JP2511005B2 - インビトロにおけるオリゴヌクレオチド合成法並びにそれに用いる試薬 - Google Patents
インビトロにおけるオリゴヌクレオチド合成法並びにそれに用いる試薬Info
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- JP2511005B2 JP2511005B2 JP61246447A JP24644786A JP2511005B2 JP 2511005 B2 JP2511005 B2 JP 2511005B2 JP 61246447 A JP61246447 A JP 61246447A JP 24644786 A JP24644786 A JP 24644786A JP 2511005 B2 JP2511005 B2 JP 2511005B2
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- oligonucleotide
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はオリゴヌクレオチドのインビトロ合成に関す
る。さらに詳しくは、組換え宿主−ベクター系に用いら
れるデオキシオリゴヌクレオチド、あるいは診断分析用
の標識化オリゴヌクレオチド調製における中間体として
用いられるデオキシオリゴヌクレオチドの合成に関する
ものである。
る。さらに詳しくは、組換え宿主−ベクター系に用いら
れるデオキシオリゴヌクレオチド、あるいは診断分析用
の標識化オリゴヌクレオチド調製における中間体として
用いられるデオキシオリゴヌクレオチドの合成に関する
ものである。
従来技術 今日、オリゴヌクレオチドは、一般的に普及している
2方法、即ち、ホスホラミダイト法(phosphoramidite
method)〔アダムスら(Adams)1983“ジヤーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイ(J.Am.Chem.So
c.)”105:661およびフレーラーら(Froehler)1983
“テトラヘドロンレターズ(Tetrahedron Letts.)”2
4:3171等参照〕、並びにホスホトリエステル法〔ドイツ
特許公開公報2644432〕のいずれかの方法によつて製造
されている。両方法共、有効であつて広く受け入れられ
ているが、高価なモノマーを大量に用いる方法である。
またこれらの方法は複雑である。ホスホラミダイト法は
各縮合反応の後に水性の系中での酸化工程を必要とし、
他方、トリエステル法は、失敗した(aborted)オリゴ
ヌクレオチド(ある反応サイクル内でモノマーが付加さ
れなかつたもの)の亜集団(サブポピユレーシヨン)
を、以後のサイクルにおいて、オリゴヌクレオチドを伸
長させないために、個々の段階で“キヤツプ(cap)す
る”必要がある。
2方法、即ち、ホスホラミダイト法(phosphoramidite
method)〔アダムスら(Adams)1983“ジヤーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイ(J.Am.Chem.So
c.)”105:661およびフレーラーら(Froehler)1983
“テトラヘドロンレターズ(Tetrahedron Letts.)”2
4:3171等参照〕、並びにホスホトリエステル法〔ドイツ
特許公開公報2644432〕のいずれかの方法によつて製造
されている。両方法共、有効であつて広く受け入れられ
ているが、高価なモノマーを大量に用いる方法である。
またこれらの方法は複雑である。ホスホラミダイト法は
各縮合反応の後に水性の系中での酸化工程を必要とし、
他方、トリエステル法は、失敗した(aborted)オリゴ
ヌクレオチド(ある反応サイクル内でモノマーが付加さ
れなかつたもの)の亜集団(サブポピユレーシヨン)
を、以後のサイクルにおいて、オリゴヌクレオチドを伸
長させないために、個々の段階で“キヤツプ(cap)す
る”必要がある。
発明の目的および構成 本発明は、今日利用し得る方法よりも経済的であり、
かつ信頼性の高いオリゴヌクレオチド合成法を提供する
ことを目的とするものである。
かつ信頼性の高いオリゴヌクレオチド合成法を提供する
ことを目的とするものである。
ヌクレオチドとりん酸とを、アリール・スルホニル・
クロリド〔セキネら(Sekine)1979“テトラヘドロンレ
ターズ”20:1145〕またはカーボジイミド〔シヨフイー
ルドら(Schofeild)、1961“ジヤーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサエテイ”、p2361〕を用いて縮
合させ、ヌクレオシドホスホネートを製造する方法は既
知である。ハールら(Hall)〔(1975)“ジヤーナル・
オブ・ケミカル・ソサエテイ”ヌクレオチド、パートXL
I、p.2316〕は、ヌクレオシドH−ホスホネートをジフ
エニルクロロホスフエートで処理した後、酸化して対応
するジヌクレオチドホスフエートにすることにより、対
応するジヌクレオチドホスホネートを得た。この様に、
1957年から、ジヌクレオチドホスフエートの製造に関す
る知識が当該技術分野に存在しており、その間に、複雑
で高価につく、オリゴヌクレオチドの合成法が2種類開
発されたにもかかわらず、このハールらの開示内容はオ
リゴヌクレオチドの製造に利用されていない。
クロリド〔セキネら(Sekine)1979“テトラヘドロンレ
ターズ”20:1145〕またはカーボジイミド〔シヨフイー
ルドら(Schofeild)、1961“ジヤーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサエテイ”、p2361〕を用いて縮
合させ、ヌクレオシドホスホネートを製造する方法は既
知である。ハールら(Hall)〔(1975)“ジヤーナル・
オブ・ケミカル・ソサエテイ”ヌクレオチド、パートXL
I、p.2316〕は、ヌクレオシドH−ホスホネートをジフ
エニルクロロホスフエートで処理した後、酸化して対応
するジヌクレオチドホスフエートにすることにより、対
応するジヌクレオチドホスホネートを得た。この様に、
1957年から、ジヌクレオチドホスフエートの製造に関す
る知識が当該技術分野に存在しており、その間に、複雑
で高価につく、オリゴヌクレオチドの合成法が2種類開
発されたにもかかわらず、このハールらの開示内容はオ
リゴヌクレオチドの製造に利用されていない。
ガレツグら(Garegg)〔“ケミカ・スクリプタ(Chem
ica Scripta)”25:280-282(1985)〕は、5′−O−
ジメトキシトリチルチミジン3′−ハイドロゲンホスホ
ネートと3′−O−ベンゾイルチミジンとは、ジフエニ
ルホスホロクロリデート(ジフエニルクロロホスフエー
トとしても知られている)、2,4,6−トリイソプロピル
ベンゼンスルホニルクロライドまたは2,4,6−トリイソ
プロピルベンゼンスルホニルテトラゾライドの如き活性
化剤の存在下において迅速に反応し、ホスホネートジエ
ステル(りん酸ジエステル)結合を定量的に形成するこ
とを見い出した。ガレツグらによると、3′−ホスホネ
ートの安定性を対応する3′−ホスホラミダイトのそれ
と比較したとき、活性化した場合、それらがホスホラミ
ダイトに匹敵する反応性を有することをも併わせて考慮
し、オリゴヌクレオチド合成の出発物質としてこれらの
化合物は適当であるといえる。本発明の発明者らは、ガ
レツグの活性化剤は得られる収率が低く、実際のオリゴ
ヌクレオチド合成に適さないことを見出したが、このこ
とが、30年間、オリゴヌクレオチド合成の対象としてホ
スホネート化学が利用されなかつたことを説明する上で
役立つと思われる。
ica Scripta)”25:280-282(1985)〕は、5′−O−
ジメトキシトリチルチミジン3′−ハイドロゲンホスホ
ネートと3′−O−ベンゾイルチミジンとは、ジフエニ
ルホスホロクロリデート(ジフエニルクロロホスフエー
トとしても知られている)、2,4,6−トリイソプロピル
ベンゼンスルホニルクロライドまたは2,4,6−トリイソ
プロピルベンゼンスルホニルテトラゾライドの如き活性
化剤の存在下において迅速に反応し、ホスホネートジエ
ステル(りん酸ジエステル)結合を定量的に形成するこ
とを見い出した。ガレツグらによると、3′−ホスホネ
ートの安定性を対応する3′−ホスホラミダイトのそれ
と比較したとき、活性化した場合、それらがホスホラミ
ダイトに匹敵する反応性を有することをも併わせて考慮
し、オリゴヌクレオチド合成の出発物質としてこれらの
化合物は適当であるといえる。本発明の発明者らは、ガ
レツグの活性化剤は得られる収率が低く、実際のオリゴ
ヌクレオチド合成に適さないことを見出したが、このこ
とが、30年間、オリゴヌクレオチド合成の対象としてホ
スホネート化学が利用されなかつたことを説明する上で
役立つと思われる。
ヌクレオチド間ホスフエート(internuclotide phosp
hate)同族体含有DNAの合成は大きい関心の寄せられて
いる分野である。ミラー(Miller)およびT′soはDNA
のメチルホスホネート同族体が細胞膜を容易に通り抜
け、タンパク合成を阻止することを見い出したが、これ
は、おそらくmRNAの翻訳阻害によるものと思われている
〔ブレークら(Blake)、バイオケミストリイ(Biochem
istry)24 6139(1985)、スミスら(Smith)、プロシ
ーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オ
ブ・サイエンスイズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)83 2787
(1986)〕。ジヌクレオチドのホスホラミデート同族体
は相補的なポリヌクレオチドと結合することから、種々
のリガンドをDNAに結合させるのに利用できることが知
られている〔レツトシンガーら(Letsinger)、ヌクレ
イツク・アシツズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)14 34
87(1986)〕。アミンの存在下でジヌクレオシドH−ホ
スホネートを酸化することにより、対応するジヌクレオ
チドホスホラミデートを高収率で得ることができる。
〔ネーマーら(Nemer)テトラヘドロンレターズ(Tetra
hedron Lett.)21 4149(1980)〕、アサートンら(Ath
erton)、ジヤーナル・オブ・ケミカル・ソサエテイ、6
60(1945)〕。オリゴヌクレオチドのホスホラミデー
