DE3689715T2

DE3689715T2 - Verfahren und Reagenzien für die In-vitro-Synthese von Oligonukleotiden.

Info

Publication number: DE3689715T2
Application number: DE3689715T
Authority: DE
Inventors: Brian Carl Froehler; Mark Douglas Matteucci
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1985-10-15
Filing date: 1986-10-14
Publication date: 1994-08-18
Anticipated expiration: 2006-10-15
Also published as: JP2511005B2; JPH0812698A; EP0219342A2; JPH0812697A; EP0219342B1; US5548076A; DE3689715D1; JP2705914B2; EP0219342A3; US5264566A; US4959463A; JP2705913B2; JPS62116593A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die in-vitro Synthese von Oligonukleotiden. Im speziellen betrifft sie die Herstellung von Desoxyoligonukleotiden zur Verwendung in rekombinanten Wirtsvektorsystemen und als Zwischenprodukte bei der Herstellung von markierten Oligonukleotid-Sonden für Diagnoseassays.
Oligonukleotide werden gegenwärtig in vitro nach einem von zwei vorherrschenden Verfahren hergestellt, dem Phosphoramiditverfahren (siehe beispielsweise Adams et al., 1983, "J.Amer.Chem.Soc." 105 : 661 und Froehler et al., 1983 "Tetrahedron Lett." 24: 3171) oder dem Phosphotriesterweg (Deutsche Offenlegungsschrift 2644432). Beide Verfahren sind zwar effizient und weitverbreitet akzeptiert, es werden dafür aber große Mengen an kostspieligem Monomer eingesetzt. Diese Verfahren sind auch komplex. Das Phosphoramiditverfahren erfordert einen wässerigen Oxidationsschritt nach jeder Kondensation, während das Triesterverfahren erfordert, daß die wegfallende Subpopulation an Oligonukleotiden (jene, denen während eines Zyklus kein Monomer hinzugefügt wurde) in einem gesonderten Schritt "verkappt" wird, um weitere Kettenverlängerung der wegfallenden Oligonukleotide in zukünftigen Zyklen zu verhindern. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Oligonukleotidsynthese zu schaffen, das wirtschaftlicher und verläßlicher als die zur Zeit verfügbaren Verfahren ist.
Es ist bekannt, Nukleosidphosphonate durch Kondensation von Nukleosiden mit Phosphorigersäure unter Verwendung von Arylsulfonylchlorid (Sekine et al., 1979; "Tetrahedron Lett." 20 : 1145) oder Carbodiimiden (Schofield et al., 1961, "J.Am.Chem. Soc." Seite 2316) herzustellen. Hall et al. ([1957], "J.Chem.Soc." Nucleotid-Teil XLI, S. 3291-3296) behandelten das Nukleosid H-Phosphonat weiter, um unter Verwendung von Diphenylchlorphosphat das entsprechende Dinukleotidphosphonat herzustellen, gefolgt von Oxidation, um das entsprechende Dinukleotidphosphat herzustellen. So ist, ungeachtet der Kenntnisse nach dem Stand der Technik über die Herstellung von Dinukleotidphosphat seit 1957 und der in der Zwischenzeit erfolgten Entwicklung von zwei komplexen und kostspieligen Methodologien für die in-vitro Herstellung von Oligonukleotiden, die Offenbarung von Hall et al. für die Herstellung von Oligonukleotiden ungenutzt geblieben.
Garegg et al., "Chemica Scripta" 25: 280-282 (1985) hat festgestellt, daß 5'-O-dimethoxytritylthymidin-3'-hydrogenphosphonat in Gegenwart eines Aktivators, wie Diphenylphosphorchloridat (auch als Diphenylchlorphosphat bekannt), 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonylchlorid oder 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonyltetrazolid rasch mit 3'-O-Benzoylthymidin reagiert, um in quantitativer Ausbeute eine Phosphonatdiesterbindung zu bilden. Nach Garegg et al. machte die Stabilität der 3'-Phosphonate im Vergleich zu den entsprechenden 3'-Phosphoramiditen, zusammen mit ihrer mit Phosphoramiditen vergleichbaren Reaktivität bei Aktivierung, sie als Ausgangsmaterialien für Oligonukleotidsynthese geeignet. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben festgestellt, daß die Aktivierungsmittel nach Garegg aufgrund der auf diese Art erhaltenen geringen Ausbeuten für praktische Oligonukleotidsynthese ungeeignet sind, eine Entdeckung, die mit eine Erklärung dafür sein kann, daß drei Jahrzehnte vergangen sind, ohne daß die Fachwelt die Phosphonatchemie dem Ziel der Oligonukleotidsynthese unterworfen hat.
Die Synthese von DNA, die Internukleotidphosphatanaloge enthält, wird nunmehr ein Gebiet, dem großes Interesse zukommt. Miller und Ts'o haben gezeigt, daß Methylphosphonatanaloge von DNA leicht durch Zellmembranen hindurchgehen und Proteinsynthese hemmen, vermutlich, indem sie die mRNA-Translation stören (Blake et al., "Biochemistry" 24, 6139 (1985), Smith et al., "Proc. Natl. Acad. Sci." 83, 2787 (1986)). Es ist bekannt, daß sich Phosphoramidatanaloge von Dinukleotiden an komplementäre Polynukleotide binden und zum Befestigen verschiedener Liganden an DNA verwendet werden können (Letsinger et al., "Nucl.Acids Res." 14, 3487 (1986)). Die Oxidation von Dinukleosid-H-Phosphonaten in Gegenwart von Aminen führt zu den entsprechenden Dinukleotidphosphoramidaten (Nemer et al., "Tetrahedron Lett." 21, 4149 (1980), Atherton et al., "J.Chem.Soc." 660 (1945)) in hoher Ausbeute. Es sind Verfahren für die einfache Herstellung von Phosphoramidat-, Thiophosphat- und Phosphattriesteranalogen von Oligonukleotiden erforderlich.
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Verfahren zum Synthetisieren eines Polynukleotid-H-Phosphonats geschaffen, welches umfaßt: (a) die Schaffung eines an einen Träger gebundenen Nukleosids, (b) das Kondensieren eines blockierten Nukleosid-H-Phosphonats mit dem 5'-Hydroxyl des trägergebundenen Nukleosids in Gegenwart eines Acylierungsmittels, (c) das Entfernen der 5'-Blockierungsgruppe des Nukleosid-H-Phosphonats von Schritt b), (d) das sequentielle Wiederholen der Schritte b) und c) unter Verwendung von ausgewählten Nukleosid-H-Phosphonaten, bis ein Polynukleotid-H-Phosphonat mit mehr als zwei Nukleotiden erhalten worden ist. Ein Polynukleotid kann dann erzeugt werden durch (e) Oxidieren des Polynukleotid-H-Phosphonats, um das entsprechende Polynukleotid zu bilden, und (f) das Abtrennen des Polynukleotids vom Träger. Die Polynukleosid-H-Phosphonate sind als Ausgangsmaterialien für die neue Synthese der Phosphoramidat-, Thiophosphat- und Phosphattriesteroligonukleotide nützlich.
In einem weiteren Aspekt schafft die Erfindung eine Zusammensetzung, die ein Polynukleotid mit zumindest einem substituierten Internukleotidphosphat umfaßt, wobei das genannte Polynukleotid die Formel
hat, worin
1) -Z -OH, -O-R,
oder
ist;
2) a eine ganze Zahl ist, die größer als 9 ist;
3) zumindest 1 Z nicht -OH ist;
4) R Aryl oder Heteroaryl ist;
5) X oder Y Wasserstoff oder Alkyl sind; und
6) M ein Nukleosid ist.
