TW201904587A - 寡核苷酸組合物及其使用方法 - Google Patents

寡核苷酸組合物及其使用方法

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錢德拉 瓦吉斯
岩本直樹
大衛 查理斯 唐納 巴特勒
薩瑞曼尼恩 馬拉帕
根良 陸
敬新 張
維納德 菲希帕蒂卡
盧西安諾 安立奎 阿波尼
漢娜 瑪麗亞 溫斯尼斯卡
成夏耘
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新加坡商波濤生命科學有限公司
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Abstract

本發明尤其提供經設計之PNPLA3寡核苷酸、其組合物及方法。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物提供改良的單股RNA干擾及/或RNase H介導之減量。本發明尤其認識到，寡核苷酸之結構要素，諸如鹼基序列、化學修飾(例如，糖、鹼基及/或核苷酸間鍵聯之修飾)或其模式、與其他化學部分之結合及/或立體化學[例如，主鏈對掌性中心(對掌性核苷酸間鍵聯)之立體化學]及/或其模式可對寡核苷酸特性及活性(例如，RNA干擾(RNAi)活性、穩定性、傳遞等)具有重大影響。在一些實施例中，本發明提供使用所提供之寡核苷酸組合物，例如以RNA干擾及/或RNase H介導之減量之方式治療疾病的方法。

Description

寡核苷酸組合物及其使用方法
靶向PNPLA3之寡核苷酸(PNPLA3寡核苷酸)適用於各種應用，例如治療性應用。天然產生之核酸(例如，未經修飾之DNA或RNA)之使用可受到限制，例如由於其對核酸內切酶及核酸外切酶之易感性而受到限制。
本發明尤其認識到，控制PNPLA3寡核苷酸之結構要素，諸如化學修飾(例如，糖、鹼基及/或核苷酸間鍵聯之修飾)或其模式、立體化學(例如，主鏈對掌性核苷酸間鍵聯之立體化學)或其模式之改變及/或與另一化學部分(例如，脂質部分、靶向部分、碳水化合物部分、結合於去唾液酸醣蛋白受體或ASGPR之部分(例如，GalNAc部分)等等)結合，可對PNPLA3寡核苷酸特性及/或活性具有重大影響。在一些實施例中，該等特性及/或活性包括(但不限於)參與導引PNPLA3基因或其基因產物之表現、活性或含量的降低，其係例如由RNA干擾(RNAi干擾)、單股RNA干擾(ssRNAi)、RNase H介導的減量、轉譯位阻等所介導。
應瞭解，前文一般描述與以下詳細描述僅舉例說明及解釋而非限制所主張之本發明。
本發明之詳細描述
參考本發明之例示性實施例之以下詳細描述及其中所包括之實例可更容易理解本發明。
應理解，本發明不限於特定合成製備方法，其當然可有所變化。亦應理解，本文所用術語僅出於描述特定實施例之目的且不意欲為限制性的。
在一些實施例中，本發明認識到，立體化學(尤其主鏈對掌性中心之立體化學)可出人意料地改良PNPLA3寡核苷酸之特性。與提高穩定性的一些結構要素亦可降低活性(例如，RNA干擾)的許多先前觀測結果相反，本發明證實控制立體化學可出人意料地在提高穩定性的同時不顯著降低活性。
在一些實施例中，本發明提供具有特定5'端結構之寡核苷酸。
在一些實施例中，本發明提供在根據本發明使用時可為寡核苷酸提供高生物活性(例如，RNAi活性)的5'端結構。
在一些實施例中，本發明認識到，諸如脂質部分及/或碳水化合物部分之各種其他化學部分在併入寡核苷酸中時可改良一或多種PNPLA3寡核苷酸特性，諸如PNPLA3靶基因或其基因產物之減量。在一些實施例中，另一化學部分為視情況存在的。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸可包含多於一個其他化學部分。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸可包含兩個或更多個其他化學部分，其中該等其他化學部分相同或不相同，或屬於相同類別(例如，靶向部分、碳水化合物部分、結合於ASPGR之部分、脂質部分等)或不屬於相同類別。在一些實施例中，某些其他化學部分有助於將寡核苷酸傳遞至所需細胞、組織及/或器官。在一些實施例中，某些其他化學部分促進寡核苷酸之內化及/或提高寡核苷酸穩定性。
在一些實施例中，本發明提供實現對偶基因特異性抑制之PNPLA3寡核苷酸組合物，其中來自特定靶基因的一個對偶基因之轉錄物相對於同一基因的至少一個其他對偶基因選擇性地被減量。
在一些實施例中，本發明證實，某些所提供的結構要素、技術及/或特徵特別適用於參與及/或導引RNAi機制之PNPLA3寡核苷酸(例如，RNAi劑)。然而，無論如何，本發明之教示不限於參與任何特定機制或經由任何特定機制起作用之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明係關於經由任何機制起作用之任何寡核苷酸，且其包含本文中描述之任何序列、結構或型式(或其部分)。在一些實施例中，本發明提供一種經由任何機制起作用之PNPLA3寡核苷酸，且其包含本文中描述之任何序列、結構或型式(或其部分)，包括(但不限於)：任何5'端結構；5'端區域；第一區域(包括(但不限於)種子區域)；第二區(包括(但不限於)種子後區域)；及3'端區域(其可為3'端二核苷酸及/或3'端帽)；視情況存在之另一化學部分(包括(但不限於)靶向部分、碳水化合物部分、結合APGR之部分及脂質部分)；立體化學或立體化學模式；修飾或修飾模式；核苷酸間鍵聯或核苷酸間鍵聯模式；糖修飾或糖修飾模式；鹼基修飾或鹼基修飾模式。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可參與(例如，導引) RNAi機制。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可參與RNase H (核糖核酸酶H)機制。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可充當轉譯抑制劑(例如，可提供轉譯之立體阻斷)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可為治療性的。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸適用於治療性應用、診斷性應用、研究應用及/或奈米材料應用。在一些實施例中，標靶為意欲改變與其相關之一或多種產物(例如，RNA及/或蛋白質產物)之表現及/或活性的特定對偶基因。在許多實施例中，靶對偶基因係其存在及/或表現與一或多種病症及/或病狀之存在、發生及/或嚴重程度相關聯(例如，相關)的對偶基因。替代地或另外，在一些實施例中，靶對偶基因係其一或多種基因產物之含量及/或活性的改變與疾病及/或病狀之一或多個態樣的改善(例如，發作延遲、嚴重程度降低、對其他治療之反應等等)相關的對偶基因。
在一些實施例中，在特定對偶基因(疾病相關對偶基因)之存在及/或活性與一或多種病症、疾病及/或病狀之存在、發生及/或嚴重程度相關聯(例如，相關)的情況下，同一基因之不同對偶基因存在但並不怎麼相關聯或在較小程度上相關聯(例如，展現不太明顯或統計學上不明顯的相關性)。在一些此類實施例中，如本文中描述之寡核苷酸及其方法可相對於一或多個較不相關/不相關對偶基因而優先或特異性地靶向相關對偶基因，由此介導對偶基因特異性抑制。
在一些實施例中，PNPLA3靶序列係如本文中描述之PNPLA3寡核苷酸所結合之序列。在許多實施例中，靶序列與所提供寡核苷酸或其中之連續殘基的序列一致或為其對應互補序列(例如，所提供之寡核苷酸包括與靶序列一致或為其對應互補序列的標靶結合序列)。在一些實施例中，標靶結合序列為轉錄物(例如，前mRNA、mRNA等)之靶序列的對應互補序列。標靶結合序列/靶序列可具有各種長度以為寡核苷酸提供所需活性及/或特性。在一些實施例中，標靶結合序列/靶序列包含5至50個鹼基。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸(之相關部分)與其靶序列之間容許少數差異/錯配，包括(但不限於)標靶及/或寡核苷酸序列之5'端及/或3'端區域。在許多實施例中，靶序列存在於由靶基因產生之轉錄物(例如，mRNA及/或前mRNA)內。
在一些實施例中，靶序列包括一或多個對偶基因位點(亦即，靶基因內出現對偶基因變異之位置)。在一些實施例中，對偶基因位點為突變。在一些實施例中，對偶基因位點為SNP。在一些此類實施例中，所提供之寡核苷酸相對於一或多個其他對偶基因優先或特異性地結合於一個對偶基因。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸優先結合於疾病相關對偶基因。舉例而言，在一些實施例中，本文所提供之PNPLA3寡核苷酸(或其標靶結合序列部分)具有至少部分地與靶序列之特定對偶基因版本一致或為其對應互補序列的序列。
除非另外指出，否則所有序列(包括(但不限於)鹼基序列以及化學、修飾及/或立體化學之模式)以5'至3'次序呈現。
在一些實施例中，本發明提供與PNPLA3寡核苷酸有關之組合物及方法，該PNPLA3寡核苷酸對標靶具有特異性，且具有或包含本文所揭示之任何寡核苷酸之鹼基序列或本文所揭示之任何寡核苷酸之鹼基序列中至少15個連續核苷酸之區域，其中該鹼基序列中之第一核苷酸或該等至少15個連續核苷酸中之第一核苷酸可視情況經T或DNA T置換。在一些實施例中，寡核苷酸能夠導引ssRNAi。
在一些實施例中，本發明提供一種包含第一複數個寡核苷酸之PNPLA3寡核苷酸組合物，該第一複數個寡核苷酸具有共同鹼基序列且包含一或多個核苷酸間鍵聯、糖及/或鹼基修飾。
在一些實施例中，核苷酸為天然核苷酸。在一些實施例中，核苷酸為經修飾核苷酸。在一些實施例中，核苷酸為核苷酸類似物。在一些實施例中，鹼基為經修飾鹼基。在一些實施例中，鹼基為受保護核鹼基，諸如用於寡核苷酸合成之受保護核鹼基。在一些實施例中，鹼基為鹼基類似物。在一些實施例中，糖為經修飾之糖。在一些實施例中，糖為糖類似物。在一些實施例中，核苷酸間鍵聯為經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，核苷酸包含鹼基、糖及核苷酸間鍵聯，其中該鹼基、該糖及該核苷酸間鍵聯中之各者獨立地且視情況為天然產生或非天然產生的。在一些實施例中，核苷包含鹼基及糖，其中該鹼基及該糖中之各者獨立地且視情況為天然產生或非天然產生的。核苷酸之非限制性實例包括DNA (2'-去氧)及RNA (2'-OH)核苷酸；及包含鹼基、糖及/或核苷酸間鍵聯處之一或多個修飾的彼等核苷酸。糖之非限制性實例包含核糖及去氧核糖；及具有2'-修飾之核糖及去氧核糖，該等2'-修飾包括(但不限於) 2'-F、LNA、2'-OMe及2'-MOE修飾。在一些實施例中，核苷酸間鍵聯可具有如本發明中所描述之式I結構。在一些實施例中，核苷酸間鍵聯為不包含磷但用以連接兩個天然或非天然糖的部分。
在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控PNPLA3寡核苷酸組合物，在與例如不存在該組合物或存在參考組合物(例如，具有相同鹼基序列及化學修飾之寡核苷酸的立體無規組合物)之參考條件相比較時，該對掌性受控PNPLA3寡核苷酸組合物導引PNPLA3基因或其基因產物之表現、活性及/或含量之較大程度降低；單股RNA干擾；及/或RNase H介導之減量。
在一些實施例中，包含複數個寡核苷酸之PNPLA3寡核苷酸組合物為立體無規的，因為該複數個寡核苷酸在任何對掌性核苷酸間鍵聯處不共用共同立體化學。在一些實施例中，包含複數個寡核苷酸之PNPLA3寡核苷酸組合物為對掌性受控的，因為該複數個寡核苷酸在一或多個對掌性核苷酸間鍵聯處共用共同立體化學。在一些實施例中，包含第一複數個寡核苷酸的對掌性受控PNPLA3寡核苷酸組合物相對於包含第一複數個寡核苷酸的立體無規PNPLA3寡核苷酸組合物而言，對核酸內切酶及核酸外切酶之易感性降低。
在一些實施例中，一種組合物包含兩個或多於兩個以下任一者之多聚體：第一複數個PNPLA3寡核苷酸及/或第二複數個寡核苷酸，其中該第一及第二複數個寡核苷酸可獨立地經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量而獨立地導引相同或不同標靶之減量。
在一些實施例中，包含複數個寡核苷酸(例如，第一複數個寡核苷酸)之PNPLA3寡核苷酸組合物為對掌性受控的，因為該複數個寡核苷酸在一或多個對掌性核苷酸間鍵聯處獨立地共用共同立體化學。在一些實施例中，該複數個寡核苷酸在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50個或更多個對掌性核苷酸間鍵聯處共用共同立體化學組態，其各自獨立地為R p或S p。在一些實施例中，該複數個寡核苷酸在各對掌性核苷酸間鍵聯處共用共同立體化學組態。在一些實施例中，組合物中預定含量之寡核苷酸共用共同立體化學組態(獨立地R p或S p)的情況下，對掌性核苷酸間鍵聯被稱為對掌性受控核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，至少5個核苷酸間鍵聯為對掌性受控的；在一些實施例中，至少10個核苷酸間鍵聯為對掌性受控的；在一些實施例中，至少15個核苷酸間鍵聯為對掌性受控的；在一些實施例中，各對掌性核苷酸間鍵聯為對掌性受控。
在一些實施例中，本發明提供一種包含第一複數個PNPLA3寡核苷酸之PNPLA3寡核苷酸組合物，該第一複數個PNPLA3寡核苷酸共用： 1)共同鹼基序列； 2)共同主鏈鍵聯模式；及 3)共同主鏈對掌性中心模式，該組合物為實質上純的單一寡核苷酸製劑，因為該組合物中預定含量之寡核苷酸具有共同鹼基序列及長度、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式。
在一些實施例中，共同主鏈對掌性中心模式包含至少一個包含對掌性受控對掌性中心之核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，寡核苷酸含量及/或非對映異構純度可藉由分析方法測定，該等分析方法例如層析方法、光譜測定方法、光譜學方法或其任何組合。
本發明尤其認識到，立體無規PNPLA3寡核苷酸製劑含有複數個彼此不同的獨特化學實體，例如在寡核苷酸鏈內之個別主鏈對掌性中心之立體化學結構(或立體化學)方面不同。在不控制主鏈對掌性中心之立體化學的情況下，立體無規寡核苷酸製劑提供不受控組合物，其包含不確定含量之寡核苷酸立體異構體。即使此等立體異構體可具有相同鹼基序列及/或化學修飾，但至少歸因於其不同的主鏈立體化學，所以其仍為不同的化學實體，且如本文所展現，其可具有不同特性，例如對核酸酶之敏感性、活性、分佈等。在一些實施例中，特定立體異構體可例如由其鹼基序列、其長度、其主鏈鍵聯模式及其主鏈對掌性中心模式定義。在一些實施例中，本發明證實，經由控制PNPLA3寡核苷酸內之立體化學而達成的特性及活性之改良可與經由使用化學修飾而達成的彼等改良相當或甚至更佳。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸在5'至3'次序上包含5'端區域、種子區域、種子後區域及3'端區域，視情況進一步包含另一化學部分。
在一些實施例中，5'端區域為PNPLA3寡核苷酸中5'至種子區域之整個部分。在一些實施例中，3'端區域為PNPLA3寡核苷酸中3'至種子後區域之整個部分。
在一些實施例中，5'端結構為5'端基。
在一些實施例中，5'端結構包含5'端基。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知的5'端區域、5'端結構、5'端基、5'端核苷或5'端核苷酸。
在一些實施例中，5'端結構、5'端區域、5'核苷酸部分、種子區域、種子後區域、3'端二核苷酸及/或3'端帽獨立地具有本文中描述或此項技術中已知的任何結構。在一些實施例中，可組合以下各者：本文中描述或此項技術中已知的5'端之任何結構；及/或本文中描述或此項技術中已知的5'核苷酸部分之任何結構；及/或本文中描述或此項技術中已知的種子區域之任何結構；及/或本文中描述或此項技術中已知的種子後區域之任何結構；及/或本文中描述或此項技術中已知的3'端二核苷酸之任何結構；及/或本文中描述或此項技術中已知的3'端帽之任何結構。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個嵌段。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個嵌段，其中嵌段包含一或多個連續核苷及/或核苷酸及/或糖或鹼基及/或核苷酸間連接物。在一些實施例中，嵌段涵蓋整個種子區域或其部分。在一些實施例中，嵌段涵蓋整個種子後區域或其部分。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為嵌段體。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為包含交替嵌段之交替體。在一些實施例中，嵌段體或交替體可由化學修飾(包括存在或不存在)或其模式定義，該等化學修飾例如鹼基修飾、糖修飾、核苷酸間鍵聯修飾、立體化學等。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個糖修飾。在一些實施例中，糖修飾在2'位置處。在一些實施例中，糖修飾係選自：2'-F、2'-OMe及2'-MOE。2'-F亦稱為2'氟。2'-OMe亦稱為2'-O-甲基。2'-MOE亦稱為2'-甲氧基乙基或MOE。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸僅包含兩個2'-F。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸僅包含兩個2'-F，其中該兩個核苷酸在第2位置及第14位置處。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸僅包含兩個2'-F，其中該兩個核苷酸在第2位置及第14位置處，且其中第一核苷酸為2'-去氧。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸僅包含兩個2'-F，其中該兩個核苷酸在第2位置及第14位置處，且其中第一核苷酸為2'-去氧T。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸僅包含兩個2'-F，其中該兩個核苷酸在第2位置及第14位置處，且其中第一核苷酸為2'-去氧，且5'端結構為-OH。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸僅包含兩個2'-F，其中該兩個核苷酸在第2位置及第14位置處，且其中第一核苷酸為2'-去氧T，且5'端結構為-OH。
在本文中之一些實施例中，提及PNPLA3寡核苷酸時，「第一」(例如，第一核苷酸)係指寡核苷酸之5'端，且「最末」或「末端」(例如，最末核苷酸或末端核苷酸)係指3'端。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含具有特定修飾的糖，該等糖與不具有修飾或具有不同修飾的糖交替。在一些實施例中，具有特定修飾的糖出現在一或多個嵌段中。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個嵌段，其包含具有特定2'修飾的糖，該等糖與獨立地不具有修飾或具有不同修飾的糖交替。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個嵌段，其包含具有2'-F修飾的糖，該等糖與獨立地不具有修飾或具有不同修飾的糖交替。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個嵌段，其包含具有2'-OMe修飾的糖，該等糖與獨立地不具有修飾或具有不同修飾的糖交替。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個嵌段，其包含具有2'-OMe修飾的糖，該等糖與具有2'-F修飾的糖交替。
在一些實施例中，糖嵌段具有或包含以下中之任一者之2'修飾模式：ff、fffm、fffmm、fffmmm、fffmmmm、fffmmmmm、fffmmmmmm、fffmmmmmmf、fffmmmmmmff、fffmmmmmmffm、fffmmmmmmffmm、fffmmmmmmffmmf、fffmmmmmmffmmfm、fffmmmmmmffmmfmf、fffmmmmmmffmmfmfm、fffmmmmmmffmmfmfmf、fffmmmmmmffmmfmfmfm、fffmmmmmmffmmfmfmfmm、fffmmmmmmffmmfmfmfmmm、ffmmffmm、ffmmmmmmffmmfmfmfmmm、fmfmfmfmfmfmfm、fmfmfmfmfmfmfmf、fmfmfmfmfmfmfmfm、fmfmfmfmfmfmfmfmf、fmfmfmfmfmfmfmfmfm、fmfmfmfmfmfmfmfmfmf、fmfmfmfmfmfmfmfmfmfm、fmfmfmfmfmfmfmfmfmfmm、fmfmfmfmfmfmfmfmfmm、fmfmfmfmfmfmfmfmm、fmfmfmfmfmfmfmm、fmfmfmfmfmfmmm、fmmffmm、fmmmmmmffmmfmfmfmmm、mff、mffm、mffmf、mffmff、mffmffm、mffmmffmm、mfmfm、mfmfmfmfmfffmfmfmfmmm、mfmfmfmfmfmfmfm、mfmfmfmfmfmfmfmfmfmm、mfmfmfmfmfmfmfmfmfmmm、mfmfmfmfmfmfmfmfmm、mfmfmfmfmfmfmfmm、mfmfmfmfmfmfmm、mfmfmfmfmfmfmmm、mfmfmfmfmfmmm、mfmfmfmfmfmmmfm、mfmfmfmfmfmmmmm、mfmfmfmfmmm、mfmfmfmfmmmfmfm、mfmfmfmfmmmfmmm、mfmfmfmfmmmmmfm、mfmfmfmmm、mfmfmfmmmfmfmfm、mfmfmfmmmfmfmmm、mfmfmfmmmfmmmfm、mfmfmfmmmmmfmfm、mfmfmmm、mfmfmmmfmfmfmfm、mfmfmmmfmfmfmmm、mfmfmmmfmfmmmfm、mfmfmmmfmmmfmfm、mfmfmmmmmfmfmfm、mfmmm、mfmmmfmfmfmfmfm、mfmmmfmfmfmfmmm、mfmmmfmfmfmmmfm、mfmmmfmfmmmfmfm、mfmmmfmmmfmfmfm、mfmmmfmmmfmfmfm、mfmmmmmfmfmfmfm、mmffm、mmffmm、mmffmm、mmffmmf、mmffmmff、mmffmmffm、mmffmmffmm、mmffmmfmfmfmmm、mmm、mmmffmmfmfmfmmm、mmmfmfmfmfmfmfm、mmmfmfmfmfmfmmm、mmmfmfmfmfmmmfm、mmmfmfmfmmmfmfm、mmmfmfmmmfmfmfm、mmmfmmmfmfmfmfm、mmmmffmmfmfmfmmm、mmm、mmmm、mmmmm、mmmmmffmmfmfmfmmm、mmmmmfmfmfmfmfm、mmmmmm、mmmmmmffmmfmfmfmmm、mfmf、mfmf、mfmfmf、fmfm、fmfmfm、fmfmfmf、dfdf、dfdfdf、dfdfdfdf、fdfd、fdfdfd、fdfdfdfd、dfdfmfmf、dfmfmf、mfdfmf或dfmfdf，其中m表示2'-OMe，f表示2'-F，且d表示2'位置處無取代。在一些實施例中，種子區域及/或種子後區域可包含糖修飾嵌段。
在一些實施例中，嵌段為立體化學嵌段。在一些實施例中，嵌段為R p嵌段，因為該嵌段之各核苷酸間鍵聯為R p。在一些實施例中，種子區域嵌段為R p嵌段。在一些實施例中，種子後區域嵌段為R p嵌段。在一些實施例中，嵌段為S p嵌段，因為該嵌段之各核苷酸間鍵聯為S p。在一些實施例中，種子區域嵌段為S p嵌段。在一些實施例中，種子後區域嵌段為S p嵌段。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含R p及S p嵌段兩者。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個R p嵌段，但無S p嵌段。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個S p嵌段，但無R p嵌段。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個PO嵌段，其中該等嵌段之各核苷酸間鍵聯為天然磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，種子區域嵌段為S p嵌段，其中各糖部分包含2'-F修飾。在一些實施例中，種子區域嵌段為S p嵌段，其中核苷酸間鍵聯各自為經修飾之核苷酸間鍵聯且各糖部分包含2'-F修飾。在一些實施例中，種子區域嵌段為S p嵌段，其中核苷酸間鍵聯各自為硫代磷酸酯鍵聯且各糖部分包含2'-F修飾。在一些實施例中，種子區域嵌段包含4個或更多個核苷單元。在一些實施例中，核苷單元為核苷。在一些實施例中，種子區域嵌段包含5個或更多個核苷單元。在一些實施例中，種子區域嵌段包含6個或更多個核苷單元。在一些實施例中，種子區域嵌段包含7個或更多個核苷單元。在一些實施例中，種子後區域嵌段為S p嵌段，其中各糖部分包含2'-F修飾。在一些實施例中，種子後區域嵌段為S p嵌段，其中核苷酸間鍵聯各自為經修飾之核苷酸間鍵聯且各糖部分包含2'-F修飾。在一些實施例中，種子後區域嵌段為S p嵌段，其中核苷酸間鍵聯各自為硫代磷酸酯鍵聯且各糖部分包含2'-F修飾。在一些實施例中，種子後區域嵌段包含4個或更多個核苷單元。在一些實施例中，種子後區域嵌段包含5個或更多個核苷單元。在一些實施例中，種子後區域嵌段包含6個或更多個核苷單元。在一些實施例中，種子後區域嵌段包含7個或更多個核苷單元。在一些實施例中，種子區域及/或種子後區域可包含嵌段。在一些實施例中，種子區域及/或種子後區域包含立體化學嵌段。
在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含第一複數個寡核苷酸，其： 1)具有共同鹼基序列；及 2)包含一或多個經修飾之糖部分及經修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含能夠導引單股RNA干擾之第一複數個寡核苷酸，其： 1)具有與轉錄物中之靶序列互補的共同鹼基序列；及 2)包含一或多個經修飾之糖部分及經修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，參考條件為不存在該組合物。在一些實施例中，參考條件為存在參考組合物。包含參考的複數個寡核苷酸的例示性參考組合物廣泛描述於本發明中。在一些實施例中，相比於所提供組合物中之第一複數個寡核苷酸，參考的複數個寡核苷酸具有不同的結構要素(化學修飾、立體化學等)。在一些實施例中，包含第一複數個寡核苷酸的所提供寡核苷酸組合物為對掌性受控的，因為該第一複數個寡核苷酸包含一或多個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，包含第一複數個寡核苷酸的所提供寡核苷酸組合物為對掌性受控的，因為該第一複數個寡核苷酸包含1至20個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，參考組合物為具有相同化學修飾之寡核苷酸的立體無規製劑。在一些實施例中，參考組合物為立體異構體混合物，而所提供之組合物為一種立體異構體的單股RNAi劑。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸具有與所提供組合物中之第一複數個寡核苷酸相同的鹼基序列。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸具有與所提供組合物中之第一複數個寡核苷酸相同的化學修飾。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸具有與所提供組合物中之第一複數個寡核苷酸相同的糖修飾。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸具有與所提供組合物中之第一複數個寡核苷酸相同的鹼基修飾。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸具有與所提供組合物中之第一複數個寡核苷酸相同的核苷酸間鍵聯修飾。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸具有與所提供組合物中之第一複數個寡核苷酸相同的鹼基序列及相同的化學修飾。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸具有與所提供組合物中之第一複數個寡核苷酸相同的立體化學，但例如鹼基修飾、糖修飾、核苷酸間鍵聯修飾等化學修飾不同。
在一些實施例中，本發明提供一種包含PNPLA3寡核苷酸之組合物，其中該寡核苷酸與標靶RNA序列互補或實質上互補，長度為總共約15至約49個核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一個非天然鹼基、糖及/或核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，本發明提供一種包含單股RNAi劑的PNPLA3寡核苷酸組合物，其中該單股RNAi劑與標靶RNA序列互補或實質上互補，長度為總共約15至約49個核苷酸，且能夠導引標靶特異性RNA干擾，其中該單股RNAi劑包含至少一個非天然鹼基、糖及/或核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，長度為總共15至49個、約17至約49個、17至49個、約19至約29個、19至29個、約19至約25個、19至25個、約19至約23個或19至23個核苷酸。
在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含第一複數個寡核苷酸，其： 1)具有與轉錄物中之靶序列互補或實質上互補的共同鹼基序列；及 2)包含一或多個經修飾之糖部分及經修飾之核苷酸間鍵聯， 該寡核苷酸組合物之特徵在於，當其與轉錄物接觸時，轉錄物之減量相對於在參考條件下觀測到的減量得到改良，該等參考條件選自由不存在該組合物、存在參考組合物及其組合組成之群。
在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含能夠導引單股RNA干擾之第一複數個寡核苷酸，其： 1)具有與轉錄物中之靶序列互補的共同鹼基序列；及 2)包含一或多個經修飾之糖部分及經修飾之核苷酸間鍵聯， 該寡核苷酸組合物之特徵在於，當其與RNA干擾系統中之轉錄物接觸時，該轉錄物的RNAi介導之減量相對於在參考條件下觀測到的減量得到改良，該等參考條件選自由不存在該組合物、存在參考組合物及其組合組成之群。
在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含第一複數個寡核苷酸，其中該第一複數個寡核苷酸屬於由以下定義之特定寡核苷酸類型： 1)鹼基序列； 2)主鏈鍵聯模式； 3)主鏈對掌性中心模式；及 4)主鏈磷修飾模式。
在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含能夠導引單股RNA干擾的第一複數個寡核苷酸，其中該第一複數個寡核苷酸屬於由以下定義之特定寡核苷酸類型： 1)鹼基序列； 2)主鏈鍵聯模式； 3)主鏈對掌性中心模式；及 4)主鏈磷修飾模式。
在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含PNPLA3寡核苷酸類型之第一複數個寡核苷酸，其中該寡核苷酸類型由以下定義： 1)鹼基序列； 2)主鏈鍵聯模式； 3)主鏈對掌性中心模式；及 4)主鏈磷修飾模式， 該組合物為對掌性受控的，因為相對於具有相同鹼基序列之寡核苷酸的實質上外消旋製劑而言，該組合物中該特定寡核苷酸類型之寡核苷酸增濃， 該寡核苷酸組合物之特徵在於，當其與轉錄物接觸時，轉錄物之減量相對於在參考條件下觀測到的減量得到改良，該等參考條件選自由不存在該組合物、存在參考組合物及其組合組成之群。
在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含能夠導引單股RNA干擾且屬於PNPLA3寡核苷酸類型之第一複數個寡核苷酸，其中該寡核苷酸類型由以下定義： 1)鹼基序列； 2)主鏈鍵聯模式； 3)主鏈對掌性中心模式；及 4) 主鏈磷修飾模式， 該組合物為對掌性受控的，因為相對於具有相同鹼基序列之寡核苷酸的實質上外消旋製劑而言，該組合物中該特定寡核苷酸類型之寡核苷酸增濃， 該寡核苷酸組合物之特徵在於，當其與RNA干擾系統中之轉錄物接觸時，該轉錄物的RNAi介導之減量相對於在參考條件下觀測到的減量得到改良，該等參考條件選自由不存在該組合物、存在參考組合物及其組合組成之群。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸具有圖1中所示型式中之任一者，或圖1中所示形式中之任一者中所示的任何結構要素。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑具有圖1中所示型式中之任一者，或圖1中所示型式中之任一者中所示的任何結構要素。
本發明尤其提供表明所揭示型式之各種寡核苷酸在靶向若干不同基因中任一者中之若干不同序列中之任一者時能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量減少的資料。在一些實施例中，本發明提供表明所揭示型式之各種RNAi劑能夠導引針對多種不同基因中任一者中之多種不同序列中之任一者之RNA干擾的資料。
在一些實施例中，具有本文中所描述及/或說明之結構中之任一者的PNPLA3寡核苷酸能夠導引RNA干擾。在一些實施例中，具有本文中所描述及/或說明之結構中之任一者的PNPLA3寡核苷酸能夠導引RNase H介導之減量。在一些實施例中，具有本文中所描述及/或說明之結構中之任一者的PNPLA3寡核苷酸能夠導引RNA干擾及/或RNase H介導之減量。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含本文中描述之任何寡核苷酸之任何結構要素，或本文中描述或圖1中所示之任何型式。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含本文中描述之任何寡核苷酸之任何結構要素，或本文中描述或圖1中所示之任何型式，且能夠導引RNA干擾。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含本文中描述之任何寡核苷酸之任何結構要素，或本文中描述或圖1中所示之任何型式，且能夠導引RNase H介導之減量。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含本文中描述之任何寡核苷酸之任何結構要素，或本文中描述或圖1中所示之任何型式，且能夠導引RNA干擾及/或RNase H介導之減量。
在一些實施例中，RNAi劑包含以下中之任一者或多者：5'端結構、5'端區域、種子區域、種子後區域及3'端區域，以及視情況存在之另一化學部分。在一些實施例中，種子區域為本文中描述或此項技術中已知的任何種子區域。在一些實施例中，種子後區域可為本文中描述或此項技術中已知的種子區域與3'端區域之間的任何區域。在一些實施例中，3'端區域可為本文中描述或此項技術中已知的任何3'端區域。在一些實施例中，任何視情況存在之其他化學部分可為本文中描述或此項技術中已知的任何視情況存在之其他化學部分。本文中描述或此項技術中已知的任何個別5'端結構、5'端區域、種子區域、種子後區域、3'端區域及視情況存在之其他化學部分可獨立地與本文中描述或此項技術中已知的任何其他5'端結構、5'端區域、種子區域、種子後區域、3'端區域及視情況存在之其他化學部分組合。在一些實施例中，作為非限制性實例，單股RNAi劑之一個區域為5'端結構、5'端區域、種子區域、種子後區域、種子區域的一部分、種子後區域的一部分或3'端二核苷酸。
在一些實施例中，所提供寡核苷酸之鹼基序列由本文中所揭示之任何寡核苷酸之鹼基序列組成。在一些實施例中，所提供寡核苷酸之鹼基序列包含本文中所揭示之任何寡核苷酸之鹼基序列。在一些實施例中，所提供寡核苷酸之鹼基序列包含包括以下之序列：本文中所揭示之任何寡核苷酸之鹼基序列中15個連續鹼基之序列。在一些實施例中，所提供寡核苷酸之鹼基序列包含包括以下之序列：本文中所揭示之任何寡核苷酸之鹼基序列中20個連續鹼基(具有至多5個錯配)之序列。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引單股RNAi干擾。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引RNase H介導之減量。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引單股RNA干擾及RNase H介導之減量。在一些實施例中，寡核苷酸包含靶向本文中所揭示之寡核苷酸所靶向的任何轉錄物或基因的序列。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸靶向PNPLA3。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可用於降低或抑制PNPLA3基因或其基因產物之活性、含量及/或表現。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可用於降低或抑制基因或其基因產物之活性、含量及/或表現，其中基因或其基因產物之以下情形與疾病有關、引起疾病或與疾病相關聯：異常或過度活性、含量及/或表現；不利突變；或異常組織分佈或細胞間或細胞內分佈。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可用於治療病症及/或用於製造用以治療病症之藥劑，該病症與基因或其基因產物之異常或過度活性、含量及/或表現或異常分佈有關、由其引起及/或與其相關聯。
在一些實施例中，本發明係關於使用本文中所揭示之寡核苷酸之方法，該等寡核苷酸能夠靶向PNPLA3且適用於治療PNPLA3相關病症及/或製造用於該病症之治療劑。
在一些實施例中，能夠靶向基因之PNPLA3寡核苷酸包含為靶基因之鹼基序列之一部分或與靶基因之鹼基序列之一部分互補或實質上互補的鹼基序列。在一些實施例中，一部分之長度至少為15個鹼基。在一些實施例中，單股RNAi劑之鹼基序列可包含以下或由以下組成：與指定鹼基序列之間具有指定最大數目個錯配的鹼基序列。
在一些實施例中，錯配為當最大限度地比對及比較兩個序列時，鹼基序列或長度之間的差異。作為非限制性實例，若在一個序列中之特定位置處的鹼基與另一序列中之對應位置處的鹼基之間存在差異，則視為錯配。因此，舉例而言，若一個序列中之位置具有特定鹼基(例如，A)，且另一序列上之對應位置具有不同鹼基(例如，G、C或U)，則視為錯配。例如，若一個序列中之位置具有鹼基(例如，A)，且另一序列上之對應位置不含鹼基(例如，該位置為包含磷酸酯-糖主鏈但不含鹼基的無鹼基核苷酸)或跳過該位置，則亦視為錯配。任一序列中(或有義股或反義股中)之單股缺口可不視為錯配，舉例而言，若一個序列包含序列5'-AG-3'，而另一序列包含在A與G之間具有單股缺口的序列5'-AG-3'，則不視為錯配。鹼基修飾一般不視為錯配，舉例而言，若一個序列包含C，且另一序列在相同位置處包含經修飾之C (例如，5mC)，則可不視為錯配。在一些實施例中，出於考慮錯配之目的，T取代U或反過來不視為錯配。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸與靶序列(例如，RNA，諸如mRNA)互補或完全互補或100%互補，意謂該寡核苷酸之鹼基序列與同靶序列完全互補之序列(例如，經由Watson-Crick鹼基配對之鹼基對)之間不具有錯配。不希望受任何特定理論束縛，本發明指出，對於單股RNAi劑而言，5'端核苷酸部分或3'端二核苷酸不需要與標靶鹼基配對。此等部分可為錯配。此外，反義寡核苷酸或單股RNAi劑可具有少數內部錯配，但仍導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低及/或導引RNase H介導之減量及/或RNA干擾。若PNPLA3寡核苷酸(例如，反義寡核苷酸或單股RNAi劑)之第一鹼基序列與同靶序列100%互補的參考鹼基序列之間具有少數錯配，則該第一鹼基序列與靶序列實質上互補。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸(例如，反義寡核苷酸或單股RNAi劑)可具有與靶序列互補或實質上互補的鹼基序列。在一些實施例中，互補係基於Watson-Crick鹼基對(鳥嘌呤-胞嘧啶及腺嘌呤-胸腺嘧啶/尿嘧啶)而判定，其中鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶可視情況且獨立地經修飾但維持其未經修飾時之配對氫鍵模式。在一些實施例中，與另一序列互補的序列包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個鹼基。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、寡核苷酸組合物或寡核苷酸類型具有共同主鏈鍵聯模式。在一些實施例中，共同主鏈鍵聯模式包含至少10個經修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，共同主鏈鍵聯模式包含至少10個硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、寡核苷酸組合物或寡核苷酸類型具有共同主鏈對掌性中心模式。在一些實施例中，共同主鏈對掌性中心模式包含至少1個呈S p組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，共同主鏈對掌性中心模式包含至少1個核苷酸間鍵聯，其為呈S p組態之硫代磷酸酯。在一些實施例中，所提供組合物中之寡核苷酸具有共同主鏈磷修飾模式。在一些實施例中，所提供之組合物為對掌性受控的PNPLA3寡核苷酸組合物，因為該組合物含有預定含量之個別寡核苷酸類型之寡核苷酸，其中PNPLA3寡核苷酸類型由以下定義： 1)鹼基序列； 2)主鏈鍵聯模式； 3)主鏈對掌性中心模式；及 4)主鏈磷修飾模式。
如上文所指出及此項技術中所瞭解，在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列可指寡核苷酸中之核苷殘基(例如，糖及/或鹼基組分，相對於諸如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥苷、胸腺嘧啶及尿嘧啶之標準天然產生之核苷酸而言)之一致性及/或修飾狀態及/或可指該等殘基之混合特徵(亦即，與特定互補殘基混合之能力)。
在一些實施例中，特定寡核苷酸類型可由以下定義： 1A) 鹼基一致性； 1B) 鹼基修飾模式； 1C) 糖修飾模式； 2) 主鏈鍵聯模式； 3) 主鏈對掌性中心模式；及 4) 主鏈磷修飾模式。 因此，在一些實施例中，特定類型之寡核苷酸可共用相同鹼基，但其鹼基修飾及/或糖修飾之模式不同。在一些實施例中，特定類型之寡核苷酸可共用相同鹼基及鹼基修飾模式(包括例如缺乏鹼基修飾)，但糖修飾模式不同。
在一些實施例中，特定類型之寡核苷酸在化學上一致，因為其具有相同鹼基序列(包括長度)、糖及鹼基部分之相同化學修飾模式、相同主鏈鍵聯模式(例如，天然磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯、硫代磷酸三酯鍵聯及其組合之模式)、相同主鏈對掌性中心模式(例如，對掌性核苷酸間鍵聯之立體化學(R p/S p)模式)及相同主鏈磷修飾模式(例如，核苷酸間磷原子上之修飾模式，諸如−S− 及式I之−L−R1 )。
本發明尤其提供用於最佳化特性之寡核苷酸組合物及技術，例如改良單股RNA干擾、RNase H介導之減量等。在一些實施例中，本發明提供用於降低與投與寡核苷酸及其組合物相關之免疫反應的方法(亦即，投與寡核苷酸組合物，使得對組合物中之寡核苷酸的非期望免疫反應(例如)相對於在具有類似或一致核苷酸序列之核苷酸的參考組合物的情況下觀測到的免疫反應減小)。在一些實施例中，本發明提供用於增加寡核苷酸及其組合物與某些蛋白質之結合的方法。在一些實施例中，本發明提供用於增加寡核苷酸及其組合物與某些蛋白質之結合的方法。在一些實施例中，本發明提供用於增強寡核苷酸及其組合物之傳遞的方法。本發明尤其認識到，在一些實施例中，寡核苷酸至其標靶之最佳傳遞涉及寡核苷酸與某些蛋白質之結合與寡核苷酸釋放之間的平衡，結合使得寡核苷酸可運輸至所要位置，釋放使得寡核苷酸可自某些蛋白質恰當地釋放以執行其所要功能，例如與其標靶混合、裂解其標靶、抑制轉譯、調節轉錄物加工等。如本發明中所例示，本發明尤其認識到，可經由化學修飾及/或立體化學達成寡核苷酸特性之改良。
在一些實施例中，本發明提供一種用於治療或預防疾病之方法，其包含向個體投與本文中描述之PNPLA3寡核苷酸組合物。
在一些實施例中，疾病為在投與所提供之組合物後，經由單股RNA干擾阻斷靶核酸之基因表現可修復、恢復或引入新的有益功能的疾病。
在一些實施例中，共同序列包含選自表1A之序列。在一些實施例中，共同序列為選自表1A之序列。在一些實施例中，主鏈對掌性中心模式係選自表1A中描述之彼等主鏈對掌性中心模式。
在一些實施例中，本發明提供一種方法，其包含投與包含第一複數個寡核苷酸之組合物，該組合物展現傳遞改良，如相比於包含複數個各自亦具有共同鹼基序列但在結構上與第一複數個寡核苷酸不同的寡核苷酸之參考組合物而言，不同之處在於： 參考的複數個寡核苷酸內之個別寡核苷酸的立體化學結構彼此不同；及/或 參考的複數個寡核苷酸內之至少一些寡核苷酸的結構與由該組合物之複數個寡核苷酸表示之結構不同。
在一些實施例中，本發明提供一種投與包含第一複數個寡核苷酸之PNPLA3寡核苷酸組合物的方法，該第一複數個寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低且具有共同核苷酸序列，改良包含： 投與包含第一複數個寡核苷酸之PNPLA3寡核苷酸，其特徵在於傳遞相對於相同共同核苷酸序列之參考寡核苷酸組合物而言改良。
在一些實施例中，本發明提供一種投與包含第一複數個寡核苷酸之PNPLA3寡核苷酸組合物的方法，該第一複數個寡核苷酸能夠導引單股RNA干擾且具有共同核苷酸序列，改良包含： 投與包含第一複數個寡核苷酸之PNPLA3寡核苷酸，其特徵在於傳遞相對於相同共同核苷酸序列之參考寡核苷酸組合物而言改良。
在一些實施例中，本發明提供選自各表中之任一者(包括(但不限於)表1A)或本文中另外所揭示之PNPLA3寡核苷酸之單股RNAi劑。在一些實施例中，本發明提供選自各表中之任一者(包括(但不限於)表1A)或本文中另外所揭示之PNPLA3寡核苷酸之單股RNAi劑，其中寡核苷酸與脂質部分結合。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含脂質部分。在一些實施例中，脂質部分藉由與脂質結合而併入。在一些實施例中，脂質部分為脂肪酸。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸與脂肪酸結合。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑進一步包含脂質。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含結合在第9或第11個核苷酸(自5'端計數)處之脂質部分。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸在鹼基處與脂肪酸結合。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質部分。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含結合在第9或第11個核苷酸(自5'端計數)處之鹼基處的脂質部分。
在一些實施例中，單股RNAi劑為前述組合物中之任一者，其進一步包含一或多種其他組分。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNase H機制及RNAi機制使靶轉錄物(例如，RNA)降解。
在一些實施例中，脂質部分與PNPLA3寡核苷酸之結合改良寡核苷酸之至少一種特性。在一些實施例中，改良特性包括增加活性(例如，提高導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量降低、及/或導引單股RNA干擾、及/或導引RNase H介導之減量的能力)及/或改良對於組織之分佈。在一些實施例中，組織為肌肉組織。在一些實施例中，組織為骨骼肌、腓腸肌、三頭肌、心臟或隔膜。在一些實施例中，改良特性包括降低hTLR9促效活性。在一些實施例中，改良特性包括hTLR9拮抗活性。在一些實施例中，改良特性包括增加hTLR9拮抗活性。
一般而言，如本文中描述之寡核苷酸組合物之特性可使用任何適當分析評定。
熟習此項技術者將清楚及/或將能夠容易地開發出用於特定寡核苷酸組合物之適當分析。定義
如本文中所用，除非另外指明，否則以下定義應適用。出於本發明之目的，化學元素係根據元素週期表(Periodic Table of the Elements), CAS版本, Handbook of Chemistry and Physics, 第75版來鑑別。另外，有機化學之一般原理描述於「Organic Chemistry」, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999及「March's Advanced Organic Chemistry」, 第5版, 編輯: Smith, M.B.及March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001。
如本說明書中所使用，「一(a/an)」可意謂一或多個。如申請專利範圍中所使用，當與字組「包含」結合使用時，字組「一(a/an)」可意謂一個或多於一個。如本文中所使用，「另一」可意謂至少第二個或更多個。
術語「約」係指表示標稱值加或減10%之近似值的相對術語，或其在一個實施例中係指加或減5%，或在另一實施例中係指加或減2%。在本發明之領域中，此近似值位準為適當的，除非具體陳述需要該值之較緊密的範圍。
脂族 ：如本文中所使用，「脂族」意謂完全飽和或含有一或多個不飽和單元的直鏈(亦即非分支鏈)或分支鏈、經取代或未經取代之烴鏈，或完全飽和或含有一或多個不飽和單元(但非芳族)的經取代或未經取代之單環、雙環或多環烴環，或其組合。在一些實施例中，脂族基含有1至50個脂族碳原子。在一些實施例中，脂族基含有1至20個脂族碳原子。在其他實施例中，脂族基含有1至10個脂族碳原子。在其他實施例中，脂族基含有1至9個脂族碳原子。在其他實施例中，脂族基含有1至8個脂族碳原子。在其他實施例中，脂族基含有1至7個脂族碳原子。在其他實施例中，脂族基含有1至6個脂族碳原子。在其他實施例中，脂族基含有1至5個脂族碳原子，且在其他實施例中，脂族基含有1、2、3或4個脂族碳原子。合適的脂族基包括(但不限於)直鏈或分支鏈、經取代或未經取代的烷基、烯基、炔基及其混合物，諸如(環烷基)烷基、(環烯基)烷基或(環烷基)烯基。
烯基 ：如本文中所用，術語「烯基」係指如本文所定義之烷基，其具有一或多個雙鍵。
烷基 ：如本文中所用，術語「烷基」以此項技術中之其一般含義給出，且可包括飽和脂族基，包括直鏈烷基、分支鏈烷基、環烷基(脂環族基)、經烷基取代之環烷基及經環烷基取代之烷基。在一些實施例中，烷基具有1至100個碳原子。在某些實施例中，直鏈或分支鏈烷基之主鏈中具有約1至20個碳原子(例如，直鏈為C1 -C20 ，分支鏈為C2 -C20 )，且可替代地具有約1至10個碳原子。在一些實施例中，環烷基環在此等環為單環、雙環或多環時在其環結構中具有約3至10個碳原子，且可替代地在環結構中具有約5、6或7個碳原子。在一些實施例中，烷基可為低碳數烷基，其中低碳數烷基包含1至4個碳原子(例如，直鏈低碳數烷基為C1 -C4 )。
炔基 ：如本文中所用，術語「炔基」係指如本文所定義之烷基，其具有一或多個參鍵。
反義：如本文中所用，術語「反義」係指寡核苷酸或其他核酸具有與能夠同其混合之靶核酸互補或實質上互補的鹼基序列之特徵。在一些實施例中，靶核酸為靶基因mRNA。在一些實施例中，混合為至少一種活性所需或產生至少一種活性，該至少一種活性例如靶核酸或其基因產物之含量、表現或活性之降低。如本文中所用，術語「反義寡核苷酸」係指與靶核酸互補的寡核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠導引靶核酸或其基因產物之含量、表現或活性之降低。在一些實施例中，反義寡核苷酸能夠經由涉及RNaseH、位阻及/或RNA干擾之機制導引靶核酸或其基因產物之含量、表現或活性之降低。
大約 ： 除非另外說明或自上下文顯而易見，否則如本文中所用，關於數字之術語「大約」或「約」一般用於包括沿任一方向(大於或小於)落在該數字之5%、10%、15%或20%範圍內之數字(該數字將小於可能值之0%或超過可能值之100%的情況除外)。在一些實施例中，關於劑量使用之術語「約」意謂±5毫克/公斤/天。
芳基： 如本文中所用，術語「芳基」單獨或作為如同「芳烷基」、「芳烷氧基」或「芳氧基烷基」之較大部分之一部分使用係指總共具有五個至三十個環成員之單環、雙環或多環系統，其中系統中之至少一個環為芳族。在一些實施例中，芳基為總共具有五個至十四個環成員之單環、雙環或多環系統，其中系統中之至少一個環為芳族，且其中系統中之各環含有3至7個環成員。在一些實施例中，芳基為聯芳基。術語「芳基」可與術語「芳環」互換使用。在本發明之某些實施例中，「芳基」係指包括(但不限於)苯基、聯二苯、萘基、聯萘、蒽基以及其類似者之芳環系統，其可具有一或多個取代基。如本文中所用，在術語「芳基」範疇內亦包括芳環稠合至一或多個非芳族環中之基團，諸如二氫茚基、鄰苯二甲醯亞胺基、萘醯亞胺基、啡啶基或四氫萘基及其類似基團。
特徵部分 ：如本文中所用，片語蛋白質或多肽之「特徵部分」為含有共同成為蛋白質或多肽之特徵的胺基酸連續延伸部或胺基酸連續延伸部之集合的部分。此類連續延伸部一般將各自含有至少兩個胺基酸。一般而言，特徵部分為除以上所指出之序列一致性之外，亦與相關完整蛋白質共用至少一個功能特徵的部分。
特徵結構要素： 術語「特徵結構要素」或「結構要素」係指多肽、小分子或核酸家族之所有成員中發現的獨特結構要素，且因此可由一般技術者用於定義家族之成員。在一些實施例中，單股RNAi劑之結構要素包括(但不限於)：5'端結構、5'端區域、5'核苷酸部分、種子區域、種子後區域、3'端區域、3'端二核苷酸、3'端帽、修飾模式、主鏈之立體化學模式、其他化學部分等等。
類似的： 術語「類似的」在本文中用以描述兩組(或更多組)狀況或情況彼此足夠類似，從而允許比較所獲得之結果或所觀察到之現象。在一些實施例中，數組類似狀況或情況之特徵在於，複數個實質上相同的特徵及一個或少量不同特徵。一般技術者應瞭解，當數組狀況的特徵在於實質上相同特徵之數目及類型足以保證以下合理結論時，該等狀況彼此類似，該合理結論為：在數組不同狀況或情況下獲得之結果或觀察到之現象的差異係由彼等特徵中不同特徵之變化引起的或指示該等不同特徵之變化。
環脂族： 術語「環脂族」、「碳環(carbocycle)」、「碳環基」、「碳環基團」及「碳環(carbocyclic ring)」可互換使用，且如本文中所使用，除非另外說明，否則係指具有3至30個環成員的如本文中所描述之飽和或部分不飽和但非芳族的環脂族單環、雙環或多環系統。環脂族基包括(但不限於)環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環庚基、環庚烯基、環辛基、環辛烯基、降基、金剛烷基及環辛二烯基。在一些實施例中，環脂族基具有3至6個碳原子。在一些實施例中，環脂族基為飽和的且為環烷基。術語「環脂族」亦可包括與一或多個芳族或非芳族環稠合的脂族環，諸如十氫萘基或四氫萘基。在一些實施例中，環脂族基為雙環。在一些實施例中，環脂族基為三環。在一些實施例中，環脂族基為多環。在一些實施例中，「環脂族」係指完全飽和或含有一或多個不飽和單元但非芳族的C3 -C6 單環烴或C8 -C10 雙環或多環烴，其具有連至分子之其餘部分的單一連接點，或係指完全飽和或含有一或多個不飽和單元但非芳族的C9 -C16 多環烴，其具有連至分子之其餘部分的單一連接點。
雜脂族 ：如本文中所用，術語「雜脂族」以此項技術中之其一般含義給出，且係指其中一或多個碳原子獨立地經一或多個雜原子(例如，氧、氮、硫、矽、磷以及其類似者)替換的如本文中所描述之脂族基。在一些實施例中，選自C、CH、CH2 及CH3 之一或多個單元獨立地經一或多個雜原子(包括其經氧化及/或經取代形式)置換。在一些實施例中，雜脂族基為雜烷基。在一些實施例中，雜脂族基為雜烯基。
雜烷基 ：如本文中所用，術語「雜烷基」以此項技術中之其一般含義給出，且係指其中一或多個碳原子獨立地經一或多個雜原子(例如，氧、氮、硫、矽、磷以及其類似者)置換的如本文中所描述之烷基。雜烷基之實例包括(但不限於)烷氧基、聚(乙二醇)-、經烷基取代之胺基、四氫呋喃基、哌啶基、嗎啉基等。
雜芳基 ：如本文中所用，術語「雜芳基」及「雜芳-」單獨或作為例如「雜芳烷基」或「雜芳烷氧基」之較大部分的一部分使用係指總共具有五至三十個環成員之單環、雙環或多環系統，其中系統中之至少一個環為芳族且至少一個芳環原子為雜原子。在一些實施例中，雜芳基為具有5至10個環原子之基團(亦即，單環、雙環或多環)，在一些實施例中具有5、6、9或10個環原子。在一些實施例中，雜芳基具有6、10或14個在環狀陣列中共用的π電子；及除碳原子外具有一至五個雜原子。雜芳基包括(但不限於)噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、異噁唑基、噁二唑基、噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、㖠啶基及喋啶基。在一些實施例中，雜芳基為雜聯芳基，諸如聯吡啶基以及其類似基團。如本文中所用，術語「雜芳基」及「雜芳-」亦包括雜芳環稠合至一或多個芳基、環脂族或雜環基環之基團，其中自由基或連接點在雜芳環上。非限制性實例包括吲哚基、異吲哚基、非限制性實例包括吲哚基、異吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、異喹啉基、㖕啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喏啉基、4H -喹嗪基、咔唑基、吖啶基、啡嗪基、啡噻嗪基、啡噁嗪基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基及吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮。雜芳基可為單環、雙環或多環。術語「雜芳基(heteroaryl)」可與術語「雜芳基環(heteroaryl ring)」、「雜芳基(heteroaryl group)」或「雜芳族基(heteroaromatic)」互換使用，該等術語中之任一者包括視情況經取代之環。術語「雜芳烷基」係指經雜芳基取代之烷基，其中烷基及雜芳基部分獨立地視情況經取代。
雜原子 ：如本文中所用，術語「雜原子」意謂並非碳或氫之原子。在一些實施例中，雜原子為氧、硫、氮、磷或矽(包括氮、硫、磷或矽之任何氧化形式；任何鹼性氮之四級銨化形式；或雜環之可取代氮(例如N (如3,4-二氫-2H -吡咯基中)、NH (如吡咯啶基中)或NR+ (如經N取代之吡咯啶基中))；等等)。
雜環 ：如本文中所用，術語「雜環(heterocycle)」、「雜環基(heterocyclyl)」、「雜環基(heterocyclic radical)」及「雜環(heterocyclic ring)」可互換使用，且係指飽和或部分不飽和且具有一或多個雜環原子的單環、雙環或多環部分(例如，3員至30員)。在一些實施例中，雜環基為穩定的5員至7員單環或7員至10員雙環雜環部分，其為飽和或部分不飽和的且除碳原子外具有一或多個、較佳地一至四個如上文所定義之雜原子。當關於雜環之環原子使用時，術語「氮」包括經取代之氮。舉例而言，在具有0至3個選自氧、硫或氮之雜原子之飽和或部分不飽和環中，氮可為N (如在3,4-二氫-2H -吡咯基中)、NH (如在吡咯啶基中)或+ NR (如在經N 取代之吡咯啶基中)。雜環可在任何雜原子或碳原子處連接至其側基，從而產生穩定結構，且任何環原子可視情況經取代。此類飽和或部分不飽和雜環基之實例包括(但不限於)四氫呋喃基、四氫噻吩基、吡咯啶基、哌啶基、吡咯啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、噁唑啶基、哌嗪基、二氧雜環己烷基、二氧戊環基、二氮呯基、噁氮呯基、噻氮呯基、嗎啉基及奎寧環基。術語「雜環(heterocycle)」、「雜環基(heterocyclyl)」、「雜環基環(heterocyclyl ring)」、「雜環基(heterocyclic group)」、「雜環部分(heterocyclic moiety)」及「雜環基(heterocyclic radical)」可在本文中互換使用，且亦包括雜環基環稠合至一或多個芳基、雜芳基或環脂族環之基團，諸如吲哚啉基、3H -吲哚基、烷基、啡啶基或四氫喹啉基。雜環基可為單環、雙環或多環。術語「雜環烷基」係指經雜環基取代之烷基，其中烷基及雜環基部分獨立地視情況經取代。
低碳數烷基： 術語「低碳數烷基」係指C1-4 直鏈或分支鏈烷基。例示性低碳數烷基為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基及第三丁基。
低碳數鹵烷基： 術語「低碳數鹵烷基」係指經一或多個鹵素原子取代之C1-4 直鏈或分支鏈烷基。
視情況經取代 ：如本文中所描述，本發明之化合物(例如寡核苷酸)可含有視情況經取代之部分及/或經取代之部分。一般而言，術語「經取代」無論前面是否有術語「視情況」均意謂指定部分之一或多個氫經適合的取代基置換。除非另有指示，否則「視情況經取代」之基團可在基團之各可取代位置處具有適合的取代基，且當任何既定結構中之超過一個位置可經超過一個選自指定基團之取代基取代時，在每一位置處之取代基可相同或不同。在一些實施例中，視情況經取代之基團未經取代。由本發明預想之取代基之組合較佳為使得形成穩定或化學上可行之化合物的彼等取代基。如本文中所用，術語「穩定」係指化合物在經受允許其產生、偵測及(在某些實施例中)其回收、純化及用於本文所揭示之一或多種目的之條件時不發生實質上改變。
可取代原子(例如，適合的碳原子)上之適合的單價取代基獨立地為鹵素；-(CH2 )0-4 R°；-(CH2 )0-4 OR°；−O(CH2 )0-4 Ro ；-O-(CH2 )0-4 C(O)OR°；-(CH2 )0-4 CH(OR°)2 ；-(CH2 )0-4 Ph，其可經R°取代；−(CH2 )0-4 O(CH2 )0-1 Ph，其可經R°取代；-CH=CHPh，其可經R°取代；-(CH2 )0-4 O(CH2 )0-1 -吡啶基，其可經R°取代；-NO2 ；-CN；-N3 ；-(CH2 )0-4 N(R°)2 ；-(CH2 )0-4 N(R°)C(O)R°；-N(R°)C(S)R°；-(CH2 )0-4 N(R°)C(O)NR°2 ；−N(R°)C(S)NR°2 ；-(CH2 )0-4 N(R°)C(O)OR°；-N(R°)N(R°)C(O)R°；−N(R°)N(R°)C(O)NR°2 ；−N(R°)N(R°)C(O)OR°；-(CH2 )0-4 C(O)R°；-C(S)R°；-(CH2 )0-4 C(O)OR°；-(CH2 )0-4 C(O)SR°；-(CH2 )0-4 C(O)OSiR°3 ；-(CH2 )0-4 OC(O)R°；-OC(O)(CH2 )0-4 SR, −SC(S)SR°；−(CH2 )0-4 SC(O)R°；-(CH2 )0-4 C(O)NR°2 ；-C(S)NR°2 ；-C(S)SR°；−SC(S)SR°, -(CH2 )0-4 OC(O)NR°2 ；-C(O)N(OR°)R°；-C(O)C(O)R°；-C(O)CH2 C(O)R°；−C(NOR°)R°;-(CH2 )0-4 SSR°；- (CH2 )0-4 S(O)2 R°；-(CH2 )0-4 S(O)2 OR°；-(CH2 )0-4 OS(O)2 R°；−S(O)2 NR°2 ；-(CH2 )0-4 S(O)R°；-N(R°)S(O)2 NR°2 ；-N(R°)S(O)2 R°；-N(OR°)R°；-C(NH)NR°2 ；-Si(R°)3 ；-OSi(R°)3 ；−B(R°)2 ；−OB(R°)2 ；−OB(OR°)2 ；−P(R°)2 ；−P(OR°)2 ；−OP(R°)2 ；−OP(OR°)2 ；−P(O)(R°)2 ；−P(O)(OR°)2 ；−OP(O)(R°)2 ；−OP(O)(OR°)2 ；−OP(O)(OR°)(SR°)；−SP(O)(R°)2 ；−SP(O)(OR°)2 ；−N(R°)P(O)(R°)2 ；−N(R°)P(O)(OR°)2 ；−P(R°)2 [B(R°)3 ]；−P(OR°)2 [B(R°)3 ]；−OP(R°)2 [B(R°)3 ]；−OP(OR°)2 [B(R°)3 ]；-(C1-4 直鏈或分支鏈伸烷基)O-N(R°)2 ；或-(C1-4 直鏈或分支鏈伸烷基)C(O)O-N(R°)2 ，其中各R°可如下文所定義經取代且獨立地為氫；C1 - 20 脂族基；具有1至5個獨立地選自氮、氧、硫、矽及磷之雜原子的C1 - 20 雜脂族基；-CH2 −(C6 - 14 芳基)；-O(CH2 )0 - 1 (C6 - 14 芳基)；−CH2 -(5員至14員雜芳基環)；具有0至5個獨立地選自氮、氧、硫、矽及磷之雜原子的5員至20員單環、雙環或多環的飽和、部分不飽和或芳環；或者不管上述定義，兩個獨立出現之R°與其插入原子一起形成具有0至5個獨立地選自氮、氧、硫、矽及磷之雜原子的5員至20員單環、雙環或多環的飽和、部分不飽和或芳環，其可如下文所定義經取代。
R° (或由兩個獨立出現之R°與其插入原子共同形成之環)上之適合的單價取代基獨立地為鹵素、-(CH2 )0-2 Rl 、-(鹵基Rl )、-(CH2 )0-2 OH、-(CH2 )0-2 ORl 、-(CH2 )0-2 CH(ORl )2 、−O(鹵基Rl )、-CN、-N3 、-(CH2 )0-2 C(O)Rl 、-(CH2 )0-2 C(O)OH、-(CH2 )0-2 C(O)ORl 、-(CH2 )0-2 SRl 、-(CH2 )0-2 SH、-(CH2 )0-2 NH2 、-(CH2 )0-2 NHRl 、-(CH2 )0-2 NRl 2 、-NO2 、-SiRl 3 、−OSiRl 3 、-C(O)SRl 、-(C1-4 直鏈或分支鏈伸烷基)C(O)ORl 或-SSRl ，其中各Rl 未經取代或在前面有「鹵基」之情況下僅經一或多個鹵素取代，且獨立地選自C1 - 4 脂族基、-CH2 Ph、-O(CH2 )0 - 1 Ph或具有0至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員至6員飽和、部分不飽和或芳環。R°之飽和碳原子上之適合的二價取代基包括=O及=S。
例如適合的碳原子上之適合的二價取代基獨立地為以下：=O、=S、=NNR* 2 、=NNHC(O)R* 、=NNHC(O)OR* 、=NNHS(O)2 R* 、=NR* 、=NOR* 、-O(C(R* 2 ))2 - 3 O-或-S(C(R* 2 ))2 - 3 S-，其中各獨立出現之R* 係選自氫、可如下文所定義經取代之C1 - 6 脂族基，以及具有0至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的未經取代之5員至6員飽和、部分不飽和或芳環。結合於「視情況經取代之」基團之鄰接可取代碳之適合的二價取代基包括：-O(CR* 2 )2 - 3 O-，其中各獨立出現之R* 係選自氫、可如下文所定義經取代之C1 - 6 脂族基，以及具有0至4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子的未經取代之5員至6員飽和、部分不飽和或芳環。
R* 之脂族基上之適合的取代基獨立地為鹵素、−Rl 、-(鹵基Rl )、-OH、-ORl 、-O(鹵基Rl )、-CN、-C(O)OH、-C(O)ORl 、-NH2 、-NHRl 、-NRl 2 或-NO2 ，其中各Rl 未經取代或在前面有「鹵基」之情況下僅經一或多個鹵素取代，且獨立地為C1 - 4 脂族基、-CH2 Ph、-O(CH2 )0 - 1 Ph或具有0至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員至6員飽和、部分不飽和或芳環。
部分不飽和： 如本文中所用，術語「部分不飽和」係指包括至少一個雙鍵或參鍵之環部分。術語「部分不飽和」意欲涵蓋具有多個不飽和位點之環，但並不意欲包括如本文所定義之芳基或雜芳基部分。
RNA 干擾： 如本文中所用，術語「RNA干擾」或「RNAi」係指涉及RISC (RNA誘導沉默複合體)之轉錄後、靶向基因抑制過程。據報導，RNAi過程在核糖核酸酶III (Dicer)將較長dsRNA裂解成被稱為siRNA之較短片段時天然發生。天然產生的siRNA (較小干擾性RNA)之長度通常為約21至23個核苷酸，具有約19個鹼基對雙螺旋體及兩個單股懸垂物，且通常為RNA。據報導，此等RNA區段隨後導引靶核酸(諸如，mRNA或前mRNA)之降解。據報導，Dicer亦涉及自保守結構之前驅體RNA切除涉及轉譯控制的21及22核苷酸小時序RNA (stRNA)。Hutvagner等人2001, Science, 293, 834。熟習此項技術者應瞭解，RNAi可藉由包括與靶序列(例如，標靶mRNA中之靶序列)互補或實質上互補之序列的單股或雙股寡核苷酸介導。因此，在本發明之一些實施例中，如本文中所描述之單股寡核苷酸可充當RNAi劑；在一些實施例中，如本文中所描述之雙股寡核苷酸可充當RNAi劑。在一些實施例中，RNAi反應涉及通常稱作RNA誘導沉默複合體(RISC)之核酸內切酶複合物，其導引與siRNA之反義股互補的單股mRNA之裂解。在一些實施例中，RISC導引與可充當單股RNAi劑之所提供寡核苷酸互補的標靶RNA之裂解。在一些實施例中，標靶RNA之裂解在與siRNA雙螺旋體或單股RNAi劑之反義股互補的區域中間發生。在一些實施例中，RNA干擾係藉由單股寡核苷酸導引，該單股寡核苷酸充當可以涉及RISC路徑之機制導引RNA干擾的單股RNAi劑。
RNAi 劑 ： 如本文中所用，術語「RNAi劑」、「iRNA劑」以及其類似者係指PNPLA3寡核苷酸，其在投與給正表現或已表現靶基因產物(例如，靶基因之轉錄物，諸如前mRNA或mRNA)之系統時降低該靶基因產物之含量及/或活性(例如，轉譯)。在一些實施例中，RNAi劑可為或可包含單股寡核苷酸或雙股寡核苷酸。在一些實施例中，RNAi劑可具有在此項技術中鑑定為siRNA (短抑制RNA)、shRNA (短髮夾或小髮夾RNA)、dsRNA (雙股RNA)、微RNA等之結構。在一些實施例中，RNAi劑可特異性結合於RNA標靶(例如，靶基因之轉錄物)。在一些實施例中，在結合於其標靶之後，且RNAi劑被裝載至RISC (RNA誘導沉默複合體)。在一些實施例中，RNAi劑(在一些實施例中)經由涉及RISC (RNA誘導沉默複合體)路徑之機制導引其標靶之降解及/或抑制其標靶之轉譯。在一些實施例中，RNAi劑為活化RISC複合物/路徑之PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，RNAi劑包含反義股序列。在一些實施例中，RNAi劑僅包括一個寡核苷酸股(例如，為單股寡核苷酸)。在一些實施例中，單股RNAi劑寡核苷酸可為或可包含有義股或反義股序列，如Sioud 2005 J. Mol. Biol. 348: 1079-1090所描述。在一些實施例中，RNAi劑為能夠導引RNA干擾之化合物。在一些實施例中，RNAi劑可具有「典型」siRNA結構中發現之結構或型式。在一些實施例中，RNAi劑可具有不同於「典型」siRNA結構之結構。僅舉若干實例，在一些實施例中，RNAi劑可比典型製劑更長或更短，可為平末端的，及/或可包含一或多個修飾、錯配、間隔及/或核苷酸替換。在一些實施例中，RNAi劑含有如本發明中所描述之3'端帽。不希望受任何特定理論束縛，申請人提出，在一些實施例中，3'端帽可實現兩個功能：(1)允許RNA干擾；及(2)增加活性及/或生物半衰期之持續時間，其可例如藉由以下實現：增加與Dicer及/或一或多種Ago蛋白質之PAZ域的結合；及/或減少或防止RNAi劑降解(例如，由核酸酶，諸如血清或腸液中之彼等核酸酶降解)。在一些實施例中，本發明之RNAi劑靶向(例如，結合於、連結於等)標靶mRNA。在一些實施例中，RNAi劑暴露於其標靶引起該標靶之活性、含量及/或表現降低，例如該標靶之「減量」或「剔除」。特定言之，在一些實施例中，在疾病、病症及/或病狀之特徵在於靶基因之過度表現及/或超活性的情況下，將RNAi劑投與至細胞、組織或個體充分地阻斷靶基因之基因表現，以恢復活性之正常程度或將活性降低至一程度，該程度可緩解、改善、減輕、抑制、預防疾病、病症及/或病狀、延遲其發作、降低其嚴重程度、及/或減小該疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀或特徵之發病率。在一些實施例中，RNAi劑為雙股的，其包含為如本文中所描述之單股RNAi劑的反義股以及可導引RNA干擾的有義股。
單股 RNA 干擾： 如本文中所用，片語「單股RNAi」或「單股RNA干擾」或其類似片語係指至少部分地藉由向系統(例如，細胞、組織、器官、個體等)投與單股RNAi劑而導引的基因沉默之過程或方法，其中RNAi係由該製劑導引且需要RISC路徑。該等術語在本文中某些情況下可用於與「雙股RNAi」或「雙股RNA干擾」進行區分，在「雙股RNAi」或「雙股RNA干擾」中，雙股RNAi劑經投與至系統，且可進一步經加工(例如)使得其兩個股中之一者裝載至RISC以例如抑止轉譯、裂解標靶RNA等。
單股 RNAi 劑 ： 如本文中所用，片語「單股RNAi劑」係指可經由RISC路徑導引單股RNA干擾(RNAi或iRNA)或基因沉默之單股寡核苷酸。單股RNAi劑可包含一或多種單股核苷酸之聚合物。
個體： 如本文中所用，術語「個體」或「測試個體」係指根據本發明，例如出於實驗、診斷、預防及/或治療目的，向其投與所提供化合物或組合物之任何生物體。典型個體包括動物(例如，哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類動物及人類；昆蟲；蠕蟲等)及植物。在一些實施例中，個體可患有及/或易患上疾病、病症及/或病狀。
實質上： 如本文中所用，術語「實質上」係指展示相關特徵或特性之全部或接近全部界限或程度的定性狀況。與第二序列實質上互補之鹼基序列同第二序列不一致，但與第二序列在很大程度上一致或接近一致。此外，生物技術中之一般技術者應理解，生物及化學現象很少(若曾經)進行完全及/或繼續進行至完全或獲得或避免絕對結果。因而本文中使用術語「實質上」以針對諸多生物及/或化學現象中固有的完整性之可能缺乏。
患有 ：「患有」疾病、病症及/或病狀之個體已經診斷具有該疾病、病症及/或病狀及/或呈現其一或多種症狀。
易患上 ：「易患上」疾病、病症及/或病狀之個體為患上該疾病、病症及/或病狀之風險高於普通公眾之個體。在一些實施例中，易患上疾病、病症及/或病狀之個體可能尚未診斷出該疾病、病症及/或病狀。在一些實施例中，易患上疾病、病症及/或病狀之個體可呈現該疾病、病症及/或病狀之症狀。在一些實施例中，易患上疾病、病症及/或病狀之個體可不呈現該疾病、病症及/或病狀之症狀。在一些實施例中，易患上疾病、病症及/或病狀之個體將患上該疾病、病症及/或病狀。在一些實施例中，易患上疾病、病症及/或病狀之個體將不患上該疾病、病症及/或病狀。
全身性 ： 如本文中所用之片語「全身性投藥」、「全身性投與」、「周邊投藥」及「周邊投與」具有其在此項技術中所瞭解之含義，係指投與化合物或組合物，使得其進入接受者之系統。
治療劑： 如本文中所用，片語「治療劑」係指當向個體投與時，具有治療作用及/或產生所要生物及/或藥理學作用之任何藥劑。在一些實施例中，治療劑為任何可用以緩解、改善、減輕、抑制、預防疾病、病症及/或病狀、延遲其發作、降低其嚴重程度及/或減小其一或多種症狀或特徵之發病率的物質。
治療有效量： 如本文中所用，術語「治療有效量」意謂當作為治療方案之一部分投與時引發所要生物反應之物質(例如治療劑、組合物及/或調配物)的量。在一些實施例中，物質之治療有效量為當向患有或易患上疾病、病症及/或病狀之個體投與時，足以治療、診斷、預防該疾病、病症及/或病狀及/或延遲其發作的量。如一般技術者將瞭解，物質之有效量可視諸如所要生物學終點、欲傳遞之物質、靶細胞或組織等因素而變化。舉例而言，調配物中之化合物之治療疾病、病症及/或病狀之有效量為緩解、改善、減輕、抑制、預防疾病、病症及/或病狀、延遲其發作、降低其嚴重程度及/或減小其一或多種症狀或特徵之發病率的量。在一些實施例中，治療有效量以單劑量投與；在一些實施例中，需要多單位劑量以傳遞治療有效量。
治療 ： 如本文中所用，術語「治療(treat/treatment/treating)」係指用於部分或完全緩解、改善、減輕、抑制、預防疾病、病症及/或病狀、延遲其發作、降低其嚴重程度及/或減小其一或多種症狀或特徵之發病率的任何方法。可向未呈現疾病、病症及/或病狀跡象之個體施以治療。在一些實施例中，舉例而言，出於降低產生與疾病、病症及/或病狀有關之病變的風險之目的，可向僅呈現疾病、病症及/或病狀之早期跡象的個體投與治療。
不飽和： 如本文中所用，術語「不飽和」意謂部分(moiety)具有一或多個不飽和單元。
野生型： 如本文中所用，術語「野生型」具有其在此項技術中所瞭解之含義，係指具有如自然界中在「正常」(相對於突變、患病、更改等而言)狀態或情況下所存在的結構及/或活性的實體。一般技術者將瞭解，野生型基因及多肽常常以多種不同形式(例如，對偶基因)存在。
核酸：如本文中所用，術語「核酸」包括任何核苷酸及其聚合物。如本文中所用，術語「聚核苷酸」係指具有任何長度之核苷酸的聚合物形式，核糖核苷酸(RNA)或去氧核糖核苷酸(DNA)。此等術語係指分子之一級結構，且因此包括雙股及單股DNA以及雙股及單股RNA。此等術語包括由經修飾之核苷酸及/或經修飾之聚核苷酸形成之RNA或DNA類似物作為等效物，諸如(但不限於)經甲基化、受保護及/或經封端之核苷酸或聚核苷酸。該等術語涵蓋多核糖核苷酸或寡核糖核苷酸(RNA)及多去氧核糖核苷酸或寡去氧核糖核苷酸(DNA)；來源於核鹼基及/或經修飾之核鹼基之N-糖苷或C-糖苷的RNA或DNA；來源於糖及/或經修飾之糖之核酸；及來源於磷酸酯橋鍵及/或經修飾之核苷酸間鍵聯之核酸。該術語涵蓋含有核鹼基、經修飾之核鹼基、糖、經修飾之糖、磷酸酯橋鍵或經修飾之核苷酸間鍵聯之任何組合的核酸。實例包括且不限於含有核糖部分之核酸、含有去氧核糖部分之核酸、含有核糖部分及去氧核糖部分之核酸、含有核糖部分及經修飾核糖部分之核酸。除非另外說明，否則字首多-係指含有2至約10,000個核苷酸單體單元之核酸，且其中字首寡-係指含有2至約200個核苷酸單體單元之核酸。
核苷酸： 如本文中所用，術語「核苷酸」係指由雜環鹼基、糖及一或多個核苷酸間鍵聯組成的聚核苷酸之單體單元。天然產生之鹼基(鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U))為嘌呤或嘧啶之衍生物，但應瞭解，亦包括天然及非天然產生之鹼基類似物。天然產生之糖為戊糖(五碳糖)、去氧核糖(其形成DNA)或核糖(其形成RNA)，但應瞭解，亦包括天然及非天然產生之糖類似物。核苷酸經由核苷酸間鍵聯連接，形成核酸或聚核苷酸。此項技術中已知多種核苷酸間鍵聯(諸如(但不限於)磷酸酯、硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯及其類似者)。人造核酸包括PNA (肽核酸)、磷酸三酯、硫代磷酸酯、H -膦酸酯、胺基磷酸酯、硼烷磷酸酯、甲基磷酸酯、膦醯乙酸酯、硫代膦醯乙酸酯及天然核酸之磷酸酯主鏈之其他變體，諸如本文中所描述之彼等者。在一些實施例中，天然核苷酸包含天然產生之鹼基、糖及核苷酸間鍵聯。如本文中所用，術語「核苷酸」亦涵蓋用於代替天然或天然產生之核苷酸的結構類似物，諸如經修飾之核苷酸及核苷酸類似物。
經修飾之核苷酸 ： 術語「經修飾之核苷酸」包括在結構上與天然核苷酸不同但能夠執行天然核苷酸之至少一種功能的任何化學部分。在一些實施例中，經修飾之核苷酸包含糖、鹼基及/或核苷酸間鍵聯處之修飾。在一些實施例中，經修飾之核苷酸包含經修飾之糖、經修飾之核鹼基及/或經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，經修飾之核苷酸具有核苷酸之至少一種功能，例如形成能夠與至少包含鹼基之互補序列的核酸進行鹼基配對的聚合物中之亞基。
類似物： 術語「類似物」意謂任何功能類似物，其中化學部分在結構上與參考化學部分或部分類別不同但能夠執行此參考化學部分或部分類別之至少一種功能。作為非限制性實例，核苷酸類似物在結構上與核苷酸不同但執行核苷酸之至少一種功能；核鹼基類似物在結構上與核鹼基不同但執行核鹼基之至少一種功能；等等。
核苷 ：術語「核苷」係指核鹼基或經修飾之核鹼基共價鍵結至糖或經修飾之糖的部分。
經修飾之核苷： 術語「經修飾之核苷」係指來源於天然核苷或在化學上類似於天然核苷但包含將其與天然核苷進行區分之化學修飾的部分。經修飾之核苷的非限制性實例包括在鹼基及/或糖處包含修飾之彼等核苷。經修飾之核苷的非限制性實例包括在糖處具有2'修飾之彼等核苷。經修飾之核苷的非限制性實例亦包括無鹼基核苷(其缺少核鹼基)。在一些實施例中，經修飾之核苷具有核苷之至少一種功能，例如形成能夠與至少包含鹼基之互補序列的核酸進行鹼基配對的聚合物中之部分。
核苷類似物： 術語「核苷類似物」係指在化學上與天然核苷不同但能夠執行核苷之至少一種功能的化學部分。在一些實施例中，核苷類似物包含糖之類似物及/或核鹼基之類似物。在一些實施例中，經修飾之核苷具有核苷之至少一種功能，例如形成能夠與包含鹼基之互補序列的核酸進行鹼基配對的聚合物中之部分。
糖： 術語「糖」係指呈閉合及/或開放形式之單醣或多醣。在一些實施例中，糖為單醣。在一些實施例中，糖為多醣。糖包括(但不限於)核糖、去氧核糖、戊呋喃糖、戊哌喃糖及己哌喃糖部分。如本文中所用，術語「糖」亦涵蓋用於代替習知糖分子之結構類似物，諸如二醇，其聚合物形成核酸類似物之主鏈二醇核酸(「GNA」)等。如本文中所用，術語「糖」亦涵蓋用於代替天然或天然產生之核苷酸的結構類似物，諸如經修飾之糖及核苷酸糖。
經修飾之糖 ：術語「經修飾之糖」係指可替換糖之部分。經修飾之糖模擬糖之空間排列、電子特性或一些其他物理化學特性。
核鹼基 ：術語「核鹼基」係指核酸中參與氫鍵結之部分，氫鍵結以序列特異性方式將一股核酸結合於另一互補股。最常見的天然產生之核鹼基為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)及胸腺嘧啶(T)。在一些實施例中，天然產生之核鹼基為經修飾之腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些實施例中，天然產生之核鹼基為甲基化腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些實施例中，核鹼基為「經修飾之核鹼基」，例如除腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)及胸腺嘧啶(T)以外的核鹼基。在一些實施例中，經修飾之核鹼基為甲基化腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些實施例中，經修飾之核鹼基模擬核鹼基之空間排列、電子特性或一些其他物理化學特性，且保留以序列特異性方式將一股核酸結合於另一股核酸的氫鍵結特性。在一些實施例中，經修飾之核鹼基可與所有五種天然產生之鹼基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤)配對，且實質上不影響熔融特性、由細胞內酶識別或寡核苷酸雙螺旋體之活性。如本文中所用，術語「核鹼基」亦涵蓋用於代替天然或天然產生之核苷酸的結構類似物，諸如經修飾之核鹼基及核鹼基類似物。
經修飾之核鹼基： 術語「經修飾之核鹼基」、「經修飾之鹼基」以及其類似者係指在化學上與核鹼基不同但能夠執行核鹼基之至少一種功能的化學部分。在一些實施例中，經修飾之核鹼基為包含修飾之核鹼基。在一些實施例中，經修飾之核鹼基具有核鹼基之至少一種功能，例如形成能夠與至少包含鹼基之互補序列的核酸進行鹼基配對的聚合物中之部分。
3 ' 端帽： 術語「3'端帽」係指結合於PNPLA3寡核苷酸(例如，RNAi劑)之3'端的非核苷酸化學部分。在一些實施例中，3'端帽代替3'端二核苷酸。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸之3'端帽執行以下功能中之至少一者：允許藉由寡核苷酸導引之RNA干擾；避免寡核苷酸降解或降低寡核苷酸降解之量或速率(例如，由核酸酶降解)；減少有義股之脫靶效應；或增加藉由寡核苷酸導引之RNA干擾的活性、持續時間或功效。藉由將3'端帽描述為「非核苷酸」，其意謂3'端帽並非連接至PNPLA3寡核苷酸之其餘部分之糖部分的核苷酸部分或寡核苷酸部分，如同其為PNPLA3寡核苷酸鏈之一部分時那樣。本文中描述某些實例3'端帽。一般技術者應理解，根據本發明可利用此項技術中已知之其他3'端帽。
阻隔基 ：術語「阻隔基」係指掩蔽官能基之反應性的基團。官能基隨後可藉由移除阻隔基來解除掩蔽。在一些實施例中，阻隔基為保護基。
部分 (moiety) ：術語「部分」係指分子之特定區段或官能基。化學部分為嵌入或附接至分子之通常公認之化學實體。
固體載體 ：術語「固體載體」係指使得能夠合成核酸之任何載體。在一些實施例中，該術語係指玻璃或聚合物，其不可溶於用於合成核酸所執行之反應步驟中所採用的介質中，且經衍生化以包含反應基。在一些實施例中，固體載體為高度交聯聚苯乙烯(HCP)或受控微孔玻璃(CPG)。在一些實施例中，固體載體為受控微孔玻璃(CPG)。在一些實施例中，固體載體為受控微孔玻璃(CPG)與高度交聯聚苯乙烯(HCP)之混合載體。
連接基團或連接部分 ：術語「連接基團」、「連接部分」以及其類似者係指將一個化學部分連接至另一化學部分之任何化學部分。在一些實施例中，連接基團為在多聚體中將一個寡核苷酸連接至另一寡核苷酸之部分。在一些實施例中，連接基團為視情況定位於末端核苷與固體載體之間或末端核苷與另一核苷、核苷酸或核酸之間的部分。
基因 ：如本文中所用之術語「基因」、「重組基因」及「基因構築體」係指編碼蛋白質或其一部分之DNA分子或DNA分子之一部分。DNA分子可含有編碼蛋白質之開放閱讀框架(如外顯子序列)且可進一步包括內含子序列。如本文中所用之術語「內含子」係指存在於指定基因中，不轉譯成蛋白質，且在一些但並非所有情況下介於外顯子之間的DNA序列。期望該基因可操作地連接於(或其可包含)一或多個啟動子、強化子、抑制子及/或其他調控序列以調節基因之活性或表現，如此項技術中所熟知。
互補 DNA ：如本文中所用，「互補DNA」或「cDNA」包括藉由mRNA反轉錄合成且已移除插入序列(內含子)之重組聚核苷酸。
寡核苷酸： 術語「寡核苷酸」係指核苷酸之聚合物或寡聚物，且可含有天然及非天然核鹼基、糖及核苷酸間鍵聯之任何組合。
寡核苷酸可為單股或雙股。如本文中所用，術語「寡核苷酸股」涵蓋單股寡核苷酸。單股寡核苷酸可具有雙股區域(由單股寡核苷酸之兩個部分形成)，且包含兩個寡核苷酸鏈之雙股寡核苷酸可例如在兩個寡核苷酸鏈並不彼此互補的區域處具有單股區域。在一些實施例中，寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，寡核苷酸能夠經由RNA干擾來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，寡核苷酸能夠經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，寡核苷酸能夠經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。實例寡核苷酸包括(但不限於)結構基因、包括控制及終止區域之基因、自行複製系統(諸如病毒或質體DNA)、單股及雙股RNAi劑及其他RNA干擾試劑(RNAi劑或iRNA劑)、shRNA、反義寡核苷酸、核酶、微小RNA、微小RNA模擬物、超級mir (supermir)、適體、抗mir (antimir)、拮抗mir (antagomir)、Ul接附蛋白、形成三螺旋體之寡核苷酸、G四螺旋體寡核苷酸、RNA活化劑、免疫刺激寡核苷酸及誘騙性寡核苷酸(decoy oligonucleotide)。
可有效誘導RNA干擾之雙股及單股寡核苷酸在本文中亦稱為RNAi劑或iRNA劑。在一些實施例中，此等RNA干擾誘導型寡核苷酸與被稱為RNAi誘導沉默複合體(RISC)的細胞質多蛋白質複合物結合。在多個實施例中，雙股RNAi劑足夠長，其可由內源性分子裂解，例如藉由Dicer裂解，產生較小寡核苷酸，該等較小寡核苷酸可進入RISC體系且參與靶序列(例如，標靶mRNA序列)之RISC介導之裂解及/或轉譯抑制。
本發明寡核苷酸可具有各種長度。在特定實施例中，寡核苷酸之長度可介於約2至約200個核苷酸範圍內。在各種相關實施例中，單股、雙股及三股寡核苷酸之長度可介於以下範圍內：約4至約10個核苷酸、約10至約50個核苷酸、約20至約50個核苷酸、約15至約30個核苷酸或約20至約30個核苷酸。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸之長度為約10至約40個核苷酸。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸之長度為約9至約39個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少4個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少5個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少6個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少7個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少8個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少9個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少10個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少11個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少12個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少15個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少20個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少25個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少30個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸為長度為至少18個核苷酸之互補股的雙螺旋體。在一些實施例中，寡核苷酸為長度為至少21個核苷酸之互補股的雙螺旋體。在一些實施例中，計算在長度中之各核苷酸獨立地包含選自腺嘌呤、胞嘧啶、鳥苷、胸腺嘧啶及尿嘧啶之視情況經取代之核鹼基。
核苷酸間鍵聯： 如本文中所用，片語「核苷酸間鍵聯」一般係指連接PNPLA3寡核苷酸或核酸之核苷單元的鍵聯。在一些實施例中，核苷酸間鍵聯為如天然存在之DNA及RNA分子中所存在的磷酸二酯鍵聯(天然磷酸酯鍵聯)。在一些實施例中，術語「核苷酸間鍵聯」包括經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，核苷酸間鍵聯為「經修飾之核苷酸間鍵聯」，其中磷酸二酯鍵聯之各氧原子視情況且獨立地經有機或無機部分置換。在一些實施例中，此有機或無機部分係選自(但不限於) =S、=Se、=NR'、-SR'、-SeR'、-N(R')2 、B(R')3 、-S-、-Se-及-N(R')-，其中各R'獨立地如本發明中所定義及描述。在一些實施例中，核苷酸間鍵聯為磷酸三酯鍵聯、硫代磷酸二酯鍵聯()或經修飾之硫代磷酸三酯鍵聯。
一般技術者應理解，由於核苷酸間鍵聯中存在酸或鹼部分，因此該鍵聯在指定pH下可以陰離子或陽離子形式存在。
在一些實施例中，「全(R p)」或「全(S p)」分別用於表示寡核苷酸中之所有對掌性鍵聯磷原子皆具有相同R p或S p組態。
寡核苷酸類型： 如本文中所用，片語「寡核苷酸類型」用於定義具有特定鹼基序列、主鏈鍵聯模式(亦即，核苷酸間鍵聯類型之模式，例如磷酸酯、硫代磷酸酯等)、主鏈對掌性中心模式(亦即，鍵聯磷立體化學模式(R p/S p))及主鏈磷修飾模式(例如，式I 中之「−XLR1 」基團之模式)的PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，具有共同指定「類型」之寡核苷酸在結構上彼此相同。
熟習此項技術者應瞭解，本發明之合成方法在PNPLA3寡核苷酸股之合成期間提供一定程度之控制，使得寡核苷酸股之各核苷酸單元可提前經設計及/或選擇以在鍵聯磷處具有特定立體化學及/或在鍵聯磷及/或特定鹼基及/或特定糖處具有特定修飾。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸股提前經設計及/或選擇以在鍵聯磷處具有特定立體中心組合。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸股經設計及/或確定以在鍵聯磷處具有特定修飾組合。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸股經設計及/或選擇以具有特定鹼基組合。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸股經設計及/或選擇以具有以上結構特徵中之一或多者的特定組合。在一些實施例中，本發明提供包含複數個寡核苷酸分子或由複數個寡核苷酸分子組成的組合物(例如，對掌性受控寡核苷酸組合物)。在一些實施例中，所有該等分子屬於相同類型(亦即，在結構上彼此相同)。然而，在多個實施例中，通常就預定相對量而言，所提供之組合物包含複數個不同類型之寡核苷酸。
對掌性控制： 如本文中所用，「對掌性控制」係指控制PNPLA3寡核苷酸內之對掌性核苷酸間鍵聯中之對掌性鍵聯磷的立體化學名稱。在一些實施例中，控制係經由PNPLA3寡核苷酸之糖及鹼基部分中不存在的對掌性元件達成，例如在一些實施例中，控制係經由在如本發明中所例示之寡核苷酸製備期間使用一或多種對掌性助劑而達成，該等對掌性助劑通常作為在寡核苷酸製備期間使用之對掌性胺基磷酸酯之一部分。一般熟習此項技術者應瞭解，與對掌性控制相比，當不使用對掌性助劑之習知寡核苷酸合成用於形成對掌性核苷酸間鍵聯時，該習知寡核苷酸合成無法控制對掌性核苷酸間鍵聯處之立體化學。在一些實施例中，控制PNPLA3寡核苷酸內之對掌性核苷酸間鍵聯中之各對掌性鍵聯磷的立體化學名稱。
對掌性受控寡核苷酸組合物： 如本文中所用，術語「對掌性受控寡核苷酸組合物」、「對掌性受控核酸組合物」以及其類似者係指包含複數個共用以下之寡核苷酸(或核酸)之組合物：1)共同鹼基序列，2)共同主鏈鍵聯模式，及3)共同主鏈磷修飾模式，其中該複數個寡核苷酸(或核酸)在一或多個對掌性核苷酸間鍵聯(對掌性受控核苷酸間鍵聯)處共用相同立體化學，且組合物中該複數個寡核苷酸(或核酸)之含量係預定的(例如，經由對掌性受控寡核苷酸製備以形成一或多個對掌性核苷酸間鍵聯)。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸組合物中之所有寡核苷酸之約1%-100% (例如，約5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80-100%、90-100%、95-100%、50%-90%，或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)為該複數個寡核苷酸。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸組合物中共用共同鹼基序列之所有寡核苷酸之約1%-100% (例如，約5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80-100%、90-100%、95-100%、50%-90%，或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)為該複數個寡核苷酸。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸組合物中共用共同鹼基序列、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈磷修飾模式之所有寡核苷酸之約1%-100% (例如，約5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80-100%、90-100%、95-100%、50%-90%，或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)為該複數個寡核苷酸。在一些實施例中，以下之預定含量為約1%-100% (例如，約5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80-100%、90-100%、95-100%、50%-90%，或約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，或至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)：組合物中之所有寡核苷酸；或組合物中共用共同鹼基序列之所有寡核苷酸(例如，複數個寡核苷酸或PNPLA3寡核苷酸類型)；或組合物中共用共同鹼基序列、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈磷修飾模式之所有寡核苷酸為該複數個寡核苷酸；或組合物中共用共同鹼基序列、共同鹼基修飾模式、共同糖修飾模式、共同核苷酸間鍵聯類型模式及/或共同核苷酸間鍵聯修飾模式之所有寡核苷酸。在一些實施例中，該複數個寡核苷酸在約1-50個(例如，約1-10、1-20、5-10、5-20、10-15、10-20、10-25、10-30個，或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)對掌性核苷酸間鍵聯處共用相同立體化學。在一些實施例中，該複數個寡核苷酸在約1%-100% (例如，約5%-100%、10%-100%、20%-100%、30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80-100%、90-100%、95-100%、50%-90%，約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%，或至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%)之對掌性核苷酸間鍵聯處共用相同立體化學，在一些實施例中，各對掌性核苷酸間鍵聯為對掌性受控核苷酸間鍵聯，且該組合物為完全對掌性受控寡核苷酸組合物。在一些實施例中，並非所有對掌性核苷酸間鍵聯皆為對掌性受控核苷酸間鍵聯，且該組合物為部分對掌性受控寡核苷酸組合物。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸組合物包含預定含量之個別寡核苷酸或核酸類型。舉例而言，在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸組合物包含一種寡核苷酸類型。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸組合物包含超過一種寡核苷酸類型。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸組合物包含複數種寡核苷酸類型。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸組合物為一種寡核苷酸類型之寡核苷酸之組合物，該組合物包含預定含量之該寡核苷酸類型之複數個寡核苷酸。
對掌性純： 如本文中所用，片語「對掌性純」用於描述PNPLA3寡核苷酸(例如，單股RNAi劑)之相對量，其中所有寡核苷酸就鍵聯磷而言皆以單一非對映異構形式存在。
對掌性均一： 如本文中所用，片語「對掌性均一」用於描述所有核苷酸單元在鍵聯磷處皆具有相同立體化學的PNPLA3寡核苷酸分子或類型。舉例而言，核苷酸單元在鍵聯磷處皆具有R p立體化學的PNPLA3寡核苷酸為對掌性均一的。同樣，核苷酸單元在鍵聯磷處皆具有S p立體化學的PNPLA3寡核苷酸為對掌性均一的。
預定 ： 預定(predetermined/pre-determined)意謂有意選擇，其例如與隨機出現或在無控制的情況下達成相對。閱讀本發明之一般熟習此項技術者將瞭解，本發明提供允許對將併入寡核苷酸組合物中之特定化學及/或立體化學特徵進行選擇且進一步實現具有該等化學及/或立體化學特徵之寡核苷酸組合物之受控製備的技術。該等所提供組合物如本文所描述「預定」。由於不受控制以有意產生特定化學及/或立體化學特徵之製程而偶然產生某些寡核苷酸，可能含有該等寡核苷酸之組合物則不為「預定」組合物。在一些實施例中，預定組合物為可有意地再製造(例如，經由重複受控製程)的組合物。在一些實施例中，組合物中預定含量之複數個寡核苷酸意謂在該組合物中該複數個寡核苷酸之絕對量及/或相對量(比率、百分比等)係受控的。在一些實施例中，組合物中預定含量之複數個寡核苷酸經由對掌性受控寡核苷酸製備而達成。
鍵聯磷： 如本文中所定義，片語「鍵聯磷」用於指示，所提及之特定磷原子為存在於核苷酸間鍵聯中之磷原子，該磷原子對應於如天然產生之DNA及RNA中所存在的核苷酸間鍵聯之磷酸二酯之磷原子。在一些實施例中，鍵聯磷原子係在經修飾之核苷酸間鍵聯中，其中磷酸二酯鍵聯之各氧原子視情況且獨立地經有機或無機部分置換。在一些實施例中，鍵聯磷原子為式I之PL 。在一些實施例中，鍵聯磷原子具有對掌性。
P 修飾： 如本文中所用，術語「P修飾」係指在鍵聯磷處除立體化學修飾以外的任何修飾。在一些實施例中，P修飾包含添加、取代或移除共價連接至鍵聯磷之側接部分。在一些實施例中，「P修飾」為-X-L-R1 ，其中X、L及R1 中之各者獨立地如本發明中所定義及描述。
出於本發明之目的，根據元素週期表, CAS版本,Handbook of Chemistry and Physics , 第67版, 1986-87, 內封面鑑別化學元素。
本文關於本發明化合物及組合物所描述的方法及結構亦適用於此等化合物及組合物之醫藥學上可接受之酸或鹼加成鹽以及所有立體異構形式。
合成寡核苷酸提供適用於廣泛多種應用之分子工具。舉例而言，寡核苷酸適用於治療應用、診斷應用、研究應用及新穎奈米材料應用。天然產生之核酸(例如，未經修飾之DNA或RNA)之使用受到限制，例如由於其對核酸內切酶及核酸外切酶之易感性而受到限制。因此，已研發出各種合成對應物來避開此等缺點。此等合成對應物包括含有化學修飾之合成寡核苷酸，該等化學修飾例如鹼基修飾、糖修飾、主鏈修飾等，其尤其使得此等分子不太容易降解且改良了寡核苷酸之其他特性。自結構觀點來看，核苷酸間磷酸酯鍵聯修飾可引入對掌性，且寡核苷酸之某些特性可能受到形成寡核苷酸主鏈之磷原子之組態的影響。舉例而言，活體外研究表明，反義寡核苷酸之特性尤其受主鏈磷原子之對掌性影響，該等特性諸如結合親和力、與互補RNA之序列特異性結合、針對核酸酶之穩定性。
本發明尤其認識到，寡核苷酸之結構要素，諸如化學修飾(例如，糖、鹼基及/或核苷酸間鍵聯之修飾)或其模式、與脂質或其他部分之結合及/或立體化學[例如，主鏈對掌性中心(對掌性核苷酸間鍵聯)之立體化學及/或其模式]，對特性及活性(例如，穩定性、特異性、選擇性、降低靶基因之產物(轉錄物及/或蛋白質)含量之活性等等)可具有重大影響。在一些實施例中，寡核苷酸特性可藉由最佳化化學修飾(鹼基、糖及/或核苷酸間鍵聯部分之修飾)、化學修飾模式、立體化學及/或立體化學模式而調節。
在一些實施例中，本發明證明，包含具有受控結構要素(例如，受控化學修飾及/或受控主鏈立體化學模式)之寡核苷酸的寡核苷酸組合物提供出人意料的特性及活性，包括(但不限於)本文中所描述之彼等特性及活性。在一些實施例中，包含具有化學修飾(例如，鹼基修飾、糖修飾、核苷酸間鍵聯修飾等)或其模式之寡核苷酸的所提供組合物具有改良之特性及活性。該等改良之特性之非限制性實例包括：導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低；及/或導引RNA干擾；及/或導引RNase H介導之減量。在一些實施例中，本發明提供用於單股RNAi之技術(例如，寡核苷酸、組合物、方法等)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為ssRNAi劑。
據報導，在一些實施例中，RNA干擾為轉錄後靶向基因沉默技術，其使用RNAi劑來靶向包含與該RNAi劑互補之序列的RNA (例如，基因轉錄物，諸如信使RNA (mRNA))，以用於藉由RISC (RNA誘導沉默複合體)路徑介導之裂解。據報導，在自然界中，一種類型的RNAi在核糖核酸酶III (Dicer)將較長dsRNA (雙股RNA) (例如，引入至哺乳動物細胞中之外源dsRNA)裂解成稱作siRNA之較短片段時發生。siRNA (小干擾RNA或短抑制RNA)之長度通常為約21至23個核苷酸且包含約19個鹼基對雙螺旋體。據報導，較小RNA區段隨後介導標靶mRNA之降解。據報導，RNAi反應之特徵亦在於通常稱作RNA誘導沉默複合體(RISC)之核酸內切酶複合物，其導引與siRNA之反義股互補的單股mRNA之裂解。據報導，標靶RNA之裂解在與siRNA雙螺旋體之反義股互補的區域中間發生。據報導，將RNAi劑用於靶轉錄物引起基因活性、含量及/或表現之降低，例如靶基因或靶序列之「減量」或「剔除」。人造siRNA既適用作治療劑亦適用於實驗用途。
在一個態樣中，RNA干擾劑包括與標靶RNA序列相互作用以導引標靶RNA之裂解的單股RNA。不希望受理論束縛，據報導，引入植物及無脊椎細胞中之較長雙股RNA由稱為Dicer之III型核酸內切酶分解成siRNA (Sharp等人, Genes Dev. 2001, 15:485)。據報導，Dicer為核糖核酸酶-III樣酶，其將dsRNA加工成特徵為兩個鹼基3'懸垂物之19至23個鹼基對的短干擾RNA (Bernstein等人, (2001) Nature 409:363)。據報導，siRNA接著併入RNA誘導沉默複合體(RISC)中，其中一或多種解螺旋酶展開siRNA雙螺旋體，使互補反義股能夠導引標靶識別(Nykanen等人, (2001) Cell 107:309)。當結合於適當標靶mRNA時，RISC內之一或多種核酸內切酶裂解標靶以誘導沉默(Elbashir等人, (2001) Genes Dev. 15: 188)。因此，在一個態樣中，本發明係關於一種單股RNA，其促進形成RISC複合物以實現靶基因之沉默。
在一些實施例中，可藉由此項技術中已知之任何方法選擇或可由一般熟習此項技術者根據本發明設想適合的RNAi劑。舉例而言，選擇準則可包括以下步驟中之一或多者：對靶基因序列進行初始分析且設計RNAi劑；此設計可考慮跨物種(人類、食蟹獼猴、小鼠等)之序列相似性以及與其他(非靶)基因之不相似性；活體外篩選RNAi劑(例如，在表現靶轉錄物之細胞中以10 nM進行篩選)；測定在細胞中之EC50或IC50；測定用RNAi劑處理的細胞之生存力，其中在一些實施例中需要針對標靶之RNAi劑不抑制此等細胞之生存力；用人類PBMC (外周血液單核細胞)進行測試，例如測試TNF-α之含量從而估計免疫原性，其中通常不太需要免疫刺激序列；以人類全血分析方式進行測試，其中用RNAi劑處理新鮮的人類血液且測定細胞介素/趨化激素含量[例如，TNF-α (腫瘤壞死因子α)及/或MCP1 (單核細胞趨化蛋白質1)]，其中通常不太需要免疫刺激序列；使用測試動物中之細胞或腫瘤在活體內測定基因減量；及最佳化RNAi劑之特定修飾。
據報導，所謂的典型siRNA結構為雙股RNA分子，其中各股之長度為約21個核苷酸。據報導，兩個股為反義(或「導引」)股及有義(或「隨從」)股，反義股識別靶轉錄物中之互補序列且與其結合，有義股與反義股互補。據報導，有義股與反義股在很大程度上互補，通常在兩個末端上形成2個核苷酸之兩個3'懸垂物。
據報導，雖然典型siRNA結構為雙股的，但RNAi劑亦可為單股的。在一些實施例中，單股RNAi劑對應於雙股siRNA之反義股，且單股RNAi劑缺少對應的隨從股。
然而，已報導，並非單股RNAi劑之所有受測試結構要素皆有效；據報導，將一些結構要素引入PNPLA3寡核苷酸中可干擾單股RNA干擾活性。
在一些實施例中，本發明提供適用作RNAi劑之寡核苷酸及組合物。在一些實施例中，本發明提供適用作單股RNAi劑之寡核苷酸及組合物。本發明尤其提供能夠導引RNA干擾之單股寡核苷酸之新穎結構。不希望受任何特定理論束縛，本發明指出，單股RNAi劑具有優於雙股RNAi劑之優點。舉例而言，單股RNAi劑之產品成本更低，因為僅需要構築一個股。另外或可替代地，僅投與一個股(反義股)以靶向靶轉錄物。dsRNA導引之脫靶效應源為有義股進入RISC中且與非所需標靶結合並減少其基因表現(Jackson等人2003 Nat. Biotech. 21: 635-637)，單股RNAi劑相比於對應的雙股RNAi劑可引起更少的脫靶效應。此外，一些單股RNAi劑(包括本文中所揭示之一些單股RNAi劑)可靶向雙股RNAi劑先前未成功靶向之特定序列(例如，其可明顯超過雙股RNAi劑地降低序列及/或序列產物(轉錄物及/或蛋白質)之含量)。本發明尤其提供可導引單股RNA干擾之寡核苷酸之新穎型式(修飾、立體化學、其組合等)。寡核苷酸
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可導引標靶產物之含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可降低靶基因轉錄物之含量。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可降低靶基因mRNA之含量。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可降低靶基因編碼之蛋白質的含量。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可經由RNA干擾來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可藉由在結合於靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含根據本發明的本文中所描述或此項技術中已知的一或多種結構要素，例如：鹼基序列；修飾；立體化學；核苷酸間鍵聯模式；主鏈鍵聯模式；主鏈對掌性中心模式；主鏈磷修飾模式；其他化學部分，包括(但不限於)一或多個靶向部分、脂質部分及/或碳水化合物部分等；種子區域；種子後區域；5'端結構；5'端區域；5'核苷酸部分；3'端區域；3'端二核苷酸；3'端帽；等等。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸之種子區域為或包含第二至第八個、第二至第七個、第二至第六個、第三至第八個、第三至第七個、第三至七個或第四至第八個或第四至第七個核苷酸，自5'端計數；且寡核苷酸之種子後區域為緊接的3'至種子區域之區域，且插在種子區域與3'端區域之間。
在一些實施例中，所提供之組合物包含PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，所提供之組合物包含一或多個脂質部分、一或多個碳水化合物部分(除非另外說明，否則不包括藉由核苷酸間鍵聯形式寡核苷酸鏈之核苷單元之糖部分)及/或一或多種靶向組分。
在一些實施例中，在特定對偶基因(及/或其一或多種產物(例如，RNA及/或蛋白質產物)) (疾病相關對偶基因)之存在及/或活性與一或多種疾病及/或病狀之存在、發生及/或嚴重程度相關聯(例如，相關)的情況下，同一序列(例如，基因)之不同對偶基因存在但並不怎麼相關聯或在較小程度上相關聯(例如，展現不太明顯或統計學上不明顯的相關性)。在一些此類實施例中，如本文中描述之寡核苷酸及其方法可相對於一或多個較不相關/不相關對偶基因而優先或特異性地靶向相關對偶基因。
在一些實施例中，靶序列係如本文中描述之PNPLA3寡核苷酸所結合之序列。在許多實施例中，靶序列與所提供寡核苷酸或其中之連續殘基的序列一致或為其對應互補序列(例如，所提供之寡核苷酸包括與靶序列一致或為其對應互補序列的標靶結合序列)。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸(之相關部分)與其靶序列之間容許少數差異/錯配。在許多實施例中，靶序列存在於靶基因內。在許多實施例中，靶序列存在於由靶基因產生之轉錄物(例如，mRNA及/或前mRNA)內。
在一些實施例中，靶序列包括一或多個對偶基因位點(亦即，靶基因內出現對偶基因變異之位置)。在一些此類實施例中，所提供之寡核苷酸相對於一或多個其他對偶基因優先或特異性地結合於一個對偶基因。在一些實施例中，標靶結合序列與一個對偶基因之靶序列一致或為其對應互補序列。在一些實施例中，標靶結合序列與一個對偶基因之靶序列一致。在一些實施例中，標靶結合序列為一個對偶基因之靶序列之對應互補序列。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸優先結合於疾病相關對偶基因。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸優先結合於疾病相關對偶基因且包含標靶結合序列，該標靶結合序列與疾病相關對偶基因而非其他對偶基因之靶序列一致或為其對應互補序列。舉例而言，在一些實施例中，本文所提供之PNPLA3寡核苷酸(或其標靶結合序列部分)具有與靶序列之特定對偶基因版本一致或為其對應互補序列的序列。在一些實施例中，靶序列為特定對偶基因之序列。在一些實施例中，本文所提供之PNPLA3寡核苷酸(或其標靶結合序列部分)具有與疾病相關對偶基因之對偶基因位點一致或為其對應互補序列的序列。
如熟習此項技術者所瞭解，根據本發明之靶序列中可包括各種對偶基因位點。在一些實施例中，靶序列包含SNP。在一些實施例中，靶序列包含突變。在一些實施例中，SNP為PNPLA3中之SNP。
根據本發明可利用各種連接基團、脂質部分、碳水化合物部分及靶向部分，包括此項技術中已知的諸多者。在一些實施例中，脂質部分為靶向部分。在一些實施例中，碳水化合物部分為靶向部分。在一些實施例中，靶向部分為脂質部分。在一些實施例中，靶向部分為碳水化合物部分。如熟習此項技術者容易瞭解，根據本發明可利用各種連接基團(包括本發明中所描述之彼等連接基團)來連接兩個部分，例如連接脂質/碳水化合物/靶向組分與PNPLA3寡核苷酸部分。如熟習此項技術者容易瞭解，針對連接兩個部分所描述之連接基團亦可用於連接其他部分，例如用於連接脂質與PNPLA3寡核苷酸部分之連接基團亦可用於連接碳水化合物或標靶部分與PNPLA3寡核苷酸部分，且反之亦然。
在一些實施例中，本發明提供對掌性受控的寡核苷酸及寡核苷酸組合物。舉例而言，在一些實施例中，所提供之組合物含有預定含量之一或多種個別寡核苷酸類型，其中PNPLA3寡核苷酸類型由以下定義：1)鹼基序列；2)主鏈鍵聯模式；3)主鏈對掌性中心模式；及4)主鏈P修飾模式。在一些實施例中，特定寡核苷酸類型可由以下定義：1A)鹼基一致性；1B)鹼基修飾模式；1C)糖修飾模式；2)主鏈鍵聯模式；3)主鏈對掌性中心模式；及4)主鏈P修飾模式。在一些實施例中，相同寡核苷酸類型之寡核苷酸為相同的。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸之對掌性受控寡核苷酸組合物，其中該組合物包含預定含量之複數個寡核苷酸，其中該複數個寡核苷酸共用共同鹼基序列，且在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個對掌性核苷酸間鍵聯(對掌性受控核苷酸間鍵聯)處包含鍵聯磷之相同組態。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含2至30個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含5至30個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含10至30個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含1個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含2個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含3個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含4個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含5個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含6個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含7個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含8個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含9個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含10個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含11個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含12個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含13個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含14個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸具有15個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸具有16個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸具有17個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸具有18個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸具有19個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸具有20個對掌性受控核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為單聚體。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為P修飾單聚體。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為立體單聚體。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為組態R p之立體單聚體。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為組態S p之立體單聚體。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為交替體。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為P修飾交替體。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為立體交替體。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為嵌段體。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為P修飾嵌段體。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為立體嵌段體。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為間隔體。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為跳過體。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為半聚體。在一些實施例中，半聚體為5'端或3'端區域之序列具有寡核苷酸其餘部分不具有之結構特徵的PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，5'端或3'端區域具有或包含2至20個核苷酸。在一些實施例中，結構特徵為鹼基修飾。在一些實施例中，結構特徵為糖修飾。在一些實施例中，結構特徵為P修飾。在一些實施例中，結構特徵為對掌性核苷酸間鍵聯之立體化學。在一些實施例中，結構特徵為或包含鹼基修飾、糖修飾、P修飾或對掌性核苷酸間鍵聯之立體化學或其組合。在一些實施例中，半聚體為5'端區域之各糖部分共用共同修飾的PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，半聚體為3'端區域之各糖部分共用共同修飾的PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，5'或3'端區域之共同糖修飾不為寡核苷酸中之任何其他糖部分所共用。在一些實施例中，實例半聚體為一種PNPLA3寡核苷酸，其一個末端區域包含經取代或未經取代之2'-O-烷基糖修飾之核苷、經雙環糖修飾之核苷、β-D-核糖核苷或β-D-去氧核糖核苷(例如經2'-MOE修飾之核苷及經LNA™或ENA™雙環糖修飾之核苷)的序列且另一末端區域包含具有不同糖部分之核苷(諸如經取代或未經取代之2'-O-烷基糖修飾之核苷、經雙環糖修飾之核苷或天然核苷)的序列。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為單聚體、交替體、嵌段體、間隔體、半聚體及跳過體中之一或多者之組合。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為單聚體、交替體、嵌段體、間隔體及跳過體中之一或多者之組合。舉例而言，在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為交替體及間隔體。在一些實施例中，所提供之核苷酸為間隔體及跳過體。化學及合成技術中之技術人員將認識到，諸多其他模式組合為可用的且僅受用於根據本發明方法合成所提供寡核苷酸所需之組成部分的商業可獲得性及/或合成可行性限制。在一些實施例中，半聚體結構提供有利益處。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為在5'端序列中包含經修飾之糖部分的5'半聚體。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為在5'端序列中包含經修飾之2'糖部分的5'半聚體。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之核苷酸。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之核苷。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個經修飾之核苷。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之LNA。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之核鹼基。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之天然核鹼基。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之經修飾之核鹼基。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個5-甲基胞嘧啶核苷、5-羥甲基胞嘧啶核苷、5-甲醯基胞嘧啶或5-羧基胞嘧啶。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個5-甲基胞嘧啶核苷。
在一些實施例中，各鹼基(BA)獨立地為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥苷、胸腺嘧啶或尿嘧啶之視情況經取代或受保護之核鹼基。如熟習此項技術者將瞭解，根據本發明可利用各種受保護核鹼基，包括此項技術中廣泛已知的彼等受保護核鹼基，例如寡核苷酸製備中使用之彼等受保護核鹼基(例如，WO/2010/064146、WO/2011/005761、WO/2013/012758、WO/2014/010250、US2013/0178612、WO/2014/012081、WO/2015/107425、WO2017/015555及WO2017/062862之受保護核鹼基，該等文獻中之每一者之受保護核鹼基以引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之糖。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代的天然產生之DNA及RNA中所存在之糖。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之核糖或去氧核糖。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之核糖或去氧核糖，其中核糖或去氧核糖部分之一或多個羥基視情況且獨立地經鹵素、R'、-N(R')2 、-OR'或-SR'置換，其中各R'獨立地如上文所定義及本文中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之去氧核糖，其中去氧核糖之2'位置視情況且獨立地經鹵素、R'、-N(R')2 、-OR'或-SR'取代，其中各R'獨立地如上文所定義及本文中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之去氧核糖，其中去氧核糖之2'位置視情況且獨立地經鹵素取代。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之去氧核糖，其中去氧核糖之2'位置視情況且獨立地經一或多個-F.鹵素取代。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之去氧核糖，其中去氧核糖之2'位置視情況且獨立地經-OR'取代，其中各R'獨立地如上文所定義及本文中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之去氧核糖，其中去氧核糖之2'位置視情況且獨立地經-OR'取代，其中各R'獨立地為視情況經取代之C1 -C6 脂族基。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之去氧核糖，其中去氧核糖之2'位置視情況且獨立地經-OR'取代，其中各R'獨立地為視情況經取代之C1 -C6 烷基。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之去氧核糖，其中去氧核糖之2'位置視情況且獨立地經-OMe取代。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個視情況經取代之去氧核糖，其中去氧核糖之2'位置視情況且獨立地經-O-甲氧基乙基取代。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為混合寡核苷酸股。在某些實施例中，所提供之寡核苷酸為部分混合之寡核苷酸股。在某些實施例中，所提供之寡核苷酸為完全混合之寡核苷酸股。在某些實施例中，所提供之寡核苷酸為雙股寡核苷酸。在某些實施例中，所提供之寡核苷酸為三股寡核苷酸(例如，三螺旋體)。
在一些實施例中，包含WO2012/030683中描繪之PNPLA3寡核苷酸的結構中之任一者可根據本發明之方法經修飾，以提供其對掌性受控組合物。舉例而言，在一些實施例中，對掌性受控組合物包含對掌性鍵聯磷原子中之任何一或多者處之立體化學控制，視情況經由併入WO2012/030683或本發明中所描述之一或多種P修飾。舉例而言，在一些實施例中，WO2012/030683之PNPLA3寡核苷酸之特定核苷酸單元經預選擇為在該核苷酸單元之鍵聯磷處具有對掌性控制及/或預選擇為在該核苷酸單元之鍵聯磷處經對掌性控制修飾之P。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含核酸類似物，例如GNA、LNA、PNA、TNA、F-HNA (F-THP或3'-氟四氫哌喃)、MNA (甘露醇核酸，例如Leumann 2002 Bioorg. Med. Chem. 10: 841-854)、ANA (anitol核酸)及N-嗎啉基。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸經表徵為具有間接或直接增加或降低蛋白質活性或者抑制或促進蛋白質表現的能力。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸的特徵在於，其適用於控制細胞增殖、病毒複製及/或任何其他細胞信號傳導過程。
在一些實施例中，所提供寡核苷酸之5'端及/或3'端經修飾。在一些實施例中，所提供寡核苷酸之5'端及/或3'端經端帽部分修飾。此類包括端帽部分之修飾的實例在本文及此項技術中廣泛描述，例如(但不限於) US專利申請公開案US 2009/0023675A1中所描述之彼等修飾。
在一些實施例中，特徵為1)共同鹼基序列及長度、2)共同主鏈鍵聯模式及3)共同主鏈對掌性中心模式之PNPLA3寡核苷酸類型的寡核苷酸具有相同化學結構。舉例而言，其具有相同鹼基序列、相同核苷修飾模式、相同主鏈鍵聯模式(亦即，核苷酸間鍵聯類型模式，例如磷酸酯、硫代磷酸酯等)、相同主鏈對掌性中心模式(亦即，鍵聯磷立體化學(R p/S p)模式)及相同主鏈磷修飾模式(例如，式I中之「−XLR1 」基團之模式)。
單股 RNAi 劑及反義寡核苷酸
在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供降低靶基因或其基因產物之表現及/或含量之寡核苷酸。讀數本發明之一般熟習此項技術者將瞭解，在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可充當RNAi劑。替代地或另外，在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可經由RNase H依賴性機制及/或不涉及RNA干擾之另一生物化學機制起作用。
本發明尤其定義在PNPLA3寡核苷酸中可能特別需要及/或有效的某些結構屬性。本發明尤其定義在充當RNAi劑之PNPLA3寡核苷酸中可能特別需要及/或有效的某些結構屬性。在一些實施例中，本發明定義在經由RNase H依賴性機制及/或其他生物化學機制而起作用之PNPLA3寡核苷酸中可能特別需要及/或有效的某些結構屬性。在一些實施例中，本發明定義在單股ssRNAi劑(ssRNAi或ssRNAi劑)中可能特別需要及/或有效的某些結構屬性；在一些此類實施例中，如下文進一步所描述，此等結構屬性可不同於雙股RNAi劑(dsRNAi或dsRNAi劑)之對應股中特別需要及/或有效之彼等結構屬性。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為單股RNAi劑(例如，其可裝載於RISC中及/或可導引或增強RISC介導之標靶)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為反義寡核苷酸(例如，其可裝載於RNase H中及/或導引或增強RNase-H介導的對標靶之裂解及/或經由另一生物化學機制起作用)。
在一些實施例中(包括在一些單股寡核苷酸實施例中)，充當RNAi劑之寡核苷酸可具有一或多個與經由RNase H依賴性機制起作用之彼等寡核苷酸不同的結構屬性及/或功能特性。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸可藉由在結合於靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除(例如，跳過)來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸可執行與RNA干擾或RISC無關之功能或功能之較大百分比(例如，10-100%，不低於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多)。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為反義寡核苷酸(ASO)，其導引由RNase H而非RISC (RNA干擾沉默複合體)介導的標靶RNA之裂解。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為單股RNAi (ssRNAi)劑，其導引由RISC (RNA干擾沉默複合物)而非酶RNase H介導的標靶mRNA之裂解。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸可執行與RNase H無關之功能或功能之較大百分比(例如，10-100%，不低於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多)。
雙股RNAi劑亦可使用RISC而非酶RNase H來導引標靶mRNA之裂解。在一些實施例中，單股RNAi劑與雙股RNAi劑之不同之處在於，ssRNAi劑僅包括單一寡核苷酸股且一般不包含較長長度之雙股區域，而dsRNAi劑包含較長長度之雙股區域(例如，在「典型」siRNA中至少約15 bp或約19 bp)。在一些實施例中，dsRNAi包含兩個獨立的互補股(其並未共價連接)，其形成雙股區域(例如，在「典型」siRNA中)；或包含較長單股，其包含一起形成雙股區域之兩個互補序列(例如，在shRNA或短髮夾RNA中)。在dsRNAi之一些實施例中，隨從股具有單股缺口，從而形成兩個股。在一些實施例中，本發明證實，有效單股RNAi劑所需之序列及/或結構要素(化學修飾、立體化學等)可不同於有效雙股RNAi劑所需之彼等序列及/或結構要素。
本發明尤其認識到，對於雙股RNAi劑可能適合之某些設計(例如，序列及/或結構要素)可能並不適合於單股RNAi劑(包括本文中所描述之所提供型式的單股RNAi劑)，且反之亦然。在一些實施例中，本發明提供用於有效ssRNAi之設計。在一些實施例中，本發明證實，某些鹼基序列在與根據本發明之結構要素(修飾、立體化學、一或多個其他化學部分等)組合時，可使所提供之寡核苷酸(例如)在以ssRNAi劑之形式投與時具有出人意料的較高活性，特別是相比於包含相同序列但為雙股且以dsRNAi劑之形式投與之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明證實，某些鹼基序列在與根據本發明之結構要素(修飾、立體化學、一或多個其他化學部分等)組合時，可使所提供之寡核苷酸具有出人意料的較高活性，例如具有降低靶基因或其基因產物之表現及/或含量之能力。
單股 RNAi ( ssRNAi ) 劑、雙股 RNAi ( dsRNAi ) 劑及 RNase H 依賴性反義寡核苷酸 ( ASO ) 之間的結構及功能差異
在一些實施例中，單股RNAi (ssRNAi)劑、雙股RNAi (dsRNAi)劑及RNase H依賴性反義寡核苷酸(ASO)皆涉及劑或寡核苷酸(或其部分)與互補(或實質上互補)的標靶RNA (例如，mRNA或前mRNA)結合，隨後裂解該標靶RNA及/或降低靶基因或其基因產物之表現及/或含量。在一些實施例中，雙股或單股之RNAi劑利用包括酶Ago-2 (Argonaute-2)之RISC或RNA干擾沉默複合體。在一些實施例中，RNase H依賴性反義寡核苷酸為單股的且利用另一種酶RNase H。據報導，RNase H為使RNA:DNA雙螺旋體之RNA股裂解的細胞核酸內切酶；參見美國專利第7,919,472號。亦參見Saetrom (2004 Bioinformatics 20: 3055-3063)；Kretschmer-Kazemi Far等人(2003 Nucleic Acids 31: 4417-4424)；Bertrand等人(2002) Biochem. Biophys. Res. Comm. 296: 1000-1004)；Vickers等人(2003 J. Biol. Chem. 278: 7108)。在一些實施例中，可導引RNase H介導之減量之寡核苷酸包括(但不限於)由以下組成或包含以下之彼等寡核苷酸：不含有2'修飾之連續2'-去氧核苷酸單元之區域。在一些實施例中，可導引RNase H介導之減量之寡核苷酸為間隔加寬之寡核苷酸或間隔體。在一些實施例中，間隔體包含內部區域，該內部區域包含複數個支援RNase H裂解之核苷酸且定位在外部區域之間，該等外部區域具有複數個在化學上不同於該內部區域之核苷的核苷酸。在一些實施例中，間隔體包含不含有2'修飾，側接或鄰接於一個或兩個翼之2'-去氧核苷酸之跨距。在一些實施例中，間隔導引對應的RNA標靶之RNase H裂解。在一些實施例中，翼並不導引RNase H裂解或充當RNase H裂解之受質。翼可具有不同長度(包括(但不限於) 1 nt至8 nt)，且可包含各種修飾或類似物(包括(但不限於) 2'修飾，包括(但不限於) 2'-OMe及2'-MOE)。作為非限制性實例，參見美國專利第9,550,988號；第7,919,472號；第5,013,830號；第5,149,797號；第5,220,007號；第5,256,775號；第5,366,878號；第5,403,711號；第5,491,133號；第5,565,350號；第5,623,065號；第5,652,355號；第5,652,356號；及第5,700,922號。在一些實施例中，一或多個此等修飾或類似物之存在可與標靶之RNase H裂解修飾(例如，增加、減少或改變)相關。
在一些實施例中，雙股RNAi劑甚至其反義股在結構上於RNase H依賴性反義寡核苷酸不同。在一些實施例中，就5'端結構及總體雙螺旋體穩定性兩者而言，RNase H依賴性反義寡核苷酸與siRNA寡核苷酸似乎具有完全相反的特徵。
據報導，雙股RNAi劑可在細胞中由Dicer酶天然產生，該酶使較大RNA分子(諸如來自入侵病毒之雙股RNA)裂解成dsRNA。dsRNA劑之典型結構包含兩個RNA股，各股之長度約19至23 nt，該兩個股連接而形成約19至21 bp之雙股區域及兩個3'二核苷酸懸垂物。據報導，對於雙股RNAi劑，有義股自雙螺旋體解開，之後反義股併入至RISC中。據報導，除雙股RNAi劑天然分離成反義股及有義股之外，人類細胞中尚未天然產生單股RNAi劑。
本發明尤其提供以下教示：在多數情況下，單股RNAi劑並非簡單地為雙股RNAi劑之經分離反義股，原因在於例如有效dsRNAi劑之反義股可能比dsRNAi劑低效得多，且ssRNAi劑在調配成dsRNAi劑(例如，藉由與有義股連接)時可能比ssRNAi劑低效得多。在一些實施例中，雙股及單股RNAi劑在許多重要方面不同。雙股RNAi劑之結構參數不一定反映在單股RNAi劑中。
在一些實施例中，本發明教示，適合於雙股RNAi劑之靶序列可能並不適合於單股RNAi劑，且反之亦然。舉例而言，在至少一些情況下，雙股RNAi劑之單股型式可能無效。作為非限制性實例，表46A展示用來源於dsRNAi之序列構築之若干ssRNAi劑。此等基於dsRNAi之ssRNAi通常比對應的dsRNAi更低效。
在一些實施例中，雙股及單股RNAi劑對於對掌性受控核苷酸間鍵聯之併入的敏感性亦不同。舉例而言，Matranga等人(2005 Cell 123: 607-620)報導，在雙股RNAi劑之有義股中引入單一Sp核苷酸間鍵聯(例如，單一Sp PS)大大降低RISC組裝及RNA干擾活性。相反，出人意料地，在一些實施例中，本文中展示之資料證實，併入Sp核苷酸間鍵聯(例如，Sp PS)可執行單股RNAi劑之兩個功能：(a)其提高針對核酸酶之穩定性；及(b)不干擾RNA干擾活性。許多實例寡核苷酸可以包含一或多個對掌性受控核苷酸間鍵聯(例如，本文中展示之Sp核苷酸間鍵聯或Sp PS (硫代磷酸酯))之有效單股RNAi劑之形式起作用。
替代地或另外，雙股及單股RNAi劑之免疫原性可不同。據報導，在一些實施例中，一些單股RNAi劑比雙股RNAi劑更具免疫原性。Sioud J. Mol. Biol. (2005) 348, 1079-1090。據報導，在一些實施例中，若干雙股RNAi劑並未誘導免疫反應，而對應的單股RNAi劑誘導了免疫反應。在一些實施例中，本發明提供具有低免疫原性之寡核苷酸。在一些實施例中，此等寡核苷酸可以ssRNAi試劑之形式使用。
本發明尤其認識到，單股RNAi劑之自雙股RNAi劑衍生出單股RNAi劑之某些習知設計(包括鹼基序列)通常無法提供有效的單股RNAi劑。出人意料地，在一些實施例中，本發明證實，來源於有效RNase H依賴性ASO之鹼基序列之ssRNAi劑可產生有效的ssRNAi劑(參見表46A)。
在一些實施例中，本發明提供可以有效RNase-H依賴性ASO之形式使用之寡核苷酸，其包含無2'修飾之2'-去氧核苷酸區域，且與RNA序列或其部分互補或實質上互補。在一些實施例中，區域可例如為側接在翼之一側或兩側上的約10 nt之核心序列，其中該等翼在化學結構方面與該核心不同且作為非限制性實例可包含2'修飾或核苷酸間鍵聯修飾。
寡核苷酸
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可經由RNA干擾來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可藉由在結合於靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸具有本文中描述之結構要素或其型式或部分。
在一些實施例中，能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低的所提供寡核苷酸具有本文中描述之結構要素或其型式或部分。
在一些實施例中，能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低的所提供寡核苷酸具有本文中所揭示之任何寡核苷酸之型式，例如表1A中或者各圖式或表中或者本文中另外所揭示之型式。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸具有圖1中所示的型式中之任一者。
本發明提供表明以下之資料：靶向多個不同物種中之多個不同基因中之多個不同序列中任一者的各種型式之各種寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低；產生證實所揭示型式之ssRNAi劑之功效的其他資料且並未展示。
在一些實施例中，能夠導引RNase H介導之減量之所提供寡核苷酸具有本文中描述之結構要素或其型式或部分。
在一些實施例中，能夠導引RNase H介導之減量之所提供寡核苷酸具有本文中所揭示之任何寡核苷酸之型式，例如表1A中或者各圖式或表中或者本文中另外所揭示之型式。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸具有圖1中所示的型式中之任一者。
本發明提供表明以下之資料：針對多個不同物種中之多個不同基因中之多個不同序列中任一者的各種型式之各種寡核苷酸能夠導引RNase H介導之減量；產生證實所揭示型式之ssRNAi劑之功效的其他資料且並未展示。
在一些實施例中，能夠導引單股RNA干擾之所提供寡核苷酸具有本文中描述之結構要素或其型式或部分。
在一些實施例中，能夠導引單股RNA干擾之所提供寡核苷酸具有本文中所揭示之任何寡核苷酸之型式，例如表1A中或者各圖式或表中或者本文中另外所揭示之型式。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑具有圖1中所示的型式中之任一者。
本發明提供表明以下之資料：針對多個不同基因中之多個不同序列中之任一者的各種型式之各種RNAi劑能夠導引RNA干擾；產生證實所揭示型式之ssRNAi劑之功效的其他資料且並未展示。
在一些實施例中，RNAi之標靶為轉錄物。在一些實施例中，轉錄物為前mRNA。在一些實施例中，轉錄物為成熟RNA。在一些實施例中，轉錄物為mRNA。在一些實施例中，轉錄物包含突變。在一些實施例中，突變為讀框轉移。在一些實施例中，轉錄物包含過早終止密碼子。在一些實施例中，RNAi之標靶為並非mRNA之RNA。在一些實施例中，RNAi之標靶為非編碼RNA。在一些實施例中，RNAi之標靶為較長非編碼RNA。在一些實施例中，所提供組合物中之所提供寡核苷酸，例如第一複數個寡核苷酸，包含鹼基修飾、糖修飾及/或核苷酸間鍵聯修飾。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含鹼基修飾及糖修飾。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含鹼基修飾及核苷酸間鍵聯修飾。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含糖修飾及核苷酸間修飾。在一些實施例中，所提供組合物包含鹼基修飾、糖修飾及核苷酸間鍵聯修飾。實例化學修飾諸如鹼基修飾、糖修飾、核苷酸間鍵聯修飾等，為此項技術中廣泛已知的，包括(但不限於)本發明中所描述的彼等化學修飾。在一些實施例中，經修飾之鹼基為經取代之A、T、C、G或U。在一些實施例中，糖修飾為2'修飾。在一些實施例中，2'修飾為2-F修飾。在一些實施例中，2'修飾為2'-OR1 。在一些實施例中，2'修飾為2'-OR1 ，其中R1 為視情況經取代之烷基。在一些實施例中，2'修飾為2'-OMe。在一些實施例中，2'修飾為2'-MOE。在一些實施例中，經修飾之糖部分為橋連雙環或多環。在一些實施例中，經修飾之糖部分為具有5至20個環原子之橋連雙環或多環，其中一或多個環原子視情況且獨立地為雜原子。實例環結構為此項技術中廣泛已知的，諸如BNA、LNA等中所存在之彼等環結構。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個經修飾之核苷酸間鍵聯及一或多個天然磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，包含經修飾之核苷酸間鍵聯及天然磷酸酯鍵聯之寡核苷酸及其組合物提供改良的特性，例如活性等。在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯為對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯為經取代之硫代磷酸酯鍵聯。
本發明尤其認識到，立體無規寡核苷酸製劑含有複數個彼此不同的獨特化學實體，例如在寡核苷酸鏈內之個別主鏈對掌性中心之立體化學結構方面不同。在不控制主鏈對掌性中心之立體化學的情況下，立體無規寡核苷酸製劑提供不受控組合物，其包含不確定含量之寡核苷酸立體異構體。即使此等立體異構體可具有相同鹼基序列，但至少歸因於其不同的主鏈立體化學，所以其仍為不同的化學實體，且如本文所展現，其可具有不同特性，例如活性、毒性等。本發明尤其提供新穎組合物，其為或含有感興趣寡核苷酸之特定立體異構體。在一些實施例中，特定立體異構體可例如由其鹼基序列、其長度、其主鏈鍵聯模式及其主鏈對掌性中心模式定義。如此項技術中所理解，在一些實施例中，鹼基序列可指PNPLA3寡核苷酸中之核苷殘基(例如，糖及/或鹼基組分，相對於諸如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥苷、胸腺嘧啶及尿嘧啶之標準天然產生之核苷酸而言)之一致性及/或修飾狀態及/或可指該等殘基之混合特徵(亦即，與特定互補殘基混合之能力)。在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含預定含量之個別寡核苷酸類型的寡核苷酸，該等寡核苷酸在化學上一致，例如其具有相同鹼基序列、相同核苷修飾模式(糖及鹼基部分之修飾(若存在))、相同主鏈對掌性中心模式及相同主鏈磷修飾模式。本發明尤其表明，特定寡核苷酸之個別立體異構體可展現彼此不同的穩定性及/或活性。在一些實施例中，經由在PNPLA3寡核苷酸內包括及/或定位特定對掌性結構所達成之特性改良可相當於經由使用特定主鏈鍵聯、殘基修飾等(例如，經由使用特定類型的經修飾之磷酸酯[例如，硫代磷酸酯、經取代之硫代磷酸酯等]、糖修飾[例如，2'修飾等]及/或鹼基修飾[例如，甲基化等])所達成之彼等特性改良或甚至更佳。本發明尤其認識到，在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸之特性(例如，活性等)可藉由最佳化其主鏈對掌性中心模式而調節，其視情況與該寡核苷酸之一或多個其他特徵(例如，鍵聯模式、核苷修飾模式等)之調節/最佳化組合。如本發明中之各種實例所例示，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物可展現改良的特性，例如改良的單股RNA干擾活性、RNase H介導之減量、改良的傳遞等。
在一些實施例中，寡核苷酸特性可藉由最佳化立體化學(主鏈對掌性中心模式)及化學修飾(鹼基、糖及/或核苷酸間鍵聯之修飾)或其模式而調節。
在一些實施例中，共同主鏈對掌性中心模式(例如，單股RNAi劑中之主鏈對掌性中心模式)包含模式OSOSO、OSSSO、OSSSOS、SOSO、SOSO、SOSOS、SOSOSO、SOSOSOSO、SOSSSO、SSOSSSOSS、SSSOSOSSS、SSSSOSOSSSS、SSSSS、SSSSSS、SSSSSSS、SSSSSSSS、SSSSSSSSS或RRR，其中S表示呈Sp組態之硫代磷酸酯，且O表示磷酸二酯，其中R表示呈Rp組態之硫代磷酸酯。
