DE3751468T2 - Verfahren zur herstellung von oligonukleotiden und verbindungen zur bildung hochmolekularer schutzgruppen. - Google Patents
Verfahren zur herstellung von oligonukleotiden und verbindungen zur bildung hochmolekularer schutzgruppen.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Synthese eines Oligonucleotides mit einer gemäß der Bindung in Nucleinsäure durch Kondensieren eines Nucleotides oder Oligonucleotides erweiterten Kette. Spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Synthese eines kettenerweiterten Oligonucleotides durch Kondensieren eines Nucleotides oder Oligonucleotides mit einer darin eingebrachten Schutzgruppe mit hohem Molekulargewicht, bei dem die Durchführung der Kondensationsreaktion in dem homogenen System sowie die Trennung und Reinigung in dem heterogenen System möglich ist und bei dem ein Produkt mit hoher Reinheit bei hoher Raum-Zeit-Ausbeute erzielbar ist.
- Des weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Verbindung zum Bilden einer polymeren Schutzgruppe, die zur Synthese des oben erwähnten Oligonucleotides und zur Synthese von Nucleinsäure, Oligosacchariden und Polysacchariden nützlich ist.
- Nucleinsäure besitzt eine Struktur, in der viele Hydroxylgruppen an speziellen Stellen der Saccharidkomponente des Nucleotides über eine Diestergruppe von Phosphorsäure verbunden sind, das heißt eine Struktur, in der alkoholische Hydroxylgruppen von Nucleotid- und Phosphorsäuregruppen sequentiell über Esterbrücken verbunden sind. Demgemäß können die folgenden zwei Verfahren zum Kondensieren von zwei Nucleotiden gemäß der Bindung in Nucleinsäure gewählt werden:
- (a) das Verfahren. bei dem eine 3'- oder 2'-Phosphorsäuregruppe mit einer 5'-Hydroxylgruppe kondensiert wird;
- (b) das Verfahren, bei dem eine 3'- oder 2'-Hydroxylgruppe mit einer 5'-Phosphorsäuregruppe kondensiert wird.
- Da die Phosphorsäuregruppe voluminös ist und die 5-Hydroxylgruppe aus einem primären Alkohol besteht und einen relativ hohen Freiheitsgrad besitzt und da die 3ro - und 2'-Hydroxylgruppen aus einem sekundären Alkohol bestehen und nahe beieinander liegen, ist das Verfahren (a) das vorteilhafteste der zwei oben erwähnten Verfahren.
- Das Verfahren (a) wird ferner nach der Art der Kondensationsreaktion in das Diester- Verfahren, das Triester-Verfahren, das Phosphit-Verfahren und das H-Phosphonat-Verfahren unterteilt. Im Hinblick auf die Reaktionsausbeute, die Stabilität des Zwischenprodukts, die Reaktionsrate und die Leichtigkeit der Reinigung des Produkts werden das Triester-Verfahren und das Phosphit-Verfahren als relativ vorteilhaft angesehen.
- Die Reaktion des Triester-Verfahrens kann durch die folgende Formel (1) ausgedrückt werden: kondensierendes Agens
- In Formel (1) stehen B&sub1; und B&sub2; für eine Basen-Komponente, bei der die Aminogruppe geschützt ist, R&sub1; steht für eine Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe, R&sub2; und R&sub4; stehen für Wasserstoff im Fall von Desoxyribonucleotid oder eine geschützte Hydroxylgruppe im Fall von Ribonucleotid, und R&sub3; sowie R&sub5; stehen für eine Schutzgruppe für die Phosphorsäuregruppe.
- Nach der oben erwähnten Reaktion zur Bildung von Triester werden die Schutzgruppen für die funktionellen Gruppen entfernt, um das angestrebte Produkt zu erhalten. Im allgemeinen besteht kein großer Unterschied in der Löslichkeit oder dergleichen des Reaktionsprodukts, der nicht reagierten Substanz und des Nebenprodukts, und daher ist es nicht immer leicht, sie zu trennen und zu reinigen.
- Zur Erleichterung dieser Trennung und Reinigung wurden mehrere Verfahren dahingehend vorgeschlagen, daß Unterschiede in den physikalischen Eigenschaften der Reaktionsprodukte durch Verwendung von Verbindungen mit hohem Molekulargewicht als der Verbindung, die eine Schutzgruppe für die funktionelle Gruppe bildet, bewirkt werden. Wenn die Verbindung mit einer polymeren Schutzgruppe unter den Reaktionsbedingungen fest ist oder nach der Reaktion als ein Feststoff erhältlich ist, kann das angestrebte Produkt ohne weiteres durch Filtration und Waschen getrennt und zurückbehalten werden.
- Die Stelle zur Bildung von R&sub5; in Formel (1) wird als diejenige Stelle angesehen, mit welcher die polymere Schutzgruppe verbunden wird, und es wurde über die Verwendung eines vernetzten Polystyrol- oder Silicagels, dessen funktionelle Gruppe als R&sub5; hiermit verbunden ist, berichtet [V.A. Efimov et al., Nucleic Acid Res. 11, 8369 (1983)]. Das durch Binden einer polymeren Schutzgruppe, wie oben erwähnt, an die endständige Phosphorsäuregruppe gebildete Oligonucleotid ist fest, und eine Reihe von Festphasen- Verfahrenstechniken ist etabliert. Im Gegensatz dazu wird das Verfahren, bei dem die durch Formel (1) dargestellte Kondensationsreaktion in einer homogenen Lösung ausgeführt wird, als das Flüssigphasenverfahren bezeichnet. In Verbindung mit dem Diester-Verfahren wurde die Verwendung von Polyvinylalkohol [H. Scott et al., Makromolekular Chemie, 173, 247 (1973)], Polyethylenglycol [H. Kosler, Tetrahedron Letters, Nr. 16, 1535 (1972)], Polystyrol [H. Hayatsu, H. G. Kohorana, J. Am. Chem. Soc., 88 3182 (1966)] und Vinylalkohol/Polyvinylpyrrolidoncopolymer [H. Seliger, G. Aumamann, Tetrahedron Letters, Nr. 31, 2911(1973)] als der Verbindung zur Bildung einer polymeren Schutzgruppe vorgeschlagen. Wenn diese in Lösungsmittel löslichen Polymere verwendet werden, wird das Verfahren als ein Flüssigphasenverfahren betrachtet, in diesem Fall ist es jedoch nicht leicht, das Reaktionsprodukt zu separieren und zu reinigen.
- Die vorliegende Erfindung beabsichtigt, ein Verfahren zur Synthese eines kettenerweiterten Oligonucleotides gemäß dem Triester-Verfahren oder dem Phosphit-Verfahren bereitzustellen, bei denen eine Trennung und Reinigung des angestrebten Produkts leicht ausgeführt und das angestrebte Produkt mit hoher Reinheit in einer hohen Ausbeute erzielt werden kann.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Synthese eines kettenerweiterten Oligonucleotides bereitgestellt, welches das Kondensieren eines Mononucleotides, eines Oligonucleotides, eines Mononucleotid-Succinates oder eines Oligonucleotid- Succinates in einem homogenen System in einem Lösungsmittel, wobei lediglich die endständige 5'-Hydroxylgruppe nicht blockiert ist und die anderen funktionellen Gruppen durch eine Mehrzahl von Schutzgruppen mit niedrigem Molekulargewicht sowie eine Schutzgruppe, die eine Hydroxylgruppe enthält, blockiert sind, mit einem Mononucleotid oder Oligonucleotid beinhaltet, bei dem die funktionellen Gruppen außer der endständigen Phosphorsäuregruppe durch Schutzgruppen mit niedrigem Molekulargewicht blockiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzgruppe, welche die Hydroxylgruppe enthält, ein Polysaccharidderivat ist, das in dem Lösungsmittel steuerbar löslich ist, wobei die Verbindung, welche die Schutzgruppe aus dem Polysaccharidderivat bildet, durch Anbinden eines Abstandshalters und einer funktionellen Gruppe an ein Polysaccharidderivat gebildet wird.
- Des weiteren wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Verbindung zur Bildung einer Schutzgruppe aus dem Polysaccharidderivat bereitgestellt, die durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt wird:
- wobei C&sub6;H&sub7;O&sub2; für einen wasserfreien Glucoserest steht, R für
- steht, n eine ganze Zahl zwischen 10 und 2.000, x eine Zahl zwischen 0,4 und 0,8 und y eine Zahl zwischen 1,0 und 2,0 ist.
- Fig. 1 ist ein Chromatogramm, das durch eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie eines Oligonucleotides (Undecamer vom RNA- Typ), von dem die Schutzgruppen vollständig entfernt wurden, erzielt wurde, erhalten in einem Beispiel (Beispiel 9) der vorliegenden Erfindung;
- Fig. 2 ist ein Chromatogramm, das dadurch erzielt wurde, daß ein gereinigtes Produkt des in Fig. 1 gezeigten Oligonucleotides erneut einer Chromatographie unterzogen wurde;
- Fig. 3 ist ein Chromatogramm, das durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie eines Oligonucleotides (Octamer vom DNA-Typ), von dem die Schutzgruppen vollständig entfernt wurden, erzielt wurde, erhalten in einem Beispiel (Beispiel 15) der vorliegenden Erfindung; und
- Fig. 4 ist ein Chromatogramm, das dadurch erzielt wurde, daß ein gereinigtes Produkt des in Fig. 3 gezeigten Oligonucleotides erneut einer Chromatographie unterzogen wurde;
- Die Verbindung zur Bildung einer Schutzgruppe aus einem Polysaccharidderivat, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist in einem herkömmlichen Lösungsmittel für ein Oligonucleotid und ein durch eine Schutzgruppe mit niedrigem Molekulargewicht blockiertes Oligonucleotid löslich, und wenn in dieses herkömmliche Lösungsmittel ein Nichtlösungsmittel zu einer Lösung hinzugegeben wird, kann die Verbindung teicht ausgefällt und separiert werden. Verbindungen zur Bildung einer Schutzgruppe aus einem Polysaccharidderivat, die zur Erfüllung der Aufgabe der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können von Polysacchariden abgeleitet werden. Schutzgruppenbildende Verbindungen, die unter Verwendung von Acetylcellulose mit einem geringen Grad an Acetylierung, eines Mischcelluloseesters, der aus Acetylcellulose und Propionylcellulose zusammengesetzt ist, oder eines Mischcelluloseesters erzeugt werden, der aus Acetylcellulose und Butyrylcellulose zusammengesetzt ist, sind besonders nützlich. Um eine schutzgruppenbildende Verbindung durch Modifizieren eines Polysaccharidderivats, zum Beispiel Acetylcellulose, herzustellen, wird vorzugsweise eine Hydroxyethylsulfonylgruppe als die funktionelle Gruppe eingebracht, welche die Phosphorsäuregruppe blockiert. Die-OH-Gruppe der Hydroxyethylsulfonylgruppe blockiert die Phosphorsäuregruppe durch Bildung eines Phosphatesters.
- Das Gerüst der Verbindung, die eine Schutzgruppe aus einem Polysaccharidderivat erzeugt, bildet durch Reaktion mit einer voluminösen Verbindung wie einem Nucleotid ein räumliches Hindernis, und daher muß, um der Hydroxyethylsulfonylgruppe eine ausreichende Reaktivität zu verleihen, die funktionelle Gruppe von der polymeren Hauptkette durch einen bestimmten Abstand separiert werden. Speziell ist die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung vorzugsweise verwendete Verbindung, die eine Schutzgruppe aus einem Polysacchariddenvat bildet, ein Acetylcellulosede rivat, bei dem zwischen der Hydroxylgruppe der Hauptkette und zum Beispiel einer 4-(2-Hydroxyethylsulfonyl)dihydrocinnamoylgruppe eine Esterbindung ausgebildet ist. Acetylcellulose mit einem Substitutionsgrad von etwa 1,7 bis etwa 1,8, die als Ausgangsmaterial für die schutzgruppenbildende Verbindung bevorzugt ist, ist dadurch charakterisiert, daß die Anzahl von Hydroxylgruppen, die an der esterbildenden Reaktion teilnehmen, groß ist, daß die Löslichkeit gut und daß die Verbindung in vielen polaren Lösungsmitteln löslich ist.
- Die Reaktion für die Synthese des oben erwähnten Acetylcellulosederivats wird durch die folgenden Formeln (2) und (3) dargestellt.
- In Formel (2) steht MMTr für eine Monomethoxytritylgruppe. Die Reaktionsformel (2) stellt die Synthese von 4-(2-Monomethoxytrityloxyethylthio)dihydrozimtsäure < 3 > durch die Dehydrochlorierungs-Kondensationsreaktion zwischen einem Monomethoxytritylether < 1 > von Ethylenchlorhydrin und 4-Mercaptodihydrozimtsäure < 2 > dar. < 3 > + Acetylcellulose 1-Meim Pyridin Acetylcellulose
- In Formel (3) steht Tps für 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid, und 1-Meim steht für 1-Methylimidazol.
- Formel (3) stellt den Reaktionsprozeß dar, bei dem 4-(2-Monomethoxytrityloxyethylthio)dihydrozimt säure < 3 > und Actylcellulose einer Esterkondensation unter Verwendung von 1-Methylimidazol als dem Katalysator und 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid als dem Kondensationsagens unterzogen werden, nicht reagierte Hydroxylgruppen in der Acetylcellulose durch Acetanhydrid verestert werden, eine Oxidation durch Verwenden von Wasserstoffperoxid und Natriumwolframat bewirkt wird, um Sulfonylgruppen in das Molekül einzubringen, und eine durch das Polymer getragene Verbindung < 4 > durch die Entfernung der Monomethoxytritylgruppe unter Verwendung von Zinkbromid synthetisiert wird. Die Verbindung < 4 > ist ein Acetylcellulosederivat mit einer 4-(2-Hydroxyethylsulfonyl)dihydrocinnamoylgruppe. Diese Verbindung ist in Pyridin löslich.
