KR20240023631A - 신규 치료 전달 모이어티 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 질환, 적합하게는 간 질환의 치료에 유용한 올리고뉴클레오티드의 전달을 위한 신규 전달 모이어티를 포함하는 신규 화합물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 질환, 적합하게는 간 질환의 치료에 유용한 올리고뉴클레오티드의 전달을 위한 신규 전달 모이어티를 포함하는 신규 화합물에 관한 것이다.
올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물은 유전자 조절이상을 수반하는 많은 상이한 유형의 질환의 개인맞춤형 치료를 위해 서열-특이적 방식으로 유전자를 표적화하는 것을 허용한다. 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물은 사용된 올리고뉴클레오티드의 특정 유형에 따라 상이한 작용 메카니즘을 나타낸다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO) 및 소형 간섭 RNA (siRNA)를 포함하는 RNA 간섭 (RNAi) 화합물이 유전자 발현을 녹다운시키는 데 사용될 수 있다. 대조적으로, 다른 올리고뉴클레오티드 함유 화합물은 짧은 활성화 RNA (saRNA)와 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유전자를 활성화시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 환자의 원하는 조직에 전달함으로써, 유전자 발현은 하향조절, 상향조절 또는 교정될 수 있다.
간 세포 상의 아시알로당단백질 수용체를 표적화하기 위해 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)을 포함하는 전달 모이어티를 사용한 올리고뉴클레오티드의 전달은 목적하는 조직으로의 전달을 위한 하나의 양식이다. GalNAc를 포함하는 예시적인 화합물은 급성 간 포르피린증을 치료하기 위해 ALAS1 유전자를 표적화하는 FDA 승인된 siRNA인 기보시란이다. 이러한 상업용 화합물의 존재에도 불구하고, 간 또는 다른 조직으로의 올리고뉴클레오티드의 전달을 위한 대안적 또는 개선된 모이어티, 및 전달 모이어티 및 1개 이상의 올리고뉴클레오티드, 예컨대 치료 siRNA를 포함하는 개선된 치료 화합물을 제공할 필요가 남아있다.
보다 구체적으로는, 개선된 조직 노출, 적합하게는 간에서의 개선된 노출; 개선된 간 대 신장 노출 비, 개선된 녹다운; 개선된 지속적인 반응; 개선된 약동학적 프로파일, 보다 적은 오프 타겟 효과, 개선된 독성 프로파일, 개선된 안전성 프로파일, 및/또는 개선된 합성 과정, 예컨대, 비제한적으로, 보다 적은 단계를 갖는 합성 과정, 보다 적은 분해 산물을 생성하는 과정, 개선된 안전성 또는 효능 프로파일을 갖는 화합물을 생성하는 합성 과정, 개선된 수율을 생성하는 과정, 또는 그의 임의의 조합 중 1종 이상을 나타내는, 전달 모이어티 및 1개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공할 필요가 있다.
한 형태에서, 본 발명은 화학식 I의 전달 모이어티를 제공한다:
화학식 I을 포함하는 본원의 화합물은 화학식 I 내의 1개 이상의 원자의 변형 또는 부가 또는 결실을 가질 수 있거나, 또는 화합물은 추가의 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 화학식 I의 1개 이상의 알킬 쇄는 연장 또는 단축될 수 있거나, 또는 화학식 I을 포함하는 화합물은 1개 이상의 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 화학식 I을 포함하는 본원의 화합물은, 예를 들어 1개 이상의 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc, 또한 N-GalNAc 또는 galnac) 모이어티에 대한 수용체, 예컨대 전형적으로 3개의 GalNAc 모이어티에 결합하는 아시알로당단백질 수용체 (ASPGR)를 갖는 세포에 1개 이상의 올리고뉴클레오티드를 전달하는 데 유용하다. 따라서, 본원의 화학식 I을 포함하는 화합물은 ASPGR을 발현하는 간 세포에 우선적으로 결합하여 간 세포 내로의 화합물의 진입을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. ASPGR은 또한 지방 조직 상에 존재하기 때문에, 화학식 I의 화합물은 따라서 ASPGR을 발현하는 지방 세포에 올리고뉴클레오티드를 전달하는 데 사용될 수 있다.
한 실시양태는 R이 부착된 2개의 수소 분자를 포함하는 것인 화학식 I을 포함하는 화합물이다. 또 다른 실시양태는 R이 메틸 기를 포함하는 것인 화학식 I의 화합물이다. 또 다른 실시양태는 R이 보호기를 포함하는 것인 화학식 I이다. 또 다른 실시양태는 R이 1개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물인 화학식 I이다. 적합한 추가 실시양태에서, 화학식 I을 포함하는 전달 모이어티는 세포외 수용체 ASPGR에 결합하고, 간 조직을 구성하는 세포 내로의 올리고뉴클레오티드의 진입을 허용함으로써 1개 이상의 올리고뉴클레오티드를 간 조직에 전달한다.
화학식 I을 포함하는 전달 모이어티는 진단 또는 치료 목적의 올리고뉴클레오티드를 전달하는 데 사용될 수 있다. 1개 이상의 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드, 또는 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있고, 1개 이상 또는 모든 변형된 뉴클레오티드 또는 변형된 결합을 포함할 수 있다.
본원에서 올리고뉴클레오티드는 세포 내의 특정 DNA 또는 RNA 서열을 표적화하도록, 즉 이에 결합 또는 어닐링하여 유전자 발현을 조절하도록 디자인된다. 한 실시양태는 R이 표적 전사체의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드인 화학식 I을 포함하는 화합물이다. 화학식 I을 포함하는 화합물의 추가 실시양태에서, R은 표적 전사체의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드이며, 이는 단백질 발현을 더욱 감소시킨다. 또 다른 실시양태에서, 표적 전사체 또는 표적 단백질의 발현의 감소는 약 99, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 또는 50%이다. 추가 실시양태에서, 발현의 감소는 약 3주, 약 1개월, 약 1.5개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월 또는 약 6개월 동안 지속된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 1개 이상의 미스매치가 올리고뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드 서열 사이에 존재할 수 있고, 여전히 유전자 발현을 조절하는 기능을 할 수 있음을 인식한다. 따라서, 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 서열과 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 또는 70% 동일성을 갖는다. 올리고뉴클레오티드는 또한 5' 또는 3' 말단에 1-10, 1-5, 또는 1-3, 또는 3, 2, 또는 1개 잔기(들)의 오버행을 가질 수 있다. 5' 또는 3' 말단은, 예를 들어, 비제한적으로 무염기 잔기 또는 포스페이트 기로 추가로 변형될 수 있다. 적합한 변형은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 당 잔기, 적합하게는 리보스의 2'-변형이 그의 안정성 및 반감기를 증가시킬 수 있음을 인식한다. 이들 변형은 비변형된 당의 2' OH 기 대신에 2' 플루오로 또는 2' 메톡시 변형을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 올리고뉴클레오티드의 백본의 변화가 또한 그의 안정성 및 반감기를 증가시킬 수 있음을 인식한다. 이들 백본 변형은 포스포디에스테르 결합에서 포스포로티오에이트 (PS) 결합으로의 변화를 포함한다.
