KR100356615B1 - 결함아데노바이러스벡터및유전자치료에서그의사용 - Google Patents

결함아데노바이러스벡터및유전자치료에서그의사용 Download PDF

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Abstract

신규한 아데노비루스-유래 비루스 벡터, 그의 제법 및 유전자 치료에서 그의 사용이 기재된다.

Description

결함 아데노바이러스 벡터 및 유전자 치료에서 그의 사용
본 발명은 신규한 바이러스 벡터, 그의 제법 및 유전자 치료에 있어서의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 바이러스 벡터를 함유하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유전자 치료에 유용한 벡터로서 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다.
유전자 치료(gene therapy)는 세포 또는 환부 기관내로 유전정보를 도입함으로써 결함 또는 이상(돌연변이, 이상발현 등)을 교정하는 것이다. 이 유전정보는 생체외에서 또는 상기 기관으로부터 추출된 세포에 도입될 수 있는데, 그 변형된 세포는 체내로 재도입하거나, 직접 생체내에서 적절한 조직내로 도입할 수 있다. 상기 두 번째 경우에는, DNA 및 DEAE-덱스트란(Pagano et al., J. Virol. 1(1967), 891)의 복합체, DNA 및 핵 단백질의 복합체(Kaneda et. al., Science 243(1989), 375), DNA 및 지질의 복합체(Felgner et al., PNAS 84(1987), 7413), 리포솜의 사용(Fraley et al., J. Biol. Chem. 255(1980), 10431) 등이 연루된 다양한 트랜스팩션(transfection) 기술들 가운데 다양한 기술이 존재한다. 보다 최근에는, 상기한 물리적인 트랜스팩션 기술에 대한 장래성 있는 대안으로서 유전자 전달(transfer) 벡터로 바이러스를 이용하는 방법이 대두되었다. 이와 관련하여, 다양한 바이러스의 특정 세포 집단 감염 능력을 시험했다. 특히, 레트로바이러스(RSV, HMS, MMS 등), HSV 바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 아데노바이러스.
이들 바이러스 가운데, 아데노바이러스는 유전자 치료에 이용하기에 유리한 몇 가지 성질을 나타낸다. 특히, 상기 바이러스는 매우 넓은 숙주 범위를 가지며, 무활동 세포를 감염시킬 수 있고, 감염된 세포의 게놈내로 합체되지 않으며, 현재까지 사람의 주요 병변들과 관련이 없었다.
아데노바이러스는 약 36kb 크기의 선형 이중 가닥 DNA를 갖는 바이러스이다. 그의 게놈에는 특히 말단부 역전 반복 서열(inverted repeat sequence, ITR), 캡슐화 서열, 초기(early) 유전자 및 후기(late) 유전자가 포함되어 있다(제 1 도 참조). 주요 초기 유전자는 E1(E1a 및 E1b), E2, E3 및 E4 유전자이다. 주요 후기 유전자는 L1 내지 L5 유전자이다.
상기 언급된 아데노바이러스의 성질이 제공되므로, 후자는 생체내 유전자 전달을 위해 이미 사용되고 있다. 이러한 목적으로, 아데노바이러스 유래의 다양한 벡터들이 제조되었는데, 다양한 유전자(β-gal, OTC, α -1AT, 사이토카안 등)를 혼입하여 제조되었다. 이들 컨스트럭트 각각에서, 아데노바이러스는 감염된 세포내에서 복제가 불가능하도록 변형시켰다. 따라서, 선행 기술에 따른 컨스트럭트들은 이종 DNA 서열이 삽입된 수준에서 E1(E1a 및/또는 E1b) 및 임의로 E3 영역이 결실된 아데노바이러스이다[Levrero et al., Gene 101(1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50(1986) 161]. 그러나, 선행 기술에 따른 벡터는 유전자 치료에서의 이용이 제한되도록 하는 많은 단점을 가지고 있다. 특히, 모든 이들 벡터들은 생체내에서 발현되는 것이 바람직하지 않은 다량의 바이러스 유전자를 유전자 치료의 구조물내에 함유하고 있다. 더욱이, 이들 벡터는 특정 용도에 따라서 필요로 될 수 있는 매우 큰 DNA 단편의 혼입을 허용하지 않는다.
본 발명은 이러한 단점을 해결할 수 있다. 본 발명은 실제로 바이러스 단백질의 생산, 바이러스의 전이, 병원성 등의 임의의 위험을 제한하면서, 생체 내에 DNA(30 kb 까지)를 효율적으로 전달할 수 있고, 생체 내에서 이 DNA을 높은 수준 및 안정한 방식으로 발현할 수 있는 유전자 치료용 재조합 아데노바이러스를 서술한다. 특히, 캡슐화된 바이러스 입자의 형성을 억제하지 아니하면서 아데노바이러스 유전자의 크기를 상당히 감소시킬 수 있음이 확인되었다. 이는 다른 바이러스, 예컨대, 레트로바이러스의 경우 특정 서열이 바이러스 입자의 효과적인 캡슐화가 필요로 되는 게놈을 따라 분포된다고 관찰되었음에 비추어 놀랍다. 이 때문에 실질적인 내부 결실을 갖는 벡터의 생산은 매우 제한되었다. 또한 본 발명은 대부분의 바이러스 유전자의 억제(suppression)가 이러한 바이러스 입자의 형성을 막지 않음을 보인다. 더욱이, 이렇게 얻어진 재조합 아데노바이러스는 게놈 구조의 실질적인 변형에도 불구하고 높은 감염성, 생체내 안정성 등의 유리한 성질을 유지한다.
본 발명의 벡터는 매우 큰 크기의 DNA 서열의 혼입을 허용하므로 특히 유리하다. 따라서, 30kb 길이 이상의 유전자를 삽입하는 것이 가능하다. 이는 치료에 몇몇 유전자의 공동-발현 또는 매우 큰 유전자의 발현을 필요로 하는 몇몇 병리학에 있어 특히 이롭다. 따라서, 예컨대 근육 영양장애의 경우에, 이러한 병변의 원인이 되는 천연 유전자(디스토핀 유전자)에 상응하는 cDNA를 수송하는 것은 그 큰 크기(14 kb) 때문에 지금까지 가능하지 않았다.
또한 본 발명의 벡터는 바이러스 기능 영역이 거의 없으므로 면역원성, 병원성, 전이, 적용, 재조합 등과 같은 유전자 치료에서 벡터로 바이러스를 사용함에 있어서의 고유한 위험이 실질적으로 감소되거나 보다더 억제된다.
따라서, 본 발명은 원하는 DNA 서열의 생체내 전달 및 발현에 특히 적합한 바이러스 벡터를 제공한다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 목적은 하기로 구성되는 결함 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다:
- ITR서열,
- 캡슐화를 허용하는 서열
- 이종 DNA 서열,
이 때:
- E1 유전자는 비-기능성이고
- E2, E4 및 L1-L5 유전자 중 적어도 하나가 비-기능성이다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "결함 아데노바이러스"란 표적세포에서 자발적으로 복제할 수 없는 아데노바이러스를 칭한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 결함 아데노바이러스의 게놈은 적어도 감염된 세포내에서 상기 바이러스가 복제되기 위해 필요로 되는 서열이 전혀 없다. 이들 영역은 (완전히 또는 부분적으로) 제거되거나 비-기능성으로 되거나, 다른 서열 및 특히 이종 DNA 서열로 치환될 수 있다.
역전반복서열(ITR)은 아데노바이러스의 복제 기원(replication origin)을 구성한다. 이는 바이러스 게놈의 3' 및 5' 말단에 위치하며(제 1 도 참조), 당업자에게 공지된 통상적인 분자 생물학 기술에 따라 상기 위치로부터 용이하게 단리될 수 있다. 인간 아데노바이러스의 ITR 서열의 뉴클레오티드 서열(특히 Ad2 및 Ad5 혈청형) 뿐만 아니라 개 아데노바이러스(특히 CAV1 및 CAV2)의 뉴클레오티드 서열이 문헌에 서술되어 있다. 예컨대, Ad5 아데노바이러스에 관해서는 좌측 ITR 서열은 게놈의 뉴클레오티드 1 내지 103을 포함하는 영역에 해당한다.
