CN100392082C

CN100392082C - 保守的奈瑟球菌抗原

Info

Publication number: CN100392082C
Application number: CNB008096244A
Authority: CN
Inventors: R·拉普奥利
Original assignee: Chrion S P A
Current assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2008-06-04
Anticipated expiration: 2020-04-28
Also published as: CY1113650T1; CA2372235A1; EP1228217B1; CN1451046A; US20100041868A1; JP2013215200A; EP1228217A2; ES2397918T3; ES2522667T3; PT1228217E; NZ530640A; WO2000066741A3; WO2000066741A2; RU2001132331A; US7368261B1; US20080132448A1; JP2010187700A; EP2278007A1; DK1228217T3; EP2290083A1

Abstract

为了确保最大程度的菌株间识别性和反应性，可以利用在不同的奈瑟球菌物种、血清型和菌株之间保守的蛋白质区域。本发明提供了含有氨基酸序列区段的蛋白质，这些区段在大多数奈瑟球菌，尤其是脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌中是共有的。

Description

保守的奈瑟球菌抗原

本文所引用的所有文献的内容都全部纳入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及奈瑟球菌属(Neisseria)细菌的保守抗原。

背景技术

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是不能动的、对人有致病性的革兰阴性双球菌。

根据该菌的荚膜多糖，已经鉴定出12种脑膜炎奈瑟球菌的血清型。A型是亚撒哈拉-非洲地区流行病中最常见的病原体。B型和C型血清型菌是导致美国以及大多数发达国家内绝大多数病例的原因。W135和Y型血清型菌是导致美国和发达国家的其余病例的原因。

目前使用的脑膜炎球菌疫苗是由血清型A、C、Y和W135组成的四价多糖疫苗。然而，这种方法不能用于B型脑膜炎球菌，因为menB荚膜多糖是α(2-8)-相连的N-乙酰基神经氨酸的聚合物，它也存在于哺乳动物组织中。一种menB疫苗方法采用外膜蛋白(OMP)的混合物。为了克服抗原性变异，已经构建了含有高达9种不同膜孔蛋白的多价疫苗(例如，Poolman JT(1992)“脑膜炎球菌疫苗的发展”Infect.Agents Dis.4：13-28)。用于外膜疫苗的其它蛋白是opa和opc蛋白，但是这些方法均不能克服抗原性变异(例如Ala′Aldeen和Borriello(1996)“脑膜炎球菌运铁蛋白结合蛋白1和2均是外露的，并产生能杀伤同源和异源菌株的杀菌性抗体”Vaccine 14(1)：49-53)。

大量的奈瑟球菌蛋白质和核苷酸序列公开于WO99/24578、WO99/36544、WO99/57280和WO00/22430。这4件申请的内容在此引用作为参考。菌株MC58的全面序列数据公开在Tettelin等人的Science(2000)287：1809-1815中，该文献的内容也在此引用作为参考。

发明描述

为了确保在菌株间的最大识别性和反应性，可以使用在不同的奈瑟球菌物种、血清型和菌株之间保守的蛋白质区域。因此，本发明提供了蛋白质，这些蛋白质含有在大多数奈瑟球菌(尤其是脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌)中共有的氨基酸序列区段。

本发明提供了含有奈瑟球菌蛋白片段的蛋白质，其中所述片段包含n个连续的保守氨基酸，条件是本发明在其范围内并不包括全长奈瑟球菌蛋白。根据具体蛋白质，n为7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20或更高)。所述片段宜包含奈瑟球菌蛋白的一个抗原或免疫原区域。

“保守的”氨基酸是在至少x％奈瑟球菌的特定奈瑟球菌蛋白中存在的氨基酸。x的值可以是50％或更高，例如66％、75％、80％、90％、95％或甚至100％(即该氨基酸存在于所有奈瑟球菌的有关蛋白质中)。

为了确定一个氨基酸在特定奈瑟球菌蛋白中是否是“保守的”，需要比较在多种不同奈瑟球菌(“参照群”)的有关蛋白序列中的该氨基酸。参照群可包括大量不同的奈瑟球菌物种(优选脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌)，或者可以包括单一物种。参照群可包括某一特定物种的大量不同的血清型(例如脑膜炎奈瑟球菌的A、B、C。、W135、X、Y、Z和29E血清型)，或者包括单一血清型。参照群还可包括某一特定血清型的大量不同的菌株(例如B型脑膜炎奈瑟球菌的NG6/88、BZ198、NG3/88、297-0、BZ147、BZ169、528、BZ133、NGE31、NGH38、NGH15、BZ232、BZ83和44/76株)。一种优选的参照群由5种最常见的脑膜炎奈瑟球菌菌株和/或5种最常见的淋病奈瑟球菌菌株构成。

参照群宜含有来自合适的系统发生树的k不同分支的k菌株，例如在以下文献中公开的那些：(a)Ni等人(1992)Epidemiol Infect 109：227-239；(b)Wolff等人(1992)核酸研究(Nucl.Acids Res.)20：46757；(c)Bygraves&Maiden(1992)遗传微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)；(d)Caugant等人，(1987)细菌学杂志(J.Bacteriol.)69：2781-2792。另一种可供使用的系统发生树如本申请图8所示，另一种如图9b所示。

应理解，某一特定物种、血清型或菌株，只有它编码蛋白质且该蛋白质中存在有关氨基酸时，才被包括在参照群中。例如，在下述ORF40中的氨基酸例子中，参照群不应包括淋病奈瑟球菌，因为该物种不含有ORF40。

因此，对于在脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌中都存在的蛋白质，优选的参照群包括：

■脑膜炎奈瑟球菌A，Z2491菌株

■脑膜炎奈瑟球菌B，NG6/88菌株

■脑膜炎奈瑟球菌W，A22菌株

■淋病奈瑟球菌，Ng F62菌株

这些菌株在下列文献中有描述：(a)Seiler A.等人(1996)分子微生物学(Mol.Microbiol.)19(4：841-856)；(b)Maiden等人，(1998)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95：3 140-3 145；(c) Virji等人(1992)分子微生物学(Mol.Microbiol.)6：1271-1279；(d)Dempsey等人，(1991)细菌学杂志(J.Bacteriol.)173：5476-5486。

然而，对于仅存在于脑膜炎奈瑟球菌中的蛋白质，优选的参照群包括：

■脑膜炎奈瑟球菌A，Z2491菌株

■脑膜炎奈瑟球菌B，NG6/88菌株

■脑膜炎奈瑟球菌W，A22菌株

不同奈瑟球菌的氨基酸序列可以用计算机轻易地进行比较。这通常涉及用算法，例如CLUSTAL[Thompson etal(1 994)核酸研究(Nucl.Acids Res.)22：4673-4680；TrendsBiochem Sci(1998)23：403-405]或PILEUP算法[GCG Wisconsin软件包的组成部分，优选9.0版]，将多个序列进行比对。

保守氨基酸在多序列比对中是很明显的，在有关的氨基酸位置处，大多数被比对的序列会含有特定的氨基酸。还可以用程序，例如BOXSHADE[可从例如NIH在线获得]、PRETTYBOX[GCG Wisconsin，版本10]或JALVIEW[可从EB在线获得]，保守氨基酸可更清楚地用肉眼看出。

所述蛋白质优选含有在WO99/24578、WO99/36544、WO99/57280和WO00/22430中公开的蛋白质之一的片段、或在Tettelin等人Science(2000)287：1809-1815中公开的2158ORF之一的片段。更具体地，它优选含有本文公开(见本文的实施例)的ORF4、ORF40、ORF46、蛋白质225、蛋白质235、蛋白质519、蛋白质726、蛋白质919和蛋白质953中一种或多种蛋白的片段。通常，本发明的蛋白不含有在WO99/24578、WO99/36544、WO99/57280、WO00/22430、或Tettelin等人文献中明确公开的蛋白质序列。

本发明还提供了含有附图中所示序列之一的蛋白质。

本发明的蛋白当然可用各种方法(例如重组表达、天然表达、从细胞培养中纯化、化学合成等)制成各种形式(例如天然的、融合蛋白等)。它们宜制成基本上纯的形式(即基本上不含其它奈瑟球菌或宿主细胞的蛋白)。

另一方面，本发明提供了能结合这些蛋白的抗体。它们可能是多克隆的或单克隆的，可用任何合适的方法制得。

另一方面，本发明提供了编码本发明蛋白的核酸。还应理解，本发明提供的核酸包括与这些序列互补的序列(例如用于反义或探针目的)。

此外，本发明提供了与实施例中公开的脑膜炎奈瑟球菌核酸杂交的核酸，优选在“高度严紧”条件下(如65℃，在0.1×SSC，0.5％SDS溶液)。

当然，本发明的核酸可用许多方式制得(例如化学合成，从基因组或cDNA文库、或从生物体本身制得等)，并可采用各种形式(例如单链、双链、载体、探针等)。

另外，术语“核酸”包括DNA和RNA，以及它们的类似物，如含有修饰骨架的那些类似物，还包括肽核酸(PNA)等。

另一方面，本发明提供了含有本发明的核苷酸序列的载体(如表达载体)以及用这些载体转化的宿主细胞。

另一方面，本发明提供了包含本发明的蛋白、抗体和/核酸的组合物。例如，这些组合物适合用作疫苗，或作为诊断性试剂，或作为免疫原性组合物。

本发明还提供了本发明的核酸、蛋白或抗体用作药剂(例如作为疫苗)或作为诊断性试剂。本发明还提供了本发明的核酸、蛋白或抗体在生产下列物质中的应用：(i)用于治疗或预防奈瑟球菌感染的药剂；(ii)用于检测奈瑟球菌或检测抗奈瑟球菌抗体是否存在的诊断性试剂；和/或(iii)用于产生抗奈瑟球菌属细菌的抗体的试剂。该用途宜适用于奈瑟球菌属的所有物种。

当奈瑟球菌蛋白含有超过q％的保守的氨基酸时，本发明就提供了奈瑟球菌蛋白

(或其片段)作为非菌株特异性的蛋白的用途，该蛋白在多个物种、血清型和菌株之间表现出交叉反应性。q值可以是50％60％、75％、80％、90％、95％或甚至100％。

本发明还提供了一种治疗患者的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的本发明的核酸、蛋白和/或抗体。

另一方面，本发明提供了各种方法。

提供了一种生产本发明蛋白的方法，该方法包括步骤：在诱导蛋白表达的条件下，培育本发明的宿主细胞。

提供了一种生产本发明的蛋白或核酸的方法，该方法包括步骤：部分或全部用化学方法合成蛋白质或核酸。

提供了一种检测本发明的多核苷酸的方法，该方法包括下列步骤：(a)在杂交条件下使本发明的核酸探针与生物样品接触，形成双链体；和(b)检测所述双链体。

提供了一种检测本发明的蛋白质的方法，该方法包括下列步骤：(a)在适合形成抗体-抗原复合物的条件下使本发明的抗体和生物样品接触；和(b)检测所述复合物。

下面列出了可用于实施本发明(例如处于免疫接种或诊断目的使用所公开的序列)的标准技术和程序的概述。这一概述并不限制本发明，相反它给出了可供使用但是并非必需的例子。

综述

除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编.1984)；《转录和翻译》(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；《动物细胞培养》(R.I.Freshney编，1986)；《固定化细胞和酶》(IRL出版社，1986)；B.Perbal，《分子克隆实用指南》(1984)；《酶学方法》系列丛书(Academic Press，Inc.)，尤其是154和155卷；《哺乳动物细胞的基因转移载体》(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，Cold SpringHarbor Laboratory)；Mayer和Walker编(1987)，《细胞和分子生物学的免疫化学方法》(Academic Press，London)；Scopes，(1987)《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编1986)。

在本说明书中采用了核苷酸和氨基酸的标准缩写。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请均全部纳入本文作参考。具体地，国际专利申请WO99/24578、WO99/36544、WO99/57280和WO00/22430的内容被并入本文。

定义

当组合物中总X+Y重量的至少85％是X时，则称含有X的组合物“基本上没有Y”。较佳的，X占组合物中X+Y总重量的至少约90％，更佳至少约95％或者甚至99％(重量)。

术语“包含”指“含有”和“由......构成”，例如“包含”X的组合物可以完全由X构成，或者可以含有X之外的物质，例如X+Y。

术语“异源”指在自然界中发现不在一起的两种生物学组分。此组分可以是宿主细胞、基因、或调控区如启动子。尽管异源组分在自然界中发现不在一起，但是它们能一起起作用，例如当与某基因异源的一种启动子与该基因操作性相连时。另一个例子是奈瑟球菌序列与小鼠宿主细胞异源。另一例子是来自相同或不同蛋白质的两个表位，它们以自然界没有的排列形式组装在单个蛋白质上。

“复制起点”是启动和调节多核苷酸(例如表达载体)复制的一种多核苷酸序列。复制起点可作为细胞内多核苷酸复制的自主性单位，能在其自身的控制下进行复制。复制起点是载体在特定宿主细胞中复制所需要的。有了某一复制起点，表达载体就能在细胞中合适蛋白的存在下高拷贝数的复制。复制起点的例子是在酵母中有效的自主复制序列；以及在COS-7细胞中有效的病毒性T-抗原。

“突变体”序列定义为与天然或公开的序列不同但具有序列相同性的DNA、RNA或氨基酸序列。根据具体的序列，天然或公开的序列与突变体序列之间的序列相同性程度宜大于50％(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高，其中序列相同性如上所述用Smith-Waterman算法计算出)。如本文所述，本文提供的核酸序列的核酸分子或区域的“等位基因变体”是在另一或第二个分离株的基因组中基本上相同的基因座上的核酸分子或区域，由于诸如突变或重组引起的自然变异，它们具有相似但不相同的核酸序列。编码区等位基因变体通常编码的蛋白具有与其比较基因所编码蛋白相似的活性。等位基因变体还可包含基因5′或3′非翻译区中的变化，例如在调节控制区中的变化(例如见美国专利5,753,235)。

