KR20180051550A - 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) iRNA 조성물 및 그의 사용 방법 - Google Patents

프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) iRNA 조성물 및 그의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) 유전자를 표적화하는 RNAi 제제, 예를 들어, 이중 가닥 RNAi 제제, 및 그러한 RNAi 제제를 사용하여 PD-L1 유전자의 발현을 저해하는 방법 및 PD-L1-관련 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) iRNA 조성물 및 그의 사용 방법
관련 출원
이 출원은 전문이 본원에 참조로 포함되는 2015 년 9 월 2 일자에 제출된 미국 가 출원 번호 62/213,224 에 대해 우선권을 주장한다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 전체가 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 상기 ASCII 복사본은 2016 년 7 월 29 일자에 생성되었으며, 121301-04220_SL.txt 로 명명되고 108,003 bytes 크기이다.
프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) 은 마우스 염색체 19 및 인간 염색체 9 상의 CD274 유전자에 의해 인코딩되는 290 아미노산 유형 I 막관통 단백질이다. PD-L1 발현은 만성 감염, 예를 들어, 만성 바이러스 감염 (이에 포함되는 것으로, 특히, 예를 들어, HIV, HBV, HCV 및 HTLV), 만성 세균 감염 (이에 포함되는 것으로, 특히, 예를 들어, 헬리코박터 파이로리 (Helicobacter pylori)), 및 만성 기생충 감염 (이에 포함되는 것으로, 예를 들어, 스키스토소마 만소니 (Schistosoma mansoni)) 에 관여되는 면역 응답의 회피에 관여된다. PD-L1 발현은 다수의 조직 및 세포 유형 예를 들어 T-세포, B-세포, 마크로파지, 수지상 세포, 및 비조혈 세포 예를 들어 내피 세포, 간세포, 근육 세포, 및 태반에서 검출되었다.
PD-L1 발현은 또한 항-종양 면역 활성의 억제에 관여된다. 종양은 숙주 T 세포에 의해 인지될 수 있는 항원을 발현하지만, 종양의 면역적 청소는 드물다. 이러한 실패의 일부는 종양 미세환경에 의한 면역 억제로 인한 것이다. 많은 종양 상의 PD-L1 발현은 이러한 억제 환경의 성분이고 다른 면역억제 신호와 협력하여 작용한다. PD-L1 발현은 유방, 폐, 대장, 난소, 흑색종, 방광, 간, 침샘, 위, 신경교종, 갑상선, 흉선 상피, 두경부를 포함하는 매우 다양한 고형 종양에서 인 시추 (in situ) 보여졌다 (Brown JA et al., 2003. J. Immunol. 170:1257-66; Dong H et al. 2002. Nat. Med. 8:793-800; Hamanishi J, et al. 2007. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3360-65; Strome SE et al. 2003. Cancer Res. 63:6501-5; Inman BA et al. 2007. Cancer 109:1499-505; Konishi J. et al. 2004. Clin. Cancer Res. 10:5094-100; Nakanishi J. et al. 2007. Cancer Immunol. Immunother. 56:1173-82; Nomi T et al. 2007. Clin. Cancer Res. 13:2151-57; Thompson RH et al. 2004. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17174-79; Wu C, Zhu Y, Jiang J, Zhao J, Zhang XG, Xu N. 2006. Acta Histochem. 108:19-24). 게다가, PD-L1 에 대한 수용체, 프로그램된 세포사 단백질 1 (또한 PD-1 및 CD279 로서 알려져 있음) 의 발현은 종양 침윤성 림프구 상에서 상향조절되고, 이는 또한 종양 면역억제에 기여한다 (Blank C et al. 2003. J. Immunol. 171:4574-81). 가장 중요하게는, 질환 극복을 위한 종양 상의 PD-L1 발현에 관한 연구는 PD-L1 발현이 신장, 난소, 방광, 유방, 위, 및 췌장 암에서의 불리한 예후와 강하게 상관관계가 있다는 것을 보여준다 (Hamanishi J. et al. 2007. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3360-65; Inman BA et al. 2007. Cancer 109:1499-505; Konishi J. et al. 2004. Clin. Cancer Res. 10:5094-100; Nakanishi J. et al. 2007. Cancer Immunol. Immunother. 56:1173-82; Nomi T et al. 2007. Clin. Cancer Res. 13:2151-57; Thompson RH et al. 2004. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:17174-79; Wu C, Zhu Y, Jiang J, Zhao J, Zhang XG, Xu N. 2006. Acta Histochem. 108:19-24). 게다가, 이러한 연구는 종양 상의 더 높은 수준의 PD-L1 발현이 종양 단계의 발전 및 더 깊은 조직 구조 내로의 침입을 촉진할 수 있다는 것을 시사한다.
PD-1 경로는 또한 혈액암에서 역할을 수행할 수 있다. PD-L1 은 다발성 골수종 세포 상에서 발현되지만 정상 원형질 세포에서는 발현되지 않는다 (Liu J. et al. 2007. Blood 110:296-304). PD-L1 은 일부 일차 T 세포 림프종, 특히 역형성 대세포 T 림프종 상에서 발현된다 (Brown JA et al., 2003. J. Immunol. 170:1257-66). PD-1 은 혈관면역모구 림프종의 T 세포에서 고도로 발현되고, PD-L1 은 관련 여포성 수지상 세포 네트워크 상에서 발현된다 (Dorfman DM et al. 2006. Am. J. Surg. Pathol. 30:802-10). 결절성 림프구-우세 호지킨 (Hodgkin) 림프종에서, 림프구 또는 조직구 (L&H) 세포와 관련되는 T 세포가 PD-1 을 발현한다. PD-1 결찰에 의해 유도되는 유전자의 판독 (readout) 을 사용하는 마이크로어레이 분석은 호지킨 림프종에서 종양-관련 T 세포가 PD-1 신호에 인 시추 응답한다는 것을 시사한다 (Chemnitz JM et al. 2007. Blood 110:3226-33). PD-1 및 PD-L1 은 HTLV-1-매개되는 성체 T 세포 백혈병 및 림프종에서의 CD4 T 세포 상에서 발현된다 (Shimauchi T et al. 2007. Int. J. Cancer 121: 2585-90). 이러한 종양 세포는 TCR 신호에 저응답성이다.
동물 모델에서의 연구는 종양 상의 PD-L1 이 T 세포 활성화 및 종양 세포의 용해를 저해하고 어떤 경우에는 증가된 종양-특이적 T 세포 죽음을 초래한다는 것을 입증한다 (Dong H et al. 2002. Nat. Med.8:793-800; Hirano F et al. 2005. Cancer Res.65:1089-96). 종양-관련 APC 는 또한 PD-1:PD-L 경로를 이용하여 항종양 T 세포 응답을 제어할 수 있다. 종양-관련 골수 DC 의 집단에서의 PD-L1 발현은 종양 환경 인자에 의해 상향조절된다 (Curiel TJ et al. 2003. Nat. Med. 9:562-67). B16 흑색종의 종양-배출 림프절에서의 형질세포양 수지상 세포 (DCs) 는 IDO 을 발현하며, 이것은 조절 T 세포의 억제 활성을 강하게 활성화시킨다. IDO-처리된 조절 T 세포의 억제 활성은 IDO-발현 DC 와의 세포 접촉을 요구했다 (Sharma MD et al. 2007. J. Clin. Invest. 117:2570-82).
따라서, PD-L1-관련 질환, 예컨대 감염 질환, 예컨대 만성 세포내 감염 질환, 예를 들어, 바이러스 질환, 예를 들어, 간염 감염, 또는 세균 감염, 예를 들어, 결핵 감염; 및 암, 예를 들어, 간암, 예를 들어, 간세포 암종에 대한 효과적 치료제에 대한 필요가 당해 기술분야에 존재한다.
본 발명은 PD-L1 유전자의 RNA 전사물의 RNA-유도되는 침묵화 복합체 (RNA-induced silencing complex) (RISC)-매개되는 절단에 영향을 미치는 iRNA 조성물을 제공한다. PD-L1 유전자는 세포, 예를 들어, 대상체, 예컨대 인간 내의 세포 내에 있을 수 있다.
따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, RNAi 는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제를 제공한다.
특정 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 표 3 의 서열 중 임의의 것으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 기타 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 표 5 의 서열 중 임의의 것으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 제제로서, RNAi 는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 표 3 에 열거된 안티센스 서열 중 임의의 하나와 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 상보성의 영역을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 제제를 제공한다. 특정 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 표 5 의 서열 중 임의의 것으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, RNAi 는 적어도 하나의 수식된 (modified) 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부는 수식 (modification) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부는 수식을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, 또는 3222-3243 중 임의의 하나와 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열의 상보적 부분과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, RNAi 제제는 적어도 하나의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-67635, AD-67637, AD-67658, AD-67632, AD-67629, AD-67631, AD-67633, AD-67643, AD-67653, AD-67640, AD-67650, AD-67676, AD-67661, AD-67667, AD-67655, AD-67672, AD-67659, AD-67673, AD-67664, AD-67662, AD-67660, AD-67656, AD-67628, AD-67647, AD-67626, 또는 AD-67645 중 임의의 하나에서의 안티센스 서열 중 임의의 하나와 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 상보성의 영역을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제를 제공한다.
하나의 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-67635, AD-67637, AD-67658, AD-67632, AD-67629, AD-67631, AD-67633, AD-67643, AD-67653, AD-67640, AD-67650, AD-67676, AD-67661, AD-67667, AD-67655, AD-67672, AD-67659, AD-67673, AD-67664, AD-67662, AD-67660, AD-67656, AD-67628, AD-67647, AD-67626, 또는 AD-67645 중 임의의 하나에서의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 하나로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제로서, 이중 가닥 RNAi 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 수식된 뉴클레오티드이고, 센스 가닥은 3'-말단에서 부착된 리간드에 컨쥬게이트되는, 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 PD-L1 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제로서, 이중 가닥 RNAi 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219,3221-3242, 또는 3222-3243 과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열의 상보적 상응하는 위치와 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며 그래서 안티센스 가닥은 센스 가닥에서의 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드에 상보적인, 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다.
특정 구현예에서, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3221-3243, 351-372, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, 또는 3222-3243 과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열의 상보적 상응하는 위치와 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며 그래서 안티센스 가닥은 센스 가닥에서의 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드에 상보적이다.
특정 구현예에서, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3221-3243, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 3221-3242, 또는 3222-3243 과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열의 상보적 상응하는 위치와 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며 그래서 안티센스 가닥은 센스 가닥에서의 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드에 상보적이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, 이중 가닥 RNAi 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, 또는 3222-3243 중 임의의 하나와 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열의 상보적 부분과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부 및 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 뉴클레오티드 수식을 포함하며, 센스 가닥은 3'-말단에서 부착된 리간드에 컨쥬게이트되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제를 제공한다.
특정 구현예에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부 또는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 수식된 뉴클레오티드이거나, 또는 양쪽 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 수식되고; 센스 가닥은 3'-말단에서 부착된 리간드에 컨쥬게이트된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 PD-L1 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제로서, 이중 가닥 RNAi 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, 또는 3222-3243 으로부터의 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열의 상보적 상응하는 위치로부터의 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며 그래서 안티센스 가닥은 센스 가닥에서의 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드에 상보적인, 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다.
특정 구현예에서, 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3221-3243, 351-372, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, 또는 3222-3243 로부터의 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열의 상보적 상응하는 위치로부터의 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며 그래서 안티센스 가닥은 센스 가닥에서의 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드에 상보적이다.
특정 구현예에서, 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3222-3243 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 3221-3243, 또는 3221-3242 로부터의 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열의 상보적 상응하는 위치로부터의 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며 그래서 안티센스 가닥은 센스 가닥에서의 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드에 상보적이다. 특정 구현예에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 수식된 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 수식된 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 양쪽 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 수식된다. 바람직한 구현예에서, 센스 가닥은 3'-말단에서 부착된 리간드에 컨쥬게이트된다.
특정 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 표 3 및 5 중 임의의 하나에 열거된 안티센스 서열 중 임의의 하나와 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 상보성의 영역을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-67635, AD-67637, AD-67658, AD-67632, AD-67629, AD-67631, AD-67633, AD-67643, AD-67653, AD-67640, AD-67650, AD-67676, AD-67661, AD-67667, AD-67655, AD-67672, AD-67659, AD-67673, AD-67664, AD-67662, AD-67660, AD-67656, AD-67628, AD-67647, AD-67626, 또는 AD-67645 의 안티센스 서열 중 임의의 하나와 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 상보성의 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 상기 듀플렉스의 안티센스 서열 중 임의의 하나의 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 상보성의 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부는 수식을 포함한다. 하나의 구현예에서, 수식된 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오티드, 3'-말단 데옥시-티민 (dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오티드, 2'-플루오로 수식된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-수식된 뉴클레오티드, 잠긴 뉴클레오티드, 잠기지 않은 뉴클레오티드, 입체구조적으로 제한된 뉴클레오티드, 구속된 에틸 뉴클레오티드, 비염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-수식된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴-수식된 뉴클레오티드, 2'-C-알킬-수식된 뉴클레오티드, 2'-히드록실-수식된 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 수식된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬-수식된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 비-자연 염기 포함 뉴클레오티드, 테트라히드로피란 수식된 뉴클레오티드, 1,5-안히드로헥시톨 수식된 뉴클레오티드, 시클로헥세닐 수식된 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 기를 포함하는 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트 기를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 및 5'-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 또다른 구현예에서, 수식된 뉴클레오티드는 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오티드 (dT) 의 짧은 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 수식된다. 특정 구현예에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 수식된다. 특정 구현예에서, 양쪽 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 수식된다.
특정 구현예에서, 듀플렉스는 표 5 에 제공된 수식된 안티센스 가닥을 포함한다. 특정 구현예에서, 듀플렉스는 표 5 에 제공된 수식된 센스 가닥을 포함한다. 특정 구현예에서, 듀플렉스는 표 5 에 제공된 수식된 듀플렉스를 포함한다.
특정 구현예에서, 안티센스 가닥 및 표적 사이의 상보성의 영역은 적어도 17 개의 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 안티센스 가닥 및 표적 사이의 상보성의 영역은 19 내지 21 개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 상보성의 영역은 21 개의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직한 구현예에서, 각각의 가닥은 30 개 이하의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1 개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하며, 예를 들어, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2 개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다.
많은 구현예에서, RNAi 제제는 리간드를 추가로 포함한다. 리간드는 RNAi 제제의 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트될 수 있다. 리간드는 하기를 포함하나 그에 제한되지 않는 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 유도체일 수 있다:
Figure pct00001
.
리간드에 컨쥬게이트된 예시적 RNAi 제제가 하기 도해에서 보여진다:
Figure pct00002
여기에서 X 는 O 또는 S 이다. 하나의 구현예에서, X 는 O 이다.
특정 구현예에서, 리간드는 콜레스테롤 모이어티일 수 있다.
특정 구현예에서, 상보성의 영역을 표 3 및 표 5 중 임의의 하나의 안티센스 서열 중 하나를 포함한다. 또다른 구현예에서, 상보성의 영역은 표 3 및 표 5 중 임의의 하나의 안티센스 서열 중 하나로 이루어진다.
또다른 양상에서, 본 발명은 PD-L1 의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 RNAi 제제로서, 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 PD-L1 을 인코딩하는 mRNA 의 일부에 상보적인 영역을 포함하며, 각각의 가닥은 약 14 개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 이중 가닥 RNAi 제제는 식 (III) 으로 표시되는, 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다:
센스: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
안티센스: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
식에서: i, j, k, 및 l 은 각각 독립적으로 0 또는 1 이고; p, p', q, 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고; 각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-25 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고; 각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-10 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고; 각각의 np, np', nq, 및 nq' 는, 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타내고; Nb 상의 수식은 Y 상의 수식과 상이하고, Nb' 상의 수식은 Y' 상의 수식과 상이하고; 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트된다.
특정 구현예에서, i 는 0 이거나; j 는 0 이거나; i 는 1 이거나; j 는 1 이거나; i 및 j 는 둘다 0 이거나; 또는 i 및 j 는 둘다 1 이다. 또다른 구현예에서, k 는 0 이거나; l 은 0 이거나; k 는 1 이거나; l 은 1 이거나; k 및 l 은 둘다 0 이거나; 또는 k 및 l 은 둘다 1 이다. 또다른 구현예에서, XXX 는 X'X'X' 에 상보적이고, YYY 는 Y'Y'Y' 에 상보적이고, ZZZ 는 Z'Z'Z' 에 상보적이다. 또다른 구현예에서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 자리에 또는 그 근처에 존재한다. 또다른 구현예에서, Y'Y'Y' 모티프는 5'-말단으로부터 안티센스 가닥의 11, 12 및 13 위치에 존재한다. 하나의 구현예에서, Y' 는 2'-O-메틸이다.
예를 들어, 식 (III) 은 식 (IIIa) 로 표시될 수 있다:
센스: 5' np-Na-YYY-Na-nq 3'
안티센스: 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIa).
또다른 구현예에서, 식 (III) 은 식 (IIIb) 로 표시된다:
센스: 5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
안티센스: 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5' (IIIb)
여기에서 각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 1-5 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
대안적으로, 식 (III) 은 식 (IIIc) 로 표시될 수 있다:
센스: 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'
안티센스: 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIc)
여기에서 각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 1-5 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
추가로, 식 (III) 은 식 (IIId) 로 표시될 수 있다:
센스: 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
안티센스: 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5' (IIId)
여기에서 각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 1-5 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 2-10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
특정 구현예에서, 이중 가닥 영역은 15-30 개의 뉴클레오티드 쌍 길이이다. 예를 들어, 이중 가닥 영역은 17-23 개의 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다. 이중 가닥 영역은 17-25 개의 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다. 이중 가닥 영역은 23-27 개의 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다. 이중 가닥 영역은 19-21 개의 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다. 이중 가닥 영역은 21-23 개의 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다.
특정 구현예에서, 각각의 가닥은 15-30 개의 뉴클레오티드를 갖는다. 기타 구현예에서, 각각의 가닥은 19-30 개의 뉴클레오티드를 갖는다.
뉴클레오티드 상의 수식은 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알킬, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-데옥시, 2'-히드록실, 및 그들의 조합을 포함하나 그에 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 또다른 구현예에서, 뉴클레오티드 상의 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이다.
특정 구현예에서, 리간드는 일가 링커 또는 이가 또는 삼가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다. 하나의 구현예에서, 리간드는
Figure pct00003
이다.
리간드는 센스 가닥의 3' 말단에 부착될 수 있다.
리간드에 컨쥬게이트된 RNAi 제제의 예시적 구조가 하기 도해에서 보여진다
Figure pct00004
.
특정 구현예에서, 리간드는 콜레스테롤 모이어티일 수 있다.
특정 구현예에서, RNAi 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결을 추가로 포함한다. 예를 들어 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결은 하나의 가닥, 즉, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3'-말단에; 또는 양쪽 가닥, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 말단에 있을 수 있다.
특정 구현예에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결은 하나의 가닥, 즉, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5'-말단에; 또는 양쪽 가닥, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 말단에 있다.
특정 구현예에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결은 하나의 가닥, 즉, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5'- 및 3'-말단 둘다에; 또는 양쪽 가닥, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 말단에 있다.
특정 구현예에서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에서의 염기 쌍은 AU 염기 쌍이다.
특정 구현예에서, Y 뉴클레오티드는 2'-플루오로 수식을 함유한다. 또다른 구현예에서, Y' 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 수식을 함유한다. 또다른 구현예에서, p'>0 이다. 일부 구현예에서, p'=2 이다. 일부 구현예에서, q'=0, p=0, q=0 이고, p' 오버행 뉴클레오티드는 표적 mRNA 에 상보적이다. 일부 구현예에서, q'=0, p=0, q=0 이고, p' 오버행 뉴클레오티드는 표적 mRNA 에 비-상보적이다.
특정 구현예에서, 센스 가닥은 총 21 개의 뉴클레오티드를 갖고, 안티센스 가닥은 총 23 개의 뉴클레오티드를 갖는다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 np' 는 이웃 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되어 있다. 기타 구현예에서, 모든 np' 는 이웃 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되어 있다.
특정 구현예에서, RNAi 제제는 표 3 및 5 중 임의의 하나에 열거된 RNAi 제제의 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부는 수식을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 세포에서 PD-L1 의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 RNAi 제제로서, 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 PD-L1 을 인코딩하는 mRNA 의 일부에 상보적인 영역을 포함하며, 각각의 가닥은 약 14 개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 이중 가닥 RNAi 제제는 식 (III) 으로 표시되는, 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다:
센스: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
안티센스: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
여기에서 i, j, k, 및 l 은 각각 독립적으로 0 또는 1 이고; p, p', q, 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고; 각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-25 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고; 각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-10 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고; 각각의 np, np', nq, 및 nq' 는, 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타내고, 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고; Nb 상의 수식은 Y 상의 수식과 상이하고, Nb' 상의 수식은 Y' 상의 수식과 상이하고; 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 세포에서 PD-L1 의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 RNAi 제제로서, 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 PD-L1 을 인코딩하는 mRNA 의 일부에 상보적인 영역을 포함하며, 각각의 가닥은 약 14 개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 이중 가닥 RNAi 제제는 식 (III) 으로 표시되는, 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다:
센스: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
안티센스: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
식에서:
i, j, k, 및 l 은 각각 독립적으로 0 또는 1 이고; 각각의 np, nq, 및 nq' 는, 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고; p, q, 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고; np' >0 이고, 적어도 하나의 np' 는 이웃 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되어 있고; 각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-25 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고; 각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-10 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타내고, 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고; Nb 상의 수식은 Y 상의 수식과 상이하고, Nb' 상의 수식은 Y' 상의 수식과 상이하고; 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 세포에서 PD-L1 의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 RNAi 제제로서, 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 PD-L1 을 인코딩하는 mRNA 의 일부에 상보적인 영역을 포함하며, 각각의 가닥은 약 14 개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 이중 가닥 RNAi 제제는 식 (III) 으로 표시되는, 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다:
센스: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
안티센스: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
여기에서 i, j, k, 및 l 은 각각 독립적으로 0 또는 1 이고;
각각의 np, nq, 및 nq' 는, 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고; p, q, 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고; np' >0 이고, 적어도 하나의 np' 는 이웃 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되어 있고; 각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-25 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고; 각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-10 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타내고, 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고; Nb 상의 수식은 Y 상의 수식과 상이하고, Nb' 상의 수식은 Y' 상의 수식과 상이하고; 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트되며, 리간드는 일가 링커 또는 이가 또는 삼가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 세포에서 PD-L1 의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 RNAi 제제로서, 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 PD-L1 을 인코딩하는 mRNA 의 일부에 상보적인 영역을 포함하며, 각각의 가닥은 약 14 개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 이중 가닥 RNAi 제제는 식 (III) 으로 표시되는, 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다:
센스: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
안티센스: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
여기에서 i, j, k, 및 l 은 각각 독립적으로 0 또는 1 이고; 각각의 np, nq, 및 nq' 는, 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고; p, q, 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고; np' >0 이고, 적어도 하나의 np' 는 이웃 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되어 있고; 각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-25 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고; 각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-10 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타내고, 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고; Nb 상의 수식은 Y 상의 수식과 상이하고, Nb' 상의 수식은 Y' 상의 수식과 상이하고; 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고; 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트되며, 리간드는 일가 링커 또는 이가 또는 삼가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 세포에서 PD-L1 의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 RNAi 제제로서, 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 PD-L1 을 인코딩하는 mRNA 의 일부에 상보적인 영역을 포함하며, 각각의 가닥은 약 14 개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 이중 가닥 RNAi 제제는 식 (III) 으로 표시되는, 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다:
센스: 5' np-Na-YYY-Na-nq 3'
안티센스: 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIa)
여기에서 각각의 np, nq, 및 nq' 는, 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고; p, q, 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고; np' >0 이고, 적어도 하나의 np' 는 이웃 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되어 있고; 각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-25 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고; YYY 및 Y'Y'Y' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타내고, 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고; 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고; 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트되며, 리간드는 일가 링커 또는 이가 또는 삼가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 PD-L1 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제로서, 이중 가닥 RNAi 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 2'-O-메틸 수식 및 2'-플루오로 수식으로부터 선택되는 수식을 포함하며, 센스 가닥은 5'-말단에서 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하며, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 2'-O-메틸 수식 및 2'-플루오로 수식로부터 선택되는 수식을 포함하며, 안티센스 가닥은 5'-말단에서 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 및 3'-말단에서 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 센스 가닥은 3'-말단에서 일가 링커 또는 분지형 이가 또는 삼가 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트되는, 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 PD-L1 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, 이중 가닥 RNAi 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, 또는 3222-3243 과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열의 상보적 부분과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 2'-O-메틸 수식 및 2'-플루오로 수식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 수식을 포함하며, 센스 가닥은 5'-말단에서 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하며, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 2'-O-메틸 수식 및 2'-플루오로 수식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 수식을 포함하며, 안티센스 가닥은 5'-말단에서 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 및 3'-말단에서 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 센스 가닥은 3'-말단에서 분지형 이가 또는 삼가 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제를 제공한다.
특정 구현예에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부는 수식된 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 각각의 가닥은 19-30 개의 뉴클레오티드를 갖는다.
특정 구현예에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 수식된다. 특정 구현예에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 수식된다. 특정 구현예에서, 양쪽 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 수식된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제를 함유하는 세포를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 RNAi 제제의 적어도 하나의 가닥을 인코딩하는 벡터로서, RNAi 제제는 PD-L1 을 인코딩하는 mRNA 의 적어도 일부에 대한 상보성의 영역을 포함하며, RNAi 는 30 염기 쌍 이하 길이이고, 여기에서 RNAi 제제는 절단을 위한 mRNA 를 표적화하는, 벡터를 제공한다. 특정 구현예에서, 상보성의 영역은 적어도 15 개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 구현예에서, 상보성의 영역은 19 내지 23 개의 뉴클레오티드 길이이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 RNAi 제제를 포함하는 PD-L1 유전자의 발현을 저해하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 하나의 구현예에서, RNAi 제제는 비완충 용액으로 투여된다. 특정 구현예에서, 비완충 용액은 염류용액 또는 물이다. 기타 구현예에서, RNAi 제제는 완충 용액으로 투여된다. 그러한 구현예에서, 완충 용액은 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카르보네이트, 또는 포스페이트, 또는 그들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 완충 용액은 포스페이트 완충 염류용액 (PBS) 일 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제 및 지질 제형을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 지질 제형은 LNP 를 포함한다. 특정 구현예에서, 지질 제형은 MC3 을 포함한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 세포에서 PD-L1 발현을 저해하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 세포를 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제 또는 본 발명의 약학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 단계 (a) 에서 생산된 세포를 PD-L1 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지하여, 그에 의해 세포에서 PD-L1 유전자의 발현을 저해하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 세포는 대상체, 예를 들어, 인간 대상체, 예를 들어 여성 인간 또는 남성 인간 내에 있다. 바람직한 구현예에서, PD-L1 발현은 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 만큼, 또는 사용되는 어세이 방법의 검출 역치 미만까지 저해된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 PD-L1 발현의 감소로부터 유익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 본 발명의 RNAi 제제 또는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하여, 그에 의해 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 PD-L1 발현의 감소로부터 유익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에게 예방적 유효량의 본 발명의 RNAi 제제 또는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하여, 그에 의해 PD-L1 발현의 감소로부터 유익을 얻을 장애를 갖는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 대상체에 대한 RNAi 의 투여는 PD-L1 신호전달 경로의 감소를 야기한다. 특정 구현예에서, RNAi 의 투여는 대상체에서 PD-L1 의 수준, 예를 들어, 대상체에서 PD-L1 의 혈청 수준의 감소를 야기한다.
특정 구현예에서, PD-L1-관련 질환은 감염 질환, 예컨대 만성, 세포내 감염 질환, 예를 들어, 바이러스 질환, 예를 들어, 간염 감염, 또는 세균 감염, 예를 들어, 결핵 감염이다.
특정 구현예에서, PD-L1-관련 질환은 암, 예를 들어, 간암, 예를 들어, 간세포 암종이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 항-바이러스 제제를 PD-L1-관련 질환을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 항-바이러스 제제는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유사체이다. 특정 구현예에서, 항-바이러스 제제는 간염 바이러스 감염, 예를 들어, HBV 감염, HDV 감염의 치료를 위한 것이다. 특정 구현예에서, 항-바이러스 제제는 면역 자극제가 아니다.
특정 구현예에서, 본 발명은 화학요법제를 PD-L1-관련 질환을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
PD-L1-관련 질환이 암인 특정 구현예에서, 대상체는 암에 대해 추가로 치료된다. 특정 구현예에서, 암에 대한 치료는 수술을 포함한다. 특정 구현예에서, 암에 대한 치료는 방사선치료를 포함한다. 특정 구현예에서, 암에 대한 치료는 화학요법제의 투여를 포함한다.
다양한 구현예에서, RNAi 제제는 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 또는 약 0.5 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏ 의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, RNAi 제제는 약 10 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏ 의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, RNAi 제제는 약 0.5 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 1.5 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 및 30 ㎎/㎏ 으로부터 선택되는 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, RNAi 제제는 약 한 주에 한 번, 한 달에 한 번, 두 달에 한 번, 또는 분기당 한 번 (즉, 세 달에 한 번) 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 5.0 ㎎/㎏ 의 용량으로 투여된다.
특정 구현예에서, RNAi 제제는 대상체에게 한 주에 한 번 투여된다. 특정 구현예에서, RNAi 제제는 대상체에게 한 달에 한 번 투여된다. 특정 구현예에서, RNAi 제제는 분기당 한 번 (즉, 세 달에 한 번) 투여된다.
일부 구현예에서, RNAi 제제는 대상체에게 피하 투여된다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상체에서의 PD-L1 수준을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, PD-L1 신호전달 경로의 발현 또는 활성의 수준의 감소는 PD-L1-관련 질환이 치료되고 있다는 것을 나타낸다.
다양한 구현예에서, PD-L1 발현의 대리 (surrogate) 마커가 측정된다. 예를 들어, 감염 질환의 치료에서, 병원체, 예를 들어, 병원체로부터의 단백질 또는 핵산, 예를 들어, HBsAg, HBeAg, HB cccDNA 의 존재가 검출된다. 특정 구현예에서, 병원체에 대한 면역 응답의 지표, 예를 들어, 항-HBs 항체가 검출된다. 특정 구현예에서, 변화, 바람직하게는 감염의 효과적 치료를 나타내는 대리 마커의 임상 관련 변화가 검출된다. 암의 치료에서, RECIST 기준을 사용하는 종양 부하의 안정화 또는 감소가 PD-L1 발현 또는 활성의 감소에 관한 대리 마커로서 사용될 수 있다.
도 1 은 항원 제시 세포와 T-세포 사이의 PD-L1 신호전달을 보여주는 도해이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) 유전자의 RNA 전사물의 RNA-유도되는 침묵화 복합체 (RISC)-매개되는 절단에 영향을 미치는 iRNA 조성물을 제공한다. 상기 유전자는 세포, 예를 들어, 대상체, 예컨대 인간 내의 세포 내에 있을 수 있다. 이러한 iRNAs 의 사용은 포유동물에서의 상응하는 유전자 (PD-L1 유전자) 의 mRNAs 의 표적화되는 분해를 가능하게 해준다.
본 발명의 iRNAs 는 기타 포유류 종의 PD-L1 오르소로그에서 보존되어 있는 유전자의 부분을 포함하는, 표적 인간 PD-L1 유전자에 맞춰 디자인되었다. 이론에 구속되는 것을 바라지 않으며, 이러한 iRNA 제제에서의 상기 특성 및 특이적 표적 자리 또는 특이적 수식의 조합 또는 하위-조합은 본 발명의 iRNAs 에게 개선된 효능, 안정성, 효력, 지속성, 및 안전성을 부여하는 것으로 여겨진다.
따라서, 본 발명은 또한 PD-L1 유전자의 RNA 전사물의 RNA-유도되는 침묵화 복합체 (RISC)-매개되는 절단에 영향을 미치는 iRNA 조성물을 사용하여, PD-L1 유전자의 발현의 저해 또는 감소에서 유익을 얻을 장애, 예를 들어, PD-L1-관련 질환, 예컨대 감염, 예를 들어, 바이러스 감염, 예를 들어, 간염 바이러스 감염, 또는 암, 예컨대 간암, 예를 들어, 간세포 암종을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
매우 적은 투여량의 본 발명의 iRNAs 는, 특히, RNA 간섭 (RNAi) 을 특이적으로 및 효율적으로 매개하여, 상응하는 유전자 (PD-L1 유전자) 의 발현의 유의한 저해를 초래할 수 있다.
본 발명의 iRNAs 는 약 30 개 이하의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22 개의 뉴클레오티드 길이인 영역을 갖는 RNA 가닥 (안티센스 가닥) 을 포함하며, 상기 영역은 PD-L1 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부에 실질적으로 상보적이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 iRNAs 는 PD-L1 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부에 실질적으로 상보적인 적어도 19 개의 인접 뉴클레오티드의 영역을 갖는 더 긴 길이, 예를 들어 66 개 이하의 뉴클레오티드, 예를 들어, 36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53 개의 뉴클레오티드 길이를 포함할 수 있는 RNA 가닥 (안티센스 가닥) 을 포함한다. 더 긴 길이의 안티센스 가닥을 갖는 이러한 iRNAs 는 바람직하게는 20-60 개의 뉴클레오티드 길이의 두번째 RNA 가닥 (센스 가닥) 을 포함하며, 센스 및 안티센스 가닥은 18-30 개의 인접 뉴클레오티드의 듀플렉스를 형성한다. 이러한 iRNAs 의 사용은 포유동물에서의 상응하는 유전자 (PD-L1 유전자) 의 mRNAs 의 표적화되는 분해를 가능하게 해준다. 매우 적은 투여량의 본 발명의 iRNAs 는, 특히, RNA 간섭 (RNAi) 을 특이적으로 및 효율적으로 매개하여, 상응하는 유전자 (PD-L1 유전자) 의 발현의 유의한 저해를 초래할 수 있다. 시험관내 및 생체내 어세이를 사용하여, 본 발명자들은 PD-L1 유전자를 표적화하는 iRNAs 가 RNAi 를 매개하여, PD-L1 의 발현의 유의한 저해, 뿐만 아니라 PD-L1 경로를 통한 신호전달의 감소를 초래하여 PD-L1-관련 질환, 예컨대 감염 질환, 예를 들어, 바이러스 질환 또는 만성 세포내 감염; 또는 암과 관련되는 증상 중 하나 이상을 감소시킬 수 있다는 것을 입증했다. 이와 같이, 이러한 iRNAs 를 포함하는 방법 및 조성물은 PD-L1-관련 질환, 예컨대 감염 질환, 예를 들어, 바이러스 질환 또는 만성 세포내 감염, 또는 암을 갖는 대상체를 치료하는데 유용하다. 본원의 방법 및 조성물은 대상체에서의 PD-L1, 예를 들어, 대상체에서의, 특히 만성 세포내 감염, 특히 만성 간감염, 또는 종양을 갖는 대상체에서의 간 PD-L1 의 수준을 감소시키는데 유용하다.
하기 상세한 설명은 PD-L1 유전자의 발현을 저해하는 iRNAs 를 함유하는 조성물을 어떻게 제조 및 사용하는지 뿐만 아니라 PD-L1 유전자의 발현의 감소로부터 유익을 얻을 질환 및 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물, 용도, 및 방법을 개시한다.
I. 정의
본 발명이 더욱 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 먼저 특정 용어를 정의한다. 또한, 파라미터의 값 또는 값의 범위가 인용되는 경우에는 항상 인용되는 값의 중간의 값 및 범위도 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도된다는 것에 주목해야 한다.
본 명세서에서 관사 "하나" 는 하나 또는 하나를 초과하는 (즉, 적어도 하나) 상기 관사의 문법적 대상을 지칭하는 것으로 사용된다. 예를 들어, "하나의 요소" 는 하나의 요소 또는 하나를 초과하는 요소, 예컨대 복수의 요소를 의미한다.
용어 "포함하는" 은 본 명세서에서, 어구 "포함하지만, 이에 한정되지 않는" 을 의미하는 것으로 사용되고, 상기 어구와 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "또는" 은 본 명세서에서, 문맥상 명확하게 달리 언급되지 않는 한, 용어 "및/또는" 을 의미하는 것으로 사용되고, 상기 용어와 상호교환가능하게 사용된다. 예를 들어, "센스 가닥 또는 안티센스 가닥" 은 "센스 가닥 또는 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥" 으로서 이해된다.
용어 "약" 은 본원에서 당해 기술분야의 허용 오차의 전형적 범위 내를 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, "약" 은 평균으로부터의 약 2 표준 편차로서 이해될 수 있다. 특정 구현예에서, 약은 ±10% 를 의미한다. 특정 구현예에서, 약은 ±5% 를 의미한다. 약이 일련의 수 또는 범위 앞에 존재할 때, "약" 은 일련의 또는 범위의 각각의 수를 수식할 수 있다고 이해된다.
수 또는 일련의 수 앞의 용어 "적어도" 는 용어 "적어도" 에 인접한 수, 및 문맥으로부터 명백한 논리적으로 포함될 수 있는 모든 다음의 수 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 핵산 분자 내의 뉴클레오티드의 수는 정수여야 한다. 예를 들어, "21 개의 뉴클레오티드 핵산 분자의 적어도 18 개의 뉴클레오티드" 는 18, 19, 20, 또는 21 개의 뉴클레오티드가 명시된 특성을 갖는다는 것을 의미한다. 적어도가 일련의 수 또는 범위 앞에 존재할 때, "적어도" 는 일련의 또는 범위의 각각의 수를 수식할 수 있다고 이해된다.
본원에서 사용되는, "이하" 또는 "미만" 은 구절에 인접한 값 및 문맥으로부터 논리적인 더 작은 값 또는 정수 내지 영으로서 이해된다. 예를 들어, "2 개 이하의 뉴클레오티드" 의 오버행이 있는 듀플렉스는 2, 1, 또는 0 개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. "이하" 가 일련의 수 또는 범위 앞에 존재할 때, "이하" 는 일련의 또는 범위의 각각의 수를 수식할 수 있다고 이해된다.
서열과 전사물 또는 기타 서열 상의 그것의 명시된 자리 사이에 충돌의 경우에, 명세서에서 언급된 뉴클레오티드 서열이 우선한다.
본 발명의 다양한 구현예는 당업자에 의해 적절히 결정되어 조합될 수 있다.
"프로그램된 세포사 1 리간드 1", "PD-L1", 또는 "CD274" 는 또한 B7-H; B7H1; PDL1; PD-L1; PDCD1L1; PDCD1LG1, B7 호모로그 1, PDCD1 리간드 1, 및 프로그램된 세포사 리간드 1 로서 알려져 있으며, 마우스 T 및 B 세포, DCs, 마크로파지, 중간엽 줄기 세포, 및 골수-유래 비만 세포에서 구성적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. PD-L1 발현은 또한 넓은 범위의 비조혈 세포에서 발견되고, 다수의 세포 유형에서 활성화 후에 상향조절된다. IFN-γ 자극시에, PD-L1 은 T 세포, NK 세포, 마크로파지, 골수 DCs, B 세포, 상피 세포, 및 혈관 내피 세포에서 발현된다 (Flies DB and Chen L (2007) J Immunother. 30 (3) : 251-60). PD-L1 은 마크로파지에서 현저히 발현된다. PD-L1 에 대한 추가의 정보가, 예를 들어 www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/29126 의 NCBI Gene Database (이는 본 출원의 출원일 현재 본원에 참조로 포함된다) 에서 제공된다.
본원에서 사용되는, "프로그램된 세포사 1 리간드 1" 은 용어 "PD-L1" (및 임의로 위에 열거된 다른 인지된 명칭 중 임의의 것) 과 호환되게 사용되고, 프로그램된 세포사 1 리간드 1 단백질을 인코딩하는 자연적으로 발생하는 유전자를 지칭한다. 인간 PDL-1 유전자의 레퍼런스 서열의 아미노산 및 완전한 코딩 서열은, 예를 들어, GenBank Accession No. GI: 390979638 (RefSeq Accession No. NM_001267706.1; SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2) 및 GenBank Accession No. GI: 292658763 (RefSeq Accession No. NM_014143.3; SEQ ID NO: 9 및 10) 에서 찾을 수 있다. 추가로 스플라이스 변이체가, 예를 들어, Grzywnowicz et al., PLoS One. 2012;7:e35178 (이는 본원에 참조로 포함된다) 에서 제공된다. 인간 PD-L1 유전자의 포유류 오르소로그는, 예를 들어, GI: 755563510 (RefSeq Accession No. XM_006527249.2, 마우스; SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4); GI: 672040129 (RefSeq Accession No. XM_006231248.2, 랫트; SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6); GenBank Accession Nos. GI: 544494555 (RefSeq Accession No. XM_005581779.1, 시노몰구스 원숭이; SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8) 에서 찾을 수 있다.
다수의 자연적으로 발생하는 SNPs 가 알려져 있고, 예를 들어, 인간 PD-L1 내의 SNPs 를 열거하는 www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?locusId=29126 의 NCBI 의 SNP Database ((이는 본원에 참조로 포함된다) 본 출원의 출원일 현재) 에서 찾을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 그러한 자연적으로 발생하는 변이체는 PD-L1 유전자 서열의 범위 내에 포함된다.
PD-L1 mRNA 서열의 추가의 예는 공개적으로 이용가능한 데이터베이스, 예를 들어, GenBank, UniProt, 및 OMIM 을 사용하여 용이하게 이용가능하다.
본 명세서에 사용된 "표적 서열" 은 일차 전사 산물의 RNA 가공의 산물인 mRNA 를 포함하는, PD-L1 유전자의 전사 동안 형성되는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 연속 부분을 지칭한다. 서열의 표적 부분은 적어도 PD-L1 유전자의 전사 동안 형성되는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 부분에서 또는 그 주위에서 iRNA-유도 절단을 위한 기질로서 작용하기에 충분한 길이일 것이다. 하나의 구현예에서, 표적 서열은 PD-L1 의 단백질 코딩 영역 내에 있다.
표적 서열은 약 9-36 개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 약 15-30 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 약 15-30 개의 뉴클레오티드, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 상기 열거된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 본 발명의 일부로 고려된다.
