KR20080059323A

KR20080059323A - 폴리뉴클레오티드 표지 시약

Info

Publication number: KR20080059323A
Application number: KR1020087012296A
Authority: KR
Inventors: 디터 하인들
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2005-11-23
Filing date: 2006-11-21
Publication date: 2008-06-26
Also published as: WO2007059816A1; HK1126183A1; CN101312985A; CA2627208A1; EP1801114B1; EP1954671A1; ATE478087T1; CA2627216A1; KR101032008B1; JP5155177B2; CN101312941A; US7741472B2; ES2332139T3; US20090005550A1; BRPI0618833A2; EP1954707A1; BRPI0618855A2; AU2006317195A1; US7795423B2; KR20080056314A

Abstract

본 발명은 변형된 올리고뉴클레오티드 제조를 위한 신규한 표지 시약 및 이의 제조 방법을 제공하며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 하기 구조를 함유한다:

P = N - SO₂ - 벤졸 - L - M - X

(식 중, L 은 - (CH₂)n - 또는 폴리에틸렌글리콜이고,

M 은 - NH -, - O -, - S -, 및 - COO - 로 이루어진 군에서 선택되고,

X 는 보호기 또는 탐지가능한 단위체임을 특징으로 한다).

L 은 바람직하게는 - (CH₂)n - 또는 폴리에틸렌글리콜이다.

Description

폴리뉴클레오티드 표지 시약{POLYNUCLEOTIDE LABELLING REAGENT}

본 발명은 뉴클레오티드 화학 분야에서 신규한 물질 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 이 물질은 히드록실기가 상응하는 모방체(mimetics)로 대체된 소위 인산염 모방체이다.

특히 본 발명은 새로운 종류의 변형 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 표지 시약에 관한 것이다.

변형된 인산염 부분(moiety)을 갖는 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 합성을 위한 다양한 방법이 당 기술분야에서 공지되어 있다.

합성 (데옥시) 올리고뉴클레오티드는 통상 고체상(solid phase) 위에서 포스포라미디트 화학의 도움으로 제조된다. 규정된 크기의 세공을 갖는 유리 비드(glass bead)이 통상 고체상{이하 CPG [제어된 세공 유리(controlled pore glass)]로 언급함}으로서 사용된다. 고체상 합성 완료 후에 유리 올리고뉴클레오티드가 절단되어 나갈 수 있도록 하기 위해, 첫번째 단량체가 절단가능한 기(cleavable group)에 의해 지지체에 연결된다. 또한 첫번째 단량체는 보호된 히드록실기를 함유하며, 이 경우 통상 디메톡시트리틸(DMT)이 보호기로서 사용된다. 보호기는 산 처리에 의해 제거될 수 있다. 이후 역시 DMT 보호기가 제 공된 (데옥시)리보뉴클레오시드의 3' 포스포라미디트 유도체가, 순환 과정에서 각 경우의 DMT 보호기가 유리되는 반응기에 5' 말단에서 연속적으로 커플링된다. 대안적으로 3' 디메톡시트리틸-보호된 5' 포스포라미디트가 역(inverse) 올리고뉴클레오티드 합성에 사용된다. H-포스포네이트 전략은 또한 특히 인산염 백본(backbone) 상에 변형을 도입하는 데, 예를 들어 방사성 표지된 포스포로티오에이트를 제조하는 데 사용된다. 변형된 또는 표지된 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 다양한 전략이 또한 이미 공지되어 있다: 3' 말단에서 표지된 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 선행 기술에 따라 3 작용성 지지체 물질이 사용된다(US 5,290,925, US 5,401,837). 5' 말단에서 표지된 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해, 표지기가 C3-12 연결자(linker)를 통해 포스포라미디트에 결합된 표지된 포스포라미디트가 통상 이용된다(US 4,997,928, US 5,231,191). 또한 변형은 개개의 염기 상에(US 5,241,060, US 5,260,433, US 5,668,266) 또는 내부적 비-뉴클레오시드 연결자를 도입함으로써(US 5,656,744, US 6,130,323) 올리고뉴클레오티드에 도입될 수 있다.

대안적으로 포스포로티오에이트의 합성후 표지에 의해(Hodges, R.R., et al., Biochemistry 28 (1989) 261-7) 또는 작용화된 포스포라미디트를 후-표지시킴으로써(Agrawal, S., Methods in Mol. Biology 26 (1994) Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Chapter 3, Humana Press, Totowa, NJ) 뉴클레오시드간(internucleoside) 인산염이 표지될 수 있다. 그러나, 포스포라미디트 및 인산 티오에스테르의 불안정성으로 인해 상기 방법들은 용인되지 않는다.

또한 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 인산염 잔기 상에 변형이 도입될 수 있다는 것이 선행기술에서 이미 공지되었다. 가장 현저한 사례들에서 이들은 포스포티오에이트 (Burgers, P.M., 및 Eckstein, F., Biochemistry 18, (1979) 592-6), 메틸포스포네이트 (Miller, P.S., et al., Biochemistry 18 (1979) 5134-43) 또는 보라노인산염 (WO 91/08213)이다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 특별한 단위체가 합성되어야 한다. 대조적으로 종래의 포스포라미디트 또는 H-포스포네이트는 포스포로티오에이트 및 보라노인산염을 합성하는 데 사용될 수 있으며, 이 경우 올리고뉴클레오티드 합성 중 또는 또한 이후에 H-포스포네이트 또는 포스폰산 트리에스테르와 반응하는 특별한 시약을 사용함으로써 보라노 또는 티오 변형이 직접 도입될 수 있다. 모든 상기 방법들이 변형된 올리고뉴클레오티드를 유도함에도 불구하고, 이에 사용되는 합성 화학의 요건들은 표지가 상기 방식으로 탐지될 수 있거나 작용기가 직접 올리고뉴클레오티드 사슬의 인산염 백본 상에 올리고뉴클레오티드 합성 중 도입되는 것을 허용하지 않는다.

Baschang, G., 및 Kvita, V. 는 "Angewandte Chemie", 85(1), (1973), 43-44 에서 뉴클레오티드 인산 트리에스테르의 아지드 예컨대 메틸술포닐 아지드와의 반응으로, 그러나 불안정해서 분해되는, 트리-알킬(아릴)이미도인산염을 제조함을 기술한다.

Nielsen, J., 및 Caruthers, M.H. 는 J. Am. Chem. Soc. 110 (1988) 6275-6276 에서 알킬 아지드의 존재 하의 2-시아노-1,1-디메틸에틸 보호기가 제공된 데 옥시뉴클레오시드 포스파이트의 반응을 기술한다. 또한, 이 저자들은 개시된 방법의 도움으로 제조된 변형 중 어떤 유형이 특별한 이점을 가질 수 있는지에 대한 설명 없이, 상기 원칙이 인산염 잔기 상에서 변형된 뉴클레오티드를 제조하는 데 적합하다고 제의한다.