表达系统

奈瑟球菌核苷酸序列可在各种不同的表达系统中表达；例如与哺乳动物细胞、杆状病毒、植物、细菌和酵母一起使用的那些系统。

i.哺乳动物系统

哺乳动物表达系统是本领域中已知的。哺乳动物启动子是能结合哺乳动物RNA聚合酶并启动下游(3′)编码序列(如结构基因)转录成mRNA的任何DNA序列。启动子具有一个转录起始区，其通常邻近编码序列的5′端，还具有一个TATA盒，其通常位于转录起始位点上游25-30个碱基对(bp)处。认为TATA盒指导RNA聚合酶II在正确位点开始RNA合成。哺乳动物启动子还含有一个上游启动子元件，其通常位于TATA盒上游100至200bp内。该上游启动子元件决定了转录启动的速度，并可在两个方向之一上起作用[Sambrook等人(1989)“克隆基因在哺乳动物细胞中的表达”《分子克隆：实验手册》，第2版]。

哺乳动物病毒基因通常是高表达的，具有宽的宿主范围；因此，编码哺乳动物病毒基因的序列提供了特别有用的启动子序列。例子包括SV40早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)以及单纯疱疹病毒启动子。另外，从非病毒基因(如鼠金属硫蛋白基因)衍生的序列也提供了有用的启动子序列。表达可以是组成型的或受调控的(诱导型)，取决于启动子能否在激素反应性细胞中用促糖皮质激素诱导。

增强元件(增强子)的存在，联合上述启动子元件通常会提高表达水平。增强子是这样一种调控性DNA序列，当其与同源或异源启动子相连，合成在正常的RNA起始位点开始时，它能刺激转录提高1000倍。当增强子位于转录起始位点的上游或下游，处于正常或翻转方向，或距离启动子1000个核苷酸以上的距离时，它均具有活性[Maniatis等人(1987)Science 236：1237；Alberts等人(1989)《细胞分子生物学》，第2版]。从病毒衍生获得的增强子元件可能是特别有用的，因为它们通常具有较宽的宿主范围。例子包括SV40早期基因增强子[Dijkema等人(1985)EMBO J.4：761]以及衍生自Rous肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)的增强子/启动子[Gorman等人(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.79：6777]以及来自人巨细胞病毒的增强子/启动子[Boshart等人(1985)Cell 41：52 1]。另外，一些增强子仅仅在诱导物(例如激素或金属离子)的存在下是可调节的并具有活性[Sassone-Corsi和Borelli(1986)Trends Genet.2：215；Maniatis等人(1987)Science236：1237]。

DNA分子可在哺乳动物细胞中胞内表达。启动子序列可以和DNA分子直接相连，在这种情况下，重组蛋白的N端第一个氨基酸始终是甲硫氨酸，其由ATG起始密码子编码。如果需要，可通过和溴化氰体外培育来从蛋白上切下此N端。

另外，外来蛋白也可从细胞中分泌到生长培养基中，方法是产生嵌合的DNA分子，该DNA分子编码的融合蛋白包括一前导序列片段，该片段在哺乳动物细胞中提供了外源蛋白的分泌。较佳的，在前导序列片段和外源基因之间可以有能在体内或体外断裂的加工位点。前导序列片段通常编码一种信号肽，该信号肽由引导蛋白分泌出细胞的疏水性氨基酸组成。腺病毒三联前导序列是哺乳动物细胞中分泌外来蛋白的一个前导序列的例子。

通常，哺乳动物细胞识别的转录终止和聚腺苷酸化序列是位于翻译终止密码子3′的调控区域，因此它和启动子元件一起连接在编码序列的侧面。成熟mRNA的3′端由定点的转录后断裂和聚腺苷酸化形成[Birnstiel等人(1985)Cell 41：349；Proudfoot和Whitelaw(1988)″真核RNA的终端和3′端加工″《转录和剪接》(B.D.Hames和D.M.Glover编)；Proudfoot(1989)Trends Biochem.Sci.14：105]。这些序列指导mRNA的转录，mRNA能被翻译成该DNA编码的多肽。转录终止子/聚腺苷酸化信号的例子包括从SV40衍生的那些[Sambrook等人(1989)“克隆基因在培养的哺乳动物细胞中的表达”《分子克隆实验指南》]。

通常，上述组件，包括启动子、聚腺苷酸化信号以及转录终止序列被一起放在表达构建物中。如果需要，表达构建物中还包括增强子、具有功能性剪接供体和受体位点的内含子以及前导序列。表达构建物通常以复制子形式维持，例如是能在宿主(如哺乳动物细胞或细菌)中稳定维持的染色体外元件(如质粒)。哺乳动物复制系统包括从动物病毒衍生的那些系统，其需要反式作用因子来进行复制。例如，含有乳多空病毒复制系统的质粒，如SV40[Gluzman(1981)Cell 23：175]或多瘤病毒，在合适的病毒T抗原存在下复制出极高的拷贝数。哺乳动物复制子的其它例子包括衍生自牛乳头瘤病毒和EB病毒的复制子。另外，复制子可以有两个复制系统，从而使其能维持在例如哺乳动物细胞中进行表达并能在原核宿主中克隆和扩增。这些哺乳动物细菌穿梭载体的例子包括pMT2[Kaufman等人(1989)Mol.Cell.Biol.9：946]和pHEBO[Shimizu等人(1986)Mol.Cell.Biol.6：1074]。

所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包裹在脂质体中以及将DNA直接显微注射到胞核中。

可作为宿主进行表达的哺乳动物细胞系是本领域中已知的，其包括许多从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖细胞系，包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、乳仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如HepG2)和其它许多细胞系。

ii.杆状病毒系统

也可将编码蛋白质的多核苷酸插入合适的昆虫表达载体中，并与该载体中的控制元件操作性相连。载体构建采用本领域已知的技术。总地来说，表达系统的组分包括一种转移载体，通常是细菌质粒，其含有杆状病毒基因组片段以及便于插入待表达异源基因的限制性位点；野生型杆状病毒，其序列与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源(这使得异源基因能同源重组到杆状病毒基因组中)；以及合适的昆虫宿主细胞和生长培养基。

将编码蛋白质的DNA序列插入转移载体中后，将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中，使载体和病毒基因组重组。表达包装的重组病毒，鉴定并纯化重组噬斑。杆状病毒/昆虫细胞表达系统材料及其方法，除别的以外，可以试剂盒形式购自Invitrogen，San Diego CA(″MaxBac″试剂盒)。这些技术通常是本领域技术人员所知的，在Summers和Smith的Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)(后称“Summer和Smith的文章”)中有充分描述。

在将编码蛋白质的DNA序列插入杆状病毒基因组之前，通常将上述组件，包括启动子、前导序列(如果需要)、感兴趣的编码序列以及转录终止序列装配在中间置换型构建物(转移载体)中。该构建物可含有单个基因以及操作性相连的调控元件；多个基因，每个基因有其自己的一套操作性相连调控元件；或是由同一组调控元件调控的多个基因。中间置换型构建物通常保持在一个复制子中，例如能在宿主(如细菌)内稳定保持的染色体外元件(如质粒)。复制子将具有一个复制系统，从而使其能保持在合适的宿主中进行克隆和扩增。

目前，用来将外源基因导入AcNPV的最常用的转移载体是pAc373。还可设计本领域技术人员已知的其它许多载体。这些载体例如包括，pVL985(其将多角体蛋白的起始密码子从ATG变为ATT，在ATT下游32个碱基对处引入一个BamHI克隆位点；见Luckow和Summers，Virology(1989)17：31)。

质粒通常还含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller等人(1988)Ann.Rev.Microbiol.，42：177)以及用来在大肠杆菌中选择和繁殖的原核氨苄青霉素抗性(amp)基因和复制起点。

杆状病毒转移载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能结合杆状病毒RNA聚合酶并启动下游(5′到3′)编码序列(如结构基因)转录成mRNA的DNA序列。启动子具有一个转录起始区，该区通常邻近编码序列的5′端。该转录起始区通常包括一个RNA聚合酶结合位点以及一个转录起始位点。杆状病毒转移载体还可能具有称为增强子的第二区，如果该区域存在，它通常远离结构基因。表达可以是调控型或组成型的。

在病毒感染周期晚期大量转录的结构基因提供了特别有用的启动子序列。例子包括从编码病毒多角体蛋白的基因衍生获得的序列，Friesen等人(1 986)“杆状病毒基因表达的调控”《杆状病毒分子生物学》(Walter Doerfier编辑)；EPO公开号127 839和155476；以及编码p10蛋白的基因，Vlak等人(1988)，J.Gen.Virol.69：765。

编码合适的信号序列的DNA可以衍生自分泌的昆虫或杆状病毒蛋白(如杆状病毒多角体蛋白基因)的基因(Carbonell等人，(1988)Gene，73：409)。另外，由于哺乳动物细胞翻译后修饰的信号(如信号肽断裂、蛋白水解断裂和磷酸化)看来可被昆虫细胞识别，且分泌和胞核积累所需的信号看来在非脊椎动物细胞和脊椎动物细胞之间是保守的，因此也可用非昆虫来源的前导序列来提供昆虫中的分泌，这些前导序列例如是从编码人α-干扰素(Maeda等人(1985)，Nature 315：592)、人胃泌素释放的肽(Lebacq-Verheyden等人(1988)，Molec.Cell.Biol.8：3129)、人IL-2(Smith等人(1985)PNAS，82：8404)、小鼠IL-3(Miyajima等人(1987)Gene 58：273)和人葡糖脑苷脂酶(Martin等人(1988)DNA，7：99)的基因衍生获得的。

重组多肽或聚蛋白可以在胞内表达，或如果它用合适的调控序列表达，它可被分泌。非融合的外源蛋白的良好胞内表达理想的通常需要具有短前导序列的异源基因在ATG起始信号前有合适的翻译起始信号。如果需要，可通过和溴化氰体外培育来从成熟蛋白上切下N端甲硫氨酸。

另外，可通过产生嵌合的DNA分子将非天然分泌的重组聚蛋白或蛋白从昆虫细胞中分泌出来，该嵌合的DNA分子所编码的融合蛋白包含-前导序列片段，该片段提供了昆虫中分泌外源蛋白的作用。该前导序列片段通常编码一种信号肽，该信号肽包含的疏水性氨基酸引导蛋白质转移到内质网中。

在插入了编码该蛋白表达产物前体的DNA序列和/或基因后，用转移载体的异源DNA和野生型杆状病毒的基因组DNA共同转化(通常是共转染)昆虫细胞宿主。此构建物的启动子和转录终止序列通常包含2-5kb的杆状病毒基因组片段。将异源DNA引入杆状病毒中所需位点内的方法是本领域所知的。(见Summers和Smith的文章，同上；Ju等人(1987)；Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)3：2156；和Luckow和Summers(1989))。例如，插入可以是通过同源双交换重组来插入一个基因如多角体蛋白基因中；插入还可以是插入工程改造入所需杆状病毒基因内的限制性酶切位点中。Miller等人(1989)，Bioessays 4：91。当DNA序列被克隆在表达载体多角体蛋白基因位置中时，其5′和3′均侧接了多角体蛋白特异性序列，并位于多角体蛋白启动子的下游。

随后将新形成的杆状病毒表达载体包装到感染性重组杆状病毒中。发生同源重组的频率很低(在约1％和5％之间)；因此，共转染后产生的大多数病毒仍是野生型病毒。因此，需要用一种方法来鉴别重组病毒。该表达系统的一个优点是肉眼筛选能区分重组病毒。在病毒感染后期，天然病毒产生的多角体蛋白在受其感染细胞的胞核中产生的水平非常高。累积的多角体蛋白形成的包涵体还含有包埋颗粒。这些包涵体的大小为15微米，它们具有高度的折光性，从而使它们呈现明亮的发光外观，在光学显微镜下很容易观察。感染了重组病毒的细胞缺少包涵体。为了区分重组病毒和野生型病毒，用本领域已知的技术将转染上清接种到单层昆虫细胞上形成噬斑。即，在光学显微镜下筛选存在(表明是野生型病毒)或不存在(表明是重组病毒)包涵体的噬斑。“当代微生物学方法”第2卷(Ausubel等人编辑)，16.8(增补10，1990)；Summers和Smith，同上；Miller等人(1989)。

已经开发出感染进入几种昆虫细胞的重组杆状病毒表达载体。例如，已经开发出用于感染以下昆虫细胞的重组杆状病毒：埃及伊蚊、苜蓿丫纹夜蛾、家蚕、黑尾果蝇、草地夜蛾和粉纹夜蛾(WO 89/046699；Carbonell等人(1985)J.Virol.56：153；Wright(1986)Nature 321：718；Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.3：2156；综述见Fraser等人(1989)InVitro Cell.Dev.Biol.25：225)。

可以购得细胞和细胞培养基用于在杆状病毒/表达系统中直接表达和融合表达异源多肽；细胞培养技术是本领域技术人员通常所知的。例如见Summers和Smith，同上。

然后，经修饰的昆虫细胞可以生长在合适的营养培养基中，该培养基能稳定地保持该质粒于修饰的昆虫宿主中。当表达产物的基因处于可诱导的控制下时，可以使宿主生长至高密度，并诱导表达。另外，当表达是组成型表达时，产物将被连续表达到培养基中，营养性培养基必需不断循环，取出感兴趣的产物同时补充消耗的营养物。产物可用以下这些技术来纯化：例如层析，如HPLC、亲和层析、离子交换层析等；电泳；密度梯度离心；溶剂抽提等。产物可按需作进一步纯化，以基本上除去所有也分泌到培养基中或由昆虫细胞裂解而产生的昆虫蛋白，以提供一种至少基本上不含宿主碎片如蛋白质、脂质和多糖的产物。