在一些實施例中，非對掌性中心為磷酸二酯鍵聯。在一些實施例中，呈S p組態之對掌性中心為硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，非對掌性中心為磷酸二酯鍵聯。在一些實施例中，呈S p組態之對掌性中心為硫代磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述之任何立體化學模式。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述之任何立體化學模式，且能夠導引RNA干擾。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述之任何立體化學模式，且能夠導引RNase H介導之減量。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述之任何立體化學模式，且能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述之任何立體化學模式，且能夠導引RNA干擾，其中該立體化學模式處於種子及/或種子後區域中。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述之任何立體化學模式，且能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量，其中該立體化學模式處於種子及/或種子後區域中。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述之任何修飾或修飾模式。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述之任何修飾或修飾模式，且能夠導引RNA干擾。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述之任何修飾模式，且能夠導引RNase H介導之減量。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述之任何修飾模式，且能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述之任何修飾模式，且能夠導引RNA干擾，其中該修飾模式處於種子及/或種子後區域中。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述之任何修飾模式，且能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量，其中該修飾模式處於種子及/或種子後區域中。在一些實施例中，修飾或修飾模式為糖之2'位置處之修飾或修飾模式。在一些實施例中，修飾或修飾模式為糖之修飾或修飾模式，例如在糖之2'位置處，該修飾或修飾模式包括(但不限於) 2'-去氧、2'-F、2'-OMe、2'-MOE及2'-OR1，其中R1為視情況經取代之C1-6烷基。
在一些實施例中，本發明證實，2'-F修飾尤其可改良單股RNA干擾。在一些實施例中，本發明證實，在5'端及3'端之S p核苷酸間鍵聯尤其可改良寡核苷酸穩定性。在一些實施例中，本發明證實，天然磷酸酯鍵聯及/或R p核苷酸間鍵聯尤其可改良寡核苷酸自系統之去除。如一般熟習此項技術者所瞭解，可採用此項技術中已知之各種分析來評定根據本發明之該等特性。
在一些實施例中，能夠導引單股RNA干擾之所提供寡核苷酸包含一或多個經修飾之糖部分。在一些實施例中，所提供寡核苷酸中5%或更多之糖部分經修飾。
在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含第一複數個寡核苷酸，其中： 該第一複數個寡核苷酸具有相同鹼基序列；且 該第一複數個寡核苷酸包含一或多個經修飾之糖部分，或包含一或多個天然磷酸酯鍵聯及一或多個經修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸包含一或多個經修飾之糖部分。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個經修飾之糖部分。
在一些實施例中，所提供之組合物改變轉錄物單股RNA干擾，使得非所需標靶及/或生物功能得以抑制。在一些實施例中，在該等情況下，所提供之組合物亦可誘導轉錄物在混合之後裂解。
在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸各自包含一或多個經修飾之糖部分及/或一或多個經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸各自包含至多約95%未經修飾之糖部分。在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸各自包含至多約50%未經修飾之糖部分。在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸各自包含至多約5%未經修飾之糖部分。在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸之各糖部分獨立地經修飾。
在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸各自包含兩個或更多個經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸各自包含三個或更多個經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸各自包含四個或更多個經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸各自包含五個或更多個經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸各自包含十個或更多個經修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸各自包含至多約30%天然磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸各自包含至多約20%天然磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸各自包含至多約10%天然磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，該第一複數個寡核苷酸各自包含至多約5%天然磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸含有增加含量之一或多種同位素。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸經例如一或多種元素(例如氫、碳、氮等)之一或多種同位素標記。在一些實施例中，所提供組合物中之所提供寡核苷酸，例如第一複數個寡核苷酸，包含鹼基修飾、糖修飾及/或核苷酸間鍵聯修飾，其中該等寡核苷酸含有增濃含量之氘。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸在一或多個位置經氘標記(用-2 H置換-1 H)。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或與該寡核苷酸結合之任何部分(例如，靶向部分、脂質部分等)之一或多個1 H經2 H取代。該等寡核苷酸可用於本文中所描述之任何組合物或方法中。
本發明包括所有醫藥學上可接受之經同位素標記之化合物，其中一或多個原子經具有相同原子數，但原子質量或質量數不同於在自然界中通常發現之原子質量或質量數之原子置換。
適合於包括在本發明化合物中之同位素之實例包括氫同位素，諸如2 H及3 H；碳同位素，諸如11 C、13 C及14 C；氯同位素，諸如36 Cl；氟同位素，諸如18 F；碘同位素，諸如123 I、124 I及125 I；氮同位素，諸如13 N及15 N；氧同位素，諸如15 O、17 O及18 O；磷同位素，諸如32 P；及硫同位素，諸如35 S。
某些經同位素標記之式(I)化合物(例如併有放射性同位素之彼等化合物)適用於藥物及/或受質組織分佈研究。放射性同位素氚(亦即3 H)及碳-14 (亦即14 C)由於其容易併入及現成偵測手段而尤其適用於此目的。
用諸如氘(亦即2 H)之較重同位素取代可得到由較大代謝穩定性產生之某些治療優勢，例如活體內半衰期增加或劑量需求減少，且因此在某些情況下可為較佳的。
用正電子發射同位素(諸如11 C、18 F、15 O及13 N)取代可適用於正電子發射斷層攝影法(PET)研究以用於檢查受質受體佔有率。
經同位素標記之化合物一般可藉由熟習此項技術者已知之習知技術，或藉由類似於隨附實例及製備中描述之彼等方法，使用適當經同位素標記之試劑替代先前使用之非標記試劑來製備。
本發明化合物可含有不對稱或對掌性中心，且因此以不同立體異構形式存在。除非另外規定，否則希望本發明化合物之所有立體異構形式以及其混合物(包括外消旋混合物)形成本發明之一部分。另外，本發明涵蓋所有幾何及位置異構體。舉例而言，若本發明之化合物併有雙鍵或稠合環，則順式形式及反式形式以及混合物涵蓋於本發明之範疇內。
本發明之對掌性化合物(及其對掌性前驅物)可在具有不對稱固定相及移動相之樹脂上使用層析法(通常高壓液相層析法(HPLC)或超臨界流體層析法(SFC))以對映異構性增濃形式獲得，該移動相由烴(通常庚烷或己烷)組成，含有0至50%異丙醇，通常2%至20%，及0至5%烷胺，通常0.1%二乙胺(DEA)或異丙胺。溶離劑之濃縮得到增濃混合物。
非對映異構混合物可基於其物理化學差異藉由熟習此項技術者所熟知之方法(諸如藉由層析及/或分步結晶)分離成其個別非對映異構體。對映異構體可如下分離：藉由與適當光學活性化合物(例如對掌性助劑，諸如對掌性醇或莫舍氏酸氯化物(Mosher's acid chloride))反應將對映異構混合物轉化為非對映異構體混合物，分離非對映異構體且將個別非對映異構體轉化(例如水解)為相應之純對映異構體。對映異構體亦可藉由使用對掌性HPLC管柱來分離。或者，特定立體異構體可藉由使用光學活性起始材料，藉由使用光學活性試劑、基質、催化劑或溶劑之不對稱合成，或藉由不對稱轉換而將一種立體異構體轉化成另一種來合成。
在一些實施例中，控制寡核苷酸之結構要素，諸如化學修飾(例如，糖、鹼基及/或核苷酸間鍵聯之修飾)或其模式、立體化學(例如，主鏈對掌性核苷酸間鍵聯之立體化學)或其模式之改變、用相同元素之同位素取代原子及/或與另一化學部分(例如，脂質部分、靶向部分等)結合，可對所需生物學效應具有重大影響。在一些實施例中，所需生物學效應增強超過2倍。
在一些實施例中，所需生物學效應為導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所需生物學效應為改良單股RNA干擾。在一些實施例中，所需生物學效應為改良RNase H介導之減量。在一些實施例中，所需生物學效應為改良單股RNA干擾及/或RNase H介導之減量。
在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含第一複數個寡核苷酸，其： 1)具有與轉錄物中之靶序列互補的共同鹼基序列；及 2)包含一或多個經修飾之糖部分及經修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物之特徵在於，當其與單股RNA干擾系統中之轉錄物接觸時，該轉錄物的RNAi介導之減量相對於在參考條件下觀測到的減量得到改良，該等參考條件選自由不存在該組合物、存在參考組合物及其組合組成之群。
在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含能夠導引單股RNA干擾之第一複數個寡核苷酸，其中PNPLA3寡核苷酸類型由以下定義： 1)鹼基序列； 2)主鏈鍵聯模式； 3)主鏈對掌性中心模式；及 4)主鏈磷修飾模式， 該組合物為對掌性受控的，因為相對於具有相同鹼基序列之寡核苷酸的實質上外消旋製劑而言，該組合物中該特定寡核苷酸類型之寡核苷酸增濃， 該寡核苷酸組合物之特徵在於，當其與單股RNA干擾系統中之轉錄物接觸時，該轉錄物的RNAi介導之減量相對於在參考條件下觀測到的減量得到改良，該等參考條件選自由不存在該組合物、存在參考組合物及其組合組成之群。
在一些實施例中，連續核苷單元中之每一者之前及/或之後獨立地為經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，連續核苷單元中之每一者之前及/或之後獨立地為硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，連續核苷單元中之每一者之前及/或之後獨立地為對掌性受控的經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，連續核苷單元中之每一者之前及/或之後獨立地為對掌性受控硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯具有式I結構。在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯具有式I-a結構。
在一些實施例中，本發明提供一種單股RNAi劑，其包含預定含量之第一複數個寡核苷酸，其中： 該第一複數個寡核苷酸具有相同鹼基序列； 該第一複數個寡核苷酸包含：種子區域，其包含2、3、4、5、6、7個或更多個連續的S p修飾之核苷酸間鍵聯；種子後區域，其包含2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個連續的S p修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，種子區域包含2個或更多個連續的S p修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯具有式I結構。在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯具有式I-a結構。
如本發明中所證實，在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物之特徵在於，當其與單股RNA干擾系統中之轉錄物接觸時，該轉錄物的RNAi介導之減量相對於在參考條件下觀測到的減量得到改良，該等參考條件選自由不存在該組合物、存在參考組合物及其組合組成之群。
在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含第一複數個由具有以下而定義之寡核苷酸： 1)共同鹼基序列及長度； 2)共同主鏈鍵聯模式；及 3)共同主鏈對掌性中心模式，該組合物為實質上純的單一寡核苷酸製劑，因為該組合物中預定含量之寡核苷酸具有共同鹼基序列及長度、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式。
在一些實施例中，共同鹼基序列及長度可稱為共同鹼基序列。在一些實施例中，具有共同鹼基序列之寡核苷酸可具有相同的核苷修飾模式，例如糖修飾、鹼基修飾等。在一些實施例中，核苷修飾模式可由位置及修飾之組合表示。在一些實施例中，主鏈鍵聯模式包含各核苷酸間鍵聯之位置及類型(例如磷酸酯、硫代磷酸酯、經取代之硫代磷酸酯等)。PNPLA3寡核苷酸之主鏈對掌性中心模式可藉由自5'至3'之鍵聯磷立體化學(R p/S p)之組合命名。如上文所例示，非對掌性鍵聯之位置可例如自主鏈鍵聯模式獲得。
如一般熟習此項技術者應理解，寡核苷酸之立體無規或外消旋製劑係藉由非立體選擇性及/或低立體選擇性偶合核苷酸單體，通常不使用任何對掌性助劑、對掌性修飾試劑及/或對掌性催化劑來製備。在一些實施例中，在實質上外消旋(或不控制對掌性)製備寡核苷酸時，所有或大部分偶合步驟並不控制對掌性，因為並未特異性地執行偶合步驟以提供增強的立體選擇性。寡核苷酸之例示性實質上外消旋製劑係經由此項技術中之熟知製程，根據常用胺基磷酸酯寡核苷酸合成，用二硫化四乙基雙甲硫羰醯胺或(TETD)或3H-1, 2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(BDTD)硫化亞磷酸三酯來製備硫代磷酸酯寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之實質上外消旋製劑提供實質上外消旋寡核苷酸組合物(或不控制對掌性之寡核苷酸組合物)。
如一般熟習此項技術者所理解，在一些實施例中，偶合或鍵聯之非對映立體選擇性可經由在相同或類似條件下形成之二聚體的非對映立體選擇性來評定，其中該二聚體具有相同的5'及3'核苷及核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，本發明提供第一複數個寡核苷酸之對掌性受控寡核苷酸組合物，相對於具有相同寡核苷酸之實質上外消旋製劑，該組合物中單一寡核苷酸類型之寡核苷酸增濃。在一些實施例中，本發明提供第一複數個寡核苷酸之對掌性受控寡核苷酸組合物，相對於具有相同寡核苷酸之實質上外消旋製劑而言，該組合物中共用以下之單一寡核苷酸類型之寡核苷酸增濃： 1)共同鹼基序列及長度； 2)共同主鏈鍵聯模式；及 3)共同主鏈對掌性中心模式。
在一些實施例中，本發明提供一種PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含能夠導引單股RNA干擾的第一複數個寡核苷酸，其中寡核苷酸屬於特定寡核苷酸類型，其特徵在於： 1)共同鹼基序列及長度； 2)共同主鏈鍵聯模式；及 3)共同主鏈對掌性中心模式； 該組合物為對掌性受控的，因為相對於具有相同鹼基序列及長度之寡核苷酸的實質上外消旋製劑而言，該特定寡核苷酸類型之寡核苷酸增濃。
在一些實施例中，具有共同鹼基序列及長度、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式之寡核苷酸具有共同主鏈磷修飾模式及共同鹼基修飾模式。在一些實施例中，具有共同鹼基序列及長度、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式之寡核苷酸具有共同主鏈磷修飾模式及共同核苷修飾模式。在一些實施例中，具有共同鹼基序列及長度、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式之寡核苷酸具有相同結構。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸類型之寡核苷酸具有共同主鏈磷修飾模式及共同糖修飾模式。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸類型之寡核苷酸具有共同主鏈磷修飾模式及共同鹼基修飾模式。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸類型之寡核苷酸具有共同主鏈磷修飾模式及共同核苷修飾模式。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸類型之寡核苷酸為相同的。
在一些實施例中，具有共同鹼基序列及長度、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式之寡核苷酸具有共同主鏈磷修飾模式。在一些實施例中，具有共同鹼基序列及長度、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式之寡核苷酸具有共同主鏈磷修飾模式及共同核苷修飾模式。在一些實施例中，具有共同鹼基序列及長度、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式之寡核苷酸具有共同主鏈磷修飾模式及共同糖修飾模式。在一些實施例中，具有共同鹼基序列及長度、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式之寡核苷酸具有共同主鏈磷修飾模式及共同鹼基修飾模式。在一些實施例中，具有共同鹼基序列及長度、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式之寡核苷酸具有共同主鏈磷修飾模式及共同核苷修飾模式。在一些實施例中，具有共同鹼基序列及長度、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式之寡核苷酸為相同的。
在一些實施例中，所提供組合物中之寡核苷酸具有共同主鏈磷修飾模式。在一些實施例中，共同鹼基序列為PNPLA3寡核苷酸類型之鹼基序列。在一些實施例中，所提供之組合物為對掌性受控的PNPLA3寡核苷酸組合物，因為該組合物含有預定含量之個別寡核苷酸類型的第一複數個寡核苷酸，其中PNPLA3寡核苷酸類型由以下定義： 1)鹼基序列； 2)主鏈鍵聯模式； 3)主鏈對掌性中心模式；及 4)主鏈磷修飾模式。
如上文所指出及此項技術中所瞭解，在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列可指寡核苷酸中之核苷殘基(例如，糖及/或鹼基組分，相對於諸如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥苷、胸腺嘧啶及尿嘧啶之標準天然產生之核苷酸而言)之一致性及/或修飾狀態及/或可指該等殘基之混合特徵(亦即，與特定互補殘基混合之能力)。
在一些實施例中，特定類型之寡核苷酸為相同的，因為其具有相同鹼基序列(包括長度)、相同的糖及鹼基部分化學修飾模式、相同主鏈鍵聯模式(例如，天然磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯、硫代磷酸三酯鍵聯及其組合之模式)、相同主鏈對掌性中心模式(例如，對掌性核苷酸間鍵聯之立體化學(R p/S p)模式)及相同主鏈磷修飾模式(例如，核苷酸間磷原子上之修飾模式，諸如−S− 及式I之−L−R1 )。
本發明尤其認識到，寡核苷酸結構要素(例如，化學修飾、主鏈鍵聯、主鏈對掌性中心及/或主鏈磷修飾之模式)之組合可提供出人意料的改良的特性，諸如生物活性。
在一些實施例中，所提供之對掌性受控(及/或立體化學純)製劑為RNAi劑寡核苷酸。
在一些實施例中，所提供之對掌性受控(及/或立體化學純)製劑所含寡核苷酸包括一或多個經修飾之主鏈鍵聯、鹼基及/或糖。
在一些實施例中，所提供組合物包含含有一或多個在糖部分經修飾之殘基的寡核苷酸。在一些實施例中，所提供組合物包含含有一或多個在糖部分之2'位置經修飾(本文中稱為「2'修飾」)之殘基的寡核苷酸。該等修飾之實例在上文及此處均有描述且包括(但不限於) 2'-OMe、2'-MOE、2'-LNA、2'-F、FRNA、FANA、S -cEt等。在一些實施例中，所提供組合物包含含有一或多個經2'修飾之殘基的寡核苷酸。舉例而言，在一些實施例中，所提供之寡核苷酸含有一或多個殘基，該一或多個殘基為經2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)修飾之殘基。在一些實施例中，所提供組合物包含不含任何2'修飾之寡核苷酸。在一些實施例中，所提供組合物為不含任何2'-MOE殘基之寡核苷酸。亦即，在一些實施例中，所提供之寡核苷酸未經MOE修飾。其他實例糖修飾描述於本發明中。
在一些實施例中，一或多個為一個。在一些實施例中，一或多個為兩個。在一些實施例中，一或多個為三個。在一些實施例中，一或多個為四個。在一些實施例中，一或多個為五個。在一些實施例中，一或多個為六個。在一些實施例中，一或多個為七個。在一些實施例中，一或多個為八個。在一些實施例中，一或多個為九個。在一些實施例中，一或多個為十個。在一些實施例中，一或多個為至少一個。在一些實施例中，一或多個為至少兩個。在一些實施例中，一或多個為至少三個。在一些實施例中，一或多個為至少四個。在一些實施例中，一或多個為至少五個。在一些實施例中，一或多個為至少六個。在一些實施例中，一或多個為至少七個。在一些實施例中，一或多個為至少八個。在一些實施例中，一或多個為至少九個。在一些實施例中，一或多個為至少十個。
在一些實施例中，無2'修飾之糖部分為天然DNA核苷中所存在之糖部分。
一般熟習此項技術者理解，所提供之組合物及方法可靶向靶轉錄物之各種區域。在一些實施例中，所提供寡核苷酸之鹼基序列包含內含子序列。在一些實施例中，所提供寡核苷酸之鹼基序列包含外顯子序列。在一些實施例中，所提供寡核苷酸之鹼基序列包含內含子及外顯子序列。
如一般熟習此項技術者所理解，所提供之寡核苷酸及組合物尤其可靶向大量核酸聚合物。舉例而言，在一些實施例中，所提供之寡核苷酸及組合物可靶向核酸序列之轉錄物，其中寡核苷酸之共同鹼基序列(例如，PNPLA3寡核苷酸類型之鹼基序列)包含或為與轉錄物之序列互補的序列。在一些實施例中，共同鹼基序列包含與標靶序列互補之序列。在一些實施例中，共同鹼基序列為與標靶序列互補之序列。在一些實施例中，共同鹼基序列包含或為與標靶序列100%互補之序列。在一些實施例中，共同鹼基序列包含與標靶序列100%互補之序列。在一些實施例中，共同鹼基序列為與標靶序列100%互補之序列。
I
在一些實施例中，共同鹼基序列包含或為與特徵序列元件互補之序列。在一些實施例中，共同鹼基序列包含與特徵序列元件互補之序列。在一些實施例中，共同鹼基序列為與特徵序列元件互補之序列。在一些實施例中，共同鹼基序列包含或為與特徵序列元件100%互補之序列。在一些實施例中，共同鹼基序列包含與特徵序列元件100%互補之序列。在一些實施例中，共同鹼基序列為與特徵序列元件100%互補之序列。在本文中之一些實施例中，作為非限制性實例，特徵序列元件為種子區域、種子後區域或種子區域之一部分或種子後區域之一部分或3'端二核苷酸。
在一些實施例中，特徵序列元件包含或為突變。在一些實施例中，特徵序列元件包含突變。在一些實施例中，特徵序列元件為突變。在一些實施例中，特徵序列元件包含或為點突變。在一些實施例中，特徵序列元件包含點突變。在一些實施例中，特徵序列元件為點突變。在一些實施例中，特徵序列元件包含或為SNP。在一些實施例中，特徵序列元件包含SNP。在一些實施例中，特徵序列元件為SNP。
在一些實施例中，共同鹼基序列100%匹配靶序列，但其不100%匹配靶序列之類似序列。
舉例而言，在一些實施例中，共同鹼基序列匹配靶核酸序列之致病複本或對偶基因中之突變，但不匹配突變位點之非致病複本或對偶基因；在一些其他實施例中，共同鹼基序列匹配靶核酸序列之致病對偶基因中之SNP，但不匹配相應位點之非致病對偶基因。
本發明尤其認識到，鹼基序列可對寡核苷酸特性造成影響。在一些實施例中，當具有鹼基序列之寡核苷酸用於例如經由涉及RNase H之路徑抑制標靶時，該鹼基序列可對標靶之裂解模式造成影響：例如，結構上類似的(所有硫代磷酸酯鍵聯、所有立體無規)具有不同序列之寡核苷酸可具有不同裂解模式。
在一些實施例中，共同鹼基序列為包含SNP之鹼基序列。
如一般熟習此項技術者所理解，所提供之寡核苷酸組合物及方法具有如一般熟習此項技術者已知的各種用途。用於評定所提供組合物及其特性及用途的方法亦為一般熟習此項技術者廣泛已知且實踐。實例特性、用途及/或方法包括(但不限於) WO/2014/012081及WO/2015/107425中所描述之彼等者。
在一些實施例中，對掌性核苷酸間鍵聯具有式I結構。在一些實施例中，對掌性核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯。在一些實施例中，所提供組合物之單一寡核苷酸中之各對掌性核苷酸間鍵聯獨立地具有式I結構。在一些實施例中，所提供組合物之單一寡核苷酸中之各對掌性核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯。
在一些實施例中，本發明寡核苷酸包含一或多個經修飾之糖部分。在一些實施例中，本發明寡核苷酸包含一或多個經修飾之鹼基部分。如一般熟習此項技術者所知及在本發明中所描述，可向糖及/或部分中引入各種修飾。舉例而言，在一些實施例中，修飾為US9006198、WO2014/012081及WO/2015/107425中所描述之修飾，其中之每一者的糖及鹼基修飾以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，糖修飾為2'修飾。常用2'修飾包括(但不限於) 2'-OR1 ，其中R1 不為氫。在一些實施例中，修飾為2'-OR，其中R為視情況經取代之脂族基。在一些實施例中，修飾為2'-OMe。在一些實施例中，修飾為2'-O -MOE。在一些實施例中，本發明證實，特定對掌性純核苷酸間鍵聯之包含及/或定位可提供類似於或優於經由使用經修飾之主鏈鍵聯、鹼基及/或糖達成之穩定性改良的穩定性改良。在一些實施例中，所提供組合物之所提供單一寡核苷酸在糖上無修飾。在一些實施例中，所提供組合物之所提供單一寡核苷酸在糖之2'位置上不具有修飾(亦即，2'位置處之兩個基團為−H/−H或−H/−OH)。在一些實施例中，所提供組合物之所提供單一寡核苷酸不具有任何2'-MOE修飾。
在一些實施例中，2'修飾為−O−L−或−L−，其將糖部分之2'-碳連接至糖部分之另一個碳。在一些實施例中，2'修飾為−O−L−或−L−，其將糖部分之2'-碳連接至糖部分之4'-碳。在一些實施例中，2'修飾為S -cEt。在一些實施例中，經修飾之糖部分為LNA部分。
在一些實施例中，2'修飾為−F。在一些實施例中，2'修飾為FANA。在一些實施例中，2'修飾為FRNA。
在一些實施例中，糖修飾為5'修飾，例如R -5'-Me、S -5'-Me等。
在一些實施例中，糖修飾改變糖環之大小。在一些實施例中，糖修飾為FHNA中之糖部分。
在一些實施例中，糖修飾用另一環或非環部分置換糖部分。該等部分之實例為此項技術中廣泛已知的，包括(但不限於) N-嗎啉基(視情況具有其二胺基磷酸酯鍵聯)、二醇核酸等中所用之彼等者。
在一些實施例中，ssRNAi劑為或包含選自由以下組成之群的PNPLA3寡核苷酸：圖1或本文中另外所描述之任何型式之任何ssRNAi。閱讀本發明之熟習此項技術者將瞭解，本發明並未特定排除本文中描述的標註為ssRNAi劑之任何寡核苷酸亦可或替代地經由另一機制(例如，作為反義寡核苷酸；經由RNaseH機制介導減量；在空間上阻礙轉譯；或任何其他生物化學機制)起作用之可能性。
在一些實施例中，反義寡核苷酸(ASO)為或包含選自由以下組成之群的PNPLA3寡核苷酸：圖2中所描述之任何型式之任何寡核苷酸。閱讀本發明之熟習此項技術者將瞭解，本發明並未特定排除本文中描述的標註為反義寡核苷酸(ASO)之任何寡核苷酸亦可或替代地經由另一機制(例如，作為ssRNAi利用RISC)起作用之可能性；本發明亦指出，各種ASO可經由不同機制(利用RNaseH、在空間上阻斷轉譯或其他轉錄後過程、改變靶核酸之構形等)起作用。
在一些實施例中，混合寡核苷酸為或包含選自由以下組成之群的PNPLA3寡核苷酸：WV-2111、WV-2113、WV-2114、WV-2148、WV-2149、WV-2152、WV-2153、WV-2156、WV-2157、WV-2387、WV-3069、WV-7523、WV-7524、WV-7525、WV-7526、WV-7527、WV-7528，及圖1L之型式S40至S42或圖1之型式30至32、66至69或101至103中之任一者之任何寡核苷酸。讀數本發明之熟習此項技術者將瞭解，本發明並未特定排除本文中描述的標註為混合寡核苷酸之任何寡核苷酸亦可或替代地經由另一機制(例如，作為反義寡核苷酸；經由RNaseH機制介導減量；在空間上阻礙轉譯；或任何其他生物化學機制)起作用之可能性。對掌性受控寡核苷酸及對掌性受控寡核苷酸組合物
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠藉由在連結至靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為對掌性受控的。
本發明提供對掌性受控寡核苷酸，及具有高粗產物純度及高非對映異構純度之對掌性受控寡核苷酸組合物。在一些實施例中，本發明提供對掌性受控寡核苷酸，及具有高粗產物純度之對掌性受控寡核苷酸組合物。在一些實施例中，本發明提供對掌性受控寡核苷酸，及具有高非對映異構純度之對掌性受控寡核苷酸組合物。
在一些實施例中，單股RNAi劑為PNPLA3寡核苷酸類型之實質上純製劑，因為在一些情況下在某些純化步驟之後，組合物中不屬於寡核苷酸類型之寡核苷酸為該寡核苷酸類型之製備製程中之雜質形式。
在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸，其包含一或多個就對掌性鍵聯磷而言之非對映異構性純核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸，其包含一或多個具有式I結構之非對映異構性純核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸，其包含一或多個就對掌性鍵聯磷而言之非對映異構性純核苷酸間鍵聯及一或多個磷酸二酯鍵聯。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸，其包含一或多個具有式I結構之非對映異構性純核苷酸間鍵聯及一或多個磷酸二酯鍵聯。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸，其包含一或多個具有式I-c結構之非對映異構性純核苷酸間鍵聯及一或多個磷酸二酯鍵聯。在一些實施例中，該等寡核苷酸係藉由使用如本申請案中所描述之立體選擇性寡核苷酸合成來製備，其用於形成就對掌性鍵聯磷而言之經預設計之非對映異構性純核苷酸間鍵聯。下文進一步描述實例核苷酸間鍵聯，包括具有式I結構之彼等核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其中寡核苷酸內之個別核苷酸間鍵聯中之至少兩者相對於彼此而言具有不同的立體化學及/或不同的P修飾。
核苷酸間鍵聯
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠藉由在連結至靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述或此項技術中已知之任何核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何核苷酸間鍵聯。
核苷酸間鍵聯或未經修飾之核苷酸間鍵聯之非限制性實例為磷酸二酯；經修飾之核苷酸間鍵聯之非限制性實例包括其中磷酸二酯之一或多個氧已經硫(如在硫代磷酸酯中)、H、烷基或不為氧之另一部分或元素(作為非限制性實例)置換的彼等核苷酸間鍵聯。核苷酸間鍵聯之非限制性實例為不包含磷但用以連接兩個糖之部分。核苷酸間鍵聯之非限制性實例為PNPLA3寡核苷酸之主鏈中不包含磷但用以連接兩個糖之部分。本文中揭示核苷酸、經修飾之核苷酸、核苷酸類似物、核苷酸間鍵聯、經修飾之核苷酸間鍵聯、鹼基、經修飾之鹼基及鹼基類似物、糖、經修飾之糖及糖類似物以及核苷、經修飾之核苷及核苷類似物之其他非限制性實例。
在某些實施例中，核苷酸間鍵聯具有式I結構：其中各變數如下文所定義及描述。在一些實施例中，式I之鍵聯為對掌性的。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含一或多個式I之經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含一或多個式I之經修飾之核苷酸間鍵聯，且其中寡核苷酸內之個別式I之核苷酸間鍵聯相對於彼此而言具有不同的P修飾。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含一或多個式I之經修飾之核苷酸間鍵聯，且其中寡核苷酸內之個別式I之核苷酸間鍵聯相對於彼此而言具有不同的-X-L-R1 。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含一或多個式I之經修飾之核苷酸間鍵聯，且其中寡核苷酸內之個別式I之核苷酸間鍵聯相對於彼此而言具有不同的X。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含一或多個式I之經修飾之核苷酸間鍵聯，且其中寡核苷酸內之個別式I之核苷酸間鍵聯相對於彼此而言具有不同的-L-R1 。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸為所提供組合物中特定寡核苷酸類型之PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸為所提供組合物中具有共同鹼基序列及長度、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式之PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸為具有特定寡核苷酸類型之對掌性受控組合物中之PNPLA3寡核苷酸，且對掌性受控寡核苷酸具有該類型。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸為包含預定含量之複數個共用共同鹼基序列、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式的寡核苷酸的所提供組合物中之PNPLA3寡核苷酸，且對掌性受控寡核苷酸共用共同鹼基序列、共同主鏈鍵聯模式及共同主鏈對掌性中心模式。
在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸包含不同的核苷酸間磷鍵聯。
在一些實施例中，硫代磷酸三酯鍵聯包含對掌性助劑，其例如用於控制反應之立體選擇性。在一些實施例中，硫代磷酸三酯鍵聯不包含對掌性助劑。在一些實施例中，有目的地維持硫代磷酸三酯鍵聯直至投與給個體及/或在投與給個體期間有目的地維持硫代磷酸三酯鍵聯。
在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸連接至固體載體。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸自固體載體裂解。
在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸包含至少一個磷酸二酯核苷酸間鍵聯及至少兩個連續的經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸包含至少一個磷酸二酯核苷酸間鍵聯及至少兩個連續的硫代磷酸三酯核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，本發明提供包含複數個所提供寡核苷酸或由複數個所提供寡核苷酸組成之組合物(例如，對掌性受控寡核苷酸組合物)。在一些實施例中，所有該等所提供寡核苷酸皆具有相同類型，亦即，所有該等所提供寡核苷酸皆具有相同的鹼基序列、主鏈鍵聯模式(亦即，核苷酸間鍵聯類型模式，例如磷酸酯、硫代磷酸酯等)、主鏈對掌性中心模式(亦即，鍵聯磷立體化學(R p/S p)模式)及主鏈磷修飾模式(例如，本文中揭示之式I中之「−XLR1 」基團之模式)。在一些實施例中，同一類型之所有寡核苷酸皆相同。然而，在多個實施例中，通常就預定相對量而言，所提供之組合物包含複數個寡核苷酸類型。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，結合ASPGR之部分例如為GalNAc部分，其為如本文所描述或此項技術中已知之任何GalNAc或其變異型或修飾。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何核苷酸間鍵聯與本文中描述之任何其他結構要素或修飾的組合，該任何其他結構要素或修飾包括(但不限於)鹼基序列或其部分、糖、鹼基(核鹼基)；立體化學或其模式；另一化學部分，包括(但不限於)靶向部分、脂質部分、碳水化合物部分等；種子區域；種子後區域；5'端結構；5'端區域；5'核苷酸部分；3'端區域；3'端二核苷酸；3'端帽；長度；另一化學部分，包括(但不限於)靶向部分、脂質部分、GalNAc等；型式或其任何結構要素，及/或本文中描述之任何其他結構要素或修飾；且在一些實施例中，本發明係關於任何此等寡核苷酸之多聚體。
在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸包含一或多個經修飾之核苷酸間磷鍵聯。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸包含例如硫代磷酸酯或硫代磷酸三酯鍵聯。
在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯。在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯係選自例如以下各者中所描述之彼等者：US 20110294124、US 20120316224、US 20140194610、US 20150211006、US 20150197540、WO 2015107425、PCT/US2016/043542及PCT/US2016/043598，Whittaker等人2008 Tetrahedron Letters 49: 6984-6987。
核苷酸間鍵聯之非限制性實例亦包括此項技術中所描述之彼等者，包括(但不限於)以下各者中之任一者中所描述之彼等者：Gryaznov, S.；Chen, J.-K. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 3143；Jones等人J. Org. Chem. 1993, 58, 2983；Koshkin等人1998 Tetrahedron 54: 3607-3630；Lauritsen等人2002 Chem. Comm. 5: 530-531；Lauritsen等人2003 Bioo. Med. Chem. Lett. 13: 253-256；Mesmaeker等人Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1994, 33, 226；Petersen等人2003 TRENDS Biotech. 21: 74-81；Schultz等人1996 Nucleic Acids Res. 24: 2966；Ts'o等人Ann. N. Y. Acad. Sci. 1988, 507, 220；及Vasseur等人J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4006。
在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸中存在的序列。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸中存在的序列，其中一或多個U經T置換。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸中存在的序列，其中該序列與本文中揭示之任何寡核苷酸之序列具有超過50%的一致性。
在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸之序列。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其具有本文中揭示之任何寡核苷酸之序列。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸中存在的序列，其中該等寡核苷酸具有本文中描述之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或主鏈磷修飾模式。
在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸中存在的序列。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸中存在的序列，其中一或多個T經U取代。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸中存在的序列，其中該序列與本文中揭示之任何寡核苷酸之序列具有超過50%的一致性。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸中存在的序列，其中該序列與本文中揭示之任何寡核苷酸之序列具有超過60%的一致性。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸中存在的序列，其中該序列與本文中揭示之任何寡核苷酸之序列具有超過70%的一致性。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸中存在的序列，其中該序列與本文中揭示之任何寡核苷酸之序列具有超過80%的一致性。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸中存在的序列，其中該序列與本文中揭示之任何寡核苷酸之序列具有超過90%的一致性。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸中存在的序列，其中該序列與本文中揭示之任何寡核苷酸之序列具有超過95%的一致性。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸之序列。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其具有本文中揭示之任何寡核苷酸之序列。
在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸之序列，其中至少一個核苷酸間鍵聯為。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其包含本文中揭示之任何寡核苷酸之序列，其中各核苷酸間鍵聯為。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其具有本文中揭示之任何寡核苷酸之序列，其中至少一個核苷酸間鍵聯為。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其具有本文中揭示之任何寡核苷酸之序列，其中各核苷酸間鍵聯為。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其具有本文中揭示之任何寡核苷酸之序列，其中各胞嘧啶視情況且獨立地經5-甲基胞嘧啶置換。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其具有本文中揭示之任何寡核苷酸之序列，其中至少一個胞嘧啶視情況且獨立地經5-甲基胞嘧啶置換。在一些實施例中，本發明提供一種對掌性受控寡核苷酸，其具有本文中揭示之任何寡核苷酸之序列，其中各胞嘧啶視情況且獨立地經5-甲基胞嘧啶置換。鹼基 ( 核鹼基 )
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠藉由在連結至靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述或此項技術中已知之任何核鹼基。
在一些實施例中，所提供寡核苷酸中存在之核鹼基為天然核鹼基或源自天然核鹼基之經修飾之核鹼基。實例包括(但不限於)其各別胺基經醯基保護基保護的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶及鳥嘌呤、2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2,6-二胺基嘌呤、氮雜胞嘧啶、嘧啶類似物(諸如假異胞嘧啶及假尿嘧啶)及其他經修飾之核鹼基，諸如8位經取代之嘌呤、黃嘌呤或次黃嘌呤(後兩者為天然降解產物)。實例經修飾之核鹼基揭示於Chiu及Rana,RNA ,2003 ,9 , 1034-1048；Limbach等人Nucleic Acids Research ,1994 ,22 , 2183-2196；以及Revankar及Rao,Comprehensive Natural Products Chemistry , 第7卷, 313中。在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經取代之尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤。在一些實施例中，經修飾之核鹼基為尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤之官能基置換，例如就氫鍵結及/或鹼基配對而言。在一些實施例中，核鹼基為視情況經取代之尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或鳥嘌呤。在一些實施例中，核鹼基為尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或鳥嘌呤。
在一些實施例中，經修飾之鹼基為視情況經取代之腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。在一些實施例中，經修飾之核鹼基獨立地為經一或多個修飾進行修飾之腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，藉此： (1)核鹼基經一或多個獨立地選自以下之視情況經取代之基團修飾：醯基、鹵素、胺基、疊氮基、烷基、烯基、炔基、芳基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、雜環基、雜芳基、羧基、羥基、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、經取代之矽烷基及其組合； (2)核鹼基之一或多個原子獨立地經不同的選自碳、氮及硫之原子置換； (3)核鹼基中之一或多個雙鍵獨立地氫化；或 (4)一或多個芳基或雜芳基環獨立地插入至核鹼基中。
此項技術中描述各種其他核鹼基。糖
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠藉由在連結至靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含本文中描述或此項技術中已知之任何糖。
在一些實施例中，能夠導引單股RNA干擾之所提供寡核苷酸除天然糖部分外亦包含一或多個經修飾之糖部分。
最常見的天然產生之核苷酸包含連接至核鹼基腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)及胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)之核糖。亦涵蓋經修飾之核苷酸，其中核苷酸中之磷酸酯基或鍵聯磷可連接至糖或經修飾糖之各個位置。作為非限制性實例，磷酸酯基或鍵聯磷可連接至糖或經修飾糖之2''、3''、4''或5''羥基部分。在此情況下亦涵蓋如本文所描述併有經修飾核鹼基之核苷酸。在一些實施例中，根據本發明方法使用包含未受保護之-OH部分的核苷酸或經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何鹼基(核鹼基)、經修飾鹼基或鹼基類似物。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何鹼基與本文中描述之任何其他結構要素或修飾的組合，該任何其他結構要素或修飾包括(但不限於)鹼基序列或其部分、糖；核苷酸間鍵聯；立體化學或其模式；另一化學部分，包括(但不限於)靶向部分、脂質部分、GalNAc部分等；5'端結構；5'端區域；5'核苷酸部分；種子區域；種子後區域；3'端區域；3'端二核苷酸；3'端帽；糖、鹼基或核苷酸間鍵聯之修飾模式；型式或其任何結構要素及/或本文中描述之任何其他結構要素或修飾；且在一些實施例中，本發明係關於任何此等寡核苷酸之多聚體。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含任何糖。
此項技術中描述各種其他糖。
PNPLA3 寡核苷酸之鹼基序列
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠藉由在連結至靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可包含本文中描述之任何鹼基序列或其部分，其中一部分為至少15個連續鹼基之跨距或具有1至5個錯配之至少15個連續鹼基之跨距。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述之任何鹼基序列。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述之任何鹼基序列或其部分。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述之任何鹼基序列或其部分，其中一部分為15個連續鹼基之跨距或具有1至5個錯配之15個連續鹼基之跨距。
單股RNAi劑之序列具有充足長度及與轉錄物標靶之充分一致性，以介導標靶特異性RNA干擾。在一些實施例中，RNAi劑與轉錄物靶序列之一部分互補。
單股RNAi劑之鹼基序列與靶轉錄物之鹼基序列互補。如本文中所用，「靶轉錄物序列」、「靶序列」、「靶基因」以及其類似者係指在基因(例如靶基因)之轉錄期間形成的mRNA分子(包括為原始轉錄產物之RNA加工產物的mRNA)之核苷酸序列之連續部分。
本文中之術語「互補」、「完全互補」及「實質上互補」可關於單股RNAi劑與靶序列之股之間或反義寡核苷酸與靶序列之間的鹼基匹配而使用，如根據其使用情境將理解。當單股RNAi劑、反義寡核苷酸或其他寡核苷酸之各鹼基與標靶股上之連續鹼基在最大限度地比對下能夠鹼基配對時，該單股RNAi劑或反義寡核苷酸或其他寡核苷酸之股與靶序列之股互補。作為非限制性實例，若靶序列具有例如5'-GCAUAGCGAGCGAGGGAAAAC-3'之鹼基序列，則具有5'GUUUUCCCUCGCUCGCUAUGC-3'之鹼基序列的PNPLA3寡核苷酸與此靶序列互補或完全互補。當然，應注意，用T取代U或反過來不會改變互補量。
如本文中所用，與靶序列「實質上互補」之聚核苷酸在很大程度上或基本上互補但並非100%互補。在一些實施例中，實質上互補之序列(例如，單股RNAi劑或反義寡核苷酸之股)與同靶序列100%互補之序列之間具有1、2、3、4或5個錯配。本發明指出，在單股RNAi劑的情況下，5'端核苷酸(N1)在多數情況下與靶序列之互補序列之間具有錯配。類似地，在單股RNAi劑中，3'端二核苷酸(若存在)可為與靶序列之互補序列之間的錯配。作為非限制性實例，若靶序列具有例如5'-GCAUAGCGAGCGAGGGAAAAC-3'之鹼基序列，則具有5'TUUUUCCCUCGCUCGCUAUTU-3'之鹼基序列的單股RNAi劑與此靶序列實質上互補。
在表1A中及其他處，本發明提供各種單股RNAi劑及反義寡核苷酸及其他寡核苷酸，其中之每一者具有經定義之鹼基序列。在一些實施例中，本發明涵蓋具有為以下、包含以下或包含以下之一部分之鹼基序列的任何寡核苷酸：本文中揭示之任何各種單股RNAi劑、反義寡核苷酸及其他寡核苷酸之鹼基序列。在一些實施例中，本發明涵蓋具有為以下、包含以下或包含以下之一部分之鹼基序列的任何寡核苷酸：本文中揭示之任何各種單股RNAi劑、反義寡核苷酸及其他寡核苷酸之鹼基序列，該鹼基序列具有任何化學修飾、立體化學、型式、結構特徵(例如，在寡核苷酸為單股RNAi劑的情況下為5'端結構、5'端區域、5'核苷酸部分、種子區域、種子後區域、3'端區域、3'端二核苷酸、3'端帽或其任何結構、模式或其部分)及/或本文中描述之任何其他修飾(例如，與另一部分之結合，該另一部分諸如靶向部分、碳水化合物部分、GalNAc部分、脂質部分等；及/或多聚化)。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有為以下、包含以下或包含以下之一部分之鹼基序列：本文中揭示之任何寡核苷酸之鹼基序列。
在一些實施例中，本發明揭示本文所述序列之PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，本發明揭示本文所述序列之PNPLA3寡核苷酸，其中該寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所述序列之PNPLA3寡核苷酸為單股RNAi劑。在一些實施例中，所述序列之PNPLA3寡核苷酸為導引RNase H介導之減量的反義寡核苷酸。在一些實施例中，所述序列之PNPLA3寡核苷酸導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者。在一些實施例中，所述序列之PNPLA3寡核苷酸包含本文中描述之任何結構(例如，本文中描述之任何5'端結構、5'端區域、5'核苷酸部分、種子區域、種子後區域、3'端二核苷酸、3'端帽或此等結構中之任一者之任何部分，或任何化學、立體化學、其他化學部分等)。若寡核苷酸為ssRNAi劑，則序列前面可為T (作為非限制性實例，2'-去氧T、5'-(R)-Me OH T、5'-(R)-Me PO T、5'-(R)-Me PS T、5'-(R)-Me PH T、5'-(S)-Me OH T、5'-(S)-Me PO T、5'-(S)-Me PS T或5'-(S)-PH T)，或第一核鹼基經T (作為非限制性實例，2'-去氧T、5'-(R)-Me OH T、5'-(R)-Me PO T、5'-(R)-Me PS T、5'-(R)-Me PH T、5'-(S)-Me OH T、5'-(S)-Me PO T、5'-(S)-Me PS T或5'-(S)-PH T)置換，及/或序列後為3'端二核苷酸(例如，作為非限制性實例：TT、UU、TU等)。在各種序列中，U可經T置換或反過來，或序列可包含U與T之混合物。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有總共不超過約49、45、40、30、35、25、23個核苷酸之長度。在一些實施例中，一部分為具有0至3個錯配之總共至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸之跨距。在一些實施例中，一部分為具有0至3個錯配之總共至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸之跨距，其中具有0個錯配之跨距為互補的，且具有1個或更多個錯配之跨距為實質上互補性之非限制性實例。在上文所述序列以5'端處之U開始之一些實施例中，U可缺失及/或經另一鹼基置換。在一些實施例中，本發明涵蓋具有為以下或包含以下或包含以下之一部分之鹼基序列的任何寡核苷酸：本文中揭示之任何寡核苷酸之鹼基序列，該鹼基序列具有本文中揭示之型式或型式之一部分。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述之任何鹼基序列。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述之任何鹼基序列或其部分。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述之任何鹼基序列或其部分，其中一部分為15個連續鹼基之跨距或具有1至5個錯配之15個連續鹼基之跨距。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述之任何鹼基序列或其部分與本文中描述之任何其他結構要素或修飾的組合，該任何其他結構要素或修飾包括(但不限於)糖、鹼基；核苷酸間鍵聯；立體化學或其模式；另一化學部分，包括(但不限於)靶向部分、脂質部分、GalNAc部分等；5'端結構；5'端區域；5'核苷酸部分；種子區域；種子後區域；3'端區域；3'端二核苷酸；3'端帽；糖、鹼基或核苷酸間鍵聯之修飾模式；型式或其任何結構要素及/或本文中描述之任何其他結構要素或修飾；且在一些實施例中，本發明係關於任何此等寡核苷酸之多聚體。
具有各種鹼基序列之寡核苷酸之非限制性實例揭示於下方表1A中。表 1A . 寡核苷酸。 PNPLA3 寡核苷酸。 本發明指出，一些序列由於其長度原因為分成多行；然而，此等序列以及表1A中之所有寡核苷酸皆為單股的(除非另外指出)。各表中所列出之部分及修飾 ( 或用於構築包含此等部分或修飾之寡核苷酸的化合物 ) ： 在一些實施例中，例如L009、L010等連接基團可代替糖，且在任一端上鍵結至核苷酸間鍵聯。舉例而言： WV-9266包含... * mAL009 * mUfG * ...，其表示自5'至3'為硫代磷酸酯(*)；糖，其為連接至鹼基(A)之2'-OMe (m)；磷酸二酯鍵聯(未指定)；L009連接基團(L009)；硫代磷酸酯(*)；糖，其為連接至鹼基U之2'-OMe (mU)；磷酸二酯鍵聯(未指定)；糖，其為附接至鹼基(G)之2'-F (f)；及硫代磷酸酯。 WV-9267包含... * mAfC * L009fG * ...，其表示自5'至3'為硫代磷酸酯(*)；糖，其為連接至鹼基(A)之2'-OMe (m)；磷酸二酯(未指定)；糖，其為連接至鹼基(C)之2'-F (f)；硫代磷酸酯；L009連接基團(L009)；磷酸二酯鍵聯(未指定)；糖，其為連接至鹼基(G)之2'-F (f)；及硫代磷酸酯。 在一些實施例中，L010可代替糖，且L010在任一端上鍵結至核苷酸間鍵聯。 其他縮寫 ： AMC6T：eo：2'-MOE F、f：2'-F GaNC6T：l：2'-O-CH2 -4' () lmU：L001：−NH−(CH2 )6 −連接基團(C6連接基團、C6胺連接基團或C6胺基連接基團)，其經由−NH−連接至Mod (若存在) (若無Mod，則連接至−H，例如在WV-8240中)，且經由如所說明之磷酸酯鍵聯(O或PO)或硫代磷酸酯鍵聯(*在硫代磷酸酯並非對掌性受控的情況下；亦可在對掌性受控的情況下為S p且具有S p組態，且在對掌性受控的情況下為R p且具有R p組態)連接至寡核苷酸鏈之5'端(例如，在WV-2406中)或3'端。舉例而言，在WV-2406中，L001經由-NH−連接至Mod001 (形成醯胺基-C(O)−NH−)，且經由磷酸酯鍵聯(O XXXXXXXXXXXXXXXXXXX)連接至寡核苷酸鏈；在WV-2422中，L001不經由-NH−連接至任何Mod而是連接至-H，且經由磷酸酯鍵聯(O XXXXXXXXXXXXXXXXXXX)連接至寡核苷酸鏈 L003：連接基團，其經由其胺基連接至Mod (若存在) (若無Mod，則連接至−H，例如在WV-2426中)，且經由如所說明之磷酸酯鍵聯(O或PO)或硫代磷酸酯鍵聯(*在硫代磷酸酯並非對掌性受控的情況下；亦可在對掌性受控的情況下為S p且具有S p組態，且在對掌性受控的情況下為R p且具有R p組態)連接至寡核苷酸鏈之5'端(例如，在WV-2407中)或3'端(例如，在WV-8070中)。舉例而言，在WV-2407中，L003經由其胺基連接至Mod001 (形成醯胺基)，且經由磷酸酯鍵聯(O XXXXXXXXXXXXXXXXXXX)連接至寡核苷酸鏈之5'端；在WV-2426中，L001不經由-NH−連接至任何Mod而是連接至-H，且經由磷酸酯鍵聯(O XXXXXXXXXXXXXXXXXXX)連接至寡核苷酸鏈；在WV-8070中，L003經由其胺基連接至Mod001 (形成醯胺基)，且經由磷酸酯鍵聯(…XXXXXXXXXXXXXXXXXXXO )連接至寡核苷酸鏈之3'端 m：2'-OMe m5：C之5位置處之甲基(核鹼基為5-甲基胞嘧啶) m5Ceo：5-甲基2'-甲氧基乙基C OMe：2'-OMe O、PO：磷酸二酯(磷酸酯)；可為端基(通常為「PO」；例如在WV-4260中：POT*fC * …)，或鍵聯(例如連接基團與寡核苷酸鏈之間的鍵聯)、核苷酸間鍵聯等 *、PS：硫代磷酸酯；可為端基(通常為「PS」，例如在WV-2653中：PST*fA* …)，或鍵聯(例如連接基團與寡核苷酸鏈之間的鍵聯)、核苷酸間鍵聯等 R、Rp：呈Rp構形之硫代磷酸酯 S、Sp：呈Sp構形之硫代磷酸酯 X：立體無規硫代磷酸酯
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物為表1A中所列或本文中另外所描述之單股RNAi劑。在一些實施例中，展現所提供寡核苷酸之實例特性。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸具有圖1中所示的型式中之任一者之結構。
本發明提供能夠介導單股RNA干擾之寡核苷酸(例如，單股RNAi劑)之多個非限制性實例。實驗資料(未展示)證實各種假定的單股RNAi劑能夠實際上介導RNA干擾。在一些實驗中，使用活體外Ago-2分析，其包括使用RNA測試受質WV-2372 (其靶向另一基因APOC3)。在寡核苷酸WV-1308及WV-2420存在下，沒有表示RNA測試受質之譜帶，表明此等寡核苷酸為能夠介導RNA干擾之單股RNAi劑。其餘單變量物(lane)為對照物：不存在陰性對照物ASO WV-2134之受質；不存在陰性對照物ASO WV-2134之受質，該陰性對照物不介導RNA干擾；不存在測試寡核苷酸WV-1308之受質；不存在測試寡核苷酸WV-2420之受質；僅受質；無受質，添加WV-2134；及無受質，添加WV-1308。在Hep3B細胞中之3' RACE分析中使用APOC3 mRNA作為測試受質，亦進行活體外Ago-2分析(資料未展示)。偵測在測試寡核苷酸WV-3021存在下APOC3 mRNA之裂解產物，該產物對應於mRNA在對應於WV-3021之位置10與位置11之間的切割位點處之裂解。亦偵測人造裂解產物。實驗資料(未展示)證實雙機制寡核苷酸WV-2111能夠藉由RNase H及RNA干擾兩者介導減量。在實驗中，若干寡核苷酸能夠介導RNA干擾。RNA測試受質為WV-2372。實驗表明，RNA測試受質在測試寡核苷酸WV-1308、WV-2114、WV-2386及WV-2387存在下消失，表明所有此等寡核苷酸能夠充當介導RNA干擾之單股RNAi劑。其餘單變量物為對照物。由此，實驗表明寡核苷酸WV-1308、WV-2114、WV-2386及WV-2387皆能夠介導RNA干擾。由此，實驗表明若干單股RNAi劑(例如，WV-1308、WV-2420、WV-3021、WV-2111、WV-2114、WV-2386及WV-2387)能夠介導RNA干擾。本發明提供寡核苷酸之多個非限制性實例，該等寡核苷酸具有各種序列、型式、修飾、5'端區域、種子區域、種子後區域及3'端區域中之任一者，且能夠介導單股RNA干擾(例如，單股RNAi劑)。
寡核苷酸型式
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠藉由在連結至靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可具有本文中描述或此項技術中已知之任何型式或其部分或其結構要素。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸可具有本文中描述或此項技術中已知之任何型式或其結構要素。
在一些實施例中，能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低的PNPLA3寡核苷酸可具有本文中描述或此項技術中已知之任何型式或其結構要素。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可具有本文中描述或此項技術中已知之任何型式或其結構要素。
各種ssRNAi型式之其他非限制性實例由本文中描述之各種單股RNAi劑體現。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何5'端所表示的5'端。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何5'端結構或5'端區域所表示的5'端結構或5'端區域。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何5'核苷酸所表示的5'核苷酸。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何5'核苷所表示的5'核苷。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何種子區域所表示的種子區域。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何種子後區域所表示的種子後區域。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何種子後區域或其組分所表示的種子後區域或其組分。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何3'端二核苷酸所表示的3'端二核苷酸。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含種子區域，其具有由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何種子區域之核苷酸間鍵聯模式所表示的核苷酸間鍵聯模式。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含種子後區域，其具有由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何種子後區域之核苷酸間鍵聯模式所表示的核苷酸間鍵聯模式。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含種子後區域或其組分，其具有由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何種子後區域或其組分之核苷酸間鍵聯模式所表示的核苷酸間鍵聯模式。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含3'端二核苷酸，其具有由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何3'端二核苷酸之核苷酸間鍵聯模式所表示的核苷酸間鍵聯模式。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含種子區域，其具有由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何種子區域之化學修飾模式所表示的化學修飾模式。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含種子後區域，其具有由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何種子後區域之化學修飾模式所表示的化學修飾模式。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含種子後區域或其組分，其具有由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何種子後區域或其組分之化學修飾模式所表示的化學修飾模式。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含3'端二核苷酸，其具有由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何3'端二核苷酸之化學修飾模式所表示的化學修飾模式。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含由圖1中描繪之任何單股RNAi型式或本文中描述之任何單股RNAi劑或單股RNAi型式之任何化學修飾所表示的化學修飾。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含由圖1中描繪或本文中描述之任何單股RNAi型式之任何化學修飾所表示的化學修飾，其中該化學修飾為包含磷酸酯、連接基團或靶向部分之部分的結合。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含由圖1中描繪或本文中描述之任何單股RNAi型式之任何化學修飾所表示的化學修飾，其中該化學修飾為包含磷酸酯、連接基團或靶向部分之部分的結合，其中該靶向部分包含GalNAc部分。在一些實施例中，GalNAc為受保護或去保護之GalNAc。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸能夠降低靶基因及/或其基因產物之表現、活性及/或含量，且具有本文中描述之任何寡核苷酸之型式。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸能夠經由RNaseH介導之機制或與轉譯位阻有關之機制來降低靶基因及/或其基因產物之表現、活性及/或含量，且具有本文中描述之任何寡核苷酸之型式。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸能夠經由RNaseH介導之機制或與轉譯位阻有關之機制來降低靶基因及/或其基因產物之表現、活性及/或含量，且具有不對稱型式。在一些實施例中，具有不對稱型式之PNPLA3寡核苷酸包含第一翼、核心及第二翼，其中該核心包含可連結至標靶mRNA且形成由RNaseH識別之結構的5個或更多個連續2'-去氧核苷酸之區域，且其中第一翼與第二翼之結構不同。在一些實施例中，第一翼與第二翼之不同之處在於其2'修飾及/或核苷酸間鍵聯或核苷酸間鍵聯之立體化學模式。
在一些實施例中，能夠降低靶基因及/或其基因產物之表現、活性及/或含量之PNPLA3寡核苷酸包含中性核苷酸間鍵聯(例如，中性主鏈)。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含中性主鏈。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為或包含三唑、中性三唑或炔烴。在一些實施例中，核酸(包括(但不限於) PNPLA3寡核苷酸)包含含有三唑、中性三唑或炔烴之核苷酸間鍵聯，其中該核苷酸間鍵聯為立體受控的且呈Rp或Sp組態。在一些實施例中，包含三唑之核苷酸間鍵聯具有下式：。在一些實施例中，包含中性三唑之核苷酸間鍵聯具有下式：，其中X為O或S。在一些實施例中，包含炔烴之核苷酸間鍵聯具有下式：，其中X為O或S。在一些實施例中，核苷酸間鍵聯包含環胍。在一些實施例中，核苷酸間鍵聯包含環胍且具有以下結構：。在一些實施例中，中性核苷酸間鍵聯或包含環胍之核苷酸間鍵聯為立體化學受控的。在一些實施例中，中性核苷酸間鍵聯改良PNPLA3寡核苷酸之活性、傳遞及/或穩定性及/或PNPLA3寡核苷酸執行內體逃逸之能力。
如熟習此項技術者所瞭解，在一些情況下，可用於表示連接位點(如)；在一些情況下，可用於表示立體無規連接。
PNPLA3 寡核苷酸之長度
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠藉由在連結至靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可具有任何長度，其中PNPLA3寡核苷酸之長度使得寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸之長度使得寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。
在一些實施例中，RNAi劑之長度使得RNAi劑能夠以序列特異性方式導引特定靶轉錄物之RNA干擾。在一些實施例中，RNAi劑包含足夠數目個具有充分一致性之核鹼基，以識別靶轉錄物。在一些實施例中，RNAi劑亦具有適用於介導RNAi干擾之長度。
序列之目標部分將至少足夠長以用作iRNA導引之彼部分處或附近之裂解的受質。舉例而言，靶序列之長度將一般為約9至36個核苷酸(「nt」)，例如長度為約15至30個核苷酸，包括其間所有子範圍。各種長度之單股RNAi劑之實例展示於表1A中。
圖1示出長度為19至25之單股RNAi劑之非限制性實例。構築具有此等長度中每一者中之任一者的單股RNAi劑，且認為其能夠阻斷靶基因之基因表現。由此，所提供之單股RNAi劑可為各種不同長度中之任一者。
長度為19個鹼基之ssRNAi劑之型式的非限制性實例包括圖1之型式20至21。
長度為20個鹼基之ssRNAi劑之型式的非限制性實例包括圖1之型式19。
包括單股 RNAi 劑之 PNPLA3 寡核苷酸的 5 ' 端
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸之5'端的結構使得寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。
在一些實施例中，RNAi劑之5'端的結構使得RNAi劑能夠以序列特異性方式導引特定靶轉錄物之RNA干擾。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何5'端區域、5'端結構、5'端基、5'端核苷或5'端核苷酸。在一些實施例中，能夠導引RNase H介導之減量的所提供寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何5'端區域、5'端結構、5'端基、5'端核苷或5'端核苷酸。在一些實施例中，能夠導引RNA干擾之所提供寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何5'端區域、5'端結構、5'端基、5'端核苷或5'端核苷酸。在一些實施例中，能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量的所提供寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何5'端區域、5'端結構、5'端基、5'端核苷或5'端核苷酸。
本發明尤其認識到，寡核苷酸之5'端結構視情況與根據本發明之其他特徵之組合提供出人意料的優勢。在一些實施例中，本發明提供可出人意料地改良寡核苷酸之一或多個特性及/或活性(例如，穩定性、活性、製造成本等)的5'端基(其對應於天然RNA中存在之核糖(或天然DNA中存在之去氧核糖)的5'-HO−CH2 −)。
在一些實施例中，所提供寡核苷酸之5'-OH基團為未經修飾的，亦即，其以游離−OH之形式存在。在一些實施例中，5'端基為5'-HO−CH2 −。本發明尤其證實，具有游離5'-OH基團之所提供寡核苷酸可達成相當於包含5'-磷酸酯(或其衍生物)基團之其他相同的寡核苷酸的特性及/或活性(例如，穩定性、用作ss-RNAi劑時之RNAi活性等)，儘管文獻中報導某些活性(例如RNAi活性)要求存在5'-磷酸酯基團。
在一些實施例中，5'端基不包含磷原子。在一些實施例中，5'端基不包含磷酸酯基團或其衍生物或生物同電子排列體。在一些實施例中，5'端基不包含酸基。在一些實施例中，5'端基不包含羧基。在一些實施例中，5'端不包含磷原子或羧基。在一些實施例中，5'端基為5'-HO−CH2 −。本發明尤其證實，不具有5'-磷酸酯或其衍生物或生物同電子排列體之所提供寡核苷酸可出人意料地達成相當於具有5'-磷酸酯但其他相同的寡核苷酸的活性，例如在經由RNAi路徑使靶基因之mRNA含量減量方面。
在一些實施例中，所提供寡核苷酸(其包括糖及核鹼基部分但不包括5'核苷單元與自5'端之第二核苷單元之間的核苷酸間鍵聯)之5'核苷單元不包含磷酸酯基團或其衍生物或生物同電子排列體。在一些實施例中，5'核苷單元不包含磷原子。在一些實施例中，5'核苷不包含酸基。在一些實施例中，5'核苷單元不包含−COOH基團或其鹽形式。
在一些實施例中，5'端基為或包含磷酸酯基團或其衍生物或生物同電子排列體。在一些實施例中，5'核苷單元包含為磷酸酯基團或其衍生物或生物同電子排列體之5'基團。如一般熟習此項技術者所瞭解，多個此類基團為此項技術中已知的且可根據本發明採用該等基團。
在一些實施例中，5'端基為−CH2 −O−P(O)(OH)−(OH)或其鹽形式。在一些實施例中，所提供之5'核苷單元具有結構或其鹽形式。在一些實施例中，所提供之5'核苷單元具有結構或其鹽形式。在一些實施例中，X為O。在一些實施例中，X為S。在一些實施例中，RE 為−(R )−CH(CH3 )−O−P(O)(OH)−S−H或其鹽形式。在一些實施例中，RE 為−(R )−CH(CH3 )−O−P(O)(OH)−O−H或其鹽形式。在一些實施例中，RE 為−(S )−CH(CH3 )−O−P(O)(OH)−S−H或其鹽形式。在一些實施例中，RE 為−(S )−CH(CH3 )−O−P(O)(OH)−O−H或其鹽形式。在一些實施例中，所提供之5'核苷單元具有結構或其鹽形式。在一些實施例中，所提供之5'核苷單元具有結構或其鹽形式。
如一般熟習此項技術者容易瞭解，所提供之化合物(例如，寡核苷酸)或其部分結構(例如，寡核苷酸之5'端結構、核苷酸間鍵聯等)可在特定pH (例如生理pH)下，例如由於其中一或多種酸性及/或鹼性部分而部分地，有時大部分地以其一或多種鹽形式存在。在一些實施例中，所提供之5'核苷單元可部分地，有時大部分地以一或多種其鹽形式存在。舉例而言，視pH而定，可以、、或其組合之形式存在。除非另外明確說明，否則在列舉所提供之化合物或結構時包括所有鹽形式。
在一些實施例中，RE 為−L−P(O)(XR)2 或其鹽形式。在一些實施例中，RE 為−L−P(O)(XR)2 或其鹽形式，其中各X獨立地為−O−、−S−或共價鍵。在一些實施例中，RE 為−L−P(O)(OR)2 或其鹽形式。在一些實施例中，RE 為−L−P(O)(OR)(SR)或其鹽形式。在一些實施例中，RE 為−L−P(O)(OR)(R)或其鹽形式。在一些實施例中，L為共價鍵或二價的視情況經取代之直鏈或分支鏈C1 - 6 脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經−O−、−S−或−N(R')−置換。在一些實施例中，RE 為−L−R5s 。在一些實施例中，RE 為−X−L−R。在一些實施例中，RE 為。在一些實施例中，RE 中之X為−C(R)2 −。在一些實施例中，X為−O−。在一些實施例中，X為−S−。在一些實施例中，X為−N(R)−。在一些實施例中，L包含視情況經取代之二價或多價基團。在一些實施例中，L包含視情況經取代之基團。在一些實施例中，L包含基團。在一些實施例中，R獨立地為−H或選自C1 - 10 烷基、C1 - 10 烯丙基及C6 - 14 芳基之視情況經取代之基團。在一些實施例中，R為−H。在一些實施例中，RE 視情況經取代。在一些實施例中，RE 為。
多種磷酸酯衍生物及/或生物同電子排列體及5'核苷單元描述於文獻中且可根據本發明使用，例如，一些此等結構描述於例如US 2016-0194349、US 2016-0186175、US 20130323836等中。在一些實施例中，5'端基團RE 或5'核苷單元描述於例如Allerson等人2005 J. Med. Chem. 48: 901-04；Lima等人2012 Cell 150: 883-894；Prakash等人2015 Nucl. Acids Res. 43: 2993-3011；及/或Prakash等人2016 Bioorg. Med. Chem. Lett. 26: 26: 2817-2820中，例如T-VP、T-PO等。
橋聯的嗎啉核酸及環己烯基核苷酸及核苷描述於例如US專利申請公開案2016-0186175中，其可根據本發明使用。
變數之實例實施例充分描述於本發明中。除非另外說明，否則對於具有兩個或更多個變數之結構而言，各變數可獨立地為本文中描述之任何實施例。
在一些實施例中，能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何5'端。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何5'端。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何5'端。
在一些實施例中，所提供單股RNAi劑之5'端包含含磷部分(例如，5'端包含磷)。其中5'端包含含磷部分之ssRNAi型式之非限制性實例包括圖1之型式1至15、20至21、23至31、80至82、92至95、97至102及104至107。
在一些實施例中，所提供單股RNAi劑之5'端不包含含磷部分(例如，5'端包含磷)。其中5'端不包含含磷部分之ssRNAi型式之非限制性實例包括圖1之型式16至19、22、32至79、83至91、96及103。
在一些實施例中，所提供單股RNAi劑之5'端包含含有磷酸酯之部分，該磷酸酯諸如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、H -膦酸酯或類似於或等同於含磷酸酯核苷酸間鍵聯之其他部分。在一些實施例中，所提供單股RNAi劑之5'端包含含有磷酸酯之部分，但該磷酸酯並非磷酸二酯；在一些實施例中，此部分稱為磷酸酯模擬物、經修飾之磷酸酯或磷酸酯類似物。
在一些實施例中，所提供單股RNAi劑之5'端不包含含有磷酸酯之部分。
在單股RNAi劑之一些實施例中，5'端結構具有選自以下之結構：5'-(R)-Me OH T、5'-(R)-Me PO T、5'-(R)-Me PS T、5'-(R)-Me PH T、5'-(S)-Me OH T、5'-(S)-Me PO T、5'-(S)-Me PS T及5'-(S)-PH T。
在所提供單股RNAi劑之一些實施例中，該等實施例包含5'端結構處之含磷部分，該5'端結構由選自式IV-a (Mod022，亦稱為C3 PO及正丙基)、式IV-b (Mod022*)、式IV-c (POMod023*)、IV-d (PSMod023*)及式IV-e (PHMod023*)之結構表示：
在所提供單股RNAi劑之一些實施例中，該等實施例包含5'端結構處之含磷部分，該5'端結構由選自式IV-f結構(亦稱為正丙基、C3 PO或Mod022)之結構表示：正丙基(Mod022) 其中5'表示糖與5'碳之連接點。
在所提供單股RNAi劑之一些實施例中，該等實施例包含5'端結構處之含磷部分，該5'端結構由選自以下結構(亦稱為C3 PS或Mod022*)之結構表示：正丙基(Mod022*) 其中5'表示糖(例如，N1)與5'碳之連接點。
在所提供單股RNAi劑之一些實施例中，該等實施例包含5'端結構處之含磷部分，該5'端結構由選自式IV-g結構(亦稱為二甲基C3或C3二甲基PS或Mod023*)之結構表示：二甲基C3 (Mod023*) 其中5'表示糖(例如，N1)與5'碳之連接點。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含選自PO (磷酸二酯) (式IV-h)、PH (H-膦酸酯) (式IV-i)及PS (硫代磷酸酯) (式IV-j)中之任一者之5'端結構：在所提供單股RNAi劑之一些實施例中，該等實施例包含5'端結構處之含磷部分，該5'端結構由選自以下中之任一者之結構表示：其中5'表示糖(例如，N1)與5'碳之連接點。
在一些實施例中，式IV-a至式IV-j中之任一者中之P為立體無規的或立構限定的，如呈Sp或Rp組態。
在一些實施例中，5'端結構係選自以下中之任一者：磷酸酯；磷酸酯模擬物；5'單磷酸酯((HO)2(O)P-O-5')；5'二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'鳥苷帽(7位甲基化或非甲基化) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'腺苷帽(Appp)；及任何經修飾或未經修飾之核苷酸帽結構(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'單硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5')；5'單二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5')；5'硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5')；經氧/硫置換之單磷酸酯、二磷酸酯及三磷酸酯之任何其他組合(例如，5'-α-硫代三磷酸酯、5'-γ-硫代三磷酸酯等)；5'胺基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5'、(HO)(NH2)(O)P-O-5')；5'烷基膦酸酯(R=烷基=甲基、乙基、異丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)-O-5'-、(OH)2(O)P-5'-CH2-)；5'烷基醚膦酸酯(R=烷基醚=甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)-O-5'-)。
在一些實施例中，包含含磷部分之5'端可具有獨特優勢，因為包含其之單股RNAi劑可在RNA干擾中更具活性。
在一些實施例中，5'端結構具有以下之結構：5'核苷酸或經修飾之5'核苷酸、5'核苷酸類似物、5'核苷或經修飾之5'核苷或5'核苷類似物。
在一些實施例中，5'端結構具有以下中之任一者之結構：5'鳥苷帽、5'腺苷帽、5'單硫代磷酸酯、5'單二硫代磷酸酯、5'硫代磷酸酯、5'胺基磷酸酯、5'烷基膦酸酯及5'烷基醚膦酸酯；5'單磷酸酯、5'二磷酸酯及5'三磷酸酯；5'三磷酸酯；單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，其中該單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯之至少一個氧原子經硫原子置換；5'-α-硫代三磷酸酯及5'-γ-硫代三磷酸酯；烷基膦酸酯；具有式RP(OH)(O)--O-5'或(OH)2 (O)P-5'-CH2 --之烷基膦酸酯，其中R為C1 -C3 烷基；烷基醚膦酸酯；或式RP(OH)(O)--O-5'之烷基醚膦酸酯，其中R為烷基醚。
各種5'核苷描述於例如以下文獻中：以US 2016-0194349 A1公佈的US專利申請案14/959,714；以US 2016-0186175 A1公佈的US專利申請案14/983,907；或以US 20130323836公佈的US專利申請案13/696,796。
在一些實施例中，5'端結構為乙烯基膦酸酯。
在某些實施例中，提供該5'端化合物具有式VIII-c之寡聚化合物，其中G為F、OCH3 或O(CH2 )2 --OCH3 。
在一些實施例中，5'端結構具有選自以下之結構：5'-(R)-Me OH T、5'-(R)-Me PO T、5'-(R)-Me PS T、5'-(R)-Me PH T、5'-(S)-Me OH T、5'-(S)-Me PO T、5'-(S)-Me PS T及5'-(S)-PH T。
在一些實施例中，5'端結構具有5'-(R)-Me OH T之結構。
在一些實施例中，5'端結構具有5'-(R)-Me PO T之結構。
在一些實施例中，5'端結構具有5'-(R)-Me PS T之結構。
在一些實施例中，5'端結構具有5'-(R)-Me PH T之結構。
在一些實施例中，5'端結構具有5'-(S)-Me OH T之結構。
在一些實施例中，5'端結構具有5'-(S)-Me PO T之結構。
在一些實施例中，5'端結構具有5'-(S)-Me PS T之結構。
在單股RNAi劑之一些實施例中，5'端結構具有5'-(R)-Me PO T之結構。
在單股RNAi劑之一些實施例中，5'端結構具有5'-(R)-Me PS T之結構。
在單股RNAi劑之一些實施例中，5'端結構具有5'-(R)-Me PH T之結構。
在單股RNAi劑之一些實施例中，5'端結構具有5'-(S)-Me OH T之結構。
在單股RNAi劑之一些實施例中，5'端結構具有5'-(S)-Me PO T之結構。
在單股RNAi劑之一些實施例中，5'端結構具有5'-(S)-Me PS T之結構。
在單股RNAi劑之一些實施例中，5'端結構具有5'-(S)-Me PH T之結構。
在一些實施例中，5'端結構具有5'-(S)-Me PH T之結構。此外，諸如EP 1520022 B1第6段之一些參考文獻已報導，siRNA雙螺旋體之標靶互補股(例如，反義股)處需要5'磷酸酯以供具有RISC活性。美國專利第8,729,036號第2行亦指出，據報導，5'磷酸酯為RNA干擾所必需的。美國專利第8,729,036號第3行亦報導，單股反義siRNA需要5'磷酸酯來觸發HeLa S100提取物中之RNAi。然而，本發明已證實，不包含5'磷酸酯之各種單股RNAi劑能夠導引RNA干擾。
在一些實施例中，5'端包含諸如T-VP或T-PO之含磷酸酯部分，或如例如以下文獻中所描述之任何其他適合的RNAi劑5'端化合物：Allerson等人2005 J. Med. Chem. 48: 901-04；Lima等人2012 Cell 150: 883-894；Prakash等人2015 Nucl. Acids Res. 43: 2993-3011；及/或Prakash等人2016 Bioorg. Med. Chem. Lett. 26: 26: 2817-2820。
在一些實施例中，不包含含磷部分之5'端可具有獨特優勢，因為單股RNAi劑可更易合成，且其可以不需要防止含磷部分降解。在一些實施例中，不包含含磷部分之所提供單股RNAi劑之5'端包含可充當靶細胞內之哺乳動物激酶之受質的部分，該哺乳動物激酶能夠連接單股RNAi劑之5'端處之含磷部分。
在一些實施例中，5'端不包含含磷部分。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-去氧。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-去氧T。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-去氧U。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-去氧A。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-去氧G。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-去氧C。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-去氧。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-去氧T。在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-去氧U。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-去氧A。在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-去氧G。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-去氧C。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-OMe。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-OMe T。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-OMe U。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-OMe A。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-OMe G。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-OMe C。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-OMe。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-OMe T。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-OMe U。在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-OMe A。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-OMe G。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-OMe C。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-F。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-F T。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-F U。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-F A。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-F G。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-F C。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-F。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-F T。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-F U。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-F A。在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-F G。在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端OH，且第一核苷為2'-F C。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-去氧。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-去氧T。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-去氧U。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-去氧A。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-去氧G。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-去氧C。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-去氧。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-去氧T。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-去氧U。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-去氧A。在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-去氧G。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-去氧C。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-F。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-F T。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-F U。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-F A。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-F G。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-F C。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-F。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-F T。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-F U。在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-F A。在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-F G。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-F C。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-OMe。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-OMe T。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-OMe U。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-OMe A。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-OMe G。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-OMe C。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-OMe。在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-OMe T。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-OMe U。在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-OMe A。在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-OMe G。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含5'端磷酸酯，且第一核苷為2'-OMe C。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含結合於ASPGR之另一組分。在一些實施例中，該另一組分在寡核苷酸之5'端上。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含另一組分，其為或包含式(K)化合物其中R為-CN、-CH2 -CN、-C≡CH、-CH2 -N3 、-CH2 -NH2 、-CH2 -N(R)-S(O)2 -R、-CH2 -CO2 H、-CO2 H、-CH2 -OH、-CH2 -SH、-CH=CH-R、-CH2 -R、-CH2 -S-R、-CH2 -N(R)-R、-CH2 -N(R)-C(O)-R、-CH2 -N(R)-C(O)-O-R、-CH2 -N(R)-C(O)-N(R)-R、-CH2 -O-R、-CH2 -O-C(O)-R、-CH2 -O-C(O)-N(R)-R、-CH2 -O-C(O)-O-R、-CH2 -S(O)-R、-CH2 -S(O)2 -R、-CH2 -S(O)2 -N(R)-R、-C(O)-NH2 、-C(O)-O-R、-C(O)-N(R)-R或芳基或雜芳基，其中該芳基或雜芳基視情況經R取代， 或R為-Z-X-Y，其中X為連接基團或藥物傳遞系統，Y不存在或為選自由以下組成之群之配位體：小分子、胺基酸序列、核酸序列、抗體、寡聚物、聚合物、遺傳衍生物質、脂質體、奈米粒子、染料、螢光探針或其一組合，且Z不存在或為-C≡C-、-CH=CH-、-CH2 -、-CH2 -O-、-C(O)-N(R)-、-CH2 -S-、-CH2 -S(O)-、-CH2 -S(O)2 -、-CH2 -S(O)2 -N(R)-、-C(O)-O-、-CH2 -N(R)-、-CH2- N(R)-C(O)-、-CH2 -N(R)-S(O)2 -、-CH2 -N(R)-C(O)-O-、-CH2 -N(R)-C(O)-N(R)-、-CH2 -O-C(O)-、-CH2 -O-C(O)-N(R)-、-CH2 -O-C(O)-O-或芳基或雜芳基，其中該芳基或雜芳基視情況經R取代； R62 為-OH、-N3 、-N(R)2 、-N(R)-C(O)-R、-N(R)-C(O)-N(R)2 、-N(R)-C(O)-OR、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R取代， 且其中當R為-CH2 -OH時，R為-N3 、-N(R)2 、-N(R)-C(O)-R、-N(R)-C(O)-N(R)2 、-N(R)-C(O)-OR、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R取代； 各R獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基或(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之-CH2 -基團可經選自-O-、-S-及-N(R)-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R)2 、-OR及-S(R)之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R)-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R)2 、-OR及-S(R)之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經一至六個鹵基原子取代；且 各R獨立地為-H、(C3 -C20 )環烷基或(C1 -C20 )烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R)-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R)2 、-OR及-S(R)之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經一至六個鹵基原子取代。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含另一組分，其為或包含式(M)化合物其中R為-CN、-CH2 -CN、-C≡CH、-CH2 -N3 、-CH2 -NH2 、-CH2 -N(R)-S(O)2 -R、-CH2 -CO2 H、-CO2 H、-CH2 -OH、-CH2 -SH、-CH=CH-R、-CH2 -R、-CH2 -S-R、-CH2 -N(R)-R、-CH2 -N(R)-C(O)-R、-CH2 -N(R)-C(O)-O-R、-CH2 -N(R)-C(O)-N(R)-R、-CH2 -O-R、-CH2 -O-C(O)-R、-CH2 -O-C(O)-N(R)-R、-CH2 -O-C(O)-O-R、-CH2 -S(O)-R、-CH2 -S(O)2 -R、-CH2 -S(O)2 -N(R)-R、-C(O)-NH2 、-C(O)-O-R、-C(O)-N(R)-R或芳基或雜芳基，其中該芳基或雜芳基視情況經R取代， 或R為-Z-X-Y、-Z-Y、-X-Y、-X、-Y或-Z-X，其中X為連接基團或藥物傳遞系統，Y為R或為選自由以下組成之群之配位體：小分子、胺基酸序列、核酸序列、抗體、寡聚物、聚合物、遺傳衍生物質、脂質體、奈米粒子、染料、螢光探針或其一組合，且Z為-C≡C-、-CH=CH-、-CH2 -、-CH2 -O-、-C(O)-N(R)-、-CH2 -S-、-CH2 -S(O)-、-CH2 -S(O)2 -、-CH2 -S(O)2 -N(R)-、-C(O)-O-、-CH2 -N(R)-、-CH2- N(R)-C(O)-、-CH2 -N(R)-S(O)2 -、-CH2 -N(R)-C(O)-O-、-CH2 -N(R)-C(O)-N(R)-、-CH2 -O-C(O)-、-CH2 -O-C(O)-N(R)-、-CH2 -O-C(O)-O-或芳基或雜芳基，其中該芳基或雜芳基視情況經R取代； R為-OH、-N3 、-N(R)2 、-N(R)-C(O)-R、-N(R)-C(O)-N(R)2 、-N(R)-C(O)-OR、-N(R)-S(O)2 -R、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R取代 且其中當R為-CH2 -OH時，R為-N3 、-N(R)2 、-N(R)-C(O)-R、-N(R)-C(O)-N(R)2 、-N(R)-C(O)-OR、N(R)-S(O)2 -R、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R取代； 各R獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基或(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之一或多個-CH2 -基團各自可經獨立地選自-O-、-S-及-N(R)-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R)2 、-OR及-S(R)之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團各自可經獨立地選自-O-、-S-或-N(R)-之雜原子置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R)2 、-OR及-S(R)之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代； 各R獨立地為-H、(C3 -C20 )環烷基或(C1 -C60 )烷基，其中該環烷基之一至六個-CH2 -基團或該烷基之一至二十個-CH2 -基團各自可經獨立地選自-O-、-S-及-N(R)-之雜原子置換，其中該等雜原子由至少兩個碳原子間隔開，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R)2 、-OR及-S(R)之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代；且 各R獨立地為H、-C≡CH、-C=CH2 、-CH3 、-N3 、-N(R)2 、-OH、-S(O)-(R)、-S(O)2 -(R)、-C(O)-OH、-S-S-芳基、-S-S-雜芳基、雜環基、芳基或雜芳基，其中各芳基或雜芳基視情況經R取代。
在一些實施例中，R61 或R71 為-X-Y，及/或R62 或R72 為-NH-C(O)-CH3 。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含選自由以下組成之群之另一組分： (4-((2-((1-(1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基)-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁基)胺基甲酸苯甲酯， (4-((1,3-雙((1-(1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基)-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)丙-2-基)胺基)-4-側氧基丁基)胺基甲酸苯甲酯， (4-((1,3-雙((1-(1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基)-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)-2-(((1-(1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基)-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)甲基)丙-2-基)胺基)-4-側氧基丁基)胺基甲酸苯甲酯， N-(2-((1-(1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基)-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙基)-4-胺基丁醯胺， 4-胺基-N-{1,3-雙[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]丙-2-基}丁醯胺， 4-胺基-N-(1,3-雙[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)丁醯胺， 4-胺基-N-[1,31-雙(1-{[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]甲基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2,6,10,14,18,22,26,30-八氧雜三十一烷-16-基]丁醯胺， 4-胺基-N-{1,31-雙(1-{[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]甲基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)-16-[15-(1-{[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]甲基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2,6,10,14-四氧雜十五烷-1-基]-2,6,10,14,18,22,26,30-八氧雜三十一烷-16-基}丁醯胺， N-{(1S,2R,3R,4R,5S)-1-[(己氧基)甲基]-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基}乙醯胺， N-[(1S,2R,3R,4R,5S)-2,3-二羥基-1-(2,5,8,11,14-五氧雜十五烷-1-基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]乙醯胺， N-((1S,2R,3R,4R,5S)-2,3-二羥基-1-(羥甲基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基)-2,2,2-三氟乙醯胺化合物，N -[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-2,3-二羥基-1-(羥甲基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]-2,2,2-三氟乙醯胺，N -[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-2,3-二羥基-1-(羥甲基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]丙醯胺，N -[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-2,3-二羥基-1-(羥甲基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]甲磺醯胺，N -[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-2,3-二羥基-1-(羥甲基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]-2,2-二氧乙醯胺，N -[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-2,3-二羥基-1-(羥甲基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]-3,3,3-三氟丙醯胺， N-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-2,3-二羥基-1-(羥甲基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]-N -甲基乙醯胺，N -[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-2,3-二羥基-1-(羥甲基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]-N -甲基甲磺醯胺， [(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-2,3-二羥基-1-(羥甲基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]甲基胺基甲酸第三丁酯， (1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-1-(羥甲基)-4-(甲胺基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛烷-2,3-二醇鹽酸鹽，N -[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-2,3-二羥基-1-(15-苯基-2,5,8,11,14-五氧雜十五烷-1-基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]乙醯胺， N-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-1-(13-疊氮基-2,5,8,11-四氧雜十三烷-1-基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]乙醯胺， N-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-2,3-二羥基-1-(2,5,8,11-四氧雜十四烷-13-烯-1-基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]乙醯胺， N-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-2,3-二羥基-1-(2,5,8,11-四氧雜十四烷-13-炔-1-基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]乙醯胺， N-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-1-(13-胺基-2,5,8,11-四氧雜十三烷-1-基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]乙醯胺， N-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-2,3-二羥基-1-(13-羥基-2,5,8,11-四氧雜十三烷-1-基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]乙醯胺， 1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-酸， 硫乙酸S -{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}酯，N - {(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-2,3-二羥基-1-[13-(吡啶-2-基二硫基)-2,5,8,11-四氧雜十三烷-1-基]-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基}乙醯胺，N -(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)-6-(吡啶-2-基二硫基)己醯胺， N-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-1-(13-{4-[(3-[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}-2-胺基丙氧基)甲基]-1H-1,2,3-三唑-1-基}-2,5,8,11-四氧雜十三烷-1-基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-4-基]乙醯胺鹽酸鹽， 6-疊氮基-N -(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)己醯胺，N -(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)庚-6-烯醯胺，N -(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)庚-6-炔醯胺， 7-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-7-側氧基庚酸(鈉鹽)， {6-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-6-側氧基己基}胺基甲酸苯甲酯， 6-胺基-N -(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)己醯胺乙酸鹽，N - {6-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-6-側氧基己基}-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)己醯胺，N -{6-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-6-側氧基己基}-6-[(溴乙醯基)胺基]己醯胺， {6-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-6-側氧基己基}胺基甲酸4-{[(2R )-5-(胺甲醯基胺基)-2-{[(2R )-2-環戊基-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)己醯基]胺基}乙醯基]胺基}戊醯基]胺基}苯甲酯，N -(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)-3,19-二側氧基-1-(吡啶-2-基二硫基)-7,10,13,16-四氧雜-4,20-二氮雜二十六烷-26-醯胺，N -(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)-3,31-二側氧基-1-(吡啶-2-基二硫基)-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧雜-4,32-二氮雜四十烷-38-醯胺，N -{6-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-6-側氧基己基}-6-(吡啶-2-基二硫基)己醯胺， {6-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-6-側氧基己基}胺基甲酸2-(吡啶-2-基二硫基)乙酯，N -{6-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-6-側氧基己基}-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)己醯胺，N -{6-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-6-側氧基己基}-N'-(1,3-二羥基丙-2-基)庚烷二醯胺， 6-疊氮基-N -{6-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-6-側氧基己基}己醯胺， 6-(苯甲氧基)-N -{6-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-6-側氧基己基}己醯胺， 乙酸(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-1-{13-[4-({3-[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-雙(乙醯氧基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-雙(乙醯氧基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}-2-({6[(6羥基己醯基)胺基]己醯基}胺基)丙氧基}甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-1-基}-3-(乙醯氧基)-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-2-基酯， [6-({6-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-6-側氧基己基}胺基)-6-側氧基己基]胺基甲酸苯甲酯， 6-胺基-N -{6-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-6-側氧基己基}己醯胺乙酸鹽， 4-(苯甲氧基)-N -(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)丁醯胺，N -(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)-4-羥基丁醯胺，及N -(2-{[6-({6-[(1,3-雙[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-2-{[(1-{1-[(1S ,2R ,3R ,4R ,5S )-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雜雙環[3.2.1]辛-1-基]-2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基}-1H -1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]甲基}丙-2-基)胺基]-6-側氧基己基}胺基)-6-側氧基己基]氧基}-1,3-二氧雜環己烷-5-基)-6-(吡啶-2-基二硫基)己醯胺
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含具有式(N)之另一組分。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含選自以下之另一組分： 及。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含選自下式中之任一者之另一組分： . 及。
在一些實施例中，本發明係關於：具有式O1之化合物： Y1 -L1 -(Z10 )za O1 或該化合物之醫藥學上可接受之鹽，其中Y1 為靶向PNPLA3之寡核苷酸； za為1、2或3；且 L1 為式L11、式L12、式L13、式L43、式L44、式L45、式L46、式L47、式L48、式L49、式L50、式L51、式L52、式L53或式L54之化合物，其中與Y1 及Z10 之連接位點經指定： 其中各T1 獨立地不存在或為伸烷基、伸烯基或伸炔基，其中該伸烷基、伸烯基或伸炔基之一或多個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-及-N(R49 )-之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各Q1 獨立地不存在或為-C(O)-、-C(O)-NR49 -、-NR49 -C(O)-、-O-C(O)-NR49 -、-NR49 -C(O)-O-、-CH2 -、-NR49 C(O)NR49 -、二價雜芳基或選自-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2 -及-NR49 -之雜原子基團，其中至少兩個碳原子將該等雜原子基團-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2 -及-NR49 -與任何其他雜原子基團間隔開；或為具有下式之結構：其中R53 為-O或-NH-，且R54 為-O或-S； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代，且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； R53 為-O或-NH； R54 為-O或-S； 各n獨立地為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40；其中若n大於0，則各(T1 -Q1 -T1 -Q1 )中之各T1 及各Q1 獨立地經選擇；且 各Z10 獨立地為式Z12、式Z13、式Z14、式Z15、式Z16、式Z17、式Z18、式Z19、式Z20或式Z21之化合物，或其幾何或位置異構體，其中與L1 之連接位點經指定：；其中各R46 獨立地為-CN、-CH2 -CN、-C≡CH、-CH2 -N3 、-CH2 -NH2 、-CH2 -N(R52 )-S(O)2 -R51 、-CH2 -CO2 H、-CO2 H、-CH2 -OH、-CH2 -SH、-CH=CH-R51 、-CH2 -R51 、-CH2 -S-R51 、-CH2 -N(R52 )-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-O-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-N(R52 )-R51 、-CH2 -O-R51 、-CH2 -O-C(O)-R51 、-CH2 -O-C(O)-N(R52 )-R51 、-CH2 -O-C(O)-O-R51 、-CH2 -S(O)-R51 、-CH2 -S(O)2 -R51 、-CH2 -S(O)2 -N(R52 )-R51 、-C(O)-NH2 、-C(O)-O-R51 、-C(O)-N(R52 )-R51 或芳基或雜芳基，其中該芳基或雜芳基視情況經R51 取代 各R47 獨立地為-OH、-N3 、-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-R48 、-N(R48 )-C(O)-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-OR48 、-N(R48 )-S(O)2 -R48 、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R48 取代； 各R48 獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之-(C3 -C6 )環烷基、-(C1 -C5 )烯基、-(C1 -C5 )炔基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )烯基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之-CH2 -基團可各自獨立地經選自-O-、-S-及-N(R52 )-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R52 )2 、-OR52 及-S(R52 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R51 獨立地為-H、-(C3 -C20 )環烷基、-(C1 -C60 )烯基、-(C1 -C60 )炔基或-(C1 -C60 )烷基，其中該環烷基之一至六個-CH2 -基團或該烷基之一至二十個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-及-N(R49 )-之雜原子置換，其中該等雜原子由至少兩個碳原子間隔開，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開，且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代；且 各R52 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基、-(C1 -C20 )烯基、-(C1 -C20 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-或-N(R49 )-之雜原子置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代。
在一些實施例中，Y1 包含至少15個鹼基。
在一些實施例中，Y1 之鹼基序列包含或為表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列，或Y1 之鹼基序列包含表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之序列中的15個連續鹼基。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個磷酸二酯核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為對掌性受控硫代磷酸酯。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為呈Sp組態之對掌性受控硫代磷酸酯。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為呈Rp組態之對掌性受控硫代磷酸酯。
在一些實施例中，Y1 ，其中對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯或對掌性受控硫代磷酸酯包含在組合物內具有至少70%非對映異構純度之磷對掌性中心。
在一些實施例中，Y1 ，其中對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯或對掌性受控硫代磷酸酯包含具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%非對映異構純度之磷對掌性中心。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個糖修飾。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個鹼基。
在一些實施例中，Y1 進一步包含主鏈鍵聯模式。
在一些實施例中，Y1 進一步包含主鏈對掌性中心模式。
在一些實施例中，Y1 進一步包含化學修飾模式。
在一些實施例中，Y1 進一步包含主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及化學修飾模式。
在一些實施例中，寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及化學修飾模式為表1A中所列之任何寡核苷酸中的寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式。
在一些實施例中，寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及化學修飾模式為表1A中所列之寡核苷酸的寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式，Y1 之鹼基序列包含或為表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列，或Y1 之鹼基序列包含表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之序列中的15個連續鹼基。
在一些實施例中，該寡核苷酸能夠介導PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性的降低。
在一些實施例中，該寡核苷酸能夠經由藉由RNaseH、位阻及/或RNA干擾介導之機制來介導PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性的降低。
在一些實施例中： 各T1 獨立地不存在或為伸烷基，其中該伸烷基之一或多個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-及-N(R49 )-之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各Q1 獨立地不存在或為-C(O)、-C(O)-NR49 、-NR49 -C(O)或選自-O-及-NR49 之雜原子基團，其中至少兩個碳原子將該等雜原子基團-O-及-NR49 與任何其他雜原子基團間隔開； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中烷基及環烷基可經鹵基原子取代； 各n獨立地為0、1、2、3或4；其中若n大於0，則各(T1 -Q1 -T1 -Q1 )中之各T1 及各Q1 獨立地經選擇； 各R46 為-CH2 -OH； 各R47 為-N(R48 )-C(O)-R48 ；且 各R48 獨立地為-H或-(C1 -C5 )烷基。
在一些實施例中，本發明係關於：具有式O2之化合物： Y1 -L2 -(Z11 )za O2 或其醫藥學上可接受之鹽，其中Y1 為靶向PNPLA3之寡核苷酸； za為1、2或3； L2 為連接基團；且 Z11 為式(B)化合物，其中與L2 之連接位點經指定：； 各R47 獨立地為-OH、-N3 、-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-R48 、-N(R48 )-C(O)-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-OR48 、-N(R48 )-S(O)2 -R48 、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R48 取代； 各R48 獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之-(C3 -C6 )環烷基、-(C1 -C5 )烯基、-(C1 -C5 )炔基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )烯基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之-CH2 -基團可各自獨立地經選自-O-、-S-及-N(R52 )-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R52 )2 、-OR52 及-S(R52 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代，且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； 各R52 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基、-(C1 -C20 )烯基、-(C1 -C20 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-或-N(R49 )-之雜原子置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代。
在一些實施例中，L2 為式L1、式L2、式L3、式L4、式L5、式L6、式L7、式L8、式L9、式L10、式L11、式L12、式L13或式L14之化合物，其中與Y1 及Z11 之連接位點經指定： 其中各T1 獨立地不存在或為伸烷基、伸烯基或伸炔基，其中該伸烷基、伸烯基或伸炔基之一或多個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-及-N(R49 )-之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各Q1 獨立地不存在或為-C(O)-、-C(O)-NR49 -、-NR49 -C(O)-、-O-C(O)-NR49 -、-NR49 -C(O)-O-、-CH2 -、-NR49 C(O)NR49 -、二價雜芳基或選自-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2 -及-NR49 -之雜原子基團，其中至少兩個碳原子將該等雜原子基團-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2 -及-NR49 -與任何其他雜原子基團間隔開；或為具有下式之結構：其中R53 為-O或-NH，且R54 為-O或-S； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代；且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； R53 為-O或-NH； R54 為-O或-S；且 各n獨立地為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40；其中若n大於0，則各(T1 -Q1 -T1 -Q1 )中之各T1 及各Q1 獨立地經選擇。
在一些實施例中，Y1 包含至少15個鹼基。
在一些實施例中，Y1 之鹼基序列包含或為表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列，或Y1 之鹼基序列包含表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之序列中的15個連續鹼基。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個磷酸二酯核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為對掌性受控硫代磷酸酯。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為呈Sp組態之對掌性受控硫代磷酸酯。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為呈Rp組態之對掌性受控硫代磷酸酯。
在一些實施例中，Y1 ，其中對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯或對掌性受控硫代磷酸酯包含在組合物內具有至少70%非對映異構純度之磷對掌性中心。
在一些實施例中，Y1 ，其中對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯或對掌性受控硫代磷酸酯包含具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%非對映異構純度之磷對掌性中心。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個糖修飾。
在一些實施例中，Y1 包含至少1個鹼基。
在一些實施例中，該寡核苷酸之主鏈鍵聯模式為表1A中所列之任何寡核苷酸之主鏈鍵聯模式。
在一些實施例中，該寡核苷酸之主鏈對掌性中心模式為表1A中所列之任何寡核苷酸之主鏈對掌性中心模式。
在一些實施例中，該寡核苷酸之化學修飾模式為表1A中所列之任何寡核苷酸之化學修飾模式。
在一些實施例中，寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及化學修飾模式為表1A中所列之任何寡核苷酸中的寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式。
在一些實施例中，寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及化學修飾模式為表1A中所列之任何寡核苷酸中的寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式。
在一些實施例中，寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及化學修飾模式為表1A中所列之寡核苷酸的Y1 之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式，且Y1 之鹼基序列包含或為表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列，或Y1 之鹼基序列包含表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之序列中的15個連續鹼基。
在一些實施例中，該寡核苷酸能夠介導PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性的降低。
在一些實施例中，該寡核苷酸能夠經由藉由RNaseH、位阻及/或RNA干擾介導之機制來介導PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性的降低。
在一些實施例中：各R47 為-N(R48 )-C(O)-R48 ；且各R48 獨立地為-H或-(C1 -C5 )烷基。
在一些實施例中： 各T1 獨立地不存在或為伸烷基，其中 該伸烷基之一或多個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-及-N(R49 )-之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各Q1 獨立地不存在或為C(O)、C(O)-NR49 、NR49 -C(O)或選自O及NR49 之雜原子基團，其中至少兩個碳原子將該等雜原子基團O及NR49 與任何其他雜原子基團間隔開； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中烷基及環烷基可經鹵基原子取代； 各n獨立地為0、1、2、3或4；其中若n大於0，則各(T1 -Q1 -T1 -Q1 )中之各T1 及各Q1 獨立地經選擇。
在一些實施例中，本發明係關於：一種含有以下之化合物者：(a)能夠靶向PNPLA3之寡核苷酸；(b)連接基團；及(c) 1、2或3個獨立地選自Z10 及Z11 之部分；其中該連接基團連接該寡核苷酸與該1、2或3個部分，且其中： 各Z10 獨立地為式Z12、式Z13、式Z14、式Z15、式Z16、式Z17、式Z18、式Z19、式Z20或式Z21之化合物，或其幾何或位置異構體，其中與L1 之連接位點經指定：；其中各R46 獨立地為-CN、-CH2 -CN、-C≡CH、-CH2 -N3 、-CH2 -NH2 、-CH2 -N(R52 )-S(O)2 -R51 、-CH2 -CO2 H、-CO2 H、-CH2 -OH、-CH2 -SH、-CH=CH-R51 、-CH2 -R51 、-CH2 -S-R51 、-CH2 -N(R52 )-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-O-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-N(R52 )-R51 、-CH2 -O-R51 、-CH2 -O-C(O)-R51 、-CH2 -O-C(O)-N(R52 )-R51 、-CH2 -O-C(O)-O-R51 、-CH2 -S(O)-R51 、-CH2 -S(O)2 -R51 、-CH2 -S(O)2 -N(R52 )-R51 、-C(O)-NH2 、-C(O)-O-R51 、-C(O)-N(R52 )-R51 或芳基或雜芳基，其中該芳基或雜芳基視情況經R51 取代 各R47 獨立地為-OH、-N3 、-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-R48 、-N(R48 )-C(O)-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-OR48 、-N(R48 )-S(O)2 -R48 、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R48 取代； 各R48 獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之-(C3 -C6 )環烷基、-(C1 -C5 )烯基、-(C1 -C5 )炔基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )烯基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之-CH2 -基團可各自獨立地經選自-O-、-S-及-N(R52 )-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R52 )2 、-OR52 及-S(R52 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R51 獨立地為-H、-(C3 -C20 )環烷基、-(C1 -C60 )烯基、-(C1 -C60 )炔基或-(C1 -C60 )烷基，其中該環烷基之一至六個-CH2 -基團或該烷基之一至二十個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-及-N(R49 )-之雜原子置換，其中該等雜原子由至少兩個碳原子間隔開，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開，且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代；且 各R52 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基、-(C1 -C20 )烯基、-(C1 -C20 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-或-N(R49 )-之雜原子置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代，且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； 各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； 且Z11 為式(B)化合物，其中與L2 之連接位點經指定：； 各R47 獨立地為-OH、-N3 、-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-R48 、-N(R48 )-C(O)-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-OR48 、-N(R48 )-S(O)2 -R48 、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R48 取代； 各R48 獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之-(C3 -C6 )環烷基、-(C1 -C5 )烯基、-(C1 -C5 )炔基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )烯基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之-CH2 -基團可各自獨立地經選自-O-、-S-及-N(R52 )-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R52 )2 、-OR52 及-S(R52 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代，且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； 46.各R52 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基、-(C1 -C20 )烯基、-(C1 -C20 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-或-N(R49 )-之雜原子置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代。一種對掌性受控PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含特定寡核苷酸類型之寡核苷酸，其特徵在於： a)共同鹼基序列及長度，其中該鹼基序列與PNPLA3靶基因互補； b)共同主鏈鍵聯模式； c)共同主鏈對掌性中心模式，其中該共同主鏈對掌性中心模式包含至少一個包含對掌性受控對掌性中心之核苷酸間鍵聯； 該組合物為對掌性受控的，因為相對於具有相同共同鹼基序列及長度之寡核苷酸的實質上外消旋製劑而言，該組合物中該特定寡核苷酸類型之寡核苷酸增濃；且 其中該寡核苷酸組合物能夠降低PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性。