WO 89/09221 은 포스포라미디트 또는, 더 정확히 말하면 적절한 알킬아민의 존재 하에 뉴클레오시드 포스파이트(보호기가 제공됨)를 요오드로 산화시킴으로써 제조된 하나 이상의 인산염 잔기 상에서 N-알킬로 치환된 올리고뉴클레오티드를 개시한다.

WO 03/02587 은 H-인산염이 아민화에 의해 포스포라미데이트로 전환되는 변형된 올리고뉴클레오티드의 제조를 개시한다.

이처럼 상기 문헌들은 모두 인산염 잔기 대신 포스포라미데이트를 함유하는 분자의 제조를 기술한다. 그러나, 포스포라미데이트를 함유하는 분자는 가수분해되기 쉬운데, 이는 아민기가 산성 환경에서 양성자화된 후 물로 치환되기 때문이다.

추가로 WO 01/14401 은 인산염 잔기가 N-ClO₃, N-NO₂ 또는 N-SO₂R 로 치환된 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 구성체(building block)를 제안한다. WO 01/14401 의 교훈에 따라 상기 물질은 데옥시 뉴클레오시드의 유리 히드록실기를 아미도포스포닐 클로리드와 피리딘의 존재 하에 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 그러나, 이런 유형의 제조는 복잡하고, 시간 소모적이고 뉴클레오티드 또 는 올리고뉴클레오티드의 상용 합성에 적합하지 않다.

Acc 아지드 예컨대 아실 아지드 및 술포닐 아지드의 제조는 단순하고 오랫 동안 공지되었다(Review: Brase, S., et al., Angewandte Chemie 117 (2005) 5320-5374, 3.4 및 3.5.2). 이들은 바람직하게는 아실 클로리드 또는 술포닐 클로리드로부터 소듐 아지드를 이용하여 또는 하이드라지드로부터 질산을 이용하여 제조된다.

술포닐 아지드 염료가 예를 들면 또한 염색 과정에서 사용된다(예, DE 19650252). 시아노젠 아지드는 소듐 아지드를 아세토니트릴 내의 브로모시아노젠과 반응시킴으로써 간단히 제조될 수 있다(McMurry, J. E., et al., J. 유기 Chemistry 38(16) (1973) 2821-7). 헤테로아릴 아지드는 할로겐을 아지드로 친핵성 치환시킴으로써 또는 헤테로아릴 히드라진으로부터 제조될 수 있다. 필요조건은 전자를-끌어당기는 질소가 아지도 기에 대해 파라 또는 오르토 위치에 있는 것인데, 이는 그때에만 공명-안정화된 인산염 모방체가 형성되기 때문이다. 오르토 및 파라 N-알킬 피리디늄 아지드가 특히 이와 관련하여 적합하다. 몇몇 아실, 술포닐 및 피리딜 아지드가 또한 시판중이다.

본 발명의 기초를 이루는 기술적 목적은 이처럼 개선된 표지된 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 그의 제조를 위한 단순 공정 중 이용될 수 있는 표지 시약을 제공하는 것이다.

발명의 간략한 설명

따라서, 본 발명은 하기 화학적 구조를 갖는 시약에 관한 것이다:

N₃ - SO₂ - 벤졸 - L - M - X

(식 중,

L 은 바람직하게는 - NH - CO - 폴리에틸렌글리콜, 또는 - NH - CO - (CH₂)n (여기서, n 은 1 과 18 사이의 자연수임)인 연결자이고,

M 은 - NH -, - O -, 및 - S - 로 이루어진 군에서 선택되고,

X 는 보호기 또는 탐지가능한 단위체임을 특징으로 한다).

한 구현예에서, X 는 DMT, TFA, Fmoc 및 S-알킬(여기서, 알킬은 탄소수 1 내지 6의 사슬임)로 이루어진 군에서 선택된다. 대안적으로, X 는 표지 화합물 예컨대 형광 화합물이다.

두번째 측면에서, 본 발명은 상기와 같이 X 를 보호기로서 갖는 화합물의, 바람직하게는 외가닥 올리고뉴클레오티드인 핵산을 변형시키기 위한 용도에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 변형은 하기 단계를 포함한다:

- 3' 포스포라미디트를 신생 올리고뉴클레오티드 사슬의 5' OH 말단과 반응시키는 단계, 및

- 중간체를 상기 시약과 반응시키는 단계.

세번째 측면에서, 본 발명은 상기 시약의 제조 방법에 관한 것으로서, 하기 화학식:

N₃ - SO₂ - 벤졸 - NH₂

을 갖는 화합물을 하기 화학식을 갖는 활성화된 카본산과 반응시키는 것을 특징으로 한다:

A - CO - L - M - X

(식 중,

L 은 바람직하게는 - (CH₂)n - (여기서, n 은 1 과 18 사이의 자연수임), 또는 폴리에틸렌글리콜인 연결자이고,

M 은 - NH -, - O -, 및 - S - 로 이루어진 군에서 선택되고,

X 는 보호기 또는 탐지가능한 단위체이고,

A 는 클로리드, 무수물 및 N - 히드록시- 숙신이미드로 이루어진 군에서 선택된다).

대안적으로, 상기 시약은 본 발명에 따라 하기 화학식:

N₃ - SO₂ - 벤졸 - (CH₂)n - COCl (여기서, n 은 0 내지 6 임)

을 갖는 화합물을 하기 화학식을 갖는 화합물과 반응시킴에 의해 합성될 수 있다:

NH₂ - (CH₂)m - M - X

(식 중,

m 은 0 또는 1 과 10 사이의 자연수이고,

M 은 - NH -, - O -, - S - 로 이루어진 군에서 선택되고,

X 는 보호기 또는 탐지가능한 단위체임을 특징으로 한다)

발명의 상세한 설명

발명의 기본 개념

본 발명의 목적은 변형된 인산염 잔기 및 또한 바람직하게는 탐지가능한 표지를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 단순한 방식으로 제조하는 데 사용될 수 있는 표지 시약을 제공하는 것이다.

본 발명의 중심 개념은 3가 인 원자로 시작하여 이를 시약과 반응시켜 안정한 인산염 모방체가 형성되도록 하는 것이었다. 본 발명에 따라서, 보호기가 제공된 하나 이상의 히드록실 잔기를 함유하는 인 원자가 상기 목적을 위해 N = N = N - Acc 구조(여기서, Acc 는 전자 수용체 또는 잔기 R 로 치환된 전자 수용체이고, R 은 임의의 유기 치환기임)를 갖는 아지드와 반응된다. 이는 강하게 전자를-끌어당기는 전자 수용체 기(group)가 N 원자를 통해 공유결합되어 있는 5가 인 원자의 형성을 초래한다. 상기 기는, 선행기술에서 공지된 포스포라미데이트 화합물과는 대조적으로, 상기 방식으로 제조된 화합물이 공명-안정화되어 가수분해되는 경향이 없도록 해준다.