따라서, 본원에 사용된 올리고뉴클레오티드 (또는 본원에서 상호교환가능하게 사용된 다량체 또는 올리고머)는 적어도 4개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 잔기의 쇄를 의미하고, 변형 또는 비변형된 염기 및/또는 변형 또는 비변형된 결합을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 잔기는 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 결합 (포스페이트가 결여된 경우에 잔기는 전형적으로 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 뉴클레오시드로 명명됨)에 의해 연결될 수 있다. 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 잔기는 피리미딘 또는 퓨린 고리 내의 1개 이상의 원자에서, 또는 당 잔기 내의 1개 이상의 원자에서, 또는 고리-당 염기 사이의 결합의 1개 이상의 원자에서 변형될 수 있다. 또한 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 변형은 올리고뉴클레오티드 가닥의 5' 또는 3' 말단에서 이루어질 수 있고, 본원에서 올리고뉴클레오티드로 지칭된다.
특정 실시양태에서, 1개 이상의 올리고뉴클레오티드는 작은 간섭 RNA (siRNA), 작은 (짧은으로도 불림) 활성화 RNA (saRNA), 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 단일 가이드 RNA (sgRNA), 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)를 포함한다. 적합한 실시양태에서, 1개 이상의 올리고뉴클레오티드는 siRNA를 포함한다. 또 다른 적합한 실시양태에서, 1개 이상의 올리고뉴클레오티드는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA이다.
일부 실시양태에서, R은 링커를 통해 화학식 I에 접합된다. 적합한 링커는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 링커는 알킬 쇄, 적합하게는 C1-10을 포함한다. 추가 실시양태에서, 링커는 하기에 링커 1, 화학식 II로 제시된다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 피페리딘을 포함한다. 추가의 적합한 실시양태에서, 링커는 하기에 링커 2, 화학식 III으로 제시된다.
한 실시양태에서, 링커 1 (화학식 II), 연결 지점 A 또는 링커 2 (화학식 III), 연결 지점 C가 화학식 I에 접합된다. 한 실시양태에서, 링커 1, 연결 지점 A가 화학식 I에 접합되고, 연결 지점 B는 R에 접합된다. 한 실시양태에서, 링커 2, 연결 지점 C가 화학식 I에 접합되고, 연결 지점 D는 R에 접합된다. 한 실시양태에서, 링커 1, 연결 지점 A가 화학식 I에 접합되고, 연결 지점 B는 R에 접합된 포스페이트 기에 접합된다. 한 실시양태에서, 링커 2, 연결 지점 C가 화학식 I에 접합되고, 연결 지점 D는 R에 접합된 포스페이트 기에 접합된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 링커가 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 있을 수 있거나, 또는 내부 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 염기 중 하나에 부착될 수 있음을 인지할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 링커가 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 연결되거나 접합될 수 있음을 인지할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 링커를 통해서든 아니든 간에, 전달 모이어티, 예컨대 화학식 I을 포함하는 전달 모이어티의 올리고뉴클레오티드 5' 말단에서의 배치가 Ago2 로딩의 잠재적 비효율적 로딩, 또는 RISC 복합체 활성의 다른 방해를 극복할 필요가 있을 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA에 연결되거나 또는 직접 접합된 화학식 I을 포함하는 전달 모이어티에 대해, 안티센스 가닥의 5' 말단에서의 전달 모이어티의 배치는 Ago2 로딩을 어렵게 하고 효율적인 녹다운을 방지할 수 있다. 적합한 실시양태에서, 1개 이상의 올리고뉴클레오티드는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA를 포함하고, 화학식 I을 포함하는 전달 모이어티는 센스 가닥의 3' 말단에 존재한다. 추가 실시양태에서, 화학식 I을 포함하는 전달 모이어티는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 접합된다. 또한 추가 실시양태에서, 링커는 고리 구조, 적합하게는 피페리딘 고리를 포함한다. 또한 추가 실시양태에서, 링커는 링커 2를 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본원의 화합물은 적어도 1개의 뉴클레오티드의 리보스가 2' 플루오로 기 또는 2' 메톡시 기로 변형된 1개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 변형 또는 치환된 포스포디에스테르 결합을 갖는다. 추가 실시양태에서, 1개 이상의 치환된 포스포디에스테르 결합은 PS 결합이다. 추가 실시양태에서, 1개 이상의 올리고뉴클레오티드는 2' 플루오로 또는 2' 메톡시 기로 변형된 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하고, 백본은 1개 이상의 변형 또는 치환된 포스포디에스테르 결합, 적합하게는 PS 결합을 갖는다.
본원에 개시된 화합물의 다른 실시양태에서, 1개 이상의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA를 포함한다. 추가 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 15-40개의 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 어닐링되고, 임의로 1개 이상의 5' 또는 3' 뉴클레오티드 오버행, 1개 이상의 5' 또는 3' 평활 말단, 또는 둘 다의 조합을 포함한다.
본원에 개시된 화합물의 또 다른 실시양태에서, 5' 또는 3' 말단은 추가로 변형된다. 추가 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5' 말단은 임의로 인산화된다. 추가 실시양태에서, 안티센스 가닥의 5' 말단의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 5' 비닐포스포네이트 변형을 포함한다.
화학식 I 및 1개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 본원의 화합물은 간 질환 또는 지방 조직 관련 질환에 대한 요법에서 유용하다. 한 실시양태에서, 질환의 요법 또는 치료의 사용에서의 화학식 I을 포함하는 화합물 및 1개 이상의 뉴클레오티드를 투여하기 위한 제약 조성물이 제공된다. 한 실시양태는 요법의 사용에서의 화학식 I 및 1개 이상의 올리고뉴클레오티드을 포함하는 화합물, 또는 그의 제약 조성물이다. 추가 실시양태는 요법이 간 질환에 대한 것이다. 대안적 실시양태는 지방 조직을 수반하는 질환, 예컨대 지방 세포에서의 유전자의 조절이상을 수반하는 질환에 대한 것이다. 또 다른 실시양태는 본원에 개시된 화합물, 적합하게는 화학식 I 및 1개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 유효량으로 적합하게 투여하는 것, 또는 상기 중 임의의 것의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 간 질환의 치료 방법이다. 또 다른 실시양태는 의약의 제조의 사용에서의 적합하게는 간 질환의 치료를 위한 본원에 개시된 화합물, 적합하게는 화학식 I 및 1개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물 또는 그의 제약 조성물이다.
