes típicamente en una vacuna en el intervalo de 1 \mug a 200 \mug, tal como de 10 a 100 \mug, preferentemente de 10 \mug a 50 \mug por dosis. El aceite en agua comprenderá típicamente entre 2 y 10% de escualeno, de 2 a 10% de alfa tocoferol y de 0,3 a 3% de Tween 80. La proporción escualeno : alfa tocoferol es preferentemente igual o menor que 1, ya que esto proporciona una emulsión más estable. También puede haber span 85 presente en un nivel de 1%. En algunos casos puede resultar ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizante.

Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas contienen preferentemente un aceite no tóxico, por ejemplo, escualano o escualeno, un emulsionante, por ejemplo Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, un tampón fosfato salino.

En el documento WO 95/17210 se describe una formulación adyuvante particularmente potente en la que participan QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite y agua.

La presente invención también proporciona una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención combinada con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes y trastornos relacionados. Tal composición de vacuna polivalente puede incluir un adyuvante inductor de TH1 tal como se describe anteriormente.

Aunque la invención se ha descrito haciendo referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB029, debe entenderse que ésta cubre fragmentos de polipéptidos y polinucleótidos de origen natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, deleciones o sustituciones que no afecten sustancialmente las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.

El antígeno puede administrarse también en forma de bacterias enteras (muertas o vivas) o como fracciones subcelulares, entre estas posibilidades se incluye la propia N. meningitidis.

Composiciones, kits y administración

En otro aspecto de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido BASB029 y/o polipéptido BASB029 para la administración a una célula o a un organismo multicelular.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o polipéptido tratado en la presente descripción o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden emplearse combinados con un vehículo o vehículos estériles o no estériles, para su uso con células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para su administración a un individuo. Tales composiciones comprenden, por ejemplo, pero no se limitan a, solución salina, tampón salino, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debería adecuarse al modo de administración. La invención se refiere también al diagnóstico y a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenos de uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente.

Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de cualquier manera conveniente y eficaz, incluida, por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica, entre otras.

El agente activo puede administrarse a un individuo, en terapia o como profiláctico, como composición inyectable, por ejemplo como dispersión acuosa estéril, preferentemente isotónica.

En otro aspecto, la presente invención prevé composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, péptido agonista o antagonista o compuesto de pequeñas moléculas, combinada con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Entre tales vehículos se incluye, pero no se limitan a, solución salina, tampón salino, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. La invención también se refiere a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenos de uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente. Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptará a la vía de administración, por ejemplo por una vía sistémica u oral. Entre las formas preferidas de administración sistémica se incluye la inyección, típicamente por inyección intravenosa. Se pueden usar otras vías de inyección, tales como la subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Entre otros medios alternativos para la administración sistémica se incluyen la administración transmucosa y transdérmica usando penetradores tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si se pueden formular un polipéptido u otros compuestos de la presente invención en una formulación entérica o encapsulada, la administración oral también puede ser posible. La administración de estos compuestos también puede ser tópica y/o localizada, en forma de ungüentos, pastas, geles, soluciones, polvos y similares.

Para la administración a mamíferos, y particularmente a humanos, se espera que el nivel de dosis diaria del agente activo será de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, típicamente alrededor de 1 mg/kg. En cualquier caso, el médico determinará la dosificación concreta que resultará más adecuada para un individuo y variará con la edad, el peso y la respuesta del individuo en particular. Las anteriores dosificaciones constituyen ejemplos del caso medio. Por supuesto, puede haber casos individuales en los que se precisen intervalos de dosificación más altos o más bajos, y éstos se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

El intervalo de dosificación requerido depende de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza del trastorno del sujeto, y el juicio del médico que le atiende. No obstante, las dosificaciones adecuadas se encuentran en el intervalo de 0,1 a 100 \mug/kg del sujeto.

La composición de la vacuna está convenientemente en forma inyectable. Se pueden emplear adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmune. Una dosis unitaria adecuada para la vacunación es de 0,5 a 5 microgramos/kg de antígeno, y tal dosis se administra preferentemente de 1 a 3 veces y con un intervalo de 1 a 3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado no se observarán efectos toxicológicos con los compuestos de la invención que pudieran excluir su administración a individuos adecuados.