ト、トリホスフエートおよびホスフエートトリエステル
同族体の簡便な製造方法が必要とされている。
hate)同族体含有DNAの合成は大きい関心の寄せられて
いる分野である。ミラー(Miller)およびT′soはDNA
のメチルホスホネート同族体が細胞膜を容易に通り抜
け、タンパク合成を阻止することを見い出したが、これ
は、おそらくmRNAの翻訳阻害によるものと思われている
〔ブレークら(Blake)、バイオケミストリイ(Biochem
istry)24 6139(1985)、スミスら(Smith)、プロシ
ーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オ
ブ・サイエンスイズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)83 2787
(1986)〕。ジヌクレオチドのホスホラミデート同族体
は相補的なポリヌクレオチドと結合することから、種々
のリガンドをDNAに結合させるのに利用できることが知
られている〔レツトシンガーら(Letsinger)、ヌクレ
イツク・アシツズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)14 34
87(1986)〕。アミンの存在下でジヌクレオシドH−ホ
スホネートを酸化することにより、対応するジヌクレオ
チドホスホラミデートを高収率で得ることができる。
〔ネーマーら(Nemer)テトラヘドロンレターズ(Tetra
hedron Lett.)21 4149(1980)〕、アサートンら(Ath
erton)、ジヤーナル・オブ・ケミカル・ソサエテイ、6
60(1945)〕。オリゴヌクレオチドのホスホラミデー
ト、トリホスフエートおよびホスフエートトリエステル
同族体の簡便な製造方法が必要とされている。
要約 本発明の目的は、(a)担体と結合したヌクレオシド
を調製し、(b)脱水剤の存在下、保護したヌクレオシ
ドH−ホスホネートと、担体と結合したヌクレオシドの
5′ヒドロキシル基とを縮合させ、(c)ステツプ
(b)のヌクレオシドH−ホスホネートの5′保護基を
除去し、(d)2以上のヌクレオチドを有するポリヌク
レオチドH−ホスホネートが得られるまで、選択したヌ
クレオシドHホスホネートを用いてステツプ(b)およ
び(c)を連続的に繰返し、(e)ポリヌクレオチドH
−ホスホネートを酸化して対応するポリヌクレオチドを
形成させ、次いで、(f)ポリヌクレオチドを担体から
分離することからなるポリヌクレオチド合成法により達
成された。ポリヌクレオシドHホスホネートはホスホラ
ミデート(phosphoramidate)、チオホスフエートおよ
びホスフエートトリエステルオリゴヌクレオチドの新規
な合成における出発物質として有用である。
を調製し、(b)脱水剤の存在下、保護したヌクレオシ
ドH−ホスホネートと、担体と結合したヌクレオシドの
5′ヒドロキシル基とを縮合させ、(c)ステツプ
(b)のヌクレオシドH−ホスホネートの5′保護基を
除去し、(d)2以上のヌクレオチドを有するポリヌク
レオチドH−ホスホネートが得られるまで、選択したヌ
クレオシドHホスホネートを用いてステツプ(b)およ
び(c)を連続的に繰返し、(e)ポリヌクレオチドH
−ホスホネートを酸化して対応するポリヌクレオチドを
形成させ、次いで、(f)ポリヌクレオチドを担体から
分離することからなるポリヌクレオチド合成法により達
成された。ポリヌクレオシドHホスホネートはホスホラ
ミデート(phosphoramidate)、チオホスフエートおよ
びホスフエートトリエステルオリゴヌクレオチドの新規
な合成における出発物質として有用である。
詳しい記述 本発明方法を実施するに際しての出発物質は、担体と
結合したヌクレオシドモノマーと保護されたヌクレオシ
ドHホスホネートモノマーである。担体と結合している
ヌクレオシドの5′ヒドロキシル基は保護されていな
い。本発明に用いられるヌクレオシドはRNAまたはDNAの
モノマー、あるいはそれらの誘導体である。リボース含
有ヌクレオシドには、例えば、アデノシン、グアノシ
ン、イノシン、シチジン、チミンリボヌクレオシドおよ
びウリジンが含まれる。デオキシリボース含有ヌクレオ
シドにはデオキシアデノシン、デオキシチジン、デオキ
シグアノシン、およびチミジンが含まれる。前者のヌク
レオシド群は、mRNAやtRNAの合成に、後のヌクレオシド
群は、DNAの製造に用いられる。
結合したヌクレオシドモノマーと保護されたヌクレオシ
ドHホスホネートモノマーである。担体と結合している
ヌクレオシドの5′ヒドロキシル基は保護されていな
い。本発明に用いられるヌクレオシドはRNAまたはDNAの
モノマー、あるいはそれらの誘導体である。リボース含
有ヌクレオシドには、例えば、アデノシン、グアノシ
ン、イノシン、シチジン、チミンリボヌクレオシドおよ
びウリジンが含まれる。デオキシリボース含有ヌクレオ
シドにはデオキシアデノシン、デオキシチジン、デオキ
シグアノシン、およびチミジンが含まれる。前者のヌク
レオシド群は、mRNAやtRNAの合成に、後のヌクレオシド
群は、DNAの製造に用いられる。
好適に保護したヌクレオシドHホスホネートモノマー
は、核酸を構成しているヌクレオチドの同族体である。
保護基は、通常、リボース、あるいはデオキシリボース
のヒドロキシ置換分のトリフエニルメチルエステルであ
る。それらの機能は、縮合反応を、担体と結合したヌク
レオシドまたはオリゴヌクレオチドの5′ヒドロキシル
基に限定することである。オリゴデオキシヌクレオチド
の製造出発物として好ましいホスホネート類並びに対応
するヌクレオシド類(括弧で表示)は、5′ジメトキシ
トリチル−3′−チミジンH−ホスホネート(チミジ
ン)、5′ジメトキシトリチル−3′−〔−N6−ベン
ゾイルデオキシアデノシン〕Hホスホネート(デオキシ
アデノシン)、5′ジメトキシトリチル−3′−〔N4
−ベンゾイルシチジン〕H−ホスホネート(デオキシシ
チジン)、および5′ジメトキシトリチル−3′−〔N
2−イソブチルデオキシグアノシン〕Hホスホネート
(デオキシグアノシン)である。同様に、オリゴリボヌ
クレオチドの製造出発物質は、例えば、アデノシン、
5′ジメトキシトリチル−2′−ジメチルt−ブチルシ
リル−〔N6−ベンゾイルアデノシン〕−3′H−ホス
ホネートである。ホスホネート出発物質は自体既知の方
法で調製される〔例、セキネら、“テトラヘドロンレタ
ーズ(Tert.Lett.)”16:1711(1973)参照〕。ホスホ
ネート出発物質の他の製造方法(好ましい方法である)
では、トリス(1,2,4−トリアゾイル)ホスフアイト(T
TP)を用いる。TTPは三塩りん(PCl3)、1,2,4−トリア
ゾールおよびN−メチルモルホリンから、無水塩化メチ
レン(CH2Cl2)中で、常法通り系中で生成される。
は、核酸を構成しているヌクレオチドの同族体である。
保護基は、通常、リボース、あるいはデオキシリボース
のヒドロキシ置換分のトリフエニルメチルエステルであ
る。それらの機能は、縮合反応を、担体と結合したヌク
レオシドまたはオリゴヌクレオチドの5′ヒドロキシル
基に限定することである。オリゴデオキシヌクレオチド
の製造出発物として好ましいホスホネート類並びに対応
するヌクレオシド類(括弧で表示)は、5′ジメトキシ
トリチル−3′−チミジンH−ホスホネート(チミジ
ン)、5′ジメトキシトリチル−3′−〔−N6−ベン
ゾイルデオキシアデノシン〕Hホスホネート(デオキシ
アデノシン)、5′ジメトキシトリチル−3′−〔N4
−ベンゾイルシチジン〕H−ホスホネート(デオキシシ
チジン)、および5′ジメトキシトリチル−3′−〔N
2−イソブチルデオキシグアノシン〕Hホスホネート
(デオキシグアノシン)である。同様に、オリゴリボヌ
クレオチドの製造出発物質は、例えば、アデノシン、
5′ジメトキシトリチル−2′−ジメチルt−ブチルシ
リル−〔N6−ベンゾイルアデノシン〕−3′H−ホス
ホネートである。ホスホネート出発物質は自体既知の方
法で調製される〔例、セキネら、“テトラヘドロンレタ
ーズ(Tert.Lett.)”16:1711(1973)参照〕。ホスホ
ネート出発物質の他の製造方法(好ましい方法である)
では、トリス(1,2,4−トリアゾイル)ホスフアイト(T
TP)を用いる。TTPは三塩りん(PCl3)、1,2,4−トリア
ゾールおよびN−メチルモルホリンから、無水塩化メチ
レン(CH2Cl2)中で、常法通り系中で生成される。
担体は、オリゴヌクレオチドの合成に用いる試薬に不
溶性のものを選択し、各縮合サイクル後におけるポリヌ
クレオチドの回収の便宜を図る。また、担体は、反応体
は入り易く、また生産物並びに反応体が溶離し易い様、
充分多孔性のものを用いる。好ましい担持は調整(コン
トロールされた)多孔性ガラスであり、シリカゲルおよ
びポリスチレンも用いることができる。担体−結合ヌク
レオシドはチヨウら(Chow)“ヌクレイツク・アシツズ
・リサーチ(Nucl.Acids Rec.)”9:2807(1981)の方
法等、既知の方法で調製される。
溶性のものを選択し、各縮合サイクル後におけるポリヌ
クレオチドの回収の便宜を図る。また、担体は、反応体
は入り易く、また生産物並びに反応体が溶離し易い様、
充分多孔性のものを用いる。好ましい担持は調整(コン
トロールされた)多孔性ガラスであり、シリカゲルおよ
びポリスチレンも用いることができる。担体−結合ヌク
レオシドはチヨウら(Chow)“ヌクレイツク・アシツズ
・リサーチ(Nucl.Acids Rec.)”9:2807(1981)の方
法等、既知の方法で調製される。
ヌクレオシドH−ホスホネートは、正(プラス)に荷
電している対イオンを伴なつた陰イオンの形で存在して
いる。対イオンとしては、トリエチルアンモニウム(TE
AH+)や1,8−ジアザビシクロ〔5.4.0〕ウンデカン−7
エン−オニウム(DBUH+)が好ましい。ホスホネート類
のDBUH塩は、無水溶媒中での安定性が増加されている。
電している対イオンを伴なつた陰イオンの形で存在して
いる。対イオンとしては、トリエチルアンモニウム(TE
AH+)や1,8−ジアザビシクロ〔5.4.0〕ウンデカン−7
エン−オニウム(DBUH+)が好ましい。ホスホネート類
のDBUH塩は、無水溶媒中での安定性が増加されている。
担体と結合したヌクレオシドおよびヌクレオシド3′
H−ホスホネートは、3′ヌクレオシドを担体に結合さ
れ、予め定められた配列のオリゴヌクレオチドを合成す
ることができる様、順次(in seriatim)選択される。
この予め定められた配列と一致させて順番に縮合させ、