Die Ausgangsmaterialien für die Praxis des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen ein trägergebundenes Nukleosid und blockierte Nukleosid-H-Phosphonatmonomere. Das 5'-Hydroxyl des trägergebundenen Nukleosids ist nicht blockiert. Die gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Nukleoside sind die Monomeren von RNA oder DNA oder ihre Derivate. Exemplarische ribosehältige Nukleoside umfassen Adenosin, Guanosin, Inosin, Cytidin, Thyminribonukleosid und Uridin. Desoxyribosehältige Nukleoside umfassen Desoxyadenosin, Desoxycytidin, Desoxyguanosin und Thymidin. Die erste Gruppe von Nukleosiden wird bei der Synthese von mRNA oder tRNA verwendet, die zweite Gruppe bei der Herstellung von DNA.
Die bevorzugten blockierten Nukleosid-H-phosphonatmonomeren sind Analoge der Nukleotide, die Nukleinsäuren aufbauen. Die Blockierungsgruppen sind im allgemeinen Triphenylmethyläther der Ribose- oder Desoxyribosehydroxylsubstituenten. Ihre Funktion besteht darin, die Kondensationsreaktion mit dem 5'-Hydroxyl des trägergebundenen Nukleosids oder Oligonukleotids einzuschränken. Die bevorzugten Ausgangsphosphonate für die Herstellung von Oligodesoxynukleotiden und ihre entsprechenden Nukleoside, in Klammern dargestellt, sind 5'-Dimethoxytrityl-3'- thymidin-H-phosphonat (Thymidin), 5'-Dimethoxytrityl-3'-[-N&sup6;benzoyldesoxyadenosin]-H-phosphonat (Desoxyadenosin), 5'-Dimethoxytrityl-3'-[N&sup4;-benzoylcytidin]-H-phosphonat (Desoxycytidin) und 5'-Dimethoxytrityl-3'-[N²-isobutyldesoxyguanosin]-H-phosphonat (Desoxyguanosin). Die Ausgangsmaterialien für die Herstellung von Oligoribonukleotiden sind ähnlich, beispielsweise für Adenosin 5'-Dimethoxytrityl-2'-dimethyl-tert.-butylsilyl-[N&sup6;-benzoyladenosin]--3'-H- phosphonat. Die Ausgangsphosphonate werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt. Siehe beispielsweise Sekine et al., "Tetr.Lett." 16: 1711 (1973). Bei einem weiteren Verfahren zur Herstellung der Ausgangsphosphonate (das bevorzugt wird) wird tris(1,2,4-Triazoyl)phosphit (TTP) eingesetzt. TTP wird zweckmäßig in situ aus Phosphortrichlorid (PCl&sub3;), 1,2,4-Triazol und N-Methylmorpholin in wasserfreiem Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) hergestellt.
Es werden Träger ausgewählt, die in den für die Oligonukleotidsynthese verwendeten Reagenzien unlöslich sind, was für die Gewinnung des Polynukleotids nach jedem Kondensationszyklus zweckmäßig ist. Der Träger ist auch ausreichend porös, um das leichte Eintreten von Reaktanden und die Eluierung von Produkt und Reaktanden zuzulassen. Ein bevorzugter Träger ist Glas mit regulierten Poren, obwohl Silikagel oder Polystyrol auch annehmbar sind. Trägergebundene Nukleoside werden nach bekannten Verfahren hergestellt, beispielsweise Chow et al., "Nucl.Acids Res." 9 : 2807 (1981). Nukleosid-H-phosphonate liegen als ein Anion mit einem positiv geladenen Gegenion vor. Triäthylammonium (TEAH&spplus;) oder 1,8 Diazabizyklo 5.4.0 undec- 7-en-onium (DBUH&spplus;) sind bevorzugte Gegenionen. Die DBUH-Salze von Phosphonaten weisen erhöhte Stabilität in wasserfreien Lösungsmitteln auf.
Das trägergebundene Nukleosid und die Nukleosid-3'-H-phosphonate werden in seriatim ausgewählt, sodaß sie der vorbestimmten Sequenz des zu synthetisierenden Oligonukleotids entsprechen, wobei das 3'-Nukleosid trägergebunden ist. Die Oligonukleotidkettenverlängerung schreitet in Übereinstimmung mit dieser vorbestimmten Sequenz in einer Reihe von Kondensationen fort, von denen jede zur Hinzufügung eines weiteren Nukleosids zum Oligomer führt.
Bei der ersten dieser Kondensationen wird das trägergebundene Nukleosid mit dem zweiten Nukleosid im Oligonukleotid kondensiert. Das Schlüsselreagens in dieser Reaktion sowie in den darauffolgenden Kondensationen ist das Dehydratisierungsmittel. Geeignete Dehydratisierungsmittel sind Acylierungsmittel und umfassen organische Säureanhydride, wie Essigsäureanhydrid, Isobuttersäureanhydrid und Trimethylessigsäureanhydrid, und organische Säurehalide, wie z. B. Pivaloylchlorid, Pivaloylbromid und Benzoylchlorid. Diphenylchlorphosphat, Carbodiimide, Arylsulfonylchloride und Arylsulfonyltetrazolide führen der Erfahrung der Autoren der vorliegenden Erfindung nach zu äußerst schlechten Ausbeuten. Die Eigenschaft des Acylierungsmittels, die am wichtigsten für die Zwecke der Herstellung von Oligonukleotiden ist, ist die Fähigkeit, ein Nukleosid im wesentlichen zu allen der entstehenden trägergebundenen Ketten in jedem Zyklus hinzuzufügen. Wenn das zusätzliche Nukleosid einem Subbestand von Ketten nicht hinzugefügt wird, d. h. ein Zyklus wegfällt, was diesen Subbestand betrifft, fehlt dem resultierenden Oligonukleotid, das durch weiteres Hinzufügen zu diesem Subbestand erzeugt wird, eine Base. Das zerstört die Nützlichkeit des Oligonukleotids als ein Bestandteil in DNA, die in rekombinierter Kultur zu exprimieren ist, weil die Löschung die DNA aus dem Leseraster verschiebt, und es ist schwierig, kontaminierende Löschungsmutanten in langen Oligonukleotidprodukten zu ermitteln. Daher ist es bei der Herstellung von Oligonukleotiden zur Verwendung in Molekularbiologie wichtig, ein Entwässerungsmittel auszuwählen, das hohe Treue bzw. Zuverlässigkeit bei der Kettenverlängerung aufweist, d. h. Hinzufügung mit hoher Ausbeute in jedem Zyklus. Die Auswahl derartiger überlegener Mittel mit Ausnahme der spezifisch hierin dargelegten wird durch die Verwendung eines Screeningassays erreicht.
Das zu verwendende Screeningassay wird detaillierter in Beispiel 2 beschrieben. Ein Nukleosid H-Phosphonat(N) wird durch vier Zyklen mit einem trägergebundenen Nukleosid kondensiert, von denen der letzte N&sub5; ergeben sollte, dann werden die Polynukleotid-H-Phosphonate vom Träger abgetrennt, in die Oligonukleotide umgewandelt und auf HPLC getrennt, um die Verteilung von Oligomeren von N&sub2; bis N&sub5; zu ermitteln. Wenn das ausgewählte Entwässerungsmittel eine Oligomermischung erzeugt, die mehr als etwa 80 Mol-% N&sub5;, wie durch spektrophotometrische Absorption gemessen, die bezüglich der Extinktionskoeffizienten der Oligomeren korrigiert ist, und üblicherweise mehr als etwa 90% enthält, wird das Mittel für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als bevorzugt betrachtet. Alternativ dazu handelt es sich bei dem Entwässerungsmittel, das ausgewählt wird, um eines, das nach 49 Zyklen von Schritt d), gefolgt von den Schritten e) und f) eine Oligonukleotidzusammensetzung ergibt, worin das gewünschte 50 Nukleotid-Oligonukleotid in der Zusammensetzung in einer größeren molaren Menge vorhanden ist als jede andere Oligonukleotidspezies in der Zusammensetzung. Die nach dem Stand der Technik verwendeten Mittel für die Herstellung von Dinukleosiden waren Phosphorylierungs oder Sulfonylierungsmittel. Nach dem Stand der Technik verwendete Mittel dieser Klassen können den rigorosen Standards gemäß vorliegender Erfindung nicht entsprechen, insbesondere Diphenylchlorphosphat, 2,4,6- Triisopropylbenzolsulfonylchlorid oder 2,4,6- Triisopropylbenzolsulfonyltetrazolid.
