DE69027431T2

DE69027431T2 - Kumarinderivate zur verwendung als nukleotidvernetzungsreagenzien

Info

Publication number: DE69027431T2
Application number: DE69027431T
Authority: DE
Inventors: Richard Glass; Don Saba; Kenichi Yabusaki
Original assignee: Naxcor Inc
Current assignee: Naxcor Inc
Priority date: 1989-04-05
Filing date: 1990-03-23
Publication date: 1996-11-28
Anticipated expiration: 2010-03-24
Also published as: EP0466773A1; EP0466773A4; US5082934A; EP0466773B1; JPH0714954B2; JPH04506206A; WO1990012020A1; DE69027431D1

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft lichtreaktive Nukleotidanaloga, die verwendet werden können, um komplementäre Nukleinsäuresequenzen zu vernetzen.

HINTERGRUND

Es besteht ein beträchtliches Interesse daran, Techniken zum Ermitteln des Vorhandenseins von Analyten mit biologischem Ursprung in Proben, insbesondere klinischen Proben, zu entwickeln. Bei einer Technik wird die als Hybridisierung bekannte komplementäre Bindung genutzt, die zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen, wie DNA und RNA, stattfindet, um das Vorhandensein von DNA oder RNA enthaltenden Analyten in Proben zu identifizieren.
Es sind spezifische Hybridisierungstechniken entwickelt worden, um das Vorhandensein eines/einer spezifischen Virus, Bakterie oder anderen Organismus in einer biologischen Probe zu ermitteln als auch genetische Defekte in Säugetierzellen festzustellen. Zu den in letzter Zeit entwickelten Techniken gehören jene, die auf der Schaffung einer kovalenten Bindung zwischen dem Ziel- und dem Reagenspolynukleotidstrang beruhen. Bei einer solchen Technik wird ein Nukleinsäurereagens (Sonde) erzeugt, das eine kovalent gebundene, lichtaktivierbare Gruppe enthält, die bei Lichtaktivierung kovalente Bindungen mit dem Analyten bilden kann. Wenn ein Sonde und ein Analyt unter Hybridisierungsbedingungen vermischt werden und die Bindungsgruppe lichtaktiviert wird, werden kovalente Bindungen ausgebildet, die die beiden Stränge aneinanderbinden. Wenn die Sonde auch ein nachweisbares Signal enthält, können rigorose Techniken zum Trennen ein- und doppelstrangiger Nukleinsäuren eingesetzt werden, um das Vorhandensein von Analyt in der Probe zu ermitteln, indem das Vorhandensein von vernetzten Nukleinsäuresträngen ermittelt wird. Beispielsweise beschreibt die US-A-4,599,303 von Yabusaki et al. Nukleinsäurehybridisierungstechniken, bei denen Sonden eingesetzt werden, die mit Ziesequenzen vernetzbar sind. Diese bekannten Techniken beruhten typischerweise auf der Verwendung einer lichtaktivierbaren Gruppe, die kovalent an einen Basenrest eines Polynukleotids gebunden ist. Die Synthese der bekannten lichtaktivierbaren Sonden ist jedoch, insbesondere im großen Maßstab, schwierig.
Demgemäß sind neue Techniken wünschenwert, die aufleichter verfügbare Analoge von Nukeotiden zurückgreifen, die lichtaktivierbar sind.
Carbohydrate Research 181, 262-266 (1988) offenbart 4-Methylumbeliiferyl-α-L- arabinofuranosid und seine Verwendung als Substrat für Arabinofuranosidase.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt lichtaktivierbare Verbindungen bereit, die als lichtvernetzbare Reagenzien in Hybridisierungsassays verwendet werden können, sowie Techniken und Zwischensubstanzen, die zur Herstellung der Endprodukte eingesetzt werden können. Die Verbindungen umfassen Nukleosidanaloga, die durch das Verbinden des Phenylrings (insbesondere an Position 7) eines Kumarins oder Kumarinanalogs mit der Position 1 eines D-Ribose- oder D-2-Desoxyribosemoleküls hergestellt werden. Die Doppelbindung zwischen den Positionen 3 und 4 des Kumarin- Ring-Systems ist die lichtaktivierbare Gruppe, die kovalent an Nukeoside im komplementären Strang vernetzt, wenn bei einem Hybridisierungsassay eine dieses Nukleosidanalog enthaltende Sonde verwendet wird. Meist hat die lichtaktivierbare Verbindung die Formel deren Substituenten und Bindegruppen nachstehend detaillierter beschrieben werden.

BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFUHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung entstand teilweise aufgrund von Untersuchungen über die Verwendbarkeit verschiedener Kumarin-Derivate als zweiwertige lichtaktivierbare Vernetzungsgruppen bei Hybridisierungsassays. Insbesondere wurde eine Doppelbindung eines Psoralens mit einem Nukleosid umgesetzt, um ein Addukt herzustellen, daß (typischerweise nach dem Entfernen einer Blockierungsgruppe) eine lichtaktivierbare Doppelbindung beibehielt. Wenn dieses Addukt in ein Oligonukleotid eingebaut und mit einem komplementären Oligonukleotid hybridisiert wird, tritt bei Lichtaktivierung Vernetzung auf. Derartige Moleküle werden in der parallelen Anmeldung Nr.07/063.239 beschrieben. Diese Art von Vernetzungsgruppe ist zwar bei vielen Anwendungen zufriedenstellend, es ist aber schwierig, das Vernetzungsgruppen/N ukleosid-Addukt zu synthetisieren, insbesondere, wenn es um große Mengen geht.
Im Verlauf der Untersuchung kleinerer Vernetzungsgruppen haben die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes festgestellt, daß die N ukleosidbase vollständig eliminiert werden kann, ohne daß die Hybridisierung im angrenzenden Bereich negativ beeinflußt wird. Das Nukleosidanalog gemäß vorliegender Erfindung umfaßt ein lichtaktivierbares Kumarin, das in der Position, die die Base normalerweise einnimmt, an einen Zucker gebunden ist. Durch Bereitstellung einer relativ kleinen lichtaktivierbaren Gruppe tritt effiziente Hybridisierung auf, auch wenn die Base, die normalerweise an der Erkennung zwischen Nukleinsäuresträngen beteiligt wäre, nun fehlt. Die Kumarin-Gruppe lagert sich während der Hybridisierung in den komplementären Oligonukleotidstrang und wird dadurch in die richtige Position zur Lichtvernetzung mit einem Thyminrest am komplementären Strang gebracht. Außerdem können große Mengen vernetzbarer Sonden leichter hergestellt werden, als das mit bekannten Techniken möglich war, bei denen Lichtaktivierung eingesetzt wurde, um ein Addukt zwischen einem Psoralen und einer Nukleosidbase zu bilden.
Die speziellen lichtaktivierbaren Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung werden hergestellt, indem der Phenylring (vorzugsweise an Position 7) einer Kumarin-Gruppe an die Position 1 einer D-Ribose- oder einer D-2-Desoxyribose-Gruppe gebunden wird. Die Kumarin-Gruppe enthält zumindest die zentrale 1,2-Benzopyranstruktur von Kumarin, die (mit Ausnahme der zwingend vorhandenen Bindung an die Zuckergruppe) unsubstituiert oder substituiert sein kann. Wenn ein Substituent am Phenyl-Ring oder an Position 3 oder 4 der Kumarin-Gruppe vorhanden ist, sind typischerweise 1 bis 3 stabile organische Substituenten der Typen vorhanden, die normalerweise an aromatischen Ringen und als Vinylsubstituenten zu finden sind, obwohl auch mehr Substituenten (bis zum möglichen Maximum) vorhanden sein können, wenn die Substituenten so gewählt sind, daß sterische Behinderung vermieden wird und ansonsten so gewählt sind, daß sie nach den Normen der organischen Chemie kompatibel sind. Diese Substituenten sind im allgemeinen klein und enthalten bis zu insgesamt 15 Atome (einschließlich Wasserstoffatomen). Derartige Substituenten sind im allgemeinen aus Halogen-, Nitro-, Cyano-, Carbonyl-, Carboxy-, Hydroxy-, Amino- und Amidogruppen; aus mit einer oder mehreren der genannten Gruppen substituierten Hydrocarbylgruppen; und aus unsubsituierten Hydrocarbyigruppen ausgewählt. Die Substituenten an den Positionen 3 und 4 der Kumarin-Gruppe sind typischerweise niedere Hydrocarbylgruppen, im allgemeinen niedere Atkylgruppen.
Verbindung gemäß vorliegender Erfindung haben vorzugsweise die Formel:
worin n 0, 1, 2 oder 3 (vorzugsweise 0, 1, 2; mehr bevorzugt 0 oder 1) ist; jedes W unabhängig ein kleiner, stabiler Substituent ist, der bis zu 15 Atome enthält (insbesondere eine niedere Hydrocarbylgruppe; eine Halogen-, Nitro-, Cyano-, Carbonyl-, Carboxy-, Hydroxy-, Amino- oder Amidogruppe; oder ein Hydrocarbylsubstituent, der eine oder mehrere der genannten Gruppen enthält, die Heteroatome umfassen); Y und Z unabhängig voneinander H oder eine Niederalkylgruppe darstellen; X eine organische Bindegruppe ist, die (a) 1 bis 5 Kohlenstoffatome, (b) 0 bis 3 Heteroatome, ausgewählt aus der Gruppe, die aus O, S und N besteht, (c) und 0 bis 2m Halogenatome enthält (wobei m die Anzahl der Kohlenstoffatome in X ist; Halogene, die sich in α-Stellung zu Heteroatomen befinden, wie - C -O-
sind aufgrund von Problemen in Zusammenhang mit der Stabilität nicht zulässig) und worin X entweder eine Bindekette aus 1 bis 4 Atomen umfaßt oder ansonsten eine Gruppe X³-(CH&sub2;)m- ist, worin m eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist und X³-NH-,-O- oder -S- ist; R H oder OR¹ ist; und R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder eine Gruppe darstellen, die zum Koppeln mit einer Hydroxylgruppe oder zum Schützen derselben während der automatisierten Polynukleotidsynthese fähig ist, oder R² oder R³ ein Nukleotid oder Polynukleotid darstellt, das über eine 3'-5'-Phosphodiesterbindung an diese Verbindung gebunden ist. Bevorzugte Kopplungsgruppen sind Phosphorenthaltende Bindegruppen, wie Phosphite, Phosphoramidite, Phosphate, H- Phosphonate, Phosphorthioate und Methylphosphonate. Andere Nicht-Phosphor- Koppl ungsgruppen umfassen Carbamate und Amide. Niedere Hydrocarbylgruppen umfassen sowohl lineare als auch verzweigte C&sub1;-C&sub6;-Alkylgruppen (und C&sub2;-C&sub6;-Alkenyl- und Alkinylgruppen, sowie zyklische C&sub3;-C&sub6;-Gruppen) und umfassen vorzugsweise C&sub1;- C&sub4;-Alkylgruppen, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, s-Butyl und t-Butyl. Typische Hydrocarbylgruppen mit Heteroatomsubstituenten sind -COCH&sub3;,- CH&sub2;OH, -CF&sub3;, -NHCH&sub3;, -(CO&sub2;CH&sub2;CH&sub3; und CON(CH&sub3;)&sub2;. Die Sterochemie der Riboseoder 2-Desoxyribose-Zuckergruppe ist die gleiche wie die in natürlichen Nukleotiden vorhandene (d.h. sie sind D-Zucker). Jeder Verweis in der vorliegenden Beschreibung auf eine Zuckergruppe bezieht sich, wenn nicht anders angegeben, auf einen D-Zucker.
Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung sind entweder als Zwischensubstanzen bei der Herstellung von oder als Komponenten von lichtaktivierbaren Polynukleotiden einsetzbar, die als Reagenzien (typischerweise als "Sonden" bekannt) bei Hybridisierungsassays verwendet werden. Da beabsichtigt ist, daß diese Moleküle schließlich einen Teil eines Polynukleotids bilden, ist die Zuckergruppe, die einen Teil des Moleküls bildet, entweder von einem Ribose- oder einem Desoxyribosemolekül abgeleitet. Das Ribose- oder Desoxyribosemolekül ist in einem polymeren Zucker- Rückgrat enthalten, in dem die einzelnen Zuckergruppen über Phosphodiestergruppen zwischen 3'- und 5'-Hydroxylgruppen verbunden sind. Das hierin verwendete Nummerierungssystem ist das gleiche wie das bei Nukleotiden verwendete, in dem die Atome der "Base" -- hier das Kumarin-Derivat -- mit arabischen Ziffern bezeichnet sind und die Positionen von Atomen in der Zuckergruppe durch arabische Ziffern mit Strichindex bezeichnet sind.
Der Kumarin-Teil der erfindungsgemäßen Verbindung kann von Kumarin selbst oder irgendeinem einer Reihe substituierter Kumarine stammen. Eine Gruppe an der Position, wo der Zucker angebunden wird (die in der vorliegenden Beschreibung als Bindeposition bezeichnet wird), fungiert typischerweise als Vorläufer der Bindegruppe, die im Endprodukt die Kumarin-Gruppe mit der Zuckergruppe verbindet. Da Endprodukte jedoch häufig durch alternative Syntheseabläufe hergestellt werden können, ist es wahrscheinlich, daß jedes beliebige Endprodukt mehrere mögliche Vorläufer hat. Außerdem ist es möglich, daß nur ein Teil der Bindegruppe aus dem Substituenten an der Bindeposition des Kumarins hergestellt ist, während der verbleibende Tei der Bindegruppe von der Zuckergruppe stammt. Tatsächlich ist das typischerweise der Fall, wenn die Hydroxygruppe an der Position 1' des Zuckers oder ein anderer reaktiver Substituent an dieser Position, wie eine Amino- oder Thiogruppe, mit einer Abgangsgruppe auf dem Substituenten umgesetzt wird, um eine kovalente Bindung zu schaffen.
An anderen Stellen als der Bindeposition kann das Kumarin-Ringsystem entweder unsubstituiert oder substituiert sein. Typische Substituenten auf dem Phenyring sind kleine Substituenten, wie sie normalerweise an aromatischen Ringen in organischen Verbindungen zu finden sind. Substituenten können nach Wunsch gewählt werden, um die Anregungswellenlänge des Kumarins zu verändern. Substituenten an den Positionen 3 und 4 sind typischerweise nicht polar und am häufigsten Kohlenwasserstoffsubstituenten, wobei Methylsubstituenten am gebräuchlichsten sind. Die Positionen der Substituenten können zwar variieren, aber die Substituenten sind am häufigsten an den Positionen 4 und 8 zu finden.
Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen hat die Kumarin-Gruppe vor der Umsetzung mit der Zuckergruppe typischerweise die Formel
in der Y, Z, n und w die oben definierten Bedeutungen haben und X¹ ein Vorläufer der gesamten oder eines Teils der X-Bindegruppe ist. Da X¹ mit einer organischen funktionellen Gruppe auf der Zuckergruppe reagiert, um in der fertigen -X-Bindegruppe eine kovalente Bindung zu bilden, muß in X¹ eine reaktive funktionelle Gruppe vorhanden sein. Typische reaktive funktionelle Gruppen sind nukleophile und elektrophile Gruppen, die zu nukleophilen oder elektrophilen Substitutions- oder Additionsreaktionen fähig sind. Die funktionelle Gruppe kann eine sein, die vollständig oder teilweise im Endprodukt beibehalten wird (wie eine Hydroxylgruppe, die an einer Sn2-Reaktion mit einer Abgangsgruppe auf der Zuckergruppe teilnimmt), oder eine Abgangsgruppe, die im Endprodukt nicht vorhanden ist (wie ein Halogen, das an einer Sn1-Reaktion oder einer Sn2-Reaktion mit einem Hydroxyl auf der Zuckergruppe teilnimmt). Beispiele für spezifische funktionelle Gruppen unfassen Hydroxy-, Amino-, Halogen-, Thiol-, Carbonyl- und Carboxy- (einschließlich Ester- und Amid-) Gruppen. Diese Vorläufer können nach Standardverfahren der organischen Synthese aus Kumarin selbst oder aus vielen im Handel erhältlichen Kumarin-Derivaten synthetisiert werden. Siehe beispielsweise S.452 des "1988 Sigma Chemical Co. Catalogue of Biochemical and Organic Compounds" und S. 406 und 407 des "1988-1989 Aldrich Catalog Handbook of Fine Chemicals"
