CN112567035A - 肌萎缩侧索硬化症及脊髓相关病症的治疗 - Google Patents

肌萎缩侧索硬化症及脊髓相关病症的治疗 Download PDF

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Abstract

本公开涉及编码靶向SOD1的多核苷酸的AAV，其可用于治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)和用于治疗包括ALS的脊髓相关病症的递送方法。

Description

肌萎缩侧索硬化症及脊髓相关病症的治疗
相关申请的引用
本申请要求在2018年7月2日提交的题为“ALS及脊髓相关病症的治疗”的美国临时专利申请第62/693,040号和2018年10月16日提交的题为“ALS及脊髓相关病症的治疗”的美国临时专利申请第62/746,104号的权益，其每一个的内容通过引用整体并入本文。
序列表的引用
本申请与作为ASCII文本文件的电子格式的序列表一起提交。序列表作为ASCII文本文件提供，标题为20571070PCT_SEQLST，在2019年7月2日创建，其大小为15,822字节。序列表的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及用于设计、制备、生产和/或配制多核苷酸的组合物、方法和过程，所述多核苷酸包括AAV载体、小干扰RNA(siRNA)双链体、shRNA、microRNA或其前体，其靶向或编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的分子，以干扰SOD1基因表达和/或SOD1酶产生。在一些实施方案中，将多核苷酸插入重组腺相关病毒(AAV)载体。
还公开了在患有与脊髓相关的疾病和/或其它病症的受试者中抑制SOD1或改变与脊髓相关疾病或病症有关的任何基因的表达的方法。所述方法包括至少通过实质内(intraparenchymal)递送至脊髓的途径，将所述至少一种多核苷酸施用至患有与脊髓相关的病症(例如，神经退化疾病)的受试者。在这些实施方案中，所述疾病是运动神经元病，更具体地说，所述疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
背景技术
肌萎缩性侧索硬化(ALS)，也称为Lou Gehrig氏病，是一种致命的进行性神经退化疾病，特征在于初级运动皮质、脑干和脊髓中的上和下运动神经元(MN)的显著丧失。上(例如，皮层)和下运动神经元(例如，脊髓)正常情况下将信息从大脑传送到肌肉以产生随意运动。当这些神经元退化和/或死亡时，传向肌肉的信息的丧失导致肌肉逐渐变弱和/或萎缩，并且不能开始或控制随意运动，直到最终患有ALS的个体丧失肌肉强度和运动、说话、进食甚至呼吸的能力。大多数患者将需要某种形式的呼吸辅助以生存，并且即使如此，大多数ALS患者在诊断的2-5年内由于呼吸衰竭而死亡。在疾病进展期间，一些患者(例如FTD-ALS)也可能发展为额颞痴呆。
根据ALS协会，每年在美国大约5,600人被诊断为患有ALS。ALS的发病率是每100,000人中发生两例，据估计，在任何给定时间可能有多达30,000名美国人患有该疾病。
已经描述了两种形式的ALS：一种是偶发性ALS(sALS)，其是美国最常见的ALS形式，占所有诊断病例的90-95％；另一种是家族性ALS(fALS)，其发生在主要具有显性遗传的家族谱系中，并且仅占美国所有病例的约5至10％。sALS和fALS在临床上是不可区分的。
病理学研究已经将许多细胞过程与疾病发病机理联系起来，例如ER应激增加、自由基(即活性氧物质(ROS))产生、线粒体功能障碍、蛋白质聚集、细胞凋亡、炎症和谷氨酸兴奋性中毒，特别是在运动神经元(MN)中。
ALS的成因复杂且异质。通常，ALS被认为是一种复杂的遗传疾病，其中多个基因与环境暴露的组合使人易感。已经发现了十几个与ALS有关的基因，包括SOD1(Cu2+/Zn2+超氧化物歧化酶)、TDP-43(TARDBP，TAR DNA结合蛋白-43)、FUS(融合在肉瘤中/在肉瘤中转位)、ANG(血管生成素)、ATXN2(Ataxin-2)、含缬酪肽的蛋白(VCP)、OPTN(Optineurin)和染色体9中非编码GGGGCC六核苷酸重复的扩展、开放阅读框72(C9ORF72)。然而，运动神经元退化的确切机制仍难捉摸。
目前，没有ALS治愈性治疗。直到最近，唯一FDA批准的药物是利鲁唑，其拮抗谷氨酸应答以减少ALS的病理发展。然而，对于早期ALS患者，仅报道了大约三个月的寿命延长，且对于晚期ALS患者没有观察到治疗益处，这表明对于该患者群缺乏治疗选项(Bensimon G等人,J Neurol.2002,249,609–615)。2017年，FDA批准了Radicava(依达拉奉)用于治疗ALS，这个批准是22年首次。Radicava通过静脉内给药，并作为自由基清除剂，减少ALS患者体内的氧化应激，并从而减缓疾病的发展。在137名患者的临床3期试验(NCT01492686)中，Radicava与服用安慰剂的那些患者相比减缓了身体功能的衰退，这是通过ALS功能评级量表修订版(ALS Functional Rating Scale-Revised，ALSFRS-R)的评分确定的(Writinggroup；Edaravone(MCI-186)ALS 19Study Group Lancet Neurol.2017Jul；16(7):505-512)。Radicava的批准被认为是在ALS治疗方面的进步，然而它仍然不能治愈。仍需要可有效预防和/或显著阻碍疾病进展的新治疗策略。
Cu2+/Zn2+超氧化物歧化酶I型(SOD1)基因中的突变是fALS最常见的成因，占所有fALS病例的约20-30％。最近的报道表明SOD1突变也可能与所有sALS病例的约4％相关(Robberecht和Philip,Nat.Rev.Neurosci.,2013,14,248-264)。SOD1相关的fALS很可能不是由正常SOD1活性的丧失引起的，而是由毒性功能的获得引起的。突变的SOD1相关的fALS毒性的一个假设提出，异常的SOD1酶引起小分子如过氧亚硝酸盐或过氧化氢产生破坏性自由基。突变的SOD1神经毒性的其它假设包括蛋白酶体活性抑制、线粒体损伤、RNA加工破坏和细胞内聚集体形成。突变的SOD1变体和/或野生型SOD1在ALS中的异常积累形成了被鉴定为病理性内含物的不溶性原纤维聚集体。聚集的SOD1蛋白可诱导细胞，特别是运动神经元的线粒体应激(Vehvilainen P等人,Front Cell Neurosci.,2014,8,126)和其它毒性。
这些发现表明，SOD1可以是家族性和偶发性ALS的潜在治疗靶标。可以减少ALS患者中枢神经系统中产生的SOD1蛋白(无论是野生型还是突变型)的治疗可以改善患者中的ALS症状，例如运动神经元退化以及肌肉无力和萎缩。旨在防止野生型和/或突变的SOD1蛋白聚集形成的试剂和方法可防止疾病进展，并可改善ALS症状。近年来，RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默引起了研究者的兴趣。在该领域中，已经教导了靶向SOD1基因的小双链RNA(小干扰RNA)分子在治疗ALS中的潜力(参见，例如，美国专利号7,632,938和美国专利公开号20060229268)。
本公开开发了基于RNA干扰或敲低的方法，用以抑制或预防ALS患者中SOD1基因的表达，用于治疗疾病。
本公开提供了新的多核苷酸，包括双链RNA(dsRNA)构建体和/或siRNA构建体、shRNA构建体和/或microRNA构建体及其设计方法。此外，这些siRNA构建体可以是在表达载体(一条链或两条链)中编码的合成分子，用于递送到细胞中。这样的载体包括但不限于腺相关病毒载体，例如任何AAV血清型的载体基因组或其它病毒递送媒介物，例如慢病毒等。
本公开还提供了用于递送和/或传递本公开的AAV载体和病毒基因组的新方法，其可应用于与脊髓相关的其它病症，例如但不限于更大家族的运动神经元病症、神经病、髓鞘疾病以及本体感觉、躯体感觉和/或感觉病症。
公开概述
本公开提供了编码靶向SOD1的多核苷酸以干扰SOD1基因表达和/或SOD1蛋白产生的AAV载体及其使用方法。本公开还包括治疗与运动神经元退化相关的疾病例如肌萎缩性侧索硬化症的方法。
在某些实施方案中，与未治疗的受试者相比，用编码靶向SOD1的多核苷酸的AAV治疗的受试者中SOD1被抑制30％。受试者可以以预先确定的剂量水平输注或推注给予AAV。作为非限制性示例，抑制可在C1至L7腹角区域中看到。
本公开涉及RNA分子介导的基因特异性干扰基因表达和蛋白产生。本公开还包括治疗与运动神经元退化相关的疾病例如肌萎缩性侧索硬化症的方法。本文所述组合物中包含的siRNA包括具有反义链(反义或引导链)的dsRNA，所述反义链具有长度为30个核苷酸或更少、通常为19-24个核苷酸的区域，该区域与SOD1基因mRNA转录物的至少一部分基本互补。
根据本公开，靶向SOD1基因的siRNA双链体的每条链长度均为约19-25个核苷酸，优选长度为约19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸或25个核苷酸。在一些方面，siRNA可以是未修饰的RNA分子。
在某些实施方案中，siRNA或dsRNA包括至少两个彼此互补的序列。dsRNA包括具有第一序列的有义链和具有第二序列的反义链。反义链包括与编码SOD1的mRNA的至少一部分基本互补的核苷酸序列，并且互补区域长度为30个核苷酸或更少且至少15个核苷酸。通常，dsRNA的长度为19至24个，例如19至21个核苷酸。在一些实施方案中，dsRNA长度为约15至约25个核苷酸，在其它实施方案中，dsRNA长度为约25至约30个核苷酸。
根据本公开，产生包含编码siRNA双链体，siRNA双链体的一条链或靶向SOD1或其他神经退行性相关基因或脊髓疾病相关基因的dsRNA的核酸的AAV载体，AAV载体血清型可为AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV穿梭100-1、AAV穿梭100-3、AAV穿梭100-7、AAV穿梭10-2、AAV穿梭10-6、AAV穿梭10-8、AAV穿梭100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAVCBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAVCHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAVCKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAVCLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAVCLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAVCSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAVCSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAV-PHP.B、AAV-PHP.A、G2B-26、G2B-13、TH1.1-32、TH1.1-35、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5及其变体。
本公开还提供了药物组合物，其包含至少一种靶向SOD1基因的siRNA双链体和药学上可接受的载体。在一些方面，将编码siRNA双链体的核酸序列插入AAV载体。
在一些实施方案中，本公开提供了抑制/沉默细胞中SOD1基因表达的方法。因此，siRNA双链体或dsRNA可用于基本上抑制细胞中，特别是运动神经元中的SOD1基因表达。在一些方面，SOD1基因表达的抑制是指抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。SOD1基因可以是野生型基因或具有至少一个突变的突变的SOD1基因。因此，SOD1蛋白是野生型蛋白或具有至少一个突变的突变的多肽。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗或改善需要治疗的受试者中与异常SOD1基因和/或SOD1蛋白相关的肌萎缩性侧索硬化的方法，所述方法包括给予受试者药物有效量的至少一种靶向SOD1基因的siRNA双链体，将所述siRNA双链体递送至靶细胞中，抑制SOD1基因表达和蛋白产生，以及改善受试者中的ALS症状。
在一些实施方案中，AAV载体基因组可包括启动子。在一个方面，启动子可以是H1。在一些实施方案中。AAV载体基因组可包括填充序列(filler sequence)。填充序列可衍生自慢病毒。在一些实施方案中，填充序列可衍生自哺乳动物白蛋白基因。在一些实施方案中，哺乳动物白蛋白基因是人白蛋白基因。
在一些方面，ALS是与SOD1突变相关的家族性ALS。在其它方面，ALS是偶发性ALS，其特征在于SOD1蛋白的异常聚集或SOD1蛋白功能或定位的破坏，尽管不一定是基因突变的结果。通过本发明方法改善的ALS症状可以包括运动神经元退化、肌无力、肌肉僵硬、言语不清和/或呼吸困难。
在一些实施方案中，可将靶向SOD1基因的siRNA双链体或dsRNA或包含此类siRNA编码分子的AAV载体直接引入受试者的中枢神经系统，例如通过颅内注射。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物用作单独疗法。在其他实施方案中，本公开的药物组合物用于组合疗法。组合疗法可以与一种或多种神经保护剂组合，例如小分子化合物、生长因子和激素，已经测试了它们对运动神经元退化的神经保护作用。
在一些实施方案中，本公开提供了通过向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的质粒或AAV载体来治疗或改善肌萎缩性侧索硬化的方法。ALS可以是家族性ALS或偶发性ALS。
所述方法可包括在一个或多个位点通过实质内向受试者施用AAV颗粒。所述方法可包括将AAV颗粒通过实质内施用至受试者的脊髓。在一些方面，AAV颗粒可施用至脊髓内的两个位点。在一些实施方案中，AAV颗粒可在两个位点施用至颈脊髓内。在一些实施方案中，AAV颗粒可以在脊髓的C3和C5水平处施用。在某些实施方案中，在脊髓C3水平处的施用体积为约5μL至约240μL，在脊髓C5水平处的施用体积为约5μL至约240μL。在某些实施方案中，在脊髓C3水平处的施用体积为约5μL至约60μL，在脊髓C5水平处的施用体积为约5μL至约60μL。在一个方面，在脊髓C3水平处的施用体积为约25至约40μL，在脊髓C5水平处的施用体积为约25至约40μL。施用至脊髓的剂量在脊髓C3水平处可为约1x1010vg至约1x1012vg，在脊髓C5水平处可为约1x1010vg至约1x1012vg。在一些方面，施用至脊髓的剂量在脊髓C3水平处为约5×1011vg至约8×1011vg，在脊髓C5水平处为约5×1011vg至约8×1011vg。在某些实施方案中，剂量在脊髓C3水平处为约2x1010vg至约7x1011vg，在脊髓C5水平处为约2x1010vg至约7x1012vg。在一个方面，注射速率可为5μL/分钟。
附图说明
从以下对如附图中所示的本公开的具体实施方案的描述，前述和其他目的、特征和优点将是显而易见的。附图不一定按比例绘制，而是将重点放在说明本公开的各种实施方案的原理上。
图1显示了人SOD1 mRNA表达与不同nM浓度的siRNA的剂量反应曲线。
图2显示SK-RST细胞系中SOD1 mRNA敲低。
详述内容
本公开涉及作为治疗剂的靶向SOD1的多核苷酸。RNA干扰介导的基因沉默可以特异性抑制基因表达。因此，本公开提供了靶向SOD1基因的多核苷酸，例如小的双链RNA(dsRNA)分子(小干扰RNA，siRNA)、shRNA、microRNA及其前体，包含此类多核苷酸的药物组合物，以及它们的设计方法。本公开还提供了它们用于抑制SOD1基因表达和蛋白产生、用于治疗与脊髓和/或神经退化疾病、特别是肌萎缩性侧索硬化(ALS)相关的病症的方法。
本公开的一个或多个实施方案的细节在以下所附描述中阐述。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何材料和方法可用于本发明的实施或测试，但现在描述优选的材料和方法。本发明的其它特征、目的和优点从说明书中将是显而易见的。在说明书中，单数形式也包括复数，除非上下文另外清楚地规定。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在冲突的情况下，以本说明书为准。
与脊髓有关的疾病
脊髓是共同表征中枢神经系统(CNS；脑和脊髓)的两个组成之一。脊髓将身体连接到大脑，充当运动和感觉所必需的信息和通信的通道。脊髓是脆弱的、薄的管状束，由位于脊柱内的神经纤维和细胞体以及支持细胞组成。
运动神经元和脊髓通路对于运动的起始、执行、改变和精确性是重要的。当这些神经元和/或通路以某种方式受损时，例如但不限于创伤、肿瘤生长、心血管缺陷、炎症、脱髓鞘、神经病变、退化和/或细胞死亡，结果通常是某种形式的运动的缺陷。类似地，感觉神经元和脊髓通路对于本体感受和感觉是关键的，并且当受损时，可以导致不能感觉某些刺激和/或疼痛综合征。
与脊髓有关的病症例如上述那些的非限制性示例包括但不限于，运动神经元疾病、肌萎缩性侧索硬化(ALS；Lou Gehrig氏病)、进行性延髓麻痹、假延髓麻痹、原发性侧索硬化、进行性肌萎缩、脊髓性肌萎缩、脊髓灰质炎后综合征、延髓麻痹、肯尼迪病、遗传性痉挛性截瘫、弗里德赖希共济失调、夏科-马利-图斯病(Charcot-Marie-Tooth disease)、遗传性运动和感觉神经病症、腓肌萎缩、神经病、脱髓鞘疾病、病毒性脱髓鞘、代谢性脱髓鞘、多发性硬化、视神经脊髓炎(Devic氏病)、同心硬化(Baló氏硬化)、共济失调、截瘫、脊髓小脑性共济失调、急性播散性脑脊髓炎(acute-disseminated encephalomyelitis)、复杂性区域疼痛综合征(CPRS I和CPRS II)、共济失调毛细血管紧张、发作性共济失调、多系统萎缩、散发性共济失调、脂质积累疾病(lipid storage disease)、尼曼-匹克病、法布里病、费伯病、GM1或GM2神经节苷脂症、泰-萨克斯病、桑德霍夫病、克拉贝病、异染性白质营养不良、马查多-约瑟夫病(脊髓小脑共济失调3型)、脑膜炎、脊髓炎、肌病、线粒体肌病、脑肌病、Barth综合征、慢性进行性眼球外麻痹、Kearns-Sayre综合征、Leigh综合征、线粒体DNA耗竭综合征、肌阵挛性癫痫伴红纤维断裂、NARP(神经病变、共济失调和视网膜色素变性、神经肌肉连接部疾病、重症肌无力、肌阵挛、神经病理性疼痛、神经退化性疾病、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、路易体病、维生素B12缺乏、脊髓亚急性联合变性(利希氏病)、热带痉挛性截瘫、远端遗传性运动神经元病、Morvan综合征、白质营养不良和/或Rett综合征。
在某些实施方案中，本公开的组合物和方法可用于治疗中枢神经系统的任何疾病。
在某些实施方案中，本公开的组合物和方法可用于治疗与脊髓相关的疾病。
在某些实施方案中，本公开的组合物和方法可用于治疗神经退化疾病。
在某些实施方案中，本公开的组合物和方法可用于治疗运动神经元疾病。
在某些实施方案中，本公开的组合物和方法可用于治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
肌萎缩性侧索硬化(ALS)和SOD1
肌萎缩性侧索硬化(ALS)是一种成年发病的神经退化疾病，是一种进行性的致命性疾病，其特征在于运动皮质、脑干和脊髓中运动神经元的选择性死亡。诊断患有ALS的患者会发展出进行性肌肉表型，其特征在于痉挛状态、反射亢进或反射不足、肌束震颤、肌肉萎缩和麻痹。这些运动损伤由运动神经元丧失导致的肌肉去神经支配引起。ALS的主要病理特征包括皮质脊髓束的退化和下运动神经元(LMN)或前角细胞的大量丧失(Ghatak等人,JNeuropathol Exp Neurol.,1986,45,385-395)，贝茨细胞和初级运动皮层中其它锥体细胞的退化和丧失(Udaka等人,Acta Neuropathol,1986,70,289-295；Maekawa等人,Brain,2004,127,1237-1251)和运动皮层与脊髓中的反应性神经胶质增生(Kawamata等人,Am JPathol.,1992,140,691-707；和Schiffer等人,J Neurol Sci.,1996,139,27-33)。归因于呼吸缺陷和/或炎症，ALS通常在诊断后3至5年内致命(Rowland LP和Shneibder NA,NEngl.J.Med.,2001,344,1688-1700)。
ALS的细胞标志是退化中的运动神经元和周围细胞(例如，星形胶质细胞)中存在蛋白质的泛素化的胞质内含物(inclusion)。泛素化的内含物(即，Lewy体样内含物或丝球状内含物)是ALS中最常见的特定类型的内含物，并且发现于脊髓和脑干的LMN以及皮质脊髓上运动神经元(UMN(Matsumoto等人,J Neurol Sci.,1993,115,208-213；和Sasak和Maruyama,Acta Neuropathol.,1994,87,578-585)。已经鉴定出一些蛋白质是内含物的成分，包括泛素、Cu/Zn超氧化物歧化酶1(SOD1)、外围蛋白和Dorfin。神经丝状内含物经常见于ALS中脊髓运动神经元的透明簇生内含物(hyaline conglomerate inclusion，HCI)和轴突“球体”中。其他类型的不太特异的内含物包括皮质上层的Bunina体(含胱抑素C的内含物)和月牙形内含物(SCI)。在ALS中观察到的其他神经病理学特征包括高尔基体片段化、线粒体空泡化和突触末端的超微结构异常(Fujita等人,Acta Neuropathol.2002,103,243-247)。
此外，在额颞痴呆ALS(FTD-ALS)中，也观察到皮质萎缩(包括额叶和颞叶)，其可在FTD-ALS患者中引起认知损伤。
ALS是一种复杂的多因素疾病，并且被假设为引起ALS发病机理的多种机制包括蛋白质降解功能障碍、谷氨酸兴奋性毒性、线粒体功能障碍、细胞凋亡、氧化应激、炎症、蛋白质折叠错误和聚集、异常的RNA代谢和改变的基因表达。
约10％的ALS病例具有该疾病的家族史，并且这些患者被称为家族性ALS(fALS)或遗传性患者，通常具有孟德尔遗传显性模式和高外显率。其余的(大约90％-95％)被分类为偶发性ALS(sALS)，因为它们与记录的家族史不相关，其被认为是归因于其它危险因素，包括环境因素、遗传多态性、体细胞突变和可能的基因-环境相互作用。在大多数情况下，家族性(或遗传性)ALS作为常染色体显性疾病遗传，但存在常染色体隐性和X连锁遗传和不完全外显率的谱系。偶发形式和家族形式在临床上无法区分，这表明了共同的发病机理。ALS中运动神经元的选择性死亡的确切原因仍然难以捉摸。在了解fALS中的遗传因素方面的进展可能会阐明该疾病的两种形式。
最近，对ALS遗传原因的研究和理解的扩展导致发现了现在已知引起fALS的超过10种不同基因的突变。最常见的突变发现于编码下述蛋白的基因中：Cu/Zn超氧化物歧化酶1(SOD1；～20％)(Rosen DR等人,Nature,1993,362,59-62)，融合在肉瘤中/翻译在脂肪肉瘤(FUS/TLS；1-5％)和TDP-43(TARDBP；1-5％)。最近，C9orf72基因中的六核苷酸重复扩张(GGGGCC)n被鉴定为是西方人群中fALS的最常见原因(约40％)(综述见Renton等人,Nat.Neurosci.,2014,17,17-23)。在ALS中突变的其它基因包括alsin(ALS2)、senataxin(SETX)、囊泡相关膜蛋白(VAPB)、血管生成素(ANG)。fALS基因控制不同的细胞机制，这表明ALS的发病机制复杂，并且可能与最终导致运动神经元退化的几种不同过程相关。
SOD1是在哺乳动物中鉴定和表征的三种人超氧化物歧化酶之一：铜锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD或SOD1)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD或SOD2)和胞外超氧化物歧化酶(ECSOD或SOD3)。SOD1是153个残基的多肽的32kDa同二聚体，每个亚基具有一个铜结合位点和一个锌结合位点，由人21号染色体上的SOD1基因(GeneBank访问号：NM_000454.4)编码(参见表10)。SOD1催化超氧阴离子(O2-)在所结合的铜离子处反应为分子氧(O2)和过氧化氢(H2O2)。SOD1的细胞内浓度高(10-100μM)，占中枢神经系统(CNS)中总蛋白含量的1％。该蛋白质不仅定位于细胞质中，而且定位于真核细胞的细胞核、溶酶体、过氧化物酶体和线粒体膜间空间中(Lindenau J等人,Glia,2000,29,25–34)。
SOD1基因的突变由15-20％的fALS患者和1-2％的全部ALS病例携带。目前，已经发现在整个153个氨基酸的SOD1多肽中分布的至少170个不同的突变引起ALS，更新的列表可见于ALS在线基因数据库(ALS online Genetic Database，ALSOD)(Wroe R等人,AmyotrophLateral Scler.,2008,9,249-250)。表1列出了ALS中SOD1突变的一些示例。这些突变主要是单个氨基酸取代(即错义突变)，尽管也发生缺失、插入和C-末端截短。不同的SOD1突变显示不同的地理分布模式。例如，约一半的患有SOD1基因突变引起的ALS的美国人具有特定的突变Ala4Val(或A4V)。A4V突变通常与更严重的体征和症状相关。I113T突变是英国迄今最常见的突变。在欧洲最普遍的突变是D90A取代。
表1.ALS中的SOD1突变的示例
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为了研究与SOD1基因缺陷相关的神经元死亡的机制，本领域开发了SOD1相关的ALS的几种啮齿动物模型，这些模型表达具有不同突变的人SOD1基因，所述突变包括错义突变、小的缺失或插入。ALS小鼠模型的一些示例包括SOD1G93A、SOD1A4V、SOD1G37R、SOD1G85R、SOD1D90A、SOD1L84V、SOD1I113T、SOD1H36R/H48Q、SOD1G127X、SOD1L126X和SOD1L126delTT。有两个携带两种不同的人SOD1突变的转基因大鼠模型：SOD1H46R和SOD1G93R。这些啮齿动物ALS模型可以发展与人ALS患者相似的肌无力和反映所述人疾病的若干特征的其他致病特征，特别是脊髓运动神经元的选择性死亡、运动神经元中蛋白内含物的聚集和小神经胶质细胞的活化。本领域公知，转基因啮齿类动物是人SOD1相关ALS疾病的良好模型，并提供了用于研究疾病发病机理和开发疾病治疗的模型。
在动物和细胞模型中的研究表明，SOD1致病变体通过获得功能引起ALS。也就是说，当通过SOD1突变而改变时，超氧化物歧化酶获得新的但有害的性质。例如，ALS中的一些SOD1突变变体通过破坏氧化还原循环增加氧化应激(例如增加毒性超氧自由基的积累)。其它研究也表明，ALS中的一些SOD1突变变体可能获得不依赖于其正常生理功能的毒性性质(例如错误折叠的SOD1变体的异常聚集)。在异常氧化还原化学模型中，突变体SOD1是不稳定的，并且通过异常化学与非常规底物相互作用，导致活性氧物质(ROS)过量产生。在蛋白质毒性模型中，不稳定的错误折叠SOD1聚集成细胞质包涵体，从而将对细胞过程至关重要的蛋白隔离。这两种假设不是相互排斥的。已经表明，在活性位点结合金属的所选组氨酸残基的氧化介导了SOD1聚集。
聚集的突变体SOD1蛋白还可诱导线粒体功能障碍(Vehvilainen P等人,FrontCell Neurosci.,2014,8,126)，轴突传输的损伤，RNA代谢异常，神经胶质细胞病理和谷氨酸兴奋毒性。在一些偶发性ALS病例中，在患病的运动神经元中发现了错误折叠的野生型SOD1蛋白，其形成与家族性ALS相关的SOD1变体相似的“毒性构象”(Rotunno MS和BoscoDA,Front Cell Neurosci.,2013,16,7,253)。这些证据表明，ALS是一种类似于其它神经退化疾病如阿尔茨海默病和帕金森病的蛋白错误折叠疾病。
目前，对于患有ALS的患者没有可用的治愈性治疗。直到最近，FDA唯一批准的药物是利鲁唑(也称为力如太(Rilutek))，它是一种谷氨酸释放抑制剂，对ALS有中度作用，服用18个月仅延长存活2-3个月。不幸的是，服用利鲁唑的患者并没有出现任何疾病进展的减缓或肌肉功能的改善。因此，利鲁唑不是治愈性或甚至有效的治疗。2017年，FDA批准了Radicava(依达拉奉)用于治疗ALS，这个批准是22年来的首次。Radicava通过静脉内给药并充当自由基清除剂和抗氧化剂，已显示出其减缓疾病的进展。在137名患者的临床3期试验(NCT01492686)中，与服用安慰剂的那些患者相比，Radicava减缓了身体功能的衰退，这是通过ALS功能评级量表修订版(ALSFRS-R)的评分确定的(Writing group；Edaravone(MCI-186)ALS19Study Group Lancet Neurol.2017Jul；16(7):505-512)。Radicava的批准被认为是在ALS治疗方面的进步，然而它仍然不能治愈。研究人员继续寻找更好的治疗剂。
抑制异常SOD1蛋白聚集的一种方法是在ALS中沉默/抑制SOD1基因表达。已经报道，用于突变的等位基因的特异性基因沉默的小干扰RNA在治疗上有益于fALS的治疗(例如，Ralgh GS等人,Nat.Medicine,2005,11(4),429-433；和Raoul C等人,Nat.Medicine,2005,11(4),423-428；和Maxwell MM等人,PNAS,2004,101(9),3178-3183；和Ding H等人,Chinese Medical J.,2011,124(1),106-110；和Scharz DS等人,Plos Genet.,2006,2(9),e140；其每一个的内容均通过引用整体并入本文)。
本领域教导了许多其它靶向ALS中SOD1基因和调节SOD1表达的RNA治疗剂，此类基于RNA的试剂包括反义寡核苷酸和双链小干扰RNA。参见，例如Wang H等人,J Biol.Chem.,2008,283(23),15845-15852)；美国专利号7,498,316、7,632,938、7,678,895、7,951,784、7,977,314、8,183,219、8,309,533和8、586、554；以及美国专利公开号2006/0229268和2011/0263680；其每一个的内容均通过引用整体并入本文。
本公开采用病毒载体如腺相关病毒(AAV)载体，以高效率地将siRNA双链体或靶向SOD1的多核苷酸递送到细胞中。包含RNAi分子，例如本发明的siRNA分子的AAV载体可增加活性剂向运动神经元的递送。靶向SOD1的多核苷酸可能能够显著抑制细胞内SOD1基因的表达(例如mRNA水平)；因此，改善SOD1表达诱导了细胞内的应激，例如蛋白质聚集和内含物形成、自由基增加、线粒体功能障碍和RNA代谢。
此类靶向SOD1的多核苷酸可用于治疗ALS。根据本公开，提供了治疗和/或改善患者ALS的方法，该方法包括给予患者有效量的至少一种编码一种或多种siRNA双链体的靶向SOD1的多核苷酸至细胞中，并允许SOD1基因表达的抑制/沉默。
组合物
载体
在一些实施方案中，本文所述的siRNA分子可以插入至载体如质粒或病毒载体中，或由其编码。优选地，siRNA分子插入至病毒载体或由其编码。
病毒载体可以是疱疹病毒(HSV)载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等。在一些具体实施方案中，病毒载体是AAV载体。
逆转录病毒载体
在一些实施方案中，靶向SOD1基因的siRNA双链体可由逆转录病毒载体编码(参见，例如，美国专利号5,399,346、5,124,263、4,650,764和4,980,289，其每一个的内容均通过引用整体并入本文)。
腺病毒载体
腺病毒是真核生物DNA病毒，其可经修饰以有效地将核酸递送至体内的多种细胞类型，并且已广泛用于包括用于将基因靶向神经细胞的基因治疗方案。已描述了将各种复制缺陷型腺病毒和最小腺病毒载体用于核酸治疗(参见，例如PCT专利公开号WO199426914、WO 199502697、WO199428152、WO199412649、WO199502697和WO199622378，其每一个的内容通过引用整体并入)。此类腺病毒载体也可用于将本公开的siRNA分子递送至细胞。
腺相关病毒(AAV)载体
AAV是依赖性细小病毒。与其它细小病毒一样，AAV是单链、无包膜DNA病毒，具有约5000个核苷酸长度的基因组，该基因组含有两个开放阅读框，编码负责复制的蛋白(Rep)和衣壳的结构蛋白(Cap)。开放阅读框的侧翼是两个反向末端重复(ITR)序列，其用作病毒基因组的复制起点。此外，AAV基因组还含有包装序列，其允许将病毒基因组包装到AAV衣壳中。AAV载体需要共辅助细胞(例如腺病毒)，以在感染的细胞中进行生产性感染。在缺乏这种辅助功能时，AAV病毒粒子主要进入宿主细胞并整合到细胞基因组中。
AAV载体由于几个独特的特征已被研究用于siRNA递送。这些特征包括(i)感染分裂和非分裂细胞二者的能力；(ii)广泛的感染性宿主范围，包括人细胞；(iii)野生型AAV从未与任何疾病相关，并且不能在感染的细胞中复制；(iv)缺乏针对载体的细胞介导的免疫应答和(v)整合到宿主染色体中或保持游离状态的能力，从而产生长期表达的潜力。此外，AAV载体感染对改变细胞基因表达模式的影响最小(Stilwell和Samulski等人,Biotechniques,2003,34,148)。
通常，用于siRNA递送的AAV载体可以是重组病毒载体，其由于在病毒基因组中缺乏编码功能性Rep和Cap蛋白的序列而具有复制缺陷。在一些情况下，缺陷性AAV载体可能缺少所有编码序列中的大部分，并且基本上仅含有一个或两个AAV ITR序列和包装序列。
AAV载体还可包含自身互补AAV载体(scAAV)。scAAV载体含有两条DNA链，它们退火在一起形成双链DNA。scAAV通过跳过第二链合成而可以在细胞中快速表达。
用于生产/修饰AAV载体的方法在本领域中公开，例如假型AAV载体(PCT专利公开号WO200028004、WO200123001、WO2004112727、WO 2005005610和WO 2005072364，其每一个的内容通过引用整体并入本文)。
用于将siRNA分子递送到哺乳动物细胞的AAV载体可以从AAV的各种血清型制备或衍生，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8和AAV-DJ。在一些情况下，不同血清型的AAV可混合在一起或与其它类型的病毒混合以产生嵌合AAV载体。
在某些实施方案中，AAV血清型是AAVrh10。
用于siRNA递送的AAV载体可经修饰以增强递送效率。此类含有siRNA表达盒的修饰的AAV载体可被有效包装，并可用于以高频率和最小毒性成功感染靶细胞。
在一些实施方案中，用于递送本公开的siRNA双链体的AAV载体可以是人血清型AAV载体。这种人AAV载体可衍生自任何已知的血清型，例如衍生自血清型AAV1-AAV11中的任一种。作为非限制性示例，AAV载体可以是在AAV1衍生的衣壳中包含AAV1衍生的基因组的载体；在AAV2衍生的基因组中包含AAV2衍生的基因组的载体；在AAV4衍生的衣壳中包含AAV4衍生的基因组的载体；在AAV6衍生的衣壳中包含AAV6衍生的基因组的载体，或在AAV9衍生的衣壳中包含AAV9衍生的基因组的载体。
在其它实施方案中，用于递送本公开的siRNA双链体的AAV载体可以是含有源自至少两种不同AAV血清型的序列和/或组分的假型AAV载体。假型AAV载体可以是包含来源于一种AAV血清型的AAV基因组和至少部分来源于不同的AAV血清型的衣壳蛋白的载体。作为非限制性示例，这类假型AAV载体可以是在AAV1衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；或在AAV6衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；或在AAV4衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；或在AAV9衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组。
在其它实施方案中，AAV载体可用于将siRNA分子递送至中枢神经系统(例如，美国专利号6,180,613；其内容通过引用整体并入本文)。
在一些方面，本公开的用于递送siRNA双链体的AAV载体可进一步包含修饰的衣壳，所述衣壳包括来自非病毒来源的肽。在其它方面，AAV载体可含有CNS特异性嵌合衣壳，以促进siRNA双链体递送到脑和脊髓中。例如，可构建对来自显示CNS向性的AAV变体的cap核苷酸序列的比对，以鉴定可变区(VR)序列和结构。
本公开涉及由衣壳(Cap)基因编码的结构衣壳蛋白(包括VP1、VP2和VP3)。这些衣壳蛋白形成病毒载体如AAV的外部蛋白结构壳(即衣壳)。从Cap多核苷酸合成的VP衣壳蛋白通常包括甲硫氨酸作为肽序列中的第一个氨基酸(Met1)，其与相应Cap核苷酸序列中的起始密码子(AUG或ATG)相关。然而，通常在多肽合成之后或期间，通过蛋白质加工酶如Met-氨肽酶将第一甲硫氨酸(Met1)残基或通常任何第一氨基酸(AA1)切除。这种“Met/AA剪切”过程通常与多肽序列中第二个氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸等)的相应乙酰化有关。Met剪切通常发生在VP1和VP3衣壳蛋白中，但也可发生在VP2衣壳蛋白中。
当Met/AA剪切不完全时，可产生包含病毒衣壳的一种或多种(一种、两种或三种)VP衣壳蛋白的混合物，其中一些可包含Met1/AA1氨基酸(Met+/AA+)，并且一些由于Met/AA剪切而缺乏Met1/AA1氨基酸(Met-/AA-)。关于衣壳蛋白中Met/AA剪切的进一步讨论，参见Jin,等人，Direct Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis for CompleteCharacterization of Recombinant Adeno-Associated Virus Capsid Proteins.HumGene Ther Methods.2017Oct.28(5):255-267；Hwang,等人N-Terminal Acetylation ofCellular Proteins Creates Specific Degradation Signals.Science.2010February19.327(5968):973–977；其内容均通过引用整体并入本文。
根据本公开，提及衣壳蛋白不限于剪切的(Met-/AA-)或未剪切的(Met+/AA+)，并且在上下文中可以指独立的衣壳蛋白、包含衣壳蛋白混合物的病毒衣壳和/或编码、描述、产生或导致本公开的衣壳蛋白的多核苷酸序列(或其片段)。直接提及“衣壳蛋白”或“衣壳多肽”(例如VP1、VP2或VP2)也可以包括包含Met1/AA1氨基酸的VP衣壳蛋白(Met+/AA+)以及相应的由于Met/AA-剪切而缺乏Met1/AA1氨基酸的VP衣壳蛋白(Met-/AA-)。
进一步根据本公开，提及分别包含或编码一种或多种包含Met1/AA1氨基酸的衣壳蛋白(Met+/AA+)的特定的SEQ ID NO：(无论是蛋白还是核酸)时，应理解为教导了缺乏Met1/AA1氨基酸的VP衣壳蛋白，因为在回顾序列后任何仅缺乏第一个所列氨基酸(无论是否为Met1/AA1)的序列均是十分明显的。
作为非限制性示例，提及长度为736个氨基酸且包含由AUG/ATG起始密码子编码的“Met1”氨基酸的VP1多肽序列(Met+)，也可理解为教导了长度为735个氨基酸且不包含736个氨基酸的Met+序列的“Met1”氨基酸的VP1多肽序列(Met-)。作为第二非限制性示例，提及长度为736个氨基酸且包括由任何NNN起始密码子编码的“AA1”氨基酸的VP1多肽序列(AA1+)，也可理解为教导了长度为735个氨基酸且不包括736个氨基酸的AA1+序列的“AA1”氨基酸的VP1多肽序列(AA1-)。
提及由VP衣壳蛋白形成的病毒衣壳(例如提及特定AAV衣壳血清型)时，可引入包含Met1/AA1氨基酸的VP衣壳蛋白(Met+/AA1+)、对应的由于Met/AA1-剪切而缺乏Met1/AA1氨基酸的VP衣壳蛋白(Met-/AA1-)，及其组合(Met+/AA1+和Met-/AA1-)。
作为非限制性示例，AAV衣壳血清型可包括VP1(Met+/AA1+)、VP1(Met-/AA1-)或VP1(Met+/AA1+)和VP1(Met-/AA1-)的组合。AAV衣壳血清型还可包括VP3(Met+/AA1+)、VP3(Met+/AA1-)或VP3(Met+/AA1+)和VP3(Met-/AA1-)的组合；并且还可以包括VP2(Met+/AA1)和VP2(Met-/AA1-)的类似的任选组合。
病毒基因组
在某些实施方案中，如所示，AAV颗粒包含具有有效载荷区域的病毒基因组。
病毒基因组大小
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是单链或双链病毒基因组。病毒基因组的大小可以是小、中、大或最大大小。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是小单链病毒基因组。小单链病毒基因组可以是2.7至3.5kb大小，如大小约2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4和3.5kb。作为非限制性示例，小单链病毒基因组的大小可以是3.2kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是小双链病毒基因组。小双链病毒基因组的大小可以是1.3-1.7kb，如大小约1.3、1.4、1.5、1.6和1.7kb。作为非限制性示例，小双链病毒基因组的大小可以是1.6kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是中等单链病毒基因组。中等单链病毒基因组的大小可以是3.6至4.3kb，如大小约3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2和4.3kb。作为非限制性示例，中等单链病毒基因组的大小可以是4.0kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是中等双链病毒基因组。中等双链病毒基因组的大小可以是1.8至2.1kb，如大小约1.8、1.9、2.0和2.1kb。作为非限制性示例，中等双链病毒基因组的大小可以是2.0kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是大单链病毒基因组。大单链病毒基因组的大小可以是4.4至6.0kb，如大小约4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9和6.0kb。作为非限制性示例，大单链病毒基因组的大小可以是4.7kb。作为另一个非限制性示例，大单链病毒基因组的大小可以是4.8kb。作为另一个非限制性示例，大单链病毒基因组的大小可以是6.0kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是大双链病毒基因组。大双链病毒基因组的大小可以是2.2至3.0kb，如大小约2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0kb。作为非限制性示例，大双链病毒基因组的大小可以是2.4kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
病毒基因组成分：反向末端重复序列(ITR)
本公开的AAV颗粒包含具有至少一个ITR区域和有效载荷区域的病毒基因组。在某些实施方案中，病毒基因组具有两个ITR。这两个ITR在5'和3'末端位于有效载荷区域的侧翼。ITR作为复制起点起作用，包括复制识别位点。ITR包含可以互补且对称配置的序列区域。引入本公开的病毒基因组中的ITR可以包含天然存在的多核苷酸序列或重组衍生的多核苷酸序列。
ITR可以衍生自与衣壳相同的血清型，所述血清型选自本文的任何血清型或其衍生物。ITR可以是与衣壳不同的血清型。在某些实施方案中，AAV颗粒具有多于一个ITR。在非限制性示例中，AAV颗粒具有包含两个ITR的病毒基因组。在某些实施方案中，ITR彼此具有相同的血清型。在另一个实施方案中，ITR具有不同的血清型。非限制性示例包括零个、一个或两个ITR具有与衣壳相同的血清型。在某些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组的两个ITR都是AAV2 ITR。