본 명세서에 사용된 용어 "서열을 포함하는 가닥" 은 표준 뉴클레오티드 명명법을 사용하여 지칭되는 서열로 기술되는 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
"G", "C", "A", "T" 및 "U" 는 각각 일반적으로, 염기로서 각각 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실을 포함하는 뉴클레오티드를 의미한다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드" 가 또한, 하기에서 추가로 상술된 바와 같은 수식된 뉴클레오티드, 또는 대리 대체 모이어티 (surrogate replacement moeity) 를 지칭할 수 있는 것으로 이해될 것이다 (예컨대 표 2 참조). 당업자는, 이러한 대체 모이어티를 가지는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기 쌍형성 특성을 실질적으로 변경하지 않고, 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실이 다른 모이어티에 의해 대체될 수 있다는 것을 잘 알 것이다. 예를 들어, 제한 없이, 그의 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오티드는, 아데닌, 시토신, 또는 우라실을 포함하는 뉴클레오티드와 염기 쌍을 이룰 수 있다. 따라서, 본 발명에서 특징으로 하는 dsRNA 의 뉴클레오티드 서열에서, 우라실, 구아닌, 또는 아데닌을 포함하는 뉴클레오티드는, 예를 들어, 이노신을 포함하는 뉴클레오티드로 대체될 수 있다. 다른 예에서, 상기 올리고뉴클레오티드의 임의 부분의 아데닌 및 시토신은 각각 구아닌 및 우라실로 대체되어, 표적 mRNA 와 G-U 워블 (Wobble) 염기 쌍을 형성할 수 있다. 이러한 대체 모이어티를 포함하는 서열은, 본 발명에서 특징으로 하는 조성물 및 방법에 적합하다.
본 명세서에 상호교환가능하게 사용되는 "iRNA", "RNAi 제제," 및 "iRNA 제제," "RNA 간섭제" 라는 용어는 용어가 본 명세서에 정의된 바와 같은 RNA 를 포함하고, RNA-유도 침묵화 복합체 (RISC) 경로를 통하여 RNA 전사물의 표적화된 절단을 매개하는 제제를 지칭한다. iRNA 는 RNA 간섭 (RNAi) 으로 알려진 과정을 통해 mRNA 의 서열-특이적 분해를 유도한다. iRNA 는 세포, 예컨대, 포유동물 대상체와 같은 대상체 내의 세포에서 PD-L1 유전자의 발현을 조절하고, 예컨대, 저해한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 RNAi 제제는 표적 RNA 서열, 예컨대, PD-L1 표적 mRNA 서열과 상호작용하여, 표적 RNA 의 절단을 유도하는 단일 가닥 RNA 를 포함한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 세포로 도입되는 긴 이중 가닥 RNA 가 다이서 (Dicer) 로 알려진 III 형 엔도뉴클레아제에 의하여 siRNA 로 분해되는 것으로 여겨진다 (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). 리보뉴클레아제-III-유사 효소인 다이서는 dsRNA 를 특징적인 2 개의 염기의 3' 오버행을 가지는 19 내지 23 개의 염기 쌍의 짧은 간섭 RNA 로 처리한다 (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). 그 후, siRNA 는 RNA-유도 침묵화 복합체 (RISC) 로 혼입되며, 여기서 하나 이상의 헬리카제는 siRNA 듀플렉스를 풀어, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 안내할 수 있게 한다 (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). 적절한 표적 mRNA 로의 결합시, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 절단시켜 침묵화를 유도한다 (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). 따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은 표적 유전자, 즉, PD-L1 유전자의 침묵화에 영향을 주는 RISC 복합체의 형성을 촉진시키는, 세포내에 생성되는 단일 가닥 RNA (siRNA) 에 관한 것이다. 따라서, 용어 "siRNA" 는 또한 전술한 iRNA 를 지칭하는 것으로 본 명세서에서 사용된다.
특정 구현예에서, RNAi 제제는 표적 mRNA 의 저해를 위해, 세포 또는 유기체로 도입되는 단일-가닥 siRNA (ssRNAi) 일 수 있다. 단일-가닥 RNAi 제제는 RISC 엔도뉴클레아제, 아르고노트 (Argonaute) 2에 결합하며, 이는 이어서 표적 mRNA 를 절단한다. 단일-가닥 siRNA 는 일반적으로 15 내지 30 개의 뉴클레오티드이며, 화학적으로 수식된다. 단일-가닥 siRNA 의 설계 및 시험은 미국 특허 번호 8,101,348 및 Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894 에 기재되어 있으며, 그 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 명세서에 기술되는 임의의 안티센스 뉴클레오티드 서열은 본 명세서에 기술된 바와 같거나, [Lima et al., (2012) Cell 150:883-894 에 기술된 방법에 의해 화학적으로 수식된 단일-가닥 siRNA 로서 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물, 용도 및 방법에서 사용하기 위한 "iRNA" 는 이중-가닥 RNA 이며, 본 명세서에서 "이중 가닥 RNAi 제제", "이중-가닥 RNA (dsRNA) 분자", "dsRNA 제제", 또는 "dsRNA" 로 지칭된다. 용어 "dsRNA" 는 표적 RNA, 즉, PD-L1 유전자에 있어서, "센스" 및 "안티센스" 배향을 가지는 것으로 지칭되는 2 개의 역평행 (anti-parallel) 의 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 듀플렉스 구조를 가지는 리보 핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 이중-가닥 RNA (dsRNA) 는 본 명세서에서 RNA 간섭 또는 RNAi 로 지칭되는 전사 후 유전자-침묵화 메커니즘을 통해 표적 RNA, 예컨대, mRNA 의 분해를 촉발시킨다.
일반적으로, dsRNA 분자의 각각의 가닥의 대부분의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이나, 본 명세서에 상세히 설명된 바와 같이, 각각의 가닥 또는 둘 모두의 가닥은 또한, 하나 이상의 비-리보뉴클레오티드, 예컨대, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 수식된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "iRNA" 는 화학적 수식을 가지는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있으며; iRNA 는 다수의 뉴클레오티드에서 실질적인 수식을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "수식된 뉴클레오티드" 는 독립적으로, 수식된 당 모이어티, 수식된 뉴클레오티드간 결합 또는 수식된 핵염기, 또는 그들의 임의의 조합을 가지는 뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 수식된 뉴클레오티드란 용어는 예컨대, 뉴클레오시드간 결합, 당 모이어티 또는 핵염기로의 작용기 또는 원자의 치환, 부가 또는 제거를 포함한다. 본 발명의 제제에 사용하기에 적합한 수식은 본 명세서에 개시되거나 또는 당해 기술분야에 공지된 모든 유형의 수식을 포함한다. siRNA 유형 분자에 사용되는 바와 같은 이러한 임의의 수식은 본 명세서 및 청구범위의 목적을 위하여 "iRNA" 또는 "RNAi 제제" 에 의해 포함된다.
듀플렉스 영역은 RISC 경로를 통해, 원하는 표적 RNA 의 특이적인 분해를 가능하게 하는 임의의 길이의 것일 수 있고, 약 9 내지 36 개의 염기 쌍 길이, 예를 들어, 약 15-30 개의 염기 쌍 길이, 예를 들어, 약 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36 개의 염기 쌍 길이, 예컨대 약 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22 개의 염기 쌍 길이의 범위일 수 있다. 상기 열거된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 본 발명의 일부로 고려된다.
듀플렉스 구조를 형성하는 2 개의 가닥은 더 큰 하나의 RNA 분자의 상이한 부분일 수 있거나, 또는 그들은 개별 RNA 분자일 수 있다. 2 개의 가닥이 더 큰 하나의 분자의 일부이고, 따라서, 듀플렉스 구조를 형성하는 하나의 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오티드의 비-단속 (non-interrupted) 사슬에 의해 연결되는 경우, 연결 RNA 사슬은 "헤어핀 루프" 로 지칭된다. 헤어핀 루프는 적어도 하나의 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 23 개 또는 그 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 10 개 이하의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 8 개 이하의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 4-10 개의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 4-8 개의 뉴클레오티드일 수 있다.
dsRNA 의 2 개의 실질적으로 상보적인 가닥이 개별 RNA 분자에 의해 포함되는 경우, 이러한 분자는 반드시 공유 결합될 필요는 없으나, 공유 결합될 수 있다. 2 개의 가닥이 하나의 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오티드의 비-단속 사슬 이외의 수단에 의해 공유 결합되어, 듀플렉스 구조를 형성하는 경우, 연결 구조는 "링커" 로 지칭된다. RNA 가닥은 동일하거나 또는 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 염기 쌍의 최대 개수는, dsRNA 의 가장 짧은 가닥에서, 듀플렉스 내에 존재하는 임의의 오버행을 제한 뉴클레오티드의 개수이다. 듀플렉스 구조에 더하여, RNAi 는 하나 이상의 뉴클레오티드 오버행을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 iRNA 제제는 각각의 가닥이 19-23 개의 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA 이며, 표적 RNA 서열, 예를 들어, PD-L1 유전자와 상호작용하며, 이론에 구속되지 않으면서, 세포내로 도입된 긴 이중 가닥 RNA 는 다이서로 공지된 유형 III 엔도뉴클레아제에 의해 siRNA 로 분해된다 (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). 리보뉴클레아제-III-유사 효소인 다이서는 dsRNA 를 특징적인 2 개 염기 3' 오버행을 가지는 19 내지 23 개 염기 쌍의 짧은 간섭 RNA 로 처리한다 (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). 이어서, siRNA 는 RNA-유도 침묵화 복합체 (RISC) 내로 혼입되고, 여기서 하나 이상의 헬리카제가 siRNA 듀플렉스를 풀어, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 안내할 수 있게 한다 (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). 적당한 표적 mRNA 로의 결합 시, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 절단하여 침묵화를 유도한다 (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188).
본 명세서에 사용되는 용어 "뉴클레오티드 오버행" 은 이중 가닥 iRNA 의 듀플렉스 구조로부터 돌출된 적어도 하나의 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, dsRNA 의 하나의 가닥의 3'-말단이 다른 가닥의 5'-말단을 넘어서 연장되거나, 또는 그 반대의 경우, 뉴클레오티드 오버행이 존재한다. dsRNA 는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 오버행을 포함할 수 있으며; 대안적으로, 오버행은 적어도 2 개의 뉴클레오티드, 적어도 3 개의 뉴클레오티드, 적어도 4 개의 뉴클레오티드, 적어도 5 개의 뉴클레오티드 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 오버행은 데옥시뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나, 이로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 그들의 임의의 조합에 존재할 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오티드(들)는 dsRNA 의 안티센스 또는 센스 가닥 중 어느 하나의 5'-말단, 3'-말단 또는 양말단에 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, dsRNA 의 안티센스 가닥은 1-10 개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 0-3, 1-3, 2-4, 2-5, 4-10, 5-10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 뉴클레오티드, 오버행을 3'-말단 또는 5'-말단에 갖는다. 특정 구현예에서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥, 또는 둘다 상의 오버행은 10 개 초과의 뉴클레오티드의 연장된 길이를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 1-30 개의 뉴클레오티드, 2-30 개의 뉴클레오티드, 10-30 개의 뉴클레오티드, 또는 10-15 개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥에 있다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥의 3' 말단에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥의 5' 말단에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥의 3' 말단에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5' 말단에 존재한다. 특정 구현예에서, 오버행의 뉴클레오티드 중 하나 이상은 뉴클레오시드 티오포스페이트로 대체되어 있다.
"블런트 (blunt)" 또는 "블런트 말단" 은 이중 가닥 RNAi 제제의 말단에서 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드, 즉, 뉴클레오티드 오버행이 존재하지 않는 것을 의미한다. "블런트 말단" 이중 가닥 RNAi 제제는 그것의 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥이며, 즉, 분자의 어느 하나의 말단에도 뉴클레오티드 오버행이 존재하지 않는다. 본 발명의 RNAi 제제는 하나의 말단에 뉴클레오티드 오버행을 갖지 않는 RNAi 제제 (즉, 하나의 오버행 및 하나의 블런트 말단을 가지는 제제) 또는 양말단에 뉴클레오티드 오버행을 갖지 않는 RNAi 제제를 포함한다.
용어 "안티센스 가닥" 또는 " 가이드 (guide) 가닥" 은 표적 서열, 예를 들어, PD-L1 mRNA 에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 iRNA, 예컨대, dsRNA 의 가닥을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "상보성 영역" 은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 서열, 예를 들어 표적 서열, 예를 들어, PD-L1 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이지 않는 경우, 미스매치는 분자의 내부 또는 말단 영역에 존재할 수 있다. 일반적으로, 대부분의 용인되는 미스매치는 말단 영역, 예를 들어 iRNA 의 5'- 및/또는 3'-말단의 5, 4, 3, 2, 또는 1 개의 뉴클레오티드 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 센스 가닥에 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 미스매치는 예를 들어, iRNA 의 3'-말단으로부터 5, 4, 3, 2, 또는 1 개의 뉴클레오티드 내에 존재한다. 또다른 구현예에서, 뉴클레오티드 미스매치는 예를 들어, iRNA 의 3'-말단 뉴클레오티드 내에 존재한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "센스 가닥" 또는 "패신저 (passenger) 가닥" 은 용어가 본 명세서에 정의된 바와 같은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 iRNA 의 가닥을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "절단 영역" 은 절단 자리에 바로 인접한 위치의 영역을 지칭한다. 절단 자리는 절단이 발생하는 표적 상의 자리이다. 일부 구현예에서, 절단 영역은 절단 자리의 어느 하나의 말단에, 그리고 그에 바로 인접한 위치에, 3 개의 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 영역은 절단 자리의 어느 하나의 말단에, 그리고 그에 바로 인접한 위치에, 2 개의 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 자리는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 10 및 11 에 의해 결합된 자리에 특이적으로 발생하며, 절단 영역은 뉴클레오티드 11, 12 및 13을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적" 은, 달리 언급되지 않는 한, 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 제 1 뉴클레오티드 서열을 제 2 뉴클레오티드 서열과 관련하여 기술하는데 사용되는 경우, 소정의 조건 하에서, 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 혼성화되어, 듀플렉스 구조를 형성하는 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 능력을 지칭한다. 이러한 조건은, 예를 들어, 12 내지 16 시간 동안 50℃ 또는 70℃ 에서 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA 후, 세척을 포함할 수 있는 엄격한 조건일 수 있다 (예컨대 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조). 기타 조건, 예를 들어, 유기체 내에서 접할 수 있는 생리학적 연관 조건이 적용될 수 있다. 당업자는, 혼성화된 뉴클레오티드의 궁극적인 용도에 따라, 2 개의 서열의 상보성 시험에 가장 적절한 조건 군을 결정할 수 있을 것이다.
iRNA, 예컨대 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 dsRNA 내의 상보적 서열은, 하나의 또는 둘 모두의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐, 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 염기 쌍 형성을 포함한다. 이러한 서열은 본 명세서에서 서로와 관련하여 "완전히 상보적인" 것으로 지칭될 수 있다. 그러나, 제 1 서열이 본 명세서에서 제 2 서열과 관련하여, "실질적으로 상보적인" 것으로 지칭되는 경우, 2 개의 서열은 완전히 상보적일 수 있거나, 또는 2 개의 서열은 이러한의 궁극적인 용도, 예를 들어, RISC 경로를 통한 유전자 발현의 저해에 가장 적합한 조건 하에서, 혼성화 능력을 보유하면서, 혼성화시, 최대 30 개의 염기 쌍의 듀플렉스에 대해, 하나 이상, 그러나 통상 5, 4, 3 또는 2 개 이하의 미스매치 염기 쌍을 형성할 수 있다. 그러나 2 개의 올리고뉴클레오티드가, 혼성화시, 하나 이상의 단일 가닥 오버행을 형성하도록 설계되는 경우, 이러한 오버행은 상보성 결정과 관련하여 미스매치로 간주하지 않는다. 예를 들어, 21 개의 뉴클레오티드 길이의 하나의 올리고뉴클레오티드 및 23 개의 뉴클레오티드 길이의 또 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 더 긴 올리고뉴클레오티드가, 더 짧은 올리고뉴클레오티드에 완전히 상보적인 21 개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 dsRNA 는 여전히, 본 명세서에서 개시되는 목적을 위해, "완전히 상보적인" 것으로 언급할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "상보적인" 서열은, 그의 혼성화 능력과 관련된 상기 필요조건이 충족되는 한, 비-자연 및 수식된 뉴클레오티드로부터 형성된 염기 쌍 또는 비-왓슨-크릭 염기 쌍으로부터 전적으로 형성될 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 이러한 비-왓슨-크릭 염기 쌍에는 G:U 워블 또는 후그스타인 염기 쌍이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서의 용어 "상보적인", "완전하게 상보적인" 및 "실질적으로 상보적인" 은, 그의 사용 문맥상 이해되는 바와 같이, dsRNA 의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, 또는 이중 가닥 RNAi 제제의 안티센스 가닥과 표적 서열 사이에 일치하는 염기와 관련하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 메신저 RNA (mRNA) 의 "적어도 일부에 실질적으로 상보적" 인 폴리뉴클레오티드는 관심 대상체의 mRNA (예컨대, PD-L1 유전자를 인코딩하는 mRNA) 의 연속 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, 서열이 PD-L1 유전자를 인코딩하는 mRNA 의 비-단속 부분에 실질적으로 상보적이라면 폴리뉴클레오티드는 PD-L1 mRNA 의 적어도 일부에 상보적이다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 센스 가닥 폴리뉴클레오티드 및 안티센스 폴리뉴클레오티드는 표적 PD-L1 서열과 완전히 상보적이다.
기타 구현예에서, 본 명세서에 개시된 안티센스 폴리뉴클레오티드는 표적 PD-L1 서열과 실질적으로 상보적이고, SEQ ID NO:1 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열의 동등한 영역, 또는 SEQ ID NO:1 중 임의의 하나의 단편과 그것의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보적인, 예컨대 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상보적인 또는 100% 상보적인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 iRNA 는 표적 PD-L1 서열에 결국 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 표 3 또는 표 5 에서의 안티센스 가닥 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열의 동등한 영역, 또는 표 3 및 표 5 에서의 안티센스 가닥 중 임의의 하나의 단편과 그것의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보적인, 예컨대 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상보적, 또는 100% 상보적인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 iRNA 는 표적 PD-L1 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥을 포함하고, 표 3 또는 5 의 안티센스 가닥 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열의 동등한 영역, 또는 표 3 및 5 의 센스 가닥 중 임의의 하나의 단편과 그것의 전체 길이에 걸쳐 적어도 80% 상보적, 예컨대 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상보적, 또는 100% 상보적인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 제제는, 안티센스 저해 메커니즘을 통해, 표적 mRNA 를 저해하는 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자이다. 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자는 표적 mRNA 내의 서열에 상보적이다. 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는, mRNA 와 염기 쌍을 이루고, 번역 기구 (translation machinery) 를 물리적으로 방해하여, 화학량론적 방식으로 번역을 저해할 수 있다. Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355 을 참조한다. 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자는 약 14 개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있으며, 표적 서열에 상보적인 서열을 가진다. 예를 들어, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자는, 본 명세서에서 기술되는 안티센스 서열 중 임의의 것 유래의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개 또는 그 초과의 연속 뉴클레오티드인 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는, 구절 "세포를 iRNA 예컨대 dsRNA 와 접촉시키는 것" 은 임의의 가능한 수단에 의해 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 세포를 iRNA 와 접촉시키는 것은 세포를 시험관내에서 iRNA 와 접촉시키는 것 또는 세포를 생체내에서 iRNA 와 접촉시키는 것을 포함한다. 접촉시키는 것은 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, iRNA 는 개별 수행 방법에 의해 세포와 물리적 접촉 상태에 놓여질 수 있거나, 또는 대안적으로, iRNA 는 그것이 나중에 세포와 접촉되는 것을 허용 또는 야기할 상황에 놓여질 수 있다.
세포를 시험관내에서 접촉시키는 것은, 예를 들어, 세포를 iRNA 와 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 세포를 생체내에서 접촉시키는 것은, 예를 들어, iRNA 를 세포가 위치하는 조직 내로 또는 그 근처에 주입함으로써, 또는 iRNA 를 또다른 영역, 예를 들어, 혈류 또는 피하 공간에 주입하여, 나중에 제제가 접촉될 세포가 위치하는 조직에 도달하게 함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, iRNA 는 iRNA 를 관심의 자리, 예를 들어, 간으로 향하게 하는 리간드, 예를 들어, GalNAc, 예를 들어, GalNAc3 를 함유하거나 또는 그것에 커플링될 수 있다. 시험관내 및 생체내 접촉 방법의 조합이 또한 가능하다. 예를 들어, 세포는 또한 시험관내에서 iRNA 와 접촉되고 나중에 대상체 내로 이식될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포를 iRNA 와 접촉시키는 것은 세포 내로의 섭취 또는 흡수를 촉진 또는 실행함으로써 "iRNA 를 세포 내로 도입하는 것" 또는 "전달하는 것" 을 포함한다. iRNA 의 흡수 또는 섭취는 도움을 받지 않는 확산 또는 활성 세포 과정을 통해, 또는 보조 제제 또는 디바이스에 의해 일어날 수 있다. iRNA 를 세포 내로 도입하는 것은 시험관내에서 또는 생체내에서일 수 있다. 예를 들어, 생체내 도입에서, iRNA 는 조직 자리 내로 주입 또는 전신 투여될 수 있다. 생체내 전달은 또한 베타-글루칸 전달 시스템, 예컨대 미국 특허 번호 5,032,401 및 5,607,677, 및 US 공개 번호 2005/0281781 (이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨) 에 기재된 것들에 의해 수행될 수 있다. 세포 내로의 시험관내 도입은 당해 기술분야에 알려진 방법 예컨대 전기천공법 및 리포펙션을 포함한다. 추가의 접근법이 본원에서 아래 기재되어 있거나 또는 당해 기술분야에 알려져 있다.
용어 "지질 나노입자" 또는 "LNP" 는 약학적 활성 분자, 예컨대 핵산 분자, 예를 들어, iRNA 또는 플라스미드 (이것으로부터 iRNA 가 전사됨) 를 캡슐화하는 지질 층을 포함하는 베지클이다. LNP 는, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,858,225, 6,815,432, 8,158,601, 및 8,058,069 (이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨) 에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 "대상체" 는 표적 유전자 서열이 iRNA 제제에 대해 표적 녹다운을 촉진하기에 충분한 상보성을 가질 때 내생적으로 또는 이종적으로 표적 유전자를 발현하는 동물 예컨대 영장류 (예컨대, 인간, 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이 및 침팬지), 비-영장류 (예컨대, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니피그, 고양이, 개, 랫트, 마우스, 말 및 고래) 를 포함하는 포유동물 또는 조류 (예컨대, 오리 또는 거위) 이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이, PD-L1 유전자 발현의 감소로 이익을 얻을, 질환, 장애 또는 병증에 대해 치료되거나 평가되는 인간; PD-L1 유전자 발현의 감소로 이익을 얻을, 질환, 장애 또는 병증에 대한 위험이 있는 인간; PD-L1 유전자 발현의 감소로 이익을 얻을, 질환, 장애 또는 병증을 가지는 인간; 및/또는 PD-L1 유전자 발현 및/또는 복제의 감소로 이익을 얻을, 질환, 장애 또는 병증에 대해 치료 중인 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 여성 인간이다. 기타 구현예에서, 대상체는 남성 인간이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료" 는 PD-L1 유전자 발현 또는 PD-L1 단백질 생산과 관련된 하나 이상의 증상, 예를 들어, 감염, 특히 만성, 세포내 감염, 예를 들어, 만성 바이러스 감염, 또는 암의 완화 또는 개선을 포함하지만 이에 한정되지 않는 유리한 또는 원하는 결과를 지칭한다. "치료" 는 또한, 치료의 부재하에 예상되는 생존에 비하여 생존의 연장을 의미할 수 있다. 치료는 동반이환의 발달의 방지, 예를 들어, 간감염을 갖는 대상체에서의 감소된 간 손상을 포함할 수 있다.
대상체에서의 PD-L1 유전자 발현 또는 대상체에서의 PD-L1 단백질 생산, 또는 질환 마커 또는 증상의 수준의 맥락에서 용어 "더 낮은" 은 이러한 수준의 통계적으로 유의미한 감소를 지칭한다. 감소는, 예를 들어, 적당한 대조군에 비해 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 또는 검출 방법에 관한 검출 수준 미만까지일 수 있다. 특정 구현예에서, 표적의 발현은 정규화되며, 즉, 이러한 장애가 없는 개체에 대하여 정상의 범위 내인 것으로 허용되는 수준으로 감소된다. 특정 구현예에서, 방법은 PD-L1 의 발현의 임상 관련 저해를 포함하며, 예를 들어 이는 PD-L1 의 발현의 감소제에 의한 대상체의 치료 후 임상 관련 결과에 의해 입증된다.
본원에서 사용되는, 용어 "프로그램된 세포사 1 리간드 1-관련 질환" 또는 "PD-L1-관련 질환" 은 PD-L1 유전자 발현 또는 PD-L1 단백질 생산에 의해 야기되거나, 또는 그와 관련되는 질환 또는 장애이다. 용어 "PD-L1-관련 질환" 은 PD-L1 유전자 발현, 복제, 또는 단백질 활성의 감소로부터 유익을 얻을 질환, 장애 또는 상태를 포함한다. PD-L1-관련 질환의 비-제한적 예는, 예를 들어, 감염, 특히 만성 세포내 감염, 예를 들어, 바이러스 감염, 예를 들어, 간염 감염, 또는 암을 포함한다.
특정 구현예에서, PD-L1-관련 질환은 감염, 특히 만성, 세포내 감염, 예를 들어, 바이러스 감염, 예를 들어, 간염 바이러스 감염, 예를 들어, 간염 B 감염 또는 간염 D 감염이다. 특정 구현예에서, 감염은 만성 세균 감염, 예를 들어, 결핵이다. 특정 구현예에서, PD-L1-관련 질환은 암, 특히 간암, 예를 들어, 간세포 암종 (HCC) 이다.
본 명세서에 사용되는 "치료적 유효량" 은 감염, 특히 만성 세포내 감염, 또는 암, 또는 기타 PD-L1-관련 질환을 가지는 대상체를 치료하기 위하여 환자에게 투여되는 경우, 질환의 치료 (예를 들어, 기존 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 그것의 관련된 동반이환을 감소시키거나, 개선시키거나, 유지시킴으로써) 를 실현하는데 충분한, iRNA 의 양을 포함하는 의도이다. "치료적 유효량" 은 iRNA, 그것의 투여 방법, 질환 및 그 중증도 및 치료할 환자의 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, PD-L1 유전자 발현에 의해 매개되는 병리학적 진행의 단계, 존재한다면 선행 또는 동반 치료의 유형, 및 기타 개별 특징에 따라 달라질 수 있다.
"치료적 유효량" 은 또한, 임의의 치료에 적용될 수 있는 합당한 이익/위험비로 몇몇의 원하는 국소 또는 전신 효과를 생성하는 iRNA 의 양을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 iRNA 는 이러한 치료에 적용될 수 있는 합당한 이득/위험비를 생성하는데 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료적 유효량은 적절히 질환 또는 상태의 지표의 임상 관련 변화 또는 안정화를 초래하는 양을 포함한다.
구절 "약학적으로 허용가능한" 은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하여 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 대상체 및 동물 대상체의 조직과 접촉시켜 사용하기에 적합한 이들 화합물, 물질, 조성물 또는 투여 형태를 언급하기 위해서 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 구절 "약학적으로-허용가능한 담체" 는 대상 화합물을 한 기관 또는 신체의 부분으로부터 또다른 기관 또는 신체의 부분으로 운반하거나 수송하는데 관여하는 약학적으로-허용가능한 물질, 조성물, 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제 (예를 들어, 윤활제, 활석 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트, 또는 스테아르산), 또는 물질 피막화 용매를 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과의 상용성의 의미에서 "허용가능" 하고 치료되는 대상체에게 유해하지 않아야 한다. 약학적으로-허용가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 하기를 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스, 및 그것의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 몰트; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 탈크; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화씨유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 아가; (14) 완충제, 예컨대 마그네슘 히드록시드 및 알루미늄 히드록시드; (15) 알긴산; (16) 발열원-비함유 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 증량제, 예컨대 폴리펩티드 및 아미노산; (23) 혈청 성분, 예컨대 혈청 알부민, HDL 및 LDL; 및 (22) 약학적 제형에서 이용되는 기타 비-독성 상용성 물질.
본 명세서에 사용된 용어 "샘플" 은 대상체로부터 분리된 유사한 유체, 세포 또는 조직뿐 아니라, 대상체 내에 존재하는 유체, 세포 또는 조직의 집합을 지칭한다. 생물학적 유체의 예는 혈액, 혈청 및 장막 유체, 혈장, 뇌척수액, 안 유체, 림프, 소변, 타액 등을 포함한다. 조직 샘플은 조직, 기관 또는 국소화된 영역 유래의 샘플을 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 특정 기관, 기관의 부분 또는 이러한 기관 내의 유체 또는 세포로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플은 간 (예컨대, 전체 간 또는 간의 특정 세그먼트 또는 예컨대, 간세포와 같이 간 내의 특정 유형의 세포) 으로부터 유래될 수 있다. "대상체로부터 유래된 샘플" 은 대상체로부터 뽑은 혈액 또는 거기에서 유래한 혈장을 지칭한다. 특정 구현예에서 PD-L1 의 수준을 검출할 때, "샘플" 은 바람직하게는 본 발명의 제제의 투여 전에 PD-L1 가 검출가능한 대상체로부터의 조직 또는 체액, 예를 들어, 간감염을 갖는 대상체로부터의 간 생검, 종양 생검을 지칭한다. 특정 대상체, 예를 들어, 건강한 대상체에서, PD-L1 의 수준은 다수의 체액, 세포 유형, 및 조직에서 검출가능하지 않을 수 있다.
I. 본 발명의 iRNA
본 발명은 PD-L1 유전자의 발현을 저해하는 iRNA 를 제공한다. 바람직한 구현예에서, iRNA 는, 세포에서, 예를 들어, PD-L1-관련 질환, 예를 들어, 만성 감염을 가지는 대상체, 예컨대 인간과 같은 포유동물 내의 세포에서, PD-L1 유전자의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 분자를 포함한다. dsRNAi 제제는, PD-L1 유전자의 발현시 형성되는 mRNA 의 적어도 일부에 상보적인 상보성 영역을 가지는 안티센스 가닥을 포함한다. 상보성 영역은 약 30 개의 뉴클레오티드 또는 그 미만의 길이 (예를 들어, 약 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 또는 18 개의 뉴클레오티드 또는 그 미만의 길이) 이다. PD-L1 유전자를 발현하는 세포와의 접촉시, iRNA 는, 예를 들어, PCR 또는 분지형 DNA (bDNA)-기반 방법에 의해, 또는 예를 들어, 웨스턴 블로팅 또는 유세포 기법을 이용한 면역형광 분석과 같은 단백질-기반 방법에 의해 분석되는 바와 같이, PD-L1 유전자 (예를 들어, 인간, 영장류, 비-영장류 또는 조류 PD-L1 유전자) 의 발현을 적어도 약 20%, 바람직하게는 적어도 30% 만큼 저해한다. 바람직한 구현예에서, 발현의 저해는 실시예에 제공된 qPCR 방법에 의해, 예를 들어, 10 nM 의 듀플렉스 농도에서 확인된다. 감소의 수준은, 예를 들어, 적당한 병력 대조군 또는 모아진 (pooled) 집단 샘플 대조군과 비교될 수 있다.
dsRNA 는, 상보적이며, dsRNA 가 사용될 조건 하에서 혼성화하여, 듀플렉스 구조를 형성하는 2 개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA 의 한 가닥 (안티센스 가닥) 은 표적 서열에 실질적으로 상보적이고, 일반적으로 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 표적 서열은, PD-L1 유전자의 발현 과정에서 형성되는 mRNA 의 서열로부터 유래할 수 있다. 다른 가닥 (센스 가닥) 은, 적절한 조건 하에서, 조합되는 경우, 2 개의 가닥이 혼성화하여, 듀플렉스 구조를 형성하도록, 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함한다. 본 명세서의 기타 부분에서 개시되고, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, dsRNA 의 상보적 서열은 또한, 개별 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 것과 반대로, 단일 핵산 분자의 자가-상보적 영역 (self-complementary region) 으로서 포함될 수 있다.
일반적으로, 듀플렉스 구조는 약 15 내지 30 개의 염기 쌍 길이, 예를 들어, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22 개의 염기 쌍 길이이다. 상술한 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이가 또한 본 발명의 일부로 고려된다.
유사하게, 표적 서열에 상보성인 영역은 약 15 내지 30 개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22 개의 뉴클레오티드 길이이다. 상술한 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이가 또한 본 발명의 일부로 고려된다.
일부 구현예에서, dsRNA 는 약 15 내지 23 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 약 25 내지 30 개의 뉴클레오티드 길이이다. 일반적으로, dsRNA 는 다이서 효소의 기질로서 작용하기에 충분한 길이이다. 예를 들어, 약 21 내지 23 개의 뉴클레오티드 길이보다 긴 dsRNA 가 다이서의 기질로서 작용할 수 있다는 것이 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 당업자가 또한 인지하는 바와 같이, 절단 표적 RNA 영역은 대부분 종종 더 큰 RNA 분자, 종종 mRNA 분자의 일부일 것이다. 관련된 경우, mRNA 표적의 "일부" 는 RNAi-유도 절단 (즉, RISC 경로를 통한 절단) 의 기질이 되게 하는데 충분한 길이의 mRNA 표적의 연속 서열이다.
당업자는 또한, 듀플렉스 영역, 예를 들어, 약 9 내지 약 36 염기 쌍, 예를 들어, 10-36, 11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11-34, 12-34, 13-34, 14-34, 15-34, 9-33, 10-33, 11-33, 12-33, 13-33, 14-33, 15-33, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32, 13-32, 14-32, 15-32, 9-31, 10-31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 15-31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22 염기 쌍의 듀플렉스 영역이 dsRNA 의 주요 기능성 부분이라는 것을 인지할 것이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 절단을 위해 원하는 RNA 를 표적으로 하는, 예컨대 15 내지 30 개의 염기 쌍의 기능성 듀플렉스로 처리되는 경우, 30 개의 염기 쌍보다 더 큰 듀플렉스 영역을 가지는 RNA 분자 또는 RNA 분자의 복합체는 dsRNA 이다. 따라서, 당업자는 하나의 구현예에서, miRNA 가 dsRNA 라는 것을 인식할 것이다. 또 다른 구현예에서, dsRNA 는 자연 발생 miRNA 가 아니다. 또 다른 구현예에서, 표적 PD-L1 유전자 발현을 표적으로 하는데 유용한 iRNA 제제는 더 큰 dsRNA 의 절단에 의해, 표적 세포에서 생성되지 않는다.
본 명세서에서 기술되는 바와 같은 dsRNA 는 하나 이상의 단일-가닥 뉴클레오티드 오버행, 예를 들어, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3, 1, 2, 3, 또는 4 개의 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 하나의 뉴클레오티드 오버행을 가지는 dsRNA 는 그의 평활 말단 대응부에 비해서, 월등한 저해 특성을 가질 수 있다. 뉴클레오티드 오버행은 데옥시뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 그들의 임의의 조합에 존재할 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오티드(들)는 dsRNA 의 안티센스 또는 센스 가닥 중 어느 하나의 5'-말단, 3'-말단 또는 양쪽 말단에 존재할 수 있다.
dsRNA 는, 이하에 더욱 논의되는 바와 같은 당해 기술분야에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대 Biosearch, Applied Biosystems, Inc. 에서 상업적으로 입수할 수 있는 것과 같은 자동 DNA 합성기를 사용하여 합성할 수 있다.
본 발명의 이중 가닥 RNAi 화합물은 2-단계 절차를 사용하여 제조할 수 있다. 먼저, 이중-가닥 RNA 분자의 개별 가닥을 개별적으로 제조한다. 그 후, 성분 가닥을 어닐링한다. siRNA 화합물의 개별 가닥은 용액 상 또는 고체 상 유기 합성 또는 둘 모두를 사용하여 제조할 수 있다. 유기 합성은, 비자연 또는 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 가닥이 용이하게 제조될 수 있다는 이점을 제공한다. 유사하게, 본 발명의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드는 용액 상 또는 고체 상 유기 합성 또는 둘 모두를 사용하여 제조할 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명의 dsRNA 는 적어도 2 개의 뉴클레오티드 서열, 센스 서열 및 안티-센스 서열을 포함한다. 센스 가닥은 표 3 및 5 에서 제공되는 서열 군으로부터 선택되고, 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥은 표 3 및 5 의 서열 군으로부터 선택된다. 이러한 양상에서, 2 개의 서열 중 하나는 2 개의 서열 중 다른 것에 상보적이며, 서열 중 하나는, PD-L1 유전자의 발현 과정에서 생성되는 mRNA 서열에 실질적으로 상보적이다. 그리하여, 이러한 양상에서, dsRNA 는, 하나의 올리고뉴클레오티드가 표 3 또는 5 에서 센스 가닥으로서 기술되고, 제 2 올리고뉴클레오티드가 표 3 또는 5 에서 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥으로 기술되는 2 개의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이다. 특정 구현예에서, dsRNA 의 실질적으로 상보적인 서열은 개별 올리고뉴클레오티드 상에 포함된다. 기타 구현예에서, dsRNA 의 실질적으로 상보적인 서열은 단일의 올리고뉴클레오티드 상에 포함된다.
표 3 의 서열이 수식된 또는 컨쥬게이트된 서열로서 기재되어 있지 않지만, 본 발명의 iRNA 예를 들어, 본 발명의 dsRNA 의 RNA 는 표 3 에 제시된 서열, 또는 수식된 표 5 의 서열, 또는 컨쥬게이트된 표 5 의 서열 중 임의의 하나를 포함할 수 있다고 이해될 것이다. 다시 말하면, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 비-수식된, 비-컨쥬게이트된, 수식된, 또는 컨쥬게이트된 표 3 및 5 의 dsRNA 를 망라한다.
당업자는, 약 20 내지 23 개의 염기 쌍, 예컨대 21 개 염기 쌍의 듀플렉스 구조를 가지는 dsRNA 가 RNA 간섭을 유도하는데 특히 효과적인 것으로 서술되었다는 것을 잘 알고 있다 (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). 그러나, 다른 연구자들은, 더 짧거나 또는 더 긴 RNA 듀플렉스 구조가 또한 효과적일 수 있다는 것을 발견했다 (Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226). 전술된 구현예에서, 표 3 및 5 중 어느 하나에서 제공되는 올리고뉴클레오티드 서열의 성질 때문에, 본 명세서에서 기술되는 dsRNA 는 최소 21 개의 뉴클레오티드 길이의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 한쪽 또는 양쪽 말단에서, 표 3 및 5 의 서열 중 하나에서 단지 소수의 뉴클레오티드를 제한 서열을 가지는 더 짧은 듀플렉스가 전술한 dsRNA 와 비교하여, 유사하게 효과적일 수 있다는 것을 합리적으로 예상할 수 있다. 따라서, 표 3 및 5 의 서열 중 하나로부터 유래하는 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20 개, 또는 그 초과의 연속 뉴클레오티드의 서열을 가지며, 완전한 서열을 포함하는 dsRNA 와, PD-L1 유전자의 발현을 저해하는 그들의 능력이, 약 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30% 이하의 저해로 상이한 dsRNA 가 본 발명의 범위 내로 고려된다.
또한, 표 3 및 5 에서 제공되는 RNA 는, RISC-매개 절단에 민감한 PD-L1 전사물의 자리(들)를 식별한다. 이와 같이, 본 발명은, 이러한 자리 중 어느 하나의 내를 표적으로 하는 iRNA 를 더욱 특징으로 한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, iRNA 가 특정 자리 내의 임의의 부분에서, 전사물의 절단을 촉진하는 경우, iRNA 는 RNA 전사물의 특정 자리 내를 표적으로 한다고 언급된다. 이러한 iRNA 는 일반적으로, PD-L1 유전자 내의 선택된 서열에 인접하는 영역의 추가적 뉴클레오티드 서열에 커플링된 표 3 및 5 에서 제공되는 서열 중 하나의 적어도 약 15 개의 연속 뉴클레오티드를 포함할 것이다.
표적 서열은 일반적으로 약 15-30 개의 뉴클레오티드 길이이지만, 임의의 주어진 표적 RNA 의 절단의 유도에 있어서, 이 범위의 특정 서열의 적합성에 큰 폭의 변화가 존재한다. 본 명세서에서 서술되는 다양한 소프트웨어 패키지 및 가이드라인이 임의의 주어진 유전자 표적의 최적의 표적 서열의 식별을 위한 지침을 제공하나, 표적 서열로서 작용할 수 있는 크기 범위의 서열의 확인을 위해, 주어진 크기 (비제한적인 예로서, 21 개의 뉴클레오티드) 의 "윈도우" 또는 "마스크" 가 표적 RNA 서열 상에 문언적이거나 또는 비유적으로 (예컨대 인 실리코 포함) 배치되는 경험적 접근 방식을 또한 취할 수 있다. 가능한 서열의 완전한 세트가 선택된 임의의 주어진 표적 크기에 대하여 확인될 때까지, 서열 "윈도우" 를 초기 표적 서열 위치의 하나의 뉴클레오티드 상류 또는 하류로 점진적으로 이동시킴으로써, 다음의 가능한 표적 서열을 확인할 수 있다. 최적으로 수행되는 이러한 서열의 확인을 위해, (본 명세서에 기술되거나 또는 당해 기술분야에 공지되거나 본 명세서에서 제공된 바와 같은 분석을 이용한) 확인된 서열의 체계적 합성 및 시험과 결합한 이러한 과정에 의해, iRNA 제제에 의해 표적화되는 경우, 표적 유전자 발현의 최적의 저해를 매개하는 이러한 RNA 서열을 확인할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 표 3 및 5 에 확인되는 서열이 효과적인 표적 서열을 나타내나, 동일하거나 또는 더 나은 저해 특성을 가지는 서열의 확인을 위해, 주어진 서열의 하나의 뉴클레오티드 상류 또는 하류로 점진적으로, "윈도우를 보행" 시킴으로써, 저해 효율의 추가적 최적화가 달성될 수 있다는 것이 고려된다.
