BRPI0618855A2 - reagente de marcação de polinucleotìdeo - Google Patents
reagente de marcação de polinucleotìdeo Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0618855A2 BRPI0618855A2 BRPI0618855-9A BRPI0618855A BRPI0618855A2 BR PI0618855 A2 BRPI0618855 A2 BR PI0618855A2 BR PI0618855 A BRPI0618855 A BR PI0618855A BR PI0618855 A2 BRPI0618855 A2 BR PI0618855A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- group
- oligonucleotide
- synthesis
- nucleotide
- reagent
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C247/00—Compounds containing azido groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B62/00—Reactive dyes, i.e. dyes which form covalent bonds with the substrates or which polymerise with themselves
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
REAGENTE DE MARCAçãO DE POLINUCLEOTìDEO. A presente invenção refere-se a um novo reagente de marcação para preparação de oligonucleotídeos modificados e processos para sua produção em que estes oligonucleotídeos contêm pelo menos uma vez a estrutura P=N-SO~2~-benzol-L-M-X, caracterizado em que L é -(CH~2~)n- ou polietilenoglicol, M é selecionado de um grupo consistindo em -NH-, -O-, -S-, e -COO-, e X é um grupo de proteção ou uma unidade detectável. L é preferivelmente -(CH~2~)n- ou polietilenoglicol.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "REAGENTE DE MARCAÇÃO DE POLINUCLEOTÍDEO".
A presente invenção refere-se a novas substâncias e processos para produção das mesmas no campo de química de nucleotídeos. Estas substâncias são assim chamadas miméticos de fosfato em que um grupo hidroxila é substituído por um correspondente mimético.
Em particular, a presente invenção refere-se a um reagente de marcação para preparação de uma nova classe de oligonucleotídeos modifi- cados.
ESTADO DA TÉCNICA
Vários processos são conhecidos na técnica para a síntese de nucleotídeos ou oligonucleotídeos com uma metade fosfato modificada.
Oligonucleotídeos sintéticos (Desóxi)são usualmente preparados sobre uma fase sólida com o auxílio de química fosforamidito. Pérolas de vidro com poros de um tamanho definido são usualmente usadas como a fase sólida (abreviada no seguinte como CPG = vidro de poro controlado). O primeiro monômero é ligado ao suporte através de um grupo clivável de mo- do que o oligonucleotídeo livre pode ser clivado após término da síntese de fase sólida. Em adição, o primeiro monômero contém um grupo hidroxila pro- tegido em cujo caso dimetoxitritila (DMT) é usualmente usado como o grupo protetor. O grupo protetor pode ser removido através de tratamento ácido. Então, na extremidade 5' derivados de 3'-fosforamidito de (desóxi) ribonu- cleosídeos que também são providos com um grupo protetor DMT são su- cessivamente acoplados ao grupo reativo que é liberado em cada caso do grupo protetor DMT em um processo cíclico. Alternativamente, 5'- fosforamiditos protegidos com 3'-dimetoxitritila são usados em síntese de oligonucleotídeo inversa. A estratégia H-fosfonato é também usada em parti- cular para introduzir modificações sobre a cadeia principal fosfato, por e- xemplo, para preparar fosforotioatos marcados com rádio. Várias estratégias também já são conhecidas para preparação de oligonucleotídeos marcados ou modificados: materiais suporte trifuncionais são usados de acordo com a técnica anterior para preparação de oligonucleotídeos marcados na extremi- dade 3' (US 5 290 925, US 5 401 837). Fosforamiditos marcados nos quais o grupo de marcação está ligado ao fosforamidito via um Iigante C3-12 são usualmente usados para preparação de oligonucleotídeos marcados na ex- tremidade 5' (US 4 997 928, US 5 231 191). Além disso, modificações po- dem ser introduzidas em oligonucleotídeos sobre as bases individuais (US 5 241 060, US 5 260 433, US 5 668 266), ou através de introdução de Iigantes não-nucleosídeos internos (US 5 656 744, US 6 130 323).
Alternativamente, um internucleosídeo fosfato pode ser marcado através de marcação pós-sintética de fosforotioatos (Hodges, R.R., et al., Biochemistry 28 (1989) 261-7) ou através de pós-marcação de um fosfora- midito funcionalizado (Agrawal, S., Methods in Mol. Biology 26 (1994) Proto- cole for Oligonucleotide Conjugates, Chapter 3, Humana Press, Totowa, NJ). Entretanto, estes processos não ganharam aceitação devido à instabilidade dos fosforamiditos e tioésteres de ácido fosfórico.
Também é conhecido da técnica anterior que modificações po- dem ser introduzidas sobre o resíduo fosfato internucleosídeo de oligonucle- otídeos. Nos casos mais proeminentes destes estão fosfotioatos (Burgers, P.M., and Eckstein, F., Biochemistry 18, (1979) 592-6), metilfosfonatos (Mil- ler, P.S., et al., Biochemistry 18 (1979) 5134-43) ou boranofosfatos (WO 91/08213). Monômeros especiais têm de ser sintetizados de modo a prepa- rar metilfosfonato oligonucleotídeos. Em contraste fosforamiditos convencio- nais ou H-fosfonatos podem ser usados para síntesizar de fosforotioatos e boranofosfatos em cujo caso a modificação borano ou tio pode ser introduzi- da diretamente durante ou também após síntese de oligonucleotídeo através de uso de reagentes especiais que reagem com o H-fosfonato ou com o tri- éster de ácido fosfônico. Embora todos estes processos conduzam a oligo- nucleotídeos modificados, os requisitos da química de síntese usada para isto não permitem marcadores que podem ser detectados desta maneira ou grupos funcionais a serem diretamente introduzidos sobre a cadeia principal fosfato da cadeia de oligonucleotídeo durante síntese de oligonucleotídeo.
Baschang, G., and Kvita, V., "AngewandteChemie" 85(1) (91973) 43-44 descreve a reação de um triéster de ácido fosfórico nucleotídeo com azidas como metil sulfonil azida para preparar tri-alquil (aril) imidofosfatos que são, entretanto, instáveis e decompossíveis.
Nielsen, J., and Caruthers, M.H., J. Am. Chem. Soe. 110 (1988) 6275-6276 descreve a reação de desoxinucleosídeo fosfitos providos com um grupo protetor 2-ciano-1,1-dimetiletila na presença de alquil azida. Além disso, o autor sugere que este princípio é apropriado para preparação de nucleotídeos que são modificados sobre o resíduo fosfato sem elucidação de que tipos de modificações preparadas com o auxílio do processo descrito podem ter vantagens particulares. Em particular, os autores sugerem a in- tradução de resíduos alquila.
WO 89/09221 descreve os N-alquil fosforamiditos ou antes oli- gonucleotídeos substituídos com N-alquila sobre pelo menos um resíduo fosfato que são preparados através de oxidação de nucleosídeos fosfitos (providos com um grupo protetor) com iodo na presença de apropriadas al- quilaminas.
WO 03/02587 descreve a preparação de oligonucleotídeos modi- ficados em que H-fosfatos são convertidos por aminação em fosforamidatos.
Assim, todas essas publicações descrevem a preparação de mo- léculas que contêm um fosforamidato ao invés de um resíduo fosfato. Entre- tanto, moléculas contendo fosforamidato são suscetíveis a hidrólise uma vez que o grupo amina é protonado em um ambiente ácido e é então substituído por água.
Em adição, WO 01/14401 propõe blocos de construção de nu- cleotídeo ou oligonucleotídeos em que um resíduo fosfato é substituído com N-CIO3, N-NO2 ou N-SO2R- De acordo com os ensinamentos do WO 01/14401, tais substâncias podem ser preparadas através de reação de gru- po hidroxila livre de um desóxi nucleosídeo com cloreto de amidofosfonila na presença de piridina. Entretanto, este tipo de preparação é complicado, con- sumidor de tempo, e impróprio para a síntese rotineira de nucleotídeos ou oligonucleotídeos.
A preparação de azidas Acc como acil azidas e sulfonil azidas é simples e conhecida por muito tempo (Revisão: Brâse, S., et al., Angewandt Chemie 117 (2005) 5320-5374, 3.4 e 3.5.2). Elas são preferivelmente prepa- radas a partir de cloretos de acila ou cloretos de sulfonila usando azidas de sódio ou a partir de hidrazidas usando ácido nitroso.