オリゴマーに他のヌクレオシドを付加することにより、
オリゴヌクレオチド鎖の延長を行う。
H−ホスホネートは、3′ヌクレオシドを担体に結合さ
れ、予め定められた配列のオリゴヌクレオチドを合成す
ることができる様、順次(in seriatim)選択される。
この予め定められた配列と一致させて順番に縮合させ、
オリゴマーに他のヌクレオシドを付加することにより、
オリゴヌクレオチド鎖の延長を行う。
縮合反応の第1回目は、担体結合ヌクレオシドと、オ
リゴヌクレオチド中の第2番目のヌクレオシドとの縮合
である。この、並びに以後の反応において重要な試薬は
脱水剤である。適当な脱水剤は、一般に、ホスホリル化
剤またはアシル化剤のクラスに含まれ、それらには、イ
ソブチルクロロホルメート、ジフエニルクロロホスフエ
ート、無水酢酸、無水イソ酪酸および無水トリメチル酢
酸の如き有機酸無水物、並びにピバロイルクロライド、
ピバロイルブロマイドおよびベンゾイルクロライドの如
き有機酸ハロゲン化物が含まれる。ジフエニルクロロホ
スフエート、カーボジイミド、アリールスルホニルクロ
ライドおよびアリールスルホニルテトラゾライドは、本
発明者の行つた実験では極めて低い収率しか与えなかつ
た。オリゴヌクレオチドの製造において最も重要なアシ
ル化剤およびホスホリル化剤の性質は、各サイクル毎
に、実質上、全ての新生(nascent)担体−結合鎖にヌ
クレオシドを付加させる能力である。もしも追加のヌク
レオシドが鎖の亜集団(subpopulation)と結合しなか
つたならば、即ち、その亜集団について反応サイクルが
失敗したならば、この亜集団に以後の付加がなされた結
果生成するオリゴヌクレオチドは、塩基1個分短かいこ
とになる。このことは、該オリゴヌクレオチドの、組換
え培養中で発現されるべきDNA中の成分としての有用性
を失なわせるものである。何故ならば、この様な欠失に
よつてDNAがリーデイングフレームから外れることにな
ると共に、長いオリゴヌクレオチド生産物中に混在する
欠失突然変異体を見出すことは困難であるからである。
この様に、分子生物学に用いるオリゴヌクレオチドを製
造するには、鎖の延長に高い忠実性を示す、即ち、各サ
イクルにおける付加収率の高い脱水剤を選択することが
重要である。本明細書中に特に示したもの以外の、その
様な優れた試薬の選択は、スクリーニングアツセイによ
つて行うことができる。
リゴヌクレオチド中の第2番目のヌクレオシドとの縮合
である。この、並びに以後の反応において重要な試薬は
脱水剤である。適当な脱水剤は、一般に、ホスホリル化
剤またはアシル化剤のクラスに含まれ、それらには、イ
ソブチルクロロホルメート、ジフエニルクロロホスフエ
ート、無水酢酸、無水イソ酪酸および無水トリメチル酢
酸の如き有機酸無水物、並びにピバロイルクロライド、
ピバロイルブロマイドおよびベンゾイルクロライドの如
き有機酸ハロゲン化物が含まれる。ジフエニルクロロホ
スフエート、カーボジイミド、アリールスルホニルクロ
ライドおよびアリールスルホニルテトラゾライドは、本
発明者の行つた実験では極めて低い収率しか与えなかつ
た。オリゴヌクレオチドの製造において最も重要なアシ
ル化剤およびホスホリル化剤の性質は、各サイクル毎
に、実質上、全ての新生(nascent)担体−結合鎖にヌ
クレオシドを付加させる能力である。もしも追加のヌク
レオシドが鎖の亜集団(subpopulation)と結合しなか
つたならば、即ち、その亜集団について反応サイクルが
失敗したならば、この亜集団に以後の付加がなされた結
果生成するオリゴヌクレオチドは、塩基1個分短かいこ
とになる。このことは、該オリゴヌクレオチドの、組換
え培養中で発現されるべきDNA中の成分としての有用性
を失なわせるものである。何故ならば、この様な欠失に
よつてDNAがリーデイングフレームから外れることにな
ると共に、長いオリゴヌクレオチド生産物中に混在する
欠失突然変異体を見出すことは困難であるからである。
この様に、分子生物学に用いるオリゴヌクレオチドを製
造するには、鎖の延長に高い忠実性を示す、即ち、各サ
イクルにおける付加収率の高い脱水剤を選択することが
重要である。本明細書中に特に示したもの以外の、その
様な優れた試薬の選択は、スクリーニングアツセイによ
つて行うことができる。
採用されたスクリーニングアツセイについては、実施
例2にさらに詳しく述べられている。担体−結合ヌクレ
オシドに、4サイクルでヌクレオシドH−ホスホネート
(N)を縮合させ(最後のサイクルにおいては必ずN5
を得る)、次いで、担体からポリヌクレオチドH−ホス
ホネートを分離してオリゴヌクレオチドに変換し、HPLC
にかけて分離し、N2からN5までのオリゴマーの分布を
調べる。もしも選択した脱水剤が、オリゴマーの吸光係
数について修正した分光光度法に基づく吸収の測定によ
り、約80モル%以上(通常、約90%以上)のN5を含む
オリゴマー混合物を産生しているならば、この試薬は本
発明の目的に好ましいものとみなされる。あるいはま
た、ステツプd)を49サイクル行つた後、ステツプe)
およびf)を行い、得られた組成物中に所望の50ヌクレ
オチドからなるオリゴヌクレオチド組成物を、他のオリ
ゴヌクレオチド種よりも多量のモル数で含有するオリゴ
ヌクレオチド組成物が得られる様な脱水剤を選択する。
当該技術分野においてジヌクレオシドの製造に用いられ
てきた試薬はホスホリル化剤またはスルホニル化剤であ
る。これら当業者に用いられてきた試薬、とりわけ、ジ
フエニルクロロホスフエート、2,4,6−トリイソプロピ
ルベンゼンスルホニルクロライドまたは2,4,6−トリイ
ソプロピルベンゼンスルホニルテトラゾライドの如き試
薬は本発明の厳密な標準に合致しない。
例2にさらに詳しく述べられている。担体−結合ヌクレ
オシドに、4サイクルでヌクレオシドH−ホスホネート
(N)を縮合させ(最後のサイクルにおいては必ずN5
を得る)、次いで、担体からポリヌクレオチドH−ホス
ホネートを分離してオリゴヌクレオチドに変換し、HPLC
にかけて分離し、N2からN5までのオリゴマーの分布を
調べる。もしも選択した脱水剤が、オリゴマーの吸光係
数について修正した分光光度法に基づく吸収の測定によ
り、約80モル%以上(通常、約90%以上)のN5を含む
オリゴマー混合物を産生しているならば、この試薬は本
発明の目的に好ましいものとみなされる。あるいはま
た、ステツプd)を49サイクル行つた後、ステツプe)
およびf)を行い、得られた組成物中に所望の50ヌクレ
オチドからなるオリゴヌクレオチド組成物を、他のオリ
ゴヌクレオチド種よりも多量のモル数で含有するオリゴ
ヌクレオチド組成物が得られる様な脱水剤を選択する。
当該技術分野においてジヌクレオシドの製造に用いられ
てきた試薬はホスホリル化剤またはスルホニル化剤であ
る。これら当業者に用いられてきた試薬、とりわけ、ジ
フエニルクロロホスフエート、2,4,6−トリイソプロピ
ルベンゼンスルホニルクロライドまたは2,4,6−トリイ
ソプロピルベンゼンスルホニルテトラゾライドの如き試
薬は本発明の厳密な標準に合致しない。
好ましい活性化剤はアシル化剤である。特に好ましい
アシル化剤は、式: 〔式中、Aはアリールまたは、式: (式中、Rは、好ましくは直鎖または分枝鎖状アルキ
ル、アリール、ヘテロアルキルまたはヘテロアリールか
ら選ばれる同一または異なる不活性な置換基を表わす) で示される基、Xはハロゲンあるいは異項環2級アミン
または活性エステル等の偽似(pseudo)ハロゲンを表わ
す〕 で示される構造を有するものである。Rはアルキルであ
ることが好ましく、Xは塩素または臭素であることが好
ましい。式中RがCH3であつてXが塩素である塩化ピバ
ロイルがアシル化剤として好ましい。
アシル化剤は、式: 〔式中、Aはアリールまたは、式: (式中、Rは、好ましくは直鎖または分枝鎖状アルキ
ル、アリール、ヘテロアルキルまたはヘテロアリールか
ら選ばれる同一または異なる不活性な置換基を表わす) で示される基、Xはハロゲンあるいは異項環2級アミン
または活性エステル等の偽似(pseudo)ハロゲンを表わ
す〕 で示される構造を有するものである。Rはアルキルであ
ることが好ましく、Xは塩素または臭素であることが好
ましい。式中RがCH3であつてXが塩素である塩化ピバ
ロイルがアシル化剤として好ましい。
代表的な異常項環アミンのX基またテトラゾールであ
る。この種の代表的な例は式: で示される化合物である。
る。この種の代表的な例は式: で示される化合物である。
このものは自体既知の方法に従い、 とテトラゾールとを反応させることにより、得られる。
代表的な活性エステルは、式: で示される化合物であつて、 とヒドロキシベンズトリアゾールとの反応によつて製造
される。その他の適切な脱離基は当業者にとつて自明で
ある。
される。その他の適切な脱離基は当業者にとつて自明で
ある。
通常、脱水剤は約25mM〜100mMの濃度で用いられる。
塩化ピバロイルは、約50mMの濃度、あるいはホスホネー
トモノマーに対し、塩化ピバロイルが5モル当量存在す
る量で用いることが好ましい。10当量を用いるとオリゴ
ヌクレオチドの収率が低下する。このことは、競合的ア
シル化によつて収率が限定されること、および余分のキ
ヤツピング工程を必要としないことを示唆している。塩
化ピバロイルは反応に失敗した鎖の小部分と反応し、以
後の縮合に関与し得ないピボレート(pivolate)エステ
ルを生成させる。この様に、不完全な鎖は別の工程、ま
たは余分の試薬を加える必要なしに、キヤツプ(閉鎖)
されるのである。
塩化ピバロイルは、約50mMの濃度、あるいはホスホネー
トモノマーに対し、塩化ピバロイルが5モル当量存在す
る量で用いることが好ましい。10当量を用いるとオリゴ
ヌクレオチドの収率が低下する。このことは、競合的ア
シル化によつて収率が限定されること、および余分のキ
ヤツピング工程を必要としないことを示唆している。塩
化ピバロイルは反応に失敗した鎖の小部分と反応し、以
後の縮合に関与し得ないピボレート(pivolate)エステ
ルを生成させる。この様に、不完全な鎖は別の工程、ま
たは余分の試薬を加える必要なしに、キヤツプ(閉鎖)
されるのである。
縮合に必要なホスホネートの量は、一般に、約5mM〜2
0mMの濃度域であり、約10mM〔相体的に5′−OH成分の5
eq.(当量)に相当〕が普通である。これは、通常、約5
0mMを要する既知のオリゴヌクレオチド合成法で用いら
れるモノマー量に比べてかなり少量である。
0mMの濃度域であり、約10mM〔相体的に5′−OH成分の5
eq.(当量)に相当〕が普通である。これは、通常、約5
0mMを要する既知のオリゴヌクレオチド合成法で用いら