Die bevorzugten Aktivierungsmittel sind Acylierungsmittel. Besonders bevorzugt werden Acylierungsmittel der Struktur
worin A Aryl oder
ist, worin die R-Gruppen inerte Substituenten sind, die vorzugsweise aus dem gleichen oder unterschiedlichen geradkettigen oder verzweigten Alkyl, Aryl, Halogen, Heteroalkyl oder Heteroaryl ausgewählt sind, und X ein Halogen oder ein Pseudohalogen ist, z. B. ein heterozyklisches sekundäres Amin oder eine Gruppe, die fähig ist, einen Aktivester zu bilden. R ist vorzugsweise Alkyl, X ist vorzugsweise Chlorid oder Bromid. Pivaloylchlorid, worin R CH&sub3; ist und X Cl ist, ist das bevorzugte Acylierungsmittel.
Eine repräsentative heterozyklische Amin-X-Gruppe ist Tetrazol. Ein typisches Beispiel für diese Spezies ist
Es wird nach an sich bekannten Verfahren erzeugt, worin mit Tetrazol umgesetzt wird.
Ein representativer Aktivester ist
der durch die Umsetzung von
mit Hydroxybenztriazol erzeugt wird. Andere geeignete austretende Gruppen werden dem Fachmann klar sein.
Das Entwässerungsmittel wird typischerweise in einer Konzentration von etwa 25 bis 100 mM eingesetzt. Pivaloylchlorid ist vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 50 mM oder 5 Mol Äquivalenten Pivaloylchlorid bezogen auf das Phosphonatmonomer vorhanden. Die Verwendung von 10 Äquivalenten verringerte die Oligonukleotidausbeute, was darauf hinweist, daß kompetitive Acylierung die Ausbeute einschränkt und daß kein von außen vorgenommener Schritt des Verkappens erforderlich ist. Das Pivaloylchlorid reagiert mit dem kleinen Anteil an wegfallenden Ketten, wodurch ein Pivalatester erzeugt wird, der unfähig ist, an weiteren Kondensationen teilzunehmen. So werden unvollständige Ketten verkappt, ohne daß es erforderlich ist, einen gesonderten Schritt oder zusätzliche Reagenzien einzubringen.
Die bei der Kondensation erforderliche Menge an Phosphonat liegt im allgemeinen im Bereich etwa von 5 mM bis 20 mM, üblicherweise etwa 10 mM ( 5 Äqu. bezogen auf den 5'-OH-Bestandteil). Das ist wesentlich weniger als die Monomermenge, die bei bekannten Oligonukleotidsyntheseverfahren eingesetzt wird, die typischerweise etwa 50 mM erfordern.
Das Lösungsmittel für die Kondensationsreaktion ist ein wasserfreies organisches Lösungsmittel, vorzugsweise wasserfreies Pyridin/Acetonitril in Volumsanteilen von 1 : 1.
Die Reaktion wird allgemein durchgeführt, indem Entwässerungsmittel und ausgewählte Phosphonatlösungen gemischt und die Mischung dann mit der trägergebundenen Oligonukleotidkette in Kontakt gebracht wird. Typischerweise liegt der Träger in Teilchenform vor und ist in eine Säule gepackt, über die dann die Lösung aus Monomer und Entwässerungsmittel geschickt wird. Die Kontaktzeit beträgt im allgemeinen etwa von 0,5 bis 5 Minuten, wobei etwa 1,5 Minuten bevorzugt werden. Die Reaktionstemperatur beträgt etwa von 10ºC bis 30ºC, vorzugsweise 20ºC.
Die das restliche Entwässerungsmittel und Nukleosid-H-Phosphonat enthaltende Lösung wird nach jedem Zyklus durch Waschen mit einem organischen Lösungsmittel, wie Acetonitril, vom Träger entfernt. Daraufhin wird die Schutzgruppe vom hinzugefügten Nukleosid entfernt, vorzugsweise durch Behandlung mit einer 2,5 Vol/Vol-% Dichloressigsäure/CH&sub2;Cl&sub2;-Lösung, obwohl 1% (Gew/Vol) Trichloressigsäure/CH&sub2;Cl&sub2; oder ZnBr&sub2;-gesättigtes Nitromethan ebenfalls nützlich sind. Andere Verfahren zum Entfernen der Schutzgruppe, die für andere bekannte Schutzgruppen geeignet sind, werden dem Fachmann klar sein. Dann wird der Träger vorzugsweise mit wasserfreiem Pyridin/Acetonitril (Volumsverhältnis 1 : 1) gewaschen, und die Kondensationsreaktion wird in so vielen zusätzlichen Zyklen wiederholt, wie erforderlich sind, um das vorbestimmte Oligonukleotid herzustellen.
Nach der erforderlichen Anzahl von Synthesezyklen wird das Polynukleotid-H-Phosphonat zur Nukleinsäure oxidiert. Um Oligonukleotide mit Phosphoramidatinternukleotidbindungen herzustellen, wird die Oxidation in Gegenwart eines primären oder sekundären Amins und, vorzugsweise, Kohlenstofftetrachlorid, durchgeführt. Das bevorzugte Oxidationsmittel ist wässeriges Jod, um aus Phosphatdiestern Nukleotidbindungen zu erzeugen. Andere repräsentative Oxidationsmittel sind N-Chlorsuccinimid, N-Bromsuccinimid oder Salze von Perjodsäure. Daraufhin wird das Oligonukleotid vom Träger abgetrennt, im bevorzugten Fall durch Inkubation mit konzentriertem Ammoniumhydroxid, gefolgt von Filtration, um das restliche Silikagel zu entfernen, und Eindampfung der oligonukleotidhältigen Lösung. Wenn gewünscht, wird das Oligonukleotid dann durch HPLC, Polyacrylamidgelelektrophorese oder andere herkömmliche Techniken gereinigt und die Getreuheit des Produkts durch Nukleinsäuresequenzanalyse bestätigt.
Während es in der obigen Erörterung um die aufeinanderfolgende Hinzufügung von Mononukleosidphosphonaten gegangen ist, wird verstanden werden, daß in einem bestimmten Zyklus mehr als ein Nukleosid hinzugefügt werden kann, indem poly(Nukleosidphosphonate), im allgemeinen Di- oder Trinukleosidphosphonate verwendet werden. Diese Reagenzien können leicht durch Kondensation eines löslichen Nukleosids (das an einen Träger gebunden sein kann oder nicht) mit einem Nukleosidphosphonat hergestellt werden, anders wie oben für Ketteneinleitung beschrieben. Derartige Dinukleosiddiphosphonate werden dann anstelle der Mononukleosidphosphonate eingesetzt, oder um andere poly(Nukleosidphosphonate) herzustellen. Diese neuen Zwischenprodukte haben die Struktur
worin Y ein Gegenion wie DBUH&spplus; ist, n 1 oder größer als 1, üblicherweise 2 ist und M ein Nukleosid ist. Üblicherweise ist das Nukleosid geschützt. Ein Beispiel ist 5'-Dimethoxytrityl-3'-thymidyl- 5'-H-phosphonat-3'-thymidin-H-phosphonat. Diese Mittel sollten gereinigt und als wasserfreie Feststoffe gelagert werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, sollen aber nicht als Einschränkungen ihres Schutzumfangs betrachtet werden, der durch die bei liegenden Ansprüche definiert ist.

