JP2014501097A - 生物由来物質の産生を高めるための組成物及び方法 - Google Patents

生物由来物質の産生を高めるための組成物及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2014501097A
JP2014501097A JP2012519677A JP2012519677A JP2014501097A JP 2014501097 A JP2014501097 A JP 2014501097A JP 2012519677 A JP2012519677 A JP 2012519677A JP 2012519677 A JP2012519677 A JP 2012519677A JP 2014501097 A JP2014501097 A JP 2014501097A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell
cells
rna effector
effector molecule
target gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2012519677A
Other languages
English (en)
Inventor
ロッソマンド、アンソニー
エム． マラガノア、ジョン
ポラード、スチュアート
コシスコ、デイビッド
マノハラン、ムシア
ヒンクル、グレッグ
ベッテンコート、ブライアン
ホーガン、シャノン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2014501097A publication Critical patent/JP2014501097A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、宿主細胞から生物由来物質を産生するための組成物及び方法を提供する。種々の実施形態において、生物由来物質は、ポリペプチド、代謝産物、機能性食品、化学中間体、バイオ燃料、食品添加物、又は抗生物質である。一つの態様において、本発明は、宿主細胞から生物由来物質を産生する方法を提供する。この方法は、一般的に、宿主細胞をＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、標的遺伝子と相補的である）と接触させ、宿主細胞を大規模バイオリアクター内で標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合、前記調節は、前記細胞の生物由来物質の産生を高める）及び生物由来物質を前記細胞から単離することを含む。