캡슐화 서열(또한 Psi 서열로 칭함)은 바이러스 DNA의 캡슐화에 필수적이다. 따라서, 이 영역은 본 발명에 따른 결함 재조합 아데노바이러스의 제조를 위해서는 반드시 존재해야 한다. 캡슐화 서열은 아데노바이러스 게놈의 좌측 (5') ITTR 및 E1 유전자 사이에 위치한다(제 1 도 참조). 이는 또한 통상적인 분자 생물학 기술에 의해 인위적으로 단리되거나 합성될 수 있다. 인간 아데노바이러스의 캡슐화 서열의 뉴클레오티드 서열(특히 Ad2 및 Ad5 혈청형) 뿐만 아니라 개 아데노바이러스의 캡슐화 서열의 뉴클레오티드 서열(특히 CAV1 및 CAV2)이 문헌에 서술되어 있다. 예컨대 Ad5 아데노바이러스에 있어서 캡슐화 설열은 게놈의 뉴클레오티드 194 내지 358를 포함하는 영역에 해당한다.
구조와 성질이 다소 다른 다양한 아데노바이러스 혈청형이 존재한다. 그럼에도 불구하고 이들 바이러스들은 필적하는 유전적 구성을 나타내며, 본 명세서에 서술된 정보는 어떤 유형의 아데노바이러스에 대해서든 당업자에 의해 용이하게 재 생산될 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스는 인간, 동물 또는 혼합된 (인간 및 동물) 기원일 수 있다.
인간 기원의 아데노바이러스에 대해서는 C군으로 분류된 것들의 사용이 바람직하다. 보다 바람직하게 다양한 인간 아데노바이러스 혈청형 중 유형 2 또는 유형 5 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad5)를 사용함이 본 발명의 작업에 바람직하다.
상기 지적된 바와 같이, 본 발명의 아데노바이러스는 또한 동물 기원일 수 있거나 동물 기원의 아데노바이러스로부터 유래된 서열을 함유할 수 있다. 본 출원인은 사실상 동물 기원 아데노바이러스가 높은 효율로 사람 세포를 감염시킬 수 있고 시험되는 인간 세포내에서 증식할 수 없음을 입증했다(출원 FR 93 05954 참조). 또한 출원인은 동물 기원 아데노바이러스가 인간 기원의 아데노바이러스에 의해 전혀 상호보완되지 않아 감염성 입자의 형성을 야기할 수 있는 인간 아데노바이러스의 존재 하에 생체 내에서 임의의 재조합 및 증식하는 위험이 없어짐을 확인했다. 따라서, 아데노바이러스 또는 동물 기원의 아데노바이러스 영역을 사용하면 유전자 치료에서 벡터로 바이러스를 사용함에 따르는 고유한 위험이 매우 적어지기 때문에 특히 유리하다.
본 발명의 수행에 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스는 개, 소, 쥐, (예컨대, Mavl, Beare et al., virology 75(1990) 81), 양, 돼지 또는 조류 또는 대안적으로 원숭이 기원(예컨대: SAV)일 수 있다. 보다 특히, 조류 아데노바이러스 중에서는 예컨대 펠프스 균주(Phelps)(ATCC VR-432), 폰데스 균주(Fontes)(ATCC VR-280), P7-A 균주(ATCC, VR-827), IBH-2A 균주(ATCC VR-828), J2-A 균주(ATCC VR-829), T8-A 균주(ATCC VR-830), K-11 균주(ATCC VR-921) 또는 대안적으로 ATCC VR-831 내지 835 균주와 같은 ATCC에서 입수가능한 혈청형 1 내지10을 언급할 수 있다. 소 아데노바이러스 중에서는 다양한 공지 혈청형을 사용할 수 있고 특히 ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 및 769 하에 ATCC에서 입수가능한 것들(유형 1 내지 8)을 사용할 수 있다. 또한 쥐 아데노바이러스 FL(ATCC VR-550) 및 E20308(ATCC WR-528), 유형 5(ATCC VR-1343), 또는 유형 6(ATCC VR-1340) 양 아데노바이러스; 돼지 아데노바이러스 5359, 또는 원숭이 아데노바이러스 특히 예를 들면 번호 VR-591-594, 941-943, 195-203 등 하에 ATCC에서 참조되는 아데노바이러스를 언급할 수 있다.
바람직하게는, 다양한 동물 기원 아데노바이러스 중 개 기원의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 영역, 및 특히 모든 CAV2 아데노바이러스 균주[예컨대 맨하탄 또는 A26/61 균주(ATCC VR-800)]를 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 개 아데노바이러스는 많은 구조적 연구 대상이었다. 따라서, CAV1 및 CAV2의 완전한 제한지도가 선행기술에 서술되었고(Spibey et al., J. Gen. Virol, 70(1989) 165) ITR 서열 뿐만 아니라 E1a 및 E3 유전자가 클로닝되고 서열화되었다(특히 Splbey et al., Virus Res. 14(1989) 241; Linne, Virus Res. 23(1992) 119, WO 91/11525참조) .
상기 지적된 바와 같이, 본 발명의 아데노바이러스는 이종 DNA 서열을 함유한다. 이종 DNA 서열을 표적세포 내에 전달 및/또는 발현되도록 재조합 바이러스 내로 도입된 임의의 DNA서열을 칭한다.
특히, 이종 DNA 서열은 하나 이상의 치료 유전자 및/또는 하나 이상의 항원 펩티드를 코딩하는 유전자를 함유할 수 있다.
따라서, 전달될 수 있는 치료 유전자는 표적세포 내에서 전사 및 임의적으로 번역되어 치료 효과를 갖는 산물을 생성할 수 있는 임의의 유전자이다.
이는 특히 치료 효과를 갖는 단백질성 산물을 코딩하는 유전자일 수 있다. 따라서, 코딩된 단백질성 산물은 단백질, 펩티드, 아미노산 등일 수 있다. 이 단백질성 산물은 표적세포에 대해 동종일 수 있다(즉, 어떠한 병변도 나타내지 않는다면 표적세포 내에서 정상적으로 발현되는 산물). 이 경우에, 단백질의 발현은 예컨대 세포에서의 불충분한 발현 또는 변형된 결과 불활성이거나 활성이 약한 단백질의 발현을 완화시키거나, 대안적으로 상기 단백질을 과도하게 발현시키는 것을 가능하게 한다. 또한 치료 유전자는 안전성이 증가되거나, 활성이 변형되는 등의 세포성 단백질의 변이체를 코딩하고 있을 수 있다. 단백질성 산물은 또한 표적세포에 대해 이종일 수 있다. 이 경우에, 발현된 단백질은 예컨대 병변에 대항하여 싸울 수 있도록 세포내 결함 있는 활성을 제공하거나 보완할 수 있다.
본 발명의 목적을 위한 치료 산물 중에, 특히 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인: 인터루킨, 인터페론, TNF 등(FR 2903120), 성장 인자, 신경전달체 또는 그의 전구체 또는 합성 효소, 자극 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 등; 아포리포단백질: ApoAI, ApoAIV, FpoE 등(FR 93 05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 9111947), 종양 억압 유전자: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev 등(FR 93 04745), 응고에 수반되는 유전자 코딩 인자: 인자 VII, VIII, IX 등을 언급할 수 있다.
또한 치료 유전자는 표적세포 내에서 발현되어 유전자들의 발현이나 세포mRNA의 해독을 제어할 수 있는 안티센스 유전자 또는 서열일 수 있다. 이러한 서열은 예컨대 표적세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사될 수 있으며, 따라서 특허 EP 140 308 에 서술된 기술에 따라 단백질로의 번역이 차단할 수 있다.
상기 지적된 바와 같이, 이종 DNA서열은 인간에서 면역 반응을 발생시킬 수 있는 항원 펩티드를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 이러한 특정 실시양태에서, 본 발명은 특히 미생물 또는 바이러스에 대항하여 인간을 면역화할 수 있게 하는 백신의 생산을 가능하게 한다. 이들은 특히 엡스타인 바르 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스(EP 185 573), 슈도-라비스 바이러스에 대해 특이성을 갖거나 대안적으로 종양(EP 259 212)에 대해 특이성을 갖는 항원 펩티드일 수 있다.
일반적으로, 이종 DNA서열은 또한 치료 유전자 및/또는 감염된 세포내 항원 펩티드를 코딩하는 유전자를 발현시키는 서열로 구성된다. 이들 서열이 감염된 세포 내에서 기능할 수 있을 때 고려된 유전자의 발현을 본래 책임지는 서열이 있을 수 있다. 또한 (다른 단백질, 또는 심지어 합성물의 발현을 책임지는) 상이한 기원의 서열일 수 있다. 예컨대, 이는 감염시키고자 하는 세포의 게놈으로부터 유래한 프로모터 서열일 수 있다. 마찬가지로, 이는 사용된 아데노바이러스를 포함하여 바이러스의 게놈으로부터 유래된 프로모터 서열일 수 있다. 이런 관점에서, 예컨대 E1A, MLP, CMV 및 RSV 유전자 등의 프로모터를 언급할 수 있다. 게다가, 이들 발현 서열은 활성화 서열, 조절 서열 등을 부가하여 변형시킬 수 있다. 더욱이, 삽입된 유전자가 발현 서열을 함유하지 않을 때에는, 그것은 결함 바이러스의 게놈 내로,상기 서열의 하류에 삽입될 수 있다.