为了进行蛋白质表达，将从转化子衍生获得的重组宿主细胞培育在允许重组蛋白的编码序列表达的条件下。这些条件将随所选定的宿主细胞而变。然而，本领域技术人员容易根据本领域已知的知识来确定该条件。

iii.植物细胞表达系统

本领域已知有许多植物细胞培养系统和全植物遗传表达系统。典型的植物细胞基因表达系统包括在以下专利中描述的那些，例如：US 5,693,506；US 5,659,1 22；和US5,608,143。Zenk，Phytochemistry 30：3861-3863(1991)中描述了在植物细胞培养物中遗传表达的其它例子。除上述参考文献外，关于植物蛋白信号肽的描述还可在下列文献中找到：Vaulcombe等人，Mol.Gen.Genet.209：33-40(1987)；Chandler等人，Plant MolecularBiology 3：407-418(1984)；Rogers，J.Biol.Chem.260：3731-3738(1985)；Rothstein等人，Gene 55：353-356(1987)；Whittier等人，Nucleic Acids Research 15：2515-2535(1987)；Wirsel等人，Molecular Microbiology 3：3-14(1989)；Yu等人，Gene 122：247-253(1992)。关于用植物激素、赤霉素酸和赤霉素酸诱导分泌的酶调节植物基因表达的描述可在R.L.Jones和J.MacMillin，Gibberellins，《植物生理学进展》，Malcolm B.Wilkins编辑，1984 Pitman Publishing Limited，London，21-52页中找到。描述其它调节代谢的基因的参考文献参见：Sheen，Plant Cell，2：1027-1038(1990)；Maas等人，欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.) 9：3447-3452(1990)；Benkel和Hickey，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.).84：1337-1339(1987)。

通常，利用本领域已知的技术，将所需的多核苷酸序列插入一表达盒中，该表达盒含有为在植物中操作而设计的基因调控元件。将该表达盒插入所需的表达载体中，表达盒的上游和下游有适合在植物宿主中表达的伴随序列。这些伴随序列可来自质粒或病毒，并为载体提供所需的性能，以允许载体将DNA从起初的克隆宿主(如细菌)中移动到所需植物宿主中。基础的细菌/植物载体构建物最好能提供宽的宿主范围原核复制起点；原核可选择标记；以及，对于农杆菌转化而言，宜提供T DNA序列用于农杆菌介导的转移至植物染色体。当异源基因不易检测时，该构建物最好还具有一个适用于确定植物细胞是否已经转化的可选择标记基因。关于合适标记(例如对于禾草类家族成员)的综述可在Wilmink和Dons，1993，Plant Mol.Biol.Reptr，11(2)：165-185中找到。

还建议采用适合将异源序列整合到植物基因组中的序列。这些序列可能包括用于同源重组的转座子序列以及允许将异源表达盒随机插入植物基因组中的Ti序列。合适的原核可选择标记包括抗生素(如氨苄青霉素或四环素)抗性标记。编码其它功能的其它DNA序列也可存在于载体中，这是本领域所知的。

本发明的核酸分子可包括在一个表达盒中来表达感兴趣的蛋白质。通常只要一个表达盒，但是两个或多个表达盒也是可行的。除了编码异源蛋白的序列外，重组表达盒还含有下列元件：启动子区域、植物5′非翻译序列、起始密码子(根据结构基因原来是否具有而定)、以及转录和翻译终止序列。表达盒5′和3′端的独特限制性酶位点能使表达盒方便地插入预先存在的载体中。

异源编码序列可以用于任何与本发明有关的蛋白。编码感兴趣的蛋白的序列将编码出一个信号肽，该信号肽能适当地加工和转运蛋白质，并且通常缺少可能会导致本发明的所需蛋白与膜结合的序列。由于对于大部分来说，转录起始区将针对发芽期间表达和转运的基因，采用提供转运的信号肽，也可提供转运感兴趣的蛋白质。通过这种方式，感兴趣的蛋白将从表达该蛋白的细胞中转运出来，并能被有效地收获。通常，种子中的分泌是通过糊粉或小盾体上皮层进入种子的胚乳。尽管不需要使蛋白从产生该蛋白的细胞中分泌出来，但是这种分泌有利于重组蛋白的分离和纯化。

由于所需基因产物的最终表达将在真核细胞中进行，因此需要确定克隆的基因部分是否含有作为内含子被宿主剪接体机制加工的序列。如果是这样，需要对“内含子”区进行定点诱变，以防止一部分遗传信息作为错误的内含子密码而丧失，Reed和Maniatis，Cell 41：95-105，1985。

可用微量移液管以机械方式转移重组DNA，将载体直接显微注射到植物细胞中。Crossway，Mol.Gen.Genet，202：179-185。还可用聚乙二醇将遗传物质转移到植物细胞中，Krens等人，Nature，296，72-74，1982。导入核酸片段的另一种方法是用小颗粒进行高速弹道贯穿，在这些小珠或颗粒的基质中或表面上带有核酸，Klein等人，Nature，327，70-73，1987，Knudsen和Muller，1991，Planta，185：330-336提出用颗粒轰击大麦胚乳以产生转基因大麦。还有一种导入方法是使原生质体和其它实体(微细胞(minicell)、细胞、溶酶体或其它可融合的脂质表面体)融合，Fraley等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，79，1859-1863，1982。

载体也可通过电穿孔导入植物细胞中。(Fromm等人，PNAS 82：5824，1958)。在该技术中，在含有基因构建物的质粒存在下电穿孔植物原生质体。高电场强度的电脉冲使生物膜可逆地被通透，从而允许导入质粒。电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁，分裂并形成植物愈伤组织。

能分离出原生质体并能培育成全再生植物的所有植物，都能用本发明进行转化，从而回收得到含有转基因的全植物。已经知道实际上可以从培育的细胞或组织再生所有的植物，其包括但不局限于，甘蔗、甜菜、棉花、果实和其它树、豆科植物和蔬菜的所有主要种类。一些合适的植物包括，例如，草莓属、莲花属、苜蓿属、驴食豆属、三叶草属、胡卢巴属、豇豆属、柑橘属、亚麻属、老鹳草属、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、鼠耳芥属、芸苔属、萝卜属、白芥属、颠茄属、辣椒属、曼陀罗属、天仙子属、番茄属、烟草属、茄属、碧冬茄属、毛地黄属、Majorana、菊苣属、向日葵属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、龙骨角属、龙面花属(Nemesia)、天竺葵属、稷属、狼尾草属、毛茛属、千里光属、Saiglossis、香瓜属、Browaalia、大豆属、黑麦草属、玉蜀黍属、小麦、蜀黍属和曼陀罗属各种类。

再生方式随各种植物而有所不同，但是通常是首先提供含有异源基因拷贝的转化的原生质体悬液。形成愈伤组织，从愈伤组织中诱生出枝条，随后是根。另外，从原生质体悬液可以诱生形成胚胎。这些胚胎象天然的胚胎那样发芽形成植物。培养基通常含有各种氨基酸和激素，如植物生长素和细胞分裂素。尤其是对于玉米和苜蓿属来说，在培养基中加入谷氨酸和脯氨酸也是很有利的。枝条和根通常同时发育。有效的再生取决于培养基、基因型以及培养史。如果控制了这三个变量，那么再生能完全再现和重复。

在一些植物细胞培养系统中，本发明所需的蛋白可能被排泄出来，或者蛋白可从全植物中提取出来。当本发明所需的蛋白被分泌到培养基中后，就可进行收集。或者，可以用机械方式破碎胚以及无胚-半种子或其它植物组织，以释放出分泌到细胞和组织之间的蛋白。将该混合物悬于缓冲液中，以收回可溶性蛋白。然后用常规的蛋白分离和纯化方法纯化重组蛋白。用常规方法调节时间、温度、pH、氧和体积等参数，以优化异源蛋白的表达和回收。

iv.细菌系统

细菌表达技术是本领域已知的。细菌启动子是能结合细菌RNA聚合酶并启动下游(3′)编码序列(如结构基因)转录成mRNA的DNA序列。启动子具有一个转录起始区，其通常位于编码序列的5′端附近。该转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点以及一个转录起始位点。细菌启动子可能还有第二个功能区域称为操纵子，它可能与毗邻的RNA合成开始的RNA聚合酶结合位点重叠。该操纵子允许(可诱导)对转录的负调节，因为基因阻遏蛋白可能结合操纵子并因而抑制特定基因的转录。在负调节元件(如操纵子)不存在时，可能发生组成型表达。另外，正调节可通过基因激活蛋白结合序列来实现，如果有的话，该结合序列通常邻近RNA聚合酶结合序列的(5′)。基因激活蛋白的例子是分解代谢物激活剂蛋白(CAP)，它帮助启动大肠杆菌(E.coli)中的lac操纵子的转录[Raibaud等人(1984)Annu.Rev.Genet.18：173]。因此，表达的调控可能是正作用或负作用，从而增强或减弱转录。

编码代谢途径中的酶的序列提供了特别有用的启动子序列。例子包括衍生自糖(如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人(1977)Nature 198：1056]和麦芽糖)代谢酶的启动子序列。其它例子包括衍生自生物合成酶(如色氨酸(trp))[Goeddel等人(1980)Nuc.Acids Res.8：4057；Yelverton等人(1981)Nucl.Acids Res.9：731；美国专利4,738,921；EP-A-0036776和EP-A-0121775]的启动子序列。β-内酰胺酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)″干扰素的克隆和其它错误″《干扰素3》(I.Gresser编辑)]，λ嗜菌体PL[Shimatake等人(1981)Nature 292：128]和T5[美国专利4,689,406]启动子系统也提供了有用的启动子序列。

另外，非天然存在的合成的启动子也可象细菌启动子一样起作用。例如，一种细菌或嗜菌体启动子的转录激活序列可以和另一种细菌或嗜菌体启动子的操纵子序列连接在一起，形成合成的杂交启动子[美国专利4,55 1,433]。例如，tac启动子是杂合的trp-lac启动子，它由trp启动子以及受lac阻遏蛋白调节的lac操纵子序列组成[Amann等人(1983)Gene 25：167；de Boer等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80：21]。另外，细菌启动子可包括非细菌来源但能结合细菌RNA聚合酶并启动转录的天然存在的启动子。天然存在的非细菌来源的启动子还能和相容的RNA聚合酶偶联在一起，从而在原核细胞中高水平地表达某些基因[Studier等人(1986)J.Mol.Biol.189：113；Tabor等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：1074]。另外，杂合的启动子还可由嗜菌体启动子以及大肠杆菌操纵子区域组成(EP-A-0267 851)。

除了有功能的启动子序列外，有效的核糖体结合位点对于外来基因在原核细胞中的表达也是有用的。在大肠杆菌中，核糖体结合位点称为Shine-Dalgarno(SD)序列，其包括起始密码子(ATG)以及在起始密码子上游3-1 1个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine等人(1975)Nature 254：34]。认为SD序列是通过SD序列和大肠杆菌16SrRNA的3′端之间碱基配对来促进mRNA与核糖体结合的[Steitz等人(1979)″信使RNA中的遗传信号和核苷酸序列″生物学调节和发育：基因表达″(编者R.F.Goldberger)]。为了表达具有弱的核糖体结合位点的原核基因和真核基因[Sambrook等人(1989)″克隆基因在大肠杆菌中的表达″《分子克隆实验手册》]。

DNA分子可以在胞内表达。启动子序列可以直接与DNA分子相连，在这种情况下，N端的第一个氨基酸始终是甲硫氨酸，其由ATG起始密码子编码。如果需要，可通过和溴化氰体外培育或通过和细菌甲硫氨酸N-端肽酶体内或体外培育，将N端的甲硫氨酸从蛋白质上切下(EP-A-0219 237)。

融合蛋白为直接表达提供了另一种方法。通常，将编码内源细菌蛋白或其它稳定的蛋白之N端部分的DNA序列与异源编码序列的5′端融合。在表达时，该构建物将提供这两个氨基酸序列的融合物。例如，λ噬菌体细胞基因可以和外源基因的5′端相连并在细菌中表达。所得融合蛋白宜保留一个酶(因子Xa)加工位点，以便将噬菌体蛋白与外源基因切开[Nagai等人(1984)Nature 309：810]。融合蛋白也可用lacZ[Jia等人(1987)Gene 60：197]，trpE[Allen等人(1987)J.Biotechnol.5：93；Makoff等人(1989)，J.Gen.Microbiol.135：11]以及Chey[EP-A-0324 647]基因的序列组成。两个氨基酸序列连接处的DNA序列可以编码或不编码一可切割的位点。另一个例子是遍在蛋白融合蛋白。这种融合蛋白由遍在蛋白区域组成，该区域宜保留一个酶(例如遍在蛋白特异性加工蛋白酶)加工位点，以便将外源蛋白和遍在蛋白切开。通过这种方法，可以分离获得天然的外源蛋白[Miller等人(1989)Bio/Technology 7：698]。

另外，还可通过产生嵌合的DNA分子来将外源蛋白分泌出细胞，该嵌合的DNA分子编码的融合蛋白含有一个信号肽序列片段，该序列片段能使细菌中的外源蛋白分泌出来[美国专利4,336,336]。信号序列片段通常编码一个信号肽，该信号肽含有疏水性氨基酸，能指引蛋白分泌出细胞。蛋白质被分泌到生长培养基(革兰阳性菌)中或细胞内膜和外膜之间的周质间隙内(革兰阴性菌)。在编码的信号肽片段和外源基因之间宜具有能在体内或体外切割的加工位点。

编码合适信号序列的DNA可以从分泌性细菌蛋白的基因衍生获得，这些基因例如是大肠杆菌外膜蛋白基因(ompA)[Masui等人(1 983)，《基因表达的实验操作》；Ghrayeb等人(1 984)EMBO J.3：2437]以及大肠杆菌碱性磷酸酶信号序列(phoA)[Oka等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：7212]。另一个例子是，可采用各种芽孢杆菌菌株的α淀粉酶基因的信号序列将异源蛋白分泌出枯草芽孢杆菌[Palva等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5582；EP-A-0244 042]。

通常，细菌所识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3′的调控区，它和启动子一起侧接在编码序列的两侧。这些序列指导mRNA的转录，而mRNA能被翻译成该DNA所编码的多肽。转录终止序列通常包括约50个核苷酸的DNA序列，该序列能形成帮助终止转录的茎环结构。例子包括衍生自具有强启动子的基因(如大肠杆菌中的trp基因以及其它生物合成的基因)的转录终止序列。

上述组件，包括启动子、信号序列(如果需要的)、感兴趣的编码序列以及转录终止序列通常一起被放在表达构建物中。表达构建物通常以复制子的形式维持，例如能在宿主(如细菌)中稳定维持的染色体外元件(如质粒)。复制子具有一个复制系统，从而允许其维持在原核宿主中或进行表达或进行克隆和扩增。另外，复制子可以是高拷贝数或低拷贝数的质粒。高拷贝数质粒的拷贝数大致在约5至200之间，通常在约10至150之间。含有高拷贝数质粒的宿主宜含有至少约10个质粒，更佳的含有至少约20个质粒。根据载体以及外源蛋白对宿主的影响，可以选择高拷贝数或低拷贝数的载体。

另外，表达构建物可以和一个整合载体一起整合入细菌基因组中。整合载体通常含有至少一个序列与细菌染色体同源，从而允许该载体整合。整合看来是载体和细菌染色体中的同源DNA之间重组的结果。例如，用不同芽孢杆菌菌株的DNA构建的整合载体整合到芽孢杆菌染色体中(EP-A-0127 328)。整合载体还可包含噬菌体或转座子序列。

通常，染色体外构建物以及整合的表达构建物可含有可选择的标记，以便选择已经转化的菌株。可选择标记可在细菌宿主中表达，其包括赋予细菌对药物(如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素(新霉素)和四环素)抗性的基因[Davies等人(1978)Annu.Rev.Microbiol.32：469]。可选择标记还可包括生物合成性基因，如在组氨酸、色氨酸以及亮氨酸生物合成途径中的那些基因。

另外，上述某些组件可以一起放在转化载体中。转化载体通常包含一个可选择标记，如上所述，该载体以复制子形式维持或发展成一个整合载体。

已经开发出了用于转化到许多细菌中的表达和转化载体(无论是染色体外复制子还是整合载体)。例如，已经开发出了用于下列细菌的表达载体：枯草芽孢杆菌[Palva等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：5582；EP-A-0036 259和063 953；PCT出版物WO 84/04541]，大肠杆菌[Shimatake等人，(1981)Nature 292：128；Amann等人，(1985)Gene 40：183；Studier等人，(1986)J.Mol.Biol.189：113；EP-A-0036 776、136 829和136907]，酪链球菌[Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655]；浅青紫链球菌[Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol. 54：655]，浅青紫链霉菌[US patent4,745,056].

