JPS5927900A - 固定化オリゴヌクレオチド - Google Patents
固定化オリゴヌクレオチドInfo
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- JPS5927900A JPS5927900A JP57138136A JP13813682A JPS5927900A JP S5927900 A JPS5927900 A JP S5927900A JP 57138136 A JP57138136 A JP 57138136A JP 13813682 A JP13813682 A JP 13813682A JP S5927900 A JPS5927900 A JP S5927900A
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- JP
- Japan
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- group
- oligonucleotide
- compound
- sepharose
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- Granted
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
C11発明の背景
技術分野
本発明は、一定の長さのオリ−r(dN)の5′−末端
リン酸基にプルキレン基またはアリレン基を介してアミ
ン基が導入されたオリゴヌクレオチド誘導体、そのアミ
ン基の部分で担体と結合した固定化オリゴヌクレオチド
およびそれらの製造法に関する。
リン酸基にプルキレン基またはアリレン基を介してアミ
ン基が導入されたオリゴヌクレオチド誘導体、そのアミ
ン基の部分で担体と結合した固定化オリゴヌクレオチド
およびそれらの製造法に関する。
生化学の領域で、生体高分子を純化することは重要な研
究線順の一つであり、過去多数の研究者により多大の努
力が払われてきた。そのような目的に対しては、アフイ
ニテイクロマトグラフイー技術ならびにポリアクリルア
ミドゲルを主体とする電気泳動法が開発されて、賞用さ
れるに到っている。
究線順の一つであり、過去多数の研究者により多大の努
力が払われてきた。そのような目的に対しては、アフイ
ニテイクロマトグラフイー技術ならびにポリアクリルア
ミドゲルを主体とする電気泳動法が開発されて、賞用さ
れるに到っている。
生体高分子の多くは、特定の物質と特異的に結合ないし
相互作用する固有の性質をもっている。
相互作用する固有の性質をもっている。
アフイニテイクロマトグラフイーは、生体高分子のもつ
この生物学的識別の原理を巧妙に利用した方法といえる
。
この生物学的識別の原理を巧妙に利用した方法といえる
。
このよりなアフイニテイ法が急速に発展しつつある今日
では、タンパク質、酵素はもとより核酸、脂質、ホルモ
ン、ビタミン、レセプターなどあらゆる生体物質の精製
、分離に広(活用されている。
では、タンパク質、酵素はもとより核酸、脂質、ホルモ
ン、ビタミン、レセプターなどあらゆる生体物質の精製
、分離に広(活用されている。
とりわけ、核酸をリガンドと1−るアフイニテイクロマ
トグラフイーは、分子生物学的にも重要な核酸やタンノ
ξり質の単離をはじめとし゛〔、今後も広(応用される
と予想される。また、効率的な単離のためにもリガンド
と担体との架橋方法の開発が太いに興味のあることであ
る。
トグラフイーは、分子生物学的にも重要な核酸やタンノ
ξり質の単離をはじめとし゛〔、今後も広(応用される
と予想される。また、効率的な単離のためにもリガンド
と担体との架橋方法の開発が太いに興味のあることであ
る。
先行技術
このような観点から、核酸を結合させた担体を用いるア
フイニテイクロマトグラフイーの中では、オリ:i’
(dT )−セルロースまたはポリ(t・)−アガロー
スカラムを使って3′−末端にポリ(A)’!に含むR
NA ’(r単離するという方法が、最も広(利用され
ている( Ono、 M、、 Kondo、 T、、
I(awakami 、 M、 :J、 Bioche
m、; 81 、941 (1977))。
フイニテイクロマトグラフイーの中では、オリ:i’
(dT )−セルロースまたはポリ(t・)−アガロー
スカラムを使って3′−末端にポリ(A)’!に含むR
NA ’(r単離するという方法が、最も広(利用され
ている( Ono、 M、、 Kondo、 T、、
I(awakami 、 M、 :J、 Bioche
m、; 81 、941 (1977))。
ポリ(U)、ポリ(dA)−セルロースなどは、ヌクレ
オチrの塩基部分’1BrcNなどで活性化した担体と
結合させる方法であるため、多点で結合して安定である
という反面、親和活性に必要な塩基部分が担体との結合
に使われているので吸着能が弱められ木という難点があ
る( Lindberg、 U、。
オチrの塩基部分’1BrcNなどで活性化した担体と
結合させる方法であるため、多点で結合して安定である
という反面、親和活性に必要な塩基部分が担体との結合
に使われているので吸着能が弱められ木という難点があ
る( Lindberg、 U、。
Perison、 T、、 : Eur、J、 Bio
chem、、 31.246 (1972))。
chem、、 31.246 (1972))。
また、オリ=r(aT)−セルロースなどは、DCC(
ジシクロへキシルカルゼイミド)など金用いズ、担体の
水酸基とオリゴヌクレオチドのリン酸基とを結合させて
いるといわれているが、非特異的な吸着を起こしたり、
吸着能に再現性を欠くという問題がある。
ジシクロへキシルカルゼイミド)など金用いズ、担体の
水酸基とオリゴヌクレオチドのリン酸基とを結合させて
いるといわれているが、非特異的な吸着を起こしたり、
吸着能に再現性を欠くという問題がある。
以上のようなヌクレオチドのホモポリマーを固定化した
例以外に、天然から得られたDNA k固定化した例が
二、三あるp’ (Anderson、 J、N、、
Monahan。
例以外に、天然から得られたDNA k固定化した例が
二、三あるp’ (Anderson、 J、N、、
Monahan。
J、J、、 OMalley、 B、W、: J、 B
lot、ehem、、 252.5789(1977)
)、一定の長さで任意の塩基配列金もつオリゴヌクレオ
チドを、特定の位置でのみ担体と結合させてその固定化
に成功したという例はかつて一件も報告されていない。
lot、ehem、、 252.5789(1977)
)、一定の長さで任意の塩基配列金もつオリゴヌクレオ
チドを、特定の位置でのみ担体と結合させてその固定化
に成功したという例はかつて一件も報告されていない。
これらの状況から、任意の塩基配列をもつオリ2ヌクレ
オチド全特定の部位で担体と結合させることができれば
、その技術は固定化ヌクレオチドホモポリマーを利用し
たアフイニテイクロマトグラフイーによるmRNAの単
離精製ばかりでな(、特定な塩基配列をもつmRNAの
単離精製、さらには特異的塩基配列を認識する各種核酸
関連酵素類の精製、などにも利用できる可能性が考えら
れる。
オチド全特定の部位で担体と結合させることができれば
、その技術は固定化ヌクレオチドホモポリマーを利用し
たアフイニテイクロマトグラフイーによるmRNAの単
離精製ばかりでな(、特定な塩基配列をもつmRNAの
単離精製、さらには特異的塩基配列を認識する各種核酸
関連酵素類の精製、などにも利用できる可能性が考えら
れる。
なお、リガンドとしてモノまたはジ程度のヌクレオチP
を用いたアフイニテイ担体の研究も数多(行なわれ、そ
のうちいくつかのものは既に市販されている。しかし、
ヌクレオチドが直接またはスペーサを介して担体と結合
している部位は、はとんどその塩基部分である&λヌク
レオチドをその塩基部分以外で結合させるものもあるカ
リ)原料リガンドの合成に手間がかかるうえ、全合成に
わたりめんどうであるという難点をかかえている。
を用いたアフイニテイ担体の研究も数多(行なわれ、そ
のうちいくつかのものは既に市販されている。しかし、
ヌクレオチドが直接またはスペーサを介して担体と結合
している部位は、はとんどその塩基部分である&λヌク
レオチドをその塩基部分以外で結合させるものもあるカ
リ)原料リガンドの合成に手間がかかるうえ、全合成に
わたりめんどうであるという難点をかかえている。
また、いずれの方法もオリゴヌクレオチドに用いること
はできない。
はできない。
a) Lee、 C1Y、 、 Lappl 、 D、
A、 、 Wermuth、 B、、 Ever+se
。
A、 、 Wermuth、 B、、 Ever+se
。
J、、 Kaplan、 N、O,: Arch、 B
iochem、 Blophys、。
iochem、 Blophys、。
168、561(1974)
Islwata、 K、 、 Yoghida、 Ho
: J、 Biochem、。
: J、 Biochem、。
83、783(1978)
、特開昭52−25795号、同53−101396号
、同53−133283号および同55−36277号
各公報b) Jervls、 L、、 Pettit、
N0M、: J、Chrematog、。
、同53−133283号および同55−36277号
各公報b) Jervls、 L、、 Pettit、
N0M、: J、Chrematog、。
97、33(1974)
Lamed、 Ro、 L@vln、 Y、、 Wll
chek、 M、: Biochem。
chek、 M、: Biochem。
Blophys、Aeta、 304.231(197
3)Janski、 A、、 Olegon、 A、E
、: Anal、Biochem、。
3)Janski、 A、、 Olegon、 A、E
、: Anal、Biochem、。
71.471(1976)
〔1〕発明の概要
要旨
このような点から、本発明者らは、核酸の精製に有用な
、アフイニテイ樹脂にも利用することのできる、有用な
固定化オリゴヌクレオチドおよびその製造法を開発した
。
、アフイニテイ樹脂にも利用することのできる、有用な
固定化オリゴヌクレオチドおよびその製造法を開発した
。
本発明者らは、既に同相合成法によって完全に精製され
たオリゴヌクレオチドを合成する方法を開発している。
たオリゴヌクレオチドを合成する方法を開発している。
そこで、本発明者らは同相合成法によって合成された目
的物と副生成物の5′−水酸基の保護基の違いに着目し
、目的物にのみ他の担体に結合できるような官能基を新
たに導入し、さらに選択的にこの部分で担体と結合させ
るという固定化の方法を見出した。
的物と副生成物の5′−水酸基の保護基の違いに着目し
、目的物にのみ他の担体に結合できるような官能基を新
たに導入し、さらに選択的にこの部分で担体と結合させ
るという固定化の方法を見出した。
このような方法により、任意の配列を有するオリゴヌク
レオチドに特定な位置で担体を結合させた、固定化オリ
ゴヌクレオチドを効果的に合成することに成功した。
レオチドに特定な位置で担体を結合させた、固定化オリ
ゴヌクレオチドを効果的に合成することに成功した。
本発明は、アフイニテイ樹脂としても使用することがで
きる、固定化オリゴヌクレオチド並びにこの中間体とし
て使用することができる、複数のオ+Jj’ヌクレオチ
ド誘導体およびそれらの製造法に関する。
きる、固定化オリゴヌクレオチド並びにこの中間体とし
て使用することができる、複数のオ+Jj’ヌクレオチ
ド誘導体およびそれらの製造法に関する。
すなわち、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、
下式(2)、(4)および(5)で表わされるものであ
る。
下式(2)、(4)および(5)で表わされるものであ
る。
また、本発明による下式(2)、(4)および(5)で
表わされるオリゴヌクレオチド合成法の製造法は、とれ
らを概念的にかつ総括的にいえば、化合物(1)ヲ化合
物(0)に反応させ、化合物(2)全生成させ、一方核
酸合成法により得られた化合物(3′)と、化合物(2
)の司′末端”リン酸の保護基R4に脱離させた誘導体
穴全縮合させて、化合物(4)全生成させ、これより保
護基金すべて脱離することにより化合物(5)を得る、
ことからなるものである。
表わされるオリゴヌクレオチド合成法の製造法は、とれ
らを概念的にかつ総括的にいえば、化合物(1)ヲ化合
物(0)に反応させ、化合物(2)全生成させ、一方核
酸合成法により得られた化合物(3′)と、化合物(2
)の司′末端”リン酸の保護基R4に脱離させた誘導体
穴全縮合させて、化合物(4)全生成させ、これより保
護基金すべて脱離することにより化合物(5)を得る、
ことからなるものである。
HO(N’Px)mR3(0)
R2−m−R’−opt (1
)HO(N’PX)nN’0COR’ (
3’)R2−NH−g’−px(N’px)mR3(2
)R2−NH−R’−Px(N’PX)m+nN’0C
OR3(4)NH2−R”−?P(NP)m+nNOH
(5)P。
)HO(N’PX)nN’0COR’ (
3’)R2−NH−g’−px(N’px)mR3(2
)R2−NH−R’−Px(N’PX)m+nN’0C
OR3(4)NH2−R”−?P(NP)m+nNOH
(5)P。
(ここで、令記号は下記の意味等)を持つ、N′ アシ
ル化(アシル基は、たとえば、低級脂肪族モノカルヂン
酸(02〜C4)からのもの、たとえば、アセチル基、
インブチリル基、または芳香族カルゼン酸からのもの、
たとえば、ベンゾイル基、アニソイル基)された、アデ
ニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およびチ
ミン(T)からなる群より選ばれた塩基残基金もつヌク
レオシドのうち、リゼシド骨格の3′および5′の酸素
を除いたもの。たyし、mまたはm+n (後記)が2
以上の場合の複数のN′は、塩基部分および(または)
アシル部分について同一でも異なってもよい。
ル化(アシル基は、たとえば、低級脂肪族モノカルヂン
酸(02〜C4)からのもの、たとえば、アセチル基、
インブチリル基、または芳香族カルゼン酸からのもの、
たとえば、ベンゾイル基、アニソイル基)された、アデ
ニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およびチ
ミン(T)からなる群より選ばれた塩基残基金もつヌク
レオシドのうち、リゼシド骨格の3′および5′の酸素
を除いたもの。たyし、mまたはm+n (後記)が2
以上の場合の複数のN′は、塩基部分および(または)
アシル部分について同一でも異なってもよい。
保護されていない上記塩基残基金もつヌクレオシドのう
ち、リゼシr骨格の3′および5′の酸素を除いたもの
。たgし、m+n(後記)が2以上の場合の複数のNは
、同一でも異なってもよい。
ち、リゼシr骨格の3′および5′の酸素を除いたもの
。たgし、m+n(後記)が2以上の場合の複数のNは
、同一でも異なってもよい。
リン酸トリエステル結合、すなわち
−0−P−0−(ROは置換されたフェニルRO
基)
P リン酸ジエステル結合、すなわち
1
H
R1直鎖ま−fは分岐鎖の二価炭化水素基、R2R3基
脱離の際安定であり、かつオリゴヌクレオチド部分が安
定なまま脱離できる置換基(たとえばトリフルオロアセ
チル基 (Tfa−) マタハo−ニトロフェニルスルフェニル
基(NPa−)など) R3他のすべての保護基が安定な条件で、容易に脱離さ
れて、末端のリン酸トリエステル結合を遊離のリン酸ジ
エステル結合とすることができる置換基(たとえば、シ
アノエチル基(CF)、)!・リクロロエチル基、ホス
ホロアミデート基等) R4通常のオリゴヌクレオチド合成法に用いられる3′
−末端水酸基保護基(−COR4)液相合成法におけば
低級アルキル基(たとえばメチル基)またはアリル基(
たとえばニトロベンジル基など)であり、また固相合成
法においてはスペーサを介したポリスチレンまたはポリ
アクリルアミド系樹脂などである。
脱離の際安定であり、かつオリゴヌクレオチド部分が安
定なまま脱離できる置換基(たとえばトリフルオロアセ
チル基 (Tfa−) マタハo−ニトロフェニルスルフェニル
基(NPa−)など) R3他のすべての保護基が安定な条件で、容易に脱離さ
れて、末端のリン酸トリエステル結合を遊離のリン酸ジ
エステル結合とすることができる置換基(たとえば、シ
アノエチル基(CF)、)!・リクロロエチル基、ホス
ホロアミデート基等) R4通常のオリゴヌクレオチド合成法に用いられる3′
−末端水酸基保護基(−COR4)液相合成法におけば
低級アルキル基(たとえばメチル基)またはアリル基(
たとえばニトロベンジル基など)であり、また固相合成
法においてはスペーサを介したポリスチレンまたはポリ
アクリルアミド系樹脂などである。
R5通常のオリゴヌクレオチド合成法を用いることがで
きろ5′−末端水酸基の保護基(たとえば、置換または
非置換のトリチル基があげられる) mO〜40の整数(好ましくは、0〜20)n O〜6
の整数(好ましくは、1〜4))なお上記式中、Pまた
はP工あるいはHOまたは0のうちN′またはNあるい
はこれらを含むカッコの右側に位Iffするものはこの
ヌクレオシPの3′−水酸基に、左側に位置するものは
このヌクレオシドの5′−水酸基に1、それぞれ結合す
るものを表わす。
きろ5′−末端水酸基の保護基(たとえば、置換または
非置換のトリチル基があげられる) mO〜40の整数(好ましくは、0〜20)n O〜6
の整数(好ましくは、1〜4))なお上記式中、Pまた
はP工あるいはHOまたは0のうちN′またはNあるい
はこれらを含むカッコの右側に位Iffするものはこの
ヌクレオシPの3′−水酸基に、左側に位置するものは
このヌクレオシドの5′−水酸基に1、それぞれ結合す
るものを表わす。
また、本発明による固定化オリゴヌクレオチドは、下式
(6)で表わされるものである。
(6)で表わされるものである。
本発明による下式(6)で表わされる固定化オリゴヌク
レオチドの製造法は、化合物(5)にセファロース全反
応させて、化合物(6)を得ることからなるものである
。
レオチドの製造法は、化合物(5)にセファロース全反
応させて、化合物(6)を得ることからなるものである
。
NH2−R’−P(NP)m+nNoH(s)〔セフ却
−ス)−NH−R1−p(Np)、、、NoH(6)〔
ここで、各記号は下記の意味を゛もつ、N、 N’、P
、P、R1、R25R3、R4、R5、mおよびnは前
記と同じである、 〔セファロース〕 アミン基と結合可能なセファロース
、たとえば、活性化CH−セファロース、+3rCN
活性化セファロース、エポキシ化セファロース、および
AH−セファロースからなる群から選ばれたセファロー
ス〕 なお、本発明で使用する記号化された上記諸式のより具
体的な内容を、たとえば式(4)について示せば、下式
の通りである。
−ス)−NH−R1−p(Np)、、、NoH(6)〔
ここで、各記号は下記の意味を゛もつ、N、 N’、P
、P、R1、R25R3、R4、R5、mおよびnは前
記と同じである、 〔セファロース〕 アミン基と結合可能なセファロース
、たとえば、活性化CH−セファロース、+3rCN
活性化セファロース、エポキシ化セファロース、および
AH−セファロースからなる群から選ばれたセファロー
ス〕 なお、本発明で使用する記号化された上記諸式のより具
体的な内容を、たとえば式(4)について示せば、下式
の通りである。
(たyし、ROはリン酸基金保護する置換基であり、通
常置換されたフェニル基、たとえば0−ニトロフェニル
基などが多く用いられる。BおよびB′は、塩基部分お
よび(または)アシル部分について同一または異なるア
シル化された塩基である。)効果 本発明によれば、一定の長さでしかも任意の塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを、特定の部位で担体に結合
させた、アフイニテイ樹脂としても有用な固定化オリゴ
ヌクレオチrt効果的に合成づ−ることかでき、さらに
従来の方法では得られなかった結合も本発明の手法金も
ってすれば良質の樹脂として合成可能になった。
常置換されたフェニル基、たとえば0−ニトロフェニル