れるモノマー量に比べてかなり少量である。
縮合反応の溶媒は無水有機溶媒、好ましくは無水ピリ
ジン/アセトニトリル(容量比1:1)の混合物である。
ジン/アセトニトリル(容量比1:1)の混合物である。
反応は、一般に、脱水剤と選択したホスホネート溶液
とを混合した後、得られた混合物を担体−結合オリゴヌ
クレオチド鎖と接触させることにより行われる。通常、
担体は粒状であり、これをカラムに詰めた後、その上か
ら、モノマーと脱水剤の溶液を通す。接触時間は通常約
0.5〜5分間であり、約1.5分間が好ましい。反応温度は
約10℃〜30℃、好ましくは20℃である。
とを混合した後、得られた混合物を担体−結合オリゴヌ
クレオチド鎖と接触させることにより行われる。通常、
担体は粒状であり、これをカラムに詰めた後、その上か
ら、モノマーと脱水剤の溶液を通す。接触時間は通常約
0.5〜5分間であり、約1.5分間が好ましい。反応温度は
約10℃〜30℃、好ましくは20℃である。
各サイクルの後に、アセトニトリルの如き有機溶媒で
洗浄することにより担体から残存する脱水剤およびヌク
レオシドH−ホスホネート含有溶液を除去する。その
後、好ましくは、2.5v/v%のジクロロ酢酸/CH2Cl2溶液
で処理することにより付加されたヌクレオシドを脱保護
する(但し、1w/v%トリクロル酢酸/CH2Cl2またはZnBr
飽和ニトロメタンも有用である)。その他の既知の保護
基に関する適当な脱保護法は当業者にとつて自明であろ
う。次いで、好ましくは担体を無水ピリジン/アセトニ
トリル(1/1 v/v)で洗浄し、この縮合反応を、予め定
められたオリゴヌクレオチドの製造に必要な回数、繰返
して行う。
洗浄することにより担体から残存する脱水剤およびヌク
レオシドH−ホスホネート含有溶液を除去する。その
後、好ましくは、2.5v/v%のジクロロ酢酸/CH2Cl2溶液
で処理することにより付加されたヌクレオシドを脱保護
する(但し、1w/v%トリクロル酢酸/CH2Cl2またはZnBr
飽和ニトロメタンも有用である)。その他の既知の保護
基に関する適当な脱保護法は当業者にとつて自明であろ
う。次いで、好ましくは担体を無水ピリジン/アセトニ
トリル(1/1 v/v)で洗浄し、この縮合反応を、予め定
められたオリゴヌクレオチドの製造に必要な回数、繰返
して行う。
必要な数の合成サイクルを行つた後、ポリヌクレオチ
ドH−ホスホネートを酸化して核酸にする。ホスホラミ
デート・ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチ
ドを調製するために、1級または2級アミン、並びに、
好ましくは四塩化炭素の存在下で酸化を行う。ヌクレオ
チド結合内にホスフエートジエステルを生成させる上で
好ましい酸化剤はヨウ素水である。その他、代表的な酸
化剤には、N−クロロスクシンイミド、N−ブロモスク
シンイミド、または過ヨウ素酸の塩類が含まれる。次い
で、オリゴヌクレオチドを担体から分離するが、濃水酸
化アンモニウムとインキユベーシヨンした後、残存する
シリカゲルを去し、オリゴヌクレオチド−含有溶液を
蒸発させる方法によることが好ましい。所望により、こ
のオリゴヌクレオチドをHPLC、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動、あるいはその他の通常の方法で精製し、核酸
配列決定法によつて生産物の忠実度を確認する。
ドH−ホスホネートを酸化して核酸にする。ホスホラミ
デート・ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチ
ドを調製するために、1級または2級アミン、並びに、
好ましくは四塩化炭素の存在下で酸化を行う。ヌクレオ
チド結合内にホスフエートジエステルを生成させる上で
好ましい酸化剤はヨウ素水である。その他、代表的な酸
化剤には、N−クロロスクシンイミド、N−ブロモスク
シンイミド、または過ヨウ素酸の塩類が含まれる。次い
で、オリゴヌクレオチドを担体から分離するが、濃水酸
化アンモニウムとインキユベーシヨンした後、残存する
シリカゲルを去し、オリゴヌクレオチド−含有溶液を
蒸発させる方法によることが好ましい。所望により、こ
のオリゴヌクレオチドをHPLC、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動、あるいはその他の通常の方法で精製し、核酸
配列決定法によつて生産物の忠実度を確認する。
上記の議論はモノヌクレオシドホスホネートの逐次付
加についてなされているが、特定のサイクルにおいて
は、ポリ(ヌクレオシドホスホネート)、通常ジ−また
はトリ−ヌクレオシドホスホネートを用い、1以上のヌ
クレオシドを付加することもできることは理解されるで
あろう。これらの反応物は、可溶性のヌクレオシド(担
体と結合していても、いなくても良い)を、上記の鎖の
開始におけるヌクレオシドホスホネート以外のヌクレオ
シドホスホネートに縮合させることにより、容易に調製
される。次いで、その様なジヌクレオシドジホスホネー
トをモノヌクレオシドホスホネートの代りに用いるか、
あるいは、他のポリ(ヌクレオシドホスホネート)の製
造に用いる。これらの新規な中間体は、式: (式中、YはDBUH+の如き対イオン、nは1またはそれ
以上であつて、通常2、Mはヌクレオシドを表わす) で示される構造式を有する。通常、ヌクレオシドは保護
される。その様な化合物の例として5′ジメトキシトリ
チル−3′−チミジル−5′−H−ホスホネート−3′
−チミジン−H−ホスホネートがある。これらの反応物
は、精製し、無水固形物として保存すべきである。
加についてなされているが、特定のサイクルにおいて
は、ポリ(ヌクレオシドホスホネート)、通常ジ−また
はトリ−ヌクレオシドホスホネートを用い、1以上のヌ
クレオシドを付加することもできることは理解されるで
あろう。これらの反応物は、可溶性のヌクレオシド(担
体と結合していても、いなくても良い)を、上記の鎖の
開始におけるヌクレオシドホスホネート以外のヌクレオ
シドホスホネートに縮合させることにより、容易に調製
される。次いで、その様なジヌクレオシドジホスホネー
トをモノヌクレオシドホスホネートの代りに用いるか、
あるいは、他のポリ(ヌクレオシドホスホネート)の製
造に用いる。これらの新規な中間体は、式: (式中、YはDBUH+の如き対イオン、nは1またはそれ
以上であつて、通常2、Mはヌクレオシドを表わす) で示される構造式を有する。通常、ヌクレオシドは保護
される。その様な化合物の例として5′ジメトキシトリ
チル−3′−チミジル−5′−H−ホスホネート−3′
−チミジン−H−ホスホネートがある。これらの反応物
は、精製し、無水固形物として保存すべきである。
以下に実施例を挙げ、本発明を説明するが、これらの
実施例は本出願の発明の範囲を制限するものと解釈され
るべきでない。
実施例は本出願の発明の範囲を制限するものと解釈され
るべきでない。
実施例1 エイコサチミジル酸(T20)およびテトラコ
ンタチミジル酸(T40)の製造 5′−ジメトキシトリチル−3′−チミジン−H−ホ
スホネート(1)の合成上の有用性は、シリカゲル上で
のT20およびT40の合成により示された。5′−ジメトキ
シトリチル−3′−チミジン−H−ホスホネートを既述
の如く製造し、31PNMR(δ−0.27ppm、J(P−H)=6
05Hz)〔31PNMRスペクトルは無水Pyr(ピリジン)/CH3C
N(1/1)溶液中、で得られ、化学シフトは、5%りん酸
/D2O(外部基準)との相対関係に基づいて示されてい
る〕により特性化された。反応は下記の反応式(1)で
示される。式中、DMTはジメトキシトリチル、Pyrはピリ
ジン、DCAはジクロロ酢酸、そしてRはスクシニル・シ
リカを表わす。
ンタチミジル酸(T40)の製造 5′−ジメトキシトリチル−3′−チミジン−H−ホ
スホネート(1)の合成上の有用性は、シリカゲル上で
のT20およびT40の合成により示された。5′−ジメトキ
シトリチル−3′−チミジン−H−ホスホネートを既述
の如く製造し、31PNMR(δ−0.27ppm、J(P−H)=6
05Hz)〔31PNMRスペクトルは無水Pyr(ピリジン)/CH3C
N(1/1)溶液中、で得られ、化学シフトは、5%りん酸
/D2O(外部基準)との相対関係に基づいて示されてい
る〕により特性化された。反応は下記の反応式(1)で
示される。式中、DMTはジメトキシトリチル、Pyrはピリ
ジン、DCAはジクロロ酢酸、そしてRはスクシニル・シ
リカを表わす。
既述の如く(チヨウら、前掲)、シリカゲル1g当り
3′−スクシニルチミジン25μモルを用いてポリマー支
持体(シリカゲル)を誘導体化した。この合成サイクル
は、2、10mMの1(2の5′−OH成分の5当量に相当)
および50mM塩化ピバロイルを無水ピリジン/アセトニト
リル(1/1)中、20℃で5分間縮合反応させた後、2.5%
DCA/CH2Cl2を用いて(2分間)3のジメトキシトリチル
を脱保護することからなる。必要な回数、合成サイクル
を行つた後、ポリチミジンHホスホネート産物3をテト
ラヒドロフラン/Pyr/H2O(90/5/5)中0.2MI2で酸化し
(2分間)、ポリチミジル酸4を得た。固体支持体から
4を除去し(濃NH4OH/5時間/55℃)、蒸発させた。粗生
成物T20をHPLC分析にかけたところ、この生成物のピー
クは、ホスホラミダイト法で調製したT20標準品と同時
に溶離することが分つた。T20およびT40粗生成物を、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、U.V.照射下に観
察して評価した。分析データーから、T20およびT40の両
者が高収率で合成されることが明らかにされた。T
40を、さらに、ポリヌクレオチドT4キナーゼを用い、
r-32P−ATPによる5′末端の標識化を行つた後、ヘビ
毒ホスホジエステラーゼにより完全に分解することによ
つて評価した。あらゆる判断基準において、合成T40は
T40標準品と同じであつた。
3′−スクシニルチミジン25μモルを用いてポリマー支
持体(シリカゲル)を誘導体化した。この合成サイクル
は、2、10mMの1(2の5′−OH成分の5当量に相当)
および50mM塩化ピバロイルを無水ピリジン/アセトニト
リル(1/1)中、20℃で5分間縮合反応させた後、2.5%
DCA/CH2Cl2を用いて(2分間)3のジメトキシトリチル
を脱保護することからなる。必要な回数、合成サイクル
を行つた後、ポリチミジンHホスホネート産物3をテト
ラヒドロフラン/Pyr/H2O(90/5/5)中0.2MI2で酸化し
(2分間)、ポリチミジル酸4を得た。固体支持体から