将外源DNA导入细菌宿主的方法是本领域熟知的，通常包括用氯化钙或其它试剂(如二价阳离子和DMSO)处理对细菌进行转化。DNA还可通过电穿孔方法导入细菌细胞。转化程序通常因待转化的细菌种类而不同。[参见，例如使用杆菌：Masson等人，(1989)FEMS Microbiol.Lett.60：273；Palva等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：5582；EP-A-0036 259和063 953；WO 84/04541；使用弯曲杆菌：Miller等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：856；和Wang等人，(1990)J. Bacteriol.172：949；使用埃希氏大肠杆菌：Cohen等人，(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.69：2110；Dower等人，(1988)NucleicAcids Res.16：6127；Kushner(1978)″用ColE l-衍生质粒转化大肠杆菌的改进方法″Genetic Engineering：Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering(H.W.Boyer和S.Nicosia编辑)；Mandel等人，(1970)J. Mol.Biol. 53：159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta 949：318；使用乳酸杆菌：Chassy等人，(1987)FEMS Microbiol.Lett.44：173；使用假单胞菌：Fiedler等人，(1988)Anal.Biochem 170：38；使用葡萄球菌：Augustin等人，(1990)FEMSMicrobiol.Lett.66：203；使用链球菌：Barany等人，(1980)J.Bacteriol. 144：698；Harlander(1987)″用电穿孔转化链球菌产乳酸微生物″Streptococcal Genetics(J.Ferretti和R.Curtiss III编辑)；Perry等人，(1981)Infect.Immun.32：1295；Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54：655；Somkuti等人，(1987)Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1：412]。

v.酵母表达

酵母表达系统也是本领域技术人员所知的。酵母启动子是能结合酵母RNA聚合酶并启动下游(3′)编码序列(如结构基因)转录成mRNA的DNA序列。启动子具有一个转录起始区，它通常位于编码序列的5′端附近。该转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点(″TATA″盒)以及一个转录起始位点。酵母启动子可能还有第二个功能区域称为上游激活序列(UAS)，如果存在的话，它通常远离结构基因。UAS能调节表达(可诱导)。在UAS不存在时，发生组成型表达。表达的调控可能是正作用或负作用的，从而增强或减弱转录。

酵母是一种发酵生物体，具有活泼的代谢途径，因此编码代谢途径中的酶的序列提供了特别有用的启动子序列。例子包括醇脱氢酶(ADH)(EP-A-0284 044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸变位酶、以及丙酮酸激酶(PyK)(EP-A-0329 203)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也提供了有用的启动子序列[Myanohara等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：1]。

另外，非天然存在的合成的启动子也可象酵母启动子一样起作用。例如，一种酵母启动子的UAS序列可以和另一种酵母启动子的转录激活区连接在一起，形成合成的杂合启动子。这种杂合启动子的例子包括与GAP转录激活区相连的ADH调控序列(美国专利No.4,876,197和4,880,734)。杂合启动子的其它例子包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调控序列组成的启动子与糖酵解酶基因如GAP或PyK的转录激活区的组合(EP-A-0164 556)。另外，酵母启动子可包括非酵母来源但能结合酵母RNA聚合酶并启动转录的天然存在的启动子。这些启动子的例子包括，尤其是，[Cohen等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：1078；Henikoff等人，(1981)Nature 283：835；Hollenberg等人，(1981)Curr.Topics Microbiol.Immunol.96：119；Hollenberg等人，(1979)″细菌抗生素抗性基因在酿酒酵母中的表达″Plasmids of Medical，Environmental andCommercial Importance(K.N.Timmis和A.Puhler编辑)；Mercerau-Puigalon等人，(1980)Gene 11：163；Panthier等人，(1980)Curr.Genet.2：109]。

DNA分子可以在酵母菌胞内表达。启动子序列可以直接与DNA分子相连，在这种情况下，重组蛋白N端的第一个氨基酸始终是甲硫氨酸，其由ATG起始密码子编码。如果需要，可通过和溴化氰体外培育将N端的甲硫氨酸从蛋白质上切下。

象在哺乳动物、植物、杆状病毒以及细菌表达系统中一样，融合蛋白为酵母表达系统提供了另一种方法。通常，将编码内源酵母蛋白或其它稳定的蛋白之N端部分的DNA序列与异源编码序列的5′端融合。在表达时，该构建物将提供这两个氨基酸序列的融合物。例如，酵母或人超氧化物歧化酶(SOD)基因可以和外源基因5′端相连并在酵母中表达。两个氨基酸序列连接处的DNA序列可以编码或不编码可切割的位点。例如参见EP-A-0196056。另一个例子是遍在蛋白融合蛋白。这种融合蛋白由遍在蛋白区域组成，该区域宜保留一个酶(例如遍在蛋白特异性加工蛋白酶)加工位点，以便将外源蛋白和遍在蛋白切开。因此，通过这种方法，可以分离获得天然的外源蛋白(例如WO88/024066)。

另外，还可通过产生嵌合的DNA分子来将外源蛋白从细胞分泌到生长培养基中，该嵌合的DNA分子编码的融合蛋白含有一个前导序列片段，该前导序列片段能使酵母中的外源蛋白分泌出来。较佳的，在编码的前导片段和外来基因之间宜具有能在体内或体外切割的加工位点。该前导序列片段通常编码了含有疏水性氨基酸的信号肽，其引导蛋白从细胞分泌出来。

编码合适信号序列的DNA可以从分泌性酵母蛋白的基因衍生获得，这些基因例如有酵母转化酶基因(EP-A-0012 873；JPO 62：096,086)以及A-因子基因(美国专利4,588,684)。另外，非酵母来源的前导序列(如干扰素前导序列)的存在也能提供分泌出酵母的作用(EP-A-0060 057)。

较佳的一类分泌前导序列采用了酵母α-因子基因的片段，其含有″pre″信号序列和″pro″区。可采用的α因子片段的类型包括全长pre-proα因子前导序列(约83个氨基酸残基)以及截短的α-因子前导序列(通常约25至50个氨基酸残基)(美国专利4,546,083和4,870,008；EP-A-0324 274)。采用α-因子前导片段提供分泌作用的其它前导序列包括杂合的α-因子前导序列，其由第一个酵母的pre序列以及第二个酵母α因子的pro区域组成(例如见WO 89/02463)。

通常，酵母识别的转录终止序列是位于翻译终止密码子3′的调控区，其和启动子一起侧接在编码序列的两侧。这些序列指导mRNA的转录，而mRNA能被翻译成该DNA所编码的多肽。转录终止序列和其它酵母识别的终止序列的例子是编码糖酵解酶的那些转录终止序列。

上述组件，包括启动子、前导序列(如果需要的)、感兴趣的编码序列以及转录终止序列，通常被一起放在表达构建物中。表达构建物通常以复制子的形式保持，例如能在宿主(如酵母或细菌)中稳定保持的染色体外元件(如质粒)。复制子可能具有两个复制系统，从而允许其能维持在例如酵母中进行表达，并能维持在原核宿主进行克隆和扩增。这些酵母-细菌穿梭载体的例子包括YEp24[Botstein等人(1979)Gene 8：17-24]，pCL/1[Brake等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：4642-4646]和YRp17[Stinchcomb等人(1982)J.Mol.Biol.158：157]。另外，复制子可以是高拷贝数或低拷贝数的质粒。高拷贝数质粒的拷贝数大致在约5至200之间，通常在约10至150之间。含有高拷贝数质粒的宿主宜含有至少约10个质粒，更佳的含有至少约20个质粒。根据载体以及外源蛋白对宿主的影响，可以选择高拷贝数或低拷贝数的载体。例如参见Brake等人，同上。

另外，表达构建物可以和一个整合载体一起整合入酵母基因组中。整合载体通常含有至少一个序列与酵母染色体同源，从而允许该载体整合，最好含有两个同源序列侧接该表达构建物。整合看来是载体和酵母染色体中同源DNA之间重组的结果[Orr-Weaver等人(1983)Methods in Enzymol.101：228-245]。通过选择合适的同源序列插入载体中，可将整合载体导入酵母中某一特定的基因座。见Orr-Weaver等人，同上。可以整合入一个或多个表达构建物，这可能会影响重组蛋白产生的水平[Rine等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：6750]。载体中的染色体序列可以载体中的单个片段形式存在(从而导致整个载体的整合)，或是与染色体中的相邻片段同源的两个片段，这两个片段在载体中侧接在表达构建物两侧，从而可导致仅表达构建物的稳定性整合。

通常，染色体外构建物以及整合的表达可建物均含有可选择的标记，以便选择已经转化的酵母菌株。可选择标记可包括能在酵母宿主中表达的生物合成基因(如ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和ALG7以及G418抗性基因)，这些基因分别赋予酵母细胞对衣霉素以及G41 8的抗性。另外，合适的可选择标记还可能为酵母在毒性化合物(如金属)存在下提供生长能力。例如，CUP1的存在使酵母能在铜离子存在下生长[Butt等人，(1987)Microbiol，Rev.51：351]。

已经开发出了用于转化入许多酵母中的表达和转化载体(无论是染色体外复制子还是整合载体)。例如，已经开发出用于下列酵母菌的表达载体和将外源DNA导入酵母宿主的方法：白色念珠菌[Kurtz，等人，(1 986)Mol.Cell.Biol.6：142]，麦芽糖念珠菌[Kunze，等人，(1985)J. BasicMicrobiol.25：141]，多形汉逊酵母[Gleeson，等人，(1986)J.Gen.Microbiol.132：3459；Roggenkamp等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202：302]，脆壁克鲁维酵母[Das，等人，(1 984)J. Bacteriol.158：1165]，乳酸克鲁维酵母[DeLouvencourt等人，(1983)J.Bacteriol.154：737；Van den Berg等人，(1990)Bio/Technology 8：135]，季也蒙毕赤酵母[Kunze等人，(1985)J. Basic Microbiol.25：141]，巴斯德毕赤酵母[Cregg，等人，(1985)Mol.Cell.Biol. 5：3376；美国专利No.4,837,148和4,929,555]，酿酒酵母[Hinnen等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：1929；Ito等人，(1983)J. Bacteriol.153：163]，栗酒裂植酵母[Beach和Nurse(1981)Nature 300：706]，以及Yarrowia lipolytica[Davidow，等人，(1985)Curr.Genet.10：380471 Gaillardin，等人，(1985)Curr.Genet.10：49]。

将外源DNA导入酵母宿主的方法是本领域熟知的，通常包括用碱阳离子处理转化原生质球或完整酵母细胞。转化程序通常因待转化的酵母种类而不同。例如参见，[Kurtz等人，(1986)Mol.Cell.Biol.6：142；Kunze等人，(1985)J.Basic Microbiol.25：141；念珠菌]；[Gleeson等人，(1986)J. Gen.Microbiol.132：3459；Roggenkamp等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202：302；汉逊酵母]；[Das等人，(1984)J. Bacteriol.158：1165；DeLouvencourt等人，(1983)J. Bacteriol.154：1165；Van den Berg等人，(1990)Bio/Technology 8：135；克鲁维酵母]；[Cregg等人，(1985)Mol.Cell.Biol.5：3376；Kunze等人，(1985)J. Basic Microbiol.25：141；美国专利No.4,837,148和4,929,555；毕赤酵母]；[Hinnen等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75；1929；Ito等人，(1983)J.Bacteriol.153：163酿酒酵母]；[Beach和Nurse(1981)Nature 300：706；裂殖酵母]；[Davidow等人，(1985)Curr.Genet.10：39；Gaillardin等人，(1985)Curr.Genet.10：49；Yarrowia]。

抗体

本文所用的术语“抗体”指由至少一个抗体结合位点组成的一个或一组多肽。“抗体结合位点”是一个三维结合空间，其内表面形状和电荷分布与抗原表位的特征互补，从而使抗体与抗原结合。“抗体”例如包括，脊椎动物抗体、杂合抗体、嵌合抗体、人源化抗体、经修饰的抗体、单价抗体、Fab蛋白以及单结构域抗体。