또한, 예컨대 표 3 및 5 에서 확인되는 임의의 서열에 있어서, 추가의 최적화가 뉴클레오티드를 체계적으로 부가하거나 또는 제거하여, 더 길거나 또는 더 짧은 서열을 생성시키고, 그 지점으로부터 표적 RNA 의 상향 또는 하향으로 크기가 더 길거나 더 짧은 윈도우를 보행함으로써 생성된 이러한 서열을 시험함으로써 달성될 수 있다는 것이 고려된다. 또한, 당해 기술분야에 알려져 있거나 본 명세서에서 기술된 바와 같은 저해 분석에서의 이러한 표적 서열을 기반으로 하는 iRNA 의 효율성 시험과, 새로운 후보 표적의 생성을 위한 이러한 접근법을 커플링함으로써, 저해 효율의 추가적 향상이 초래될 수 있다. 또한, 이러한 최적화된 서열은 예를 들어, 본원에 기술되거나 당해 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이 수식된 뉴클레오티드의 도입, 오버행에의 부가 또는 변경, 또는 당해 기술분야에 공지되어 있거나 본원에 논의된 바와 같은 다른 수식에 의해, 발현 저해제로서 분자를 추가로 최적화시킴으로써 (예를 들어, 혈청 안정성 또는 순환 반감기의 증가, 열 안정성의 증가, 막횡단 전달의 향상, 특정 위치 또는 세포 유형으로의 표적화, 침묵화 경로 효소와의 상호작용의 증가, 엔도솜으로부터의 방출 증가) 조정될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같은 iRNA 는 표적 서열에 대해 하나 이상의 미스매치를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 iRNA 는 3 개 이하의 미스매치를 포함한다. iRNA 의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 포함하는 경우, 미스매치 영역이 상보성 영역의 중심에 위치하지 않는 것이 바람직하다. iRNA 의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 포함하는 경우, 미스매치가 상보성 영역의 5'- 또는 3'-말단 중 어느 하나로부터 마지막 5 개의 뉴클레오티드 내에 제한되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 23 개의 뉴클레오티드 iRNA 제제에 있어서, PD-L1 유전자의 영역에 상보적인 가닥은 일반적으로, 중심 13 개의 뉴클레오티드 내에 임의의 미스매치를 포함하지 않는다. 본 명세서에서 개시되는 방법 또는 당해 기술분야에 공지된 방법을 이용하여, 표적 서열에 대한 미스매치를 포함하는 iRNA 가 PD-L1 유전자의 발현의 저해에 효과적인지 여부를 결정할 수 있다. PD-L1 유전자의 발현의 저해에서, 미스매치를 가지는 iRNA 의 효율에 대한 고려는, 특히, PD-L1 유전자의 특정 상보성 영역이 상기 모집단 내에, 다형성 서열 변화를 가지는 것으로 공지되어 있는 경우에 중요하다.
II. 본 발명의 수식된 iRNA
특정 구현예에서, 본 발명의 iRNA, 예를 들어 dsRNA 의 RNA 는 수식되지 않으며, 예컨대 당해 기술분야에 공지되고, 본 명세서에서 기술되는 화학적 수식 또는 컨쥬게이션을 포함하지 않는다. 기타 구현예에서, 본 발명의 iRNA, 예를 들어 dsRNA 의 RNA 는, 안정성 또는 기타 유리한 특성을 향상시키기 위해, 화학적으로 수식된다. 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 iRNA 의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부가 수식된다. 본 발명의 다른 구현예에서, iRNA 의 뉴클레오티드의 전부 또는 iRNA 의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부가 수식되며, 즉, 5, 4, 3, 2, 또는 1 개 이하의 수식되지 않은 뉴클레오티드가 iRNA 의 가닥에 존재한다.
본 발명에서 특징으로 하는 핵산은, 그의 전체가 본 명세서에서 참조로서 포함되는 "Current protocols in nucleic acid chemistry" Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USA 에 기술된 것과 같은 당해 기술분야에 잘 확립된 방법에 의해, 합성 또는 수식될 수 있다. 수식에는, 예를 들어, 말단 수식, 예컨대 5'-말단 수식 (인산화, 컨쥬게이션, 역위 결합 (inverted linkages)) 또는 3'-말단 수식 (컨쥬게이션, DNA 뉴클레오티드, 역위 결합 등); 염기 수식, 예컨대 안정화 염기, 불안정화 염기 또는, 파트너의 연장된 레퍼토리와 염기 쌍을 이루는 염기로의 대체, 염기의 제거 (무염기 뉴클레오티드), 또는 컨쥬게이트된 염기; 당 수식 (예컨대 2'-위치 또는 4'-위치) 또는 당의 대체; 또는 포스포디에스테르 결합의 수식 또는 대체를 비롯한 골격 수식이 포함된다. 본 명세서에서 기술되는 구현예에 유용한 iRNA 화합물의 특정 예에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 수식된 골격 또는 비자연 뉴클레오시드간 결합을 포함하는 RNA 가 포함된다. 수식된 골격을 가지는 RNA 에는, 이들 중, 골격 내에, 인 원자를 가지지 않는 것들이 포함된다. 본 명세서의 목적을 위해, 때때로 당해 기술분야에서 인용되는 바와 같이, 그들의 뉴클레오시드간 골격에 인 원자를 가지지 않는 수식된 RNA 가 또한 올리고뉴클레오시드로 고려될 수 있다. 일부 구현예에서, 수식된 iRNA 는 그의 뉴클레오시드간 골격 내에 인 원자를 가질 것이다.
수식된 RNA 골격에는, 예를 들어, 정상적인 3'-5' 결합을 가지는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 비롯한 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 비롯한 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 보라노포스페이트, 이러한의 2'-5'-결합 유사체 및, 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍이 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결되어 있는 반대 극성을 가지는 것이 포함된다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리 산 형태도 또한 포함된다.
상기의 인-함유 결합의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 그의 전체가 본 명세서에서 참조로 포함되는, 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6, 239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; 및 미국 특허 번호 RE39464 가 포함된다.
수식된 RNA 골격 내에 인 원자를 포함하지 않는 수식된 RNA 골격은, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드간 결합에 의해 형성되는 골격을 가진다. 이에는 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성되는) 모르폴리노 결합을 가지는 것들; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 술폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 기타 혼합 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 가지는 것들이 포함된다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 그의 전체가 본 명세서에서 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 및 5,677,439 가 포함된다.
당 및 뉴클레오시드간 결합 둘 모두, 즉, 뉴클레오티드 단위의 골격이 신규한 군으로 대체된 적절한 RNA 모방체가 본원에서 제공되는 iRNA 에서 사용하기 위한 것으로 고려된다. 염기 단위는, 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 뛰어난 혼성화 특성을 가지는 것으로 밝혀진 이러한 올리고머 화합물 중 하나인 RNA 모방체는 펩티드 핵산 (PNA) 으로서 지칭된다. PNA 화합물의 경우, RNA 의 당 골격은 아미드 함유 골격, 특히, 아미노에틸글리신 골격에 의해 대체된다. 핵 염기는 보유되며, 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자 (aza nitrogen atom) 에 직접적이거나 또는 간접적으로 결합한다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262 가 포함된다. 본 발명의 iRNA 에서 사용하기에 적절한 추가적 PNA 화합물은, 예를 들어 Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500 에 개시되어 있다.
본 발명에서 특징으로 하는 일부 구현예에는 포스포로티오에이트 골격을 가지는 RNA, 및 헤테로원자 골격, 특히 상기 인용된 미국 특허 번호 5,489,677 의 --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 알려짐], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2--[여기서, 고유 포스포디에스테르 골격은 --O--P--O--CH2-- 로서 제시됨] 및 상기 인용된 미국 특허 번호 5,602,240 의 아미드 골격을 가지는 올리고뉴클레오시드가 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명에서 특징으로 하는 RNA 는 상기 인용된 미국 특허 번호 5,034,506 의 모르폴리노 골격 구조를 가진다.
수식된 RNA 는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명에서 특징으로 하는 iRNA, 예를 들어 dsRNA 는 2'-위치에서 하기 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬, 여기에서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환된 또는 치환되지 않은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있음. 예시적 적합한 수식은 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2 를 포함하며, n 및 m 은 1 내지 약 10 이다. 기타 구현예에서, dsRNAs 는 2' 위치에서 하기 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터칼레이터 (intercalator), iRNA 의 약동학적 특성의 개선을 위한 기, 또는 iRNA 의 약역학적 특성의 개선을 위한 기, 및 유사한 특성을 가지는 기타 치환기. 일부 구현예에서, 수식은 2'-메톡시에톡시 (2'-O--CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE 로서 알려짐) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) 즉, 알콕시-알콕시 기를 포함한다. 또다른 예시적 수식은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, O(CH2)2ON(CH3)2 기 (또한 2'-DMAOE 로서 알려짐, 본 명세서 하기의 실시예에서 개시되는 바와 같음), 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (또한, 당해 기술분야에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE 로서 알려짐), 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2 이다. 추가의 예시적 수식은 하기를 포함한다: 5'-Me-2'-F 뉴클레오티드, 5'-Me-2'-OMe 뉴클레오티드, 5'-Me-2'-데옥시뉴클레오티드, (이러한 세 패밀리에서의 R 및 S 이성질체 둘모두); 2'-알콕시알킬; 및 2'-NMA (N-메틸아세타미드).
기타 수식은 2'-메톡시 (2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로 (2'-F) 를 포함한다. iRNA 의 RNA 상의 다른 위치, 특히 2'-5' 결합 dsRNA 에서 또는 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서, 유사한 수식이 또한 이루어질 수 있다. iRNA 는 또한 펜토푸라노실 당 대신에, 당 모방체, 예를 들어 사이클로부틸 모이어티를 가질 수 있다. 이중 일부는 일반적으로 본 출원에 속하는 것으로서, 이러한 수식된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허에는, 이에 제한되는 것은 아니나 미국 특허 번호 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 및 5,700,920 가 포함된다. 이러한 특허의 각각의 전문은 본 명세서에서 참조로 포함된다.
iRNA 는 또한 핵염기 (당해 기술분야에서는 종종 간단히 "염기" 로서 지칭됨) 수식 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "수식되지 않은" 또는 "자연" 핵염기에는 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U) 이 포함된다. 수식된 핵염기에는 다른 합성 및 자연 핵염기, 예를 들어 데옥시-티민 (dT), 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌이 포함된다. 추가의 핵염기에는 미국 특허 번호 3,687,808 에 기술된 것들, Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008 에 기술된 것들; The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990 에 기술된 것들, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613 에 기술된 것들, 및 Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993 에 기술된 것들이 포함된다. 이러한 핵염기 중 일부는 본 발명에서 특징으로 하는 올리고머 화합물의 결합 친화성의 증가에 특히 유용하다. 이에는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린, 예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신이 포함된다. 5-메틸시토신 치환은 0.6 내지 1.2℃ 에 의해 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 밝혀졌으며 (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 더욱 특히, 2'-O-메톡시에틸 당 수식과 조합되는 경우의 예시적 염기 치환이다.
다른 수식된 핵염기뿐만 아니라, 상기 언급된 수식된 핵염기 중 일부의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 명세서에서, 각각의 전문이 참조로 포함되는 전술된 미국 특허 번호 3,687,808, 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; 및 7,495,088 가 포함된다.
iRNA 의 RNA 는 또한 하나 이상의 잠긴 핵산 (locked nucleic acids) (LNA) 을 포함하도록 수식될 수 있다. 잠긴 핵산은, 리보스 모이어티가 2' 및 4' 탄소를 결합시키는 추가의 가교를 포함하는 수식된 리보스 모이어티를 가지는 뉴클레오티드이다. 이러한 구조는 3'-엔도 입체구조에서, 리보스를 효과적으로 "잠근다 (lock)". siRNA 로의 잠긴 핵산의 부가는 혈청에서 siRNA 안정성을 증가시키고, 표적외 효과를 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
일부 구현예에서, 본 발명의 iRNA 는 UNA (잠기지 않은 핵산 (unlocked nucleic acids)) 뉴클레오티드인 하나 이상의 단량체를 포함한다. UNA 는 당의 결합 중 임의의 것이 제거되어, 잠기지 않은 "당" 잔기를 형성하는 잠기지 않은 비고리형 핵산이다. 하나의 예에서, UNA 는 또한 C1'-C4' 사이의 결합 (즉 C1' 탄소와 C4' 탄소 사이의 공유적 탄소-산소-탄소 결합) 이 제거된 단량체를 망라한다. 또다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합 (즉 C2' 탄소와 C3' 탄소 사이의 공유적 탄소-탄소 결합) 이 제거되었다 (참조, Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) 및 Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, 이들은 본원에 참조로 포함됨).
iRNA 의 RNA 는 또한 하나 이상의 바이시클릭 당 모이어티를 포함하도록 수식될 수 있다. "바이시클릭 당" 은 두 원자의 가교에 의해 수식된 푸라노실 고리이다. "바이시클릭 뉴클레오시드" ("BNA") 는 당 고리의 두 탄소 원자를 연결하여, 바이시클릭 고리계를 형성하는 가교를 포함하는 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드이다. 특정 구현예에서, 가교는 당 고리의 4'-탄소 및 2'-탄소를 연결한다. 따라서, 일부 구현예에서 본 발명의 제제는 하나 이상의 잠긴 핵산 (LNA) 을 포함할 수 있다. 잠긴 핵산은 리보오스 모이어티가 2' 탄소 및 4' 탄소를 연결하는 추가의 가교를 포함하는 수식된 리보오스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드이다. 다시 말하면, LNA 는 4'-CH2-O-2' 가교를 포함하는 바이시클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드이다. 이러한 구조는 3'-엔도 구조 입체배치에서 리보오스를 효과적으로 "잠근다". siRNAs 에 대한 잠긴 핵산의 첨가는 혈청에서의 siRNA 안정성을 증가시키고, 오프-타깃 효과를 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). 본 발명의 폴리뉴클레오티드에서 사용하기 위한 바이사이클릭 뉴클레오시드의 예에는, 제한 없이 4' 및 2' 리보실 고리 원자 사이에 가교를 포함하는 뉴클레오시드가 포함된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드 물질에는, 4' 에서 2' 가교를 포함하는 하나 이상의 바이사이클릭 뉴클레오시드가 포함된다. 이러한 4' 에서 2' 가교 바이사이클릭 뉴클레오시드의 예에는, 이에 제한되는 것은 아니나 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (또한 "구속된 에틸" 또는 "cEt" 로서 지칭됨) 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (및 그의 유사체; 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,399,845); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (및 그의 유사체; 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,278,283); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (및 그의 유사체; 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,278,425); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (참조, 예를 들어,미국 특허 공개 번호 2004/0171570); 4'-CH2-N(R)-O-2', 여기에서 R 은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기임 (참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,427,672); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (참조, 예를 들어, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); 및 4'-CH2-C(-CH2)-2' (및 그의 유사체; 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,278,426) 이 포함된다. 상기 문헌은 각각 본 명세서에서, 그 전문이 참조로서 포함된다.
잠긴 핵산 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 추가의 대표적 미국 특허 및 미국 특허 공보에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 명세서에서, 그 전문이 참조로서 포함되는 하기가 포함된다: 미국 특허 번호 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,034,133;7,084,125; 7,399,845; 7,427,672; 7,569,686; 7,741,457; 8,022,193; 8,030,467; 8,278,425; 8,278,426; 8,278,283; US 2008/0039618; 및 US 2009/0012281.
예를 들어, α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스를 포함하는 하나 이상의 입체화학적 당 입체구조를 가지는 임의의 상기 바이사이클릭 뉴클레오시드가 제조될 수 있다 (WO 99/14226 참조).
iRNA 의 RNA 는 또한 하나 이상의 구속된 에틸 뉴클레오티드를 포함하도록 수식될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "구속된 에틸 뉴클레오티드" 또는 "cEt" 는 4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 잠긴 핵산이다. 하나의 구현예에서, 구속된 에틸 뉴클레오티드는, 본 명세서에서 "S-cEt" 로서 지칭되는 S 입체구조이다.
본 발명의 iRNA 는 또한 하나 이상의 "입체구조 제한된 뉴클레오티드" ("CRN") 를 포함할 수 있다. CRN 은 리보스의 C2' 및 C4' 탄소 또는 리보스의 C3 및 C5' 탄소를 결합시키는 링커를 가지는 뉴클레오티드 유사체이다. CRN 은 리보스 고리를 안정한 입체구조로 잠그고, mRNA 에 대한 혼성화 친화성을 증가시킨다. 상기 링커는, 안정성 및 친화성을 위한 최적의 위치에 산소가 배치되기에 충분한 길이이며, 이로서, 더욱 적은 리보스 고리 퍼커링 (ribose ring puckering) 이 초래된다.
상술한 CRN 중 일부의 제조를 교시하는 대표적 공보에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 명세서에서, 각각의 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 2013/0190383; 및 PCT 공보 WO 2013/036868 이 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 iRNA 는 UNA (잠기지 않은 핵산) 뉴클레오티드인 하나 이상의 단량체를 포함한다. UNA 는 당의 결합 중 임의의 것이 제거되어, 잠기지 않은 "당" 잔기를 형성하는 잠기지 않은 비고리형 핵산이다. 하나의 예에서, UNA 는 또한 C1'-C4' 사이의 결합 (즉 C1' 탄소와 C4' 탄소 사이의 공유적 탄소-산소-탄소 결합) 이 제거된 단량체를 망라한다. 또다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합 (즉 C2' 탄소와 C3' 탄소 사이의 공유적 탄소-탄소 결합) 이 제거되었다 (참조, Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) 및 Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, 이들은 본원에 참조로 포함됨).
UNA 의 제조를 교시하는 대표적 미국 공보에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 명세서에서, 각각의 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,314,227; 및 미국 특허 공개 번호 2013/0096289; 2013/0011922; 및 2011/0313020 이 포함된다.
RNA 분자 말단에 대한 가능한 안정화 수식에는 N-(아세틸아미노카프로일)-4-히드록시프롤리놀 (Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-히드록시프롤리놀 (Hyp-C6), N-(아세틸-4-히드록시프롤리놀 (Hyp-NHAc), 티미딘-2'-0-데옥시티미딘 (에테르), N-(아미노카프로일)-4-히드록시프롤리놀 (Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3"- 포스페이트, 역방위 염기 dT (idT) 및 다른 것들이 포함될 수 있다. 이러한 수식의 개시내용은 PCT 공개 번호 WO 2011/005861 에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 iRNA 의 뉴클레오티드의 다른 수식에는 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체, 예를 들어, iRNA 의 안티센스 가닥 상의 5'-말단 포스페이트 또는 포스페이트 모방체가 포함된다. 적합한 포스페이트 모방체는 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2012/0157511 에 개시되어 있으며, 그의 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다.
A. 본 발명의 모티프를 포함하는 수식된 iRNA
본 발명의 특정 양상에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는, 예를 들어, 본 명세서에서, 전문이 참조로서 포함되는, WO 2013/075035호에서 기술된 바와 같이 화학적으로 수식된 제제를 포함한다. WO 2013/075035 는, 특히 절단 자리에서 또는 그 부근에서, dsRNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 내로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나 이상의 모티프를 도입시킴으로써, 뛰어난 결과를 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, dsRNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 다르게는 완전히 수식될 수 있다. 이러한 모티프의 도입은, 존재한다면, 센스 또는 안티센스 가닥의 수식 패턴을 중단시킨다. dsRNAi 제제는 임의로, 예를 들어 센스 가닥 상의 GalNAc 유도체 리간드와 컨쥬게이트될 수 있다.
더욱 구체적으로, 이중 가닥 RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 dsRNAi 제제의 적어도 하나의 가닥의 절단 자리에서 또는 그 부근에서, 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나 이상의 모티프를 가지도록 완전히 수식된 경우, dsRNAi 제제의 유전자 침묵화 활성이 관찰되었다.
따라서, 본 발명은, 생체내, 표적 유전자 (즉, PD-L1 유전자) 의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다. RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. RNAi 제제의 각각의 가닥은, 독립적으로, 12-30 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 각각의 가닥은 독립적으로 14-30 개의 뉴클레오티드 길이, 17-30 개의 뉴클레오티드 길이, 25-30 개의 뉴클레오티드 길이, 27-30 개의 뉴클레오티드 길이, 17-23 개의 뉴클레오티드 길이, 17-21 개의 뉴클레오티드 길이, 17-19 개의 뉴클레오티드 길이, 19-25 개의 뉴클레오티드 길이, 19-23 개의 뉴클레오티드 길이, 19-21 개의 뉴클레오티드 길이, 21-25 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 21-23 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥은 전형적으로, 또한 본 명세서에서, "dsRNAi 제제" 로도 지칭되는 듀플렉스 이중 가닥 RNA ("dsRNA") 를 형성한다. dsRNAi 제제의 듀플렉스 영역은 12-30 개의 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다. 예를 들어, 듀플렉스 영역은 14-30 개의 뉴클레오티드 쌍 길이, 17-30 개의 뉴클레오티드 쌍 길이, 27-30 개의 뉴클레오티드 쌍 길이, 17-23 개의 뉴클레오티드 쌍 길이, 17-21 개의 뉴클레오티드 쌍 길이, 17-19 개의 뉴클레오티드 쌍 길이, 19-25 개의 뉴클레오티드 쌍 길이, 19-23 개의 뉴클레오티드 쌍 길이, 19-21 개의 뉴클레오티드 쌍 길이, 21-25 개의 뉴클레오티드 쌍 길이, 또는 21-23 개의 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다. 또다른 예에서, 듀플렉스 영역은 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 개의 뉴클레오티드 길이로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥은 훨씬 더 길 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 독립적으로 25-35 개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 구현예에서, 각각의 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 27-53 개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 27-49, 31-49, 33-49, 35-49, 37-49, 및 39-49 개의 뉴클레오티드 길이이다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제는 한 또는 양쪽 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 양 말단에 하나 이상의 오버행 영역 또는 캡핑 기를 함유할 수 있다. 오버행은, 독립적으로, 1-6 개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 2-6 개의 뉴클레오티드 길이, 1-5 개의 뉴클레오티드 길이, 2-5 개의 뉴클레오티드 길이, 1-4 개의 뉴클레오티드 길이, 2-4 개의 뉴클레오티드 길이, 1-3 개의 뉴클레오티드 길이, 2-3 개의 뉴클레오티드 길이, 또는 1-2 개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 구현예에서, 오버행 영역은 위에 제공된 바와 같은 연장된 오버행 영역을 포함할 수 있다. 오버행은, 한쪽 가닥이 다른 쪽보다 긴 결과이거나 또는 동일한 길이의 2 개의 가닥이 엇갈려 있는 결과일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA 와 미스매치를 형성할 수 있거나 또는 그것은 표적화되는 유전자 서열에 상보적일 수 있거나, 또는 또 다른 서열일 수 있다. 제 1 및 제 2 가닥은 또한, 예를 들어 헤어핀을 형성하는 추가적 염기에 의해, 또는 다른 비-염기 링커에 의해, 연결될 수 있다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제의 오버행 영역의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-당 수식된, 예컨대, 2'-F, 2'-O-메틸, 티미딘 (T), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘 (Teo), 2'-O-메톡시에틸아데노신 (Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸시티딘 (m5Ceo), 및 그들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 수식된 또는 수식되지 않은 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, TT 는 어느 한쪽 가닥의 어느 한 말단에 대한 오버행 서열일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA 와 미스매치를 형성할 수 있거나 또는 그것은 표적화되는 유전자 서열에 상보적일 수 있거나, 또는 또다른 서열일 수 있다.
dsRNAi 제제의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 양쪽 가닥의 5'- 또는 3'- 오버행은 인산화될 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행 영역(들)은, 2 개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트를 가지는 2 개의 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서, 2 개의 뉴클레오티드는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 양쪽 가닥의 3'-말단에 존재한다. 일부 구현예에서, 이러한 3'-오버행은 안티센스 가닥에 존재한다. 일부 구현예에서, 이러한 3'-오버행은 센스 가닥에 존재한다.
dsRNAi 제제는, 그의 전체 안정성에 영향을 미치지 않고, RNAi 의 간섭 활성을 강화할 수 있는 단일의 오버행만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일-가닥 오버행은 센스 가닥의 3'-말단에, 또는 대안적으로, 안티센스 가닥의 3'-말단에 위치할 수 있다. RNAi 는 또한, 안티센스 가닥의 5'-말단 (또는, 센스 가닥의 3'-말단) 에 위치하거나 또는 그 반대인 블런트 말단을 가질 수 있다. 일반적으로, dsRNAi 제제의 안티센스 가닥은 3'-말단에서 뉴클레오티드 오버행을 가지며, 5'-말단은 블런트이다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 안티센스 가닥의 5'-말단의 비대칭 블런트 말단 및 안티센스 가닥의 3'-말단 오버행은 RISC 과정으로의 가이드 가닥 로딩을 돕는다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제는 19 개 뉴클레오티드 길이의 이중 말단 블런트머 (bluntmer) 이며, 여기서, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 7, 8, 9 에서 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 2'-F 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13 에서 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 2'-O-메틸 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
다른 구현예에서, dsRNAi 제제는 20 개의 뉴클레오티드 길이의 이중 말단 블런트머이며, 여기서, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 8, 9, 10 에서 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 2'-F 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13 에서 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 2'-O-메틸 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
또다른 구현예에서, dsRNAi 제제는 21 개의 뉴클레오티드 길이의 이중 말단 블런트머이며, 여기서, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 9, 10, 11 에서 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 2'-F 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13 에서 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 2'-O-메틸 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제는 21 개의 뉴클레오티드 센스 가닥 및 23 개의 뉴클레오티드 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 9, 10, 11 에서 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 2'-F 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함하고; 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13 에서 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 2'-O-메틸 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, RNAi 제제의 한쪽 말단은 블런트인 반면, 다른 쪽 말단은 2 개의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 바람직하게는, 2 개의 뉴클레오티드 오버행이 안티센스 가닥의 3'-말단에 존재한다.
2 개 뉴클레오티드 오버행이 안티센스 가닥의 3'-말단에 존재하는 경우, 3 개의 말단 뉴클레오티드 사이에 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이 존재할 수 있으며, 3 개의 뉴클레오티드 중 2 개는 오버행 뉴클레오티드이고, 제 3 뉴클레오티드는 오버행 뉴클레오티드 옆의 쌍을 이루는 뉴클레오티드이다. 하나의 구현예에서, RNAi 제제는 추가로 센스 가닥의 5'-말단 및 안티센스 가닥의 5'-말단 둘 모두에서 3 개의 말단 뉴클레오티드 사이에 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 가진다. 특정 구현예에서, 모티프의 일부인 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내의 모든 뉴클레오티드는 수식된 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 각각의 잔기는, 예를 들어, 교대 모티프에서, 독립적으로, 2'-O-메틸 또는 3'-플루오로로 수식된다. 선택적으로, dsRNAi 제제는 리간드 (바람직하게는 GalNAc3) 를 추가로 포함한다.
특정 구현예서, dsRNAi 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 25 내지 30 개의 뉴클레오티드 잔기 길이이며, 5' 말단 뉴클레오티드 (위치 1) 에서 시작하여, 제 1 가닥의 위치 1 내지 23 은 적어도 8 개의 리보뉴클레오티드를 포함하고; 안티센스 가닥은 36 내지 66 개 뉴클레오티드 잔기 길이이며, 3' 말단 뉴클레오티드에서 시작하여, 센스 가닥의 위치 1 내지 23과 쌍을 이루는 위치에서 적어도 8 개의 리보뉴클레오티드를 포함하여, 듀플렉스를 형성하고; 안티센스 가닥의 적어도 3' 말단 뉴클레오티드는 센스 가닥과 쌍을 이루지 않으며, 최대 6 개의 연속 3' 말단 뉴클레오티드는 센스 가닥과 쌍을 이루지 않고, 이에 의해, 1 내지 6 개의 뉴클레오티드로 된 3' 단일 가닥 오버행을 형성하고; 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍을 이루지 않는 10 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하여, 이에 의해, 10 내지 30 개 뉴클레오티드 단일 가닥 5' 오버행을 형성하고; 센스 및 안티센스 가닥이 최대 상보성을 위해 정렬되는 경우, 적어도 센스 가닥 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기 쌍을 이루어, 이에 의해, 센스 및 안티센스 가닥 간에 실질적으로 듀플렉스인 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은, 이중 가닥 핵산이 포유동물 세포로 도입되는 경우, 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해, 적어도 19개의 리보뉴클레오티드의 안티센스 가닥 길이를 따라 표적 RNA 에 충분히 상보적이고; 센스 가닥은 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 2'-F 수식의 적어도 하나의 모티프를 함유하며, 모티프 중 적어도 하나는 절단 자리에 또는 그 부근에 존재한다. 안티센스 가닥은 절단 자리에 또는 그 부근에 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 2'-O-메틸 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서, dsRNAi 제제는 적어도 25 개, 최대 29개의 뉴클레오티드 길이를 가지는 제 1 가닥, 및 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13 에서 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 2'-O-메틸 수식의 적어도 하나의 모티프를 가지는 최대 30 개 뉴클레오티드 길이를 가지는 제 2 가닥을 포함하고; 제 1 가닥의 3' 말단 및 제 2 가닥의 5' 말단은 블런트 말단을 형성하며, 제 2 가닥은 그의 3' 말단에서 제 1 가닥 보다 1 내지 4 개의 뉴클레오티드가 더 길고, 듀플렉스 영역은 적어도 25 개 뉴클레오티드 길이의 영역이며, 제 2 가닥은, dsRNAi 제제가 포유동물 세포내로 도입되는 경우, 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해, 제 2 가닥 길이의 적어도 19개의 뉴클레오티드를 따라, 표적 mRNA 에 충분히 상보적이고, RNAi 제제의 다이서 절단은 우선적으로, 제 2 가닥의 3' 말단을 포함하는 siRNA 를 초래하여, 그에 의해, 포유동물에서 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 선택적으로, dsRNAi 제제는 리간드를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제의 센스 가닥은 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함하며, 모티프 중 하나는 센스 가닥 내의 절단 자리에 존재한다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제의 안티센스 가닥은 또한, 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함할 수 있으며, 모티프 중 하나는 안티센스 가닥 내의 절단 자리 또는 그 부근에 존재한다.
17 내지 23 개의 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 가지는 dsRNAi 제제에 있어서, 안티센스 가닥의 절단 자리는 전형적으로 5'-말단으로부터 10, 11 및 12 위치 주변에 존재한다. 따라서, 3 개의 동일한 수식의 모티프는 안티센스 가닥의 위치 9, 10, 11; 위치 10, 11, 12; 위치 11, 12, 13; 위치 12, 13, 14; 또는 위치 13, 14, 15 에 존재할 수 있으며, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 제 1 뉴클레오티드로부터 시작하여 계수하거나, 또는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 제 1 뉴클레오티드로부터 시작하여 계수한다. 안티센스 가닥 내의 절단 자리는 또한, 5'-말단으로부터 dsRNAi의 듀플렉스 영역의 길이에 따라 변할 수 있다.
dsRNAi 제제의 센스 가닥은, 가닥의 절단 자리에서, 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함할 수 있으며; 안티센스 가닥은 가닥의 절단 자리에서 또는 그의 부근에서, 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 적어도 하나의 모티프를 가질 수 있다. 센스 가닥과 안티센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스를 형성하는 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 센스 가닥 상의 3 개의 뉴클레오티드의 하나의 모티프와, 안티센스 가닥 상의 3 개의 뉴클레오티드의 하나의 모티프가 적어도 하나의 뉴클레오티드 중첩을 갖도록, 즉, 센스 가닥 내의 모티프의 3 개의 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 안티센스 가닥 내의 모티프의 3 개의 뉴클레오티드 중 적어도 하나와 염기 쌍을 형성하도록, 정렬될 수 있다. 대안적으로, 적어도 2 개의 뉴클레오티드가 중첩될 수 있거나, 또는 3 개의 뉴클레오티드 모두 중첩될 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제의 센스 가닥은 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 1 개 초과의 모티프를 포함할 수 있다. 제 1 모티프는 가닥의 절단 자리 또는 그 부근에 존재할 수 있으며, 다른 모티프는 윙 (wing) 수식일 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "윙 수식" 은, 동일한 가닥의 절단 자리 또는 그 부근의 모티프로부터 분리된, 가닥의 다른 자리에 존재하는 모티프를 지칭한다. 윙 수식은 제 1 모티프에 인접해 있거나, 또는 하나 이상 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 모티프가 서로 바로 인접해 있는 경우, 모티프의 화학적 성질은 서로 구별되며, 모티프가 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있는 경우, 화학적 성질은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 2 개 또는 그 초과의 윙 수식이 존재할 수 있다. 예를 들어, 2 개의 윙 수식이 존재하는 경우, 각각의 윙 수식은 절단 자리 또는 그 부근에 존재하는 제 1 모티프에 대해 한쪽 말단에 또는 선도 모티프의 어느 하나의 측에 존재할 수 있다.
센스 가닥과 마찬가지로, dsRNAi 제제의 안티센스 가닥은 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 1 개 초과의 모티프를 포함할 수 있으며, 모티프 중 적어도 하나는 가닥의 절단 자리 또는 그 부근에 존재한다. 이러한 안티센스 가닥은 또한, 센스 가닥 상에 존재할 수 있는 윙 수식과 유사한 정렬로 하나 이상의 윙 수식을 또한 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 수식은 전형적으로, 가닥의 3'-말단, 5'-말단 또는 양쪽 말단에서 1 또는 2 개의 제 1 말단 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
다른 구현예에서, dsRNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 수식은 전형적으로, 가닥의 3'-말단, 5'-말단 또는 양쪽 말단에서 듀플렉스 영역 내에 1 개 또는 2 개의 쌍을 이룬 제 1 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
dsRNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 하나의 윙 수식을 포함하는 경우, 윙 수식은 듀플렉스 영역의 동일한 말단 상에 존재할 수 있으며, 1, 2 또는 3 개의 뉴클레오티드의 중첩을 가진다.
dsRNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 2 개의 윙 수식을 포함하는 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은, 하나의 가닥으로부터 2 개의 수식이 각각 듀플렉스 영역의 한쪽 말단에 존재하고, 1, 2 또는 3 개의 뉴클레오티드의 중첩을 가지거나; 하나의 가닥으로부터 2 개의 수식이 각각 듀플렉스 영역의 다른 쪽 말단에 존재하고, 1, 2 또는 3 개의 뉴클레오티드 중첩을 가지거나; 하나의 가닥의 2 개의 수식이 선도 모티프의 각 측에 존재하고, 듀플렉스 영역에서 1, 2 또는 3 개의 뉴클레오티드의 중첩을 가지도록 정렬될 수 있다.
일부 구현예에서, 모티프의 일부인 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내의 모든 뉴클레오티드가 수식될 수 있다. 각각의 뉴클레오티드는, 비결합 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 모두 또는 하나 이상의 결합 포스페이트 산소의 변경; 리보스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보스 당의 2'-히드록실의 변경; 포스페이트 모이어티의 "데포스포" 링커로의 대규모 대체; 자연 발생 염기의 수식 또는 대체; 및 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 수식을 하나 또는 그 이상 포함할 수 있는 동일하거나 또는 상이한 수식에 의해, 수식될 수 있다.
핵산이 하위단위의 중합체이기 때문에, 핵산 내의 반복적 위치에서, 다수의 수식, 예를 들어, 염기, 또는 포스페이트 모이어티, 또는 포스페이트 모이어티의 비-결합 O 의 수식이 발생된다. 일부 경우, 수식은 핵산의 모든 대상 위치에서 발생할 것이나, 많은 경우, 그렇지 않을 것이다. 예를 들어, 3' 또는 5' 말단 위치에서만 수식이 발생할 수 있으며, 가닥의 말단 영역, 예를 들어 말단 뉴클레오티드 상의 위치, 또는 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10 개의 뉴클레오티드에서만 발생할 수 있다. 수식은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역, 또는 두 영역 모두에서 발생할 수 있다. 수식은 dsRNAi 제제의 이중 가닥 영역에서만 발생할 수 있거나, 또는 dsRNAi 제제의 단일 가닥 영역에서만 발생할 수 있다. 예를 들어, 비결합 O 위치에서의 포스포로티오에이트 수식이 한쪽 또는 양쪽 말단에서만 발생할 수 있거나, 가닥의 말단 영역, 예를 들어, 말단 뉴클레오티드 상의 위치 또는 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10 개의 뉴클레오티드에서만 발생할 수 있거나, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 영역, 특히 말단에서 발생할 수 있다. 5' 말단 또는 말단들은 인산화될 수 있다.
예를 들어, 안정성을 향상시키기 위해, 단일 가닥 오버행, 예를 들어 5'- 또는 3'- 오버행, 또는 양쪽 모두에서, 수식된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 대리물을 포함하거나 또는 오버행에서, 특정 염기를 포함하는 것이 가능할 수 있다. 예를 들어, 오버행에 퓨린 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 3'- 또는 5'- 오버행 내의 모든 염기 또는 그 일부가, 예를 들어, 본 명세서에서 기술되는 수식에 의해, 수식될 수 있다. 수식에는, 예를 들어, 당해 기술분야에 공지된 수식을 가지는 리보스 당의 2' 위치에서의 수식의 사용, 예를 들어, 핵염기의 리보당 대신에 수식된 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'-F) 또는 2'-O-메틸의 이용, 및 포스페이트 기에서의 수식, 예를 들어, 포스포로티오에이트 수식이 포함될 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성일 필요가 없다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 독립적으로, LNA, CRN, cET, UNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 2'-히드록실 또는 2'-플루오로로 수식된다. 가닥은 1 개 초과의 수식을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 잔기는 각각 독립적으로, 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 수식된다.
적어도 2 개의 상이한 수식이 전형적으로, 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 존재한다. 그들 2 개의 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식, 또는 기타 수식일 수 있다.
특정 구현예에서, Na 또는 Nb 는 교대 패턴 (alternating pattern) 의 수식을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "교대 모티프" 는 하나 이상의 수식을 가지는 모티프를 지칭하며, 각각의 수식은 하나의 가닥의 교대 뉴클레오티드에서 발생한다. 교대 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 2 개마다 하나, 또는 뉴클레오티드 3 개마다 하나 또는 유사한 패턴을 지칭할 수 있다. 예를 들어, A, B 및 C가 각각 뉴클레오티드에 대한 하나의 유형의 수식을 나타내는 경우, 교대 모티프는 "ABABABABABAB...," "AABBAABBAABB...," "AABAABAABAAB...," "AAABAAABAAAB...," "AAABBBAAABBB...," 또는 "ABCABCABCABC...," 등일 수 있다.
교대 모티프에 포함되는 수식의 유형은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, A, B, C, D 가 각각 뉴클레오티드 상의 하나의 유형의 수식을 나타내는 경우, 교대 패턴, 즉 뉴클레오티드 2 개 마다의 수식은 동일할 수 있지만, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 각각 교대 모티프, 예를 들어 "ABABAB...,", "ACACAC...," "BDBDBD...," 또는 "CDCDCD...," 등 내의 몇몇의 가능한 수식으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNAi 제제는, 안티센스 가닥의 교대 모티프의 수식 패턴에 비하여 이동된 센스 가닥의 교대 모티프의 수식 패턴을 포함한다. 이동은, 센스 가닥의 뉴클레오티드의 수식된 기가 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 다르게 수식된 기에 상응하도록 이루어질 수 있으며, 그 반대의 경우도 그러하다. 예를 들어, dsRNA 듀플렉스에서, 센스 가닥이 안티센스 가닥과 쌍을 이루는 경우, 센스 가닥의 교대 모티프는 가닥의 5' 에서 3' 방향으로 "ABABAB" 로 시작할 수 있으며, 안티센스 가닥의 교대 모티프는 듀플렉스 영역 내의 가닥의 5' 에서 3' 방향으로 "BABABA" 로 시작할 수 있다. 또 다른 예로서, 센스 가닥의 교대 모티프는 가닥의 5' 에서 3' 방향으로 "AABBAABB" 로 시작할 수 있으며, 안티센스 가닥의 교대 모티프는 듀플렉스 영역 내의 가닥의 5' 에서 3' 방향으로 "BBAABBAA" 로 시작하여, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 수식 패턴의 완전하거나 또는 부분적인 이동이 존재하게 할 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제는, 처음의 안티센스 가닥 상의 2'-O-메틸 수식 및 2'-F 수식의 교대 모티프의 패턴에 비해 이동된 처음의 센스 가닥 상의 2'-O-메틸 수식 및 2'-F 수식의 교대 모티프의 패턴, 즉, 안티센스 가닥 상의 2'-F 수식된 뉴클레오티드와 염기 쌍을 이루는 센스 가닥 상의 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오티드 및 그 반대의 경우를 포함한다. 센스 가닥의 위치 1 은 2'-F 수식으로 시작할 수 있으며, 안티센스 가닥의 위치 1 은 2'-O-메틸 수식으로 시작할 수 있다.
3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나 이상의 모티프를 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 도입시키면, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 존재하는 초기 수식 패턴이 중단된다. 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나 이상의 모티프를 센스 또는 안티센스 가닥에 도입함에 의한, 센스 또는 안티센스 가닥의 수식 패턴의 중단은 표적 유전자에 대한 유전자 침묵화 활성을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 모티프가 임의의 가닥에 도입되는 경우, 모티프 다음의 뉴클레오티드의 수식은 모티프의 수식과 상이한 수식이다. 예를 들어, 모티프를 포함하는 서열의 부분은 "...NaYYYNb...," 이며, 여기서, "Y" 는 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 모티프의 수식을 나타내며, "Na" 및 "Nb" 는 Y 의 수식과 상이한 모티프 "YYY" 다음의 뉴클레오티드의 수식을 나타내며, Na 및 Nb 는 동일하거나 또는 상이한 수식일 수 있다. 대안적으로, 윙 수식이 존재하는 경우, Na 또는 Nb 는 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다.
iRNA 는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합을 추가로 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합 수식은 가닥의 임의의 위치에서, 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥의 임의의 뉴클레오티드에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드간 결합 수식은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오티드에서 발생할 수 있거나; 각각의 뉴클레오티드간 결합 수식은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 교대 패턴에서 발생할 수 있거나; 또는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교대 패턴에서 뉴클레오티드간 결합 수식 둘 모두를 포함할 수 있다. 센스 가닥 상의 뉴클레오티드간 결합 수식의 교대 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 센스 가닥의 상의 뉴클레오티드간 결합 수식의 교대 패턴은 안티센스 가닥 상의 뉴클레오티드간 결합 수식의 교대 패턴에 비해 이동될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 6 내지 8 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 5'-말단에 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합, 및 3'-말단에 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함하며, 센스 가닥은 5'-말단 또는 3'-말단 중 어느 한쪽에 적어도 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 포함한다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합 수식을 포함한다. 예를 들어, 오버행 영역은 2 개의 뉴클레오티드 간에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합을 가지는 2 개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드간 결합 수식은 또한, 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 말단 뉴클레오티드와 오버행 뉴클레오티드를 결합하도록 이루어질 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4 개 또는 모든 오버행 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합을 통해 결합될 수 있으며, 선택적으로, 오버행 뉴클레오티드 다음의 쌍을 이루는 뉴클레오티드와 오버행 뉴클레오티드를 결합하는 추가의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합이 존재할 수 있다. 예를 들어, 3 개의 말단 뉴클레오티드 간에는 적어도 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이 존재할 수 있으며, 3 개의 뉴클레오티드 중 2 개는 오버행 뉴클레오티드이며, 제 3 뉴클레오티드는 오버행 뉴클레오티드 다음의 쌍을 이루는 뉴클레오티드이다. 이러한 3 개의 말단 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 3'-말단, 센스 가닥의 3'-말단, 안티센스 가닥의 5'-말단 또는 안티센스 가닥의 5' 말단에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 2 개 뉴클레오티드 오버행은 안티센스 가닥의 3'-말단에 존재하며, 3 개의 말단 뉴클레오티드 간에는 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이 존재하고, 3 개의 뉴클레오티드 중 2 개는 오버행 뉴클레오티드이며, 제 3 뉴클레오티드는 오버행 뉴클레오티드 다음의 쌍을 이루는 뉴클레오티드이다. 선택적으로, dsRNAi 제제는 센스 가닥의 5'-말단과 안티센스 가닥의 5'-말단 둘 모두에서 3 개의 말단 뉴클레오티드 간에 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 추가로 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, dsRNAi 제제는 듀플렉스 내에 표적과의 미스매치(들), 또는 그의 조합을 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에 발생할 수 있다. 염기 쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 그의 특성을 기반으로 하여 평가될 수 있다 (예를 들어, 특정 쌍 형성의 회합 또는 해리의 자유 에너지에 있어서, 그와 매우 근사하거나 또는 유사한 분석이 또한 이용될 수 있으나, 가장 간단한 접근 방식은 개별 쌍 기준에서, 쌍을 시험하는 것임). 해리의 촉진이라는 관점에서, A:U 는 G:C 보다 바람직하고; G:U 는 G:C 보다 바람직하고; I:C 는 G:C 보다 바람직하다 (I=이노신). 미스매치, 예를 들어, 비정규 (non-canonical) 쌍형성 또는, 정규 쌍형성 이외의 것 (본 명세서의 다른 부분에서 개시된 바와 같음) 이 정규 (A:T, A:U, G:C) 쌍형성보다 바람직하고; 보편적인 염기를 포함하는 쌍형성이 정규 쌍형성보다 바람직하다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제는, 듀플렉스의 5' 말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진하기 위해, 독립적으로, A:U, G:U, I:C, 및 미스매치 쌍, 예를 들어, 비정규 쌍형성 또는 정규 쌍형성 이외의 것 또는, 보편적인 염기를 포함하는 쌍형성의 군으로부터 선택되는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에 처음의 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 염기 쌍 중 적어도 하나를 포함한다.