- Um die Erläuterung zu vereinfachen, wird die vorliegende Erfindung nun unter Bezugnahme auf die Kondensationsreaktion zwischen einem Mononucleotid und einem Mononucleotid beschrieben, die im folgenden beschriebenen Techniken können jedoch auch auf Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung angewendet werden, bei denen einer oder beide der Reaktionspartner Oligonucleotide sind. Kurz gesagt wird gemäß der vorliegenden Erfindung die Verbindung < 4 > mit einem Nucleotid reagiert, bei dem die funktionellen Gruppen mit Ausnahme einer einzigen Phosphorsäuregruppe blockiert sind, zum Beispiel 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-tetrahydropyranylribonucleosid-3'-(2- chlorphenyl)phosphat < 5 > , um die Phosphorsäuregruppe zu blockieren, wie durch die folgende Formel (4) gezeigt: 1-Meim Extraktion Pyridin Acetylcellulose
- In Formel (4) steht DMTr für eine Dimethoxytritylgruppe, Thp steht für eine Tetrahydropyranylgruppe, PhCl steht für eine 2-Chlorphenylgruppe und TsOH steht für p-Toluolsulfonsäure.
- Zwischen < 4 > und < 5 > wird kaltes Wasser zu der Flüssigkeit der Kondensationsreaktion hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen, und wenn die Reaktionsflüssigkeit mit Methylenchlorid extrahiert wird, wird das Reaktionsprodukt in die Methylenchloridschicht überführt. Die Hydroxylgruppe der Hydroxyethylgruppe in < 4 > , die an der Reaktion nicht teilgenommen hat, ist durch eine Acetylgruppe blockiert, und p- Toluolsulfonsäure wird hinzugefügt, um die Dimethoxytritylgruppe freizusetzen. Wenn ein Nichtlösungsmittel, das heißt in diesem Fall Ethanol, zu der Reaktionsfiüssigkeit hinzugefügt wird, wird < 6 > als die Ausfällung erhalten. Die Verbindung < 6 > ist ein Mononucleotid, das durch die Schutzgruppe aus dem Polysaccharidderivat blockiert ist.
- Dann werden < 5 > und < 6 > kondensiert, um zwei Nucleotide über einen Triester von Phosphorsäure zu binden und eine Verbindung < 7 > zu erzielen, bei der die endständige Phosphorsäuregruppe durch die polymere Schutzgruppe blockiert ist, wie durch die folgende Formel (5) gezeigt: l-Meim Pyridin Acetylcellulose Et&sub3;N-Pyridin
- Die Schutzgruppe aus dem Polysaccharidderivat, welche die endständige Phosphorsäuregruppe von < 7 > blockiert, wird isoliert, und das Produkt wird separiert, wodurch das angestrebte Dinucleotidderivat < 8 > erhalten wird. Diese Isolierungsreaktion ist eine β-Eliminierungsreaktion, und ein Acetylcellulosederivat < 9 > mit einer endständigen Olefingruppe wird gebildet. Das Derivat < 9 > wird durch Hinzufügen von Ethanol zu der Reaktionsfiüssigkeit ausgefällt und kann leicht von < 8 > separiert werden. Die Separierung von < 8 > von dem nicht reagierten Nucleotid und dergleichen wird durch Umkehrphasenchromatographie erzielt.
- Das so synthetisierte Oligonucleotid wird in dem Zustand verwendet, in dem die an dasselbe gebundene Schutzgruppe als das Ausgangsmaterial für die kettenerweiternde Reaktion dient. Andererseits wird, um das Oligonucleotid von dem Oligonucleotid mit der an dasselbe gebundenen Schutzgruppe zu erhalten, die Schutzgruppe in der folgenden Weise entfernt. Als erstes wird eine Behandlung während 16 Stunden in 0,5 M 2-Pyridinaldoximat - 0,5 M 1,1,3,3-Tetramethylguanidin/Pyridin - Wasser (9:1 v/v) bei Raumtemperatur durchgeführt, um die 2-Chlorphenylgruppe als der die Phosphorsäuregruppe schützenden Gruppe zu entfernen, und dann wird eine Behandlung mit wäßrigem Ammoniak (28% bis 30%) bei 50ºC während 5 Stunden ausgeführt, um die Schutzgruppe für die Aminogruppe des Basisteils zu entfernen.
- Des weiteren wird eine Behandlung mit einer wäßrigen Salzsäurelösung mit einem pH- Wert von 2 bei Raumtemperatur während eines Tages ausgeführt, um die Dimethoxytritylgruppe als der Schutzgruppe für die 5'-Hydroxylgruppe und die Tetrahydropyranylgruppe als der Schutzgruppe für die 2'-Hydroxylgruppe zu entfernen.
- Ein Oligonucleotid, von dem die Schutzgruppen vollständig entfernt sind, wird gemäß der oben erwähnten Prozeduren erhalten.
- Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können optionale Oligonucleotide im Bereich von einem Nucleotiddimer bis zu einem Nucleotidpolymer (zum Beispiel ein Eicosamer) erzielt werden. Speziell wird ein Oligonucleotid von einem Mononucleotid erzielt, ein Oligonucieotid mit hohem Molekulargewicht wird durch Kondensieren dieses Oligonucleotides mit einem Mononucleotid oder Oligonucleotid erzielt, und ein optionales Polymer wird durch Wiederholen dieser Prozeduren erzielt.
- Die Synthese des kettenerweiterten Oligonucleotides wurde unter Bezugnahme auf das Triester-Verfahren im Detail beschrieben. Nichtsdestoweniger kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung in ähnlicher Weise auf das Phosphit-Verfahren angewendet werden.
- Polysaccharide, Oligosaccharide und Nucleinsäure, die als physiologisch aktive Substanzen von Bedeutung sind, werden im allgemeinen durch Kondensieren einer kleinen Anzahl von Arten von Monosacchariden oder Mononucleotiden mit einer bestimmten Regelmäßigkeit gebildet, und eine reine Synthese derselben ist chemisch sehr wichtig, enthält jedoch viele ungelöste Probleme. Die meisten der bei der Synthese auftretenden Probleme entstehen, weil es schwierig ist, die Reaktion zum Überführen der Bestandteile mit polyfunktionellen Gruppen in eine gewünschte Bindungsform selektiv durchzuführen. Des weiteren ist es, da es keinen großen Unterschied in den physikalischen Eigenschaften des Ausgangsmaterials, des angestrebten Produktes und des Nebenproduktes gibt, sehr schwierig, das angestrebte Produkt zu separieren und zu reinigen, auch-wenn die angestrebte Reaktion weit entwickelt ist. Aus diesen Gründen stellt die Technik des selektiven Schützens jeder funktionellen Gruppe der Bestandteile und des Isolierens der Schutzgruppe ein wichtiges Mittel für die Synthese oder die Analyse von Polysacchariden, Oligosacchariden und Nucleinsäure bereit.
- Die vorliegende Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzgruppe für die endständige Phosphorsäuregruppe des Nucleotides aus einer polymeren Verbindung gebildet wird, die in Lösungsmitteln löslich ist und leicht durch Ausfällung separiert werden kann, daß die Kondensationsreaktion in einer homogenen Lösungsphase ausgeführt wird und daß das Produkt durch Feststoff-Flüssigkeits-Trennung gewonnen werden kann.
- Die Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden nun durch Vergleichen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung mit den herkömmlichen Verfahren beschrieben.
- Die Hauptpunkte des herkömmlichen Flüssigphasenverfahrens werden durch die folgenden Formeln (6) und (7) dargestellt. Phosphorylierung Silicagel-Säulenchromatographie Entfernen der Gruppe R&sub1;
- In Formel (6) steht R&sup6; für -H oder OR&sup7;, und Rg steht für -OR&sup5; oder -NHR&sup9;. Kondensation Silicagel-Säulenchromatographie Entfernen der Gruppe Umkehrphasen-Silicagel-Chromatographie
- Im Flüssigphasenverfahren, das heißt dem Verfahren, das lediglich Schutzgruppen mit niedrigem Molekulargewicht verwendet, müssen die in den jeweiligen Schritten erhaltenen Produkte durch Säulenchromatographie gereinigt werden können. Im Gegensatz dazu ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung dahingehend von Vorteil, daß das Produkt durch Ausfällen des Produktes in Form eines Polymerderivats durch ein Nichtlösungsmittel leicht und rasch gereinigt werden kann und daß eine überschüssige Menge des nicht an das Polymer gebundenen Ausgangsmaterials verwendet wird und der überschüssige Teil des Ausgangsmaterials mit hoher Reinheit zurückbehalten wird.
- Bei allen herkömmlichen Festphasenverfahren wird die Reaktion in einem heterogenen System ausgeführt. Demgemäß ist die Menge, die auf dem Festphasenträger getragen wird, das heißt die gebundene Menge des Ausgangsmaterials, klein. Selbst im Fall eines Polystyrolharzes, das mit 1% bis 2% Divinylbenzen vernetzt ist, wobei es sich dabei um einen herkömmlichen Träger handelt, der als einer mit einer hohen getragenen Menge angesehen wird, beträgt die getragene Menge eines Nucleosides oder Nucleotides 0,1 Millimol/g bis 0,4 Millimol/g. Im Gegensatz dazu kann im Fall von Acetylcellulose, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine große Menge des Nucleotides getragen werden, da die Menge des eingebrachten Abstandshalters 1,65 Millimol/g bis 1,97 Millimol/g beträgt und die Kondensationsreaktion zum Einbringen eines Nucleotides quantitativ wesentlich verbessert ist. Des weiteren ist es in dem herkömmlichen Festphasenverfahren, da die Reaktion ein heterogenes System ist, notwendig, das kondensieren de Agens, das Nucleotid- oder Oligonucleotid-3'-phosphodiesterderivat in großem Überschuß zu verwenden, während in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, da die Kondensationsreaktion in einem homogenen System ausgeführt wird, die Mengen der Ausgangsmaterialien reduziert werden können und die Raum-Zeit- Ausbeute erhöht werden kann. In speziellen Beispielen der vorliegenden Erfindung wird Acetylcellulose mit einem geringen Acetylierungsgrad (D.S. = 1,7 bis 1,8) als Ausgangsmaterial der Verbindung verwendet, die eine Schutzgruppe aus einem Polysaccharidderivat bildet, und Acetylcellulose mit einem geringen Acetylierungsgrad wird dahingehend als vorteilhaft angesehen, daß die Acetylcellulose viele Hydroxylgruppen aufweist, die Acetylcellulose in Pyridin, Pyridin/Wasser und dergleichen löslich ist, Hydroxylgruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, leicht blockiert werden können und die Acdylcellulose geeignete Nichtlösungsmittel besitzt.
- Ein weiteres charakteristisches Merkmal der in speziellen Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindung, die eine Schutzgruppe aus dem Polysaccharidderivat bildet, besteht darin, daß ein Abstandshalter eingebracht wird, um funktionelle Gruppen an die Acetylcellulose zu binden. In speziellen Beispielen der vorliegenden Erfindung wird in der Reaktion zum Einbringen einer funktionellen Gruppe mit einem Abstandshalter 4-(2-Monomethoxytrityloxyethylthio)dihydroxy zimtsäure < 3 > reagiert. Bei dieser Reaktion handelt es sich um eine Veresterung, und die Reaktionsmenge pro Mengeneinheit des Polymers ist groß, und die Menge des eingebrachten Abstandshalters ist groß. Dies dominiert die gebundene Menge der funktionellen Gruppe zum Blockieren der Phosphorsäuregruppe des Nucleotides, und als Folge wird eine große Menge an gebundenem Nucleotid pro Einheitsmenge des Polymers erhalten. In speziellen Beispielen der vorliegenden Erfindung wird eine 2-Hydroxyethylsulfonylgruppe als funktionelle Gruppe zum Blockieren der Phosphorsäuregruppe verwendet, und da die alkoholische Hydroxylgruppe in dieser funktionellen Gruppe eine primäre Hydroxylgruppe ist, kann die Phosphorsäureveresterung leicht erreicht werden. Des weiteren kann, da die Sulfonylgruppe angrenzend an das Kohlenstoffatom in der β-Position liegt, die funktionelle Gruppe durch β-Eliminierung unter schonenden Bedingungen entfernt werden, die keinen Einfluß auf andere funktionelle Gruppen haben. Diese Sulfonylgruppe wird durch Nachoxidieren des Schwefelatoms von 4-(2-Monomethoxytrityloxyethylthio)dihydroxyzimtsäure < 3 > erzielt. Dieses Schwefelatom kann zur Bestimmung des eingebrachten Abstandshalters verwendet werden.
- Die alkoholische Hydroxylgruppe der 2-Hydroxyethylsulfonylgruppe der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindung, welche die Schutzgruppe aus dem Polysaccharidderivat bildet, reagiert mit einer Carbonsäure oder Sulfonsäure ebenso wie mit Phosphorsäure, um eine Esterbindung zu bilden und als Schutzgruppe zu wirken. In der vorliegenden Erfindung wird zusätzlich zu der Reaktion mit der Phosphorsäuregruppe eine Reaktion verwendet, bei der Succinsäure an die Hydroxylgruppe der 2-Hydroxyethylsulfonylgruppe des Polysaccharidderivats gebunden wird, und die Verbindung, weldie die Schutzgruppe aus dem Polysaccharidderivat bildet, wird als die Schutzgruppe für das resultierende Mononucleotidsuccinat oder Oligonucleotidsuccinat mit endständiger Carboxylgruppe verwendet.
- Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele im Detail beschrieben, die in keiner Weise den Umfang der Erfindung beschränken.