또 다른 실시양태는 화학식 IV를 포함하는 화합물이고:
여기서 Z는 고체 지지체, 수지 또는 비드이다.
본원에 개시된 제약 조성물은 조성물 또는 제제의 화합물 및 다른 성분과 상용성이며 환자에게 유해하지 않은 1종 이상의 담체, 희석제 및 부형제를 포함한다. 제약 조성물 및 그의 제조 방법의 예는 문헌 ["Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Loyd, V., et al. Eds., 22nd Ed., Mack Publishing Co., 2012]에서 찾아볼 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 장애 또는 질환을 치료하는 데 효과적인 양을 지칭한다.
본원에 사용된 "상보성 영역"은 적절한 혼성화 조건 하에 (예를 들어, 포스페이트 완충제 중에서, 세포에서 등) 뉴클레오티드의 2개의 서열 사이의 혼성화를 허용하기 위해 역평행 뉴클레오티드 서열에 대해 충분히 상보성인 핵산의 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, ds 올리고뉴클레오티드)을 의미한다. 일부 실시양태에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 mRNA 표적 서열에 상보성인 영역을 갖는 표적화 서열을 포함한다.
화학식 I을 포함하는 전달 모이어티는 하기 비제한적 합성 단계 및 반응식에 의해 만들어질 수 있다.
특정 약어는 하기와 같이 정의된다: "1,2-DCE"는 1,2-디클로로에탄을 지칭하고; "DCM"은 디클로로메탄을 지칭하고; "DIEA"는 N,N-디이소프로필에틸아민을 지칭하고; "DMF"는 N,N-디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMAP"는 4-디메틸아미노피리딘을 지칭하고; "DMTCl"은 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드를 지칭하고; "DPP4"는 디펩티딜 펩티다제를 지칭하고; "EDC"는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드를 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "GalNAc"는 N-아세틸갈락토사민을 지칭하고; "HATU"는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "HBTU"는 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "HOBt"는 1-히드록시벤조트리아졸 수화물을 지칭하고; "HPRT"는 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제를 지칭하고; "IPA"는 이소프로판올 및 이소프로필 알콜을 지칭하고; "LDHA"는 락테이트 데히드로게나제-A를 지칭하고; "MeCN"은 아세토니트릴을 지칭하고; "MeOH"는 메탄올 및 메틸 알콜을 지칭하고; "MWCO"는 분자량 컷-오프를 지칭하고; "NHS"는 N-히드록시숙신이미드를 지칭하고; "OD"는 광학 밀도를 지칭하고; "PBS"는 포스페이트-완충 염수를 지칭하고; "PhSiH3"는 페닐실란을 지칭하고; "PTS"는 휴대용 내독소 시험 시스템을 지칭하고; "siRNA"는 소형 간섭 리보핵산을 지칭하고; "TEA"는 트리에틸아민을 지칭하고; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭하고; "TLC"는 박층 크로마토그래피를 지칭하고; "TMP"는 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘을 지칭한다.
반응식 1
반응식 1, 단계 A는 용매 예컨대 1,2-DCE 중 트리메틸 트리플루오로메탄술포네이트를 사용하여 화합물 (2)를 제공하는 화합물 (1)의 고리화를 도시한다. 단계 B는 용매, 예컨대 1,2-DCE 중 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트를 사용하여 화합물 (2)에 헥스-5-엔-1-올을 첨가하여 화합물 (3)을 제공하는 것을 나타낸다. 적절한 산화제, 예컨대 과아이오딘산나트륨을 촉매, 예컨대 염화루테늄(III)과 함께 사용하여 화합물 (3)을 산화시켜 화합물 (4)를 제공하는 것은 단계 C에 제시되어 있다.
반응식 2
반응식 2, 단계 A는 용매, 예컨대 DMF 중 적절한 염기, 예컨대 DIEA와 함께 HBTU 및 HOBt를 사용하여 화합물 (5) 및 tert-부틸 N-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸아미노]에틸]카르바메이트 사이의 아미드 커플링으로 화합물 (6)을 제공하는 것을 나타낸다. 단계 B는 THF 및 MeOH 용매계 중 염기, 예컨대 수성 NaOH를 사용하여 화합물 (7)을 제공하는 화합물 (6)의 염기성 가수분해를 도시한다. 단계 C는 용매, 예컨대 DMF 중 적절한 염기, 예컨대 DIEA와 함께 HATU를 사용하여 화합물 (7) 및 알릴 11-아미노운데카노에이트 히드로클로라이드 사이의 아미드 커플링으로 화합물 (8)을 제공하는 것을 나타낸다. 단계 D는 용매, 예컨대 DCM 중 TFA로 화합물 (8)을 산성 탈보호하여 화합물 (9)를 제공하는 것을 나타낸다. 화합물 (10)을 제공하기 위한 용매, 예컨대 DCM 중 EDC 및 HOBt를 사용한 화합물 (9)와 화합물 (4) 사이의 아미드 커플링은 단계 E에 제시된다. 단계 F는 용매, 예컨대 DCM 중 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 및 PhSiH3로 화합물 (10)을 탈보호하여 화합물 (11)을 제공하는 것을 나타낸다. 단계 F는 용매, 예컨대 DCM 중 EDC를 사용하여 화합물 (11)을 NHS와 커플링시켜 화합물 (12)를 제공하는 것을 도시한다.
반응식 3
반응식 3, 단계 A-C는 반응식 2, 단계 C-E의 것들과 본질적으로 유사하며, 화합물 (7)로 시작하여 화합물 (13), (14) 및 (15)를 제공한다. 단계 D는 용매, 예컨대 MeOH 중 탄소 상 팔라듐을 사용하여 화합물 (15)를 수소화시켜 화합물 (16)을 제공하는 것을 도시한다. 단계 E는 반응식 2, 단계 G의 제조와 본질적으로 유사하며, 화합물 (17)을 제공한다.
반응식 4
반응식 4, 단계 A-I는 반응식 2 및 3에서 발견되는 것들과 본질적으로 유사한 방법을 사용하는 일련의 아미드 커플링 및 탈보호로 구성되며, 화합물 (18)로 시작하여 화합물 (27)을 제공한다.
반응식 5
반응식 5, 단계 A-C는 반응식 4, 단계 G-I에서 발견되는 것들과 본질적으로 유사한 방법을 도시하며, 화합물 (24)로 시작하여 화합물 (30)을 제공한다.