Description

関連出願
本出願は、Ｍａｒａｇａｎｏｒｅらによって、生物由来物質の産生を高めるための組成物及び方法（ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＥＮＨＡＮＣＩＮＧ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ Ａ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＰＲＯＤＵＣＴ）という名称で、２００９年７月６日付けで出願された米国仮特許出願第６１／２２３，３７０号、Ｍａｒａｇａｎｏｒｅらによって、生物由来物質の産生を高めるための組成物及び方法（ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＥＮＨＡＮＣＩＮＧ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ Ａ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＰＲＯＤＵＣＴ）という名称で、２００９年９月２２日付けで出願された米国仮特許出願第６１／２４４，８６８号、Ｍａｎｏｈａｒａｎらによって、治療薬の送達のための新規な脂質及び組成物（ＮＯＶＥＬ ＬＩＰＩＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ）という名称で、２００９年１２月７日付けで出願された米国仮特許出願第６１／２６７，４１９号、Ｍａｎｏｈａｒａｎらによって、核酸送達のための荷電脂質及び組成物（ＣＨＡＲＧＥＤ ＬＩＰＩＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＤＥＬＩＶＥＲＹ）という名称で、２０１０年５月１３日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３３４，３９８号、Ｒｏｓｓｏｍａｎｄｏらによって、生物由来物質の産生を高めるための組成物及び方法（ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＥＮＨＡＮＣＩＮＧ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ Ａ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＰＲＯＤＵＣＴ）という名称で、２０１０年１月１１日付けで出願された米国仮特許出願第６１／２９３，９８０号、Ｒｏｓｓｏｍａｎｄｏらによって、細胞に基づいたバイオプロセシング（ＣＥＬＬ−ＢＡＳＥＤ ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ）という名称で、２０１０年３月３１日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３１９，５８９号、及びＲｏｓｓｏｍａｎｄｏらによって、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞トランスクリプトーム、対応するｓｉＲＮＡ及びその使用（ＣＨＩＮＥＳＥ ＨＡＭＳＴＥＲ ＯＶＡＲＹ （ＣＨＯ） ＣＥＬＬ ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＯＭＥ，ＣＯＲＲＥＳＰＯＮＤＩＮＧ ＳＩＲＮＡＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ）という名称で、２０１０年６月１５日付けで出願された米国仮特許出願第６１／３５４，９３２号の利益を請求し、これらの出願のそれぞれは、参照することにより本明細書で完全に援用される。
（配列に関する言及）
本明細書は、配列表を最初に出願された主題の一部として含む。配列番号１〜３，２９０，９３９の配列表は、本明細書において電子フォーマットで、ファイル名「５１０５８０６６．ＴＸＴ」として「ＣＲＦ」、「ＣＯＰＹ １」、「ＣＯＰＹ ２」及び「ＣＯＰＹ ３」とラベルを貼った４枚のコンパクトディスク（ＣＤ−Ｒ）で提供され、本出願においてこれらの全体を参照することによって本明細書で援用される。
本出願は、プリントされた紙コピーの代わりにＣＤ−Ｒで提出された「長い」配列表を含み、該配列表は、その全体を参照することによって本明細書で援用される。２０１０年７月１日付けで記録された前記ＣＤ−Ｒは、「ＣＲＦ」、「Ｃｏｐｙ １」、「Ｃｏｐｙ ２」及び「Ｃｏｐｙ ３」それぞれとしてラベルが貼られ、それぞれは、一つの同じ７７４，６３５ＫＢのファイル（５１０５８０６６．ＴＸＴ）だけを含む。
本発明は、一般的にはバイオプロセシングの分野に関し、さらに詳しくは宿主細胞を標的遺伝子の発現を調節できるＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって宿主細胞において生物由来物質を産生するための方法であって、前記調節が生物由来物質の産生を高める方法に関する。また、本発明は、一般的にはトランスクリプトーム、組織的なトランスクリプトーム、並びに細胞において生体分子産生の標的とされる調節を設計するためにトランスクリプトームを使用するシステム及び方法に関する。さらにまた、本発明は、生体分子のより効果的及び効率的な産生のための工学細胞及び細胞株に関する。本発明はまた、前記方法を実施するのに有用な分子、組成物、細胞、及びキット並びに前記方法によって産生される生物由来物質に関する。
細胞培養技術は、種々様々な生物由来物質、例えば生物医薬、バイオ燃料、代謝産物、ビタミン類及び機能性食品を製造するのに使用される。工業規模生産を促進し及び製品の品質及び一致性について適用規格を満たすことを目的として、多数の方法が、細胞培養バイオプロセスの生産性、収量、効率及びその他の面を高めるために開発されている。細胞培養バイオプロセスを最適化するための伝統的な方法は、物理的及び生化学的パラメータ、例えば培地（例えば、ｐＨ、養分）及び条件（例えば、温度、期間）を調整すること並びに所望の表現型を有する宿主細胞を選択することを伴う。遺伝学的方法もまた、組換えＤＮＡを宿主細胞に導入することによって細胞培養バイオプロセスを最適化するために開発されており、この場合に前記ＤＮＡは、生物由来物質の産生に影響を及ぼす外来性タンパク質をコードするか又は生物由来物質の産生に影響を及ぼす内在性タンパク質の発現を調節する。しかし、このような方法は、費用がかかり、時間のかかる実験室操作を必要とし、ある種の遺伝子、タンパク質、宿主細胞及び生物由来物質と適合しないものであり得る。従って、当該技術において、種々様々な宿主細胞及び生物由来物質に関係する細胞培養バイオプロセスを最適化するための新規な遺伝学的方法の必要性がある。
最近、生物学的産生のための宿主細胞が、生物由来物質の産生に影響を及ぼす遺伝子のサイレンシングのためにｓｈＲＮＡを発現するゲノム遺伝子に組み込むために修飾されている。しかし、これらの場合には、産生物の収量は、宿主細胞の生存率を低下させるｓｈＲＮＡの制御されない、意図されない発現のために、調節することが困難であると判明している。また、ｓｈＲＮＡを組み込む方法も、時間のかかる細胞工学を必要とする。さらにまた、制御されない発現は、最終的に表現型の変化を招き、時間外に、発現されたｓｈＲＮＡのための遺伝子を有する宿主細胞は、任意の有意な収量でその生物由来物質を産生する能力を失う。
例えば、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）卵巣（ＣＨＯ）細胞が、種々のバイオプロセスで広く使用されているが、これらの細胞での遺伝子発現についてはまだ比較的わずかしか知られていない、従って、これらの細胞におけるバイオプロセスの標的とした及びインテリジェントな調節は、容易に、行うことができない又は設計することができない。従って、当該技術において、種々様々な宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、及びこれらの細胞において産生される生物由来物質に関係する細胞培養バイオプロセスを最適化するための新規な遺伝学的方法の必要性がある。
本発明は、少なくとも部分的には、宿主細胞によって産生される生物由来物質の品質及び量を大規模な細胞株の操作を必要とせずに向上させることができるように、ＲＮＡエフェクター分子を、培養において細胞に低濃度で適用して遺伝子発現の効果のある永続的な調節を行うことができるという意外な発見に基づく。従って、第一の態様において、本発明は、宿主細胞から生物由来物質を産生させるための組成物及び方法を提供する。種々の実施形態において、生物由来物質は、ポリペプチド、代謝産物、機能性食品、化学中間体、バイオ燃料、食品添加物又は抗生物質である。特定の実施形態において、生物由来物質は、ポリペプチドである。
別の態様において、本発明は、宿主細胞から生物由来物質を産生させるための方法を提供する。この方法は、一般的に、宿主細胞を、ＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、標的遺伝子と相補的である）と接触させ、大規模バイオリアクターにおいて宿主細胞を、標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持する（この場合に、前記調節は、宿主細胞から生物由来物質の産生を高める）ことを含む。一つの実施形態において、この方法は、さらに、生物由来物質を宿主細胞から単離することを含む。
一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の発現を一時的に調節する。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の発現を一時的に抑制する。
別の実施形態において、宿主細胞は、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は真菌細胞である。一つの実施形態において、動物細胞は、哺乳動物細胞である。別の実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、齧歯類動物細胞、イヌ細胞、又は非ヒト霊長類動物細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣から誘導される細胞である。別の特定の実施形態において、宿主細胞は、ＭＤＣＫ細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、生物由来物質又はウイルス受容体をコードする導入遺伝子を含有する。
一つの実施形態において、宿主細胞を、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子と接触させる。前記複数のＲＮＡエフェクター分子は、単一の標的遺伝子又は多数の標的遺伝子の発現を調節するのに使用できる。
別の実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の投与計画に従って、例えば６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間又はそれ以上の頻度で細胞に投与するために製剤される。前記組成物の投与は、一つ又はそれ以上の細胞増殖期、例えば誘導期、初期対数期、中期対数期、後期対数期、定常期又は死滅期の間に維持することができる。
別の実施形態において、別個の標的遺伝子に指向する２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物が、培養細胞において第一の標的遺伝子及び少なくとも第二の標的遺伝子の発現を調節することによって細胞培養において生物由来物質の産生を高めるのに使用される。別の実施形態において、同じ標的遺伝子に指向する２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物が、培養細胞において標的遺伝子の発現を調節することによって細胞培養において生物由来物質の産生を高めるのに使用される。
別の実施形態において、第一のＲＮＡエフェクター分子が、培養細胞に投与され、次いで第二のＲＮＡエフェクター分子が、前記細胞に投与される（又は逆の場合も同様）。別の実施形態において、第一及び第二のＲＮＡエフェクター分子が、培養細胞に実質的に同時に投与される。
一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子が、生物由来物質の産生を可能にする条件下で細胞を保持するのに使用される細胞培地に加えられる。ＲＮＡエフェクター分子は、異なる時間で又は同時に加えることができる。一つの実施形態において、異なるＲＮＡエフェクター分子の一つ又はそれ以上が、例えば連続平均抑制率又はＲＮＡエフェクター分子濃度を維持するために、細胞培養培地に連続注入によって加えられる。別の実施形態において、異なるＲＮＡエフェクター分子の一つ又はそれ以上が、例えば最小平均抑制率又はＲＮＡエフェクター分子濃度を維持するために、細胞培養培地に連続注入によって加えられる。一つの実施形態において、連続注入は、少なくとも一つの標的遺伝子について所定の平均抑制率を達成する速度で投与される。一つの実施形態において、連続注入は、異なる時間、例えば１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、１８時間、２４時間、４８時間、７２時間又はそれ以上行われる（これは、反復することができる）。複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を施用する場合には、前記複数のＲＮＡエフェクター分子のそれぞれは、同じ頻度で又は異なる頻度で加えることができる。前記複数の異なるＲＮＡエフェクター分子は、同じ濃度で又は異なる濃度で加えることができる。いくつかの実施形態において、細胞とＲＮＡエフェクター分子の最後の接触は、生物由来物質の単離又は上清を収穫する少なくとも２４時間前、４８時間前、７２時間前、１２０時間又はそれ以上前である。
一般的に、ＲＮＡエフェクター分子は、２００ｎＭ以下（例えば、１００ｎＭ、８０ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ以下）の所定の濃度で加えられる。本明細書に記載のように、低濃度のＲＮＡエフェクター分子が、大規模バイオプロセシングにおいて効率的に標的遺伝子を調節するために使用できる。低濃度のＲＮＡエフェクター分子を使用することについて、顕著な経済的及び商業的利点（例えば、より低いコスト及びより容易な除去）がある。従って、一つの実施形態において、細胞は、ＲＮＡエフェクター分子と１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下の濃度で接触させる。特定の実施形態において、一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、細胞培養培地に、増殖期及び／又は産生期の間に１ｎＭの最終濃度で少なくとも１回（例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回又はそれ以上）投与される。
さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、異なるＲＮＡエフェクター分子のそれぞれの所定の開始濃度で（例えば、１ｎＭそれぞれで）加えられ、さらにＲＮＡエフェクター分子の連続注入で補充される。
細胞と接触させるべきＲＮＡエフェクター分子は、細胞内への取り込み及び送達を促進する製剤に組み込むことができる。異なるＲＮＡエフェクター分子の一つ又はそれ以上は、細胞を、ＲＮＡエフェクター分子及びＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する試薬、例えば、エマルジョン、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、荷電脂質、リポソーム、陰イオン性脂質、浸透促進剤、トランスフェクション試薬、又は結合のためのＲＮＡエフェクター分子に対する修飾、例えばリガンド、標的部分、ペプチド、親油性基などと接触させることによって加えることができる。
特定の実施形態において、脂質製剤が、ＲＮＡエフェクター分子組成物に、ＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する試薬として加えられる。特定の実施形態において、脂質製剤は、本明細書に記載のようなＬＮＰ製剤、ＬＮＰ０１製剤、ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ製剤又はＳＮＡＬＰ製剤であることができる。関連する実施形態において、ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ製剤は、次の通りであり：２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＸＴＣ）を、ＸＴＣ／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃＤＭＡが５７．１／７．１／３４．４／１．４の比率で及び約７の脂質：ｓｉＲＮＡ比率で使用する。さらに別の関連する実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ｄｓＲＮＡであり、次の通り：２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＸＴＣ）を、ＸＴＣ／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃＤＭＡが５７．１／７．１／３４．４／１．４の比率で及び約７の脂質：ｓｉＲＮＡ比率で使用してＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ製剤に製剤化される。あるいは、ＲＮＡエフェクター分子、例えば本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子は、次の通り：ＸＴＣ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ２０００−Ｃ１４を５０／１０／３８．５／１．５モル％の比率で及び約１１：１の脂質：ｓｉＲＮＡの比率で使用してＬＮＰ０９製剤に製剤化することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、次の通り：ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ２０００−Ｃ１４を５０／１０／３８．５／１．５モル％の比率で及び約１１：１の脂質：ｓｉＲＮＡの比率で使用してＬＮＰ１１製剤に製剤化される。さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ＬＮＰ０９製剤又はＬＮＰ１１製剤に製剤化され、ＰＢＳ対照群に比べて、標的遺伝子ｍＲＮＡ量を０．３ｍｇ／ｋｇの用量で約８５〜９０％減少させる。さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ＬＮＰ０９製剤又はＬＮＰ１１製剤に製剤化され、ＰＢＳ対照群に比べて、標的遺伝子ｍＲＮＡ量を０．１ｍｇ／ｋｇの用量で約５０％減少させる。さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ＬＮＰ０９製剤又はＬＮＰ１１製剤に製剤化され、標的遺伝子タンパク質量を、ウェスタンブロットによって測定されるようにＰＢＳ対照群に比べて用量に依存した方法で低下させる。さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、次の通り：ＤｌｉｎＤＭＡをＤＬｉｎＤＭＡ／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ２０００−ｃＤＭＡが５７．１／７．１／３４．４／１．４の比率で及び約７の脂質：ｓｉＲＮＡ比率で使用してＳＮＡＬＰ製剤に製剤化される。
いくつかの実施形態において、脂質製剤は、次式：
Figure 2014501097
 ｛式中：
Ｒ１及びＲ２は、それぞれの存在についてそれぞれ独立して、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルキル、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルコキシ、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルケニルオキシ、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルキニルオキシ、又は場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アシルであり；
Figure 2014501097
 は、Ｌ２とＬ１の間の結合を表し、この結合は：
（１）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子の間の単結合であり〔この場合、
Ｌ１は、Ｃ（Ｒｘ）、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｑ）であり；
Ｌ２は、−ＣＲ５Ｒ６−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｑ）−、＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、又は−Ｃ（Ｏ）−である〕；
（２）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子の間の二重結合であり〔この場合、
Ｌ１は、Ｃであり；
Ｌ２は、−ＣＲ５＝、−Ｎ（Ｑ）＝、−Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝である〕；
（３）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合、及びＬ２の第二の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合であり〔この場合、
Ｌ１は、Ｃであり；
Ｌ２は、次式：
Figure 2014501097
 を有し、式中のＸは、Ｌ２の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ２の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ１の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｚ１及びＺ４は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
Ｚ２は、ＣＨ又はＮであり；
Ｚ３は、ＣＨ又はＮであり；
あるいは、Ｚ２とＺ３は、一緒になって、単一のＣ原子であり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
それぞれのＺは、Ｎ、Ｃ（Ｒ５）、又はＣ（Ｒ３）であり；
ｋは、０、１、又は２であり；
それぞれのｍは、独立して０〜５であり；
それぞれのｎは、独立して０〜５であり；
この場合に、ｍとｎは、一緒になって３、４、５、６、７又は８員環を生じる〕；
（４）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合、及びＬ２の第一の原子とＬ１の第二の原子の間の単結合であり〔この場合に、
（Ａ）Ｌ１は、次式：
Figure 2014501097
 を有し、式中のＸは、Ｌ１の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ１の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ２の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｔ１は、ＣＨ又はＮであり；
Ｔ２は、ＣＨ又はＮであり；
あるいは、Ｔ１とＴ２は、一緒になって、Ｃ＝Ｃであり；
Ｌ２は、ＣＲ５であるか；又は
（Ｂ）Ｌ１は、次式：
Figure 2014501097
 を有し、式中のＸは、Ｌ１の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ１の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ２の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｔ１は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
Ｔ２は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
Ｌ２は、ＣＲ５又はＮである〕；
Ｒ３は、次式：
Figure 2014501097
 を有し、式中、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４のそれぞれは、独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、又はアルキニルであるか；あるいは、
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の任意の２つは、これらを結合しているＮ原子と一緒になって３〜８員複素環を形成するか；あるいは、
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、全てがこれらを結合しているＮ原子と一緒になって二環式５〜１２員複素環を形成し；
それぞれのＲｎは、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；
Ｌ３は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｌ４は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｌ５は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｒ５及びＲ６のそれぞれの存在は、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；あるいは、隣り合った２個の炭素原子上の２個のＲ５基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で二重結合を形成するか；又は隣り合った２個の炭素原子上の２個のＲ５基と、同じ隣り合った炭素原子上の２個のＲ６基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で三重結合を形成し；
それぞれのａは、独立して、０、１、２、又は３であり；
この場合に、
Ｌ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基は、場合によりＬ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基と一緒になって、３〜８員シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリール基を形成し；及び
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の任意の一つは、場合により、Ｌ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６基、及びこれらを結合している原子と一緒になって、３〜８員ヘテロシクリル基を形成し；
それぞれのＱは、独立して、Ｈ、アルキル、アシル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり；並びに
それぞれのＱ２は、独立してＯ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）（Ｑ）、アルキル又はアルコキシである｝
を有する脂質を含んでなる。
特定の実施形態において、前記製剤は、第四級アミンを含有する脂質、例えば本明細書に記載の脂質（例えば、脂質Ｈ、脂質Ｋ、脂質Ｌ、脂質Ｍ、脂質Ｐ及び脂質Ｒ）を、ＲＮＡエフェクター分子取り込みを促進する試薬として含む。標準的な方法又は押出しを含まない方法のいずれかで調製できる「脂質Ｈ」、「脂質Ｋ」、「脂質Ｌ」、「脂質Ｍ」、「脂質Ｐ」及び「脂質Ｒ」のための製剤は、以下の通りに示される：
Figure 2014501097
 ＲＮＡエフェクター分子組成物が送達促進剤を用いて製剤化される実施形態において、前記組成物は、溶液（例えば、滅菌溶液、例えば単位剤形で包装された滅菌溶液）であることができるし、又は滅菌凍結乾燥組成物（例えば、１リットルの細胞培養培地に使用のための単位で予備投与される）としてあることができる。
別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子を含む組成物は、さらに増殖培地、例えば合成培地を含む。
さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子を含むＲＮＡエフェクター分子組成物は、さらに、増殖培地補助物質、例えば、必須アミノ酸（例えば、グルタミン）、２−メルカプト−エタノール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脂質濃縮物、コレステロール、カタラーゼ、インスリン、ヒトトランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、ビオチン、酢酸ＤＬα−トコフェロール、ＤＬα−トコフェロール、ビタミン類（例えば、ビタミンＡ（酢酸エステル）、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ニコチンアミド、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、ｉ−イノシトール）、コルチコステロン、Ｄ−ガラクトース、エタノールアミンＨＣｌ、グルタチオン（還元型）、Ｌ−カルニチンＨＣｌ、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレッシン２ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、Ｔ３（トリヨード−Ｉ−チロニン）、増殖因子（例えば、ＥＧＦ）、鉄、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ヒポキサンチンナトリウム、アミノプテリン及びチミジン、アラキドン酸、エチルアルコール１００％、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ＰＬＵＲＯＮＩ ＣＦ６８（登録商標）、ステアリン酸１０、ＴＷＥＥＮ ８０（登録商標）非イオン性界面活性剤、ピルビン酸ナトリウム、及びグルコースからなる群から選択される作用物質を含む。
種々の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、ギャップマー、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）又はリボザイムを含むことができる。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ｓｈＲＮＡではない。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど又はこれらの組み合わせ）である。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、一つの鎖が少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、１７個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチド又は１９個のヌクレオチド）を含む二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、少なくとも１７個の連続したヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、さらに、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、さらに、少なくとも２個のデオキシリボヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、さらに、少なくとも２個のデオキシチミジン残基を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、アンチセンス鎖が少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、１７個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチド又は１９個のヌクレオチド）を含む二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、少なくとも１７個の連続したヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、さらに、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、さらに、少なくとも２個のデオキシリボヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、前記アンチセンス鎖は、さらに、少なくとも２個のデオキシチミジン残基を含む。
一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子を活性化することができる。
別の実施形態において、ＲＮＡエフェクターは、標的遺伝子を抑制することができる。
いくつかの実施形態において、少なくとも一つの測定可能なパラメータ、例えば細胞密度、培地ｐＨ、酸素濃度、グルコース濃度、乳酸濃度温度及びタンパク質産生のいずれか一つは、生物由来物質の産生中に監視することができる。
別の実施形態において、前記方法は、さらに、宿主細胞に第二の作用物質を投与することを含む。第二の作用物質は、増殖因子；アポトーシス阻害剤；キナーゼ阻害剤；ホスファターゼ阻害剤；プロテアーゼ阻害剤；病原体の阻害剤（例えば、ウイルスが生物由来物質である場合には、その他のウイルスあるいは真菌性又は細菌性病原体の増殖及び／又は繁殖を抑制する作用物質）；ヒストン脱メチル化剤；抗生物質；抗真菌剤；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート）；増殖因子（例えば、インスリン）；アポトーシス阻害剤；キナーゼ阻害剤、例えばＭＡＰキナーゼ阻害剤；ＣＤＫ阻害剤及び／又はＫ２５２ａ；ホスファターゼ阻害剤、例えばバナジン酸ナトリウム及びオカダ酸；プロテアーゼ阻害剤；及びヒストン脱メチル化剤、例えば５−アザシチジンであることができる。繁殖するウイルスがインフルエンザである場合には、第二の物質は、インフルエンザ赤血球凝集素を切断するプロテアーゼ、例えばプロナーゼ、サーモリシン、スブチリシンＡ又は組換えプロテアーゼであることができる。
別の実施形態において、本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子、例えば宿主細胞標的遺伝子に指向するｄｓＲＮＡを含有する組成物は、培養細胞に、細胞による生物由来物質の産生を高めるのに有用な非ＲＮＡ作用物質と共に投与される。
いくつかの実施形態において、生物由来物質は、ポリペプチドであり、及び標的遺伝子は、宿主細胞において翻訳後修飾に影響を及ぼすタンパク質をコードする。種々の実施形態において、翻訳後修飾は、タンパク質グリコシル化、タンパク質脱アミド化、タンパク質ジスルフィド結合形成、メチオニン酸化、タンパク質ピログルタミン酸化、タンパク質折りたたみ又はタンパク質分泌であることができる。
更なる実施形態において、標的遺伝子は、宿主細胞の生理学的プロセスに影響を及ぼすタンパク質をコードする。種々の実施形態において、生理学的プロセスは、アポトーシス、細胞周期の進行、炭素の代謝又は輸送、乳酸形成、ＲＮＡｉ取り込み及び／又は効率、又はアクチン動態である。
別の実施形態において、標的遺伝子は、酸化促進酵素をコードするか、又は細胞ｐＨに影響を及ぼすタンパク質をコードする。
別の態様において、本発明は、本明細書において提供される少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子を含有する培養真核細胞を提供する。前記細胞は、哺乳動物細胞、例えば齧歯類動物細胞、イヌ細胞、非ヒト霊長類動物細胞、又はヒト細胞である。
別の態様において、本発明は、宿主細胞において標的遺伝子の発現を調節することによって細胞培養において生物由来物質の産生を高めるための組成物を提供する。前記組成物は、典型的には、本明細書に記載の一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子と、適当な担体又は送達ビヒクル、例えば許容される担体及び／又はＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する試薬とを含む。ＲＮＡエフェクター分子組成物は、水性媒体、非水性媒体又は混合媒体中の懸濁物として製剤化でき、また脂質又非脂質製剤に製剤化できる。ＲＮＡエフェクター分子組成物は、滅菌溶液で提供することができるし又は凍結乾燥できる（例えば、濃縮及び／又は体積による離散単位で提供できる）。
一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター組成物は、ＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する試薬、例えばエマルジョン、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、荷電脂質、リポソーム、陰イオン性脂質、浸透促進剤、トランスフェクション試薬又は結合のためのＲＮＡエフェクター分子に対する修飾、例えばリガンド、標的部分、ペプチド、親油性基などを含む。
一つの実施形態において、培養細胞において標的遺伝子の発現を調節するためのベクターが提供され、この場合に前記標的遺伝子は、細胞による生物由来物質の産生に影響を及ぼすタンパク質をコードする。一つの実施形態において、前記ベクターは、ＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つの鎖をコードするヌクレオチド配列に操作により連結された少なくとも一つの調節配列を含む。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ベクターによってコードされない。
別の実施形態において、本発明は、細胞において標的遺伝子の発現を抑制するためのベクターを含有する細胞を提供する。前記ベクターは、ＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つの鎖をコードするポリヌクレオチドに操作により連結された調節配列を含む。
本発明のさらに別の態様は、本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子を含むキットを包含する。一つの実施形態において、前記キットは、生物由来物質の産生に影響を及ぼすタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子を含む。別の実施形態において、前記キットは、さらに、生物由来物質の産生に影響を及ぼすタンパク質の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子を発現する修飾細胞株を含む。また、前記キットは、本明細書において提供される方法を実施するための取扱説明書も含む。
一つの実施形態において、前記キットは、さらに、宿主細胞を増殖させるのに適した培養及び／又はＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列を宿主細胞に導入するための構造物（例えば、プラスミド、ウイルスなど）含む。さらに別の実施形態において、前記キットは、さらに、生物由来物質を検出及び／又は精製するための試薬を含むことができる。適当な試薬の非限定的な例としては、ＰＣＲプライマー、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、アフィニティークロマトグラフィー媒体などが挙げられる。
一つの実施形態において、キットは、潜在ウイルス、外来ウイルス又は内在性ウイルスの発現を抑制するために、従って所望の生物由来物質の産生に影響を及ぼすために標的遺伝子の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子を含む。別の実施形態において、キットは、所望の生物由来物質の産生に影響を及ぼす潜在ウイルス、外来ウイルス又は内在性ウイルスの発現を調節するＲＮＡエフェクター分子を発現する宿主細胞を含む。このようなキットは、本明細書において提供される方法を実施するための取扱説明書も含むことができる。キットはまた、ＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する少なくとも一つの試薬であって、荷電脂質、エマルジョン、リポソーム、陽イオン性又は非陽イオン性脂質、陰イオン性脂質、トランスフェクション試薬又は浸透促進剤を含む少なくとも一つの試薬含むこともできる。特定の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する試薬は、荷電脂質を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、収穫した生物由来物質の収量及び／又は品質を低下させることができる内在性ウイルス、潜在ウイルス又は外来ウイルスの発現を抑制するために、微生物接種又はベクター形質導入の間又は後に、宿主細胞においてＲＮＡ干渉を開始することに関する。例えば、実施形態は、ｓｉＲＮＡ、又は例えばｓｈＲＮＡを、内在性、潜在又は外来ウイルス経路（例えば、トリ細胞内の内在性トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ−Ｅ）のｅｖ遺伝子座；ＣＨＯ細胞内の内在性Ｃ型レトロウイルス様粒子ゲノム；又はベロ細胞内のブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ−１）のｒｅｐ遺伝子）を標的とし、それによって所望の生物由来物質の品質及び／又は収量を上昇させるむき出しの形態、複合化形態又は製剤化形態（例えば、ナノ粒子）で投与する。
本発明のいくつかの実施形態において、単純な（むき出しの（すなわち非複合化）ＲＮＡエフェクター分子）又は複合した（例えば、コレステロール又はその他の標的リガンドに直接に複合した）ＲＮＡエフェクター分子が使用できる。別の実施形態において、ｓｈＲＮＡについてプラスミドベクター又はウイルスベクターにコードされたＲＮＡエフェクター分子が使用できる。
本発明のいくつかの実施形態において、ＬＮＰ製剤又は別のポリマー製剤が使用される。いくつかの実施形態において、前記製剤は、ＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する作用物質、例えば荷電脂質、エマルジョン、リポソーム、陽イオン性又は非陽イオン性脂質、陰イオン性脂質、トランスフェクション試薬又は浸透促進剤を含む。特定の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する試薬は、荷電脂質を含む。また、前記製剤は、前記作用物質／ベクターが所望の産生物を産生できる関連細胞に対する送達を促進するか又はＲＮＡｉ物質を安定化させるために感染性種子又はベクターそれ自体に同時に製剤化するか又は組み込むことができる。
特定の実施形態において、標的遺伝子は、内在性、外来又は潜在ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、肝炎ウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、ボルナウイルス、レトロウイルス、アレナウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、ハンタウイルス、サーコウイルス又はベシウイルスに関連する。
本発明の方法によって標的とすることができる具体的な内在性ウイルス及び潜在ウイルスとしては、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）、ネズミ白血病／肉腫ウイルス（ＭＬＶ）、サーコウイルス、例えばブタサーコウイルス（ＰＣＶ−１、ＰＣＶ−２）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス（ＬＤＨ又はＬＤＶ）、ヒト種Ｃ型アデノウイルス、トリアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、霊長類内在性レトロウイルスファミリーＫ（ＥＲＶ−Ｋ）及びヒト内在性レトロウイルスＫ（ＨＥＲＶ−Ｋ）が挙げられる。
さらにＥＲＶに関して、本発明の実施形態において、ＥＲＶの標的遺伝子は、霊長類／ヒトクラスＩガンマＥＲＶ類 ｐｔ０１−Ｃｈｒ１０ｒ−１７１１９４５８、ｐｔ０１−Ｃｈｒ５−５３８７１５０１、ＢａＥＶ、ＧａＬＶ、ＨＥＲＶ−Ｔ、ＥＲＶ−３、ＨＥＲＶ−Ｅ、ＨＥＲＶ−ＡＤＰ、ＨＥＲＶ−Ｉ、ＭＥＲ４様、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶＨ−ＲＴＶＬＨ２、ＨＥＲＶＨ−ＲＧＨ２、ＨＥＲＶ−Ｈｃｏｎｓｅｎｓｕｓ、ＨＥＲＶ−Ｆｃ１；霊長類／ヒトイプシロンＥＲＶ ｈｇ１５−ｃｈｒ３−１５２４６５２８３；霊長類／ヒト中間（イプシロン様）ＨＥＲＶＬ６６；霊長類／ヒトクラスＩＩＩスプーマ様ＥＲＶ類 ＨＳＲＶ、ＨＦＶ、ＨＥＲＶ−Ｓ、ＨＥＲＶ−Ｌ、ＨＥＲＶＬ４０、ＨＥＲＶＬ７４；霊長類／ヒトデルタＥＲＶ類 ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２；霊長類／ヒトレンチＥＲＶ類 ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２；霊長類／ヒトクラスＩＩ、ベータＥＲＶ ＭＰＭＶ、ＭＭＴＶ、ＨＭＬ１、ＨＭＬ２、ＨＭＬ３、ＨＭＬ４、ＨＭＬ７、ＨＭＬ８、ＨＭＬ５、ＨＭＬ１０、ＨＭＬ６又はＨＭＬ９の標的遺伝子であることができる。
本発明の別の実施形態において、ＥＲＶは、齧歯類動物クラスＩＩベータＥＲＶ ＭＭＴＶ；齧歯類動物クラスＩガンマＥＲＶ ＭＬＶ；ネコクラスＩガンマＥＲＶ ＦＬＶ；有蹄動物クラスＩガンマＥＲＶ ＰＥＲＶ；有蹄動物デルタＥＲＶ ＢＬＶ；有蹄動物レンチウイルスビスナ、ＥＩＡＶ；有蹄動物クラスＩＩ、ベータＥＲＶ ＪＳＲＶ；トリクラスＩＩＩ、スプーマ様ＥＲＶ類 ｇｇ０１−ｃｈｒ７−７１６３４６２；ｇｇ０１−ｃｈｒＵ−５２１９０７２５、ｇｇ０１−Ｃｈｒ４−４８１３０８９４；トリアルファＥＲＶ類 ＡＬＶ、ｇｇ０１−ｃｈｒ１−１５１６８８４５；トリ中間ベータ様ＥＲＶ類 ｇｇ０１−ｃｈｒ４−７７３３８２０１；ｇｇ０１−ＣｈｒＵ−１６３５０４８６９、ｇｇ０１−ｃｈｒ７−５７３３７８２；爬虫類中間ベータ様ＥＲＶ インドニシキヘビ；魚類イプシロンＥＲＶ ＷＤＳＶ；魚類中間（イプシロン様）ＥＲＶ ＳｎＲＶ；両生類イプシロンＥＲＶ Ｘｅｎ１；昆虫エランティウイルスＥＲＶ Ｇｙｐｓｙから選択される。
本発明の他の実施形態は、動物起源の外来ウイルス、例えばベシウイルス、サーコウイルス、ハンターンウイルス、マルブルグウイルス、ＳＶ４０、ＳＶ２０、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、サルウイルス５（ｓｖ５）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ブタパルボウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、マウス肺炎ウイルス（ＰＶＭ）、タイラー脳脊髄炎ウイルス（ＴＨＥＭＶ）、ネズミ微小ウイルス（ＭＭＶ又はＭＶＭ）、マウスアデノウイルス（ＭＡＶ）、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、マウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）、キルハムラットウイルス（ＫＲＶ）、トゥーランＨ−１ウイルス、センダイウイルス〔ＳｅＶ、ネズミパラインフルエンザ１型ウイルス又は日本のヘマグルチン化ウイルス（ＨＶＪ）としても知られている〕、パーカーラットコロナウイルス（ＲＣＶ又はＳＤＡ）、偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、レオウイルス、カシェ渓谷ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ウシパラインフルエンザ３型ウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシアデノウイルス、ウシパルボウイルス、ウシヘルペスウイルス１（ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス）、その他のウシヘルペスウイルス、ウシレオウイルス、狂犬病ウイルス、ブルータングウイルス、ウシポリオーマウイルス、ウシサーコウイルス、及び牛痘以外のオルトポックスウイルス、偽牛痘ウシ（ヒトに感染することができる広範囲にわたるパラポックスウイルス）、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、又はレポリポックスウイルスを標的とする。
他の実施形態は、ヒト起源の外来物質、例えばＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２；ヒトＴ細胞リンパ指向性Ｉ型ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）及びＨＴＬＶ−ＩＩ；ヒト肝炎Ａ、Ｂ及びＣ型ウイルス；ヒトサイトメガロウイルス；エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ又はＨＨＶ−４）；ヒトヘルペスウイルス６、７及び８；ヒトパルボウイルスＢ１９；レオウイルス；ポリオーマ（ＪＣ／ＢＫ）ウイルス；ＳＶ４０ウイルス；ヒトコロナウイルス；ヒトパピローマウイルス；インフルエンザＡ、Ｂ及びＣ型ウイルス；ヒトエンテロウイルス；ヒトパラインフルエンザウイルス；及びヒト呼吸器合胞体ウイルスを標的とする。
本発明のさらにその他の実施形態は、内在性ウイルス、潜在ウイルス又は外来ウイルスが結合するか又はウイルス複製に必要である宿主細胞表面受容体又は細胞内タンパク質を標的とする。例えば、特定の実施形態において、標的遺伝子は、ＣＨＯ細胞ＭＶＭ受容体遺伝子、例えば細胞シアル酸産生に関連する遺伝子である。
本明細書に記載のようなシアル酸に関連する標的遺伝子の他に、生物由来物質の収量及び／又は品質は、宿主細胞においてグリコシル化に関連する遺伝子を標的とすることによって最適化し得る。Ｇａｌｅ遺伝子は、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ、例えば、ＣＨＯ Ｇａｌｅ転写産物配列番号：５５６４をコードし、Ｇａｌｅヌクレオチド配列及び／又は例えば配列番号：１８８８６５６−１８８９００７に提供されるような配列の少なくとも１６個のヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含む典型的なＲＮＡエフェクター分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）を使用して標的とすることができる。この酵素は、前記細胞がガラクトースをグルコースに転化させる（及びその逆も同様）ことによってラクトースを処理することを可能にする。ＵＤＰ−ガラクトースは、化学的シグナル伝達、細胞構造の構築、分子の輸送及びエネルギー生産において重要な役割を果たすガラクトース含有タンパク質及び脂肪を作り上げるのに使用される。ハムスターＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラーゼ（ＧＭＤＳ）に対する典型的なｄｓＲＮＡ配列が、配列番号：３１５２７５４−３１５２７９３として本明細書に開示され、偶数番号を付した配列番号（例えば、配列番号：３１５２７５４）は、センス鎖を表し、奇数番号を付した配列番号（例えば、配列番号：３１５２７５５）は、相補的アンチセンス鎖を表す。
従って、本明細書に記載の実施形態において、ＧＭＤＳの発現は、センス鎖とアンチセンス鎖〔その一つは、配列番号：３１５２７５４−３１５２７９３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、１７個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチド又は１９個のヌクレオチド）を含む〕を含む対応ＲＮＡエフェクター分子を使用して調節できる。一つの実施形態において、一つの鎖は、配列番号：３１５２７５４−３１５２７９３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、一つの鎖は、配列番号：３１５２７５４−３１５２７９３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１７個の連続したヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、一つの鎖は、配列番号：３１５２７５４−３１５２７９３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、一つの鎖は、配列番号：３１５２７５４−３１５２７９３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号：３１５２７５４−３１５２７９３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個のヌクレオチド（例えば、１７個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチド又は１９個のヌクレオチド）を含み、さらに少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号：３１５２７５４−３１５２７９３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個のヌクレオチド（例えば、１７個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチド又は１９個のヌクレオチド）を含み、さらに少なくとも２個のデオキシリボヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号：３１５２７５４−３１５２７９３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個のヌクレオチド（例えば、１７個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチド又は１９個のヌクレオチド）を含み、さらに少なくとも２個のデオキシチミジン残基を含む。
種々の実施形態において、生物由来物質は、ポリペプチド、代謝産物、機能性食品、化学中間体、バイオ燃料、食品添加物又は抗生物質である。さらに詳しくは、いくつかの実施形態において、生物由来物質は、ポリペプチドである。ポリペプチドは、組換えポリペプチドであるか又は宿主細胞に内在性のポリペプチドであることができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗原、糖タンパク質、受容体、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、酵素、増殖因子、増殖因子受容体、抗体、抗原結合ペプチド又はその他の免疫エフェクター、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン、インテグリン、可溶性主要組織適合性複合抗原、結合タンパク質、転写因子、翻訳因子、腫瘍性タンパク質又は腫瘍原性タンパク質、筋タンパク質、骨髄タンパク質、神経活性タンパク質、腫瘍増殖抑制剤、構造タンパク質又は血液タンパク質（例えば、トロンビン、プロトロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、タンパク質Ｃ又はフォンウイルブランド因子）である。特定の実施形態において、生物由来物質は、抗体（例えば、組換えモノクロナール抗体）である。
本発明の方法はまた、宿主細胞培養物の増殖、産生及び活性化レベルを監視する工程も含むことができ、並びに宿主細胞の増殖、産生及び活性化レベル並びに所望の産生物を最大にするために宿主細胞培養の条件を変化させるために、及び生物由来物質を細胞又は培養物から収穫し、収穫した生物由来物質を用いて製剤を調製するために、及び前記方法によって得られた製剤を、疾患の治療及び／又は予防を必要とする対象に投与することによって疾患の治療及び／又は予防するために含むことができる。
一つの実施形態において、宿主細胞は、多数の標的遺伝子の発現を調節するために複数の異なるＲＮＡエフェクター分子が投与される。複数のＲＮＡエフェクター分子は、異なる時間で又は同時に、同じ頻度で又は異なる頻度で、同じ濃度で又は異なる濃度で投与することができる。
別の実施形態において、本発明は、細胞での標的遺伝子の発現を調節することによって宿主細胞において生物由来物質の産生を高めるための組成物を提供する。前記組成物は、典型的には、一つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチド、例えば本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子と、適当な担体又は送達ビヒクルとを含む。
さらなる実施形態において、標的遺伝子は、宿主細胞の生理学的プロセスに影響を及ぼすタンパク質をコードする。種々の実施形態において、前記生理学的プロセスは、アポトーシス、細胞周期の進行、炭素の代謝又は輸送、乳酸形成又はＲＮＡｉ取り込み及び／又は効果である。
さらに具体的には、いくつかの実施形態において、第二の標的遺伝子は、宿主細胞免疫反応に関連する遺伝子、並びにＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ２１、ＲＩＧ−１、ＬＰＧＰ２、ＲＩＧ１様受容体、ＴＲＩＭ２５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＡＶＳ／ＶＩＳＡ／ＩＰＳ１／Ｇａｒｄｉｆ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＲ２、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＪＡＫ−１、ＪＡＫ−２、ＪＡＫ−３、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＩＲＦ１０、２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ、ＲＮａｓｅＬ、ｄｓＲＮＡ−ｄＰＫＲ、Ｍｘ、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３、炎症誘発性サイトカイン、ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ、ＰＫＲ、及びこれらのいずれかの調節領域からなる群から選択される標的遺伝子である。
他の特定の実施形態において、第二の標的遺伝子は、宿主細胞の生存率、増殖又は細胞周期に関連する遺伝子であり、並びに該標的遺伝子は、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦ１、ＨＳＰ７０、ＴＲＡＩＬ、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ１４、ＦＡＳＬＧ、ＤＰＦ２、ＡＩＦＭ２、ＡＩＦＭ３、ＳＴＫ１７Ａ、ＡＰＩＴＤ１、ＳＩＶＡ１、ＦＡＳ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦＢＲ１、ＬＯＣ３７８９０２，又はＢＣＬ２Ａ１、ＰＵＳＬ１、ＴＰＳＴ１、ＷＤＲ３３、Ｎｏｄ２、ＭＣＴ４、ＡＣＲＣ、ＡＭＥＬＹ、ＡＴＣＡＹ、ＡＮＰ３２Ｂ、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳ１０、Ｄ０ＣＫ４、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８、ＫＩＡＡ０７５３、ＬＰＧＡＴ１、ＭＳＭＢ、ＮＦＳ１、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４、ＳＰＴＢＮ４、ＴＭＥＭ１４６、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＦＯＸＯ１、ＰＴＥＮ、ＦＮ１、ＣＳＫＮ２Ｂ、ｍｉＲＮＡアンタゴニスト、宿主シアリダーゼ、ＮＥＵ２シアリダーゼ２、ＮＥＵ３シアリダーゼ３、ダイサー、ＩＳＲＥ、Ｂ４ＧａｌＴ１、Ｂ４ＧａｌＴ６、Ｃｍａｓ、Ｇｎｅ、ＳＬＣ３５Ａ１及びこれらのいずれかの調節領域からなる群から選択される。
一つの態様において、本明細書に記載の方法は、培養において哺乳動物細胞の生存率を向上させる方法であって、（ａ）前記細胞を、Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨの発現の抑制を可能にする複数の異なるＲＮＡエフェクター分子と接触させ；及び（ｂ）前記細胞を、Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨの発現を抑制するのに十分な時間保持する（この場合に、発現の抑制は、哺乳動物細胞の生存率を向上させる）ことを含む方法に関する。この態様の一つの実施形態において、ＢＡＸを標的とするＲＮＡエフェクター分子は、センス鎖を含み、少なくとも一つの鎖は、配列番号：３１５２４１２−３１５２５３９、配列番号：３１５２７９４−３１５２８０３、配列番号：３０２３２３４−３０２３５１５、配列番号：３１５４３９３−３１５４４１３、配列番号：３１５４４１４−３１５４４３４、配列番号：３１５４９２３−３１５４９７０、及び配列番号：３１５４９７１−３１５５０１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチドなど）を含む。この態様の別の実施形態において、ＢＡＫを標的とするＲＮＡエフェクター分子は、センス鎖を含み、少なくとも一つの鎖は、配列番号：３１５２４１２−３１５２４７５、配列番号：３１５２８０４−３１５２８１３、配列番号：２２５９８５５−２２６０１６１、配列番号：３１５４３９３−３１５４４１３、配列番号：３１５４４１４−３１５４４３４、配列番号：３１５４８２７−３１５４８７４、配列番号：３１５４８７５−３１５４９２２及び表２２に列記した配列からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチドなど）を含む。この態様の別の実施形態において、ＬＤＨを標的とするＲＮＡエフェクター分子は、センス鎖を含み、少なくとも一つの鎖は、配列番号：３１５２５４０−３１５２６０３、配列番号：３１５２８１４−３１５２８２３、配列番号：１２９７２８３−１２９７６０４、配列番号：３１５４５５３−３１５４５７８、配列番号：３１５４５７９−３１５４６０４、配列番号：３１５５５８９−３１５５６３５，及び配列番号：３１５５６３６−３１５５６８２からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチドなど）を含む。
一つの態様において、本明細書に記載の方法は、大規模宿主細胞培養において生物由来物質を産生させる方法であって、
（ａ）宿主細胞を、大規模宿主細胞培養において、少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である）と接触させ；（ｂ）宿主細胞培養物を、前記少なくとも一つの第一の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合、発現の調節は、宿主細胞において生物由来物質の産生を向上させる）；（ｃ）生物由来物質を宿主細胞から単離する；ことを含み、前記大規模宿主細胞培養が、少なくとも１リットルの規模であり、及び前記ＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に標的遺伝子の発現が一時的に抑制されるように加えることによって、前記宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる、生物由来物質を産生させる方法を提供する。
また別の態様において、大規模宿主細胞培養において生物由来物質を産生させる方法であって、（ａ）宿主細胞を、大規模宿主細胞培養において、少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である）と接触させ；（ｂ）宿主細胞培養物を、前記少なくとも一つの第一の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合、発現の調節は、宿主細胞において生物由来物質の産生を向上させる）；（ｃ）生物由来物質を宿主細胞から単離する；ことを含み、前記ＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に、標的遺伝子の発現が一時的に抑制されるように生物由来物質の産生全体を通じて多数回加えることによって、前記宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる、生物由来物質を産生させる方法が、本明細書において提供される。
本明細書に記載の態様の一つの実施形態において、前記宿主細胞を、大規模宿主細胞培養において、複数のＲＮＡエフェクター分子と接触させ、前記複数のＲＮＡエフェクター分子が、少なくとも一つの標的遺伝子、少なくとも２つの標的遺伝子又は複数の標的遺伝子の発現を調節する。
別の態様において、前記方法は、細胞において生物由来物質を産生させる方法であって、（ａ）宿主細胞を、複数のＲＮＡエフェクター分子と接触させ（この場合、２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、複数の標的遺伝子の発現を調節する）；（ｂ）前記細胞を、前記複数の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合、発現の調節は、宿主細胞において生物由来物質の産生を向上させる）；及び（ｃ）生物由来物質を細胞から単離する；ことを含み、前記複数の標的遺伝子が少なくともＢａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨを含む、生物由来物質を産生させる方法に関する。
本明細書に記載の態様の一つの実施形態において、前記ＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に、標的遺伝子の発現が一時的に抑制されるように加えることによって、前記宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる。
本明細書に記載の態様の別の実施形態において、前記ＲＮＡエフェクター分子又は複数のＲＮＡエフェクター分子は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、前記ｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２つの配列を含み並びにセンス鎖は、第一の配列を含み及びアンチセンス鎖は、標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的である相補性の領域を含む第二の配列を含み、並びに前記相補性の領域は、１０〜３０個のヌクレオチドの長さである。
本明細書に記載の態様の別の実施形態において、前記接触工程は、前記ＲＮＡエフェクター分子又は複数のＲＮＡエフェクター分子を、前記宿主細胞培養物を保持して生物由来物質を産生させるために使用する培地に連続的に注入することによって行う。
本明細書に記載の態様の別の実施形態において、前記発現の調節は、発現の抑制であり、及び前記抑制は、部分抑制である。本明細書に記載の態様の別の実施形態において、前記部分抑制は、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、及び８５％からなる群から選択される抑制率よりも大きくない。
本明細書に記載の態様の別の実施形態において、前記ＲＮＡエフェクター分子は、１００ｎＭ未満の濃度で接触させる。
本明細書に記載の態様の別の実施形態において、前記ＲＮＡエフェクター分子は、５０ｎＭ未満の濃度で接触させる。
いくつかの実施形態において、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、標的遺伝子と相補的である）は、ヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む対応ｓｉＲＮＡであり、前記ヌクレオチド配列は、本明細書に示す表（例えば、表１〜１６、２１〜２５、２７〜３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１〜６１、６５及び６６参照）のいずれかに記載される。
また、生物由来物質の産生を高めるのに有用な組成物が、本明細書において提供される。一つの態様において、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である）と、宿主細胞を培養するのに適した細胞培地とを含んでなる組成物であって、前記ＲＮＡエフェクター分子が、標的遺伝子の発現を調節でき及び前記発現の調節が、生物由来物質の産生を高め、前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３３９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（たとえば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡである組成物が、提供される。
また、複数のＲＮＡエフェクター分子を含んでなる組成物であって、それぞれのＲＮＡエフェクター分子の一部分が、宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的であり、並びに前記組成物がＢａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨの発現を調節することができ及び前記発現の調節が生物由来物質の産生を高める組成物が、本明細書において提供される。
本明細書に記載の別の態様は、培養細胞による生物由来物質の産生を高めるキットであって、（ａ）生物由来物質が産生される条件下で細胞を培養するのに適した一つ又はそれ以上のアッセイ表面を含む支持体；（ｂ）一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子（それぞれのＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は、標的遺伝子と相補的である）；及び（ｃ）生物由来物質又はその細胞による産生を検出するための試薬；を含み、前記一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３３９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであるキットを提供する。
また、培養細胞による生物由来物質の産生を最適化するためのキットであって、（ａ）複数のアッセイ表面を含むマイクロアレイ支持体（前記アッセイ表面は、生物由来物質が産生される条件下で細胞を培養するのに適している）；（ｂ）一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子（それぞれのＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は、標的遺伝子と相補的である）；及び（ｃ）前記一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子の生物由来物質の産生に対する効果を検出するための試薬；を含み、前記一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３３９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであるキットが、本明細書において提供される。
また、細胞においてタンパク質の発現を調節するのに適した少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子のヌクレオチド配列を選択するためのシステムであって、（ａ）少なくとも一つのプロセッサと関連メモリとを含むコンピュータシステム（前記メモリは、コンピュータシステムの操作を制御するための少なくとも一つのコンピュータプログラムを格納する）；（ｂ）前記コンピュータシステムに連結され、少なくとも一つの細胞の少なくとも一つのトランスクリプトーム（細胞トランスクリプトーム）のトランスクリプトーム情報（前記情報は、前記トランスクリプトームのそれぞれの転写産物のための配列、及び場合により前記転写産物の名前、及び場合により前記転写産物が役割を果たす分子経路の名前を含む）と；少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子に関する情報（前記情報は、少なくともＲＮＡエフェクター分子の配列、及び場合により前記ＲＮＡエフェクター分子の標的特異性を含み、それぞれのＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも一つの細胞トランスクリプトームの少なくとも配列にマッチさせるために設計される）とを含むデータベース；（ｃ）前記コンピュータシステムによって実行され並びに細胞型選択、標的生物選択、細胞経路選択、交差反応性選択、転写産物量選択、標的遺伝子名及び／又は配列選択、及び場合により生体内又は生体外送達選択肢のいずれかを含む送達選択の方法の少なくとも一つを含むユーザパラメータと；さらに、場合によりユーザアドレス情報とを受け取るために構成されたユーザインターフェースプログラムモジュール；（ｄ）前記コンピュータシステムによって実行され並びに前記パラメータのマッチする組み合わせのためのデータベース中の配列及びトランスクリプトーム転写産物配列と照合するために構成された第一のモジュール；及び（ｅ）前記コンピュータシステムによって実行され及び細胞でのタンパク質の発現を調節するのに適した少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子の選択された配列を示すために構成された第二のモジュール；を含むシステムが、本明細書において提供される。
また、本明細書に記載のいずれか一つのシステムを使用して細胞においてタンパク質の発現を調節するためのＲＮＡエフェクター分子の選択方法が、本明細書において提供される。
別の態様において、配列番号：１〜９７７１を有する転写産物の選択又は編集を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞トランスクリプトームが、本明細書において提供される。別の態様において、配列番号：３１５７１４９〜３１５８４２０を有する転写産物の選択又は編集を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞トランスクリプトームが、本明細書において提供される。これらの態様の一つの実施形態において、前記ＣＨＯ細胞トランスクリプトーム配列は、データベースの一部である。
また、本明細書に記載のＣＨＯ細胞トランスクリプトームのいずれか一つに指向するｓｉＲＮＡ（一つ又は複数）が、本明細書において提供される。
別の態様において、細胞株を改良する方法であって、本明細書に示す表、例えば表１〜１６のいずれかから選択される転写産物から翻訳される少なくとも一つのタンパク質を調節することを含む方法が提供される。
別の態様において、細胞株を改良する方法であって、少なくとも２つの転写産物を、エフェクターＲＮＡ分子を使用して調節することを含み、第一の転写産物が、第一の細胞培養表現型に影響を及ぼし及び第二の転写産物が、第二の異なる細胞培養表現型に影響を及ぼし、前記細胞培養表現型が、細胞増殖速度、細胞生産性、ピーク細胞密度、持続した細胞生存率、アンモニア産生及び消費の速度、又は乳酸産生もしくは消費の速度からなる群から選択され；並びに前記第一及び第二の転写産物が、配列番号：１〜９７７１及び配列番号：３１５７１４９〜３１５８４２０からなる群から選択される方法が、提供される。
一つの実施形態において、本発明は、本明細書において提供される少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子を含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、昆虫、両生類、魚類、爬虫類、鳥類、哺乳動物又はヒトから誘導することができるし又はハイブリドーマ細胞であることができる。例えば、前記細胞は、ヒトＮａｍａｌｗａ Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞（ＢＬｃｌ−ｋａｒ−Ｎａｍａｌｗａ）、ベビーハムスター腎線維芽細胞（ＢＨＫ）、ＣＨＯ細胞、ネズミ骨髄腫細胞（ＮＳＯ、ＳＰ２／０）、ハイブリドーマ細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（２９３ＨＥＫ）、ヒト網膜由来細胞〔ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞〕、昆虫細胞株〔Ｓｆ９（ヨトウガのサナギ卵巣組織から誘導される）；又はＨｉ−５（イラクサギンウワバ卵細胞ホモジネートから誘導される）〕、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、初代マウス脳細胞又は組織、初代子牛リンパ細胞又は組織、初代サル腎細胞、孵化鶏卵、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、アカゲザル胎児肺細胞（ＦＲｈＬ−２）、ヒト胎児肺細胞（ＷＩ−３８、ＭＲＣ−５）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ、ＣＶ−１）、アカゲザル腎細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２）又は酵母細胞であることができる。特定の実施形態において、細胞は、ＭＤＣＫ細胞である。
本発明の他の実施形態は、ＣＨＯ細胞によって発現される遺伝子を含むＣＨＯ細胞のトランスクリプトーム及びこれらの転写産物を標的とする一組のｓｉＲＮＡを提供する。これらの実施形態は、ＣＨＯトランスクリプトームデータ及びそれぞれの転写産物の少なくとも一つの機能的面を概説するＣＨＯトランスクリプトームデータの系統的な編集を使用するために構成されるシステム、並びに適切な標的の設計及び選択を可能にするための対応ｓｉＲＮＡ及び特にＣＨＯ細胞において生物学的プロセスの最適化のためのエフェクターＲＮＡ分子を含む。
従って、本発明の実施形態は、細胞においてタンパク質の発現を調節するのに適した少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子のヌクレオチド配列を選択するためのシステムであって、一つ又はそれ以上のプロセッサと関連メモリを含むコンピュータシステム、及び少なくとも一つの細胞の少なくとも一つのトランスクリプトーム情報（前記情報は、前記トランスクリプトームのそれぞれの転写産物のための配列、及び場合により転写産物の名前、及び転写産物が役割を果たす分子経路の名前を含む）と；少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子情報（前記情報は、少なくともＲＮＡエフェクター分子の配列、及び場合によりＲＮＡエフェクター分子の標的特異性を含み、それぞれのＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも一つの細胞トランスクリプトームの少なくとも配列にマッチさせるために設計される）とを含むデータベース；細胞型選択、標的生物選択、細胞経路選択、交差反応性選択、転写産物量選択、標的遺伝子名及び／又は配列選択、及び場合により生体内又は生体外送達選択肢のいずれかを含む送達方法選択の少なくとも一つを含むユーザインプットパラメータと；さらに、場合によりユーザアドレス情報；とを受け取るために適合させ、構成される前記コンピュータシステムのプログラム；前記パラメータとトランスクリプトーム転写産物配列のマッチする組み合わせについて前記パラメータを前記データベース中の配列と照合するために構成される第一のモジュール；並びに細胞においてタンパク質の発現を調節するのに適した少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子の選択された配列を示すための第二のモジュール；を含むシステムを提供する。前記システムはまた、適切なＲＮＡエフェクター分子を、確認された標的の関数として決定するための一つ又はそれ以上のデータ処理アルゴリズムを実行するためのモジュールも含む。
いくつかの実施形態において、前記システムは、さらに、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子をコンテナに格納するための記憶モジュール（この場合、２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が存在する場合には、それぞれのＲＮＡエフェクター分子は、別個のコンテナに格納される）及びロボットハンドリングモジュール（これは、前記マッチする組み合わせの選択の際に、マッチングコンテナを選択し、及び場合により前記コンテナに生体内又は生体外送達のためのユーザ選択に基づいた付加物を加え、及び場合によりさらに、ユーザアドレスに送るべき前記マッチングＲＮＡエフェクター分子を含むコンテナをパッケージする）を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、前記のシステムのいずれか一つのシステムを使用して細胞においてタンパク質の発現を調節するためのＲＮＡエフェクター分子を選択する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記システムは、さらに細胞のゲノム情報を含み、ユーザ選択によって、前記ＲＮＡエフェクター分子を、ゲノムに存在するプロモーター、エンハンサー、イントロン及びエクソンを含む標的ゲノム配列にマッチさせることができる。
他の実施形態において、本発明は、ＣＨＯ細胞トランスクリプトーム配列がデータベースの一部であるＣＨＯ細胞トランスクリプトームを提供する。関連する実施形態において、ｓｉＲＮＡ配列が、データベースの一部である。
また、本発明は、細胞株を改良する方法であって、少なくとも２つの転写産物を、エフェクターＲＮＡ分子を使用して調節することを含み、第一の転写産物が、第一の細胞培養表現型に影響を及ぼし及び第二の転写産物が、第二の異なる細胞培養表現型に影響を及ぼし、前記細胞培養表現型が、細胞増殖速度、細胞生産性、ピーク細胞密度、持続した細胞生存率、アンモニア産生及び消費の速度、又は乳酸産生もしくは消費の速度からなる群から選択される方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は、さらに、第一及び第二の細胞培養表現型と異なる第三の細胞培養表現型に影響を及ぼす第三の転写産物を調節することを含む。特定の実施形態において、細胞株はＣＨＯ細胞株である。
また、本発明の実施形態は、改良された細胞生産性、改良された細胞増殖速度、又は改良された細胞生存率を有する組換え細胞株であって、組換え細胞の個体群を含み、そのそれぞれが一つ又はそれ以上の転写産物を調節する組換え構造物を含む組換え細胞株を提供する。
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの群から選択され、ＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチドなど）を含むアンチセンス鎖を含む。
実施形態はまた、宿主細胞から、特にＣＨＯ細胞から生物由来物質を産生させるための組成物及び方法を提供し、前記方法は、前記細胞を、ＲＮＡエフェクター分子、例えばＣＨＯトランスクリプトーム転写産物（その一部分は、標的転写産物と相補的である）を標的とする一つ又はそれ以上のｓｉＲＮＡ分子と接触させ、前記細胞をバイオリアクター中で、標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合、前記調節は、細胞から生物由来物質の産生を高める）、及び生物由来物質を前記細胞から単離することを含む。
本発明の利点は、宿主細胞によって産生される生物由来物質の収量及び／又は純度を実質的に上昇させることができ、従って生産コストを低下させることができること又は開発時間を著しく短縮できることである。改良された製造ロジスティクスは、品質を高める、及び生物由来物質供給を拡大するという後から続く効果を有する。
本発明の一つ又はそれ以上の実施形態の詳細を、以下の記載において明らかにする。本発明のその他の特徴、目的及び利点は、本明細書の記載及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかであろう。
２日目のＣＨＯ−Ｓ細胞中のＢａｘタンパク質を標識する免疫ブロットである。Ｂａｘの発現は、ＣＨＯ−Ｓ細胞培養物において時間と共に生存率の低下と相関する。Ｂａｘの発現は、ＣＨＯ−Ｓ細胞培養物において時間と共に生存率の低下と相関する。 細胞生存率、全細胞数、及び生存細胞の割合を細胞培養の日数の関数として表すＣＨＯ−Ｓ細胞の増殖曲線を表すグラフである。生存率は、おおよそ６日目に急激に低下する。 ハムスターＢａｋ及びＢａｘ遺伝子（表３及び４それぞれ）に対するＲＮＡエフェクター分子によるＣＨＯ細胞でのＢａｘの発現の濃度に依存した抑制を表すグラフである。試験したＲＮＡエフェクター分子のそれぞれは、低いナノモル範囲のＩＣ５０で発現を抑制したＢａｘに対するＲＮＡエフェクター分子Ｂ２を除いて、サブナノモル範囲のＩＣ５０で発現を抑制した。 ハムスターＢａｋ及びＢａｘ遺伝子（表３及び４それぞれ）に対するＲＮＡエフェクター分子によるＣＨＯ細胞でのＢａｋの発現の濃度に依存した抑制を表すグラフである。試験したＲＮＡエフェクター分子のそれぞれは、低いナノモル範囲のＩＣ５０で発現を抑制したＢａｘに対するＲＮＡエフェクター分子Ｂ２を除いて、サブナノモル範囲のＩＣ５０で発現を抑制した。 ハムスター乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子に対するＲＮＡエフェクター分子によるＣＨＯ細胞におけるＬＤＨ（ＬＤＨ活性として測定される）の発現の濃度に依存した抑制を表すグラフである。試験したＲＮＡエフェクター分子のそれぞれは、サブナノモル範囲のＩＣ５０で発現を抑制した。 ハムスター乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に対するＲＮＡエフェクター分子は、対照細胞と比較してＣ２、Ｃ１６及びＣ３６ＣＨＯ細胞株においてＬＤＨ−Ａ ｍＲＮＡの量を低下させる。ＬＤＨの抑制は、ＣＨＯ細胞株の生産性を著しく高める（図４Ｄ）。 ハムスター乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に対するＲＮＡエフェクター分子は、対照細胞と比較してＣ２、Ｃ１６及びＣ３６ＣＨＯ細胞株においてＬＤＨ−Ａタンパク質の量を低下させる。 ハムスター乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に対するＲＮＡエフェクター分子は、対照細胞と比較してＣ２、Ｃ１６及びＣ３６ＣＨＯ細胞株においてＬＤＨ−Ａ活性の量を低下させる。 ＬＤＨの抑制は、ＣＨＯ細胞株の生産性を著しく高める。 培養ＣＨＯ細胞の生存率に関してＢａｘ／Ｂａｋ及びＬＤＨに対するＲＮＡエフェクター分子の効果を示す棒グラフ。ｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）を、培養細胞に０時間、４８時間及び９６時間の時間点（曲線上の矢印）で加え、細胞生存率を、５日目（グラフ）で及び時間と共に（曲線）積分細胞面積（ＩＣＡ）として測定した。対照細胞は、Ｓｔｅａｌｔｈ ｓｉＲＮＡ（スクランブル対照）で処理した。Ｂａｘ／Ｂａｋ及びＬＤＨに対するｓｉＲＮＡで処理した細胞は、測定した時間点の全てにおいて対照細胞と比較して高められた生存率を示した。 培養ＣＨＯ細胞の生存率に関してＢａｘ／Ｂａｋ及びＬＤＨに対するＲＮＡエフェクター分子の効果を示す線グラフ。ｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）を、培養細胞に０時間、４８時間及び９６時間の時間点（曲線上の矢印）で加え、細胞生存率を、５日目（グラフ）で及び時間と共に（曲線）積分細胞面積（ＩＣＡ）として測定した。対照細胞は、Ｓｔｅａｌｔｈ ｓｉＲＮＡ（スクランブル対照）で処理した。Ｂａｘ／Ｂａｋ及びＬＤＨに対するｓｉＲＮＡで処理した細胞は、測定した時間点の全てにおいて対照細胞と比較して高められた生存率を示した。 Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡの添加が、生存ＣＨＯ細胞密度を少なくとも９０％上昇させることを表すグラフである。対照細胞（■）及び処理細胞（▲）の密度を、細胞生存率が５０％に達するまで毎日測定した。積分細胞面積（ＩＧＡ）を、測定した（差し込み図；対照に対するＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理）。Ｘ軸の矢印は、ｓｉＲＮＡ投与日数又は栄養分供給日数を示す。 Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡの添加が、ＣＨＯの生存率を少なくとも５０％上昇させることを表すグラフである。対照細胞（■）及びＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞（▲）の生存率を、トリパンブルーを使用して測定した。アポトーシス細胞死の割合を、５日目から１２日目までそれぞれの試料の傾きを測定することによって調べた（差し込み図；対照に対するＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理）。Ｘ軸の矢印は、ｓｉＲＮＡ投与日数を示す。 ＬＤＨ酵素活性が、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞において低下することを表すグラフである。毎日のＬＤＨ活性を、対照処理細胞（■）及びＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞（▲）において監視した。Ｘ軸に沿った矢印は、ｓｉＲＮＡの投与日数を示す。 乳酸量が、対照処理細胞培地と比べてＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞培養培地では低いことを示すグラフである。培養培地の乳酸量は、対照ｓｉＲＮＡ処理細胞培養（■）及びＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞培養（▲）において毎日監視した。Ｘ軸の矢印は、ｓｉＲＮＡの投与日数を示す。 対照ｓｉＲＮＡ処理細胞におけるグルコース消費が増殖曲線の７日後に減少することを示すグラフである。Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞培地（▲）からのグルコース濃度は、対照ｓｉＲＮＡ処理細胞培地（■）よりも著しく低い。Ｘ軸に沿った矢印は、栄養分の供給日数を示す。 Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理ＣＨＯ細胞が、対照と比較して対数期増殖後のカスパーゼ３活性を低下させたことを示すグラフである。Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞は、６日より前では対照ｓｉＲＮＡ処理細胞と同様のカスパーセ３活性を実証するが、その後の時間点では、対照細胞ではそれよりも高いカスパーゼ活性を示す。Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞でのカスパーゼ３活性と対照処理細胞でのカスパーゼ３活性との間の比（▲）は、二相性活性反応を示す。 Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨ ｓｉＲＮＡ添加後のｍＲＮＡ量の抑制率を示すグラフである。 Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡが、ＣＨＯ細胞アポトーシス死亡率を〜３００％減少させることを示すグラフである。 対照ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）と比較したＢａｘ／Ｂａｋ ｓｉＲＮＡ（それぞれ１ｎＭ）で処理した細胞の生存率及び細胞密度を示すグラフである。 対照処理細胞と比較したＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨを標的とするｓｉＲＮＡで処理した細胞の細胞密度比及び生存率比を示すグラフである。 Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡが、大規模１ＬバイオリアクターでのＣＨＯ細胞の密度及び生存率の両方を向上させることを示す。 本発明の一つの実施形態のコンピュータシステムの線図を示す。 本発明の別の実施形態のコンピュータシステムの線図を示す。 本発明の一つの実施形態のデータ構造のダイアグラムを示す。 本発明の一つの実施形態の方法のフローダイアグラムを示す。 ３７℃及び２８℃の温度で、脂質ＲＮＡｉＭａｘで処理し、ｓｉＲＮＡで処理していない対照ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、すなわち脂質処理対照での日数での経過時間（Ｘ軸）にわたるＧＦＰの発現量（蛍光分析単位、ｙ軸）を示すグラフである。 ３７℃及び２８℃の温度で、脂質ＲＮＡｉＭａｘ又はｓｉＲＮＡで処理していない対照ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、すなわち未処理対照での日数での経過時間（Ｘ軸）にわたるＧＦＰの発現量（蛍光分析単位、ｙ軸）を示すグラフである。 日数での経過時間（Ｘ軸）にわたる３７℃及び２８℃の温度で、ＧＦＰに対して一時的形質移入ｓｉＲＮＡによるＤＧ４４ ＣＨＯ細胞でのＧＦＰ発現の抑制％（ｙ軸）を示すグラフである。図２２Ａは、０．１ｎＭ ｓｉＲＮＡである。 日数での経過時間（Ｘ軸）にわたる３７℃及び２８℃の温度で、ＧＦＰに対して一時的形質移入ｓｉＲＮＡによるＤＧ４４ ＣＨＯ細胞でのＧＦＰ発現の抑制％（ｙ軸）を示すグラフである。図２２Ｂは、１．０ｎＭ ｓｉＲＮＡである。 日数での経過時間（Ｘ軸）にわたる３７℃及び２８℃の温度で、ＧＦＰに対して一時的形質移入ｓｉＲＮＡによるＤＧ４４ ＣＨＯ細胞でのＧＦＰ発現の抑制％（ｙ軸）を示すグラフである。図２２Ｃは、１０ｎＭ ｓｉＲＮＡである。 リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘと比較した９個の取り込み増強製剤を使用する相対％ＧＦＰシグナルノックダウン（ｙ軸）を示す棒グラフである。ｘ軸に示した９個の製剤については、表１９を参照。 Ｋ８（製剤４）を種々の濃度で使用するＬＤＨ活性（ｙ軸）が、２５０ｍＬ振盪フラスコ中のＤＧ４４細胞内のＬＤＨに対するｓｉＲＮＡの取り込みエンハンサーとして有効であったことを示す棒グラフである。 Ｋ８（製剤４）、Ｌ８及びＰ８製剤を種々の濃度で使用するＬＤＨ活性（ｙ軸）が、懸濁物中のＤＧ４４内のＬＤＨに対するｓｉＲＮＡの取り込みエンハンサーとして有効であったことを示す棒グラフである。 Ｐ８製剤又は市販製剤ＲＮＡｉＭａｘを推奨濃度で使用して懸濁ＣＨＯ細胞５０ｍＬ振盪フラスコ中での時間にわたる細胞密度を示すグラフである。脂質製剤は、０日目に細胞に投与した。 Ｐ８製剤又は市販製剤ＲＮＡｉＭａｘを推奨濃度で使用して懸濁ＣＨＯ細胞５０ｍＬ振盪フラスコ中での時間にわたる％細胞生存率を示すグラフである。脂質製剤は、０日目に細胞に投与した。 Ｐ８ＮＤＬを使用する場合には、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に指向するｓｉＲＮＡが、１Ｌバイオリアクターで、単回１ｎＭ用量で６日間ＬＤＨの８０％〜９０％ノックダウンを達成することを示すグラフである。 ３Ｌ及び４０Ｌ培養において６日間の経過時間にわたる生存細胞密度及び％ＬＤＨ活性に対するＰ８脂質を用いて製剤された１ｎＭ ＬＤＨ ｓｉＲＮＡの単回投与の結果を示すグラフである。 Ｐ８をトランスフェクション試薬として使用する４０ＬのＤＧ４４細胞培養のトランスフェクション後の日数での経過時間にわたる生存細胞密度及び％生存率（ｙ軸）を示すグラフである。 ４０ＬのＤＧ４４細胞培養及び０日目でのｓｉＲＮＡの単回投与において経過時間にわたる％ＬＤＨ活性の低下を示すグラフである。 フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）及びＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラーゼ（ＧＭＤＳ）遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡと接触させた細胞の対照細胞から調製された抗体の棒グラフである。図３１Ａは、これらの細胞によって産生された抗体の濃度を示すグラフである。 フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）及びＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラーゼ（ＧＭＤＳ）遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡと接触させた細胞の対照細胞から調製された抗体の棒グラフである。図３１Ｂは、ＦＵＴ８及びＧＭＤＳ ｄｓＲＮＡ処理細胞から産生された抗体が、フコース特異的レクチンに対して＞８５％減少した結合を有することを示すグラフである。
詳細な説明
本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル及び組成物などに限定されず、それ自体変化し得る。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的とするものであり、特許請求の範囲によって単に定義されるだけである本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形は、特にその内容が明確に示されない限りは、複数言及を含み及びその逆も同様である。操作実施例又は別の方法で示した場合以外は、本明細書で使用する成分の量又は反応条件を表す全ての数値は、全ての場合において用語「約」で修飾されると解釈されるべきである。
本明細書において特定される全ての特許、遺伝子識別番号によって識別されるオリゴヌクレオチド配列及びの他の刊行物は、例えば本発明に関連して使用し得るような刊行物に記載される方法を記載及び開示することを目的として参照することによって明確に援用される。これらの刊行物は、これらの本出願の出願日前の開示についてのみ提供される。これに関して、先行発明によって又は任意のその他の理由で、本発明者らが、このような開示に先行する資格がないと認められると解釈されるべきではない。日付に関する全ての陳述又はこれらの文書の内容に関する説明は、本出願人らが入手できる情報に基づくものであり、これらの文書の日付又は内容の正確さに関して承認を構成するものではない。
特に定義されない限りは、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。ヒト遺伝子記号は、典型的には大文字で示されるが、本願明細書では、大文字又は小文字の遺伝子記号の使用は、同じ意味で使用し得、ヒト種又は非ヒト種の両方を含む。従って、例えば、「ＬＤＨＡ」（又は「ＬｄｈＡ」）のような遺伝子又は遺伝子標的「乳酸デヒドロゲナーゼＡ」に関する本明細書の言及は、ヒト及び／又は非ヒト（例えば、トリ、齧歯類、イヌ）遺伝子及び遺伝子標的を含む。すなわち、特定の遺伝子記号において大文字又は小文字は、遺伝子又は遺伝子標的の範囲をヒト種又は非ヒト種に限定しない。本明細書において提供される全ての遺伝子識別番号（遺伝子ＩＤ）は、特に特定されない限りは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）「Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ」ウェブサイトの遺伝子識別番号である。
本発明は、宿主細胞において生物由来物質を産生する方法であって、宿主細胞を、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、標的遺伝子の少なくとも一部分と相補的である）と接触させ、前記細胞を、標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合に、前記調節は、生物由来物質の産生を高める）、及び前記生物由来物質を前記細胞から回収する工程を含む方法を提供する。本明細書に提供される記載は、本明細書において提供される方法に従って宿主細胞において生物由来物質を産生させるためにどのようにＲＮＡエフェクター分子を調製し、使用するかを開示する。また、開示された方法を実施するための細胞培養試薬及びＲＮＡエフェクター分子を含む組成物並びにキットが開示される。
Ｉ．定義
本明細書で使用する用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、本発明に不可欠であるが、不可欠であろうとなかろうと、特定されていない要素を含むことができる組成物、方法、及びこれらのそれぞれの成分（一つ又は複数）に関連して使用される。
本明細書で使用する用語「から本質的になる」は、所定の実施形態に必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のその実施形態の基本的及び新規又は機能的特徴に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を可能にする。
用語「からなる」は、実施形態のその記載に挙げられていない任意の要素を含まない、本明細書に記載のような組成物、方法及びこれらのそれぞれの成分を指す。
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」又は「核酸分子」は、発現されるか又は自然界に見出される核酸分子ばかりではなく、本明細書に記載のような又は当該技術において知られているような一つ又はそれ以上のリボ又はデオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシド類似体又は誘導体を含む核酸の類似体又は誘導体も包含する。このような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、本明細書においてさらに論じられる、例えば高められた細胞取り込み、ヌクレアーゼの存在下での上昇した安定性などの特性から、多くの場合、天然型全体にわたって使用される。「ヌクレオシド」は、ヌクレオシド塩基及びリボース糖を含み、「ヌクレオチド」は、１個、２個又は３個のリン酸部分を有するヌクレオシドである。用語「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」は、本明細書で使用されるように同等物であるとみなすことができる。オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡヌクレオチドへの修飾を含め、例えば本明細書に記載のように核酸塩基構造又はリボース−リン酸主鎖構造において修飾することができる。ヌクレオシド類似体又は誘導体を含む分子は、二重鎖を形成する能力を保持しなければならない。
非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの修飾ヌクレオシド、例えば以下に限定されないが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステロール誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に連結されたに末端ヌクレオシド、固定化ヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオシド、２’−アミノ−修飾ヌクレオシド、２’−アルキル−修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ヌクレオシドを含むホスホロアミデート又は非天然塩基、あるいはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。あるいは、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個の修飾ヌクレオシド、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個又はそれ以上の修飾ヌクレオシドを、最大オリゴヌクレオチドの全長まで含むことができる。修飾は、オリゴヌクレオチドのこのような複数の修飾ヌクレオシドのそれぞれについて必ずしも同じである必要はない。ＲＮＡエフェクター分子が二本鎖である場合には、それぞれの鎖は、独立して、修飾ヌクレオシドの数、型及び／又は位置について修飾することができる。一つの実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物に使用することを意図する修飾オリゴヌクレオチドは、必要な二重鎖構造を形成する能力を有し及びＲＩＳＣ経路による標的ＲＮＡの特異的分解を可能にするか又は仲介するペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
用語「リボヌクレオシド」、「リボヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、又は「デオキシリボヌクレオチド」は、本明細書でさらに詳述するような修飾ヌクレオチド、又は代理置換部分を指すこともできる。当該技術では、チミン塩基を含むリボヌクレオチドは、５−メチルウリジンともいい、ウラシル塩基を含むデオキシリボヌクレオチドは、デオキシウリジンともいう。グアニン、シトシン、アデニン、チミン及びウラシルは、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変えることなく他の部分で置換することができる。例えば、限定されることなく、イノシンをその塩基として含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン又はウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対合できる。従って、ウラシル、グアニン又はアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明において特徴付けられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えばイノシンを含有するヌクレオチドで置換することができる。別の例において、オリゴヌクレオチドのどこでもアデニン及びシトシンは、グアニン及びウラシルで置換して、それぞれ標的ｍＲＮＡとＧ−Ｕウォッブル塩基対合を形成することができる。このような置換部分を含有する配列は、本発明において特徴付けられる組成物及び方法に適する。
同様に、当業者は、用語「ＲＮＡ分子」又は「リボ核酸分子」が、発現されるか又は自然界に見出されるＲＮＡ分子ばかりではなく、本明細書に記載のような又は当該技術において知られているような一つ又はそれ以上のリボヌクレオチド又はリボヌクレオシド類似体又は誘導体を含むＲＮＡの類似体又は誘導体も包含することを理解するであろう。用語「リボヌクレオシド」及び「リボヌクレオチド」は、本明細書で使用するように同等物であるとみなすことができる。ＲＮＡは、例えば本明細書に記載のように、核酸塩基構造又はリボース−リン酸主鎖構造において修飾することができる。
一つの態様において、ＲＮＡエフェクター分子は、デオキシリボヌクレオシド残基を含むことができる。このような場合には、ＲＮＡエフェクター分子作用物質は、ｄｓＲＮＡの二本鎖部分内に、一つ又はそれ以上のデオキシヌクレオシド、例えばデオキシヌクレオシドオーバーハング（一つ又は複数）又は一つ又はそれ以上のデオキシヌクレオシドを含むことができる。
いくつかの実施形態において、複数のＲＮＡエフェクター分子が、一つ又はそれ以上の標的遺伝子の発現を調節するために使用される。「複数」とは、少なくとも２個又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子、例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、８０個、１００個のＲＮＡエフェクター分子又はそれ以上を指す。「複数」とは、少なくとも２個又はそれ以上の標的遺伝子、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個の標的遺伝子又はそれ以上を指すことができる。
本明細書で使用する「宿主細胞を接触させる」という用語は、作用物質が細胞に導入されるような作用物質による宿主細胞の処理を指す。典型的には、宿主細胞は、例えば培地に組成物を加えることによって培養物中で細胞を接触させるために、例えば多くの場合に細胞内へのＲＮＡエフェクターの取り込みを促進する送達剤を含む組成物中で調製される、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用する培養物中にある。一つの実施形態において、宿主細胞は、ＲＮＡエフェクター分子をコードするベクター、例えば組込み又は非組込みベクターと接触させる。一つの実施形態において、宿主細胞は、生物学的産生のために宿主細胞を培養する前に、例えばトランスフェクション又は形質導入によって、ＲＮＡエフェクター分子をコードするベクターと接触させる。
一つの実施形態において、宿主細胞を接触させるとは、宿主細胞を、ＲＮＡエフェクター分子をコードするベクターと接触させることを含まない。一つの実施形態において、宿主細胞を接触させるとは、宿主細胞を、生物学的産生のために宿主細胞を培養する前にＲＮＡエフェクター分子をコードするベクターと接触させることを含まない、すなわち、宿主細胞は、例えば生物由来物質を産生する方法中に宿主細胞培養物に加えられる細胞増殖培養物のＲＮＡエフェクター分子のみと接触させる。宿主細胞を、培養において、ＲＮＡエフェクター分子（一つ又は複数）と接触させる工程は、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、３０回、４０回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、１００回又はそれ以上）繰り返すことができる。一つの実施形態において、前記細胞は、例えば生物由来物質の産生のために使用される細胞培地にＲＮＡエフェクター分子組成物を加えることによって、標的遺伝子が一時的にのみ調節されるように接触させる（この場合、ＲＮＡエフェクター分子の存在は、経時的に消失する、すなわちＲＮＡエフェクター分子は、細胞において構成的に発現されない）。
「細胞に導入する」とは、ＲＮＡエフェクター分子について言及する場合には、当業者によって理解されるように、細胞内への取り込み又は吸収を促進する又は行うことを意味する。ＲＮＡエフェクター分子の吸収又は取り込みは、磁力拡散又は活性細胞プロセスによって、あるいは補助剤又は補助デバイスによって生じさせることができる。例えば、細胞に導入するとは、宿主細胞を少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させることを意味するか、又は多くの場合にＲＮＡエフェクター分子及びＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する送達剤（例えば、トランスフェクション試薬、エマルジョン、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、荷電脂質、リポソーム、陰イオン性脂質、浸透促進剤、又は例えばリガンド、標的部分、ペプチド、親油性基などを結合するためにＲＮＡエフェクター分子に対する修飾）を含む組成物中で調製される、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子及び細胞への取り込み又は吸収を促進するか又は行う作用物質による細胞の処理を意味する。細胞内への生体外導入としては、当該技術で公知の方法、例えば電気穿孔法及びリポフェクションが挙げられる。別のアプローチは、本明細書において以下に記載されるか又は当該技術で公知である。
本明細書で使用する「ＲＮＡエフェクター組成物」は、有効量のＲＮＡエフェクター分子と許容される担体とを含む。本明細書で使用する「有効量」とは、生物由来物質の産生のためのバイオプロセスに効果（例えば、調節効果）をもたらすのに有効なＲＮＡエフェクター分子の量を指す。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター組成物は、ＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進する試薬（例えば、トランスフェクション試薬、エマルジョン、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、荷電脂質、リポソーム、陰イオン性脂質、浸透促進剤、又は例えばリガンド、標的部分、ペプチド、親油性基などを結合するためにＲＮＡエフェクター分子に対する修飾）を含む。
用語「許容される担体」は、ＲＮＡエフェクター分子を培養細胞に投与するための担体を指す。このような担体としては、以下に限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及びこれらの組み合わせが挙げられる。一つの実施形態において、用語「許容される担体」は、具体的には細胞培地を除外する。
本明細書で使用する用語「発現」は、ＲＮＡ及び／又はポリペプチドの配列をコードする標的遺伝子からＲＮＡへの転写及び／又は一つ又はそれ以上のポリペプチドへの翻訳を意味することを意図する。
本明細書で使用する「標的遺伝子」とは、遺伝子の発現の調節が生物由来物質の産生を高めるように、宿主細胞による生物由来物質の産生の一つ又はそれ以上の態様に影響を及ぼすタンパク質をコードする遺伝子を指す。標的遺伝子は、宿主細胞から誘導できるし、宿主細胞に内在する（宿主細胞ゲノムに存在する）ことができるし、導入遺伝子（宿主細胞ゲノムの異所性部位で挿入される遺伝子構造物）であることができるし、あるいは宿主細胞に又は生物由来物質又はその誘導体を使用するであろう被験者（例えば、ヒト）に感染することができる病原体（例えば、ウイルス、真菌類又は細菌類）から誘導できる。また、いくつかの実施形態において、「標的遺伝子」とは、遺伝子の発現の調節が生物由来物質の産生を高めるように、細胞による生物由来物質の産生の一つ又はそれ以上の態様に影響を及ぼす核酸の発現を調節する遺伝子（すなわち、非コード遺伝子）を指す。
「標的遺伝子ＲＮＡ」又は「標的ＲＮＡ」とは、標的遺伝子から転写されるＲＮＡを意味する。従って、標的遺伝子は、標的遺伝子のコード領域、プロモーター領域、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）及び／又は５’−ＵＴＲであることができる。
ポリペプチドをコードする標的遺伝子ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）としてより一般的に知られている。標的遺伝子は、宿主細胞から誘導できるし、宿主細胞中に潜在することができるし、宿主細胞に内在する（宿主細胞ゲノムに存在する）ことができるし、導入遺伝子（宿主細胞ゲノムの異所性部位で挿入される遺伝子構造物）であることができるし、あるいは宿主細胞に又は生物由来物質あるいはその誘導体又は産生物を使用するであろう被験者に感染することができる病原体（例えば、ウイルス、真菌類又は細菌類）から誘導できる。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、宿主細胞による翻訳後修飾の一つ又はそれ以上の態様、例えばペプチドグリコシル化に影響を及ぼすタンパク質をコードする。例えば、翻訳後プロセシングに関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現の調節は、少なくとも一つの末端マンノースを含むポリペプチドの産生を高める。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えば非翻訳領域をコードする。本明細書で使用するように、ｎｃＲＮＡとは、タンパク質に翻訳されない標的遺伝子ＲＮＡを指す。また、ｎｃＲＮＡは、当該技術において非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｐｃＲＮＡ）、非メッセンジャーＲＮＡ（ｎｍＲＮＡ）、小分子非メッセンジャーＲＮＡ（ｓｎｍＲＮＡ）及び機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）と呼ぶこともできる。標的遺伝子であってそれからｎｃＲＮＡが最終生成物として転写される標的遺伝子もまた、ＲＮＡ遺伝子又はｎｃＲＮＡ遺伝子と呼ばれる。ｎｃＲＮＡ遺伝子としては、極めて豊富な及び機能的に重要なＲＮＡ類、例えば転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、並びにＲＮＡ類、例えばｓｎｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｐｉＲＮＡが挙げられる。本明細書で使用されるように、ＲＮＡエフェクター分子は、ＲＮＡエフェクター分子が特定の部位内のどこでも転写産物の切断を促進する場合には、ＲＮＡ転写産物の特定の部位内を標的とすると言われる。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、宿主細胞の内在性遺伝子である。例えば、標的遺伝子は、生物由来物質がポリペプチドである場合には、生物由来物質又はその一部分をコードすることができる。また、標的遺伝子は、生物由来物質の産生の一つ又はそれ以上の態様に直接的に又は間接的に影響を及ぼす宿主細胞タンパク質をコードすることもできる。ポリペプチドの産生に影響を及ぼす標的遺伝子の例としては、ポリペプチドの分泌、折りたたみ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、脱アミド化、ジスルフィド結合形成、メチオニン酸化又はピログルタミン酸化）に関与するタンパク質をコードする遺伝子；宿主細胞の性質又は表現型（例えば、増殖、生存率、細胞ｐＨ、細胞周期の進行、アポトーシス、炭素の代謝又は輸送、乳酸形成、細胞骨格構造（例えば、アクチン動態）、ウイルス感染に対する感受性あるいはＲＮＡｉ取り込み、活性又は効果）に影響を及ぼすタンパク質をコードする遺伝子；及び宿主細胞による生物由来物質の産生を損なうタンパク質（例えば、生物由来物質を結合するか又は生物由来物質と同時精製するタンパク質）をコードする遺伝子が挙げられる。
いくつかの実施形態において、生物由来物質の産生は、該産生物に結合するタンパク質の発現を標的とすることによって高められる。例えば、増殖因子、ホルモン又は細胞シグナル伝達タンパク質の産生において、細胞においてその産生が生物学的反応を誘発しないように、その受容体／リガンドの発現を低下させるか又は抑制することが好都合であり得る。受容体は、細胞表面受容体又は内部（例えば、核）受容体であることができる。従って、例えば、生物由来物質、インターフェロン（例えば、インターフェロンβ）の産生は、宿主細胞に存在するインターフェロン受容体、例えばＩＦＮＡＲ１又はＩＦＮＡＲ２の発現量を低下させることによって（例えば、配列番号：２４３６５３６−２４３６８６３からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個の連続したヌクレオチド、少なくとも１８個の連続したヌクレオチド、少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む）アンチセンス鎖を含む対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することにより宿主細胞を接触させることによって）は高めることができる。結合パートナーの発現は、本明細書に記載の方法に従って、宿主細胞を、前記受容体遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって調節できる。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、標的遺伝子の発現の抑制が生物由来物質の産生を高めるように生物由来物質の産生に間接的に影響を及ぼす宿主細胞タンパク質をコードする。例えば、標的遺伝子は、生物由来物質の産生に直接影響を及ぼさないが、例えば他の方法で生物由来物質の産生を高めることができる細胞源を利用することによってその産生を間接的に低下させる豊富に発現される宿主細胞タンパク質をコードすることができる。標的遺伝子は、本明細書でさらに詳細に説明する。
用語「の発現を調節する」及びその他は、それが標的遺伝子に言及する限りには、本明細書において、第一の細胞又は細胞の群と実質的に同じであるがそのように処理されていない第二の細胞又は細胞の群（対照細胞）と比較して、標的遺伝子が転写され及び標的遺伝子の発現が調節されるように処理されている第一の細胞又は細胞の群から単離できるかあるいは前記第一の細胞又は細胞の群において検出できる標的遺伝子ｍＲＮＡの量の変化（例えば、増加又は減少）によって明らかにされるような、標的遺伝子の発現の調節を指す。調節の度合いは、
Figure 2014501097
 で表すことができる
あるいは、調節の度合いは、標的遺伝子発現と機能的に関連があるパラメータ、例えば標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量、又は特定の表現型、例えば微小管の安定化を示す細胞の数に関して示すことができる。原則として、標的遺伝子の調節は、標的遺伝子を発現する任意の宿主細胞において、構成的に又はゲノム工学によって、及び当該技術において公知の適切なアッセイによって調べることができる。
例えば、場合によっては、標的遺伝子の発現は抑制される。例えば、標的遺伝子の発現は、本明細書において提供されるＲＮＡエフェクター分子の投与によって少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％抑制される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＲＮＡエフェクター分子の投与によって少なくとも約６０％、７０％、又は８０％抑制される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、本明細書に記載のようなＲＮＡエフェクター分子の投与によって少なくとも約８５％、９０％、又は９５％あるいはそれ以上抑制される。他の場合には、標的遺伝子の発現は、本明細書において提供されるＲＮＡエフェクター分子の投与によって少なくとも約１０％、２０％、２５％、５０％、１００％、２００％、４００％又はそれ以上活性化される。いくつかの実施形態において、前記発現の調節は、部分抑制である。いくつかの態様において、部分抑制は、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％及び８５％からなる群から選択される抑制率よりも大きくない。
本明細書で使用する用語「ＲＮＡエフェクター分子」は、宿主細胞内で本明細書において定義されるような標的遺伝子の発現を調節できるオリゴヌクレオチド作用物質、又は場合により宿主細胞内で（すなわち、宿主細胞に導入されると）このようなオリゴヌクレオチドを形成することができるオリゴヌクレオチド作用物質を指す。ＲＮＡエフェクター分子の一部分は、標的遺伝子の少なくとも一部分、例えば標的遺伝子のコード領域、プロモーター領域、３’非非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）及び／又は５’−ＵＴＲと実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的とすべきヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、標的とすべきヌクレオチド配列の少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個又はそれ以上の連続したヌクレオチド）を含む。
本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子は、一般的に第一の鎖と第二の鎖（これらの一つは、少なくとも標的遺伝子の一部分と実質的に相補的である）を有し、種々様々なメカニズム、例えば以下に限定されないが、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のＡｒｇｏｎａｕｔｅ介在転写後切断（時には、当該技術においてＲＮＡｉと呼ばれる）及び／又はその他の転写前及び翻訳前メカニズムの一つ又はそれ以上によって標的遺伝子発現を調節する。
ＲＮＡエフェクター分子は、一本鎖又は二本鎖以上の鎖を含むことができ、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、プロモーター指向ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、発現干渉ＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、ｄｅｃｏｙ ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド及びアプタマーを含むことができる。ＲＮＡエフェクター分子は、一本鎖又は二本鎖であることができる。一本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、二本鎖領域を有することができ、二本鎖ＲＮＡエフェクターは、一本鎖領域を有することができる。
用語「一部分」とは、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡエフェクター分子）に関連して使用される場合には、標的遺伝子の領域に相補的結合を行う所望の長さを有するか又は所望の長さの二重鎖領域を有するＲＮＡエフェクター分子の一部分を指す。例えば、「一部分」又は「領域」とは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個又はそれ以上で最大完全ＲＮＡエフェクター分子よりも１個短いヌクレオチドまでの核酸配列を指す。いくつかの実施形態において、「領域」又は「一部分」は、ＲＮＡエフェクター分子に関連して使用される場合には、ＲＮＡエフェクター分子の鎖の完全核酸配列よりも短いヌクレオチドの核酸配列を含む。当業者は、標的遺伝子と相補的であるか又は所望の特徴（例えば、標的遺伝子の抑制又は安定性）を有するＲＮＡエフェクター分子が産生されるように二重鎖に配置される前記「一部分」の長さを変化させることができる。理論に束縛されないが、本明細書において提供されるＲＮＡエフェクター分子は、種々様々なメカニズム、例えば以下に限定されないが、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のＡｒｇｏｎａｕｔｅ介在転写後切断（時には、当該技術でＲＮＡｉと呼ばれる）及び／又はその他の転写前及び翻訳前メカニズムの一つ又はそれ以上によって標的遺伝子発現を調節できる。
本明細書に開示されるＲＮＡエフェクター分子は、３０ヌクレオチド以下の長さ、例えば、１０〜３０個のヌクレオチドの長さ又は１９〜２４個のヌクレオチドの長さである領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、その領域は、生物由来物質の産生の一つ又はそれ以上の態様、例えば生物由来物質の収量、純度、均一性、生物活性又は安定性に影響を及ぼす標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的である。ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用し、その選択的分解に介在するか又はその翻訳を妨害する。
用語「アンチセンス鎖」は、標的配列に実質的に相補的である領域を含むＲＮＡエフェクター分子、例えばｄｓＲＮＡの鎖を指す。用語「相補性の領域」は、本明細書で定義するような配列、例えば標的配列と実質的に相補的であるアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が標的配列と完全に相補的でない場合には、誤対合が、分子の内部又は末端領域に存在し得る。一般的に、最も許容される誤対合は、末端領域、例えば５’及び／又は３’末端の５、４、３又は２ヌクレオチド内にある。
用語「センス鎖」は、この用語が本明細書において定義されるようなアンチセンス鎖の領域と実質的に相補的である領域を含むＲＮＡエフェクター分子の鎖を指す。
本明細書で使用されるように及び特に明示されない限りは、用語「相補的な」は、第二のヌクレオチド配列に関連して第一のヌクレオチド配列を説明するのに使用される場合には、当業者によって理解されるように、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、第二のクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと特定の条件下でハイブリダイズし、二重鎖構造を形成できることを指す。「相補的」配列はまた、前記ヌクレオチドがハイブリダイズすることができることに関して上記の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン・クリック塩基対及び／又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含むことができるし又はこれらの塩基対から完全に形成されることができる。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、以下に限定されないが、Ｇ：Ｕウォッブル又はフーグステイン塩基対が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、ストリンジェントな条件であることができ、この場合、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃、１２〜１６時間、次いで洗浄を含むことができる。その他の条件、例えば生物内で遭遇し得るような生理学的に関連する条件が適用できる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適した一組の条件を決定できるであろう。
本明細書において用語「相補的な」、「完全に相補的な」及び「実質的に相補的な」は、使用する文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間又はＲＮＡエフェクター分子作用物質のアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基対合に関して使用できる。本明細書で使用されるように、標的遺伝子「の少なくとも一部分と実質的に相補的である」オリゴヌクレオチドとは、関心の標的遺伝子の近接部分と実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ、標的遺伝子のプロモーター領域又は３’ＵＴＲ、又はＥＲＶ ＬＴＲ）を指す。例えば、オリゴヌクレオチドは、配列が標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的である場合には、少なくとも標的ｍＲＮＡの一部分と相補的である。
ＲＮＡエフェクター分子内、例えば、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ（二本鎖リボ核酸）内の相補的配列は、ヌクレオチド配列の一つ又は両方の全長にわたって第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対する第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基対合を含む。このような配列は、本明細書において互いに関して「完全に相補的である」ということができる。第一の配列が本明細書において第二の配列に対して「実質的に相補的である」という場合には、この２つの配列は、完全に相補的であることができるし、又はこの２つの配列は、その最終用途、例えばＲＩＳＣ経路による遺伝子発現の抑制に最も適切な条件下でハイズリダイズする能力を保持しながら、最大３０塩基対までの二重鎖のためのハイブリダイゼーションに際して一つ又はそれ以上であるが、一般的には５個以下、４個以下、３個以下又は２個以下の誤対合塩基対を形成できる。２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションに際して、一つ又はそれ以上の一本鎖オーバーハングを形成するために設計される場合には、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関して誤対合とみなされないであろう。例えば、２１個のヌクレオチドの長さの一方のオリゴヌクレオチドと、２３個のヌクレオチドの長さの他方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡ（前記長いオリゴヌクレオチドは、前記短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的である２１個のヌクレオチドの配列を含む）は、本明細書に記載の目的に「完全に相補的」とさらにいうことができる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用し、該ＲＮＡ転写産物の切断を指示する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。例えば、一本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、該エフェクター分子をヌクレアーゼ分解から保護するために一つ又はそれ以上のリン酸基又はその類似体を含む５’修飾を含む。ＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも標的遺伝子の「センス」核酸の一部分、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的であるヌクレオチド配列又はＲＮＡ配列、例えばｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを有する一本鎖アンチセンス核酸であることができる。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸標的と水素結合を形成できる。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも９個のヌクレオチドの長さの二重鎖領域を含む。
コード鎖配列（例えば、ｃＤＮＡ分子のセンス鎖の配列）を考慮に入れて、アンチセンス核酸は、ワトソン・クリック塩基対合の規則に従って設計できる。アンチセンス核酸は、ＲＮＡのコード領域又は非コード領域の一部分、例えばｐｒｅ−ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域、例えば５’ＵＴＲと相補的であることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約１０〜２５個のヌクレオチドの長さ（例えば、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個又は２４個のヌクレオチドの長さ）であることができる。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その分子の生物学的安定性及び／又はアンチセンス核酸と標的核酸の間で形成される二重鎖の物理的安定性を高めるために設計される、一つ又はそれ以上の修飾ヌクレオチド、例えばホスホロチオエート誘導体及び／又はアクリジン置換ヌクレオチドを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド）を含むことができるし又はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含むことができる。例えば、リボヌクレオチドのみからなるアンチセンス剤は、相補的ＲＮＡとハイブリダイズし、標的ＲＮＡ転写産物への翻訳機構のアクセスを防止し、それによってタンパク質合成を防止することができる。デオキシリボヌクレオチドのみを含むか又はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとを含むアンチセンス分子は、相補的ＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ＲＮＡ標的は、その後に翻訳を防止するために酵素、例えばリボヌクレアーゼＨによって実質的に切断されることができる。フランキングＲＮＡ配列は、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、及びホスホロチオエート連鎖を含むことができ、内部ＤＮＡ配列は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連鎖を含むことができる。内部ＤＮＡ配列は、リボヌクレアーゼＨ活性による標的化が望まれる場合には、少なくとも５個のヌクレオチドの長さであることが好ましい。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、二本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書で使用する用語「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」は、標的ＲＮＡに関して「センス」及び「アンチセンス」配向を有すると言われるであろう２つの逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を含むハイブリダイズした二重鎖領域を有するオリゴヌクレオチド分子又は分子の複合体を指す。典型的には、相補性の領域は、一般的に例えば１０〜２６個のヌクレオチドの長さ、１８〜２５個のヌクレオチドの長さ、又は１９〜２４個のヌクレオチドの長さを含め、３０個又はそれよりも少ないヌクレオチドの長さである。標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の発現を、例えばＰＣＲ又は分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に基づいた方法で、あるいはタンパク質に基づいた方法で、例えばウェスタンブロットでアッセイされるように少なくとも１０％抑制する。細胞培養における標的遺伝子の発現は、標的遺伝子ｍＲＮＡ量を、例えばｂＤＮＡ又はＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイで測定することによって、あるいはタンパク質量を、例えば免疫蛍光分析又は定量免疫ブブロットで測定することによってアッセイすることができる。
二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路による所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さであることができるが、典型的には９〜３６個の塩基対の長さ、例えば１５〜３０個の塩基対の長さの範囲にあるであろう。さらに具体的には、二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路による所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さであることができるが、典型的には９〜３６個の塩基対の長さ、例えば１５〜３０個の塩基対の長さの範囲にあるであろう。９〜３６個の塩基対の二重鎖を考慮すると、二重鎖は、この範囲内の任意の長さであることができ、例えば９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５又は３６個の塩基対の長さであることができ、例えば、以下に限定されないが、１５〜３０塩基対、１５〜２６個の塩基対、１５〜２３個の塩基対、１５〜２２個の塩基対、１５〜２１個の塩基対、１５〜２０個の塩基対、１５〜１９個の塩基対、１５〜１８個の塩基対、１５〜１７個の塩基対、１８〜３０個の塩基対、１８〜２６個の塩基対、１８〜２３個の塩基対、１８〜２２個の塩基対、１８〜２１個の塩基対、１８〜２０個の塩基対、１９〜３０個の塩基対、１９〜２６個の塩基対、１９〜２３個の塩基対、１９〜２２個の塩基対、１９〜２１個の塩基対、１９〜２０個の塩基対、２０〜３０個の塩基対、２０〜２６個の塩基対、２０〜２５個の塩基対、２０〜２４個の塩基対、２０〜２３個の塩基対、２０〜２２個の塩基対、２０〜２１個の塩基対、２１〜３０個の塩基対、２１〜２６個の塩基対、２１〜２５個の塩基対、２１〜２４個の塩基対、２１〜２３個の塩基対，又は２１〜２２個の塩基対を含む任意の部分範囲であることができる。
ダイサー酵素及び類似酵素を用いるプロセシングによって細胞内で生じたｄｓＲＮＡは、一般的に１９〜２２個の塩基対の長さの範囲にある。ｄｓＤＮＡの二重鎖領域の一つの鎖は、標的ＲＮＡの領域と実質的に相補的である配列を含む。二重鎖構造を形成する２つの鎖は、少なくとも一つの自己相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子に由来するものであることができるし、又は２個又はそれ以上の別個のＲＮＡ分子から形成されることができる。二重鎖領域が、単一分子の２つの鎖から形成される場合には、該分子は、一方の鎖の３’末端と、二重鎖構造を形成するそれぞれの他方の鎖の５’末端の間のヌクレオチドの一本鎖（「ヘアピンループ」）によって隔てられている二重鎖領域を有することができる。ヘアピンループは、少なくとも１個の不対ヌクレオチドを含むことができる；いくつかの実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個又はそれ以上の不対ヌクレオチドを含むことができる。ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖が、別個のＲＮＡ分子によって構成される場合には、これらのＲＮＡ分子は、必ずしも必要ではないが、共有結合されることができる。前記２つの鎖が、ヘアピンループ以外の手段によって共有結合される場合には、その結合構造は、「リンカー」と呼ばれる。用語「ｓＲＮＡエフェクター分子」もまた、本明細書においてｄｓＲＮＡを指すために使用される。
標的遺伝子の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子が、本明細書に記載される。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子作用物質は、細胞において標的遺伝子の発現を抑制するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含み、前記ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現において形成される標的遺伝子の少なくとも一部分と相補的である相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含み、前記相補性の領域は、３０個以下のヌクレオチドの長さ、一般的には１０〜２４個のヌクレオチドの長さであり、及び前記ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、標的遺伝子の発現を、例えばＰＣＲ、ＰＥＲＴ、又は分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に基づいた方法で、あるいはタンパク質に基づいた方法、例えばウェスタンブロットでアッセイされるように少なくとも１０％抑制する。細胞での標的遺伝子の発現は、標的遺伝子ｍＲＮＡ量を、例えばＰＥＲＴ、ｂＤＮＡ又はＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現アッセイで測定することによって、あるいはタンパク質量を、例えば免疫蛍光分析又は定量タンパク質免疫ブブロットで測定することによってアッセイすることができる。
ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを使用するであろう条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分に相補的である２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、例えば標的遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列から誘導される標的配列と実質的に相補的であり、一般的に完全に相補的である相補性の領域を含む。ｄｓＲＮＡの他方の鎖（センス鎖）は、前記２つの鎖が、ハイブリダイズし、適当な条件下で結合した場合に二重鎖構造を形成するようにアンチセンス鎖と相補的である領域を含む。一般的に、二重鎖構造は、例えば９〜３６個の塩基対、１０〜３０個の塩基対、１８〜２５個の塩基対、１９〜２４個の塩基対又は１９〜２１個の塩基対の長さを含む。同様に、標的配列と相補性の領域は、例えば、１０〜３０個、１８〜２５個、１９〜２４個、又は１９〜２１個のヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１０〜２０個のヌクレオチドの長さを含む。その他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２５〜３０個のヌクレオチドの長さを含む。従って、一つの実施形態において、切断のために所望のＲＮＡを標的とする例えば１５〜３０個の塩基対の機能的二重鎖に処理される程度まで、ＲＮＡ分子又は３０個を超える塩基対の二重鎖領域を有するＲＮＡ分子の複合体は、ｄｓＲＮＡである。当業者が認識するであろうように、切断のために標的とされるＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合により大きいＲＮＡ分子、多くの場合にはｍＲＮＡ分子の一部分であろう。一つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡである。
適切な場合には、ｍＲＮＡ標的の「一部分」は、ＲＮＡｉ指向切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路による切断）のための支持体であるのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続配列である。９個の塩基対ほどの短い二重鎖を有するｄｓＲＮＡは、ある状況下では、ＲＮＡｉ指向ＲＮＡ切断に介在する。ほとんどの場合、標的は、少なくとも１０個のヌクレオチドの長さ、例えば１５〜３０個のヌクレオチドの長さを含むであろう。
当業者は、２０〜２３個の塩基対、具体的には２１個の塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導することに特に有効であると認められていることをよく分かっている。Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２０ ＥＭＢＯ ６８７７−８８（２００１）。前記の実施形態において、オリゴヌクレオチド配列の性質によって、本明細書に記載のｄｓＲＮＡは、２１個のヌクレオチドの長さの少なくとも一つの鎖を含むことができる。一端又は両端の数個のヌクレオチドのみがない配列を有する短い二重鎖が、詳細に記載したｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であることができることが合理的に予測できる。従って、所定の配列由来の少なくとも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又はそれ以上の連続したヌクレオチドの部分配列を有し、完全な配列を含むｄｓＲＮＡとは標的遺伝子の発現を５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は３０％以下の抑制率まで抑制できることにおいて異なるｄｓＲＮＡが、本発明によって意図される。
ｄｓＲＮＡは、以下でさらに論じるような当該技術で公知の標準方法によって、例えば、自動化ＤＮＡ合成装置、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）から商業的に入手できるような自動化ＤＮＡ合成装置を使用することによって合成できる。一つの実施形態において、標的遺伝子は、ヒト標的遺伝子である。特定の実施形態において、第一の配列は、センス配列を含むｄｓＲＮＡのセンス鎖であり、及び第二の配列は、アンチセンス配列を含むｄｓＲＮＡの鎖である。標的配列のほかの部分を標的とする別のｄｓＲＮＡ作用物質は、標的配列及びフランキング標的配列を使用して容易に決定できる。この態様において、２つの配列の一つは、この２つの配列の他方と相補的であり、これらの配列の一つは、標的遺伝子の発現において生じたｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。従って、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含むであろうし、一つのオリゴヌクレオチドは、センス鎖として記載され及び第二のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖として記載される。本明細書の他の個所に記載されるように及び当該技術において知られているように、ｄｓＲＮＡの相補的配列は、別個のオリゴヌクレオチド上に存在するのとは対照的に、単一の核酸分子の自己相補的領域として含まれることもできる。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含むことができる。本明細書で使用する用語「ヌクレオチドオーバーハング」は、二本鎖オリゴヌクレオチド、例えばｄｓＲＮＡの二重鎖構造の末端から突き出る少なくとも一つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて伸びるか又はその逆の場合には、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのヌクレオチドのオーバーハングを含むことができる；あるいは、前記オーバーハングは、少なくとも２個のヌクレオチド、少なくとも３個のヌクレオチド、少なくとも４個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチド又はそれ以上を含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むことができるし又はヌクレオチド／ヌクレオシド類似体からなることができる。オーバーハング（一つ又は複数）は、センス鎖、アンチセンス鎖又はこれらの任意の組み合わせに存在することができる。また、オーバーハングのヌクレオチド（一つ又は複数）は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖又はセンス鎖いずれかの５’末端、３’末端又は両端に存在することができる。
一つの実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも一つの末端は、１〜４個、一般的には１個又は２個のヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端化対応物に比べて意外にも優れた阻害特性を有する。また、一方の鎖（ｄｓＲＮＡの一方の末端）にのみヌクレオチドオーバーハングが存在すると、その全体の安定性に影響を及ぼすことなくｄｓＲＮＡの干渉活性を増強する。このようなオーバーハングは、必ずしも単一のヌクレオチドオーバーハングである必要はなく；ジヌクレオチドオーバーハングも存在することができる。
二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有し、例えば二本鎖オリゴヌクレオチドは、３’末端及び／又は５’末端に１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。オーバーハングのヌクレオチド間連鎖の一つ又はそれ以上は、ホスホロチオエートで置換することができる。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、一つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレオシドを含むか又はオーバーハングは、一つ又はそれ以上のｄＴ、例えば配列５’−ｄＴｄＴ−３’又は５’−ｄＴｄＴｄＴ−３’を含む。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、配列５’−ｄＴ＊ｄＴ−３（式中、＊ は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連鎖である）を含む。
理論に束縛されることなく、少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチドは、その平滑末端化カウンターパートに比べて意外にも優れた阻害特性を有する。また、一方の鎖（ｄｓＲＮＡの一方の端部）にのみヌクレオチドオーバーハングが存在すると、二本鎖オリゴヌクレオチドの干渉活性を、その全体の安定性に影響を及ぼすことなく増強する。
一つのオーバーハングだけを有するｄｓＲＮＡは、生体内で、並びに種々様々な細胞、細胞培養培地、血液及び血清内で特に安定で、有効であることを証明している。一般的に、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端、あるいはセンス鎖の３’末端に配置される。一端にのみオーバーハングを有するｄｓＲＮＡもまた、一般的にアンチセンスの鎖の５’末端に配置された一つの平滑末端を有するであろう。このようなｄｓＲＮＡは、優れた安定性及び阻害活性を有し、従って低用量で、すなわち１日当たり５ｍｇ未満／受容者体重ｋｇで投与することを可能にする。一つの実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態において、オーバーハングのヌクレオチドの一つ又はそれ以上は、ヌクレオシドホスホロチオエートで置換することができる。
二本鎖オリゴヌクレオチドに関連して本明細書で使用する用語「平滑末端」又は「平滑末端化」は、二本鎖オリゴヌクレオチドの所定の末端に不対ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体が存在しない、すなわちヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。二本鎖オリゴヌクレオチドの一端又は両端は、平滑末端であることができる。両端が平滑末端である場合には、オリゴヌクレオチドは、二重平滑末端化されるという。明確にするために、「二重平滑末端化」オリゴヌクレオチドは、両端が平滑末端である、すなわち分子のいずれかの端部にヌクレオチドオーバーハングが存在しない二本鎖オリゴヌクレオチドである。ほとんどの場合、このような分子は、その全長にわたって二本鎖であろう。一端のみが平滑末端である場合には、オリゴヌクレオチドは、単一平滑末端化されるという。明確にするために、「単一平滑末端化」オリゴヌクレオチドは、一端でのみ平滑末端である、すなわち分子の一端にヌクレオチドオーバーハングが存在しない二本鎖オリゴヌクレオチドである。一般的に、単一平滑末端化オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’末端で平滑末端化される。
本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子は、標的配列に対する一つ又はそれ以上の誤対合を含有することができる。例えば、本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子は、３個以下の誤対合を含有する。ＲＮＡエフェクター分子のアンチセンス鎖が、標的配列に対する誤対合を含有する場合には、誤対合の領域は、相補性の領域の中心に配置されないことが好ましい。ＲＮＡエフェクター分子のアンチセンス鎖が、標的配列に対する誤対合を含有する場合には、誤対合は、相補性の領域の５’末端又は３’末端のいずれかから最後の５個のヌクレオチド内にあるように制限されることが好ましい。例えば、標的遺伝子の領域と相補的である２３個のヌクレオチドのＲＮＡエフェクター分子作用物質ＲＮＡ鎖について、ＲＮＡ鎖は、一般的に中心の１３個のヌクレオチド内に何ら誤対合を含有しない。本明細書に記載の方法又は当該技術で公知の方法が、標的配列に対して誤対合を含有するＲＮＡエフェクター分子が、標的遺伝子の発現を抑制することにおいて有効であるか否かを調べるのに使用できる。特に標的遺伝子の相補性の特定の領域が、その集団内に多型配列変異を有することが知られている場合には、標的遺伝子の発現の抑制において誤対合を有するＲＮＡエフェクター分子の効果を考慮することが重要である。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の非コード領域の少なくとも一部分と実質的に相補的であるプロモーター指向ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）である。一つの実施形態において、ｐｄＲＮＡは、転写開始部位から上流に配置された部位、例えば転写開始部位から１００塩基を越える、２００塩基を越える又は１，０００塩基を越える上流に配置された部位の標的遺伝子ｍＲＮＡのプロモーター領域の少なくとも一部分と実質的に相補的である。別の実施形態において、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物の３’−ＵＴＲの少なくとも一部分と実質的に相補的である。一つの実施形態において、ｐｄＲＮＡは、場合によりそれぞれの鎖に３’ジ又はトリヌクレオチドオーバーハングを有する１８〜２８個の塩基のｄｓＲＮＡを含む。前記ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のプロモーター領域又は３’−ＵＴＲ領域の少なくとも一部分と実質的に相補的である。別の実施形態において、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のプロモーター領域又は３’−ＵＴＲ領域の少なくとも一部分と実質的に相補的であるＤＮＡ配列含む一本鎖ポリヌクレオチドからなり、ギャップマーを細胞ヌクレアーゼから保護する一つ又はそれ以上の修飾ヌクレオチド、例えば２’ＭＯＥ、２’ＯＭｅ、又は固定化核酸塩基（ＬＮＡ）を含むポリヌクレオチド配列（例えば、ギャップマーの５’末端及び３’末端のそれぞれに５個の末端塩基を含む）に隣接するギャップマーを含む。
ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子の発現を選択的に高めるか、低下させるか又は調節するのに使用できる。理論に制約されることなく、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物の非コード領域とオーバーラップする内在性アンチセンスＲＮＡ転写産物に結合し、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（ｄｓＲＮＡの場合）又は宿主細胞ヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼＨ）（ギャップマーの場合）補充して内在性アンチセンスＲＮＡを選択的に分解することによって標的遺伝子の発現を調節すると考えられる。いくつかの実施形態において、内在性アンチセンスＲＮＡは、標的遺伝子の発現を負に調節し、ｐｄＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の発現を活性化する。従って、いくつかの実施形態において、ｐｄＲＮＡは、内在性アンチセンスＲＮＡによる標的遺伝子発現の負の調節を抑制することによって標的遺伝子の発現を選択的に活性化させるのに使用できる。標的遺伝子のプロモーター配列によってコードされるアンチセンス転写産物を同定する方法及びプロモーター指向ＲＮＡを調製及び使用する方法が知られている。例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０４６３９７号明細書参照。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、非核酸リガンド、例えば有機小分子又はタンパク質、例えば転写又は翻訳因子に結合し、その後に活性を修飾する（例えば、抑制する）アプタマーを含む。アプタマーは、非核酸リガンドの標的化結合部位の認識を指示する特異構造に折り畳むことができる。アプタマーは、本明細書に記載の修飾のいずれかを含有することができる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）を含む。アンタゴミアは、ｍｉｃｒｏＲＮＡを標的とする一本鎖、二本鎖、部分的二本鎖又はヘアピン構造である。アンタゴミアは、内在性ｍｉＲＮＡ、さらに詳しくはｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヌクレオチド配列の標的配列と実質的に相補的である少なくとも１０個又はそれ以上の連続したヌクレオチドから本質的になるか又は該ヌクレオチドを含む。アンタゴミアは、アンタゴミアが標的配列にハイブリダイズすることを可能にするために約１２〜２５個のヌクレオチド、例えば約１５〜２３個のヌクレオチドのｍｉＲＮＡ標的配列と十分と相補的なヌクレオチド配列を有することが好ましい。さらに好ましくは、標的配列は、アンタゴミアの配列とは１個、２個又は３個以下のヌクレオチドが異なる。いくつかの実施形態において、アンタゴミアは、オリゴヌクレオチド作用物質の３’又は５’末端に結合させることができる非ヌクレオチド部分、例えばコレステロール部分を含む。
いくつかの実施形態において、アンタゴミアは、修飾、例えばヌクレオチド修飾の組み込みによって核酸分解に対して安定化される。例えば、いくつかの実施形態において、アンタゴミアは、ヌクレオチド配列の５’末端又は３’末端に少なくとも第一、第二及び／又は第三のヌクレオチド間連鎖を含むホスホロチオエートを含有する。別の実施形態において、アンタゴミアは、２’−修飾ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、又は２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含む。いくつかの実施形態において、アンタゴミアは、少なくとも一つの２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の非コード領域の少なくとも一部分と実質的に相補的であるプロモーター指向ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）である。一つの実施形態において、ｐｄＲＮＡは、転写開始部位から上流に配置された部位、例えば転写開始部位から１００塩基を越える、２００塩基を越える又は１，０００塩基を越える上流に配置された部位の標的遺伝子ｍＲＮＡのプロモーター領域の少なくとも一部分と実質的に相補的であることができる。また、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物の３’−ＵＴＲの少なくとも一部分と実質的に相補的であることができる。例えば、ｐｄＲＮＡは、場合によりそれぞれの鎖に３’ジ又はトリヌクレオチドオーバーハングを有する１８〜２８個の塩基のｄｓＲＮＡを含む。前記ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のプロモーター領域又は３’−ＵＴＲ領域の少なくとも一部分と実質的に相補的である。別の実施形態において、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のプロモーター領域又は３’−ＵＴＲ領域の少なくとも一部分と実質的に相補的であるＤＮＡ配列含む一本鎖ポリヌクレオチドからなり、ギャップマーを細胞ヌクレアーゼから保護する一つ又はそれ以上の修飾ヌクレオチド、例えば２’ＭＯＥ、２’ＯＭｅ、又は固定化核酸塩基（ＬＮＡ）を含むポリヌクレオチド配列（例えば、ギャップマーの５’末端及び３’末端のそれぞれに５個の末端塩基を含む）に隣接するギャップマーを含む。
ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子の発現を選択的に高めるか、低下させるか又は調節するのに使用できる。理論に制約されることなく、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物の非コード領域とオーバーラップする内在性アンチセンスＲＮＡ転写産物に結合し、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（ｄｓＲＮＡの場合）又は宿主細胞ヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼＨ）（ギャップマーの場合）補充して内在性アンチセンスＲＮＡを選択的に分解することによって標的遺伝子の発現を調節し得る。いくつかの実施形態において、内在性アンチセンスＲＮＡは、標的遺伝子の発現を負に調節し、ｐｄＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の発現を活性化する。従って、いくつかの実施形態において、ｐｄＲＮＡは、内在性アンチセンスＲＮＡによる標的遺伝子発現の負の調節を抑制することによって標的遺伝子の発現を選択的に活性化させるのに使用できる。標的遺伝子のプロモーター配列によってコードされるアンチセンス転写産物を同定する方法及びプロモーター指向ＲＮＡを調製及び使用する方法が知られている。例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０４６３９７号明細書参照。
発現干渉ＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）は、標的遺伝子の発現を選択的に高めるか、低下させるか又は調節するのに使用できる。典型的には、ｅｉＲＮＡ、すなわち前記ｄｓＲＮＡは、発現ベクター由来の第一の形質移入細胞で発現される。このようなベクターにおいて、ｄｓＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、例えば核酸配列のいずれかの末端で２つの収束型プロモーターを使用するか、あるいはセンス配列又はアンチセンス配列を転写する別個のプロモーターを使用して同じ核酸配列から転写できる。あるいは、２つのプラスミドは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖を転写するために設計され、同時に他方が他方の鎖を転写するために設計される複数のプラスミドの一つを用いて形質移入できる。ｅｉＲＮＡエフェクター分子を調製し、使用する方法は、当該技術において公知である。例えば、国際公開第ＷＯ２００６／０３３７５６号、米国特許出願公開第２００５／０２３９７２８号及び同第２００６／００３５３４４号明細書参照。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、本明細書で定義されるような標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的であり及びＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質のＰｉｗｉ又はＡｕｂｅｒｇｉｎｅサブクラスのタンパク質に選択的に結合する小さな一本鎖Ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡエフェクター分子）を含む。特定の理論に制約されることなく、ｐｉＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用し、Ｐｉｗｉ及び／又はＡｕｂｅｒｇｉｎｅタンパク質を補充して標的遺伝子の転写及び／又は転写後遺伝子サイレンシングを誘導するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成すると考えられる。ｐｉＲＮＡエフェクター分子は、約１０〜５０個のヌクレオチドの長さ、約２５〜３９個のヌクレオチドの長さ又は約２６〜３１個のヌクレオチドの長さであることができる。例えば、米国特許出願公開第２００９／００６２２２８号明細書参照。
ｍｉｃｒｏＲＮＡは、植物及び動物のゲノムのＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻訳されない高度に保存されたクラスの小ＲＮＡ分子である。ｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡは、ｍｉＲＮＡに処理される。処理されたｍｉｃｒｏＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれようになり及び発生、細胞増殖、アポトーシス及び分化の重要な調節剤として確認されている一本鎖〜１７−２５個のヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡ分子である。これらの処理されたｍｉｃｒｏＲＮＡは、特異的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合することによって遺伝子発現の調節において役割を果たすと考えられる。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、例えば標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制するか又は分解を開始することによって特異的標的遺伝子の転写後サイレンシングを引きこす。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、標的核酸と完全に相補的である。別の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、標的核酸と非相補性の領域を有し、非相補性の領域で「バルジ」をもたらす。いくつかの実施形態において、非相補性の領域（バルジ）は、二重鎖の形成を可能にするために、十分な相補性、例えば完全な相補性の領域が側面に配置されている。例えば、相補性の領域は、少なくとも８〜１０個のヌクレオチドの長さ（例えば、８個、９個又は１０個のヌクレオチドの長さ）である。
ｍｉＲＮＡは、例えばｍｉＲＮＡが標的核酸と完全に相補的でない場合には、例えば翻訳を抑制することによって、又はｍｉＲＮＡが完全な又は高度の相補性を有するその標的に結合する場合には標的ＲＮＡの分解を生じることによって、遺伝子の発現を抑制することができる。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、内在性ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド作用物質を含むことができる。例えば、ＲＮＡエフェクターは、ＲＮＡエフェクターが標的遺伝子のｍｉＲＮＡに基づいた抑制を緩和するように、標的遺伝子の発現を負に調節する内在性ｍｉＲＮＡを標的とすることができる。オリゴヌクレオチド作用物質は、天然核酸塩基、糖、及び共有ヌクレオチド間（主鎖）連鎖及び／又は望ましい特性、例えば高められた細胞取り込み、内在性ｍｉＲＮＡ標的に対する高められた親和性、及び／又はヌクレアーゼの存在下での高められた安定性を付与する一つ又はそれ以上の天然に存在しない特徴を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、特異的内在性ｍｉＲＮＡに結合するために設計されたオリゴヌクレオチド作用物質は、標的ｍｉＲＮＡの少なくとも１０個、２０個又は２５個あるいはそれ以上の塩基と相当な相補性、例えば少なくとも７０％、８０％、９０％、又は１００％の相補性を有する。ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを標的とする典型的なオリゴヌクレオチド作用物質は、例えば米国特許出願公開第２００９０３１７９０７号、同第２００９０２９８１７４号、同第２００９０２９１９０７号、同第２００９０２９１９０６号、同第２００９０２８６９６９号、同第２００９０２３６２２５号、同第２００９０２２１６８５号、同第２００９０２０３８９３号、同第２００７００４９５４７号、同第２００５０２６１２１８号、同第２００９０２７５７２９号、同第２００９００４３０８２号、同第２００７０２８７１７９号、同第２００６０２１２９５０号、同第２００６０１６６９１０号、同第２００５０２２７９３４号、同第２００５０２２２０６７号、同第２００５０２２１４９０号、同第２００５０２２１２９３号、同第２００５０１８２００５号、及び同第２００５００５９００５号各明細書に記載されている。
ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、１０〜２００個のヌクレオチドの長さ、例えば１６〜８０個のヌクレオチドの長さであることができる。成熟ｍｉＲＮＡは、１６〜３０個のヌクレオチドの長さ、例えば２１〜２５個のヌクレオチドの長さ、特に２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のヌクレオチドの長さを有することができる。ｍｉＲＮＡ前駆物質は、７０〜１００個のヌクレオチドの長さを有することができ、ヘアピン立体配置を有することができる。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、生体内で酵素ｃＤｉｃｅｒ及びＤｒｏｓｈａによりｐｒｅ−ｍｉＲＮＡから生じる。ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、細胞に基づいた系で、生体内で合成できるし又は化学的に合成できる。ｍｉＲＮＡは、例えばエンドサイトーシス依存又は非依存メカニズムによって、一つ又はそれ以上の所望の特性、例えば優れた安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織又は細胞型に対する標的化、及び／又は細胞透過性を付与する修飾を含むことができる。修飾はまた、配列特異性を高め、その結果として部位外標的化を減少させることもできる。
別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、内在性ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド作用物質を含むことができる。例えば、ＲＮＡエフェクターは、ＲＮＡエフェクターが標的遺伝子のｍｉＲＮＡに基づいて抑制を緩和するように、標的遺伝子の発現を負に調節する内在性ｍｉＲＮＡを標的とすることができる。
本明細書で使用する「少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子の存在下で」という語句は、細胞で発現されたＲＮＡエフェクター分子、例えばｓｈＲＮＡへの細胞の暴露、又は細胞へのＲＮＡエフェクター分子の外からの添加、例えば場合により細胞内への取り込みを促進する作用物質を使用する細胞へのＲＮＡエフェクター分子の送達による暴露を包含する。ＲＮＡエフェクター分子の一部分は、標的遺伝子ＲＮＡの少なくとも一部分、例えば標的遺伝子ＲＮＡのコード領域、プロモーター領域、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）又は長い末端反復（ＬＴＲ）と実質的に相補的である。本明細書に開示されるＲＮＡエフェクター分子は、３０個以下のヌクレオチドの長さ、例えば１０〜２００個のヌクレオチドの長さ又は１９〜２４個のヌクレオチドの長さである領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、その領域は、生物由来物質の産生の一つ又はそれ以上の態様、例えば生物由来物質の収量、純度、均一性、生物活性又は安定性に影響を及ぼすタンパク質をコードする標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的である。ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写産物と相互作用し、その選択的分解に介在するか又はその翻訳を妨害する。本発明の種々の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも一つのギャップマー、あるいはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、アンタゴミア又はリボザイムである。
ＲＮＡ干渉を誘導するのに有効である二本鎖及び一本鎖オリゴヌクレオチドは、本明細書ではｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ剤又はｉＲＮＡ剤ともいう。これらのＲＮＡ干渉誘導オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られている細胞質多タンパク質複合体と会合する。理論に拘束されることなく、ＲＮＡ干渉は、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物のＡｒｇｏｎａｕｔｅ介在転写後切断をもたらす。多くの実施形態において、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡｉ作用物質は、内在性分子、例えばダイサーで切断され、ＲＩＳＣ機構に入り、標的配列、例えば標的ｍＲＮＡのＲＩＳＣ介在切断に関与できるより小さいオリゴヌクレオチドを生じることができるのに十分に長い。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ介在切断の影響を受け易い標的転写産物の部位を特定する。従って、本発明は、さらに、このような配列の一つの内部を標的とするＲＮＡエフェクター分子を特徴とする。このようなＲＮＡエフェクター分子は、一般的に標的遺伝子内の選択された配列に隣接する領域から採取されるさらなるヌクレオチド配列に結合された提供される配列の一つに由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む。
本明細書において並びに特許請求の範囲及び明細書全体を通じて使用する「ゲノム情報」という語句は、生物の部分ゲノム又は全ゲノム、例えばタンパク質コード領域又は非コード領域由来の配列情報を指すことを意味する。これらの配列は、同じ生物から生じるどんな細胞にも存在する。トランスクリプトーム配列情報とは対照的に、ゲノム情報は、コード領域ばかりではなく、例えばイントロン配列、プロモーター配列、サイレンサー配列及びエンハンサー配列も含む。従って、「ゲノム情報」とは、例えばヒトゲノム、マウスゲノム、ラットゲノムを指すことができる。データベース配列にさらなる長さを付加するために完全ゲノム情報又は部分ゲノム情報を使用して、ＲＮＡエフェクター分子を用いて修飾する可能性のある標的を増加させることができる。
「役割を果たす」という語句は、当業者に知られているか又は本明細書の他の個所に特定されている分子経路における転写産物又はタンパク質の任意の活性を指す。細胞活性のような経路は、以下に限定されないが、アポトーシス、細胞分裂、グリコシル化、増殖速度、細胞生産性、最大細胞密度、持続細胞生存性、アンモニア産生又は消費の速度、あるいは乳酸産生の速度を含む。