본 발명의 기초를 이룬 상기 개념은 3가 인이 중간체로서 형성되는 모든 과정에 적용될 수 있다.

포스포라미디트를 이용한 종래의 올리고뉴클레오티드 합성 중에, 3가 인 원자를 갖는 포스폰산 트리에스테르가 중간 생성물로서 형성된다. 첫번째 및 두번째 에스테르 결합은 뉴클레오시드간 연결을 나타낸다. 인 원자는 보호된 히드록실기 예컨대 베타-시아노에틸옥시기에 세번째 에스테르 결합을 통해 연결된다. 요오드에 의한 산화 대신, 신생 올리고뉴클레오티드는 이후 본 발명에 따라 적절한 아지드와 반응될 수 있고, 이 과정에서 질소를 절단하면서 -N-Acc 를 인 원자에 공유 연결시킴으로써 3가 인 원자가 5가 원자로 산화된다.

올리고뉴클레오티드 합성이 이후 선행기술에서 공지된 바와 같이 이어서 계속될 수 있다. 하나 이상의 뉴클레오티드내부 인산염 잔기 상에서 대부분의 임의의 방식으로 변형된 안정한 올리고뉴클레오티드가 최종 생성물로서 수득된다.

정의

본 발명의 범위 안에서 사용된 몇몇 용어들은 하기와 같이 정의된다:

반응기란 공유 결합을 형성하면서 적절한 조건 하에 또다른 분자와 반응할 수 있는 분자의 기를 말한다. 반응기의 예는 히드록실기, 아미노기, 티올, 히드라지노, 히드록실아미노, 디엔, 알킨 및 카르복실산기이다.

보호기란, 다단계 합성 반응의 일부로서 유일의 특정한 비-보호된 반응기만이 목적하는 반응 상대와 반응할 수 있도록, 분자의 하나 이상의 반응기와 반응하는 분자를 의미한다. 히드록실기를 보호하기 위해 흔히 사용되는 보호기의 예는 베타-시아노-에틸, 베타-시아노메틸, 트리알킬실릴 및 알릴이다. 아미노기를 보호하기 위한 보호기는 트리플루오로아세틸 및 Fmoc 이다. 기타 가능한 보호기는 표준 교과서에 개괄되어 있다(Greene, T.W., Protective groups in organic synthesis, Wiley Interscience Publications, John Wiley & Sons (1981) New York, Chichester, Brisbane, Toronto; Souveaux, E., Methods in Mol. Biology 26 (1994) Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Humana Press, Totowa, NJ, Chapter 1, ed. S. Agrawal).

연결자는 0 내지 40 탄소 원자의 길이를 갖는 탄소 사슬로 정의된다. 상기 연결자 사슬은 또한 추가적으로 하나 이상의 내부 질소, 산소, 황 및/또는 인 원자를 가질 수 있다. 연결자는 또한 분지형일 수 있고 예를 들면 또한 수지상일 수 있다. 연결자는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬을 보호기에 의해 임의 보호되는 반응기 또는 탐지가능한 단위체와 상호연결시킨다.

본 발명의 문맥에서, 연결자는 바람직하게는 6 개 이상의 원자를 갖는다. 또한 바람직하게는, 사슬은 20 개 까지의 헤테로원자를 함유할 수 있는 탄소 원자로 구성된다. 특정 구현예에서, 상기 연결자는 하나 이상의 하기 구조를 포함할 수 있다:

-NR-(C=O)-,

-C(=O)-NR-,

-S(=O)₂-NR-,

-NR-S(=O)₂-

(식 중, R 은 H 또는 C₁ - C₆ 알킬

또는 O-CH₂CH₂-O 임).

탐지가능한 단위체는 분석법의 도움으로 탐지될 수 있는 물질을 의미하는 것으로 이해된다. 이는 예를 들면 질량 분광법에 의해, 면역학적으로 또는 NMR의 도움으로 탐지될 수 있는 단위체일 수 있다. 탐지가능한 단위체는 특히 또한 광학적 방법 예컨대 형광 및 UV/VIS 분광법에 의해 탐지될 수 있는 물질, 예컨대 플루오레세인(Fluorescein), 로다민 및 금 입자이다. 이는 또한 용융 행태에 영향을 미칠 수도 있고 그의 형광이 혼성화(hybridization)에 의해 변화될 수 있는 삽입체(intercalator) 및 부홈 결합체(minor groove binder)를 포함한다.

포스포라미디트는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유도체의 5' 종결 말단에 커플링될 수 있는 3가 인 원자를 함유하는 분자를 의미한다. 따라서 포스포라미디트는 올리고뉴클레오티드 합성에 이용될 수 있다. 사슬 신장에 이용되는 (데옥시)리보뉴클레오티드 포스포라미디트에 외에도, 올리고뉴클레오티드 합성 중 또는 마지막 단계에서 올리고뉴클레오티드를 표지하기 위한 공정 같은 데 사용될 수 있는 표지로 유도체화된 포스포라미디트가 존재한다(Beaucage, S. L., Methods in Molecular Biology 20 (1993) 33-61, ed. S. Agrawal; Wojczewski, C., et al., Synlett 10 (1999) 1667-1678).

본 발명과 관련하여 용어 "올리고뉴클레오티드"는 (데옥시)올리고리보뉴클레오티드 뿐만 아니라, 인산염 백본 상의 변형(예를 들면 메틸 포스포네이트, 포스포티오에이트), 당 상의 변형(예컨대 2'-O- 알킬 유도체, 3' 및/또는 5' 아미노리보오스, LNA, HNA, TCA)을 갖거나 또는 7-데아자퓨린과 같은 변형된 염기를 갖는, 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 PNA 또는 기타 생중합체 예를 들면 펩티드와 같은 비-뉴클레오시드 유사체를 함유하는 접합체(conjugate) 및 키메라(chimera)를 포함한다. 더욱이, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 또한 스페이서(spacer)와 같은 비-뉴클레오시드 단위체 예를 들면 헥사에틸렌 글리콜 또는 Cn (n = 3.6) 스페이서를 각 위치에서 하나 이상 함유할 수 있다.

용어 "전자 수용체" 는 자유 전자쌍을 끌어당기는 경향을 갖는 원자 구조를 포함한다. 이의 한 측정은 Hammett 상수이다. 본 발명은 특히 Hammett 상수 σ_p 가 특정 수치 0.30, 바람직하게는 0.45 및 특히 바람직하게는 0.60을 초과하는 구현예와 관련된다.