반응식 6
반응식 6, 단계 A는 용매, 예컨대 DCM 중 적합한 염기, 예컨대 DIEA와 함께 DMTCl을 사용하여 화합물 (32)를 제공하는 화합물 (31)의 보호를 도시한다. 단계 B는 용매, 예컨대 DCM 중 HBTU 및 HOBt와 TMP를 사용한 화합물 (32) 및 피페리딘-4-일 메탄올 사이의 아미드 커플링을 나타내며, 화합물 (33)을 제공한다. 화합물 (33)을 DMF 중 20% 피페리딘으로 탈보호하여 화합물 (34)를 제공하는 것을 단계 C에 나타내었다.
반응식 7
반응식 7, 단계 A는 반응식 2, 단계 A와 본질적으로 유사하며, 화합물 (16) 및 (34)의 커플링으로부터 화합물 (35)를 제공한다. 단계 B는 적절한 용매, 예컨대 DCM 중 TEA 및 DMAP의 염기 시스템을 이용하여 화합물 (35)에 숙신산 무수물을 첨가함으로써 화합물 (36)을 형성하는 것을 나타낸다. 단계 C는 용매계, 예컨대 MeCN 및 DCM 중 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 및 염기, 예컨대 DIEA를 사용하여 화합물 (36)을 수지 상에 로딩하여 화합물 (37)을 제공하는 것을 도시한다.
제조예 1
(6,7-디아세톡시-2-메틸-5,6,7,7a-테트라히드로-3aH-피라노[3,2-d]옥사졸-5-일)메틸 아세테이트
1,2-DCE (46 mL) 중 (5-아세트아미도-3,4,6-트리아세톡시-테트라히드로피란-2-일)메틸 아세테이트 (9.00 g, 23.1 mmol)의 용액에 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트 (6.5 mL, 35 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 50℃로 가열하고, 18시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 DCM (200 mL)으로 희석하고, 포화 NaHCO3 (200 mL) 및 포화 수성 염화나트륨 용액 (200 mL)으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 0-10% MeOH/DCM으로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물 (6.434 g, 84%)을 수득하였다. ES/MS m/z 330 (M+H).
제조예 2
(5-아세트아미도-3,4-디아세톡시-6-헥스-5-에녹시-테트라히드로피란-2-일)메틸 아세테이트
1,2-DCE (231 mL) 중 (6,7-디아세톡시-2-메틸-5,6,7,7a-테트라히드로-3aH-피라노[3,2-d]옥사졸-5-일)메틸 아세테이트 (30.43 g, 92.42 mmol)의 용액에 헥스-5-엔-1-올 (22.2 mL, 185 mmol)에 이어서 활성화된 분말 4Å 분자체 (15.6 g)를 첨가하였다. 현탁액을 주위 온도에서 30분 동안 교반한 다음, 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트 (19 mL, 101.9 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 규조토를 통해 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 30-100% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물 (34.76 g, 86%)을 수득하였다. ES/MS m/z 430.4 (M+H).
제조예 3
5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜탄산
MeCN (174 mL) 및 DCM (174 mL) 중 (5-아세트아미도-3,4-디아세톡시-6-헥스-5-에녹시-테트라히드로피란-2-일)메틸 아세테이트 (34.76 g, 80.93 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시켰다. 과아이오딘산나트륨 (22.4 g, 104.7 mmol)의 용액을 첨가하고, 0℃에서 10분 동안 계속 교반하였다. 그 후, 염화루테늄(III) (270 mg, 1.3 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 주위 온도로 가온하면서 교반하였다. 2시간 동안 교반한 후, 추가의 과아이오딘산나트륨 (66 g, 308.4 mmol)을 첨가하고, 18시간 동안 계속 교반하였다. 그 후, 혼합물을 3:1 CH3Cl:IPA (2 x 500 mL)로 추출하고, 포화 수성 염화나트륨 용액 (1 L)으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 0-40% MeOH/DCM으로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물 (29.75 g, 82%)을 수득하였다. ES/MS m/z 448.4 (M+H).
제조예 4
벤질 6-아미노헥사노에이트 히드로클로라이드
THF (38 mL) 중 6-아미노헥산산 (5.00 g, 38.1 mmol)의 현탁액에 벤질 알콜 (47 mL, 453.7 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 티오닐 클로라이드 (8.6 mL, 120 mmol)를 적가하고, 혼합물을 주위 온도로 가온하면서 18시간 동안 교반하였다. 그 후, 에테르 (166 mL)를 첨가하고, 반응 용기를 -20℃에서 1시간 동안 동결기로 옮겼다. 그 후, 고체 침전물을 여과에 의해 수집하여 표제 화합물 (8.57 g, 81%)을 수득하였다. ES/MS m/z 222 (M+H).
제조예 5
벤질 11-아미노운데카노에이트 히드로클로라이드
제조예 4의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 11-아미노운데칸산으로부터 표제 화합물을 제조하였다. ES/MS m/z 292.2 (M+H).
제조예 6
알릴 11-아미노운데카노에이트 히드로클로라이드
용기에 알릴 알콜 (42 mL) 중 11-아미노운데칸산 (9.00 g, 44.7 mmol)을 채우고, 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 티오닐 클로라이드 (6.5 mL, 89.4 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 주위 온도로 가온하면서 18시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 에테르 (200 mL)를 잔류물에 첨가하여 백색 현탁액을 수득하였다. 혼합물을 주위 온도에서 10분 동안 교반하고, 고체 침전물을 여과에 의해 수집하여 생성물 (12.0 g, 97%)을 수득하였다. ES/MS m/z 242.2 (M+H).
제조예 7
(2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노) 프로판산
건조 DCM (400 mL) 중 (2S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)-3-히드록시-프로판산 (40 g, 0.122 mol)의 교반 용액에 DIEA (64 mL, 0.366 mol)를 0℃에서 불활성 분위기 하에 첨가하였다. 여기에, DCM (200 mL) 중 DMTCl (49.6 g, 0.146 mol)의 용액을 천천히 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 주위 온도가 되도록 하고, 16시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 물 (12.5 vol)로 희석하고, DCM (25 vol)으로 추출하였다. 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 수득된 조 물질을 10% EtOAc/헥산 (12.5 vol)으로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 연갈색 고체 (62 g, 조 물질)로서 수득하였다. 이 물질을 어떠한 추가 정제 없이 후속 단계에 사용하였다. TLC: 5% MeOH/ CH2Cl2 (Rf: 0.5) UV, 254 nM.