Corantes sulfonil azidas são, por exemplo, também usados em processos de tingimento (por exemplo, DE 19650252). Cianogênio azida pode ser produzida simplesmente através de reação de azida sódica com bromocianogênio em acetonitrila (McMurry, J.E., et al., J. Organic Chemistry 38(16) (1973) 2821-7). Heteroaril azidas podem ser preparadas através de substituição nucleofílica de um halogênio com azida ou a partir de heteroaril hidrazinas. Um pré-requisito é que o nitrogênio de atração de elétrons esteja na posição para ou orto em relação ao grupo azido uma vez que somente então é formado um fosfato mimético estabilizado com ressonância. Orto e para N-alquil piridínio azidas são particularmente apropriadas neste sentido. Algumas acil, sulfonil e piridil azidas também são comercialmente disponí- veis.
O objetivo técnico formando as bases da presente invenção foi assim prover aperfeiçoados oligonucleotídeos marcados e prover reagentes de marcação que podem ser usados dentro de um processo simples para sua preparação.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Assim, a presente invenção é direcionada a um reagente tendo a estrutura química
N3-S02-benzol-L-M-X, caracterizada pelo fato de que
L é um Iigante que é preferivelmente tanto -NH-CO- polietilenoglicol, como -NH-CO-(CH2)n com η sendo um número natural en- tre 1 e 18.
M é selecionado de um grupo consistindo em -NH-, -O-, e -S-, e X é um grupo protetor ou uma unidade detectável.
Em uma modalidade, X é selecionado de um grupo consistindo em DMT, TFA, Fmoc e S-alquila, em que alquila é uma cadeia de 1-6 áto- mos de carbono. Alternativamente, X é um composto de marcação tal como um composto fluorescente. Em um segundo aspecto, a presente invenção é direcionada ao uso de um composto com X como um grupo de proteção como descrito aci- ma para modificação de um ácido nucléico que é preferivelmente um oligo- nucleotídeo de fita única. Em uma modalidade preferida, uma tal modificação compreende etapas de
- reagir um 3' fosforamidito com a extremidade 5' OH de uma cadeia de oligonucleotídeo nascente, e
- reagir intermediário com um reagente como descrito acima.
Em um terceiro aspecto, a presente invenção é direcionada a um processo para preparação de um reagente como descrito acima, caracteri- zado pelo fato de que
um composto tendo a fórmula química
N3-SO2-benzol-NH2
é reagido com um ácido carbônico ativado tendo a fórmula
A-CO-L-M-X
em que
L é um ligante que é preferivelmente tanto -(CH2)n- com η sen- do um número natural entre 1 e 18, ou polietilenoglicol,
M é selecionado do grupo consistindo em -NH-, -O-, e -S-,
X é tanto um grupo protetor como uma unidade detectável,
e A é selecionado de um grupo consistindo em cloreto, anidrido, e N-hidróxi-succinimida.
Alternativamente, um tal reagente pode ser sintetizado de acor- do com a invenção através de meios de reação de um composto tendo a fórmula química
N3-S02-benzol-(CH2)n-C0Cl com η = 0-6
com um composto tendo a fórmula
NH2-(CH2)m-M-X caracterizado pelo fato de que
m é 0 ou um número natural entre 1 e 10,
M é selecionado de um grupo consistindo em -NH-, -O-, -S-, e
X é um grupo protetor ou uma unidade detectável.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO IDÉIA FUNDAMENTAL DA INVENÇÃO
O objetivo da presente invenção é prover reagentes de marca- ção que podem ser usados para produção de oligonucleotídeos em uma maneira simples os quais contêm resíduos fosfato modificados e assim tam- bém podem ser preferivelmente marcadores detectáveis.
A idéia central da presente invenção foi iniciar com um átomo de fósforo trivalente e reagir o mesmo com um reagente em uma maneira tal que um fosfato mimético estável seja formado. De acordo com a invenção, um átomo de fósforo contendo pelo menos um resíduo hidroxila que é provi- do com um grupo protetor é para este propósito reagido com uma azida ten- do a estrutura N=N=N-Acc em que Acc é um aceptor de elétrons ou um a- ceptor de elétrons substituído com um resíduo R e R é qualquer substituinte orgânico. Isto resulta na formação de um átomo de fósforo pentavalente ao qual um grupo aceptor de elétrons atraindo fortemente elétrons é covalente- mente ligado via um átomo de N. Este grupo assegura que os compostos produzidos desta maneira são, em contraste aos compostos fosforamidato conhecidos da técnica anterior, estabilizados por ressonância e não são suscetíveis a hidrólise.
Esta idéia subjacente à invenção pode ser aplicada a todos os processos nos quais um fósforo trivalente é formado como intermediário.
Durante síntese convencional de oligonucleotídeo usando fosfo- ramiditos, triésteres de ácido fosfônico com um átomo de fósforo trivalente são formados como produtos intermediários. A primeira e segunda ligação éster representam a ligação internucleosídeo. O átomo de fósforo está ligado a um grupo hidroxila protegido tal como, por exemplo, a um grupo betacia- noetilóxi via a terceira ligação éster. Ao invés de uma oxidação com iodo, o oligonucleotídeo nascente então pode ser reagido de acordo com a invenção com uma azida apropriada no processo do qual o átomo de fósforo trivalente é oxidado a um átomo penta - valente através de ligação covalente de -N- Acc ao átomo de fósforo enquanto clivando nitrogênio.
Síntese de oligonucleotídeo então pode ser subseqüentemente continuada como conhecido da técnica anterior. Oligonucleotídeos estáveis são obtidos como um produto final os quais são modificados em quase qual- quer maneira sobre um ou mais resíduos de fosfato de internucleotídeo. DEFINIÇÕES
Dentro do escopo da presente invenção alguns dos termos são definidos como se segue:
Grupo reativo refere-se a grupos de uma molécula que são ca- pazes de reagirem sob apropriadas condições com uma outra molécula en- quanto formando uma ligação covalente. Exemplos de grupos reativos são grupos hidroxila, grupos amino, tiol, hidrazino, hidroxilamino, dieno, alquino e grupos ácido carboxílico.
Grupo protetor representa moléculas que reagem com um ou mais grupos reativos de uma molécula de modo que, como parte de uma reação de síntese multietapas, somente um grupo reativo não-protegido, particular, pode reagir com o desejado parceiro de reação. Exemplos de grupos protetores freqüentemente usados para proteção de grupos hidroxila são beta-ciano-etila, beta-cianometila, trialquilsilila e alila. Grupos protetores para proteção de grupos amino são trifluoroacetila e Fmoc. Outros possíveis grupos protetores são resumidos em livros textos padrões (Greene, T.W., Protective groups in organic synthesis, Wiley Interscience Publications, John Wiley & Sons (1981) New York, Chichester, Brisbane, Toronto; Souveaux, E., Methods in Mol. Biology 26 (1994) Protocols for Oligonucleotide Conjuga- tes, Humana Press, Totowa, NJ, Chapter 1, ed. S. Agrawal).
Ligantes são definidos como cadeias de carbono tendo um com- primento de 0-40 átomos de C. Tais cadeias Iigadoras adicionalmente tam- bém podem ter um ou mais átomos de nitrogênio, oxigênio, enxofre e/ou fós- foro internos. Ligantes também podem ser ramificados, por exemplo, tam- bém serem dendríticos. Ligante interliga um nucleotídeo ou uma cadeia de nucleotídeos com uma unidade detectável ou um grupo reativo que está op- cionalmente protegido por um grupo protetor.
No contexto da presente invenção, um Iigante preferivelmente tem pelo menos 6 átomos. Também preferivelmente, a cadeia é composta de átomos de C, que podem conter até 20 heteroátomos. Em modalidades particulares, um tal Iigante pode compreender uma ou mais das seguintes estruturas:
<formula>formula see original document page 9</formula>
Uma unidade detectável é entendida representar substâncias que podem ser detectadas com o auxílio de processos analíticos. Elas po- dem ser, por exemplo, unidades que podem ser detectadas por espectros- copia de massa, imunologicamente, ou com o auxílio de NMR. Unidades detectáveis também são em particular substâncias que podem ser detecta- das através de processos óticos como fluorescência e espectroscopia de UWVIS tais como fluoresceínas, rodaminas e partículas de ouro. Elas tam- bém incluem intercaladores e aglutinantes de ranhura menores que também podem ter um efeito sobre o comportamento de fusão e cuja fluorescência é alterada por hibridização.