전자 수용체는 그밖에 올리고뉴클레오티드 합성에서의 모든 화학 반응과 상용성이어야 한다, 즉

- 요오드에 의해 산화되지 않아야 하고,

- 디클로로아세트산 및 트리클로로아세트산에 대해 비활성이어야 하고,

- 염기에 대해 및 특히 암모니아에 대해 비활성이어야 하고,

- 3가 포스포라미데이트와 반응하지 않아야 한다.

상기 조건을 충족시키는 전자 수용체의 예는 하기와 같다:

-NO₂, SO₂-R, -CN, -CO-R, 피리니디닐, 피리디닐, 피리다지닐, 헥사플루오로페닐, 벤조트리아졸릴 (Hansch, C., et al., Chem. Reviews 91 (1991) 165-195). 또한 상기 수용체는 질소 원자에 비닐위치 또는 페닐위치 방식으로 결합될 수도 있다.

용어 "치환된" 은 치환되어 있다고 언급된 구조가 더 자세히 정의되지 않은 임의의 위치에서 또다른 잔기를 함유하는 것을 의미한다. 용어 "임의 치환된" 은 이렇게 언급된 구조가 부가적인 잔기를 함유하는 및 함유하지 않는 구현예를 포함함을 의미한다.

용어 "아미노-치환된 알킬" 은 보호된 또는 연결자를 통해 탐지가능한 단위체에 결합된 하나 이상의 아미노기를 함유하는 C₁-C₃₀ 선형 또는 분지형 알킬을 포함한다.

용어 "전자-부족, 6-원 N¹ -헤테로고리" 는 sp2 질소 상에서 알킬화되어 헤테로고리의 총괄 전하가 양성인 N-헤테로고리를 포함한다. 이의 예는 피리디늄, 피리미디늄 및 퀴놀리늄이다.

용어 "뉴클레오티드 사슬" 은 인산염 부분에 의해 5'-3' 내부-연결된 둘 이상의 뉴클레오시드 잔기를 함유하는 분자 또는 분자의 일부로 이해된다.

본 발명에 따른 화학적 표지 시약

본 발명은 하기 화학 구조를 갖는 시약에 관한 것이다:

N₃ - SO₂ - 벤졸 - L - M - X

(식 중, L 은 상기와 같은 연결자 구조이다. 한 구현예에서, L 은 바람직하게는 - NH - CO - 폴리에틸렌글리콜 또는 -NH - CO - (CH₂)n 이다(n 은 자연수 1 과 18 사이임). 또다른 특정 구현예에서, L 은 - CO - NH - 폴리에틸렌글리콜 또는 -NH - CO - (CH₂)n (n 은 자연수 1과 18 사이임)이다.

M 은 - NH -, - O -, 및 - S - 로 이루어진 군에서 선택되고,

X 는 보호기 또는 탐지가능한 단위체이다).

벤졸에 연결된 부분은 메타 배치 또는 파라 배치에 위치한다. 바람직하게는 그들은 파라 배치에 있다. 부가적으로, 벤졸은 하나 이상의 위치에서 할로겐 예컨대 클로리드와 같이 부피가 크지 않은 치환기에 의해 치환될 수 있다.

L 이 - (CH₂)n - 인 경우, n 은 1 과 18 사이의, 바람직하게는 2 와 12 사이의 및 가장 바람직하게는 3 과 6 사이의 자연수이다.

L 이 폴리에틸렌글리콜인 경우, 사슬 길이는 바람직하게는 2 (디에틸렌글리콜) 와 6 (헥사에틸렌글리콜) 사이에서 다양할 수 있다.

바람직하게는, M 은 - NH - 이다.

X 가 보호기인 경우, 이는 DMT(디메톡시트리틸), TFA(트리플루오르아세틸), Fmoc((플루오렌-9-일)메톡시-카르보닐), 및 - S - 알킬로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서 알킬기는 1 내지 6 의 탄소 원자의 사슬 길이를 갖는다. M 의 성질에 따라, 다른 보호기가 선택된다. - NH - 의 경우, TFA 및 Fmoc 가 매우 바람직하다. - O - 및 - S - 의 경우, DMT 를 사용할 것이 권장된다. - S - 의 경우, - S - 알킬이 사용될 수 있다.

X 가 탐지가능한 단위체인 경우, 탐지가능한 단위체는 색 표지 염료 예컨대 형광 표지일 수 있다. 추가적 예는 매스 태그(mass tag), 디그옥시제닌 또는 비오틴과 같은 합텐(hapten), 또는 소형 펩티드이며, 이들 모두는 항체에 의해 탐지가능하다. 바람직하게는, X 는 형광 화합물 예컨대 플루오레세인 또는 실시간 PCR 에 이용되는 임의의 기타 형광 염료이다.

X, M 및 L 의 정의 및 개시된 구체적 구현예들은 또한 "본 발명에 따른 화학적 표지 시약의 합성", "본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조", 및 "본 발명에 따른 표지 시약에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드"를 개시하는 이어지는 장에도 적용됨을 유의한다.

본 발명에 따른 화학적 표지 시약의 합성

본 발명은 또한 본 발명에 따른 화합물을 합성하기 위한 쉽고 간단한 방법을 제공한다.

화학식 N₃ - SO₂ - 벤졸 - NH₂ 을 갖는 화합물은 당 기술분야에서 공지된 표준 방법에 의해 비교적 저렴한 시판중인 N₃ - SO₂ - 벤졸 - NH 아세틸로부터 용이하게 얻을 수 있다.

상기 화학적 화합물은 하기 화학식을 갖는 활성화된 카본산과 반응된다:

A- CO - L - M - X

(식 중, A 는 클로리드, 무수물 및 N-히드록시-숙신이미드 (NHS 에스테르) 로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, A 는 N-히드록시-숙신이미드이다.

L 은 바람직하게는 - (CH₂)n - 또는 폴리에틸렌글리콜인 연결자이다. L 이 - (CH₂)n - 인 경우, n 은 1 과 18 사이의, 바람직하게는 2 와 12 사이의 및 가장 바람직하게는 3 과 6 사이의 자연수이다. L 이 폴리에틸렌글리콜인 경우, 사슬 길이는 바람직하게는 2 (디에틸렌글리콜) 와 6 (헥사에틸렌글리콜) 사이에서 다양할 수 있다.

M 은 - NH -, - O -, 및 - S - 로 이루어진 군에서 선택되고,

X 는 상기와 같이 보호기 또는 탐지가능한 단위체이다).