제조예 8
9H-플루오렌-9-일메틸 N-[(1S)-1-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-2-[4-(히드록시메틸)-1-피페리딜]-2-옥소-에틸]카르바메이트
DCM (750 mL) 중 (2S)-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-2-(9H-플루오렌-9일메톡시카르보닐아미노) 프로판산 (62 g, 0.103 mol)의 교반 용액에 HBTU (78.3 g, 0.206 mol), HOBt (27.9 g, 0.206 mol) 및 피페리딘-4-일 메탄올 (15.4 g, 0.134 mol)에 이어서 TMP (15 mL, 0.113 mol)를 0℃에서 불활성 분위기 하에 서서히 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 주위 온도가 되도록 하고, 4시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 물 (8 vol)로 희석하고, DCM (15 vol)으로 추출하였다. 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 20-40% EtOAc/헥산 및 1% MeOH/DCM으로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물 (40 g, 52%, 2 단계에 걸침)을 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d6) δ 7.88 (br d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.79 - 7.59 (m, 3H), 7.45 - 7.12 (m, 13H), 6.92 - 6.76 (m, 4H), 4.79 - 4.44 (m, 2H), 4.32 (br d, J = 11.4 Hz, 2H), 4.20 (br s, 2H), 3.71 (s, 6H), 3.21 (br s, 4H), 2.99 - 2.79 (m, 1H), 2.69 (br s, 2H), 1.81 - 1.43 (m, 3H), 1.08 - 0.73 (m, 2H).
제조예 9
(2S)-2-아미노-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-1-[4-(히드록시메틸)-1-피페리딜]프로판-1-온
9H-플루오렌-9-일메틸 N-[(1S)-1-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-2-[4-(히드록시메틸)-1-피페리딜]-2-옥소-에틸]카르바메이트 (40 g, 0.055 mol)에 DMF (400 mL) 중 20% 피페리딘의 용액을 0℃에서 불활성 분위기 하에 천천히 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 주위 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 물 (15 vol)로 희석하고, EtOAc (30 vol)로 추출하였다. 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 1-8% MeOH/DCM으로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물을 회백색 고체 (13 g, 47%)로서 수득하였다. ES/MS m/z 1009.5 (2M+H).
제조예 10
메틸 (2S)-5-[비스[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜타노에이트
(S)-4-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-5-메톡시-5-옥소펜탄산 (7.00 g, 26.8 mmol) 및 HOBt (4.16 g, 30.8 mmol)가 들어 있는 플라스크에 DMF (179 mL) 및 (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (11.7 g, 30.9 mmol)를 첨가하였다. DIEA (14 mL, 80.3 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 5분 동안 교반하였다. 그 후, tert-부틸 N-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸아미노]에틸]카르바메이트 (8.94 g, 29.5 mmol)를 1 부분으로 첨가하고, 주위 온도에서 교반을 계속하였다. 18시간 동안 교반한 후, 혼합물을 EtOAc (400 mL)로 희석하고, 물 (2 x 400 mL) 및 포화 수성 염화나트륨 용액 (400 mL)으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 40-100% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물 (13.01 g, 89%)을 수득하였다. ES/MS m/z 547.40 (M+H).
제조예 11
(2S)-5-[비스[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜탄산
플라스크를 메틸 (2S)-5-[비스[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜타노에이트 (13.01 g, 23.8 mmol), THF (120 mL) 및 MeOH (120 mL)로 충전시켰다. 1N NaOH (71 mL, 71 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 1시간 후, 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 물 (300 mL)에 재용해시켰다. 5N HCl (12 mL)을 첨가하여 pH를 4로 만들었다. 혼합물을 DCM (3 x 300 mL)으로 추출하고, 합한 유기 층을 포화 수성 염화나트륨 용액 (1 L)으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 표제 화합물 (12.41 g, 98%)을 수득하였다. ES/MS m/z 531.60 (M-H).
제조예 12
알릴 11-[[(2S)-5-[비스[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜타노일]아미노]운데카노에이트
(2S)-5-[비스[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜탄산 (500 mg, 0.94 mmol) 및 알릴 11-아미노운데카노에이트 히드로클로라이드 (313 mg, 1.13 mmol)가 들어 있는 플라스크에 DMF (6.25 mL) 및 (1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 (428 mg, 1.12 mmol)를 첨가하였다. DIEA (0.5 mL, 3 mmol)를 첨가한 후, 혼합물을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 EtOAc (200 mL)로 희석하고, 물 (3 x 200 mL) 및 포화 수성 염화나트륨 용액 (200 mL)으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 40-100% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물 (687 mg, 97%)을 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d6) δ 7.78-7.64 (m, 1H), 6.98-6.7 (m, 2H), 5.96-5.84 (m, 1H), 5.31-5.25 (m, 1H), 5.23-5.17 (m, 1H), 4.56-4.50 (m, 2H), 3.88-3.67 (m, 1H), 3.30-3.19 (m, 4H), 3.11-2.91 (m, 6H), 2.35-2.12 (m, 4H), 1.88-1.65 (m, 2H), 1.58-1.47 (m, 2H), 1.46-1.30 (m, 30H), 1.30-1.18 (m, 12H).
제조예 13
알릴 (S)-11-(2-아미노-5-(비스(2-아미노에틸)아미노)-5-옥소펜탄아미도)운데카노에이트
DCM (15 mL) 중 알릴 11-[[(2S)-5-[비스[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜타노일]아미노]운데카노에이트 (687 mg, 0.91 mmol)의 용액에 TFA (15 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 1.5시간 후, 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 MeOH에 녹이고, 이온 교환 카트리지에 적용하였다. 카트리지를 MeOH (150 mL)에 이어서 7N NH3/MeOH (150 mL)로 용리시켰다. 염기성 분획을 진공 하에 농축시켜 표제 화합물 (410 mg, 99%)을 수득하였다. ES/MS m/z 456.4 (M+H).
제조예 14
알릴 11-[[(2S)-2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]운데카노에이트
플라스크를 5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜탄산 (489 mg, 1.09 mmol) 및 알릴 (S)-11-(2-아미노-5-(비스(2-아미노에틸)아미노)-5-옥소펜탄아미도)운데카노에이트 (150 mg, 0.33 mmol)로 충전시켰다. DCM (3.35 mL)에 이어서 1-히드록시벤조트리아졸 1수화물 (164 mg, 1.07 mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (206 mg, 1.07 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 EtOAc (100 mL)로 희석하고, 포화 NaHCO3 (2 x 100 mL), 포화 수성 NH4Cl (100 mL), 및 포화 수성 염화나트륨 용액 (100 mL)으로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 0-10% MeOH/DCM으로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물 (424 mg, 74%)을 수득하였다. ES/MS m/z 872.80 (M+2H)/2.