Fosforamiditos representam moléculas contendo um átomo de fósforo trivalente que pode ser acoplado à extremidade terminal 5' de um nucleosídeo ou derivado de nucleosídeo. Assim, fosforamiditos podem ser usados em síntese de oligonucleotídeo. Em adição a (desóxi) ribonucleotí- deo fosforamiditos que são usados para extensão de cadeia, existem tam- bém fosforamiditos derivados com um marcador que podem ser usados em processos similares durante ou no final de síntese de oligonucleotídeo para marcar o oligonucleotídeo (Beaucage, S.L., Methods in Molecular Biology 20 (1993) 33-61, ed. S. Agrawal; Wojczewski, C., et ai-, Synlett 10 (1999) 1667- 1678).
Em conexão com a presente invenção, o termo "oligonucleotí- deos" abrange não somente (desóxi) oligorribonucleotídeos mas também oligonucleotídeos que contêm um ou mais análogos de nucleotídeo com modificações sobre a cadeia principal fosfato (tais como, por exemplo, fosfo- natos de metila, fosfotioatos), sobre o açúcar (tais como derivados de 2'-0- alquila, 3' e/ou 5' aminorribose, LNA, HNA, TCA) ou bases modificadas co- mo 7-desazapurina. Neste sentid.o a invenção também abrange conjugados e quimeras contendo análogos não-nucleosídicos como PNAs ou outros bio- polímeros, por exemplo, peptídeos. Além disso, os oligonucleotídeos de a- cordo com a invenção também podem conter uma ou mais unidades não- nucleosídicas tais como espaçadores em cada posição, por exemplo, espa- çadores hexaetileno glicol ou Cn (n = 3,6).
O termo "aceptor de elétrons" abrange estruturas atômicas que têm a tendência de atraírem pares de elétrons livres. Uma medida disto é a constante Hammett. A presente invenção refere-se em particular a modali- dades em que a constante Hammett σρ excede um certo valor de 0,30, pre- ferivelmente 0,45 e particularmente preferivelmente 0,60.
O aceptor de elétrons adicionalmente tem de ser compatível com todas as reações químicas em síntese de oligonucleotídeos, isto é,
- ele não deve ser oxidado por iodo
- ele tem de ser inerte para ácido dicloroacético e ácido tricloroacético e
- ele tem de ser inerte para bases e em particular para amônia e
- ele não deve reagir com fosforamidatos trivalentes.
Exemplos de aceptores de elétrons que satisfazem estas condições são:
-NO2, SO2-R, -CN, -CO-R, pirinidinila, piridinila, piridazinila, he- xafluorofenila, benzotriazolila (Hansch, C., et al., Chem. Reviews 91 (1991) 165-195). Em adição, estes aceptores também podem estar ligados ao áto- mo de nitrogênio em uma maneira homóloga vinila ou homóloga fenila.
O termo "substituído" significa que a estrutura que é referida como estando substituída contém um outro resíduo em qualquer posição contanto que esta posição não seja definida em mais detalhes. O termo "op- cionalmente substituído" significa que a estrutura referida desta maneira compreende modalidades com e sem um resíduo adicional.
O termo "alquila substituída com amino" abrange alquila linear ou ramificado C1-C30 que contém pelo menos um grupo amino em que este grupo amino está protegido ou está ligado a uma unidade detectável via um ligante.
O termo "N'-heterociclo de seis membros, deficiente de elétrons" abrange N-heterociclos que são alquilados sobre um nitrogênio sp2 de modo que a carga total do heterociclo é positiva. Exemplos destes são piridinium, pirimidínio e quinolínio.
O termo "cadeia de nucleotídeo" é entendido como uma molécu- la ou uma parte de uma molécula contendo pelo menos dois resíduos de nucleosídeos que são 5'-3' interligados através de uma metade fosfato.
REAGENTES DE MARCAÇÃO QUÍMICA DE ACORDO COM A INVENÇÃO
A presente invenção é direcionada a um reagente tendo a estru- tura química
N3-S02-benzol-L-M-X, caracterizada pelo fato de que
L é uma estrutura Iigadora como definida acima. Em uma moda- lidade, L é preferivelmente -NH-CO-polietilenoglicol ou -NH-CO—(CH2)n com η sendo um número natural entre 1 e 18. Em uma outra modalidade específica, L é -CO-NH-polietilenoglicol ou -NH-CO-(CH2)n com η sendo um número natural entre 1 e 18.
M é selecionado de um grupo consistindo em -NH-, -O-, e -S-, e X é um grupo de proteção ou uma unidade detectável. As metades ligadas ao benzol são posicionadas em configura- ção meta ou em configuração para. Preferivelmente, elas estão em uma con- figuração para. Em adição, o benzol pode estar substituído em uma ou mais posições com substituintes não-volumosos como halogênios tais como clore- to.
No caso de L ser -(CH2)n-, η é um número natural entre 1 e 18, preferivelmente entre 2 e 12 e mais preferivelmente entre 3 e 6.
No caso de L ser um polietilenoglicol, o comprimento de cadeia pode preferivelmente variar entre 2 (dietilenoglicol) e 6 (hexaetilenoglicol).
Preferivelmente, M é -NH-.
No caso de X ser um grupo protetor, ele é selecionado de um grupo consistindo em DMT (dimetoxitritila), TFA (trifluoroacetila), Fmoc ((Fluoren-9-il) metóxi-carbonila), e -S-alquila, em que o dito grupo alquila tem um comprimento de cadeia de 1 -6 átomos de carbono. Dependendo da natu- reza de M, diferentes grupos protetores são selecionados. Para -NH-, TFA e Fmoc são altamente preferidos. Para -O- e -S-, é imaginável usar DMT. Para -S-, -S-alquila pode ser usado.
No caso de X ser uma unidade detectável, a dita unidade detec- tável pode ser um corante marcador de cor tal como um marcador fluores- cente. Ainda exemplos são etiquetas de massa, haptenos, como Digoxigeni- na ou Biotina, ou peptídeos pequenos, todos os quais são detectáveis por um anticorpo. Preferivelmente, X é um composto fluorescente tal como, por exemplo, Fluoresceína ou qualquer outro corante fluorescente que seja usa- do em PCR de tempo real.
É notado que as definições e modalidades específicas mostra- das de X, M e L também aplicam-se aos capítulos seguintes descrevendo "síntese de reagentes marcadores químicos de acordo com a presente in- venção", "produção de oligonucleotídeos de acordo com a invenção", e "oli- gonucleotídeos gerados com um reagente marcador de acordo com a pre- sente invenção".
SÍNTESE DE REAGENTES MARCADORES QUÍMICOS DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO
A presente invenção também provê um processo fácil e direto para síntese de um composto de acordo com a presente invenção. Um composto tendo a fórmula química N3-S02-benzol-NH2 é facilmente disponível através de processos padrões conhecidos na técnica a partir de N3-S02-benzol-NH acetila comer- cialmente disponível razoavelmente barato.
Este composto químico é reagido com um ácido carbônico ativa- do tendo a fórmula
A-CO-L-M-X
caracterizada pelo fato de que A é selecionado do grupo consis- tindo em cloreto, anidrido e N-hidróxi-succinimida (NHS éster). Preferível- mente, A é N-hidróxi-succinimida.
L é um ligante que é preferivelmente -(CH2)n- ou polietilenogli- col. No caso de L ser -(CH2)n-, n é um número natural entre 1 e 18, preferi- velmente entre 2 e 12 e mais preferivelmente entre 3 e 6. No caso de L ser um polietilenoglicol, o comprimento de cadeia pode preferivelmente variar entre 2 (dietilenoglicol) e 6 (hexaetilenoglicol).
M é selecionado de um grupo consistindo em -NH-, -O-, e -S-, e X é um grupo protetor ou uma unidade detectável como mostra- da acima.