在一些實施例中，該寡核苷酸能夠經由藉由RNaseH、位阻及/或RNA干擾介導之機制來降低PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性。
在一些實施例中，本發明係關於：包含如前述技術方案中任一者之化合物的組合物。
在一些實施例中，本發明係關於：包含為單股RNAi劑之PNPLA3寡核苷酸的組合物，其中該單股RNAi劑與PNPLA3標靶RNA序列互補或實質上互補， 長度為約15至約49個核苷酸，且 能夠導引標靶特異性RNA干擾， 其中該單股RNAi劑包含至少一個非天然鹼基、糖及/或核苷酸間鍵聯，且 其中該組合物能夠降低PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性。
在一些實施例中，該一或多個寡核苷酸進一步包含橋聯雙環縮酮。
在一些實施例中，RCD 為。
在一些實施例中，RCD 為。
在一些實施例中，RCD 具有使得RCD −H為以下之結構： 。
在一些實施例中，RCD 經由連接基團連接至一或多個寡核苷酸。
在一些實施例中，連接基團為LM 。
在一些實施例中，連接基團具有以下之結構： 。
在一些實施例中，RCD 係選自： 。
在一些實施例中，本發明係關於：一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如前述技術方案中任一者之組合物與至少一種醫藥學上可接受之賦形劑的混合物。
在一些實施例中，該組合物進一步包含選自由以下組成之群之至少一種其他藥劑：消炎劑、抗糖尿病劑及膽固醇/脂質調節劑。
在一些實施例中，該其他藥劑係選自由以下組成之群：乙醯基-CoA羧化酶(ACC)抑制劑；二醯甘油O-醯基轉移酶1 (DGAT-1)抑制劑；二醯甘油O-醯基轉移酶2 (DGAT-2)抑制劑；單醯甘油O-醯基轉移酶抑制劑；磷酸二酯酶(PDE)-10抑制劑；AMPK活化劑；磺醯脲；美格替耐(meglitinide)；α-澱粉酶抑制劑；α-葡糖苷水解酶抑制劑；α-葡糖苷酶抑制劑；PPARγ促效劑；PPAR α/γ促效劑；二胍；類升糖素肽1 (GLP-1)調節劑；利拉魯肽(liraglutide)；阿必魯肽(albiglutide)；艾塞那肽(exenatide)；阿必魯肽；利司那肽(lixisenatide)；度拉糖肽(dulaglutide)；司美魯肽(semaglutide)；蛋白質酪胺酸磷酸酶-1B (PTP-1B)抑制劑；SIRT-1活化劑；二肽基肽酶IV (DPP-IV)抑制劑；胰島素促泌素；脂肪酸氧化抑制劑；A2拮抗劑；c-jun胺基端激酶(JNK)抑制劑；葡糖激酶活化劑(GKa)；胰島素；胰島素模擬物；肝糖磷酸化酶抑制劑；VPAC2受體促效劑；SGLT2抑制劑；升糖素受體調節劑；GPR119調節劑；FGF21衍生物或類似物；TGR5受體調節劑；GPBAR1受體調節劑；GPR40促效劑；GPR120調節劑；高親和力菸鹼酸受體(HM74A)活化劑；SGLT1抑制劑；肉鹼軟脂醯基轉移酶之抑制劑或調節劑；果糖1,6-二磷酸酶之抑制劑；醛醣還原酶之抑制劑；鹽皮質激素受體抑制劑；TORC2之抑制劑；CCR2及/或CCR5之抑制劑；PKC同功異型物之抑制劑(例如，PKCα、PKCβ、PKCγ)；脂肪酸合成酶之抑制劑；絲胺酸軟脂醯基轉移酶之抑制劑；GPR81、GPR39、GPR43、GPR41、GPR105、Kv1.3、視黃醇結合蛋白4、糖皮質激素受體、生長抑素受體之調節劑；PDHK2或PDHK4之抑制劑或調節劑；MAP4K4之抑制劑；IL1家族(包括IL1β)之調節劑；HMG-CoA還原酶抑制劑；角鯊烯合成酶抑制劑；纖維酸酯；膽酸螯合劑；ACAT抑制劑；MTP抑制劑；脂加氧酶抑制劑；膽固醇吸收抑制劑；PCSK9調節劑；膽固醇酯轉移蛋白抑制劑及RXRα之調節劑。
在一些實施例中，該組合物進一步包含選自由以下組成之群之至少一種其他藥劑：半胱胺或其醫藥學上可接受之鹽；胱胺或其醫藥學上可接受之鹽；抗氧化劑化合物；卵磷脂；維生素B複合物；膽汁鹽製劑；大麻素-1 (CB1)受體之拮抗劑；大麻素-1 (CB1)受體之反向促效劑；過氧化體增殖物活化受體活性調節劑；苯并噻氮呯(benzothiazepine/benzothiepine)化合物；用以抑制蛋白質酪胺酸磷酸酶PTPRU之RNA反義構築體；雜原子鍵聯之經取代哌啶及其衍生物；能夠抑制硬脂醯基輔酶α δ-9去飽和酶之氮雜環戊烷衍生物；具有脂聯素之促泌素或誘導劑活性的醯胺化合物；季銨化合物；乙酸格拉替雷(Glatiramer acetate)；五聚蛋白；HMG-CoA還原酶抑制劑；正乙醯基半胱胺酸；異黃酮化合物；巨環內酯抗生素；半乳糖凝集素抑制劑；抗體；或其任何組合。
在一些實施例中，本發明係關於：一種用於人類之將非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪變性肝炎定級評分系統之嚴重度降低至少一個點、降低非酒精性脂肪變性肝炎活性之血清標記物之含量、降低非酒精性脂肪變性肝炎疾病活性或減少非酒精性脂肪變性肝炎之醫療後果的方法，該方法包含以下步驟：向有需要之患者，向需要此類降低之人類投與治療有效量之如前述技術方案中任一者之組合物。
在一些實施例中，本發明係關於：一種用於治療人類之脂肪肝、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝纖維化之非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝硬化之非酒精性脂肪變性肝炎或伴隨肝硬化及肝細胞癌之非酒精性脂肪變性肝炎的方法，該方法包含以下步驟：向有需要之患者，向需要此類治療之人類投與治療有效量之如前述技術方案中任一者之組合物。
在一些實施例中，本發明係關於：一種用於治療人類之以下疾病之方法：高脂質血症、I型糖尿病、II型糖尿病、特發性I型糖尿病(Ib型)、成人隱匿遲發性自體免疫糖尿病(LADA)、早發型2型糖尿病(EOD)、青年發作之非常型糖尿病(YOAD)、青少年發病的成年型糖尿病(MODY)、營養不良相關糖尿病、妊娠期糖尿病、冠心病、缺血性中風、血管成形術後再狹窄、周邊血管疾病、間歇性跛行、心肌梗塞、血脂異常、餐後脂血症、葡萄糖耐受異常病狀(IGT)、空腹血漿葡萄糖異常病狀、代謝性酸中毒、酮症、關節炎、肥胖、骨質疏鬆、高血壓、充血性心臟衰竭、左心室肥大、周邊動脈疾病、糖尿病性視網膜病變、黃斑變性、白內障、糖尿病腎病變、腎小球硬化、慢性腎衰竭、糖尿病神經病變、代謝症候群、症候群X、經前症候群、心絞痛、血栓、動脈粥樣硬化、暫時性腦缺血、中風、血管再狹窄、高血糖症、高胰島素血症、高三酸甘油酯血症、抗胰島素症、葡萄糖代謝減弱、勃起功能障礙、皮膚及結締組織病症、足部潰瘍及潰瘍性結腸炎、內皮細胞功能不良及血管順應性減弱、超apo B脂蛋白血症、阿茲海默氏症(Alzheimer's)、精神分裂症、認知障礙、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)及腸躁症候群、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，該方法包含以下步驟：向有需要之患者，向需要此類治療之人類投與治療有效量之如前述技術方案中任一者之組合物。
在一些實施例中，本發明係關於：一種用於治療人類之脂肪肝、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝纖維化之非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝硬化之非酒精性脂肪變性肝炎或伴隨肝硬化及肝細胞癌之非酒精性脂肪變性肝炎的方法，該方法包含以下步驟：向需要此類治療之人類投與治療有效量之兩種獨立醫藥組合物，該等醫藥組合物包含 a. 如前述技術方案中任一者之第一組合物；及 b. 第二組合物，其包含選自由消炎劑、抗糖尿病劑及膽固醇/脂質調節劑組成之群之至少一種其他藥劑及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，該第一組合物及該第二組合物同時投與。
在一些實施例中，該第一組合物及該第二組合物依序且以任何次序投與。
在一些實施例中，本發明係關於：一種用於降低人類門脈高壓、肝蛋白合成能力、高膽紅素血症或腦病之方法，該方法包含以下步驟：向有需要之患者，向需要此類治療之人類投與治療有效量之如前述技術方案中任一者之組合物。
在一些實施例中，本發明係關於：一種降低細胞中PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、活性及/或含量之方法，該方法包含以下步驟：使該細胞與如前述技術方案中任一者之化合物或組合物接觸。
在一些實施例中，本發明係關於：一種降低患者中PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、活性及/或含量之方法，該方法包含以下步驟：使細胞與如前述技術方案中任一者之化合物或組合物接觸。
在一些實施例中，如本文中所用之術語GalNAc係指在結構上類似於GalNAc及/或執行GalNAc之至少一個功能(例如，結合於ASPGR)的化學個體。
在一些實施例中，單股RNAi劑之5'端包含GalNAc或其變異型或衍生物。
下方展示PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑之5'端處之GalNAc部分(例如，5' GalNAc部分)的非限制性實例，其中5'端結構由以下表示：。
在一些實施例中，GalNAc部分，例如GalNAc或其變異型或衍生物，描述於以下文獻中之任一者中：Migawa等人2016 Bioorg. Med. Chem. Lett. 26: 2914-7；Ostergaard等人2015 Bioconjug. Chem. 26: 1451-1455；Prakash等人2014 Nucl. Acids Res. 42: 8796-8807；Prakash等人2016 J. Med. Chem. 59: 2718-33；Shemesh等人2016 Mol. Ther. Nucl. Acids 5: e319；St-Pierre等人2016 Bioorg. Med. Chem. 24: 2397-409；及/或Yu等人2016 Mol. Ther. Nucl. Acids 5: e317。
在一些實施例中，與PNPLA3寡核苷酸結合之化學部分(例如，另一組分)結合於ASPGR。
在一些實施例中，與PNPLA3寡核苷酸結合之化學部分(例如，另一組分)結合於ASPGR且包含以下中之任一者：Mod031、Mod034、Mod035、Mod036、Mod038、Mod039、Mod040或Mod041。
在一些實施例中，另一組分可為或包含以下中之任一者：Mod079、Mod080、Mod081、Mod082或Mod083。在一些實施例中，另一組分可為或包含以下中之任一者： Mod059：Mod060：Mod065：Mod070：Mod071：Mod072：Mod073：Mod074：Mod075：Mod076：Mod077：Mod084：Mod085：Mod087：Mod088：或Mod089：。
在一些實施例中，另一組分可為或包含： Mod061：其中Mod061與三個相同或不相同的寡核苷酸結合。
PNPLA3 寡核苷酸之 5 ' 核苷或 5 ' 核苷酸
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠藉由在連結至靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何5'核苷或5'核苷酸。
在一些實施例中，單股RNAi劑之(例如N1中之) 5'核苷(例如，5'端處之核苷)可為此項技術中已知之任何核苷、經修飾之核苷或通用核苷。
在一些實施例中，單股RNAi劑之(例如N1中之)5'核苷酸(例如，5'端處之核苷)可在鹼基處包含2'修飾。
在一些實施例中，單股RNAi劑之5'端處之(例如N1中之)核苷可包含2'-去氧(DNA)、2'-F、2'-OMe或2'-MOE，或反式核苷或核苷酸。
ssRNAi劑之5'端處之核苷為2'-去氧(DNA)的ssRNAi劑型式之非限制性實例包括：圖1之型式1至5、16至18、22至29、32至78、84至93、97及103至107。
ssRNAi劑之5'端處之核苷為2'-F的ssRNAi劑型式之非限制性實例包括：圖1之型式11至15、19、79至83及98至100。
ssRNAi劑之5'端處之核苷為2'-OMe的ssRNAi劑型式之非限制性實例包括：圖1之型式6至10、20至21、30至31、94至96及101至102。
在一些實施例中，單股RNAi劑之5'端處之(例如N1中之)核鹼基為T。在一些實施例中，單股RNAi劑之5'端處之(例如N1中之)核鹼基為U。在一些實施例中，單股RNAi劑之5'端處之(例如N1中之)核鹼基為A。在一些實施例中，單股RNAi劑之5'端處之(例如N1中之)核鹼基為G。在一些實施例中，單股RNAi劑之5'端處之(例如N1中之)核鹼基為C。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑具有5'錯配，其中單股RNAi劑之5'端處之核鹼基(位置N1)與靶轉錄物之對應位置之間具有錯配。如此項技術中已報導，有效雙股siRNA不需要5'核苷酸部分與靶轉錄物之對應位置之間的互補性。本文中描述之各種實例單股RNAi劑亦具有5'錯配且仍能夠導引RNA干擾。已構築出在5'位置(N1)處與標靶mRNA之序列具有錯配的有效ssRNAi劑。已構築出在5'位置處與標靶mRNA之序列具有錯配之有效ssRNAi劑，且該ssRNAi之N1位置為T。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑在N1處具有5'錯配，其中N1中之核鹼基為T。
在一些實施例中，5'位置處之核苷為LNA。
在一些實施例中，5'位置處之核苷為5'-H (去氧)。已構築出5'位置處之核苷為5'-H (去氧)之有效ssRNAi劑。在一些實施例中，5'位置處之核苷為去氧T、A、G或C。在一些實施例中，5'位置處之核苷為去氧T。在一些實施例中，5'位置處之核苷為去氧A。在一些實施例中，5'位置處之核苷為2'-F。已構築出5'位置處之核苷為2'-F之有效ssRNAi劑。在一些實施例中，5'位置處之核苷為2'-FA。在一些實施例中，5'位置處之核苷為2'-FG。在一些實施例中，5'位置處之核苷為2'-OMe。已構築出5'位置處之核苷為2'-OMe之有效ssRNAi劑。在一些實施例中，5'位置處之核苷為2'-OMe U。在一些實施例中，5'位置處之核苷為2'-OMe A。在一些實施例中，5'位置處之核苷為2'-OMe C。
包括單股 RNAi 劑之 PNPLA3 寡核苷酸的種子區域
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何種子區域或其部分或結構要素。
在一些實施例中，所提供單股RNAi劑之種子區域為RNAi劑之一部分，其在將RNAi劑結合至轉錄物標靶方面尤其重要。Lim等人2005 Nature 433: 769-773。據報導，在多數情況下，高RNAi活性要求RNAi劑反義股之種子區域與mRNA標靶之間的完全互補性。舉例而言，據報導，種子區域中位置6處之單一錯配消除雙股RNAi活性；Lim等人2005 Nature 433: 769-773。相反，據報導，dsRNAi反義股更易受種子區域外部之錯配影響，例如5'位置處、種子後區域中以及3'端二核苷酸中之錯配。
在一些實施例中，種子區域中的各核苷酸為2'-OMe。
在一些實施例中，種子區域中的各核苷酸為2'-OMe，且種子後區域中的各核苷酸為2'-OMe。
在一些實施例中，種子區域中的一個核苷酸為2'-F，且種子區域中的各其他核苷酸為2'-OMe。
在一些實施例中，種子區域中的一個核苷酸為2'-F及種子區域中的各其他核苷酸為2'-OMe，且種子後區域中的一個核苷酸為2'-F及種子後區域中的各其他核苷酸為2'-OMe。
在一些實施例中，位置2 (自5'端計數)處之核苷酸為2'-F及種子區域中的各其他核苷酸為2'-OMe，且種子後區域中的一個核苷酸為2'-F及種子後區域中的各其他核苷酸為2'-OMe。
在一些實施例中，位置2 (自5'端計數)處之核苷酸為2'-F及種子區域中的各其他核苷酸為2'-OMe，且位置14 (自5'端計數)處之核苷酸為2'-F及種子後區域中的各其他核苷酸為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中任何數目之N可為2'-去氧、2'-F、2'-OMe及/或2'-OH，及/或在糖之2'位置處具有任何其他修飾。
單股RNAi劑之種子區域之各種非限制性實例提供於表1A中、各圖中及本文中其他處。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個核苷酸獨立地為2'-F。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個核苷酸獨立地為2'-F。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個核苷酸獨立地為2'-F。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個核苷酸獨立地為2'-F。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何5個或更多個核苷酸獨立地為2'-F。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何6個或更多個核苷酸獨立地為2'-F。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個核苷酸獨立地為2'-OMe。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個核苷酸獨立地為2'-OMe。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個核苷酸獨立地為2'-OMe。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個核苷酸獨立地為2'-OMe。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何5個或更多個核苷酸獨立地為2'-OMe。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何6個或更多個核苷酸獨立地為2'-OMe。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中N2至N7中之7者獨立地為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個核苷酸獨立地為2'-MOE。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個核苷酸獨立地為2'-MOE。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個核苷酸獨立地為2'-MOE。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個核苷酸獨立地為2'-MOE。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何5個或更多個核苷酸獨立地為2'-MOE。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何6個或更多個核苷酸獨立地為2'-MOE。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中N2至N7中之7者獨立地為2'-MOE。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個核苷酸獨立地為2'-去氧。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個核苷酸獨立地為2'-去氧。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個核苷酸獨立地為2'-去氧。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個核苷酸獨立地為2'-去氧。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何5個或更多個核苷酸獨立地為2'-去氧。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何6個或更多個核苷酸獨立地為2'-去氧。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中N2至N7中之7者獨立地為2'-去氧。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個非連續核苷酸獨立地為2'-F。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個非連續核苷酸獨立地為2'-F。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個非連續核苷酸獨立地為2'-F。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個非連續核苷酸獨立地為2'-F。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個非連續核苷酸獨立地為2'-OMe。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個非連續核苷酸獨立地為2'-OMe。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個非連續核苷酸獨立地為2'-OMe。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個非連續核苷酸獨立地為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個非連續核苷酸獨立地為2'-MOE。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個非連續核苷酸獨立地為2'-MOE。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個非連續核苷酸獨立地為2'-MOE。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個非連續核苷酸獨立地為2'-MOE。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個非連續核苷酸獨立地為2'-去氧。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個非連續核苷酸獨立地為2'-去氧。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個非連續核苷酸獨立地為2'-去氧。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個非連續核苷酸獨立地為2'-去氧。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個核苷酸獨立地為2'-去氧。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個核苷酸間鍵聯獨立地為PO (磷酸二酯)。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為PO。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為PO。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為PO。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何5個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為PO。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何6個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為PO。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中N2至N7中之7者獨立地為PO。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個核苷酸間鍵聯獨立地為PS (硫代磷酸酯)。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為PS。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為PS。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為PS。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何5個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為PS。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何6個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為PS。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中N2至N7中之7者獨立地為PS。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個核苷酸間鍵聯獨立地為Sp (呈Sp組態之硫代磷酸酯)。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為Sp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為Sp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為Sp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何5個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為Sp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何6個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為Sp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中N2至N7中之7者獨立地為Sp。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個核苷酸間鍵聯獨立地為Rp (呈Rp組態之硫代磷酸酯)。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為Rp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為Rp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為Rp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何5個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為Rp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何6個或更多個核苷酸間鍵聯獨立地為Rp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中N2至N7中之7者獨立地為Rp。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為PO。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為PO。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為PO。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為PO。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為Sp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為Sp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為Sp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為Sp。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為Rp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為Rp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為Rp。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為Rp。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何一或多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為PS。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何2個或更多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為PS。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何3個或更多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為PS。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域中之任何4個或更多個非連續核苷酸間鍵聯獨立地為PS。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含圖1中展示之任何單股RNAi型式之種子區域中的核苷酸之2'修飾模式。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：fmfmfm，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：fmfmfmf，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfmfmf，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：fmfmf，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfmfmf，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfmfm，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfmfmfm，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：fmfmf，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfmfmfm，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfMfmf，其中f為2'-F，m為2'-OMe，且M為2'-MOE。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfMfmfm，其中f為2'-F，m為2'-OMe，且M為2'-MOE。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfMfm，其中f為2'-F，m為2'-OMe，且M為2'-MOE。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfMf，其中f為2'-F，m為2'-OMe，且M為2'-MOE。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfmfMf，其中f為2'-F，m為2'-OMe，且M為2'-MOE。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfmfMfm，其中f為2'-F，m為2'-OMe，且M為2'-MOE。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfmfM，其中f為2'-F，m為2'-OMe，且M為2'-MOE。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfMfMf，其中f為2'-F，m為2'-OMe，且M為2'-MOE。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfMfMfM，其中f為2'-F，m為2'-OMe，且M為2'-MOE。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfMfM，其中f為2'-F，m為2'-OMe，且M為2'-MOE。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：fdfdfd，其中d為2'-去氧，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：fdfdfdf，其中d為2'-去氧，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：dfdfdf，其中d為2'-去氧，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：fdfdf，其中d為2'-去氧，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：ffmmmm，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：fmmmm，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：ffmmm，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：ffmm，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：ffmmmmmm，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：ffmmmmm，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該核苷酸之2'修飾模式包含：mmmm，其中m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mmmmm，其中m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該核苷酸之2'修飾模式包含：mmmmmm，其中m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸之2'修飾模式包含：mfmfm，其中f為2'-F，且m為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含圖1中展示之任何單股RNAi型式之種子區域中的核苷酸間鍵聯模式。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：XOXOXO，其中X為硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：XOXOXOX，其中X為硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：OXOXOX，其中X為硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：XOXOX，其中X為硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：OXOXOX，其中X為硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：OXOXOXO，其中X為硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：OXOXO，其中X為硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：OXOX，其中X為硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：XXOXOX，其中X為硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：XXOXOXO，其中X為硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：XXOXO，其中X為硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：XXOX，其中X為硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：OOOOOO，其中O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：OOOOO，其中O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：OOOO，其中O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：SOSOSO，其中S為呈Sp組態的硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：SOSOSOS，其中S為呈Sp組態的硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：OSOSOS，其中S為呈Sp組態的硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域包含呈Sp組態的硫代磷酸酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中該種子區域包含呈Sp組態的硫代磷酸酯及磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：SOSOS，其中S為呈Sp組態的硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：SOSSSS，其中S為呈Sp組態的硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：SOSSS，其中S為呈Sp組態的硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含：SOSS，其中S為呈Sp組態的硫代磷酸酯，且O為磷酸二酯。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含圖1所示之第一單股RNAi型式之種子區域中的核苷酸間鍵聯模式；且核苷酸之2'修飾模式包含圖1所示之第二單股RNAi型式之種子區域中的核苷酸之2'修飾模式。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含種子區域，其中核苷酸間鍵聯模式包含圖1所示之第一單股RNAi型式之種子區域中的核苷酸間鍵聯模式；且核苷酸之2'修飾模式包含圖1所示之第一單股RNAi型式之種子區域中的核苷酸之2'修飾模式。
包括單股 RNAi 劑 之 PNPLA3 寡核苷酸的種子後區域
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾的PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知的任何種子後區域或其部分或結構要素。
在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：包含至少1個2'-F修飾的核苷酸序列。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：包含至少2至20個2'-F修飾的核苷酸序列。
在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：包含至少1個2'-OMe修飾的核苷酸序列。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：包含至少2至20個2'-OMe修飾的核苷酸序列。
在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：包含至少1個完整2'-OMe和/或2'-F修飾的核苷酸序列。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：包含至少2至20個完整2'-OMe和/或2'-F修飾的核苷酸序列。
在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：至少2至10個具有2'-F及2'-OMe或2'-OMe及2'-F修飾的連續核苷酸對。
在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含交替2'修飾模式，其中該模式包含2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含交替2'修飾模式，其中該模式包含2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含交替2'修飾模式，其中該模式包含2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含交替2'修飾模式，其中該模式包含2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含交替2'修飾模式，其中該模式包含2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含交替2'修飾模式，其中該模式包含2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含交替2'修飾模式，其中該模式包含2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含交替2'修飾模式，其中該模式包含2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe、2'-F、2'-OMe。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含交替2'修飾模式，其中該模式包含fmfmfmfmfm。
在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含交替2'修飾模式，其中該模式包含mfmf、mfmfmf、mfmfmfmf、mfmfmfmfmf、mfmfmfmfmf、mfmfmfmfmfmf、mfmfmfmfmfmfmf、mfmfmfmfmfmfmfmf、mfmfmfmfmfmfmfmfmf，其中m為2'-OMe且f為2'-F。
在一些實施例中，種子區域中的各核苷酸為2'-OMe。
在一些實施例中，種子區域中的各核苷酸為2'-OMe，且種子後區域中的各核苷酸為2'-OMe。
在一些實施例中，種子區域中的一個核苷酸為2'-F，且種子區域中的各其他核苷酸為2'-OMe。
在一些實施例中，種子區域中的一個核苷酸為2'-F及種子區域中的各其他核苷酸為2'-OMe，且種子後區域中的一個核苷酸為2'-F及種子後區域中的各其他核苷酸為2'-OMe。
在一些實施例中，位置2 (自5'端計數)處之核苷酸為2'-F及種子區域中的各其他核苷酸為2'-OMe，且種子後區域中的一個核苷酸為2'-F及種子後區域中的各其他核苷酸為2'-OMe。
在一些實施例中，位置2 (自5'端計數)處之核苷酸為2'-F及種子區域中的各其他核苷酸為2'-OMe，且位置14 (自5'端計數)處之核苷酸為2'-F及種子後區域中的各其他核苷酸為2'-OMe。
不希望受任何特定理論束縛，本發明表明，在至少一些情況下，降低2'-F核苷酸之數目(例如，經2'-OMe、2'-去氧或並非2'-F之任何其他核苷酸置換)可以在降低與2'-F相關之潛在毒性的同時實現活體外效力且實現或提高穩定性。
在一些實施例中，種子後區域包含至少1、2、3、4、5、6、7、8或9個硫代磷酸酯和/或至少1、2、3、4、5、6、7、8或9個磷酸二酯核苷酸間鍵聯。
在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含一或多組連續硫代磷酸酯和/或一或多組連續磷酸二酯。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之修飾模式的一部分糖：mfmfmfmfmfmfm、mfmfmfmfmfm、mfmfmfmfm、mfmfmfm、mfmfm、mfm、fmfmfmfmfmfm、fmfmfmfmfm、fmfmfmfm、fmfmfm及fmfm，其中m為2'-OMe且f為2'-F。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之修飾模式的一部分糖：dddfdfdfdfdfd、dddfdfdfdfd、dddfdfdfd、dddfdfd及dddfd，其中d為2'-去氧且f為2'-F。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之修飾模式的一部分糖：dfdfdfdfdfdfd、fdfdfdfdfdfd及fdfdfdfdfd。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之修飾模式的一部分糖：fdfdfdfd、fdfdfd及fdfd。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：XOXOXOXOOOO、OXOXOXOOOO、XOXOXOXOOO、XOXOXOXOO、XOXOXOOOO、OXOXOXOO、XOXOXOOO、OXOXOOOO、OXOXOOO及XOXOOO，其中O為磷酸二酯且X為立體無規硫代磷酸酯。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有模式OOOOOOO的一部分核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：OOOOOO、OOOOO、OOOO及OOO。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：OOOOOOOOXXXXXX、OOOOOOOOXXXXX、OOOOOOOOXXXX、OOOOOOOOXXX、OOOOOOOOXX、OOOOOOOOX、OOOOOOOXXXXXX、OOOOOOXXXXXX、OOOOOXXXXXX、OOOOXXXXXX、OOOXXXXXX、OOXXXXXX、OXXXXXX、OOOOOOX、OOOOOX、OOOOX及OOOX。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：OOOOOOOXXXXX、OOOOOOOXXXX、OOOOOOOXXX、OOOOOOXXXXX、OOOOOOXXXX、OOOOOXXXXX、OOOOOXXXX、OOOOOXXX、OOOOXXXX、OOOOXXX、OOOXXXXX、OOOXXXX及OOOXXX。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含至少一個對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含至少一個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含為硫代磷酸酯的至少一個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含為呈Sp組態之硫代磷酸酯的至少一個對掌性受控核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含為呈Rp組態之硫代磷酸酯的至少一個對掌性受控核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：OSSSOSSSSSSSSSS、OSSSOSSSSSSSSS、OSSSOSSSSSSSS、OSSSOSSSSSSS、OSSSOSSSSSS、OSSSOSSSSS、OSSSOSSSS、OSSSOSSS、OSSSOSS、OSSSOS及OSSSO，其中O為磷酸二酯且S為呈Sp組態之硫代磷酸酯。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：OSOSOSOSSSSSSSS、OSOSOSOSSSSSSS、OSOSOSOSSSSSS、OSOSOSOSSSSS、OSOSOSOSSSS、OSOSOSOSSS及OSOSOSOSS。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：SOSOSOSSSSSSSS、OSOSOSSSSSSSS、SOSOSSSSSSSS、OSOSSSSSSSS、SOSSSSSSSS及OSSSSSSSS。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：SOSOSOSSSSSSSS、SOSOSOSSSSSSS、SOSOSOSSSSSS、SOSOSOSSSSS、SOSOSOSSSS、SOSOSOSSS、SSSSSSSS、SSSSSSS、SSSSSS、SSSSS、SSSS、SSS及SS。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：OSSSSSO、OSSSSS、OSSSS、SSSSSO、SSSSO及SSSO。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：SOSOSOSOSOOOOOOS、SOSOSOSOSOOOOOO、SOSOSOSOSOOOOO、SOSOSOSOSOOOO、SOSOSOSOSOOO及SOSOSOSOSOO。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：OSOSOSOSOOOOOOS、SOSOSOSOOOOOOS、OSOSOSOOOOOOS、SOSOSOOOOOOS、OSOSOOOOOOS、SOSOOOOOOS及OSOOOOOOS。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：XOOOXOOXXXX、XOOOXOOXXXX、XOOOXOOXXX、XOOOXOOXX、XOOOXOOX、XOOOXOO、OOOXOOXXXXX、OOXOOXXXXX、OXOOXXXXX、XOOXXXXX及OOXXXXX。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：XOXOXOXXXXXX、XOXOXOXXXXX、XOXOXOXXXX、XOXOXOXXX、XOXOXOXX、XOXOXOX、OXOXOXXXXXX、XOXOXXXXXX、OXOXXXXXX、XOXXXXXX及OXXXXXX。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：XXXOOOXOXOXXX、XXXOOOXOXOXX、XXXOOOXOXOX、XXXOOOXOXO、XXXOOOXOX、XXXOOOXO、XXOOOXOXOXXX、XOOOXOXOXXX、OOOXOXOXXX、OOXOXOXXX、OXOXOXXX、XOXOXXX、XXOOOXOXOXX、XXOOOXOXOX、XOOOXOXOXX及XOOOXOXOX。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：XOOOXOXO、XOOOXOX、XOOOXO、OOOXOXO、OOOXOX及OOOXO。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：XOXOOOXOXOXXX、XOXOOOXOXOXX、XOXOOOXOXOX、XOXOOOXOXO、XOXOOOXOX、XOXOOOXO、XOXOOOX、OXOOOXOXOXXX、XOOOXOXOXXX、OOOXOXOXXX、OOXOXOXXX、OXOXOXXX、OXOOOXOXOXX、OXOOOXOXOX、XOOOXOXOXX及XOOOXOXOX。
在一些實施例中，單股RNAi劑包含種子後區域，其包含具有以下中之任一者之模式的一部分核苷酸間鍵聯：OOOOOOS、OOOOOSO、OOOOSOO、OOOSOOO OOSOOOO、OSOOOOO及SOOOOOO。
在一些實施例中，雜交寡核苷酸包含：(a)能夠連結至第一互補標靶mRNA區域之種子區域；以及(b)包含2'-去氧區域之種子後區域，其中雜交寡核苷酸能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者，其中2'-去氧區域包含至少5個連續2'-去氧。在一些實施例中，2'-去氧可為DNA或經修飾核苷酸，例如具有2'-去氧之經修飾核苷酸，其中DNA或經修飾核苷酸包含天然糖和/或天然鹼基、和/或經修飾鹼基、和/或任何核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，2'-去氧區域包含一連串連續核苷酸，其中各核苷酸為2'-去氧，且各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯。在一些實施例中，2'-去氧區域包含具有至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個核苷酸的一連串連續核苷酸，其中各核苷酸為2'-去氧，且各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯。
作為單股RNAi劑中的種子後區域之非限制性實例：型式2、7、8、9、12及13 (其各自包含：一組6個連續磷酸二酯；以及一組6個連續二硫代磷酸酯)；型式3 (6個連續二硫代磷酸酯)；型式4、5及6；型式10及11；以及本文中所揭示之各種其他單股RNAi劑。
在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含最3'位置處的錯配。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑可包含在以下中之任一者或多者處的錯配：5'位置，任一或兩個3'端二核苷酸，及種子區域與3'端區域之間的區域之最3'位置。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾的PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知的任何種子後區域或其部分或結構要素。
包括單股 RNAi 劑 之 PNPLA3 寡核苷酸的 3 ' 端區域
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠藉由在連結至靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何3'端區域。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸之3'端區域使得寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。
在一些實施例中，RNAi劑之3'端區域使得RNAi劑能夠以序列特異性方式導引特定靶轉錄物之RNA干擾。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾的PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知的任何3'端區域及/或3'端二核苷酸及/或3'端帽。在一些實施例中，3'端區域可包含GalNAc部分。在一些實施例中，GalNAc部分為如本文中所描述或此項技術中已知之任何GalNAc，或其變異體、衍生物或修飾。
在一些實施例中，3'端區域及/或3'端二核苷酸及/或3'端帽執行兩個功能：(a)降低寡核苷酸對核酸外切酶及/或核酸內切酶之敏感度；以及(b)允許寡核苷酸之功能，其中該功能為導引RNA干擾、導引RNase H介導之減量或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者。
因此，單股RNAi劑之3'端區域可包含3'端二核苷酸及/或3'端帽。
據報導，在哺乳動物細胞中，Dicer將雙股RNA (dsRNA)處理成19至23鹼基對siRNA，其包含各股封端於單股3'懸垂物中的雙股區域，各股可為1至4 nt長，但通常為3'端二核苷酸。Bernstein等人 2001 Nature 409: 363；Elbashir等人 2001 Nature 411: 494-498；Elbashir等人 2001 EMBO J. 20: 6877。據報導，兩個二核苷酸懸垂物並不促成靶特異性。然而，據報導，其確實幫助保護siRNA之末端免受核酸酶降解且有時改良活性。Elbashir等人 2001 Nature 411: 494-498；Elbashir等人 2001 EMBO J. 20: 6877-6888；及Kraynack等人 2006 RNA 12:163-176。因此，據報導，功能性雙股RNAi劑之3'端二核苷酸無需包含與靶基因序列互補的序列。
據報導，在人工雙股RNAi劑中，3'單股二核苷酸懸垂物已以實驗方式經各種部分(包括其他單股二核苷酸、核苷酸及3'端蓋)置換。據報導，為21 mer之3'端二核苷酸通常經人工二核苷酸(諸如UU、TT、dTdT、sdT、dTsdT、sdTsdT或sdTdT)置換。據報導，用去氧核糖核苷酸置換siRNA之各端上的至多四個核苷酸係可以接受的，然而經去氧核糖核苷酸完全取代導致無RNAi活性。國際PCT公開案第WO 00/44914號及Beach等人的國際PCT公開案第WO 01/68836號初步報導，siRNA可包括對磷酸酯-糖主鏈或核苷之修飾，以便包括氮或硫雜原子中之至少一者。Kreutzer等人的加拿大專利申請案第2,359,180號亦報導用於dsRNA構築體以便抵抗雙股RNA依賴性蛋白激酶PKR之活化的某些化學修飾，特定言之2'胺基或2-O-甲基核苷酸，及含有2'-O或4'-C亞甲基橋鍵之核苷酸。其他3'端核苷酸懸垂物包括dT (去氧胸苷)、2'-O、4'-C-乙烯胸苷(eT)及磷酸2-羥基乙酯(hp)。其他人工3'懸垂物(3'端二核苷酸)包括序列AA、CC、GG及UG之二核苷酸。Elbashir等人 2001 EMBO J. 20: 6877-6888。據報導，在一些實施例中，3'端二核苷酸為AA。
或者，據報導，在雙股RNAi劑中，3'端二核苷酸中之一或兩者可刪除(且未經置換)，使得功能性siRNA包含形成19-bp鈍端雙螺旋體的兩個19-nt股。據報導，刪除及不置換雙股RNAi劑中的3'端二核苷酸使得股之末端易受核酸酶損壞；為了對此進行補償，可添加人工3'端帽。據報導，3'端蓋為非核苷酸；其不為核苷酸，因為其並不包含核苷酸之所有組分(磷酸酯、糖及鹼基)。據報導，雙股RNAi劑中的二核苷酸懸垂物有時在功能上可由3'端帽替代，使得鈍端19-bp雙螺旋體具有可保護分子免受核酸酶影響的一或兩個3'端帽。一般而言，據報導，3'端帽不可以阻礙RNAi劑介導之RNA干擾；許多3'端帽亦賦予額外的優勢，諸如提高的RNAi活性及/或抵抗核酸酶之穩定性。
不希望受任何特定理論束縛，本申請案指出，據報導，在至少一些情況下，先前描述之3'端帽經理論化與PAZ域相互作用。據報導，在一些實施例中，3'端帽為PAZ配體。WO 2015/051366。據報導，Dicer為RNase III酶且由六個可識別域構成。據報導，N端處或附近為大約550 aa之DExH-box RNA解螺旋酶域，其後緊隨被稱作DUF283的大約100 aa之保守域；僅DUF283域之C端為PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille)域，該PAZ域識別單股二核苷酸懸垂物。Myers等人 2005. RNA interference Technology, Appasani編, Cambridge University Press, Cambridge UK,第29-54頁；Bernstein等人 2001 Nature 409: 363-366；及Schauer等人 2002 Trends Plant Sci. 7: 487-491；Lingel等人 2003 Nature 426: 465-469；Song等人 2003 Nature Struct. Biol. 10: 1026-1032；Yan等人 2003 Nature 426: 468-474；Lingel等人 2004 Nature Struct. Mol. Biol. 1 1 : 576-577；Ma等人 2004 Nature 429: 318-322。據報導，Dicer中的PAZ域亦可結合RNA以定位用於裂解在催化域。Zhang等人 2004 Cell 1 18: 57-68。在一些實施例中，3'端帽為與PAZ域相互作用的PAZ配體。
在一些實施例中，3'端帽可實現兩個功能：(1)允許RNA干擾；以及(2)提高活性及/或生物半衰期之持續時間，其可例如藉由增加與Dicer之PAZ域的結合及/或減少或預防RNAi劑之降解(例如，藉由核酸酶，諸如血清或腸液)實現。
各種3'端二核苷酸描述於表1A中所列之寡核苷酸中。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含一對3'端核苷酸。倒數第二個核苷酸為2'-OMe，且5'核苷酸為2'-OMe。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含一對3'端核苷酸，且倒數第二個核苷酸為2'-去氧，且5'核苷酸為2'-OMe。具有此結構的本文中所揭示之單股RNAi劑之非限制性實例包括：型式10、11、13及14，圖1；以及本文中所揭示之各種其他單股RNAi劑。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含一對3'端核苷酸，且倒數第二個核苷酸為2'-去氧，且5'核苷酸為2'-OMe，且其中倒數第二個核苷酸包含連接基團。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含一對3'端核苷酸，且其中倒數第二個核苷酸包含連接基團。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含一對3'端核苷酸，且倒數第二個核苷酸為2'-去氧，且5'核苷酸為2'-OMe，且其中倒數第二個核苷酸包含與另一化學部分結合之連接基團。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含一對3'端核苷酸，且倒數第二個核苷酸為2'-去氧T，且5'核苷酸為2'-OMe U，且其中倒數第二個核苷酸包含與另一化學部分結合之連接基團。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含一對3'端核苷酸，且其中倒數第二個核苷酸包含與選自以下之另一化學部分結合的連接基團：靶向部分、脂質部分、碳水化合物部分、雙環縮酮及GalNAc部分。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含一對3'端核苷酸，且倒數第二個核苷酸為2'-去氧，且5'核苷酸為2'-OMe，且其中倒數第二個核苷酸包含與選自以下之另一化學部分結合的連接基團：靶向部分、脂質部分、碳水化合物部分、雙環縮酮及GalNAc部分。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含一對3'端核苷酸，且倒數第二個核苷酸為2'-去氧T，且5'核苷酸為2'-OMe U，且其中倒數第二個核苷酸包含與選自以下之另一化學部分結合的連接基團：靶向部分、脂質部分、碳水化合物部分、雙環縮酮及GalNAc部分。
在一些實施例中，3'端區域或3'端帽包含GN3，或如以下中所描述之任何其他適合RNAi劑3'端區域化合物：例如Allerson等人 2005 J. Med. Chem. 48: 901-04；Lima等人 2012 Cell 150: 883-894；Prakash等人 2015 Nucl. Acids Res. 43: 2993-3011；及/或Prakash等人 2016 Bioorg. Med. Chem. Lett. 26: 26: 2817-2820。
各種3'端帽已描述於文獻中。
通常，3'端帽接合至3'端核苷酸間鍵聯。3'端核苷酸間鍵聯可選自：磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及本文中描述之任何核苷酸間鍵聯。
所提供之單股RNAi劑之3'端帽可選自例如本文中描述之任何3'端帽。
在一些實施例中，3'端帽係選自：2',3'-環狀磷酸酯、C3 (或C6、C7、C12)胺基連接基團、硫醇連接基團、羧基連接基團、非核苷酸間隔子(C3、C6、C9、C12、無鹼基、三甘醇、六甘醇)、生物素及螢光素。
在一些實施例中，3'端帽係選自描述於WO 2015/051366中之任何3'端帽，包括(但不限於)C3、胺基C3、C6、C8、C10及C12。在一些實施例中，3'端帽係選自：三甘醇、環己基(或Cyclohex)、苯基、BP (聯苯基)、金剛烷及石膽酸(或Lithochol)，如美國專利第8,097,716號、第8,084,600號、第8,344,128號、第8,404,831號及第8,404,832號中所描述。
適用於所提供之RNAi劑之各種功能性3'端帽描述於以下中：例如EP 1520022 B1；美國專利第8,097,716號、第8,084,600號、第8,404,831號、第8,404,832號及第8,344,128號；以及WO 2015/051366。
另外，本發明指出，本文中揭示各種5'端結構及3'端區域及其組合，其用於單股RNAi劑。然而，應注意，相比之下，已報導許多5'端結構及3'端帽及其組合降低或消除各種雙股RNAi劑之RNA干擾能力。參見例如Czauderna等人 2003 Nucl. Acids Res. 31 :2705-2716；Hadwiger等人 2005,第194-206頁, RNA interference Technology, K. Appasani編, Cambridge University Press, Cambridge, UK；Deleavey等人 2009 Curr. Prot. Nucl. Acid Chem. 16.3.1 -16.3.22；Terrazas等人 2009 Nucleic Acids Res. 37: 346-353；Harboth等人 2003 Antisense Nucl. Acid Drug Dev 13: 83-105；Song等人 2003 Nature Med. 9: 347-351；美國專利第5,998,203號；Lipardi等人 2001 Cell 107: 299-307；Schwarz等人 2002 Mol. Cell 10: 537-548；及WO 2015/051366。
雙環縮酮，PNPLA3 寡核苷酸之其他視情況存在之結構要素
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量之降低的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何結構要素或其模式。
雙環縮酮，與 PNPLA3 寡核苷酸結合之視情況存在之另一化學部分
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠藉由在連結至靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸可包含任何視情況存在之另一化學部分，包括(但不限於)本文中描述或此項技術中已知之靶向部分、脂質部分、碳水化合物部分、雙環縮酮、GalNAc部分等。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量之降低的PNPLA3寡核苷酸可包含任何視情況存在之另一化學部分，包括(但不限於)本文中描述或此項技術中已知之靶向部分、脂質部分、碳水化合物部分、雙環縮酮、GalNAc部分等。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含任何視情況存在之另一化學部分，包括(但不限於)本文中描述或此項技術中已知之靶向部分、脂質部分、碳水化合物部分、雙環縮酮、GalNAc部分等。
在一些實施例中，另一化學部分與單股RNAi劑結合。
與 PNPLA3 寡核苷酸結合之視情況存在之另一化學部分 ： 靶向部分
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物進一步包含靶向部分(例如，靶向化合物、藥劑、配體或組分)。靶向部分可與脂質或PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑結合或不與其結合。在一些實施例中，靶向部分與PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑結合。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑與脂質及靶向部分兩者結合。如本文中所描述，在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑為所提供之寡核苷酸。因此，在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物除脂質及寡核苷酸之外，進一步包含靶元件。可根據本發明使用各種靶向部分，例如脂質、抗體、肽、碳水化合物等。
靶向部分可經由根據本發明之多種方法併入所提供之技術中。在一些實施例中，靶向部分以物理方式與所提供之寡核苷酸混合，以形成所提供之組合物。在一些實施例中，靶向部分以化學方式與寡核苷酸結合。
在一些實施例中，所提供之組合物包含兩個或更多個靶向部分。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含兩個或更多個結合靶向部分。在一些實施例中，兩個或更多個結合靶向部分相同。在一些實施例中，兩個或更多個結合靶向部分不同。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含不超過一個靶組分。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸包含不同類型的結合靶向部分。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸包含相同類型之靶向部分。
在一些實施例中，所提供之組合物包含兩個或更多個靶向部分。在一些實施例中，能夠導引單股RNA干擾的所提供之寡核苷酸包含兩個或更多個結合靶向部分。在一些實施例中，兩個或更多個結合靶向部分相同。在一些實施例中，兩個或更多個結合靶向部分不同。在一些實施例中，能夠導引單股RNA干擾的所提供之寡核苷酸包含不超過一個靶組分。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸包含不同類型的結合靶向部分。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸包含相同類型之靶向部分。
靶向部分可視情況經由連接基團與寡核苷酸結合。根據本發明，可利用此項技術中各種類型之連接基團。在一些實施例中，連接基團包含磷酸酯基，其可例如用於經由類似於寡核苷酸合成中所採用之化學方法的化學方法結合靶向部分。在一些實施例中，連接基團包含醯胺、酯或醚基。在一些實施例中，連接基團具有-L-之結構。靶向部分可經由與脂質相同或不同之連接基團結合。
視情況經由連接基團，脂質可在各種適合位置與寡核苷酸結合。在一些實施例中，靶向部分經由5'-OH基團結合。在一些實施例中，靶向部分經由3'-OH基團結合。在一些實施例中，靶向部分經由一或多個糖部分結合。在一些實施例中，靶向部分經由一或多個鹼基結合。在一些實施例中，靶向部分經由一或多個核苷酸間鍵聯併入。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸可含有多個結合靶向部分，其獨立地經由其5'-OH、3'-OH、糖部分、鹼基部分及/或核苷酸間鍵聯結合。靶向部分及脂質可在相同、相鄰及/或間隔開的位置結合。在一些實施例中，靶組分在PNPLA3寡核苷酸之一端結合，且脂質在另一端結合。
在一些實施例中，所提供之組合物進一步包含靶向組分或部分。靶向組分可併入(靶向部分)或不併入PNPLA3寡核苷酸中。在一些實施例中，靶向組分為脂質。在一些實施例中，靶向組分為碳水化合物或雙環縮酮。在一些實施例中，靶向組分為如本發明中所描述之−RLD 。在一些實施例中，靶向組分為如本發明中所描述之−RCD 。
靶向組分可經由根據本發明之多種方法(例如針對脂質及碳水化合物所描述之彼等方法)併入所提供之技術中。在一些實施例中，靶向組分以物理方式與所提供之寡核苷酸混合，以形成所提供之組合物。在一些實施例中，靶向組分以化學方式與寡核苷酸部分結合。
在一些實施例中，所提供之組合物包含兩個或更多個靶向組分。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含兩個或更多個結合靶向組分。在一些實施例中，兩個或更多個結合靶向組分相同。在一些實施例中，兩個或更多個結合靶向組分不同。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含不超過一個靶向組分。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸包含不同類型的結合靶向組分。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸包含相同類型之靶向組分。
靶向組分可例如如針對脂質及碳水化合物所描述視情況經由連接基團與寡核苷酸結合。根據本發明，可利用此項技術中各種類型之連接基團。在一些實施例中，連接基團包含磷酸酯基，其可例如用於經由類似於寡核苷酸合成中所採用之化學方法的化學方法結合靶向組分。在一些實施例中，連接基團包含醯胺、酯或醚基。在一些實施例中，連接基團具有-L-之結構。靶向組分可經由與脂質相同或不同之連接基團結合。
視情況經由連接基團，靶向組分可在各種適合位置與寡核苷酸結合。在一些實施例中，靶向組分經由5'-OH基團結合。在一些實施例中，靶向組分經由3'-OH基團結合。在一些實施例中，靶向組分經由一或多個糖部分結合。在一些實施例中，靶向組分經由一或多個鹼基結合。在一些實施例中，靶向組分經由一或多個核苷酸間鍵聯併入。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸可含有多個結合靶向組分，其獨立地經由其5'-OH、3'-OH、糖部分、鹼基部分及/或核苷酸間鍵聯結合。靶向組分及脂質可在相同、相鄰及/或間隔開的位置結合。在一些實施例中，靶向組分在PNPLA3寡核苷酸之一端結合，且脂質在另一端結合。
在一些實施例中，靶向組分與目標細胞表面上之蛋白質相互作用。在一些實施例中，該等相互作用有助於至目標細胞中之內化。在一些實施例中，靶向組分包含糖部分。在一些實施例中，靶向組分包含多肽部分。在一些實施例中，靶向組分包含抗體。在一些實施例中，靶向組分為抗體。在一些實施例中，靶向組分包含抑制劑。在一些實施例中，靶向組分為小分子抑制劑之部分。在一些實施例中，抑制劑為目標細胞表面上之蛋白質的抑制劑。在一些實施例中，抑制劑為碳酸酐酶抑制劑。在一些實施例中，抑制劑為靶細胞表面上表現之碳酸酐酶抑制劑。在一些實施例中，碳酸酐酶為I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV或XVI。在一些實施例中，碳酸酐酶經膜結合。在一些實施例中，碳酸酐酶為IV、IX、XII或XIV。在一些實施例中，抑制劑為IV、IX、XII及/或XIV。在一些實施例中，抑制劑為碳酸酐酶III抑制劑。在一些實施例中，抑制劑為碳酸酐酶IV抑制劑。在一些實施例中，抑制劑為碳酸酐酶IX抑制劑。在一些實施例中，抑制劑為碳酸酐酶XII抑制劑。在一些實施例中，抑制劑為碳酸酐酶XIV抑制劑。在一些實施例中，抑制劑包含或為磺醯胺(例如，Supuran, CT.Nature Rev Drug Discover 2008 ,7 , 168-181中所描述之彼等磺醯胺，該等磺醯胺以引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，抑制劑為磺醯胺。在一些實施例中，目標細胞為肌肉細胞。
在一些實施例中，靶向組分為RTD ，其中RTD 為如本發明中所描述之RLD 或RCD 。
在一些實施例中，靶向組分為如本發明中所定義及所描述之RLD 。在一些實施例中，本發明提供包含RLD 之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸組合物，其包含含有RLD 之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸組合物，其包含第一複數個包含RLD 之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供包含RLD 之寡核苷酸的對掌性受控寡核苷酸組合物。
在一些實施例中，靶向組分為如本發明中所定義及所描述之RCD 。在一些實施例中，本發明提供包含RCD 之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸組合物，其包含含有RCD 之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸組合物，其包含第一複數個包含RCD 之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供包含RCD 之寡核苷酸的對掌性受控寡核苷酸組合物。
在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 為包含或為脂質部分的靶向組分。在一些實施例中，X為O。在一些實施例中，X為S。
在一些實施例中，本發明提供用於將各種部分結合至寡核苷酸部分之技術(例如，試劑、方法等)。在一些實施例中，本發明提供用於將靶向組分結合至寡核苷酸部分之技術。在一些實施例中，本發明提供包含用於結合之靶向組分的酸，例如RLD -COOH。在一些實施例中，本發明提供用於結合之連接基團，例如LM 。一般熟習此項技術者理解，可利用許多已知且廣泛實踐的技術來與根據本發明之寡核苷酸部分結合。在一些實施例中，所提供之酸為。在一些實施例中，所提供之酸為。在一些實施例中，所提供之酸為。在一些實施例中，所提供之酸為。在一些實施例中，所提供之酸為脂肪酸，其可提供脂質部分作為靶向組分。在一些實施例中，本發明提供用於製備該等酸之方法及試劑。
在一些實施例中，靶向部分為脂質部分，例如膽固醇或其衍生物之部分(RTD −H為視情況經取代之膽固醇或其衍生物)。
在一些實施例中，靶向部分為肽。在一些實施例中，靶向部分為蛋白質或其域。在一些實施例中，靶向部分為抗體或其部分。
與 PNPLA3 寡核苷酸結合之視情況存在之其他化學部分 ： 脂質部分
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸或寡核苷酸組合物進一步包含一或多種脂質或脂質部分。在一些實施例中，脂質為脂質部分。在一些實施例中，脂質部分為或包含直接或間接地與PNPLA3寡核苷酸結合的脂質。在一些實施例中，脂質結合可達成一或多個出人意料之大大改良之特性(例如，活性、毒性、分佈、藥物動力學等)。如一般熟習此項技術者所瞭解，各種碳水化合物部分描述於文獻中且可根據本發明利用。
脂質部分可視情況經由一或多個二價或多價連接基團(其可用於將兩個或更多個碳水化合物部分連接至寡核苷酸)在各種位置(例如糖單元、核苷酸間鍵聯單元、核鹼基單元等)處併入寡核苷酸中。在一些實施例中，本發明提供用於脂質至寡核苷酸中之併入的技術。在一些實施例中，本發明提供作為核苷酸間鍵聯及/或糖單元處之併入之替代及/或添加視情況經由一或多個連接基團在核鹼基單元處併入脂質部分，從而提供巨大可撓性及/或改良特性及/或活性的技術。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含至少一個脂質部分，其視情況經由連接基團在核鹼基單元處併入寡核苷酸中。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸具有以下之結構： Ac −[−LM −(RD )a ]b ，或[(Ac )a −LM ]b −RD ， 其中： Ac 為PNPLA3寡核苷酸鏈([H]b −Ac 為PNPLA3寡核苷酸)； a為1至1000； b為1至1000； 各LM 獨立地為連接基團；且 各RD 獨立地為RLD 或RCD ， RCD 為選自以下之視情況經取代之直鏈或分支鏈基團：具有1至30個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的C1 - 100 脂族基及C1 - 100 雜脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經以下置換：C1 - 6 伸烷基、C1 - 6 伸烯基、、−C(R')2 −、−O−、−S−、−S−S−、−N(R')−、−C(O)−、−C(S)−、−C(NR')−、−C(O)N(R')−、−N(R')C(O)N(R')−、−N(R')C(O)O−、−S(O)−、−S(O)2 −、−S(O)2 N(R')−、−C(O)S−、−C(O)O−、−P(O)(OR')−、−P(O)(SR')−、−P(O)(R')−、−P(O)(NR')−、−P(S)(OR')−、−P(S)(SR')−、−P(S)(R')−、−P(S)(NR')−、−P(R')−、−P(OR')−、−P(SR')−、−P(NR')−、−P(OR')[B(R')3 ]−、−OP(O)(OR')O−、−OP(O)(SR')O−、−OP(O)(R')O−、−OP(O)(NR')O−、−OP(OR')O−、−OP(SR')O−、−OP(NR')O−、−OP(R')O−或−OP(OR')[B(R')3 ]O−；且一或多個碳原子視情況且獨立地經Cy置換； RLD 為選自C1 - 100 脂族基之視情況經取代之直鏈或分支鏈基團，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經以下置換：C1 - 6 伸烷基、C1 - 6 伸烯基、、−C(R')2 −、−O−、−S−、−S−S−、−N(R')−、−C(O)−、−C(S)−、−C(NR')−、−C(O)N(R')−、−N(R')C(O)N(R')−、−N(R')C(O)O−、−S(O)−、−S(O)2 −、−S(O)2 N(R')−、−C(O)S−、−C(O)O−、−P(O)(OR')−、−P(O)(SR')−、−P(O)(R')−、−P(O)(NR')−、−P(S)(OR')−、−P(S)(SR')−、−P(S)(R')−、−P(S)(NR')−、−P(R')−、−P(OR')−、−P(SR')−、−P(NR')−、−P(OR')[B(R')3 ]−、−OP(O)(OR')O−、−OP(O)(SR')O−、−OP(O)(R')O−、−OP(O)(NR')O−、−OP(OR')O−、−OP(SR')O−、−OP(NR')O−、−OP(R')O−或−OP(OR')[B(R')3 ]O−；且一或多個碳原子視情況且獨立地經Cy置換； LM 為共價鍵，或選自以下之二價或多價之視情況經取代之直鏈或分支鏈基團：具有1至30個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的C1 - 100 脂族基及C1 - 100 雜脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經以下置換：C1 - 6 伸烷基、C1 - 6 伸烯基、、−C(R')2 −、−O−、−S−、−S−S−、−N(R')−、−C(O)−、−C(S)−、−C(NR')−、−C(O)N(R')−、−N(R')C(O)N(R')−、−N(R')C(O)O−、−S(O)−、−S(O)2 −、−S(O)2 N(R')−、−C(O)S−、−C(O)O−、−P(O)(OR')−、−P(O)(SR')−、−P(O)(R')−、−P(O)(NR')−、−P(S)(OR')−、−P(S)(SR')−、−P(S)(R')−、−P(S)(NR')−、−P(R')−、−P(OR')−、−P(SR')−、−P(NR')−、−P(OR')[B(R')3 ]−、−OP(O)(OR')O−、−OP(O)(SR')O−、−OP(O)(R')O−、−OP(O)(NR')O−、−OP(OR')O−、−OP(SR')O−、−OP(NR')O−、−OP(R')O−或−OP(OR')[B(R')3 ]O−；且一或多個碳原子視情況且獨立地經CyL 置換； CyL 為選自以下之視情況經取代之四價基團：C3 - 20 環脂族環，C6 - 20 芳環，具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷及矽之雜原子的5員至20員雜芳基環，及具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的3員至20員雜環基環； 各R'獨立地為−R、−C(O)R、−C(O)OR或−S(O)2 R；且 各R獨立地為−H，或選自以下之視情況經取代之基團：C1 - 30 脂族基，具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷及矽之雜原子的C1 - 30 雜脂族基，C6 - 30 芳基，C6 - 30 芳基脂肪族基，具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷及矽之雜原子的C6 - 30 芳基雜脂族基，具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷及矽之雜原子的5員至30員雜芳基，及具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷及矽之雜原子的3員至30員雜環基，或 兩個R基團視情況且獨立地一起形成共價鍵，或： 同一原子上之兩個或更多個R基團視情況且獨立地與該原子一起形成除該原子外還具有0至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷及矽之雜原子的視情況經取代之3員至30員單環、雙環或多環環；或 兩個或更多個原子上之兩個或更多個R基團視情況且獨立地與其插入原子一起形成除插入原子外還具有0至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷及矽之雜原子的視情況經取代之3員至30員單環、雙環或多環環。
在一些實施例中，RCD 為碳水化合物部分或雙環縮酮。在一些實施例中，RCD 包含至少一個單醣、雙醣或多醣單元。在一些實施例中，RCD 包含至少一個GalNAc部分或其衍生物。
在一些實施例中，RLD 為脂質部分。在一些實施例中，RLD 包含一或多個視情況經取代之C6 - 20 脂族鏈。在一些實施例中，RLD 包含一或多個未經取代之C6 - 20 脂族鏈。
在一些實施例中，至少一個LM 直接結合於所提供之寡核苷酸之糖單元。在一些實施例中，LM 直接結合於將脂質部分併入PNPLA3寡核苷酸中的糖單元。在一些實施例中，LM 直接結合於將碳水化合物部分併入PNPLA3寡核苷酸中的糖單元。在一些實施例中，LM 直接結合於將RLD 基團併入PNPLA3寡核苷酸中的糖單元。在一些實施例中，LM 直接結合於將RCD 基團併入PNPLA3寡核苷酸中的糖單元。
在一些實施例中，至少一個LM 直接結合於所提供之寡核苷酸之核苷酸間鍵聯單元。在一些實施例中，LM 直接結合於將脂質部分併入PNPLA3寡核苷酸中的核苷酸間鍵聯單元。在一些實施例中，LM 直接結合於將碳水化合物部分併入PNPLA3寡核苷酸中的核苷酸間鍵聯單元。在一些實施例中，LM 直接結合於將RLD 基團併入PNPLA3寡核苷酸中的核苷酸間鍵聯單元。在一些實施例中，LM 直接結合於將RCD 基團併入PNPLA3寡核苷酸中的核苷酸間鍵聯單元。
在一些實施例中，至少一個LM 直接結合於所提供之寡核苷酸之核鹼基單元。在一些實施例中，LM 直接結合於將脂質部分併入PNPLA3寡核苷酸中的核鹼基單元。在一些實施例中，LM 直接結合於將碳水化合物部分併入PNPLA3寡核苷酸中的核鹼基單元。在一些實施例中，LM 直接結合於將RLD 基團併入PNPLA3寡核苷酸中的核鹼基單元。在一些實施例中，LM 直接結合於將RCD 基團併入PNPLA3寡核苷酸中的核鹼基單元。
在一些實施例中，[H]b −Ac 為本發明中所描述之PNPLA3寡核苷酸。
在一些實施例中，脂質至所提供之寡核苷酸中之併入改良分佈及/或藥物動力學。在一些實施例中，脂質至所提供之寡核苷酸中之併入改良藥物動力學之一或多個選自以下之量測值：投與後藥物之峰值血漿濃度Cmax ；達到Cmax 之時間tmax ；在投與下一劑量之前藥物所達到的最低(谷值)濃度Cmin ；消除半衰期，即藥物濃度達到其初始值之一半所需的時間；消除速率常數，即藥物自體內去除之速率；曲線下面積，即濃度-時間曲線之積分(在單一劑量後或穩態時)；及清除率，即每單位時間清除藥物之血漿的體積。不受任何特定理論限制，本發明指出，諸如半衰期之藥物動力學特徵之最佳化可有別於最大化。在一些實施例中，一般而言，可能期望特定藥物之半衰期足以允許達成其所要功能之效能，但儘可能地短，以使脫靶效應及其他毒性降至最低。在一些實施例中，最佳化半衰期之長度足以允許在使毒性降至最低的同時具有活性；可不期望延長的或最大化的半衰期。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物進一步包含一或多種脂質。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物進一步包含一或多種脂肪酸。在一些實施例中，脂質可併入組合物中之所提供之寡核苷酸中。在一些實施例中，兩種或更多種相同或不同脂質可經由相同或不同化學方法及/或位置併入一個寡核苷酸中。
根據本發明，可在所提供之技術中利用多種脂質。在一些實施例中，脂質包含RLD 基團。在一些實施例中，RLD 為視情況經取代之C10 -C80 飽和或部分不飽和脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經選自以下的視情況經取代之基團置換：C1 -C6 伸烷基、C1 -C6 伸烯基、、C1 -C6 雜脂族部分、−C(R')2 -及-Cy-。在一些實施例中，RLD 為視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經選自以下的視情況經取代之基團置換：C1 -C6 伸烷基、C1 -C6 伸烯基、、C1 -C6 雜脂族部分、−C(R')2 -及-Cy-。在一些實施例中，RLD 為由碳原子及氫原子組成之烴基。在一些實施例中，−Cy−為選自以下之視情況經取代之二價基團：C3 - 20 環脂族環，C6 - 20 芳環，具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷及矽之雜原子的5員至20員雜芳基環，及具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的3員至20員雜環基環。
在一些實施例中，RLD 為視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經選自以下的視情況經取代之基團置換：C1 -C6 伸烷基、C1 -C6 伸烯基、、C1 -C6 雜脂族部分、−C(R')2 -及-Cy-。在一些實施例中，RLD 為視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經選自以下的視情況經取代之基團置換：C1 -C6 伸烷基、C1 -C6 伸烯基、、C1 -C6 雜脂族部分、−C(R')2 -及-Cy-。在一些實施例中，RLD 為由碳原子及氫原子組成之烴基。
在一些實施例中，RLD 為視情況經取代之C10 -C40 飽和或部分不飽和脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經選自以下之視情況經取代之基團置換：C1 -C6 伸烷基、C1 -C6 伸烯基、、C1 -C6 雜脂族部分、−C(R')2 -及-Cy-。在一些實施例中，RLD 為視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經選自以下的視情況經取代之基團置換：C1 -C6 伸烷基、C1 -C6 伸烯基、、C1 -C6 雜脂族部分、−C(R')2 -及-Cy-。在一些實施例中，RLD 為由碳原子及氫原子組成之烴基。
RLD 之脂族基可為各種適合長度。在一些實施例中，其為C10 -C80 。在一些實施例中，其為C10 -C75 。在一些實施例中，其為C10 -C70 。在一些實施例中，其為C10 -C65 。在一些實施例中，其為C10 -C60 。在一些實施例中，其為C10 -C50 。在一些實施例中，其為C10 -C40 。在一些實施例中，其為C10 -C35 。在一些實施例中，其為C10 -C30 。在一些實施例中，其為C10 -C25 。在一些實施例中，其為C10 -C24 。在一些實施例中，其為C10 -C23 。在一些實施例中，其為C10 -C22 。在一些實施例中，其為C10 -C21 。在一些實施例中，其為C12 -C22 。在一些實施例中，其為C13 -C22 。在一些實施例中，其為C14 -C22 。在一些實施例中，其為C15 -C22 。在一些實施例中，其為C16 -C22 。在一些實施例中，其為C17 -C22 。在一些實施例中，其為C18 -C22 。在一些實施例中，其為C10 -C20 。在一些實施例中，範圍之下限為C10 、C11 、C12 、C13 、C14 、C15 、C16 、C17 或C18 。在一些實施例中，範圍之上限為C18 、C19 、C20 、C21 、C22 、C23 、C24 、C25 、C26 、C27 、C28 、C29 、C30 、C35 、C40 、C45 、C50 、C55 或C60 。在一些實施例中，其為C10 。在一些實施例中，其為C11 。在一些實施例中，其為C12 。在一些實施例中，其為C13 。在一些實施例中，其為C14 。在一些實施例中，其為C15 。在一些實施例中，其為C16 。在一些實施例中，其為C17 。在一些實施例中，其為C18 。在一些實施例中，其為C19 。在一些實施例中，其為C20 。在一些實施例中，其為C21 。在一些實施例中，其為C22 。在一些實施例中，其為C23 。在一些實施例中，其為C24 。在一些實施例中，其為C25 。在一些實施例中，其為C30 。在一些實施例中，其為C35 。在一些實施例中，其為C40 。在一些實施例中，其為C45 。在一些實施例中，其為C50 。在一些實施例中，其為C55 。在一些實施例中，其為C60 。
在一些實施例中，脂質包含不超過一個RLD 基團。在一些實施例中，脂質包含兩個或更多個RLD 基團。
在一些實施例中，脂質以包含RLD 基團之部分之形式視情況經由連接基團與生物活性劑結合。在一些實施例中，脂質以包含不超過一個RLD 基團之部分之形式視情況經由連接基團與生物活性劑結合。在一些實施例中，脂質以RLD 基團之形式視情況經由連接基團與生物活性劑結合。在一些實施例中，脂質以包含兩個或更多個RLD 基團之部分之形式視情況經由連接基團與生物活性劑結合。
在一些實施例中，RLD 為視情況經取代之C10 -C40 飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C40 飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，RLD 為視情況經取代之C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，RLD 為視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為視情況經一或多個C1 - 2 脂族基取代的C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 2 脂族基取代的C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為視情況經一或多個甲基取代的C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個甲基取代的C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，RLD 為未經取代之C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含未經取代之C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含不超過一個視情況經取代之C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含兩個或更多個視情況經取代之C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，RLD 為視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，RLD 為視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，RLD 為視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為視情況經一或多個C1 - 2 脂族基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 2 脂族基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為視情況經一或多個甲基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個甲基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，RLD 為未經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含未經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含不超過一個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含兩個或更多個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，RLD 為視情況經取代之C10 -C80 飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C80 飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，RLD 為視情況經取代之C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，RLD 為視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為視情況經一或多個C1 - 2 脂族基取代的C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 2 脂族基取代的C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為視情況經一或多個甲基取代的C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個甲基取代的C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，RLD 為未經取代之C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含未經取代之C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含不超過一個視情況經取代之C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含兩個或更多個視情況經取代之C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，RLD 為或包含C10 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C10 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C11 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C11 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C12 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C12 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C13 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C13 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C14 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C14 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C15 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C15 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C16 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C16 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C17 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C17 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C18 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C18 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C19 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C19 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C20 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C20 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C21 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C21 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C22 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C22 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C23 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C23 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C24 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C24 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C25 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C25 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C26 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C26 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C27 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C27 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C28 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C28 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C29 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C29 部分不飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C30 飽和直鏈脂族鏈。在一些實施例中，RLD 為或包含C30 部分不飽和直鏈脂族鏈。
在一些實施例中，RLD 來源於膽固醇或其衍生物，例如RLD -H為視情況經取代之膽固醇或其衍生物。
在一些實施例中，脂質具有RLD −OH之結構。在一些實施例中，脂質具有RLD −C(O)OH之結構。在一些實施例中，RLD 為。 在一些實施例中，脂質為月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、二十二碳六烯酸(DHA或順-DHA)、喇叭藻酸、花生四烯酸及二亞油基。在一些實施例中，脂質為月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、二十二碳六烯酸(DHA或順-DHA)、喇叭藻酸及二亞油基。在一些實施例中，脂質具有以下之結構：
在一些實施例中，脂質為以下中之任一者、包含以下中之任一者或由以下中之任一者組成：至少部分疏水性或兩性分子、磷脂、三酸甘油酯、二酸甘油脂、單酸甘油酯、脂溶性維生素、固醇、脂肪及蠟。在一些實施例中，脂質為以下中之任一者：脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、固醇脂質、異戊烯醇脂質、醣脂、聚酮及其他分子。
脂質可經由根據本發明之多種方法併入所提供之技術中。在一些實施例中，脂質以物理方式與所提供之寡核苷酸混合，以形成所提供之組合物。在一些實施例中，脂質以化學方式與寡核苷酸部分結合。
在一些實施例中，所提供之組合物包含兩種或更多種脂質。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含兩種或更多種結合脂質。在一些實施例中，兩種或更多種結合脂質相同。在一些實施例中，兩種或更多種結合脂質不同。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含不超過一種脂質。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸包含不同類型的結合脂質。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸包含相同類型之脂質。
脂質可視情況經由連接基團與寡核苷酸結合。根據本發明，可利用此項技術中各種類型之連接基團。在一些實施例中，連接基團為本發明中所描述之LM 。在一些實施例中，連接基團包含磷酸酯基，其可例如用於經由類似於寡核苷酸合成中所採用之化學方法的化學方法結合脂質。在一些實施例中，連接基團包含醯胺、酯或醚基。
在一些實施例中，連接基團具有−LM −之結構。在一些實施例中，LM 為LD 。在一些實施例中，LD 為具有結構之TD ，其中各變數獨立地如所定義及描述。在一些實施例中，TD 具有式I 結構。在一些實施例中，TD 與PNPLA3寡核苷酸部分之5'−O−形成硫代磷酸酯鍵聯(−OP(O)(S− )O−)。在一些實施例中，TD 與PNPLA3寡核苷酸部分之5'-O-形成S p硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，TD 與PNPLA3寡核苷酸部分之5'-O-形成R p硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，TD 與PNPLA3寡核苷酸部分之5'-O-形成磷酸酯鍵聯(−OP(O)(O− )O−)。在一些實施例中，TD 與PNPLA3寡核苷酸部分之5'-O-形成二硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，LD 為−L−TD −。在一些實施例中，Y連接至-L-且-Z-為共價鍵，使得P直接連接至寡核苷酸部分之羥基。在一些實施例中，P連接至5'端羥基(5'-O-)，以形成磷酸酯基(天然磷酸酯鍵聯)或硫代磷酸酯基(硫代磷酸酯鍵聯)。在一些實施例中，硫代磷酸酯鍵聯為對掌性受控的且可為R p或S p。除非另外規定，否則連接基團中之對掌性中心(例如，TD 中之P)可為立體無規或對掌性受控的，且其不視為例如用於判定組合物是否為對掌性受控的主鏈對掌性中心之一部分。在一些實施例中，LD 為−NH−(CH2 )6 −TD −。在一些實施例中，LD 為−C(O)−NH−(CH2 )6 −TD −。
在一些實施例中，連接基團具有-L-之結構。在一些實施例中，在與寡核苷酸結合之後，脂質形成具有-L-RLD 之結構的部分，其中L及RLD 中之每一者獨立地如本文所定義及描述。
在一些實施例中，−L−包含二價脂族鏈。在一些實施例中，-L-包含磷酸酯基。在一些實施例中，−L−包含硫代磷酸酯基。在一些實施例中，-L-具有−C(O)NH−(CH2 )6 −OP(=O)(S− )−之結構。在一些實施例中，−L−具有−C(O)NH−(CH2 )6 −OP(=O)(O− )−之結構。
視情況經由連接基團，脂質可在各種適合位置併入寡核苷酸中。在一些實施例中，脂質經由5'-OH基團結合。在一些實施例中，脂質經由3'-OH基團結合。在一些實施例中，脂質經由一或多個糖部分結合。在一些實施例中，脂質經由一或多個鹼基結合。在一些實施例中，脂質經由一或多個核苷酸間鍵聯併入。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸可含有多個結合脂質，其獨立地經由其5'-OH、3'-OH、糖部分、鹼基部分及/或核苷酸間鍵聯結合。
在一些實施例中，連接基團為連接組合物之兩個部分的部分；作為非限制性實例，連接基團將PNPLA3寡核苷酸部分以物理方式連接至脂質。適合連接基團之非限制性實例包括：不帶電連接基團；帶電連接基團；包含烷基之連接基團；包含磷酸酯之連接基團；分支鏈連接基團；非分支鏈連接基團；包含至少一個裂解基團之連接基團；包含至少一個氧化還原裂解基團之連接基團；包含至少一個基於磷酸酯之裂解基團之連接基團；包含至少一個酸裂解基團之連接基團；包含至少一個基於酯之裂解基團之連接基團；包含至少一個基於肽之裂解基團之連接基團。
在一些實施例中，脂質視情況經由連接基團部分與活性化合物結合。一般熟習此項技術者瞭解，可利用各種技術將脂質結合至根據本發明之活性化合物。舉例而言，關於包含羧基之脂質，該等脂質可經由羧基結合。在一些實施例中，脂質經由具有−L−之結構的連接基團結合，其中L如式I 中所定義及描述。在一些實施例中，L包含磷酸二酯或經修飾之磷酸二酯部分。在一些實施例中，藉由脂質結合形成之化合物具有(RLD −L−)a −(活性化合物)之結構，其中a為1或大於1之整數，且RLD 及L中之每一者獨立地如本文所定義及描述。在一些實施例中，a為1。在一些實施例中，a大於1。在一些實施例中，a為1至50。在一些實施例中，活性化合物為PNPLA3寡核苷酸。舉例而言，在一些實施例中，結合物具有以下結構中之任一者：，其中Oligo指示寡核苷酸。
在一些實施例中，連接基團係選自：不帶電連接基團；帶電連接基團；包含烷基之連接基團；包含磷酸酯之連接基團；分支鏈連接基團；非分支鏈連接基團；包含至少一個裂解基團之連接基團；包含至少一個氧化還原裂解基團之連接基團；包含至少一個基於磷酸酯之裂解基團之連接基團；包含至少一個酸裂解基團之連接基團；包含至少一個基於酯之裂解基團之連接基團；以及包含至少一個基於肽之裂解基團之連接基團。在一些實施例中，連接基團(例如LM )具有−LLD −之結構。在一些實施例中，連接基團(例如LM )具有−L−之結構。在一些實施例中，連接基團包含式I 之鍵聯。在一些實施例中，連接基團為-C(O)NH-(CH2 )6 -LI -，其中LI 具有如本文中所描述之式I 結構。在一些實施例中，連接基團為−C(O)NH−(CH2 )6 −O−P(=O)(SR1 )−O−。在一些實施例中，R1 為−H，且連接基團為−C(O)NH−(CH2 )6 −O−P(=O)(SH)−O−，在一些條件下，例如某些pH下，為−C(O)NH−(CH2 )6 −O−P(=O)(S− )−O−。在一些實施例中，連接基團為−C(O)NH−(CH2 )6 −O−P(=S)(SR1 )−O−。在一些實施例中，R1 為−H，且連接基團為−C(O)NH−(CH2 )6 −O−P(=S)(SH)−O−，在一些條件下，例如某些pH下，為−C(O)NH−(CH2 )6 −O−P(=S)(S− )−O−。在一些實施例中，連接基團為−C(O)NH−(CH2 )6 −O−P(=S)(OR1 )−O−，其中R1 為−CH2 CH2 CN。在一些實施例中，連接基團為−C(O)NH−(CH2 )6 −O−P(=S)(SR1 )−O−，其中R1 為−CH2 CH2 CN。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸與連接基團偶合且形成H-連接基團-寡核苷酸之結構。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸與脂質結合且形成脂質-連接基團-寡核苷酸之結構，例如RLD -LLD -寡核苷酸。在一些實施例中，連接基團之-O-端連接至PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，連接基團之-O-端連接至5'端寡核苷酸(-O-為5'-OH中之氧)。
在一些實施例中，例如LM 之連接基團包含PO (磷酸二酯鍵聯)、PS (硫代磷酸酯鍵聯)或PS2 (二硫代磷酸酯鍵聯)。包括PS連接基團之非限制性實例展示如下。在一些實施例中，連接基團為−O−P(O)(OH)−O−[磷酸二酯]、−O−P(O)(SH)−O−[硫代磷酸酯]或−O−P(S)(SH)−O−[二硫代磷酸酯]。在一些實施例中，連接基團包含C6胺基部分(-NH-(CH2 )6 -)，其說明於下文中。在一些實施例中，連接基團包含結合於PO、PS或PS2之C6胺基。在一些實施例中，連接基團為結合於PO、PS或PS2之C6胺基。在一些實施例中，例如LLD 或L之連接基團為-C(O)-NH--(CH2 )6 -P(O)(OH)-。在一些實施例中，例如LLD 或L之連接基團為-C(O)-NH--(CH2 )6 -P(O)(OH)-，其中-C(O)-連接至脂質部分且-P(O)(OH)-連接至PNPLA3寡核苷酸部分。在一些實施例中，例如LLD 或L之連接基團為-C(O)-NH--(CH2 )6 -P(O)(OH)-，其中-C(O)-連接至脂質部分且-P(O)(OH)-連接至PNPLA3寡核苷酸部分之5'-O-。在一些實施例中，例如LLD 或L之連接基團為-C(O)-NH--(CH2 )6 -P(O)(OH)-，其中-C(O)-連接至脂質部分且-P(O)(OH)-連接至PNPLA3寡核苷酸部分之3'-O-。在一些實施例中，例如LLD 或L之連接基團為−C(O)−NH−−(CH2 )6 −P(O)(SH)−。在一些實施例中，例如LLD 或L之連接基團為−C(O)−NH−−(CH2 )6 −P(O)(SH)−，其中-C(O)-連接至脂質部分且−P(O)(SH)−連接至PNPLA3寡核苷酸部分。在一些實施例中，例如LLD 或L之連接基團為−C(O)−NH−−(CH2 )6 −P(O)(SH)−，其中-C(O)-連接至脂質部分且−P(O)(SH)−連接至PNPLA3寡核苷酸部分之5'-O-。在一些實施例中，例如LLD 或L之連接基團為−C(O)−NH−−(CH2 )6 −P(O)(SH)−，其中-C(O)-連接至脂質部分且−P(O)(SH)−連接至PNPLA3寡核苷酸部分之3'-O-。在一些實施例中，例如LLD 或L之連接基團為−C(O)−NH−−(CH2 )6 −P(S)(SH)−。在一些實施例中，例如LLD 或L之連接基團為−C(O)−NH−−(CH2 )6 −P(S)(SH)−，其中-C(O)-連接至脂質部分且−P(S)(SH)−連接至PNPLA3寡核苷酸部分。在一些實施例中，例如LLD 或L之連接基團為−C(O)−NH−−(CH2 )6 −P(S)(SH)−，其中-C(O)-連接至脂質部分且−P(S)(SH)−連接至PNPLA3寡核苷酸部分之5'-O-。在一些實施例中，例如LLD 或L之連接基團為−C(O)−NH−−(CH2 )6 −P(S)(SH)−，其中-C(O)-連接至脂質部分且−P(S)(SH)−連接至PNPLA3寡核苷酸部分之3'-O-。如一般熟習此項技術者所瞭解，在某一pH下，−P(O)(OH)−、−P(O)(SH)−、−P(S)(SH)−可分別以−P(O)(O− )−、−P(O)(S− )−、−P(S)(S− )−之形式存在。在一些實施例中，脂質部分為RLD 。結合硫代磷酸酯之C6胺基結合磷酸酯之C6胺基C6胺基
根據本發明，可將各種化學試劑及連接基團用於結合。例如，在一些實施例中，使用下文描述之化學方法或類似製程併入脂質：
在一些實施例中，脂質經由核鹼基直接併入PNPLA3寡核苷酸中，例如：。 在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含直接鍵結至核鹼基之−LM −RLD 。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含。在一些實施例中，連接基團(LM )為。在一些實施例中，連接基團(LM )為。在一些實施例中，脂質部分RLD 為。 在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含在核鹼基處視情況經由連接基團連接至寡核苷酸部分的碳水化合物部分。在一些實施例中，核鹼基為T。在一些實施例中，核鹼基為受保護之T。在一些實施例中，核鹼基為視情況經取代之T。在一些實施例中，該連接係在T或視情況經取代之T之5-碳處。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個−LM −(RLD )a，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個−LM −(RLD )a，其鍵結至核鹼基，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中X為O或S，R1 為H，且各其他變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，R2s 及R4s 為氫。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中X為O或S，R1 為H，且各其他變數獨立地如本發明中所描述。
在一些實施例中，a為1。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個−LM −RCD ，其鍵結至核鹼基，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，核鹼基為T。在一些實施例中，核鹼基為受保護之T。在一些實施例中，核鹼基為視情況經取代之T。在一些實施例中，該連接係在T或視情況經取代之T之5-碳處。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中X為O或S，R1 為H，且各其他變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，R2s 及R4s 為氫。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個，其中X為O或S，R1 為H，且各其他變數獨立地如本發明中所描述。
在一些實施例中，本發明提供一種組合物，其包含PNPLA3寡核苷酸，該PNPLA3寡核苷酸包含含有或為C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈的脂質部分。在一些實施例中，本發明提供一種組合物，其包含PNPLA3寡核苷酸，該PNPLA3寡核苷酸包含含有或為視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈的脂質部分。
在一些實施例中，組合物包含PNPLA3寡核苷酸，該PNPLA3寡核苷酸包含選自以下之經由結合化合物形成的脂質部分：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、二十二碳六烯酸(順-DHA)、喇叭藻酸、花生四烯酸及二亞油基乙醇。
在一些實施例中，連接基團為連接組合物之兩個部分的部分；作為非限制性實例，連接基團以物理方式將PNPLA3寡核苷酸連接至脂質。適合連接基團之非限制性實例包括：不帶電連接基團；帶電連接基團；包含烷基之連接基團；包含磷酸酯之連接基團；分支鏈連接基團；非分支鏈連接基團；包含至少一個裂解基團之連接基團；包含至少一個氧化還原裂解基團之連接基團；包含至少一個基於磷酸酯之裂解基團之連接基團；包含至少一個酸裂解基團之連接基團；包含至少一個基於酯之裂解基團之連接基團；包含至少一個基於肽之裂解基團之連接基團。在一些實施例中，連接基團為不帶電連接基團或帶電連接基團。在一些實施例中，連接基團包含烷基。
在一些實施例中，連接基團包含磷酸酯。在各種實施例中，磷酸酯亦可藉由用氮(橋連胺基磷酸酯)、硫(橋連硫代磷酸酯)及碳(橋連亞甲基膦酸酯)置換橋連氧(亦即連接磷酸酯與核苷之氧)來加以修飾。置換可發生在任一連接氧或兩個連接氧處。在一些實施例中，當橋連氧為核苷之3'-氧時，用碳置換。在一些實施例中，當橋連氧為核苷之5'-氧時，用氮置換。在各種實施例中，包含磷酸酯之連接基團包含以下中之任一者或多者：二硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、硼烷磷酸酯或式(I)化合物：(I)，其中R3 係選自OH、SH、NH2 、BH3 、CH3 、C1 - 6 烷基、C6 - 10 芳基、C1 - 6 烷氧基及C6 - 10 芳基-氧基，其中C1 - 6 烷基及C6 - 10 芳基為未經取代之或視情況獨立地經取代的1至3個獨立地選自以下之基團：鹵基、羥基及NH2 ；且R4 係選自O、S、NH或CH2 。
在一些實施例中，連接基團包含直接鍵或諸如氧或硫之原子、諸如NR1 、C(O)、C(O)NH、SO、SO2 、SO2 NH之單元或諸如以下之原子鏈：經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷芳基烷基、烷芳基烯基、烷芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，其中一或多個亞甲基可由O、S、S(O)、SO2 、N(R1 )2 、C(O)、可裂解連接基團、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環間雜或封端；其中R1 為氫、醯基、脂族基或經取代之脂族基。
在一些實施例中，連接基團為分支鏈連接基團。在一些實施例中，分支鏈連接基團之分支點可為至少三價，但可為四價、五價或六價原子，或呈現此類多價之基團。在一些實施例中，分支點為−N、−N(Q)-C、−O−C、−S−C、−SS−C、−C(O)N(Q)-C、−OC(O)N(Q)-C、−N(Q)C(O)−C或−N(Q)C(O)O−C；其中Q在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基。在其他實施例中，分支點為甘油或甘油衍生物。
在一個實施例中，連接基團包含至少一個可裂解連接基團。作為非限制性實例，可裂解連接基團在細胞外部可足夠穩定，但其在進入靶細胞後裂解，釋放出連接基團保持在一起之兩個部分。作為非限制性實例，諸如二硫鍵之可裂解鍵聯基團可對pH敏感。作為非限制性實例，連接基團可包括能夠藉由酶裂解之可裂解連接基團。舉作為非限制性實例，連接基團可含有肽鍵，其可在靶向富含肽酶之細胞類型(諸如肝細胞及滑膜細胞)時使用。作為非限制性實例，可藉由測試降解劑(或條件)裂解候選連接基團之能力來評估候選可裂解連接基團之適合性。在一些實施例中，連接基團包含氧化還原可裂解連接基團、可藉由降解或水解磷酸酯基之試劑裂解的基於磷酸酯之可裂解連接基團，連接基團包含酸可裂解連接基團、基於酯之連接基團及/或基於肽之裂解基團。
可使用此項技術中報導之任何連接基團，作為非限制性實例，包括描述於美國專利申請案第20150265708號中之彼等連接基團。
在一些實施例中，根據本發明，脂質使用此項技術中已知之任何方法與PNPLA3寡核苷酸結合。靶向部分
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸或寡核苷酸組合物進一步包含靶向組分或部分。靶向部分可與PNPLA3寡核苷酸部分結合或不與該部分結合。在一些實施例中，靶向部分為脂質。在一些實施例中，靶向部分為碳水化合物或雙環縮酮。在一些實施例中，靶向部分為如本發明中所描述之−RLD 。在一些實施例中，靶向部分為如本發明中所描述之−RCD 。
靶向部分可經由根據本發明之多種方法(例如針對脂質及碳水化合物所描述之彼等方法)併入所提供之技術中。在一些實施例中，靶向部分以物理方式與所提供之寡核苷酸混合，以形成所提供之組合物。在一些實施例中，靶向部分與PNPLA3寡核苷酸結合。在一些實施例中，靶向部分不與PNPLA3寡核苷酸結合。
在一些實施例中，所提供之組合物包含兩個或更多個靶向部分。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含兩個或更多個結合靶向部分。在一些實施例中，兩個或更多個結合靶向部分相同。在一些實施例中，兩個或更多個結合靶向部分不同。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含不超過一個靶向部分。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸包含不同類型的結合靶向部分。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸包含相同類型之靶向部分。
靶向部分可例如如針對脂質及碳水化合物所描述視情況經由連接基團與寡核苷酸結合。根據本發明，可利用此項技術中各種類型之連接基團。在一些實施例中，連接基團包含磷酸酯基，其可例如用於經由類似於寡核苷酸合成中所採用之化學方法的化學方法結合靶向部分。在一些實施例中，連接基團包含醯胺、酯或醚基。在一些實施例中，連接基團具有-L-之結構。靶向部分可經由與脂質相同或不同之連接基團結合。
視情況經由連接基團，脂質可在各種適合位置與寡核苷酸結合。在一些實施例中，靶向部分經由5'-OH基團結合。在一些實施例中，靶向部分經由3'-OH基團結合。在一些實施例中，靶向部分經由一或多個糖部分結合。在一些實施例中，靶向部分經由一或多個鹼基結合。在一些實施例中，靶向部分經由一或多個核苷酸間鍵聯併入。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸可含有多個結合靶向部分，其獨立地經由其5'-OH、3'-OH、糖部分、鹼基部分及/或核苷酸間鍵聯結合。靶向部分及脂質可在相同、相鄰及/或間隔開的位置結合。在一些實施例中，靶向部分在PNPLA3寡核苷酸之一端結合，且脂質在另一端結合。
在一些實施例中，靶向部分與目標細胞表面上之蛋白質相互作用。在一些實施例中，該等相互作用有助於至目標細胞中之內化。在一些實施例中，靶向部分包含糖部分。在一些實施例中，靶向部分包含多肽部分。在一些實施例中，靶向部分包含抗體。在一些實施例中，靶向部分為抗體。在一些實施例中，靶向部分包含抑制劑。在一些實施例中，靶向部分為小分子抑制劑之部分。在一些實施例中，抑制劑為目標細胞表面上之蛋白質的抑制劑。在一些實施例中，抑制劑為碳酸酐酶抑制劑。在一些實施例中，抑制劑為靶細胞表面上表現之碳酸酐酶抑制劑。在一些實施例中，碳酸酐酶為I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV或XVI。在一些實施例中，碳酸酐酶經膜結合。在一些實施例中，碳酸酐酶為IV、IX、XII或XIV。在一些實施例中，抑制劑為IV、IX、XII及/或XIV。在一些實施例中，抑制劑為碳酸酐酶III抑制劑。在一些實施例中，抑制劑為碳酸酐酶IV抑制劑。在一些實施例中，抑制劑為碳酸酐酶IX抑制劑。在一些實施例中，抑制劑為碳酸酐酶XII抑制劑。在一些實施例中，抑制劑為碳酸酐酶XIV抑制劑。在一些實施例中，抑制劑包含或為磺醯胺(例如，Supuran, CT.Nature Rev Drug Discover 2008 ,7 , 168-181中所描述之彼等磺醯胺，該等磺醯胺以引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，抑制劑為磺醯胺。在一些實施例中，目標細胞為肌肉細胞。
在一些實施例中，靶向部分為RTD ，其中RTD 為如本發明中所描述之RLD 或RCD 。
在一些實施例中，靶向部分為如本發明中所定義及所描述之RLD 。在一些實施例中，本發明提供包含RLD 之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸組合物，其包含含有RLD 之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸組合物，其包含第一複數個包含RLD 之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供包含RLD 之寡核苷酸的對掌性受控寡核苷酸組合物。
在一些實施例中，靶向部分為如本發明中所定義及所描述之RCD 。在一些實施例中，本發明提供包含RCD 之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸組合物，其包含含有RCD 之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸組合物，其包含第一複數個包含RCD 之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供包含RCD 之寡核苷酸的對掌性受控寡核苷酸組合物。
在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 包含或為。在一些實施例中，RTD 為包含或為脂質部分的靶向部分。在一些實施例中，X為O。在一些實施例中，X為S。
在一些實施例中，本發明提供用於將各種部分結合至寡核苷酸部分之技術(例如，試劑、方法等)。在一些實施例中，本發明提供用於將靶向部分結合至寡核苷酸部分之技術。在一些實施例中，本發明提供包含用於結合之靶向部分的酸，例如RLD -COOH。在一些實施例中，本發明提供用於結合之連接基團，例如LM 。一般熟習此項技術者理解，可利用許多已知且廣泛實踐的技術來與根據本發明之寡核苷酸部分結合。在一些實施例中，所提供之酸為。在一些實施例中，所提供之酸為。在一些實施例中，所提供之酸為。在一些實施例中，所提供之酸為。在一些實施例中，所提供之酸為脂肪酸，其可提供脂質部分作為靶向部分。在一些實施例中，本發明提供用於製備該等酸之方法及試劑。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量之降低的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何脂質。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何脂質。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含脂質部分。在一些實施例中，脂質部分藉由與脂質結合而併入。在一些實施例中，脂質為脂肪酸。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸與脂肪酸結合。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含與種子區域中之核苷酸結合的脂質。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含與種子後區域中之核苷酸結合的脂質。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含結合在第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24或第25個核苷酸(自5'端計數)處的脂質。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含結合在第9或第11個核苷酸(自5'端計數)處之脂質。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸在鹼基處與脂肪酸結合。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含結合在第9或第11個核苷酸(自5'端計數)處之鹼基處的脂質。
在一些實施例中，脂肪酸包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個碳原子。在一些實施例中，脂肪酸包含10個或更多個碳原子。在一些實施例中，脂肪酸包含11個或更多個碳原子。在一些實施例中，脂肪酸包含12個或更多個碳原子。在一些實施例中，脂肪酸包含13個或更多個碳原子。在一些實施例中，脂肪酸包含14個或更多個碳原子。在一些實施例中，脂肪酸包含15個或更多個碳原子。在一些實施例中，脂肪酸包含16個或更多個碳原子。在一些實施例中，脂肪酸包含17個或更多個碳原子。在一些實施例中，脂肪酸包含18個或更多個碳原子。在一些實施例中，脂肪酸包含19個或更多個碳原子。在一些實施例中，脂肪酸包含20個或更多個碳原子。在一些實施例中，脂肪酸包含30個或更多個碳原子。
在一些實施例中，脂質為棕櫚酸。在一些實施例中，脂質為硬脂酸或喇叭藻酸。在一些實施例中，脂質為硬脂酸。在一些實施例中，脂質為喇叭藻酸。
在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C80 飽和或部分不飽和脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經選自以下之視情況經取代之基團置換：C1 -C6 伸烷基、C1 -C6 伸烯基、、C1 -C6 雜脂族部分、−C(R')2 -、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、−N(R')-、−C(O)-、-C(S)-、-C(NR')-、-C(O)N(R')-、−N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)-、-N(R')C(O)O-、−OC(O)N(R')-、-S(O)-、-S(O)2 -、−S(O)2 N(R')-、-N(R')S(O)2 -、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-及−C(O)O-，其中各變數獨立地如本文所定義及描述。
在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經選自以下之視情況經取代之基團置換：C1 -C6 伸烷基、C1 -C6 伸烯基、、C1 -C6 雜脂族部分、−C(R')2 -、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、−N(R')-、−C(O)-、-C(S)-、-C(NR')-、-C(O)N(R')-、−N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)-、-N(R')C(O)O-、−OC(O)N(R')-、-S(O)-、-S(O)2 -、−S(O)2 N(R')-、−N(R')S(O)2 -、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-及−C(O)O-，其中各變數獨立地如本文所定義及描述。
在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C40 飽和或部分不飽和脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經選自以下之視情況經取代之基團置換：C1 -C6 伸烷基、C1 -C6 伸烯基、、C1 -C6 雜脂族部分、−C(R')2 -、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、−N(R')-、−C(O)-、-C(S)-、-C(NR')-、-C(O)N(R')-、−N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)-、-N(R')C(O)O-、−OC(O)N(R')-、-S(O)-、-S(O)2 -、−S(O)2 N(R')-、−N(R')S(O)2 -、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-及−C(O)O-，其中各變數獨立地如本文所定義及描述。
在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含未經取代之C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含不超過一個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含兩個或更多個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含未經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含不超過一個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含兩個或更多個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含未經取代之C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含不超過一個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含兩個或更多個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含C10 -C30 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含C10 -C20 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含C10 -C16 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含C12 -C16 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含C14 -C16 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。
在一些實施例中，脂質係選自由以下組成之群：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、二十二碳六烯酸(DHA或順-DHA)、喇叭藻酸及二亞油基。
在一些實施例中，脂質不與寡核苷酸結合。
在一些實施例中，脂質與寡核苷酸結合。
在一些實施例中，脂質經由連接基團與寡核苷酸結合。在一些實施例中，連接基團具有-L-之結構。
在一些實施例中，靶向部分與PNPLA3寡核苷酸結合。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個靶向部分。在一些實施例中，靶向部分經由連接基團結合。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個脂質部分及一或多個靶向部分。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質部分，其中脂質為C16 直鏈。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質，其中脂質為棕櫚酸。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含與鹼基結合之脂質。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質，其中脂質為與鹼基結合之C16 直鏈。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質，其中脂質為與鹼基結合之棕櫚酸。
在一些實施例中，本發明係關於一種對掌性受控寡核苷酸組合物，其中該組合物進一步包含脂質。在一些實施例中，脂質為硬脂酸或喇叭藻酸。在一些實施例中，脂質與寡核苷酸結合。
在一些實施例中，脂質與PNPLA3寡核苷酸之結合改良寡核苷酸之至少一種特性。在一些實施例中，該特性為提高之活性(例如，提高之介導單股RNA干擾的能力)，或至組織之改良分佈。在一些實施例中，脂質結合改良活性。在一些實施例中，脂質結合改良至一或多個靶組織之傳遞。在一些實施例中，組織為肌肉組織。在一些實施例中，組織為骨骼肌、腓腸肌、三頭肌、心臟或隔膜。
在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C80 飽和或部分不飽和脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經選自以下之視情況經取代之基團置換：C1 -C6 伸烷基、C1 -C6 伸烯基、C1 -C6 雜脂族部分、-C(R)2 -、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR)-、-C(O)N(R)-、-N(R)C(O)N(R)、-N(R)C(O)-、-N(R)C(O)O-、-OC(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2 -、-S(O)2 N(R)-、-N(R)S(O)2 -、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-及-C(O)O-，其中各變數獨立地如本文所定義及描述。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經選自以下之視情況經取代之基團置換：C1 -C6 伸烷基、C1 -C6 伸烯基、C1 -C6 雜脂族部分、-C(R)2 -、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR)-、-C(O)N(R)-、-N(R)C(O)N(R)、-N(R)C(O)-、-N(R)C(O)O-、-OC(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2 -、-S(O)2 N(R)-、-N(R)S(O)2 -、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-及-C(O)O-，其中各變數獨立地如本文所定義及描述。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C40 飽和或部分不飽和脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經選自以下之視情況經取代之基團置換：C1 -C6 伸烷基、C1 -C6 伸烯基、C1 -C6 雜脂族部分、-C(R)2 -、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR)-、-C(O)N(R)-、-N(R)C(O)N(R)、-N(R)C(O)-、-N(R)C(O)O-、-OC(O)N(R)-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2 N(R)-、-N(R)S(O)2 -、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(O)-及-C(O)O-，其中各變數獨立地如本文所定義及描述。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含未經取代之C10 -C80 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含不超過一個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含兩個或更多個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含未經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含不超過一個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含兩個或更多個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含未經取代之C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含不超過一個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含兩個或更多個視情況經取代之C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質係選自由以下組成之群：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、二十二碳六烯酸(順-DHA)、喇叭藻酸及二亞油基。在一些實施例中，脂質不與寡核苷酸結合。在一些實施例中，脂質與寡核苷酸結合。