Sin embargo, se deben esperar grandes variaciones en la dosificación necesaria en vista de la variedad de compuestos disponibles y las diferentes eficacias de las diversas vías de administración. Por ejemplo, se esperaría que la administración oral requiriera dosificaciones más altas que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar usando rutinas empíricas estándar para la optimización, tal como bien se entiende en la técnica.

Bases de datos de secuencias, secuencias en un medio tangible y algoritmos

Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos constituyen un recurso de información valiosa con la que determinar sus estructuras bi y tridimensionales así como para identificar más secuencias de homología similar. Estos enfoques se facilitan de la forma más sencilla almacenando la secuencia en un medio que legible por ordenador y usando después los datos almacenados en un programa de estructuras macromoleculares conocido o para buscar una base de
datos de secuencias usando herramientas de búsqueda muy conocidas, tales como el paquete de programas GCG.

La invención también proporciona procedimientos para el análisis de secuencias o cadenas de caracteres, particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Entre los procedimientos preferidos de análisis de secuencias se incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencias, tal como el análisis de identidad y similaridad, análisis de estructura de ADN, ARN y proteína, ensamblaje de secuencias, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencias, determinación de marco de lectura abierto, llamada a bases de ácidos nucleicos, análisis de uso de codones, recorte de bases de ácidos nucleicos, y análisis de secuenciación del pico cromatográfico.

Se proporciona un procedimiento basado en ordenador para realizar la identificación de la homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia de polinucleótidos con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar la homología.

Todas las publicaciones y referencias, que incluyen, pero no se limitan a, las patentes y solicitudes de patente citadas en la presente descripción, se incorporan en la misma por referencia en su totalidad como si se indicara específica e individualmente que cada publicación o referencia individual se incorporara por referencia en la presente descripción como si se expusieran por completo. Cualquier solicitud de patente sobre la que la presente solicitud reivindique prioridad se incorpora también por referencia en la presente descripción en su totalidad de la manera descrita anteriormente para las publicaciones y referencias.

Definiciones

"Identidad", tal como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, según el caso, según se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según el caso, según se determina mediante la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "identidad" puede calcularse fácilmente mediante procedimientos conocidos, incluidos, pero no limitados a, los descritos en Computational Molecular Biology, A. M. Lesk, ed. Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, D. W. Smith, ed. Academic Press, Nueva York, 1993; Computer analysis of Sequence Data, 1ª parte, A. M. Griffin y H. G. Griffin, ed. Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heine, Academic Press, Nueva York, 1987; y Sequence Analysis Primer, M. Gribskov, y J. Devereux, ed. M Stockton Press, Nueva York, 1991; y H. Carrillo y D. Lipman, SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos para determinar la identidad están diseñados para dar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad están codificados en programas informáticos disponibles públicamente. Entre los procedimientos de programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias se incluye, pero no se limitan a, el programa GAP del paquete de programas GCG (J. Devereux y col., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (S. F. Altschul y col., J. Molec. Biol. 215: 403 a 410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444 a 2448 (1988). La familia de programas BLAST está disponible públicamente en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, S. Altschul y col, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; S. Altschul y col., J. Mol. Biol. 215: 403 a 410 (1990). También se puede usar el famoso algoritmo Smith Waterman para determinar la identidad.

Los parámetros para la comparación de la secuencia de polipéptidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453 (1970).

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915 a 10919 (1992).

Penalización de hueco: 8

Penalización de longitud de hueco: 2

Hay un programa útil con estos parámetros, disponible públicamente como el programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para las comparaciones de péptidos (además de sin penalización para huecos terminales).

Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453 (1970).

Matriz de comparación: coincidencias = +10, no coincidencias = 0.

Penalización por hueco: 50

Penalización por longitud de hueco: 3

Disponible como: el programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por defecto para las comparaciones de ácidos nucleicos.

A continuación, en (1) y (2), se proporciona un significado preferido de "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, según el caso.