Der Rest des X¹-Vorläufers unterliegt keiner speziellen Einschränkung, solange die zuvor genannten Einschränkungen bezüglich Größe und Polarität beachtet werden, nämlich daß die -X-Endgruppe nicht polar bis mäßig polar ist (enthält typischerweise keine freien Hydroxyl- oder Aminogruppen der zuvor genannten Gruppen) und 1 bis 5 Kohlenstoffatome und 0 bis 3 Heteroatome enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus O, S und N besteht, und worin die -X- Endgruppe eine Bindekette aus 1 bis 4 Atomen zwischen der Position 1' des Zuckers und der Bindeposition des Kumarin- Derivats umfaßt. Es können auch Halogene vorhanden sein, typischerweise in halogenierten Kohlenwasserstoff-Brückengruppen (bis zu 2m Halogene, wobei m die Anzahl der Kohlenstoffatome in der Brückengruppe ist). Vorzugsweise hat die X- Bindegruppe die Formel X², OX², SX² oder NHX², worin X² eine C&sub1;-C&sub5;- Hydrocarbylgruppe oder eine C&sub1;-C&sub5;-Hydrocarboxygruppe ist, von denen jede mit 0 bis 2 Carbonylsauerstoffen in Form von Keto- oder Esterfunktionalitäten (oder ähnlichen) substituiert ist, mit der Maßgabe, daß, im Falle O, S oder NH als Teil von X vorhanden ist, das O, S oder NH (oder eine solche Gruppe, wenn mehr als eine vorhanden ist) an die Position 1' des Zuckerrings gebunden ist und die X²-Gruppe an das angegebene Heteroatom gebunden ist, um eine stabile kovalente Bindung zu schaffen. Besonders bevorzugte Bindegruppen sind jene, bei denen X
X³-(CH&sub2;)m- ist, worin m eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist und X³ O, S oder NH ist. Besonders bevorzugte Bindegruppen weisen 2 Atome in der Bindekette auf, wie z.B. die ersten 6 Gruppen des vorhergehenden Satzes.
Die angegebenen Gruppen auf der Zuckergruppe in der allgemeinen Formel, nämlich die R-, R²- und R³-Gruppen sind jene, die bei der Synthese eines Polynukleotids durch synthetische chemische Mittel typischerweise auf der Zuckergruppe eine Nukleotids, Polynukleotids oder Vorläufers vorhanden sind, insbesondere Schutzgruppen und Aktivierungsgruppen, die bei der Festphasensynthese vorhanden sind. R ist entweder H oder OR¹, worin R¹ nachstehend definiert wird. Wenn R H ist, ist der Zucker Desoxyribose, und das Nukleosidanalog soll in ein DNA-Molekül eingebaut werden. Wenn R OR¹ ist, ist der Zucker Ribose oder ein Ribosederivat, und das Nukleosidanalog soll in ein RNA-Molekül eingebaut werden.
R¹, R² und R³ stellen unabhängig voneinander H oder eine Hydroxyl-Schutz- oder eine Hydroxyl-Kopplungsgruppe dar, und R² und R³ können weiters ein Nukleotid oder Polynukleotid umfassen, das, typischerweise über eine 3'-5'-Phosphodiesterbindung. mit dem Rest des Moleküls verbunden ist. Im spezielleren sind Hydroxyl-Schutz- oder Hydroxyl-Kopplungsgruppen jene, die normalerweise in der Nukleotidchemie verwendet werden, insbesondere bei chemischer Festphasensynthese von DNA- und RNA-Molekülen, bei der eine chemische Bindung durch eine 3'- oder 5'- Hydroxylgruppe mit einem Nukleosid, Nukleosidderivat, Polynukleotid oder Polynukleotidderivat ein Ziel des Syntheseverfahrens ist. Ein Überblick über diese Chemie und die Arten von Schutz- und Kopplungsgruppen, die während der Synthese eines Polynukleotids typischerweise auf Zuckergruppen vorhanden sind, findet sich in "Oligonudeotide Synthesis, a Practical Approach", Hrsg. M.J. Gait, IRL Press Ltd., Oxford, Großbritannien 1984; Reese, G.B., Tetrahedron (1978) 34: 3143; und Amarnath, V. und A.D. Broom, Chemical Reviews (1977) 77:183. Besonders bevorzugt werden Verbindungen, bei denen R¹, R² und R³ unabhängig voneinander aus H; Benzoyl; mit C&sub1;-C&sub4;-Alkyl, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy, (Cyano, Nitro oder Halogen substituiertem Benzoyl; Triarylmethyl (in dem Aryl üblicherweise aus Phenyl und Naphthyl ausgewählt ist); oder mit C&sub1;-C&sub4;-Alkyl-, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-, Cyano-, Nitro- oder anderen kleinen organischen Gruppen substituiertem Triarylmethyl ausgewählt sind. Die Trityl- und substituierten Trityl (insbesondere 4,4'-Dimethoxytrityl)-Substituenten werden für R³ besonders bevorzugt, da diese Gruppen oft bei der Festphasensynthese an dieser Position verwendet werden. Eine Pixyl- (9-Phenylxanthenyl)-Gruppe wird ebenfalls häufig verwendet. Trityl- und substituierte Tritylgruppen werden weniger häufig als R¹ und R² verwendet. Für R¹ wird die 4-Methoxytetrahydropyran-4-yl-Gruppe vorgezogen.
Erfindungsgemäße Verbindungen können unter Beachtung der in der vorliegenden Beschreibung dargelegten Richtlinien nach Standardtechniken der synthetischen organischen Chemie hergestellt werden. Beispielsweise wird im nachstehenden Reaktionsschema eine typische Synthese auf der Basis von im Handel erhältlichen Ausgangsmaterialien dargelegt. In diesem Schema werden die folgenden Abkürzungen verwendet: NBS = N-Bromsuccinimid; DME = 1,2-Dimethoxyethan, pyr = Pyridin; DMT-Cl = Dimethoxytritylchlorid; (iPr)&sub2;EtN = Dusopropylethylamin. Weitere Details der gezeigten Reaktionen sind in den nachstehenden Beispielen dargelegt. Es wird nur eines der beiden möglichen Anomere an den 1-Positionen des Zuckers gezeigt. Bei der Synthese werden üblicherweise Gemische aus α und β-Anomeren erhalten. Die Trennung von Anomeren, um reine einzelne Anomere bereitzustellen, kann in verschiedenen Stufen der Synthese durchgeführt werden, wie in den nachstehenden Beispielen (z.B. Beispiel 6) gezeigt. REAKTIONSSCHEMA Rückfluß Toluoyl Pyridin H-Phosphonat-Monomer