BEISPIEL 1

Herstellung von Eicosathymidylsäure (T20) und Tetracontathymidylsäure (T40)

Die synthetische Nützlichkeit von 5'-Dimethoxytrityl-3'-thymidin-H-phosphonat 1 wurde durch die Synthese von- T&sub2;&sub0; und T&sub4;&sub0; auf Silikagel gezeigt. 5'-Dimethoxytrityl-3'- thymidin-H-Phosphonat wurde wie zuvor beschrieben hergestellt und durch ³¹P NMR (δ-0,27 ppm, J(P-H) = 605 Hz) charakterisiert (³¹P NMR-Spektren wurden in einer wasserfreien Pyr/CH&sub3;CN (1/1)-Lösung erhalten und chemische Verschiebungen werden relativ zu 5%-Phosphorsäure/D&sub2;O berichtet (äußerer Standard)). Das Reaktionsschema (Schema 1) war wie folgt, worin DMT Dimethoxytrityl ist, pyr Pyridin ist, DCA Dichloressigsäure ist und R Succinylsilika ist. Wäsche Kettenverlängerung
Der Polymerträger (Silikagel) wurde zu 25 uMol 3'-Succinylthymidin pro g Silikagel derivatisiert, wie zuvor beschrieben (Chow et al., Id.). Der Synthesezyklus bestand aus einer 5minütigen Kondensationsreaktion von 2 mit 10 mM 1 (&supmin;5 Äqu. relativ zu 5'-OH-Bestandteil 2) und 50 mM Pivaloylchlorid bei 20ºC in wasserfreiem Pyridin/Acetonitril (1/1), gefolgt von Entfernung der Dimethoxytrityl-Schutzgruppe von 3 unter Verwendung von 2,5% DCA/CH&sub2;Cl&sub2; (2 min). Nach der erforderlichen Anzahl an Synthesezyklen wurde das Polythymidin-H-Phosphonatprodukt 3 mit 0,2 M I&sub2; in Tetrahydrofuran/Pyr/H&sub2;O (90/5/5) zu Polythymidylsäure 4 oxidiert (5 min). Das Produkt 4 wurde vom festen Träger entfernt (konz. NH&sub4;OH/5 h/55ºC) und eingedampft. HPLC-Analyse des Rohprodukts T&sub2;&sub0; zeigte, daß der Produktpeak gemeinsam mit einem durch das Phosphoramiditverfahren hergestellten T&sub2;&sub0;-Standard eluierte. Die T&sub2;&sub0;- und T&sub4;&sub0;-Rohprodukte wurden auch durch Polyacrylamidgelelektrophorese bewertet und durch UV-Schattenbildung sichtbar gemacht. Die Analysedaten zeigten deutlich die hohe Synthese-Ausbeute von sowohl T&sub2;&sub0; als auch T&sub4;&sub0;. T&sub4;&sub0; wurde weiter durch 5'-Endenmarkierung mit γ-³²P-ATP unter Verwendung von Polynukleotid T&sub4;-Kinase, gefolgt von vollständigem Abbau mit Schlangengiftphosphodiesterase bewertet. Nach allen Kriterien war das synthetische T&sub4;&sub0; mit einem Standard-T&sub4;&sub0; vergleichbar.

BEISPIEL 2

Identifizierung von bevorzugtem Entwässerungsmittel

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß parallele Zyklen mit Diphenylchlorphosphat (DPCP) als dem Entwässerungsmittel durchgeführt wurden und die Reaktion nur durch 4 Zyklen bis zu Pentathymidylsäure (T&sub5;) fortgesetzt wurde. Das rohe Säuleneluat wurde HPLC-Analyse unterworfen, um den Prozentsatz an Oligonukleotiden zu bestimmen, die vorzeitige Kettenterminationen darstellen. Das HPLC-Harz war die Zorbax-NH&sub2;-Marke. Die Fließgeschwindigkeit betrug 2,5 ml/min mit einem linearen Gradienten von 25 mM bis 250 mM KH&sub2;PO&sub4; in 15 Vol-% CH&sub3;CN (pH 5,5). Fraktionen wurden über 15 min gesammelt und die dekadische Extinktion bei 254 nm gemessen. Die Höhen der einzelnen im wesentlichen symmetrischen Peaks für jedes von T&sub2;, T&sub3;, T&sub4; und T&sub5; wurden den HPLC-Kurven entnommen und in Prozentsätze an Gesamtpolythymidin in jedem rohem Eluat umgewandelt, wobei für den Extinktionskoeffizienten für jedes Oligomer korrigiert wurde (indem die Peakwerte mit 2,5, 1,75, 1,25 bzw. 1 multipliziert wurden). Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle gezeigt. Prozent Oligomer Pivaloychlorid
Diese Ergebnisse zeigen, daß Pivaloylchlorid ein bevorzugtes Entwässerungsmittel ist, das durch 4 Zyklen nur etwa 11% an vorzeitig beendeten Oligomeren erzeugt.
Die Ausbeute an T5 unter Verwendung von DPDC betrug nur etwa 10% derjenigen, die durch die Verwendung von Pivaloylchlorid erhalten wurde. Arylsulfonylchloride und Carbodiimide erzeugten kein nachweisbares T5. So führt das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der bevorzugten Acylierungsmittel unerwartet zu größeren Ausbeuten und verringert die vorzeitige Kettenbeendigung.