Alguns compostos que são cobertos pela estrutura genérica A- O-CO-L-M-X também são comercialmente disponíveis como reagentes que são oferecidos para marcação após síntese de oligonucleotídeos. Em parti- cular, corantes fluorescentes são freqüentemente oferecidos na forma de ésteres de NHS como é o caso para LC Red 640 e LC Red 610 (Roche Ap- plied Science Cat. N-: 12 015 161 001, 03, 03 561 488 001). No contexto da presente invenção, entretanto, tais compostos são reagidos primeiro com N3- S02-benzol-NH2 com o resultado de que tais compostos são então disponí- veis na forma de uma azida. Como descrito abaixo, tais azidas subseqüen- temente podem ser usadas para introdução de um marcador já durante sín- tese de oligonucleotídeo.
Alternativamente, síntese de um reagente de marcação pode ser realizada através de síntese de N3-S02-benzol-L-NH-X com X como um gru- po protetor de acordo com o processo descrito acima e então desprotegendo X, enquanto X tem de ser escolhido a partir de grupos protetores que podem ser removidos sob condições em que a azida é razoavelmente estável. A- propriados grupos protetores são Tritila, Boc, e Fenilacetila. O resultante N3- S02-benzol-L-NH2 então pode ser reagido com ésteres ativados de um gru- po detectável, por exemplo, com ésteres NHS comercialmente disponíveis de corantes.
Em um outro aspecto da invenção a síntese pode ser iniciada a
partir de compostos N3-SO2-benzol-(L)n-C(=O)CI com n = 0-1. Tais compos- tos são facilmente sintetizados a partir de cloretos de arilsulfonila que são substituídos com um ácido carboxílico embora o ácido carboxílico possa ser diretamente ligado ao anel arila ou via uma metade ligante. Compostos co- mercialmente disponíveis são, por exemplo, CI-S(=O)2-Ph-C00H ou Cl- S(=O)2-Ph-(CH2)2C00H. O cloreto de sulfonila é transferido para a sulfoni- lazida através de reação com azida sódica e então o ácido carboxílico pode ser convertido ao cloreto ácido através de processos padrões (por exemplo, FR 1455154). Alternativamente, N3-S(=O)2-Ph-NH2 pode ser reagido com um anidrido de ácido dicarboxílico para N3-S(=O)2-Ph-NHC(=O) (CH2) CO- OH, seguido por conversão do ácido carboxílico ao cloreto ácido através de processos padrões. Compostos N3-S02-benzol-(L)n-C(=O)CI então podem ser reagidos com NH2-L-M-X, que é comercialmente disponível ou pode ser facilmente sintetizado de NHS éster de grupos detectáveis através de reação de ditos ésteres com um excesso de NH2-L-NH2.
PRODUÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE ACORDO COM A INVENÇÃO
Em geral, a presente invenção refere-se a reagentes marcado- res para produção de oligonucleotídeos modificados que são caracterizados pelo fato de que um derivado de fósforo trivalente da estrutura química
<formula>formula see original document page 14</formula>
em que PG representa um grupo protetor. A representa a extremidade 5' de um nucleotídeo ou de uma ca- deia de nucleotídeo ou representa um ligante ligado a uma fase sólida e
B representa a extremidade 3' de um nucleotídeo ou de uma ca- deia de nucleotídeo ou representa um ligante
é reagido com uma azida da seguinte estrutura N3-S02-benzol-L-M-X, caracterizada pelo fato de que L é um ligante que é preferivelmente -NH-CO-polietilenoglicol ou -NH-CO-(CH2)n com η sendo um número natural entre 1 e 18.
M é selecionado de um grupo consistindo em -NH-, -O-, e -S-, e X é um grupo protetor ou uma unidade detectável. Betacianoetila, metila, alila ou silila são particularmente preferi- dos como grupos protetores (PG). Alternativamente, metil-fosfonatos podem ser produzidos de acordo com a invenção em que -O-PG é substituído por CH3-
O processo de acordo com a invenção também pode ser rotinei- ramente usado em particular dentro de uma síntese convencional de oligo- nucleotídeo. Portanto, a presente invenção também refere-se a um processo compreendendo as seguintes etapas
a) eação de um 3' fosforamidito com a extremidade 5' OH de uma cadeia de oligonucleotídeo nascente
b) reação com uma azida da seguinte estrutura N3-S02-benzol-L-M-X, caracterizada pelo fato de que
L é um Iigante que é preferivelmente -NH-GO-polietilenoglicol ou NH-CO-(CH2)n com η sendo um número natural entre 1 e 18.
M é selecionado de um grupo consistindo em -NH-, -O-, e -S-, e
X é um grupo protetor ou uma unidade detectável.
Neste caso, a extremidade 5' OH da cadeia de oligonucleotídeo nascente pode ser a extremidade 5' de um nucleotídeo terminal 5' ou o gru- po OH livre de uma CPG.
Química convencional de oligonucleotídeo começa sobre um material suporte de fase sólida reativo. Material suporte de fase sólida refe- re-se a substâncias poliméricas que formam uma fase sólida contendo um grupo reativo sobre o qual ainda moléculas podem ser imobilizadas. No caso de síntese de oligonucleotídeo, o material suporte é usualmente pérolas de vidro porosas com um definido tamanho de poro, assim chamadas partículas de vidro de poro controlado (CPG). Alternativamente, também é possível usar resíduos de poliestireno e outros polímeros e copolímeros orgânicos (Ghosh, P.K., et al., J. Indian. Chem. Soe. 75 (1998) 206-218). Se os oligo- nucleotídeos devem permanecer imobilizados após a síntese sobre o subs- trato, vidro e também chips semicondutores podem ser usados como o ma- terial suporte de fase sólida. Tais materiais suportes de fase sólida são co- mercialmente disponíveis. O suporte pode ser ligado por meio de um assim chamado grupo ligante contendo uma ligação clivável para o resíduo hidroxila reativo termi- nal protegido por um grupo protetor tal como DMT (dimetoxitritila). Um grupo Iigante com uma ligação clivável representa aqueles grupos que estão entre o espaçador trifuncional e o material suporte de fase sólida e pode ser cliva- do através de uma simples reação química. Eles podem ser grupos succinila ou oxalila ou outros grupos Iigantes que contenham uma ligação éster clivá- vel. Outros grupos Iigantes são conhecidos por aqueles versados na técnica (Ghosh, P.K., et al., J. Indian. Chem. Soe. 75 (1998) 206-218).
Tais grupos Iigantes são essenciais para o uso do material su- porte para síntese de oligonucleotídeos que são pretendidos estarem pre- sentes em solução aquosa após término da síntese. Se, em contraste, o oli- gonucleotídeo deve permanecer sobre a superfície do material suporte após a síntese como para a produção de arranjos de ácido nucléico (US 5 624 711; Shchepinov, M.S., et al., Nucl. Acids. Res. 25 (1997) 1155-1161), um grupo Iigante clivável é desnecessário mas antes um grupo Iigante não- clivável é preferido.
Os detalhes de uma síntese de oligonucleotídeo para a incorpo- ração das estruturas de acordo com a invenção são como se segue:
um grupo hidroxila reativo sobre o qual uma extensão de cadeia na direção 3'-5' pode ocorrer é formado após remoção de grupo protetor DMT através de tratamento ácido. Então, derivados 3' fosforamidito de (de- sóxi)ribonucleosídeos que também são providos com um grupo protetor DMT são sucessivamente acoplados na extremidade 5' de cada grupo reati- vo liberto do grupo protetor DMT na presença de tetrazol. Um intermediário contendo um átomo de fósforo trivalente é formado neste processo como um produto intermediário que forma uma ligação éster com cada um dos nucle- osídeos que são ligados pela reação e uma terceira ligação éster com um grupo hidroxila protegido que já está presente no fosforamidito que é usado. Este grupo protetor que pode ser, por exemplo, formado por betacianoetila, metila, alila ou silila é subseqüentemente clivado com amônia após término da síntese de oligonucleotídeo no processo o qual os grupos protetores base e o Iigante para CPG, também são clivados.
Ao invés de oxidação com o auxílio de iodo, o oligonucleotídeo nascente é reagido de acordo com a invenção com uma azida da seguinte estrutura:
N3-S02-benzol-L-M-X, caracterizada pelo fato de que L é um Iigante que é preferivelmente -NH-CO-polietilenoglicol ou -NH-CO-(CH2)n com η sendo um número natural entre 1 e 18.