针对本发明蛋白的抗体可用于亲和层析、免疫试验以及区别/鉴定奈瑟球菌蛋白。

针对本发明蛋白的多克隆和单克隆抗体可用常规方法制得。通常，首先用蛋白来免疫合适的动物，较佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可获得的血清体积多，能获得标记的抗家兔和抗山羊抗体，因此对于制备多克隆抗血清来说，家兔和山羊是较佳的。免疫通常这样进行：将蛋白以盐水(较佳的以佐剂如Freund氏完全佐剂)混合或乳化，然后肠胃外(通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂。每次注射50-200微克的剂量就足够了。2-6周后用盐水(较佳的是用Freund氏不完全佐剂)配的蛋白质注射一次或多次以强化免疫。另外可以用本领域已知的方法进行体外免疫来产生抗体，从本发明的目的来看，认为其与体内免疫等效。将免疫后的动物血液抽取到玻璃或塑料容器中，25℃培育该血液1小时，然后4℃培育2-18小时，获得多克隆抗血清。离心(例如1000g10分钟)回收血清。家兔每次取血可获得约20-50亳升。

用Kohler和Milstein的标准方法[Nature(1975)256：495-96]或其改进方法制得单克隆抗体。通常，如上所述对小鼠或大鼠免疫。然而，并非是对动物取血然后抽提血清，而是取出脾脏(以及任选地取出几个大的淋巴结)，将其分离成单细胞。如果需要，可将细胞悬液(在除去非特异性粘附的细胞后)加入包被了蛋白质抗原的板或孔中，对脾细胞进行筛选。表达抗原特异性的膜结合免疫球蛋白的B细胞结合到板上，不象悬液其它物质那样被洗去。然后使所得B细胞或所有解离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，培养在选择性培养基(如次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷培养基，“HAT”)中。通过有限稀释接种所得杂交瘤，并测定特异性结合免疫抗原(且不结合无关抗原)的抗体的产生。然后，体外(例如在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(如小鼠腹水中)培养所选的分泌单克隆抗体的杂交瘤。

如果需要，抗体(无论是多克隆还是单克隆抗体)可用常规技术来标记。合适的标记包括荧光团、发色团、放射活性原子(具体是³²P和¹²⁵I)、密电子试剂、酶、以及具有特异性结合配偶的配体。酶通常靠其活性来检测。例如，辣根过氧化物酶通常是检测其将3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)转变成蓝色的能力，可用分光光度计定量测定。“特异性结合配偶”指能以高特异性结合配体分子的蛋白质，例如抗原以及对其有特异性的单克隆抗体。其它特异性结合配偶包括生物素和亲和素或链亲和素，IgG和蛋白A，以及本领域已知的许多受体-配体对。应理解，上述内容并非要将各种标记分成不同的类，因为同一标记可在几种不同的模型中起作用。例如，¹²⁵I可作为放射活性标记，或作为密电子试剂。HRP可作为酶或单抗的抗原。另外，一种物质可以和各种标记组合以获得所需的效果。例如，在实施本发明中，单抗和亲和素也需要标记，因此，可以用生物素标记单抗，并用标记了¹²⁵I的亲和素检测其存在，或用标记HRP的抗生物素单抗检测其存在。其它替换和可能性对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，所以应认作等价物属于本发明的范围。

药物组合物

药物组合物可包含本发明的多肽、抗体或核酸。该药物组合物将包含治疗有效量的本发明的多肽、抗体或多核苷酸。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果例如可通过化学标记或抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少，例如导致体温降低。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克或0.05毫克/千克至10毫克/千克的DNA构建物。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如抗体、多肽、基因或其它治疗剂)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可能是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。

本文可用的药学上可接受的盐例如有：无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。在Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

输药方法

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是动物；尤其可以治疗人对象。

直接输送该组合物通常可通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射或输送至组织间隙来实现。组合物也可输送至病灶区。其它给药方式包括口服和肺给药、栓剂和透皮或经皮肤施用(参见例如WO98/20734)、用针、基因枪或手持喷雾器(hypospray)。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。

疫苗

本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即在感染后治疗疾病)。

这些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸，通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原或免疫原可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方(有或没有其它特异性的免疫刺激剂，如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁成分)，例如，(a)MF59(WO 90/14837；第10章疫苗设计：亚基和佐剂方法，Powell&Newman编，Plenum Press，1995)，其含有5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85(任选地含有不同量的MTP-PE(见下文)，虽然并不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA))制成亚微米级颗粒；(b)SAF，其含有10％鲨烯、0.4％吐温80、5％普卢兰尼克(pluronic)嵌段聚合物L121以及thr-MDP(见下文)，微量流化成亚微米级乳剂或涡流振荡产生粒径较大的乳剂，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，其含有2％鲨烯、0.2％吐温80以及取自单磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁组分，较佳的是MPL+CWS(Detox^TM)；(3)皂素佐剂，例如可采用Stimulon^TM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或从其产生的颗粒，如ISCOM(免疫刺激性复合物)；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；以及(6)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。Alum和MF59是较佳的。

如上所述，胞壁酰肽包括但不局限于，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。

免疫原性组合物(如用于免疫的抗原/免疫原/多肽/蛋白/核酸，药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

通常，可将免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。

用作疫苗的免疫原性组合物，包含免疫学有效量的抗原性或免疫原性多肽以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

常规方法是从肠胃外途径通过注射给予免疫原性组合物，例如皮下、肌内或透皮给药(例如WO98/20734)。适合其它给药方式的其它配方包括口服和肺制剂、栓剂和透皮应用。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。

作为以蛋白质为基础的疫苗的一种替代方案是，可以采用DNA疫苗接种[例如，Robinson和Torres(1997)Seminars in Immunology 9：271-283；Donnelly等人(1997)AnnuRev.Immunol 15：617-648；见下文]。

基因输送载体

用于输送构建物的基因治疗载体可以口服或全身性给予，其中所述构建物包括本发明治疗剂的编码序列，将其输送至哺乳动物以便在哺乳动物体内表达。这些构建物可利用体内或活体外方式中的病毒或非病毒载体方法。这些编码序列的表达可用内源哺乳动物启动子或异源启动子诱导。编码序列的体内表达可以是组成型的或受调控的。

本发明包括能表达所涉及的核酸序列的基因输送运载体。基因输送运载体宜为病毒载体，更佳的是逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒或甲病毒载体。病毒载体还可以是星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒或披膜病毒的病毒载体。通常参见Jolly(1994)Cancer GeneTherapy 1：51-64；Kimura(1994)Human Gene Therapy 5：845-852；Connelly(1995)HumanGene Therapy6：185-193；以及Kaplitt(1994)Nature Genetics 6：148-153。

逆转录病毒载体是本领域中熟知的并且我们认为任何逆转录病毒基因治疗载体都可用于本发明，它们包括B、C和D型逆转录病毒、异嗜性逆转录病毒(例如NZB-X1、NZB-X2和NZB9-1(见O′Neill(1985)J.Virol.53：160)广嗜性逆转录病毒如MCF和MCF-MLV(见Kelly(1983)J.Virol 45：291)、泡沫病毒和慢病毒。见《RNA肿瘤病毒》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，1985。

逆转录病毒基因治疗载体的诸部分可从不同逆转录病毒衍生获得。例如，逆转录载体LTR可以从小鼠肉瘤病毒衍生获得，tRNA结合位点可以从Rous肉瘤病毒衍生获得，包装信号从小鼠白血病病毒获得，第二链的合成起点从禽类白血病病毒获得。

可将这些重组逆转录病毒载体导入合适的包装细胞系，用来产生转导感受态逆转录病毒载体颗粒(见美国专利5,59 1,624)。通过将嵌合性整合酶掺入逆转录病毒颗粒，构建逆转录病毒载体，以便将其定点整合到宿主细胞DNA中(见WO96/37626)。较佳的重组病毒载体是复制缺陷型重组病毒。

适合与上述逆转录病毒载体一起使用的包装细胞系是本领域熟知的，很容易制得(见WO95/30763和WO92/05266)，并能用来产生能生产重组载体颗粒的生产型细胞系(也称为载体细胞系或“VCL”)。包装细胞系宜从人亲代细胞(如HT1080细胞)或貂亲代细胞系制取，以便消除人血清的灭活作用。

用来构建逆转录病毒基因治疗载体的较佳的逆转录病毒，包括禽类白血病病毒、牛白血病病毒、鼠白血病病毒、水貂细胞灶诱导病毒、鼠肉瘤病毒、网状内皮组织增殖病毒和Rous肉瘤病毒。特别佳的鼠白血病病毒包括4070A和1504A(Hartley和Rowe(1976)J Virol19：19-25)，Abelson(ATCC No.VR-999)，Friend(ATCC No.VR-245)，Graffi，Gross(ATCC Nol VR-590)，Kirsten，Harvey肉瘤病毒和Rauscher(ATCC No.VR-998)以及莫洛尼鼠白血病病毒(ATCC No.VR-190)。这些逆转录病毒可以从保藏机构或保藏中心如Rockville，Maryland的美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，或用常用的技术从已知来源分离获得。

可用于本发明的典型的已知逆转录病毒基因治疗载体包括在以下专利申请中描述的那些载体：GB2200651，EP0415731，EP0345242，EP0334301，WO89/02468；WO89/05349，WO89/0927 1，WO90/02806，WO90/07936，WO94/03622，WO93/25698，WO93/25234，WO93/11230，WO93/1021 8，WO91/02805，WO91/02825，WO95/07994，US 5,219,740，US 4,405,712，US 4,861,719，US 4,980,289，US 4,777,127，US 5,591,624.另见Vile(1993)Cancer Res 53：3860-3864；Vile(1993)Cancer Res 53：962-967；Ram(1993)Cancer Res 53(1993)83-88；Takamiya(1992)J Neurosci Res 33：493-503；Baba(1993)JNeurosurg 79：729-735；Mann(1983)Cell 33：153；Cane(1984)Proc NatlAcad Sci81：6349；以及Miller(1990)Human Gene Therapy 1。

人腺病毒基因治疗载体也是本领域中已知的，并可用于本发明。例如参见Berkner(1988)Biotechniques 6：616和Rosenfeld(1991)Science 252：431，以及WO93/07283，WO93/06223和WO93/07282。用于本发明的典型的已知的腺病毒基因治疗载体包括在上述文献以及下述专利中描述的那些例子：WO94/12649，WO93/03769，WO93/19191，WO94/28938，WO95/11984，WO95/00655，WO95/27071，WO95/29993，WO95/34671，WO96/05320，WO94/08026，WO94/11506，WO93/06223，WO94/24299，WO95/14102，WO95/24297，WO95/02697，WO94/28152，WO94/24299，WO95/09241，WO95/25807，WO95/05835，WO94/18922和WO95/09654。另外，可以采用Curiel(1992)Hum.Gene Ther.3：147-154中描述的给予和已杀死腺病毒相连的DNA的方法。本发明的基因输递载体还包括腺病毒伴随病毒(AAV)载体。用于本发明的这种载体的主要且较佳的例子是Srivastava，WO93/09239中公开的AAV-2为基础的载体。最佳的AAV载体包含两个AAV反向末端重复序列，其中通过替换核苷酸对天然D-序列进行修饰，使至少5-18个天然的核苷酸(较佳的至少10-18个天然核苷酸，最佳的10个天然核苷酸)被保留下来，而D-序列其余的核苷酸缺失或用非天然核苷酸取代。AAV反向末端重复序列的天然D-序列是每个AAV反向末端重复序列中不参与HP形成的20个串联核苷酸的序列(即每一端有一个序列)。非天然的替换核苷酸可以是天然D-序列该位置中所见核苷酸以外的任何核苷酸。其它可采用的典型AAV载体是pWP-19、pWN-1，两者均公开在Nahreini(1993)Gene 124：257-262中。这样的AAV载体的另一个例子是psub201(见Samulski(1987)J.Virol.61：3096)。另一个典型的AAV载体是Double-D ITR载体。Double-D ITR载体的构建方案公开在美国专利5,478,745中。还有其它的载体是公开在Carter的美国专利4,797,368和Muzyczka的美国专利5,139,941、Chartejee的美国专利5,474,935和Kotin的WO94/288157中的载体。可用于本发明的另一个AAV载体例子是SSV9AFABTKneo，它含有AFP增强子和白蛋白启动子，并且主要指导肝内表达。其结构和构建方案公开在Su(1996)Human Gene Therapy 7：463-470中。其它的AAV基因治疗载体在美国专利5,354,678，5,173,414，5,139,941，5,252,479中有所描述。

本发明的基因治疗载体还包括疱疹载体。主要且较佳的例子是含有编码胸苷激酶多肽的序列的单纯疱疹病毒载体，如公开在US5,288,641和EP0176170(Roizman)中的那些。其它典型的单纯疱疹病毒载体包括WO95/04139中公开的HFEM/ICP6-LacZ(WistarInstitute)、Geller(1988)Science 241：1667-1669以及WO90/09441和WO92/07945中公开的pHSVlac、Fink(1992)Human Gene Therapy 3：11-19中描述的HSV Us3::pgC-lacZ、EP0453242(Breakefield)中描述的HSV 7134、2 RH 105和GAL4以及保藏于ATCC、保藏号为ATCC VR-977和ATCC VR-260的那些病毒。

还考虑到甲病毒基因基因治疗载体也可用于本发明。较佳的甲病毒载体是新培斯病毒载体。披膜病毒、Semliki Forest病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、Middleberg病毒(ATCC VR-370)、Ross River病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)、委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532)、以及在美国专利5,091,309，5,217,879以及WO92/10578中描述的那些。更具体地说，可以采用1995年3月15日提交的美国申请08/405,627、WO94/21792、WO92/10578、WO95/07994、US 5,091,309和US 5,217,879中描述的那些甲病毒载体。这些甲病毒可以从保藏机构或保藏中心如Rockville，Maryland的美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，或用常用的技术从已知来源分离获得。较佳的是，采用细胞毒性降低的甲病毒载体(见USSN08/679640)。

DNA载体系统，如真核分层的(layered)表达系统也可用于表达本发明的核酸。关于真核分层的表达系统详见WO95/07994。较佳的，本发明的真核分层表达系统宜从甲病毒载体衍生获得，更佳的从新培斯病毒载体衍生获得。