在一些實施例中，脂質與PNPLA3寡核苷酸之結合出乎意料地改良寡核苷酸之至少一種特性。在一些實施例中，該特性為提高之活性(例如，提高之介導單股RNA干擾的能力)，或至組織之改良分佈。在一些實施例中，組織為肌肉組織。在一些實施例中，組織為骨骼肌、腓腸肌、三頭肌、心臟或隔膜。在一些實施例中，包含脂質部分之寡核苷酸形成例如微胞。在一些實施例中，例如在圖式中之一或多者中展現實例改良特性。
在一些實施例中，當分析小鼠中之實例寡核苷酸時，以所測試量(例如10 mg/kg、30 mg/kg等)經由雄性C57BL/10ScSnDMDmdx小鼠 (4至5週大)之尾部靜脈靜脈內注射所測試寡核苷酸。在一些實施例中，在注射之後，在所測試時間(例如第2天、第7天及/或第14等)收集組織，在一些實施例中，新鮮冷凍於液氮中且在分析之前儲存於-80℃下。
根據本發明，可使用各種分析來評定寡核苷酸含量。在一些實施例中，使用混合型ELISA定量組織中之寡核苷酸含量，使用測試物品連續稀釋液作為標準曲線：舉例而言，在一實例程序中，在37℃下，用2.5% NaHCO3 (Gibco, 25080-094)中之50 l捕捉探針以500 nM塗佈經順丁烯二酸酐活化之96孔培養盤(Pierce 15110) 2小時。隨後用PBST (PBS + 0.1% Tween-20)洗滌培養盤3次，且用5%脫脂奶-PBST在37℃下阻斷1小時。將測試物品寡核苷酸連續稀釋至基質中。此標準與初始樣品一起用溶解緩衝液(4 M胍；0.33% N-月桂基肌胺酸；25 mM檸檬酸鈉；10 mM DTT)稀釋，使得所有樣品中之寡核苷酸量小於100 ng/mL。將20 l經稀釋之樣品與180 l 333 nM於PBST中稀釋之偵測探針混合，隨後在PCR機器(65℃，10 min；95℃，15 min；4℃)中變性。將50 l變性樣品一式三份分佈於經阻斷之ELISA培養盤中，且在4℃下培育隔夜。在用PBST洗滌3次之後，以50升/孔添加含1:2000抗生蛋白鏈菌素-AP之PBST，且在室溫下培育1小時。在用PBST大量洗滌之後，添加100 l AttoPhos (Promega S1000)，在室溫下於暗處培育10 min且在盤式讀取器(Molecular Device，M5)螢光通道上讀數：Ex435 nm，Em555 nm。根據標準曲線，藉由4參數回歸計算樣品中之寡核苷酸。
如本發明中所描述及證實，在一些實施例中，脂質結合改良至組織之傳遞。在一些實施例中，脂質結合改良至肌肉之傳遞。在一些實施例中，脂質結合包含與脂肪酸結合。在一些實施例中，寡核苷酸與喇叭藻酸結合。在一些實施例中，與喇叭藻酸結合對於改良寡核苷酸至肌肉之傳遞尤其有效。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸在血漿及組織均質物兩者中係穩定的。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含結合於位置9或11 (自5'端計數)處之脂質。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質，其中脂質為結合於位置9或11 (自5'端計數)處之C16 直鏈。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質，其中脂質為結合於位置9或11 (自5'端計數)處之棕櫚酸。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含在位置9或11 (自5'端計數)處與鹼基結合的脂質。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質，其中脂質為在位置9或11 (自5'端計數)處與鹼基結合的C16 直鏈。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質，其中脂質為在位置9或11 (自5'端計數)處與鹼基結合的棕櫚酸。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含在位置9或11 (自5'端計數)處與U鹼基結合的脂質。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質，其中脂質為在位置9或11 (自5'端計數)處與U鹼基結合的C16 直鏈。在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑包含脂質，其中脂質為在位置9或11 (自5'端計數)處與U鹼基結合的棕櫚酸。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi包含ImU或5'-脂質-2'OMeU之結構。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含任何另一化學部分，包括(但不限於)描述於以下中之任一者中的脂質：美國專利第5,614,503號、第5,780,009號、第6,074,863號、第6,258,581號、第6,489,117號、第6,677,445號、第6,828,435號、第6,846,921號、第7,416,849號、第7,494,982號、第7,981,871號、第8,106,022號、第8,148,344號、第8,318,508號、第8,389,707號、第8,450,467號、第8,507,455號、第8,703,731號、第8,828,956號、第8,901,046號、第9,107,904號、第9,352,048號、第9,370,581號、第9,370,582號、第9,387,257號、第9,388,415號、第9,388,416號、第9,393,316及第9,404,112號。
與 PNPLA3 寡核苷酸結合的視情況存在之另一化學部分 ： 碳水化合物部分或雙環縮酮 ， 包括 ( 但不限於 ) GalNAc 部分
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸或寡核苷酸組合物包含一或多種碳水化合物或碳水化合物部分或雙環縮酮部分。在一些實施例中，碳水化合物部分為碳水化合物。在一些實施例中，碳水化合物部分為或包含直接地或間接地與PNPLA3寡核苷酸結合的碳水化合物。在一些實施例中，碳水化合物部分有助於寡核苷酸至所需位置(例如細胞、組織、器官等)之目標傳遞。在一些實施例中，所提供之碳水化合物部分有助於至肝臟之傳遞。如一般熟習此項技術者所瞭解，各種碳水化合物部分描述於文獻中且可根據本發明利用。
碳水化合物部分可視情況經由一或多個二價或多價連接基團(其可用於將兩個或更多個碳水化合物部分連接至寡核苷酸)在各種位置(例如糖單元、核苷酸間鍵聯單元、核鹼基單元等)處併入寡核苷酸中。在一些實施例中，本發明提供用於碳水化合物至寡核苷酸中之併入的技術。在一些實施例中，本發明提供作為核苷酸間鍵聯及/或糖單元處之併入之替代及/或添加視情況經由一或多個連接基團在核鹼基單元處併入碳水化合物部分，從而提供巨大可撓性及/或改良特性及/或活性的技術。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含至少一個碳水化合物部分，其視情況經由連接基團在核鹼基單元處併入寡核苷酸中。
在一些實施例中，連接基團為LM ，其中LM 為共價鍵，或選自以下之二價或多價之視情況經取代之直鏈或分支鏈基團：具有1至30個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的C1 - 100 脂族基及C1 - 100 雜脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經以下置換：C1 - 6 伸烷基、C1 - 6 伸烯基、、−C(R')2 −、−O−、−S−、−S−S−、−N(R')−、−C(O)−、−C(S)−、−C(NR')−、−C(O)N(R')−、−N(R')C(O)N(R')−、−N(R')C(O)O−、−S(O)−、−S(O)2 −、−S(O)2 N(R')−、−C(O)S−、−C(O)O−、−P(O)(OR')−、−P(O)(SR')−、−P(O)(R')−、−P(O)(NR')−、−P(S)(OR')−、−P(S)(SR')−、−P(S)(R')−、−P(S)(NR')−、−P(R')−、−P(OR')−、−P(SR')−、−P(NR')−、−P(OR')[B(R')3 ]−、−OP(O)(OR')O−、−OP(O)(SR')O−、−OP(O)(R')O−、−OP(O)(NR')O−、−OP(OR')O−、−OP(SR')O−、−OP(NR')O−、−OP(R')O−或−OP(OR')[B(R')3 ]O−；且一或多個碳原子視情況且獨立地經Cy置換。在一些實施例中，LM 係二價的。在一些實施例中，LM 係多價的。在一些實施例中，LM 為，其中LM 直接鍵結至核鹼基，例如如在：中。在一些實施例中，LM 為。在一些實施例中，LM 為。在一些實施例中，LM 為。在一些實施例中，LM 為。
在一些實施例中，碳水化合物部分或雙環縮酮或雙環縮酮部分為RCD ，其中RCD 為選自以下之視情況經取代之直鏈或分支鏈基團：具有1至30個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的C1 - 100 脂族基及C1 - 100 雜脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經以下置換：C1 - 6 伸烷基、C1 - 6 伸烯基、、−C(R')2 −、−O−、−S−、−S−S−、−N(R')−、−C(O)−、−C(S)−、−C(NR')−、−C(O)N(R')−、−N(R')C(O)N(R')−、−N(R')C(O)O−、−S(O)−、−S(O)2 −、−S(O)2 N(R')−、−C(O)S−、−C(O)O−、−P(O)(OR')−、−P(O)(SR')−、−P(O)(R')−、−P(O)(NR')−、−P(S)(OR')−、−P(S)(SR')−、−P(S)(R')−、−P(S)(NR')−、−P(R')−、−P(OR')−、−P(SR')−、−P(NR')−、−P(OR')[B(R')3 ]−、−OP(O)(OR')O−、−OP(O)(SR')O−、−OP(O)(R')O−、−OP(O)(NR')O−、−OP(OR')O−、−OP(SR')O−、−OP(NR')O−、−OP(R')O−或−OP(OR')[B(R')3 ]O−；且一或多個碳原子視情況且獨立地經CyL 置換。在一些實施例中，RCD 為選自以下之視情況經取代之直鏈或分支鏈基團：具有1至30個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的C1 - 100 脂族基及C1 - 100 雜脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經以下置換：C1 - 6 伸烷基、C1 - 6 伸烯基、、−C(R')2 −、−O−、−S−、−S−S−、−N(R')−、−C(O)−、−C(S)−、−C(NR')−、−C(O)N(R')−、−N(R')C(O)N(R')−、−N(R')C(O)O−、−S(O)−、−S(O)2 −、−S(O)2 N(R')−、−C(O)S−、−C(O)O−、−P(O)(OR')−、−P(O)(SR')−、−P(O)(R')−、−P(O)(NR')−、−P(S)(OR')−、−P(S)(SR')−、−P(S)(R')−、−P(S)(NR')−、−P(R')−、−P(OR')−、−P(SR')−、−P(NR')−、−P(OR')[B(R')3 ]−、−OP(O)(OR')O−、−OP(O)(SR')O−、−OP(O)(R')O−、−OP(O)(NR')O−、−OP(OR')O−、−OP(SR')O−、−OP(NR')O−、−OP(R')O−或−OP(OR')[B(R')3 ]O−；且一或多個碳原子獨立地經四價單醣、雙醣或多醣部分置換。在一些實施例中，RCD 為選自以下之視情況經取代之直鏈或分支鏈基團：具有1至30個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的C1 - 100 脂族基及C1 - 100 雜脂族基，其中一或多個亞甲基單元視情況且獨立地經以下置換：C1 - 6 伸烷基、C1 - 6 伸烯基、、−C(R')2 −、−O−、−S−、−S−S−、−N(R')−、−C(O)−、−C(S)−、−C(NR')−、−C(O)N(R')−、−N(R')C(O)N(R')−、−N(R')C(O)O−、−S(O)−、−S(O)2 −、−S(O)2 N(R')−、−C(O)S−、−C(O)O−、−P(O)(OR')−、−P(O)(SR')−、−P(O)(R')−、−P(O)(NR')−、−P(S)(OR')−、−P(S)(SR')−、−P(S)(R')−、−P(S)(NR')−、−P(R')−、−P(OR')−、−P(SR')−、−P(NR')−、−P(OR')[B(R')3 ]−、−OP(O)(OR')O−、−OP(O)(SR')O−、−OP(O)(R')O−、−OP(O)(NR')O−、−OP(OR')O−、−OP(SR')O−、−OP(NR')O−、−OP(R')O−或−OP(OR')[B(R')3 ]O−；且一或多個碳原子獨立地經四價GalNac部分或GalNac衍生物之四價部分置換。
在一些實施例中，RCD 為視情況經取代之。在一些實施例中，R'為−C(O)R。在一些實施例中，RCD 為單醣部分。在一些實施例中，RCD 為單價GalNac部分。在一些實施例中，RCD 為。在一些實施例中，RCD 為視情況經取代之。在一些實施例中，RCD 為視情況經取代之。在一些實施例中，R'為−C(O)R。在一些實施例中，RCD 為視情況經取代之。在一些實施例中，RCD 為雙醣部分。在一些實施例中，RCD 為多醣部分。
在一些實施例中，RCD 具有RG −L−之結構，其中RG 為−H或選自以下之視情況經取代之基團：C3 -C20 環脂族基，及具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的3員至20員雜環基。在一些實施例中，RCD 具有RG −L−之結構，其中RG 為選自以下之視情況經取代之基團：C3 -C20 環脂族基，及具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的3員至20員雜環基。在一些實施例中，RCD 具有RG −L−之結構，其中RG 為選自以下之視情況經取代之基團：C3 -C20 環脂族基，及具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的3員至20員雜環基，其中至少一個雜原子為氧。在一些實施例中，RG 經取代，且各RG 之至少一個取代基經由氧原子鍵結至RG 。在一些實施例中，RG 經取代，且各RG 之至少一個取代基經由氮原子鍵結至RG 。在一些實施例中，RG 獨立地經取代，且各RG 之各碳原子經由氧原子或氮原子獨立地鍵結至取代基。在一些實施例中，RG 獨立地經取代，且各RG 之各碳原子經由氧原子或氮原子獨立地鍵結至取代基。在一些實施例中，RG 為視情況經取代之具有1至10個氧原子之3員至20員雜環基。在一些實施例中，RG 為視情況經取代之具有一個氧原子之3員至6員雜環基。在一些實施例中，各RG 獨立地為視情況經取代之具有1至10個氧原子之3員至20員雜環基。在一些實施例中，RG 獨立地為視情況經取代之具有一個氧原子之3員至6員雜環基。在一些實施例中，RG 之雜環基環之各碳獨立地鍵結至氧原子或氮原子。在一些實施例中，RG 之雜環基環之兩個或更多個碳原子獨立地鍵結至氧原子或氮原子。在一些實施例中，RG 之雜環基環之兩個或更多個碳原子獨立地鍵結至氧原子或氮原子。在一些實施例中，RG 之雜環基環之三個或更多個碳原子獨立地鍵結至氧原子或氮原子。在一些實施例中，RG 之雜環基環之四個或更多個碳原子獨立地鍵結至氧原子或氮原子。在一些實施例中，RG 之雜環基環之五個或更多個碳原子獨立地鍵結至氧原子或氮原子。在一些實施例中，RG 之雜環基環之兩個或更多個碳原子獨立地結合於氧原子。在一些實施例中，RG 之雜環基環之三個或更多個碳原子獨立地鍵結至氧原子。在一些實施例中，RG 之雜環基環之四個或更多個碳原子獨立地鍵結至氧原子。在一些實施例中，RG 之雜環基環之五個或更多個碳原子獨立地鍵結至氧原子。在一些實施例中，RG -H為包含−CHO或−C(O)−基團之C3 - 20 多元醇。
在一些實施例中，RCD 具有RG −L−之結構，其中RG 為−H或選自以下之經取代基團：C3 -C20 環脂族基，及具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的3員至20員雜環基，其中1至20個取代基為R基團。在一些實施例中，RCD 具有RG −L−之結構，其中RG 為−H或選自以下之經取代基團：C3 -C20 環脂族基，及具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的3員至20員雜環基，其中1至20個取代基為−OR或−N(R)2 基團。在一些實施例中，RCD 具有RG −L−之結構，其中RG 為−H或選自以下之經取代基團：C3 -C20 環脂族基，及具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的3員至20員雜環基，其中1至20個取代基為−OH及−N(R)2 。在一些實施例中，RCD 具有RG −L−之結構，其中RG 為−H或選自以下之經取代基團：C3 -C20 環脂族基，及具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的3員至20員雜環基，其中1至20個取代基為−OH及−NHR。在一些實施例中，RCD 具有RG −L−之結構，其中RG 為−H或選自以下之經取代基團：C3 -C20 環脂族基，及具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的3員至20員雜環基，其中1至20個取代基為−OH及−NHC(O)R。
在一些實施例中，RG 為經取代之具有1至10個獨立地選自氧、氮、硫、磷、硼及矽之雜原子的3員至20員雜環基。在一些實施例中，RG 為經取代之具有1至10個獨立地選自氧及氮之雜原子的3員至20員雜環基。在一些實施例中，RG 為經取代之具有1至10個氧的3員至20員雜環基。在一些實施例中，RG 為經取代。在一些實施例中，RG 為經取代。在一些實施例中，RG 為經取代。
在一些實施例中，RG 為，其中各變數獨立地如本發明中所描述。在一些實施例中，t為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，t至少為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，t至少為1。在一些實施例中，t至少為2。在一些實施例中，t至少為3。在一些實施例中，t至少為4。在一些實施例中，t至少為5。在一些實施例中，t至少為6。在一些實施例中，各R1s 獨立地為−OR'或−N(R')2 。在一些實施例中，各R'獨立地為−C(O)R。在一些實施例中，各R1s 獨立地為−OR'或−NHR'。在一些實施例中，各R1s 獨立地為−OH或−NHR'。在一些實施例中，各R1s 獨立地為−OH或−NHC(O)R。在一些實施例中，環A為視情況經取代之。在一些實施例中，環A為視情況經取代之。在一些實施例中，環A為視情況經取代之。
在一些實施例中，RG 為，其中各變數獨立地如本發明中所描述(亦即RG −H為)。在一些實施例中，R1s 、R2s 、R3s 、R4s 及R5s 中之至少1、2、3、4、5或6者獨立地為−OR'或−N(R')2 。在一些實施例中，R1s 、R2s 、R3s 、R4s 及R5s 中之至少1、2、3、4、5或6者獨立地為−OR'或−NHR'。在一些實施例中，R1s 、R2s 、R3s 、R4s 及R5s 中之至少1、2、3、4、5或6者獨立地為−OH或−NHR'。在一些實施例中，R1s 、R2s 、R3s 、R4s 及R5s 中之至少1、2、3、4、5或6者獨立地為−OH或−NHC(O)R。在一些實施例中，R1s 、R2s 、R3s 、R4s 及R5s 中之至少1、2、3、4、5或6者獨立地為−OH。
在一些實施例中，RG 之環脂族環或雜環之各環碳原子獨立地經取代。在一些實施例中，RG 之環脂族環或雜環之不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個環碳原子未經取代。在一些實施例中，不超過1個環碳原子未經取代。在一些實施例中，不超過2個環碳原子未經取代。在一些實施例中，不超過3個環碳原子未經取代。在一些實施例中，不超過4個環碳原子未經取代。在一些實施例中，不超過5個環碳原子未經取代。在一些實施例中，不超過6個環碳原子未經取代。在一些實施例中，不超過7個環碳原子未經取代。在一些實施例中，不超過8個環碳原子未經取代。在一些實施例中，不超過9個環碳原子未經取代。在一些實施例中，不超過10個環碳原子未經取代。在一些實施例中，RG 之環脂族環或雜環之不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個環碳原子未經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，不超過1個環碳原子未經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，不超過2個環碳原子未經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，不超過3個環碳原子未經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，不超過4個環碳原子未經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，不超過5個環碳原子未經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，不超過6個環碳原子未經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，不超過7個環碳原子未經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，不超過8個環碳原子未經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，不超過9個環碳原子未經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，不超過10個環碳原子未經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，RG 之環脂族環或雜環之不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，不超過1個環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，不超過2個環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，不超過3個環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，不超過4個環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，不超過5個環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，不超過6個環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，不超過7個環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，不超過8個環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，不超過9個環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，不超過10個環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，RG 之環脂族環或雜環之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%百分比之環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，RG 之環脂族環或雜環之不超過10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，不超過10%之環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，不超過20%之環碳原子未經−OH取代。在一些實施例中，RG 之環脂族環或雜環之各環碳原子獨立地經取代。在一些實施例中，RG 之環脂族環或雜環之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個環碳原子經取代。在一些實施例中，至少1個環碳原子經取代。在一些實施例中，至少2個環碳原子經取代。在一些實施例中，至少3個環碳原子經取代。在一些實施例中，至少4個環碳原子經取代。在一些實施例中，至少5個環碳原子經取代。在一些實施例中，至少6個環碳原子經取代。在一些實施例中，至少7個環碳原子經取代。在一些實施例中，至少8個環碳原子經取代。在一些實施例中，至少9個環碳原子經取代。在一些實施例中，至少10個環碳原子經取代。在一些實施例中，RG 之環脂族環或雜環之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少1個環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少2個環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少3個環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少4個環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少5個環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少6個環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少7個環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少8個環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少9個環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少10個環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，RG 之環脂族環或雜環之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少1個環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少2個環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少3個環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少4個環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少5個環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少6個環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少7個環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少8個環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少9個環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少10個環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，RG 之環脂族環或雜環之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%百分比之環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少10%之環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少20%之環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少30%之環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少40%之環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少50%之環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少60%之環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少70%之環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少80%之環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少90%之環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少95%之環碳原子經−OH或−N(R')2 取代。在一些實施例中，RG 之環脂族環或雜環之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%之環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少10%之環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少20%之環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少30%之環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少40%之環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少50%之環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少60%之環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少70%之環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少80%之環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少90%之環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少95%之環碳原子經−OH取代。在一些實施例中，至少一個環碳原子經−N(R')2 取代。在一些實施例中，至少一個環碳原子經−NHC(O)R取代。在一些實施例中，至少一個環碳原子經−NHC(O)R取代，其中R為視情況經取代之C1 - 6 脂族基。在一些實施例中，至少一個環碳原子經−NHAc取代。
在一些實施例中，RG 為視情況經取代之。在一些實施例中，R'為−C(O)R。在一些實施例中，RG 為。在一些實施例中，RG 為視情況經取代之。
在一些實施例中，RG 為視情況經取代之。在一些實施例中，R'為−C(O)R。在一些實施例中，RG 為視情況經取代之。
在一些實施例中，RCD 或RG 具有某一結構，使得RCD −H或RG −H為： 。在一些實施例中，RCD 或RG 具有某一結構，使得RCD −H或RG −H為去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)之配體。各種其他ASGPR配體為此項技術中已知且可根據本發明進行利用。在一些實施例中，描述之碳水化合物部分適用於所提供之寡核苷酸至肝臟的目標傳遞。
在一些實施例中，L為共價鍵。在一些實施例中，L為二價的視情況經取代之C1 - 6 脂族基，其中一或多個亞甲基單元獨立地且視情況經−O−置換。在一些實施例中，L為−O−CH2 −。
在一些實施例中，RCD 為RG −H之寡聚或聚合部分，其中各RG 獨立地如本發明中所描述。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑包含本文中描述或此項技術中已知的任何靶向部分。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸為單股RNAi劑。
在一些實施例中，靶向部分為去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)之配體。
在一些實施例中，靶向部分為揭示於Sanhueza等人 J. Am. Chem. Soc., 2017, 139 (9),第3528-3536頁中的去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)之配體。
在一些實施例中，靶向部分為揭示於Liras等人 US 20160207953中的去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)之配體。
在一些實施例中，靶向部分為揭示於Liras等人 US 20160207953中的經取代-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛烷-2,3-二醇衍生物。
在一些實施例中，靶向部分為揭示於Liras等人 US 20150329555中的去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)之配體。
在一些實施例中，靶向部分為揭示於Liras等人 US 20150329555中的經取代-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛烷-2,3-二醇衍生物。
在一些實施例中，與PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑結合的另一化學部分為GalNAc部分。在一些實施例中，與PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑結合的另一化學部分為結合在任何位置處的GalNAc部分。
在一些實施例中，與PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑結合的另一化學部分為經由連接基團與5'-H T結合的GalNAc部分。在一些實施例中，與PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑結合的另一化學部分為經由連接基團與5'-H T結合的GalNAc部分，其結合在任何位置處。
在一些實施例中，另一化學部分為任何位置處之GaNC6T (亦稱為TGaNC6T，或GalNAc部分與5'H T經由胺基C6連接基團之結合)。
在一些實施例中，另一化學部分為GaNC6T，例如GalNAc部分與5'H T經由胺基C6連接基團之結合，例如，在倒數第二或倒數第三個核苷酸[自5'至3'計數]處；例如3'端二核苷酸之5'核苷酸(例如，3'端二核苷酸之5'核苷酸為3'端二核苷酸之兩個核苷酸中更接近寡核苷酸之5'端的核苷酸)或最接近3'端二核苷酸之5'核苷酸之5'的核苷酸：
在單股RNAi劑之一些實施例中，寡核苷酸或單股RNAi劑包含將GalNAc部分結合至寡核苷酸或單股RNAi劑的連接基團。在單股RNAi劑之一些實施例中，寡核苷酸或單股RNAi劑包含將GalNAc部分結合至寡核苷酸或單股RNAi劑的連接基團，其中連接基團連接在糖之2'位置處。在單股RNAi劑之一些實施例中，寡核苷酸或單股RNAi劑包含將GalNAc部分結合至寡核苷酸單股RNAi劑的連接基團，其中連接基團連接至鹼基。在單股RNAi劑之一些實施例中，寡核苷酸或單股RNAi劑包含將GalNAc部分結合至寡核苷酸或單股RNAi劑的連接基團，其中連接基團連接至T鹼基。在單股RNAi劑之一些實施例中，寡核苷酸或單股RNAi劑包含將GalNAc部分結合至寡核苷酸或單股RNAi劑的連接基團。
在一些實施例中，連接GalNAc部分之連接基團為生物可裂解連接基團。此連接基團允許細胞內去除GalNAc部分，使得GalNAc部分將不會干擾Ago-2活性或RNA干擾。
在一些實施例中，GalNAc部分與PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑結合在倒數第二或倒數第三個核苷酸處。
在一些實施例中，GalNAc部分可結合在單股RNAi劑之倒數第二個核苷酸(3'端二核苷酸之更5'位置)處，或在單股RNAi劑之倒數第三個核苷酸(最接近3'端二核苷酸之5'的核苷酸)處。不希望受任何特定理論束縛，本發明表明，單股RNAi劑之倒數第二或倒數第三個核苷酸(例如，3'端二核苷酸之更5'位置)可鄰近Ago-2中之凹穴，且GalNAc部分可能能夠插入至該凹穴中，使得GalNAc部分不干擾Ago-2活性。不希望受任何特定理論束縛，本發明表明，若GalNAc部分連接在倒數第二或倒數第三個核苷酸處，則其可因此而不為裂解GalNAc部分以實現RNAi活性所必需，且其可因此可接受使用更穩固之非生物可裂解連接基團來將GalNAc部分連接至寡核苷酸或單股RNAi劑。更穩固連接基團因此對裂解較不敏感，從而提高GalNAc部分將增加寡核苷酸或單股RNAi劑之傳遞的機率。
在一些實施例中，GalNAc部分經由AMC6連接基團連接。
在一些實施例中，GalNAc部分經由連接在T鹼基處之AMC6連接基團(AMC6T)連接。
在一些實施例中，AMC6T具有以下結構：在一些非限制性實例中，AMC6T為倒數第二或倒數第三個核苷酸[自5'至3'計數]；例如3'端二核苷酸之5'核苷酸，或最接近3'端二核苷酸之5'核苷酸之5'的核苷酸。
在單股RNAi劑之一些實施例中，單股RNAi劑包含倒數第二或倒數第三個核苷酸處之AMC6T。
如本文所揭示，GaNC6T為有效單股RNAi劑中之組分。在一些非限制性實例中GaNC6T處於倒數第二或倒數第三個核苷酸[自5'至3'計數]處；例如3'端二核苷酸之5'核苷酸，或最接近3'端二核苷酸之5'核苷酸之5'的核苷酸。在本文中所揭示之一些非限制性實例中，GaNC6T在21個核苷酸之位置20處(自5'端計數)，或25個核苷酸之位置24處(自5'端計數)。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑與三觸GalNAc酸結合(例如，經由C10、C3或三嗪連接基團)：此等結構表示受保護之型式，因為其包含-OAc (-O-乙酸酯基)。在一些實施例中，Ac基團在化合物結合至寡核苷酸之後的脫除保護基期間經去除。在一些實施例中，用濃縮氫氧化銨脫除保護基，例如如實例37B中所描述。在此等結構之經脫除保護基型式中，-OAc經-OH置換。
在一些實施例中，GalNAc部分結合在5'端處。 此等其他化學部分中之每一者(三觸GalNAc酸，藉由C12、C5或三嗪連接基團中之每一者)與PNPLA3寡核苷酸靶向因數XI (FXI)結合，其經由RNase H機制操作。
構築若干種寡核苷酸；各寡核苷酸包含PNPLA3寡核苷酸靶向因數XI (FXI)，其經由RNase H機制操作，其中各寡核苷酸藉由C12、C5或三嗪連接基團中之每一者與不同三觸GalNAc酸結合。實驗顯示(資料未展示)，三觸GalNAc酸改良寡核苷酸至肝臟之傳遞。
在一些實施例中，本發明係關於與三觸GalNAc酸結合之任何寡核苷酸。在一些實施例中，本發明係關於經由C10、C3或三嗪連接基團與三觸GalNAc酸結合之任何寡核苷酸。在一些實施例中，本發明係關於與三觸GalNAc酸結合之任何寡核苷酸，其中寡核苷酸導引由RNase H或RNA干擾機制介導之靶轉錄物之減量。在一些實施例中，本發明係關於經由C10、C3或三嗪連接基團與三觸GalNAc酸結合的任何寡核苷酸，其中寡核苷酸導引由RNase H或RNA干擾機制介導之靶轉錄物之減量。
在一些實施例中，本發明係關於與三觸GalNAc酸結合之任何寡核苷酸，其中寡核苷酸導引由RNase H或RNA干擾機制介導之靶轉錄物之減量，其中RNA干擾機制藉由包含1個、2個或更多個股之RNAi劑導引。在一些實施例中，本發明係關於經由C10、C3或三嗪連接基團與三觸GalNAc酸結合之任何寡核苷酸，其中寡核苷酸導引由RNase H或RNA干擾機制介導之靶轉錄物之減量，其中RNA干擾機制藉由包含1個、2個或更多個股之RNAi劑導引。
另外，本發明展示，對於能夠導引單股RNA干擾的所提供之寡核苷酸，單股RNAi劑之5'端上之第一核苷酸不必匹配靶轉錄物之序列之對應部分。
使用根據本發明之各種方法製備及表徵能夠導引單股RNA干擾之寡核苷酸。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物為表1A中所列PNPLA3寡核苷酸類型之單股RNAi劑。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物為如圖1中所說明之型式中之任一者所列的PNPLA3寡核苷酸類型之單股RNAi劑。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸能夠藉由RNase H介導之減量及RNA干擾兩者導引靶轉錄物之減量。此PNPLA3寡核苷酸在本文中經描述為雙機制或雜交寡核苷酸。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾之PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含任何另一化學部分，包括(但不限於)以下中之任一者所描述或參考之任何GalNAc部分：5,382,524、5,491,075、5,545,553、5,705,367、5,733,765、5,786,184、5,798,233、5,854,042、5,871,990、5,945,322、6,165,469、6,187,310、6,342,382、6,465,220、6,503,744、6,699,705、6,723,545、6,780,624、6,825,019、6,905,867、6,911,337、7,026,147、7,078,207、7,138,258、7,166,717、7,169,593、7,169,914、7,189,836、7,192,756、7,202,353、7,208,304、7,211,657、7,217,549、7,220,848、7,238,509、7,338,932、7,371,838、7,384,771、7,462,474、7,598,068、7,608,442、7,682,787、7,723,092、8,039,218、8,137,941、8,268,596、8,871,723或9,222,080。
雙機制或雜交寡核苷酸
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述或此項技術中已知之任何寡核苷酸之結構要素。
如本文所揭示，一些寡核苷酸能夠藉由RNase H介導之減量及RNA干擾兩者導引轉錄物標靶之減量。
如本文所揭示，一些寡核苷酸(包括(但不限於)本文中描述為雙機制或雜交寡核苷酸或雜交RNAi劑之彼等寡核苷酸)能夠藉由RNase H介導之減量及RNA干擾兩者導引轉錄物標靶之減量。
希望受任何特定理論束縛，本發明表明，相比僅能夠藉由RNase H介導之減量導引減量的PNPLA3寡核苷酸或僅能夠藉由RNA干擾導引減量的PNPLA3寡核苷酸，雜交寡核苷酸可具有特定優勢。舉例而言，若將若干種雜交寡核苷酸引入至同一細胞中，則一些但並非所有雜交寡核苷酸可參與RISC路徑；未參與RISC路徑之彼等雜交寡核苷酸可參與RNase H介導之路徑。舉例而言，若將若干種雜交寡核苷酸引入至同一細胞中，則一些但並非所有雜交寡核苷酸可參與RNase H介導之路徑；未參與RNase H介導之路徑的彼等雜交寡核苷酸可參與RISC路徑。不希望受任何特定理論束縛，本發明表明，相比僅能夠藉由RNase H介導之減量導引減量的PNPLA3寡核苷酸或僅能夠藉由RNA干擾導引減量的PNPLA3寡核苷酸，雜交寡核苷酸可能夠介導更有效之減量，因為雜交寡核苷酸能夠經由兩個路徑導引減量。在至少一些細胞中，RNase H活性及RNA干擾之水準可視細胞區室而不同。在一些實施例中，雜交寡核苷酸可經由RNase H介導之減量或RNA干擾於各種細胞區室中導引減量。在一些實施例中，若RNase H為寡核苷酸飽和的，則過量寡核苷酸可供用於RNA干擾介導之減量。在一些實施例中，若Ago-2為寡核苷酸飽和的，則過量寡核苷酸可供用於RNase H介導之減量。
在一些實施例中，雜交寡核苷酸包含允許經由RNase H介導之減量實現之減量及經由RNA干擾實現之減量兩者的結構。
據報導，RNase H及RNAi兩者涉及標靶mRNA之減量，但其涉及不同機制。據報導，RNase H天然包含單股DNA分子，其結合於mRNA標靶且藉由在空間上妨礙轉譯或藉由充當RNase H之受質的RNA/DNA雙螺旋體來降低表現，RNase H裂解mRNA標靶。
相比之下，據報導，RNAi天然包含雙股RNA分子，其天然地產自於Dicer與兩個3'懸垂物，包括反義股及有義股。該等股以雙螺旋體展開且反義股併入包括Argonaute-2之RISC (RNA干擾沉默複合體)中的形式間隔開。反義股充當RISC之導引物以鑑別互補mRNA標靶及使其裂解。如本文中所示，某些型式之單股RNAi劑亦有效，但單股RNAi劑並非天然地產自於Dicer。
據報導，RNase H及RISC天然地偏好結構上不同之兩種類型之分子。RNase H天然地使用單股DNA分子來靶向mRNA標靶，從而形成DNA/RNA雙螺旋體。據報導，RISC據報導天然地使用單股RNA反義股來靶向mRNA標靶，從而形成RNA/RNA雙螺旋體。Crooke等人 1995 Biochem. J. 312: 599-608；以及Elbashir等人 Nature 2001 411: 494。
Crooke等人 1995 Biochem. J. 312: 599-608亦報導，已結晶且研究大腸桿菌RNase H1，且較佳受質據報導為RNA/DNA雙螺旋體。據報導，在DNA股中，諸如2'-OMe及2'-F之2'修飾降低或消除RNase H活性。另外，據報導，對於RNA干擾，藉由DNA完全置換RNA能消除雙股RNAi劑之RNA干擾活性。Elbashir等人 2001 EMBO J. 20: 6877-6888。因此，據報導，RNase H介導之減量據報導需要一部分DNA (2'-去氧)，而RNA干擾可藉由用DNA (2'-去氧)置換一部分核苷酸來消除。
相比之下，如本文中所示，2'-OMe及2'-F修飾高度適用於單股RNAi劑。申請人因此設計及構築了若干種寡核苷酸，其包含：(a)包含2'-經修飾核苷酸之種子區域；以及(b)包含一連串2'-去氧(2'-去氧)核苷酸之種子後區域。其在本文中經展示經由RNAi及RNase H介導之減量機制起作用。
在一些實施例中，雜交寡核苷酸包含：(a)能夠連結至第一互補標靶mRNA區域且介導RNA干擾之種子區域；以及(b)包含2'-去氧(2'-去氧)區域之能夠連結第二互補標靶mRNA區域及導引RNase H介導之減量的種子後區域。種子區域可視情況包含RNA或經修飾核苷酸，例如具有2'修飾(包括(但不限於)2'-F、2'-OMe及2'-MOE)，其中RNA或經修飾核苷酸包含天然糖及/或天然鹼基、及/或經修飾鹼基、及/或核苷酸間鍵聯。
在至少一些情況下，對於RNase H介導之減量有效的DNA (2'-去氧)區域之最小長度據報導為約5個連續DNA (2'-去氧)；此最小去氧長度據報導與使用部分經純化之哺乳動物RNase H酶活體外進行高效RNase H活化所需之最小長度相關。Monia等人 1993 JBC 268: 14514-14522。
在一些實施例中，雜交寡核苷酸包含：(a)能夠連結至第一互補標靶mRNA區域之種子區域；以及(b)包含2'-去氧區域之種子後區域，其中雜交寡核苷酸能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者，其中2'-去氧區域包含至少5個連續2'-去氧。在一些實施例中，2'-去氧可為DNA或經修飾核苷酸，例如具有2'-去氧之經修飾核苷酸，其中DNA或經修飾核苷酸包含天然糖和/或天然鹼基、和/或經修飾鹼基、和/或任何核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，2'-去氧區域包含一連串連續核苷酸，其中各核苷酸為2'-去氧，且各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯。在一些實施例中，2'-去氧區域包含具有至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個核苷酸的一連串連續核苷酸，其中各核苷酸為2'-去氧，且各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯。
在一些實施例中，雜交寡核苷酸包含：(a)能夠連結至第一互補標靶mRNA區域之種子區域；以及(b)包含2'-去氧區域之種子後區域，其中雜交寡核苷酸能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者，其中2'-去氧區域包含至少5個連續2'-去氧。在一些實施例中，2'-去氧可為DNA或經修飾核苷酸，例如具有2'-去氧之經修飾核苷酸，其中DNA或經修飾核苷酸包含天然糖和/或天然鹼基、和/或經修飾鹼基、和/或任何核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，2'-去氧區域包含或為一部分連續核苷酸，其中各核苷酸為2'-去氧，且各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯。在一些實施例中，2'-去氧區域包含或為一連串連續核苷酸，其中各核苷酸為2'-去氧，且各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯。在一些實施例中，2'-去氧區域包含具有至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個核苷酸的一連串連續核苷酸，其中各核苷酸為2'-去氧，且各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯。
不希望受任何特定理論束縛，本發明指出，WO 2015/107 425已報導，由RNase H介導之裂解可藉由在導引RNase H裂解之反義寡核苷酸中之硫代磷酸酯中佈置對掌性中心來調節。舉例而言，放置藉由至少2或3個Sp側接之單一Rp可改變裂解模式，使得裂解位點之數目降低且RNase H介導之裂解之位點受控。
在一些實施例中，雜交寡核苷酸包含：(a)能夠連結至第一互補標靶mRNA區域之種子區域；以及(b)包含2'-去氧區域之種子後區域，其中雜交寡核苷酸能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者，其中2'-去氧區域包含具有至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個核苷酸的一連串連續核苷酸，其中各核苷酸為2'-去氧，且各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯。
在一些實施例中，雜交寡核苷酸包含：(a)能夠連結至第一互補標靶mRNA區域之種子區域；以及(b)包含2'-去氧區域之種子後區域，其中雜交寡核苷酸能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者，其中2'-去氧區域包含具有至少9個核苷酸之一連串連續核苷酸，其中各核苷酸為2'-去氧，且各核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯。
在一些實施例中，第一及第二互補標靶mRNA區域為同一標靶mRNA之區域。
在一些實施例中，第一及第二互補標靶mRNA區域為不同標靶mRNA之區域。
在雜交寡核苷酸之一些實施例中，種子區域包含能夠連結至互補標靶mRNA區域及導引RNase H介導之減量的DNA區域。
不希望受任何特定理論束縛，本發明指出，在許多情況下，RNase H裂解結合於單股DNA之單股RNA標靶。在一些實施例中，雜交寡核苷酸包含單股2'-去氧部分，其能夠結合於標靶RNA轉錄物，從而形成RNase H之受質。在一些實施例中，雜交寡核苷酸包含單股2'-去氧部分(其包含可為本文中描述或此項技術中已知之任何核苷酸間鍵聯的核苷酸間鍵聯)，其能夠結合於標靶RNA轉錄物，從而形成RNase H之受質。
在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：包含至少4個連續2'-去氧之一系列核苷酸。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：包含至少5個連續2'-去氧之一系列核苷酸。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：包含至少6個連續2'-去氧之一系列核苷酸。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：包含至少7個連續2'-去氧之一系列核苷酸。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：包含至少8個連續2'-去氧之一系列核苷酸。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：包含至少9個連續2'-去氧之一系列核苷酸。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：包含至少10至20個連續2'-去氧之一系列核苷酸。
在雜交寡核苷酸之一些實施例中，種子後區域包含：至少9個連續2'-去氧。在單股RNAi劑之一些實施例中，種子後區域包含：至少10個連續2'-去氧。各種單股RNAi劑及反義寡核苷酸介導RNA干擾或RNase H減量之能力描述於本文中且作為非限制性實例展示於圖式及表格中。
詳細地描述於本文別處之實驗性數據(未展示)證實，推定之雙機制寡核苷酸能夠介導RNA干擾及RNase H減量兩者。RNA干擾以兩種不同之活體外Ago-2分析進行測試，且RNase H減量以活體外RNase H分析進行測試。
實驗使用RNase H分析，用WV-1868 (ASO，介導RNase H減量機制)作為陽性對照，且用WV-2110 (單股RNAi劑)作為陰性對照。RNA分子WV-2372用作測試受質。在RNase H分析中，雙機制寡核苷酸WV-2111介導RNase H減量。
對偶基因特異性抑制
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠介導對偶基因特異性抑制(或對偶基因特異性減量)。
在一些實施例中，在一些疾病病況下，患者(例如，人類患者)可包含同一基因之兩個複本，其中一個複本為野生型(其不與疾病相關)，而另一染色體上之另一複本具有突變(其與疾病相關)。在一些實施例中，野生型及突變型對偶基因可藉由突變處之特定序列區分，或可另外藉由有害突變外部(例如，SNP處)之序列區分。有時可能不期望使突變型及野生型對偶基因兩者減量，因為野生型基因之表現可能係必需或有益的，而突變型基因之表現可能有害或與疾病相關。
在一些實施例中，靶序列可經設計，相對於野生型轉錄物，該靶序列較佳地識別突變型轉錄物(例如，包含有害突變或目標SNP的突變型轉錄物)。
在一些實施例中，在被稱為對偶基因特異性抑制或對偶基因特異性減量之過程中，對偶基因特異性寡核苷酸使突變型對偶基因之減量達至最高，同時使野生型對偶基因之減量降至最低。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸能夠選擇性地靶向基因之突變型對偶基因。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸能夠以相較於野生型對偶基因至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50倍之特異性阻斷突變型對偶基因之基因表現。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸能夠選擇性地靶向基因之突變型對偶基因，其中突變型對偶基因由一個對偶基因表示且野生型對偶基因由不同之對偶基因表示。在一些實施例中，突變可為雙突變(例如，通常一起出現於同一基因組中的十分靠近之兩個突變)。在一些實施例中，突變處於PNPLA3中。在一些實施例中，突變為PNPLA3中之雙突變。在一些實施例中，I148M突變處於PNPLA3中。在一些實施例中，對偶基因特異性寡核苷酸為反義寡核苷酸。在一些實施例中，對偶基因特異性寡核苷酸為PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑。在一些實施例中，對偶基因特異性寡核苷酸為PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑，其具有或包含本文中描述之任何型式或結構。
在一些實施例中，在被稱為對偶基因特異性抑制之過程中，對偶基因特異性RNAi劑使突變型對偶基因之減量達至最高，同時使野生型對偶基因之減量降至最低。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑能夠選擇性地靶向基因之突變型對偶基因。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑能夠以相較於野生型對偶基因至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50倍之特異性阻斷突變型對偶基因之基因表現。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑能夠選擇性地靶向基因之突變型對偶基因，其中突變型對偶基因由一個對偶基因表示，且野生型對偶基因由不同之對偶基因表示。在一些實施例中，突變可為雙突變(例如，通常一起出現於同一基因組中的十分靠近之兩個突變)。在一些實施例中，突變處於PNPLA3中。在一些實施例中，突變為PNPLA3中之雙突變。在一些實施例中，I148M突變處於PNPLA3中。
在一些實施例中，設計對偶基因特異性RNAi劑之方法之非限制性實例為將SNP或單核苷酸多形現象併入至鹼基序列中，其中突變型對偶基因由SNP之一個對偶基因表示，且野生型對偶基因由SNP之不同的對偶基因表示。在一些實施例中，SNP可處於並非疾病相關突變之位點，但用以區分兩個對偶基因之位置。
在一些實施例中設計對偶基因特異性RNAi劑之方法之非限制性實例為將突變併入鹼基序列中，其中突變型對偶基因由一個對偶基因表示，且野生型對偶基因由不同之對偶基因表示。在一些實施例中，突變可為雙突變(例如，通常一起出現於同一基因組中的十分靠近之兩個突變)。在一些實施例中，突變處於PNPLA3中。在一些實施例中，突變為PNPLA3中之雙突變。在一些實施例中，I148M突變處於PNPLA3中。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑包含區分基因之突變型與野生型對偶基因且能夠相對於野生型對偶基因選擇性地阻斷突變型對偶基因基因表現的SNP或另一序列。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑之靶序列表示靶轉錄物之一個對偶基因。
如本發明中所示，所提供之單股RNAi劑能夠導引對偶基因特異性RNA干擾，其中ssRNAi能夠阻斷具有一個序列(例如，突變型序列)之標靶mRNA之基因表現，但不會或不會顯著地使具有相關之不同序列(例如，突變型序列之野生型型式)之標靶mRNA減量。在一些實施例中，突變型及野生型序列在一個鹼基位置處不同。在一些實施例中，突變型及野生型序列在兩個鹼基位置處不同。在一些實施例中，突變型及野生型序列在三個鹼基位置處不同。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑能夠導引抵抗靶基因之對偶基因的RNA干擾，而在相同濃度下，其不介導抵抗靶基因之不同對偶基因的RNA干擾。
在一些實施例中，能夠導引對偶基因特異性抑制之PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑在其鹼基序列中包含在特定位置處之一或多個SNP。此等特定位置可為已知或懷疑對錯配敏感之位置；例如此等位置中之一或多者處之錯配可改變RNAi活性之水準。參見例如Miller等人 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 7195-7200；Brummelkamp等人 2002 Cancer Cell 2: 243；及Naito等人 2004 Nucl. Acids Res. 32: W124-W129。在許多情況下，種子區域與mRNA標靶之完全互補對於高RNAi活性係必需或有益的；相比之下，在許多情況下，在5'核苷酸部分或3'端二核苷酸處不需要互補。在一些實施例中，對偶基因特異性單股RNAi劑在種子區域中具有SNP。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑能夠介導對偶基因特異性抑制。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸能夠介導對偶基因特異性抑制。
在一些實施例中，單股RNAi劑能夠介導對偶基因特異性抑制。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑能夠介導PNPLA3之對偶基因特異性抑制。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸能夠介導PNPLA3之對偶基因特異性抑制。
在一些實施例中，單股RNAi劑能夠介導PNPLA3之對偶基因特異性抑制。
在一些實施例中，對偶基因特異性單股RNAi劑在種子區域中具有SNP，其處於種子與3'端二核苷酸之間。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑具有在任何位置處包含一或多個SNP之鹼基序列。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑具有在選自以下之任何位置處包含一或多個SNP之鹼基序列：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑具有在種子區域內部之任何位置處包含一或多個SNP的鹼基序列。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑具有在種子區域外部之任何位置處包含一或多個SNP的鹼基序列。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑具有在種子後區域中之任何位置處包含一或多個SNP的鹼基序列。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑具有在以下位置中之任一者處包含一或多個SNP的鹼基序列：8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑具有在位置14或17中之任一者處包含一或多個SNP的鹼基序列。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑具有在位置9或10中之任一者處包含一或多個SNP的鹼基序列。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑具有包含兩個或更多個SNP之鹼基序列。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑具有包含兩個SNP之鹼基序列。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑具有包含兩個SNP (在位置14及17處各一個)之鹼基序列。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑能夠導引相對於基因之野生型對偶基因抵抗同一基因之突變型對偶基因的對偶基因特異性抑制。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑能夠導引相對於PNPLA3之野生型對偶基因抵抗PNPLA3之突變型對偶基因的對偶基因特異性抑制。
表70A展示活體外效力及藉由不同PNPLA3單股RNAi劑導引之對偶基因特異性抑制。所測試寡核苷酸為：Huh7及Hep3B細胞中之WV-3387。表70B及表70C展示靶向PNPLA3之不同單股RNAi劑的活體外效力及IC50。所測試寡核苷酸為：WV-4054及WV-4098。WV-4054具有與位置14及17處的一對SNP (rs738408 T及rs738409 G)互補的序列，且能夠介導抵抗包含此等兩個SNP之細胞(Huh7)之對偶基因特異性RNA干擾。在所測試濃度下，在並不包含此等SNP而是具有rs738408C及rs738409 C之不同細胞(Hep3B)中，此寡核苷酸不介導顯著RNAi干擾。另外，單股RNAi劑WV-4098亦能夠阻斷互補序列(與Huh7細胞中之SNP rs738408 T及rs738409 G)之基因表現，但在所測試濃度下，不阻斷非互補序列(與Hep3B細胞中之SNP rs738408C及rs738409 C)之基因表現。
表71展示活體外效力及藉由單股RNAi劑導引之對PNPLA3之對偶基因特異性減量。所測試寡核苷酸為：表71A，WV-2477、WV-3387及WV-4054；表71B，非對偶基因特異性對照ASO WV-3387；以及表71C，對偶基因特異性ssRNAi WV-4054。
表90A至90F展示靶向PNPLA3之不同寡核苷酸之活體外對偶基因特異性抑制。所測試寡核苷酸中之I148M中的雙突變展示於表90A中，作為所測試之寡核苷酸型式之草圖。具有I148M雙突變之寡核苷酸經測試抵抗：Hep3B細胞(野生型)及Huh7細胞(具有雙突變)。寡核苷酸用脂染胺傳遞，且在48小時時測試細胞。所測試之寡核苷酸為：表90B，WV-7778至WV-7793，以及WV-3858至WV-3864；表90C，WV-7794至WV-7816；表90D，WV-7817至WV-7839；表90E，WV-7840至WV-7862；以及表90F，WV-993、WV-3390及WV-4054，其中WV-4054為單股RNAi劑。在此等數據中，使用之寡核苷酸為具有翼-核心-翼型式之反義寡核苷酸，其中核心為2'-去氧硫代磷酸酯(在立體化學中無規)，且翼為完整2'-OMe、完整2'-MOE或具有5'及3'端LNA之所有2'-OMe或具有5'及3'端LNA之所有2'-MOE。翼亦為磷酸二酯以及5'及3'端立體無規硫代磷酸酯。
資料證實，許多寡核苷酸能夠導引對偶基因特異性抑制(例如，對偶基因特異性減量)。表90B至90E中所示之寡核苷酸展示Huh7細胞中的突變型對偶基因之顯著減量及Hep3B細胞中的野生型對偶基因之相對較少減量。即使在翼中，單一錯配亦足以介導對偶基因特異性抑制；然而，在至少一些情況下，對偶基因特異性抑制在DNA核心中存在兩個錯配時提高。
不希望受任何特定理論束縛，本發明指出，在許多情況下，立體受控對掌性核苷酸間鍵聯(代替立體無規對掌性核苷酸間鍵聯)之引入可增加PNPLA3寡核苷酸之對偶基因特異性抑制、穩定性、功效、特異性、傳遞及/或白蛋白結合。
在一些實施例中，能夠介導對偶基因特異性抑制之PNPLA3寡核苷酸包含一或多個立體純對掌性核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，能夠介導對偶基因特異性抑制之PNPLA3寡核苷酸包含呈Sp組態之一或多個立體純對掌性核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，能夠介導對偶基因特異性抑制之PNPLA3寡核苷酸包含呈Sp組態之一或多個立體純對掌性核苷酸間鍵聯及呈Rp組態之一或多個立體純對掌性核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，能夠介導對偶基因特異性抑制之PNPLA3寡核苷酸包含一或多個立體純硫代磷酸酯。
在一些實施例中，能夠介導對偶基因特異性抑制之PNPLA3寡核苷酸包含呈Sp組態之一或多個立體純硫代磷酸酯。
在一些實施例中，能夠介導對偶基因特異性抑制之PNPLA3寡核苷酸包含呈Rp組態之一或多個立體純硫代磷酸酯。
在一些實施例中，能夠介導對偶基因特異性抑制之PNPLA3寡核苷酸包含呈Sp組態之一或多個立體純硫代磷酸酯及呈Rp組態之一或多個立體純硫代磷酸酯。
在一些實施例中，能夠對偶基因-特異性抑制靶基因或其基因產物之PNPLA3寡核苷酸可包含本文中描述之任何結構或型式。
寡核苷酸之多聚體
在一些實施例中，多聚體包含以下中之兩者或多者：PNPLA3寡核苷酸、導引RNA干擾的PNPLA3寡核苷酸、導引RNase H介導之減量的PNPLA3寡核苷酸及/或導引RNA干擾及RNase H介導之減量兩者的PNPLA3寡核苷酸可具有本文中描述或此項技術中已知的任何型式或其結構要素。
在一些實施例中，所提供之組合物包含一或多種所提供之寡核苷酸類型之組合。化學及醫藥技術中之技術人員將認識到，所提供組合物中之一或多種類型之所提供寡核苷酸中之每一者的選擇及量將視彼組合物之預期用途而定。換言之，相關技術之技術人員將設計所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物，使得其中所含之所提供寡核苷酸之量及類型使該組合物總體上具有某些合乎需要之特徵(例如，生物學上合乎需要、治療上合乎需要等)。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸類型係選自WO/2014/012081及WO/2015/107425中所描述之彼等類型，其中每一者之寡核苷酸、寡核苷酸類型、寡核苷酸組合物及其方法以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物包含選自WO/2014/012081及WO/2015/107425中所描述之彼等PNPLA3寡核苷酸類型之寡核苷酸。
在一些實施例中，本發明係關於包含對掌性受控寡核苷酸組合物的組合物，其中寡核苷酸之序列包含本文中所揭示之任何對掌性受控寡核苷酸組合物的序列或由該序列組成。
在一些實施例中，本發明係關於包含對掌性受控寡核苷酸組合物的組合物，其中寡核苷酸之序列包含表1A中所列或本文中以其他方式描述之任何單股RNAi劑組合物之序列或由該序列組成。
在一些實施例中，本發明係關於包含寡核苷酸(例如單股RNAi劑、反義寡核苷酸及/或其他寡核苷酸)之多聚體之組合物，其中之至少一者具有如本文中所描述之結構、序列或其他特徵。
在一些實施例中，本發明係關於包含單股RNAi劑、反義寡核苷酸及/或其他寡核苷酸之多聚體的組合物，其中多聚體之大小為至少約16 kD。
在一些實施例中，本發明係關於包含單股RNAi劑、反義寡核苷酸及/或其他寡核苷酸之多聚體的組合物，且進一步包含碳水化合物部分、脂質部分、靶向部分或其他化合物。
在一些實施例中，本發明係關於包含單股RNAi劑、反義寡核苷酸及/或其他寡核苷酸之多聚體的組合物，且進一步包含碳水化合物部分、脂質部分、靶向部分或其他化合物，其總重量之大小為至少約16 kD。
在一些實施例中，多聚體可包含至少2種單股RNAi劑，反義寡核苷酸及/或其他寡核苷酸。在一些實施例中，多聚體可包含至少3種單股RNAi劑，反義寡核苷酸及/或其他寡核苷酸。在一些實施例中，多聚體可包含至少4種單股RNAi劑，反義寡核苷酸及/或其他寡核苷酸。在一些實施例中，多聚體可包含至少5種單股RNAi劑，反義寡核苷酸及/或其他寡核苷酸。在一些實施例中，多聚體可包含至少6種單股RNAi劑，反義寡核苷酸及/或其他寡核苷酸。在一些實施例中，多聚體可包含至少7種單股RNAi劑，反義寡核苷酸及/或其他寡核苷酸。在一些實施例中，多聚體可包含至少8種單股RNAi劑，反義寡核苷酸及/或其他寡核苷酸。在一些實施例中，多聚體可包含至少9種單股RNAi劑，反義寡核苷酸及/或其他寡核苷酸。在一些實施例中，多聚體可包含至少10種單股RNAi劑，反義寡核苷酸及/或其他寡核苷酸。
不希望受任何特定理論束縛，本發明表明,寡核苷酸之多聚化可提供具有足以經由淋巴系統輸送之總分子量的多聚體。Supersaxo等人報導，藥物之分子量與經淋巴吸收之劑量之比例之間存在線性關係，且分子量超過16 kD之分子主要由淋巴管吸收，該等淋巴管汲取皮下注射位點。Supersaxo等人 1990 Pharm. Res. 7: 167-9。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有約8 kD之分子量。在一些實施例中，包含多個寡核苷酸之多聚體具有至少約16 kD之分子量。
不希望受任何特定理論束縛，本發明指出，皮下注射據報導廣泛地用於藥物之傳遞，包括(但不限於)經口可用性有限之彼等藥物，或作為修飾或延長釋放曲線之手段的彼等藥物。McLennan等人 2005 Drug Disc. Today: Technologies 2: 89-96。據報導，皮下注射促成至皮膚之真皮下方之間質區域的傳遞，藥物自此進入循環系統或淋巴系統；據報導，輸送受分子量、粒徑、電荷、親水性及與間質中之組分之相互作用影響。據報導，諸如藥物濃度、注射量、離子強度、黏度及pH之藥物調配物特徵全部亦可在自皮下注射位點之擴散中起到作用。McLennan等人 2005；Paniagua等人 2012 Lymphology 45：144-153；以及Bagby等人 2012 Pharmaceutics 4: 276-295。
在一些實施例中，分子量、粒徑、電荷、親水性及與間質中之組分之相互作用、藥物濃度、注射量、離子強度、黏度及/或pH中之一或多個特性經調節以改良包含PNPLA3寡核苷酸之組合物之功效、生物可用性或傳遞或使功效、生物可用性或傳遞達至最高。
如上文所指出，據報導，分子量超過16 kD之分子主要由淋巴管吸收。Supersaxo等人 1990 Pharm. Res. 7: 167-9。在一些實施例中，本發明係關於一種包含寡核苷酸之多聚體的組合物，其中多聚體具有至少約16 kD之總分子量。在一些實施例中，本發明係關於一種包含兩種或更多種不同類型或大小之寡核苷酸多聚體的組合物，其中不同類型之多聚體中之一或多者具有至少約16 kD之總分子量。
在一些實施例中，多聚體中之各寡核苷酸可靶向相同或不同標靶。在其中多聚體中之各寡核苷酸可靶向相同或不同標靶的一些實施例中，多聚體之投與可用於治療涉及過度表現或多個靶基因之疾病。在其中多聚體中之各寡核苷酸可靶向相同或不同標靶的一些實施例中，多聚體之投與可用於治療涉及不同靶基因之過度表現的不同疾病。
在一些實施例中，多聚體中之各寡核苷酸可靶向同一標靶中之同一序列。在一些實施例中，多聚體中之各寡核苷酸可靶向同一標靶中之不同序列。
多聚體之非限制性實例展示於表89A中。
在一些實施例中，多聚體包含彼此直接連接(例如，經由一鍵或直接鍵，諸如共價鍵)或經由連接基團連接的兩個或更多個寡核苷酸。
本文中描述或此項技術中已知之任何連接基團可用於連接多聚體中之寡核苷酸。用於構築多聚體及使用各種連接基團之各種方法說明於表89B及表89C中。
不希望受任何特定理論束縛，本發明指出，在至少一些情況下，呈Rp組態之硫代磷酸酯對核酸酶裂解尤其敏感。在2型多聚體之一些實施例中，多聚體為實質上單一長寡核苷酸，其中寡核苷酸包含多個較短之寡核苷酸，其藉由短連接基團寡核苷酸連接。在2型多聚體之一些實施例中，多聚體為實質上單一長寡核苷酸，其中寡核苷酸包含多個較短之寡核苷酸，其藉由短連接基團寡核苷酸連接，其中短連接基團寡核苷酸包含呈Rp組態之一或多個核苷酸間鍵聯。在2型多聚體之一些實施例中，多聚體為實質上單一長寡核苷酸，其中寡核苷酸包含多個較短之寡核苷酸，其藉由短連接基團寡核苷酸連接，其中短連接基團寡核苷酸包含呈Rp組態之一或多個硫代磷酸酯。
連接基團之非限制性實例包括：可裂解連接基團或生物可降解連接基團；不可裂解或非生物可降解連接基團；包含呈Rp組態之包含對掌性中心之一或多個核苷酸間鍵聯的連接基團；包含呈Rp組態之包含對掌性磷之一或多個核苷酸間鍵聯的連接基團；包含呈Rp組態之一或多個硫代磷酸酯的連接基團；包含呈Rp組態之兩個或更多個硫代磷酸酯的連接基團；包含呈Rp組態之三個或更多個硫代磷酸酯的連接基團；可光裂解連接基團；1-(5-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-2-硝基苯基)乙醇N-羥基丁二醯亞胺酯；包含順丁烯二醯亞胺基部分之連接基團；包含N-羥基丁二醯亞胺酯部分的連接基團；在鹼基處與PNPLA3寡核苷酸結合的連接基團；在核苷酸間鍵聯處與PNPLA3寡核苷酸結合的連接基團；結合於糖處之連接基團；磷酸二酯；磷酸三酯；磷酸甲酯；P3'→N5'胺基磷酸酯；N3'→P5'胺基磷酸酯；N3'→P5'硫代胺基磷酸酯；硫代磷酸酯鍵聯；硫脲連接基團；C5或C6連接基團，如美國專利第9,572,891號中所描述；包含烷基、環烷基、芳基、雜環基及雜芳基的連接基團；包含經取代烷基、環烷基、芳基、雜環基及雜芳基的連接基團；美國專利第9,512,163號之式(A)結構的連接基團；包含C1-C12烴基鏈的連接基團；聚乙二醇連接基團；六甘醇連接基團；烴基鏈；經取代烴基鏈；包含以下中之一或多者的連接基團：烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基或炔基雜芳基；包含具有選自以下之胺基酸序列之肽的連接基團：ALAL、APISFFELG、FL、GFN、R/KXX、GRWHTVGLRWE、YL、GF及FF，其中X為任何胺基酸；包含式-(CH2)wS-S(CH2)m-的連接基團，其中n及m獨立地為0至10之整數；包含低pH不穩定鍵的連接基團；包含低pH不穩定鍵的連接基團，包含胺、亞胺、酯、苯甲酸亞胺、胺基酯、二原酯、聚磷酸酯、聚磷氮烯、縮醛、乙烯基醚、腙、疊氮基甲基-甲基順丁烯二酸酐、硫代丙酸酯、掩蔽之核內體溶解劑或檸康醯基；分支鏈連接基團；對裂解劑(例如pH、氧化還原電勢或降解分子之存在)敏感的可裂解連接基團；氧化還原可裂解連接基團；基於磷酸酯之可裂解連接基團；基於磷酸酯之可裂解連接基團，包含--O--P(O)(OH)--O--、--O--P(S)(OH)--O--、--O--P(S)(SH)--O--、--S--P(O)(OH)--O--、--O--P(O)(OH)--S--、--S--P(O)(OH)--S--、--O--P(S)(OH)--S--、--S--P(S)(OH)--O--、--O--P(O)(H)--O--、--O--P(S)(H)--O--、--S--P(O)(H)--O--、--S--P(S)(H)--O--、--S--P(O)(H)--S--或--O--P(S)(H)--S--；酸可裂解連接基團；基於酯之連接基團；基於肽之可裂解連接基團；以及包含此等連接基團中之任一者的部分。
在一些實施例中，連接基團包含相比對於藉由靶向寡核苷酸之裂解，對於藉由哺乳動物提取物中之肽鏈內切酶之裂解更敏感的多肽。在一些實施例中，肽鏈內切酶為胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶或肽鏈內切酶V8。在一些實施例中，肽鏈內切酶為組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、組織蛋白酶L、組織蛋白酶C、番木瓜蛋白酶、組織蛋白酶S或核內體酸性胰島素酶。
寡核苷酸之多聚化的各種連接基團及方法作為非限制性實例描述於以下中：美國專利第9,370,582號、第9,371,348號、第9,512,163號、第9,572,891號及第6,031,091號；以及國際公開專利申請案WO1998000435、WO2014043544及WO2013040429。
本發明亦指出，本文中描述或此項技術中已知之任何連接基團可用於使一或多個寡核苷酸彼此連接，或連接一或多個部分(作為非限制性實例，靶向部分、碳水化合物部分、GalNAc部分、脂質部分等)與一或多個寡核苷酸(作為非限制性實例，單股RNAi劑、反義寡核苷酸、雙股RNAi劑、能夠導引或抑制外顯子跳過之PNPLA3寡核苷酸等)。用於製備寡核苷酸及組合物之實例方法
用於製備所提供之寡核苷酸及寡核苷酸組合物的方法為此項技術中廣泛已知的，包括(但不限於) WO/2010/064146、WO/2011/005761、WO/2013/012758、WO/2014/010250、US2013/0178612、WO/2014/012081、WO/2015/107425、PCT/US2016/043542及PCT/US2016/043598中所描述之彼等方法，其中每一者之方法及試劑以引用的方式併入本文中。
對掌性受控寡核苷酸 .
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸為對掌性受控的。
在一些實施例中，本發明提供對掌性受控寡核苷酸組合物，其相較於參考條件[例如不存在該組合物，存在參考組合物(例如，具有同一鹼基序列、相同化學修飾等之寡核苷酸的立體無規組合物、PNPLA3寡核苷酸或另一立體異構體之單股RNAi劑等)，及其組合]能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。
在一些實施例中，本發明提供對掌性受控寡核苷酸組合物，其相較於參考條件[例如不存在該組合物，存在參考組合物(例如，具有同一鹼基序列、相同化學修飾等之寡核苷酸的立體無規組合物、PNPLA3寡核苷酸或另一立體異構體之單股RNAi劑等)，及其組合]經由單股RNA干擾或RNase H介導轉錄物之改良減量。
本發明尤其提供包含一或多種特定核苷酸類型之對掌性受控ssRNAi劑及對掌性受控組合物。在一些實施例中，如本文所用，片語「寡核苷酸類型」定義具有特定鹼基序列、主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及主鏈磷修飾模式(例如，「-XLR1 」基團)之PNPLA3寡核苷酸。具有共同指定「類型」之寡核苷酸就鹼基序列、主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及主鏈磷修飾模式而言，在結構上彼此相同。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸類型之寡核苷酸相同。
在一些實施例中，本發明中所提供之對掌性受控寡核苷酸或單股RNAi劑的特性不同於對應立體無規寡核苷酸或單股RNAi劑混合物之彼等特性。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸或單股RNAi劑的親脂性不同於立體無規寡核苷酸或單股RNAi劑混合物之親脂性。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸或單股RNAi劑在HPLC上之滯留時間不同。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸或單股RNAi劑之峰值滯留時間可顯著不同於對應立體無規寡核苷酸或單股RNAi劑混合物之彼峰值滯留時間。在使用HPLC如此項技術中一般所實踐進行寡核苷酸或單股RNAi劑純化期間，某些對掌性受控寡核苷酸或單股RNAi劑將大部分(若非全部)被消耗。在使用HPLC如此項技術中一般所實踐進行寡核苷酸或單股RNAi劑純化期間，某些對掌性受控寡核苷酸或單股RNAi劑將大部分(若非全部)被消耗。結果之一為在分析中不能測試到立體無規寡核苷酸或單股RNAi劑混合物之某些非對映異構體(某些對掌性受控寡核苷酸或單股RNAi劑)。另一結果為視批次而定，歸因於不可避免的儀器及人為誤差，假設「純淨」之立體無規寡核苷酸或單股RNAi劑將具有不一致之組合物，此係因為組合物中之非對映異構體以及其相對及絕對量因批次而不同。本發明中提供之對掌性受控寡核苷酸或單股RNAi劑及對掌性受控寡核苷酸或單股RNAi劑組合物克服此等問題，因為對掌性受控寡核苷酸或單股RNAi劑以對掌性受控方式以單一非鏡像異構物(非對映異構體)形式合成，且寡核苷酸或單股RNAi劑包含預定含量之一或多種個別寡核苷酸或單股RNAi劑類型。
化學及合成技術中之技術人員應瞭解，本發明之合成方法在所提供之單股RNAi劑之各合成步驟期間提供一定程度之控制，使得單股RNAi劑之各核苷酸單元可提前設計及/或選擇，以在鍵聯磷處具有特定立體化學及/或在鍵聯磷處具有特定修飾、及/或特定鹼基、及/或特定糖。在一些實施例中，提前設計及/或選擇所提供之單股RNAi劑，以在核苷酸間鍵聯之鍵聯磷處具有特定立體異構中心組合。
在一些實施例中，所提供的使用本發明方法製得之單股RNAi劑經設計及/或確定具有特定的鍵聯磷修飾組合。在一些實施例中，所提供的使用本發明方法製得之單股RNAi劑經設計及/或確定具有特定的鹼基組合。在一些實施例中，所提供的使用本發明方法製得之單股RNAi劑經設計及/或確定具有特定的糖組合。在一些實施例中，所提供的使用本發明方法製得之單股RNAi劑經設計及/或確定具有以上結構特徵中之一或多者之特定組合。
本發明方法證實高度對掌性控制。舉例而言，本發明方法有助於控制所提供之單股RNAi劑內之每一單一鍵聯磷之立體化學組態。在一些實施例中，本發明方法提供一種單股RNAi劑，其包含獨立地具有式I結構之一或多個經修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，本發明方法提供一種單股RNAi劑，其為單聚體。在一些實施例中，本發明方法提供一種單股RNAi劑，其為組態R p之單聚體。在一些實施例中，本發明方法提供一種單股RNAi劑，其為組態S p之單聚體。
在一些實施例中，本發明方法提供一種對掌性受控單股RNAi劑組合物，亦即含有預定含量之個別單股RNAi劑類型的單股RNAi劑組合物。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑包含一種單股RNAi劑類型。在一些實施例中，單股RNAi劑包含超過一種單股RNAi劑類型。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑組合物包含複數種寡核苷酸及/或單股RNAi劑類型。本文中描述根據本發明製得之實例對掌性受控寡核苷酸及單股RNAi劑組合物。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含對掌性核苷酸間鍵聯(例如，經立體受控)。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含經立體受控之對掌性核苷酸間鍵聯及未經立體受控之對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸包含經立體受控之對掌性核苷酸間鍵聯及非對掌性之核苷酸間鍵聯。經立體受控(對掌性受控)寡核苷酸之型式之各種非限制性實例展示於表71A至表71C中。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S1之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S2之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S3之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S4之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S5之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S6之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S7之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S8之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S9之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S10之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S11之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S12之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S13之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S14之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S15之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S16之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S17之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S18之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S19之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S20之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S21之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S22之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S23之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S24之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S25之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S26之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S27之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S28之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S29之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S30之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S31之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S32之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S33之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S34之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S35之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S36之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S37之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S38之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S39之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S40之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S41之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S42之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S43之結構。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸具有型式S44之結構。
在一些實施例中，就鍵聯磷之組態而言，本發明方法提供對掌性純組合物。換言之，在一些實施例中，本發明方法提供組合物，其中就鍵聯磷之組態而言，寡核苷酸以單一非鏡像異構物形式存在於組合物中。
在一些實施例中，就鍵聯磷之組態而言，本發明方法提供對掌性均一組合物。換言之，在一些實施例中，本發明方法提供組合物，其中就鍵聯磷之組態而言，其中的所有核苷酸單元皆具有相同立體化學，例如所有核苷酸單元在鍵聯磷處皆為R p組態或所有核苷酸單元在鍵聯磷處皆為S p組態。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑包含至少一個Sp (例如，呈Sp組態之硫代磷酸酯或具有對掌性中心之其他核苷酸間鍵聯)。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑包含至少5個Sp。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑包含至少10個Sp。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑包含至少15至25個Sp。
如本文中所示，一或多個Sp核苷酸間鍵聯或一或多個Sp PS (硫代磷酸酯)之併入執行單股RNAi劑之兩個功能：(a)其增大抵抗核酸酶之穩定性；以及(b)不干擾RNA干擾活性。雖然單股RNAi劑及雙股RNAi劑在許多態樣中不同，但本發明指出，據報導，已針對雙股RNAi劑嘗試許多化學修飾，其中該等修飾不會：(a)穩定抵抗核酸酶之分子；以及(b)實現RNA干擾活性。據報導，許多化學修飾執行一個功能而不執行另一個功能。據報導，雙股RNAi劑之一些化學修飾使抵抗核酸酶之分子穩定，但干擾或消除RNAi活性。據報導，雙股RNAi劑之其他化學修飾既不干擾RNAi活性，亦不穩定抵抗核酸酶之分子。參見例如Czauderna等人 2003 Nucl. Acids Res. 31: 2705-2716；Hadwiger等人 2005,第194-206頁, RNA interference Technology,K. Appasani編, Cambridge University Press, Cambridge, UK；Deleavey等人 2009 Curr. Prot. Nucl. Acid Chem. 16.3.1 - 16.3.22；Terrazas等人 2009 Nucl. Acids Res. 37: 346-353；Schwarz等人 2002 Mol. Cell 10: 537-548；以及Lipardi等人 2001 Cell 107: 299-307。僅雙股RNAi劑之少數化學修飾能夠執行兩個功能。另外，Matranga等人2005 Cell 123: 607-620展示，單一Sp核苷酸間鍵聯(例如，單一Sp PS)至雙股RNAi劑之有義股的引入大大降低RISC組裝及RNA干擾活性。因此，具有單一Sp核苷酸間鍵聯(例如，單一Sp PS)之雙股RNAi劑之化學修飾不能(b)實現RNA干擾活性。因此，本發明力圖測試將核苷酸間鍵聯或Sp PS併入至單股RNAi劑的效應。本文中展示之資料展示，出人意料地，Sp核苷酸間鍵聯或Sp PS之併入執行單股RNAi劑之兩個功能：(a)其增大抵抗核酸酶之穩定性；以及(b)不干擾RNA干擾活性。
如展示於表45中之資料所示，單股RNAi劑抵抗核酸酶之穩定性藉由將5'端及/或3'端處之立體無規硫代磷酸酯轉化成呈Sp組態之硫代磷酸酯來提高。穩定性之其他提高藉由將本文中鑑別之核酸酶裂解位點處之立體無規硫代磷酸酯轉化成呈Sp組態之硫代磷酸酯來獲得。
不希望受任何特定理論束縛，本發明表明，硫代磷酸酯或呈Sp組態之其他對掌性核苷酸間鍵聯之併入可保護單股RNAi劑免受核酸酶影響。實驗顯示立體無規單股RNAi劑WV-2817中鑑別之核酸酶裂解位點，其靶向不同之基因APOC3。此等主要裂解位點位於兩個嘧啶之間(5'-U'U-3'、5'-U'U-3'或5'-T'U-3'，其中'指示裂解位點)。鑑別了立體無規單股RNAi劑WV-3242之其他主要核酸酶裂解位點：5'-U'U-3'、5'-C'U-3'及5'-T'U-3'。六個主要核酸酶裂解位點之中，五個處於兩個相鄰嘧啶之間，且一個鄰近一嘧啶。展示於表45中之實驗性數據指示用Sp核苷酸間鍵聯(或呈Sp組態之對掌性核苷酸間鍵聯，例如Sp PS或呈Sp組態之硫代磷酸酯)置換核酸酶裂解位點中之一或多者會大大提高單股RNAi劑之穩定性。
包含多個Sp核苷酸間鍵聯(例如，Sp PS)之單股RNAi劑亦經測試以確定Sp是否消除RNAi活性。本發明指出，先前操作展示許多立體無規寡核苷酸在轉化成經立體受控型式時可降低或完全喪失其酶活性或生物活性。對於許多前述寡核苷酸，Sp核苷酸間鍵聯之引入可降低或消除活性。
表44展示，出人意料地，除提高穩定性以外，用Sp核苷酸間鍵聯(例如，Sp PS)置換多個核苷酸間鍵聯(無論係立體無規抑或磷酸二酯)不會降低或消除單股RNAi劑之RNA干擾活性。此等結果亦出人意料，因為據報導，已知Sp PS至立體無規寡核苷酸之引入在許多情況下會降低生物活性。因此，一或多個Sp核苷酸間鍵聯或Sp PS之引入既提高單股RNAi劑之穩定性，又不會降低或消除RNAi活性。
表69A至表69C亦展示，出人意料地，除提高穩定性以外，用Sp核苷酸間鍵聯(例如，Sp PS)置換多個核苷酸間鍵聯(無論係立體無規抑或磷酸二酯)提高單股RNAi劑之穩定性且同時不會降低或消除其RNA干擾活性。在一些情況下，提高了活性。此等結果亦出人意料，因為據報導，已知Sp PS至立體無規寡核苷酸之引入在許多情況下會降低生物活性。因此，一或多個Sp核苷酸間鍵聯或Sp PS之引入既提高單股RNAi劑之穩定性，又不會降低或消除RNAi活性。
在單股RNAi劑之一些實施例中，寡核苷酸或單股RNAi包含1個或更多個Sp核苷酸間鍵聯。在單股RNAi劑之一些實施例中，寡核苷酸或單股RNAi在寡核苷酸或單股RNAi劑之5'及/或3'端處包含1個或更多個Sp核苷酸間鍵聯。在單股RNAi劑之一些實施例中，寡核苷酸或單股RNAi在對核酸酶裂解敏感之位點處包含1個或更多個Sp核苷酸間鍵聯。
在單股RNAi劑之一些實施例中，寡核苷酸或單股RNAi劑包含1個或更多個Sp PS。在單股RNAi劑之一些實施例中，寡核苷酸或單股RNAi劑在寡核苷酸或單股RNAi劑之5'及/或3'端處包含1個或更多個Sp PS。在單股RNAi劑之一些實施例中，寡核苷酸或單股RNAi在對核酸酶裂解敏感之位點處包含1個或更多個Sp PS。
本發明本發明尤其認識到單股RNAi劑之立體選擇性(而非立體無規或外消旋)製備之挑戰。本發明尤其提供用於立體選擇性製備包含多個(例如，超過5、6、7、8、9或10個)核苷酸間鍵聯之單股RNAi劑及尤其包含多個(例如，超過5、6、7、8、9或10個)對掌性核苷酸間鍵聯之單股RNAi劑的方法及試劑。在一些實施例中，在單股RNAi劑之立體無規或外消旋製備中，以小於90:10、95:5、96:4、97:3或98:2之非對映立體選擇性形成至少一個對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，對於單股RNAi劑之立體選擇性或對掌性受控製備，以大於90:10、95:5、96:4、97:3或98:2之非對映立體選擇性形成各對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，對於單股RNAi劑之立體選擇性或對掌性受控製備，以大於95:5之非對映立體選擇性形成各對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，對於單股RNAi劑之立體選擇性或對掌性受控製備，以大於96:4之非對映立體選擇性形成各對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，對於單股RNAi劑之立體選擇性或對掌性受控製備，以大於97:3之非對映立體選擇性形成各對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，對於單股RNAi劑之立體選擇性或對掌性受控製備，以大於98:2之非對映立體選擇性形成各對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，對於單股RNAi劑之立體選擇性或對掌性受控製備，以大於99 :1之非對映立體選擇性形成各對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，單股RNAi劑中之對掌性核苷酸間鍵聯之非對映立體選擇性可經由模型反應量測，例如在基本上相同或類似的條件下形成二聚體，其中二聚體具有與對掌性核苷酸間鍵聯相同的核苷酸間鍵聯，二聚體之5'-核苷與對掌性核苷酸間鍵聯5'端之核苷相同，且二聚體之3'-核苷與對掌性核苷酸間鍵聯3'端之核苷相同。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑為經設計包含多種寡核苷酸及/或單股RNAi劑類型之組合物。在一些實施例中，本發明方法允許產生對掌性受控單股RNAi劑庫，使得預先選擇之量的任何一或多種對掌性受控單股RNAi劑類型可與任何一或多種其他對掌性受控單股RNAi劑類型混合以產生對掌性受控單股RNAi劑組合物。在一些實施例中，預先選擇之量的單股RNAi劑類型為具有上文所描述之非對映異構純度中之任一者的組合物。
在一些實施例中，本發明提供用於製備對掌性受控單股RNAi劑之方法，其包含以下步驟： (1)偶合； (2)封端； (3)修飾； (4)脫除阻隔基；以及 (5)重複步驟(1)至(4)，直至達成所需長度為止。
在描述所提供之方法時，「循環」一詞具有如一般熟習此項技術者所理解之普通含義。在一些實施例中，步驟(1)至(4)一輪稱為一循環。
在一些實施例中，本發明提供用於製備對掌性受控單股RNAi劑組合物之方法，其包含以下步驟： (a)提供一定量之第一對掌性受控單股RNAi劑；以及 (b)視情況提供一定量之一或多種其他對掌性受控單股RNAi劑。
在一些實施例中，第一對掌性受控單股RNAi劑為如本文中所描述之單股RNAi劑類型。在一些實施例中，一或多種其他對掌性受控單股RNAi劑為一或多種如本文中所描述之單股RNAi劑類型。
相關化學及合成技術中之技術人員將認識到，當使用本發明方法合成時，所提供之單股RNAi劑之結構變異及立體化學組態之變通性及控制之程度。舉例而言，在第一循環完成之後，後一循環可使用針對彼後一循環個別地選擇的核苷酸單元執行，在一些實施例中，其包含不同於第一循環核鹼基及/或糖的核鹼基及/或糖。類似地，後一循環之偶合步驟中所用之對掌性助劑可不同於第一循環中所用之對掌性助劑，使得第二循環產生不同立體化學組態之磷鍵聯。在一些實施例中，新形成之核苷酸間鍵聯中之鍵聯磷的立體化學係藉由使用立體化學純胺基磷酸酯來控制。另外，後一循環之修飾步驟中所用之修飾試劑可不同於第一或前一循環中所用之修飾試劑。此迭代組裝方法之累積效應使得所提供之單股RNAi劑之各組分可在結構上及組態上進行高度調整。此方法之另一優勢為封端步驟將「n-1」雜質之形成降至最低，否則該等雜質將使所提供之單股RNAi劑及尤其長度更長之單股RNAi劑之分離極具挑戰性。
在一些實施例中，用於製備對掌性受控單股RNAi劑之方法的實例循環說明於本發明中所描述之實例流程中。在一些實施例中，用於製備對掌性受控單股RNAi劑之方法的實例循環說明於流程I中。在一些實施例中，表示固體載體及視情況表示連接至固體載體之增長對掌性受控單股RNAi劑的一部分。所例示之對掌性助劑具有式3-I之結構：，式 3-I 其進一步描述於下文中。「帽(cap)」為藉由封端步驟引入氮原子之任何化學部分，且在一些實施例中，為胺基保護基。一般熟習此項技術者理解，在第一循環中，開始時可僅存在一個連接至固體載體之核苷，且可視情況在脫除阻隔基之前執行循環退出。如熟習此項技術者所理解，BPRO 為單股RNAi劑合成中所用之受保護鹼基。流程I之以上所描繪之循環的各步驟進一步描述於下文中。流程 I . 對掌性受控單股RNAi劑之合成. 固體載體上之合成
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑之合成在固相上執行。在一些實施例中，固體載體上所存在之反應基受保護。在一些實施例中，固體載體上所存在之反應基未受保護。在單股RNAi劑合成期間，在若干合成循環中用各種試劑處理固體載體以達成用個別核苷酸單元逐步地延長增長單股RNAi劑鏈。如本文所用，在鏈末端直接連接於固體載體之核苷單元稱為「第一核苷」。第一核苷經由連接基團部分結合於固體載體，該連接基團部分亦即二價基團，在CPG、聚合物或其他固體載體中之任一者與核苷之間具有共價鍵。連接基團在用於組裝寡核苷酸鏈所執行之合成循環期間保持完整，且在鏈組裝之後裂解，從而自載體釋放出寡核苷酸。
用於固相核酸合成之固體載體包括以下中所描述之載體：例如美國專利4,659,774、5,141,813、4,458,066；Caruthers之美國專利第4,415,732號、第4,458,066號、第4,500,707號、第4,668,777號、第4,973,679號及第5,132,418號；Andrus等人之美國專利第5,047,524號、第5,262,530號；及Koster之美國專利第4,725,677號(再頒佈為RE34,069)。在一些實施例中，固相為有機聚合物載體。在一些實施例中，固相為無機聚合物載體。在一些實施例中，有機聚合物載體為聚苯乙烯、胺甲基聚苯乙烯、聚乙二醇-聚苯乙烯接枝共聚物、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、高度交聯聚合物(HCP)或其他合成聚合物、碳水化合物(諸如纖維素及澱粉)或其他聚合碳水化合物、或其他有機聚合物及任何共聚物、複合材料或以上無機或有機材料之組合。在一些實施例中，無機聚合物載體為二氧化矽、氧化鋁、受控苯乙烯玻璃(controlled polyglass；CPG，其為矽膠載體)，或胺丙基CPG。其他適用之固體載體包括含氟固體載體(參見例如WO/2005/070859)、長鏈烷基胺(LCAA)受控微孔玻璃(CPG)固體載體(參見例如S. P. Adams, K. S. Kavka, E. J. Wykes, S. B. Holder及G. R. Galluppi,J . Am . Chem . Soc . ,1983 ,105 , 661-663；G. R. Gough, M. J. Bruden及P. T. Gilham,Tetrahedron Lett . ,1981 ,22 , 4177-4180)。膜載體及聚合物膜(參見例如Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis, Peptides, Proteins and Nucleic Acids, 第21章第157-162頁, 1994, Roger Epton編及美國專利第4,923,901號)亦適用於合成核酸。形成之後，膜可以化學方式官能化以用於核酸合成。除使官能基連接至膜之外，在一些實施例中，亦使用連接至膜之連接基團或間隔基團以使膜與合成鏈之間的位阻降至最低。
其他適合之固體載體包括此項技術中通常已知適用於固相方法中之彼等固體載體，包括(例如)以PrimerTM 200載體、受控微孔玻璃(CPG)、草醯基受控微孔玻璃出售之玻璃(參見例如Alul等人,Nucleic Acids Research ,1991 ,19 , 1527)、胺基聚乙二醇衍生化載體TentaGel載體(參見例如Wright等人,Tetrahedron Lett . ,1993 ,34 , 3373)及聚苯乙烯/二乙烯苯之Poros-a共聚物。
已證實表面活化聚合物可用於在若干固體載體培養基上合成天然及經修飾之核酸及蛋白質。固體載體材料可為孔隙率適當均一、具有足夠的胺含量及足夠的可撓性以在不喪失完整性的情況下經受住任何附帶操控的任何聚合物。所選擇的適合材料之實例包括耐綸、聚丙烯、聚酯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯及硝化纖維。視研究者之設計而定，其他材料可充當固體載體。考慮到一些設計，例如經塗佈金屬，尤其可選擇金或白金(參見例如美國公開案第20010055761號)。在單股RNAi劑合成之一個實施例中，舉例而言，將核苷錨定至經羥基或胺基殘基官能化之固體載體。或者，使固體載體經衍生化，得到酸不穩定的三烷氧基三苯甲基，諸如三甲氧基三苯甲基(TMT)。在不受理論束縛之情況下，預期三烷氧基三苯甲基保護基之存在將允許在DNA合成器上常用之條件下發生初始去三苯甲基化。針對單股RNAi劑物質於含氨水之溶液中之較快釋放，視情況將二乙醇酸酯連接基團引入載體上。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑替代地自5'至3'方向合成。在一些實施例中，經由增長核酸之5'端將核酸連接至固體載體，從而呈遞其3'基團進行反應，亦即使用5'-核苷胺基磷酸酯或在酶促反應中(例如，使用核苷5'-三磷酸酯連接及聚合)。當考慮5'至3'合成時，本發明之迭代步驟保持不變(亦即關於對掌性磷之封端及修飾)。連接部分
視情況使用連接部分或連接基團將固體載體連接至包含游離親核部分之化合物。適合之連接基團為吾人所知，諸如在固相合成技術中用來將固體載體連接至初始核苷分子之官能基(例如，羥基)的短分子。在一些實施例中，連接部分為丁二醯胺酸連接基團或丁二酸酯連接基團(-CO-CH2 -CH2 -CO-)或草醯基連接基團(-CO-CO-)。在一些實施例中，連接部分及核苷經由酯鍵鍵結在一起。在一些實施例中，鍵聯部分及核苷經由醯胺鍵鍵結在一起。在一些實施例中，連接部分將核苷連接至另一核苷酸或核酸。適合之連接基團揭示於例如Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach , Ekstein, F.編, IRL Press, N.Y.,1991 ,第1章及Solid-Phase Supports for Oligonucleotide Synthesis, Pon, R. T.,Curr . Prot . Nucleic Acid Chem . ,2000 , 3.1.1-3.1.28中。
使用連接基團部分將包含游離親核部分之化合物連接至另一核苷、核苷酸或核酸。在一些實施例中，連接部分為磷酸二酯鍵聯。在一些實施例中，連接部分為H -膦酸酯部分。在一些實施例中，連接部分為如本文中所描述之經修飾之磷鍵聯。在一些實施例中，使用通用連接基團(UnyLinker)將寡核苷酸連接至固體載體(Ravikumar等人,Org . Process Res . Dev . ,2008 ,12 (3), 399-410)。在一些實施例中，使用其他通用連接基團(Pon, R. T.,Curr . Prot . Nucleic Acid Chem . ,2000 , 3.1.1-3.1.28)。在一些實施例中，使用各種正交連接基團(諸如二硫鍵連接基團) (Pon, R. T.,Curr . Prot . Nucleic Acid Chem . ,2000 , 3.1.1-3.1.28)。
本發明尤其認識到，可選擇或設計與單股RNAi劑合成中所採用的一組反應條件相容的連接基團。在一些實施例中，為避免單股RNAi劑降解及避免脫硫，在脫除保護基之前選擇性去除助劑基團。在一些實施例中，可藉由F− 離子選擇性去除DPSE基團。在一些實施例中，本發明提供在DPSE脫除保護基條件下穩定的連接基團，該條件例如0.1 M TBAF於MeCN中、0.5 M HF-Et3 N於THF或MeCN中等。在一些實施例中，所提供之連接基團為SP連接基團。在一些實施例中，本發明證實，SP連接基團在DPSE脫除保護基條件下穩定，該條件例如0.1 M TBAF於MeCN中、0.5 M HF-Et3 N於THF或MeCN中等；其在例如無水鹼性條件下亦穩定，該等條件諸如om1M DBU於MeCN中。丁二醯基-哌啶(SP)連接基團
在一些實施例中，實例連接基團為：在一些實施例中，丁二醯基連接基團、Q連接基團或草醯基連接基團在使用F− 之一或多個DPSE脫除保護基條件下不穩定。一般條件 - 用於合成之溶劑
所提供之寡核苷酸之合成一般係在非質子有機溶劑中執行。在一些實施例中，溶劑為腈溶劑，諸如乙腈。在一些實施例中，溶劑為鹼性胺溶劑，諸如吡啶。在一些實施例中，溶劑為醚溶劑，諸如四氫呋喃。在一些實施例中，溶劑為鹵化烴，諸如二氯甲烷。在一些實施例中，使用溶劑混合物。在某些實施例中，溶劑為上文所描述之各類溶劑中之任何一或多者的混合物。
在一些實施例中，當非質子有機溶劑不為鹼性時，在反應步驟中存在鹼。在存在鹼之一些實施例中，鹼為胺鹼，諸如吡啶、喹啉或N,N-二甲基苯胺。其他胺鹼之實例包括吡咯啶、哌啶、N -甲基吡咯啶、吡啶、喹啉、N , N -二甲胺基吡啶(DMAP)或N , N -二甲基苯胺。
在一些實施例中，鹼不為胺鹼。
在一些實施例中，非質子有機溶劑無水。在一些實施例中，無水非質子有機溶劑為新蒸餾的。在一些實施例中，新蒸餾的無水非質子有機溶劑為鹼性胺溶劑，諸如吡啶。在一些實施例中，新蒸餾的無水非質子有機溶劑為醚溶劑，諸如四氫呋喃。在一些實施例中，新蒸餾的無水非質子有機溶劑為腈溶劑，諸如乙腈。對掌性試劑 / 對掌性助劑
在一些實施例中，在產生對掌性受控寡核苷酸時使用對掌性試劑賦予立體選擇性。根據本發明方法，可使用熟習此項技術者及本文中亦稱為對掌性助劑的許多不同對掌性試劑。此等對掌性試劑之實例描述於本文及以上提及之Wada I、II及III中。在本發明之一些實施例中，對掌性試劑為下式之一的化合物：
如本文中所證實，當用於製備對掌性核苷酸間鍵聯時，為獲得立體選擇性，一般利用立體化學純對掌性試劑。
額其他對掌性助劑及其用途可見於例如Wada I (JP4348077；WO2005/014609；WO2005/092909)、Wada II (WO2010/064146)、Wada III (WO2012/039448)、對掌性控制(WO2010/064146)等中。活化
用第一活化試劑處理非對掌性H -膦酸酯部分，以形成第一中間產物。在一個實施例中，在縮合步驟期間，向反應混合物中添加第一活化試劑。第一活化試劑之使用視反應條件而定，諸如反應所用之溶劑。第一活化試劑之實例為光氣、氯甲酸三氯甲酯、雙(三氯甲基)碳酸酯(BTC)、乙二醯氯、Ph3 PCl2 、(PhO)3 PCl2 、N , N ' -雙(2-側氧基-3-噁唑啶基)次膦醯氯(BopCl)、六氟磷酸1,3-二甲基-2-(3-硝基-1,2,4-三唑-1-基)-2-吡咯啶-1-基-1,3,2-二氮鏻(MNTP)或六氟磷酸3-硝基-1,2,4-三唑-1-基-參(吡咯啶-1-基)鏻(PyNTP)。
非對掌性H -膦酸酯部分之實例為以上流程中所示之化合物。DBU表示1,8-二氮二環[5.4.0]十一-7-烯。H+ DBU可為例如銨離子、烷基銨離子、雜芳香族亞銨離子或雜環亞銨離子，其中任一者為一級、二級、三級或四級銨離子；或單價金屬離子。與對掌性試劑反應
在第一活化步驟之後，使經活化非對掌性H -膦酸酯部分與對掌性試劑反應。立體特異性縮合步驟
用第二活化試劑及核苷處理對掌性中間產物以形成縮合中間產物。核苷可在固體載體上。第二活化試劑之實例為4,5-二氰基咪唑(DCI)、4,5-二氯咪唑、三氟甲磺酸1-苯基咪唑鎓(PhIMT)、三氟甲磺酸苯并咪唑鎓(BIT)、苯并三唑、3-硝基-1,2,4-三唑(NT)、四唑、5-乙硫基四唑(ETT)、5-苯硫基四唑(BTT)、5-(4-硝基苯基)四唑、三氟甲磺酸N -氰基甲基吡咯啶鎓(CMPT)、三氟甲磺酸N -氰基甲基哌啶鎓、三氟甲磺酸N -氰基甲基二甲基銨。式Z-Va ((Z-Vb)、(Z-Va')或(Z-Vb'))之對掌性中間產物可分離為單體。通常，Z-Va ((Z-Vb)、(Z-Va')或(Z-Vb'))之對掌性中間產物未經分離且在同一釜中與核苷或經修飾之核苷反應，得到縮合中間產物對掌性亞磷酸酯化合物。在其他實施例中，當經由固相合成執行該方法時，自副產物、雜質及/或試劑中過濾出包含該化合物之固體載體。封端步驟
若最終核酸大於二聚體，則未反應的-OH部分用阻隔基封端且化合物中之對掌性助劑亦可用阻隔基封端，以形成封端縮合中間產物。若最終核酸為二聚體，則封端步驟為不必要的。修飾步驟
藉由與親電試劑反應來修飾化合物。可對封端縮合中間產物執行修飾步驟。在一些實施例中，使用硫親電試劑、硒親電試劑或硼化劑執行修飾步驟。修飾步驟之實例為氧化及硫化步驟。
在方法之一些實施例中，硫親電試劑為具有下式中之一者的化合物： S8 (式Z-B)、Zz1 -S-S-Zz2 或Zz1 -S-Vz -Zz2 ； 其中Zz1 及Zz2 獨立地為烷基、胺基烷基、環烷基、雜環、環烷基烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、芳氧基、雜芳氧基、醯基、醯胺、醯亞胺或硫羰基，或Zz1 及Zz2 一起形成可經取代或未經取代之3員至8員脂環或雜環；Vz 為SO2 、O或NRf ；且Rf 為氫、烷基、烯基、炔基或芳基。
其他硫親電試劑為此項技術中已知的。
在一些實施例中，在修飾步驟之後，對掌性助劑基團離開增長寡核苷酸鏈。在一些實施例中，在修飾步驟之後，對掌性助劑基團保持連接至核苷酸間磷原子。
在方法之一些實施例中，修飾步驟為氧化步驟。在方法之一些實施例中，修飾步驟為使用如本申請案中上文所描述之類似條件的氧化步驟。在一些實施例中，氧化步驟如例如JP 2010-265304 A及WO2010/064146中所揭示。鏈延長循環及脫除保護基步驟
脫除封端縮合中間產物之阻隔基以去除增長核酸鏈5'端的阻隔基，得到一化合物。視情況使化合物再進入鏈延長循環，以形成縮合中間產物、封端縮合中間產物、經修飾之封端縮合中間產物及5'脫除保護基之經修飾之封端中間產物。在至少一輪鏈延長循環之後，藉由去除對掌性助劑配體及其他保護基(例如核鹼基、經修飾之核鹼基、糖及經修飾之糖保護基)，進一步脫除5'脫除保護基之經修飾之封端中間產物的阻隔基，得到核酸。在其他實施例中，包含5'-OH部分之核苷為來自如本文中所描述之前述鏈延長循環的中間產物。在其他實施例中，包含5'-OH部分之核苷為自另一已知核酸合成方法獲得之中間產物。在使用固體載體之實施例中，磷原子經修飾之核酸隨後自固體載體裂解。在某些實施例中，出於純化目的，核酸保持連接在固體載體上，且隨後在純化之後自固體載體裂解。
在其他實施例中，包含5'-OH部分之核苷為自另一已知核酸合成方法獲得之中間產物。在其他實施例中，包含5'-OH部分之核苷為自如本申請案中所描述之另一已知核酸合成方法獲得之中間產物。在其他實施例中，包含5'-OH部分之核苷為自另一已知核酸合成方法獲得之中間產物，該方法包含一或多個在流程I中所說明之循環。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸合成方法，其使用穩定且可在商購的物質作為起始物質。在一些實施例中，本發明提供寡核苷酸合成方法，其使用非對掌性起始物質來產生立體受控、磷原子經修飾之寡核苷酸衍生物。
在一些實施例中，本發明方法不會引起在脫除保護基步驟下降解。此外，該方法不需要特定封端劑來產生磷原子經修飾之寡核苷酸衍生物。縮合試劑
根據本發明方法適用之縮合試劑(CR )具有以下通式中之任一者：其中Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 、Z6 、Z7 、Z8 及Z9 獨立地為選自烷基、胺基烷基、環烷基、雜環、環烷基烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、芳氧基或雜芳氧基的視情況經取代之基團，或其中Z2 及Z3 、Z5 及Z6 、Z7 及Z8 、Z8 及Z9 、Z9 及Z7 、或Z7 及Z8 及Z9 中之任一者一起形成3員至20員脂環或雜環；Q- 為抗衡陰離子；且LG為離去基。
在一些實施例中，縮合試劑CR 之抗衡離子為Cl- 、Br- 、BF4 - 、PF6 - 、TfO- 、Tf2 N- 、AsF6 - 、ClO4 - 或SbF6 - ，其中Tf為CF3 SO2 。在一些實施例中，縮合試劑CR 之離去基為F、Cl、Br、I、3-硝基-1,2,4-三唑、咪唑、烷基三唑、四唑、五氟苯或1-羥基苯并三唑。
在一些實施例中，縮合試劑係選自WO/2006/066260中所描述之彼等縮合試劑。
在一些實施例中，縮合試劑為六氟磷酸1,3-二甲基-2-(3-硝基-1,2,4-三唑-1-基)-2-吡咯啶-1-基-1,3,2-二氮鏻(MNTP)或六氟磷酸3-硝基-1,2,4-三唑-1-基-參(吡咯啶-1-基)鏻(PyNTP)：。核苷偶合搭配物之鹼基及糖之選擇
如本文所描述，根據本發明方法使用之核苷偶合搭配物可彼此相同或可彼此不同。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸之合成中所用的核苷偶合搭配物具有彼此相同的結構及/或立體化學組態。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸之合成中所用的各核苷偶合搭配物與寡核苷酸之某些其他核苷偶合搭配物不具有相同結構及/或立體化學組態。根據本發明方法使用之實例核鹼基及糖描述於本文中。相關化學及合成技術中之技術人員將認識到，涵蓋本文中所描述之核鹼基及糖之任何組合以供根據本發明方法使用。偶合步驟
根據本發明使用之實例偶合程序及對掌性試劑及縮合試劑尤其概述於Wada I (JP4348077；WO2005/014609；WO2005/092909)、Wada II (WO2010/064146)、Wada III (WO2012/039448)及對掌性控制(WO2010/064146)中。根據本發明使用之對掌性核苷偶合搭配物在本文中亦稱作「Wada胺基酸酯」。在一些實施例中，偶合搭配物具有之結構，其中BPRO 為受保護核鹼基。在一些實施例中，偶合搭配物具有之結構，其中BPRO 為受保護核鹼基。在一些實施例中，偶合搭配物具有之結構，其中BPRO 為受保護核鹼基，且R1 如本文所定義及描述。在一些實施例中，偶合搭配物具有之結構，其中BPRO 為受保護核鹼基，且R1 如本文所定義及描述。在一些實施例中，R1 為視情況經取代之C1 - 6 烷基。在一些實施例中，R1 為Me。
其他實例描述於WO/2010/064146、WO/2011/005761、WO/2013/012758、WO/2014/010250、US2013/0178612、WO/2014/012081、WO/2015/107425、WO/2017/015555及WO/2017/062862中，其中每一者之胺基磷酸酯以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，偶合步驟包含使PNPLA3寡核苷酸之核苷酸單元之游離羥基與核苷偶合搭配物在適合條件下反應以實現偶合。在一些實施例中，偶合步驟係在脫除阻隔基步驟之前。舉例而言，在一些實施例中，阻隔(亦即，保護)增長寡核苷酸之5'羥基且為了隨後與核苷偶合搭配物反應，必須脫除阻隔基。
在已脫除增長寡核苷酸之適當羥基之阻隔基之後，對載體進行洗滌及乾燥，準備好用於傳遞包含對掌性試劑之溶液及包含活化劑之溶液。在一些實施例中，對掌性試劑及活化劑同時傳遞。在一些實施例中，共同傳遞包含於諸如腈溶劑(例如，乙腈)之極性非質子溶劑中傳遞含一定量對掌性試劑之溶液(例如，胺基磷酸酯溶液)及含一定量活化劑之溶液(例如，CMPT溶液)。
在一些實施例中，偶合步驟提供粗產物組合物，其中對掌性亞磷酸酯產物以＞95%之非對映異構過量存在。在一些實施例中，對掌性亞磷酸酯產物以＞96%之非對映異構過量存在。在一些實施例中，對掌性亞磷酸酯產物以＞97%之非對映異構過量存在。在一些實施例中，對掌性亞磷酸酯產物以＞98%之非對映異構過量存在。在一些實施例中，對掌性亞磷酸酯產物以＞99%之非對映異構過量存在。封端步驟 ： 所提供之用於製備對掌性受控寡核苷酸之方法包含封端步驟。在一些實施例中，封端步驟為單一步驟。在一些實施例中，封端步驟為兩個步驟。在一些實施例中，封端步驟為超過兩個步驟。在一些實施例中，封端步驟包含使對掌性助劑之游離胺封端及使任何殘餘未反應的5'羥基封端的步驟。在一些實施例中，對掌性助劑之游離胺及未反應的5'羥基用相同封端基團封端。在一些實施例中，對掌性助劑之游離胺及未反應的5'羥基用不同封端基團封端。在某些實施例中，用不同封端基團封端允許在寡核苷酸合成期間選擇性去除一個封端基團，優先於另一個。在一些實施例中，兩個基團之封端同時發生。在一些實施例中，兩個基團之封端反覆發生。在某些實施例中，封端反覆發生且包含使游離胺封端之第一步驟，繼之以使游離的5'羥基封端之第二步驟，其中游離胺及5'羥基均用相同封端基團封端。舉例而言，在一些實施例中，使用酸酐(例如，苯氧基乙酸酐，亦即Pac2 O)使對掌性助劑之游離胺封端，隨後用相同酸酐使5'羥基封端。在某些實施例中，用相同酸酐使5'羥基封端在不同條件下(例如，在一或多種其他試劑存在下)發生。在一些實施例中，5'羥基之封端在含胺鹼之醚類溶劑(例如，含NMI (N-甲基咪唑)之THF)存在下發生。片語「封端基團」在本文中可與片語「保護基」及「阻隔基」互換使用。在一些實施例中，胺封端基團之特徵在於，其有效地使胺封端，因此其防止中間產物亞磷酸酯物質重組及/或分解。在一些實施例中，封端基團係針對其保護對掌性助劑之胺從而防止核苷酸間鍵聯磷之分子內裂解的能力來加以選擇。在一些實施例中，5'羥基封端基團之特徵在於，其有效地使羥基封端，使得其阻止短體(shortmer)之出現，該等短體例如由在第一循環未反應但隨後在一或多個後續循環中反應的PNPLA3寡核苷酸鏈之反應產生的「n-m」(m及n為整數且m＜n；n為目標寡核苷酸中之鹼基數目)雜質。此等短體、尤其「n-1」之存在對粗寡核苷酸之純度具有不利影響且使得寡核苷酸之最終純化繁瑣且通常低產。在一些實施例中，基於在特定條件下促進特定類型之反應的趨勢選擇特定帽。舉例而言，在一些實施例中，封端基團係針對其促進E1消除反應之能力來加以選擇，該反應自增長寡核苷酸裂解帽及/或助劑。在一些實施例中，封端基團係針對其促進E2消除反應之能力來加以選擇，該反應自增長寡核苷酸裂解帽及/或助劑。在一些實施例中，封端基團係針對其促進β-消除反應之能力來加以選擇，該反應自增長寡核苷酸裂解帽及/或助劑。修飾步驟 ：
如本文所用之片語「修飾步驟(modifying step/modification step)」及「P修飾步驟(P-modification step)」可互換使用且一般指任何一或多個用於安裝經修飾之核苷酸間鍵聯的步驟。在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯具有式I結構。本發明之P修飾步驟發生在所提供之寡核苷酸之組裝期間而非在所提供之寡核苷酸之組裝完成之後。因此，所提供寡核苷酸之各核苷酸單元可個別地在安裝核苷酸單元之循環期間在鍵聯磷處加以修飾。在一些實施例中，適合之P修飾試劑為硫親電試劑、硒親電試劑、氧親電試劑、硼化試劑或疊氮試劑。
舉例而言，在一些實施例中，硒試劑為元素硒、硒鹽或經取代之二硒化物。在一些實施例中，氧親電試劑為元素氧、過氧化物或經取代之過氧化物。在一些實施例中，硼化試劑為硼烷-胺(例如，N , N -二異丙基乙胺(BH3 ·DIPEA)、硼烷-吡啶(BH3 ·Py)、硼烷-2-氯吡啶(BH3 ·CPy)、硼烷-苯胺(BH3 ·An))、硼烷-醚試劑(例如，硼烷-四氫呋喃(BH3 ·THF))、硼烷-二烷基硫化物試劑(例如，BH3 ·Me2 S)、苯胺-氰基硼烷或三苯基膦-烷氧羰基硼烷。在一些實施例中，疊氮試劑包含能夠進行後續還原以提供胺基的疊氮基。
在一些實施例中，P修飾試劑為如本文中所描述之硫化試劑。在一些實施例中，修飾步驟包含使磷硫化以得到硫代磷酸酯鍵聯或硫代磷酸三酯鍵聯。在一些實施例中，修飾步驟提供具有式I之核苷酸間鍵聯的PNPLA3寡核苷酸。
在一些實施例中，本發明提供硫化試劑，及其製備方法及用途。
在一些實施例中，此等硫化試劑為硫代磺酸酯試劑。
各種硫化試劑及硫代磺酸酯試劑為此項技術中已知的。
在一些實施例中，根據本發明使用之硫化試劑的特徵在於，在硫化期間轉移至磷之部分為經取代之硫(例如，-SR)，與單一硫原子(例如，-S- 或=S)相對照。
在一些實施例中，根據本發明使用之硫化試劑的特徵在於，該試劑之活性可藉由用某些拉電子或供電子基團修飾該試劑來調整。
在一些實施例中，根據本發明使用之硫化試劑的特徵在於其為結晶。在一些實施例中，根據本發明使用之硫化試劑的特徵在於其具有高結晶度。在某些實施例中，根據本發明使用之硫化試劑的特徵在於易於經由例如再結晶來純化試劑。在某些實施例中，根據本發明使用之硫化試劑的特徵在於其實質上不含含硫雜質。在一些實施例中，實質上不含含硫雜質之硫化試劑展示提高之效率。
在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸包含一或多個磷酸二酯鍵聯。為合成此等對掌性受控寡核苷酸，視情況用氧化步驟替代一或多個修飾步驟以安裝對應磷酸二酯鍵聯。在一些實施例中，氧化步驟以類似於普通寡核苷酸合成的方式執行。在一些實施例中，氧化步驟包含使用I2 。在一些實施例中，氧化步驟包含使用I2 及吡啶。在一些實施例中，氧化步驟包含使用含0.02 M I2 之THF/吡啶/水(70:20:10 - v/v/v)共溶劑系統。實例循環描繪於流程I-c中。
在一些實施例中，藉由硫化試劑(例如3-苯基-1,2,4-二噻唑啉-5-酮)硫化，直接形成硫代磷酸酯。在一些實施例中，在直接安裝硫代磷酸酯之後，對掌性助劑基團保持連接至核苷酸間磷原子。在一些實施例中，需要另一脫除保護基步驟來去除對掌性助劑(例如，針對DPSE型對掌性助劑，使用TBAF、HF-Et3 N等)。
在一些實施例中，使用硫代磷酸酯前驅體合成包含硫代磷酸酯鍵聯的對掌性受控寡核苷酸。
在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸包含一或多個磷酸二酯鍵聯及一或多個硫代磷酸二酯鍵聯。在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸包含一或多個磷酸二酯鍵聯及一或多個硫代磷酸二酯鍵聯，其中至少一個磷酸二酯鍵聯係在自3'至5'合成時在所有硫代磷酸二酯鍵聯之後安裝。為合成此等對掌性受控寡核苷酸，在一些實施例中，視情況用氧化步驟替代一或多個修飾步驟以安裝對應磷酸二酯鍵聯，且為硫代磷酸二酯鍵聯中之每一者安裝硫代磷酸酯前驅體。在一些實施例中，硫代磷酸酯前驅體在達成所需寡核苷酸長度之後轉化為硫代磷酸二酯鍵聯。在一些實施例中，在循環退出期間或之後的脫除保護基/釋放步驟將硫代磷酸酯前驅體轉化為硫代磷酸二酯鍵聯。
在一些實施例中，硫代磷酸酯前驅體為如本文所描述之磷保護基，例如2-氰基乙基(CE或Cne)、2-三甲基矽烷基乙基、2-硝基乙基、2-磺醯基乙基、甲基、苯甲基、鄰硝基苯甲基、2-(對硝基苯基)乙基(NPE或Npe)、2-苯乙基、3-(N -第三丁基甲醯胺基)-1-丙基、4-側氧基戊基、4-甲硫基-1-丁基、2-氰基-1,1-二甲基乙基、4-N -甲胺基丁基、3-(2-吡啶基)-1-丙基、2-[N -甲基-N -(2-吡啶基)]胺乙基、2-(N -甲醯基,N -甲基)胺乙基、4-[N -甲基-N -(2,2,2-三氟乙醯基)胺基]丁基。實例進一步描繪於下文中。
如上文所指出，在一些實施例中，硫化在使對掌性試劑自增長寡核苷酸裂解的條件下發生。在一些實施例中，硫化在不使對掌性試劑自增長寡核苷酸裂解的條件下發生。
在一些實施例中，將硫化試劑溶解於適合溶劑中且傳遞至管柱。在某些實施例中，溶劑為極性非質子溶劑，諸如腈溶劑。在一些實施例中，溶劑為乙腈。在一些實施例中，藉由將硫化試劑(例如，如本文中所描述之硫代磺酸酯衍生物)與BSTFA (N,O-雙-三甲基矽烷基-三氟乙醯胺)混合於腈溶劑(例如，乙腈)中來製備硫化試劑溶液。在一些實施例中，不包括BSTFA。舉例而言，本發明人已發現，通式Rs2 -S-S(O)2 -Rs3 之反應性相對較強的硫化試劑常常可在不存在BSTFA的情況下成功地參與硫化反應。僅舉一例，本發明人已證明，若Rs2 為對硝基苯基且Rs3 為甲基，則不需要BSTFA。根據本發明，熟習此項技術者將能夠容易地確定不需要BSTFA的其他情況及/或硫化試劑。
在一些實施例中，在室溫下執行硫化步驟。在一些實施例中，在諸如約0℃、約5℃、約10℃或約15℃之低溫下執行硫化步驟。在一些實施例中，在大於約20℃之高溫下執行硫化步驟。
在一些實施例中，硫化反應進行約1分鐘至約120分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約1分鐘至約90分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約1分鐘至約60分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約1分鐘至約30分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約1分鐘至約25分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約1分鐘至約20分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約1分鐘至約15分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約1分鐘至約10分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約5分鐘至約60分鐘。
在一些實施例中，硫化反應進行約5分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約10分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約15分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約20分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約25分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約30分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約35分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約40分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約45分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約50分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約55分鐘。在一些實施例中，硫化反應進行約60分鐘。
意外發現，根據本發明方法製得的硫化修飾產物中之某些出乎意料地穩定。在一些實施例中，出乎意料地穩定的產物為硫代磷酸三酯。在一些實施例中，出乎意料地穩定的產物為對掌性受控寡核苷酸，其包含一或多個具有式I-c結構的核苷酸間鍵聯。
相關技術中之技術人員將認識到，本文中描述之硫化方法及本文中描述之硫化試劑亦適用於修飾H-膦酸酯寡核苷酸的情況，諸如Wada II (WO2010/064146)中所描述之彼等。
在一些實施例中，硫化反應具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%之逐步硫化效率。在一些實施例中，硫化反應提供至少98%純的粗二核苷酸產物組合物。在一些實施例中，硫化反應提供至少90%純的粗四核苷酸產物組合物。在一些實施例中，硫化反應提供至少70%純的粗十二核苷酸產物組合物。在一些實施例中，硫化反應提供至少50%純的粗二十核苷酸產物組合物。
在鍵聯磷之修飾步驟完成之後，寡核苷酸經歷另一脫除阻隔基步驟以準備再進入循環。在一些實施例中，對掌性助劑在硫化之後保持完好且在後續脫除阻隔基步驟期間脫除阻隔基，該脫除阻隔基步驟必須發生在再進入循環之前。重複脫除阻隔基、偶合、封端及修飾之過程，直至增長寡核苷酸達到所需長度為止，此時寡核苷酸可立即自固體載體裂解或出於純化目的保持連接至載體且稍後裂解。在一些實施例中，核苷酸鹼基中之一或多者上存在一或多個保護基，且寡核苷酸自載體之裂解及脫除鹼基之保護基發生在單一步驟中。在一些實施例中，核苷酸鹼基中之一或多者上存在一或多個保護基，且寡核苷酸自載體之裂解及脫除鹼基之保護基發生在多於一個步驟中。在一些實施例中，脫除保護基及自載體裂解發生在鹼性條件下，使用例如一或多種胺鹼。在某些實施例中，一或多種胺鹼包含丙胺。在某些實施例中，一或多種胺鹼包含吡啶。
在一些實施例中，自載體裂解及/或脫除保護基發生在約30℃至約90℃之高溫下。在一些實施例中，自載體裂解及/或脫除保護基發生在約40℃至約80℃之高溫下。在一些實施例中，自載體裂解及/或脫除保護基發生在約50℃至約70℃之高溫下。在一些實施例中，自載體裂解及/或脫除保護基發生在約60℃之高溫下。在一些實施例中，自載體裂解及/或脫除保護基發生在環境溫度下。
實例純化程序描述於本文中及/或為相關技術中通常所知。
值得注意的是，在各循環期間自增長寡核苷酸去除對掌性助劑至少出於以下原因為有利的：(1)將不必在寡核苷酸合成結束時及將可能敏感的官能基安裝在磷上時在單獨步驟中去除助劑；及(2)容易進行副反應及/或干擾後續化學反應的不穩定磷輔助中間產物得以避免。因此，在各循環期間去除對掌性助劑使得整體合成更有效。
雖然上文已描述了在循環情況下脫除阻隔基之步驟，但下文包括其他的一般方法。脫除阻隔基步驟
在一些實施例中，偶合步驟係在脫除阻隔基步驟之前。舉例而言，在一些實施例中，阻隔(亦即，保護)增長寡核苷酸之5'羥基且為了隨後與核苷偶合搭配物反應，必須脫除阻隔基。
在一些實施例中，使用酸化去除阻隔基。在一些實施例中，酸為布朗斯特酸(Brønsted acid)或路易斯酸(Lewis acid)。適用之布朗斯特酸為羧酸、烷基磺酸、芳基磺酸、磷酸及其衍生物、膦酸及其衍生物、烷基磷酸及其衍生物、芳基磷酸及其衍生物、次膦酸、二烷基次膦酸及二芳基次膦酸，其在有機溶劑或水(在80%乙酸之情況下)中之pKa (25℃，於水中)值為-0.6 (三氟乙酸)至4.76 (乙酸)。酸化步驟中所用之酸的濃度(1至80%)視酸之酸性而定。考慮酸強度時必須考慮到強酸條件將引起去嘌呤/去嘧啶，其中嘌呤基或嘧啶基鹼基自核糖環及或其他糖環裂解。在一些實施例中，酸係選自Ra1 COOH、Ra1 SO3 H、Ra3 SO3 H、，其中Ra1 及Ra2 中之每一者獨立地為氫或視情況經取代之烷基或芳基，且Ra3 為視情況經取代之烷基或芳基。
在一些實施例中，藉由含路易斯酸之有機溶劑實現酸化。此等適用路易斯酸之實例為Zn(Xa )2 ，其中Xa 為Cl、Br、I或CF3 SO3 。
在一些實施例中，酸化步驟包含添加一定量之可有效自縮合中間產物去除阻隔基且不去除嘌呤部分的布朗斯特酸或路易斯酸。
適用於酸化步驟中之酸亦包括(但不限於)含10%磷酸之有機溶劑、含10%鹽酸之有機溶劑、含1%三氟乙酸之有機溶劑、含3%二氯乙酸或三氯乙酸之有機溶劑或含80%乙酸之水。選擇此步驟中所用之任何布朗斯特酸或路易斯酸的濃度，使得酸之濃度不超過會引起核鹼基自糖部分裂解之濃度。
在一些實施例中，酸化包含添加含1%三氟乙酸之有機溶劑。在一些實施例中，酸化包含添加含約0.1%至約8%三氟乙酸之有機溶劑。在一些實施例中，酸化包含添加含3%二氯乙酸或三氯乙酸之有機溶劑。在一些實施例中，酸化包含添加含約0.1%至約10%二氯乙酸或三氯乙酸之有機溶劑。在一些實施例中，酸化包含添加含3%三氯乙酸之有機溶劑。在一些實施例中，酸化包含添加含約0.1%至約10%三氯乙酸之有機溶劑。在一些實施例中，酸化包含添加含80%乙酸之水。在一些實施例中，酸化包含添加含約50%至約90%、或約50%至約80%、約50%至約70%、約50%至約60%、約70%至約90%乙酸之水。在一些實施例中，酸化包含向酸性溶劑中進一步添加陽離子清除劑。在某些實施例中，陽離子清除劑可為三乙基矽烷或三異丙基矽烷。在一些實施例中，藉由酸化脫除阻隔基，酸化包含添加含1%三氟乙酸之有機溶劑。在一些實施例中，藉由酸化脫除阻隔基，酸化包含添加含3%二氯乙酸之有機溶劑。在一些實施例中，藉由酸化脫除阻隔基，酸化包含添加含3%三氯乙酸之有機溶劑。在一些實施例中，藉由酸化脫除阻隔基，酸化包含添加含3%三氯乙酸之二氯甲烷。
在某些實施例中，在合成器上完成本發明方法且脫除增長寡核苷酸之羥基的阻隔基之步驟包含向合成器管柱傳遞一定量的溶劑，該管柱含有連接寡核苷酸的固體載體。在一些實施例中，溶劑為鹵化溶劑(例如，二氯甲烷)。在某些實施例中，溶劑包含一定量之酸。在一些實施例中，溶劑包含一定量之有機酸，諸如三氯乙酸。在某些實施例中，酸以約1%至約20% w/v之量存在。在某些實施例中，酸以約1%至約10% w/v之量存在。在某些實施例中，酸以約1%至約5% w/v之量存在。在某些實施例中，酸以約1至約3% w/v之量存在。在某些實施例中，酸以約3% w/v之量存在。脫除羥基之阻隔基的方法進一步描述於本文中。在一些實施例中，酸以3% w/v存在於二氯甲烷中。
在一些實施例中，在脫除阻隔基步驟之前去除對掌性助劑。在一些實施例中，在脫除阻隔基步驟期間去除對掌性助劑。
在一些實施例中，在脫除阻隔基步驟之前執行循環退出。在一些實施例中，在脫除阻隔基步驟之後執行循環退出。用於阻隔基 / 保護基去除之一般條件
位於核鹼基或糖部分上之諸如羥基或胺基部分的官能基常規地在合成期間經阻隔(保護)基(部分)阻隔且隨後脫除阻隔基。一般而言，阻隔基使得分子之化學官能基對特定反應條件惰性且可在稍後自分子之此等官能基去除而實質上不損害分子之剩餘部分(參見例如Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis,第2版, John Wiley & Sons, New York, 1991)。舉例而言，胺基可由氮阻隔基阻隔。化學官能基亦可藉由以前驅體形式包括來進行阻隔。因此，疊氮基可視為胺之阻隔形式，因為疊氮基容易轉化為胺。核酸合成中所用之其他代表性保護基為已知的(參見例如Agrawal等人, Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Humana Press編, New Jersey, 1994, 第26卷, 第1-72頁)。
已知各種用於自核酸去除阻隔基的方法。在一些實施例中，去除所有阻隔基。在一些實施例中，去除一部分阻隔基。在一些實施例中，可調節反應條件以選擇性去除某些阻隔基。
在一些實施例中，核鹼基阻隔基(若存在)可在所提供寡核苷酸之組裝之後經酸性試劑裂解。在一些實施例中，核鹼基阻隔基(若存在)可在既非酸性亦非鹼性條件下裂解，例如可經氟化物鹽或氫氟酸複合物裂解。在一些實施例中，核鹼基阻隔基(若存在)可在所提供寡核苷酸之組裝之後在鹼或鹼性溶劑存在下裂解。在某些實施例中，核鹼基阻隔基中之一或多者的特徵在於，其可在所提供寡核苷酸之組裝之後在鹼或鹼性溶劑存在下裂解，但對所提供寡核苷酸之組裝期間發生的一或多個早期脫除保護基步驟之特定條件穩定。
在一些實施例中，核鹼基不需要阻隔基。在一些實施例中，核鹼基需要阻隔基。在一些實施例中，某些核鹼基需要一或多個阻隔基，而其他核鹼基不需要一或多個阻隔基。
在一些實施例中，在合成之後，寡核苷酸自固體載體裂解。在一些實施例中，自固體載體裂解包含使用丙胺。在一些實施例中，自固體載體裂解包含使用含丙胺之吡啶。在一些實施例中，自固體載體裂解包含使用含20%丙胺之吡啶。在一些實施例中，自固體載體裂解包含使用含丙胺之無水吡啶。在一些實施例中，自固體載體裂解包含使用含20%丙胺之無水吡啶。在一些實施例中，自固體載體裂解包含使用極性非質子溶劑，諸如乙腈、NMP、DMSO、碸及/或二甲基吡啶。在一些實施例中，自固體載體裂解包含使用溶劑，例如極性非質子溶劑；及一或多種一級胺(例如，C1 - 10 胺)；及/或甲氧胺、肼及純無水氨中之一或多者。
在一些實施例中，脫除寡核苷酸之保護基包含使用丙胺。在一些實施例中，脫除寡核苷酸之保護基包含使用含丙胺之吡啶。在一些實施例中，脫除寡核苷酸之保護基包含使用含20%丙胺之吡啶。在一些實施例中，脫除寡核苷酸之保護基包含使用含丙胺之無水吡啶。在一些實施例中，脫除寡核苷酸之保護基包含使用含20%丙胺之無水吡啶。
在一些實施例中，在裂解期間脫除寡核苷酸之保護基。
在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在約室溫下執行。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在高溫下執行。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在高於約30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃下執行。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在約30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃下執行。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在約40℃至80℃下執行。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在約50℃至70℃下執行。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在約60℃下執行。
在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基執行超過0.1小時、1小時、2小時、5小時、10小時、15小時、20小時、24小時、30小時或40小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基執行約0.1至5小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基執行約3至10小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基執行約5至15小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基執行約10至20小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基執行約15至25小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基執行約20至40小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基執行約2小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基執行約5小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基執行約10小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基執行約15小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基執行約18小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基執行約24小時。
在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在室溫下執行超過0.1小時、1小時、2小時、5小時、10小時、15小時、20小時、24小時、30小時或40小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在室溫下執行約5至48小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在室溫下執行約10至24小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在室溫下執行約18小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在高溫下執行超過0.1小時、1小時、2小時、5小時、10小時、15小時、20小時、24小時、30小時或40小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在高溫下執行約0.5至5小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在60℃下執行約0.5至5小時。在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基係在約60℃下執行約2小時。
在一些實施例中，自固體載體裂解寡核苷酸或脫除寡核苷酸之保護基包含使用丙胺且在室溫或高溫下執行超過0.1小時、1小時、2小時、5小時、10小時、15小時、20小時、24小時、30小時或40小時。實例條件為含20%丙胺之吡啶，在室溫下持續約18小時；及含20%丙胺之吡啶，在60℃下持續約18小時。
在一些實施例中，在自固體載體裂解之前，若對掌性助劑基團仍連接至核苷酸間磷原子，則執行用於去除對掌性助劑基團之步驟。在一些實施例中，舉例而言，在寡核苷酸合成循環期間，一或多個DPSE型對掌性助劑基團保持連接至核苷酸間磷原子。適合去除剩餘對掌性助劑基團之條件為此項技術中廣泛已知的，例如Wada I、Wada II、Wada III、對掌性控制等中所述之彼等條件。在一些實施例中，用於去除DPSE型對掌性助劑之條件為TBAF或HF-Et3 N，例如含0.1 M TBAF之MeCN、含0.5 M HF-Et3 N之THF或MeCN等。在一些實施例中，本發明認識到，連接基團可在去除對掌性助劑基團之過程期間裂解。在一些實施例中，本發明提供連接基團，諸如SP連接基團，其在對掌性助劑基團去除期間提供較佳穩定性。本發明所提供之某些連接基團尤其提供改良之產率及/或純度。
在一些實施例中，實例循環描繪於流程I中。 流程I. 使用DPSE對掌性助劑之實例循環.