M é selecionado de um grupo consistindo em -NH-, -O-, e -S-, e X é um grupo protetor ou uma unidade detectável
em posições nas quais fosfatos miméticos são para serem intro- duzidos na cadeia de nucleotídeo.
Em particular, se X é um grupo protetor, X pode ser removido após síntese de oligonucleotídeo e uma marcação após síntese de oligonu- cleotídeo com uma unidade detectável reativa pode ser efetuada como é bem conhecido na técnica.
Preferivelmente, entretanto, X é uma unidade detectável, por exemplo, uma molécula fluorescente e assim, marcação do oligonucleotídeo nasente está ocorrendo já durante a síntese de oligonucleotídeo baseada em fosforamidito.
Certas modalidades da presente invenção referem-se à prepara- ção de sondas oligonucleotídeos marcadas duais nas quais um marcador é preferivelmente introduzido internamente no oligonucleotídeo de acordo com o processo inventivo e um outro marcador é introduzido no oligonucleotídeo preferivelmente na extremidade 5' ou 3' de acordo com um processo conhe- cido na técnica.
No caso de um marcador 5' na posição 5' da ribose do nucleotí- deo terminal-5', a incorporação é realizada através de processos convencio- nais usando um fosforamidito marcado com corante na extremidade da sín- tese de oligonucleotídeo (Beaucage, S.L., Methods in Molecular Biology 20 (1993) 33-61, S. Agrawal Publishers).
Marcação na extremidade 3' é realizada através de uso de CPG comercialmente disponível como um suporte de fase sólida reativo que já contém um marcador detectável em adição ao grupo hidroxila tritilado. Após clivagem do grupo protetor DMT, síntese padrão de oligonucleotídeo pode ser iniciada no grupo hidroxila que agora está livre.
Processos alternativos conhecidos na técnica anterior para pós- marcação podem ser usados para um adicional marcador 5' ou 3' (US 5 002 885; US 5 401 837).
A invenção também refere-se a intermediários da síntese de a- cordo com a invenção que podem ser preparados antes de síntese padrão de oligonucleotídeo. Neste caso, intermediários que ainda estão ligados à fase sólida e ainda não foram desprotegidos e podem conter grupos espa- çadores abásicos são preferidos. CPGs que são familares para aqueles ver- sados na técnica como fosfato CPG são preferivelmente usados para a pre- paração uma vez que um oligonucleotídeo fosforilado 3' é formado após a oligossíntese. Após destritilação tais fosfato CPGs são reagidos com um fos- foramidito espaçador na presença de um ativador. O intermediário fósforo trivalente que é formado é então reagido com um N3-S02-benzol-L-M-X co- mo descrito acima em que X é uma unidade detectável. Estes intermediários de síntese podem ser estocados e usados como CPGs trifuncionais para marcação 3' universal.
Um intermediário fósforo trivalente também é formado durante a síntese de metilfosfonatos que podem ser reagidos com uma azida de acor- do com a presente invenção. Metil fosforamiditos também são comercial- mente disponíveis.
Em uma estratégia de síntese inversa (EP 1 155 027) que é u- sada para oligonucleotídeos padrões assim como em particular para análo- gos, por exemplo, para a síntese de N3'->P5' oligonucleotídeos, um inter- mediário contendo um fósforo trivalente também é formado o qual pode ser reagido de acordo com a invenção com uma azida de acordo com a inven- ção. Os correspondentes fosforamiditos são comercialmente disponíveis.
OLIGONUCLEOTÍDEOS GERADOS COM UM REAGENTE DE MARCA- ÇÃO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO
A estratégia de síntese de acordo com a invenção permite a preparação de uma ampla variedade de oligonucleotídeos modificados sobre a cadeia principal fosfato. O grau de modificação, a diversidade e a carga das modificações são determinadas pelo uso pretendido.
A presente invenção abrange qualquer composto químico con- tendo a seguinte estrutura pelo menos uma vez
<formula>formula see original document page 19</formula>
em que
A representa a extremidade 5' de um nucleotídeo ou de uma cadeia de nucleotídeo ou OH
B representa a extremidade 3' de um nucleotídeo ou de uma cadeia de nucleotídeo ou OH
e Acc representa -SO2-benzol-L-M-X, caracterizado pelo fato de que
L é um Iigante que é preferivelmente -NH-CO-polietilenoglicol ou -NH-CO-(CH2)n com n sendo um número natural entre 1 e 18.
M é selecionado de um grupo consistindo em -NH-, -O-, e -S-, e
X é um grupo protetor ou uma unidade detectável.
Também é entendido por aqueles versados na técnica que os grupos -OH do oligonucleotídeo estão usualmente presentes em um status desprotonado.
Além disso, a presente invenção também abrange metilfosfona- tos da seguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 19</formula>
Dependendo do uso pretendido do oligonucleotídeo, as estrutu- ras descritas acima podem ocorrer uma vez, duas vezes, muitas vezes ou mesmo sobre todos os resíduos fosfato presentes no oligonucleotídeo. Os resíduos fosfato dentro do oligonucleotídeo são assim chamados internucle- osídeo fosfatos nos quais
A representa a extremidade 5' de um primeiro nucleosídeo
e
B representa a extremidade 3' de um segundo nucleosídeo dentro da cadeia de nucleotídeo.
Além disso, as estruturas de acordo com a invenção podem es- tar localizadas na extremidade 3' ou extremidade 5' de um oligonucleotídeo. Se elas estão presentes na extremidade 5' do oligonucleotídeo, então
A representa a extremidade 5' da cadeia de nucleotídeo e B é um grupo hidroxila ou um Iigante que opcionalmente 1 pode conter um grupo detectável ou um outro grupo reativo, e pode ser usa- do para sintetizar um grupo detectável sobre o oligonucleotídeo.
Se o aceptor de elétrons contém um substituinte que também representa uma unidade detectável, então um oligonucleotídeo está presen- te de acordo com a invenção com uma marcação dual na extremidade 5'. Se a estrutura de acordo com a invenção está na extremidade 3' de uma cadeia de nucleotídeo, então
B representa a extremidade 3' do dito oligonucleotídeo e
A é hidroxila ou um Iigante ligado a uma fase sólida em que a fase sólida é preferivelmente partículas de vidro de poros controlados tais como aquelas que são usadas como um material de partida para síntese rotineira de oligonucleotídeo.
Os nucleosídeos individuais dentro de oligonucleotídeos de a- cordo com a invenção podem conter qualquer tipo de nucleosídeos ou nu- cleosídeos modificados ou derivados de nucleosídeos. As unidades de açú- car são usualmente desoxirribose para oligonucleotídeos DNA ou ribose pa- ra oligonucleotídeos RNA. As núcleobases contidas nos oligonucleotídeos de acordo com a invenção podem ser bases ocorrendo naturalmente tais como adenina, guanina, timidina, citidina, uridina, seus derivados das mes- mas ou assim chamadas bases universais como nitroindol.
Oligonucleotídeos marcados com um reagente de marcação de acordo com a presente invenção podem ser usados vantajosamente para numerosas diferentes aplicações em biologia molecular tal como em PCR de tempo real. O marcador detectável é preferivelmente um corante fluorescen- te ou uma molécula "quencher" de fluorescência. Corantes correspondentes e moléculas que podem servir como uma unidade detectável para oligonu- cleotídeos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplos destes que não limitam o escopo protetor da presente invenção são: fluores- ceínas, rodaminas, cianinas, merocianinas, carbocianinas e compostos azo e poli-azo.
O reagente de marcação de acordo com a presente invenção pode ser usado para sintetizar sondas de PCR de tempo real tendo a estru- tura descrita acima em que pelo menos um marcador fluorescente está liga- do ao átomo de fosfato da cadeia de oligonucleotídeo por meio de um grupo aceptor de elétrons / amida. Exemplos de tais sondas são sondas de hibridi- zação FRET (WO 97/46707) ou assim chamadas sondas marcadas simples (WO 02/14555). Neste sentido, sondas oligonucleotídeo nas quais há uma modificação interna de acordo com a invenção sobre um resíduo fosfato in- ternucleosídeo são particularmente preferidas.