本明細書で使用する「バイオリアクター」とは、一般的に、宿主細胞が生物由来物質を産生するように宿主細胞を増殖させ、保持するのに適した任意の反応容器、及びこのような生物由来物質を回収するのに適した任意の反応容器を指す。本明細書に記載のバイオリアクターとしては、種々の大きさの細胞培養装置、例えば小培養フラスコ、Ｎｕｎｃ多層細胞工場、小さな高収量バイオリアクター（例えば、ＭｉｎｉＰｅｒｍ、ＩＮＴＥＧＲＡ−ＣＥＬＬｉｎｅ）、スピナーフラスコ、中空線維−ＷＡＶＥバッグ（Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｔａｇｅｌｓｗａｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び工業規模バイオリアクターが挙げられる。いくつかの実施形態において、生物由来物質は、生物由来物質の製薬学的又は工業的生産に適した１Ｌ又はそれ以上の容量（例えば、少なくとも１Ｌ、少なくとも２Ｌ、少なくとも５Ｌ、少なくとも１０Ｌ、少なくとも２５Ｌ、少なくとも５０Ｌ、少なくとも１００Ｌ又はそれ以上の容量を含む）を有し、多くの場合ｐＨ、グルコース、乳酸、温度及び／又はその他のバイオプロセスパラメータを監視する手段を含む「大規模培養」バイオリアクターで生産される。一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも１Ｌの容量である。
一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも２Ｌの容量である。一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも５Ｌの容量である。一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも２５Ｌの容量である。一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも４０Ｌの容量である。一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも５０Ｌの容量である。一つの実施形態において、大規模培養は、少なくとも１００Ｌの容量である。
本明細書で使用する「宿主細胞」は、本明細書で定義するように、生物由来物質の有用量の産生及び回収を可能にする条件下で細胞培養において増殖させ、保持することができる任意の細胞、細胞培養物、細胞バイオマス又は組織である。宿主細胞は、酵母、昆虫、両生類、魚類、爬虫類、鳥類、哺乳動物又はヒトから誘導できるし、あるいはハイブリドーマ細胞であることができる。宿主細胞は、未変性細胞又は細胞株、あるいは（例えば、生物由来物質の産生を促進するために）遺伝子組換えされている細胞株であることができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、所定の条件、例えば血清無含有培地、細胞懸濁培養又付着細胞培養での増殖を可能にするために変性されている細胞株である。
哺乳動物宿主細胞は、生物由来物質が哺乳動物組換えポリペプチドである場合、特に前記ポリペプチドが生物学的治療剤であるか又はヒトへの投与又はヒトによる消費を目的とする場合に好都合であり得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、多数の組換えタンパク質の発現に使用される細胞株であるＣＨＯ細胞である。組換えタンパク質の発現に一般的に使用されるさらなる哺乳動物細胞としては、２９３ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ジャーカット細胞、ＮＳＯ細胞及びＨＵＶＥＣ細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、組換えタンパク質又はその他の生物由来物質の産生を促進するために遺伝子組換えされているＣＨＯ細胞誘導体である。例えば、細胞の特定の遺伝子又は発現領域への組換えＤＮＡの安定した挿入、挿入されたＤＮＡの増幅、及び組換えタンパク質の高レベル発現を示す細胞の選択を可能にする種々のＣＨＯ細胞株が、開発されている。本明細書において提供される方法に有用なＣＨＯ細胞誘導体としては、以下に限定されないが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ Ｂ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１細胞，及びＣＨＯ−ｈｌＦＮγ細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞において組換えタンパク質を発現させる方法は、当該技術において知られており、例えば米国特許第４，８１６，５６７号及び同第５，９８１，２１４号明細書に記載されている。
本明細書において提供される方法に有用なヒト細胞の例としては、細胞株２９３Ｔ（胎児腎臓）、７８６−０（腎臓）、Ａ４９８（腎臓）、Ａ５４９（肺胞基底上皮）、ＡＣＨＮ（腎臓）、ＢＴ−５４９（乳房）、ＢｘＰＣ−３（膵臓）、ＣＡＫＩ−１（腎臓）、Ｃａｐａｎ−１（膵臓）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（白血病）、ＣＯＬＯ２０５（結腸）、ＤＬＤ−１（結腸）、ＤＭＳ１１４（小細胞肺）、ＤＵ１４５（前立腺）、ＥＫＶＸ（非小細胞肺）、ＨＣＣ−２９９８（結腸）、ＨＣＴ−１５（結腸）、ＨＣＴ−１１６（結腸）、ＨＴ２９（結腸）、ＨＴ−１０８０（線維肉腫）、ＨＥＫ２９３（胎児腎臓）、ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）、ＨＬ−６０（ＴＢ）（白血病）、ＨＯＰ−６２（非小細胞肺）、ＨＯＰ−９２（非小細胞肺）、ＨＳ５７８Ｔ（乳房）、ＨＴ−２９（結腸腺癌）、ＩＧＲ−ＯＶ１（卵巣）、ＩＭＲ３２（神経芽細胞腫）、ジャーカット（Ｔリンパ球細胞）、Ｋ−５６２（白血病）、ＫＭ１２（結腸）、ＫＭ２０Ｌ２（結腸）、ＬＡＮ５（神経芽細胞腫）、ＬＮＣａｐ．ＦＧＣ（Ｃａｕｃａｓｉａｎ前立腺癌）、ＬＯＸ ＩＭＶＩ（黒色腫）、ＬＸＦＬ５２９（非小細胞肺）、Ｍ１４（黒色腫）、Ｍ１９−ＭＥＬ（黒色腫）、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ（黒色腫）、ＭＣＦｌＯＡ（乳房上皮）、ＭＣＦ７（乳腺）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（乳房上皮）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳房）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳房）、ＭＤＡ−Ｎ（乳房）、ＭＯＬＴ−４（白血病）、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ（卵巣）、ＮＣＩ−Ｈ２２６（非小細胞肺）、ＮＣＩ−Ｈ２３（非小細胞肺）、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（非小細胞肺）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（非小細胞肺）、ＮＣＩ−Ｈ５２２（非小細胞肺）、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣）、ＯＶＣＡＲ−４（卵巣）、ＯＶＣＡＲ−５（卵巣）、ＯＶＣＡＲ−８（卵巣）、Ｐ３８８（白血病）、Ｐ３８８／ＡＤＲ（白血病）、ＰＣ−３（前立腺）、ＰＥＲＣ６（登録商標）（Ｅ１形質転換胎生網膜）、ＲＰＭＩ−７９５１（黒色腫）、ＲＰＭＩ−８２２６（白血病）、ＲＸＦ３９３（腎臓）、ＲＸＦ−６３１（腎臓）、Ｓａｏｓ−２（骨）、ＳＦ−２６８（ＣＮＳ）、ＳＦ−２９５（ＣＮＳ）、ＳＦ−５３９（ＣＮＳ）、ＳＨＰ−７７（小細胞肺）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（神経芽細胞腫）、ＳＫ−ＢＲ３（乳房）、ＳＫ−ＭＥＬ−２（黒色腫）、ＳＫ−ＭＥＬ−５（黒色腫）、ＳＫ−ＭＥＬ−２８（黒色腫）、ＳＫ−ＯＶ−３（卵巣）、ＳＮ１２Ｋ１（腎臓）、ＳＮ１２Ｃ（腎臓）、ＳＮＢ−１９（ＣＮＳ）、ＳＮＢ−７５（ＣＮＳ）、ＳＮＢ−７８（ＣＮＳ）ＳＲ（白血病）、ＳＷ−６２０（結腸）、Ｔ−４７Ｄ（乳房）、ＴＨＰ−１（単細胞由来マクロファージ）、ＴＫ−１０（腎臓）、Ｕ８７（膠芽細胞種）、Ｕ２９３（腎臓）、Ｕ２５１（ＣＮＳ）、ＵＡＣＣ−２５７（黒色腫）、ＵＡＣＣ−６２（黒色腫）、ＵＯ−３１（腎臓）、Ｗ１３８（肺）及びＸＦ４９８（ＣＮＳ）が挙げられる。
本明細書において提供される方法に有用な非ヒト霊長類細胞株の例としては、細胞株サル腎（ＣＶＩ−７６）細胞、アフリカミドリザル腎（ＶＥＲＯ−７６）細胞、ミドリザル線維芽（ＣＯＳ−１）細胞、及びＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎（ＣＶＩ）細胞が挙げられる。さらなる哺乳動物細胞株が、当業者に知られており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）カタログ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に掲載されている。
本明細書において提供される方法に有用な齧歯類動物細胞株の例としては、細胞株ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞（例えば、ＢＨＫ２１、ＢＨＫ ＴＫ）、マウスセルトリ（ＴＭ４）細胞、バッファローラット肝（ＢＲＬ３Ａ）細胞、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ）細胞、ラット肝癌（ＨＴＣ）細胞、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞、ネズミハイブリドーマ（Ｓｐ２／０）、マウス胸腺腫（ＥＬ４）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＣＨＯ細胞誘導体、ネズミ胎児（ＮＩＨ／３Ｔ３、３Ｔ３ Ｌ１）細胞、ラット心筋（Ｈ９ｃ２）細胞、マウス筋芽（Ｃ２Ｃ１２）細胞及びマウス腎（ｍｉＭＣＤ−３）細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、多能性幹細胞又は前駆細胞である。本明細書において提供される方法に有用な多能性細胞の例としては、ネズミ胚性幹（ＥＳ−Ｄ３）細胞、ヒト臍帯静脈内皮（ＨｕＶＥＣ）細胞、ヒト臍帯動脈平滑筋（ＨｕＡＳＭＣ）細胞、ヒト分化幹（ＨＫＢ−Ｉ１）細胞、ヒト間葉幹（ｈＭＳＣ）細胞及び人工誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、植物細胞である。培養において容易に増殖する植物細胞の例としては、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（クレソン）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）中国イチイ（Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、イチイ（Ｔ．ｃｕｓｐｉｄａｔａ）、ヨーロッパイチイ（Ｔ．ｂａｃｃａｔａ）、タイヘイヨウイチイ（Ｔ．ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）及び南方イチイ（Ｔ．ｍａｉｒｅｉ）、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）（ナス科）、タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）、例えばタバコ細胞株、例えばＮＴ−１又はＢＹ−２（ＮＴ−１細胞は、ＡＴＣＣ、Ｎｏ．７４８４０から入手できる、米国特許第６，１４０，０７５号明細書も参照）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｕｌｅｎｔｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）及びクローバ（Ｍ．ｓａｔｉｖａ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種、チーク（Ｔｅｃｔｏｎａ ｇｒａｎｄｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ）種、クロチク（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ）、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）及びビチス・ガメイ（ブドウ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｉｕｓ ａｌｂａ）、アブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）、ニレ（Ｕｌｍｕｓ）種、アキカラマツ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ ｍｉｎｕｓ）、イボツヅラフジ（Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）、ツルニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ ｒｏｓｅａ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）種、ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ニガキモドキ（Ｂｒｕｃｅａ ｊａｖａｎｉｃａ）、ドリティノプス（Ｄｏｒｉｔａｅｎｏｐｓｉｓ）属及びフェラノプシス（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ）属（ラン）、ホムロイイチゴ（Ｒｕｂｕｓ ｃｈａｍａｅｍｏｒｕｓ）、コーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ）、キウイ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）、ガマ（Ｔｙｐｈａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ）、インドセンダン（Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ ｉｎｄｉｃａ）（ニーム）、キャッツクロー（Ｕｎｃａｒｉａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）及びキャッツクロー（Ｕ．ｇｕｉａｎｅｎｓｉｓ）、キキョウ（Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）、カイガンタバコ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ ｇｉｇａｎｔｅａ）、コツレッキア・バージニカ（Ｋｏｓｔｅｌｅｔｚｋｙａ ｖｉｒｇｉｎｉｃａ）（アオイ科植物）、リンゴ（Ｐｙｒｕｓ ｍａｌｕｓ）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、カンキツ（Ｃｉｔｒｕｓ）種、メキシカンオレンジ（Ｃｈｏｉｓｙａ ｔｅｒｎａｔａ）、トゲナシヌグラ（Ｇａｌｉｕｍ ｍｏｌｌｕｇｏ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａ及びＤ．ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ステビア（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）、ハッショウマメ（Ｓｔｉｚｏｌｏｂｉｕｍ ｈａｓｓｊｏｏ）（スベリヒユ）、オオクサキビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、Ｒｕｄｇｅａ ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ、アメリカニンジン（Ｐａｎａｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｓ）、イトスギ〔モントレーイトスギ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）及びアリゾナイトスギ（Ｃ．ａｒｉｚｏｎｉｃａ）〕、ベチベルソウ（Ｖｅｔｉｖｅｒｉａ ｚｉｚａｎｉｏｉｄｅｓ）、インドニンジン（Ｗｉｔｈａｎｉａ ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）、ササゲ（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）、キダチミカンソウ（Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｒｕｒｉ） （トウダイグサ属）、インドクズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｔｕｂｅｒｏｓａ）及びクズ（Ｐ．ｌｏｂａｔａ）、シナカンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｅｃｈｉｎａｔａ）、ヨコマメヒ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、オオアザミ（Ｓｉｌｙｂｕｍ ｍａｒｉａｎｕｍ）、キンポウジュ（Ｃａｌｌｉｓｔｅｍｏｎ ｃｉｔｒｉｎｕｓ）、タネツケバナ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｃｈｒｙｓｏｃｈｌｏｒｕｓ）、コロニラ・バギナリス（Ｃｏｒｏｎｉｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、例えば細胞株３９ＲＡＲ（クラウンベッチ）、タンジン（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）、ギセキア・ファルナセオイデス（Ｇｉｓｅｋｉａ ｐｈａｒｎａｃｅｏｉｄｅｓ）、ヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｔａｔｕｌａ）及びシロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）並びにトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）種が挙げられる。
本明細書において提供される植物細胞培養は、植物細胞を形質転換する任意の特定の方法に限定されない。ＤＮＡを植物細胞に導入する方法は、当業者には周知である。例えば、米国特許出願公開第２０１０／０００９４４９号明細書参照。外来ＤＮＡを植物細胞中に送達させる基本的な方法、例えば化学的方法〔Ｇｒａｈａｍ＆ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，５４ Ｖｉｒｏｌ．，５３６−３９（１９７３）；Ｚａｔｌｏｕｋａｌら、６６０ Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１３６−５３（１９９２）〕；物理的方法、例えば微量注入法〔Ｃａｐｅｅｃｈｉ，２２ Ｃｅｌｌ．，４７９−８８（１９８０）〕、電気穿孔法〔Ｗｏｎｇ＆Ｎｅｕｍａｎｎ，１０７ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｎ．，５８４−８７（１９８２）；Ｆｒｏｍｍら、８２ ＰＮＡＳ，５８２４−２８（１９８５）；米国特許第５，３８４，２５３号明細書〕及び「遺伝子銃」法〔Ｊｏｈｎｓｔｏｎ＆Ｔａｎｇ，４３ Ｍｅｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３５３−６５（１９９４）；Ｆｙｎａｎら、９０ ＰＮＡＳ，１１４７８−８２（１９９３）〕；ウイルス法〔Ｃｌａｐｐ，２０ Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．，１５５−６８（１９９３）；Ｌｕら、１７８ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０８９−９６（１９９３）；Ｅｇｌｉｔｉｓ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ，６ Ｂｉｏｔｅｃｈｓ．，６０８−１４（１９８８）；Ｅｇｌｉｔｉｓら、２４１ Ａｖｄ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１９−２７（１９８８）〕；及び受容体媒介法〔Ｃｕｒｉｅｌら、８８ ＰＮＡＳ，８８５０−５４（１９９１）；Ｃｕｒｉｅｌら、３ Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．，１４７−５４（１９９２）；Ｗａｇｎｅｒら、８９ ＰＮＡＳ，６０９９−１０３（１９９２）〕が、記載されている。遺伝子導入植物は、本明細書では、植物細胞培養物、植物細胞株、植物組織培養物、下等植物、単子葉植物細胞培養物、双子葉植物細胞培養物、又は形質転換植物細胞又はプロトプラストから誘導されるこれらの後代として定義され、前記形質転換植物のゲノムは、実験室技法によって導入され、同じ種の天然の非遺伝子導入植物細胞中に本来存在しない外来ＤＮＡを含有する。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真菌類、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パルトリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）又はピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、リゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、シゾサッカロミセス・ボンベ（Ｓｃｉｚｏｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓａｎｕｅｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）又はクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）である。例えば、Ｐｅｔｒａｎｏｖｉｃ＆Ｖｅｍｕｒｉ，１４４ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０４−１１（２００９）；Ｂｏｌｌｏｋら、３ Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９２−２０１（２００９）；Ｔａｋｅｇａｗａら、５３ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２７−３５（２００９）；Ｃｈｉｂａ＆Ａｋｅｂｏｓｈｉ，３２ Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，７８６−９５（２００９）参照。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞株〔ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のサナギ卵巣組織から誘導される〕；Ｈｉ−５〔イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）卵細胞ホモジネートから誘導される〕；又はＳ２細胞〔キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から誘導される〕である。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、懸濁培養での増殖に適している。懸濁適格宿主細胞は、一般的に単分散性であるか又は実質的な凝集なしにゆるい凝集物で増殖する。懸濁適格宿主細胞としては、順化又は操作なしで懸濁培養に適した細胞（例えば、造血細胞、リンパ系細胞）及び付着依存性細胞の修飾又は順化によって懸濁適格性にされている細胞（例えば、上皮細胞、線維芽細胞）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、付着培養において増殖し、保持される付着依存性細胞である。本明細書において提供される方法に有用なヒト付着細胞株の例としては、ヒト神経芽細胞腫（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＩＭＲ３２及びＬＡＮ５）細胞、ヒト子宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞、ヒト胸部上皮（ＭＣＦｌＯＡ）細胞、ヒト胎児腎（２９３Ｔ）細胞、及びヒト乳癌（ＳＫ−ＢＲ３）細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、所定の条件下で、例えば血清無含有培地において、細胞懸濁培養において又は付着細胞培養において増殖を可能にするために変性されている細胞である。前記宿主細胞は、例えば、ヒトＮａｍａｌｗａ Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞（ＢＬｃｌ−ｋａｒ−Ｎａｍａｌｗａ）、ベビーハムスター腎線維芽細胞（ＢＨＫ）、ＣＨＯ細胞、ネズミ骨髄腫細胞（ＮＳ０、ＳＰ２／０）、ハイブリドーマ細胞、ヒト胎児腎細胞（２９３ＨＥＫ）、ヒト網膜由来細胞〔ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標Ｒ）細胞、米国特許第７，５５０，２８４号明細書〕、昆虫細胞株｛Ｓｆ９〔ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のサナギ卵巣組織から誘導される〕；又はＨｉ−５〔イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）卵細胞ホモジネートから誘導される〕；米国特許第７，０４１，５００号明細書も参照｝、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、初代マウス脳細胞又は組織、初代子牛リンパ細胞又は組織、初代サル腎細胞、孵化鶏卵、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、アカゲザル胎児肺細胞（ＦＲｈＬ−２）、ヒト胎児肺細胞（ＷＩ−３８、ＭＲＣ−５）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ、ＣＶ−１）、アカゲザル腎細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２）又は酵母細胞であることができる。組換えタンパク質の発現の一般的に使用される別の哺乳動物細胞株としては、以下に限定されないが、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ジャーカット細胞、及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）細胞が挙げられる。
宿主細胞は、未変性であることができるし又は遺伝子組換えすることができる（例えば、遺伝子導入動物由来の細胞）。例えば、遺伝子導入鶏卵由来のＣＥＦは、ＩＦＮ経路に不可欠な一つ又はそれ以上の遺伝子を有することができ、例えばインターフェロン受容体、ＳＴＡＴ１などは、破壊されている、すなわち「ノックアウト」である。例えば、Ｓａｎｇ，１２ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，４１５（１９９４）；Ｐｅｒｒｙら、２ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．，１２５（１９９３）；Ｓｔｅｒｎ，２１２ Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９５−２０６（１９９６）；Ｓｈｕｍａｎ，４７ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，８９７（１９９１）参照。また、宿主細胞は、所定の条件下で、例えば３０℃でのインキュベーション下で増殖を可能にするために変性させることができる。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、懸濁培養物での増殖に適している。懸濁適格宿主細胞は、一般的に単分散性であるか又は実質的な凝集なしにゆるい凝集物で増殖する。懸濁適格宿主細胞としては、順化又は操作なしで懸濁培養に適した細胞（例えば、造血細胞、リンパ系細胞）及び付着依存性細胞の修飾又は順化によって懸濁適格性にされている細胞（例えば、上皮細胞、線維芽細胞）が挙げられる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、付着培養において増殖し、保持される付着依存性細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、卵、例えば魚類、両生類又はトリの卵に含有される。
「生物由来物質を宿主細胞から単離する」とは、生物由来物質を、宿主細胞物質、例えば宿主細胞、宿主細胞培養培地、宿主細胞バイオマス又は宿主組織から分離する少なくとも一つの工程を意味する。従って、宿主細胞培養培地に分泌され、最終的に収穫される生物由来物質を単離することは、「宿主細胞から単離する」という語句に包含される。有用な量とは、例えばアリコート又は試料を含め、標的遺伝子発現の調節を監視することを含め産生について選別するか又は産生を監視するのに使用される量を包含する。
本発明は、生物由来物質、例えばポリペプチド、代謝産物、機能性食品、化学中間体、バイオ燃料、食品添加物、抗生物質、又は免疫原性作用物質の製造を提供する。さらに具体的には、「生物由来物質」としては、宿主細胞によって産生され、有用な量で回収することができる任意の物質、例えば以下に限定されないが、ポリペプチド（例えば、糖タンパク質、抗体、ペプチド基剤の増殖因子）、糖質、脂質、脂肪酸、代謝産物（例えば、ポリケチド、マクロライド）及び化学中間体を挙げることができる。この「生物由来物質」はまた、用語「生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）」、すなわち製剤、例えば生物（ｌｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）又はその産生物から合成され、診断薬、予防薬又は治療薬として使用される薬物、ワクチン又は抗毒素も包含する。従って、生物由来物質は、種々様々な用途、例えば生物学的治療薬、ワクチン、研究又は診断試薬、発酵食品、食品添加物、機能性食品、バイオ燃料、工業用酵素（例えば、グルコアミラーゼ、リパーゼ）、工業薬品（例えば、乳酸塩又はエステル、フマル酸塩又はエステル、グリセロール、エタノール）などとして使用できる。
いくつかの実施形態において、生物由来物質は、ポリペプチドである。ポリペプチドは、組換えポリペプチド又は宿主細胞に内在するポリペプチドであることができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、糖タンパク質であり及び宿主細胞は、哺乳動物細胞である。本明細書において提供される方法に従って産生させることができるポリペプチドの非限定的な例としては、受容体、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、酵素、増殖因子、増殖因子受容体、抗体、抗体誘導体及びその他の免疫エフェクター、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン、インテグリン、可溶性主要組織適合性複合体抗原、結合タンパク質、転写因子、翻訳因子、腫瘍性タンパク質又は腫瘍原性タンパク質、筋タンパク質、骨髄タンパク質、神経活性タンパク質、腫瘍増殖抑制剤、構造タンパク質及び血液タンパク質（例えば、トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、フォンウイルブランド因子など）が挙げられる。本明細書で使用するように、ポリペプチドは、翻訳後修飾、例えば脱アミド化、糖化などを受けている糖タンパク質又はその他のポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態において、生物由来物質は、抗体（例えば、モノクロナール抗体）である。哺乳動物宿主細胞において産生されるモノクロナール抗体は、それぞれの重鎖にＮ−結合グリコシル化部位を含有する。重鎖グリカンは、典型的には、高レベルのコアフコシル化を有する複合構造物である。Ｆｃ領域Ｎ−結合オリゴサッカライドの最内部Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌａｃＮＡｃ）残基にα１，６結合によって結合されたフコース残基は、抗体活性に最も重要な糖鎖構造である。例えば、非フコシル化抗体は、劇的に上昇した抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）活性に関連する。従って、一つの実施形態において、モノクロナール抗体の産生は、フコシルトランスフェラーゼ、例えばＦＵＴ８をコードする標的遺伝子の発現を調節することによって、例えば配列番号：２０９８４１−２１０２２７からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって宿主細胞を接触させることによって高められる。特定の実施形態において、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を、ヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド又はそれ以上）を含む一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子と接触させて生物由来物質のフコシル化を調節することによって生物由来物質、例えば組換え抗体あるいはその断片又は誘導体の産生を高める方法が提供される。例えば、前記細胞は、配列番号：３１５２７１４−３１５２７５３の一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子と接触することができ、前記接触は、ＣＨＯ細胞フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）の発現を調節する。ＡＤＣＣ活性は、生体外ＡＤＣＣアッセイ（例えば、米国特許同第５，５００，３６２号、同第５，８２１，３３７号及び同６，７３７，０５６号明細書に記載のＡＤＣＣアッセイ）並びに末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をエフェクター細胞として使用して評価することができる。また、ＡＤＣＣ活性は、例えば動物モデルで、例えばＣｌｙｎｅｓら、９５ ＰＮＡＳ，６５２−５６（１９９８）に開示されている動物モデルで生体内で評価することもできる。
一つの実施形態において、生物由来物質（例えば、抗体）の産生は、宿主細胞を、ＦＵＴ８、ＴＳＴＡ３及びＧＭＤＳからなる群から選択される標的遺伝子に対する少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させて、例えばフコシル化を調節することによって高められる。一つの実施形態において、ＦＵＴ８、ＴＳＴＡ３及びＧＭＤＳからなる群から選択される標的遺伝子に対する少なくとも２つのＲＮＡエフェクター分子が、使用される。これらの実施形態の一つの態様において、宿主細胞は、さらに、シアリルトランスフェラーゼ、例えばＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ３、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ５、ＳＴ６（α−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−β−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ６、又はＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ２をコードする遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子と接触させることができる。
一つの実施形態において、シアリルトランスフェラーゼをコードする標的遺伝子は、配列番号：２０８８、配列番号：２１６７、配列番号：３４１１、配列番号：３４８４、配列番号：４１８６、配列番号：４３１９からなる群から選択される。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、シアリルトランスフェラーゼ配列の及び／又はＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ３、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ５、ＳＴ６（α−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−β−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ６、又はＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ２それぞれを標的とする、配列番号：６８１１０５−６８１４５４、配列番号：７０７５３５−７０７８７０、配列番号：１１３１１２３−１１３１４４５、配列番号：１１５５３２４−１１５５７１１、配列番号：１３９１０７９−１３９１４４９及び配列番号：１４３５９８９−１４３６３１７からなる群から選択される少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡである。
さらなる実施形態において、生物由来物質は、抗体誘導体、例えばヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、又は抗体のエピトープ結合部分である。抗体及び抗体断片の産生方法は、当該技術において公知である。例えば、米国特許第４，８１６，３９７１号、同第４，３７６，１１０号、同第４，９４６，７７８号、同第４，８１６，５６７号、同第５，８１６，３９７号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号各明細書、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，２５６ Ｎａｔｕｒｅ，４９５−９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら、４ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，７２−７９（１９８３）；Ｃｏｌｅら、８０ ＰＮＡＳ，２０２６−３０（１９８３）参照。
他の実施形態において、生物由来物質は、免疫原性のウイルスタンパク質、細菌タンパク質、原虫タンパク質、又は発現ベクターから誘導される組換えタンパク質である。ウイルス性ワクチンを製造する典型的なアプローチは、複製できるが病原性がない、従って持続免疫を提供し、疾患に対してより大きな保護を提供する弱毒化生ウイルスワクチンの使用を含む。弱毒化ウイルスを産生させる従来の方法は、宿主域突然変異体の偶然単離を含み、これらの宿主域突然変異体の多くは温度感受性であり、例えば、前記ウイルスは、非天然宿主によって継代され、免疫原性であるが病原性でない子孫ウイルスが選択される。効率的なワクチン生産は、宿主系から高収量で産生される多量のウイルスの増殖を必要とする。異なる型のウイルスは、許容される収量を得るために異なる増殖条件を必要とする。従って、ウイルスを増殖させる宿主が、極めて重要である。ウイルス型に応じて、ウイルスは、孵化鶏卵、初代組織培養細胞又は確立された細胞株で増殖させることができる。
従って、本発明のいくつかの実施形態において、生物由来物質は、ウイルス産生物、例えば天然ウイルス株、変異体又は突然変異体；突然変異ウイルス（例えば、突然変異原への暴露、反復継代及び／又は非許容宿主での継体によって生じる）、再集合体（分節ウイルスゲノムの場合）、及び／又は所望の表現型を有する遺伝子組換えウイルス（例えば、「逆遺伝学」技法を使用する）である。これらの実施形態のウイルスは、弱毒化することができる；すなわち、ウイルスは、感染性であり、生体内で複製できるが、一般的に非病原性である無症状レベルの感染をもたらす低い力価を生じる。
また、本発明の生物由来物質は、生物由来物質を本発明の組成物、細胞及び／又は方法を使用して、例えばＲＮＡエフェクター分子を使用して高めることができるための細胞内寄生体から誘導できる。例えば、本発明の別の実施形態は、真核細胞における細菌性免疫原の産生を提供する。これらの細菌としては、シゲラ・フレキシネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、恙虫病リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）、ロッキー山紅斑熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）亜種が挙げられる。本発明の別の実施形態は、真核細胞における原虫免疫原の産生を提供する。これらの原虫としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｉｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）及びドノヴァンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、生物由来物質の産生の増強は、培養における細胞の生存率を向上させることによって達成される。本明細書で使用するように、用語「細胞生存性を向上させる」とは、ＲＮＡエフェクター分子（一つ又は複数）の存在下で、このような処理の不存在下での細胞密度又はアポトーシスレベルと比較して少なくとも１０％の細胞密度の上昇（例えば、トリパンブルー排除アッセイで評価される）又はアポトーシスの減少（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して評価される）を指す。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子（一つ又は複数）による処理に応答する細胞密度の上昇又はアポトーシスの減少は、未処理細胞と比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％でさえある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子（一つ又は複数）による処理に応答する細胞密度の上昇は、ＲＮＡエフェクター分子（一つ又は複数）の不存在下での細胞密度よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍又はそれよりも高い。
本明細書で使用するように、「免疫原性作用物質」とは、被験者の免疫系を刺激するのに使用され、それによって前記免疫系の一つ又はそれ以上の機能が上昇し、免疫原性作用物質に指向する作用物質を指す。抗原又は免疫原とは、宿主免疫系を刺激して分泌性免疫反応、体液性免疫反応及び／又は細胞性免疫反応をその抗原に特異的にすることができる一つ又はそれ以上のエピトープを含有する分子を意味することを意図する。免疫原性作用物質は、当該技術で公知の方法を使用する抗体、単離ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体の両方の産生において使用できる。免疫原性作用物質としては、ワクチンが挙げられる。
本明細書で使用するように、「ワクチン」とは、被験者の免疫系によって自己免疫として認識されない抗原に対して保護が提供されるように被験者の免疫系を刺激するのに使用される作用物質を指す。免疫処置とは、被験者において高レベルの抗体及び／又は細胞性免疫反応を誘導するプロセスであって、生体が暴露されている病原体又は抗原に指向するプロセスを指す。本明細書で使用するワクチン及び免疫原性作用物質とは、被験者の免疫系：すなわち被験者が、被験者の細胞又は細胞外液に侵入する抗原性物質に対して抗体及び／又は細胞免疫反応を産生する解剖学的特徴及びメカニズムを指す。抗体産生の場合には、そのように産生された抗体は、免疫学的分類、例えば免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ又はＭのいずれかに属することができる。免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の産生を刺激するワクチンは、ＩｇＡが温血動物の分泌系の主要な免疫グロブリンであることから、重要である。ワクチンは、ＩｇＡ形成の他に種々様々な免疫反応、例えば細胞性免疫及び体液性免疫を生じる可能性がある。抗原に対する免疫反応は、よく研究され、広く報告されている。例えば、Ｅｌｇｅｒｔ，ＩＭＭＵＮＯＬ．（Ｗｉｌｅｙ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９６）；Ｓｔｉｔｅｓら、ＢＡＳＩＣ＆ＣＬＩＮ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，（７ｔｈ Ｅｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，１９９１）参照。対照的に、「宿主細胞の免疫反応」という語句は、異物の存在に対する単細胞宿主生物の反応を指す。
本明細書で使用する「バイオプロセシング」とは、典型的には以下の工程：（ａ）異種タンパク質をコードする導入遺伝子を含有する哺乳動物宿主細胞を、細胞培養培地を入れた種培養容器に接種し、前記細胞を最小閾値交差接種密度に達するまで増殖させ；（ｂ）増殖させた種培養細胞又はその一部を、大規模バイオリアクターに移し；（ｃ）大規模培養物を、迅速な増殖及び細胞分裂を可能にする条件下で前記細胞が所定の密度に達するまで増殖させ；（ｄ）培養物を、連続的な細胞増殖及び／又は宿主細胞分裂を嫌い、異種タンパク質の発現を促進する条件下で保持する；工程を含む、細胞培養において（例えば、哺乳動物宿主細胞において）生物由来物質（例えば、異種ポリペプチド）の工業規模の産生のために典型的な方法を指す。
前記方法の工程（ａ）〜（ｃ）は、一般的に「増殖」期を含み、これに対して工程（ｄ）は、一般的に「産生」期を含む。いくつかの実施形態において、流加培養又は連続細胞培養条件は、増殖期の宿主細胞の増殖及び分裂を高め、産生期の間の細胞の増殖及び／又は分裂を嫌い、異種タンパク質の発現を促進するために調整される。例えば、いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、約１ｍｇ／Ｌ、又は約２．５ｍｇ／Ｌ、又は約５ｍｇ／Ｌ、又は約１ｇ／Ｌ、又は約５ｇ／Ｌ、又は約１５ｇ／Ｌ、又はそれよりも高いレベルで発現される。細胞の増殖及び／又は分裂の速度は、培養条件、例えば温度、ｐＨ、溶存酸素（ｄＯ２）などを変化させることによって調節できる。例えば、増殖期に適した条件としては、約ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５の間のｐＨ、約３０℃〜３８℃の間の温度、及び約５％〜９０％飽和の間のｄＯ２を挙げることができる。いくつかの実施形態において、異種タンパク質の発現は、産生期において、より低い培養温度への温度変化（例えば、約３７℃から約３０℃に）を誘導するか、細胞培養培地中の溶質の濃度を上昇させるか又は毒素（例えば、酪酸ナトリウム）を細胞培養培地に加えることによって高めることができる。いくつかの実施形態において、異種タンパク質の発現は、産生期において、温度変化を約２８℃に誘導して、例えば細胞分裂の不存在下でタンパク質の発現を増加させることによって高めることができる（例えば、実施例１２参照）。産生期の間の増殖及び／又はタンパク質発現を高めるための種々のさらなるプロトコル及び条件は、当該技術において知られている。
宿主細胞は、宿主細胞と培地を最初にバイオリアクターに供給し、さらなる培養養分を、細胞培養法全体を通じて連続的に又は徐々に供給する流加培養法において撹拌タンク式バイオリアクター装置で培養できる。流加培養法は、定期的に全培養物（細胞及び培地を含む）を取り出し、新しい培地に置き換える半連続法であることができる。あるいは、細胞培養のための全成分（細胞及び培地を含む）を方法の最初に培養容器に供給する単純回分培養法を使用できる。細胞を培養中に例えばろ過、カプセル化、微小担体への固定などによって固定化し、方法中に上清を培養容器から連続的に取り出し、新しい培地に置き換える連続灌流法も使用できる。
一つの実施形態において、産生期の後に、生物由来物質は、細胞培養培地から当該技術で公知の種々の方法を使用して回収される。例えば、分泌された異種タンパク質の回収は、典型的には、培地から、例えば遠心分離又はろ過による宿主細胞及び破片の除去を含む。ある場合には、特に、生物由来物質が分泌されないタンパク質である場合には、タンパク質の回収は、培養宿主細胞を、例えば機械的剪断、浸透圧衝撃又は酵素処理によって溶解して細胞の内容物をホモジネート中に放出させることによって行うこともできる。次いで、タンパク質は、細胞よりも小さい断片、不溶物などから、分画遠心分離、ろ過、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動法〔例えば、分取等電点電気泳動（ＩＥＦ）〕、硫酸アンモニウム沈降などによって分離できる。特定の種類のタンパク質を回収し、精製する方法は、当該技術で公知である。
いくつかの実施形態において、細胞を血清無含有培地に順応させ、付着細胞を懸濁において細胞増殖に順応させることが望ましい。いくつかの実施形態において、細胞は、血清無含有培地で増殖させるのに順応させる。本発明の一つの態様において、細胞の順応は、可塑性の制御に関与する遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を使用することによって細胞可塑性を増大させることによって促進される。例えば、細胞周期調節因子（例えば、本明細書に記載のサイクリンキナーゼなど）を標的とするＲＮＡエッフェクター〔例えば、表１３参照、これは例示的ＣＨＯ転写産物標的遺伝子及び典型的ｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖）を特定する〕；ヒストンデアセチラーザ及びＤＮＡメチラーゼ〔例えば、表２〜３参照、これは、例示的ＣＨＯ転写産物標的遺伝子及び典型的ｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖）を特定する〕、ｐ５３〔例えば、表１３参照、これは、例示的ＣＨＯ転写産物標的遺伝子及び典型的ｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖）を特定する〕；及びストレス応答タンパク質、例えば熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰ４０など）〔例えば、表１５及び／又は表５５参照、これは、例示的ＣＨＯ転写産物標的遺伝子及び典型的ｓｉＲＮＡｓ（アンチセンス鎖）を特定する〕などが使用できる。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクターは、配列番号：４９５７を含む形質転換関連タンパク質Ｐ５３（ＣＨＯ４９５７．１）をコードする転写産物を標的とする。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：１６４９８５７−１６５０１５７からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む。
Figure 2014501097
Figure 2014501097
 用語「システム」、「計算デバイス」及び「コンピュータベース・システム」は、本発明の情報を解析するのに使用するコンピュータハードウエア、関連ソフトウエア及びデータ記憶デバイスを指す。一つの実施形態において、本発明のコンピュータベース・システムは、一つ又はそれ以上の中央演算処置装置（例えば、ＣＰＵ、ＰＡＬ、ＰＬＡ、ＰＧＡ）、入力手段（例えば、キ−ボード、カーソルコントロールデバイス、タッチスクリーン）、出力手段（例えば、コンピュータディスプレイ、プリンター）及びデータ記憶デバイス（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、揮発性及び不揮発性メモリデバイス、ハードディスクデバイス、ネットワーク接続記憶、光記憶デバイス、磁気デバイス、固体記憶デバイス）を含む。このように、任意の都合のよいコンピュータベース・システムが、本発明において使用できる。また、計算デバイスは、コンピュータハードウエアと関連ソフトウエア又はファームウエアの組み合わせに基づいた組み込みシステムを含むことができる。
「プロセッサ」は、プログラム制御下で諸機能を実行することができる任意のハードウエア及び／又はソフトウエアの組み合わせを含む。例えば、本明細書において任意のプロセッサは、組み込みシステムの形態で入手できるようなプログラム可能デジタルマイクロプロセッサ、プログラム可能コントローラー、メインフレーム、サーバー又はパーソナルコンピュータ（デスクトップ又はポータブル）であることができる。プロセッサが選択的にプログラム可能な適当なプログラムである場合には、ソフトウエア又はファームウエアは、遠隔地からプロセッサにつながることができるし又はコンピュータプログラム製品（例えば、磁気デバイス、光デバイス又は固体デバイスに基づこうと基づかなかろうとポータブル又は固定コンピュータ読み取り可能記憶媒体）にあらかじめ保存することができる。例えば、磁気媒体又は光ディスクは、プログラム又は操作命令を記憶することができ、読み取り、その対応ステーションのそれぞれのプロセッサに移すことができる。
本明細書で使用する「コンピュータ読み取り可能媒体」とは、実行及び／又は処理のためにコンピュータに命令及び／又はデータを提供するのに関与する任意の記憶又は伝送媒体を指す。記憶媒体の例としては、フロッピーディスク、磁気媒体（テープ、ディスク）、ＵＢＳ、光媒体（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ブルーレイ）、固体媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ又は集積回路、光磁気ディスク又はコンピュータ読み取り可能カード、例えばＰＣＭＣＩＡカードなどが、このようなデバイスがコンピュータの内部又は外部にあるか否かに関係なく挙げられる。情報を含むファイルは、コンピュータ読み取り可能媒体に「記憶させる」ことができ、この場合に「を記憶する」とは、後日コンピュータがアクセスでき、検索できるように情報を記録することを意味する。
コンピュータ読み取り可能媒体に関して、「固定メモリ」又は「不揮発性メモリ」とは、データ記憶媒体に永久に保存されるメモリを指す。固定メモリは、コンピュータ又はプロセッサへの電源供給の停止によって消去されない。コンピュータハードドライブ、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピーディスク及びＤＶＤは、全て固定メモリの例である。ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）は、非固定又は揮発性メモリの例である。
データ、プログラミング情報又はその他の情報をコンピュータ読み取り可能媒体に「記録する」又は「保存する」とは、任意の都合のよい方法を使用して情報を保存する方法を指す。任意の都合のよいデータ記憶構造物が、保存される情報に基づいて選択することができる。
「メモリ」又は「記憶装置」とは、プロセッサによる後の検索のための情報を保存できる任意のデバイスを指し、磁気デバイス又は光デバイス（例えば、ハードディスク、フロッピーディスク、ＣＤ又はＤＶＤ）又は固体記憶デバイス（例えば、揮発性又は不揮発性ＲＡＭ）を挙げることができる。メモリ又は記憶装置は、同じ種類又は異なる種類の２つ以上の物理的記憶デバイスを有することができる（例えば、メモリは、多数のメモリデバイス、例えば多数のハードドライブ又は多数の固体メモリデバイス又はハードドライブと固体メモリデバイスとのいくつかの組み合わせを有することができる）。
本出願は、種々の遺伝子、転写産物、タンパク質などを核酸配列について公知の名前を使用して記載する。特定の配列識子がこのような名前と相互参照されない範囲において、当業者は公知の手段によって容易にそのように記載することができる。例えば、多数の検索可能サイト、例えばＧｅｎｅＣａｒｄｓ．ｏｒｇ（全ての公知の及び予測されるヒト遺伝子に関する簡潔なゲノム、トランスクリプトーム、遺伝子、プロテオーム、機能及び疾患に関連した情報を提供するヒト遺伝子の共同検索可能な統合データベース；Ｃｒｏｗｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅで開発されたデータベース）、及びこのようなサイトの基本となる刊行物がある。配列を位置づけるために前記の名前を容易に使用でき、このような配列を使用して本明細書で使用する配列番号を相互参照できる。同様に、少なくとも１５個の核酸の相補的配列を探索することによって、このような遺伝子に対して対応ｓｉＲＮＡを特定する。
明細書全体を通じて、場合によっては、本発明者らは、標的遺伝子の遺伝子略号又は別名及びその遺伝子の対応ｓｉＲＮＡ配列番号を示す。場合によっては、本発明者らは、標的遺伝子の完全な遺伝子名、その標的遺伝子の対応配列番号（例えば、転写産物配列）及び標的遺伝子に指向する例示的ｓｉＲＮＡ配列番号を示す。本発明の種々の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号によって本明細書において特定されるｓｉＲＮＡ配列のいずれかのｓｉＲＮＡヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むｉＲＮＡであり、例えば表１〜１６、２１〜２５、２７〜３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１〜６１、６５及び６６が参照される。
配列番号によって特定されるｓｉＲＮＡは、多くの場合、本明細書において配列番号の範囲内で、例えば配列番号：２４８００１８−２４８０３６２から参照されることが理解されるべきである。この範囲は、全ての配列番号を含み：その範囲内には、例えば配列番号：２４８００１８、配列番号：２４８００１９、配列番号：２４８００２０などから配列番号：２４８０３６２まで幅広く含む。
ＩＩ．バイオプロセシングを高める
本発明は、本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子を使用して生物由来物質（例えば、ポリペプチド、代謝産物、機能性食品、化学中間体、バイオ燃料、食品添加物、抗生物質など）の産生を高める方法を提供する。この方法は、一般的に、細胞をＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、標的遺伝子と相補的である）と接触させ、細胞を培養物（例えば、大規模バイオリアクター）中で標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持する（この場合、前記調節は、宿主細胞から生物由来物質の産生を高める）ことを含む。次いで、生物由来物質は、細胞から単離される。ＲＮＡエフェクター分子は、細胞を生物由来物質の産生を可能にする条件下で保持するために、例えば標的遺伝子の一時的な調節するために使用する細胞培養培地に加えて、それによって生物由来物質の発現を高めることができる。
当業者には知られているように、脂質ポリヌクレオチド担体を使用するｓｉＲＮＡのリポソーム介在送達は、一般に研究用途で使用される。しかし、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０１２１７３号明細書（２００８年７月１１日付けで出願された）に記載のように、脂質ポリヌクレオチド担体、例えば一般的なリポソームトランスフェクション試薬の使用は、タンパク質のバイオプロセシングにおいて使用すると有害であることが認められている。ポリヌクレオチド担体は、宿主細胞が工業規模で所望の生物由来物質の産生能力を損なうような毒性のために、宿主細胞に対して有毒であることが報告されている。また、ポリヌクレオチド担体は、宿主細胞が関心の生物由来物質を産生する能力を損なう宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞の表現型の悪い及び望まれない変化を引き起こすことが観察されている。従って、当業者は、このようなポリヌクレオチド担体の使用は、細胞が所望のタンパク質を産生する能力を妨げることを予期するであろう。意外にも、本発明者らは、本明細書全体を通じて記載するように、ＲＮＡエフェクター分子（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＣ及び／又はＬＤＨを標的とする）は、大規模培養（例えば、１Ｌ、例えば４０Ｌ）でのバイオプロセス手順中にポリヌクレオチド担体（例えば、製剤化された脂質介在送達）を使用することによって、細胞に悪に影響を及ぼすことなく、培養において宿主細胞に一時的に送達させることができる、例えば細胞生存性及び密度が保持されることを見出した。従って、生物由来物質の大規模生産は、細胞が培養（例えば、懸濁培養）中である場合にはＲＮＡエフェクター取り込みを促進するために、例えば生物学的タンパク質産生を増大させる遺伝子の一時的な調節をもたらすために、脂質試薬を使用して工業規模で行うことができる。本発明の特定の実施形態は、脂質製剤介在送達によるＲＮＡエフェクター分子の送達に限定されないことが理解されるべきである。
一つの実施形態において、生物由来物質（例えば、異種タンパク質）の産生は、タンパク質発現、翻訳後修飾、折りたたみ、分泌、及び／又は異種タンパク質の産生及び／又は回収に関連したその他のプロセスに影響を及ぼすタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節するために、培養細胞を、産生期中に本明細書において提供されるＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって高められる。別の実施形態において、異種タンパク質の産生は、培養細胞を、産生期の間の細胞増殖及び／又は細胞分裂を阻止するＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって高められる。
いくつかの実施形態において、培養宿主細胞における生物由来物質の産生は、細胞を、宿主細胞においてウイルスの感染力及び／又は量が低下するように、混入ウイルスのタンパク質の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって高められる。別の実施形態において、培養宿主細胞における生物由来物質の産生は、細胞を、宿主細胞において混入ウイルスの感染力及び／又は量が低下するように、ウイルス感染に関与する宿主細胞タンパク質、例えば細胞膜リガンドの発現、又はウイルスの増殖を調節するＲＮＡエフェクター分と接触させることによって高められる。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子の調節の際の生物由来物質の産生の増強は、一つ又はそれ以上の測定可能なバイオプロセスパラメータ、例えば細胞密度、ｐＨ、酸素濃度、グルコース濃度、乳酸濃度、温度及びタンパク質産生からなる群から選択されるパラメータを監視することによって検出される。タンパク質産生は、特定生産性（ＳＰ）（溶液中の産生物、例えば異種発現されるポリペプチドの濃度）として測定でき、ｍｇ／Ｌ又はｇ／Ｌとして表すことができる；あるいは、特定生産性は、ｐｇ／細胞／日として表すことができる。ＳＰの増大は、２組の規定された条件下で産生される産生物の濃度の絶対的又は相対的増加〔例えば、ＲＮＡエフェクター分子（一つ又は複数）で処理されていない対照と比較した場合に〕を指すことができる。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子の調節の際の生物由来物質の産生の増強は、一つ又はそれ以上の測定可能なバイオプロセスパラメータ、例えば細胞密度、培地ｐＨ、酸素濃度、グルコース濃度、乳酸濃度、温度、ウイルスタンパク質又はウイルス粒子産生を監視することによって検出される。例えば、タンパク質産生は、特定生産性（ＳＰ）（溶液中の産生物の濃度）として測定でき、ｍｇ／Ｌ又はｇ／Ｌとして表すことができる；あるいは、特定生産性は、ｐｇ／細胞／日として表すことができる。ＳＰの増大は、２組の規定された条件下で産生される生物由来物質の濃度の絶対的又は相対的増加を指すことができる。あるいは、ウイルス粒子産生物は、周知のプラークアッセイで力値測定でき、ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍＬ）として測定される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター組成物は、２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含有し、例えば２つ、３つ、４つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含む。種々の実施形態において、２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子は、同じ標的遺伝子及び／又は一つ又はそれ以上の追加標的遺伝子の発現を調節できる。都合のよいことに、多数のＲＮＡエフェクター分子を含む特定の組成物は、生物由来物質の産生を高めることにおいて、あるいはこのような産生の一つ又はそれ以上の態様において、個々のＲＮＡエフェクター分子を含む別個の組成物よりも効果がある。
他の実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子は、細胞培養物と接触し、一つ又はそれ以上の標的遺伝子の調節を可能にする。一つの実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つは、グルタミナーゼ、グルタミンシンテターゼ又はＬＤＨの発現を調節するＲＮＡエフェクター分子である。別の実施形態において、Ｂａｘ及びＢａｋを標的とするＲＮＡエフェクター分子は、生物由来物質の産生中に細胞培養物に同時投与され、場合により少なくとも一つの追加ＲＮＡエフェクター分子又は作用物質を含有することができる。別の実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子は、細胞と培養において接触してＢａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨの発現の調節を可能にする。別の実施形態において、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子は、細胞と培養において接触してＢａｘ及びＢａｋ並びにグルタミナーゼ及び／又はグルタミンシンテターゼの発現の調節を可能にする。
複数の異なるＲＮＡエフェクター分子が一つ又はそれ以上の標的遺伝子の発現を調節するために使用される場合には、複数のＲＮＡエフェクター分子は、同時に又は別個に細胞と接触させることができる。また、それぞれのＲＮＡエフェクター分子は、それ自体の投与計画を有することができる。例えば、細胞と接触させる複数のＲＮＡエフェクター分子を含む組成物を調製することができる。あるいは、一つのＲＮＡエフェクター分子を細胞培養物に一度に投与することができる。このようにして、それぞれの標的遺伝子に望まれる平均抑制率を、特定のＲＮＡエフェクター分子の投与の頻度を変えることによって容易に調整することができる。例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の強力な抑制（例えば、＞８０％抑制）は、必ずしも生物由来物質の産生を著しく向上させる必要があるとは限らないかもしれず、ある条件下では、若干の残留ＬＤＨ活性を有することが好ましいものであり得る。従って、細胞を、ＬＤＨを標的とするＲＮＡエフェクター分子と、他のＲＮＡエフェクター分子の投与よりも低い頻度（例えば、より少ない頻度）で又は低い投与量（例えば、ＩＣ５０を越える低い倍量）で接触させることが望ましいものであり得る。細胞と各ＲＮＡエフェクター分子それぞれとの接触は、標的遺伝子の調節の効率を低下させることができるＲＮＡエフェクター分子同士の間の相互作用を防止することができる。使い易いために及び混入可能性を防ぐために、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子のカクテルを投与し、それによって必要な投与の回数を減らし、細胞又は細胞培養物に混入物を導入する機会を最小限にすることが好ましいものであり得る。
いくつかの実施形態において、生物由来物質の産生は、細胞増殖、細胞分裂、細胞生存性、アポトーシス、養分処理及び／又は細胞増殖及び／又は分裂に関連するその他の特性に影響を及ぼすタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節するために、培養細胞を、増殖期の間に、本明細書において提供されるＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって高められる。別の実施形態において、異種タンパク質の産生は、培養細胞を、増殖期の間に、異種タンパク質の発現を一時的に抑制するＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって高められる。
さらに別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子による標的遺伝子の発現の調節（例えば、抑制）は、細胞を、第二のＲＮＡエフェクター分子（この場合に、第二のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は、宿主細胞においてＲＮＡｉに介在するタンパク質をコードする標的遺伝子と相補的である）と接触させることによって弱めることができる。例えば、標的遺伝子の発現の調節は、細胞を、アルゴノートタンパク質（例えば、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ−２）又は細胞のＲＮＡｉ経路のその他の成分の発現を抑制するＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって弱めることができる。一つの実施形態において、生物由来物質は、組換えタンパク質であり、及び産生物の発現は、細胞を、産生物をコードする導入遺伝子を標的とする第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって一時的に抑制される。産生物の発現の抑制は、この場合には、宿主細胞を、細胞のＲＮＡｉ経路のタンパク質をコードする遺伝子を標的とする第二のＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって弱められる。
宿主細胞の免疫反応
別の実施形態において、宿主細胞における生物由来物質の産生は、さらに、微生物の感染力及び／又は量が増大するように微生物感染又は増殖に関与する宿主細胞タンパク質の発現を調節するＲＮＡエフェクター分子を導入することによって高められる。また、宿主細胞の免疫反応の調節は、それ自体免疫反応を調節するのに関与する特定の生物由来物質（例えば、インターフェロンなど）の産生に役立ち得る。
いくつかのヒトウイルス、哺乳動物ウイルス及びトリウイルスが、ウイルス産生（例えば、最終的にワクチン生産のために）のために又は異種タンパク質発現のために培養細胞に導入される。感染又はトランスフェクションは、細胞又は細胞用培地から適当な培養時間の後に収集できる生物由来物質、例えば免疫原（生ウイルス粒子）の蓄積をもたらす。例えば、ワクチン生産の標準的な方法は、細胞を培養し、生ウイルス（例えば、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、黄熱ウイルス）に感染させ、インキュベーションし、細胞又は細胞用培地を収穫し、下流処理し、並びに充填し及び仕上げることからなる。古典的不活性化インフルエンザワクチンについては、この収穫した免疫原性作用物質の精製、不活性化及び安定化は、生物学的ワクチン製品を生成し、これらの技術は、当該技術で周知である。
組換えＤＮＡ技術及び遺伝子組換え技術は、理論において、特異的突然変異がウイルスゲノム中に計画的に操作されることから、弱毒化ウイルスを生産する優れた方法を提供し得る。しかし、ウイルスの弱毒化に必要な遺伝子変化は、必ずしも実行できるとは限らない。一般に、組換えＤＮＡ技術を使用してウイルスワクチンを操作する試みは、牛痘ウイルス又はバキュロウイルスなどの組換えウイルスベクターにおいて発現される、免疫反応に関与する病原体のタンパク質サブユニットだけを含有するサブユニットワクチンの生産に向けられている。最近になって、組換えＤＮＡ技術は、天然又は公知の宿主域突然変異体において見出される弱毒化ウイルスを模倣するヘルペスウイルス欠失突然変異体又はポリオウイルスを生産するのに利用されている。
宿主細胞で作られる生物由来物質、例えば弱毒化生インフルエンザウイルス又は免疫調節ポリペプチドの収量は、宿主細胞の免疫反応、例えばウイルス又はウイルスベクターを複製する宿主細胞のインターフェロン応答によって悪影響を受ける可能性がある。さらに、感染した宿主細胞（一つ又は複数）は、ウイルス収量が最大になる前にアポトーシス性になる可能性がある。従って、これらの弱毒化ウイルスは、免疫原性及び非病原性であるが、多くの場合、ワクチンを作るために従来の細胞基質において増殖させることが困難である。従って、本発明のいくつかの実施形態は、逆の宿主細胞応答の発現を調節するために、従って収量を増加させるためにＲＮＡエフェクター分子を使用する組成物及び方法を提供する。例えば、本発明のいくつかの実施形態は、産生物収穫の収量及び品質を損なう細胞プロセス及び抗ウイルスプロセスを抑制するために、ウイルス又はベクターの投与の前に、間に又は後に細胞をＲＮＡｉに基づいた産生物ｓｉＲＮＡと接触させることに関する。
生物由来物質の製造のための細胞に基づいたバイオプロセスの使用は、いくつかの実施形態において、ウイルス感染に対する宿主細胞の反応に影響を及ぼす標的遺伝子の発現を調節することによって高められる。このアプローチは、生物由来物質がウイルスであるか又は免疫調節性である場合、あるいはウイルスベクターが、異種タンパク質を宿主細胞に導入するのに使用される場合には有用である。
例えば、いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、細胞インターフェロンタンパク質であるか又はインターフェロンシグナル伝達に関連するタンパク質である。具体的には、標的遺伝子は、インターフェロン遺伝子、例えばＩＦＮ−α〔例えば、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）ＩｆｎＡ、遺伝子ＩＤ：３９６３９８〕；ＩＦＮ−β〔例えば、野鶏属（Ｇａｌｌｕｓ）ＩｆｎＢ、遺伝子ＩＤ：５５４２１９〕；又はＩＦＮ−γ（例えば、野鶏属ＩｆｎＧ、遺伝子ＩＤ：３９６０５４）であることができる。標的遺伝子は、インターフェロン受容体、例えばＩＦＮＡＲ１（インターフェロンα、β及びω受容体１）（例えば、野鶏属ＩＦＮＡＲ１、遺伝子ＩＤ：３９５６６５）、ＩＦＮＡＲ２（インターフェロンα、β及びω受容体２）（例えば、野鶏属ＩＦＮＡＲ２、遺伝子ＩＤ：３９５６６４）、ＩＦＮＧＲ１（インターフェロンγ受容体１）（例えば、野鶏属ＩＦＮＧＲ１、遺伝子ＩＤ：４２１６８５）又はＩＦＮＧＲ２〔インターフェロンγ受容体２（インターフェロンγトランスデューサー１）（例えば、野鶏属ＩＦＮＧＲ２、遺伝子ＩＤ：４１８５０２）であることができる。
例えば、いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、細胞インターフェロンタンパク質であるか又はインターフェロンシグナル伝達に関連するタンパク質である。具体的には、標的遺伝子は、インターフェロン遺伝子、例えばＩＦＮ−α（例えば、野鶏属ＩＮＦ−α、遺伝子ＩＤ：３９６３９８）；ＩＦＮ−β（例えば、野鶏属ＩＦＮ−β、遺伝子ＩＤ：５５４２１９）；又はＩＦＮ−γ（例えば、野鶏属ＩＦＮ−γ、遺伝子ＩＤ：３９６０５４）であることができる。従って、例えば、ＩＦＮ−βの発現は、培養細胞に応じて、配列番号：３１５６１５５−３１５６１８０（野鶏属、センス）、配列番号：３１５６１８１−３１５６２０６（野鶏属、アンチセンス）、配列番号：３１５５４９３−３１５５５４０〔イヌ属（Ｃａｎｉｓ）、センス〕、配列番号：３１５５４４５−３１５５４９２（イヌ属、アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節することができる。
あるいは、標的遺伝子は、インターフェロン受容体、例えばＩＦＮＡＲ１（インターフェロンα、β及びω受容体１）（例えば、野鶏属ＩＦＮＡＲ１、遺伝子ＩＤ：３９５６６５）、ＩＦＮＡＲ２（インターフェロンα、β及びω受容体２）（例えば、野鶏属ＩＦＮＡＲ２、遺伝子ＩＤ：３９５６６４）、ＩＦＮＧＲ１（インターフェロンγ受容体１）（例えば、野鶏属ＩＦＮＧＲ１、遺伝子ＩＤ：４２１６８５）又はＩＦＮＧＲ２〔インターフェロンγ受容体２（インターフェロンγトランスデューサー１）〕（例えば、野鶏属ＩＦＮＧＲ２、遺伝子ＩＤ：４１８５０２）であることができる。従って、例えば、ＩＦＮＡＲ１の発現は、培養細胞に応じて、配列番号：２４３６５３６−２４３６８６３（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４６０５−３１５４６３３（野鶏属、センス）、配列番号：３１５４６３４−３１５４６６２（野鶏属、アンチセンス）、配列番号：３１５５３９７−３１５５４４４（イヌ属、センス）、配列番号：３１５５４４５−３１５５４９２（イヌ属、アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節することができる。
いくつかの実施形態において、遺伝子は、インターフェロンシグナル伝達、例えばＳＴＡＴ−１（シグナル伝達兼転写活性化因子１）（例えば、野鶏属Ｓｔａｔ１、遺伝子ＩＤ：４２４０４４）、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３（例えば、野鶏属Ｓｔａｔ３、遺伝子ＩＤ：４２００２７）、ＳＴＡＴ−４（例えば、野鶏属Ｓｔａｔ４、遺伝子ＩＤ：７６８４０６）、ＳＴＡＴ−５（例えば、野鶏属Ｓｔａｔ５、遺伝子ＩＤ：３９５５５６）；ＪＡＫ−１（ヤーヌスキナーゼ１）（例えば、野鶏属Ｊａｋ１、遺伝子ＩＤ：３９５６８１）；ＪＡＫ−２（例えば、野鶏属Ｊａｋ２、遺伝子ＩＤ：３７４１９９）、ＪＡＫ−３（例えば、野鶏属Ｊａｋ３、遺伝子ＩＤ：３９５８４５）、ＩＲＦ１（インターフェロン調節因子１）（例えば、野鶏属ＩＲＦ１、遺伝子ＩＤ：３９６３８４）、ＩＲＦ２（例えば、野鶏属ＩＲＦ２、遺伝子ＩＤ：３９６１１５）、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４（例えば、野鶏属ＩＲＦ４、遺伝子ＩＤ：３７４１７９）、ＩＲＦ５（例えば、野鶏属ＩＲＦ５、遺伝子ＩＤ：４３０４０９）、ＩＲＦ６（例えば、野鶏属ＩＲＦ６、遺伝子ＩＤ：４１９８６３）、ＩＲＦ７（例えば、野鶏属ＩＲＦ７、遺伝子ＩＤ：３９６３３０）、ＩＲＦ８（例えば、野鶏属ＩＲＦ８、遺伝子ＩＤ：３９６３８５）、ＩＲＦ９又はＩＲＦ１０（例えば、野鶏属ＩＲＦ９、遺伝子ＩＤ：３９５２４３）に関連することができる。
従って、例えば、ＩＲＦ３の発現は、培養細胞に応じて、配列番号：１４３０４７３−１４３０７８６（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３２８８９４８−３２８９２４９（野鶏属、センス）、配列番号：３２８９２５０−３２８９５５１（野鶏属、アンチセンス）、配列番号：３２９０１４２−３２９０４４５（イヌ属、センス）、配列番号：３２０４４６−３２０７４９（イヌ属、アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節することができる。
同様に、標的遺伝子は、インターフェロン誘導タンパク質、例えば２’，５’オリゴアデニル酸シンテターゼ（２−５ＯＡＳ）、インターフェロン誘導抗ウイルスタンパク質；ＲＮアーゼＬ〔リボヌクレアーゼＬ（２’，５’−オリゴイソアデニル酸シンテターゼ依存性）、遺伝子ＩＤ：４２４４１０（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、１４ Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．，１０１−０４（１９９４））；ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）ａｋａ：真核生物翻訳開始因子２−αキナーゼ２（ＥＩＦ２ＡＫ２）〔Ｌｉら、１０６ ＰＮＡＳ，１６４１０−０５（２００９）〕；Ｍｘ〔ＭＸ１ミクソウイルス（インフルエンザウイルス）耐性１、インターフェロン誘導性タンパク質ｐ７８〕（例えば、野鶏属ＭＸ、遺伝子ＩＤ：３９５３１３）；ＩＦＩＴＭ１〔Ｂｒａｓｓら、１３９ Ｃｅｌｌ，１２４３−５４（２００９）〕；ＩＦＩＴＭ２、ＩＦＩＴＭ３〔Ｈａｌｌｅｒら、９ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．，１６３６−４３（２００７）〕；炎症誘発性サイトカイン；ウイルス感染の際に上方調節されるＭＹＤ８８（骨髄様分化一次応答遺伝子）（例えば、野鶏属Ｍｙｄ８８、遺伝子ＩＤ：４２０４２０）、又はＴＲＩＦ（ｔｏｌｌ様受容体アダプター分子１）（例えば、野鶏属ＴＲＩＦ、遺伝子ＩＤ：１００００８５８５）〔Ｈｇｈｉｇｈｉら、Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２０１０年１月１３日）〕をコードすることができる。
従って、例えば、ＭＸ１の発現は、培養細胞に応じて、配列番号：２５８８６１５−２５８８９５１（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３２６６８２−３２８６９７５（野鶏属、センス）、配列番号：３２８６９７６−３２８７２６９（野鶏属、アンチセンス）、配列番号：３２８６１３２−３２８６４０６（イヌ属、センス）、配列番号：３２８６４０７−３２８６６８１（イヌ属、アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節することができる。
また、例えば、ＩＦＴＭ１の発現は、配列番号：３１５５１１５−３１５５１６１（イヌ属、センス）、配列番号：３１５５１６２−３１５５２０８（イヌ属、アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むオリゴヌクレオチド鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節することができる。
さらに、ＩＦＩＴＭ２の発現は、培養細胞に応じて、配列番号：３１５６５８７−３１５６６３３（ＣＨＯ細胞、センス）、配列番号：３１５６６３４−３１５６６８０（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：２６８５１７１−２６８５５５０（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５５２０９−３１５５２５５（イヌ属、センス）、配列番号：３１５５２５６−３１５５３０２（イヌ属、アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むオリゴヌクレオチド鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節することができる。
同様に、ＩＦＩＴＭ３の発現は、培養細胞に応じて、配列番号：３１５６６８１−３１５６７２７（ＣＨＯ細胞、センス）、配列番号：３１５６７２８−３１５６７７４（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：２６９６１６９−２６９６５４６（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５５３０３−３１５５３４９（イヌ属、センス）、配列番号：３１５５３５０−３１５５３５０（イヌ属、アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節することができる。
さらに、例示的インターフェロン誘導発現に関して、ＰＫＲ（ＥＩＦ２ＡＫ２）の発現は、以下の表６７及び６８から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節することができる。
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
別の実施形態において、生物由来物質は、一つ又はそれ以上のレトロウイルスベクターを用いて形質移入した細胞によって産生される。第一のレトロウイルスベクターを用いたトランスフェクションの際に、レトロウイルスベクターＥｎｖ及び／又はＧａｇ分子の発現は、細胞を第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させ（すなわち、ｅｎｖ遺伝子又はｇａｇ遺伝子を標的とし）、第二のレトロウイルスベクターを用いたより効率的なトランスフェクションを可能にすることによって一時的に抑制される。例えば、第一のレトロウイルスベクターは、第一の抗体鎖をコードすることができ、第二のレトロウイルスベクターは、第二の相補的抗体鎖をコードすることができる。さらに、発現の抑制は、ＲＮＡｉ経路のタンパク質をコードする遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を導入することによって弱めることができる。
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、細胞のＥＲＶの調節要素又は遺伝子である。例えば、特定の実施形態において、標的遺伝子は、ポリペプチド又はタンパク質、例えばＥＲＶ ＬＴＲ、ｅｎｖタンパク質、又はｇａｇタンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、潜在ウイルス、例えばヘルペスウイルス又はアデノウイルスの遺伝子である。特定の実施形態において、例えば、標的遺伝子は、ポリペプチド又はタンパク質、例えば潜在ＨＳＶ糖タンパク質Ｄ又はＰＣＶ−１ Ｒｅｐタンパク質をコードすることができる。ＰＣＶ−１を標的とするための典型的なＲＮＡエフェクター分子を、本明細書の表６４に提供する：
Figure 2014501097
Figure 2014501097
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、内在性非ＥＲＶ遺伝子である。例えば、標的遺伝子は、生物由来物質がポリペプチドである場合には、生物由来物質又はその一部分をコードすることができる。
また、生物由来物質の産生は、生物由来物質又はそのベクターに結合するタンパク質の発現を低下させることによっても高めることができる。例えば、組換えタンパク質の産生において、宿主細胞におけるその発現は、組換えベクターによる重複感染を抑制しないように、ＥＲＶによって産生される受容体／リガンドの発現を低下させるか又は抑制することが好都合であり得る。別の例として、増殖因子、ホルモン又は細胞シグナル伝達タンパク質の産生において、宿主細胞におけるその産生が、細胞による生物学的反応を誘発しないようにその受容体／リガンドの発現を低下させるか又は抑制することが好都合であり得る。受容体が細胞表面受容体又は内部（例えば、核）受容体であることができることは、当業者には公知である。従って、一例を挙げると、インターフェロン（例えば、βインターフェロン）などの生物由来物質の産生は、細胞に存在する受容体（例えば、ＩＦＮＡＲ１受容体又はＩＦＮＡＲ２受容体）の量を調節する（例えば、減少させる）ことによって高めることができる。結合パートナーの発現は、宿主細胞を、本明細書に記載の方法に従って受容体遺伝子に指向するＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって調節できる。
さらなる実施形態において、標的遺伝子は、ウイルス感染性に介在する細胞タンパク質、例えばｄｓＲＮＡを検出するＴＬＲ３（例えば、野鶏属ＴＬＲ３、遺伝子ＩＤ：４２２７２０）、ｓｓＲＮＡを検出するＴＬＲ７（例えば、野鶏属ＴＬＲ７、遺伝子ＩＤ：４１８６３８）、ＣｐＧモチーフを有する非メチル化ＤＮＡを認識するＴＬＲ２１（例えば、野鶏属Ｔｌｒ３、遺伝子ＩＤ：４１５６２３）、ウイルス検出に関与するＲＩＧ−１〔Ｍｙｏｎｇら、３２３ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０７０−７４（２００９）〕；ウイルス検出の陽性レギュレータであるＬＰＧＰ２受容体及びその他のＲＩＧ−１様受容体〔Ｓａｔｏｈら、１０７ ＰＮＡＳ，１２６１−６２（２０１０）；Ｎａｋｈａｅｉら、２００９〕；ＴＲＩＭ２５〔例えば、野鶏属Ｔｒｉｍ２５、遺伝子ＩＤ：４１７４０１；Ｇａｃｋら、５ Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂ．，４３９−４９（２００９）〕又はＲＩＧ−１と相互作用して抗ウイルスシグナル伝達カスケードを開始するＭＡＶＳ／ＶＩＳＡ／ＩＰＳ−１／Ｇａｒｄｉｆ〔Ｃｕｉら、２９ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１６９−７９（２００８）；Ｋａｗａｉら、６ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９８１−８８（２００５）〕である。
従って、例えば、ＴＬＲ３の発現は、培養細胞に応じて、配列番号：３１５６４９１−３１５６５３８（ＣＨＯ細胞、センス）、配列番号：３１５６５３９−３１５６５８６（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：２５９３１７９−２５９３５２５（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５５９６５−３１５６０１１（野鶏属、センス）、配列番号：３１５６０１２−３１５６０５８（野鶏属、アンチセンス）、配列番号：３１５７７７−３１５５８２３（イヌ属、センス）及び配列番号：３１５５８２４−３１５５８７０（イヌ属、アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子（一つ又は複数）を使用することによって調節することができる。
さらに、例えば、ＭＡＶＳの発現は、培養細胞に応じて、３１５６３９７−３１５６４４３（ＣＨＯ細胞、センス）、配列番号：３１５６４４４−３１５６４９０（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：１６０７１８４−１６０７５２７（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３２８６６８２−３２８６９７５（野鶏属、センス）、配列番号：３２８６９７６−３２８７２６９（野鶏属、アンチセンス）、配列番号：３２８６１３２−３２８６４０６（イヌ属、センス）及び配列番号：３２８６４０７−３２８６６８１（イヌ属、アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節することができる。
特異的な方法でウイルス複製に影響を及ぼす宿主細胞タンパク質が存在するが、この活性の正確なメカニズムは、解決されていない。例えば、細胞タンパク質カゼインキナーゼ２β（ＣＳＫＮ２Ｂ）の抑制は、インフルエンザウイルス複製、タンパク質産生及びウイルス力価を増大させる。Ｍａｒｊｕｋｉら、３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｉｇｎａｌ．，１３（２００８）。ＣＳＫＮ２Ｂの発現は、培養細胞に応じて、配列番号：２６３４９７８−２６３５３５８（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３２８９５５２−３２８９８４６（野鶏属、センス）、配列番号：３２８９８４７−３２９０１４１（野鶏属、アンチセンス）、配列番号：３２８８３６８−３２８８６５７（イヌ属、センス）、配列番号：３２８８６５８−３２８８９４７（イヌ属、アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節することができる。
別の実施形態において、組成物は、細胞の一般的な生物学的プロセス又は性質、例えばＩＦＮを含むインターフェロンシグナル伝達経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路におけるＳＴＡＴタンパク質又はその他のタンパク質、ＩＦＮＲＡ１及び／又はＩＦＮＲＡ２を含むに関連する一つ又は多数の遺伝子の発現を調節できる一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含むことができる。例えば、ウイルス感染は、ＩＦＮα及びＩＦＮβの産生に特徴がある、可能な溶菌感染、形質転換及び／又はアポトーシスに対して感染細胞において迅速な生得応答をもたらす。このシグナル伝達は、ＩＦＮの効果に介在するＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）の活性化をもたらす。ＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ）は、コンセンサスＩＦＮ刺激応答要素（ＩＳＲＥ）に結合し、その他のＩＳＧを誘導する９種類の細胞因子のファミリーである。Ｋｉｒｓｈｎｅｒら、７９ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，９３２０−２４（２００５）参照。ＩＦＮは、内在性タンパク質、例えばＴＲＩＭ５α、Ｆｖ、Ｍｘ、ｅＩＦ２α及び２’−５’ＯＡＳの発現を高め、ウイルス感染細胞のアポトーシス及びウイルス感染に対する細胞抵抗性を誘導する。Ｋｏｙａｍら、４３ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３３６−４１（２００８）。従って、特定の実施形態は、ＩＦＮＲ１遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を提供する。他の実施形態は、ＩＦＮシグナル伝達経路の一つ又はそれ以上の遺伝子を標的とする。
ＩＦＮシグナル伝達応答の抑制は、ウイルス感染の後にＩＦＮ経路の成分、例えばＩＲＦ−３（これは、ウイルスｄｓＲＮＡに応答してリン酸化される）のリン酸化された状態を測定することによって調べることができる。Ｉ型ＩＦＮに応答して、Ｊａｋ１キナーゼ及びＴｙＫ２キナーゼ、ＩＦＮ受容体のサブユニット、すなわちＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ２が、容易にチロシンリン酸化される。従って、ＲＮＡエフェクター分子がＩＦＮ応答を抑制するか否かを調べるために、細胞を、ＲＮＡエフェクター分子と接触させ、その後にウイルス感染させ、細胞を溶解する。ＩＦＮ経路成分、例えばＪａｋ１キナーゼ又はＴｙＫ２キナーゼは、特異ポリクロナール血清又は抗体を使用して感染細胞溶解液から免疫沈降させ、キナーゼのチロシンリン酸化状態は、抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫ブロットアッセイによって調べられる。例えば、Ｋｒｉｓｈｎａｎら、２４７ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９８−３０５（１９９７）参照。ウイルスに感染した後のＩＦＮ経路の成分のいずれかのリン酸化状態の低下は、ＲＮＡエフェクター分子（一つ又は複数）に応答してウイルスによるＩＦＮ応答の低下を示す。
また、ＩＦＮシグナル伝達抑制の効果も、特定のＤＮＡ配列を結合する能力又はウイルス感染、及び例えばＩＲＦ３、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２などを標的とするＲＮＡエフェクター分子処理に応答して誘導される転写因子のトランスロケーションを測定することによって調べることができる。特に、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ２は、リン酸化され、Ｉ型ＩＦＮに応答して細胞質から核に移される。特定のＤＮＡ配列を結合する能力又は転写因子のトランスロケーションは、当業者に公知の方法、例えば電気移動性ゲルシフトアッセイ、細胞染色などによって測定できる。ＩＦＮ誘導の抑制を測定する別のアプローチは、所望のウイルス産生物を産生し、ＲＮＡエフェクター分子と接触させる細胞培養由来の抽出物が、ウイルス感染に対して保護活性を付与することができるか否かを調べる。さらに具体的には、例えば、細胞は、所望のウイルスに感染させ、ＲＮＡエフェクターと接触させる。感染後約１５〜２０時間で、細胞又は細胞培養培地が収穫され、ウイルス力価についてアッセイされるか又は定量的産生物増強逆転写酵素（ＰＥＲＴ）アッセイ、免疫アッセイ又は生体内感染によってアッセイされる。
宿主細胞受容体
いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、膜受容体又はその他の部分をコードするかあるいは膜受容体又はその他の部分の合成又は調節に関する宿主細胞遺伝子（内在性）である。細胞膜の発現の調節は、ウイルス感染を高めるか又は低下させることができる（例えば、受容体の発現を高めるか又は低下させることによって）が、あるいは他の方法で宿主細胞膜に吸着するであろう（受容体の発現を低下させることによって）産生物の回収を増加させることができる。
例えば、多くのウイルスが、宿主細胞表面ヘパリン、例えばＰＣＶ〔Ｍｉｓｉｎｚｏら、８０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，３４８７−９４（２００６）〕；ＣＭＶ〔Ｃｏｍｐｔｏｎら、１９３ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８３４−４１（１９９３）〕；偽性狂犬病ウイルス〔Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒら、６４ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２７８−８６（１９９０）〕；ＢＨＶ−１〔Ｏｋａｚａｋｉら、１８１ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６６６−７０（１９９１）〕；ブタ水疱病ウイルス〔Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ−Ｒｏｍｅｒｏら、８５ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６５３−６３（２００４）〕；及びＨＳＶ〔ＷｕＤｕｎｎ＆Ｓｐｅａｒ，６３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５２−５８（１９８９）〕に付着する。さらに、表面ヘパリン結合に関連する感染力を有するエンベロープウイルスとして、ＨＩＶ−１〔Ｍｏｎｄｏｒら、７２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，３６２３−３４（１９９８）〕；ＡＡＶ−２（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，７２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１４３８−４５（１９９８）〕；ウマ動脈炎ウイルス（Ａｓａｇｏｅら、５９ Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７２７−２８（１９９７）〕；ベネズエラウマ脳炎ウイルス〔Ｂｅｒｎａｒｄら、２７６ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９３−１０３（２０００）〕；シンドビスウイルス〔Ｂｙｒｎｅｓ＆Ｇｒｉｆｆｉｎ，７２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３４９−５６（１９９８）；Ｃｈｕｎｇら、７２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１５７７−８５（１９９８）〕；ブタコレラウイルス〔Ｈｕｌｓｔら、７５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，９５８５−９５（２００１）〕；ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス〔Ｊｕｓａら、６２ Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．，２６１−６４（１９９７）〕；及びＲＳＶ〔Ｋｒｕｓａｔ＆Ｓｔｒｅｃｋｅｒｔ，１４２ Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１２４７−５４（１９９７）〕が挙げられる。さらに、多数の非エンベロープウイルスが、細胞表面ヘパリンに結合する。いくつかのピコルナウイルス科のメンバーは、細胞表面ヘパリン、例えば口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）（生体外培養において結合する）〔Ｆｒｙら、１８ ＥＭＢＯ Ｊ．，５４３−５４（１９９９）；Ｊａｃｋｓｏｎら、７０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５２８２−８７（１９９６）〕；コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）〔Ｚａｕｔｎｅｒら、７７ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１００７１−７７（２００３）〕；タイラーネズミ脳脊髄炎ウイルス〔Ｒｅｄｄｉ＆Ｌｉｐｔｏｎ，７６ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８４００−０７（２００２）〕；及びある種のエコーウイルス血清型〔Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗら、７５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４９１８−２１（２００１）〕に結合する。
従って、本発明の特定の実施形態において、ヘパリンの細胞発現は、宿主細胞へのウイルス吸着を減少又は増加させるために調節できる。例えば、一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子は、ヘパリン合成又は構造に関連する一つ又はそれ以上の遺伝子、例えばエピメラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ又は２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼを標的とすることができる。例えば、Ｒｏｓｔａｎｄ＆Ｅｓｋｏ、６５ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１−８（１９９７）参照。
細胞表面ヘパリンの発現が増加する場合には、ＲＮＡエフェクター分子は、ヘパリン分解に関連する遺伝子、例えばヘパラナーゼ（ｈｅｐ）〔例えば、マウスｈｅｐ遺伝子ＩＤ：１５４４２、マウスｈｅｐ２遺伝子ＩＤ：５４５２９１、ラットｈｅｐ遺伝子ＩＤ：６４５３７、ラットｈｅｐ２遺伝子ＩＤ：３６８１２８、ヒトＨＥＰ遺伝子ＩＤ：１０８５５、ヒトＨＥＰ２遺伝子ＩＤ：６０４９５、クセノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）属ｈｅｐ遺伝子ＩＤ：１００１４５３２０、野生ブタ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）ｈｅｐ遺伝子ＩＤ：１００２７１９３２、ニワトリ（Ｇ．ｇａｌｌｕｓ）ｈｅｐ遺伝子ＩＤ：３７３９８１、ニワトリｈｅｐ２遺伝子ＩＤ：４２３８３４、イヌｈｅｐ遺伝子ＩＤ：６０８７０７、ウシｈｅｐ遺伝子ＩＤ：８２８４４７１、コモンマーセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ）サルｈｅｐ遺伝子ＩＤ：１００４０２６７１、コモンマーセットｈｅｐ２遺伝子ＩＤ：１００４０７５９８、チンパンジー（Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ｈｅｐ遺伝子ＩＤ：４６１２０６、ウサギｈｅｐ遺伝子ＩＤ：１００１０１６０１、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ Ｍａｃａｑｕｅ）ｈｅｐ遺伝子ＩＤ：７０７５８３、又はゼブラフィッシュｈｅｐ遺伝子ＩＤ：５６３０２０〕をコードする遺伝子を標的とすることができる。Ｇｉｎｇｉｓ−Ｖｅｌｉｔｓｋｉら、２７９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４０８４−９２（２００４）。
同様に、インフルエンザウイルスの感染力は、ロタウイルス〔Ｉｓａら、２３ Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．，２７−３７（２００６）；Ｆｕｋｕｄｏｍｅら、１７２ Ｖｉｒｏｌ．，１９６−２０５（１９８９）〕、その他のレオウイルス〔Ｐａｕｌら、１７２ Ｖｉｒｏｌ．，３８２−８５（１９８９）〕、及びウシコロナウイルス〔Ｓｃｈｕｌｚｅ＆Ｈｅｒｒｌｅｒ，７３ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，９０１−０６（１９９２）〕の感染力のように、細胞表面のシアル酸の存在に依存する〔Ｐｅｄｒｏｓｏら、１２３６ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，３２３−３０（１９９５）〕。このように、宿主シアリダーゼ遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクターは、宿主細胞感染力を調節するのに使用できる（例えば、実施例７参照）。さらなる宿主細胞表面受容体としては、脳心筋炎ウイルスについてはＶＣＡＭ１〔Ｈｕｂｅｒｍ ６８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，３４５３−５８（１９９４）〕；エコーウイルスについてはインテグリンＶＬＡ−２〔Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎら、１７１８−２０（１９９２）〕；及びポリオウイルスについては免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー〔Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、５６ Ｃｅｌｌ，８５５−６５（１９８９）〕が挙げられる。このように、宿主シアリダーゼ遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクターは、宿主細胞感染力を調節するのに使用できる。
従って、いくつかの実施形態において、遺伝子標的は、シアリダーゼに関与する宿主細胞遺伝子を含む〔Ｗａｎｇら、１０ ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５１２（２００９）参照〕。例えば、インフルエンザは、細胞表面シアル酸残基に結合するので、減少したシアリダーゼは、精製の速度を増大することができる。標的遺伝子としては、例えば、ＮＥＵ２シアリダーゼ２（細胞質ゾルシアリダーゼ）（野鶏属Ｎｅｕ２、遺伝子ＩＤ：４３０５４２）；ＮＥＵ３シアリダーゼ３（膜シアリダーゼ）（野鶏属Ｎｅｕ３、遺伝子ＩＤ：６８８２３）；溶質担体ファミリー３５（ＣＭＰ−シアル酸輸送体）メンバーＡ１（Ｓｌｃ３５Ａ１）が挙げられる。ＳＣＬ３５Ａ１を標的とする例示的ＲＮＡエフェクター分子は、ＳＬＣ３５Ａ１配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド含むことができるし又は配列番号：３１５４３４５−３１５４３６８（野鶏属、センス）及び配列番号：３１５４３６９−３１５４３９２（野鶏属、アンチセンス）に提供される配列を有することができ；及びＳＣＬ３５Ａ２については、配列番号：４６４６７４−４６５０５５（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）に提供される配列を有することができる。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（Ｇｎｅ）については、例示的ｓｉＲＮＡは、Ｇｎｅ配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むことができる及び／又は例えば、配列番号：２０７３９７１−２０７４３６８（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４２９７−３１５４３２０（野鶏属、センス）及び配列番号：３１５４３２１−３１５４３４４（野鶏属、アンチセンス）も含むことができる；シチジンモノホスホ−Ｎ−アセチルニラミン酸シンテターゼ（Ｃｍａｓ）については、例示的ｓｉＲＮＡは、配列番号：１６３３１０１−１６３３４０６（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４２４９−３１５４２７２（野鶏属、センス）及び配列番号：３１５４２７３−３１５４２９６（野鶏属、アンチセンス）に示される；ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＴ１）については、例示的ｓｉＲＮＡは、配列番号：２５２８４５４−２５２８７６３（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４１５３−３１５４１７６（野鶏属、センス）及び配列番号：３１５４１７７−３１５４２００（野鶏属、アンチセンス）から選択される配列を有する；及びＵＤＰ−Ｇａ１：βＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド６（Ｂ４ＧａｌＴ６）については、例示的ｓｉＲＮＡは、配列番号：１６３５１７３−１６３５５６１（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４２０１−３１５４２２４（野鶏属、センス）及び配列番号：３１５４２２５−３１５４２４８（野鶏属、アンチセンス）に示される。
宿主細胞生存性
いくつかの実施形態において、宿主細胞における生物由来物質の産生は、細胞増殖、細胞分裂、細胞生存性、アポトーシス、養分処理及び／又は細胞の増殖及び／又は分裂に関連するその他の特性に影響を及ぼすさらなるＲＮＡエフェクター分子を導入することによって高められる。また、標的遺伝子は、生物由来物質の産生の一つ又はそれ以上の態様に直接又は間接的に影響を及ぼす宿主細胞タンパク質もコードすることができる。ポリペプチドの産生に影響を及ぼす標的遺伝子の例としては、ポリペプチドの分泌、折りたたみ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、脱アミド化、ジスルフィド結合形成、メチオニン酸化、ピログルタミン酸化）に関与するタンパク質をコードする遺伝子；宿主細胞の性質又は表現型（例えば、増殖、生存率、細胞ｐＨ、細胞周期の進行、アポトーシス、炭素の代謝又は輸送、乳酸形成、ウイルス感染に対する感受性又はＲＮＡｉ取り込み、活性又は効率）に影響を及ぼすタンパク質をコードする遺伝子；及び宿主細胞による生物由来物質の産生を損なうタンパク質（例えば、生物由来物質を結合するか又は同時精製するタンパク質）をコードする遺伝子が挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態において、標的遺伝子は、標的遺伝子の発現の抑制が生物由来物質の産生を高めるように生物由来物質の産生に間接的に影響を及ぼす宿主細胞タンパク質をコードする。例えば、標的遺伝子は、例えば別の方法で生物由来物質の産生を高める細胞供給源を利用することによって、生物由来物質の産生に直接影響を及ぼさないが、その産生を間接的に低下させる豊富に発現された宿主細胞タンパク質をコードすることができる。
いくつかの実施形態において、Ａｇｏ１（真核生物翻訳開始因子２Ｃ、１）；ＢＬＫ（Ｂリンパ系チロシンキナーゼ）；ＣＣＮＢ３（サイクリンＢ３）；ＨＩＬＩ〔ｐｉｗｉ様２（ショウジョウバエ属）〕；ＨＩＷＩ１〔ｐｉｗｉ様２（ショウジョウバエ属）〕；ＨＩＷＩ２〔ｐｉｗｉ様２（ショウジョウバエ属）〕；ＨＩＷＩ３〔ｐｉｗｉ様２（ショウジョウバエ属）〕が、本明細書に記載の方法及び組成物を使用して標的とされる。
本明細書に記載の細胞に基づいたバイオプロセスにおける最適な生物由来物質の産生のために、細胞生存性を最大にすることが望ましい。従って、一つの実施形態において、生物由来物質の産生は、アポトーシス又は細胞生存性に影響を及ぼす細胞タンパク質、例えばＢａｘ（ＢＣＬ２結合Ｘタンパク質）、Ｂａｋ（ＢＣＬ２アンタゴニスト／キラー１）（例えば、野鶏属Ｂａｋ、遺伝子ＩＤ：４１９９１２）、ＬＤＨＡ（乳酸デヒドロゲナーゼＡ）（例えば、野鶏属ＬｄｈＡ、遺伝子ＩＤ：３９６２２１）、ＬＤＨＢ（例えば、野鶏属ＬｄｈＢ、遺伝子ＩＤ：３７３９９７）、ＢＩＫ、ＢＡＤ（配列番号：３０４９４３６−３０４９７２１）、ＢＩＤ（配列番号：２５８２５１７−２５８２８２３）、ＢＩＭ、ＨＲＫ（ｈａｒａｋｉｒｉ、ＢＣＬ２相互作用性タンパク質、ＢＨ３ドメインだけを含有する）、ＢＣＬＧ（ＢＣＬ２様１４（アポトーシス促進剤）、ＨＲ、ＮＯＸＡ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化剤１）、ＰＵＭＡ（配列番号：１７１２０４５−１７１２４２５）、ＢＯＫ（ＢＣＬ２関連卵巣キラー）（例えば、ハツカネズミＢｏｋ、遺伝子ＩＤ：３９５４４５、野鶏属Ｂｏｋ、遺伝子ＩＤ：９９５４４５、ヒトＢＯＫ、遺伝子ＩＤ：６６６）、ＢＯＯ〔ＢＣＬ２様１０（アポトーシス促進剤）〕、ＢＣＬＢ〔ＢＣＬ２様１０（アポトーシス促進剤）〕、ＣＡＳＰ２（アポトーシス関連システインペプチダーゼ２）（例えば、野鶏属Ｃａｓｐ２、遺伝子ＩＤ：３９５８５７）（配列番号：２７１８６７５−２７１９０３９）、ＣＡＳＰ３（アポトーシス関連システインペプチダーゼ）（例えば、野鶏属Ｃａｓｐ３、遺伝子ＩＤ：３９５４７６）（配列番号：１９２４８３６−１９２５１９５）、ＣＡＳＰ６（例えば、野鶏属Ｃａｓｐ６、遺伝子ＩＤ：３９５４７７（配列番号：２４０８４６６−２４０８８４３）、ＣＡＳＰ７（例えば、野鶏属、遺伝子ＩＤ：４２３９０１）（配列番号：２３０１６１８−２３０１９６０）、ＣＡＳＰ８（例えば、野鶏属Ｃａｓｐ８、遺伝子ＩＤ：３９５２８４、ヒトＣＡＳＰ８ ＧｅｎｅＤ：８４１、ハツカネズミＣａｓｐ８、遺伝子ＩＤ：１２３７０、イヌ科Ｃａｓｐ８、遺伝子ＩＤ：４８８４７３）（配列番号：２９９５５９３−２９９５８７０）、ＣＡＳＰ９（例えば、野鶏属Ｃａｓｐ９、遺伝子ＩＤ：４２６９７０）（配列番号：１４１２５８９−１４１２８６０）、ＣＡＳＰ１０（例えば、野鶏属Ｃａｓｐ１０、遺伝子ＩＤ：４２４０８１）、ＢＣＬ２（Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２）（例えば、野鶏属Ｂｃｌ２、遺伝子ＩＤ：３９６２８２）、ｐ５３（例えば、野鶏属ｐ５３、遺伝子ＩＤ：３９６２００）（配列番号：１２８３５０６−１２８３８６７）、ＡＰＡＦｌ、ＨＳＰ７０（例えば、野鶏属Ｈｓｐ７０、遺伝子ＩＤ：４２３５０４）（配列番号：３１４７０２９−３１４７０８０）、ＴＲＡＩＬ（ＴＲＡＩＬ様ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド様）（例えば、野鶏属Ｔｒａｉｌ、遺伝子ＩＤ：３９５２８３）、ＢＣＬ２Ｌ１（ＢＣＬ２様１）（例えば、野鶏属Ｂｃｌ２Ｌ１，遺伝子ＩＤ：３７３９５４）ＢＣＬ２Ｌ１３〔ＢＣＬ２様１３（アポトーシス促進剤）〕（例えば、野鶏属Ｂｃｌ２１１３、遺伝子ＩＤ：４１８１６３、ヒトＢＣＬ２Ｌ１３、遺伝子ＩＤ：２３７８６）、ＢＣＬ２Ｌ１４（ＢＣＬ２様１４［アポトーシス促進剤］）（例えば、野鶏属Ｂｃｌ２１１４、遺伝子ＩＤ：４１９０９６）、ＦＡＳＬＧ〔Ｆａｓリガンド（ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー６）〕（例えば、野鶏属Ｆａｓｌｇ、遺伝子ＩＤ：４２９０６４）、ＤＰＦ２（Ｄ４、ジンク鉛及び二重ＰＨＤフィンガーファミリー２）（例えば、野鶏属Ｄｐｆ２、遺伝子ＩＤ：４２９０６４）、ＡＩＦＭ２（アポトーシス誘導因子ミトコンドリア結合２）（例えば、ヒトＡＩＦＭ２、遺伝子ＩＤ：８４８８３、野鶏属Ａｉｆｍ２、遺伝子ＩＤ：４２３７２０）、ＡＩＦＭ３（例えば、野鶏属Ａｉｆｍ３、遺伝子ＩＤ：４１６９９９）、ＳＴＫ１７Ａ〔セリン／スレオニンキナーゼ１７ａ（アポトーシス誘導性）〕（例えば、野鶏属Ｓｔｋ１７Ａ、遺伝子ＩＤ：４２０７７５）、ＡＰＩＴＤ１（アポトーシス誘導、ＴＡＦ９−様ドメイン１）（例えば、野鶏属Ａｐｉｔｄ１、遺伝子ＩＤ：７７１４１７）、ＳＩＶＡ１（アポトーシス誘導因子）（例えば、野鶏属Ｓｉｖａ１、遺伝子ＩＤ：４２３４９３）、ＦＡＳ（ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー６）（例えば、野鶏属Ｆａｓ、遺伝子ＩＤ：３９５２７４）、ＴＧＦβ２（形質転換増殖因子β２）（例えば、野鶏属ＴｇｆＢ２、遺伝子ＩＤ：４２１３５２）、ＴＧＦＢＲ１（形質転換増殖因子、β受容体Ｉ）（例えば、野鶏属ＴｇｆＲ１、遺伝子ＩＤ：３７４０９４）、ＬＯＣ３７８９０２（デスドメインを含有腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２３）（野鶏属遺伝子ＩＤ：３７８９０２），又はＢＣＬ２Ａ１（ＢＣＬ２関連タンパク質Ａ１）（例えば、野鶏属Ｂｃｌ２Ａ１、遺伝子ＩＤ：３９５６７３）の発現を調節することによって高められる。例えば、ＢＡＫタンパク質は、細胞アポトーシス経路を下方制御することが知られている。Ｓｕｙａｍａら、Ｓ１ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０７−０８（２００１）。従って、特定の実施形態は、ＢＡＫ１遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を提供する。
例えば、ＬＤＨＡの発現は、配列番号：３１５４５５３−３１５４５７８（野鶏属、センス）、配列番号：３１５４５７９−３１５４６０４（野鶏属、アンチセンス）、配列番号：３１５２５４０−３１５２６０３（ＣＨＯ細胞）、配列番号：３１５２８４３−３１５２８２３（ＣＨＯ細胞）、配列番号：１２９７２８３−１２９７６０４（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５５５８９−３１５５６３５（イヌ属、センス）、配列番号：３１５４９７１−３１５５０１８（イヌ属、アンチセンス）のヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節できる。
また、例えば、Ｂａｋタンパク質は、細胞アポトーシス経路を下方制御することが知られている。従って、Ｂａｋを標的とするＲＮＡエフェクター分子は、アポトーシスを抑制し、産生物収量を増加させるのに使用でき、配列番号：３１５２４１２−３１５２４７５（ＣＨＯ細胞）、配列番号：３１５２８０４−３１５２８１３）、配列番号：２２５９８５５−２２０１６１（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４３９３−３１５４４１３（野鶏属、センス）、配列番号：３１５４４１４−３１５４４３４（野鶏属、アンチセンス）、配列番号：３１５４８２７−３１５４８７４（イヌ属、センス）、配列番号：３１５４８７５−３１５４９２２（イヌ属、アンチセンス）のヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含むことができる。Ｓｕｙａｍａら、Ｓ１ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０７−０８（２００１）。従って、特定の実施形態は、ＢＡＫ１遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を提供する。
同様に、Ｂａｘタンパク質は、細胞アポトーシス経路を下方制御することが知られている。従って、ニワトリＢａｘを標的とするＲＮＡエフェクター分子は、アポトーシスを抑制し、産生物収量を増加させるのに使用でき、配列番号：３１５４３９３−３１５４４１３（野鶏属、センス）、配列番号：３１５４１４−３１５４４３４（野鶏属、アンチセンス）、配列番号：３１５２４１２−３１５２５３９（ＣＨＯ細胞）、配列番号：３１５２７９４−３１５２８０３（ＣＨＯ細胞）、配列番号：３０２３２３４−３０２３５１５（ＣＨＯ細胞、アンチセンス）、配列番号：３１５４９２３−３１５４９７０（イヌ属、センス）及び配列番号：３１５４９７１−３１５５０１８（イヌ属、アンチセンス）のヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含むことができる。
いくつかの実施形態において、アポトーシスに関与する少なくとも一つの遺伝子（例えば、Ｂａｋ、Ｂａｘ、カスパーゼなど）を標的とするＲＮＡエフェクター分子の投与の後に、細胞を乳酸利用モードに切り替えるために細胞培養培地へのグルコースの投与が続く。いくつかの実施形態において、グルコースの濃度は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍上昇する。
別の実施形態は、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を、Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨの発現の調節を可能にするために、培養において細胞と接触させることを提供する。別の実施形態において、Ｂａｘを標的とするＲＮＡエフェクター分子とＢａｋを標的とするＲＮＡエフェクター分子は、生物由来物質の産生の間、同時投与され、場合により少なくとも一つの追加ＲＮＡエフェクター分子又は作用物質を含有することができる。
あるいは、一つのＲＮＡエフェクター分子を、細胞培養物に一度に投与することができる。このようにして、特定のＲＮＡエフェクター分子の投与の頻度を変えることによってそれぞれの標的遺伝子に望まれる平均抑制率を容易に調整できる。例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の＞８０％の抑制は、必ずしも生物由来物質の産生を著しく向上させるのに必要ではないかもしれないし、ある条件下では細胞生存性に悪影響をもたらす場合にさえあり得る。従って、細胞を、ＬＤＨを標的とするＲＮＡエフェクター分子と、他のＲＮＡエフェクター分子（例えば、Ｂａｘ／Ｂａｋ）と接触させる頻度より低い頻度（例えば、より少ない頻度で）接触させることが望ましいものであり得る。あるいは、細胞は、ＬＤＨを標的とするＲＮＡエフェクター分子と、他のＲＮＡエフェクター分子（例えば、Ｂａｘ／Ｂａｋ）の投与量よりも少ない投与量（例えば、ＩＣ５０を越える低い倍量）で接触させることができる。使い易いために及び混入可能性を防ぐために、複数の異なるＲＮＡエフェクター分子のカクテルを投与し、それによって必要な投与の回数を減らし、細胞培養物に混入物を導入する機会を最小限にすることが好ましいものであり得る。
本明細書に記載の細胞に基づいたバイオプロセスにおける最適な生物由来物質の産生は、選別によって特定されている遺伝子を標的とすることによっても最適化できる。これらの遺伝子としては、例えば、ＰＵＳＬ１（ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ様１）（ＣＨＯ−Ｐｕｓｌ１：配列番号：３１５７２３７、ｓｉＲＮＡ配列番号：３２４９２１７−３２４９３１６）、ＴＰＳＴ１（チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ１）（例えば、野鶏属Ｔｐｓｔ１、遺伝子ＩＤ：４１７５４６）（ＣＨＯ ＴＰＳＴ１：配列番号：２６１３、ｓｉＲＮＡ：配列番号：８５８８０８−８５９１０４）及びＷＤＲ３３（ＷＤ反復ドメイン３３）（例えば、野鶏属Ｗｄｒ３３、遺伝子ＩＤ：４２４７５３）（ＣＨＯ：配列番号：３４３３、ｓｉＲＮＡ：配列番号：１１３８３４１−１１３８６４９）〔Ｂｒａｓｓら、１３９ Ｃｅｌｌ，１２４３−５４（２００９）〕、Ｎｏｄ２（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有２）（ＣＨＯ：配列番号：６８５８、ｓｉＲＮＡ配列番号：２３２２１２３−２３２２４２９）〔Ｓａｂｂａｈら、１０ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９７３−８０（２００９）〕、ＭＣＴ４（溶質担体ファミリー１６、メンバー４［モノカルボン酸輸送体４］）（例えば、ニワトリＭｃｔ４、遺伝子ＩＤ：３９５３８３）、ＡＣＲＣ（酸性反復含有）（例えば、野鶏属ＡｃｒＣ、遺伝子ＩＤ：４２２２０２）、ＡＭＥＬＹ、ＡＴＣＡＹ（小脳、Ｃａｙｍａｎ型［カイタキシン］）（例えば、野鶏属Ａｔｃａｙ、遺伝子ＩＤ：４２００９４）、ＡＮＰ３２Ｂ（酸性［ロイシンリッチ］核リンタンパク質３２ファミリーメンバー）（例えば、野鶏属Ａｎｐ３２Ｂ、遺伝子ＩＤ：４２００８７）、ＤＥＦＡ３、ＤＨＲＳ１０、ＤＯＣＫ４（サイトキエシス４のデジケーター）（例えば、野鶏属Ｄｏｃｋ４、遺伝子ＩＤ：４１７７７９）、ＦＡＭ１０６Ａ、ＦＫＢ１Ｂ（ＦＫ５０６結合タンパク質１Ｂ）（例えば、ヒトＦＫＣＢ１Ｂ、遺伝子ＩＤ：２２８１、ハツカネズミＦｋｂｐ１ｂ、遺伝子ＩＤ：１４２２６、野鶏属Ｆｋｂｐ１Ｂ、遺伝子ＩＤ：３９５２５４）、ＩＲＦ３、ＫＢＴＢＤ８（ｋｅｌｃｈ反復及びＢＴＢ［ＰＯＺ］ドメイン含有８）（例えば、野鶏属Ｋｂｔｂｄ８、遺伝子ＩＤ：４１６０８５）、ＫＩＡＡ０７５３（例えば、野鶏属Ｋｉａａ０７５３、遺伝子ＩＤ：４１７６８１）、ＬＰＧＡＴ１（リソホスファチジル−グリセロールアシルトランスフェラーゼ１）（例えば、野鶏属Ｌｐｇａｔ１、遺伝子ＩＤ：４２１３７５）、ＭＳＭＢ（マイクロセミノタンパク質β）（例えば、野鶏属Ｍｓｍｂ、遺伝子ＩＤ：４２３７７３）、ＮＦＳ１（窒素固定１ホモローグ）（例えば、野鶏属Ｎｆｓｌ、遺伝子ＩＤ：４１９１３３）、ＮＰＩＰ、ＮＰＭ３（ヌクレオホスミン／ヌクレオプラスミン３）（例えば、野鶏属Ｎｐｍ３、遺伝子ＩＤ：７７０４３０）、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＥＲＰＩＮＢ７、ＳＬＣ１６Ａ４（溶質担体ファミリー１６、メンバー４［モノカルボン酸輸送体５］（例えば、野鶏属Ｓｌｃ１６ａ４、遺伝子ＩＤ：４１９８０９）、ＳＰＴＢＮ４（スペクトリン、β、ｎｏｎ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ４）（例えば、野鶏属ＳｐｔＢｎ４、遺伝子ＩＤ：４３０７７５）、又はＴＭＥＭ１４６（Ｋｒｉｓｈｎａｎら、２００８）が挙げられる。前記標的用の典型的なｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）は、標的ヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド又はそれ以上）を含むことができる。
生物学的産生を最適化するのに影響を及ぼすことができる他の標的遺伝子としては、細胞周期及び／又は細胞増殖に関連する遺伝子、例えばＣＤＫＮ１Ｂ（サイクリン依存キナーゼ阻害剤１Ｂ、ｐ２７、ｋｉｐ１）（例えば、野鶏属Ｃｄｋｎ１ｂ、遺伝子ＩＤ：３７４１０６）、すなわちｐ２７ｋｉｐ１に対するｓｉＲＮＡが増殖を誘導するための標的〔Ｋｉｋｕｃｈｉら、４７ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．，４８０３−０９（２００６）〕、又はＦＯＸ０１、すなわちｓｉＲＮＡが大動脈内皮細胞の増殖を誘導するための標的〔Ｆｏｓｂｒｉｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９００９−１８（２００６）〕が挙げられる。従って、例えば、ＣＥＦ又はその他のニワトリの細胞において、細胞分裂に関連したＣＤＫＮ２Ａの発現は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有し、その一つの鎖が配列番号：３１５４６６３−３１５４６９６（野鶏属、センス）及び配列番号：３１５４６９７−３１５４７３０（野鶏属、アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド又はそれ以上）を含む対応ＲＮＡエフェクター分子を使用して調節できる。
活性酸素種（ＲＯＳ）は、宿主細胞に毒性があり、生物由来物質の非特異的酸化、分解及び／又は切断、並びに本明細書において提供される方法によって産生される生物製剤の不均一性の増大、生物活性の低下、回収の低下及び／又はその他の機能障害を招くその他の構造修飾に介在することができる。従って、生物由来物質の産生は、酸化促進酵素、例えばＮＡＤ（ｐ）Ｈオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばグルタチオンペルオキシダーゼ〔例えば、配列番号：７２１３、配列番号：７５８２、配列番号：８０１１及び配列番号：９７５６それぞれのオリゴヌクレオチド（ＲＮＡエフェクター分子：配列番号：２４３９２１７−２４３９６１２、配列番号：２５６０５５９−２５６０８９５、配列番号：２７０３８６５−２７０４２２５、配列番号：３１５１５８９−３１５１６８５）によってコードされるグルタチオンペルオキシダーゼ１、グルタチオンペルオキシダーゼ４、グルタチオンペルオキシダーゼ８（推定される）、グルタチオンペルオキシダーゼ３〕、ミエロペルオキシダーゼ、構成性神経型一酸化窒素合成酵素（ｃｎＮＯＳ）、キサンチン オキシダーゼ（ＸＯ）（配列番号：３７４８４６−３７５２１６）及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、１５−リポキシゲナーゼ−１（配列番号：２４８００１８−２４８０３６２）、ＮＡＤＰＨシトクロムｃレダクターゼ、ＮＡＰＨシトクロムｃレダクターゼ、ＮＡＤＨシトクロムｂ５レダクターゼ（配列番号：５６９４６０−５６９７７７、配列番号：１２６１９１０−１２６２２１８、配列番号：２１９５３１１−２１９５６８１、配列番号：３１４６０４８−３１４６０７１、配列番号：２５９８２７−２６００６０）及びシトクロムＰ４５０２Ｅ１からなる群から選択されるタンパク質の発現を調節することによって高められる。前記標的用の典型的なｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）は、標的ヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド又はそれ以上）を含むことができる。
さらに、タンパク質の産生は、配列番号：２４４７３４０−２４４７６３２、配列番号：２４６３７８２−２４６４０７３、配列番号：２４６６００４−２４６６２７４、配列番号：２６５９５０２−２６５９８７１、配列番号：２７３１０７６−２７３１４４０、配列番号：２７４８５８３−２７４８９１４、配列番号：２８９５０１５２８９５３５９、配列番号：２９０４１８３−２９０４５３０、配列番号：２９６６３６２−２９６６６５７、配列番号：３０８８８４８−３０８９０６１、配列番号：３１０７７０６−３１０７９１９及び配列番号：３１２２５８９−３１２２７３４それぞれからなる群から選択される配列を有するヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む対応ＲＮＡエフェクター分子、又はサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）を使用することによって、宿主細胞の細胞周期に影響を及ぼすタンパク質、例えばサイクリン〔例えば、サイクリンＭ４、サイクリンＪ、サイクリンＴ２、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ａ（Ｐ２１）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｂ、サイクリンＭ３、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ｂ（ｐ１５、ＣＤＫ４を阻害する）、サイクリンＥ２、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ６（カルサイクリン）、サイクリン依存性キナーゼ５、調節サブユニット１（ｐ３５）、サイクリンＴ１、ＣＤＫの阻害剤、サイクリンＡ１相互作用性タンパク質１〕の発現を調節することによって高めることができる。いくつかの実施形態において、サイクリン依存性キナーゼは、ＣＤＫ２（配列番号：１１９３３３６−１１９３６８４）、ＣＤＫ４（配列番号：１６０９５２２−１６０９８５２）、Ｐ１０（配列番号：３０１３９９８−３０１４２７４）、Ｐ２１（配列番号：２６５９５０２−２６５９８７１）、Ｐ２７（配列番号：２７３１０７６−２７３１４４０）、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ及びＣＤＫ４（配列番号：１６０９５２２−１６０９８５２）からなる群から選択される。例えば、種々の実施形態において、細胞周期の進行に影響を及ぼす一つ又はそれ以上のタンパク質の発現は、異種タンパク質の発現及び回収を高めるために増殖及び／又は異種タンパク質産生の産生期の間に一時的に調節することができる。
また、バイオプロセシングにおける過剰アンモニアの産生は、一般的な問題である。高いアンモニア濃度は、細胞株及びプロセス条件に応じて細胞及び産生物の収量の低下をもたらす。アンモニアの遊離は、グルタミナーゼによるグルタミンのグルタミン酸への分解による及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼによるグルタミン酸のα―ケトグルタル酸への転化によると考えられる。従って、一つの実施形態において、生物由来物の産生は、アンモニア産生に影響を及ぼすタンパク質、例えばグルタミナーゼ又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節することによって高めることができる。特定の実施形態は、配列番号：３１１の転写産物を有するハムスターグルタミナーゼ（ＣＨＯ３１１．１）を標的とするＲＮＡエフェクターを提供する。一つの実施形態において ＲＮＡエフェクターは、グルタミナーゼを標的とする、配列番号：１０５１７０−１０５４３８から選択されるｓｉＲＮＡである。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクターは、配列番号：５６９を有するハムスターグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＣＨＯ５６９．１）を標的とする。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクターは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ１を標的とする、配列番号：１７７７７９−１７８０１０から選択されるｓｉＲＮＡである。
細胞培養における乳酸の産生は、細胞増殖を抑制し、解糖及びグルタミノリシスに関与する代謝経路に影響を及ぼすことが知られている〔Ｌａｏ＆Ｔｏｔｈ，１３ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｐｒｏｇ．，６８８−９１（１９９７）〕。細胞内の乳酸の蓄積は、主にグルコースのＣＯ２及びＨ２Ｏへの不完全な酸化によって生じ、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によってグルコースの大部分がピルビン酸に酸化され、最終的に乳酸に転化される。細胞内の乳酸の蓄積は、高い細胞密度及び生存性を達成するのに悪影響を及ぼす。従って、一つの実施形態において、免疫原性タンパク質産生は、乳酸形成に影響を及ぼすタンパク質、例えば乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）の発現を調節することによって高められる。従って、特定の実施形態は、ＬＤＨＡ１遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を提供する。
いくつかの実施形態において、細胞のグルコースの利用は、例えば標的遺伝子Ｍｙｃ及びＡＫＴの調節発現によって巧みに操作される。一つの実施形態において、標的遺伝子は、配列番号：２１８５の配列を含むＣＨＯ ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ ｏｎｃｏｇｅｎｅ（ＣＨＯ２１８５．１）である。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：７１３４３８−７１３７４５から選択される配列を有するｓｉＲＮＡである。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：７１３４３８−７１３４７３から選択される配列を有するｓｉＲＮＡである。一つの実施形態において、標的遺伝子は、配列番号：１７９３の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド又はそれ以上）を含むＣＨＯ ｔｈｙｍｏｍａ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ−１（ＣＨＯ１７９３．１）である。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：５８１２８６−５８１６４３から選択される配列を有するｓｉＲＮＡである。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：５８１２８６−５８１３３４から選択される配列を有するｓｉＲＮＡである。
一つの実施形態において、細胞培養物は、Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨ発現の調節を可能にするＲＮＡエフェクター分子を用いて本明細書に記載のように処理される。別の実施形態において、Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨを標的とするＲＮＡエフェクター分子は、一つ又はそれ以上の別のＲＮＡエフェクター分子及び／又は作用物質と組み合わせて投与できる。Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨの発現を標的とするＲＮＡエフェクター分子のカクテルであって、場合により本明細書に記載の別のＲＮＡエフェクター分子又は生物活性作用物質と組み合わせることができるカクテルが本明細書において提供される。
いくつかの実施形態において、生物由来物質の産生は、細胞ｐＨに影響を及ぼすタンパク質、例えばＬＤＨ又はリソソームＶ型ＡＴＰアーゼの発現を調節することによって高められる。
いくつかの実施形態において、生物由来物質の産生は、炭素の代謝又は輸送に影響を及ぼすタンパク質、例えばＧＬＵＴ１〔例えば、細胞をＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって、この場合のＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：４３８１５５−４３８４９０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む〕、ＧＬＵＴ２〔溶質担体ファミリー２（促進グルコース輸送体）、メンバー２）〕、ＧＬＵＴ３〔溶質担体ファミリー２（促進グルコース輸送体）、メンバー３）〕、ＧＬＵＴ４〔溶質担体ファミリー２（促進グルコース輸送体）、メンバー４）〕、ＰＴＥＮ（配列番号：６９０９１−６９０９４）〔ＲＮＡエフェクター分子を用いて、この場合のＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：６９０９１−６９４０４からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む〕又はＬＤＨ〔ＲＮＡエフェクター分子を用いて、この場合のＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：１２９７２８３−１２９７６０４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む〕の発現を調節することによって高められる−表１０も参照。
Figure 2014501097
 いくつかの実施形態において、生物由来物質の産生は、コフィリン（例えば、筋肉コフィリン２又は非筋肉コフィリン−１）の発現を調節することによって高められる。一つの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子を有する細胞〔この場合のＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：４３５２１３−４３５６１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む〕は、ハムスター筋肉コフィリン２（配列番号：１３６６）を標的とする。別の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子を有する細胞〔この場合のＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：１９１４０３６−１９１４３５６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む〕は、ハムスター非筋肉コフィリン１（配列番号：５７１６）を標的とする。
別の実施形態において、調節に有用なハムスター宿主細胞標的遺伝子としては、以下の表１に記載の標的遺伝子が挙げられる（Ａｖｇ Ｃｏｖは、ａｖｅｒａｇｅ ｃｏｖｅｒａｇｅを指す）：
Figure 2014501097
Figure 2014501097
いくつかの実施形態において、生物由来物質の産生は、宿主細胞においてＲＮＡエフェクター分子の取り込み又は効力に影響を及ぼすタンパク質、例えばＡｐｏＥ、マンノース／ＧａｌＮＡｃ−受容体の（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体）及びＥｒｉ１の発現を調節することによって高められる。種々の実施形態において、細胞においてＲＮＡｉの取り込み又は効力に影響を及ぼす一つ又はそれ以上のタンパク質の発現は、本明細書において提供される方法に従って、一つ又はそれ以上の追加の標的遺伝子の調節の程度及び／又は範囲を高めるために一つ又はそれ以上の追加の標的遺伝子、例えば本明細書に記載の標的遺伝子の調節と同時に調節される。
いくつかの実施形態において、生物由来物質の産生は、増殖停止及び生産性の上昇を生じる宿主細胞におけるストレス応答を誘導することによって高められる。ストレス応答は、例えば、養分利用性を制限し、溶質濃度あるいは低い温度又はｐＨシフト、及び酸化ストレスを上昇させることによって誘導できる。生産性の上昇と共に、ストレス応答はまた、タンパク質の折りたたみ及び分泌に対して悪影響も及ぼし得る。いくつかの実施形態において、このような悪影響は、ストレス応答タンパク質、例えば本明細書に記載のタンパク質の折りたたみ及び／又は分泌に影響を及ぼすタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節することによって改善される。
いくつかの実施形態において、生物由来物質の産生は、細胞骨格構造に影響を及ぼすタンパク質の発現を調節することによって、例えば単量体アクチンと繊維状アクチンの間の平衡を変えることによって高められる。一つの実施形態において、標的遺伝子は、コフィリンをコードし及びＲＮＡエフェクター分子は、コフィリンの発現を抑制する。一つの実施形態において、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子は、細胞質アクチンキャッピングタンパク質（ＣａｐＺ）、エズリン（ＶＩＬ２）及びラミニンＡからなる群から選択される標的遺伝子の発現を増加させる。例えば、例示的ＣＨＯ転写産物標的遺伝子及びｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖）を特定する表５参照：
Figure 2014501097
 ＲＮＡエフェクター分子による標的遺伝子の発現の調節（例えば、抑制）は、さらに、第二のＲＮＡエフェクター分子を導入することによって弱めることができ、前記第二のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は、宿主細胞においてＲＮＡｉ仲介するタンパク質をコードする標的遺伝子と相補的である。例えば、標的遺伝子の発現の調節は、細胞に、細胞のＲＮＡｉ経路のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（例えば、アルゴノート−２）又はその他の成分の発現を抑制する細胞ＲＮＡエフェクター分子を導入することによって弱めることができる。一つの実施形態において、生物由来物質は、細胞を、生物由来物質を標的とする第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって一時的に抑制される。生物由来物質の発現の抑制は、この場合には、ＲＮＡｉ経路のタンパク質をコードする遺伝子を標的とする第二のＲＮＡエフェクター分子を細胞に導入することによって弱められる。
また、所望の生物由来物質の産生は、産生期の間に細胞にＲＮＡエフェクター分子を導入して、タンパク質の発現、翻訳後修飾、折りたたみ、分泌、及び／又は所望の生物由来物質の産生及び／又は回収に関連するその他のプロセスに影響を及ぼすタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節することによって高めることができる。あるいは、生物由来物質の産生は、産生期の間に細胞に、細胞の増殖及び／又は細胞分裂を抑制するＲＮＡエフェクター分子を導入することによって高められる。
翻訳後プロセシング
翻訳後修飾は、生物製剤の産生の費用を上昇させ及び効率を低下させる修飾及び非修飾ポリペプチドを分離するために追加のバイオプロセス工程を必要とすることができる。従って、いくつかの実施形態において、細胞におけるポリペプチド作用物質の産生は、翻訳後修飾に影響を及ぼすタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節することによって高められる。別の実施形態において、生物製剤の産生は、第一の翻訳後修飾に影響を及ぼすタンパク質をコードする第一の標的遺伝子の発現を調節し及び第二の翻訳後修飾に影響を及ぼすタンパク質をコードする第二の標的遺伝子の発現を調節することによって高められる。
さらに具体的には、真核細胞において発現されるタンパク質は、生物由来物質の産生及び／又は構造、生物活性、安定性、均一性及び／又はその他の特性を損なうことができるいくつかの翻訳後修飾を受けることができる。これらの修飾の多くは、細胞の増殖及びポリペプチドの発現中に自然に生じ、所定のポリペプチドのいくつかの部位で、例えばペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端及び／又はカルボキシル末端で生じることができる。また、所定のポリペプチドは、いくつかの異なる型の修飾を含むことができる。例えば、トリ及び哺乳動物細胞において発現されるタンパク質は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ユビキチン化、メチオニン酸化、ジスルフィド結合形成、メチル化、脱メチル化、硫酸化、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、ヒドロキシ化、ヨウ素化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、グルコニル化、配列変異、Ｎ末端グルタミン環化及び脱アミド化、並びにアスパラギン脱アミド化を受けることができる。Ｎ末端アスパラギン脱アミド化は、細胞を、Ｎ末端Ａｓｎアミダーゼ（例えば、配列番号：５９５０によってコードされる）を標的とするＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって抑制することができ、この場合のＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：１９９９４１０−１９９９７５６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、タンパク質の産生は、タンパク質の脱アミド化に関与するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節することによって高められる。タンパク質は、いくつかの経路、例えばＮ末端グルタミンの環化及び脱アミド化並びにアスパラギンの脱アミド化によって脱アミド化できる。従って、一つの実施形態において、タンパク質の脱アミド化に関与するタンパク質は、Ｎ末端アスパラギンアミドヒドロラーゼである。タンパク質の脱アミド化は、構造特性の変化、有効性の低下、生物活性の低下、効力の低下、免疫原性の上昇、及び／又はその他の望ましくない特性をもたらすことができ、いくつかの方法、例えば、以下に限定されないが、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動、天然ゲル電気泳動、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、質量分析又はＬ−イソパルチルメチルトランスフェラーゼの使用による電荷に基づいたタンパク質の分離によって測定できる。
生物由来物質が、糖タンパク質、例えばウイルス表面膜タンパク質を有するウイルス産生物又はグリコシル化アミノ酸残基を有するモノクロナール抗体を含む場合には、生物製剤の産生は、タンパク質グリコシル化に関与するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節することによって高めることができる。グリコシル化パターンは、多くの場合、哺乳動物糖タンパク質の構造及び機能の重要な決定因子であり、糖タンパク質の溶解性、熱安定性、プロテアーゼ耐性、抗原性、免疫原性、血中半減期、安定性及び生物活性に影響を及ぼすことができる。
種々の実施形態において、グリコシル化に影響を及ぼすタンパク質は、ドリチル−ジホスホオリゴサッカライド−タンパク質グリコシルトランスフェラーゼ（チャイニーズハムスター遺伝子配列番号：２７４２８９４−２７４３２３９）、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（配列番号：８５１１１５−８５１４８９、配列番号：１５５２４６１−１５５２７２８、配列番号：１５６２８１３−１５６３１０８、及び配列番号：１６３５１７３−１６３５５６１）、ＵＤＰ−ガラクトース−セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ（２０９８４１−２１０２２７）、タンパク質Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ（配列番号：９１６７２６−９１７０３５）、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（配列番号：５７１４７−５７４２２、配列番号：６５７３７−６５９９９、配列番号：１０１３００２−１０１３３７６、配列番号：１３６３５８３−１３６３９７０、配列番号：１５４６６０９−１５４６９９９、配列番号：１９６５２１７−１９６５６１３、配列番号：２８７６２４１−２８７６５９５）、特にＴ４（配列番号：２８７６２４１−２８７６５９５）、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（配列番号：６０７０１２−６０７３４８）、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（配列番号：８９７３８−９００２４、配列番号：２６２３６８−２６２６２１）、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、並びにα−ガラクトシダーゼ（配列番号：１６００９６８−１６０１２８８）及びβ−ガラクトシダーゼ（配列番号：６９０６０１−６９０９８９）からなる群から選択される。上記の標的のための典型的なｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）は、標的ヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド又はそれ以上）を含むことができる。
他の実施形態において、グリコシル化に影響を及ぼすタンパク質は、例示的チャイニーズハムスター転写産物標的遺伝子及び典型的なｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖）を特定する以下の表６から選択される：
Figure 2014501097
Figure 2014501097
別の実施形態において、糖タンパク質の産生は、シアリダーゼ又はシアリルトランスフェラーゼ酵素の発現を調節することによって高められる。糖タンパク質の末端シアル酸残基は、糖タンパク質の溶解性、熱安定性、プロテアーゼ作用に対する耐性、抗原性及び特異活性の特に重要な決定因子である。例えば末端シアル酸が血清糖タンパク質から除去されると、脱シアリル化タンパク質は、シアリル化された対応物に比べて著しく低下した生物活性及び低い循環半減期を有する。糖タンパク質中のシアル酸の量は、２つの対立するプロセス、すなわちシアリルトランスフェラーゼによるシアル酸の細胞内付加及びシアリダーゼによるシアル酸の除去の結果である。従って、いくつかの実施形態において、糖タンパク質の産生は、シアリダーゼの発現を抑制する及び／又はシアリルトランスフェラーゼの発現を活性化させることによって高められる。例示的シアリルトランスフェラーゼ標的及び典型的なｓｉＲＮＡは、表７に見出される。
Figure 2014501097
Figure 2014501097
いくつかの実施形態において、タンパク質の産生は、アンモニアを放出するＮ末端グルタミン残基のピログルタミン酸への分子内環化（ピログルタミン酸化）を触媒するグルタミニルシクラーゼの発現を調節することによって高められる。グルタミニルシクラーゼの調節は、細胞を、グルタミニルシクラーゼ遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子（例えば、配列番号：５４８６によってコードされる）と接触させることによって達成でき、この場合のＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：１８３２６２６−１８３２９９３（ハムスター）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、生物由来物質は、イズロン酸２−スルファターゼ（ＩＤＳ）である。ＩＤＳは、ヒトリソソームにおいて硫酸エステルを加水分解するエキソスルファターゼである。ヒトでの活性ＩＤＳの欠損は、リソソームのヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸断片の蓄積に特徴があるハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型）を招く。ハンター症候群は、外来性ＩＤＳ、例えば野生型組換えヒトＩＤＳの投与によって治療できる。
ヒトＩＤＳは、糖タンパク質であり、その活性は、グリコシル化の度合いを調節することによって高めることができる。従って、一つの実施形態において、培養宿主細胞を、組換えＩＤＳのグリコシル化に関与する宿主細胞遺伝子の発現を調節できるＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって宿主細胞において組換えヒトＩＤＳの産生を高める方法が、本明細書において提供される。典型的な標的遺伝子としては、例えばグリコシル化酵素が挙げられる。組換えＩＤＳは、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ−ＫＩ細胞及びＣＨＯ−Ｌｅｃ１細胞において産生させることができる。組換えＩＤＳは、野生型ＩＤＳ（例えば、ヒトの肝臓から単離されるＩＤＳ）と比べて同じグリコシル化パターンであるが、高められたグリコシル化の度合いを有することができる。本明細書において提供される方法によって産生されるＩＤＳの高グリコシル化された形の高められたグリコシル化は、野生型ＩＤＳよりも少なくとも５ｋＤａ大きいか又は野生型ＩＤＳよりも少なくとも１０ｋＤａ大きい、野生型ＩＤＳよりも少なくとも１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ又はそれ以上大きい分子量を有するＩＤＳをもたらす。本明細書において提供される方法によって産生される組換えＩＤＳの高グリコシル化体は、野生型酵素（例えば、平均的なグリコシル化の度合いを有するＩＤＳ）と比べて高められた酵素活性を示す。組換えＩＤＳ及び野生型ＩＤＳの酵素活性は、当該技術で公知の方法、例えば放射標識二糖支持体ＩｄｏＡ２Ｓ−ａｎＭ６Ｓを使用するＢｉｅｌｉｃｋｉら、２７１ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７５−８６（１９９０）に記載の方法を使用してアッセイできる。
別の実施形態において、生物由来物質は、アリールスルファターゼＡである。ヒトのアリールスルファターゼＡの欠損は、特に神経系の細胞において、神経系に進行性障害をもたらすスルファチドの蓄積を招く。イズロン酸２−スルファダーゼのように、アリールスルファターゼＡは、最適酵素活性にグリコシル化を必要とする糖タンパク質である。従って、一つの実施形態において、培養宿主細胞を、組換えＩＤＳのグリコシル化に関与する宿主細胞遺伝子の発現を調節できるＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって宿主細胞において組換えヒトＩＤＳの産生を高める方法が、本明細書において提供される。組換えＩＤＳは、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞において産生される。
いくつかの実施形態においてジスルフィド結合を含んでいるタンパク質の産生は、ジスルフィド結合の酸化、還元及び／又は異性化に影響を及ぼすタンパク質、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ又はスルフヒドリルオキシダーゼの発現を調節することによって高められる。ジスルフィド結合の形成は、真核細胞培養においてマルチサブユニットタンパク質又はペプチドの産生に特に問題となり得る。マルチサブユニットタンパク質又はペプチドの例としては、受容体、細胞外マトリックスタンパク質、免疫調節剤、例えばＭＨＣタンパク質、完全鎖抗体及び抗体断片、酵素及び膜タンパク質が挙げられる。
いくつかの実施形態において、タンパク質の産生は、メチオニン酸化に影響を及ぼすタンパク質の発現を調節することによって高められる。活性酸素種（ＲＯＳ）は、メチオニン（Ｍｅｔ）をメチオニンスルホキシド（ＭｅｔＯ）に酸化することができ、分解及び産生物不均一性の増加並びに生物活性及び安定性の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＭｅｔＯ残基のメチオニンへの還元を触媒するメチオニンスルホキシドレダクターゼをコードする。例えば、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：２０４４３８７−２０４４６７６、配列番号：２５５７４９２−２５５７８０９、及び配列番号：３０７６１０４−３０７６３０９（チャイニーズハムスター）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む。
工業規模の細胞培養において産生される生物由来物質（いくつかの生弱毒化ウイルスを含む）は、典型的には培養細胞によって分泌され、周囲の細胞培養培地から回収され、精製される。一般に、タンパク質産生の割合及び回収タンパク質の収量は、タンパク質の折りたたみの割合及び宿主細胞による分泌に直接関係する。例えば、宿主細胞の小胞体（ＥＲ）における異常な折りたたみ構造のタンパク質の蓄積は、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）経路によって分泌を遅らせるか又は停止することができる。ＵＰＲは、過剰の変性タンパク質を検出するＥＲ膜においてストレス感受性タンパク質によって引き金が引かれる。ＵＰＲ活性化は、異常タンパク質に結合し、適切な折りたたみを促進するシャペロンタンパク質〔例えば、Ｂｉｐ（熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（グルコース調節タンパク質、７８ｋＤａ）〕の上方制御を招く。ＵＰＲ活性化はまた、転写因子ＸＢＰ−１（配列番号：１８７９５５−１８８１５２）及びＣＨＯＰ（配列番号：２８１３６２２−２８１３９５６）（チャイニーズハムスター）も上方制御する。ＣＨＯＰは、一般的に細胞の増殖、分化及び生存の負の調節因子として機能し、ＵＰＲによるその上方制御は、細胞周期の停止を引き起こし、タンパク質折りたたみ及び分泌の割合を増大して過剰な変性タンパク質を細胞から取り除く。従って、細胞周期は、最初に促進され、次いでウイルス産生期の間に抑制されてウイルス産生物の収量を増大させることができる。宿主細胞による免疫原性タンパク質分泌の割合の増大は、例えば経時的に培養物に存在するタンパク質の量を監視することによって測定できる。
本発明は、宿主細胞によるタンパク質の分泌に影響を及ぼすタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節することによって培養真核宿主細胞において分泌ポリペプチドの産生を高める方法を提供する。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＵＰＲ経路のタンパク質、例えばＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ４（配列番号：１５５２０６７−１５５２４６０）、ＡＴＦ６（配列番号：５７０１３８−５７０４９８）（チャイニーズハムスター）、ｅＩＦ２α（配列番号：１８２８１２２−１８２８４９２）（チャイニーズハムスター）、ＧＲＰ７８〔熱ショック７０ｋＤＡタンパク質５（グルコース調節タンパク質、７８ｋＤａ、配列番号：２９２５９０−２９２８３７〕（チャイニーズハムスター）、ＧＲＰ９４（配列番号：１８０５７４−１８０９５４）（チャイニーズハムスター）、カルレチクリン（配列番号：８９５６９１−８９６０５１）（チャイニーズハムスター）又はこれらの変異体、あるいはＵＰＲ経路を調節するタンパク質、例えば転写調節因子〔例えば、ｃｉｓ作用ＵＰＲ因子（ＵＰＲＥ）〕をコードする。上記の標的のための典型的なｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）は、標的ヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド又はそれ以上）を含むことができる。
タンパク質の分泌に関与するその他の標的遺伝子を、例示的チャイニーズハムスター転写産物標的遺伝子及び典型的なｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖）を特定する以下の表８に列記する。
Figure 2014501097
 いくつかの実施形態において、タンパク質の分泌に影響を及ぼすタンパク質は、Ｈｓｐ４０（配列番号：６７７２０３−６７７５５８）、ＨＳＰ４７（セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＨ；熱ショックタンパク質４７ともいう）（配列番号：７７７０３６−７７７３１７）、ＨＳＰ６０（配列番号：４９４７４３−４９５０８６）、Ｈｓｐ７０（配列番号：３１４７０２９−３１４７０８０）、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１００、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（配列番号：７２７４８−７２９９６）、ペプチジルプロリルイソメラーゼ（配列番号：３８７８１−３９０６７、配列番号：１０７４１３９−１０７４４７５、配列番号：１１２７０６１−１１２７４２６、配列番号：１６４９１７０−１６４９５１５、配列番号：２１９７１４６−２１９７５３２、配列番号：２２５３９７８−２２５４３７３、配列番号：２２６１７６５−２２６２０５８、配列番号：２２７５３３０−２２７５６３３、配列番号：２５７９５４７−２５７９９０８、及び配列番号：３１１５０１０−３１１５１９９）、カルネキシン（配列番号：６１５５９−６１７８５）、Ｅｒｐ５７（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーＡ、メンバー３；配列番号：７７４３５５−７７４６７７）及びＢＡＧ−１（前記は、チャイニーズハムスターを指す）からなる群から選択される分子シャペロンである。
いくつかの実施形態において、タンパク質の分泌に影響を及ぼすタンパク質は、γ−セクレターゼ、ｐ１１５（例えば、配列番号：８９３４０−８９７３７）（チャイニーズハムスター）、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）タンパク質、セクレチン及びキナーゼ（例えば、ＭＥＫ）からなる群から選択される。
細胞培養における生物由来物質の産生は、生物由来物質に親和性を有するタンパク質あるいは生物由来物質に特異的に結合する分子又は因子によって悪影響を及ぼされ得る。例えば、多数の異種タンパク質が、宿主細胞表面で糖タンパク質ヘパリン及びヘパラン硫酸を結合することが明らかにされている。これは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及び／又はヘパリン／ヘパラン硫酸−結合タンパク質と、回収タンパク質の収量を低下させ並びに均一性、安定性、生物活性、及び／又はその他の特性の低下させる、組換えタンパク質産生物との同時精製をもたらすことができる。ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸を結合することが明らかにされている異種タンパク質の例としては、ＢＭＰ３（骨形成タンパク質３又はオステオゲニン）、ＴＮＦ−α、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ−βファミリーメンバー及びＨＧＦが挙げられる。従って、一つの実施形態において、培養宿主細胞において異種タンパク質、例えばＢＭＰ３、ＴＮＦ−α、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ−βファミリーメンバー又はＨＧＦ、あるいはその他の生物由来物質の産生は、細胞を、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸の発現及び／又は産生を調節する（例えば、抑制する）ＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって高められる。一つの実施形態において、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸の量は、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸の産生に関与する宿主細胞酵素、例えば宿主細胞キシロシルトランスフェラーゼ（配列番号：１５５４７７４−１５５５０５４）（チャイニーズハムスター）、及び本明細書において提供される表に列記される配列の発現を調節することによって減少する。
いくつかの実施形態において、例えば、生物由来物質が、ウイルス、例えばインフルエンザウイルスである場合には、標的遺伝子は、ウイルス結合を減少させ、従って細胞培養培地においてウイルスの回収を増加させる（すなわち、依然として宿主細胞膜にくっついているウイルスは少ない）宿主細胞表面からシアル酸を減少させることに関与する遺伝子である。これらの標的としては、溶質担体ファミリー３５（ＣＭＰ−シアル酸輸送体）メンバーＡ１（ＳＬＣ３５Ａ１）（例えば、ハツカネズミＳｌａｃ３５ａ１から推測されるハムスター遺伝子、遺伝子ＩＤ：２４０６０）（配列番号：３１５４３４５−３１５４３６８及び配列番号：３１５４３６９−３１５４３９２から選択される野鶏属標的遺伝子配列）（配列番号：４６４６７４−４６５０５５から選択されるハムスター遺伝子配列）；溶質担体ファミリー３５（ＵＤＰ−ガラクトース輸送体）、メンバーＡ２（ＳＬＣ３５Ａ２）（例えば、ハツカネズミＳｌｃ３５ａ２から推測されるハムスター遺伝子、遺伝子ＩＤ：２２２３２）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン ２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）（例えば、ハツカネズミＧｎｅから推測されるハムスター遺伝子、遺伝子ＩＤ：１００９０）（配列番号：３１５４２９７−３１５４３２０及び配列番号：３１５４３２１−３１５４３４４から選択される野鶏属標的遺伝子配列）（配列番号：２０７３９７１−２０７４３６８から選択されるハムスター細胞標的遺伝子配列）；シチジンモノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（Ｃｍａｓ）（例えば、ハツカネズミＣｍａｓから選択されるハムスター遺伝子、遺伝子ＩＤ：１２７６４）（配列番号：３１５４２４９−３１５４２７２及び配列番号：３１５４２７３−３１５４２９６から選択される野鶏属標的遺伝子配列）（配列番号：１６３３１０１−１６３３４０６から選択されるハムスター標的遺伝子配列）；ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＴ１）（例えば、ハツカネズミＢ４ｇａｌＴ１から推測されるハムスター遺伝子、遺伝子ＩＤ：１４５９５）（配列番号：３１５４１５３−３１５４１７６及び配列番号：３１５４１７７−３１５４２００から選択される野鶏属標的遺伝子配列）（配列番号：２５２８４５４−２５２８７６３から選択されるハムスター標的遺伝子配列）；及びＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド６（Ｂ４ＧａｌＴ６）（例えば、ハツカネズミＢ４ＧａｌＴ６から推測されるハムスター遺伝子、遺伝子ＩＤ：５６３８６）（配列番号：３１５４２０１−３１５４２２４及び配列番号：３１５４２２５−３１５４２４８から選択される野鶏属標的遺伝子配列）（配列番号：１６３５１７３−１６３５５６１から選択されるハムスター細胞標的遺伝子配列）が挙げられる。上記の標的のための典型的なｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）は、標的ヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド又はそれ以上）を含むことができる。
さらなる標的としては、トリ細胞において宿主シアリダーゼに関与する標的を挙げることができる〔Ｗａｎｇら、１０ ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５１２（２００９）参照〕、なぜならば、インフルエンザは、細胞表面シアル酸残基に結合し、従って減少したシアリダーゼが、感染又は精製の割合を増加し得るからである：ＮＥＵ２シアリダーゼ２（細胞質ゾルシアリダーゼ）（例えば、野鶏属Ｎｅｕ２、遺伝子ＩＤ：４３０５４２）及びＮＥＵ３シアリダーゼ３（膜シアリダーゼ）（例えば、野鶏属Ｎｅｕ３、遺伝子ＩＤ：６８８２３）。さらなる標的遺伝子としては、細胞において十分に増殖しないいくつかのウイルスの基礎となるか否かを調べるために使用できるｍｉＲＮＡアンタゴニスト、例えばダイサーのノックダウンが感染の割合の適度の増加を招くことからダイサー（ダイサー１、リボヌクレアーゼＩＩＩ型）〔Ｍａｔｓｋｅｖｉｃｈら、８８ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，２６２７−３５（２００７）〕；又はデコイ核酸がＩＳＲＥ含有プロモーターから離れているＴＦを滴定することからＩＳＲＥ（インターフェロン刺激応答要素）が挙げられる。シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）に関連する遺伝子及び標的の例を、以下の表９に示す：
Figure 2014501097
 生物由来物質、例えばポリペプチドを工業規模で製造するためのバイオプロセスの使用は、病原体、例えば活性ウイルス粒子及びその他の外来作用物質（例えば、プリオン）の存在によって困惑させられ、調節手順に従うために検出、除去（例えば、ウイルスろ過）及び／又は不活性化（例えば、加熱処理）のための費用がかかり、時間のかかる工程の使用を必要とする場合が多い。このような問題は、このようなウイルスの存在を検出及び監視することが困難であるために深刻化し得る。従って、いくつかの実施形態において、病原性感染に対する宿主細胞の感受性に影響及ぼす標的遺伝子の発現を調節することによって生物由来物質の産生を高める方法が提供される。例えば、いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ウイルス感染性に介在する宿主細胞タンパク質、例えば貫膜タンパク質ＸＰＲ１（配列番号：６２０２１−６２３６２）（チャイニーズハムスター）、ＲＤＲ、Ｆｌｖｃｒ、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４、Ｐｉｔ１及びＰｉｔ２（配列番号：３０６８２２２−３０６８４５５）（チャイニーズハムスター）である。
標的配列は、一般的に１０〜３０個のヌクレオチドの長さであるが、任意の所定の標的ＲＮＡの切断を指示することに対するこの範囲内の特定の配列の適合性には多様性がある。本明細書に記載の種々のソフトウエアパッケージ及び指針は、任意の所定の遺伝子標的に最適な標的配列の特定のための手引きを提供するが、所定のサイズ（非限定的な例として、２１個のヌクレオチド）の「ウインドウ」又は「マスク」が、標的配列として働くことができるサイズ範囲内の配列を特定するために標的ＲＮＡ配列に遂語的に又は比喩的に（例えば、コンピュータ内で）配置される実験的アプローチを採用することもできる。配列「ウインドウ」を最初の標的配列の配置の１個のヌクレオチド上流又は下流に徐々に移動することによって、可能な配列の完全な一組が選択された任意の所定の標的サイズについて同定されるまで、次の可能性のある標的配列を特定することができる。この方法は、最適に機能を果たす配列を特定するために（本明細書に記載のアッセイ又は当該技術で公知のアッセイを使用して）特定された配列の系統的合成及び検査と結び付けて、ＲＮＡエフェクター分子作用物質を標的に向けた場合に、標的遺伝子の発現の最もよい抑制に介在するＲＮＡ配列を特定できる。従って、例えば、本明細書、表の範囲内で、及び配列番号：１−９７７１、配列番号：３１５４１４８及び配列番号：３１５７１４９−３１５８４２０（チャイニーズハムスター）において、本明細書において特定された配列は、有効な標的配列に相当するが、同等の又はより良い抑制特性を有する配列を特定するために、所定の配列の一つのヌクレオチド上流又は下流に徐々に「ウインドウを歩行させる」ことによって、抑制効率のさらなる最適化が達成できることが意図される。
また、特定された任意の配列について、例えば本明細書の表において及び配列番号：９７７２−３１５２３９９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３（チャイニーズハムスター）において特定された任意の配列について、ヌクレオチドを系統的に付加するか又は除去してより長い又はより短い配列を生じさせ、これらの配列及び前記のより長い又はより短いサイズのウインドウを、その位置から標的ＲＮＡの上下に歩行させることによって生じた配列を検査することによって、さらなる最適化が達成できることが意図される。当該技術で知られているかような又は本明細書に記載されているような抑制アッセイにおいて、新しい候補標的を生じさせるこのアプローチを、これらの標的配列に基づいてＲＮＡエフェクター分子の有効性の検査と結び付けると、抑制の効率のさらなる向上をもたらすことができる。さらにまた、このような最適化された配列は、例えば、本明細書に記載されているような又は当該技術で知られているような修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加又は改変、あるいは当該技術で知られているような及び／又は本明細書で論じたその他の修飾によって調整して、前記分子を発現抑制剤としてさらに最適化できる（例えば、血清安定性又は循環半減期の増大、熱安定の安定性の上昇、貫膜送達の増強、特定の位置又は細胞型へのターゲテッィング、サイレンシング経路酵素との相互作用の増大、エンドソームからの放出の増加など）。
ＩＩＩ．生物汚染
生物工学製造方法において一般的に使用される細胞株、例えばＣＨＯ細胞及びＭＤＣＫ細胞は、レトロウイルス様粒子を産生することが実証されている。また、大規模生物製剤製造方法においてＭＭＶ（ネズミ微小ウイルス）の混入が生じており、製造に使用する原料の偶発的汚染に起因すると考えられた。その結果、国際規制機関は、生物製剤製造業者に、包括的ウイルス排除方策、例えば細胞株及び原料の特性決定、しっかりとしたウイルス不活性化及び除去工程の採用、並びにプロセス中間物及び最終製品の検査を採用するように要求している。多数の直交する工程、例えばクロマトグラフ法、物理化学的不活性化（例えば、低ｐＨ、溶剤洗浄）及びサイズ排除ろ過は、一緒になってウイルスの累加的不活性化及び除去を生じる。例えば、Ｍａｒｑｕｅｓら、２５ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｐｒｏｇ．，４８３−９１（２００９）；Ｋｈａｎら、５２ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９３−３０１（２００９）参照。ウイルス排除及び排除有効性確認は、バイオプロセシングにおいて最も時間のかかり、費用を要する活動のいくつかである：下流プロセシングは、生物製造コスト全体の約７０％を占める。Ｃｈｏｃｈｏｉｓら、３６ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｌ．，（Ｊｕｎｅ，２００９）。下流バイオプロセシングフィルター製品は、単独で、生物工学及びワクチン製造業者に毎年１０億ドルを越える費用を費やさせる。
従って、別の実施形態において、産生は、細胞に、宿主細胞においてウイルスタンパク質の発現を抑制する細胞ＲＮＡエフェクター分子を導入することによって高められる。さらに具体的には、例えば、潜在ＤＮＡウイルス（例えば、ヘルペスウイルス）及び内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）、又はレトロウイルス要素は、おそらく全ての脊椎動物に存在するであろう。内在性レトロウイルス配列は、真核生物ゲノムの不可欠な部分であり、これらの配列の大部分は、欠陥があるが、いくつかは、感染性ウイルスを、自然に又は長期培養で産生させることができる。ＥＲＶウイルス産生は、標準的な産生系の一部であることができる種々の化学物質又はその他の作用物質で処理すると誘導することができる。また、多くの内在性レトロウイルスは、それ自体の細胞には容易に再感染しないが、他の種には生体外で及び生体内で感染することができる。例えば、ブタＥＲＶ（ＰＥＲＶ）の３つの亜群のうちの２つは、ヒト細胞に生体外で感染できる。
少なくとも２６の異なる群のヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）；並びに関連する外来性ウイルスと相互作用することができるマウス、ネコ及びブタに宿る複製可能ＥＲＶが存在する。レトロウイルス誘導腫瘍形成は、複製可能配列と複製欠損配列の間の組換えによる新規な病原性ウイルスの発生及び／又はレトロウイルス配列の上流又は下流挿入による長い末端反復（ＬＴＲ）による細胞性癌遺伝子の活性化を伴うことができる。従って、生物製剤の生産に使用される細胞基質における内在性の感染性レトロウイルスの活性化は、特に最小限の精製及び不活性化工程が高いワクチン効果を保つために使用される生ウイルスワクチンの場合には、重要な安全上の懸念がある。