더욱이, 이종 DNA 서열은 또한 합성된 치료 산물을 표적세포의 분비 경로로 인도하는 시그날 서열을, 특히 치료 유전자의 상류에, 포함할 수 있다. 이러한 시그날 서열은 치료 산물의 천연 시그날 서열일 수 있으나, 또한 그외 다른 기능적 시그날 서열 또는 인공 시그날 서열일 수 있다.
상기 지적된 바와 같이, 본 발명의 벡터는 비-기능성 E2, E4, 및 L1-L5 유전자 중 적어도 하나를 갖는다. 고려되는 바이러스 유전자는, 당업자에게 공지된 임의의 기술, 특히 억압, 치환 결실 또는 고려된 유전자 내 하나 이상의 염기의 첨가로 비-기능성으로 만들 수 있다. 상기 변형은 생체 외에서 (단리된 DNA 상에서) 또는 현장에서, 예컨대 유전자 조작 기술에 의해 또는 대안적으로 돌연변이 약제로 처리함에 의해 얻어질 수 있다.
돌연변이 약제 중, 예컨대 에너지 방사(X-선, g-선 및 자외선 등)와 같은 물리적인 방법 또는 DNA 염기의 다양한 기능성 군과 반응할 수 있는 화학약품 및, 예컨대 , 알킬화제[에틸 메탄설포네이트(EMS) , N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, N-니트로퀴놀린-1-옥사이드(NQO)], 비알킬화제, 삽입제 등을 언급할 수 있다.
결실에 의해, 본 발명의 목적을 위해 고려된 유전자의 억제가 이해될 것이다. 이는 특히 상기 유전자의 코딩 영역의 전부 또는 일부 및/또는 상기 유전자의 전사를 위한 프로모터 영역의 전부 또는 일부일 수 있다. 억제는 실시예에서 예시되는 바의 통상적인 분자 생물학 기술에 따라 적절한 제한 효소에 의한 소화와 이어지는 결찰에 의해 수행될 수 있다.
또한 유전자 변형은 예컨대 Rothstein[Meth, Enzymol. 101 (1983) 202]에 의해 초기에 서술된 절차에 따라 얻을 수 있다. 이 경우에, 코딩 서열의 전부 또는 일부를 동종 재조합에 의해 비-기능 서열 또는 변이 서열로 게놈서열이 치환될 수 있도록 교란시키는 것이 바람직하다.
상기 유전자 변형체(들)는 관련 유전자의 코딩 부분 또는 코딩 영역의 외부에, 그리고, 예를들면 상기 유전자의 발현 및/또는 전사 조절에 책임이 있는 영역에 위치할 수 있다. 그러므로 상기 유전자의 비-기능적 특성은 구조적 또는 형태적 변형에 기인한 불활성 단백질의 생산, 생산의 부재, 변형된 활성을 갖는 단백질의 생산, 또는 대안적으로 감쇠된 수준으로 또는 원하는 조절 모드에 따른 천연 단백질의 생산에 의해 입증될 수 있다.
더욱이, 점 돌연변이와 같은 몇몇의 변형은 본질적으로 세포기작에 의해 보정되거나 감쇠될 수 있다. 그리하여 상기 유전자의 변형은 산업 수준에서 제한된 관심사이다. 그러므로 비-기능적 특성이 분리적으로 완전히 안정하거나 및/또는 비가열성인 것이 특히 바람직하다.
바람직하게, 유전자는 부분적 또는 전체적 결실에 기인한 비-기능성이다.
바람직하게, 본 발명의 결함 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 후기 유전자가 없다.
본 발명의 특히 유리한 실시양태는:
- ITR 서열
- 캡슐화를 허용하는 서열
- 이종 DNA 서열, 및
- 유전자 또는 유전자 E2의 일부를 운반하는 영역을 포함하는 결함 재조합 아데노바이러스이다.
본 발명의 다른 특히 유리한 실시양태는
- ITR서열
- 캡슐화를 허용하는 서열
- 이종 DNA 서열, 및
- 유전자 또는 유전자 E4의 일부를 운반하는 영역을 포함하는 결함 재조합 아데노바이러스이다.
다른 특히 유리한 실시양태에서, 본 발명의 벡터는, 부가로, 이종 프로모터의 조절하에 기능성 유전자 E3을 포함한다. 보다 바람직하게, 벡터는 단백질 gp19K의 발현을 허용하는 E3 유전자 부분을 갖는다.
본 발명에 따른 결함 재조합 아데노바이러스는 다양한 방법으로 제조할 수 있다.
제 1 방법은 시험관내에서 제조된(결찰에 의해, 또는 플라스미드 형태로) 결함 재조합 바이러스로부터 얻는 DNA를 적당한 세포라인 내에 트랜스팩션 시키는 것으로, 다시말해 결함 바이러스의 보충을 위해 필요한 모든 기능성을 운반하는 것으로 구성된다. 상기 기능성은 바람직하게 세포의 게놈내로 통합되고, 재조합의 위험을 피할 수 있게 하며, 세포주의 안정성을 증가시킨다. 상기 세포주의 제조는 실시예에 서술된다.
제 2 방법은 시험관내에서 제조된 결함 재조합 바이러스(결찰에 의해 또는 플라스미드 형태로)로부터의 DNA 및 헬퍼 바이러스로부터의 DNA를 적합한 세포주내에 함께 트랜스팩션시키는 것으로 구성된다. 상기 방법에 따르면, 재조합 아데노바이러스의 모든 결핍된 기능을 보충할 수 있는 적당한 세포주가 요구되지 않는다. 이들 기능의 일부는 실제로 헬퍼 바이러스에 의해 보충된다. 상기 헬퍼 바이러스는 그 자체가 결함이 있어야 하고 세포주는 그를 보충하는 필요한 기능을 운반한다. 상기 방법에 따른 본 발명의 결함 재조합 아데노바이러스의 제조는 또한 실시예에서 예시된다.
상기 제 2 방법의 구성에서 사용될 수 있는 세포주 중, 특히 인간 배 신장 세포주 293, KB 세포, Hela, MDCK 및 GHK 세포 등이 언급될 수 있다(실시예 참조).
그리고 나서 증식된 벡터를 회수하여, 정제하고 종래의 분자 생물학 기술에 따라 증폭시킨다.
그러므로 본 발명은 또한, 그의 게놈내 통합되어, 상기 결함 재조합 아데노바이러스의 보충에 요구되는 기능들을 포함하는, 아데노바이러스에 의해 감염될 수 있는 세포주에 관한 것이다. 구체적으로, 상기는 그의 게놈 내 통합된, 영역 E1 및 E2(특별히 72K 단백질을 암호화하는 영역) 및/또는 E4 및/또는 글루코코르티코이드 수용체를 위한 유전자를 함유하는 세포주에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 세포주는 293 또는 gm DBP6 세포주로부터 얻어진다.
본 발명은 또한 상기한 하나 이상의 결함 재조합 아데노바이러스를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 제약학적 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하, 안구내 및 경피 투여 등을 위해 제재될 수 있다.
바람직하게, 제약학적 조성물은 주사 가능 배합물로서 제약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 이들은 특히 식염수(인산 모노나트륨 또는 인산 이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등, 또는 상기 염의 혼합물), 무균액 또는 등장액, 또는 경우에 따라 무균수 또는 생리적 식염수를 첨가하여 주사가능한 용액의 구성을 허용하는 건조된, 특별히 냉동건조된 조성물일 수 있다.
주사에 사용되는 바이러스의 양은 다양한 매개변수의 작용으로, 그리고 특히 사용된 투여 방식, 관련 병변, 발현될 유전자, 또는 대안적으로 원하는 치료기간의 작용으로 조절될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 104- 1014pfu/ml, 바람직하게는 106- 1010pfu/ml의 사용량 형태로 배합되고 투여된다. 용어 pfu("플라크 형성 단위")는 바이러스, 용액의 감염성을 나타내는 것으로서, 적합한 세포 배양물을 감염시키고, 일반적으로 5일 후, 감염된 세포의 플라크 수를 측정함에 의해 결정된다. 바이러스 용액의 pfu 적가 결정을 위한 기술은 참고 문헌에 잘 기록되어 있다.