独立地，每个ITR可以是约100至约150个核苷酸长。ITR可以是约100至105个核苷酸长，106至110个核苷酸长，111至115个核苷酸长，116至120个核苷酸长，121至125个核苷酸长，126至130个核苷酸长，131至135个核苷酸长，136至140个核苷酸长，141至145个核苷酸长或146至150个核苷酸长。在某些实施方案中，ITR为140至142个核苷酸长。ITR长度的非限制性示例是长度为102、140、141、142、145个核苷酸，和与其具有至少95％同一性的那些。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中flip ITR的5'端附近。在另一实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中flip ITR的3'端附近。在另一实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中flop ITR的5'端附近。在另一实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中flop ITR的3'端附近。在某些实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中flip ITR的5’端和flip ITR的3'端之间。在某些实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于(例如，flip ITR的5'端和flop ITR的3'端之间的中间位置，或flop ITR的3'端和flip ITR的5'端之间的中间位置)，在表达载体中flip ITR的3'端和flip ITR的5'端之间。作为非限制性示例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中ITR(例如，Flip或FlopITR)5'或3'端下游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为非限制性示例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中ITR(例如，Flip或Flop ITR)5’或3’端上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为另一个非限制性示例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中ITR(例如Flip或Flop ITR)5’或3’端下游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为另一个非限制性示例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中ITR(例如Flip或Flop ITR)5’或3’端上游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、20-30或25-30内。作为非限制性示例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中ITR(例如，Flip或Flop ITR)的5’或3’端上游前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或超过25％的核苷酸内。作为另一个非限制性示例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中ITR(例如，flip或flop ITR)5’或3’端下游前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％处。
病毒基因组成分：启动子
在某些实施方案中，病毒基因组的有效载荷区域包含至少一个增强转基因靶特异性和表达的元件(参见例如Powell等人Viral Expression Cassette Elements toEnhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy,2015，其内容通过引用整体并入本文)。增强转基因靶特异性和表达的元件的非限制性示例包括启动子、内源miRNA、转录后调节元件(PRE)、聚腺苷酸化(PolyA)信号序列和上游增强子(USE)、CMV增强子和内含子。
本领域技术人员可以认识到，本公开的多肽在靶细胞中的表达可能需要特异性启动子，包括但不限于物种特异性、诱导型、组织特异性或细胞周期特异性启动子(Parr等人,Nat.Med.3:1145-9(1997)，其内容通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，当启动子驱动AAV颗粒病毒的基因组有效载荷区域中编码的多肽表达时，认为该启动子是有效的。
在某些实施方案中，启动子是被认为有效驱动调节性多核苷酸表达的启动子。
在某些实施方案中，启动子是当其驱动在被靶向的细胞中表达时被认为有效的启动子。
在某些实施方案中，启动子驱动有效载荷在靶组织中表达一段时间。由启动子驱动的表达可以持续1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3周、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年。表达可以持续1-5小时、1-12小时、1-2天、1-5天、1-2周、1-3周、1-4周、1-2个月、1-4个月、1-6个月、2-6个月、3-6个月、3-9个月、4-8个月、6-12个月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年或5-10年。
在某些实施方案中，启动子驱动有效载荷表达至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年、31年、32年、33年、34年、35年、36年、37年、38年、39年、40年、41年、42年、43年、44年、45年、46年、47年、48年、49年、50年、55年、60年、65年或超过65年。
启动子可以是天然存在的或非天然存在的。启动子的非限制性示例包括病毒启动子、植物启动子和哺乳动物启动子。在一些实施方案中，启动子可以是人启动子。在一些实施方案中，启动子可以是截短的。
驱动或促进在大多数组织中表达的启动子包括但不限于人延伸因子1α-亚基(EF1α)、巨细胞病毒(CMV)即早期增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡萄糖醛酸苷酸酶(GUSB)或泛素C(UBC)。组织特异性表达元件可用于将表达限制于某些细胞类型，例如但不限于肌肉特异性启动子、B细胞启动子、单核细胞启动子、白细胞启动子、巨噬细胞启动子、胰腺腺泡细胞启动子、内皮细胞启动子、肺组织启动子、星形胶质细胞启动子或可用于限制在神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞中表达的神经系统启动子。
肌肉特异性启动子的非限制性示例包括哺乳动物肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物结蛋白(DES)启动子、哺乳动物肌钙蛋白I(TNNI2)启动子和哺乳动物骨骼α-肌动蛋白(ASKA)启动子(参见例如美国专利公开US20110212529，其内容通过引用整体并入本文)
神经元的组织特异性表达元件的非限制性示例包括神经元特异性烯醇化酶(NSE)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)、突触蛋白(SYN)、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)、促代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)、神经丝轻肽(NFL)或神经丝重肽(NFH)、β-珠蛋白小基因nβ2、前脑啡肽原(PPE)、脑啡肽(Enk)和兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)启动子。星形胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性示例包括神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和EAAT2启动子。少突胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性示例包括髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子。
在某些实施方案中，启动子可以小于1kb。启动子可以具有200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超过800个核苷酸的长度。启动子的长度可以是200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800。
在某些实施方案中，启动子可以是具有相同或不同起始或亲代启动子的两种或多种组分的组合，所述起始或亲代启动子例如但不限于CMV和CBA。每个组分可以具有200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或大于800的长度。每个组分的长度可以是200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800。在某些实施方案中，启动子是382个核苷酸的CMV增强子序列与260个核苷酸的CBA启动子序列的组合。
在某些实施方案中，病毒基因组包含遍在启动子。遍在启动子的非限制性示例包括CMV、CBA(包括衍生物CAG、CBh等)、EF-1α、PGK、UBC、GUSB(hGBp)和UCOE(HNRPA2B1-CBX3的启动子)。
Yu等人(Molecular Pain 2011，7:63；其内容通过引用整体并入本文)使用慢病毒载体评估了CAG、EFIα、PGK和UBC启动子控制下的eGFP在大鼠DRG细胞和原代DRG细胞中的表达，并发现UBC显示出比其它3个启动子更弱的表达，并且对于所有启动子仅观察到10-12％的胶质细胞表达。Soderblom等人(E.neuro2015；其内容通过引用整体并入本文)评价了注射入运动皮质后eGFP在具有CMV和UBC启动子的AAV8和具有CMV启动子的AAV2中的表达。鼻内施用含有UBC或EFIα启动子的质粒显示持续的气道表达大于用CMV启动子的表达(参见例如Gill等人,Gene Therapy 2001,Vol.8,1539-1546)。Husain等人(Gene Therapy 2009，其内容通过引用整体并入本文)评价了具有hGUSB启动子、HSV-1LAT启动子和NSE启动子的HβH构建体，并发现HβH构建体在小鼠脑中显示比NSE弱的表达。Passini和Wolfe(J.Virol.2001,12382-12392，其内容通过引用整体并入本文)评估了在新生小鼠脑室内注射后HβH载体的长期作用，并发现其持续表达至少一年。Xu等人(Gene Therapy 2001,8,1323-1332，其内容通过引用整体并入本文)发现，与CMV-lacZ、CMV-luc、EF、GFAP、hENK、nAChR、PPE、PPE+wpre、NSE(0.3kb)、NSE(1.8kb)和NSE(1.8kb+wpre)相比，当使用NFL和NFH启动子时，在所有脑区域中表达低。Xu等人发现启动子活性按照降序是NSE(1.8kb)、EF、NSE(0.3kb)、GFAP、CMV、hENK、PPE、NFL和NFH。NFL是一个650个核苷酸的启动子，而NFH是一个920个核苷酸的启动子，它们在肝脏中都不存在，但是NFH在感觉本体感受神经元、大脑和脊髓中含量丰富，并且NFH存在于心脏中。Scn8a是一个470个核苷酸的启动子，可在整个DRG、脊髓和脑中表达，并在海马神经元和小脑浦肯野细胞、皮质、丘脑和下丘脑中表现出特别高的表达(参见例如Drews等人Identification of evolutionary conserved,functionalnoncoding elements in the promoter region of the sodium channel gene SCN8A,Mamm Genome(2007)18:723-731；和Raymond等人Expression of Alternatively SplicedSodium Channelα-subunit genes,Journal of Biological Chemistry(2004)279(44)46234-46241；其每一个的内容通过引用整体并入本文)。
由上述Yu、Soderblom、Gill、Husain、Passini、Xu、Drews或Raymond教导的任何启动子可用于本公开的组合物。
在某些实施方案中，启动子不是细胞特异性的。
在某些实施方案中，启动子是泛素c(UBC)启动子。UBC启动子可具有300-350个核苷酸的大小。作为非限制性示例，UBC启动子为332个核苷酸。
在某些实施方案中，启动子是β-葡糖糖醛酸酶(GUSB)启动子。GUSB启动子可具有350-400个核苷酸的大小。作为非限制性示例，GUSB启动子是378个核苷酸。
在某些实施方案中，启动子是神经丝轻肽(neurofilament light，NFL)启动子。NFL启动子的大小可以是600-700个核苷酸。作为非限制性示例，NFL启动子是650个核苷酸。作为非限制性示例，构建体可为AAV-启动子-CMV/珠蛋白内含子-调节性多核苷酸-RBG，其中AAV可为自身互补的，且AAV可为DJ血清型。
在某些实施方案中，启动子是神经丝重肽(neurofilament heavy，NFH)启动子。NFH启动子的大小可以是900-950个核苷酸。作为非限制性示例，NFH启动子是920个核苷酸。作为非限制性示例，构建体可为AAV-启动子-CMV/珠蛋白内含子-调节性多核苷酸-RBG，其中AAV可为自身互补的，且AAV可为DJ血清型。
在某些实施方案中，启动子是scn8a启动子。scn8a启动子可具有450-500个核苷酸的大小。作为非限制性示例，scn8a启动子是470核苷酸。作为非限制性示例，构建体可以是AAV-启动子-CMV/珠蛋白内含子-调节性多核苷酸-RBG，其中AAV可以是自身互补的，AAV可以是DJ血清型
在某些实施方案中，病毒基因组包含pol III启动子。
在某些实施方案中，病毒基因组包含P1启动子。
在某些实施方案中，病毒基因组包含FXN启动子。
在某些实施方案中，启动子是磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子。
在某些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。
在某些实施方案中，启动子是CAG启动子，其是包含与鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的构建体。
在某些实施方案中，启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。
在某些实施方案中，病毒基因组包含H1启动子。
在某些实施方案中，病毒基因组包含U6启动子。
在某些实施方案中，启动子是肝或骨骼肌启动子。肝启动子的非限制性示例包括人α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)和甲状腺素结合球蛋白(TBG)。骨骼肌启动子的非限制性示例包括结蛋白(desmin)、MCK或合成的C5-12。
在某些实施方案中，启动子是RNA pol III启动子。作为非限制性示例，RNA polIII启动子是U6。作为非限制性示例，RNA pol III启动子是H1。
在某些实施方案中，病毒基因组包含两个启动子。作为非限制性示例，启动子是EF1α启动子和CMV启动子。
在某些实施方案中，病毒基因组包含增强子元件、启动子和/或5'UTR内含子。增强子元件，本文也称为“增强子”，可以是但不限于CMV增强子，启动子可以是但不限于CMV、CBA、UBC、GUSB、NSE、突触蛋白、MeCP2和GFAP启动子，且5'UTR/内含子可以是但不限于SV40和CBA-MVM。作为非限制性示例，组合使用的增强子、启动子和/或内含子可以是：(1)CMV增强子，CMV启动子，SV40 5'UTR内含子；(2)CMV增强子，CBA启动子，SV40 5'UTR内含子；(3)CMV增强子，CBA启动子，CBA-MVM 5'UTR内含子；(4)UBC启动子；(5)GUSB启动子；(6)NSE启动子；(7)突触蛋白启动子；(8)MeCP2启动子，(9)GFAP启动子，(10)H1启动子；和(11)U6启动子。
在某些实施方案中，病毒基因组包含工程化的启动子。
在另一个实施方案中，病毒基因组包含来自天然表达的蛋白的启动子。
病毒基因组成分：非翻译区(UTR)
根据定义，基因的野生型非翻译区(UTR)被转录但不被翻译。通常，5'UTR在转录起始位点开始并在起始密码子结束，并且3'UTR紧随终止密码子之后开始并持续至转录终止信号。
可以将通常在特定靶器官大量表达的基因中发现的特征工程化到UTR中，以增强稳定性和蛋白产生。作为非限制性示例，来自通常在肝脏中表达的mRNA(例如白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子VIII)的5'UTR可用于本公开的AAV颗粒的病毒基因组中，以增强在肝细胞系或肝脏中的表达。
尽管不希望受理论的束缚，野生型5’非翻译区(UTR)包括在翻译起始中起作用的特征。通常已知参与许多基因的核糖体启动翻译过程的Kozak序列通常包括在5'UTR中。Kozak序列具有共有的CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(ATG)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后是另一个“G”。
在某些实施方案中，病毒基因组中的5'UTR包括Kozak序列。
在某些实施方案中，病毒基因组中的5'UTR不包括Kozak序列。
虽然不希望受理论的束缚，已知野生型3'UTR具有嵌入其中的腺苷和尿苷延伸段。这些富含AU的标签在高转换率的基因中特别普遍。基于它们的序列特征和功能特性，富含AU的元件(ARE)可以分成三类(Chen等人，1995，其内容通过引用整体并入本文)：I类ARE，例如但不限于c-Myc和MyoD，在富含U的区域内含有AUUUA基序的几个分散的拷贝。II类ARE，例如但不限于GM-CSF和TNF-α，具有两个或多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。III类ARES，例如但不限于c-Jun和肌细胞生成素，尚未被很好定义。这些富含U的区域不含有AUUUA基序。已知大多数结合ARE的蛋白使信使不稳定，而据记载ELAV家族成员(最著名的是HuR)增加mRNA的稳定性。HuR结合所有三类的ARE。将HuR特异性结合位点工程化到核酸分子的3'UTR中将导致HuR结合，并因此导致体内信息的稳定。
3'UTR富含AU元件(ARE)的引入、去除或修饰可以用来调节多核苷酸的稳定性。当工程化特定的多核苷酸，例如病毒基因组的有效载荷区域时，可以引入ARE的一个或多个拷贝以使多核苷酸更不稳定，并从而缩短翻译并降低所得蛋白的产生。同样，可以鉴定和去除或突变ARE以增加细胞内稳定性，并从而增加所得蛋白的翻译和产生。
在某些实施方案中，病毒基因组的3'UTR可以包括用于poly-A尾的模板化添加的寡(dT)序列。
在某些实施方案中，病毒基因组可以包括至少一个miRNA种子、结合位点或全序列。microRNA(或miRNA或miR)是19-25个核苷酸的非编码RNA，其结合到核酸靶标的位点，并且通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。microRNA序列包含“种子”区域，即成熟microRNA的2-8位区域中的序列，该序列与核酸的miRNA靶序列具有完全的沃森-克里克互补性。
在某些实施方案中，病毒基因组可以被工程化以包括、改变或去除至少一个miRNA结合位点、序列或种子区域。
本领域已知任何基因的任何UTR可引入到AAV颗粒的病毒基因组中。这些UTR或其部分可以与在从中选择它们的基因中相同的方向放置，或者它们可以在方向或位置上发生改变。在某些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组中所用的UTR可被倒置、缩短、延长、用本领域已知的一种或多种其它5'UTR或3'UTR制备。如本文所用，当涉及UTR时术语“改变的”是指，UTR已经相对于参考序列以某种方式改变。例如，3'或5'UTR可以如上文教导通过方向或位置的改变而相对于野生型或天然UTR发生改变，或者可以通过纳入额外的核苷酸、缺失核苷酸、交换或转位核苷酸而改变。
在某些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组包含至少一个人工UTR，其不是野生型UTR的变体。
在某些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组包含UTR，其选自其蛋白具有共同功能、结构、特征或性质的转录物家族。
病毒基因组成分：聚腺苷酸化序列
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒的病毒基因组包含至少一个聚腺苷酸化序列。AAV颗粒的病毒基因组可在有效载荷编码序列的3'末端和3'ITR的5’末端之间包含聚腺苷酸化序列。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列或“polyA序列”的长度范围可以是从缺失到约500个核苷酸。聚腺苷酸化序列可以是但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499和500个核苷酸的长度。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为50-100个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为50-150个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为50-160个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为50-200个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为60-100个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为60-150个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为60-160个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为60-200个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为70-100个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为70-150个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为70-160个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为70-200个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为80-100个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为80-150个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为80-160个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为80-200个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为90-100个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为90-150个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为90-160个核苷酸。
在某些实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为90-200个核苷酸。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中聚腺苷酸化序列的上游。此外，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中启动子的下游，所述启动子例如但不限于CMV、U6、CAG、CBA或具有SV40内含子或人β珠蛋白内含子的CBA启动子。作为非限制性示例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为另一非限制性示例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为非限制性示例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或更多的核苷酸内。作为另一个非限制性示例，AAV颗粒包含编码siRNA分子的核酸序列，其可位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％处。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含兔珠蛋白聚腺苷酸化(polyA)信号序列(rBGpA)。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含人生长激素聚腺苷酸化(polyA)信号序列。
病毒基因组成分：内含子
在某些实施方案中，有效载荷区域包含至少一个增强表达的元件，例如一个或多个内含子或其部分。内含子的非限制性示例包括MVM(67-97bp)、F.IX截短的内含子1(300bp)、β-珠蛋白SD/免疫球蛋白重链剪接受体(250bp)、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体(500bp)、SV40晚期剪接供体/剪接受体(19S/16S)(180bp)和杂合腺病毒剪接供体/IgG剪接受体(230bp)。
在某些实施方案中，内含子或内含子部分的长度可以是100-500个核苷酸。内含子的长度可以是80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500。内含子的长度可以是80-100、80-120、80-140、80-160、80-180、80-200、80-250、80-300、80-350、80-400、80-450、80-500、200-300、200-400、200-500、300-400、300-500或400-500之间。
在某些实施方案中，AAV病毒基因组可包含启动子，例如但不限于CMV或U6。作为非限制性示例，本公开的包含siRNA分子的核酸序列的AAV的启动子是CMV启动子。作为另一个非限制性示例，本公开的包含siRNA分子的核酸序列的AAV的启动子是U6启动子。
在某些实施方案中，AAV病毒基因组可包含CMV启动子。
在某些实施方案中，AAV病毒基因组可包含U6启动子。
在某些实施方案中，AAV病毒基因组可包含CMV和U6启动子。
在某些实施方案中，AAV病毒基因组可包含H1启动子。
在某些实施方案中，AAV病毒基因组可包含CBA启动子。
在某些实施方案中，编码的siRNA分子可以位于表达载体中启动子的下游，所述启动子例如但不限于CMV、U6、H1、CBA、CAG或具有内含子(例如SV40或本领域已知的其它内含子)的CBA启动子。此外，编码的siRNA分子也可位于表达载体中聚腺苷酸化序列的上游。作为非限制性示例，编码的siRNA分子可以位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为另一个非限制性示例，编码的siRNA分子可以位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为非限制性示例，编码的siRNA分子可以位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或25％以上的核苷酸内。作为另一个非限制性示例，编码的siRNA分子可以位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％。
病毒基因组成分：填充序列(filler sequence)
在某些实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充序列。
在某些实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充序列，以使病毒基因组的长度为包装的最佳大小。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，以使病毒基因组的长度为约2.3kb。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，以使病毒基因组的长度为约4.6kb。
在某些实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充序列，以降低载体基因组的发夹结构(例如，本文所述的调节性多核苷酸)在表达和/或包装期间可被读作反向末端重复(ITR)的可能性。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，以使病毒基因组的长度为约2.3kb。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，以使病毒基因组的长度为约4.6kb。
在某些实施方案中，病毒基因组是单链(SS)病毒基因组，并且包含一个或多个长度约介于0.1kb-3.8kb之间的填充序列，例如但不限于0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb或3.8kb。作为非限制性示例，载体基因组中的全长填充序列为3.1kb。作为非限制性示例，载体基因组中的全长填充序列为2.7kb。作为非限制性示例，载体基因组中的全长填充序列为0.8kb。作为非限制性示例，载体基因组中的全长填充序列为0.4kb。作为非限制性示例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.8kb。作为非限制性示例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.4kb。
在某些实施方案中，病毒基因组是自身互补(SC)病毒基因组，并且包含一个或多个填充序列，所述填充序列具有约0.1kb-1.5kb之间的长度，例如但不限于0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb或1.5kb。作为非限制性示例，载体基因组中的全长填充序列为0.8kb。作为非限制性示例，载体基因组中的全长填充序列为0.4kb。作为非限制性示例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.8kb。作为非限制性示例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.4kb。
在某些实施方案中，病毒基因组包含填充序列的任何部分。病毒基因组可以包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的填充序列。
在某些实施方案中，病毒基因组是单链(SS)病毒基因组，并且包含一个或多个填充序列，以便具有约4.6kb的病毒基因组长度。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于5'ITR序列的3’。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于启动子序列的5’。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于3'ITR序列的5’。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于两个内含子序列之间。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于内含子序列内。作为非限制性示例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一个填充序列位于5'ITR序列的3’端，并且第二个填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’端。作为非限制性示例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一个填充序列位于启动子序列的5’端，并且第二个填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’端。作为非限制性示例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一个填充序列位于5'ITR序列的3’端，并且第二个填充序列位于5'ITR序列的5’端。
在某些实施方案中，病毒基因组是自身互补(sc)的病毒基因组，并且包含一个或多个填充序列，以便具有约2.3kb的病毒基因组长度。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于5'ITR序列的3’。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于启动子序列的5’。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于3'ITR序列的5’。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于两个内含子序列之间。作为非限制性示例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于内含子序列内。作为非限制性示例，病毒基因组包含两个填充序列，去第一个填充序列位于5'ITR序列的3’端，并且第二个填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’端。作为非限制性示例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一个填充序列位于启动子序列的5’端，并且第二个填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’端。作为非限制性示例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一个填充序列位于5'ITR序列的3’端，并且第二个填充序列位于5'ITR序列的5’端。
在某些实施方案中，病毒基因组可以在病毒基因组的多个区域中的一个之间包含一个或多个填充序列。在某些实施方案中，填充区域可以位于一个区域之前，所述区域例如但不限于有效载荷区域、反向末端重复(ITR)、启动子区域、内含子区域、增强子区域、聚腺苷酸化信号序列区域和/或外显子区域。在某些实施方案中，填充区域可以位于一个区域之后，所述区域例如但不限于有效载荷区域、反向末端重复(ITR)、启动子区域、内含子区域、增强子区域、聚腺苷酸化信号序列区域和/或外显子区域。在某些实施方案中，填充区可以位于一个区域之前和之后，所述区域例如但不限于有效载荷区域、反向末端重复(ITR)、启动子区域、内含子区域、增强子区域、聚腺苷酸化信号序列区域和/或外显子区域。
在某些实施方案中，病毒基因组可以包含使病毒基因组的至少一个区域分叉的一个或多个填充序列。病毒基因组的分叉区域可以包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的填充序列区域的5’的区域。作为非限制性示例，填充序列可以使至少一个区域分叉，使得区域的10％位于填充序列的5’，且区域的90％位于填充序列的3’。作为非限制性示例，填充序列可以使至少一个区域分叉，使得区域的20％位于填充序列的5’，且区域的80％位于填充序列的3’。作为非限制性示例，填充序列可以使至少一个区域分叉，使得区域的30％位于填充序列的5’，且区域的70％位于填充序列的3’。作为非限制性示例，填充序列可以使至少一个区域分叉，使得区域的40％位于填充序列的5’，且区域的60％位于填充序列的3’。作为非限制性示例，填充序列可以使至少一个区域分叉，使得区域的50％位于填充序列的5’，且区域的50％位于填充序列的3’。作为非限制性示例，填充序列可以使至少一个区域分叉，使得区域的60％位于填充序列的5’，且区域的40％位于填充序列的3’。作为非限制性示例，填充序列可以使至少一个区域分叉，使得区域的70％位于填充序列的5’，且区域的30％位于填充序列的3’。作为非限制性示例，填充序列可以使至少一个区域分叉，使得区域的80％位于填充序列的5’，且区域的20％位于填充序列的3’。作为非限制性示例，填充序列可以使至少一个区域分叉，使得区域的90％位于填充序列的5’，且区域的10％位于填充序列的3’。
在某些实施方案中，病毒基因组在5'ITR之后包含填充序列。
在某些实施方案中，病毒基因组在启动子区域之后包含填充序列。在某些实施方案中，病毒基因组在有效载荷区域之后包含填充序列。在某些实施方案中，病毒基因组在内含子区域之后包含填充序列。在某些实施方案中，病毒基因组在增强子区域之后包含填充序列。在某些实施方案中，病毒基因组在聚腺苷酸化信号序列区域之后包含填充序列。在某些实施方案中，病毒基因组在外显子区域之后包含填充序列。
在某些实施方案中，病毒基因组在启动子区域之前包含填充序列。在某些实施方案中，病毒基因组在有效载荷区域之前包含填充序列。在某些实施方案中，病毒基因组在内含子区域之前包含填充序列。在某些实施方案中，病毒基因组在增强子区域之前包含填充序列。在某些实施方案中，病毒基因组在聚腺苷酸化信号序列区域之前包含填充序列。在某些实施方案中，病毒基因组在外显子区域之前包含填充序列。
在某些实施方案中，病毒基因组在3'ITR之前包含填充序列。
在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于5'ITR和启动子区域之间。在某些实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5'ITR和有效载荷区域之间。在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于5'ITR和内含子区域之间。在某些实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5'ITR和增强子区域之间。在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于5'ITR和聚腺苷酸化信号序列区域之间。
在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于5'ITR和外显子区域之间。
在某些实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区域和有效载荷区域之间。在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于启动子区域和内含子区域之间。在某些实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区域和增强子区域之间。在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于启动子区域和聚腺苷酸化信号序列区域之间。在某些实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区域和外显子区域之间。在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于启动子区域和3'ITR之间。
在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区域和内含子区域之间。在某些实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区域和增强子区域之间。在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区域和聚腺苷酸化信号序列区域之间。在某些实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区域和外显子区域之间。
在某些实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区域和3'ITR之间。
在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于内含子区域和增强子区域之间。在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于内含子区域和聚腺苷酸化信号序列区域之间。在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于内含子区域和外显子区域之间。在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于内含子区域和3'ITR之间。在某些实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于增强子区域和聚腺苷酸化信号序列区域之间。在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于增强子区域和外显子区域之间。在某些实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于增强子区域和3'ITR之间。
在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于聚腺苷酸化信号序列区域和外显子区域之间。在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于聚腺苷酸化信号序列区域和3'ITR之间。
在某些实施方案中，填充序列可位于两个区域之间，例如但不限于外显子区域和3'ITR之间。
在某些实施方案中，填充序列可来源于慢病毒的区域或部分。
在一些实施方案中，填充序列可来源于白蛋白基因的区域或部分。在某些实施方案中，填充序列可来源于人白蛋白基因(NCBI参考序列：NG_009291.1)的区域或部分。
有效载荷
本公开的AAV颗粒包含至少一个有效载荷区域。如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区域”是指由病毒基因组编码或在病毒基因组内编码的一个或多个多核苷酸或多核苷酸区域，或此类多核苷酸或多核苷酸区域的表达产物，例如转基因、编码多肽或多个多肽的多核苷酸或调节性核酸或调控性核酸。本公开的有效载荷通常编码调节性多核苷酸或其片段或变体。
有效载荷区域的构建方式可反映出类似于或映射mRNA的天然组构的区域。
有效载荷区域可以包含编码和非编码核酸序列的组合。
在一些实施方案中，AAV有效载荷区域可编码编码或非编码RNA。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含具有有效载荷区域的病毒基因组，所述有效载荷区域包含编码siRNA、miRNA或其它RNAi试剂的核酸序列。在这样的实施方案中，编码多于一种多肽的病毒基因组可以被复制并包装到病毒颗粒中。用病毒颗粒转导的靶细胞可以在单个细胞内表达所编码的siRNA、miRNA或其它RNAi试剂。
调节性多核苷酸
在某些实施方案中，调节性多核苷酸，例如RNA或DNA分子，可以用于治疗神经退化疾病，特别是肌萎缩性侧索硬化(ALS)。如本文所用，“调节性多核苷酸”是具有调节(增加或减少)靶基因水平或量(例如mRNA或蛋白水平)的功能的任何核酸序列。
在某些实施方案中，调节性多核苷酸可以包含编码至少一种siRNA分子的至少一种核酸序列。如果存在多于一个，则所述核酸可以独立地编码1、2、3、4、5、6、7、8、9或多于9个siRNA分子。
在某些实施方案中，分子支架可位于CMV启动子、其片段或变体的下游。
在某些实施方案中，分子支架可位于CBA启动子、其片段或变体的下游。
在某些实施方案中，分子支架可以是位于CMV启动子下游的天然pri-miRNA支架。作为非限制性示例，天然pri-miRNA支架源自人miR155支架。
在某些实施方案中，分子支架可以是位于CBA启动子下游的天然pri-miRNA支架。
在某些实施方案中，通过比较pri-miRNA中的调节性多核苷酸的方法来确定分子支架和调节性多核苷酸的选择(参见，例如Miniarikova等人Design,Characterization,and Lead Selection of Therapeutic miRNAs Targeting Huntingtin for Developmentof Gene Therapy for Huntington’s Disease.Molecular Therapy-Nucleic Acids(2016)5,e297和国际公开号WO2016102664中描述的方法；其每一个的内容通过引用整体并入本文)。为了评价调节性多核苷酸的活性，可以使用的分子支架是人pri-miRNA支架(例如，miR155支架)，且启动子可以是CMV。活性可以使用HEK293T细胞和报道分子(例如荧光素酶)在体外测定。
为了评价调节性多核苷酸的最佳分子支架，将调节性多核苷酸用于具有CAG启动子的pri-miRNA支架中。用报道分子(例如荧光素酶报道分子)以50ng共转染构建体。在50ng共转染时敲低大于80％的构建体被认为是有效的。在一个方面，优选具有强的引导链活性的构建体。分子支架可在HEK293T细胞中通过NGS处理，以确定引导-过客比和处理变异性。
为了在体内评价分子支架和调节性多核苷酸，将包含调节性多核苷酸的分子支架包装在AAV中(例如，血清型可以是AAV5(参见例如，WO2015060722中描述的方法和构建体，其内容通过引用整体并入本文))并施用至体内模型，并且可在模型的不同区域(例如，组织区域)中确定引导-过客比、5’和3’末端加工、引导链与过客链的比率和敲低。