화학식 A- O - CO - L - M - X 로 포괄되는 몇몇 화합물들이 또한 올리고뉴클레오티드의 합성후 표지용으로 제공되는 시약으로서 시판된다. 특히, 형광 염료는 LC Red 640 및 LC Red 610 (Roche Applied Science Cat. Nos: 12 015 161 001, 03, 03 561 488 001)의 경우와 같이 NHS 에스테르의 형태로 흔히 제공된다. 그러나, 본 발명의 문맥에서, 상기 화합물들은 첫번째로 N₃ - SO₂ - 벤졸 - NH₂ 와 반응되어 결과적으로 상기 화합물들을 아지드 형태로 얻을 수 있다. 하기와 같이 상기 아지드는 이어서 이미 합성 중인 올리고뉴클레오티드에 표지를 도입하기 위해 사용될 수 있다.

대안적으로, 표지 시약의 합성은 N₃ - SO₂ - 벤졸 - L - NH - X (X 는 상기 방법에 따른 보호기임)을 합성한 후 X 를 탈보호시킴으로써 수행될 수 있으며, 여기서 X 는 아지드가 비교적 안정한 조건 하에서 제거될 수 있는 보호기로부터 선택되어야 한다. 적절한 보호기는 트리틸, Boc, 및 페닐아세틸이며, 생성된 N₃ - SO₂ - 벤졸 - L - NH₂ 는 이후 탐지가능한 기의 활성화된 에스테르와, 예를 들면 시판중인 염료의 NHS 에스테르와 반응될 수 있다.

본 발명의 또다른 측면에서 합성은 화합물 N₃ - SO₂ - 벤졸 - (L)n - C(=O)Cl (여기서, n = 0-1 임)로부터 시작될 수 있다. 상기 화합물은 카르복실산으로 치환된 아릴술포닐코리드로부터 용이하게 합성되며, 여기서 카르복실산은 아릴 고리에 직접 또는 연결 부분을 통해 부착될 수 있다. 시판중인 화합물은 예를 들면 Cl-S(=O)₂-Ph-COOH 또는 Cl-S(=O)₂-Ph-(CH₂)₂COOH 이다. 술포닐코리드는 소듐 아지드와 반응시킴으로써 술포닐아지드로 전달되고, 이후 카르복실산이 표준 방법(예, FR 1455154)에 의해 산 염화물로 전환된다. 대안적으로, N₃-S(=O)₂-Ph-NH₂ 이 디카르복실산 무수물과 반응하여 N₃-S(=O)₂-Ph-NHC(=O)(CH₂)COOH 로 된 후, 카르복실산을 표준 방법에 의해 산 염화물로 전환시킬 수 있다. 화합물 N₃ - SO₂ - 벤졸-(L)n- C(=O)Cl 은 이후, 시판중인 또는 탐지가능한 기의 NHS 에스테르로부터 에스테르를 과량의 NH₂-L-NH₂ 와 반응시킴으로써 용이하게 합성될 수 있는, NH₂-L-M-X 와 반응할 수 있다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조

일반적으로 본 발명은 변형된 올리고뉴클레오티드 제조를 위한 표지 시약에 관한 것으로서, 하기 화학적 구조를 갖는 3가 인 유도체가:

(식 중, PG 는 보호기를 나타내고,

A 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 5' 말단을 나타내고 또는 고체상에 결합된 연결자를 나타내고,

B 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 3' 말단을 나타내고 또는 연결자를 나타낸다)

하기 구조를 갖는 아지드와 반응하는 것을 특징으로 한다:

N₃ - SO₂ - 벤졸 - L - M - X

(식 중, L 은 바람직하게는 - NH - CO - 폴리에틸렌글리콜 또는 -NH - CO - (CH₂)n (n 은 1 과 18 사이의 자연수임)인 연결자이고,

M 은 - NH -, - O -, 및 - S - 로 이루어진 군에서 선택되고,

X 는 보호기 또는 탐지가능한 단위체임을 특징으로 한다).

베타-시아노에틸, 메틸, 알릴 또는 실릴이 보호기(PG)로서 특히 바람직하다. 대안적으로 메틸-포스포네이트가 본 발명에 따라 -O-PG 가 CH₃ 로 대체되어 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 또한 특히 통상의 올리고뉴클레오티드 합성에서 상용될 수 있다. 이처럼 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:

a) 3' 포스포라미디트를 신생 올리고뉴클레오티드 사슬의 5' OH 말단과 반응시키는 단계,

b) 하기 구조를 갖는 아지드와 반응시키는 단계:

N₃ - SO₂ - 벤졸 - L - M - X

M 은 - NH -, - O -, 및 - S - 로 이루어진 군에서 선택되고,

X 는 보호기 또는 탐지가능한 단위체임을 특징으로 한다).

상기의 경우 신생 올리고뉴클레오티드 사슬의 5' OH 말단은 5' 종결 뉴클레오티드의 5' 말단 또는 CPG 의 유리 OH 기일 수 있다.

통상의 올리고뉴클레오티드 화학은 반응성 고체상 지지체 물질 상에서 시작한다. 고체상 지지체 물질이란 반응기를 함유하는 고체상을 형성하고 그 위에 추가적 분자가 고정화될 수 있는 중합성 물질을 말한다. 올리고뉴클레오티드 합성의 경우, 지지체 물질은 통상 규정된 세공 크기를 갖는 다공성 유리 비드, 소위 제어된 세공 유리 입자(CPG)이다. 대안적으로 폴리스티렌 잔기 및 다른 유기 중합체 및 공중합체를 사용하는 것이 또한 가능하다(Ghosh, P. K., et al., J. Indian. Chem. Soc. 75 (1998) 206-218). 올리고뉴클레오티드가 합성 후 기질 상에 고정화되어 남아있어야 한다면, 유리 및 또한 반도체 칩이 고체상 지지체 물질로서 사용될 수 있다. 상기 고체상 지지체 물질은 시판중이다.

지지체는 절단가능한 결합을 함유하는 소위 연결자 기에 의해 보호기 예컨대 DMT(디메톡시트리틸)에 의해 보호된 종결 반응성 히드록실 잔기에 결합될 수 있다. 절단가능한 결합을 갖는 연결자 기는 3 작용성 스페이서와 고체상 지지체 물질 사이에 있고, 간단한 화학 반응에 의해 절단될 수 있는 기를 의미한다. 이는 숙시닐 또는 옥살릴 또는 기타 절단가능한 에스테르 결합을 함유하는 연결자 기일 수 있다. 기타 연결자 기는 당업자에게 공지되어 있다 (Ghosh, P. K., et al., J. Indian. Chem. Soc. 75 (1998) 206-218).

상기 연결자 기는 합성 완료 후 수용액 내에 존재할 것이 의도되는 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위한 지지체 물질의 용도에 필수적이다. 만약, 반대로 핵산 배열 제조에 있어서 올리고뉴클레오티드가 지지체 물질의 표면 상에 합성후 남아있어야 한다면(US 5,624,711; Shchepinov, M.S., et al., Nucl. Acids. Res. 25 (1997) 1155-1161), 절단가능한 연결자 기는 불필요하나 오히려 절단불가능한 연결자 기가 바람직하다.