- Die Synthese einer Verbindung, die eine Schutzgruppe aus einem Polysaccharidderivat bildet, ist in Beispiel 1 dargestellt, die Synthese von Oligonucleotiden vom RNA-Typ ist in den Beispielen 2 bis 9 dargestellt, und die Synthese von Oligonucleotiden vom DNA-Typ ist in den Beispielen 10 bis 15 dargestellt.
- 2-Chlorethanol (4,02 ml, 60 mmol) und Monomethoxytritylchlorid (9,2643 g, 30 mmol) wurden in Pyridin (150 ml) bei Raumtemperatur während 3 Stunden gerührt. Kaltes Wasser (15 ml) wurde zu der Reaktionslösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde während 30 Minuten gerührt, und das Reaktionsgemisch wurde mit Chloroform (500 ml) extrahiert und mit Wasser (200 ml x 3 Mal) gewaschen. Die organische Schicht wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde unter einem reduzierten Druck destilliert. n-Hexan (100 ml) wurde zu dem Rückstand hinzugefügt, um eine Kristallisation zu bewirken, und so wurden 9,6307 g (Ausbeute = 91%) 2- Chlorethylmonomethoxytritylether < 1 > erhalten.
- m.p.: 87ºC bis 88ºC
- ¹H-n.m.r. (CDCl&sub3;-TMS): δ3,30-3,50 (4H, m, -C-C &sub2; x 2), 3,60 (3H, s, OC &sub3;), 6,70 (2H, d, J = 9 Hz, Phenylproton x 2), 6,97 - 7,53 (12H, m, Phenylproton x 12)
- Elementaranalysenwerte als C&sub2;&sub2;H&sub2;&sub1;O&sub2;Cl:
- Berechnete Werte: C = 74, 89, H = 6,00
- Gefundene Werte: C = 75,00, H = 5,98
- 4-Mercaptodihydrozimtsäure wurde gemäß dem Verfahren von Gait et al. [M.J. Gait und R.C. Sheppard, Nucleic Acids Res., 4, 1135 bis 1158 (1977)] synthetisiert.
- 2-Chlorethylmonomethoxytritylether < 1 > (2,1172 g, 6 mmol) und 4-Mercaptodihydrozimtsäure < 2 > (0,9112 g, 5 mmol) wurden in Ethanol (15 ml) gelöst, und Diisopropylethylamin (2,45 ml, 15 mmol) wurde zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde erwärmt und während 12 Stunden refluxiert. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter einem reduzierten Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie gereinigt, um 1,9945 g (Ausbeute = 80%) 4- (2-Monomethoxytrityloxyethylthio)dihydrozimtsäure < 3 > in Form eines Sirups zu erhalten.
- ¹H-n.m.r. (CDCl&sub3;-TMS): δ2,56 (2H, t, J = 7,6 Hz, C-C &sub2;), 2,83 (2H, t, J = 7,6 Hz, C-C &sub2;), 3,01(2H, t, J = 6,8 Hz C-C &sub2;), 3,32 (2H, t, J = 6,8 Hz, C-C &sub2;), 3,64 (3H, s, OC &sub3;), 6,75 (2H, d, J = 8,8 Hz, Phenylproton x 2), 6,98 - 7,45 (16H, m, Phenylproton x 16)
- iv) 4-(2-Monomethoxytrityloxyethylthio)diiiydrozimtsäure < 3 > (2,7924 g, 5,6 mmol) und Acetylcellulose (D.S. = 1,77) (1,1794 g) wurden in Pyridin (5 ml) gelöst, und das Pyridin wurde durch Destillation unter einem reduzierten Druck entfernt. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt. Wasser in dem Gemisch wurde durch azeotrope Dehydratation entfernt, und der Rückstand wurde in Pyridin (28 ml) gelöst, 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (4,0231 g, 14,0 mmol) und 1-Methylimidazol (2,24 ml, 28,0 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt.
- Kaltes Wasser (5 ml) wurde zu der Reaktionslösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde während 30 Minuten gerührt, mit Chloroform extrahiert und mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert. Der Rückstand wurde einer azeotropen Destillation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen und in Pyridin (14 ml) gelöst, Acetanhydrid (4,7 ml) wurde zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 5 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, und eine kleine Menge Toluol wurde zu dem Konzentrat hinzugefügt, und eine azeotrope Destillation wurde unter einem reduzierten Druck ausgeführt, bis der Geruch von Pyridin verschwand. Der Rückstand wurde in Dioxan (130 ml) - Essigsäure (9 ml) gelöst, und eine wäßrige Lösung (19 ml) von Na&sub2;WO&sub4; H&sub2;O (0,1869 g) wurde zu der Lösung hinzugefügt. Die Temperatur wurde auf 80ºC erhöht, und 30% wäßriges Wasserstoffperoxid (28 ml) wurde über eine Zeitspanne von 1 Stunde hinweg in das Gemisch hineingetropft, und das Gemisch wurde während 1 Stunde gerührt. Die Reaktionstemperatur wurde auf Raumtemperatur abgesenkt, und das Reaktionsgemisch wurde mit Chloroform (150 ml) - Pyridin (20 ml) extrahiert und mit Wasser gewaschen (100 ml x 2 Mal). Die organische Schicht wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, der Rückstand wurde in Chloroform (30 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol (500 ml) getropft. Die gebildete Ausfällung wurde durch Filtration zuruckbehalten, mit Ethanol (200 ml) gewaschen und unter einem reduzierten Druck getrocknet, um 2,9753 g eines weißen Pulvers zu erhalten.
- Das so erhaltene weiße Pulver (2,6316 g) wurde in einer 0,7 M Lösung (30 ml) von Zinkbromid in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) gelöst, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, bis das Volumen auf etwa 1/2 reduziert war, und das Konzentrat wurde unter starkem Rühren in Ethanol (400 ml) getropft. Die gebildete Ausfällung wurde durch Filtration zurückbehalten, mit Ethanol (100 ml) gewaschen und unter einem reduzierten Druck getrocknet, um 1,8160 g 4-(2-Hydroxyethylsulfonyl)dihydrocinnamoyl acetyl cellulose < 4 > in Form eines weißen Pulvers zu erhalten. Die Menge des in die Verbindung < 4 > eingebrachten Abstandshalters wurde zu 1,65 mmol/g von dem S-Gehalt (5,30%, 1,65 mmol S pro Gramm) berechnet.
- 4-(2-Hydroxyethylsulfonyl)dihydrocinnamoylacetylcellulose < 4 > (1,65 mmol/g) (0,2424 g, 0,4 mmol) und Triethylamin-N³-anisoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tetrahydropyranyluridin-3'-(2-chlorphenyl)phosphat < 5 > (0,3170 g, 0,3 mmol) wurden in Pyridin (3 ml) gelöst, und das Pyridin wurde durch Destillation unter einem reduziert en Druck entfernt. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt, und Wasser in dem Gemisch wurde durch azeotrope Dehydratation entfernt. Der Rückstand wurde in Pyridin (3 ml) gelöst, und 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,2726 g, 0,9 mmol) und 1-Metliylinudazol (0,14 ml, 1,8 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt. Kaltes Wasser (0,5 ml) wurde zu der Reaktionslösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde während 30 Minuten gerührt, und Methylenchlorid (50 ml) wurde zu dem Gemisch hinzugefügt, und das Gemisch wurde mit Wasser (30 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, und der Rückstand wurde einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (3 ml x 3 Mal) unterzogen. Der Rückstand wurde in Pyridin (7,5 ml) gelöst, Acetanhydrid (2,5 ml) wurde zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 5 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, eine kleine Menge Toluol urde zu dem Konzentrat hinzugefügt, und eine azeotrope Destillation wurde unter einem reduzierten Druck ausgeführt, bis der Pyridingeruch verschwand.
- Der Rückstand, der das Acetylcellulosederivat < 4 > enthielt, in den eine kleine Menge Triethylamin-N³-anisoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tetrahydropyranyluridin-3'-(2-chlorphenyl)phosphat < 5 > eingebracht wurde, wurde in einer kleinen Menge Methylenchlorid gelöst, und die Lösung wurde in Ethanol getropft, um die Verbindung < 4 > in ein Pulver (3,1 mg) umzuwandeln. Die Dimethoxytritylgruppe wurde von der 5'- Hydroxylgruppe durch eine Behandlung mit einer 2%igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) entfernt, und eine Färbung wurde in 60% Perchlorsäure - Ethanol (3:2 v/v) ausgeführt, und die Menge der in das Acetylcellulosederivat < 4 > eingebrachten Verbindung < 5 > wurde durch Messen der dekadischen Extinktion bei 498 nm (ε = 72000) bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die Menge der eingebrachten Verbindung < 5 > 0,56 mmol/g betrug und die Kondensationsausbeute 99% war.
- Der Rückstand wurde in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt, und eine Lösung von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,3954 g) in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) (5 ml) wurde zu der obigen Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde während 15 Minuten gerührt, und die Reaktionslösung wurde mit einer gesättigten wäßrigen Lösung aus Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und mit Chloroform extrahiert. Die organische Schicht wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, der Rückstand wurde in Chloroform (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol (200 ml) getropft. Die gebildete Ausfällung wurde durch Filtration zurückbehalten, um 0,3330 g (0,224 mmol, Ausbeute = 75%, 0,674 mmol/g) der pulverigen Verbindung < 6 > zu erhalten [siehe Formel (4)].
- Die Verbindung < 6 > (0,3330 g) und Triethylamin-N³-anisoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'- O-tetrahydropyranyluridin-3'-(2-chlorphenyl)phosphat < 5 > (0,2958 g, 0,28 Millimol) wurden einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (3 ml x 3 Mal) unterzogen. Der Rückstand wurde in Pyridin (2,8 ml) gelöst, 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,2544 g, 0,84 mmol) und 1-Methylimidazol (0,13 ml, 0,168 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt. Kaltes Wasser (0,5 ml) wurde zu der Reaktionsflüssigkeit hinzugefügt, und das Gemisch wurde wanrend 30 Minuten gerührt, mit Methylenchlorid extrahiert und mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert. Eine kleine Menge des Rückstandes wurde in Methylenchlorid gelöst, und die Lösung wurde in Ethanol getropft, uin ein pulveriges Produkt (2,9 mg) zu erhalten. Bei der Bestimmung der Dimethoxytritylgruppe wurde festgestellt, daß der Gehalt der Limethoxytritylgruppe 0,401 mmol/g betrug und die Kondensationsausbeute 97% war.
- Der Rückstand wurde in Pyridin - Triethylamin (3:1 v/v) (8 ml) gelöst, die Lösung wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt, und die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Pyridin (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol (200 ml) getropft, die gebildete Ausfällung < 9 > [siehe Formel (5)] wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Umkehrphasen-Säulenchromatographie (Eluent: 40% bis 60% Aceton - 0,05 M wäßrige Lösung von TEAB) separiert, um 0,2926 g eines Dinucleotidderivats < 8 > (0,173 mmol, 58%) zu erhalten. Bei diesem Schritt wurden 0,526 g (0,05 mmol) der Verbindung < 5 > zurückbehalten.
- Der Rf-Wert von TLC unter Verwendung von Silicagel als dem Träger und die Daten von ¹H-n.m.r. der Verbindung < 8 > befanden sich in Übereinstimmung mit jenen der < 8' > , die durch das Flüssigphasenverfahren synthetisiert wurde, und es wurde bestätigt, daß < 8 > die Struktur von < 8' > aufwies.
- Die Werte der physikalischen Eigenschaften der Verbindung < 8 > (B&sub1; = B&sub2; = N³- Anisoyluracil-1-yl) waren wie folgt (für diese Messung wurde das Diastereomer von 2'-O-Tetrahydropyranyluridin mit einer hohen Polarität verwendet).
- ¹H/n.m.r. (CDCl&sub3;-TMS): δ1,21 (9H, t, J = 7,3 Hz, C &sub2; x 3), 1,27 - 1,75 (12H, m, C-C &sub3; x 6), 2,95 (6H, q, C-C &sub2; x 3), 3,41 - 3,68 (6H, m, 11-5',5' und O-C &sub2; x 2), 3,796, 3,80, 3,83 und 3,85 (12H, s x 4, OC &sub3; x 4), 4,16 - 5,75 (12H, m, H-5 x 2, 2' x 2, 3' x 2, 4' x 2, 5', 5" und -O-C -O x 2), 5,30 (1H, s, -OH), 6,05, 6,11, 6,15 und 6,27 (2H, d x 4, Hl' x 2), 6,83 - 7,92 (31H, m, Phenylproton x 29 und H6 x 2)
- Rf-Werte: 0,28 (Aceton - Wasser, 6:4 v/v), 0,65 (Aceton - Wasser, 7:3 v/v)
- Gemäß den gleichen Prozeduren, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden die Verbindung < 4 > (1,65 mmol/g) (0,2424 g, 0,4 mmol) und Triethylamin-³N-anisoyl-5'- O-dimethoxytrityl-2'-O'-tetrahydropyranyluridin-3,-(2-chlorphenyl)phosphat < 5 > (0,3170 g, 0,3 Millimol) in Pyridin (3 ml) als dem Lösungsmittel mit 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,2726 g, 0,9 mmol) und 1-Methylimidazol (0,14ml, 1,8 mmol) reagiert, und das Reaktionsgemisch wurde mit Acetanhydrid (2,5 ml) - Pyridin (7,5 ml) behandelt (die Kondensationsausbeute betrug 99%). Dann wurde das Reaktionsgemisch mit einer 2%igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) behandelt, das Reaktionsgemisch wurde in Chloroform gelöst, und die Lösung wurde in Ethanol getropft, um 0,3680 g der pulverigen Verbindung < 6 > (0,255 mmol 85%, 0,693 mmol/g) zu erhalten.