适用于本发明的其它病毒载体包括：从脊髓灰质炎病毒衍生的载体，例如ATCCVR-58以及在Evans，Nature 339(1989)385和Sabin(1973)J. Biol.Standardization 1：115中描述的那些；鼻病毒，例如ATCC VR-1110以及在Arnold(1990)J Cell Biochem L401中描述的那些；痘病毒，如金黄色痘病毒或牛痘病毒，例如ATCC VR-111和ATCCVR-2010，以及在Fisher-Hoch(1989)Proc Natl Acad Sci 86：317；Flexner(1989)Ann NYAcad Sci 569：86，Flexner(1990) Vaccine 8：17；US 4,603,112，US 4,769,330以及WO89/O1973中描述的那些；SV40病毒，例如ATCC VR-305以及在Mulligan(1979)Nature 277：108和Madzak(1992)J Gen Virol 73：1533中描述的那些；流感病毒，例如ATCC VR-797以及用例如US 5,166,057和Enami(1990)Proc Natl Acad Sci87：3802-3805；Enami和Palese(1991)J Virol 65：2711-2713；Luytjes(1989)Cell 59：110中所述的反基因技术制得的重组流感病毒(另见McMichael(1983)NEJMed 309：13，Yap(1978)Nature 273：238以及Nature(1979)277：108)；EP-0386882和Buchschacher(1992)J.Virol.66：2731中描述的人免疫缺陷病毒；麻疹病毒，例如ATCC VR-67和VR-1247，以及EP-0440219中描述的那些；奥拉病毒，例如ATCC VR-368；Bebaru病毒，例如ATCC VR-600和ATCC VR-1240；Cabassou病毒，例如ATCC VR-922；屈曲病毒，例如ATCC VR-64和ATCC VR-1241；Fort Morgan病毒，例如ATCC VR-924；Getah病毒，例如ATCC VR-369和ATCC VR-1243；Kyzylagach病毒，例如ATCC VR-927；Mayaro病毒，例如ATCC VR-66；Mucambo病毒，例如ATCC VR-580和ATCCVR-1244；Ndumu病毒，例如ATCC VR-371；Pixuna病毒，例如ATCC VR-372和ATCCVR-1245；Tonate病毒，例如ATCC VR-925；Triniti病毒，例如ATCC VR-469；Una病毒，例如ATCC VR-374；Whataroa病毒，例如ATCC VR-926；Y-62-33病毒，例如ATCC VR-375；O′Nyong病毒，东部脑炎病毒，例如ATCC VR-65和ATCC VR-1242；西部脑炎病毒，例如ATCC VR-70，ATCC VR-1251，ATCC VR-622和ATCC VR-1252；和冠状病毒，例如ATCC VR-740和在Hamre(1966)Proc Soc Exp Biol Med 121：190中描述的那些。

将本发明的组合物输送至细胞内并不局限于上述病毒载体。还可采用其它输送方法和介质，例如核酸表达载体、与已被杀死的腺病毒相连或不相连的单独的聚阳离子凝缩的DNA(例如参见1994年12月30日美国申请No.08/366,787和Curiel(1992)HumGene Ther 3：147-154)、配体连接的DNA(例如参见Wu(1989)J.Biol.Chem.264：16985-16987)、真核细胞输送载体细胞(例如参见1994年5月9日提交的美国申请No.08/240,030以及美国申请No.08/404,796)、光聚合水凝胶材料的沉淀、手提式基因转移颗粒枪(如美国专利5,149,655所述)、电离辐射(如US5,206,152和WO92/l1033所述)、核电荷中和或与细胞膜融合。其它方法在Philip(1994)Mol Cell Biol 14：2411-2418以及Woffendin(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：1581-1585中有所描述。

可以采用颗粒介导的基因转移，例如参见美国申请No.60/023,867。简言之，可将序列插入含有控制高水平表达的常规序列的常规载体中，然后和合成性基因转移分子一起培育，这些基因转移分子例如是聚合性DNA-结合阳离子(如聚赖氨酸、鱼精蛋白和白蛋白)，其与细胞寻靶配体(如脱唾液酸血清类粘蛋白(如Wu和Wu(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432所述)、胰岛素(如Hucked(1990)Biochem Pharmacol 40：253-263所述)、半乳糖(如Plank(1992)Bioconjugate Chem 3：533-539所述)、乳糖或运铁蛋白)相连。

裸DNA也可用于转化宿主细胞。典型的裸DNA导入方法在WO 90/11902和US5,580,859中有所描述。用可生物降解的乳胶珠可以改善摄取效果。在对珠粒的胞吞作用开始后，DNA包被的乳胶珠粒被有效地运输到细胞中。通过处理珠粒以提高其疏水性可进一步改进该方法，从而促进核内体的破坏和将DNA释放到细胞质中。

可作为基因输送运载体的脂质体在US 5,422,120，WO95/13796，WO94/23697，WO91/14445和EP-524,968中有所描述。如USSN 60/023,867中所描述的，在非病毒输送时，可将编码多肽的核酸序列插入含有控制高水平表达的常规序列的常规载体中，然后和合成性基因转移分子一起培育，这些基因转移分子例如是聚合性DNA-结合阳离子(如聚赖氨酸、鱼精蛋白和白蛋白)，其与细胞寻靶配体(如脱唾液酸血清类粘蛋白、胰岛素、半乳糖、乳糖或运铁蛋白)相连。其它输送系统包括采用脂质体来包裹DNA，该DNA所含基因在各种组织特异性或活性普遍存在的启动子控制下。适用的其它非病毒输送系统包括机械输送系统，如Woffendin等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(24)：11581-11585中描述的方法。另外，这类编码序列和表达产物可以通过光聚合的水凝胶材料的沉淀来输送。可用来输送编码序列的其它基因输送常规方法例如包括，用手提式基因转移颗粒枪(如美国专利5,149,655所述)；用电离辐射来激活转移的基因(如US 5,206,152和WO92/11033所述)。

典型的脂质体和聚阳离子基因输送载体在下列文献中有所描述：US 5,422,120和4,762,915；WO 95/13796；WO94/23697；WO91/14445；EP-0524968；Stryer，Biochemistry，236-240页(1975)W.H.Freeman，San Francisco；Szoka(1 980)Biochem Biophys Acta600：1；Bayer(1979)Biochem Biophys Acta 550：464；Rivnay(1987)Meth Enzymol149：119；Wang(1987)Proc Natl Acad Sci 84：7851；Plant(1989)Anal Biochem 176：420。

多核苷酸组合物可包含治疗有效量的基因治疗运载体，其定义如上所述。出于本发明的目的，有效的剂量是给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克或0.05毫克/千克至10毫克/千克的DNA构建物。

输送方法

一旦配制后，本发明的多核苷酸组合物可以以下三种方式给予：(1)直接给予对象；(2)活体外输送给对象衍生的细胞；或(3)体外表达重组蛋白。待处理的对象可以是哺乳动物或鸟类。另外，也可对人进行治疗。

直接输送该组合物通常可通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射或输送至组织间隙来实现。该组合物也可输送至病损部位。其它给药方式包括口服和肺给药、栓剂和透皮或经皮肤应用(例如见WO98/20734)、用针、基因枪或手持喷雾器(hypospray)。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。

活体外输送以及将转化的细胞重新植入对象体内的方法是本领域所熟知的，在例如WO93/14778中有所描述。用于活体外应用的细胞例子包括例如干细胞、尤其是造血细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞或肿瘤细胞。

通常，对于活体外和体外应用，核酸的输送可通过以下步骤来实现，例如葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包裹在脂质体中以及将DNA直接显微注射到胞核中，所有这些均是本领域所熟知的。

多核苷酸和多肽药物组合物

除了上述的药学上可接受的载体和盐外，多核苷酸和多肽组合物中还可采用下列附加试剂。

A.多肽

一个例子是多肽，其包括但不局限于：脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)；运铁蛋白；脱唾液酸糖蛋白；抗体；抗体片段；铁蛋白；白介素；干扰素；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子和促红细胞生成素。还可使用病毒抗原，如包膜蛋白。另外，可用来自其它侵袭性生物的蛋白，例如疟原虫恶性疟疾的环孢子蛋白的17个氨基酸的肽(称为RII)。

B.激素，维生素等

其它可包括的种类例如是：激素、类固醇、雄激素、雌激素、甲状腺激素或维生素、叶酸。

C.聚亚烷基、多糖等

另外，聚(亚烷基)二醇可以和所需的多核苷酸或多肽组合在一起。在一个较佳的实施方案中，聚(亚烷基)二醇是聚乙二醇。另外，可以加入单糖、二糖或多糖。在此方面的一个较佳实施方案中，多糖是葡聚糖或DEAE-葡聚糖。另外有脱乙酰壳多糖和聚交酯-聚乙醇酸内酯共聚物。

D.脂质和脂质体

所需的多核苷酸或多肽还可在输送给对象或对象衍生的细胞之前包裹在脂质中或包裹在脂质体中。

脂质包裹通常用能稳定结合或捕获并保留核酸的脂质体来实现。浓缩的多核苷酸或多肽与脂质制剂之比可以不同，但是通常在约1∶1(毫克DNA：微摩尔脂质)之间，或脂质更多。关于脂质体作为输送核酸的载体的综述参见Hug和Sleight(1991)Biochim.Biophys.Acta.1097：1-17；Straubinger(1983)Meth.Enzymol.101：512-527。

用于本发明的脂质体制剂包括阳离子(带正电荷)、阴离子(带负电荷)和中性制剂。阳离子脂质体已经显示出能以有功能的形式介导质粒DNA的胞内输送(Felgner(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7416)；mRNA(Malone(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6077-6081)；和纯化的转录因子的胞内输送(Debs(1990)J.Biol.Chem.265：10189-10192)。

阳离子脂质体很容易购得。例如，N[1-2，3-二油烯基氧)丙基]-N，N，N-三乙铵(DOTMA)脂质体可以以Lipofectin的商标从GIBCO BRL，Grand Island，NY购得。(另见Felgner，同上)。其它商品脂质体包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其它阳离子脂质体可用本领域熟知的方法从易购得的材料制得。例如参见，Szoka(1 978)PNAS 75：41 94-41 98；WO90/11092关于DOTAP(1，2-二(油酰基氧)-3-(三甲基铵溶)丙烷)脂质体合成的描述。

同样，阴离子和中性脂质体也是容易获得的，例如购自Avanti PolarLipids(birmingham，AL)，或容易用易购得的材料制得。这种材料包括磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。这些材料还能以合适比例与DOTMA和DOTAP原料混合。用这些材料制备脂质体的方法是本领域熟知的。

脂质体可包含多层脂质体(MLV)，小的单层脂质体(SUV)、或大的单层脂质体(LUV)。各种脂质体-核酸复合物可用本领域已知的方法制得。例如参见Straubinger(1983)Meth.Immunol.101：512-527；Szoka(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：4194-4198；Papahadjopoulos(1975)Biochim.Biophys.Acta 394：483；Wilson(1979)Cell 17：77)；Deamer和Bangham(1976)Biochim.Biophys.Acta 443：629；Ostro(1977)Biochem.Biophys.Res.Commun.76：836；Fraley(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：3348)；Enoch和Strittmatter(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：145；Fraley(1 980)J. Biol.Chem.(1980)255：10431；Szoka和Papahadjopoulos(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：145；以及Schaefer-Ridder(1982)Science 215：166。

E.脂蛋白

另外，脂蛋白也可加入待输送的多核苷酸或多肽中。采用的脂蛋白的例子包括：乳糜微粒、HDL、IDL、LDL和VLDL。还可采用这些蛋白的突变体、片段或融合蛋白。另外，可采用天然存在的脂蛋白的修饰物，例如乙酰化的LDL。这些脂蛋白能使多核苷酸的输送指向表达脂蛋白受体的细胞。较佳的，如果待输送的多核苷酸中加入了脂蛋白，则组合物中不加入其它寻靶的配体。

天然存在的脂蛋白包含脂质和蛋白部分。蛋白部分称为脱辅基蛋白。目前，已经分离并鉴定出了脱辅基蛋白A、B、C、D和E。其中至少有两个含有几种蛋白，用罗马数字AI、AII、AIV；CI、CII、CIII命名。

脂蛋白可包含多个脱辅基蛋白。例如，天然存在的乳糜微粒包含A、B、C和E，随着时间的推移，这些脂蛋白失去A，得到C和E脱辅基蛋白。VLDL包含A、B、C、和E脱辅基蛋白，LDL包含脱辅基蛋白B；HDL包含脱辅基蛋白A、C和E。

这些脱辅基蛋白的氨基酸是已知的，并且在下列文献中有所描述：Breslow(1985)Annu Rev.Biochem 54：699；Law(1986)Adv.Exp Med.Biol.151：162；Chen(1986)J BiolChem 261：12918；Kane(1980)Proc Natl Acad Sci USA 77：2465；and Utermann(1984)HumGenet 65：232。

脂蛋白含有各种脂质，包括甘油三酯、胆固醇(游离的和酯型)以及磷脂。天然存在的脂蛋白中脂质的组成是不同的。例如，乳糜微粒主要含甘油三酯。关于天然存在的脂蛋白的脂质含量更详细的描述可在例如Meth.Enzymol.128(1986)中找到。选择脂质的组成，以使脱辅基蛋白的构型有利于受体结合活性。还可选择脂质的组成，以促进与多核苷酸结合分子中的疏水性相互作用和结合。

天然存在的脂蛋白可以用诸如超离心方法从血清中分离出来。这些方法在Meth.Enzymol.(同上)；Pitas(1980)J.BioChem.255：5454-5460以及Mahey(1979)J Clin.Invest64：743-750中有所描述。脂蛋白还可在体外产生，或通过在所需宿主细胞中表达脱辅基蛋白基因的重组方法产生。例如参见Atkinson(1986)Annu Rev Biophys Chem 15：403和Radding(1958)Biochim Biophys Acta 30：443。脂蛋白也可购自商业供应商，如BiomedicalTechniologies，Inc.，Stoughton，Massachusetts，USA。关于脂蛋白的进一步描述可在WO98/06437中找到。

F.聚阳离子试剂

聚阳离子试剂可以与或不与脂蛋白一起包括在含所需待输送多核苷酸或多肽的组合物中。

聚阳离子试剂通常在生理性相关的pH下表现出净的正电荷，并能中和核酸的电荷，而有助于输送至所需位置。这些试剂具有体外、活体外和体内的用途。聚阳离子试剂可用来将核酸通过肌内或皮下等输送至活的对象。