基などが多く用いられる。BおよびB′は、塩基部分お
よび(または)アシル部分について同一または異なるア
シル化された塩基である。)効果 本発明によれば、一定の長さでしかも任意の塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを、特定の部位で担体に結合
させた、アフイニテイ樹脂としても有用な固定化オリゴ
ヌクレオチrt効果的に合成づ−ることかでき、さらに
従来の方法では得られなかった結合も本発明の手法金も
ってすれば良質の樹脂として合成可能になった。
これは、オリゴヌクレオチドと担体との結合における官
能基として、1級アミン基を導入したことによる。すな
わち、これによって下記の効果が実現されると考えられ
る。
能基として、1級アミン基を導入したことによる。すな
わち、これによって下記の効果が実現されると考えられ
る。
1)オリげヌクレオチド中に存在する他の官能基(水酸
永、リン酸基および塩基部分のアミン基など)よりも反
応性が高い。
永、リン酸基および塩基部分のアミン基など)よりも反
応性が高い。
2)シたがって、脱保護したオリゴヌクレオチドの混合
物を精製せずに担体との縮合に用いても、反応条件等に
より選択的にこの部分でのみ結合させることができる。
物を精製せずに担体との縮合に用いても、反応条件等に
より選択的にこの部分でのみ結合させることができる。
またこの結果、固相法および液相法いかなる方法で合成
された、どのような塩基配列をもつオリゴヌクレオチド
をも固定化することが可能となった。
された、どのような塩基配列をもつオリゴヌクレオチド
をも固定化することが可能となった。
さらに、吸着活性を阻害する塩基部分での結合を避けた
ことにより、本発明により得られた固定化オリゴヌクレ
オチドは、すぐれた吸着能を有する。
ことにより、本発明により得られた固定化オリゴヌクレ
オチドは、すぐれた吸着能を有する。
したがって、従来のもの(オ!J:’(dT)−セルロ
ースおよびポリ(U)−アガロース)よりも、吸着能、
再現性、選択性および耐久性にすぐれた高良質のオリ−
?(dN)−セファロースが得られ、位置特異的な合成
法により、簡単な工程しかも効果的な架橋により、いか
なるオリザヌクレオチF″をも固定化することが可能と
なった。
ースおよびポリ(U)−アガロース)よりも、吸着能、
再現性、選択性および耐久性にすぐれた高良質のオリ−
?(dN)−セファロースが得られ、位置特異的な合成
法により、簡単な工程しかも効果的な架橋により、いか
なるオリザヌクレオチF″をも固定化することが可能と
なった。
本発明は合成可能な任意の塩基配列をもつオリゴヌクレ
オチド全担体に結合させた、固定化オリゴヌクレオチド
製造の一環として捉えることができ、この観点から固相
法により合成されたオリゴヌクレオチドから出発して、
固定化オリゴヌクレオチドに至る反応をその最適実施態
様に則して示せば第1図の通りである。
オチド全担体に結合させた、固定化オリゴヌクレオチド
製造の一環として捉えることができ、この観点から固相
法により合成されたオリゴヌクレオチドから出発して、
固定化オリゴヌクレオチドに至る反応をその最適実施態
様に則して示せば第1図の通りである。
この反応スキーム中の記号の意味は、前記の通りおよび
下記の通りである。
下記の通りである。
MSNT メシチレンスルホニトリルトリアゾリドT
MG−0棉rpvO,5M−テトラメチルグアノシン−
ビリジン−2−カルゼアミドキシメイトのジオキサン−
水(9:i)溶液 以下においては、この反応スキームに基いて具体的な化
合物(1)〜(6)について、この順序で説明を行なう
ものとする。
MG−0棉rpvO,5M−テトラメチルグアノシン−
ビリジン−2−カルゼアミドキシメイトのジオキサン−
水(9:i)溶液 以下においては、この反応スキームに基いて具体的な化
合物(1)〜(6)について、この順序で説明を行なう
ものとする。
2、化合物(1)
化合物(1)は、式(1)で表わされる。
R2−Nu−R’ −0)((1)
化合物(1)は、ω−アミノアルコール(NH2−R1
−OH)のアミノ保護基としてR2を置換させることに
より得ろことができる。
−OH)のアミノ保護基としてR2を置換させることに
より得ろことができる。
R1は直鎖または分岐鎖の二価の炭化水素であり、アル
キレン基(C2〜020%好ましくはC2〜C12)ま
たはアリレン基(C4〜C20、好ましくはC2〜Cl
2)である。(υ−アミノアルコールとしては、C2〜
C12のものが市販されている。
キレン基(C2〜020%好ましくはC2〜C12)ま
たはアリレン基(C4〜C20、好ましくはC2〜Cl
2)である。(υ−アミノアルコールとしては、C2〜
C12のものが市販されている。
R2は、後に示す化合物(2)におげろ、R3基(−C
E)の脱離条件(たとえばEt3N−Py−R201:
3 : 1 )中、あるいはリン酸化の条件(たとえ
ば、py−1−メチルイミダゾール、py中DMAP
(ジメチルアミノピリジン))中などで安定であり、さ
らに、 はオリゴヌクレオチPの部分を安定なまま脱
離できる保護基であればいい。
E)の脱離条件(たとえばEt3N−Py−R201:
3 : 1 )中、あるいはリン酸化の条件(たとえ
ば、py−1−メチルイミダゾール、py中DMAP
(ジメチルアミノピリジン))中などで安定であり、さ
らに、 はオリゴヌクレオチPの部分を安定なまま脱
離できる保護基であればいい。
できることならば、オリザヌクレオチrの保護基の脱離
条件(たとえば濃アンモニア水)中で同時に除去するこ
とが可能である保護基であればさらに好都合である。
条件(たとえば濃アンモニア水)中で同時に除去するこ
とが可能である保護基であればさらに好都合である。
アミノ基の保護基である置換基R2の具体例としては、
濃アンモニア水で除去できるトリフルオロアセチル基、
および弱酸性またはメルカフトエタノールで除去できる
0−ニトロフェニルスルフェニル基、などがあげられる
。
濃アンモニア水で除去できるトリフルオロアセチル基、
および弱酸性またはメルカフトエタノールで除去できる
0−ニトロフェニルスルフェニル基、などがあげられる
。
3、化合物(2)
(1)定義
化合物(2)は、式(2)で表わされる新規物質である
・R2−NH−R’−Px(N’PX)mR3(2)化
合物(2)の置換基の定義および好ましい具体例は、前
記した通りである。
・R2−NH−R’−Px(N’PX)mR3(2)化
合物(2)の置換基の定義および好ましい具体例は、前
記した通りである。
(2)合成
化合物(2)は、下式(0)で表わされるオリゴヌクレ
オチド訪導体の5′−水酸基をリン酸化(たとえば、ホ
スホシトリアシリP、ホスホジクロリド、またはホスホ
ジペンゾトリアシリ)4を用いる)し、次いで化合物(
1)全縮合条件下(好ましくは1−メチル−イミダゾー
ル存在下)に反応させることにより得ることかでさる。
オチド訪導体の5′−水酸基をリン酸化(たとえば、ホ
スホシトリアシリP、ホスホジクロリド、またはホスホ
ジペンゾトリアシリ)4を用いる)し、次いで化合物(
1)全縮合条件下(好ましくは1−メチル−イミダゾー
ル存在下)に反応させることにより得ることかでさる。
反応条件の具体例については、後記実験例を参照された
い。
い。
HO(N′Px)mR3(0)
4、化合物(3)
化合物(3)は、式(3)で表わされる。
R5−0(N’PX)nN ’OCo R4(3)化合
物(3)は広い意味においては完全に保護されたオリゴ
ヌクレオチドであり、いかなる方法で合成されたもので
あるかは問わない。
物(3)は広い意味においては完全に保護されたオリゴ
ヌクレオチドであり、いかなる方法で合成されたもので
あるかは問わない。
化合物(3)においてオリゴヌクレオチPの3′末端は
カルダニル基を有していて、R4で保護されている。R
4としては、低級アルキル基、アリル基または通常の同
相合成法に用いられる、適当なスペー−(CH2) 2
CON)I(CH2) 2NH−CO−1−(CH2)
2CONI(((CJ(2)2N)I″1n−CH2−
1−(CI(2)2CO(NI((CH2)2CO″)
nNH−1−(CM、2)2CONI(CH2÷など)
をもつ担体(ポリスチレン誘導体、ポリアクリルアミド
誘導体など)などがある。とりわけ操作および処理が容
易であるということから、固相合成法によって得られる
第三の基(すなわち担体。ちなみに、第一の基は低級ア
ルキル基、第二の基はアリル基である)が好ましい。
カルダニル基を有していて、R4で保護されている。R
4としては、低級アルキル基、アリル基または通常の同
相合成法に用いられる、適当なスペー−(CH2) 2
CON)I(CH2) 2NH−CO−1−(CH2)
2CONI(((CJ(2)2N)I″1n−CH2−
1−(CI(2)2CO(NI((CH2)2CO″)
nNH−1−(CM、2)2CONI(CH2÷など)
をもつ担体(ポリスチレン誘導体、ポリアクリルアミド
誘導体など)などがある。とりわけ操作および処理が容
易であるということから、固相合成法によって得られる
第三の基(すなわち担体。ちなみに、第一の基は低級ア
ルキル基、第二の基はアリル基である)が好ましい。
オリゴヌクレオチドの5′末端のR5は、通常用いられ
る保護基である。一般的に置換または非置換トリチル基
(好ましくは・ジメトキシトリチル基)が用いられる。
る保護基である。一般的に置換または非置換トリチル基
(好ましくは・ジメトキシトリチル基)が用いられる。
5、化合物(4)
(1)定義
化合物(4)は、式(4)で表わされる新規物質である
。
。
R2−NI(−R’−PX(N’Px)rn+nN’0
COR4(4)化合物(4)の置換基の定義および好ま
しい具体例は、前記した通りである。
COR4(4)化合物(4)の置換基の定義および好ま
しい具体例は、前記した通りである。
(2)合成
化合物(4)は、化合物(2)のR3基および化合物(
3)のR5基をそれぞれ脱離させ、縮合剤の存在下で反
応させることにより得ることができる。
3)のR5基をそれぞれ脱離させ、縮合剤の存在下で反
応させることにより得ることができる。
出発化合物(2)のR3基は容易に脱離される保護基で
あり、オリ2ヌクレオチ゛ドの3′−末端リン酸基PO
0(遊離の形)であってもよく、適当な塩の形であって
もよい。R3基は通常シアノエチル基が用いられ、塩の
場合の代表例は第三級アミン塩、たとえばトリエチルア
ンモニウム塩、である。
あり、オリ2ヌクレオチ゛ドの3′−末端リン酸基PO
0(遊離の形)であってもよく、適当な塩の形であって
もよい。R3基は通常シアノエチル基が用いられ、塩の
場合の代表例は第三級アミン塩、たとえばトリエチルア
ンモニウム塩、である。
出発化合物(3)のR5が通常用いられるトリチル基で
ある場合は、脱離は酢酸またはZrBr2 /溶媒中で
行なわれるが、後者の方が好ましい。
ある場合は、脱離は酢酸またはZrBr2 /溶媒中で
行なわれるが、後者の方が好ましい。
縮合は、縮合剤の存在下に行なうことが好まl〜い。こ
の工程で使用することができる縮合剤の具体例としては
トシルクロリド、メシチレンスルホニルクロリド、メシ
チレンスルホニルテトラソリ)’ (MS’l”j’
) オよびメシチレンスルホニルニトロトリアゾリド(
MSNT )などが挙げられる。反応条件の具体例につ
いては、後記実験例を参照され6、化合物(5) (1)定義 化合物(5)は、式(5)で表わされる新規物質である
。
の工程で使用することができる縮合剤の具体例としては
トシルクロリド、メシチレンスルホニルクロリド、メシ
チレンスルホニルテトラソリ)’ (MS’l”j’
) オよびメシチレンスルホニルニトロトリアゾリド(
MSNT )などが挙げられる。反応条件の具体例につ
いては、後記実験例を参照され6、化合物(5) (1)定義 化合物(5)は、式(5)で表わされる新規物質である
。
Nl2−R1−P (NP)、nNOH(5)化合物(
5)の置換基の定義および好ましい具体例は、前記した
通りである。
5)の置換基の定義および好ましい具体例は、前記した
通りである。
(2)合成
化合物(4)のCOR’基、R2基、塩基上のアシル基
およびリン酸トリエステル中の保護基(通常アリル基、
たとえば。−クロロフェニル基など)を、オリザヌクレ
オチドを安定なまま脱離させることにより得ることがで
きる。
およびリン酸トリエステル中の保護基(通常アリル基、
たとえば。−クロロフェニル基など)を、オリザヌクレ
オチドを安定なまま脱離させることにより得ることがで
きる。
Co R4基およびリン酸トリエステルキっ0−クロロ
フェニル基はTMG−0麩盟溶液を用いて脱離させるの
が好ましい。その他の保護基(R2基および塩基部分の
アシル基)もアルカリ処理(#アンモニア水)を行なう
ことにより脱離される。なお、TMG−0斧(ツ啓液は
、0.5 M TMG (テトラメチルグアノシン)−
Py(ピリジン)−2−カルゼアルドキシメイトのジオ
キサン−水(9:1)溶液、である。
フェニル基はTMG−0麩盟溶液を用いて脱離させるの
が好ましい。その他の保護基(R2基および塩基部分の
アシル基)もアルカリ処理(#アンモニア水)を行なう
ことにより脱離される。なお、TMG−0斧(ツ啓液は
、0.5 M TMG (テトラメチルグアノシン)−
Py(ピリジン)−2−カルゼアルドキシメイトのジオ
キサン−水(9:1)溶液、である。
R2がTfa−の場合は、アンモニア処理により充分脱
離されるが、NPs−の場合はさらにメルカプトエタノ
ニル処理が必要である。他の保護基を用いろ場合は、オ
リ2ヌクレオチ゛ド分が安定な限りで、さらに別の処理
を加えることも考えられる。
離されるが、NPs−の場合はさらにメルカプトエタノ
ニル処理が必要である。他の保護基を用いろ場合は、オ
リ2ヌクレオチ゛ド分が安定な限りで、さらに別の処理
を加えることも考えられる。
反応条件の具体例については、後記実験例を参照された
い。
い。
7、化合物(6)
(1)定義
化合物(6)は、式(6)で表わされる新規物質である
。
。
〔セファロース〕−N)I−R1−P(NP)、nNO
H(6)化合物(4)の置換基の定義および好ましい具
体例は、前記した通りである。
H(6)化合物(4)の置換基の定義および好ましい具
体例は、前記した通りである。
(2)合成
化合物(6)は、化合物(5)に〔セファロース〕を縮
合させることにより得られる。縮合剤は、結合させる〔
セファロース〕の種類によっては必要なことも不要なこ
ともある。
合させることにより得られる。縮合剤は、結合させる〔
セファロース〕の種類によっては必要なことも不要なこ
ともある。
〔セファロース〕は、アミノ基と結合可能なものであれ
ばよい。具体的例は、活性化CH−セファロース、Br
CN活性化−セファロース、エポキシ化セファロース、
CH−セファロースおよヒM(−セファロースなどが
上げられる。このうち、CH−セファロースまたは届−
セファロースを用いる場合は縮合剤(たとえばDCC)
の存在が必要である。
ばよい。具体的例は、活性化CH−セファロース、Br
CN活性化−セファロース、エポキシ化セファロース、
CH−セファロースおよヒM(−セファロースなどが
上げられる。このうち、CH−セファロースまたは届−
セファロースを用いる場合は縮合剤(たとえばDCC)
の存在が必要である。
また、結合させるべき化合物(5)を考慮すれば、−級
アミン基とのみ選択的に反応する活性化CH−セファロ
ースが最も好ましい。
アミン基とのみ選択的に反応する活性化CH−セファロ
ースが最も好ましい。
縮合は、通常の方法で行なわれる。反応条件の具体例に
ついては、後記実験例を参照されたい。
ついては、後記実験例を参照されたい。
(3)結合量および吸着能の検定
化合物(5)とセファロースとの結合量は、セファロー
ス1mg あたりに結合した化合物(5)の量、または
吸着物質としてHOA13またはnoTt3t:用いて
吸着した量、をOD単位で示すことにする。
ス1mg あたりに結合した化合物(5)の量、または
吸着物質としてHOA13またはnoTt3t:用いて
吸着した量、をOD単位で示すことにする。
また、本発明により合成された化合物(6)と従来方法
で合成された担体〔オーリ−?(dT)−セルロースま
たはオリf(dA)−セルロース(共に市販品)〕と全
比較するため、同様の吸着実験も行なう。
で合成された担体〔オーリ−?(dT)−セルロースま
たはオリf(dA)−セルロース(共に市販品)〕と全
比較するため、同様の吸着実験も行なう。
化合物(6)の生成を確認する(すなわち、結合量を求
めろ)のと同様に、トリデカアデニル酸(HOAt3)
、トリデカチミジル酸(■IO′乃3)なと本発明によ
る5パ−末端リン酸基から延長したアミン基のな′いオ
リゴヌクレオチドのセファロースとの結合を調べること
は、結合位置を確定するうえで重要なことである。
めろ)のと同様に、トリデカアデニル酸(HOAt3)
、トリデカチミジル酸(■IO′乃3)なと本発明によ
る5パ−末端リン酸基から延長したアミン基のな′いオ
リゴヌクレオチドのセファロースとの結合を調べること
は、結合位置を確定するうえで重要なことである。
この結果、化合物(6)は結合量0.060D/ mg
に近い値を示すものをも得ることができ、化合物(5)
は塩基配列を問わずすべてが結合可能であることがわか
る。また、アミン基をもたないオリゴヌクレオチドにお
ける担体との結合が全く行なわれていないことより、化
合物(5)はその塩基部分では全(結合せず、その−級
アミン基のみで結合していることもわかる。
に近い値を示すものをも得ることができ、化合物(5)
は塩基配列を問わずすべてが結合可能であることがわか
る。また、アミン基をもたないオリゴヌクレオチドにお
ける担体との結合が全く行なわれていないことより、化
合物(5)はその塩基部分では全(結合せず、その−級
アミン基のみで結合していることもわかる。
一方、本発明者の実験によれば、市販の樹脂のうちオリ
ゴ(dT)−セルロースでは、0.010〜0.037
0D/mg 程度の吸着能が検定されたこともあった
が、再度の検定に際し豊現性のある値は得られていない
。また、オリゴ(dA)−セルロースには、はとんど吸
着能は存在しない(オリゴ(dT)−セルロースに比べ
てオリq (a人)−セルロースは良質のものがないこ
とが従来より知られているが、それがこの理由であると
解される)。
ゴ(dT)−セルロースでは、0.010〜0.037
0D/mg 程度の吸着能が検定されたこともあった
が、再度の検定に際し豊現性のある値は得られていない
。また、オリゴ(dA)−セルロースには、はとんど吸
着能は存在しない(オリゴ(dT)−セルロースに比べ
てオリq (a人)−セルロースは良質のものがないこ
とが従来より知られているが、それがこの理由であると
解される)。
したがって、本発明の化合物(6)は、新たに開発した
スペーサの先端にある一級アミノ基でのみ担体と結合し
、それ以外での(塩基部分のアミノ基など)非特異的な
結合が全くな(、しかも合成可能ないかなる塩基配列を
もつオリゴヌクレオチドをも担体に結合させることがで
きる、非常に良質のアフイニテイ担体であることがいえ
る。
スペーサの先端にある一級アミノ基でのみ担体と結合し
、それ以外での(塩基部分のアミノ基など)非特異的な
結合が全くな(、しかも合成可能ないかなる塩基配列を
もつオリゴヌクレオチドをも担体に結合させることがで
きる、非常に良質のアフイニテイ担体であることがいえ
る。
実施例
実施例1−1 (R1=Hex (すなわち(=C6
1112−)、R2=Tfaの場合) 1)試料 6−アミンヘキサノール (1,17g、 10mm
ol )トリフルオロアセチルチオエチル(Tfa−S
Et)(1,80m1 、14.4mmol)ジオキサ
ン (15ml) 2)合成 6−アミンヘキサノール(量は上記)をジオキサン(1
5ml)に溶解し、トリフルオロアセチルエチ/I/
(、Tft−’−spt ) (量は上記)を徐々に加
えて、室温にて一夜反応させる。反応後、濃縮し、残有
をエーテルに溶解し、水で3回抽出する。エーテル層を
乾燥(無水NIL2SO4)後、濃縮する。残渣にエー
テル全方えて溶解したのち、ペンタンを加先て結晶化さ
せると、粉末状の化合物(1−1)が得られる。
