JP2009516521A - リン酸塩模倣物を含むポリヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
修飾されたリン酸塩残基を有するヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを作製するための種々の方法が既に以前に記載されている。
したがって、本発明は、好ましくは以下の構造
(式中、Aは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の5’末端を表すか、または固相に結合されたリンカーを表す、および
Bは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の3’末端を表すか、またはリンカーを表す
Dは、OHまたはCH3のいずれかである、および
Accは電子受容体または残基Rで置換された電子受容体であり、Rは任意の有機置換基である)
を少なくとも1回含むオリゴヌクレオチドである化合物に関する。
- -CN、
- -SO2-R’、ここで、R’は、少なくとも1つのアミノ置換アルキル、任意に置換されたアリールまたは任意に置換された複素環を含有する、
-および電子不足六員環N+-複素環、ここで、少なくとも1つの窒素原子がアルキル化され、オルトまたはパラ位に位置し、これらの複素環はRで任意に置換され得る、
を含む群から選択される。
化学構造
(式中、Eは、メチル基または保護されたヒドロキシル基のいずれかを表す、
式中、Aは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の5’末端を表すか、または固相に結合されたリンカーを表す、および
式中、Bは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の3’末端を表すか、またはリンカーを表す)
の3価のリンの誘導体を、以下の構造
N=N=N-Acc
(式中、Accは電子受容体または残基Rで置換された電子受容体であり、Rは任意の有機置換基である)
のアジドと反応させることを特徴とする方法により本発明に従って調製される。
- -CN、-SO2-R
- および、電子不足六員環N+-複素環、ここで、少なくとも1つの窒素原子がアルキル化され、オルトまたはパラ位に位置し、これらの複素環はRで任意に置換され得る、
を含む群から選択される。
a)3’ホスホルアミダイトをまず、生成される(nascent)オリゴヌクレオチド鎖の5’OH末端と反応させ、
続いて、
b)以下の構造
N=N=N-Acc
(式中、Accは電子受容体または残基Rで置換された電子受容体であり、Rは任意の有機置換基である)
のアジドの反応を行なう。
本発明の基本的概念
本発明の目的は、修飾されたリン酸塩残基を含み、したがって、好ましくは検出可能な標識もまた含み得るヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを、簡単な様式で作製することである。
本発明の範囲において、使用されるいくつかの用語は、以下のとおりに規定される。
- ヨウ素によって酸化されるべきではない
- ジクロロ酢酸およびトリクロロ酢酸に対して不活性でなければならない、ならびに
- 塩基に対して、特にアンモニアに対して不活性でなければならない、ならびに
- 3価のホスホルアミデートと反応すべきではない。
-NO2、SO2-R、-CN、-CO-R、ピリニジニル、ピリジニル、ピリダジニル、ヘキサフルオロフェニル、ベンゾトリアゾリルである(Hansch, C., et al., Chem. Reviews 91 (1991)165-195)。また、これらの受容体は、ビニル系またはフェニル系の様式で窒素原子にも結合され得る。
本発明は、
以下の構造
(式中、
Aは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の5’末端を表すか、または固相に結合されたリンカーを表す、および
Bは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の3’末端を表すか、またはリンカーを表し、Accは電子受容体または残基Rで置換された電子受容体であり、Rは任意の有機置換基である、この残基は、さらに、オリゴヌクレオチド合成で生じるすべての化学反応に適合性でなければならない、すなわち、
- ヨウ素によって酸化されるべきではない