Zahlreiche Variationen dieses Reaktionsschemas können eingesetzt werden, um andere Moleküle herzustellen, entweder indem andere Ausgangsmaterialien ausgewählt werden, oder indem die im oben gezeigten Schema zum Umwandeln funktioneller Gruppen verwendeten Techniken modifiziert werden. Beispielsweise liefert die 7- Brommethylgruppe eine leicht alkylierbare Gruppe, die als Vorläufer komplexerer Bindegruppen verwendet werden kann. Zu den im Handel erhältlichen Kumarinen, die als Vorläufer von Molekülen mit einem Sauerstoff- oder einem anderen Heteroatom, das direkt an den aromatischen Kumarin-Ring gebunden ist, verwendet werden können, gehört beispielsweise 7-Hydroxy-3-methylkumarin. Es ist auch ein Derivat dieses Moleküls erhältlich, bei dem die 7-Hydroxygruppe in eine Chlorcarbonylmethylengruppe umgewandelt worden ist. Andere nützliche im Handel erhältliche Verbindungen umfassen 6-Methylkumarin, 7-Methylkumarin, 7-Hydroxykumarin, 7- Hydroxy-4-methylkumarin, 7-Amino-4-methylkumarin, 7-Amino-4-trifluormethylkumarin, 7-Carboxymethyl-4-methylkumarin und 7-Methoxykumarin, 4'-Hydroxymethyl-4,5'-8-trimethylpsoralen, 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen und Angellicine. Bei Psoralenen und Angellicinen umfaßt die Bindegruppe einen Abschnitt des Furanrings; z.B. kann die Bindekette in HMT-Psoralen als der 4'-Kohlenstoff und der Hydroxymethylsubstituent oder der Furansauerstoff, die 5'- und 4'-Kohlenstoffe und der Hydroxymethylsubstituent betrachtet werden. Ausgangszucker umfassen Ribose und Desoxyribose selbst sowie zahlreiche andere im Handel erhältliche Verbindungen, bei denen an verschiedenen Positionen bereits Blockierungsgruppen vorhanden sind. Beispiele dafür umfassen Methyl-2-desoxy-3, 5-di-O-(p-nitrobenzoyl)-D-ribofuranose, Tri-O-benzoyl-1-acetyl-D-ribofuranose und Tetra-O-acetyl-D-ribofuranose.
Wie im obigen Reaktionsschema gezeigt, ist das erste erhaltene Produkt typischerweise eine Verbindung, bei der R² und R³ als geschützte Hydroxygruppen vorhanden sind. Bei solchen Verbindungen wird typischerweise die Schutzgruppe entfernt, und dann werden spezifische Schutz- oder Aktivierungsgruppen zugegeben, um ein Polynukleotid herzustellen, das das Nukleosidanalog gemäß vorliegender Erfindung enthält. Zur Herstellung von Polynukleotiden kännen Standardtechniken mit nur geringen Modifikationen eingesetzt werden, da die Polymerisationsreaktion nicht das Basenanalog, sondern nur die Zuckergruppe betrifft. In den meisten Fällen ist die einzige notwendige Modifikation die Behandlung des neu synthetisierten Harzoligonukleotids mit 1 M Natriumkarbonat bei 50ºC 2 h lang vor dem Deblockieren mit heißem Ammoniak. Diese Behandlung dient dazu, den Kumarin-Ring zu öffnen und dadurch die Amidbildung durch den Angriff von Ammoniak an der 2-Position des Kumarin-Ringes zu verhindern. Amidbildung muß vermieden werden, weil sie das Wiederverschl ießen des Kumarin-Ringes unter darauffolgenden milden Säurebedingungen verhindert. Beispiele für nützliche Techniken werden in M.J. Gait, Hrsg., s.o., angeführt.
Nukleosidanaloge gemäß vorliegender Erfindung können in das Polynukleotid entweder am 3'-Ende, am 5'-Ende oder an einer inneren Stelle eingebaut werden. Wenn ein natürlich auftretendes Polynukleotid mit einem Nukleosidanalog gemäß vorliegender Erfindung markiert wird, findet das Markieren typischerweise an einem der Enden des Moleküls oder an einer Restriktionsstelle statt, wo die Manipulation der Nukeotide einfacher ist. Wenn ein Nukleosidanalogon gemäß vorliegender Erfindung in ein synthetisch hergestelltes Polynukleotid eingebaut wird, kann es während der Synthese leicht an jeder Stelle im Molekül eingefügt werden. Die Sonde wird ansonsten so gewählt, daß sie zu einem Abschnitt des Analytnukleotids komplementär ist, mit der Ausnahme, daß die Sonde das erfindungsgemäße Nukleosid enthält, das eine Fehlpaarung mit einem Nukleosid im Analytnukleotid bildet. Das Nukleotidanalog gemäß vorliegender Erfindung sollte sich an der Stelle in der Sonde befinden, sodaß, wenn die Sonde mit ihrem beabsichtigten Analytpolynukleotid hybridisiert, unmittelbar an der 5'-Seite des Nukleosidrests im Analytpolynukleotid ein Thymidin- oder Uridinrest vorhanden ist, der eine Fehlpaarung mit dem Nukleosidanalog gemäß vorliegender Erfindung bildet. Diese Beziehung ist der Formel
..XpT...(5")
(5')..YpA...
zu entnehmen, die zwei benachbarte Nukleotide in zwei hybridisierten Polynukleotidketten zeigt, wobei T Thymidin, A Adenosin, X jedes beliebige Nukleotide und Y ein Nukleotidanalog gemäß vorliegender Erfindung ist, und die 5'- Enden beider Stränge gezeigt werden.
Da das Nukosidanalog gemäß vorliegender Erfindung in einem Hybridisierungsassay keine Wasserstoffbrückenbindung mit der entsprechenden Base in einem komplementären Strang bildet, werden einige Vorteile erzielt, indem das Vernetzungsmittel an einem der Enden der Sonde eingebaut wird. Beispielsweise würde bei einer Polynukleotidsonde mit einer Länge von 15 Basen das Einbauen eines Vernetzungsmittels gemäß vorliegender Erfindung in der Mittelposition zwei komplementäre Sequenzen mit einer Länge von 7 Basen mit einer gewissen möglichen Unterbrechung in der Mittelposition hinterlassen. Da die Bindungsaffinität exponentiell mit einer Zunahme der Anzahl aufeinanderfolgender Bindungspaare steigt, ist größere Bindungsaffinität vorhanden, wenn sich das Vernetzungsmittel nahe einem Ende des Moleküls befindet, sodaß 12 oder 13 aufeinanderfolgende Basen eher komplementär sind als 2 Gruppen zu je sieben. Die Anordnung des Nukleosidanalogs 1 oder 2 Basen vom Ende der Sonde verringert das nichtspezifische Vernetzen und wird dem Anordnen des Analogs am Ende der Sonde vorgezogen.
Wenn das Nukleosid an einem oder nahe an einem der Enden der Sonde angeordnet ist, kann es entweder ein α- oder ein β-Anomer mit wenig oder keiner Auswirkung auf die Vernetzungseffizienz sein. Wenn es sich an einer mittleren Position in einer Sonde befindet, ist das Nukleosid in Hinblick auf die erhöhte Vernetzungseffizienz vorzugsweise ein β-Anomer.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben worden ist, wird zum besseren Verständnis auf die folgenden detaillierten Beispiele Bezug genommen, die dem Zweck der Veranschaulichung dienen und die Erfindung, wenn nicht anders angegeben, nicht einschränken sollen.