外来ウイルスは、ヒト使用について、細胞基質由来の生物製剤、例えばワクチン及び抗体の使用に付随した大きな危険性を示す。ウイルス混入の可能性は、一次培養物及び確立された培養物、並びにマスターセルバンク、産生終了細胞及びバルク収穫液に存在する。例えば、これは、形質転換のメカニズムが知られていない新生物不死化細胞の使用に対する大きな障害である。なぜならば、これらの細胞は、発癌ウイルスを含むという高い危険性を有し得るからである。従って、可能性のある外部作用物質の存在についての広範な検査が、ワクチンの安全性を保証するために必要とされる。生物製剤の外来ウイルス混入について最も一般的な状況として、ウシ胎仔血清中のウシウイルス性下痢症ウイルス；ブタ基質中のブタパルボウイルス；並びにチャイニーズハムスター細胞由来のバルク収穫物中のネズミ微小ウイルス、レオウイルス、ベシウイルス及びカシェ渓谷ウイルスが挙げられる。３つの最後に名前を挙げたウイルス実体は、製造プロセス中に（スケールアップ中に又は全プロセス中に）使用されるウシ血清によって導入されると考えられる。
生弱毒化ウイルスワクチンの生産中に、混入するウイルス粒子、核酸又はタンパク質の除去は、任意の抗ウイルスアプローチはウイルス産生物をそのままに及び免疫原性の状態にしておかなければならないので、問題になる。実際に、内在性トリウイルス粒子が、ニワトリ胚線維芽細胞から誘導された商業的に発売されているヒトはしか及びおたふく風邪ワクチンに見出されている。また、内在性ウイルスタンパク質、特にエンベロープタンパク質は、多くの場合に、形質転換細胞株の作製において使用される組換えウイルスベクターの有効性を阻害する。また、内在性ウイルスは、多くの場合にウイルス産生又はレトロウイルス形質導入の間に引き金を引かれる宿主細胞の免疫反応をさらに悪化させることができる。従って、外来ウイルス、潜在ウイルス及び内在性ウイルスの活性を抑制し、従って細胞において産生される生物由来物質、例えば免疫原性作用物質の純度及び収量を増大させる技術について未だに要求がある。
本発明は、場合により外来ウイルス、潜在ウイルス又は内在性ウイルスの発現に関与するタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を調節するために、細胞にＲＮＡエフェクター分子を導入することによって生物由来物質の産生を高めることを提供する。従って、いくつかの実施形態において、宿主細胞において生物由来物質の産生は、細胞において所望の生物由来物質の感染力及び／又は量が増大するように、細胞に潜在又は内在性ウイルスタンパク質の発現を抑制するＲＮＡエフェクター分子を導入することによって高められる。
例えば、細胞培養に基づいた不活性インフルエンザウイルス又はインフルエンザウイルス抗原の特別な利点は、卵タンパク質に対するアレルギー反応の引き金を引き得る卵特異的タンパク質が存在しないことである。従って、本発明の使用は、特に、高リスク群を構成する人々、例えば喘息患者、アレルギーを有する喘息患者、並びに抑制免疫系を有する人々及び高齢者においてインフルエンザウイルス感染症の予防に特に適している。
ウイルス株が細胞培養において増殖する培養条件もまた、ウイルス株の許容できる高い収量を達成することに関して極めて重要である。所望のウイルス株の収量を最大にするために、宿主系及び培養条件の両方は、所望のウイルス株の産生に都合の良い環境を提供するために特異的に適合させなければならない。多くのウイルスは、極めて特異的な宿主系に限定されており、そのいくつかは、ウイルス収量に関して極めて不十分である。ウイルス宿主系として使用される哺乳動物細胞のいくつかは、ウイルスを高収量で産生するが、このような細胞の腫瘍原性は、ワクチン生産のための使用に対して調節制限を引き起こす。
細胞培養における血清及び／又は培地に添加される動物又はヒト起源に由来するタンパク質添加物の使用により生じる問題、例えば、異なるバッチの様々な品質及び組成並びにマイコプラズマ、ウイルス又はＢＳＥ作用物質による混入の危険性は、周知である。一般に、アルブミン、トランスフェリン又はインスリンのような血清又は血清由来物質は、培養物及びそれから産生される生物由来物質に混入することができる望まれない作用物質を含有することができる。また、ヒト血清由来の添加物は、血清によって感染されることができる肝炎又はＨＩＶのような全ての公知のウイルスについて検査されなければならない。ウシ血清及びそれから誘導される製品、例えばトリプシンは、ウシ海綿状脳症混入の危険性を有する。また、全ての血清由来製品は、未だ知られていない作用物質によって汚染される可能性がある。従って、血清又はその他の血清由来化合物を必要としない細胞及び培養条件が、探求中である。
例えば、天然痘ワクチン、変性ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）の産生は、一次又は二次ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞培養において増幅される。ＣＥＦは、１０〜１２日間インキュベートされている鶏卵の胚から得られ、次いでそれから細胞が分離され、精製される。これらの一次ＣＥＦ細胞は、直接使用できるか、又は１回さらに細胞継代後に二次ＣＥＦ細胞として使用できる。その後に、一次又は二次ＣＥＦ細胞に、ＭＶＡを感染させる。ＭＶＡの増幅のために、感染細胞は、３７℃で２〜３日間インキュベートされる。例えば、Ｍｅｙｅｒら、７２ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１０３１−３８（１９９１）；Ｓｕｔｔｅｒら、１２ Ｖａｃｃｉｎｅ，１０３２−４０（１９９４）参照。多数のポックスウイルスは、３７℃よりも低い温度、例えば３０℃でインキュベートされたＣＥＦにおいて効率的に複製する。米国特許第６，９２４，１３７号明細書参照。
確立された哺乳動物細胞株、例えばメイディン・ダービーイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞株の使用が、いくつかのウイルス株の複製において成功しており、ワクチン生産において頻繁に使用される。それにもかかわらず、多数のウイルス株が、ＭＤＣＫ株において複製しないであろう。また、ヒトワクチン生産のために腫瘍形成能を有する細胞を用いることに関連した起こり得る悪影響に対する恐れが、ＭＤＣＫ、これに関連して高形質転換細胞株の使用を排除している。
代替ワクチン生産方法を開発する他の試みが、行われている。米国特許第第４，７８３，４１１号明細書は、金魚細胞培養物においてインフルエンザワクチンを調製する方法を論じている。金魚細胞培養物に感染させるためのウイルス粒子は、その確立後に、ニワトリ胚培養物から又は感染ＣＤ−Ｉ株マウスから得られた。このウイルスは、金魚細胞培養物中で少なくとも２回継代され、生ワクチンとして使用できる弱毒化インフルエンザウイルスをもたらす。また、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ）及びニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）が、血清を含有していない、タンパク質も含有していない培地においてインフルエンザウイルス及び組換えインフルエンザタンパク質を増殖させ、産生させるのに適合させられている。国際公開第ＷＯ９６／０１５２３１号明細書参照。
タンパク質及び血清を含有していない培地の使用は、外来ウイルス混入の危険性を制限するが、細胞バンクに存在する潜在ウイルス又は内在性レトロウイルスによって引き起こされる継続する危険性に対処しない。生物製剤の生産に使用される細胞基質における内在性感染性レトロウイルスの活性化は、特に高いワクチン効果を保つために最小限の精製及び不活性化工程がある生ウイルスワクチンの場合には、重要な安全性に対する懸念がある。
いくつかの実施形態において、ベシウイルスを標的とするＲＮＡエフェクター分子は、本明細書に記載の方法及び組成物と共に使用できる。ベシウイルスを標的とする典型的なＲＮＡエフェクター分子としては、以下に限定されないが、以下の表６３に記載のものが挙げられる：
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
内在性レトロウイルス
レトロウイルスは、ウイルスｐｏｌ遺伝子によってコードされるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）によって介在される逆転写によって複製する。レトロウイルスはまた、さらに少なくとも２つの遺伝子：ｇａｇ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子を有する：前記ｇａｇ遺伝子は、ウイルス骨格、マトリックス、ヌクレオカプシド及びカプシドのタンパク質をコードし；前記ｅｎｖ遺伝子は、エンベロープ糖タンパク質をコードする。さらに、レトロウイルス転写は、レトロウイルスゲノムの両端に存在する高反復領域（ＬＴＲ）にあるプロモーター領域又は「エンハンサー」によって調節される。
細胞の感染中に、逆転写酵素は、ＲＮＡゲノムのＤＮＡコピーを作製する；このコピーは、次いで、宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。レトロウイルスは、胚細胞又は胚に初期に感染でき、垂直メンデル伝達によって伝達される。これらの内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）は、宿主生物の発生中に退化し、その初期特性を失うことができる。いくつかのＥＲＶは、その特性又はその構成モチーフの特性の全部又は一部を保存するか、あるいは宿主生物のための利点を有する新規な機能的特性を獲得する。また、これらのレトロウイルス配列は、何世代にもわたって、その潜在能力のいくつかの引き金を引き、病理学的プロセスを生じるか又は促進することができる個別の修飾を受けることもできる。
ヒト内在性レトロウイルス配列（ＨＥＲＶ）は、ヒトゲノムの相当な部分に相当する。これらのレトロウイルス領域は、いくつかの形態で存在する：すなわち感染性レトロウイルスのＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ＬＴＲ構造との重要な類似性を示す反復核酸配列が側面に配置されているｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖモチーフを組み合わせる完全内在性レトロウイルス構造；先端切断レトロウイルス配列（例えば、そのレトロトランスポゾンは、そのｅｎｖドメインを欠いている）；及びｅｎｖ及びＬＴＲ領域を欠いているレトロポゾンで存在する。ウイルス粒子を取り除くことができるＥＲＶは、多くの場合、Ｃ型ＥＲＶと呼ばれる。
重要なＥＲＶとしては、ヒトテラトカルシノーマレトロウイルス（ＨＴＤＶ）、又はＨＥＲＶ−Ｋ（内在性プロウイルスからウイルス粒子を産生することが知られている内在性レトロウイルス）が挙げられる。Ｌｏｅｗｅｒら６８ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，２８０７−１５（１９８７）；Ｍｏｌｄら、４ Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７８０８２（２００５）。ＨＥＲＶ−Ｒは、それが多数の組織、例えば副腎皮質及び種々の腎臓腫瘍、例えば皮質腺腫及び褐色細胞腫で発現されることが認められていることから、別の重要なＥＲＶである。Ｋａｔｓｕｍａｔａら、６６ Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０９−１５（１９９８）。ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）は、誘導時に齧歯類動物由来の細胞培養物中で感染性ウイルス粒子を産生する別の重要なＥＲＶである。Ｋｈａｎ＆Ｓｅａｒｓ，１０６ Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．，３８７−９２（２００１）。実際に、細胞の代謝状態及び／又はタンパク質発現の速度を著しく変える細胞培養変化（例えば、ｐＨ、温度変化、酪酸ナトリウムの添加）は、ＣＨＯ細胞における内在性レトロウイルス合成の速度を測定できるほど増大させた。Ｂｒｏｒｓｏｎら、８０ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．，２５７−６７（２００２）。
ＨＥＲＶｄ（ヒト内在性レトロウイルスデータベース）（ＮＡＲ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｅｎｔｒｙ ｎｕｍｂｅｒ ０４９５）と呼ばれるオンラインデータベースは、種々の進行中のヒトゲノムプロジェクトにおいて主として得られたヒトゲノムヌクレオチド配列から編集されている。これは、ＨＥＲＶをスクリーニングするための比較的簡単で迅速な環境を提供し、レトロウイルスファミリーの分類及び特性決定を絶え間なく向上させることを可能にする。ＨＥＲＶｄデータベースは、現在、ヒトゲノムの９０％を越えるヒトゲノム由来のレトロウイルスを含有する。また、ＥＲＶ配列は、国立衛生研究所のオンライン「Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ」サイトによって容易に得ることができる。
さらにＥＲＶに関して、本発明の実施形態は、霊長類／ヒトクラスＩガンマＥＲＶ類、ｐｔ０１−Ｃｈｒ１０ｒ−１７１１９４５８、ｐｔ０１−Ｃｈｒ５−５３８７１５０１、ＢａＥＶ、ＧａＬＶ、ＨＥＲＶ−Ｔ、ＨＥＲＶ−Ｒ（ＨＥＲＶ−３、ＥＲＶ３ ｅｎｖ遺伝子、遺伝子ＩＤ：２０８６）、ＨＥＲＶ−Ｅ（ＥＲＶＥ１、遺伝子ＩＤ：８５３１４）、ＨＥＲＶ−ＡＤＰ、ＨＥＲＶ−１、ＭＥＲ４様、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ〔ＥＲＶＦＲＤ１、Ｅｎｖタンパク質、遺伝子ＩＤ：４０５７５４；チンパンジーＥｎｖタンパク質、遺伝子ＩＤ：４７１８５６；ドブネズミＨｅｒｖ−ｆｒｄ Ｅｎｖポリタンパク質、遺伝子ＩＤ：２９０３４８〕、ＨＥＲＶ−Ｗ〔ＥＲＶＷＥ２、ＥＲＶ−Ｗ、ｅｎｖ（Ｃ７）、メンバー２、チンパンジー、遺伝子ＩＤ：１００１９０９０５；ＨＥＲＶＷＥ１、ＥＲＶ−Ｗ、ｅｎｖ（Ｃ７）、メンバー１、遺伝子ＩＤ：３０８１６〕、ＨＥＲＶ−Ｈ（ＨＨＬＡ１、ＨＥＲＶ−Ｈ ＬＴＲ結合タンパク質１、遺伝子ＩＤ：１００８６、チンパンジー、遺伝子ＩＤ：７３６２８２；Ｈｈｌａ１、マウス遺伝子ＩＤ：６５４４９８；ＨＨＬＡ２、ＨＥＲＶ−Ｈ ＬＴＲ結合タンパク質２、遺伝子ＩＤ：１１１４８；ＨＨＬＡ３、ＨＥＲＶ−Ｈ ＬＴＲ結合タンパク質３、遺伝子ＩＤ：１１１４７；クセノプス属 ｈｈｌａ２、遺伝子ＩＤ：７３４１３１）、ＨＥＲＶＨ−ＲＴＶＬＨ２、ＨＥＲＶＨ−ＲＧＨ２、ＨＥＲＶ−Ｈコンセンサス、ＨＥＲＶ−Ｆｃ１；霊長類／ヒトイプシロン内在性レトロウイルスｈｇ１５−ｃｈｒ３−１５２４６５２８３；霊長類／ヒト Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ（イプシロン様）ＨＥＲＶＬ６６；霊長類／ヒトクラスＩＩＩＳｐｕｍａ様ＥＲＶ類 ＨＳＲＶ、ＨＦＶ、ＨＥＲＶ−Ｓ、ＨＥＲＶ−Ｌ、ＨＥＲＶＬ４０、ＨＥＲＶＬ７４；霊長類／ヒトデルタＥＲＶ ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２；霊長類／ヒトレンチＥＲＶ（レンチウイルス）ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２；霊長類／ヒトクラスＩＩ、ベータＥＲＶ類 ＭＰＭＶ、ＭＭＴＶ、ＨＭＬ１、ＨＭＬ２、ＨＭＬ３、ＨＭＬ４、ＨＭＬ７、ＨＭＬ８、ＨＭＬ５、ＨＭＬ１０、ＨＭＬ６、ＨＭＬ９、ヒトテラトカルシノーマ由来レトロウイルス（ＨＴＤＶ／ＨＥＲＶ−Ｋ）、又はＨＥＲＶ−Ｖ（ＨＥＲＶ−Ｖ１ Ｅｎｖ１、遺伝子ＩＤ：１４７６６４；ＨＥＲＶ−Ｖ２、ＨＳＶ２、遺伝子ＩＤ：１００２７１８４６）の少なくとも一つの遺伝子又はＬＴＲを標的とする。
本発明の方法で標的とすることができるさらなる霊長類ＥＲＶ遺伝子としては、ＬＯＣ４７１５８６（以下に類する：ＥＲＶ−ＢａｂＦｃｅｎｖプロウイルス祖先Ｅｎｖポリプロテイン、チンパンジー遺伝子ＩＤ：４７１５８６）、ＬＯＣ４７０６３９（以下に類する：ＥＲＶ−ＢａｂＦｃｅｎｖプロウイルス祖先ポリプロテイン、チンパンジー遺伝子ＩＤ：４７０６３９）、ＬＯＣ１００１３８３２２〔以下に類する：ＨＥＲＶ−Ｋ＿７ｐ２２．１プロウイルス祖先Ｐｏｌタンパク質、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）遺伝子ＩＤ：１００１３８２２〕；ＬＯＣ１１０１３８４３１（以下に類する：ＨＥＲＶ−Ｋ＿１ｑ２２プロウイルス祖先 Ｐｏｌタンパク質、ウシ遺伝子ＩＤ：１００１３８４３１）；ＬＯＣ１００１３７７５７（以下に類する：ＨＥＲＶ−Ｋ＿６ｑ１４．１プロウイルス祖先 Ｇａｇ−Ｐｏｌポリプロテイン、ウシ遺伝子ＩＤ：１００１３７７５７）；ＬＯＣ１００１４１０８５（以下に類する：ＨＥＲＶ−Ｋ＿８ｐ２３．１プロウイルス祖先 Ｐｏｌタンパク質、ウシ遺伝子ＩＤ：１００１４１０８５）；ＬＯＣ１００１３８１０６〔以下に類する：ＨＥＲＶ−Ｆ（ｃ）１＿Ｘｑ２１．３３プロウイルス祖先 Ｇａｇポリプロテイン、ウシ遺伝子ＩＤ：ＬＯＣ１００１３８１０６〕；ＬＯＣ１００１４０７３１（以下に類する：ＨＥＲＶ−Ｗ＿３ｑ２６．３２プロウイルス祖先 Ｇａｇポリプロテイン、ウシ、遺伝子ＩＤ：１００１４０７３１）；ＬＯＣ１００１３９６５７（以下に類する：ＨＥＲＶ−Ｗ＿３ｑ２６．３２プロウイルス祖先 Ｇａｇポリプロテイン、ウシ、遺伝子ＩＤ：１００１３９６５７）が挙げられる。
本発明の別の実施形態において、ＥＲＶは、齧歯類動物クラスＩＩ、ベータＥＲＶマウス乳腺腫瘍（ＭＭＴＶ、遺伝子ＩＤ：２８２８７２９；ＭＭＴＶｇｐ７、遺伝子ＩＤ：１４９１８６３；ＭＭＴＶ ｅｎｖ遺伝子ＩＤ：１４９１８６２；ＭＭＴＶｇｐ１、遺伝子ＩＤ：１７２４７２４；ＭＭＴＶｇｐ２、遺伝子ＩＤ：１７２４７２３；ＭＭＴＶ ｐｏｌ遺伝子ＩＤ：１４９１８６５；ＭＭＴＶ ｐｒｏ、遺伝子ＩＤ：１４９１８６５；ＭＭＴＶ ｇａｇ、遺伝子ＩＤ：１４９１８６４）；齧歯類動物クラスＩガンマＥＲＶ ＭＬＶ（Ｍｌｖ１、マウス遺伝子ＩＤ：１０８３１７）；ネコクラスＩガンマＥＲＶ ＦＬＶ；有蹄動物クラスＩガンマＥＲＶ ＰＥＲＶ；有蹄動物デルタＥＲＶ ＢＬＶ；有蹄動物レンチウイルスビスナ、ＥＩＡＶ；有蹄動物クラスＩＩ、ベータＥＲＶ ＪＳＲＶ；トリクラスＩＩＩ、Ｓｐｕｍａ様ＥＲＶ類 ｇｇ０１−ｃｈｒ７−７１６３４６２；ｇｇ０１−ｃｈｒＵ−５２１９０７２５、ｇｇ０１−Ｃｈｒ４−４８１３０８９４；トリアルファＥＲＶ類 ＡＬＶ（ＡＬＶ ｐｏｌ遺伝子ＩＤ：１４９１９１０；ＡＬＶ ｐ２、遺伝子ＩＤ：１４９１９０９；ＡＬＹ ｐ１０、遺伝子ＩＤ：１４９１９０８；ＡＬＶ ｅｎｖ、遺伝子ＩＤ：１４９１９０７；ＡＬＶ貫膜タンパク質、ｔｍ、遺伝子ＩＤ：１４９１９０６；ＡＬＶトランス作用因子、遺伝子ＩＤ：１４９１９１１）、ｇｇ０１−ｃｈｒ１−１５１６８８４５；トリ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ベータ様ＥＲＶ類 ｇｇ０１−ｃｈｒ４−７７３３８２０１；ｇｇ０１−ＣｈｒＵ−１６３５０４８６９、ｇｇ０１−ｃｈｒ７−５７３３７８２；爬虫類Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ベータ様ＥＲＶ インドニシキヒビ；魚類イプシロンＥＲＶ ＷＤＳＶ；魚類Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ（イプシロン様）ＥＲＶ ＳｎＲＶ；両生類イプシロンＥＲＶ Ｘｅｎ１；昆虫エランティウイルスＥＲＶ Ｇｙｐｓｙ；又はサッカロミセス・セレヴィシエ、酵母ＯＲＦ１６１のＴｙ１〔ＥＲＶ−１様タンパク質、シオミドロウイルス１、遺伝子ＩＤ：９２０７１６〕である。
また、本明細書に述べるＥＲＶに関して、ＨＥＲＶ−Ｋ ＥＲＶ類が、種々の刺激によって活性化することができることから、特に関連性がある。従って、本発明の態様は、ＨＥＲＶ−Ｋファミリー、例えばＨＥＲＶ−Ｋ３、遺伝子ＩＤ：２０８８；ＨＥＲＶ−Ｋ２、遺伝子ＩＤ：２０８７；ＨＥＲＶ−Ｋ＿１１ｑ２２．１プロウイルス祖先Ｐｏｌタンパク質、遺伝子ＩＤ：１００１３３４９５；ＨＥＲＶ−Ｋ７、遺伝子ＩＤ：４４９６１９；ＨＥＲＶ−Ｋ６、遺伝子ＩＤ：６４００６；ＨＥＲＶ−Ｋ（１）、ＥＲＶＫ４、遺伝子ＩＤ：６０３５９；及びＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）、ＥＲＶＫ５、遺伝子ＩＤ：６０３５８；ＬＯＣ１００１３３４９５（ＨＥＲＶ−Ｋ＿１１ｑ２２．１プロウイルス祖先Ｐｏｌタンパク質、遺伝子ＩＤ：１００１３３４９５）の遺伝子を標的とする。
本明細書に記載のように、本発明の特定の態様において、標的遺伝子は、ＥＲＶ ｅｎｖ遺伝子、例えばｅＥＲＶファミリーＷ、ｅｎｖ（Ｃ７）、メンバー１（ＥＲＶＷＥ１）、遺伝子ＩＤ：３０８１６；ＬＯＣ１４７６６４（ＨＥＲＶ−Ｖ１又はＥｎｖＶ１）、遺伝子ＩＤ：１４７６６４；ＨＥＲＶ−ＦＲＤプロウイルスＥｎｖポリタンパク質（ＥＲＶＦＲＤＥ１）、遺伝子ＩＤ：４０５７５４及び遺伝子ＩＤ：４７１８５６；ＥＲＶ配列Ｋ、６（ＥＲＶＫ６又はＨＥＲＶ−Ｋ１０８）、遺伝子ＩＤ：６４００６；ＥＲＶ配列３エンベロープタンパク質（ＥＲＶ３）、遺伝子ＩＤ：２０８６及び遺伝子ＩＤ：１００１９０８９３；ＡＬＶＥｎｖタンパク質、遺伝子ＩＤ：１４９１９０７、又はＨＥＲＶ−Ｋ１８のＥｎｖタンパク質である。
一つの実施形態において、ＨＥＲＶ−Ｋ Ｅｎｖ１の発現は、配列番号：３２８７２７０−３２８７５６９（センス）及び配列番号：３２８７５７０−３２８７８６９（アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節できる。
ＥＲＶ遺伝子及び調節配列を標的とする他に、本発明のいくつかの実施形態は、ＥＲＶ受容体を標的とする。例えば、ヒト溶質担体ファミリー１（中性アミノ酸輸送体）、メンバー５（ＳＬＣ１Ａ５、遺伝子ＩＤ：６５１０）は、サルＤ型レトロウイルス及びネコ内在性ＲＤ−１１４ウイルスの受容体である。溶質担体ファミリー１（グルタミン酸／中性アミノ酸輸送体）、メンバー４（Ｓｌｃ１ａ４、遺伝子ＩＤ：５５９６３）及びメンバー５（Ｓｌｃ１ａ５、遺伝子ＩＤ：２０５１４）は、関連タンパク質のマウスバージョンである。ヒト溶質担体ファミリー１（グルタミン酸／中性アミノ酸輸送体）、メンバー４（ＳＬＣ１Ａ４、遺伝子ＩＤ：６５０９）は、ＨＥＲＶ−Ｗ Ｅｎｖ糖タンパク質によって受容体として使用される。従って、細胞ウイルス受容体の抑制は、受容体干渉、潜在ウイルス、内在性ウイルス又は外来ウイルスの感染を減少させることができ、従って細胞において生物由来物質の産生を増大させることができる。
潜在ウイルス
ボルナウイルスは、細胞核において持続感染を確立する非分節マイナス一本鎖非レトロウイルスＲＮＡウイルスの属である。ボルナウイルス核タンパク質（Ｎ）遺伝子と相同性の要素が、いくつかの哺乳動物種のゲノムに存在し、内在性Ｂｏｒｎａ様Ｎ（ＥＢＬＮ）要素をコードするｍＲＮＡを産生する。Ｈｏｒｉｅら、４６３ Ｎａｔｕｒｅ，８４−８７（２０１０）。従って、本発明のいくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ボルナウイルス遺伝子である。
本発明の方法で標的とすることができる潜在ＤＮＡウイルスとしては、アデノウイルスが挙げられる。例えば、血清型Ｃアデノウイルスの種は、ヒト組織において潜伏感染を確立することができる。Ｇａｒｎｅｔｔら、８３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２４１７−２８（２０００）参照。トリアデノウイルス及びアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）タンパク質は、特異的病原体を含まないニワトリによって産生されており、トリＡＡＶがニワトリの生殖細胞系において潜伏感染として存在し得ることを示す。Ｓａｄａｓｉｖら、３３ Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．，１２５−３３（１９８９）；またＫａｔａｎｏら、３６ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ．，６７６−８０（２００４）も参照。本発明のいくつかの実施形態において、標的遺伝子は、潜在ＤＮＡウイルスである。例えば、標的遺伝子は、ＨＨＶ−４（ＥＢＶ）、遺伝子ＩＤ：３７８３７５１由来の潜在性膜タンパク質（ＬＭＰ）−２Ａであることができ、そのタンパク質もＨＥＲＶ−Ｋ１８のＥｎｖタンパク質を転写活性化する。
サーコウイルス科は、潜在期を示すＤＮＡウイルスである。ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）は、ロタウイルスワクチンが調製されるＶｅｒｏ細胞バンクに混入することが見出され、ワクチンの投与に関して一時的なＦＤＡ停止命令を生じる。Ａｓｓｏｃ．Ｐｒｅｓｓ．，Ｍａｒｃｈ ２３（２０１０）。ＰＣＶ１のｒｅｐ遺伝子は、ウイルスＤＮＡの複製に不可欠である。Ｍａｎｋｅｒｔｚ＆Ｈｉｌｌｅｎｂｒａｎｄ，２７９ Ｖｉｒｏｌ．，４２９−３８（２００１）。従って、本発明の特定の実施形態は、ＰＣＶ１ ｒｅｐ遺伝子を抑制するＲＮＡエフェクター分子を提供する。例示的ｄｓＲＮＡ分子が、本明細書において提供される。
本発明の実施形態は、ＰＣＶ１ ｒｅｐ又はｃａｐ遺伝子を抑制するＲＮＡエフェクター分子を提供する。ＰＣＶ１のｒｅｐ遺伝子は、ウイルスＤＮＡの複製に不可欠である。Ｍａｎｋｅｒｔｚ＆Ｈｉｌｌｅｎｂｒａｎｄ，２７９ Ｖｉｒｏｌ．，４２９−３８（２００１）。特定の実施形態において、ＰＣＶ１ Ｒｅｐタンパク質の発現は、配列番号：３１５２８２４−３１５３４８５（センス）、配列番号：３１５３４８６−３１５４１４７（アンチセンス）、及び本明細書に提供される表からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節できる。
別の特定の実施形態において、ＰＣＶ１ Ｃａｐタンパク質の発現は、配列番号：３１５４７３１−３１５４７７８（センス）、配列番号：３１５４７７８−３１５４８２６（アンチセンス）、及び本明細書において提供される表からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節できる。
外来ウイルス
本明細書で使用する「外来ウイルス」又は「外来ウイルス作用物質」とは、生物由来物質内に存在するウイルス混入物、例えばワクチン、細胞株及びその他の細胞由来物質を指す。ワクチン製品に関して、例えば、外来性の外来ＡＬＶは、種々の製造業者によってＣＥＦ又はＤＥＦ細胞培養において増殖された市販のマレック病ワクチンにおいて認められた。また、これらのワクチンのいくつかも、内在性ＡＬＶを混入している。Ｆａｄｌｙら、５０ Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３８０−８５（２００６）；Ｚａｖａｌａ＆Ｃｈｅｎｇ，５０ Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０９−１５（２００６）。
本発明の他の実施形態は、外来動物ウイルス、例えばベシウイルス、ブタサーコウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ブタパルボウイルス、アデノ随伴ウイルス、レオウイルス、狂犬病ウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、レポリポックスウイルス、及び白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ハンターンウイルス、マルブルグウイルス、ＳＶ４０、ＳＶ２０、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、サルウイルス５（ｓｖ５）、ネコ肉腫ウイルス、ブタパルボウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ又はＭＭＬＶ、ｇａｇタンパク質遺伝子ＩＤ：１４９１８７０）、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、マウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ）、タイラー脳脊髄炎ウイルス（ＴＨＥＭＶ）、ネズミ微小ウイルス（ＭＭＶ又はＭＶＭ、遺伝子ＩＤ：２８２８４９５、ｖｐ１、遺伝子ＩＤ：１４８５９２；ｖｐ、遺伝子ＩＤ：１４８９５９１；ｎｓ１、遺伝子ＩＤ：１４８９５９０）、マウスアデノウイルス（ＭＡＶ）、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、マウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）、キルハムラットウイルス（ＫＲＶ）、トゥーランＨ−１ウイルス、センダイウイルス〔ＳｅＶ、ネズミパラインフルエンザ１型ウイルス又は日本のヘマグルチン化ウイルス（ＨＶＪ）としても知られている〕、ラットコロナウイルス〔ＲＣＶ又は唾液腺涙腺炎ウイルス（ＳＤＡ）〕、偽性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、カシェ渓谷ウイルス、ウシ下痢症ウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシアデノウイルス、ウシパルボウイルス、ウシヘルペスウイルス１（ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス）、その他のウシヘルペスウイルス、ウシレオウイルス、その他のウシヘルペスウイルス、ウシレオウイルス、ブルータングウイルス、ウシポリオーマウイルス、ウシサーコウイルス、及び牛痘以外のオルトポックスウイルス、偽牛痘ウシ（ヒトに感染し得る広範囲にわたるパラポックスウイルス）、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、レポリポックスウイルス、又は外来性レトロウイルスの遺伝子を標的とする。
特定の実施形態において、ＭＭＬＶ Ｇａｇタンパク質の発現は、配列番号：３２８７８７０−３２８８１１８：（センス）及び配列番号：３２８８１１９−３２８８３６７（アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節できる。
特定の実施形態において、ベシウイルスの発現は、配列番号：３１５２６０４−３１５２７１３及び本明細書に提供される表からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節できる。
他の実施形態は、ヒト起源の外来作用物質、例えばＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２；ヒトＴ細胞リンパ指向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）及びＨＴＬＶ−ＩＩ；ヒト肝炎Ａ型、Ｂ型及びＣ型ウイルス；ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；ＥＢＶ；ＨＨＶ６、７及び８；ヒトパルボウイルスＢ１９；レオウイルス；ポリオーマ（ＪＣ／ＢＫ）ウイルス；ＳＶ４０ウイルス；ヒトコロナウイルス；ヒトパピローマウイルス；インフルエンザＡ型、Ｂ型及びＣ型ウイルス；種々のヒトエンテロウイルス；ヒトパラインフルエンザウイルス；及びヒト呼吸器合胞体ウイルスを標的とする。
パルボウイルス科は、約４〜５ｋｂのゲノムを有する一本鎖ＤＮＡウイルスである。このファミリーとしては、ディペンドウイルス、例えばヒトヘルパー依存性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型１−８、自律性トリパルボウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ１−８）；エリスロウイルス、例えばウシ、シマリス及び自律性霊長類パルボウイルス、例えばヒトパルボウイルスＢ１９（第五病の原因）及びＶ９；並びにその他の動物及び齧歯類動物、肉食性動物及びブタのパルボウイルスを含むパルボウイルス、例えばＭＶＭが挙げられる。これらのパルボウイルスは、いくつかの細胞型に感染することができ、臨床試料に記載されている。ＡＡＶは、特に、その他のウイルスの複製、増殖及び成長の低下に関与している。
ＭＶＭは、ビリオンタンパク質１（ＶＰｌ、ＭＭＶｇｐ３とも呼ばれる）、すなわちＭＶＭマイナーコートタンパク質、遺伝子ＩＤ：１４８９５９２のＮ末端で発現される脂肪分解酵素、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）を配置することによって細胞に侵入する。Ｆａｒｒら、１０２ ＰＮＡＳ，１７１４８−５３（２００５）。他のＭＶＭの標的はＭＶＭ ＶＰ（ＭＭＶｇｐ２とも呼ばれる）、遺伝子ＩＤ：１４８９５９１；及びＭＶＭ非構造、開始タンパク質（ＮＳ１、ＭＭＶｇｐ１とも呼ばれる）、遺伝子ＩＤ：１４８９５９０から選択することができる。特定の実施形態において、ＭＶＭ ＮＳ２タンパク質の発現は、配列番号：３２８５５２４−３２８５８２７（センス）及び配列番号：３２８５８２８−３２８６１３１（アンチセンス）からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する対応ＲＮＡエフェクター分子を使用することによって調節できる。
ポリオーマウイルスは、例えば、ヒト、霊長類、齧歯類動物、ウサギ及び鳥類に感染することができる二本鎖ＤＮＡウイルスである。ポリオーマウイルス（ＰｙＶ）としては、ＳＶ４０、ＪＣ及びＢＫウイルス、ネズミ肺向性ウイルス、ハムスターＰｙＶ、ネズミＰｙＶウイルス及びリンパ指向性パポーバウイルス（ＬＰＶ、アフリカミドリザルパポーバウイルス）が挙げられる。これらのウイルスの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ経由で入手できる。また、米国特許出願公開第２００９／０２２０９３７号明細書も参照。これらの腫瘍形成能及び発癌能のために、ワクチン生産に使用される細胞基質においてこれらのウイルスを排除することが重要である。
パピローマウイルス科は、種々様々な宿主特異性及び配列相同性を示す１５０を越える公知の種を含む。これらは、哺乳動物（ヒト、サル、ウシ、イヌ、ヒツジ）及び鳥類において特定されている。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の大部分、例えば生殖器及び粘膜ＨＰＶと伝統的に呼ばれる全てのＨＰＶ種は、スーパーグループ（ｓｕｐｅｒｇｒｏｕｐ）Ａに属する。スーパーグループＡの中には、１１の群がある；これらの群の最も医学的に重要なものは、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ６及びＨＰＶ２である。これらのヒトパピローマウイルスのそれぞれは、医学文献において「危険度の高いウイルス」として報告されている。
外来性レトロウイルスは、種々様々な種にわたる動物において種々の悪性及び非悪性疾患を引き起こすことが知られている。これらのウイルスは、ほとんどの公知の動物及び齧歯類動物に感染する。例として、デルタレトロウイルス（ＨＴＬＶ−１、−２、−３、及び−４、ＳＴＬＶ−１、−２及び−３）、ガンマレトロウイルス（ＭＬＶ、ＰＥＲＶ）、アルファレトロウイルス（トリ白血病ウイルス及びトリ内在性ウイルス）、並びにＨＩＶ１及び２が挙げられる。
本発明の実施形態が関連する可能性のある外来混入物であるその他のウイルスファミリーとしては、ブニヤウイルス科（ＬＣＭＶ、ハンタウイルス）、ヘルペスウイルス科（ヒトヘルペスウイルス１−８型、ウシヘルペスウイルス、イヌヘルペスウイルス及びサルサイトメガロウイルス）、肝炎ウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）、ヘペウイルス科（Ｅ型肝炎ウイルス）、デルタウイルス（肝炎デルタウイルス）、アデノウイルス科（ヒトアデノウイルスＡ−Ｆ型及びネズミアデノウイルス）、コロナウイルス科、フラビウイルス科（ウシウイルス性下痢症ウイルス、ＴＢＥ、黄熱ウイルス、デング熱ウイルス１−４型、ＷＮＶ及びＣ型肝炎ウイルス）、オルトミクソウイルス科（インフルエンザ）、パラミクソウイルス科（パラインフルエンザ、おたふく風邪、はしか、ＲＳＶ、マウスの肺炎ウイルス、センダイウイルス及びサルパラインフルエンザウイルス５型）、トガウイルス科（西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、風疹ウイルス）、ピコルナウイルス科（ポリオウイルス１−１３型、コクサッキーＢ型、エコーウイルス、ライノウイルス、ヒト肝炎Ａ、ヒトコクサッキーウイルス、ヒトカルジオウイルス、ヒトライノウイルス及びウシライノウイルス）、レオウイルス科（マウスロタウイルス、レオウイルス３型及びコロラドダニコレラウイルス）及びラブドウイルス科（水疱性口内炎ウイルス）が挙げられる。
例えば、生物由来物質を調製するのに使用されるマウス及びハムスター細胞バンクは、ヒトに対して病原性であることが知られているウイルスに感染させることができる。マウス細胞バンクは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、センダイウイルス、ハンターンウイルス及び／又は乳酸デヒドロゲナーゼウイルスを保有することができる；ハムスター細胞バンクは、ＬＣＭ、センダイウイルス及び／又はレオウイルス３型を保有することができる。実際に、遺伝子導入マウス由来の細胞から産生される商業的に入手できるモノクロナール抗体は、ウイルス、例えばＬＣＭ、エクトロメリアウイルス（ＭＥＶ）、マウス脳脊髄炎ウイルス（ＧＤＶＩＩ）、ハンターンウイルス、ＭＶＭ、マウスアデノウイルス（ＭＡＶ）、マウス肝炎イルス（ＭＨＶ）、マウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ）、ポリオーマウイルス、レオウイルス３型（ＲＥＯ−３；ウイルス標的）、センダイウイルス（ＳｅＶ）、未成熟マウス伝染性下痢症ウイルス（ＥＤＩＭ）、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、パポーバウイルスＫ及びＬＤＶＨウイルス；Ｔｈｙｍｉｃ Ａｇｅｎｔウイルス；ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤ）、感染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）ウイルス、呼吸器感染パラインフルエンザ−３（ＰＩ−３）ウイルス、パピローマウイルス（ＢＰＶ）及びアデノウイルス−３（ＢＡＶ−３）ウイルス；及びヤギ（ｇｏａｔ）アデノウイルス（ＣＡＶ）、ヘルペスウイルス（ＣＨＶ）及び関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ウイルスについて検査される。Ｇｅｉｇｅｒｔ，ＣＨＡＬＬＥＮＧＥ ＯＦ ＣＭＣ ＲＥＧＵＬＡＴＯＲＹ ＣＯＭＰＬＩＡＮＣＥ ＦＯＲ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴIＣＡＬＳ、１０９−１１（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００４）；ＢＬＡ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｎｏ．９８−９９１２，Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ Ｄｅｔａｉｌｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｖｉｅｗ（１９９７）；ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊ．（Ｆａｌｌ，２００９）参照。
いくつかの実施形態において、宿主細胞における生物由来物質の産生は、細胞に、細胞増殖、細胞分裂、細胞生存性、アポトーシス、細胞の免疫反応、養分取り込み及び／又は細胞内の細胞増殖及び／又は分裂に関連するその他の特性に影響を及ぼすさらなるＲＮＡエフェクター分子を導入することによって高められる。別の実施形態において、産生は、細胞に、増殖期の間に生物由来物質の発現を一時的に抑制する細胞ＲＮＡエフェクター分子を導入することによって高められる。
ＩＶ．トランスクリプトーム
また、本発明の実施形態は、「ＣＨＯ細胞トランスクリプトーム」とも呼ばれるＣＨＯ細胞において発現される一組の転写産物を提供し、またＣＨＯ細胞トランスクリプトームの転写産物のいずれか一つを標的とするために設計されたｓｉＲＮＡ分子を提供する。エフェクターＲＮＡを調節するＣＨＯ細胞を選択し、設計するための系統的ＣＨＯ細胞転写産物配列データベースの形でのトランスクリプトームの使用が、方法及びシステムの形で提供される。別の実施形態は、さらに、ＣＨＯトランスクリプトームにおける転写産物のそれぞれを標的とするｓｉＲＮＡの選択、及び例えば、生体分子の産生を向上させるためのＣＨＯ細胞を操作又は修飾するためのその使用を提供する。従って、特定の実施形態は、修飾ＣＨＯ細胞を提供する。
種々の条件下でプールされたＣＨＯ細胞、例えば早期、中期及び後期対数期細胞において発見された一組の転写産物を、合成培地の下での標準的な条件で３７℃及び２８℃で増殖させた。転写産物を、例えば、表１〜１６に、並びに配列番号：１−９７７１（３７℃）及び配列番号：３１５７１４９−３１５８４２０（２８℃）に示す。
ＣＨＯトランスクリプトームの発見は、ＣＨＯ細胞において一つ又はそれ以上の細胞プロセスを特異的に部分変更するのに有用であり、例えばこのような細胞における生体分子の産生に有用である。例えば、公知の発現された転写産物に基づいて、アポトーシス調節遺伝子、細胞周期遺伝子、ＤＮＡ増幅（ＤＨＦＲ）調節遺伝子、ウイルス遺伝子産生調節遺伝子、例えば、細胞において生体分子の産生を駆動するのに使用されるウイルスプロモーターの場合には、グリコシル化関連遺伝子、炭素代謝調節遺伝子、酸化促進酵素コード遺伝子を調節できる。公知の発現された遺伝子又は転写産物を調節することによって、タンパク質折りたたみ、メチオニン酸化、タンパク質ピログルタミン酸化、ジスルフィド結合形成、タンパク質分泌、細胞生存性、細胞の特異的生産性、栄養必要量、細胞内ｐＨを調節できる。
宿主細胞、特にＣＨＯ細胞において生物由来物質の産生を調節する方法であって、宿主細胞を、ＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、少なくとも標的遺伝子の一部分と相補的である）と接触させ、宿主細胞を、バイオリアクター中で前記標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合、前記調節は、生物由来物質の産生を高める）及び生物由来物質を宿主細胞から単離する工程を含む方法が、提供される。
この開示は、ＣＨＯトランスクリプトームの転写産物の核酸配列、前記転写産物が翻訳されるタンパク質、及び転写されたタンパク質が役割を果たすいくつかの経路を含む。また、この記載は、トランスクリプトームの配列を標的とするために設計されるＲＮＡエフェクター分子としてのｓｉＲＮＡ分子の編集も記載する。また、公知のトランスクリプトーム転写産物配列に基づいて、細胞、特にＣＨＯ細胞において遺伝子の発現を調節するのに適切なＲＮＡエフェクター分子を選択するためのシステム、例えばコンピュータ支援システム、及び方法、例えばコンピュータ支援方法も記載される。
ＣＨＯ細胞トランスクリプトーム：本発明者らは、ＣＨＯ細胞において発現された定義された一組の転写産物を発見した。定義された一組の転写産物は、本明細書において「トランスクリプトーム」と呼ぶ。転写産物名、転写産物が役割を果たす少なくとも一つの経路、関連する配列番号（一つ又は複数）及び対応する典型的なｓｉＲＮＡ分子配列番号を、本明細書に示す表（例えば、表１〜１６、２１〜２５、２７〜３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１〜６１、６５及び６６参照）のいずれかにリストとして示す。
ＣＨＯ細胞トランスクリプトームにおける転写産物の配列は、関連する配列番号：１−９７７１及び配列番号：３１５７１４９−３１５８４２０に示す。
従って、一つの実施形態において、本発明は、配列番号：１−９７７１（３７℃）及び／又は配列番号：３１５７１４９−３１５８４２０（２８℃）を有する転写産物の選択又は編集を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞トランスクリプトームを提供する。いくつかの実施形態において、前記ＣＨＯトランスクリプトームは、本質的に配列番号：１−９７７１及び／又は配列番号：３１５７１４９−３１５８４２０を有する転写産物の選択又は編集からなる。いくつかの実施形態において、前記ＣＨＯ細胞トランスクリプトームは、配列番号：１−９７７１を有する転写産物の選択又は編集からなる。いくつかの実施形態において、前記ＣＨＯトランスクリプトームは、配列番号：１−９７７１及び／又は配列番号：３１５７１４９−３１５８４２０を有する転写産物の選択又は編集からなる。いくつかの実施形態において、前記ＣＨＯ細胞トランスクリプトームは、配列番号：３１５７１４９−３１５８４２を有する転写産物の選択又は編集からなる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に示す表（例えば、表１〜１６、２１〜２５、２７〜３０、５２〜６１、６５及び６６参照）のいずれかに示すＣＨＯ細胞トランスクリプトーム転写産物のいずれか一つに向けられる少なくとも一つのｓｉＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡは、表１〜１６、２１〜３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５２〜６１及び６３に示すｓｉＲＮＡの群から選択される。いくつかの実施形態において、全ての転写産物配列番号が本明細書に記載の表に示されているとは限らない。いくつかの実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、配列番号：９７７２−３１５２３９９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含む。発現の改良された品質／量のために調節できるさらなる標的が、本明細書に示される。
ＣＨＯ転写産物、すなわち配列番号：１−９７７１及び配列番号：３１５７１４９−３１５８４２０が、本明細書において提供される。これらの転写産物は、コードされるタンパク質名に割り当てることができ、機能群に分類することができる。特定の機能を有することが知られている配列に対する相同性によって転写産物を分類するために機能群を容易に調べることができる。一つの実施形態において、公知の機能的ドメインを使用し、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の相同性を探す。例えば、配列番号転写産物を、コードされるタンパク質及び機能の説明、例えば、表１３の細胞周期／細胞分裂転写産物と相互に関連付ける表１０〜１６を参照。転写産物を分類できる典型的なカテゴリーは、本出願明細書全体を通じて記載され、例えばアポトーシス、細胞周期遺伝子、ＤＮＡ増幅（ＤＨＦＲ）、グリコシル化、炭素代謝、酸化促進酵素、タンパク質折りたたみ、メチオニン酸化、タンパク質ピログルタミン酸化、ジスルフィド結合形成、タンパク質分泌、免疫反応、細胞栄養必要量、及びＲＮＡ干渉シャットダウンに関与するタンパク質をコードする転写産物（すなわち、標的遺伝子）を含む。機能が本明細書に具体的に挙げられていない本明細書に開示される転写産物について、当業者は、容易に、配列番号：１−９７７１及び配列番号：３１５７１４９−３１５８４２０の転写産物配列を、種々の生物のいずれかに見出される転写産物の配列情報と比較し（公知のアルゴリズム及びプログラムを使用して）、前記の機能及び／又はタンパク質コード名に割り当てることができる。例えば、当業者は、Ｆｒｅｉｔａｓら、７ ＩＥＥＥ／ＡＣＭ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＴＣＢＢ）１７２−８２（２０１０）；Ｒｅｎｔｚｓｃｈａ＆Ｏｒｅｎｇｏａ，２７ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２１０−１９（２００９）；Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎら、１０ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，２０７（２００９）又はＦｒｉｅｄｂｅｒｇ，７ Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２２５−４２（２００６）のいずれかに概説されているように、ワールドワイドウェブに見出される任意の予測方法、アルゴリズム及び／又は供給源及び用途を使用してタンパク質機能を予測するために、本明細書に記載の配列情報を使用できる。あるいは、転写産物配列は、生物の部分又は完全ゲノム（ゲノム情報）、例えばタンパク質コード又は非コード領域と比較することができる。
例えば配列番号：９７７２−３１５２３９９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３に記載されるようなｓｉＲＮＡを使用して標的転写産物を抑止することができる。特定のｓｉＲＮＡは、９０％相補的である相補的配列を含有する転写産物を探索することによって、その対応する標的と容易にマッチさせることができる。周知のアルゴリズムを使用して、本明細書において特定される転写産物を標的とするのに適切なＲＮＡエフェクター分子を決定することができる。例えば、当業者は、Ｐａｐｐａｓら、１２ Ｅｘｐ．Ｏｐ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ，１１５−２７（２００８）；Ｋｕｒｒｅｃｋら、２００９，４８ Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，１３７８−９８（２００９）；Ｇｒｅｄｅｌｌら、１６ Ｅｎｇｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔ．ｂｙ ＲＮＡ Iｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇｉｎ．，１７５−９４（２００９）；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４４６６２号（２００６年６月１５日）；同ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３９９３７号（２００９年１０月１５日）；又は同ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５１６４８号（２０１０年１月２８日）の各明細書に概説されているか又は記載されているように、ワールドワイドウェブに見出される任意の予測方法、アルゴリズム及び／又は供給源及び用途を使用して、本明細書に記載の転写産物を標的とするのに適切なＲＮＡ配列を決定するために、及びこれらのＲＮＡ配列に対する免疫反応を防止／促進するために、本明細書に記載の配列情報を使用できる。
従って、本明細書に記載のシステム（すなわち、細胞においてタンパク質の発現を調節するのに適した少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子の配列を選択するために）は、宿主細胞における任意の特定の機能を調節するのに使用できるＣＨＯ転写産物配列及びＲＮＡエフェクター分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）の両方を同定するのに使用できる。ＣＨＯ転写産物は、転写産物配列が、機能及びタンパク質名が知られている生物の転写産物に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％配列同一性を有する場合には、割り当てられた機能及び／又はコードされたタンパク質名である。
ＲＮＡエフェクター分子を選択するためのシステム及び方法：
既知のＣＨＯトランスクリプトームに基づき、本発明者らは、例えば、細胞における生体分子の産生を改善する細胞プロセスを操ることを通じて細胞に影響を与えるＲＮＡエフェクター分子を選択するための方法及びシステムを開発した。
したがって、本実施態様は、ＣＨＯトランスクリプトーム配列、及び、場合により、各転写産物の少なくとも一つの機能的態様（例えば、特定の細胞プロセスまたは経路における転写産物の役割、ならびに対応するｓｉＲＮＡ）を概説して、特にＣＨＯ細胞における生物学的プロセスの最適化に関して標的及びエフェクターＲＮＡ分子の設計及び選択を可能にするＣＨＯトランスクリプトームの体系的編集物も含む及び使用するデータベースならびにシステムを提供する。
転写産物の機能的態様は、例えば、アポトーシス、細胞周期、ＤＮＡ増幅（ＤＨＦＲ）、ウイルス遺伝子産生（例えば、細胞における生体分子の産生を推進するのに使用されるウイルスプロモーターの場合）、グリコシル化、炭素代謝、酸化促進酵素、タンパク質折り畳み、メチオニン酸化、タンパク質ピログルタミン酸化、ジスルフィド結合形成、タンパク質分泌、細胞生存性、細胞の特異的生産性、栄養要求、細胞内ｐＨにおけるそれらの役割に関する。他の細胞プロセスは、当業者に知られており、例えば、ワールドワイドウェブを通じて利用可能な遺伝子オントロジーデータベースで見ることができる。
したがって、図１６に示されるように、本発明は、細胞におけるタンパク質発現を調節するのに好適な少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子の配列を選択するためのシステム１００であって、処理装置１１２及び関連記憶装置１１４を有する計算装置１１０、ならびに、トランスクリプトームの各転写産物に関する配列、及び場合により転写産物の名称、及び転写産物が役割を果たす経路を含む少なくとも一つの細胞トランスクリプトーム情報；及び、ＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つの配列、及び場合によりＲＮＡエフェクター分子の標的特異性を含む少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子情報を含むデータベース１２０、ここで、各ＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも一つの細胞トランスクリプトームにおける少なくとも一つ以上の配列に適合するように設計される；計算装置１１０によって実行され、ユーザ入力装置１１８を介してユーザから受け取るように設定される、記憶装置１１４に保存されるコンピュータプログラム、細胞型選択、標的生物選択、細胞経路選択、交差反応性選択、標的遺伝子名称及び／または配列選択を含むパラメータ、ならびに、場合によりインビボまたはインビトロ送達オプションのいずれかを含む送達選択の方法；ならびに、さらに場合によりユーザアドレス情報；適合する組み合わせのパラメータ及びトランスクリプトーム転写産物配列に関して、パラメータをデータベース中の配列と照合するように設定された第一のモジュール；ならびに、細胞におけるタンパク質発現を調節するのに好適な少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子の選択された配列を表示する第二のモジュール、を含むシステムを提供する。
計算装置１１０、及び記憶装置１１４に保存される関連プログラムは、例えば、一つ以上のドロップダウン手段または構造化テキスト入力もしくは自由形式テキスト入力を使用して検索ターゲットパラメータをユーザが入力することを可能にし、所望の細胞における適切な標的を見つけるのに適切なパラメータを選択するグラフィカルユーザインターフェースなどのユーザインターフェースを提供するように改造ならびに設定され得る。例えば、ユーザが、ＣＨＯ細胞における炭素代謝を調節するための標的を見つけたい場合、ユーザが、標的細胞を「ＣＨＯ」として、そして経路を「炭素代謝」として特定すると、サーバーは、例えば、Ｇｌｕｔｓ、ＰＴＥＮ及びＬＤＨ遺伝子に関する転写産物を同定するであろうデータベースを通じて検索を実行し、それらをｓｉＲＮＡデータベース部分の適切なｓｉＲＮＡ分子と照合する。この出力情報は、コンピュータディスプレー１１６または他の出力装置（例えば、印刷装置）でユーザに提示され得る。
システムは、独立型システムまたはインターネットを利用したシステムであり得、ここで、エフェクターＲＮＡ分子の計算及び選択は、同じまたは別の場所で実行される。図１６に示されるように、トランスクリプトーム情報は、データベース１２０に保存され、計算装置１１０によってアクセスされ得る。本明細書において使用される場合、データベースという用語は、それが、要求された情報の検索を可能にする構造化または非構造化されたものであるかどうかにかかわらず、任意のデータ編成を含む。データベースは、記憶装置に保存されるフラットファイルまたはフラットファイルのセット、記憶装置に保存される一つ以上のテーブル、記憶装置に保存される不連続データ要素のセットであり得る。データベースはまた、ユーザがデータに直接的または間接的に（別のプログラムを通じて）アクセスすることを可能にする任意の周知データベースプログラムを含み得る。これらの例としては、ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ（登録商標）ＡＣＣＥＳＳ（登録商標）及びＯＲＡＣＬＥ（登録商標）データベースならびにＭＹＳＱＬ（登録商標）オープンソースデータベースが挙げられる。
図１７に示される本発明の代替的な実施態様では、システム２００は、ネットワークを基盤にしたシステムであり得る。システム２００は、サーバーシステム２１０、ならびに、ネットワーク２３０（例えば、プライベートユーザネットワーク、またはイーサネット（登録商標）、またはインターネット）に接続された一つ以上のクライアントシステム２４０及び２５０、を含み得る。サーバーシステム２１０ならびにクライアントシステム２４０及び２５０は、本明細書において記載されるように、計算装置であり得る。サーバーシステム２１０は、一つ以上の処理装置２１２、ならびに、関連記憶装置２１４、ならびに、サーバーシステム２１０の動作及び機能を管理するように改造及び設定された一つ以上のコンピュータプログラムまたはソフトウェアを含み得る。サーバーシステム２１０は、ワイヤーを介してまたは無線でネットワーク２３０に接続するための一つ以上のネットワークインターフェースを含み得る。サーバーシステムの例としては、ヒューレットパッカード開発会社、有限パートナーシップ；デル；及びＡＰＰＬＥ（登録商標）社から入手可能なＩＮＴＥＬ（登録商標）及びＡＭＤマイクロプロセッサのアーキテクチャに基づくコンピュータサーバーが挙げられる。
クライアントシステム２４０及び２５０は、一つ以上の処理装置２４２及び２５２、ならびに、関連記憶装置２４４及び２５４、ならびに、クライアントシステム２４０及び２５０の動作及び機能を管理するように改造及び設定された一つ以上のコンピュータプログラムまたはソフトウェア、を含み得る。クライアントシステム２４０及び２５０は、ワイヤーを介してまたは無線でネットワーク２３０に接続するための一つ以上のネットワークインターフェースを含み得る。クライアントシステムの例としては、ヒューレットパッカード開発会社、有限パートナーシップ；デル；及びＡＰＰＬＥ社から入手可能なＩＮＴＥＬ（登録商標）及びＡＭＤマイクロプロセッサのアーキテクチャに基づくデスクトップコンピュータ及びポータブルコンピュータ、ならびに、パーソナルデジタルアシスタント（ＰＤＡ）（例えば、ＤＲＯＩＤ（登録商標）、ＨＴＣ社）、スマートフォン（例えば、ＢＬＡＣＫＢＥＲＲＹ（登録商標）スマートフォン、リサーチ・イン・モーション社）、ｉＰｏｄ（登録商標）、ｉＰａｄ（商標）及びｉＰｈｏｎｅ（登録商標）装置（ＡＰＰＬＥ（登録商標）社）などのより小さなネットワークを可能にする携帯端末、が挙げられる。
一実施態様によれば、サーバーシステム２１０は、例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）もしくは．ＮＥＴ ＦＲＡＭＥＷＯＲＫ製品（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ（登録商標）社）またはアパッチオープンソースＨＴＴＰサーバー（アパッチソフトウェア財団）のインターネット情報サービス（ＩＩＳ）に基づくウェブサーバーであり、インターネットを介して遠隔クライアントシステムによってアクセスされるウェブ基盤アプリケーションを使用して、トランスクリプトーム情報のデータベースを検索し、細胞におけるタンパク質発現を調節するのに好適であり得るＲＮＡエフェクター分子を同定する。システムは、ユーザに配送されるべき同定されたＲＮＡエフェクター分子の所望量をユーザが選択及び購入することを可能にするフルフィルメントシステムを含み得るか、またはこれに接続され得る。
また、コンピュータによって実行されるソフトウェアを販売することによってもシステムを提供することができ、ここで、パラメータを配列情報及び他の情報と照合するデータベースならびにアルゴリズムは、ユーザに提供される。次いで、ユーザは、エフェクターＲＮＡ分子を合成するか、またはそれらを第三者供給業者に別々に注文することができる。
いくつかの実施態様では、システムは、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子をコンテナに保存するための記憶モジュールをさらに含み、ここで、２つ以上のＲＮＡエフェクター分子が存在する場合、各ＲＮＡエフェクター分子は別々のコンテナに保存され、ロボット式操作モジュールは、適合する組み合わせを選択すると、適合するコンテナを選択し、場合により、インビボまたはインビトロ送達に関するユーザの選択に基づいて添加物をコンテナに添加し、場合により、ユーザの住所に送られるべき適合するＲＮＡエフェクター分子を含むコンテナをさらに梱包する。ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの混合物に添加され得る例示的な添加物は、本明細書において記載されている。
記憶モジュールは、システムコンポーネントに連結された冷却モジュールであり得る。
システムはまた、核酸または他の生体分子合成装置にも連結され得る。
ロボット式操作モジュールは、記憶モジュール及びまたは生体分子合成装置から成分を取り出し、場合により混合し、場合によりコンテナを梱包する任意のシステムであり得る。ロボット式操作モジュールは、システムからの命令に基づき機能する一つ以上の部分を含み得る。ロボット式操作モジュールは、計算が実行される場所と同じまたは別の場所に存在し得る。
いくつかの実施態様では、システムは、細胞のゲノム情報をさらに含み、ここで、ユーザの選択によって、ＲＮＡエフェクター分子は、ゲノム中に存在するプロモーター、エンハンサー、イントロン及びエクソンを含む標的ゲノム配列と照合され得る。
本発明のいくつかの実施態様では、システムは、システムの特定のタスク（例えば、情報の入力及び出力を管理すること、情報を処理することなど）を実行し、システムを構成する一つ以上の計算装置上で及び該計算装置全体を通じてソフトウェアアプリケーションを実行することによって実行され得るハードウェアコンポーネント、またはハードウェアコンポーネント及びソフトウェアコンポーネントのシステム、を含み得る。本発明は、任意の便利な種類の計算装置（例えば、サーバー、メインフレームコンピュータ、ワークステーションなど）を含み得る。２つ以上の計算装置が存在する場所で、各装置は、例えば、イーサネット（登録商標）（有線または無線「ＷｉＦｉ」）、ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ（登録商標）技術、ＺＩＧＢＥＥ（登録商標）無線技術、ＡＴ＆Ｔ（商標）３Ｇネットワーク、またはＳＰＲＩＮＴ（商標）３Ｇもしくは３Ｇ／４Ｇネットワークを含む周知の相互接続技術を使用する任意の便利な種類のコミュニケーション相互接続（本明細書においてネットワークと称される）を介して接続され得る。２つ以上の計算装置が使用される場所で、装置は同じ場所に配置され得るか、またはそれらは物理的に離され得る。様々なオペレーティングシステムソフトウェアが任意の計算装置に採用され得、ここで、代表的なオペレーティングシステムとしては、ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ（登録商標）ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）オペレーティングシステム、ＭＡＣＯＳ（商標）オペレーティングシステムソフトウェア（ＡＰＰＬＥ（登録商標）社）、ＳＯＬＡＲＩＳ（登録商標）オペレーティングシステム（オラクル社）、ＬＩＮＵＸ（登録商標）（リナックスオンライン社）、ＵＮＩＸ（登録商標）サーバーシステム及びＯＳ／４００ソフトウェア（ＩＢＭ社）、ＡＮＤＲＯＩＤ（商標）（スプリント）、Ｃｈｒｏｍｅ ＯＳ（グーグル社）などが挙げられる。システムの機能要素もまた、様々なソフトウェアファシリテイター、プラットホームまたは他の便利な方法にしたがって実装され得る。
同じデータ入力（例えば、ファイル名またはディレクトリ名または検索語）がリンク項目（同じファイル中かどうかを問わず）を読み出すか、または一つ以上のリンク項目の入力が一つ以上の他のものを読み出す場合、データの項目は、記憶装置において互いに「リンク」され得る。
図１８は、本発明の一実施態様によるデータ構造の線図を示す。この実施態様では、入力フィールドの語は、例えば、データベース中の関連配列ＩＤによって標的ＲＮＡにリンクされ得、本発明によれば、一つ以上の入力フィールドの語を検索するソフトウェアモジュールを実行すると、一つ以上の標的の配列ＩＤが返ってくる。加えて、各標的ＲＮＡは、例えば、関連配列ＩＤによって一つ以上のＲＮＡエフェクター分子にリンクされ得、本発明によれば、同定された各標的に関して、ソフトウェアモジュールは、実行されて続いて同定された標的の一部またはすべてを検索し得、所望のＲＮＡエフェクター分子に関する一つ以上の配列ＩＤを返し、ＲＮＡエフェクター分子及びそれらの配列ＩＤのリストを返し得る。
または、同定された各標的に関して、所望のＲＮＡエフェクター分子を決定するための一つ以上の周知のアルゴリズムを実行するソフトウェアモジュールは、実行され、ＲＮＡエフェクター分子及びそれらの配列ＩＤのリストを返し得る。
図１９は、本発明の一実施態様によるＲＮＡエフェクター分子を同定するための方法のフローチャートを示す。方法４００は、所望の細胞における標的を見つけるための所望のパラメータをユーザが入力することを可能にする入力スクリーン４０２をユーザに提示する段階を含む。入力は、自由形式テキスト、またはユーザが所定の語を選択することを可能にする一つ以上のドロップダウンボックスであり得る。工程４０４において、ユーザが、適切なユーザインターフェース要素（例えば、「検索」ボタン）を選択すると、システムは、入力パラメータに関連する標的に関するデータベースを検索する。工程４０６において、ユーザは、各々がチェックボックスに関連する標的のリストを提示され得、ユーザは、各標的に関連するチェックボックスを選択または非選択して、検索をさらに絞り込むことができる。工程４０８において、ユーザが、適切なユーザインターフェース要素（例えば、「検索」ボタン）を選択すると、システムは、入力標的に関連するＲＮＡエフェクター分子に関するデータベースを検索して、及び／または、周知のアルゴリズムを使用して、入力標的に関連するＲＮＡエフェクター分子を決定し得る。システムは、例えば、ＲＮＡエフェクター分子を検索して、もし何も見つからない場合は周知のアルゴリズムを使用して、適切なＲＮＡエフェクター分子を決定し得る。続いて、決定された分子は、データベースに追加され、その後の検索で表示され得る。または、ＲＮＡエフェクター分子が見つからない場合でも、システムは、さらに、周知のアルゴリズムを使用して、さらなる適切なＲＮＡエフェクター分子を決定し得る。工程４１０において、ユーザは、データベースで見つかった情報から、報告されたＲＮＡエフェクター分子を注文するなどの任意の機能を提供され得る。例えば、米国特許公開第２００５／０２４０３５２号に記載されるように、オンライン入手が提供され得る。
システム、及びシステムを使用する方法の一例において、顧客などの者は、細胞株を使用したタンパク質生産の問題を経験している。問題は、例えば、グリコシル化（例えば、過度のフコシル化）などのタンパク質の翻訳後修飾及び／または別のプロセス（例えば、過度の乳酸の蓄積または過度の低収率）であり得る。
本発明のシステムは、ユーザが経験している問題もしくは複数の問題（過度に低い細胞増殖速度または過度のフコシル化）、及び／またはユーザが調節したい標的遺伝子もしくは転写産物、または複数の標的遺伝子もしくは転写産物（例えば、ＦＵＴ８、ＧＭＤＳ及び／またはＴＳＴＡ３）などのパラメータを、ユーザがユーザインターフェースに入力することを可能にする。
システムは、パラメータを取り上げ、それらを配列データ及びＲＮＡエフェクター分子データと照合し、提案されたＲＮＡエフェクター分子を顧客に配送する。例えば、システムは、細胞経路（例えば、グリコシル化）の問題を、グリコシル化において役割を果たすことが知られている転写産物と照合し得、次いで、これらの配列を標的とするＲＮＡエフェクター分子とマッチさせ、例えば、顧客が実験を行うことができるｓｉＲＮＡのリストを配送する。
顧客が一つ以上の配列を受け取ることを希望する場合、顧客は、適切な核酸を顧客が定義した場所に合成及び／もしくは送付するようシステムに命令または指示することができる。システムはまた、配列を作製するようヌクレオチド合成システムに指示を送り得る。合成装置は、他のシステム部分と同じ場所か、または他のシステム部分から遠く離れた場所に存在し得る。システムはまた、顧客が定義した場所に適切な分子が送付され得るように、記憶場所から既存の配列を選択し、包装情報を提供し得る。顧客が、ＲＮＡエフェクター分子の異なる混合物を取得することを希望する場合、当該物は、最終的な発注前に定義され得、次いで、システムは、例えば、アンチセンス及びセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ二本鎖などの適切なＲＮＡエフェクター分子を、一つのバイアルまたはチューブまたは他のコンテナ中で混合するようロボットコンポーネントに指示するであろう。
本発明者らは、ＣＨＯ細胞トランスクリプトームにおける少なくとも一つの転写産物を標的とするｓｉＲＮＡ分子のセットをさらに見出した。表１はまた、ＣＨＯ細胞トランスクリプトームにおける転写産物を標的とするｓｉＲＮＡ分子のセットを記載する。
したがって、本明細書において、例えば、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を、組換え抗体もしくは部分またはそれらの誘導体のフコシル化の調節を可能にする一つ以上のＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって、組換え抗体もしくは部分またはそれらの誘導体の産生を増強するための方法が提供される。例えば、配列番号３１５２７１４〜３１５２７５３は、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）の発現を調節するために、細胞と接触され得る。別の実施態様では、細胞は、一つ以上のＲＮＡエフェクター分子と接触され、ここで、該接触は、ＧＤＰ０マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤＳ）（例えば、配列番号５０６９によってコードされる）の発現を調節する。ＧＭＤＳを標的とするＲＮＡエフェクター分子は、配列番号１６８８２０２〜１６８８５１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する少なくとも１６個の連続するヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含み得る。
別の実施態様では、細胞は、一つ以上のＲＮＡエフェクター分子と接触され、ここで、該接触は、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースエピメラーゼ−レダクターゼ（ＴＳＴＡ３によってコードされる）（例えば、配列番号５５０５によってコードされる）をコードする遺伝子の発現を調節する。ＴＳＴＡ３を標的とするＲＮＡエフェクター分子は、配列番号１８３９５７８〜１８３９９３７からなる群から選択される少なくとも１６個の連続するヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）のオリゴヌクレオチド分子を含むアンチセンス鎖を含み得る。さらに別の実施態様では、細胞は、ＦＵＴ８、ＧＭＤＳ及びＴＳＴＡ３の２つ以上の発現を標的とする多数のＲＮＡエフェクター分子と接触される。
抗体のシアル含有量の減少は、ＡＤＣＣをさらに増加させると考えられる。したがって、さらに別の実施態様では、細胞は、一つ以上のＲＮＡエフェクター分子と接触され、ここで、該接触は、シアリルトランスフェラーゼの発現を調節する。細胞におけるシアリルトランスフェラーゼ活性は、細胞を、少なくとも一つのシアリルトランスフェラーゼ遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子と接触させることによって調節され得る。調節され得るシアリルトランスフェラーゼのいくつかの例、及びシアリルトランスフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖）の例は、例えば、調節され得るいくつかのシアリルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを標的とするＲＮＡエフェクター分子を掲載する表７に開示されている。
ハムスターのシアリルトランスフェラーゼを標的とするＲＮＡエフェクター分子は、本明細書において提示される配列番号（すなわち、配列番号６８１１０５〜６８１４５４、配列番号７０７５３５〜７０７８７０、配列番号１１３１１２３〜１１３１４４５、配列番号１１５５３２４〜１１５５７１１、配列番号１３９１０７９〜１３９１４４９、配列番号１４３５９８９〜１４３６３１７）のヌクレオチド配列を有する少なくとも１６個の連続するヌクレオチド（例えば、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個のヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。
さらに別の実施態様では、細胞は、ＦＵＴ８、ＧＭＤＳ及びＴＳＴＡ３の一つを標的とする少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子、ならびに一つのシアリルトランスフェラーゼを標的とする別のＲＮＡエフェクター分子と接触される。特定の実施態様では、細胞は、ＦＵＴ８及びＳＴ６（α−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−β−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ６を標的とするＲＮＡエフェクター分子と接触される。
本発明の実施態様は、当業者に知られているか、もしくは本明細書中の他の部分で同定された分子経路における転写産物またはタンパク質の活性を調節した。このような分子経路細胞活性としては、アポトーシス、細胞分裂、グリコシル化、増殖速度、細胞生産性、細胞密度のピーク、持続性細胞生存性、アンモニア産生もしくは蓄積の速度、または乳酸産生の速度が挙げられるが、これらに限定されない。表１０〜１６は、標的が細胞において果たすそれらの機能または役割に基づき、標的の例を示す：
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Ｖ．ＲＮＡエフェクター修飾
本発明のいくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡエフェクター分子）は、安定性または他の有益な特性を増強するために、化学修飾されている。一実施態様では、ＲＮＡエフェクター分子は、化学修飾されていない。
オリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ及びエクソヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの急速な分解を防止し、望ましくないオフターゲット効果を避けるために、修飾され得る。本発明において特徴付けられる核酸は、当技術分野で確立された方法（例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（Ｂｅａｕｃａｇｅら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）において記載されているもの）によって、合成及び／または修飾され得る。修飾としては、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、結合、逆結合など）または３’末端修飾（結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基もしくは拡張レパートリーのパートナーと塩基対をつくる塩基による置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、または結合塩基、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位または４’位における）または糖の置換、及び（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾または置換などのインターヌクレオシド結合修飾が挙げられる。本発明に有用なオリゴヌクレオチド化合物の具体例としては、修飾骨格を含むかまたは天然のインターヌクレオシド結合を含まないＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。修飾骨格を有するＲＮＡとしてはとりわけ、骨格においてリン原子を有しないものが挙げられる。本発明に有用なオリゴヌクレオチド化合物の具体例としては、修飾または非天然のインターヌクレオシド結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。修飾インターヌクレオシド結合を含むオリゴヌクレオチドとしてはとりわけ、インターヌクレオシド結合においてリン原子を有しないものが挙げられる。
本明細書の目的のために、そして当技術分野で時々参照されるように、そのインターヌクレオシド結合においてリン原子を有しない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考えられ得る。特定の実施態様では、修飾オリゴヌクレオチドは、そのインターヌクレオシド結合においてリン原子を有するであろう。本明細書の目的のために、そして当技術分野で時々参照されるように、そのインターヌクレオシド骨格においてリン原子を有しない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると考えられ得る。特定の実施態様では、修飾ＲＮＡは、そのインターヌクレオシド骨格においてリン原子を有するであろう。
修飾インターヌクレオシド結合（例えば、ＲＮＡ骨格）としては、例えば：ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートなどのメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートなどのホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’−５’結合、これらの２’−５’結合類似物を有するボラノホスフェート、ならびにヌクレオシド単位の隣接対が、３’−５’から５’−３’に結合か、または２’−５’から５’−２’に結合する逆極性を有するものが挙げられる。上記修飾物の種々の塩、混合塩、及び遊離酸形態もまた含まれる。
上記リン含有結合の調製を教示する代表的な特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，４６９，８６３号、米国特許第４，４７６，３０１号、米国特許第５，０２３，２４３号、米国特許第５，１７７，１９５号、米国特許第５，１８８，８９７号、米国特許第５，２６４，４２３号、米国特許第５，２７６，０１９号、米国特許第５，２７８，３０２号、米国特許第５，２８６，７１７号、米国特許第５，３２１，１３１号、米国特許第５，３９９，６７６号、米国特許第５，４０５，９３９号、米国特許第５，４５３，４９６号、米国特許第５，４５５，２３３号、米国特許第５，４６６，６７７号、米国特許第５，４７６，９２５号、米国特許第５，５１９，１２６号、米国特許第５，５３６，８２１号、米国特許第５，５４１，３１６号、米国特許第５，５５０，１１１号、米国特許第５，５６３，２５３号、米国特許第５，５７１，７９９号、米国特許第５，５８７，３６１号、米国特許第５，６２５，０５０号、米国特許第６，０２８，１８８号、米国特許第６，１２４，４４５号、米国特許第６，１６０，１０９号、米国特許第６，１６９，１７０号、米国特許第６，１７２，２０９号、米国特許第６，２３９，２６５号、米国特許第６，２７７，６０３号、米国特許第６，３２６，１９９号、米国特許第６，３４６，６１４号、米国特許第６，４４４，４２３号、米国特許第６，５３１，５９０号、米国特許第６，５３４，６３９号、米国特許第６，６０８，０３５号、米国特許第６，６８３，１６７号、米国特許第６，８５８，７１５号、米国特許第６，８６７，２９４号、米国特許第６，８７８，８０５号、米国特許第７，０１５，３１５号、米国特許第７，０４１，８１６号、米国特許第７，２７３，９３３号、米国特許第７，３２１，０２９号、及び米国特許第ＲＥ３９４６４号が挙げられるが、これらに限定されない。
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチドインターヌクレオシド結合（例えば、ＲＮＡ骨格）は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルインターヌクレオシド結合、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルインターヌクレオシド結合、または一つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式インターヌクレオシド結合によって形成されるインターヌクレオシド結合を有する。これらとしては、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分からの一部に形成された）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものを有するものが挙げられる。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な特許としては、米国特許第５，０３４，５０６号、米国特許第５，１６６，３１５号、米国特許第５，１８５，４４４号、米国特許第５，２１４，１３４号、米国特許第５，２１６，１４１号、米国特許第５，２３５，０３３号、米国特許第５，６４，５６２号、米国特許第５，２６４，５６４号、米国特許第５，４０５，９３８号、米国特許第５，４３４，２５７号、米国特許第５，４６６，６７７号、米国特許第５，４７０，９６７号、米国特許第５，４８９，６７７号、米国特許第５，５４１，３０７号、米国特許第５，５６１，２２５号、米国特許第５，５９６，０８６号、米国特許第５，６０２，２４０号、米国特許第５，６０８，０４６号、米国特許第５，６１０，２８９号、米国特許第５，６１８，７０４号、米国特許第５，６２３，０７０号、米国特許第５，６６３，３１２号、米国特許第５，６３３，３６０号、米国特許第５，６７７，４３７号、及び米国特許第５，６７７，４３９号が挙げられるが、これらに限定されない。
ＲＮＡエフェクター分子に使用するのに好適なまたは企図される他の修飾オリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオチド単位の糖及びインターヌクレオシド結合の両方、すなわち骨格を、新規の基で置換する。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示されているこのようなオリゴマー化合物の一つであるＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合されている。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号、米国特許第５，７１４，３３１号、及び米国特許第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、２５４ Ｓｃｉｅｎｃｅ １４９７−１５００（１９９１）において見られ得る。
本発明において特徴付けられるいくつかの実施態様は、ホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有するオリゴヌクレオチド、ならびにヘテロ原子骨格、そして特に−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここで、天然のホスホジエステルインターヌクレオシド結合は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］（米国特許第５，４８９，６７７号参照）及びアミド骨格（米国特許第５，６０２，２４０号参照）を有するオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、本明細書において特徴付けられるオリゴヌクレオチドは、モルホリノ骨格構造を有する（米国特許第５，０３４，５０６号参照）。
修飾オリゴヌクレオチドはまた、一つ以上の置換糖部分も含み得る。本明細書において特徴付けられるＲＮＡエフェクター分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、２’位に以下の一つを含み得る：Ｈ（デオキシリボース）、ＯＨ（リボース）、Ｆ、Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル、Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル、またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］］２が挙げられ、ここで、ｎ及びｍは１から１０である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、２’位に以下の一つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡエフェクター分子）の薬物動態特性を向上するための基、またはオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡエフェクター分子）の薬理特性を向上するための基、ならびに同様の特性を有する他の置換基を含む。いくつかの実施態様では、修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎら、７８ Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ４８６−５０４（１９９５））、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。別の例示的な修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書における実施例に記載されるように、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。
他の修飾としては、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾もまた、オリゴヌクレオチドの他の位、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位において作製され得る。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体も有し得る。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な特許としては、米国特許第４，９８１，９５７号、米国特許第５，１１８，８００号、米国特許第５，３１９，０８０号、米国特許第５，３５９，０４４号、米国特許第５，３９３，８７８号、米国特許第５，４４６，１３７号、米国特許第５，４６６，７８６号、米国特許第５，５１４，７８５号、米国特許第５，５１９，１３４号、米国特許第５，５６７，８１１号、米国特許第５，５７６，４２７号、米国特許第５，５９１，７２２号、米国特許第５，５９７，９０９号、米国特許第５，６１０，３００号、米国特許第５，６２７，０５３号、米国特許第５，６３９，８７３号、米国特許第５，６４６，２６５号、米国特許第５，６５８，８７３号、米国特許第５，６７０，６３３号、及び米国特許第５，７００，９２０号が挙げられるが、これらに限定されず、これらのいくつかは、本出願によって一般に所有される。
オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡエフェクター分子）はまた、核酸塩基（しばしば当技術分野において単に「塩基」と称される）修飾または置換も含み得る。本明細書において使用される場合、「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基としては、他の合成及び天然の核酸塩基、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン、２−（ハロ）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２（アミノ）アデニン、２−（アミノアルキル）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン、２−（アルキル）グアニン、２（プロピル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６（メチル）グアニン、７（アルキル）グアニン、７（メチル）グアニン、７（デアザ）グアニン、８（アルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、Ｎ（メチル）グアニン、２−（チオ）シトシン、３（デアザ）５（アザ）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３（メチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、６−（アゾ）シトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、２−（チオ）ウラシル、５（メチル）２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル、４−（チオ）ウラシル、５（メチル）４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル、５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル、５（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５（アミノアリル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、ウラシル−５オキシ酢酸、５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、６（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、５−ウラシル（すなわち、シュードウラシル）、２（チオ）シュードウラシル、４（チオ）シュードウラシル、２，４−（ジチオ）シュードウラシル（ｐｓｕｅｄｏｕｒａｃｉｌ）、５−（アルキル）シュードウラシル、５−（メチル）シュードウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）シュードウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）シュードウラシル、５−（アルキル）−４（チオ）シュードウラシル、５−（メチル）−４（チオ）シュードウラシル、５−（アルキル）−２，４（ジチオ）シュードウラシル、５−（メチル）−２，４（ジチオ）シュードウラシル、１置換シュードウラシル、１置換２（チオ）−シュードウラシル、１置換４（チオ）シュードウラシル、１置換２，４−（ジチオ）シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２（チオ）−シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）シュードウラシル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン（フェンチアジン（ｐｈｅｎｔｈｉａｚｉｎ））−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキル−ヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３−（メチル）イソカルボスチリリル（ｉｓｏｃａｒｂｏｓｔｙｒｉｌｙｌ）、５−（メチル）イソカルボスチリリル、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、７−（アザ）インドリル、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル（ｉｍｉｄｉｚｏｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル（ｐｙｒｒｏｌｏｐｙｒｉｚｉｎｙｌ）、イソカルボスチリリル（ｉｓｏｃａｒｂｏｓｔｙｒｉｌｙｌ）、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、２，４，５−（トリメチル）フェニル、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル（ｐｈｅｎａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）、ピレニル、スチルベニル（ｓｔｉｌｂｅｎｙｌ）、テトラセニル（ｔｅｔｒａｃｅｎｙｌ）、ペンタセニル（ｐｅｎｔａｃｅｎｙｌ）、ジフルオロトリル、４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンゾイミダゾール、４−（メチル）ベンゾイミダゾール、６−（アゾ）チミン、２−ピリジノン、５ニトロインドール、３ニトロピロール、６−（アザ）ピリミジン、２（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５置換ピリミジン、Ｎ２−置換プリン、Ｎ６−置換プリン、Ｏ６−置換プリン、置換１，２，４−トリアゾール、ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルソ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルソ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルソ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルソ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル、またはそれらの任意のＯ−アルキル化もしくはＮ−アルキル化誘導体が挙げられる。修飾核酸塩基としては、結合部分（例えば、リガンド）を含む天然の塩基も挙げられ得る。
さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号、ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ ＢＩＯＣＨＥＭ．，ＢＩＯＴＥＣＨ．＆ＭＥＤＩＣＩＮＥ（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８）、国際公開公報第ＷＯ２００９／１２０８７８号、ＣＯＮＣＩＳＥ ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ ＯＦ ＰＯＬＹＭＥＲ ＳＣＩＥＮＣＥ＆ＥＮＧＩＮ．８５８−５９（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０）、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、３０ Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．６１３（１９９１）、Ｓａｎｇｈｖｉ，１５ ＤＳＲＮＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ＆ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ２８９−３０２（Ｃｒｏｏｋｅ及びＬｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、１９９３）において開示されているものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明において特徴付けられるオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンなどの５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ、２７６−７８において）、さらにとりわけ２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、例示的な塩基置換である。
上記修飾核酸塩基のいくつか及び他の修飾核酸塩基の調製を教示する代表的な特許としては、上記米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、米国特許第５，１３０，３０号、米国特許第５，１３４，０６６号、米国特許第５，１７５，２７３号、米国特許第５，３６７，０６６号、米国特許第５，４３２，２７２号、米国特許第５，４５７，１９１米国特許第５，４５７，１８７号、米国特許第５，４５９，２５５号、米国特許第５，４８４，９０８号、米国特許第５，５０２，１７７号、米国特許第５，５２５，７１１号、米国特許第５，５５２，５４０号、米国特許第５，５８７，４６９号、米国特許第５，５９４，１２１，米国特許第５，５９６，０９１号、米国特許第５，６１４，６１７号、米国特許第５，６８１，９４１号、米国特許第６，０１５，８８６号、米国特許第６，１４７，２００号、米国特許第６，１６６，１９７号、米国特許第６，２２２，０２５号、米国特許第６，２３５，８８７号、米国特許第６，３８０，３６８号、米国特許第６，５２８，６４０号、米国特許第６，６３９，０６２号、米国特許第６，６１７，４３８号、米国特許第７，０４５，６１０号、米国特許第７，４２７，６７２号、及び米国特許第７，４９５，０８８号、及び米国特許第５，７５０，６９２号が挙げられるが、これらに限定されない。
オリゴヌクレオチドはまた、一つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾され得る。ロックド核酸は、修飾リボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、２’及び４’炭素を接続する特別な架橋を含む。この構造は、３’末端構造立体配座において、リボースを効果的に「ロック」する。ロックド核酸のオリゴヌクレオチド分子への付加は、血清中のオリゴヌクレオチド分子安定性を増加させ、オフターゲット効果を減少させることが示されている。Ｅｌｍｅｎら、３３ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３９−４７（２００５）、Ｍｏｏｋら、６ Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．８３３−４３（２００７）、Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒら、３１ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１８５−９３（２００３）、米国特許第６，２６８，４９０号、米国特許第６，６７０，４６１号、米国特許第６，７９４，４９９号、米国特許第６，９９８，４８４号、米国特許第７，０５３，２０７号、米国特許第７，０８４，１２５号、及び米国特許第７，３９９，８４５号。
場合によっては、ＲＮＡエフェクター分子のオリゴヌクレオチドは、非リガンド基によって修飾され得る。オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するために、多数の非リガンド分子がオリゴヌクレオチドに結合されており、このような結合を実施するための手順は科学文献で利用可能である。このような非リガンド部分としては、コレステロールなどの脂質部分（Ｋｕｂｏら、３６５ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．５４−６１（２００７））、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、８６ ＰＮＡＳ ６５５３（１９８９））、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、１９９４）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、１９９２、Ｍａｎｏｈａｒａｎら、１９９３）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、１９９２）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、１９９１、Ｋａｂａｎｏｖら、２５９ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３２７（１９９０）、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、７５ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７５（１９９３））、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、１９９５）、Ｓｈｅａら、１８ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７７７（１９９０））、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、１９９５）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、１９９６）が挙げられている。このようなＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は、本明細書において掲載されている。典型的な結合プロトコルは、配列の一つ以上の位置にアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドの合成を含む。次いで、適切なカップリング剤または活性化剤を使用して、アミノ基を結合すべき分子と反応させる。結合反応は、液相中で、固体支持体に常に結合しているＲＮＡ、または以下のＲＮＡの切断のいずれかと一緒に実施し得る。ＨＰＬＣによるＲＮＡ複合体の精製によって、通常、純粋な複合体が得られる。
例示的なＲＮＡエフェクター分子の核酸配列は、表１７の正式名称及び特に略号を使用して、以下に示される：
Figure 2014501097
 リガンド
本発明において特徴付けられるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡエフェクター分子）の別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布もしくは細胞取り込みを増強する一つ以上のリガンド、部分または複合体にオリゴヌクレオチドを化学的に結合することを含む。このような部分としては、コレステロールなどの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、８６ ＰＮＡＳ ６５５３−５６（１９８９）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、４ Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．１０５３−６０（１９９４））、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、６６０ Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３０６３０９（１９９２）、Ｍａｎｏｈａｒａｎら、３ Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．２７６５−７０（１９９３））、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、２０ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．５３３−３８（１９９２））、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、１０ ＥＭＢＯ Ｊ．１１１１−１８（１９９１）、Ｋａｂａｎｏｖら、２５９ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３２７−３０（１９９０）、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、７５ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ４９−５４（１９９３））、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、３６ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６５１−５４（１９９５）、Ｓｈｅａら、１８ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７７７−８３（１９９０））、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、１４ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ９６９−７３（１９９５））、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、１２６４ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２２９−３７（１９９５））、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、２２７ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．９２３−３７（１９９６））が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施態様では、リガンドは、リガンドが組み込まれるＲＮＡエフェクター分子剤の分布、ターゲッティング、または寿命を変える。いくつかの実施態様では、リガンドは、例えば、リガンドなどの種が存在しない場合と比較して、選択された標的（例えば、分子、細胞または細胞型、コンパートメント（例えば、細胞内または器官内コンパートメント）、組織、器官または身体の領域）に対する増強された親和性を提供する。
リガンドとしては、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸）、または脂質が挙げられ得る。リガンドはまた、合成高分子（例えば、合成ポリアミノ酸）などの組換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン無水マレイン酸共ポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル無水マレイン酸共ポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共ポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチドポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第４級塩、またはαヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドとしては、標的基、例えば、細胞または組織標的薬剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、腎細胞などの特定の細胞型に結合する抗体も挙げられ得る。標的基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタント・タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣薬であり得る。
リガンドの他の例としては、染料、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サップフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化薬、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボ核酸（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザ大環状分子のＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質（例えば、糖タンパク）、またはペプチド（例えば、コリガンドに対して特異親和性を有する分子）、または抗体（例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体）であり得る。リガンドとしては、ホルモン及びホルモン受容体も挙げられ得る。それらとしては、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド種も挙げられ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。
リガンドは、例えば細胞骨格を破壊するによって（例えば、細胞の微小管、微小繊維、及び／または中間径繊維を破壊することによって）、ＲＮＡエフェクター分子剤の細胞内への取り込みを増大させることができる物質（例えば、薬物）であり得る。薬物は、例えば、タクソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。
リガンドの例は、脂質または脂質に基づく分子である。このような脂質または脂質に基づく分子は、好ましくは血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、複合体の標的組織（例えば、身体の非腎標的組織）への分配を可能にする。例えば、標的組織は、肝実質細胞などの肝臓であり得る。ＨＳＡに結合することができる他の分子もまた、リガンドとして使用され得る。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンが使用され得る。脂質または脂質に基づくリガンドは、（ａ）複合体の分解に対する耐性を増大させ、（ｂ）標的細胞もしくは細胞膜へのターゲッティングまたは輸送を増大させ得、及び／または（ｃ）血清タンパク質（例えば、ＨＳＡ）への結合を調整するのに使用され得る。
脂質に基づくリガンドは、標的組織への複合体の結合を調節（例えば、制御）するのに使用され得る。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質に基づくリガンドは、腎臓を標的とする可能性が低く、したがって、胚から取り除かれる可能性が低い。ＨＳＡにあまり強く結合しない脂質または脂質に基づくリガンドは、複合体を腎臓に標的とするのに使用され得る。例えば、脂質に基づくリガンドはＨＳＡに結合するか、またはそれは、複合体が非腎組織に可逆的に分配されるように、十分な親和性によってＨＳＡに結合する。または、脂質に基づくリガンドは、複合体が腎臓に分配されるように、ＨＳＡに弱く結合するか、または全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分もまた、脂質に基づくリガンドの代わりに、またはそれに加えて使用され得る。
別の態様では、リガンドは、胚細胞（例えば、増殖細胞）によって取り込まれる部分（例えば、ビタミン）である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ及びＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、ビタミンＢ（例えば、葉酸）、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または胚細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。また、ＨＳＡ及び低密度リポタンパク質も挙げられる。
別の態様では、リガンドは、細胞浸透物質、好ましくはヘリックス細胞浸透物質（ｈｅｌｉｃａｌ ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）である。好ましくは、物質は両親媒性である。例示的な物質は、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。物質がペプチドである場合、それは、ペプチジル模倣、逆転異性体、非ペプチドまたは擬ペプチド結合、及びＤ−アミノ酸の使用などの修飾をされ得る。ヘリックス物質（ｈｅｌｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）は、αヘリックス物質であり得、親油性相及び疎油性相を含み得る。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣薬であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似する規定の３次元構造に折り畳まれることができる分子である。ペプチド及びペプチド模倣薬のＲＮＡエフェクター分子物質への付加は、例えば、細胞認識及び吸収を増大させることによってＲＮＡエフェクター分子の薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る（例えば、表１８参照）。
Figure 2014501097
 ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば、細胞浸透ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）、または架橋ペプチドであり得る。別の実施態様では、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号３２８４９５８）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含むＲＦＧＦ類似物（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号３２８４９５９））もまた、ターゲッティング部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質などの大きな極性分子を細胞膜のいたる所で運ぶ「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３２８４９６０））及びショウジョウバエ・アンテナペディア・タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２８４９６１））に由来する配列は、送達ペプチドとして機能し得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチドなどのランダム配列のＤＮＡによってコードされ得る。Ｌａｍら、３５４ Ｎａｔｕｒｅ ８２−８４（１９９１）。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ物質に繋留され得、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、またはＲＧＤ模倣薬などの細胞標的ペプチドである。記載されるように、ペプチド部分は、安定性を増大させるか、または配座特性を管理するなどの構造修飾を有し得る。本明細書において記載される任意の構造修飾が利用され得る。
ＲＧＤペプチド部分は、内皮系腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするのに使用され得る。Ｚｉｔｚｍａｎｎら、６２ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１３９−４３（２００２）。ＲＧＤペプチドは、ｄｓＲＮＡ物質が、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む様々な他の組織の腫瘍にターゲッティングするのを容易にし得る。Ａｏｋｉら、８ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７８３−８７（２００１）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、ＲＮＡエフェクター分子物質が腎臓にターゲッティングするのを容易にするであろう。ＲＧＤペプチドは、直線状または環状であり得るか、または特定の組織にターゲッティングするのを容易にするために修飾（例えば、グリコシル化またはメチル化）され得る。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、ＲＮＡエフェクター分子物質を、αＶβ３を発現する腫瘍細胞に送達し得る。Ｈａｕｂｎｅｒら、４２ Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３２６−３６（２００１）。
「細胞浸透ペプチド」は、細胞を浸透することができる。それは、例えば、αヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ−３７またはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−ディフェンシン、β−ディフェンシン、またはバクテネシン）、または一つもしくは２つの支配的アミノ酸（ｄｏｍｉｎａｔｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）のみを含むペプチド（例えば、ＰＲ−３９またはインドリシジン）であり得る。細胞浸透ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含み得る。例えば、細胞浸透ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメイン及びＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳに由来する二部分両親媒性ペプチド（例えば、ＭＰＧ）であり得る。Ｓｉｍｅｏｎｉら、３１ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７１７−２４（２００３）。
オリゴヌクレオチド複合体の調製を教示する代表的な特許としては、米国特許第４，８２８，９７９号、米国特許第４，９４８，８８２号、米国特許第５，２１８，１０５号、米国特許第５，５２５，４６５号、米国特許第５，５４１，３１３号、米国特許第５，５４５，７３０号、米国特許第５，５５２，５３８号、米国特許第５，５７８，７１７，米国特許第５，５８０，７３１号、米国特許第５，５９１，５８４号、米国特許第５，１０９，１２４号、米国特許第５，１１８，８０２号、米国特許第５，１３８，０４５号、米国特許第５，４１４，０７７号、米国特許第５，４８６，６０３号、米国特許第５，５１２，４３９号、米国特許第５，５７８，７１８号、米国特許第５，６０８，０４６号、米国特許第４，５８７，０４４号、米国特許第４，６０５，７３５号、米国特許第４，６６７，０２５号、米国特許第４，７６２，７７９号、米国特許第４，７８９，７３７号、米国特許第４，８２４，９４１号、米国特許第４，８３５，２６３号、米国特許第４，８７６，３３５号、米国特許第４，９０４，５８２号、米国特許第４，９５８，０１３号、米国特許第５，０８２，８３０号、米国特許第５，１１２，９６３号、米国特許第５，２１４，１３６号、米国特許第５，０８２，８３０号、米国特許第５，１１２，９６３号、米国特許第５，２１４，１３６号、米国特許第５，２４５，０２２号、米国特許第５，２５４，４６９号、米国特許第５，２５８，５０６号、米国特許第５，２６２，５３６号、米国特許第５，２７２，２５０号、米国特許第５，２９２，８７３号、米国特許第５，３１７，０９８号、米国特許第５，３７１，２４１，米国特許第５，３９１，７２３号、米国特許第５，４１６，２０３，米国特許第５，４５１，４６３号、米国特許第５，５１０，４７５号、米国特許第５，５１２，６６７号、米国特許第５，５１４，７８５号、米国特許第５，５６５，５５２号、米国特許第５，５６７，８１０号、米国特許第５，５７４，１４２号、米国特許第５，５８５，４８１号、米国特許第５，５８７，３７１号、米国特許第５，５９５，７２６号、米国特許第５，５９７，６９６号、米国特許第５，５９９，９２３号、米国特許第５，５９９，９２８号、米国特許第５，６８８，９４１号、米国特許第６，２９４，６６４号、米国特許第６，３２０，０１７号、米国特許第６，５７６，７５２号、米国特許第６，７８３，９３１号、米国特許第６，９００，２９７号、及び米国特許第７，０３７，６４６号が挙げられるが、これらに限定されない。
所定の化合物中のすべての位置が均一に修飾されることは必要ではなく、実際に、２つ以上の上記修飾は、単一の化合物中に、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにおいても組み込まれ得る。本発明はまた、キメラ化合物であるオリゴヌクレオチド分子化合物を含む。本発明の文脈において、「キメラ」ＲＮＡエフェクター分子化合物または「キメラ」は、２つ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチド化合物（例えば、ｄｓＲＮＡ）であり、ｄｓＲＮＡ化合物の場合、それぞれが少なくとも一つのモノマー単位（すなわち、ヌクレオチド）で構成されている。これらのＲＮＡエフェクター分子は、典型的には少なくとも一つの領域を含み、ここで、ＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解耐性の増大、細胞取り込みの増大及び／または標的核酸に対する結合親和性の増大をＲＮＡエフェクター分子に付与するように修飾される。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として働き得る。例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のＲＮＡエフェクター分子阻害の効率を非常に高める。その結果として、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同一の標的領域に対してハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いＲＮＡエフェクター分子を用いて同程度の結果がしばしば得られる。オリゴヌクレオチドの切断は、ゲル電気泳動によって、そして必要な場合には当技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、通常検出され得る。
ＶＩ．ＲＮＡエフェクター分子の導入／送達
本明細書で提供される方法によるオリゴヌクレオチド（例えばＲＮＡエフェクター分子）の細胞への送達は、多くの異なる方法で達成され得る。例えば、ＲＮＡエフェクター分子、例えばｄｓＲＮＡを含有する組成物を細胞培養物に投与することによって直接的に送達を実施することができる。あるいは、ＲＮＡエフェクター分子をコードし、その発現を指令する１またはそれ以上のベクターを細胞に投与することによって間接的に送達を実施することができる。これらの選択肢を本明細書中でさらに論じる。
一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、１もしくはそれ以上のｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡエフェクター分子または１もしくはそれ以上のｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡエフェクター分子をコードするＤＮＡを含有する侵入性細菌を細胞に導入すること（時としてトランスキングダムＲＮＡｉ（ｔｋＲＮＡｉ）と称されるプロセス）によって細胞に導入されるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡエフェクター分子である。侵入性細菌は、リステリア属、赤痢菌属、サルモネラ属、大腸菌もしくはビフィドバクテリウム属の弱毒株、または、例えば侵入性細菌が細胞の細胞質にアクセスすることを可能にする１もしくはそれ以上の遺伝子を導入することによって、その侵入特性を高めるように遺伝的に修飾された非侵入性細菌であり得る。そのような細胞質標的遺伝子の例は、リステリア属のリステリオリシンＯ及び偽結核エルジニア菌のインベーシンタンパク質を含む。トランスキングダムＲＮＡｉ（ｔｋＲＮＡｉ）を誘導するためにＲＮＡエフェクター分子を動物細胞に送達する方法は当技術分野において公知である。例えば、米国特許出願公開第２００８／０３１１０８１号及び同第２００９／０１２３４２６号参照。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡ分子である。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子はｓｈＲＮＡ分子ではない。
本明細書で述べるように、オリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防ぎ、望ましくないオフターゲット効果を回避するように修飾され得る。例えば、ＲＮＡエフェクター分子を、細胞取込みを増強し、分解を防ぐためにコレステロールなどの親油基に化学結合することによって修飾できる。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は親油基、例えばコレステロールへの化学結合によって修飾されない。
選択的実施形態では、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソームまたはカチオン送達システム（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）などの薬剤送達システムを用いてＲＮＡエフェクター分子を送達することができる。正に荷電したカチオン送達システムは、ＲＮＡエフェクター分子（負に荷電している）の結合を促進し、また効率的な細胞取込みを可能にする負に荷電した細胞膜での相互作用を増強する。カチオン性脂質、デンドリマーまたはポリマーをＲＮＡエフェクター分子に結合するか、またはＲＮＡエフェクター分子を包み込む小胞またはミセルを形成するように誘導することができる。例えば、Ｋｉｍら、１２９ Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌｅａｓｅ １０７−１６（２００８）参照。カチオン−ＲＮＡエフェクター分子複合体を作製し、使用するための方法は、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、３２７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７６１−６６（２００３）、Ｖｅｒｍａら、９ Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２９１−１３００（２００３）、Ａｒｎｏｌｄら、２５ Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ． １９７−２０５（２００７）参照。
ＲＮＡエフェクター分子が、センス鎖とアンチセンス鎖を含む、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの二本鎖分子である場合は、センス鎖とアンチセンス鎖を別々にかつ経時的に細胞、細胞溶解物、組織または細胞培養物に暴露することができる。「別々にかつ経時的に」という語句は、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子の各々の鎖を一本鎖形態で、例えば両方の鎖のアニーリングしていない混合物の形態でまたは各々の鎖の別々の、すなわち非混合製剤を細胞、細胞溶解物、組織または細胞培養物に導入することを指す。一部の実施形態では、各々の鎖の導入の間に、数秒間から数分間、さらには約１時間またはそれ以上、例えば１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、８４時間、９６時間または１０８時間またはそれ以上にわたり得る時間間隔が存在する。別々かつ経時的な投与は、正準または非正準ＲＮＡエフェクター分子を用いて実施できる。
複数のＲＮＡエフェクター分子を別々にかつ経時的に投与することも本明細書で企図される。従って、標的遺伝子に対する所望の平均パーセント阻害を達成するために複数のＲＮＡエフェクター分子の各々を別々の時点でまたは異なる頻度間隔で投与できる。例えば、Ｂａｋを標的するＲＮＡエフェクター分子はＬＤＨを標的するＲＮＡエフェクター分子よりも頻繁に投与することができ、これは、Ｂａｋの発現がＢａｋ ＲＮＡエフェクター分子での処理後により速く回復するためである。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を約０．０１ｎＭ〜２００ｎＭの濃度で添加する。別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を約５０ 分子／細胞〜５００，０００分子／細胞の量で添加する。別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を約０．１ｆｍｏｌ／１０６細胞〜約 １ｐｍｏｌ／１０６細胞の濃度で添加する。
別の態様では、標的遺伝子の発現を調節するためのＲＮＡエフェクター分子を、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入した転写単位から発現させることができる。例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅら、１２ ＴＩＧ ５−１０（１９９６）、国際公開広報第ＷＯ００／２２１１３号、国際公開広報第ＷＯ００／２２１１４号、米国特許第６，０５４，２９９号参照。発現は、使用される特定の構築物及び標的組織または細胞型に依存して、一過性（およそ数時間から数週間）または持続性（数週間から数か月間またはそれ以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、組込みまたは非組込みベクターであり得る、線状構築物、環状プラスミドまたはウイルスベクターとして導入できる。導入遺伝子はまた、染色体外プラスミドとして遺伝されることを可能にするように構築することもできる。Ｇａｓｓｍａｎｎら、９２ ＰＮＡＳ １２９２（１９９５）。
ＲＮＡエフェクター分子の個々の鎖または両方の鎖は、発現ベクター上のプロモーターから転写され得る。２つの別々の鎖を、例えばｄｓＲＮＡを生成するように発現させる場合、２つの別々の発現ベクターを標的細胞に同時導入することができる（例えばトランスフェクションまたは感染によって）。あるいは、ｄｓＲＮＡの各々個々の鎖は、両方ともが同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一つの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステム及びループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向反復配列として発現される。
ＲＮＡエフェクター分子発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞と適合性の発現ベクター、例えば脊椎動物細胞、昆虫細胞または酵母細胞と適合性のものは、本明細書で述べるＲＮＡエフェクター分子の発現のための組換え構築物を作製するために使用できる。真核細胞発現ベクターは当技術分野において周知であり、多くの商業的供給元から入手可能である。典型的には、所望核酸セグメントの挿入のために好都合な制限部位を含むそのようなベクターが提供される。ＲＮＡエフェクター分子発現ベクターは、標準的なトランスフェクション及び形質導入法を用いて標的細胞に直接的に送達できる。
ＲＮＡエフェクター分子発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えばＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）トランスフェクション試薬）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴＲＡＮＳＩＴ−ＴＫＯ（登録商標）トランスフェクション試薬、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）との複合体として標的細胞にトランスフェクトできる。１週間またはそれ以上の期間にわたって標的ＲＮＡの種々の領域を標的するＲＮＡエフェクター分子を介したノックダウンのための複数の脂質トランスフェクションも本発明によって企図される。宿主細胞へのベクターの導入の成功は、様々な公知の方法を用いて観測できる。例えば、一過性トランスフェクションは、蛍光マーカー、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーターで示され得る。エクスビボでの細胞の安定なトランスフェクションは、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定の環境因子（例えば抗生物質及び薬剤）に対する耐性を備えたトランスフェクト細胞を提供するマーカーを使用して確保され得る。ＲＮＡエフェクター分子発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えばＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）試薬）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴＲＡＮＳＩＴ−ＴＫＯ（登録商標）トランスフェクション試薬）との複合体として標的細胞にトランスフェクトできる。１週間またはそれ以上の期間にわたって標的ＲＮＡの種々の領域を標的するＲＮＡエフェクター分子を介したノックダウンのための複数の脂質トランスフェクションも本発明によって企図される。宿主細胞へのベクターの導入の成功は、様々な公知の方法を用いて観測できる。例えば、一過性トランスフェクションは、蛍光マーカー、例えばＧＦＰなどのレポーターで示され得る。エクスビボでの細胞の安定なトランスフェクションは、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定の環境因子（例えば抗生物質及び薬剤）に対する耐性を備えたトランスフェクト細胞を提供するマーカーを使用して確保され得る。
本明細書で述べる方法及び組成物に関して利用できるウイルスベクター系は、（ａ）アデノウイルスベクター、（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス等を含むがこれらに限定されない、レトロウイルスベクター、（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター、（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター、（ｅ）ＳＶ４０ベクター、（ｆ）ポリオーマウイルスベクター、（ｇ）パピローマウイルスベクター、（ｈ）ピコルナウイルスベクター、（ｉ）オルトポックス、例えばワクシニアウイルスベクターまたはアビポックス、例えばカナリアポックスまたはニワトリポックスウイルスベクターなどのポックスウイルスベクター、及び（ｊ）ヘルパー依存型またはガットレスアデノウイルスを含むが、これらに限定されない。複製欠損ウイルスも好都合であり得る。種々のベクターが細胞のゲノムに組み込まれるまたは組み込まれない。構築物は、所望する場合は、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物を、エピソーム複製することができるベクター、例えばＥＰＶ及びＥＢＶベクターに組み込むことができる。ＲＮＡエフェクター分子の組換え発現のための構築物は、一般に、標的細胞におけるＲＮＡエフェクター分子の発現を確実にするための調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー等を必要とする。ベクター及び構築物について考慮する他の態様を本明細書でさらに説明する。
ＲＮＡエフェクター分子の送達のために有用なベクターは、所望標的細胞または組織におけるＲＮＡエフェクター分子の発現のために十分な調節エレメント（プロモーター、エンハンサー等）を含む。調節エレメントは、構成的または調節的／誘導的発現のいずれかを提供するように選択され得る。
ＲＮＡエフェクター分子の発現は、例えば、特定の生理的調節因子、例えばグルコースレベルに対して感受性である誘導的調節配列を使用することによって正確に調節できる。Ｄｏｃｈｅｒｔｙら、８ ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０−２４（１９９４）。細胞におけるｄｓＲＮＡ発現の制御のために適切な、かかる誘導的発現系は、例えば、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学的誘導物質及びイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む。当業者は、ＲＮＡエフェクター分子導入遺伝子の意図される用途に基づいて適切な調節／プロモーター配列を選択することができる。
特定の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用できる。例えば、レトロウイルスベクターが使用できる。Ｍｉｌｌｅｒら、２１７ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８１−９９（１９９３）、米国特許第６，９４９，２４２号参照。レトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要な成分を含有する。ＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列を１またはそれ以上のベクターにクローニングし、これによって細胞への核酸の送達が促進される。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、例えば、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするためにｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するレトロウイルスベクターの使用を述べる、Ｂｏｅｓｅｎら、６ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ２９１−３０２（１９９４）に見出される。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓら、９３ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６４４−６５１（１９９４）、Ｋｉｅｍら、８３ Ｂｌｏｏｄ １４６７−７３（１９９４）、Ｓａｌｍｏｎｓ＆Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，４ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２９−１１（１９９３）、Ｇｒｏｓｓｍａｎ＆Ｗｉｌｓｏｎ，３ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｄｅｖｅｌ．１１０−１４（１９９３）を含む。使用のために企図されるレンチウイルスベクターは、例えば、米国特許第６，１４３，５２０号、同第５，６６５，５５７号、及び同第５，９８１，２７６号に記載されているＨＩＶベースのベクターを含む。
本明細書で論じるように、レトロウイルスの侵入のための宿主細胞表面受容体がＥＲＶ Ｅｎｖタンパク質によって占拠され得ること（ウイルス干渉）に留意すべきである。Ｍｉｌｌｅｒ，９３ ＰＮＡＳ １１４０７−１３（１９９６）参照。レトロウイルスエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質は、ウイルス粒子のそれらの細胞受容体への結合を媒介し、ウイルスの侵入を可能にする、新たな複製周期の第一段階である。ＥＲＶが細胞において発現された場合、関連する外因性レトロウイルスによる再感染が干渉を介して阻止される（受容体干渉とも呼ばれる）、細胞膜に挿入されたＥＲＶのＥｎｖタンパク質は、受容体競合によって対応する外因性ウイルスを妨げる。これは、細胞をレトロウイルスの過剰負荷から保護する。例えば、外因性ＪＳＲＶはすべて細胞ヒアルロニダーゼ２を受容体として利用するので、内因性ＪＳＲＶは外因性ＪＳＲＶの侵入をブロックすることができる。Ｓｐｅｎｃｅｒら、７７ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７４９−５３（２００３）。欠損ＥＲＶは全く干渉しないことに注目すべきである。２つの内因性ＪＳＲＶ、内因性ＪＳ５６Ａ１及び内因性ＪＳＲＶ−２０は、外因性ＪＳＲＶの後期複製を妨げ得る突然変異型Ｇａｇポリタンパク質を含有する。Ａｒｎａｕｄら、２ ＰＬｏＳ ｅ１７０（２００７）。従って、欠損レトロウイルスと自律複製可能なレトロウイルスの間の干渉は、ＥＲＶコピー数の制御の重要な機構を提供する。ＥＲＶによって発現されるＥｎｖ分子（例えばＨＥＲＶ−Ｈファミリーによって発現される）による受容体干渉は、組換えタンパク質を生産することを意図された細胞のトランスフェクションまたは再感染を妨げ得る。そのような作用は、各々が一本の相補的な抗体鎖をコードする２つのレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた宿主細胞のような、レトロウイルスベクターを介した組換え宿主細胞における低いコピー数または低い発現を説明し得る。従って、ＥＲＶ Ｅｎｖタンパク質の発現を阻害する本実施形態の標的遺伝子は、宿主細胞におけるレトロウイルスベクターの多重度の上昇及び生物由来物質の収量の増大を提供する。
アデノウイルスもＲＮＡエフェクター分子の送達における使用のために企図される。本発明を特徴付けるＲＮＡエフェクター分子を発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｘｉａら、２０ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１００６−１０（２００２）に記載されている。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用も企図される（Ｗａｌｓｈら、２０４ Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２８９−３００（１９９３）、米国特許第５，４３６，１４６号）。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、例えばＵ６もしくはＨ１ ＲＮＡプロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組換えＡＡＶから２つの別々の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡを発現するための適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、６１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３０９６−１０１（１９８７）、Ｆｉｓｈｅｒら、７０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２０−３２（１９９６）、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、６３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３８２２−２６ （１９８９）、米国特許第５，２５２，４７９号及び同第５，１３９，９４１号、国際公開広報第ＷＯ９４／１３７８８号、同第ＷＯ９３／２４６４１号に記載されている。
もう一つのウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、例えば改変ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）もしくはＮＹＶＡＣなどの弱毒ワクシニアウイルス、ニワトリポックスもしくはカナリアポックスなどのアビポックスウイルスのようなポックスウイルスである。
ウイルスベクターの指向性は、適宜に、他のウイルスからのエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原でベクターを偽型化することによって、または異なるウイルスキャプシドタンパク質を代用することによって改変できる。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルス、バキュロウイルス等からの表面タンパク質で偽型化できる。モノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）、例えばＶＳＶまたはＲＳウイルス（ＲＳＶ）は、バキュロウイルスで偽型化できる。米国特許第７，０４１，４８９号。ＡＡＶベクターは、異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを遺伝子操作することによって異なる細胞を標的させることができる。例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、７６ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９１−８０１（２００２）参照。
一つの実施形態では、本発明は、本明細書で述べるＲＮＡエフェクター分子及び許容される担体を含有する組成物を提供する。ＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物は、細胞における標的遺伝子の発現または活性を調節することによって細胞による生物由来物質の産生を増強するために有用である。そのような組成物は、送達の方法に基づいて製剤される。生物由来物質の産生を改善するうえで有用な例示的ＲＮＡエフェクター分子が本明細書で提供される。一つの実施形態では、組成物中のＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡである。あるいは、組成物中のＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡではない。
別の実施形態では、ＩＮＦＲＡ１またはＩＦＮＢ遺伝子及びＰＴＥＮ、ＢＡＫ、ＦＮ１またはＬＤＨＡ遺伝子などの、免疫応答経路及び細胞プロセスの発現の阻害を可能にする複数のＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物が本明細書で提供される。組成物は、場合により、以下を含むがこれらに限定されない付加的な細胞プロセスを標的する少なくとも一つの付加的なＲＮＡエフェクター分子と組み合わせる（または投与する）ことができる：炭素の代謝及び輸送、アポトーシス、ＲＮＡｉの取込み及び／または効率、反応性酸素種の産生、細胞周期の制御、タンパク質の折りたたみ、ピログルタミン酸化タンパク質修飾、デアミダーゼ、グリコシル化、ジスルフィド結合の形成、タンパク質分泌、遺伝子増幅、ウイルス複製、ウイルス感染、ウイルス粒子の放出、ｐＨの制御ならびにタンパク質産生。
一つの実施形態では、本明細書で述べる組成物は複数のＲＮＡエフェクター分子を含有する。この態様の一つの実施形態では、複数のＲＮＡエフェクター分子の各々は異なる濃度で提供される。この態様の別の実施形態では、複数のＲＮＡエフェクター分子の各々は同じ濃度で提供される。この態様の別の実施形態では、複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも２つは同じ濃度で提供され、複数のうちの少なくとも一つの他のＲＮＡエフェクター分子は異なる濃度で提供される。ＲＮＡエフェクター分子及び濃度の様々な組合せが、本明細書で述べる所望作用を生じさせるために培養細胞に提供され得ることは当業者に認識される。
一つの実施形態では、第一ＲＮＡエフェクター分子を培養細胞に投与し、次に第二ＲＮＡエフェクター分子を細胞に投与する（または逆も同様である）。さらなる実施形態では、第一ＲＮＡエフェクター分子と第二ＲＮＡエフェクター分子を実質的に同時に培養細胞に投与する。
別の実施形態では、本明細書で述べるＲＮＡエフェクター分子、例えば宿主細胞標的遺伝子に対するｄｓＲＮＡを含有する組成物を、細胞による生物由来物質の産生を増強するために有用な非ＲＮＡ物質と共に培養細胞に投与する。
本明細書を特徴付ける組成物は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で投与される。一般に、ＲＮＡエフェクター分子の適切な用量は、１日につき単位容量当たり０．００１〜２００．０ｍｇの範囲内である。別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を１日当たり０．００１ｎＭ〜２００ｍＭの範囲内、一般に０．１ ｎＭ〜５００ｎＭ（両端を含む）の範囲内で提供する。例えば、ｄｓＲＮＡは単回用量当たり０．０１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１ｎＭ、１．５ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭまたは５００ｎＭで投与し得る。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を５０ｎＭ未満の濃度で投与するまたは細胞と接触させる。
組成物は１日１回投与することができ、またはＲＮＡエフェクター分子を、１日を通して適切な間隔で２、３もしくはそれ以上の分割用量としてまたは制御放出製剤による送達として投与できる。その場合、各分割用量に含まれるＲＮＡエフェクター分子は、総１日用量を達成するために対応してより少用量でなければならない。投与単位はまた、例えば数日間にわたるＲＮＡエフェクター分子の持続放出を提供する従来の持続放出製剤を用いて、数日間にわたる送達用に配合され得る。持続放出製剤は当技術分野で周知であり、本発明の物質に関して使用できるような、特定部位への薬剤の送達のために特に有用である。留意すべき点として、複数のＲＮＡエフェクター分子を投与する場合、ＲＮＡエフェクター分子の総用量が各々を単独で投与した場合よりも高くなることを考慮しなければならない。例えば、各々１ｎＭの３つのＲＮＡエフェクター分子の投与（例えば標的遺伝子発現の有効な阻害のため）は、必然的に細胞への３ｎＭの総用量を生じさせる。当業者は、ＲＮＡエフェクター分子または送達剤のいずれかの高濃度から生じる胚への望ましくない毒性作用を予防しつつ、各標的遺伝子の有効な阻害を生じさせるように各ＲＮＡエフェクター分子の必要量を変更することができる。
標的遺伝子の転写産物レベルへの単回用量の作用は、その後の用量が多くても３、４もしくは５日の間隔で、または多くても１、２、３または４週間の間隔で投与されるように、長時間作用性であり得る。
一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子の投与を、生物由来物質の単離の少なくとも６時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１８時間前、少なくとも３６時間前、少なくとも４８時間前、少なくとも６０時間前、少なくとも７２時間前、少なくとも９６時間前または少なくとも１２０時間前または少なくとも１週間前に停止する。従って一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子と宿主細胞（例えば大規模宿主細胞培養物中の）との接触は、生物由来物質の単離の少なくとも６時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１８時間前、少なくとも３６時間前、少なくとも４８時間前、少なくとも６０時間前、少なくとも７２時間前、少なくとも９６時間前または少なくとも１２０時間前または少なくとも１週間前に完了する。
また、特定の実施形態では、各細胞につき一定数（または少なくとも最小数）のＲＮＡエフェクター分子が維持されるように培養細胞をＲＮＡエフェクター分子と接触させることが有益であり得ることが留意される。ＲＮＡエフェクター分子自体のレベルを維持することにより、高い細胞密度であっても標的遺伝子発現の調節を確実に維持することができる。
あるいは、細胞密度に応じたＲＮＡエフェクター分子の量を投与することができる。かかる実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を少なくとも０．０１ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも０．１ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも０．５ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも０．７５ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも１ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも２ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも５ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも１０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも２０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも３０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも４０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも５０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも６０ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも１００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも２００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも３００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも４００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも５００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも７００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも８００ｆｍｏｌ／１０６細胞、少なくとも９００ｆｍｏｌ／１０６細胞または少なくとも１ｐｍｏｌ／１０６細胞またはそれ以上の濃度で添加する。
選択的実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を細胞につき少なくとも１０分子、細胞につき少なくとも２０分子（分子／細胞）、少なくとも３０分子／細胞、少なくとも４０分子／細胞、少なくとも５０分子／細胞、少なくとも６０分子／細胞、少なくとも７０分子／細胞、少なくとも８０分子／細胞、少なくとも９０分子／細胞、少なくとも１００分子／細胞、少なくとも２００分子／細胞、少なくとも３００分子／細胞、少なくとも４００分子／細胞、少なくとも５００分子／細胞、少なくとも６００分子／細胞、少なくとも７００分子／細胞、少なくとも８００分子／細胞、少なくとも９００分子／細胞、少なくとも１０００分子／細胞、少なくとも２０００分子／細胞、少なくとも５０００分子／細胞またはそれ以上（包括的）の用量で投与する。
一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を１０〜１００分子／細胞、１０〜９０分子／細胞、１０〜８０分子／細胞、１０〜７０分子／細胞、１０〜６０分子／細胞、１０〜５０分子／細胞、１０〜４０分子／細胞、１０〜３０分子／細胞、１０〜２０分子／細胞、９０〜１００分子／細胞、８０〜１００分子／細胞、７０〜１００分子／細胞、６０〜１００分子／細胞、５０〜１００分子／細胞、４０〜１００分子／細胞、３０〜１００分子／細胞、２０〜１００分子／細胞、３０〜６０分子／細胞、３０〜５０分子／細胞、４０〜５０分子／細胞、４０〜６０分子／細胞の範囲内またはそれらの間の任意の範囲内の用量で投与する。
本明細書で述べる方法の一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を持続注入中で細胞に提供する。持続注入は、ゼロ日目（例えば細胞培養の１日目またはＲＮＡエフェクター分子の接種の当日）に開始し得るかまたは生物由来物質の生産工程の間の任意の時点で開始できる。同様に、持続注入は生物由来物質の生産工程の間の任意の時点で停止できる。従って、ＲＮＡエフェクター分子または組成物の注入は、細胞増殖の特定の期、生産工程中の時間帯または任意の他の所望時点で提供及び／または除去できる。持続注入はまた、標的遺伝子に対する「所望平均パーセント阻害」［この用語が本明細書で使用される場合］を達成するように提供できる。
一つの実施形態では、細胞培養物へのＲＮＡエフェクター分子の初期ボーラス投与後に持続注入を使用することができる。この実施形態では、持続注入は、所望期間にわたってＲＮＡエフェクター分子の濃度を最小レベルより上に維持する。持続注入は、培養物０．０３ｐｍｏｌ／Ｌ／時〜培養物３ｐｍｏｌ／Ｌ／時、例えば０．０３ｐｍｏｌ／Ｌ／時、０．０５ｐｍｏｌ／Ｌ／時、０．０８ｐｍｏｌ／Ｌ／時、０．１ｐｍｏｌ／Ｌ／時、０．２ｐｍｏｌ／Ｌ／時、０．３ｐｍｏｌ／Ｌ／時、０．５ｐｍｏｌ／Ｌ／時、１．０ｐｍｏｌ／Ｌ／時、２ｐｍｏｌ／Ｌ／時または３ｐｍｏｌ／Ｌ／時またはそれらの間の任意の値の速度で送達され得る。
一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を滅菌水溶液として投与する。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を非脂質製剤中に製剤する。別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子をカチオン性または非カチオン性脂質製剤中に製剤する。さらに別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を、宿主細胞を培養するのに適した細胞培地（例えば無血清培地）中に製剤する。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子の初期濃度を、標的遺伝子の発現の調節を維持するためにＲＮＡエフェクター分子の持続注入で補完する。別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を、一定濃度（例えば１ｎＭ）を達成するためにボーラス投与において細胞増殖の特定の段階（例えば初期対数期）で培養細胞に適用し、ＲＮＡエフェクター分子の持続注入を行う。
ＲＮＡエフェクター分子は１日１回投与することができ、またはＲＮＡエフェクター分子治療は、生物由来物質の生産中を通して適切な間隔／頻度で組成物を培地に添加することによって反復できる（例えば２回、３回またはそれ以上の投与）。本明細書で使用される「頻度」という用語は、細胞培養物のトランスフェクションが生じる間隔であり、各標的遺伝子に対する所望阻害レベルを維持するように当業者によって最適化され得る間隔を指す。一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を４８時間ごとの頻度で培養細胞と接触させる。他の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を、生物由来物質の生産期間中、例えば４時間ごと、６時間ごと、１２時間ごと、１８時間ごと、２４時間ごと、３６時間ごと、７２時間ごと、８４時間ごと、９６時間ごと、５日ごと、７日ごと、１０日ごと、１４日ごと、３週間ごとまたはそれ以上の期間ごとの頻度で投与する。頻度はまた、各々の投与の間の間隔が異なるように（例えば最初は３６時間の間隔；２回目は４８時間の間隔；３回目は７２時間の間隔等）変化させ得る。
「頻度」という用語は、同様に生物由来物質の生産の間の細胞培養物の栄養供給にも適用され得る。ＲＮＡエフェクター分子での処理の頻度と栄養供給の頻度は同じである必要はない。明瞭にするため、栄養分は、ＲＮＡエフェクター処理の時点でまたは交互に添加することができる。栄養供給の頻度は、ＲＮＡエフェクター分子処理より短い間隔であってもよくまたはより長い間隔であってもよい。例えば、ＲＮＡエフェクター分子の用量を４８時間の間隔で適用し、栄養供給を２４時間の間隔で適用することができる。生物由来物質を生産するための間隔全体（例えば３週間）の間に、ＲＮＡエフェクター分子より多い栄養分の投与量またはＲＮＡエフェクター分子より少ない栄養分の投与量が供給され得る。あるいは、ＲＮＡエフェクター分子での処理の量は栄養供給の量に等しい。
ＲＮＡエフェクター分子処理の頻度は、特定標的遺伝子の「平均パーセント阻害」を維持するように最適化できる。本明細書で使用される、「所望平均パーセント阻害」という用語は、所望作用を生じさせるのに必要であり、かつ望ましくないまたは負の作用を生じさせる阻害の程度よりも低い、経時的な標的遺伝子発現の阻害の平均度合を指す。例えば、Ｂａｘ／Ｂａｋの所望阻害は、典型的にはアポトーシスの低減を生じさせるために＞８０％阻害であり、一方ＬＤＨの所望平均阻害は、高度のＬＤＨ平均阻害（例えば９０％）は細胞生存能を低下させるので、より低くてよい（例えば７０％）。一部の実施形態では、所望平均パーセント阻害は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも ９９％、さらには１００％（すなわち不在）である。当業者は、所望パーセント阻害についての上限（例えば望ましくない作用を生じさせる阻害のレベル）を決定するために通常の細胞死アッセイを使用することができる。当業者はまた、遺伝子調節を生じさせるＲＮＡエフェクター分子の量を決定するために標的遺伝子発現を検出する方法（例えばＰＥＲＴ）が使用できる。Ｚｈａｎｇら、１０２ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１４３８−４７（２００９）参照。阻害の量は動的であり、ＲＮＡエフェクター分子の用量間でわずかに変動し得るので、本明細書ではパーセント阻害を経時的な平均値として述べる。
本明細書で述べる方法の一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を培養細胞の培地に添加する。本明細書で述べる方法は、任意の大きさの細胞培養フラスコ及び／またはバイオリアクターに適用できる。例えば、該方法は、１Ｌ、３Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、４０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、２０００Ｌ、３０００Ｌ、４０００Ｌ、５０００Ｌまたはそれ以上のバイオリアクターまたは細胞培養物において適用できる。一部の実施形態では、細胞培養物の大きさは、０．０１Ｌ〜５０００Ｌ、０．１Ｌ〜５０００Ｌ、１Ｌ〜５０００Ｌ、５Ｌ〜５０００Ｌ、４０Ｌ〜５０００Ｌ、１００Ｌ〜５０００Ｌ、５００Ｌ〜５０００Ｌ、１０００Ｌ〜５０００Ｌ、２０００Ｌ〜５０００Ｌ、３０００Ｌ〜５０００Ｌ、４０００Ｌ〜５０００Ｌ、４５００Ｌ〜５０００Ｌ、０．０１Ｌ〜１０００Ｌ、０．０１Ｌ〜５００Ｌ、０．０１Ｌ〜１００Ｌ、０．０１Ｌ〜４０Ｌ、１５Ｌ〜２０００Ｌ、４０Ｌ〜１０００Ｌ、１００Ｌ〜５００Ｌ、２００Ｌ〜４００Ｌまたはそれらの間の任意の整数にわたり得る。
ＲＮＡエフェクター分子は、誘導期、定常期、初期対数期、中間対数期、後期対数期、指数期または死滅期を含むがこれらに限定されない、細胞増殖の任意の期の間に添加できる。細胞が死滅期に入る前に細胞をＲＮＡエフェクター分子と接触させることが好ましい。アポトーシス経路を標的する場合のような、一部の実施形態では、誘導期、初期対数期、中間対数期または後期対数期などの早期増殖期に細胞を接触させることが望ましいと考えられる（例えばＢａｘ／Ｂａｋ阻害）。他の実施形態では、例えば乳酸塩などの増殖制限生成物が形成される場合（例えばＬＤＨ阻害）、細胞増殖周期の後期（例えば後期対数期または定常期）に標的遺伝子発現を阻害することが望ましいまたは許容されると考えられる。
組成物
宿主細胞中の標的遺伝子の発現を調節することによって細胞培養物における生物由来物質の産生を増強するための組成物も提供される。
一つの実施形態では、本発明は、本明細書で述べるＲＮＡエフェクター分子及び許容される担体を含有する組成物を提供する。ＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物は、細胞における標的遺伝子の発現または活性を調節することによって細胞による生物由来物質の産生を増強するために有用である。そのような組成物は、送達の方法に基づいて製剤される。生物由来物質の産生を改善するうえで有用な例示的ＲＮＡエフェクター分子が本明細書で提供される。一つの実施形態では、組成物中のＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡである。あるいは、組成物中のＲＮＡエフェクター分子はｓｉＲＮＡではない。
本発明のＲＮＡエフェクター分子組成物は、水性、非水性または混合媒質中の懸濁液として製剤でき、また、例えば本明細書で述べるような、脂質または非脂質製剤中に製剤できる（例えば、本明細書の以下の表題の章参照：リガンド、脂質／オリゴヌクレオチド複合体、乳剤、界面活性剤、透過促進剤及び付加的な担体）。
一つの実施形態では、組成物は、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子及びＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬、例えば乳剤、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、荷電脂質、リポソーム、アニオン性脂質、透過促進剤、トランスフェクション試薬または結合のためのＲＮＡエフェクター分子への修飾物、例えばリガンド、標的部分、ペプチド、親油基等を含有する。
一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子組成物は、脂質Ｎｏ．２００としても知られる「脂質Ｈ」、脂質Ｎｏ．２０１としても知られる「脂質Ｋ」、脂質Ｎｏ．２０２としても知られる「脂質Ｌ」、脂質Ｎｏ．２０３としても知られる「脂質Ｍ」、脂質Ｎｏ．２０４としても知られる「脂質Ｐ」または脂質Ｎｏ．２０５としても知られる「脂質Ｒ」を含む、ＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬を含有し、前記脂質の式は以下のように示される：
Figure 2014501097
 別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物は、例えば宿主細胞の増殖に適した、増殖培地をさらに含有する。一つの実施形態では、増殖培地は、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）ＰＯＷＥＲＣＨＯ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＹＣＬＯＮＥ ＰＦ ＣＨＯ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＣＤ ＤＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｍｅｄｉｕｍ Ｍ１９９（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＯＰＴＩＰＲＯ（商標）ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）等のような化学的組成の明らかな培地である。ＲＮＡエフェクターは、理想的には、再溶解されたとき、好都合な投与単位であるような濃度、例えば１Ｌ培養物中での使用のために有用な濃度である。
さらに別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子組成物は、増殖培地添加物、例えば必須アミノ酸（例えばグルタミン）、２−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脂質濃縮物、コレステロール、カタラーゼ、インスリン、ヒトトランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、ビオチン、ＤＬ α−トコフェロールアセテート、ＤＬ α−トコフェロール、ビタミン類（例えばビタミンＡ（アセテート）、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ニコチンアミド、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、ｉ−イノシトール）、コルチコステロン、Ｄ−ガラクトース、エタノールアミンＨＣｌ、グルタチオン（還元型）、Ｌ−カルニチンＨＣｌ、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン２ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、Ｔ３（トリヨード−Ｉ−チロニン）、増殖因子（例えばＥＧＦ）、鉄、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、ヒポキサンチンナトリウム、アミノプテリン及びチミジン、アラキドン酸、エチルアルコール１００％、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、プルロニックＦ−６８（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ステアリン酸１０、ＴＷＥＥＮ ８０（登録商標）非イオン性界面活性剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ピルビン酸ナトリウム及びグルコースから成る群より選択される物質を含有する。
ＲＮＡエフェクター分子組成物は、滅菌溶液中でまたは凍結乾燥されて提供され得る。一つの実施形態では、組成物は、例えば様々な投与頻度及び用量、例えば本明細書で述べる頻度及び用量での投与に適したＲＮＡエフェクター分子を供給するために、濃度及び／または容量別に個別単位で包装される。
一つの実施形態では、組成物は、本明細書で述べる投与レジメンに従った、例えば６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間またはそれ以上の頻度での、細胞への投与用に製剤される。あるいは、組成物は持続注入用の用量で製剤される。
別々の標的遺伝子に対する２またはそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物も提供される。組成物は、培養細胞中の第一標的遺伝子及び少なくとも第二標的遺伝子の発現を調節することによって細胞培養物における生物由来物質の産生を増強するために使用できる。別の実施形態では、同じ標的遺伝子に対する２またはそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含有する組成物が提供される。
脂質／オリゴヌクレオチド複合体
一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬は、本明細書で述べる荷電脂質、乳剤、リポソーム、カチオン性または非カチオン性脂質、アニオン性脂質、トランスフェクション試薬または透過促進剤を含む。一つの実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬は、２００９年１２月７日出願の米国仮特許出願第６１／２６７，４１９号に記載されている荷電脂質を含む。
本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム内に封入され得るかまたはリポソームとの複合体、特にカチオン性リポソームとの複合体を形成し得る。あるいは、ＲＮＡエフェクター分子は、脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成し得る。適切な脂肪酸及びエステルは、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはＣ１〜２０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドまたはそれらの許容される塩を含むが、これらに限定されない。
一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は脂質製剤中に完全に封入される（例えばＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰまたは他の核酸−脂質粒子を形成するように）。「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定な核酸−脂質粒子：ＲＮＡエフェクター分子またはＲＮＡエフェクター分子がそこから転写されるプラスミドなどの核酸を含有する、水分量の低い内部を被覆する脂質の小胞を指す。ＳＮＡＬＰは、例えば米国特許出願公開第２００６／０２４００９３号、同第２００７／０１３５３７２号、同第２００９／０２９１１３１号、米国特許出願第１２／３４３，３４２号、同第１２／４２４，３６７号に記載されている。「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内に封入されたプラスミドＤＮＡを含有する核酸−脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、典型的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を防ぐ脂質（例えばＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＰＬＰは「ｐＳＰＬＰ」を包含し、ｐＳＰＬＰは、国際公開広報第ＷＯ００／０３６８３号に示されている封入された縮合剤−核酸複合体を含む。この実施形態の粒子は、典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、または約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、または約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、または典型的には約７０ｎｍ〜約９０ｎｍ（両端を含む）の平均直径を有し、実質的に非毒性である。加えて、本発明の核酸−脂質粒子中に存在する場合の核酸は、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性である。核酸−脂質粒子及びそれらの作製方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号、同第５，９８１，５０１号、同第６，５３４，４８４号、同第６，５８６，４１０号、同第６，８１５，４３２号、及び国際公開広報第ＷＯ９６／４０９６４号に報告されている。
脂質対薬剤の比率（質量／質量比）（例えば脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１または約６：１〜約９：１（両端を含む）の範囲内であり得る。
製剤のカチオン性脂質は、４〜１５のｐＫａを有する少なくとも一つのプロトン化可能な基を含有し得る。カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン、またはそれらの混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％〜約７０モル％（両端を含む）、または約４０モル％〜約６０モル％（両端を含む）を構成し得る。一つの実施形態では、カチオン性脂質はリガンドにさらに結合できる。
非カチオン性脂質は、アニオン性脂質または中性脂質、例えばジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物であり得る。非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％〜約９０モル％（両端を含む）、またはコレステロールが含まれる場合は、約１０モル％〜約５８モル％（両端を含む）であり得る。
粒子の凝集を阻害する脂質は、例えば、以下に限定しないが、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）またはそれらの混合物を含むポリエチレングリコール−脂質であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リピドであり得る。粒子の凝集を防ぐ脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％〜約２０モル％または約２モル％であり得る。一つの実施形態では、ＰＥＧ脂質はリガンドにさらに結合できる。
一部の実施形態では、核酸−脂質粒子は、例えば粒子中に存在する総脂質の約１０モル％〜約６０モル％（両端を含む）または約４８モル％の、コレステロールなどのステロイドをさらに含む。
一つの実施形態では、脂質粒子は、ステロイド、ＰＥＧ脂質及び式（Ｉ）：
Figure 2014501097
 ［式中、各々のＸａ及びＸｂは、存在する各々の場合に、独立してＣ１〜６アルキレンであり、
ｎは０、１、２、３、４または５であり、各々のＲは、独立してＨ、
Figure 2014501097
 ［式中、ｍは０、１、２、３または４であり；Ｙは、存在しないか、Ｏ、ＮＲ２またはＳであり、Ｒ１は、各々が場合により１またはそれ以上の置換基で置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルである］
であり；及びＲ２は、Ｈ、各々が場合により１またはそれ以上の置換基で置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルである］
のカチオン性脂質を含有する。