- ジクロロ酢酸およびトリクロロ酢酸に対して不活性でなければならない、ならびに
- 塩基に対して、特にアンモニアに対して不活性でなければならない、ならびに
- 3価のホスホルアミデートと反応すべきではない)
を少なくとも1回を含む任意の化合物を包含する。
(定義は上記のとおりである)
のメチルホスホネートを包含する。
Aは、第1のヌクレオシドの5’末端を表す、および
Bは、ヌクレオチド鎖の第2のヌクレオシドの3’末端を表す
ような、いわゆるヌクレオシド間リン酸塩である。
Aは、ヌクレオチド鎖の5’末端を表す、および
Bは、任意に保護されたヒドロキシル基または検出可能な基もしくは別の反応性基を任意に含有し得るリンカーのいずれかであり、オリゴヌクレオチドに検出可能な基を導入するために使用され得る。
Bは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端を表す、および
Aは、ヒドロキシルまたは固相に結合されたリンカーのいずれかであり、ここで、固相は、好ましくは、常套的なオリゴヌクレオチド合成のための出発材料として使用されるものなどの制御細孔ガラス粒子である。
a) -CN、
b) -SO2-R’、式中、R’は、少なくとも1つのアミノ置換アルキル、任意に置換されたアリールまたは任意に置換された複素環を含有する、
c) 電子不足六員環N+-複素環、ここで、少なくとも1つの窒素原子がアルキル化され、オルトまたはパラ位に位置し、これらの複素環はRで任意に置換され得る、
が使用され得る。
(式中、Aは、固相に結合されたリンカーを表す、
Bは、好ましくは保護された反応性基を保有するリンカーまたは検出可能な単位を表す
Eは、メチルまたは保護されたヒドロキシルのいずれかである、
Accは電子受容体または残基Rで置換された電子受容体であり、Rは任意の有機置換基である)
を有する化合物に関する。
本発明はまた、修飾オリゴヌクレオチドの作製方法、特に、上記のオリゴヌクレオチドの作製方法に関する。
(式中、Eはメチル基または保護されたヒドロキシルのいずれかであり、好ましくはβ-シアノエチル基によって保護されている
Aは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の5’末端を表すか、または固相に結合されたリンカーを表す、および
Bは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の3’末端を表すか、またはリンカーを表す)
の3価のリンの誘導体を、以下の構造
N=N=N-Acc
(式中、Accは電子受容体または残基Rで置換された電子受容体であり、Rは任意の有機置換基である)
のアジドと反応させることを特徴とする、修飾オリゴヌクレオチドの作製方法に関する。
a) -CN、
b) -SO2-R、
c) 電子不足六員環N+-複素環、ここで、少なくとも1つの窒素原子がアルキル化され、オルトまたはパラ位に位置し、これらの複素環はRで任意に置換され得る、
が使用され得る。
a) 生成されるオリゴヌクレオチド鎖の5’OH末端との3’ホスホルアミダイトの反応
b) 以下の構造
N=N=N-Acc
(式中、Accは電子受容体または残基Rで置換された電子受容体であり、Rは任意の有機置換基である)
のアジドとの反応
を含む方法に関する。
N=N=N-Acc
(式中、Accは電子受容体または残基Rで置換された電子受容体であり、Rは任意の有機残基である)
のアジドと、リン酸塩模倣物がヌクレオチド鎖に導入される位置で反応させる。記載の合成化学は、基本的に任意の残基Rの取込み、特に、任意の型の蛍光色素の取込みを可能にする。
本発明による合成ストラテジーは、リン酸塩主鎖が修飾された広範な種々のオリゴヌクレオチドの調製を可能にする。修飾の程度、多様性および修飾の電荷は、意図される使用によって決定される。
修飾dT(P(=NSO2PhNHAc)dTの合成
ダイマー合成は、ABI 394合成機において10μmolスケールで行なった。固相として、市販のdT CPG支持体を用いた。標準的な合成用の全ての化学物質はGlen Researchから得た。
4.10 [m, 4H, H4', H5'] 2.38-2.24 m [4H, H2'], 2.22 [3H, CH3], 2.16 [3H, CH3], 2.14 [3H, CH3]
31P NMR: (Bruker DPX 300) D2O中: 2.14