- Die Verbindung < 6 > (0,3680 g) und Triethylamin-N&sup6;-benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tetrahydropyranyladenosin-3,-(2-chlorphenyl)phosphat < 5 > (0,3359 g, 0,32 mmol) wurden in Pyridin (3,2 ml) als dem Lösungsmittel mit 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,2907 g, 0,96 mmol) und 1-Methylimidazol (0,15 ml, 1,92 mmol) reagiert (die Kondensationsausbeute betrug 96%). Das Reaktionsgemisch wurde mit Triethylamin - Pyridin (1:3 v/v) (8 ml) behandelt, und der Acetylcelluloserest wurde durch Ethanol ausgefällt, durch Filtration zurückbehalten und durch Umkehrphasen- Silicagel-Säulenchromatographie separiert, um 0,2978 g des Dinucleotidderivats < 8 > (1,77 mml, 59%) zu erhalten. Bei diesem Schritt wurden 0,0630 g (0,06 mmol) der Verbindung < 5 > (B&sub2; = N&sup6;-Benzoyladenin-9-yl) gewonnen. Es ist zu erwähnen, daß der Rf-Wert von TLC und die Daten von ¹H-n.m.r. der Verbindung < 8 > identisch mit jenen der Verbindung < 8' > waren, die durch das Flüssigphasenverfahren synthetisiert wurde, und es wurde bestätigt, daß die Verbindung < 8 > die Struktur der Verbindung < 8' > aufwies.
- Die Werte der physikalischen Eigenschaften der Verbindung < 8 > (B&sub1; = N³-Anisoyluracil-1-yl, B&sub2; = N&sup6;-Benzoyladenin-9-yl) waren wie folgt (für die Messung wurden die Diastereomere von 2'-O-Tetrahydropyranyluridin und 2'-O-Tetrahydropyranyladenosin mit einer hohen Polarität verwendet).
- ¹H-n.m.r. (CDCl&sub3;/TMS): δ1,19 - 1,66 (12H, m, C-C &sub2; x 6), 1,22 (9H, t, J = 7,3 Hz, C &sub3; x 3), 2,96 (6H, q, C-C &sub2; x 3), 3,04 - 3,78 (6H, m, H5', 5" und O-C &sub2; x 2), 3,75 (6H, s, OC &sub3;), 3,83 (3H, s, OC &sub3;), 4,28 - 5,84 (11H, m, H-5, 2' x 2, 3' x 2, 4' x 4, 5', 5" und O-C -O x 2), 5,38 (1H, s, -OH) 6,15, 6,17, 6,34 und 6,39 (2H, d x 4, H-1' x 2), 6,76 - 8,67 (33H, m, Phenylproton x 30, H-2,8 und H-6), 9,28 (1H, br s, NH)
- Rf-Werte. 0,30 (Aceton - Wasser, 6:4 v/v), 0,6((Aceton Wasser, 7.3 v/v)
- Gemäß den gleichen Prozeduren, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden die Verbindung < 4 > (1,65 mmol/g) (0,6061 g, 1,00 mmol) und Triethylamin-N&sup6;-benzoyl-5'-O- dimethoxytrityl-2'-O-tetrahydropyranyladenosin-3'-(2-chlorphenyl)phosphat (0,7872 g, 0,75 mmol) in Pyridin (7,5 ml) als dem Lösungsmittel mit 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlond (0,6814 g, 2,25 mmol) und 1-Methylimidazol (0,36 ml, 4,5 mmol) reagiert, und das Reaktionsgemisch wurde mit Acetanhydrid (6,25 ml) - Pyridin (18,25 ml) behandelt (die Kondensatioiisausbeute betrug 96%). Das Reaktionsgemisch wurde mit einer 2%igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) behandelt und wurde in Chloroform gelöst, und die Lösung wurde in Ethanol getropft, um 0,9166 g der pulverigen Verbindung < 6 > (0,638 mmol, Ausbeute von 85%, 0,696 mmol/g) zu erhalten. Die Verbindung < 6 > (0,9166 g) und Triethylamin-N&sup6;- benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tetrahydropyranyladenosin-3,-(2-chlorphenyl)phosphat < 5 > (0,8370 g, 0,80 mmol) wurden in Pyridin (8 ml) als dem Lösungsmittel mit 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,7269 g, 2,40 mmol) und 1-Methylimidazol (0,38 ml, 4,8 mmol) reagiert (die Umwandlungsausbeute betrug 94%). Das Reaktionsgemisch wurde mit Triethylamin - Pyridin (1:3 v/v) (20 ml) behandelt, und die Acetylcellulose < 9 > wurde durch Ethanol ausgefällt, durch Filtration zurückbehalten und durch Umkehrphasen-Silicagel-Säulenchromatographie separiert, um 0,7701 g des Dinudeotidderivats < 8 > (0,459 mmo], Ausbeute von 61%) zu erhalten. Bei diesem Schritt wurden 0,1679 g (0,160 mmol) der Verbindung < 5 > (B&sub2; = N&sup6;-Benzoyladenin-9-yl) gewonnen.
- Die Rf-Werte und die Daten von ¹H n.m.r. der Verbindung < 8 > waren identisch jenen der Verbindung < 8' > , die durch das Flüssigphasenverfahren synthetisiert wurde, und es wurde bestätigt, daß die Verbindung < 8 > die Struktur der Verbindung < 8'> aufwies.
- Die Werte der physikalischen Eigenschaften der Verbindung < 8 > (B&sub1; = B&sub2; = N&sup6;- Benzoyladenin-9-yl) waren wie folgt (für die Messung wurde das Diastereomer von 2'-O-Tetrahydropyranyladenosin mit einer niedrigen B&sub1;-Polarität und einer hohen B&sub2;- Polarität verwendet).
- ¹H-n.m.r. (CDCl&sub3;/TMS): δ1,22 - 1,62 (12H, m, C-CH&sub2; x 6), 1,25 (9H, t, J = 7,3 Hz, C &sub3; x 3), 2,60 - 3,85 (6H, m, H-5', 5" und -C-C &sub2; x 2), 3,00 (6H, q, -C-C &sub2; x 3), 3,74 und 3,75 (6H, s x 2, OC &sub3; x 2), 4,53 - 5,51 (10H, m, H-2' x 2, 3' x 2, 4' x 2,5',5" und O-C -O x 2), 5,30 (1H, s, -OH), 6,26, 6,31, 6,36 und 6,39 (2H, d x 4, H-1' x 2), 6,74 - 8,79 (35H, m, H-2 x 2, 8 x 2 und Phenylproton x 31), 9,20 - 9,44 (2H, m, -NH x 2)
- Rf-Werte: 0,32, 0,29 (Aceton - Wasser, 6:4 v/v), 0,69, 0,66 (Aceton - Wasser, 7:3 v/v)
- Gemäß den gleichen Prozeduren, wie oben bei der Synthese (i) von < 8 > beschrieben, wurden die Verbindung < 4 > (1,65 mmol/g) (0,3182 g, 0,525 mmol) und eine Verbindung < 8 > (B&sub1; = B&sub2; = N&sup6;-Benzoyladenin-9-yl) (0,5871 g, 0,35 mmol) in Pyridin (10,5 ml) als dem Lösungsmittel mit 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,3180 g, 1,05 mmol) und 1-Methylimidazol (0,17 ml, 2,10 mmol) reagiert, und das Reaktionsgemisch wurde mit Acetanhydrid (2,5 ml) - Pyridin (7,5 ml) behandelt (die Kondensationsausbeute betrug 100%). Dann wurde das Reaktionsgemisch mit einer 2%igen Lösung voll Toluolsulfonsäure in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) behandelt und in Chloroform gelöst, und die Lösung wurde in Ethanol getropft, um 0,6248 g eines pulverigen Acetylcellulosederivats zu erhalten, das ein darauf getragenes Dinucleotid mit einer freien Carboxylgruppe am 5'-Ende aufweist (0,288 mmol, Ausbeute von 82%, 0,462 mmol/g).
- Dieses Pulver (0,6248 g) und eine Verbindung < 8 > (B&sub1; = B&sub2; = N&sup6;-Benzoyladenin-9-yl) (0,6760 g, 0,403 mmol) wurden in Pyridin (8 ml) als dem Lösungsmittel mit 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,3662 g, 1,21 mmol) und 1-Methylimidazol (0,20 ml, 2,42 mmol) reagiert (die Kondensationsausbeute betrug 90%).
- Darin wurde das Reaktionsgemisch mit Triethylamin - Pyridin (1:3 v/v) (10,5 ml) behandelt, und der Acetylcelluloserest wurde durch Ethanol ausgefällt, durch Filtration zurückbehalten und durch Umkehrphasen-Silicagel-Säulenchromatographie separiert, um 0,5095 g (0,174 mmol, Ausbeute,non 50%) eines Tetranucleotidderivats zu erhalten. Bei diesem Schritt wurden 0,1778 g (0,106 mmol) der Verbindung < 8 > gewonnen.
- Die Werte der physikalischen Eigenschaften der Verbindung < 10 > (B&sub1; = B&sub2; = B&sub3; = B&sub4; = N&sup6;-Benzoyladenin-9-yl) waren wie folgt (für die Messung wurde das Diastereomer von 2'-O-Tetrahydropyranyladenosin mit einer hohen Polarität verwendet).
- ¹H-n.m.r. (CDCl&sub3;/TMS): δ1,12 - 1,76 (24H, m, C-C &sub2; x 12), 1,23 (9H, t, J = 7,3 Hz, C &sub3; x 3), 2,90 - 3,56 (8H, m, O-CH&sub2;- x 4), 2,97 (6H, q, C-CH&sub2; x 4), 3,68 - 3,92 (2H, m, H-5' und 5"), 3,72 (6H, s, OC &sub3; x 2), 4,12 - 5,72 (22H, m, H-2' x 4, 3' x 4, 4' x 4, 5' x 3, 5" x 3 und O-CH-O x 4). 5,30 (1H, s, -OH), 6,10 - 6,35 (4H, m, H - 1' x 4), 6,73 - 8,81(57H, m, H -2 x 4, 8 x 4 und Phenylproton x 49), 9,20 - 9,76 (4H, m, NH x 4)
- Rf-Werte: 0,10 (Aceton - Wasser, 6:4 v/v), 0,45 (Aceton - Wasser, 7:3 v/v)
- 5'-O-Dimethoxytrityl-O&sup6;-diphenylcarbamoyl-N²-isobutyryl-2'-O-(tetrahydropyran-2- yl)guanosin (1, 6670 g, 1,78 mmol) wurde in Methylenchlorid (8,9 ml) gelöst, und Bernsteinsäureanhydrid (0,3568 g, 3,57 mmol) sowie DMAP (0,4362 g, 3,57 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt. Kaltes Wasser (5 ml) wurde zu dem Gemisch hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und mit Methylenchlorid (50 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit 0,1 M TEAB (20 ml x 3 Mal) gewaschen und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und das Magnesiumsulfat wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde einer Destillation unter einem reduzierten Druck unterzogen, und der Rückstand wurde durch Silicagel- Säulenchromatographie [2,5 cm im Durchmesser x 10 cm in der Länge, Methanol - Methylenchlorid] gereinigt, um 1,7370 g (die Ausbeute betrug 94%) glasartiges 5'- O-Dimethoxytrityl-O&sup6;-diphenylcarbamoyl-N²-isobutyryl-2'-O-(tetrahydropyran-2-yl)guanosin-3'-succinat < 11 > zu erhalten.
- Rf-Wert: 0,42 (CHCl&sub3; - MeOH, 9:1 v/v)
- ¹H-n.m.r. (CDCl&sub3; - TMS): δ1,12 - 1,19 (6H, m, C(CH&sub3;)&sub2;), 1,24 - 1,70 (6H, m, C-CH&sub2;-C x 3), 2,51 - 2,84 (3H, m, C (CH&sub3;)&sub2; und -CH&sub2;COOH), 2,96 - 3,23 (2H, m O-C &sub2;), 3,29 - 3,49 (2H, m, CH&sub2;COO-), 3,67 - 3,82 (2H, m, H - 5' und 5"), 3,75, 3,74 und 3,79 (9H, s x 3, OC &sub3;), 4,30 - 4,35 (1H, m, H - 4'), 4,68 - 4,74 (1H, m, O-CH-O), 5,25 (1H, dd, J2'3' = 4,88 Hz, Hz'), 5,50 - 5,56 (1H, m, H-3'), 6,27 (1H, d, J1'2' = 7,81 Hz, H - 1'), 6,77 - 7,76 (23H, m, Phenylproton x 23), 8,18 (1H, s, H - 8), 8,31 (1H, s, N² - H), 8,54 - 8,62 (1H, m, COO )
- Elementaranalysenwerte (C&sub5;&sub7;H&sub5;&sub8;N&sub6;O&sub1;&sub3; H&sub2;O):
- Berechnete Werte: C = 65,01, H = 5 74 N = 7,98
- Gefundene Werte: C = 64,74, H = 5,62, N = 7,92
- 4-(2-Hydroxyethylsulfonyl)dihydrocinnamoylacetylcellulose < 4 > (1,65 mmol/g) (0,3636 g, 0,6 mmol), das in Beispiel 1 erhalten wurde, und 5'-O-Dimethoxytrityl- O&sup6;-diphenylcarbamoyl-N²isobutyryl-2'-O-(tetrahydropyran-2-yl)guanosin-3'-succinat < 11 > (0,4140 g, 0,4 mmol), das in Beispiel 6 erhalten wurde, wurden einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen, und das Reaktionsgemisch wurde in Pyridin (6 ml) gelöst. Dann wurden 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,3634 g, 1,2 mmol) und 1-Methylimidazol (0,20 ml, 2,4 mmol) zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt. Kaltes Wasser (2 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Methylenchlorid (60 ml) extrahiert und mit Wasser (20 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde konzentriert und einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen, Acetanhydrid - Pyridin (1:3 v/v) (15 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 5 Stunden gerührt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde konzentriert, und eine kleine Menge Toluol wurde hinzugefügt, und eine azeotrope Destillation wurde wiederholt, bis der Pyridingeruch verschwand. Eine kleine Menge des Rückstandes wurde in Methylenchlorid gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol getropft, und die Dimethoxytritylgruppe wurde durch Verwenden eines weißen Pulvers (4,3 mg) bestimmt, das durch Scheiden der gebildeten Ausfällung erhalten wurde (die darauf getragene Menge war 0,5 mmol/g, und die Kondensationsausbeute betrug 98%).