4を除去し(濃NH4OH/5時間/55℃)、蒸発させた。粗生
成物T20をHPLC分析にかけたところ、この生成物のピー
クは、ホスホラミダイト法で調製したT20標準品と同時
に溶離することが分つた。T20およびT40粗生成物を、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、U.V.照射下に観
察して評価した。分析データーから、T20およびT40の両
者が高収率で合成されることが明らかにされた。T
40を、さらに、ポリヌクレオチドT4キナーゼを用い、
r-32P−ATPによる5′末端の標識化を行つた後、ヘビ
毒ホスホジエステラーゼにより完全に分解することによ
つて評価した。あらゆる判断基準において、合成T40は
T40標準品と同じであつた。
実施例2 好ましい脱水剤の同定 ジフエニルクロロホスフエート(DPCP)を脱水剤とす
る並行(パラレル)サイクルを行うと共に、ペンタチミ
ジル酸(T5)を得るまで、4サイクルまで反応を行う
ことを除き、実施例1の方法を繰返して行つた。カラム
からの粗溶出液をHPLC分析に付し、未成熟な鎖で終つて
いるオリゴヌクレオチドの割合(%)を調べた。HPLC樹
脂はゾルバツクス(Zorbax)−NH2(商標)を用いた。
流速は2.5ml/分であり、15v/v%CH3CN中、25mM〜250mMK
H2PO4(pH5.5)のリニアーグラデイエントを用いた。15
分間、フラクシヨンを集め、254nmにおける吸収を測定
した。HPLCチヤートから、T2、T3、T4およびT5各々
の1個の実質上対称的なピークの高さを測り、各オリゴ
マーについての吸光度係数を補正し(各ピークの値に、
それぞれ2.5、1.75、1.25おび1を掛ける)、各粗溶出
液中の全ポリチミジンに対する割合(%)に変換した。
結果を下記の表に示す。
る並行(パラレル)サイクルを行うと共に、ペンタチミ
ジル酸(T5)を得るまで、4サイクルまで反応を行う
ことを除き、実施例1の方法を繰返して行つた。カラム
からの粗溶出液をHPLC分析に付し、未成熟な鎖で終つて
いるオリゴヌクレオチドの割合(%)を調べた。HPLC樹
脂はゾルバツクス(Zorbax)−NH2(商標)を用いた。
流速は2.5ml/分であり、15v/v%CH3CN中、25mM〜250mMK
H2PO4(pH5.5)のリニアーグラデイエントを用いた。15
分間、フラクシヨンを集め、254nmにおける吸収を測定
した。HPLCチヤートから、T2、T3、T4およびT5各々
の1個の実質上対称的なピークの高さを測り、各オリゴ
マーについての吸光度係数を補正し(各ピークの値に、
それぞれ2.5、1.75、1.25おび1を掛ける)、各粗溶出
液中の全ポリチミジンに対する割合(%)に変換した。
結果を下記の表に示す。
これらの結果は、塩化ピバロイルが、4サイクル反応
において約11%の未成熟に終結したオリゴマーを与える
にすぎず、従つて、好ましい脱水剤であることを証明す
るものである。
において約11%の未成熟に終結したオリゴマーを与える
にすぎず、従つて、好ましい脱水剤であることを証明す
るものである。
DPDCを用いたT5の収率は塩化ピバロイルを用いた場
合の約10%にすぎない。アリールスルホニルクロライド
およびカーボジイミド類ではT5の生成を検出できなか
つた。この様に、好ましいアシル化剤を用いる本発明の
方法は、予想外の高い収率をもたらすと共に、未成熟な
鎖の終結を減少させる結果を与えた。
合の約10%にすぎない。アリールスルホニルクロライド
およびカーボジイミド類ではT5の生成を検出できなか
つた。この様に、好ましいアシル化剤を用いる本発明の
方法は、予想外の高い収率をもたらすと共に、未成熟な
鎖の終結を減少させる結果を与えた。
実施例3 ヌクレオシドHホスホネートの製造 本発明に用いるデオキシヌクレオシドの製造は下記の
反応式2に従つて行われた。
反応式2に従つて行われた。
反応式2 B=a)チミン b)N6−ベンゾイルアデニン c)N4−ベンゾイルシトシン d)N2−イソブチリルグアニン e)N6−ジイソブチルホルムアミジンアデニン 無水CH2Cl2750ml中のPCl3(75ミリモル)およびN−
メチルモルホリン(750ミリモル)の撹拌溶液に1,2,4−
トリアゾール(250ミリモル)を室温で加えた。30分
後、反応混合物を0℃に冷却し、5′−ジメトキシトリ
チルチミジン(Ia、15ミリモル、CH3CNから共沸蒸留し
て乾燥)を無水CH2Cl2200ml中に入れ、これを20分間で
滴下し、10分間撹拌した後、1.0Mトリエチルアンモニウ
ムビカーボネート水溶液(TEAB、pH8.5)600ml中に注ぎ
入れ、振盪した後、分離させた。水層をCH2Cl2200mlで
抽出し、有機層を一緒にしてNa2SO4で乾燥し、蒸発させ
て泡状体とした。シリカゲルカラムクロマトグラフイー
(2%Et3N/CH2Cl2−>2% Et3N/10%MeOH/CH2Cl2)
にかけた後、TEABで抽出し、蒸留することにより、5′
−ジメトキシトリチル−3′−チミジンH−ホスホネー
ト(1a)を収率90%で得た。その他のデオキシヌクレオ
シドH−ホスホネート類は全て同様の方法で得られた。
個々の収率と31PNMRデーターを表1に示す。
メチルモルホリン(750ミリモル)の撹拌溶液に1,2,4−
トリアゾール(250ミリモル)を室温で加えた。30分
後、反応混合物を0℃に冷却し、5′−ジメトキシトリ
チルチミジン(Ia、15ミリモル、CH3CNから共沸蒸留し
て乾燥)を無水CH2Cl2200ml中に入れ、これを20分間で
滴下し、10分間撹拌した後、1.0Mトリエチルアンモニウ
ムビカーボネート水溶液(TEAB、pH8.5)600ml中に注ぎ
入れ、振盪した後、分離させた。水層をCH2Cl2200mlで
抽出し、有機層を一緒にしてNa2SO4で乾燥し、蒸発させ
て泡状体とした。シリカゲルカラムクロマトグラフイー
(2%Et3N/CH2Cl2−>2% Et3N/10%MeOH/CH2Cl2)
にかけた後、TEABで抽出し、蒸留することにより、5′
−ジメトキシトリチル−3′−チミジンH−ホスホネー
ト(1a)を収率90%で得た。その他のデオキシヌクレオ
シドH−ホスホネート類は全て同様の方法で得られた。
個々の収率と31PNMRデーターを表1に示す。
実施例4 デオキシオリゴヌクレオチドの合成 ここに示す方法は、本発明の実施例における最も優れ
た方法である。合成はバイオサーチモデル(Biosearch
Model)8600DNA合成装置を用いて行われた。トリメチル
アセチルクロライド(塩化ピバロイル)を大気圧下で蒸
留し、アルゴン(Ar)下に保存した。ピリジン(Pyr)
をp−トルエンスルホニルクロライドから蒸留した後、
水素化カルシウムから新らたに蒸留した。アセトニトリ
ル(CH3CN)を、活性化した3オングストロームのモレ
キユラーシーブで乾燥した。デオキシ−ヌクレオシドH
−ホスホネート(1a-1d)を無水CH3CNから共沸蒸留して
乾燥し、無水Pry/CH3CN(1:1)中で再構成した。合成
は、調整(コントロール)多孔生ガラス(0.1μモルの
スケール)上で、以下のプロトコールに従つて行つた。
た方法である。合成はバイオサーチモデル(Biosearch
Model)8600DNA合成装置を用いて行われた。トリメチル
アセチルクロライド(塩化ピバロイル)を大気圧下で蒸
留し、アルゴン(Ar)下に保存した。ピリジン(Pyr)
をp−トルエンスルホニルクロライドから蒸留した後、
水素化カルシウムから新らたに蒸留した。アセトニトリ
ル(CH3CN)を、活性化した3オングストロームのモレ
キユラーシーブで乾燥した。デオキシ−ヌクレオシドH
−ホスホネート(1a-1d)を無水CH3CNから共沸蒸留して
乾燥し、無水Pry/CH3CN(1:1)中で再構成した。合成
は、調整(コントロール)多孔生ガラス(0.1μモルの
スケール)上で、以下のプロトコールに従つて行つた。
合成サイクル(実施例1の反応式1) 1) 洗浄:無水CH3CN(45秒間)。
2) 脱保護:2.5%ジクロロ酢酸(DCA)/CH2Cl2(1分
間)。
間)。
3) 洗浄:無水Pyr/CH3CN(45秒間)。
4) 結合(カツプリング):10mMデオキシヌクレオシ
ドH−ホスホネート(1a-1d)、無水Pry/CH3CN(1/1 v
/v)中50mM塩化ピバロイル(1.5分間)。
ドH−ホスホネート(1a-1d)、無水Pry/CH3CN(1/1 v
/v)中50mM塩化ピバロイル(1.5分間)。
5) ヌクレオチド配列が完成するまでステツプ1−4
を繰返す。
を繰返す。
6) 脱保護:2.5%DCA/CH2Cl2(1分間)。
7) H−ホスホネートDNAの酸化:Pyr/NMI/H2O/THF
(容量比5/1/5/90)中0.1MI2(2.5分間)、Et3N/H2O/
THF(容量比5/5/90)中0.1MI2(2.5分間)による。ポリ
マーからDNAを除き、脱保護(濃NH4OH、55℃、5時間)
し、蒸留する。
(容量比5/1/5/90)中0.1MI2(2.5分間)、Et3N/H2O/
THF(容量比5/5/90)中0.1MI2(2.5分間)による。ポリ
マーからDNAを除き、脱保護(濃NH4OH、55℃、5時間)
し、蒸留する。
デオキシヌクレオシドHホスホネート(1a-1d)を、
長さ107塩基までのデオキシオリゴヌクレオチド(DNA)
の合成に用いたが、これが合成の許容範囲の上限ではな
い。上記の合成プロトコールでは、簡便かつ迅速な方法
(4分/サイクル)に於いて、最少量のデオキシヌクレ
オシドHホスホネート(2.5mg/結合)を用いている。ヌ
クレオシド間のりん原子は、それが酸化状態にあること
で望ましくない副反応から保護されており、固有のホス
フエートジエステルはヨウ素水による酸化合成反応の後
に生成する。
長さ107塩基までのデオキシオリゴヌクレオチド(DNA)
の合成に用いたが、これが合成の許容範囲の上限ではな
い。上記の合成プロトコールでは、簡便かつ迅速な方法
(4分/サイクル)に於いて、最少量のデオキシヌクレ
オシドHホスホネート(2.5mg/結合)を用いている。ヌ
クレオシド間のりん原子は、それが酸化状態にあること
で望ましくない副反応から保護されており、固有のホス
フエートジエステルはヨウ素水による酸化合成反応の後
に生成する。
ポリマーと結合したポリヌクレオシドHホスホネート
(3)のPyr/H2O/THF(5/5/90)中0.1MI2溶液による酸
化は、首尾一貫した結果を得るには不適当であつた。ジ
アルキルホスホネートのヨウ素水による酸化には一般的
な塩基生触媒に委ねられており〔ルイス(Lewis,E.S.)