Beispiel 1

Herstellung von 7-Brommethylkumarin

Zu 50 ml Chloroform wurden 7-Methylkumarin (10 g, 62,4 mmol) und N- Bromsuccinimid (11,1 g, 62,4 mmol) zugegeben. Die Suspension wurde dann 24 h lang am Rückfluß gehalten, was eine klare Lösung zur Folge hatte. Der Rückfluß wurde 5 Tage fortgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt hatte sich ein kugelförmiger Klumpen aus Kristallen gebildet. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und dann 24 h lang in einen Kühlschrank mit 0ºC gestellt. Die Kristalle wurden durch Flltration gesammelt und mit einer kleinen Menge an kaltem Chloroform gewaschen. Nach kurzem Absaugen, um Chloroform zu entfernen, wurden die Kristalle in einer minimalen Menge an kochendem Aceton aufgelöst und einige Tage lang kristallisieren gelassen. Die Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und mit ein wenig kaltem Aceton gewaschen. Nach dem Trocken im Vakuum betrug die Ausbeute 7,15 g (48% d.Th.). Der Schmelzpunkt lag bei 179,5 - 181,5ºC.

Beispiel 2

Herstellung von 7-Hydroxymethylkumarin

Zu einem 1:1-Gemisch aus Aceton und Wasser (560 ml) wurde 7-Brommethylkumarin (7,0 g, 29,3 mmol) zugegeben. Die resultierende Suspension wurde 48 h lang am Rückfluß gehalten, zu welchem Zeitpunkt das Reaktionsgemisch zu einer klaren Lösung wurde. Die Lösung wurde dann abgekühlt und mit Natriumbikarbonat (2,4 g, 29,3 mmol) neutralisiert und im Vakuum auf etwa 65 ml eingeengt. Das Ergebnis war eine dicke Masse aus Kristallen. Die Kristalle wurden durch Flltration gesammelt, was nach dem Trocknen im Vakuum 5,27 g Produkt ergab (100% d.Th.). Der Schmelzpunkt lag bei 116-117ºC.

Beispiel 3

Verschmelzung von 7-Hydroxymethyl kumarin und 2-Desoxy-3,5-di-O-p-toluyl-α-D ribofuranosylchlorid

(Bildung des 2'-Desoxyribosids von Hydroxymethylkumarin)

In ein Testrohr mit 25 mm Durchmesser und einem Seitenrohr zum Anlegen eines Vakuums wurden 7-Hydroxymethylkumarin (300 mg, 1,70 mmol) und 2-Desoxy-3,5-di-O-p-toluoyl-α-D-ribofuranosylchlorid (600 mg, 1,54 mmol) gegeben. Das Testrohr wurde dicht verstoppelt und Vakuum von etwa 1 mm wurde durch das Seitenrohr an das Rohr angelegt. Das evakuierte Rohr wurde dann in einem Ölbad 5 min lang auf 110ºC erhitzt. Während der ersten 2 min des Erhitzens entwickelte sich heftig HCl-Gas. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, und der Rückstand wurde in 3 bis 4 mi eines 1:1-Gemischs von Aceton und Hexan aufgenommen. Die Lösung wurde dann einer Chromatographie auf einer 50 mm x 150 mm Silikagelsäule unterzogen, wobei Aceton/Hexan im Verhältnis 1:1 als Elutionsmittel verwendet wurde. Die Produkt enthaltenden Fraktionen wurden durch TLC identifiziert und gepoolt und bis zu einem glasartigen Zustand eingeengt. Das "Glas" wurde in 10 ml Ethylacetat aufgenommen. Die Ethylacetatlösung in einem 50 ml-Erlenmeyerkolben wurde in ein Gefäß gegeben, das 20 ml Pentan enthielt. Das Gefäß wurde dann abgedichtet, und man ließ die Kristallisation ablaufen. Die Ausbeute waren 330 mg weiße Kristalle (41% d.Th.), der Schmelzpunkt lag bei 92-106ºC. Rf = 0,48 in 1:1 Aceton/Hexan. NMR zeigte, daß dieses Material in etwa ein 1:1-Gemisch aus α- und β-Anomeren war.

Beispiel 4

Umsetzung des Alkoxids von 7-Hydroxymethylkumarin mit 2-Desoxy-3.5-di-O-p-toluylα-D-ribofuranosylchlorid

(Bildung des 2'-Desoxyribosids von 7-Hydroxymethylkumarin)
Zu 125 ml 1,2-Dimethoxyethan wurden 7-Hydroxymethylkumarin (2,49 g, 14,15 mmol) und 50%iges Natriumhydrid in Öl (747 mg, 15,57 mmol) zugegeben. Das Ergebnis war eine Suspension. Dann wurde der rasch gerührten Suspension langsam und in kleinen Teilmengen 2-Desoxy-3, 5-di-O-p-toluoyl-α-D-ribofuranosylchlorid (5,50 g, 14,1 5 mmol) zugegeben. Nach 5 min wurde 1 ml Eisessig zugegeben, um das Reaktionsgemisch zu neutralisieren. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert und im Vakuum zu einem Öl eingeengt. Das Öl wurde durch Silikagelchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (EtOAc/Hex) im Verhältnis 1:1 als Elutionsmittel gereinigt. Die Produkt enthaltenden Fraktionen wurden durch TLC identifiziert und gepoolt und im Vakuum zu einem Öl eingeengt. Das Produkt war nach TLC homogen. NMR zeigte, daß das Produkt ein Gemisch aus α- und β-Anomeren mit einem Verhältnis von in etwa 1:1 war. Ausbeute: 3,77 g (50% d.Th.).