1112−)、R2=Tfaの場合) 1)試料 6−アミンヘキサノール (1,17g、 10mm
ol )トリフルオロアセチルチオエチル(Tfa−S
Et)(1,80m1 、14.4mmol)ジオキサ
ン (15ml) 2)合成 6−アミンヘキサノール(量は上記)をジオキサン(1
5ml)に溶解し、トリフルオロアセチルエチ/I/
(、Tft−’−spt ) (量は上記)を徐々に加
えて、室温にて一夜反応させる。反応後、濃縮し、残有
をエーテルに溶解し、水で3回抽出する。エーテル層を
乾燥(無水NIL2SO4)後、濃縮する。残渣にエー
テル全方えて溶解したのち、ペンタンを加先て結晶化さ
せると、粉末状の化合物(1−1)が得られる。
収量 1.40g(収率 70%)
実施例1−2 (R1=Et (丁なわち=C1(2
CH2−)、R2=NPSの場合) 2−アミノエタノ−A/(NH2−EtOH) およ
び〇−二トロフェニルスルフェニルクロ!J )’ (
NFS−CI)を用い、実施例1−1と同様の操作全行
なう。
CH2−)、R2=NPSの場合) 2−アミノエタノ−A/(NH2−EtOH) およ
び〇−二トロフェニルスルフェニルクロ!J )’ (
NFS−CI)を用い、実施例1−1と同様の操作全行
なう。
実施例1−3 (R1=Hex、 R2=NFSの場
合)6−アミノヘキサノール(NH2−H1!l xO
H)および〇−二i四フェニルスルフェニルクロ9 )
’ (Nps−Ct)を用い、実施例1−1と同様の操
作を行なう。
合)6−アミノヘキサノール(NH2−H1!l xO
H)および〇−二i四フェニルスルフェニルクロ9 )
’ (Nps−Ct)を用い、実施例1−1と同様の操
作を行なう。
表1
実施例2−1 (R’=11ex、 R2=’、L’
fa、 N’=AB”、m=2およびR3= CEの場
合) 1)試料 1(04ZAi”CE (BzはN6−ベンゾイル基)
X (800mg、 0.71mmol )o−クロロフェ
ニルホスホロジトリアゾリド(1,0mmol ) ジオキサン (6,Oml ) 化合物(1−1) (300mg、 1.4mmo
l )1−メチル−イミダゾール (115mg、 1.4mmol )2)合成 Py共沸により無水にした)TOAp、7Aζ’CE(
量は上記)に0−り四ロフェニルホスホロジトリアソリ
ド(量は上記−)のジオキサン(量は上記)溶液を加え
て2時間反応させる。TLC(CHCl 3−Me o
H== 14 ;1)でMeOH分解物および水分解物
をチェックしたのち、化合物(1−1)(量は上記)お
よび1−メチル−イミダゾール(量は上記)を加えて、
2時間反応させる。TLCで反応の進行をチェックした
のち、水を加えて過剰のトリアシリrを分解し、溶媒を
留去する。残渣’kcHc13に溶かし、水、0.5
M −NaH2PO2、飽和Na1ICO3および5
% NaC1水溶液で洗浄したのち、無水Na 2SO
4で乾燥させる。CHCl 3層を濃縮し、シリカゲル
ショートカラムで精製する(溶出液; 0〜4 % M
eOH/CHCl 3)。
fa、 N’=AB”、m=2およびR3= CEの場
合) 1)試料 1(04ZAi”CE (BzはN6−ベンゾイル基)
X (800mg、 0.71mmol )o−クロロフェ
ニルホスホロジトリアゾリド(1,0mmol ) ジオキサン (6,Oml ) 化合物(1−1) (300mg、 1.4mmo
l )1−メチル−イミダゾール (115mg、 1.4mmol )2)合成 Py共沸により無水にした)TOAp、7Aζ’CE(
量は上記)に0−り四ロフェニルホスホロジトリアソリ
ド(量は上記−)のジオキサン(量は上記)溶液を加え
て2時間反応させる。TLC(CHCl 3−Me o
H== 14 ;1)でMeOH分解物および水分解物
をチェックしたのち、化合物(1−1)(量は上記)お
よび1−メチル−イミダゾール(量は上記)を加えて、
2時間反応させる。TLCで反応の進行をチェックした
のち、水を加えて過剰のトリアシリrを分解し、溶媒を
留去する。残渣’kcHc13に溶かし、水、0.5
M −NaH2PO2、飽和Na1ICO3および5
% NaC1水溶液で洗浄したのち、無水Na 2SO
4で乾燥させる。CHCl 3層を濃縮し、シリカゲル
ショートカラムで精製する(溶出液; 0〜4 % M
eOH/CHCl 3)。
目的物を集めて濃縮し、これをペンタンに滴下して、粉
末状の化合物(2−1)t−得る。
末状の化合物(2−1)t−得る。
収 量 610mg (収率57%)実施例2−2〜
実施例2−6 実施例2−1と同様の操作を行ない、結果を下表2に示
す。
実施例2−6 実施例2−1と同様の操作を行ない、結果を下表2に示
す。
よびR4=バーGrの場合)
1)試料
DMTr”OA”0CO−JAA−e (300mg、
0.033mmol )D請r−OA萼t 0Et3
NH (150mg、 0.1mmol) MSNT (150mg 0.5nonol
)* DMTrはジメトキシトリf)’Iy、−A″′
A−[相]ハ(CH2)2CONI(CH2合[相](
[相]はポリスチレン)、である。
0.033mmol )D請r−OA萼t 0Et3
NH (150mg、 0.1mmol) MSNT (150mg 0.5nonol
)* DMTrはジメトキシトリf)’Iy、−A″′
A−[相]ハ(CH2)2CONI(CH2合[相](
[相]はポリスチレン)、である。
2)合成
りMTr−OA”0CO−AAA−e (量は上記)を
取り、(1) 1soPrOH−CH2C12(15:
85 v/v 、 10 ml X 3 )で洗浄、
(2) 0.I M ZrBr2の1soPrOH−C
H2C12(15:85v/v、 8 ml X 4、
計加分)溶液で脱トリチル化、(3) 1ioPrOH
−CH2C1215: 85 v/v 、 10 ml
X 3 )で洗浄、(4)ピリ・ジン(Py、)(l
oml x 3 )で洗浄後、(5) Py−Et3N
−H2O(3: 1 : 1 v/v 、 10’ml
、 30分)処理し、無水にしてDMrr−ω者A鰭
0Et3NH(量は上記)のpy溶液を加えて、py共
沸して完全に無水とする。(6)これにMSNT (量
は上記)と無水取(2ml)とを加えて、90分間振盪
しながら反応させる。(7)Py (10m1 X 3
)で洗浄後、(8)触媒量のジメチルアミノピリジン
(DMAP)’を含むAc2O−Py (1: 9 v
/v、10m1 ’) を加えて10分反応させて、未
反応5′−水酸基を保護する。(9) Py(xomt
x3) で洗浄して、1回の縮合全路える。
取り、(1) 1soPrOH−CH2C12(15:
85 v/v 、 10 ml X 3 )で洗浄、
(2) 0.I M ZrBr2の1soPrOH−C
H2C12(15:85v/v、 8 ml X 4、
計加分)溶液で脱トリチル化、(3) 1ioPrOH
−CH2C1215: 85 v/v 、 10 ml
X 3 )で洗浄、(4)ピリ・ジン(Py、)(l
oml x 3 )で洗浄後、(5) Py−Et3N
−H2O(3: 1 : 1 v/v 、 10’ml
、 30分)処理し、無水にしてDMrr−ω者A鰭
0Et3NH(量は上記)のpy溶液を加えて、py共
沸して完全に無水とする。(6)これにMSNT (量
は上記)と無水取(2ml)とを加えて、90分間振盪
しながら反応させる。(7)Py (10m1 X 3
)で洗浄後、(8)触媒量のジメチルアミノピリジン
(DMAP)’を含むAc2O−Py (1: 9 v
/v、10m1 ’) を加えて10分反応させて、未
反応5′−水酸基を保護する。(9) Py(xomt
x3) で洗浄して、1回の縮合全路える。
この操作を同様に6回繰り返して、目的の化合物(3−
1)()リデカアデニン酸)を得る。
1)()リデカアデニン酸)を得る。
各回のトリチル基の定量による収率は、89%、8;3
%、80チ、79%、81チおよび90係である。
%、80チ、79%、81チおよび90係である。
通算収率 34%
実施例3’−1(脱保獲)
DIvffTr−0(AB、”)12ABzOCO−/
IAA−■(15mg )fig遠沈に取り、05 M
TMG−OxImeのPy−H2O(9: 1 v/
v)溶液(100μm)t−加えて室温でU時間放置す
る。
IAA−■(15mg )fig遠沈に取り、05 M
TMG−OxImeのPy−H2O(9: 1 v/
v)溶液(100μm)t−加えて室温でU時間放置す
る。
これに濃アンモニア(2,5m1)を加えて密閉し、圓
℃で一夜放置する。樹脂を戸別し、F液を濃縮後、水に
溶解し、エーテルで3回抽出する。水層全濃縮後、セフ
ァデックスG −50(1,5X 120の)で脱塩す
る(溶出液: 0,05 M −TEAB (重炭酸ト
リエチルアンモニウム)緩衝液p)(7,5)。
℃で一夜放置する。樹脂を戸別し、F液を濃縮後、水に
溶解し、エーテルで3回抽出する。水層全濃縮後、セフ
ァデックスG −50(1,5X 120の)で脱塩す
る(溶出液: 0,05 M −TEAB (重炭酸ト
リエチルアンモニウム)緩衝液p)(7,5)。
溶出パターンは第2図に示す。
得られた−2−りの部分を集め、濃縮したのち、804
“酢酸(2ml、10分)で処理すると、トリデカカア
デニル酸(HQA13 )が得られる。これはHP L
C(/1−Bondapak C−18) により純
度全チェックし、得られる溶出パターンを第3図に示す
。
“酢酸(2ml、10分)で処理すると、トリデカカア
デニル酸(HQA13 )が得られる。これはHP L
C(/1−Bondapak C−18) により純
度全チェックし、得られる溶出パターンを第3図に示す
。
実施例3′−2〜3−6
実施例3−1と同様の操作を行なって各種の化合物(3
)ヲ本発明者らが合成したことは既に報告済みである。
)ヲ本発明者らが合成したことは既に報告済みである。
平均すると一回の縮合につき85チ程度の収率を上げて
いる。
いる。
Tetrahedron Letters 1979.
3635(1979)Nucjelc Ac1ds R
e1each 8.5473 (1980)Nucle
ic Ac1ds Re5earch 8.54.91
(1980)Nucleic Ac1ds Re5e
arch 8.5507(1980)Nucleic
Ac1ds Re5earch Symposium
5eries+7.281(1980) J、Am、 Chem、 Soc、 103 706(
1981)Nuclaic Ac1ds Re5ear
ch 10.197(1981)実施例4−1 (R
’==Hex 、 R2=Tf a 、 N’=A”、
m=2、n=12. R4=五〇) 1)試料 化合物(3−1) (DMI’r−0(Ap、”)12
A、 0CO−A−A−■)(115mg、 3.45
/jmol )化合物(2−1) (Tfa−NH−H
exPX(4,”)2CE)(60mg10.04mm
ol ) MSNT (60mg O,2mrnol )
2)合成 化合物(3−1) (DMrr−0(4,”)ABc+
co e )(量は上記)を取り、1soPrOH
−CH2C12(+5 : 85φ、10m1X3)
でよ(膨潤させたのち、1 M −ZnBr2のig
oPrOH−CH2C12(15: 85 v/v。
3635(1979)Nucjelc Ac1ds R
e1each 8.5473 (1980)Nucle
ic Ac1ds Re5earch 8.54.91
(1980)Nucleic Ac1ds Re5e
arch 8.5507(1980)Nucleic
Ac1ds Re5earch Symposium
5eries+7.281(1980) J、Am、 Chem、 Soc、 103 706(
1981)Nuclaic Ac1ds Re5ear
ch 10.197(1981)実施例4−1 (R
’==Hex 、 R2=Tf a 、 N’=A”、
m=2、n=12. R4=五〇) 1)試料 化合物(3−1) (DMI’r−0(Ap、”)12
A、 0CO−A−A−■)(115mg、 3.45
/jmol )化合物(2−1) (Tfa−NH−H
exPX(4,”)2CE)(60mg10.04mm
ol ) MSNT (60mg O,2mrnol )
2)合成 化合物(3−1) (DMrr−0(4,”)ABc+
co e )(量は上記)を取り、1soPrOH
−CH2C12(+5 : 85φ、10m1X3)
でよ(膨潤させたのち、1 M −ZnBr2のig
oPrOH−CH2C12(15: 85 v/v。
5m1X6.30分)溶液で脱トリチル化する。樹脂’
k 1soPrOH−CH2C12(15: 85 v
/v 、 5 ml X 3 ) ’で、続いて
P’! (5ml X 3 )で、洗浄する。一方、化
合物(2−1) (Tf a−NH−HexPx(4,
”)2CE) (量は上記)を取り、Py−Et3N−
H2O(3: 1 : 1.3ml、15分)で処理し
て、脱シアンエチル化する。溶媒を留去後、〜で2回共
沸する。これePyに溶解させ、先はどの樹脂に加えて
〜共沸して、完全に無水とする。これにMSNT (量
は上記)および無水Py’ (15m1 ) ’fr、
加えて、振盪しながら90分反応させる。反応波樹脂e
Py及びMeOHで洗浄し乾燥することにより、化合物
(4−1) ’!r得る。
k 1soPrOH−CH2C12(15: 85 v
/v 、 5 ml X 3 ) ’で、続いて
P’! (5ml X 3 )で、洗浄する。一方、化
合物(2−1) (Tf a−NH−HexPx(4,
”)2CE) (量は上記)を取り、Py−Et3N−
H2O(3: 1 : 1.3ml、15分)で処理し
て、脱シアンエチル化する。溶媒を留去後、〜で2回共
沸する。これePyに溶解させ、先はどの樹脂に加えて
〜共沸して、完全に無水とする。これにMSNT (量
は上記)および無水Py’ (15m1 ) ’fr、
加えて、振盪しながら90分反応させる。反応波樹脂e
Py及びMeOHで洗浄し乾燥することにより、化合物
(4−1) ’!r得る。
収量120mg
実施例4−2
実施例4−1と同様に、化合物(3−2)(DMrrO
(TPX)12’1bCOJ〜■〕と化合物(2−3)
CTfts−NH−Hex−Px(TPx)2CE:]
とを用いて、化合物(4−2) (Tfa−NH−He
x−PX(’1’PX)14TOCO−”\S) )f
合成する。
(TPX)12’1bCOJ〜■〕と化合物(2−3)
CTfts−NH−Hex−Px(TPx)2CE:]
とを用いて、化合物(4−2) (Tfa−NH−He
x−PX(’1’PX)14TOCO−”\S) )f
合成する。
実施例4−3
実施例4−1と同様に、化合物(3−3)(DMTro
(A園) gA”0CO−NSA−■〕と化合物(2
−1)(Tf a−NH−Hex−Pc(A”Px)2
CE) とを用いて、化合物(4−3) [:Tf
a −NH−He x−P、 (A”1−人4LA”o
co−AM−(Q :)を合成する。
(A園) gA”0CO−NSA−■〕と化合物(2
−1)(Tf a−NH−Hex−Pc(A”Px)2
CE) とを用いて、化合物(4−3) [:Tf
a −NH−He x−P、 (A”1−人4LA”o
co−AM−(Q :)を合成する。
実施例4−1と同様に、化合物(3−4)匣′。背臂堂
〜′ゆ臂cB”lp、、、ll+、、、吹鳴x X
x CBzOCOJ随O〕ト化合物(2−3)(T” f
a −Ni+−I(e x Px (9,)2CD’:
lとを用いて、化合物(4−4)(Tfa−NH−He
x−P、(TP、)2吋臂臂夾4.”C4:u CBz
IJ7p、1.Ni; C,&、CEz CBz −o
co 五■〕全合成する。
〜′ゆ臂cB”lp、、、ll+、、、吹鳴x X
x CBzOCOJ随O〕ト化合物(2−3)(T” f
a −Ni+−I(e x Px (9,)2CD’:
lとを用いて、化合物(4−4)(Tfa−NH−He
x−P、(TP、)2吋臂臂夾4.”C4:u CBz
IJ7p、1.Ni; C,&、CEz CBz −o
co 五■〕全合成する。
実施例4−5
実施例4−1と同様に、化合物(3−2)(DMTrO
(’1’PX)12TOCO−”A−e )と化合物(
2−5)(Tf a−NH−NPS−Px(昨、)2C
E)とを用いて、化合物(4−5)(Tfa−Nl(−
NPS−PX(’l’P、)l、TOCO−NA−■〕
を合成する。
(’1’PX)12TOCO−”A−e )と化合物(
2−5)(Tf a−NH−NPS−Px(昨、)2C
E)とを用いて、化合物(4−5)(Tfa−Nl(−
NPS−PX(’l’P、)l、TOCO−NA−■〕
を合成する。
実施例4−6
実施例4−1と同様に、化合物(3−5)浄苦胸CO−
〇〕 と化合物(2−6) C’J’fa−NH−Pen−P
会fcrd:”)2CE3とを用いて、化合物(4−6
) (Tfa−Nu−Pen−PxrPPAp A o
co−AM−(8〕y合y、j 6゜x 実施例4−7 実施例4−1と同様に、化合物(3−6)C’pl″z
A&Z(3p”lr OCO−M+−6) ) ト、化
合物(2−6)X x X (Tfa−NH−Pen−Px(Gpj;)2C1とを
用いて、化合物(4−6) (Tfa−NH−Pen−
px(Gp” )2斌喝、Toco−w”@]を合成す
る。
〇〕 と化合物(2−6) C’J’fa−NH−Pen−P
会fcrd:”)2CE3とを用いて、化合物(4−6
) (Tfa−Nu−Pen−PxrPPAp A o
co−AM−(8〕y合y、j 6゜x 実施例4−7 実施例4−1と同様に、化合物(3−6)C’pl″z
A&Z(3p”lr OCO−M+−6) ) ト、化
合物(2−6)X x X (Tfa−NH−Pen−Px(Gpj;)2C1とを
用いて、化合物(4−6) (Tfa−NH−Pen−
px(Gp” )2斌喝、Toco−w”@]を合成す
る。
実施例5−1
化合物(4−t)(Tfa−NH−Hex−Px(Ap
、”)1,4”()Co e’1(15mg)e遠
沈管に取り、0.5 M TMa−oypHρPy−O
H(9: 1 v/v )溶液(100ml ) を加
えて、室温でU時間放置する。これに濃アンモニア水(
2,5m1)e加えて密閉し、50”Cで一夜放置する
。樹脂をヂ別し、P液を濃縮後、水に溶解し、エーテル
で3回抽出する。水層を濃縮後、セファデックスG−5
0(1,5X120(:rrL)で脱塩精製する(溶出
液: 50 mM TEAB緩衝液、pn 7.5 )
、その溶出JRパターン第4図に示す。
、”)1,4”()Co e’1(15mg)e遠
沈管に取り、0.5 M TMa−oypHρPy−O
H(9: 1 v/v )溶液(100ml ) を加
えて、室温でU時間放置する。これに濃アンモニア水(
2,5m1)e加えて密閉し、50”Cで一夜放置する
。樹脂をヂ別し、P液を濃縮後、水に溶解し、エーテル
で3回抽出する。水層を濃縮後、セファデックスG−5
0(1,5X120(:rrL)で脱塩精製する(溶出
液: 50 mM TEAB緩衝液、pn 7.5 )
、その溶出JRパターン第4図に示す。
ピークを集めて濃縮後、得られた化合物(5−1)につ
いてHPLC(11−Bondapak C18)にて
純度を検定する。その溶出パターンを第7図に示す。
いてHPLC(11−Bondapak C18)にて
純度を検定する。その溶出パターンを第7図に示す。
実施例5−2
実施例5−1と同様に、化合物(4−2) ’e脱保護
して、化合物(5−2) (NH2−He x−P (
AP)14AOH) k合成する。その溶出パターンを
第5図および第7図に示す。
して、化合物(5−2) (NH2−He x−P (
AP)14AOH) k合成する。その溶出パターンを
第5図および第7図に示す。
実施例5−3
実施例5−1と同様に、化合物(4−3) ’を脱保
護して、化合物(5−3) (NH2−He x−p(
Tp)14′rou) k合成するO 実施例5−4 実施例5−1と同様に、化合物(4−4) e脱保護
して、化合物(5−4) CNI2−He x−P (
Tp)2Gp (3p GpApAp Gp CpTp
TpCp CpωH〕 を合成する。その溶出ノぐタ
ーンを第6図および第9図に示す。