下面是用作聚阳离子试剂的多肽例子：聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸和鱼精蛋白。其它例子包括组蛋白、鱼精蛋白、人血清白蛋白、DNA结合蛋白、非组蛋白染色体蛋白、DNA病毒的外壳蛋白，如(X174，转录因子还含有结合DNA的结构域，因此可用作核酸凝聚剂。简言之，转录因子如C/CEBP、c-jun、c-fos、AP-1、AP-2、AP-3、CPF、Prot-1、Sp-1、Oct-1、Oct-2、CREP、和TFIID含有结合DNA序列的基本结构域。

聚阳离子有机试剂包括：精胺、亚精胺和腐胺。

从上面的清单可以推出聚阳离子试剂的尺寸和生理性能，以构建其它多肽聚阳离子试剂或产生合成的聚阳离子试剂。

有用的合成聚阳离子试剂例如包括，DEAE-葡聚糖、Polybrene。Lipofectin^TM和lipofectAMINE^TM是与多核苷酸/多肽组合时形成聚阳离子复合物的单体。

免疫诊断试验

本发明的奈瑟球菌抗原可用于免疫试验来检测抗体水平(或相反，可用抗奈瑟球菌抗体来检测抗原水平)。根据明确的免疫试验，可以开发重组抗原，以代替侵入性诊断方法。可检测生物学样品(例如包括血液或血清样品)中的抗奈瑟球菌蛋白的抗体。免疫试验的设计可作很大变化，其各种方案均是本领域中已知的。免疫试验的方案可采取例如竞争性、或直接反应或夹心型试验。方案例如还可采用固体支持物，或可以采用免疫沉淀法。大多数试验涉及采用有标记的抗体或多肽；该标记例如可以是荧光标记、化学发光标记、放射活性标记或染料分子。扩增探针信号的试验也是已知的；其例子是采用生物素和亲和素的试验，酶标记的和介导的免疫试验，如ELISA试验。

将合适的材料(包括本发明的组合物)以及进行试验所需的其它试剂和材料(例如合适的缓冲液、盐溶液等)和合适的试验说明书包装到合适的容器中，构成适用于免疫诊断且含有适当标记的试剂的试剂盒。

核酸杂交

“杂交”指两个核酸序列相互之间通过氢键而结合。通常，一个序列固定于固体载体，另一个将游离于溶液内。然后，在有利于形成氢键的条件下使两个序列相互接触。影响这种结合的因素包括：溶剂的类型和体积；反应温度；杂交时间；搅拌；封闭液相序列与固体载体非特异性结合的试剂(Denhardt′s试剂或BLOTTO)；各序列的浓度；是否使用化合物来增加序列结合的速度(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；以及杂交后洗涤条件的严谨程度。见Sambrook等人[同上]第2卷，第9章，9.47至9.57页。

“严谨性”指有利于非常相似的序列结合而不利于不同序列结合的杂交反应条件。例如，应选择温度和盐浓度的组合，使温度比所研究的杂交的Tm计算值低大约120至200℃。温度和盐浓度常可通过初步实验中凭经验来确定，在初步实验中，固定在滤膜上的基因组DNA样品与感兴趣的序列杂交，然后在不同的严谨度条件下洗涤。见Sambrook等人第9.50页。

在进行例如Southern印迹时，要考虑的参数是(1)待印迹的DNA的复杂性以及(2)探针与受检测序列之间的同源性。对于高度复杂的真核基因组中的单拷贝基因，待研究片段的总量可以在10的一个数量级范围内变化，质粒为0.1至1微克，或将噬菌体消化至10^-9至10^-8克。对于复杂性较低的多核苷酸，可以采用实际上更短的印迹、杂交以及接触时间，更少量的起始多核苷酸，以及比活更低的探针。例如，从1微克酵母DNA开始，用仅仅1小时的接触时间，印迹2小时，然后和10⁸cpm/μg的探针杂交4-8小时，就可以检测单拷贝酵母基因。对于单拷贝哺乳动物基因而言，一种保守的方法是从10微克DNA开始，印迹过夜，在10％硫酸葡聚糖存在下用10⁸cpm/μg以上的探针杂交过夜，导致接触时间约为24小时。

有几个因素可能会影响探针与感兴趣片段之间的DNA-DNA杂交物的解链温度(Tm)，因而影响杂交和洗涤的合适条件。在许多情况下，探针并非与待测片段100％同源。其它常常遇到的变量包括杂交序列的长度和G+C总含量，以及杂交缓冲液的离子强度和甲酰胺含量。所有这些因素的作用可近似表示成一个方程式：

Tm＝81+16.6(log₁₀Ci)+0.4[％(G+C)]-0.6(％甲酰胺)-600/n-1.5(％错配)

其中Ci是盐浓度(单价离子)，n是杂交物碱基对的长度(对Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284中的稍稍作了修改)。

在设计杂交实验时，影响核酸杂交的一些因素可以方便地予以改变。杂交和洗涤时的温度以及洗涤时的盐浓度的调节最为简单。随着杂交温度(即严谨度)的升高，不同源的链之间发生杂交的可能性变得更少，结果背景值降低。如果放射性标记的探针并非与固定的片段完全同源(这在基因家族和种间杂交实验中是常见的)，则必须降低杂交温度，而背景值将会增加。洗涤温度以类似的方式影响杂交带的强度和背景值的程度。洗涤的严谨性也随盐浓度的降低而升高。

通常，在50％甲酰胺存在下的方便的杂交温度是：对于靶片段同源性达95％至100％的探针而言，是42℃；对于同源性为90％至95％的探针，为37℃；对于同源性为85％和90％的探针，为32℃。对于较低的同源性，应用上述方程式应相应地降低甲酰胺含量和调节温度。如果探针和靶片段之间的同源性是未知的，则最简单的方法是从非严谨的杂交和洗涤条件开始。如果在放射自显影后发现了非特异性的条带或高背景值，则可在高严谨性下洗涤滤膜，并重新曝光。如果曝光所需时间使得该方法不切实际，则应平行测试几种杂交和/或洗涤严谨性。

附图简述

图1-7显示了由BOXSHADE提供的(1)ORF40、(2)ORF4、(3)225、(4)235、(5)287、(6)519、(7)919的序列比对。保守氨基酸有黑色背景。

图8显示了系统发生树。

图9A显示了在脑膜炎奈瑟球菌中ORF4、ORF40、225、235、287、519、919的氨基酸序列的变异性。这些序列被用于构建图9B中所示的系统发生树。

图10-19显示了由BOXSHADE提供的(10)ORF4、(11)ORF40、(12)ORF46、(13)225、(14)235、(15)287、(16)519、(17)726、(18)919、(19)953的序列比对。

图20显示了ORF4、225、235、519、和919的Western印迹结果。

实施例

实施例1

WO99/36544的实施例1公开了称为“ORF40”的奈瑟球菌蛋白的克隆和表达。公开了来自A和B血清型脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质和DNA序列，完整的蛋白质序列在601个氨基酸的重迭区上有83.7％相同。

对于由脑膜炎奈瑟球菌的21个菌株构成的参照群，对ORF40进行了测序。

这21个序列的比对示于图1。保守氨基酸的区段是明显的。例如前17个氨基酸是保守的(MNKIYRIIWNSALNAWV)，尽管在11位残基处的丝氨酸并不存在于100％奈瑟球菌中。这之后是不保守的氨基酸，随后又是16个保守氨基酸(BSELTRNHTKRASATV)。此蛋白质的C端由116个保守氨基酸构成。

本实施例中鉴别出的保守区域证实，全长ORF40蛋白的片段适合作为多特异性的疫苗或诊断剂。

再次对总共31个菌株的ORF40进行了测序，并对序列进行比对。结果示于图11。

特别感兴趣的保守区域是：

- MNKIYRIIWNSALNAWV

- VSELTRNHTKRASATV

- TAVLATLL

- TLKAGDNLKIKQ

- FTYSLKKDLTDLTSV

- TEKLSFGANG

- KVNITSDTKGLNFAKETAGTNGD

- TVHLNGIGSTLTDTL

- RAAS(V/I)KDVLNAGWNIKGVK

- NVDFVRTYDTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKKTEVKIGAKTSVIKEKDGKLVTGK

- KGENGSSTDEGEGLVTAKEVIDAVNKAGWRMKTTTANGQTGQADKFETVTSGT

- GTTATVSKDDQGNITV

- YDVNVGDALNVNQLQNSGWNLDSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSM

- PQFSSVSLGAGADAPTLSVD

- NKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNLNNRIDNVDGNARAGIAQAIATAGLVQAYLPGKSMMAI

GGGTYRGEAGYAIGYSSISDGGNWIIKGTASGNSRGHFGASASVGYQW.

实施例2

WO99/24578的实施例26公开了称为“ORF4”的奈瑟球菌蛋白的克隆和表达。公开了来自A和B血清型脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质和DNA序列，以及脑膜炎奈瑟球菌的序列。氨基酸水平上序列间的相同性如下：

对于由脑膜炎奈瑟球菌的32个菌株构成的参照群，对ORF4进行了测序。

用PILEUP产生的序列比对示于图2。保守氨基酸的区段是明显的。例如前34个氨基酸是保守的，尽管在26位残基处的丝氨酸并不存在于100％奈瑟球菌中。此蛋白质的C端由228个保守氨基酸构成。

本实施例中鉴别出的保守区域证实，全长ORF4蛋白的片段适合作为多特异性的疫苗或诊断剂。

再次对总共35个菌株的ORF4进行了测序，并对序列进行比对。结果示于图10。

特别感兴趣的保守区域是：

- MKTFFKTLSAAALALILAACGGQKDSAPAASASAAADNGA

- KKEIVFGTTVGDFGDMVKE

- ELEKKGYTVKLVEFTDYVRPNLALAEGELDINVFQHKPYLDDFKKEHNLDITEVFQVPTAPLGLYPGK

LKSLEEVKDGSTVSAPNDPSNFARVLVMLDELGWIKLKDGINPLTASKADIAENLKNIKIVELEAAQL

PRSRADVDFAVVNGNYAISSGMKLTEALFQEPSFAYVNWSAVKTADKDSQWLKDVTEAYNSDAFKAYA

HKRFEGYKS PAAWNEGAAK

实施例3

WO99/57280的实施例16公开了称为“225”的奈瑟球菌蛋白的克隆和表达。公开了来自A和B血清型脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质和DNA序列，以及来自淋病奈瑟球菌的序列。

对于由脑膜炎奈瑟球菌的34个菌株构成的参照群，对225进行了测序。

用PILEUP产生的序列比对示于图3。保守氨基酸的区段是明显的。例如前74个氨基酸是保守的，尽管在51位残基处的异亮氨酸并不存在于100％奈瑟球菌中。此蛋白质的C端由148个保守氨基酸构成。类似的比对示于图13。

本实施例中鉴别出的保守区域证实，全长225蛋白的片段适合作为多特异性的疫苗或诊断剂。

实施例4

WO99/57280的实施例16公开了称为“235”的奈瑟球菌蛋白的克隆和表达。公开了来自A和B血清型脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质和DNA序列，以及来自淋病奈瑟球菌的序列。

对于由脑膜炎奈瑟球菌的31个菌株构成的参照群，对235进行了测序。

用PILEUP产生的序列比对示于图4。保守氨基酸的区段是明显的。蛋白质整体上是保守的，尽管在168位残基处的丝氨酸显示有某些变化。

本实施例中鉴别出的保守区域证实，全长235蛋白的片段适合作为多特异性的疫苗或诊断剂。

再次对总共35个菌株的235进行了测序，并对序列进行比对。结果示于图14。

实施例5

WO99/57280的实施例16公开了称为“287”的奈瑟球菌蛋白的克隆和表达。公开了来自A和B血清型脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质和DNA序列，以及来自淋病奈瑟球菌的序列。

对于由脑膜炎奈瑟球菌的6个菌株构成的参照群，对287进行了测序。

用PILEUP产生的序列比对示于图5。保守氨基酸的区段是明显的。例如前42个氨基酸是保守的，并且在蛋白质的C端可从看见一个长的保守区域。

本实施例中鉴别出的保守区域证实，全长287蛋白的片段适合作为多特异性的疫苗或诊断剂。

再次对总共35个菌株(包括C11，一种C血清型脑膜炎奈瑟球菌菌株)的287进行了测序，并对序列进行比对。结果示于图15。

特别感兴趣的保守区域是：

- MFKRSVIAMACI

- ALSACGGGGGGSPDVKSADT

- SKPAAPVV

- QDMAAVS

- ENTGNGGAATTD

- QNDMPQ

- DGPSQNITLTHCK

- KSEFE

- RRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKL

- GGSYAL

- VQGEPAKGEMLAGTAVYNGEVLHFH

- GRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMG

- QKFKAAIDGNGFKGTWTENGGGDVSG(R/K)FYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKDRD

实施例6

WO99/57280的实施例16公开了称为“519”的奈瑟球菌蛋白的克隆和表达。公开了来自A和B血清型脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质和DNA序列，以及来自淋病奈瑟球菌的序列。

对于由脑膜炎奈瑟球菌的22个菌株构成的参照群，对519进行了测序。

用PILEUP产生的序列比对示于图6。保守氨基酸的区段是明显的，并且此蛋白质显示在其全长上是保守的。

本实施例中鉴别出的保守区域证实，全长519蛋白的片段适合作为多特异性的疫苗或诊断剂。

再次对总共33个菌株的519进行了测序，并对序列进行比对。结果示于图16。

特别感兴趣的保守区域是：

- MEFFIILL

- AVAVFGFKSFVVIPQQEVHVVERLGRFHRALTAGLNILIPFIDRVAYRHSLKEIPLDVPSQVCITRDN

TQLTVDGIIYFQVTDPKLASYGSSNYIMAITQLAQTTLRSVIGRMELDKTFEERDEINSTVV

- ALDEAAGAWGVKVLRYEIKDLVPPQEILRSMQAQITAEREKRARIAESEGRKIEQINLASGQREAEIQ

QSEGEAQAAVNASNAEKIARINRAKGEAESLRLVAEANAEANRQIAAALQTQSGADAVNLKIAGQYVT

AFKNLAKEDNTRIKPAKVAEIGNPNFRRHEKFSPEAKTAK

实施例7

WO99/57280的实施例16公开了称为“919”的奈瑟球菌蛋白的克隆和表达。公开了来自A和B血清型脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质和DNA序列，以及来自淋病奈瑟球菌的序列。