在某些实施方案中，通过比较天然pri-miRNA和合成pri-miRNA中的调节性多核苷酸的方法，来确定分子支架和调节多核苷酸的选择。调节性多核苷酸可以，但不限于，靶向外显子1之外的外显子。为了评价调节性多核苷酸的活性，将分子支架与CBA启动子一起使用。在一个方面，可以使用HEK293T细胞、HeLa细胞和报道分子(例如荧光素酶)体外测定活性，并且有效敲低的调节性多核苷酸显示在测试细胞中至少80％的SOD1敲低。另外，被认为最有效的调节性多核苷酸显示低至无显著的过客链(p链)活性。在另一方面，通过使用HEK293T细胞、HeLa细胞和报道分子体外转染，评价内源性SOD1敲低效力。有效的调节性多核苷酸显示大于50％的内源SOD1敲低。在另一方面，通过感染(例如AAV2)在不同细胞类型(例如HEK293、HeLa、原代星形胶质细胞、U251星形胶质细胞、SH-SY5Y神经元细胞和ALS患者的成纤维细胞)中评价内源SOD1敲低效力。有效的调节性多核苷酸显示大于60％的内源SOD1敲低。
为了在体内评价分子支架和调节性多核苷酸，将包含调节性多核苷酸的分子支架包装在AAV中并施用于体内模型，并且可以在模型的不同区域(例如，组织区域)中确定引导-过客比、5’和3’末端加工、引导链与过客链的比率以及敲低。分子支架可以通过NGS在体内样品中加工，以确定引导-过客比和加工变异性。
在某些实施方案中，使用以下性质中的至少一种来设计调节性多核苷酸：环变体、种子错配/凸起/摆动变体、茎错配、环变体和附属茎错配变体、种子错配和基茎错配变体、茎错配和基茎错配变体、种子摆动和基茎摆动变体或茎序列变体。
本公开部分涉及用于治疗神经退行性病症的RNA干扰(RNAi)诱导的基因表达抑制。提供了靶向SOD1基因的siRNA双链体或dsRNA。这类siRNA双链体或dsRNA可沉默细胞例如运动神经元中的SOD1基因表达，因此改善ALS症状如运动死亡和肌肉萎缩。SOD1 siRNA可以在重组AAV载体的多核苷酸中编码。
可以设计和合成靶向特定mRNA的siRNA双链体或dsRNA，作为体外靶向SOD1靶标的多核苷酸的一部分，并将其引入细胞以激活RNAi过程。
siRNA分子
本公开涉及用于治疗神经退行性病症的RNA干扰(RNAi)诱导的基因表达抑制。本文提供了靶向目的基因的siRNA双链体或编码的dsRNA(本文统称为“siRNA分子”)。这类siRNA双链体或编码的dsRNA可以降低或沉默细胞中的基因表达，所述细胞例如但不限于中等多刺神经元(medium spiny neuron)、皮层神经元和/或星形胶质细胞。
RNAi(也称为转录后基因沉默(PTGS)、压制或共抑制)是一种转录后基因沉默过程，其中RNA分子以序列特异性方式抑制基因表达，通常通过引起特定mRNA分子的破坏。RNAi的活性成分是短/小双链RNA(dsRNA)，称为小干扰RNA(siRNA)，其通常含有15-30个核苷酸(例如19-25、19-24或19-21个核苷酸)和2个核苷酸的3’突出端，并与靶基因的核酸序列匹配。这些短RNA物质可以通过Dicer介导的较大dsRNA的裂解在体内天然产生，并且它们在哺乳动物细胞中发挥功能。
天然表达的小RNA分子，称为microRNA(miRNA)，通过调节mRNA的表达引发基因沉默。含有miRNA的RNA诱导沉默复合物(RISC)靶向这样的mRNA，所述mRNA与miRNA的5’区的核苷酸2-7(称为种子区)具有完全序列互补性，并且其他碱基与其3’区配对。miRNA介导的基因表达的下调可能由靶mRNA的裂解、靶mRNA的翻译抑制或mRNA降解引起。miRNA靶向序列通常位于靶mRNA的3'-UTR中。单个miRNA可以靶向来自不同基因的超过100个转录物，并且一个mRNA可以被不同的miRNA靶向。
可以设计并体外合成靶向特定mRNA的siRNA双链体或dsRNA，并将其引入细胞中以激活RNAi过程。Elbashir等人证明，21个核苷酸的siRNA双链体(称为小干扰RNA)能够在哺乳动物细胞中实现有效且特异性的基因敲低而不诱导免疫应答(Elbashir SM等人、Nature、2001、411、494-498)。自从这个最初的报道以来，siRNA导致的转录后基因沉默迅速成为哺乳动物细胞中基因分析的有力工具，并且具有产生新的治疗剂的潜力。
被设计成靶向编码引起聚谷氨酰胺扩张疾病(例如亨廷顿病)的聚谷氨酰胺重复蛋白的核酸序列的RNAi分子描述于美国专利号9,169,483和9,181,544以及国际专利公开号WO2015179525中，其每一个的内容通过引用整体并入本文。美国专利号9,169,483和9,181,544号和国际专利公开号WO2015179525各自提供了包含RNA的第一链(例如，15个连续核苷酸)和RNA的第二链(例如，与第一链的至少12个连续核苷酸互补)的分离的RNA双链体，其中所述RNA双链体的长度为约15至30个碱基对。RNA的第一链和RNA的第二链可以通过RNA环(～4至50个核苷酸)有效地连接，以形成可以插入表达盒中的发夹结构。环部分的非限制性示例包括美国专利号9,169,483的SEQ ID NO：9-14，其内容通过引用整体并入本文。可以用于形成RNA双链体的RNA链(全序列或部分序列)的非限制性示例包括美国专利号9,169,483的SEQ ID NO：1-8和美国专利号9,181,544的SEQ ID NO：1-11、33-59、208-210、213-215和218-221，其每一个的内容通过引用整体并入本文。RNAi分子的非限制性示例包括美国专利号9,169,483的SEQ ID NO：1-8，美国专利号9,181,544的SEQ ID NO：1-11、33-59、208-210、213-215和218-221和国际专利公开号WO2015179525的SEQ ID NO：1、6、7和35-38，其每一个的内容通过引用整体并入本文。
可以将体外合成的siRNA分子导入细胞以激活RNAi。当将外源siRNA双链体引入细胞时，与内源dsRNA相似，可以将其装配以形成RNA诱导沉默复合物(RISC，一种与互补于siRNA双链体的两条链中的一条(即反义链)的RNA序列相互作用的多单位复合物)。在该过程中，siRNA的有义链(或过客链)从复合物中丢失，而siRNA的反义链(或引导链)与其互补RNA匹配。特别地，含有siRNA的RISC复合物的靶标是呈现完全序列互补性的mRNA。然后，通过切割、释放和降解靶标，发生siRNA介导的基因沉默。
与使用单链(ss)-siRNA(例如反义链RNA或反义寡核苷酸)相比，包含与靶mRNA同源的有义链和与靶mRNA互补的反义链的siRNA双链体在破坏靶RNA的效率方面具有更多优势。在许多情况下，需要更高浓度的ss-siRNA以达到相应双链体的有效基因沉默效力。
任何前述分子均可由病毒基因组编码。
靶向目标基因的siRNA双链体的设计和序列
本公开提供了靶向mRNA以干扰基因表达和/或蛋白产生的小干扰RNA(siRNA)双链体(和编码它们的调节性多核苷酸)。
本公开的编码的siRNA双链体含有反义链和有义链，其杂交在一起形成双链体结构，其中反义链与靶基因的核酸序列互补，并且其中有义链与靶基因的核酸序列同源。在一些方面，反义链的5’端具有5’磷酸基团，并且有义链的3’端含有3’羟基。在其它方面，在每条链的3’端不存在、存在一个或2个核苷酸突出。
本领域已经提出了一些设计siRNA的指导方针。这些指导方针通常推荐产生19个核苷酸的双链体区域、对称的2-3个核苷酸的3’突出、5'-磷酸和3'-羟基，靶向待沉默的基因中的区域。其它可以控制siRNA序列偏好的规则包括但不限于(i)反义链5’末端的A/U；(ii)有义链5’末端的G/C；(iii)在反义链的5’末端三分之一中的至少五个A/U残基；和(iv)不存在长度超过9个核苷酸的任何GC延伸段。根据这种考量，结合靶基因的特定序列，可以容易地设计抑制哺乳动物靶基因表达所必需的高效siRNA分子。
根据本公开，设计了靶向目的基因的siRNA分子(例如siRNA双链体或编码的dsRNA)。这类siRNA分子可以特异性地阻抑基因表达和蛋白产生。在一些方面，设计siRNA分子并用于选择性“敲除”细胞中的基因变体，即突变的转录物。在一些方面，设计siRNA分子并用于选择性“敲低”细胞中的基因变体。在其它方面，siRNA分子能够抑制或阻抑目的基因的野生型和突变型二者。
在某些实施方案中，本公开的siRNA分子包含有义链和互补的反义链，其中两条链杂交在一起形成双链体结构。反义链与靶mRNA序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNAi，即siRNA分子具有足以通过RNAi机制或过程触发靶mRNA破坏的序列。
在某些实施例中，本公开的siRNA分子包含有义链和互补的反义链，其中两条链杂交在一起形成双链结构，并且其中与mRNA杂交的起始位点在靶mRNA序列上的核苷酸10和1000之间。作为非限制性示例，起始位点可在靶mRNA序列上的核苷酸10-20、20-30、30-40、40-50、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-70、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000之间。作为另一个非限制性示例，起始位点可以是靶mRNA序列上的核苷酸10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999和1000。
在一些实施方案中，反义链和靶mRNA序列具有100％互补性。反义链可以与靶mRNA序列的任何部分互补。
在其它实施方案中，反义链和靶mRNA序列包含至少一个错配。作为非限制性示例，反义链和靶mRNA序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。
在某些实施方案中，siRNA或dsRNA包括至少两条彼此互补的序列。
根据本公开，siRNA分子具有约10-50个或更多核苷酸的长度，即，每条链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。优选地，siRNA分子在每条链中具有约15-30个，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，其中一条链与靶区域充分互补。在某些实施方案中，siRNA分子的每条链具有约19至25、19至24或19至21个核苷酸的长度。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为19个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为20个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为21个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为22个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为23个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为24个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为25个核苷酸。
在一些实施方案中，本公开的siRNA分子可以是合成的RNA双链体，其包含约19个核苷酸至约25个核苷酸以及在3'-末端的两个突出的核苷酸。在一些方面，siRNA分子可以是未修饰的RNA分子。在其它方面，siRNA分子可以含有至少一个修饰的核苷酸，例如碱基、糖或骨架修饰。
在某些实施方案中，本公开的siRNA分子可以包含反义序列和有义序列，或其片段或变体。作为非限制性示例，反义序列和有义序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。
在其它实施方案中，本公开的siRNA分子可以在用于递送至细胞中的质粒载体、AAV颗粒、病毒基因组或其它核酸表达载体中编码。
DNA表达质粒可用于在细胞中稳定表达本公开的siRNA双链体或dsRNA，并实现靶基因表达的长期抑制。在一个方面，siRNA双链体的有义和反义链通常通过短间隔序列连接，导致称为短发夹RNA(shRNA)的茎环结构的表达。发夹被Dicer识别和切割，从而产生成熟的siRNA分子。
根据本公开，制备包含编码靶向mRNA的siRNA分子的核酸的AAV颗粒，AAV血清型可以是本文所列的任何血清型。AAV血清型的非限制性示例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8、AAV-DJ、AAV-PHP.A、AAV-PHP.B、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5及其变体。
在一些实施方案中，本公开的siRNA双链体或编码的dsRNA阻抑(或降解)靶mRNA。因此，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于基本上抑制细胞例如神经元中的基因表达。在一些方面，基因表达的抑制是指抑制至少约20％，优选至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、99％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-45％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、35-45％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-75％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-65％、57-68％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、85-99％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、99％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-45％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、35-45％,40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-75％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-65％、57-68％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、85-99％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性示例，抑制可以是30-40％。作为非限制性示例，抑制可以是30-45％。作为非限制性示例，抑制可以是35-45％。作为非限制性示例，抑制可以大于50％。作为非限制性示例，抑制可以是50-60％。作为非限制性示例，抑制可以大于60％。作为非限制性示例，抑制可以是50-75％。作为非限制性示例，抑制可以是55-65％。作为非限制性示例，抑制可以是57-68％。作为非限制性示例，抑制可以是70-80％。作为非限制性示例，抑制可以是70-85％。作为非限制性示例，抑制可以是85-99％。作为非限制性示例，抑制可以是35％。作为非限制性示例，抑制可以是36％。作为非限制性示例，抑制可以是40％。作为非限制性示例，抑制可以是41％。作为非限制性示例，抑制可以是43％。作为非限制性示例，抑制可以是45％。作为非限制性示例，抑制可以是49％。作为非限制性示例，抑制可以是62％。作为非限制性示例，抑制可以是64％。作为非限制性示例，抑制可以是74％。作为非限制性示例，抑制可以是77％。作为非限制性示例，抑制可以是84％。作为非限制性示例，抑制可以是87％。作为非限制性示例，抑制可以是95％。作为非限制性示例，抑制可以是99％。作为非限制性示例，抑制可以是100％。
在某些实施方案中，本公开的siRNA双链体或编码的dsRNA阻抑(或降解)脊髓运动神经元中的靶mRNA。在一些方面，基因表达的抑制是指阻抑至少约20％，优选至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、99％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-45％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、35-45％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-75％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-65％、57-68％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、85-99％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、99％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-45％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、35-45％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-75％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-65％、57-68％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、85-99％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性示例，抑制可以是30-45％。作为非限制性示例，抑制可以是35-45％。作为非限制性示例，抑制可以大于50％。作为非限制性示例，抑制可以大于60％。作为非限制性示例，抑制可以是50-60％。作为非限制性示例，抑制可以是55-65％。作为非限制性示例，抑制可以是50-75％。作为非限制性示例，抑制可以是57-68％。作为非限制性示例，抑制可以是70-80％。作为非限制性示例，抑制可以是70-85％。作为非限制性示例，抑制可以是85-99％。作为非限制性示例，抑制可以是35％。作为非限制性示例，抑制可以是36％。作为非限制性示例，抑制可以是40％。作为非限制性示例，抑制可以是41％。作为非限制性示例，抑制可以是43％。作为非限制性示例，抑制可以是45％。作为非限制性示例，抑制可以是49％。作为非限制性示例，抑制可以是62％。作为非限制性示例，抑制可以是64％。作为非限制性示例，抑制可以是74％。作为非限制性示例，抑制可以是77％。作为非限制性示例，抑制可以是84％。作为非限制性示例，抑制可以是87％。作为非限制性示例，抑制可以是95％。作为非限制性示例，抑制可以是99％。作为非限制性示例，抑制可以是100％。
在某些实施方案中，本公开的siRNA双链体或编码的dsRNA将脊髓运动神经元中的靶mRNA阻抑(或降解)78％。
在某些实施方案中，本公开的siRNA双链体或编码的dsRNA将脊髓运动神经元中的靶mRNA阻抑(或降解)45-55％。
在某些实施方案中，本公开的siRNA双链体或编码的dsRNA阻抑(或降解)运动神经元形态的vg+细胞中的靶mRNA。在一些方面，基因表达的抑制是指抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。
在某些实施方案中，本公开的siRNA双链体或编码的dsRNA将运动神经元形态的vg+细胞中的靶mRNA阻抑(或降解)53％。
在某些实施方案中，siRNA分子包含位于引导链中的针对靶标的miRNA种子匹配。在另一个实施方案中，siRNA分子包含位于过客链中的针对靶标的miRNA种子匹配。在另一个实施方案中，靶向目的基因的siRNA双链体或编码的dsRNA不包含位于引导链或过客链中的针对靶标的种子匹配。
在某些实施方案中，靶向目的基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对引导链可几乎没有显著的全长脱靶效应。在另一个实施方案中，靶向目的基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对过客链可几乎没有显著的全长脱靶效应。靶向目的基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对于过客链可具有小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。在另一个实施方案中，靶向目的基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对引导链或过客链可几乎没有显著的全长脱靶效应。靶向目的基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对引导链或过客链可具有小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。
在某些实施方案中，靶向目的基因的siRNA双链体或编码的dsRNA在体外可具有高活性。在另一个实施方案中，siRNA分子在体外可能具有低活性。在另一个实施方案中，靶向目的基因的siRNA双链体或dsRNA在体外可具有高引导链活性和低过客链活性。
在某些实施方案中，siRNA分子在体外具有高引导链活性和低过客链活性。引导链的靶敲低(KD)可以为至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％。引导链的靶敲低可以是40-50％、45-50％、50-55％、50-60％、60-65％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、60-99％、60-99.5％、60-100％、65-70％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、65-99％、65-99.5％、65-100％、70-75％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、70-99％、70-99.5％、70-100％、75-80％、75-85％、75-90％、75-95％、75-99％、75-99.5％、75-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-99.5％、80-100％、85-90％、85-95％、85-99％、85-99.5％、85-100％、90-95％、90-99％、90-99.5％、90-100％、95-99％、95-99.5％、95-100％、99-99.5％、99-100％或99.5-100％。作为非限制性示例，引导链的靶敲低(KD)大于70％。作为非限制性示例，引导链的靶敲低(KD)大于60％。
在某些实施方案中，在注射位点周围观察到siRNA分子递送的最高敲低。
在某些实施方案中，在递送siRNA分子后，在腹角和注射位点周围观察到敲低。
在某些实施方案中，设计siRNA双链体使得有义或反义序列与非目的基因序列没有miRNA种子匹配。
在某些实施方案中，针对最接近脱靶(the nearest off target)的引导链的IC50大于针对中靶基因的引导链的IC50乘以100。作为非限制性示例，如果针对最接近脱靶的引导链的IC50大于针对靶的引导链的IC50乘以100，则认为siRNA分子具有高的引导链用于在体外抑制目的基因的选择性。
在某些实施方案中，引导链的5’加工在体外或体内的至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的时间在5’末端处具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，引导链的5’加工是精确的，并且在体外至少99％的时间在5’末端具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，引导链的5’加工是精确的，并且在体内至少99％的时间在5’末端具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，引导链的5’加工是精确的，并且在体外至少90％的时间在5’末端具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，引导链的5’加工是精确的，并且在体内至少90％的时间在5’末端具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，引导链的5’加工是精确的，并且在体外至少85％的时间在5’末端具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，引导链的5’加工是精确的，并且在体内至少85％的时间在5’末端具有正确的起点(n)。
在某些实施方案中，在体外或体内，所表达的过客链与引导链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例为1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1；1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。引导链与过客链的比例是指在pri-microRNA的细胞内加工后引导链与过客链的比例。例如，80:20的引导链与过客链的比例表示针对从前体加工的每2条过客链具有8条引导链。作为非限制性示例，在体外，引导链与过客链的比例为8:2。作为非限制性示例，在体内，引导链与过客链的比例为8:2。作为非限制性示例，在体外，引导链与过客链的比例为9:1。作为非限制性示例，在体内，引导链与过客链的比例为9:1。
在某些实施方案中，引导链与过客链(G：P)的比例在1-99、1.3-99、5-99、10-99、15-99、20-99、25-99、30-99、35-99、40-99、45-99、50-99、55-99、60-99、65-99、70-99、75-99、80-99、85-99、90-99、95-99、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-55、10-60、10-65、10-70、10-75、10-80、10-85、10-90、10-95、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-45、15-50、15-55、15-60、15-65、15-70、15-75、15-80、15-85、15-90、15-95、20-25、20-30、20-35、20-40、20-45、20-50、20-55、20-60、20-65、20-70、20-75、20-80、20-85、20-90、20-95、25-30、25-35、25-40、25-45、25-50、25-55、25-60、25-65、25-70、25-75、25-80、25-85、25-90、25-95、30-35、30-40、30-45、30-50、30-55、30-60、30-65、30-70、30-75、30-80、30-85、30-90、30-95、35-40、35-45、35-50、35-55、35-60、35-65、35-70、35-75、35-80、35-85、35-90、35-95、40-45、40-50、40-55、40-60、40-65、40-70、40-75、40-80、40-85、40-90、40-95、45-50、45-55、45-60、45-65、45-70、45-75、45-80、45-85、45-90、45-95、50-55、50-60、50-65、50-70、50-75、50-80、50-85、50-90、50-95、55-60、55-65、55-70、55-75、55-80、55-85、55-90、55-95、60-65、60-70、60-75、60-80、60-85、60-90、60-95、65-70、65-75、65-80、65-85、65-90、65-95、70-75、70-80、70-85、70-90、70-95、75-80、75-85、75-90、75-95、80-85、80-90、80-95、85-90、85-95或90-95的范围内。作为非限制性示例，引导链与过客链的比例在1.3至99的范围内。作为非限制性示例，引导链与过客链的比例在10到99的范围内。
在某些实施方案中，引导链与过客链(G：P)的比例为10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5、40、40.5、41、41.5、42、42.5、43、43.5、44、44.5、45、45.5、46、46.5、47、47.5、48、48.5、49、49.5、50、50.5、51、51.5、52、52.5、53、53.5、54、54.5、55、55.5、56、56.5、57、57.5、58、58.5、59、59.5、60、60.5、61、61.5、62、62.5、63、63.5、64、64.5、65、65.5、66、66.5、67、67.5、68、68.5、69、69.5、70、70.5、71、71.5、72、72.5、73、73.5、74、74.5、75、75.5、76、76.5、77、77.5、78、78.5、79、79.5、80、80.5、81、81.5、82、82.5、83、83.5、84、84.5、85、85.5、86、86.5、87、87.5、88、88.5、89、89.5、90、90.5、91、91.5、92、92.5、93、93.5、94、94.5、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5或99。作为非限制性示例，引导链与过客链(G：P)的比例为11.5。作为非限制性示例，引导链与过客链(G：P)的比例为99。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例大于1。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例大于2。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例大于5。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例大于10。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例大于20。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例大于50。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例大于300。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例为314。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例大于400。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例为434。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例为至少3:1。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例为至少5:1。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例为至少10:1。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例为至少20:1。
在某些实施方案中，所表达的引导链与过客链(G：P)(也称为反义链与有义链)的比例为至少50:1。
在某些实施方案中，在体外或体内，所表达的过客链与引导链(P：G)(也称为有义链与反义链)的比例为1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1；1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。过客链与引导链的比例是指在pri-microRNA的细胞内加工后过客链与引导链的比例。例如，80:20的过客链与引导链的比例表示针对从前体加工的每2条引导链具有8条过客链。作为非限制性示例，在体外，过客链与引导链的比例为80:20。作为非限制性示例，在体内，过客链与引导链的比例为80:20。作为非限制性示例，在体外，过客链与引导链的比例为8:2。作为非限制性示例，在体内，过客链与引导链的比例为8:2。作为非限制性示例，在体外，过客链与引导链的比例为9:1。作为非限制性示例，在体内，过客链与引导链的比例为9:1。
在某些实施方案中，过客链与引导链(P：G)的比例范围在1-99、1.3-99、5-99、10-99、15-99、20-99、25-99、30-99、35-99、40-99、45-99、50-99、55-99、60-99、65-99、70-99、75-99、80-99、85-99、90-99、95-99、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-55、10-60、10-65、10-70、10-75、10-80、10-85、10-90、10-95、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-45、15-50、15-55、15-60、15-65、15-70、15-75、15-80、15-85、15-90、15-95、20-25、20-30、20-35、20-40、20-45、20-50、20-55、20-60、20-65、20-70、20-75、20-80、20-85、20-90、20-95、25-30、25-35、25-40、25-45、25-50、25-55、25-60、25-65、25-70、25-75、25-80、25-85、25-90、25-95、30-35、30-40、30-45、30-50、30-55、30-60、30-65、30-70、30-75、30-80、30-85、30-90、30-95、35-40、35-45、35-50、35-55、35-60、35-65、35-70、35-75、35-80、35-85、35-90、35-95、40-45、40-50、40-55、40-60、40-65、40-70、40-75、40-80、40-85、40-90、40-95、45-50、45-55、45-60、45-65、45-70、45-75、45-80、45-85、45-90、45-95、50-55、50-60、50-65、50-70、50-75、50-80、50-85、50-90、50-95、55-60、55-65、55-70、55-75、55-80、55-85、55-90、55-95、60-65、60-70、60-75、60-80、60-85、60-90、60-95、65-70、65-75、65-80、65-85、65-90、65-95、70-75、70-80、70-85、70-90、70-95、75-80、75-85、75-90、75-95、80-85、80-90、80-95、85-90、85-95或90-95内。
在某些实施方案中，过客链与引导链(P：G)的比例为10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5、40、40.5、41、41.5、42、42.5、43、43.5、44、44.5、45、45.5、46、46.5、47、47.5、48、48.5、49、49.5、50、50.5、51、51.5、52、52.5、53、53.5、54、54.5、55、55.5、56、56.5、57、57.5、58、58.5、59、59.5、60、60.5、61、61.5、62、62.5、63、63.5、64、64.5、65、65.5、66、66.5、67、67.5、68、68.5、69、69.5、70、70.5、71、71.5、72、72.5、73、73.5、74、74.5、75、75.5、76、76.5、77、77.5、78、78.5、79、79.5、80、80.5、81、81.5、82、82.5、83、83.5、84、84.5、85、85.5、86、86.5、87、87.5、88、88.5、89、89.5、90、90.5、91、91.5、92、92.5、93、93.5、94、94.5、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5或99。
在某些实施方案中，所表达的过客链与引导链(P：G)(也称为有义链与反义链)的比例大于1。
在某些实施方案中，所表达的过客链与引导链(P：G)(也称为有义链与反义链)的比例大于2。
在某些实施方案中，所表达的过客链与引导链(P：G)(也称为有义链与反义链)的比例大于5。
在某些实施方案中，所表达的过客链与引导链(P：G)(也称为有义链与反义链)的比例大于10。
在某些实施方案中，所表达的过客链与引导链(P：G)(也称为有义链与反义链)的比例大于20。
在某些实施方案中，所表达的过客链与引导链(P：G)(也称为有义链与反义链)的比例大于50。
在某些实施方案中，所表达的过客链与引导链(P：G)(也称为有义链与反义链)的比例为至少3:1。
在某些实施方案中，所表达的过客链与引导链(P：G)(也称为有义链与反义链)的比例为至少5:1。
在某些实施方案中，所表达的过客链与引导链(P：G)(也称为有义链与反义链)的比例为至少10:1。
在某些实施方案中，所表达的过客链与引导链(P：G)(也称为有义链与反义链)的比例为至少20:1。
在某些实施方案中，所表达的过客链与引导链(P：G)(也称为有义链与反义链)的比例为至少50:1。
在某些实施方案中，当测量加工时，在pri-或pre-microRNA表现出(通过本领域已知和本文所述的方法)引导链与过客链的比例大于2倍时，认为过客链-引导链双链体是有效的。作为非限制性示例，当测量加工时，pri-或pre-microRNA表现出引导链与过客链的比例大于2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍或2至5倍、2至10倍、2至15倍、3至5倍、3至10倍、3至15倍、4至5倍、4至10倍、4至15倍、5至10倍、5至15倍、6至10倍、6至15倍、7至10倍、7至15倍、8至10倍、8至15倍、9至10倍、9至15倍、10至15倍、11至15倍、12至15倍、13至15倍或14至15倍。
在某些实施方案中，编码dsRNA的载体基因组包含占构建体全长的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或超过99％的序列。作为非限制性示例，载体基因组包含构建体全长序列的至少80％的序列。
在某些实施方案中，siRNA分子可用于通过靶向目的基因序列上的至少一个外显子而沉默野生型或突变型的目的基因。外显子可以是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66和/或外显子67。
靶向SOD1基因的siRNA双链体的设计和序列
本公开提供了小干扰RNA(siRNA)双链体(和编码它们的调节性多核苷酸)，其靶向SOD1 mRNA，以干扰SOD1基因表达和/或SOD1蛋白产生。
本公开的编码的siRNA双链体含有反义链和有义链，其杂交在一起形成双链体结构，其中反义链与靶向的SOD1基因的核酸序列互补，并且其中有义链与靶向的SOD1基因的核酸序列同源。在一些方面，反义链的5’端具有5’磷酸基团，并且有义链的3’端含有3’羟基。在其它方面，在每条链的3’端不存在、存在一个或2个核苷酸突出。
本领域已经提出了一些设计siRNA的指导方针。这些指导方针通常推荐产生19个核苷酸的双链体区域、对称的2-3个核苷酸的3’突出、5'-磷酸和3'-羟基，靶向待沉默的基因中的区域。其它可以控制siRNA序列偏好的规则包括但不限于(i)反义链5’末端的A/U；(ii)有义链5’末端的G/C；(iii)在反义链的5’末端三分之一中的至少五个A/U残基；和(iv)不存在长度超过9个核苷酸的任何GC延伸段。根据这种考量，结合靶基因的特定序列，可以容易地设计阻抑SOD1基因表达必需的高效siRNA分子。
根据本公开，设计了靶向SOD1基因的siRNA分子(例如，siRNA双链体或编码的dsRNA)。此类siRNA分子可以特异性地阻抑SOD1基因表达和蛋白产生。在一些方面，设计siRNA分子并用于选择性“敲除”细胞中的SOD1基因变体，即在ALS疾病患者中鉴定的突变的SOD1转录物。在一些方面，设计siRNA分子并用于选择性“敲低”细胞中的SOD1基因变体。在其它方面，siRNA分子能够抑制或阻抑野生型和突变的SOD1基因二者。
在某些实施方案中，本公开的siRNA分子包含有义链和互补的反义链，其中两条链杂交在一起形成双链体结构。反义链与SOD1 mRNA序列具有足够的互补性以指导靶特异性RNAi，即siRNA分子具有足以通过RNAi机制或过程触发靶mRNA破坏的序列。
在某些实施方案中，本公开的siRNA分子包含有义链和互补反义链，其中两条链均杂交在一起以形成双链体结构，并且其中与SOD1 mRNA杂交的起始位点在SOD1 mRNA序列上的核苷酸15至1000之间。作为非限制性示例，起始位点可在SOD1 mRNA序列上的核苷酸15-25、15-50、15-75、15-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-70、750-800、800-850、850-900、900-950和950-1000之间。作为另一个非限制性示例，起始位点可以是SOD1 mRNA序列上的核苷酸26、27、28、29、30、32、33、34、35、36、37、74、76、77、78、149、153、157、160、177、192、193、195、196、197、198、199、206、209、210、239、241、261、263、264、268、269、276、278、281、284、290、291、295、296、316、317、329、330、337、350、351、352、354、357、358、364、375、378、383、384、390、392、395、404、406、417、418、469、470、475、476、480、487、494、496、497、501、504、515、518、522、523、524、552、554、555、562、576、577、578、579、581、583、584、585、587、588、589、593、594、595、596、597、598、599、602、607、608、609、610、611、612、613、616、621、633、635、636、639、640、641、642、643、644、645、654、660、661、666、667、668、669、673、677、692、698、699、700、701、706、749、770、772、775、781、800、804、819、829、832、833、851、854、855、857、858、859、861、869、891、892、906、907、912、913、934、944和947。
在一些实施方案中，反义链和靶SOD1 mRNA序列具有100％互补性。反义链可以与靶SOD1 mRNA序列的任何部分互补。
在其它实施方案中，反义链和靶SOD1 mRNA序列包含至少一个错配。作为非限制性示例，反义链和靶SOD1 mRNA序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。
在某些实施方案中，靶向SOD1的siRNA或dsRNA包括至少两条彼此互补的序列。
根据本公开，靶向SOD1的siRNA分子具有约10-50或更多核苷酸的长度，即，每条链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。优选地，siRNA分子在每条链中具有约15-30个，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，其中一条链与靶区域充分互补。在某些实施方案中，siRNA分子的每条链具有约19至25、19至24或19至21个核苷酸的长度。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为19个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为20个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为21个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为22个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为23个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为24个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为25个核苷酸。
在一些实施方案中，本公开的靶向SOD1的siRNA分子可以是合成的RNA双链体，其包含约19个核苷酸至约25个核苷酸，和在3'-末端的两个突出核苷酸。在一些方面，siRNA分子可以是未修饰的RNA分子。在其它方面，siRNA分子可以含有至少一个修饰的核苷酸，例如碱基、糖或骨架修饰。
在某些实施方案中，本公开的靶向SOD1的siRNA分子可包含核苷酸序列，例如但不限于表2中的反义(引导)序列或其片段或变体。作为一个非限制性的例子，本公开的siRNA分子中使用的反义序列至少为表2中的核苷酸序列的30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％。作为另一个非限制性示例，本公开的siRNA分子中使用的反义序列包含表2中核苷酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或多于21个连续核苷酸。作为另一个非限制性示例，本公开的siRNA分子中使用的反义序列包含表2中序列的核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21或18至22。