특정 구현예에서, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 위치 1 의 뉴클레오티드는 A, dA, dU, U, 및 dT 로부터 선택된다. 대안적으로, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음 1, 2 또는 3 개의 염기 쌍 중 적어도 하나는 AU 염기 쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음의 염기 쌍은 AU 염기 쌍이다.
다른 구현예에서, 센스 가닥에서의 3'-말단의 뉴클레오티드는 데옥시-티민 (dT) 이거나 또는 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 뉴클레오티드는 데옥시-티민 (dT) 이다. 예를 들어, 센스, 안티센스 가닥, 또는 양쪽 가닥의 3'-말단에 데옥시-티민 뉴클레오티드, 예를 들어, 2 개의 dT 뉴클레오티드의 짧은 서열이 존재한다.
특정 구현예에서, 센스 가닥 서열은 식 (I) 로 표시될 수 있다:
5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' (I)
식에서:
i 및 j 는 각각 독립적으로 0 또는 1 이고;
p 및 q 는 각각 독립적으로 0-6 이고;
각각의 Na 는 독립적으로 0 내지 25 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 2 개 이상의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb 는 독립적으로 0 내지 10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며;
각각의 np 및 nq 는 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내며;
여기서 Nb 및 Y 는 동일한 수식을 가지지 않으며;
XXX, YYY, 및 ZZZ 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타낸다. 바람직하게는, YYY 는 모든 2'-F 수식된 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, Na 또는 Nb 는 교대 패턴의 수식을 포함한다.
일부 구현예에서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 자리 또는 그 부근에 존재한다. 예를 들어, dsRNAi 제제가 17 내지 23 개의 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 가지는 경우, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 자리 또는 그 부근에 존재할 수 있으며 (예를 들어, 위치 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11, 12; 또는 11, 12, 13 에서 발생할 수 있음), 5'-말단의 제 1 뉴클레오티드에서 시작하여 계수하거나; 또는 선택적으로, 5'-말단의 듀플렉스 영역 내의 제 1 뉴클레오티드 쌍에서 시작하여 계수한다.
하나의 구현예에서, i 는 1 이고, j 는 0 이거나, 또는 i 는 0 이고, j 는 1 이거나, 또는 i 및 j 는 둘 모두 1 이다. 따라서, 센스 가닥은 하기 화학식으로 표시될 수 있다:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); 또는
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
센스 가닥이 식 (Ib) 로 표시되는 경우, Nb 는 0 내지 10 개, 0 내지 7 개, 0 내지 5 개, 0 내지 4 개, 0 내지 2 개 또는 0 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na 는 각각 독립적으로, 2 내지 20 개, 2 내지 15 개, 또는 2 내지 10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥이 식 (Ic) 로 표시되는 경우, Nb 는 0 내지 10 개, 0 내지 7 개, 0 내지 10 개, 0 내지 7 개, 0 내지 5 개, 0 내지 4 개, 0 내지 2 개 또는 0 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na 는 각각 독립적으로, 2 내지 20 개, 2 내지 15 개, 또는 2 내지 10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥이 식 (Id) 로 표시되는 경우, Nb 는 각각 독립적으로, 0 내지 10 개, 0 내지 7 개, 0 내지 5 개, 0 내지 4 개, 0 내지 2 개 또는 0 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 바람직하게는, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 이다. Na 는 각각 독립적으로, 2 내지 20 개, 2 내지 15 개, 또는 2 내지 10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
각각의 X, Y 및 Z는 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
다른 구현예에서, i 는 0 이고, j 는 0 이고, 센스 가닥은 하기 화학식으로 표시될 수 있다:
5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia).
센스 가닥이 식 (Ia) 로 표시되는 경우, Na 는 각각 독립적으로 2 내지 20 개, 2 내지 15 개, 또는 2 내지 10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
하나의 구현예에서, RNAi 의 안티센스 가닥 서열은 식 (II) 로 표시될 수 있다:
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
식에서:
k 및 l 은 각각 독립적으로 0 또는 1 이고;
p' 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고;
각각의 Na' 는 독립적으로 0-25 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb' 는 독립적으로 0-10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
각각의 np' 및 nq' 는 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
여기에서 Nb' 및 Y' 는 동일한 수식을 가지지 않고;
X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타낸다.
일부 구현예에서, Na' 또는 Nb' 는 교대 패턴의 수식을 포함한다.
Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 절단 자리에 또는 그의 부근에 존재한다. 예를 들어, RNAi 제제가 17 내지 23 개의 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 가지는 경우, Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 위치 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; 또는 13, 14, 15 에 존재할 수 있으며, 계수는 5'-말단으로부터 제 1 뉴클레오티드에서 시작하거나; 또는 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 제 1 뉴클레오티드에서 시작한다. 바람직하게는, Y'Y'Y' 모티프는 위치 11, 12, 13 에 존재한다.
특정 구현예에서, Y'Y'Y' 모티프는 모든 2'-OMe 수식된 뉴클레오티드이다.
특정 구현예에서, k 는 1 이고, l 은 0 이거나, 또는 k 는 0 이고, l 은 1 이거나, 또는 k 및 l 은 둘 모두 1 이다.
따라서, 안티센스 가닥은 하기 식으로 표시될 수 있다:
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3' (IIb);
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (IIc); 또는
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np' 3' (IId).
안티센스 가닥이 식 (IIb) 로 표시되는 경우, Nb ' 는 0 내지 10 개, 0 내지 7 개, 0 내지 10 개, 0 내지 7 개, 0 내지 5 개, 0 내지 4 개, 0 내지 2 개 또는 0 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na' 는 각각 독립적으로, 2 내지 20 개, 2 내지 15 개, 또는 2 내지 10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥이 식 (IIc) 로 표시되는 경우, Nb' 는 0 내지 10 개, 0 내지 7 개, 0 내지 10 개, 0 내지 7 개, 0 내지 5 개, 0 내지 4 개, 0 내지 2 개 또는 0 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na' 는 각각 독립적으로, 2 내지 20 개, 2 내지 15 개, 또는 2 내지 10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥이 식 (IId) 로 표시되는 경우, Nb' 는 각각 독립적으로, 0 내지 10 개, 0 내지 7 개, 0 내지 10 개, 0 내지 7 개, 0 내지 5 개, 0 내지 4 개, 0 내지 2 개 또는 0 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. Na' 는 각각 독립적으로 2 내지 20 개, 2 내지 15 개, 또는 2 내지 10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 바람직하게는, Nb 는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 이다.
다른 구현예에서, k 는 0 이고, l 은 0 이고, 안티센스 가닥은 하기 식으로 표시될 수 있다:
5' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 3' (Ia).
안티센스 가닥이 화학식 (IIa) 로 표시되는 경우, Na' 는 각각 독립적으로, 2 내지 20 개, 2 내지 15 개, 또는 2 내지 10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
각각의 X', Y' 및 Z' 는 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오티드는 독립적으로 LNA, CRN, UNA, cET, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-히드록실, 또는 2'-플루오로로 수식될 수 있다. 예를 들어, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 수식된다. 각각의 X, Y, Z, X', Y' 및 Z' 는 특히 2'-O-메틸 수식 또는 2'-플루오로 수식을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제의 센스 가닥은, 듀플렉스 영역이 21 개의 뉴클레오티드인 경우, 가닥의 위치 9, 10 및 11 에 존재하는 YYY 모티프를 포함할 수 있으며, 5'-말단으로부터 제 1 뉴클레오티드에서 시작하여 계수하거나, 또는 선택적으로, 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 제 1 뉴클레오티드에서 시작하여 계수하고; Y 는 2'-F 수식을 나타낸다. 센스 가닥은 듀플렉스 영역의 반대쪽 말단에 XXX 모티프 또는 ZZZ 모티프를 윙 수식으로서 추가로 포함할 수 있으며; XXX 및 ZZZ 는 각각 독립적으로 2'-OMe 수식 또는 2'-F 수식을 나타낸다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 가닥의 위치 11, 12 및 13 에 존재하는 Y'Y'Y' 모티프를 포함할 수 있으며, 5'-말단으로부터 제 1 뉴클레오티드에서 시작하여, 계수하거나, 또는 선택적으로, 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 제 1 뉴클레오티드 쌍에서 시작하여, 계수하고; Y' 는 2'-O-메틸 수식을 나타낸다. 안티센스 가닥은 듀플렉스 영역의 반대쪽 말단에 X'X'X' 모티프 또는 Z'Z'Z' 모티프를 윙 수식으로서 추가로 포함하고; X'X'X' 및 Z'Z'Z' 는 각각 독립적으로 2'-OMe 수식 또는 2'-F 수식을 나타낸다.
상기 식 (Ia), (Ib), (Ic), 및 (Id) 중 어느 하나로 표시되는 센스 가닥은 각각 식 (IIa), (IIb), (IIc), 및 (IId) 중 어느 하나로 표시되는 안티센스 가닥과 듀플렉스를 형성한다.
따라서, 본 발명의 방법에 이용하기 위한 dsRNAi 제제는, 각각의 가닥이 14 내지 30 개의 뉴클레오티드를 가지는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있으며, iRNA 듀플렉스는 식 (III) 으로 표시된다:
센스:5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
안티센스: 3' np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq ' 5'
(III)
식에서:
i, j, k, 및 l 은 각각 독립적으로 0 또는 1 이고;
p, p', q, 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고;
각각의 Na 및 Na ' 는 독립적으로 0-25 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb ' 는 독립적으로 0-10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
여기에서 각각의 np', np, nq', 및 nq 는 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타낸다.
하나의 구현예에서, i 는 0 이고, j 는 0 이거나; 또는 i 는 1 이고, j 는 0 이거나; 또는 i 는 0 이고, j 는 1 이거나; 또는 i 및 j 는 둘 모두 0 이거나; 또는 i 및 j 둘 모두 1 이다. 또 다른 구현예에서, k 는 0 이고, l 은 0 이거나; 또는 k 는 1 이고, l 은 0 이거나; k 는 0 이고, l 은 1 이거나; 또는 k 및 l 둘 모두 0 이거나; 또는 k 및 l 은 둘 모두 1 이다.
iRNA 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 예시적인 조합은 하기 식의 것들을 포함한다:
5' np -Na-YYY-Na-nq 3'
3' np '-Na '-Y'Y'Y'-Na 'nq ' 5'
(IIIa)
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
3' np '-Na '-Y'Y'Y'-Nb '-Z'Z'Z'-Na 'nq ' 5'
(IIIb)
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'
3' np '-Na '-X'X'X'-Nb '-Y'Y'Y'-Na '-nq ' 5'
(IIIc)
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
3' np '-Na '-X'X'X'-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-Z'Z'Z'-Na-nq ' 5'
(IIId)
dsRNAi 제제가 식 (IIIa) 로 표시되는 경우, 각각의 Na 는 독립적으로 2-20, 2-15, 또는 2-10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
dsRNAi 제제가 식 (IIIb) 로 표시되는 경우, 각각의 Nb 는 독립적으로 1-10, 1-7, 1-5, 또는 1-4 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na 는 독립적으로 2-20, 2-15, 또는 2-10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
dsRNAi 제제가 식 (IIIc) 로 표시되는 경우, 각각의 Nb, Nb' 는 독립적으로 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na 는 독립적으로 2-20, 2-15, 또는 2-10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
dsRNAi 제제가 식 (IIId) 로 표시되는 경우, 각각의 Nb, Nb' 는 독립적으로 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na ' 는 독립적으로 2-20, 2-15, 또는 2-10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na', Nb, 및 Nb ' 는 독립적으로 교대 패턴의 수식을 포함한다.
식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), 및 (IIId) 에서 각각의 X, Y, 및 Z 는 서로 동일 또는 상이할 수 있다.
dsRNAi 제제가 식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), 및 (IIId) 로 표시되는 경우, Y 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 Y' 뉴클레오티드 중 하나와 염기 쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, Y 뉴클레오티드 중 적어도 2 개는 상응하는 Y' 뉴클레오티드와 염기 쌍을 형성하거나; 또는 3 개의 Y 뉴클레오티드 모두가 상응하는 Y' 뉴클레오티드와 염기 쌍을 형성한다.
dsRNAi 제제가 식 (IIIb) 또는 (IIId) 로 표시되는 경우, Z 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 Z' 뉴클레오티드 중 하나와 염기 쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, Z 뉴클레오티드 중 적어도 2 개가 상응하는 Z' 뉴클레오티드와 염기 쌍을 형성하거나; 또는 3 개의 Z 뉴클레오티드 모두가 상응하는 Z' 뉴클레오티드와 염기 쌍을 형성한다.
dsRNAi 제제가 식 (IIIc) 또는 (IIId) 로 표시되는 경우, X 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 X' 뉴클레오티드 중 하나와 염기 쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, X 뉴클레오티드 중 적어도 2 개가 상응하는 X' 뉴클레오티드와 염기 쌍을 형성하거나; 또는 3 개의 X 뉴클레오티드 모두가 상응하는 X' 뉴클레오티드와 염기 쌍을 형성한다.
특정 구현예에서, Y 뉴클레오티드 상의 수식은 Y' 뉴클레오티드 상의 수식과 상이하고/거나, Z 뉴클레오티드 상의 수식은 Z' 뉴클레오티드 상의 수식과 상이하고/거나, X 뉴클레오티드 상의 수식은 X' 뉴클레오티드 상의 수식과 상이하다.
특정 구현예에서, dsRNAi 제제가 식 (IIId) 로 표시되는 경우, Na 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이다. 기타 구현예에서, RNAi 제제가 식 (IIId) 로 표시되는 경우, Na 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고, np' >0 이고, 적어도 하나의 np' 는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃 뉴클레오티드에 연결된다. 또다른 구현예에서, RNAi 제제가 식 (IIId) 로 표시되는 경우, Na 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고, np' >0 이고, 적어도 하나의 np' 는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃 뉴클레오티드에 연결되고, 센스 가닥은 이가 또는 삼가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트된다 (아래 기재됨). 기타 구현예에서, RNAi 제제가 식 (IIId) 로 표시되는 경우, Na 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고, np' >0 이고, 적어도 하나의 np' 는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃 뉴클레오티드에 연결되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고, 센스 가닥은 이가 또는 삼가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트된다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제가 식 (IIIa) 로 표시되는 경우, Na 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고, np' >0 이고, 적어도 하나의 np' 는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃 뉴클레오티드에 연결되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고, 센스 가닥은 이가 또는 삼가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트된다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제는 식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), 및 (IIId) 로 표시되는 적어도 2 개의 듀플렉스를 포함하는 다합체며, 듀플렉스는 링커에 의해 결합된다. 링커는 절단가능하거나 또는 비절단가능할 수 있다. 선택적으로, 다합체는 리간드를 추가로 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2 개의 상이한 유전자를 표적으로 할 수 있거나; 또는 듀플렉스 각각은 2 개의 상이한 표적 자리에서 동일한 유전자를 표적으로 할 수 있다.
일부 구현예에서, dsRNAi 제제는 식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), 및 (IIId) 로 표시되는 3, 4, 5, 6 개 또는 그 초과의 듀플렉스를 포함하는 다합체며, 듀플렉스는 링커에 의해 결합된다. 링커는 절단가능하거나 또는 비절단가능할 수 있다. 선택적으로, 다합체는 리간드를 추가로 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2 개의 상이한 유전자를 표적으로 할 수 있거나; 또는 듀플렉스 각각은 2 개의 상이한 표적 자리에서 동일한 유전자를 표적으로 할 수 있다.
하나의 구현예에서, 식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), 및 (IIId) 로 표시되는 2 개의 RNAi 제제는 5' 말단에서 서로 결합하며, 3' 말단 중 하나 또는 둘 모두는 리간드에 선택적으로 컨쥬게이트된다. 제제 각각은 동일한 유전자 또는 2 개의 상이한 유전자를 표적으로 할 수 있거나; 또는 제제 각각은 2 개의 상이한 표적 자리에서 동일한 유전자를 표적으로 할 수 있다.
다양한 공개문헌에, 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 다합체 iRNA 가 개시되어 있다. 이러한 공개문헌에는, 본 명세서에서, 각각 그 전문이 참조로서 포함되는 미국 특허 번호 7,858,769, WO2007/091269, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887, 및 WO2011/031520 가 포함된다.
하기에서 더욱 상세히 개시되는 바와 같이, iRNA 로의 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 컨쥬게이션을 포함하는 iRNA 는 iRNA 의 하나 이상의 특성을 최적화할 수 있다. 많은 경우, 탄수화물 모이어티는 iRNA 의 수식된 하위 단위에 부착될 것이다. 예를 들어, iRNA 의 하나 이상의 리보뉴클레오티드 하위단위의 리보스 당은 또 다른 모이어티, 예를 들어, 탄수화물 리간드가 부착된 비-탄수화물 (바람직하게는, 사이클릭) 담체로 대체될 수 있다. 하위단위의 리보스 당이 그와 같이 대체된 리보뉴클레오티드 하위단위는 본 명세서에서, 리보스 대체 수식 하위단위 (RRMS) 로 지칭된다. 사이클릭 담체는 카르보사이클릭 고리계일 수 있으며, 즉, 모든 고리 원자가 탄소 원자이거나, 또는 헤테로사이클릭 고리계일 수 있으며, 즉, 하나 이상의 고리 원자가 헤테로원자, 예를 들어 질소, 산소, 황일 수 있다. 사이클릭 담체는 모노사이클릭 고리계일 수 있거나, 또는 2 개 또는 그 초과의 고리, 예를 들어, 융합 고리를 포함할 수 있다. 사이클릭 담체는 완전 포화 고리계일 수 있거나, 또는 그것은 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있다.
리간드는 담체를 통해 폴리뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 담체는, (i) 적어도 하나의 "골격 부착점", 바람직하게는 2 개의 "골격 부착점", 및 (ii) 적어도 하나의 "테더링 (tethering) 부착점" 을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "골격 부착점" 은 작용기, 예를 들어 히드록실 기, 또는, 일반적으로 골격, 예를 들어, 리보핵산의 포스페이트, 또는 수식된 포스페이트, 예를 들어, 황 함유 골격으로의 담체의 혼입에 적절하며 이에 이용가능한 결합을 지칭한다. 일부 구현예에서, "테더링 부착점" (TAP) 은, 선택된 모이어티와 결합하는 (골격 부착점을 제공하는 원자와 구별되는) 사이클릭 담체의 구성 고리 원자, 예를 들어 탄소 원자 또는 헤테로원자를 지칭한다. 모이어티는, 예를 들어, 탄수화물, 예를 들어 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당, 또는 다당류일 수 있다. 선택적으로, 선택된 모이어티는 개재 테더링 (intervening tethering) 에 의해 사이클릭 담체에 결합한다. 따라서, 사이클릭 담체는 종종 작용기, 예를 들어 아미노기를 포함하거나, 또는 일반적으로, 또 다른 화학적 엔티티, 예를 들어 리간드의 구성 고리로의 혼입 또는 테더링에 적절한 결합을 제공할 것이다.
iRNA 는 담체를 통해 리간드에 컨쥬게이트될 수 있으며, 담체는 사이클릭 기 또는 비사이클릭 기일 수 있으며; 바람직하게는, 사이클릭 기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라히드로푸릴 및 데칼린으로부터 선택되며; 바람직하게는, 비사이클릭 기는 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격이다.
특정 구현예에서, iRNA 는 표 3 및 표 5 에 열거된 제제로부터 선택되는 제제이다. 하나의 구현예에서, iRNA 제제는 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 3221-3243 을 표적화한다. 하나의 구현예에서, RNAi 제제는 AD-67635 (SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 3224-3243 을 표적화함) 이다. 또다른 구현예에서, RNAi 제제는 AD-67637 (SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 3223-3242 을 표적화함) 이다. 이러한 제제는 리간드를 추가로 포함할 수 있다.
III. 리간드에 컨쥬게이된 iRNA
본 발명의 iRNA 의 RNA 의 또 다른 수식에는, iRNA 의 활성, 세포 분포, 또는 예를 들어 세포내로의 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 리간드, 모이어티 또는 컨쥬게이트를 iRNA 에 화학적으로 연결시키는 것이 포함된다. 이러한 모이어티에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 지질 모이어티, 예를 들어 콜레스테롤 모이어티 (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), 콜산 (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060) 이 포함된다. 특정 구현예에서, 수식에는 티오에테르, 예를 들어 베릴-S-트리틸티올 (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), 지방족 사슬, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), 또는 아다만탄 아세트산 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), 팔미틸 모이어티 (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티 (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937) 가 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 리간드는, 이것이 혼입되는 iRNA 제제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 리간드가 존재하지 않는 종에 비해서, 리간드는 선택된 표적, 예를 들어, 분자, 세포 또는 세포들 유형, 구획, 예를 들어, 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체 영역에 대해 향상된 친화성을 제공한다. 바람직한 리간드는 듀플렉스 핵산에서 듀플렉스 쌍형성에 관여하지 않는다.
리간드에는 자연 발생 물질, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA), 저밀도 지질 단백질 (LDL), 또는 글로불린); 탄수화물 (예를 들어 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린, N-아세틸갈락토사민 또는 히알루론산); 또는 지질이 포함될 수 있다. 리간드는 또한, 재조합 또는 합성 분자, 예를 들어, 합성 중합체, 예를 들어 합성 폴리아미노산일 수 있다. 폴리아미노산의 예에는 폴리리신 (PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리 (L-락티드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-히드록시프로필) 메타크릴아미드 공중합체 (HMPA), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리우레탄, 폴리 (2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 또는 폴리포스파진인 폴리아미노산이 포함된다. 폴리아민의 예에는 폴리에틸렌이민, 폴리리신 (PLL), 스페르민, 스페르미딘, 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티드모방체 폴리아민 (peptidomimetic polyamine), 덴드리머 폴리아민 (dendrimer polyamine), 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차 염, 또는 알파 나선형 펩티드가 포함된다.
리간드에는 또한 표적화 기, 예를 들어 세포 또는 조직 표적화제, 예를 들어 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어 신장 세포와 같은 특정 세포 유형과 결합하는 항체가 포함될 수 있다. 표적화 기는 갑상선 자극 호르몬, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, 일가 또는 다가 N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노오스, 다가 푸코오스, 당화 폴리아미노산, 다가 갈락토오스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙 산, 폴레이트, 비타민 B12, 비타민 A, 비오틴 또는 RGD 펩티드 또는 RGD 펩티드 모방체일 수 있다. 특정 구현예에서, 리간드는 일가 또는 다가 N-아세틸-갈락토사민이다. 특정 구현예에서, 리간드는 콜레스테롤이다.
리간드의 다른 예에는 염료, 인터칼레이팅제 (intercalating agent) (예를 들어 아크리딘), 가교제 (예를 들어 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린 (TPPC4, 텍사피린, 사피린), 폴리사이클릭 방향족 탄화수소 (예를 들어 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제 (예를 들어 EDTA), 친유성 분자, 예를 들어 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O (헥사데실) 글리세롤, 제라닐옥시헥실 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일) 리토콜산, O3-(올레오일) 콜렌산 (cholenic acid), 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진) 및 펩티드 컨쥬게이트 (예를 들어 안테나페디아 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG (예를 들어 PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지 마커, 효소, 합텐 (예를 들어 비오틴), 수송/흡수 촉진제 (예를 들어 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제 (예를 들어 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 컨쥬게이트, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP, 또는 AP 가 포함된다.
리간드는 단백질, 예를 들어 당단백질, 또는 펩티드, 예를 들어 공동 리간드에 대해 특이적 친화성을 가지는 분자, 또는 항체, 예를 들어 간 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체일 수 있다. 리간드에는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체가 포함될 수 있다. 이에는 또한 비-펩티드 종, 예를 들어, 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조 인자, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노오스 또는 다가 푸코오스가 포함될 수 있다. 리간드는, 예를 들어, 지질 다당류, p38 MAP 키나제의 활성화제 또는 NF-κB 의 활성화제일 수 있다.
리간드는 예를 들어 세포의 세포 골격을 파열시킴으로써, 예를 들어 세포의 미소관, 미세섬유, 또는 중간 필라멘트를 파열시킴으로써, iRNA 제제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 물질, 예를 들어 약물일 수 있다. 약물은, 예를 들어, 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴 (vinblastine), 사이토칼라신 (cytochalasin), 노코다졸 (nocodazole), 자플라키놀리데 (japlakinolide), 라트룬쿨린 A (latrunculin A), 팔로이딘 (phalloidin), 스윈홀리데 A (swinholide A), 인다노신 (indanocine) 또는 미오세르빈 (myoservin) 일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 iRNA 에 부착되는 리간드는 약동학적 조절제 (PK 조절제) 로 작용한다. PK 조절제에는 친유성 기, 담즙 산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩티드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등이 포함된다. 예시적 PK 조절제에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세리드, 디아실글리세리드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센 (naproxen), 이부프로펜 (ibuprofen), 비타민 E, 비오틴 등이 포함된다. 복수의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 또한, 혈청 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 따라서, 골격 내에, 다수의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 짧은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 약 5 개의 염기, 10 개의 염기, 15 개의 염기 또는 20 개의 염기의 올리고뉴클레오티드는 리간드 (예를 들어 PK 조절 리간드) 로서, 본 발명에 적용가능하다. 또한, 본 명세서에서 개시되는 구현예에서, 혈청 성분 (예를 들어 혈청 단백질) 과 결합하는 압타머가 PK 조절 리간드로서 사용하기에 적합하다.
본 발명의 리간드-컨쥬게이트된 iRNAs 는, 결합 분자의 올리고뉴클레오티드로의 부착으로부터 유래된 것과 같이, 펜던트 반응성 작용기를 보유하는 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써, 합성될 수 있다 (하기에서 기술됨). 이러한 반응성 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 이용가능한 리간드, 다양한 보호기 중 임의의 것을 보유하는 합성된 리간드 또는 이에 부착된 결합 모이어티를 가지는 리간드와 직접적으로 반응할 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트에 이용되는 올리고뉴클레오티드는 고상 합성의 잘 알려진 기술을 통해, 용이하게 통상적으로 제조할 수 있다. 이러한 합성 장비는, 예를 들어, Applied Biosystems (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 를 비롯한 다수의 판매 회사에 의해 판매된다. 당해 기술분야에 공지된 이러한 합성을 위한 기타 임의의 수단이 추가적으로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 또한, 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위하여 유사 기술을 이용하는 것도 공지되어 있다.
본 발명의 리간드-컨쥬게이트된 iRNA 및, 리간드-분자를 가지는 서열-특이적 결합 뉴클레오시드에 있어서, 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오시드는 표준 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 전구물질 또는, 결합 모이어티를 이미 가지고 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 컨쥬게이트 전구물질, 리간드 분자를 이미 가지고 있는 리간드-뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드-컨쥬게이트 전구물질 또는 비-뉴클레오시드 리간드를 가지는 빌딩 블록을 사용하여 적절한 DNA 합성기에서 조립될 수 있다.
결합 모이어티를 이미 가지고 있는 뉴클레오티드-컨쥬게이트 전구물질을 이용하는 경우, 서열-특이적 결합 뉴클레오시드의 합성이 전형적으로 완료된 후, 리간드 분자가 결합 모이어티와 반응하여, 리간드-컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드가 형성된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 결합된 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드 합성에 있어서, 상업적으로 이용가능하며 통상적으로 이용되는 표준 포스포르아미디트 및 비-표준 포스포르아미디트에 더하여, 리간드-뉴클레오시드 컨쥬게이트로부터 유래된 포스포르아미디트를 이용하여 자동 합성기에 의해 합성된다.
A. 지질 컨쥬게이트
특정 구현예에서, 리간드 또는 컨쥬게이트는 지질 또는 지질-기반 분자이다. 이러한 지질 또는 지질 기반 분자는 바람직하게는, 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민 (HSA) 과 결합한다. HSA 결합 리간드는 신체의 표적 조직, 예를 들어 비-신장 표적 조직으로의 컨쥬게이트의 분포를 가능하게 한다. 예를 들어, 표적 조직은 간의 실질 세포를 비롯한 간일 수 있다. HSA 와 결합할 수 있는 기타 분자가 또한 리간드로 이용될 수 있다. 예를 들어, 나프록센 또는 아스피린을 이용할 수 있다. 지질 또는 지질 기반 리간드는, (a) 컨쥬게이트의 분해에 대한 내성을 증가시키거나, (b) 표적 세포 또는 세포막으로의 표적화 또는 수송을 증가시키거나, (c) 혈청 단백질, 예를 들어 HSA 로의 결합을 조절하는데 사용될 수 있다.
지질 기반 리간드는, 표적 조직으로의 컨쥬게이트의 결합의 저해, 예를 들어 조절에 이용될 수 있다. 예를 들어, HSA 에 더욱 강하게 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드는 신장으로 표적화될 가능성이 적을 것이며, 따라서, 신체로부터 제거될 가능성이 적다. HSA 에 덜 강하게 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드는 신장으로의 컨쥬게이트의 표적화에 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 지질 기반 리간드는 HSA 와 결합한다. 바람직하게는, 이것은, 컨쥬게이트가 바람직하게는 비-신장 조직으로 분포되도록 하기에 충분한 친화성으로 HSA 와 결합한다. 그러나, HSA-리간드 결합이 반전될 수 없도록 친화성이 너무 강하지 않은 것이 바람직하다.
다른 바람직한 구현예에서, 지질 기반 리간드는, 컨쥬게이트가 바람직하게는 신장으로 분포되도록 하기 위해, HSA 와 약하게 결합하거나 또는 전혀 결합하지 않는다. 신장 세포를 표적으로 하는 다른 모이어티가 또한, 지질 기반 리간드 대신에 사용되거나 또는 이에 더하여 사용될 수 있다.
또다른 양상에서, 리간드는 모이어티, 예를 들어 표적 세포, 예를 들어 증식 세포에 의해 취해지는 비타민이다. 그들은, 예를 들어 악성 또는 비-악성 유형, 예를 들어 암 세포의 원치 않는 세포 증식을 특징으로 하는 장애의 치료에 특히 유용하다. 예시적인 비타민에는 비타민 A, E 및 K 가 포함된다. 기타 예시적인 비타민에는 비타민 B, 예를 들어 엽산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살 또는, 표적 세포, 예를 들어, 간 세포에 의해 취해지는 비타민 또는 영양소가 포함된다. HSA 및 저밀도 지질 단백질 (LDL) 이 또한 포함된다.
B. 세포 침투제
또다른 양상에서, 리간드는 세포-침투제, 바람직하게는 나선형 세포-침투제이다. 바람직하게는, 침투제는 양친매성 (amphipathic) 이다. 예시적인 침투제는 tat 또는 안테노페디아와 같은 펩티드이다. 침투제가 펩티드인 경우, 그것은, 펩티드 모방체, 인버토머 (invertomer), 비펩티드 또는 슈도펩티드 결합 및 D-아미노산의 이용을 포함하여, 수식될 수 있다. 나선형 침투제는, 바람직하게는 친유성 및 소유성 상을 가지는 알파-나선형 침투제가 바람직하다.
리간드는 펩티드 또는 펩티드 모방체일 수 있다. 펩티드 모방체 (또한, 본 명세서에서, 올리고펩티드 모방체로 지칭됨) 는, 자연 펩티드와 유사한 소정의 3차원 구조로 접힐 수 있는 분자이다. iRNA 제제로의 펩티드 및 펩티드 모방체의 부착은, 예를 들어, 세포 인식 및 흡수의 향상에 의해, iRNA 의 약동학적 분포에 영향을 미칠 수 있다. 펩티드 또는 펩티드 모방체 모이어티는 약 5 내지 50 개의 아미노산 길이, 예를 들어 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 개의 아미노산 길이일 수 있다.
펩티드 또는 펩티드 모방체는, 예를 들어, 세포 침투 펩티드, 양이온성 펩티드, 양친매성 펩티드 또는 소수성 펩티드 (예를 들어 주로 Tyr, Trp, 또는 Phe로 구성됨) 일 수 있다. 펩티드 모이어티는 덴드리머 펩티드, 구속된 펩티드 또는 가교성 펩티드일 수 있다. 또다른 대안으로, 펩티드 모이어티는 소수성 막 전좌 서열 (membrane translocation sequence) (MTS) 을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS-함유 펩티드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 14) 을 가지는 RFGF 이다. 소수성 MTS 를 포함하는 RFGF 유사체 (예를 들어, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:15)) 는 또한 표적화 모이어티일 수 있다. 펩티드 모이어티는 세포막을 가로지르는 펩티드, 올리고뉴클레오티드 및 단백질을 포함하는 큰 극성 분자를 운반할 수 있는 "전달" 펩티드일 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 단백질 (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO:16)) 및 드로소필라 안테나페디아 단백질 (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:17)) 로부터의 서열이 전달 펩티드로서 작용할 수 있다는 것이 발견되었다. 펩티드 또는 펩티드 모방체는 파지-디스플레이 라이브러리 또는 1-비드-1-화합물 (one-bead-one-compound) (OBOC) 조합 라이브러리로부터 확인되는 펩티드와 같이, 무작위 DNA 서열에 의해 인코딩될 수 있다 (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). 세포 표적화를 위해, 혼입된 단량체 단위를 통해, dsRNA 제제로 테더링된 펩티드 또는 펩티드 모방체의 예에는 아르기닌-글리신-아스파르트산 (RGD)-펩티드 또는 RGD 모방체가 있다. 펩티드 모이어티는 약 5 개의 아미노산 내지 약 40 개의 아미노산 길이 범위일 수 있다. 펩티드 모이어티는, 안정성을 증가시키거나, 또는 입체구조적 특성을 유도하는 것과 같은 구조적 수식을 가질 수 있다. 하기에서 개시되는 구조적 수식 중 임의의 것이 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 이용되는 RGD 펩티드는 선형 또는 환형일 수 있으며, 특정 조직(들)으로의 표적화의 촉진을 위해, 수식, 예를 들어 글리코실화 또는 메틸화될 수 있다. RGD-함유 펩티드 및 펩티드 모방체에는 합성 RGD 모방체뿐만 아니라 D-아미노산이 포함될 수 있다. RGD에 더하여, 인테그린 리간드를 표적으로 하는 다른 모이어티가 이용될 수 있다. 이러한 리간드의 바람직한 컨쥬게이트는 PECAM-1 또는 VEGF를 표적으로 한다.
"세포 침투 펩티드" 는 세포, 예를 들어 박테리아 또는 진균 세포와 같은 미생물 세포, 또는 인간 세포와 같은 포유동물 세포를 침투할 수 있다. 미생물 세포-침투 펩티드는 예를 들어, α-나선 선형 펩티드 (예를 들어 LL-37 또는 세로핀 P1), 이황화 결합-함유 펩티드 (예를 들어 α-디펜신, β-디펜신 또는 박테네신 (bactenecin)), 또는 1 또는 2 개의 우세 아미노산만을 포함하는 펩티드 (예를 들어 PR-39 또는 인돌리시딘 (indolicidin)) 일 수 있다. 세포 침투 펩티드는 또한 핵 국소화 신호 (NLS) 를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 침투 펩티드는, SV40 거대 T 항원의 NLS 및 HIV-1 gp41 의 융합 펩티드 도메인으로부터 유래된 MPG와 같은 이분 양친매성 펩티드 (bipartite amphipathic peptide) 일 수 있다 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
C. 탄수화물 컨쥬게이트
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 구현예에 있어서, iRNA 는 탄수화물을 추가로 포함한다. 탄수화물 컨쥬게이트된 iRNA 는 본 명세서에서 개시되는 바와 같이, 생체내 치료용으로 적합한 조성물뿐만 아니라 핵산의 생체내 전달에 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 "탄수화물" 은, 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 적어도 6 개의 탄소 원자 (선형, 분지형 또는 환형일 수 있음) 를 가지는 하나 이상의 단당류 단위로 구성된 탄수화물 자체인 화합물; 또는, 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 적어도 6 개의 탄소 원자 (선형, 분지형 또는 환형일 수 있음) 를 각각 가지는 하나 이상의 단당류 단위로 구성된 탄수화물 모이어티를 그의 일부로서 가지는 화합물을 지칭한다. 대표적인 탄수화물에는 당 (약 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 단당류 단위를 포함하는 단당류, 이당류, 삼당류 및 올리고당) 및, 전분, 글리코겐, 셀룰로오스 및 다당류 검과 같은 다당류가 포함된다. 구체적 단당류에는 HBV 및 그 초과의 (예를 들어 C6, C7 또는 C8) 당이 포함되며; 이당류 및 삼당류에는 2 또는 3 개의 단당류 단위를 가지는 당 (예를 들어 C6, C7 또는 C8) 이 포함된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 컨쥬게이트는 단당류이다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 컨쥬게이트는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
하나의 구현예에서, 단당류는 하기와 같은 N-아세틸갈락토사민이다
Figure pct00010
본 명세서에서 기술되는 구현예에서 사용하기 위한 또다른 대표적 탄수화물 컨쥬게이트에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 하기의 것이 포함된다:
Figure pct00011
상기 식에서, X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오티드인 경우, 다른 하나는 수소이다.
본 발명의 특정 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 본 발명의 iRNA 제제에 일가 링커를 통해 부착된다. 일부 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 본 발명의 iRNA 제제에 이가 링커를 통해 부착된다. 본 발명의 기타 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 본 발명의 iRNA 제제에 삼가 링커를 통해 부착된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 iRNA 제제에 부착된 하나의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 제제는 각각 독립적으로 이중 가닥 RNAi 제제의 복수의 뉴클레오티드에 복수의 일가 링커를 통해 부착된 복수 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6) 의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 본 발명의 iRNA 제제의 두 가닥이 하나의 가닥의 3'-말단과 복수의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 뉴클레오티드의 중단되지 않는 사슬에 의해 연결된 하나의 더 큰 분자의 일부일 때, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드는 독립적으로은 일가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함할 수 있다. 헤어핀 루프는 또한 듀플렉스의 하나의 가닥에서의 연장된 오버행에 의해 형성될 수 있다.
일부 구현예에서, 탄수화물 컨쥬게이트에는, 이에 제한되는 것은 아니나, PK 조절제 및/또는 세포 침투 펩티드와 같은, 전술된 바와 같은 하나 이상의 추가적 리간드가 추가로 포함된다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 부가적 탄수화물 컨쥬게이트는 PCT 공개 번호 WO 2014/179620 및 WO 2014/179627 에 기재된 것들을 포함한다 (이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다).
D. 링커
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시되는 컨쥬게이트 또는 리간드는, 절단가능하거나 비-절단가능한 다양한 링커로 iRNA 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다.
용어 "링커" 또는 "연결" 은, 화합물의 2 개 부분을 연결시키는, 예를 들어, 화합물의 2 개의 부분을 공유적으로 부착시키는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는 전형적으로, 직접 결합 또는 산소 또는 황과 같은 원자, NR8, C(O), C(O) NH, SO, SO2, SO2NH 또는 원자 사슬, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 치환되거나 또는 치환되지 않은 알킬, 치환되거나 또는 치환되지 않은 알케닐, 치환되거나 또는 치환되지 않은 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로사이클릴알킬, 알킬헤테로사이클릴알케닐, 알킬헤테로사이클릴알키닐, 알케닐헤테로사이클릴알킬, 알케닐헤테로사이클릴알케닐, 알케닐헤테로사이클릴알키닐, 알키닐헤테로사이클릴알킬, 알키닐헤테로사이클릴알케닐, 알키닐헤테로사이클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴과 같은 단위를 포함하며, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환되거나 또는 치환되지 않은 아릴, 치환되거나 또는 치환되지 않은 헤테로아릴, 또는 치환되거나 또는 치환되지 않은 헤테로사이클릭에 의해 중단되거나 또는 종결될 수 있으며; R8 은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다. 하나의 구현예에서, 링커는 약 1-24 개의 원자, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16, 또는 8-16 개의 원자이다.
절단가능한 연결은, 세포 밖에서는 충분히 안정하지만, 표적 세포로 유입되는 경우, 절단되어, 링커가 고정하는 2 개의 부분을 방출하는 것이다. 바람직한 구현예에서, 절단가능한 연결은, 대상체의 혈액 내에서 또는 (예를 들어 혈액 또는 혈청 내에서 발견되는 조건을 모방하거나 또는 그를 나타내도록 선택될 수 있는) 제 2 기준 조건 하에서보다, 표적 세포내에서 또는 (예를 들어 세포내 조건을 모방하거나 또는 그를 나타내도록 선택될 수 있는) 제 1 기준 조건 하에서, 적어도 약 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 또는 약 100 배 더 빠르게 절단된다.
절단가능한 연결은 절단 물질, 예를 들어 pH, 산화환원 전위 또는 분해 분자의 존재에 민감하다. 일반적으로, 절단 제제는 혈청 또는 혈액 내에서보다 세포내에서 더 우세하거나 더 높은 수준 또는 활성으로 관찰된다. 이러한 분해 제제의 예에는, 예를 들어 환원에 의해, 산화환원 절단가능 연결을 분해할 수 있는, 세포내에 존재하는 메르캅탄과 같은 산화 또는 환원 효소 또는 환원제를 비롯하여, 특정 기질에 대하여 선택되거나, 또는, 기질 특이성이 없는 산화환원제; 에스테라제; 엔도솜 또는 산성 환경을 생성할 수 있는 제제, 예를 들어 5 이하의 pH 를 초래하는 엔도솜 또는 제제; 일반 산으로 작용함으로써, 산 절단가능한 연결을 가수분해하거나 또는 분해할 수 있는 효소, (기질 특이적일 수 있는) 펩티다제 및 포스파타제가 포함된다.