(1) entre las formas de realización de los polinucleótidos se incluye además un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que posee al menos una identidad de 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% con respecto a la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 1, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 1 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluidas transición y transversión, o inserción de nucleótidos, y en la que dichas alteraciones pueden tener lugar en las posiciones terminales 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente en los nucleótidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en SEQ ID NO: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y restando después ese producto de dicho número total de nucleótidos en SEQ ID NO: 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos en SEQ ID NO: 1, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97% o 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo del operador de la multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo hasta el entero más cercano antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2 pueden crear mutaciones sin sentido, de cambio de sentido o de desplazamiento del marco de lectura en esta secuencia codificante y de ese modo alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido siguiendo tales alteraciones.

A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 1, es decir, puede ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos en comparación con la secuencia de referencia, de tal forma que el porcentaje de identidad es menor que una identidad del 100%. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluidas transición y transversión, o inserción de ácidos nucleicos, y en la que dichas alteraciones pueden tener lugar en las posiciones terminales 5' y 3' de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente en los ácidos nucleicos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en SEQ ID NO: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y restando después ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en SEQ ID NO: 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en SEQ ID NO: 1, y es, por ejemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, etc., \cdot es el símbolo del operador de la multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo hasta el entero más cercano antes de restarlo de x_{n}.

(2) entre las formas de realización de polipéptidos se incluye además un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que posee al menos una identidad de 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% con respecto a la secuencia de referencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia de polipéptidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 2 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluidas sustitución conservadora y no conservadora, o inserción de aminoácidos, y en la que dichas alteraciones pueden tener lugar en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente en los aminoácidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en SEQ ID NO: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y restando después ese producto de dicho número total de aminoácidos en SEQ ID NO: 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en SEQ ID NO: 2, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97% o 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo del operador de la multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo hasta el entero más cercano antes de restarlo de x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia de polipéptidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 2, es decir, puede ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, de tal forma que el porcentaje de identidad es menor que una identidad del 100%. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluidas transición y transversión, o inserción de aminoácidos, y en la que dichas alteraciones pueden tener lugar en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente en los aminoácidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un % de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos en SEQ ID NO: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y restando después ese producto de dicho número total de aminoácidos en SEQ ID NO: 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en SEQ ID NO: 2, y es, por ejemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, etc., y \cdot es el símbolo del operador de la multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo hasta el entero más cercano antes de restarlo de x_{a}.

Cuando se usa en la presente descripción en referencia a un organismo, "individuo(s)" significa un eucariota multicelular, incluidos, pero no limitados a, metazoos, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate y un humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" con respecto a su estado natural, es decir, si se da en la naturaleza, ha sido cambiado o eliminado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", según se emplea el término en la presente descripción. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduzca en un organismo mediante una transformación, manipulación genética o mediante cualquier otro procedimiento recombinante está "aislado" aunque aún esté presente en dicho organismo, el cual puede estar vivo o no.

"Polinucleótido(s)" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificados o ARN o ADN modificados que incluyen regiones mono y bicatenarias.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero conserva las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere de otro polinucleótido de referencia en la secuencia de nucleótidos. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar lugar a sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, tal como se explica más adelante. Una variante típica de un polipéptido difiere de otro polipéptido de referencia en la secuencia de aminoácidos. Generalmente, las diferencias se limitan a fin de que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante sean muy similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones y deleciones en cualquier combinación. Un residuo aminoacídico sustituido o insertado puede ser o no uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede darse en la naturaleza tal como una variante alélica, o puede ser una variante de la que no se conoce su existencia en la naturaleza. Las variantes de polinucleótidos y polipéptidos que no se dan en la naturaleza pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

"Enfermedad(es)" significa cualquier enfermedad causada por o relacionada con la infección por una bacteria, incluidas, por ejemplo, infección del tracto respiratorio superior, enfermedades bacterianas invasivas, tales como bacteremia y meningitis.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se llevan a cabo usando técnicas estándar, que son muy conocidas y rutinarias para los expertos en la materia, a excepción de allí donde se describa lo contrario detalladamente. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1 Descubrimiento y secuenciación confirmatoria de ADN del gen BASB029 procedente de dos cepas de N. meningitidis A: BASB029 en serogrupo B, cepa ATCC13090 de N. meningitidis

El gen BASB029 de SEQ ID NO: 1 se descubrió en la base de datos Incyte Pathoseq que contiene secuencias inacabadas de ADN genómico de la cepa ATCC13090 de N. meningitidis. La traducción de la secuencia de polinucleótidos BASB029, que se muestra en SEQ ID NO: 2, mostró una similaridad considerable (identidad de 52% en un solapamiento de 582 aminoácidos) con la proteína de fibrilla de superficie (HSF) de Haemophilus influenzae.