제조예 15
11-[[(2S)-2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]운데칸산
DCM (2 mL) 중 알릴 11-[[(2S)-2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]운데카노에이트 (354 mg, 0.20 mmol)의 용액에 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (29 mg, 0.02 mmol)에 이어 PhSiH3 (51 μL, 0.41 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 2시간 동안 교반한 후, 포화 수성 NaHCO3 (100 mL)로 희석하였다. 1N NaOH (15 mL)를 첨가하여 pH를 약 10으로 만들었다. 수용액을 DCM (3 x 100 mL)으로 세척한 다음, 진한 HCl (5 mL)에 이어서 수성 5N HCl (15 mL)로 산성화시켰다. 수성 층을 DCM (100 mL)으로 추출하고, 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 0-20% MeOH/DCM으로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물 (151 mg, 44%)을 수득하였다. ES/MS m/z 852.60 (M+2H)/2.
제조예 16
(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 11-[[(2S)-2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]운데카노에이트
반응 바이알에 11-[[(2S)-2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]운데칸산 (50 mg, 0.03 mmol), N-히드록시숙신이미드 (5 mg, 0.04 mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (8 mg, 0.04 mmol)를 첨가하였다. DCM (0.3 mL)을 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 18시간 후, 혼합물을 실리카 겔 카트리지 상에 직접 로딩하고, 조 혼합물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 0-10% MeOH/DCM으로 용리시키면서 정제하여 표제 화합물 (49 mg, 93%)을 수득하였다. ES/MS m/z 901.40 (M+2H)/2.
제조예 17
벤질 6-[[(2S)-5-[비스[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜타노일]아미노]헥사노에이트
제조예 10의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 (2S)-5-[비스[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜탄산 및 벤질 6-아미노헥사노에이트 히드로클로라이드로부터 표제 화합물을 제조하였다. ES/MS m/z 736.40 (M+H).
제조예 18
벤질 6-[[(2S)-2-아미노-5-[비스(2-아미노에틸)아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥사노에이트 트리스(트리플루오로아세트산)
DCM (105 mL) 중 벤질 6-[[(2S)-5-[비스[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜타노일]아미노]헥사노에이트 (15.47 g, 21.02 mmol)의 용액에 TFA (16 mL, 210.2 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 24시간 동안 교반하였다. 그 후, 추가의 TFA (16 mL, 210.2 mmol)를 첨가하고, 교반을 추가로 2시간 동안 계속하였다. 그 후, 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 톨루엔 (2 x 30 mL)과 공비혼합하였다. 생성된 오일을 진공 오븐에서 40℃에서 4시간 동안 추가로 건조시켜 표제 화합물 (28.08 g, 잔류 톨루엔, 99+%를 고려하여 58% 순도)을 수득하였다. ES/MS m/z 436.40 (M+H). 화합물을 DMF 70 mL 중에 용해시켜 0.3M 용액을 제조하고, 이를 다음 단계에서 사용하였다.
제조예 19
벤질 6-[[(2S)-2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥사노에이트
표제 화합물을 제조예 10의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜탄산 및 벤질 6-[[(2S)-2-아미노-5-[비스(2-아미노에틸)아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥사노에이트 트리스 트리플루오로아세트산으로부터 제조하였다. ES/MS m/z 862 (M+2H)/2.
제조예 20
6-[[(2S)-2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥산산
탄소 상 팔라듐 (1.90 g, 0.89 mmol, 5 질량%, 50% 습윤)을 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 용기를 배기시키고, 질소로 3회 재충전하였다. MeOH (178 mL) 중 벤질 6-[[(2S)-2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥사노에이트 (15.41 g, 8.94 mmol)의 용액을 시린지를 통해 첨가하였다. 플라스크를 배기시키고, 1 atm 수소로 재충전하고, 혼합물을 주위 온도에서 1 atm 수소 하에 18시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 규조토를 통해 여과하고, 여과물을 진공 하에 농축시켜 표제 화합물 (13.85 g, 95%)을 수득하였다. ES/MS m/z 817.2 (M+2H)/2.
제조예 21
(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 6-[[(2S)-2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥사노에이트
제조예 16의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 6-[[(2S)-2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥산산으로부터 표제 화합물을 제조하였다. ES/MS m/z 866.20 (M+2H)/2.
제조예 22
벤질 (2S)-5-[비스[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜타노에이트
표제 화합물을 제조예 12의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 tert-부틸 N-[2-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸아미노]에틸]카르바메이트 및 (4S)-5-벤질옥시-4-(tert-부톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜탄산으로부터 제조하였다. ES/MS m/z 623.6 (M+H).
제조예 23
벤질 (2S)-2-아미노-5-[비스(2-아미노에틸)아미노]-5-옥소-펜타노에이트 트리스(트리플루오로아세트산) 염
제조예 18의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 벤질 (2S)-5-[비스[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에틸]아미노]-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)-5-옥소-펜타노에이트로부터 표제 화합물을 제조하였다. ES/MS m/z 323.2 (M+H).
제조예 24
벤질 (2S)-5-[비스[2-[5-(tert-부톡시카르보닐아미노)펜타노일아미노]에틸]아미노]-2-[5-(tert-부톡시카르보닐아미노)펜타노일아미노]-5-옥소-펜타노에이트
제조예 10의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 5-(tert-부톡시카르보닐아미노)펜탄산 및 벤질 (2S)-2-아미노-5-[비스(2-아미노에틸)아미노]-5-옥소-펜타노에이트 트리스(트리플루오로아세트산) 염으로부터 표제 화합물을 제조하였다. ES/MS m/z 920.6 (M+H).
제조예 25
벤질 (2S)-2-(5-아미노펜타노일아미노)-5-[비스[2-(5-아미노펜타노일아미노)에틸]아미노]-5-옥소-펜타노에이트 트리스(트리플루오로아세트산) 염
제조예 18의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 벤질 (2S)-5-[비스[2-[5-(tert-부톡시카르보닐아미노)펜타노일아미노]에틸]아미노]-2-[5-(tert-부톡시카르보닐아미노)펜타노일아미노]-5-옥소-펜타노에이트로부터 표제 화합물을 제조하였다. ES/MS m/z 620.4 (M+H).
제조예 26
벤질 (2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노에이트
표제 화합물을 제조예 10의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜탄산 및 벤질 (2S)-2-(5-아미노펜타노일아미노)-5-[비스[2-(5-아미노펜타노일아미노)에틸]아미노]-5-옥소-펜타노에이트 트리스(트리플루오로아세트산) 염으로부터 제조하였다. ES/MS m/z 954.80 (M+2H)/2.