삽입되는 이종 DNA 서열에 따라, 본 발명의 아데노바이러스는 유전자 질병(발육이상, 낭포성 섬유증 등), 신경조직 질병(알츠하이머, 파킨슨, ALS 등), 암, 혈액 응고 이상 및 이상지방단백혈증과 관련된 병변, 바이러스성 감염(간염, AIDS등)과 관련된 병변 등을 포함하는 다수의 병변의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 충분히 서술될 것이며 이는 예시일 뿐 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다.
제 1 도: Ad 5 아데노바이러스의 유전자 구조. Ad 5의 완전한 서열은 데이터베이스로서 입수가능하고 당업자가 임의의 제한 부위를 선택하거나 생성하여, 임의의 게놈 영역을 단리할 수 있게 한다.
제 2 도: CAV2 아데노바이러스 Manhattan 균주의 제한 지도(앞서 인용한 Spibey 일동에 따름)
제 3 도: 결찰에 의한 본 발명의 결함 바이러스 구성
제 4도: E4 유전자를 운반하는 재조합 바이러스의 구성
제 5 도: E2 유전자를 운반하는 재조합 바이러스의 구성
제 6 도: 플라스미드 pPY32의 구성 및 도시
제 7도: 플라스미드 pPY 55의 도시
제 8 도: 플라스미드 p2의 도시
제 9도: 플라스미드 pITRL5-E4의 구성에 사용되는 중간체 플라스미드의 도시
제 10 도: 플라스미드 pITRL5-E4의 도시
일반적인 분자 생물학 기술
플라스미드 DNA의 제조 추출, 염화세슘 구배내 플라스미드 DNA의 원심분리,아가로스 또는 아크릴아미드 겔 상 전기영동, 전기용출에 의한 DNA 단편 정제, 페놀 또는 페놀-클로로포름을 사용한 단백질 추출, 에탄올 또는 이소프로판올을 사용한 식염수 매질내 DNA 침전, 대장균 내 형질전환과 같은 분자 생물학에서 사용되는 종래의 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고 참고 문헌에 폭넓게 서술되어 있다[Maniatis T. 일동 "분자 클로닝, 실험 계획안 (Molecular Cloning, a Laboratory Manual)", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M. 일동(편집), "분자 생물학의 최근 프로토콜 (Current Protocols in Molecular Biology)", John Wiley & Sons, New York, 1987].
pBR 322 및 pUC 유형 플라스미드 및 M13 시리즈 파아지는 시판용 공급원이다(Bethesda Research Laboratories).
결찰을 위해, DNA 단편을 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 크기에 따라 분리하고, 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물로 추출하고, 에탄올로 침전시키고 나서 공급자의 제안에 따라 파아지 T4 DNA 리가아제(Biolabs) 존재하에 배양시킬 수 있다.
돌출한 5' 말단을 채우는 것은 공급자의 지시에 따라 E. Coli(Biolabs)의 DNA 중합효소 I의 Klenow 단편으로 수행할 수 있다. 돌출한 3' 말단의 파괴는 제작자의 권고에 따라 사용되는 파아지 T4 DNA 중합효소(Biolabs)의 존재하에 수행한다. 돌출한 5' 말단의 파괴는 S1 누클레아제로 제어된 처리에 의해 수행한다.
합성 올리고데옥시누클레오티드의 시험관내 부위특이적 돌연변이는 Amersham에 의해 고안된 기구를 사용하여 Taylor 일동.[Nucleic Acides Res. 13 (1985)8749 - 8764]에 의해 개발된 방법을 따라 수행할 수 있다.
소위 PCR 기술[Polymerase-catalysed Chain Reaction., Saiki R.K. 일동, Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. 및 Faloona F. A., Meth. Enzym-155(1987)335-350]에 의한 DNA 단편의 효소적 증폭은 제작자의 지시에 따라 "DNA열 사이클러"(Perkin Elmer Cetus)를 사용하여 수행할 수 있다.
누클레오티드 서열의 변형은 Amersham에 의해 고안된 기구를 사용하여 Sanger 일동.[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74(1977)5463-5467]에 의해 개발된 방법에 의해 수행할 수 있다.
사용된 세포 라인
하기 실시예에서, 하기 세포 라인이 사용되었거나 사용가능하다:
-인간 배 신장 세포주 293(Graham 일동, J. Gen. Virol. 36 (1977)59). 상기 세포주는 특별히 그의 게놈내 통합된, 인간 아데노바이러스 Ad5(12%)의 게놈의 왼쪽 부분을 함유한다.
-인간 세포주 KB: 인간 상피 종양으로부터 유도됨, 상기 세포주는 그의 배양을 허용하는 조건하에서, 그뿐만 아니라 ATCC(참고 CCL17)에서 입수가능하다.
-인간 세포주 Hela: 인간 상피의 종양으로부터 유도됨, 상기 세포주는 그의 배양을 허용하는 조건하에서, 뿐만 아니라 ATCC(참고 CCL2)에서 입수가능하다.
-개 세포주 MBCK: MDCK 세포의 배양을 위한 조건이 특히 Macatney 일동, Science 44(1988) 9에 서술되어있다.
-세포주 gm DBP6(Brough 일동 Virology 190(1992) 624). 상기 세포주는 MMTV의 LTR의 제어하에 아데노바이러스 E2 유전자를 운반하는 Hela 세포로 구성된다.
실시예 1
본 실시예는 바이러스 유전자가 대부분 결실된 재조합 아데노바이러스의 실시가능성을 나타낸다. 이를 위해, 일련의 아데노바이러스의 결실 변이체를 생체외에서 결찰로 제작하고, 각각의 상기 변이체를 KB 세포내로 헬퍼 바이러스와 공트랜스팩션시켰다. 이들 세포는 E1에 대해 결함이 있는 바이러스의 증식을 허용하지 아니하므로, 교차보층을 E1 영역에 적용한다.
다양한 결실 변이체를, 생체외에서의 소화와 결찰을 통해 Ad5 아데노바이러스로부터 제조했다. 이를 위해 Ad5로부터의 바이러스 DNA를 Lipp 일행(J. Virol. 63 (1989) 5133)에 의해 기재된 기술에 따라 단리시킨 후, 다양한 제한 효소의 존재하에 소화시킨 다음(제 3 도), 소화 생성물을 T4, DNA 리가제의 존재하에 결찰시킨다. 그 후, 다양한 결실 변이체의 크기를 0.8% SDS-아가로스 겔상에서 검사한다. 그리고 나서, 상기 변이체의 유전자지도를 작성한다(제 3도). 상기 다양한 변이체는 하기 영역을 포함한다:
mt 1: Ad 5 단편 0-20642 (Saul)와 (Saul) 33797-35935사이의 결찰
mt 2: Ad 5 단편 0 19549 (NdeI)와 (NdeI) 31089-35935사이의 결찰
mt 3: Ad 5 단편 0-10754 (Aat II)와 (Aat II) 25915-35935사이의 결찰
mt 4: Ad 5 단편 0-11311 (MluI)과 (MluI) 24392-35935 사이의 결찰
mt 5: Ad 5 단편 0-9642 (SaII)와 (XhoI) 29791-35935 사이의 결찰
mt 6: Ad 5 단편 0-5788 (XhoI)과 (XhoI) 29791-35935 사이의 결찰
mt 7: Ad 5 단편 0-3665 (SphI)와 (SphI) 31224-35935사이의 결찰
상기 제조된 각각의 변이체를 인산 칼슘 존재하에 KB 세포로 Ad, RSVβ Gal(stratford-Perricaudet 일동, J. Clin, Invest. 90 (1992) 625)으로부터의 바이러스 DNA와 공트랜스팩션시켰다. 세포를 트랜스팩션 시킨 후 8일째에 회수하고, 배양 상층액은 회수한 후 각 트랜스펙션에 대해 50개 디쉬를 얻을 때까지 KB 세포 상에서 증폭시켰다. 각 샘플로부터, 에피솜 DNA를 단리시키고 염화 세륨 구배상에서 분리시켰다. 두 개의 뚜렷한 바이러스 밴드가 각각의 경우에 관찰되었으며, 이들을 수집하여 분석했다. 보다 무거운 것은 Ad. RSVβ Gal로부터의 바이러스 DNA에 대응되는 것이고, 보다 가벼운 것은 결찰에 의해 형성된 재조합 바이러스 DNA에 대응되는 것이다(제 3 도). 후자로부터 얻어진 역가는 약 108pfu/ml이다.