護して、化合物(5−3) (NH2−He x−p(
Tp)14′rou) k合成するO 実施例5−4 実施例5−1と同様に、化合物(4−4) e脱保護
して、化合物(5−4) CNI2−He x−P (
Tp)2Gp (3p GpApAp Gp CpTp
TpCp CpωH〕 を合成する。その溶出ノぐタ
ーンを第6図および第9図に示す。
実施例5−5
実施例5−1と同様に、化合物(4−6)を脱保護して
、化合物(5−5) [N)I2−Pen−p(Gp)
2GpApApGpCpTpTpTpCpApCpGp
TpApAOCO篇[株]〕ケ合成する。
、化合物(5−5) [N)I2−Pen−p(Gp)
2GpApApGpCpTpTpTpCpApCpGp
TpApAOCO篇[株]〕ケ合成する。
ス1上J二」
実施例5−1と同様に、化合物(4−7)k脱保護して
、化合物(5−6) CNI(2−Pen−,1’(G
p)2Gp””p0pGpAp9pTpAPAp0pG
p0pApGpT000−e )を合成する。
、化合物(5−6) CNI(2−Pen−,1’(G
p)2Gp””p0pGpAp9pTpAPAp0pG
p0pApGpT000−e )を合成する。
の合成〕
実施例6−1
1)試料
BrCN活性化−セファロース4B (40m
*)化合物(s−1)〔N[(2−uex−p(AP)
14Δ0■(〕(4,00D ) 2)反応 BrCN活性化セファロース4B(:ta:は上記)を
取り、1 mM−HClで洗浄し、さらに0.5 M−
NaC1゜0、I M−NaHCO3(pH8,3)溶
液で洗浄後、化合物(5−1) (量は上記)の’<)
、 5 M −NaC1,0,1M−NaHCO3(
pH8,3)溶液(200μm ) e加えておだやか
に振盪しながら、室温で一夜反応させる。反応後濾過し
、樹脂’e 10 mM−Tris−HCI (pH7
,5)および0.5NaC1,10mM−Trim−H
CI (pH7,5)で洗浄する。
*)化合物(s−1)〔N[(2−uex−p(AP)
14Δ0■(〕(4,00D ) 2)反応 BrCN活性化セファロース4B(:ta:は上記)を
取り、1 mM−HClで洗浄し、さらに0.5 M−
NaC1゜0、I M−NaHCO3(pH8,3)溶
液で洗浄後、化合物(5−1) (量は上記)の’<)
、 5 M −NaC1,0,1M−NaHCO3(
pH8,3)溶液(200μm ) e加えておだやか
に振盪しながら、室温で一夜反応させる。反応後濾過し
、樹脂’e 10 mM−Tris−HCI (pH7
,5)および0.5NaC1,10mM−Trim−H
CI (pH7,5)で洗浄する。
3)吸着能の検定
この樹脂約半量(20mg)t−取り、合成トリデカチ
ミジル酸を用いて、アフイニテイクロマトグラフイーを
行なって、吸着量を検定する。
ミジル酸を用いて、アフイニテイクロマトグラフイーを
行なって、吸着量を検定する。
吸着量: 1 、140D/ 20 mg樹脂(0,0
570D/mg >(第10図)。
570D/mg >(第10図)。
4)結合部位の検定
化合物< 6−’1 >の代わりに、トリデカアデニル
(I■0Ai3)(粗精製物)を用いて同様の操作を行
なう。はとんど結合されてなく、吸着能を検定しても全
く検出されない。
(I■0Ai3)(粗精製物)を用いて同様の操作を行
なう。はとんど結合されてなく、吸着能を検定しても全
く検出されない。
アフイニテイクロマトカラムの結果を第11図に示すが
、吸着能ははr 00D/ 15mg (OOf)7m
g )である。
、吸着能ははr 00D/ 15mg (OOf)7m
g )である。
5)結論
以上のことより、アデニン部分のアミノ基上では全(反
応がおこらないことがわかる。したがって、化合物(6
−1)における担体との結合は、すべて5′末端リン酸
基より延長されたアミノ基でのみ起こっているといえる
。
応がおこらないことがわかる。したがって、化合物(6
−1)における担体との結合は、すべて5′末端リン酸
基より延長されたアミノ基でのみ起こっているといえる
。
実施例6−2
1)試料
活性化CH−セファロース4B (30mg
)化合物(5−1) (NI(2−He x−P (A
p )14AOH)(4,00D ) 2)反応および吸着能の検定 活性化CH−セファロース4B(量は上記)を取り、1
mM HCIでよ(洗浄する。樹脂’fr: 0,5
M −NaC1。
)化合物(5−1) (NI(2−He x−P (A
p )14AOH)(4,00D ) 2)反応および吸着能の検定 活性化CH−セファロース4B(量は上記)を取り、1
mM HCIでよ(洗浄する。樹脂’fr: 0,5
M −NaC1。
0.1 M −NaHCO3(pH8,3)ですばや(
洗浄したのち、化合物(5−1) (量は上記)の0.
5 M−Mail 。
洗浄したのち、化合物(5−1) (量は上記)の0.
5 M−Mail 。
0.1 M−NaHCO3(pH8,3)溶液(160
μm)’に加えて、おだやかに振盪しながら室温で3時
間反応させる。反応波濾過し、樹脂f 10mM−Tr
lB−HCI(pH7,5)および0.5 M−NaC
1、10mM−Tris−HCI (pH7,5)で洗
浄する。
μm)’に加えて、おだやかに振盪しながら室温で3時
間反応させる。反応波濾過し、樹脂f 10mM−Tr
lB−HCI(pH7,5)および0.5 M−NaC
1、10mM−Tris−HCI (pH7,5)で洗
浄する。
樹脂について、トリデカチミ・ジル酸を用いて実施例6
−1と同様に吸着量を算出する(第12図)。
−1と同様に吸着量を算出する(第12図)。
吸着量: 0,620D/15mg (0,0420D
/mg )3)結合部位の検定 実施例6−1と同様に反応を行なつズ、吸着能の検定を
行なう(第13図) 吸着能:はr OOD/ 15 rng (00D/
mg )4)結論 実施例6−1と同様、0.0420D / mgの結合
はすべて5′−末端リン酸基より延長されたアミン基で
のみ起こっていることがいえろ。
/mg )3)結合部位の検定 実施例6−1と同様に反応を行なつズ、吸着能の検定を
行なう(第13図) 吸着能:はr OOD/ 15 rng (00D/
mg )4)結論 実施例6−1と同様、0.0420D / mgの結合
はすべて5′−末端リン酸基より延長されたアミン基で
のみ起こっていることがいえろ。
市販のオリゴ(dA)−セルロースは77’二ンノ塩基
部分で結合しているといわれているが、との縮合条件で
は可能性として考えられたアデニン塩基部分での結合が
全(起っていないと考えられる。
部分で結合しているといわれているが、との縮合条件で
は可能性として考えられたアデニン塩基部分での結合が
全(起っていないと考えられる。
実施例6−3
1)試料
BrCN活性化−セファロース4B (30mg)
化合物(5−2) (3,430D)
HOT13 (2,47
0Dr2)反応および結合量の検定 実施例6−1の結果から、アミン基をもたないオリゴチ
ミジン酸(HOT13)はHO人3よりもさらに反応性
がなく、BrCN活性化−セファロースと反応しないも
のと考えられたので、HPLCでの分析を容易にするた
め、内部標準物質としてHOT13 k加えて反応を行
なう。
化合物(5−2) (3,430D)
HOT13 (2,47
0Dr2)反応および結合量の検定 実施例6−1の結果から、アミン基をもたないオリゴチ
ミジン酸(HOT13)はHO人3よりもさらに反応性
がなく、BrCN活性化−セファロースと反応しないも
のと考えられたので、HPLCでの分析を容易にするた
め、内部標準物質としてHOT13 k加えて反応を行
なう。
反応は、実施例6−1と同様の操作により行なう。
反応前の溶液のHPLCノ’!ターンより、化合物(5
−2)ユ3.20D、 HOT13二2.IOD、未知
物質上〇、60D (計5,90D )であったが、反
応後は化合物(5−2)ユ2.10D、 HOT13ユ
2.OOD、未知物質上〇、50D (計4,90D)
となり(第14図)、セファロースはほとんど化合物(
5−,2)と反応していることがわかる。
−2)ユ3.20D、 HOT13二2.IOD、未知
物質上〇、60D (計5,90D )であったが、反
応後は化合物(5−2)ユ2.10D、 HOT13ユ
2.OOD、未知物質上〇、50D (計4,90D)
となり(第14図)、セファロースはほとんど化合物(
5−,2)と反応していることがわかる。
結合量1.10D/30rnFC(0,0370D/m
g )3)吸着能の検定 dAll (粗精製物、56%の不純物を含む)を用い
、アフイニテイカラムにより吸着能を検定する。
g )3)吸着能の検定 dAll (粗精製物、56%の不純物を含む)を用い
、アフイニテイカラムにより吸着能を検定する。
(1)粗dA11 (0,550D% dAll =
0.240Dに相当)をアプライした結果、目的のみし
かもほぼ完全に精4!Rjることかできる(第15図(
A))非吸着部分: 0,340D 吸着部分7 0,230D (2)粗dA11 (0,950D 、 dA11=
0.410Dに相当・、)を吸着・溶出した結果、非吸
着部分0.730D、吸着部分00270Dであった。
0.240Dに相当)をアプライした結果、目的のみし
かもほぼ完全に精4!Rjることかできる(第15図(
A))非吸着部分: 0,340D 吸着部分7 0,230D (2)粗dA11 (0,950D 、 dA11=
0.410Dに相当・、)を吸着・溶出した結果、非吸
着部分0.730D、吸着部分00270Dであった。
この結果、用いたカラムの吸着能力が0,270Dであ
ることがわかり、HPLCかも算出された結合量の約半
分であることがわかる。これは、反応液を洗浄する際の
損失と考えられるが、架橋後の残りのHOT13が5,
200程度であった゛と考えれば説明される。
ることがわかり、HPLCかも算出された結合量の約半
分であることがわかる。これは、反応液を洗浄する際の
損失と考えられるが、架橋後の残りのHOT13が5,
200程度であった゛と考えれば説明される。
吸着部分のHPLC、Rターンを第16図に示す。この
dAllは非常に純粋であることがわかる。
dAllは非常に純粋であることがわかる。
(3)上記非吸着部分(0,730D、 dA11=o
、150D)のうち0.310D (dA11= 0.
060D相当)の部分を再度このカラムにより溶出させ
る。非吸着部分0.2800’、吸着部分0,050D
である。
、150D)のうち0.310D (dA11= 0.
060D相当)の部分を再度このカラムにより溶出させ
る。非吸着部分0.2800’、吸着部分0,050D
である。
非吸着部分のHPLCノ#ターンより、非吸着部が全<
dAllt−含んでいないことがわかる(第17図)
。
dAllt−含んでいないことがわかる(第17図)
。
以上のクロマトグラフィーの結果をまとめて示せば、第
15図の通りである。
15図の通りである。
実施例6−4〜実施例6−8
実施例6−3と同様の操作を行ない、結果を後記衣6に
示す。また、実施例6−4において、実施例6−3の第
14図に相当するものを第18図に示す。
示す。また、実施例6−4において、実施例6−3の第
14図に相当するものを第18図に示す。
比較例1
1)樹 脂
市販のオリゴ(dA)−セルロース
(P−L Biochemieals Lot No、
115577 )2)吸着能の検定 上記の樹脂520 m g取り、0.5 M−NaC1
、10mM−T’rls−HCI (pH7,5)
溶液で膨潤させたのち、カラムに充填し、10mM−T
ria−HCI (pH7,5)および0.5 M−N
aC1,10mM−Trls−HCI (pH7,5)
溶液で洗浄する。これについて、合成トリデカチミジル
酸(HOT13 ) ’e用いて吸着能を検定する。
115577 )2)吸着能の検定 上記の樹脂520 m g取り、0.5 M−NaC1
、10mM−T’rls−HCI (pH7,5)
溶液で膨潤させたのち、カラムに充填し、10mM−T
ria−HCI (pH7,5)および0.5 M−N
aC1,10mM−Trls−HCI (pH7,5)
溶液で洗浄する。これについて、合成トリデカチミジル
酸(HOT13 ) ’e用いて吸着能を検定する。
溶離液: 10 mM Tris−HCI (pH7,
5)1両分=15滴(350μ1) (1) HO’l’131,330Dの0.5 M−
NaC1、10mM−Trls−HCI溶液24m1’
iiアゾライしたが、はとんど吸着されない。
5)1両分=15滴(350μ1) (1) HO’l’131,330Dの0.5 M−
NaC1、10mM−Trls−HCI溶液24m1’
iiアゾライしたが、はとんど吸着されない。
(2)上記(1)の溶出液を回収し、再び吸着を試みる
。
。
全く吸着されない。
(3)改めてカラムを作成し、同様に検定を行なう。以
上の3点については、その結果を第19図に示す。
上の3点については、その結果を第19図に示す。
3)結論
市販されている吸着用樹脂でありながら、はとんど吸着
能がないことがわかる。
能がないことがわかる。
従来より、オリ:r(dT)−セルロースに比べてオI
J −r (aA )−七ルp−スは良質のものがな〜
・と知られているが、この結果はそれを裏書きするもの
と解される。
J −r (aA )−七ルp−スは良質のものがな〜
・と知られているが、この結果はそれを裏書きするもの
と解される。
比較例2
1)樹脂
市販のオリゴ(a’r)−セルロース
(P−L Biochemicals Lot No、
675130 )2)吸着能の検定 比較例1と同様、HOA13 を用いて検定し、第加図
より算出される結果を下表5に示す。
675130 )2)吸着能の検定 比較例1と同様、HOA13 を用いて検定し、第加図
より算出される結果を下表5に示す。
3)結 輪
生検体の量または濃度の違いにより、あるいは吸着、お
よび溶出を繰り返すごとに吸着能が変化することによっ
て、再現性のある結果が得られない。
よび溶出を繰り返すごとに吸着能が変化することによっ
て、再現性のある結果が得られない。
以上の結果をまとめて表6に示す。
a=BrcN活性化−セファロース4Bb=活性化CH
−セファロース4B (aおよびbはPharmacia Fine Che
micalII製)C=ニオリボdA)−セルロース(
Lot No、115577 )d=オリ((dT)−
セルロース(Lot No、675130 )* =
”HOC:PGPGPAPAPGPCPTPTPCPC
PCOI(” ’**−自己相補性のためカラムに吸着
されず、測定不能。
−セファロース4B (aおよびbはPharmacia Fine Che
micalII製)C=ニオリボdA)−セルロース(
Lot No、115577 )d=オリ((dT)−
セルロース(Lot No、675130 )* =
”HOC:PGPGPAPAPGPCPTPTPCPC
PCOI(” ’**−自己相補性のためカラムに吸着
されず、測定不能。
*** =5’HOGpApApGpCpi’pTp’
1pCPApCp(TPTI、APAOH3’ −**
** =”’HOGpTpCpGp−ApCpTpAp
ApCp(7pCpApGpTO1(3’
1pCPApCp(TPTI、APAOH3’ −**
** =”’HOGpTpCpGp−ApCpTpAp
ApCp(7pCpApGpTO1(3’
第1図は、本発明が関係する一連の反応を示すスキーム
である。 第2.4.5および6図は、セファデックスヵラムクロ
マトダラム金示すものである。 第3.7.8.9.14.16.17および18図は、
イスレモHPLCノリーンを示すものである。 第10.11.12.13.15.11719および加
図は、いずれもアフィニティ担体にょるカラムクロマト
グラムを示すものである。 a) セファディクスG−50カラムによる精製条件カ
ラム:セファデックスG−50 カラムゼリューム: 1.5 Cm X 120 c
rn溶出液: 50 mM TEABM衝液、jiH7
,5分画量:35滴/分画 b) HPLCによる分析条件 カラム: μm Bondapak C18(Wate
rs )溶出液: CH3CN in O,02M E
DAA緩衝液(pH7,8)勾 起上図中に示す 流速:2m11分 チャートスf−ド:10龍/分 温度:50℃ C) アフイニテイクロマトカラムによる検定条件洗浄
液: 0.5 M NaC1、10mM Tris−H
CI (pH7,5)溶出液: 10 mM Tris
−HCI (pH7,5)分画量:15滴(350μl
) 生検体のアプライtAで、溶出開始?Bで示す。 出願人代理人 猪 股 清 第1図 第4図 会画数 第5図 分 画 数 莞6図 分画数 ¥7図 原符時間(8) 第8図 イ珂(持 Bデt 間 (4)第9図 イ米 才寺 時 間 1分)第1
0区 第11図 分画数 分画数 第12図 第13図 分画数 分画数 第16閃 保持時間(分) 第17図 保 持 8寺 間 (イとト)第19
図 (A) (B)(OD)
(OD)分画数
分画数 (C) 分画数 第20図 (A) CB) (C)(
D) 、 (E) 手続補正書 1.事件の表示 昭和57年!11許願第138136号2、発明の名称 固定化オリゴヌクレオチドおよび その製造法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 湧水製薬株式会社 するO 明 細 書 1、発明の名称 固定化オリゴヌクレオチドおよびそ
の製造法 2、特許請求の範囲 1、下式〔■〕で示されるものであることを特徴とする
、固定化オリゴヌクレオチド。 〔ただし、mお↓びnはそれぞれ0または任意の自然数
であり、Rは二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基で
あり、Bはヌクレオチドを構成する塩基である(Bが複
数個存在するときは、それらは同一でも異なってもよい
)。〕2、塩基Bがアデニン、チミン、シ小シンおよび
グアニンからなる群より選ばれたものである、特許請求
の範囲第1項記載の固定化オリサヌクレオチド。 3、R1が炭素数2〜旬の直鎖または分岐鎖のアルキレ
ン基である、特許請求の範囲第1項または第2項記載の
固定化オリゴヌクレオチド。 4、 mが0または6までの自然数、nがOまたは40
までの自然数である、特許請求の範囲第1〜\ 3項のいずれか1項に記載の固定化オリゴヌクレオチド
。 5、担体がセファロースである、特許請求の範囲第1〜
4項のいずれか1項に記載の固定化オリゴヌクレオチド
。 6、セファロースが活性化上ファロースである、特許請
求の範囲第5項に記載の固定化オリゴヌクレオチド。 7、下式CM)で示されるオリゴヌクレオチド誘導体の
末端アミノ基とそのアミノ基と結合可能な担体とを反応
させて式〔■〕で示される固定化オリゴヌクレオチドを
得ること、を特徴とする化合物〔■〕の製造法。 〔ただし、mおよびnはそれぞれOまたは任意の自然数
であり、R1は二価の直鎖または分岐鎖′の炭化水素残
基であり、Bはヌクレオチドを構成する塩基である(B
が複数個存在するときは、それらは同一でも異なっても
よい)。〕3、発明の詳細な説明 発明の背景 技術分野 本発明は、一般に、固定化オリゴヌクレオチドに関する
。さらに具体的には、本発明は、ヌクレオチドの塩基以
外の部分に担体を結合させてなる固定化オリゴヌクレオ
チドに関する。 本発明は、また、このような固定化オリゴヌクレオチド
の製造法にも関する。 先行技術 生化学の領域で、生体高分子を純化することは重要な研
究課題の一つであって、従来より多くの研究者達により
種々検討が重ねられてきた。従って、この分野では、現
在、アフイニテイクロマトグラフイー技術ならびにポリ
アクリルアミドゲルを主体とすな電気泳動法が開発され
て賞用されるに至っている。 このうちアフイニテイクロマトグラフイーは、生体高分
子のもつ生物学的識別の原理、すなわち、特定の物質と
特異的に結合ないし相互作用する固有の性質をもつこと
、を巧妙に利用した方法であって、タンパク質、酵素は
もとより、核酸、脂質、ホルモン、ビタミン、レセプタ
ーなどあらゆる生体物質の精製、分離に広く活用されて
いる。とりわけ、核酸をリガンドとするアフイニテイク
ロマトグラフイーは、分子生物学的にも重要な核酸やタ