제조예 27
(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜탄산
둥근 바닥 플라스크에 탄소 상 팔라듐 (467 mg, 0.22 mmol, 5 질량%, 50% 습윤)을 채우고, 플라스크를 배기시키고, 질소로 3회 재충전하였다. MeOH (44 mL) 중 벤질 (2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노에이트 (4.19 g, 2.20 mmol)의 용액을 시린지를 통해 첨가하고, 이어서 3 방울의 아세트산을 첨가하였다. 플라스크를 배기시키고, 1 atm 수소로 재충전하고, 혼합물을 주위 온도에서 1 atm 수소 하에 교반하였다. 2시간 후, 혼합물을 규조토를 통해 여과하고, 여과물을 진공 하에 농축시켜 표제 화합물 (3.99 g, 99+%)을 수득하였다. ES/MS m/z 909.6 (M+2H)/2.
제조예 28
벤질 6-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥사노에이트
표제 화합물을 제조예 10의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 (2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜탄산 및 벤질 6-아미노헥사노에이트 히드로클로라이드로부터 제조하였다. ES/MS m/z 1011.6 (M+2H)/2.
제조예 29
6-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥산산
둥근 바닥 플라스크에 탄소 상 팔라듐 (24 mg, 0.01 mmol, 질량 기준 5%, 50% 습윤)을 채우고, 플라스크를 배기시키고, 질소로 재충전하였다. MeOH (2.2 mL) 중 벤질 6-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥사노에이트 (222 mg, 0.11 mmol)의 용액을 시린지를 통해 첨가하고, 이어서 3 방울의 아세트산을 첨가하였다. 플라스크를 배기시키고, 1 atm 수소로 재충전하고, 혼합물을 1 atm 수소 하에 주위 온도에서 교반하였다. 5시간 후, 플라스크를 질소로 퍼징하고, 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 여과물을 진공 하에 농축시켜 표제 화합물 (180 mg, 85%)을 수득하였다. ES/MS m/z 966.2 (M+2H)/2.
제조예 30
(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 6-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥사노에이트
제조예 16의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 6-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥산산으로부터 표제 화합물을 제조하였다. ES/MS m/z 1014.6 (M+2H)/2.
제조예 31
벤질 11-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]운데카노에이트
제조예 10의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 (2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜탄산 및 벤질 11-아미노운데카노에이트 히드로클로라이드로부터 표제 화합물을 제조하였다. ES/MS m/z 1046.6 (M+2H)/2.
제조예 32
11-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]운데칸산
둥근 바닥 플라스크에 탄소 상 팔라듐 (35 mg, 0.02 mmol, 5 질량%, 50% 습윤)을 첨가하고, 플라스크를 배기시키고, 질소로 3회 재충전하였다. 벤질 11-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]운데카노에이트 (285 mg, 80% 순도, 0.11 mmol)의 용액을 시린지를 통해 첨가하였다. 용기를 배기시키고, 1 atm 수소로 재충전한 다음, 혼합물을 1 atm 수소 하에 주위 온도에서 교반하였다. 3시간 동안 교반한 후, 플라스크를 질소로 퍼징하고, 혼합물을 규조토를 통해 여과하였다. 여과물을 농축시켜 표제 화합물 (213 mg, 79% 순도, 77%)을 수득하였다. ES/MS m/z 1001.20 (M+2H)/2.
제조예 33
(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 11-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]운데카노에이트
제조예 16의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 11-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]운데칸산으로부터 표제 화합물을 제조하였다. ES/MS m/z 1050 (M+2H)/2
제조예 34
[5-아세트아미도-6-[5-[2-[[(4S)-4-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[[6-[[(1S)-1-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-2-[4-(히드록시메틸)-1-피페리딜]-2-옥소-에틸]아미노]-6-옥소-헥실]아미노]-5-옥소-펜타노일]-[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]에틸아미노]-5-옥소-펜톡시]-3,4-디아세톡시-테트라히드로피란-2-일]메틸 아세테이트
제조예 10의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 6-[[(2S)-2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥산산 및 (2S)-2-아미노-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]-1-[4-(히드록시메틸)-1-피페리딜]프로판-1-온으로부터 표제 화합물을 제조하였다. ES/MS m/z 1059.2 (M-2H)/2.
제조예 35
4-[[1-[(2S)-2-[6-[[(2S)-2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥사노일아미노]-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]프로파노일]-4-피페리딜]메톡시]-4-옥소-부탄산
DCM (11 mL) 중 [5-아세트아미도-6-[5-[2-[[(4S)-4-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[[6-[[(1S)-1-[[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]메틸]-2-[4-(히드록시메틸)-1-피페리딜]-2-옥소-에틸]아미노]-6-옥소-헥실]아미노]-5-옥소-펜타노일]-[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]에틸아미노]-5-옥소-펜톡시]-3,4-디아세톡시-테트라히드로피란-2-일]메틸 아세테이트 (1.194 g, 0.56 mmol)의 용액에 숙신산 무수물 (113 mg, 1.13 mmol), TEA (0.4 mL, 3 mmol) 및 DMAP (213 mg, 1.69 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 포화 NH4Cl (200 mL)로 희석하고, DCM (3 x 200 mL) 및 3:1 CHCl3:IPA (200 mL)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 0-40% MeOH/DCM으로 용리시키면서 정제하고, 생성된 생성물을 진공 오븐에서 40℃에서 3시간 동안 건조시켜 표제 화합물 (1.081 g, 86%)을 수득하였다. ES/MS m/z 1109.60 (M-2H)/2.
제조예 36
수지 로딩
MeCN (6 mL) 중 4-[[1-[(2S)-2-[6-[[(2S)-2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]헥사노일아미노]-3-[비스(4-메톡시페닐)-페닐-메톡시]프로파노일]-4-피페리딜]메톡시]-4-옥소-부탄산 (1.00 g, 0.61 mmol) 및 DCM (1 mL)의 용액을 수지 로딩 카트리지로 옮겼다. 용기에 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (386 mg, 0.97 mmol) 및 DIEA (0.25 mL, 0.48 mmol)를 첨가하고, 카트리지를 주위 온도에서 5분 동안 진탕시켰다. 그 후, 1000 Å LCAA 제어된-세공 유리 수지 (5.39 g, 90 μmol/g 로딩, 켐진스(ChemGenes)로부터 구입함)를 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 18시간 동안 진탕시켰다. 그 후, 카트리지를 흡인에 의해 배출시키고, 수지를 DCM (10 mL)과 함께 10분 동안 진탕시킴으로써 세척하였다. 카트리지를 배수시키고, 세척 및 배수 절차를 10% MeOH/DCM (10 mL) 및 Et2O (10 mL)를 사용하여 반복하였다. 배수 후, 아세트산 무수물 (6.4 mL), 피리딘 (20 mL) 및 TEA (0.22 mL)의 용액을 첨가하고, 카트리지를 2시간 동안 진탕시켰다. 그 후, 카트리지를 배수시키고, 상기 세척 및 배수 절차를 DCM (10 mL), 10% MeOH/DCM (10 mL) 및 디에틸 에테르 (10 mL)를 사용하여 반복하였다. 배수 후, 수지를 진공 하에 30분 동안 건조시켰다. 수지 로딩은 표준 트리틸 검정을 사용하여 결정된다. 수지 로딩은 34.7 μmol/g인 것으로 계산되었다.