- Der verbliebene Rückstand wurde in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) (5 ml) gelöst, und unter Abkühlung auf 0ºC wurde eine Lösung von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,3954 g) in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) (5 ml) zu der obigen Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde während 15 Minuten gerührt, durch eine 5%ige wäßrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und mit Chloroform (100 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Chloroform (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol (200 ml) getropft. Die gebildete Ausfällung wurde durch Filtration gesammelt, um ein Acdylcellulosederivat < 12 > , das ein Guanosin-3'-succinat mit einer freien 5'-Hydroxylgruppe trägt, mit einer Ausbeute von 66% zu erhalten (0,4511 g, 0,589 mmol/g).
- 4-(2-Hydroxyethylsulfönyl)dihydrocinnamoylacetylcellulose < 4 > (1,65 mmol/g) (0,2727 g, 0,45 mmol), das in Beispiel 4 erhalten wurde, und ein Dinucleotid-3'-phosphodiesterderivat < 8 > (B&sub1; = UAN, B&sub2; = ABz) (0,5048 g, 0,3 mmol) wurden in Pyridin (4,5 ml) gelöst, und 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (TPS) (0,2726 g, 0,9 mmol) sowie 1-Methylimidazol (1-Meim) (0,144 mml, 1,8 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, um eine Kondensation zu bewirken. Das Reaktionsgemisch wurde mit Acetanhydrid (2,5 ml) - Pyridin (7,5 ml) behandelt (die Kondensationsausbeute betrug 94%). Dann wurde das Reaktionsgemisch mit einer 2%igen Lösung von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) behandelt und in Chloroform (10 ml) gelöst. Die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol (200 ml) getropft, um ein pulveriges Acetylcellulosederivat mit einem darin eingebrachten Dinucleotid mit einer freien Hydroxylgruppe am 5'-Ende (n = 2, B&sub1; = UAN, B&sub2; = ABZ) mit einer Ausbeute von 72% zu erhalten (0,5090 g, 0,427 mmol/g).
- Dann wurden die Verbindung < 14 > (n = 2, B&sub1; = UAN, B&sub2; = ABZ) (0,5090 g) und ein Dinucleotid-3'-phosphodiesterderivat < 8 > (B&sub1; = B&sub2; = UAN) (0,5526 g, 0,326 mmol) in Pyridin (6,5 ml) gelöst, und 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,2962 g, 0,978 mmol) sowie 1-Methylimidazol (0,156 ml, 1,96 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, um eine Kondensation zu bewirken (die Kondensationsausbeute betrug 99%). Das Reaktionsgemisch wurde in Methylenchlond (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol (200 ml) getropft, um ein pulveriges Acetylcellulosederivat < 15 > mit einem darauf getragenen Tetramer mit einer Äusbeute,Ton 61% (0,7307 g, 0,252 mmol/g) zu erhalten.
- Es ist zu erwähnen, daß das Filtrat konzentriert wurde und der Rückstand durch Umkehrphasen-Silicagel-Säulenchromatographie (2,5 cm im Innendurchmesser x 10 cm in der Länge, 40% bis 60% Aceton - 0,05 M TEAB wäßrige Lösung) gereinigt wurde, um 0,1251 g (0,072 ml) von < 8 > (B&sub1; = B&sub2; = UAN) zurückzubehalten.
- Das pulverförmige, am Tetramer getragene Acetylcellulosederivat < 15 > (0,7306 g), das durch Wiederholen des oben erwähnten Vorgangs erhalten wurde wurde mit Acetanhydrid (2,5 ml) - Pyridin (7,5 ml) behandelt und dann mit einer 2%igen Lösung von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde in Chloroform (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde in Ethanol (200 ml) getropft, um ein pulveriges Acetylcellulosederivat < 16 > mit einem darauf getragenen Tetranucleotid mit einer freien Hydroxylgruppe am 5'-Ende (n = 4, B&sub1; = B&sub3; = B - UAN, B&sub2; = ABZ) mit einer Ausbeute von 47% (0,5173 g, 0,273 mmol/g) zu erhalten.
- Des weiteren wurden < 16 > (n = 4, B&sub1; = B&sub3; = B&sub4; = UAN, B&sub2; = ABZ) (0,5173 g) und < 8 > (B&sub1; = B&sub2; = ABZ) (0,3523 g, 0,21 mmol) in Pyridin (4,2 ml) gelöst, und 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,1908 g, 0,63 mmol) sowie 1-Methylimidazol (0,1 ml, 1,26 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, um eine Kondensation zu bewirken (die Kondensationsausbeute betrug 84%). Dann wurde das Reaktionsgemisch mit einer Lösung aus Triethylamin - Pyridin (1:3 v/v) behandelt, um den in ein Sulfonylalken umgewandelten Rückstandsanteil der Acetylcellulose aus Ethanol auszufällen. Die Ausfällung wurde durch Filtration zurückbehalten und durch Umkehrphasen-Silicagel-Säulenchromatographie separiert, um ein Hexanucleotid-3'-phosphodiesterderivat < 13 > (m = 6, B&sub1; = B&sub3; = B&sub4; = UAN, B&sub2; = B&sub5; = B&sub6; = ABZ) mit einer Ausbeute von 21% (0,2527 g) zu erhalten. Bei diesem Schritt wurden 0,1310 g (0,078 mmol) eines Dinucleotid-3'-phosphodiesterderivats < 8 > (B&sub1; = B = ABZ) zurückbehalten.
- Die Werte der physikalischen Eigenschaften des Hexanucleotid-3'-phosphodiesterderivats < 13 > (m = 6, B&sub1; = B&sub3; = B&sub4; = UAN, B&sub2; = B&sub5; = B&sub6; = ABZ) waren wie folgt.
- Rf-Werte: 0,05 (Aceton - Wasser, 6:4 v/v), 0,27 (Aceton - Wasser, 7:3 v/v).
- Ein Hexanucleotidderivat < 13 > (DMTr[AAUUAU]pOH) (0,4208 g, 0,1 mmol) mit einer funktionellen Phosphodiestergruppe am 5'-Ende und das Acetylcellulosederivat < 12 > (0,4244 g, 0,25 mmol) mit einem darauf getragenen Guanosin-3'-succinat mit einer freien 5'-Hydroxylgruppe, das in Beispiel 7 erhalten wurde, wurden einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen, und das Reaktionsgemisch wurde in Pyridin (5 ml) gelöst.
- 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,1211 g, 0,4 mmol) und 1-Methylimidazd (0,065 ml, 0,8 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt. Dann wurde kaltes Wasser (2 ml) in dem Reaktions gemisch hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt, mit Methylenchlorid (60 ml) extrahiert und mit Wasser (20 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde konzentriert und einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen, Acetanhydrid - Pyridin (1:3 v/v) (10 ml) wurde zu dem Rückstand hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 5 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde konzentriert, und eine kleine Menge Toluol wurde zu dem Rückstand hinzugefügt, und die azeotrope Destillation wurde wiederholt, bis der Pyridingeruch verschwand (die Konzentrationsausbeute betrug 98%, 0,117 mmol/g). Der Rückstand wurde in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) (10 ml) gelöst, und unter Abkühlen auf 0ºC wurde eine Lösung von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,3954 g) in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) (10 ml) zu der Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde während 15 Minuten gerührt, mit einer 5%igen wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und mit Chloroform (100 ml) extrahiert, und die organische Schicht wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Chloroform (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol (200 ml) getropft. Die gebildete Ausfällung wurde durch Filtration gesammelt, um ein Acetylcellulosederivat < 18 > mit einem darauf getragenen Heptamer mit einer Hydroxylgruppe am 5'-Ende mit einer Ausbeute von 87% zu erhalten (0,7210 g, 0,121 mmol/g).
- Das so erhaltene Cellulosederivat < 18 > (0,7210 g, 0,087 mmol) und das Tetranucleotidderivat < 10 > mit einer funktionellen Phosphodiestergruppe am 3'-Ende (DMTr[AAAA]pOH) (0,6424 g, 0,219 mmol), das in Beispiel 5 erhalten wurde, wurden einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen, und der Rückstand wurde in Pyridin (8,7 ml) gelöst. 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,1990 g, 0,657 mmol) und 1-Methylimidazol (0,107 ml, 1,314 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt. Dann wurde kaltes Wasser (2 ml) zu dem Reaktionsgemlsch hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt, mit Methylenchlorid (100 ml) extrahiert und mit Wasser (30 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, der Rückstand wurde in Methylenchlorid (10 ml) gelöst, und die Lösung würde unter starkem Rühren in Ethanol (200 ml) getropft. Die gebildete Ausfällung wurde durch Filtration gesammelt, um ein Acetylcellulosederivat < 19 > mit einem darauf getragenen Undecamer mit einer Gesamtausbeute von 69% (0,7911 g, 0,087 mmol/g) zu erhalten (die Kondensationsausbeute betrug 96%). Es ist zu erwahnen, daß 0,2180 g (0,074 mmol) des Tetranucleotidderivats < 10 > von dem Filtrat durch Entfernen von Ethanol mittels Destillation und Durchführen einer Reinigung durch Umkehrphasen-Silicagel-Säulen chromatographie zurückbehalten wurden.
- Das am Undecamer getragene Acetylcellulosederivat < 19 > (44,8 mg, 3,97 mmol) wurde in einer 0,5 M Lösung von 2-Pyridincarboxyaldoxim-1,1,3,3-tetramethylguanidin in Pyridin-Wasser (9:1 v/v) (0,6 ml) gelöst, und man ließ die Lösung bei Raumtemperatur 1 Tag lang stehen. Ethanol (30 ml) wurde zu der Reaktionslösung hinzugefügt, um den Acetylcellulosederivatrückstand < 9 > , von dem das Undecamer freigesetzt worden war, auszufällen, und es wurde eine Zentrifugaltrennung ausgeführt (3000 U/min, 4ºC, 10 Minuten), und der Flüssigkeitsüberstand wurde konzentriert. Konzentrierter wäßriger Ammoniak (28%) (20 ml) wurde zu dem Rückstand hinzugefügt, und das Gemisch wurde abgedeckt, man ließ es bei 55ºC während 6 Stunden stehen und konzentrierte es unter einem reduzierten Druck. SEP-PAK (C-18) (Waters Co.), das für mehr als 3 Stunden nach Injektion von Acetonitril - Wasser (9:1 v/v) (10 ml) stehengelassen wurde, wurde mit 20 ml 50 mM TEAB (hergestellt durch Verdünnen von 1 M TEAB mit einem pH-Wert von 8,0) gewaschen, und die in 50 mM TEAB (20 ml) gelöste Probe (Rückstand) wurde in das gewaschene SEP-PAK (C-18) (Waters Co.) injiziert.
- 2-Pyridincarboxyaldoxim und 1,1,3,3-Tetramethylguanidin wurden durch 15% Acetonitril - 50 mM TEAB (30 ml) und dann durch 18% Acetonitril - 50 mM TEAB (10 ml) eluiert, und das Undecamer wurde durch 35% Acetonitril - 50 mM TEAB (10 ml) eluiert, und das Eluat wurde gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in Wasser (1 ml) gelöst, und die Probe (0,1 ml) wurde durch HPLC (M & S PACK C-18, 4,6 mm im Innendurchmesser x 150 mm in der Länge, 10% bis 50% Acetonitril - 0,1 M TEAA) gereinigt (die erzielten Resultate sind in Fig. 1 gezeigt). Das Eluat wurde durch einen UV-Monitor (280 nm) bestatigt, und der mittlere Teil des Hauptpeaks wurde gesammelt und unter reduziertem Druck konzentriert. Wasser (1 ml) wurde zu dem Konzentrat hinzugefügt, und eine Destillation wurde unter einem reduzierten Druck ausgeführt, bis das Triethylamin verschwand. Der Rückstand,wurde in einer wäßrigen Salzsäurelösung (5 ml) mit einem pH-Wert von 2,0 gelöst, und man ließ die Lösung bei Raumtemperatur 2 Tage lang stehen. Die Lösung wurde mit verdünntem wäßrigem Ammoniak neutralisiert und mit Ethylacetat (10 ml x 3 Mal) gewaschen, und die wäßrige Phase wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert. Die Probe (Rückstand) wurde in Wasser (200 ul) gelöst, und die Probe (180 ul) wurde durch HPLC (M & S PACK C-18, 4,6 mm im Innendurchmesser x 150 mm in der Länge, 5% bis 19% Acetonitril 0,1 M TEAA) gereinigt (die erzielten Resultate sind in Fig. 2 ge- zeigt). Bei diesem Schritt wurde das Eluat durch einen UV-Monitor bestätigt und der mittlere Teil jedes Peaks wurde gesammelt und gefriergetrocknet, um 1,51 OD eines Undecamers (ApApApApApApUpUpApUpG) zu erhalten, von dem alle Schutzgruppen entfernt worden waren.
- Ein 1 M Ammoniumacetatpuffer (pH 5,3) (10 ul) und Nuclease P1 (Yamasa Shoyu Co., 1 mg/5 ul) (3 ul) wurden zu einer wäßrigen Lösung (86,32 ul) des Undecamers < 17 > (0,1 OD) mit entfernten Schutzgruppen hinzugefügt, und man ließ das Gemisch bei 37ºC während 30 Minuten stehen.