一例では、脂質ＲＮＡエフェクター分子ナノ粒子（例えばＬＮＰ０１粒子）を作製するためにリピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（分子量１４８７）（式２）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）が使用できる。エタノール中の各々の保存溶液は以下のように調製できる：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍＬ、コレステロール、２５ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍＬ。ＮＤ９８、コレステロール及びＰＥＧ−セラミドＣ１６保存溶液を、次に、例えば４２：４８：１０のモル比で合わせることができる。合わせた脂質溶液を、最終エタノール濃度が約３５％〜４５％及び最終酢酸ナトリウム濃度が約１００ｍＭ〜３００ｍＭ（両端を含む）になるように水性ＲＮＡエフェクター分子と混合し得る（例えばｐＨ５の酢酸ナトリウム中で）。脂質ＲＮＡエフェクター分子ナノ粒子は、典型的には混合時に自発的に形成される。所望粒子径分布に依存して、生じたナノ粒子混合物を、例えばＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用してポリカーボネート膜（例えば１００ｎｍカットオフ）を通して押し出すことができる。一部の場合は、押出工程を省くことができる。エタノール除去及び同時緩衝液交換は、例えば透析または接線流ろ過によって達成し得る。緩衝液は、例えば約ｐＨ７、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と交換できる。
Figure 2014501097
 ＬＮＰ０１製剤は、例えば国際公開広報第ＷＯ２００８／０４２９７３号に記載されている。
一つの実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬は、例えば２００９年１２月７日出願の米国仮特許出願第６１／２６７，４１９号及び２０１０年５月１３日出願の米国仮特許出願第６１／３３４，３９８号に記載されているようなカチオン性脂質を含む。様々な実施形態において、本明細書で述べるＲＮＡエフェクター分子組成物は、「脂質Ｈ」、「脂質Ｋ」、「脂質Ｌ」、「脂質Ｍ」、「脂質Ｐ」または「脂質Ｒ」から成る群より選択されるカチオン性脂質を含有し、前記脂質の式は以下のように示される：
Figure 2014501097
 また、例えば、それぞれ脂質Ｋ、Ｐ及びＬを含有する製剤を指すＫ８、Ｐ８及びＬ８などの、上述した脂質の様々な製剤も本明細書で企図される。本明細書で述べる方法及び組成物に関する使用のための一部の例示的な脂質製剤は、例えば表１９に認められる：
Figure 2014501097
 別の実施形態では、本明細書で述べるＲＮＡエフェクター分子組成物は、脂質Ｈ、脂質Ｋ、脂質Ｌ、脂質Ｍ、脂質Ｐ及び脂質Ｒから成る群より選択される脂質を含む脂質製剤をさらに含有し、中性脂質及びステロールをさらに含有する。特定の実施形態では、脂質製剤は約２５モル％〜１００モル％の脂質を含む。別の実施形態では、脂質製剤は約０モル％〜５０モル％のコレステロールを含む。さらに別の実施形態では、脂質製剤は３０モル％〜６５モル％の中性脂質を含む。特定の実施形態では、脂質製剤は、以下のように表２０に列挙される相対モル％の成分を含有する：
Figure 2014501097
 さらなる例示的な脂質−ｓｉＲＮＡ製剤は、以下の表６９に示されているとおりである。
Figure 2014501097
Figure 2014501097
ＬＮＰ０９製剤及びＸＴＣ含有製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年９月３日出願の米国仮特許出願第６１／２３９，６８６号に記載されている。
ＬＮＰ１１製剤及びＭＣ３含有製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年９月２２日出願の米国仮特許出願第６１／２４４，８３４号に記載されている。
ＬＮＰ１２製剤及びＴｅｃｈＧ１含有製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年５月５日出願の米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号に記載されている。
標準法または押出フリー法のいずれかによって調製される製剤を同様の方法で特徴付けることができる。例えば、典型的には目視検査によって製剤を特徴付ける。それらは、凝集体または沈降物を含まない白っぽい透明な溶液であるはずである。脂質−ナノ粒子の粒径及び粒径分布は、例えばＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）を用いて光散乱によって測定できる。粒子は約２０〜３００ｎｍ、例えば４０〜１００ｎｍの大きさであるはずである。粒径分布は単峰型であるはずである。製剤ならびに取り込まれた画分中の総ｄｓＲＮＡエフェクター分子濃度は、色素排除アッセイを用いて推定される。製剤されたＲＮＡエフェクター分子の試料を、製剤破壊界面活性剤、例えば０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在下または不在下でＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合色素と共にインキュベートすることができる。製剤中の総ＲＮＡエフェクター分子は、標準曲線と比較した、界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定できる。取り込まれた画分は、総ＲＮＡエフェクター分子含量から「遊離」ＲＮＡエフェクター分子含量（界面活性剤の不在下でのシグナルによって測定される）を差し引くことによって決定される。取り込まれるＲＮＡエフェクター分子のパーセントは、典型的には＞８５％である。脂質ナノ粒子製剤に関して、粒径は少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍまたは少なくとも１２０ｎｍである。適切な範囲は、典型的には少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍ（両端を含む）である。
リポソームは、親油性物質から形成される膜と水性内部を有する単層または多重層の小胞である。水性部分は送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、効率的に細胞壁と融合することはできないが、インビボでマクロファージによって取り込まれる。無傷細胞膜を越えるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、各々が直径５０ｎｍ未満の一連の微細孔を通り抜けなければならない。従って、高度に変形可能であり、そのような微細孔を通過できるリポソームを使用することが望ましい。
リポソームのさらなる利点は、天然リン脂質から得られるリポソームは生体適合性及び生分解性であること；リポソームは広範囲の水溶性及び脂溶性薬剤を組み込み得ること；ならびにリポソームは、その内部区画内に封入された薬剤を代謝及び分解から保護し得ることを含む。例えば、Ｗａｎｇら、ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ＆ＡＰＰＬ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２００５）；Ｒｏｓｏｆｆ，１９８８参照。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な点は、脂質表面の電荷、小胞の大きさ及びリポソームの水分容量である。
リポソームは、作用部位への有効成分の輸送及び送達のために有用である。リポソーム膜は構造的に生体膜に類似するので、リポソームを組織に適用した場合、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞の融合が進行すると共に、リポソームの内容物が細胞内に流入して、そこで活性物質が作用し得る。リポソーム製剤は多くの薬剤のための送達方法として広範な研究の中心となってきた。局所投与に関して、リポソームが他の製剤に比べていくつかの利点を示すことの証拠が増えつつある。かかる利点は、投与された薬剤の高い全身吸収に関連する副作用の低減、所望標的における投与薬剤の蓄積の増大、ならびに親水性及び疎水性の両方の多種多様な薬剤を皮膚内に投与できることを含む。
リポソームは２つの大きなクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電したポリヌクレオチド分子と相互作用して安定な複合体を形成する、正に荷電したリポソームである。正に荷電したポリヌクレオチド／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソーム内にインターナライズされる。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームは破裂して、その内容物を細胞質中に放出する。Ｗａｎｇら、１４７ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，９８０−８５（１９８７）。
ｐＨ感受性であるかまたは負に荷電したリポソームは、ポリヌクレオチドと複合体を形成するのではなくポリヌクレオチドを取り込む。ポリヌクレオチドと脂質の両方が同様に荷電しているので、複合体形成ではなく斥力が生じる。それにもかかわらず、一部のポリヌクレオチドはこれらのリポソームの水性内部に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養下の細胞単層に送達するために使用されてきた。外因性遺伝子の発現が標的細胞において検出された。Ｚｈｏｕら、１９ Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．２６９−７４（１９９２）。
リポソーム組成物の主要なタイプの一つは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成できる。アニオン性リポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性の膜融合性リポソームは主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えばダイズＰＣ及び卵ＰＣなどから形成される。別のタイプは、リン脂質及び／またはホスファチジルコリン及び／またはコレステロールの混合物から形成される。
リポソームはまた、「立体的に安定化された」リポソームを含み、この用語は、本明細書で使用される場合、リポソームに組み込まれたとき、そのような特殊な脂質を欠くリポソームと比較して長い循環寿命を生じさせる１またはそれ以上の特殊な脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１のような１もしくはそれ以上の糖脂質を含む、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような１またはそれ以上の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはＰＥＧで誘導体化された脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームに関しては、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の延長は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取込みの減少に由来すると当技術分野では考えられている。Ａｌｌｅｎら、２２３ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２（１９８７）；Ｗｕら、５３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３７６５（１９９３）。
１またはそれ以上の糖脂質を含有する様々なリポソームが当技術分野において公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（５０７ Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６４（１９８７））は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド及びホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を改善する能力を報告した。これらの所見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（８５ ＰＮＡＳ ６９４９（１９８８））によって詳しく説明された。いずれもＡｌｌｅｎらへの米国特許第４，８３７，０２８号及び国際公開広報第ＷＯ８８／０４９２４号は、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧＭ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開広報第ＷＯ９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）に開示されている。
１またはそれ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム及びその調製法が当技術分野において公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（５３ Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．２７７８（１９８０））は、ＰＥＧ部分を含む非イオン性界面活性剤２Ｃ１２１５Ｇを含有するリポソームを記述した。Ｉｌｌｕｍら（１６７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．７９（１９８４））は、高分子グリコールでのポリスチレン粒子の親水性コーティングが血中半減期の有意の延長を生じさせることを指摘した。ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）のカルボキシル基の結合によって修飾された合成リン脂質がＳｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号及び同第４，５３４，８９９号）によって記述されている。加えて、ポリアルキレンで誘導体化されたリポソームに抗体を結合することができる（例えば、ＰＣＴ特許出願第ＵＳ２００８／００１４２５５号参照）。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（２６８ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２３５（１９９０））は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが血液循環半減期の有意の延長を有することを実証する実験を記述した。Ｂｌｕｍｅら（１０２９ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０２９，（１９９０））は、そのような所見を他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組合せから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧに拡大適用した。外表面上にＰＥＧ部分が共有結合しているリポソームが欧州特許第０４４５１３１Ｂ１号及びＦｉｓｈｅｒへの国際公開広報第ＷＯ９０／０４３８４号に記載されている。
１〜２０モル％のＰＥＧで誘導体化されたＰＥを含有するリポソーム組成物及びその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号及び同第５，３５６，６３３号）ならびにＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号及び欧州特許第０４９６８１３Ｂ１号）によって記述されている。多くの他の脂質−ポリマーコンジュゲートを含むリポソームが、国際公開広報第ＷＯ９１／０５５４５号及び米国特許第５，２２５，２１２号及び国際公開広報第ＷＯ９４／２００７３号に開示されている。ＰＥＧ修飾されたセラミド脂質を含むリポソームは、国際公開広報第ＷＯ９６／１０３９１号に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号及び同第５，５５６，９４８号は、表面上の官能基部分でさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームを記述する。ＰＥＧを含むリポソームに関する方法及び組成物は、例えば米国特許第６，０４９，０９４号、同第６，２２４，９０３号、同第６，２７０，８０６号、同第６，４７１，３２６号、同第６，９５８，２４１号に認められる。
上述したように、リポソームは、場合により、抗体または抗体フラグメント、細胞表面受容体と相互作用するための小さなエフェクター分子、抗原及び他の同様の化合物などの表面基を含むように作製することができ、これらの基は特定の細胞集団へのリポソーム及びその内容物の送達を促進し得る。標的分子で誘導体化された脂質またはあらかじめ形成されたリポソーム中の標的分子で誘導体化され得る極性頭部化学基を有する脂質をリポソーム脂質に含めることにより、そのようなリガンドをリポソームに含めることができる。あるいは、あらかじめ形成されたリポソームをリガンド−ポリマー−脂質コンジュゲートと共にインキュベートすることにより、標的部分をあらかじめ形成されたリポソームに挿入できる。
脂質は、リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン類（例えばリボフラビン）及びモノクロナール抗体などの様々な標的部分を用いて、リガンドを親水性ポリマー鎖の遊離遠位端に共有結合し、それを近位端で小胞形成脂質に結合することによって誘導体化できる。選択した親水性ポリマーを選択した脂質に結合し、選択したリガンドとの反応のためにポリマーの遊離非結合末端を活性化するための多種多様な技術が存在し、上述したように、親水性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は広く検討されてきた。Ａｌｌｅｎら、１２３７ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９９−１０８（１９９５）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，４ Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２９６−９９（１９９３）、Ｚａｌｉｐｓｋｙら、３５３ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１−７４（１９９４）、Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．７０５−０８（１９９５）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｉｎ ＳＴＥＡＬＴＨ ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ（Ｌａｓｉｃ＆Ｍａｒｔｉｎ，ｅｄｓ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９５）。
高分子量核酸をリポソームに封入するための方法のような、核酸を含有する多くのリポソームが当技術分野において公知である。国際公開広報第ＷＯ９６／４００６２号。Ｔａｇａｗａらへの米国特許第５，２６４，２２１号はタンパク質結合リポソームを開示し、そのようなリポソームの内容物はｄｓＲＮＡを含み得ると主張している。Ｒａｈｍａｎらへの米国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに封入する特定の方法を記述する。Ｌｏｖｅらへの国際公開広報第ＷＯ９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示する。加えて、核酸を含有するリポソーム組成物を作製するための方法は、例えば、米国特許第６，０１１，０２０号、同第６，０７４，６６７号、同第６，１１０，４９０号、同第６，１４７，２０４号、同第６，２７１，２０６号、同第６，３１２，９５６号、同第６，４６５，１８８号、同第６，５０６，５６４号、同第６，７５０，０１６号、同第７，１１２，３３７号に見出される。
トランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）はさらに別のタイプのリポソームであり、薬剤送達ビヒクルの魅力的な候補物である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、高度に変形可能な脂質小滴であるため該小滴よりも小さい細孔を容易に通り抜けることができる脂質小滴と表すことができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応性であり、例えばそれらは自己最適化性であり、自己修復性であり、しばしば分断されることなく標的に到達し、そしてしばしば自己充填性である。トランスファーソームを作製するために、標準的なリポソーム組成物に表面端活性化剤、通常は界面活性剤を添加することが可能である。
封入されたナノ粒子もＲＮＡエフェクター分子の送達に使用できる。そのような封入ナノ粒子の例は、酵母細胞壁粒子（ＹＣＷＰ）を用いて作製されるものを含む。例えば、グルカンが封入されたｓｉＲＮＡ粒子（ＧｅＲＰ）は、酵母細胞壁粒子（ＹＣＷＰ）外部及び多層ナノ粒子内部から作られるペイロード送達系であり、該多層ナノ粒子内部は、捕捉剤と複合体形成したペイロードを含むコアを有する。２００８年１０月２９日出願の米国特許出願第１２／２６０，９９８号に記載されているもののような、グルカン封入送達システムは、インビトロ及びインビボでサイレンシングを達成するためにｓｉＲＮＡ二本鎖を送達するのに使用できる。
乳剤
本発明の組成物は、乳剤として調製し、製剤することができる。乳剤は、典型的には一方の液体が通常は直径０．１μｍを超える小滴の形態で他方の中に分散している不均一系である。例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．（８ｔｈ ｅｄ．Ａｌｌｅｎら、ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＮＹ，２００４）、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ １ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ １９９（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ １ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ２４５（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）、Ｂｌｏｃｋ ｉｎ ２ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ３３５（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）、Ｈｉｇｕｃｈｉら、ｉｎ ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．３０１（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５）参照。乳剤は、しばしば、互いに十分に混合され、分散された２つの非混和性の液相を含む二相系である。
一般に、乳剤は油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水相が大量の油相中に微細に分割され、細かい小滴として分散される場合、生じる組成物は油中水型（ｗ／ｏ）乳剤と呼ばれる。あるいは、油相が大量の水相中に微細に分割され、細かい小滴として分散される場合、生じる組成物は水中油型（ｏ／ｗ）乳剤と呼ばれる。乳剤は、分散相に加えて、付加的な成分及び、水相、油相中またはそれ自体が分離した相としての溶液として存在し得る活性薬剤を含有し得る。乳化剤、安定剤、染料及び酸化防止剤などの医薬賦形剤も、必要に応じて乳剤中に存在し得る。医薬乳剤はまた、例えば油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）乳剤及び水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）乳剤の場合のような、３以上の相で構成される多相乳剤であり得る。そのような複雑な製剤は、単純な２成分の乳剤にはない特定の利点をしばしば提供する。ｏ／ｗ型乳剤の個々の油滴が小さな水滴を囲む多相乳剤は、ｗ／ｏ／ｗ型乳剤を構成する。同様に油性連続相中に安定化された水の小球に囲まれた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏ型乳剤を提供する。
乳剤は、熱力学的安定性がほとんどまたは全くないことを特徴とする。多くの場合、乳剤の分散相または不連続相は、外相または連続相中に十分に分散しており、乳化剤の使用または製剤の粘性を介してこの形態に維持される。乳剤型の軟膏基剤及びクリームの場合のように、乳剤の相のいずれかは半固体または固体であり得る。乳剤を安定化する他の手段は、乳剤のいずれかの相に組み込むことができる乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、大きく４つのカテゴリー：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤及び微細分散固体に分類できる。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．，２００４、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ，１９８８参照。
表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、乳剤の製剤において広い適用性が認められており、文献で総説されている。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．，２００４、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ，１９８８、Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ，１９８８参照。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性と疎水性の比率は親水／親油バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製において界面活性剤を分類し、選択するうえで有益なツールである。界面活性剤は、親水基の性質に基づいて種々のクラス：非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性に分類できる。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．，２００４、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ，１９８８、Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ，１９８８参照。
乳剤製剤において使用される天然の乳化剤は、ラノリン、蜜ろう、ホスファチド、レシチン及びアラビアゴムを含む。無水ラノリン及び親水ワセリンなどの吸収基剤は、水分を吸収してｗ／ｏ型乳剤を形成し、それでもなおそれらの半固体粘稠度を維持できるように親水性特性を有する。微粉固体も、特に界面活性剤と組み合わせて及び粘性製剤において、良好な乳化剤として使用されてきた。これらは、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム及びコロイド状ケイ酸マグネシウムアルミニウムなどの非膨潤性粘土、色素ならびに炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固体を含む。
乳化作用のない種々様々な物質も乳剤製剤中に含まれ、乳剤の特性に寄与する。これらは、脂肪、油、ろう、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水コロイド、防腐剤及び酸化防止剤を含む。Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ １ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ３３５（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ（１９８８）。
親水コロイドまたはハイドロコロイドは、天然に存在するゴム及び合成ポリマー、例えば多糖類（例えばアラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤゴム及びトラガント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）ならびに合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル及びカルボキシビニルポリマー）を含む。これらは水中で分散または膨張し、分散相の小滴の周囲に丈夫な界面膜を形成すること及び外相の粘性を高めることによって乳剤を安定化するコロイド溶液を形成する。
乳剤はしばしば、微生物の増殖を容易に促進し得る炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドなどの多くの成分を含有するので、これらの製剤には防腐剤が組み込まれることが多い。乳剤製剤に含められる一般的に使用される防腐剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル及びホウ酸を含む。酸化防止剤も、製剤の劣化を防ぐために乳剤製剤に一般的に添加される。使用される酸化防止剤は、フリーラジカル捕捉剤、例えばトコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなど、または還元剤、例えばアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムなど、ならびに酸化防止相乗剤、例えばクエン酸、酒石酸及びレシチンなどであり得る。
一つの実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子及び核酸の組成物はマイクロエマルジョンとして製剤される。マイクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定な溶液である、水、油及び両親媒性物質の系と定義され得る。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．（８ｔｈ ｅｄ．，Ａｌｌｅｎら、ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＮＹ，２００４）、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ，１９８８参照。典型的には、マイクロエマルジョンは、最初に油を水性界面活性剤溶液中に分散させ、次に十分な量の第四成分、一般には中鎖長アルコールを添加して透明な系を形成することによって調製される系である。従って、マイクロエマルジョンはまた、表面活性分子の界面膜によって安定化された２つの非混和性液体の、熱力学的に安定で等方的に透明な分散液とも表されてきた。Ｌｅｕｎｇ＆Ｓｈａｈ，ｉｎ ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ ＲＥＬＥＡＳＥ ＤＲＵＧＳ：ＰＯＬＹＭＥＲＳ＆ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ ＳＹＳ．１８５−２１５（Ｒｏｓｏｆｆ，ｅｄ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８９）。マイクロエマルジョンは一般に、油、水、界面活性剤、共界面活性剤及び電解質を含む３〜５の成分の組合せによって調製される。マイクロエマルジョンが油中水型（ｗ／ｏ）であるか水中油型（ｏ／ｗ）であるかは、使用される油及び界面活性剤の性質ならびに界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素尾部の構造及び幾何学的充填に依存する。Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．２７１（１９８５）。
状態図を利用する現象学的アプローチが広汎に検討されており、マイクロエマルジョンを製剤する方法についての包括的な知識が当業者にもたらされている。例えば、ＡＮＳＥＬ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ＆ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．ＳＹＳ．（８ｔｈ ｅｄ．，Ａｌｌｅｎら、ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＮＹ，２００４）、Ｒｏｓｏｆｆ，１９８８、Ｂｌｏｃｋ，１９８８参照。従来の乳剤と比較して、マイクロエマルジョンは、自然に形成される熱力学的に安定な小滴の製剤中に水不溶性の薬剤を可溶化するという利点を提供する。
マイクロエマルジョンは、本明細書でさらに論じる界面活性剤、例えば、限定されることなく、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）などを、単独でまたは共界面活性剤と組み合わせて含み得る。通常は、エタノール、１−プロパノール及び１−ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤の界面膜に浸透し、その結果として界面活性剤分子の間に生じた空隙による不規則な膜を作り出すことによって界面の流動性を高める役割を果たす。マイクロエマルジョンは、しかしながら、共界面活性剤を使用せずに調製され得、アルコール不含の自己乳化型マイクロエマルジョン系が当技術分野において公知である。水相は、典型的には水、薬剤の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール及びエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相は、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油を含み得るが、これらに限定されない。
マイクロエマルジョンは、より良好な薬剤の可溶化、酵素加水分解からの薬剤の保護、界面活性剤が誘導する膜の流動性及び透過性の変化による薬剤吸収の増大の可能性、調製の容易さ、ならびに低い毒性という利点を提供する。例えば、米国特許第６，１９１，１０５号、同第７，０６３，８６０号、同第７，０７０，８０２号、同第７，１５７，０９９号、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、１１ Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３８５（１９９４）、Ｈｏら、８５ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１３８−４３（１９９６）参照。多くの場合、マイクロエマルジョンはその成分を周囲温度で組み合わせた場合に自然に形成され得る。このことは、熱不安定薬剤、ペプチドまたはＲＮＡエフェクター分子を製剤する場合に特に有利であり得る。
本発明のマイクロエマルジョンはまた、製剤の性質を改善し、本発明のＲＮＡエフェクター分子及び核酸の吸収を高めるために、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ及び浸透促進剤などの付加的な成分及び添加剤も含み得る。本発明のマイクロエマルジョンにおいて使用される浸透促進剤は、５つの広いカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤及び非キレート化非界面活性剤の一つに属すると分類され得る。Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９２（１９９１）。
マイクロエマルジョン以外にも薬剤の製剤のために検討され、使用されてきた多くの組織化された界面活性剤構造体が存在する。これらは、単層、ミセル、二重層及び小胞を含む。リポソームなどの小胞は、薬剤送達の見地から、それらが提供する特異性及び作用持続時間のゆえに大きな関心を集めてきた。本発明において使用される、「リポソーム」という用語は、球状の１またはそれ以上の二重層中に配置された両親媒性脂質から成る小胞を意味する。
界面活性剤
一部の実施形態では、本発明を特徴付けるＲＮＡエフェクター分子は、１またはそれ以上の浸透促進剤、界面活性剤及び／またはキレート剤と共に投与される。適切な界面活性剤は、脂肪酸及び／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸及び／またはその塩を含む。適切な胆汁酸／塩は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムを含む。適切な脂肪酸は、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはモノグリセリド、ジグリセリドまたはそれらの医薬的に許容される塩（例えばナトリウム塩）を含む。一部の実施形態では、浸透促進剤の組合せ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が使用される。一つの例示的な組合せは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含む。
界面活性剤は、乳剤（マイクロエマルジョンを含む）及びリポソームなどの製剤において広く適用される。天然及び合成の両方の多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類し、ランクづける最も一般的な方法は、親水／親油バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水基（「頭部」としても知られる）の性質は、製剤に使用される種々の界面活性剤を分類するために最も有用な手段を提供する。例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，ＳＵＲＦＡＣＴＡＮＴＳ＆ＰＯＬＹＭＥＲＳ ＩＮ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．（Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，ＮＹ，２００２）、Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ ＰＨＡＲＭ．ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ２８５（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８８）参照。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、その分子は非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品及び化粧品に広い用途が見出され、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に依存して２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤は、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグルセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル及びエトキシ化エステルなどの非イオン性エステルを含む。非イオン性アルカノールアミド及びエーテル、例えば脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシ化アルコール及びエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなどもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は非イオン性界面活性剤クラスの最も一般的な成員である。
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたとき負電荷を担持する場合、その界面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤は、セッケン、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミドなどのカルボキシレート、硫酸アルキル及びエトキシ化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネートならびにホスフェートを含む。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な成員は硫酸アルキル及びセッケンである。
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたとき正電荷を担持する場合、その界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤は、第四級アンモニウム塩及びエトキシ化アミンを含む。第四級アンモニウム塩はこのクラスの最も広く使用される成員である。界面活性剤分子が正電荷または負電荷のどちらも担持する能力を有する場合、その界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤は、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン及びホスファチドを含む。
浸透促進剤
一つの実施形態では、本発明は、細胞への核酸、特にＲＮＡエフェクター分子の効率的な送達を生じさせるために様々な浸透促進剤を使用する。大部分の薬剤は、イオン化形態及び非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。通常は、脂溶性または親油性薬剤だけが容易に細胞膜を横断する。横断する細胞膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬剤であっても細胞膜を横断し得ることが発見された。、浸透促進剤はまた、非親油性薬剤が細胞膜を越えて拡散するのを助けることに加えて、親油性薬剤の透過性も上昇させる。
浸透促進剤は、５つの広いカテゴリー：界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤及び非キレート化非界面活性剤の一つに属すると分類され得る。例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，２００２、Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９２（１９９１）参照。
本発明に関連して、浸透促進剤は界面活性剤（または「表面活性剤」）を含み、界面活性剤とは、水溶液中に溶解された場合、溶液の表面張力または水溶液と別の液体との間の界面張力を低下させ、その結果として細胞膜及び他の生物学的障壁を通してのＲＮＡエフェクター分子の吸収を増大させる化学的実体である。胆汁酸塩及び脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，２００２、Ｌｅｅら、１９９１参照）、ならびにＦＣ−４３（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、４０ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２５２（１９８８））などのペルフルオロケミカル乳剤を含む。
浸透促進剤として働く様々な脂肪酸及びそれらの誘導体は、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル及びｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノグリセリド及びジグリセリド（すなわちオレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエート等）を含む。例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕら、ＥＮＨＡＮＣＥＭＥＮＴ ＩＮ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６）、Ｌｅｅら、１９９１、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，７ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．１−３３（１９９０）、Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉら、４４ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５１−５４（１９９２）参照。
胆汁の生理的役割は、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進を含む。例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，２００２、Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔ．３８ ｉｎ ＧＯＯＤＭＡＮ＆ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，９ＴＨ ＥＤ．９３４−３５（Ｈａｒｄｍａｎら、ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１９９６）参照。様々な天然胆汁酸塩及びそれらの合成誘導体は浸透促進剤として働く。従って「胆汁酸塩」という用語は、天然に存在する胆汁の成分の任意のものならびにそれらの合成誘導体の任意のものを包含する。適切な胆汁酸塩は、例えばコール酸（またはその医薬的に許容されるナトリウム塩であるコール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）を含む（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，２００２、Ｌｅｅら、１９９１、Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔ．３９ ｉｎ ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．，１８ｔｈ Ｅｄ．７８２−８３（Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０）、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，１９９０、Ｙａｍａｍｏｔｏら、２６３ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５（１９９２）、Ｙａｍａｓｈｉｔａら、７９ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．５７９−８３（１９９０）参照）。
キレート剤は、本発明に関連して使用される場合、金属イオンと複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、その結果として粘膜を介したＲＮＡエフェクター分子の吸収を高める化合物と定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、特徴付けられている大部分のＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、従ってキレート剤によって阻害されるので、キレート剤はＤＮアーゼ阻害剤としての役割も果たすという付加的な利点を有する。Ｊａｒｒｅｔｔ，６１８ Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３１５−３９（１９９３）。適切なキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えばサリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレート及びホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９ならびにβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｋａｔｄａｒｅら、ＥＸＣＩＰＩＥＮＴ ＤＥＶＥＬ．ＰＨＡＲＭ．ＢＩＯＴＥＣＨ．＆ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶ．（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６）、Ｌｅｅら、１９９１、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，１９９０、Ｂｕｕｒら、１４ Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．４３−５１（１９９０）参照。
本明細書で使用される場合、非キレート化非界面活性剤である浸透促進化合物は、キレート剤としてまたは界面活性剤としては有意ではない活性を示すが、それにもかかわらず消化管粘膜を介したＲＮＡエフェクター分子の吸収を高める化合物と定義され得る。例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，１９９０参照。このクラスの浸透促進剤は、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロアルカノン誘導体（Ｌｅｅら、１９９１）ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンなどの非ステロイド系抗炎症薬を含む（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９８７）。
細胞レベルでＲＮＡエフェクター分子の取込みを増強する作用物質も、本発明の医薬組成物及び他の組成物に添加し得る。例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号）などのカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリシン（国際公開広報第ＷＯ９７／３０７３１号）などのポリカチオン分子も、ｄｓＲＮＡの細胞内取込みを増強することが公知である。市販のトランスフェクション試薬の例としては、例えば、数ある中でも特に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００（商標）、２９３ＦＥＣＴＩＮ（商標）、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＭＡＸ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００ＣＤ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＲＮＡｉＭＡＸ、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）及びＯＰＴＩＦＥＣＴ（商標）トランスフェクション試薬（各々Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）、ならびにＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬（Ａｖａｎｔｅ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）、ＤＯＳＰＥＲリポソームトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）、またはＦｕＧＥＮＥ（登録商標）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）試薬、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ（商標）トランスフェクション試薬、ＴＦＸ（商標）−２０試薬、ＴＦＸ（商標）−５０試薬（各々Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩより）、ＤＲＥＡＭＦＥＣＴ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（登録商標）Ｄ１トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、ＬＹＯＶＥＣ（商標）／ＬＩＰＯＧＥＮ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬、ＮＥＵＲＯＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ ２トランスフェクション試薬、ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮトランスフェクション試薬、ＢＡＣＵＬＯＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬もしくはＴＲＯＧＡＮＰＯＲＴＥＲ（商標）トランスフェクション試薬（各々Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより）、ＲＩＢＯＦＥＣＴ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．）、ＰＬＡＳＦＥＣＴ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、またはＵＮＩＦＥＣＴＯＲ、ＳＵＲＥＦＥＣＴＯＲもしくはＨＩＦＥＣＴ（商標）（各々Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡより）が含まれる。
付加的な担体
投与した核酸の浸透を促進するために、エチレングリコール及びプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン、ならびにリモネン及びメントンなどのテルペンを含む他の作用物質を利用し得る。
本発明の特定の組成物はまた、製剤中に担体化合物を組み込む。本明細書で使用される、「担体化合物」または「担体」は、不活性である（すなわちそれ自体は生物学的活性を有さない）が、例えば生物学的に活性な核酸を分解するまたはその除去を促進することにより、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを低下させるインビボプロセスによって核酸として認識される、核酸またはその類似体を表し得る。
本発明の組成物は、他の補助成分を、添加された場合にかかる物質が本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨げない限り、付加的に含有し得る。製剤は、滅菌することができ、所望する場合は、製剤のＲＮＡエフェクター分子と有害な相互作用を生じない補助剤と混合し得る。
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増大させる物質を含み得る。懸濁液はまた、安定剤も含み得る。
そのような化合物の毒性及び治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％を死に至らせる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養物または細胞における標準的な薬学的手順によって測定し得る。毒性作用と治療効果との間の用量比が治療指数であり、治療指数はＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物は特に有用である。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータを、本発明の方法における使用のための用量範囲の策定に使用できる。本発明を特徴付ける組成物の用量は、一般に毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ５０を含む濃度範囲内にある。用量は、使用される剤形及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動し得る。
さらに別の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現が長期間、例えば少なくとも２日間、３日間、４日間またはそれ以上、例えば１週間、２週間、３週間または４週間またはそれ以上にわたって低下するように、本発明を特徴付ける組成物を宿主細胞に投与することによって宿主細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。標的遺伝子の発現低下の作用は、好ましくは、処置前のレベルと比較して、標的遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％または少なくとも６０％またはそれ以上の低下を生じさせる。
ＶＩＩ．キット及びアッセイ
一部の実施形態では、細胞による生物由来物質の産生への１個のＲＮＡエフェクター分子または一連のＲＮＡエフェクター分子の作用を試験するためのキットが提供され、該キットは、生物由来物質の産生を可能にする条件下で細胞を培養するのに適した１またはそれ以上のアッセイ表面を有する支持体を含む。一部の実施形態では、支持体の外側は、アッセイ表面に対応する位置に穴、刻み目、境界等を含む。一部の実施形態では、穴、刻み目、境界等は、アッセイ表面の上に細胞培養培地などの液体を保持する。
一部の実施形態では、支持体上のアッセイ表面は無菌であり、生物由来物質の大規模（例えば工業規模）生産の間の培養条件を代表する条件下で宿主細胞を培養するのに適する。好都合には、本明細書で提供されるキットは、生物由来物質の生産に関して広い範囲の作用物質及び／または条件を試験するための迅速で費用効率が高い手段を提供し、生物由来物質の本格的生産に先立って細胞培養条件を確立することを可能にする。
一部の実施形態では、支持体の１またはそれ以上のアッセイ表面は、アッセイ表面に適切な培地を添加することによってアッセイ表面の周囲のＲＮＡエフェクター分子の所望濃度がもたらされるように、ＲＮＡエフェクター分子などの濃縮試験物質を含有する。一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、アッセイ表面にプリントし得るもしくは染み込ませ得るか、または、適切な量の培地を添加したときエフェクター分子が再構成され得るように、例えば穴内に、凍結乾燥形態で提供され得る。一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、支持体のアッセイ表面に細胞を塗布することによって再構成される。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、対象とする生物由来物質の産生を可能にする条件下で細胞を培養するのに適した細胞培養培地をさらに含む。培地は、すぐに使用できる形態であり得るか、または濃縮され得る（例えば保存溶液として）、凍結乾燥され得るもしくは別の再構成可能な形態で提供され得る。
さらなる実施形態では、本明細書で提供されるキットは、細胞、細胞培養物または組織培養物による生物由来物質の産生を検出するのに適した１またはそれ以上の試薬を含む。さらなる実施形態では、試薬は、所望生物由来物質の生産を示す、最大細胞密度、細胞生存能等のような細胞の特性を検出するのに適する。一部の実施形態では、試薬は、生物由来物質またはその特性、例えば生物由来物質のインビトロまたはインビボでの生物学的活性、均一性または構造などを検出するのに適する。
一部の実施形態では、支持体の１またはそれ以上のアッセイ表面は、細胞によるＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進するための担体をさらに含む。ＲＮＡエフェクター分子のための担体は当技術分野において公知であり、本明細書で説明する。例えば、一部の実施形態では、担体は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などの脂質製剤または関連製剤である。そのような担体の製剤の例は本明細書に記載されている。一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬は、本出願全体にわたって述べる荷電脂質、乳剤、リポソーム、カチオン性または非カチオン性脂質、アニオン性脂質、トランスフェクション試薬または透過促進剤を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子の取込みを促進する試薬は、２００９年１２月７日出願の米国仮特許出願第６１／２６７，４１９号に記載されている荷電脂質を含む。
一部の実施形態では、支持体の１またはそれ以上のアッセイ表面は、試験細胞をアッセイ表面に塗布することにより、細胞によるＲＮＡエフェクター分子の取込み及びＲＮＡエフェクター分子によって標的される１またはそれ以上の遺伝子の発現の調節を促進するために有効なＲＮＡエフェクター分子及び担体の濃度がもたらされるように、各々濃縮された形態の、１個のＲＮＡエフェクター分子または一連のＲＮＡエフェクター分子及び担体を含む。
一部の実施形態では、支持体は、３次元細胞増殖及び／または細胞による生物由来物質の産生を促進する基材をさらに含む。さらなる実施形態では、基材は、細胞の足場依存性増殖を促進する。本明細書で述べる様々なキットに関する使用に適する基材の材料の非限定的な例は、寒天、アガロース、メチルセルロース、アルギネートヒドロゲル（例えば５％アルギネート＋５％Ｉ型コラーゲン）、キトサン、ハイドロアクティブな親水コロイドポリマーゲル、ポリビニルアルコール−ヒドロゲル（ＰＶＡ−Ｈ）、ポリアクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、コラーゲンビトリゲル、ＰＨＥＭＡ（ポリ（２−ヒドロキシルメタクリレート））ヒドロゲル、ＰＶＰ／ＰＥＯヒドロゲル、ＢＤ ＰＵＲＡＭＡＴＲＩＸ（商標）ヒドロゲル、及び２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）のコポリマーを含む。
一部の実施形態では、支持体は、培養細胞による生物由来物質の産生に関する様々な試験物質、条件及び／またはそれらの組合せの高処理能力の自動検査を可能にする、マイクロアレイプレート、バイオチップ等を含む。例えば、支持体は、アッセイ表面のｍ縦列とｎ横列を有する（例えば穴内に存在する）２次元マイクロアレイプレートまたはバイオチップを含み得、それらは試験物質及び／または条件のｍ×ｎの組合せの検査を可能にする（例えば２４穴、９６穴または３８４穴マイクロアレイプレート上で）。マイクロアレイ支持体は、好ましくは、すべての必要な陽性及び陰性対照が試験物質及び／または条件の検査と並行して実施できるように設計される。
さらなる実施形態では、生物由来物質の生産に影響を及ぼす特定の経路、機能または細胞の特性を調節するように設計されたひと組のＲＮＡエフェクター分子を接種した１またはそれ以上のマイクロアレイ支持体を含むキットが提供される。例えば、一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、細胞による組換えタンパク質産物の発現、折りたたみ、分泌または翻訳後修飾に関与する経路を含む標的遺伝子を対象とする。
さらなる実施形態では、細胞ベースの系における免疫原性物質の生産に関連する特定の問題または問題のクラスに対処するように設計されたひと組のＲＮＡエフェクター分子を接種した１またはそれ以上のマイクロアレイ支持体を含むキットが本明細書で提供される。例えば、一部の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、潜在もしくは内在性ウイルスによって発現される標的遺伝子、または生物由来物質の生産もしくは精製を阻害するもしくは妨げる、細胞周期進行、細胞代謝もしくはアポトーシスなどの細胞プロセスに関与する標的遺伝子を対象とする。さらなる実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、生物由来物質の活性、均一性、安定性及び／または他の品質を低下させる酵素分解、凝集、ミスフォールディングまたは他のプロセスを媒介する標的遺伝子を対象とする。なおさらなる実施形態では、エフェクター分子は、外因性または偶発的汚染微生物の感染性に影響を及ぼす標的遺伝子を対象とする。一つの実施形態では、生物由来物質は糖タンパク質を含み、ＲＮＡエフェクター分子は、グリコシル化（例えばフコシル化）及び／または宿主細胞による糖タンパク質のタンパク質分解プロセシングに関与する標的遺伝子を対象とする。別の実施形態では、生物由来物質はマルチサブユニット組換えタンパク質であり、ＲＮＡエフェクター分子は、宿主細胞によるタンパク質の折りたたみ及び／または分泌に関与する標的遺伝子を対象とする。別の実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、細胞における生物由来物質の翻訳後修飾、例えばメチオニン酸化、グリコシル化、ジスルフィド結合形成、ピログルタミン酸化及び／またはタンパク質の脱アミド化などに関与する標的遺伝子を対象とする。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生物由来物質の生産を増大させるための少なくとも一つの因子の選択または最適化を可能にする。例えば、キットは、一連の候補ＲＮＡエフェクター分子の中から１個のＲＮＡエフェクター分子を選択すること、または所与のＲＮＡエフェクター分子のより広い範囲の濃度から一つの濃度もしくは濃度範囲を選択することを可能にし得る。一部の実施形態では、キットは、共通の標的遺伝子に対する一連の候補ＲＮＡエフェクター分子の中から１またはそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を選択することを可能にする。さらなる実施形態では、キットは、２もしくはそれ以上の機能的に関連する標的遺伝子または共通の宿主細胞経路の２もしくはそれ以上の標的遺伝子に対する一連の候補ＲＮＡエフェクター分子の中から１またはそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を選択することを可能にする。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるキットは、生物由来物質の生産における２またはそれ以上の因子の組合せの選択または最適化を可能にする。例えば、キットは、一連の候補ＲＮＡエフェクター分子の中から１個の適切なＲＮＡエフェクター分子を選択することならびにＲＮＡエフェクター分子の一つの濃度を選択することを可能にし得る。さらなる実施形態では、本明細書で提供されるキットは、第一シリーズの候補ＲＮＡエフェクター分子から第一ＲＮＡエフェクター分子を選択し、第二シリーズの候補ＲＮＡエフェクター分子から第二のＲＮＡエフェクター分子を選択することを可能にする。一部の実施形態では、第一及び／または第二シリーズの候補ＲＮＡエフェクター分子は、共通の標的遺伝子を対象とする。さらなる実施形態では、第一及び／または第二シリーズのＲＮＡエフェクター分子は、２もしくはそれ以上の機能的に関連する標的遺伝子または共通の宿主細胞経路の２もしくはそれ以上の標的遺伝子を対象とする。
別の実施形態では、細胞における生物由来物質の産生を増大させるためのキットは、少なくとも、その一部が少なくとも潜在または内在性ウイルスの第一標的遺伝子に相補的である第一ＲＮＡエフェクター分子、その一部が少なくとも細胞免疫応答の第二標的遺伝子に相補的である第二ＲＮＡエフェクター分子、及び、場合により、その一部が少なくとも細胞プロセスの第三標的遺伝子に相補的である第三ＲＮＡエフェクター分子を含む。例えば、第一標的遺伝子はＥＲＶ ｅｎｖ遺伝子であり、第二標的遺伝子はＩＦＮＡＲ１またはＩＦＮＢ遺伝子であり、及び第三標的遺伝子はＰＴＥＮ、ＢＡＫ１、ＦＮ１またはＬＤＨＡ遺伝子である。キットは、少なくとも、炭素の代謝及び輸送、アポトーシス、ＲＮＡｉの取込み及び／または効率、反応性酸素種の産生、細胞周期の制御、タンパク質の折りたたみ、ピログルタミン酸化タンパク質修飾、デアミダーゼ、グリコシル化、ジスルフィド結合の形成、タンパク質分泌、遺伝子増幅、ウイルス複製、ウイルス感染、ウイルス粒子の放出、ｐＨの制御ならびにタンパク質産生を含むがこれらに限定されない細胞プロセスを標的する付加的なＲＮＡエフェクター分子をさらに含み得る。
さらに別の態様では、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。該方法は、標的遺伝子の発現が、例えば長期間、例えば少なくとも２日間、３日間、４日間またはそれ以上にわたって低下するように、本発明を特徴付ける組成物を細胞に投与することを含む。本発明を特徴付ける方法及び組成物のために有用なＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ（一次またはプロセシングされた）を特異的に標的する。ＲＮＡエフェクター分子を使用してこれらの標的遺伝子の発現を阻害するための組成物及び方法は、本明細書で述べるように作製し、実施し得る。
本発明は、以下の番号を付したパラグラフのいずれか一つに定義される通りであり得る。
１．大規模宿主細胞培養において生物由来物質を産生する方法であって、
（ａ）宿主細胞を、大規模宿主細胞培養において、少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である）と接触させ；
（ｂ）宿主細胞培養物を、前記少なくとも一つの第一の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合、発現の調節は、宿主細胞において生物由来物質の産生を向上させる）；
（ｃ）生物由来物質を宿主細胞から単離する；
ことを含み、前記大規模宿主細胞培養が、少なくとも１リットルの規模であり、及び前記ＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に標的遺伝子の発現が一時的に抑制されるように加えることによって、前記宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる、生物由来物質を産生させる方法。
２．大規模宿主細胞培養において生物由来物質を産生する方法であって、
（ａ）宿主細胞を、大規模宿主細胞培養において、少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である）と接触させ；
（ｂ）宿主細胞培養物を、前記少なくとも一つの第一の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合、発現の調節は、宿主細胞において生物由来物質の産生を向上させる）；
（ｃ）生物由来物質を宿主細胞から単離する；
ことを含み、前記ＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に、標的遺伝子の発現が一時的に抑制されるように生物由来物質の産生全体を通じて多数回加えることによって、前記宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる、生物由来物質を産生させる方法。
３．前記宿主細胞を、大規模宿主細胞培養において、複数のＲＮＡエフェクター分子と接触させ、前記複数のＲＮＡエフェクター分子が、少なくとも一つの標的遺伝子、少なくとも２つの標的遺伝子又は複数の標的遺伝子の発現を調節する、パラグラフ１〜２のいずれかに記載の方法。
４．細胞において生物由来物質を産生する方法であって、
（ａ）宿主細胞を、複数のＲＮＡエフェクター分子と接触させ（この場合、２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、複数の標的遺伝子の発現を調節する）；
（ｂ）前記細胞を、前記複数の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持し（この場合、発現の調節は、宿主細胞において生物由来物質の産生を向上させる）；及び
（ｃ）生物由来物質を細胞から単離する；
ことを含み、前記複数の標的遺伝子が少なくともＢａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨを含む、生物由来物質を産生させる方法。
５．前記ＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に、標的遺伝子の発現が一時的に抑制されるように加えることによって、前記宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる、パラグラフ４に記載の方法。
６．前記ＲＮＡエフェクター分子又は複数のＲＮＡエフェクター分子が、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、前記ｄｓＲＮＡが、相互に相補的である少なくとも２つの配列を含み並びにセンス鎖が、第一の配列を含み及びアンチセンス鎖が、標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的である相補性の領域を含む第二の配列を含み、並びに前記相補性の領域が、１０〜３０個のヌクレオチドの長さである、パラグラフ１〜５のいずれかに記載の方法。
７．前記接触工程を、前記ＲＮＡエフェクター分子又は複数のＲＮＡエフェクター分子を、前記宿主細胞培養物を保持して生物由来物質を産生させるために使用する培地に連続的に注入することによって行う、パラグラフ１〜６のいずれかに記載の方法。
８．前記発現の調節が発現の抑制であり、及び前記抑制が部分抑制である、パラグラフ１〜７のいずれかに記載の方法。
９．前記部分抑制が、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、及び８５％からなる群から選択される抑制率よりも大きくない、パラグラフ７に記載の方法。
１０．前記接触工程を、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、８４時間、９６時間及び１０８時間からなる群から選択される頻度で多数回繰り返す、パラグラフ１〜６又は８〜９のいずれかに記載の方法。
１１．前記接触工程を少なくとも１回繰り返す、パラグラフ１〜６又は８〜９のいずれかに記載の方法。
１２．前記発現の調節が、発現の抑制であり及び前記接触工程を、生物由来物質の産生全体を通じて標的遺伝子（一つ又は複数）について少なくとも５０％の平均抑制率を維持するために、多数回繰り返すか又は連続的に注入する、パラグラフ１〜１１のいずれか１に記載の方法。
１３．前記平均抑制率が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％からなる群から選択される、パラグラフ１２に記載の方法。
１４．前記ＲＮＡエフェクター分子を、１００ｎＭ未満の濃度で接触させる、パラグラフ１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．前記ＲＮＡエフェクター分子を、５０ｎＭ未満の濃度で接触させる、パラグラフ１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．宿主細胞を、大規模宿主細胞培養において、ＲＮＡエフェクター分子と接触させる前記接触を、生物由来物質を単離する少なくとも６時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１８時間前、少なくとも３６時間前、少なくとも４８時間前、少なくとも６０時間前、少なくとも７２時間前、少なくとも９６時間前又は少なくとも１２０時間前あるいは少なくとも１週間前に行う、パラグラフ１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．前記ＲＮＡエフェクター分子が、脂質製剤に製剤された組成物である、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．前記ＲＮＡエフェクター分子が、非脂質製剤に製剤された組成物である、パラグラフ１〜１７のいずれかに記載の方法。
１９．前記ＲＮＡエフェクター分子が、ｓｈＲＮＡではない、パラグラフ１〜１８のいずれかに記載の方法。
２０．前記ＲＮＡエフェクター分子が、ｓｉＲＮＡである、パラグラフ１〜１９のいずれかに記載の方法。
２１．前記ＲＮＡエフェクター分子が、化学的に修飾される、パラグラフ１〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．前記ＲＮＡエフェクター分子が、化学的に修飾されない、パラグラフ１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．さらに、細胞密度、培地ｐＨ、酸素濃度、グルコース濃度、乳酸濃度、温度及びタンパク質産生からなる群から選択される少なくとも一つの測定可能パラメータを監視することを含む、パラグラフ１〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．前記複数の異なるＲＮＡエフェクター分子のそれぞれを、同時に又は異なる時間で加える、パラグラフ２〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．前記複数の異なるＲＮＡエフェクター分子のそれぞれを、同じ濃度で又は異なる濃度で加える、パラグラフ２〜２３のいずれかに記載の方法。
２６．前記複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を、同じ頻度で又は異なる頻度で加える、パラグラフ２〜６又は８〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．さらに、前記細胞を、第二の作用物質と接触させることを含む、パラグラフ１〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．前記第二の作用物質が、抗体、増殖因子、アポトーシス阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤及びヒストン脱メチル化剤からなる群から選択される、パラグラフ２７に記載の方法。
２９．前記キナーゼ阻害剤が、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤及びＫ２５２ａからなる群から選択される、パラグラフ２８に記載の方法。
３０．前記ホスファターゼ阻害剤が、バナジン酸ナトリウム及びオカダ酸からなる群から選択される、パラグラフ２８に記載の方法。
３１．前記ヒストン脱メチル化剤が、５−アザシチジンである、パラグラフ２８に記載の方法。
３２．前記生物由来物質が、ポリペプチドである、パラグラフ１〜３１のいずれかに記載の方法。
３３．前記生物由来物質が、代謝産物である、パラグラフ１〜３１のいずれかに記載の方法。
３４．前記生物由来物質が、機能性食品である、パラグラフ１〜３１のいずれかに記載の方法。
３５．前記細胞を、ＲＮＡエフェクター分子と、定常期、初期対数期、中期対数期、後期対数期、誘導期及び死滅期からなる群から選択される細胞増殖の期で接触させる、パラグラフ１〜３４のいずれかに記載の方法。
３６．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、二重鎖領域を含む、請パラグラフ１〜３５のいずれかに記載の方法。
３７．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、１５〜３０個のヌクレオチドの長さである、パラグラフ１〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、１７〜２８個のヌクレオチドの長さである、パラグラフ１〜３７のいずれかに記載の方法。
３９．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む、パラグラフ１〜３８のいずれかに記載の方法。
４０．前記細胞が、植物細胞、真菌細胞、又は動物細胞である、パラグラフ１〜３９のいずれかに記載の方法。
４１．前記細胞が哺乳動物細胞である、パラグラフ１〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、パラグラフ４１に記載の方法。
４３．前記ヒト細胞が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＩＭＲ３２細胞、ＬＡＮ５細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦｌＯＡ細胞、２９３Ｔ細胞及びＳＫ−ＢＲ３細胞からなる群から選択される付着細胞である、パラグラフ４２に記載の方法。
４４．前記ヒト細胞が、ＨｕＶＥＣ細胞、ＨｕＡＳＭＣ細胞、ＨＫＢ−Ｉ１細胞及びｈＭＳＣ細胞からなる群から選択される初代細胞である、パラグラフ４２に記載の方法。
４５．前記ヒト細胞が、Ｕ２９３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲＣ６（登録商標）細胞、ジャーカット細胞、ＨＴ−２９細胞、ＬＮＣａｐ．ＦＧＣ細胞、Ａ５４９細胞、ＭＤＡ ＭＢ４５３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＴＨＰ−Ｉ細胞、ＭＣＦ７細胞、ＢｘＰＣ−３細胞、Ｃａｐａｎ−１細胞、ＤＵ１４５細胞及びＰＣ−３細胞からなる群から選択される、パラグラフ４２に記載の方法。
４６．前記哺乳動物細胞が、ＢＨＫ２１細胞、ＢＨＫ（ＴＫ−）細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＥＬ４細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞誘導体、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＥＳ−Ｄ３細胞、Ｈ９ｃ２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞，及びｍｉＭＣＤ３細胞からなる群から選択される齧歯類動物細胞である、パラグラフ４１に記載の方法。
４７．前記ＣＨＯ細胞誘導体が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸＢ１及びＣＨＯ−ＤＧ４４細胞からなる群から選択される、パラグラフ４６に記載の方法。
４８．前記細胞が、ＰＥＲＣ６細胞、ＨＴ−２９細胞、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞、Ａ５４９細胞、ＭＤＡ ＭＢ４５３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＴＨＰ−１細胞、ｍｉＭＣＤ−３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｃｏｓ−７細胞、ＢｘＰＣ−３細胞、ＤＵ１４５細胞、ジャーカット細胞、ＰＣ−３細胞及びＣａｐａｎ−１細胞からなる群から選択される、パラグラフ４２に記載の方法。
４９．前記細胞が、ＢＨＫ２１、ＢＨＫ（ＴＫ−）、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、Ｕ２９３細胞、ＥＬ４細胞、ＣＨＯ細胞，及びＣＨＯ細胞誘導体からなる群から選択される齧歯類動物細胞である、請求項４１に記載の方法。
５０．前記細胞が、さらに、前記生物由来物質をコードする遺伝子構造物を含む、パラグラフ１〜４９のいずれかに記載の方法。
５１．前記細胞が、さらに、ウイルス受容体をコードする遺伝子構造物を含む、パラグラフ１〜５０のいずれかに記載の方法。
５２．前記標的遺伝子が、タンパク質グリコシル化に影響を及ぼすタンパク質をコードする、パラグラフ１〜５１のいずれかに記載の方法。
５３．前記標的遺伝子が、前記生物由来物質をコードする、パラグラフ１〜５２のいずれかに記載の方法。
５４．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つを、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、及び６０ｎＭからなる群から選択される濃度で加える、パラグラフ１〜５３のいずれかに記載の方法。
５５．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つを、５０分子／細胞、１００分子／細胞、２００分子／細胞、３００分子／細胞、４００分子／細胞、５００分子／細胞、６００分子／細胞、７００分子／細胞、８００分子／細胞、９００分子／細胞、１０００分子／細胞、２０００分子／細胞、又は５０００分子／細胞の量で加える、パラグラフ１〜５３のいずれかに記載の方法。
５６．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つを、０．０１フェムトモル／１０６細胞、０．１フェムトモル／１０６細胞、０．５フェムトモル／１０６細胞、０．７５フェムトモル／１０６細胞、１フェムトモル／１０６細胞、２フェムトモル／１０６細胞、５フェムトモル／１０６細胞、１０フェムトモル／１０６細胞、２０フェムトモル／１０６細胞、３０フェムトモル／１０６細胞、４０フェムトモル／１０６細胞、５０フェムトモル／１０６細胞、６０フェムトモル／１０６細胞、１００フェムトモル／１０６細胞、２００フェムトモル／１０６細胞、３００フェムトモル／１０６細胞、４００フェムトモル／１０６細胞、５００フェムトモル／１０６細胞、７００フェムトモル／１０６細胞、８００フェムトモル／１０６細胞、９００フェムトモル／１０６細胞，及び１ピコモル／１０６細胞からなる群から選択される濃度で加える、パラグラフ１〜５３のいずれかに記載の方法。
５７．前記少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は前記複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、ギャップマー、アンタゴミア、リボザイム及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ１〜５６のいずれかに記載の方法。
５８．前記方法が、さらに、前記細胞を、炭素の代謝及び輸送、アポトーシス、ＲＮＡｉ取り込み及び／又は効率、活性酸素種産生、細胞周期の調節、タンパク質折りたたみ、タンパク質ピログルタミン酸化、タンパク質脱アミド化、タンパク質グリコシル化、ジスルフィド結合形成、タンパク質分泌、遺伝子増幅、ウイルス複製、ウイルス感染、ウイルス粒子放出、細胞ｐＨの調節、及びタンパク質産生からなる群から選択される細胞プロセスを調節する少なくとも一つの追加のＲＮＡエフェクター分子又は作用物質と接触させることを含む、パラグラフ１〜５７のいずれかに記載の方法。
５９．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸 ３−ホスファターゼ（ＰＴＥＮ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群から選択され、及び前記発現の調節が、細胞内の炭素の代謝又は輸送を調節することによって細胞において生物由来物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
６０．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）であり及び前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２５４０−３１５２６０３からなる群から選択される、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
６１．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、Ｂｃｌ−Ｇ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢｉｍＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｏｏ、Ｍｃｌ−１、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９及びＣＡＳＰ１０からなる群から選択され、及び前記発現の調節が、細胞のアポトーシスを調節することによって細胞において生物由来物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
６２．前記少なくとも一つの標的遺伝子がＢａｋであり及び前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２４１２〜３１５２４７５からなる群から選択される、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
６３．前記少なくとも一つの標的遺伝子がＢａｘであり及び前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２４７６〜３１５２５３９からなる群から選択される、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
６４．前記ＲＮＡエフェクター分子が、初期アポトーシスに入る細胞の比率を著しく低下させる、パラグラフ１６又は１７に記載の方法。
６５．前記複数の標的遺伝子が、少なくともＢａｘ及びＢａｋである、パラグラフ３に記載の方法。
６６．前記複数の標的遺伝子が、少なくともＢａｘ、Ｂａｃ及びＬＤＨである、パラグラフ３に記載の方法。
６７．その一部分がＢａｘと相補的である前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２４７６〜３１５２５３９からなる群から選択され、その一部分がＢａｋと相補的である前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２４１２〜３１５２４７５からなる群から選択される、パラグラフ４、５、６５又は６６のいずれかに記載の方法。
６８．その一部分がＬＤＨと相補的である前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２５４０〜３１５２６０３からなる群から選択される、パラグラフ４又は６６に記載の方法。
６９．前記の少なくとも２つの標的遺伝子の発現が調節され及び前記少なくとも２つの標的遺伝子が、Ｂｃｌ−Ｇ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ，及びＢｉｍＬからなる群から選択される、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７０．さらに、前記細胞を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）と相補的な配列を含むＲＮＡエフェクター分子と接触させることを含む、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７１．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、Ａｇｏ４、ＨＩＷＩ１、ＨＩＷＩ２、ＨＩＷＩ３、ＨＩＬＩ、インターフェロン受容体、ＡｐｏＥ、Ｅｒｉ１及びマンノース／ＧａｌＮＡｃ受容体からなる群から選択され、及び前記発現の調節が、細胞でのＲＮＡｉ取り込み及び／又は効率を調節することによって細胞において生物由来物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７２．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＮＡＤ（ｐ）Ｈオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、構成性神経一酸化窒素シンターゼ（ｃｎＮＯＳ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）、１５−リポキシゲナーゼ−１、ＮＡＤＰＨシトクロムｃ２レダクターゼ、ＮＡＰＨシトクロムｃレダクターゼ、ＮＡＤＨシトクロムｂ５レダクターゼ及びシトクロムＰ４５０２Ｅ１からなる群から選択され、及び前記発現の調節が、細胞での活性酸素種の産生を抑制することによって細胞において生物由来物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７３．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＭｕＬＶタンパク質、ＭＶＭタンパク質、Ｒｅｏ−３タンパク質、ＰＲＶタンパク質及びベシウイルスタンパク質からなる群から選択され；及び前記発現の調節が、細胞のウイルス感染を抑制することによって細胞において生物由来物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７４．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、キシロシルトランスフェラーゼである、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７５．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ベシウイルスタンパク質であり及び前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：３１５２６０４〜３１５２７１３からなる群から選択される、パラグラフ７３に記載の方法。
７６．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、Ｐ１０、Ｐ２１、Ｐ２７、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ及びＣＤＫ４からなる群から選択され、及び前記発現の調節が、細胞の細胞周期を調節することによって細胞において生物由来物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７７．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ４、ＡＴＦ６、ｅＩＦ２α、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、Ｂｉｐ、Ｈｓｐ４０、ＨＳＰ４７、ＨＳＰ６０、Ｈｓｐ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１００、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼ、カルレチクリン、カルネキシン、Ｅｒｐ５７及びＢＡＧ−１からなる群から選択され；及び前記発現の調節が、タンパク質の折りたたみを高めることによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７８．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、宿主細胞内のメチオニンスルホキシドレダクターゼ遺伝子であり、及び前記発現の調節が、メチオニン酸化によるタンパク質の修飾を抑制することによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
７９．前記標的遺伝子が、宿主細胞内のグルタミニルシクラーゼ遺伝子であり、及び前記発現の調節が、ピログルタミン酸化によるタンパク質の修飾を抑制することによって細胞でのタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８０．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、アスパラギンデアミダーゼ及びグルタミンデアミダーゼからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、脱アミド化によってタンパク質の修飾を抑制することによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８１．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ドリチル−ジホスホオリゴサッカライド−タンパク質グリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、タンパク質Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＴ−４、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、α−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、タンパク質のグリコシル化を調節することによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８２．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ及びスルフヒドリルオキシダーゼからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、タンパク質においてジスルフィド結合形成を調節することによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８３．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、γ−セクレターゼ、ｐ１１５、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）タンパク質、セクレチン及びキナーゼからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、タンパク質の分泌を調節することによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８４．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、宿主細胞内のデヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子であり、及び前記発現の調節が、細胞での遺伝子増幅を高めることによって細胞においてタンパク質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８５．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ウイルスの遺伝子又は細胞の標的遺伝子であり、それによって減少したウイルス量を有する宿主細胞から生物由来物質を産生させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
８６．前記ウイルスが、ベシウイルス、ＭＭＶ、ＭｕＬＶ、ＰＲＶ及びＲｅｏ−３からなる群から選択される、パラグラフ８５に記載の方法。
８７．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ウイルスタンパク質をコードする、パラグラフ８５に記載の方法。
８８．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、非ウイルスタンパク質をコードする、パラグラフ８５に記載の方法。
８９．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、酸化促進酵素、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦＩ及びＨＳＰ７０からなる群から選択され；及び前記発現の調節が、細胞の生存率を高めることによって細胞において生物由来物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
９０．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、Ｐ１０、Ｐ２１、Ｐ２７、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、Ｂｃｌ−Ｇ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢｉｍＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｏｏ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸 ３−ホスファターゼ（ＰＴＥＮ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群から選択され；及び前記発現の調節が、細胞の特異的生産性を高めることによって細胞において生物由来物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
９１．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸 ３−ホスファターゼ（ＰＴＥＮ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、Ｐ１０、Ｐ２１、Ｐ２７、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ及びＣＤＫ４からなる群から選択され；及び前記発現の調節が、細胞の栄養必要量を調節することによって細胞において生物由来物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
９２．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ及びリソソームＶ型ＡＴＰアーゼからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、細胞のｐＨを調節することによって細胞での生物由来物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
９３．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、細胞質アクチンキャッピングタンパク質（ＣａｐＺ）、エズリン（ＶＩＬ２）、ラミニンＡ及びコフィリン（ＣＦＬ１）からなる群から選択され；及び前記遺伝子発現の調節が、細胞のアクチン動態を調節することによって細胞において生物由来物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
９４．少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、標的遺伝子コフィリンの発現を調節する、パラグラフ９３に記載の方法。
９５．少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、細胞質アクチンキャッピングタンパク質（ＣａｐＺ）、エズリン（ＶＩＬ２）及びラミニンＡからなる群から選択される標的遺伝子の発現を増加させる、パラグラフ９３に記載の方法。
９６．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、宿主細胞潜在ウイルス、外来ウイルス又は宿主細胞内在性レトロウイルスの遺伝子であるか、あるいはこのようなウイルスの宿主細胞結合リガンドである、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
９７．前記標的遺伝子が、ＨＥＲＶ−Ｋ、ｐｔ０１−Ｃｈｒ１０ｒ−１７１１９４５８、ｐｔ０１−Ｃｈｒ５−５３８７１５０１、ＢａＥＶ、ＧａＬＶ、ＨＥＲＶ−Ｔ、ＥＲＶ−３、ＨＥＲＶ−Ｅ、ＨＥＲＶ−ＡＤＰ、ＨＥＲＶ−Ｉ、ＭＥＲ４様、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶＨ−ＲＴＶＬＨ２、ＨＥＲＶＨ−ＲＧＨ２、ＨＥＲＶ−Ｈコンセンサス、ＨＥＲＶ−Ｆｃ１、ｈｇ１５−ｃｈｒ３−１５２４６５２８３、ＨＥＲＶＬ６６、ＨＳＲＶ、ＨＦＶ、ＨＥＲＶ−Ｓ、ＨＥＲＶ−Ｌ、ＨＥＲＶＬ４０、ＨＥＲＶＬ７４、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＭＰＭＶ、ＭＭＴＶ、ＨＭＬ１、ＨＭＬ２、ＨＭＬ３、ＨＭＬ４、ＨＭＬ７、ＨＭＬ８、ＨＭＬ５、ＨＭＬ１０、ＨＭＬ６、ＨＭＬ９、ＭＭＴＶ、ＦＬＶ、ＰＥＲＶ、ＢＬＶ、ＥＩＡＶ、ＪＳＲＶ、ｇｇ０１−ｃｈｒ７−７１６３４６２、ｇｇ０１−ｃｈｒＵ−５２１９０７２５、ｇｇ０１−Ｃｈｒ４−４８１３０８９４、ＡＬＶ、ｇｇ０１−ｃｈｒ１−１５１６８８４５、ｇｇ０１−ｃｈｒ４−７７３３８２０１、ｇｇ０１−ＣｈｒＵ−１６３５０４８６９、ｇｇ０１−ｃｈｒ７−５７３３７８２、ニシキヘビ、ＷＤＳＶ、ＳｎＲＶ、Ｘｅｎ１、Ｇｙｐｓｙ及びＴｙ１から選択される内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）の遺伝子である、パラグラフ９６に記載の方法。
９８．前記標的遺伝子が、Ｃ血清型アデノウイルス、トリアデノウイルス、トリアデノウイルス随伴ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−４（ＥＢＶ）及びサーコウイルスからなる群から選択される潜在ウイルスの遺伝子である、パラグラフ９６に記載の方法。
９９．前記潜在ウイルスがサーコウイルスであり、及び前記標的遺伝子が、ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）又はサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のｒｅｐ遺伝子である、パラグラフ９８に記載の方法。
１００．前記潜在ウイルスがＥＢＶであり及び前記標的遺伝子が潜在膜タンパク質（ＬＭＰ）−２Ａである、パラグラフ９８に記載の方法。
１０１．前記標的遺伝子が、外来性レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、ヒトＴ細胞リンパ指向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ヒト肝炎Ａ型（ＨＨＡ）、ＨＨＢ、ＨＨＣ、ヒトサイトメガロウイルス、ＥＢＶ、ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ６）、ＨＨＶ７、ＨＨＶ８、ヒトパルボウイルスＢ１９、レオウイルス、ポリオーマ（ＪＣ／ＢＫ）ウイルス、ＳＶ４０、ヒトコロナウイルス、パピローマウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザＡ型、Ｂ型及びＣ型ウイルス、ヒトエンテロウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ベシウイルス、ブタサーコウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス、ブタパルボウイルス、アデノ随伴ウイルス、レオウイルス、狂犬病ウイルス、レポリポックスウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ハンターンウイルス、マルブルグウイルス、ＳＶ２０、セムリキ森林ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ブタパルボウイルス、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、マウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ）、タイラー脳脊髄炎ウイルス、ネズミ微小ウイルス、マウスアデノウイルス（ＭＡＶ）；マウスサイトメガロウイルス、マウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）、キルハムラットウイルス、トゥーランＨ−１ウイルス、センダイウイルス、ラットコロナウイルス、偽性狂犬病ウイルス、カシェ渓谷ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシアデノウイルス、ウシパルボウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ウシヘルペスウイルス、ウシレオウイルス、ブルータングウイルス、ウシポリオーマウイルス、ウシサーコウイルス、牛痘、牛痘以外のオルトポックスウイルス、偽牛痘ウイルス及びレポリポックスウイルスからなる群から選択される外来ウイルスの遺伝子である、パラグラフ９６に記載の方法。
１０２．標的遺伝子が、内在性ウイルス、潜在ウイルス又は外来ウイルスのための宿主細胞結合リガンドである、パラグラフ９６に記載の方法。
１０３．前記標的遺伝子が、ＳＬＣ３５Ａ１、Ｇｎｅ、Ｃｍａｓ、Ｂ４ＧａｌＴ１又はＢ４ＧａｌＴ６である、パラグラフ１０２に記載の方法。
１０４．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、ＦＵＴ８、ＴＳＴＡ３及びＧＭＤＳからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、フコシル化を調節することによって細胞において生物由来物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
１０５．さらに、宿主細胞を、シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を標的とする少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させることを含む、請パラグラフ１０４に記載の方法。
１０６．前記シアリルトランスフェラーゼが、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ３、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ５、ＳＴ６（α−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−β−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ６及びＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ２からなる群から選択される、パラグラフ１０５に記載の方法。
１０７．前記少なくとも一つの標的遺伝子が、グルタミナーゼ及びグルタミンデヒドロゲナーゼからなる群から選択され；及び前記発現の調節が、アンモニア増強を調節することによって細胞において生物由来物質の産生を向上させる、パラグラフ１〜３又は６〜５８のいずれかに記載の方法。
１０８．さらに、前記宿主細胞を、グルタミナーゼの発現を調節する少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させることを含む、パラグラフ１〜１０８のいずれかに記載の方法。
１０９．さらに、前記宿主細胞を、グルタミンシンテターゼの発現を調節する少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させることを含む、パラグラフ１〜１０８のいずれかに記載の方法。
１１０．少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である）と、宿主細胞を培養するのに適した細胞培地とを含んでなる組成物であって、前記ＲＮＡエフェクター分子が、標的遺伝子の発現を調節でき及び前記発現の調節が、生物由来物質の産生を高め、前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３３９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡである組成物。
１１１．２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含んでなり、前記２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子がそれぞれ異なる標的遺伝子と相補的である、パラグラフ１１０に記載の組成物。
１１２．複数のＲＮＡエフェクター分子を含んでなる組成物であって、それぞれのＲＮＡエフェクター分子の一部分が、宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的であり、並びに前記組成物がＢａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨの発現を調節することができ及び前記発現の調節が生物由来物質の産生を高める組成物。
１１３．さらに、少なくとも一つの追加のＲＮＡエフェクター分子又は物質を含む、パラグラフ１１０又は１１２に記載の組成物。
１１４．前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子がｓｉＲＮＡである、１１０又は１１２に記載の組成物。
１１５．前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が二重鎖領域を含む、パラグラフ１１０又は１１２に記載の組成物。
１１６．前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、１５〜３０個のヌクレオチドの長さである、パラグラフ１１０又は１１２に記載の組成物。
１１７．前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、１７〜２８個のヌクレオチドの長さである、パラグラフ１１０又は１１２に記載の組成物。
１１８．前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、修飾ヌクレオチドを含む、パラグラフ１１０又は１１２に記載の組成物。
１１９．前記細胞培地が血清無含有培地である、パラグラフ１１０に記載の組成物。
１２０．前記組成物が、非脂質製剤に製剤される、パラグラフ１１０〜１１９のいずれかに記載の組成物。
１２１．前記組成物が、脂質製剤に製剤される、パラグラフ１１０〜１１９に記載の組成物。
１２２．前記製剤中の脂質が、陽イオン性又は非イオン性脂質を含む、パラグラフ１２１のいずれか１つに記載の組成物。
１２３．前記組成物が、さらに一つ又はそれ以上の細胞培養培地補助物質を含む、パラグラフ１１０〜１２２のいずれかに記載の組成物。
１２４．前記少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、前記ｄｓＲＮＡが、相互に相補的である少なくとも２つの配列を含み及び前記センス鎖が、第一の配列を含み及びアンチセンス鎖が、標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的である相補性の領域を含む第二の配列を含み、並びに前記相補性の領域が、１０〜３０個のヌクレオチドの長さである、パラグラフ１１０〜１２３のいずれかに記載の組成物。
１２５．培養細胞による生物由来物質の産生を高めるキットであって、
（ａ）生物由来物質が産生される条件下で細胞を培養するのに適した一つ又はそれ以上のアッセイ表面を含む支持体；
（ｂ）一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子（それぞれのＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は、標的遺伝子と相補的である）、及び
（ｃ）生物由来物質又はその細胞による産生を検出するための試薬、
を含み、前記一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３３９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであるキット。
１２６．前記一つ又はそれ以上のアッセイ表面が、さらに宿主細胞の増殖及び維持を支持するための基材を含む、パラグラフ１２５に記載のキット。
１２７．前記一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、前記支持体表面に沈着している、パラグラフ１２５に記載のキット。
１２８．さらに、前記宿主細胞によるＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進するための担体を含む、パラグラフ１２５に記載のキット。
１２９．前記担体が陽イオン性脂質組成物を含む、パラグラフ１２８に記載のキット。
１３０．前記担体が、支持体表面に沈着している、パラグラフ１２８に記載のキット。
１３１．さらに、宿主細胞を培養するのに適した細胞培養培地を含む、パラグラフ１２５に記載のキット。
１３２．さらに、一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子の存在下で宿主細胞を培養し、前記細胞を生物由来物質の産生についてアッセイするための取扱説明書を含む、パラグラフ１２５に記載のキット。
１３３．培養細胞による生物由来物質の産生を最適化するためのキットであって、
（ａ）複数のアッセイ表面を含むマイクロアレイ支持体（前記アッセイ表面は、生物由来物質が産生される条件下で細胞を培養するのに適している）；
（ｂ）一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子（それぞれのＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は、標的遺伝子と相補的である）；及び
（ｃ）前記一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子の生物由来物質の産生に対する効果を検出するための試薬；
を含み、前記一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３３９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであるキット。
１３４．前記支持体が、マルチウエルプレート又はバイオチップである、パラグラフ１３３に記載のキット。
１３５．前記支持体が、二次元マイクロアレイプレート又はバイオチップある、パラグラフ１３３に記載のキット。
１３６．前記一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、支持体のアッセイ表面に沈着している、パラグラフ１３３に記載のキット。
１３７．複数の異なるＲＮＡエフェクター分子が、マイクロアレイの第一の寸法にわたってアッセイ表面に沈着している、パラグラフ１３５に記載のキット。
１３８．前記複数のＲＮＡエフェクター分子が、それぞれ異なる標的遺伝子と相補的である、パラグラフ１３７に記載のキット。
１３９．前記異なる標的遺伝子が、Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨである、パラグラフに記載のキット。
１４０．複数のＲＮＡエフェクター分子が、それぞれ同じ標的遺伝子の異なる領域と相補的である、パラグラフ１３７に記載のキット。
１４１．前記複数を含むＲＮＡエフェクター分子のそれぞれが、マイクロアレイの第二の寸法に沿ったアッセイ表面に種々の濃度で沈着している、パラグラフ１３７に記載のキット。
１４２．前記ＲＮＡエフェクター分子（その一部分は、標的遺伝子と相補的である）が、ヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む対応ｓｉＲＮＡであり、前記ヌクレオチド配列が、表１〜１６、２１〜２５、２７〜３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４５、４７、５１〜６１、６５及び６６のいずれかに記載される、請求項１〜１０９のいずれかに記載の方法。
１４３．細胞においてタンパク質の発現を調節するのに適した少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子のヌクレオチド配列を選択するためのシステムであって、
（ａ）少なくとも一つのプロセッサと関連メモリとを含むコンピュータシステム（前記メモリは、コンピュータシステムの操作を制御するための少なくとも一つのコンピュータプログラムを格納する）；
（ｂ）前記コンピュータシステムに連結され、少なくとも一つの細胞の少なくとも一つのトランスクリプトーム（細胞トランスクリプトーム）のトランスクリプトーム情報（前記情報は、前記トランスクリプトームのそれぞれの転写産物のための配列、及び場合により前記転写産物の名前、及び場合により前記転写産物が役割を果たす分子経路の名前を含む）と；少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子に関する情報（前記情報は、少なくともＲＮＡエフェクター分子の配列、及び場合により前記ＲＮＡエフェクター分子の標的特異性を含み、それぞれのＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも一つの細胞トランスクリプトームの少なくとも配列にマッチさせるために設計される）とを含むデータベース；
（ｃ）前記コンピュータシステムによって実行され並びに細胞型選択、標的生物選択、細胞経路選択、交差反応性選択、転写産物量選択、標的遺伝子名及び／又は配列選択、及び場合により生体内又は生体外送達選択肢のいずれかを含む送達選択の方法の少なくとも一つを含むユーザパラメータと；さらに、場合によりユーザアドレス情報とを受け取るために構成されたユーザインターフェースプログラムモジュール；
（ｄ）前記コンピュータシステムによって実行され並びに前記パラメータとトランスクリプトーム転写産物配列のマッチする組み合わせについて前記パラメータをデータベース中の配列と照合するために構成される第一のモジュール；及び
（ｅ）前記コンピュータシステムによって実行され及び細胞でのタンパク質の発現を調節するのに適した少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子の選択された配列を示すために構成された第二のモジュール；
を含むシステム。
１４４．さらに、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子をコンテナに格納するための記憶モジュール（この場合、２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が存在する場合には、それぞれのＲＮＡエフェクター分子は、別個のコンテナに格納される）及びロボットハンドリングモジュール（これは、前記マッチする組み合わせの選択の際に、マッチングコンテナを選択し、及び場合により前記コンテナに生体内又は生体外送達のためのユーザ選択に基づいた付加物を加え、及び場合によりさらに、ユーザアドレスに送るべき前記マッチングＲＮＡエフェクター分子を含むコンテナをパッケージする）を含む、パラグラフ１４４に記載のシステム。
１４５．前記少なくとも一つの細胞トランスクリプトーム配列情報が、本質的に配列番号：１−９７７１及び配列番号：３１５７１４９−３１５８４２０からなる、パラグラフ１４３〜１４４のいずれかに記載のシステム。
１４６．前記ＲＮＡエフェクター分子が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、ギャップマー、アンタゴミア、リボザイム及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ１４３〜１４５のいずれかに記載のシステム。
１４７．前記ＲＮＡエフェクター分子が、ｓｉＲＮＡ、製剤化ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ混合物及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、パラグラフ１４３〜１４５のいずれかに記載のシステム。
１４８．前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３９９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡ鎖を含む、パラグラフ１４３〜１４７のいずれかに記載のシステム。
１４９．前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３９９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６〜１９個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡ鎖を含む、パラグラフ１４３〜１４７のいずれかに記載のシステム。
１５０．前記の少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子の配列が、本質的に配列番号：９７７２−３１５２３９９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる、パラグラフ１４３〜１４９のいずれかに記載のシステム。
１５１．少なくとも一つのトランスクリプトーム中の少なくとも一つ又はそれ以上の配列とマッチする複数のＲＮＡエフェクター分子が選択される、パラグラフ１４３〜１５０のいずれかに記載のシステム。
１５２．前記パラグラフのいずれか一つに記載のシステムを使用して細胞においてタンパク質の発現を調節するためのＲＮＡエフェクター分子の選択方法。
１５３．さらに細胞のゲノム情報を含み、ユーザ選択によって、前記ＲＮＡエフェクター分子を、ゲノムに存在するプロモーター、エンハンサー、イントロン及びエクソンを含む標的ゲノム配列にマッチさせることができる、前記パラグラフのいずれかに記載のシステム。
１５４．配列番号：１−９７７１を有する転写産物の選択又は編集を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞トランスクリプトーム。
１５５．配列番号：３１５７１４９−３１５８４２０を有する転写産物の選択又は編集を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞トランスクリプトーム。
１５６．前記ＣＨＯ細胞トランスクリプトーム配列が、データベースの一部である、パラグラフ１５４又は１５５に記載のＣＨＯ細胞トランスクリプトーム。
１５７．パラグラフ１５４又は１５５に記載のＣＨＯ細胞トランスクリプトームのいずれか一つに指向するｓｉＲＮＡ。
１５８．前記ｓｉＲＮＡが、配列番号：９７７２−３１５２３９９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む、パラグラフ１５７に記載のｓｉＲＮＡ。
１５９．前記ｓｉＲＮＡが、配列番号：９７７２−３１５２３９９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６〜１９個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む、パラグラフ１５７又は１５８に記載のｓｉＲＮＡ。
１６０．前記ｓｉＲＮＡが、配列番号：９７７２−３１５２３５９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択される、パラグラフ１５６〜１５９のいずれか一つに記載のｓｉＲＮＡ。
１６１．前記ｓｉＲＮＡ配列又はそのアンチセンス配列が、データベースの一部である、前記請求項のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
１６２．細胞株を改良する方法であって、表１〜１６から選択される転写産物から翻訳される少なくとも一つのタンパク質を調節することを含む方法。
１６３．細胞株を改良する方法であって、少なくとも２つの転写産物を、エフェクターＲＮＡ分子を使用して調節することを含み、第一の転写産物が、第一の細胞培養表現型に影響を及ぼし及び第二の転写産物が、第二の異なる細胞培養表現型に影響を及ぼし、前記細胞培養表現型が、細胞増殖速度、細胞生産性、ピーク細胞密度、持続した細胞生存率、アンモニア産生及び消費の速度、又は乳酸産生もしくは消費の速度からなる群から選択され；並びに前記第一及び第二の転写産物が、配列番号：１−９７７１及び配列番号：３１５７１４９−３１５８４２０からなる群から選択される方法。
１６４．さらに、第一及び第二の細胞培養表現型と異なる第三の細胞培養表現型に影響を及ぼす第三の転写産物を調節することを含む、パラグラフ１６３に記載の方法。
１６５．前記ＲＮＡエフェクター分子が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、ギャップマー、アンタゴミア又はリボザイムからなる群から選択される、パラグラフ１６３〜１６４のいずれかに記載の方法。
１６６．前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３５９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む、パラグラフ１６３〜１６５のいずれかに記載の方法。
１６７．前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３９９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６〜１９個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む、パラグラフ１６３〜１６７のいずれかに記載の方法。
１６８．前記エフェクターＲＮＡ分子が、配列番号：９７７２−３１５２３９９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択される、パラグラフ１６３〜１６７のいずれかに記載の方法。
１６９．前記細胞株がＣＨＯ細胞株である、パラグラフ１６３〜１６８のいずれかに記載の方法。
１７０．改良された細胞生産性、改良された細胞増殖速度、又は改良された細胞生存率を有する組換え細胞株であって、組換え細胞の個体群を含み、そのそれぞれが、表１〜１６、２１〜２５、２７〜３０、５２〜６１、６５及び６６から選択される一つ又はそれ以上の転写産物を調節する組換え構造物を含む組換え細胞株。
１７１．前記の一つ又はそれ以上の転写産物を調節する組換え構造物が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、ギャップマー、アンタゴミア、リボザイム及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＲＮＡエフェクター分子を含む、パラグラフ１７０に記載の組換え細胞株。
１７２．前記ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号：９７７２−３１５２３９９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１６〜１９個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む、パラグラフ１７１に記載の組換え細胞株。
１７３．前記組み換え構造物が、配列番号：９７７２−３１５２３９９及び配列番号：３１６１１２１−３１７６７８３からなる群から選択されるｓｉＲＮＡを含む、パラグラフ１６９〜１７２のいずれかに記載の組換え細胞株。
１７４．前記脂質製剤が、次式：
Figure 2014501097
 ｛式中：
Ｒ１及びＲ２は、それぞれの存在についてそれぞれ独立して、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルキル、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルコキシ、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルケニルオキシ、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アルキニルオキシ、又は場合により置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ３０アシルであり；
Figure 2014501097
 は、Ｌ２とＬ１の間の結合を表し、この結合は：
（１）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子の間の単結合であり〔この場合、
Ｌ１は、Ｃ（Ｒｘ）、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｑ）であり；
Ｌ２は、−ＣＲ５Ｒ６−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｑ）−、＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、又は−Ｃ（Ｏ）−である〕；
（２）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子の間の二重結合であり〔この場合、
Ｌ１は、Ｃであり；
Ｌ２は、−ＣＲ５＝、−Ｎ（Ｑ）＝、−Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝である〕；
（３）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合、及びＬ２の第二の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合であり〔この場合、
Ｌ１は、Ｃであり；
Ｌ２は、次式：
Figure 2014501097
 を有し、式中のＸは、Ｌ２の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ２の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ１の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｚ１及びＺ４は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
Ｚ２は、ＣＨ又はＮであり；
Ｚ３は、ＣＨ又はＮであり；
あるいは、Ｚ２とＺ３は、一緒になって、単一のＣ原子であり；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
それぞれのＺは、Ｎ、Ｃ（Ｒ５）、又はＣ（Ｒ３）であり；
ｋは、０、１、又は２であり；
それぞれのｍは、独立して０〜５であり；
それぞれのｎは、独立して０〜５であり；
この場合に、ｍとｎは、一緒になって３、４、５、６、７又は８員環を生じる〕；
（４）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子の間の単結合、及びＬ２の第一の原子とＬ１の第二の原子の間の単結合であり〔この場合に、
（Ａ）Ｌ１は、次式：
Figure 2014501097
 を有し、式中のＸは、Ｌ１の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ１の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ２の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｔ１は、ＣＨ又はＮであり；
Ｔ２は、ＣＨ又はＮであり；
あるいは、Ｔ１とＴ２は、一緒になって、Ｃ＝Ｃであり；
Ｌ２は、ＣＲ５であるか；又は
（Ｂ）Ｌ１は、次式：
Figure 2014501097
 を有し、式中のＸは、Ｌ１の第一の原子であり、Ｙは、Ｌ１の第二の原子であり、−−−−−は、Ｌ２の第一の原子に対する単結合を表し、並びにＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
Ｔ１は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
Ｔ２は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
Ｌ２は、ＣＲ５又はＮである〕；
Ｒ３は、次式：
Figure 2014501097
 を有し、式中、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４のそれぞれは、独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、又はアルキニルであるか；あるいは、
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の任意の２つは、これらを結合しているＮ原子と一緒になって３〜８員複素環を形成するか；あるいは、
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、全てがこれらを結合しているＮ原子と一緒になって二環式５〜１２員複素環を形成し；
それぞれのＲｎは、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；
Ｌ３は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｌ４は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｌ５は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
Ｒ５及びＲ６のそれぞれの存在は、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；あるいは、隣り合った２個の炭素原子上の２個のＲ５基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で二重結合を形成するか；又は隣り合った２個の炭素原子上の２個のＲ５基と、同じ隣り合った炭素原子上の２個のＲ６基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で三重結合を形成し；
それぞれのａは、独立して、０、１、２、又は３であり；
この場合に、
Ｌ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基は、場合によりＬ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基と一緒になって、３〜８員シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリール基を形成し；及び
Ｙ１、Ｙ２及びＹ３の任意の一つは、場合により、Ｌ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６基、及びこれらを結合している原子と一緒になって、３〜８員ヘテロシクリル基を形成し；
それぞれのＱは、独立して、Ｈ、アルキル、アシル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり；並びに
それぞれのＱ２は、独立してＯ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）（Ｑ）、アルキル又はアルコキシである｝
を有する脂質を含んでなる、パラグラフ１２１に記載の方法。
１７５．前記哺乳動物細胞が、ＭＤＣＫ細胞である、パラグラフ４１に記載の方法。
（実施例）
（実施例１） ＲＮＡエフェクター分子合成
試薬の供給源が本明細書中で具体的に記載されていない場合、そのような試薬は、分子生物学における応用に標準的な品質／純度で分子生物学用試薬の任意の供給元から入手することができる。
オリゴヌクレオチド合成：オリゴヌクレオチドは全てＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置で合成する。市販のコントロールドポアガラス固体支持体（ｄＴ−ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）及び標準的保護基を有するＲＮＡホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−-イソブチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、及び５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をオリゴヌクレオチド合成のために使用した。２’−Ｆホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルロ−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイト及び５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルロ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイトを（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入する。１０％ＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中０．２Ｍの濃度で使用するグアノシン以外、全てのホスホルアミダイトはアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中０．２Ｍの濃度で使用する。１６分のカップリング／リサイクリング時間を使用する。アクチベータは、５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であり；ＰＯ酸化には、ヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ酸化には、２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）中ＰＡＤＳ（２％）を使用する。
３’−リガンド結合鎖は、対応するリガンドを含む固体支持体を使用して合成する。例えば、配列中のコレステロール単位の導入は、ヒドロキシプロリノール−コレステロールホスホルアミダイトから実施する。コレステロールを６−アミノヘキサノエート結合によりｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリノールと結合させて、ヒドロキシプロリノール−コレステロール部分を得る。５’末端Ｃｙ−３及びＣｙ−５．５（フルオロフォア）標識されたＲＮＡエフェクター分子を、対応するＱｕａｓａｒ（登録商標）５７０インドカルボシアニンから合成する。Ｃｙ（商標）３ホスホルアミダイトをＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）から購入する。リガンドの５’末端及び又は内部位置への結合は、適切に保護されたリガンド−ホスホルアミダイトビルディングブロックを用いることによって達成される。ホスホルアミダイトの無水ＣＨ３ＣＮ中０．１Ｍ溶液の、５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾールアクチベータの存在下での固体支持体結合オリゴヌクレオチドへの拡大された１５分のカップリング。ヌクレオチド間ホスファイトのホスフェートへの酸化は、文献で報告されているように、標準的ヨウ素−水を用いるか、又はｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）での処理（１０分間の酸化待ち時間を伴う）によって実施する。ホ硫黄転移試薬、例えばＤＤＴＴ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入）、ＰＡＤＳ及び又はＢｅａｕｃａｇｅ試薬を使用することによりホスファイトをホスホロチオエートに酸化することによって、スホロチオエートを導入する。コレステロールホスホルアミダイトを自家合成し、ジクロロメタン中０．１Ｍの濃度で使用する。コレステロールホスホルアミダイトのカップリング時間は１６分である。
脱保護Ｉ（核酸塩基脱保護）：合成完了後、支持体を１００ｍＬのガラスビン（ＶＷＲ）に移す。８０ｍＬのエタノール性アンモニア混合物［アンモニア：エタノール（３：１）］で６．５時間５５℃にて、塩基及びリン酸基を同時に脱保護して、オリゴヌクレオチドを支持体から切断する。ビンを氷上で短時間冷却し、次いでエタノール性アンモニア混合物を新しい２５０ｍＬビン中にろ過する。ＣＰＧを２×４０ｍＬのエタノール／水（１：１ｖ／ｖ）で洗浄する。混合物の体積を次いでロト・バップにより〜３０ｍＬまで減じる。混合物を次いでドライアイス上で凍結させ、スピード・バックで真空乾燥する。
脱保護ＩＩ（２’−ＴＢＤＭＳ基の除去）：乾燥残留物を２６ｍＬのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ・３ΗＦ）又はピリジン−ＨＦ及びＤＭＳＯ（３：４：６）中に再懸濁させ、６０℃で９０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去する。反応を次いで５０ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムでクエンチし、ｐＨを６．５に調節する。オリゴヌクレオチドを精製するまで冷凍庫中で保存する。
分析：オリゴヌクレオチドを精製前に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、緩衝液及びカラムの選択は、配列及び又は結合リガンドの性質に依存する。
ＨＰＬＣ精製：リガンド結合オリゴヌクレオチドを逆相分取ＨＰＬＣにより精製する。非結合オリゴヌクレオチドを、自家充填したＴＳＫゲルカラム上アニオン交換ＨＰＬＣにより精製する。緩衝液は、１０％ＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ａ）；及び１０％ＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、１Ｍ ＮａＢｒ（緩衝液Ｂ）である。全長オリゴヌクレオチドを含むフラクションをプールし、脱塩し、凍結乾燥する。約０．１５ＯＤの脱塩されたオリゴヌクレオチドを水中で１５０μＬに希釈し、次いでＣＧＥ及びＬＣ／ＭＳ分析用の特別なバイアル中にピペッティングする。化合物を次いでＬＣ−ＥＳＭＳ及びＣＧＥにより分析する。
ＲＮＡエフェクター分子調製：ＲＮＡエフェクター分子の一般的な調製のために、等モル量のセンス鎖及びアンチセンス鎖を１×ＰＢＳ中、９５℃で５分間加熱し、そして室温までゆっくりと冷却する。二本鎖の完全性をＨＰＬＣ分析により確認する。
ハムスターＢａｘ、Ｂａｋ、及びＬＤＨ ｍＲＮＡを分解するように設計されたｓｉＲＮＡを、一般公開されている配列データに基づいて合成した。約３２のｓｉＲＮＡの１セットを各標的に関して設計し、合成した。各ｓｉＲＮＡを細胞培地に１０ｎＭで３日間添加して、効果についてスクリーニングした。９６ウェルプレート中で、２９．５μＬのＣＤＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）を試験ウェルに添加し、４７μＬを対照ウェルに添加した。このために、ＣＤＣＨＯ培地中１００ｎＭのｓｉＲＮＡ（１７．５μＬ）を試験ウェルに添加した。全てのウェルに対して、ＣＤＣＨＯ培地中で１：１０に希釈した３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。混合物を室温で１５分間インキュベートし、次いで２０，０００〜３０，０００細胞を含有する１２５μＬのＣＤＣＨＯ培地を全てのウェルに添加した。プレートを次いで３７℃ＣＯ２インキュベータ中に３日間入れた。
３日後、細胞を毒性について視覚的に調査し、次いで製造業者の指示にしたがってＭａｇＭＡＸ（商標）９６ウェルＲＮＡ抽出キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ．／Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して、ＲＮＡを抽出した。製造業者の指示にしたがってＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ．）を使用して、ｃＤＮＡをＲＮＡから作製した。最後に、ｑＰＣＲを用いて、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＰＣＲ装置及びＲｏｃｈｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｂｅｓマスターミックスで標的ｃＤＮＡの２５倍希釈を定量化した。ＡＰＤＨを内部標準として使用するΔΔＣｔ法を用いて、標的遺伝子の相対的ノックダウンを計算した。
ｑＰＣＲに関して、以下のプライマー及びプローブを使用した：
Ｂａｘ
順方向プライマー ５’−ＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＧＧＡＧＧＣＧ−３’（配列番号３１５２４００）
逆方向プライマー ５’−ＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＧＡ−３’（配列番号３１５２４０１）
プローブ ５’−６ＦＡＭ−ＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＧＡＧＣＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３１５２４０２）
Ｂａｋ
順方向プライマー ５’−ＣＣＴＣＣＴＡＧＧＣＡＧＧＡＣＴＧＴＧＡ−３’（配列番号３１５２４０３）
逆方向プライマー ５’−ＣＣＡＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＴＴＣＴ−３’（配列番号３１５２４０４）
プローブ ５’−６ＦＡＭ−ＴＣＡＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３１５２４０５）
ＬＤＨ
順方向プライマー ５’−ＴＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＴＴＧＧ−３’（配列番号３１５２４０６）
逆方向プライマー ５’−ＴＣＡＣＡＡＣＡＴＣＧＧＡＧＡＴＴＣＣＡ−３’（配列番号３１５２４０７）
プローブ ５’−６ＦＡＭ−ＴＧＡＡＧＡＡＴＣＴＴＡＧＧＣＧＧＧＴＧ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３１５２４０８）
ＧＡＰＤＨ
順方向プライマー ５’−ＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＴＧＧ−３’（配列番号３１５２４０９）
逆方向プライマー ５’−ＧＴＧＡＧＧＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＧＴＧＴ−３’（配列番号３１５２４１０）
プローブ ５’−ＶＩＣ−ＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＣＣＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３１５２４１１）
１０ｎＭでの最初のスクリーンの後、１７．５μＬのＣＤＣＨＯ培地中のｓｉＲＮＡの濃度を必要に応じて変更して所望の最終濃度を得る以外は、前述と同じ条件下、１００ｎＭ〜１ｐＭの範囲の濃度で、最も強力なｓｉＲＮＡをさらに試験した。この手順を用いて同定される、さらに強力なｓｉＲＮＡのいくつかを表２５に示す。
ＬＤＨ活性アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して、３〜４日のＬＤＨ ｓｉＲＮＡでの処理後のＬＤＨのレベルの低下について試験した。９６ウェルプレートのウェル中で、細胞を１７５μＬの培地中に溶解させるために、２０μＬの１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し、プレートを１０分間室温にて振盪した。アッセイを製造業者のプロトコルにしたがって実施した。
ハムスター（モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ））Ｂａｋに対する例示的ｄｓＲＮＡ配列は本明細書中で配列番号：３１５２４１２〜３１５２１４５として開示され、ここで、偶数の配列番号（たとえば、配列番号３１５２４１２）はセンス鎖を表し、奇数の配列番号（たとえば、配列番号３１５２４１３）は相補性アンチセンス鎖を表し；本明細書中で記載される実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子は、これらの配列の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含み得る。
Figure 2014501097
Figure 2014501097
ハムスター（モンゴルキヌゲネズミ）Ｂａｘに対する例示的ｄｓＲＮＡ配列を本明細書中では配列番号：３１５２４７６〜３１５２５３９として開示し、ここで、偶数の配列番号（たとえば、配列番号３１５２４７６）はセンス鎖を表し、奇数の配列番号（たとえば、配列番号３１５２４７７）は相補性アンチセンス鎖を表し；本明細書中で記載される実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子はこれらの配列の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含み得る。
ハムスター（モンゴルキヌゲネズミ）ＬＤＨ−Ａに対する例示的ｄｓＲＮＡ配列を、本明細書中では配列番号３１５２５４０〜３１５２６０３として開示し、ここで、偶数の配列番号（たとえば、配列番号３１５２５４０）はセンス鎖を表し、奇数の配列番号（たとえば、配列番号３１５２５４１）は相補性アンチセンス鎖を表し；本明細書中で記載される実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子はこれらの配列の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含み得る。
Figure 2014501097
 （実施例２） ヒトＨＴ−１０８０細胞におけるグルコセレブロシダーゼの増大した産生
ヒトグルコセレブロシダーゼの産生は、ヒトＨＴ−１０８０細胞において増大し、この場合、グルコセレブロシダーゼ遺伝子は、細胞を１以上のＲＮＡエフェクター分子と接触させることにより、米国特許第５，６４１，６７０号（Ｇｅｎｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ（登録商標）ＧＣＢ（ＧＡ−ＧＣＢ））で記載されるように活性化され、ここで、各ＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部は、宿主細胞マンノシダーゼをコード化する標的遺伝子に相補的である。ＲＮＡエフェクター分子は、ゴルジマンノシダーゼＩＡ、ゴルジマンノシダーゼＩＢ、ゴルジマンノシダーゼＩＣ、及び／又はゴルジマンノシダーゼＩＩなどのクラス１プロセシング及び／又はクラス２プロセシングマンノシダーゼをコード化する標的遺伝子の発現を阻害する。種々のマンノシダーゼのコーディング鎖配列が開示されている。たとえば、Ｂａｕｓｅ，２１７ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３５−４０（１９９３）；Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２７４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１３７５−８６（１９９９）；Ｍｉｓａｇｏら、９２ ＰＮＡＳ １１７６６−７０（１９９５）；Ｔｒｅｍｂｌａｙら、８ Ｇｌｙｃｏｂｉｏ．５８５−９５（１９９８）；Ｔｒｅｍｂｌａｙら、２７５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３１６５５−６０（２０００）を参照。マンノシダーゼを標的とするＲＮＡエフェクター分子を、ワトソン・クリックの塩基対合則及び本明細書中に開示されているか、さもなければ当該技術分野で公知の他の検討事項にしたがって設計することができる。
ＧＡ−ＧＣＢ糖型に対するＲＮＡエフェクター分子の影響：ＧＡ−ＧＣＢを産生するＨＴ−１０８０細胞を蒔き、生産培地を、０（薬剤を含まない）〜１０μｇ／ｍＬの範囲のＲＮＡエフェクター分子濃度が得られるように調節する。培地を収集し、細胞を２４時間ごとに３日間再供給する。第３日からの試料を等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析に付して、発現されたグルコセレブロシダーゼに対するＲＮＡエフェクター分子の影響を分析する。タンパク質の見かけの等電点（ｐＩ）は、ＲＮＡエフェクター分子の濃度に依存して増大する。最も急なｐＩの増大を示すＲＮＡエフェクター分子は、グルコセレブロシダーゼの産生を増大させるための好ましいＲＮＡエフェクター分子と認定される。
ＧＡ−ＧＣＢ産生に対するＲＮＡエフェクター分子の影響：１０本のローラービン（表面積、それぞれ１７００ｃｍ２）に、増殖培地（１０％仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ）中、ＧＡ−ＧＣＢを産生するＨＴ−１０８０細胞を播種する。２週間の増殖後、培地を吸引し、２００ｍＬの新しい生産培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、０％仔ウシ血清）を３セットのローラービンに添加する。４本のローラービンの２セットを〜１μｇ／ｍＬのＲＮＡエフェクター分子で処理する。２本のローラービンの第３群には薬物処置をしない。約２４時間後、各ローラービンからの培地を収集し、プールし、そしてＧＡ−ＧＣＢ酵素活性分析のために試料を採取する。酵素活性分析を次のように実施する：試験物を酵素基質（４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシド）と混合し、１時間、３７℃でインキュベートする。ＮａＯＨ／グリシン緩衝液を添加することにより反応を停止させ、蛍光分光光度計の使用により蛍光を定量化する。比活性は２，５００単位／ｍｇと表され、ここで、１単位は、３７℃で１時間に１マイクロモルの基質が変換されることと定義される。全処理を７日間繰り返す。ＧＡ−ＧＣＢの安定な産生が７つの毎日収集したもの全てにわたって全ローラービンで観察される。しかし、酵素の絶対レベルは、ＲＮＡエフェクター分子処理群によって変化し得る。
ｈｍＧＣＢの精製及び特性化：ｈｍＧＣＢを、ＲＮＡエフェクター分子の存在下で増殖させたヒトヒト繊維芽細胞の培地から精製する。ｈｍＧＣＢ上に存在する４つのＮ結合グリカンは、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦにより放出され、Ｓｅｐ−ｐａｋ Ｃ１８カートリッジを用いて精製する。５％酢酸フラクション中に溶出するオリゴ糖を、水酸化ナトリウム及びヨウ化メチルを用いて過メチル化し、メタノール：水（８０：２０）中に溶解させ、過メチル化グリカン混合物の一部をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により分析する。２，５−ジヒドロキシ安息香酸のマトリックスを使用した遅延引き出しを伴うＶＯＹＡＧＥＲ（商標）ＳＴＲＢＩＯＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ（商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｔｉｏｎレーザー脱離質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ．）で試料を分析する。擬分子（ｐｓｅｕｄｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ）イオンのパターンがｍ／ｚ１５００〜２５００の範囲で見られ、このことは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２までの範囲の高マンノースグリカンの存在を示す。
存在する最も多量の高マンノースグリカンは、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２及びＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２であり、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、及びＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の量は減少する。２個のシアル酸残基を含む微量のフコシル化二分岐複合型グリカンが観察される。各グリカンの相対量の近似表示は、ピークの高さを測定することにより得られる。高マンノースグリカンの平均鎖長のより正確な評価は、インタクト糖タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により得られる。グリカン鎖の均一性のために、およそｍ／ｚ６２，４８３．１で鋭いピークが得られる。アミノ酸配列から計算される成熟ペプチドの質量は、約５５，５７７．６であり、このことは、４個のＮ結合グリカン鎖がｈｍＧＣＢの合計量に対する寄与は６９０５．５であることを示す。この数値から、平均グリカン長さは８．１５マンノース残基であると計算できる。
マクロファージ中へのＧＡ−ＧＣＢ取り込みに対するＲＮＡエフェクター分子の効果：
ＨＴ−１０８０細胞において産生されるＧＡ−ＧＣＢをインビトロアッセイで使用して、マウスマクロファージ細胞系における取り込み効率を測定する。実験の具体的な目的は、マウスＪ７７４Ｅ細胞におけるＧＡ−ＧＣＢの絶対及びマンノース受容体特異的取り込みを測定することである。アッセイの１日前に、Ｊ７７４Ｅ細胞を５０，０００細胞／ｃｍ２で１２ウェルプレートにおいて増殖培地中に蒔く。アッセイのために、５０ｎＭのビタミンＤ３（１，２−５，ジヒドロキシビタミンＤ３）を含む０．５ｍＬの生産培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、０％仔ウシ血清）を細胞に添加する。未精製ＧＡ−ＧＣＢを、２μｇ／ｍＬマンナン（マンノース受容体の競合相手）の存在下又は非存在下で１０μｇ／ｍＬの最終濃度にて試験ウェルに添加する。
以下の形態のＧＡ−ＧＣＢを使用する：ＲＮＡエフェクター分子（１μｇ／ｍＬ）で処理した細胞由来のＧＡ−ＧＣＢ及び未処理細胞由来のＧＡ−ＧＣＢ（１μｇ／ｍＬ）。対照ウェルにはＧＡ−ＧＣＢを加えない。ウェルを４時間３７℃でインキュベートし、次いで緩衝塩溶液中でよく洗浄し、ＧＡ−ＧＣＢ酵素反応緩衝液中にかき落とし、２回の凍結／解凍サイクルを経て、遠心分離により清澄化する。上清を次いで酵素活性及び全タンパク質について定量的に試験する。酵素活性を次のように測定する：試料を酵素基質（４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシド）と混合し、１時間、３７℃でインキュベートする。ＮａＯＨ／グリシン緩衝液を添加することにより反応を停止させる。蛍光分光光度計の使用により蛍光を定量化する。全タンパク質をビシンコニン酸（ＢＣＡ）により凍結／解凍細胞可溶化物中で測定する。活性を単位／ｍｇ全タンパク質として報告し、ここでは、１単位は、３７℃で１時間での１マイクロモルの基質の変換と定義される。ＲＮＡエフェクター分子で処理された細胞は、マンナン（２μｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下でＲＮＡエフェクター分子を受ける。ＧＡ−ＧＣＢのマウスＪ７４４Ｅ細胞中へのインタナリゼーションを単位／ｍｇ細胞可溶化物で報告する。
結果は、ＲＮＡエフェクター分子処理細胞からのＧＡ−ＧＣＢの取り込みは、バックグラウンドよりも約７倍〜１４倍高く、マンナンにより約６７％〜７３％阻害可能であることを示す。加えて、この結果により、未処理細胞からのＧＡ−ＧＣＢの取り込みがバックグラウンドよりも約３倍高く、マンナンにより５３％阻害可能であることも示される。したがって、ＲＮＡエフェクター分子による細胞内マンノシダーゼの阻害の結果、マンノース受容体により効率的に細胞中に輸送できるＧＡ−ＧＣＢが得られる。マンノース受容体による細胞に対するＧＡ−ＧＣＢの標的化における改善は、したがって、１以上のＲＮＡエフェクター分子の存在下でのＧＡ−ＧＣＢの産生により最適化することができる。
（実施例３） 様々なｓｉＲＮＡで処理された懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞の増殖曲線
５０ｍＬの全体積中約４００，０００細胞／ｍＬでフラスコを準備した。まず、２０μＭのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｔｅａｌｔｈ ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡ２．５μＬ又は１μＭのＢａｘ ｓｉＲＮＡ５０μＬ及び１μＭのＢａｋ ｓｉＲＮＡ５０μＬの又は１μＭのＬＤＨ ｓｉＲＮＡ５０μＬを、３つの異なる１４．３ｍＬの体積のＣＤＣＨＯ培地（ＧＩＢＣＯ）に添加した。溶液を穏やかに混合し、次いで８５．５μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれに添加し、溶液を穏やかに再度混合した。溶液を室温で１５分間インキュベートした。１５分後、３２．８ｍＬの温めた培地を各溶液に添加した。最後に、２．９ｍＬの培地を７，０００，０００細胞／ｍＬで添加し、フラスコを３７℃ＣＯ２インキュベータ中、１６０ｒｐｍに設定されたシェーカープレート上に置いた。翌日、アリコートを培地からとり、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞カウンターで細胞を計数し、それらの生存度を測定した。
２及び４日に、さらなるｓｉＲＮＡを添加した。これを行うために、２５ｍＬを各フラスコから取り出し、〜４００×ｇで５分間回転させて、細胞をペレット化した。次いで、１４．３ｍＬの無細胞培地を別の試験管に取り出し、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ試薬を前述のように添加した。溶液を穏やかに混合し、室温で１５分間インキュベートした。溶液を各細胞ペレットに戻し、ピペットで混合して、細胞集塊を壊し、次いでもとのフラスコに戻した。
（実施例４） Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨの阻害は、培養における細胞の生存度を増強する。
Ｂａｘ及びＢａｋは、重要なプロアポトーシス（プログラムされた細胞死を誘発できる）機能を果たすミトコンドリア調節ＢＣＬ−２タンパク質ファミリーのメンバーである。前述のように、低ピコモル濃度範囲内にＩＣ５０を有するＢａｘ及びＢａｋに対して有効なｓｉＲＮＡを、１Ｌのバイオリアクター中で増殖させたＣＨＯ細胞に周期的間隔で添加した。加えて、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に対するｓｉＲＮＡもｓｉＲＮＡ配合物中に含める。ＬＤＨは嫌気性ストレスの期間中のピルビン酸から乳酸への変換を触媒する。乳酸は、培養中で増殖させた細胞で産生された主要代謝老廃物であり、細胞増殖及び代謝経路の両方を阻害することが示された。Ｂａｘ／Ｂａｋ及びＬＤＨ経路の活性化は、培養中の細胞の増殖可能性を制限すると考えられるので、これらの遺伝子に対する有効なｓｉＲＮＡを１Ｌのバイオプロセシング様条件下で、懸濁液中で増殖させたＣＨＯ細胞に添加する効果を評価した。非特異的ＦＩＴＣで標識されたｓｉＲＮＡで処理されたＣＨＯ細胞と比較した場合、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞は、対照よりも９０％高い細胞密度まで増殖し、対応してアポトーシス死亡率が２倍減少した。
材料及び方法：懸濁適応させたＣＨＯ細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し、１Ｌの使い捨てバイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ）中、３７℃及び５．５％ＣＯ２でＤＧ４４既知組成培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃１２６１０−０１０）を用いて、製造業者により指示された速度で一定して撹拌しながら増殖させた（０．２×１０６細胞／ｍＬ播種密度）。播種後４日から始めて、ＣＨＯＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１０２３４，１０２４０）を用いて細胞培養に５％培養量（３０ｍＬ）を追加した。培養に次いで４８時間ごとに同じフィード培地及び体積を用いて供給した。
Ｂａｘ、Ｂａｋ、及びＬＤＨ ｓｉＲＮＡ配列を表２６に示し、まずＲＬＤ小規模合成により修飾なしに小規模で合成し（３’ｄＴｄＴを除く）、続いて中規模合成を行った。対照ｓｉＲＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した（ＦＩＴＣ標識されたｏｌｉｇｏ；＃４４−２９２６）。各ｓｉＲＮＡを１Ｌのバイオリアクターに１ｎＭの最終濃度で添加し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクション用に処方した。Ｂａｘ、Ｂａｋ、及びＬＤＨ ｓｉＲＮＡをあわせて混合して、最終合計ｓｉＲＮＡ濃度３ｎＭにした。対照ｓｉＲＮＡ配合物は、６ｍＬのＤＧ４４培地、２４０μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＲＮＡｉＭａｘ試薬、及び３０μＬのＦＩＴＣ標識オリゴ（２０μＭストック濃度）を含んでいた。実験のｓｉＲＮＡ配合物は、６ｍＬのＤＧ４４培地、２４０μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＲＮＡｉＭａｘ試薬、及びそれぞれ６ｕＬのＢａｘ、Ｂａｋ、及びＬＤＨ ｓｉＲＮＡ（１００μＭストック濃度）を含んでいた。０日から始めて培地に添加する前に、対照及び実験ｓｉＲＮＡの両方を室温で１５分間インキュベートし、同様の濃度で４８時間ごとに合計６回再度添加した。毎日、５ｍＬの培養試料を取り出し、細胞を計数し、血球計でトリパンブルー色素（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）排除を用いて生存度を測定した。すべての細胞試料を、ｓｉＲＮＡ又は栄養フィードのさらなる添加の前に採取した。残りの細胞を等分し、細胞ペレットを沈降させ、次のアッセイ：ｑＰＣＲ、乳酸塩、グルコース、ＬＤＨ、及びカスパーゼ３に必要になるまで−７０℃で凍結した。
Figure 2014501097
 結果：Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡをＣＨＯ細胞培養に添加することにより、非特異的ＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡを用いた対照トランスフェクションと比較した場合、生存細胞密度が約２倍改善される（図６）。対照細胞集団は、６日に〜１．５×１０６細胞／ｍＬの最大細胞密度に達し；一方、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞は、７日に〜１．８×１０６細胞／ｍＬの最大細胞密度を達成した。Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ処理細胞の総細胞面積（ＩＧＡ）は対照ｓｉＲＮＡ処理細胞よりも〜９０％増大した（図６、挿入画）。
対照細胞の５０％生存度がＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ処理細胞について１０日及び１６日で観察された（図７）。両試料は０日から始まって５日まで比較的安定した生存度を示した。細胞生存度は、対照処理試料については６日、実験試料については７日からはじまって９０％以下に減少し始めた。細胞死亡速度は％生存度反応曲線の傾きに正比例する。傾斜が鋭い方が、なだらかな傾斜に比べてアポトーシス死亡速度が速いことを示す。アポトーシス細胞死の速度は、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理培養物と比較して対照について２．８倍速かった（図７、挿入画）。
これらのデータは、１Ｌのバイオリアクターにおいて懸濁液中で増殖させたＣＨＯ細胞に添加した場合の可溶性ｓｉＲＮＡが、非特異的対照ｓｉＲＮＡと比較した場合、細胞密度と生存度との両方に対してプラスの影響を及ぼし得ることを強力に支持する。
乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性及び乳酸レベルはどちらも、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理後のＣＨＯ細胞において減少する。
乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を細胞増殖曲線のコースで追跡した（図８）。曲線下面積（ＡＵＣ）分析は対照ｓｉＲＮＡ処理細胞と比較してＢａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞において酵素活性の６７％減少を示した。乳酸レベルにおいて対応する減少が観察された（図９）。ＡＵＣ分析により測定されるように、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理培養物において観察される乳酸レベルの減少は約３３％であり、酵素活性減少について観察されるものの約半分であり、このことは、ＬＤＨピルビン酸から乳酸への変換率が増大して、減少した酵素濃度が相殺されたことを示す。
対照ｓｉＲＮＡ処理細胞におけるグルコース消費量は増殖曲線の７日後に減少する。グルコースを培養フィーディイング法の一部として使用し、増殖曲線全体にわたってモニタリングした。７日の前に、対照と実験培養とはどちらも、グルコースを同じ程度まで利用した（図１０）。７日の後に、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞は、７日の前と同様に引き続きグルコースを使用するが、対照細胞集団はそれらのグルコース消費量が減るようである。
これらのデータは、Ｂａｘ／Ｂａｘ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡが、１ＬのＣＨＯバイオプロセシング培養物に添加された場合、対照ｓｉＲＮＡ処理培養物と比較して対数期増殖後のグルコース利用を促進することを証明し（対照ｓｉＲＮＡ処理培養物は促進しなかった）、このことは、対照細胞が死滅するか、またはグルコース代謝ができないことを示唆する。
Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡは、１ＬのＣＨＯバイオプロセシング培養物に添加された場合に、対照ｓｉＲＮＡと比較して、カスパーゼ３活性を有意に減少させる。カスパーゼ３活性化は、アポトーシス死を遂げる細胞におけるＤＮＡ分解に至る最後から２番目のステップである。Ｂａｘタンパク質及びＢａｋタンパク質はどちらもこのプロセスの上流であるので、Ｂａｘ／Ｂａｋノックダウンは、カスパーゼ３活性も減少させることが予想される。二相カスパーゼ３活性反応が対照条件と実験条件との両方について観察された（図１１）。対数期増殖中に、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ−ｓｉＲＮＡ処理細胞培養及び対照ｓｉＲＮＡ処理細胞培養はどちらも類似したカスパーゼ３レベルを有していた。非アポトーシス細胞において活性なカスパーゼ３の理由はわからないが、対数期後に、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡ処理細胞培養は対照細胞集団と比較して著しく低いカスパーゼ３活性を有し、９日にカスパーゼ３活性は観察されず、対照と比較して１２日の実験細胞集団では＜１０％活性であった。
これらのデータから、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡは、Ｂａｘ及びＢａｋがミトコンドリアにより誘発されるアポトーシスを活性化する能力をブロックし、適切な標的経路が影響を受けたことを示す。
Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡは、２週間にわたって複数回投与された場合、＞８０％ｍＲＮＡノックダウンを維持することができる。最近の刊行物では、アポトーシスの最大ブロックを維持するために、Ｂａｘ及びＢａｋ ｍＲＮＡはどちらも相当ノックダウンされなければならないことが報告されているが（Ｌｉｍら、８ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇ．５０９−２２（２００６））、別のグループは、ＬＤＨがＬＤＨ活性を減少させるには＞８０％ ｍＲＮＡノックダウンで十分であることを示唆した（Ｋｉｍ＆Ｌｅｅ，７４ Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５２−５９（２００７））。したがって、複数回ｓｉＲＮＡを投与する目的は、３つの遺伝子全てについて％ノックダウンを＞８０％に維持することであった。時間経過のほとんどにわたってＢａｘ及びＬＤＨメッセージノックダウンは実際に＞８０％であった（図１２）。Ｂａｋ ｍＲＮＡノックダウンは時間経過を通して８０％前後で推移した。このｓｉＲＮＡは、それぞれの新しい用量と相関するようであるジグザグ反応パターンにより示唆されるように、複数の用量から最も恩恵を受けるようであった。ジグザグ効果は、他のｓｉＲＮＡについても観察されるが、Ｂａｋ ｓｉＲＮＡほど大きくはなかった。
これらのデータは、この研究で使用した３つのｓｉＲＮＡ全てが２週間にわたってｍＲＮＡノックダウンを維持したことを示す。Ｂａｋ ｓｉＲＮＡについてのメッセージノックダウンＩＣ５０がＢａｘ（表２６）と類似していても、時間経過にわたるｍＲＮＡノックダウンの維持は匹敵しなかった。この理由はわからないが、他のＢａｋ ｓｉＲＮＡを評価すべきであることが示唆される。
まとめ：アポトーシス調節因子Ｂａｘ及びＢａｋに対するサイレンシングＲＮＡを、重要な代謝酵素である乳酸デヒドロゲナーゼに対するｓｉＲＮＡと組み合わせて、１Ｌのバイオリアクターを使用して、２週間にわたりチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるノックダウン活性について評価した。本明細書中で提示する結果は、サイレンシングＲＮＡがバイオプロセシング様条件下、懸濁液中で増殖させたＣＨＯ細胞中への効率的な取り込みのために適切に処方することができるという考えを明らかに支持する。Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＬＤＨ ｓｉＲＮＡは、２週間にわたって複数回投与された場合、＞８０％ｍＲＮＡノックダウンを維持し、これは、カスパーゼ３及びＬＤＨ活性の両方を低下させ、結果として非特異的ｓｉＲＮＡ対照と比較して細胞密度及び生存度を増大させるのに十分であった。さらに、これらのデータは、複数のｓｉＲＮＡｓ（少なくとも３）をそれぞれがその所望のノックダウン効果を有する懸濁細胞培養において複数量と同時に添加することができ、生存度に対する影響が最小でＣＨＯ細胞により十分に許容されるトランスフェクション試薬を認定できることを示す。
（実施例５） ＲＮＡエフェクターの使用による抗体の改善されたＡＤＣＣ
多くの治療抗体、特に抗癌治療抗体は、有効性のために抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を必要とする。高ＡＤＣＣを達成するために、抗体の適切なグリコシル化が必要であると考えられる。例えば、Ｆｃオリゴ糖のコアフコースが無い抗体は、それらのフコシル化カウンターパートよりもヒトにおいてはるかに高いＡＤＣＣを示すことが判明した。加えて、抗体におけるＮ結合オリゴ糖の広範囲のα２，６−シアル化はまた、ＡＤＣＣを減少させると考えられる。
したがって、フコシル化の量が実質的に減少し、またα２，６−シアル化が減少した抗体を産生するのが望ましい。