Neste sentido, o reagente de marcação de acordo com a presen- te invenção é particularmente útil para produção de oligonucleotídeos mar- cados duais que têm duas unidades detectáveis. Exemplos de tais sondas são sondas TaqMan (US 5 804 375), faróis moleculares (US 5 118 801). Neste sentido, a presente invenção refere-se a preparação de oligonucleotí- deos marcados duais nos quais um primeiro marcador fluorescente é ligado a um átomo de fosfato internucleosídeo da cadeia de oligonucleotídeo por meio de um grupo aceptor de elétrons / amida e uma segunda unidade de- tectável está presente terminalmente na extremidade 5' ou extremidade 3' do oligonucleotídeo. Moléculas que têm tais marcadores e processos para sua preparação são bem conhecidos entre versados.
A invenção é elucidada em mais detalhes nos exemplos que se seguem, o escopo protetor dos quais é derivado das reivindicações de pa- tente. Os processos descritos são para serem entendidos como exemplos que ainda descrevem o objeto da invenção mesmo após modificações.
Os exemplos que se seguem são providos para auxiliarem o en- tendimento da presente invenção, o verdadeiro escopo da qual é mostrado nas reivindicações apenas. É entendido que modificações podem ser feitas nos procedimentos mostrados sem fugir do espírito da invenção.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: 4-AMINOBENZENOSULFONIL AZIDA (DE ACORDO COM DE 2919823)
2,0 g (8 mmoles) de p-acetilaminobenzoilsulfonilazida foram agi- tados com 4,0 g (3,4 mL) de cloreto de hidrogênio 32% e aquecidos a 95°C por 20 minutos. Uma solução clara foi formada. Com resfriamento para tem- 1 peratura ambiente, o cloridrato precipita e foi separado por filtração. Os cris- tais foram dissolvidos em 20 mL de água e uma soiução saturada de carbo- nato de sódio foi adicionada e a fase aquosa foi então extraída 3 vezes com diclorometano. As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água e secadas com sulfato de sódio. Após remoção de solventes, o resultante óleo vermelho claro foi seco por toda noite sobre cloreto de cálcio sob vácuo para render 1,04 g (66%) de produto bruto.
TLC sílica sobre folha plástica (tolueno : etilacetato : metanol =4:1:1)
Rf (produto) = 0,63
EXEMPLO 2: CLORETO DE (2.2,2-TRIFLUOROACETIL AMINO)- HEXANOILA
735 mg (3 mmoles) de ácido (2,2,2-trifluoroacetilamino) hexanói- co foram dissolvidos em 5 mL de diclorometano seco e agitados sob fluxo de argônio a 0°C. Então, 0,6 mL (6,6 mmoles) de cloreto de oxalila foram adi- cionados em gotas a 0°C, umas poucas gotas de dimetilformamida seca também foram adicionadas, o que conduziu a desenvolvimento de gás e co- loração amarela da mistura anteriormente branca. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 70 minutos. Então, a mistura foi repetidamente evaporada com diclorometano. O produto bruto foi usado diretamente na etapa seguinte. EXEMPLO 3: 4-[6-(2,2,2-TRIFLUOROACETILAMINO) HEXANOILA- MINO] BENZENOSULFONIL AZIDA
A 0,57 g (3 mmoles) de para-amino-benzenosulfonil azida dis- solvido em 5 mL de dimetilformamida, foi adicionado 0,9 mL (6 mmoles) de trietilamina, então o cloreto de (2,2,2-trifluoroacetilamino) hexanoíla dissolvi- do em 10 mL de dimetilformamida foi adicionado em gotas. A mistura tornou- se marrom e foi agitada sob argônio por 24 horas. Solvente foi evaporado, e o óleo restante foi dissolvido em 10 mL de diclorometano e deixado em tem- peratura ambiente por 1 hora. O precipitado foi filtrado e a solução foi evapo- rada para render 1,10 g de óleo bruto. O composto obtido foi usado direta- mente em síntese de oligonucleotídeo.
EXEMPLO 4: SÍNTESE DE UM OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO COM AMINO
5' Ap*GG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-p
p*=p=N-SO2-Ph-NH-C(=O)-(CH2)5-NH2
A síntese de oligonucleotídeos foi realizada em uma escala de 1 μmοl em um sintetizador ABI 394. Fosfato CPG comercialmente disponível (Glen Research) foi usado como o material suporte. Todos os outros com- postos químicos para as sínteses padrões foram obtidos de Glen Research. Fosforamiditos com grupos protetores terc-butilfenóxi-acetila (conhecidos como monômeros "tac" ou "Expedite") de Proligo foram usados.
O protocolo padrão foi usado para a síntese. Somente no último ciclo de síntese, o oxidante foi substituído por uma solução 0,1 M de 4-[6- (2,2,2-trifluoroacetilamino)-hexanoilamino] benzenosulfonil azida em acetoni- trila anidra e o tempo de "oxidação" foi estendido para 16 minutos.
O produto foi clivado do suporte por 15 h a 55°C com amônia 33% e purificado por cromatografia de fase reversa sobre uma coluna Poros Oligo R3 4,6 χ 50 mm. Cromatografia: tampão A: acetato de trietilamônio 0,1 M em água pH 6,8, tampão B: acetato de trietilamônio 0,1 M em água / ace- tonitrila 1:1, gradiente 2 minutos 0% B a 100% B em 45 minutos. A absorção UV do eluante foi medida em 260 nm. Uma principal fração foi obtida que conteve o oligonucleotídeo modificdo com amino. O solvente foi removido sobre uma centrífuga à vácuo.
MALDI: calc: 11436, 7 encontrada 11435,6
EXEMPLO 5: PÓS-MARCACÃO COM LIGHTCYCLER VERMELHO 640
5' Ap*GG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-p
p*=p=N-S02-Ph-NH-C(=0)-(CH2)5-NH LC Vermelho 640
O resíduo foi tomado em 1 mL de tampão borato de sódio 0,1 M (pH = 8,5). Uma solução de 1 mg de LightCycIer-VermeIho 640 NHS éster (Roche Applied Science) em 1000 μί de DMF foi adicionada e a mistura foi mantida em temperatura ambiente por toda noite. A mistura foi evaporada e purificada sob as mesmas condições corno descrito acima. Como detetor, um arranjo de diodo foi usado e deteção foi realizada em 260 nm e 625 nm. Frações tendo ambas absorções foram coletadas e evaporadas em vácuo. O restante foi dissolvido em água bidestilada e novamente evaporado em vá- cuo. O resíduo foi então dissolvido em água bidestilada e liofilizado.
MALDI: calc: 12438,35 encontrada: 12435,5
EXEMPLO 6: CLORETO DE N-DANSIL 3 AMINO PROPANOÍLA
970 mg (3 mmoles) de dansil beta alanina foram dissolvidos em 5 mL de diclorometano seco e agitados sob fluxo de argônio a O0C. Então 0,6 mL (6,6 mmoles) de cloreto de oxalila foi adicionado em gotas a O0C, e subseqüentemente, poucas gotas de dimetilformamida seca foram adiciona- das o que conduziu a desenvolvimento de gás. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 100 minutos. Os solventes foram removidos atra- vés de uso de um evaporador rotatório e o restante foi duas vezes evapora- do com diclorometano. O produto bruto foi usado diretamente na etapa se- guinte.
EXEMPLO 7: N-DANSIL (3 AMINO PROPANOIL) BENZENO SULFO- NIL AZIDA
A 152 mg (0,8 mmoles) de para-amino-benzenosulfonil azida dissolvidos em 5 mL de dimetilformamida foi adicionado 0,11 mL (6 mmoles) de trietilamina, então 0,5 mmol de cloreto de N-Dansil 3 aminopropanoíla dissolvido em 10 mL de dimetilformamida foi adicionado em gotas. A mistura foi agitada sob argônio por 24 horas. O solvente foi evaporado, o óleo res- tante foi purificado por cromatografia sobre sílica (eluente toluol / etil éster de ácido acético 1:1). As frações contendo o produto foram coletadas e a solu- ção foi evaporada.