BEISPIEL 3

Herstellung von Nukleosid-H-Phosphonat

Das folgende Schema wurde eingesetzt, um Desoxynukleoside zur erfindungsgemäßen Verwendung herzustellen. Schema 2
B = a) Thymin
b) N&sup6;-Benzoyladenin
c) N&sup4;-Benzoylcytosin
d) N²-Isobutyrylguanin
e) N&sup6;-Diisobutylformamidinadenin
Einer gerührten Lösung aus PCl&sub3; (75 mmol) und N-Methylmorpholin (750 mmol) in 750 ml wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; wurde 1,2,4-Triazol (250 mmol) bei Raumtemperatur hinzugefügt. Nach 30 Min. wurde die Reaktionsmischung auf 0ºC abgekühlt, und 5'-Dimethoxytritylthymidin (Ia, 15 mmol, getrocknet durch gemeinsame Verdampfung aus CH&sub3;CN) in 200 ml wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; wurde tropfenweise über 20 min hinzugefügt, 10 Minuten lang gerührt, in 600 ml 1,0M wässeriges Triäthylammoniumbikarbonat (TEAB, pH 8,5) gegossen, geschüttelt und abgetrennt. Die wässerige Phase wurde mit 200 ml CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert, und die kombinierte organische Phase wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem Schaum eingedampft. Silikagelsäulenchromatographie (2% Et&sub3;N/CH&sub2;Cl&sub2; - > 2% Et&sub3;N/10% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;), gefolgt von TEAB-Extraktion und Eindampfung ergab 5'-Dimethoxytrityl-3'-thymidin-H-phosphonat (1a) in einer Ausbeute von 90%. Alle anderen Desoxynukleosid-H-phosphonate wurden nach dem gleichen Verfahren hergestellt. Tabelle 1 gibt isolierte Ausbeuten und ³¹P NMR-Daten an: Tabelle 1 Nukleosid-H-Phosphonat chemische Verschiebung Ausbeute Thymidin (1a) Desoxyadenosin (1b) Desoxycytidin (1c) Desoxyguanosin (1d)
1) ³¹P-NMR-Spektren wurden in einer wasserfreien Pyr/CH&sub3;CN (1/1)-Lösung erhalten, und die chemischen Verschiebungen werden bezogen auf 5% Phosphorsäure/D&sub2;O angegeben (äußerer Standard).
2) Isolierte Ausbeute basierend auf geschütztem Desoxynukleosid (Ia-d).

BEISPIEL 4

Synthese von Desoxyoligonukleotiden

Das stellt zur Zeit die beste Art der praktischen Durchführung der Erfindung dar. Synthesen wurden mit einem Biosearch-DNA-Synthesizer Modell 8600 durchgeführt. Trimethylacetylchlorid (Pivaloylchlorid) wurde bei atmosphärischem Druck destilliert und unter Argon (Ar) gelagert. Pyridin (Pyr) wurde aus p-Toluolsulfonylchlorid destilliert, dann frisch aus Kalziumhydrid destilliert. Acetonitril (CH&sub3;CN) wurde über aktivierten 3 Ångstrom-Molekularsieben getrocknet. Desoxynukleosid-H-Phosphonate (1a-d) wurden durch gemeinsame Verdampfung aus wasserfreiem CH&sub3;CN getrocknet und in wasserfreiem Pyr/CH&sub3;CN (1/1) rekonstituiert. Synthesen wurden unter Verwendung der folgenden Vorschrift an Glas mit regulierten Poren (0,1 umol Bereich) durchgeführt.

Synthesezyklus (Schema 1, Beispiel 1)