이황화 결합과 같은 절단가능한 연결은 pH 에 민감할 수 있다. 인간 혈청의 pH 는 7.4 인 반면, 세포내 평균 pH 는 이보다 다소 더 낮은 약 7.1 내지 7.3 의 범위이다. 엔도솜은 5.5 내지 6.0 의 범위의 더욱 산성인 pH 를 가지며, 리소좀은 약 5.0 의 좀 더 산성인 pH 를 가진다. 일부 링커는 바람직한 pH 에서 절단되는 절단가능한 연결을 가짐으로써, 리간드로부터 세포내측 또는 세포의 원하는 구획 내로 양이온성 지질을 방출할 것이다.
링커는 특정 효소에 의해 절단될 수 있는 절단가능한 연결을 포함할 수 있다. 링커 내로 혼입되는 절단가능한 연결의 유형은 표적화되는 세포에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 간-표적화 리간드는, 에스테르기를 포함하는 링커를 통해, 양이온성 지질에 결합할 수 있다. 간 세포는 에스테라제가 풍부하며, 따라서, 링커는, 에스테라제가 풍부하지 않은 세포 유형 내에서보다 간 세포에서 더 효율적으로 절단될 것이다. 에스테라제가 풍부한 기타 세포-유형에는 폐, 신장 피질 및 고환 세포가 포함된다.
펩티드 결합을 포함하는 링커는, 간 세포 및 윤활막 세포와 같이, 펩티다제가 풍부한 세포 유형을 표적으로 하는 경우에 이용될 수 있다.
일반적으로, 후보 절단가능한 연결의 적합성은, 후보 연결을 절단하는 분해 제제 (또는 조건) 의 능력을 시험함으로써, 평가될 수 있다. 또한, 혈액 내에서 또는 기타 비표적 조직과 접촉하는 경우, 절단에 저항하는 후보 절단가능한 연결의 능력을 시험하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 제 1 조건이 표적 세포내에서의 절단을 나타내도록 선택되고, 제 2 조건이 기타 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들어 혈액 또는 혈청 내에서의 절단을 나타내도록 선택되는 것인 제 1 조건 및 제 2 조건 사이의 상대적 절단 민감성이 측정될 수 있다. 당해 평가는 무세포계에서, 세포내, 세포 배양액 내, 기관 또는 조직 배양액 내, 또는 전체 동물에서 수행될 수 있다. 무세포 또는 배양 조건에서, 초기 평가를 실시하고, 전체 동물에서의 추가 평가에 의해 확인하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 유용한 후보 화합물은, 혈액 또는 혈청 (또는, 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서) 에 비해서, 세포 (또는, 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서) 에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 배 더 빨리 절단된다.
i. 산화환원 절단가능한 연결
특정 구현예에서, 절단가능한 연결은 산화 또는 환원시에 절단되는 산화환원 절단가능한 연결이다. 환원적 절단가능한 연결의 하나의 예에는 이황화 연결 (-S-S-) 이 있다. 후보 절단가능 연결이 적절한 "환원적으로 절단가능한 연결" 인지 또는, 예를 들어, 특정 iRNA 모이어티 및 특정 표적화 제제와 사용하기에 적절한지 여부를 결정하기 위해, 본 명세서에서 개시되는 방법을 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 세포, 예를 들어 표적 세포내에서 관찰될 수 있는 절단 속도를 모방하는, 당해 기술분야에 알려진 시약을 이용한 기타 환원제, 또는 디티오트레이톨 (DTT) 과의 인큐베이션에 의해, 후보를 평가할 수 있다. 또한, 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에서, 후보를 평가할 수 있다. 한가지 경우, 후보 화합물은 혈액 내에서 최대 약 10% 절단된다. 다른 구현예에서, 유용한 후보 화합물은, 혈액 (또는, 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서) 과 비교하여, 세포내 (또는, 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건) 에서, 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 약 100 배 더 빨리 분해된다. 세포외 매질을 모방하도록 선택된 조건과 비교하여, 세포내 매질을 모방하는 것으로 선택된 조건 하에서, 표준 효소 동력학 분석을 이용하여, 후보 화합물의 절단 속도를 측정할 수 있다.
ii. 포스페이트-기반 절단가능한 연결
다른 구현예에서, 절단가능한 링커는 포스페이트-기반 절단가능한 연결을 포함한다. 포스페이트-기반 절단가능한 연결은, 포스페이트 기를 분해하거나 또는 가수분해하는 제제에 의해 절단된다. 세포에서, 포스페이트 기를 절단하는 제제의 예에는 세포내 포스파타제와 같은 효소가 있다. 포스페이트-기반 연결의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S- 이다. 바람직한 구현예는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, 및 -O-P(S)(H)-S- 이다. 바람직한 구현예는 -O-P(O)(OH)-O- 이다. 이러한 후보들은 전술된 것과 유사한 방법을 사용하여, 평가할 수 있다.
iii. 산 절단가능한 연결
다른 구현예에서, 절단가능한 링커는 산 절단가능한 연결을 포함한다. 산 절단가능한 연결은, 산성 조건 하에서 절단되는 연결이다. 바람직한 구현예에서, 산 절단가능한 연결은 약 6.5 또는 그 미만 (예를 들어 약 6.0, 5.5, 5.0, 또는 그 미만) 의 pH 를 가지는 산성 환경에서 또는, 일반 산으로 작용할 수 있는 효소와 같은 제제에 의해 절단된다. 세포에서, 엔도솜 및 리소좀과 같은 특이적으로 낮은 pH 세포 기관은 산 절단가능한 연결의 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단가능한 연결의 예에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 히드라존, 에스테르 및 아미노산의 에스테르가 포함된다. 산 절단가능한 기는 일반식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O) 을 가질 수 있다. 바람직한 구현예는, 에스테르 (알콕시 기) 의 산소에 부착된 탄소가 아릴기, 치환된 알킬기 또는 삼차 알킬기, 예를 들어 디메틸 펜틸 또는 t-부틸인 경우이다. 이러한 후보들은 전술된 것과 유사한 방법을 이용하여, 평가할 수 있다.
iv. 에스테르-기반 연결
다른 구현예에서, 절단가능한 링커는 에스테르-기반 절단가능 연결을 포함한다. 에스테르-기반 절단가능한 연결은 세포내에서 에스테라제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 절단된다. 에스테르-기반 절단가능한 연결의 예에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 기의 에스테르가 포함된다. 에스테르 절단가능한 연결은 일반식 -C(O)O-, 또는 -OC(O)- 을 가진다. 이러한 후보들은 전술된 것과 유사한 방법을 사용하여, 평가할 수 있다.
v. 펩티드-기반 절단기
또다른 구현예에서, 절단가능한 링커는 펩티드-기반 절단가능한 연결을 포함한다. 펩티드-기반 절단가능한 연결은 세포내에서 펩티다제 및 프로테제와 같은 효소에 의해 절단된다. 펩티드-기반 절단가능한 연결은, 아미노산 사이에 형성되어, 올리고펩티드 (예를 들어, 디펩티드, 트리펩티드 등) 및 폴리펩티드를 생성시키는 펩티드 결합이다. 펩티드-기반 절단가능한 기는 아미드 기 (-C(O)NH-) 를 포함하지 않는다. 아미드 기는 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키닐렌 사이에 형성될 수 있다. 펩티드 결합은, 아미노산 사이에 형성되어, 펩티드 및 단백질을 생성시키는 아미드 결합의 특수 유형이다. 펩티드 기반 절단기는 일반적으로, 아미노산 사이에 형성되어, 펩티드 및 단백질을 생성시키는 펩티드 결합 (즉, 아미드 결합) 에 한정되며, 전체 아미드 작용기가 포함되지는 않는다. 펩티드-기반 절단가능한 연결은 일반식 -NHCHRAC(O) NHCHRBC(O)-(SEQ ID NO: __) 를 가지며, 여기서 RA 및 RB는 2 개의 인접 아미노산의 R 기이다. 이러한 후보들은 전술된 것과 유사한 방법을 이용하여, 평가할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 iRNA 는 링커를 통해 탄수화물에 컨쥬게이트된다. 본 발명의 조성물 및 방법의 링커와의 iRNA 탄수화물 컨쥬게이트의 비제한적 예에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 하기의 것이 포함된다:
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
상기 식에서, X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오티드인 경우, 다른 하나는 수소이다.
본 발명의 조성물 및 방법의특정 구현예에서, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 "GalNAc" (N-아세틸갈락토사민) 유도체이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 는 식 (XXXII)-(XXXV) 중 어느 하나에 제시된 구조의 군으로부터 선택되는 2가 또는 3가 분지형 링커에 컨쥬게이트된다:
Figure pct00015
식에서:
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C 는 각각의 경우 독립적으로 0 내지 20을 나타내며, 반복 단위는 동일하거나 또는 상이할 수 있고;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C 는 각각의 경우 각각 독립적으로 존재하지 않거나, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH, 또는 CH2O 이고;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C 는 각각의 경우 독립적으로 존재하지 않거나, 알킬렌, 치환된 알킬렌이고, 여기서, 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R"), C≡C, 또는 C(O) 중 하나 이상에 의해 중단되거나 또는 종결될 수 있으며;
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C 는 각각의 경우 각각 독립적으로 존재하지 않거나, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O,
Figure pct00016
또는 헤테로사이클릴이고;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B, 및 L5C 는 리간드를 나타내며; 즉 각각의 경우 각각 독립적으로 단당류 (예를 들어 GalNAc), 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당, 또는 다당류를 나타내고; RA 는 H 또는 아미노산 측쇄이다. 3가 컨쥬게이트 GalNAc 유도체, 예를 들어, 식 (XXXV) 의 것은, 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 RNAi 제제와 이용하기에 특히 유용하다:
Figure pct00017
,
여기에서 L5A, L5B 및 L5C 는 단당류, 예를 들어 GalNAc 유도체를 나타낸다.
적합한 이가 및 삼가 분지형 링커 기 컨쥬게이트 GalNAc 유도체의 예에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 화학식 II, VII, XI, X, 및 XIII 로서 상기에서 인용된 구조가 포함된다.
RNA 컨쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 그의 전체가 본 명세서에서 참조로서 포함되는, 미국 특허 번호 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928;5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; 및 8,106,022 가 포함된다.
주어진 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 수식될 필요는 없으며, 사실상, 상술한 수식 중 하나를 초과하는 것이 단일 화합물 내 또는, 심지어 iRNA 내의 단일 뉴클레오시드에 혼입될 수 있다. 본 발명에는 또한 키메라 화합물인 iRNA 화합물이 포함된다.
본 발명의 맥락상, "키메라" iRNA 화합물 또는 "키메라" 는, 각각이 적어도 하나의 단량체 단위, 즉, dsRNA 화합물의 경우, 뉴클레오티드로 구성된 2 개 또는 그 초과의 화학적으로 구별되는 영역을 포함하는 iRNA 화합물, 바람직하게는, dsRNA 제제이다. 이러한 iRNA 는 전형적으로, iRNA 에 뉴클레아제 분해에 대한 내성의 증가, 세포 흡수의 증가 또는 표적 핵산에 대한 결합 친화성의 증가가 부여되도록, RNA 가 수식된 적어도 하나의 영역을 포함한다. iRNA 의 추가적 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 혼성체를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로 작용할 수 있다. 예로서, RNase H 는, RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RNase H 의 활성화에 의해, RNA 표적의 절단이 초래되고, 따라서, 유전자 발현의 iRNA 의 저해 효율이 현저히 향상된다. 결과적으로, 동일한 표적 영역에 혼성화하는 포스포로티오에이트 데옥시 dsRNA 에 비해서, 키메라 dsRNA 가 사용되는 경우, 더 짧은 iRNA 에 의해, 유사한 결과를 종종 얻을 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동 및 필요한 경우, 당해 기술분야에 공지된 관련 핵산 혼성화 기술에 의해 통상적으로 검출될 수 있다.
특정한 경우, iRNA 의 RNA 는 비-리간드 기에 의해 수식될 수 있다. iRNA 의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키기 위해, 다수의 비-리간드 분자가 iRNA 에 컨쥬게이트되었으며, 이러한 컨쥬게이트 수행 절차는 과학 문헌에서 입수할 수 있다. 이러한 비-리간드 모이어티에는 지질 모이어티, 예를 들어, 콜레스테롤 (Kubo, T et al., Biochem. Biophys. Res Comm, 2007, 365 (1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553) 이 포함되고 본 발명의 제제에 사용될 수 있다. 다른 비-리간드 모이어티에는 지질 모이어티, 콜산 (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올 (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 사슬, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 팔미틸 모이어티 (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티 (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923) 가 포함된다. 이러한 RNA 컨쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허가 상기에 열거되어 있다. 전형적 컨쥬게이트 프로토콜에는, 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커를 보유하는 RNA 의 합성이 포함된다. 그 후, 아미노기를, 적절한 커플링 시약 또는 활성화 시약을 이용하여, 컨쥬게이션되는 분자와 반응시킨다. 컨쥬게이션 반응은, 고체 지지체에 여전히 결합되어 있는 RNA 를 이용하거나 또는, RNA 의 절단 후 용액 상 (phase) 에서 수행할 수 있다. HPLC 에 의한 RNA 컨쥬게이트의 정제에 의해, 전형적으로 순수한 컨쥬게이트가 제공된다.
IV. 본 발명의 iRNA 의 전달
본 발명의 iRNA 의 세포, 예를 들어 인간 대상체와 같은 대상체 (예를 들어 PD-L1 유전자 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병증을 가지는 대상체와 같은 이를 필요로 하는 대상체) 내의 세포로의 전달은 다수의 상이한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 전달은, 시험관내 또는 생체내, 세포를 본 발명의 iRNA 와 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 생체내 전달은 또한, iRNA, 예를 들어 dsRNA 를 포함하는 조성물을 대상체에 투여함으로써 직접 수행될 수 있다. 대안적으로, 생체내 전달은, iRNA 를 인코딩하고 그의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터를 투여함으로써, 간접적으로 수행될 수 있다. 이러한 대안은 하기에서 추가로 논의된다.
일반적으로, (시험관내 또는 생체내) 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법이 본 발명의 iRNA 와 사용하기 위해 채용될 수 있다 (예를 들어 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함되는, Akhtar S. and Julian RL., (1992) Trends Cell. Biol. 2 (5) : 139-144 및 WO94/02595 참조). 생체내 전달에 있어서, iRNA 분자 전달을 위해 고려되는 인자에는, 예를 들어, 전달 분자의 생체 안정성, 비-특이적 효과의 저해 및 표적 조직 내의 전달 분자의 축적이 포함된다. iRNA 의 비-특이적인 효과는, 국소 투여, 예를 들어, 조직으로의 직접 주입 또는 이식 또는 제조물의 국소 투여에 의해 최소화될 수 있다. 치료 자리로의 국소 투여는 제제의 국소 농도를 최대화하고, 달리는, 제제에 의해 유해할 수 있거나, 또는 제제를 분해할 수 있는 전신 조직으로의 제제의 노출을 제한하며, 더욱 소량의 iRNA 분자의 총 투여량이 투여될 수 있도록 한다. 다수의 연구에 의해, dsRNAi 제제가 국소 투여되는 경우, 유전자 생성물의 성공적인 녹다운이 나타났다. 예를 들어, 시아노몰거스 원숭이에서, 유리체 내 주입 (Tolentino, MJ., et al. (2004) Retina 24:132-138) 및 마우스에서, 망막 하 주입 (Reich, SJ., et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216) 에 의한 VEGF dsRNA 의 안구 내 전달에 의해, 두 경우 모두, 연령 관련 황반 변성의 실험적 모델에서 신혈관 신생이 저해되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 마우스에서, dsRNA 의 직접적인 종양 내 주입에 의해, 종양 용적이 감소하고 (Pille, J., et al (2005) Mol. Ther.11:267-274), 종양 보유 마우스의 생존이 연장될 수 있다 (Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., et al (2007) Mol. Ther. 15:515-523). RNA 간섭에 의해, 직접 주입에 의한 CNS 로의 국소 전달 (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) 및 비강 내 투여에 의한 폐로의 국소 전달 (Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55) 이 또한 성공적인 것으로 밝혀졌다. 질환 치료를 위한 iRNA 의 전신 투여에 있어서, RNA 는 수식되거나, 또는, 대안적으로, 약물 전달 시스템을 이용하여 전달될 수 있으며; 두 가지 방법 모두, 생체내, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의한 dsRNA 의 급속한 분해를 저해하는 작용을 한다. RNA 또는 약제학적 담체의 수식은 또한 iRNA 의 표적 조직으로의 표적화를 가능하게 할 수 있으며, 원치 않는 표적외 효과를 회피할 수 있게 한다. iRNA 분자는, 세포 흡수를 향상시키고, 분해를 저해하기 위해, 콜레스테롤과 같은 친유성 기로의 화학적 컨쥬게이션에 의해 수식될 수 있다. 예를 들어, 친유성 콜레스테롤 모이어티에 컨쥬게이트된 ApoB 에 대해 유도된 iRNA 를 마우스에 전신 주입하였으며, 간 및 빈 창자 둘 모두에서, apoB mRNA 의 녹다운이 초래되었다 (Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178). iRNA 의 압타머로의 컨쥬게이션은 전립선암 마우스 모델에서, 종양 성장을 저해하고, 종양 퇴화를 매개하는 것이 밝혀졌다 (McNamara, JO, et al (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). 대안적 구현예에서, iRNA 는 나노입자, 덴드리머, 중합체, 리포좀 또는 양이온성 전달 시스템과 같은 약물 전달 시스템을 이용하여 전달될 수 있다. 양전하의 양이온성 전달 시스템은 iRNA 분자 (음전하) 의 결합을 용이하게 하고, 또한, 음전하를 띠는 세포막에서의 상호작용을 향상시켜, 세포에 의한 iRNA 의 효율적인 흡수를 가능하게 한다. 양이온 지질, 덴드리머 또는 중합체는 iRNA 에 결합될 수 있거나, 또는 iRNA 를 내포하는 소낭 또는 미셀 (micelle) 을 형성하도록, 유도될 수 있다 (예를 들어 Kim SH, et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116 참조). 소낭 또는 미셀의 형성은, 전신 투여되는 경우, iRNA 의 분해를 추가로 저해한다. 양이온성 iRNA 복합체의 제조 및 투여 방법은 완전히 당업자의 능력 내이다 (예를 들어 본 명세서에서, 그 전문이 참조로서 포함되는 Sorensen, DR, et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN, et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205 참조). iRNA 의 전신 전달에 유용한 약제 전달 시스템의 일부 비제한 예에는 DOTAP (상기 Sorensen, DR., et al. (2003) ; 상기 Verma, UN., et al. (2003)), 올리고펙타민, "고체 핵산 지질 입자" (Zimmermann, TS., et al. (2006) Nature 441:111-114), 카르디올리핀 (Chien, PY., et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al. (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), 폴리에틸렌이민 (Bonnet ME, et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp (RGD) 펩티드 (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487) 및 폴리아미도아민 (Tomalia, DA, et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804) 이 포함된다. 일부 구현예에서, iRNA 는 전신 투여를 위해, 사이클로덱스트린과 복합체를 형성한다. iRNA 및 사이클로덱스트린의 약제학적 조성물 및 투여 방법은, 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,427,605 에서 찾아 볼 수 있다.
A. 본 발명의 iRNA 를 인코딩하는 벡터
PD-L1 유전자를 표적으로 하는 iRNA 는, DNA 또는 RNA 벡터로 삽입된 전사 단위로부터 발현될 수 있다 (예를 들어 Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., 국제 PCT 공보 WO 00/22113, Conrad, 국제 PCT 공보 번호 WO 00/22114, 및 Conrad, 미국 특허 번호 6,054,299 참조). 발현은, 사용된 특정 작제물 및 표적 조직 또는 세포 유형에 따라, 일시적 (수 시간 내지 수 주) 일 수 있거나, 또는 지속적 (수 주 내지 수개월 또는 그 초과) 일 수 있다. 이러한 트랜스유전자는, 통합 (integrating) 또는 비통합 벡터일 수 있는 선형 작제물, 원형 플라스미드, 또는 바이러스 벡터로서 도입될 수 있다. 트랜스유전자는 또한, 염색체 외 플라스미드로서 유전될 수 있도록 작제될 수 있다 (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
iRNA 의 각각의 가닥 또는 가닥들은 발현 벡터 상의 프로모터로부터 전사될 수 있다. 2 개의 개별 가닥들이 발현되어, 예를 들어, dsRNA 가 생성되는 경우, 2 개의 개별 발현 벡터는 표적 세포로 (예를 들어 트랜스펙션 또는 감염에 의해) 동시 도입될 수 있다. 대안적으로, dsRNA 의 각각의 개별 가닥은, 둘 모두 동일한 발현 플라스미드 상에 위치하는 프로모터에 의해 전사될 수 있다. 하나의 구현예에서, dsRNA 는, 링커 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 결합된 역 반복 (inverted repeat) 폴리뉴클레오티드로서 발현되어, dsRNA 가 스템 및 루프 구조를 갖게 한다.
iRNA 발현 벡터는 일반적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 진핵 세포와 양립가능한 발현 벡터, 바람직하게는 척추동물 세포와 양립가능한 발현 벡터는 본 명세서에서 기술된 바와 같이, iRNA 의 발현을 위한 재조합 작제물의 생성에 이용할 수 있다. 진핵 세포 발현 벡터는 당해 기술분야에 잘 공지되어 있으며, 다수의 상업적 공급원으로부터 구할 수 있다. 전형적으로, 원하는 핵산 절편의 삽입을 위한 용이한 제한 자리를 포함하는 이러한 벡터가 제공된다. iRNA 발현 벡터의 전달은, 정맥 내 또는 근육 내 투여에 의하거나, 환자로부터 외식 (explantation) 된 표적 세포로의 투여 후, 상기 대상체로의 재도입에 의해, 또는 원하는 표적 세포로의 도입을 가능하게 하는 기타 임의의 수단에 의해, 전신적으로 이루어질 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 의해, 사용될 수 있는 바이러스 벡터 시스템에는, 이에 제한되는 것은 아니나, (a) 아데노바이러스 벡터; (b) 이에 제한되는 것은 아니나, 렌티바이러스 벡터, 몰로니 설치류 백혈병 바이러스 등을 비롯한 레트로바이러스 벡터; (c) 아데노 관련 바이러스 벡터; (d) 단순 포진 바이러스 벡터; (e) SV 40 벡터; (f) 폴리오마 바이러스 벡터; (g) 유두종 바이러스 벡터; (h) 피코르나바이러스 벡터; (i) 수두 바이러스 벡터, 예를 들어 오르토폭스 (orthopox), 예를 들어 우두 바이러스 벡터 또는 조류두, 예를 들어 카나리아 수두 또는 계두; 및 (j) 헬퍼 (helper)-종속 또는 무력화 (gutless) 아데노바이러스가 포함된다. 복제-결함 바이러스가 또한 유리할 수 있다. 상이한 벡터가 세포 게놈으로 혼입되거나 또는 혼입되지 않을 것이다. 작제물은, 필요에 따라, 트랜스펙션을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 작제물은, 에피솜 복제가 가능한 벡터, 예를 들어 EPV 및 EBV 벡터로 혼입될 수 있다. iRNA 의 재조합 발현을 위한 작제물은 일반적으로, 표적 세포에서 iRNA 의 발현을 확보하기 위해, 조절 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서 등을 요구할 것이다. 벡터 및 작제물에 있어서, 고려되는 다른 양상이 당해 기술분야에 알려져 있다.
V. 본 발명의 약학적 조성물
본 발명은 또한, 본 발명의 iRNA 를 포함하는 약학적 조성물 및 제형을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 iRNA 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 본 명세서에서 제공된다. iRNA 를 포함하는 약학적 조성물은, PD-L1 유전자의 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애의 치료에 유용하다. 이러한 약학적 조성물은 전달 방식을 기반으로 제형화된다. 하나의 예는 비경구 전달을 통해, 예를 들어, 피하 (SC) 또는 정맥내 (IV) 전달에 의해 전신 투여용으로 제형화되는 조성물이다. 본 발명의 약학적 조성물은 PD-L1 유전자의 발현의 저해에 충분한 투여량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 PD-L1 유전자의 발현의 저해에 충분한 투여량으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 iRNA 의 적합한 용량은 일당 수여자의 체중 ㎏ 당 약 0.001 내지 약 200.0 밀리그램의 범위일 것이며, 일반적으로 일당 체중 ㎏ 당 약 1 내지 50 ㎎ 의 범위일 것이다. 전형적으로, 본 발명의 iRNA 의 적합한 용량은 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 5.0 ㎎/㎏, 예를 들어, 약 0.3 ㎎/㎏ 내지 약 3.0 ㎎/㎏ 의 범위일 것이다. 반복-용량 섭생법은 정기적 체계로, 예컨대 격일로 또는 년 1 회로의, 치료량의 iRNA 의 투여를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, iRNA 는 월 약 1 회 내지 분기 당 약 1 회 투여된다 (즉, 3 개월 마다 약 1 회).
초기 치료 섭생법 후, 치료는 덜 빈번한 체계로 투여될 수 있다. 예를 들어, 3 개월 동안의 매주 또는 격주 투여 후, 6 개월 또는 1 년 또는 그 초과의 기간 동안, 월 1 회 반복 투여될 수 있다.
약학적 조성물은 매일 1 회 투여될 수 있거나, 또는 iRNA 는, 하루종일 적절한 간격으로 2, 3 또는 그 초과의 횟수의 하위 투여량으로 또는 심지어 연속 주입 또는 방출 조절 제형을 통한 전달을 이용하여 투여될 수 있다. 이러한 경우, 각각의 하위 투여량에 포함된 iRNA 는, 일일 총 투여량을 달성하기 위해, 그에 상응하게 더욱 소량이어야 한다. 투여량 단위는 또한, 예를 들어 수일 동안, iRNA 의 지속 방출을 제공하는 통상의 지속 방출 제형을 이용하여, 수일 동안의 전달을 위해 배합될 수 있다. 지속 방출 제형은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있으며, 특정 자리에서의 제제의 전달을 위해 특히 유용하며, 예를 들어 본 발명의 제제와 함께 사용될 수 있다. 이 구현예에서, 투여량 단위는 상응하는 복수의 일일 투여량을 포함한다.
다른 구현예에서, 약학적 조성물의 단일 투여량은, 후속 투여량이 3, 4 또는 5일 이하의 간격, 또는 1, 2, 3 또는 4 주 이하의 간격으로 투여되도록, 장기 지속될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 단일 용량의 본 발명의 약학적 조성물은 주 1 회 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 단일 용량의 본 발명의 약학적 조성물은 2 개월마다 투여된다. 특정 구현예에서, iRNA 는 매월 약 1 회 내지 분기 당 약 1 회 (즉, 약 3 개월 마다 1 회 투여된다).
당업자는, 이에 제한되는 것은 아니나, 질환 또는 장애의 중증도, 선행 치료, 대상체의 일반적 건강 상태 또는 연령 및 존재하는 기타 질환을 비롯한 특정 인자가 대상체의 효과적 치료에 필요한 투여량 및 시기에 영향을 줄 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 치료학적 유효량의 조성물을 이용한 대상체의 치료에는 단일 치료 또는 일련의 치료가 포함될 수 있다. 본 발명에 의해 포괄되는 개별 iRNA 의 효과적 투여량 및 생체내 반감기의 추산은, 당해 기술분야에 알려진 바와 같이, 적합한 동물을 사용한 생체내 시험을 기반으로 하거나 또는 통상의 방법론을 이용하여, 행해질 수 있다.
예를 들어, 간염 B 감염의 동물 모델은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 침팬지, 우드척, 및 HBV 의 트랜스제닉 마우스 모델을 포함한다 (Wieland, 2015. Cold Spring Harb. Perspect. Med., 5:a021469, 2015; Tennant and Gerin, 2001. ILAR Journal, 42:89-102; 및 Moriyama et al., 1990. Science, 248:361-364). 침팬지 모델은 또한 간염 D 감염에 관한 모델로서 사용될 수 있다. 화학적으로 유도된 및 이종이식 종양을 포함하는 다수의 암 모델이 당해 기술분야에 알려져 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 국소 또는 전신 치료의 필요 여부 및 치료 자리에 따라, 다양한 방식으로 투여될 수 있다. (예를 들어 경피 패치에 의한) 국소, 폐, 예를 들어 분무기에 의한 것을 비롯한 것으로서, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기 (insufflation); 기관삽관, 비강 내, 표피 및 경피, 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여에는 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복막 내 또는 근육 내 주입 또는 주사; 피하층 (subdermal), 예를 들어 이식 장치를 통하거나; 또는 두개 내, 예를 들어 뇌실질 내, 척수강 내 또는 뇌실 내 투여가 포함된다.
iRNA 는 특정 조직 (예를 들어, 간 세포) 을 표적으로 하는 방식으로 전달될 수 있다.
국소 또는 경피 투여를 위한 약학적 조성물 및 제형에는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 드롭, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말이 포함될 수 있다. 통상의 약학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅 콘돔, 장갑 등이 또한 유용할 수 있다. 적절한 국소 제형에는, 본 발명에서 특징으로 하는 iRNA 가 국소 전달 제제 예를 들어 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제 및 계면활성제와 혼합되어 있는 것들이 포함된다. 적절한 지질 및 리포좀에는 중성 (예를 들어 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아롤리포스파티딜 콜린), 음성 (예를 들어 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성 (예를 들어 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA) 이 포함된다. 본 발명에서 특징으로 하는 iRNA 는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있거나, 또는 복합체, 특히 양이온 리포좀을 형성할 수 있다. 대안적으로, iRNA 는 지질, 특히 양이온성 지질로 복합체화될 수 있다. 적절한 지방산 및 에스테르에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 아라키돈산, 올레산, 에이코사노산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로펩탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 C1-20 알킬 에스테르 (예를 들어 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염) 가 포함된다. 본 명세서에서, 참조로서 포함되는 미국 특허 번호 6,747,014호에 국소 제형에 대해, 상세히 개시되어 있다.
A. 막 분자 조립체를 포함하는 iRNA 제형
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 iRNA 는 전달을 위해, 막 분자 조립체, 예를 들어 리포좀 또는 미셀 내에 제형화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "리포좀" 은, 하나 이상의 이중 층, 예를 들어 하나의 이중 층 또는 복수의 이중 층 내에 배열된 양친매성 지질로 구성된 소낭을 지칭한다. 리포좀에는, 친유성 물질로부터 형성된 막 및 수성 내부를 가지는 단일 층상 또는 다중 층상 소낭이 포함된다. 상기 수성 부분은 iRNA 조성물을 포함한다. 상기 친유성 제제는, 일부 예의 경우, 그러할 수 있다 할지라도, 전형적으로는 iRNA 를 포함하지 않는 수성 외부로부터 수성 내부를 분리한다. 리포좀은 작용 자리로의 활성 성분의 수송 및 전달에 유용하다. 리포좀 막이 생체 막과 구조적으로 유사하기 때문에, 리포좀이 조직에 적용되는 경우, 리포좀 이중 층은 세포막 이중 층과 융합된다. 리포좀과 세포의 합체가 진행됨에 따라, iRNA 를 포함하는 내부 수성 내용물이 세포로 전달되며, 여기서, iRNA 는 표적 RNA 와 특이적으로 결합할 수 있고, iRNA 간섭을 매개할 수 있다. 일부 경우, 리포좀은 또한, 예를 들어 iRNA 를 특정 세포 유형으로 유도하기 위해, 특이적으로 표적화된다.
iRNA 제제를 포함하는 리포좀은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 하나의 실시예에서, 리포좀의 지질 성분은, 미셀이 지질 구성성분으로 형성되도록 세정제에 용해된다. 예를 들어, 지질 성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 컨쥬게이트일 수 있다. 상기 세정제는 높은 임계 미셀 농도를 가질 수 있으며, 비이온성일 수 있다. 예시적 세정제에는 콜레이트, CHAPS, 옥틸글루코시드, 데옥시콜레이트 및 라우로일 사르코신이 포함된다. 그 후, iRNA 제제 제조물을, 지질 성분을 포함하는 미셀에 첨가한다. 상기 지질의 양이온 기는 iRNA 제제와 상호작용하고, iRNA 제제 주위에 응축되어, 리포좀이 형성된다. 응축 후, 세정제를, 예를 들어 투석에 의해 제거하여, iRNA 제제의 리포좀 제조물을 생성시킨다.
필요에 따라, 응축 반응 동안, 응축을 보조하는 담체 화합물이, 예를 들어조절 첨가에 의해 첨가될 수 있다. 예를 들어, 상기 담체 화합물은 핵산 이외의 중합체 (예를 들어 스페르민 또는 스페르미딘) 일 수 있다. 또한, pH 를 조절하여 응축을 보조할 수 있다.
전달 비히클의 구조적 구성성분으로서 폴리뉴클레오티드/양이온 지질 복합체를 혼입하는 안정한 폴리뉴클레오티드 전달 비히클의 생성 방법은, 예를 들어 그의 전체가 본 명세서에서 참조로 포함되는 WO 96/37194 에 추가로 기술되어 있다. 리포좀 형성은 또한, Felgner, P L et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; 미국 특허 번호 4,897,355호; 미국 특허 번호 5,171,678; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; 및 Fukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984 에 기술된 예시적인 방법의 하나 이상의 양상을 포함할 수 있다. 전달 비히클로서 사용하기에 적당한 크기의 지질 응집체의 제조를 위한 통상 사용 기술에는 초음파처리 및 동결-해동 플러스 압출이 포함된다 (예를 들어 Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986 참조). 일정한 소형 (50 nm 내지 200 nm) 의 비교적 균일한 응집체를 원하는 경우, 미세유동화를 사용할 수 있다 (Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). 이러한 방법은 iRNA 제제 제조물을 리포좀으로 패키징하는데 간편하게 채택된다.
리포좀은 2 개의 광범위한 종류에 속한다. 양이온성 리포좀은 양전하를 띠는 리포좀이며, 이것은 음전하를 띠는 핵산 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성한다. 양전하를 띠는 핵산/리포좀 복합체는 음전하를 띠는 세포 표면과 결합하고, 엔도솜에 내재화된다. 엔도솜 내의 산성 pH로 인해, 리포좀이 파열되고, 그 내용물이 세포의 세포질로 방출된다 (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
pH-민감성이거나 또는 음전하를 띠는 리포좀은, 핵산과 복합체화하기 보다는 핵산을 포획한다. 핵산 및 지질은 비슷한 전하를 띠므로, 복합체를 형성하기 보다는 반발력이 발생한다. 그럼에도 불구하고, 일부 핵산은 이러한 리포좀의 수성 내부에 포획된다. pH-민감성 리포좀은, 배양시, 세포 단일 층으로 티미딘 키나제 유전자를 인코딩하는 핵산을 전달하는데 이용되어 왔다. 외인성 유전자의 발현을 표적 세포에서 검출했다 (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
하나의 중요한 유형의 리포좀 조성물로는 자연-유래 포스파티딜콜린 이외의 인지질이 포함된다. 중성 리포좀 조성물은, 예를 들어, 디미리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC) 으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포좀 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되고, 음이온성 융합성 리포좀은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE) 으로부터 형성된다. 다른 유형의 리포좀 조성물은, 예를 들어, 대두 PC 및 계란 PC와 같은 포스파티딜콜린 (PC) 으로부터 형성된다. 다른 유형은 인지질, 포스파티딜콜린, 및 콜레스테롤 중 둘 이상의 혼합물로부터 형성된다.
시험관내 및 생체내 리포좀을 세포로 도입하는 다른 방법의 예에는 미국 특허 번호 5,283,185 및 5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; 및 Strauss EMBO J. 11:417, 1992 이 포함된다.
또한, 비이온성 리포좀 시스템, 특히, 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템을, 피부로의 약제의 전달에서의 그 유용성을 측정하기 위해, 조사했다. 마우스 피부의 진피로 사이클로스포린-A 를 전달하기 위해, Novasome™ I (글리세릴 딜라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 Novasome™ II (글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 를 포함하는 비이온성 리포좀 제형을 사용했다. 그 결과에 따르면, 이러한 비이온성 리포좀 시스템이 사이클로스포린-A 의 피부의 다른 층으로의 침착을 촉진시키는데 효과적이라는 것을 시사한다 (Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466).
리포좀에는 또한 "입체적으로 안정한" 리포좀이 포함되며, 본 명세서에서 사용되는 상기 용어는, 하나 이상의 특수 지질을 포함하는 리포좀으로서, 하나 이상의 특수 지질이 리포좀에 혼입되는 경우, 이러한 특수 지질이 결여된 리포좀에 비해서, 순환 수명의 향상이 초래되는 리포좀을 지칭한다. 입체적으로 안정한 리포좀의 예로는, 리포좀의 소낭-형성 지질 부분의 일부가, (A) 모노시알로강글리오시드 GM1 과 같은 하나 이상의 당지질을 포함하거나, 또는 (B) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티와 같은 하나 이상의 친수성 중합체에 의해, 유도체화된 것들이 있다. 임의의 특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 적어도, 강글리오시드, 스핑고미엘린 또는 PEG-유도체화 지질을 포함하는 입체적으로 안정한 리포좀에 있어서, 이러한 입체적으로 안정한 리포좀의 향상된 순환 반감기는 세망내피계통 (RES) 의 세포로의 섭취의 감소로부터 유래한다는 것이, 당해 기술분야에 주지되어 있다 (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
하나 이상의 당지질을 포함하는 다양한 리포좀이 당해 기술분야에 공지되어 있다. Papahadjopoulos et al. (Ann. N. Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) 은, 리포좀의 혈액 반감기를 향상시키는 모노시알로강글리오시드 GM1, 갈락토세레브로시드 설페이트 및 포스파티딜리노시톨의 능력을 보고했다. 이러한 시험 결과는 Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949) 에 의해 상세히 설명되었다. 둘 모두 Allen et al. 에 의한 미국 특허 번호 4,837,028 및 WO 88/04924 는 (1) 스핑고미엘린 및 (2) 강글리오시드 GM1 또는 갈락토세레브로시드 설페이트 에스테르를 포함하는 리포좀을 기술한다. 미국 특허 번호 5,543,152호 (Webb 등) 는 스핑고미엘린을 포함하는 리포좀을 기술한다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포좀은 WO 97/13499 (Lim 등) 에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 양이온성 리포좀이 사용된다. 양이온성 리포좀은 세포막으로 융합할 수 있는 이점을 가진다. 비-양이온성 리포좀은 비록 원형질막과 효율적으로 융합할 수 없다고 하더라도, 생체내 대식세포에 의해 섭취되며, iRNA 제제를 대식세포로 전달하는데 이용될 수 있다.
리포좀의 다른 이점에는 하기의 것들이 포함된다: 자연 인지질로부터 수득된 리포좀은 생화합성 및 생분해성이고; 리포좀에는 광범위한 물 및 지질 용해성 약제가 혼입될 수 있으며; 리포좀은 그 내부 격실에 캡슐화된 iRNA 를 물질 대사 및 분해로부터 보호할 수 있다 (Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). 리포좀 제형의 제조에 있어서 중요한 고려사항은 리포좀의 지질 표면 전하, 소낭 크기 및 수성 용적이다.
핵산과 자발적으로 상호작용하여, 지질-핵산 복합체를 형성하고, 조직 배양 세포의 세포막의, 음전하를 띠는 지질과 융합함으로써, iRNA 제제의 전달을 초래하는 소형 리포좀의 형성에 있어서, 양전하를 띠는 합성 양이온성 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 가 사용된다 (예를 들어 DOTMA 및 그의 DNA 와의 사용에 대한 설명을 위해, Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 및 미국 특허 번호 4,897,355 참조).
DOTMA 유사체인 1,2-비스 (올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니아) 프로판 (DOTAP) 는 인지질과 조합하여 DNA-복합 소낭을 형성하는데 사용될 수 있다. Lipofectin™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) 은, 음전하를 띠는 폴리뉴클레오티드와 자발적으로 상호작용하여, 복합체를 형성하는, 양전하를 띠는 DOTMA 리포좀을 포함하는 것으로서, 살아 있는 조직 배양 세포로, 고도의 음이온성 핵산을 전달하는데, 효과적인 제제이다. 충분한 양전하를 띠는 리포좀이 이용되는 경우, 생성된 복합체의 순 전하 역시 양전하이다. 이러한 방식으로 제조된 양전하를 띠는 복합체는 음전하를 띠는 세포 표면에 자발적으로 부착되고, 원형질막과 융합된 후, 예를 들어 조직 배양 세포로 기능성 핵산을 효과적으로 전달한다. 또다른 상업적으로 구할 수 있는 양이온성 지질인, 1,2-비스 (올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모니아) 프로판 ("DOTAP") (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) 은, 올레오일 모이어티가 에테르 결합보다는 에스테르에 의해 결합한다는 점에서 DOTMA 와 다르다.
보고된 다른 양이온성 지질 화합물에는, 예를 들어, 두 가지 유형의 지질 중 하나에 컨쥬게이트되고, 5-카르복시스페르밀글리신 디옥타올레오일아미드 ("DOGS") (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) 및 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카르복시스페르밀-아미드 ("DPPES") 와 같은 화합물을 포함하는 카르복시스페르민을 포함하는 다양한 모이어티들에 컨쥬게이트된 것들이 포함된다 (예를 들어 미국 특허 번호 5,171,678 참조).
또다른 양이온성 지질 컨쥬게이트에는, DOPE 와 조합되어 리포좀으로 제형화되는, 콜레스테롤 ("DC-Chol") 과 지질의 유도체화가 포함된다 (Gao, X. 및 Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991 참조). 폴리리신과 DOPE의 컨쥬게이트에 의해 제조되는 리포폴리리신이 혈청의 존재하에, 트랜스펙션에 효과적인 것으로 보고되어 있다 (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). 특정 세포주에서, 컨쥬게이트된 양이온성 지질을 포함하는 이러한 리포좀은 DOTMA-함유 조성물보다 낮은 독성을 나타내며, 더욱 효과적인 트랜스펙션을 제공한다고 언급되고 있다. 기타 상업적으로 입수가능한 양이온성 지질 생성물에는 DMRIE 및 DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) 및 리포펙타민 (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland) 이 포함된다. 올리고뉴클레오티드의 전달에 적합한 기타 양이온성 지질이 WO 98/39359 및 WO 96/37194 에 기술되어 있다.
리포좀 제형은 국소 투여에 특히 적합하며, 리포좀은 다른 제형보다 다수의 이점을 제공한다. 이러한 이점에는, 투여 약제의 높은 전신 흡수율과 관련된 부작용의 감소, 원하는 표적에서의 투여 약제의 축적의 증가 및 피부로 iRNA 제제를 투여하는 능력이 포함된다. 일부 구체예에서, 리포좀은 iRNA 제제를 상피 세포로 전달하고, 또한, iRNA 제제의 피부 조직, 예를 들어 피부로의 투과를 향상시키기 위해, 이용된다. 예를 들어, 리포좀은 국소적으로 적용될 수 있다. 리포좀으로 제형화되는 약제의 피부로의 국소 전달이 보고되었다 (예를 들어 Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 and du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987 참조).