Beispiel 5

Entfernen der p-Toluoylgruppen aus dem 3',5'-Di-O-p-toluyl-2'-desoxyribosid von 7- Hydroxymethylkumarin

Das 3',5'-Di-O-p-toluyl-2'-desoxyribosid von 7-Hydroxymethylkumarin (2,6 g, 4,92 mmol) aus Beispiel 4 wurde in 25 ml Pyridin/Methanol/Wasser (65:3α5) aufgelöst und kurz in Eiswasser abgekühlt. Dann wurden 25 ml 2 M NaOH in Pyridin/Methanol/Wasser (65:30:5) unter Rühren in einem Eisbad zugegeben. Nach 20 min wurde die Umsetzung durch die Zugabe von 3,2 g NH&sub4;Cl unterbrochen. Das Präzipitat wurde abfiltriert, dann im Vakuum zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in EtOAc/Aceton (9:1, 10 ml) aufgenommen, und die Lösung wurde auf eine Silikagelsäule mit einer Breite von 50 mm und einer Höhe von 152 mm aufgebracht und mit EtOAc/Aceton (9:1) eluiert. Fraktionen wurden durch TLC identifiziert. Der Rf von Produkt im Elutionsmittel betrug etwa 0,42. Die Produkt-(Gemisch aus α- und β- Anomeren) enthaltenden Fraktionen wurden im Vakuum eingeengt, was 600 mg Produkt ergab (Ausbeute 42%).

Beispiel 6

Herstellung des 4,4'-Dimethoxytritylderivats an der 5'-Position des 2'-Desoxyribosids von 7-Hydroxymethylkumarin

Zu 20 ml Pyridin wurden 7-Kumarinyl-methyl-β-D-2'-desoxyribosid von Beispiel 5 (580 mg, 1,98 mmol), 4-N,N-Dimethylaminopyridin (12 mg) und Triethylamin (385 µl, 2,77 mmol) zugegeben. Der resultierenden Lösung wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (812 mg, 2,40 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann 3 h lang gerührt. Das Gemisch wurde dann mit 25 ml Wasser behandelt, und das resultierende Gemisch wurde mit 2 x 120 ml Ethylether extrahiert. Die kombinierten Etherextrakte wurden im Vakuum eingeengt, in 2,5 ml Aceton/Methylenchlorid (0,5:9,5) aufgelöst und durch Chromatographie auf einer Silikagelsäule unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels (das 2% Triethylamin enthielt) gereinigt. Es werden zwei Fraktionen erhalten (Rf durch Silikagel-Dünnschichtchromatographie von 0,30 und 0,40 im gleichen Elutionssystem). Diese Fraktionen sind dann die getrennten α- und β-Anomere. Ausbeute der Rf =0,40-Fraktion: 365 mg.

Beispiel 7

Herstellung des H-Phosphonats des 4.4¹-Dimethoxytritylderivat an der 5'-Position des 2'-Desoxyribosids von 7-Hydroxymethylkumarin

Phosphortrichlorid (257,4 µl, 2,95 mmol) und N-Methylmorpholin (3,24 ml, 29,5 mmol) wurden in 30 ml Methylenchond aufgelöst. Dann wurde der Lösung Triazol (678 mg, 9,82 mmol) zugegeben. Nach 30 min wurde das Reaktionsgemisch auf 0ºC abgekühlt, und das DMT-Derivat von Beispiel 6 (350 mg, 0,589 mmol, getrocknet durch gemeinsame Verdampfung aus CH&sub3;CN) in 8 ml trockenem Methylenchond wurde tropfenweise unter Rühren über 20 min zugegeben. Nach insgesamt 30 min ab dem Beginn der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch in 24 ml 1 M Triethylammoniumbikarbonat, pH 8,5, gegossen und in einem Scheidetrichter geschüttelt. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wäßrige Phase wurde mit 8 ml Methylenchlond extrahiert, und die kombinierten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet. Die trockene organische Phase wurde dann zu einem Schaum eingeengt, in 1,5 ml Methylenchlorid/Methanol/Triethylamin (500:4:6) aufgelöst und durch Slikagelchromatographie im gleichen Lösungsmittel gereinigt. Ausbeute 500 mg eines "Glases".

Beispiel 8

Herstellung von Oligodesoxynukleotiden. die ein Nukosidanalog gemäß vorliegender Erfindung enthalten

Unter Einsatz des H-Phosphonat-Verfahrens von Froehler et al., (Nucleic Acids Research (1986)14:5399) wurde das folgende Oligonukleotid zusammengebaut:
5'-CAGCCTTXA-3
In dieser Formel steht X für (7-Kumarinyi)methyl-β-D-2'-desoxyribosid, und A, C, G und T haben ihre normale Bedeutung bei Nukleotiden.
Nach dem Zusammenbau wurde der mit anhaftenden Oligonukleotiden (10 mg) versehene feste Träger 2 h lang bei 50ºC mit 1 M Na&sub2;CO&sub3; (200 ml) behandelt, gefolgt von der Zugabe von 2 ml konzentriertem Ammoniak und dem Erhitzen auf 55ºC für 18 h. Dann wurden die Oligonukleotide durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt.
Es wurde gezeigt, daß das Oligonukleotid wirksam beim spezifischen Hybridisieren und Vernetzen (nach Lichtaktivierung) mit einem Zielpolynukleotid ist.