表2：反义序列
反义ID 序列 SEQ ID NO
A-4002 UAUUAAAGUGAGGACCUGCUU 1
在某些实施方案中，本公开的靶向SOD1的siRNA分子可包含核苷酸序列，例如但不限于表3中的有义(过客)序列或其片段或变体。作为一个非限制性示例，本公开的siRNA分子中使用的有义序列至少为表3中核苷酸序列的30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％。作为另一个非限制性示例，本公开的siRNA分子中使用的有义序列包含表3中核苷酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或多于21个连续核苷酸。作为另一个非限制性示例，本公开的siRNA分子中使用的有义序列包含表3中序列的核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21或18至22。
表3：有义序列
有义ID 序列 SEQ ID NO
S-4003 GCAGGUCCUCACUUUAAUGCU 2
在某些实施方案中，本公开的靶向SOD1的siRNA分子可包含表2的反义序列和表3的有义序列，或其片段或变体。作为非限制性示例，反义序列和有义序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。
在某些实施方案中，本公开的靶向SOD1的siRNA分子可包含表4所述的有义和反义siRNA双链体。作为非限制性示例，可以测试这些siRNA双链体对内源性SOD1基因表达的体外抑制活性。
表4：SOD1 dsRNA的有义和反义链序列
Figure BDA0002938829440000711
在其它实施方案中，本公开的靶向SOD1的siRNA分子可以在用于递送至细胞中的质粒载体、AAV颗粒、病毒基因组或其它核酸表达载体中编码。
DNA表达质粒可用于在细胞中稳定表达本公开的靶向SOD1的siRNA双链体或dsRNA，并实现靶基因表达的长期抑制。在一个方面，siRNA双链体的有义和反义链通常通过短间隔序列连接，导致称为短发夹RNA(shRNA)的茎环结构的表达。发夹被Dicer识别和切割，从而产生成熟的siRNA分子。
根据本公开，制备包含编码靶向SOD1 mRNA的siRNA分子的核酸的AAV颗粒，AAV血清型可以是本文所列的任何血清型。AAV血清型的非限制性示例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8、AAV-DJ、AAV-PHP.A和/或AAV-PHP.B、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5及其变体。
在一些实施方案中，本公开的siRNA双链体或编码的dsRNA阻抑(或降解)SOD1mRNA。因此，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于基本上抑制细胞中的SOD1基因表达。在一些方面，SOD1基因表达的抑制是指抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。
根据本公开，设计并检测siRNA分子降低培养细胞中SOD1 mRNA水平的能力。这样的siRNA分子可以形成双链体，例如但不限于包括表4中列出的那些。作为非限制性示例，siRNA双链体可以是siRNA双链体ID D-4012。
在某些实施方案中，siRNA分子包含位于引导链中的针对SOD1的miRNA种子匹配。在另一个实施方案中，siRNA分子包含位于过客链中的针对SOD1的miRNA种子匹配。在另一个实施方案中，靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA在引导链或过客链中不包含针对SOD1的种子匹配。
在某些实施方案中，靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对引导链可具有几乎不显著的全长脱靶效应。在另一个实施方案中，靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对过客链可具有几乎不显著的全长脱靶效应。靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可对过客链具有小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。在另一个实施方案中，靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对引导链或过客链可具有几乎不显著的全长脱靶效应。靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对于引导链或过客链可具有小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。
在某些实施方案中，靶向SOD1基因的siRNA双链体或编码的dsRNA在体外可具有高活性。在另一个实施方案中，siRNA分子在体外可具有低活性。在另一个实施方案中，靶向SOD1基因的siRNA双链体或dsRNA在体外可具有高引导链活性和低过客链活性。
在某些实施方案中，靶向SOD1的siRNA分子在体外具有高引导链活性和低过客链活性。引导链的靶敲低(KD)可以为至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％。引导链的靶敲低可以是40-50％、45-50％、50-55％、50-60％、60-65％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、60-99％、60-99.5％、60-100％、65-70％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、65-99％、65-99.5％、65-100％、70-75％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、70-99％、70-99.5％、70-100％、75-80％、75-85％、75-90％、75-95％、75-99％、75-99.5％、75-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-99.5％、80-100％、85-90％、85-95％、85-99％、85-99.5％、85-100％、90-95％、90-99％、90-99.5％、90-100％、95-99％、95-99.5％、95-100％、99-99.5％、99-100％或99.5-100％。作为非限制性示例，引导链的靶敲低(KD)大于70％。作为非限制性示例，引导链的靶敲低(KD)大于60％。
在某些实施方案中，设计靶向SOD1的siRNA双链体，使得有义或反义序列没有对于非SOD1序列的miRNA种子匹配。
在某些实施方案中，针对最接近脱靶的靶向SOD1的siRNA双链体中引导链的IC50大于针对中靶基因SOD1的引导链的IC50乘以100。作为非限制性示例，如果针对最接近脱靶的引导链的IC50大于针对靶标的引导链的IC50乘以100，则认为siRNA分子具有高引导链用于体外抑制SOD1的选择性。
在某些实施方案中，靶向SOD1的siRNA双链体的引导链的5’加工在体外或体内的至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的时间在5’末端具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，引导链的5’加工是精确的，并且在体外至少99％的时间在5’末端具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，引导链的5’加工是精确的，并且在体内至少99％的时间在5’末端具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，引导链的5’加工是精确的，并且在体外至少90％的时间在5’末端具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，引导链的5’加工是精确的，并且在体内至少90％的时间在5’末端具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，引导链的5’加工是精确的，并且在体外至少85％的时间在5’末端具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，引导链的5’加工是精确的，并且在体内至少85％的时间在5’末端具有正确的起点(n)。
在某些实施方案中，靶向SOD1的siRNA双链体的引导链的5’加工在5’端在75-95％、75-90％、75-85％、75-80％、80-95％、80-90％、80-85％、85-95％、85-90％或90-95％范围内具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，靶向SOD1的siRNA双链体的引导链的5’加工在5’末端在75-95％的范围内具有正确的起点(n)。
在某些实施方案中，靶向SOD1的siRNA双链体的引导链的5'加工在5'端针对所表达构建体的75％、75.1％、75.2％、75.3％、75.4％、75.5％、75.6％、75.7％、75.8％、75.9％、76％、76.1％、76.2％、76.3％、76.4％、76.5％、76.6％、76.7％、76.8％、76.9％、77％、77.1％、77.2％、77.3％、77.4％、77.5％、77.6％、77.7％、77.8％、77.9％、78％、78.1％、78.2％、78.3％、78.4％、78.5％、78.6％、78.7％、78.8％、78.9％、79％、79.1％、79.2％、79.3％、79.4％、79.5％、79.6％、79.7％、79.8％、79.9％、80％、80.1％、80.2％、80.3％、80.4％、80.5％、80.6％、80.7％、80.8％、80.9％、81％、81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％、81.6％、81.7％、81.8％、81.9％、82％、82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％、82.6％、82.7％、82.8％、82.9％、83％、83.1％、83.2％、83.3％、83.4％、83.5％、83.6％、83.7％、83.8％、83.9％、84％、84.1％、84.2％、84.3％、84.4％、84.5％、84.6％、84.7％、84.8％、84.9％、85％、85.1％、85.2％、85.3％、85.4％、85.5％、85.6％、85.7％、85.8％、85.9％、86％、86.1％、86.2％、86.3％、86.4％、86.5％、86.6％、86.7％、86.8％、86.9％、87％、87.1％、87.2％、87.3％、87.4％、87.5％、87.6％、87.7％、87.8％、87.9％、88％、88.1％、88.2％、88.3％、88.4％、88.5％、88.6％、88.7％、88.8％、88.9％、89％、89.1％、89.2％、89.3％、89.4％、89.5％、89.6％、89.7％、89.8％、89.9％、90％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％或95％具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，靶向SOD1的siRNA双链体的引导链的5'加工在5'末端针对81％的所表达构建体具有正确的起点(n)。作为非限制性示例，靶向SOD1的siRNA双链体的引导链的5'加工在5'末端针对所表达的90％构建体具有正确的起点(n)。
在某些实施方案中，当测定加工时，在pri-或pre-microRNA表现出(通过本领域已知和本文所述的方法)引导链与过客链的比例大于2倍时，认为针对SOD1的过客-引导链双链体是有效的。作为非限制性示例，当测量加工时，pri-或pre-microRNA表现出引导链与过客链的比例大于2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍或2至5倍、2至10倍、2至15倍、3至5倍、3至10倍、3至15倍、4至5倍、4至10倍、4至15倍、5至10倍、5至15倍、6至10倍、6至15倍、7至10倍、7至15倍、8至10倍、8至15倍、9至10倍、9至15倍、10至15倍、11至15倍、12至15倍、13至15倍或14至15倍。
在某些实施方案中，siRNA分子可用于通过靶向SOD1序列上的至少一个外显子而沉默野生型或突变型SOD1。外显子可以是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66和/或外显子67。
在某些实施方案中，引导链相对于miRNA的总内源库的范围为0.001-0.6％、0.005-0.6％、0.01-0.6％、0.015-0.6％、0.02-0.6％、0.025-0.6％、0.03-0.6％、0.035-0.6％、0.04-0.6％、0.045-0.6％、0.05-0.6％、0.055-0.6％、0.06-0.6％、0.065-0.6％、0.07-0.6％、0.075-0.6％、0.08-0.6％、0.085-0.6％、0.09-0.6％、0.095-0.6％、0.1-0.6％、0.15-0.6％、0.2-0.6％、0.25-0.6％、0.3-0.6％、0.35-0.6％、0.4-0.6％、0.45-0.6％、0.5-0.6％、0.55-0.6％、0.001-0.5％、0.005-0.5％、0.01-0.5％、0.015-0.5％、0.02-0.5％、0.025-0.5％、0.03-0.5％、0.035-0.5％、0.04-0.5％、0.045-0.5％、0.05-0.5％、0.055-0.5％、0.06-0.5％、0.065-0.5％、0.07-0.5％、0.075-0.5％、0.08-0.5％、0.085-0.5％、0.09-0.5％、0.095-0.5％、0.1-0.5％、0.15-0.5％、0.2-0.5％、0.25-0.5％、0.3-0.5％、0.35-0.5％、0.4-0.5％、0.45-0.5％、0.001-0.4％、0.005-0.4％、0.01-0.4％、0.015-0.4％、0.02-0.4％、0.025-0.4％、0.03-0.4％、0.035-0.4％、0.04-0.4％、0.045-0.4％、0.05-0.4％、0.055-0.4％、0.06-0.4％、0.065-0.4％、0.07-0.4％、0.075-0.4％、0.08-0.4％、0.085-0.4％、0.09-0.4％、0.095-0.4％、0.1-0.4％、0.15-0.4％、0.2-0.4％、0.25-0.4％、0.3-0.4％、0.35-0.4％、0.001-0.3％、0.005-0.3％、0.01-0.3％、0.015-0.3％、0.02-0.3％、0.025-0.3％、0.03-0.3％、0.035-0.3％、0.04-0.3％、0.045-0.3％、0.05-0.3％、0.055-0.3％、0.06-0.3％、0.065-0.3％、0.07-0.3％、0.075-0.3％、0.08-0.3％、0.085-0.3％、0.09-0.3％、0.095-0.3％、0.1-0.3％、0.15-0.3％、0.2-0.3％、0.25-0.3％、0.001-0.2％、0.005-0.2％、0.01-0.2％、0.015-0.2％、0.02-0.2％、0.025-0.2％、0.03-0.2％、0.035-0.2％、0.04-0.2％、0.045-0.2％、0.05-0.2％、0.055-0.2％、0.06-0.2％、0.065-0.2％、0.07-0.2％、0.075-0.2％、0.08-0.2％、0.085-0.2％、0.09-0.2％、0.095-0.2％、0.1-0.2％、0.15-0.2％、0.001-0.1％、0.005-0.1％、0.01-0.1％、0.015-0.1％、0.02-0.1％、0.025-0.1％、0.03-0.1％、0.035-0.1％、0.04-0.1％、0.045-0.1％、0.05-0.1％、0.055-0.1％、0.06-0.1％、0.065-0.1％、0.07-0.1％、0.075-0.1％、0.08-0.1％、0.085-0.1％、0.09-0.1％或0.095-0.1％。作为非限制性示例，范围为0.06-0.6％。作为非限制性示例，范围为0.4-0.5％。
在某些实施方案中，引导链相对miRNA的总内源库的百分比为0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或0.6％。作为非限制性示例，该百分比为0.06％。作为非限制性示例，百分比为0.4％。作为非限制性示例，百分比为0.5％。
siRNA修饰
在一些实施方案中，本公开的siRNA分子，当不作为前体或DNA递送时，可以进行化学修饰以调节RNA分子的一些特征，例如但不限于增加siRNA的体内稳定性。化学修饰的siRNA分子可用于人类治疗应用，并且在不损害siRNA分子的RNAi活性的情况下得到改善。作为非限制性示例，siRNA分子在有义链和反义链两者的3'和5'末端两端修饰。
在一些方面，本公开的siRNA双链体可以含有一个或多个修饰的核苷酸，例如但不限于糖修饰的核苷酸、核碱基修饰和/或主链修饰。在一些方面，siRNA分子可以含有组合的修饰，例如组合的核碱基和主链修饰。
在某些实施方案中，修饰的核苷酸可以是糖修饰的核苷酸。糖修饰的核苷酸包括但不限于2’-氟、2’-氨基和2’-硫代修饰的核糖核苷酸，例如2’-氟修饰的核糖核苷酸。修饰的核苷酸可以在糖部分上修饰，以及具有不是核糖基的糖或其类似物的核苷酸。例如，糖部分可以是或者基于甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4’-硫代核糖和其它糖、杂环或碳环。
在某些实施方案中，修饰的核苷酸可以是核碱基修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，修饰的核苷酸可以是主链修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本公开的siRNA双链体可进一步在主链上包含其它修饰。本文所用的正常“主链”是指DNA或RNA分子中重复的交替糖-磷酸序列。脱氧核糖/核糖在3'-羟基和5'-羟基与磷酸酯基团以酯键(也称为“磷酸二酯”键/连接物(PO连接))连接。PO主链可以被修饰为“硫代磷酸酯主链”(PS连接)。在一些情况下，天然磷酸二酯键可被酰胺键替代，但保留两个糖单元之间的四个原子。这种酰胺修饰可以促进寡核苷酸的固相合成，并增加与siRNA互补物形成的双链体的热力学稳定性。参见例如Mesmaeker等人,Pure&Appl.Chem.,1997,3,437-440，其内容通过引用整体并入本文。
修饰的碱基是指已经通过一个或多个原子或基团的取代或添加而修饰的核苷酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、肌苷和辫苷(queuosine)。核碱基部分上的修饰的一些示例包括但不限于单独地或组合的烷基化、卤化、硫醇化、胺化、酰胺化或乙酰化的碱基。更具体的示例包括，例如，5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和在5位具有修饰的其它核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、4-乙酰胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、2,2-二甲基鸟苷、5-甲基氨乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、脱氮核苷酸(例如7-脱氮-腺苷)、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6-偶氮胸苷、5-甲基-2-硫代尿苷、其它硫代碱基(如2-硫代尿苷和4-硫代尿苷和2-硫代胞苷)、二氢尿苷、假尿苷、辫苷、古嘌苷、萘基和取代的萘基、任何O-和N-烷基化的嘌呤和嘧啶(例如N6-甲基腺苷)、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和修饰的苯基(例如氨基苯酚或2,4,6-三甲氧基苯)、充当G钳位核苷酸(G-clamp nucleotide)的修饰的胞嘧啶、8位取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、羧基羟烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸和烷基羰基烷基化核苷酸。
在某些实施方案中，修饰的核苷酸可以仅在有义链上。
在另一个实施方案中，修饰的核苷酸可以仅在反义链上。
在一些实施方案中，修饰的核苷酸可以在有义链和反义链两者中。
在一些实施方案中，化学修饰的核苷酸不影响反义链与靶mRNA序列配对的能力。
在某些实施方案中，本公开的包含编码siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可编码为多顺反子分子的siRNA分子。siRNA分子可以另外包含siRNA分子的区域之间的一个或多个接头。
分子支架
在某些实施方案中，siRNA分子可以在还包含分子支架的调节性多核苷酸中编码。如本文所用，“分子支架”是框架或起始分子，其形成设计或制备后续分子所依据的序列或结构基础。
在某些实施方案中，分子支架包含至少一个5’侧翼区域。作为非限制性示例，5’侧翼区域可包含5’侧翼序列，其可以是任何长度，并且可以全部或部分源自野生型microRNA序列，或者可以是完全人工的序列。
在一些实施方案中，5’和3’侧翼序列之一或两者不存在。
在一些实施方案中，5’和3’侧翼序列是相同长度。
在一些实施方案中，5’侧翼序列为1-10个核苷酸的长度、5-15个核苷酸的长度、10-30个核苷酸的长度、20-50个核苷酸的长度、大于40个核苷酸的长度、大于50个核苷酸的长度、大于100个核苷酸的长度或大于200个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，5’侧翼序列可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，3’侧翼序列为1-10个核苷酸的长度、5-15个核苷酸的长度、10-30个核苷酸的长度、20-50个核苷酸的长度、大于40个核苷酸的长度、大于50个核苷酸的长度、大于100个核苷酸的长度或大于200个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，3’侧翼序列可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，5’和3’侧翼序列是相同的序列。在一些实施方案中，当彼此比对时，它们相差2％、3％、4％、5％、10％、20％或超过30％。
在某些实施方案中，分子支架包含至少一个3’侧翼区域。作为非限制性示例，3’侧翼区域可包含3’侧翼序列，其可以是任何长度，并且可以全部或部分源自野生型microRNA序列，或者可以是完全人工的序列。
在某些实施方案中，分子支架包含至少一个环基序区域。作为非限制性示例，环基序区域可以包含任何长度的序列。
在某些实施方案中，分子支架包含5’侧翼区域、环基序区域和/或3’侧翼区域。
在某些实施方案中，本文所述的至少一种siRNA、miRNA或其它RNAi剂可以由调节性多核苷酸编码，所述调节性多核苷酸还可以包含至少一种分子支架。分子支架可包含5’侧翼序列，其可以是任何长度，并且可以全部或部分源自野生型microRNA序列，或者可以是完全人工的。3’侧翼序列在大小和来源上可反映5’侧翼序列和/或3’侧翼序列。两侧翼序列中的任一个都可以不存在。3’侧翼序列可任选地含有一个或多个CNNC基序，其中“N”代表任何核苷酸。
形成茎环结构的茎是编码本文所述的至少一种siRNA、miRNA或其它RNAi剂的调节性多核苷酸的最小要求。在一些实施方案中，本文所述的siRNA、miRNA或其它RNAi剂包含至少一种与靶序列部分互补或杂交的核酸序列。在一些实施方案中，有效载荷是siRNA分子或siRNA分子的片段。
在一些实施方案中，调节性多核苷酸的茎环结构的5’臂包含编码有义序列的核酸序列。表3中描述了可以由调节性多核苷酸编码的有义序列或其片段或变体的非限制性示例。
在一些实施方案中，调节性多核苷酸的茎环的3’臂包含编码反义序列的核酸序列。在某些情况下，反义序列在5’最末端包含“G”核苷酸。表2中描述了可以由调节性多核苷酸编码的反义序列或其片段或变体的非限制性示例。
在其它实施方案中，有义序列可以位于调节性多核苷酸的茎环结构的茎的3’臂上，而反义序列位于5’臂上。表2和3中描述了可以由调节性多核苷酸编码的有义和反义序列的非限制性示例。
在某些实施方案中，有义和反义序列可以在它们长度的相当大部分上完全互补。在其它实施方案中，有义序列和反义序列可以独立地跨越链长度的至少50、60、70、80、85、90、95或99％上具有至少70、80、90、95或99％的互补性。
有义序列的同一性和反义序列的同源性都不需要与靶序列100％互补。
在某些实施方案中，将调节性多核苷酸的茎环结构的有义序列和反义序列分开的是环序列(也称为环基序、接头或接头基序)。环序列可以是任何长度，4-30个核苷酸之间，4-20个核苷酸之间，4-15个核苷酸之间，5-15个核苷酸之间，6-12个核苷酸之间，6个核苷酸，7个核苷酸，8个核苷酸，9个核苷酸，10个核苷酸，11个核苷酸，12个核苷酸，13个核苷酸，14个核苷酸，和/或15个核苷酸。
在一些实施方案中，环序列包含编码至少一个UGUG基序的核酸序列。在一些实施方案中，编码UGUG基序的核酸序列位于环序列的5’末端。
在某些实施方案中，调节性多核苷酸中可以存在间隔区，以将一个或多个模块(例如，5’侧翼区域、环基序区域、3’侧翼区域、有义序列、反义序列)彼此分开。可以存在一个或多个这样的间隔区域。
在某些实施方案中，在有义序列和侧翼区域序列之间可以存在8-20个，即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的间隔区域。
在某些实施方案中，间隔区域的长度为13个核苷酸，并且位于有义序列的5’末端和侧翼序列的3’末端之间。在某些实施方案中，间隔区域具有足够的长度以形成所述序列的大约一个螺旋转角。
在某些实施方案中，反义序列和侧翼序列之间可存在8-20个，即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的间隔区域。
在某些实施方案中，间隔区序列在10-13个之间，即10、11、12或13个核苷酸，并且位于反义序列的3’末端和侧翼序列的5’末端之间。在某些实施方案中，间隔区具有足够的长度以形成所述序列的大约一个螺旋转角。
在某些实施方案中，调节性多核苷酸的分子支架在5’至3’方向上包含5’侧翼序列、5’臂、环基序、3’臂和3’侧翼序列。作为非限制性示例，5’臂可包含编码有义序列的核酸序列，并且3’臂包含编码反义序列的核酸序列。在另一个非限制性示例中，5’臂包含编码反义序列的核酸序列，并且3’臂包含编码有义序列的核酸序列。
在某些实施方案中，5’臂、有义和/或反义序列、环基序和/或3’臂序列可以改变(例如，取代1个或更多个核苷酸、添加核苷酸和/或缺失核苷酸)。改变可以引起构建体功能的有益改变(例如，增加靶序列的敲低，减少构建体的降解，减少脱靶效应，增加有效载荷的效率，和减少有效载荷的降解)。
在某些实施方案中，将调节性多核苷酸的分子支架进行比对，以使引导链(在本文中也称为反义链)的切除率大于过客链(在本文中也称为有义链)的切除率。引导链或过客链的切除率可以独立地为1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％。作为非限制性示例，引导链的切除率为至少80％。作为另一个非限制性示例，引导链的切除率为至少90％。
在某些实施方案中，引导链的切除率大于过客链的切除率。在一个方面，引导链的切除率可以比过客链大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％。
在某些实施方案中，引导链的切除效率为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％。作为非限制性示例，引导链的切除效率大于80％。
在某些实施方案中，引导链的切除效率大于过客链从分子支架的切除。引导链的切除可以比过客链从分子支架的切除效率高2、3、4、5、6、7、8、9、10或10倍以上。
在某些实施方案中，分子支架包含双功能靶向调节性多核苷酸。如本文所用，“双功能靶向”调节性多核苷酸是引导链和过客链均敲低相同靶标或引导链和过客链敲低不同靶标的多核苷酸。
在某些实施方案中，本文所述的调节性多核苷酸的分子支架可包含5’侧翼区域、环基序区域和3’侧翼区域。在表5-7中显示了本文所述的调节性多核苷酸中可以使用的5’侧翼区域、环基序区域(也可以称为接头区域)和3’侧翼区域的序列或其片段的非限制性示例。
表5：分子支架的5’侧翼区域
Figure BDA0002938829440000861
表6：分子支架的环基序区域
Figure BDA0002938829440000862
表7：分子支架的3'侧翼区域
Figure BDA0002938829440000863
Figure BDA0002938829440000871
在某些实施方案中，分子支架可包含表5中所列的至少一个5’侧翼区域、其片段或变体。作为非限制性示例，5’侧翼区域可以是5F1。
在某些实施方案中，分子支架可包含至少一个5F1侧翼区域。
在某些实施方案中，分子支架可以包含表6中列出的至少一个环基序区域、其片段或变体。作为非限制性示例，环基序区域可以是L1。
在某些实施方案中，分子支架可包含至少一个L1环基序区域。
在某些实施方案中，分子支架可包含表7中所列的至少一个3’侧翼区域、其片段或变体。作为非限制性示例，3’侧翼区域可以是3F1。
在某些实施方案中，分子支架可包含至少一个3F1侧翼区域。
在某些实施方案中，分子支架可包含至少一个5’侧翼区域、其片段或变体，和至少一个环基序区域、其片段或变体，如表5和6中所述。作为非限制性示例，5’侧翼区域和环基序区域可以是5F1和L1。
在某些实施方案中，分子支架可包含至少一个3’侧翼区域、其片段或变体，和至少一个基序区域、其片段或变体，如表6和7中所述。作为非限制性示例，3’侧翼区域和环基序区域可以是3F1和L1。
在某些实施方案中，分子支架可包含至少一个5’侧翼区域、其片段或变体，和至少一个3’侧翼区域、其片段或变体，如表5和7中所述。作为非限制性示例，侧翼区域可以是5F1和3F1。
在某些实施方案中，分子支架可包含至少一个5’侧翼区域、其片段或变体，至少一个环基序区域、其片段或变体和至少一个3’侧翼区域，如表5-7中所述。作为非限制性的例子，侧翼区域和环基序区域可以是5F1、L1和3F1。
在某些实施方案中，分子支架可以是天然pri-miRNA支架。作为非限制性示例，分子支架可以是源自人miR155支架的支架。
在某些实施方案中，分子支架可包含一个或多个本领域已知的接头。接头可以将多个区域或一个分子支架与另一个分开。作为非限制性示例，分子支架可以是多顺反子的。
包含靶向SOD1的分子支架和siRNA分子的调节性多核苷酸
在某些实施方案中，调节性多核苷酸可以包含表8中所述的5’和3’侧翼区域、环基序区域以及编码有义序列和反义序列的核酸序列。在表8中，描述了过客链和引导链的DNA序列标识符以及5’和3’侧翼区域和环区域(也称为接头区域)。在表8中，序列名称的“miR”部分不一定对应于miRNA基因的序列编号(例如，VOYSOD1miR-102是序列的名称，并不一定意味着miR-102是序列的一部分)。
表8：SOD1调节性多核苷酸序列区域(5’至3’)
Figure BDA0002938829440000881
包含调节性多核苷酸的AAV颗粒
在某些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组具有包含调节性多核苷酸序列的有效载荷区。在这样的实施方案中，编码多于一种多肽的病毒基因组可以复制并包装到病毒颗粒中。用包含调节性多核苷酸的病毒颗粒转导的靶细胞可以在单个细胞中表达编码的有义和/或反义序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒可用于治疗、预防、缓解或改善神经疾病和/或病症的医学领域。
在某些实施方案中，可将包含调节性多核苷酸序列的AAV颗粒导入哺乳动物细胞，所述调节性多核苷酸序列包含编码至少一种siRNA分子的核酸序列。
当AAV颗粒有效载荷区域包含调节性多核苷酸时，该调节性多核苷酸可包含有义和/或反义序列以敲低靶基因。编码本文所述的调节性多核苷酸的AAV病毒基因组可用于人类疾病、病毒、感染性兽医应用领域以及多种体内和体外环境。
在某些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个反向末端重复(ITR)区域。ITR区域的长度可独立地是例如但不限于75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174和175个核苷酸。所述病毒基因组的ITR区域的长度可以是75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175和170-175个核苷酸。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的ITR。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约141个核苷酸的ITR。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约130个核苷酸的ITR。
在某些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含两个反向末端重复(ITR)区域。每个ITR区域的长度可独立地是例如但不限于75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174和175个核苷酸。所述病毒基因组的ITR区域的长度可以是75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175和170-175个核苷酸。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸和长度为141个核苷酸的ITR。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸和长度为130个核苷酸的ITR。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约130个核苷酸和长度为141个核苷酸的ITR。
在某些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含两个ITR序列区域。
在某些实施例中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个多填充序列区域。填充区域的长度可以独立地是诸如但不限于50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073、1074、1075、1076、1077、1078、1079、1080、1081、1082、1083、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096、1097、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1121、1122、1123、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1136、1137、1138、1139、1140、1141、1142、1143、1144、1145、1146、1147、1148、1149、1150、1151、1152、1153、1154、1155、1156、1157、1158、1159、1160、1161、1162、1163、1164、1165、1166、1167、1168、1169、1170、1171、1172、1173、1174、1175、1176、1177、1178、1179、1180、1181、1182、1183、1184、1185、1186、1187、1188、1189、1190、1191、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1198、1199、1200、1201、1202、1203、1204、1205、1206、1207、1208、1209、1210、1211、1212、1213、1214、1215、1216、1217、1218、1219、1220、1221、1222、1223、1224、1225、1226、1227、1228、1229、1230、1231、1232、1233、1234、1235、1236、1237、1238、123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9、3240、3241、3242、3243、3244、3245、3246、3247、3248、3249和3250个核苷酸。病毒基因组的任意填充区域的长度可以为50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200和3200-3250个核苷酸。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约55个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约56个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约97个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约103个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约357个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约363个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约712个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约714个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约1203个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约1209个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约1512个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约1519个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约2395个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约2403个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约2405个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约3013个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约3021个核苷酸的填充区域。
在某些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个多填充序列区域。填充区域可以独立地具有一定长度，例如，但不限于50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073、1074、1075、1076、1077、1078、1079、1080、1081、1082、1083、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096、1097、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1121、1122、1123、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1136、1137、1138、1139、1140、1141、1142、1143、1144、1145、1146、1147、1148、1149、1150、1151、1152、1153、1154、1155、1156、1157、1158、1159、1160、1161、1162、1163、1164、1165、1166、1167、1168、1169、1170、1171、1172、1173、1174、1175、1176、1177、1178、1179、1180、1181、1182、1183、1184、1185、1186、1187、1188、1189、1190、1191、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1198、1199、1200、1201、1202、1203、1204、1205、1206、1207、1208、1209、1210、1211、1212、1213、1214、1215、1216、1217、1218、1219、1220、1221、1222、1223、1224、1225、1226、1227、1228、1229、1230、1231、1232、1233、1234、1235、1236、1237、123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8、3239、3240、3241、3242、3243、3244、3245、3246、3247、3248、3249和3250个核苷酸。病毒基因组的任意填充区域的长度可以为50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200和3200-3250个核苷酸。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约55个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约56个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约97个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约103个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约357个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约363个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约712个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约714个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约1203个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约1209个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约1512个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约1519个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约2395个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约2403个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约2405个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约3013个核苷酸的填充区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约3021个核苷酸的填充区域。
在某些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个增强子序列区域。增强子序列区域的长度可以独立的是例如但不限于300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399和400个核苷酸。所述病毒基因组的增强子区域的长度可以是300-310、300-325、305-315、310-320、315-325、320-330、325-335、325-350、330-340、335-345、340-350、345-355、350-360、350-375、355-365、360-370、365-375、370-380、375-385、375-400、380-390、385-395和390-400个核苷酸。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约303个核苷酸的增强子区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约382个核苷酸的增强子区域。