본 발명에 따른 구조의 결합을 위한 올리고뉴클레오티드 합성의 상세는 하기와 같다:

사슬 연장이 3' - 5' 방향으로 일어날 수 있는 반응성 히드록실기는 산 처리에 의해 DMT 보호기를 제거한 후 형성된다. 이후 DMT 보호기가 역시 제공된 (데옥시) 리보뉴클레오시드의 3' 포스포라미디트 유도체가 테트라졸의 존재 하에 DMT 보호기가 제거된 각각의 반응기에 5' 말단에서 연속적으로 커플링된다. 3가 인 원자를 함유한 중간체가 상기 과정에서 중간 생성물로서 형성되고, 이는 반응에 의해 함께 연결된 각각의 뉴클레오시드와 에스테르 결합을 형성하고, 사용된 포스포라미디트 내에 이미 존재하는 보호된 히드록실기와 세번째 에스테르 결합을 형성한다. 예를 들어 베타-시아노에틸, 메틸, 알릴 또는 실릴에 의해 형성될 수 있는 상기 보호기는, 올리고뉴클레오티드의 합성 완료 후 암모니아에 의해 연속적으로 절단되며, 이 과정에서 염기 보호기 및 CPG 에 대한 연결자도 또한 끊어진다.

요오드의 도움에 의한 산화 대신, 신생 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 따라 하기 구조를 갖는 아지드와 인산염 모방체가 뉴클레오티드 사슬에 도입되는 위치에서 반응된다:

N₃ - SO₂ - 벤졸 - L - M - X

M 은 - NH -, - O -, 및 - S - 로 이루어진 군에서 선택되고,

X 는 보호기 또는 탐지가능한 단위체임을 특징으로 한다).

특히, X 가 보호기인 경우, X 는 올리고뉴클레오티드 합성 후 제거될 수 있고, 반응성 탐지가능한 단위체에 의한 올리고뉴클레오티드의 합성후 표지가 당 기술분야에서 공지된 바와 같이 수행될 수 있다.

바람직하게는, 그러나, X 는 탐지가능한 단위체, 예를 들면 형광 분자이고, 이처럼 신생 올리고뉴클레오티드의 표지는 포스포라미디트계 올리고뉴클레오티드 합성 중에 이미 발생한다.

본 발명의 특정 구현예는 이중 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 제조에 관한 것으로서, 여기서 표지가 바람직하게는 본 방법 발명에 따라 올리고뉴클레오티드에 내부적으로 도입되고 또다른 표지가 올리고뉴클레오티드에 바람직하게는 5' 또는 3' 말단에 선행기술에서 공지된 방법에 따라 도입된다.

5'-종결 뉴클레오티드의 리보오스의 5' 위치에서 5' 표지의 경우, 올리고뉴클레오티드 합성 마지막에 염료-표지된 포스포라미디트를 이용하는 종래의 방법에 의해 결합이 수행된다(Beaucage, S. L., Methods in Molecular Biology 20 (1993) 33-61 , S. Agrawal Publishers).

트리틸화 히드록실기에 더하여 탐지가능한 표지를 이미 함유하는 시판 중인 CPG 를 반응성 고체 상 지지체로서 이용하여 3' 말단에서 표지가 수행된다. DMT 보호기의 절단 후 표준 올리고뉴클레오티드 합성이 이제 유리된 히드록실기에서 시작될 수 있다.

대안적으로 선행 기술에서 공지된 후-표지(post-labelling) 방법이 추가적인 5' 또는 3' 표지에 이용될 수 있다(US 5,002,885; US 5,401,837).

본 발명은 또한 표준 올리고뉴클레오티드 합성 전에 제조될 수 있는 본 발명에 따른 합성의 중간체에 관한 것이다. 이 경우 고체상에 여전히 결합되어 있고 아직 탈보호되지 않고 염기가 결여된(abasic) 스페이서 기를 함유할 수 있는 중간체가 바람직하다. 당업자에게 인산염 CPG 로서 잘 알려진 CPG 가 바람직하게는 제조에 이용되는데, 이는 3' 포스포릴화 올리고뉴클레오티드가 올리고 합성후 형성되기 때문이다. 탈트리틸화(detritylation) 후 상기 인산염 CPG 는 스페이서 포스포라미디트와 활성제의 존재 하에 반응한다: 형성된 3가 인 중간체는 이후 상기 N₃ - SO₂ - 벤졸 - L - M - X 와 반응되며, 여기서 X 는 탐지가능한 단위체이다. 상기 합성 중간체들은 저장되어, 보편적 3' 표지를 위한 3 작용성 CPG 와 같이 이용될 수 있다.

3가 인 중간체가 또한 메틸 포스포네이트의 합성 중에 형성되고, 이는 본 발명에 따라 아지드와 반응할 수 있다. 메틸 포스포라미디트도 또한 시판된다.

표준 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 특히 유사체 예를 들면 N3'- >P5' 올리고뉴클레오티드의 합성에 이용되는 역(inverse) 합성 전략(EP 1 155 027)에서, 3가 인을 함유하는 중간체가 또한 형성되며, 이는 본 발명에 따라 본 발명에 따른 아지드와 반응될 수 있다. 상응하는 포스포라미디트가 시판된다.

본 발명에 따른 표지 시약에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드

본 발명에 따른 합성 전략은 인산염 백본 상에서 변형된 매우 다양한 올리고뉴클레오티드의 제조를 허용한다. 변형의 정도, 다양성 및 변형의 전하는 목적하는 용도에 따라 결정된다.

본 발명은 하기 구조를 하나 이상 함유하는 임의의 화학적 화합물을 포함한다:

(식 중,

A 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 5' 말단 또는 OH 를 나타내고,

B 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 3' 말단 또는 OH 를 나타내고,

Acc 는 - SO₂ - 벤졸 - L - M - X 를 나타내며, 여기서

L 은 바람직하게는 - NH - CO - 폴리에틸렌글리콜 또는 -NH - CO - (CH₂)n (n 은 1 과 18 사이의 자연수임)인 연결자이고,

M 은 - NH -, - O -, 및 - S - 로 이루어진 군에서 선택되고,

X 는 보호기 또는 탐지가능한 단위체임을 특징으로 한다).

올리고뉴클레오티드의 -OH 기가 통상 탈양성자화 상태로 존재한다는 것이 당업자에게 이해된다.