또한, 비이온성 리포좀 시스템, 특히, 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템을, 피부로의 약제의 전달에서의 그 유용성을 측정하기 위해, 조사했다. 노바솜 (Novasome) ™ I (글리세릴 딜라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 노바솜™ II (글리세릴 디스테아레이트/ 콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 를 포함하는 비이온성 리포좀 제형은 마우스 피부의 표피로 약제를 전달하는데 사용했다. iRNA 제제를 가지는 이러한 제형은 피부 장애를 치료하는데 유용하다.
iRNA 를 포함하는 리포좀은 고도로 수식 가능하게 제조될 수 있다. 이러한 수식 가능함은, 리포좀이 상기 리포좀의 평균 반경보다 더 작은 기공을 통해, 투과될 수 있도록 한다. 예를 들어, 트랜스퍼솜 (transfersome) 은 일종의 수식 가능한 리포좀이다. 트랜스퍼솜은, 표면 엣지 활성화제 (surface edge activator), 일반적으로 계면활성제를 표준 리포좀 조성물에 첨가함으로써 제조될 수 있다. iRNA 를 포함하는 트랜스퍼솜은, 예를 들어, iRNA 를 피부의 각질 세포로 전달하기 위해, 감염에 의해 피하로 전달될 수 있다. 무손상 포유 동물의 피부를 통과하기 위해, 지질 소낭은, 적절한 경피 구배의 영향하에, 각각이 50 nm 미만의 직경을 가지는 일련의 미세 기공들을 통해, 통과되어야 한다. 또한, 지질 특성으로 인해, 이러한 트랜스퍼솜은 자가-최적화 (예를 들어 피부 기공의 형상으로의 적응), 자가-복구할 수 있으며, 빈번한 경우, 단편화되지 않으면서, 그의 표적에 도달할 수 있고, 종종 자가-부하할 수 있다.
본 발명에 적용 가능한 기타 제형이 WO 2008/042973 에 기술되어 있다.
트랜스퍼솜은 다른 유형의 리포좀이며, 고도로 수식 가능한 지질 응집체이고, 약제 전달 비히클로서, 매력적인 후보이다. 트랜스퍼솜은 고도로 수식가능 하여, 소적보다 더 작은 기공을 통해, 용이하게 투과할 수 있는 지질 소적으로 기술할 수 있다. 트랜스퍼솜은, 이러한이 사용되는 환경에 맞게 조정될 수 있으며, 예를 들어 그들은 자가-최적화하고 (피부 내의 기공의 형상으로 적응됨), 자가-복구하며, 빈번한 경우, 단편화되지 않으면서, 그의 표적에 도달하고, 종종 자가-부하한다. 트랜스퍼솜 제조에서, 표면 엣지-활성화제, 일반적으로는 계면활성제를 표준 리포좀 조성물에 첨가하는 것이 가능하다. 트랜스퍼솜은 피부에 혈청 알부민을 전달하는데 이용되어 왔다. 혈청 알부민의 트랜스퍼솜-매개 전달은 혈청 알부민을 포함하는 용액의 피하 주입으로서, 효과적인 것으로 밝혀졌다.
계면활성제는, 에멀전 (마이크로에멀전 포함) 및 리포좀과 같은 제형에서, 광범위한 용도를 발견한다. 다른 다수 유형의 자연 및 합성 계면활성제 양자의 특성을 분류하여, 서열화하기 위한 가장 통상적인 방법은 친수성/친유성 균형 (HLB) 을 사용하는 것이다. 친수성 기 (또한, "헤드 (head) " 로서 알려짐) 의 특성은, 제형에 사용되는 다른 계면활성제의 범주화를 위해, 가장 유용한 수단을 제공한다 (Rieger, "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
계면활성제 분자가 이온화되지 않는 경우, 이것은 비이온성 계면활성제로 분류된다. 비이온성 계면활성제는 약학적 생성물 및 화장품에서 광범위한 용도를 발견하며, 광범위한 pH 값으로 사용할 수 있다. 일반적으로, 그 HLB 값은 그 구조에 따라 2 내지 약 18 의 범위이다. 비이온성 계면활성제에는 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 수크로스 에스테르 및 에톡시화 에스테르와 같은 비이온성 에스테르가 포함된다. 지방 알코올 에톡실레이트, 프로폭시화 알코올 및 에톡시화/프로폭시화 블록 중합체와 같은 비이온성 알칸올아미드 및 에테르가 또한 이러한 종류에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비이온성 계면활성제 종류 중 가장 일반적인 멤버이다.
물에 용해되거나 분산되는 경우, 계면활성제 분자가 음전하를 띤다면, 상기 계면활성제는 음이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제에는 카브록실레이트, 예를 들어 비누, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 황산의 에스테르, 예를 들어 알킬 설페이트 및 에톡시화 알킬 설페이트, 설포네이트, 예를 들어 알킬 벤젠 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포석시네이트 및 포스페이트가 포함된다. 음이온성 계면활성제 종류 중 가장 중요한 멤버는 알킬 설페이트 및 비누이다.
물에 용해되거나 분산되는 경우, 계면활성제 분자가 양전하를 보유한다면, 상기 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제에는 4차 암모늄 염 및 에톡시화 아민이 포함된다. 4차 암모늄 염은 이 종류 중 가장 많이 이용되는 멤버이다.
계면활성제 분자가 양전하 또는 음전하 중 어느 하나를 보유하는 능력을 가지는 경우, 상기 계면활성제는 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제에는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 포스파티드가 포함된다.
의약 제품, 제형 및 에멀전에서의 계면활성제의 사용이 검토되었다 (Rieger, "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
본 발명의 방법에 사용되는 iRNA 는 또한 미셀 제형으로 제공될 수 있다. 본 명세서에서, "미셀" 은, 분자의 모든 소수성 부분이 내부로 향하여, 친수성 부분이 주위의 수상과 접촉되는 구형 구조로, 양친매성 분자가 배열되는 특정 유형의 분자 조립체로서 정의된다. 상기 환경이 소수성인 경우, 반대 배열로 존재한다.
경피막을 통한 전달에 적합한 혼합 미셀 제형은, iRNA, 알칼리 금속 C8-C22 알킬 설페이트 및 미셀 형성 화합물의 수용액을 혼합함으로써 제조할 수 있다. 예시적인 미셀 형성 화합물에는 레시틴, 히알루론산, 히알루론산의 약학적으로 허용 가능한 염, 글리콜산, 락트산, 카모마일 추출물, 오이 추출물, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 모노올레인, 모노올리에이트, 모노라우레이트, 보라지유, 달맞이꽃유, 멘톨, 트리히드록시 옥소 콜라닐 글리신 및 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 글리세린, 폴리글리세린, 리신, 폴리리신, 트리올레인, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 그의 유사체, 폴리도카놀 알킬 에테르 및 그의 유사체, 케노데옥시콜산염, 데옥시콜산염, 및 그의 혼합물이 포함된다. 미셀 형성 화합물은 알칼리 금속 알킬 설페이트와 동시에 또는 그의 첨가 후, 첨가될 수 있다. 혼합 미셀은, 더 작은 크기의 미셀을 제공하기 위해, 실질적으로 임의의 방식이나, 격렬한 혼합 방식으로, 구성요소를 혼합함으로써, 형성될 것이다.
한 가지 방법에서, RNAi 및 적어도 알칼리 금속 알킬 설페이트를 포함하는 제 1 미셀 조성물을 제조한다. 그 후, 제 1 미셀 조성물이 적어도 3 개의 미셀 형성 화합물과 혼합되어, 혼합 미셀 조성물이 형성한다. 또다른 방법에서, RNAi, 알칼리 금속 알킬 설페이트 및 하나 이상의 미셀 형성 화합물를 혼합한 후, 잔여 미셀 형성 화합물을 격렬히 혼합하면서 첨가하여, 미셀 조성물을 제조한다.
페놀 또는 m-크레졸을 상기 혼합 미셀 조성물에 첨가하여 상기 제형을 안정화시키고, 박테리아 성장으로부터 보호할 수 있다. 대안적으로, 페놀 또는 m-크레졸은 미셀 형성 성분과 함께 첨가할 수 있다. 혼합 미셀 조성물 형성 후에, 글리세린과 같은 등장화제를 또한 첨가할 수 있다.
미셀 제형을 분무로서 전달하기 위해서, 상기 제형을 에어로졸 디스펜서 (aerosol dispenser) 에 넣을 수 있으며, 이 디스펜스에 추진제 (propellant) 로 충진한다. 가압 하에, 상기 추진제는 디스펜스 내에서 액체 형태이다. 수상 및 추진제 상이 하나가 되도록, 즉, 한가지 상만이 존재하도록, 성분 비율을 조정한다. 2 가지의 상이 존재하는 경우, 내용물의 일부를 예를 들어 계량 밸브를 통해, 분산시키기 전에, 디스펜스를 흔들어 줄 필요가 있다. 약학적 제제의 분산 용량이 계량밸브로부터 미세한 분무상으로 추진된다.
추진제는 수소-함유 클로로플루오로탄소, 수소-함유 플루오로탄소, 디메틸 에테르 및 디에틸 에테르가 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, HFA 134a (1,1,1,2 테트라플루오로에탄) 를 사용할 수 있다.
필수 성분의 특정 농도는 비교적 간단한 실험에 의해 측정할 수 있다. 구강을 통한 흡수에서, 많은 경우, 주입을 통한 투여량 또는 위장관을 통한 투여를 예를 들어 적어도 2배 또는 3배 증가시키는 것이 바람직하다.
B. 지질 입자
본 발명의 iRNA, 예를 들어 dsRNAi 제제는 지질 제형, 예를 들어 LNP, 또는 다른 핵산-지질 입자 내에 완전히 캡슐화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "LNP" 는 안정한 핵산-지질 입자를 지칭한다. LNP는 전형적으로, 입자의 응집 (예를 들어 PEG-지질 컨쥬게이트) 을 저해하는 양이온성 지질, 비양이온성 지질, 및 지질을 포함한다. LNP는, 이러한이 정맥 내 (i.v.) 주입 후, 순환 수명의 연장을 나타내고, 원위 (예를 들어 투여 자리로부터 물리적으로 분리된 자리) 에 축적되는 것으로 인해, 전신 적용에 극히 유용하다. LNP 는 PCT 공보 WO 00/03683 에 설명된 바와 같은 캡슐화된 응축화제-핵산 복합체를 포함하는 "pSPLP" 를 포함한다. 본 발명의 입자는 전형적으로 약 50 nm 내지 약 150 nm, 더욱 전형적으로는 약 60 nm 내지 약 130 nm, 더욱 전형적으로는 약 70 nm 내지 약 110 nm, 가장 전형적으로는 약 70 nm 내지 약 90 nm의 평균 직경을 가지며, 실질적으로 비독성이다. 또한, 본 발명의 핵산-지질 입자 내에 존재하는 경우, 핵산은 수용액 내에서, 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 내성이 있다. 핵산-지질 입자 및 그 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; 미국 공개 번호 2010/0324120 및 PCT 공보 WO 96/40964 에 기술되어 있다.
하나의 구현예에서, 지질 대 약제의 비율 (질량/질량 비율) (예를 들어 지질 대 dsRNA 비율) 은 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1 의 범위 내일 것이다. 전술된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이가 또한 본 발명의 일부로 고려된다.
양이온성 지질은, 예를 들어, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 (DDAB), N-(I-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP), N-(I-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민 (DODMA), 1,2-딜리놀에일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), l,2-딜리놀에닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLenDMA), 1,2-딜리놀에일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-C-DAP), 1,2-딜리놀레이옥시-3-(디메틸아미노) 아세톡시프로판 (DLin-DAC), 1,2-딜리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판 (DLin-MA), 1,2-딜리놀레오일-3-디메틸아미노프로판 (DLinDAP), 1,2-딜리놀에일티오-3-디메틸아미노프로판 (DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-2-DMAP), 1,2-딜리놀에일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TMA.Cl), 1,2-딜리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TAP.Cl), 1,2-딜리놀에일옥시-3-(N-메틸피페라지노) 프로판 (DLin-MPZ), 또는 3-(N,N-딜리놀에일아미노)-1,2-프로판디올 (DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오 (DOAP), 1,2-딜리놀에일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판 (DLin-EG-DMA), l,2-딜리놀에닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 2,2-딜리놀에일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA) 또는 그의 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디 ((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐) 테트라하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민 (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트 (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일) 에틸아잔에디일) 디도데칸-2-올 (Tech G1), 또는 그의 혼합물일 수 있다. 양이온성 지질은, 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 20 몰% 내지 약 50 몰% 또는 약 40 몰% 를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 지질-siRNA 나노입자의 제조에, 화합물 2,2-딜리놀에일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란을 이용할 수 있다.
일부 구현예에서, 지질-siRNA 입자는, 63.0 ± 20 nm 의 입자 크기 및 0.027 siRNA/지질 비율을 가지는 40% 2,2-딜리놀에일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란: 10% DSPC: 40% 콜레스테롤: 10% PEG-C-DOMG (몰%) 를 포함한다.
이온화성/비양이온성 지질은, 이에 제한되는 것은 아니나, 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민 (POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로핵산-l-카르복실레이트 (DOPE-말), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일- 포스파티디에탄올아민 (SOPE), 콜레스테롤, 또는 그의 혼합물을 비롯한 음이온성 지질 또는 중성 지질일 수 있다. 콜레스테롤이 포함되는 경우, 비양이온 지질은, 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 90 몰%, 약 10 몰%, 또는 약 58 몰% 일 수 있다.
입자의 응집을 저해하는 컨쥬게이트 지질은, 예를 들어, 제한 없이, PEG-디아실글리세롤 (DAG), PEG-디알킬옥시프로필 (DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드 (Cer), 또는 그의 혼합물을 비롯한 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-지질일 수 있다. PEG-DAA 컨쥬게이트는, 예를 들어, PEG-디라우릴옥시프로필 (Ci2), PEG-디미리스틸옥시프로필 (Ci4), PEG-디팔미틸옥시프로필 (Ci6), 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필 (Ci8) 일 수 있다. 입자의 응집을 저해하는 컨쥬게이트 지질은, 입자 내에 존재하는 총 지질의 0 몰% 내지 약 20 몰% 또는 약 2 몰% 일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 핵산-지질 입자는, 입자 내에 존재하는 총 지질의 예를 들어 약 10 몰% 내지 약 60 몰% 또는 약 48 몰% 의 콜레스테롤을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 지질-dsRNA 나노입자 (즉, LNP01 입자) 의 제조를 위해, 리피도이드 (lipidoid) ND98·4HCl (MW 1487)(본 명세서에서 참조로 포함되는 US20090023673 참조), 콜레스테롤 (Sigma-Aldrich), 및 PEG-세라미드 C16 (Avanti Polar Lipids) 을 이용할 수 있다. ND98, 133 ㎎/ml; 콜레스테롤, 25 ㎎/ml, PEG-세라미드 C16, 100 ㎎/ml 과 같은 각각의 에탄올 중 원액을 제조할 수 있다. ND98, 콜레스테롤, 및 PEG-세라미드 C16 원액을 그 후, 예를 들어 42:48:10 의 몰 비율로 조합할 수 있다. 조합 지질 용액을, 최종 에탄올 농도가 약 35 내지 45% 이고, 최종 아세트산 나트륨 농도가 약 100 내지 300 mM 이 되도록 수성 dsRNA (예를 들어 pH 5의 아세트산 나트륨 중) 와 혼합할 수 있다. 혼합시, 지질-dsRNA 나노입자가 전형적으로 자발적으로 형성된다. 원하는 입자 크기 분포에 따라, 생성된 나노입자 혼합물을, 예를 들어, Lipex Extruder (노던 Lipids, Inc) 와 같은 열 배럴 압출기 (thermobarrel extruder) 를 이용하여, 폴리카보네이트 막 (예를 들어 100 nm 컷-오프 (cut-off)) 을 통해, 압출시킬 수 있다. 일부 경우, 압출 단계는 생략할 수 있다. 예를 들어, 투석 또는 접선 유동 여과 (tangential flow filtration) 에 의해, 에탄올 제거 및 완충액 동시 교환을 달성할 수 있다. 완충액은, 예를 들어, 약 pH 7, 예를 들어 약 pH 6.9, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 또는 약 pH 7.4 의 인산염 완충 식염수 (PBS) 와 교환할 수 있다.
Figure pct00018
LNP01 제형은, 예를 들어 본 명세서에서 참조로 포함되는 국제 출원 공보 WO 2008/042973 에 기술되어 있다.
추가의 예시적 지질-dsRNA 제형이 표 1 에 기술된다.
표 1. 예시적 지질 제형
Figure pct00019
Figure pct00020
DSPC: 디스테아로일포스파티딜콜린
DPPC: 디팔미토일포스파티딜콜린
PEG-DMG: PEG-디디미리스토일 글리세롤 (C14-PEG, 또는 PEG-C14)(평균 분자량 2000 의 PEG)
PEG-DSG: PEG-디스티릴 글리세롤 (C18-PEG, 또는 PEG-C18)(평균분자량 2000 의 PEG)
PEG-cDMA: PEG-카바모일-1,2-디미리스틸옥시프로필아민 (평균 분자량 2000 의 PEG)
SNALP (l,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA)) 함유 제형은 본 명세서에서 참조로 포함되는 국제출원 공개 WO2009/127060에 기술되어 있다.
XTC 함유 제형은 예를 들어, 그 전체 내용이 본 명세서에서 참조로 포함되는 PCT 공보 WO2010/088537호에 기술되어 있다.
MC3 함유 제형은 예를 들어, 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 2010년 6월 10일에 출원된 미국 특허 공개 제 2010/0324120호에 기술되어 있다.
ALNY-100 함유 제형은 예를 들어, 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 PCT 공보 WO 2010/054406호에 기술되어 있다.
C12-200 함유 제형은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 PCT 공보 WO 2010/129709호에 기술되어 있다.
i. 이온화가능/양이온성 지질의 합성
본 발명의 핵산-지질 입자에서 사용되는 임의의 화합물, 예를 들어, 양이온성 지질 등은 알려진 유기 합성 기술에 의해 제조될 수 있다.
표준 또는 비압출 방법에 의해 제조된 제형은 유사항 방식으로 특성분석될 수 있다. 예를 들어, 제형은 전형적으로 시각적 검사에 의해 특성분석된다. 제형은 응집물 또는 침강물이 없는 약간 하얀 반투명 용액일 것이다. 지질-나노입자의 입자 크기 및 입자 크기 분포는 광 산란에 의해, 예를 들어, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA) 를 사용하여 측정될 수 있다. 입자는 약 20-300 nm, 예컨대 40-100 nm 크기일 것이다. 입자 크기 분포는 단봉형일 것이다. 제형에서의 총 dsRNA 농도 뿐만 아니라 포획된 분획은 염료 배제 어세이를 사용하여 추정된다. 제형화된 dsRNA 의 샘플은 RNA-결합 염료, 예컨대 Ribogreen (분자 탐침) 과 함께 제형 파괴 계면활성제, 예를 들어, 0.5% Triton®-X100 의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션될 수 있다. 제형 중의 총 dsRNA 는 표준 곡선에 상대적인, 계면활성제를 함유하는 샘플로부터의 신호에 의해 확인될 수 있다. 포획된 분획은 "자유" dsRNA 함량 (이는 계면활성제의 부재 하의 신호에 의해 측정됨) 을 총 dsRNA 함량으로부터 뺄셈하여 확인된다. 퍼센트 포획된 dsRNA 는 전형적으로 >85% 이다. SNALP 제형에서, 입자 크기는 적어도 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 110 nm, 또는 120 nm 이다. 적합한 범위는 전형적으로 50 nm 내지 110 nm, 60 nm 내지 100 nm, 또는 80 nm 내지 90 nm 이다.
경구 투여용 조성물 및 제형에는 분말 또는 과립, 마이크로미립자, 나노미립자, 물 또는 비수성 배지의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 젤 캡슐, 향낭, 정제 또는 미니정제가 포함된다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 경구 제형은, 본 발명에서 특징으로 하는 dsRNA 가 하나 이상의 투과성 향상 계면활성제 및 킬레이트화제와 함께 투여되는 경구 제형이다. 적절한 계면활성제에는 지방산 또는 그의 에스테르 또는 염, 담즙산 또는 그의 염이 포함된다. 적절한 담즙산/염에는 케노데옥시콜산 (CDCA) 및 우르소데옥시케노데옥시콜산 (UDCA), 콜산, 데하이드로콜산, 데옥시콜산, 글루콜산, 글리콜산, 글리코데옥시콜산, 타우로콜산, 타우로데옥시콜산, 소듐 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트 및 소듐 글리코디하이드로푸시데이트가 포함된다. 적당한 지방산에는 아라키돈산, 운데칸 산, 올레산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로펩탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염 (예를 들어 나트륨) 이 포함된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 담즙산/염과 조합된 지방산/염과 같은 침투성 향상제의 조합물이 이용된다. 예시적인 한가지 조합물에는 라우르산, 카프르산 및 UDCA 의 나트륨 염이 있다. 추가의 투과성 향상제에는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르가 포함된다. 본 발명의 특징을 이루는 DsRNA 는, 분무 건조 입자를 비롯한 과립 형태로 경구적으로 전달될 수 있거나, 또는 복합체화되어, 마이크로 또는 나노입자를 형성할 수 있다. DsRNA 복합화제에는 폴리아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트, 폴리옥세탄, 폴리알킬시아노아크릴레이트; 양이온화된 젤라틴, 알부빈, 전분, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 및 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트; DEAE-유도체화 폴리이민, 풀루란, 셀룰로오스 및 전분이 포함된다. 적절한 복합화제에는 키토산, N-트리메틸키토산, 폴리-L-리신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스페르민, 프로타민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P (TDAE), 폴리아미노스티렌 (예를 들어 p-아미노), 폴리 (메틸시아노아크릴레이트), 폴리 (에틸시아노아크릴레이트), 폴리 (부틸시아노아크릴레이트), 폴리 (이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리 (이소헥실시아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-알부민 및 DEAE-덱스트란, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리헥실아크릴레이트, 폴리 (D,L-락트산), 폴리 (DL-락틱-코-글리콜산 (PLGA), 알기네이트, 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 이 포함된다. dsRNA 의 경구 제형 및 그의 제조물은, 본 명세서에서 참조로 포함되는 미국 특허 번호 6,887,906, 미국 공개 번호 20030027780 및 미국 특허 번호 6,747,014 에 상세히 기술되어 있다.
비경구, (뇌로의) 실질세포내, 척수강 내, 뇌실 내 또는 간 내 투여용 조성물 및 제형은, 완충액, 희석제, 및 이에 제한되는 것은 아니나, 투과성 향상제, 담체 화합물 및 기타 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 같은 기타 적절한 첨가제를 또한 포함할 수 있는 살균 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 용액, 에멀전 및 리포좀-함유 제형을 포함한다. 이러한 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 기성 액체 (preformed liquid), 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하는 다양한 구성성분으로부터 생성시킬 수 있다. 제형에는 간암종과 같은 간 장애의 치료시, 간을 표적으로 하는 제형이 포함된다.
단위 투여량 형태로 간편하게 제공될 수 있는, 본 발명의 약학적 제형은 의약품 산업 분야에 잘 공지되어 있는 종래 기술에 따라 제조할 수 있다. 이러한 기술에는, 활성 구성요소와 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)를 결합시키는 단계가 포함된다. 일반적으로, 상기 제형은 활성 구성요소를 액체 담체 또는 미분화 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 밀접하게 결합시킨 다음, 필요한 경우, 생성물을 성형함으로써, 제조한다.
본 발명의 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 정제, 캡슐, 젤 캡슐, 액체 시럽, 연질 젤, 좌약 및 관장제와 같은 임의의 다양한 가능한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 수성, 비수성 또는 혼합 배지 중의 현탁액으로 제형화될 수 있다. 수성 현탁액은, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란을 비롯하여, 현탁액의 점성을 증가시키는 제제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 현탁액은 또한 안정화제를 포함할 수 있다.
C. 추가 제형
i. 에멀전
본 발명의 iRNA 는 에멀전으로 제조 및 제형화될 수 있다. 에멀전은, 일반적으로 직경이 0.1 ㎛를 초과하는 소적의 형태로, 하나의 액체를 또다른 액체에 분산시킨 전형적 이종 시스템이다 (예를 들어 Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301 참조). 에멀전은 종종, 서로 밀접하게 혼합 및 분산된 2 가지의 비혼성 액체 상을 포함하는 2 상계이다. 일반적으로, 에멀전은 유중수 (w/o) 또는 수중유 (o/w) 종류 중 어느 하나일 수 있다. 수상이 벌크유상 (bulk oily phase) 으로 세분되고, 극미 소적으로서 분산되는 경우, 생성된 조성물은 유중수 (w/o) 에멀전으로 불린다. 대안적으로, 유상이 벌크 수성상으로 세분되고, 극미 소적으로서 분산되는 경우, 생성된 조성물은 수중유 (o/w) 에멀전으로 불린다. 에멀전은, 수상, 유상 또는 개별 상으로서 그 자체 중 어느 하나의 용액으로서 존재할 수 있는 활성 약제 및 분산 상에 더하여, 추가의 성분을 포함할 수 있다. 유화제, 안정화제, 염료 및 항산화제와 같은 약학적 부형제는 또한, 필요에 따라, 에멀전에 존재할 수 있다. 약학적 에멀전은 또한, 예를 들어, 유중수중유 (o/w/o) 및 수중유중수 (w/o/w) 에멀전의 경우에서와 같이, 2 개를 초과하는 상으로 구성된 다상 에멀전 (multiple emulsion) 일 수 있다. 이러한 복합체 제형은 종종, 단순 2 상 에멀전이 제공하지 않는 특정 이점을 제공한다. o/w 에멀전의 개별 유성 소적이 작은 물방울 (water droplet) 을 둘러싸는 다상 에멀전은 w/o/w 에멀전을 구성한다. 마찬가지로, 연속 유상 내에서, 안정화된 물의 소구체에 둘러싸인 유성 소적의 시스템은 o/w/o 에멀전을 제공한다.
에멀전은 열역학적 안정성이 거의 없거나 또는 전혀 없는 것을 특징으로 한다. 종종, 에멀전의 분산 또는 불연속적 상은 외부 또는 연속 상으로 잘 분산되며, 제형의 점성 또는 유화제 수단을 통해, 이러한 형태로 유지된다. 에멀전의 상 중 어느 하나는, 에멀전-스타일 연고 베이스 및 크림의 경우와 같이, 반고체 또는 고체일 수 있다. 에멀전을 안정화시키는 다른 수단은, 에멀전의 상 중 어느 하나로 혼입될 수 있는 유화제의 이용을 수반한다. 유화제는 4 개의 범주: 합성 계면활성제, 자연발생 유화제, 흡수 베이스 및 미세 분산 고체로 광범위하게 분류될 수 있다 (예를 들어 Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199 참조).
또한, 표면 활성제로 알려진 합성 계면활성제는 에멀전 제형에서 광범위한 용도가 발견되었으며, 하기 문헌에서 검토되었다 (예를 들어 Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199 참조). 계면활성제는 전형적으로 양친매성이며, 친수성 및 소수성 부분을 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성의 비율은 친수성/친유성 균형 (HLB) 으로 지칭되며, 제형의 제조시, 계면활성제의 범주화와 및 선택에서, 중요한 수단이다. 계면활성제는 친수성 기의 특성을 기반으로 하여, 상이한 종류로 분류될 수 있다: 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성 (예를 들어 Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285 참조).
에멀전 제형에 사용되는 자연발생 유화제에는 라놀린, 밀랍, 인지질, 레시틴 및 아카시아가 포함된다. 흡수 베이스는 친수성을 가지며, 이에 따라, 그들은 물을 흡수하여, w/o 에멀전을 형성하나, 무수 라놀린 및 친수성 광유 (petrolatum) 와 같이, 이러한의 반고체 조도 (consistency) 를 유지할 수 있다. 세분 고체는 또한, 특히 계면활성제와의 조합물 및 점성 제조물에서, 양호한 유화제로서 사용되어 왔다. 그들은 극성 무기 고체, 예를 들어 중금속 수산화물, 비팽창성 점토, 예를 들어 벤토나이트, 아타풀자이트, 헥토라이트, 고령토, 몬모릴로나이트, 콜로이드성 알루미늄 실리케이트 및 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 안료 및 비극성 고체, 예를 들어 탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트가 포함된다.
매우 다양한 비유화 제제가 또한 에멀전 제형에 포함되며, 에멀전의 특성에 기여한다. 이에는 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알코올, 지방 에스테르, 보습제, 친수성 콜로이드, 보존제 및 항산화제가 포함된다 (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
친수성 콜로이드 또는 수성 콜로이드는 자연발생 검 및 합성 중합체, 예를 들어 다당류 (예를 들어, 아카시아, 한천, 알긴산, 카라기난, 구아 검, 카라야 검 및 트라가칸트), 셀룰로오스 유도체 (예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스 및 카르복시프로필셀룰로오스) 및 합성 중합체 (예를 들어, 카르보머, 셀룰로오스 에테르 및 카르복시비닐 중합체) 가 포함된다. 그들은, 물에서 분산되거나 또는 팽창되어, 분산 상의 소적 주위에 강한 계면 필름을 형성하고, 외부 상의 점성을 증가시킴으로써, 에멀전을 안정화시키는 콜로이드성 용액을 형성한다.
에멀전이 종종 미생물의 성장을 용이하게 지원할 수 있는 다양한 성분, 예를 들어 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 인지질을 포함하기 때문에, 이러한 제형은 종종 보존제를 포함한다. 에멀전 제형에 포함되는 통상적으로 사용되는 보존제에는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4차 암모늄 염, 염화 벤잘코늄, p-히드록시벤조산의 에스테르 및 붕산이 포함된다. 항산화제 역시, 제형의 열화 저해를 위해, 에멀전 제형에 통상적으로 첨가되는 것이다. 사용 항산화제는 자유 라디칼 스캐빈저, 예를 들어 토코페롤, 알킬 갈레이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 또는 환원제, 예를 들어 아스코르브산 및 소듐 메타비설파이트 및 항산화 상승제, 예를 들어 시트르산, 타르타르산 및 레시틴일 수 있다.
피부, 경구 및 비경구 경로를 통한 에멀전 제형의 적용 및 그의 제조법이 문헌에서 검토되었다 (예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199 참조). 경구 절달을 위한 에멀전 제형은 제형의 용이성 뿐만 아니라 흡수 및 생물학적 이용능력 관점으로부터의 효과 때문에 매우 광범위하게 사용되어 왔다 (예를 들어 Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199 참조). 미네랄 오일 베이스 완하제, 유용성 비타민 및 고지방 영양제가 o/w 에멀전으로서 통상적으로 경구 투여되는 물질들이다.
ii. 마이크로에멀전
본 발명의 하나의 구현예에서, iRNA 는 마이크로에멀전으로 제형화된다. 마이크로에멀전은, 단일 광학적 등방성이며, 열역학적으로 안정한 액체 용액인 물, 오일 및 친양쪽성 제제의 시스템으로 정의될 수 있다 (예를 들어 Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245 참조). 전형적인 마이크로에멀전은, 우선 오일을 수성 계면활성제 용액에 분산시킨 후, 일반적으로, 중간 사슬 길이 알코올로서, 제4 구성성분의 충분한 양을 첨가하여, 투명 시스템을 형성함으로써, 제조되는 시스템이다. 따라서, 마이크로에멀전은 또한 표면 활성 분자의 계면 필름에 의해 안정화되는 2종의 비혼성 액체의 열역학적으로 안정한 등방성의 맑은 분산액으로 기술되어 있다 (Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M, Ed, 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). 마이크로에멀전은 통상적으로, 오일, 물, 계면활성제, 공계면활성제 및 전해질을 포함하는 3 내지 5종의 구성성분의 조합을 통해, 제조된다. 마이크로에멀전이 유중수 (w/o) 또는 수중유 (o/w) 유형인지의 여부는 사용된 오일 및 계면활성제의 특성 및, 계면활성제 분자의 극성 헤드 및 탄화수소 꼬리의 구조 및 기하학적인 패킹에 의존한다 (Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co, Easton, Pa, 1985, p. 271).
상 다이아그램 (phase diagram) 을 활용한 현상학적 접근법이 광범위하게 연구되어 왔으며, 마이크로에멀전의 제형화 방법에 대한 방대한 지식을 당업자에게 제공했다 (예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV, Popovich NG, and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed), New York, N.Y.; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p 335 참조). 종래의 에멀전에 비해, 마이크로에멀전은, 자발적으로 형성되는 열역학적으로 안정한 소적의 제형시, 수 불용성 약제가 가용화되는 이점을 제공한다.
마이크로에멀전의 제조에 사용되는 계면활성제에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, Brij® 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트 (ML310), 테트라글리세롤 모노올리에이트 (MO310), 헥사글리세롤 모노올리에이트 (PO310), 헥사글리세롤 펜타올리에이트 (PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트 (MCA750), 데카글리세롤 모노올리에이트 (MO750), 데카글리세롤 세퀴올리에이트 (SO750), 데카글리세롤 데카올리에이트 (DAO750) 가 단독 또는 공계면활성제와 조합하여 포함된다. 공계면활성제, 일반적으로 단쇄 알코올, 예를 들어 에탄올, 1-프로판올 및 1-부탄올은, 계면활성제 분자들 사이에 생성된 빈 공간으로 인해, 계면활성제 필름을 투과하고, 그 결과, 결함이 있는 필름이 생성됨으로써, 계면 유동성을 증가시키는 작용을 한다. 그러나, 마이크로에멀전은 공계면활성제를 사용함이 없이 제조될 수 있으며, 무알코올 자가-유화 마이크로에멀전 시스템이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 수상은 전형적으로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 물, 약제 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 유도체일 수 있다. 유상에는, 이에 제한되는 것은 아니나, Captex® 300, Captex® 355, Capmul® MCM, 지방산 에스테르, 중간 사슬 (C8-C12) 모노, 디, 및 트리-글리세리드, 폴리옥시에틸화 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알코올, 폴리글리콜화 글리세리드, 포화 폴리글리콜화 C8-C10 글리세리드, 식물성유 및 규소수지유가 포함될 수 있다.
마이크로에멀전은 약제 가용화 및 약제 흡수의 향상의 관점에서 특히 관심을 받고 있다. 펩티드를 비롯하여, 약제의 경구적 생물학적 이용 가능성을 향상시키기 위한 지질 기반 마이크로에멀전 (o/w 및 w/o 둘 모두) 이 제안되었다 (예를 들어 미국 특허 번호 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205 참조). 마이크로에멀전은 약제 가용화의 개선, 효소적 가수분해로부터의 약제의 보호, 막 유동성 및 침투성에서 계면활성제-유도 변경으로 인한 약제 흡수의 가능한 향상, 제조의 용이성, 고체 투여 형태의 경구 투여 용이성, 임상 효과의 개선 및 독성의 감소의 이점을 제공한다 (예를 들어 미국 특허 번호 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J Pharm Sci, 1996, 85, 138-143 참조). 종종, 마이크로에멀전은, 주위 온도에서 그 구성성분이 함께 적용되는 경우, 자발적으로 형성될 수 있다. 이는, 열불안정성 약제, 펩티드 또는 iRNA 의 제형시, 특히 유리할 수 있다. 마이크로에멀전은 또한, 화장품 및 약학적 적용의 양 분야에서, 활성 구성성분의 경피 전달에 효과적이었다. 본 발명의 마이크로에멀전 조성물 및 제형은, iRNA 및 핵산의 국소 세포성 섭취를 개선시킬뿐만 아니라, 위장관으로부터 iRNA 및 핵산의 전신 흡수의 증가를 촉진할 것으로 예측된다.
본 발명의 마이크로에멀전은 또한, 제형의 특성을 개선시키고, 본 발명의 iRNA 및 핵산의 흡수를 향상시키기 위해, 추가적 구성성분 및 첨가제, 예를 들어 소르비탄 모노스테아레이트 (Grill® 3), 라브라졸 (Labrasol)®, 및 투과성 향상제를 포함할 수 있다. 본 발명의 마이크로에멀전에서 사용되는 투과성 향상제는 5종의 광범위한 범주--계면활성제, 지방산, 담즙산 염, 킬레이트화제 및 비킬레이트화 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다 (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). 각각의 이러한 종류는 상기에서 논의되었다.
iii. 마이크로입자
본 발명의 iRNA 제제는 입자, 예를 들어 마이크로입자로 혼입될 수 있다. 마이크로입자는 분무-건조에 의해 생성될 수 있으나, 동결 건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이러한 기술의 조합을 비롯한 기타 방법에 의해서도, 생성될 수 있다.
iv. 투과성 향상제
하나의 구현예에서, 본 발명에서는, 동물의 피부에 핵산, 특히 iRNA 를 효과적으로 전달하기 위해, 다양한 투과성 향상제가 사용된다. 대부분의 약제는 이온 및 비이온의 양자 형태로 용액 내에 존재한다. 그러나 일반적으로 단지 지질 용해성 또는 친유성 약제만이 세포막을 용이하게 통과한다. 통과해야 하는 막을 투과성 향상제로 처리한 경우, 심지어 비친유성 약제가 세포막을 통과할 수 있다는 것이 발견되었다. 세포막을 통과한 비친유성 약제의 확산을 지원하는 것에 더하여, 투과성 향상제는 또한 친유성 약제의 투과성을 향상시킨다.
투과성 향상제는 5종의 광범위한 범주, 즉, 계면활성제, 지방산, 담즙산 염, 킬레이트화제 및 비킬레이트화 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다 (예를 들어, Malmsten, M Surfactants and polymers in Drug Delivery, Informa Health Care, New York, N.Y., 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p92 참조). 그러한 화합물은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
v. 담체
본 발명의 특정 조성물은 또한 제형 중에 담체 화합물을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "담체 화합물" 또는 "담체" 라 함은 핵산 또는 그의 유사체를 지칭할 수 있으며, 이것은 비활성 (즉, 그 자체로 생물학적 활성을 갖지 않음) 이지만, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 핵산을 분해하거나 또는 순환으로부터 생물학적 활성인 핵산을 제거하는 것을 촉진함으로써, 생물학적 활성을 갖는 핵산의 생물학적 이용가능성을 감소시키는 생체내 프로세스에 의해, 핵산으로 인식된다. 핵산과 담체 화합물의 동시 투여는, 즉 전형적으로 후자의 물질이 과잉인 것은, 아마도 공통의 수용체에 대하여 담체 화합물과 핵산 사이의 경쟁에 기인하여, 간, 신장 또는 다른 체외 순환 레저보아 (extracirculatory reservoirs) 에서 회수되는 핵산의 양의 실질적인 감소를 초래할 수 있다. 예를 들어, 간장 조직에서의 부분적인 포스포로티오에이트 dsRNA 의 회수는 폴리이노신산, 덱스트란 설페이트, 폴리시티드산 또는 4-아세트아미도-4'이소티오시아노-스틸벤-2,2'-디설폰산과 동시투여되는 경우체 감소될 수 있다 (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
vi. 부형제
담체 화합물과는 대조적으로, "약학적 담체" 또는 "부형제" 는 약학적으로 허용 가능한 용매, 현탁제 또는, 하나 이상의 핵산을 동물에 전달하기 위한 임의의 기타 약리학적 비활성인 비히클이다. 부형제는 액체 또는 고체일 수 있으며, 핵산과 소정의 약학적 조성물의 다른 성분이 조합되는 경우, 원하는 벌크, 점조도 등이 제공되도록 고려하여 계획된 투여 방식으로 선택될 수 있다. 대표적인 약학적 담체로서는, 이에 제한되는 것은 아니나, 결합제 (예를 들어 미리 젤라틴화한 메이즈 전분 (maize starch), 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 등); 충전제 (예를 들어 락토오스 및 기타 당류, 미세결정성 셀룰로오스, 펙틴, 젤라틴, 칼슘 설페이트, 에틸 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트 또는 칼슘 수소 포스페이트 등); 윤활제 (예를 들어 스테아르산 마그네슘, 활석, 이산화규소, 콜로이드성 이산화 규소, 스테아르산, 스테아린산 금속염, 수소화 식물성유, 옥수수 전분 (corn starch), 폴리에틸렌 글리콜, 벤조산 나트륨, 아세트산 나트륨 등); 붕해제 (예를 들어 전분, 소듐 전분 글리콜레이트 등); 및 습윤제 (예를 들어 소듐 라우릴 설페이트 등) 가 포함된다.
핵산과 유해하게 반응하지 않는, 비경구 이외의 투여에 적합한 약학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 부형제가 또한 본 발명의 조성물을 제형화하는데 사용될 수 있다. 적절한 약학적으로 허용 가능한 담체에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 스테아르산 마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함된다.
핵산의 국소 투여를 위한 제형에는 살균 및 비살균 수용액, 알코올과 같은 통상적 용매의 비수용액 또는, 액체 또는 고체 오일 베이스의 핵산 용액이 포함될 수 있다. 상기 용액에는 또한 완충액, 희석제 및 기타 적절한 첨가제가 포함될 수 있다. 핵산과 유해하게 반응하지 않는 비경구 이외의 투여에 적합한 약학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 부형제가 사용될 수 있다.
적절한 약학적으로 허용 가능한 부형제에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 스테아르산 마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함된다.
vii. 기타 성분
본 발명의 조성물은, 약학적 조성물에서 종래 발견되는 기타 부가 성분을 당해 기술분야에 확립된 사용 수준에서 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 조성물은, 예를 들어, 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제와 같은 화합성인 추가의 약학적 활성 제제를 포함할 수 있거나, 또는, 염료, 향미제, 보존제, 항산화제, 불투명화제 (opacifier), 증점제 및 안정화제와 같이, 본 발명의 조성물의 다양한 투여 형태의 물리적 제형에 유용한 추가적 제제를 포함할 수 있다. 그러나, 첨가시, 이러한 제제는, 본 발명의 조성물의 구성성분의 생물학적 활성을 과도하게 간섭해서는 안 된다. 상기 제형은 살균될 수 있으며, 바람직한 경우, 상기 제형의 핵산(들)과 유해하게 반응하지 않는 것으로서, 예를 들어 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주기 위한 염, 완충액, 착색제, 향미 및/또는 방향 물질 등과 같은 보조제와 혼합될 수 있다.
수성 현탁액은, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란을 비롯한 것으로서, 현탁액의 점성을 증가시키는 제제를 포함할 수 있다. 상기 현탁액은 또한 안정화제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 특성화되는 약학적 조성물은 (a) 하나 이상의 iRNA 및 (b) 비-iRNA 메커니즘에 의해 기능하고, PD-L1-관련 질환을 치료하는데 유용한 하나 이상의 제제를 포함한다.