- Das Enzymzersetzungsprodukt wurde durch HPLC (M & S PACK C-18, 4,6 mm im Innendurchmesser x 150 mm in der Länge) separiert.
- Das Undecamer wurde vollständig zersetzt, um ein Zersetzungsprodukt mit Adenosin, Guanosin-5-phosphat, Uridin-5'-phosphat und Adenosin-5'-phosphat mit einem Verhältnis von 1,38:1,31:3,00:5,95 zu erhalten.
- Es wird gesagt, daß Nuclease P1 die Eigenschaft aufweist, Adenosin-5'-phosphat weiter zu Adenosin zu zersetzen. Das im Hinblick auf diese Tatsache bestimmte Verhältnis, das heißt das Verhältnis von (Adenosin + Adenosin-5'-phosphat) zu Uridin-5'-phosphat zu Guanosin-5'-phosphat, beträgt 7,00:2,87:1,25.
- Ein Di-2'-deoxyribonudeotid-3'-phosphodiester < 20 > (B&sub1; = B&sub2; = TBZ) wurde aus 4-(2-Hydroxyethylsulfonyl)dihydrocinnamoylacetylcellulose < 4 > , die in Beispiel 1 erhalten wurde, gemäß der folgenden Reaktionsformel synthetisiert: Acetylcellulose Pyridin l-Meim Acetylcellulose Umkehrphasen-Silicagel-Chromatographie
- Das Acetylcellulosederivat < 4 > (1,65 mmol/g) (0,3272 g, 0,53 mmol), das in Beispiel 1 erhalten wurde, und Triethyiammonium-N³-benzoyl-5'-O-dimethoxytritylthymidin- 3'-(2-chlorphenyl)phosphat < 21 > (0,3766 g, 0,4 mmol) wurden in Pyridin (3 ml) gelöst, und das Pyridin wurde durch Destillation unter einem reduzierten Druck entfernt. Dieser Vorgang wurde 3 Mal wiederholt, um Wasser in dem Gemisch durch azeotrope Destillation zu entfernen. Der Rückstand wurde in Pyridin (4 ml) gelöst, und 2,4,6-Triisopropylbenzensuffonylchlorid (0,3634 g, 1,2 mmol) sowie 1-Methylimidazol (0,19 ml, 2,4 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt. Kaltes Wasser (0,5 ml) wurde zu der Reaktionslösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde während 30 Minuten gerührt, und die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert. Pyridin (3 ml x 3 Mal) wurde hinzugefügt und durch Destillation unter einem reduzierten Druck entfernt, um Wasser in dem Gemisch durch azeotrope Dehydratation zu entfernen. Der Rückstand wurde in Pyridin (9 ml) gelöst, und Acetanhydrid (3 ml) wurde zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 5 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert. Eine kleine Menge Toluol wurde zu dem Rückstand hinzugefügt, und eine Destillation wurde unter einem reduzierten Druck ausgeführt, bis der Pyridingeruch verschwand. Eine sehr kleine Menge des Acetylcellulosederivats mit darin eingebrachtem < 21 > wurde in einer kleinen Menge Methylenchlorid gelöst, und die Lösung wurde in Ethanol getropft, und die gebildete Ausfällung wurde durch Filtration gesammelt und unter einem reduzierten Druck getrocknet, um ein Pulver (4,6 mg) zu erhalten.
- Eine 2%ige Lösung (1 ml) von p-Toluolsulfonsäure in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) wurde zu dem Pulver hinzugefügt, und man ließ das Gemisch bei Raumtemperatur während 15 Minuten stehen, um die Dimethoxytritylgruppe zu entfernen, und eine Färbung wurde durch 60% Perchlorsäure - Methanol (3:2 v/v) bewirkt. Durch Messen der decadischen Extinktion bei 498 nm (ε = 72000) wurde die Menge des in das Acetylcellulosederivat eingebrachten < 21 > bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die eingebrachte Menge an < 21 > 0,604 mmol/g betrug und die Kondensationsausbeute 100% war.
- Das verbliebene Acetylcellulosederivat mit darin eingebrachtem < 21 > wurde in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) (8 ml) gelöst, und unter Abkühlen auf 0ºC wurde eine Lösung (4 ml) von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,3164 g) in Chloroform - Methanol (7.3 v/v) zu der obigen Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde während 15 Minuten gerührt. Dann wurde Pyridin (1 ml) zu dem Gemisch hinzugefügt, und die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, bis das Volumen auf etwa 1/2 reduziert war. Die restliche Lösung wurde unter starkem Ruhren in Ethanol (200 ml) getropft, und die gebildete Ausfallung wurde durch Filtration zuruckbehalten und unter einem reduzierten Druck getrocknet, um ein pulveriges Acetylcellulosederivat < 22 > (B&sub1; = TBZ) mit einem darauf getragenen Thymidin-3'-phosphatderivat mit einer freien Hydroxylgruppe an der 5'-Position mit einer Ausbeute von 95% (0,5120 g, 0,378 mmol; 0,739 mmol/g) zu erhalten.
- < 22 > (B&sub1; = TBZ) und < 21 > (B&sub2; = TBZ) (0,449 g, 0,473 mmol) wurden zu Pyridin (3 ml x 3 Mal) hinzugefügt, und Wasser in dem Gemisch wurde durch azeotrope Dehydratation entfernt. Das Gemisch wurde in Pyridin (9,5 ml) gelöst, und 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,4298 g, 1,42 mmol) sowie 1-Methylimidazol (0,225 ml, 2,84 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt (0,432 mmol/g, Kondensationsausbeute = 99%). Kaltes Wasser (1 ml) wurde zu der Reaktionslösung hinzugefügt, das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt, und die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert.
- Dann wurde der Rückstand in Triethylamin - Pyridin (1:3 v/v) (16 ml) gelöst, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt. Der in das Sulfonylalken umgewandelte Rückstandsanteil < 9 > des Acetylcellulosederivats wurde von Ethanol (100 ml) ausgefällt und durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert und durch Umkehrphasen-Silicagel-Chromatographie (10% bis 40% Aceton - 0,05 M TEAB System) separiert, um < 20 > (B&sub1; = B&sub2; = TBZ) mit einer Ausbeute von 63% (0,3710 g, 0,254 mmol) zu erhalten. Bei diesem Schritt wurden 0,789 g (0,083 mmol) < 21 > (B = TBZ) gewonnen.
- Die physikalischen Eigenschaften von < 20 > (Bi = B&sub2; = TBZ) waren wie folgt.
- Rf-Wert: 0,29 (Aceton - Wasser, 6:4 v/v)
- ¹H-n.m.r. (CDCl&sub3; - TMS): δ1,24 (9H, t, J = 7,3 Hz, [C-C &sub3; in N-C&sub2;H&sub5;- Gruppe] x 3), 1,27 (3H, s, CH&sub3;-5), 1,35 (3H, s, CH&sub3;-5), 2,05 - 2,70 (4H, m, H - 2' x 2 und H - 2" x 2), 2,97 (6H, q, C-C &sub2;-N x 3), 3,78 (6H, s, OCH&sub3; x 2), 3,30 - 4,50 (6H, m, H - 4' x 2, H - 5' x 2 und H - 5" x 2), 4,95 - 5,40 (2H, m, H - 3' x 2), 6,29 - 6,45 (2H, m, H - 1' x 2) und 6,30 - 8,60 (33H, m, Phenylproton x 31 und H - 6 x 2)
- Gemäß der in Beispiel 10 beschriebenen Reaktionsformel wurde ein Di-2'-deoxyribonucleotid-3-phosphodiesterderivat < 20 > (B&sub1; = B&sub2; = AACa) aus dem Acetylcellulosederivat < 4 > synthetisiert.
- Spezieller wurden in der gleichen Weise, wie in Beispiel 10 beschrieben, < 4 > (1,65 mmol/g) (0,3272 g, 0,53 mmol) und Triethylammonium-5'-O-dimethoxytrityl-N&sup6;- (dimethylamino)ethylen-2'-deoxyadenosin-3'-(2-chlorphenyl)phosphat < 21 > (0,3882 g, 0,4 mmol) in Pyridin (4 ml) gelöst, und 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,3634 g, 1,2 mmol) sowie 1-Methyhmidazol (0,19 ml, 2,4 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt. Kaltes Wasser (1 ml) wurde hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen, und die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert und mit Acetanhydrid - Pyridin (1:3 v/v) (12 ml) (0,590 mmol/g, Kondensationsausbeute = 99%) behandelt. Dann wurde die Reaktionslösung mit einer Lösung (12 ml) von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,3164 g) in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) behandelt und unter starkem führen in Ethanol (200 ml) getropft, um pulveriges < 22 > (B&sub1; - AAca) mit einer Ausbeute von 89% (0,4970 g, 0,357 mmol; 0,717 mmol/g) zu erhalten.
- < 22 > (B&sub1; = AAca) und < 21 > (B&sub2; = AAca) (0,4325 g, 0,446 mmol) wurden in Pyridin (9 ml) gelöst, und 2,4,6-Triisopropylbenzensullonylchlorid (0,3377 g, 1,34 mmol) sowie 1-Methylimidazol (0,21 ml, 2,68 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt. Kaltes Wasser (1 ml) wurde hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen, und die Reaktionslösung wurde unter hinein reduzierten Druck konzentriert, so daß das Volumen auf etwa 1/2 reduziert wurde, und das Konzentrat wurde unter starkem Rühren in Ethanol (200 ml) getropft, um ein pulveriges, auf Dinucleotid getragenes Acetylcellulosederivat < 23 > mit einer Ausbeute von 0,6900 g, 0,283 mmol (0,410 mmol/g, Kondensationsausbeute = 97%) zu erhalten.
- Der durch die Behandlung mit Triethylamin - Pyridin (1.3 v/v) (16 ml) in ein Sulfonylalken umgewandelte Acetylcellulosederivatrückstand < 9 > wurde von Ethanol (100 ml) ausgefallt, durch Filtration zuruckbehalten und durch Umkehrphasen Silicagel-Chromatographie separiert, um < 20 > (B&sub1; = B&sub2; = AAca) mit einer Ausbeute von 63% (0,3710 g, 0,254 mmol) zu erhalten. Bei diesem Schritt wurden 0,0789 g (0,083 mmol) < 21 > (B = AAca) gewonnen.
- Die physikalischen Eigenschaften von < 20 > (B&sub1; = B&sub2; = AAca) sind wie folgt.
- Rf-Wert: 0,34 (Aceton - Wasser, 6:4 v/v)
- ¹H-n.m.r. (CDCl&sub3; - TMS): δ1,27 (9H, t, J = 7,3 Hz, [C-C &sub3; in N-Ethylgruppe] x 3), 2,10 (6H, s, C(C &sub3;) von N(C &sub3;)&sub2; x 2), 2,85 - 2,90 (4H, m, H - 2' x 2 und H - 2" x 2), 2,90 (6H, q, C-C &sub2;-N x 3), 3,13 (12H, m, N(CH&sub3;)&sub2; x 2), 3,34 (4H, m, H - 5' x 2 und H - 5" x 2), 3,72 (6H, s, O-CH&sub3; x 2), 4,40 (2H, m, H - 4' x 2), 5,40 - 5,55 (2H, m, H - 3' x 2), 6,36 - 6,50 (2H, m, H - 1' x 2), 6,70 - 7,50 (21H, m, Phenylproton x 21), 8,00 (2H, s, H - 2 x 2) und 8,55 (2H, s, H - 8 x 2)
- Gemäß der in Beispiel 10 beschriebenen Reaktionsformel wurde ein Di-2'-deoxyribonucleotid-3'-phosphodiesterderivat < 20 > (B&sub1; = B&sub2; = GDpc,iBu) aus der Acetylcellulose < 4 > synthetisiert
- Spezieller wurden in der gleichen Weise, wie in Beispiel 10 beschrieben, < 4 > (1,65 mmol/g) (0,2424 g, 0,4 mmol) und Triethylammonium-5'-O-dimethoxytrityl-N&sup6;- diphenylcarbamoyl-N²-isobutyryl-2-deoxyguanosin-3'-(2-chlorphenyl)phosphat < 21 > (B&sub1; = GDpc,iBu) (0,3375 g, 0,3 mmol) in Pyridin (3 ml) gelöst, und 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,2726 g, 0,9 mmol) sowie 1-Methylimidazol (0,144 ml, 1,8 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt. Kaltes Wasser (1 ml) wurde hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen, und die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert und mit Acetanhydrid - Pyridin (1:3 v/v) (10 ml) (0,533 mmol/g, Kondensationsausbeute = 98%) behandelt. Dann wurde die Reaktionslösung mit p- Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,3164 g) und Chloroform - Methanol (7:3 v/v) (12 ml) behandelt und unter starkem Rühren in Ethanol (200 ml) getropft, um das Pulver < 22 > (B&sub1; = GDpc,iBu) mit einer Ausbeute von 88% (0,4150 g, 0,264 mmol; 0,635 mmol/g) zu erhalten.
- < 22 > (B&sub1; = GDpc,iBu) und < 21 > (B&sub2; = GDpc,iBu) (0,3708 g, 0,33 mmol) wurden in Pyridin (6,6 ml) gelöst, und 2,4,6 Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,2999 g, 0,99 mmol) sowie 1-Methylimidazol (0,16 ml, 1,98 mmol) wurden zu der Lösung hin zugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt.