La secuencia del gen BASB029 también se confirmó experimentalmente. Con este fin, se extrajo ADN genómico de 10^{10} células de las células de N. meningitidis (cepa ATC 13090) usando el kit QUIAGEN de extracción de ADN genómico (Quiagen Gmbh), y se sometió 1 \mug de este material a la amplificación de ADN de reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores Hsf1 (5'-GGG GCA TAT GAA CAA AAT ATA CCG CAT CAT TTG GAA-3') [SEQ ID NO: 5] que contiene un sitio interno NdeI (subrayado) y Hsf2 (5'-GGG GCT CGA GCC ACT GAT AAC CGA CAG ATG CGG A-3') [SEQ ID NO: 6] que contiene un sitio interno XhoI (subrayado). Este producto de la PCR se purifico en gel y se sometió a la secuenciación de ADN usando el kit Big Dig Cycle Sequencing (Perkin Elmer) y un secuenciador de ADN ABI 373A/PRISM. La secuenciación de ADN se llevó a cabo en ambas cepas con una redundancia de 2 y la secuencia completa se ensambló usando el programa SeqMan del paquete de software DNASTAR Lasergene. La secuencia de ADN resultante resultó ser 100% idéntica a SEQ ID NO: 1.

B: BASB029 en el serogrupo B, cepa H44/76 de N. meningitidis

La secuencia del gen BASB029 también se determinó en otra cepa del serogrupo B, la cepa H44/76. Con este fin, se extrajo ADN genómico de la cepa H44/76 de N. meningitidis usando las condiciones experimentales presentadas en el ejemplo 1. Este material se sometió después a la amplificación de ADN por reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores Hsf1 y Hsf2 específicos para el gen BASB029. Se obtuvo un fragmento de ADN 4389bp, digerido por las endonucleasas de restricción de NdeI/XhoI e insertado en los sitios correspondientes del vector de expresión/clonación pET-24b (Novagen) usando técnicas estándar de biología molecular (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, segunda edición, ed. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Press 1989). Después se sometió el pET-24b/BASB029 recombinante a la secuenciación de ADN usando el kit Big Dyes (Applied Biosystems) y se analizó en un secuenciador de ADN ABI 373/A en las condiciones descritas por el proveedor. A consecuencia de ello, se obtuvieron las secuencias del polinucleótido y, deducida, del polipéptido denominadas SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 respectivamente. Usando el programa PILEUP del paquete GCG, se realizó una alineación de las secuencias de polinucleótido de SEQ ID NO: 1 y 3, y se muestra en la figura 1; su nivel de identidad asciende a 96,8% según se determina mediante el programa GAP. Usando el mismo programa PILEUP, se realizó una alineación de las secuencias de polipéptido de SEQ ID NO: 2 y 4, y se muestra en la figura 2; su nivel de identidad asciende a 94,2% según se determina mediante el programa GAP. Tomados en conjunto, estos datos indican una fuerte conservación de la secuencia del gen BASB029 entre las dos cepas del serogrupo B de N. meningitidis.

Ejemplo 2 Expresión y purificación de la proteína BASB029 recombinante en Escherichia coli