およびスペアーズ(Spears,L.G.)ジヤーナル・オブ・
アメリカン・ケミカル・ソサエテイ(J.Amer.Chem.So
c.)107,3918(1985)〕、このことから、本発明者ら
は、N−メチルイミダゾール(NMI)またはより強力な
塩基〔即ち、N−メチルモルホリンまたはトリエチルア
ミン(Et3N)〕を加えると酸化速度が増大し、従つて
長いデオキシオリゴヌクレオシドHホスホネート(3、
>40塩基)の酸化にそれが必須であると断定した。ジア
ルキルH−ホスホネートはアルカリ加水分解を受け易い
とされており〔クメ(Kume,A)、フジイ(Fujii,M)、
(Sekine,M.)およびハタ(Hata,T)、ジヤーナル・オ
ブ・オーガニツク・ケミストリイ(J,Org.Chem)49、21
39(1984)〕、本発明者らはEt3Nを用いたポリヌクレ
オシドHホスホネート(3)の水中での酸化は競合的加
水分解により複雑化していることを見い出した。長いデ
オキシオリゴヌクレオシドHホスホネート(3)(>40
塩基)のヨウ素酸化においては、まず弱塩基生溶液(Py
r/NMI)、次いで強塩基生溶液(Et3N)で酸化すると、
生成物デオキシオリゴヌクレオチド(4)を最も高い収
率で得ることができることが分つた。さらに、本発明者
らは、ヨウ素(I2)水溶液はIO3 -とI-とに不均衡化さ
れていることを見出したが(ルイス、前掲)、このアル
カリ性IO3 -溶液はジヌクレオシドH−ホスホネート
(3)を酸化しないであろうと思われる〔ブラウン(Br
own,D.M.およびハモンド(Hammond,P.R.)、ジヤーナル
・オブ・ケミカル・ソサエテイ(J.Chem.Soc.)4229(1
960)〕。従つて、別々の溶液を調製し〔A=0.2MI2/TH
F、B=塩基/H2O/THF(1/1/8)〕、デオキシオリゴヌク
レオシドH−ホスホネート(3)の首尾一貫して迅速な
酸化を行う直前にこれらを混合する必要がある。
(3)のPyr/H2O/THF(5/5/90)中0.1MI2溶液による酸
化は、首尾一貫した結果を得るには不適当であつた。ジ
アルキルホスホネートのヨウ素水による酸化には一般的
な塩基生触媒に委ねられており〔ルイス(Lewis,E.S.)
およびスペアーズ(Spears,L.G.)ジヤーナル・オブ・
アメリカン・ケミカル・ソサエテイ(J.Amer.Chem.So
c.)107,3918(1985)〕、このことから、本発明者ら
は、N−メチルイミダゾール(NMI)またはより強力な
塩基〔即ち、N−メチルモルホリンまたはトリエチルア
ミン(Et3N)〕を加えると酸化速度が増大し、従つて
長いデオキシオリゴヌクレオシドHホスホネート(3、
>40塩基)の酸化にそれが必須であると断定した。ジア
ルキルH−ホスホネートはアルカリ加水分解を受け易い
とされており〔クメ(Kume,A)、フジイ(Fujii,M)、
(Sekine,M.)およびハタ(Hata,T)、ジヤーナル・オ
ブ・オーガニツク・ケミストリイ(J,Org.Chem)49、21
39(1984)〕、本発明者らはEt3Nを用いたポリヌクレ
オシドHホスホネート(3)の水中での酸化は競合的加
水分解により複雑化していることを見い出した。長いデ
オキシオリゴヌクレオシドHホスホネート(3)(>40
塩基)のヨウ素酸化においては、まず弱塩基生溶液(Py
r/NMI)、次いで強塩基生溶液(Et3N)で酸化すると、
生成物デオキシオリゴヌクレオチド(4)を最も高い収
率で得ることができることが分つた。さらに、本発明者
らは、ヨウ素(I2)水溶液はIO3 -とI-とに不均衡化さ
れていることを見出したが(ルイス、前掲)、このアル
カリ性IO3 -溶液はジヌクレオシドH−ホスホネート
(3)を酸化しないであろうと思われる〔ブラウン(Br
own,D.M.およびハモンド(Hammond,P.R.)、ジヤーナル
・オブ・ケミカル・ソサエテイ(J.Chem.Soc.)4229(1
960)〕。従つて、別々の溶液を調製し〔A=0.2MI2/TH
F、B=塩基/H2O/THF(1/1/8)〕、デオキシオリゴヌク
レオシドH−ホスホネート(3)の首尾一貫して迅速な
酸化を行う直前にこれらを混合する必要がある。
デオキシオリゴヌクレオシドH−ホスホネート結合
(3)の、デオキシオリゴヌクレオチド合成に用いた試
薬に対する安定性を評価するための実験を行つた。24量
体を製造し、デオキシヌクレオシドH−ホスホネート
(3)の酸化に先立ち、固体支持体の一部を、1)無水
Pyr/CH3CN(1/1)、2)無水CH3CN、3)無水Pyr/CH3CN
(1/1)中100mM塩化ピバロイル、および4)2.5%DCA/C
H2Cl2で4時間処理し、次いで、CH3CN洗浄、酸化、洗
浄、脱保護(濃NH4OH/5時間/55℃)、および蒸留を行つ
た。ポリヌクレオチドT4キナーゼを用い、γ−32P−A
TPで5′末端を標識した後、試料をゲル電気泳動とオー
トラジオグラフイー(データーは示されていない)によ
つて分析した。これらの条件下ではポリヌクレオシドH
ホスホネート(3)の検出し得る程度の分解は認められ
なかつたが、CH3CNまたはPyr/CH3CN溶液に水を加えて1
%とすると4時間の間に、検出し得る分解が起きた。こ
れらの結果は、H−ホスホネート結合が、合成の間中、
りん保護基として作用することを示唆している。
(3)の、デオキシオリゴヌクレオチド合成に用いた試
薬に対する安定性を評価するための実験を行つた。24量
体を製造し、デオキシヌクレオシドH−ホスホネート
(3)の酸化に先立ち、固体支持体の一部を、1)無水
Pyr/CH3CN(1/1)、2)無水CH3CN、3)無水Pyr/CH3CN
(1/1)中100mM塩化ピバロイル、および4)2.5%DCA/C
H2Cl2で4時間処理し、次いで、CH3CN洗浄、酸化、洗
浄、脱保護(濃NH4OH/5時間/55℃)、および蒸留を行つ
た。ポリヌクレオチドT4キナーゼを用い、γ−32P−A
TPで5′末端を標識した後、試料をゲル電気泳動とオー
トラジオグラフイー(データーは示されていない)によ
つて分析した。これらの条件下ではポリヌクレオシドH
ホスホネート(3)の検出し得る程度の分解は認められ
なかつたが、CH3CNまたはPyr/CH3CN溶液に水を加えて1
%とすると4時間の間に、検出し得る分解が起きた。こ
れらの結果は、H−ホスホネート結合が、合成の間中、
りん保護基として作用することを示唆している。
3′または5′−ホスフエートリンエステルがデオキ
シアデノシンのグリコシド結合を、酸によつて触媒され
る脱プリン化から安定化すること示された〔タナカ(Ta
naka,T.)およびレツツインガー(Letsinger,R.L.)ヌ
クレイツク・アシツズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)1
0 3249(1982)〕。ヌクレオシド間H−ホスホネート結
合(3)が脱プリン化速度に及ぼす影響を評価した。N
6−ベンゾイルアミド(3b、a)またはN6−ジイソブ
チルホルムアミジン(3e、a)で保護された、ポリマ
ーと結合している3′−チミジン−5′−デオキシアデ
ノシンジヌクレオシドH−ホスホネートを2.5%DCA/CH2
Cl2で24時間処理し、分析した。H−ホスホネートジエ
ステル(3)とメチルホスフエートトリエステルの間に
は脱プリン化速度において検出可能な差異を認めなかつ
た(データーは記載されていない。また、この実験で
は、N6−ベンゾイルアミドで保護されたデオキシアデ
ノシンと比較して、N6−アミジンで保護されたデオキ
シアデノシンの方がより安定であることが確認された。
シアデノシンのグリコシド結合を、酸によつて触媒され
る脱プリン化から安定化すること示された〔タナカ(Ta
naka,T.)およびレツツインガー(Letsinger,R.L.)ヌ
クレイツク・アシツズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)1
0 3249(1982)〕。ヌクレオシド間H−ホスホネート結
合(3)が脱プリン化速度に及ぼす影響を評価した。N
6−ベンゾイルアミド(3b、a)またはN6−ジイソブ
チルホルムアミジン(3e、a)で保護された、ポリマ
ーと結合している3′−チミジン−5′−デオキシアデ
ノシンジヌクレオシドH−ホスホネートを2.5%DCA/CH2
Cl2で24時間処理し、分析した。H−ホスホネートジエ
ステル(3)とメチルホスフエートトリエステルの間に
は脱プリン化速度において検出可能な差異を認めなかつ
た(データーは記載されていない。また、この実験で
は、N6−ベンゾイルアミドで保護されたデオキシアデ
ノシンと比較して、N6−アミジンで保護されたデオキ
シアデノシンの方がより安定であることが確認された。
記載のプロトコールを用いてDNAの特定の配列を合成
し、粗生成物の特性を調べた。
し、粗生成物の特性を調べた。
デオキシオリゴヌクレオチド78a、78bおよび99をメト
キシジイソプロピルアミノホスホラミダイトを用いて合
成し、比較のために表に示した。アミダイト合成は、存
在し得るホスフアイト−異項環塩基生成物を酸化して加
水分解する前に30秒間の水洗を行うことを除き、標準的
なプロトコールを用いて行つた。表に示したデーター
は、デオキシヌクレオシドH−ホスホネート中間体を用
いて生産物デオキシオリゴヌクレオチドが高収率で合成
されることを明白に示している。この時点では、H−ホ
スホネートDNAの配列における忠実度は、ホスホラミダ
イト法により生産されたものよりも低いが、この短所
は、合成サイクルがより単純であり、合成に必要なデオ
キシヌクレオシドH−ホスホネート濃度が低いというこ
とによつて十分相殺される。
キシジイソプロピルアミノホスホラミダイトを用いて合
成し、比較のために表に示した。アミダイト合成は、存
在し得るホスフアイト−異項環塩基生成物を酸化して加
水分解する前に30秒間の水洗を行うことを除き、標準的
なプロトコールを用いて行つた。表に示したデーター
は、デオキシヌクレオシドH−ホスホネート中間体を用
いて生産物デオキシオリゴヌクレオチドが高収率で合成
されることを明白に示している。この時点では、H−ホ
スホネートDNAの配列における忠実度は、ホスホラミダ
イト法により生産されたものよりも低いが、この短所
は、合成サイクルがより単純であり、合成に必要なデオ
キシヌクレオシドH−ホスホネート濃度が低いというこ