- Kaltes Wasser (1 ml) wurde hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen, und die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert (0,356 mmol/g, Kondensationsausbeute = 95%). Das Konzentrat wurde mit Triethylamin - Pyridin (1:3 v/v) (8 ml) behandelt, und der in ein Sulfonylalken umgewandelte Acetylcellulosederivatrückstand < 9 > wurde von Ethanol (100 ml) ausgefällt, durch Filtration zurückbehalten und durch Umkehrphasen-Silicagel- Säulenchromatographie separiert, um < 20 > (B&sub1; = B&sub2; = GDpc,iBu) mit einer Ausbeute von 51% (0,2797 g, 0,153 mmol) zu erhalten. Bei diesem Schritt wurde < 21 > (B = GDpc,iBu) in einer Menge von 0,0496 g (0,0441 mmol) gewonnen.
- Die physikalischen Eigenschaften von < 20 > (B&sub1; = B&sub2; = GDpc,iBu) sind wie folgt.
- Rf-Wert: 0,17 (Aceton - Wasser, 6:4 v/v)
- ¹H-n.m.r. (CDCl&sub3; - TMS): δ1,05 - 1,25 (21H, m [C-C &sub3; in N-Ethylgruppe] x 3 und CH(C &sub3;)&sub2; x 2), 2,50 - 3,45 (14H, m, C-C &sub2;-N x 3, CH(CH&sub3;)&sub2; x 2, H - 2' x 2, H - 2" x 2, H - 5' x 2 und H - 5" x 2), 3,70 (6H, s, OCH&sub3; x 2), 4,50 - 4,65 (2H, m, H - 4' x 2), 5,30 - 5,55 (2H, m, H - 3' x 2), 6,30 - 6,45 (2H, m, H - 1' x 2), 6,66 - 7,64 (41H, m, Phenylproton x 41), 8.05 und 8,07 (2H, s x 2, H - 8 x 2) sowie 8,55 und 8,80 (2H, s x 2 N CO x 2)
- Ein Tri-2'-deoxyribonucleotid-3'-phosphodiesterderivat < 24 > wurde aus dem Acetylcellulosederivat < 4 > gemäß der folgenden Reaktionsformel synthetisiert: Acetylcellulose 1-Meim Et&sub3;N-Pyridin Umkehrphasen-Silicagel-Säulenchromatographie
- Das Acetylcellulosederivat < 4 > (1,63 mmol/g) (0,8650 g, 1,39 mmol), das in Beispiel 1 erhalten wurde, und N&sup4;-Anisoyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-deoxycytidin-3'-(2-chlorphenyl)phosphat < 21 > (0,9550 g, 1 mmol) wurden einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3) unterzogen, um Wasser aus dem System zu entfernen, und das Gemisch wurde in Pyridin (10 ml) gelöst. Dann wurden 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,9086 g, 3 mmol) sowie 1-Methylimidazol (0,48 ml, 6 mmol) zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur,während 4 Stunden gerührt. Kaltes Wasser (0,5 ml) wurde zu der Reaktionslösung hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen, und das Reaktionsgemisch wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, Wasser wurde aus dem Reaktionsgemisch durch azeotrope Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) entfernt, der Rückstand wurde in Pyridin (7,5 ml) gelöst, Acetanhydrid (2,5 ml) wurde zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 5 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, und eine kleine Menge Toluol wurde zu dem Konzentrat hinzugefügt, und eine Destillation wurde unter einem reduzierten Druck ausgeführt, bis der Pyridingeruch nicht mehr wahrgenommen wurde (0,554 mmol/g, Kondensationsausbeute = 82%).
- Dann wurde der Rückstand in einer Lösung (20 ml) von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,5412 g) in Chloroform - Methanol (7:3 vv/v) gelöst, und die Lösung wurde bei 0ºC während 15 Minuten gerührt, mit Pyridin neutralisiert und unter einem reduzierten Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol (100 ml) getropft. Die gebildete Ausfällung wurde durch Filtration zurückbehalten und unter einem reduzierten Druck getrocknet, um pulveriges < 25 > (B&sub1; = CAn) mit einer Ausbeute von 64% (0,9624 g, 0,64 mmol; 0,665 mmol/g) zu erhalten.
- Dann wurden < 25 > (B&sub1; = CAn) und < 20 > (B&sub1; = B&sub2; = TBZ) (0,7565 g, 0,518 mmol) einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen, um Wasser in dem System zu entfernen, und das Gemisch wurde in Pyridin (10 ml) gelöst, und 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,4840 g, 1,60 mmol) sowie 1-Methylimidazol (0,26 ml, 3,2 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 4 Stunden gerührt. Kaltes Wasser (0,5 ml) wurde zu der Reaktionslösuug hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und unter einem reduzierten Druck konzentriert, um < 26 > zu erhalten.
- Der Rückstand wurde in Triethylamin - Pyridin (1:3 v/v) (20 ml) gelöst, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt und unter einem reduzierten Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol (100 ml) getropft, um den in ein Sulfonylalken umgewandelten Acetylcellulosederivatrückstand < 9 > auszufällen. Die Ausfällung wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert und durch die Umkehrphasen-Silicagel-Säulenchromatographie (10% bis 40% Aceton - 0,05 M TEAB System) separiert, um < 24 > (B&sub1; = (CAn, B&sub2; = B&sub3; = TBZ) mit einer Ausbeute non 47% (0,5180 g, 0,25 mmol) zu erhalten.
- Die physikalischen Eigenschaften non < 24 > (B&sub1; = CAn, B&sub2; = B&sub3; = TBZ) sind wie folgt.
- Rf-Werte: 0,19 (Aceton - Wasser, 6:4 v/v), 0,43 (Aceton - Wasser, 7:3 v/v)
- Ein Tetra-2'-deoxyribonucleotid-3'-phosphodiesterderivat < 27 > (B&sub1; = B&sub2; = AAca, B&sub3; = B&sub4; = GDpc,iBu) wurde von dem Acetylcellulosederivat gemäß der folgenden Reaktionsformel synthetisiert: 1-Meim Pyridin Acetylcellulose Et&sub3;N-Pyridin Umkehrphasen-Silicagel-Säulenchromatographie
- Das Acetylcellulosederivat < 4 > (1,63 mmol/g) (0,3750 g, 0,604 mmol), das in Beispiel 1 erhalten wurde, und < 20 > (B&sub1; = B&sub2; = AAca) (0,6140 g, 0,405 mmol), das in Beispiel 11 erhalten wurde, wurden einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen, um Wasser in dem Gemisch zu entfernen, und das Gemisch wurde in Pyridin (10 ml) gelöst. Dann wurden 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,3660 g, 1,21 mmol) und 1-Methylimidazol (0,20 ml, 2,48 mmol) zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 4 Stunden gerührt. Kaltes Wasser (0,5ml) wurde zu der Reaktionslösung hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen, die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, und der Rückstand wurde einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen, um Wasser in dem Gemisch zu entfernen. Der Rückstand wurde in Pyridin (7,5 ml) gelöst, und Acetanhydrid (2,5 ml) wurde zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 5 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, und eine kleine Menge Toluol wurde zu dem Konzentrat hinzugefügt, und eine Destillation wurde unter einem reduzierten Druck wiederholt, bis der Pyridingeruch verschwand (0,345 mmol/g, Kondensationsausbeute = 94%).
- Der Rückstand wurde in einer Lösung (20 ml) von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,5412 g) in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) gelöst, und die Lösung wurde bei 0ºC während 15 Minuten gerührt, mit Pyridin neutralisiert und unter einem reduzierten Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol (100 ml) getropft. Die gebildete Ausfällung wurde durch Filtration zurückbehalten und unter einem reduzierten Druck getrocknet, um pulveriges < 28 > (B&sub1; = B&sub2; = AACa) mit einer Ausbeute von 76% (0,7720 g, 0,306 mmol; 0,397 mmol/g) zu erhalten.
- Dann wurden < 28 > (B&sub1; = B&sub2; = AACa) und < 20 > (B&sub1; = B&sub2; = GDpc,iBu) (0,6710 g, 0,36 mmol), das in Beispiel 12 erhalten wurde, einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen, um Wasser in dem Gemisch zu entfernen, und das Gemisch wurde in Pyridin (10 ml) gelöst, und 2,4,5-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,3336 g, 1,1 mmol) sowie 1-Methylimidazol (0,15 ml, 2,21 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 4 Stunden gerührt, und kalt es Wasser (0,5 ml) wurde zu der Reaktionslösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und unter einem reduzierten Druck konzentriert.
- Der Rückstand wurde in Triethylamin - Pyridin (1:3 v/v) (20 ml) gelöst, die Lösung wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt und unter einem reduzierten Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol (100 ml) getropft, um den in ein Sulfonylalken umgewandelten Acetylcellulosederivatrückstand < 9 > auszufällen, das durch Filtration entfernt wurde. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert und durch Umkehrphasen-Silicagel-Säulenchromatographie (10% bis 40% Aceton - 0,05 M TEAB System) separiert, um < 27 > (B&sub1; = B&sub2; = AACa, B&sub3; = B&sub4; = GDpc,iBu) mit einer Ausbeute von 69% (0,6000 g, 0,21 mmol) zu erhalten.
- Der Wert der physikalischen Eigenschaften von < 27 > (B&sub1; = B&sub2; = AAca, B&sub3; = B&sub4; = GDpc,iBu) ist wie folgt.
- Rf-Wert: 0,17 (Aceton - Wasser, 7:3 v/v)
- Gemäß der folgenden Reaktionsformel wurde aus der Acetylcellulose < 4 > ein Acetylcellulosederivat < 30 > mit darauf getragenem 2'-Deoxycytidin-3'-succinat synthetisiert, ein Acetylcellulosederivat < 31 > mit darauf getragenem Octa-2'-deoxyribojiucleotid wird aus < 30 > synthetisiert, und die Schutzgruppen wurden von < 31 > entfernt, und eine Reinigung wurde ausgeführt, um Octa-2'-deoxyribonucleotid < 29 > (GpGpApApTpTpCpC) zu erhalten: 1-Meim Pyridin Acetylcellulose Acetylcellulose Umkehrphasen-HPLC
- Das Acetylcellulosederivat < 4 > (1,63 mmol/g) (0,9663 g, 1,58 mmol) und N&sup4;-Anisoyl- 3'-O-(3-carboxy)propionyl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-deoxycytidin < 32 > (0,802 g, 1,05 mmol) wurden einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen, und das Gemisch wurde in Pyridin (10,5 ml) gelöst, und 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,9450 g, 3,15 mmol) sowie 1-Methyhmidazol (0,53 ml, 6,3 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt. Kaltes Wasser (1 ml) wurde zu der Reaktionslösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde während 30 Minuten gerührt, Methylenchlorid (100 ml) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde mit Wasser (40 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, und das Konzentrat wurde einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen. Acetanhydrid - Pyridin (1:3 v/v) (20 ml) wurde zu dem Rückstand hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 5 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, und eine kleine Menge Toluol wurde zu dem Rückstand hinzugefügt, und eine azeotrope Destillation wurde ausgeführt, bis der Pyridingeruch verschwand (0,5 mmol/g, Kondensationsausbeute = 98%). Der Rückstand wurde in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt, und eine Lösung (10 ml) von p-Toluolsulfonsäuremoriohydrat (0,5412 g) in Chloroform - Methanol (7:3 v/v) wurde zu der obigen Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde während 15 Minuten gerührt und mit Pyridin neutralisiert, und die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid (20 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol (200 ml) getropft. Die gebildete Ausfällung wurde durch Filtration zurückbehalten und unter einem reduzierten Druck getrocknet, um pulverlges < 30 > mit einer Ausbeute von 84% (1,3190 g, 0,877 mmol; 0,665 mmol/g) zu erhalten.
- < 24 > (B&sub1; = CAn, B&sub2; = B&sub3; = TBZ) (0,2735 g, 0,132 mmol), das in Beispiel 13 erhalten wurde, und < 30 > (0,4910 g, 0,33 mmol), das in i) oben erhalten wurde, wurden einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen, um Wasser aus dem Gemisch zu entfernen, und das Gemisch wurde in Pyridin (3,3 ml) gelöst, und 2,4,6-Triisopropyibenzensulfonylchlorid (0,1599 g, 0,528 mmol) sowie 1-Methylimidazol (0,09 ml, 1,06 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt, und kaltes Wasser (0,5 ml) wurde zu der Reaktionslösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und unter einem reduzierten Druck konzentriert. Der Rückstand wurde einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen, um Wasser aus dem Gemisch zu entfernen. Der Rückstand wurde in Pyridin (15 ml) gelöst, und Acetanhydrid (5 ml) wurde zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 5 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, und eine kleine Menge Toluol wurde zu dem Konzentrat hinzugefügt, und eine Destillation unter einem reduzierten Druck wurde ausgeführt, bis der Pyridingeruch verschwand (0,163 mmol/g, Kondensationsausbeute = 93%). Dann wurde der Rückstand in Chloroform - Methanol (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt, und eine Lösung (10 ml) von p Toluolsulfonsäuremonohydrat (0,5412 g) in Chloroform - Methanol (7.3 v/v) wurde zu der obigen Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde während 15 Minuten gerührt und mit Pyridin neutralisiert, und die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol getropft. Die gebildete Ausfällung wurde durch Filtration zurückbehalteil und unter einem reduzierten Druck getrocknet, um pulveriges < 33 > mit einer Ausbeute von 86% (0,6685 g, 0,115 mmol; 0,171 mmol/g) zu erhalten.
- < 33 > (0,445 g, 0,076 mmol) und < 27 > (B&sub5; = B&sub6; = AAca, B&sub7; = B&sub8; = GDpc,iBu) (0,4343 g, 0,152 mmol), das in Beispiel 14 erhalten wurde, wurden einer azeotropen Dehydratation mit Pyridin (5 ml x 3 Mal) unterzogen, und das Gemisch wurde in Pyridin (3,4 ml) gelöst, und 2,4,6-Triisopropylbenzensulfonylchlorid (0,1726 g, 0,57 mmol) sowie 1-Methyiimidazol (0,09 ml, 1,14 mmol) wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt. Kaltes Wasser (0,5 ml) wurde zu der Reaktionslösung hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und unter einem reduzierten Druck konzentriert (Kondensationsausbeute = 80,43%). Der Rückstand wurde in Methylenchlorid (10 ml) gelöst, und die Lösung wurde unter starkem Rühren in Ethanol (100 ml) getropft. Die gebildete Ausfällung wurde durch Filtration zurückbehalten und unter einem reduzierten Druck getrocknet, um pulveriges < 31 > mit einer Ausbeute von 91% (0,6120 g, 0,069 mmol; 0,113 mmol/g) zu erhalten.