1) Wäsche - wasserfreies CH&sub3;CN (45 sek).
2) Entblocken - 2,5% Dichloressigsäure (DCA)/CH&sub2;Cl&sub2; (1 min).
3) Wäsche - wasserfreies Pyr/CH&sub3;CN (45 sek).
4) Koppeln - 10 mM Desoxynukleosid-H-Phosphonat (la-d), 50 mM Pivaloylchlorid in wasserfreiem Pyr/CH&sub3;CN (Volumsverhältnis 1/1) (1,5 min).
5) Wiederholen der Schritte 1-4, bis die Nukleotidsequenz vollständig ist.
6) Entblocken - 2,5% DCA/CH&sub2;Cl&sub2; (1 min).
7) Oxidieren von H-Phosphonat-DNA mit: 1) 0,1 M I&sub2; in Pyr/NMI/H&sub2;O/THF (Volumsverhältnis 5/1/5/90) (2,5 min), 2) 0,1 M I&sub2; in Et&sub3;N/H&sub2;O/THF (Volumsverhältnis 5/5/90) (2,5 min). Die DNA wurde vom Polymer entfernt, die Schutzgruppe entfernt (konz. NH&sub4;OH, 55ºC, 5 h) und verdampft.
Desoxynukleosid-H-Phosphonate (1a-d) sind für die vollständige Synthese von Desoxyoligonukleotiden (DNA) in einer Länge von bis zu 107 Basen verwendet worden, obwohl das keine Obergrenze für die Synthesefähigkeit darstellt. Bei der oben beschriebenen Synthesevorschrift wird eine minimale Menge an Desoxynukleosid-H-Phosphonat (2,5 mg/Kopplung) in einem vereinfachten und raschen Verfahren (4 min/Zyklus) verwendet. Der Internukleosidphosphor wird durch seinen Oxidationszustand vor unerwünschten Nebenreaktionen geschützt und der native Phosphatdiester wird nach der Synthese durch Oxidation mit wässerigem I&sub2; erzeugt.
Oxidation eines polymergebundenen Polynukleosid-H-Phosphonats (3) mit 0,1M I&sub2; in einer Pyr/H&sub2;O/THF (5/5/90)-Lösung war für konsistente Ergebnisse inadäquat. Die Oxidation von Dialkyl-H-Phosphonaten mit wässerigem I&sub2; ist allgemeiner Basenkatalyse unterworfen (Lewis, E.S. und Spears, L.G., "J.Amer.Chem.Soc." 107, 3918 (1985)), und die Autoren der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, daß die Hinzufügung von N-Methylimidazol (NMI) oder stärkeren Basen (z. B. N-Methylmorpholin oder Triäthylamin (Et&sub3;N)) die Oxidationsrate erhöht und für die Oxidation von langen Desoxyoligonukleosid-H-Phosphonaten (3, > 40 Basen) wesentlich ist. Dialkyl-H-Phosphonate sind für alkalische Hydrolyse anfällig (Kume, A., Fujii, M., Sekine, M und Hata, T., "J.Org.Chem." 49, 2139 1984 ), und die Autoren der vorliegenden Erfindung haben beobachtet, daß die wässerige Oxidation von Polynukleosid-H-Phosphaten (3) unter Verwendung von Et&sub3;N durch kompetitive Hydrolyse kompliziert wird. Die I&sub2;-Oxidation von langen Desoxyoligonukleosid-H-Phosphonaten (3), > 40 Basen), zuerst mit einer schwach basischen Lösung (Pyr/NMI), gefolgt von Oxidation mit einer stark basischen Lösung (Et&sub3;N) ergibt die höchste Ausbeute an Produkt Desoxyoligonukleotid (4). Zusätzlich haben die Autoren der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß eine wässerige I&sub2;-Lösung zu JO&sub3;&supmin; und J&supmin; disproportioniert (Lewis, Id.) und eine alkalische IO&sub3;&supmin;-Lösung ein Dinukleosid-H-Phosphonat (3) nicht oxidiert (Brown, D.M. und Hammond, P.R., "J.Chem.Soc." 4229 [1960]). Daher ist es für die konsistente und rasche Oxidation von Desoxyoligonukleosid-H-Phosphonaten (3) notwendig, getrennte Lösungen herzustellen [A=0,2M J&sub2;/THF, B=Base/H&sub2;O/THF (1/1/8)] und sie unmittelbar vor der Verwendung zu mischen.
Es wurden Versuche durchgeführt, um die Stabilität der Desoxyoligonukleosid-H-Phosphonatbindung (3) an die bei Desoxyoligonukleotidsynthese verwendeten Reagenzien zu bewerten. Ein 24-mer wurde hergestellt und vor der Oxidation des Desoxynukleosid-H-Phosphonats (3) wurden Aliquote des festen Trägers vier Stunden lang mit 1) wasserfreiem Pyr/CH&sub3;CN (1/1), 2) wasserfreiem CH&sub3;CN, 3) 100 mM Pivaloylchlorid in wasserfreiem Pyr/CH&sub3;CN (1/1) und 4) 2,5% DCA/CH&sub2;Cl&sub2; behandelt, mit CH&sub3;CN gewaschen, oxidiert, gewaschen, die Schutzgruppe(n) entfernt (konz. NH&sub4;OH/5 h/55ºC) und eingedampft. Nach 5'-Endenmarkierung mit γ-³²P-ATP unter Verwendung von Polynukleotid T4-Kinase wurden die Proben durch Gelelektrophorese und Autoradiographie analysiert (Daten nicht gezeigt). Unter diesen Bedingungen wird kein nachweisbarer Abbau des Polynukleosid-H-Phosphonats (3) beobachtet, aber das Hinzufügen von 1% H&sub2;O zu CH&sub3;CN oder der Pyr/CH&sub3;CN-Lösung führt zu nachweisbarem Abbau bei 4stündigem Zeitraum. Diese Ergebnisse zeigen an, daß die H-Phosphonatbindung während der gesamten Synthese als eine Phosphor-Schutzgruppe dient.
Es ist gezeigt worden, daß der 3'- oder 5'-Phosphattriester die Glycosidbindung von Desoxyadenosin gegenüber säurevermittelter Depurinierung stabilisiert (Tanaka, T. und Letsinger, R.L., "Nucl.Acids Res." 10, 3249 (1982)). Die Wirkung, die eine Internukleosid-H-Phosphonatbindung (3) auf die Depurinierungsrate hätte, wurde ermittelt. Ein polymergebundenes 3'-Thymidin-5'-desoxyadenosindinukleosid-H-Phosphonat, geschützt mit einem N&sup6;-Benzoylamid (3b, a) oder N&sup6;-Diisobutylformamidin (3e, a) wurde mit 2,5 % DCA/CH&sub2;Cl&sub2; 24 Stunden lang behandelt und analysiert. Es wurde keine feststellbare Differenz in der Depurinierungsrate zwischen dem H-Phosphonatdiester (3) und dem Methylphosphattriester beobachtet (Daten nicht gezeigt). Dieser Versuch bestätigte auch die zusätzliche Stabilität des N&sup6;-Amidin-geschützten Desoxyadenosins bezogen auf das N&sup6;-Benzoylamid-geschützte Desoxyadenosin.
Spezifische DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung der beschriebenen Vorschrift synthetisiert und das Rohprodukt charakterisiert. Tabelle Sequenzen von synthetisierten Desoxyoligonukleotiden
Die Desoxyoligonukleotide 78a, 78b und 99 wurden auch mit Methoxydiisopropylaminophosphoramiditen synthetisiert und sind in der Tabelle zum Vergleich enthalten. Die Amiditsynthesen wurden unter Verwendung einer Standardvorschrift durchgeführt, mit der Ausnahme, daß vor der Oxidation eine 30sekündige wässerige Wäsche eingeschlossen wurde, um mögliche phosphit-heterozyklische Basenaddukte zu hydrolysieren. Die in der Tabelle angeführten Daten zeigen deutlich die hohe Syntheseausbeute von Produkt-Desoxyoligonukleotiden unter Verwendung von Desoxynukleosid-H-Phosphonat-Zwischenprodukten. Zu diesem Zeitpunkt ist die Sequenzgetreuheit von H-Phosphonat-DNA geringer als die durch Phosphoramidite erzeugte; jedoch wird dieser Nachteil dadurch ausgeglichen, daß für die Synthese ein einfacherer Synthesezyklus und eine beträchtlich geringere Konzentration an Desoxynukleosid-H-Phosphonat erforderlich ist.

BEISPIEL 5

Die Dinukleotidphosphoramidate 2e und 2f (Schema 3) wurden zu Beginn durch 5minütige Oxidation des polymergebundenen Dinukleosid-H-Phosphonats 1 Schema 3
mit 0,05M I&sub2; in einer Lösung aus dem entsprechenden Amin (10%) und Tetrahydrofuran (THF) hergestellt. Die Produktamidate wurden vom festen Träger entfernt (50% konz. Ammoniumhydroxid (NH&sub4;OH)/Dioxan, 8 Stunden, R.t.) und verdampft. ³¹P NMR-Spektren beider Produkte zeigen das Vorhandensein von in etwa gleichen Mengen an Diastereomeren (³¹P NMR-Spektren wurden in CDCl&sub3; erhalten und chemische Verschiebungen werden bezogen auf 5% Phosphorsäure/D&sub2;O (externer Standard) berichtet; 2e δ-9,1, -8,8 ppm; 2f δ -7,9, -7,6 ppm). Die Oxidation von H-Phosphonatdiestern zu Phosphoramidaten wird durch kompetitive Hydrolyse kompliziert, wobei der Phosphatdiester 2a erzeugt wird. Kohlenstofftetrachlorid (CCl&sub4;)-Oxidation von H-Phosphonatdiestern zu Phosphoramidaten (Atherton et al., "J.Chem.Soc." 660 (1945), Zwierzak, A. "Synthesis" 507 (1975) bietet den Vorteil geringer Wasserlöslichkeit in CCl&sub4;. Alle Dinukleotidphosphoramidate (2b-g) wurden mit einer 10%igen Lösung des entsprechenden Amins in CCl&sub4; hergestellt (5 min). (Eine gesättigte Lösung aus Ammoniak oder Methylamin in Dioxan/CCl&sub4; (1/4) wurde verwendet, um die entsprechenden Phosphoramidate herzustellen).
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) der Proben zeigt eine hohe Ausbeute an Produktphosphoramidat mit sehr wenig kompetitiver Hydrolyse (< 3% Dithymidinphosphatdiester, 2a) an.
Die Stabilität der Phosphoramidatbindung gegenüber konz. NH&sub4;OH wurde für jedes untersucht, und die Ergebnisse zeigen an, daß die Phosphoramidate 2c-g gegenüber den Bedingungen stabil sind, die zum Entfernen der gemeinsamen heterozyklischen N-Acyl-Schutzgruppen notwendig sind (55ºC, 5 h). Das Phosphoramidat 2b zersetzt sich unter diesen Bedingungen (t1/2, &supmin;15 min) rasch in eine Mischung aus dem 3'- und dem 5'-Phosphoramidsäuremonoester (Tomasz, J. "Nukleosides and Nukleotides" 2, 51 (1983)). Die Stabilität der Dinukleotidphosphoramidate (2b-g) gegenüber enzymatischen Abbau durch Exonukleasen wurde unter Verwendung von Milzphosphodiesterase und Schlangengiftphosphodiesterase untersucht. Inkubation der Dinukleotide (2a-g) mit der entsprechenden Enzym/Puffer-Lösung bei 37ºC für 1 Stunde führte zu vollständigem Abbau des Phosphatdiesters (2a) ohne nachweisbaren Abbau der Phosphoramidate 2b-g (ermittelt durch Umkehrphasen-HPLC). Die beobachtete enzymatische Stabilität des Dinukleotidphosphoramidats 2b widerspricht den Behauptungen von Ogilvie (Nemer et al., "Tetrahedron Lett." 21 4149 (1980)), stimmt aber mit den von Letsinger berichteten überein (Letsinger et al., "Nucl.Acids Res." 14, 3487 (1986)).
Um den Umfang dieses Oxidationsverfahrens weiter zu untersuchen, wurde Undecathymidylsäure (T&sub1;&sub1;) hergestellt, die von 1 bis 9 Phosphormorpholidatbindungen enthielt. Die Synthese von Polythymidin-H-Phosphonat an Glas mit regulierten Poren wurde unter Anwendung der oben beschriebenen Synthesevorschrift durchgeführt. Die in Schema 4 dargelegte Strategie zeigt die Synthese von T&sub1;&sub1;, das 9 Phosphormorpholidatbindungen gefolgt von 1 Phosphatdiesterbindung enthält. Diese Strategie wurde für alle T&sub1;&sub1;-Produkte, die 3'-Phosphoramidat-Bindungen enthielten, verwendet.