La construcción del vector de clonación/expresión de pET-24b/BASB029 se describió en el ejemplo 1B. Este vector mantiene el gen BASB029 aislado de la cepa H44/76 en fusión con un tramo de residuos de 6 histidina, colocado bajo el control del promotor del gen 10 del bacteriófago T7. Para el estudio de la expresión, este vector se introdujo en la cepa (DE3) Novablue de Escherichia coli (Novagen), en la que el gen para la T7 polimerasa se coloca bajo el control del promotor lac regulable de isopropil-beta-D tiogalactósido (IPTG). Los cultivos líquidos (100 ml) de la cepa recombinante de E. coli [pET-24b/BASB029] Novablue (DE3) se cultivaron a 37ºC bajo agitación hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,6. En ese momento se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y el cultivo se cultivó durante 4 horas más. Después se centrifugó el cultivo a 10.000 rpm y el granulado se congeló a -20ºC durante al menos 10 horas. Tras descongelarlo, el granulado se resuspendió durante 30 min. A 25ºC en un tampón A (clorhidrato de guanidina 6 M, NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, Tris 0,01 M, pH 8,0), pasó tres veces a través de una aguja y se clarificó mediante centrifugado (20.000 rpm, 15 min.). Después se cargó la muestra a una velocidad de flujo de 1 ml/min en una columna Hitrap cargada con Ni^{2+} (Pharmacia Biotech). Después de pasar el flujo, la columna se lavó consecutivamente con 40 ml del tampón B (urea 8 M, NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, Tris 0,01 M, pH 8,0), 40 ml del tampón C (urea 8 M, NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, Tris 0,01 M, pH 6,3). Después se eluyó de la columna la proteína recombinante BASB029/His6 con 30 ml de tampón D (urea 8M, NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, Tris 0,01 M, pH 6,3) que contiene 500 mM de imidazol y se recogieron fracciones con un tamaño de 3 ml. Tal como se muestra en la figura 3 (carril 1), se eluyó de la columna una proteína BASB029/His6 altamente enriquecida (pureza estimada en más de 90% en manchado con coomassie), migrando a 66 kDa (masa molecular relativa estimada). Este polipéptido era reactivo contra un anticuerpo monoclonal de ratón producido contra el motivo 5-histidina (véase figura 3, carril 2). Tomados en su conjunto, estos datos indican que el gen BASB029 puede expresarse y purificarse bajo una forma recombinante (BASB029/His6) en E. coli.

Ejemplo 3 Inmunización de ratones con BASB029 recombinante

Se ha inyectado a ratones Balb/C, en los días 0, 14 y 29 (8 animales/grupo) la proteína BASB029 recombinante purificada parcialmente. A los animales se les inyectaron por vía subcutánea 5 \mug de antígeno en dos formulaciones diferentes: adsorbidas en 100 \mug de AIPO_{4} formulado en emulsión de SBAS2 (emulsión de SB62 que contiene 5 \mug de MPL y 5 \mug de QS21 por dosis). Sólo se ha añadido en el experimento un grupo de control negativo constituido por ratones inmunizados con la emulsión de SBAS2. Se obtuvo sangre de los ratones en los días 29 (15 días post II) y 35 (6 días post III) con el fin de detectar anticuerpos antiBASB029 específicos. Los anticuerpos antiBASB029 específicos se midieron en sueros combinados (de 10 ratones/grupo) mediante técnicas de hibridación de tipo Western en seis cepas de NmB diferentes (figuras 4 y 5).

Reconocimiento de epitopos de BASB029 en diferentes cepas NmB mediante técnicas de hibridación de tipo Western

En este análisis se han analizado sueros (combinados) de ratones inmunizados mediante técnicas de hibridación de tipo Western para el reconocimiento de los epitopos de BASB029 en seis cepas de neisseria meningitidis B diferentes: H44/76 (B:15:P1,7, 16, estirpe ET-5), M97 250987 (B:4:P1,15), BZ10 (B:2b:P1,2, estirpe A4), BZ198 (B:NT*: -, estirpe 3), EG328 (B:NT^{*}, estirpe ST-18), y la cepa ATCC 13090 Men B así como en proteína BASB029 recombinante purificado parcialmente ( * : NT : no escrito).