더욱이 본 발명은 또한 하기 구조를 갖는 메틸 포스포네이트를 포함한다:

올리고뉴클레오티드의 목적된 용도에 따라서, 상기 구조는 한번, 두번, 여러번 또는 심지어 올리고뉴클레오티드 내에 존재하는 모든 인산염 잔기 상에서 나타날 수 있다. 올리고뉴클레오티드 내의 인산염 잔기는 소위 뉴클레오시드간 인산염이며, 여기서

A 는 첫번째 뉴클레오시드의 5' 말단을 나타내고,

B 는 뉴클레오티드 사슬 내의 두번째 뉴클레오시드의 3' 말단을 나타낸다.

또한 본 발명에 따른 구조는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단에 존재할 수 있다. 만약, 그들이 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 존재하는 경우,

A 는 뉴클레오티드 사슬의 5' 말단을 나타내고,

B 는 히드록실기 또는 임의로 탐지가능한 기 또는 또다른 반응기를 함유할 수 있는 연결자이며, 올리고뉴클레오티드 상에서 탐지가능한 기를 합성하는 데 이용될 수 있다.

전자 수용체가 탐지가능한 단위체를 또한 나타내는 치환기를 함유하는 경우, 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 따라 5' 말단에 이중 표지를 갖는다. 본 발명에 따른 구조가 뉴클레오티드 사슬의 3' 말단에 있는 경우,

B 는 상기 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 나타내고

A 는 히드록실 또는 고체상에 결합된 연결자이며, 여기서 고체상은 바람직하게는 상용 올리고뉴클레오티드 합성에 개시물질로서 이용되는 것과 같은 제어된 세공 유리 입자이다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 내의 각각의 뉴클레오시드는 임의의 유형의 뉴클레오시드 또는 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유도체를 함유할 수 있다. 당 단위체는 통상 DNA 올리고뉴클레오티드에 대한 데옥시리보오스 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 대한 리보오스이다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 내에 함유된 핵염기(nucleobase)는 자연적으로 존재하는 염기 예컨대 아데닌, 구아닌, 티미딘, 시티딘, 우리딘, 이들의 유도체 또는 소위 보편적 염기 예컨대 니트로인돌일 수 있다.

본 발명에 따른 표지 시약으로 표지된 올리고뉴클레오티드는 분자 생물학에서의 수많은 다른 적용 예컨대 실시간 PCR 에서 유리하게 이용될 수 있다. 탐지가능한 표지는 바람직하게는 형광 염료 또는 형광 소광(quencher) 분자이다. 올리고뉴클레오티드에 대한 탐지가능한 단위체의 역할을 하는 상응하는 염료 및 분자는 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 보호 범위를 한정하지 않는 이들의 예는: 플루오레세인, 로다민, 시아닌, 메로시아닌, 카르보시아닌 및 아조 및 폴리-아조 화합물이다.

본 발명에 따른 표지 시약은, 상기 구조를 가지고 하나 이상의 형광 표지가 올리고뉴클레오티드 사슬의 인산염 원자에 아미드/전자 수용체 기에 의해 결합되어 있는, 실시간 PCR 탐침을 합성하는 데 이용될 수 있다. 이런 탐침의 예는 FRET 혼성화 탐침 (WO 97/46707) 또는 소위 단일-표지된 탐침 (WO 02/14555)이다. 이와 관련하여 본 발명에 따른 내부 변형이 뉴클레오시드간 인산염 잔기 상에 존재하는 올리고뉴클레오티드 탐침이 특히 바람직하다.

이와 관련하여 본 발명에 따른 표지 시약은 2 개의 탐지가능한 단위체를 갖는 이중 표지된 올리고뉴클레오티드를 제조하는 데 특히 유용하다. 이런 탐침의 예는 TaqMan 탐침(US 5,804,375) 분자비콘(molecular beacon)(US 5,118,801)이다. 이와 관련하여 본 발명은, 첫번째 형광 표지가 올리고뉴클레오티드 사슬의 뉴클레오시드간 인산염 원자에 아미드/전자 수용체 기에 의해 결합되어 있고, 두번째 탐지가능한 단위체가 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단의 끝에 존재하는, 이중 표지된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기 표지를 갖는 분자 및 그의 제조 방법은 전문가들 사이에 공지되어 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 자세히 설명되고, 본 발명의 보호 범위는 특허 청구항에서 유래한다. 기술된 방법은 본 발명의 목적을 변경 후에도 여전히 기술하는 실시예로서 이해되어야 한다.

하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구항에서 진술된다. 진술될 과정에서 본 발명의 정신에서 벗어나지 않은 채 변경이 가해질 수 있음이 이해된다.

실시예 1: 4- 아미노벤젠술포닐 아지드 ( DE 2919823 에 따름)

2.0 g (8 mmol)의 p-아세틸아미노벤조일술포닐아지드를 4.0 g (3.4 mL)의 32% 염화 수소와 함께 교반하고 95 ℃까지 20 분 내에 가열했다. 맑은 용액이 형성되었다. 실온으로 냉각시킨 후, 히드로클로리드 침전물을 여과로 분리했다. 결정을 20 ml 의 물 중에 용해시키고 포화 탄산 나트륨 용액을 첨가한 후 수상을 디클로르메탄으로 3회 추출했다. 배합된 유기상을 물로 세정하고 황산 나트륨으로 건조시켰다. 용매를 제거한 후 생성된 담적색 오일을 밤새 칼슘 클로리드 상에서 진공하에 건조시켜 1.04g (66%)의 미정제 생성물을 산출했다.

플라스틱 판 상의 TLC 실리카 (톨루엔:에틸아세테이트:메탄올=4:1:1) Rf(생성물)=0.63,

실시예 2: (2,2,2- 트리플루오로 - 아세틸아미노 )- 헥사노일 클로리드

735 mg (3 mmol)의 (2,2,2-트리플루오로-아세틸아미노)-헥산산을 5 mL 의 건조된 디클로로메탄 중에 용해시키고 아르곤 유동 하에 0 ℃에서 교반했다. 그후, 0.6 mL (6.6 mmol)의 옥살릴 클로리드를 0 ℃에서 적가하고, 몇 방울의 건조된 디메틸포름아미드를 또한 적가하여 가스 발생 및 백색이었던 혼합물의 황변을 초래했다. 혼합물을 실온에서 70 분 동안 교반했다. 그후 혼합물을 디클로로메탄으로 반복적으로 증발시켰다. 미정제 생성물을 다음 단계에서 직접 사용했다.

실시예 3: 4-[6-(2,2,2- 트리플루오로 - 아세틸아미노 )- 헥사노일아미노 ]- 벤젠술포닐 아지드

5 mL 의 디메틸포름아미드 중에 용해된 0.57 g (3 mmol)의 파라-아미노-벤젠술포닐 아지드에 0.9 mL (6 mmol)의 트리에틸아민을 첨가한 후, 10 mL 의 디메틸포름아미드에 용해된 (2,2,2-트리플루오로-아세틸아미노)-헥사노일 클로리드를 적가했다. 혼합물이 갈색으로 변했고 아르곤 하에 24 시간 동안 교반했다. 용매를 증발시키고, 잔류하는 오일을 10 mL 의 디클로로메탄 중에 용해시키고 실온에 서 1 시간 동안 놔뒀다. 침전물을 여과시키고 용액을 증발시켜 1.10 g 의 미정에 오일을 산출했다. 수득된 화합물을 올리고뉴클레오티드 합성에 직접 사용했다.