在一些實施例中，X為H或2'修飾。在一些實施例中，X為H或−OR1 ，其中R1 不為氫。在一些實施例中，X為H或−OR1 ，其中R1 為視情況經取代之C1 - 6 烷基。在一些實施例中，X為H。在一些實施例中，X為−OMe。在一些實施例中，X為−OCH2 CH2 OCH3 。在一些實施例中，X為−F。
一般熟習此項技術者應理解，可組合不同類型的循環以提供對寡核苷酸之化學修飾及立體化學的完全控制。在一些實施例中，舉例而言，PNPLA3寡核苷酸合成製程可含有一或多個循環。在一些實施例中，所提供之方法包含至少一個使用DPSE型對掌性助劑之循環。
在一些實施例中，本發明提供用於製備所提供之寡核苷酸及寡核苷酸組合物之方法。在一些實施例中，所提供之方法包含提供具有之結構的所提供之對掌性試劑的步驟，其中W1 為−NG5 ，W2 為O，G1 及G3 中之每一者獨立地為氫或選自C1 - 10 脂族基、雜環基、雜芳基及芳基的視情況經取代之基團，G2 為−C(R)2 Si(R)3 ，且G4 及G5 一起形成具有至多約20個環原子的視情況經取代之飽和、部分不飽和或不飽和含雜原子之環，該環為單環或多環、經稠合或未稠合，其中各R獨立地為氫或選自C1 -C6 脂族基、碳環基、芳基、雜芳基及雜環基的視情況經取代之基團。在一些實施例中所提供之，所提供之對掌性試劑具有之結構。在一些實施例中，所提供之方法包含提供胺基磷酸酯，該胺基磷酸酯包含來自對掌性試劑之具有 之結構的部分，其中−W1 H及−W2 H或羥基及胺基與胺基磷酸酯之磷原子形成鍵。在一些實施例中，−W1 H及−W2 H或羥基及胺基與胺基磷酸酯之磷原子形成鍵，例如在 中。在一些實施例中，胺基磷酸酯具有以下之結構： 。在一些實施例中，R為保護基。在一些實施例中，R為DMTr。在一些實施例中，G2 為−C(R)2 Si(R)3 ，其中−C(R)2 −為視情況經取代之−CH2 −，且−Si(R)3 之各R獨立地為選自C1 - 10 脂族基、雜環基、雜芳基及芳基之視情況經取代之基團。在一些實施例中，−Si(R)3 之至少一個R獨立地為視情況經取代之C1 - 10 烷基。在一些實施例中，−Si(R)3 之至少一個R獨立地為視情況經取代之苯基。在一些實施例中，−Si(R)3 之一個R獨立地為視情況經取代之苯基，且另兩個R各自獨立地為視情況經取代之C1 - 10 烷基。在一些實施例中，−Si(R)3 之一個R獨立地為視情況經取代之C1 - 10 烷基，且另兩個R各自獨立地為視情況經取代之苯基。在一些實施例中，G2 為視情況經取代之−CH2 Si(Ph)(Me)2 。在一些實施例中，G2 為視情況經取代之−CH2 Si(Me)(Ph)2 。在一些實施例中，G2 為−CH2 Si(Me)(Ph)2 。在一些實施例中，G4 及G5 一起形成含有一個氮原子(其與G5 連接)的視情況經取代之飽和5員至6員環。在一些實施例中，G4 及G5 一起形成含有一個氮原子的視情況經取代之飽和5員環。在一些實施例中，G1 為氫。在一些實施例中，G3 為氫。在一些實施例中，G1 及G3 均為氫。在一些實施例中，G1 及G3 均為氫，G2 為−C(R)2 Si(R)3 ，其中−C(R)2 −為視情況經取代之−CH2 −，且−Si(R)3 之各R獨立地為選自C1 - 10 脂族基、雜環基、雜芳基及芳基的視情況經取代之基團，且G4 及G5 一起形成含有一個氮原子的視情況經取代之飽和5員環。在一些實施例中，所提供之方法進一步包含提供含氟試劑。在一些實施例中，所提供之含氟試劑在合成之後自寡核苷酸去除對掌性試劑或由對掌性試劑形成之產物。可根據本發明利用各種已知的含氟試劑，包括用於去除−SiR3 基團之彼等F- 來源，例如TBAF、HF3 -Et3 N等。在一些實施例中，含氟試劑提供較佳結果，例如相較於諸如濃氨之傳統方法而言，處理時間縮短，溫度降低，脫硫減少等。在一些實施例中，關於某些含氟試劑，本發明提供用於改良結果之連接基團，例如在對掌性試劑(或在寡核苷酸合成期間自其形成之產物)之去除期間，寡核苷酸自載體之裂解減少。在一些實施例中，所提供之連接基團為SP連接基團。在一些實施例中，本發明證實，可利用HF-鹼複合物，諸如HF-NR3 ，以控制在對掌性試劑(或在寡核苷酸合成期間自其形成之產物)之去除期間的裂解。在一些實施例中，HF-NR3 為HF-NEt3 。在一些實施例中，HF-NR3 使得能夠使用傳統連接基團，例如丁二醯基連接基團。
在一些實施例中，一種用於產生PNPLA3寡核苷酸之方法包含使用DPSE型對掌性助劑之至少一個循環，諸如以下非限制性實例中所示：
去三苯甲基化：
寡核苷酸之合成以將含2'-F-U-DMTr裝載CPG固體載體(3%二氯乙酸酸(DCA))之甲苯用於自連接於固體載體上之初始核鹼基去除二甲氧基三苯甲基(DMTr)開始，繼之以436 nm之波長下的UV觀測命令模式。用於去三苯甲基化之線性流率為424 cm/hr。
偶合：
在偶合步驟中，將所有胺基酸酯以0.2M之濃度溶解於乙腈(ACN)或20%異丁腈(IBN)/ACN中；在使用之前，使溶液經分子篩(3Å)NLT乾燥4 h (10%，v/v)。將雙活化劑(CMIMT及ETT)偶合方法用於製造寡核苷酸。兩種活化劑均以0.6M之濃度溶解於ACN中。CMIMT向來用於立體限定之核苷酸之高效偶合，且ETT為用於無規/標準胺基酸酯/核苷酸之偶合的活化劑。2.5當量之胺基酸酯用於歷時10 min之再循環時間偶合立體限定核苷酸(線性recycle模式，212 cm/hr)。在偶合步驟中，CMIMT活化劑與立體限定之胺基酸酯之莫耳比維持在6 . 1 : 1 (CMIMT/胺基酸酯=6.1/1)。使所有無規胺基酸酯與ETT活化劑偶合，歷時8 min。ETT與無規/標準胺基酸酯之莫耳比為4 . 5 : 1 。
帽1：
帽1為在硫醇化之前執行的步驟。1-1.5 CV帽B溶液用於歷時4 min之接觸時間使DPSE上之助劑胺封端。用帽B溶液使DPSE對掌性助劑封端有助於降低早期失效及FLP後雜質之含量。
硫醇化：
在帽1步驟之後，用硫醇化試劑，即含0.2M氫化黃原素(xanthane hydride；XH)之吡啶(0.6 CV)歷時6 min之接觸時間使亞磷酸三酯鍵聯P(III)穩定化，以形成穩定P(V)鍵。
氧化：
此處應注意，帽1步驟並非標準核苷酸循環所必需。因此，在將標準核苷酸偶合至固體載體上之後，用0.05M之碘/ 水/ 吡啶溶液(3.5當量)歷時2 min之接觸時間使亞磷酸三酯鍵聯P(III)氧化，以形成穩定P(V)鍵。
帽2 (硫醇化/氧化後封端)：
一般而言，基於DMTr釋放陽離子在偶合步驟中觀測到97-100%之耦合效率。用帽A及帽B溶液、使用0.4 CV歷時0.8 min阻隔固體載體上之殘餘未偶合羥基(通常為1-3%，藉由去三苯甲基監測)，以防止形成缺失序列。倘若仍存在任何助劑胺，則封端前步驟中未封端之彼等助劑胺亦將在此步驟中封端。
重複之循環
重複合成循環(DPSE循環=去三苯甲基化→偶合→帽1→硫醇化→帽2及標準循環=去三苯甲基化→偶合→氧化→帽2)，直至於固體載體上合成所需長度之寡核苷酸為止。
在一些實施例中，本發明包含一種用於製造經導引至所選靶序列之PNPLA3寡核苷酸組合物之方法，該方法包含製造所提供之能夠導引單股RNA干擾且包含第一複數個寡核苷酸的寡核苷酸組合物，該等寡核苷酸中之每一者具有與靶序列互補之鹼基序列。在一些實施例中，所提供之方法進一步包含提供醫藥學上可接受之載劑。
如一般熟習此項技術者所瞭解，所提供之寡核苷酸亦可使用根據本發明所提供之試劑及方法，經由已知溶液相合成來製備。
作為非限制性實例，所提供之寡核苷酸亦可經由此項技術中已知之任何製程製備，包括(但不限於)描述於以下中之彼等製程：JP 4348044、WO2005092909、USPN 9394333、WO2011005761、USPN 8470987、USPN 8859755、USPN 8822671、WO2013012758、EP 13817386、WO2014012081、WO2015107425、WO2017015555及WO2017062862。
包含本文中所揭示之單股寡核苷酸的雙股寡核苷酸
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸為單股或雙股寡核苷酸。在一些實施例中，本發明涵蓋一種雙股寡核苷酸或分子，該雙股寡核苷酸或分子包含如本文所揭示中單股寡核苷酸及至少部分與其互補之另一寡核苷酸。在一些實施例中，本發明係關於包含此雙股寡核苷酸之組合物。
在一些實施例中，本發明涵蓋一種雙股分子，該雙股分子包含如本文所揭示之單股寡核苷酸及至少部分與其互補中另一寡核苷酸，例如分子之一個或兩個末端具有3'或5'懸垂物。
在一些實施例中，本發明涵蓋一種雙股分子，該雙股分子包含如本文所揭示之單股寡核苷酸及完全與其互補之另一寡核苷酸。
在一些實施例中，本發明涵蓋一種能夠導引RNA干擾之雙股分子，該雙股分子包含如本文所揭示中單股寡核苷酸及至少部分與其互補之另一寡核苷酸。
在一些實施例中，本發明涵蓋一種能夠導引RNA干擾之雙股分子，該雙股分子包含如本文所揭示之單股寡核苷酸及至少部分與其互補之另一寡核苷酸，例如能夠導引RNA干擾之分子之一個或兩個末端具有3'或5'懸垂物。
在一些實施例中，本發明涵蓋一種能夠導引RNA干擾之雙股分子，該雙股分子包含如本文所揭示中單股寡核苷酸及完全與其互補之另一寡核苷酸。
在一些實施例中，本發明涵蓋一種能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量的雙股分子，該雙股分子包含如本文所揭示之單股寡核苷酸及至少部分與其互補之另一寡核苷酸。
在一些實施例中，本發明涵蓋一種能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量的雙股分子，該雙股分子包含如本文所揭示之單股寡核苷酸及至少部分與其互補之另一寡核苷酸，例如能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量的分子之一個或兩個末端具有3'或5'懸垂物。
在一些實施例中，本發明涵蓋一種能夠導引RNA干擾及RNase H介導之減量的雙股分子，該雙股分子包含如本文所揭示之單股寡核苷酸及完全與其互補之另一寡核苷酸。
所提供之第一寡核苷酸及寡核苷酸組合物可具有本文中所揭示之任何寡核苷酸之任何型式、結構要素或鹼基序列，且進一步包含至少部分與第一寡核苷酸互補的第二寡核苷酸或寡核苷酸股。在一些實施例中，第一及/或第二寡核苷酸可包含本文中所揭示之任何寡核苷酸之任何型式、結構要素或鹼基序列(或至少部分與其鹼基序列互補的鹼基序列)。在一些實施例中，結構要素為5'端結構、5'端區域、5'核苷酸、種子區域、種子後區域、3'端區域、3'端二核苷酸、3'端帽或此等結構中之任一者之任何部分、GC含量、長GC延伸部、及/或任何修飾、化學、立體化學、修飾模式、化學模式或立體化學模式、或另一化學部分(例如，包括(但不限於)靶向部分、脂質部分、GalNAc部分、碳水化合物部分等)、任何組分或以上各者中的任一者之任何組合。生物應用
如本文所描述，所提供之組合物及方法能夠改良減量，包括轉錄物之單股RNA干擾。在一些實施例中，所提供之組合物及方法提供相較於參考模式得以改良的轉錄物之單股RNA干擾，該參考模式為根據選自由不存在該組合物、存在參考組合物及其組合組成之群的參考條件的模式。改良可為任何所需生物功能之改良。
在一些實施例中，本發明提供一種用於改良靶轉錄物之單股RNA干擾之方法，其包含投與包含第一複數個寡核苷酸之組合物，其中靶轉錄物之單股RNA干擾相對於參考條件得到改良，該等參考條件選自由不存在該組合物、存在參考組合物及其組合組成之群。
在一些實施例中，本發明提供一種介導靶之單股RNA干擾之方法，該方法包含以下步驟： 使含有靶轉錄物之單股RNA干擾系統與包含第一複數個寡核苷酸之PNPLA3寡核苷酸組合物以一定量及在一定條件下接觸一段時間，該等條件足以產生一組單股RNA干擾產物，該組產物不同於在參考條件下產生的一組產物，該等參考條件選自由不存在該組合物、存在參考組合物及其組合組成之群。
在一些實施例中，本發明提供用於治療或預防疾病之組合物及方法，包括(但不限於)本發明中所引用之參考文獻中所描述之彼等組合物及方法。
在一些實施例中，本發明提供一種用於治療或預防疾病之方法，其包含向個體投與本文中描述之PNPLA3寡核苷酸組合物。
在一些實施例中，本發明提供一種用於治療或預防疾病之方法，其包含向個體投與包含第一複數個寡核苷酸之PNPLA3寡核苷酸組合物，其： 1)具有與轉錄物中之靶序列互補的共同鹼基序列；及 2)包含一或多個經修飾之糖部分及經修飾之核苷酸間鍵聯， 該寡核苷酸組合物之特徵在於，當其與單股RNA干擾系統中之轉錄物接觸時，該轉錄物的RNAi介導之減量相對於在參考條件下觀測到的減量得到改良，該等參考條件選自由不存在該組合物、存在參考組合物及其組合組成之群。
在一些實施例中，本發明提供一種用於治療或預防疾病之方法，其包含向個體投與包含第一複數個能夠導引單股RNA干擾之寡核苷酸的PNPLA3寡核苷酸組合物，其中寡核苷酸屬於由以下定義之特定寡核苷酸類型： 1)鹼基序列； 2)主鏈鍵聯模式； 3)主鏈對掌性中心模式；及 4)主鏈磷修飾模式， 該組合物為對掌性受控的，因為相對於具有相同鹼基序列之寡核苷酸的實質上外消旋製劑而言，該組合物中該特定寡核苷酸類型之寡核苷酸增濃，其中： 該寡核苷酸組合物之特徵在於，當其與單股RNA干擾系統中之轉錄物接觸時，該轉錄物的RNAi介導之減量相對於在參考條件下觀測到的減量得到改良，該等參考條件選自由不存在該組合物、存在參考組合物及其組合組成之群。
在一些實施例中，疾病為投與所提供之能夠導引單股RNA干擾之組合物可修復、恢復或引入新的有益功能的疾病。
在一些實施例中，疾病為在投與所提供之組合物之後能藉由改良基因轉錄物之單股RNA干擾系統有效地減少基因之基因表現的疾病。
在一些實施例中，疾病為癌症。
在一些實施例中，本發明提供一種治療疾病之方法，其係藉由投與包含第一複數個共用共同鹼基序列之寡核苷酸的組合物，該共同鹼基序列包含核苷酸序列與靶轉錄物中之靶序列互補的共同鹼基序列， 包含用作寡核苷酸組合物之立體受控寡核苷酸組合物的該改良之特徵在於，當其與PNPLA3寡核苷酸或單股RNA干擾系統中之轉錄物接觸時，轉錄物之RNAi介導之減量相對於在參考條件下觀測到之減量得到改良，該等參考條件選自由不存在該組合物、存在參考組合物及其組合組成之群。
在一些實施例中，疾病為癌症。
在一些實施例中，疾病治療包含藉由改良單股RNA干擾系統使基因功能減量。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑靶向標靶mRNA轉錄物。
在一些實施例中，共同鹼基序列能夠與細胞中之轉錄物雜交。在一些實施例中，共同鹼基序列與本文中描述或此項技術中已知之任何基因之轉錄物雜交。
病症之治療
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠藉由在連結至靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸靶向PNPLA3。
在一些實施例中，PNPLA3為基因或其基因產物(包括(但不限於)轉錄物或蛋白質)，亦稱為：PNPLA3、脂肪營養蛋白(adiponutrin)、ADPN、C22orf20、醯化甘油O-醯基轉移酶或非鈣依賴型磷脂酶A2-ε、iPLA(2)ε、塊莖儲藏蛋白樣磷脂酶域蛋白3；外部ID：MGI: 2151796；HomoloGene: 11883；GeneCards: PNPLA3；物種；人類: Entrez；80339；Ensembl；ENSG00000100344；UniProt；Q9NST1；RefSeq (mRNA)；NM_025225；RefSeq (蛋白質)；NP_079501；位置(UCSC)；Chr 22: 43.92 - 43.96 Mb；物種；小鼠: Entrez；116939；Ensembl；ENSMUSG00000041653；UniProt；Q91WW7；RefSeq (mRNA)；NM_054088；RefSeq (蛋白質)；NP_473429.2 NP_473429；位置(UCSC)；Chr 15: 84.17 - 84.19 Mb。據報導，亦稱為脂肪營養蛋白(ADPN)、醯化甘油O-醯基轉移酶或非鈣依賴型磷脂酶A2-ε (iPLA2-ε)之塊莖儲藏蛋白樣磷脂酶域蛋白3(PNPLA3)為人體內由PNPLA3基因編碼之酶。PNPLA3編碼屬於塊莖儲藏蛋白樣磷脂酶家族之481胺基酸蛋白。據報導，此家族祖代塊莖儲藏蛋白為馬鈴薯塊莖之主要蛋白質且具有非特異性脂質醯基水解酶活性。據報導，PNPLA3 (塊莖儲藏蛋白樣磷脂酶域蛋白3)中之變異體(I148M)在很大程度上與增加之肝脂肪含量及肝臟炎症相關聯。據報導，PNPLA3-1148M之標記物為SNP rs738409。據報導，PNPLA3-I148M與肝脂肪含量之間的關聯在調節BMI、糖尿病狀態、酒精使用以及全球及當地血統之後仍高度顯著，且與全部三個族群之肝臟TG含量之顯著增加相關聯。據報導，PNPLA3-I148M對偶基因之頻率反映三個族群之NAFLD之相對發生率；最高頻率發生在西班牙人中(0.49)，在歐裔美國人(0.23)及非裔美國人(0.17)中觀測到較低頻率。Collins等人 2003 Genome Res. 13 (1): 27-36；Collins等人 2005 Genome Biol. 5 (10): R84；Dunham等人 1999 Nature. 402 (6761): 489-95；Gerhard等人 2004 Genome Res. 14 (10B): 2121-7；Jenkins等人 2005 J. Biol. Chem. 279 (47): 48968-75；Kienesberger等人 2009 J. Lipid Res. 50 Suppl.: S63-8；Lake等人 2006 J. Lipid Res. 46 (11): 2477-87；Liu等人 2004 J. Clin. Endocrinol. Metab. 89 (6): 2684-9；Strausberg等人 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899-903；Wilson等人 2006 J Lipid Res. 47 (9): 1940-9。
在一些實施例中，PNPLA3相關病症為與以下情形相關的病症、引起以下情形及/或與以下情形相關聯：PNPLA3基因或其基因產物之異常或過高之活性、含量及/或表現、或異常組織分佈、或細胞間細胞內分佈。PNPLA3相關病症之非限制性實例包括：肝病、脂肪肝(例如，脂肪在肝中之聚集或肝脂肪之增加或超常肝脂肪)、肝臟脂肪變性(例如，單純性脂肪肝)、脂肪變性肝炎、肝炎、非酒精性脂肪肝病(例如，NAFLD)及/或與肝病或相關聯繼發於肝病的一或多種疾病及/或一或多種症狀或病狀，包括(但不限於)：炎症、肝細胞之損壞(例如，肝細胞壞死)、肝臟之疤痕形成(例如，纖維化)、肝臟之不可逆晚期疤痕形成(例如，肝硬化)、抗胰島素症、糖尿病、血脂異常、刺蝟(Hh)信號傳導路徑之蛋白質活性提高、疲勞、無力、噁心、腹痛、蛛樣血管、黃疸、瘙癢、水腫、腹水、精神錯亂、肥胖、肝細胞癌。
在一些實施例中，PNPLA3相關病症之非限制性實例包括：高脂質血症、I型糖尿病、II型糖尿病、特發性I型糖尿病(Ib型)、成人隱匿遲發性自體免疫糖尿病(LADA)、早發型2型糖尿病(EOD)、青年發作之非常型糖尿病(YOAD)、青少年發病的成年型糖尿病(MODY)、營養不良相關糖尿病、妊娠期糖尿病、冠心病、缺血性中風、血管成形術後再狹窄、周邊血管疾病、間歇性跛行、心肌梗塞、血脂異常、餐後脂血症、葡萄糖耐受異常病狀(IGT)、空腹血漿葡萄糖異常病狀、代謝性酸中毒、酮症、關節炎、肥胖、骨質疏鬆、高血壓、充血性心臟衰竭、左心室肥大、周邊動脈疾病、糖尿病性視網膜病變、黃斑變性、白內障、糖尿病腎病變、腎小球硬化、慢性腎衰竭、糖尿病神經病變、代謝症候群、症候群X、經前症候群、心絞痛、血栓、動脈粥樣硬化、暫時性腦缺血、中風、血管再狹窄、高血糖症、高胰島素血症、高三酸甘油酯血症、抗胰島素症、葡萄糖代謝減弱、勃起功能障礙、皮膚及結締組織病症、足部潰瘍及潰瘍性結腸炎、內皮細胞功能不良及血管順應性減弱、超apo B脂蛋白血症、阿茲海默氏症、精神分裂症、認知障礙、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病及腸躁症候群、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
在一些實施例中，PNPLA3相關病症之非限制性實例包括：脂肪肝、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝纖維化之非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝硬化之非酒精性脂肪變性肝炎，或伴隨肝硬化及肝細胞癌之非酒精性脂肪變性肝炎。
本發明係關於使用本文中所揭示之寡核苷酸之方法，該等寡核苷酸能夠靶向PNPLA3且適用於治療PNPLA3相關病症及/或製造用於PNPLA3相關病症之治療劑。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑之鹼基序列可包含具有與指定鹼基序列之指定最大數目之錯配的鹼基序列或由該鹼基序列組成。
PNPLA3 相關病症之治療
在一些實施例中，本發明係關於一種PNPLA3寡核苷酸，其靶向PNPLA3 (例如，包含PNPLA3靶序列或與PNPLA3靶序列互補之序列的PNPLA3寡核苷酸)。在一些實施例中，本發明係關於一種PNPLA3寡核苷酸，其導引PNPLA3之標靶特異性減量。在一些實施例中，本發明係關於一種PNPLA3寡核苷酸，其導引由RNaseH及/或RNA干擾介導的PNPLA3之標靶特異性減量。能夠靶向PNPLA3之各種此等寡核苷酸揭示於本文中。
在一些實施例中，PNPLA3相關病症之非限制性實例包括：肝病、脂肪肝(例如，脂肪在肝中之聚集或肝脂肪之增加或超常肝脂肪)、肝臟脂肪變性(例如，單純性脂肪肝)、脂肪變性肝炎、肝炎、非酒精性脂肪肝病(例如，NAFLD)及/或與肝病相關聯或繼發於肝病的一或多種疾病及/或一或多種症狀或病狀，包括(但不限於)：炎症、肝細胞之損壞(例如，肝細胞壞死)、肝臟之疤痕形成(例如，纖維化)、肝臟之不可逆晚期疤痕形成(例如，肝硬化)、抗胰島素症、糖尿病、血脂異常、刺蝟(Hh)信號傳導路徑之蛋白質活性提高、疲勞、無力、噁心、腹痛、蛛樣血管、黃疸、瘙癢、水腫、腹水、精神錯亂、肥胖、肝細胞癌。
在一些實施例中，本發明係關於一種治療或改善患者之PNPLA3相關病症的方法，該方法包含向患者投與治療有效量之靶向PNPLA3之PNPLA3寡核苷酸的步驟。
在一些實施例中，本發明係關於一種治療或改善患者之PNPLA3相關病症的方法，該方法包含向患者投與治療有效量之靶向PNPLA3之PNPLA3寡核苷酸的步驟，其中該PNPLA3相關病症係選自：肝病、脂肪肝、脂肪變性、脂肪變性肝炎、肝炎及非酒精性脂肪肝病。
在一些實施例中，本發明係關於一種用於將降低PNPLA3基因表現之PNPLA3寡核苷酸引入至細胞中的方法，該方法包含：使細胞與PNPLA3寡核苷酸接觸。在一些實施例中，寡核苷酸為反義寡核苷酸或單股RNAi劑。
在一些實施例中，本發明係關於一種用於降低有需要之哺乳動物之PNPLA3基因表現的方法，該方法包含：向哺乳動物投與包含靶向PNPLA3之PNPLA3寡核苷酸的核酸-脂質顆粒。在一些實施例中，寡核苷酸為反義寡核苷酸或單股RNAi劑。
在一些實施例中，本發明係關於一種用於在活體內傳遞靶向PNPLA3基因表現之PNPLA3寡核苷酸的方法，該方法包含：向哺乳動物投與靶向PNPLA3之PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸為反義寡核苷酸或單股RNAi劑。在一些實施例中，哺乳動物為人類。在一些實施例中，哺乳動物罹患及/或患有PNPLA3相關病症。在一些實施例中，哺乳動物罹患及/或患有選自以下之PNPLA3相關病症：肝病、脂肪肝、脂肪變性、脂肪變性肝炎、肝炎及非酒精性脂肪肝病。
在一些實施例中，本發明之方法用於治療人類之高脂質血症、I型糖尿病、II型糖尿病、特發性I型糖尿病(Ib型)、成人隱匿遲發性自體免疫糖尿病(LADA)、早發型2型糖尿病(EOD)、青年發作之非常型糖尿病(YOAD)、青少年發病的成年型糖尿病(MODY)、營養不良相關糖尿病、妊娠期糖尿病、冠心病、缺血性中風、血管成形術後再狹窄、周邊血管疾病、間歇性跛行、心肌梗塞、血脂異常、餐後脂血症、葡萄糖耐受異常病狀(IGT)、空腹血漿葡萄糖異常病狀、代謝性酸中毒、酮症、關節炎、肥胖、骨質疏鬆、高血壓、充血性心臟衰竭、左心室肥大、周邊動脈疾病、糖尿病性視網膜病變、黃斑變性、白內障、糖尿病腎病變、腎小球硬化、慢性腎衰竭、糖尿病神經病變、代謝症候群、症候群X、經前症候群、心絞痛、血栓、動脈粥樣硬化、暫時性腦缺血、中風、血管再狹窄、高血糖症、高胰島素血症、高三酸甘油酯血症、高水準之低密度脂蛋白(LDL)膽固醇(高膽固醇血症)、抗胰島素症、葡萄糖代謝減弱、勃起功能障礙、皮膚及結締組織病症、足部潰瘍及潰瘍性結腸炎、內皮細胞功能不良及血管順應性減弱、超apo B脂蛋白血症、阿茲海默氏症、精神分裂症、認知障礙、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病及腸躁症候群、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，其中該方法包含向個體投與治療有效量之本發明PNPLA3寡核苷酸。
在一些實施例中，該方法降低門脈高壓、肝蛋白合成能力、高膽紅素血症或腦病，其中該方法包含向個體投與治療有效量之本發明PNPLA3寡核苷酸。
本發明亦係關於一種用於人類之治療之方法，該治療為向個體投與治療有效量之本發明PNPLA3寡核苷酸來將非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪變性肝炎定級評分系統之嚴重度降低至少一個點、降低非酒精性脂肪變性肝炎活性之血清標記物之含量、降低非酒精性脂肪變性肝炎疾病活性或減少非酒精性脂肪變性肝炎之醫療後果。
在一些實施例中，本發明係關於一種用於治療及/或改善有需要之哺乳動物的與PNPLA3相關病症相關的一或多個症狀的方法，該方法包含：向哺乳動物投與治療有效量之靶向PNPLA3之PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，本發明係關於一種用於降低有需要之哺乳動物對PNPLA3相關病症之易感性的方法，該方法包含：向哺乳動物投與治療有效量之靶向PNPLA3之PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，本發明係關於一種預防或延遲有需要之哺乳動物的PNPLA3相關病症之發作的方法，該方法包含：向哺乳動物投與治療有效量之靶向PNPLA3之PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，本發明係關於一種用於治療及/或改善有需要之哺乳動物的與PNPLA3相關病症相關的一或多個症狀的方法，該方法包含：向哺乳動物投與治療有效量的包含靶向PNPLA3之PNPLA3寡核苷酸的核酸-脂質顆粒。在一些實施例中，本發明係關於一種用於降低有需要之哺乳動物對PNPLA3相關病症之易感性的方法，該方法包含：向哺乳動物投與治療有效量的包含靶向PNPLA3之PNPLA3寡核苷酸的核酸-脂質顆粒。在一些實施例中，本發明係關於一種用於預防或延遲有需要之哺乳動物的PNPLA3相關病症之發作的方法，該方法包含：向哺乳動物投與治療有效量的包含靶向PNPLA3之PNPLA3寡核苷酸的核酸-脂質顆粒。在一些實施例中，寡核苷酸為反義寡核苷酸或單股RNAi劑。在一些實施例中，哺乳動物為人類。在一些實施例中，哺乳動物罹患及/或患有PNPLA3相關病症。在一些實施例中，哺乳動物罹患及/或患有選自以下之PNPLA3相關病症：肝病、脂肪肝、脂肪變性、脂肪變性肝炎、肝炎及非酒精性脂肪肝病。
在一些實施例中，本發明係關於一種抑制細胞中之PNPLA3表現的方法，該方法包含：(a)使細胞與靶向PNPLA3之PNPLA3寡核苷酸接觸；以及(b)將產生之細胞維持在步驟(a)中達足以獲得PNPLA3基因之mRNA轉錄物降解的一段時間，從而抑制PNPLA3基因於細胞中之表現。在一些實施例中，將PNPLA3表現抑制至少30%。在一些實施例中，寡核苷酸為反義寡核苷酸或單股RNAi劑。
在一些實施例中，本發明係關於一種治療由PNPLA3表現介導之病症的方法，其包含向需要此類治療之人類投與治療有效量之靶向PNPLA3之PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸為反義寡核苷酸或單股RNAi劑。
在一些實施例中，本發明係關於一種用於個體以治療PNPLA3相關病症的化合物，其包含靶向PNPLA3之PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸為反義寡核苷酸或單股RNAi劑。在一些實施例中，PNPLA3相關病症係選自：肝病、脂肪肝、脂肪變性、脂肪變性肝炎、肝炎或非酒精性脂肪肝病。
在一些實施例中，向個體投與第二藥劑(例如，另一治療劑)。在一些實施例中，第二藥劑為PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸靶向PNPLA3。在一些實施例中，寡核苷酸為反義寡核苷酸或單股RNAi劑。
本發明之寡核苷酸可單獨或與一或多種其他治療劑組合投與。「組合投與」或「組合療法」意謂向所治療之哺乳動物同時投與本發明之寡核苷酸及一或多種其他治療劑。當組合投與時，各組分可同時投與或以任何順序依序在不同時間點投與。因此，各組分可單獨但時間上充分接近地投與，以便提供所需治療性效應。因此，本文中描述之用於預防及治療之組合物及方法包括使用組合藥劑。
以治療有效量向哺乳動物投與該等組合藥劑。「治療有效量」意謂本發明PNPLA3寡核苷酸之量在單獨或與另一治療劑組合向哺乳動物投與時，對於治療所需疾病/病狀(例如，肥胖、糖尿病及心血管病狀)有效。
因此，本發明之寡核苷酸可與用於治療非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)之藥劑(亦即，抗NASH及抗NAFLD劑)共同投與，該等藥劑諸如：奧利司他、TZD及其他胰島素增敏劑，FGF21類似物，二甲雙胍，ω-3-脂肪酸乙酯(例如，Lovaza)，纖維酸酯，HMG CoA還原酶抑制劑，依澤替米貝(Ezitimbe)，普羅布可(Probucol)，熊去氧膽酸，TGR5促效劑，FXR促效劑，維生素E，甜菜鹼，配妥西菲林(Pentoxifylline)，CB1拮抗劑，肉鹼，N-乙醯半胱胺酸，還原型麩胱甘肽，氯卡色林(lorcaserin)，納曲酮(naltrexone)與丁胺苯丙酮之組合，SGLT2抑制劑，苯丁胺(Phentermine)，托吡酯(Topiramate)，腸泌素(GLP及GIP)類似物及血管緊張素受體阻斷劑。用於治療非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)及/或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)之較佳藥劑(亦即，抗NASH及抗NAFLD劑)為乙醯基-CoA羧化酶(ACC)抑制劑、己酮糖激酶(KHK)抑制劑、GLP-1受體促效劑、FXR促效劑、CB1拮抗劑、ASK1抑制劑、CCR2及/或CCR5之抑制劑、PNPLA3抑制劑、DGAT1抑制劑、DGAT2抑制劑、FGF21類似物、FGF19類似物、SGLT2抑制劑、PPAR促效劑、AMPK活化劑、SCD1抑制劑或MPO抑制劑。共同讓渡之2017年1月12日申請之專利申請案PCT/IB2017/057577係關於GLP-1受體促效劑。最佳為FXR促效劑、細胞凋亡信號調節激酶1 (ASK1)抑制劑、PPAR促效劑、GLP-1受體促效劑、SGLT抑制劑、ACC抑制劑及KHK抑制劑。
另外，本發明之寡核苷酸可與抗糖尿病劑(例如，胰島素、二甲雙胍、DPPIV抑制劑(例如，西他列汀(sitagliptin))，GLP-1受體促效劑、類似物及模擬物，SGLT1及SGLT2抑制劑(例如，埃格列淨(ertuglifozin)))共同投與。較佳之藥劑為二甲雙胍、西他列汀及埃格列淨。適合之抗糖尿病劑包括：乙醯基-CoA羧化酶-(ACC)抑制劑，諸如描述於WO2009144554、WO2003072197、WO2009144555及WO2008065508中之彼等抑制劑；二醯甘油O-醯基轉移酶1 (DGAT-1)抑制劑，諸如描述於WO09016462或WO2010086820中之彼等抑制劑；AZD7687或LCQ908；二醯甘油O-醯基轉移酶2 (DGAT-2)抑制劑，諸如描述於WO2015/140658中之彼等抑制劑；單醯甘油O-醯基轉移酶抑制劑；磷酸二酯酶(PDE)-10抑制劑；AMPK活化劑；磺醯脲(例如，乙醯苯磺醯環己脲(acetohexamide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、氯磺丙脲(diabinese)、格列本脲(glibenclamide)、格列吡嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)、格列美脲(glimepiride)、格列齊特(gliclazide)、格列太特(glipentide)、格列喹酮(gliquidone)、格列索脲(glisolamide)、甲磺吖庚脲(tolazamide)及甲苯磺丁脲(tolbutamide))；美格替耐(meglitinide)；α-澱粉酶抑制劑(例如，澱粉酶抑肽(tendamistat)、萃他汀(trestatin)及AL-3688)；α-葡糖苷水解酶抑制劑(例如，阿卡波糖(acarbose))；α-葡糖苷酶抑制劑(例如，脂解素、卡格列波糖(camiglibose)、乙格列酯(emiglitate)、米格列醇(miglitol)、伏格列波糖(voglibose)、普拉米星-Q (pradimicin-Q)及沙波他汀(salbostatin))；PPARγ促效劑(例如，巴拉列酮(balaglitazone)、環格列酮(ciglitazone)、達格列酮(darglitazone)、恩格列酮(englitazone)、伊薩列酮(isaglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)及羅格列酮(rosiglitazone))；PPARα/γ促效劑(例如，CLX-0940、GW-1536、GW-1929、GW-2433、KRP-297、L-796449、LR-90、MK-0767及SB-219994)；二胍(例如，二甲雙胍)；類升糖素肽1 (GLP-1)受體促效劑(例如，腸促胰島素類似物-3及腸促胰島素類似物-4)；利拉魯肽(liraglutide)；阿必魯肽(albiglutide)；艾塞那肽(exenatide) (Byetta®)；阿必魯肽；利司那肽(lixisenatide)；度拉糖肽(dulaglutide)；司美魯肽(semaglutide)；NN-9924；TTP-054；TTP-273；蛋白質酪胺酸磷酸酶-1B (PTP-1B)抑制劑(例如，特羅杜明(trodusquemine)，西替歐醛(hyrtiosal)提取物及由Zhang, S.等人, Drug Discovery Today, 12(9/10), 373-381 (2007)揭示之化合物)；SIRT-1活化劑(例如，白藜蘆醇(resveratrol)、GSK2245840或GSK184072)；二肽基肽酶IV (DPP-IV)抑制劑(例如，WO2005116014中之彼等抑制劑、西他列汀、維格列汀、阿格列汀、多格列汀、利格列汀及沙格列汀)；胰島素促泌素；脂肪酸氧化抑制劑；A2拮抗劑；c-jun胺基端激酶(JNK)抑制劑；葡糖激酶活化劑(GKa)，諸如描述於WO2010103437、WO2010103438、WO2010013161、WO2007122482中之彼等活化劑、TTP-399、TTP-355、TTP-547、AZD1656、ARRY403、MK-0599、TAK-329、AZD5658或GKM-001；胰島素；胰島素模擬物；肝糖磷酸化酶抑制劑(例如，GSK1362885)；VPAC2受體促效劑；SGLT2抑制劑，諸如描述於E.C. Chao等人 Nature Reviews Drug Discovery 9, 551-559 (2010年7月)中之彼等抑制劑，包括達格列淨、卡格列淨、依帕列淨、托格列淨(CSG452)、埃格列淨、ASP-1941、THR1474、TS-071、ISIS388626及LX4211，以及WO2010023594中之彼等抑制劑；升糖素受體調節劑，諸如描述於Demong, D.E.等人 Annual Reports in Medicinal Chemistry 2008, 43, 119-137中之彼等調節劑；GPR119調節劑，詳言之促效劑，諸如描述於WO2010140092、WO2010128425、WO2010128414、WO2010106457、Jones, R.M.等人 in Medicinal Chemistry 2009, 44, 149-170中之彼等調節劑(例如，MBX-2982、GSK1292263、APD597及PSN821)；FGF21衍生物或類似物，諸如描述於Kharitonenkov, A.等人, Current Opinion in Investigational Drugs 2009, 10(4)359-364中之彼等FGF21衍生物或類似物；TGR5 (亦稱為GPBAR1)受體調節劑)，詳言之促效劑，諸如描述於Zhong, M., Current Topics in Medicinal Chemistry, 2010, 10(4), 386-396中之彼等促效劑及INT777；GPR40促效劑，諸如描述於Medina, J.C., Annual Reports in Medicinal Chemistry, 2008, 43, 75-85中之彼等促效劑，包括(但不限於)TAK-875、GPR120調節劑(詳言之促效劑)；高親和力菸鹼酸受體(HM74A)活化劑；及SGLT1抑制劑，諸如GSK1614235。可與本發明寡核苷酸組合之抗糖尿病劑之另一代表性清單可見於例如WO2011005611之第28頁第35行至第30頁第19行。較佳抗糖尿病劑為二甲雙胍及DPP-IV抑制劑(例如，西他列汀、維格列汀、阿格列汀、多格列汀、利拉利汀及沙格列汀)。其他抗糖尿病劑可包括：肉鹼軟脂醯基轉移酶之抑制劑或調節劑；果糖1,6-二磷酸酶之抑制劑；醛醣還原酶之抑制劑；鹽皮質激素受體抑制劑；TORC2之抑制劑；CCR2及/或CCR5之抑制劑；PKC同功異型物(例如PKC、PKC、PKC)之抑制劑；脂肪酸合成酶之抑制劑；絲胺酸軟脂醯基轉移酶之抑制劑；GPR81、GPR39、GPR43、GPR41、GPR105、Kv1.3、視黃醇結合蛋白4、糖皮質激素受體、生長抑素受體(例如SSTR1、SSTR2、SSTR3及SSTR5)之調節劑；PDHK2或PDHK4之抑制劑或調節劑；MAP4K4之抑制劑；IL1家族(包括IL1β)之調節劑；及RXRα之調節劑。另外，適合之抗糖尿病劑包括Carpino, P.A., Goodwin, B. Expert Opin. Ther. Pat, 2010, 20(12), 1627-51所列之機制。
適合之抗肥胖劑包括11-羥基類固醇去氫酶-1 (11-HSD 1型)抑制劑、硬脂醯-CoA去飽和酶-1 (SCD-1)抑制劑、MCR-4促效劑、膽囊收縮素-A (CCK-A)促效劑、單胺再吸收抑制劑(諸如諾美婷(sibutramine))、擬交感神經藥試劑、3腎上腺素促效劑、多巴胺促效劑(諸如溴麥角環肽)、黑色素細胞-刺激激素類似物、5HT2c促效劑、黑色素濃縮激素拮抗劑、瘦素(OB蛋白)、瘦素類似物、瘦素促效劑、甘丙胺素拮抗劑、脂肪酶抑制劑(諸如四氫利普司他汀(tetrahydrolipstatin)，亦即奧利司他)、厭食劑(諸如鈴蟾素促效劑)、神經肽-Y拮抗劑(例如，NPY Y5拮抗劑)、PYY3-36(包括其類似物)、擬甲狀腺素試劑、脫氫表雄酮或其類似物、糖皮質激素促效劑或拮抗劑、食慾素拮抗劑、升糖素樣肽-1促效劑、睫狀神經營養性因子(諸如，購自 Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY及Procter & Gamble Company, Cincinnati, OH之Axokine™)、人類野鼠色相關蛋白(AGRP)抑制劑、饑餓素拮抗劑、組胺3拮抗劑或反向促效劑、神經介肽U促效劑、MTP/ApoB抑制劑(例如，腸選擇性MTP抑制劑，諸如迪羅哌德)、類鴉片拮抗劑、食慾素拮抗劑、納曲酮與丁胺苯丙酮之組合、及類似物。
用於本發明之組合態樣之較佳抗肥胖劑包括腸選擇性MTP抑制劑(例如，迪羅哌德(dirlotapide)、米瑞他匹(mitratapide)及英普他派(implitapide)、R56918 (CAS編號403987)及CAS編號913541-47-6)；CCKa促效劑(例如，PCT公開案第WO 2005/116034號或US公開案第2005-0267100 A1號中描述之N-苯甲基-2-[4-(1H-吲哚-3-基甲基)-5-側氧基-1-苯基-4,5-二氫-2,3,6,10b-四氮雜-苯并[e]薁-6-基]-N-異丙基-乙醯胺)；5HT2c促效劑(例如，氯卡色林(lorcaserin))；MCR4促效劑(例如，US 6,818,658中描述之化合物)；脂肪酶抑制劑(例如，賽利司他(Cetilistat))；PYY3-36 (如本文中所使用之「PYY3-36」包括類似物，諸如peglated PYY3-36，例如US公開案2006/0178501中描述之彼等)；類鴉片拮抗劑(例如，納曲酮)；納曲酮與丁胺苯丙酮之組合；油醯基-雌酮(CAS編號180003-17-2)；奧尼匹肽(obinepitide) (TM30338)；普蘭林肽(pramlintide) (Symlin®)；泰索酚辛(tesofensine) (NS2330)；瘦素；利拉魯肽(liraglutide)；溴麥角環肽(bromocriptine)；奧利司他；艾塞那肽(exenatide) (Byetta®)；AOD-9604 (CAS編號221231-10-3)；苯丁胺及托吡酯(商標：Qsymia)及諾美婷。較佳地，本發明之寡核苷酸及組合療法結合鍛煉及合理的膳食而投與。
熟習此項技術者將認識到本發明之寡核苷酸亦可結合以下段落中所描述之心血管或腦血管治療來使用。本發明之寡核苷酸亦可與包括PCI之心血管療法、支架術、藥物溶離支架、幹細胞療法及諸如植入起搏器、電震發生器之醫學裝置或心肌再同步療法一起使用。
本發明之寡核苷酸可與膽固醇調節劑(包括降膽固醇劑)組合使用，該等膽固醇調節劑諸如脂肪酶抑制劑、HMG-CoA還原酶抑制劑、HMG-CoA合成酶抑制劑、HMG-CoA還原酶基因表現抑制劑、HMG-CoA合成酶基因表現抑制劑、MTP/Apo B分泌抑制劑、CETP抑制劑、膽酸吸收抑制劑、膽固醇吸收抑制劑、膽固醇合成抑制劑、角鯊烯合成酶抑制劑、角鯊烯環氧酶抑制劑、角鯊烯環化酶抑制劑、組合角鯊烯環氧酶/角鯊烯環化酶抑制劑、袪脂乙酯製劑、菸酸、離子交換樹脂、抗氧化劑、ACAT抑制劑或膽酸螯合劑或諸如米泊美生之藥劑。
適合膽固醇/脂質降低劑及脂質綜合測試療法之實例包括：HMG-CoA還原酶抑制劑(例如，普伐他汀(pravastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、NK-104 (亦稱為伊伐他汀或尼伐他汀(nisvastatin))及ZD-4522 (亦稱為羅素他汀(rosuvastatin)或阿伐他汀或維沙他汀(visastatin))；角鯊烯合成酶抑制劑；纖維酸酯；膽酸螯合劑(諸如降膽敏)；ACAT抑制劑；MTP抑制劑；脂加氧酶抑制劑；膽固醇吸收抑制劑；以及膽固醇酯轉移蛋白抑制劑。其他動脈粥樣硬化藥劑包括PCSK9調節劑。
PNPLA3 寡核苷酸或單股 RNAi 劑 之投與
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由生物化學機制導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低，該生物化學機制不涉及RNA干擾或RISC (包括(但不限於) RNaseH介導之減量或基因表現之位阻)。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠經由RNA干擾及/或RNase H介導之減量導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸能夠藉由在連結至靶基因mRNA之後在空間上阻斷轉譯及/或藉由改變或干擾mRNA剪接及/或外顯子包含或排除來導引靶基因或其基因產物之表現及/或含量的降低。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸與任何媒劑一起以任何給藥方案且以本文中描述或此項技術中已知之任何方式進行投與。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物以比在改良靶轉錄物之減量方面具有類似效應的其他方面類似的參考寡核苷酸組合物的劑量及/或頻率低的劑量及/或頻率進行投與。在一些實施例中，立體受控寡核苷酸組合物以比在改良靶轉錄物之減量方面具有類似效應的其他方面類似的立體無規參考寡核苷酸組合物的劑量及/或頻率低的劑量及/或頻率進行投與。
在一些實施例中，本發明認識到，寡核苷酸及其組合物之特性(例如改良單股RNA干擾活性等)可藉由化學修飾及/或立體化學最佳化。在一些實施例中，本發明提供用於經由化學修飾及立體化學使寡核苷酸特性最佳化的方法。
藉由控制化學修飾及/或立體化學，本發明提供改良之寡核苷酸組合物及方法。在一些實施例中，能夠導引單股RNA干擾的所提供之寡核苷酸包含化學修飾。在一些實施例中，能夠導引單股RNA干擾的所提供之寡核苷酸包含鹼基修飾、糖修飾、核苷酸間鍵聯修飾或其任何組合。在一些實施例中，能夠導引單股RNA干擾的所提供之寡核苷酸包含鹼基修飾。在一些實施例中，能夠導引單股RNA干擾的所提供之寡核苷酸包含糖修飾。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含糖部分上之2'修飾。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個經修飾之核苷酸間鍵聯及一或多個天然磷酸酯鍵聯。天然磷酸酯鍵聯可併入PNPLA3寡核苷酸之各種位置中。在一些實施例中，天然磷酸酯鍵聯併入5'端區域中。在一些實施例中，天然磷酸酯鍵聯併入PNPLA3寡核苷酸之中部中。在一些實施例中，本發明提供一種方法，其包含投與包含第一複數個寡核苷酸之組合物，該組合物相較於包含複數個寡核苷酸之參考組合物展現改良之傳遞，該複數個寡核苷酸各自亦具有共同鹼基序列但在結構上與第一複數個寡核苷酸不同，不同之處在於： 參考的複數個寡核苷酸內之個別寡核苷酸的立體化學結構彼此不同；及/或 參考的複數個寡核苷酸內之至少一些寡核苷酸的結構與由該組合物之複數個寡核苷酸表示之結構不同。
在一些實施例中，本發明提供一種投與PNPLA3寡核苷酸組合物的方法，該PNPLA3寡核苷酸組合物包含第一複數個能夠導引單股RNA干擾且具有共同核苷酸序列之寡核苷酸，改良包含： 投與包含第一複數個寡核苷酸之PNPLA3寡核苷酸，其特徵在於傳遞相對於相同共同核苷酸序列之參考寡核苷酸組合物而言改良。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸、組合物及方法提供改良之全身傳遞。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸、組合物及方法提供改良之細胞質傳遞。在一些實施例中，改良之傳遞係至細胞群體之傳遞。在一些實施例中，改良之傳遞係至組織之傳遞。在一些實施例中，改良之傳遞係至器官之傳遞。在一些實施例中，改良之傳遞係至生物體之傳遞。提供改良之傳遞的實例結構要素(例如，化學修飾、立體化學、其組合等)、寡核苷酸、組合物及方法詳述於本發明中。
在一些實施例中，本發明提供一種鑑別及/或表徵PNPLA3寡核苷酸組合物之方法，該方法包含以下步驟： 提供至少一種包含第一複數個寡核苷酸之組合物；及 相對於參考組合物評定傳遞。
在一些實施例中，本發明提供一種鑑別及/或表徵PNPLA3寡核苷酸組合物之方法，該方法包含以下步驟： 提供至少一種包含第一複數個寡核苷酸之組合物；及 相對於參考組合物評定細胞吸收。
在一些實施例中，比較所提供寡核苷酸組合物之特性與參考寡核苷酸組合物。在一些實施例中，參考寡核苷酸組合物包含參考的複數個寡核苷酸。
在一些實施例中，參考寡核苷酸組合物為立體無規寡核苷酸組合物。在一些實施例中，參考寡核苷酸組合物為所有核苷酸間鍵聯皆為硫代磷酸酯之寡核苷酸的立體無規組合物。在一些實施例中，參考寡核苷酸組合物為所有皆為磷酸酯鍵聯之DNA寡核苷酸組合物。
在一些實施例中，參考組合物為具有相同鹼基序列及相同化學修飾之寡核苷酸的組合物。在一些實施例中，參考組合物為具有相同鹼基序列及相同化學修飾模式之寡核苷酸的組合物。在一些實施例中，參考組合物為具有相同鹼基序列及化學修飾之寡核苷酸的對掌性不受控(或立體無規)組合物。
在一些實施例中，參考組合物為具有相同鹼基序列，但化學修飾不同的寡核苷酸之組合物。在一些實施例中，參考組合物為具有相同鹼基序列、鹼基修飾、核苷酸間鍵聯修飾，但糖修飾不同的寡核苷酸之組合物。在一些實施例中，參考組合物具有較少經2'修飾之糖修飾。在一些實施例中，參考組合物為具有相同鹼基序列、鹼基修飾、糖修飾，但核苷酸間鍵聯修飾不同的寡核苷酸之組合物。在一些實施例中，參考組合物具有較多核苷酸間鍵聯修飾。在一些實施例中，參考組合物具有較少天然磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，參考組合物包含無天然磷酸酯鍵聯之寡核苷酸。
在一些實施例中，參考組合物為包含參考的複數個寡核苷酸之組合物，其中參考的複數個寡核苷酸內的個別寡核苷酸的立體化學結構彼此不同。在一些實施例中，參考組合物為包含參考的複數個寡核苷酸之組合物，其中參考的複數個寡核苷酸內的至少一些寡核苷酸的結構不同於由與參考組合物相比的組合物之複數個寡核苷酸表示的結構。
在一些實施例中，參考寡核苷酸組合物包含參考的複數個寡核苷酸，其能夠導引單股RNA干擾且具有相同的共同核苷酸序列，但不具有與參考組合物相比的寡核苷酸組合物之寡核苷酸中的一或多個經修飾糖部分中之至少一者。在一些實施例中，參考寡核苷酸組合物包含參考的複數個寡核苷酸，其能夠導引單股RNA干擾且具有相同共同核苷酸序列，但不具有經修飾糖部分。在一些實施例中，參考寡核苷酸組合物包含參考的複數個寡核苷酸，其能夠導引單股RNA干擾且具有相同共同核苷酸序列，但不包含天然磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，參考組合物為具有相同化學修飾模式的寡核苷酸之PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑。在一些實施例中，參考組合物為另一立體異構體之PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑。
在一些實施例中，所提供寡核苷酸組合物之參考寡核苷酸組合物為不存在所提供組合物中之脂質的類似組合物。在一些實施例中，參考寡核苷酸組合物為立體無規寡核苷酸組合物。在一些實施例中，參考寡核苷酸組合物為所有核苷酸間鍵聯皆為硫代磷酸酯之寡核苷酸的立體無規組合物。在一些實施例中，參考寡核苷酸組合物為所有皆為磷酸酯鍵聯之DNA寡核苷酸組合物。在一些實施例中，參考組合物為具有相同鹼基序列及相同化學修飾之寡核苷酸的組合物。在一些實施例中，參考組合物為具有相同鹼基序列及相同化學修飾模式之寡核苷酸的組合物。在一些實施例中，參考組合物為具有相同鹼基序列及化學修飾之寡核苷酸的對掌性不受控(或立體無規)組合物。在一些實施例中，參考組合物為具有相同鹼基序列，但化學修飾不同的寡核苷酸之組合物。在一些實施例中，參考組合物為具有相同鹼基序列、鹼基修飾、核苷酸間鍵聯修飾，但糖修飾不同的寡核苷酸之組合物。在一些實施例中，參考組合物具有較少經2'修飾之糖修飾。在一些實施例中，參考組合物為具有相同鹼基序列、鹼基修飾、糖修飾，但核苷酸間鍵聯修飾不同的寡核苷酸之組合物。在一些實施例中，參考組合物具有較多核苷酸間鍵聯修飾。在一些實施例中，參考組合物具有較少天然磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，參考組合物包含無天然磷酸酯鍵聯之寡核苷酸。在一些實施例中，參考組合物為包含參考的複數個寡核苷酸之組合物，其中參考的複數個寡核苷酸內的個別寡核苷酸的立體化學結構彼此不同。在一些實施例中，參考組合物為包含參考的複數個寡核苷酸之組合物，其中參考的複數個寡核苷酸內的至少一些寡核苷酸的結構不同於由與參考組合物相比的組合物之複數個寡核苷酸表示的結構。在一些實施例中，參考寡核苷酸組合物包含參考的複數個寡核苷酸，其能夠導引單股RNA干擾且具有相同的共同核苷酸序列，但不具有與參考組合物相比的寡核苷酸組合物之寡核苷酸中的一或多個經修飾糖部分中之至少一者。在一些實施例中，參考寡核苷酸組合物包含參考的複數個寡核苷酸，其能夠導引單股RNA干擾且具有相同共同核苷酸序列，但不具有經修飾糖部分。在一些實施例中，參考寡核苷酸組合物包含參考的複數個寡核苷酸，其能夠導引單股RNA干擾且具有相同共同核苷酸序列，但不包含天然磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，參考組合物為具有相同化學修飾模式的寡核苷酸之PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑。在一些實施例中，參考組合物為另一立體異構體之PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑。
在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸包含一或多個參考的複數個寡核苷酸並非皆具有之結構要素(例如，修飾、立體化學、模式等)。此等結構要素可為本發明中所描述之任一者。
在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸所包含的硫代磷酸酯鍵聯比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸多。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸在5'端區域包含的硫代磷酸酯鍵聯比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸多。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸在3'端區域包含的硫代磷酸酯鍵聯比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸多。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸所包含的S p對掌性核苷酸間鍵聯比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸多。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸所包含的S p硫代磷酸酯鍵聯比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸多。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸在5'端區域包含的S p硫代磷酸酯鍵聯比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸多。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸在3'端區域包含的S p硫代磷酸酯鍵聯比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸多。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸所包含的經修飾之鹼基比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸多。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸所包含的甲基化鹼基比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸多。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸在5'端區域包含的甲基化鹼基比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸多。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸在3'端區域包含的甲基化鹼基比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸多。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸所包含的2'-MOE修飾比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸少。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸所包含的2'-MOE修飾比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸少。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸在5'端區域包含的2'-MOE修飾比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸少。在一些實施例中，第一複數個寡核苷酸在3'端區域包含的2'-MOE修飾比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸少。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸內的個別寡核苷酸的立體化學結構彼此不同。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸內的至少一些寡核苷酸的結構不同於由組合物之複數個寡核苷酸表示的結構。在一些實施例中，參考組合物為共用鹼基序列之寡核苷酸的實質上外消旋製劑。在一些實施例中，參考組合物為另一寡核苷酸類型之PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較多硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸僅包含硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較少經修飾之糖部分。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較少經修飾之糖部分，其中該修飾為2'-OR1 。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較多經修飾之糖部分。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較多經修飾之糖部分，該修飾為2'-OR1 。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較少硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較少甲基化鹼基。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較多2'-MOE修飾。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較少天然磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸在5'及/或3'端區域包含較少天然磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸所包含的2'-MOE修飾比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸少。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸所包含的2'-MOE修飾比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸少。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸在5'端區域包含的2'-MOE修飾比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸少。在一些實施例中，所提供之組合物之寡核苷酸在3'端區域包含的2'-MOE修飾比參考組合物之PNPLA3寡核苷酸少。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸內的個別寡核苷酸的立體化學結構彼此不同。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸內的至少一些寡核苷酸的結構不同於由組合物之複數個寡核苷酸表示的結構。在一些實施例中，參考組合物為共用鹼基序列之寡核苷酸的實質上外消旋製劑。在一些實施例中，參考組合物為另一寡核苷酸類型之PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較多硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸僅包含硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較少經修飾之糖部分。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較少經修飾之糖部分，其中該修飾為2'-OR1 。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較多經修飾之糖部分。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較多經修飾之糖部分，該修飾為2'-OR1 。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較少硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較少甲基化鹼基。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較多2'-MOE修飾。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸包含較少天然磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，參考組合物之寡核苷酸在5'及/或3'端區域包含較少天然磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸包含較少含-F之核苷酸單元。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸包含較少經2'-F修飾之糖部分。在一些實施例中，參考的複數個寡核苷酸包含較少對掌性受控的經修飾之核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物包含一種寡核苷酸類型之寡核苷酸。在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物包含僅一種寡核苷酸類型之寡核苷酸。在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物具有僅一種寡核苷酸類型之寡核苷酸。在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物包含兩種或更多種寡核苷酸類型之寡核苷酸。在一些實施例中，使用此等組合物，所提供之方法可靶向超過一個標靶。在一些實施例中，包含兩種或更多種寡核苷酸類型之PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑靶向兩個或更多個標靶。在一些實施例中，包含兩種或更多種寡核苷酸類型之PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑靶向兩個或更多個錯配。在一些實施例中，單一寡核苷酸類型靶向兩個或更多個標靶，例如突變。在一些實施例中，一種寡核苷酸類型之寡核苷酸之靶區域包含兩個或更多個「靶點」，諸如兩個突變或SNP。
在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物中之寡核苷酸視情況包含經修飾之鹼基或糖。在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物不具有任何經修飾之鹼基或糖。在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物不具有任何經修飾之鹼基。在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物中之寡核苷酸包含經修飾之鹼基及糖。在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物中之寡核苷酸包含經修飾之鹼基。在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物中之寡核苷酸包含經修飾之糖。用於寡核苷酸之經修飾之鹼基及糖為此項技術中廣泛已知的，包括(但不限於)本發明中所描述之彼等經修飾之鹼基及糖。在一些實施例中，經修飾之鹼基為5-mC。在一些實施例中，經修飾之糖為經2'修飾之糖。寡核苷酸糖之適合2'修飾為一般熟習此項技術者廣泛已知的。在一些實施例中，2'修飾包括(但不限於) 2'-OR1 ，其中R1 不為氫。在一些實施例中，2'修飾為2'−OR1 ，其中R1 為視情況經取代之C1 - 6 脂族基。在一些實施例中，2'修飾為2'-MOE。在一些實施例中，修飾為2'-鹵素。在一些實施例中，修飾為2'−F。在一些實施例中，經修飾之鹼基或糖可進一步增強對掌性受控寡核苷酸組合物之活性、穩定性及/或選擇性，該對掌性受控寡核苷酸組合物之共同主鏈對掌性中心模式提供出人意料的活性、穩定性及/或選擇性。
在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物不具有任何經修飾之糖。在一些實施例中，所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物不具有任何經2'修飾之糖。在一些實施例中，本發明意外發現，藉由使用對掌性受控寡核苷酸組合物，經修飾之糖將不再為穩定性、活性及/或裂解模式之控制所需。另外，在一些實施例中，本發明意外發現，不含經修飾之糖的寡核苷酸之對掌性受控寡核苷酸組合物就穩定性、活性、裂解模式之轉換及/或控制而言傳遞較佳特性。舉例而言，在一些實施例中，意外發現，不具有經修飾之糖的寡核苷酸之對掌性受控寡核苷酸組合物相比含經修飾之糖的寡核苷酸之組合物而言，自裂解產物解離快得多且提供顯著增加的轉換。
如本文中詳細論述，本發明尤其提供一種對掌性受控寡核苷酸組合物，意謂該組合物含有複數個至少一種類型之寡核苷酸。各特定「類型」之寡核苷酸分子包含在以下方面經過預先選擇(例如，預定)之結構要素：(1)鹼基序列；(2)主鏈鍵聯模式；(3)主鏈對掌性中心模式；及(4)主鏈P修飾部分之模式。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物含有在單一合成製程中製備的寡核苷酸。在一些實施例中，所提供之組合物含有在單一寡核苷酸分子內具有超過一種對掌性組態的寡核苷酸(例如，其中沿著寡核苷酸之不同殘基具有不同立體化學)；在一些此類實施例中，此等寡核苷酸可在單一合成製程中獲得，不需要二級結合步驟來產生含超過一種對掌性組態之個別寡核苷酸分子。
如本文所提供之寡核苷酸組合物可用作單股RNAi劑。另外，如本文所提供之寡核苷酸組合物可用作用於研究及/或診斷用途之試劑。一般技術者將容易認識到，本文中之本發明揭示內容不限於特定用途，而是適用於需要使用合成寡核苷酸之任何情況。所提供組合物尤其適用於各種治療、診斷、農業及/或研究應用。
在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物包含包括如本文中詳細描述之一或多個結構修飾的寡核苷酸及/或其殘基。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物包含含有一或多個經修飾之核苷酸的寡核苷酸。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸組合物包含含有一或多個人工核酸或殘基之寡核苷酸，包括(但不限於)：肽核酸(PNA)、N-嗎啉基及鎖核酸(LNA)、甘油核酸(GNA)、蘇糖核酸(TNA)、異種核酸(Xeno nucleic acid；XNA)、甘露糖醇核酸(MNA)、阿尼托核酸(anitol nucleic acid；ANA)及F-HNA，及其任何組合。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含如以下中所描述之N-嗎啉基：Braasch等人 2002 Biochem. 41: 4503-4510或美國專利第5,698,685號、第5,166,315號、第5,185,444號或第5,034,506號。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含如以下中所描述之F-HNA：美國專利第8,088,904號、第8,440,803號或第8,796,437號；或WO 2017/011276。包括經修飾之糖多各種經修飾之核苷酸描述於例如WO 2016 154096及WO 2016/141236中。
在任一實施例中，本發明適用於基因表現、免疫反應等之基於寡核苷酸的調節。 因此，含有預定類型之寡核苷酸(亦即，其為對掌性受控的，且視情況為對掌性純的)的本發明立體限定的寡核苷酸組合物可代替習知立體無規或對掌性不純的對應物使用。在一些實施例中，所提供之組合物展示所要效應增強及/或不當副作用減少。本發明之生物及臨床/治療應用之某些實施例明確論述於下文中。
可利用各種給藥方案來投與所提供之對掌性受控寡核苷酸組合物。在一些實施例中，間隔一定時間段投與多個單位劑量。在一些實施例中，指定組合物具有推薦的給藥方案，其可涉及一或多次給藥。在一些實施例中，給藥方案包含複數次給藥，其各自彼此間隔開相同長度的時間段；在一些實施例中，給藥方案包含複數次給藥及至少兩個用於間隔開個別給藥之不同時間段。在一些實施例中，給藥方案內之所有給藥具有相同之單位給藥量。在一些實施例中，給藥方案內之不同給藥具有不同之量。在一些實施例中，給藥方案包含以第一給藥量第一次給藥，繼之以另一或多次以不同於第一給藥量之第二給藥量給藥。在一些實施例中，給藥方案包含以第一給藥量第一次給藥，繼之以另一或多次與第一次給藥(或另一先前給藥)量相同或不同的第二(或後續)給藥量給藥。在一些實施例中，給藥方案包含投與至少一個單位劑量，持續至少一天。在一些實施例中，給藥方案包含在至少一天且有時超過一天之時間段內投與超過一個劑量。在一些實施例中，給藥方案包含在至少一週之時間段內投與多個劑量。在一些實施例中，該時間段為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多(例如，約45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多)週。在一些實施例中，給藥方案包含每週投與一個劑量，持續超過一週。在一些實施例中，給藥方案包含每週投與一個劑量，持續2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多(例如，約45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多)週。在一些實施例中，給藥方案包含每兩週投與一個劑量，持續超過兩週時間。在一些實施例中，給藥方案包含在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多(例如，約45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多)週之時間段內每兩週投與一個劑量。在一些實施例中，給藥方案包含每月投與一個劑量，持續一個月。在一些實施例中，給藥方案包含每月投與一個劑量，持續超過一個月。在一些實施例中，給藥方案包含每個月投與一個劑量，持續2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個月。在一些實施例中，給藥方案包含每週投與一個劑量，持續約10週。在一些實施例中，給藥方案包含每週投與一個劑量，持續約20週。在一些實施例中，給藥方案包含每週投與一個劑量，持續約30週。在一些實施例中，給藥方案包含每週投與一個劑量，持續26週。在一些實施例中，根據不同於用於具有相同序列之對掌性不受控(例如，立體無規)寡核苷酸組合物及/或具有相同序列之不同對掌性受控寡核苷酸組合物的給藥方案投與PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑。在一些實施例中，根據相較於具有相同序列之對掌性不受控(例如，立體無規)寡核苷酸組合物之給藥方案降低的給藥方案來投與PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑，降低之處在於其達成指定單位時間內之較低水準之完全暴露、涉及一或多個較低單位劑量及/或包括指定單位時間內的較少給藥次數。在一些實施例中，根據時間段比具有相同序列之對掌性不受控(例如，立體無規)寡核苷酸組合物之時間段更長的給藥方案來投與PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑。不希望受理論限制，申請人指出，在一些實施例中，較短給藥方案及/或各次給藥之間的較長時間段可歸因於對掌性受控寡核苷酸組合物之改良之穩定性、生物可用性及/或功效。在一些實施例中，相較於對應對掌性不受控寡核苷酸組合物，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑之給藥方案更長。在一些實施例中，相較於對應對掌性不受控寡核苷酸組合物，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑在至少兩次給藥之間的時間段較短。不希望受理論限制，申請人指出，在一些實施例中，較長給藥方案及/或各次給藥之間的較短時間段可歸因於對掌性受控寡核苷酸組合物之改良安全性。
在一些實施例中，憑藉其改良之傳遞(及其他特性)，所提供之組合物可以較低劑量及/或以較低頻率投與以達成生物效應，例如臨床功效。
單一劑量可含有各種量之寡核苷酸。在一些實施例中，單一劑量可含有各種量之視應用需要適合的一種類型之對掌性受控寡核苷酸。在一些實施例中，單一劑量含有約1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300或大於300(例如，約350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或大於1000)毫克之一種類型的對掌性受控寡核苷酸。在一些實施例中，單一劑量含有約1 mg一種類型的對掌性受控寡核苷酸。在一些實施例中，單一劑量含有約5 mg一種類型的對掌性受控寡核苷酸。在一些實施例中，單一劑量含有約10 mg一種類型的對掌性受控寡核苷酸。在一些實施例中，單一劑量含有約15 mg一種類型的對掌性受控寡核苷酸。在一些實施例中，單一劑量含有約20 mg一種類型的對掌性受控寡核苷酸。在一些實施例中，單一劑量含有約50 mg一種類型的對掌性受控寡核苷酸。在一些實施例中，單一劑量含有約100 mg一種類型的對掌性受控寡核苷酸。在一些實施例中，單一劑量含有約150 mg一種類型的對掌性受控寡核苷酸。在一些實施例中，單一劑量含有約200 mg一種類型的對掌性受控寡核苷酸。在一些實施例中，單一劑量含有約250 mg一種類型的對掌性受控寡核苷酸。在一些實施例中，單一劑量含有約300 mg一種類型的對掌性受控寡核苷酸。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸在單一劑量及/或總劑量方面按比對掌性不受控寡核苷酸低的量投與。在一些實施例中，歸因於改良之功效，對掌性受控寡核苷酸在單一劑量及/或總劑量方面按比對掌性不受控寡核苷酸低的量投與。在一些實施例中，對掌性受控寡核苷酸在單一劑量及/或總劑量方面按比對掌性不受控寡核苷酸高的量投與。在一些實施例中，歸因於改良之安全性，對掌性受控寡核苷酸在單一劑量及/或總劑量方面按比對掌性不受控寡核苷酸高的量投與。生物活性寡核苷酸
在一些實施例中，本發明涵蓋能夠充當單股RNAi劑之寡核苷酸。
在一些實施例中，所提供之組合物包括一或多個與以下之股完全或部分互補的寡核苷酸：結構基因、基因控制及/或終止區及/或諸如病毒或質體DNA之自我複製系統。在一些實施例中，所提供之組合物包括一或多個寡核苷酸，其為或充當RNAi劑或其他RNA干擾試劑(RNAi劑或iRNA劑)、shRNA、反義寡核苷酸、自裂解RNA、核糖核酸酶、其片段及/或其變異體(諸如肽基轉移酶23S rRNA、RNase P、I類及II類內含子、GIR1分支核糖核酸酶、先導酶(Leadzyme)、髮夾核糖核酸酶、錘頭狀核糖核酸酶、HDV核糖核酸酶、哺乳動物CPEB3核糖核酸酶、VS核糖核酸酶、glmS核糖核酸酶、CoTC核糖核酸酶等)、微小RNA、微小RNA模擬物、超級miR、適體、抗miR、拮抗miR、Ul接附子、形成三螺旋體之寡核苷酸、RNA活化劑、長非編碼RNA、短非編碼RNA (例如，piRNA)、免疫調節性寡核苷酸(諸如免疫刺激性寡核苷酸、免疫抑制性寡核苷酸)、GNA、LNA、ENA、PNA、TNA、嗎啉核酸、G-四聯體(RNA及DNA)、抗病毒寡核苷酸及誘騙性寡核苷酸。
在一些實施例中，所提供之組合物包括一或多個雜交(例如，嵌合)寡核苷酸。在本發明之上下文中，術語「雜交」廣泛地指寡核苷酸之混合結構要素。雜交寡核苷酸可指例如(1)具有混合種類之核苷酸的PNPLA3寡核苷酸分子，例如在單一分子內含部分DNA及部分RNA(例如，DNA-RNA)；(2)數對互補的不同種類之核酸，使得發生分子內或分子間或分子內及分子間DNA:RNA鹼基配對；(3)含兩種或更多種主鏈或核苷酸間鍵聯的PNPLA3寡核苷酸。
在一些實施例中，所提供之組合物包括一或多個在單一分子內包含超過一類核酸殘基的寡核苷酸。舉例而言，在本文中描述之任一實施例中，PNPLA3寡核苷酸可包含DNA部分及RNA部分。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸可包含未經修飾之部分及經修飾之部分。
所提供之寡核苷酸組合物可包括含有各種修飾中之任一者的寡核苷酸，例如如本文中所描述。在一些實施例中，舉例而言，根據預期用途選擇特定修飾。在一些實施例中，需要修飾雙股寡核苷酸(或單股寡核苷酸之雙股部分)之一股或兩股。在一些實施例中，兩股(或部分)包括不同修飾。在一些實施例中，兩股包括相同修飾。熟習此項技術者應瞭解，藉由本發明方法實現之修飾程度及類型允許發生多次修飾置換。此等修飾之實例描述於本文中且不意欲為限制性的。
如本文所用，片語「反義股」係指大體上或100%與相關靶序列互補的PNPLA3寡核苷酸。片語「反義股」包括兩個寡核苷酸中由兩個單獨股形成的反義區域以及能夠形成髮夾或啞鈴型結構的單分子寡核苷酸。關於雙股RNAi劑，諸如siRNA，反義股為優先併入RISC中且靶向RNA標靶的RISC介導之減量的股。關於雙股RNAi劑，術語「反義股」及「引導股(guide strand)」在本文中可互換使用；且術語「有義股」或「隨從股(passenger strand)」涉及並非反義股之股時在本文中可互換使用。
片語「有義股」係指具有與諸如信使RNA或DNA序列之靶序列完全或部分相同之核苷序列的PNPLA3寡核苷酸。
「靶序列」意謂任何有待調節表現或活性之核酸序列。靶核酸可為DNA或RNA，諸如內源性DNA或RNA、病毒DNA或病毒RNA、或由基因、病毒、細菌、真菌、哺乳動物或植物編碼的其他RNA。在一些實施例中，靶序列與疾病或病症相關。關於RNA干擾及RNase H介導之減量，靶序列一般為RNA靶序列。
「可特異性雜交」及「互補」意謂核酸可藉由傳統的華特生-克里克(Watson-Crick)或其他非傳統類型與另一核酸序列形成氫鍵。關於本發明之核分子，核酸分子與其互補序列之結合自由能足以允許核酸之相關功能繼續下去，例如RNAi活性。核酸分子之結合自由能之測定為此項技術中熟知的(參見例如Turner等人 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LIT第123-133頁；Frier等人, 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA83:9373-9377；Turner等人, 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785)。
互補性百分比指示可與第二核酸序列形成氫鍵(例如，華特生-克里克鹼基配對)的核酸分子之相鄰殘基之百分比(例如，10分之5、6、7、8、9、10，即50%、60%、70%、80%、90%及100%互補)。「完美互補」或100%互補意謂核酸序列之所有相鄰殘基皆將與第二核酸序列中相同數目之相鄰殘基形成氫鍵。次完美互補係指兩股之一些但並非所有核苷單元可彼此形成氫鍵的情況。「基本上互補」係指聚核苷酸股展現90%或更高的互補性，不包括聚核苷酸股中針對非互補所選擇之區域(諸如懸垂物)。特異性結合要求足夠程度之互補性以避免寡聚化合物與非靶序列在特異性結合所需的條件下非特異性結合，例如在活體內分析或治療性治療之情況下為在生理條件下，或在活體外分析之情況下為在執行該等分析之條件下。在一些實施例中，非靶序列與對應靶序列相差至少5個核苷酸。
當用作療法時，以醫藥組合物形式投與所提供之寡核苷酸。在一些實施例中，醫藥組合物包含治療有效量之包含所提供之寡核苷酸或其藥學上可接受之鹽，及至少一種醫藥學上可接受之非活性成分，其選自醫藥學上可接受之稀釋劑、醫藥學上可接受之賦形劑及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥組合物經調配用於靜脈內注射、經口投與、經頰投與、吸入、經鼻投與、局部投與、經眼投與或經耳投與。在其他實施例中，醫藥組合物為錠劑、丸劑、膠囊、液體、吸入劑、鼻用噴霧溶液、栓劑、懸浮液、凝膠、膠質、分散液、懸浮液、溶液、乳液、軟膏、洗劑、滴眼劑或滴耳劑。醫藥組合物
當用作療法時，本文中描述之所提供之寡核苷酸或寡核苷酸組合物以醫藥組合物形式投與。在一些實施例中，醫藥組合物包含治療有效量之所提供之寡核苷酸或其藥學上可接受之鹽，及至少一種醫藥學上可接受之非活性成分，其選自醫藥學上可接受之稀釋劑、醫藥學上可接受之賦形劑及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥組合物經調配用於靜脈內注射、經口投與、經頰投與、吸入、經鼻投與、局部投與、經眼投與或經耳投與。在一些實施例中，醫藥組合物為錠劑、丸劑、膠囊、液體、吸入劑、鼻用噴霧溶液、栓劑、懸浮液、凝膠、膠質、分散液、懸浮液、溶液、乳液、軟膏、洗劑、滴眼劑或滴耳劑。
在一些實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含對掌性受控寡核苷酸或其組合物與醫藥學上可接受之賦形劑的混合物。熟習此項技術者將認識到，醫藥組合物包括對掌性受控寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽或其組合物，上文所描述。
可使用各種超分子奈米載劑來傳遞核酸。實例奈米載劑包括(但不限於)脂質體、陽離子聚合物複合物及各種聚合物。核酸與各種聚陽離子複合為細胞內傳遞之另一方法；此方法包括使用聚乙二醇化聚陽離子、聚乙烯胺(PEI)複合物、陽離子嵌段共聚物及樹狀體。包括PEI及聚醯胺基胺樹狀體之若干陽離子奈米載劑有助於自核內體釋放內容物。其他方法包括使用聚合奈米粒子、微球、脂質體、樹狀體、生物可降解聚合物、結合物、前藥、諸如硫或鐵之無機膠體、抗體、插入物、生物可降解插入物、生物可分解微球、滲透受控插入物、脂質奈米粒子、乳液、油狀溶液、水溶液、生物可降解聚合物、聚乳酸羥基乙酸共聚物、聚乳酸、液體儲存物、聚合物微胞、量子點及脂複合體。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸與另一分子結合。
除本文中描述之實例傳遞策略之外，亦已知其他核酸傳遞策略。
在治療及/或診斷應用中，本發明化合物可經調配用於各種投與模式，包括全身性及局部或區域化投與。技術及調配物一般可見於Remington, The Science and Practice of Pharmacy, (第20版 2000)中。
所提供之寡核苷酸及其組合物在寬劑量範圍內有效。舉例而言，在治療成年人時，每天約0.01至約1000 mg、約0.5至約100 mg、約1至約50 mg及每天約5至約100 mg之劑量為可用劑量之實例。精確劑量將視投與途徑、化合物之投與形式、待治療之個體、待治療之個體之體重及主治醫師之偏好及經驗而定。
醫藥學上可接受之鹽通常為一般熟習此項技術者熟知的，且可包括例如(但不限於)乙酸鹽、苯磺酸鹽(benzenesulfonate/besylate)、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、乙二胺四乙酸鈣、樟腦磺酸鹽(carnsylate)、碳酸鹽、檸檬酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二磺酸鹽(edisylate)、衣托酸鹽(estolate)、乙磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽(gluceptate)、葡糖酸鹽、麩胺酸鹽、乙內醯胺苯胂酸鹽、己基間苯二酚酸鹽(hexylresorcinate)、海卓胺(hydrabamine)、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥基萘甲酸鹽、碘化物、羥乙基磺酸鹽(isethionate)、乳酸鹽、乳糖酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、杏仁酸鹽、甲磺酸鹽、半乳糖二酸鹽(mucate)、萘磺酸鹽、硝酸鹽、雙羥萘酸鹽(恩波酸鹽(embonate))、泛酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、次乙酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、丹寧酸鹽(tannate)、酒石酸鹽或茶氯酸鹽(teoclate)。其他醫藥學上可接受之鹽可見於例如Remington, The Science and Practice of Pharmacy (第20版 2000)中。較佳醫藥學上可接受之鹽包括例如乙酸鹽、苯甲酸鹽、溴化物、碳酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲磺酸鹽、萘磺酸鹽、雙羥萘酸鹽(恩波酸鹽)、磷酸鹽、水楊酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽或酒石酸鹽。
在一些實施例中，所提供之單股RNAi劑以描述於以下中之醫藥組合物調配：美國申請案第61/774759號、12/19/13申請之第61/918,175號、第61/918,927號、第61/918,182號、第61/918941號、第62/025224號、第62/046487號；或國際申請案第PCT/US04/042911號、第PCT/EP2010/070412號或第PCT/I B2014/059503號。
視待治療之特定病狀而定，此等藥劑可調配成液體或固體劑型且全身性地或局部投與。該等藥劑可例如以如熟習此項技術者已知的定時釋放或持續低釋放形式傳遞。用於調配及投與之技術可見於Remington, The Science and Practice of Pharmacy, (第20版 2000)中。適合之途徑可包括：經口、經頰、藉由吸入噴霧、舌下、經直腸、經皮、經陰道、經黏膜、經鼻或經腸投與；非經腸傳遞，包括肌肉內、皮下、髓內注射以及鞘內、直接室內、靜脈內、關節內、胸骨內、滑膜內、肝臟內、病灶內、顱內、腹膜內、鼻內或眼內注射或其他傳遞模式。
為進行注射，本發明之藥劑可於水溶液，諸如於生理學上相容之緩衝液(諸如漢克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或鹽水緩衝液)中調配及稀釋。對於此類經黏膜投與，在調配物中使用適於待滲透之屏障的滲透劑。此類滲透劑一般為此項技術中已知的。
使用醫藥學上可接受之惰性載劑調配本文中所揭示之化合物以便將本發明實踐為適用於全身性投與之劑量係在本發明之範疇內。藉由恰當選擇載劑及適合製造規範，本發明之組合物、尤其是以溶液形式調配之彼等組合物可非經腸投與，諸如藉由靜脈內注射投與。
化合物可使用此項技術中熟知的醫藥學上可接受之載劑容易地調配成適合經口投與的劑量。此類載劑可使得本發明化合物能調配成用於由待治療之個體(例如，患者)口服攝取之錠劑、丸劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液及其類似者。
對於經鼻或吸入傳遞，本發明之藥劑亦可藉由熟習此項技術者已知之方法調配，且可包括例如(但不限於)溶解、稀釋或分散諸如鹽水、防腐劑(諸如苯甲醇)、吸收促進劑及氟碳化物之物質的實例。
在某些實施例中，寡核苷酸及組合物傳遞至CNS。在某些實施例中，寡核苷酸及組合物傳遞至腦脊髓液。在某些實施例中，寡核苷酸及組合物投與至腦實質。在某些實施例中，寡核苷酸及組合物藉由鞘內投與或腦室內投與傳遞至動物/個體。本文中描述之寡核苷酸及組合物在中樞神經系統內之廣泛分佈可藉由腦實質內投與、鞘內投與或腦室內投與達成。
在某些實施例中，非經腸投與係藉由注射，例如藉由注射器、泵等。在某些實施例中，注射為快速注射。在某些實施例中，注射係直接投與至組織，諸如紋狀體、尾狀體、皮質、海馬區及小腦。
在某些實施例中，特異性定位醫藥劑之方法(諸如藉由快速注射)使中值有效濃度(EC50)降低20、25、30、35、40、45或50倍。在某些實施例中，醫藥劑為如本文中進一步描述之反義化合物。在某些實施例中，目標組織為腦組織。在某些實施例中，目標組織為紋狀體組織。在某些實施例中，降低EC50為合乎需要的，因為其降低了在有需要之患者中達成藥理學結果所需的劑量。
在某些實施例中，反義寡核苷酸藉由注射或輸注傳遞，每個月、每兩個月、每90天、每3個月、每6個月一次；一年兩次或一年一次。
適用於本發明之醫藥組合物包括如下組合物，其中含有有效量之活性成分以達成其預期用途。有效量的測定完全在熟習此項技術者的能力範圍內(尤其根據本文提供的詳細揭示內容)。
除活性成分之外，此等醫藥組合物可含有適合的醫藥學上可接受之載劑，包含賦形劑及助劑，其有助於將活性化合物處理成可在藥學上使用之製劑。經調配用於經口投與之製劑可呈錠劑、糖衣藥丸、膠囊或溶液形式。
經口使用之醫藥製劑可藉由組合活性化合物與固體賦形劑，視情況研磨所得混合物且必要時在添加適合助劑之後加工顆粒之混合物以得到錠劑或糖衣藥丸核心來獲得。適合賦形劑尤其為填充劑，諸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纖維素製劑，例如玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉(CMC)及/或聚乙烯吡咯啶酮(PVP：普維酮(povidone))。若需要，則可添加崩解劑，諸如交聯聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，諸如海藻酸鈉。
糖衣藥丸核心具有適合包衣。出於此目的，可使用濃縮糖溶液，其可視情況含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯啶酮、卡波普凝膠(carbopol gel)、聚乙二醇(PEG)及/或二氧化鈦、漆液及適合有機溶劑或溶劑混合物。可向錠劑或糖衣藥丸包衣中添加染料或顏料以鑑別或表徵活性化合物劑量之不同組合。
可經口使用之醫藥製劑包括由明膠製成之配合插入型膠囊以及由明膠及塑化劑(諸如甘油或山梨糖醇)製成之密封軟膠囊。配合插入型膠囊可含有活性成分與諸如乳糖之填充劑、諸如澱粉之黏合劑及/或諸如滑石或硬脂酸鎂之潤滑劑以及視情況存在之穩定劑的混合物。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮於諸如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇(PEG)之適合液體中。另外，可添加穩定劑。
可藉由將活性化合物與脂質組合來獲得組合物。在一些實施例中，脂質與活性化合物結合。在一些實施例中，脂質不與活性化合物結合。在一些實施例中，脂質包含C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C40 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質係選自由以下組成之群：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、二十二碳六烯酸(順-DHA)、喇叭藻酸及二亞油基。在一些實施例中，脂質具有以下中之任一者之結構： 在一些實施例中，活性化合物為本文中描述之任何寡核苷酸或其他核酸。在一些實施例中，活性化合物為具有包含表1A中所列之任何核酸之任何序列或由該序列組成的序列的核酸。在一些實施例中，組合物包含脂質及活性化合物，且進一步包含另一組分，其選自：另一脂質及靶向化合物或部分。在一些實施例中，脂質包括(但不限於)：胺基脂質；兩性脂質；陰離子脂質；脂蛋白元；陽離子脂質；低分子量陽離子脂質；諸如CLinDMA及DLinDMA之陽離子脂質；可電離陽離子脂質；遮蓋組分；輔助脂質；脂肽；中性脂質；中性兩性離子脂質；疏水性小分子；疏水性維生素；PEG-脂質；經一或多個親水性聚合物修飾之不帶電脂質；磷脂；諸如1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺之磷脂；隱形脂質；固醇；膽固醇；及靶向脂質；及本文中描述或此項技術中所報導之任何其他脂質。在一些實施例中，組合物包含脂質及另一脂質之能夠介導另一脂質之至少一種功能的部分。在一些實施例中，靶向化合物或部分能夠使化合物(例如，包含脂質及活性化合物在組合物)靶向至特定細胞組織或細胞或組織之亞群。在一些實施例中，靶向部分經設計以利用特定標靶、受體、蛋白質或其他次細胞組分之細胞或組織特異性表現；在一些實施例中，靶向部分為使組合物靶向至細胞或組織及/或結合於標靶、受體、蛋白質或其他次細胞組分的配體(例如，小分子、抗體、肽、蛋白質、碳水化合物、適體等)。
用於製備供傳遞活性化合物用之組合物的某些實例脂質允許(例如，並不阻止或干擾)活性化合物之功能。非限制性實例脂質包括：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、二十二碳六烯酸(順-DHA)、喇叭藻酸及二亞油基。
如本發明中所描述，脂質結合(諸如與脂肪酸結合)可改良寡核苷酸之一或多個特性。
在一些實施例中，用於傳遞活性化合物之組合物能夠使活性化合物視需要靶向至特定細胞或組織。在一些實施例中，用於傳遞活性化合物之組合物能夠使活性化合物靶向至肌肉細胞或組織。在一些實施例中，本發明係關於與活性化合物之傳遞相關的組合物及方法，其中組合物包含活性化合物脂質。在至肌肉細胞或組織之各種實施例中，脂質係選自：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、二十二碳六烯酸(順-DHA)、喇叭藻酸及二亞油基。所用之實例脂質包括硬脂酸、油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、順-DHA、喇叭藻酸及二亞油酸。在此等表中，「TBD」指示特定組合物可有效進行傳遞，但數值結果超出標準範圍，且因此最終結果仍有待測定；然而，表中指示為「TBD」之組合物可有效傳遞活性化合物。
包含活性化合物及以下中之任一者的組合物能夠將活性化合物傳遞至腓腸肌肌肉組織：硬脂酸、油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、順-DHA或喇叭藻酸。包含活性化合物及以下中之任一者的組合物能夠將活性化合物傳遞至心肌組織：硬脂酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、順-DHA或喇叭藻酸。包含活性化合物及以下中之任一者的組合物能夠將活性化合物傳遞至四頭肌肌肉組織：硬脂酸、油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、順-DHA或喇叭藻酸。包含活性化合物及以下中之任一者的組合物能夠將活性化合物傳遞至腓腸肌肌肉組織：硬脂酸、油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、順-DHA或喇叭藻酸。包含活性化合物及以下中之任一者的組合物能夠將活性化合物傳遞至心肌組織：硬脂酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、順-DHA或喇叭藻酸。包含活性化合物及以下中之任一者的組合物能夠將活性化合物傳遞至隔膜肌肉組織：二亞油基、硬脂酸、油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、順-DHA或喇叭藻酸。
因此：包含選自月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、二十二碳六烯酸(順-DHA)、喇叭藻酸及二亞油基之脂質及活性化合物的組合物能夠將活性化合物傳遞至肝外細胞及組織，例如肌肉細胞及組織。
視待治療或預防之特定病狀或疾病病況而定，可與本發明寡核苷酸一起投與其他治療劑，其通常為治療或預防彼病狀而投與。舉例而言，化學治療劑或其他抗增生劑可與本發明寡核苷酸組合以治療增生性疾病及癌症。已知化學治療劑之實例包括(但不限於)阿德力黴素(adriamycin)、地塞米松(dexamethasone)、長春新鹼(vincristine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、拓朴替康(topotecan)、紫杉醇(taxol)、干擾素及鉑衍生物。實例使用
在一些實施例中，本發明涵蓋包含脂質及PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑之組合物的使用。在一些實施例中，本發明提供用於將PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑傳遞至靶位置的方法，其包含投與所提供之組合物。在一些實施例中，所提供之方法將PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑傳遞至細胞。在一些實施例中，所提供之方法將PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑傳遞至肌肉細胞。在一些實施例中，所提供之方法將PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑傳遞至組織內之細胞。在一些實施例中，所提供之方法將PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑傳遞至器官內之細胞。在一些實施例中，所提供之方法將PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑傳遞至個體之細胞，包含向個體投與所提供之組合物。在一些實施例中，所提供之方法將PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑傳遞至細胞質。在一些實施例中，所提供之方法將PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑傳遞至細胞核。
在一些實施例中，本發明係關於與將PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑傳遞至細胞或組織或者哺乳動物(例如，人類個體)在細胞或組織相關的方法，該方法係關於包含生物製劑及脂質之組合物的使用。任何一或多個其他組分選自：聚核苷酸、染料、嵌入劑(例如，吖啶)、交聯劑(例如，補骨脂素或絲裂黴素C)、卟啉(例如，TPPC4、德卟啉(texaphyrin)或賽卟啉(Sapphyrin))、多環芳族烴(例如，吩嗪或二氫吩嗪)、人工核酸內切酶、螯合劑、EDTA、烷化劑、磷酸酯、胺基、巰基、PEG (例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2 、聚胺基、烷基、經取代烷基、放射性標記標記物、酶、半抗原(例如，生物素)、輸送/吸收促進劑(例如，阿司匹林、維生素E或葉酸)、合成核糖核酸酶、蛋白質(例如醣蛋白或肽，例如對於協同配體或抗體具有特異性親和力之分子，例如抗體)、激素、激素受體、非肽物質、脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子或藥物。在一些實施例中，本發明係關於與包含PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑及脂質的組合物相關之組合物或方法，該脂質包含C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，本發明係關於與包含PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑及脂質的組合物相關之組合物或方法，該脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，本發明提供對掌性受控寡核苷酸組合物及選自由以下組成之群的脂質：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、二十二碳六烯酸(順-DHA)、喇叭藻酸及二亞油基，其中該組合物適用於將寡核苷酸傳遞至肌肉細胞或組織，或哺乳動物(例如，人類個體)之肌肉細胞或組織。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑為包含一或多個對掌性核苷酸間鍵聯之PNPLA3寡核苷酸，且所提供之組合物為PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑。在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑為包含一或多個對掌性核苷酸間鍵聯之PNPLA3寡核苷酸，且所提供之組合物為寡核苷酸之非對掌性受控寡核苷酸組合物。
在一些實施例中，本發明係關於一種將PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑傳遞至細胞或組織的方法，其中該方法包含以下步驟：提供包含PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑及脂質之組合物；以及使細胞或組織與該組合物接觸；在一些實施例中，本發明係關於一種向個體投與PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑的方法，其中該方法包含以下步驟：提供包含PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑及脂質之組合物；以及向個體投與該組合物。在一些實施例中，脂質包含C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質包含視情況經一或多個C1 - 4 脂族基取代的C10 -C60 直鏈飽和或部分不飽和脂族鏈。在一些實施例中，脂質係選自由以下組成之群：月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、二十二碳六烯酸(順-DHA)、喇叭藻酸及二亞油基。
在一些實施例中，PNPLA3寡核苷酸或單股RNAi劑為如下PNPLA3寡核苷酸，其序列為或包含與細胞核酸中之目標元件實質上互補之元件。在一些實施例中，目標元件為或包含與肌肉疾病、病症或病狀相關的序列元件。在一些實施例中，肌肉疾病、病症或病狀為DMD。在一些實施例中，細胞核酸為或包含轉錄物。在一些實施例中，細胞核酸為或包含初級轉錄物。在一些實施例中，細胞核酸為或包含基因組核酸。本發明涵蓋如下認識：某些脂質及其他化合物適用於將單股RNAi劑傳遞至例如哺乳動物或人類個體之細胞及組織。許多用於傳遞此等藥劑之技術可能具有不能靶向所需細胞或組織之缺點。
單股RNAi劑至肝臟外部組織之傳遞仍然很困難。Juliano報導，儘管臨床水準有所提高，但寡核苷酸在活體內之有效傳遞仍然為主要挑戰，尤其是在肝外位點處。Juliano 2016 Nucl. Acids Res. Doi: 10.1093/nar/gkw23。Lou亦報導，RNAi劑至肝臟外器官之傳遞仍為將該技術用於大量疾病之最大障礙。Lou 2014 SciBX 7(48); doi:10.1038/scibx.2014.1394。
本發明涵蓋某些意外發現，包括：某些脂質及其他化合物對於將包括寡核苷酸之單股RNAi劑傳遞至特定細胞及組織(包括肝臟外部之細胞及組織，包括(但非限制)肌肉細胞及組織)尤其有效。
在一些實施例中，所提供之組合物改變單股RNA干擾系統，使得非所需標靶及/或生物功能得以抑制。在一些實施例中，在此等情況下，所提供之組合物亦可誘導轉錄物在雜交之後裂解。
在一些實施例中，所提供之組合物改變單股RNA干擾系統，使得所需標靶及/或生物功能得以增強。在一些實施例中，藉由併入化學修飾、立體化學及/或其組合，所提供在組合物可有效地抑制或防止靶轉錄物在接觸之後裂解。
在一些實施例中，複數個寡核苷酸各自包含一或多個經修飾之糖部分及經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，複數個寡核苷酸各自包含兩個或更多個經修飾之糖部分。在一些實施例中，複數個寡核苷酸各自包含三個或更多個經修飾之糖部分。在一些實施例中，複數個寡核苷酸各自包含四個或更多個經修飾之糖部分。在一些實施例中，複數個寡核苷酸各自包含五個或更多個經修飾之糖部分。在一些實施例中，複數個寡核苷酸各自包含十個或更多個經修飾之糖部分。在一些實施例中，複數個寡核苷酸各自包含約15個或更多個經修飾之糖部分。在一些實施例中，複數個寡核苷酸各自包含約20個或更多個經修飾之糖部分。在一些實施例中，複數個寡核苷酸各自包含約25個或更多個經修飾之糖部分。範例
以上內容為本發明之某些非限制性實施例之說明。因此，應理解，本文中所描述之本發明實施例僅為本發明原理應用之說明。本文中對所說明實施例之詳情的提及不意欲限制申請專利範圍之範疇。
用於製備寡核苷酸及寡核苷酸組合物之某些方法為此項技術中廣泛已知且可根據本發明使用，包括(但不限於)描述於以下中之彼等方法：WO/2010/064146、WO/2011/005761、WO/2013/012758、WO/2014/010250、US2013/0178612、WO/2014/012081、WO/2015/107425、WO/2017/015555及WO/2017/062862，其中之每一者之方法及試劑以引用之方式併入本文中。
申請人在本文中描述所提供之寡核苷酸及其組合物以及用於製備、評定、分析及使用某些所提供之寡核苷酸及其組合物等的方法的某些實例。
實例 1 . 用於評定寡核苷酸之實例方案 .