抗体のフコシル化、特にα１，６−フコシル化は、
（ｉ）ＧＤＰ−マンノース４，６デヒドラターゼ（ＧＭＤＳによりコード化される）（ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへの変換を触媒する）；
（ｉｉ）ＧＤＰ−Ｄ−マンノース代謝における２ステップエピメラーゼ及びリダクターゼ反応を触媒するＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースエピメラーゼリダクターゼ（ＴＳＴＡ３によりコード化される）（ＧＤＰ−４−ケト−６−Ｄ−デオキシマンノースをＧＤＰ−Ｌ−フコースに変換する。ここで、ＧＤＰ−Ｌ−フコースは、いくつかのフコシルトランスフェラーゼの基質である）；及び
（ｉｉｉ）ＧＤＰ−フコースからＮ結合型複合糖ペプチドへのフコースの転移を触媒するフコシルトランスフェラーゼ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）（ＦＵＴ８によりコード化される）
を含む多くの酵素ステップにより行う。
アルファ１，６，フコシルトランスフェラーゼにおいて欠失又は不足している細胞を単離し、本発明で使用して、フコシル化が減少した抗体を産生する。しかし、細胞の倍加時間はゆっくりであり、増殖するために特別な条件を必要とする。さらに、細胞は多くの遺伝的背景で利用できない。
抗体の高シアル化はまた、ＡＤＣＣの減少をもたらすことも示唆されている。シアル化は、表７に記載されているものなどのシアリルトランスフェラーゼの作用により起こる。
したがって、抗体の増大したＡＤＣＣは、本明細書中に記載されている方法を用いて宿主細胞において抗体を産生することによって達成される。例えば、抗体を発現する宿主細胞を：
・ＦＵＴ８：配列番号２０９８４１〜２１０２２７の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス配列；又は配列番号３１５２７１４〜３１５２７５３から選択される少なくとも一つの鎖を含むｓｉＲＮＡ、若しくは表４３及び４４に記載されているもの；
・ＧＭＤＳ：配列番号１６８８２０２〜１６８８５１９；及び配列番号３１５２７５４〜３１５２７９３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続するヌクレオチド（たとえば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡ；
・ＴＳＴＡ３：ＴＳＴＡ３を標的とするｄｓＲＮＡ分子は、配列番号１８３９５７８〜１８３９９３７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド分子の少なくとも１６個の連続するヌクレオチド（たとえば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含み得る
のいずれか一つに対するｓｉＲＮＡと接触させる。
ヒト抗ＣＤ２０抗体を発現するＣＨＯ細胞の１２の別個の培養を培養フラスコ中で増殖させ、まず１日に〜２００，０００細胞／ｍｌの密度で播種し、２日に以下の処理を施す：
フラスコＡ：トランスフェクション剤のみ；
フラスコＢ：負の対照として１ｎＭ（添加後の最終濃度）のルシフェラーゼｄｓＲＮＡを含むトランスフェクション剤；
フラスコＣ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＦＵＴ８ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＤ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＴＳＴＡ３ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＥ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＧＭＤＳ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＦ：トランスフェクション試薬中１ｎＭ ＴＳＴＡ３ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭ ＦＵＴ８ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＧ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＧＭＤＳ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭ ＦＵＴ８ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＨ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＴＳＴＡ３ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭのＧＭＤＳ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＩ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＳｔ６ＧａｌＮａｃ６ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭのＦＵＴ８ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＪ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＳｔ６ＧａｌＮａｃ６ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭのＧＭＤＳ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＫ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＳｔ６ＧａｌＮａｃ６ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭのＴＳＴＡ３ ｄｓＲＮＡ；
フラスコＬ：トランスフェクション試薬中１ｎＭのＳｔ６ＧａｌＮａｃ６ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭ ＦＵＴ８ ｄｓＲＮＡ＋１ｎＭのＧＭＤＳ ｄｓＲＮＡ；
細胞をさらに４日間増殖させ、各フラスコの上清を集める。タンパク質Ａ−セファロースクロマトグラフィーを用いて上清から抗体を単離する。部分的に精製された抗体を全収率（抗ヒトＡｂを用いたＥＬＩＳＡによる）、抗原結合（たとえば、ＣＤ２０結合）、及びＡＤＣＣ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイを使用）について特性化する。様々な細胞から単離された抗体のオリゴ糖構造を陽イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により特性化する。
ハムスター（モンゴルキヌゲネズミ）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）に対する例示的ｄｓＲＮＡ配列を本明細書中では配列番号３１５２７１４〜３１５２７５３として開示し、ここで、偶数の配列番号（たとえば、３１５２７１４）はセンス鎖を表し、そして奇数の配列番号（たとえば、３１５２７１５）は相補性アンチセンス鎖を表し；本明細書中で記載される実施形態では、ＲＮＡエフェクター分子はこれらの配列の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含み得る。
Figure 2014501097
Figure 2014501097
 （実施例９） 細胞生存度と関連した標的遺伝子
本明細書中で議論するように、宿主細胞生存度と関連する遺伝子を標的として、細胞ベースのバイオプロセシングにおいて生体適合材料産物の収率を改善することができる。標的遺伝子の例にはニワトリ（セキショクヤケイ）（Ｂａｋ、配列番号３１５４３９３〜３１５４４１３（センス）及び
配列番号３１５４４１４〜３１５４４３４（アンチセンス）が例示的ｓｉＲＮＡであり、ＰＴＥＮ、配列番号３１５４４９３〜３１５４５２２（センス）及び配列番号３１５４５２３〜３１５４５５２（アンチセンス）が例示的ｓｉＲＮＡであり、ＬＤＨＡ、配列番号３１５４５５３〜３１５４５７８（センス）及び配列番号３１５４５７９〜３１５４６０４（アンチセンス）が例示的ｓｉＲＮＡであり、ＦＮｌ番号３１５４４３５〜３１５４４６３（センス）
番号３１５４４６４−３１５４４９２（アンチセンス）が例示的ｓｉＲＮＡである）及びイヌ（ケイネス・ファミリアリス）（Ｂａｋｌ、配列番号３１５４８２７〜３１５４８７４（センス）及び配列番号：３１５４８７５−３１５４９２２（アンチセンス）が例示的ｓｉＲＮＡであり、Ｂａｘ、配列番号３１５４９２３〜３１５４９７０（センス）及び配列番号３１５４９７１〜３１５５０１８（アンチセンス）が例示的ｓｉＲＮＡである）が含まれる。
（実施例１０） 高グルコース条件におけるバイオプロセス
一般的に、バイオプロセシングにおいて細胞の増殖中に高濃度のグルコース（たとえば、少なくとも１５ｍＭ）を含めると、増殖培地中に乳酸が蓄積し、このことは細胞増殖にとって有害であり得る。乳酸蓄積の結果、早期アポトーシスが起こる。それを別にすれば高レベルの炭素源、例えばグルコースを提供することは非常に有利であるので、乳酸蓄積及びその後のアポトーシスを引き起こすことなく高グルコースで細胞を増殖させる方法が非常に望ましい。
この実施例では、プロアポトーシス遺伝子を標的とするＲＮＡエフェクター分子を用いて、アポトーシスを受けることなく増殖培地中、少なくとも１０ｍＭ（例えば、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ又はそれ以上）のさらに高いグルコース濃度で細胞を増殖させる。
０日目に、生物由来物質を発現できる宿主細胞を、通常のグルコースレベル（約４〜６ｍＭ）を含む増殖培地中でそれぞれ１ｎＭのＢａｘ及びＢａｋを標的とするＲＮＡエフェクターと（場合によって１ｎＭのＬＤＨを標的とするｄｓＲＮＡとも）接触させる。約２４時間後に、１５ｍＭのグルコースを含む培地に細胞を切り替える。その後、Ｂａｘ及びＢａｋを標的とするＲＮＡエフェクターをさらに３〜５日ごとに１ｎＭで提供する。これらの細胞におけるタンパク質産生を、ＲＮＡエフェクター分子でトランスフェクトされていない（又は非特異的対照ＲＮＡエフェクターでトランスフェクトされた）細胞からのものと比較する。
高グルコースでの増殖を可能にするために有用な他のＲＮＡエフェクターは、表１４で記載されているものをはじめとする、任意のプロアポトーシス遺伝子を標的とするものを含み得る。他の例には、表３０からの以下のものからなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドヌクレオチドの少なくとも１６個の連続するヌクレオチド（たとえば、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９ヌクレオチド）を含むアンチセンス鎖を含むＲＮＡエフェクター分子が含まれる：
Figure 2014501097
 （実施例１１） ＰＫ１５細胞及びＤＧ４４細胞におけるｓｉＲＮＡの有効性
ＤＧ４４細胞におけるｓｉＲＮＡスクリーニング：対象のＣＨＯ標的に対するｓｉＲＮＡを設計し、合成する。数セットのスクリーンされるｓｉＲＮＡ（二本鎖）を細胞培地に１００ｐＭ〜１０ｎＭで１〜４日間効果を得るために添加する。９６ウェルプレート中、８ｍＭのＬ−グルタミン及び０．１８％のＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ６８（登録商標）を追加した２９．５μＬのＣＤ ＤＧ４４培地（ＧＩＢＣＯ（商標） Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を試験ウェルに添加し、４７μＬを対照ウェルに添加する。このために、ＣＤ ＤＧ４４培地中所望の最終濃度の１０倍で１７．５μＬのｓｉＲＮＡを試験ウェルに添加する。全てのウェルに、ＣＤ ＤＧ４４培地中１：１０に希釈した３μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬ＲＮＡｉＭＡｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加する。混合物を１５分間室温でインキュベートし、次いで約２０，０００ＤＧ４４細胞を含む１２５μＬのＣＤ ＤＧ４４培地を全てのウェルに添加する。プレートを次いで３７℃ＣＯ２インキュベータ中に１〜４日間入れる。
インキュベーション後、細胞を毒性について視覚的に調査し、ＭａｇＭａｘ９６ウェルＲＮＡ抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造業者の指示に従って使用してＲＮＡを抽出する。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）を製造業者の指示に従って使用して、ｃＤＮＡをＲＮＡから作製する。最後に、ｑＰＣＲを用いて、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＰＣＲ装置及びＲｏｃｈｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｂｅｓマスターミックスで標的のｃＤＮＡの適切な希釈を定量化する。ＧＡＰＤＨを内部標準として使用するΔΔＣｔ法を用いて標的遺伝子の相対的ノックダウンを計算した。標的遺伝子ｃｏｆｉｌｉｎｌ、ＬＤＬＲ、ＧＮＥ、ＳＬＣ３５Ａ１．ＧＡＬＥ、ＦＵＴ８、ＧＭＤＳ、及びＸＹＬＡＴの％ｍＲＮＡノックダウンは本明細書中の他の場所で示されている。
最も有効なｓｉＲＮＡを様々な濃度で更に試験する。この試験法は、種々のｓｉＲＮＡ濃度を同時に試験する以外は前記と同じであった。
ＰＫｌ５細胞におけるｓｉＲＮＡスクリーニング：対象のＰＣＶｌ標的に対するｓｉＲＮＡを設計し、合成する。スクリーンする数セットのｓｉＲＮＡを、効果を得るために、細胞培地に１０ｎＭで１日間添加する。９６ウェルプレートにおいて、アールの平衡塩を含むイーグル（ＥＭＥＭ）最小必須培地培地（ＡＴＣＣ）２９．５μＬを試験ウェルに添加し、４７μＬを対照ウェルに添加する。このために、１７．５μＬのｓｉＲＮＡ（ＣＤ ＤＧ４４培地中１００ｎＭ）を試験ウェルに添加する。全てのウェルに、４μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭｌＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡｘ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＥＭＥＭ培地中１：１０に希釈）を添加する。混合物を室温で１５分間インキュベートし、次いで約２０，０００ＰＫｌ５細胞を含む１２５μＬのＥＭＥＭ培地を全てのウェルに添加する。プレートを次いで３７℃ＣＯ２インキュベータ中に１日間入れた。
インキュベーション後、細胞を毒性について視覚的に調査し、次いでＭａｇＭａｘ９６ウェルＲＮＡ抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ）を製造業者の指示にしたがって使用して、ＲＮＡを抽出する。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の指示に従って使用して、ｃＤＮＡをＲＮＡから作製した。最後に、ｑＰＣＲを使用して、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＰＣＲ装置及びＲｏｃｈｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｂｅｓマスターミックスで標的ｃＤＮＡの適切な希釈を定量化する。ＧＡＰＤＨを内部標準として使用するΔΔＣｔ法を用いて標的遺伝子の相対的ノックダウンを計算する。
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
（実施例１２） 種々の温度で増殖させたＤＧ４４懸濁培養中の一時的にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡは、０．１ｎＭもの低い濃度で最高１８日まで遺伝子発現の有意かつ永続的なノックダウンを示す。
種々の温度で増殖させた懸濁培養のＲＮＡ干渉：細胞系ベースの生物学的産生は、典型的には常温（すなわち３７℃）又は（２８℃以下のような）低温で起こる。細胞を、多くの場合、まず高温で増殖させて急速な細胞増殖を促進し、次いで、理想的な細胞密度に達したら、場合によって低温に切り替えて、細胞周期停止を誘発して、細胞源のより多くが細胞分裂よりもタンパク質産生に使用されるようにする。そのような「生産段階」になったら、細胞をバイオリアクター中に数日間維持して、タンパク質産生を継続することができる。したがって、バイオプロセシングで用いられるものと類似した条件下で培養された細胞におけるＲＮＡ干渉の程度及び期間を測定するために実験を設計した。
ＣＭＶ−ＧＦＰ構築物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で安定してトランスフェクトされたＧＦＰ発現ＣＨＯ ＤＧ４４細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中に０日で（３７℃細胞について２×１０４細胞／ウェルで、そして２８℃細胞については１０５細胞／ウェルで）播種し、これもまた０日に、０．１、１、及び１０ｎＭ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘと混合）でＧＦＰに対するｓｉＲＮＡで一時的にトランスフェクトした。蛍光測定によりＧＦＰ発現を測定し、発現の阻害（各温度及び時間で、ＲＮＡｉＭａｘのみの対照と比較した発現の％として表す）。発現の阻害を、初期ｓｉＲＮＡトランスフェクション後、１８日までの間モニタリングした。
対照実験：
未処理であるか又はＲＮＡｉＭａｘのみで処理されたかのいずれかのＣＨＯ ＤＧ４４細胞におけるＧＦＰの発現を時間とともにモニタリングした。結果を図２０（未処理）及び図２１（脂質（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＲＮＡｉＭａｘ試薬のみで処理、ｓｉＲＮＡはなし）に示す。ＧＦＰは全期間にわたって発現されるが、２８℃細胞におけるＧＦＰの発現は、最終的にはるかに高くなり、このことは、細胞分裂の非存在下でも、継続してタンパク質が発現されることを示す（図２０及び２１）。
脂質処理対照（図２０）を、ＲＮＡ干渉の有効性を測定するための対照として使用した。図２２Ａ〜２２Ｃのグラフは、０．１ｎＭもの低いｓｉＲＮＡ濃度でＧＦＰの発現の有意な阻害を示す（図２２Ａ）。さらに、発現の阻害は、測定値が得られるかぎり維持された（すなわち、数例では初期発現後１８日まで）。この実験は、ＲＮＡ干渉を細胞培養で使用して、バイオプロセスに適した温度で、遺伝子の強力かつ永続的な阻害をもたらすことができることを示す。
（実施例１３） ４０Ｌバイオリアクター中で増殖させたＣＨＯ細胞の計測可能なｓｉＲＮＡ取り込みプロトコル
当業者には公知のように、脂質ポリヌクレオチド担体を使用したｓｉＲＮＡのリポソーム介在性送達を、研究用途で一般的に使用するが、ＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０１２１７３（２００８年７月１１日出願）で記載されているように、脂質ポリヌクレオチド担体、例えば一般的なリポソームトランスフェクション試薬の使用は、タンパク質のバイオプロセシングで使用される場合、有害であることが判明している。ポリヌクレオチド担体は、おそらくは毒性のために典型的に使用される濃度で宿主細胞の増殖に有害であり、したがって宿主細胞が所望の生物由来物質を工業的レベルで産生する能力を損なうことが報告されている。加えて、ポリヌクレオチド担体は、宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞の表現型における有害かつ望ましくない変化を引き起こし、宿主細胞が対象の生物由来物質を産生する能力を損なうことが観察されている。したがって、当業者は、そのようなポリヌクレオチド担体の使用が所望のタンパク質を産生する細胞の能力を損なうであろうと予想する。驚くべきことに、本発明者等は、明細書全体にわたって記載されるように、細胞に関して試験される条件下で細胞に対して有害な影響をおよぼすことなく（たとえば細胞生存度及び密度が維持される）、大規模培養（たとえば、１Ｌ及び、たとえば４０Ｌ）でのバイオプロセシング処理の間、ポリヌクレオチド担体（たとえば、リポソーム介在性送達）を用いることによって（たとえば、ＢＡＸ、ＢＡＣ及び／又はＬＤＨを標的とする）ＲＮＡエフェクター分子を宿主細胞へ一時的に送達することができることを見出した。したがって、生物由来物質の大規模産生は、培養（たとえば、懸濁培養）中にある場合に細胞中のＲＮＡエフェクター取り込みを促進するために、例えば、生物由来物質（例えば、ポリペプチド）の産生を改善する遺伝子発現の有効な一時的調節をもたらすために、脂質試薬を用いて工業的規模で実施することができる。
さらに、本発明者らは、細胞増殖や生存度に対する影響を最小にして産生細胞系中への効率的なｓｉＲＮＡ取り込みを促進する、効率的な取り込みを増強する試薬を同定するために種々の脂質組成物を調査した。本発明者らは、第四カチオン性脂質配合物のパネルをスクリーニングして、９６ウェルプレート培養において、ＬＤＨ活性が９０％を超えて減少すること（ＬＤＨに対するｓｉＲＮＡを使用）を以前に証明した（データは省略）。この実施例では、本発明者らは、取り込みインデューサとしてＰ８と混合したｓｉＲＮＡ（たとえば表１９を参照）は、５０ｍｌ培養における細胞密度及び細胞生存度に対する各配合物の影響に関して市販のＲＮＡｉＭａｘよりも十分に寛容性であることを示す。本発明者らは、本発明者らの培養を大規模バイオリアクターにスケールアップし、ＬＤＨに対するＰ８配合ｓｉＲＮＡを使用することによって、１回の１ｎＭ量で６日間ＬＤＨ活性において８０〜９０％減少したことを見出した。本発明者らは次いで、本発明者らの培養を３Ｌ及び４０Ｌにスケールアップした。本発明者らは、配合物Ｐ８が乳酸デヒドロゲナーゼに対するｓｉＲＮＡ（ＬＤＨ−Ａ）の効率的な取り込みを促進し、その結果、３Ｌ又は４０Ｌバイオリアクターのいずれかで増殖させたＣＨＯ細胞においてＬＤＨ活性の＞９０％ＬＤＨ減少がもたらされたことを見出した。驚くべきことに、３Ｌ培養を４０Ｌ培養と比較するスケールアップ実験では、サイレンシング効率は完全に直線的である。結果を本明細書中に示す。
材料／方法
トランスフェクション試薬の処方：クロロホルム中のカチオン性脂質及びコリピッド（たとえば、コレステロール及びＤＯＰＥ）をＮ２流とそれに続く真空乾燥により乾燥して、有機溶媒を除去した。乾燥した脂質フィルムを、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４を３７℃で使用して水和した。形成されたリポソームを押し出して、〜２００ｎｍの平均粒径を得た。
播種されたＧＦＰ−ＣＨＯ細胞に対するトランスフェクション試薬の試験：９の異なる登録商標のトランスフェクション配合物（たとえば表１９を参照）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＧＦＰに対する有効なｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）をＧＦＰ−ＣＨＯ細胞系に送達した。ＲＮＡｉＭａｘを０．４μＬ／ｍＬで試験し、９の配合物を０．５、１、及び２．５μｇ／ｍＬで使用した。トランスフェクション試薬とｓｉＲＮＡとの混合物を光学用黒底９６ウェルプレート中で作製し、次いで細胞を添加した。２日後、蛍光プレートリーダーを用いて相対的ＧＦＰ強度を測定した。
懸濁されたＤＧ４４ＣＨＯ細胞に関するトランスフェクション試薬の試験：ＧＦＰ−ＣＨＯ試験からの３つの最も活性なトランスフェクション剤（Ｋ８、Ｌ８及びＰ８）を用いて、懸濁されたＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。５μＬの１０μＭ ＬＤＨ−Ａ ｓｉＲＮＡのアリコートを試験管に添加し、５００μＬのＣＤ ＤＧ４４培地をこれに添加した。トランスフェクション試薬を混合物に添加し、試験管をピペット吸引により混合し、そして室温で１５分間インキュベートした。次いで、２００，０００細胞／ｍｌを含む培地４９．５ｍＬに混合物を添加した。フラスコをインキュベートし、１２０ｒｐｍで数日間振とうした。ＬＤＨ活性をＶｅｔＴｅｓｔ８００８スライドアナライザにより測定した。
４０Ｌのトランスフェクション：ＤＧ４４細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣＤ ＤＧ４４培地中で増殖させた。４０Ｌバイオリアクターに播種するために、細胞を４つの１Ｌの使い捨てバイオリアクターからとった。４０Ｌの培養物中の出発細胞密度は１２０，０００細胞／ｍｌであった。バイオリアクターを添加された細胞とトランスフェクション前１時間平衡化させた。トランスフェクションのために、４００μＬのＬＤＨ−Ａ ｓｉＲＮＡ（配列番号３１５２５６０及び３１５２５６１の対）（１００ｕＭストック溶液）を４００ｍＬの培地に添加し、混合した。次いで１ｍｇ／ｍＬのＰ８試薬３２ｍＬを添加し、再度混合した。これを室温で１５分間インキュベートし、次いで４０Ｌのバイオリアクターに添加した。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞カウンターを用いて細胞密度及び生存度を測定し、トランスフェクションの効率を測定し、ＶｅｔＴｅｓｔ８００８スライドアナライザを用いてＬＤＨ活性を測定した。
結果及び考察
９のカチオン性脂質配合物の振とうフラスコ中のＣＨＯ細胞における取り込み効率に関する評価：脂質配合物の有効性を測定するために、ＧＦＰ−ＣＨＯ細胞において強力なＧＦＰ ｓｉＲＮＡとともに使用した。有効濃度のＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭｌＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡｘ試薬と比較すると、３つの化合物は活性であった（図２３）。これらの処方をＫ８、Ｌ８、及びＰ８と表示した。任意の配合物の試験した濃度で明らかな細胞毒性は観察されなかった。
Ｋ８はＧＦＰ−ＣＨＯ細胞において最も活性な配合物であったので、２５０ｍＬの振とうフラスコにおいて、５０ｍＬの培養物中ＤＧ４４ＣＨＯ細胞及び強力なＬＤＨ ｓｉＲＮＡを用いて試験した。種々のＫ８濃度を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭｌＮＥ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡｘトランスフェクション試薬の有効濃度とともに試験した。３日後、ＬＤＨ活性は、Ｋ８を使用した培養物中で低かった（図２４）。ＲＮＡｉＭＡｘ試薬と比較して、フラスコ中の細胞密度もさらに高く、０．６μｇ／ｍＬ又は１．２μｇ／ｍＬのＫ８であった。ＲＮＡｉＭＡｘ試薬は、Ｋ８処理細胞と比較した場合、懸濁液中でＣＨＯ細胞の増殖を阻害したようである。Ｋ８の最高濃度は、ＬＤＨ活性がさらに減少する場合でも細胞密度を減少させた。
一部のトランスフェクション試薬は振とうフラスコ中で９６ウェルプレート中と同じ活性を有さないように見えたので、３つの最も活性の高い配合物を、２５０ｍＬの振とうフラスコ中、５０ｍＬのＤＧ４４中で同様に試験した。驚くべきことに、ＧＦＰ−ＣＨＯ細胞に対してごくわずかしか活性でなかった配合物Ｐ８が、懸濁されたＤＧ４４細胞培養を用いて最も良好に機能した（図２５）。５日後、０．８μｇ／ｍＬのＰ８の結果、最高のＬＤＨ活性ノックダウンが得られた。また、Ｐ８の存在下での細胞密度が、トランスフェクション試薬が添加されていない対照細胞以上であったということは重要である。０．８μｇ／ｍＬの最終濃度でのＰ８をさらに小さなバイオリアクター中で多数回使用し（データは省略）、４０Ｌの系で試験した。
図２６は、推奨される濃度でＰ８配合物又は市販のＲＮＡｉＭａｘ配合物を使用して、５０ｍＬの振とうフラスコ中懸濁ＣＨＯ細胞において長時間にわたる細胞密度（図２６Ａ）又は％細胞生存度（図２６Ｂ）を示す。脂質配合物を０日に細胞上に添加した。Ｐ８は市販のＲＮＡｉＭａｘよりも十分に寛容性であることが判明した。図３０は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に対するＰ８混合ｓｉＲＮＡを使用した場合、１Ｌのバイオリアクター中で１回の１ｎＭ用量で６日間にＬＤＨ活性の８０％〜９０％ノックダウンが達成されることを示す。ＬＤＨ活性のノックダウンは永続的であり、効果が６日間にわたって持続することが見いだされた。
カチオン性脂質配合物Ｐ８の３Ｌ対４０Ｌバイオリアクターにおける取り込み効率に関する評価。図２８は、Ｐ８脂質と混合した１ｎＭのＬＤＨ ｓｉＲＮＡの１回投与の、３Ｌ及び４０Ｌ培養において６日間の経過時間にわたる生存細胞密度及び％ＬＤＨ活性に対する結果を示す。驚くべきことに、３Ｌ培養を４０Ｌ培養と比較するスケールアップ実験では、サイレンシング効率は完全に直線的であり、このことは、さらに大規模でも成功することを示す。複数用量のプロトコルを用いて、効果の期間を延長することができる。
カチオン性脂質配合物Ｐ８の４０Ｌバイオリアクターにおける取り込み効率に関する評価。４０Ｌのバイオリアクターに播種した後、細胞は一般的に約２４時間の倍加時間で増殖し、細胞生存度は９８％超であった（図２６Ｂ）。細胞は５日で３．１×１０６細胞／ｍＬの最高濃度に達し、その後、減少し始めた。この無供給バッチ培養で予想されるように、６日までに細胞は減少した。
ｓｉＲＮＡ処理細胞のＬＤＨ活性は、播種及びトランスフェクション後に細胞が増殖するにつれ、減少した。ＬＤＨ活性は、３回以上に倍加した後でも〜８０％減少した（図３０）。実験全体にわたってＬＤＨ活性が減少した。有意に減少したＬＤＨ活性に基づいて、トランスフェクションはＣＨＯ細胞において検出可能な毒性がなく成功した。
これらの実験は、ｓｉＲＮＡでの培養における細胞のトランスフェクションは、生物学的産生に必要な大きな体積で機能できることを示す。
（実施例１４） 標的遺伝子の発現を滴定するためのＲＮＡエフェクターの使用
安定にトランスフェクトされたｓｈＲＮＡを有する細胞と異なり、ｄｓＲＮＡ分子の使用により、細胞工学を必要とすることなく宿主細胞内で実際的に任意の標的遺伝子の発現を調節することが可能になる。加えて、前述のように、構成的に阻害された標的遺伝子を有する細胞は十分に増殖することができず、望ましくない特性（たとえば、特別な増殖培地又は他の増殖条件の必要性、増大した変異率など）を示す可能性がある。細胞の増殖又は生物学的産生中の所望の時点で、標的遺伝子の発現を調節する能力を有することが、したがって非常に望ましい。
安定なトランスフェクションに依存しないｄｓＲＮＡ剤などのＲＮＡエフェクター分子を使用するさらに別の利点は、所定の標的遺伝子の発現を微調整する潜在能力である。数例では、標的遺伝子の発現を調節して、その発現レベルが中程度にのみ変更され（たとえば、未処理状態から〜５０％減少し）、望ましくない表現型を回避するか、又は生物学的産生の質を改善することが重要であり得る。このように、本発明者らは所定の標的遺伝子の発現を滴定できる条件を見いだすために実験を行った。
０日に、ＣＤ ＤＧ４４培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させたＣＨＯ ＤＧ−４４細胞を、５００μＬの体積で配合物８中脂質Ｐを含む配合物（すなわち、配合物「Ｐ８」；表１９を参照）中、ＬＤＨＡ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ（本明細書中で記載のとおり；例えば表６２を参照）で、０ｎＭ、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ、１ｎＭ及び５ｎＭ（２５ｍＬの培養中最終濃度）にてトランスフェクトした。使用したｄｓＲＮＡ二本鎖は同様の条件下で〜５０ｐＭの見かけのＥＣ５０を有する。トランスフェクション後、２４．５ｍＬの培地を含むフラスコに細胞を添加し（２００，０００細胞／ｍｌの細胞密度）、そして３７℃で増殖させた。３日後、ＬＤＨ活性を測定し、細胞密度に対して正規化した。
ＬＤＨ活性を下記表６２に示す：
Figure 2014501097
 結果から、ｄｓＲＮＡの濃度を滴定することにより、ＬＤＨ活性を１５％〜７５％超阻害の範囲に調節できることがわかる。したがって、本明細書中に示すｄｓＲＮＡなどのＲＮＡエフェクター分子を使用して、標的遺伝子の所望の発現レベルを達成することができる。加えて、先の実験（不掲載）に基づいて、部分的阻害が達成される濃度（例えば、１０〜１００ｐＭ）で処理された細胞は、さらに高濃度で処理されたものよりも迅速にＲＮＡ干渉から回復すると予想される。このように、細胞が標的遺伝子の阻害からより早く回復することが望ましい（すなわち、遺伝子発現の阻害の持続時間が短い）場合、低濃度のＲＮＡエフェクター分子（たとえば、見かけのＥＣ５０の３倍以下、例えば見かけのＥＣ５０の２倍、見かけのＥＣ５０の１倍など）を提供することができる。
下記表は、本明細書中に記載する方法及び組成物に関して有用な標的遺伝子及びｓｉＲＮＡ配列を例示する。
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097
Figure 2014501097