在某些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个启动子序列区域。启动子序列区域的长度可以独立是例如但不限于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599和600个核苷酸。病毒基因组的启动子区域的长度可以为4-10、10-20、10-50、20-30、30-40、40-50、50-60、50-100、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、100-150、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、150-200、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、200-250、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、250-300、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、300-350、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、350-400、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、400-450、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、450-500、460-470、470-480、480-490、490-500、500-510、500-550、510-520、520-530、530-540、540-550、550-560、550-600、560-570、570-580、580-590和590-600个核苷酸。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约4个核苷酸的启动子区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约17个核苷酸的启动子区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约204个核苷酸的启动子区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约219个核苷酸的启动子区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约260个核苷酸的启动子区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约303个核苷酸的启动子区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约382个核苷酸的启动子区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约588个核苷酸的启动子区域。
在某些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个外显子序列区域。外显子区域的长度可以独立的为例如但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150个核苷酸。病毒基因组的外显子区域的长度可以为2-10、5-10、5-15、10-20、10-30、10-40、15-20、15-25、20-30、20-40、20-50、25-30、25-35、30-40、30-50、30-60、35-40、35-45、40-50、40-60、40-70、45-50、45-55、50-60、50-70、50-80、55-60、55-65、60-70、60-80、60-90、65-70、65-75、70-80、70-90、70-100、75-80、75-85、80-90、80-100、80-110、85-90、85-95、90-100、90-110、90-120、95-100、95-105、100-110、100-120、100-130、105-110、105-115、110-120、110-130、110-140、115-120、115-125、120-130、120-140、120-150、125-130、125-135、130-140、130-150、135-140、135-145、140-150和145-150个核苷酸。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约53个核苷酸的外显子区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约134个核苷酸的外显子区域。
在某些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个内含子序列区域。内含子区域的长度可以独立的为例如但不限于25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349和350个核苷酸。病毒基因组的内含子区域的长度可以为25-35、25-50、35-45、45-55、50-75、55-65、65-75、75-85、75-100、85-95、95-105、100-125、105-115、115-125、125-135、125-150、135-145、145-155、150-175、155-165、165-175、175-185、175-200、185-195、195-205、200-225、205-215、215-225、225-235、225-250、235-245、245-255、250-275、255-265、265-275、275-285、275-300、285-295、295-305、300-325、305-315、315-325、325-335、325-350和335-345个核苷酸。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约32个核苷酸的内含子区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约172个核苷酸的内含子区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约201个核苷酸的内含子区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约347个核苷酸的内含子区域。
在某些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含至少一个聚腺苷酸化信号序列区域。聚腺苷酸化信号区域序列区域的长度可以独立的为例如但不限于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599和600个核苷酸。病毒基因组的聚腺苷酸化信号序列区域的长度可以为4-10、10-20、10-50、20-30、30-40、40-50、50-60、50-100、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、100-150、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、150-200、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、200-250、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、250-300、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、300-350、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、350-400、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、400-450、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、450-500、460-470、470-480、480-490、490-500、500-510、500-550、510-520、520-530、530-540、540-550、550-560、550-600、560-570、570-580、580-590和590-600个核苷酸。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约127个核苷酸的聚腺苷酸化信号序列区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约225个核苷酸的聚腺苷酸化信号序列区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约476个核苷酸的聚腺苷酸化信号序列区域。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约477个核苷酸的聚腺苷酸化信号序列区域。
在某些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含一个以上的polyA信号序列区域。
表9A描述了包含病毒基因组的AAV颗粒的ITR至ITR序列的非限制性示例，所述病毒基因组具有包含调节性多核苷酸序列的有效载荷区域。表9A还提供了由“VOYSOD”标识符表示的ITR-ITR构建体的替代名称。
表9A：包含调节性多核苷酸的AAV颗粒H1.mir.104-788.2(具有慢病毒衍生的填充序列)的ITR至ITR序列。
Figure BDA0002938829440001181
表9B提供了具有白蛋白衍生的填充序列的H1.mir104-788.2的ITR至ITR序列。表9B中还提供了包含ITR至ITR序列的组分。在一些实施方案中，所述组分可以通过载体骨架序列彼此分离。
表9B：包含调节性多核苷酸的AAV颗粒H1.mir104-788.2(具有白蛋白衍生的填充序列)的ITR至ITR及其组分。
Figure BDA0002938829440001182
Figure BDA0002938829440001191
在某些实施方案中，AAV颗粒包含含有与SEQ ID NO：9具有百分比同一性的序列的病毒基因组。病毒基因组可与SEQ ID NO：9具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。病毒基因组可与SEQ ID NO：9具有1-10％、10-20％、30-40％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-99％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-99％、60-100％、70-80％、70-90％、70-99％、70-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-100％、90-95％、90-99％或90-100％的同一性。作为非限制性示例，病毒基因组包含与SEQ ID NO：9具有80％同一性的序列。作为另一个非限制性示例，病毒基因组包含与SEQ ID NO：9具有85％同一性的序列。作为另一个非限制性示例，病毒基因组包含与SEQ ID NO：9具有90％同一性的序列。作为另一个非限制性示例，病毒基因组包含与SEQ ID NO：9具有95％同一性的序列。作为另一个非限制性示例，病毒基因组包含与SEQ ID NO：9具有99％同一性的序列。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含含有与SEQ ID NO：25具有百分比同一性的序列的病毒基因组。病毒基因组可与SEQ ID NO：25具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。病毒基因组可与SEQ ID NO：25具有1-10％、10-20％、30-40％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-99％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-99％、60-100％、70-80％、70-90％、70-99％、70-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-100％、90-95％、90-99％或90-100％的同一性。作为非限制性示例，病毒基因组包含与SEQ ID NO：25具有80％同一性的序列。作为另一个非限制性示例，病毒基因组包含与SEQ ID NO：25具有85％同一性的序列。作为另一个非限制性示例，病毒基因组包含与SEQ ID NO：25具有90％同一性的序列。作为另一个非限制性示例，病毒基因组包含与SEQ ID NO：25具有95％同一性的序列。作为另一个非限制性示例，病毒基因组包含与SEQ ID NO：25具有99％同一性的序列。
AAV颗粒可被修饰以提高递送效率。本公开的包含编码siRNA分子的核酸序列的这类修饰的AAV颗粒可被有效包装，并可用于以高频率和最小毒性成功感染靶细胞。
在一些实施方案中，本公开的包含编码siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以是人类血清型AAV颗粒。这种人AAV颗粒可衍生自任何已知的血清型，例如衍生自血清型AAV1-AAV11中的任一种。作为非限制性示例，AAV颗粒可以是在AAV1衍生的衣壳中包含AAV1衍生的基因组的载体；在AAV2衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；在AAV4衍生的衣壳中包含AAV4衍生的基因组的载体；在AAV6衍生的衣壳中包含AAV6衍生的基因组的载体，或在AAV9衍生的衣壳中包含AAV9衍生的基因组的载体。
在其它实施方案中，本公开的含有编码siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以是假型杂交或嵌合AAV颗粒，其含有来源自至少两种不同AAV血清型的序列和/或组分。假型AAV颗粒可以是包含衍生自一种AAV血清型的AAV基因组和至少部分衍生自不同AAV血清型的衣壳蛋白的载体。作为非限制性示例，这类假型AAV颗粒可以是在AAV1衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；或在AAV6衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；或在AAV4衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；或在AAV9衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组。以类似的方式，本公开包含任何杂交或嵌合AAV颗粒。
在其它实施方案中，本公开的包含编码siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可用于将siRNA分子递送至中枢神经系统(例如美国专利第6,180,613号，其内容通过引用整体并入本文)。
在一些方面，本公开的包含编码siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可进一步包含修饰的衣壳，所述衣壳包括来自非病毒来源的肽。在其它方面，AAV颗粒可含有CNS特异性嵌合衣壳，以促进编码的siRNA双链体递送到脑和脊髓中。例如，可构建对来自显示CNS向性的AAV变体的cap核苷酸序列的比对，以鉴定可变区(VR)序列和结构。
在其它实施方案中，本公开的siRNA分子可以在用于递送至细胞中的质粒载体、病毒载体(例如AAV载体)、基因组或其它核酸表达载体中编码。
DNA表达质粒可用于在细胞中稳定表达本公开的siRNA双链体或dsRNA，并实现靶基因的长期抑制。
在一个方面，由靶向SOD1的多核苷酸编码的siRNA双链体的有义链和反义链通常通过短间隔序列连接，导致称为短发夹RNA(shRNA)的茎环结构的表达。发夹被Dicer识别和切割，从而产生成熟的siRNA分子。
根据本公开，制备了包含靶向SOD1 mRNA的siRNA分子的核酸的AAV载体，所述AAV载体可以是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8和AAV-DJ，及其变体。
在一些实施方案中，本公开的siRNA双链体或dsRNA当表达时阻抑(或降解)靶mRNA(即SOD1)。因此，由靶向SOD1的多核苷酸编码的siRNA双链体或dsRNA可用于在细胞例如运动神经元中基本上抑制SOD1基因表达。在一些方面，SOD1基因表达的抑制是指抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。SOD1基因可以是野生型基因或具有至少一个突变的突变型SOD1基因。因此，蛋白是野生型蛋白或具有至少一个突变的突变型多肽。
病毒生产
本公开提供了通过病毒复制细胞中的病毒基因组复制产生细小病毒颗粒，例如AAV颗粒的方法，所述方法包括使病毒复制细胞与AAV多核苷酸或AAV基因组接触。
本公开提供了一种用于生产具有增强的(增加的、改善的)转导效率的AAV颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：1)用杆粒载体和病毒构建体载体和/或AAV有效载荷构建体载体共转染感受态细菌细胞，2)分离所得的病毒构建体表达载体和AAV有效载荷构建体表达载体，并分别转染病毒复制细胞，3)分离和纯化所得的有效载荷和包含病毒构建体表达载体或AAV有效载荷构建体表达载体的病毒构建体颗粒，4)用AAV有效载荷和包含病毒构建体表达载体或AAV有效载荷构建体表达载体的病毒构建体颗粒共感染病毒复制细胞，和5)收获和纯化包含细小病毒基因组的病毒颗粒。
在某些实施方案中，本公开提供了一种生产AAV颗粒的方法，该方法包括以下步骤：1)用有效载荷区域、表达rep和cap基因的构建体和辅助构建体同时共转染哺乳动物细胞，例如但不限于HEK293细胞，2)收获并纯化包含病毒基因组的AAV颗粒。
细胞
本公开提供了一种含有AAV多核苷酸和/或AAV基因组的细胞。
本文公开的病毒生产描述了用于生产AAV颗粒的过程和方法，所述AAV颗粒接触靶细胞以递送有效载荷构建体，例如重组病毒构建体，其包含编码有效载荷分子的多核苷酸序列。
在某些实施方案中，AAV颗粒可在包含昆虫细胞的病毒复制细胞中产生。
培养中昆虫细胞的生长条件和培养中异源产物在昆虫细胞中的生产是本领域公知的，参见美国专利号6,204,059，其内容通过引用整体并入本文。
根据本公开，可以使用允许细小病毒复制并且可以在培养物中维持的任何昆虫细胞。可以使用来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的细胞系(包括但不限于Sf9或Sf21细胞系)、果蝇(Drosophila)细胞系或蚊子细胞系(例如白纹伊蚊(Aedes albopictus)衍生的细胞系)。昆虫细胞表达异源蛋白的用途已有充分的文献记载，将核酸(如载体，例如昆虫细胞相容载体)引入这些细胞的方法，以及将这些细胞维持在培养物中的方法也有充分的文献记载。参见，例如，Methods in Molecular Biology,ed.Richard,Humana Press,NJ(1995)；O'Reilly等人,Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,Oxford Univ.Press(1994)；Samulski等人,J.Vir.63:3822-8(1989)；Kajigaya等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88:4646-50(1991)；Ruffing等人,J.Vir.66:6922-30(1992)；Kimbauer等人,Vir.219:37-44(1996)；Zhao等人,Vir.272:382-93(2000)；和Samulski等人,U.S.Pat.No.6,204,059，其每一个的内容通过引用整体并入本文。
病毒复制细胞可以选自任何生物有机体，包括原核(例如细菌)细胞和真核细胞，包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。病毒复制细胞可包括哺乳动物细胞，例如A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO.W138、HeLa、HEK293、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2和源自哺乳动物的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。病毒复制细胞包括来源于哺乳动物物种的细胞，包括但不限于人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠，或细胞类型，包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞、细胞系转化细胞等。
哺乳动物细胞(小规模)生产AAV颗粒
本文公开的病毒生产描述了用于生产AAV颗粒的过程和方法，所述AAV颗粒接触靶细胞以递送有效载荷，例如重组病毒构建体，其包含编码有效载荷的多核苷酸序列。
在某些实施方案中，AAV颗粒可在包含哺乳动物细胞在内的病毒复制细胞中生产。
通常用于生产重组AAV颗粒的病毒复制细胞包括但不限于293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞和其它哺乳动物细胞系，如美国专利号6,156,303、5,387,484、5,741,683、5,691,176和5,688,676，美国专利申请2002/0081721和国际专利申请WO 00/47757、WO 00/24916和WO 96/17947中所述，其每一个的内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，在哺乳动物细胞中产生AAV颗粒，其中所有三种VP蛋白以接近1:1:10的化学计量(VP1：VP2：VP3)表达。允许这种受控的表达水平的调节机制包括产生两种mRNA，一种用于VP1，并且另一种用于VP2和VP3，通过差异剪接产生。
在另一个实施方案中，使用三重转染方法在哺乳动物细胞中生产AAV颗粒，其中有效载荷构建体、细小病毒Rep和细小病毒Cap以及辅助构建体包含在三种不同的构建体中。AAV颗粒生产的三种组分的三重转染方法可用于生产少量的病毒，用于包括转导效率、靶组织(向性)评价和稳定性的分析。
本文所述的AAV颗粒可通过三重转染或杆状病毒介导的病毒生产或本领域已知的任何其它方法来生产。可以使用本领域已知的任何合适的允许或包装细胞来产生载体。哺乳动物细胞通常是优选的。还优选的是提供从复制缺陷型辅助病毒中删除的功能的反式互补包装细胞系，例如293细胞或其它E1a反式互补细胞。
所述基因盒可包含一些或全部细小病毒(例如AAV)cap和rep基因。然而，优选地，通过将编码衣壳和/或Rep蛋白的包装载体导入细胞，以反式提供一些或全部的cap和Rep功能。最优选地，基因盒不编码衣壳或Rep蛋白。或者，使用被稳定转化以表达cap和/或rep基因的包装细胞系。
在一些情况下，根据US20160032254(其内容通过引用并入本文)中描述的方法，从培养上清液中制备和纯化重组AAV病毒颗粒。生产也可包括本领域已知的方法，包括使用293T细胞、Sf9昆虫细胞、三重转染或任何合适的生产方法的那些方法。
在某些情况下，用聚乙烯亚胺(PEI)和生产AAV所需的质粒转染293T细胞(贴壁/悬浮)，所述质粒即AAV2 rep，其是腺病毒辅助构建体和侧翼有ITR的转基因盒。AAV2 rep质粒还含有所研究的特定病毒的cap序列。转染后二十四小时(对于悬浮，没有培养基改变)，其发生在含/不含血清的DMEM/F17中，用含或不含血清的新鲜培养基替换培养基。转染后三(3)天，从293贴壁细胞的培养基中取样。随后刮取细胞，或沉淀悬浮细胞，并转移到容器中。对于贴壁细胞，在离心以除去细胞沉淀后，从刮擦后的上清液中采集第二样品。接着，通过三次连续的冻融循环(-80℃至37℃)或加入去污剂Triton，实现细胞裂解。通过离心或深层过滤除去细胞碎片，并从培养基中采集样品3。通过DNA qPCR进行DNase抗性基因组滴定，对样品的AAV颗粒进行定量。这种转染的总产量等于样品3的颗粒浓度。
AAV颗粒滴度根据基因组拷贝数(每毫升的基因组颗粒)来测量。基因组颗粒浓度基于以前报道的载体DNA的DNA定量PCR(Clark等人(1999)Hum.Gene Ther.,10:1031-1039；Veldwijk等人(2002)Mol.Ther.,6:272-278)。
杆状病毒
本文公开的颗粒生产描述了用于生产AAV颗粒的过程和方法，所述AAV颗粒接触靶细胞以递送有效载荷构建体，所述有效载荷构建体包含编码有效载荷的多核苷酸序列。
简言之，通过本领域技术人员已知和进行的标准分子生物学技术，通过转座子供体/受体系统将病毒构建体载体和AAV有效载荷构建体载体各自引入到杆粒(也称为杆状病毒质粒)。转染单独的病毒复制细胞群产生两种杆状病毒，一种包含病毒构建体表达载体，且另一种包含AAV有效载荷构建体表达载体。两种杆状病毒可用于感染用于产生AAV颗粒的单病毒复制细胞群。
用于在昆虫细胞(包括但不限于草地贪夜蛾(Sf9)细胞)中产生病毒颗粒的杆状病毒表达载体提供了高滴度的病毒颗粒产物。编码病毒构建体表达载体和AAV有效载荷构建体表达载体的重组杆状病毒启动了病毒复制细胞的生产性感染。从初次感染中释放的感染性杆状病毒颗粒会二次感染培养物中的其它细胞，并在多个感染周期中指数性地感染整个细胞培养物群体，感染循环是感染的初始多重性的函数，参见Urabe,M.等人,J Virol.2006Feb；80(4):1874-85，其内容通过引用整体结合到本文中。
在昆虫细胞系统中用杆状病毒生产AAV颗粒可解决已知的杆状病毒遗传和物理不稳定性问题。在某些实施方案中，生产系统通过利用无滴度的受感染细胞保存和扩大系统解决了杆状病毒多个传代后的不稳定性。用编码病毒颗粒的结构、非结构性组分的病毒表达构建体转染病毒生产细胞的小规模种子培养物。将杆状病毒感染的病毒生产细胞收获成可以在液氮中冷冻保存的等分试样；等份试样保留了感染大规模病毒生产细胞培养物的活力和感染性，Wasilko DJ等人,Protein Expr Purif.2009Jun；65(2):122-32，其内容通过引用整体结合于此。
遗传稳定的杆状病毒可用于产生一种或多种用于在无脊椎动物细胞中产生AAV颗粒的组分的来源。在某些实施方案中，缺陷杆状病毒表达载体可以在昆虫细胞中以游离体的形式维持。在这样的实施方案中，杆粒载体用复制控制元件工程化，所述复制控制元件包括但不限于启动子、增强子和/或细胞周期调节的复制元件。
在某些实施方案中，杆状病毒可以用(非)选择性标记进行工程化，以重组到几丁质酶/组织蛋白酶基因座中。chia/V-cath基因座对于在组织培养物中繁殖杆状病毒不是必需的，并且V-cath(EC 3.4.22.50)是半胱氨酸内切蛋白酶，其对含有Arg-Arg二肽的底物最有活性。Arg-Arg二肽存在于浓核病毒和细小病毒衣壳结构蛋白中，但很少发生在依赖病毒VP1中。
在某些实施方案中，容许杆状病毒感染的稳定病毒复制细胞用AAV复制和病毒颗粒产生所必需的任何元件的至少一个稳定整合拷贝工程化，所述元件包括但不限于完整AAV基因组、Rep和Cap基因、Rep基因、Cap基因、作为单独转录盒的各Rep蛋白、作为单独转录盒的各VP蛋白、AAP(装配活化蛋白)或具有天然或非天然启动子的至少一个杆状病毒辅助基因。
大规模生产
在一些实施方案中，可修饰AAV颗粒生产以增加生产规模。本公开的大规模病毒生产方法可包括在以下中教导的任何方法：美国专利号5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508或者国际公开号WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353和WO2001023597，其每一个的内容通过引用整体并入本文。增加病毒颗粒生产规模的方法通常包括增加病毒复制细胞的数量。在一些实施方案中，病毒复制细胞包括贴壁细胞。为了增加贴壁的病毒复制细胞生产病毒颗粒的规模，需要更大的细胞培养表面。在一些情况下，大规模生产方法包括使用滚瓶来增加细胞培养表面。具有增加的表面积的其它细胞培养基材是本领域已知的。具有增加的表面积的其他贴壁细胞培养物的示例包括但不限于
Figure BDA0002938829440001271
(Corning Corp.,Corning,NY)和NUNCTM CELLFACTORYTM(Thermo Scientific,Waltham,MA.)。在一些情况下，大规模的贴壁细胞表面可包含约1,000cm2至约100,000cm2。在一些情况下，大规模的贴壁细胞培养物可包含约107至约109个细胞、约108至约1010个细胞、约109至约1012个细胞或至少1012个细胞。在一些情况下，大规模的贴壁培养物可产生约109至约1012、约1010至约1013、约1011至约1014、约1012至约1015或至少1015个病毒颗粒。
在一些实施方案中，本公开的大规模病毒生产方法可包括使用悬浮细胞培养物。悬浮细胞培养可以显著增加细胞数量。通常，可以在约10-50cm2表面积上生长的贴壁细胞的数目可以以约1cm3体积悬浮生长。
大规模培养形式的复制细胞的转染可以根据本领域已知的任何方法进行。对于大规模贴壁细胞培养，转染方法可包括但不限于使用无机化合物(例如磷酸钙)、有机化合物[例如聚乙烯亚胺(PEI)]或使用非化学方法(例如电穿孔)。对于悬浮生长的细胞，转染方法可包括但不限于使用磷酸钙和PEI。在一些情况下，大规模悬浮培养物的转染可根据Feng，L.等人，2008.Biotechnol Appl.Biochem.50:121-32中标题为“转染方法”的部分的描述进行，其内容通过引用整体并入本文。根据这样的实施方案，可以形成PEI-DNA复合物以引入待转染的质粒。在一些情况下，用PEI-DNA复合物转染的细胞可以在转染前被“冲击(shocked)”。这包括将细胞培养温度降低到4℃约1小时。在一些情况下，可将细胞培养物冲击约10分钟至约5小时。在一些情况下，可以在约0℃至约20℃的温度下对细胞培养物进行冲击。
在一些情况下，转染可包括一种或多种用于表达RNA效应分子的载体，以减少自一种或多种AAV有效载荷构建体的核酸表达。这些方法可以通过减少表达有效载荷构建体所浪费的细胞资源来提高病毒颗粒的产量。在一些情况下，这些方法可根据美国公开号US2014/0099666中教导的那些来实施，其内容通过引用整体并入本文。
生物反应器
在一些实施方案中，细胞培养生物反应器可用于大规模病毒生产。在一些情况下，生物反应器包括搅拌釜反应器。这类反应器通常包括一个容器，该容器通常为圆柱形，带有搅拌器(如叶轮)。在一些实施方案中，这样的生物反应器容器可以放置在水套中以控制容器温度和/或使来自环境温度变化的影响最小化。生物反应器容器容积的尺寸范围可以是约500ml至约2L、约1L至约5L、约2.5L至约20L、约10L至约50L、约25L至约100L、约75L至约500L、约250L至约2,000L、约1,000L至约10,000L、约5,000L至约50,000L或至少50,000L。容器底部可以是圆形的或扁平的。在一些情况下，动物细胞培养物可维持在具有圆形容器底部的生物反应器中。
在一些情况下，生物反应器容器可以通过使用热循环器来加温。热循环器将热水泵送至水套周围。在一些情况下，加热的水可以通过存在于生物反应器容器内的管道(例如，盘管)泵送。在一些情况下，热空气可以围绕生物反应器循环，包括但不限于在培养基正上方的空气空间。另外，可维持pH和CO2水平以优化细胞活力。
在一些情况下，生物反应器可以包括中空纤维反应器。中空纤维生物反应器可支持锚定依赖性和锚定非依赖性细胞的培养。其他生物反应器可以包括但不限于填充床或固定床生物反应器。这样的生物反应器可以包括具有玻璃珠的容器，用于贴壁细胞附着。另外的填充床反应器可以包含陶瓷珠。
在一些情况下，病毒颗粒通过使用一次性生物反应器产生。在一些实施方案中，这样的生物反应器可以包括WaveTM一次性生物反应器。
在一些实施方案中，可根据美国专利号5,064764、6,194,191、6,566,118、8,137,948或美国专利申请号US2011/0229971中教导的方法在动物细胞生物反应器培养物中进行AAV颗粒生产，其内容均通过引用整体并入本文。
细胞裂解
本公开的细胞，包括但不限于病毒生产细胞，可以根据本领域已知的任何方法进行细胞裂解。可以进行细胞裂解以获得存在于本文所述的任何细胞内的一种或多种试剂(例如病毒颗粒)。在一些实施方案中，可以根据以下中列出的任意方法进行细胞裂解：美国专利号7,326,555、7,579,181、7,048,920、6,410,300、6,436,394、7,732,129、7,510,875、7,445,930、6,726,907、6,194,191、7,125,706、6,995,006、6,676,935、7,968,333、5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508或国际公开号WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353和WO2001023597，其内容均通过引用整体并入本文。细胞裂解方法可以是化学的或机械的。化学细胞裂解通常包括使一种或多种细胞与一种或多种裂解剂接触。机械裂解通常包括使一种或多种细胞经受一种或多种裂解条件和/或一种或多种裂解力。
在一些实施方案中，化学裂解可用于裂解细胞。如本文所用，术语“裂解剂”是指可有助于细胞破碎的任何试剂。在一些情况下，将裂解剂引入溶液中，称为裂解溶液或裂解缓冲液。如本文所用，术语“裂解溶液”是指包含一种或多种裂解剂的溶液(通常为水溶液)。除了裂解剂之外，裂解溶液还可以包含一种或多种缓冲剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、冷冻保护剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。裂解缓冲液是包含一种或多种缓冲剂的裂解溶液。裂解溶液的其它组分可以包括一种或多种增溶剂。本文所用的术语“增溶剂”是指提高溶液的一种或多种组分的溶解度和/或提高溶液所应用于的一种或多种实体的溶解度的化合物。在一些情况下，增溶剂增强蛋白质溶解度。在一些情况下，基于增溶剂在增强蛋白质溶解度同时保持蛋白质构象和/或活性的能力来选择增溶剂。
示例性的裂解剂可以包括在以下中描述的任何裂解剂：美国专利号8,685,734、7,901,921、7,732,129、7,223,585、7,125,706、8,236,495、8,110,351、7,419,956、7,300,797、6,699,706和6,143,567，其内容均通过引用整体并入本文。在一些情况下，裂解剂可以选自裂解盐、两性试剂、阳离子试剂、离子去污剂和非离子去污剂。裂解盐可以包括但不限于氯化钠(NaCl)和氯化钾(KCl)。其他的裂解盐可以包括以下中描述的任何裂解盐：美国专利号8,614,101、7,326,555、7,579,181、7,048,920、6,410,300、6,436,394、7,732,129、7,510,875、7,445,930、6,726,907、6,194,191、7,125,706、6,995,006、6,676,935和7,968,333，其内容均通过引用整体并入本文。可以增加或降低盐的浓度以获得使细胞膜破裂的有效浓度。如本文所指，两性试剂是能够作为酸或碱反应的化合物。两性试剂可以包括但不限于溶血磷脂酰胆碱、3-((3-氯酰胺基丙基)二甲基铵)-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、
Figure BDA0002938829440001301
等。阳离子试剂可包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵(C(16)TAB)和苯扎氯铵。包含去污剂的裂解剂可以包括离子去污剂或非离子去污剂。去污剂可以起到分裂或溶解细胞结构的作用，包括但不限于细胞膜、细胞壁、脂质、碳水化合物、脂蛋白和糖蛋白。示例性离子去污剂包括美国专利7,625,570和6,593,123或美国公开号US2014/0087361中教导的任何一种，其内容均通过引用整体并入本文。一些离子去污剂可以包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)、胆酸盐和脱氧胆酸盐。在一些情况下，裂解溶液中可以包含离子去污剂作为增溶剂。非离子去污剂可以包括但不限于辛基葡糖苷、毛地黄皂苷、lubrol、C12E8、
Figure BDA0002938829440001302
Triton X-100和Noniodet P-40。非离子去污剂通常是较弱的裂解剂，但可以作为增溶剂包括在内，以溶解细胞和/或病毒蛋白。其他裂解剂可以包括酶和尿素。在一些情况下，可以在裂解溶液中组合一种或多种裂解剂，以增强细胞裂解和蛋白质溶解性中的一种或多种。在一些情况下，裂解溶液可以包含酶抑制剂，以防止可能由细胞膜破坏而触发的蛋白水解。
在一些实施方案中，进行机械细胞裂解。机械细胞裂解方法可以包括使用一种或多种裂解条件和/或一种或多种裂解力。如本文所用，术语“裂解条件”是指促进细胞破裂的状态或环境。裂解条件可以包括某些温度、压力、渗透纯度、盐度等。在一些情况下，裂解条件包括升高或降低的温度。根据一些实施方案，裂解条件包括温度的变化以促进细胞破碎。根据这些实施方案进行的细胞裂解可包括冻融裂解。如本文所用，术语“冻融裂解”是指细胞裂解，其中细胞溶液经历一个或多个冻融循环。根据冻融裂解法，将溶液中的细胞冷冻以诱导由冰晶的形成和膨胀引起的细胞膜的机械破裂。冻融裂解法使用的细胞溶液可以进一步包含一种或多种裂解剂、增溶剂、缓冲剂、冷冻保护剂、表面活性剂、防腐剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。一旦经过冷冻的细胞溶液解冻，这些组分就可以提高所需细胞产物的回收率。在一些情况下，经历冻融裂解的细胞溶液中包含一种或多种冷冻保护剂。如本文所用，术语“冷冻保护剂”是指用于保护一种或多种物质免受冷冻损伤的试剂。冷冻保护剂可以包括美国公开号US2013/0323302或美国专利号6,503,888、6,180,613、7,888,096、7,091,030中教导的那些冷冻保护剂中的任一种，其内容均通过引用整体并入本文。在一些情况下，冷冻保护剂可包括但不限于二甲亚砜、1，2-丙二醇、2，3-丁二醇、甲酰胺、甘油、乙二醇、1，3-丙二醇和N-二甲基甲酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、琼脂糖、葡聚糖、肌醇、葡萄糖、羟乙基淀粉、乳糖、山梨糖醇、甲基葡萄糖、蔗糖和尿素。在一些实施方案中，冻融裂解可以根据美国专利7,704,721中描述的任何方法进行，其内容通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“裂解力”是指用于破碎细胞的物理活动。裂解力可以包括但不限于机械力、声波力、重力、光学力、电力等。通过机械力进行的细胞裂解在本文中称为“机械裂解”。根据机械裂解可以使用的机械力可以包括高剪切流体力。根据这类机械裂解方法，可以使用微流化器。微流化器通常包括入口储槽，其中可以施加细胞溶液。然后可以经由泵(例如高压泵)以高速和/或高压将细胞溶液泵入相互作用腔室中以产生剪切流体力。然后，可以将所得裂解物收集在一个或多个输出储器中。可以调节泵速和/或压力以调节细胞裂解并提高产物(例如病毒颗粒)的回收率。其他机械裂解方法可以包括通过刮擦对细胞进行物理破坏。
可以基于待裂解细胞的细胞培养形式选择细胞裂解方法。例如，对于贴壁细胞培养，可以使用一些化学和机械裂解方法。这种机械裂解方法可以包括冻融裂解或刮擦。在另一个示例中，贴壁细胞培养物的化学裂解可通过与包含表面活性剂(例如Triton-X-100)的裂解溶液一起温育来进行。在一些情况下，从贴壁细胞培养物产生的细胞裂解物可以用一种或多种核酸酶处理，以降低由释放的DNA引起的裂解物的粘度。
在某些实施方案中，无需裂解即可收获AAV颗粒的方法可用于有效且可扩展的AAV颗粒生产。在非限制性示例中，AAV颗粒可通过以下生产：培养缺少肝素结合位点的AAV颗粒，从而使AAV颗粒进入细胞培养物的上清液中，从培养物中收集上清液；并从上清液中分离AAV颗粒，如美国专利申请20090275107所述，其内容通过引用整体并入本文。
澄清
可以对包含病毒颗粒的细胞裂解物进行澄清。澄清是指从细胞裂解物中纯化病毒颗粒所采取的初始步骤。澄清的作用是通过除去较大的不溶性碎片来制备用于进一步纯化的裂解物。澄清步骤可以包括但不限于离心和过滤。在澄清过程中，可以低速进行离心以仅除去较大的碎片。类似地，可以使用具有较大孔径的过滤器进行过滤，从而仅去除较大的碎片。在一些情况下，可以在澄清期间使用切向流过滤。病毒澄清的目标包括细胞裂解物的高通量处理和优化最终病毒回收。纳入澄清步骤的优点包括可放大地加工更大体积的裂解物。在一些实施方案中，澄清可以根据美国专利号8,524,446、5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498、7,491,508，美国公开号US2013/0045186、US2011/0263027、US2011/0151434、US2003/0138772和国际公开号WO2002012455、WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353和WO2001023597中提出的任何方法进行，其内容均通过引用整体并入本文。
通过过滤澄清细胞裂解物的方法是本领域熟知的，并且可以根据多种可用的方法进行，包括但不限于被动过滤和流动过滤。所用的过滤器可以包括各种材料和孔径。例如，细胞裂解物过滤器可以包含约1μM至约5μM、约0.5μM至约2μM、约0.1μM至约1μM、约0.05μM至约0.05μM和约0.001μM至约0.1μM的孔径。细胞裂解物过滤器的示例性孔径可以包括但不限于2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.02、0.019、0.018、0.017、0.016、0.015、0.014、0.013、0.012、0.011、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002、0.001和0.001μM。在某些实施方案中，澄清可包括通过具有2.0μM孔径的过滤器过滤以除去大的碎片，随后通过具有0.45μM孔径的过滤器以除去完整的细胞。
过滤材料可以由多种材料组成。示例性的材料可以包括但不限于聚合物材料和金属材料(烧结金属和多孔铝)。示例性材料可以包括但不限于尼龙、纤维素材料(例如，醋酸纤维素)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜、聚酰胺、聚砜、聚丙烯以及聚对苯二甲酸乙二酯。在一些情况下，用于澄清细胞裂解物的过滤器可以包括但不限于ULTIPLEAT PROFILETM过滤器(Pall Corporation,Port Washington,NY)、SUPORTM膜过滤器(Pall Corporation,PortWashington,NY)。
在一些情况下，可以进行流动过滤以增加过滤速度和/或效率。在一些情况下，流动过滤可包括真空过滤。根据这些方法，在过滤器的与待过滤的细胞裂解物的相对的一侧上形成真空。在一些情况下，细胞裂解物可以通过离心力通过过滤器。在一些情况下，使用泵迫使细胞裂解物通过澄清过滤器。细胞裂解物通过一个或多个过滤器的流速可以通过调节通道大小和/或流体压力之一来调节。
根据一些实施方案，细胞裂解物可以通过离心澄清。离心可用于沉淀裂解物中的不溶性颗粒。在澄清过程中，离心强度[以重力单位(g)表示，其代表标准重力的倍数]可能低于随后的纯化步骤。在一些情况下，可以在约200g至约800g、约500g至约1500g、约1000g至约5000g、约1200g至约10000g或约8000g至约15000g对细胞裂解物进行离心。在一些实施方案中，细胞裂解物的离心在8000g进行15分钟。在一些情况下，可以进行密度梯度离心，以通过沉降速率来分配细胞裂解物中的颗粒。根据本公开的方法使用的梯度可以包括但不限于氯化铯梯度和碘克沙醇分级梯度。
纯化：色谱