ンパク質の単離なはじめとして、今後も広く応用される
ことが予想される。また、効率的な単離のためにもリガ
ンドと担体との架橋方法の開発が望まれるところである
。 このような観点から、核酸を結合させた担体を用いるア
フイニテイクロマトグラフイーの中では、オリゴ(dT
)−セルロースまたはポリ(U)−アガロースカラムを
使って3′−末端にポリ(A)を含むRNAを単離する
という方法が、最も広(利用されている( J、 Bl
ochem、、 81 、941(1977) )。 しかしながら、ポリ(U) −、ポリ(dA)−セルロ
ースなどは、ヌクレオチドの塩基部分を臭化シアンなど
で活性化した担体と結合させる方法であるため、ヌクレ
オチドは多点で結合して安定であるという反面、親和活
性に必要な塩基部分が担体との結合に使われているので
吸着能が弱められるという難点がある( Eur、 J
、、Biochemo、虱、246(1972))。 また、オリ♂(dT)−セルロースなどは、ジシクロヘ
キシルカルゼイミド(以下DCCと記す)などを用いて
、担体の水酸基とオリゴヌクレオチドのリン酸基とを結
合させているといわれているが、非特異的な吸着を起こ
したり、吸着能に再現性を欠くという問題点がある。 以上のようなヌクレオチドのホモポリマーを固定化した
例以外に、天然から得られたDNAを固定化した例が二
、三あるが(J、Rlot、Chem、、252.57
89(1977) ) 、一定の長さで任意の塩基配列
をもつオリゴヌクレオチドを、特定の位置でのみ担体と
結合させてその固定化に成功したという例はかつて一件
も報告されていない。 これらの状況から、任意の塩基配列をもつオリゴヌクレ
オチドを特定の部位で担体と結合させることができれば
、その技術は固定化ヌクレオチドホモポリマーを利用し
たアフイニテイクロマトグラフイーによるmRNAの単
離精製ばかりでなく、特定な塩基配列をもつmRNAの
単離精製、さらには特異的塩基配列を認識する各種核酸
関連酵素類の精製、などにも利用できる可能性が考えら
れる。 なお、リガンドとしてモノまたはジ程度のヌクレオチド
を用いたアフイニテイ担体の研究も数多く行なわれ、そ
のうちい(つかのものは既に市販されている。しかし、
ヌクレオチドが直接またはスペーサを介して担体と結合
している部位は、はとんどその塩基部分である″)。一
方、ヌクレオチドをその塩基部分以外で結合させるもの
もあるがb)、原料リガンドの合成に手間がかかるうえ
、全合成にわたりめんどうであるという難点をかかえて
いる。また、いずれの方法もオリゴヌクレオチドに用い
ることはできない。 a) Arch、Bioehem、 131ophyg
、、塵、561(1974)、J、 Biochem、
、發、フ83(1978)、 特開昭52−25795
号、同53−101396号、同53’ −13328
3号および同55−36277号各公報。 b) J、 Chromatog、、97.33(19
74) 、 Biochem。 Blophys、Acta、 304.231(197
3)、Anal。 Biocheml、旦、471(1976)。 発明の概要 要旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、特定
のオリビデオキシリゼヌクレオチドのヌクレオチドの塩
基以外の特定部位に担体な結合させてなる固定化オリゴ
ヌクレオチドによってこの目的を達成しようとするもの
である。 従って、本発明による固定化オリゴヌクレオチドは、下
式〔■〕で示されるものであること、を特徴とするもの
である。 また、本発明による固定化オリザヌクレオチドの製造法
は、下式(Vl〕で示されるオリゴヌクレオチド誘導体
の末端アミン基とそのアミン基と結合可能な担体とを反
応させて式〔■〕で示される固定化オリゴヌクレオチド
を得ること、を特徴とするものである。 BOB 〔ただし、mおよびnはそれぞれ0または任意の自然数
であり、R1は二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基
であり、Bはヌクレオチドを構成する塩基である(R7
り″−複数個存在するときは、それらは同一でも異なっ
てもよい)。〕 効果 本発明者らの合成した固定化オリゴデオキシリゼヌクレ
オチドは、前記の核酸をリガンドとするアフイニテイク
ロマトグラフイーの短所を回避することができる。すな
わち、吸着活性を阻害する塩基部分での結合を避けたこ
とにより、この固定化オリゴデオキシリゼヌクレオチド
はすぐれた吸着能を有する。従って、従来のもの(オ+
) −! (dT)−セルロース、ポリ(U)−アガロ
ース等)よりも吸着能、再現性、選択性および耐久性に
すぐれた高品質のアフイニテイ用樹脂を得ることができ
る。 また、本発明者らの製造方法に従えば、従来困難であっ
た、特定の長さ、特定の配列をもつ固定化オリゴヌクレ
オチドを合成することができる。 本発明による固定化オリザヌクレオチドは、前記の式〔
■〕で示されるものである。 式中、記号上は、2′−デオキシリゼヌクレオシドの3
′−および5′−水酸基を除いたデオキシリゼヌクレオ
シド残基な示すのに慣用されているものであって、具体
的には下記のものである。 置換基Bはヌクレオチドを構成する塩基を示し、通常は
アデニン、チミン、シトシンまたはグアニンである。化
合物CM)中にBが複数個存在するときは、それらは同
一でも異なってもよいOmおよびnは、それぞれOまた
は自然数を示す。 本発明の固定化オリサヌクレオチPの重合度がm+nで
表示されているのは、本発明の好ましい製造方法で重合
度が各々mおよびnのフンクションを縮合させているこ
とによるものである(詳細後記)。その場合のmは実用
的にはOm6、特に1〜4、nは実用的には0〜40、
特に0〜20、である。 基R1は、化合物〔■〕の核酸部分と担体部分とを連結
する二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基である。こ
れは、特に炭素数2〜20程度の直鎖または分岐鎖のア
ルキレン基が適当である。好ましく・R1は、炭素数2
〜6のアルキレン基である。 化合物〔■〕の合成 一般的説明 化合物〔■〕、すなわち本発明による固定化オリゴヌク
レオチド、は合目的的な任意の方法によって合成するこ
とができる。 一つの好ましい方法は、前記の式CM)のオリゴヌクレ
オチド誘導体、すなわちオリビデオキシヌクレオチドの
5′−末端リン酸基に基R1を介して−級アミノ基が導
入されたもの、のアミノ基に担体な結合させることから
なるものである。 一方、式〔■〕の化合物は、オリゴヌクレオチドの合成
および生成オリゴヌクレオチドの5′−水酸基延長上で
のム級アミン基の導入からなる方法で合成す゛ることか
できる。 第1図は、この好ましい合成法の一例を示すフローチャ
ートである。フローチャート中の記号は、下記の意味を
持つ(その意義ないし詳細は、後記した通りである)。 ROIJン酸基を保護する置換基であって、通常オルト
クロロフェニル基が用いラレル。 R1二価の炭化水素残基である。 R25′−末端水酸基の保護基であって、通常ジメトキ
シトリチル基が用いられる。 R3他のすべての保護基が安定な条件で容易に脱離され
て、リン酸ジエステルを与えることができる置換基であ
って、通常シアンエチル基が用いられる。 R4アミノ基の保護基であって、通常トリフルオロアセ
チル基が用いられる。 q nより小さい任意の自然数。 mOまたは任意の自然数。 noおよび任意の自然数。 B 塩基を示す。 B′ 保設された塩基を示すが、通常はR6−ベンゾイ
ルアデニン、N−インブチリルグアニン、R6−ベンゾ
イルシトシンおよびチミン(すなわち、保護不要)より
選択される。 −一のスペーサーを介した担体であって、通常は下記の
ものである。 CH2NHCOCH2CH2− 化合物[[の合成 一般にオリゴヌクレオチド合成法としては、トリエステ
ル法、ホスファイト法およびそれぞれの固相法および液
相法がある。本発明者らは既に同相法によるオリゴヌク
レオチド製造技術を確立しており、化合物[Mlの合成
には本発明者らの下記の方法が好ましい。 Tetrahedron Letters 1979.
3635(1979)Nucleic Ac1ds R
e5earch 8’、5473 (1980)Nuc
leic AcidgI?、e!Iearch 8.5
491(1980)Nuclelc Ac1ds Re
5earch 8.5507(1980)Nuclel
c Ac1ds R85earch Symposiu
m 5eries 7 。 281(1980) また、上記で合成したオリゴヌクレオチドの5′−水酸
基にリン酸基を介して一級アミン基を導入除去したもの
と化合物CI〕の保護基R2を除去したものとを縮合さ
せ、これらの操作をくり返すことによつ℃、化合物〔■
〕を合成する。オリゴヌクレオチド化合物(Ill)の
合成法は、上記分備→公知である。 一方、式〔■〕の化合物の合成は、化合物CDのR2を
除去して5′−水酸基化合物とし、これにリン酸化剤(
たとえば、ホスホジトリアゾリド、ホスホジクロリドま
たはホスホジペンゾトリアゾリド等)を作用させてリン
酸化し、ついでアミノ基が保護されているアミノアルコ
ール化合物R2−N)1−R’−oI(cこの化合物は
オメガ−アミノアルコール(NH2R’ OR)のアミ
ノ基をR2で保護することにより得ることができる〕を
縮合させることにより、化合物〔■〕を得ることができ
る(詳細は後記実験例参照)。 この化合物1゛■〕の保護基R3を除去し、化合物し+
[〕の保保護基2を除去したものと縮合させて、化合物
〔■〕を合成する。縮合は、化合物〔m〕の合成の際の
縮合と本質的には変らない方法で行なうことができる。 このようにして合成された化合物〔v〕の保護基なすべ
て除去すれば、化合物〔■〕が得られる。保護基COA
■、リン酸トリエステル中のオルト−クロロフェニル基
および塩基部分のアシル基は、0.5Mのテトラメチル
グアニジン−ビリジン−2−カルゼアルドキシムのジオ
キサン−水(9:1゜(V/V) )溶液で処理後、ア
ルカリ処理(#アンモニア水)を行なうことより除去さ
れる。R4がトリフルオロアセチル基の場合は、アンモ
ニア処理により充分脱離されるが、オルトニトロフエ=
yスルフェニル基である場合はメルカプトエタノール処
理が必要で・ある。R4として他の保護基を用いた場合
は、オリゴヌクレオチド部分が安定な条件で、さらに別
の処理を加えることも可能である。 なお、デオキシオリサリセヌクレオチドの合成法は既に
各種のものが公知であって、保護基の種類およびその導
入ないし除去ならびに縮合その他について上記以外の詳
細は核酸の化学合成に関する放置や総説たとえば「ヌク
レオシド・ヌクレオチドの合成」(丸善1977年)、
「核酸有機化学」(化学同人1979年)、「核酸」
(朝食書店1979年)、Tetrahedron 、
34.3143(1978)、有合化、34.723
(1978)および化学の領域、33.566(197
9)等を参照することができる。 化合物〔■〕の合成 固定化オリゴデオキシリボヌクレオチド(化合物〔■〕
)は、上記化合物〔■〕の5′−末端延長上のることか
できる。担体としては、天然の不溶性担体として、アガ
ロース、デキストラン、セルロース、ガラス粒が、合成
ポリマーとしてポリアクリルアミド、等が考えられるが
、上記化合物と結合反応させやすいように、そのもの自
体でなくその誘導体が好ましい。アガロースの場合は、
その誘導体としてセファロース誘導体(ファルマシア社
)が数種市販されている。 両者の結合は、例えば担体がセファロース誘導体であれ
ばその誘導体中のカルゼキシル基と化合物[M〕のアミ
ン基との間の脱水によるアミド結合を実現することので
きる任意の方法によって行なうことができる。化合物〔
■〕中にセファロース誘導体のカルゼキシル基との反応
が可能なアミン基または水酸基が存在するときは、それ
らを適当に保肢した状態でこの反応を行なうことができ
る。 従って、本発明で[式[VI)で示されるオリゴヌクレ
オチド誘導体の末端アミン基に担体を結合させて式し■
〕で示される固定化オリゴヌクレオチドな得る」という
表現は、化合物[MTlがこのように保護されている場
合をも包含するものである。また、この表現は担体がそ
の機能的誘導体の形にある場合をも包含するものである
。 担体が化770ニスの場合は、セファロースの機能的訪
導0体の具体例としては、臭化シアン活性化セファロー
ス(ロ)、活性化CHセファロース(■)およびエポキ
シ化セファロース(■)等がある。またセファロースの
その他の誘導体としては、CH−セファロース(■)お
よびAH−セファロース(■)等がある(この場合は化
合物〔■〕との反応に際して縮合剤(例えばDCC)が
必要である)。結合させるべき化合物CM)の5′−末
端延長上の一級アミン基とのみ選択的に反応し、なおか
つ縮合剤のいらいいことから考えて、活性化CH−セフ
ァ o −スl:r’h最も好ましい(これらの詳細は
下記参照)。 縮合反応は合目的的な任意のものであり、所与の反応系
に対する具体的な反応方法は放置や文献(アフイニテイ
クロマトグラフイー、EII!IevierSelen
tific Pub、 Co、Amsterdam (
1978)% Agric。 Blot、Chemo、37.465(1973)、1
bid、 37.1191(1973)、1bld 、
郡、409(1976) 、蛋白質・核酸・酵素(別冊
) ff122 (1980) ) および後記実■
セファロース−〇−CH2−CH−CH2−0−H ■ セファロースーN)I(CH2)5−COOH■
セファロース−NH(CH2)5−NH2結合量および
吸着能の検定 化合物1]■〕と担体(ここではセファロース)との結
合量は、担体1rn9あたり結合した化合物CM)の量
、門たは吸着物質としてトリデカアゾニル酸(HOA1
3) またはトリデカチミジル酸(HOT 13)を用
いて吸着した量をOD年単位示すことにする。 また、本発明により合成された化合物〔■〕と従来方法
で合成された担体〔オリゴ(aT)−セルロースまたは
オリゴ(dA)−セルロース(共に市販品)〕との吸着
能を比較するため、市販品についても化合物〔■〕と同
様の吸着実験を行なった。 一方、化合物[■]の生成を確認(結合部を求める)す
るのと同様に、第2図のフローチャートで〔■〕に相当
するトリデカアデニル酸(HOA13)、トリデカチミ
ジル酸(HOT 13)等による5′−水酸基化合物と
担体との結合を調べた。このことは、化合物〔■〕と担
体との結合位置を確定するために重要なことである。 従って、化合物〔■]を製造後、吸着能および結合部位
の検定を行なった。なお、HOA13、HOT13等の
製造は、化合物〔■〕を合成する際に用いた化合物シ■
〕の保護基をすべて除去することによって行なわれる。 第2図のフローチャートに従って、本発明化合、 物
(同図の化合物■)を製造した。 第2図で、記号は次の意味を持つ。 B′ ベンゾイル化アデニン B アデニン DMTr )メトキシトリチル CIL2 NHCOCH2CH2− ROオルトクロロフェニル Et エチル CE −シアノエチル 2 一一去 12 化合物(■〕(第2図の、■)の合成 実験1−1 ジメトキシトリチルアデノシン/樹脂〔■〕(樹脂は担
体に過ぎないが 樹脂に担持された目的化合物は外観的
には樹脂そのものと変らないので、樹脂に担持された当
該化合物を以下において単に樹脂と呼ぶことにする)
300 mg(0,033mmol )をインプロパノ
−ルー塩化メチレン(15: 85、V/V )溶液1
0m1で3回洗浄後、臭化亜鉛ノ1.0Mのイソプロノ
にノール−塩化メチレン溶液8mlで5分間ずつ4回反
応(脱トリチル化)させて樹脂〔■〕を得る。樹脂〔■
〕をイソプロノミノール−塩化メチレン溶液10m1で
3回洗浄し、これにジヌクレオチド〔■’:l 150
mg (0,1mmol)のピリジン溶液を添加後、共
沸させて系を無水とし、メシチレンスルホニルニトロト
リアゾリド(以下MSNTと記す) 150mg (0
,5m mol )と無水ピリジン2ml とを添加
して90分間反応(縮合)させる。反応後、ビリ・ジン
10m1で3回洗浄し、触媒量(約10mg)のジメチ
ルアミノピリジン(以下DMAP )を含む無水酢酸−
ビリジ7(1:9、(V/V))溶液10m1を添加し
10分間反応させて未反応5′−水酸基をアセチル化し
て保護し、これを2リジンで洗浄して、化合物〔■’]
(n=2) を得る。以上のような操作を6回くり返
して、化合物〔■](n=12)を得る。 一方、5′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔■〕800
mg (0,71m mol )とオルトクロロフェ
ニルホスホジトリアゾリドとを後者のジオキサン溶液(
1,0mmol、 6ml ) 中で2時間反応させ
、続いてトリフルオロアセチル−6−アミンヘキサノー
ル300 mg (t4 m mol )および1−メ
チル−イミダゾール115 mg (1,4m mol
)を加えてさらに2時間反応させる。反応終了後、溶
媒を留去し、残渣をクロロホルムに溶解した後、水、0
.5Mリン酸二水素す) IJウム水溶液、飽和炭酸水
素ナトリウム水溶液および5チの塩化す) IJウム水
溶液でそれぞれ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する
。クロロホルム層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製(
溶出液として0〜4%のメタノール含有クロロホルムを
使用)シ、溶出液を濃縮後ペンタン中に滴下し粉末状の
化合物〔■〕を得る。 上記で合成した化合物[■] (n =12 ) 11
1mg 、 ”(3,45μmol)を前述と同様の方
法で脱トリチル化したもの〔■〕に、化合物〔■160
mg (0,04m mol )をトリエチルアミン
−ピリジン−水(l:llv、’v )溶液3ml で
処理(脱シアンエチル化)した化合物〔■〕を加え、無
水にしたのち、MSNT50mg(0,2mmol)お
よびピリジン1mlを加え90分間反応(縮合)させ、
反応終了後ぎりジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥し
て、完全に保護されたオリゴヌクレオデド誘導体〔■〕
ヲ得ル。 オリゴヌクレオチド誘導体[■]1.5 mgを0.5
Mテトラメチルグアニジン−ピリジン−2−カルゼア
ルドキシメイトの・ジオキサン−水(9;1、V/V
)溶液200μm を加え、遠沈管中、室温でu時間反
応させる。反応後、濃アンモニア水(2,5m1)を加
えて密閉し、50℃で一夜反応させる。反応終了後、許
過し、涙液を濃縮後、水に溶解させてからエーテルで抽
出を行なう。水層な濃縮後、セファデックスG−50(
φ1゜5 X 120 cm、溶出液ハ0.05M の
M炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液pH7,5)で脱
塩精製しペンタデカアデニル酸誘導体〔[F]〕を得た
。 また同様の方法で実験1−2.1−3.1−4.1−5
および1−6のオリゴヌクレオチド誘導体を得た。実験
例1−1〜1−6の化合物の塩基配列その他を第1表に
示す。 ただし、この表で人はアデニン、Tはチミン、Gはグア
ニン、Cはシトシンを示す。 なお、実験例1−1.1−2および1−3についてのセ
ファデックスおよび高速液体クロマトグラフィーの結果
を第3〜4.5〜6および7〜8図に示す。これらの結
果より、化合物〔■〕が生成していることがわかる。 固定化オリゴヌクレオチド〔■〕の製造実施例 臭化シアン活性化セファロース4B(40mg)を1
mM−塩酸で洗浄し、さらに0.5M塩化ナトリウム−
〇、I Ml炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH8,3)
で洗浄後、化合物〔■〕(実験例1−1;4、OOD量
)の0.5M塩化ナトリウム−0,1M、炭酸水系ナト
リウム緩衝液(pH8,3) 200μlを加え、振盪
しながら室温で一夜反応させる。反応後沖過し、樹脂を
10mM)!Jス塩酸緩衝液(pH7,5)および0.