Beispiel 9

Herstellung von 3'-O-(N-Diisopropylamino)-phosphoramidit-Derivat aus dem 4-4'- Dimethoxytrityl-Derivat an der Position 5' vom 2'-Desoxyribosids von 7- Hydroxymethylkumarin

Trockenes DMT-Derivat aus dem Verfahren von Beispiel 6 (827 pg, 1,39 mmol) wird mit Diisopropylethylamin (1,21 ml, 5,56 mmol) und Dichlormethan (3 ml) behandelt Die Suspension wird gerührt, bis sie zu einer klaren Lösung wird. Dann wird Chlor-N,Ndiisopropylaminomethoxyphosphin (400 µl, 2,09 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 15 min lang gerührt, daraufhin wird die Reaktion durch die Zugabe von wasserfreiem Methanol (20 µl) unterbrochen. Das Reaktionsgemisch wird dann mit Ethylacetat (30 ml) und Triethylamin (1,5 ml) verdünnt, mit 10%igem wäßrigen Natriumkarbonat (2 x 20 ml) und dann mit gesättigtem wäßrigen Natriumchlorid (2 x 20 ml) extrahiert. Die organische Phase wird dann im Vakuum eingeengt. Das Produkt wird durch Chromatographie auf Silikagel unter Verwendung von Ethylacetat/Dichlormethan/Triethylamin (45:45:10) als Entwicklungslösungsmittel gereinigt. Die Produkt enthaltenden Fraktionen werden im Vakuum konzentriert, sodaß ein weißes Pulver entsteht. Die Ausbeute beträgt etwa 1 g. Um Cyanoethylphosphoramidite anstelle von Methylphosphoramiditen herzustellen, ist Chlor-N,N- Di isopropylaminomethoxyphosphin durch Chlor-N, N-diisopropylaminocyanoethoxyphosphin (479 µl, 2,09 mmol) zu ersetzen.
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in der vorliegenden Beschreibung erwähnt werden, geben den Wissenstand der Fachleute auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung an. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin im gleichen Maß durch Verweis eingeschlossen, als ob jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und einzeln als durch Verweis eingeschlossen angeführt wäre.
Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben worden ist, wird Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar sein, daß viele Änderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne daß dadurch vom Schutzumfang der Erfindung abgewichen wird.

Claims

1. Lichtaktivierbare Verbindung, die eine Kumarin-Gruppe enthält, die über eine Bindegruppe X an eine D-Zucker-Gruppe gebunden ist, wobei die Verbindung die Formel T

aufweist, worin:

n 0,1,2 oder 3 ist;

jedes W unabhängig einen stabilen Substituenten darstellt, der bis zu 15 Atome aufweist;

Y und Z unabhängig voneinander H oder Niederalkyl darstellen;

X eine organische Bindegruppe ist, die 1 bis 5 Kohlenstoffatome, 0 bis 3 Heteroatome, ausgewählt aus der aus O, S und N bestehenden Gruppe, und 0 bis 2m Halogenatome enthält, worin m die Anzahl der Kohlenstoffatome in X ist, wobei sich keines der Halogenatome in α-Stellung zu einem Heteroatom befindet und worin X entweder eine einzelne Bindekette aus 1 bis 4 Atomen enthält, welche die Kumarin-Gruppe an die Zuckergruppe bindet, oder ansonsten eine Gruppe -X³-(CH&sub2;)m ist, worin m eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist und X³ -NH-, -O- oder -S- ist;

R H oder -OR ¹ist;

R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder eine Gruppe darstellen, die fähig ist, sich während der Polynukleotidsynthese mit einer Hydroxylgruppe zu koppeln oder diese zu schützen, und R² und R³ weiters ein Nukleotid oder ein Polynukleotid darstellen können, das über eine 3'-5'-Phosphodiesterbindung an die Verbindung gebunden ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin die Bindegruppe kovalent an die Position 7 der Kumarin-Gruppe gebunden ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder eine organische Hydroxylschutz- oder Hydroxylkopplungsgruppe darstellen, die bei der in vitro-Synthese von Oligonukleotiden verwendet werden, und R² und R³ weiter ein Nukleotid oder ein Polynukleotid darstellen können, das über eine 3'-5'- Phosphodiesterbindung an die Verbindung gebunden ist.

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin R H oder -OH ist und R² und R³ unabhängig voneinander H oder ein Nukleotid oder ein Polynukleotid darstellen, das über eine 3ro 5'-Phosphodiesterbindung an die Verbindung gebunden ist.

5. Verbindung nach Anspruch 1, worin X X², OX, SX² oder NHX² ist, worin X eine C&sub1;- C&sub5;-Hydrocarbylgruppe oder eine C&sub1;-C&sub5;-Hydrocarbyloxygruppe ist, die mit 0 bis 2 Carbonyl-Sauerstoffen substituiert ist, mit der Maßgabe, daß, im Falle das O, S oder NH als Teil von X vorhanden ist, ein Kohlenstoffatom von X² an das O, S oder N gebunden ist und das O, S oder NH an die 1't-Position des Furanose-Rings in der Formel gebunden ist.

6. Verbindung nach Anspruch 5, worin X X² oder OX² ist.

7. Verbindung nach Anspruch 5, worin X

ist,

worin m eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist und X³ -NH-, -O- oder -S- ist.

8. Verbindung nach Anspruch 5, worin R¹ H ist.

9. Verbindung nach Anspruch 5, worin R¹ 4-Methoxytetrahydropyran-4-yl ist.

10. Verbindung nach Anspruch 5, worin R² H; Benzoyl; mit C&sub1;-C&sub4;-Alkyl, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyl, Cyano, Nitro oder Halogen substituiertes Benzoyl; Trityl; oder mit C&sub1;-C&sub4;-Alkyl oder Alkoxyl, Cyano, Nitro oder Halogen substituiertes Trityl ist.

11. Verbindung nach Anspruch 5, worin R³ H; mit C&sub1;-C&sub4;-Alkyl, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyl, Cyano, Nitro oder Halogen substituiertes Benzoyl, Trityl; oder mit C&sub1;-C&sub4;-Alkyl oder Alkoxyl, Cyano, Nitro oder Halogen substituiertes Trityl ist.

1 2. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin jedes W unabhängig aus niederen Hydrocarbylgruppen, Halogen-, Nitro-, Cyano-, Carbonyl-, Carboxy-, Hydroxy-, Amino- oder Amido- und Hydrocarbylsubstituenten ausgewählt ist, die eine oder mehrere dieser Heteroatome umfassenden Gruppen enthalten.