T(P(=NSO2PhNHAc)T9オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチド合成は、ABI 394合成機において1μmolスケールで行なった。固相として市販のdT CPG支持体を使用した。標準的な合成用の全ての化学物質はGlen Researchから得た。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの合成
それぞれP=OがP=N-pPh-NAcに置き換えられた5'AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TCフルオレセイン-3'(配列番号:4)
オリゴヌクレオチド合成はABI 394合成機において1μmolスケールで行なった。支持体材料として、市販のLightCyclerフルオレセインCPG(Roche Applied Science)を使用した。標準的な合成に使用した全ての化学物質はGlen Reseasrchから得た。Proligoのtert.ブチルフェノキシ-アセチル保護基(「tac」または「Expetide」モノマーとして公知)を有するホスホルアミダイトを使用した。
特定の位置でP=OをP=N Accに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドの合成
合成はABI 394合成機において1μmolスケールで行なった。合成中の酸化剤を変更する必要がないようにするため、N3-Acc溶液が余分な塩基位置に接触し得るように合成プログラムを変更した。プログラミングの制限のために、アジドをアクチベータと共に反応させた。これは修飾には影響を及ぼさなかった。三価のリン酸中間体を介したN3 Accの反応時間を5分とした。
を合成し、質量分析によりその後分析した。
本発明による3'末端標識
a)ダブシル(dabsyl)アジドの調製
0.71g(2.19mmol)ダブシルクロライド(dabsyl chloride)を10mlのアセトンに溶解した。2ml水中142mg(2.19 mmol)のアジ化ナトリウムの溶液を、氷上で冷却、攪拌しながら徐々に滴下した。0℃で2時間攪拌し、次いで室温で2時間攪拌した。その後、500μl水中32mgのアジ化ナトリウムの溶液(0.5mmol)を、室温、1時間で添加した。(TLCシリカゲルCH2Cl2)。200mlの塩化メチレンを、次いで懸濁液に添加して濾過した。濾過物を2回、水を加えて振り、1回5%炭酸水素ナトリウムを加えて振り、次いで、水を加えて2回振った。硫酸ナトリウムで分離した有機相を乾燥させた。浴温<20℃で回転式エバポレーターでの蒸留により溶媒を除去した。残渣を2mlのアセトニトリルに懸濁して濾過した。この残渣をエーテルで洗浄した。
CPG-1caa-NHC(=O)-CH2-CH2-C(=O)-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-O-P(O-CH2-CH2-CN) (=N-SO2-Ph-p-N=N-Ph-p-NMe2)-O CH2-CH2-CH2-ODMTr
1.2gホスホ結合(phospholink)CPGロード49μmol/gをSchlenkフリットに充填して、アルゴン下で無水アセトニトリルで洗浄した。次いで、濾液が無色になるまで塩化メチレン中0.1Mジクロロ酢酸で洗浄した。その後、無水アセトニトリルで完全に洗浄した。その後、アセトニトリル中0.25Mジシアノイミダゾール(アクチベータ)2mlおよび2mlアクチベータで洗浄し、直後に2mlのスペーサーC3ホスホルアミダイトの0.1M溶液を添加した。次いで懸濁物を3分間静置した。アルゴン圧力下で濾過した。次いで、2mlアクチベータで洗浄し、再度2mlアクチベータで洗浄し、直後に2mlの0.1MスペーサーC3ホスホルアミダイト溶液を添加した。次いで、調製物を12分間静置した。溶媒をアルゴン圧力下で濾過し、2mlの塩化メチレン中0.1Mダブシルアジド溶液を添加して混合物を15分間静置した。修飾したCPGを最終的に100ml塩化メチレンで洗浄し、次いで100mlの無水アセトニトリルで洗浄し真空下で乾燥させた。
5’フルオレセイン-GCA CCA GAT CCA CGC CCT TGA TGA GC-O-CH2-CH2-CH2-O (O2)P(=N-SO2-Ph-p-N=N-Ph-p-NMe2)
オリゴヌクレオチド合成は、ABI 394合成機において1μmolスケールで行なった。実施例5aのダブシル-CPGを支持体材料として使用した。6-カルボキシフルオレセインホスホルアミダイト(Glen Research, Report No. 10 (GR10-1) (1997) 1-12)を5'標識に使用した。