Claims (175)

  1. 大規模宿主細胞培養において生物由来物質を産生する方法であって、
    （ａ）大規模宿主細胞培養において、宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程であって、第一のＲＮＡエフェクター分子の一部分は宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である工程と、
    （ｂ）宿主細胞培養物を、少なくとも一つの第一の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持する工程であって、発現の調節が宿主細胞における生物由来物質の産生を向上させる工程と、
    （ｃ）生物由来物質を宿主細胞から単離する工程と
    を含み、大規模宿主細胞培養が、少なくとも１リットルの規模であり、かつＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に添加することによって宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させることにより、標的遺伝子の発現が一時的に抑制される方法。
  2. 大規模宿主細胞培養において生物由来物質を産生する方法であって、
    （ａ）大規模宿主細胞培養において、宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程であって、第一のＲＮＡエフェクター分子の一部分は宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である工程と、
    （ｂ）宿主細胞培養物を、少なくとも一つの第一の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持する工程であって、発現の調節が宿主細胞における生物由来物質の産生を向上させる工程と、
    （ｃ）生物由来物質を宿主細胞から単離する工程と
    を含み、生物由来物質の産生全体を通じてＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に多数回加えることによって宿主細胞を少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子と接触させることにより、標的遺伝子の発現が一時的に抑制される方法。
  3. 大規模宿主細胞培養において、宿主細胞を複数のＲＮＡエフェクター分子と接触させ、複数のＲＮＡエフェクター分子が、少なくとも一つの標的遺伝子、少なくとも２つの標的遺伝子又は複数の標的遺伝子の発現を調節する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 細胞において生物由来物質を産生する方法であって、
    （ａ）宿主細胞を複数のＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程であって、２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が複数の標的遺伝子の発現を調節する工程と、
    （ｂ）細胞を、複数の標的遺伝子の発現を調節するのに十分な時間保持する工程であって、発現の調節が細胞における生物由来物質の産生を向上させる工程と、
    （ｃ）生物由来物質を細胞から単離する工程と
    を含み、複数の標的遺伝子が少なくともＢａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨを含む方法。
  5. ＲＮＡエフェクター分子を大規模宿主細胞培養の培地に添加することによって宿主細胞を複数のＲＮＡエフェクター分子と接触させることにより、標的遺伝子の発現が一時的に抑制される請求項４に記載の方法。
  6. ＲＮＡエフェクター分子又は複数のＲＮＡエフェクター分子が、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、ｄｓＲＮＡが相互に相補的である少なくとも２つの配列からなり、センス鎖が第一の配列からなるとともにアンチセンス鎖が標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的である相補性の領域を含む第二の配列からなり、かつ、相補性の領域が１０〜３０ヌクレオチド長である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 接触させる工程が、宿主細胞培養物を保持して生物由来物質を産生するために使用する培地にＲＮＡエフェクター分子又は複数のＲＮＡエフェクター分子を連続的に注入することによって実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 発現の調節が発現の抑制であり、かつ前記抑制が部分的抑制である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 部分的抑制が、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、及び８５％からなる群から選択される抑制率以下である、請求項７に記載の方法。
  10. 接触させる工程が少なくとも１回繰り返される、請求項１〜６及び８〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 接触させる工程を、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、８４時間、９６時間及び１０８時間からなる群から選択される頻度で多数回繰り返す、請求項１〜６及び８〜９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 発現の調節が発現の抑制であり、かつ、生物由来物質の産生全体を通じて一つまたは複数の標的遺伝子に対して少なくとも５０％の平均抑制率を維持するために、接触させる工程を多数回繰り返すか又は連続的に注入する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 平均抑制率が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. ＲＮＡエフェクター分子を１００ｎＭ未満の濃度で接触させる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. ＲＮＡエフェクター分子を２０ｎＭ未満の濃度で接触させる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 大規模宿主細胞培養における宿主細胞のＲＮＡエフェクター分子との接触が、生物由来物質の単離又は上清の回収の少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間又は少なくとも１２０時間あるいは少なくとも１週間前に実施される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ＲＮＡエフェクター分子が、脂質製剤に製剤化された組成物である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. ＲＮＡエフェクター分子が、非脂質製剤に製剤化された組成物である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ＲＮＡエフェクター分子がｓｈＲＮＡではない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. ＲＮＡエフェクター分子がｓｉＲＮＡである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ＲＮＡエフェクター分子が化学的に修飾される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. ＲＮＡエフェクター分子が化学的に修飾されない、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 細胞密度、培地ｐＨ、酸素濃度、グルコース濃度、乳酸濃度、温度及びタンパク質産生量からなる群から選択される少なくとも一つの測定可能パラメータを監視することをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 複数の異なるＲＮＡエフェクター分子のそれぞれを、同時に又は異なる時間で添加する、請求項２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 複数の異なるＲＮＡエフェクター分子のそれぞれを、同じ濃度で又は異なる濃度で添加する、請求項２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  26. 複数の異なるＲＮＡエフェクター分子を、同じ頻度で又は異なる頻度で添加する、請求項２〜６及び８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 細胞を第二の作用物質と接触させる工程をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 第二の作用物質が、抗体、増殖因子、アポトーシス阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤及びヒストン脱メチル化剤からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. キナーゼ阻害剤が、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤及びＫ２５２ａからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. ホスファターゼ阻害剤が、バナジン酸ナトリウム及びオカダ酸からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  31. ヒストン脱メチル化剤が５−アザシチジンである、請求項２８に記載の方法。
  32. 生物由来物質がポリペプチドである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 生物由来物質が代謝産物である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  34. 生物由来物質が機能性食品である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  35. 細胞を、ＲＮＡエフェクター分子と、定常期、初期対数期、中期対数期、後期対数期、誘導期及び死滅期からなる群から選択される細胞増殖期で接触させる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが二重鎖領域を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが１５〜３０ヌクレオチド長である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが１７〜２８ヌクレオチド長である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 細胞が、植物細胞、真菌細胞、又は動物細胞である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項４１に記載の方法。
  43. ヒト細胞が、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＩＭＲ３２細胞、ＬＡＮ５細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦｌＯＡ細胞、２９３Ｔ細胞及びＳＫ−ＢＲ３細胞からなる群から選択される付着細胞である、請求項４２に記載の方法。
  44. ヒト細胞が、ＨｕＶＥＣ細胞、ＨｕＡＳＭＣ細胞、ＨＫＢ−Ｉ１細胞及びｈＭＳＣ細胞からなる群から選択される初代細胞である、請求項４２に記載の方法。
  45. ヒト細胞が、Ｕ２９３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲＣ６（登録商標）細胞、ジャーカット細胞、ＨＴ−２９細胞、ＬＮＣａｐ．ＦＧＣ細胞、Ａ５４９細胞、ＭＤＡ ＭＢ４５３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＴＨＰ−Ｉ細胞、ＭＣＦ７細胞、ＢｘＰＣ−３細胞、Ｃａｐａｎ−１細胞、ＤＵ１４５細胞及びＰＣ−３細胞からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
  46. 哺乳動物細胞が、ＢＨＫ２１細胞、ＢＨＫ（ＴＫ−）細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＥＬ４細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞誘導体、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＥＳ−Ｄ３細胞、Ｈ９ｃ２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、及びｍｉＭＣＤ３細胞からなる群から選択される齧歯類動物細胞である、請求項４１に記載の方法。
  47. ＣＨＯ細胞誘導体が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸＢ１及びＣＨＯ−ＤＧ４４細胞からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. 細胞が、ＰＥＲＣ６細胞、ＨＴ−２９細胞、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞、Ａ５４９細胞、ＭＤＡ ＭＢ４５３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＴＨＰ−１細胞、ｍｉＭＣＤ−３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｃｏｓ−７細胞、ＢｘＰＣ−３細胞、ＤＵ１４５細胞、ジャーカット細胞、ＰＣ−３細胞及びＣａｐａｎ−１細胞からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
  49. 細胞が、ＢＨＫ２１、ＢＨＫ（ＴＫ−）、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、Ｕ２９３細胞、ＥＬ４細胞、ＣＨＯ細胞、及びＣＨＯ細胞誘導体からなる群から選択される齧歯類動物細胞である、請求項４１に記載の方法。
  50. 細胞が、生物由来物質をコードする遺伝子構造物をさらに含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 細胞が、ウイルス受容体をコードする遺伝子構造物をさらに含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 標的遺伝子が、タンパク質グリコシル化に影響を及ぼすタンパク質をコードする、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 標的遺伝子が生物由来物質をコードする、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つを、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．７５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ及び１００ｎＭからなる群から選択される濃度で加える、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つを、５０分子／細胞、１００分子／細胞、２００分子／細胞、３００分子／細胞、４００分子／細胞、５００分子／細胞、６００分子／細胞、７００分子／細胞、８００分子／細胞、９００分子／細胞、１０００分子／細胞、２０００分子／細胞、又は５０００分子／細胞の量で加える、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  56. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、０．０１フェムトモル／１０６細胞、０．１フェムトモル／１０６細胞、０．５フェムトモル／１０６細胞、０．７５フェムトモル／１０６細胞、１フェムトモル／１０６細胞、２フェムトモル／１０６細胞、５フェムトモル／１０６細胞、１０フェムトモル／１０６細胞、２０フェムトモル／１０６細胞、３０フェムトモル／１０６細胞、４０フェムトモル／１０６細胞、５０フェムトモル／１０６細胞、６０フェムトモル／１０６細胞、１００フェムトモル／１０６細胞、２００フェムトモル／１０６細胞、３００フェムトモル／１０６細胞、４００フェムトモル／１０６細胞、５００フェムトモル／１０６細胞、７００フェムトモル／１０６細胞、８００フェムトモル／１０６細胞、９００フェムトモル／１０６細胞，及び１ピコモル／１０６細胞からなる群から選択される濃度で添加される、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  57. 少なくとも第一のＲＮＡエフェクター分子、又は複数のＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一つが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、ギャップマー、アンタゴミア、リボザイム及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 細胞を、炭素の代謝及び輸送、アポトーシス、ＲＮＡｉ取り込み及び効率の少なくとも一方、活性酸素種産生、細胞周期の調節、タンパク質折りたたみ、タンパク質ピログルタミン酸化、タンパク質脱アミド化、タンパク質グリコシル化、ジスルフィド結合形成、タンパク質分泌、遺伝子増幅、ウイルス複製、ウイルス感染、ウイルス粒子放出、細胞ｐＨの調節、及びタンパク質産生からなる群から選択される細胞プロセスを調節する少なくとも一つの追加のＲＮＡエフェクター分子又は作用物質と接触させる工程をさらに含む、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸３−ホスファターゼ（ＰＴＥＮ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞内の炭素の代謝又は輸送を調節することによって細胞における生物由来物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 少なくとも一つの標的遺伝子が乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）であり、かつＲＮＡエフェクター分子が配列番号３１５２５４０〜３１５２６０３からなる群から選択される、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  61. 少なくとも一つの標的遺伝子が、Ｂｃｌ−Ｇ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢｉｍＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｏｏ、Ｍｃｌ−１、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９及びＣＡＳＰ１０からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞のアポトーシスを調節することによって細胞における生物由来物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  62. 少なくとも一つの標的遺伝子がＢａｋであり、かつＲＮＡエフェクター分子が配列番号３１５２４１２〜３１５２４７５からなる群から選択される、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  63. 少なくとも一つの標的遺伝子がＢａｘであり、かつＲＮＡエフェクター分子が配列番号３１５２４７６〜３１５２５３９からなる群から選択される、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  64. ＲＮＡエフェクター分子が、初期アポトーシスに入る細胞の比率を著しく低下させる、請求項１６又は１７に記載の方法。
  65. 複数の標的遺伝子が、少なくともＢａｘ及びＢａｋである、請求項３に記載の方法。
  66. 複数の標的遺伝子が、少なくともＢａｘ、Ｂａｃ及びＬＤＨである、請求項３に記載の方法。
  67. その一部分がＢａｘと相補的であるＲＮＡエフェクター分子が、配列番号３１５２４７６〜３１５２５３９からなる群から選択され、その一部分がＢａｋと相補的であるＲＮＡエフェクター分子が、配列番号３１５２４１２〜３１５２４７５からなる群から選択される、請求項４、５、６５及び６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. その一部分がＬＤＨと相補的であるＲＮＡエフェクター分子が、配列番号３１５２５４０〜３１５２６０３からなる群から選択される、請求項４又は６６に記載の方法。
  69. 少なくとも２つの標的遺伝子の発現が調節され、かつ少なくとも２つの標的遺伝子が、Ｂｃｌ−Ｇ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ，及びＢｉｍＬからなる群から選択される、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 細胞を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）と相補的な配列を含むＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程をさらに含む、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  71. 少なくとも一つの標的遺伝子が、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、Ａｇｏ４、ＨＩＷＩ１、ＨＩＷＩ２、ＨＩＷＩ３、ＨＩＬＩ、インターフェロン受容体、ＡｐｏＥ、Ｅｒｉ１及びマンノース／ＧａｌＮＡｃ受容体からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞でのＲＮＡｉ取り込み及び効率の少なくとも一方を調節することによって細胞における生物由来物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  72. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＮＡＤ（ｐ）Ｈオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、構成型神経性一酸化窒素シンターゼ（ｃｎＮＯＳ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）、１５−リポキシゲナーゼ−１、ＮＡＤＰＨシトクロムｃ２レダクターゼ、ＮＡＰＨシトクロムｃレダクターゼ、ＮＡＤＨシトクロムｂ５レダクターゼ及びシトクロムＰ４５０２Ｅ１からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞での活性酸素種の産生を抑制することによって細胞における生物由来物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  73. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＭｕＬＶタンパク質、ＭＶＭタンパク質、Ｒｅｏ−３タンパク質、ＰＲＶタンパク質及びベシウイルスタンパク質からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞のウイルス感染を抑制することによって細胞における生物由来物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  74. 少なくとも一つの標的遺伝子がキシローストランスフェラーゼである、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  75. 少なくとも一つの標的遺伝子がベシウイルスタンパク質であり、かつ少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が配列番号３１５２６０４〜３１５２７１３からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む少なくとも一つの鎖を含む、請求項７３に記載の方法。
  76. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、Ｐ１０、Ｐ２１、Ｐ２７、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ及びＣＤＫ４からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞の細胞周期を調節することによって細胞における生物由来物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  77. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ４、ＡＴＦ６、ｅＩＦ２α、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、Ｂｉｐ、Ｈｓｐ４０、ＨＳＰ４７、ＨＳＰ６０、Ｈｓｐ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１００、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼ、カルレチクリン、カルネキシン、Ｅｒｐ５７及びＢＡＧ−１からなる群から選択され、かつ発現の調節が、タンパク質の折りたたみを高めることによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  78. 少なくとも一つの標的遺伝子が、宿主細胞内のメチオニンスルホキシドレダクターゼ遺伝子であり、かつ発現の調節が、メチオニン酸化によるタンパク質の修飾を抑制することによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  79. 標的遺伝子が、宿主細胞内のグルタミニルシクラーゼ遺伝子であり、かつ発現の調節が、ピログルタミン酸化によるタンパク質の修飾を抑制することによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３又は６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 少なくとも一つの標的遺伝子が、アスパラギンデアミダーゼ及びグルタミンデアミダーゼからなる群から選択され、かつ発現の調節が、脱アミド化によってタンパク質の修飾を抑制することによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  81. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ドリチル−ジホスホオリゴサッカライド−タンパク質グリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｇａｌ：βＧｌｃＮＡｃβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、タンパク質Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＴ−４、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、α−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択され、かつ発現の調節が、タンパク質のグリコシル化を調節することによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  82. 少なくとも一つの標的遺伝子が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ及びスルフヒドリルオキシダーゼからなる群から選択され、かつ発現の調節が、タンパク質においてジスルフィド結合形成を調節することによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  83. 少なくとも一つの標的遺伝子が、γ−セクレターゼ、ｐ１１５、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）タンパク質、セクレチン及びキナーゼからなる群から選択され、かつ発現の調節が、タンパク質の分泌を調節することによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  84. 少なくとも一つの標的遺伝子が、宿主細胞内のデヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子であり、かつ発現の調節が、細胞での遺伝子増幅を高めることによって細胞におけるタンパク質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  85. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ウイルスの遺伝子又は細胞の標的遺伝子であり、それによって減少したウイルス量を有する宿主細胞から生物由来物質を産生させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  86. ウイルスが、ベシウイルス、ＭＭＶ、ＭｕＬＶ、ＰＲＶ及びＲｅｏ−３からなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
  87. 少なくとも一つの標的遺伝子がウイルスタンパク質をコードする、請求項８５に記載の方法。
  88. 少なくとも一つの標的遺伝子が非ウイルスタンパク質をコードする、請求項８５に記載の方法。
  89. 少なくとも一つの標的遺伝子が、酸化促進酵素、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＨＲＫ、ＢＣＬＧ、ＨＲ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＯＫ、ＢＯＯ、ＢＣＬＢ、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＣＬ２、ｐ５３、ＡＰＡＦＩ及びＨＳＰ７０からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞の生存率を高めることによって細胞における生物由来物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、Ｐ１０、Ｐ２１、Ｐ２７、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、Ｂｃｌ−Ｇ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｌｋ、Ｈｒｋ、ＢＮＩＰ３、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢｉｍＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｏｏ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ１０、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸３−ホスファターゼ（ＰＴＥＮ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞の特異的生産性を高めることによって細胞における生物由来物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  91. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸 ３−ホスファターゼ（ＰＴＥＮ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、Ｐ１０、Ｐ２１、Ｐ２７、ｐ５３、Ｐ５７、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ１４ＡＲＦ及びＣＤＫ４からなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞の栄養必要量を調節することによって細胞における生物由来物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  92. 少なくとも一つの標的遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ及びリソソームＶ型ＡＴＰアーゼからなる群から選択され、かつ発現の調節が、細胞のｐＨを調節することによって細胞における生物由来物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  93. 少なくとも一つの標的遺伝子が、細胞質アクチンキャッピングタンパク質（ＣａｐＺ）、エズリン（ＶＩＬ２）、ラミニンＡ及びコフィリン（ＣＦＬ１）からなる群から選択され、かつ遺伝子発現の調節が、細胞のアクチン動態を調節することによって細胞における生物由来物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  94. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が標的遺伝子コフィリンの発現を調節する、請求項９３に記載の方法。
  95. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、細胞質アクチンキャッピングタンパク質（ＣａｐＺ）、エズリン（ＶＩＬ２）及びラミニンＡからなる群から選択される標的遺伝子の発現を増加させる、請求項９３に記載の方法。
  96. 少なくとも一つの標的遺伝子が、宿主細胞潜在ウイルス、外来ウイルス又は宿主細胞内在性レトロウイルスの遺伝子であるか、あるいはこのようなウイルスの宿主細胞結合リガンドである、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  97. 標的遺伝子が、ＨＥＲＶ−Ｋ、ｐｔ０１−Ｃｈｒ１０ｒ−１７１１９４５８、ｐｔ０１−Ｃｈｒ５−５３８７１５０１、ＢａＥＶ、ＧａＬＶ、ＨＥＲＶ−Ｔ、ＥＲＶ−３、ＨＥＲＶ−Ｅ、ＨＥＲＶ−ＡＤＰ、ＨＥＲＶ−Ｉ、ＭＥＲ４様、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶＨ−ＲＴＶＬＨ２、ＨＥＲＶＨ−ＲＧＨ２、ＨＥＲＶ−Ｈコンセンサス、ＨＥＲＶ−Ｆｃ１、ｈｇ１５−ｃｈｒ３−１５２４６５２８３、ＨＥＲＶＬ６６、ＨＳＲＶ、ＨＦＶ、ＨＥＲＶ−Ｓ、ＨＥＲＶ−Ｌ、ＨＥＲＶＬ４０、ＨＥＲＶＬ７４、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＭＰＭＶ、ＭＭＴＶ、ＨＭＬ１、ＨＭＬ２、ＨＭＬ３、ＨＭＬ４、ＨＭＬ７、ＨＭＬ８、ＨＭＬ５、ＨＭＬ１０、ＨＭＬ６、ＨＭＬ９、ＭＭＴＶ、ＦＬＶ、ＰＥＲＶ、ＢＬＶ、ＥＩＡＶ、ＪＳＲＶ、ｇｇ０１−ｃｈｒ７−７１６３４６２、ｇｇ０１−ｃｈｒＵ−５２１９０７２５、ｇｇ０１−Ｃｈｒ４−４８１３０８９４、ＡＬＶ、ｇｇ０１−ｃｈｒ１−１５１６８８４５、ｇｇ０１−ｃｈｒ４−７７３３８２０１、ｇｇ０１−ＣｈｒＵ−１６３５０４８６９、ｇｇ０１−ｃｈｒ７−５７３３７８２、インドニシキヘビ（Ｐｙｔｈｏｎ−ｍｏｌｕｒｕｓ）、ＷＤＳＶ、ＳｎＲＶ、Ｘｅｎ１、Ｇｙｐｓｙ及びＴｙ１から選択される内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）の遺伝子である、請求項９６に記載の方法。
  98. 標的遺伝子が、Ｃ血清型アデノウイルス、トリアデノウイルス、トリアデノウイルス随伴ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−４（ＥＢＶ）及びサーコウイルスからなる群から選択される潜在ウイルスの遺伝子である、請求項９６に記載の方法。
  99. 潜在ウイルスがサーコウイルスであり、かつ標的遺伝子がブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）又はサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のｒｅｐ遺伝子である、請求項９８に記載の方法。
  100. 潜在ウイルスがＥＢＶであり、かつ標的遺伝子が潜在膜タンパク質（ＬＭＰ）−２Ａである、請求項９８に記載の方法。
  101. 標的遺伝子が、外来性レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、ヒトＴ細胞リンパ指向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ヒト肝炎Ａ型（ＨＨＡ）、ＨＨＢ、ＨＨＣ、ヒトサイトメガロウイルス、ＥＢＶ、ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ６）、ＨＨＶ７、ＨＨＶ８、ヒトパルボウイルスＢ１９、レオウイルス、ポリオーマ（ＪＣ／ＢＫ）ウイルス、ＳＶ４０、ヒトコロナウイルス、パピローマウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザＡ型、Ｂ型及びＣ型ウイルス、ヒトエンテロウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ベシウイルス、ブタサーコウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス、ブタパルボウイルス、アデノ随伴ウイルス、レオウイルス、狂犬病ウイルス、レポリポックスウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ハンターンウイルス、マルブルグウイルス、ＳＶ２０、セムリキ森林ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ブタパルボウイルス、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、マウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ）、タイラー脳脊髄炎ウイルス、ネズミ微小ウイルス、マウスアデノウイルス（ＭＡＶ）；マウスサイトメガロウイルス、マウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）、キルハムラットウイルス、トゥーランＨ−１ウイルス、センダイウイルス、ラットコロナウイルス、偽性狂犬病ウイルス、カシェ渓谷ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシアデノウイルス、ウシパルボウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ウシヘルペスウイルス、ウシレオウイルス、ブルータングウイルス、ウシポリオーマウイルス、ウシサーコウイルス、牛痘、牛痘以外のオルトポックスウイルス、偽牛痘ウイルス及びレポリポックスウイルスからなる群から選択される外来ウイルスの遺伝子である、請求項９６に記載の方法。
  102. 標的遺伝子が、内在性ウイルス、潜在ウイルス又は外来ウイルスのための宿主細胞結合リガンドである、請求項９６に記載の方法。
  103. 標的遺伝子が、ＳＬＣ３５Ａ１、Ｇｎｅ、Ｃｍａｓ、Ｂ４ＧａｌＴ１又はＢ４ＧａｌＴ６である、請求項１０２に記載の方法。
  104. 少なくとも一つの標的遺伝子が、ＦＵＴ８、ＴＳＴＡ３及びＧＭＤＳからなる群から選択され、かつ発現の調節が、フコシル化を調節することによって細胞における生物由来物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  105. 宿主細胞を、シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を標的とする少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程をさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
  106. シアリルトランスフェラーゼが、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ３、ＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ５、ＳＴ６（α−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−β−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ６及びＳＴ３β−ガラクトシドα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ２からなる群から選択される、請求項１０５に記載の方法。
  107. 少なくとも一つの標的遺伝子が、グルタミナーゼ及びグルタミンデヒドロゲナーゼからなる群から選択され、かつ発現の調節が、アンモニア増強を調節することによって細胞における生物由来物質の産生を向上させる、請求項１〜３及び６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
  108. 宿主細胞を、グルタミナーゼの発現を調節する少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程をさらに含む、請求項１〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
  109. 宿主細胞を、グルタミンシンテターゼの発現を調節する少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と接触させる工程をさらに含む、請求項１〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. その一部分が宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的である少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子と、宿主細胞を培養するのに適した細胞培地とを含む組成物であって、ＲＮＡエフェクター分子が標的遺伝子の発現を調節可能であり、かつ発現の調節が生物由来物質の産生を高めるとともに、少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が、配列番号９７７２〜３１５２３３９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡである組成物。
  111. ２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を含み、前記２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子がそれぞれ異なる標的遺伝子と相補的である、請求項１１０に記載の組成物。
  112. 複数のＲＮＡエフェクター分子を含む組成物であって、それぞれのＲＮＡエフェクター分子の一部分が宿主細胞の少なくとも一つの標的遺伝子と相補的であり、かつ組成物がＢａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨの発現を調節可能であるとともに、発現の調節が生物由来物質の産生を高める組成物。
  113. 少なくとも一つの追加のＲＮＡエフェクター分子又は作用物質をさらに含む、請求項１１０又は１１２に記載の組成物。
  114. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子がｓｉＲＮＡである、請求項１１０又は１１２に記載の組成物。
  115. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が二重鎖領域を含む、請求項１１０又は１１２に記載の組成物。
  116. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が１５〜３０ヌクレオチド長である、請求項１１０又は１１２に記載の組成物。
  117. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が１７〜２８ヌクレオチド長である、請求項１１０又は１１２に記載の組成物。
  118. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が修飾ヌクレオチドを含む、請求項１１０又は１１２に記載の組成物。
  119. 細胞培地が血清非含有培地である、請求項１１０に記載の組成物。
  120. 組成物が非脂質製剤に製剤化される、請求項１１０〜１１９のいずれか一項に記載の組成物。
  121. 組成物が脂質製剤に製剤化される、請求項１１０〜１１９のいずれか一項に記載の組成物。
  122. 製剤中の脂質が陽イオン性又は非イオン性脂質を含む、請求項１２１に記載の組成物。
  123. 組成物が、さらに一つ又はそれ以上の細胞培養培地補助物質を含む、請求項１１０〜１２２のいずれか一項に記載の組成物。
  124. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子が二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、ｄｓＲＮＡが相互に相補的である少なくとも２つの配列からなり、センス鎖が第一の配列からなり、アンチセンス鎖が標的遺伝子の少なくとも一部分と実質的に相補的である相補性の領域を含む第二の配列からなり、かつ相補性の領域が１０〜３０ヌクレオチド長である、請求項１１０〜１２３のいずれか一項に記載の組成物。
  125. 培養細胞による生物由来物質の産生を高めるキットであって、
    （ｄ）生物由来物質が産生される条件下で細胞を培養するのに適した一つ又はそれ以上のアッセイ表面を含む支持体、
    （ｅ）一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子であって、それぞれのＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は標的遺伝子と相補的であるＲＮＡエフェクター分子、及び
    （ｆ）生物由来物質又はその細胞による産生を検出するための試薬
    を含み、一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、配列番号９７７２〜３１５２３３９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであるキット。
  126. 一つ又はそれ以上のアッセイ表面が、さらに宿主細胞の増殖及び維持を支持するための基材を含む、請求項１２５に記載のキット。
  127. 一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が支持体表面に沈着している、請求項１２５に記載のキット。
  128. 宿主細胞によるＲＮＡエフェクター分子の取り込みを促進するための担体をさらに含む、請求項１２５に記載のキット。
  129. 担体が陽イオン性脂質組成物を含む、請求項１２８に記載のキット。
  130. 担体が支持体表面に沈着している、請求項１２８に記載のキット。
  131. 宿主細胞を培養するのに適した細胞培養培地をさらに含む、請求項１２５に記載のキット。
  132. 一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子の存在下で宿主細胞を培養し、細胞を生物由来物質の産生についてアッセイするための取扱説明書をさらに含む、請求項１２５に記載のキット。
  133. 培養細胞による生物由来物質の産生を最適化するためのキットであって、
    （ａ）生物由来物質が産生される条件下で細胞を培養するのに適した複数のアッセイ表面を含むマイクロアレイ支持体、
    （ｂ）一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子であって、それぞれのＲＮＡエフェクター分子の少なくとも一部分は標的遺伝子と相補的であるＲＮＡエフェクター分子、及び
    （ｃ）生物由来物質の産生に対する一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子の効果を検出するための試薬
    を含み、一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が、配列番号９７７２〜３１５２３３９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチを有するアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであるキット。
  134. 支持体がマルチウェルプレート又はバイオチップである、請求項１３３に記載のキット。
  135. 支持体が二次元マイクロアレイプレート又はバイオチップある、請求項１３３に記載のキット。
  136. 一つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が支持体のアッセイ表面に沈着している、請求項１３３に記載のキット。
  137. 複数の異なるＲＮＡエフェクター分子が、マイクロアレイの第一の寸法にわたってアッセイ表面に沈着している、請求項１３５に記載のキット。
  138. 複数のＲＮＡエフェクター分子が、それぞれ異なる標的遺伝子と相補的である、請求項１３７に記載のキット。
  139. 異なる標的遺伝子が、Ｂａｘ、Ｂａｋ及びＬＤＨである、請求項に記載のキット。
  140. 複数のＲＮＡエフェクター分子が、それぞれ同じ標的遺伝子の異なる領域と相補的である、請求項１３７に記載のキット。
  141. 複数を含むＲＮＡエフェクター分子のそれぞれが、マイクロアレイの第二の寸法に沿ったアッセイ表面に様々な濃度で沈着している、請求項１３７に記載のキット。
  142. その一部分が標的遺伝子と相補的であるＲＮＡエフェクター分子が、ヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む対応ｓｉＲＮＡであり、前記ヌクレオチド配列が、表１〜１６、２１〜２５、２７〜３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１〜６１、６５及び６６のいずれかに記載される、請求項１〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
  143. 細胞においてタンパク質の発現を調節するのに適した少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子のヌクレオチド配列を選択するためのシステムであって、
    （ａ）少なくとも一つのプロセッサ及び関連付けられたメモリを含むコンピュータシステムであって、メモリは、コンピュータシステムの操作を制御するための少なくとも一つのコンピュータプログラムを格納するコンピュータシステムと、
    （ｂ）コンピュータシステムに連結され、少なくとも一つの細胞の少なくとも一つのトランスクリプトーム（細胞トランスクリプトーム）のトランスクリプトーム情報（前記情報は、トランスクリプトームのそれぞれの転写産物に関する配列、及び任意で転写産物の名前、及び任意で転写産物が役割を果たす分子経路の名前を含む）、及び少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子に関する情報（前記情報は、少なくともＲＮＡエフェクター分子の配列、及び任意でＲＮＡエフェクター分子の標的特異性を含み、それぞれのＲＮＡエフェクター分子は、少なくとも一つの細胞トランスクリプトームの少なくとも配列にマッチするように設計される）を含むデータベースと、
    （ｃ）コンピュータシステムによって実行され、かつ細胞型選択、標的生物選択、細胞経路選択、交差反応性選択、転写産物量選択、標的遺伝子名及び配列の少なくとも一方の選択、及び任意で生体内送達か生体外送達かの選択肢を含む送達方法の選択のうちの少なくとも一つを含むユーザパラメータ、さらに任意でユーザアドレス情報を受け取るように構成されたユーザインターフェースプログラムモジュールと、
    （ｄ）コンピュータシステムによって実行され、かつパラメータとトランスクリプトーム転写産物配列とのマッチする組み合わせのために、パラメータをデータベース中の配列と照合するように構成された第一のモジュールと、
    （ｅ）コンピュータシステムによって実行され、かつ細胞におけるタンパク質の発現を調節するのに適した少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子の選択された配列を示すように構成された第二のモジュール
    を含むシステム。
  144. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子をコンテナに格納するための記憶モジュール（２つ又はそれ以上のＲＮＡエフェクター分子が存在する場合、それぞれのＲＮＡエフェクター分子は別個のコンテナに格納される）及びロボットハンドリングモジュールをさらに含み、ロボットハンドリングモジュールは、マッチする組み合わせの選択の際にマッチングコンテナを選択し、かつ任意でコンテナに生体内送達又は生体外送達に関するユーザ選択に基づいた付加物を加え、かつ任意でさらにユーザアドレスに送るべきマッチングＲＮＡエフェクター分子を含むコンテナをパッケージする、請求項１４３に記載のシステム。
  145. 少なくとも一つの細胞トランスクリプトーム配列情報が、本質的に配列番号１〜９７７１及び配列番号３１５７１４９〜３１５８４２０からなる、請求項１４３又は１４４に記載のシステム。
  146. ＲＮＡエフェクター分子が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、ギャップマー、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、リボザイム及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１４３〜１４５のいずれか一項に記載のシステム。
  147. ＲＮＡエフェクター分子が、ｓｉＲＮＡ、製剤化ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ混合物及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１４３〜１４５のいずれか一項に記載のシステム。
  148. ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号９７７２〜３１５２３９９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡ鎖を含む、請求項１４３〜１４７のいずれか一項に記載のシステム。
  149. ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号９７７２〜３１５２３９９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１６〜１９個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡ鎖を含む、請求項１４３〜１４７のいずれか一項に記載のシステム。
  150. 少なくとも一つのＲＮＡエフェクター分子の配列が、本質的に配列番号９７７２〜３１５２３９９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる、請求項１４３〜１４９のいずれか一項に記載のシステム。
  151. 少なくとも一つのトランスクリプトーム中の少なくとも一つ又はそれ以上の配列とマッチする複数のＲＮＡエフェクター分子が選択される、請求項１４３〜１５０のいずれか一項に記載のシステム。
  152. 請求項１〜１５１のいずれか一項に記載のシステムを使用して細胞におけるタンパク質の発現を調節するためのＲＮＡエフェクター分子の選択方法。
  153. さらに細胞のゲノム情報を含み、ユーザ選択によって、ＲＮＡエフェクター分子を、ゲノムに存在するプロモーター、エンハンサー、イントロン及びエクソンを含む標的ゲノム配列にマッチさせることができる、請求項１〜１５２のいずれか一項に記載のシステム。
  154. 配列番号１〜９７７１を有する転写産物の選択又は編集を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞トランスクリプトーム。
  155. 配列番号３１５７１４９〜３１５８４２０を有する転写産物の選択又は編集を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞トランスクリプトーム。
  156. ＣＨＯ細胞トランスクリプトーム配列がデータベースの一部である、請求項１５４又は１５５に記載のＣＨＯ細胞トランスクリプトーム。
  157. 請求項１５４又は１５５に記載のＣＨＯ細胞トランスクリプトームのいずれか一つに指向するｓｉＲＮＡ。
  158. ｓｉＲＮＡが、配列番号９７７２〜３１５２３９９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む、請求項１５７に記載のｓｉＲＮＡ。
  159. ｓｉＲＮＡが、配列番号９７７２〜３１５２３９９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６〜１９個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む、請求項１５７又は１５８に記載のｓｉＲＮＡ。
  160. ｓｉＲＮＡが、配列番号９７７２〜３１５２３５９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択される、請求項１５６〜１５９のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。
  161. ｓｉＲＮＡ配列又はそのアンチセンス配列がデータベースの一部である、請求項１〜１６０のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。
  162. 細胞株を改良する方法であって、表１〜１６から選択される転写産物から翻訳される少なくとも一つのタンパク質を調節することを含む方法。
  163. 細胞株を改良する方法であって、エフェクターＲＮＡ分子を使用して少なくとも２つの転写産物を調節することを含み、第一の転写産物が第一の細胞培養表現型に影響を及ぼし、かつ第二の転写産物が第二の異なる細胞培養表現型に影響を及ぼし、細胞培養表現型が、細胞増殖速度、細胞生産性、ピーク細胞密度、持続した細胞生存率、アンモニア産生及び消費の速度、又は乳酸産生もしくは消費の速度からなる群から選択され、かつ第一及び第二の転写産物が、配列番号１〜９７７１及び配列番号３１５７１４９〜３１５８４２０からなる群から選択される方法。
  164. 第一及び第二の細胞培養表現型とは異なる第三の細胞培養表現型に影響を及ぼす第三の転写産物を調節することをさらに含む、請求項１６３に記載の方法。
  165. ＲＮＡエフェクター分子が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、ギャップマー、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）又はリボザイムからなる群から選択される、請求項１６３又は１６４に記載の方法。
  166. ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号９７７２〜３１５２３５９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む、請求項１６３〜１６５のいずれか一項に記載の方法。
  167. ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号９７７２〜３１５２３９９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１６〜１９個の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む、請求項１６３〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
  168. エフェクターＲＮＡ分子が、配列番号９７７２〜３１５２３９９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択される、請求項１６３〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
  169. 細胞株がＣＨＯ細胞株である、請求項１６３〜１６８のいずれか一項に記載の方法。
  170. 改良された細胞生産性、改良された細胞増殖速度、又は改良された細胞生存率を有する組換え細胞株であって、組換え細胞の個体群を含み、そのそれぞれが、表１〜１６、２１〜２５、２７〜３０、５２〜６１、６５及び６６から選択される一つ又はそれ以上の転写産物を調節する組換え構造物を含む組換え細胞株。
  171. 一つ又はそれ以上の転写産物を調節する組換え構造物が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔｋＲＮＡｉ、ｅｉＲＮＡ、ｐｄＲＮＡ、ギャップマー、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、リボザイム及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＲＮＡエフェクター分子を含む、請求項１７０に記載の組換え細胞株。
  172. ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号９７７２〜３１５２３９９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１６〜１９個の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む、請求項１７１に記載の組換え細胞株。
  173. 組み換え構造物が、配列番号９７７２〜３１５２３９９及び配列番号３１６１１２１〜３１７６７８３からなる群から選択されるｓｉＲＮＡを含む、請求項１６９〜１７２のいずれか一項に記載の組換え細胞株。
  174. 脂質製剤が、次式：
    Figure 2014501097
     ｛式中：
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれの存在についてそれぞれ独立して、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルコキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニルオキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニルオキシ、又は任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アシルであり；
    Figure 2014501097
     は、Ｌ２とＬ１の間の結合を表し、この結合は：
    （１）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子との間の単結合であり〔この場合、
    Ｌ１は、Ｃ（Ｒｘ）、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｑ）であり；
    Ｌ２は、−ＣＲ５Ｒ６−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｑ）−、＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、又は−Ｃ（Ｏ）−である〕；
    （２）Ｌ２の一つの原子とＬ１の一つの原子との間の二重結合であり〔この場合、
    Ｌ１は、Ｃであり；
    Ｌ２は、−ＣＲ５＝、−Ｎ（Ｑ）＝、−Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝である〕；
    （３）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子との間の単結合、及びＬ２の第二の原子とＬ１の第一の原子との間の単結合であり〔この場合、
    Ｌ１は、Ｃであり；
    Ｌ２は、次式：
    Figure 2014501097
     を有し、式中のＸはＬ２の第一の原子であり、ＹはＬ２の第二の原子であり、−−−−−はＬ１の第一の原子に対する単結合を表し、かつＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
    Ｚ１及びＺ４は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
    Ｚ２は、ＣＨ又はＮであり；
    Ｚ３は、ＣＨ又はＮであり；
    あるいは、Ｚ２とＺ３は、一緒になって、単一のＣ原子であり；
    Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−、−ＣＨＲ５−、又は−ＣＲ５Ｒ５−であり；
    それぞれのＺは、Ｎ、Ｃ（Ｒ５）、又はＣ（Ｒ３）であり；
    ｋは、０、１、又は２であり；
    それぞれのｍは、独立して０〜５であり；
    それぞれのｎは、独立して０〜５であり；
    この場合、ｍとｎは、一緒になって３、４、５、６、７又は８員環を生じる〕；
    （４）Ｌ２の第一の原子とＬ１の第一の原子との間の単結合、及びＬ２の第一の原子とＬ１の第二の原子との間の単結合であり〔この場合、
    （Ａ）Ｌ１は、次式：
    Figure 2014501097
     を有し、式中のＸはＬ１の第一の原子であり、ＹはＬ１の第二の原子であり、−−−−−はＬ２の第一の原子に対する単結合を表し、かつＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
    Ｔ１は、ＣＨ又はＮであり；
    Ｔ２は、ＣＨ又はＮであり；
    あるいは、Ｔ１とＴ２は、一緒になって、Ｃ＝Ｃであり；
    Ｌ２は、ＣＲ５であるか；又は
    （Ｂ）Ｌ１は、次式：
    Figure 2014501097
     を有し、式中のＸはＬ１の第一の原子であり、ＹはＬ１の第二の原子であり、−−−−−はＬ２の第一の原子に対する単結合を表し、かつＸ及びＹは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、アルキレン、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ（ＣＯ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−、及び−ＯＰ（Ｏ）（Ｑ２）Ｏ−からなる群から選択され；
    Ｔ１は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
    Ｔ２は、−ＣＲ５Ｒ５−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、又は−Ｓ−であり；
    Ｌ２は、ＣＲ５又はＮである〕；
    Ｒ３は、次式：
    Figure 2014501097
     を有し、式中、
    Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３及びＹ４のそれぞれは、独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、又はアルキニルであるか；あるいは、
    Ｙ１、Ｙ２及びＹ３のうち任意の２つは、これらと結合しているＮ原子と一緒になって３〜８員複素環を形成するか；あるいは、
    Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、全てがこれらと結合しているＮ原子と一緒になって二環式５〜１２員複素環を形成し；
    それぞれのＲｎは、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；
    Ｌ３は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
    Ｌ４は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
    Ｌ５は、結合、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−（ＣＲ５Ｒ６）ａ−、−Ｃ（Ｏ）−、又はこれらの任意の２つの組み合わせであり；
    Ｒ５及びＲ６のそれぞれの存在は、独立して、Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり；あるいは、隣り合った炭素原子上の２個のＲ５基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で二重結合を形成するか；又は隣り合った炭素原子上の２個のＲ５基と、隣り合った同じ炭素原子上の２個のＲ６基は、一緒になってこれらのそれぞれの炭素原子の間で三重結合を形成し；
    それぞれのａは、独立して、０、１、２、又は３であり；
    この場合、
    Ｌ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基は、任意にＬ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６置換基と一緒になって、３〜８員シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリール基を形成し；かつ
    Ｙ１、Ｙ２及びＹ３のうち任意の一つは、任意にＬ３、Ｌ４又はＬ５のいずれかに由来するＲ５又はＲ６基、及びこれらと結合している原子と一緒になって、３〜８員ヘテロシクリル基を形成し；
    それぞれのＱは、独立して、Ｈ、アルキル、アシル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり；かつ
    それぞれのＱ２は、独立してＯ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）（Ｑ）、アルキル又はアルコキシである｝
    を有する脂質を含む、請求項１２１に記載の方法。
  175. 哺乳動物細胞がＭＤＣＫ細胞である、請求項４１に記載の方法。
JP2012519677A 2009-07-06 2010-07-06 生物由来物質の産生を高めるための組成物及び方法 Pending JP2014501097A (ja)