对于由脑膜炎奈瑟球菌的35个菌株构成的参照群，对919进行了测序。

用PILEUP产生的序列比对示于图7。另一比对示于图18。保守氨基酸的区段是明显的。该蛋白质显示几乎全部保守。

本实施例中鉴别出的保守区域证实，全长919蛋白的片段适合作为多特异性的疫苗或诊断剂。

特别感兴趣的保守区域是：

- MKKYLFRAAL

- GIAAAILAACQSKSIQTFPQPDTSVINGPDRPVGIPDPAGTTV(G/A)GGGAVYTWPHLSLPHWAAQ

DFAKSLQSFRLGCANLKNRQGWQDVCAQAFQTPVHSFQAKQFFERYFTPWQVAGNGSLAGTVTGYYEP

VLKGDDRRTAQARFPIYGIPDDFISVPLPAGLRSGKALVRIRQTGKNSGTIDN

- GGTHTADLS

- FPITARTTAIKGRFEGSRFLPYHTRNQINGGALDGKAPILGYAEDPVELFFMHIQGSGRLKTPSGKYI

RIGYADKNEHPYVSIG(R/K)YMADKGYLKLGQTSMQGIK

- YMRQNPQRLAEVLGQNPSYIFFREL

- NDGPVGALGTPLMGEYAGAVDRHYITLGAPLFVATAHPVTRKALNRLIMAQDTGSAIKGAVRVDYFWG

YGDEAGELAGKQKTTGYVWQLLPNGMKPEYRP

实施例8

WO99/23578的实施例55公开了称为“ORF46”的奈瑟球菌蛋白的克隆和表达。公开了来自A和B血清型脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质和DNA序列，以及来自淋病奈瑟球菌的序列。

对于由B血清型脑膜炎奈瑟球菌的6个菌株构成的参照群，对全长ORF46进行了测序。这些序列的比对示于图12，从中可明显看出保守氨基酸的区段。

特别感兴趣的保守区域是：

- RKISLILSILAVCLPMHAHASDLANDSFIRQVLDRQHFEPDGKYHLFGSRGELAERSGHIGLG

- IQSHQLGNLMIQQAAIKGNIGYIVRFSDHGHEVHSPFDNHASHSDSDEAGSPVDGFSLYRIHWDGYEH

HPADGYDGPQGGGYPAPKGARDIYSYDIKGVAQNIRLNLTDNRSTGQRLADRFHNAG

- MLTQGVGDGFKRATRYSPELDRSGNAAEAFNGTADIVKNIIGAAGEIVGAGDAVQGISEGSNIAVMHG

LGLLSTENKMARINDLADMAQLKDYAAAAIRDWAVQNPNAAQGIEAVSNIF

- IPIKGIGAVRGKYGLGGITAHP(V/I)KRSQMGEIALPKGKSAVS

- NFADAAYAKYPSPYHSRNIRSNLEQRYGKENITSSTVPPSNGKNVKLANKRHPKTKVPFDGKGFPNFE

KDVKY

ORF46的保守区域证实，该蛋白的片段适合作为多特异性的疫苗或诊断剂。

实施例9

WO99/57280公开了称为“726”的奈瑟球菌蛋白的克隆和表达。公开了来自A和B血清型脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质和DNA序列。

对于由A、B和C血清型脑膜炎奈瑟球菌的7个菌株构成的参照群，对726进行了测序。这些序列的比对示于图17，从中可明显看出保守氨基酸的区段。

特别感兴趣的保守区域是：

- IYFKNGFYDDTLG

- IPEGAVAVRAEEYAALLAGQAQGGQIAADSDGRPVLTPPRPS(D/E)YHEWDGKKW

- AAAAARFAEQKTATAFRLA

- KADELKNSLLAGYPQVEIDSFYRQEKEALARQADNNAPTPMLAQIAAARGVELDVLIEKV(I/V)EKS

ARLAVAAGAIIGKRQQLEDKLN

- IETAPGLDALEKEIEEWT

726的保守区域证实，该蛋白的片段适合作为多特异性的疫苗或诊断剂。

实施例10

WO99/57280公开了称为“953”的奈瑟球菌蛋白的克隆和表达。公开了来自A和B血清型脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质和DNA序列，以及来自淋病奈瑟球菌的序列。

对于由A、B和C血清型脑膜炎奈瑟球菌的8个菌株构成的参照群，对953进行了测序。这些序列的比对示于图19，从中可明显看出保守氨基酸的区段。该蛋白质是高度保守的。

特别感兴趣的保守区域是：

- MKKIIFAALAAAAVGTASAATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDIT

IP(I/V)ANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLK

AEKFNCYQSPM

- ATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIP(I/V)ANLQSGSQHFTD

HLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPM

- KTEVCGGDFSTTIDRTKWG(M/V)DYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ

953的保守区域证实，该蛋白的片段适合作为多特异性的疫苗或诊断剂。

系统发生树

图8是显示107种脑膜炎奈瑟球菌菌株的遗传关系的树状分枝图，它基于对6个基因片段的MLST分析结果[改编自Maiden等人(1998)PNAS USA 95：3140]。该树状分枝图可用于选择代表性的B血清型脑膜炎球菌菌株(箭头)。5种额外的菌株(对于这5种菌株，Wang等人[J.Infect.Dis(1993)167：1320]、Seiler等人[Mol.Microbiol.(1996)19：841]和Virji等人[Mol.Microbiol.(1992)6：1271]已独立地确定了它们在遗传上归为超毒谱系)，被叠加在树状分枝图上并用星号标出。除了22种MenB菌株之外，还使用2种MenA菌株，2种MenC菌株，MenY、X、Z和W135中各一种菌株。这些菌株用名称前的粗体字母表示。当没有系统发生数据时，菌株就列于系统发生树之外。标出了超毒株ET-5、ET-37和IV-1。

序列变异性

图9a是脑膜炎奈瑟球菌中蛋白质225、235、287、519、919、ORF4和ORF40的氨基酸序列变异性的示意图。水平轴表示MC58的序列。MenB菌株中的氨基酸差异用水平轴上方的垂直线表示。在A、C、Y、X、Z和W135血清型之中的差异用轴下方的线表示。垂直线的高度表示具有氨基酸差异的菌株数目。这样，峰表示可变区域。在225和287下方的短横线表示在某些菌株中缺失的序列区段。

图9b是用相同的7种蛋白获得的脑膜炎奈瑟球菌菌株的树状分枝图。根据这些基因的系统发生分析提供了与图8相符的、包括了超毒株的树状分枝图。线条标出的菌株包括了与MLST分析相符的、得到100％引导支持(bootstrap support)的菌株。在每个节点下方的数目是引导数值(仅报道大于80％的数值)。不同菌株的基因序列用GCG软件包中的PILEUP程序比对。用邻接算法[Saitou&Nei(1987)Mol.Biol.Evol.4：406]，使用PHYLIP软件包中的NEIGHBOR程序，进行系统发生分析。用Kimura-双参数[Kimura(1980)，J.Mol.Evol.16：111]，计算31种脑膜炎奈瑟球菌菌株的两两距离。在分析中排出了ORF40的N端区域、全长27和225的串联重复区域。允许总共1000个引导复制(replicate)来评估支持水平。超毒株的聚集成束得到了最大简约性分析的证实。

Western印迹

通过Western印迹分析各种不同菌株的ORF4、225、235、519和919抗原。结果示于图20。对于225，印迹显示不同菌株有不同大小的片段，其中箭头指出了正确大小的条带。225蛋白含有缺失区域和所界定的重复插入片段，印迹上的片段大小与基因变异性数据相符。

用于图20的菌株如下：

B血清型脑膜炎奈瑟球菌：

1＝NG6/88 2＝BZ198 3＝NG3/88 4＝297-0 5＝1000

6＝BZ147 7＝BZ169 8＝528 9＝NGP165 10＝BZ133

11＝NGE31 12＝NGF26 13＝NGE28 14＝NGH38 15＝SWZ107

16＝NGH15 17＝NGH36 18＝BZ232 19＝BZ83 20＝44/76

21＝MC58 96＝2996

A血清型脑膜炎奈瑟球菌：

22＝205900 23＝F6124

C血清型脑膜炎奈瑟球菌：

24＝90/18311 25＝93/4286

其他脑膜炎奈瑟球菌

26＝A22(W血清型)

27＝E26(X血清型)

28＝860800(Y血清型)

29＝E32(Z血清型)

其他奈瑟球菌

30＝灰色奈瑟菌

L17＝乳糖奈瑟菌

L19＝乳糖奈瑟菌

31＝淋病奈瑟球菌F62

32＝淋病奈瑟球菌SN4

应理解，本发明是仅通过实施例方式进行描述的，而且可以在本发明的精神和范围内进行改动。

Claims

1.一种蛋白质，其特征在于，它是 ‘ORF40’的片段，其中，(a)所述片段由7个或更多个连续的保守氨基酸组成，所述的这些保守氨基酸存在于至少50％的奈瑟球菌参照群的ORF40中，(b)所述‘ORF40’具有脑膜炎奈瑟球菌B血清型的MC58株的氨基酸序列

MNKIYRIIWNSALNAWVVVSELTRNHTKRASATVKTAVLATLLFATVQASANNEEQEEDLYLDPVQRTVAVLIVNS

DKEGTGEKEKVEENSDWAVYFNEKGVLTAREITLKAGDNLKIKQNGTNFTYSLKKDLTDLTSVGTEKLSFSANGNK

VNITSDTKGLNFAKETAGTNGDTTVHLNGIGSTLTDTLLNTGATTNVTNDNVTDDEKKRAASVKDVLNAGWNIKGV

KPGTTASDNVDFVRTYDTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKKTEVKIGAKTSVIKEKDGKLVTGKDKGENGSSTDEG

EGLVTAKEVIDAVNKAGWRMKTTTANGQTGQADKFETVTSGTNVTFASGKGTTATVSKDDQGNITVMYDVNVGDAL

NVNQLQNSGWNLDSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSMTPQFSSVSLGAGA

DAPTLSVDGDALNVGSKKDNKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNLNNRIDNVDGNARAGIAQAIATAGLVQ

AYLPGKSMMAIGGGTYRGEAGYAIGYSSISDGGNWIIKGTASGNSRGHFGASASVGYQW，

和(c)所述蛋白质不具有所述MC58株的ORF40的氨基酸序列，所述参照群包含以下菌株：BZ198、NG3/88、297-0、BZ147、BZ169、528、BZ133、NGE31、NGH38、NGH15、BZ232、BZ83、44/76、MC58、205900、F6124、Z2491、90/18311、93/4286、860800和E32。

2.一种蛋白质，其特征在于，它是7个或更多个连续的保守氨基酸片段，其中，所述片段出现在图1和图11所示的至少两条氨基酸序列中。

3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述片段出现在图1所示的至少十条氨基酸序列中。

4.如权利要求3所述的蛋白质，其特征在于，所述片段出现在图1所示的所有氨基酸序列中。

5.如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述片段出现在图11所示的至少十条氨基酸序列中。

6.如权利要求5所述的蛋白质，其特征在于，所述片段出现在图11所示的所有氨基酸序列中。

7.如前述任一项权利要求所述的蛋白质，其特征在于，所述片段由20个或更多个连续的保守氨基酸组成。

8.一种蛋白质，其特征在于，它由一条或多条以下氨基酸序列组成：

MNKIYRIIWNSALNAWV；

VSELTRNHTKRASATV；

TAVLATLL；

TLKAGDNLKIKQ；

FTYSLKKDLTDLTSV；

TEKLSFGANG；

KVNITSDTKGLNFAKETAGTNGD；

TVHLNGIGSTLTDTL；

RAASVKDVLNAGWNIKGVK；

RAASIKDVLNAGWNIKGVK；

NVDFVRTYDTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKKTEVKIGAKTSVIKEKDGKLVTGK；

KGENGSSTDEGEGLVTAKEVIDAVNKAGWRMKTTTANGQTGQADKFETVTSGT；

GTTATVSKDDQGNITV；

YDVNVGDALNVNQLQNSGWNLDSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSM；

PQFSSVSLGAGADAPTLSVD；

NKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNLNNRIDNVDGNARAGIAQAIATAGLVQAYLPGKSMMAIGGGTYR

GEAGYAIGYSSISDGGNWIIKGTASGNSRGHFGASASVGYQW，

条件是，所述蛋白质不含以下氨基酸序列：

MNKIYRIIWNSALNAWVVVSELTRNHTKRASATVKTAVLATLLFATVQASANNEEQEEDLYLDPVQRTVAVLIV

NSDKEGTGEKEKVEENSDWAVYFNEKGVLTAREITLKAGDNLKIKQNGTNFTYSLKKDLTDLTSVGTEKLSFSA

NGNKVNITSDTKGLNFAKETAGTNGDTTVHLNGIGSTLTDTLLNTGATTNVTNDNVTDDEKKRAASVKDVLNAG

WNIKGVKPGTTASDNVDFVRTYDTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKKTEVKIGAKTSVIKEKDGKLVTGKDKGE

NGSSTDEGEGLVTAKEVIDAVNKAGWRMKTTTANGQTGQADKFETVTSGTNVTFASGKGTTATVSKDDQGNITV

MYDVNVGDALNVNQLQNSGWNLDSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSMT

PQFSSVSLGAGADAPTLSVDGDALNVGSKKDNKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNLNNRIDNVDGNAR

AGIAQAIATAGLVQAYLPGKSMMAIGGGTYRGEAGYAIGYSSISDGGNWIIKGTASGNSRGHFGASASVGYQW。

9.一种核酸，其特征在于，它编码前述任一项权利要求所述的蛋白质。

10.权利要求1-8中任一项所述的蛋白质的用途，其特征在于，用于制备用于治疗或预防奈瑟球菌引起的感染的药剂。

11.权利要求9所述的核酸的用途，其特征在于，用于制备用于治疗或预防奈瑟球菌引起的感染的药剂。

12.权利要求1-8中任一项所述的蛋白质的用途，其特征在于，用于制备多特异性诊断剂。

13.权利要求9所述的核酸的用途，其特征在于，用于制备多特异性诊断剂。