リアルタイムPCRおよび融解曲線解析
ハイブリダイゼーションの際のリン酸模倣物の効果を解析するために、第V因子DNA定量的リアルタイムPCRと共にその後の融解曲線解析を、LightCycler 1.2(登録商標)装置(Roche Diagnostics GmbH)を用いて行なった。フルオレセイン/LightCycler Red 640 FRETハイブリダイゼーションプローブのペアと組み合わせてプライマーを使用した。プライマーおよび5'LightCycler Red 640プローブを一定に維持した。実施例4由来のリン酸を修飾した種々の3'フルオレセインプローブおよび参照として未修飾のフルオレセインプローブをFRETドナープローブとして使用した。増幅効率の測定値である交点(crossing point)上の効果および融点上の効果を評価した。
第V因子野生型遺伝子および変異体を含む106コピーのプラスミド(Gene Bank受託番号:M_014335)
13mM MgCl2
各500nMの配列番号:1および2を有するプライマー
各200nMのFRET配列番号:3および4を有するハイブリダイゼーションプローブ
配列番号:1
フォワードプライマー:
5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A
配列番号:2
リバースプライマー
5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA
配列番号:3
FRET受容体プローブ
5' LC-Red 640 AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT
配列番号:4
FRETドナープローブ
5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC-フルオレセイン
リアルタイムPCR + 融解曲線解析
a)リサミンアジド(=ローダミンB)の調製
5ml水中195mg(3.0mmol)アジ化ナトリウムの溶液を0℃で、20mlアセトン中577mg(1mmol)スルホローダミンB酸クロライドの溶液に滴下した。混合物を2時間、0℃で攪拌し、次いで6時間室温で攪拌した。混合物を分離漏斗に移し300mlの水および300mlの塩化メチレンを添加した。有機相を分離して100mlの水で2回洗浄した。硫酸ナトリウムで有機相を乾燥させた。回転式エバポレーターで蒸留により溶媒を除去した。それ以上精製することなく、残渣(140mg)をオリゴヌクレオチド合成に使用した。
オリゴヌクレオチド合成は、ABI 394合成機において1μlスケールで行なった。支持体材料として、市販のホスホ結合CPG(Glen Research)を使用した。標準的な合成に使用した全ての化学物質はGlen Researchから得た。Proligoのtert.ブチルフェノキシアセチル保護基を有するホスホルアミダイト(「tac」または「Expedite」モノマーとして公知)を使用した。
リアルタイムPCRの適当性を明らかにするために、第V因子DNAのリアルタイムPCRをLightCycler 2.0で実行した。リサミン(ローダミンB)がFRET受容体として作用する場合、フルオレセイン/リサミンFRETハイブリダイゼーションプローブのペアと組み合わせてプライマーを使用した。定量曲線を記録して、標的核酸の濃度の関数としてcp値を測定した。
修飾プライマーを用いたリアルタイムPCR
プライマー伸長に対するリン酸模倣物の効果を解析するために、ヒト第V因子DNAの定量的リアルタイムPCRを、LightCycler 1.2(登録商標)装置(Roche Diagnostics GmbH)を用いて行なった。プライマーペアの異なる位置に導入したP=N-pPh-NAc模倣物をヒト第V因子DNAの増幅に使用した。修飾プライマーは実施例4に従って合成した。実施例3のトリチル有り形式の逆相クロマトグラフィーにより精製を行なった。80%酢酸で20分間処理することで脱トリチル化を実施した。
ピリジニウムホスフェート模倣物(pyridinium phosphatmimetikum)を含むフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドの合成:
配列番号:4のオリゴヌクレオチドの合成は、ABI 394合成機において1μmolスケールで行なった。市販のLightCycler fluorescein CPG(Roche Applied Science)を支持体材料として使用した。標準的な合成に使用した全ての化学物質はGlen Researchから得た。Proligoのtert.ブチルフェノキシ-アセチル保護基を有するホスホルアミダイト(「tac」または「Expedite」モノマーとして公知)を使用した。
を含む中間体(intermeduiate)が生じた。
異なる温度およびpHで未修飾dAdTと比較したdA(P(=NSO2PhNHAc)dTジヌクレオチドの安定性
dA(P(=NSO2PhNHAc)dTは、実施例1に従って合成および精製した。dAdTはまた、実施例1に従って合成したが、標準的な酸化剤を使用した(0,02Mヨウ素入りTHF)。
Claims (9)
- 以下の構造
(式中、Aは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の5'末端を表すか、または固相に結合されたリンカーを表し、
Bは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の3'末端を表すか、またはリンカーを表し、
Dは、OHまたはCH3のいずれかであり、
Accは、電子受容体または残基Rで置換された電子受容体であり、Rは任意の有機置換基であり、Accは、
(i) -CN、
(ii) -SO2-R'(式中、R'は少なくとも1つのアミノ置換アルキル、任意に置換されたアリールまたは任意に置換された複素環を含む)
(iii) オルトもしくはパラ位に少なくとも1つのアルキル化N原子を有し、ピリジニウム、ピリミジニウムおよびキノリニウムからなる群より選択される6員環N+複素環
からなる群より選択される)
を少なくとも1回含む化合物。 - RもしくはR'単独、または電子受容体との組合せが検出可能な単位または官能基を含むことを特徴とする、請求項1記載の化合物。
- AおよびBが共に少なくとも2つのヌクレオチド残基を含むことを特徴とする、請求項1または2記載のオリゴヌクレオチド。
- 化学構造
(式中、Eは、メチル基または保護ヒドロキシル基のいずれかを表し、
式中、Aは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の5'末端を表すか、または固相に結合されたリンカーを表し、
式中、Bは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖の3'末端を表すか、またはリンカーを表す)
の3価のリンの誘導体を以下の構造
N=N=N-Acc
(式中、Accは、電子受容体または残基Rで置換された電子受容体であり、Rは任意の有機置換基であり、Accは、
(i) -CN、
(ii) -SO2-R'(式中、R'は少なくとも1つのアミノ置換アルキル、任意に置換されたアリールまたは任意に置換された複素環を含む)
(iii) オルトもしくはパラ位に少なくとも1つのアルキル化N原子を有し、ピリジニウム、ピリミジニウムおよびキノリニウムからなる群より選択される6員環N+複素環
からなる群より選択される)
のアジドと反応させることを特徴とする、修飾オリゴヌクレオチドの生成方法。 - 以下の工程
a) 3'ホスホルアミダイトと生成されるオリゴヌクレオチド鎖の5'OH末端を反応させる工程
b) 以下の構造
N=N=N-Acc
(式中、Accは、電子受容体または残基Rで置換された電子受容体であり、Rは任意の有機置換基であり、Accは、
(i) -CN、
(ii) -SO2-R'(式中、R'は少なくとも1つのアミノ置換アルキル、任意に置換されたアリールまたは任意に置換された複素環を含む)
(iii) オルトもしくはパラ位に少なくとも1つのアルキル化N原子を有し、ピリジニウム、ピリミジニウムおよびキノリニウムからなる群より選択される6員環N+複素環
からなる群より選択される)
と反応させる工程
を含む、請求項4記載の方法。 - RまたはR'が検出可能な単位である、請求項4または5記載の方法。
- ハイブリダイゼーションパートナーとしての、請求項1〜3記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- ハイブリダイゼーションプローブとしての、請求項7記載の使用。
- 細胞培養実験における、遺伝子発現を不活性化させるための請求項7記載の使用。
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