Applications Claiming Priority (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22337009P 2009-07-06 2009-07-06
US61/223,370 2009-07-06
US24486809P 2009-09-22 2009-09-22
US61/244,868 2009-09-22
US26741909P 2009-12-07 2009-12-07
US61/267,419 2009-12-07
US29398010P 2010-01-11 2010-01-11
US61/293,980 2010-01-11
US31958910P 2010-03-31 2010-03-31
US61/319,589 2010-03-31
US33439810P 2010-05-13 2010-05-13
US61/334,398 2010-05-13
US35493210P 2010-06-15 2010-06-15
US61/354,932 2010-06-15
PCT/US2010/041099 WO2011005786A2 (en) 2009-07-06 2010-07-06 Compositions and methods for enhancing production of a biological product

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2014501097A true JP2014501097A (ja) 2014-01-20

Family

ID=43429810

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012519677A Pending JP2014501097A (ja) 2009-07-06 2010-07-06 生物由来物質の産生を高めるための組成物及び方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20140099666A1 (ja)
EP (1) EP2451823A4 (ja)
JP (1) JP2014501097A (ja)
BR (1) BR112012000421A2 (ja)
CA (1) CA2767225A1 (ja)
WO (1) WO2011005786A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017506903A (ja) * 2014-03-04 2017-03-16 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ ウイルス耐性細胞及びその使用
US11710048B2 (en) 2016-07-05 2023-07-25 Samsung Electronics Co., Ltd. Method and device for assessing feasibility of biochemical reaction in organism

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8153435B1 (en) 2005-03-30 2012-04-10 Tracer Detection Technology Corp. Methods and articles for identifying objects using encapsulated perfluorocarbon tracers
US9687550B2 (en) * 2009-12-07 2017-06-27 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
AU2014280918B2 (en) * 2009-12-18 2016-11-17 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Organic compositions to treat HSF1-related diseases
US8293718B2 (en) * 2009-12-18 2012-10-23 Novartis Ag Organic compositions to treat HSF1-related diseases
US20120191434A1 (en) * 2010-08-25 2012-07-26 Gt Life Sciences, Inc. Articles of manufacture and methods for modeling chinese hamster ovary (cho) cell metabolism
WO2012177639A2 (en) * 2011-06-22 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing and bioproduction using avian cell lines
WO2013013017A2 (en) * 2011-07-21 2013-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modifying the glycosylation of lysosomal storage disorder therapeutics
EP2773777B1 (en) 2011-10-31 2020-05-13 University of Utah Research Foundation Genetic alterations in glioblastoma
WO2013102155A1 (en) * 2011-12-29 2013-07-04 Cell Machines, Inc. Cells for virus and protein production
EP2831232A4 (en) 2012-03-30 2015-11-04 Univ Washington METHODS OF MODULATING THE EXPRESSION OF TAU TO REDUCE THE STROKE AND MODIFY A NEURODEGENERATIVE SYMPTOM
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
WO2013173608A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating mecp2 expression
AU2013262649A1 (en) 2012-05-16 2015-01-22 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating smn gene family expression
JP6144355B2 (ja) * 2012-11-26 2017-06-07 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 化学修飾ｍＲＮＡ
WO2014113089A2 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
CN105264091B (zh) 2013-03-14 2020-02-28 Ionis制药公司 用于调节tau表达的组合物和方法
RU2019110030A (ru) 2013-05-01 2019-05-06 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы
TWI702046B (zh) 2013-07-19 2020-08-21 美商Ionis製藥公司 用於調節τ蛋白表現之組合物
EP2865758A1 (en) * 2013-10-22 2015-04-29 Sylentis, S.A.U. siRNA and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the ORAI1 gene
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
WO2016030863A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Compounds and methods for treating viral infections
SG11201703148TA (en) 2014-11-05 2017-05-30 Voyager Therapeutics Inc Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease
CN107109407A (zh) 2014-11-14 2017-08-29 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
MX2017006217A (es) 2014-11-14 2018-05-02 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos moduladores.
WO2016094783A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
EP3355924A1 (en) 2015-09-29 2018-08-08 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Methods of treating and preventing amyotrophic lateral sclerosis
EP3359670B2 (en) 2015-10-05 2024-02-14 ModernaTX, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
CA3001853A1 (en) * 2015-10-14 2017-04-20 Aquinnah Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid based tia-1 inhibitors
EP3368054A4 (en) 2015-10-28 2019-07-03 Voyager Therapeutics, Inc. REGULATORY EXPRESSION USING THE ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV)
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
IL262784B2 (en) 2016-05-18 2023-10-01 Voyager Therapeutics Inc modulatory polynucleotides
KR20220108216A (ko) 2016-05-18 2022-08-02 보이저 테라퓨틱스, 인크. 헌팅톤 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
CA3035522A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
JOP20190065A1 (ar) 2016-09-29 2019-03-28 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير عن tau
KR101837855B1 (ko) 2016-10-18 2018-03-13 단국대학교 산학협력단 뎅기바이러스 혈청형 2의 메틸트랜스퍼라제 활성을 억제하는 rna 앱타머
CN109952370B (zh) * 2016-10-19 2023-09-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于产生免疫缀合物的方法
EP3618839A4 (en) 2017-05-05 2021-06-09 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND TREATMENT METHODS FOR AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
MX2019013172A (es) 2017-05-05 2020-09-07 Voyager Therapeutics Inc Composiciones y metodos para tratar la enfermedad de huntington.
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
CA3070087A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
WO2019079240A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
EP3719128A4 (en) 2017-12-01 2021-10-27 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. DOUBLE STRANDED OLIGONUCLEOTIDE, COMPOSITION AND CONJUGATE WITH DOUBLE STRANDED OLIGONUCLEOTIDE, METHOD OF MANUFACTURING THEREOF AND USE THEREOF
JP7365052B2 (ja) 2017-12-01 2023-10-19 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用
WO2019115417A2 (en) * 2017-12-12 2019-06-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating rb1 expression
AU2018394875B2 (en) 2017-12-29 2023-08-03 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Conjugates and preparation and use thereof
WO2019173434A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 Voyager Therapeutics, Inc. Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes
JP7268049B2 (ja) 2018-03-08 2023-05-02 インサイト・コーポレイション ＰＩ３Ｋ－γ阻害剤としてのアミノピラジンジオール化合物
EP4242307A3 (en) * 2018-04-12 2023-12-27 MiNA Therapeutics Limited Sirt1-sarna compositions and methods of use
US20210214749A1 (en) 2018-05-16 2021-07-15 Voyager Therapeutics, Inc. Directed evolution
WO2019222441A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
WO2020007702A1 (en) * 2018-07-02 2020-01-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting bcl2l11
WO2020010003A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Incyte Corporation AMINOPYRAZINE DERIVATIVES AS PI3K-γ INHIBITORS
AU2019299861A1 (en) 2018-07-02 2021-01-14 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
MX2021000810A (es) 2018-07-24 2021-04-28 Voyager Therapeutics Inc Sistemas y metodos para producir formulaciones de terapia genetica.
JP2021533800A (ja) 2018-08-21 2021-12-09 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッドSuzhou Ribo Life Science Co., Ltd. 核酸、当該核酸を含む薬物組成物及び複合体ならびにその使用
EP3628735A1 (en) * 2018-09-25 2020-04-01 Centre National De La Recherche Scientifique Antisense rna targeting pmp22 for the treatment of charcot-marie-tooth 1a disease
WO2020063198A1 (zh) 2018-09-30 2020-04-02 苏州瑞博生物技术有限公司 一种siRNA缀合物及其制备方法和用途
US20210348242A1 (en) 2018-10-04 2021-11-11 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
US20210371470A1 (en) 2018-10-12 2021-12-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
WO2020097252A1 (en) * 2018-11-06 2020-05-14 University Of Miami Compositions and production of recombinant aav viral vectors capable of glycoengineering in vivo
SG11202107645RA (en) 2019-01-18 2021-08-30 Voyager Therapeutics Inc Methods and systems for producing aav particles
CN109852648B (zh) * 2019-04-11 2022-08-09 广西大学 酶法制备右旋糖酐硒聚物的方法
EP3962536A1 (en) 2019-04-29 2022-03-09 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing baculoviral infected insect cells (biics) in bioreactors
CN110117607A (zh) * 2019-04-29 2019-08-13 贵州大学 一种玉米黑粉菌效应蛋白Pit2基因的重组载体和表达方法
CN114375336A (zh) * 2019-05-07 2022-04-19 伯尔尼大学 用于抑制细胞中pros1表达的核酸
CA3136470A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Dna Twopointo Inc. Modifications of mammalian cells using artificial micro-rna to alter their properties and the compositions of their products
US20220290182A1 (en) 2019-08-09 2022-09-15 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
TW202122582A (zh) 2019-08-26 2021-06-16 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
WO2021247995A2 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating neuropathic pain
WO2022032282A1 (en) * 2020-08-06 2022-02-10 Alfred E. Mann Institute For Biomedical Engineering At The University Of Southern California Methods and reagents for microbiome analysis
EP4192514A1 (en) 2020-08-06 2023-06-14 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
WO2022051627A2 (en) * 2020-09-04 2022-03-10 Dna Twopointo Inc. Modifications of mammalian cells using artificial micro-rna to alter their properties and the compositions of their products
IT202000023647A1 (it) * 2020-10-07 2022-04-07 Univ Degli Studi Padova Sirna nel trattamento della sindrome ectrodattilia-displasia ectodermica-palatoschisi (eec)
CN112430625B (zh) * 2020-11-23 2022-08-05 武汉枢密脑科学技术有限公司 含有变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体、病毒及其制备和应用
US20240141377A1 (en) 2021-03-03 2024-05-02 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2022187548A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
JP2024514222A (ja) * 2021-04-19 2024-03-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 改変された哺乳動物細胞
EP4346897A1 (en) * 2021-06-02 2024-04-10 SiVEC Biotechnologies LLC Bacterial delivery of antibodies, antibody derivatives, and polypeptides to eukaryotic cells
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2023111335A1 (en) * 2021-12-17 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides capable of increasing glucocerebrosidase expression
CN114317511B (zh) * 2022-03-10 2022-06-14 北京爱普益医学检验中心有限公司 蛋白、基因、重组载体、表达盒、宿主及用途
WO2023194586A2 (en) * 2022-04-08 2023-10-12 Secarna Pharmaceuticals Gmbh & Co. Kg Oligonucleotide for reducing the expression of leucine-rich repeat kinase 2 (lrrk2) and its use for preventing and/or treating human diseases
GB202208022D0 (en) * 2022-05-31 2022-07-13 Sisaf Ltd Therapeutic compounds and compositions
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
CN117344061B (zh) * 2023-12-05 2024-02-27 云南省细胞质量检测评价中心有限公司 一种同时检测五种人源病毒ebv、hbv、hcv、hiv、hpv的方法、试剂盒、引物和探针及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7517644B1 (en) * 1991-08-23 2009-04-14 Larry J. Smith Method and compositions for cellular reprogramming
US20020132346A1 (en) * 2001-03-08 2002-09-19 Jose Cibelli Use of RNA interference for the creation of lineage specific ES and other undifferentiated cells and production of differentiated cells in vitro by co-culture
KR100434118B1 (ko) * 2001-09-17 2004-06-04 한국과학기술원 카스파제-3에 대한 안티센스 뉴클레오타이드, 그의발현벡터 및 이를 이용한 세포예정사의 억제방법
US20090023670A1 (en) * 2006-05-19 2009-01-22 Sebestyen Magdolna G Regulation of Transgene Expression by RNA Interference
BRPI0717601A2 (pt) * 2006-10-24 2013-10-22 Trubion Pharmaceuticals Inc Materiais e métodos para imunoglicoproteínas melhoradas
US8273722B2 (en) * 2007-07-13 2012-09-25 Dharmacon, Inc. Enhanced biotherapeutic production using inhibitory RNA

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017506903A (ja) * 2014-03-04 2017-03-16 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ ウイルス耐性細胞及びその使用
US11710048B2 (en) 2016-07-05 2023-07-25 Samsung Electronics Co., Ltd. Method and device for assessing feasibility of biochemical reaction in organism

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012000421A2 (pt) 2019-09-24
US20140099666A1 (en) 2014-04-10
EP2451823A2 (en) 2012-05-16
EP2451823A4 (en) 2013-07-03
CA2767225A1 (en) 2011-01-13
WO2011005786A2 (en) 2011-01-13
WO2011005786A3 (en) 2011-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2014501097A (ja) 生物由来物質の産生を高めるための組成物及び方法
JP2014501489A (ja) 細胞ベースのバイオプロセシング
WO2011005765A1 (en) Bioprocessing
US20130164329A1 (en) Cell-based methods and reagents
KR102605775B1 (ko) 보체 성분 Ｃ5 ｉＲＮＡ 조성물 및 그 이용 방법
JP2020054362A (ja) 対象中の治療剤の活性を判定するアッセイおよび方法
WO2020219941A1 (en) Lipid nanoparticles
JP2020513824A (ja) Ｃｒｉｓｐｒ関連タンパク質をコードする核酸、及びその使用
JP2022544412A (ja) 免疫賦活特性が減少したｒｎａ組み合わせおよび組成物
US20240035011A1 (en) Optimized engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the hepatitis b virus genome
WO2012005898A2 (en) Chinese hamster ovary (cho) cell transcriptome, corresponding sirnas and uses thereof
WO2012177639A2 (en) Bioprocessing and bioproduction using avian cell lines
WO2013013013A2 (en) Compositions and methods for producing modified glycoproteins
KR20180051550A (ko) 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) iRNA 조성물 및 그의 사용 방법
KR102305215B1 (ko) B형 간염 바이러스 게놈 내의 인식 서열에 대해 특이적인 조작된 메가뉴클레아제
US20130196410A1 (en) Compositions and methods for modifying the glycosylation pattern of a polypeptide
US20130164851A1 (en) Gene amplification and transfection methods and reagents related thereto
KR20160118346A (ko) 케토헥소키나제(ＫＨＫ) ｉＲＮＡ 조성물 및 그의 사용 방법
KR20160009687A (ko) Ｔｍｐｒｓｓ6 조성물 및 이의 사용 방법
JP2016520312A (ja) ＳＥＲＰＩＮＡ１ ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
KR20230122081A (ko) Peg 지질 및 지질 나노입자
WO2020117705A1 (en) Methods for the treatment of trinucleotide repeat expansion disorders associated with mlh1 activity
EP4326861A1 (en) Engineered meganucleases that target human mitochondrial genomes

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20131203

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20140603