두 번째 시리즈의 아데노바이러스 결실 변이제를 동일한 방법에 따라 생체외에서 결찰에 의해 제작하였다. 상기 다양한 변이체는 하기 영역을 함유한다:
mt 8: Ad RSVβ Gal로부터의 단편 0-4623(Apal)과 Ad 5로부터의 (ApaI)31909-35935사이의 결찰.
mt 9: Ad RSVβ Gal로부터의 단편 0-10178(BglII)과 Ad 5로부터의 (BamHI)21562-35935 사이의 결찰.
그리고 나서, RSV 바이러스의 LTR 촉진제의 제어하에 LacZ 유전자를 함유하는 상기 변이체는 E4 영역이 결실된 H2d1808(Weinberg 일행. J. Virol. 57(1986)833)로부터의 바이러스성 DNA의 존재하에 세포 293으로 공트랜스팩션된다. 상기 제 2 기술에 따라서, 교차보충을 E4에 적용하고, E1에는 더이상 적용하지 않는다. 따라서, 상기 기술은 상기 기재된 바대로 바이러스성 유전자로서 E4 영역만을 갖는 재조합 바이러스의 형성을 가능하게 한다.
실시예 2
본 실시예는 헬퍼 바이러스와, 플라스미드에 병합된 DNA의 재조합 바이러스를 공트랜스팩션 시킴으로써 본 발명에 따른 결함 재조합 아데노바이러스를 제조하는 것을 서술한다.
이를 위해, Ad 5의 연결 ITRs, 캡슐화 서열, 그 자신의 프로모터 제어하에 있는 E4 유전자, 및 RSV 바이러스의 LTR 프로모터의 제어하에 있는 이종 유전자로서의 LacZ 유전자를 운반하는 플라스미드를 구성했다(제 4 도). 상기 플라스미드, 지적된 pE4Gal을 하기 단편의 클로닝 및 결찰로 얻었다(제 4 도):
- 플라스미드 pFG144로부터 유도된 HindIII-Sac II 단편(Graham 일행, EMBO J. 8 (1989) 2077). 상기 단편은 텐덤 내 Ad 5로부터의 ITR 서열 및 캡슐화 서열을 운반한다: Hind III(34920)-Sac II(352) 단편;
- Sac II(염기쌍 3827의 수준에 위치됨) 및 Pst I(염기쌍 4245의 수준에 위치됨) 부위 사이의 Ad 5로부터의 단편;
- Pst I(bp 32) 및 Sal I(bp 34) 부위 사이의 pSP 72(Promega)의 단편;
- Stratford-Perricaudet 일동에 의해 기재된 플라스미드 pAdLTR Ga1IX의 XhoI-XbaI 단편(JCI 90 (1992) 626). 상기 단편은 RSV 바이러스의 LTR 제어하에LacZ 유전자를 운반한다;
- 플라스미드 pSP 72의 XbaI(bp 40)-Nde I(bp 2379) 단편;
- Ad 5로부터의 NdeI(bp 31089)-Hind III(bp 34930) 단편. Ad 5 게놈의 우측 말단 내 위치된 상기 단편은 그 자신 프로모터의 제어하에 E4 영역을 함유한다. 상기는 플라스미드 pSP 72의 Nde I 부위(2379) 및 제 1 단편의 HindIII 부위로 클로닝되었다.
다양한 단편을 플라스미드 pSP 72의 지적된 영역으로 클로닝시킴으로써 상기 플라스미드를 얻었다. 동량의 단편이 다른 원료로부터 당업자에 의해 얻어질 수 있음이 이해된다.
그리고 나서, 플라스미드 pE4Gal을 인산 칼슘의 존재하에 세포 293으로 바이러스 H2d1808로부터의 DNA와 공트랜스팩션시킨다. 그리고 나서, 재조합 바이러스를 실시예 1에 기재된 바대로 제조한다. 상기 바이러스는 Ad 5 아데노바이러스로 부터 E4 유전자를 단독 바이러스 유전자로서 운반한다(제 4 도). 상기 게놈은 약 12 kb의 크기를 갖고, 이는 매우 큰 크기(20 kb 이하)의 이종 DNA의 삽입을 허용한다. 따라서, 당업자 LacZ 유전자를 상기 언급된 바와 같은 임의의 다른 치료적 유전자로 용이하게 대치할 수 있다. 더욱이, 상기 바이러스는 플라스미드 pSP 72로부터 유도된 몇몇 서열을 함유하고, 필요하다면 통상적인 분자 생물학 기술로 제거시킬 수 있다.
실시예 3
본 실시예는 헬퍼 바이러스와, 플라스미드로 병합된 DNA의 재조합 바이러스를 공트랜스팩션 시킴으로써 본 발명에 따른 여러 가지의 결함 재조합 아데노바이러스를 제조하는 것을 서술한다.
이를 위해, Ad 5로부터의 연결 ITRs, 캡슐화 서열, 그 자신의 프로모터 제어하에 있는 Ad 2로부터의 E2 유전자, 및 RSV 바이러스의 LTR 프로모터의 제어하에 있는 이종 유전자로서의 LacZ 유전자를 운반하는 플라스미드를 제작했다(제 5 도). 상기 플라스미드, 지적된 pE2Gal을 하기 단편의 클로닝 및 결찰로 얻었다(제 5도):
- 플라스미드 pFG144로부터 유도된 HindIII-Sac II 단편(Graham 일행, EMBO J. 8 (1989) 2077). 상기 단편은 탠덤 내 Ad 5로부터의 ITR 서열 및 캡슐화 서열을 운반한다: Hind III(34920)-Sac II(352) 단편, 상기를 플라스미드 pSP 72의 Hind III(16)-Pst I(32) 부위로 하기 단편과 함께 클로닝시켰다;
- Sac II(염기쌍 3827의 수준에 위치됨) 및 Pst I(염기쌍 4245의 수준에 위치됨) 부위 사이의 Ad 5로부터의 단편. 상기 단편을 전술한 단편의 Sac II 부위 및 플라스미드 pSP 72의 Pst I(32) 부위로 클로닝시켰다;
- Pst I(bp 32) 및 Sal I(bp 34) 부위 사이의 pSP 72(프로메가)의 단편;
- Stratford-Perricaudet 일동에 의해 기재된 플라스미드 pAdLTR GalIX의 XhoI-XbaI 단편(JCI 90 (1992) 626). 상기 단편은 RSV 바이러스의 LTR 제어하에 LacZ 유전자를 운반한다. 상기를 플라스미드 pSP 72의 Sal I(34) 및 XbaI 부위로 클로닝시켰다.
- XbaI(bp 34) 및 BamHI(bp 46) 부위 사이의 pSP 72(프로메가)의 단편.
- Ad 2의 BamHI(bp 21606)-SmaI(bp 27339) 단편. Ad 2 게놈의 상기 단편은그 자신 프로모터의 제어하에 E2 영역을 함유한다. 상기를 플라스미드 pSP 72의 Bam HI(46) 및 EcoRV부위로 클로닝시켰다;
- 플라스미드 pSP 72의 EcoRV(bp 81)-HindIII(bp 16) 단편.
다양한 단편을 플라스미드 pSP 72의 지시된 영역으로 클로닝시킴으로써 상기 플라스미드를 얻었다. 동량의 단편이 다른 기원으로부터 당업자에 의해 얻어질 수 있음이 이해된다.
그리고 나서, 플라스미드 pE2Gal을 인산 칼슘의 존재하에 세포 293으로 바이러스 H2d1802로부터의 DNA와 공트랜스팩션 시킨다. 그리고 나서, 재조합 바이러스를 실시예 1에 기재된 바대로 제조한다. 상기 바이러스는 Ad 2 아데노바이러스로부터 E2 유전자를 단독 바이러스 유전자로서 운반한다(제 5 도). 상기 게놈은 약 12 kb의 크기를 갖고, 이는 매우 큰 크기(20 kb 이하)의 이종 DNA의 삽입을 허용한다. 따라서, 당업자는 LacZ 유전자를 상기 언급된 바와 같은 임의의 다른 치료적 유전자로 용이하게 대치할 수 있다. 더욱이, 상기 바이러스는 중간체 플라스미드로부터 유도된 몇몇 서열을 함유하고, 필요하다면 통상적인 분자 생물학 기술로 제거시킬 수 있다.
실시예 4
본 실시예는 아데노바이러스의 E1, E2 및/또는 E4 영역에 대해 세포주를 보충하는 구성을 서술한다. 상기 세포주는 헬퍼 바이러스의 도움없이 상기 영역이 결실된, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스의 구성을 허용한다. 상기 바이러스는 생체내 재조합에 의해 얻어지고, 이는 세포주 동종 서열을 함유할 수 있다.