5 mM塩化ナトリウム、10mM )リス塩酸緩衝液
(pH7,5)で洗浄して、樹脂〔■〕を得る。 イ)吸着能の検討 樹脂〔■Tl ’A) mg を用い、合成トリデカチ
ミジル酸(実験例1−2を製造する際に用いた化合物〔
■〕の3′−末端保瞳基を除去した〔@〕に相当する化
合物)“を試料として、アフイニテイクロマトグラフイ
ーを行なった。このときの溶出ノぞターンを第9図に示
す。 口)結合部位の検定 上記で製造した樹脂〔■〕のかわりに、トリデカアデニ
ル酸(実験例1−1を合成する際に用いた化合物1■〕
の3′−末端保獲基を除去した〔■〕に相当する化合物
1.以下HOA13とする)の粗精製物を用いて、イ)
と同様にトリデカチミジル酸を試料としてアフイニテイ
クロマトグラフイーを行なった。 このときの溶出パターンを第10図に示す。 ハ)結果の解析 第9図の場合は、累通り画分が殆どなく、溶出溶媒をか
えることにより物質の浴出がみられた。 第10図では供試試料は殆ど素通りしており、溶媒をか
えても物質の溶出がみられなかった。 従って、樹脂〔■〕は、アデニン部分(塩基部分)のア
ミン基がセファロースとオリゴヌクレオチド誘導体との
結合に関与しておらず、オリゴヌクレオチド誘導体の5
1−末端延長上のアミン基のみが選択的にセファロース
と結合しているものであるといえる。またこの結果から
樹脂〔■〕はHOA 13と特異的に結合しているので
アフイニテイ樹脂として用いることができるといえる。 実施例 活性化CI■−セファロース4B(30mg)を1 m
M塩酸で洗浄する。樹脂を0.5Mの塩化ナトリウム−
01Mの炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH8,3)で洗
浄したのち、化合物(実験例1−1 : 4.00D量
)の0.5Mの塩化ナトリウム−0,1Mの炭酸水素ナ
トリウム緩衝液(pH8,3)160μl を加えて、
振盪しながら室温で3時間反応させる。 反応波濾過し、樹脂を10 mMのトリス塩酸緩衝液(
pH7,5)および0.5Mの塩化ナトリウム−10m
Mのトリス塩酸緩衝液(pH7,5)で洗浄して、樹脂
〔■〕を得る。 イ)吸着能の検討、および口)結合部位の検定は上記実
験例2−1と同様にトリデカチミジル酸を用いて行った
。その際のアフィニティークロマトグラフィーの溶出、
eターンを第11および12図に示した。 ハ)結果の解析 実験例2−1と同様の結果が得られている。ただし、素
通り画分で物質HOT 13が溶出している(第11図
)のは、試料の添加液が多過ぎたため吸着しきれずに溶
出したものと考えられた。 従って、この実験例で製造した樹脂でも、塩基部分のア
ミン基でな(てオリザヌクレオチドの5′−末端延長上
のアミン基がセファロースとの結合反応に選択的に関与
しているということができ、またこの樹脂はアフイニテ
イ樹脂として用いることができるといえる。 実施例 樹脂の製造は臭化シアン活性化セファロース4 B (
30mg)と化合物(実験例1−2 : 3゜43 O
Dml)とを用い、上記実験例と同様の操作で行なつた
。ところで、この操作に際して、内部標準物質としてト
リデカチミジル酸(HOT13)を添加した。 というのはHOT 13は反応性がなく(塩基部分にア
ミノ基をもたない)、臭化シアン活性化セファロースと
も反応せずかつ高速液体クロマトグラフィーでの分析を
容易にするためである。そのときの結果を第13図に示
した。A)はHOT 13と化合物1−2との混合物の
ものであり、B)はセファロースと化合物1−2との結
合反応後のものである。 第13図のA)およびB)を比較しても、セファロース
と化合物1−2とが反応していることがわかるが、OD
の収支からもこのように推察される。ODの収支を第2
表にまとめた。 第2表 イ)結合量の検討は上記実験例と同様の操作で行なった
。 口)吸着能の検定 ウンデカデオキシアデニル酸(以下dA11とする)の
粗精製物で56チの不純物を含むものを用いてアフイニ
ナイクロマトグラフイーな行なう。 粗dA11 (0,550Dすなわち0.240Dに相
当)を用いた結果、非吸着部分が0.340D、吸着部
分が0.230Dとなった。この際の吸着部分の高速液
体クロマトグラフィーを行なった結果、単一ピークを得
た(w、14図)。また、非吸着部分の高速液体クロマ
トグラフィーを行なった結果、物質のピークが得られな
かった(第15図)ので、この部分はdAllを含んで
いないと考えられる。従って、ここで製造した樹脂はd
Allと親和性をもち、セファロースとオリゴヌクレオ
チドの5′−末端アミノ基とのみが選択的に反応してい
ることがわかる。 実験例2−4〜2−8 これらの実験例については、実験例2−3と同様の操作
を行なった。その除用いた担体とオリゴヌクレオチド誘
導体を第3表にまとめた。 第3表 a:活性化CH−セファtff−7;4Bb=臭化シア
ン活性化−セファロース4B比較例 現在市販されている下記のものと、本発明者らの製造し
たものとの吸着能を比較するために下記の試料を用いて
吸着能の検定を行なった。 ■:オリザ(dA)−セルロース (P−L Biochemicals Lot No、
115577)■:オリザ(dT)−セルロース (P−L Biochemieals Lot No、
675130)比較例−1 樹脂■(20mg) を0.5M、塩化ナトリウム−
10mM )リス塩酸緩衝液(pH7,5)で膨潤さ
せたのち、カラムに充填し1.10 mMのトリス塩酸
緩衝液(pH7,”+ 、)および0.5Mの塩化ナト
リウム−10m’Mのトリス塩酸緩衝液(pH7,5)
で洗浄する。このカラムにトリデカチミジル酸(HOT
13)をかけ℃吸着能の検定を行なった。なお、溶離
液は10mMのトリス塩酸緩衝液(pI(7,5)を用
いた。 この樹脂を用いて計3回カラムクロマトグラフィーを行
なった。すなわち、1回目はHOT 13(1,330
D M’c )を2.1 ml かけたが殆ど吸着され
ず、このときの溶出液を回収して再度カラムにかけた(
2回目)。3回目はカラムを作成しなおして上記と同様
の実験を行なった。そのときの溶出パターンを第16図
に示した。この結果から、HOT13は殆ど吸着されて
いないことがわかる。 比較例−2 樹脂■を用いて上記例−1と同様の吸着実験を行なった
。なお、カラムの供試試料としても上記と同様HOA
13を用いた。カラムクロマドグ2フイーを5回行なっ
たが、そのときの溶出パターンを第17図に示し、吸着
能を第4表に示した。 第4表 これらの結果から、樹脂■では素通り画分が多く、吸着
能も一番よいのが0.0370D/mgであった。また
、検体の量または濃度の違いにより、あるいは吸着、お
よび溶出を繰り返すごとに吸着能が変化することにより
、再現性のある結果が得られない。 以上の実験例および比較例から、本発明の7フイニテイ
樹脂としての能力を、吸着能および結合量の点から市販
品と比較したものの一覧表を第5表に示した。 第5表 *1=塩基配列5′GGGAAGCTTCCC3’のオ
リゴヌクレオチド リボヌクレオチド 5′ *3=塩基配列 ACTGCGTTAGTCGA3’の
オリゴヌクレオチP *4=測定不能は、樹脂の自己相補性のためカラムに吸
着されなかったためである。 結果のまとめ 以上の結果から総合判断すると、本発明の樹脂〔■〕は
、支持体であるセファロース誘導体との結合がオリゴヌ
クレオチド銹導体の5′−末端延長上の一級アミン基の
みが関与して生成したものであるといえる。また、この
樹脂〔■〕は、アンイニテイ樹脂として用いることがで
きる。そしてまた、結合壁および吸着能の比較から、本
発明の方法によれば合成可能ないかなる塩基配列をもつ
オリゴヌクレオチドをも支持体に結合させることができ
、非常に良質のアフイニテイ樹脂が合成できるといえる
。 4、図面の簡単な説明 第1図は、本発明の化合物を合成する方法の一例を示す
フローチャートである。 第2図は、実験例で示した本化合物のフローチャートで
ある。 第3、;5および7図は、化合物〔V〕(それぞれ実験
例1−1.1−2および1−4)についてのセファデッ
クスG−50での溶出、eターンを示したものである。 第4.6および8図は、化合物〔■〕(それぞれ実験例
1−1.1−2および1−4)についての高速液体クロ
マトグラフィーの溶出、eターンを示したものである。 第9および10図は、実験例2−1で合成した樹脂およ
びその比較としてHOA13を用いて各々アフイニテイ
クロマトグラフイーを行なったときの溶出Aターンを示
したものである。 第11および12図は、実験例2−2で合成した樹脂お
よびその比較としてHOT 13を用いて各々アフイニ
テイクロマトグラフイーな行なったときの浴出/Rター
ンを示したものである。 第13図は、実験例2−3での高速液体クロマトグラフ
ィーの結果である。Aは化合物1−2とセファロース誘
導体との反応前の、Bは反応後の、溶出パターンをそれ
ぞれ示したものである。 第14図は実験例2−3で合成した樹脂を用いてアフイ
ニテイクロマトグラフイーを行なったときのカラム吸着
部分の高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンであ
り、第15図は非吸着部分の高速液体クロマトグラフィ
ーの結果である。 第】6図は市販の樹脂(■)を用いた際のアフィニテイ
クロマトグラフイーの浴出パターンであって、A、I3
およびCはそれぞれ1回目、2回目および3回目の結果
である。 第17図は市販の樹脂(■)を用いた際のアフイニテイ
クロマトグラフイーの溶出ノぞターンであって、A、B
、C,DおよびEはそれぞれ1回目〜5回目までの結果
である。 なお、弗9〜12図および第16〜17図の横軸欄外の
記号AおよびBは溶出液の添加時期を示し、A〜Bでは
主に洗浄をし、Bで溶出液をかえて物質の溶出を試みた
ことを示すものである。 出願人代理人 猪 股 清 児3図 方 画 数 范4図 保1子時間(労) 第5図 力 画 数 尾6図 イ5唾 特 8岬F 間 (5)) 鬼7図 分 画 数 保持時間彷) 南11図 児12図 分画I! 分画数 為14図 保持時間4分) 鬼15図 保持時間(2) 帛17図 (A) (B)
(C)方向数 方向数 方向数 (D) (E) 方向数 分画数
である。 第2.4.5および6図は、セファデックスヵラムクロ
マトダラム金示すものである。 第3.7.8.9.14.16.17および18図は、
イスレモHPLCノリーンを示すものである。 第10.11.12.13.15.11719および加
図は、いずれもアフィニティ担体にょるカラムクロマト
グラムを示すものである。 a) セファディクスG−50カラムによる精製条件カ
ラム:セファデックスG−50 カラムゼリューム: 1.5 Cm X 120 c
rn溶出液: 50 mM TEABM衝液、jiH7
,5分画量:35滴/分画 b) HPLCによる分析条件 カラム: μm Bondapak C18(Wate
rs )溶出液: CH3CN in O,02M E
DAA緩衝液(pH7,8)勾 起上図中に示す 流速:2m11分 チャートスf−ド:10龍/分 温度:50℃ C) アフイニテイクロマトカラムによる検定条件洗浄
液: 0.5 M NaC1、10mM Tris−H
CI (pH7,5)溶出液: 10 mM Tris
−HCI (pH7,5)分画量:15滴(350μl
) 生検体のアプライtAで、溶出開始?Bで示す。 出願人代理人 猪 股 清 第1図 第4図 会画数 第5図 分 画 数 莞6図 分画数 ¥7図 原符時間(8) 第8図 イ珂(持 Bデt 間 (4)第9図 イ米 才寺 時 間 1分)第1
0区 第11図 分画数 分画数 第12図 第13図 分画数 分画数 第16閃 保持時間(分) 第17図 保 持 8寺 間 (イとト)第19
図 (A) (B)(OD)
(OD)分画数
分画数 (C) 分画数 第20図 (A) CB) (C)(
D) 、 (E) 手続補正書 1.事件の表示 昭和57年!11許願第138136号2、発明の名称 固定化オリゴヌクレオチドおよび その製造法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 湧水製薬株式会社 するO 明 細 書 1、発明の名称 固定化オリゴヌクレオチドおよびそ
の製造法 2、特許請求の範囲 1、下式〔■〕で示されるものであることを特徴とする
、固定化オリゴヌクレオチド。 〔ただし、mお↓びnはそれぞれ0または任意の自然数
であり、Rは二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基で
あり、Bはヌクレオチドを構成する塩基である(Bが複
数個存在するときは、それらは同一でも異なってもよい
)。〕2、塩基Bがアデニン、チミン、シ小シンおよび
グアニンからなる群より選ばれたものである、特許請求
の範囲第1項記載の固定化オリサヌクレオチド。 3、R1が炭素数2〜旬の直鎖または分岐鎖のアルキレ
ン基である、特許請求の範囲第1項または第2項記載の
固定化オリゴヌクレオチド。 4、 mが0または6までの自然数、nがOまたは40
までの自然数である、特許請求の範囲第1〜\ 3項のいずれか1項に記載の固定化オリゴヌクレオチド
。 5、担体がセファロースである、特許請求の範囲第1〜
4項のいずれか1項に記載の固定化オリゴヌクレオチド
。 6、セファロースが活性化上ファロースである、特許請
求の範囲第5項に記載の固定化オリゴヌクレオチド。 7、下式CM)で示されるオリゴヌクレオチド誘導体の
末端アミノ基とそのアミノ基と結合可能な担体とを反応
させて式〔■〕で示される固定化オリゴヌクレオチドを
得ること、を特徴とする化合物〔■〕の製造法。 〔ただし、mおよびnはそれぞれOまたは任意の自然数
であり、R1は二価の直鎖または分岐鎖′の炭化水素残
基であり、Bはヌクレオチドを構成する塩基である(B
が複数個存在するときは、それらは同一でも異なっても
よい)。〕3、発明の詳細な説明 発明の背景 技術分野 本発明は、一般に、固定化オリゴヌクレオチドに関する
。さらに具体的には、本発明は、ヌクレオチドの塩基以
外の部分に担体を結合させてなる固定化オリゴヌクレオ
チドに関する。 本発明は、また、このような固定化オリゴヌクレオチド
の製造法にも関する。 先行技術 生化学の領域で、生体高分子を純化することは重要な研
究課題の一つであって、従来より多くの研究者達により
種々検討が重ねられてきた。従って、この分野では、現
在、アフイニテイクロマトグラフイー技術ならびにポリ
アクリルアミドゲルを主体とすな電気泳動法が開発され
て賞用されるに至っている。 このうちアフイニテイクロマトグラフイーは、生体高分
子のもつ生物学的識別の原理、すなわち、特定の物質と
特異的に結合ないし相互作用する固有の性質をもつこと
、を巧妙に利用した方法であって、タンパク質、酵素は
もとより、核酸、脂質、ホルモン、ビタミン、レセプタ
ーなどあらゆる生体物質の精製、分離に広く活用されて
いる。とりわけ、核酸をリガンドとするアフイニテイク
ロマトグラフイーは、分子生物学的にも重要な核酸やタ
ンパク質の単離なはじめとして、今後も広く応用される
ことが予想される。また、効率的な単離のためにもリガ
ンドと担体との架橋方法の開発が望まれるところである
。 このような観点から、核酸を結合させた担体を用いるア
フイニテイクロマトグラフイーの中では、オリゴ(dT
)−セルロースまたはポリ(U)−アガロースカラムを
使って3′−末端にポリ(A)を含むRNAを単離する
という方法が、最も広(利用されている( J、 Bl
ochem、、 81 、941(1977) )。 しかしながら、ポリ(U) −、ポリ(dA)−セルロ
ースなどは、ヌクレオチドの塩基部分を臭化シアンなど
で活性化した担体と結合させる方法であるため、ヌクレ
オチドは多点で結合して安定であるという反面、親和活
性に必要な塩基部分が担体との結合に使われているので
吸着能が弱められるという難点がある( Eur、 J
、、Biochemo、虱、246(1972))。 また、オリ♂(dT)−セルロースなどは、ジシクロヘ
キシルカルゼイミド(以下DCCと記す)などを用いて
、担体の水酸基とオリゴヌクレオチドのリン酸基とを結
合させているといわれているが、非特異的な吸着を起こ
したり、吸着能に再現性を欠くという問題点がある。 以上のようなヌクレオチドのホモポリマーを固定化した
例以外に、天然から得られたDNAを固定化した例が二
、三あるが(J、Rlot、Chem、、252.57
89(1977) ) 、一定の長さで任意の塩基配列
をもつオリゴヌクレオチドを、特定の位置でのみ担体と
結合させてその固定化に成功したという例はかつて一件
も報告されていない。 これらの状況から、任意の塩基配列をもつオリゴヌクレ
オチドを特定の部位で担体と結合させることができれば
、その技術は固定化ヌクレオチドホモポリマーを利用し
たアフイニテイクロマトグラフイーによるmRNAの単
離精製ばかりでなく、特定な塩基配列をもつmRNAの
単離精製、さらには特異的塩基配列を認識する各種核酸
関連酵素類の精製、などにも利用できる可能性が考えら
れる。 なお、リガンドとしてモノまたはジ程度のヌクレオチド
を用いたアフイニテイ担体の研究も数多く行なわれ、そ
のうちい(つかのものは既に市販されている。しかし、
ヌクレオチドが直接またはスペーサを介して担体と結合
している部位は、はとんどその塩基部分である″)。一
方、ヌクレオチドをその塩基部分以外で結合させるもの
もあるがb)、原料リガンドの合成に手間がかかるうえ
、全合成にわたりめんどうであるという難点をかかえて
いる。また、いずれの方法もオリゴヌクレオチドに用い