如一般熟習此項技術者所瞭解，許多技術(例如，試劑、方法等)可用於評定所提供之寡核苷酸之活性及特性。以下為描述使用用於評定細胞中之寡核苷酸活性的Lipofectamine® 2000 (Invitrogen)以96孔培養盤型式反向轉染寡核苷酸(使用可充當例如ssRNAi在某些寡核苷酸)的一個實例方案： 1.較佳地以多個(例如，8個)劑量，例如以25 μL之最終體積製備各ssRNAi。實例初始濃度可為150 nM；通常例如在不含血清之Opti-MEM®培養基中連續稀釋4倍。 2.在使用之前宜輕緩地混合Lipofectamine® 2000，接著在單獨之容器中於不含血清之25 μl Opti-MEM®培養基中稀釋0.25 μl Lipofectamine® 2000。可在培育後在室溫下再輕緩地混合例如5分鐘。 3.培育後，可將經稀釋之Lipofectamine® 2000 (例如，25 μL)添加至(經稀釋之) ssRNAi分子(通常體積相當，例如25 μL)。宜輕緩地混合該組合且可在室溫下培育例如15分鐘以允許複合物形成。 4.隨後例如藉由將不含抗生素之具有15,000 Hep3B細胞之100 μl完全生長培養基添加至各ssRNAi分子-Lipofectamine® 2000複合物來使複合物與細胞接觸。如此獲得150 μl之最終體積，且最終寡核苷酸濃度為25、6.25、1.56、0.39、0.097、0.024、0.0061及0.0015 nM。藉由來回擺動培養盤來輕緩地混合。 5.例如在37℃下於CO2 培育箱中培育細胞48小時。 6.按照供應商提供之方案，例如使用TurboCapture mRNA套組(Qiagen)，收集細胞且分離mRNA。 7.按照供應商提供之方案，例如使用Roche cDNA合成套組(Roche)製備cDNA。 8.按照供應商提供之方案，例如藉由使用與HPRT1探針複用之基因特異性Taqman探針的Taqman分析於LightCycler®480 探針基本混合物(Roche)中對標靶減量定量。通常，例如相對於諸如HPRT1 (次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶1)之管家基因正規化資料。 9.若利用多個劑量強度/濃度，則可例如使用Prism軟體製備各ssRNAi劑之劑量反應曲線。可視需要測定IC50 。
類似方案可用於靶向其他基因之不同寡核苷酸且可使用不同細胞。
或者或另外，可使用根據本發明之其他技術(例如，試劑、套組、方法等)評定寡核苷酸之一或多種活性及特性。自各類分析產生之某些資料提供於表中，證實當前所提供之技術的例如出乎意料地高的活性、穩定性、選擇性等。
各種模型可用於針對個體評定所提供之技術。在一些實施例中，所提供之技術在向動物投與時展示高活性、穩定性及/或選擇性。熟習此項技術者知曉被認為與可得益於如本文中所描述之寡核苷酸療法的某些相關人類疾病、病症及/或病狀相關及/或預示某些相關人類疾病、病症及/或病狀的動物系統。
實例 2 . 某些所提供之寡核苷酸之實例 IC50 .
使用諸如實例1中提出之方案來量測之某些寡核苷酸(其可充當PNPLA3之反義寡核苷酸)之IC50提供於下表中。
實例 3 . 用於併入部分 - 三觸 GalNAc ( 具有 C12 、 C5 或三嗪連接基團 ) 之合成的實例化合物 .
在一些實施例中，本發明提供用於將各種部分(例如，碳水化合物部分、脂質部分、靶向部分等)併入至所提供之寡核苷酸的技術(例如，試劑、方法、結合物等)。本文中描述用於併入碳水化合物部分之某些實例。在一些實施例中，碳水化合物部分可充當靶向部分。
實例3-1. 1-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)-16,16-雙((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,11,18-三側氧基-14-氧雜-6,10,17-三氮二十九烷-29-酸之合成.
步驟 1 ： 向3,3'-((2-胺基-2-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基丙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸二第三丁酯(5.0 g，9.89 mmol)及12-甲氧基-12-側氧基十二烷酸(2.416 g，9.89 mmol)於DMF (45 mL)中之溶液中添加HATU (3.76 g，9.89 mmol)及DIPEA (2.58 ml，14.83 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物5小時。減壓濃縮溶劑，且用鹽水稀釋、用EtOAc萃取、經無水硫酸鈉乾燥及濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO (120 g金矽膠濾筒)純化，用10% EtOAc/己烷至40% EtOAc/己烷溶離，得到呈無色油狀物之 3,3'-((2-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-2-(12-甲氧基-12-側氧基十二烷胺基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸二第三丁酯(5.13 g，7.01 mmol，產率70.9%)。1 H NMR (400 MHz, 氯仿-d ) δ 6.03 (s, 1H), 3.74 - 3.61 (m, 15H), 2.45 (t,J = 6.3 Hz, 6H), 2.31 (td,J = 7.5, 3.9 Hz, 2H), 2.19 - 2.10 (m, 2H), 1.64 - 1.59 (m, 4H), 1.46 (s, 27H), 1.32 - 1.24 (m, 12H); MS (ESI), 732.6 (M+H)+。
步驟 2 ： 將3,3'-((2-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-2-(12-甲氧基-12-側氧基十二烷胺基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸二第三丁酯(5.0 g，6.83 mmol)於甲酸(50 mL)中之溶液在室溫下攪拌48小時。將溶劑減壓蒸發，與甲苯(3×)共蒸發，得到白色固體，將其在高真空下乾燥2天。LC-MS及H NMR顯示反應不完全。將粗產物再溶解於甲酸(50 mL)中。在室溫下攪拌反應混合物24小時。LC-MS顯示反應完全。將溶劑減壓蒸發，與甲苯(3×)共蒸發，在高真空下乾燥，得到呈白色固體狀之3,3'-((2-((2-羧基乙氧基)甲基)-2-(12-甲氧基-12-側氧基十二烷胺基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸(4.00 g)。MS (ESI): 562.4 (M-H)- 。
步驟 3 ： 在0℃下向3,3'-((2-((2-羧基乙氧基)甲基)-2-(12-甲氧基-12-側氧基十二烷胺基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸(3.85 g，6.83 mmol)及HOBt (3.88 g，28.7 mmol)於DCM (60 mL)及DMF (15 mL)中之溶液中添加(3-胺基丙基)胺基甲酸第三丁酯(4.76 g，27.3 mmol)、EDAC HCl鹽(5.24 g，27.3 mmol)及DIPEA (8.33 ml，47.8 mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌15分鐘且在室溫下攪拌20小時。LC-MS顯示反應不完全。將(3-胺基丙基)胺基甲酸第三丁酯(1.59 g，9.12 mmol)及EDC HCl鹽(1.75 g，9.13 mol)添加至反應混合物。在室溫下持續攪拌反應混合物4小時。蒸發溶劑，得到殘餘物，將其溶解於EtOAc (300 mL)中，用水(1×)、飽和碳酸氫鈉(2×)、10%檸檬酸(2×)及水洗滌，經硫酸鈉乾燥及濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO (80 g金濾筒)純化，用DCM至30% MeOH/DCM溶離，得到呈白色固體狀之15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸甲酯(6.61 g，6.40 mmol，2個步驟後產率為94%)。MS (ESI): 1033.5 (M+H)+。
步驟 4 ： 向15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸甲酯(6.56 g，6.35 mmol)於THF (75 mL)中之溶液中添加LiOH (0.457 g，19.06 mmol)於水(25 mL)中之水溶液。在室溫下攪拌混合物隔夜。LC-MS顯示反應完成。蒸發溶劑，使用1 N HCl (45 mL)酸化，用DCM (3×)萃取，經無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到呈白色固體狀之15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸(6.31 g，6.20 mmol，產率98 %)。MS (ESI): 1019.6 (M+H)+ 。
步驟 5 ： 向15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸(6.31 g，6.20 mmol)及(溴甲基)苯(1.272 g，7.44 mmol)於DMF (40 mL)中之溶液中添加K2 CO3 (2.57 g，18.59 mmol)。將混合物在40℃下攪拌4小時且在室溫下攪拌隔夜。減壓蒸發溶劑。將反應混合物用EtOAc稀釋，用水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO (80 g濾筒)純化，用DCM至30% MeOH/DCM溶離，得到呈無色油狀物之15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸苯甲酯(6.41 g，5.78 mmol，產率93%)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.80 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 7.39 - 7.30 (m, 5H), 6.95 (s, 1H), 6.74 (t,J = 5.8 Hz, 3H), 5.07 (s, 2H), 3.53 (J,J = 7.3 Hz, 6H), 3.51 (s, 6H), 3.02 (q,J = 6.7 Hz, 6H), 2.94 - 2.85 (m, 6H), 2.29 (dt,J = 26.1, 6.9 Hz, 8H), 2.02 (q,J = 9.7, 8.6 Hz, 2H), 1.56 - 1.39 (m, 10H), 1.35 (s, 27H), 1.20 (brs, 14H); MS (ESI): 1019.6 (M+H)+ 。
步驟 6 ： 向15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸苯甲酯(2.42 g，2.183 mmol)於DCM (40 mL)中之溶液中添加2,2,2-三氟乙酸(8 ml，105 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。將溶劑減壓蒸發，與甲苯(2×)共蒸發，用醚濕磨，在高真空下乾燥隔夜。在下一步驟直接使用TFA鹽。
步驟 7 ： 向5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊酸(3.91 g，8.73 mmol)、HBTU (3.48 g，9.17 mmol)及HOBT (1.239 g，9.17 mmol)於DCM (25 mL)中之溶液中添加DIPEA (6.08 ml，34.9 mmol)，之後添加含12-((1,19-二胺-10-((3-((3-胺基丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,15-二側氧基-8,12-二氧雜-4,16-二氮十九烷-10-基)胺基)-12-側氧基十二烷酸苯甲酯(1.764 g，2.183 mmol)之DMF (4.0 mL)。在室溫下攪拌混合物5小時。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，藉由ISCO (40 g金管柱)純化，用5管柱值之5% MeOH/DCM溶離以去除HOBt，之後用5%至30% MeOH/DCM溶離，得到呈白色固體狀之1-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)-16,16-雙((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,11,18-三側氧基-14-氧雜-6,10,17-三氮二十九烷-29-酸苯甲酯(3.98 g，產率87%)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.82 - 7.74 (m, 6H), 7.69 (t,J = 5.6 Hz, 3H), 7.33-7.27 (m, 5H), 6.94 (s, 1H), 5.16 (d,J = 3.4 Hz, 3H), 5.03 (s, 2H), 4.92 (dd,J = 11.2, 3.4 Hz, 3H), 4.43 (d,J = 8.4 Hz, 3H), 4.02 - 3.95 (m, 9H), 3.82 (dt,J = 11.2, 8.8 Hz, 3H), 3.65 (dt,J = 10.5, 5.6 Hz, 3H), 3.51 - 3.44 (m, 12 H), 3.36 (dt,J = 9.6, 6.0 Hz, 3H), 3.01 - 2.95 (m, 12H), 2.29 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 2.23 (t,J = 6.3 Hz, 6H), 2.05 (s, 9H), 1.99 (t,J = 7.0 Hz, 8H), 1.94 (s, 9H), 1.84 (s, 9H), 1.72 (s, 9H), 1.50 - 1.14 (m, 34H); MS (ESI): 1049.0 (M/2+H)+ 。
步驟 8 ： 向用Ar沖洗之圓底燒瓶中添加10% Pd/C (165 mg，0.835 mmol)及EtOAc (15 mL)。添加受苯甲基保護之參GalNAc (1.75 g，0.835 mmol)於甲醇(15 mL)中之溶液，之後逐滴添加三乙基矽烷(2.67 ml，16.70 mmol)。在室溫下攪拌混合物3小時。LC-MS顯示反應完全，用EtOAc稀釋，且經由矽藻土過濾，用20% MeOH/EtOAc洗滌，減壓濃縮，得到呈白色固體狀之1-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)-16,16-雙((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,11,18-三側氧基-14-氧雜-6,10,17-三氮二十九烷-29-酸(1.67 g，0.832 mmol，產率100%)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.95 (s, 1H), 7.83 - 7.74 (m, 6H), 7.69 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 6.93 (s, 1H), 5.16 (d,J = 3.4 Hz, 3H), 4.92 (dd,J = 11.2, 3.4 Hz, 3H), 4.43 (d,J = 8.4 Hz, 3H), 4.01 - 3.94 (m, 9H), 3.82 (dt,J = 11.3, 8.8 Hz, 3H), 3.66 (dt,J = 10.7, 5.6 Hz, 3H), 3.54 - 3.43 (m, 12H), 3.41 - 3.33 (m, 3H), 3.03 - 2.94 (m, 12H), 2.24 (t,J = 7.4 Hz, 10H), 2.14 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 2.06 (s, 9H), 2.00 (t,J = 7.2 Hz, 8H), 1.95 (s, 9H), 1.84 (s, 9H), 1.73 (s, 9H), 1.51 - 1.14 (m, 34H). MS (ESI): 1003.8 (M/2+H)+ 。
實例3-2. 22-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)-7,7-雙((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,12,18-三側氧基-9-氧雜-6,13,17-三氮二十二烷酸之合成.
步驟1：將3,3'-((2-胺基-2-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基丙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸二第三丁酯(4.0 g，7.91 mmol)及二氫-2H-哌喃-2,6(3H)-二酮(0.903 g，7.91 mmol)於THF (40 mL)中之溶液在50℃下攪拌3小時且在室溫下攪拌3小時。LC-MS顯示所需產物。蒸發溶劑，得到酸，其不經純化即直接用於下一步驟。
步驟 2 ： 向5-((9-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-2,2,16,16-四甲基-4,14-二側氧基-3,7,11,15-四氧雜十七烷-9-基)胺基)-5-側氧基戊酸(4.90 g，7.91 mmol)及(溴甲基)苯(1.623 g，9.49 mmol)於DMF中之溶液中添加無水K2 CO3 (3.27 g，23.73 mmol)。將混合物在40℃下攪拌4小時且在室溫下攪拌隔夜。減壓蒸發溶劑。將反應混合物用EtOAc稀釋，用水洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，且減壓濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO純化，用10% EtOAc/己烷至50% EtOAc/己烷溶離，得到呈無色油狀物之3,3'-((2-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯胺基)-2-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基丙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸二第三丁酯(5.43 g，7.65 mmol，產率97%)。1 H NMR (400 MHz, 氯仿-d ) δ 7.36 - 7.28 (m, 5H), 6.10 (s, 1H), 5.12 (s, 2H), 3.70 (s, 6 H), 3.64 (t,J = 8.0 Hz, 6H), 2.50 - 2.38 (m, 8H), 2.22 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 1.95 (p,J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (s, 27H); MS, 710.5 (M+H)+ 。
步驟 3 ： 將3,3'-((2-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯胺基)-2-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基丙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸二第三丁酯(5.43 g，7.65 mmol)於甲酸(50 mL)中之溶液在室溫下攪拌48小時。LC-MS顯示反應不完全。減壓蒸發溶劑。將粗產物再溶解於甲酸(50 mL)中且在室溫下攪拌6小時。LC-MS顯示反應完全。將溶劑減壓蒸發，在減壓下與甲苯(3×)共蒸發，且在真空下乾燥，得到呈白色固體狀之3,3'-((2-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯胺基)-2-((2-羧基乙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸(4.22 g，7.79 mmol，產率102%)。1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 12.11 (s, 3H), 7.41 - 7.27 (m, 5H), 6.97 (s, 1H), 5.07 (s, 2H), 3.55 (t,J = 6.4 Hz, 6H), 3.53 (s, 6 H), 2.40 (t,J = 6.3 Hz, 6H), 2.37 - 2.26 (m, 2H), 2.08 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 1.70 (p,J = 7.4 Hz, 2H); MS, 542.3 (M+H)+ 。
步驟 4 ： 在0℃下向3,3'-((2-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯胺基)-2-((2-羧基乙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸(4.10 g，7.57 mmol)及HOBt (4.60 g，34.1 mmol)於DCM (60 mL)及DMF (15 mL)中之溶液中添加(3-胺基丙基)胺基甲酸第三丁酯(5.94 g，34.1 mmol)、EDAC HCl鹽(6.53 g，34.1 mmol)及DIPEA (10.55 ml，60.6 mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌15分鐘且在室溫下攪拌20小時。LC-MS顯示反應不完全。將EDAC鹽酸鹽(2.0 g)及(3-胺丙基)胺基甲酸第三丁酯(1.0 g)添加至反應混合物中。在室溫下攪拌反應混合物4小時。蒸發溶劑，得到殘餘物，將其溶解於EtOAc (300 mL)中，用水(1×)、飽和碳酸氫鈉(2×)、10%檸檬酸(2×)及水洗滌，經硫酸鈉乾燥及濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO (80 g金濾筒)純化殘餘物，用DCM至30% MeOH/DCM溶離，得到呈白色固體狀之15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十一烷-21-酸苯甲酯(6.99 g，6.92 mmol，產率91%)。1 H NMR (500 MHz, 氯仿-d ) δ 7.38 - 7.33 (m, 5H), 6.89 (brs, 3H), 6.44 (s, 1 H), 5.23 (brs, 3H), 5.12 (s, 2H), 3.71 - 3.62 (m, 12H), 3.29 (q,J = 6.2 Hz, 6H), 3.14 (q,J = 6.5 Hz, 6H), 2.43 (dt,J = 27.0, 6.7 Hz, 8H), 2.24 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 1.96 (p,J = 7.5 Hz, 2H), 1.64 - 1.59 (m, 6H), 1.43 (d,J = 5.8 Hz, 27H); MS (ESI): 1011.5 (M+H)+ 。
步驟 5 ： 向15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十一烷-21-酸苯甲酯(0.95 g，0.940 mmol)於DCM (5 mL)中之溶液中添加TFA (5 mL)。在室溫下攪拌反應混合物4小時。LC-MS顯示反應完成。減壓蒸發溶劑，得到呈無色油狀物之5-((1,19-二胺-10-((3-((3-胺基丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,15-二側氧基-8,12-二氧雜-4,16-二氮十九烷-10-基)胺基)-5-側氧基戊酸苯甲酯。其不經純化即直接用於下一步驟。
步驟 6 ： 向5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊酸(1.684 g，3.76 mmol)、HBTU (1.246 g，3.29 mmol)及HOBT (0.052 g，0.376 mmol)於DCM (40 mL)中之溶液中，之後為10-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯胺基)-N1,N19-二氯-10-((3-((3-(氯銨基)丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,15-二側氧基-8,12-二氧雜-4,16-二氮十九烷-1,19-二銨(0.767 g，0.940 mmol)於DMF (2.0 mL)中。在室溫下攪拌混合物5小時。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，藉由ISCO (40 g金管柱)純化，用DCM至30% MeOH/DCM溶離，得到呈白色固體狀之22-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)-7,7-雙((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,12,18-三側氧基-9-氧雜-6,13,17-三氮二十二烷酸苯甲酯(1.11 g，0.556 mmol，產率59%)。MS (ESI): 1000.0 (M/2+H)+ 。
步驟 7 ： 向用Ar沖洗之圓底燒瓶中添加10% Pd/C (100 mg，0.500 mmol)及EtOAc (10 mL)。添加22-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)-7,7-雙((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,12,18-三側氧基-9-氧雜-6,13,17-三氮二十二烷酸苯甲酯(1.00 g，0.500 mmol)於甲醇(10 mL)中之溶液，之後逐滴添加三乙基矽烷(1.599 ml，10.01 mmol)。在室溫下攪拌混合物3小時。LC-MS顯示反應完全，用EtOAc稀釋，且經由矽藻土過濾，用20% MeOH/EtOAc洗滌，減壓濃縮，得到呈白色固體狀之 22-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)-7,7-雙((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,12,18-三側氧基-9-氧雜-6,13,17-三氮二十二烷-1-酸(0.9433 g，0.494 mmol，產率99%)。1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.85 - 7.78 (m, 6H), 7.72 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 7.03 (s, 1H), 5.20 (d,J = 3.4 Hz, 3H), 4.95 (dd,J = 11.2, 3.5 Hz, 3H), 4.47 (d,J = 8.3 Hz, 3H), 4.05-3.99 (m, 9H), 3.85 (dt,J = 11.0, 8.8 Hz, 3H), 3.69 (dt,J = 10.6, 5.8 Hz, 3H), 3.52 (dd,J = 12.3, 5.6 Hz, 12H), 3.39 (dt,J = 11.2, 6.3 Hz, 3H), 3.02 (p,J = 6.3 Hz, 12H), 2.26 (t,J = 6.4 Hz, 6H), 2.17 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 2.11 - 2.07 (m, 11H), 2.03 (t,J = 7.1 Hz, 6H), 1.98 (s, 9H), 1.87 (s, 9H), 1.76 (s, 9H), 1.53 - 1.18 (m, 20H); MS (ESI): 1909.4 (M+H)+ 。
實例3-3. 5-(4-(4-((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-6-(雙(3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸之合成.
步驟 1 至 3 ： 在0℃下向含固體試劑2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪(0.700 g，3.80 mmol)之DCM (25 mL)添加3-胺基丙酸第三丁酯HCl鹽(0.690 g，3.80 mmol)及TEA (0.635 ml，4.56 mmol)。在0℃下攪拌反應混合物1小時。LC-MS顯示所需產物。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，其直接用於下一步驟。向3-((4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)胺基)丙酸第三丁酯(1.114 g，3.80 mmol)於DMF (15 mL)中之溶液中添加3,3'-氮二基二丙酸二第三丁酯(1.039 g，3.80 mmol)及DIPEA (1.324 ml，7.60 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物2小時。LC-MS顯示所需產物。向以上反應混合物中添加5-側氧基-5-(哌嗪-1-基)戊酸苯甲酯(1.103 g，3.80 mmol)及K2 CO3 (1.576 g，11.40 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。用EtOAc稀釋，過濾且減壓濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO (40 g金)純化，用10% EtOAc/己烷至50% EtOAc/己烷溶離，得到呈無色油狀物之3,3'-((4-(4-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯基)哌嗪-1-基)-6-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)氮二基)二丙酸二第三丁酯(0.90 g，30%)。1 H NMR (500 MHz, 氯仿-d ) δ 7.43 - 7.31 (m, 5H), 5.12 (s, 2H), 3.81 - 3.66 (m, 8H), 3.60 (dd,J = 7.6, 4.8 Hz, 4H), 3.40 (t,J = 5.1 Hz, 2H), 2.57 - 2.44 (m, 8H), 2.39 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 2.06 - 1.95 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.43 (s, 18H); MS (ESI): 784.7 (M+H)+ 。
步驟 4 ： 在室溫下攪拌3,3'-((4-(4-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯基)哌嗪-1-基)-6-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)氮二基)二丙酸二第三丁酯(0.90 g，1.148 mmol)於甲酸(20 mL)中之溶液隔夜。LC-MS顯示反應不完全，且蒸發溶劑。將甲酸(20 mL)添加至反應混合物，且在室溫下攪拌反應混合物隔夜。LC-MS顯示反應完全。將溶劑濃縮，與甲苯(2×)共蒸發，且在真空下乾燥隔夜，得到呈白色固體狀之3,3'-((4-(4-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯基)哌嗪-1-基)-6-((2-羧基乙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)氮二基)二丙酸(0.75 g，1.218 mmol，產率106%)。MS (ESI), 616.5 (M+H)+ 。
步驟 5 ： 在0℃下向3,3'-((4-(4-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯基)哌嗪-1-基)-6-((2-羧基乙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)氮二基)二丙酸(0.707 g，1.148 mmol)及HOBt (0.651 g，4.82 mmol)於DCM (60 mL)及DMF (15 mL)中之溶液中添加(3-胺基丙基)胺基甲酸第三丁酯(0.840 g，4.82 mmol)、EDAC HCl鹽(0.924 g，4.82 mmol)及DIPEA (1.400 ml，8.04 mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌15分鐘且在室溫下攪拌20小時。LC-MS顯示反應不完全。將(3-胺基丙基)胺基甲酸第三丁酯(0.28 g)及EDC HCl鹽(0.46 g)添加至反應混合物。在室溫下持續攪拌反應混合物4小時。蒸發溶劑，得到殘餘物，將其溶解於EtOAc (300 mL)中，用水(1×)、飽和碳酸氫鈉(2×)、10%檸檬酸(2×)及水洗滌，經硫酸鈉乾燥及濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO (80 g金濾筒)純化，用DCM至30% MeOH/DCM溶離，得到呈白色固體狀之5-(4-(4-(雙(3-((3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-6-((3-((3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(1.24 g，1.144 mmol，產率100%)。MS (ESI): 1084.8 (M+H)+ 。
步驟 6 ： 向5-(4-(4-(雙(3-((3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-6-((3-((3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(328.3 mg，0.303 mmol)於DCM (5.0 mL)中之溶液中添加TFA (3.0 mL)。在室溫下攪拌反應混合物3小時。減壓蒸發溶劑，不經純化即直接用於下一步驟。MS (ESI): 784.6 (M+H)+ 。
步驟 7 ： 向5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊酸(0.570 g，1.273 mmol)於DCM (6 mL)中之溶液中添加DIPEA (0.40 mL，2.296 mmol)及2,2,2-三氟乙酸全氟苯酯(0.535 g，1.910 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物2小時。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，其直接用於下一步驟。MS (ESI): 614.3 (M+H)+ 。向5-(4-(4-((3-((3-胺基丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-6-(雙(3-((3-胺基丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(0.238 g，0.303 mmol)於DCM (15 mL)及DMF (3 mL)中之溶液中添加DIPEA (0.633 ml，3.64 mmol)及二乙酸(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺基-2-(乙醯氧基甲基)-6-((5-側氧基-5-(全氟苯氧基)戊基)氧基)四氫-2H-哌喃-3,4-二酯(0.781 g，1.273 mmol)於DCM (6 mL)中之溶液。在室溫下攪拌反應混合物4小時。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，藉由ISCO (40 g金)純化，用DCM至40% MeOH/DCM溶離，得到呈白色固體狀之5-(4-(4-((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-6-(雙(3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(0.47 g，0.227 mmol，產率74.9%)。1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.82-7.78 (m, 6H), 7.70 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 7.35 - 7.28 (m, 5H), 6.63 (brs, 1H), 5.20 (d,J = 3.3 Hz, 3H), 5.08 (s, 2H), 4.95 (dd,J = 11.2, 3.4 Hz, 3H), 4.47 (d,J = 8.4 Hz, 3H), 4.05 - 3.96 (m, 9H), 3.85 (dt,J = 11.1, 8.8 Hz, 3H), 3.72 - 3.53 (m, 12H), 3.43 - 3.36 (m, 6H), 3.05 - 2.97 (m, 12H), 2.41 - 2.27 (m, 10H), 2.08 (s, 9H), 2.03 (d, J = 7.0 Hz, 6H), 1.98 (s, 9H), 1.87 (s, 9H), 1.75 (s, 9H), 1.47 (s, 9H), 1.53 - 1.19 (m, 13H); MS (ESI): 1037.0 (M+H)/2+ 。
步驟 8 ： 向5-(4-(4-((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-6-(雙(3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(0.39 g，0.188 mmol)於EtOAc (10 mL)中之溶液中添加10% Pd-C (50 mg)，之後在Ar下添加10 mL MeOH。將三乙基矽烷(0.601 ml，3.76 mmol)緩慢添加至反應混合物。在室溫下攪拌反應混合物2小時。經由矽藻土過濾，用50% MeOH/EtOAc洗滌，減壓蒸發溶劑，得到呈白色固體狀之5-(4-(4-((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-6-(雙(3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸(0.373 g，產率100%)。1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.82 - 7.78 (m, 6H), 7.71 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 6.64 (s, 1H), 5.20 (d,J = 3.3 Hz, 3H), 4.95 (dd,J = 11.2, 3.4 Hz, 3H), 4.47 (d,J = 8.5 Hz, 3H), 4.06 - 3.96 (m, 9H), 3.85 (dt,J = 11.1, 8.8 Hz, 3H), 3.73 - 3.56 (m, 11H), 3.45 - 3.35 (m, 5H), 3.09 - 2.98 (m, 13H), 2.37 - 2.28 (m, 10H), 2.25 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 2.09 (s, 9H), 2.03 (t,J = 7.0 Hz, 6H), 1.98 (s, 9H), 1.88 (s, 9H), 1.76 (s, 9H), 1.74 - 1.67 (m, 2H), 1.55 - 1.40 (m, 15H); MS (ESI): 1983.4 (M+H)+ 。
實例 4A . 用於併入部分之實例化合物 .
18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮二十四烷-24-酸之合成.
步驟 1 ： 向5-溴戊酸第三丁酯(4.0 g，16.87 mmol)於丙酮(80 mL)中之溶液中添加NaI (7.59 g，50.6 mmol)。在57℃下攪拌反應混合物2小時，過濾，且用EtOAc洗滌。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，將其溶解於EtOAc中，用水、鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥，濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO (40 g管柱)純化，用20% EtOAc/己烷至50% EtOAc/己烷溶離，得到呈黃色油狀物之5-碘戊酸第三丁酯(4.54 g，15.98 mmol，產率95%)。1 H NMR (500 MHz, 氯仿-d ) δ 3.19 (t,J = 6.9 Hz, 2H), 2.24 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 1.86 (p,J = 7.1 Hz, 2H), 1.70 (p,J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H)。
步驟 2 ： 向N-((1S,2R,3R,4R,5S)-2,3-二羥基-1-(羥甲基)-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-4-基)乙醯胺(600 mg，2.57 mmol)於DMF (15 mL)中之溶液中添加2,2-二甲氧基丙烷(2087 μl，17.03 mmol)，之後添加(+/-)-樟腦-10-磺酸(264 mg，1.135 mmol)。在70℃下攪拌反應混合物24小時。使反應混合物冷卻至室溫，且隨後添加甲醇(2.5 mL)。在室溫下攪拌反應混合物30分鐘且用TEA (0.10 mL)中和。蒸發溶劑且將殘餘物與甲苯共蒸發。藉由ISCO (24 g金)純化殘餘物，用EtOAc至10% MeOH/EtOAc溶離，得到N-((3aR,4S,7S,8R,8aR)-4-(羥基甲基)-2,2-二甲基六氫-4,7-環氧樹脂[1,3]二氧雜環戊并[4,5-d]氧呯-8-基)乙醯胺(666 mg，2.437 mmol，產率95%)。1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.09 (d,J = 8.1 Hz, 1H), 5.15 - 5.05 (m, 2H), 4.26 (d,J = 5.8 Hz, 1H), 4.09 (dd,J = 7.3, 5.8 Hz, 1H), 3.80 - 3.60 (m, 5H), 1.83 (s, 3H), 1.37 (s, 3H), 1.26 (s, 3H); MS, 274.3 (M+H)+ 。
步驟 3 ： 向5-碘戊酸第三丁酯(1310 mg，4.61 mmol)及N-((3aR,4S,7S,8R,8aR)-4-(羥基甲基)-2,2-二甲基六氫-47-環氧樹脂[1,3]二氧雜環戊并[4,5-d]氧呯-8-基)乙醯胺7 (420 mg，1.537 mmol)於DCM (10.5 mL)中之溶液中添加四丁基硫酸氫銨(783 mg，2.305 mmol)，之後添加12.5 M氫氧化鈉溶液(7 mL)。在室溫下攪拌反應混合物24小時。用DCM及水稀釋反應混合物，且用DCM (2×)萃取。用1 N HCl溶液洗滌有機層，且經硫酸鈉乾燥。減壓濃縮溶劑，得到殘餘物。向所得粗物質中添加乙酸乙酯(30 mL)且音波處理5分鐘。過濾所得沈澱物，用乙酸乙酯(10 mL×2)洗滌。LC-MS顯示過濾器不含有所需產物而為四丁銨鹽。減壓濃縮濾液,得到殘餘物，藉由ISCO (40 g金矽膠濾筒)純化，用50% EtOAc/己烷至EtOAc溶離，得到呈淺黃色油狀物之5-(((3aR,4S,7S,8R,8aR)-8-乙醯胺基-2,2-二甲基六氫-4,7-環氧樹脂[1,3]二氧雜環戊并[4,5-d]氧呯-4-基)甲氧基)戊酸第三丁酯(0.470 g，1.094 mmol，產率71.2%)。1 H NMR (500 MHz, 氯仿-d ) δ 5.56 (d,J = 9.1 Hz, 1H), 4.21 (d,J = 5.9 Hz, 1H), 4.12 (dtd,J = 7.7, 3.8, 1.7 Hz, 1H), 3.99 (t,J = 6.3 Hz, 1H), 3.90 (d,J = 9.5 Hz, 1H), 3.77 (d,J = 2.0 Hz, 2H), 3.67 (d,J = 9.5 Hz, 1H), 3.52 (ddt,J = 30.5, 9.2, 5.8 Hz, 2H), 2.23 (t,J = 7.1 Hz, 2H), 2.03 (d,J = 14.5 Hz, 3H), 1.65 - 1.55 (m, 7H), 1.44 (s, 9H), 1.35 (s, 3H); MS, 452.4 (M+Na)+ 。
步驟 4 ： 向15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十一烷-21-酸苯甲酯(0.168 g，0.166 mmol)於DCM (3 mL)中之溶液中添加TFA (3 mL)。在室溫下攪拌反應混合物3小時。LC-MS顯示反應完成。減壓蒸發溶劑，得到呈無色油狀物之5-((1,19-二胺-10-((3-((3-胺基丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,15-二側氧基-8,12-二氧雜-4,16-二氮十九烷-10-基)胺基)-5-側氧基戊酸苯甲酯。MS, 710.5 (M+H)+。其不經純化即直接用於下一步驟。
步驟 5 ： 向5-(((3aR,4S,7S,8R,8aR)-8-乙醯胺基-2,2-二甲基六氫-4,7-環氧樹脂[1,3]二氧雜環戊并[4,5-d]氧呯-4-基)甲氧基)戊酸第三丁酯(285 mg，0.664 mmol)於DCM (5 mL)中之溶液中添加TFA (5 mL)，在室溫下攪拌4小時。LC-MS顯示反應完全。蒸發溶劑，得到5-(((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)甲氧基)戊酸。MS (ESI): 334.3 (M+H)+。其不經純化即直接用於下一步驟。
步驟 6 ： 向5-(((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)甲氧基)戊酸(221 mg，0.664 mmol)於DCM (10 mL)中之溶液中添加DIPEA (2313 μl，13.28 mmol)、HBTU (208 mg，0.548 mmol)、HOBT (67.3 mg，0.498 mmol)、5-((1,19-二胺-10-((3-((3-胺基丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,15-二側氧基-8,12-二氧雜-4,16-二氮十九烷-10-基)胺基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(118 mg，0.166 mmol) (GL08-02)於DMF (3.0 mL)及DCM (5.0 mL)中之溶液。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。LC-MS顯示所需產物。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，藉由ISCO (24 g金濾筒)純化，用DCM至80% MeOH/DCM溶離，得到18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮二十四烷-24-酸苯甲酯(272 mg，0.164 mmol，產率99%) (管30至42處之產物(40% MeOH/DCM至60% MeOH/DCM))。1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.89 (d,J = 7.8 Hz, 3H), 7.81 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 7.75 (s, 3H), 7.34 (q,J = 7.5, 6.9 Hz, 5H), 7.05 (s, 1 H), 5.07 (s, 5H), 4.83 (d,J = 5.3 Hz, 3H), 4.56 (d,J = 7.1 Hz, 3H), 3.73 (dd,J = 23.3, 9.2 Hz, 6H), 3.64 (d,J = 7.0 Hz, 6H), 3.58 - 3.35 (m, 27H), 3.02 (p,J = 6.2 Hz, 12H), 2.33 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 2.26 (t,J = 6.4 Hz, 6H), 2.10 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.04 (t,J = 7.4 Hz, 6 H), 1.82 (s, 9H), 1.72 (q,J = 7.6 Hz, 2H), 1.52 - 1.39 (m, 18 H); MS (ESI), 1656.3 (M+H)+ 。
步驟 7 ： 向18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮二十四烷-24-酸苯甲酯(270 mg，0.163 mmol)於EtOAc (10 mL)中之溶液中添加10% Pd-C (50 mg)及MeOH (5.0 mL)以及三乙基矽烷(1042 μl，6.52 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，過濾且濃縮，得到呈白色固體狀之18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮二十四烷-24-酸(246 mg，0.157 mmol，產率96%)。1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.99 (brs, 1 H), 7.89 (d,J = 7.9 Hz, 3H), 7.82 (t,J = 5.4 Hz, 3H), 7.75 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 7.03 (s, 1 H), 5.07 (d,J = 1.6 Hz, 3H), 4.83 (brs, 3H), 4.56 (brs, 3H), 3.79 - 3.68 (m, 6H), 3.64 (d,J = 7.2 Hz, 6H), 3.58 - 3.34 (m, 27 H), 3.02 (p,J = 6.3 Hz, 12 H), 2.27 (t,J = 6.4 Hz, 6H), 2.17 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 2.08 (t,J = 7.5 Hz, 2 H), 2.04 (t,J = 7.3 Hz, 6H), 1.82 (s, 9H), 1.65 (p,J = 7.5 Hz, 2 H), 1.54 - 1.40 (m, 18 H); MS(ESI), 1566.3 (M+H)+。
實例 4B .
18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮三十一烷-31-酸之合成
使用與18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮二十四烷-24-酸相同之程序合成18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮三十一烷-31-酸。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.90 (d,J = 7.8 Hz, 3H), 7.83 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 7.76 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 6.98 (d,J = 6.2 Hz, 1H), 5.09 (s, 3H), 3.81 - 3.69 (m, 6H), 3.69 - 3.62 (m, 6H), 3.62 - 3.40 (m, 24H), 3.04 (p,J = 6.1 Hz, 9H), 2.28 (t,J = 6.4 Hz, 4H), 2.18 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 2.06 (t,J = 7.7 Hz, 6H), 1.84 (s, 6H), 1.48 (tq,J = 14.9, 7.4 Hz, 16H), 1.23 (s, 8H). MS(ESI), 1664.0 (M+H)+ 。
實例 5 . 用於併入部分之實例化合物 .
5-(4-(4,6-bis((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸之合成.
步驟 1 至 2 ： 向含固體試劑2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪(0.500 g，2.71 mmol)之THF (30 mL)中添加3-胺基丙酸第三丁酯HCl鹽(0.985 g，5.42 mmol)及DIPEA (2.36 ml，13.56 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物5小時。LC-MS顯示所需產物；MS(ESI): 402.4 (M+H)+ 。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，其直接用於下一步驟。向3,3'-((6-氯-1,3,5-三嗪-2,4-二基)雙(氮二基))二丙酸二第三丁酯(1.052 g，2.71 mmol)於乙腈(50 mL)中之溶液中添加5-側氧基-5-(哌嗪-1-基)戊酸苯甲酯(1.103 g，3.80 mmol)及K2CO3 (2.248 g，16.27 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌隔夜且在50℃下攪拌。用EtOAc稀釋，過濾且減壓濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO (40 g金)純化，用20% EtOAc/己烷至50% EtOAc/己烷溶離，得到呈白色固體狀之3,3'-((6-(4-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)雙(氮二基))二丙酸二第三丁酯(1.13 g，64%)。1 H NMR (400 MHz, 氯仿-d ) δ 7.43 - 7.30 (m, 5 H), 5.15 (s, 2H), 3.75 (brs, 4H), 3.63 (brs, 6H), 3.43 (brs, 2H), 2.51 (q,J = 7.0, 6.5 Hz, 6H), 2.42 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 2.09 - 1.96 (m, 2H), 1.48 (s, 18H); MS (ESI): 656.6 (M+H)+ 。
步驟 3 ： 在室溫下攪拌3,3'-((6-(4-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)雙(氮二基))二丙酸二第三丁酯(1.10 g，1.68 mmol)於甲酸(20 mL)中之溶液隔夜。LC-MS顯示反應不完全，且蒸發溶劑。將甲酸(20 mL)添加至反應混合物，且在室溫下攪拌反應混合物5小時。LC-MS顯示反應完全。濃縮溶劑，與甲苯(2×)共蒸發，且在真空下乾燥隔夜，得到呈白色固體狀之3,3'-((6-(4-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)雙(氮二基))二丙酸(0.91 g，產率100%)。MS (ESI), 544.2 (M+H)+ 。
步驟 4 ： 在0℃下向3,3'-((6-(4-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)雙(氮二基))二丙酸(0.91 g，1.68 mmol)及HOBt (0.76 g，4.36 mmol)於DCM (30 mL)及DMF (3 mL)中之溶液中添加(3-胺基丙基)胺基甲酸第三丁酯(0.840 g，4.36 mmol)、EDC HCl鹽(0.836 g，4.36 mmol)及DIPEA (1.460 ml，8.39 mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌15分鐘且在室溫下攪拌20小時。蒸發溶劑，得到殘餘物，將其溶解於EtOAc (300 mL)中，用水(1×)、飽和碳酸氫鈉(2×)、10%檸檬酸(2×)及水洗滌，經硫酸鈉乾燥及濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO (80 g金濾筒)純化，用DCM至30% MeOH/DCM溶離，得到呈白色固體狀之5-(4-(4,6-雙((3-((3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(1.11 g，產率77%)。MS (ESI): 857.5 (M+H)+ 。
步驟 5 ： 向5-(4-(4,6-雙((3-((3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(212.3 mg，0.250 mmol)於DCM (5.0 mL)中之溶液中添加TFA (3.0 mL)。在室溫下攪拌反應混合物3小時。減壓蒸發溶劑，不經純化即直接用於下一步驟。MS (ESI): 656.3 (M+H)+ 。
步驟 6 ： 向5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊酸(333 mg，0.740 mmol)於DCM (5 mL)中之溶液中添加DIPEA (2.16 ml，12.4 mmol)、HBTU (235 mg，0.620 mmol)、HOBT(67 mg，0.50 mmol)、5-(4-(4,6-雙((3-((3-胺基丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(163 mg，0.250 mmol)於DCM (3.0 mL)中之溶液。在室溫下攪拌反應混合物3小時。LC-MS顯示所需產物。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，藉由ISCO (24 g金濾筒)純化，用DCM至50% MeOH/DCM溶離，得到含有一些HOBt之(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R,6R,6'R)-((((((3,3'-((6-(4-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)雙(氮二基))雙(丙醯基))雙(氮二基))雙(丙烷-3,1-二基))雙(氮二基))雙(5-側氧基戊烷-5,1-二基))雙(氧基))雙(5-乙醯胺基-2-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-6,3,4-三基)四乙酸酯(460 mg)。MS (ESI), 1515.7 (M+H)+ 。
步驟 7 ： 向(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R,6R,6'R)-((((((3,3'-((6-(4-(5-(苯甲氧基)-5-側氧基戊醯基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)雙(氮二基))雙(丙醯基))雙(氮二基))雙(丙烷-3,1-二基))雙(氮二基))雙(5-側氧基戊烷-5,1-二基))雙(氧基))雙(5-乙醯胺基-2-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-6,3,4-三基)四乙酸酯(0.44 g，0.290 mmol)於EtOAc (20 mL)中之溶液中添加10% Pd-C (40 mg)，之後在Ar下添加2.0 mL MeOH。將三乙基矽烷(2.784 ml，17.43 mmol)緩慢添加至反應混合物。在室溫下攪拌反應混合物2小時，經由矽藻土過濾，用50% MeOH/EtOAc洗滌。減壓蒸發溶劑，得到呈白色固體狀之5-(4-(4,6-雙((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸(0.43 g，產率100%)。MS (ESI): 1425.0 (M+H)+ 。
實例 6 . 用於併入部分之實例化合物 .
5-(4-(4,6-雙((3-((3-(5-(((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)甲氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸之合成.
步驟 1 ： 向5-(4-(4,6-雙((3-((3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(212.3 mg，0.250 mmol)於DCM (5.0 mL)中之溶液中添加TFA (3.0 mL)。在室溫下攪拌反應混合物3小時。減壓蒸發溶劑，不經純化即直接用於下一步驟。MS (ESI): 656.3 (M+H)+ 。
步驟 2 ： 向5-(((3aR,4S,7S,8R,8aR)-8-乙醯胺基-2,2-二甲基六氫-4,7-環氧樹脂[1,3]二氧雜環戊并[4,5-d]氧呯-4-基)甲氧基)戊酸第三丁酯(373 mg，0.870 mmol)於DCM (5 mL)中之溶液中添加TFA (5 mL)，在室溫下攪拌4小時。LC-MS顯示反應完全。蒸發溶劑，得到5-(((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)甲氧基)戊酸。MS (ESI): 334.3 (M+H)+。其不經純化即直接用於下一步驟。
步驟 3 ： 向55-(((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)甲氧基)戊酸(289 mg，0.870 mmol)於DCM (5 mL)中之溶液中添加DIPEA (2.16 ml，12.4 mmol)、HBTU (330 mg，0.870 mmol)、HOBT (67 mg，0.50 mmol)、5-(4-(4,6-雙((3-((3-胺基丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(163 mg，0.250 mmol)於DCM (3.0 mL)中之溶液。在室溫下攪拌反應混合物3小時。LC-MS顯示所需產物。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，藉由ISCO (24 g金濾筒)純化，用DCM至50% MeOH/DCM溶離，得到5-(4-(4,6-雙((3-((3-(5-(((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)甲氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(227 mg，71%)。MS (ESI), 1287.0 (M+H)+ 。
步驟 4 ： 向5-(4-(4,6-雙((3-((3-(5-(((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)甲氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(0.167 g，0.130 mmol)於EtOAc (10 mL)中之溶液中添加10% Pd-C (50 mg)，之後在Ar下添加2.0 mL MeOH。將三乙基矽烷(1.66 ml，10.39 mmol)緩慢添加至反應混合物。在室溫下攪拌反應混合物2小時，經由矽藻土過濾，用50% MeOH/EtOAc洗滌。減壓蒸發溶劑，得到呈白色固體狀之5-(4-(4,6-雙((3-((3-(5-(((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)甲氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙基)胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)-5-側氧基戊酸(32 mg，產率21%)。MS (ESI): 1196.7 (M+H)+ 。
實例7 . 某些胺基磷酸酯之實例製備.
在一些實施例中，本發明提供單體(胺基磷酸酯)及其用於寡核苷酸製備之方法。在一些實施例中，所提供之胺基磷酸酯包含提供特殊及/或大大改良之活性及/或特性的5'端結構。在一些實施例中，所提供之胺基磷酸酯包含用於併入至寡核苷酸中的所需化學部分，例如碳水化合物部分、脂質部分等。在一些實施例中，所提供之胺基磷酸酯包含用於併入所需化學部分(例如碳水化合物部分、脂質部分等)的連接基團/柄部(handle)。可利用多種技術來製備根據本發明之胺基磷酸酯，包括(但不限於)描述於以下中之技術：WO/2010/064146、WO/2011/005761、WO/2013/012758、WO/2014/010250、US2013/0178612、WO/2014/012081、WO/2015/107425、WO/2017/015555及WO/2017/062862，其中之每一者之方法及試劑以引用之方式併入本文中。下文以實例形式提供某些胺基磷酸酯之製備。
實例7-1. 胸苷-5'-二甲基乙烯基膦酸酯-2'-去氧-3'-CNE胺基磷酸酯之製備.
化合物7 - 1 - 2 之製備.
向化合物7 - 1 - 1 (20.00 g，36.72 mmol，1.00當量)於DMF (100.00 mL)中之溶液中添加咪唑(25.00 g，367.20 mmol，10.00當量)，之後添加TBDPSCl (50.47 g，183.60 mmol，47.17 mL，5.00當量)。在25℃下攪拌反應混合物16 h。TLC (二氯甲烷：甲醇=1:1)顯示化合物7 - 1 - 1 完全耗盡。添加EtOAc (300 mL)且用水(60 mL×3)洗滌混合物。有機相經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠管柱層析(石油醚:乙酸乙酯=20:1、1:1、1:4)純化殘餘物。獲得呈白色泡沫狀固體狀之化合物7 - 1 - 2 (30.00 g)。1 H NMR:(CDCl3 , 400MHz)δ= 8.165 (s, 1H), 7.575-7.080 (m, 21H), 6.718-6.741 (m, 4H), 6.473(d,J =2.8Hz, 1H), 4.520-4.534(m, 1H), 4.037-4.043 (d,J =2.4Hz, 1H), 3.758(s, 6H), 3.184-3.217 (m, 1H), 2.841-2.874 (m, 1H), 2.319-2.338 (m, 1H), 2.025-2.078 (m, 1H), 1.321(s, 3H), 1.021(s, 9H)。
化合物7-1-3 之製備.
向化合物7 - 1 - 2 (25.00 g，31.93 mmol，1.00當量)於DCM (250 mL)中之溶液中添加TFA (8.37 g，73.44 mmol，5.44 mL，2.30 當量)。溶液顏色變為紅色。在25℃下添加Et3 SiH (8.17 g，70.24 mmol，11.19 mL，2.20當量)。在25℃下攪拌反應混合物2 h，且紅色溶液變得無色。TLC (石油醚：乙酸乙酯=1:1)顯示化合物7 - 1 - 2 完全耗盡。減壓去除溶劑且將殘餘物溶解於EtOAc (100 mL)中。將有機相用NaHCO3 (40 mL)、鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠管柱層析(石油醚:乙酸乙酯=20:1、1:1)純化殘餘物。獲得呈白色固體狀之化合物7 - 1 - 3 (9.80 g，產率56.20%，純度88%)。1 H NMR: (CDCl3 , 400MHz) δ= 8.108 (s, 1H), 7.643 (s, 1H), 7.403-7.412 (m, 6H), 7.269(d,J =4.8Hz, 2H), 6.217(d,J =5.6 Hz, 1H), 4.451(s, 1H), 3.975(s, 1H), 3.631(d,J =12 Hz, 1H), 3.255(s, 1H), 2.264-2.296 (m, 1H), 2.136-2.184 (m, 1H), 1.957(s, 1H), 1.859(s, 3H), 1.090(s, 9H)。
化合物7-1-4 之製備.
在0℃下向化合物7 - 1 - 3 (18.00 g，37.45 mmol，1.00當量)於DCM (500 mL)中之溶液中添加DMP (17.47 g，41.20 mmol，12.75 mL，1.10當量)。在25℃下攪拌反應混合物3 h。TLC (石油醚：乙酸乙酯=1:1)顯示反應完全。依次添加Na2 SO3 (飽和，100 mL)及NaHCO3 (飽和，100 mL)。用DCM (100 mL×3)萃取混合物。有機相經Na2 SO4 乾燥且濃縮。獲得呈黃色油狀物之化合物7 - 1 - 4 (17.92 g，粗產物)。
化合物7-1-5 之製備.
在0℃下向化合物7 - 1 - 4A (16.08 g，69.26 mmol，1.85當量)於THF (29 mL)中之溶液中添加t-BuOK (1 M，69.26 mL，1.85當量)。 在0℃下攪拌混合物10 min，隨後升溫至25℃，持續30 min。在0℃下將以上混合物添加至化合物7 - 1 - 4 (17.92 g，37.44 mmol，1.00當量)於THF (36 mL)中之溶液中。在0℃下攪拌反應混合物1 h且隨後使其在80 min內升溫至25℃。TLC (二氯甲烷：甲醇=20:1)顯示反應完全。向反應混合物添加水(200 mL)且用EtOAc (300 mL×4)萃取。乾燥(Na2 SO4 )、過濾且濃縮有機相。藉由矽膠管柱層析(PE (10% DCM):EA=10:1、1:8)純化殘餘物。獲得呈黃色固體狀之化合物7 - 1 - 5 (15.00 g)。
化合物7-1-6 之製備.
在25℃下向化合物7 - 1 - 5 (21.00 g，35.92 mmol，1.00當量)於THF (60 mL)中之溶液中添加N, N-二乙基乙胺三氫氟酸(28.95 g，179.59 mmol，29.24 mL，5.00當量)。在25℃下攪拌反應混合物20 h。TLC (二氯甲烷：甲醇=10:1)顯示反應完全。減壓濃縮反應混合物，且用Na2 CO3 (飽和水溶液)將混合物中和至pH=7。凍乾水相。用DCM:MeOH=10:1 (300 mL×2)洗滌凍乾固體。濃縮有機相。藉由矽膠管柱層析(二氯甲烷：甲醇=100:1、100:8)純化所獲得之殘餘物。獲得呈白色固體狀之化合物7 - 1 - 6 (5.20 g，15.02 mmol，產率41.81%)。1 H NMR: (CDCl3 , 400MHz) δ= 9.521 (s, 1H), 7.120 (s, 1H), 6.974-7.074 (m, 1H), 6.372-6.405 (m, 1H), 5.961-6.050 (m, 1H), 4.684(s, 1H), 4.504-4.518 (m, 1H), 4.393-4.409 (m, 1H), 3.726-3.775 (m, 6H), 3.151-3.180 (m, 2H), 2.411-2.427 (m, 1H), 1.930-2.218(m, 1H), 1.927(s, 3H)。
化合物7-1-7 之製備.
向化合物7 - 1 - 6 (3.80 g，10.97 mmol，1.00當量)於DMF (23 mL)中之溶液中添加5-乙基硫基-2H-四唑(1.43 g，10.97 mmol，1.00當量)、1-甲基咪唑(1.80 g，21.94 mmol，1.75 mL，2.00當量)及3-雙(二異丙胺基)磷烷氧基丙腈(4.96 g，16.46 mmol，5.22 mL，1.50當量)。在25℃下於N2 下攪拌反應混合物3 h。TLC (二氯甲烷：甲醇=10:1)顯示反應完全。用EtOAc (200 mL)稀釋反應混合物。反應混合物用飽和NaHCO3 水溶液(20 mL×4)洗滌，經Na2 SO4 乾燥，過濾且減壓濃縮。管柱用MeOH (20 min)、EA (20 min)、石油醚(20 min)及石油醚/乙酸乙酯(20 min)溶離。藉由矽膠管柱層析純化因此獲得之殘餘物(用石油醚:EtOAc=10:1、1:1且隨後用EtOAc/乙腈=1000:1、100:2、100:4溶離)。獲得呈黃色固體狀之化合物7 - 1 - 7 (4.80 g，8.78 mmol，產率80.04%)。MS：LCMS，計算值C22H36N4O8P2，546.2008；在+Ve模式下觀測到：568.95；569.43[M+Na]。1 H NMR: (CDCl3 , 400MHz) δ= 9.489(s, 1H), 7.233 (s, 1H), 6.835-7.035 (m, 1H), 6.303-6.337 (m, 1H), 5.931-5.983 (m, 1H), 4.388-4.504 (m, 1H), 3.703-3.846 (m, 1H), 3.666-3.694 (m, 6H), 3.533-3.559 (m, 2H), 2.594-2.702(m, 2H), 2.162-2.578(m, 2H), 1.863(s, 3H), 1.111-1.189(m, 12H).13 C NMR (101 MHz, CDCl3 ) δ 163.66, 162.54, 150.47, 150.40, 148.68, 148.61, 148.41, 148.35, 135.10, 135.01, 118.73, 118.25, 117.76, 117.61, 116.91, 116.85, 116.38, 111.74, 84.83, 84.79, 84.75, 84.72, 84.62, 84.56, 84.53, 84.50, 84.40, 84.33, 77.40, 77.29, 77.09, 76.77, 76.03, 75.87, 75.49, 75.48, 75.34, 75.32, 58.21, 58.19, 58.16, 58.12, 58.00, 57.92, 52.59, 52.55, 52.54, 52.52, 52.49, 52.46, 45.33, 45.27, 43.43, 43.40, 43.30, 43.27, 38.45, 38.40, 38.37, 36.45, 24.62, 24.57, 24.54, 24.49, 24.46, 22.96, 22.94, 22.88, 22.85, 20.47, 20.39, 20.37, 20.30, 20.11, 20.04, 12.50, 12.48。31 P NMR (162 MHz, CDCl3 ) δ 149.40, 149.38, 19.99, 19.64, 14.10。
實例7-2. 立體純L-DPSE-5'-DMT-5'VP-dT胺基酸酯7-2-8。
L-DPSE-NOPCl之製備.
藉由在35℃下於旋轉式蒸發器中用無水甲苯(60 ml)共沸蒸發來乾燥L-DPSE (8.82 g，28.5 mmol)，且在高真空下進一步乾燥隔夜。將溶解於無水甲苯(50 ml)中之此經乾燥L-DPSE及4-甲基嗎啉(5.82 g，6.33 mL，57.5 mmol)之溶液添加至置於250 mL三頸圓底燒瓶中的PCl3 (4.0 g，2.5 mL，29.0 mmol)於無水甲苯(25 ml)中之溶液中，該燒瓶在-5℃下於氬氣下經冷卻(起始溫度：-2℃，最高溫度：5℃，添加10 min)，且在0 ℃下再攪拌反應混合物40 min。此後，使用特殊過濾管(Chemglass: Medium Frit, Airfree, Schlenk)在氬氣下藉由真空過濾沈澱之白色固體。在氬氣下於浴液溫度(25℃)下藉由旋轉式蒸發器去除溶劑，且獲得粗產物油狀混合物，且在真空下乾燥隔夜(約15 h)，且用於下一步驟。
L-DPSE-5'-DMT-5'VP-dT胺基酸酯之製備.
在45℃下藉由與75 mL無水甲苯共蒸發來乾燥化合物7 - 2 - 6 (7.0 g，20.2 mmol)兩次，且保持在高真空下隔夜。隨後，在氬氣下於250 mL三頸燒瓶中將乾燥之化合物7 - 2 - 6 溶解在無水THF (70 mL)中，之後添加三乙胺(14 mL，101 mmol)，且將混合物冷卻至-45℃。經由針筒向此經冷卻反應混合物逐滴添加來自前一步驟之粗產物L-DPSE-NOPCl (28.5 mmol，1.4當量，於THF 50 mL中)之溶液(約10 min，將內部溫度維持於-40℃至-35℃)。隨後使反應混合物逐漸升溫至5℃。保持在5℃下30 min後，TLC及LC-MS分析指示SM完全轉化成產物(總反應時間2 h)。在冰浴中冷卻反應混合物，且藉由添加水(0.36 mL，20.2 mmol)淬滅，且攪拌10 min，之後添加無水Mg2 SO4 (3.0 g，20.2 mmol)。經由Airfree,Schlenk過濾管過濾反應物，用無水THF (50 mL)洗滌，且在28℃下藉助旋轉蒸發進行蒸發，得到淺黃色固體粗產物，使其在高真空下乾燥隔夜。使用含5% TEA之乙酸乙酯/己烷混合物作為溶劑，藉由120矽膠管柱(其用含5% TEA的3管柱體積之乙酸乙酯預先去活)純化經乾燥粗產物。管柱純化後，藉由TLC及LC-MS分析溶離份，且將其彙集在一起。在28℃下於旋轉式蒸發器中蒸發溶劑，且在高真空下乾燥殘餘物，得到呈白色固體狀之產物。產量：11.8 g (87%)。1 H NMR (400 MHz, 氯仿-d ) δ 7.46 (ddt,J = 16.5, 7.6, 2.7 Hz, 4H), 7.33 - 7.17 (m, 6H), 6.93 - 6.88 (m, 1H), 6.75 (ddd,J = 22.6, 17.2, 4.4 Hz, 1H), 6.16 (dd,J = 7.5, 6.3 Hz, 1H), 5.85 (ddd,J = 19.2, 17.1, 1.8 Hz, 1H), 4.71 (dt,J = 8.7, 5.7 Hz, 1H), 4.38 (dp,J = 10.7, 3.6 Hz, 1H), 4.15 (tt,J = 5.6, 2.7 Hz, 1H), 3.68 (dd,J = 11.1, 3.7 Hz, 6H), 3.55 - 3.29 (m, 2H), 3.09 (tdd,J = 10.8, 8.8, 4.3 Hz, 1H), 2.11 (ddd,J = 13.9, 6.3, 3.3 Hz, 1H), 1.96 (s, 1H), 1.87 (d,J = 1.2 Hz, 3H), 1.85 - 1.73 (m, 2H), 1.70 - 1.49 (m, 2H), 1.38 (ddd,J = 15.9, 10.4, 6.3 Hz, 2H), 1.26 - 1.11 (m, 2H), 0.60 (s, 3H).31 P NMR (162 MHz, CDCl3 ) δ 152.41, 19.95.13 C NMR (101 MHz, CDCl3 ) δ 171.07, 163.62, 163.59, 150.21, 150.19, 148.49, 148.43, 136.61, 135.84, 135.15, 134.57, 134.33, 129.48, 129.42, 127.97, 127.93, 127.81, 118.38, 116.50, 111.52, 85.02, 84.72, 84.70, 84.51, 84.48, 79.25, 79.16, 77.40, 77.28, 77.08, 76.76, 74.93, 74.91, 74.83, 74.81, 68.01, 67.98, 60.35, 52.60, 52.55, 52.47, 52.42, 47.03, 46.67, 38.12, 38.08, 27.18, 25.85, 25.82, 21.01, 17.58, 17.54, 14.19, 12.58, -3.00, -3.27。MS: LCMS, 計算值C32H41N3O8P2Si, 685.7255: 在+Ve模式下觀測到：686.21 [M+H], 708.14 [M+Na]。
實例7-3. 5'-DMT-2'OMe-5-脂質-3'-CNE胺基磷酸酯之合成—所需部分經由核鹼基之併入.
化合物7-3-2之製備.
用N2 將化合物7-3-1 (13.00 g，18.94 mmol)、丙-2-炔-1-胺(2.09 g，37.87 mmol，2.43 mL)、CuI (901.63 mg，4.73 mmol)、Pd(PPh3 )4 (2.19 g，1.89 mmol)及TEA (3.83 g，37.87 mmol，5.25 mL)於DMF (130 mL)中之混合物脫氣及吹掃3次，且隨後在25℃下於在N2 氛圍下及黑暗下攪拌混合物12小時。LC-MS顯示化合物7-3-1完全耗盡，且偵測到一個具有所需MS之主峰。真空濃縮混合物。藉由管柱層析(SiO2 ，二氯甲烷/甲醇=100/1至0:1)純化殘餘物。獲得呈黃色固體狀之化合物7-3-2 (11.00 g，粗產物)。1 H NMR (400MHz, CDCl3 ): δ = 8.23 (s, 1H), 7.48 - 7.14 (m, 13H), 6.83 (br d,J =7.3 Hz, 5H), 5.94 (br s, 1H), 4.48 (br t,J =5.8 Hz, 2H), 4.05 (br d,J =6.4 Hz, 2H), 3.93 (br d,J =2.9 Hz, 1H), 3.81 - 3.70 (m, 8H), 3.62 (s, 4H), 3.52 (br d,J =11.0 Hz, 2H), 3.35 (br d,J =9.0 Hz, 1H). LCMS: (M+H+ ): 614.2。TLC (二氯甲烷/甲醇=10:1) Rf=0.19。
化合物7-3-3之製備.
向棕櫚酸(5.06 g，19.72 mmol)於DCM (130 mL)中之溶液中添加TEA (3.63 g，35.85 mmol，4.97 mL)、EDCI (5.15 g，26.89 mmol)、HOBt (3.63 g，26.89 mmol)及化合物7-3-3 (11.00 g，17.93 mmol)。在25℃下攪拌混合物1小時。LC-MS顯示化合物7-3-3完全耗盡，且偵測到一個具有所需MS之主峰。真空濃縮混合物。藉由管柱層析(SiO2 ，二氯甲烷:乙酸乙酯=10/1至0:1；二氯甲烷:乙酸乙酯=100/1至0:1)純化殘餘物。獲得呈黃色固體狀之化合物7-3-3 (6.20 g，產率40.58%)。1 H NMR (400MHz, CDCl3 ): δ = 8.25 (s, 1H), 7.50 - 7.14 (m, 10H), 6.90 - 6.77 (m, 4H), 5.93 (d,J =2.0 Hz, 1H), 5.01 (br s, 1H), 4.53 - 4.44 (m, 1H), 4.06 (br d,J =6.8 Hz, 1H), 3.94 (dd,J =2.0, 5.1 Hz, 1H), 3.83 - 3.73 (m, 9H), 3.63 (s, 3H), 3.55 - 3.48 (m, 1H), 3.39 (dd,J =2.5, 11.1 Hz, 1H), 2.79 (q,J =7.1 Hz, 1H), 1.85 - 1.76 (m, 2H), 1.50 - 1.41 (m, 2H), 1.24 (br s, 22H), 0.87 (t,J =6.7 Hz, 3H).13 CNMR (100MHz, CDCl3 ): δ = 172.37, 162.32, 158.66, 158.58, 158.55, 149.58, 144.63, 142.49, 135.55, 135.44, 130.14, 130.00, 129.94, 128.08, 127.86, 126.91, 113.51, 113.35, 99.62, 89.56, 87.56, 86.85, 83.77, 83.68, 74.14, 68.49, 61.77, 58.82, 55.24, 45.30, 36.10, 31.89, 29.84, 29.67, 29.63, 29.49, 29.37, 29.33, 25.42, 22.66, 14.79, 14.11, 9.74。LCMS: (M+H+ ): 850.4。
5'-DMT-2'OMe-5-脂質-3'-CNE胺基磷酸酯之製備.
使化合物7-3-3 (2.8 g，3.29 mmol)與無水甲苯共蒸發兩次(25 mL×2)，且在高真空下乾燥隔夜。將經乾燥泡沫狀固體溶解於無水DMF (5 ml)中，且添加5-乙基硫基-1H-四唑(0.43 g，3.29 mmol)、N - 甲基咪唑(0.052 mL，0.66 mmol)，繼之以2-氰基乙基-N ,N ,N ',N '-四異丙基二胺基磷酸酯(1.49 g，4.93 mmol)。在室溫下於氬氣氛圍下攪拌反應混合物隔夜。TLC指示完成後，用EtOAc (70 mL)稀釋反應物，且用飽和NaHCO3 水溶液(10 mL)洗滌，且經Mg2 SO4 乾燥。減壓蒸發溶液且在真空中乾燥過夜。藉由Combi-Flash Rf (Teledyne ISCO)使用80 g矽膠管柱(其用含5% TEA之3管柱體積之乙酸乙酯預先去活)，將含有5% TEA之己烷/乙酸乙酯/乙腈用作溶離劑來純化經乾燥粗產物，得到呈泡沫狀固體形式之5'-DMT-2'OMe-5-脂質-3'CNE胺基磷酸酯。產量3.1g (90%)。31 P NMR (162 MHz, CDCl3 ) δ 150.58(s) 150.26(s)。13 C NMR (101 MHz, CDCl3 ) δ 172.20, 172.18, 161.78, 161.66, 158.70, 158.68, 149.45, 149.35, 144.71, 144.57, 142.69, 142.62, 137.91, 135.63, 135.53, 135.49, 135.40, 130.16, 130.11, 128.08, 128.06, 128.01, 127.00, 126.97, 117.71, 117.51, 113.39, 113.36, 113.32, 99.75, 99.46, 89.30, 89.26, 88.49, 88.00, 87.05, 86.84, 83.86, 83.04, 82.98, 82.93, 82.66, 77.39, 77.27, 77.07, 76.75, 74.45, 74.30, 69.88, 69.77, 69.64, 62.10, 61.24, 58.94, 58.92, 58.65, 58.47, 58.44, 57.97, 57.76, 55.30, 55.27, 43.35, 43.32, 43.23, 43.19, 36.11, 36.09, 33.26, 31.90, 29.88, 29.67, 29.65, 29.63, 29.58, 29.50, 29.37, 29.33, 25.41, 24.70, 24.64, 24.61, 24.57, 24.54, 24.50, 22.66, 20.47, 20.40, 20.34, 20.27, 14.82, 14.09。1 H NMR (400 MHz, 氯仿-d ) δ 7.40 (dd,J = 10.5, 7.6 Hz, 2H), 7.35 - 7.12 (m, 7H), 6.78 (ddd,J = 9.0, 4.2, 2.7 Hz, 4H), 4.82 (dt,J = 22.1, 4.9 Hz, 1H), 4.57 - 4.38 (m, 1H), 4.24 - 4.10 (m, 1H), 4.06 - 3.96 (m, 1H), 3.86 - 3.67 (m, 7H), 3.67 - 3.58 (m, 2H), 3.57 - 3.39 (m, 6H), 3.25 (ddd,J = 13.5, 11.3, 2.8 Hz, 1H), 2.55 (t,J = 6.1 Hz, 1H), 2.30 (t,J = 6.2 Hz, 1H), 1.71 (qd,J = 7.4, 7.0, 1.4 Hz, 2H), 1.38 (dtt,J = 10.5, 7.7, 2.8 Hz, 2H), 1.09 (dd,J = 6.7, 5.1 Hz, 17H), 0.97 (d,J = 6.8 Hz, 3H), 0.80 (t,J = 6.6 Hz, 3H)。MS: LCMS: 計算值C59H82N5O10P; 1051.5730; +Ve模式下觀測到: m/z: 1153.69 [M+Et3 N]。
實例7-4. 5'-(R)-C-Me-5'-DMT-dT-CNE胺基酸酯之合成.
化合物7-4-6B之製備.
向化合物7-4-5 (46.00 g，124.83 mmol)於溶解於水(1.84 L)中之EtOAc (460.00 mL)及甲酸鈉(353.17 g，5.19 mol)之混合物中的溶液中添加1-異丙基-4-甲基-苯(1.59 g，2.50 mmol)，且隨後添加[[(1R,2R)-2-胺基-1,2-二苯基-乙基]-(對甲苯磺醯基)胺基]-氯-釕。在25℃下於N2 下攪拌所得二相混合物12 h。TLC顯示起始物質耗盡。用EtOAc (50 mL×3)萃取混合物。用鹽水(30 mL)洗滌合併之有機物，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮，獲得粗產物。藉由自石油醚/乙酸乙酯=5:1重結晶純化殘餘物，得到呈白色固體狀之化合物7-4-6B (36.00 g，產率77.83%)。1 H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ = 11.31 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 6.16 (dd, J=5.5, 8.8 Hz, 1H), 5.05 (d, J=5.1 Hz, 1H), 4.49 (br d, J=5.1 Hz, 1H), 3.78 - 3.70 (m, 1H), 3.55 (d, J=3.7 Hz, 1H), 2.20 - 2.09 (m, 1H), 1.96 (br dd, J=5.7, 13.0 Hz, 1H), 1.77 (s, 3H), 1.11 (d, J=6.4 Hz, 3H), 0.87 (s, 9H), 0.09 (s, 6H)。HPLC: HPLC純度：97.7%。SFC: SFC純度：99.1%。TLC (石油醚/乙酸乙酯=1:1) Rf = 0.37。
化合物7-4-7B之製備.
藉由於旋轉式蒸發器上與吡啶(100 mL)及甲苯(100 mL×2)共沸蒸餾來乾燥化合物7-4-6B (18.00 g，48.58 mmol)。用N2 將化合物7-4-6B (18.00 g，48.58 mmol)及DMTCl (1.89 g，5.59 mmol)於吡啶(180.00 mL)及THF (720.00 mL)之混合物中的溶液脫氣及吹掃3次，且隨後添加AgNO3 (14.19 g，83.56 mmol)。在25℃下攪拌混合物15小時。TLC顯示起始物質耗盡。添加MeOH (5 mL)，且攪拌15 min，隨後過濾混合物，且用甲苯(300 mL×3)洗滌濾餅。濃縮濾液以獲得呈黃色油狀物之化合物7-4-7B(65.38 g，粗產物)。混合物不經任何純化即直接用於下一步驟。TLC (石油醚/乙酸乙酯) Rf=0.63。
5'-(R)-C-Me-5'-DMTr-dT之製備.
向化合物7-4-7B (65.38 g，97.16 mmol)於THF (650.00 mL)中之溶液中添加TBAF (1 M，184.60 mL)。在25℃下攪拌混合物12小時。TLC顯示起始物質耗盡。濃縮混合物以得到粗產物，隨後添加飽和NaCl (5%水溶液，200 mL×2)，且用EtOAc (200 mL×3)萃取混合物。合併之有機相經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮以得到粗產物，其藉由MPLC (石油醚:乙酸乙酯 5:1、1:1、1:4，5% TEA)純化以得到呈白色固體狀之5'-(R)-C-Me-5'-DMTr-dT (47.50 g，85.03 mmol，產率87.52%)。1 H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ = 11.32 (s, 1H), 7.46 (br d, J=7.8 Hz, 2H), 7.37 - 7.25 (m, 6H), 7.23 - 7.16 (m, 1H), 7.07 (s, 1H), 6.89 (dd, J=4.6, 8.5 Hz, 4H), 6.12 (t, J=7.2 Hz, 1H), 5.27 (d, J=4.6 Hz, 1H), 4.54 - 4.46 (m, 1H), 3.73 (d, J=1.8 Hz, 6H), 3.62 (t, J=2.9 Hz, 1H), 3.40 - 3.34 (m, 1H), 2.09 - 2.02 (m, 2H), 1.40 (s, 3H), 0.77 (d, J=6.2 Hz, 3H).13 C NMR (101MHz, DMSO-d6): δ = 163.98, 158.58, 150.81, 146.95, 137.11, 136.79, 135.76, 130.49, 130.41, 128.20, 128.15, 127.04, 113.54, 113.52, 110.16, 89.87, 86.24, 83.35, 70.28, 70.05, 60.20, 55.47, 55.35, 21.20, 17.82, 14.52, 12.08. HPLC: HPLC純度：98.7%。LC-MS: (M-H+ ) = 557.2;.LCMS純度：98.9%。SFC: SFC純度：100.0%。TLC (石油醚/乙酸乙酯=1:1, 5% TEA) Rf =0.02。
5'-(R)-C-Me-5'-DMT-dT-CNE-胺基酸酯之製備.
用甲苯(50 mL)乾燥5'-(R)-C-Me-5'-OMT-dT (5 g，8.95 mmol)。在0℃下於N2 下向DIEA (1.39 g，10.74 mmol，1.87 mL)及5'-(R)-C-Me-5'-DMT-dT (5 g，8.95 mmol)於無水DCM (50 mL)中之溶液中添加化合物7-4-1 (2.76 g，9.40 mmol)。在15℃下攪拌混合物2 h。TLC顯示起始物質耗盡且發現兩個新斑點。藉由添加飽和NaHCO3 水溶液(20 mL)淬滅混合物，且用DCM (30mL×3)進行萃取。合併之有機相經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮，得到粗產物，其在來自Teledyne之Combiflash儀器上經純化。首先藉由用含有5% Et3 N之10% EtOAc/石油醚(300 mL)溶離來預處理40 g矽膠濾筒管柱。將粗產物溶解於含有5% Et3 N之二氯甲烷：石油醚之2:1體積：體積混合物中，且裝載至管柱上。裝載後，使用以下梯度進行純化製程：含有5% Et3 N之10%至50% EtOAc/石油醚。收集溶離份。蒸發溶劑後，獲得呈白色固體狀之5'-(R)-C-Me-5'-DMT-dT-CNE-胺基酸酯(3.6 g，產率53%)。1 H NMR (400MHz, 氯仿-d) δ = 8.11 (br s, 1H), 7.53 (br d, J=7.7 Hz, 3H), 7.42 (br t, J=8.2 Hz, 4H), 7.32 - 7.17 (m, 4H), 7.07 - 6.99 (m, 1H), 6.84 (br d, J=8.2 Hz, 4H), 6.31 (br dd, J=5.5, 8.7 Hz, 1H), 4.94 (br s, 1H), 3.96 - 3.73 (m, 10H), 3.72 - 3.41 (m, 4H), 2.65 (td, J=6.1, 18.0 Hz, 2H), 2.53 - 2.37 (m, 1H), 2.10 (br d, J=8.2 Hz, 1H), 1.47 (br s, 4H), 1.33 - 1.16 (m, 15H), 1.00 - 0.90 (m, 3H)。31 P NMR (162MHz, 氯仿-d) δ = 148.81 (s, 1P), 148.35 (s, 1P)。
實例7-5. 5'-(S)-C-Me-5'-DMT-dT -CNE胺基酸酯之合成.
化合物7-5-2之製備.
在10℃下向化合物7-5-1 (63.00 g，176.72 mmol)於H2 O (250.00 mL)及MeCN (250.00 mL)之混合物中的溶液中添加PhI(OAc)2 (125.23 g，388.79 mmol)及TEMPO (5.56 g，35.34 mmol)。在25℃下攪拌混合物2小時。TLC (石油醚/乙酸乙酯=1 :1，Rf=0)顯示起始物質耗盡。濃縮混合物，且添加MTBE (1 L)。攪拌混合物0.5 h，且隨後過濾。用MTBE (1 L×2)洗滌濾餅，且乾燥以得到呈白色固體狀之化合物7-5-2 (126 g，產率96.23%)。1 H NMR (400MHz, DMSO): δ = 11.21 (s, 1H), 7.89 (d, J=1.0 Hz, 1H), 6.18 (dd, J=5.9, 8.6 Hz, 1H), 4.61 - 4.41 (m, 1H), 4.17 (d, J=0.9 Hz, 1H), 2.51 - 2.26 (m, 3H), 2.09 - 1.85 (m, 2H), 1.74 - 1.58 (m, 3H), 0.90 - 0.58 (m, 10H), 0.00 (d, J=2.0 Hz, 6H)。LC-MS: (M+H+ ): 371.1。TLC (石油醚/乙酸乙酯=1:1) Rf = 0。
化合物7-5-3之製備.
向化合物7-5-2 (50.00 g，134.96 mmol)於DCM (500.00 mL)中之溶液中添加DIEA (34.89 g，269.92 mmol，47.15 mL)及2,2-二甲基丙醯氯(21.16 g，175.45 mmol)。在-10℃至0℃下攪拌混合物1.5小時。TLC顯示起始物質耗盡。DCM中之混合物直接用於下一步驟。TLC (石油醚/乙酸乙酯=1 :1) Rf =0.15。
化合物7-5-4之製備.
向含化合物7-5-3之DCM添加TEA (40.94 g，404.55 mmol，56.08 mL)及N-甲氧基甲基胺鹽酸鹽(19.73 g，202.27 mmol)。在0℃下攪拌混合物1 h。TLC顯示起始物質耗盡。用HCl (1 N，100 mL)且隨後用NaHCO3 水溶液(100 mL)洗滌混合物。有機層經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮以得到粗產物，其藉由矽膠層析(石油醚/乙酸乙酯=30/1、0/1)純化，得到呈白色固體狀之化合物7-5-4(95.5 g，產率85.63%)。1 H NMR (400MHz, CDCl3 ): δ = 8.29 (s, 1H), 8.19 (br s, 1H), 6.46 (dd, J=5.1, 9.3 Hz, 1H), 4.71 (s, 1H), 4.38 (d, J=4.2 Hz, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.15 (s, 3H), 2.18 - 2.08 (m, 1H), 2.00 - 1.90 (m, 1H), 1.87 (d, J=1.1 Hz, 3H), 0.88 - 0.74 (m, 10H), 0.00 (d, J=3.7 Hz, 6H)。TLC (石油醚/乙酸乙酯=1:1) Rf = 0.43。
化合物7-5-5之製備.
在0℃下向化合物7-5-4 (115.00 g，278.09 mmol)於THF (1.20 L)中之溶液中添加MeMgBr (3 M，185.39 mL)。在0℃下攪拌混合物2 h。TLC顯示起始物質耗盡。在0℃下向混合物添加水(1 L)，且用EtOAc (300 mL×2)萃取混合物。合併之有機相經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮以得到呈白色固體狀之化合物7-5-5 (100.00 g，產率97.58%)。混合物未經進一步純化即直接使用。1 H NMR (400MHz, CDCl3 ): δ = 8.81 (br s, 1H), 7.95 (s, 1H), 6.41 (dd, J=5.6, 8.1 Hz, 1H), 4.60 - 4.40 (m, 2H), 2.40 - 2.16 (m, 4H), 1.98 (s, 3H), 1.02 - 0.83 (m, 10H), 0.14 (d, J=3.3 Hz, 6H), 0.20 - 0.00 (m, 1H)。TLC (石油醚/乙酸乙酯=1:1) Rf= 0.68。
化合物7-5-6A之製備.
向化合物7-5-5 (46.00 g，124.83 mmol)於溶解於水(1.84 L)中之EtOAc (460.00 mL)及甲酸鈉(353.17 g，5.19 mol)以及N-[(1S,2S)-2-胺基-1,2-二苯基-乙基]-4-甲基-苯磺醯胺氯釕之混合物中的溶液中添加1-異丙基-4-甲基-苯(1.59 g，2.50 mmol)。在25℃下於N2 下攪拌所得二相混合物12 h。TLC顯示起始物質耗盡。用EtOAc (500 mL×3)萃取混合物。用鹽水(300 mL)洗滌合併之有機物，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮，得到粗產物。藉由MPLC (石油醚/MTBE=10:1至1:1)純化混合物七次，得到呈黃色油狀物之化合物7-5-6A (25.6 g，產率57.53%)。1 H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ = 11.28 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 6.16 (t, J=6.8 Hz, 1H), 5.04 (d, J=4.6 Hz, 1H), 4.46 - 4.29 (m, 1H), 3.79 (br t, J=6.8 Hz, 1H), 3.59 (br s, 1H), 3.32 (s, 1H), 2.21 - 2.09 (m, 1H), 2.06 - 1.97 (m, 1H), 1.76 (s, 3H), 1.17 - 1.08 (m, 4H), 0.91 - 0.81 (m, 10H), 0.08 (s, 6H)。SFC: SFC純度：98.6%。TLC (石油醚/乙酸乙酯=1:1) Rf = 0.38。
化合物7-5-7A之製備.
藉由於旋轉式蒸發器上與吡啶(100 mL)及甲苯(100 mL×2)共沸蒸餾來乾燥化合物7-5-6A (12.80 g，34.55 mmol)。用N2 將化合物7-5-6A (12.80 g，34.55 mmol)及DMTCl (1.89 g，5.59 mmol)於吡啶(120.00 mL)及THF (400.00 mL)之混合物中的溶液脫氣及吹掃3次，且隨後添加AgNO3 (10.09 g，59.43 mmol)。在25℃下攪拌混合物15小時。TLC顯示起始物質耗盡。添加MeOH (5 mL)，且攪拌15 min，隨後過濾混合物，且用甲苯(300 mL×3)洗滌濾餅。濃縮濾液，得到呈黃色油狀物之化合物7-7-7A(46.50 g，粗產物)。混合物不經任何純化即直接用於下一步驟。TLC (石油醚/乙酸乙酯) Rf=0.63。
5'-(S)-C-Me-5'-DMT-dT之製備.
向化合物7-5-7A (46.50 g，69.11 mmol)於THF (460.00 mL)中之溶液中添加TBAF (1 M，131.31 mL)。在25℃下攪拌混合物5小時。TLC顯示起始物質耗盡。濃縮混合物，隨後添加飽和NaCl (5%水溶液，200 mL)，且用EtOAc (200 mL×3)萃取水相。合併之有機層經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮以得到粗產物，其藉由MPLC (石油醚/乙酸乙酯5:1、1:1、1:4，5% TEA)純化以得到呈白色固體狀之5'-(S)-C-Me-5'-DMT-dT (29.0 g，產率75.12%)。1 H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ = 11.35 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.58 - 7.53 (m, 1H), 7.44 (d, J=7.8 Hz, 2H), 7.37 - 7.24 (m, 6H), 7.23 - 7.17 (m, 1H), 6.87 (t, J=8.3 Hz, 4H), 6.13 (t, J=6.9 Hz, 1H), 5.21 (d, J=4.9 Hz, 1H), 4.23 (br s, 1H), 3.73 (d, J=2.9 Hz, 6H), 3.67 (t, J=3.7 Hz, 1H), 3.57 - 3.46 (m, 1H), 2.23 - 2.04 (m, 2H), 1.67 (s, 3H), 1.70 - 1.65 (m, 1H), 0.71 (d, J=6.2 Hz, 3H).13 CNMR (101MHz, DMSO-d6): δ = 170.78, 164.16, 158.64, 158.59, 150.86, 146.71, 137.00, 136.75, 135.97, 130.65, 130.52, 128.38, 128.07, 127.11, 113.48, 110.11, 89.78, 86.41, 83.87, 70.58, 70.22, 60.21, 55.48, 21.20, 18.08, 14.53, 12.54。HPLC: HPLC純度：98.4%。LCMS: (M-H+) = 557.2; LCMS純度：99.0%。SFC: SFC純度：99.4%。TLC (石油醚/乙酸乙酯=1:1, 5% TEA) Rf =0.01。
5'-(S)-C-Me-5'-DMT-dT-CNE-胺基酸酯之製備.
向5'-(S)-C-Me-5'-DMT-dT (5.00 g，8.95 mmol)於MeCN (50.00 mL)中之溶液中添加5-乙基硫基-2H-四唑(1.17 g，8.95 mmol)、1-甲基咪唑(1.47 g，17.90 mmol，1.43 mL)及化合物7-5-1 (4.05 g，13.43 mmol，4.26 mL)。在20℃下於N2下攪拌反應混合物2小時。TLC及LC-MS顯示一些起始物質耗盡且形成所需物質。減壓濃縮反應混合物，且用EtOAc (20 mL)稀釋殘餘物。用飽和NaHCO3 水溶液(20 mL)洗滌反應混合物，經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮以得到粗產物，其藉由MPLC (石油醚5% TEA：乙酸乙酯為10:1至1:1)純化以得到呈白色固體狀之5'-(S)-C-Me-5'-DMT-dT-CNE-胺基酸酯(4.3 g，產率63.31%)。1 H NMR (400MHz, 氯仿-d) δ = 8.19 (br s, 1H), 7.69 - 7.60 (m, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.43 - 7.33 (m, 2H), 7.32 - 7.07 (m, 8H), 6.73 (ddd, J=3.7, 5.8, 9.0 Hz, 4H), 6.27 - 6.15 (m, 1H), 4.49 - 4.37 (m, 1H), 3.82 - 3.65 (m, 8H), 3.63 - 3.55 (m, 2H), 3.53 - 3.39 (m, 3H), 2.50 (t, J=6.3 Hz, 1H), 2.46 - 2.31 (m, 1H), 2.29 - 2.19 (m, 1H), 2.16 - 2.04 (m, 1H), 1.68 (s, 3H), 1.20 - 1.00 (m, 13H), 0.95 (d, J=6.8 Hz, 3H), 0.92 - 0.74 (m, 4H)。31 P NMR (162MHz, 氯仿-d) δ = 149.11 (s, 1P), 148.99 (s, 1P)。
實例7-6. L-DPSE-5'-(R)-C-Me-5'-DMT-dT胺基酸酯之合成.
在45℃下藉由與80 mL無水甲苯共蒸發來乾燥5'-(R)-C-Me-5'-OMT-dT (11.17 g，20 mmol)兩次，且保持在高真空下隔夜。隨後，在氬氣下於500 mL三頸燒瓶中將5'-(R)-C-Me-5'-OMT-dT溶解在無水THF (80 mL)中，之後添加三乙胺(13.93 mL，100 mmol)，且將混合物冷卻至-40℃。經由針筒向此經冷卻反應混合物逐滴添加來自儲備液的粗產物L-DPSE-NOPCl (30 mmol，1.4當量，於THF 40 mL中)之溶液(約15 min，將內部溫度維持在-40℃至-35℃)。隨後使混合物逐漸升溫至5℃。保持在5℃下30 min後，TLC及LC-MS分析指示SM完全轉化成產物(總反應時間2 h)。在冰浴中冷卻反應混合物，且藉由添加水(0.36 mL，20 mmol)淬滅反應物。攪拌混合物10 min，之後添加無水Mg2 SO4 (3.0 g，20 mmol)。經由Airfree,Schlenk過濾管過濾反應物，用無水THF (60 mL)洗滌，且在28℃下藉助旋轉蒸發來蒸發溶劑，得到呈灰白色固體狀之粗產物，使其在高真空下乾燥隔夜。藉由Combi-Flash Rf (Teledyne ISCO)使用220矽膠管柱(其用含5% TEA的3管柱體積之乙酸乙酯預先去活)，將含有5% TEA之乙酸乙酯/己烷混合物用作溶劑來純化經乾燥之粗產物。藉由TLC及LC-MS分析溶離份，且將其彙集在一起。在28℃下於旋轉式蒸發器中蒸發溶劑，且在高真空下乾燥殘餘物，得到呈白色固體狀之產物。產量：16.3 g (91%)。1 H NMR (400 MHz, 氯仿-d ) δ 7.50 - 7.36 (m, 6H), 7.35 - 7.06 (m, 13H), 6.85 (d,J = 1.4 Hz, 1H), 6.73 (dq,J = 8.7, 3.2 Hz, 4H), 6.13 (dd,J = 9.3, 5.3 Hz, 1H), 5.10 (td,J = 7.8, 7.1, 3.4 Hz, 1H), 4.80 (dt,J = 8.6, 5.8 Hz, 1H), 4.04 (q,J = 7.1 Hz, 1H), 3.69 (d,J = 2.3 Hz, 6H), 3.57 - 3.36 (m, 3H), 3.29 - 3.05 (m, 2H), 2.05 (dd,J = 13.6, 5.5 Hz, 1H), 1.96 (s, 2H), 1.73 - 1.50 (m, 3H), 1.47 - 1.32 (m, 2H), 1.30 (d,J = 1.2 Hz, 3H), 1.17 (t,J = 7.2 Hz, 2H), 0.75 (d,J = 6.5 Hz, 3H), 0.60 (s, 3H).31 P NMR (162 MHz, CDCl3 ) δ 151.34 (s)。MS: LCMS: 計算值C51H56N3O8PSi, 897.3574; +Ve模式下觀測到: m/z: 898.52 [M+H]; 999.95 [M+Et3N]。13 C NMR (101 MHz, CDCl3 ) δ 171.12, 163.83, 158.65, 158.61, 150.21, 146.50, 136.96, 136.71, 136.59, 135.94, 135.54, 134.60, 134.34, 130.24, 130.15, 129.45, 129.39, 128.02, 127.96, 127.94, 127.88, 127.79, 126.86, 113.17, 113.11, 110.93, 89.27, 89.25, 86.48, 83.68, 79.09, 78.99, 77.42, 77.30, 77.10, 76.78, 71.78, 71.70, 70.26, 68.39, 68.36, 60.39, 55.24, 47.19, 46.83, 46.09, 39.48, 39.44, 27.35, 25.97, 25.93, 21.05, 18.33, 17.85, 17.81, 14.23, 11.73, 11.45。
實例7-7. L-DPSE-5'-(S)-C-Me-5'-DMT-dT胺基酸酯之合成.
在45℃下藉由與20 mL無水甲苯共蒸發來乾燥5'-(S)-C-Me-5'-OMT-dT (1.20 g，2 mmol)兩次，且保持在高真空下隔夜。隨後，在氬氣下於100 mL三頸燒瓶中將5'-(S)-C-Me-5'-OMT-dT溶解在無水THF (20 mL)中，之後添加三乙胺(1.4 mL，10 mmol)，且將混合物冷卻至-40℃。在約5 min內經由針筒向此經冷卻反應混合物逐滴添加來自儲備液的粗產物L-DPSE-NOPCl (3 mmol，1.5當量，於THF 3.0 mL中)之溶液(將內部溫度維持在-40℃，隨後逐漸升溫至5℃)。保持在5℃下30 min後，TLC及LC-MS分析指示SM完全轉化成產物(總反應時間1.5 h)。在冰浴中冷卻反應混合物，且藉由添加水(0.036 mL，2 mmol)淬滅反應物。攪拌混合物10 min，之後添加無水MgSO4 (0.3 g，2 mmol)。經由Airfree,Schlenk過濾管過濾反應物，且用無水THF (20 mL)洗滌。在28℃下藉助旋轉蒸發來蒸發溶劑以得到灰白色固體，使其在高真空下乾燥隔夜。藉由Combi-Flash Rf (Teledyne ISCO)使用40 g矽膠管柱(其用含5% TEA的3管柱體積之乙酸乙酯預先去活)，將含有5% TEA之乙酸乙酯/己烷混合物用作溶劑來純化經乾燥之粗產物。管柱純化後，藉由TLC及LC-MS分析溶離份，將其彙集在一起，且在28℃下於旋轉式蒸發器中蒸發。在高真空下乾燥殘餘物，得到呈白色固體狀之L-DPSE-5'-(S)-C-Me-5'-DMT-dT胺基酸酯。產量：1.27g (70%)。31 P NMR (162 MHz, CDCl3 ) δ 149.73 (s)。MS: LC-MS; 計算值: C51H56N3O8PSi, 897.3574; +Ve模式下觀測到: m/z: 898.56[M+H]。
實例7-8. L-DPSE-5'-DMT-5-C6-胺基連接基團胺基酸酯之合成-所需部分經由核鹼基之併入.
藉由在45℃下與100 mL無水甲苯共蒸發來乾燥5'-DMT-5-C6胺基TFA-dT (25 g，31.5 mmol，來自Berry & Associates Inc)兩次，且保持在高真空下隔夜。隨後，在氬氣下於500 mL三頸燒瓶中將經乾燥物質溶解在無水THF (100 mL)中，之後添加三乙胺(21.92 mL，157 mmol)，且隨後冷卻至-70℃。經由針筒向此經冷卻反應混合物逐滴添加來自儲備液的粗產物L-DPSE-NOPCl (44 mmol，1.4當量，於THF 44 mL中)之溶液(約15 min，將內部溫度維持在-60℃至50℃)。使混合物逐漸升溫至5℃。保持在5℃下30 min後，TLC及LC-MS分析指示SM完全轉化成產物(總反應時間2 h)。在冰浴中冷卻反應混合物，且藉由添加水(0.56 mL，31.5 mmol)淬滅，且攪拌10 min，之後添加無水Mg2 SO4 (3.8 g，31.5 mmol)。經由Airfree,Schlenk過濾管過濾反應物，用無水THF (80 mL)洗滌，且在28℃下藉助旋轉蒸發來蒸發，得到呈灰白色固體狀之粗產物，使其在高真空下乾燥隔夜。藉由Combi-Flash Rf (Teledyne ISCO)使用220矽膠管柱(其用含5% TEA的3管柱體積之乙酸乙酯預先去活)，將含有5% TEA之乙酸乙酯/己烷混合物用作溶劑來純化經乾燥之粗產物。管柱純化後，藉由TLC及LC-MS分析溶離份，且將其彙集在一起。在28℃下於旋轉式蒸發器中蒸發溶劑，且在高真空下乾燥殘餘物，得到呈白色固體狀之產物。產量：30g (88%)。MS: LC-MS; 計算值：C60H67F3N5O10PSi, 1133.4347; 在+Ve模式下觀測到：1235.55(M+Et3N)。1 H NMR (400 MHz, 氯仿-d ) δ 7.78 (s, 1H), 7.40 (ddd,J = 9.8, 6.5, 2.2 Hz, 5H), 7.32 (d,J = 7.3 Hz, 2H), 7.30 - 7.09 (m, 15H), 6.99 (d,J = 15.5 Hz, 1H), 6.76 (dd,J = 8.9, 2.7 Hz, 4H), 6.54 (d,J = 15.5 Hz, 1H), 5.12 (t,J = 6.1 Hz, 1H), 4.66 - 4.49 (m, 2H), 4.04 (q,J = 7.1 Hz, 1H), 3.81 (q,J = 3.0 Hz, 1H), 3.67 (s, 6H), 3.41 (ddt,J = 14.8, 10.2, 7.7 Hz, 1H), 3.30 - 3.13 (m, 4H), 3.12 - 2.91 (m, 4H), 1.96 (s, 2H), 1.92 - 1.69 (m, 2H), 1.58 (ddt,J = 15.1, 11.6, 8.0 Hz, 1H), 1.50 - 1.29 (m, 5H), 1.18 (tq,J = 15.8, 8.8, 8.0 Hz, 9H), 0.52 (s, 3H).31 P NMR (162 MHz, CDCl3 ) δ 150.88 (s).13 C NMR (101 MHz, CDCl3 ) δ 171.18, 165.77, 161.89, 158.76, 158.74, 157.85, 157.49, 157.12, 156.76, 149.17, 144.52, 139.69, 136.68, 135.86, 135.53, 135.44, 134.54, 134.30, 131.15, 129.97, 129.89, 129.44, 129.38, 128.09, 127.93, 127.91, 127.18, 122.36, 120.31, 117.44, 114.58, 113.42, 113.39, 111.72, 110.53, 86.65, 86.04, 86.02, 85.67, 79.28, 79.19, 77.42, 77.31, 77.11, 76.79, 73.20, 73.12, 68.05, 68.02, 63.09, 60.41, 55.27, 46.96, 46.60, 45.81, 40.48, 39.56, 38.88, 29.33, 28.52, 27.23, 25.83, 21.04, 17.55, 17.52, 14.20。
實例7-9. 5-硫代乙酸炔基酯-5'-DMT-3'CNE-2'OMe-U胺基酸酯之合成.