Brevemente, se ponen 10 \mul (> 10^{8} células/carril) de cada muestra tratada con el tampón de la muestra (10 min. A 95ºC) en un gel SDS-PAGE en gradiente (tris-glicina 4 a 20%, Novex, código nº EC60252), la migración electroforética tiene lugar a 125 voltios durante 90 min. Después, las proteínas se transfieren a una hoja de nitrocelulosa (0,45 \mum, código Bio-Rad nº 162-0114) a 100 voltios durante 1 hora usando un sistema Bio-Rad Transblot (código nº 170-3930). El filtro se bloqueó con PBS -0,05% Tween 20 toda la noche a temperatura ambiente, antes de la incubación con los sueros de ratón que contienen los anticuerpos antiBASB029 proveniente de las formulaciones AIPO_{4} y SBAS2. Estos sueros se diluyen 100 veces en PBS -0,05% Tween 20, y se incubaron en la lámina de nitrocelulosa durante dos horas a temperatura ambiente con una agitación suave, usando un sistema miniblotter (Miniprotean, código Bio-Rad nº 170-4017). Tras repetir tres etapas de lavado en PBS -0,05% Tween 20 durante 5 minutos, la hoja de nitrocelulosa se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora bajo una agitación suave con el conjugado apropiado (anticuerpos anti Ig de ratón biotinilados procedentes de la oveja, código Amersham nºRPN1001) diluida a 1/1000 en el mismo tampón de lavado. La membrana se lava tres veces, como antes, y se incuba durante 30 min. con agitación usando el complejo estreptavidina-peroxidasa (código Amersham nº1051) diluido a 1/1000 en el tampón de lavado. Después de repetir tres veces las etapas de lavado, el revelado tiene lugar durante un tiempo de incubación de 20 min. en 50 ml de una solución que contiene 30 mg de 4-cloro-1-naftol (Sigma), 10 ml de metanol, 40 ml de PBS, y 30 \mul de H_{2}O_{2}. El manchado se detiene mientras se lava la membrana varias veces en agua destilada.

Los resultados que se ilustran en las figuras 4 y 5 muestran que todas las cepas analizadas presentan la banda esperada alrededor de 65 a 70 kDa, y otras dos bandas principales alrededor de 55 y 90 kDa, que están relacionadas claramente con esta proteína BASB029 (polímeros, productos de degradación). Esto significa que la proteína BASB029 se expresa probablemente en la mayor parte de, si no en todas, las cepas NmB. En la figura 4, la proteína BASB029 recombinante aparece como cuatro proteínas diferentes, dos en los pesos moleculares esperados de 65 a 70 kDa, y otros en pesos moleculares muy elevados (>200 kDa) que son probablemente agregados de proteína BASB029 recombinante.

Ejemplo 4 Presencia de anticuerpos antiBASB029 en sueros de pacientes convalecientes

En este análisis, los sueros de convalecientes se han analizado mediante técnicas de hibridación de tipo Western para el reconocimiento de la proteína BASB029 recombinante purificada.

Brevemente, se ponen 5 \mug de proteína NmB BASB029 purificada parcialmente en un gel SDS-PAGE en gradiente (4 a 20%, Novex, código nº EC60252) para la migración electroforética. Las proteínas se transfieren a una hoja de nitrocelulosa (0,45 \mum, código Bio-Rad nº 162-0114) a 100 voltios durante 1 hora usando un sistema Bio-Rad Transblot (código nº 170-3930). Después, el filtro se bloqueó con PBS - 0,05% Tween 20 toda la noche a temperatura ambiente, antes de la incubación con los sueros humanos. Estos sueros se diluyen 100 veces en PBS - 0,05% Tween 20, y se incubaron en la lámina de nitrocelulosa durante dos horas a temperatura ambiente con una agitación suave, usando un sistema miniblotter (Miniprotean, código Bio-Rad nº 170-4017). Tras repetir tres etapas de lavado en PBS - 0,05% Tween 20 durante 5 minutos, la hoja de nitrocelulosa se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora bajo una agitación suave con el conjugado apropiado (anticuerpos anti Ig humana biotinilados procedentes de la oveja, código Amersham nºRPN1003) diluida a 1/500 en el mismo tampón de lavado. La membrana se lava tres veces, como antes, y se incuba durante 30 min. con agitación usando el complejo estreptavidina-peroxidasa (código Amersham nº1051) diluido a 1/1000 en el tampón de lavado. Después de repetir tres veces las etapas de lavado, el revelado tiene lugar durante el tiempo de incubación de 20 min. en 50 ml de una solución que contiene 30 mg de 4-cloro-1-naftol (Sigma), 10 ml de metanol, 40 ml de agua ultra pura, y 30 \mul de H_{2}0_{2}. El manchado se detiene mientras se lava la membrana varias veces en agua destilada.