ることはできない。 a) Arch、Bioehem、 131ophyg
、、塵、561(1974)、J、 Biochem、
、發、フ83(1978)、 特開昭52−25795
号、同53−101396号、同53’ −13328
3号および同55−36277号各公報。 b) J、 Chromatog、、97.33(19
74) 、 Biochem。 Blophys、Acta、 304.231(197
3)、Anal。 Biocheml、旦、471(1976)。 発明の概要 要旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、特定
のオリビデオキシリゼヌクレオチドのヌクレオチドの塩
基以外の特定部位に担体な結合させてなる固定化オリゴ
ヌクレオチドによってこの目的を達成しようとするもの
である。 従って、本発明による固定化オリゴヌクレオチドは、下
式〔■〕で示されるものであること、を特徴とするもの
である。 また、本発明による固定化オリザヌクレオチドの製造法
は、下式(Vl〕で示されるオリゴヌクレオチド誘導体
の末端アミン基とそのアミン基と結合可能な担体とを反
応させて式〔■〕で示される固定化オリゴヌクレオチド
を得ること、を特徴とするものである。 BOB 〔ただし、mおよびnはそれぞれ0または任意の自然数
であり、R1は二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基
であり、Bはヌクレオチドを構成する塩基である(R7
り″−複数個存在するときは、それらは同一でも異なっ
てもよい)。〕 効果 本発明者らの合成した固定化オリゴデオキシリゼヌクレ
オチドは、前記の核酸をリガンドとするアフイニテイク
ロマトグラフイーの短所を回避することができる。すな
わち、吸着活性を阻害する塩基部分での結合を避けたこ
とにより、この固定化オリゴデオキシリゼヌクレオチド
はすぐれた吸着能を有する。従って、従来のもの(オ+
) −! (dT)−セルロース、ポリ(U)−アガロ
ース等)よりも吸着能、再現性、選択性および耐久性に
すぐれた高品質のアフイニテイ用樹脂を得ることができ
る。 また、本発明者らの製造方法に従えば、従来困難であっ
た、特定の長さ、特定の配列をもつ固定化オリゴヌクレ
オチドを合成することができる。 本発明による固定化オリザヌクレオチドは、前記の式〔
■〕で示されるものである。 式中、記号上は、2′−デオキシリゼヌクレオシドの3
′−および5′−水酸基を除いたデオキシリゼヌクレオ
シド残基な示すのに慣用されているものであって、具体
的には下記のものである。 置換基Bはヌクレオチドを構成する塩基を示し、通常は
アデニン、チミン、シトシンまたはグアニンである。化
合物CM)中にBが複数個存在するときは、それらは同
一でも異なってもよいOmおよびnは、それぞれOまた
は自然数を示す。 本発明の固定化オリサヌクレオチPの重合度がm+nで
表示されているのは、本発明の好ましい製造方法で重合
度が各々mおよびnのフンクションを縮合させているこ
とによるものである(詳細後記)。その場合のmは実用
的にはOm6、特に1〜4、nは実用的には0〜40、
特に0〜20、である。 基R1は、化合物〔■〕の核酸部分と担体部分とを連結
する二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基である。こ
れは、特に炭素数2〜20程度の直鎖または分岐鎖のア
ルキレン基が適当である。好ましく・R1は、炭素数2
〜6のアルキレン基である。 化合物〔■〕の合成 一般的説明 化合物〔■〕、すなわち本発明による固定化オリゴヌク
レオチド、は合目的的な任意の方法によって合成するこ
とができる。 一つの好ましい方法は、前記の式CM)のオリゴヌクレ
オチド誘導体、すなわちオリビデオキシヌクレオチドの
5′−末端リン酸基に基R1を介して−級アミノ基が導
入されたもの、のアミノ基に担体な結合させることから
なるものである。 一方、式〔■〕の化合物は、オリゴヌクレオチドの合成
および生成オリゴヌクレオチドの5′−水酸基延長上で
のム級アミン基の導入からなる方法で合成す゛ることか
できる。 第1図は、この好ましい合成法の一例を示すフローチャ
ートである。フローチャート中の記号は、下記の意味を
持つ(その意義ないし詳細は、後記した通りである)。 ROIJン酸基を保護する置換基であって、通常オルト
クロロフェニル基が用いラレル。 R1二価の炭化水素残基である。 R25′−末端水酸基の保護基であって、通常ジメトキ
シトリチル基が用いられる。 R3他のすべての保護基が安定な条件で容易に脱離され
て、リン酸ジエステルを与えることができる置換基であ
って、通常シアンエチル基が用いられる。 R4アミノ基の保護基であって、通常トリフルオロアセ
チル基が用いられる。 q nより小さい任意の自然数。 mOまたは任意の自然数。 noおよび任意の自然数。 B 塩基を示す。 B′ 保設された塩基を示すが、通常はR6−ベンゾイ
ルアデニン、N−インブチリルグアニン、R6−ベンゾ
イルシトシンおよびチミン(すなわち、保護不要)より
選択される。 −一のスペーサーを介した担体であって、通常は下記の
ものである。 CH2NHCOCH2CH2− 化合物[[の合成 一般にオリゴヌクレオチド合成法としては、トリエステ
ル法、ホスファイト法およびそれぞれの固相法および液
相法がある。本発明者らは既に同相法によるオリゴヌク
レオチド製造技術を確立しており、化合物[Mlの合成
には本発明者らの下記の方法が好ましい。 Tetrahedron Letters 1979.
3635(1979)Nucleic Ac1ds R
e5earch 8’、5473 (1980)Nuc
leic AcidgI?、e!Iearch 8.5
491(1980)Nuclelc Ac1ds Re
5earch 8.5507(1980)Nuclel
c Ac1ds R85earch Symposiu
m 5eries 7 。 281(1980) また、上記で合成したオリゴヌクレオチドの5′−水酸
基にリン酸基を介して一級アミン基を導入除去したもの
と化合物CI〕の保護基R2を除去したものとを縮合さ
せ、これらの操作をくり返すことによつ℃、化合物〔■
〕を合成する。オリゴヌクレオチド化合物(Ill)の
合成法は、上記分備→公知である。 一方、式〔■〕の化合物の合成は、化合物CDのR2を
除去して5′−水酸基化合物とし、これにリン酸化剤(
たとえば、ホスホジトリアゾリド、ホスホジクロリドま
たはホスホジペンゾトリアゾリド等)を作用させてリン
酸化し、ついでアミノ基が保護されているアミノアルコ
ール化合物R2−N)1−R’−oI(cこの化合物は
オメガ−アミノアルコール(NH2R’ OR)のアミ
ノ基をR2で保護することにより得ることができる〕を
縮合させることにより、化合物〔■〕を得ることができ
る(詳細は後記実験例参照)。 この化合物1゛■〕の保護基R3を除去し、化合物し+
[〕の保保護基2を除去したものと縮合させて、化合物
〔■〕を合成する。縮合は、化合物〔m〕の合成の際の
縮合と本質的には変らない方法で行なうことができる。 このようにして合成された化合物〔v〕の保護基なすべ
て除去すれば、化合物〔■〕が得られる。保護基COA
■、リン酸トリエステル中のオルト−クロロフェニル基
および塩基部分のアシル基は、0.5Mのテトラメチル
グアニジン−ビリジン−2−カルゼアルドキシムのジオ
キサン−水(9:1゜(V/V) )溶液で処理後、ア
ルカリ処理(#アンモニア水)を行なうことより除去さ
れる。R4がトリフルオロアセチル基の場合は、アンモ
ニア処理により充分脱離されるが、オルトニトロフエ=
yスルフェニル基である場合はメルカプトエタノール処
理が必要で・ある。R4として他の保護基を用いた場合
は、オリゴヌクレオチド部分が安定な条件で、さらに別
の処理を加えることも可能である。 なお、デオキシオリサリセヌクレオチドの合成法は既に
各種のものが公知であって、保護基の種類およびその導
入ないし除去ならびに縮合その他について上記以外の詳
細は核酸の化学合成に関する放置や総説たとえば「ヌク
レオシド・ヌクレオチドの合成」(丸善1977年)、
「核酸有機化学」(化学同人1979年)、「核酸」
(朝食書店1979年)、Tetrahedron 、
34.3143(1978)、有合化、34.723
(1978)および化学の領域、33.566(197
9)等を参照することができる。 化合物〔■〕の合成 固定化オリゴデオキシリボヌクレオチド(化合物〔■〕
)は、上記化合物〔■〕の5′−末端延長上のることか
できる。担体としては、天然の不溶性担体として、アガ
ロース、デキストラン、セルロース、ガラス粒が、合成
ポリマーとしてポリアクリルアミド、等が考えられるが
、上記化合物と結合反応させやすいように、そのもの自
体でなくその誘導体が好ましい。アガロースの場合は、
その誘導体としてセファロース誘導体(ファルマシア社
)が数種市販されている。 両者の結合は、例えば担体がセファロース誘導体であれ
ばその誘導体中のカルゼキシル基と化合物[M〕のアミ
ン基との間の脱水によるアミド結合を実現することので
きる任意の方法によって行なうことができる。化合物〔
■〕中にセファロース誘導体のカルゼキシル基との反応
が可能なアミン基または水酸基が存在するときは、それ
らを適当に保肢した状態でこの反応を行なうことができ
る。 従って、本発明で[式[VI)で示されるオリゴヌクレ
オチド誘導体の末端アミン基に担体を結合させて式し■
〕で示される固定化オリゴヌクレオチドな得る」という
表現は、化合物[MTlがこのように保護されている場
合をも包含するものである。また、この表現は担体がそ
の機能的誘導体の形にある場合をも包含するものである
。 担体が化770ニスの場合は、セファロースの機能的訪
導0体の具体例としては、臭化シアン活性化セファロー
ス(ロ)、活性化CHセファロース(■)およびエポキ
シ化セファロース(■)等がある。またセファロースの
その他の誘導体としては、CH−セファロース(■)お
よびAH−セファロース(■)等がある(この場合は化
合物〔■〕との反応に際して縮合剤(例えばDCC)が
必要である)。結合させるべき化合物CM)の5′−末
端延長上の一級アミン基とのみ選択的に反応し、なおか
つ縮合剤のいらいいことから考えて、活性化CH−セフ
ァ o −スl:r’h最も好ましい(これらの詳細は
下記参照)。 縮合反応は合目的的な任意のものであり、所与の反応系
に対する具体的な反応方法は放置や文献(アフイニテイ
クロマトグラフイー、EII!IevierSelen
tific Pub、 Co、Amsterdam (
1978)% Agric。 Blot、Chemo、37.465(1973)、1
bid、 37.1191(1973)、1bld 、
郡、409(1976) 、蛋白質・核酸・酵素(別冊
) ff122 (1980) ) および後記実■
セファロース−〇−CH2−CH−CH2−0−H ■ セファロースーN)I(CH2)5−COOH■
セファロース−NH(CH2)5−NH2結合量および
吸着能の検定 化合物1]■〕と担体(ここではセファロース)との結
合量は、担体1rn9あたり結合した化合物CM)の量
、門たは吸着物質としてトリデカアゾニル酸(HOA1
3) またはトリデカチミジル酸(HOT 13)を用
いて吸着した量をOD年単位示すことにする。 また、本発明により合成された化合物〔■〕と従来方法
で合成された担体〔オリゴ(aT)−セルロースまたは
オリゴ(dA)−セルロース(共に市販品)〕との吸着
能を比較するため、市販品についても化合物〔■〕と同
様の吸着実験を行なった。 一方、化合物[■]の生成を確認(結合部を求める)す
るのと同様に、第2図のフローチャートで〔■〕に相当
するトリデカアデニル酸(HOA13)、トリデカチミ
ジル酸(HOT 13)等による5′−水酸基化合物と
担体との結合を調べた。このことは、化合物〔■〕と担
体との結合位置を確定するために重要なことである。 従って、化合物〔■]を製造後、吸着能および結合部位
の検定を行なった。なお、HOA13、HOT13等の
製造は、化合物〔■〕を合成する際に用いた化合物シ■
〕の保護基をすべて除去することによって行なわれる。 第2図のフローチャートに従って、本発明化合、 物
(同図の化合物■)を製造した。 第2図で、記号は次の意味を持つ。 B′ ベンゾイル化アデニン B アデニン DMTr )メトキシトリチル CIL2 NHCOCH2CH2− ROオルトクロロフェニル Et エチル CE −シアノエチル 2 一一去 12 化合物(■〕(第2図の、■)の合成 実験1−1 ジメトキシトリチルアデノシン/樹脂〔■〕(樹脂は担
体に過ぎないが 樹脂に担持された目的化合物は外観的
には樹脂そのものと変らないので、樹脂に担持された当
該化合物を以下において単に樹脂と呼ぶことにする)
300 mg(0,033mmol )をインプロパノ
−ルー塩化メチレン(15: 85、V/V )溶液1
0m1で3回洗浄後、臭化亜鉛ノ1.0Mのイソプロノ
にノール−塩化メチレン溶液8mlで5分間ずつ4回反
応(脱トリチル化)させて樹脂〔■〕を得る。樹脂〔■
〕をイソプロノミノール−塩化メチレン溶液10m1で
3回洗浄し、これにジヌクレオチド〔■’:l 150
mg (0,1mmol)のピリジン溶液を添加後、共
沸させて系を無水とし、メシチレンスルホニルニトロト
リアゾリド(以下MSNTと記す) 150mg (0
,5m mol )と無水ピリジン2ml とを添加
して90分間反応(縮合)させる。反応後、ビリ・ジン
10m1で3回洗浄し、触媒量(約10mg)のジメチ
ルアミノピリジン(以下DMAP )を含む無水酢酸−
ビリジ7(1:9、(V/V))溶液10m1を添加し
10分間反応させて未反応5′−水酸基をアセチル化し
て保護し、これを2リジンで洗浄して、化合物〔■’]
(n=2) を得る。以上のような操作を6回くり返
して、化合物〔■](n=12)を得る。 一方、5′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔■〕800
mg (0,71m mol )とオルトクロロフェ
ニルホスホジトリアゾリドとを後者のジオキサン溶液(
1,0mmol、 6ml ) 中で2時間反応させ
、続いてトリフルオロアセチル−6−アミンヘキサノー
ル300 mg (t4 m mol )および1−メ
チル−イミダゾール115 mg (1,4m mol
)を加えてさらに2時間反応させる。反応終了後、溶
媒を留去し、残渣をクロロホルムに溶解した後、水、0
.5Mリン酸二水素す) IJウム水溶液、飽和炭酸水
素ナトリウム水溶液および5チの塩化す) IJウム水
溶液でそれぞれ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する
。クロロホルム層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製(
溶出液として0〜4%のメタノール含有クロロホルムを
使用)シ、溶出液を濃縮後ペンタン中に滴下し粉末状の
化合物〔■〕を得る。 上記で合成した化合物[■] (n =12 ) 11
1mg 、 ”(3,45μmol)を前述と同様の方
法で脱トリチル化したもの〔■〕に、化合物〔■160
mg (0,04m mol )をトリエチルアミン
−ピリジン−水(l:llv、’v )溶液3ml で
処理(脱シアンエチル化)した化合物〔■〕を加え、無
水にしたのち、MSNT50mg(0,2mmol)お
よびピリジン1mlを加え90分間反応(縮合)させ、
反応終了後ぎりジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥し
て、完全に保護されたオリゴヌクレオデド誘導体〔■〕
ヲ得ル。 オリゴヌクレオチド誘導体[■]1.5 mgを0.5
Mテトラメチルグアニジン−ピリジン−2−カルゼア
ルドキシメイトの・ジオキサン−水(9;1、V/V
)溶液200μm を加え、遠沈管中、室温でu時間反
応させる。反応後、濃アンモニア水(2,5m1)を加
えて密閉し、50℃で一夜反応させる。反応終了後、許
過し、涙液を濃縮後、水に溶解させてからエーテルで抽
出を行なう。水層な濃縮後、セファデックスG−50(
φ1゜5 X 120 cm、溶出液ハ0.05M の
M炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液pH7,5)で脱
塩精製しペンタデカアデニル酸誘導体〔[F]〕を得た
。 また同様の方法で実験1−2.1−3.1−4.1−5
および1−6のオリゴヌクレオチド誘導体を得た。実験
例1−1〜1−6の化合物の塩基配列その他を第1表に
示す。 ただし、この表で人はアデニン、Tはチミン、Gはグア
ニン、Cはシトシンを示す。 なお、実験例1−1.1−2および1−3についてのセ
ファデックスおよび高速液体クロマトグラフィーの結果
を第3〜4.5〜6および7〜8図に示す。これらの結
果より、化合物〔■〕が生成していることがわかる。 固定化オリゴヌクレオチド〔■〕の製造実施例 臭化シアン活性化セファロース4B(40mg)を1
mM−塩酸で洗浄し、さらに0.5M塩化ナトリウム−
〇、I Ml炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH8,3)
で洗浄後、化合物〔■〕(実験例1−1;4、OOD量
)の0.5M塩化ナトリウム−0,1M、炭酸水系ナト
リウム緩衝液(pH8,3) 200μlを加え、振盪
しながら室温で一夜反応させる。反応後沖過し、樹脂を
10mM)!Jス塩酸緩衝液(pH7,5)および0.