상기 세포주에서, 잠재적으로 세포독성인 E2 및 E4 영역을 발현유도 프로모터의 제어하에 놓는다; 덱사메타손(dexamethasone)에 의해 유도된 MMTV(페르마시아)의 LTR: PNAS 90(1993) 5603에 기재된 음성이거나 최소인 형태; 또는 Gossen 및 Bujard(PNAS 89 (1992) 5547)에 의해 기재된 테트라시클린-억제된 시스템, 그 외 다른 촉진제가 사용될 수 있고, 특히 MMTV로부터의 LTR 변이가 예를 들어 이종 조절부위(특히, "인핸서" 영역)을 운반할 수 있다고 이해된다. 본 발명의 세포주는 전사 프로모터 및 종결자(폴리아데닐화 부위)의 제어하에서 지시된 유전자(아데노바이러스 영역 및/또는 글루코르티코이드 수용체를 위한 유전자)를 운반하는 DNA 단편과 함께, 인산 칼슘의 존재하에 대응 세포를 트랜스팩션 시킴으로써 구성된다. 종결자는 트랜스팩션된 유전자의 천연 종결자이거나, 예를 들어 SV40 바이러스의 일차 전달자의 종결자와 같은 이질적 종결자일 수 있다.
유리하게, 또한, DNA단편은 형질전환된 세포의 선택을 허용하는 유전자 및, 예를 들면, 제네티신에 대해 저항성인 유전자를 운반한다. 또한, 저항성 유전자는 공트렌스펙션된 채, 상이한 DNA 단편에 의해 운반될 수 있다.
트랜스팩션 후, 형질전환된 세포를 선택하고, 게놈내 DNA단편의 통합여부를 확인하기 위해 상기 DNA를 분석한다.
상기 기술을 통해 하기 세포주를 얻는 것이 가능하다:
1. MMTV의 LTR 제어하에 Ad 5의 E2 영역의 72K유전자를 갖는 세포 293;
2. MMTV의 LTR 제어하에 Ad 5의 E2 영역의 72K 유전자 및 글루코코르티코이드 수용체를 위한 유전자를 갖는 세포 293;
3. MMTV의 LTR 제어하에 Ad 5의 E2 영역 및 MMTV의 LTR 제어하에 E4 영역의 72K 유전자를 갖는 세포 293;
4. MMTB의 LTR 제어하에 Ad 5의 E2 영역, MMTV의 LTr 제어하에 E4 영역의 72K 유전자 및 글루코코르티코이드 수용체를 위한 유전자를 갖는 세포 293;
5. MMTV의 LTR의 제어하에 E4 영역을 갖는 세포 293;
6. MMTV의 LTR의 제어하에 E4 영역 및 글루코르티코이드 수용체를 위한 유전자를 갖는 세포 293;
7. E1A 및 E1B 영역 자신의 프로모터의 제어하에 그 자신의 영역을 갖는 세포 gm DBP6;
8. E1A 및 E1B 자신의 프로모터의 제어하에 그 자신의 영역 및 MMTV의 LTR제어하에 E4 영역을 갖는 세포 gm DBP6.
실시예 5
본 실시예는 E1, E3 및 E4 유전자가 결실된 게놈으로부터 본 발명에 따른 결함 재조합 아데노바이러스의 제조를 서술한다. 구체적으로 본 실시예 및 실시예 3에 설명된 유리한 실시양태에 따라, 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 게놈은 적어도 E1 및 E4 유전자가 비-기능성이도록 변형된다. 상기 아데노바이러스는 무엇 보다도 이종 유전자를 도입시킬 수 있는 대용량을 가진다. 더욱이, 상기 벡터는 E4 영역의 결실로 인해 상당히 안정한데, 이는 후기 유전자의 발현의 조절, 후기 핵 RNA의 안정성, 숙주 세포 단백질의 발현의 소거, 및 바이러스 DNA 복제의 효능에 관련된다. 그러므로, 상기 벡터는 전사 배경 잡음 및 상당히 감소된 바이러스 유전자 발현을 갖는다. 최종적으로, 특히 유리한 방식으로 상기 벡터는 야생-형 아데노바이러스에 견줄만한 역가로 생산될 수 있다.
상기 아데노바이러스를 헬퍼 플라스미드와 공트랜스팩션 시킴으로써(또한 실시예 1, 2 및 3 참고) 또는, 보충 세포주의 방식에 의해서(실시예 4), Ad5 아데노바이러스 게놈의 변형된 우측 부분을 운반하도록, 플라스미드 pPY55로부터 제조했다.
5.1 플라스미드 pPY55의 구성
a) 플라스미드 pPY32의 구성
Ad5 아데노바이러스의 게놈의 우측 말단에 대응하는 플라스미드 pFG144[F.L. Graham 일행. EMBO J. 8 (1989) 2077-2085]의 AvrII-BcII은 댐-컨텍스트(dam-context)로부터 제조된 벡터 pIC19H의 XbaI 및 BamHI 부위 사이에 먼저 클로닝되었다. 상기는 플라스미드 pPY23을 발생시킨다. 플라스미드 pPY23의 유리한 특징 중 하나는 벡터 pIC19H의 다중 클로닝 부위로부터 얻어진 SaII 부위만이 남아서 Ad5 아데노바이러스 게놈의 우측 말단 측면에 위치한다는 것이다. 그리고 나서, 위치 35614에 위치한 HaeII 부위로부터 Ad5 아미노바이러스의 게놈의 우측 말단을 함유하는 플라스미드 pPY23의 HaeIII-SaII 단편을, 플라스미드 pPY29를 발생시키는 벡터 pIC20H의 EcoRV 및 XhoI 사이에 클로닝시켰다. 상기 플라스미드의 유리한 특징 하나는 베터 pIC2OH의 다중 클로닝 부위로부터 얻은 XbaI 및 ClaI는 클로닝 결과 얻는 EcoRv/HaeIII 접합 측면에 위치된다는 것이다. 게다가, 상기 접합은 현재 댐-컨텍스트내 메틸화 가능한 ClaI 부위에 직접 인접한 누클레오티드의 내용을 변형시킨다. 그리고 나서, Ad5 아데노바이러스의 게놈의 XbaI(30470)-MaeII(32811) 단편을 댐-컨텍스트로부터 제조된 플라스미드 pPY29의 XbaI 및 ClaI 부위 사이에 클로닝시켜 플라스미드 pPY30을 형성했다. 우측 말단까지 30556 위치에 SstI 부위로부터 Ad5 아데노바이러스 게놈의 서열에 상응하는 플라스미드 pPY30의 SstI 단편을 벡터 pIC2OH의 SstI 부위들 사이에 최종적으로 클로닝시켜 플라스미드 pPY31을 형성하는데, 여기서 HindIII 부위들 사이에 위치된 삽입의 제한지도는 제 6도에 주어진다.
BgIII로 플라스미드 pPY31을 부분적으로 소화한 다음 BamHI로 전체적으로 소화시킨 후 결찰하여 플라스미드 pPY32를 얻었다. 그러므로, 플라스미드 pPY32는 플라스미드 pPY31의 BamHI 부위 및 위치 30818내 위치된 BgIII 부위 사이에 놓인 Ad5 아데노바이러스의 게놈의 결실부위에 상응한다. 플라스미드 pPY32의 HindII 단편의 제한지도는 제 6 도에 주어진다. 플라스미드 pPY32의 특징 중 하나는 독특한 SaII 및 XbaI 부위를 갖는다는 것이다.
b) 플라스미드 pPY47의 구조
Ad5 아데노바이러스의 게놈의 BamHI (21562)- XbaI(28592) 단편은 댐-컨텍스트로부터 제조된 벡터 pIC19H의 BamHI 및 XbaI 부위 사이에 먼저 클로닝시켰고, 이는 플라스미드 pPY17을 발생시킨다. 그러므로, 상기 플라스미드는 벡터 pIC2OR의 HindIII 및 BglII 부위 사이에 클로닝될 수 있는 Ad5 아데노바이러스의 게놈의 HindIII(26328)-BglII(28133) 단편을 포함시켜 플라스미드 pPY34를 형성한다. 상기 플라스미드의 특징 중 하나는 다중 클로닝 부위로부터 얻은 BamHI 부위가 Ad5 아데노바이러스의 게놈의 HindIII(26328)의 인접하여 위치된다는 것이다.