在一些情况下，可通过一种或多种色谱方法从澄清的细胞裂解物中纯化AAV颗粒。色谱法是指本领域已知的用于从混合物中分离出一种或多种成分的任何数量的方法。这样的方法可以包括但不限于离子交换色谱(例如阳离子交换色谱和阴离子交换色谱)、免疫亲和色谱和尺寸排阻色谱。在一些实施方案中，病毒色谱方法可包括美国专利号5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508或国际公开号WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353和WO2001023597中教导的任何方法，其内容均通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，离子交换色谱可用于分离病毒颗粒。离子交换色谱用于结合病毒颗粒，这基于衣壳蛋白与固定相(通常是病毒制备物(例如澄清的裂解物)通过的柱)上存在的带电位点之间的电荷-电荷相互作用。在应用病毒制备物后，结合的病毒颗粒然后可以通过应用洗脱溶液破坏电荷-电荷相互作用来洗脱。可通过调节盐浓度和/或pH值来优化洗脱溶液，以提高结合的病毒颗粒的回收。根据分离的病毒衣壳的电荷，可选择阳离子或阴离子交换色谱方法。离子交换色谱的方法可以包括但不限于美国专利号7,419,817、6,143,548、7,094,604、6,593,123、7,015,026和8,137,948中教导的任何方法，其内容均通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用免疫亲和色谱。免疫亲和色谱是利用一种或多种免疫化合物(例如抗体或抗体相关结构)来保留病毒颗粒的色谱形式。免疫化合物可以特异性结合病毒颗粒表面上的一种或多种结构，包括但不限于一种或多种病毒外壳蛋白。在一些情况下，免疫化合物可以对特定病毒变体具有特异性。在一些情况下，免疫化合物可以结合多种病毒变体。在一些实施方案中，免疫化合物可以包括重组单链抗体。这样的重组单链抗体可以包括Smith,R.H.等人,2009.Mol.Ther.17(11):1888-96描述的那些，其内容通过引用整体并入本文。这样的免疫化合物能够结合几种AAV衣壳变体，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV6和AAV8。
在一些实施方案中，可以使用尺寸排阻色谱(SEC)。SEC可以包括使用凝胶根据尺寸分离颗粒。在病毒颗粒纯化中，SEC过滤有时称为“精制(polishing)”。在某些情况下，可进行SEC以产生接近均质的最终产物。在一些情况下，这些最终产品可用于临床前研究和/或临床研究(Kotin,R.M.2011.Human Molecular Genetics.20(1):R2-R6，其内容通过引用整体并入本文)。在一些情况下，SEC可根据美国专利号6,143,548、7,015,026、8,476,418、6,410,300、8,476,418、7,419,817、7,094,604、6,593,123和8,137,948中教导的任何方法进行，其内容均通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，包含至少一种AAV颗粒的组合物可使用美国专利号US6146874中所述的方法分离或纯化，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，包含至少一种AAV颗粒的组合物可使用美国专利号US6660514中所述的方法分离或纯化，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，包含至少一种AAV颗粒的组合物可使用美国专利号US8283151中所述的方法分离或纯化，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，包含至少一种AAV颗粒的组合物可使用美国专利号US8524446中所述的方法分离或纯化，其内容通过引用整体并入本文。
导入细胞
为了确保siRNA双链体的化学和生物稳定性，将编码siRNA的多核苷酸递送到靶细胞内是重要的。可使用多种方法中的任一种将本公开的多核苷酸引入细胞中。
在一些实施方案中，通过使细胞与多核苷酸接触将本公开的多核苷酸引入细胞中。在一些实施方案中，通过使细胞与包含多核苷酸和亲脂载体的组合物接触而将多核苷酸引入细胞中。在其它实施方案中，通过用包含能在细胞中转录时产生siRNA双链体的核酸序列的载体转染或感染细胞，将多核苷酸导入细胞。
在一些实施方案中，通过将包含能在细胞中转录时产生siRNA双链体的核酸序列的载体注射到细胞中，将siRNA双链体导入细胞。
在其它实施方案中，本公开的多核苷酸可以通过电穿孔递送到细胞中(例如，美国专利公开号20050014264；其内容通过引用整体并入本文)。
此外，插入病毒载体(例如AAV载体)的siRNA分子可以通过病毒感染递送到细胞中。这些病毒载体经过工程化和优化，以促进siRNA分子进入不易修改用于转染的细胞。而且，一些合成的病毒载体具有将shRNA整合到细胞基因组中的能力，从而导致稳定的siRNA表达和靶基因的长期敲低。以这种方式，病毒载体被工程化为用于特异性递送，同时缺乏野生型病毒中发现的有害复制和/或整合特征的载体。
在一些实施方案中，细胞可以包括但不限于哺乳动物来源的细胞、人来源的细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、神经干细胞和神经祖细胞。
药物组合物和制剂
除了要递送的药物组合物，例如siRNA双链体(包括编码质粒或表达载体，例如病毒，例如AAV)之外，本文提供了主要涉及适于给予人的药物组合物，本领域技术人员应当理解，这样的组合物通常适于给予任何其它动物，例如非人动物，例如非人哺乳动物。为了使组合物适于施用于各种动物，适于施用于人的药物组合物的修饰是公知的，并且普通技术的兽医学药理学家可以仅用普通的实验(如果有的话)设计和/或进行这样的修饰。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其它灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，如牛、猪、马、羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或禽类，包括商业相关的禽类，例如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
在一些实施方案中，将组合物施用给人、人患者或受试者。为了本公开的目的，短语“活性成分”通常指合成的siRNA双链体或携带siRNA双链体的病毒载体，或由本文所述的病毒载体递送的siRNA分子。
本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法制备。通常，这样的制备方法包括以下步骤：将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分结合，然后，如果必要和/或需要，将产品分开、成形和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量将根据待治疗的受试者的身份、大小和/或状况并且进一步根据组合物待施用的途径而变化。
siRNA双链体或编码它们的病毒载体可以使用一种或多种赋形剂来配制，以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染或转导；(3)允许持续或延迟释放；或(4)改变生物分布(例如，将病毒载体靶向特定组织或细胞类型，如脑和运动神经元)。
本公开的制剂可以包括但不限于盐水、类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用病毒载体转染的细胞(例如，用于移植到受试者中)、纳米颗粒模拟物及其组合。此外，本公开的病毒载体可使用自组装的核酸纳米颗粒配制。
本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法制备。通常，这样的制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分结合的步骤。
本公开的药物组合物可以以单一单位剂量和/或以多个单一单位剂量制备、包装和/或散装销售。如本文所用，“单位剂量”是指包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将要施用给受试者的活性成分的剂量和/或这样的剂量的合宜分数，如这样的剂量的一半或三分之一。
本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量可以变化，这取决于被治疗的受试者的身份、大小和/或状况，并且还取决于组合物将被施用的途径。例如，组合物可包含0.1％至99％(w/w)的活性成分。例如，组合物可包含0.1％至100％，例如5至50％、1至30％、5至80％、至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，本文所述的制剂可以含有至少一种靶向SOD1的多核苷酸。作为非限制性示例，制剂可以含有在不同位点靶向SOD1基因的1、2、3、4或5个多核苷酸。
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施方案中，赋形剂被批准用于人类和兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂可以被美国食品和药品管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂可以是药用级的。在一些实施方案中，赋形剂可满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
赋形剂，如本文所用，包括但不限于任意和所有的溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等，只要适合于所需的特定剂型。用于配制药物组合物的各种赋形剂和制备组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；其通过引用整体并入本文)。在本公开的范围包括常规赋形剂介质的使用，除非任何常规赋形剂介质可能与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不期望的生物效应或以有害方式与药物组合物的任何其它组分相互作用。
示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或其组合。
在一些实施方案中，制剂可包含至少一种非活性成分。如本文所用，术语“非活性成分”是指制剂中包含的一种或多种非活性剂。在一些实施方案中，可用于本公开的制剂中的所有、没有或一些非活性成分可由美国食品和药品管理局(FDA)批准。
携带本文公开的靶向SOD1的多核苷酸的病毒载体的制剂可包括阳离子或阴离子。在某些实施方案中，所述制剂包括金属阳离子，例如但不限于Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg+及其组合。
本文所用的“药学上可接受的盐”是指公开的化合物的衍生物，其中通过将存在的酸或碱部分转化为其盐形式(例如通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的示例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属或有机盐；等等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括母体化合物的常规无毒盐，例如由无毒无机或有机酸形成。本公开的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，这些盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；通常，优选非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表见Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahland C.G.Wermuth(eds.),Wiley-VCH,2008,和Berge等人,Journal of PharmaceuticalScience,66,1-19(1977)；其每一个的内容通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“药学上可接受的溶剂合物”是指其中合适溶剂的分子掺入晶格中的本公开的化合物。合适的溶剂是指在给药剂量下生理上可耐受的。例如，溶剂合物可以通过从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液中结晶、重结晶或沉淀来制备。合适的溶剂的示例是乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N'-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苄醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当水是溶剂时，溶剂合物被称为“水合物”。
根据本公开，靶向SOD1的多核苷酸或包含其的AAV载体可配制用于CNS递送。可以使用穿过脑血屏障的试剂。例如，可以将能够使siRNA分子靶向脑血屏障内皮的一些细胞穿透肽用于配制靶向SOD1基因的siRNA双链体(例如Mathupala,Expert Opin Ther Pat.,2009,19,137-140，其内容通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可与环氧乙烷/环氧丙烷共聚物(也称为普朗尼克或泊洛沙姆)组合配制在PBS中。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可在pH约7.0的含有0.001％普朗尼克酸(F-68)(泊洛沙姆188)的PBS中配制。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可在pH约7.3的含有0.001％普朗尼克酸(F-68)(泊洛沙姆188)的PBS中配制。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可在pH约7.4的含有0.001％普朗尼克酸(F-68)(泊洛沙姆188)的PBS中配制。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可在包含氯化钠、磷酸钠和环氧乙烷/环氧丙烷共聚物的溶液中配制。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可配制在包含氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和泊洛沙姆188/普朗尼克酸(F-68)的溶液中。
施用
本公开的靶向SOD1的多核苷酸可以通过导致治疗有效结果的任何途径施用。这些包括但不限于实质内(进入脑组织)、实质内(脊髓)、实质内(CNS)、肠内(进入肠)、胃肠、硬膜外(进入脑硬膜)、口服(通过口)、透皮、硬膜外、大脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、表皮(施用在皮肤上)、真皮内(进入皮肤本身)、皮下(皮肤下)、鼻施用(通过鼻)、静脉内(进入静脉)、静脉内推注、静脉内滴注、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、腹膜(输注或注射进入腹膜)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼)、海绵窦内注射(进入病理性腔内)、腔内(进入阴茎根部)、阴道内施用、子宫内、羊膜外给药、透皮(通过完整皮肤扩散用于全身分布)、透粘膜(通过粘膜扩散)、经阴道、吹入法(嗅吸法)、舌下、唇下、灌肠、滴眼(在结膜上)、滴耳、耳(在耳朵中或通过耳朵)、含服(朝向脸颊)、结膜、皮肤、牙(至一个或多个牙)、电渗透、宫颈内、窦内(endosinusial)、气管内、体外、血液透析、渗入、间质、腹部内、羊膜内、关节内、胆内、支气管内、囊内、软骨内(在软骨内)、脊尾内(在马尾内)、脑池内(在小脑延髓池内)、角膜内(在角膜内)、牙冠内(dental intracornal)、冠状动脉内(在冠状动脉内)、阴茎海绵体内(intracorporuscavernosum)(在阴茎海绵体的可扩张空间内)、椎间盘内(在椎间盘内)、导管内(在腺的导管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬膜内或下)、表皮内(至表皮)、食管内(至食管)、胃内(在胃内)、牙龈内(在牙龈内)、回肠内(在小肠的远端部分)、病灶内(在局部病灶内或直接引入局部病灶)、管腔内(在管腔内)、淋巴管内(在淋巴内)、骨髓内(在骨的骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、眼内(在眼内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺或它的支气管内)、窦内(在鼻或眼窝窦内)、椎管内(在脊柱内)、滑膜内(在关节的滑液腔内)、腱内(在肌腱内)、睾丸内(在睾丸内)、鞘内(在脑脊髓轴的任何水平在脑脊液内)、胸腔内(在胸腔内)、小管内(在器官的管内)、肿瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在aurus介质内)、血管内(在一个或多个血管内)、心室内(在心室内)、离子透入法(借助于电流，其中可溶性盐的离子迁移进身体的组织中)、冲洗(浸泡或冲洗开放性创伤或体腔)、喉头(直接在喉上)、鼻胃(穿过鼻并进入胃)、封闭敷裹技术(局部途径施用，其然后被封闭该区域的敷料覆盖)、眼(至外眼)、口咽(直接至口和咽)、胃肠外、经皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸(在呼吸道内，为了局部或全身效应通过口或鼻吸入)、眼球后(脑桥后或眼球后)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(通过或穿过胎盘)、经气管(穿过气管壁)、经鼓膜(穿过或通过鼓室)、输尿管(至输尿管)、尿道(至尿道)、阴道、骶管阻滞、诊断、神经传导阻滞、胆灌注、心脏灌注、光分离置换法(photopheresis)、纹状体内(在纹状体内部)输注或脊柱。
在具体实施方案中，包括含有至少一种靶向SOD1的多核苷酸的AAV载体的组合物可以以允许它们进入中枢神经系统并穿透进入运动神经元的方式施用。
在一些实施方案中，本公开的治疗剂可以通过肌肉注射施用。Rizvanov等人首次证明，靶向突变人SOD1 mRNA的siRNA分子被坐骨神经摄取，逆向转运到运动神经元的核周体，并抑制SOD1G93A转基因ALS小鼠中的突变SOD1 mRNA(Rizvanov AA等人,Exp.BrainRes.,2009,195(1),1-4；其内容通过引用整体并入本文)。另一项研究还证明，表达针对突变SOD1基因的小发夹RNA(shRNA)的AAV的肌肉递送导致肌肉中以及神经支配运动神经元中突变SOD1的显著敲低(Towne C等人,Mol Ther.,2011；19(2):274–283；其内容通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，表达本公开的siRNA双链体的AAV载体可通过外周注射和/或鼻内递送施用予受试者。本领域公开了siRNA双链体的AAV载体的外周给药可以被转运到中枢神经系统，例如运动神经元(例如，美国专利公开号20100240739和20100130594；其内容均通过引用整体并入本文)。
在其它实施方案中，包含至少一种本公开的siRNA双链体的组合物可以通过颅内递送施用给受试者(参见，例如，美国专利号8,119,611；其内容通过引用整体并入本文)。
本公开的靶向SOD1的多核苷酸可以以任何合适的形式施用，作为液体溶液或悬浮液，作为适于液体溶液或液体溶液中的悬浮液的固体形式。它们可以与任何适当的和药学上可接受的赋形剂一起配制。
本公开的靶向SOD1的多核苷酸可以以“治疗有效”量施用，即足以减轻和/或预防与疾病相关的至少一种症状或提供受试者的状况的改善的量。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以通过实质内注射或输注来施用。如本文所用，“注射”和“输注”可互换使用，并且表示相同。作为非限制性示例，本公开的药物组合物可以通过实质内注射施用于受试者。在某些实施方案中，实质内注射可以是脊柱实质内注射，其中药物组合物可以直接施用于脊髓组织。在某些实施方案中，实质内注射可以是CNS(中枢神经系统)实质内注射，其中药物组合物可以直接施用至CNS组织。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物可以以治疗有效量施用于大池，以转导脊髓运动神经元和/或星形胶质细胞。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物可以通过纹状体内输注来施用。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以通过实质内注射以及通过本文所述的另一种施用途径施用。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以通过实质内注射到CNS、脑和/或脊髓来施用。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以通过实质内注射和鞘内注射施用。在某些实施方案中，本公开的药物组合物可以通过实质内注射和纹状体内注射施用。
在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒通过实质内(IPa)输注在脊髓的任何水平、在单个或多个位点、以大于1μL的体积给药。在某些实施方案中，施用1μL-100μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-240μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-240μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-220μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-200μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-180μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-160μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-150μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-140μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-130μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-120μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-110μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-90μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-80μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-70μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-60μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-50μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-40μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-30μL的体积。在某些实施方案中，施用1μL-20μL的体积。在某些实施方案中，施用5μL-60μL的体积。在某些实施方案中，给予5μL-240μL体积。在某些实施方案中，施用10μL-20μL的体积。在某些实施方案中，施用10μL-30μL的体积。在某些实施方案中，施用10μL-40μL的体积。在某些实施方案中，施用10μL-50μL的体积。在某些实施方案中，施用10μL-60μL的体积。在某些实施方案中，施用10μL-80μL的体积。在某些实施方案中，施用10μL-90μL的体积。在某些实施方案中，施用20μL-240μL的体积。在某些实施方案中，施用20μL-200μL的体积。在某些实施方案中，施用20μL-180μL的体积。在某些实施方案中，施用20μL-150μL的体积。在某些实施方案中，施用20μL-120μL的体积。在某些实施方案中，施用20μL-100μL的体积。在某些实施方案中，施用20μL-80μL的体积。在某些实施方案中，施用20μL-60μL的体积。在某些实施方案中，施用20μL-50μL的体积。在某些实施方案中，施用20μL-40μL的体积。在某些实施方案中，施用20μL-30μL的体积。在某些实施方案中，施用50μL-200μL的体积。在某些实施方案中，施用50μL-180μL的体积。在某些实施方案中，施用50μL-150μL的体积。在某些实施方案中，施用50μL-100μL的体积。在某些实施方案中，施用50μL-80μL的体积。在某些实施方案中，施用50μL-70μL的体积。在某些实施方案中，施用100μL-240μL的体积。在某些实施方案中，施用100μL-200μL的体积。在某些实施方案中，施用100μL-180μL的体积。在某些实施方案中，施用100μL-150μL的体积。
脊髓位于脊柱内。脊柱由一系列椎骨节段组成。有7个颈段(C1-C7)、12个胸段(T1-T12)、5个腰段(L1-L5)和5个骶段(S1-S5)。本文所述AAV颗粒向脊髓内的实质内注射或输注可发生在这些椎骨节段的一个或多个处。例如，将本文所述的AAV颗粒向脊髓中的实质内注射或输注可发生在1、2、3、4、5或5个以上位点。实质内注射或者输注部位可以在独立地选自颈脊髓、胸脊髓、腰脊髓和骶脊髓的一个或者多个区域。在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒通过实质内(IPa)输注在两个位点施用至脊髓。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可通过实质内(IPa)输注施用至选自C1、C2、C3、C4、C5、C6和C7的一个或多个位点(例如2、3、4或5个位点)。在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可通过实质内(IPa)输注施用至选自C1、C2、C3、C4、C5、C6和C7的两个位点。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可通过实质内(IPa)输注施用至选自T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11和T12的一个或多个位点(例如2、3、4或5个位点)。在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可通过实质内(IPa)输注施用至选自T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11和T12的两个位点。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可通过实质内(IPa)输注施用至选自L1、L2、L3、L4和L5的一个或多个位点(例如2、3、4或5个位点)。在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可通过实质内(IPa)输注施用至选自L1、L2、L3、L4和L5的两个位点。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可通过实质内(IPa)输注施用至选自S1、S2、S3、S4和S5的一个或多个位点(例如2、3、4或5个位点)。在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可通过实质内(IPa)输注施用至选自S1、S2、S3、S4和S5的两个位点。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可在一个或多个位点(例如2、3、4或5个位点)通过实质内输注(IPa)施用，所述位点选自C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4、L5、S1、S2、S3、S4和S5。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可在两个位点通过实质内输注(IPa)施用，所述位点选自C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4、L5、S1、S2、S3、S4和S5。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可施用至一个或多个位点(例如2、3、4或5个位点)，所述位点选自C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4和L5。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可在两个位点通过实质内输注(IPa)施用，所述位点选自C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4和L5。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可施用至一个或多个水平(例如2、3或4个位点)，所述水平选自C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11和T12。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可在两个位点通过实质内(IPa)输注施用，所述位点选自C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11和T12。作为非限制性的例子，两个位点可以包括来自颈脊髓区域(例如，C1-C7)的一个位点和来自胸脊髓区域(例如，T1-T12)的一个位点。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可施用至一个或多个水平(例如2、3或4个位点)，所述水平选自C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、L1、L2、L3、L4和L5。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可在两个位点通过实质内输注(IPa)施用，所述位点选自C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、L1、L2、L3、L4和L5。作为非限制性示例，两个位点可以包括来自颈脊髓区域(例如，C1-C7)的一个位点和来自腰脊髓区域(例如，L1-L5)的一个位点。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可施用至一个或多个水平(例如2、3或4个位点)，所述水平选自T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4和L5。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可在两个位点通过实质内(IPa)输注施用，所述位点选自T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4和L5。作为非限制性的例子，两个位点可以包括来自胸脊髓区域(例如，T1-T12)的一个位点和来自腰脊髓区域(例如，L1-L5)的一个位点。
在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7和/或L1通过实质内(IPa)输注施用。
在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C1通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C2通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C3通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C4通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C5通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C6通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C7通过实质内(IPa)输注施用。
在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C1和C2通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C1和C3通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C1和C4通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C1和C5通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C1和C6通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C1和C7通过实质内(IPa)输注施用。
在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C2和C3通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C2和C4通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C2和C5通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C2和C6通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C2和C7通过实质内(IPa)输注施用。
在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C3和C4通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C3和C5通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C3和C6通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C3和C7通过实质内(IPa)输注施用。
在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C4和C5通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C4和C6通过实质内(IPa)施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C4和C7通过实质内(IPa)输注施用。
在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C5和C6通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在C5和C7通过实质内(IPa)输注施用。
在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在脊髓的C6和C7通过实质内(IPa)输注施用。
在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒在两个位点通过脊髓输注施用。在另一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒包括在脊髓的C3或C5水平施用。在另一个实施方案中，本文所的述AAV颗粒在脊髓的C3和C5水平施用。
实质内(IPa)输注可以持续1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或超过60分钟。作为非限制性示例，输注持续10分钟。作为非限制性示例，输注持续11分钟。作为非限制性示例，输注持续12分钟。作为非限制性示例，输注持续13分钟。作为非限制性示例，输注持续14分钟。作为非限制性示例，输注持续15分钟。
实质内(IPa)，例如脊髓，输注可以独立地是约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、80、120、240或大于240μL的剂量体积。作为非限制性示例，剂量体积为约20μL。作为非限制性示例，剂量体积为约25μL。作为非限制性示例，剂量体积为约30μL。作为非限制性示例，剂量体积为约35μL。作为非限制性示例，剂量体积为约40μL。作为非限制性示例，剂量体积为约45μL。作为非限制性示例，剂量体积为约50μL。作为非限制性示例，剂量体积为约60μL。作为非限制性示例，剂量体积为约80μL。作为非限制性示例，剂量体积为约120μL。作为非限制性示例，剂量体积为约240μL。
在某些实施方案中，剂量体积为每施用位点5μL-60μL。在另一个实施方案中，剂量体积为每施用位点25μL-40μL。在某些实施方案中，剂量体积为5μL-60μL，用于施用至脊髓C3、C5、C6或C7水平。在某些实施方案中，剂量体积为5μL-60μL，用于施用至脊髓C3水平。在另一个实施方案中，剂量体积为5μL-60μL，用于施用至脊髓C5水平。在又一个实施方案中，剂量体积为5μL-60μL，用于施用至脊髓C3水平，且剂量体积为5μL-60μL，用于施用至脊髓C5水平。在某些实施方案中，剂量体积为25μL-40μL，用于施用至脊髓C3、C5、C6或C7水平。在某些实施方案中，剂量体积为25μL-40μL，用于施用至脊髓C3水平。在另一个实施方案中，剂量体积为25μL-40μL，用于施用至脊髓C5水平。在又一个实施方案中，剂量体积为25μL-40μL，用于施用至脊髓C3水平，且剂量体积为25μL-40μL，用于施用至脊髓C5水平。
实质内(IPa)，例如脊髓，输注可以以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或大于15μL/min的注射速率进行。作为非限制性示例，注射速率为5μL/min。
脑实质内(IPa)例如脊髓的输注剂量可在约1x106VG至约1x1016VG之间。在一些实施方案中，递送可包括以下的组合物浓度：约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、2.1x1011、2.2x1011、2.3x1011、2.4x1011、2.5x1011、2.6x1011、2.7x1011、2.8x1011、2.9x1011、3x1011、4x1011、4.1x1011、4.2x1011、4.3x1011、4.4x1011、4.5x1011、4.6x1011、4.7x1011、4.8x1011、4.9x1011、5x1011、6x1011、6.1x1011、6.2x1011、6.3x1011、6.4x1011、6.5x1011、6.6x1011、6.7x1011、6.8x1011、6.9x1011、7x1011、7.1x1011、7.2x1011、7.3x1011、7.4x1011、7.5x1011、7.6x1011、7.7x1011、7.8x1011、7.9x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.1x1012、1.2x1012、1.3x1012、1.4x1012、1.5x1012、1.6x1012、1.7x1012、1.8x1012、1.9x1012、2x1012、3x1012、4x1012、4.1x1012、4.2x1012、4.3x1012、4.4x1012、4.5x1012,4.6x1012、4.7x1012、4.8x1012、4.9x1012、5x1012、6x1012、7x1012、8x1012、8.1x1012、8.2x1012、8.3x1012、8.4x1012、8.5x1012、8.6x1012、8.7x1012、8.8x1012、8.9x1012、9x1012、1x1013、2x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6.7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016VG。作为非限制性示例，剂量为4.4x1010VG。作为非限制性示例，剂量为1.4x1011VG。作为非限制性示例，剂量为4.1x1011VG。作为非限制性示例，剂量为4.4x1011VG。作为非限制性示例，剂量为5.0x1011VG。作为非限制性示例，剂量为5.1x1011VG。作为非限制性示例，剂量为6.6x1011VG。作为非限制性示例，剂量为7.2x1011VG。作为非限制性示例，剂量为8.0x1011VG。作为非限制性示例，剂量为8.1x1011VG。作为非限制性示例，剂量为1.0x1012VG。作为非限制性示例，剂量为1.1x1012VG。作为非限制性示例，剂量为1.2x1012VG。作为非限制性示例，剂量为1.3x1012VG。作为非限制性示例，剂量为1.0x1010vg-1.0x1012VG。作为非限制性示例，剂量为5.0x1011vg-8.0x1011VG。
在某些实施方案中，实质内(IPa)例如脊髓内输注可以为约1.0x1013VG/ml至约3x1013VG/ml。在另一个实施方案中，实质内(IPa)例如脊髓内输注为1.5x1013VG/ml-3.0x1013VG/ml。在再一个实施方案中，实质内(IPa)例如脊髓内输注为1.8x1013VG/ml-2.5x1013VG/ml。在某些实施方案中，实质内(IPa)例如脊髓内输注为1.8x1013VG/ml、1.85x1013VG/ml、1.9x1013VG/ml、1.95x1013VG/ml、2x1013VG/ml、2.01x1013VG/ml、2.02x1013VG/ml、2.03x1013VG/ml、2.04x1013VG/ml、2.05x1013VG/ml、2.06x1013VG/ml、2.07x1013VG/ml、2.08x1013VG/ml、2.09x1013VG/ml或2.10x1013VG/ml。
在某些实施方案中，剂量体积为每施用位点5μL-60μL，且剂量为1.0x1010VG-1.0x1012VG。在某些实施方案中，剂量体积为每施用位点5μL-60μL，且剂量为5.0x1011VG-8.0x1011VG。在另一个实施方案中，剂量体积为每施用位点25μL-40μL，且剂量为1.0x1010VG-1.0x1012VG。在另一个实施方案中，剂量体积为每施用位点25μL-40μL，且剂量为5.0x1011VG-8.0x1011VG。在某些实施方案中，剂量体积为5μL-60μL，用于施用至脊髓的C3、C5、C6或C7水平，且剂量为1.0x1010VG-1.0x1012VG。在某些实施方案中，剂量体积为5μL-60μL，用于施用至脊髓的C3、C5、C6或C7水平，且剂量为5.0x1011VG-8.0x1011VG。在某些实施方案中，剂量体积为5μL-60μL，用于施用至脊髓的C3水平，且剂量为1.0x1010VG-1.0x1012VG。在某些实施方案中，剂量体积为5μL-60μL，用于施用至脊髓的C3水平，且剂量为5.0x1011VG-8.0x1011VG。在另一个实施方案中，剂量体积为5μL-60μL，用于施用至脊髓的C5水平，且剂量为1.0x1010VG-1.0x1012VG。在另一个实施方案中，剂量体积为5μL-60μL，用于施用至脊髓的C5水平，且剂量为5.0x1011VG-8.0x1011VG。在再一个实施方案中，i)剂量体积为5μL-60μL，用于施用至脊髓的C3水平，且剂量为1.0x1010VG-1.0x1012VG，例如，5.0x1011VG-8.0x1011VG，和ii)用于施用至脊髓的C5水平的剂量体积为5μL-60μL，且剂量为1.0x1010VG-1.0x1012VG，例如，5.0x1011VG-8.0x1011VG。在某些实施方案中，剂量体积为25μL-40μL，用于施用至脊髓的C3、C5、C6或C7水平，且剂量为1.0x1010VG-1.0x1012VG。在某些实施方案中，剂量体积为25μL-40μL，用于施用至脊髓的C3、C5、C6或C7水平，且剂量为5.0x1011VG-8.0x1011VG。在某些实施方案中，剂量体积为25μL-40μL，用于施用至脊髓的C3水平，且剂量为1.0x1010VG-1.0x1012VG。在某些实施方案中，剂量体积为25μL-40μL，用于施用至脊髓的C3水平，且剂量为5.0x1011VG-8.0x1011VG。在另一个实施方案中，剂量体积为25μL-40μL，用于施用至脊髓的C5水平，且剂量为1.0x1010VG-1.0x1012VG。在另一个实施方案中，剂量体积为25μL-40μL，用于施用至脊髓的C5水平，且剂量为5.0x1011VG-8.0x1011VG。在再一个实施方案中，i)剂量体积为25μL-40μL，用于施用至脊髓的C3水平，且剂量为1.0x1010VG-1.0x1012VG，例如，5.0x1011VG-8.0x1011VG，并且ii)用于施用至脊髓的C5水平的剂量体积为25μL-40μL，且剂量为1.0x1010VG-1.0x1012VG，例如，5.0x1011VG-8.0x1011VG。
在某些实施方案中，本文所述的编码siRNA分子的AAV颗粒可在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。AAV颗粒可以针对两个位点以相同或不同的体积递送。AAV颗粒可以针对两个位点以相同或不同的体积递送。AAV颗粒可以针对两个位点以相同或不同的输注速率递送。