SCHEMA 4

Synthese von T&sub1;&sub1;, das 9 Phosphormorpholidatbindungen (3'-Ende) gefolgt von einer Phosphatdiesterbindung (5'-Ende) enthält. * gibt Phosphormorpholidatbindung an 3'-T-ODMT Wiederholte 5'-DMT-Schutzgruppenentfernung und wiederholte Nukleosid-H-Phosphonat-Kondensation Oxidation des Polynukleosid-Phosphonats zu einem Polynukleotidphosphormorpholidat mit CCl&sub4; (10 min) 5'-DMT-Schutzgruppenentfernung und Nukleosid-H-Phosphonatkondensation 5'-DMT-Schutzgruppenentfernung gefolgt von Oxidation des Endprodukts mit wässerigem I&sub2;.
Die Produkte wurden mit konz. NH&sub4;OH (2 Stunden/R.t.) vom festen Träger entfernt und eingedampft. Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) und UV-Schattenbildung zeigten bei jedem ein Hauptproduktband. Das Band wurde ausgeschnitten, zerkleinert, mit H&sub2;O eluiert und durch Umkehrphasen-HPLC (C&sub1;&sub8;) isoliert. Ein Autoradiogramm wurde von 5'-Endenmarkierung dieser Produkte mit T4-Polynukleotidkinase und -³²P-ATP, gefolgt von PAGE (17% Polyacrylamid/7M Harnstoff) abgeleitet. Die Änderung der elektrophoretischen Mobilität der unterschiedlichen T&sub1;&sub1;-Produkte war sehr ausgeprägt, wobei jedes zusätzliche Morpholidat zu einer Zunahme der Masse und einer Abnahme der Ladung führte. Es ist interessant, festzustellen, daß die elektrophoretischen Mobilitäten der unterschiedlichen T&sub1;&sub1;-Produkte keiner strengen Masse/Ladungs-Verhältnisabhangigkeit folgen. Die viele Phosphoramidatbindungen enthaltenden Produkte (hohes Verhältnis Masse/Ladung) weisen größere Mobilität auf, als ausgehend von den Mobilitäten der T&sub1;&sub1;-Produkte mit weniger Phosphoramidaten vorhergesagt werden würde. Die Behandlung einer jeden dieser Polythymidinphosphormorpholidate mit 85% Ameisensäure (95ºC, 15 min) erzeugte T&sub1;&sub1;, das alle Diesterbindungen enthält.
Nukleosid-H-Phosphonatdiester sind als Vorläufer für Thiophosphatanaloge verwendet worden (Fujii et al., "Tetrahedron Lett." 26, 935 (1986)). Diese Umwandlung wird in hoher Ausbeute (> 98%) direkt vom polymergebundenen Oligonukleosid-H-Phosphonatdiester (1) durch Behandlung mit einer Lösung aus 0,1M S&sub8; in Triäthylamin (TEA)/Schwefelkohlenstoff (1/9, 5 min) erreicht. Um radioisotopisch markierte Oligonukleotide mit extrem hoher spezifischer Aktivität zur Verwendung als Hybridisierungssonden herzustellen, enthält das S&sub8;, das eingesetzt wird, einen- Anteil an ³&sup5;S-Radioisotop.
Sauerstofftriester werden durch Umsetzung von Oligonukleosid-H-Phosphonaten (1) mit einer 10%igen Lösung des entsprechenden Alkanols (ROH) in N-Methylimidazol/TEA/CCl&sub4; (5/5/90) hergestellt. R ist Aryl, Alkyl, Heteroalkyl oder Heteroaryl mit im allgemeinen weniger als 10 C-Atomen, vorzugsweise MeOH oder n-BuOH. Diese Reaktion ist sehr anfällig für kompetitive Hydrolyse und es muß darauf geachtet werden, wasserfreie Bedingungen sicherzustellen.
Die primären und sekundären Amine b) - g) sind als lediglich repräsentativ zu betrachten. Es fällt in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, Substituenten mit der allgemeinen Formel
zu verwenden, worin X und Y gleich oder voneinander verschieden sind und aus der Gruppe aus Wasserstoff, Alkyl, Heteroalkyl, Heteroaryl oder Aryl ausgewählt sind oder zusammengenommen ein Zykloalken, Zykloalkan oder einen Heterozyklus bilden. Die Spezies, in der X oder Y Heteroalkyl- und Heteroarylsubstituenten sind oder konjugiert sind, um diese zu bilden, werden zur Verwendung als in vitro Hybridisierungssonden bevorzugt, während die Alkyl- oder Arylsubstituenten zur in vivo-Hybridisierung bevorzugt werden.
Das Heteroatom in Heteroaryl ROH, X oder Y ist aus der Gruppe aus S, N oder O ausgewählt, von dem etwa 1 bis 5 in der Heteroarylgruppe vorhanden sind. Heteroarylspezien, die besonders nützlich in der in vitro-Diagnostik sind, sind jene, bei denen die Heteroarylgruppe fluoreszierend ist, beispielsweise Seltenerdmetallchelate zur Verwendung in gepulster Fluoreszenz, oder andere bekannte Substituenten zur Verwendung in polarisierten Fluoreszenzhybridisierungsassays. Derartige fluoreszierende markierte Oligonukleotide sind besonders nützlich in Hybridisierungsassays, da es möglich ist, die Assays ohne eine Phasentrennung durchzuführen, indem Änderungen der Fluoreszenz nach Hybridisierung an die Ziel-DNA, z. B. Änderungen der Polarisation, Emissionswellenlänge, Absorptionswellenlänge-, Emissionsintensität und ähnliches ermittelt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erleichtert die Herstellung von Oligonukleotiden, die schwer mit solchen fluoreszierenden Spezien substituiert sind und demgemäß hohe spezifische Aktivität aufweisen.
Die oben dargelegten Ergebnisse zeigen, daß Polynukleosid-H-Phosphonate wertvolle Vorläufer für eine Vielzahl von Internukleotidphosphatanalogen sind. Die Oxidation eines Polynukleosid-H-Phosphonats in Gegenwart von Aminen führt zum entsprechenden Polynukleotidphosphoramidat in hoher Ausbeute. Das H-Phosphonatverfahren der DNA-Synthese ist ein einfaches, rasches und reagenseffizientes Verfahren, das nun auf die rasche Synthese von DNA angewandt werden kann, die Internukleotidphosphatanaloge enthält. Dieses Verfahren schafft einen einfachen und effizienten Weg zu einer Vielzahl von Internukleotidphosphatanalogen von DNA, die die natürlich auftretenden Nukleotide enthält.