- Das Octamer < 31 > (30 mg, 3,39 mnol), das in ii) oben erhalten wurde, wurde in einer 0,5 M Lösung von N¹,N¹,N³,N³-Tetramethylguanidin-(E)-2-pyridinald oximat in Pyridin - Wasser (9:1 v/v) (0,6 ml) gelöst, und man ließ die Lösung bei Raumtemperatur einen Tag lang stehen. Ethanol (30ml) wurde zu der Reaktionslösung hinzugefügt, um den Rückstandsanteil (9) des Acetylcellulosederivats auszufällen, der durch Filtraion entfernt wurde. Das Filtrat wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert. Konzentrierter wäßriger Ammoniak (28%) (20 ml) wurde zu dem Rückstand hinzugefügt, und das Gemisch wurde abgedeckt, und man ließ es bei 55ºC 6 Stunden lang stehen, gefolgt von einer Konzentration unter einem reduzierten Druck. Der in einer 50 mM wäßrigen Lösung von TEAB (20 ml) gelöste Octamerrückstand wurde in SEP- PAK (C-18) (vertrieben von Waters Co.) injiziert, das man mehr als 3 Stunden lang nach einer Injektion von Acetonitril-Wasser (9:1 v/v) (10 ml) stehengelassen hatte, und dann mit einer 50 mM wäßrigen Lösung von TEAB (20 ml) gewaschen. Dann wurde N¹.N¹,N³,N³-Tetramethylguanidin-(E)-2-pyridinald oximat mit 5% Acetonitril - 0,05 mM TEAB wäßriger Lösung (20 ml) eluiert, und das Octamer wurde dann mit 10% Acetonitril - 0,05 mM TEAB wäßriger Lösung (20 ml) oder 15% Acetonitril - 0,05 M TEAB wäßriger Lösung (10 ml) eluiert. Das Eluat wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, und der Rückstand wurde in Wasser (1 ml) gelöst, und die Probe (0,63 ml) wurde gesammelt, und das Octamer < 34 > mit einer Dimethoxytritylgruppe an der 5'-Position wurde durch HPLC gereinigt. Der mittlere Anteil des Hauptpeaks wurde gesammelt und unter einem reduzierten Druck konzentriert. Wasser (1 ml) wurde zu dem Rückstand hinzugefügt, und es wurde eine Destillation unter einem reduzierten Druck durchgeführt, bis der Triethylamingeruch verschwand. Dann wurde eine 80% wäßrige Lösung von Essigsäure (1,31 ml) zu 1/2 der gesammelten Probe hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter einem reduzierten Druck konzentriert, und eine kleine Nienge Wasser wurde zu dem Rückstand hinzugefügt, und die Essigsäure wurde durch azeotrope Destillation entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser (1 ml) gelöst, und die Probe (0,46 ml) wurde durch HPLC [LiChrosorb RP-18, 4 mm im Innendurchmesser x 250 mm in der Länge, 10% Acetonitril - 0,1 M TEAA wäßrige Lösung) gereinigt (die erzielten Ergenisse sind in Fig. 3 gezeigt). Der mittlere Anteil des Hauptpeaks wurde gesammelt, und das Eluat wurde unter einem reduzierten Druck auf 1,95 OD des Octamers < 29 > konzentriert, von dem alle Schutzgruppen entfernt worden waren (die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt).
- Das Octamer < 29 > (0,6 OD) wurde in 0,05 M Trispuffer (pH 8,48) (200 ul) gelöst, und Schlangengift-Phosphodiesterase (20 ug) wurde zu der Lösung hinzugefügt, und man ließ das Gemisch bei 37ºC 2 Stunden lang stehen. Dann wurde alkalische Phosphatase (50 ug) zu dem Gemisch hinzugefügt, und man ließ das Gemisch bei 25ºC 1 Stunde lang stehen. Das Enzym-Zersetzungsprodukt wurde durch HPLC [Lichrosorb RP-18, 4 mm im Innendurchmesser x 250 mm in der Länge, 10% Acetonitril - 0,1 M Natriumphosphat wäßrige Lösung (pH 4,2)] separiert, und es wurde bestätigt, daß < 29 > vollständig in die jeweiligen 2'-Deoxynucleotide zersetzt worden war.
- Mit dem raschen Fortschritt in der Biochemie oder Gentechnik, insbesondere mit der Entwicklung der Rekombinations-DNA-Technik, nahm der Bedarf an synthetischen Oligonucleotiden zu, und die vorliegende Erfindung ist dafür nutzbar, diesen Bedarf zu decken.
- Synthetische DNA wird zur Synthese von strukturellen Genen, wie menschlichen Interferonen und menschlichen Wachstumshormonen verwendet, und des weiteren hat die Verwendung synthetischer DNA-Decamere über Eicosamere zur Herstellung von Primeren für eine Bestimmung von Sequenzen, von Linkern zum Klonen, von Sonden für eine Auswahl und Bestätigung angestrebter Gene, von Agenzien für eine direkte Diagnose (genetische Diagnose) von durch Mikroorganismen übertragbaren Krankheiten und von Arzneimitteln, wie Anti-Virus-Agenzien, auf den medizinischen und therapeutischen Gebieten und dergleichen beträchtlich zugenommen. Primere, Linker und Sonden weiben spezielle Sequenzen auf, und große Mengen von hochreinen DNA-Oligomeren sind für deren Herstellung notwendig. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung, das einfach und für diese Synthese in großen Mengen geeignet ist, stellt einen großen Beitrag zu deren Herstellung dar.
- In dem Protein-Biosynthesesystem befindet sich RNA an einer Zwischenposition zwischen DNA und einem Protein und spielt eine wichtige Rolle. Es gibt jedoch viele unbekannte Punkte, und, um die Funktionen zu klären, ist es wüiischenswert, RNA mit einer optionalen Sequenz in großen Mengen zu erzielen. Gemäß dem Verfahren, das Enzyme verwendet, wird RNA lediglich in einer kleinen Menge erhalten, und die angestrebte Sequenz ist eingeschränkt. Demgemäß ist das chemische Syntheseverfahren sehr vorteilhaft. Gemäß dem herkömmlichen Flüssigphasen-Phosphotriester-Verfahren ist es jedoch sehr schwierig, hochreine RNA-Oligomere, wie Decamere, in großen Mengell zu erhalten. Des weiteren wurde bei dem Festphasen-Phosphotriester-Verfahren bislang noch keine allgemeine Vorgehensweise zur Synthese von RNA-Oligomeren, wie sie bei der Synthese von DNA-Oligomeren besteht, bereitgestellt.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist sehr wertvoll als dasjenige Verfahren, DNA-Oligomere und RNA-Oligomere leicht und in großen Mengen herzustellen, deren Synthese äußerst arbeitsintensiv und beschwerlich ist.
Claims (5)
1. Verfahren zur Synthese eines kettenerweiterten Oligonucleotides, welches das
Kondensieren eines Mononucleotides, eines Oligonucleotides, eines Mononucleotid-
Succinates oder eines Oligonucleotid-Succinates in einem homogenen System in
einem Lösungsmittel beinhaltet, bei denen lediglich die endständige 5'-Hydroxylgruppe
nicht blockiert ist und die anderen funktionellen Gruppen durch eine Mehrzahl von
Schutzgruppen mit niedrigem Molekulargewicht sowie eine Schutzgruppe, die eine
Hydroxylgruppe enthält, blockiert sind, mit einem Mononucleotid oder
Oligonucleotid, bei dem die funktionellen Gruppen außer der endständigen
Phosphorsäuregruppe durch Schutzgruppen mit niedrigem Molekulargewicht blockiert sind,
dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzgruppe, welche die Hydroxylgruppe enthält,
ein Polysaccharidderivat ist, das in dem Lösungsmittel steuerbar löslich ist, wobei
die Verbindung, welche die Schutzgruppe aus dem Polysaccharidderivat bildet, durch
Anbinden eines Abstandshalters und einer funktionellen Gruppe an ein
Polysaccharidderivat gebildet wird.
2. Verfahren zur Synthese eines Oligonucleotides nach Anspruch 1, wobei die
Verbindung, welche die Schutzgruppe aus dem Polysaccharidderivat bildet, durch
die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt wird:
wobei C&sub6;H&sub7;O&sub2; für einen wasserfreien Glucoserest steht, R für
steht, n eine ganze Zahl zwischen 10 und 2.000, x eine Zahl zwischen 0,4 und 0,8
und y eine Zahl zwischen 1,0 und 2,0 ist.
3. Verfahren zur Synthese eines Oligonucleotides nach Anspruch 1 oder
Anspruch 2, wobei das Polysaccharidderivat in der Verbindung, welche die
Schutzgruppe aus dem Polysaccharidderivat bildet, Acetylcellulose ist.
4. Verbindung zum Bilden einer Schutzgruppe aus einem Polysaccharidderivat,
die durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt wird:
wobei C&sub6;H&sub7;O&sub2; für einen wasserfreien Glucoserest steht, R für
steht, n eine ganze Zahl zwischen 10 und 2.000, x eine Zahl zwischen 0,4 und 0,8
und y eine Zahl zwischen 1,0 und 2,0 ist.
5. Verbindung nach Anspruch 4, wobei R in der Formel (I)
CH&sub3; -.
ist.
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Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5175266A (en) * | 1991-04-19 | 1992-12-29 | Triplex Pharmaceutical Corporation | Nucleosides and oligonucleosides with a phosphate-free internucleoside backbone and process for preparing the same |
| NZ245720A (en) * | 1992-01-22 | 1995-12-21 | Hoechst Ag | Oligonucleotide analogues; use as gene expression inhibitor or dna probe |
| US5646261A (en) * | 1992-01-22 | 1997-07-08 | Hoechst Aktiengesellschaft | 3'-derivatized oligonucleotide analogs with non-nucleotidic groupings, their preparation and use |
| US6033909A (en) * | 1992-01-22 | 2000-03-07 | Hoechst Aktiengesellschaft | Oligonucleotide analogs, their preparation and use |
| TW323284B (de) * | 1992-03-23 | 1997-12-21 | Novartis Ag | |
| CA2114355A1 (en) * | 1993-01-29 | 1994-07-30 | Hidehiko Furukawa | Modified oligodeoxyribonucleotides, their preparation and their therapeutic use |
| US6232465B1 (en) | 1994-09-02 | 2001-05-15 | Andrew C. Hiatt | Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides |
| US5872244A (en) * | 1994-09-02 | 1999-02-16 | Andrew C. Hiatt | 3' protected nucleotides for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds |
| US5763594A (en) * | 1994-09-02 | 1998-06-09 | Andrew C. Hiatt | 3' protected nucleotides for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds |
| US6214987B1 (en) | 1994-09-02 | 2001-04-10 | Andrew C. Hiatt | Compositions for enzyme catalyzed template-independent formation of phosphodiester bonds using protected nucleotides |
| US5990300A (en) * | 1994-09-02 | 1999-11-23 | Andrew C. Hiatt | Enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides |
| US5808045A (en) * | 1994-09-02 | 1998-09-15 | Andrew C. Hiatt | Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides |
| EP1163251A1 (de) | 1999-03-24 | 2001-12-19 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | N-acylphosphoramiditen und ihre verwendung in oligonukleotidsynthesen |
| US6932943B1 (en) | 2001-01-26 | 2005-08-23 | Third Wave Technologies | Nucleic acid synthesizers |
| US20080261220A1 (en) * | 2000-11-30 | 2008-10-23 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic Acid Detection Assays |
| US7435390B2 (en) * | 2001-01-26 | 2008-10-14 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid synthesizers |
| US20030072689A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-04-17 | Third Wave Technologies, Inc. | Polymer synthesizer |
| US7355037B2 (en) * | 2001-12-03 | 2008-04-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Thermolabile hydroxyl protecting groups and methods of use |
| WO2006065751A2 (en) * | 2004-12-13 | 2006-06-22 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cpg oligonucleotide prodrugs, compositions thereof and associated therapeutic methods |
| KR101069877B1 (ko) | 2009-10-28 | 2011-10-05 | 임기표 | 원심분리 키트 및 이를 이용한 원심분리 방법 |
Family Cites Families (17)
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| US4458066A (en) * | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
| US4500707A (en) * | 1980-02-29 | 1985-02-19 | University Patents, Inc. | Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides |
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| JPS5927900A (ja) * | 1982-08-09 | 1984-02-14 | Wakunaga Seiyaku Kk | 固定化オリゴヌクレオチド |
| DE3301833A1 (de) * | 1983-01-20 | 1984-07-26 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig | Verfahren zur simultanen synthese mehrerer oligonocleotide an fester phase |
| DE3329892A1 (de) * | 1983-08-18 | 1985-03-07 | Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg | Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden |
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| GB2164650A (en) * | 1984-09-25 | 1986-03-26 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Process for production of y-interferon |
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| US4739044A (en) * | 1985-06-13 | 1988-04-19 | Amgen | Method for derivitization of polynucleotides |
| FR2584090B1 (fr) * | 1985-06-27 | 1987-08-28 | Roussel Uclaf | Nouveaux supports, leur preparation et les intermediaires obtenus, leur application a la synthese d'oligonucleotides et les nouveaux nucleosides et oligonucleotides relies aux supports ainsi obtenus |
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