使化合物7 - 9 - 1 (5.0 g，6.72 mmol)與無水甲苯共蒸發兩次(40 mL×2)，且在高真空下乾燥隔夜。在氬氣下將經乾燥黃色固體溶解於無水THF (14 ml，約0.5 mmol/mL)中，且向溶液添加5-乙基硫基-1H-四唑(1.05 g，8.07 mmol)、N - 甲基咪唑(0.045 g，0.044 mL，0.67 mmol)，繼之以2-氰基乙基-N,N,N',N'-四異丙基二胺基磷酸酯(2.23 g，2.34 mL，7.39 mmol)。在氬氣下在室溫下攪拌混合物5 h。由以上溶劑系統預先平衡之TLC (溶劑系統：40% CH3 CN/EtOAC/5% TEA)指示反應5小時完成，其亦由LC-MS證實。用EtOAc (100 mL)稀釋反應混合物，且將溶液轉移至分液漏斗，用飽和NaHCO3 水溶液(40 mL)洗滌且經無水Mg2 SO4 乾燥。在浴液溫度28℃下藉助旋轉蒸發來蒸發經乾燥溶液，得到呈淡黃色固體狀之粗產物，使其在高真空下進一步乾燥隔夜。在Combi-Flash Rf (Teledyne ISCO)中使用80 g急驟矽膠管柱純化經乾燥粗產物，該管柱使用含5% TEA的2管柱體積(CV 125 mL，60 mL/min)之乙酸乙酯預先去活，繼之以用2管柱體積之20% EtOAc/己烷平衡。使用含有5% TEA之己烷/EtOAc/CH3CN混合物作為溶劑系統來純化化合物。純化後，藉由TLC及LC-MS分析管柱溶離份。將所需溶離份彙集在一起，在28℃下於旋轉式蒸發器中蒸發，且在高真空下乾燥，得到呈白色固體狀之7 - 9 - 2 - CNE胺基酸酯。產量：4.8g (76%)。MS: LC-MS; 計算值：C48H58N5O11PS, 943.35;在+Ve模式下觀測到: m/z 1045.92(M+Et3N)。1 H NMR (400 MHz, 氯仿-d ) δ 8.36 - 8.07 (m, 1H), 7.47 - 7.09 (m, 10H), 6.78 (dt,J = 9.1, 3.8 Hz, 4H), 5.87 (dd,J = 26.6, 3.1 Hz, 1H), 4.73 (d,J = 14.9 Hz, 1H), 4.57 - 4.30 (m, 1H), 4.21 - 4.00 (m, 2H), 3.86 - 3.32 (m, 17H), 3.23 (ddd,J = 13.0, 11.2, 2.5 Hz, 1H), 2.91 (td,J = 7.0, 2.4 Hz, 2H), 2.54 (q,J = 6.1 Hz, 1H), 2.27 (d,J = 24.2 Hz, 4H), 1.96 (d,J = 7.1 Hz, 3H), 1.21 - 0.82 (m, 14H).31 P NMR (162 MHz, CDCl3 ) δ 150.60 (s), 150.24(s).13 C NMR (101 MHz, CDCl3 ) δ 195.80, 169.61, 161.45, 158.70, 158.68, 149.06, 144.75, 144.61, 142.82, 135.67, 135.58, 135.48, 135.38, 130.18, 130.16, 130.12, 128.14, 128.11, 128.09, 128.02, 127.01, 117.69, 117.53, 113.42, 113.38, 113.34, 99.60, 99.33, 88.98, 88.95, 88.50, 88.06, 87.06, 86.85, 83.89, 82.99, 82.62, 77.34, 77.22, 77.02, 76.70, 74.55, 74.40, 69.74, 69.62, 62.04, 61.26, 60.38, 58.97, 58.59, 58.47, 58.45, 57.89, 57.68, 55.34, 55.31, 43.33, 43.21, 35.44, 35.41, 30.54, 29.95, 24.71, 24.65, 24.63, 24.58, 24.56, 24.49, 21.04, 20.50, 20.43, 20.38, 20.31, 14.20。
如熟習此項技術者所容易瞭解，化合物7-9-2可以根據本發明之胺基磷酸酯的形式用於寡核苷酸合成，從而將受保護硫醇基併入寡核苷酸中。根據本發明，脫除保護基後，游離硫醇基可用於連接寡核苷酸單體以藉由形成一或多個二硫鍵來形成多聚體。
如一般熟習此項技術者所瞭解，多種技術(例如，化學、試劑、連接基團、方法等)可用於製備寡核苷酸(包括具有各種5'端結構之彼等寡核苷酸)及將各種化學部分(例如碳水化合物部分、脂質部分、靶向部分等)併入根據本發明之寡核苷酸，例如(但不限於)描述於以下中之彼等方法：WO/2010/064146、WO/2011/005761、WO/2013/012758、WO/2014/010250、US2013/0178612、WO/2014/012081、WO/2015/107425、WO/2017/015555及WO/2017/062862。本文中描述用於製備寡核苷酸的實例技術，該等寡核苷酸包括包含各種部分之彼等寡核苷酸。
如表61至表73中所示，構築各種寡核苷酸，且測試其介導PNPLA3之減量(包括活體外)的能力。不希望受任何理論束縛，本發明表明，表61至表73中之寡核苷酸中之至少一些可能能夠經由RISC介導之ssRNAi機制來介導減量。另外，此等表中之一些寡核苷酸具有雜交型式。另外，本文中描述之寡核苷酸中之至少一些能夠以對偶基因特異性方式介導PNPLA3之減量。
表61. 表61展示靶向PNPLA3之不同單股RNAi劑之活體外功效。所測試寡核苷酸為：WV-4054及WV-4098。在為同種接合野生型(PNPLA3中之I/I aa)的Hep3B (I/I)細胞中及為同種接合突變型(PNPLA3中之M/M aa)的Huh7細胞中測試寡核苷酸。Huh7細胞中之WV-4054之IC50為0.239 nM；且Huh7細胞中之WV-4098之IC50為0.158 nM。寡核苷酸WV-4054及WV-4098長度不同，但均能夠介導PNPLA3之對偶基因特異性減量。WV-4098經由RNA干擾機制介導減量之能力藉由如下發現來支援：AGO-2 (其為RNA干擾所需)之CRISPR剔除阻止WV-4098減量之能力，而AGO-1、AGO-3及AGO-4(其不為RNA干擾所需)之剔除則不會(資料未展示)。表 61A . 寡核苷酸之活性 .
表62. 表62展示靶向PNPLA3之不同單股RNAi劑的活體外效能及IC50 。所測試寡核苷酸為：WV-2477 (陽性對照)、WV-3380 (陽性對照)、WV-4018、WV-4019、WV-4020、WV-4021、WV-4022、WV-4023、WV-4024及WV-4025，各自在Hep3B (Hep)及Huh7 (Huh)細胞中進行測試。使用Lipofectamine® 2000轉染試劑(ThermoFisher, Grand Island, NY)傳遞用於PNPLA3分析之寡核苷酸。在此表格及其他表格中，於2 nM、8.25 nM及33 nM之濃度下測試寡核苷酸。表 62 . 寡核苷酸之活性 .
表63. 表63展示靶向PNPLA3之不同單股RNAi劑的活體外效能及IC50 。所測試寡核苷酸為：WV-2477 (陽性對照)、WV-3380 (陽性對照)、WV-4026、WV-4027、WV-4028、WV-4029、WV-4030、WV-4031、WV-4032及WV-4033，各自在Hep3B (Hep)及Huh7 (Huh)細胞中進行測試。表 63 . 寡核苷酸之活性 .
表64. 表64展示靶向PNPLA3之不同單股RNAi劑的活體外效能及IC50 。所測試寡核苷酸為：WV-2477 (陽性對照)、WV-3380 (陽性對照)、WV-4034、WV-4035、WV-4036、WV-4037、WV-4038、WV-4039、WV-4040、WV-4041，各自在Hep3B (Hep)及Huh7 (Huh)細胞中進行測試。表 64.寡核苷酸之活性 .
表65. 表65展示靶向PNPLA3之不同單股RNAi劑的活體外效能及IC50 。 所測試寡核苷酸為：WV-3380 (陽性對照)、WV-2477 (陽性對照)、WV-4042、WV-4043、WV-4044、WV-4045、WV-4046、WV-4047、WV-4048及WV-4049，各自在Hep3B (Hep)及Huh7 (Huh)細胞中進行測試。表 65 . 寡核苷酸之活性 .
表66. 表66展示靶向PNPLA3之不同單股RNAi劑的活體外效能及IC50 。所測試寡核苷酸為：WV-2477 (陽性對照)、WV-3380 (陽性對照)、WV-4050、WV-4051、WV-4052、WV-4053、WV-4054、WV-4055、WV-4056、WV-4057，各自在Hep3B (Hep)及Huh7 (Huh)細胞中進行測試。表 66 . 寡核苷酸之活性 .
表67. 表67展示靶向PNPLA3之不同單股RNAi劑的活體外效能及IC50 。所測試寡核苷酸為WV-2477 (陽性對照)、WV-3380 (陽性對照)、WV-4058、WV-4059、WV-4060、WV-4061、WV-4062、WV-4063、WV-4064及WV-4065。寡核苷酸在Hep3B (Hep)及Huh7 (Huh-7或Huh或P-Huh7或P-Huh-7)細胞中進行測試。表 67 . 寡核苷酸之活性 .
表68. 表68展示靶向PNPLA3之不同單股RNAi劑的活體外效能。 所測試寡核苷酸為：WV-4098、WV-7462、WV-7464、WV-7467及WV-7469。表 68 . 寡核苷酸之活性 . 提供寡核苷酸之濃度。亦提供所用之細胞及所用之寡核苷酸。數值表示PNPLA3 mRNA含量(PNPLA3/HPRT1)，其中100將表示100% mRNA含量(無減量)，且0將表示0% mRNA含量(或100%減量)。展示來自複本之資料。第 1 部分 . Hep3B 細胞中之活性 . 第 2 部分 . Huh7 ( P - Huh7 ) 細胞中之活性 .
表69. 表69A及表69B展示靶向PNPLA3之不同單股RNAi劑的活體外效能及IC50 。所測試寡核苷酸為：表69A，WV-4098、WV-4075、WV-7465、WV-7466及WV-7468；及表69B，WV-3380、WV-4098及WV-7469。表 69A . 寡核苷酸之活性 . 提供寡核苷酸之濃度。亦提供所用之細胞及所用之寡核苷酸。數值表示PNPLA3 mRNA含量(PNPLA3/HPRT1)，其中100將表示100% mRNA含量(無減量)，且0將表示0% mRNA含量(或100%減量)。展示來自複本之資料。第 1 部分 . Hep3B 細胞中之活性 . 第 2 部分 . Huh7 細胞中之活性 . 表 69B . 寡核苷酸之活性 . 提供寡核苷酸之濃度。亦提供所用之細胞及所用之寡核苷酸。數值表示PNPLA3 mRNA含量(PNPLA3/HPRT1)，其中100將表示100% mRNA含量(無減量)，且0將表示0% mRNA含量(或100%減量)。展示來自複本之資料。
表69C展示大鼠肝組織勻漿穩定性分析(24小時)。所測試寡核苷酸為：WV-4098、WV-7463、WV-7462、WV-7316、WV-4075、WV-7469、WV-7464、WV-7468、WV-7467、WV-7466、WV-7465。表 69C . 寡核苷酸之穩定性 . 數值指示用大鼠肝組織勻漿處理24小時後剩餘之全長寡核苷酸之百分比。100將表示剩餘100%全長寡核苷酸；0將表示剩餘0%全長寡核苷酸。不同寡核苷酸具有不同數目個立體受控硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。展示來自複本之資料。
表70. 表70展示不同單股RNAi劑之IC50。 所測試寡核苷酸為Huh7及Hep3B細胞中之WV-2477、WV-4054及WV-3387。WV-2477未顯著使任一種細胞中之PNPLA3減量。WV-4054具有與SNP對rs738408 T及rs738409 G互補之序列，且能夠介導針對包含此等兩種SNP之細胞(Huh7)的對偶基因特異性RNA干擾。在所測試濃度下，在並不包含此等SNP而是具有rs738408C及rs738409 C之不同細胞(Hep3B)中，此寡核苷酸不介導顯著RNAi干擾。另外，單股RNAi劑WV-4098亦能夠阻斷互補序列(與Huh7細胞中之SNP rs738408 T及rs738409 G)之基因表現，但在所測試濃度下，不阻斷非互補序列(與Hep3B細胞中之SNP rs738408C及rs738409 C)之基因表現。表 70 . 寡核苷酸之 IC50 .
表71. 表71A至表71D展示立體受控(例如，對掌性受控)寡核苷酸(例如，單股RNAi劑)之型式之非限制性實例。
表72. 表72展示ssRNAi WV-4054在原代食蟹獼猴肝細胞中之活體外效能。
表74. 表74展示Hep3B 24小時分析中，反義寡核苷酸在RNase H介導的PNPLA3之減量中的功效。所測試寡核苷酸為：WV-1868 (陰性對照)、WV-3367、WV-3368、WV-3369、WV-3370、WV-3371、WV-3372、WV-3373、WV-3374、WV-3375、WV-3376、WV-3377、WV-3378、WV-3379及WV-3380。WV-1868為反義寡核苷酸(經由RNase H介導之減量操作)，而其他所測試寡核苷酸為RNAi劑。所用之細胞為PCH細胞。
表73. 表73展示PNPLA3 ssRNAi劑WV-7467、WV-7469、WV-7466及WV-7468以及ASO WV-6825之結構。
如表74至表90中所示，構築各種寡核苷酸，且測試其介導PNPLA3之減量(包括活體外)的能力。不希望受任何理論束縛，本發明表明，表74至表90中之寡核苷酸中之至少一些可能能夠經由RNaseH介導之機制來介導減量。另外，此等表中之一些寡核苷酸具有雜交型式。
表74. 表74展示ASO對PNPLA3之活體外效能。所測試寡核苷酸為：WV-1868及WV-3367至WV-3380。所用之細胞為Hep3B細胞。表 74 . 寡核苷酸之活性 .
表75. 表75展示ASO對PNPLA3之活體外效能。所測試寡核苷酸為：WV-1868及WV-3381至WV-3394。表 75 . 寡核苷酸之活性 .
表76. 表76A及表76B展示ASO對PNPLA3之活體外效能。所測試寡核苷酸為：表76A，WV-1868及WV-3395至WV-3408；表76B，WV-1868及WV-3409至WV-3422。表 76A . 寡核苷酸之活性 . 表 76B. 寡核苷酸之活性 .
表77. 表77展示ASO對PNPLA3之活體外效能。所測試寡核苷酸為：WV-1868及WV-3423至WV-3436。表 77. 寡核苷酸之活性 .
表78. 表78展示ASO對PNPLA3之活體外效能。所測試寡核苷酸為：WV-1868及WV-3437至WV-3450。表 78. 寡核苷酸之活性 .
表79. 表79展示Hep3B 24小時分析中，反義寡核苷酸在RNase H介導的PNPLA3之減量中的功效。所測試寡核苷酸為：WV-1868 (對照)、WV-3451、WV-3452、WV-3453、WV-3454、WV-3455、WV-3456、WV-3457、WV-3458、WV-3459、WV-3460、WV-3461及WV-3462。WV-1868為反義寡核苷酸(經由RNase H介導之減量操作)，而其他所測試寡核苷酸為RNAi劑。表 79. 寡核苷酸之活性 .
表81. 表81展示靶向PNPLA3之不同寡核苷酸的活體外效能及IC50 。所測試寡核苷酸為：WV-2477 (其經由RNA干擾介導之機制阻斷標靶之基因表現)及WV-3387 (其經由RNase H介導之減量來阻斷標靶之基因表現)。表 81. 寡核苷酸之活性 .
表82. 表82展示Hep3B分析中，反義寡核苷酸在RNase H介導的PNPLA3之減量中的功效。 所測試寡核苷酸為：WV-3380 (陽性對照)、WV-3387、WV-3391、WV-3393、WV-3402、WV-3411、WV-3416、WV-3443及WV-3454。表 82. 寡核苷酸之活性 .
表83. 表83展示ASO針對Huh7細胞中之PNPLA3的IC50。所測試寡核苷酸為：WV-3380、WV-3387、WV-3391、WV-3393、WV-3402、WV-3411、WV-3416、WV-3443及WV-3454。表 83. 寡核苷酸之活性 .
表84. 表84展示ASO對PNPLA3之活體外效能。所測試寡核苷酸為：WV-3380、WV-3393、WV-3402、WV-3421、WV-3390、WV-3399、WV-3404、WV-3443、WV-3391、WV-3394、WV-3408、WV-3387及WV-3381。表 84. 寡核苷酸之 IC50.
表85. 表85展示ASO針對PNPLA3之IC50。所測試寡核苷酸為：WV-3380、WV-3381、WV-3387、WV-3391、WV-3393、WV-3394、WV-3399、WV-3402、WV-3404、WV-3408、WV-3421及WV-3443。表 85. 寡核苷酸之 IC50. 寡核苷酸具有各種序列，且在PNPLA3之編碼區段(CDS)或3'非轉譯區域(3'UTR)中。
表86. 表86展示ASO對PNPLA3之活體外效能。所測試寡核苷酸為：WV-3421、WV-3393、WV-3380及WV-3402。在展示於表86及表87中之資料中，在食蟹獼猴細胞中測試具有人類序列中寡核苷酸。卵形指示錯配，其中寡核苷酸序列匹配人類序列，但與食蟹獼猴序列不匹配。表 86. 寡核苷酸之活性 . 數值表示相對PNPLA3 mRNA含量(PNPLA3/GAPDH)。1.0將表示100% mRNA含量或0%減量，且0.0將表示0.0% mRNA含量或100%減量。數值為近似的，且不包括誤差杠。食蟹獼猴細胞經活體外處理。
表87. 表87展示ASO對PNPLA3之活體外效能。所測試寡核苷酸為：WV-3404、WV-3399、WV-3443及WV-3421。 表87. 寡核苷酸之活性. 數值表示相對PNPLA3 mRNA含量(PNPLA3/GAPDH)。1.0將表示100% mRNA含量或0%減量，且0.0將表示0.0% mRNA含量或100%減量。數值為近似的，且不包括誤差杠。食蟹獼猴細胞經活體外處理。
不希望受任何特定理論束縛，本發明指出，其他實驗亦提供支援如下結論之其他資料：各種推定之單股RNAi劑實際上能夠介導RNA干擾；且各種寡核苷酸經設計以能夠經由RNaseH介導之機制介導減量，實際上經由RNaseH介導之機制介導了減量。針對不同標靶之PNPLA3寡核苷酸經由RNaseH介導之機制導引減量的發現支援如下觀點：具有相同或類似型式但具有PNPLA3且能夠阻斷PNPLA3之基因表現的另一寡核苷酸很可能亦經由RNaseH介導之機制導引減量。
在一個實驗中，執行活體外RNase H分析，其中將APOC3寡核苷酸WV-1868 (ASO，介導非PNPLA3基因APOC3之RNase H減量機制)作為陽性對照及APOC3寡核苷酸WV-2110 (單股RNAi劑)作為陰性對照。RNA分子WV-2372用作測試受質。在RNase H分析中，雙機制APOC3寡核苷酸WV-2111介導RNase H減量(資料未展示)。
在另一實驗中，執行活體外Ago-2分析(針對單股RNA干擾)。用針對另一基因APOC3之單股RNAi劑執行此分析，但該基因具有類似於或等同於關於PNPLA3寡核苷酸所描述之型式的型式。針對不同標靶之PNPLA3寡核苷酸導引RNA干擾的發現支援如下觀點：具有相同或類似型式但具有PNPLA3且能夠阻斷PNPLA3之基因表現的另一寡核苷酸很可能亦經由所導引之RNA干擾來如此作用。
RNA測試受質為WV-2372 (APOC3)。在結果中，在APOC3寡核苷酸WV-1308及WV-2420存在下，表示RNA測試受質之帶不存在，指示此等寡核苷酸為能夠介導RNA干擾之單股RNAi劑。使用各種對照：不存在陰性對照ASO WV-2134之受質；不存在陰性對照ASO WV-2134之受質，該陰性對照不介導RNA干擾；不存在測試寡核苷酸WV-1308之受質；不存在測試寡核苷酸WV-2420之受質；僅受質；無受質，添加WV-2134；及無受質，添加WV-1308 (資料未展示)。
在另一實驗中，使用APOC3 mRNA作為Hep3B細胞之3'RACE分析中之測試受質，執行活體外Ago-2分析(針對單股RNA干擾)。偵測APOC3 mRNA在測試寡核苷酸WV-3021存在下之裂解產物，對應於該mRNA在與WV-3021之位置10與11之間的切口對應的位點處之裂解(資料未展示)，此結果符合RNA干擾。亦偵測人造裂解產物。
在其他實驗中，顯示雙機制(雜交型式)APOC3寡核苷酸WV-2111能夠藉由RNase H及RNA干擾兩者介導減量。發現包含GCUGGCCUCCCAAUAAAGCUGGACA之序列(其與APOC3寡核苷酸WV-2111之序列互補)的用於WV-2111之RNA受質在WV-2111存在下於以下位置處裂解：GC/UGGC/C/U/CC/CAAUA//AAGCUGGACA，其中/指示獨有RNaseH活性之位置中之裂解位點，且//指示獨有Ago-2 (RNA干擾)活性之位置中之裂解位點。此等資料支援以下觀點：WV-2111經由RNaseH及RNA干擾機制兩者介導減量。
Ago-2活體外分析中亦發現若干種寡核苷酸能夠介導RNA干擾。RNA測試受質為APOC3寡核苷酸WV-2372；此受質在APOC3寡核苷酸WV-1308、WV-2114、WV-2386或WV-2387 (各自分別進行測試)存在下消失，指示此等寡核苷酸中之每一者能夠充當介導RNA干擾之單股RNAi劑。
不希望受任何特定理論束縛，本發明表明，本文中指定為單股RNAi劑之寡核苷酸中之至少一些經由RISC (RNA干擾沉默複合體)介導減量；然而，在至少一些實驗中，本文中指定為單股RNAi劑之寡核苷酸能夠介導標靶之觀測到的蛋白質水準之減量，高於觀測到的對應mRNA含量之減量，且不希望受任何特定理論束縛，本發明表明，此觀測結果符合如下推測：能夠阻斷靶基因或蛋白質之基因表現的本文中指定為單股RNAi劑之寡核苷酸可能能夠經由RISC介導之機制及/或位阻來減量。
本發明提供寡核苷酸之許多非限制性實例，該等寡核苷酸具有各種序列、型式、修飾、5'端區域、種子區域、種子後區域及3'端區域中之任一者，且能夠介導單股RNA干擾(例如，單股RNAi劑)。
圖3. 圖3A及圖3B展示實例多聚體型式。寡核苷酸可直接及/或經由連接基團而接合。如所說明，多聚體可包含具有相同或不同結構/類型之寡核苷酸單體。在一些實施例中，多聚體之單體為ssRNAi劑。在一些實施例中，多聚體之單體為RNase H依賴性反義寡核苷酸(ASO)。單體可經由各種位置接合，該等位置例如5'端、3'端或兩者之間的位置。
下文直接展示適用於經由形成二硫鍵連接基團連接寡核苷酸單體的胺基磷酸酯。在併入寡核苷酸單體中之後，硫酯可水解釋放游離硫醇，其可與另一寡核苷酸單體之硫醇反應形成二硫鍵，從而將寡核苷酸單體連接在一起。多個硫醇基可併入寡核苷酸中，使得可形成各種數目之單體的多聚體。
表90展示靶向PNPLA3之不同寡核苷酸之活體外對偶基因特異性抑制。實例寡核苷酸與一個對偶基因之靶序列完全互補，該等靶序列包含一或兩個SNP位點。一個SNP位點與蛋白質序列之I148M變化相關。在Hep3B細胞(野生型,C及C，I148)及Huh7細胞(具有雙突變，T及G，M148)中評定包含與含有兩個SNP之靶序列完全互補的標靶結合序列的寡核苷酸。在各種位置(8及11；9及12；10及13；等)處且藉由各種修飾測試雙突變以鑑別能夠進行PNPLA3之對偶基因特異性減量的寡核苷酸。
如表90B中所示，測試WV-7778至WV-7793及WV-3858至WV-3864。在此等寡核苷酸中，翼中之第一及最後一個核苷酸間鍵聯為立體無規PS，且其他的為PO；5'翼及3'翼包含2'-OMe。若干寡核苷酸展現PNPLA3之對偶基因特異性減量。表 90B. 寡核苷酸之活性 .
如表90C中所示，測試WV-7794至WV-7816。在此等寡核苷酸中，翼中之第一及最後一個核苷酸間鍵聯為立體無規PS，且其他的為PO；5'翼及3'翼包含2'-MOE。若干寡核苷酸展現PNPLA3之對偶基因特異性減量。表 90C. 寡核苷酸之活性 .
如表90D中所示，測試WV-7817至WV-7839。在此等寡核苷酸中，第一及最後一個核苷酸為LNA；5'翼具有寡核苷酸之5'端處的LNA，繼之以若干2'-OMe；且3'翼具有若干2'-OMe，繼之以寡核苷酸之3'端處的LNA。若干寡核苷酸展現PNPLA3之對偶基因特異性減量。表 90D. 寡核苷酸之活性 .
如表90E中所示，測試WV-7840至WV-7862。在此等寡核苷酸，第一及最後一個核苷酸為LNA；5'翼具有寡核苷酸之5'端處的LNA，繼之以若干2'-MOE；且3'翼具有若干2'-MOE (或5-甲基2'-MOE)，繼之以寡核苷酸之3'端處的LNA。若干寡核苷酸展現PNPLA3之對偶基因特異性減量。表 90E. 寡核苷酸之活性 .
如表90F中所示，測試WV-993、WV-3390及WV-4054。表 90F. 寡核苷酸之活性 .
如表90G中所示，測試WV-3860至WV-3864。寡核苷酸在位置8及11 (WV-3860)、9及12 (WV-3861)、10及13 (WV-3862)、11及14 (WV-3863)以及12及15 (WV-3864)處具有錯配(野生型對偶基因與突變型對偶基因之間)。若干寡核苷酸展現PNPLA3之對偶基因特異性減量，尤其在8 nM之濃度下。表 90G. 寡核苷酸之活性 .
如表90H中所示，測試WV-7804至WV-7808。寡核苷酸在位置8及11 (WV-7804)、9及12 (WV-7805)、10及13 (WV-7806)、11及14 (WV-7807)以及12及15 (WV-7808)處具有錯配。一些寡核苷酸展現PNPLA3之對偶基因特異性減量，尤其在3.2 nM及8 nM之濃度下。表 90H. 寡核苷酸之活性 .
如表90I中所示，測試WV-7827至WV-7831。寡核苷酸在位置8及11 (WV-7827)、9及12 (WV-7828)、10及13 (WV-7829)、11及14 (WV-7830)以及12及15 (WV-7831)處具有錯配。若干寡核苷酸展現PNPLA3之對偶基因特異性減量，尤其在3.2 nM及8 nM之濃度下。表 90I. 寡核苷酸之活性 .
如表90J中所示，測試WV-993 (陰性對照)、WV-3390 (陽性對照)、WV-4054、WV-7850至WV-7854。寡核苷酸在位置8及11 (WV-7850)、9及12 (WV-7851)、10及13 (WV-7852)、11及14 (WV-7853)以及12及15 (WV-7854)處具有錯配。若干寡核苷酸展現PNPLA3之高對偶基因特異性減量，尤其在3.2 nM及8 nM之濃度下。表 90J. 寡核苷酸之活性 .
如表90K及表90L中所示，測試WV-3860至WV-3864、WV-7804至WV-7808、WV-7827至WV-7831及WV-7850至WV-7854。WV-4054展現高對偶基因特異性活性。表 90K. 寡核苷酸之活性 . 表 90L. 各種寡核苷酸在 Huh7 細胞 ( 突變型對偶基因 ) 中之 IC50 . 表 91. 寡核苷酸之活性 . PNPLA3 mRNA含量 (PNPLA3/HPRT1) 表 92. 寡核苷酸之活性 . 表 93. 寡核苷酸之活性 . 表 94. 寡核苷酸之活性 . 表 95. 表 98. 寡核苷酸之活性 . 10 nM. 表 99. 寡核苷酸之活性 . 10 nM. 表 100. 寡核苷酸之活性 . 剩餘mRNA百分比 (RhPNPLA3 / hSFRS9) 48小時後之猴肝細胞. 表 101. 寡核苷酸之活性 . PNPLA3 mRNA 含量 (PNPLA3/GAPDH) 表 102A. 寡核苷酸之活性 . 原代食蟹獼猴肝細胞 . 表 102B. 寡核苷酸之 Tm. 在與完全互補或除兩個錯配(表示突變型對偶基因)以外完全互補之RNA呈雙螺旋體時量測各種寡核苷酸之Tm。所用之條件為：1 µM含雙螺旋體之1×PBS (pH 7.2)；溫度範圍：15℃至90℃；溫度速率：0.5℃/min；量測間隔：0.5℃。 表 103. 寡核苷酸之活性 . Huh7 細胞 . 表 104. 寡核苷酸之活性 . nM 表 105. 寡核苷酸之活性 . 表 106. 寡核苷酸之活性 . 表 107. 寡核苷酸之活性 . 表 108. 寡核苷酸之活性 . 在PNPLA3寡核苷酸之一些測試中，APOC3寡核苷酸WV-1868(其靶向不同於PNPLA2之基因APOC3)用作陰性對照。 表 109A. 寡核苷酸之活性 . 表 109B. 寡核苷酸之活性 . Huh7 細胞 ( 突變型對偶基因 ) 中之 IC50 ： 表 110. 寡核苷酸之活性 . Huh7 細胞： 表 111. 寡核苷酸之活性 . 亦製備及測試若干PNPLA3 ssRNAi劑，其具有無鹼基位點，特定言之(磷烷基)氧基)丙-1-醇(PS)或3'-(磷烷基)氧基)四氫呋喃。展示2 nM下之寡核苷酸投與之結果，且亦在0 nM、0.05 nM、0.128 nM、0.32 nM及0.8 nM下測試寡核苷酸(資料未展示)。數值為近似的且表示殘餘PNPLA3 mRNA含量(PNPLA3/HPRT1)，其中100將表示100%殘餘mRNA含量(0%減量)，且0將表示0%殘餘mRNA含量(100%減量)。在本文中之各種表中，除非另外指出，否則量測mRNA之含量。 表 112. 寡核苷酸之活性 . 亦製備及測試若干APOC3 ssRNAi劑，其具有C3修飾。展示2 nM下之寡核苷酸投與之結果，且亦在0 nM、0.05 nM、0.128 nM、0.32 nM及0.8 nM下測試寡核苷酸(資料未展示)。數值為近似的且表示殘餘PNPLA3 mRNA含量(PNPLA3/HPRT1)，其中100將表示100%殘餘mRNA含量(0%減量)，且0將表示0%殘餘mRNA含量(100%減量)。在本文中之各種表中，除非另外指出，否則量測mRNA之含量。 表 113. 寡核苷酸之活性 . 展示25 nM下之資料；亦在0 nM、1.6 nM及6.2 nM下測試寡核苷酸(資料未展示)。活體外測試原代食蟹獼猴肝細胞中之寡核苷酸。 表 114. 寡核苷酸之活性 . 原代食蟹獼猴肝細胞.展示4 nM下之資料。亦在0 nM、0.1 nM、0.25 nM、0.66 nM、1.6 nM及10 nM下測試寡核苷酸(資料未展示)。數值表示剩餘PNPLA3 mRNA含量(PNPLA3/HPRT1)，且數值為近似的。 WV-9893及WV-12101具有不對稱型式。 測試具有不對稱型式但為立體無規之其他寡核苷酸，其在P9/P12 (位置9及12)處具有雙突變。WV-8609、WV-8847、WV-8848、WV-8849全部具有約4 nM至5 nM之IC50。表 115A. 寡核苷酸之活性 . 測試若干PNPLA3寡核苷酸(其中一些具有不對稱結構)2天內在大鼠肝組織勻漿中之穩定性。數值表示剩餘全長寡核苷酸之%；數值為近似的。 表 115B. 寡核苷酸之活性 . 亦製備若干寡核苷酸，其靶向具有不同基因(XI因子，FXI或F11)之小鼠同系物且包含另一組分，該組分為三觸、二觸或單觸配體，其為GalNAc或PFE配體。在0.3、1或3 mpK QDx3下將此等寡核苷酸投與至小鼠。以下數值表示3 mpk下相對於對照之mFXI/mHPRT1 mRNA含量。亦在0.3 mpk及1 mpk下向小鼠投與寡核苷酸(資料未展示)。 表 115C. 寡核苷酸 . 此表格中之各種組件(例如，*、Mod038等)與表1A中之彼等組件相同。所有此等寡核苷酸為單股的，但序列經拆分成多行以供格式化。 構築各種寡核苷酸，其包含三觸、雙觸或單觸配體，其為PFE配體或GalNAc。 在一些實驗中，構築化合物，其包含與單觸、雙觸或三觸GalNAc (亦稱為參考GalNAc)或PFE配體(亦描述為PFE ASPGR配體、PFE GalNAc、橋連雙環縮酮或雙環配體)結合的寡核苷酸。 在一些實施例中，寡核苷酸為PNPLA3寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸靶向不同之基因APOC3。 此等APOC3寡核苷酸包括：表 115D. 寡核苷酸 . 參考三觸GalNAc亦稱為三GalNAc；三觸PFE配體亦稱為三PFE配體；參考雙觸GalNAc亦稱為雙GalNAc；雙觸PFE配體亦稱為雙PFE配體；參考單觸GalNAc亦稱為單GalNAc；且單觸PFE配體亦稱為單PFE配體。Mod001、Mod079、Mod080、Mod081、Mod082、Mod083及L001之結構提供於表1A之圖例及本文中之其他本文中。配體亦描述於實例27中。Mod083亦描述於實例4A及實例4B中。 實例29、實例35及實例36中之GalNAc結構表示受保護型式，因為其包含-OAc (-O-乙酸酯基)。在所列寡核苷酸之構築中，Ac基團在化合物結合至寡核苷酸之後的脫除保護基期間經去除。舉例而言，例如如實例37B中所描述用濃縮氫氧化銨執行脫除保護基。在此等結構之經脫除保護基型式中，-OAc經-OH置換。 WV-8877 (陰性對照)靶向並非APOC3或PNPLA3之不同基因。 在第1天向含有人類APOC3轉殖基因(B6.Cg-Tg(APOC3)2Bres/J)之Tg (轉殖基因)小鼠分別投與以不同價數(單觸、雙觸或三觸)與GalNAc或PFE配體結合的APOC3寡核苷酸WV-7107以及陰性對照，且藉由血清hAPOC3蛋白還原監測APOC3減量。 此表格中之各種組件(例如，*、Mod083等)與表1A中之彼等組件相同。所有此等寡核苷酸為單股的，但序列經拆分成多行以供格式化。 經由類似於關於對應APOC3寡核苷酸所描述之彼等方法的方法來構築包含各種配體(包括(但不限於)參考GalNAc三觸、PFE配體三觸、參考GalNAc雙觸、PFE配體雙觸、參考GalNAc單觸、PFE配體單觸)之PNPLA3寡核苷酸。表 115E. 寡核苷酸之活性 在第1天以3 mg/kg單一劑量(皮下)向動物投與所有寡核苷酸。另外，亦在第1天以1 mg/kg單一劑量(皮下)向動物投與WV-6558及WV-9542。在第0、8、15、22、29、36、43及50天收集血清。各組包含5個動物。PBS及WV-8877 (其靶向並非APOC3之基因)為陰性對照。 數值指示相對APOC3蛋白含量，其中1.00表示相對於PBS為100%。 在各種活體內研究中，包括此研究，所測試動物為表現人類APOC3基因之轉殖基因小鼠。 表 115F. 第 I 部分 . 肝中之寡核苷酸聚集 亦在單次3 mg/kg給藥30 min之後分析肝中之寡核苷酸聚集。數值指示每公克組織之寡核苷酸之微克數。所測試動物為表現人類APOC3基因之轉殖基因小鼠。 在同一實驗中：亦在單次1 mg/kg給藥30 min之後針對WV-6558及WV-9542分析肝中之寡核苷酸聚集。數值指示每公克組織之寡核苷酸之微克數。 表 115F. 第 II 部分 . 肝中之寡核苷酸聚集 亦在單次3 mg/kg給藥8天之後分析肝中之寡核苷酸聚集。數值指示每公克組織之寡核苷酸之微克數。所測試動物為表現人類APOC3基因之轉殖基因小鼠。 在同一實驗中：亦在單次1 mg/kg (1 mpk)給藥8天之後針對WV-6558及WV-9542分析肝中之寡核苷酸聚集。數值指示每公克組織之寡核苷酸之微克數。 資料展示與APOC3寡核苷酸結合之各種配體之功效；此等相同配體亦可結合至PNPLA3寡核苷酸上。表 116. 寡核苷酸之活性 . 測試各種PNPLA3 RNAi劑在大鼠肝組織勻漿中之穩定性。數值表示5天後剩餘之全長寡核苷酸之百分比；亦在2天後測試寡核苷酸(資料未展示)；且數量為近似的。一些寡核苷酸包含5'-DNA-T，且一些寡核苷酸包含5'-Rc-Me-T。 表 117. 寡核苷酸之活性 . 亦測試具有另一組分之各種PNPLA3寡核苷酸之功效，該組分為三觸GalNAc結合物(包括(但不限於)WV-7805、WV-8132、WV-8566、WV-8599、WV-9859及WV-9670)。在10 nM下活體外測試Huh7-148 OE細胞(其包含PNPLA3之突變型對偶基因)上之寡核苷酸。數值表示PNPLA3 mRNA含量(PNPLA3/HPRT1)，且數值為近似的。在許多情況下，寡核苷酸未在食蟹獼猴(非人類靈長類或NHP)肝細胞中展現野生型PNPLA3之顯著減量。舉例而言，當在至多10 nM下測試時，WV-8132、WV-8600、WV-9868及WV-9860未在食蟹獼猴(非人類靈長類或NHP)肝細胞中展現野生型PNPLA3之顯著減量(資料未展示)。表 118. 寡核苷酸之活性 . 活體外測試用寡核苷酸處理後之細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。在此表格中，100.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 表 119. 寡核苷酸之活性 . 在RNaseH分析中活體外測試各種PNPLA3寡核苷酸。 在為wt對偶基因(WV-8808)或148對偶基因(WV-8807)之標靶RNA之存在下培育PNPLA3寡核苷酸。數值表示剩餘標靶RNA (WV-8808或WV-8807)之百分比。在此表格中，100.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 PNPLA3寡核苷酸WV-980、WV-9893、WV-8606及WV-7805亦顯著降低具有PNLA3 148突變之Huh7細胞中之PNPLA3 148突變型mRNA含量(在12.5 nM下降至相對於HPRT1約25%至55%剩餘突變型PNPLA3之間)，丁此等寡核苷酸未顯著降低具有wt PNPLA3之Huh7細胞中之wt PNPLA3含量(在12.5 nM下，剩餘wt PNPLA3含量為約90%或更大)。表 120. 寡核苷酸之活性 . 在用寡核苷酸處理後48小時，活體外測試Hep3B細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。在此表格中，1.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 表 121. 寡核苷酸之活性 . 在用寡核苷酸處理後48小時，活體外測試Hep3B細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。在此表格中，1.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 表 122. 寡核苷酸之活性 . 在用寡核苷酸處理後48小時，活體外測試Hep3B細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。在此表格中，1.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 表 123. 寡核苷酸之活性 . 在用寡核苷酸處理後48小時，活體外測試Hep3B細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。在此表格中，1.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 表 124. 寡核苷酸之活性 . 活體外測試用寡核苷酸處理後之細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。在此表格中，100.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 表 125. 寡核苷酸之活性 . 活體外測試用寡核苷酸處理後之細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。在此表格中，100.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 表 126. 寡核苷酸之活性 . 活體外測試用寡核苷酸處理後之細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。在此表格中，100.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 表 127. 寡核苷酸之活性 . 活體外測試用寡核苷酸處理後之細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。在此表格中，100.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 表 129. 寡核苷酸之活性 . 活體外測試用寡核苷酸處理後之細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。在此表格中，100.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 表 130. 寡核苷酸之活性 . 活體外測試Huh7細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。展示PNPLA3 mRNA之剩餘含量，其中PNPLA3係相對於HPRT1。在此表格中，100.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 表 131. 寡核苷酸之活性 . 活體外測試Huh7細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。展示PNPLA3 mRNA之剩餘含量，其中PNPLA3係相對於HPRT1。在此表格中，100.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 表 132. 寡核苷酸之活性 . 活體外測試Huh7細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。展示PNPLA3 mRNA之剩餘含量，其中PNPLA3係相對於HPRT1。在此表格中，100.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 表 133 寡核苷酸之活性 . 測試Huh7細胞中之各種PNPLA3寡核苷酸。展示PNPLA3 mRNA之剩餘含量，其中PNPLA3係相對於HPRT1。在此表格中，100.00將表示100% PNPLA3 mRNA含量，且0.00將表示用寡核苷酸處理後之0% PNPLA3 mRNA。 亦活體外測試若干PNPLA3寡核苷酸之細胞介素釋放，包括WV-8061、WV-8291、WV-8698及WV-8700。4種PNPLA3 ssRNAi劑均不在供體樣品中之任一者中誘導細胞介素釋放(IL-1β、IL-6、MCP-1、IL-12p40、IL-12p70、IL-1α、MIP-1α、MIP-1β、TNFα)。相比之下，陽性對照即使在低濃度(0.78 μg/mL)下亦誘導細胞介素活化。實例 27 . 寡核苷酸之其他組分之實例 . 設計及構築各種寡核苷酸，其包含各種其他組分。本文中描述之各種其他PNPLA3寡核苷酸亦可與此等其他組分結合。 此等其他組分包括本文中所列之彼等組分： 三觸配體亦稱為三PFE ASPGR配體或三PFE配體或三PFE： 雙觸 ( 或二觸 ) 配體 ， 亦稱為雙 ( 或二 ) 觸 PFE 配體或雙 ( 或二 ) 觸 PFE ASPGR 配體或雙 PFE ： 單觸配體 ， 亦稱為單觸 PFE 配體或單觸 PFE ASPGR 配體或單 PFE ： 三觸GalNAc或三GalNAc：以下之受保護型式： 雙觸(二觸) GalNAc或雙GalNAc：單觸GalNAc或單GalNAc：此等結構表示受保護之型式，因為其包含-OAc (-O-乙酸酯基)。在一些實施例中，Ac基團在化合物結合至寡核苷酸之後的脫除保護基期間經去除。在一些實施例中，用濃縮氫氧化銨脫除保護基，例如如實例37B中所描述。在此等結構之經脫除保護基型式中，-OAc經-OH置換。 用於產生各種其他組分之製程之一些非限制性實例描述於下文中： 本文中描述之各種其他組分可與本文中描述之各種寡核苷酸結合。實例 28 . 實例分析方法 . 1.5分鐘操作LRMS(低解析度質譜)：Waters Acquity HSS T3，2.1 mm×50 mm，C18，1.7 µm；移動相：A：0.1%甲酸/水(v/v)；移動相B：0.1%甲酸/乙腈(v/v)；流量-1.25 ml/min；初始條件：A-95%:B-5%；自0.0至0.1 min維持於初始；經0.1-1.0 min線性勻變至A-5%:B-95%；自1.0至1.1 min維持於A-5%:B-95%；返回至初始條件1.1-1.5 min。 3.0分鐘操作LRMS(低解析度質譜)：Waters Acquity HSS T3，2.1 mm×50 mm，C18，1.7 µm；移動相：A：0.1%甲酸/水(v/v)；移動相B：0.1%甲酸/乙腈(v/v)；流量-1.25 ml/min；初始條件：A-95%:B-5%；自0.0至0.1 min維持於初始；經0.1-2.6 min線性勻變至A-5%:B-95%；自2.6至2.95 min維持於A-5%:B-95%；返回至初始條件2.95-3.0 min。5 , 9 , 16 , 22 - 四側氧基 - 11 , 11 - 雙 {[ 3 - 側氧基 - 3 -({ 3 -[( 5 -{[ 3 , 4 , 6 - 三 - O - 乙醯基 - 2 -( 乙醯胺基 )- 2 - 去氧 - β - D - 半乳哌喃糖基 ] 氧基 } 戊醯基 ) 胺基 ] 丙基 } 胺基 ) 丙氧基 ] 甲基 }- 26 -{[ 3 , 4 , 6 - 三 - O - 乙醯基 - 2 -( 乙醯胺基 )- 2 - 去氧 - β - D - 半乳哌喃糖基 ] 氧基 }- 13 - 氧雜 - 4 , 10 , 17 , 21 - 四氮二十六 - 1 - 基 磷酸 5 - 羧基戊酯 反應流程： 步驟 1 ： 6 - 羥基己酸酯 . 在70℃下加熱氫氧化鈉(9.02 g，226 mmol)及6-己內酯(25 mL，0.23 mmol)於水(401 mL)中之混合物隔夜。TLC顯示起始物質完全耗盡。在50℃下用旋轉式蒸發器小心地去除水，且使所得白色固體與甲苯共沸。在於高真空下乾燥隔夜之後，將固體懸浮於丙酮(100 mL)中，且添加四丁基溴化銨(3.64 g，11.3 mmol)及苯甲基溴(32.2 mL，271 mmol)。加熱回流反應混合物，直至TLC分析顯示中間產物甲酸完全耗盡為止(96 h)。真空去除溶劑且將殘餘物分配於鹽酸水溶液與乙酸乙酯之間。用乙酸乙酯(×2)萃取水層。用飽和碳酸氫鈉(×2)、鹽水洗滌合併之有機萃取物，經硫酸鎂乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠塞(20-70%乙酸乙酯/庚烷)純化粗殘餘物，得到呈無色油狀物之標題化合物(43.9 g，88%)。1 H NMR (600 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.40-7.30 (m, 5H), 5.12 (s, 2H), 3.63 (t, 2H), 2.38 (t, 2H), 1.73-1.65 (m, 2H), 1.62-1.53 (m, 2H), 1.44-1.35 (m, 2H), 1.28 (br.s., 1H)。步驟 2 ： 6 -((( 3 -(( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 ) 丙氧基 )( 2 - 氰基乙氧基 ) 磷醯基 ) 氧基 ) 己酸苯甲酯 . 在0℃下向2-氰基乙基-N,N-二異丙基胺基氯磷酸酯(20.3 g，67.5 mmol)於無水二氯甲烷(150 mL)中之溶液中緩慢添加0℃下之4,5-二氰基咪唑(1 M於乙腈中，31.5 mL，31.5 mmol)。隨後在0℃下於惰性氛圍下向混合物逐滴添加6-羥基己酸酯(10.0 g，45.0 mmol)。在0℃下攪拌混合物，直至TLC分析顯示起始物質耗盡為止(1 h)。用飽和碳酸氫鈉(80 mL)淬滅反應物。隨後分離兩相混合物且用二氯甲烷(2×60 mL)萃取水層。用鹽水洗滌合併之有機相，經無水硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮至乾燥，得到呈淡黃色油狀物之粗產物(23.0 g，＞100%)，其直接用於下一步驟。將此粗物質溶解於乙腈(50 mL)中，且歷時10 min逐滴添加至3-(Boc-胺基)-1-丙醇(10.0 g，57.2 mmol)及四唑(19.1 g，272 mmol)於無水乙腈(300 mL)中之溶液中。在環境溫度下攪拌所得無色溶液1.5 h。TLC顯示起始物質完全耗盡。隨後，將I2 (0.4 M於THF/H2 O/吡啶(78:20:2)中，90 mL，54.4 mmol)之溶液緩慢添加至以上反應混合物，且在添加結束時，棕色並未消散。在環境溫度下攪拌混合物，直至TLC分析顯示反應完全為止(1 h)。用飽和亞硫酸鈉淬滅混合物，且真空濃縮以去除有機溶劑。將剩餘混合物用水稀釋，且用乙酸乙酯(×2)萃取。用飽和氯化銨及鹽水洗滌合併之有機相，經無水硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠急驟層析(20-75乙酸乙酯/石油醚)純化粗物質，得到呈無色油狀物之標題化合物(10.0 g，三個步驟後為43%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.41-7.28 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 4.23 (ddd, 2H), 4.18-4.04 (m, 4H), 3.24 (q, 2H), 2.75 (ddd, 2H), 2.38 (t, 2H), 1.87 (dq, 2H), 1.76-1.64 (m, 4H), 1.43 (s, 9H), 1.31-1.20 (m, 2H)。步驟 3 ： ( 6 -( 苯甲氧基 )- 6 - 側氧基己基 ) 磷酸 3 - 銨基丙 酯 . 在0℃下向6-(((3-((第三丁氧基羰基)胺基)丙氧基)(2-氰基乙氧基)磷醯基)氧基)己酸苯甲酯(9.00 g，17.6 mmol)於無水1,4-二噁烷(36 mL)中之溶液中逐滴添加鹽酸(100 mL，400 mmol，4 M於二噁烷中)。在環境溫度下攪拌所得無色溶液1.5 h。濃縮混合物至乾燥，得到呈無色膠狀物之粗產物(7.90 g)，其直接用於下一步驟。向此粗物質於乙腈(72 mL)中之溶液中添加三乙胺(36 mL，0.26 mmol)。在25℃下攪拌所得白色懸浮液16 h。隨後濃縮混合物，且藉由矽膠急驟層析(5-50%甲醇/二氯甲烷，1%氫氧化銨)純化粗物質，得到呈白色固體狀之標題化合物(3.70 g，兩個步驟後為59%)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ ppm 7.41-7.27 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 3.95 (dt, 2H), 3.85 (q, 2H), 3.08 (t, 2H), 2.39 (t, 2H), 1.94 (dq, 2H), 1.78-1.56 (m, 4H), 1.51-1.34 (m, 2H)。C16 H27 NO6 P+ 之LCMS (m/z) (M+H)+ 360.1; 滯留時間 = 0.677 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 4 ： 26 -{[ 4 , 6 - 二 - O - 乙醯基 - 2 -( 乙醯胺基 )- 2 - 去氧 - β - D - 半乳哌喃糖基 ] 氧基 }- 5 , 9 , 16 , 22 - 四側氧基 - 11 , 11 - 雙 {[ 3 - 側氧基 - 3 -({ 3 -[( 5 -{[ 3 , 4 , 6 - 三 - O - 乙醯基 - 2 -( 乙醯胺基 )- 2 - 去氧 - β - D - 半乳哌喃糖基 ] 氧基 } 戊醯基 ) 胺基 ] 丙基 } 胺基 ) 丙氧基 ] 甲基 }- 13 - 氧雜 - 4 , 10 , 17 , 21 - 四氮二十六 - 1 - 基 磷酸 6 -( 苯甲氧基 )- 6 - 側氧基己酯 . 將N,N-二異丙基乙胺(305 mg，2.36 mmol，0.41 mL)及6-(苯甲氧基)-6-側氧基己基磷酸3-銨基丙酯(297 mg，0.825 mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(5 mL)中之溶液添加至18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮二十四烷-24-酸(1.50 g，0.790 mmol)於DMF (10 mL)中之溶液中。隨後在室溫下將六氟磷酸1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物(328 mg，0.065 mmol)添加至反應混合物。1 h後，用飽和氯化銨(30 mL)使反應物淬滅，且用二氯甲烷(4×30 mL)萃取。用鹽水洗滌合併之有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。粗產物不經進一步純化即向下一步推進。C98 H155 N11 O43 PNa2 2+ (M+2Na)2+ 之LCMS (m/z) 1125.5; 滯留時間= 0.71 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 5 ： 實例 29 . 將粗產物參苯甲酯26-{[4,6-二-O-乙醯基-2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖基]氧基}-5,9,16,22-四側氧基-11,11-雙{[3-側氧基-3-({3-[(5-{[3,4,6-三-O-乙醯基-2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖基]氧基}戊醯基)胺基]丙基}胺基)丙氧基]甲基}-13-氧雜-4,10,17,21-四氮二十六-1-基磷酸6-(苯甲氧基)-6-側氧基己酯(1.77 g，0.790 mmol)溶解於甲醇(0.05 M)中，且使用H-cube (10% Pd/C，流動速率1.0 mL/min，在完全H2 下，在60℃下)氫化。利索地獲得產物，且藉由製備型HPLC純化大塊材料[管柱：Phenomenex Gemini XB C18 150 mm×3.0 mm 5 μm。梯度條件：移動相A=0.1% 10 mM乙酸三乙銨pH7/水，移動相B=0.1% 10 mM乙酸三乙銨pH7/乙腈(22-100-22% B/A，27.0 mL/min)]。獲得呈白色固體狀之含有乙酸三乙銨(14當量，藉由1 H NMR積分)(475 mg)之大塊材料。產物之純度經計算為49 wt%，且產量經測定為233 mg (14%)1 H NMR (600 MHz, CD3 OD) δ 5.34 (d, 3H), 5.07 (dd, 3H), 4.57 (d, 3H), 4.22-4.05 (m, 9H), 4.02 (t, 3H), 3.94-3.81 (m, 7H), 3.72-3.63 (m, 12H), 3.54 (dt, 3H), 3.35 (s, 6H), 3.26-3.20 (m, 17H), 3.19 (q, 84H, 乙酸三乙銨), 2.43 (t, 6H), 2.30-2.17 (m, 13H), 2.14 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.93 (s, 9H), 1.93 (s, 42H, 乙酸三乙銨), 1.90-1.78 (m, 4H), 1.74-1.57 (m, 22H), 1.49-1.38 (m, 2H), 1.30 (t, 126H)。C93 H154 N11 O44 P2+ (M+2H)2+ 之LCMS (m/z) 1080.5; 滯留時間: 0.65 min (UPLC 1.5分鐘法).5 - 羧基戊基磷酸 18 -{[ 27 -({( 2R , 3R , 4R , 5R , 6R )- 3 -( 乙醯胺基 )- 4 , 5 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 -[( 乙醯氧基 ) 甲基 ] 四氫 - 2H - 哌喃 - 2 - 基 } 氧基 )- 12 , 12 - 雙 ({ 3 -[( 3 -{[ 5 -({( 2R , 3R , 4R , 5R , 6R )- 3 -( 乙醯胺基 )- 4 , 5 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 -[( 乙醯氧基 ) 甲基 ] 四氫 - 2H - 哌喃 - 2 - 基 } 氧基 ) 戊醯基 ] 胺基 } 丙基 ) 胺基 ]- 3 - 側氧基丙氧基 } 甲基 )- 6 , 10 , 17 , 23 - 四側氧基 - 14 - 氧雜 - 5 , 11 , 18 , 22 - 四氮二十七烷 - 1 - 醯基 ] 胺基 }- 43 - 羧基 - 18 -( 25 - 羧基 - 19 , 19 - 二氧離子基 - 5 - 側氧基 - 2 , 9 , 12 , 15 , 18 , 20 - 六氧雜 - 6 - 氮雜 - 19 - λ ~ 5 ~- 磷雜二十五 - 1 - 基 )- 37 , 37 - 二氧離子基 - 13 , 23 - 二側氧基 - 3 , 6 , 9 , 16 , 20 , 27 , 30 , 33 , 36 , 38 - 十氧雜 -12,24- 二氮雜 - 37 - λ ~ 5 ~- 磷雜四十三 - 1 - 基 酯 反應流程： 步驟 1 ： 6 -((( 2 -( 2 -( 2 -( 2 - 胺基乙氧基 ) 乙氧基 ) 乙氧基 ) 乙氧基 )( 2 - 氰基乙氧基 ) 磷醯基 ) 氧基 ) 己酸苯甲酯 . 此化合物係由(2-(2-(2-(2-羥基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)胺基甲酸第三丁酯(6.03 g，20.5 mmol)及2-氰基乙基-N,N-二異丙基胺基氯磷酸酯(6.87 mL，30.8 mmol)及6-羥基己酸酯(6.85 g，30.8 mmol)以與實例29步驟2相似之方式製備。在藉由矽膠急驟層析(50-100%乙酸乙酯/庚烷，隨後5%甲醇/乙酸乙酯)純化之後獲得呈黃色油狀物之標題化合物(8.64 g，三個步驟後為67%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.40-7.31 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 5.04 (s, 1H), 4.31-4.15 (m, 4H), 4.08 (q, 2H), 3.71 (ddd,2H), 3.69-3.58 (m, 8H), 3.53 (t, 2H), 3.31 (q, 2H), 2.77 (t, 2H), 2.37 (t, 2H), 1.76-1.63 (m, 4H), 1.44 (s, 9H), 1.48-1.36 (m, 2H)。C29 H47 N2 NaO11 P+ (M+Na)+ 之LCMS (m/z) 653.5;滯留時間= 0.93 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 2 ： 2 -( 2 -( 2 -( 2 -(((( 6 -( 苯甲氧基 )- 6 - 側氧基己基 ) 氧基 )( 2 - 氰基乙氧基 ) 磷醯基 ) 氧基 ) 乙氧基 ) 乙氧基 ) 乙氧基 ) 乙 - 1 - 氯化銨 . 在0℃下向6-(((2-(2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)(2-氰基乙氧基)磷醯基)氧基)己酸苯甲酯(8.64 g，14.1 mmol)於1,4-二噁烷(33 mL)中之溶液中添加鹽酸溶液(4 M於1,4-二噁烷中，87 mL，348 mmol)。在環境溫度下攪拌所得混合物1 h。真空去除溶劑以產生8.76 g (＞100%)呈黃色油狀物之標題化合物。粗產物不經進一步純化即使用。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ ppm 7.45-7.26 (m, 5H), 5.12 (s, 2H), 4.29-4.19 (m, 4H), 4.12 (q, 2H), 3.79-3.69 (m, 4H), 3.67 (m, 8H), 3.13 (t, 2H), 2.88 (ddd, 2H), 2.41 (t, 2H), 1.81-1.59 (m, 4H), 1.51-1.37 (m, 2H)。C24 H40 N2 O9 P+ 之LCMS (m/z) (M+H)+ 531.5; 滯留時間= 0.70 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 3 ： 4 -[( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 ] 丁酸五氟苯酯 . 在環境溫度下向4-(第三丁氧羰基胺基)丁酸(12.0 g，59.0 mmol)於二氯甲烷中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(20.6 mL，118 mmol)，之後在0℃下添加三氟乙酸五氟苯酯(12.2 mL，70.9 mmol)。將反應混合物升溫至環境溫度且攪拌17 h。隨後濃縮反應混合物。藉由矽膠急驟層析(10-60%乙酸乙酯/庚烷)純化粗物質，得到呈白色固體狀之標題化合物(19.1 g，88%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 4.65 (s, 1H), 3.25 (q, 2H), 2.72 (t, 2H), 1.96 (p, 2H), 1.45 (s, 9H)。C15 H16 F5 NNaO4 + (M+Na)+ 之LCMS (m/z) 392.3; 滯留時間 = 1.01 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 4 ： 11 , 11 - 雙 [( 3 - 第三丁氧基 - 3 - 側氧基丙氧基 ) 甲基 ]- 2 , 2 - 二甲基 - 4 , 9 - 二側氧基 - 3 , 13 - 二氧雜 - 5 , 10 - 二氮十六烷 - 16 - 酸第三丁酯 . 將N,N-二異丙基乙胺(13.0 g，101 mmol，17.6 mL)添加至4-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸五氟苯酯(9.68 g，26.2 mmol)於THF (25 mL)中之溶液中。隨後以緩慢流呈於THF (50 mL)中之溶液形式將3-{2-胺基-3-(3-第三丁氧基-3-側氧基丙氧基)-2-[(3-第三丁氧基-3-側氧基丙氧基)甲基]丙氧基}丙酸第三丁酯1 1 本化合物係根據已報導文獻的步驟製備：Cardonna, C. M.; Gawley, R. E.J. Org. Chem. 2002 ,67 , 1411. (10.2 g，20.2 mmol)添加至反應物，且在50℃下攪拌反應物78 h。濃縮反應物，藉由矽膠層析(0-20%甲醇/二氯甲烷及第二次之0-100%乙酸乙酯/庚烷)純化兩次，得到呈無色油狀物之標題化合物(13.3 g，95%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 6.27-6.13 (m, 1H), 5.02-4.84 (m, 1H), 3.70 (s, 6H), 3.64 (t, 6H), 3.16 (q, 2H), 2.45 (t, 6H), 2.20 (t, 2H), 1.78 (quin, 2H), 1.45 (s, 36H)。步驟 5 ： 11 , 11 - 雙 [( 2 - 羧基乙氧基 ) 甲基 ]- 2 , 2 - 二甲基 - 4 , 9 - 二側氧基 - 3 , 13 - 二氧雜 - 5 , 10 - 二氮十六烷 - 16 - 酸 . 將三氟乙酸(46 g，0.40 mol，30 mL)添加至11,11-雙[(3-第三丁氧基-3-側氧基丙氧基)甲基]-2,2-二甲基-4,9-二側氧基-3,13-二氧雜-5,10-二氮十六烷-16-酸第三丁酯(13.3 g，19.2 mmol)於二氯甲烷(100 mL)中之溶液中，且在室溫下攪拌所得溶液。在20 h後，濃縮反應混合物。隨後將所得殘餘物懸浮於四氫呋喃(30 mL)及飽和碳酸氫鈉水溶液(160mL)之混合物中，向其添加二-二碳酸第三丁酯(12.6 g，57.7 mmol)。將所得懸浮液加熱至40℃。將二-二碳酸第三丁酯之兩份額外等分試樣(各3.70 g，17.0 mmol)添加至反應混合物，一份在30 min處加入，第二份在90 min處加入，且在40℃下攪拌反應物。20 h後，用乙酸乙酯洗滌反應混合物一次，且捨棄洗液。用1 N鹽酸將水層之pH調節至pH=3。隨後用乙酸乙酯(×2)萃取水層，且經合併之萃取物經硫酸鎂乾燥、過濾及濃縮，得到呈無色油狀物之標題化合物，其不經純化即用於後續步驟。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ ppm 4.45-4.30 (m, 12H), 3.70 (q, 2H), 3.23 (t, 6H), 2.84 (t, 2H), 2.34 (quin, 2H), 2.18 (s, 9H)。步驟 6 ： 3 -( 2 -[( 4 - 胺基丁醯基 ) 胺基 ]- 3 -[ 3 - 側氧基 - 3 -( 五氟苯氧基 ) 丙氧基 ]- 2 -{[ 3 - 側氧基 - 3 -( 五氟苯氧基 ) 丙氧基 ] 甲基 } 丙氧基 ) 丙酸五氟苯酯 . 將N,N-二異丙基乙胺(17.0 g，132 mmol，23.0 mL)添加至11,11-雙[(2-羧基乙氧基)甲基]-2,2-二甲基-4,9-二側氧基-3,13-二氧雜-5,10-二氮十六烷-16-酸(7.49 g，13.0 mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(100 mL)之溶液中。隨後歷時15 min將三氟乙酸五氟苯酯(20.4 g，72.7 mmol，12.5 mL)逐滴添加至反應混合物，得到淺粉色溶液，其隨時間推移變為黃色。1 h後，用飽和碳酸氫鈉淬滅反應物。用乙酸乙酯(×2)萃取所得混合物。用鹽水洗滌合併之有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾，且濃縮。藉由矽膠層析(0-80%乙酸乙酯/庚烷)純化所得殘餘物，得到呈無色油狀物之標題化合物(8.76 g，2個步驟之後為63%)。1 H NMR (400 MHz, (CD3 )2 SO) δ ppm 7.10 (s, 1H), 6.73 (t, 1H), 3.70 (t, 6H), 3.64 (s, 6H), 2.98 (t, 6H), 2.87 (q, 2H), 2.03 (t, 2H), 1.53 (quin, 2H), 1.36 (s, 9H)。步驟 7 ： 27 -({ 4 -[( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 ] 丁醯基 } 胺基 )- 8 , 46 - 雙 ( 2 - 氰基乙氧基 )- 27 -[ 19 -( 2 - 氰基乙氧基 )- 19 - 氧離子基 - 5 , 26 - 二側氧基 - 28 - 苯基 - 2 , 9 , 12 , 15 , 18 , 20 , 27 - 七側氧基 - 6 - 氮雜 - 19 - λ ~ 5 ~- 磷雜二十八 - 1 - 基 ]- 22 , 32 - 二側氧基 - 7 , 9 , 12 , 15 , 18 , 25 , 29 , 36 , 39 , 42 , 45 , 47 - 十二氧雜 - 21 , 33 - 二氮雜 - 8 , 46 - 二磷雜五十三烷 - 1 , 53 - 二酸二苯甲酯 8 , 46 - 二氧化物 . 使兩種起始物質與甲苯共沸兩次，且在使用之前置放於高真空下隔夜。向3-(2-[(4-胺基丁醯基)胺基]-3-[3-側氧基-3-(五氟苯氧基)丙氧基]-2-{[3-側氧基-3-(五氟苯氧基)丙氧基]甲基}丙氧基)丙酸五氟苯酯(3.97 g，3.89 mmol)於二氯甲烷(15 mL)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(6.8 mL，39 mmol)。隨後在0℃下添加2-(2-(2-(2-((((6-(苯甲氧基)-6-側氧基己基)氧基)(2-氰基乙氧基)磷醯基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-氯化銨(8.76 g粗產物，14.0 mmol)於二氯甲烷(25 mL)中之溶液。使反應混合物升溫至環境溫度且攪拌直至TLC分析顯示起始物質耗盡為止(15 h)。真空去除溶劑，且將殘餘物再溶解於乙酸乙酯中。用水、用飽和碳酸氫鈉且隨後再用水洗滌溶液，且用乙酸乙酯萃取合併之水層一次。合併之有機萃取物經硫酸鎂乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠急驟層析(0-22%甲醇/二氯甲烷)純化粗物質，得到呈無色膠狀物之標題化合物(3.23 g，40%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.38-7.30 (m, 15H), 6.71 (s, 3H), 6.52 (s, 1H), 5.19 (t, 1H), 5.11 (s, 6H), 4.32-4.14 (m, 12H), 4.08 (q, 6H), 3.76-3.60 (m, 42H), 3.55 (t, 6H), 3.43 (q, 6H), 3.14 (dd, 2H), 2.77 (t, 6H), 2.42 (t, 6H), 2.38 (t, 6H), 2.23 (t, 2H), 1.79-1.64 (m, 14H), 1.46-1.38 (m, 15H)。C94 H151 F5 N8 O36 P3 2+ (M+2H)2+ 之LCMS (m/z) 1031.0; 滯留時間= 1.00 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 8 ： 磷酸 29 -[( 4 - 銨基丁醯基 ) 胺基 ]- 29 -( 19 , 19 - 二氧離子基 - 5 , 26 - 二側氧基 - 28 - 苯基 - 2 , 9 , 12 , 15 , 18 , 20 , 27 - 七側氧基 - 6 - 氮雜 - 19 - λ ~ 5 ~- 磷雜二十八 - 1 - 基 )- 10 , 10 - 二氧離子基 - 3 , 24 , 34 - 三側氧基 - 1 - 苯基 - 2 , 9 , 11 , 14 , 17 , 20 , 27 , 31 , 38 , 41 , 44 - 十一側氧基 - 23 , 35 - 二氮雜 - 10 - λ ~ 5 ~- 磷雜四十六烷 - 46 - 基 6 -( 苯甲氧基 )- 6 - 側氧基己酯 . 在0℃下向27-({4-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁醯基}胺基)-8,46-雙(2-氰基乙氧基)-27-[19-(2-氰基乙氧基)-19-氧離子基-5,26-二側氧基-28-苯基--2,9,12,15,18,20,27-七側氧基-6-氮雜-19-λ~5~-磷雜二十八-1-基]-22,32-二側氧基-7,9,12,15,18,25,29,36,39,42,45,47-十二氧雜-21,33-二氮雜-8,46-二磷雜五十三烷-1,53-二酸二苯甲酯8,46-二氧化物(3.22 g，1.56 mmol)於1,4-二噁烷(18 mL)中之溶液中添加鹽酸溶液(4 M於1,4-二噁烷中，16mL，63 mmol)。在環境溫度下攪拌所得混合物1 h。隨後去除溶劑以得到油狀殘餘物。將此粗產物懸浮於乙腈(18 mL)中，且添加三乙胺(12 mL，86 mmol)。在環境溫度下攪拌反應混合物40 h，且隨後真空濃縮。藉由逆相HPLC使用Phenomenex NX-C18管柱(5-100%乙腈/水，含有0.1%氫氧化鈉)純化粗物質，且凍乾以得到呈無色油狀物之標題化合物(1.33 g，兩個步驟之後為47%)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ ppm 7.41-7.27 (m, 15H), 5.11 (s, 6H), 4.03-3.92 (m, 6H), 3.85 (q,6H), 3.71-3.58 (m, 42H), 3.55 (t, 6H), 3.38 (t, 6H), 2.99 (t, 2H), 2.44 (t, 6H), 2.42-2.29 (m, 8H), 1.92 (p, 2H), 1.72-1.57 (m, 12H), 1.48-1.37 (m, 6H)。C80 H134 N5 O34 P3 2+ (M+2H)2+ 之LCMS (m/z) 901.5; 滯留時間= 0.77 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 9 ： 磷酸 29 -{[ 27 -({( 2R , 3R , 4R , 5R , 6R )- 3 -( 乙醯胺基 )- 4 , 5 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 -[( 乙醯氧基 ) 甲基 ] 四氫 - 2H - 哌喃 - 2 - 基 } 氧基 )- 12 , 12 - 雙 ({ 3 -[( 3 -{[ 5 -({( 2R , 3R , 4R , 5R , 6R )- 3 -( 乙醯胺基 )- 4 , 5 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 -[( 乙醯氧基 ) 甲基 ] 四氫 - 2H - 哌喃 - 2 - 基 } 氧基 ) 戊醯基 ] 胺基 } 丙基 ) 胺基 ]- 3 - 側氧基丙氧基 } 甲基 )- 6 , 10 , 17 , 23 - 四側氧基 - 14 - 氧雜 - 5 , 11 , 18 , 22 - 四氮雜二十七烷 - 1 - 醯基 ] 胺基 }- 29 -( 19 , 19 - 二氧離子基 - 5 , 26 - 二側氧基 - 28 - 苯基 - 2 , 9 , 12 , 15 , 18 , 20 , 27 - 七側氧基 - 6 - 氮雜 - 19 - λ ~ 5 ~- 磷雜二十八 - 1 - 基 )- 10 , 10 - 二氧離子基 - 3 , 24 , 34 - 三側氧基 - 1 - 苯基 -- 2 , 9 , 11 , 14 , 17 , 20 , 27 , 31 , 38 , 41 , 44 - 十一側氧基 - 23 , 35 - 二氮雜 - 10 - λ ~ 5 ~- 磷雜四十六烷 - 46 - 基 6 -( 苯甲氧基 )- 6 - 側氧基己酯 . 使兩種起始物質與甲苯共沸三次，且在使用之前置放於高真空下隔夜。向胺磷酸29-[(4-銨基丁醯基)胺基]-29-(19,19-二氧離子基-5,26-二側氧基-28-苯基-2,9,12,15,18,20,27-七側氧基-6-氮雜-19-λ~5~-磷雜二十八-1-基)-10,10-二氧離子基-3,24,34-三側氧基-1-苯基-2,9,11,14,17,20,27,31,38,41,44-十一側氧基-23,35-二氮雜-10-λ~5~-磷雜四十六烷-46-基6-(苯甲氧基)-6-側氧基己酯(270 mg，0.147 mmol)於無水二甲基甲醯胺(0.5 mL)中之溶液中添加含18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮二十四烷-24-酸(337 mg，0.177 mmol)之二甲基甲醯胺(1.5 mL)、N,N-二異丙基乙胺(0.21 mL，1.18 mmol)且隨後添加丙基膦酸酐溶液(50 wt%於乙酸乙酯中，0.26 mL，0.44 mmol)。在50℃下攪拌反應混合物17 h。在冷卻至環境溫度後，添加水且用85:15之CH2 Cl2 :i - PrOH (100 mL×3)萃取混合物。有機萃取物經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮。藉由逆相HPLC使用Phenomenex NX-C18管柱(35-100乙腈/水，含有10 mM乙酸三乙銨)純化粗物質且凍乾以得到202 mg含有乙酸三乙銨之所需產物(12.3當量，基於1 H NMR積分)。此產物之純度經計算為66 wt%，且產量經測定為133 mg (24%)。此物質不經進一步純化即用於下一步驟。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ ppm 7.43-7.24 (m, 15H), 5.33 (d, 3H), 5.11 (s, 6H), 5.07 (dd, 3H), 4.57 (d, 3H), 4.22-3.80 (m, 25H), 3.75-3.57 (m, 59H), 3.57-3.47 (m, 12H), 3.41-3.34 (m, 12H), 3.20 (q, 74H, 乙酸三乙銨), 2.48-2.35 (m, 18H), 2.27-2.17 (m, 12H), 2.14 (s, 9H), 2.02 (s, 9H), 1.96, (s, 111H, 乙酸三乙銨) 1.95 (s, 9H), 1.93 (s, 9H), 1.77-1.54 (m, 33H), 1.44 (m 9H), 1.31 (t, 111H,乙酸三乙銨)。 C164 H266 N15 O72 P3 2+ (M+2H)2+ 之LCMS (m/z) 1845.8;滯留時間 = 1.07 min (UPLC 3分鐘法)。步驟 10 ： 實例 30 . 在25℃下於氫氣壓力(50 psi)下攪拌磷酸29-{[27-({(2R,3R,4R,5R,6R)-3-(乙醯胺基)-4,5-雙(乙醯氧基)-6-[(乙醯氧基)甲基]四氫-2H-哌喃-2-基}氧基)-12,12-雙({3-[(3-{[5-({(2R,3R,4R,5R,6R)-3-(乙醯胺基)-4,5-雙(乙醯氧基)-6-[(乙醯氧基)甲基]四氫-2H-哌喃-2-基}氧基)戊醯基]胺基}丙基)胺基]-3-側氧基丙氧基}甲基)-6,10,17,23-四側氧基-14-氧雜-5,11,18,22-四氮二十七烷-1-醯基]胺基}-29-(19,19-二氧離子基-5,26-二側氧基-28-苯基-2, 9,12,15,18,20,27-七側氧基-6-氮雜-19-λ~5~-磷雜二十八-1-基)-10,10-二氧離子基-3,24,34-三側氧基-1-苯基-2,9,11,14,17,20,27,31,38,41,44-十一側氧基-23,35-二氮雜-10- λ ~5~-磷雜四十六烷-46-基6-(苯甲氧基)-6-側氧基己酯(200 mg，0.0330 mmol，66 wt%)及10%鈀/碳(7.0 mg，0.0066 mmol)於甲醇(2 mL)中之混合物20 h。經由0.45 μm耐綸Acrodisc過濾器過濾催化劑，且用甲醇(40 mL)洗滌。隨後濃縮濾液且將所得油狀物溶解於乙腈及水之1:1混合物(22 mL)中，藉由鹽酸(1 N)調節至pH 5.70。凍乾溶液隔夜，得到呈吸濕性白色固體形式之標題化合物(13當量鹽酸三乙胺)(110 mg，59%)。1 H NMR (600 MHz, CD3 OD) δ ppm 5.34 (d, 3H), 5.07 (dd, 3H), 4.57 (d, 3H), 4.20-3.91 (m, 14H), 3.93-3.84 (m, 9H), 3.75-3.62 (m, 63H), 3.60-3.50 (m, 10H), 3.43-3.35 (m, 8H), 3.27-3.14 (m, 80H,鹽酸三乙胺), 3.12-2.90 (m, 2H), 2.57-2.38 (m, 12H), 2.30-2.20 (m, 18H), 2.14 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.95-1.94 (m, 18H), 1.89-1.83 (m, 1H), 1.73-1.55 (m, 34H), 1.46-1.40 (m, 9H), 1.31 (t, 120H, 鹽酸三乙胺)。C143 H249 N15 O72 P3 3+ (M+3H)3+ 之 LCMS (m/z) 1141.2; 滯留時間= 1.06 min (UPLC 3分鐘法)。1 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 18 , 18 - 雙 17 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 5 , 11 - 二側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 6 , 10 - 二氮十七 - 1 - 基 }- 7 , 13 , 20 - 三側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 8 , 12 , 19 - 三氮三十一烷 - 31 - 酸 合成流程： 步驟 1 ： 5 - 碘戊酸第三丁酯 . 向5-溴戊酸第三丁酯(60.0 g，250 mmol)於丙酮(400 mL)中之溶液中添加碘化鈉(94.8 g，633 mmol)。在57℃下攪拌反應混合物4 h，冷卻至室溫，過濾且用二氯甲烷洗滌。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，將其溶解於二氯甲烷，用飽和碳酸氫鈉(200 mL)及鹽水(100 mL)洗滌。分離有機相經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮，得到呈黃色油狀物之標題化合物(69.3 g，100%)。1 H NMR (600 MHz, CDCl3 ) δ ppm 3.20 (t, 2H), 2.25 (t, 2H), 1.86 (p, 2H), 1.70 (p, 2H), 1.45 (s, 9H)。步驟 2 ： 5 -{[( 1S , 2R , 6R , 7R , 8S )- 7 -( 乙醯胺基 )- 4 , 4 - 二甲基 - 3 , 5 , 9 , 11 - 四氧雜三環 [ 6 . 2 . 1 . 0 ~ 2 , 6 ~] 十一 - 1 - 基 ] 甲氧基 } 戊酸 第三丁 酯 . 向5-碘戊酸第三丁酯(59 g，0.21 mol)及N-((3aR,4S,7S,8R,8aR)-4-(羥基甲基)-2,2-二甲基六氫-4,7-環氧樹脂[1,3]二氧雜環戊并[4,5-d]氧呯-8-基)乙醯胺(20 g，69 mmol)於二氯甲烷(210 mL)中之溶液中添加硫酸氫四丁銨(35.3 g，104 mmol)，之後在冰浴中添加12.5 M氫氧化鈉溶液(160 mL)。在室溫下攪拌反應混合物24 h。將反應混合物分配於二氯甲烷(200 mL)與水(200 mL)之間。藉由1 N鹽酸(300 mL)洗滌經分離有機相，經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。在環境溫度下於二乙醚(500 mL)中濕磨粗產物30 min。藉由過濾去除所得固體且藉由二乙醚(100 mL)沖洗濾餅。濃縮濾液，且真空乾燥隔夜，得到呈黃色油狀物之標題化合物之粗產物(50.9 g，45.5 wt%純，藉由用1,3,5-三甲氧基苯作為內部標準物之qNMR測定)，其不經純化即用於下一步驟。C21 H36 NO8 + 之LCMS (m/z) (M+H)+ 430.3;滯留時間 = 0.88 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 3 ： 5 -{[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ] 甲氧基 } 戊酸第三丁酯 . 歷時5 min經由加料漏斗向粗產物5-{[(1S,2R,6R,7R,8S)-7-(乙醯胺基)-4,4-二甲基-3,5,9,11-四氧雜三環[6.2.1.0~2,6~]十一-1-基]甲氧基}戊酸第三丁酯(50.9 g，45.5 wt%，53.9 mmol)於四氫呋喃(105 mL)中之冰冷溶液中添加濃鹽酸(16 mL)於水(49 mL)中之溶液。在室溫下於氮氣下攪拌反應溶液6 h。用2-甲基-四氫呋喃(300 mL)稀釋反應混合物且用鹽水(100 mL)洗滌。用二氯甲烷(300 mL)萃取水相。藉由飽和碳酸氫鈉(75 mL)及鹽水(75 mL)之混合物洗滌各經分離有機相，隨後用鹽水(120 mL)洗滌。將有機相合併，經硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮，且藉由庚烷(100 mL)繼之以甲基-第三丁基-醚(100 mL)共沸。在室溫下於甲基-第三丁基-醚(200 mL)中濕磨所得粗產物15 min。藉由過濾收集所得沈澱物，用甲基-第三丁基-醚(200 mL)沖洗，且真空乾燥，得到呈白色固體狀之標題化合物(17.9 g，2個步驟後為66%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 5.79 (d, 1H), 5.36 (d, 1H), 4.07-3.88 (m, 4H), 3.79-3.62 (m, 4H), 3.60-3.46 (m, 2H), 3.37 (d, 1H), 2.30-2.19 (m, 2H), 2.07 (s, 3H), 1.75-1.51 (m, 4H), 1.45 (s, 9H)。C18 H32 NO8 + 之LCMS (m/z) (M+H)+ 390.5;滯留時間 = 0.70 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 4 ： 5 -{[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ] 甲氧基 } 戊酸第三丁酯 . 將乙酸酐(18.7 g，183 mmol)逐滴添加至5-{[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]甲氧基}戊酸第三丁酯(18.6 g，49.7 mmol)及吡啶(14.0 g，183 mmol)以及二甲胺基吡啶(1.12 g，9.16 mmol)於二氯甲烷(150 mL)中之冰冷溶液中。在室溫下攪拌混合物2.5 h。藉由鹽酸(1 N，150 mL)淬滅反應混合物，且用二氯甲烷(200 mL)萃取。用鹽酸(1 N，150 mL)、飽和碳酸氫鈉(150 mL)洗滌有機相，經硫酸鈉乾燥，濃縮，且使粗產物與庚烷(4×100 mL)共沸，藉由矽膠塞(210 g矽膠，100%庚烷(1 L)、隨後25%乙酸乙酯/庚烷(2 L)繼之以100%乙酸乙酯(2 L))將其純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(21.2 g，98%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 5.65 (d, 1H), 5.41-5.39 (m, 2H), 5.09 (dd, 1H), 4.34 (t, 1H), 3.93 (d, 1H), 3.75 (d, 1H), 3.65 (d, 1H), 3.50 (d, 1H), 3.45 (td, 1H), 3. 38 (td, 1H), 2.21 (t, 2H), 2.17 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.64-1.52 (m, 4H), 1.44 (s, 9H)。 C22 H35 NNaO10 + (M+Na)+ 之LCMS (m/z) 496.1; 滯留時間= 0.85 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 5 ： 5 -{[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ] 甲氧基 } 戊酸 .向放置在冰浴中的5-{[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-雙(乙醯氧基)-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]甲氧基}戊酸第三丁酯(21.1 g，44.6 mmol)於二氯甲烷(110 mL)中之溶液中添加鹽酸(11g，0.31 mol，78 mL，4.0 M於1,4-二噁烷中)。去除冷卻浴且在環境溫度下於氮氣下攪拌反應物4 h。濃縮反應混合物，使其與二乙醚(200 mL)、乙酸乙酯(200 mL)及庚烷(3×200 mL)共沸，且最後藉由真空乾燥隔夜，得到呈白色固體狀之標題化合物(18.6 g，定量)。1 H NMR (400 MHz, CD3 CN) δ ppm 8.84 (br.s., 1H), 6.50 (d, 1H), 5.35 (d, 1H), 5.30 (d, 1H), 5.00 (dd, 1H), 4.17-4.07 (m, 1H), 3.93 (d, 1H), 3.78-3.56 (m, 2H), 3.52 (d, 1H), 3.49-3.34 (m, 2H), 2.26 (t, 2H), 2.12 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.85 (s, 3H), 1.60-1.47 (m, 4H)。C18 H28 NO10 + 之LCMS (m/z) (M+H)+ 418.0; 滯留時間= 0.60 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 6 ： 1 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 18 , 18 - 雙 { 17 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 5 , 11 - 二側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 6 , 10 - 二氮十七 - 1 - 基 }- 7 , 13 , 20 - 三側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 8 , 12 , 19 - 三氮三十一烷 - 31 - 酸苯甲酯 . 向5-{[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-雙(乙醯氧基)-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]甲氧基}戊酸(1.53 g，3.63 mmol)於乙腈(6 mL)中之溶液中添加1,1'-羰基二咪唑(0.580 g，3.56 mmol)且在室溫下攪拌反應混合物。3 h後，將12-((1,19-二胺-10-((3-((3-胺基丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,15-二側氧基-8,12-二氧雜-4,16-二氮十九烷-10-基)胺基)-12-側氧基十二烷酸酸苯甲酯參三氟乙酸鹽(1.58 g，1.03 mmol，75.4 wt%)添加至呈於乙腈(6 mL)中之溶液形式的反應混合物，之後添加N,N-二異丙基乙胺(0.540 g，4.14 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌隔夜。濃縮反應混合物，藉由二氯甲烷(70 mL)稀釋，藉由鹽酸(1 N，30 mL)、鹽水(30 mL)及飽和碳酸氫鈉(30 mL)洗滌。有機相經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠塞(20 g矽膠，用二氯甲烷(100 mL)、10%甲醇/二氯甲烷(200 mL)繼之以25%甲醇/二氯甲烷(200 mL)溶離)純化所得殘餘物，得到呈白色玻璃狀之標題化合物(2.25 g，定量產率)。1 H NMR (600 MHz, CD3 OD) δ ppm δ 7.73-7.30 (m, 5H), 5.44 (d, 3H), 5.32 (s, 3H), 5.12-5.09 (m, 5H), 4.18 (d, 3H), 4.00 (d, 3H), 3.71 (dd, 6H), 3.68-3.67 (m, 12H), 3.51-3.45 (m, 6H), 3.41-3.38 (m, 3H), 3.21 (q, 12H), 2.42 (t, 6H), 2.35 (t, 2H), 2.22-2.17 (m, 6H), 2.16 (s, 9H), 1.94 (s, 18H), 1.72-1.58 (m, 16H), 1.58-1.42 (m, 8H), 1.38-1.29 (m, 12 H)。C95 H150 N10 O36 2+ (M+2H)2+ 之LCMS (m/z) 1004.7; 滯留時間 = 0.86 min (UPLC 3分鐘法)步驟 7 ： 實例 31 . 在25℃下於氫氣壓力(50 psi)下在攪拌Parr反應器中攪拌1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-雙(乙醯氧基)-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]-18,18-雙{17-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-雙(乙醯氧基)-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七-1-基}-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮三十一烷-31-酸苯甲酯(2.36 g，1.18 mmol)及10%鈀/碳(0.376 mg)於甲醇(14mL)中之混合物4.5 h。經由矽藻土過濾反應混合物以去除催化劑。用甲醇(20 mL)洗滌矽藻土，且濃縮合併之濾液並使其與甲基第三丁基醚(3×20 mL)共沸。於甲基第三丁基醚(20 mL)中濕磨粗產物隔夜。藉由過濾收集所得白色固體，真空乾燥，得到呈白色固體狀之標題化合物(2.14 g，95%)。1 H NMR (600 MHz, CD3 OD) δ ppm 5.45 (d, 3H), 5.32 (s, 3H), 5.11 (dd, 3H), 4.18 (d, 3H), 4.01 (d, 3H), 3.72 (dd, 6H), 3.70-3.64 (m, 12H), 3.52-3.47(m, 6H), 3.42-3.39 (m, 3H), 3.22 (q, 12H), 2.42 (t, 6H), 2.28 (t, 2H), 2.19 (t, 6H) 2.16 (s, 9H) 1.95 (s, 18H) 1.73-1.50 (m, 24H) 1.38-1.29 (m, 12H)。 C88 H143 N10 O36 + 之LCMS (m/z) 1916.2(M+H)+ ;滯留時間= 1.35 min (UPLC 3分鐘法)。1 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 18 -{ 17 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 5 , 11 - 二側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 6 , 10 - 二氮十七 - 1 - 基 }- 7 , 13 , 20 - 三側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 8 , 12 , 19 - 三氮三十一烷 - 31 - 酸 反應流程： 步驟 1 ： 3 , 3 '-[( 2 - 胺基丙烷 - 1 , 3 - 二基 ) 雙 ( 氧基 )] 二丙酸二第三丁酯 . 在‑5℃下歷時1小時將2-丙烯酸1,1-二甲基乙酯(1.44 kg，11.3 mol)逐滴添加至2-胺基-1,3-丙二醇(500 g，5.49 mol)於二甲基甲醯胺(1.5 L)中之攪拌懸浮液中。隨後使反應混合物升溫至25℃且在此溫度下持續攪拌，直至TLC分析顯示起始物質耗盡為止(16 h)。用水(3 L)稀釋反應混合物，且用乙酸乙酯(5 L×1，2.5 L×2)萃取混合物。合併之有機層經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮，得到殘餘物(1.30 kg)。藉由管柱層析(5%乙酸乙酯/石油醚，隨後10%甲醇/二氯甲烷)純化粗產物，得到呈黃色油狀物之標題化合物(600 g，31%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 3.69-3.60 (m, 4H), 3.45-3.37 (m, 2H), 3.29 (dd, 2H), 3.18-3.00 (m, 1H), 2.44 (t, 4H), 1.42 (s, 18H)。步驟 2 ： 12 - 側氧基 - 12 -[( 2 , 2 , 16 , 16 - 四甲基 - 4 , 14 - 二側氧基 - 3 , 7 , 11 , 15 - 四氧雜十七烷 - 9 - 基 ) 胺基 ] 十二烷酸甲酯 . 分2個批次同時進行此反應。在20℃下將1,12-十二烷二酸單甲酯(128 g，0.524 mmol)、羥基苯并三唑(70.7 g，0.524 mmol)、二異丙基乙胺(271 g，2.10 mol)及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(201 g，1.05 mol)添加至3,3'-[(2-胺基丙烷-1,3-二基)雙(氧基)]二丙酸二第三丁酯(182 g，0.524 mol)於二氯甲烷(1.6 L)中之攪拌溶液中，且在室溫下攪拌反應物，直至TLC分析顯示起始物質耗盡為止(12 h)。合併此反應混合物之兩個批次，用水(2 L)稀釋且在室溫下攪拌10分鐘。將有機層分離，經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(20-50%乙酸乙酯/石油醚)純化所得粗殘餘物，得到呈淡黃色油狀物之標題化合物(500 g，83%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 6.21 (d, 1H), 4.14-4.03 (m, 1H), 3.68-3.54 (m, 7H), 3.49 (dd, 2H), 3.32 (dd, 2H), 2.49-2.30 (m, 4H), 2.21 (t, 2H), 2.10 (t, 2H), 1.53 (br.s., 4H), 1.37 (s, 18H), 1.09 - 1.27 (m, 12 H)步驟 3 ： 3 , 3 '-[{ 2 -[( 12 - 甲氧基 - 12 - 側氧基十二醯基 ) 胺基 ] 丙烷 - 1 , 3 - 二基 } 雙 ( 氧基 ))] 二丙酸 . 在30℃至35℃下攪拌12-側氧基-12-[(2,2,16,16-四甲基-4,14-二側氧基-3,7,11,15-四氧雜十七烷-9-基)胺基]十二烷酸甲酯(546 g，0.950 mol)於甲酸(2.5 L)之溶液，直至TLC分析顯示起始物質耗盡為止(18 h)。濃縮混合物，得到粗殘餘物，將其在20℃下於石油醚/乙酸乙酯(10:1，1.5 L)濕磨12 h。過濾所得漿液，且真空乾燥濾餅，得到呈白色固體狀之標題化合物(370 g，84%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 10.02 (br.s., 2H), 6.33 (d, 1H), 4.27-4.16 (m, 1H), 3.73 (t, 4H), 3.66 (s, 3H), 3.59 (dd, 2H), 3.45 (dd, 2H), 2.59 (t, 4H), 2.30 (t, 2H), 2.20 (t, 2H), 1.66-1.53 (m, 4H), 1.26 (br.s., 12H)。步驟 4 ： 15 -( 13 , 13 - 二甲基 - 5 , 11 - 二側氧基 - 2 , 12 - 二氧雜 - 6 , 10 - 二氮十四 - 1 - 基 )- 2 , 2 - 二甲基 - 4 , 10 , 17 - 三側氧基 - 3 , 13 - 二氧雜 - 5 , 9 , 16 - 三氮二十八烷 - 28 - 酸甲酯 . 在0℃至5℃下將1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(348 g，1.82 mol)、羥基苯并三唑(205 g，1.52 mol)及二異丙基乙胺(470 g，3.64 mol)添加至3,3'-[{2-[(12-甲氧基-12-側氧基十二醯基)胺基]丙烷-1,3-二基}雙(氧基)]二丙酸(280 g，0.606 mmol)於DCM/DMF (2 L/250 mL)中之攪拌溶液中。隨後在0℃至5℃下歷時20 min將(3-胺基丙基)胺基甲酸第三丁酯(243 g，1.39 mol)分4份添加至反應混合物。隨後使反應物升溫至25℃且在此溫度下持續攪拌，直至TLC分析顯示起始物質耗盡為止(12 h)。濃縮反應混合物，且用水(2 L)稀釋所得殘餘物。隨後用乙酸乙酯(2 L×1，700 mL×2)萃取混合物，且將合併之有機層經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(100%乙酸乙酯，繼之以10%甲醇/二氯甲烷)純化所得殘餘物，得到白色固體，將其在15℃下於石油醚/乙酸乙酯(1:2，1 L)濕磨。16 h後，過濾漿液，用乙酸乙酯(200 mL)洗滌濾餅且隨後真空乾燥。將所得固體在15℃下於石油醚/乙酸乙酯(1:3，600 mL)再濕磨24 h。過濾漿液且用乙酸乙酯(200 mL)洗滌濾餅。真空乾燥濾餅，得到呈白色固體狀之標題化合物(190 g，40%)。1 H NMR (400 MHz, (CD3 )2 SO) δ ppm 7.81 (t, 2H), 7.63 (d, 1H), 6.76 (t, 2H), 4.01-3.85 (m, 1H), 3.64-3.48 (m, 7H), 3.41-3.22 (m, 4H), 3.02 (q, 4H), 2.90 (q, 4H), 2.28 (t, 6H), 2.05 (t, 2H), 1.57-1.43 (m, 8H), 1.37 (s, 18H), 1.22 (br.s., 12H)。步驟 5 ： 15 -( 13 , 13 - 二甲基 - 5 , 11 - 二側氧基 - 2 , 12 - 二氧雜 - 6 , 10 - 二氮十四 - 1 - 基 )- 2 , 2 - 二甲基 - 4 , 10 , 17 - 三側氧基 - 3 , 13 - 二氧雜 - 5 , 9 , 16 - 三氮二十八烷 - 28 - 酸 . 在20℃下將單水合氫氧化鋰(35.7 g，853 mmol)於水(400 mL)中之溶液添加至15-(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四-1-基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸甲酯(220 g，284 mmol)於四氫呋喃(1.2 L)中之攪拌溶液中。隨後將反應混合物加熱至28℃，直至TLC分析顯示起始物質耗盡為止(18 h)。濃縮反應混合物，且用水(2 L)稀釋所得殘餘物。隨後用二氯甲烷(1 L×2)洗滌混合物，且用鹽酸水溶液(1 N，900 mL)酸化至pH＜4。用二氯甲烷(1 L×2)萃取混合物，合併之有機層經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮，得到呈淺黃色膠狀物之標題化合物(190 g，88%)。1 H NMR (400 MHz, (CD3 )2 SO) δ ppm 11.97 (br.s., 1H), 7.81 (t, 2H), 7.62 (d, 1H), 6.75 (t, 2H), 3.98-3.87 (m, 1H), 3.56 (t, 4H), 3.38-3.24 (m, 4H), 3.02 (q, 4H), 2.90 (q, 4H), 2.28 (t, 4H), 2.18 (t, 2H), 2.05 (t, 2H), 1.57-1.41(m, 8H), 1.37 (s, 18H), 1.23 (br.s., 12 H)。步驟 6 ： 15 -( 13 , 13 - 二甲基 - 5 , 11 - 二側氧基 - 2 , 12 - 二氧雜 - 6 , 10 - 二氮十四 -1-基)- 2 , 2 - 二甲基 - 4 , 10 , 17 - 三側氧基 - 3 , 13 - 二氧雜 - 5 , 9 , 16 - 三氮二十八烷 - 28 - 酸苯甲酯 .在20℃下將碳酸鉀(107 g，773 mmol)及苯甲基溴(52.9 g，309 mmol)添加至15-(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四-1-基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸(196g，258 mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(800 mL)中之攪拌溶液中。隨後將反應混合物加熱至35℃，直至TLC分析顯示起始物質耗盡為止(12 h)。用水(1.5 L)稀釋混合物，且用甲基第三丁基醚(1 L×1，500 mL×2)萃取。用5%氯化鋰水溶液(800 mL×2)洗滌合併之有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。首先藉由矽膠層析(10%甲醇/二氯甲烷)且隨後藉由製備型HPLC(prepL-LD，Phenomenex Luna C18 250×80mm×10 μm，經10 mM碳酸氫銨改質之30-100%乙腈/水，250 mL/min)來純化所得殘餘物，得到呈白色固體狀之標題化合物(100 g，46%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.41-7.28 (m, 5H), 6.86 (t, 2H), 6.61 (d, 1H), 5.21 (t, 2H), 5.11 (s, 2H), 4.26-4.14 (m, 1H), 3.81-3.72 (m, 2H), 3.72-3.63 (m, 2H), 3.58 (dd, 2H), 3.41 (dd, 2H), 3.36-3.24 (m, 4H), 3.16 (q, 4H), 2.52-2.38 (m, 4H), 2.35 (t, 2H), 2.19 (t, 2H), 1.68-1.55 (m, 8H), 1.43 (s, 18H), 1.34-1.20 (m, 12 H)。步驟 7 ： 12 -[( 1 , 3 - 雙 { 3 -[( 3 - 胺基丙基 ) 胺基 ]- 3 - 側氧基丙氧基 } 丙 - 2 - 基 ) 胺基 ]- 12 - 側氧基十二烷酸苯甲酯 . 在冰浴中冷卻15-(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四-1-基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸苯甲酯(5.0 g，5.9 mmol)於二氯甲烷(35 mL)中之攪拌溶液。歷時15分鐘逐滴添加三氟乙酸(8.8 mL，0.12 mol)。另一15分鐘後，去除冰浴，且在環境溫度下攪拌反應物2小時。濃縮反應物，且添加乙腈(20 mL)。濃縮溶液，且於高真空泵上乾燥隔夜。將所得油狀物溶解於二氯甲烷(125 mL)中，且添加MP-碳酸酯樹脂(Biotage) (18 g，3.1 mmol/g)以除去基底物質。在環境溫度下於氮氣下攪拌混合物2.5小時。隨後過濾出樹脂且用二氯甲烷(25mL)繼之以甲醇(25mL)洗滌。濃縮合併之濾液，且真空乾燥隔夜，得到呈白色固體狀之標題化合物(4.1 g，定量)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ ppm 7.40-7.28 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 4.17-4.06 (m, 1H), 3.70 (t, 4H), 3.46 (d, 4H), 3.30-3.28 (m, 4H,與甲醇偏移重疊), 2.95 (t, 4H), 2.46 (t, 4H), 2.36 (t, 2H), 2.20 (t, 2H), 1.85 (m, 4H), 1.61 (d, 4H), 1.30 (br.s., 12H)。步驟 8 ： 5 -{[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ] 甲氧基 } 戊酸五氟苯酯 . 向置於冰浴中之5-{[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-雙(乙醯氧基)-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]甲氧基}戊酸第三丁酯(0.990 g，2.04 mmol)於二氯甲烷(8 mL)中之溶液中添加三氟乙酸(1.90 g，170 mmol)，且在環境溫度下於氮氣下攪拌反應物隔夜。酯之脫除保護基完成，如由LCMS證實[C18 H28 NO10+ 之(m/z) (M+H)+ 418.0]。將反應混合物冷卻至0℃，且經由加料漏斗依序添加2,6-二甲基吡啶(2.18 g，20.5 mmol)，繼之以三氟乙酸五氟苯酯(0.86 g，3.06 mmol mL)，且在環境溫度下攪拌反應混合物。3 h後，藉由添加鹽酸(1 N，150 mL)淬滅反應物，且用二氯甲烷(200 mL)萃取。用鹽酸(1 N，3×150 mL)及飽和碳酸氫鈉(150 mL)洗滌有機相，隨後經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(25-75%乙酸乙酯/庚烷)純化粗殘餘物，得到呈白色固體狀之標題化合物(1.03 g，87%)。1 H NMR (600 MHz, CD3 CN) δ ppm 6.49 (d, 1H), 5.36 (d, 1H), 5.30 (s, 1H), 5.01 (dd, 1H), 4.10 (t, 1H), 3.94 (d, 1H), 3.69 (dd, 2H), 3.55-3.46 (m, 2H), 3.46-3.36 (m, 1H), 2.72 (t, 2H), 2.12 (s, 3H), 1.91 (s, 3H), 1.85 (s, 3H), 1.80-1.68 (m, 2H), 1.66-1.53 (m, 2H)。C24 H27 F5 NO10 + 之LCMS (m/z) (M+H)+ 584.8;滯留時間= 0.94 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 9 ： 1 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 18 -{ 17 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 雙 ( 乙醯氧基 )- 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 5 , 11 - 二側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 6 , 10 - 二氮十七 - 1 - 基 }- 7 , 13 , 20 - 三側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 8 , 12 , 19 - 三氮三十一烷 - 31 - 酸苯甲酯 . 向12-[(1,3-雙{3-[(3-胺基丙基)胺基]-3-側氧基丙氧基}丙-2-基)胺基]-12-側氧基十二烷酸苯甲酯(1.05 g，1.31 mmol)於乙腈(18 mL)及二甲基甲醯胺(8 mL)之混合物中之懸浮液中添加N,N-二異丙基乙胺(1.83 mL，10.5 mmol)。隨後將所得混合物添加至5-{[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-雙(乙醯氧基)-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]甲氧基}戊酸五氟苯酯(1.75 g，3.00 mmol)於乙腈(5 mL)中之溶液中，且在環境溫度下於氮氣下攪拌反應物2小時。隨後用1 N 鹽酸(50 ml)稀釋反應物，且用二氯甲烷(2×125 mL)萃取。合併之二氯甲烷提取物經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。藉由管柱層析(20-100%乙酸乙酯/庚烷及隨後之0-30%甲醇/二氯甲烷)純化所得殘餘物，得到呈白色固體狀之標題化合物(1.71 g，89%)。1 H NMR (600 MHz, CD3 OD) δ ppm 7.37-7.28 (m, 5H), 5.46 (d, 2H), 5.34 (s, 2H), 5.17-5.07 (m, 4H), 4.20 (d, 2H), 4.15-4.09 (m, 1H), 4.02 (d, 2H), 3.67 - 3.79 (m, 8H), 3.57-3.18 (m, 18H,與甲醇峰重疊), 2.45 (t, 4H), 2.38 (t, 2H), 2.25-2.12 (m, 12H), 1.96 (s, 12H), 1.76-1.48 (m, 14H), 1.43-1.25 (m, 14H)。步驟 10 ： 實例 32 . 在25℃下於完全H2 (20巴)下使1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-雙(乙醯氧基)-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]-18-{17-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-雙(乙醯氧基)-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七-1-基}-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮三十一烷-31-酸苯甲酯(1.71 g，1.18 mmol)於甲醇(24 mL)中之溶液以1 mL/min流動速率通過H-cube上之較小10% Pd/C Catcart。用另一份甲醇(10 mL)沖洗Catcart，且將流過物濃縮成油狀物。將殘餘物溶解於二氯甲烷中且濃縮(2 × 25 mL)，得到黏性白色泡沫。於真空泵上乾燥物質隔夜，隨後溶解於乙腈/水(3.8 mL，1:1)中且凍乾成白色固體(1.52 g，95%)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ ppm 5.44 (d, 2H), 5.32 (s, 2H), 5.12-5.09 (m, 2H), 4.18 (d, 2H), 4.13-4.10 (m, 1H) 4.01 (d, 2H) 3.79-3.67 (m, 8H), 3.56-3.35 (m, 10H), 3.26-3.14 (m, 8H), 2.43 (t, 4H), 2.28 (t, 2H), 2.23-2.14 (m, 12H) 1.97-1.92 (m, 12H), 1.74-1.50 (m, 14H), 1.41-1.28 (m, 14H)。C63 H104 N7 O25 + 之LCMS (m/z) (M+H)+ 1359.1; 滯留時間= 0.80 min (UPLC 1.5分鐘運行)。1 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 18 -{ 17 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 5 , 11 - 二側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 6 , 10 - 二氮十七 - 1 - 基 }- 7 , 13 , 20 - 三側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 8 , 12 , 19 - 三氮三十一烷 - 31 - 酸 反應流程： 步驟 1 ： 12 -( 苯甲氧基 )- 12 - 側氧基十二酸 . 將十二烷二酸(15.0 g，65.0 mmol)及Dowex-H-型(65 g)添加至庚烷(0.52 L)及甲酸苯甲酯(142 g，1.04 mol，130 mL)之混合物，且將反應物加熱至回流，持續24 h。隨後使反應物冷卻且過濾出樹脂。真空濃縮濾液且藉由矽膠層析(0-20%乙酸乙酯/庚烷)純化所得殘餘物，得到泥狀殘餘物。將分離物製成漿液隔夜(5%乙酸乙酯/庚烷，20 mL)。藉由真空過濾來過濾混合物，且用庚烷洗滌所得固體，得到呈白色固體狀之標題化合物(6.66 g，39%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.36 (s, 5H), 5.12 (s, 2H), 2.42-2.30 (m, 4H), 1.75-1.54 (m, 4H), 1.45-1.16 (m, 12H)。步驟 2 ： 12 - 側氧基 - 12 -[( 2 , 2 , 16 , 16 - 四甲基 - 4 , 14 - 二側氧基 - 3 , 7 , 11 , 15 - 四氧雜十七烷 - 9 - 基 ) 胺基 ] 十二烷酸苯甲酯 . 將正丙基膦酸酐環狀三聚體(2.3 g，3.6 mmol，2.0 mL，50%於乙酸乙酯中)添加至12-(苯甲氧基)-12-側氧基十二酸(0.95 g，2.98 mmol)、3, 3'-[(2-胺基丙烷-1,3-二基)雙(氧基)]二丙酸二第三丁酯(1.03 g，2.98 mmol)及N,N-二異丙基乙胺(1.2 g，8.9 mmol，1.6 mL)於二甲基甲醯胺(8 mL)中之懸浮液中，且在室溫下攪拌反應混合物隔夜。用乙酸乙酯(100 mL)稀釋反應混合物，且用鹽酸(1 N，30 mL)、飽和碳酸氫鈉(30 mL)及鹽水(30 mL)洗滌。有機相經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮，得到殘餘物，隨後使其與庚烷(3×40 mL)共沸，得到呈固體狀之標題化合物(2.0 g，100%)。1 H NMR (600 MHz, CD3 CN) δ ppm 7.41-7.31 (m, 5H), 6.34 (d, 1H), 5.08 (s, 2H), 4.01 (td, 1H), 3.67-3.58 (m, 4H), 3.44 (dd, 2H), 3.36 (dd, 2H), 2.40 (t, 4H), 2.33 (t, 2H), 2.09 (t, 2H), 1.61-1.49 (m, 4H), 1.43 (s, 18H), 1.30-1.25 (m, 12H)。C36 H60 NO9 + 之LCMS (m/z) (M+H)+ 650.5; 滯留時間= 1.23 min (UPLC 1.5分鐘法)步驟 3 ： 3 , 3 '-[( 2 -{[ 12 -( 苯甲氧基 )- 12 - 側氧基十二醯基 ] 胺基 } 丙烷 - 1 , 3 - 二基 ) 雙 ( 氧基 )] 二丙酸 . 在環境溫度下攪拌12-側氧基-12-[(2,2,16,16-四甲基-4,14-二側氧基-3,7,11,15-四氧雜十七烷-9-基)胺基]十二烷酸酯(1.60 g，2.47 mmol)於三氟乙酸(15 g，130 mmol，10.0 mL)中之溶液隔夜。濃縮反應混合物，且在20℃下使所得殘餘物與二乙醚(4×70 mL)共沸，且隨後真空乾燥隔夜，得到呈膠狀物之標題化合物(4.03 g，99%，2.11當量TFA)。1 H NMR (600 MHz, CD3 CN) δ ppm 7.52-7.24 (m, 5H), 6.89 (d, 1H), 5.14-5.04 (m, 2H), 4.15-4.01 (m, 1H), 3.65(t, 4H), 3.49-3.46 (m, 2H), 3.44-3.41 (m, 2H), 2.50 (t, 4H), 2.33 (t, 2H), 2.21 (t, 2H), 1.57 (td, 4H), 1.23-1.32 (m, 12H)。 C28 H44 NO9 + 之LCMS (m/z) (M+H)+ 538.6; 滯留時間= 0.92 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 4 ： 12 -({ 1 , 3 - 雙 [ 3 - 側氧基 - 3 -( 五氟苯氧基 ) 丙氧基 ] 丙 - 2 - 基 } 胺基 )- 12 - 側氧基十二烷酸苯甲酯 . 於冰浴中向3,3'-[(2-{[12-(苯甲氧基)-12-側氧基十二醯基]胺基}丙烷-1,3-二基)雙(氧基)]二丙酸(1.57 g，2.41 mmol，1當量TFA)及二異丙基乙胺(3.11 g，24.1 mmol，4.20 mL)於二甲基甲醯胺(10 mL)中之懸浮液中逐滴添加三氟乙酸五氟苯酯(5.40 g，19.3 mmol，3.31 mL)。在環境溫度下攪拌所得溶液。濃縮反應混合物，且使其與庚烷(2×20 mL)共沸。用乙酸乙酯(80 mL)稀釋所得殘餘物，用10%檸檬酸(30 mL)、飽和碳酸氫鈉(30 mL)及鹽水(30 mL)洗滌，經Na2 SO4 乾燥，且濃縮。藉由矽膠層析(0-60%乙酸乙酯/庚烷)來純化粗產物，得到呈固體狀之標題化合物(983 mg，47%)。1 H NMR (600 MHz, CD3 CN-d3 ) δ ppm 7.44-7.24 (m, 5H), 6.23 (d, 1H), 5.08 (s, 2H), 4.08 (td, 1H), 3.81-3.76 (m, 4H), 3.53-3.42 (m, 4H), 2.92 (t, 4H), 2.32 (t, 2H), 2.07 (t, 2H), 1.62-1.46 (m, 4H), 1.32-1.19 (m, 12H)。 C40 H42 NO9 + 之LCMS (m/z) (M+H)+ 870.6;滯留時間= 1.23 min (UPLC 1.5分鐘法)。步驟 5 ： 5 -{[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ] 甲氧基 } 戊酸 . 向5-{[(1S,2R,6R,7R,8S)-7-(乙醯胺基)-4,4-二甲基-3,5,9,11-四氧雜三環[6.2.1.0~2,6~]十一-1-基]甲氧基}戊酸第三丁酯(2.09 g，4.87 mmol)於二氯甲烷(15 mL)及水(2 mL)中之溶液中添加三氟乙酸(22 g，200 mmol，15 mL)，且在環境溫度下攪拌反應混合物隔夜。濃縮粗產物，使其與甲苯(3×50 mL)、隨後之庚烷(3×50 mL)共沸，且真空乾燥，得到呈膠狀物之標題化合物(2.08 g，定量，0.83當量TFA)。C14 H24 NO8 + 之LCMS (m/z) (M+H)+ 334.2; 滯留時間= 0.45 min (UPLC 1.5分鐘法)步驟 6 ： 二乙酸 ( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 1 -( 3 , 9 - 二側氧基 - 1 - 苯基 - 2 , 14 - 二氧雜 - 4 , 8 - 二氮十五烷 - 15 - 基 )- 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛烷 - 2 , 3 - 二酯 . 向含有約1當量TFA (1.0 g，2.05 mmol)之5-{[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]甲氧基}戊酸於二氯甲烷(12 mL)及二甲基甲醯胺(5 mL)中之溶液中添加二異丙基乙胺(1.59 g，12.3 mmol)、六氟磷酸鄰(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基(0.93 g，2.46 mmol)及1H-苯并三唑-1-醇 (277 mg，2.05 mmol)。在室溫下攪拌混濁混合物20 min。隨後添加正(3-胺基丙基)胺基甲酸苯甲酯鹽酸鹽(502 mg，2 mmol)。在環境溫度下攪拌所得混合物隔夜。藉由LCMS證實醯胺產物之形成[C25 H38 N3 O9 + , (M+H)+ 524.5]。將反應混合物濃縮至5 mL，且用吡啶(6 mL)稀釋。向此溶液中添加乙酸酐(6.0 g，60 mmol)且在50℃下攪拌反應混合物隔夜。將反應混合物冷卻至室溫，用乙酸乙酯(70 mL)稀釋，用鹽酸(1 N，30 mL)、飽和碳酸氫鈉(30 mL)及鹽水(30 mL)洗滌。經分離有機相經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(0-15%甲醇/二氯甲烷)來純化粗產物，得到呈玻璃狀之標題化合物(1.28 g，100%)。 C29 H42 N3 O11 + 之LCMS (m/z), (M+H)+ 608.5; 滯留時間= 0.70 min (UPLC 1.5分鐘法)步驟 7 ： { 3 -[( 5 -{[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ] 甲氧基 } 戊醯基 ) 胺基 ] 丙基 } 胺基甲酸苯甲酯 . 向二乙酸(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-1-(3,9-二側氧基-1-苯基-2,14-二氧雜-4,8-二氮十五烷-15-基)-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛烷-2,3-二酯(1.5 g，2.47 mmol)於甲醇(8 mL)中之懸浮液中添加氫氧化鉀(1 M於甲醇中，5.3 mL，5.3 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物1 h。隨後用鹽酸(4.0 M於二噁烷中，1.5 mL)逐滴處理反應混合物。濃縮所得漿液，且在酒精(15 mL)中濕磨10 min。藉由過濾去除所得氯化鉀沈澱，藉由酒精(5 mL)沖洗。濃縮濾液，藉由真空乾燥，得到呈膠狀物之標題化合物(1.28 g，98%)。1 H NMR (600 MHz,甲醇-d4 ) δ ppm 7.41-7.25 (m, 5H), 5.21 (s, 1H), 5.07 (s, 2H), 3.93 (dd, 2H), 3.86 (d, 1H), 3.77 (d, 1H), 3.71 (dd, 1H), 3.65 (d, 1H), 3.58 (d, 1H), 3.53-3.46 (m, 2H), 3.20 (t, 2H), 3.15 (t, 2H), 2.20 (t, 2H), 1.99 (s, 3H), 1.70-1.62 (m, 4H), 1.61-1.53 (m, 2H)。 C25 H38 N3 O9 + 之LCMS (m/z), (M+H)+ 524.5;滯留時間= 0.64 min (UPLC 1.5分鐘法)步驟 8 ： 5 -{[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ] 甲氧基 }- N -( 3 - 胺基丙基 ) 戊醯胺 . 在環境溫度下於氫氣壓力(50 psi)下在Parr反應器中攪拌{3-[(5-{[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]甲氧基}戊醯基)胺基]丙基}胺基甲酸苯甲酯(1.60 g，2.4 mmol)及10%鈀/碳(200 mg)於甲醇(20 mL)中之混合物隔夜。經由矽藻土過濾反應混合物。用甲醇(50 ml)洗滌矽藻土，濃縮合併之濾液且真空乾燥，得到呈固體狀之標題化合物(925 mg，97%)。1 H NMR (600 MHz, 甲醇-d4 ) δ ppm 5.21 (s, 1H), 3.94 (d, 1H), 3.90 (d, 1H), 3.86 (d, 1H), 3.77 (d, 1H), 3.71 (dd, 1H), 3.65 (d, 1H), 3.61 (d, 1H), 3.58-3.46 (m, 2H), 3.26 (t, 2H), 2.82 (t, 2H), 2.22 (t, 2H), 1.99 (s, 3H), 1.76 (quin, 2H), 1.68 (quin, 2H), 1.63-1.56 (m, 2H)。 C17 H32 N3 O7 + 之LCMS (m/z), (M+H)+ 390.5;滯留時間 = 0.47 min (UPLC 1.5分鐘法)步驟 9 ： 1 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 18 -{ 17 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 5 , 11 - 二側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 6 , 10 - 二氮十七 - 1 - 基 }- 7 , 13 , 20 - 三側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 8 , 12 , 19 - 三氮三十一烷 - 31 - 酸苯甲酯 . 在室溫下攪拌5-{[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]甲氧基}-N-(3-胺基丙基)戊醯胺(607 mg，1.40 mmol)及12-({1,3-雙[3-側氧基-3-(五氟苯氧基)丙氧基]丙-2-基}胺基)-12-側氧基十二烷酸苯甲酯(500 mg，0.58 mmol)以及N,N-二異丙基乙胺(200 mg，2.0 mmol)於二氯甲烷(8 mL)及二甲基甲醯胺(3 mL)之混合物中之混合物隔夜。濃縮反應混合物，使其與庚烷(3×10 mL)共沸，且濃縮。藉由矽膠層析(0-40%甲醇/二氯甲烷)純化粗殘餘物，得到呈玻璃狀之標題化合物(520 mg，71%)。1 H NMR (600 MHz, 甲醇-d 4 ) δ ppm 7.37-7.29 (m, 5H), 5.21 (s, 2H), 5.11 (s, 2H), 4.11 (t, 1H), 3.94 (dd, 4H), 3.87 (d, 2H), 3.77 (d, 2H), 3.75-3.67 (m, 6H), 3.64 (d, 2H), 3.57 (d, 2H), 3.55-3.42 (m, 8H), 3.23-3.19 (m, 8H), 2.43 (t, 4H), 2.36 (t, 2H), 2.20 (q, 6H), 1.98 (s, 6H), 1.72-1.54 (m, 16H), 1.35-1.28 (m, 12 H)。LCMS C62 H102 N7 O21 + , (M+H)+ 1280.3;滯留時間= 1.45 min (UPLC 3分鐘法)步驟 10 ： 實例 33 . 1 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 18 , 18 - 雙 { 17 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 5 , 11 - 二側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 6 , 10 - 二氮十七 - 1 - 基 }- 7 , 13 , 20 - 三側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 8 , 12 , 19 - 三氮三十一烷 - 31 - 酸 . 在25℃下於完全H2 下使1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]-18-{17-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七-1-基}-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮三十一烷-31-酸苯甲酯(520 mg，0.41 mmol)於甲醇(16 mL)中之溶液以1 mL/min之流動速率通過ThalesNano H-Cube Pro™上之10% Pd/C 30×4 CatCart®。藉由甲醇(20 mL)沖洗該系統。濃縮濾液，使其與二氯甲烷(20 mL)共沸，隨後與庚烷(20 mL)共沸。將所得殘餘物溶解於乙腈/水(1:1，20 mL)中且凍乾，得到呈白色固體狀之標題化合物(477 mg，99%)。1 H NMR (600 MHz,甲醇-d 4 ) δ ppm 5.21 (s, 2H), 4.11 (t, 1H), 3.98-3.87 (m, 4H), 3.87 (d, 2H), 3.78 (d, 2H), 3.74-3.67 (m, 6H), 3.65 (d, 2H), 3.58 (d, 2H), 3.55-3.45 (m, 8H), 3.21 (q, 8H), 2.43 (t, 4H), 2.27 (t, 2H), 2.23-2.16 (m, 6H), 1.99 (s, 6H), 1.72-1.62 (m, 8H), 1.63-1.54 (m, 8H), 1.35-1.28 (m, 12 H)。 C55 H96 N7 O21 + 之LCMS (m/z), (M+H)+ 1190.7; 滯留時間= 1.07 min (UPLC 3分鐘法)。1 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 7 , 13 , 20 - 三側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 8 , 12 , 19 - 三氮三十一烷 - 31 - 酸 反應流程： 步驟 1 ： 12 -{[ 2 -( 3 - 第三丁氧基 - 3 - 側氧基丙氧基 ) 乙基 ] 胺基 }- 12 - 側氧基十二烷酸苯甲酯 . 將12-苯甲氧基-12-側氧基十二烷酸(2.33 g，7.26 mmol)、3-(2-胺基乙氧基)丙酸第三丁酯(1.25 g，6.60 mmol)及N,N-二異丙基乙胺(2.3 mL，13 mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(35 mL)中。向此溶液中添加六氟磷酸N,N,N',N'-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)、六氟磷酸O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基(2.75 g，7.26 mmol)，且在環境溫度下攪拌反應物16 h。濃縮反應物，將殘餘物溶解於乙酸乙酯(100 mL)中，且依序用飽和碳酸氫鈉、水及鹽水(各25 mL)洗滌。有機層隨後經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮成無色油狀物。藉由矽膠層析(0-100%乙酸乙酯/庚烷)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之所需產物(2.58 g，80%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.41-7.30 (m, 5H), 6.18 (br.s., 1H), 5.12 (s, 2H), 3.69 (t, 2H), 3.57-3.51 (m, 2H), 3.49-3.42 (m, 2H), 2.49 (t, 2H), 2.36 (t, 2H), 2.23-2.14 (m, 2H), 1.63 (d, 4H), 1.47 (s, 9H), 1.36-1.22 (m, 12H)。步驟 2 ： 3 -( 2 -{[ 12 -( 苯甲氧基 )- 12 - 側氧基十二醯基 ] 胺基 } 乙氧基 ) 丙酸 . 將12-{[2-(3-第三丁氧基-3-側氧基丙氧基)乙基]胺基}-12-側氧基十二烷酸苯甲酯(2.58 g，5.25 mmol)溶解於二氯甲烷(12 mL)中。向其中添加三氟乙酸(20 ml，0.27 mol)。在環境溫度下攪拌2 h後，濃縮反應物。將所得殘餘物溶解於甲苯中且濃縮(2×20mL)，且隨後於真空泵上乾燥，得到固體(2.21 g)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.41-7.30 (m, 5H) 6.08 (br.s., 1H) 5.12 (s, 2H) 3.74 (t, 2H) 3.61-3.51 (m, 2H) 3.50-3.40 (m, 2H) 2.64 (t, 2H) 2.36 (t, 2H) 2.25-2.11 (m, 2H) 1.72-1.54 (m, 4H) 1.27 (m, 12H)。步驟 3 ： 12 - 側氧基 - 12 -({ 2 -[ 3 - 側氧基 - 3 -( 五氟苯氧基 ) 丙氧基 ] 乙基 } 胺基 ) 十二烷酸苯甲酯 . 將N,N-二異丙基乙胺(3.52 ml，20.2 mmol)添加至3-(2-{[12-(苯甲氧基)-12-側氧基十二醯基]胺基}乙氧基)丙酸(2.20 g，5.05 mmol)於二甲基甲醯胺(24 mL)中之溶液中。隨後以緩慢流向其中添加五氟苯酚-2,2,2-三氟乙酸酯(1.74 mL，10.1 mmol)。反應物變為紫色，且在環境溫度下攪拌18 h。