그리고 나서, 플라스미드 pPY17로부터 얻어진 Ad5 아데노바이러스 게놈의 BamHI(21562)-HindIII(26328) 단편을 플라스미드 pPY34의 BamHI 및 HindIII 사이에 클로닝시켜 플라스미드 pPY39를 형성한다. 그리고 나서, BamHI(21562) 및 BglII(28133) 사이의 Ad5 아데노바이러스 게놈의 일부분을 함유하는 댐-컨텍스트로 부터 제조된 플라스미드 pPY39의 BamHI-XbaI 단편을 댐-컨텍스트로부터 제조된 벡터 pIC19H이 BamHI 및 XbaI 부위 사이에 클로닝시켰다. 결과 플라스미드 pPY47이 형성되는데, 이의 유리한 특징 중 하나는 다중 클로닝 부위로부터 얻어진 SaII 부위가 HindIII 부위 부근내에 위치된다는 것이다(제 7 도).
c) 플라스미드 pPY55의 구조
댐-컨텍스트로부터 제조되고, BamHI(21562)로부터 Bg1II(28133) 부위까지 연장된 Ad5 아데노바이러스 게놈의 부분을 함유하는 플라스미드 pPY47의 Sa1I-XbaI 단편을 플라스미드 pPY32의 Sa1I 및 XbaI 부위 사이에 클로닝시켜 플라스미드 pPY55를 형성한다. 상기 플라스미드는 적어도 E3 영역(Ad5 아데노바이러스 게놈의 28133 및 30818 위치에 위치된 Bg1II 부위들 사이의 결실)에 대해, 및 전체 E4 영역(Ad5 아데노바이러스 게놈의 MaeII (32811) 및 HaeII (35614) 부위 사이의 결실)에 대해 결실된 재조합 아데노바이러스를 생산하는데 직접 사용할 수 있다.
5.2 E4 영역내, 및 바람직하게 적어도 E1 및 E4 영역내 적어도 하나의 결실을 포함하는 아데노바이러스의 제조.
a) 헬퍼 바이러스 E4와 세포 293으로 공트랜스팩션 시킴에 의한 제조.
상기 원리는 E4 영역을 발현시키는 "미니-바이러스"(헬퍼 바이러스) 및 적어도 E3 및 E4가 결실된 재조합 바이러스 사이의 교차보충을 기초로 한다. 상기 바이러스를 생체외 결찰에 의해, 또는 생체내 재조합 후에 하기 계획에 따라 얻는다:
(i) 모두 BamHI로 소화된 Ad-d1324 바이러스(Thimmappaya 일동, 세포 31(1982) 543) 및 플라스미드 pPy55로부터의 DNA를 먼저 생체내에서 결찰시키고 나서 플라스미드 pEAGal(실시예 2에 기재됨)과 함께 세포 293에 공트랜스팩션한다.
(ii) EcoRI로 소화된 Ad-d1324 바이러스로부터의 DNA 및 BamHI로 소화된 플라스미드 pPY55는 플라스미드 pE4Gal과 세포 293으로 공트랜스팩션한다.
(iii) 모두 BamHI로 소화된 Ad5 아데노바이러스로부터의 DNA 및 플라스미드 pPY55를 결찰시키고 플라스미드 pE4Gal과 세포 293으로 공트랜스팩션시킨다.
(iv) EcoRI로 소화된 Ad5 아데노바이러스로부터의 DNA 및 BamHI로 소화된 플라스미드 pPY55를 세포 293으로 pEAGal과 공트랜스팩션시킨다.
계획 (i) 및 (ii)에 따름으로써 E1, E3 및 E4 영역이 결실된 재조합 아데노바이러스를 형성가능하고, 계획 (iii) 및 (iv)에 따름으로써 E3 및 E4 영역이 결실된 재조합 아데노바이러스를 형성 가능하다. 물론, E1 영역이 결실되나 임의의 교차 유전자를 발현시키는 재조합 바이러스로부터의 DNA는 E1, E3 및 E4 영역이 결실되고 상기 교차 유전자를 발현시키는 재조합 바이러스를 발생시키기 위해 계획 (i) 또는 (ii)에 따라 Ad-d1324바이러스로부터 DNA를 대신하여 사용할 수 있다.
b) E1 및 E4기능을 교차 보충시키는 세포주에 의한 제조.
본 발명에서, 원리는 E1 영역을 발현시키는 세포주, 예를 들면 세포주 293,및 또한 촉진제의 제어 하에 Ad5 아데노바이러스의 E4 영역이 적어도 오픈 프레임 ORF6 및 ORF 6/7을 발현시키는 라인으로부터 유도되고, 예를 들여 유도 세포주를 Ad5 아데노바이러스의 E1 및 E4 영역 모두에 대해서 교차 보충할 수 있다는 사실을 기초로 한다. 상기 세포주는 실시예 4에 기재되었다.
그러므로 E1, E3, 및 E4 영역이 결실된 재조합 바이러스를 상기 기재된 방법에 따라 생체외 결찰 및 생체내 재조합에 의해 얻을 수 있다. 적어도 E4 영역이 결실된 바이러스를 발생시키는데 사용되는 방법과는 무관하게, 사용된 세포로 트랜스팩션시킨 후에 세포 병리 효과(재조합 바이러스의 생산을 가리킴)를 관찰했다. 그리고 나서, 세포를 회수하고, 그의 상층액은 3회의 냉동-해동 주기로 파괴시킨 후, 10 분동안 4000 rpm에서 원심분리시켰다. 그리고 나서, 얻어진 상층액을 신선한 세포 배양물(절차 a)에 대해 세포주 293 및 프로토콜 b)에 대해 E4 영역을 발현시키는 세포주 293 상에서 증폭시켰다. 그리고나서, 바이러스를 플라크로부터 정제했고, 상기 DNA는 Hirt 방법(앞서 인용됨)에 따라 분석한다. 그리고 나서, 바이러스 스톡을 염화 세슘 구배 상에서 제조한다.
실시예 6
상기 실시예는 E1, E3, L5 및 E4 유전자가 결실된 게놈으로부터 본 발명에 따른 결함 재조합 아데노바이러스의 제조를 서술한다. 특히, 상기 벡터는 L5 영역이 섬유상을 코팅하기 때문에 유리하고, 상기는 세포에 대해 특히 독성인 단백질이다.
상기 아데노바이러스를, 다양한 헬퍼 플라스미드와 공트랜스팩션시킴으로써Ad5 아데노바이러스 게놈의 변형된 우측 부분을 운반하는 플라스미드 p2로부터 제조했다. 또한 상기는 보충 라인에 의해 제조할 수 있다.
6.1 플라스미드 p2의 구조
상기 플라스미드는 BamHI(21562) 부위로부터, E3, L5 및 E4 유전자를 운반하는 XbaI (28592) 및 AvrII (35463) 부위들 사이의 단편이 결실된 Ad5 아데노바이러스 게놈의 모든 우측 영역을 함유한다. 하기 단편을 BamHI로 선형화되고 탈이산화된 플라스미드 pIC19R로 클로닝시키고 결찰시킴으로써 플라스미드 p2를 얻었다(제 8 도 참고):
- BamHI(21562) 및 XbaI(28592) 사이의 Ad5 아데노바이러스 게놈의 단편, 및
- AvrII(35463) 부위로부터 Bc1I 부위(BamHI에 대응함)까지 Ad5 아데노바이러스의 게놈의 우측 말단(우측 ITR을 함유함).
6.2 헬퍼 플라스미드의 구조
헬퍼 플라스미드 pITRL5-E4는 트랜스 E4 및 L5 유전자내 제공한다. 상기는 Ad2 아데노바이러스의 MLP 촉진제 제어하게 섬유상을 코드화하는 L5 영역을 부가로 함유하는 실시예 2에 기재된 플라스미드 pE4GaI에 대응한다. 플라스미드 pI7RL5-E4는 하기 방식으로 구조된다(제 9 및 10도):
Ad5 아데노바이러스의 게놈의 위치 31089내 NdeI 부위까지의 섬유상의 코딩서열, 섬유상의 ATG, 및 HindIII 부위를 5'-3' 방향으로 함유하는 58bp 올리고누클레오티드를 합성했다. 상기 올리고누클레오티드의 서열은 5'-3' 배향으로, 하기에주어진다.
5'에서의 HindIII 부위 및 3'에서의 NdeI 부위는 단일선으로 밑줄 그어진 부분이고, 섬유상의 ATG는 이중선으로 밑줄그어진 것이다.
MLP 촉진제의 서열 다음에 Ad2 아데노바이러스의 트리파르타이트(tripartite) 리더를 함유하는 SspI-HindIII 단편을 플라스미드 pMLP10으로부터 단리시켰다(Ballay 일행, (1987) 분자 및 세포 생물학 상의 ULCA 심포지아, New series, Vol 70, 로빈슨 일행(Eds) New-York, 481). 상기 단편을 플라스미드 pIC19R의 NdeI 및 EcoRV 부위 사이에, 상기 기재된 58bp 올리고누클레오티드로 삽입하여 중간체 플라스미드를 얻었다(제 9 도 참고). 그리고 나서 플라스미드 pE4Gal(실시예 2)의 SacII(무디게 나타남)-NdeI 단편을 플라스미드 pITRL5-E4를 발생시키기 위해 SsapI 및 NddeI 부위 사이에 중간체 플라스미드로 도입시켰다(제 10 도).