1H NMR (Bruker DPX 300 MHz): d6 DMSO: 2.53 m [2H], 2.82 s[6H], 3.12 m [2H], 7.20 m [2H], 7.59 t [1H], 7.62 t [1H], 7.81 d[2H], 7.93 d[2H], 8.07 t [1H], 8.12 d [1H], 8.27 d[1H], 8.44[1H], 10.47 s [1H], ( protona- ted form) IR ( Nujol) 2122 cm-1 -
Claims (5)
1. Reagente tendo a estrutura química N3-S02-benzol-L-M-X, caracterizado pelo fato de que L é ou -NH-CO-polietilenoglicol, ou -NH-CO-(CH2)n com η sen- do um número natural entre 1 e 18, M é selecionado de um grupo consistindo em -NH-, -O-, e -S-, X ou é selecionado de um grupo consistindo em DMT1 TFA, Fmoc e S- C1-6-alquila, ou X é um composto fluorescente.
2. Uso de um composto como definido na reivindicação i, para modificação de um ácido nucléico que é preferivelmente um oligonucleotídeo de fita única.
3. Uso de acordo com a reivindicação 2, para modificação de um oligonucleotídeo de fita única compreendendo as etapas de -reação de um fosforamidito 3' com a extremidade OH 5' de uma cadeia de oligonucleotídeo nascente -reação com um reagente como definido na reivindicação 1.
4. Processo para preparação de um reagente como definido na reivindicação 1, em que um composto tendo a fórmula química N3-SCVbenzoI-NH2 é reagido com um ácido carbônico ativado tendo a fórmula A-CO-L-M-X caracterizado pelo fato de que L é um ligante que é preferivelmente ou -(CH2)n- ou polietileno- glicol M é selecionado de um grupo consistindo em -NH-, -O-, -S-, e X ou é um grupo protetor ou uma unidade detectável e A é selecionado do grupo consistindo em cloreto, anidrido e N- hidróxi-succinimida.
5. Processo para preparação de um reagente como definido na reivindicação 1, em que um composto tendo a fórmula química N3-SO2-benzol-(CH2)n-COCl, com η sendo 0 ou um número na- tural entre 1 e 10 é reagido com um composto tendo a fórmula NH2-(CH2)m-M-X, caracterizado pelo fato de que méO ou um número natural entre 1 e 10, M é selecionado de um grupo consistindo em -NH-, -O-, -S-, e X é um grupo protetor ou uma unidade detectável.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP05025499.4 | 2005-11-23 | ||
| EP05025499A EP1801114B8 (de) | 2005-11-23 | 2005-11-23 | Polynukleotid mit Phosphatmimetikum |
| EPPCT/EP2006/008842 | 2006-09-12 | ||
| PCT/EP2006/008842 WO2007059816A1 (en) | 2005-11-23 | 2006-09-12 | Polynucleotide containing a phosphate mimetic |
| PCT/EP2006/011122 WO2007059912A1 (en) | 2005-11-23 | 2006-11-21 | Polynucleotide labelling reagent |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0618855A2 true BRPI0618855A2 (pt) | 2011-09-13 |
Family
ID=36128618
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0618833-8A BRPI0618833B1 (pt) | 2005-11-23 | 2006-09-12 | Polinucleotídeo contendo um fosfato mimético, oligonucleotídeo, seu uso e processo de produção |
| BRPI0618855-9A BRPI0618855A2 (pt) | 2005-11-23 | 2006-11-21 | reagente de marcação de polinucleotìdeo |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0618833-8A BRPI0618833B1 (pt) | 2005-11-23 | 2006-09-12 | Polinucleotídeo contendo um fosfato mimético, oligonucleotídeo, seu uso e processo de produção |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7741472B2 (pt) |
| EP (3) | EP1801114B8 (pt) |
| JP (2) | JP5155177B2 (pt) |
| KR (2) | KR101028980B1 (pt) |
| CN (2) | CN101312985B (pt) |
| AT (2) | ATE443072T1 (pt) |
| AU (1) | AU2006317195B2 (pt) |
| BR (2) | BRPI0618833B1 (pt) |
| CA (2) | CA2627208C (pt) |
| DE (2) | DE502005008153D1 (pt) |
| ES (2) | ES2332139T3 (pt) |
| HK (2) | HK1126183A1 (pt) |
| WO (1) | WO2007059816A1 (pt) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
| US20030166282A1 (en) | 2002-02-01 | 2003-09-04 | David Brown | High potency siRNAS for reducing the expression of target genes |
| ATE529512T1 (de) | 2002-02-01 | 2011-11-15 | Life Technologies Corp | Doppelsträngige oligonukleotide |
| DE502005008153D1 (de) | 2005-11-23 | 2009-10-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Polynukleotid mit Phosphatmimetikum |
| CA2676115C (en) | 2007-04-18 | 2011-09-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleotide with an alpha-phosphate mimetic |
| US8906306B2 (en) | 2009-04-09 | 2014-12-09 | Roche Molecular Systems, Inc. | Fluid transfer control for real-time PCR |
| US8674080B2 (en) | 2009-04-09 | 2014-03-18 | Roche Molecular Systems, Inc. | Dye composition for liquid transfer control |
| DK2459743T3 (da) | 2009-07-30 | 2017-11-06 | Hoffmann La Roche | Sæt af oligonukleotidprober såvel som fremgangsmåder og anvendelser relateret dertil |
| CA2781519A1 (en) | 2009-09-16 | 2011-03-24 | Genentech, Inc. | Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof |
| TW201138821A (en) | 2010-03-26 | 2011-11-16 | Roche Glycart Ag | Bispecific antibodies |
| EP2630255B1 (en) | 2010-10-22 | 2014-09-10 | Roche Diagnostics GmbH | A conjugate between a thiophilic solid phase and an oligonucleotide comprising a thiooxonucleotide |
| ES2656969T3 (es) | 2010-12-23 | 2018-03-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Detección de un dímero polipeptídico por un agente de unión bivalente |
| WO2012085113A1 (en) | 2010-12-23 | 2012-06-28 | Roche Diagnostics Gmbh | Binding agent |
| CN103384825B (zh) | 2010-12-23 | 2017-05-24 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 通过二价结合剂检测经翻译后修饰的多肽 |
| JP5766296B2 (ja) | 2010-12-23 | 2015-08-19 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用 |
| EP2495336B8 (en) | 2011-03-04 | 2014-07-23 | Roche Diagnostics GmbH | A new type of universal probes for the detection of genomic variants |
| KR101411013B1 (ko) | 2011-12-01 | 2014-06-23 | 제일모직주식회사 | (메타)아크릴로일 이미노포스파젠계 화합물, 그 제조방법 및 이를 포함한 공중합체 |
| KR20140127854A (ko) | 2012-02-10 | 2014-11-04 | 제넨테크, 인크. | 단일-쇄 항체 및 다른 이종다량체 |
| CN104395340B9 (zh) | 2012-06-27 | 2018-11-30 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 包含至少两个不同靶向实体的定制选择性和多特异性治疗分子的方法及其用途 |
| RU2639287C2 (ru) | 2012-06-27 | 2017-12-20 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения |
| WO2014001325A1 (en) | 2012-06-27 | 2014-01-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof |
| US9382581B2 (en) * | 2012-12-13 | 2016-07-05 | Roche Molecular Systems, Inc. | Primers with modified phosphate and base in allele-specific PCR |
| RU2708237C2 (ru) * | 2014-08-22 | 2019-12-05 | Общество с ограниченной ответственностью "НооГен" | Модифицированные олигонуклеотиды и способ их получения |
| WO2016087416A1 (en) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Multispecific antibodies |
| WO2017111137A1 (ja) * | 2015-12-22 | 2017-06-29 | 味の素株式会社 | オリゴヌクレオチドの製造方法 |
| RU2740501C2 (ru) * | 2017-02-21 | 2021-01-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, АКТИВИРУЮЩИЕ РНКазу Н |
| JP7557941B2 (ja) | 2017-06-02 | 2024-09-30 | ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッド | オリゴヌクレオチド組成物及びその使用方法 |
| WO2018223056A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Wave Life Sciences Ltd. | Oligonucleotide compositions and methods of use thereof |
| AU2019252680A1 (en) * | 2018-04-12 | 2020-10-22 | Wave Life Sciences Ltd. | Oligonucleotide compositions and methods of use thereof |
| JP7353301B2 (ja) | 2018-05-07 | 2023-09-29 | アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | 肝臓外送達 |
| US11384376B2 (en) | 2018-05-31 | 2022-07-12 | Roche Molecular Systems, Inc. | Reagents and methods for post-synthetic modification of nucleic acids |