5 mM塩化ナトリウム、10mM )リス塩酸緩衝液
(pH7,5)で洗浄して、樹脂〔■〕を得る。 イ)吸着能の検討 樹脂〔■Tl ’A) mg を用い、合成トリデカチ
ミジル酸(実験例1−2を製造する際に用いた化合物〔
■〕の3′−末端保瞳基を除去した〔@〕に相当する化
合物)“を試料として、アフイニテイクロマトグラフイ
ーを行なった。このときの溶出ノぞターンを第9図に示
す。 口)結合部位の検定 上記で製造した樹脂〔■〕のかわりに、トリデカアデニ
ル酸(実験例1−1を合成する際に用いた化合物1■〕
の3′−末端保獲基を除去した〔■〕に相当する化合物
1.以下HOA13とする)の粗精製物を用いて、イ)
と同様にトリデカチミジル酸を試料としてアフイニテイ
クロマトグラフイーを行なった。 このときの溶出パターンを第10図に示す。 ハ)結果の解析 第9図の場合は、累通り画分が殆どなく、溶出溶媒をか
えることにより物質の浴出がみられた。 第10図では供試試料は殆ど素通りしており、溶媒をか
えても物質の溶出がみられなかった。 従って、樹脂〔■〕は、アデニン部分(塩基部分)のア
ミン基がセファロースとオリゴヌクレオチド誘導体との
結合に関与しておらず、オリゴヌクレオチド誘導体の5
1−末端延長上のアミン基のみが選択的にセファロース
と結合しているものであるといえる。またこの結果から
樹脂〔■〕はHOA 13と特異的に結合しているので
アフイニテイ樹脂として用いることができるといえる。 実施例 活性化CI■−セファロース4B(30mg)を1 m
M塩酸で洗浄する。樹脂を0.5Mの塩化ナトリウム−
01Mの炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH8,3)で洗
浄したのち、化合物(実験例1−1 : 4.00D量
)の0.5Mの塩化ナトリウム−0,1Mの炭酸水素ナ
トリウム緩衝液(pH8,3)160μl を加えて、
振盪しながら室温で3時間反応させる。 反応波濾過し、樹脂を10 mMのトリス塩酸緩衝液(
pH7,5)および0.5Mの塩化ナトリウム−10m
Mのトリス塩酸緩衝液(pH7,5)で洗浄して、樹脂
〔■〕を得る。 イ)吸着能の検討、および口)結合部位の検定は上記実
験例2−1と同様にトリデカチミジル酸を用いて行った
。その際のアフィニティークロマトグラフィーの溶出、
eターンを第11および12図に示した。 ハ)結果の解析 実験例2−1と同様の結果が得られている。ただし、素
通り画分で物質HOT 13が溶出している(第11図
)のは、試料の添加液が多過ぎたため吸着しきれずに溶
出したものと考えられた。 従って、この実験例で製造した樹脂でも、塩基部分のア
ミン基でな(てオリザヌクレオチドの5′−末端延長上
のアミン基がセファロースとの結合反応に選択的に関与
しているということができ、またこの樹脂はアフイニテ
イ樹脂として用いることができるといえる。 実施例 樹脂の製造は臭化シアン活性化セファロース4 B (
30mg)と化合物(実験例1−2 : 3゜43 O
Dml)とを用い、上記実験例と同様の操作で行なつた
。ところで、この操作に際して、内部標準物質としてト
リデカチミジル酸(HOT13)を添加した。 というのはHOT 13は反応性がなく(塩基部分にア
ミノ基をもたない)、臭化シアン活性化セファロースと
も反応せずかつ高速液体クロマトグラフィーでの分析を
容易にするためである。そのときの結果を第13図に示
した。A)はHOT 13と化合物1−2との混合物の
ものであり、B)はセファロースと化合物1−2との結
合反応後のものである。 第13図のA)およびB)を比較しても、セファロース
と化合物1−2とが反応していることがわかるが、OD
の収支からもこのように推察される。ODの収支を第2
表にまとめた。 第2表 イ)結合量の検討は上記実験例と同様の操作で行なった
。 口)吸着能の検定 ウンデカデオキシアデニル酸(以下dA11とする)の
粗精製物で56チの不純物を含むものを用いてアフイニ
ナイクロマトグラフイーな行なう。 粗dA11 (0,550Dすなわち0.240Dに相
当)を用いた結果、非吸着部分が0.340D、吸着部
分が0.230Dとなった。この際の吸着部分の高速液
体クロマトグラフィーを行なった結果、単一ピークを得
た(w、14図)。また、非吸着部分の高速液体クロマ
トグラフィーを行なった結果、物質のピークが得られな
かった(第15図)ので、この部分はdAllを含んで
いないと考えられる。従って、ここで製造した樹脂はd
Allと親和性をもち、セファロースとオリゴヌクレオ
チドの5′−末端アミノ基とのみが選択的に反応してい
ることがわかる。 実験例2−4〜2−8 これらの実験例については、実験例2−3と同様の操作
を行なった。その除用いた担体とオリゴヌクレオチド誘
導体を第3表にまとめた。 第3表 a:活性化CH−セファtff−7;4Bb=臭化シア
ン活性化−セファロース4B比較例 現在市販されている下記のものと、本発明者らの製造し
たものとの吸着能を比較するために下記の試料を用いて
吸着能の検定を行なった。 ■:オリザ(dA)−セルロース (P−L Biochemicals Lot No、
115577)■:オリザ(dT)−セルロース (P−L Biochemieals Lot No、
675130)比較例−1 樹脂■(20mg) を0.5M、塩化ナトリウム−
10mM )リス塩酸緩衝液(pH7,5)で膨潤さ
せたのち、カラムに充填し1.10 mMのトリス塩酸
緩衝液(pH7,”+ 、)および0.5Mの塩化ナト
リウム−10m’Mのトリス塩酸緩衝液(pH7,5)
で洗浄する。このカラムにトリデカチミジル酸(HOT
13)をかけ℃吸着能の検定を行なった。なお、溶離
液は10mMのトリス塩酸緩衝液(pI(7,5)を用
いた。 この樹脂を用いて計3回カラムクロマトグラフィーを行
なった。すなわち、1回目はHOT 13(1,330
D M’c )を2.1 ml かけたが殆ど吸着され
ず、このときの溶出液を回収して再度カラムにかけた(
2回目)。3回目はカラムを作成しなおして上記と同様
の実験を行なった。そのときの溶出パターンを第16図
に示した。この結果から、HOT13は殆ど吸着されて
いないことがわかる。 比較例−2 樹脂■を用いて上記例−1と同様の吸着実験を行なった
。なお、カラムの供試試料としても上記と同様HOA
13を用いた。カラムクロマドグ2フイーを5回行なっ
たが、そのときの溶出パターンを第17図に示し、吸着
能を第4表に示した。 第4表 これらの結果から、樹脂■では素通り画分が多く、吸着
能も一番よいのが0.0370D/mgであった。また
、検体の量または濃度の違いにより、あるいは吸着、お
よび溶出を繰り返すごとに吸着能が変化することにより
、再現性のある結果が得られない。 以上の実験例および比較例から、本発明の7フイニテイ
樹脂としての能力を、吸着能および結合量の点から市販
品と比較したものの一覧表を第5表に示した。 第5表 *1=塩基配列5′GGGAAGCTTCCC3’のオ
リゴヌクレオチド リボヌクレオチド 5′ *3=塩基配列 ACTGCGTTAGTCGA3’の
オリゴヌクレオチP *4=測定不能は、樹脂の自己相補性のためカラムに吸
着されなかったためである。 結果のまとめ 以上の結果から総合判断すると、本発明の樹脂〔■〕は
、支持体であるセファロース誘導体との結合がオリゴヌ
クレオチド銹導体の5′−末端延長上の一級アミン基の
みが関与して生成したものであるといえる。また、この
樹脂〔■〕は、アンイニテイ樹脂として用いることがで
きる。そしてまた、結合壁および吸着能の比較から、本
発明の方法によれば合成可能ないかなる塩基配列をもつ
オリゴヌクレオチドをも支持体に結合させることができ
、非常に良質のアフイニテイ樹脂が合成できるといえる
。 4、図面の簡単な説明 第1図は、本発明の化合物を合成する方法の一例を示す
フローチャートである。 第2図は、実験例で示した本化合物のフローチャートで
ある。 第3、;5および7図は、化合物〔V〕(それぞれ実験
例1−1.1−2および1−4)についてのセファデッ
クスG−50での溶出、eターンを示したものである。 第4.6および8図は、化合物〔■〕(それぞれ実験例
1−1.1−2および1−4)についての高速液体クロ
マトグラフィーの溶出、eターンを示したものである。 第9および10図は、実験例2−1で合成した樹脂およ
びその比較としてHOA13を用いて各々アフイニテイ
クロマトグラフイーを行なったときの溶出Aターンを示
したものである。 第11および12図は、実験例2−2で合成した樹脂お
よびその比較としてHOT 13を用いて各々アフイニ
テイクロマトグラフイーな行なったときの浴出/Rター
ンを示したものである。 第13図は、実験例2−3での高速液体クロマトグラフ
ィーの結果である。Aは化合物1−2とセファロース誘
導体との反応前の、Bは反応後の、溶出パターンをそれ
ぞれ示したものである。 第14図は実験例2−3で合成した樹脂を用いてアフイ
ニテイクロマトグラフイーを行なったときのカラム吸着
部分の高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンであ
り、第15図は非吸着部分の高速液体クロマトグラフィ
ーの結果である。 第】6図は市販の樹脂(■)を用いた際のアフィニテイ
クロマトグラフイーの浴出パターンであって、A、I3
およびCはそれぞれ1回目、2回目および3回目の結果
である。 第17図は市販の樹脂(■)を用いた際のアフイニテイ
クロマトグラフイーの溶出ノぞターンであって、A、B
、C,DおよびEはそれぞれ1回目〜5回目までの結果
である。 なお、弗9〜12図および第16〜17図の横軸欄外の
記号AおよびBは溶出液の添加時期を示し、A〜Bでは
主に洗浄をし、Bで溶出液をかえて物質の溶出を試みた
ことを示すものである。 出願人代理人 猪 股 清 児3図 方 画 数 范4図 保1子時間(労) 第5図 力 画 数 尾6図 イ5唾 特 8岬F 間 (5)) 鬼7図 分 画 数 保持時間彷) 南11図 児12図 分画I! 分画数 為14図 保持時間4分) 鬼15図 保持時間(2) 帛17図 (A) (B)
(C)方向数 方向数 方向数 (D) (E) 方向数 分画数
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.3′末端リン酸基およびヌクレオチドの塩基部分が
適当に保護されたオリザヌクレオチドの5′末端リン酸
基に、適度の長さのスペーサを介して、脱離可能な保護
基で保護されたアミン基を有する、オリビヌクレオチド
誘導体。 2、下式(2)で表わされる、特許請求の範囲第1項記
載の誘導体。 R2−NH−R’−P (N’P )・R3(2)X
Xm 〔ここで、置換基は下記の意味を持′つ、N それぞれ
アシル化された、アデニン、グアニン、シトシンおよび
チミン、からなる群より選ばれた塩基残基金もつヌクレ
オシドのうち、リゼシド骨格の3′および5′の酸素を
除いたもの、たyし、m(後記)が2以上の場合の複数
のN′は、塩基部分および(または)アシル部分につい
て同一でも異なってもよい。 P リン酸トリエステル結合 R1置換または非置換の二価炭化水素基、R2R3脱離
の際安定であり、かつオリビヌクレオチr部分が安定な
まま脱離できる置換基。 R3他のすべての保護基が安定な条件で、容易に脱離さ
れ末端リン酸トリエステルを遊離のリン酸ジエステルと
することができる保護基。 m Oから6、とりわけ1から4の整数である。〕 3、R2がトリフルオロアセチル基(Tfa−)である
、特許請求の範囲第2項記載の誘導体。 4、R2が0−ニトロフェニルス/I/フェニル基(N
、、−)である、特許請求の範囲第2項記載の誘導体。 5、R1が直鎖桑たは分岐鎖アルキレン基(02〜勉、
好ましくは02〜Cl2)またはアリレン基(C4〜c
20.好ましくは04〜Cl2)である、特許請求の範
囲第2項から第4項記載の誘導体。 6、R3がシアノエチル基(−CE )である、特許請
求の範囲第一シ項から第5項記載の誘導体。 7、特許請求の範囲第2項から第6項記載のオリゴヌク
レオチド誘導体を製造するにあたり、下式(0) %式%(0) (式中、N′、P 、mおよびR3は前記と同じ)で表
わされる、3′末端リン酸基を保護されたオリゴヌクレ
オチドの5′水酸基と下式(1)%式%(1) (式中、R1およびR2は前記と同じ)で表わされる化
合物とをホスホジトリアゾリド、ホスホジクロリP1ホ
スホジベンズトリアゾリド法などのリン酸化試薬を用い
て結合させること全特徴とするオリゴヌクレオチド誘導
体の製造法。 8、下式(4)で表わされる、特許請求の範囲第1項記
載の誘導体。 R2−NH−R1−PX(N’Px)n、+nN’O・
Co−R4(4)〔ここで、置換基は下記の意味を持つ
、N’、P R’、R2およびmは前記と同じ、1 R4通常のオリゴヌクレオチド合成法に用いられる3′
−水酸基保護基、たとえば低級アルキル基、アリル基、
またはスペーサを介したポリスチレンまたはポリアクリ
ルアミド系樹脂、 n oから40、とりわけOから加の整数である。〕 9、R2がTfa−である、特許請求の範囲第8項記載
の誘導体。 10、R2がNp5−である特許請求の範囲第8項記載
の誘導体。 11、R1が直鎖ま・tLは分岐鎖アルキレン基(C2
〜C□2、好ましくはC2〜c12)またはアリレン基
(04〜C20−好ましくは04〜Cl2)である、特
許請求の範囲第8項から第10項記載の誘導体。 12、R4がポリスチレン樹脂またはポリアクリルアミ
ド樹脂などの高分子物質である、特許請求の範囲第8項
から第11項記載の誘導体。 13、特許請求の範囲第8項から第12項記載のオリゴ
ヌクレオチド誘導体を製造するにあたり、特許請求の範
囲第2項から第6項記載のオリゴヌクレオチド誘導体よ
りR3基を脱離させて遊離または塩の形に変え、これに
下式(3′)HO(N’P ) N’0COR’
(3’) n (式中、N’、 p 、 R4およびnは前記と同じ)
で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体と縮合剤によっ
て結合させること’r%徴とする製造法。 14.3’末端水酸基、リン酸部分および塩基部分にお
いて全く保護されていないオリゴヌクレオチドの5′末
端リン酸基に、適度の長さのスペーサを介して、−級ア
ミノ基金有する、オリゴヌクレオチド誘導体。 15、下式(5)で表わされる、特許請求の範囲第14
項記載の誘導体。 NH2−R’−P(NP)m+nNOH(5)〔ここで
、置換基は下記の意味を持つ、R1、mおよびnは前記
と同じである、N それぞれ、アデニン、グアニン、シ
トシンおよびチミンからなる群より選ばれた塩基成育を
もつヌクレオシドのうち、リゼシド骨格の3′および5
′の酸素を除いたもの。たyし、m+nが2以上の場合
の複数のNは、同一でも異なってもよい。 P リン酸ジエステル結合。〕 16、R1が直鎖御な味は枝鎖アルキレン基(C2〜智
、好ましくはC2〜C□2)またはアリレン基(C4〜
c20.好ましくはC4〜Cl2)である、特許請求の
範囲第15項記載の誘導体。 17、%許請求の範囲第15項および第16項記載のオ
リゴヌクレオチド誘導体を製造するにあたり、特許請求
の範囲第8項から第12項記載のオリゴヌクレオチド誘
導体よりR2基、 COR’基、塩基部分の保護基(ア
シル基)およびリン酸部分の保護基をすべて脱離させる
ことを特徴とする製造法。 18、オリゴヌクレオチドの5′末端リン酸を適度の長
さのスペーサを介して一級アミン基をもって担体と結合
させた、固定化オリゴヌクレオチド。 19、担体がセファロースである、特許請求の範囲第1
8項記載の固定化オリゴヌクレオチド。 加、、下式ω)で表わされる、特許請求の範囲第19項
記載の固定化オリゴヌクレオチド。 〔セファロース]−NH−R1−P(NP) No
)((6)m+n 〔ここで、置換基は下記の意味を持つ、R1、m、n、
NおよびPは前記と同じである、〔セファロース〕 ア
ミノ基と結合可能なセファロースである。〕 21、IiL’が直鎖まミな畦仕岐鐵アルキレン基(C
2〜もい好ましくはC2〜Cl2)またはアリレン基(
C4〜C20、好ましくはC4〜Cl2)である、特許
請求の範囲第加須記載の固定化オリ2ヌクレオチド。 22、 (セファロース) カBrCN活性化−セファ
ロースまたは活性化OH−セファロースである、特許請
求の範囲第九項または第21項記載の固定化オリザヌク
レオチP7 n、特許請求の範囲第1項記載のオリゴヌクレオチド誘
導体の3′−保護基および5′−末端リン酸に存在する
保護基を脱離し、先端の一級アミン基をもって担体と結
合させることを特徴とする特許請求の範囲第15項記載
の固定化オリビヌクレオチPの製造法。 2、特許請求の範囲第8項記載のオリゴヌクレオチド誘
導体のR2、−CoR4基、塩基部分のアシル基および
、P (リン酸トリエステル)部分の保護基を脱離し、
下式(5) %式%(5) (式中、N、P、R’、mおよびnは前記と同じ) で表されるオリゴヌクレオチド誘導体を形成し、さらに
セファロースと反応させることを特徴とする特許請求の
範囲第九項から第22項記載の固定化オリゴヌクレオチ
ドの製造法。
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- 1987-02-20 US US07/016,835 patent/US4789737A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-20 US US07/016,889 patent/US4820812A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59130221A (ja) * | 1982-10-26 | 1984-07-26 | シ−テイエイ・フイナンツ・アクチエンゲゼルシヤフト | ヒトと動物の遺伝学的変動域内における器官の組織物質の改良剤と改良方法 |
US7491857B2 (en) | 2005-07-27 | 2009-02-17 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Oligonucleotide probe |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CA1202254A (en) | 1986-03-25 |
US4789737A (en) | 1988-12-06 |
US4667025A (en) | 1987-05-19 |
DE3373817D1 (en) | 1987-10-29 |
JPH0372639B2 (ja) | 1991-11-19 |
EP0101985B1 (en) | 1987-09-23 |
US4820812A (en) | 1989-04-11 |
EP0101985A1 (en) | 1984-03-07 |
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