실시예 4: 아미노-변형된 올리고뉴클레오티드의 합성

올리고뉴클레오티드 합성을 1 μmol 척도로 ABI 394 합성기(synthesizer) 상에서 실시했다. 시판되는 Phosphate CPG (Glen Reserach)를 지지체 물질로서 사용했다. 표준 합성을 위한 모든 다른 화학물질들을 Glen Research 로부터 입수했다. Proligo 로부터의 tert.부틸페녹시-아세틸 보호기("tac" 또는 "Expedite" 단량체로 알려짐)를 갖는 포스포라미디트를 사용했다.

표준 프로토콜(protocol)을 합성에 이용했다. 오직 마지막 합성 사이클에서, 산화제를 4-[6-(2,2,2-트리플루오로-아세틸아미노)-헥사노일아미노]-벤젠술포닐 아지드의 무수 아세토니트릴 중 0.1 M 용액으로 교체하고, "산화" 시간을 16 분으로 연장했다.

생성물을 지지체로부터 15 시간 동안 55 ℃에서 33 % 암모니아로 절단하고 역 상 크로마토그래피에 의해 Poros Oligo R3 4.6 x 50 mm 칼럼 상에서 정제했다. 크로마토그래피: 완충액 A: 물 중의 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 pH 6.8, 완충액 B: 물/아세토니트릴 1:1 중의 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트, 기울기 2 분 0 % B 에서 100 % B 45 분 동안. 용리액의 UV 흡수를 260 nm에서 측정했다. 아미노 변형된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 주 분획을 수득했다. 용매를 진공 원심분리기 상에서 제거했다.

MALDI: 계산치: 11436.7 실측치 11435.6

실시예 5: LightCycler Red 640 에 의한 후표지

잔기를 1 ml 의 0.1 M 소듐 보레이트 완충액 (pH=8.5) 중에 녹였다. 1 mg LightCycler Red 640 NHS 에스테르(Roche Applied Science)의 1000 μl DMF 중 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 밤새 놔뒀다. 상기와 동일한 조건 하에 혼합물을 증발시키고 정제했다. 검출기로서, 다이오드 어레이(diode array)를 사용하고, 260 및 625 nm에서 검출을 수행했다.

두 개의 흡수를 보이는 분획을 수집하여 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 bidest. 물 중에 용해시키고 진공에서 다시 증발시켰다. 잔류물을 그후 bidest. 물 중에 용해시키고 동결건조시켰다.

MALDI: 계산치: 12438.35 실측치: 12435.5

실시예 6: N- 단실 3 아미노 프로파노일 클로리드

970 mg (3 mmol)의 단실 베타 알라닌을 5 mL 의 건조된 디클로로메탄 중에 용해시키고 아르곤 유동 하에 0 ℃에서 교반했다. 그후 0.6 mL (6.6 mmol)의 옥살릴 클로리드를 0 ℃에서 적가하고, 이어서 몇방울의 건조된 디메틸포름아미드를 첨가하여 기체 발생을 초래했다. 혼합물을 실온에서 100 분 동안 교반했다. 용매를 회전식 증발기를 이용하여 제거한 후 잔류물을 디클로로메탄으로 2회 증발시켰다. 미정제 생성물을 직접 다음 단계에서 사용했다.

실시예 7: N- 단실 (3 아미노프로파노일 ) 벤젠술포닐 아지드

5 mL의 디메틸포름아미드 중에 용해된 152 mg (0.8 mmol)의 파라-아미노-벤젠술포닐 아지드에 0.11 mL (6 mmol)의 트리에틸아민을 첨가한 후, 10 mL의 디메틸포름아미드 중에 용해된 0.5 mmol의 N-단실 3 아미노프로파노일 클로리드를 적가했다. 혼합물을 아르곤 하에 24 시간 동안 교반했다. 용매를 증발시키고, 잔류 오일을 크로마토그래피에 의해 실리카 상에서 정제했다(용리액 톨루올/아세트산에틸에스테르 1:1). 생성물을 함유하는 분획을 수집하고 용액을 증발시켰다.

Claims

하기 화학적 구조를 갖는 시약:

N₃ - SO₂ - 벤졸 - L - M - X

(식 중,

L 은 바람직하게는 - NH - CO - 폴리에틸렌글리콜 또는 -NH - CO - (CH₂)n (n 은 1 과 18 사이의 자연수임)인 연결자이고,

M 은 - NH -, - O -, 및 - S - 로 이루어진 군에서 선택되고,

X 는 보호기 또는 탐지가능한 단위체임을 특징으로 한다).
제 1 항에 있어서, X 가 DMT, TFA, Fmoc, 및 S-C₁ _-6-알킬로 이루어진 군에서 선택되는 시약.
제 1 항에 있어서, X 가 형광 화합물인 시약.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 화합물의 바람직하게는 외가닥 올리고뉴클레오티드인 핵산을 변형시키기 위한 용도.
제 4 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 외가닥 올리고뉴클레오티드를 변형 시키기 위한 용도:

- 3' 포스포라미디트를 신생 올리고뉴클레오티드 사슬의 5' OH 말단과 반응시키는 단계,

- 제 1 항에 따른 시약과 반응시키는 단계.
하기 화학식:

N₃ - SO₂ - 벤졸 - NH₂

을 갖는 화합물을 하기 화학식을 갖는 활성화된 카본산과 반응시키는, 제 1 항에 따른 시약의 제조 방법:

A - CO - L - M - X

(식 중, L 은 바람직하게는 - (CH₂)n - 또는 폴리에틸렌글리콜인 연결자이고,

M 은 - NH -, - O -, - S - 로 이루어진 군에서 선택되고,

X 는 보호기 또는 탐지가능한 단위체이고,

A 는 클로리드, 무수물 및 N-히드록시-숙신이미드로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 한다).
하기 화학식:

N₃ - SO₂ - 벤졸 -(CH₂)n - COCl (n 은 0 또는 1 과 10 사이의 자연수임)

을 갖는 화합물을 하기 화학식을 갖는 화합물과 반응시키는, 제 1 항에 따른 시약의 제조 방법:

NH₂ - (CH₂)m - M - X

(식 중, m 은 0 또는 1 과 10 사이의 자연수이고,

M 은 - NH -, - O -, - S - 로 이루어진 군에서 선택되고,

X 는 보호기 또는 탐지가능한 단위체임을 특징으로 한다).