とによつて十分相殺される。
実施例5 まず、ジヌクレオチドホスホラミデート2eおよび2f
(反応式3参照)を製造するため、ポリマーと結合した
ジヌクレオシドH−ホスホネート1を、対応するアミン
(10%)とテトラヒドロフラン(THF)との溶液中、0.0
5MI2で5分間酸化した。
(反応式3参照)を製造するため、ポリマーと結合した
ジヌクレオシドH−ホスホネート1を、対応するアミン
(10%)とテトラヒドロフラン(THF)との溶液中、0.0
5MI2で5分間酸化した。
反応式3 生成したアミダイトを固体支持体から除去し(50%濃
水酸化アンモニウム(NH4OH)/ジオキサン、8時間、
r.t.)、蒸留した。両生成物の31PNMRスペクトルは、略
同量のジアステリオマー(diasteriormer)が存在する
ことを示していた〔31PNMRスペクトルはCDCl3中で得ら
れ、ケミカルシフトは5%りん酸/D2O(外部基準)と
の相対値で示されている;2e δ−9.1、−8.8ppm;2f
δ−7.9、−7.6ppm〕。H−ホスホネートジエステルの
ホスホラミデートへの酸化は、競合的加水分解によりジ
エステル2aが生成し複雑であつた。H−ホスホネートジ
エステルを四塩化炭素で酸化してホスホラミデートを得
る方法〔アサートンら(Atherton)、ジヤーナル・オブ
・ケミカルソサエテイ(J.Chem.Soc.)660(1945)、ツ
ヴイアーザツク(Zwierzak,A.)シンセシス(Synthesi
s)507(1975)〕は、CCl4への水の溶解度が低いという
利点がある。全てのジヌクレオチドホスホラミデート
(2b-g)は、対応するアミンのCCl4中10%溶液を用いて
(5分間)調製した(対応するホスホラミデートを調製
するには、ジオキサン/CCl4(1/4)中、アンモニアまた
はメチルアミン飽和溶液を用いた)。試料の高速液体ク
ロマトグラフイー(HPLC)は、競合的加水分解は極く少
量で、生産物ホスホラミデートが高収率で得られている
ことを示していた(ジチミジンホスフエートジエステル
2a<3%)。
水酸化アンモニウム(NH4OH)/ジオキサン、8時間、
r.t.)、蒸留した。両生成物の31PNMRスペクトルは、略
同量のジアステリオマー(diasteriormer)が存在する
ことを示していた〔31PNMRスペクトルはCDCl3中で得ら
れ、ケミカルシフトは5%りん酸/D2O(外部基準)と
の相対値で示されている;2e δ−9.1、−8.8ppm;2f
δ−7.9、−7.6ppm〕。H−ホスホネートジエステルの
ホスホラミデートへの酸化は、競合的加水分解によりジ
エステル2aが生成し複雑であつた。H−ホスホネートジ
エステルを四塩化炭素で酸化してホスホラミデートを得
る方法〔アサートンら(Atherton)、ジヤーナル・オブ
・ケミカルソサエテイ(J.Chem.Soc.)660(1945)、ツ
ヴイアーザツク(Zwierzak,A.)シンセシス(Synthesi
s)507(1975)〕は、CCl4への水の溶解度が低いという
利点がある。全てのジヌクレオチドホスホラミデート
(2b-g)は、対応するアミンのCCl4中10%溶液を用いて
(5分間)調製した(対応するホスホラミデートを調製
するには、ジオキサン/CCl4(1/4)中、アンモニアまた
はメチルアミン飽和溶液を用いた)。試料の高速液体ク
ロマトグラフイー(HPLC)は、競合的加水分解は極く少
量で、生産物ホスホラミデートが高収率で得られている
ことを示していた(ジチミジンホスフエートジエステル
2a<3%)。
ホスホラミデート結合の濃NH4OHに対する安定性をそ
れについて調べ、その結果、ホスホラミデート2c-2g
は、通常の異項環N−アシル保護基の除去に必要な条件
(55℃、5時間)下に安定であることが示された。この
様な条件下、ホスホラミデート2bは迅速に分解(t1/2=
15分)し、3′ホスホラミン酸モノエステルと5′ホス
ホラミン酸モノエステルの混合物となつた〔トマス(To
masz,J.)ヌクレオシドとヌクレオチド(Nucleosides a
nd Nucleotides)2 51(1983)〕。ジヌクレオチドホ
スホラミデート(2b-g)の、エキソヌクレアーゼによる
酵素分解に対する安定性を、膵臓のホスホジエステラー
ゼとヘビ毒のホスホジエステラーゼを用いて調べた。ジ
ヌクレオチド(2a-g)と対応する酵素/バツフアー溶液
とを37℃で1時間インキユベーシヨンすると、ホスフエ
ートジエステル(2a)は完全に分解されたが、ホスホラ
ミデート(2b-g)の分解は検出されなかつた(逆相HPLC
による評価)。観察されたジヌクレオチドホスホラミデ
ート2bの酵素学的安定性は、オギルビー(Ogilvie)
〔ネーマーら(Nemer)、テトラヘドロン・レター(Tet
ra hedron Lett.)21 4149(1980)〕の説に反するが、
レツシンガー(Letzinger)〔レツシンガーら、ヌクレ
イツク・アシツズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)14 34
87(1986)〕の報告とは一致する。
れについて調べ、その結果、ホスホラミデート2c-2g
は、通常の異項環N−アシル保護基の除去に必要な条件
(55℃、5時間)下に安定であることが示された。この
様な条件下、ホスホラミデート2bは迅速に分解(t1/2=
15分)し、3′ホスホラミン酸モノエステルと5′ホス
ホラミン酸モノエステルの混合物となつた〔トマス(To
masz,J.)ヌクレオシドとヌクレオチド(Nucleosides a
nd Nucleotides)2 51(1983)〕。ジヌクレオチドホ
スホラミデート(2b-g)の、エキソヌクレアーゼによる
酵素分解に対する安定性を、膵臓のホスホジエステラー
ゼとヘビ毒のホスホジエステラーゼを用いて調べた。ジ
ヌクレオチド(2a-g)と対応する酵素/バツフアー溶液
とを37℃で1時間インキユベーシヨンすると、ホスフエ
ートジエステル(2a)は完全に分解されたが、ホスホラ
ミデート(2b-g)の分解は検出されなかつた(逆相HPLC
による評価)。観察されたジヌクレオチドホスホラミデ
ート2bの酵素学的安定性は、オギルビー(Ogilvie)
〔ネーマーら(Nemer)、テトラヘドロン・レター(Tet
ra hedron Lett.)21 4149(1980)〕の説に反するが、
レツシンガー(Letzinger)〔レツシンガーら、ヌクレ
イツク・アシツズ・リサーチ(Nucl.Acids Res.)14 34
87(1986)〕の報告とは一致する。
この酸化工程の範囲をさらに追求するために、1〜9
個のホスホモルホリデート(phosphor-morpholidate)
結合を含有するウンデカチミジル酸(T11)を調製し
た。上記のプロトコールを用い、調整多孔ガラス上でポ
リチミジンH−ホスホネート合成を行つた。反応式4に
よつてその概略が示されている方法は、1個のホスフエ
ート・ジエステル結合に付随し、9個のホスホモルホリ
デート結合を含有するT11の合成に関するものである。
この方法は、3′ホスホラミデート結合を含有するT11
産物の全てについて用いられた。
個のホスホモルホリデート(phosphor-morpholidate)
結合を含有するウンデカチミジル酸(T11)を調製し
た。上記のプロトコールを用い、調整多孔ガラス上でポ
リチミジンH−ホスホネート合成を行つた。反応式4に
よつてその概略が示されている方法は、1個のホスフエ
ート・ジエステル結合に付随し、9個のホスホモルホリ
デート結合を含有するT11の合成に関するものである。
この方法は、3′ホスホラミデート結合を含有するT11
産物の全てについて用いられた。
反応式4 1個のホスフエートジエステル結合(5′末
端)に付随する9個のホスホモルホリデート結合(3′
端末)を含有するT11の合成 (*はホスホモルホリデート結合を示す) 5′−DMT脱保護の後、最終生産物をI2水溶液で酸化
する。
端)に付随する9個のホスホモルホリデート結合(3′
端末)を含有するT11の合成 (*はホスホモルホリデート結合を示す) 5′−DMT脱保護の後、最終生産物をI2水溶液で酸化
する。
濃NH4OH(2時間/r.t.)によつて生成物を固体支持体
から除去し、蒸留した。ポリアクリルアミドゲル電気泳
動(PAGE)およびU.V.像(シヤドウイング)は、各々主
生成物バンドを示唆していた。バンドを切り取り、粉砕
してH2O抽出し、逆相HPLC(C18)によつて単離し
た。これらの生成物をT4ポリヌクレオチドキナーゼと
γ−32PATPで処理して5′末端を標識した後、PAGE(17
%ポリアクリルアミド/7M尿素)に付してオートラジオ
グラムを得た。種々のT11生成物の電気泳動的易動度は
極めて顕著であり、モルホリデートが付加される毎に質
量が増大し、電荷が減少した。様々なT11生成物の電気
泳動的易動度は厳密には質量/電荷比に依存していない
という点は興味深い。多くのホスホラミデート結合を含
有している生成物(高質量/電荷比)は、ホスホラミデ
ート結合のより少ないT11生産物の易動度に基づく予想
よりも大きい易動度を有する。これらのポリチミジンホ
スホモルホリデート類の各々を85%ギ酸で処理すると
(95℃、15分間)、全てのジエステル結合を含有するT
11が生成した。
から除去し、蒸留した。ポリアクリルアミドゲル電気泳
動(PAGE)およびU.V.像(シヤドウイング)は、各々主
生成物バンドを示唆していた。バンドを切り取り、粉砕
してH2O抽出し、逆相HPLC(C18)によつて単離し
た。これらの生成物をT4ポリヌクレオチドキナーゼと
γ−32PATPで処理して5′末端を標識した後、PAGE(17
%ポリアクリルアミド/7M尿素)に付してオートラジオ
グラムを得た。種々のT11生成物の電気泳動的易動度は
極めて顕著であり、モルホリデートが付加される毎に質
量が増大し、電荷が減少した。様々なT11生成物の電気
泳動的易動度は厳密には質量/電荷比に依存していない
という点は興味深い。多くのホスホラミデート結合を含
有している生成物(高質量/電荷比)は、ホスホラミデ
ート結合のより少ないT11生産物の易動度に基づく予想
よりも大きい易動度を有する。これらのポリチミジンホ
スホモルホリデート類の各々を85%ギ酸で処理すると
(95℃、15分間)、全てのジエステル結合を含有するT
11が生成した。