6.3 E1, E3, E5 및 E4 영역의 손실을 포함하는 결함 재조합 아데노바이러스의 제조
a) 세포 293으로 헬퍼 바이러스와 공트랜스팩션 시킴에 의한 제조.
상기 원리는 L5 영역 또는 E4 및 L5 영역을 발현시키는 "미니-바이러스"(헬퍼 바이러스) 및 적어도 E3, E4 및 L5에 대해 결실된 재조합 바이러스 사이에 교차 보충을 기초로 한다.
상기 바이러스를 하기 계획에 따라 생체외 결찰 또는 생체내 재조합 후에 얻었다:
(i) 모두 BamHI로 소화된 Ad-d1324 바이러스(Thimmappaya 일행, 세포 31(1982) 543) 및 플라스미드 p2로부터의 DNA를 먼저 생체내 결찰시키고 나서 플라스미드 pEAGal(실시예 2에 기재됨)와 함께 세포 293으로 공트랜스펙션한다.
(ii) EcoRI로 소화된 Ad-d1324 바이러스로부터의 DNA 및 BamHI로 소화된 플라스미드 p2는 플라스미드 pITRL5-E4와 세포 293으로 공트랜스팩션한다.
(iii) 모두 BamHI로 소화된 Ad5 아데노바이러스로부터의 DNA 및 플라스미드 p2를 결찰시키고 플라스미드 pITRL5-E4와 세포 293으로 공트랜스팩션한다.
(iv) EcoRI로 소화된 Ad5 아데노바이러스로부터의 DNA 및 BamHI로 소화된 플라스미드 p2를 세포 293으로 pITRL5-E4와 공트랜스팩션한다.
계획 (i) 및 (ii)는 E1, E3, E5 및 E4 영역에 대해 결실된 재조합 아데노바이러스를 발생시키는 것을 가능케하고; 계획 (iii) 및 (iv)는 E3, L5 및 E4 영역에 대해 결실된 재조합 아데노바이러스를 발생시키는 것을 가능케한다. 물론, E1 영역에 대해 결실되나 임의의 교차 유전자를 발현시키는 재조합 바이러스로부터의 DNA는 E1, E3, L5 및 E4 영역에 대해 결실되고 상기 교차 유전자를 발현시키는 재조합 바이러스를 발생시키기 위해 계획 (i) 또는 (ii)에 따라 Ad-d1324 바이러스로 부터 DNA를 대신하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 기재된 방법은 실시예 4에 기재된 바와 같이, 아데노바이러스의 E1 및 E4 영역을 발현시킬 수 있는 세포주를 사용하여 단치 L5 영역을 운반하는 헬퍼 바이러스와 사용될 수 있다.
더욱이, 또한 헬퍼 바이러스를 완전히 사용하지 않기 위해, E1, E4 및 L5 영역을 발현시킬 수 있는 보충 세포주를 사용하는 것이 가능하다.
트랜스팩션 후, 생산된 바이러스를 회수하고 증폭시키고 실시예 5에 기재된 조건 하에 정제시킨다.

Claims (30)

  1. - ITR서열
    - 캡슐화를 허용하는 서열
    - 이종 DNA 서열
    을 포함하며, 상기에서 E1 유전자와, E2, E4 및 L1-L5 유전자 중 하나 이상의 유전자가 비-기능성인 결합 재조합 아데노바이러스.
  2. 제 1항에 있어서, 인간, 동물 또는 혼합된 기원인 아데노바이러스.
  3. 제 2 항에 있어서, 인간 기원의 아데노바이러스가 C군으로 분류된 것들로부터 선택되는 아데노바이러스.
  4. 제 2 항에 있어서, 동물 기원의 아데노바이러스가 개, 소, 쥐, 양, 돼지, 새 또는 원숭이 기원의 아데노바이러스로부터 선택되는 아데노바이러스.
  5. 제 1-4 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 E1 및 E4 유전자가 비-기능성인 아데노바이러스.
  6. 제 1-4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 후기 유전자가 결실된 아데노바이러스.
  7. 제 1 항에 있어서, 하기를 포함하는 아데노바이러스.
    - ITR 서열
    - 캡슐화를 허용하는 서열
    - 이종 DNA 서열, 및
    - 유전자 또는 유전자 E2의 부분을 운반하는 영역.
  8. 제 1 항에 있어서, 하기를 포함하는 아데노바이러스:
    - ITR 서열
    - 캡슐화를 허용하는 서열
    - 이종 DNA 서열, 및
    - 유전자 또는 유전자 E4의 부분을 운반하는 영역
  9. 제 1 항에 있어서, 게놈으로부터 E1, E3 및 E4 유전자가 결실된 아데노바이러스.
  10. 제 1 항에 있어서, 게놈으로부터 E1, E3, L5 및 E4 유전자가 결실된 아데노바이러스.
  11. 제 1-4 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이종 프로모터의 제어하에 기능성 유전자 E3을 부가로 더 포함하는 아데노바이러스.
  12. 제 1-4 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이종 DNA 서열이 하나 이상의 치료 유전자 또는 항원 펩티드를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 함유하는 아데노바이러스.
  13. 제 12 항에 있어서, 치료 유전자가 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인, 성장 인자, 신경전달물질 또는 그들의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자, 아폴리포프로테인, 디스트로핀 또는 미니디스트로핀, 종양 억제 유전자를 코딩하는 유전자, 또는 혈액응고와 관련된 인자를 코딩하는 유전자로부터 선택되는 아데노바이러스.
  14. 제 12 항에 있어서, 치료 유전자가 그의 타겟 세포내 발현이 유전자의 발현 또는 세포상 mRNA 의 전사를 제어가능하게 하는 안티센스 유전자 또는 서열인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
  15. 제 12 항에 있어서, 유전자가 미생물 또는 바이러스에 대한 인간의 면역 반응을 발생시킬 수 있는 항원 펩티드를 코딩하는 아데노바이러스.
  16. 제 15 항에 있어서, 유전자가 엡스타인 바아르 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스, 가성-광견병 바이러스에 특이적인 항원 펩티드 또는 대안적으로 종양에 특이적인 펩티드를 코딩하는 아데노바이러스.
  17. 제 1-4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이종 DNA 서열이 또한 치료 유전자의 또는 감염 세포내 항원 펩티드를 코딩하는 유전자의 발현을 허용하는 서열을 포함하는 아데노바이러스.
  18. 제 1-4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이종 DNA 서열이 치료 유전자의 상류, 표적세포의 분비경로에서 합성되는 치료적 생성물을 유도하는 시그날 서열을 포함하는 아데노바이러스.
  19. 제 1-4항 중 어느 하나의 항에 따른 결함 재조합 아데노바이러스의 보충에 필요로 되는 기능을 게놈 내에 통합된 채 포함하는 아데노바이러스에 의해 감염될 수 있는 세포주.
  20. 제 19 항에 있어서, 게놈내에 아데노바이러스 유래의 E1 및 E2 유전자를 적어도 포함하는 세포주.
  21. 제 20항에 있어서, 아데노바이러스 유래의 E4 유전자를 또한 포함하는 세포주.
  22. 제 19항에 있어서, 글루코코르르티코이드 수용체를 위한 유전자를 부가로 포함하는 세포주.
  23. 제 19항에 있어서, E2 및 E4 유전자가 유도성 프로모터의 조절하에 위치하는 세포주.
  24. 제 19항에 있어서, E2 및 E4유전자가 유도성 프로모터의 조절하에 위치하는 세포주.
  25. 제 24항에 있어서, 유도성 프로모터가 MMTV의 LTR 프로모터인 세포주.
  26. 제 19항에 있어서, E2 유전자가 72K 단백질을 코딩하는 세포주.
  27. 제 19항에 있어서, 세포주 293으로부터 얻어지는 세포주.
  28. 제 1-4항 중 어느 하나의 항에 따른 하나 이상의 결함 재조합 아데노바이러스를 포함하는 유전자 치료용 제약학적 조성물.
  29. 제 28항에 있어서, 제 5항에 따른 재조합 아데노바이러스를 포함하는 유전자 치료용 제약학적 조성물.
  30. 제 28항에 있어서, 주사가능한 배합물에 제약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 유전자 치료용 제약학적 조성물.
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