Claims

1. Verfahren zur Synthese eines Polynukleotid-H-Phosphonats umfassend (a) die Schaffung eines an einen Träger gebundenen Nukleosids, (b) das Kondensieren eines blockierten Nukleosid-H-Phosphonats mit dem 5'-Hydroxyl des trägergebundenen Nukleosids in Gegenwart eines Acylierungsmittels, (c) das Entfernen der 5'-Blockierungsgruppe des Nukleosid-H-Phosphonats von Schritt (b), und (d) das sequentielle Wiederholen der Schritte (b) und (c) unter Verwendung von Nukleosid-H-Phosphonaten, bis ein Polynukleotid-H-Phosphonat mit mehr als zwei Nukleotiden erhalten worden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Acylierungsmittel die Struktur

aufweist, worin A Aryl, Heteroaryl oder

ist, worin jedes R, die untereinander gleich oder voneinander verschieden sind, ein normales oder verzweigtes Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl oder Halogen ist und X ein Halogen oder ein Pseudohalogen ist, das aus Azid, heterozyklischen sekundären Aminen oder Gruppen ausgewählt ist, die fähig sind, Aktivester zu bilden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin X Chlorid ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Acylierungsmittel Pivaloylchlorid ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Acylierungsmittel ein Halid einer organischen Säure ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Nukleosid ein Desoxyribonukleosid ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Schritte (b) und (c) in etwa 4-125 Zyklen wiederholt werden.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Träger kovalent an das 3'-Hydroxyl des Nukleosids gebunden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin der Träger aus Glas mit regulierten Poren, Silikagel und Polystyrol ausgewählt ist.

10. Verfahren zur Synthese eines Polynukleotids, umfassend das Synthetisieren eines Polynukleotid-H-Phosphonats durch ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche; und (e) das Oxidieren des genannten H-Phosphonats, um das entsprechende Polynukleotid zu bilden; und (f) das Abtrennen des Polynukleotids vom Träger.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Schritt (e) erst durchgeführt wird, nachdem das gesamte Polynukleotid-H-Phosphonat synthetisiert worden ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin das Oxidationsmittel wässeriges Jod, N-Chlorsuccinimid, N-Bromsuccinimid oder ein Salz von Perjodsäure ist.

13. Verfahren zur Herstellung eines Internukleotidphosphoramidats, umfassend das Erzeugen eines H-Phosphonats nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, woraufhin das Polynukleotid-H-Phosphonat mit einem primären oder sekundären Amin unter Bedingungen zur Herstellung eines Internukleotidphosphoramidats in Kontakt gebracht wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das Polynukleotid-H-Phosphonat außerdem mit Kohlenstofftetrachlorid in Kontakt gebracht wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, worin das Amin ein Heterozyklus ist,der 1 N-Atom enthält oder die allgemeine Formel HN(X)Y aufweist, worin X und Y gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Heteroaryl sind, das von 1 bis 5 S-, N- oder O-Atome enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, worin das Amin ein Heterozyklus ist, der 1 N-Atom enthält.

17. Verfahren zur Herstellung eines Internukleotidtriesters, welches das Erzeugen eines H-Phosphonats nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfaßt, woraufhin das Polynukleotid-H-Phosphonat unter Bedingungen zur Herstellung eines Internukleotidtriesters mit ROH in Kontakt gebracht wird, worin R Alkyl, Aryl oder Heteroaryl ist, das von 1 bis 5 S-, N- oder O-Atome und weniger als 10 C-Atome enthält.

18. Verfahren zur Herstellung eines Internukleotidthiophosphats, umfassend die Herstellung eines H-Phosphonats nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, woraufhin das Polynukleotid-H-Phosphonat unter Bedingungen zur Herstellung eines Internukleotidthiophosphats mit S&sub8; in Kontakt gebracht wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15, 16 oder 17, worin die Heteroarylgruppe fluoreszierend ist.

20. Verfahren, welches das In-Kontakt-Bringen eines trägergebundenen Polyribonukleotid-H-Phosphonats oder Polydesoxyribonukleotid-H-Phosphonats mit von 5 bis etwa 125 Nukleotiden mit einem Oxidationsmittel und S&sub8; unter Bedingungen zur Herstellung eines Internukleotidthiophosphats umfaßt.

21. Verfahren, welches das In-Kontakt-Bringen eines trägergebundenen Polyribonukleotid-H-Phosphonats oder Polydesoxyribonukleotid-H-Phosphonats mit von 5 bis etwa 125 Nukleotiden mit einem Oxidationsmittel und einem primären oder sekundären Amin unter Bedingungen zur Herstellung eines Internukleotidphosphoramidats umfaßt.

22. Verfahren nach Anspruch 21, worin das Amin ein Heterozyklus ist, der 1 N-Atom enthält, oder HN(X)V, worin X und Y gleich oder voneinander verschieden sind und Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Heteroaryl sind, das 1 bis 5 N-, S- oder O-Atome enthält.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin der 1 N-Atom enthaltende Heterozyklus

ist.

24. Zusammensetzung mit der Formel

worin Y ein Gegenion ist, n ≥ 1 ist und M ein Ribonukleosid oder Desoxyribonukleosid ist und die Nukleoside über ihre 5'- und 3'-Hydroxygruppen verbunden sind.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, worin M ein blockiertes Nukleosid ist.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 25, worin die Blockierungsgruppe ein Dialkylformamidin ist.

27. Zusammensetzung, die ein Polynukleotid mit zumindest einem substituierten Internukleotidphosphat enthält, wobei das genannte Polynukleotid die Formel

aufweist, worin

1) -Z -OH, -O-R,

oder

ist;

2) a eine ganze Zahl größer als 9 ist;

3) zumindest 1 Z nicht -OH ist;

4) R Aryl, Heteroaryl oder Alkyl ist;

5) X oder Y Wasserstoff oder Alkyl sind; und

6) M ein Nukleosid ist.

28. Zusammensetzung nach Anspruch 27, worin Z

ist.

29. Zusammensetzung nach Anspruch 27, worin -OR oder

fluoreszierend sind.

31. Zusammensetzung nach Anspruch 27, worin -Z -OR ist.

32. Zusammensetzung nach Anspruch 27, worin alle -Z -OR, -N(X)Y,

sind.