이러한 화합물의 독성 및 치료학적 효능은, 예를 들어 LD50 (집단 내 50%의 치사량) 및 ED50 (집단 내 50% 의 치료학적 유효량) 의 측정을 위해, 세포 배양액 또는 실험 동물에서, 약학적 표준 절차에 의해 측정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 투여량 비율이 치료 지수이며, 이는 비율 LD50/ED50 으로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간 사용을 위한 투여량 범위의 제형화에 이용될 수 있다. 본 발명의 특징을 이루는 조성물의 투여량은, 일반적으로, 독성이 거의 없거나 또는 전혀 없는 것으로서, ED50을 포함하는 범위의 순환 농도 내에 존재한다. 상기 투여량은 이용 투여 형태 및 사용 투여 경로에 따라, 이 범위 내에서 변화될 수 있다. 본 발명의 특징을 이루는 방법에 사용되는 임의의 화합물에서, 치료학적 유효량은 우선 세포 배양 분석으로부터 추산될 수 있다. 투여량은, 동물 모델에서, 화합물 또는, 필요에 따라, 세포 배양에서 측정된 바와 같은 IC50 (즉, 증상의 절반-최대 저해 (half-maximal inhibition) 를 달성하는 시험 화합물의 농도) 을 포함하는, 표적 서열의 폴리펩티드 생성물의 순환 혈장 농도 범위가 달성 (예를 들어 감소된 농도의 폴리펩티드를 달성) 되도록, 계산될 수 있다. 이러한 정보는, 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 측정하는데 이용될 수 있다. 혈장 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
상기에서 논의된 바와 같은 그의 투여법에 더하여, 본 발명의 특징을 이루는 iRNA 는 PD-L1 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 치료에 효과적인 기타 공지 물질과 조합하여, 투여될 수 있다. 어쨌든, 투여 의사는, 본 명세서에서 개시되었거나 또는 당해 기술분야에 공지된 표준 효능 척도를 이용하여, 관찰 결과를 기반으로 한 iRNA 의 투여량 및 투여 일정을 조정할 수 있다.
VI. PD-L1 발현의 저해 방법
본 발명은 또한 세포에서 PD-L1 유전자의 발현을 저해하는 방법을 제공한다. 방법은 세포를 세포에서의 PD-L1 의 발현을 저해하는데 효과적인 양의 RNAi 제제, 예를 들어, 이중 가닥 RNAi 제제와 접촉시켜, 세포에서의 PD-L1 의 발현을 저해하는 것을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, PD-L1 은 간 세포에서 우선적으로 저해된다.
세포를 iRNA, 예를 들어, 이중 가닥 RNAi 제제와 접촉시키는 것은 시험관내에서 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 세포를 생체내에서 iRNA 와 접촉시키는 것은 대상체, 예를 들어, 인간 대상체 내의 세포 또는 세포의 군을, iRNA 와 접촉시키는 것을 포함한다. 시험관내 및 생체내 세포 접촉 방법의 조합이 또한 가능하다. 세포를 접촉시키는 것은 위에서 논의된 바와 같이 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 게다가, 세포를 접촉시키는 것은 본원에 기재된 또는 당해 기술분야에 알려진 임의의 리간드를 포함하는 표적화 리간드를 통해 달성될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 표적화 리간드는 RNAi 제제를 관심의 자리로 향하게 하는 탄수화물 모이어티, 예를 들어, GalNAc3 리간드, 또는 임의의 기타 리간드이다.
본원에서 사용되는 용어 "저해" 는 "감소", "침묵화", "하향조절", "억제", 및 기타 유사한 용어와 호환되게 사용되고, 임의의 수준의 저해를 포함한다.
구절 "PD-L1 의 발현의 저해" 는 임의의 PD-L1 유전자 (예컨대, 예를 들어, 마우스 PD-L1 유전자, 랫트 PD-L1 유전자, 원숭이 PD-L1 유전자, 또는 인간 PD-L1 유전자) 뿐만 아니라 PD-L1 유전자의 변이체 또는 돌연변이체의 발현의 저해를 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, PD-L1 유전자는 유전자 조작된 세포, 세포의 군, 또는 유기체의 맥락에서 야생형 PD-L1 유전자, 돌연변이체 PD-L1 유전자, 또는 트랜스제닉 PD-L1 유전자일 수 있다.
"PD-L1 유전자의 발현의 저해" 는 PD-L1 유전자의 임의의 수준의 저해, 예를 들어, PD-L1 유전자의 발현의 적어도 부분적 억제를 포함한다. PD-L1 유전자의 발현은 PD-L1 유전자 발현과 관련되는 임의의 변수의 수준, 예를 들어, PD-L1 mRNA 수준 또는 PD-L1 단백질 수준, 또는 수준 변화에 기초하여 평가될 수 있다. 이러한 수준은 개별 세포 또는 세포의 군, 예를 들어, 대상체에서 유래하는 샘플에서 평가될 수 있다. PD-L1 의 발현은 정상 대상체에서 많은 세포 유형 및 체액에서 검출 수준 근처 또는 미만일 수 있다고 이해된다. 그러므로, PD-L1 의 발현의 저해는 예를 들어, PD-L1 의 저해를 위한 제제에 의한 치료 전에 및 후에 간염 바이러스로 감염된 대상체의 간 또는 PD-L1 의 저해를 위한 제제에 의한 치료 전에 또는 후에 종양에서의 PD-L1 의 수준을 비교할 수 있다.
특정 구현예에서, 대리 마커가 사용되어 PD-L1 의 저해를 검출할 수 있다. 예를 들어, PD-L1 발현의 감소제에 의한 허용가능한 진단 및 모니터링 기준에 의해 입증되는 감염, 예를 들어, 간염 바이러스 감염의 효과적 치료는 PD-L1 에서의 임상 관련 감소를 입증하는 것으로 이해될 수 있다. PD-L1 의 감소제에 의한 치료 후에 RECIST 기준에 의해 확인되는 암을 갖는 대상체에서의 종양 부하의 안정화 또는 감소는 PD-L1 에서의 임상 관련 감소를 입증하는 것으로 이해될 수 있다.
저해는 대조군 수준과 비교되는 PD-L1 발현과 관련되는 하나 이상의 변수의 절대 또는 상대 수준의 감소에 의해 평가될 수 있다. 대조군 수준은 당해 기술분야에서 이용되는 임의의 유형의 대조군 수준, 예를 들어, 프리-도스 (pre-dose) 기준선 수준, 또는 대조군 (예컨대, 예를 들어, 완충제 단독 대조군 또는 불활성 제제 대조군) 으로 처리된 또는 처리되지 않은 유사한 대상체 (예를 들어, 병력 대조군), 세포, 또는 샘플로부터 확인되는 수준일 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, PD-L1 유전자의 발현은 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 만큼, 또는 어세이의 검출 수준 미만까지 저해된다. 특정 구현예에서, 방법은, 예를 들어 PD-L1 의 발현의 감소제에 의한 대상체의 치료 후에 임상 관련 결과에 의해 입증되는, PD-L1 의 발현의 임상 관련 저해를 포함한다.
PD-L1 유전자의 발현의 저해는, 첫번째 세포 또는 세포의 군과 실질적으로 동일한 그러나 그렇게 처리되지 않은 두번째 세포 또는 세포의 군 (iRNA 로 처리되지 않은 또는 관심의 유전자를 표적화하는 iRNA 로 처리되지 않은 대조군 세포(들)) 과 비교되는, PD-L1 유전자가 전사되고 PD-L1 유전자의 발현이 저해되도록 처리된 (예를 들어, 세포 또는 세포들을 본 발명의 iRNA 와 접촉시킴으로써, 또는 본 발명의 iRNA 를 세포가 존재하는 또는 존재했던 대상체에게 투여함으로써) 첫번째 세포 또는 세포의 군 (그러한 세포는, 예를 들어, 대상체로부터 유래하는 샘플에 존재할 수 있다) 에 의해 발현되는 mRNA 의 양의 감소에 의해 나타날 수 있다. 바람직한 구현예에서, 저해는 실시예 2 에 제공된 방법에 의해 10 nM iRNA 로 처리된 RKO 인간 대장 암종 세포에서 그리고 하기 식을 사용하여 처리된 세포에서의 mRNA 의 수준을 대조군 세포에서의 mRNA 의 수준의 백분율로 표현함으로써 평가된다:
Figure pct00021
다른 구현예에서, PD-L1 유전자의 발현의 저해는 PD-L1 유전자 발현, 예를 들어, PD-L1 단백질 발현 또는 PD-L1 신호전달 경로와 기능적으로 연관되는 파라미터의 감소의 면에서 평가될 수 있다. PD-L1 유전자 침묵화는 내생적인 또는 발현 구축물과 이종성인 PD-L1 을 발현하는 임의의 세포에서, 및 당해 기술분야에 알려진 임의의 어세이에서 확인될 수 있다.
PD-L1 단백질의 발현의 저해는 세포 또는 세포의 군에 의해 발현되는 PD-L1 단백질의 수준 (예를 들어, 대상체로부터 유래하는 샘플에서 발현되는 단백질의 수준) 의 감소에 의해 나타날 수 있다. 위에서 설명된 바와 같이, mRNA 억제의 평가에서, 처리된 세포 또는 세포의 군에서의 단백질 발현 수준의 저해는 대조군 세포 또는 세포의 군에서의 단백질의 수준의 백분율로서 유사하게 표현될 수 있다.
PD-L1 유전자의 발현의 저해를 평가하는데 사용될 수 있는 대조군 세포 또는 세포의 군은 본 발명의 RNAi 제제와 아직 접촉된 적이 없는 세포 또는 세포의 군을 포함한다. 예를 들어, 대조군 세포 또는 세포의 군은 RNAi 제제에 의한 대상체의 치료 전에 개별 대상체 (예를 들어, 인간 또는 동물 대상체) 로부터 유래될 수 있다.
세포 또는 세포의 군에 의해 발현되는 PD-L1 mRNA 의 수준은 당해 기술분야에 알려진 임의의 mRNA 발현 평가 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 하나의 구현예에서, 샘플에서의 PD-L1 의 발현의 수준은 전사된 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 일부, 예를 들어, PD-L1 유전자의 mRNA 를 검출함으로써 확인된다. RNA 는 세포로부터 RNA 추출 기술을 사용하여, 예를 들어, 산 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 추출 (RNAzol B; Biogenesis), RNeasy™ RNA 제조 키트 (Qiagen®) 또는 PAXgene (PreAnalytix, Switzerland) 을 사용하여 추출될 수 있다. 리보핵산 하이브리드화를 이용하는 전형적인 어세이 포맷은 핵 런-온 (run-on) 어세이, RT-PCR, RNase 보호 어세이, 노던 블롯팅, 인 시추 (in situ) 하이브리드화, 및마이크로어레이 분석을 포함한다. 순환하는 PD-L1 mRNA 는 PCT 공보 WO2012/177906 (이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨) 에 기재된 방법을 사용하여 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, PD-L1 의 발현의 수준은 핵산 탐침을 사용하여 확인된다. 본원에서 사용되는 용어 "탐침" 은 특이적 PD-L1 에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 탐침은 당업자에 의해 합성되거나, 또는 적당한 생물학적 제제로부터 유래될 수 있다. 탐침은 라벨링되도록 특이적으로 디자인될 수 있다. 탐침으로서 이용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체, 및 유기 분자를 포함하나, 그에 제한되지 않는다.
단리된 mRNA 는 서던 또는 노던 분석, 폴리머라아제 사슬 반응 (PCR) 분석 및 탐침 어레이를 포함하나, 그에 제한되지 않는 하이브리드화 또는 증폭 어세이에서 사용될 수 있다. mRNA 수준의 확인을 위한 하나의 방법은 단리된 mRNA 를 PD-L1 mRNA 에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자 (탐침) 와 접촉시키는 것을 수반한다. 하나의 구현예에서, 예를 들어 단리된 mRNA 를 아가로스 겔 상에서 런 (run) 시키고 mRNA 를 겔로부터 막, 예컨대 니트로셀룰로오스로 옮김으로써, mRNA 는 고체 표면에 부동화되고 탐침과 접촉된다. 대안적 구현예에서, 예를 들어, Affymetrix GeneChip® 어레이에서, 탐침(들)이 고체 표면에 부동화되고 mRNA 가 탐침(들)과 접촉된다. 당업자는 알려진 mRNA 검출 방법을 PD-L1 mRNA 의 수준을 확인하는데 사용하기 위해 용이하게 조정할 수 있다.
샘플에서의 PD-L1 의 발현의 수준을 확인하기 위한 대안적 방법은, 예를 들어, RT-PCR (Mullis, 1987, 미국 특허 번호 4,683,202 에 제시된 실험 구현예), 리가아제 사슬 반응 (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), 자가 지속되는 서열 복제 (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템 (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 레플리카제 (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), 회전환 복제 (Lizardi et al., 미국 특허 번호 5,854,033) 또는 임의의 기타 핵산 증폭 방법에 의한 핵산 증폭 및/또는 예를 들어 샘플 중의 mRNA 의 역전사 (cDNA 를 제조), 그에 뒤이어 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하는 증폭된 분자의 검출의 과정을 수반한다. 이러한 검출 계획은 핵산 분자 검출에 그러한 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 특정 양상에서, PD-L1 의 발현의 수준은 정량적 형광발생 RT-PCR (즉, TaqMan™ System) 또는 실시예 2 에서의 Dual-Glo® 루시퍼라제 어세이에 의해 확인된다.
PD-L1 mRNA 의 발현 수준은 막 블롯 (예컨대 하이브리드화 분석 예컨대 노던, 서던, 도트 등에서 사용됨), 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 겔, 비드 또는 섬유 (또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체) 를 사용하여 모니터링될 수 있다. 참조, 미국 특허 번호 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 및 5,445,934 (이는 본원에 참조로 포함된다). PD-L1 발현 수준의 확인은 또한 용액에서 핵산 탐침을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, mRNA 의 수준 발현은 분지형 DNA (bDNA) 어세이 또는 실시간 PCR (qPCR) 을 사용하여 평가된다. 이러한 PCR 방법의 사용은 본원에 제시되는 실시예에서 기재 및 예시되어 있다. 그러한 방법은 또한 병원체 핵산, 예를 들어, 간염 바이러스 핵산의 검출에 사용될 수 있다.
PD-L1 단백질 발현의 수준은 당해 기술분야에 알려진 임의의 단백질 수준 측정 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 그러한 방법은, 예를 들어, 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 박층 크로마토그래피 (TLC), 과확산 (hyperdiffusion) 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침강소 반응, 흡수 분광법, 비색 어세이, 분광광도측정 어세이, 유세포분석, 면역확산 (단일 또는 이중), 면역전기영동, 웨스턴 블롯팅, 방사면역어세이 (RIA), 효소-결합 면역흡착 어세이 (ELISAs), 면역형광 어세이, 전기화학발광 어세이 등을 포함한다. 그러한 어세이는 또한 병원체, 예를 들어 바이러스 단백질의 존재 또는 복제의 지표인 단백질의 검출에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, PD-L1-관련 질환의 치료에서 있어서의 본 발명의 방법의 효능은 PD-L1 mRNA 수준의 감소에 의해 평가된다 (간 생검에 의해).
일부 구현예에서, HBV 감염의 치료에서 있어서의 본 발명의 방법의 효능은 아래서 논의되는 혈청학적 마커의 조합을 평가함으로써 모니터링된다. HBV 를 갖는 대상체의 치료의 효능은 대상체에서의 간염 B s 항원 (HBsAg) 또는 HBeAg 의 수준을 검출함으로써 모니터링될 수 있으며, 여기에서, 예를 들어, 혈청에서의, HBsAg 또는 HBeAg 의 수준의 감소는 질환의 효과적 치료의 지표이다. 바람직한 구현예에서, HBsAg 또는 HbeAg 의 수준의 감소는 임상적으로 적절하며, 예를 들어, 관리의 표준으로 관찰되는 감소의 수준과 비슷하다. 치료의 효능은 또한 대상체에서의 HBV DNA 의 수준의 임상적으로 적절한, 예를 들어, 관리의 표준으로 관찰되는 감소의 수준과 비슷한 감소, 예를 들어, 적어도 4 log10 IU/mL, 바람직하게는 적어도 5 log10 IU/mL 만큼의 억제에 의해 확인될 수 있다 (Dienstag, Hepatology, 2009, 49:S112-S121). 치료의 효능은 또한 항-HBsAg 항체의 존재에 의해 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 암의 치료에 있어서의 본 발명의 방법의 효능은 대상체를 일차 종양 또는 전이성 종양(들)의 종양 부하의 유지 또는 바람직하게는 감소 또는 전이의 방지에 관해 평가함으로써 모니터링될 수 있다. 종양 부하의 검출 및 모니터링 방법은 당해 기술분야에서, 예를 들어, Eisenhauer et al., 2009, New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1). Eur. J. Cancer. 45:228-247 에서 제공된 RECIST 기준에서 알려져 있다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, iRNA 가 대상체 내의 특정 자리로 전달되도록 iRNA 가 대상체에게 투여된다. PD-L1 의 발현의 저해는 대상체 내의 특정 자리, 예를 들어, 간에서 유래되는 샘플 중의 PD-L1 mRNA 또는 PD-L1 단백질의 수준 또는 수준의 변화의 측정을 사용하여 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 방법은, 예를 들어 PD-L1 의 발현의 감소제에 의한 대상체의 치료 후에 임상 관련 결과에 의해 입증되는, PD-L1 의 발현의 임상 관련 저해를 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 피분석물 수준의 검출 또는 확인은 물질, 예를 들어, 단백질, RNA 가 존재하는지 여부를 확인하는 수행 단계를 의미하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는, 검출 또는 확인 방법은 사용되는 방법에 관한 검출 수준 미만인 피분석물 수준의 검출 또는 확인을 포함한다.
PD-L1 관련 질환의 동물 모델은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 침팬지, 우드척, 및 HBV 의 트랜스제닉 마우스 모델 (Wieland, 2015. Cold Spring Harb. Perspect. Med., 5:a021469, 2015; Tennant and Gerin, 2001. ILAR Journal, 42:89-102; and Moriyama et al., 1990. Science, 248:361-364) 을 포함하는 간염 B 감염의 동물 모델이 당해 기술분야에 알려져 있다. 침팬지 모델은 또한 간염 D 감염에 관한 모델로서 사용될 수 있다. 만성 vs. 급성 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV) 감염의 비교 모델은 면역 고갈의 연구에 유용하다 (Matloubian et al., 1994, J. Virol. 68:8056-8063). PD-L1 발현 종양을 포함하는 다수의 암 모델이 당해 기술분야에 알려져 있다 (Iwai et al., 2002, PNAS, 99:12293-12297).
VII. PD-L1-관련 질환의 치료 또는 예방 방법
본 발명은 또한 세포에서의 PD-L1 발현을 감소 또는 저해시키는 본 발명의 iRNA 또는 본 발명의 iRNA 를 함유하는 조성물의 사용 방법을 제공한다. 방법은 세포를 본 발명의 dsRNA 와 접촉시키고 세포를 PD-L1 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지하고, 그에 의해 세포에서 PD-L1 유전자의 발현을 저해하는 것을 포함한다. 유전자 발현의 감소는 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, PD-L1 의 발현의 감소는 PD-L1 의 mRNA 발현 수준을, 예를 들어, 간 샘플에서, 당업자에게 일상적인 방법, 예를 들어, 노던 블롯팅, qRT-PCR, 예를 들어, 실시예 2 에서 제공되는 방법을 사용하여 확인함으로써; 단백질 PD-L1 의 수준을 당업자에게 일상적인 방법, 예컨대 웨스턴 블롯팅, 면역학적 기술을 사용하여 확인함으로써 확인될 수 있다. PD-L1 의 발현의 감소는 또한 PD-L1 의 생물학적 활성의 감소를 측정 또는 대상체 샘플 (예를 들어, 혈청 샘플) 에서의 PD-L1 의 수준을 측정함으로써 간접 평가될 수 있다. PD-L1 의 발현의 감소는 또한 PD-L1 관련 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 변화, 바람직하게는 임상 관련 변화를 측정 또는 관찰함으로써 간접 평가될 수 있다.
본 발명의 방법에서 세포는 시험관내 또는 생체내 접촉될 수 있으며, 즉, 세포는 대상체 내에 있을 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하는 치료에 적합한 세포는 PD-L1 유전자를 발현하는 임의의 세포, 전형적으로 간 세포일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 세포는 표적 유전자 서열이 iRNA 제제에 대해 표적 녹다운을 촉진하기에 충분한 상보성을 가질 때 포유동물 세포, 예를 들어, 영장류 세포 (예를 들어, 인간 세포 또는 비인간 영장류 세포, 예를 들어, 원숭이 세포 또는 침팬지 세포), 비영장류 세포 (예를 들어, 소 세포, 돼지 세포, 낙타 세포, 라마 세포, 말 세포, 염소 세포, 토끼 세포, 양 세포, 햄스터, 기니 피그 세포, 고양이 세포, 개 세포, 랫트 세포, 마우스 세포, 사자 세포, 호랑이 세포, 곰 세포 또는 버팔로 세포), 조류 세포 (예를 들어, 오리 세포 또는 거위 세포) 또는 고래 세포일 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포는 인간 세포, 예를 들어, 인간 간 세포이다.
PD-L1 발현은 세포에서 적어도 20%, 25%, 바람직하게는 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 만큼, 또는 어세이의 검출 수준 미만의 수준까지 저해된다. 특정 구현예에서, 방법은, 예를 들어 PD-L1 의 발현의 감소제에 의한 대상체의 치료 후에 임상 관련 결과에 의해 입증되는, PD-L1 의 발현의 임상 관련 저해를 포함한다.
본 발명의 생체내 방법은 iRNA 를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, iRNA 는 치료받는 포유동물의 PD-L1 유전자의 RNA 전사물의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 치료받는 유기체가 포유동물 예컨대 인간인 경우, 조성물을 이에 제한되는 것은 아니나, 경구, 복강 내, 또는 두개 내 (예를 들어 심실 내, 뇌 실질 내, 및 막내), 정맥내, 근육 내, 피하, 경피, 기도 (에어로졸), 비강, 직장, 및 국소 (구강 및 설하 포함) 를 비롯한 비경구 경로를 포함하는 당해 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의하여 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 특정 구현예에서, 조성물은 피하 주사에 의해 투여된다.
일부 구현예에서는, 데포 주입 (depot 주입) 을 통해 투여된다. 데포 주입은 연장 시간 동안 일정한 방식으로 iRNA 를 방출할 수 있다. 따라서, 데포 주입은, 바람직한 효과, 예를 들어 바람직한 PD-L1 의 저해 또는 치료학적 효과를 획득하는데 필요한 투여 횟수를 감소시킬 수 있다. 데포 주입은 또한, 더욱 일정한 혈청 농도를 제공할 수 있다. 데포 주입은 피하 주입 또는 근육 내 주입을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 데포 주입은 피하 주입이다.
일부 구현예에서는, 펌프를 통해 투여된다. 상기 펌프는 외부 펌프 또는 외과적으로 이식된 펌프일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 펌프는 피하 이식 삼투 펌프이다. 다른 구현예에서, 상기 펌프는 투입 펌프이다. 투입 펌프는 정맥 내, 피하, 동맥, 또는 경막 외용으로 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 투입 펌프는 피하용 투입 펌프이다. 다른 구현예에서, 상기 펌프는, iRNA 를 간에 전달하는 외과적 이식 펌프이다.
투입 방식은, 바람직한 것이 국소 처리인지 또는 전신 처리인지 여부 및, 처리 영역을 기반으로 하여, 선택될 수 있다. 표적화의 향상을 위해, 투여 경로 및 위치가 선택될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 또한 포유동물에서 PD-L1 유전자의 발현을 저해하는 방법을 제공한다. 방법은 포유동물에게 포유동물의 세포 내의 PD-L1 유전자를 표적화하는 dsRNA 를 포함하는 조성물을 투여하고 포유동물을 PD-L1 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지하고, 그에 의해 세포에서 PD-L1 유전자의 발현을 저해하는 것을 포함한다. 유전자 발현의 감소는 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 및 본원에 기재된 방법, 예를 들어 qRT-PCR 에 의해 평가될 수 있다. 단백질 생산의 감소는 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 및 본원에 기재된 방법, 예를 들어 ELISA 에 의해 평가될 수 있다. 하나의 구현예에서, 천자 간 생검 샘플은 PD-L1 유전자 또는 단백질 발현의 감소를 모니터링하기 위한 조직 물질로서의 역할을 한다. 특정 구현예에서, PD-L1 발현의 저해는 임상 관련 결과의 관찰에 의해 확인된다.
본 발명은 추가로 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 치료 방법은 본 발명의 iRNA 를 대상체, 예를 들어, PD-L1 발현의 감소 또는 저해로부터 유익을 얻을 대상체에게, 치료적 유효량의 PD-L1 유전자를 표적화하는 iRNA 또는 PD-L1 유전자를 표적화하는 iRNA 를 포함하는 약학적 조성물로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 iRNA 는 "자유 iRNA" 로서 투여될 수 있다. 자유 iRNA 는 약학적 조성물의 부재 하에 투여된다. 네이키드 (naked) iRNA 는 적합한 완충 용액에 있을 수 있다. 완충 용액은 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카르보네이트, 또는 포스페이트, 또는 그들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 완충 용액은 포스페이트 완충 염류용액 (PBS) 이다. iRNA 를 함유하는 완충 용액의 pH 및 오스몰농도는 그것이 대상체에게 투여하기에 적합하게 되도록 조정될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 iRNA 는 약학적 조성물, 예컨대 dsRNA 리포솜 제형으로서 투여될 수 있다.
PD-L1 유전자 발현의 감소 또는 저해로부터 유익을 얻을 대상체는 증가된 면역 응답으로부터 유익을 얻을 장애, 예를 들어, 감염 질환, 예를 들어, 바이러스 질환, 예를 들어, 간염; 또는 암을 갖는 대상체이다.
iRNA 및 부가적 치료제는 동시에 또는 동일한 조합으로, 예를 들어, 비경구적으로 투여될 수 있거나, 또는 부가적 치료제는 별개의 조성물의 일부로서 또는 별개의 시간에 또는 당해 기술분야에 알려진 또는 본원에 기재된 또다른 방법에 의해 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 방법은 본원에 특별히 기재된 조성물을 투여하여 표적 PD-L1 유전자의 발현이, 예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24 시간, 28, 32, 또는 약 36 시간 동안 감소되는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, 표적 PD-L1 유전자의 발현은 연장된 지속시간, 예를 들어, 적어도 약 2, 3, 4 일 또는 그 이상, 예를 들어, 약 1 주, 2 주, 3 주, 또는 4 주 또는 그 이상, 예를 들어, 약 1 개월, 2 개월, 또는 3 개월 동안 감소된다.
바람직하게는, 본원에 특별히 기재된 방법 및 조성물에 유용한 iRNAs 는 표적 PD-L1 유전자의 RNAs (일차 또는 가공된) 를 특이적으로 표적화한다. iRNAs 를 사용하여 이러한 유전자의 발현을 저해하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 기재된 바와 같이 제조 및 주행될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 iRNA 의 투여는, 예를 들어, 상승된 PD-L1 또는 PD-L1 응답성 종양을 갖는 환자에서 그러한 질환 또는 장애의 중증도, 징후, 증상, 또는 마커의 감소를 초래할 수 있다. 이러한 맥락에서 "감소" 는 그러한 수준, 예를 들어, 대상체에서의 병원체의 존재의 지표, 예를 들어, 간염 B 로 감염된 대상체의 혈청 중의 HBsAg, HBeAg, 또는 HB cccDNA 의 수준의 통계적으로 유의한 감소를 의미한다. 감소는, 예를 들어, 적어도 약 20%, 25%, 바람직하게는 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 또는 사용되는 어세이의 검출 수준 미만까지일 수 있다. 특정 구현예에서, 마커, 예를 들어, 항-HBs 항체의 증가는 질환의 중증도의 감소의 지표이다. 그러므로, 증가는, 예를 들어, 대상체에서 탐지가능한 수준까지의, 항체의 수준의 통계적으로 유의한 증가일 수 있다.
질환의 치료 또는 예방의 효능은, 예를 들어 질환 진행, 질환 완화, 증상 중증도, 통증 감소, 삶의 질, 치료 효과를 지속하는데 요구되는 약제의 용량, 질환 마커, 또는 치료되는 또는 예방 목표가 되는 주어진 질환에 적당한 임의의 기타 측정가능한 파라미터의 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 그러한 파라미터 중 임의의 하나, 또는 파라미터의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것은 당업자의 능력에 속한다. 예를 들어, 증가된 면역 응답으로부터 유익을 얻을 장애, 예를 들어, 감염 질환, 예를 들어, 바이러스 질환, 예를 들어, 간염, 또는 암의 치료의 효능.
감염 질환의 치료의 효능은, 예를 들어, 대상체 샘플로부터 제제를 배양하는 무능력에 의해 입증되는 감염원의 존재의 감소에 의해 입증될 수 있다. 감염 질환의 치료의 효능은, 예를 들어, 감염원에 존재하는 단백질, 핵산, 또는 탄수화물의 감소에 의해 입증되는, 감염원의 존재의 감소에 의해 입증될 수 있다. 치료의 효능은, 예를 들어, 감염원을 표적으로 삼는 항체 또는 면역 세포의 존재에 의해 입증되는 면역 응답의 존재에 의해 입증될 수 있다. 감염 질환의 치료의 효능은, 예를 들어, 감염의 하나 이상의 징후 또는 증상, 예를 들어, 열, 통증, 구역, 구토, 비정상 혈액 화학, 체중 감소의 감소에 의해 입증되는 감염원의 존재의 감소에 의해 입증될 수 있다. 특이적 징후 또는 증상은 특이적 병원체에 따라 좌우될 것이다. 감염 질환의 치료의 효능은 병원체를 표적으로 삼는 항체 또는 면역 세포의 발달에 의해 입증될 수 있다.
암의 치료의 효능은 일차 종양, 전이성 종양의 안정화 또는 종양 부하의 감소에 의해 입증되는 안정화 또는 종양 부하의 감소, 또는 종양 전이의 지연 또는 방지에 의해 입증될 수 있다. 진단 및 모니터링 방법, 예를 들어, RECIST 기준이 본원에서 제공된다.
나중의 판독과 처음의 판독의 비교는 의사에게 치료가 효과적인지 여부의 지시를 제공한다. 그러한 파라미터 중 임의의 하나, 또는 파라미터의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것은 당업자의 능력에 속한다. PD-L1 을 표적화하는 iRNA 또는 그의 약학적 조성물의 투여와 관련하여, PD-L1 관련 장애 "에 대해 효과적" 은 임상적으로 적절한 방식의 투여가 환자의 적어도 통계적으로 유의한 분획에 대해 유익한 효과, 예컨대 증상의 개선, 치유, 질환의 감소, 생명 연장, 삶의 질 개선, 또는, 예를 들어, 본원에 제공된 HBV 에 관한 진단 기준에서, 제공되는 PD-L1-관련 장애의 치료에 익숙한 의사에 의해 양성으로 일반적으로 인식되는 기타 효과를 초래하는 것을 시사한다.
치료 또는 예방 효과는 질환 상태의 하나 이상의 파라미터의 통계적으로 유의한 개선이 있을 때, 또는 그렇지 않은 경우에 예상되는 증상의 악화 또는 발달의 실패에 의해 명백하다. 예로서, 질환의 측정가능한 파라미터의 적어도 10% 의 유리한 변화, 및 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상은 효과적 치료의 지표일 수 있다. 주어진 iRNA 약물 또는 그 약물의 제형에 관한 효능은 또한 당해 기술분야에 알려진 주어진 질환에 관한 실험 동물 모델을 사용하여 판단될 수 있다. 실험 동물 모델을 사용할 때, 치료의 효능은 마커 또는 증상의 통계적으로 유의한 감소가 관찰될 때 증명된다.
대안적으로, 효능은 임상적으로 수용되는 질환 중증도 채점 등급에 기초하는 진단의 당업자에 의해 확인되는 질환의 중증도의 감소에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 적절한 등급을 사용하여 측정되는 질환의 중증도의 경감을 초래하는, 임의의 양성 변화는 본원에 기재된 바와 같은 iRNA 또는 iRNA 제형을 사용하는 적절한 치료를 나타낸다.
대상체에게 치료적 양, 예컨대 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 200 ㎎/㎏ 의 iRNA 가 투여될 수 있다.
iRNA 는 정맥내 주입에 의해 일정한 시간 기간 동안, 정기적으로, 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 초기 치료 섭생법 후에, 치료는 더 적은 빈도로 투여될 수 있다. iRNA 의 투여는, 예를 들어, 환자의 세포 또는 조직에서의, PD-L1 수준을 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 만큼, 또는 사용되는 어세이 방법의 검출 수준 미만까지 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 투여는 PD-L1 관련 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 임상 안정화 또는 바람직하게는 임상 관련 감소를 초래한다.
특정 구현예에서, 전체 용량의 iRNA, 환자에게는 투여 더 작은 용량, 예컨대 5% 주입 반응이 투여되고, 유해 효과, 예컨대 알레르기 반응에 관해 모니터링될 수 있다. 또다른 예에서, 환자는 원치 않는 면역자극성 효과, 예컨대 증가된 사이토카인 (예를 들어, TNF-알파 또는 INF-알파) 수준에 관해 모니터링될 수 있다.
대안적으로, iRNA 는 피하에, 즉, 피하 주입에 의해 투여될 수 있다. 하나 이상의 주입이 사용되어 요망되는 일일 용량의 iRNA 를 대상체에게 전달할 수 있다. 주입은 일정한 시간 기간 동안 반복될 수 있다. 투여는 정기적으로 반복될 수 있다. 특정 구현예에서, 초기 치료 섭생법 후에, 치료는 더 적은 빈도로 투여될 수 있다. 반복-용량 섭생법은 정기적으로, 예컨대 하루 걸러 또는 일년에 한 번 치료적 양의 iRNA 의 투여를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, iRNA 는 약 한 달에 한 번 내지 약 분기당 한 번 (즉, 약 세 달에 한 번) 투여된다.
IX. PD-L1 관련 질환에 관한 진단 기준 및 치료
다양한 PD-L1 관련 질환에 관한 예시적 진단 및 모니터링 기준이 아래 제공되어 있다.
A. 간염 B
간염은 간의 염증을 의미하는 일반 용어이고 여러 가지 상이한 바이러스 예컨대 간염 A, B, C, D 및 E 에 의해 야기될 수 있다. 황달의 발달은 간 질환의 특징적 특색이므로, 정확한 진단은 오직 환자의 혈청을 특이적 항-바이러스 항원또는 항체의 존재에 관해 시험함으로써 이루어질 수 있다. 지속적 HBV 감염의 심각한 병리학적 결과는 만성 간 부전, 간경변, 및 간세포 암종 (HCC) 의 발달을 포함한다. 게다가, HBV 담체는 질환을 다년간 전파할 수 있다.
HBV 는 큰 바이러스이고 태반을 가로지르지 않지만, HBV 로 감염된 임신한 여성은 그들의 질환을 그들의 아기에게 출생시 전파할 수 있다. 출생시 백신접종되지 않는 경우에, 이러한 아기 중 많은 수는 평생의 HBV 감염을 발달시키고, 많은 수는 만년에 간 부전 또는 간암을 발달시킨다. 급성 HBV 감염에 뒤이어, 만성 감염을 발달시킬 위험은 연령에 역비례하여 달라진다. 만성 HBV 감염은 출생시 감염된 아기 중 약 90% 에서 발생하고, 1-5 세에 감염된 어린이 중 25-50% 및 더 나이 많은 어린이 및 성체로서 감염된 사람 중 약 1-5% 에서 발생한다. 만성 HBV 감염은 또한 면역결핍증이 있는 사람에서 흔하다 (Hepatitis B: World Health Organization. Department of Communicable Diseases Surveillance and Response, www.who.int/csr/disease/hepatitis/HepatitisB_whocdscsrlyo2002_2.pdf?ua=1 에서 입수가능, 본원에 참조로 포함된다).
질환의 잠복기 (6 내지 24 주) 동안, 환자는 편치 않다고 느낄 수 있으며 구역, 구토, 설사, 식욕부진, 및 두통이 있을 수 있다. 환자는 그 때 황달에 걸릴 수 있지만 낮은 등급 열 및 식욕의 상실이 개선될 수 있다. 때때로 HBV 감염은 황달도 명백한 증상도 야기하지 않는다. 무증상 케이스는 그들의 혈액에서 생화학적 또는 바이러스-특이적 혈청학적 변화를 검출함으로써 확인될 수 있다. 그러한 무증상 개체는 바이러스의 조용한 담체가 되고 다른 개체에 대한 추가 전파의 저장소가 될 수 있다.
대부분의 성체 환자는 그들의 HBV 감염으로부터 완전히 회복되지만, 다른 환자, 약 5 내지 10% 는, 바이러스를 쫓아내지 않을 것이고 진행하여 무증상 담체로 되거나 또는 만성 간염을 발달시켜 아마도 간경변 또는 간암을 초래할 것이다. 드물게, 일부 환자는 전격성 간염을 발달시키고 죽을 수 있다. 지속성 또는 만성 HBV 감염은 인간에서 대부분의 흔한 지속성 바이러스 감염에 속한다. 전세계적으로 35 억 명 초과의 사람들이 오늘날 HBV 로 지속적으로 감염되는 것으로 추정된다. 이 중 큰 분획은 동아시아 및 사하라 사막 이남의 아프리카에 있고, 여기에서 만성 간 질환 및 간암의 관련 합병증은 가장 중요한 건강 문제이다.
간염 B 에 대한 3 가지 표준 혈액 시험 (HBs 항원, 항HBs 항체, 및 HBc 항원) 은 사람이 현재 HBV 로 감염되어 있는지, 회복되었는지, 만성 담체인지, 또는 HBV 감염에 취약한지 여부를 확인할 수 있다.
Figure pct00022
출처: Hollinger FB, Liang TJ. Hepatitis B Virus. In: Knipe DM et al., eds. Fields Virology, 4th ed., Philadelphia, Lippincott Williams &Wilkins, 2001:2971-3036.
추가의 혈청학적 시험이 수행되어 만성 또는 급성 HBV 을 갖는, 또는 담체일 수 있는 대상체를 구별할 수 있다. HBV 에 대한 다수의 백신이 입수가능하고 현재 치료보다 훨씬 더 효과적이고, 비용-효과적이다.
현재, 급성 간염 B 에 이용가능한 치료가 존재하지 않는다. 구역, 식욕부진, 구토, 및 기타 증상의 대증 치료가 권고될 수 있다.
만성 간염 B 의 치료는 감염력을 제거하여 HBV 의 전파 및 확산을 방지하고는, 간 질환의 진행을 멈추고 임상적 및 조직학적 그림을 개선하고, 혈청 및 간에서 HBV 복제의 마커 예컨대 HBV DNA, HBeAg, 및 HBcAg 를 줄임으로써, HCC 가 발달하는 것을 방지하는 것을 목표로 한다. ALT 활성의 정상화, 간 염증의 해결 및 환자의 증상의 개선은 통상 이들 바이러스학적 변화를 동반한다. 그러나, HBV 에 현재 이용가능한 치료는 좀처럼 치유력이 있지 않다. 환자는 질환을 억제하고 전파를 방지하는 치료를 무기한으로 받아야 한다.
두 가지 주요 부류의 치료가 존재한다: 항바이러스제: 바이러스 복제를 방해함으로써 HBV 를 억제 또는 파괴하는 것을 목표로 함; 및 면역 조정제: 인간 면역 시스템이 바이러스에 대항하는 방어를 증가시키는 것을 돕는 것을 목표로 함. 바이러스 및 바이러스 항원의 증가된 발현, 및 T-림프구 기능의 억제를 유도하는 코르티코스테로이드도, 아데닌 아라비노사이드, 아시클로비르, 또는 디데옥시이노신도, 만성 간염 B 의 치료에 유익하지 않은 것으로 밝혀졌다.
현재, 만성 간염 B 는 면역 응답을 조정하는 인터페론으로 치료된다. 유일하게 승인된 것은 인터페론-α-2a 및 인터페론-α-2b 이다. 인터페론은 항바이러스, 면역조정, 및 항증식 효과를 포함하는 여러 가지 특성을 나타낸다. 그들은 T-세포 헬퍼 활성을 향상시키고, B 림프구의 돌연변이를 야기하고, T-세포 억제인자를 저해하고, HLA 유형 I 발현을 향상시킨다. 인터페론 요법에 자격이 있으려면, 환자는 적어도 6 개월 동안 문서기록된 감염, 상승된 간 효소 (AST 및 ALT), 및 그들의 혈액에서 활발히 분열하는 바이러스 (HBeAg 및/또는 HBV DNA 양성 시험) 를 가져야 한다. 급성 감염, 말기 간경변 또는 기타 주요 의학적 문제를 갖는 환자는 치료되지 않을 것이다. 인터페론-α 는 만성 간염 B 을 갖는 환자의 35% 에서 질환의 장기, 지속되는 완화와, 간 효소의 정상화 및 활성 감염에 관한 세 가지 마커 (HBeAg, HBV DNA, 및 HBsAg) 의 상실을 초래한다. 바이러스의 완전한 제거는 일부 신중히 선택된 환자에서 달성된다.
HBV-관련 간경변을 갖는 환자를 위한 인터페론 요법은, 특히 더 많은 양의 혈청 HBV DNA 를 갖는 환자에서, HCC 비율을 유의하게 감소시킨다. HBeAg-양성 대상성 간경변, 바이러스학적 및 생화학적 완화를 갖는 환자에서 하기 인터페론 요법은 개선된 생존률과 연관된다. 만성 HBV 감염을 갖는 환자에서, 인터페론-α 에 의한 치료 후 HBeAg 의 청소는 개선된 임상 결과와 연관된다.
인터페론-α [인트론 A (인터페론-α-2b), 셰링 플라우 (Schering Plough), 및 로페론 (Roferon), (인터페론-α-2a) Roche Labs] 는 만성 간염 B 에 대한 일차 치료이다. 요법의 표준 지속시간은 16 주로 여겨진다. 표준 섭생법의 마지막에 낮은 수준의 바이러스 복제를 나타내는 환자는 연장된 치료로부터 가장 유익을 얻는다.
뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 유사체는 HBV 의 치료에 오랫 동안 사용되어 왔다. 현재 이용가능한 및 개발 중인 화합물은 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 텔비부딘, 테노포비르, 엠트리시타빈, 클레부딘, 리토나비르, 디피복실, 로부카비르, 팜비르, FTC, N-아세틸-시스테인 (NAC), PC1323, 테라다임-HBV, 티모신-알파, 및 간시클로비르를 포함한다. 일부는 기타 바이러스 감염, 예를 들어, HCV, HIV 에 대해 유용하지만, 다른 것들은 주로 HBV 의 치료에서 효과적이다.
HBV DNA 및 HBeAg 의 영구적 상실은 항바이러스 치료의 목표로 여겨지며, 이들 결과는 괴사-염증 손상의 개선, 및 감소된 감염력과 연관된다.