在某些实施方案中，本文所述的编码siRNA分子的AAV颗粒可在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。AAV颗粒可以针对两个位点以相同体积递送。AAV颗粒可以针对两个位点以相同剂量递送。AAV颗粒可以针对两个位点以相同的输注速率递送。
在某些实施方案中，本文所述的编码siRNA分子的AAV颗粒可在两个位点通过实质内(IPa)输注来施用。AAV颗粒可以针对两个位点以不同体积递送。AAV颗粒可以针对两个位点以不同剂量递送。AAV颗粒可以针对两个位点以不同的输注速度递送。
在某些实施方案中，本文所述的编码siRNA分子的AAV颗粒可在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。AAV颗粒可以针对两个位点以相同体积递送。AAV颗粒可以针对两个位点以不同剂量递送。AAV颗粒可以针对两个位点以不同的输注速度递送。
在某些实施方案中，本文所述的编码siRNA分子的AAV颗粒可在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。AAV颗粒可以针对两个位点以相同体积递送。AAV颗粒可以针对两个位点以不同剂量递送。AAV颗粒可以针对两个位点以相同的输注速度递送。
在某些实施方案中，本文所述的编码siRNA分子的AAV颗粒可在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。AAV颗粒可以针对两个位点以相同体积递送。AAV颗粒可以针对两个位点以相同剂量递送。AAV颗粒可以针对两个位点以不同的输注速度递送。
在某些实施方案中，本文所述的编码siRNA分子的AAV颗粒可在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。AAV颗粒可以针对两个位点以不同体积递送。AAV颗粒可以针对两个位点以相同剂量递送。AAV颗粒可以针对两个位点以相同的输注速度递送。
在某些实施方案中，本文所述的编码siRNA分子的AAV颗粒可在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。AAV颗粒可以针对两个位点以不同体积递送。AAV颗粒可以针对两个位点以不同剂量递送。AAV颗粒可以针对两个位点以相同的输注速度递送。
在某些实施方案中，本文所述的编码siRNA分子的AAV颗粒可在两个位点通过实质内(IPa)输注施用。AAV颗粒可以针对两个位点以不同体积递送。AAV颗粒可以针对两个位点以相同剂量递送。AAV颗粒可以针对两个位点以不同的输注速度递送。
在某些实施方案中，本文所述的编码siRNA分子的AAV颗粒可在C3和C5通过实质内(IPa)输注施用。对于C3输注，体积可以是25μL，且剂量可以是4.1×1011vg。对于C5输注，体积可以是40μL，且剂量可以是6.6×1011vg。两次输注的注射速率可以是5μL/min，持续约13分钟。
在一些实施方案中，IPa输注(例如脊髓)可导致药物组合物(即AAV颗粒)沿脊髓的头-尾轴(rostral-caudal axis)的范围递送。在一些实施方案中，IPa输注(例如脊髓)产生头尾梯度的AAV颗粒传输。在一些实施方案中，IPa输注(例如脊髓)导致药物组合物递送至远离注射部位的区域。尽管不希望受理论的束缚，本公开的AAV颗粒在特定位点处的IPa输注后可在脊髓头尾轴的长度传送。换句话说，AAV颗粒可能不局限于注射位点的紧邻区域。作为非限制性示例，AAV颗粒可通过跨突触(跨越突触)机制转运。这种跨突触机制可按照沿脊髓头-尾轴存在的通道或途径。
装置
如本文所用，术语“装置”是指经构造或修饰以适合特定目的任何制品，所述目的例如促进药物组合物递送至受试者或在受试者中检测所施用的药物组合物。
在一些实施方案中，所述装置可用于实质内注射药物组合物。装置也可用于将药物组合物施用至脊髓。
在一些实施方案中，该装置可以是定制浮动管(custom floating cannula)。在某些实施方案中，具有窄直径的定制输注管用于注射。所述管可以包括固定长度的30号斜面针头，其连接有可变长度的30号柔性硅橡胶管系统。远端可以装有Hamilton luer锁，Hamilton Luer锁又可以连接到微型注射器泵上。近端硅橡胶管系统可以被套进位于注射针凸缘的近端上的24号刚性外管中。凸缘安置在外套管上，并可用作注射针的限深器。
在某些实施方案中，所述装置可以是脊柱内管。脊柱内管可以包括近端注射器连接部分和远端尖头。近端注射器连接部分包括母luer锁注射器连接器，它可以连接到具有保护套的3-20'管上。所述管可以包括从远侧尖端到注射器的单个内腔。所述管可以包括靠近远侧尖端的4-6"柔性部分。远侧尖端包括凸缘/限深器和钝的刚性尖端。脊柱内管还可以包括用于连接到患者的机制。
在某些实施方案中，装置可以是复杂的立体定向框架。
在某些实施方案中，装置可以是简化的立体定向框架。
在某些实施方案中，药物组合物可以在没有框架的情况下递送。
在某些实施方案中，装置可以是磁共振成像器。当与造影剂例如钆结合使用时，这种成像器可以检测受试者中所施用的药物组合物。
在某些实施方案中，本文所述的任何装置可以组合以递送和/或检测所施用的药物组合物。
给药量(dosing)
本公开的药物组合物可使用任何有效预防和治疗SOD1相关病症(例如ALS)的量给予受试者。所需的确切量将随受试者而变化，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用模式、其活性模式等。
本公开的组合物通常配制成单位剂型以便于施用和剂量一致性。然而，应当理解，本公开的组合物的总日用量可以由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对任何特定患者的具体治疗效果将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所采用的具体组成；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间和给药途径；治疗的持续时间；与所用的特定化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域公知的类似因素。
在一些具体实施方案中，根据疾病状况、受试者和治疗策略等，可以改变用于递送本公开的siRNA双链体的AAV载体的剂量。通常，每剂量可施用约105、106、1012、1013、1014、1015至1016个病毒基因组(单位)。
所需剂量可以每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周或每四周递送。
在某些实施方案中，所需剂量可使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)递送。当采用多次施用时，可以使用分割的给药量方案，例如本文所述的那些。如本文所用，“分割的剂量”是将单一单位剂量或总日剂量分成两个或更多个剂量，例如，单一单位剂量两次或更多次施用。如本文所用，“单一单位剂量”是任何调节性多核苷酸治疗剂以一个剂量/一个时间/单一途径/单一接触点，即单一施用事件施用的剂量。如本文所用，“总日剂量”是在24小时期间内给予或开具的量。它可以作为单一单位剂量施用。在某些实施方案中，将包含本公开的靶向SOD1的多核苷酸的病毒载体以分割的剂量给予受试者。它们可以仅配制在缓冲液中或配制在本文所述的制剂中。
治疗包括ALS的脊髓相关病症的方法
本公开提供了用于将本文所述的靶向SOD1的多核苷酸引入细胞的方法，所述方法包括将任何所述多核苷酸以足以发生SOD1 mRNA靶降解的量引入所述细胞。在一些方面，细胞可以是干细胞、神经元如运动神经元、肌细胞和神经胶质细胞如星形胶质细胞。
本文描述了将AAV颗粒递送至脊髓的方法，用于治疗与脊髓相关的病症，例如但不限于运动神经元疾病(例如ALS)。在某些实施方案中，这些方法导致跨突触传递。
本文还公开了在需要治疗的受试者中治疗与异常SOD1功能相关的ALS的方法。该方法任选包括给予受试者治疗有效量的组合物，该组合物包含或编码至少一种靶向SOD1基因的siRNA双链体。所述siRNA双链体将沉默SOD1基因表达并抑制SOD1蛋白产生，并减轻受试者中ALS的一种或多种症状，从而治疗性地治疗ALS。
在一些实施方案中，将本公开的靶向SOD1的多核苷酸或者包含或编码它的组合物施用至受试者的中枢神经系统。在其它实施方案中，将本公开的siRNA双链体或包含它的组合物施用至受试者的肌肉。
具体地，靶向SOD1的多核苷酸可被递送至特定类型的靶向细胞，包括运动神经元；神经胶质细胞，包括少突胶质细胞、星形胶质细胞和小神经胶质细胞；和/或围绕神经元的其它细胞，例如T细胞。在人ALS患者和动物SOD1 ALS模型中的研究表明，神经胶质细胞在ALS神经元的功能障碍和死亡中起早期作用。周围的保护性神经胶质细胞中的正常SOD1可防止运动神经元死亡，即使突变SOD1存在于运动神经元中(例如，由Philips和Rothstein,Exp.Neurol.,2014,May 22.pii:S0014-4886(14)00157-5综述的；其内容通过引用整体并入本文)。
在一些具体实施方案中，用作ALS治疗的至少一种靶向SOD1基因的siRNA双链体插入病毒载体，例如AAV载体中。
在一些实施方案中，本公开的组合物作为用于治疗ALS的单一治疗剂或组合治疗剂施用。
包含或编码靶向SOD1基因的siRNA双链体的病毒载体可与一种或多种其它治疗剂组合使用。“组合”并不意味着必须同时施用药剂和/或将药剂配制成一起递送，尽管这些递送方法在本公开的范围内。组合物可以与一种或多种其它期望的治疗或医疗程序同时、之前或之后施用。通常，每种试剂将以针对该试剂确定的剂量和/或时间表施用。
可与本公开的靶向SOD1的多核苷酸组合使用的治疗剂可为小分子化合物，其为抗氧化剂、抗炎剂、抗凋亡剂、钙调节剂、抗谷氨酸能药剂、结构蛋白抑制剂和参与金属离子调节的化合物。
用于组合治疗ALS的化合物可以包括但不限于降低氧化应激的试剂，例如自由基清除剂，或Radicava(依达拉奉)，抗谷氨酸能试剂：利鲁唑、托吡酯、他仑帕奈、拉莫三嗪、右美沙芬、加巴喷丁和AMPA拮抗剂；抗细胞凋亡剂：米诺环素、苯丁酸钠和阿莫氯醇；抗炎剂：神经节苷脂、塞来考昔、环孢菌素、硫唑嘌呤、环磷酰胺、血浆去除术(Plasmaphoresis)、醋酸格拉替雷和沙利度胺；头孢曲松(Berry等人，Plos One，2013，8(4))；β-内酰胺类抗生素；普拉克索(多巴胺激动剂)Wang等人,Amyotrophic Lateral Scler.,2008,9(1),50-58)；美国专利公开号20060074991中的尼美舒利；公开于美国专利公开号20130143873中的二氮嗪)；公开于美国专利公开号20080161378中的吡唑酮衍生物；抑制氧化应激诱导的细胞死亡的自由基清除剂，例如溴隐亭(美国专利公开号20110105517)；PCT专利公开号2013100571中讨论的苯基氨基甲酸酯化合物；公开于美国专利号6,933,310和8,399,514以及美国专利公开号20110237907和20140038927中的神经保护化合物；和在美国专利公开号20070185012中教导的糖肽；其每一个的内容均通过引用整体并入本文。
可与本公开的靶向SOD1基因的siRNA双链体组合治疗的治疗剂可以是可保护神经元损失的激素或变体，例如促肾上腺皮质激素(ACTH)或其片段(例如，美国专利公开号20130259875)；雌激素(例如美国专利号6,334,998和6,592,845)；其每一个的内容均通过引用整体并入本文。
神经营养因子可用于与本公开的靶向SOD1基因的siRNA双链体的组合治疗中，用于治疗ALS。通常，神经营养因子被定义为促进神经元存活、生长、分化、增殖和/或成熟，或刺激神经元活性增加的物质。在一些实施方案中，本公开的方法还包括将一种或多种营养因子递送到需要治疗的受试者中。营养因子可包括但不限于IGF-I、GDNF、BDNF、CTNF、VEGF、Coliverlin、扎利罗登(xaliproden)、促甲状腺素-释放激素和ADNF，及其变体。
在一个方面，包含至少一个靶向SOD1基因的siRNA双链体的AAV载体可与表达神经营养因子的AAV载体如AAV-IGF-I(Vincent等人,Neuromolecular medicine,2004,6,79-85；其内容通过引用整体并入本文)和AAV-GDNF(Wang等人,J Neurosci.,2002,22,6920-6928；其内容通过引用整体并入本文)共同施用。
在一些实施方案中，将用于治疗ALS的本公开的组合物静脉内、肌内、皮下、腹膜内、鞘内、实质内(CNS、脑和/或脊髓)和/或心室内施用于需要的受试者，使siRNA双链体或包含siRNA双链体的载体通过血脑屏障和血液脊髓屏障之一或两者。在一些方面，所述方法包括(使用例如输液泵和/或递送支架)向受试者的中枢神经系统(CNS)直接施用(例如，实质内施用、心室内地施用和/或鞘内地施用)治疗有效量的组合物，所述组合物包含靶向SOD1基因的至少一个siRNA双链体或者所述组合物包含含有至少一个靶向SOD1基因的siRNA双链体的AAV载体，沉默/阻抑SOD1基因表达和降低受试者中ALS的一种或多种症状从而治疗性地治疗ALS。
在一些实施方案中，将本公开的用于治疗ALS的组合物实质内(CNS、脑和/或脊髓)施用于需要的受试者，使siRNA双链体或包含该siRNA双链体的载体通过血脑屏障和血脊髓屏障之一或两者。
在某些方面，在治疗的受试者中改善ALS的症状，包括运动神经元退化、肌无力、肌萎缩、肌僵硬、呼吸困难、言语不清、肌束震颤发生、额颞痴呆和/或早产儿死亡。在其他方面，本公开的组合物被应用于脑和脊髓中的一者或两者。在其它方面，肌肉协调和肌肉功能中的一者或两者得到改善。在其他方面，受试者的存活被延长。
定义
除非另有说明，以下术语和短语具有以下描述的含义。这些定义并不意味着本质上是限制性的，并且用于提供对本公开的某些方面的更清楚的理解。
如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指任何由多聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)或多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)或任何其它类型的多聚核苷酸(嘌呤或嘧啶碱基或修饰的嘌呤或嘧啶碱基的N糖苷)组成的核酸聚合物。术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间无意区分长度，并且这些术语将互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。
如本文所用，术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”是指核糖核苷酸的聚合物；术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸的聚合物。DNA和RNA可以天然合成，例如分别通过DNA复制和DNA转录；或化学合成。DNA和RNA可以是单链的(即分别为ssRNA或ssDNA)或多链的(例如双链的，即分别为dsRNA和dsDNA)。如本文所用，术语“mRNA”或“信使RNA”是指编码一条或多条多肽链的氨基酸序列的单链RNA。
如本文所用，术语“RNA干扰”或“RNAi”是指由RNA分子介导的序列特异性调节机制，其导致抑制或干扰或“沉默”相应蛋白编码基因的表达。RNAi已经在许多类型的生物体中观察到，包括植物、动物和真菌。RNAi天然地存在于细胞中以除去外来RNA(例如，病毒RNA)。天然RNAi通过从游离dsRNA切割的片段进行，所述片段引导降解机制至其它相似的RNA序列。RNAi由RNA诱导的沉默复合物(RISC)控制，并由细胞质中的短/小dsRNA分子启动，在细胞质中它们与催化RISC组分argonaute相互作用。dsRNA分子可以外源引入细胞。外源dsRNA通过激活核糖核酸酶蛋白Dicer启动RNAi，Dicer结合并切割dsRNA以产生21-25个碱基对的双链片段，每个末端具有几个未配对的突出碱基。这些短的双链片段被称为小干扰RNA(siRNA)。
如本文所用，术语“小/短干扰RNA”或“siRNA”指能够指导或介导RNAi的包含约5-60个核苷酸(或核苷酸类似物)的RNA分子(或RNA类似物)。优选地，siRNA分子包含约15-30个核苷酸或核苷酸类似物，更优选约16-25个核苷酸(或核苷酸类似物)，甚至更优选约18-23个核苷酸(或核苷酸类似物)，甚至更优选约19-22个核苷酸(或核苷酸类似物)(例如19、20、21或22个核苷酸或核苷酸类似物)。术语“短”siRNA指包含5-23个核苷酸，优选21个核苷酸(或核苷酸类似物)，例如19、20、21或22个核苷酸的siRNA。术语“长”siRNA指包含24-60个核苷酸，优选约24-25个核苷酸，例如23、24、25或26个核苷酸的siRNA。在某些情况下，短siRNA可以包含少于19个核苷酸，例如16、17或18个核苷酸，或者少至5个核苷酸，只要较短的siRNA保留介导RNAi的能力。同样，在一些情况下，长siRNA可以包括超过26个核苷酸，例如27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60个核苷酸，只要较长的siRNA保留介导RNAi或翻译抑制的能力，而无需进一步加工(例如酶促加工)成短siRNA。siRNA可以是单链RNA分子(ss-siRNA)或包含有义链和反义链的双链RNA分子(ds-siRNA)，它们杂交形成称为siRNA双链体的双链体结构。根据本公开，重组AAV载体可编码一种或多种RNAi分子，如siRNA、shRNA、microRNA或其前体。
如本文所用，siRNA分子的术语“反义链”或“第一链”或“引导链”是指与被靶向沉默的基因的mRNA的约10-50个核苷酸，例如约15-30、16-25、18-23或19-22个核苷酸部分基本互补的链。反义链或第一链具有与所需靶mRNA序列充分互补的序列以指导靶特异性沉默，例如，充分互补以通过RNAi机制或过程触发所需靶mRNA的破坏。
如本文所用，siRNA分子的术语“有义链”或“第二链”或“过客链”是指与反义链或第一链互补的链。siRNA分子的反义链和有义链杂交形成双链体结构。如本文所用，“siRNA双链体”包括与为了沉默而靶向的基因的mRNA的约10-50个核苷酸的部分具有足够互补性的siRNA链，和与siRNA链具有足够互补性以形成双链体的siRNA链。根据本公开，重组AAV载体可编码有义和/或反义链。
如本文所用，术语“互补”是指多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反平行多核苷酸链中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补的多核苷酸链可以Watson-Crick方式(例如，A-T、A-U、C-G)或以允许形成双链体的任何其它方式形成碱基对。如本领域技术人员所知，当使用RNA而不是DNA时，尿嘧啶而不是胸腺嘧啶被认为是与腺苷互补的碱基。然而，当在本公开的上下文中提及U时，暗示了取代T的能力，除非另有说明。完全互补性或100％互补性是指其中一条多核苷酸链的每个核苷酸单元都可与第二多核苷酸链的核苷酸单元形成氢键的情况。小于完全互补性是指两条链中的一些但不是全部核苷酸单位可以彼此形成氢键的情况。例如，对于两个20-聚体，如果每条链上仅两个碱基对可以彼此形成氢键，则多核苷酸链表现出10％互补性。在相同的示例中，如果每条链上的18个碱基对可以彼此形成氢键，则多核苷酸链表现出90％互补性。
如本文所用，“靶向”是指设计和选择将与靶核酸杂交并诱导所需效果的核酸序列的过程。
术语“基因表达”是指这样的过程，其中核酸序列通过该过程经历成功转录和(在大多数情况下)翻译以产生蛋白或肽。为了清楚起见，当提及“基因表达”的测量时，这应当理解为是指可以测量转录的核酸产物，例如RNA或mRNA，或翻译的氨基酸产物，例如多肽或肽。测量RNA、mRNA、多肽和肽的量或水平的方法是本领域公知的。
如本文所用，术语“突变”是指基因结构的任何改变，其导致可传递至后代的变体(也称为“突变体”)形式。基因中的突变可以是由DNA中单个碱基的改变，或基因或染色体的较大区段的缺失、插入或重排引起的。
如本文所用，术语“载体”是指转运、转导异源分子或以其它方式充当异源分子(如本公开的靶向SOD1的多核苷酸)的载体的任何分子或部分。“病毒载体”是包含一个或多个多核苷酸区域的载体，所述多核苷酸区域编码或包含目标分子(例如转基因)、编码多肽或多个多肽的多核苷酸或调节性核酸(例如小干扰RNA(siRNA))。病毒载体通常用于将遗传物质递送到细胞中。病毒载体通常为特定应用而修饰。病毒载体的类型包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。
本文所用的术语“腺相关病毒”或“AAV”或“AAV载体”是指包含或源自腺相关载体的组分并且适于感染哺乳动物细胞，优选人细胞的任何载体。术语AAV载体通常指包含编码siRNA双链体的核酸分子的AAV型病毒颗粒或病毒体。AAV载体可衍生自各种血清型，包括血清型的组合(即“假型”AAV)或衍生自各种基因组(例如单链或自身互补)。此外，AAV载体可以是复制缺陷型和/或靶向的。
如本文所用，短语“抑制基因表达”是指引起基因表达产物的量减少。表达产物可以是从基因转录的RNA分子(例如mRNA)或从基因转录的mRNA翻译的多肽。通常，mRNA水平的降低导致由其翻译的多肽水平的降低。表达水平可以使用测量mRNA或蛋白质的标准技术来测定。
如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在培养皿中等，而不是在生物体(例如动物、植物或微生物)内发生的事件。
如本文所用，术语“体内”是指在生物体(例如动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。
如本文所用，术语“修饰的”是指本公开的分子的改变的状态或结构。分子可以以许多方式修饰，包括化学修饰、结构修饰和功能修饰。
如本文所用，术语“合成的”是指由人的手生产、制备和/或制造。本公开的多核苷酸或多肽或其它分子的合成可以是化学的或酶促的。
如本文所用，术语“转染”是指将外源核酸引入细胞的方法。转染方法包括但不限于化学方法、物理处理和阳离子脂质或混合物。可转染到细胞中的试剂的列表大并包括但不限于siRNA、有义和/或反义序列、AAV载体或颗粒、编码一个或多个基因并组织成表达质粒的DNA、蛋白、蛋白片段和更多。
如本文所用，“脱靶”是指对任何一个或多个靶、基因或细胞转录物的任何非预期的效果。
入本文所用，短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。
如本文所用，术语试剂的“有效量”是足以产生有益或所需结果例如临床结果的量，因此，“有效量”取决于其应用的上下文。例如，在施用治疗ALS的试剂的情况下，试剂的有效量是例如与没有施用该试剂获得的应答相比足以实现如本文定义的ALS治疗的量。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指待递送的试剂(例如核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，当向患有或易患感染、疾病、病症和/或病况的受试者施用时，其足以治疗感染、疾病、病症和/或病况，改善其症状，诊断、预防和/或延迟其发作。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指可施用本公开的组合物以例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、诸如黑猩猩和其它猿类和猴类的非人灵长类以及人)和/或植物。
如本文所用，术语“预防”是指延迟或预先阻止病症或疾病的发作、发展或进展一段时间，包括数周、数月或数年。
如本文所用，术语“治疗”是指一种或多种用于治愈或改善疾病的具体方法的应用。在某些实施方案中，具体方法是施用一种或多种药剂。在本公开的上下文中，具体的方法是给予一种或多种靶向SOD1基因的siRNA双链体或dsRNA。
如本文所用，术语“改善”是指减轻病况或疾病的至少一种指标的严重程度。例如，在神经退化疾病的情况下，改善包括神经元损失的减少。
如本文所用，术语“施用”是指向受试者提供药剂或组合物。
如本文所用，术语“神经退化”是指导致神经细胞死亡的病理状态。大量神经病症均以神经退化作为共同的病理状态。例如，阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化(ALS)都会导致慢性神经退化，其特征是在几年的时间内缓慢的进行性神经细胞死亡，而急性神经退化的特点是突然发作的神经细胞死亡，原因是局部缺血(如中风)或创伤(如创伤性脑损伤)，或者原因是由脱髓鞘或创伤(例如脊髓损伤或多发性硬化造成)导致的轴突横断。在一些神经病症中，主要一种类型的神经元细胞是变性的，例如ALS中的运动神经元变性。
实施例
实施例1.靶向SOD1的多核苷酸设计(siRNA)
进行siRNA设计以鉴定靶向人SOD1基因的siRNA。该设计分别使用人SOD1转录物(GenBank登录号NM_000454.4(SEQ ID NO：10))、猕猴SOD1转录物(GenBank登录号NM_001285406.1(SEQ ID NO：11))、恒河猴SOD1转录物(GenBank登录号NM_001032804.1(SEQID NO：11))和猪(GenBank登录号NM_001190422.1(SEQ ID NO：12))(表10)。siRNA双链体设计为对于反义链的2-18位与人SOD1转录物具有100％同一性，并且对于反义链的2-18位与非人SOD1转录物具有部分同一性或100％同一性。在所有siRNA双链体中，反义链的1位被工程化为U，有义链的19位被工程化为C，以便在该位置解除双链体配对。
表10.SOD1基因序列
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实施例2.AAV实质内递送至脊髓
AAV递送的传统途径，如鞘内或静脉内施用，在大型哺乳动物中没有产生颈脊髓和胸脊髓的可靠转导，因此评价了AAV递送的新途径-实质内注射，以改善颈脊髓的转导效率。在腹角的多个脊髓水平(包括颈水平)评价了病毒基因组的生物分布和SOD1 mRNA敲低。
在第一个实验中，使用了各重14-20kg的三只哥廷根成年(6月龄)雌性迷你猪，用于研究。动物没有预先筛选AAV的中和抗体。在C3和C5之间进行4-5cm椎板切除术，从而使注射之间为3cm。将具有SEQ ID NO：9的ITR至ITR序列的自互补(sc)AAV载体(scAAV)包装在AAVrh10(scAAV-miRSOD1)中，该载体包括H1启动子和包含靶向SOD1的siRNA的调节多核苷酸(SEQ ID NO：6)。
施用两次scAAV-miRSOD1注射(滴度2.03×1013vg/mL)，总剂量/动物为1.3×1012vg。在椎板切除术的头部末端，即脊髓的C3水平，单个25μL(5.1×1011vg)体积注射到脊髓的腹角。在椎板切除术的尾端，即在脊髓的C5水平，将单个40μL(8.1×1011vg)体积注射到对侧的腹角。两次注射均以5μL/min的速率施用，产生约13分钟的总输注时间。在操作后四周，处死动物，收集脊髓组织用于分析。
为了确定实质内施用scAAV-miRSOD1是否导致脊髓转导和SOD1mRNA的敲低，通过分支DNA(bDNA)方法分析腹角穿孔，以定量SOD1mRNA的水平，该水平相对于β-肌动蛋白(ACTB)、TATA-盒结合蛋白(TBP)和肽基脯氨酰基异构酶A(PPIA)mRNA水平的几何平均值标准化。然后，相对于来自相同动物的脊髓腰部区域(L1-L3)的腹角穿孔中的标准化SOD1mRNA水平，表示这些标准化的SOD1 mRNA水平。
相对于L1-L3的腹角穿孔中SOD1 mRNA水平，C1至T7-10的腹角穿孔中SOD1 mRNA的显著敲低是明显的，脊髓两侧的腹角穿孔中SOD1mRNA水平相似。单向ANOVA和邓内特检验表明在脊髓的每个水平上SOD1 mRNA的显著敲低(C1-T5 p＜0.0001；T7-10 p＜0.05)。如表11所示，最接近注射的脊髓节段显示最大的SOD1 mRNA敲低。脊髓节段C1至C8具有强烈且显著的SOD1 mRNA敲低(约50-75％敲低)。甚至在远离载体注射位点的脊髓节段T5，也观察到SOD1 mRNA的显著敲低(32.6±5.1％敲低)。
表11.相对于L1-L3的SOD1 mRNA水平
Figure BDA0002938829440001661
Figure BDA0002938829440001671
AAV颗粒处理的猪的腹角穿孔中的标准化SOD1 mRNA水平也相对于来自单个未经处理的猪脊髓的腹角穿孔中的标准化SOD1 mRNA水平表示。将SOD1 mRNA水平相对于β-肌动蛋白(ACTB)、TATA盒结合蛋白(TBP)和肽基脯氨酸异构酶A(PPIA)mRNA水平的几何平均值进行标准化。然后使用来自未经处理的猪的C2 SOD1 mRNA水平，相对于标准化的SOD1 mRNA水平，表示来自治疗猪的每个颈部节段的SOD1 mRNA水平。胸脊髓SOD1 mRNA水平(治疗猪)使用T2 SOD1 mRNA水平(未经处理的猪)标准化，腰脊髓SOD1 mRNA水平(治疗猪)使用来自未经处理的猪的L2 SOD1 mRNA水平标准化。从C2、T2和L2水平收集来自未经处理的猪脊髓的腹角穿孔。如表12所示，施用scAAV-miRSOD1的猪的腹角穿孔中的SOD1 mRNA水平显示在所有测试的脊髓水平上，相对于未经处理的猪具有显著的敲低(单向ANOVA和邓内特检验；p<0.0001)。在脊髓两侧的腹角穿孔中观察到相似的SOD1 mRNA水平。在C3和C5注射部位附近，SOD1 mRNA的敲低最强(79-84％敲低)。即使在远离AAV注射部位的脊髓水平，腹角穿孔也显示出显著的SOD1 mRNA敲低。在T5、T7-T10和L1脊髓水平，腹角穿孔显示分别为55.1±3.4％、44.0±2.6％和33.4±1.2％的显著的SOD1 mRNA敲低。
表12.相对于未经处理的对照的SOD1 mRNA水平
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如表13所示，通过数字液滴PCR进行的载体基因组生物分布分析显示，在最接近注射位点的颈脊髓的腹角穿孔中，每个二倍体细胞具有高载体基因组拷贝数。载体基因组拷贝数从C3到C2和从C7到C8脊髓水平急剧下降(＞10倍)。然而，即使在远离AAV注射的C3和C5位点的脊髓水平，腹角穿孔也表现出显著的载体基因组拷贝。在T5、T7-T10和L1-L3脊髓水平，腹角穿孔显示每个二倍体细胞分别有显著的1.7±1.2、0.2±0.0和0.5±0.2个载体基因组拷贝。
表13.载体基因组定量
Figure BDA0002938829440001682
Figure BDA0002938829440001691
在两个分析中都显示了载体基因组分布与SOD1 mRNA敲低的线性相关，即，当SOD1敲低与L1-L3相比时(r2＝0.26，p＜0.0001)和与未经处理的对照相比时(r2＝0.26，p＜0.0001)。低载体基因组拷贝数/二倍体细胞(＜1gv/dc)，如平均0.2或0.5载体基因组拷贝/二倍体细胞，仍提供了基本的SOD1 mRNA敲低。在第二个实验中，使用了6头哥廷根成年(>9个月龄)雌性和雄性迷你猪，每头体重15-30公斤。未对动物进行AAV中和抗体的预筛选。在C3至C5水平进行多水平椎板切除术以进入脊髓，两次注射之间具有3cm。
在三头猪的第一组中，两次注射scAAV-miRSOD1(滴度为2.03x1013vg/mL)，总剂量为1.6x1012vg/动物。在椎板切除术的头端，向右侧头端C3的腹角注射单一的40μL(8.1x1011vg)的体积。在椎板切除术的尾端，在左侧尾端C5的腹角注射单一的40μL(8.1E11vg)的体积。两个注射均以5μL/min的速率给药，总输注时间约为16分钟。在三头猪的第二组中，用相同的给药方式注射溶媒。术后四周处死动物，并收集脊髓组织用于分析。
通过分支DNA(bDNA)方法分析腹角穿孔的SOD1 mRNA敲减，其相对于β-肌动蛋白(ACTB)、TATA盒结合蛋白(TBP)和肽基脯氨酸异构酶A(PPIA)mRNA水平的几何平均值标准化，并相对于溶媒处理动物的相同脊髓水平的腹角穿孔中的标准化SOD1 mRNA水平表达。从C1到T12的左腹角获取的穿孔中和从C1到L1的右腹角获取的穿孔中SOD1mRNA的显著敲低是明显的，脊髓两侧的腹角打孔中的SOD1 mRNA水平相似。双向ANOVA和Sidak多重比较检验表明，相对于溶媒对照组，脊髓各水平的SOD1 mRNA均显著敲低(左侧：C1-T7 p<0.0001；T10 p<0.001，T12 p<0.01；右侧：C1-T10 p<0.0001；T12 p<0.001，L1 p<0.01)。如表14所示，最接近注射的脊髓节段表现出最大的SOD1 mRNA敲低，在C5处表现出最大的SOD1 mRNA敲低。脊髓节段C1到T5具有稳健且显著的SOD1 mRNA敲低(50-82％的敲低)。即使在左侧脊髓节段和T12右侧脊髓节段L1，远离载体注射部位，也观察到SOD1 mRNA的显著敲低(分别为35.22±2.76％；29.14±10.36％敲低)。
表14.相对于溶媒组的SOD1 mRNA水平
Figure BDA0002938829440001701
Figure BDA0002938829440001711
Figure BDA0002938829440001721
如表15所示，通过数字液滴PCR进行的载体基因组生物分布分析显示，在最接近注射位点的颈脊髓腹角穿孔中，每个二倍体细胞具有高载体基因组拷贝数。载体基因组拷贝数从C3到C2和从C5到C7脊髓水平急剧下降(平均＞10倍)。然而，即使在远离AAV注射的C3和C5位点的脊髓水平，腹角穿孔也表现出远高于背景水平的载体基因组拷贝。在T5、T7、T10、T12和L1脊髓水平，腹角穿孔分别显示每个二倍体细胞有0.73±0.18、0.35±0.03、0.27±0.04、0.25±0.03和0.38±0.19个载体基因组拷贝。
表15:载体基因组定量
Figure BDA0002938829440001722
Figure BDA0002938829440001731
与溶媒对照组相比，载体基因组分布显示与SOD1 mRNA敲低水平呈线性相关(r2＝0.15，p＝0.0002)。在注射部位尾侧约30cm的腹角打孔中，以每二倍体细胞的低载体基因组拷贝数实现50％SOD1基因敲低(<1vg/dc)，例如平均每二倍体细胞的载体基因组拷贝数为0.2或0.5。
实施例3.组织和细胞中的SOD1减少
SOD1 mRNA的原位杂交研究是使用来自用于实质内递送研究的动物脊髓腹角的组织切片进行的(实施例2)。
注射scAAV-miRSOD1颗粒的302猪的C6和T5脊髓节段的腹角显示少至没有SOD1mRNA特异性染色，这表明了SOD1基因敲低。内源性SOD1 mRNA表达显著降低以头尾梯度见于大运动神经元，其中颈区降低最强。SOD1 mRNA特异性染色见于注射scAAV颗粒的302猪的L1-L3脊髓节段中，这与L1-L3的bDNA方法数据一致-表明了在L1-L3脊髓节段中SOD1的有限敲低。与预期一样，未注射的未经处理的猪脊髓节段L2的腹角显示SOD1 mRNA的强染色。
在通过激光捕获从脊髓节段T13分离出的运动神经元池中、耗尽的灰质中或实施例2所述研究的整个脊髓节段的横截面中，测量SOD1 mRNA水平。同时测量了运动神经元胞质标志物胆碱乙酰转移酶(ChAT)的水平，以证实运动神经元在分离的运动神经元样本中的富集。结果如表16a所示，其中VH表示腹角，MN表示运动神经元，DGM表示耗尽的灰质，且左/右表示采获样本的脊髓侧。表16a中的SOD1倍数变化值是相对于溶媒组的，并且ChAT富集是相对于整个脊髓的溶媒T13横截面测量的。数值表示为平均值±标准偏差。
表16a.运动神经元中的相对SOD1 mRNA水平和ChAT富集
Figure BDA0002938829440001741
从左和右腹角获得的分离的运动神经元显示SOD1 mRNA水平的显著降低(与匹配的溶媒对照相比，p＜0.05，2-向ANOVA，Sidak氏检验)。这些结果与相同猪的T12和L1节段中SOD1 mRNA水平(bDNA分析)相似。在分离的运动神经元中观察到ChAT富集，但在T13脊髓横截面样品中未观察到。
在通过激光捕获从脊髓节段C4分离的运动神经元中和在实施方案2所述研究的耗尽的灰质中，测量SOD1 mRNA水平。结果示于表16b中，其中VH表示腹角，MN表示运动神经元，DGM表示耗尽的灰质，左/右表示采获样品的脊髓侧。表16b中的SOD1倍数变化值是相对于溶媒组的，测量是相对于溶媒C4横截面的。数值表示为平均值±标准偏差。
表16b.运动神经元中的相对SOD1 mRNA水平
Figure BDA0002938829440001742
Figure BDA0002938829440001751
分离的运动神经元和在C4的运动神经元耗尽的灰质(DGM)均显示SOD1 mRNA水平的显著降低(与匹配的溶媒对照相比，p＜0.05，2-向ANOVA，Sidak氏检验)。这些数据与C3和C5的SOD1 mRNA水平(bDNA分析)一致。这些数据还证明了与灰质相比，运动神经元中观察到进一步特异性提高了SOD1 mRNA的减少，导致颈脊髓运动神经元中SOD1 mRNA几乎完全抑制(97％敲低)。
舌下神经核和疑核是可受ALS影响的脑干核的区域。舌下神经核包含提供舌部肌肉的大运动神经元的突出簇，并且疑核包含与言语和吞咽强烈相关的大运动神经元。SOD1mRNA的原位杂交使用来自实质内注射scAAV-miRSOD1到脊髓的猪的脑干的组织切片进行。通过原位杂交测定，发现溶媒处理组和SOD1 AAV颗粒处理组中SOD1 mRNA水平相似。为了确定实质内脊髓施用AAV颗粒是否导致脑干转导和SOD1 mRNA敲低，还通过分支DNA(bDNA)方法分析了左和右尾部的脑干样品。将mRNA水平相对于β-肌动蛋白(ACTB)、TATA-盒结合蛋白(TBP)和肽基脯氨酰基异构酶A(PPIA)mRNA水平的几何平均值标准化。相对于用溶媒对照处理的动物的脑干中的标准化SOD1 mRNA水平，来表示标准化SOD1 mRNA水平(表17)。通过数字液滴PCR测定两种给药的scAAV-miRSOD1的载体基因组生物分布，并测定载体基因组/二倍体细胞的数目(表17)。在表17中，BLLQ代表“低于定量下限”，并且对于40ng模板输入，BLLQ大约＜0.005vg/dc。
表17.脑干中的SOD1 mRNA和载体基因组分布
Figure BDA0002938829440001752
Figure BDA0002938829440001761
在尾部脑干的左侧和右侧观察到统计学上显著的SOD1 mRNA敲低，分别是p值＜0.01和p值＜0.001(单向-ANOVA和邓内特多重比较检验)。在脑干区域中检测到的载体基因组水平与IPa给药后在脊髓节段T5至L1中观察到的相似。
测定注射scAAV-miRSOD1或溶媒对照的猪的血浆中的血清中和抗体水平。没有观察到中和抗体状态与SOD1 mRNA或病毒基因组水平之间的相关性。这些结果提示中和抗体不影响观察到的SOD1 mRNA水平。
实施例4：SOD1 siRNA在体外的作用
测定靶向SOD1的miR788.2 siRNA对HuH-7细胞中内源人SOD1表达的抑制。根据制造商的说明书，用Lipofectamine 2000(Invitrogen/Life Technologies)进行不同剂量siRNA对HuH-7细胞的转染。使用bDNA(分支DNA)分析对人SOD1和GAPDH(对照)mRNA水平进行定量。人SOD1mRNA表达水平百分比示于图1。如图1所示，提高siRNA的浓度降低了人SOD1mRNA的相对表达水平。IC50是达到50％人SOD1 mRNA表达水平所需的siRNA浓度，如图1中虚线所示。
为了测试miR788.2是否对人SOD1具有选择性，使用反义链的生物信息学分析来鉴定9种潜在的人脱靶基因。这些基因包括Slit向导配体2(SLIT2)、核受体共激活因子2(NCOA2)、磷脂酶C Eta 1(PLCH1)、BRD4相互作用染色质重塑复合物相关蛋白样(BICRAL)、含溴结构域1(BRD1)、具有四个Mbt结构域的Scm样1(SFMBT1)、动力蛋白轴丝重链7(DNAH7)、锌指基质蛋白型3(ZMAT3)和苹果酸脱氢酶1B(MDH1B)。选择表达人SOD1和这些潜在脱靶之一的细胞系，转染含有miR788.2的引导链的SOD1 siRNA，并评价SOD1、潜在脱靶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA表达的水平。含有miR788.2的引导链的SOD1 siRNA对任何给定的中靶或脱靶的活性表示为，处理细胞中中靶或脱靶mRNA水平(相对于GAPDH mRNA标准化)相对于对照孔中平均中靶或脱靶mRNA水平(相对于GAPDH mRNA标准化)的百分比。含有miR788.2引导链的SOD1 siRNA对SOD1敲低的IC50值在Huh-7细胞中＜0.02nM，在C42细胞中＜0.15nM，这显示了有效的中靶敲低。相比之下，用0.1pM到24nM浓度范围的含有miR788.2引导链的SOD1 siRNA，不能计算任何潜在脱靶的IC50值。这些结果显示，对于9种潜在脱靶，中靶(人SOD1)对脱靶mRNA抑制的IC50分离为至少160倍。因此，miR788.2的引导链对SOD1的选择性高于预测的最近潜在脱靶至少160倍。
实施例5.靶向SOD1的AAV-miRNA载体的体外活性
通过在ITR-ITR序列内工程化靶向SOD1的VOYSOD1miR104-788.2(调节性多核苷酸SEQ ID NO：6)设计miRNA表达载体，所述ITR-ITR序列包含两种不同填充序列之一，即具有慢病毒衍生的填充序列的ITR-ITR(SEQ ID NO：9)或具有白蛋白填充序列的ITR-ITR(SEQID NO：25)。ITR-ITR序列被包装在AAVrh10中，以分别产生scAAVrh10.H1.mir104-788.2(lenti)或scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)构建体。如本文所用，在构建体名称的括号中显示的术语“lenti”表示构建体包含慢病毒衍生的填充序列，而在构建体名称的括号中显示的术语“白蛋白”表示构建体包含白蛋白基因衍生的填充序列。使用HEK293T和利用滚瓶的三重转染(TT)方法制备AAV颗粒。将颗粒感染到HEK293T细胞中。包含具有绿色荧光蛋白(GFP)转基因的AAVrh10的载体用作阴性对照。将HEK293T细胞接种到96孔板(100μL细胞培养基中2.0×104细胞/孔)中，并用1.52×103至1×107的9个不同感染复数(MOI)感染，每种条件三个孔。感染后四十八小时，收获细胞用于即刻细胞裂解。将细胞裂解物用于定量RT-PCR以定量人SOD1 mRNA水平以及管家基因的mRNA水平。将人SOD1 mRNA水平相对于丙氨酰-tRNA合成酶(AARS)和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA水平的几何平均值标准化，然后进一步相对于GFP对照组标准化，以获得人SOD1mRNA的相对水平。针对两种测试载体，MOI和相对人SOD1 mRNA水平示于表18中，所述人SOD1 mRNA水平是相对于AARS和GAPDH(相对于GFP对照，％)的几何平均值标准化的。
表18.利用不同剂量的AAV-miRSOD1载体的人SOD1 mRNA水平
Figure BDA0002938829440001781
对于两种载体scAAVrh10.H1.mir104-788.2(lenti)和scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)，在HEK293T细胞中都观察到了人SOD1 mRNA的剂量依赖性敲低。人SOD1的相对mRNA值也拟合到曲线上，数值在表19中显示。
表19.AAV-miRSOD1的最佳拟合值
Figure BDA0002938829440001782
Figure BDA0002938829440001791
如表19所示，用两种载体观察到相似的效力，p值为0.08。IC50值也是相似的，两种载体均在104范围内。
病毒基因组和衣壳蛋白独立地从纯化的AAV制备物中提取。使用变性凝胶评价基因组完整性，其检测到约3kb的条带。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳对衣壳蛋白的银染来测量衣壳完整性，其在75kDa范围内显示3条带。
实施例6.转基因小鼠模型中的体内人SOD1敲低
将如实施例4所述的具有靶向SOD1并在ITR-ITR内含有不同填充序列的siRNA构建体(VOYSOD1miR104-788.2)的自身互补(sc)AAV载体(scAAV)包装在AAVrh10中，并配制在具有0.001％F-68的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。表达人SOD1的14-30周龄的雌性或雄性Tg(SOD1)3Cje/J小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)接受双侧纹状体内输注(5μL，0.5μL/min)scAAVrh10.H1.mir104-788.2(leni)、scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)或溶媒(每组n为3-5)。对于scAAVrh10.H1.mir104-788.2(lenti)，载体浓度为1.5×1013、3.0×1012、5.6×1011或1.9×1011vg/mL，对应于7.5×1010、1.5×1010、2.8×109或9.4×108vg的总剂量。对于scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)，载体浓度为1.5×1013、3.0×1012、5.7×1011或1.9×1011vg/mL，对应于7.6×1010、1.5×1010、2.9×109或9.5×108vg的总剂量。给药后四周，使动物安乐死，取出脑，解剖左纹状体区和右纹状体区并快速冷冻。对于每只动物，通过qRT-PCR评价整个纹状体样品的人SOD1mRNA抑制。根据制造商的方案(QIAGEN)，使用RNeasy Mini试剂盒从纹状体组织样品中提取总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit，Applied Biosystems)，通过逆转录进行互补DNA合成。所有TaqMan测定和主混合物均购自Life Technologies，并根据制造商的建议使用。使用CFX384实时系统(BIO-RAD)进行qRT-PCR，并用ΔΔCT方法分析数据。将人SOD1 mRNA水平相对于鼠GAPDH(mGAPDH)mRNA水平标准化，然后进一步相对于溶媒对照组标准化。计算这些组的平均值以获得组(处理)平均值。qRT-PCR mRNA结果显示在下表20中。人SOD1 mRNA水平表示为平均值±标准偏差(SD)。