| CN114555621A (zh) * | 2019-08-15 | 2022-05-27 | Ionis制药公司 | 键修饰的寡聚化合物及其用途 |
| WO2022081046A1 (ru) * | 2020-10-12 | 2022-04-21 | Максим Сергеевич КУПРЮШКИН | Химическое соединение с триазиновой группой и способ его получения |
Family Cites Families (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3792025A (en) * | 1972-12-15 | 1974-02-12 | Upjohn Co | Novel compounds and process |
| US4031068A (en) * | 1976-07-26 | 1977-06-21 | Uniroyal Inc. | Non-migratory sulfonyl azide antioxidants |
| US5241060A (en) | 1982-06-23 | 1993-08-31 | Enzo Diagnostics, Inc. | Base moiety-labeled detectable nucleatide |
| US5260433A (en) | 1982-06-23 | 1993-11-09 | Enzo Diagnostics, Inc. | Saccharide specific binding system labeled nucleotides |
| US4948882A (en) | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
| US5002885A (en) | 1984-01-30 | 1991-03-26 | Enzo Biochem, Inc. | Detectable molecules, method preparation and use |
| US5585481A (en) | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
| US5231191A (en) | 1987-12-24 | 1993-07-27 | Applied Biosystems, Inc. | Rhodamine phosphoramidite compounds |
| EP0406309A4 (en) | 1988-03-25 | 1992-08-19 | The University Of Virginia Alumni Patents Foundation | Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates |
| US4997928A (en) | 1988-09-15 | 1991-03-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Fluorescent reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
| US5118801A (en) | 1988-09-30 | 1992-06-02 | The Public Health Research Institute | Nucleic acid process containing improved molecular switch |
| US5141813A (en) | 1989-08-28 | 1992-08-25 | Clontech Laboratories, Inc. | Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis |
| US5177198A (en) | 1989-11-30 | 1993-01-05 | University Of N.C. At Chapel Hill | Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5290925A (en) | 1990-12-20 | 1994-03-01 | Abbott Laboratories | Methods, kits, and reactive supports for 3' labeling of oligonucleotides |
| JPH06102267A (ja) * | 1992-09-18 | 1994-04-15 | Japan Organo Co Ltd | 非イオン界面活性剤の分析方法 |
| US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| US5624711A (en) | 1995-04-27 | 1997-04-29 | Affymax Technologies, N.V. | Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis |
| US6130323A (en) | 1996-05-15 | 2000-10-10 | Biogenex Laboratories | Non-nucleotide linking reagents |
| JP4281877B2 (ja) | 1996-06-04 | 2009-06-17 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | 生物学的プロセスを実行し且つモニタリングするためのシステムと方法 |
| DE19650252C2 (de) | 1996-12-04 | 2002-01-17 | Univ Dresden Tech | Verfahren zum Färben von Filamenten, Fasern und Garnen, natürlicher oder synthetischer Herkunft und von Kunststoffen in Folienform |
| JPH11140488A (ja) * | 1997-11-05 | 1999-05-25 | Nippon Shokubai Co Ltd | 洗剤ビルダーおよび洗剤組成物 |
| US6255476B1 (en) | 1999-02-22 | 2001-07-03 | Pe Corporation (Ny) | Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports |
| US6303774B1 (en) * | 1999-08-20 | 2001-10-16 | Sri International | Nucleoside pyrophosphate and triphosphate analogs and related compounds |
| TWI287536B (en) * | 2000-04-18 | 2007-10-01 | Ind Tech Res Inst | Method for preparing azide photo-initiators |
| ATE332398T1 (de) | 2000-08-11 | 2006-07-15 | Univ Utah Res Found | Einfach markierte oligonukleotidsonden |
| WO2003002587A2 (en) | 2001-06-29 | 2003-01-09 | Micrologix Biotech Inc. | Phosphoramide containing nucleic acid-based compounds and libraries as antivirals |
| AU2003219383B2 (en) * | 2002-04-22 | 2010-08-26 | Bioniche Life Sciences Inc. | Oligonucleotide compositions and their use for the modulation of immune responses |
| DE502005008153D1 (de) | 2005-11-23 | 2009-10-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Polynukleotid mit Phosphatmimetikum |
-
2005
- 2005-11-23 DE DE502005008153T patent/DE502005008153D1/de active Active
- 2005-11-23 AT AT05025499T patent/ATE443072T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-11-23 ES ES05025499T patent/ES2332139T3/es active Active
- 2005-11-23 EP EP05025499A patent/EP1801114B8/de active Active
-
2006
- 2006-09-12 EP EP06791985A patent/EP1954707B1/en active Active
- 2006-09-12 CN CN200680043667.3A patent/CN101312985B/zh active Active
- 2006-09-12 ES ES06791985T patent/ES2349129T3/es active Active
- 2006-09-12 BR BRPI0618833-8A patent/BRPI0618833B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-09-12 AT AT06791985T patent/ATE478087T1/de not_active IP Right Cessation
- 2006-09-12 DE DE602006016325T patent/DE602006016325D1/de active Active
- 2006-09-12 JP JP2008541599A patent/JP5155177B2/ja active Active
- 2006-09-12 CA CA2627208A patent/CA2627208C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-12 WO PCT/EP2006/008842 patent/WO2007059816A1/en active Application Filing
- 2006-09-12 AU AU2006317195A patent/AU2006317195B2/en not_active Ceased
- 2006-09-12 KR KR1020087012000A patent/KR101028980B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2006-11-21 JP JP2008541627A patent/JP5364380B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-11-21 EP EP06818687A patent/EP1954671B1/en not_active Not-in-force
- 2006-11-21 KR KR1020087012296A patent/KR101032008B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2006-11-21 CA CA2627216A patent/CA2627216C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-11-21 CN CN2006800434199A patent/CN101312941B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-11-21 BR BRPI0618855-9A patent/BRPI0618855A2/pt not_active Application Discontinuation
-
2008
- 2008-05-16 US US12/121,842 patent/US7741472B2/en active Active
- 2008-05-20 US US12/123,656 patent/US7795423B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-05-19 HK HK09104557.8A patent/HK1126183A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2009-05-19 HK HK09104559.6A patent/HK1126224A1/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BRPI0618855A2 (pt) | reagente de marcação de polinucleotìdeo | |
| JP4634615B2 (ja) | 固体支持体上での標識化オリゴヌクレオチドおよびアナログの合成のための方法および組成物 | |
| US5252760A (en) | Method of using colored phosphorylating reagents | |
| AU2006316903B8 (en) | Polynucleotide labelling reagent | |
| JP5975524B2 (ja) | 化合物、核酸、核酸の製造方法および核酸を製造するためのキット | |
| EP1152010B1 (en) | Oligonucleotide labeling reactants and their use | |
| BRPI0609351A2 (pt) | método para preparar um oligonucleotìdeo, e, uso de cetonas | |
| BRPI0706586A2 (pt) | sìntese de oligonnucleotìdeos usando ligantes fotocliváveis | |
| US5332845A (en) | Phosphorylating reagents | |
| PT1538154E (pt) | Composições de agentes de extinção com porções de antraquinona | |
| EP1308452B1 (en) | Oligonucleotide labeling reactants based on acyclonucleosides and conjugates derived thereof | |
| US8569515B2 (en) | Directed synthesis of oligophosphoramidate stereoisomers | |
| FI102072B (fi) | 2-dansyylietoksiklooriformiaattihydrokloridin käyttö hydroksiryhmän su ojaamiseen oligonukleotidisynteesissä, näin suojattuja välituotteita, menetelmiä niiden valmistamiseksi ja menetelmä oligonukleotidien synte tisoimiseksi | |
| CN101103040B (zh) | 使用季铵杂环活化剂合成亚磷酸酯化化合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B11B | Dismissal acc. art. 36, par 1 of ipl - no reply within 90 days to fullfil the necessary requirements |