B. 간염 D
간염 델타 바이러스 (HDV) 는 활성 HBV 감염의 존재시에만 감염성인 결손 바이러스이다. HDV 감염은 HBV 와의 동시감염 또는 HBV 담체의 중복감염으로서 발생한다. 동시감염은 보통 해결된다. 중복감염은, 그러나, 빈번히 만성 HDV 감염 및 만성 활성 간염을 야기한다. 두 가지 유형의 감염은 전격성 간염을 야기할 수 있다.
전파 경로는 HBV 의 전파 경로와 유사하다. 백신접종에 의한 취약한 사람의 급성 및 만성 HBV 감염의 예방은 또한 HDV 감염을 예방할 것이다. 특정 HBV 치료, 예를 들어, 아데포비르를 사용하거나 사용하지 않는 인터페론-α 는 또한 HDV 의 치료에서 효과적이다. 그러나 다른 것들, 예컨대 라미부딘, HBV-DNA 복제의 저해제는 만성 간염 D 의 치료에 유용하지 않다.
C. 결핵 (TB)
결핵은 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 에 의해 야기되는 질환이다. 결핵은 설명되지 않는 체중 감소, 식욕의 상실, 식은땀, 열, 피로, 3 주 초과 동안의 기침, 객혈 (혈액을 토해냄), 및 가슴 통증을 포함하는 증상과 관련된다. 사람이 TB 박테리아로 감염되었는지 여부를 확인하는데 사용되는 두 종류의 시험이 있다: 튜베르쿨린 피부 시험 및 TB 혈액 시험 (이는 QuantiFERON®-TB Gold In-Tube 시험 (QFT-GIT) 및 T-SPOT®.TB 시험 (T-Spot) 을 포함한다). 그러나, 상기 시험은 활성 TB 감염의 지표가 아니다. TB 감염의 진단은 병력의 평가, 신체 검사, 흉부 방사선촬영, 및 약물 내성에 관한 분석을 포함하는 진단적 미생물 배양 어세이를 포함한다. TB 의 징후 또는 증상의 임상 관련 변화의 평가는 당업자의 능력에 속한다.
D. 암
암은 주변 조직을 침입하고 새로운 신체 자리로 전이하는 경향이 있는 역형성 세포의 증식을 특징으로 하는 임의의 다양한 악성 신생물을 지칭하고, 또한 그러한 악성 신생물 성장을 특징으로 하는 병리학적 상태를 지칭한다. 암은 종양 또는 혈액성 악성종양일 수 있고, 모든 유형의 림프종/백혈병, 암종 및 육종을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 암은 간암을 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 간세포 암종 (HCC) 을 포함한다.
RECIST 기준은 고형 종양 측정에 대한 표준 접근법을 제공하고 임상 시험에서 사용하기 위한 종양 크기의 변화의 객관적 평가를 위한 정의를 제공하는데 사용되는 임상적으로 수용되는 평가 기준이다. 그러한 기준은 또한 고형 종양에 대한 치료를 받고 있는 개체의 응답을 모니터링하는데 사용될 수 있다. RECIST 1.1 기준은 Eisenhauer et al., New response evaluation criteria in solid tumors: Revised RECIST guideline (version 1.1). Eur. J. Cancer. 45:228-247, 2009 (이는 본원에 참조로 포함된다) 에서 상세히 논의된다. 표적 병변에 관한 응답 기준은 하기를 포함한다:
완전한 응답 (CR) : 모든 표적 병변의 소멸. 임의의 병적 림프절 (표적 또는 비-표적) 은 짧은 축에서 <10 mm 까지의 감소를 가져야 한다.
부분적 응답 (PR) : 표적 병변의 직경의 합계에서 적어도 30% 감소, 기준선 합계 직경을 참조로 함.
진행성 질환 (PD) : 표적 병변의 직경의 합계에서 적어도 20% 증가, 연구에서 최소 합계를 참조로 함 (이는 그것이 연구에서 최소인 경우에 기준선 합계를 포함한다). 20% 의 상대 증가에 더하여, 합계는 또한 적어도 5 mm 의 절대 증가를 입증해야 한다. (주의: 하나 이상의 새로운 병변의 출현은 또한 진행으로 여겨진다).
안정적 질환 (SD) : PR 의 자격을 얻기에 충분한 수축도 PD 의 자격을 얻기에 충분한 증가도 없음, 연구 중의 최소 합계 직경을 참조로 함.
RECIST 1.1 기준은 또한 측정가능할 수 있으나, 측정될 필요는 없고, 오직 요망되는 시점에서 정성적으로 평가되어야 하는 병변으로서 정의되는 비-표적 병변을 고려한다. 비-표적 병변에 관한 응답 기준은 하기를 포함한다:
완전한 응답 (CR) : 모든 비-표적 병변의 소멸 및 종양 마커 수준의 정상화. 모든 림프절은 크기에서 비-병적이어야 한다 (<10 mm 짧은 축).
비-CR/비-PD: 하나 이상의 비-표적 병변(들)의 지속성 및/또는 정상 한계 초과에서 종양 마커 수준의 유지.
진행성 질환 (PD) : 기존 비-표적 병변의 명백한 진행. 하나 이상의 새로운 병변의 출현은 또한 진행으로 여겨진다. 비-표적 질환에 기초하여 "명백한 진행" 을 달성하기 위해서, 비-표적 질환의 실질적 악화의 전체적 수준이 존재해야 하며, 그래서, 표적 질환에서 SD 또는 PR 의 존재 하에서도, 전체적 종양 부하가 요법을 중단을 받을 만하게 충분히 증가되었다. 하나 이상의 비-표적 병변의 크기의 보통의 "증가" 는 통상 명백한 진행 상태의 자격을 얻기에 충분하지 않다. 오로지 표적 질환에서 SD 또는 PR 의 면에서 비-표적 질환의 변화에 기초하는 전체적 진행의 지정은 그러므로 극히 드물 것이다.
급성 백혈병에서 치료에 대한 응답에 관한 임상적으로 허용가능한 기준은 다음과 같다:
완전한 완화 (CR) : 환자는 백혈병과 관련되는 모든 증상을 갖지 않아야 하고 절대 호중구 계수 ≥ 1.0 x 109/L, 혈소판 계수 ≥ 100 x 109/L, 및 <5% 모구가 있는 정상 골수를 가져야 하고 아우어 막대 (Auer rod) 를 갖지 않아야 한다.
불완전한 혈액 계수 회복이 있는 완전한 완화 (Cri) : CE 에 따름, 그러나 잔류 혈소판감소증 (혈소판 계수 <100 x 109/L) 또는 잔류 호중구감소증 (절대 호중구 계수 <1.0 x 109/L) 이 있음.
부분적 완화 (PR) : 골수 모구의 ≥ 50% 감소 내지 골수에서의 5 내지 25% 비정상 세포; 또는 아우어 막대가 존재하는 경우에 ≤ 5% 모구가 있는 CR.
치료 실패: 치료는 CR, Cri, 또는 PR 를 달성하기에 실패했다. 재발.
확인된 CR 후 재발: 말초 혈액에서 백혈병 모구의 재출현 또는 임의의 기타 원인 (예를 들어, 통합 요법 후 골수 재생) 에 기인하지 않는 골수에서의 ≥ 5% 모구 또는 새로운 이형성 변화의 출현.
본 발명의 조성물 및 방법의 사용은 고형 종양을 갖는 대상체에서 충분한 시간 동안 적어도 안정적 질환을 달성하여 RECIST 기준에 의한 안정적 질환의 정의를 만족시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 사용은 고형 종양을 갖는 대상체에서 충분한 시간 동안 적어도 부분적 응답을 달성하여 RECIST 기준에 의한 안정적 질환의 정의를 만족시키는 것을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법의 사용은 급성 백혈병을 갖는 대상체에서 충분한 시간 동안 적어도 부분적 완화를 달성하여 RECIST 기준에 의한 안정적 질환의 정의를 만족시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 사용은 급성 백혈병을 갖는 대상체에서 충분한 시간 동안 적어도 불완전한 혈액 계수 회복이 있는 완전한 완화를 달성하여 RECIST 기준에 의한 안정적 질환의 정의를 만족시키는 것을 포함한다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 하기의 실시예는 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 명세서에 언급된 모든 참조문헌, 특허 및 특허 출원 공보의 전체 내용 및 서열 목록은 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1. iRNA 합성
시약 공급처
시약 공급처가 구체적으로 본원에 제공되지 않는 경우, 이러한 시약은 분자 생물학에 응용하기 위한 품질/순도 표준으로, 분자 생물학을 위한 임의의 시약의 공급처로부터 수득될 수 있다.
전사물
siRNA 디자인
인간 PD-L1/ CD274 (인간: NCBI refseqID NM_001267706; NCBI GeneID: 29126; SEQ ID NO:1), 뿐만 아니라 독성학-종 PD-L1 오르소로그 (마우스: XM_006527249 (SEQ ID NO:3); 랫트, XM_006231248 (SEQ ID NO:5); 및 시노몰구스 원숭이: XM_005581779 (SEQ ID NO: 7)) 를 표적화하는 siRNA 의 집합을 커스텀 R 및 Python 스크립트를 사용하여 디자인했다. 인간 PD-L1 REFSEQ mRNA 는 3349 염기의 길이를 갖는다. siRNA 의 집합 디자인에 관한 근거 및 방법은 다음과 같다: 위치 109 로부터 위치 3349 (코딩 영역 및 3' UTR) 를 통한 모든 잠재적 19mer siRNA 에 관한 예측되는 효능을 다수의 척추동물 유전자를 표적화하는 20,000 개 초과의 구별되는 siRNA 디자인으로부터 mRNA 녹다운의 직접 측정에서 유도되는 선형 모델로 확인했다. PD-L1 siRNAs 의 부분집합을 인간과 시노몰구스 원숭이 사이의 완벽한 또는 거의-완벽한 매치로 디자인했다. 추가의 부분집합을 마우스 및 랫트 PD-L1 오르소로그와의 완벽한 또는 거의-완벽한 매치로 디자인했다. 추가의 부분집합을 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 및 랫트 PD-L1 오르소로그와의 완벽한 또는 거의-완벽한 매치로 디자인했다. siRNA 의 각각의 가닥에 관해, 커스텀 Python 스크립트를 브루트 포스 서치 (brute force search) 에서 사용하여 siRNA 사이의 미스매치의 수 및 위치 및 표적 종 전사체에서의 모든 잠재적 정렬을 측정했다. 본원에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 위치 2-9 로서 정의되는 시드 영역, 뿐만 아니라 본원에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 위치 10-11 로서 정의되는 siRNA 의 절단 자리에서의 미스매치에 추가의 가중치를 부여했다. 시드 미스매치, 절단 자리, 및 안티센스 위치 19 까지의 기타 위치에 관한 미스매치의 상대 가중치는 2.8; 1.2: 1 이다. 첫번째 위치에서의 미스매치는 무시했다. 각각의 가중된 미스매치의 값을 합계내어 각각의 가닥에 대해 특이성 점수를 계산했다. 인간 및 시노몰구스 원숭이에서의 안티센스 점수가 >= 3.0 이고 예측된 효능이 PD-L1 전사물의 >= 70% 녹다운이었던 siRNA 가 선호되었다.
수식되지 않은 PD-L1 센스 및 안티센스 가닥 서열의 상세한 목록이 표 3 에서 보여진다. 수식된 PD-L1 센스 및 안티센스 가닥 서열의 상세한 목록이 표 5 에서 보여진다.
siRNA 합성
PD-L1 siRNA 서열을 고체 지지체 매개의 포스포르아미디트 화학을 사용하여 Mermade 192 합성기 (BioAutomation) 에서 1 μmol 규모로 합성했다. 고체 지지체는 커스텀 GalNAc 리간드가 로딩된 조절 공극 유리 (500 A) 또는 범용 고체 지지체 (AM biochemical) 였다. 보조 합성 시약, 2'-F 및 2'-O-메틸 RNA 및 데옥시 포스포르아미디트를 Thermo-Fisher (미국 위스콘신주 밀워키 소재) 및 Hongene (중국) 으로부터 수득했다. 상응하는 포스포르아미디트를 사용하여 2'F 2'-O-메틸, GNA (글리콜 핵산), 5' 포스페이트 및 기타 수식을 도입했다. 3' GalNAc 컨쥬게이트된 단일 가닥의 합성을 GalNAc 수식된 CPG 지지체 상에서 수행했다. 커스텀 CPG 범용 고체 지지체를 안티센스 단일 가닥의 합성에 사용했다. 모든 포스포르아미디트 (아세토니트릴 중 100 mM ) 에 관한 커플링 시간은 활성화제로서 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT) (아세토니트릴 중 0.6 M) 을 사용하여 5 분이었다. 무수 아세토니트릴/피리딘 (1:1 v/v) 중 3-((디메틸아미노-메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온 (DDTT, Chemgenes® (미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재) 로부터 수득) 의 50 mM 용액을 사용하여 포스포로티오에이트 연결을 생성했다. 산화 시간은 3 분이었다. 모든 서열을 DMT 기의 최종 제거 ("DMT 오프 (off) ") 로 합성했다.
고체상 합성의 완료시에, 올리고리보뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 절단하고, 60℃ 에서 20 분 동안 200 ㎕ 의 수성 메틸아민 시약을 사용하여 밀봉된 96 딥 웰 플레이트에서 탈보호시켰다. tert-부틸 디메틸 실릴 (TBDMS) 기로 보호되는 2' 리보 잔기 (2'-OH) 를 함유하는 서열에 관해, 두번째 단계 탈보호를 TEA.3HF (트리에틸아민 트리히드로 플루오라이드) 시약을 사용하여 수행했다. 메틸아민 탈보호 용액에, 200uL 의 디메틸 술폭시드 (DMSO) 및 300ul TEA.3HF 시약을 첨가하고 용액을 부가적 20min 동안 60℃ 에서 인큐베이션했다. 절단 및 탈보호 단계의 마지막에, 합성 플레이트가 실온이 되게 하고, 1 ㎖의 아세토니트릴:에탄올 혼합물 (9:1) 의 첨가에 의해 침전시켰다. 플레이트를 2 시간 동안 -80℃ 로 냉각시키고, 다중 채널 피펫을 이용하여 상청액을 조심스럽게 경사분리했다. 올리고뉴클레오티드 펠렛을 20 mM NaOAc 완충제 중에 재현탁시키고, A905 자동샘플추출기 (autosampler) 및 Frac 950 분획 수집기가 구비된 AKTA® 퓨리파이어 시스템 (Purifier System) 에서 5 ㎖ HiTrap® 크기 배제 컬럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 탈염시켰다. 탈염된 샘플을 96-웰 플레이트에 수집했다. 각 서열로부터의 샘플을 LC-MS 에 의해 분석하여 아이덴티티를 확인하고, UV (260 nm) 에 의해 정량화하고, 선택된 샘플의 세트를 IEX 크로마토그래피에 의하여 순도를 확인했다.
PD-L1 단일 가닥의 어닐링을 Tecan® 액체 취급 로봇에서 수행했다. 센스 및 안티센스 단일 가닥의 등몰 혼합물을 조합하고, 96 웰 플레이트에서 어닐링시켰다. 상보적인 단일 가닥을 조합한 후에, 96-웰 플레이트를 단단히 밀봉하고 100 ℃에서 10 분 동안 오븐에서 가열하고, 2 내지 3 시간의 기간에 걸쳐 천천히 실온이 되게 했다. 각 듀플렉스의 농도를 1X PBS 에서 10 μM 로 정규화시켰다.
실시예 2 - 시험관내 스크리닝:
Dual-Glo® 어세이를 위한 세포 배양 및 플라스미드/트랜스펙션:
Cos7 세포 (ATCC®, Manassas, VA) 를 10% FBS 로 보충된 DMEM (ATCC®) 에서 5% CO2 의 분위기에서 37℃ 에서 컨플루언스 근처까지 성장시키고, 그 후 트립신처리에 의해 플레이트로부터 방출시켰다. 완전한 인간 CD274 레퍼런스 서열 (NM_001267706.1) 을 대략 750bp, 1.4kb, 및 1.4kb 길이의 인서트 (SEQ ID NOs: 11-13) 를 갖는 3 개의 구축물을 사용하여 듀얼-루시퍼라제 psiCHECK2™ 벡터 내로 클로닝했다. 듀얼-루시퍼라제 플라스미드를 15x103 세포 내로 Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen™, Carlsbad CA. cat # 11668-019) 을 사용하여 siRNA 와 동시-트랜스펙션시켰다. 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 대해, 0.2ul 의 Lipofectamine™ 을 14.8ul 의 Opti-MEM® 중 10ng 의 플라스미드 벡터 및 siRNA 에 첨가하고 실온에서 15 분 동안 복합체화하게 두었다. 혼합물을 그 후 80ul 의 신선한 완전한 배지에 재현탁된 세포에 첨가했다. 세포를 48 시간 동안 인큐베이션하고, 그 후 루시퍼라제를 측정했다. 단일 용량 실험을 10nM 및 0.1nM 최종 듀플렉스 농도에서 수행했다.
Dual-Glo® 루시퍼라제 어세이
siRNAs 를 트랜스펙션한지 48 시간 후에, 반딧불이 (트랜스펙션 대조군) 및 레닐라 (3' UTR 에서 PD-L1 표적 서열에 융합됨) 루시퍼라제를 측정했다. 먼저, 세포로부터 배지를 제거했다. 그 후 배양 배지 부피와 동등한 75ul 의 Dual-Glo® 루시퍼라제 시약을 각각의 웰에 첨가하고 혼합하여 반딧불이 루시퍼라제 활성을 측정했다. 혼합물을 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하고, 그 후 발광 (500nm) 을 Spectramax® (Molecular Devices®) 에서 측정하여 반딧불이 루시퍼라제 신호를 검출했다. 75ul 의 실온의 Dual-Glo® Stop & Glo® 시약을 각각의 웰에 첨가하여 레닐라 루시퍼라제 활성을 측정하고, 플레이트를 10-15 분 동안 인큐베이션하고, 그 후 발광을 다시 측정하여 레닐라 루시퍼라제 신호를 확인했다. Dual-Glo® Stop & Glo® 시약은 반딧불이 루시퍼라제 신호를 켄치하고 레닐라 루시퍼라제 반응에 관한 발광을 지속시켰다. 레닐라 (PD-L1) 신호를 각각의 웰 내의 반딧불이 (대조군) 신호로 정규화시켜 siRNA 활성을 확인했다. siRNA 활성의 규모를 그 후 동일한 벡터로 트랜스펙션되었으나 siRNA 로 처리되지 않은 또는 비-표적화 siRNA 로 처리된 세포에 상대적으로 평가했다. 모든 트랜스펙션을 삼회 (triplicate) 수행했다.
qPCR 을 위한 세포 배양 및 트랜스펙션:
RKO 인간 대장 암종 세포 (ATCC®, Manassas, VA) 를 10% FBS 로 보충된 EMEM (ATCC®) 에서 5% CO2 의 분위기에서 37℃ 에서 컨플루언스 근처까지 성장시키고, 그 후 트립신처리에 의해 플레이트로부터 방출시켰다.
웰 당 4.9㎕ 의 Opti-MEM + 0.1㎕ 의 Lipofectamine™ RNAiMax (Invitrogen™, Carlsbad CA. cat # 13778-150) 와 웰 당 5㎕ 의 siRNA 듀플렉스를 384-웰 플레이트 내로 첨가하여 세포를 트랜스펙션시키고 실온에서 15 분 동안 인큐베이션했다. ~5 x103 세포를 함유하는 40㎕ 의 DMEM 를 그 후 siRNA 혼합물에 첨가했따. 세포를 RNA 정제 전에 24 시간 동안 인큐베이션했다. 단일 용량 실험을 10nM 및 0.1nM 최종 듀플렉스 농도에서 수행했다.
DYNABEADS® mRNA 단리 키트를 사용하는 총 RNA 단리:
RNA 를 자동화된 프로토콜을 사용하여 BioTek-EL406 플랫폼에서 DYNABEADs® (Invitrogen™, cat#61012) 를 사용하여 단리했다. 간략히, 50㎕ 의 용해/결합 완충제 및 3㎕ 의 자기 비드를 함유하는 25㎕ 의 용해 완충제를 세포를 함유하는 플레이트에 첨가했다. 플레이트를 전자기 셰이커에서 10 분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 그 후 자기 비드를 포획하고, 상청액을 제거했다. 비드-결합된 RNA 를 그 후 150㎕ 세정 완충액 A 로 2 회 및 세정 완충액 B 로 1 회 세정했다. 비드를 그 후 150㎕ 용리 완충액으로 세정하고, 다시 포획하고, 상청액을 제거했다.
ABI™ 고용량 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems®, Foster City, CA, Cat #4368813) 를 사용하는 cDNA 합성 :
반응 당 1㎕ 10X 완충제, 0.4㎕ 25X dNTPs, 1㎕ 10x 랜덤 프라이머, 0.5㎕ 역전사효소, 0.5㎕ RNase 저해제 및 6.6㎕ 의 H2O 을 함유하는 10 ㎕ 의 마스터 믹스를 상기 단리된 RNA 에 첨가했다. 플레이트를 밀봉하고, 혼합하고, 전자기 셰이커에서 10 분 동안 실온에서, 그에 뒤이어 2h 동안 37℃ 에서 인큐베이션했다. 플레이트를 그 후 81℃ 에서 5min 동안 인큐베이션했다.
실시간 PCR:
2 ㎕ 의 cDNA 를 384 웰 플레이트 (Roche cat # 04887301001) 내의 웰 당 0.5㎕ 의 GAPDH TaqMan® 탐침 (Hs99999905), 0.5㎕ CD274 탐침 (Hs01125301_m1, CD274) 및 5㎕ Lightcycler® 480 탐침 마스터 믹스 (Roche Cat # 04887301001) 을 함유하는 마스터 믹스에 첨가했다. 실시간 PCR 을 LightCycler®480 실시간 PCR 시스템 (Roche) 에서 ΔΔCt(RQ) 어세이를 사용하여 수행했다. 각각의 듀플렉스를 4 개의 독립적 트랜스펙션으로 시험했다.
상대 배수 (fold) 변화를 계산하기 위해서, 실시간 데이타를 ΔΔCt 방법을 사용하여 분석하고, 10nM AD-1955 로 트랜스펙션된 세포, 또는 가짜 (mock) 트랜스펙션된 세포로 수행된 어세이로 정규화했다.
표 2. 핵산 서열 표시에서 사용된 뉴클레오티드 단량체의 약어. 이러한 단량체는, 올리고뉴클레오티드에 존재할 때, 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 상호 연결된다는 것이 이해될 것이다.
Figure pct00023
Figure pct00024
표 3. PD-L1 dsRNAs 의 수식되지 않은 센스 및 안티센스 가닥 서열
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
표 4. CD274 Dual-Glo® 루시퍼라제 및 qPCR 데이타
데이타는 비-표적화 대조군에 상대적인 남은 퍼센트 메시지로서 표현된다.
Figure pct00028
Figure pct00029
표 5. PD-L1 수식된 서열
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
균등물
당업자는 단지 통상적인 실험을 이용하여 본 명세서에서 기술되는 특정 구현예 및 방법에 대한 다수의 균등물을 인식하거나 또는 이를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 특허청구범위의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC. <120> PROGRAMMED CELL DEATH 1 LIGAND 1 (PD-L1) IRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 121301-04220 <140> <141> <150> 62/213,224 <151> 2015-09-02 <160> 221 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3349 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggcgcaacgc tgagcagctg gcgcgtcccg cgcggcccca gttctgcgca gcttcccgag 60 gctccgcacc agccgcgctt ctgtccgcct gcagggcatt ccagaaagat gaggatattt 120 gctgtcttta tattcatgac ctactggcat ttgctgaacg ccccatacaa caaaatcaac 180 caaagaattt tggttgtgga tccagtcacc tctgaacatg aactgacatg tcaggctgag 240 ggctacccca aggccgaagt catctggaca agcagtgacc atcaagtcct gagtggtaag 300 accaccacca ccaattccaa gagagaggag aagcttttca atgtgaccag cacactgaga 360 atcaacacaa caactaatga gattttctac tgcactttta ggagattaga tcctgaggaa 420 aaccatacag ctgaattggt catcccagaa ctacctctgg cacatcctcc aaatgaaagg 480 actcacttgg taattctggg agccatctta ttatgccttg gtgtagcact gacattcatc 540 ttccgtttaa gaaaagggag aatgatggat gtgaaaaaat gtggcatcca agatacaaac 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oligonucleotide" <400> 221 uuuuauuaaa uuaaugcagg uac 23

Claims (106)

  1. 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, 또는 3222-3243 중 임의의 하나와 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열의 상보적 부분과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하며, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 적어도 하나의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  2. 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-67635, AD-67637, AD-67658, AD-67632, AD-67629, AD-67631, AD-67633, AD-67643, AD-67653, AD-67640, AD-67650, AD-67676, AD-67661, AD-67667, AD-67655, AD-67672, AD-67659, AD-67673, AD-67664, AD-67662, AD-67660, AD-67656, AD-67628, AD-67647, AD-67626, 또는 AD-67645 중 임의의 하나에서의 안티센스 서열 중 임의의 하나와 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 상보성의 영역을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-67635, AD-67637, AD-67658, AD-67632, AD-67629, AD-67631, AD-67633, AD-67643, AD-67653, AD-67640, AD-67650, AD-67676, AD-67661, AD-67667, AD-67655, AD-67672, AD-67659, AD-67673, AD-67664, AD-67662, AD-67660, AD-67656, AD-67628, AD-67647, AD-67626, 또는 AD-67645 중 임의의 하나에서의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 하나로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  4. 제 1 항 내제 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부 또는 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 뉴클레오티드 수식을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  5. 제 1 항 내제 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부 및 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부는 수식을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  6. 프로그램된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1) 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며,
    상기 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, 또는 3222-3243 중 임의의 하나와 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열의 상보적 부분과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부 및 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 뉴클레오티드 수식을 포함하고,
    상기 센스 가닥은 3'-말단에서 부착된 리간드에 컨쥬게이트되는,
    이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부 및 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부는 수식을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  8. 제 1 항 내제 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 수식 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오티드, 3'-말단 데옥시-티민 (dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오티드, 2'-플루오로 수식된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-수식된 뉴클레오티드, 잠긴 뉴클레오티드, 잠기지 않은 뉴클레오티드, 입체구조적으로 제한된 뉴클레오티드, 구속된 에틸 뉴클레오티드, 비염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-수식된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴-수식된 뉴클레오티드, 2'-C-알킬-수식된 뉴클레오티드, 2'-히드록실-수식된 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 수식된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬-수식된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 비-자연 염기 포함 뉴클레오티드, 테트라히드로피란 수식된 뉴클레오티드, 1,5-안히드로헥시톨 수식된 뉴클레오티드, 시클로헥세닐 수식된 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 기를 포함하는 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트 기를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 및 5'-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 수식은 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오티드 (dT) 의 짧은 서열을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  10. 제 2 항에 있어서, 상보성의 영역은 적어도 17 개의 뉴클레오티드 길이인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  11. 제 2 항에 있어서, 상보성의 영역은 19-21 개의 뉴클레오티드 길이인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  12. 제 11 항에 있어서, 상보성의 영역은 19 개의 뉴클레오티드 길이인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  13. 제 1 항, 제 2 항, 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥은 30 개 이하의 뉴클레오티드 길이인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  14. 제 1 항, 제 2 항, 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1 개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  15. 제 1 항, 제 2 항, 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2 개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  16. 제 1 항 내제 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드를 추가로 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  17. 제 16 항에 있어서, 리간드는 dsRNA 제제의 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  18. 제 6 항 또는 제 16 항에 있어서, 리간드는 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 유도체인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  19. 제 18 항에 있어서, 리간드는
    Figure pct00033

    인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  20. 제 18 항에 있어서, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 하기 도해에서 나타나는 바와 같은 리간드에 컨쥬게이트되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제:
    Figure pct00034

    여기에서 X 는 O 또는 S 임.
  21. 제 20 항에 있어서, X 는 O 인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  22. 제 2 항에 있어서, 상보성의 영역은 표 3 및 표 5 에서의 안티센스 서열 중 임의의 하나를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  23. 제 2 항에 있어서, 상보성의 영역은 표 3 또는 표 5 에서의 안티센스 서열 중 임의의 하나로 이루어지는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  24. PD-L1 의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 PD-L1 을 인코딩하는 mRNA 의 일부에 상보적인 영역을 포함하며, 각각의 가닥은 약 14 개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 식 (III) 으로 표시되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제:
    센스: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
    안티센스: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
    식에서: i, j, k, 및 l 은 각각 독립적으로 0 또는 1 이고;
    p, p', q, 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고;
    각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-25 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
    각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-10 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
    각각의 np, np', nq, 및 nq' 는, 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
    XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타내고;
    Nb 상의 수식은 Y 상의 수식과 상이하고, Nb' 상의 수식은 Y' 상의 수식과 상이하고;
    센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트됨.
  25. 제 24 항에 있어서, i 는 0 이거나; j 는 0 이거나; i 는 1 이거나; j 는 1 이거나; i 및 j 는 둘다 0 이거나; 또는 i 및 j 는 둘다 1 인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  26. 제 24 항에 있어서, k 는 0 이거나; l 은 0 이거나; k 는 1 이거나; l 은 1 이거나; k 및 l 은 둘다 0 이거나; 또는 k 및 l 은 둘다 1 인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  27. 제 24 항에 있어서, XXX 는 X'X'X' 에 상보적이고, YYY 는 Y'Y'Y' 에 상보적이고, ZZZ 는 Z'Z'Z' 에 상보적인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  28. 제 24 항에 있어서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 자리에 또는 그 근처에 존재하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  29. 제 24 항에 있어서, Y'Y'Y' 모티프는 5'-말단으로부터 안티센스 가닥의 11, 12 및 13 위치에 존재하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  30. 제 29 항에 있어서, Y' 는 2'-O-메틸인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  31. 제 24 항에 있어서, 식 (III) 은 식 (IIIa) 로 표시되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제:
    센스: 5' np-Na-YYY-Na-nq 3'
    안티센스: 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIa).
  32. 제 24 항에 있어서, 식 (III) 은 식 (IIIb) 로 표시되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제:
    센스: 5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
    안티센스: 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5' (IIIb)
    여기에서 각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 1-5 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타냄.
  33. 제 24 항에 있어서, 식 (III) 은 식 (IIIc) 로 표시되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제:
    센스: 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'
    안티센스: 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIc)
    여기에서 각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 1-5 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타냄.
  34. 제 24 항에 있어서, 식 (III) 은 식 (IIId) 로 표시되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제:
    센스: 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
    안티센스: 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5' (IIId)
    여기에서 각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 1-5 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 2-10 개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타냄.
  35. 제 6 항 또는 제 24 항에 있어서, 이중 가닥 영역은 15-30 개의 뉴클레오티드 쌍 길이인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  36. 제 35 항에 있어서, 이중 가닥 영역은 17-23 개의 뉴클레오티드 쌍 길이인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  37. 제 35 항에 있어서, 이중 가닥 영역은 17-25 개의 뉴클레오티드 쌍 길이인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  38. 제 35 항에 있어서, 이중 가닥 영역은 23-27 개의 뉴클레오티드 쌍 길이인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  39. 제 35 항에 있어서, 이중 가닥 영역은 19-21 개의 뉴클레오티드 쌍 길이인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  40. 제 6 항 또는 제 24 항에 있어서, 이중 가닥 영역은 21-23 개의 뉴클레오티드 쌍 길이인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  41. 제 6 항 또는 제 24 항에 있어서, 각각의 가닥은 15-30 개의 뉴클레오티드를 갖는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  42. 제 6 항, 제 24 항 및 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥은 19-30 개의 뉴클레오티드를 갖는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  43. 제 6 항 또는 제 24 항에 있어서, 뉴클레오티드 수식은 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알킬, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-데옥시, 2'-히드록실, 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  44. 제 43 항에 있어서, 뉴클레오티드 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  45. 제 6 항 또는 제 24 항에 있어서, 리간드는 이가 또는 삼가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체; 또는 콜레스테롤인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  46. 제 24 항에 있어서, 리간드는
    Figure pct00035

    인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  47. 제 24 항에 있어서, 리간드는 센스 가닥의 3' 말단에 부착된, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  48. 제 47 항에 있어서, RNAi 제제는 하기 도해에서 나타나는 바와 같은 리간드에 컨쥬게이트된, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제:
    Figure pct00036
    .
  49. 제 6 항 또는 제 24 항에 있어서, 상기 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결을 추가로 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  50. 제 49 항에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결은 하나의 가닥의 3'-말단에 있는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 가닥은 안티센스 가닥인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  52. 제 50 항에 있어서, 상기 가닥은 센스 가닥인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  53. 제 49 항에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결은 하나의 가닥의 5'-말단에 있는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  54. 제 53 항에 있어서, 상기 가닥은 안티센스 가닥인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  55. 제 53 항에 있어서, 상기 가닥은 센스 가닥인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  56. 제 49 항에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결은 하나의 가닥의 5'- 및 3'-말단 둘다에 있는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  57. 제 56 항에 있어서, 상기 가닥은 안티센스 가닥인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  58. 제 6 항 또는 제 24 항에 있어서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에서의 염기 쌍은 AU 염기 쌍인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  59. 제 24 항에 있어서, Y 뉴클레오티드는 2'-플루오로 수식을 함유하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  60. 제 24 항에 있어서, Y' 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 수식을 함유하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  61. 제 24 항에 있어서, p'>0 인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  62. 제 24 항에 있어서, p'=2 인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  63. 제 62 항에 있어서, q'=0, p=0, q=0 이고, p' 오버행 뉴클레오티드는 표적 mRNA 에 상보적인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  64. 제 62 항에 있어서, q'=0, p=0, q=0 이고, p' 오버행 뉴클레오티드는 표적 mRNA 에 비-상보적인, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  65. 제 56 항에 있어서, 센스 가닥은 총 21 개의 뉴클레오티드를 갖고, 안티센스 가닥은 총 23 개의 뉴클레오티드를 갖는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  66. 제 61 항 내제 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 np' 는 이웃 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되어 있는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  67. 제 66 항에 있어서, 모든 np' 는 이웃 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되어 있는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  68. 제 24 항에 있어서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 표 3 및 표 5 에 열거된 RNAi 제제의 군으로부터 선택되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  69. 제 24 항에 있어서, 상기 센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부 및 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부는 수식을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  70. 세포에서 PD-L1 의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 PD-L1 을 인코딩하는 mRNA 의 일부에 상보적인 영역을 포함하며, 각각의 가닥은 약 14 개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 식 (III) 으로 표시되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제:
    센스: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
    안티센스: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
    식에서:
    i, j, k, 및 l 은 각각 독립적으로 0 또는 1 이고;
    p, p', q, 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고;
    각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-25 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
    각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-10 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
    각각의 np, np', nq, 및 nq' 는, 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
    XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타내고, 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고;
    Nb 상의 수식은 Y 상의 수식과 상이하고, Nb' 상의 수식은 Y' 상의 수식과 상이하고;
    센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트됨.
  71. 세포에서 PD-L1 의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 PD-L1 을 인코딩하는 mRNA 의 일부에 상보적인 영역을 포함하며, 각각의 가닥은 약 14 개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 식 (III) 으로 표시되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제:
    센스: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
    안티센스: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
    식에서:
    i, j, k, 및 l 은 각각 독립적으로 0 또는 1 이고;
    각각의 np, nq, 및 nq' 는, 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
    p, q, 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고;
    np' >0 이고, 적어도 하나의 np' 는 이웃 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되어 있고;
    각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-25 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
    각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-10 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
    XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타내고, 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고;
    Nb 상의 수식은 Y 상의 수식과 상이하고, Nb' 상의 수식은 Y' 상의 수식과 상이하고;
    센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트됨.
  72. 세포에서 PD-L1 의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 PD-L1 을 인코딩하는 mRNA 의 일부에 상보적인 영역을 포함하며, 각각의 가닥은 약 14 개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 식 (III) 으로 표시되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제:
    센스: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
    안티센스: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
    식에서:
    i, j, k, 및 l 은 각각 독립적으로 0 또는 1 이고;
    각각의 np, nq, 및 nq' 는, 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
    p, q, 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고;
    np' >0 이고, 적어도 하나의 np' 는 이웃 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되어 있고;
    각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-25 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
    각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-10 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
    XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타내고, 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고;
    Nb 상의 수식은 Y 상의 수식과 상이하고, Nb' 상의 수식은 Y' 상의 수식과 상이하고;
    센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트되며, 리간드는 이가 또는 삼가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체임.
  73. 세포에서 PD-L1 의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 PD-L1 을 인코딩하는 mRNA 의 일부에 상보적인 영역을 포함하며, 각각의 가닥은 약 14 개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 식 (III) 으로 표시되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제:
    센스: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
    안티센스: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
    식에서:
    i, j, k, 및 l 은 각각 독립적으로 0 또는 1 이고;
    각각의 np, nq, 및 nq' 는, 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
    p, q, 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고;
    np' >0 이고, 적어도 하나의 np' 는 이웃 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되어 있고;
    각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-25 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
    각각의 Nb 및 Nb' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-10 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
    XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', 및 Z'Z'Z' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타내고, 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고;
    Nb 상의 수식은 Y 상의 수식과 상이하고, Nb' 상의 수식은 Y' 상의 수식과 상이하고;
    센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고;
    센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트되며, 리간드는 이가 또는 삼가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체임.
  74. 세포에서 PD-L1 의 발현을 저해할 수 있는 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 상기 안티센스 가닥은 PD-L1 을 인코딩하는 mRNA 의 일부에 상보적인 영역을 포함하며, 각각의 가닥은 약 14 개 내지 약 30 개의 뉴클레오티드 길이이며, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 식 (III) 으로 표시되는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제:
    센스: 5' np-Na-YYY-Na-nq 3'
    안티센스: 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIa)
    식에서:
    각각의 np, nq, 및 nq' 는, 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
    p, q, 및 q' 는 각각 독립적으로 0-6 이고;
    np' >0 이고, 적어도 하나의 np' 는 이웃 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되어 있고;
    각각의 Na 및 Na' 는 독립적으로 수식된 또는 수식되지 않은 0-25 개의 뉴클레오티드 또는 그들의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내며, 각각의 서열은 적어도 둘의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
    YYY 및 Y'Y'Y' 는 각각 독립적으로 3 개의 연속 뉴클레오티드 상의 3 개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타내고, 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고;
    센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고;
    센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 컨쥬게이트되며, 리간드는 이가 또는 삼가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체임.
  75. PD-L1 의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제로서,
    상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며,
    상기 센스 가닥은 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 3221-3243, 351-372, 618-641, 618-639, 619-640, 620-641, 1093-1115, 1093-1114, 1094-1115, 1167-1188, 1293-1314, 1518-1539, 2103-2124, 2220-2261, 2220-2241, 2240-2261, 2648-2680, 2648-2669, 2658-2679, 2659-2680, 3143-3164, 3198-3219, 3221-3242, 또는 3222-3243 과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열의 상보적 부분과 3 개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15 개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 2'-O-메틸 수식 및 2'-플루오로 수식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 수식을 포함하고,
    상기 센스 가닥은 5'-말단에서 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하며,
    여기에서 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 실질적으로 전부는 2'-O-메틸 수식 및 2'-플루오로 수식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 수식을 포함하고,
    상기 안티센스 가닥은 5'-말단에서 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 및 3'-말단에서 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하고,
    상기 센스 가닥은 3'-말단에서 분지형 이가 또는 삼가 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 컨쥬게이트됨.
  76. 제 75 항에 있어서, 상기 센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부 및 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 전부는 뉴클레오티드 수식을 포함하는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  77. 제 75 항에 있어서, 각각의 가닥은 19-30 개의 뉴클레오티드를 갖는, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제.
  78. 제 1 항, 제 2 항, 제 6 항, 제 24 항, 및 제 70 항 내지 제 75 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제를 함유하는 세포.
  79. 제 1 항 내제 제 77 항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제를 포함하는 PD-L1 유전자의 발현을 저해하기 위한 약학적 조성물.
  80. 제 79 항에 있어서, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 비완충 용액 중에 투여되는, 약학적 조성물.
  81. 제 80 항에 있어서, 상기 비완충 용액은 염류용액 또는 물인, 약학적 조성물.
  82. 제 79 항에 있어서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 완충 용액과 함께 투여되는, 약학적 조성물.
  83. 제 82 항에 있어서, 상기 완충 용액은 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카르보네이트, 또는 포스페이트 또는 그들의 임의의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  84. 제 82 항에 있어서, 상기 완충 용액은 포스페이트 완충 염류용액 (PBS) 인, 약학적 조성물.
  85. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제, 및 지질 제형을 포함하는 약학적 조성물.
  86. 제 85 항에 있어서, 지질 제형은 LNP 를 포함하는, 약학적 조성물.
  87. 제 85 항에 있어서, 지질 제형은 MC3 을 포함하는, 약학적 조성물.
  88. 세포에서 PD-L1 발현을 저해하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    세포를 제 1 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제 또는 제 79 항 내지 제 87 항 중 어느 한 항의 약학적 조성물과 접촉시키고, 그에 의해 세포에서 PD-L1 유전자의 발현을 저해하는 단계.
  89. 제 88 항에 있어서, 상기 세포는 대상체 내에 있는, 방법.
  90. 제 89 항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  91. 제 88 항 내제 제 90 항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1 발현은 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 만큼; 또는 어세이의 검출 수준 미만까지 저해되는, 방법.
  92. PD-L1 발현의 감소로부터 유익을 얻을 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 치료적 유효량의 제 1 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제 또는 제 79 항 내지 제 87 항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 투여하여, 그에 의해 상기 대상체를 치료하는 것을 포함하는 방법.
  93. 제 92 항에 있어서, 대상체에 대한 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제의 투여는 PD-L1 신호전달 경로의 감소를 야기하는, 방법.
  94. 제 92 항에 있어서, 장애는 PD-L1-관련 질환인, 방법.
  95. 제 94 항에 있어서, PD-L1-관련 질환은 감염인, 방법.
  96. 제 95 항에 있어서, 감염은 만성, 세포내 감염인, 방법.
  97. 제 94 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1-관련 질환은 바이러스 감염인, 방법.
  98. 제 94 항 내지 제 97 항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1 관련 질환은 간염 바이러스 감염인, 방법.
  99. 제 95 항 내지 제 98 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서의 감염의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 검출하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  100. 제 92 항에 있어서, PD-L1 관련 질환은 암인, 방법.
  101. 제 92 항 내지 제 100 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  102. 제 92 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 있어서, 감염 또는 암의 치료를 위한 제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  103. 제 92 항 내지 제 102 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏ 의 용량으로 투여되는, 방법.
  104. 제 92 항 내지 제 103 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 리보핵산 (RNAi) 제제는 대상체에게 피하 투여되는, 방법.
  105. 제 92 항 내지 제 104 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서의 PD-L1 신호전달 경로 수준을 측정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  106. 제 92 항 내지 제 104 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서의 PD-L1 수준을 측정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
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