表20.野生型人SOD1转基因小鼠纹状体中的人SOD1 mRNA抑制
Figure BDA0002938829440001801
在人SOD1转基因小鼠纹状体中，在纹状体内输注每纹状体9.4×108vg至1.5×1010vg后约28天，scAAVrh10.H1.mir104-788.2(lenti)引起人SOD1mRNA约48％-64％沉默。在纹状体内输注每纹状体1.0×109vg至8.0×1010vg后约28天，scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)引起人SOD1 mRNA约60％-79％沉默。用scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)(剂量为8.0×1010病毒基因组(vg)/5μL)观察到79％的最大敲低。即使用最低剂量的任一测试载体也观察到显著的敲低。
在人SOD1转基因小鼠中研究了通过纹状体内输注施用的AAV载体的耐受性。在给予溶媒、scAAVrh10.H1.mir104-788.2(lenti)或scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)前后，记录体重。各组获得的体重变化以给药前测量的体重的百分比示于表21。
表21.人SOD1转基因小鼠纹状体的体重变化
Figure BDA0002938829440001811
使用单向ANOVA、邓内特检验计算p值。用最高剂量1.60E+10(vg/5μL)的scAAVrh10.H1.mir104-788.2(lenti)载体获得＜0.05的p值，并用最高剂量8.00E+10(vg/5μL)的scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)载体获得＜0.001的p值，这表明在最高剂量的载体下发生显著的体重减轻。在较高剂量组中也观察到发病率。在1.60E+10(vg/5μL)的剂量下，到注射后第4周，发现scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)组的2/6只小鼠和scAAVrh10.H1.mir104-788.2(lenti)组的5/5只小鼠死亡或安乐死。在最高剂量(8.00E+10)的scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)组，2/5小鼠分别在2天和3.5周死亡。死后分析揭示，死亡可能归因于产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)感染。
实施例7.SOD1siRNA在体外的作用
将VOYSOD1miR104-788.2、VOYSOD1miR127-860、VOYSOD1miR114-806和VOYSOD1miR114-861工程化到具有CBA启动子的scAAVDJ载体中。在体外培养猪上皮细胞系SK-RST，并用所述载体以3种不同的MOI(即4.00E+03、2.00E+04和1.00E+05)感染。对照scAAVDJ.EGFP载体也以这些MOI评价。测量SOD1 mRNA的表达并相对于猪GAPDH mRNA标准化。SOD1 mRNA的相对水平显示为相对于GFP表达的百分比，见图2。VOYSOD1miR104-788.2显示最强的剂量依赖性敲低。
实施例8.SOD1 siRNA向脊髓的实质内递送
在腹角在猪脊髓的多个水平(包括颈水平)评价病毒基因组的生物分布和SOD1mRNA敲低。
针对研究中的每组，使用三只哥廷根成年(6月龄)雌性迷你猪，各重14-20kg。动物没有预先筛选AAV的中和抗体。在C3和C5之间进行4-5cm椎板切除术，注射之间具有3cm。将具有调节性多核苷酸(SEQ ID NO：6)的自身互补(sc)AAV载体(scAAV)包装到AAVrh10载体中，以产生scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)，所述调节性多核苷酸包含靶向SOD1的siRNA和ITR-ITR序列(SEQ ID NO：25)，所述ITR-ITR序列包含白蛋白衍生的填充序列。
对于高剂量，施用两次scAAV注射(滴度1.73×1013vg/mL)。在椎板切除术的头端，即脊髓的C3水平，将单一的40μL(6.9×1011vg/注射)体积注射到脊髓的腹角。在椎板切除术的尾端，即脊髓的C5水平，将单一的40μL(6.9×1011vg/注射)体积注射到对侧的腹角，总剂量为1.38×1012vg。对于两个剂量中较低的，施用scAAV的两次注射(滴度为5.8×1011vg/mL)(高剂量的1/30)。在椎板切除术的头端，即脊髓的C3水平，将单一的40μL(2.3×1010vg/注射)体积注射到脊髓的腹角。在椎板切除术的尾端，即脊髓的C5水平，将单一的40μL(2.3×1010vg/注射)体积注射到对侧的腹角，总剂量为4.6×1010vg。所有注射均以5μL/min的速率施用，产生约13分钟的总输注时间。在操作后四周，处死动物，并收集脊髓组织用于分析。
为了确定AAV颗粒的实质内施用是否导致脊髓转导和SOD1 mRNA的敲低，通过分支DNA(bDNA)方法分析腹角穿孔。将SOD1 mRNA的mRNA水平相对于β-肌动蛋白(ACTB)、TATA-盒结合蛋白(TBP)和肽基脯氨酰异构酶A(PPI)mRNA水平的几何平均值进行标准化。相对于用溶媒对照处理的动物的腹角穿孔中的标准化SOD1 mRNA水平表示标准化SOD1mRNA水平。
在用6.9E+11vg/注射处理的猪的C1至L1的腹角穿孔中，SOD1mRNA的显著敲低是明显的。相对于来自溶媒对照处理的动物的腹角穿孔中SOD1 mRNA水平评估mRNA敲低。结果示于表22a中。从脊髓两侧的腹角穿孔获得相似的SOD1 mRNA水平。双向ANOVA和Sidak多重比较检验表明了脊髓的每个水平上SOD1 mRNA的显著敲低(C1-T12左侧p＜0.0001；T12右侧p＜0.001，L1 p＜0.01)。如表22a所示，最接近注射的脊髓节段显示最大的SOD1 mRNA敲低。脊髓节段C1至T12具有稳健且显著的SOD1 mRNA敲低(约50-75％敲低)。甚至在远离载体注射位点的脊髓节段L1，也观察到SOD1 mRNA的显著敲低(大约30％敲低)。
表22a.相对于溶媒组的SOD1 mRNA水平(高剂量组)(％)
Figure BDA0002938829440001831
Figure BDA0002938829440001841
Figure BDA0002938829440001851
Figure BDA0002938829440001861
比较用scAAVrh10.H1.mir104-788.2(lenti)获得的SOD1 mRNA水平(表11)与用scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)获得的水平(表22a)，表明用含有慢病毒衍生的填充序列(总共1.6E+12vg)或含有白蛋白衍生的填充序列(总共1.4E+12vg)的AAV都实现了类似的SOD1 mRNA敲低。
用较低剂量的scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)注射的猪的结果示于表22b中。
表22b.相对于溶媒组的SOD1 mRNA水平(％)(较低剂量组)
Figure BDA0002938829440001862
Figure BDA0002938829440001871
Figure BDA0002938829440001881
用两个剂量中较低剂量(2.3E+10vg/注射)注射的猪显示SOD1 mRNA在脊髓节段C2至C8的腹角穿孔中敲低。从脊髓两侧的腹角穿孔获得相似的SOD1 mRNA水平。双向ANOVA和Sidak多重比较检验表明了脊髓的每个水平上SOD1 mRNA的显著敲低(C3-C5 p＜0.0001，敲低50％)。
将6.9E+11vg/注射获得的SOD1 mRNA水平与2.3E+10vg/注射获得的SOD1 mRNA水平进行比较。双向ANOVA和Sidak多重比较检验表明，SOD1 mRNA敲低在下列脊髓节段的较低剂量组中显著较低：C1右侧，C2右侧，C7，C8右侧，T1-T4，T7左侧，T10右侧，T12右侧(p＜0.0001)；C1左侧，T5(p＜0.001)；C2左侧，T7右侧，T12左侧(p＜0.01；C5左侧，和L1(p＜0.05)。在注射位点C3-C5没有观察到敲低的显著差异。
通过数字液滴PCR测定两个剂量的scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)的载体基因组生物分布。两种剂量水平的结果在表23中显示为每个二倍体细胞的载体基因组平均值(vg)±平均值标准偏差(SEM)。
表23.载体基因组生物分布
Figure BDA0002938829440001891
Figure BDA0002938829440001901
高剂量(6.9E+11vg/注射)组在最接近输注部位的颈脊髓腹角穿孔中显示高载体基因组拷贝数/二倍体细胞。然后载体基因组拷贝数从C3到C1和从C7到T1脊髓水平急剧下降(＞10倍)，然后从T4到L1保持恒定。计算两个剂量组的载体基因组拷贝数的平均值的比率，并示于表24中，其中VH表示腹角。
表24.6.9E+11vg/注射:2.3E+10vg/注射剂量组的vg/dc的平均值的比率
脊髓水平 左VH 右VH 整体VH
C1 5.93 11.53 7.53
C2 11.46 3.26 5.28
C3 17.28 37.59 32.33
C5-R 29.51 9.84 23.88
C5-C 67.92 49.01 62.47
C7 18.87 16.43 18.04
C8 12.8 12.86 12.83
T1 10.55 10.81 10.67
T4 4 7.01 5.06
T5 3.43 1.31 1.88
T7 3 2.81 2.91
T10 5.43 1.31 2.05
T12 2.07 0.67 1.04
L1 2.41 5.9 2.9
发现除了靠近注射位点外，在脊髓两侧的载体基因组分布水平相似。在注射位点附近的高剂量(6.9E+11vg/注射)和低剂量(2.3E+10vg/注射)组之间的载体基因组的比率类似于剂量的30倍差异，但该比率在远离注射位点的区域(T5至L1)中逐渐降低至1-3倍。
如表25所示，使用scAAVrh10.H1.mir104-788.2(lenti)和scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)观察到类似的载体基因组分布，其中VH表示腹角。
表25.scAAVrh10.H1.mir104-788.2(lenti)和scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)组在腹角穿孔中的载体基因组拷贝数的比较
Figure BDA0002938829440001921
Figure BDA0002938829440001931
观察到类似的载体基因组分布，具有朝向用scAAVrh10.H1.mir104-788.2(lenti)观察到的更多载体基因组的趋势(虽然小)。在C5观察到两组之间的最大差异，其中包含慢病毒衍生的填充序列的载体的值比包含白蛋白衍生的填充序列的载体的值高4-9倍。在T4右侧、T7右侧和T12右侧观察到两组之间载体基因组分布的统计学显著差异(p＜0.01)。
通过使用H&E染色来自脊髓C3注射位点的组织切片进行组织病理学分析。对表26中所示的所有构建体评估相对于溶媒对照的组织病理学变化。将样品分级为构建体与溶媒对照之间的以下之一：1级：最低，2级：轻微(mild)，3级：中度(moderate)，4级：显著(marked)或5级：严重差异。在表26中，等级旁边的括号中的数字表示显示所示表型的样品(猪)的数目。
表26.脊髓病理
Figure BDA0002938829440001941
在AAV治疗组中观察到最小至轻微的变化。
在用溶媒或scAAVrh10.H1.mir104-788.2(白蛋白)处理的动物的颈和胸脊髓的横截面上进行猪SOD1 mRNA和载体基因组的原位杂交(ISH)。在AAV治疗的动物中观察到腹角两侧的运动神经元中的载体基因组信号。VG信号在最靠近注射的一侧上的运动神经元中更丰富。在大运动神经元中观察到内源性SOD1 mRNA信号的显著降低，以头尾梯度，在颈区中具有最强的降低。在注射AAV的动物C5脊髓节段两侧腹角中的运动神经元中观察到SOD1mRNA信号的大幅降低。通过ISH的SOD1 mRNA的减少与通过bDNA评价的腹角穿孔中SOD1mRNA的敲低相关。
等同方案和范围
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文公开的具体实施方案的许多等同方案。本公开的范围不旨在被限制于以上描述，而是如所附权利要求中所述。
在权利要求中，除非相反地指示或从上下文中明显可见，否则诸如“一个”、“一种”和“所述”的冠词可以表示一个/种或多于一个/种。如果组成员中的一个、多于一个或所有成员均存在于、用于给定的产品或方法中或以其它方式与给定的产品或方法相关，则认为满足在一组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述，除非相反地指出或以其它方式从上下文显而易见。本公开包括其中组中的正好一个成员存在于、用于给定产品或方法中或以其它方式与给定产品或方法相关的实施方案。本公开包括其中组成员中多于一个或全部均存在于、用于给定产品或方法中或以其他方式与给定产品或方法相关的实施方案。
还应注意，术语“包括”旨在是开放式的，并且允许但不要求包括额外的要素或步骤。因此，当术语“包含”在本文中使用时，还包括和公开了术语“由……组成”。
在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解，除非另外指明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则以范围表示的值可在本公开的不同实施方案中采用所述范围内的任何具体值或子范围，直至范围下限单位的十分之一，除非上下文另外清楚地指明。
此外，应当理解，落入现有技术范围内的本公开的任何特定实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。由于这些实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，因此即使在此没有明确地阐述排除，也可以将它们排除。本公开的组合物的任何具体实施方案(例如，任何抗生素、治疗或活性成分；任何生产方法；任何使用方法等)可以出于任何原因从任何一个或多个权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在相关。
应当理解，所使用的词语是描述性的词语而不是限制性的词语，并且可以在所附权利要求的范围内进行变化，而不偏离本公开在其更广泛方面的真实范围和精神。
虽然已经在一定长度上并且利用关于若干所述实施方案的一些特殊性描述了本公开，但是不意在将本发明局限于任何这样的细节或实施方案或任何特定实施方案，而是应当参考所附权利要求来解释本发明，以便鉴于现有技术提供这样的权利要求的最宽泛的可能解释，并且因此有效地涵盖本公开的预期范围。
所有引用的来源，例如本文引用的参考文献、出版物、数据库、数据库条目和技术，都通过引用并入本申请，即使在引用中没有明确陈述。在引用源和本申请的陈述冲突的情况下，应以本申请中的陈述为准。
章节和表格标题不旨在是限制性的。
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ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgtagcc atgctctagg 120
aagatcaatt caattcacgc gtccatggct tagaaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga 180
tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact catttgcacc 240
actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat ttggaatcac 300
acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttaat acactcctta 360
attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag aattattgga attagataaa 420
tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc tgtggtatat aaaattattc 480
ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg 540
aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg 600
ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag agagagacag agacagatcc 660
attcgattag tgaacggatc tcgacggtat cgatcacgag actagcctcg agcggccgca 720
attcgaacgc tgacgtcatc aacccgctcc aaggaatcgc gggcccagtg tcactaggcg 780
ggaacaccca gcgcgcgtgc gccctggcag gaagatggct gtgagggaca gggagtggcg 840
ccctgcaata tttgcatgtc gctatgtgtt ctgggaaatc accataaacg tgaaatgtct 900
ttggatttgg gaatcttata agttctgtat gagaccacac cggtaccgag ctctcccgca 960
gaacaccatg cgctccacgg aagcaggtcc tcactttaat gctgtggcca ctgagaagta 1020
ttaaagtgag gacctgcttc tgaggagcgc cttgacagca gccatgggag ggcctcgagg 1080
acggggtgaa ctacgcctga ggatccgatc tttttccctc tgccaaaaat tatggggaca 1140
tcatgaagcc ccttgagcat ctgacttctg gctaataaag gaaatttatt ttcattgcaa 1200
tagtgtgttg gaattttttg tgtctctcac tcggcctagg tagataagta gcatggcggg 1260
ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct 1320
cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg 1380
gcctcagtga gcgagcgagc gcgcag 1406
<210> 10
<211> 981
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
gtttggggcc agagtgggcg aggcgcggag gtctggccta taaagtagtc gcggagacgg 60
ggtgctggtt tgcgtcgtag tctcctgcag cgtctggggt ttccgttgca gtcctcggaa 120
ccaggacctc ggcgtggcct agcgagttat ggcgacgaag gccgtgtgcg tgctgaaggg 180
cgacggccca gtgcagggca tcatcaattt cgagcagaag gaaagtaatg gaccagtgaa 240
ggtgtgggga agcattaaag gactgactga aggcctgcat ggattccatg ttcatgagtt 300
tggagataat acagcaggct gtaccagtgc aggtcctcac tttaatcctc tatccagaaa 360
acacggtggg ccaaaggatg aagagaggca tgttggagac ttgggcaatg tgactgctga 420
caaagatggt gtggccgatg tgtctattga agattctgtg atctcactct caggagacca 480
ttgcatcatt ggccgcacac tggtggtcca tgaaaaagca gatgacttgg gcaaaggtgg 540
aaatgaagaa agtacaaaga caggaaacgc tggaagtcgt ttggcttgtg gtgtaattgg 600
gatcgcccaa taaacattcc cttggatgta gtctgaggcc ccttaactca tctgttatcc 660
tgctagctgt agaaatgtat cctgataaac attaaacact gtaatcttaa aagtgtaatt 720
gtgtgacttt ttcagagttg ctttaaagta cctgtagtga gaaactgatt tatgatcact 780
tggaagattt gtatagtttt ataaaactca gttaaaatgt ctgtttcaat gacctgtatt 840
ttgccagact taaatcacag atgggtatta aacttgtcag aatttctttg tcattcaagc 900
ctgtgaataa aaaccctgta tggcacttat tatgaggcta ttaaaagaat ccaaattcaa 960
actaaaaaaa aaaaaaaaaa a 981
<210> 11
<211> 465
<212> DNA
<213> 猕猴属（Macaca sp.）
<400> 11
atggcgatga aggccgtgtg cgtgttgaag ggcgacagcc cagtgcaggg caccatcaat 60
ttcgagcaga aggaaagtaa tggaccagtg aaggtgtggg gaagcattac aggattgact 120
gaaggcctgc atggattcca tgttcatcag tttggagata atacacaagg ctgtaccagt 180
gcaggtcctc actttaatcc tctatccaga caacacggtg ggccaaagga tgaagagagg 240
catgttggag acctgggcaa tgtgactgct ggcaaagatg gtgtggccaa ggtgtctttc 300
gaagattctg tgatctcgct ctcaggagac cattccatca ttggccgcac attggtggtc 360
catgaaaaag cagatgactt gggcaaaggt ggaaatgaag aaagtaaaaa gacaggaaac 420
gctggaggtc gtctggcttg tggtgtaatt gggatcgccc aataa 465
<210> 12
<211> 658
<212> DNA
<213> 猪（Sus scrofa）
<400> 12
cgtcggcgtg tactgcggcc tctcccgctg cttctggtac cctcccagcc cggaccggag 60
cgcgcccccg cgagtcatgg cgacgaaggc cgtgtgtgtg ctgaagggcg acggcccggt 120
gcagggcacc atctacttcg agctgaaggg agagaagaca gtgttagtaa cgggaaccat 180
taaaggactg gctgaaggtg atcatggatt ccatgtccat cagtttggag ataatacaca 240
aggctgtacc agtgcaggtc ctcacttcaa tcctgaatcc aaaaaacatg gtgggccaaa 300
ggatcaagag aggcacgttg gagacctggg caatgtgact gctggcaaag atggtgtggc 360
cactgtgtac atcgaagatt ctgtgatcgc cctctcggga gaccattcca tcattggccg 420
cacaatggtg gtccatgaaa aaccagatga cttgggcaga ggtggaaatg aagaaagtac 480
aaagacggga aatgctggaa gtcgtttggc ctgtggtgta attgggatca cccagtaaac 540
attccctcat gccatggtct gaatgccagt aactcatctg ttatcttgct agttgtagtt 600
gtagaaattt aacttgataa acattaaaca ctgtaacctt aaaaaaaaaa aaaaaaaa 658
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 13
gtgctgggcg gggggcggcg ggccctcccg cagaacacca tgcgctcttc ggaa 54
<210> 14
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 14
gtgctgggcg gggggcggcg ggccctcccg cagaacacca tgcgctccac ggaa 54
<210> 15
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 15
tgtgatttgg 10
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 16
gtggccactg agaag 15
<210> 17
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 17
tggccgtgta gtgctaccca gcgctggctg cctcctcagc attgcaattc ctctcccatc 60
tgggcaccag tcagctaccc tggtgggaat ctgggtagcc 100
<210> 18
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 18
ctgtggagcg ccttgacagc agccatggga gggccgcccc ctacctcagt ga 52
<210> 19
<211> 260
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 19
gaagcaaaga aggggcagag ggagcccgtg agctgagtgg gccagggact gggagaagga 60
gtgaggaggc agggccggca tgcctctgct gctggccaga ccccttaact catttgttcc 120
cgtctgcacc tgtcactagt aacagatgag ttaaggggtt tggccgtgta gtgctaccca 180
gcgctggctg cctcctcagc attgcaattc ctctcccatc tgggcaccag tcagctaccc 240
tggtgggaat ctgggtagcc 260
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 20
ccccttaact catttgttcc c 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 21
taacagatga gttaaggggt t 21
<210> 22
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 22
gtgctgggcg gggggcggcg ggccctcccg cagaacacca tgcgctcttc ggaaccctta 60
actgatctgt taacctgtga cctggttaac agatgagtta agggttctgt ggagcgcctt 120
gacagcagcc atgggagggc cgccccctac ctcagtga 158
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 23
cccttaactg atctgttaac c 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 24
ttaacagatg agttaagggt t 21
<210> 25
<211> 1412
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 25
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgtagcc atgctctagg 120
aagatcaatt caattcacgc gtatagtctt ctgcacaggg cattcttttt gcttcaggat 180
gtttacaaca tttgctgccc acttttccta ggtttcttga gacctctaca agagttggag 240
ttgacacttg gggtactttc ttggtgtaac gaactaatag cctgaaaaaa agaagtcatg 300
tgttttcagc aaggcaagaa actgtctaac atagtagata aaacagagaa cacttggccg 360
gaatcaacta agatgttgct atgttccatt catcatatta tctccatctg cagagtagtg 420
ggttagtgga gggtagaaaa cattctcctg aacaactagt taaacttggc tttgagttcc 480
acctgtacca cttgcataat cttgggaaag tgagttgcct aattcagtga cattaataaa 540
tttattaatt tcttctttca ataaaacctg gagagagctt catatgtatc agcatatgct 600
aaacttgaaa gatacaagta gaaaatggaa ggaaatatat ctgactcaat agggatagtt 660
caagggttaa attaaaagta gtaaagtatt ataattaatc tgacatggta ccctctagcg 720
gccgcaattc gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac 780
taggcgggaa cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacaggga 840
gtggcgccct gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa 900
atgtctttgg atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccacaccggt accgagctct 960
cccgcagaac accatgcgct ccacggaagc aggtcctcac tttaatgctg tggccactga 1020
gaagtattaa agtgaggacc tgcttctgag gagcgccttg acagcagcca tgggagggcc 1080
tcgaggacgg ggtgaactac gcctgaggat ccgatctttt tccctctgcc aaaaattatg 1140
gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca 1200
ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg cctaggtaga taagtagcat 1260
ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg 1320
cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc 1380
cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc ag 1412
<210> 26
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 26
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtg 105
<210> 27
<211> 570
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 27
atagtcttct gcacagggca ttctttttgc ttcaggatgt ttacaacatt tgctgcccac 60
ttttcctagg tttcttgaga cctctacaag agttggagtt gacacttggg gtactttctt 120
ggtgtaacga actaatagcc tgaaaaaaag aagtcatgtg ttttcagcaa ggcaagaaac 180
tgtctaacat agtagataaa acagagaaca cttggccgga atcaactaag atgttgctat 240
gttccattca tcatattatc tccatctgca gagtagtggg ttagtggagg gtagaaaaca 300
ttctcctgaa caactagtta aacttggctt tgagttccac ctgtaccact tgcataatct 360
tgggaaagtg agttgcctaa ttcagtgaca ttaataaatt tattaatttc ttctttcaat 420
aaaacctgga gagagcttca tatgtatcag catatgctaa acttgaaaga tacaagtaga 480
aaatggaagg aaatatatct gactcaatag ggatagttca agggttaaat taaaagtagt 540
aaagtattat aattaatctg acatggtacc 570
<210> 28
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 28
aattcgaacg ctgacgtcat caacccgctc caaggaatcg cgggcccagt gtcactaggc 60
gggaacaccc agcgcgcgtg cgccctggca ggaagatggc tgtgagggac agggagtggc 120
gccctgcaat atttgcatgt cgctatgtgt tctgggaaat caccataaac gtgaaatgtc 180
tttggatttg ggaatcttat aagttctgta tgagaccac 219
<210> 29
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 29
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcg 127
<210> 30
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /备注："人工序列描述：合成的多核苷酸"
<400> 30
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag 130

Claims (36)

1.一种抑制细胞中SOD1基因表达的方法，其包括在一个或多个位点通过实质内递送向受试者施用包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，所述AAV载体包含位于两个反向末端重复(ITR)之间的用于抑制或阻抑细胞中SOD1表达的核酸序列，其中所述核酸序列包含有义链序列和反义链序列，其中所述有义链序列包含与SEQ ID NO：7的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链序列包含与SEQ ID NO：8的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且其中所述有义链序列和反义链序列共享长度为至少四个核苷酸的互补区域。
2.如权利要求1所述的方法，其中SOD1的表达被抑制或阻抑。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述SOD1是野生型SOD1、具有至少一个突变的突变SOD1或者野生型SOD1和具有至少一个突变的突变SOD1二者。
4.如权利要求2所述的方法，其中SOD1的表达被抑制或阻抑约20％至约100％。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核酸序列包含siRNA双链体的有义链序列和反义链序列。
6.如权利要求1-5所述的方法，其中位于两个反向末端重复(ITR)之间的所述核酸序列包括由SEQ ID NO：25组成的所述ITR。
7.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述互补区域长度为至少17个核苷酸。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述互补区域的长度在19至21个核苷酸之间。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述互补性区域的长度为19个核苷酸。
10.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述有义链序列和所述反义链序列独立地为30个核苷酸或更少。
11.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含位于两个反向末端重复(ITR)之间的用于抑制或阻抑细胞中SOD1表达的核酸序列，其中所述核酸序列包含有义链序列和反义链序列，其中所述有义链序列包含与SEQ ID NO：7的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链序列包含与SEQ ID NO：8的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且其中所述有义链序列和反义链序列共有长度为至少四个核苷酸的互补区域。
12.一种多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：9。
13.一种多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：25组成。
14.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述AAV载体包含载体基因组序列，所述载体基因组序列包含包装在AAV衣壳中的SEQ ID NO：25。
15.如权利要求14所述的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV衣壳血清型选自AAVrh10和AAV9。
16.如权利要求14所述的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述载体基因组是自身互补的(scAAV)。
17.一种治疗和/或改善需要治疗的受试者的神经退化或脊髓相关疾病的方法，所述方法包括在多于一个位点通过实质内递送向所述受试者施用治疗有效量的包含腺相关病毒(AAV)载体的组合物，所述AAV载体包含位于两个反向末端重复(ITR)之间用于抑制或阻抑细胞中与所述神经退化或脊髓相关疾病相关的基因的表达的核酸序列，其中所述核酸序列包含有义链序列和反义链序列，其中所述有义链序列包含至少15个连续核苷酸，并且所述反义链序列包含至少15个连续核苷酸，并且其中所述有义链序列和反义链序列共有长度为至少四个核苷酸的互补区域。
18.如权利要求17中任一项所述的方法，其中所述互补区域的长度是至少17个核苷酸。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述互补区域的长度在19至21个核苷酸之间。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述互补区域的长度为19个核苷酸。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述有义链序列和所述反义链序列独立地为30个核苷酸或更少。
22.如权利要求17所述的方法，其中所述AAV载体包含选自由以下组成的组的血清型：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV穿梭100-1、AAV穿梭100-3、AAV穿梭100-7、AAV穿梭10-2、AAV穿梭10-6、AAV穿梭10-8、AAV穿梭100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAVCBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAVCHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAVCKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAVCLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAVCLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAVCSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAVCSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAV-PHP.B、AAV-PHP.A、G2B-26、G2B-13、TH1.1-32、TH1.1-35、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、AAVG2B5及其变体。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述衣壳血清型是AAVrh.10。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述AAV载体包含启动子，且其中所述启动子是H1。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述AAV包含填充序列。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述填充序列选自慢病毒衍生的填充序列和白蛋白基因衍生的填充序列。
27.如权利要求1或17所述的方法，其中通过实质内递送的施用步骤发生在所述脊髓内的两个位点处。
28.如权利要求1或17的方法，其中通过实质内递送的施用发生在颈脊髓内的两个位点处。
29.如权利要求1或17所述的方法，其中两个施用位点在脊髓的C3和C5水平处。
30.如权利要求1或17所述的方法，其中施用体积在脊髓C3水平处为约5μL至约240μL，且在脊髓C5水平处为约5μL至约240μL。
31.如权利要求1或17所述的方法，其中施用体积在脊髓C3水平处为约5μL至约60μL，且在脊髓C5水平处为约5μL至约60μL。
32.如权利要求31所述的方法，其中施用体积在脊髓C3水平处为约25至约40μL且在脊髓C5水平处为约25至约40μL。
33.如权利要求1或17所述的方法，其中剂量在脊髓C3水平处为约1x1010 vg至约1x1012vg，且在脊髓C5水平处为约1x1010 vg至约1x1012vg。
34.如权利要求33所述的方法，其中剂量在脊髓C3水平处为约5×1011vg至约8×1011vg，且在脊髓C5水平处为约5×1011vg至约8×1011vg。
35.如权利要求33所述的方法，其中剂量在脊髓C3水平处为约2×1010vg至约7×1011vg，且在脊髓C5水平处为约2×1010vg至约7×1012vg。
36.如权利要求30-35中任一项所述的方法，其中注射速率为5μL/min。
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