Los resultados se ilustran en las figuras 6 y 7 que muestra que los 7 convalecientes reaccionan contra la proteína BASB019 rec. a alrededor de 65 a 70 kDa, mientras que las dos bandas superiores (> 200 kDa) son reconocidas por la mayoría de ellos, aunque con una reacción débil para unos pocos de ellos. Las reactividades con las proteínas de alto peso molecular confirma que estas dos bandas están claramente relacionadas con la proteína BASB029, que están probablemente en sus formas agregadas. En la parte A de las figuras 6 y 7, se observan las mismas reacciones contra estas cuatro bandas con los sueros de ratones inmunizados. Esto confirma claramente que estas cuatro bandas están relacionadas con la proteína BASB029 recombinante. Los sueros de ratón negativos no reaccionan con la proteína recombinante según se muestra también en la fig. 7.

Materiales depositados

Se ha depositado un depósito que contiene una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis con la American Type Culture Collection ("ATCC" en la presente descripción) el 22 de junio de 1997 y el número de depósito asignado 13090. El depósito se describió como Neisseria meningitidis (Albrecht y Ghon) y es una genoteca de insertos de 1,5 a 2,9 kb congelada en seco, construida a partir del aislado de N. meningitidis. El depósito se describe en Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 8: 1 a 15 (1958).

El depósito de la cepa de Neisseria meningitidis se denomina en la presente descripción "la cepa depositada" o "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene el gen BASB029 completo. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en la cepa depositada, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado de ese modo, controlan en caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias de la presente descripción.

El depósito de la cepa depositada se ha elaborado bajo las condiciones del tratado de Budapest en el procedimiento de reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para patentes. La cepa se ofrecerá al público irrevocablemente y sin restricciones o condiciones tras la expedición de una patente. La cepa depositada se proporciona meramente por conveniencia para los expertos en la materia y no se admite que el depósito es necesario para su habilitación, tal como se requiere bajo la 35 U.S.C \NAK112.

1

<110> Smithkline Beecham Biologicals S.A.

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<120> Nuevos compuestos

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<130> BM45321

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 6

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows versión 3.0

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<210> 1

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<211> 1785

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<212> ADN

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<213> Bacterias

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<400> 1

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3

4

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<210> 2

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<211> 594

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<212> PRT

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<213> Bacterias

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<400> 2

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5

6

7

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<210> 3

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<211> 1776

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<212> ADN

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<213> Bacterias

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<400> 3

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8

9

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<210> 4

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<211> 591

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<212> PRT

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<213> Bacterias

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<400> 4

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10

11

12

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<210> 5

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggcatatg aacaaaatat accgcatcat ttggaa

\hfill

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggggctcgag ccactgataa ccgacagatg cgga

\hfill

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Secuencias de polinucleótidos y polipéptidos BASB029

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SEQ ID NO: 1

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Secuencia de polinucleótidos BASB029 de Neisseria meningitidis

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13

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SEQ ID NO: 2

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Secuencia de polinucleótidos BASB029 de Neisseria meningitidis deducida a partir de la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO:1

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14

15

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SEQ ID NO: 3

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Secuencia de polinucleótidos BASB029 de Neisseria meningitidis procedente de la cepa H44/76

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16

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SEQ ID NO: 4

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Secuencia de polinucleótidos BASB029 de Neisseria meningitidis deducida a partir de la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO:3

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17

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SEQ ID NO: 5

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GGG GCA TAT GAA CAA AAT ATA CCG CAT CAT TTG GAA

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SEQ ID NO: 6

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GGG GCT CGA GCC ACT GAT AAC CGA CAG ATG CGG A

Claims

1. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

2. Un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

3. Un fragmento inmunogénico de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que posee al menos una identidad del 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en la que dicho fragmento es capaz (acoplada a un portador si es necesario) de producir una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de SEQ ID NO: 4, y además en la que a dicho fragmento le falta un domino de anclaje C-terminal.

4. Un fragmento inmunogénico según la reivindicación 3 en el que a dicho fragmento le falta también una secuencia líder N-terminal.

5. Un fragmento inmunogénico de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en la que dicho fragmento es una región no variable del polipéptido de SEQ ID NO: 4 cuando se alinea con SEQ ID NO: 2, y es capaz (acoplada a un portador si es necesario) de producir una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de SEQ ID NO: 4.

6. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que es SEQ ID NO: 3 o una secuencia de nucleótidos totalmente complementara a dicho polinucleótido aislado.

7. Un polinucleótido aislado constituido por una secuencia de nucleótidos que es SEQ ID NO: 3.

8. Un polinucleótido aislado que codifica el fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

9. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

10. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 9.