於旋轉式蒸發器(50℃，高真空泵)上將反應混合物濃縮至1/3體積，且用乙酸乙酯(300 mL)稀釋所得濃縮物，用10%檸檬酸(100 mL)、飽和碳酸氫鈉(100 mL)及鹽水(100 mL)洗滌。有機層經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(0-100%乙酸乙酯/庚烷)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之所需產物(2.46 g，2個步驟後為78%)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.41-7.30 (m, 5H), 5.85 (br.s., 1H) 5.12 (s, 2H), 3.85 (t, 2H), 3.64-3.54 (m, 2H), 3.52-3.43 (m, 2H), 2.94 (t, 2H), 2.36 (t, 2H), 2.16 (t, 2H), 1.70-1.60 (m, 4H), 1.26 (m, 12H)。步驟 4 ： 1 -[( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 -( 乙醯胺基 )- 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 ]- 20 - 側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 8 , 12 , 19 - 三氮三十一烷 - 31 - 酸苯甲酯 . 在室溫下攪拌5-{[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]甲氧基}-N-(3-胺基丙基)戊醯胺(172 mg，0.440 mmol)及12-側氧基-12-({2-[3-側氧基-3-(五氟苯氧基)丙氧基]乙基}胺基)十二烷酸苯甲酯(220 mg，0.402 mmol)、N,N-二異丙基乙胺(95 mg，0.73 mmol)於二氯甲烷(3.3 mL)與二甲基甲醯胺(0.7 mL)之混合物中之混合物隔夜。濃縮反應混合物，使其與庚烷(3×10 mL)共沸，且濃縮。藉由矽膠層析(0-25%甲醇/二氯甲烷)來純化粗產物，得到呈油狀物標題化合物(185 mg，57%)。1 H NMR (600 MHz, 甲醇-d 4 ) δ ppm 7.39-7.28 (m, 5H), 5.21 (s, 1H), 5.11 (s, 2H), 3.99-3.89 (m, 2H), 3.87 (d, 1H), 3.77 (d, 1H), 3.75-3.67 (m, 3H), 3.64 (d, 1H), 3.57 (d, 1H), 3.55-3.44 (m, 4H), 3.38-3.32 (m, 2H), 3.26-3.16 (m, 4H), 2.44 (t, 2H), 2.36 (t, 2H), 2.19 (td, 4H), 1.99 (s, 3H), 1.70--1.55 (m, 10H), 1.33-1.25 (m, 12H)。 C41 H67 N4 O12 + 之LCMS (m/z), (M+H)+ 807.8;滯留時間= 1.60 min (UPLC 3分鐘法)。 步驟5：實例34 . 在25℃下於完全H2 下使1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(乙醯胺基)-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基]-20-側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮三十一烷-31-酸苯甲酯(0.22 g，0.25 mmol)於甲醇(22 mL)中之溶液以1 mL/min之流動速率通過ThalesNano H-cubePro™上之10% Pd/C 30×4 CatCart®。藉由甲醇(40 mL)沖洗該系統。濃縮濾液，使其與二氯甲烷(20 mL)共沸，隨後與庚烷(20 mL)共沸。將所得殘餘物溶解於乙腈/水(1:1，20 mL)中且凍乾，得到呈白色固體狀之標題化合物(177 mg，99%)。1 H NMR (600 MHz, 甲醇-d 4 ) δ ppm 5.20 (s, 1H), 4.01-3.89 (m, 2H), 3.87 (d, 1H), 3.77 (d, 1H), 3.75-3.68 (m, 3H), 3.65 (d, 1H), 3.57 (d, 1H), 3.55-3.45(m, 4H), 3.34 (t, 2H), 3.27-3.14 (m, 4H), 2.44 (t, 2H), 2.28 (t, 2H), 2.20 (td, 4H), 1.98 (s, 3H), 1.67 (t, 4H), 1.63-1.54 (m, 6H), 1.35-1.28 (m, 12 H)。C34 H61 N4 O12 + , (M+H)+ 717.7;滯留時間= 1.12 min (UPCL 3分鐘法)。5 , 11 , 18 - 三側氧基 - 16 -{[ 3 - 側氧基 - 3 -({ 3 -[( 5 -{[ 3 , 4 , 6 - 三 - O - 乙醯基 - 2 -( 乙醯胺基 )- 2 - 去氧 - β - D - 半乳哌喃糖基 ] 氧基 } 戊醯基 ) 胺基 ] 丙基 } 胺基 ) 丙氧基 ] 甲基 }- 1 -{[ 3 , 4 , 6 - 三 - O - 乙醯基 - 2 -( 乙醯胺基 )- 2 - 去氧 - β - D - 半乳哌喃糖基 ] 氧基 }- 14 - 氧雜 - 6 , 10 , 17 - 三氮二十九烷 - 29 - 酸 反應流程： 步驟 1 ： { 3 -[( 5 -{[ 3 , 4 , 6 - 三 - O - 乙醯基 - 2 -( 乙醯胺基 )- 2 - 去氧 - β - D - 半乳哌喃糖基 ] 氧基 } 戊醯基 ) 胺基 ] 丙基 } 胺基甲酸苯甲酯 . 將N,N-二異丙基乙胺(1.38 mL，7.95 mmol)添加至(3-胺基丙基)胺基甲酸苯甲酯鹽酸鹽(0.713 g，2.01 mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(3.5 mL)之溶液中。隨後將所得混合物添加至5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊酸(1.19 g，2.65 mmol)於二甲基甲醯胺(10 mL)中之溶液中。隨後添加六氟磷酸1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物(1.11 g，2.91 mmol)，且在環境溫度下於氮氣氛圍下攪拌反應混合物(2.5 h)。用飽和氯化銨(50 mL)淬滅反應物，且用二氯甲烷(4×75 mL)萃取。用鹽水(50 mL)洗滌合併之有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(2-6%甲醇/二氯甲烷)來純化所得油狀物，得到呈白色泡沫狀之所需產物(0.904 g，53%)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ ppm 7.41-7.25 (m, 5H), 5.33 (d, 1H), 5.12-5.02 (m, 3H), 4.54 (d, 1H), 4.19-4.03 (m, 3H), 4.03-3.97 (m, 1H), 3.91-3.82 (m, 1H), 3.60-3.46 (m, 2H), 3.11-3.25 (m, 4H), 2.16-2.23 (m, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.73-1.53 (m, 6H), 1.40-1.34 (m, 2H)。步驟 2 ： N -( 3 - 胺基丙基 )- 5 -{[ 3 , 4 , 6 - 三 - O - 乙醯基 - 2 -( 乙醯胺基 )- 2 - 去氧 - β - D - 半乳哌喃糖基 ] 氧基 } 戊醯胺 乙酸鹽 . 將{3-[(5-{[3,4,6-三-O-乙醯基-2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖基]氧基}戊醯基)胺基]丙基}胺基甲酸苯甲酯5-{[3,4,6-三-O-乙醯基-2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖基]氧基}戊酸(1.01 g，1.59 mmol)溶解於甲醇(30 mL)及冰醋酸之混合物(91 μL，1.6 mmol)中。在氮氣下向其中添加10% Pd/C (0.2 g，濕潤)，且將反應混合物置於50 psi氫氣下的經密封之攪拌Parr反應器中。16 h後，用氮氣(×4)吹掃頂部空間，且經由0.45 μm耐綸針筒過濾器過濾。用甲醇洗滌過濾器，且濃縮合併之濾液，得到呈白色泡沫狀之標題化合物(0.86 g，96%)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ ppm 5.34 (d, 1H), 5.06-5.02 (m, 1H), 4.52 (d, 1H), 4.19-4.05 (m, 3H), 4.04-3.98 (m, 1H), 3.92-3.84 (m, 1H), 3.56-3.47 (m, 1H), 2.98-2.89 (m, 2H), 2.23 (t, 2H), 2.14 (s, 3H), 2.06 (d, 1H), 2.03 (s, 3H), 1.94 (d, 5H), 1.91 (s, 3H), 1.83 (m, 2H), 1.74-1.54 (m, 4H), 1.39-1.31 (m, 1H)。步驟 3 ： 5 , 11 , 18 - 三側氧基 - 16 -{[ 3 - 側氧基 - 3 -({ 3 -[( 5 -{[ 3 , 4 , 6 - 三 - O - 乙醯基 - 2 -( 乙醯胺基 )- 2 - 去氧 - β - D - 半乳哌喃糖基 ] 氧基 } 戊醯基 ) 胺基 ] 丙基 } 胺基 ) 丙氧基 ] 甲基 }- 1 -{[ 3 , 4 , 6 - 三 - O - 乙醯基 - 2 -( 乙醯胺基 )- 2 - 去氧 - β - D - 半乳哌喃糖基 ] 氧基 }- 14 - 氧雜 - 6 , 10 , 17 - 三氮二十九烷 - 29 - 酸苯甲酯 . 將12-({1,3-雙[3-側氧基-3-(五氟苯氧基)丙氧基]丙-2-基}胺基)-12-側氧基十二烷酸苯甲酯(150 mg，0.172 mmol)、N-(3-胺基丙基)-5-{[3,4,6-三-O-乙醯基-2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖基]氧基}戊醯胺乙酸鹽(233 mg，0.414 mmol)及N,N-二異丙基乙胺(0.15 ml，0.862 mmol)溶解於二氯甲烷(3.5 mL)中，且在環境溫度下攪拌64 h。濃縮反應混合物且添加庚烷，且再次濃縮殘餘物(×3)。藉由矽膠層析(4-14%甲醇/二氯甲烷)來純化所得殘餘物，得到呈無色玻璃狀之所需產物(175 mg，67%)。隨後將化合物溶解於乙腈及水之混合物(1:1，30 mL)中且凍乾，得到白色固體。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm 7.42-7.37 (m, 5H), 7.15 (br.s., 2H) 6.94-6.84 (m, 3H), 6.51-6.45 (m, 2H), 5.38 (d, 2H), 5.20 (d, 2H), 5.14 (s, 2H), 4.65-4.57 (m, 2H), 4.27-4.06 (m, 8H), 4.02-3.90 (m, 4H), 3.73 (br.s., 6H), 3.63-3.42 (m, 8H), 3.37-3.26 (m, 8H), 2.47 (br.s., 5H), 2.38 (t, 3H), 2.34-2.15 (m, 15H), 2.12 (s, 6H), 2.03 (s, 6H), 1.98 (s, 6H), 1.78 (br.s., 4H) 1.28 (d, 14H)。步驟 4 ： 實例 35 . 將10% Pd/C (30 mg，濕潤)添加至苯甲基-5,11,18-三側氧基-16-{[3-側氧基-3-({3-[(5-{[3,4,6-三-O-乙醯基-2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖基]氧基}戊醯基)胺基]丙基}胺基)丙氧基]甲基}-1-{[3,4,6-三-O-乙醯基-2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖基]氧基}-14-氧雜-6,10,17-三氮二十九烷-29-酸酯(282 mg，0.187 mmol)於甲醇(5 mL)中之溶液中。將混合物置於50 psi氫氣下之HelCat中，且在環境溫度下攪拌16 h。隨後用氮氣(×3)吹掃頂部空間，且經由0.2 μm耐綸針筒過濾器過濾溶液。用甲醇洗滌過濾器，且濃縮合併之濾液，得到呈白色泡沫狀之標題化合物，隨後將其溶解於乙腈及水之混合物(1:1，20 mL)中且凍乾成白色固體(262 mg，99%)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ ppm 5.33 (d, 2H), 5.08-5.04 (m, 2H), 4.55 (d, 2H) 4.21-3.98 (m, 10H), 3.91-3.83 (m, 2H), 3.69 (t, 4H) 3.60-3.44 (m, 8H), 3.24-3.19 (m, 8H), 2.43 (t, 4H), 2.31-2.16 (m, 8H), 2.14 (s, 6H), 2.06-2.00 (m, 6H), 1.94 (d, 10H), 1.73-1.55 (m, 15H), 1.40-1.28 (m, 12H)。 C65 H108 N7 O27 + 之LCMS (m/z) (M+H)+ 1419.7; 滯留時間= 1.34 min (UPLC 3.0分鐘運行)5 , 11 , 18 - 三側氧基 - 1 -{[ 3 , 4 , 6 - 三 - O - 乙醯基 - 2 -( 乙醯胺基 )- 2 - 去氧 - β - D - 半乳哌喃糖基 ] 氧基 }- 14 - 氧雜 - 6 , 10 , 17 - 三氮二十九烷 - 29 - 酸 反應流程： 步驟 1 ： 5 , 11 , 18 - 三側氧基 - 1 -{[ 3 , 4 , 6 - 三 - O - 乙醯基 - 2 -( 乙醯胺基 )- 2 - 去氧 - β - D - 半乳哌喃糖基 ] 氧基 }- 14 - 氧雜 - 6 , 10 , 17 - 三氮二十九烷 - 29 - 酸苯甲酯 . 將N-(3-胺基丙基)-5-{[3,4,6-三-O-乙醯基-2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖基]氧基}戊醯胺乙酸鹽(159 mg，0.264 mmol)添加至12-側氧基-12-({2-[3-側氧基-3-(五氟苯氧基)丙氧基]乙基}胺基)十二烷酸苯甲酯(164 mg，0.291 mmol)及N,N-二異丙基乙胺(200 μL，1.32 mmol)於二氯甲烷(5 mL)中之溶液中，且在環境溫度下攪拌反應物16 h。濃縮反應混合物，且將所得殘餘物溶解於庚烷中，且濃縮(3×10 mL)。藉由矽膠層析(0-10%甲醇/二氯甲烷)來純化所得殘餘物，得到呈無色玻璃狀之標題化合物(116 mg，48%)。C48 H72 N4 O15 + 之LCMS (m/z) (M+H)+ 921.8; 滯留時間= 0.91 min (UPLC 1.3分鐘運行)。步驟 2 ： 實例 36 . 在氮氣下將10% Pd/C (25 mg，濕潤)添加至5,11,18-三側氧基-1-{[3,4,6-三-O-乙醯基-2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖基]氧基}-14-氧雜-6,10,17-三氮二十九烷-29-酸苯甲酯(196 mg,0.213 mmol)於甲醇(5 mL)中之溶液。將反應物置於50 psi氫氣下之HelCat中，且在環境溫度下攪拌16 h。用氮氣(×3)吹掃頂部空間，且經由0.2 μm耐綸針筒過濾器過濾溶液。用甲醇洗滌過濾器，且濃縮合併之濾液，得到呈無色玻璃狀之標題化合物，隨後將其溶解於乙腈及水之混合物(1:1，20 mL)中且凍乾，得到白色固體(165 mg，93%)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ ppm 8.01-7.91 (m, 1H), 5.33 (d, 1H), 5.06 (m, 1H), 4.55 (d, 1H), 4.19-3.98 (m, 4H), 3.91-3.84 (m, 1H), 3.76-3.67 (m, 2H), 3.57-3.47 (m, 4H), 3.25-3.18 (m, 4H), 2.44 (t, 2H), 2.30-2.16 (m, 6H), 2.14 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 1.93 (s, 3H), 1.73-1.54 (m, 10H), 1.39-1.28 (m, 12H)。 C39 H67 N4 O15 + 之LCMS (m/z) (M+H)+ 831.8; 滯留時間 = 1.30 min (UPLC 3.0分鐘運行)。實例 37 . 寡核苷酸之合成 各種寡核苷酸之合成描述於本文中。在WV寡核苷酸名稱後的小數點之後的兩個數字指示批號。舉例而言，WV-7107.03指示WV-7107之03批。實例 37A . WV - 7107 及 WV - 6558 之合成 . 具有序列5'- Mod001L001Aeo*SGeom5CeoTeoTeo*RC*ST*ST*SG*RT*SC*SC*RA*SG*SC*RTeoTeoTeoAeo*STeo -3'之WV-6558為具有序列5'- L001Aeo*SGeom5CeoTeoTeo*RC*ST*ST*SG*RT*SC*SC*RA*SG*SC*RTeoTeoTeoAeo*STeo -3'之WV-7107之GalNAc結合物。對WV-7107進行GalNAc結合步驟以製得WV-6558。 WV-7107之固相合成： 在ÄKTA OP100合成器(GE Healthcare)上使用6.0 cm直徑之不鏽鋼管柱反應器，於3300 µmol刻度上使用CPG載體(裝載72 μmol/g)進行WV-7107之合成。該製程由五個步驟組成：去三苯甲基化、偶合、封端1、氧化/硫醇化及封端2。 使用3% DCA/甲苯用設定於436 nm下之UV觀測命令進行去三苯甲基化。去三苯甲基化之後，將至少4個管柱體積(CV)之ACN用於洗去去三苯甲基化試劑。 準備所有胺基磷酸酯及活化劑溶液(CMIMT及ETT)，且在合成之前經3Å分子篩乾燥至少4個小時。 使用0.2 M胺基酸酯溶液及0.6 M CMIMT進行立體限定之胺基酸酯偶合。將除dC-L及dC-D胺基酸酯外之所有胺基酸酯溶解於ACN中，將dC-L及dC-D胺基酸酯溶解於異丁腈(IBN)中。將立體限定MOE胺基酸酯溶解於20% IBN/ACN v/v中。將CMIMT溶解於ACN中。在添加至管柱之前，使用4當量，藉由協調地混合40% (按體積計)之各別胺基酸酯溶液與67%之CMIMT活化劑進行偶合。隨後使偶合混合物再循環最少10分鐘以最大化耦合效率。 使用0.2 M胺基酸酯溶液及0.6 M ETT/ACN進行標準立體無規胺基酸酯偶合。將MOE-T胺基酸酯溶解於20% IBN/ACN v/v中。在添加至管柱之前，使用4當量，藉由協調地混合40% (按體積計)之各別胺基酸酯溶液與60%之ETT活化劑進行偶合。隨後使偶合混合物再循環最少6分鐘以最大化耦合效率。 兩個實例中，皆在偶合之後用2CV之ACN洗滌管柱。 對於立體限定偶合，隨後用1 CV之封端1溶液(乙酸酐、二甲基吡啶、ACN)處理管柱，以在4分鐘內乙醯化對掌性助劑胺。在此步驟之後，用至少2 CV之ACN洗滌管柱。隨後用2 CV之0.2 M氫化黃原素/吡啶以6 min之接觸時間進行硫醇化。在使用ACN之2 CV硫醇化洗滌步驟之後，使用0.5 CV之經協調混合的封端A及封端B試劑(1:1)進行封端2，繼之以2 CV ACN洗滌。 對於立體無規偶合循環，不存在封端1步驟。使用50 mM碘/Pyridine/H2O (9:1)進行氧化2.5 min，3.5當量。在2CV ACN洗滌之後，使用0.5 CV之經協調混合的封端A及封端B試劑(1:1)進行封端2，繼之以2 CV ACN洗液。 WV-7107之裂解及脫除保護基： 將上文合成之物質之67% (或2200 µmol)用於此步驟。藉由用以39:8:1:2.5之v/v比率混合DMSO、水、TEA及TEA.3HF製得的1 M TEA.HF溶液處理寡核苷酸結合固體載體來去除WV-7107上之DPSE保護基，以用每毫莫耳寡核苷酸製得100 mL溶液。隨後在25℃下於保溫振盪器中振盪混合物6小時。冷卻(冰浴)混合物，隨後每毫莫耳寡核苷酸添加200 mL氨水。隨後在45℃下搖晃混合物16小時。隨後過濾(0.2-1.2 µm過濾器)混合物，且用水沖洗濾餅。獲得濾液，且藉由UPLC分析，獲得30.8% FLP之純度。使用一種光譜光度計Nano Drop(Thermo Scientific)完成定量，且獲得約101,200 OD/mmol之產量。 WV-7107之純化及去鹽： 將粗產物-7107裝載至組裝有Source 15Q之Agilent Load&Lock管柱(5 cm×32 cm) (GE Healthcare)上。使用20 mM NaOH及2.5 M NaCl作為溶離劑於ÄKTA 150 Pure (GE Healthcare)上進行純化。分析溶離份，且進行彙集以獲得具有≥70%純度之物質。隨後於2K再生纖維素膜上使經純化物質去鹽，繼之以凍乾以獲得呈白色粉末狀之WV-7107。隨後將此物質用於結合實驗。實例 37B . WV - 6558 之合成 GalNAc結合之方案 前驅體材料：WV-7107.03 最終結合產物：WV-6558.03 用於結合之試劑 表2：寡核苷酸水溶液 稱量1-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)-16,16-雙((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,11,18-三側氧基-14-氧雜-6,10,17-三氮二十九烷-29-酸(1.6當量)及HATU (1.4當量)，且轉移至50 ml塑膠管。將材料溶解於無水乙腈中，隨後添加DIEA (d=0.742)(10當量)至管中。在37℃下攪拌透明混合物20 min。用8 mL水使凍乾WV-7107樣品復原至濃度50 mg/mL。隨後將GalNac混合物添加至樣品WV-7107且在37℃下攪拌60 min。藉由UPLC監測反應進程。在培育1 h之後，反應完全。真空濃縮(藉由速度真空)溶液以去除乙腈，且用濃縮氫氧化銨(5 mL)處理所得GalNAc結合寡核苷酸以藉由在37℃下培育1 h來脫除保護基。藉由UPLC及質譜分析證實形成最終產物WV-6558。藉由陰離子交換層析純化經結合之樣品。觀測之質量：8802.4 (解卷積)，目標質量：8801.6。實例 37C. WV-9542 之合成 PFE結合之方案 前驅體材料：WV-7107.02 最終結合產物：WV-9542.01 用於結合之試劑 表2：寡核苷酸水溶液 稱量三觸PFE ASGPR配體(18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮三十一烷-31-酸) (1.6當量)及HATU (1.2當量)，且轉移至50 mL管。將材料溶解於無水二甲基甲醯胺中，隨後將DIEA (d=0.742)(10當量)添加至管中。音波處理溶液直至其變得透明為止，且在37℃下攪拌20 min。用13 mL水使WV-7107樣品復原。隨後將三觸PFE配體混合物添加至樣品WV-7107，且在37℃下攪拌1小時。藉由UPLC監測反應進程。在1小時培育之後，反應不完全。稱量第二次添加之三觸PFE配體(1.2當量)及HATU (1當量)，且溶解於5 mL DMF與DIEA (15當量)中。在37℃下培育配體20 min以進行活化。隨後將經活化配體添加至反應混合物，且在37℃下培育1小時。反應完成，且藉由UPLC及質譜分析證實形成最終產物WV-9542。藉由陰離子交換層析純化經結合之樣品。觀測之質量：8837.6 (解卷積)，目標質量：8837.6。實例 37D. WV-9543 之合成 PFE結合之方案 前驅體材料：WV-7107.02 最終結合產物：WV-9543.01 用於結合之試劑 表2：寡核苷酸水溶液 稱量雙觸GalNAc (1-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)-16-((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,11,18-三側氧基-14-氧雜-6,10,17-三氮二十九烷-29-酸) (2.0當量)及HATU (1.8當量)，且轉移至50 mL管。將材料溶解於無水二甲基甲醯胺(1.5 mL)中，隨後添加DIEA (d=0.742)(10當量)至管中。音波處理溶液直至其變得透明為止，且在37℃下攪拌20 min。用1.5 mL水使WV-7107樣品復原。隨後將雙觸GalNAc混合物添加至樣品WV-7107，且在37℃下攪拌1小時。藉由UPLC監測反應進程。在1小時培育之後，反應完成。用濃縮氫氧化銨(2 mL)處理混合物以藉由在37℃下培育1 h來脫除保護基。藉由UPLC及質譜分析證實形成最終產物WV-9543。藉由陰離子交換層析純化經結合之樣品。觀測之質量：8342.6 (解卷積)，目標質量：8340.1。實例 37E. WV-9544 之合成 PFE結合之方案 前驅體材料：WV-7107.02 最終結合產物：WV-9544.01 用於結合之試劑 表2：寡核苷酸水溶液 稱量雙觸PFE ASGPR配體(18-(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮三十一烷-31-酸) (2.0當量)及HATU (1.8當量)，且轉移至50 mL管。將材料溶解於無水二甲基甲醯胺(1.5 mL)中，隨後將DIEA (d=0.742)(10當量)添加至管中。音波處理溶液直至其變得透明為止，且在37℃下攪拌20 min。用1.5 mL水使WV-7107樣品復原。隨後將雙觸PFE ASGPR配體混合物添加至樣品WV-7107，且在37℃下攪拌1小時。藉由UPLC監測反應進程。在1小時培育之後，反應完成。藉由UPLC及質譜分析證實形成最終產物WV-9544。藉由陰離子交換層析純化經結合之樣品。觀測之質量：8367.2 (解卷積)，目標質量：8364.1。實例 37F. WV-9545 之合成 PFE結合之方案 前驅體材料：WV-7107.02 最終結合產物：WV-9545.01 用於結合之試劑 表2：寡核苷酸水溶液 稱量單GalNAc (1-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)-5,11,18-三側氧基-14-氧雜-6,10,17-三氮二十九烷-29-酸) (2.0當量)及HATU (1.8當量)，且轉移至50 mL管。將材料溶解於無水二甲基甲醯胺(1.5 mL)中，隨後將DIEA (d=0.742)(10當量)添加至管中。音波處理溶液直至其變得透明為止，且在37℃下攪拌20 min。用1.5 mL水使WV-7107樣品復原。隨後將單GalNAc配體混合物添加至樣品WV-7107，且在37℃下攪拌1小時。藉由UPLC監測反應進程。在1小時培育之後，反應完成。用濃縮氫氧化銨(2 mL)處理混合物以藉由在37℃下培育1 h來脫除保護基。藉由UPLC及質譜分析證實形成最終產物WV-9545。藉由陰離子交換層析純化經結合之樣品。觀測之質量：7881.3 (解卷積)，目標質量：7878.6。實例 37G. WV-9546 之合成 PFE結合之方案 前驅體材料：WV-7107.02 最終結合產物：WV-9546.01 用於結合之試劑 表2：寡核苷酸水溶液 稱量單PFE ASGPR配體(1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮三十一烷-31-酸) (2.0當量)及HATU (1.8當量)，且轉移至50 mL管。將材料溶解於無水二甲基甲醯胺(1.5 mL)中，隨後將DIEA (d=0.742)(10當量)添加至管中。音波處理溶液直至其變得透明為止，且在37℃下攪拌20 min。用1.5 mL水使WV-7107樣品復原。隨後將單GalNAc配體混合物添加至樣品WV-7107，且在37℃下攪拌1小時。藉由UPLC監測反應進程。在1小時培育之後，反應完成。藉由UPLC及質譜分析證實形成最終產物WV-9546。藉由陰離子交換層析純化經結合之樣品。觀測之質量：7893.1 (解卷積)，目標質量：7890.6。實例 37H . IEX 純化條件 對於樣品WV-9542 對於樣品WV-6558、WV-9542至WV-9546 實例 38 . 配體之合成 . 1 -((( 2R , 3R , 4R , 5R , 6R )- 3 - 乙醯胺基 - 4 , 5 - 二乙醯氧基 - 6 -( 乙醯氧基甲基 ) 四氫 - 2H - 哌喃 - 2 - 基 ) 氧基 )- 16 , 16 - 雙 (( 3 -(( 3 -( 5 -((( 2R , 3R , 4R , 5R , 6R )- 3 - 乙醯胺基 - 4 , 5 - 二乙醯氧基 - 6 -( 乙醯氧基甲基 ) 四氫 - 2H - 哌喃 - 2 - 基 ) 氧基 ) 戊醯胺基 ) 丙基 ) 胺基 )- 3 - 側氧基丙氧基 ) 甲基 )- 5 , 11 , 18 - 三側氧基 - 14 - 氧雜 - 6 , 10 , 17 - 三氮二十九烷 - 29 - 酸之合成 步驟 1 ： 向3,3'-((2-胺基-2-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基丙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸二第三丁酯(5.0 g，9.89 mmol)及12-甲氧基-12-側氧基十二烷酸(2.416 g，9.89 mmol)於DMF (45 mL)中之溶液中添加HATU (3.76 g，9.89 mmol)及DIPEA (2.58 ml，14.83 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物5小時。減壓濃縮溶劑，且用鹽水稀釋、用EtOAc萃取、經無水硫酸鈉乾燥及濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO (120 g金矽膠濾筒)純化殘餘物、用10% EtOAc/己烷至40% EtOAc/己烷溶離，得到呈無色油狀物之 3,3'-((2-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-2-(12-甲氧基-12-側氧基十二烷胺基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸二第三丁酯(5.13 g，7.01 mmol，產率70.9%)。1 H NMR (400 MHz, 氯仿-d ) δ 6.03 (s, 1H), 3.74 - 3.61 (m, 15H), 2.45 (t,J = 6.3 Hz, 6H), 2.31 (td,J = 7.5, 3.9 Hz, 2H), 2.19 - 2.10 (m, 2H), 1.64 - 1.59 (m, 4H), 1.46 (s, 27H), 1.32 - 1.24 (m, 12H); MS (ESI), 732.6 (M+H)+。步驟 2 ： 將3,3'-((2-((3-(第三丁氧基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-2-(12-甲氧基-12-側氧基十二烷胺基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸二第三丁酯(5.0 g，6.83 mmol)於甲酸(50 mL)中之溶液在室溫下攪拌48小時。將溶劑減壓蒸發，與甲苯(3×)共蒸發，得到白色固體，將其在高真空下乾燥2天。LC-MS及H NMR顯示反應不完全。將粗產物再溶解於甲酸(50 mL)中。在室溫下攪拌反應混合物24小時。LC-MS顯示反應完全。將溶劑減壓蒸發，與甲苯(3×)共蒸發，在高真空下乾燥，得到呈白色固體狀之3,3'-((2-((2-羧基乙氧基)甲基)-2-(12-甲氧基-12-側氧基十二烷胺基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸(4.00 g)。MS (ESI): 562.4 (M-H)- 。步驟 3 ： 在0℃下向3,3'-((2-((2-羧基乙氧基)甲基)-2-(12-甲氧基-12-側氧基十二烷胺基)丙烷-1,3-二基)雙(氧基))二丙酸(3.85 g，6.83 mmol)及HOBt (3.88 g，28.7 mmol)於DCM (60 mL)及DMF (15 mL)中之溶液中添加(3-胺基丙基)胺基甲酸第三丁酯(4.76 g，27.3 mmol)、EDAC HCl鹽(5.24 g，27.3 mmol)及DIPEA (8.33 ml，47.8 mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌15分鐘且在室溫下攪拌20小時。LC-MS顯示反應不完全。將(3-胺基丙基)胺基甲酸第三丁酯(1.59 g，9.12 mmol)及EDC HCl鹽(1.75 g，9.13 mol)添加至反應混合物。在室溫下持續攪拌反應混合物4小時。蒸發溶劑，得到殘餘物，將其溶解於EtOAc (300 mL)中，用水(1×)、飽和碳酸氫鈉(2×)、10%檸檬酸(2×)及水洗滌，經硫酸鈉乾燥及濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO (80 g金濾筒)純化，用DCM至30% MeOH/DCM溶離，得到呈白色固體狀之15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸甲酯(6.61 g，6.40 mmol，2個步驟後產率為94%)。MS (ESI): 1033.5 (M+H)+。步驟 4 ： 向15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸甲酯(6.56 g，6.35 mmol)於THF (75 mL)中之溶液中添加LiOH (0.457 g，19.06 mmol)於水(25 mL)中之水溶液。在室溫下攪拌混合物隔夜。LC-MS顯示反應完成。蒸發溶劑，使用1 N HCl (45 mL)酸化，用DCM (3×)萃取，經無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到呈白色固體狀之15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸(6.31 g，6.20 mmol，產率98 %)。MS (ESI): 1019.6 (M+H)+ 。步驟 5 ： 向15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸(6.31 g，6.20 mmol)及(溴甲基)苯(1.272 g，7.44 mmol)於DMF (40 mL)中之溶液中添加K2 CO3 (2.57 g，18.59 mmol)。將混合物在40℃下攪拌4小時且在室溫下攪拌隔夜。減壓蒸發溶劑。將反應混合物用EtOAc稀釋，用水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO (80 g濾筒)純化，用DCM至30% MeOH/DCM溶離，得到呈無色油狀物之15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸苯甲酯(6.41 g，5.78 mmol，產率93%)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.80 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 7.39 - 7.30 (m, 5H), 6.95 (s, 1H), 6.74 (t,J = 5.8 Hz, 3H), 5.07 (s, 2H), 3.53 (J,J = 7.3 Hz, 6H), 3.51 (s, 6H), 3.02 (q,J = 6.7 Hz, 6H), 2.94 - 2.85 (m, 6H), 2.29 (dt,J = 26.1, 6.9 Hz, 8H), 2.02 (q,J = 9.7, 8.6 Hz, 2H), 1.56 - 1.39 (m, 10H), 1.35 (s, 27H), 1.20 (brs, 14H); MS (ESI): 1019.6 (M+H)+ 。步驟 6 ： 向15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十八烷-28-酸苯甲酯(2.42 g，2.183 mmol)於DCM (40 mL)中之溶液中添加2,2,2-三氟乙酸(8 ml，105 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。將溶劑減壓蒸發，與甲苯(2×)共蒸發，用醚濕磨，在高真空下乾燥隔夜。在下一步驟直接使用TFA鹽。步驟 7 ： 向5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊酸(3.91 g，8.73 mmol)、HBTU (3.48 g，9.17 mmol)及HOBT (1.239 g，9.17 mmol)於DCM (25 mL)中之溶液中添加DIPEA (6.08 ml，34.9 mmol)，之後添加含12-((1,19-二胺-10-((3-((3-胺基丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,15-二側氧基-8,12-二氧雜-4,16-二氮十九烷-10-基)胺基)-12-側氧基十二烷酸苯甲酯(1.764 g，2.183 mmol)之DMF (4.0 mL)。在室溫下攪拌混合物5小時。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，藉由ISCO (40 g金管柱)純化，用5管柱值之5% MeOH/DCM溶離以去除HOBt，之後用5%至30% MeOH/DCM溶離，得到呈白色固體狀之1-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)-16,16-雙((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,11,18-三側氧基-14-氧雜-6,10,17-三氮二十九烷-29-酸苯甲酯(3.98 g，產率87%)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.82 - 7.74 (m, 6H), 7.69 (t,J = 5.6 Hz, 3H), 7.33-7.27 (m, 5H), 6.94 (s, 1H), 5.16 (d,J = 3.4 Hz, 3H), 5.03 (s, 2H), 4.92 (dd,J = 11.2, 3.4 Hz, 3H), 4.43 (d,J = 8.4 Hz, 3H), 4.02 - 3.95 (m, 9H), 3.82 (dt,J = 11.2, 8.8 Hz, 3H), 3.65 (dt,J = 10.5, 5.6 Hz, 3H), 3.51 - 3.44 (m, 12 H), 3.36 (dt,J = 9.6, 6.0 Hz, 3H), 3.01 - 2.95 (m, 12H), 2.29 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 2.23 (t,J = 6.3 Hz, 6H), 2.05 (s, 9H), 1.99 (t,J = 7.0 Hz, 8H), 1.94 (s, 9H), 1.84 (s, 9H), 1.72 (s, 9H), 1.50 - 1.14 (m, 34H); MS (ESI): 1049.0 (M/2+H)+。步驟 8 ： 向用Ar沖洗之圓底燒瓶中添加10% Pd/C (165 mg，0.835 mmol)及EtOAc (15 mL)。添加受苯甲基保護之參GalNAc (1.75 g，0.835 mmol)於甲醇(15 mL)中之溶液，之後逐滴添加三乙基矽烷(2.67 ml，16.70 mmol)。在室溫下攪拌混合物3小時。LC-MS顯示反應完全，用EtOAc稀釋，且經由矽藻土過濾，用20% MeOH/EtOAc洗滌，減壓濃縮，得到呈白色固體狀之1-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)-16,16-雙((3-((3-(5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2-基)氧基)戊醯胺基)丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,11,18-三側氧基-14-氧雜-6,10,17-三氮二十九烷-29-酸(1.67 g，0.832 mmol，產率100%)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.95 (s, 1H), 7.83 - 7.74 (m, 6H), 7.69 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 6.93 (s, 1H), 5.16 (d,J = 3.4 Hz, 3H), 4.92 (dd,J = 11.2, 3.4 Hz, 3H), 4.43 (d,J = 8.4 Hz, 3H), 4.01 - 3.94 (m, 9H), 3.82 (dt,J = 11.3, 8.8 Hz, 3H), 3.66 (dt,J = 10.7, 5.6 Hz, 3H), 3.54 - 3.43 (m, 12H), 3.41 - 3.33 (m, 3H), 3.03 - 2.94 (m, 12H), 2.24 (t,J = 7.4 Hz, 10H), 2.14 (t,J = 7.4 Hz, 2H), 2.06 (s, 9H), 2.00 (t,J = 7.2 Hz, 8H), 1.95 (s, 9H), 1.84 (s, 9H), 1.73 (s, 9H), 1.51 - 1.14 (m, 34H). MS (ESI): 1003.8 (M/2+H)+.實例 39 . 配體之合成 . 18 , 18 - 雙 ( 17 -(( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 - 乙醯胺基 - 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 )- 5 , 11 - 二側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 6 , 10 - 二氮十七基 )- 1 -(( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 - 乙醯胺基 - 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 )- 7 , 13 , 20 - 三側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 8 , 12 , 19 - 三氮二十四烷 - 24 - 酸之合成 步驟 1 ： 向5-溴戊酸第三丁酯(4.0 g，16.87 mmol)於丙酮(80 mL)中之溶液中添加NaI (7.59 g，50.6 mmol)。在57℃下攪拌反應混合物2小時，過濾，且用EtOAc洗滌。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，將其溶解於EtOAc中，用水、鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥，濃縮，得到殘餘物，藉由ISCO (40 g管柱)純化，用20% EtOAc/己烷至50% EtOAc/己烷溶離，得到呈黃色油狀物之5-碘戊酸第三丁酯6 (4.54 g，15.98 mmol，產率95%)。1 H NMR (500 MHz, 氯仿-d ) δ 3.19 (t,J = 6.9 Hz, 2H), 2.24 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 1.86 (p,J = 7.1 Hz, 2H), 1.70 (p,J = 7.4 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H)。步驟 2 ： 向N-((1S,2R,3R,4R,5S)-2,3-二羥基-1-(羥甲基)-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-4-基)乙醯胺(600 mg，2.57 mmol)於DMF (15 mL)中之溶液中添加2,2-二甲氧基丙烷(2087 μl，17.03 mmol)，之後添加(+/-)-樟腦-10-磺酸(264 mg，1.135 mmol)。在70℃下攪拌反應混合物24小時。使反應混合物冷卻至室溫，且隨後添加甲醇(2.5 mL)。在室溫下攪拌反應混合物30分鐘且用TEA (0.10 mL)中和。蒸發溶劑且將殘餘物與甲苯共蒸發。藉由ISCO (24 g金)純化殘餘物，用EtOAc至10% MeOH/EtOAc溶離，得到N-((3aR,4S,7S,8R,8aR)-4-(羥基甲基)-2,2-二甲基六氫-4,7-環氧樹脂[1,3]二氧雜環戊并[4,5-d]氧呯-8-基)乙醯胺7 (666 mg，2.437 mmol，產率95%)。1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.09 (d,J = 8.1 Hz, 1H), 5.15 - 5.05 (m, 2H), 4.26 (d,J = 5.8 Hz, 1H), 4.09 (dd,J = 7.3, 5.8 Hz, 1H), 3.80 - 3.60 (m, 5H), 1.83 (s, 3H), 1.37 (s, 3H), 1.26 (s, 3H); MS, 274.3 (M+H)+。步驟 3 ： 向5-碘戊酸第三丁酯(1310 mg，4.61 mmol)及N-((3aR,4S,7S,8R,8aR)-4-(羥基甲基)-2,2-二甲基六氫-47-環氧樹脂[1,3]二氧雜環戊并[4,5-d]氧呯-8-基)乙醯胺7 (420 mg，1.537 mmol)於DCM (10.5 mL)中之溶液中添加四丁基硫酸氫銨(783 mg，2.305 mmol)，之後添加12.5 M氫氧化鈉溶液(7 mL)。在室溫下攪拌反應混合物24小時。用DCM及水稀釋反應混合物，且用DCM (2×)萃取。 用1 N HCl溶液洗滌有機層，且經硫酸鈉乾燥。減壓濃縮溶劑，得到殘餘物。向所得粗物質中添加乙酸乙酯(30 mL)且音波處理5分鐘。過濾所得沈澱物，用乙酸乙酯(10 mL×2)洗滌。LC-MS顯示過濾器不含有所需產物而為四丁銨鹽。減壓濃縮濾液,得到殘餘物，藉由ISCO (40 g金矽膠濾筒)純化，用50% EtOAc/己烷至EtOAc溶離，得到呈淺黃色油狀物之5-(((3aR,4S,7S,8R,8aR)-8-乙醯胺基-2,2-二甲基六氫-4,7-環氧樹脂[1,3]二氧雜環戊并[4,5-d]氧呯-4-基)甲氧基)戊酸第三丁酯(0.470 g，1.094 mmol，產率71.2%)。1 H NMR (500 MHz,氯仿-d ) δ 5.56 (d,J = 9.1 Hz, 1H), 4.21 (d,J = 5.9 Hz, 1H), 4.12 (dtd,J = 7.7, 3.8, 1.7 Hz, 1H), 3.99 (t,J = 6.3 Hz, 1H), 3.90 (d,J = 9.5 Hz, 1H), 3.77 (d,J = 2.0 Hz, 2H), 3.67 (d,J = 9.5 Hz, 1H), 3.52 (ddt,J = 30.5, 9.2, 5.8 Hz, 2H), 2.23 (t,J = 7.1 Hz, 2H), 2.03 (d,J = 14.5 Hz, 3H), 1.65 - 1.55 (m, 7H), 1.44 (s, 9H), 1.35 (s, 3H); MS, 452.4 (M+Na)+。步驟 4 ： 向15,15-雙(13,13-二甲基-5,11-二側氧基-2,12-二氧雜-6,10-二氮十四基)-2,2-二甲基-4,10,17-三側氧基-3,13-二氧雜-5,9,16-三氮二十一烷-21-酸苯甲酯(0.168 g，0.166 mmol)於DCM (3 mL)中之溶液中添加TFA (3 mL)。在室溫下攪拌反應混合物3小時。LC-MS顯示反應完成。減壓蒸發溶劑，得到呈無色油狀物之5-((1,19-二胺-10-((3-((3-胺基丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,15-二側氧基-8,12-二氧雜-4,16-二氮十九烷-10-基)胺基)-5-側氧基戊酸苯甲酯。MS, 710.5 (M+H)+。其不經純化即直接用於下一步驟。步驟 5 ： 向5-(((3aR,4S,7S,8R,8aR)-8-乙醯胺基-2,2-二甲基六氫-4,7-環氧樹脂[1,3]二氧雜環戊并[4,5-d]氧呯-4-基)甲氧基)戊酸第三丁酯(285 mg，0.664 mmol)於DCM (5 mL)中之溶液中添加TFA (5 mL)，在室溫下攪拌4小時。LC-MS顯示反應完全。蒸發溶劑，得到5-(((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)甲氧基)戊酸。MS (ESI): 334.3 (M+H)+。其不經純化即直接用於下一步驟。步驟 6 ： 向5-(((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)甲氧基)戊酸(221 mg，0.664 mmol)於DCM (10 mL)中之溶液中添加DIPEA (2313 μl，13.28 mmol)、HBTU (208 mg，0.548 mmol)、HOBT (67.3 mg，0.498 mmol)、5-((1,19-二胺-10-((3-((3-胺基丙基)胺基)-3-側氧基丙氧基)甲基)-5,15-二側氧基-8,12-二氧雜-4,16-二氮十九烷-10-基)胺基)-5-側氧基戊酸苯甲酯(118 mg，0.166 mmol) (GL08-02)於DMF (3.0 mL)及DCM (5.0 mL)中之溶液。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。LC-MS顯示所需產物。減壓蒸發溶劑，得到殘餘物，藉由ISCO (24 g金濾筒)純化，用DCM至80% MeOH/DCM溶離，得到18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮二十四烷-24-酸苯甲酯(272 mg，0.164 mmol，產率99%) (管30至42處之產物(40% MeOH/DCM至60% MeOH/DCM))。1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.89 (d,J = 7.8 Hz, 3H), 7.81 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 7.75 (s, 3H), 7.34 (q,J = 7.5, 6.9 Hz, 5H), 7.05 (s, 1 H), 5.07 (s, 5H), 4.83 (d,J = 5.3 Hz, 3H), 4.56 (d,J = 7.1 Hz, 3H), 3.73 (dd,J = 23.3, 9.2 Hz, 6H), 3.64 (d,J = 7.0 Hz, 6H), 3.58 - 3.35 (m, 27H), 3.02 (p,J = 6.2 Hz, 12H), 2.33 (t,J = 7.6 Hz, 2H), 2.26 (t,J = 6.4 Hz, 6H), 2.10 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.04 (t,J = 7.4 Hz, 6 H), 1.82 (s, 9H), 1.72 (q,J = 7.6 Hz, 2H), 1.52 - 1.39 (m, 18 H); MS (ESI), 1656.3 (M+H)+ 。步驟 7 ： 向18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮二十四烷-24-酸苯甲酯(270 mg，0.163 mmol)於EtOAc (10 mL)中之溶液中添加10% Pd-C (50 mg)及MeOH (5.0 mL)以及三乙基矽烷(1042 μl，6.52 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，過濾且濃縮，得到呈白色固體狀之18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮二十四烷-24-酸(246 mg，0.157 mmol，產率96%)。1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.99 (brs, 1 H), 7.89 (d,J = 7.9 Hz, 3H), 7.82 (t,J = 5.4 Hz, 3H), 7.75 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 7.03 (s, 1 H), 5.07 (d,J = 1.6 Hz, 3H), 4.83 (brs, 3H), 4.56 (brs, 3H), 3.79 - 3.68 (m, 6H), 3.64 (d,J = 7.2 Hz, 6H), 3.58 - 3.34 (m, 27 H), 3.02 (p,J = 6.3 Hz, 12 H), 2.27 (t,J = 6.4 Hz, 6H), 2.17 (t,J = 7.5 Hz, 2H), 2.08 (t,J = 7.5 Hz, 2 H), 2.04 (t,J = 7.3 Hz, 6H), 1.82 (s, 9H), 1.65 (p,J = 7.5 Hz, 2 H), 1.54 - 1.40 (m, 18 H); MS(ESI), 1566.3 (M+H)+。實例 40.配體之合成 .18 , 18 - 雙 ( 17 -(( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 - 乙醯胺基 - 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 )- 5 , 11 - 二側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 6 , 10 - 二氮十七基 )- 1 -(( 1S , 2R , 3R , 4R , 5S )- 4 - 乙醯胺基 - 2 , 3 - 二羥基 - 6 , 8 - 二氧雙環 [ 3 . 2 . 1 ] 辛 - 1 - 基 )- 7 , 13 , 20 - 三側氧基 - 2 , 16 - 二氧雜 - 8 , 12 , 19 - 三氮三十一烷 - 31 - 酸之合成 使用與18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮二十四烷-24-酸相同之程序合成18,18-雙(17-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-5,11-二側氧基-2,16-二氧雜-6,10-二氮十七基)-1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-乙醯胺基-2,3-二羥基-6,8-二氧雙環[3.2.1]辛-1-基)-7,13,20-三側氧基-2,16-二氧雜-8,12,19-三氮三十一烷-31-酸。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.90 (d,J = 7.8 Hz, 3H), 7.83 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 7.76 (t,J = 5.7 Hz, 3H), 6.98 (d,J = 6.2 Hz, 1H), 5.09 (s, 3H), 3.81 - 3.69 (m, 6H), 3.69 - 3.62 (m, 6H), 3.62 - 3.40 (m, 24H), 3.04 (p,J = 6.1 Hz, 9H), 2.28 (t,J = 6.4 Hz, 4H), 2.18 (t,J = 7.3 Hz, 2H), 2.06 (t,J = 7.7 Hz, 6H), 1.84 (s, 6H), 1.48 (tq,J = 14.9, 7.4 Hz, 16H), 1.23 (s, 8H). MS(ESI), 1664.0 (M+H)+ 。等效物
在已描述了本發明之一些說明性實施例之後，熟習此項技術者應清楚，以上內容僅為說明性的且非限制性的，僅為舉例而呈現。大量修改及其他說明性實施例在一般熟習此項技術者之範疇內且皆涵蓋落入本發明之範疇內。特定言之，雖然本文中所呈現之實例中之多者涉及方法動作或系統要素之特定組合，但應瞭解，彼等動作及彼等要素可以其他方式組合來實現相同目標。不欲自其他實施例中之類似角色中排除所論述之僅與一個實施例相關的動作、要素及特徵。另外，對於列舉之一或多種含義加功能限制，例如在所主張之發明中，若存在，則該含義不欲受限於本文中經揭示用於執行所列舉功能之含義，而是打算覆蓋範疇中之任何當經已知或稍後出現的用於執行所列舉功能之含義。
在申請專利範圍中使用諸如「第一」、「第二」、「第三」等序數術語修飾請求項要素本身不意味著一個請求項要素相對於另一請求項要素的任何優先權、優先性或次序或執行方法動作之時間次序，而是僅用作標籤以區分具有某一名稱之一個請求項要素與具有相同名稱(但使用序數術語)之另一要素以便區分該等請求項要素。類似地，使用a)、b)等或i)、ii)等本身不意味著申請專利範圍中之步驟的任何優先權、優先性或次序。類似地，在說明書中使用此等術語本身不意味著任何所要求之優先權、優先性或次序。亦不使用任何此等術語指示所描述(包括所主張之)發明中之元件的數目。
前述書面說明書足以使熟習此項技術者能夠實施本發明中描述之任何發明。本發明之範疇不限於所提供之實例，該等實例欲用作所描述發明之一或多個態樣之說明，且其他功能上等效之實施例在所描述發明之範疇內。熟習此項技術者將自前述描述顯而易知除本文中所示及所描述之彼等修飾外的所描述發明之各種修飾，且該等修飾處於所描述發明之範疇內。所描述發明之各實施例未必涵蓋所描述發明之優勢及目標。
前述書面說明書被認為足以使熟習此項技術者能夠實施本發明。本發明的範疇不限於所提供之實例，因為該等實例欲作為本發明之一個態樣之單一說明，且其他功能上等效之實施例在本發明之範疇內。熟習此項技術者將自前述描述顯而易知除本文中所示及所描述之彼等修飾外的本發明之各種修飾，且該等修飾處於隨附實施例之範疇內。本發明之各實施例未必涵蓋本發明之優勢及目標。
在整個本申請案中，提及多個公開案。出於所有目的，此等公開案之全部揭示內容以引用之方式併入本申請案中。實施例 1.一種化合物，其具有式O1： Y1 -L1 -(Z10 )za O1 或該化合物之醫藥學上可接受之鹽，其中Y1 為靶向PNPLA3之寡核苷酸； za為1、2或3；且 L1 為式L11、式L12、式L13、式L43、式L44、式L45、式L46、式L47、式L48、式L49、式L50、式L51、式L52、式L53或式L54之化合物，其中與Y1 及Z10 之連接位點經指定： 其中各T1 獨立地不存在或為伸烷基、伸烯基或伸炔基，其中該伸烷基、伸烯基或伸炔基之一或多個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-及-N(R49 )-之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各Q1 獨立地不存在或為-C(O)-、-C(O)-NR49 -、-NR49 -C(O)-、-O-C(O)-NR49 -、-NR49 -C(O)-O-、-CH2 -、-NR49 C(O)NR49 -、二價雜芳基或選自-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2 -及-NR49 -之雜原子基團，其中至少兩個碳原子將該等雜原子基團-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2 -及-NR49 -與任何其他雜原子基團間隔開；或為具有下式之結構：其中R53 為-O或-NH-，且R54 為-O或-S； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代，且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； R53 為-O或-NH； R54 為-O或-S； 各n獨立地為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40；其中若n大於0，則各(T1 -Q1 -T1 -Q1 )中之各T1 及各Q1 獨立地經選擇；且 各Z10 獨立地為式Z12、式Z13、式Z14、式Z15、式Z16、式Z17、式Z18、式Z19、式Z20或式Z21之化合物，或其幾何或位置異構體，其中與L1 之連接位點經指定：；其中各R46 獨立地為-CN、-CH2 -CN、-C≡CH、-CH2 -N3 、-CH2 -NH2 、-CH2 -N(R52 )-S(O)2 -R51 、-CH2 -CO2 H、-CO2 H、-CH2 -OH、-CH2 -SH、-CH=CH-R51 、-CH2 -R51 、-CH2 -S-R51 、-CH2 -N(R52 )-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-O-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-N(R52 )-R51 、-CH2 -O-R51 、-CH2 -O-C(O)-R51 、-CH2 -O-C(O)-N(R52 )-R51 、-CH2 -O-C(O)-O-R51 、-CH2 -S(O)-R51 、-CH2 -S(O)2 -R51 、-CH2 -S(O)2 -N(R52 )-R51 、-C(O)-NH2 、-C(O)-O-R51 、-C(O)-N(R52 )-R51 或芳基或雜芳基，其中該芳基或雜芳基視情況經R51 取代 各R47 獨立地為-OH、-N3 、-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-R48 、-N(R48 )-C(O)-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-OR48 、-N(R48 )-S(O)2 -R48 、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R48 取代； 各R48 獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之-(C3 -C6 )環烷基、-(C1 -C5 )烯基、-(C1 -C5 )炔基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )烯基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之-CH2 -基團可各自獨立地經選自-O-、-S-及-N(R52 )-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R52 )2 、-OR52 及-S(R52 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R51 獨立地為-H、-(C3 -C20 )環烷基、-(C1 -C60 )烯基、-(C1 -C60 )炔基或-(C1 -C60 )烷基，其中該環烷基之一至六個-CH2 -基團或該烷基之一至二十個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-及-N(R49 )-之雜原子置換，其中該等雜原子由至少兩個碳原子間隔開，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開，且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代；且 各R52 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基、-(C1 -C20 )烯基、-(C1 -C20 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-或-N(R49 )-之雜原子置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代。 2.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 包含至少15個鹼基。 3.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 之鹼基序列包含或為表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列，或Y1 之鹼基序列包含表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之序列中的15個連續鹼基。 4.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 包含至少1個磷酸二酯核苷酸間鍵聯。 5.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯。 6.如前述實施例中任一者之化合物，Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為對掌性受控硫代磷酸酯。 7.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為呈Sp組態之對掌性受控硫代磷酸酯。 8.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為呈Rp組態之對掌性受控硫代磷酸酯。 9.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 ，其中該對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯或對掌性受控硫代磷酸酯包含在該組合物內具有至少70%非對映異構純度之磷對掌性中心。 10.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 ，其中該對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯或對掌性受控硫代磷酸酯包含具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%非對映異構純度之磷對掌性中心。 11.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 包含至少1個糖修飾。 12.如前述實施例中任一者之化合物，Y1 包含至少1個鹼基修飾。 13.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 進一步包含主鏈鍵聯模式。 14.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 進一步包含主鏈對掌性中心模式。 15. 如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 進一步包含化學修飾模式。 16.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 進一步包含主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及化學修飾模式。 17. 如前述實施例中任一者之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈鍵聯模式、該主鏈對掌性中心模式及該化學修飾模式為表1A中所列之任何寡核苷酸中的寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式。 18.如前述實施例中任一者之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈鍵聯模式、該主鏈對掌性中心模式及該化學修飾模式為表1A中所列之寡核苷酸的寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式，Y1 之鹼基序列包含或為表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列，或Y1 之鹼基序列包含表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之序列中的15個連續鹼基。 19.如前述實施例中任一者之化合物，其中該寡核苷酸能夠介導PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性的降低。 20.如前述實施例中任一者之化合物，其中該寡核苷酸能夠經由藉由RNaseH、位阻及/或RNA干擾介導之機制來介導PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性的降低。 21.如前述實施例中任一者之化合物，其中： 各T1 獨立地不存在或為伸烷基，其中該伸烷基之一或多個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-及-N(R49 )-之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各Q1 獨立地不存在或為-C(O)、-C(O)-NR49 、-NR49 -C(O)或選自-O-及-NR49 之雜原子基團，其中至少兩個碳原子將該等雜原子基團-O-及-NR49 與任何其他雜原子基團間隔開； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代； 各n獨立地為0、1、2、3或4；其中若n大於0，則各(T1 -Q1 -T1 -Q1 )中之各T1 及各Q1 獨立地經選擇； 各R46 為-CH2 -OH； 各R47 為-N(R48 )-C(O)-R48 ；且 各R48 獨立地為-H或-(C1 -C5 )烷基。 22.一種化合物，其具有式O2： Y1 -L2 -(Z11 )za O2 或其醫藥學上可接受之鹽，其中Y1 為靶向PNPLA3之寡核苷酸； za為1、2或3； L2 為連接基團；且 Z11 為式(B)化合物，其中與L2 之連接位點經指定：； 各R47 獨立地為-OH、-N3 、-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-R48 、-N(R48 )-C(O)-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-OR48 、-N(R48 )-S(O)2 -R48 、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R48 取代； 各R48 獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之-(C3 -C6 )環烷基、-(C1 -C5 )烯基、-(C1 -C5 )炔基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )烯基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之-CH2 -基團可各自獨立地經選自-O-、-S-及-N(R52 )-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R52 )2 、-OR52 及-S(R52 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代，且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； 各R52 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基、-(C1 -C20 )烯基、-(C1 -C20 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-或-N(R49 )-之雜原子置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代。 23.如前述技術方案中任一者之化合物，其中L2 為式L1、式L2、式L3、式L4、式L5、式L6、式L7、式L8、式L9、式L10、式L11、式L12、式L13或式L14之化合物，其中與Y1 及Z11 之連接位點經指定： 其中各T1 獨立地不存在或為伸烷基、伸烯基或伸炔基，其中該伸烷基、伸烯基或伸炔基之一或多個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-及-N(R49 )-之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各Q1 獨立地不存在或為-C(O)-、-C(O)-NR49 -、-NR49 -C(O)-、-O-C(O)-NR49 -、-NR49 -C(O)-O-、-CH2 -、-NR49 C(O)NR49 -、二價雜芳基或選自-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2 -及-NR49 -之雜原子基團，其中至少兩個碳原子將該等雜原子基團-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2 -及-NR49 -與任何其他雜原子基團間隔開；或為具有下式之結構：其中R53 為-O或-NH，且R54 為-O或-S； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代；且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； R53 為-O或-NH； R54 為-O或-S；且 各n獨立地為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40；其中若n大於0，則各(T1 -Q1 -T1 -Q1 )中之各T1 及各Q1 獨立地經選擇。 24.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 包含至少15個鹼基。 25.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 之鹼基序列包含或為表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列，或Y1 之鹼基序列包含表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之序列中的15個連續鹼基。 26.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 包含至少1個磷酸二酯核苷酸間鍵聯。 27.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯。 28.如前述實施例中任一者之化合物，Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為對掌性受控硫代磷酸酯。 29.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為呈Sp組態之對掌性受控硫代磷酸酯。 30.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為呈Rp組態之對掌性受控硫代磷酸酯。 31.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 ，其中該對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯或對掌性受控硫代磷酸酯包含在該組合物內具有至少70%非對映異構純度之磷對掌性中心。 32.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 ，其中該對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯或對掌性受控硫代磷酸酯包含具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%非對映異構純度之磷對掌性中心。 33.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 包含至少1個糖修飾。 34.如前述實施例中任一者之化合物，其中Y1 包含至少1個鹼基修飾。 35.如前述實施例中任一者之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈鍵聯模式為表1A中所列之任何寡核苷酸之主鏈鍵聯模式。 36.如前述實施例中任一者之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈對掌性中心模式為表1A中所列之任何寡核苷酸之主鏈對掌性中心模式。 37.如前述實施例中任一者之化合物，其中該寡核苷酸之該化學修飾模式為表1A中所列之任何寡核苷酸之化學修飾模式。 38.如前述實施例中任一者之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈鍵聯模式、該主鏈對掌性中心模式及/或該化學修飾模式為表1A中所列之任何寡核苷酸中的寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式。 39.如前述實施例中任一者之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈鍵聯模式、該主鏈對掌性中心模式及該化學修飾模式為表1A中所列之任何寡核苷酸中的寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式。 40.如前述實施例中任一者之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈鍵聯模式、該主鏈對掌性中心模式及該化學修飾模式為表1A中所列之寡核苷酸的Y1 之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式，且Y1 之鹼基序列包含或為表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列，或Y1 之鹼基序列包含表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之序列中的15個連續鹼基。 41.如前述實施例中任一者之化合物，其中該寡核苷酸能夠介導PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性的降低。 42.如前述實施例中任一者之化合物，其中該寡核苷酸能夠經由藉由RNaseH、位阻及/或RNA干擾介導之機制來介導PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性的降低。 43.如前述實施例中任一者之化合物，其中： 各R47 為-N(R48 )-C(O)-R48 ；且 各R48 獨立地為-H或-(C1 -C5 )烷基。 44.如前述實施例中任一者之化合物，其中： 各T1 獨立地不存在或為伸烷基，其中 該伸烷基之一或多個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-及-N(R49 )-之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各Q1 獨立地不存在或為C(O)、C(O)-NR49 、NR49 -C(O)或選自O及NR49 之雜原子基團，其中至少兩個碳原子將該等雜原子基團O及NR49 與任何其他雜原子基團間隔開； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代； 各n獨立地為0、1、2、3或4；其中若n大於0，則各(T1 -Q1 -T1 -Q1 )中之各T1 及各Q1 獨立地經選擇。 45.一種組合物，其包含含有以下之化合物：(a)能夠靶向PNPLA3之寡核苷酸；(b)連接基團；及(c) 1、2或3個獨立地選自Z10 及Z11 之部分；其中該連接基團連接該寡核苷酸與該1、2或3個部分，且其中： 各Z10 獨立地為式Z12、式Z13、式Z14、式Z15、式Z16、式Z17、式Z18、式Z19、式Z20或式Z21之化合物，或其幾何或位置異構體，其中與L1 之連接位點經指定：；其中各R46 獨立地為-CN、-CH2 -CN、-C≡CH、-CH2 -N3 、-CH2 -NH2 、-CH2 -N(R52 )-S(O)2 -R51 、-CH2 -CO2 H、-CO2 H、-CH2 -OH、-CH2 -SH、-CH=CH-R51 、-CH2 -R51 、-CH2 -S-R51 、-CH2 -N(R52 )-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-O-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-N(R52 )-R51 、-CH2 -O-R51 、-CH2 -O-C(O)-R51 、-CH2 -O-C(O)-N(R52 )-R51 、-CH2 -O-C(O)-O-R51 、-CH2 -S(O)-R51 、-CH2 -S(O)2 -R51 、-CH2 -S(O)2 -N(R52 )-R51 、-C(O)-NH2 、-C(O)-O-R51 、-C(O)-N(R52 )-R51 或芳基或雜芳基，其中該芳基或雜芳基視情況經R51 取代 各R47 獨立地為-OH、-N3 、-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-R48 、-N(R48 )-C(O)-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-OR48 、-N(R48 )-S(O)2 -R48 、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R48 取代； 各R48 獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之-(C3 -C6 )環烷基、-(C1 -C5 )烯基、-(C1 -C5 )炔基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )烯基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之-CH2 -基團可各自獨立地經選自-O-、-S-及-N(R52 )-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R52 )2 、-OR52 及-S(R52 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R51 獨立地為-H、-(C3 -C20 )環烷基、-(C1 -C60 )烯基、-(C1 -C60 )炔基或-(C1 -C60 )烷基，其中該環烷基之一至六個-CH2 -基團或該烷基之一至二十個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-及-N(R49 )-之雜原子置換，其中該等雜原子由至少兩個碳原子間隔開，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開，且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代；且 各R52 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基、-(C1 -C20 )烯基、-(C1 -C20 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-或-N(R49 )-之雜原子置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代，且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； 各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； 且Z11 為式(B)化合物，其中與L2 之連接位點經指定：； 各R47 獨立地為-OH、-N3 、-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-R48 、-N(R48 )-C(O)-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-OR48 、-N(R48 )-S(O)2 -R48 、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R48 取代； 各R48 獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之-(C3 -C6 )環烷基、-(C1 -C5 )烯基、-(C1 -C5 )炔基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )烯基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之-CH2 -基團可各自獨立地經選自-O-、-S-及-N(R52 )-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R52 )2 、-OR52 及-S(R52 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代，且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； 各R52 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基、-(C1 -C20 )烯基、-(C1 -C20 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-或-N(R49 )-之雜原子置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代。 47.一種對掌性受控PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含特定寡核苷酸類型之寡核苷酸，其特徵在於： a)共同鹼基序列及長度，其中該鹼基序列與PNPLA3靶基因互補； b)共同主鏈鍵聯模式； c)共同主鏈對掌性中心模式，其中該共同主鏈對掌性中心模式包含至少一個包含對掌性受控對掌性中心之核苷酸間鍵聯； 該組合物為對掌性受控的，因為相對於具有相同共同鹼基序列及長度之寡核苷酸的實質上外消旋製劑而言，該組合物中該特定寡核苷酸類型之寡核苷酸增濃；且 其中該寡核苷酸組合物能夠降低PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性。 48.如前述實施例中任一者之化合物，其中該寡核苷酸能夠經由藉由RNaseH、位阻及/或RNA干擾介導之機制來降低PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性。 49.一種組合物，其包含如前述實施例中任一者之化合物。 50.一種組合物，其包含為單股RNAi劑之PNPLA3寡核苷酸，其中該單股RNAi劑與PNPLA3標靶RNA序列互補或實質上互補， 長度為約15至約49個核苷酸，且 能夠導引標靶特異性RNA干擾， 其中該單股RNAi劑包含至少一個非天然鹼基、糖及/或核苷酸間鍵聯，且 其中該組合物能夠降低PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性。 51.如前述實施例中任一者之組合物，其中該一或多個寡核苷酸進一步包含橋聯雙環縮酮。 52.如前述實施例中任一者之組合物，其中RCD 為。 53.如前述實施例中任一者之組合物，其中RCD 為。 54.如前述實施例中任一者之組合物，其中RCD 具有使得RCD −H為以下之結構： 。 55.如前述實施例中任一者之組合物，其中RCD 經由連接基團連接至該一或多個寡核苷酸。 56.如前述實施例中任一者之組合物，其中該連接基團為LM 。 57.如前述實施例中任一者之組合物，其中該連接基團具有以下結構： 。 58.如前述實施例中任一者之組合物，其中RCD 係選自： 。 60.一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如前述實施例中任一者之組合物與至少一種醫藥學上可接受之賦形劑的混合物。 61.如前述實施例中任一者之組合物，其進一步包含選自由消炎劑、抗糖尿病劑及膽固醇/脂質調節劑組成之群之至少一種其他藥劑。 62.如前述實施例中任一者之組合物，其中該其他藥劑係選自由以下組成之群：乙醯基-CoA羧化酶(ACC)抑制劑；二醯甘油O-醯基轉移酶1 (DGAT-1)抑制劑；二醯甘油O-醯基轉移酶2 (DGAT-2)抑制劑；單醯甘油O-醯基轉移酶抑制劑；磷酸二酯酶(PDE)-10抑制劑；AMPK活化劑；磺醯脲；美格替耐(meglitinide)；α-澱粉酶抑制劑；α-葡糖苷水解酶抑制劑；α-葡糖苷酶抑制劑；PPARγ促效劑；PPAR α/γ促效劑；二胍；類升糖素肽1 (GLP-1)調節劑；利拉魯肽(liraglutide)；阿必魯肽(albiglutide)；艾塞那肽(exenatide)；阿必魯肽；利司那肽(lixisenatide)；度拉糖肽(dulaglutide)；司美魯肽(semaglutide)；蛋白質酪胺酸磷酸酶-1B (PTP-1B)抑制劑；SIRT-1活化劑；二肽基肽酶IV (DPP-IV)抑制劑；胰島素促泌素；脂肪酸氧化抑制劑；A2拮抗劑；c-jun胺基端激酶(JNK)抑制劑；葡糖激酶活化劑(GKa)；胰島素；胰島素模擬物；肝糖磷酸化酶抑制劑；VPAC2受體促效劑；SGLT2抑制劑；升糖素受體調節劑；GPR119調節劑；FGF21衍生物或類似物；TGR5受體調節劑；GPBAR1受體調節劑；GPR40促效劑；GPR120調節劑；高親和力菸鹼酸受體(HM74A)活化劑；SGLT1抑制劑；肉鹼軟脂醯基轉移酶之抑制劑或調節劑；果糖1,6-二磷酸酶之抑制劑；醛醣還原酶之抑制劑；鹽皮質激素受體抑制劑；TORC2之抑制劑；CCR2及/或CCR5之抑制劑；PKC同功異型物之抑制劑(例如，PKCα、PKCβ、PKCγ)；脂肪酸合成酶之抑制劑；絲胺酸軟脂醯基轉移酶之抑制劑；GPR81、GPR39、GPR43、GPR41、GPR105、Kv1.3、視黃醇結合蛋白4、糖皮質激素受體、生長抑素受體之調節劑；PDHK2或PDHK4之抑制劑或調節劑；MAP4K4之抑制劑；IL1家族(包括IL1β)之調節劑；HMG-CoA還原酶抑制劑；角鯊烯合成酶抑制劑；纖維酸酯；膽酸螯合劑；ACAT抑制劑；MTP抑制劑；脂加氧酶抑制劑；膽固醇吸收抑制劑；PCSK9調節劑；膽固醇酯轉移蛋白抑制劑及RXRα之調節劑。 63.如前述實施例中任一者之組合物，其進一步包含選自由以下組成之群之至少一種其他藥劑：半胱胺或其醫藥學上可接受之鹽；胱胺或其醫藥學上可接受之鹽；抗氧化劑化合物；卵磷脂；維生素B複合物；膽汁鹽製劑；大麻素-1 (CB1)受體之拮抗劑；大麻素-1 (CB1)受體之反向促效劑；過氧化體增殖物活化受體活性調節劑；苯并噻氮呯(benzothiazepine/benzothiepine)化合物；用以抑制蛋白質酪胺酸磷酸酶PTPRU之RNA反義構築體；雜原子鍵聯之經取代哌啶及其衍生物；能夠抑制硬脂醯基輔酶α δ-9去飽和酶之氮雜環戊烷衍生物；具有脂聯素之促泌素或誘導劑活性的醯胺化合物；季銨化合物；乙酸格拉替雷(Glatiramer acetate)；五聚蛋白；HMG-CoA還原酶抑制劑；正乙醯基半胱胺酸；異黃酮化合物；巨環內酯抗生素；半乳糖凝集素抑制劑；抗體；或其任何組合。 64.一種用於人類之將非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪變性肝炎定級評分系統之嚴重度降低至少一個點、降低非酒精性脂肪變性肝炎活性之血清標記物之含量、降低非酒精性脂肪變性肝炎疾病活性或減少非酒精性脂肪變性肝炎之醫療後果的方法，該方法包含以下步驟：向有需要之患者，向需要此類降低之人類投與治療有效量之如前述實施例中任一者之組合物。 65.一種用於治療人類之以下疾病之方法：脂肪肝、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝纖維化之非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝硬化之非酒精性脂肪變性肝炎或伴隨肝硬化及肝細胞癌之非酒精性脂肪變性肝炎，該方法包含以下步驟：向有需要之患者，向需要此類治療之人類投與治療有效量之如前述實施例中任一者之組合物。 66.一種用於治療人類之以下疾病之方法：高脂質血症、I型糖尿病、II型糖尿病、特發性I型糖尿病(Ib型)、成人隱匿遲發性自體免疫糖尿病(LADA)、早發型2型糖尿病(EOD)、青年發作之非常型糖尿病(YOAD)、青少年發病的成年型糖尿病(MODY)、營養不良相關糖尿病、妊娠期糖尿病、冠心病、缺血性中風、血管成形術後再狹窄、周邊血管疾病、間歇性跛行、心肌梗塞、血脂異常、餐後脂血症、葡萄糖耐受異常病狀(IGT)、空腹血漿葡萄糖異常病狀、代謝性酸中毒、酮症、關節炎、肥胖、骨質疏鬆、高血壓、充血性心臟衰竭、左心室肥大、周邊動脈疾病、糖尿病性視網膜病變、黃斑變性、白內障、糖尿病腎病變、腎小球硬化、慢性腎衰竭、糖尿病神經病變、代謝症候群、症候群X、經前症候群、心絞痛、血栓、動脈粥樣硬化、暫時性腦缺血、中風、血管再狹窄、高血糖症、高胰島素血症、高三酸甘油酯血症、抗胰島素症、葡萄糖代謝減弱、勃起功能障礙、皮膚及結締組織病症、足部潰瘍及潰瘍性結腸炎、內皮細胞功能不良及血管順應性減弱、超apo B脂蛋白血症、阿茲海默氏症(Alzheimer's)、精神分裂症、認知障礙、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)及腸躁症候群、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，該方法包含以下步驟：向有需要之患者，向需要此類治療之人類投與治療有效量之如前述實施例中任一者之組合物。 67.一種用於治療人類之以下疾病之方法：脂肪肝、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝纖維化之非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝硬化之非酒精性脂肪變性肝炎或伴隨肝硬化及肝細胞癌之非酒精性脂肪變性肝炎，該方法包含以下步驟：向需要此類治療之人類投與治療有效量之兩種獨立醫藥組合物，該等醫藥組合物包含 a.如前述實施例中任一者之第一組合物；及 c.第二組合物，其包含選自由消炎劑、抗糖尿病劑及膽固醇/脂質調節劑組成之群之至少一種其他藥劑及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。 68.如前述實施例中任一者之方法，其中該第一組合物及該第二組合物同時投與。 69.如前述實施例中任一者之方法，其中該第一組合物及該第二組合物依序且以任何次序投與。 70. 一種用於降低人類門脈高壓、肝蛋白合成能力、高膽紅素血症或腦病之方法，該方法包含以下步驟：向有需要之患者，向需要此類治療之人類投與治療有效量之如前述實施例中任一者之組合物。 71.一種降低細胞中PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、活性及/或含量之方法，其包含以下步驟：使該細胞與如前述實施例中任一者之化合物或組合物接觸。 72.一種降低患者中PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、活性及/或含量之方法，其包含以下步驟：使細胞與如前述實施例中任一者之化合物或組合物接觸。
圖1.包括圖1A至圖1L之圖1呈現各種ssRNAi型式及混合型式之草圖。
圖2.圖2呈現各種反義寡核苷酸型式之草圖。
圖3.圖3A展示實例多聚體型式。寡核苷酸可直接及/或經由連接基團而接合。如所示，多聚體可包含具有相同或不同結構/類型之寡核苷酸單體。在一些實施例中，多聚體之單體為ssRNAi劑。在一些實施例中，多聚體之單體為RNase H依賴性反義寡核苷酸(ASO)。單體可經由各種位置接合，該等位置例如5'端、3'端或兩者之間的位置。圖3B展示用於接合單體以形成多聚體之實例化學方法，該等單體可經由各種路徑執行其功能。

Claims (70)

  1. 一種化合物，其具有式O1： Y1 -L1 -(Z10 )za O1 或該化合物之醫藥學上可接受之鹽，其中Y1 為靶向PNPLA3之寡核苷酸； za為1、2或3；且 L1 為式L11、式L12、式L13、式L43、式L44、式L45、式L46、式L47、式L48、式L49、式L50、式L51、式L52、式L53或式L54之化合物，其中與Y1 及Z10 之連接位點經指定： 其中各T1 獨立地不存在或為伸烷基、伸烯基或伸炔基，其中該伸烷基、伸烯基或伸炔基之一或多個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-及-N(R49 )-之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各Q1 獨立地不存在或為-C(O)-、-C(O)-NR49 -、-NR49 -C(O)-、-O-C(O)-NR49 -、-NR49 -C(O)-O-、-CH2 -、-NR49 C(O)NR49 -、二價雜芳基或選自-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2 -及-NR49 -之雜原子基團，其中至少兩個碳原子將該等雜原子基團-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2 -及-NR49 -與任何其他雜原子基團間隔開；或為具有下式之結構：其中R53 為-O或-NH-，且R54 為-O或-S； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代，且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； R53 為-O或-NH； R54 為-O或-S； 各n獨立地為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40；其中若n大於0，則各(T1 -Q1 -T1 -Q1 )中之各T1 及各Q1 獨立地經選擇；且 各Z10 獨立地為式Z12、式Z13、式Z14、式Z15、式Z16、式Z17、式Z18、式Z19、式Z20或式Z21之化合物，或其幾何或位置異構體，其中與L1 之連接位點經指定：；其中各R46 獨立地為-CN、-CH2 -CN、-C≡CH、-CH2 -N3 、-CH2 -NH2 、-CH2 -N(R52 )-S(O)2 -R51 、-CH2 -CO2 H、-CO2 H、-CH2 -OH、-CH2 -SH、-CH=CH-R51 、-CH2 -R51 、-CH2 -S-R51 、-CH2 -N(R52 )-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-O-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-N(R52 )-R51 、-CH2 -O-R51 、-CH2 -O-C(O)-R51 、-CH2 -O-C(O)-N(R52 )-R51 、-CH2 -O-C(O)-O-R51 、-CH2 -S(O)-R51 、-CH2 -S(O)2 -R51 、-CH2 -S(O)2 -N(R52 )-R51 、-C(O)-NH2 、-C(O)-O-R51 、-C(O)-N(R52 )-R51 或芳基或雜芳基，其中該芳基或雜芳基視情況經R51 取代 各R47 獨立地為-OH、-N3 、-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-R48 、-N(R48 )-C(O)-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-OR48 、-N(R48 )-S(O)2 -R48 、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R48 取代； 各R48 獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之-(C3 -C6 )環烷基、-(C1 -C5 )烯基、-(C1 -C5 )炔基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )烯基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之-CH2 -基團可各自獨立地經選自-O-、-S-及-N(R52 )-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R52 )2 、-OR52 及-S(R52 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R51 獨立地為-H、-(C3 -C20 )環烷基、-(C1 -C60 )烯基、-(C1 -C60 )炔基或-(C1 -C60 )烷基，其中該環烷基之一至六個-CH2 -基團或該烷基之一至二十個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-及-N(R49 )-之雜原子置換，其中該等雜原子由至少兩個碳原子間隔開，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開，且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代；且 各R52 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基、-(C1 -C20 )烯基、-(C1 -C20 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-或-N(R49 )-之雜原子置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代。
  2. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 包含至少15個鹼基。
  3. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 之鹼基序列包含或為表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列，或Y1 之鹼基序列包含表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之序列中的15個連續鹼基。
  4. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 包含至少1個磷酸二酯核苷酸間鍵聯。
  5. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯。
  6. 如前述請求項中任一項之化合物，Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為對掌性受控硫代磷酸酯。
  7. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為呈Sp組態之對掌性受控硫代磷酸酯。
  8. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為呈Rp組態之對掌性受控硫代磷酸酯。
  9. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 ，其中該對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯或對掌性受控硫代磷酸酯包含在該組合物內具有至少70%非對映異構純度之磷對掌性中心。
  10. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 ，其中該對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯或對掌性受控硫代磷酸酯包含具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%非對映異構純度之磷對掌性中心。
  11. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 包含至少1個糖修飾。
  12. 如前述請求項中任一項之化合物，Y1 包含至少1個鹼基修飾。
  13. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 進一步包含主鏈鍵聯模式。
  14. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 進一步包含主鏈對掌性中心模式。
  15. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 進一步包含化學修飾模式。
  16. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 進一步包含主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及化學修飾模式。
  17. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈鍵聯模式、該主鏈對掌性中心模式及該化學修飾模式為表1A中所列之任何寡核苷酸中的寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式。
  18. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈鍵聯模式、該主鏈對掌性中心模式及該化學修飾模式為表1A中所列之寡核苷酸的寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式，Y1 之鹼基序列包含或為表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列，或Y1 之鹼基序列包含表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之序列中的15個連續鹼基。
  19. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該寡核苷酸能夠介導PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性的降低。
  20. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該寡核苷酸能夠經由藉由RNaseH、位阻及/或RNA干擾介導之機制來介導PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性的降低。
  21. 如前述請求項中任一項之化合物，其中： 各T1 獨立地不存在或為伸烷基，其中該伸烷基之一或多個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-及-N(R49 )-之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各Q1 獨立地不存在或為-C(O)、-C(O)-NR49 、-NR49 -C(O)或選自-O-及-NR49 之雜原子基團，其中至少兩個碳原子將該等雜原子基團-O-及-NR49 與任何其他雜原子基團間隔開； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代； 各n獨立地為0、1、2、3或4；其中若n大於0，則各(T1 -Q1 -T1 -Q1 )中之各T1 及各Q1 獨立地經選擇； 各R46 為-CH2 -OH； 各R47 為-N(R48 )-C(O)-R48 ；且 各R48 獨立地為-H或-(C1 -C5 )烷基。
  22. 一種化合物，其具有式O2： Y1 -L2 -(Z11 )za O2 或其醫藥學上可接受之鹽，其中Y1 為靶向PNPLA3之寡核苷酸； za為1、2或3； L2 為連接基團；且 Z11 為式(B)化合物，其中與L2 之連接位點經指定：； 各R47 獨立地為-OH、-N3 、-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-R48 、-N(R48 )-C(O)-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-OR48 、-N(R48 )-S(O)2 -R48 、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R48 取代； 各R48 獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之-(C3 -C6 )環烷基、-(C1 -C5 )烯基、-(C1 -C5 )炔基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )烯基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之-CH2 -基團可各自獨立地經選自-O-、-S-及-N(R52 )-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R52 )2 、-OR52 及-S(R52 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代，且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； 各R52 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基、-(C1 -C20 )烯基、-(C1 -C20 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-或-N(R49 )-之雜原子置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代。
  23. 如前述請求項中任一項之化合物，其中L2 為式L1、式L2、式L3、式L4、式L5、式L6、式L7、式L8、式L9、式L10、式L11、式L12、式L13或式L14之化合物，其中與Y1 及Z11 之連接位點經指定： 其中各T1 獨立地不存在或為伸烷基、伸烯基或伸炔基，其中該伸烷基、伸烯基或伸炔基之一或多個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-及-N(R49 )-之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各Q1 獨立地不存在或為-C(O)-、-C(O)-NR49 -、-NR49 -C(O)-、-O-C(O)-NR49 -、-NR49 -C(O)-O-、-CH2 -、-NR49 C(O)NR49 -、二價雜芳基或選自-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2 -及-NR49 -之雜原子基團，其中至少兩個碳原子將該等雜原子基團-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2 -及-NR49 -與任何其他雜原子基團間隔開；或為具有下式之結構：其中R53 為-O或-NH，且R54 為-O或-S； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代；且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； R53 為-O或-NH； R54 為-O或-S；且 各n獨立地為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40；其中若n大於0，則各(T1 -Q1 -T1 -Q1 )中之各T1 及各Q1 獨立地經選擇。
  24. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 包含至少15個鹼基。
  25. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 之鹼基序列包含或為表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列，或Y1 之鹼基序列包含表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之序列中的15個連續鹼基。
  26. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 包含至少1個磷酸二酯核苷酸間鍵聯。
  27. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯。
  28. 如前述請求項中任一項之化合物，Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為對掌性受控硫代磷酸酯。
  29. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為呈Sp組態之對掌性受控硫代磷酸酯。
  30. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 包含至少1個對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯，該核苷酸間鍵聯為呈Rp組態之對掌性受控硫代磷酸酯。
  31. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 ，其中該對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯或對掌性受控硫代磷酸酯包含在該組合物內具有至少70%非對映異構純度之磷對掌性中心。
  32. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 ，其中該對掌性受控經修飾之核苷酸間鍵聯或對掌性受控硫代磷酸酯包含具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%非對映異構純度之磷對掌性中心。
  33. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 包含至少1個糖修飾。
  34. 如前述請求項中任一項之化合物，其中Y1 包含至少1個鹼基修飾。
  35. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈鍵聯模式為表1A中所列之任何寡核苷酸之主鏈鍵聯模式。
  36. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈對掌性中心模式為表1A中所列之任何寡核苷酸之主鏈對掌性中心模式。
  37. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該寡核苷酸之該化學修飾模式為表1A中所列之任何寡核苷酸之化學修飾模式。
  38. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈鍵聯模式、該主鏈對掌性中心模式及/或該化學修飾模式為表1A中所列之任何寡核苷酸中的寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式。
  39. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈鍵聯模式、該主鏈對掌性中心模式及該化學修飾模式為表1A中所列之任何寡核苷酸中的寡核苷酸之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式。
  40. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該寡核苷酸之該主鏈鍵聯模式、該主鏈對掌性中心模式及該化學修飾模式為表1A中所列之寡核苷酸的Y1 之主鏈鍵聯模式、主鏈對掌性中心模式及/或化學修飾模式，且Y1 之鹼基序列包含或為表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之鹼基序列，或Y1 之鹼基序列包含表1A中所列之任何PNPLA3寡核苷酸之序列中的15個連續鹼基。
  41. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該寡核苷酸能夠介導PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性的降低。
  42. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該寡核苷酸能夠經由藉由RNaseH、位阻及/或RNA干擾介導之機制來介導PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性的降低。
  43. 如前述請求項中任一項之化合物，其中： 各R47 為-N(R48 )-C(O)-R48 ；且 各R48 獨立地為-H或-(C1 -C5 )烷基。
  44. 如前述請求項中任一項之化合物，其中： 各T1 獨立地不存在或為伸烷基，其中 該伸烷基之一或多個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-及-N(R49 )-之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各Q1 獨立地不存在或為C(O)、C(O)-NR49 、NR49 -C(O)或選自O及NR49 之雜原子基團，其中至少兩個碳原子將該等雜原子基團O及NR49 與任何其他雜原子基團間隔開； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代； 各n獨立地為0、1、2、3或4；其中若n大於0，則各(T1 -Q1 -T1 -Q1 )中之各T1 及各Q1 獨立地經選擇。
  45. 一種組合物，其包含含有以下之化合物：(a)能夠靶向PNPLA3之寡核苷酸；(b)連接基團；及(c) 1、2或3個獨立地選自Z10 及Z11 之部分；其中該連接基團連接該寡核苷酸與該1、2或3個部分，且其中： 各Z10 獨立地為式Z12、式Z13、式Z14、式Z15、式Z16、式Z17、式Z18、式Z19、式Z20或式Z21之化合物，或其幾何或位置異構體，其中與L1 之連接位點經指定：；其中各R46 獨立地為-CN、-CH2 -CN、-C≡CH、-CH2 -N3 、-CH2 -NH2 、-CH2 -N(R52 )-S(O)2 -R51 、-CH2 -CO2 H、-CO2 H、-CH2 -OH、-CH2 -SH、-CH=CH-R51 、-CH2 -R51 、-CH2 -S-R51 、-CH2 -N(R52 )-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-O-R51 、-CH2 -N(R52 )-C(O)-N(R52 )-R51 、-CH2 -O-R51 、-CH2 -O-C(O)-R51 、-CH2 -O-C(O)-N(R52 )-R51 、-CH2 -O-C(O)-O-R51 、-CH2 -S(O)-R51 、-CH2 -S(O)2 -R51 、-CH2 -S(O)2 -N(R52 )-R51 、-C(O)-NH2 、-C(O)-O-R51 、-C(O)-N(R52 )-R51 或芳基或雜芳基，其中該芳基或雜芳基視情況經R51 取代 各R47 獨立地為-OH、-N3 、-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-R48 、-N(R48 )-C(O)-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-OR48 、-N(R48 )-S(O)2 -R48 、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R48 取代； 各R48 獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之-(C3 -C6 )環烷基、-(C1 -C5 )烯基、-(C1 -C5 )炔基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )烯基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之-CH2 -基團可各自獨立地經選自-O-、-S-及-N(R52 )-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R52 )2 、-OR52 及-S(R52 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R51 獨立地為-H、-(C3 -C20 )環烷基、-(C1 -C60 )烯基、-(C1 -C60 )炔基或-(C1 -C60 )烷基，其中該環烷基之一至六個-CH2 -基團或該烷基之一至二十個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-及-N(R49 )-之雜原子置換，其中該等雜原子由至少兩個碳原子間隔開，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開，且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代；且 各R52 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基、-(C1 -C20 )烯基、-(C1 -C20 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-或-N(R49 )-之雜原子置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代，且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； 各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； 且Z11 為式(B)化合物，其中與L2 之連接位點經指定：； 各R47 獨立地為-OH、-N3 、-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-R48 、-N(R48 )-C(O)-N(R48 )2 、-N(R48 )-C(O)-OR48 、-N(R48 )-S(O)2 -R48 、四唑或三唑，其中該四唑及三唑視情況經R48 取代； 各R48 獨立地為-H、-(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之(C1 -C5 )烷基、經鹵基取代之-(C3 -C6 )環烷基、-(C1 -C5 )烯基、-(C1 -C5 )炔基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )烯基、經鹵基取代之-(C1 -C5 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之-CH2 -基團可各自獨立地經選自-O-、-S-及-N(R52 )-之雜原子基團置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R52 )2 、-OR52 及-S(R52 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開； 各R49 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可經-O-、-S-或-N(R49a )-置換，且該烷基之-CH3 可經選自-N(R49a )2 、-OR49a 及-S(R49a )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基及環烷基可經鹵基原子取代，且其中各R49a 獨立地為-H、-(C1 -C6 )烷基或-(C3 -C6 )環烷基； 各R52 獨立地為-H、-(C1 -C20 )烷基、-(C1 -C20 )烯基、-(C1 -C20 )炔基或-(C3 -C6 )環烷基，其中該烷基或環烷基之由至少兩個碳原子間隔開的一至六個-CH2 -基團可各自獨立地經獨立地選自-O-、-S-或-N(R49 )-之雜原子置換，且該烷基之-CH3 可各自獨立地經選自-N(R49 )2 、-OR49 及-S(R49 )之雜原子基團置換，其中該等雜原子基團由至少2個碳原子間隔開；且其中該烷基、烯基、炔基及環烷基可經鹵基原子取代。
  46. 一種對掌性受控PNPLA3寡核苷酸組合物，其包含特定寡核苷酸類型之寡核苷酸，其特徵在於： a)共同鹼基序列及長度，其中該鹼基序列與PNPLA3靶基因互補； b)共同主鏈鍵聯模式； c)共同主鏈對掌性中心模式，其中該共同主鏈對掌性中心模式包含至少一個包含對掌性受控對掌性中心之核苷酸間鍵聯； 該組合物為對掌性受控的，因為相對於具有相同共同鹼基序列及長度之寡核苷酸的實質上外消旋製劑而言，該組合物中該特定寡核苷酸類型之寡核苷酸增濃；且 其中該寡核苷酸組合物能夠降低PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性。
  47. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該寡核苷酸能夠經由藉由RNaseH、位阻及/或RNA干擾介導之機制來降低PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性。
  48. 一種組合物，其包含如前述請求項中任一項之化合物。
  49. 一種組合物，其包含為單股RNAi劑之PNPLA3寡核苷酸，其中該單股RNAi劑與PNPLA3標靶RNA序列互補或實質上互補， 長度為約15至約49個核苷酸，且 能夠導引標靶特異性RNA干擾， 其中該單股RNAi劑包含至少一個非天然鹼基、糖及/或核苷酸間鍵聯，且 其中該組合物能夠降低PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、含量及/或活性。
  50. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該一或多個寡核苷酸進一步包含橋聯雙環縮酮。
  51. 如前述請求項中任一項之組合物，其中RCD 為。
  52. 如前述請求項中任一項之組合物，其中RCD 為。
  53. 如前述請求項中任一項之組合物，其中RCD 具有使得RCD −H為以下之結構： 。
  54. 如前述請求項中任一項之組合物，其中RCD 經由連接基團連接至該一或多個寡核苷酸。
  55. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該連接基團為LM 。
  56. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該連接基團具有以下結構： 。
  57. 如前述請求項中任一項之組合物，其中RCD 係選自： 。
  58. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如前述請求項中任一項之組合物與至少一種醫藥學上可接受之賦形劑的混合物。
  59. 如前述請求項中任一項之組合物，其進一步包含選自由消炎劑、抗糖尿病劑及膽固醇/脂質調節劑組成之群之至少一種其他藥劑。
  60. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該其他藥劑係選自由以下組成之群：乙醯基-CoA羧化酶(ACC)抑制劑；二醯甘油O-醯基轉移酶1 (DGAT-1)抑制劑；二醯甘油O-醯基轉移酶2 (DGAT-2)抑制劑；單醯甘油O-醯基轉移酶抑制劑；磷酸二酯酶(PDE)-10抑制劑；AMPK活化劑；磺醯脲；美格替耐(meglitinide)；α-澱粉酶抑制劑；α-葡糖苷水解酶抑制劑；α-葡糖苷酶抑制劑；PPARγ促效劑；PPAR α/γ促效劑；二胍；類升糖素肽1 (GLP-1)調節劑；利拉魯肽(liraglutide)；阿必魯肽(albiglutide)；艾塞那肽(exenatide)；阿必魯肽；利司那肽(lixisenatide)；度拉糖肽(dulaglutide)；司美魯肽(semaglutide)；蛋白質酪胺酸磷酸酶-1B (PTP-1B)抑制劑；SIRT-1活化劑；二肽基肽酶IV (DPP-IV)抑制劑；胰島素促泌素；脂肪酸氧化抑制劑；A2拮抗劑；c-jun胺基端激酶(JNK)抑制劑；葡糖激酶活化劑(GKa)；胰島素；胰島素模擬物；肝糖磷酸化酶抑制劑；VPAC2受體促效劑；SGLT2抑制劑；升糖素受體調節劑；GPR119調節劑；FGF21衍生物或類似物；TGR5受體調節劑；GPBAR1受體調節劑；GPR40促效劑；GPR120調節劑；高親和力菸鹼酸受體(HM74A)活化劑；SGLT1抑制劑；肉鹼軟脂醯基轉移酶之抑制劑或調節劑；果糖1,6-二磷酸酶之抑制劑；醛醣還原酶之抑制劑；鹽皮質激素受體抑制劑；TORC2之抑制劑；CCR2及/或CCR5之抑制劑；PKC同功異型物之抑制劑(例如，PKCα、PKCβ、PKCγ)；脂肪酸合成酶之抑制劑；絲胺酸軟脂醯基轉移酶之抑制劑；GPR81、GPR39、GPR43、GPR41、GPR105、Kv1.3、視黃醇結合蛋白4、糖皮質激素受體、生長抑素受體之調節劑；PDHK2或PDHK4之抑制劑或調節劑；MAP4K4之抑制劑；IL1家族(包括IL1β)之調節劑；HMG-CoA還原酶抑制劑；角鯊烯合成酶抑制劑；纖維酸酯；膽酸螯合劑；ACAT抑制劑；MTP抑制劑；脂加氧酶抑制劑；膽固醇吸收抑制劑；PCSK9調節劑；膽固醇酯轉移蛋白抑制劑及RXRα之調節劑。
  61. 如前述請求項中任一項之組合物，其進一步包含選自由以下組成之群之至少一種其他藥劑：半胱胺或其醫藥學上可接受之鹽；胱胺或其醫藥學上可接受之鹽；抗氧化劑化合物；卵磷脂；維生素B複合物；膽汁鹽製劑；大麻素-1 (CB1)受體之拮抗劑；大麻素-1 (CB1)受體之反向促效劑；過氧化體增殖物活化受體)活性調節劑；苯并噻氮呯(benzothiazepine/benzothiepine)化合物；用以抑制蛋白質酪胺酸磷酸酶PTPRU之RNA反義構築體；雜原子鍵聯之經取代哌啶及其衍生物；能夠抑制硬脂醯基輔酶α δ-9去飽和酶之氮雜環戊烷衍生物；具有脂聯素之促泌素或誘導劑活性的醯胺化合物；季銨化合物；乙酸格拉替雷(Glatiramer acetate)；五聚蛋白；HMG-CoA還原酶抑制劑；正乙醯基半胱胺酸；異黃酮化合物；巨環內酯抗生素；半乳糖凝集素抑制劑；抗體；或其任何組合。
  62. 一種用於人類之將非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪變性肝炎定級評分系統之嚴重度降低至少一個點、降低非酒精性脂肪變性肝炎活性之血清標記物之含量、降低非酒精性脂肪變性肝炎疾病活性或減少非酒精性脂肪變性肝炎之醫療後果的方法，該方法包含以下步驟：向有需要之患者，向需要此類降低之人類投與治療有效量之如前述請求項中任一項之組合物。
  63. 一種用於治療人類之以下疾病之方法：脂肪肝、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝纖維化之非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝硬化之非酒精性脂肪變性肝炎或伴隨肝硬化及肝細胞癌之非酒精性脂肪變性肝炎，該方法包含以下步驟：向有需要之患者，向需要此類治療之人類投與治療有效量之如前述請求項中任一項之組合物。
  64. 一種用於治療人類之以下疾病之方法：高脂質血症、I型糖尿病、II型糖尿病、特發性I型糖尿病(Ib型)、成人隱匿遲發性自體免疫糖尿病(LADA)、早發型2型糖尿病(EOD)、青年發作之非常型糖尿病(YOAD)、青少年發病的成年型糖尿病(MODY)、營養不良相關糖尿病、妊娠期糖尿病、冠心病、缺血性中風、血管成形術後再狹窄、周邊血管疾病、間歇性跛行、心肌梗塞、血脂異常、餐後脂血症、葡萄糖耐受異常病狀(IGT)、空腹血漿葡萄糖異常病狀、代謝性酸中毒、酮症、關節炎、肥胖、骨質疏鬆、高血壓、充血性心臟衰竭、左心室肥大、周邊動脈疾病、糖尿病性視網膜病變、黃斑變性、白內障、糖尿病腎病變、腎小球硬化、慢性腎衰竭、糖尿病神經病變、代謝症候群、症候群X、經前症候群、心絞痛、血栓、動脈粥樣硬化、暫時性腦缺血、中風、血管再狹窄、高血糖症、高胰島素血症、高三酸甘油酯血症、抗胰島素症、葡萄糖代謝減弱、勃起功能障礙、皮膚及結締組織病症、足部潰瘍及潰瘍性結腸炎、內皮細胞功能不良及血管順應性減弱、超apo B脂蛋白血症、阿茲海默氏症(Alzheimer's)、精神分裂症、認知障礙、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)及腸躁症候群、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，該方法包含以下步驟：向有需要之患者，向需要此類治療之人類投與治療有效量之如前述請求項中任一項之組合物。
  65. 一種用於治療人類之以下疾病之方法：脂肪肝、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝纖維化之非酒精性脂肪變性肝炎、伴隨肝硬化之非酒精性脂肪變性肝炎或伴隨肝硬化及肝細胞癌之非酒精性脂肪變性肝炎，該方法包含以下步驟：向需要此類治療之人類投與治療有效量之兩種獨立醫藥組合物，該等醫藥組合物包含 a.如前述請求項中任一項之第一組合物；及 d.第二組合物，其包含選自由消炎劑、抗糖尿病劑及膽固醇/脂質調節劑組成之群之至少一種其他藥劑及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
  66. 如前述請求項中任一項之方法，其中該第一組合物及該第二組合物同時投與。
  67. 如前述請求項中任一項之方法，其中該第一組合物及該第二組合物依序且以任何次序投與。
  68. 一種用於降低人類門脈高壓、肝蛋白合成能力、高膽紅素血症或腦病之方法，其包含以下步驟：向有需要之患者，向需要此類治療之人類投與治療有效量之如前述請求項中任一項之組合物。
  69. 一種降低細胞中PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、活性及/或含量之方法，其包含以下步驟：使該細胞與如前述請求項中任一項之化合物或組合物接觸。
  70. 一種降低患者中PNPLA3靶基因或其基因產物之表現、活性及/或含量之方法，其包含以下步驟：使細胞與如前述請求項中任一項之化合物或組合物接觸。
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