チオホスフエート同族体の前駆物質としてヌクレオシ
ドH−ホスホネートジエステルが用いられている〔フジ
イら(Fujii)、テトラヘドロン・レター(Tetrahedron
Lett.)26、935(1986)〕。この変換は、ポリマーと
結合したオリゴヌクレオシドH−ホスホネート・ジエス
テル(1)をトリエチルアミン(TEA)/二硫化炭素(1
/9)中0.1MS8溶液で処理する(5分間)ことにより、直
接、高収率で達成された(>98%)。ハイブリダイゼー
シヨン用のプローブとして用いる上で極めて高い比活性
を有する放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドを
調製するために、35S放射性同位体を一部含むS8を用
いる。
ドH−ホスホネートジエステルが用いられている〔フジ
イら(Fujii)、テトラヘドロン・レター(Tetrahedron
Lett.)26、935(1986)〕。この変換は、ポリマーと
結合したオリゴヌクレオシドH−ホスホネート・ジエス
テル(1)をトリエチルアミン(TEA)/二硫化炭素(1
/9)中0.1MS8溶液で処理する(5分間)ことにより、直
接、高収率で達成された(>98%)。ハイブリダイゼー
シヨン用のプローブとして用いる上で極めて高い比活性
を有する放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドを
調製するために、35S放射性同位体を一部含むS8を用
いる。
酵素のトリエステルは、オリゴヌクレオシドH−ホス
ホネート(1)と対応するアルカノール〔ROH(ここ
に、Rは通常、炭素原子数10以下のアリール、アルキ
ル、ヘテロアルキルまたはヘテロアリールを表わす)で
示され、好ましくはMeOHまたは、n−BuOHである〕のN
−メチルイミダゾール/TEA/CCl4(5/5/90)中10%溶液
とを反応させることにより得られる。この反応は競合的
加水分解を極めて受け易いので、無水条件下で行う様、
注意する必要がある。
ホネート(1)と対応するアルカノール〔ROH(ここ
に、Rは通常、炭素原子数10以下のアリール、アルキ
ル、ヘテロアルキルまたはヘテロアリールを表わす)で
示され、好ましくはMeOHまたは、n−BuOHである〕のN
−メチルイミダゾール/TEA/CCl4(5/5/90)中10%溶液
とを反応させることにより得られる。この反応は競合的
加水分解を極めて受け易いので、無水条件下で行う様、
注意する必要がある。
b)−g)の1級および2級アミン類は単なる例示で
ある。一般式 (式中、XおよびYは水素、アルキル、ヘテロアルキ
ル、ヘテロアリールまたはアリルからなる群から選ばれ
る同一または異なる基であるか、あるいは一緒になつて
シクロアルケン、シクロアルカンまたは異項環を形成し
ていてもよい)で示される置換基を用いてもよく、これ
もまた本発明の範囲内に含まれる。XまたはY、あるい
はこれらが一緒になつてヘテロアルキルおよびヘテロア
リール置換基を形成している種は、インビトロでのハイ
ブリダイゼーシヨンプローブとして用いるのに好まし
く、XまたはYがアルキルまたはアリール置換基である
種は、インビボでのハイブリダイゼーシヨンに好まし
い。
ある。一般式 (式中、XおよびYは水素、アルキル、ヘテロアルキ
ル、ヘテロアリールまたはアリルからなる群から選ばれ
る同一または異なる基であるか、あるいは一緒になつて
シクロアルケン、シクロアルカンまたは異項環を形成し
ていてもよい)で示される置換基を用いてもよく、これ
もまた本発明の範囲内に含まれる。XまたはY、あるい
はこれらが一緒になつてヘテロアルキルおよびヘテロア
リール置換基を形成している種は、インビトロでのハイ
ブリダイゼーシヨンプローブとして用いるのに好まし
く、XまたはYがアルキルまたはアリール置換基である
種は、インビボでのハイブリダイゼーシヨンに好まし
い。
ヘテロアリールROH、XまたはY中のヘテロ(異種)
原子はS、NまたはOからなる群から選ばれ、ヘテロア
リール基中に約1〜5個存在している。インビトロでの
診断に特に有用なヘテロアリール種は螢光性であつて、
例えば、パルス螢光に用いられる希土類金属のキレート
類や、偏光螢光ハイブリダイゼーシヨンアツセイに用い
得ることが分つている他の置換基である、ヘテロアリー
ル基を有する種である。その様な螢光標識オリゴヌクレ
オチドは、標的DNAとのハイブリダイゼーシヨンに際
し、例えば、偏光の変化、発光の波長における変化、発
光強度の変化等の螢光の変化を検出することにより、相
の分離を行わずにハイブリダイゼーシヨンアツセイを行
うことができるので、このアツセイにおいて、特に有用
である。本明細書に示した方法によれば、その様な螢光
種でかなりの程度に置換されており、従つて高い比活性
を示すオリゴヌクレオチドを容易に得ることができる。
原子はS、NまたはOからなる群から選ばれ、ヘテロア
リール基中に約1〜5個存在している。インビトロでの
診断に特に有用なヘテロアリール種は螢光性であつて、
例えば、パルス螢光に用いられる希土類金属のキレート
類や、偏光螢光ハイブリダイゼーシヨンアツセイに用い
得ることが分つている他の置換基である、ヘテロアリー
ル基を有する種である。その様な螢光標識オリゴヌクレ
オチドは、標的DNAとのハイブリダイゼーシヨンに際
し、例えば、偏光の変化、発光の波長における変化、発
光強度の変化等の螢光の変化を検出することにより、相
の分離を行わずにハイブリダイゼーシヨンアツセイを行
うことができるので、このアツセイにおいて、特に有用
である。本明細書に示した方法によれば、その様な螢光
種でかなりの程度に置換されており、従つて高い比活性
を示すオリゴヌクレオチドを容易に得ることができる。
以上に示した結果は、ポリヌクレオシドH−ホスホネ
ートが種々のヌクレオチド間ホスホネート同族体の価値
ある前駆体であることを証明するものである。アミンの
存在下、ポリヌクレオシドH−ホスフエートを酸化する
と、対応するポリヌクレオチドホスホラミデートが高収
率で得られる。DNA合成におけるH−ホスホネート法
は、簡便かつ迅速で試薬効率的な方法であり、ヌクレオ
チド間ホスフエート同族体を含有するDNAの迅速な合成
に適用することができる。この方法は、天然に存在する
ヌクレオチドを含有するDNAの、種々のヌクレオチド間
ホスフエート同族体のための容易かつ有効な合成ルート
を与えるものである。
ートが種々のヌクレオチド間ホスホネート同族体の価値
ある前駆体であることを証明するものである。アミンの
存在下、ポリヌクレオシドH−ホスフエートを酸化する
と、対応するポリヌクレオチドホスホラミデートが高収
率で得られる。DNA合成におけるH−ホスホネート法
は、簡便かつ迅速で試薬効率的な方法であり、ヌクレオ
チド間ホスフエート同族体を含有するDNAの迅速な合成
に適用することができる。この方法は、天然に存在する
ヌクレオチドを含有するDNAの、種々のヌクレオチド間
ホスフエート同族体のための容易かつ有効な合成ルート
を与えるものである。
Claims (2)
- 【請求項1】ポリヌクレオチドのヌクレオチド間ホスフ
ェート同族体を製造する方法であって、 a) 2以上のヌクレオチドを含有する、担体と結合し
たポリヌクレオシドH−ホスホネートを用意し、 b) ポリヌクレオシドH−ホスホネートと、i)
S8、ii)ROH(式中、Rはアルキル、ヘテロアルキル、
ヘテロアリールまたはアリールを表わす)、あるいは (式中、XおよびYは互に独立して水素、アリール、ヘ
テロアリール、ヘテロアルキル、アルキルを表わすか、
あるいは一緒になってシクロアルケン、シクロアルカン
または異項環を形成していてもよい)で示される化合物
からなる群から選択される試薬とを反応させ、次いで、 c) ヌクレオチド間ホスフェート同族体を回収するこ
とからなる方法。 - 【請求項2】少くとも1個の置換されたヌクレオチド間
ホスフェートを含有するポリヌクレオチドであって、
式: [式中、 (a) −Zは−OH、−SH、−O−Rまたは であり、ここにRはアリール、ヘテロアリール、アルキ
ルまたはヘテロアルキルであり、XおよびYは同一また
は異なって水素、アリール、ヘテロアルキルまたはアル
キルであるか、あるいはXおよびYはそれらが結合する
窒素原子と一緒になって窒素含有シクロアルケン、窒素
含有シクロアルカン、または窒素の外に更に他のヘテロ
原子を含んでいるヘテロ環を表わしてもよいが少なくと
も1つのZは−OHではなく、 (b) aは約10より大きく約125より小さい整数であ
り、 (c) Mはヌクレオシドである] で表わされるポリヌクレオチド。
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US787280 | 1986-09-19 | ||
US06/910,048 US4959463A (en) | 1985-10-15 | 1986-09-19 | Intermediates |
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JP7059112A Division JP2705913B2 (ja) | 1985-10-15 | 1995-03-17 | インビトロにおけるオリゴヌクレオチド合成法 |
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Family Applications (3)
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JP7059112A Expired - Lifetime JP2705913B2 (ja) | 1985-10-15 | 1995-03-17 | インビトロにおけるオリゴヌクレオチド合成法 |
JP7059116A Expired - Lifetime JP2705914B2 (ja) | 1985-10-15 | 1995-03-17 | 新規ポリヌクレオチド |
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US4959463A (en) * | 1985-10-15 | 1990-09-25 | Genentech, Inc. | Intermediates |
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