11. Una microorganismo vivo que comprende un vector de expresión según la reivindicación 9.

12. Una célula huésped de N. meningitidis que comprende un vector de expresión, en la que dicho vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 85% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, o un fragmento de la misma capaz (acoplada a un portador si es necesario) de producir una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de SEQ ID NO: 4.

13. Una célula huésped según la reivindicación 12 en la que dicha secuencia de nucleótidos tiene una identidad de al menos el 85% con la de SEQ ID NO: 3.

14. Una membrana o fracción subcelular de una célula huésped que expresa un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, o un fragmento inmunogénico de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

15. Un procedimiento para producir un polipéptido tal como se define en la reivindicación 1 ó 2, o un fragmento inmunogénico según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 que comprende el cultivo de una célula huésped de la reivindicación 10, bajo condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y que recupera el polipéptido de su medio natural.

16. Un procedimiento para producir un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la de SEQ ID NO: 4 o un fragmento de la misma capaz (acoplada a un portador si es necesario) de producir una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de SEQ ID NO: 4, que comprende el cultivo de una célula huésped de las reivindicaciones 12 ó 13, bajo condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y que recupera el polipéptido de su medio natural.

17. Un procedimiento para expresar un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 que comprende el cultivo de una célula huésped de la reivindicación 10, bajo condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polipéptidos.

18. Un procedimiento para expresar un polipéptido que tenga una identidad de al menos el 85% con la de SEQ ID NO: 3, que comprende el cultivo de una célula huésped de las reivindicaciones 12 ó 13, bajo condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polipéptidos.

19. Un procedimiento para producir la membrana según se define en la reivindicación 14 que comprende la transformación de una célula huésped con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2 o un fragmento inmunogénico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, y el cultivo de la célula huésped bajo condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido, y la recuperación de dicha membrana del medio de cultivo.

20. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido de la reivindicación 1 ó 2 o un fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de la membrana o la fracción subcelular de las reivindicación 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. Una composición de vacuna que comprende:

(i) una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o un fragmento de la misma capaz (acoplada a un portador si es necesario) de producir una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de SEQ ID NO: 4;

(ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable; y

(iii) un adyuvante seleccionado entre el grupo constituido por monofosforil lípido A 3 des-O-acilado, QS21, QS21 y colesterol, un oligonucleótido inmunomodulatorio, y combinaciones de los mismos.

24. Una composición de vacuna que comprende:

(i) una cantidad eficaz de un polinucleótido que tiene una identidad de al menos el 85% con la de SEQ ID NO: 3;

(ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable; y

25. Una vacuna según la reivindicación 23 ó 24 en la que dicho oligonucleótido inmunomodulatorio es la CpG no metilado.

26. Una composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 en la que el vehículo comprende una emulsión de aceite en agua que comprende un aceite metabolizable.

27. Una composición de vacuna según la reivindicación 26 en la que el aceite metabolizable comprende escualeno, alfa tocoferol y Tween 80.

28. La composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27 en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de Neisseria meningitidis.

29. Un procedimiento de diagnóstico de la infección de Neisseria meningitidis, que comprende la identificación de un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2 presente dentro de una muestra de un animal sospechoso de poseer tal infección.

30. Una vacuna que posee un epitopo de proteína capaz de proporcionar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica a la Neisseria meningitidis, el cual se puede identificar mediante el procedimiento que comprende

(i) la administración a un individuo de un fragmento inmunogénico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 o un polinucleótido que lo codifica; y

(ii) la determinación de la respuesta inmune profiláctica o terapéutica a Neisseria meningitidis.

31. Un procedimiento de purificación de un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que posee una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o un fragmento de la misma capaz (acoplada a un portador si es necesario) de producir una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de SEQ ID NO: 4, en la que dicho procedimiento se escoge entre el grupo constituido por precipitación de sulfato de amonio, precipitación de etanol, extracción de ácido, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina.

32. El uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, o un fragmento inmunogénico según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

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33. El uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

34. Un anticuerpo generado contra el fragmento inmunogénico según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

35. Una composición terapéutica útil para tratar humanos con la enfermedad de la Neisseria meningitidis que comprende al menos un anticuerpo dirigido contra el fragmento según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.