제조예 37
벤질 2-[2-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]아세테이트
제조예 10의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 (2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜탄산 및 벤질 2-(2-아미노에톡시)아세테이트 히드로클로라이드로부터 표제 화합물을 제조하였다. ES/MS m/z 1005.2 (M+2H/2).
제조예 38
2-[2-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]아세트산
벤질 2-[2-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]아세테이트 (0.120 mmol, 240 mg)를 MeOH (12.0 ml) 중 5% Pd/C (1.17 mmol, 124 mg)와 합하였다. 혼합물을 파르(Parr) 진탕기 (주위 온도, 10 psi) 상에서 48분 동안 수소화시키고, 규조토를 통해 여과하고, 진공 하에 농축시켜, 표제 화합물을 회색 고체 (187 mg, 82%)로서 수득하였다. ES/MS m/z 960.0 (M+2H/2).
제조예 39
(2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 2-[2-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]아세테이트
DCM (3.0 ml) 중 2-[2-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]아세트산 (0.096 mmol, 184 mg) 및 DIEA (0.765 mmol, 140 μL)에 (2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 2,2,2-트리플루오로아세테이트 (0.383 mmol, 100 mg)를 혼합물에 적가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 16 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 0%에서 50% MeOH/DCM으로 용리시키면서 직접 정제하여 표제 화합물을 황갈색 고체 (197 mg, 99%)로서 수득하였다. ES/MS m/z 1034.0 (M+2H/2).
제조예 40
벤질 2-[2-[2-[2-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]아세테이트
제조예 10의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 (2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜탄산 및 벤질 2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트 히드로클로라이드로부터 표제 화합물을 제조하였다. ES/MS m/z 1049.0 (M+2H/2).
제조예 41
2-[2-[2-[2-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]아세트산
벤질 2-[2-[2-[2-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]아세테이트 (0.118 mmol, 247 mg)를 MeOH (12.0 mL) 중 5% Pd/C (1.17 mmol, 124 mg)와 합하였다. 혼합물을 파르 진탕기 (주위 온도, 10 psi) 상에서 1시간 동안 수소화시키고, 규조토를 통해 여과하고, 진공 하에 농축시켜, 표제 화합물을 회색 고체로서 수득하였다 (227 mg, 96%). ES/MS m/z 1004.0 (M+2H/2).
제조예 42
(2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 2-[2-[2-[2-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]아세테이트
DCM (3.0 ml) 중 2-[2-[2-[2-[[(2S)-2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]-5-[비스[2-[5-[5-[3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시펜타노일아미노]펜타노일아미노]에틸]아미노]-5-옥소-펜타노일]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]아세트산 (0.111 mmol, 222 mg) 및 DIEA (0.883 mmol, 154 μL)에 (2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 2,2,2-트리플루오로아세테이트 (0.443 mmol, 116 mg)를 혼합물에 적가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 16 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 0%에서 50% MeOH/DCM으로 용리시키면서 직접 정제하여 표제 화합물을 황갈색 고체 (174 mg, 73%)로서 수득하였다. ES/MS m/z 1078.2 (M+2H/2).
실시예 1
접합 프로토콜
GalNAc-접합 센스 가닥의 합성을 위해, 3' C6-NH2 관능기가 있는 센스 가닥이 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 먼저 합성된다. GalNAc 리간드-NHS 에스테르의 원액 (아세토니트릴 중 10 mmol/L; 1 당량)을 제조하였다. 에펜도르프(Eppendorf) 튜브 내에서 보레이트 완충제 (10% v/v; 20x)를 올리고뉴클레오티드 C6-NH2 센스 가닥에 첨가한 다음, GalNAc 리간드 (5 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 16시간 동안 진탕시켰다. 그 후, 혼합물을 15 mL 팔콘 튜브로 옮기고, 수산화암모늄 (28 질량%)을 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 2시간 동안 진탕시켰다. 이어서 암모니아를 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 조건: 용매 A: 15% MeCN/20 mM NaH2PO4, 용매 B: 15%MeCN/20mM NaH2PO4, 1M NaBr; 5 CV에 걸쳐 8 mL/분으로 35-55%B, 칼럼 온도 60℃. 목적 분획을 풀링하고, 탈염 칼럼 또는 에펜도르프 원심분리기를 사용한 스핀-여과에 의해 탈염시켰다. 탈염 후, 이 물질을 회수하고, OD 및 부피를 측정하여 농도를 얻는다.
대안적으로, 접합은 미세다공성 폴리스티렌 수지 또는 제어된 세공 유리(controlled pore glass) 상에 GalNAc 리간드를 고정시키고, 5'-CE β-시아노에틸) 포스포르아미다이트를 사용하는 확립된 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 사용하여 합성하는 것을 통해 센스 가닥의 5' 위치에 대해 이루어진다.
대안적으로, GalNAc 리간드는 적합한 포스포르아미다이트로 전환되고, 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 센스 가닥의 5' 위치로 전달된다.
실시예 2: 어닐링
센스 및 안티센스 가닥의 siRNA 듀플렉스를 생성하기 위해, 하기 절차를 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 센스 가닥-GalNAc 접합체를 함유하는 팔콘 튜브에, 상응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (1 당량)를 첨가하고, 10초 동안 볼텍싱한 후, 100K MWCO 아미콘(Amicon) 필터 유닛을 통해 스핀-여과하여 미립자를 제거하였다. 여과물을 회수하고, 진백(Genevac) 증발기 상에서 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 1x PBS 중에 재구성하고, 0.2 μ 필터를 통해 여과하고, OD 및 부피를 측정하여 농도를 얻는다.
엔도세이프(Endosafe)®-넥스겐(nexgen) PTS 기기 상에서 리물러스(Limulus) 유주세포 용해질을 사용하여 내독소 시험을 수행하였다.
표 1 - 상기 언급된 접합 및 어닐링 프로토콜을 이용하여 합성된 예시적인 분자.
실시예 3: GalNAc-관능화 CPG를 사용한 올리고 합성에 대한 일반적 절차
올리고 합성은 머메이드(Mermade) 12 기기 상에서 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 수행하였다. 센스 가닥은 예비관능화된 GalNAc 고체 지지체로부터 합성되고, 안티센스 가닥은 올리고 서열의 제1 뉴클레오티드가 미리 로딩된 표준 지지체를 사용하여 합성된다. 올리고를 절단하고, 진한 수산화암모늄 용액 (질량 기준 28%)을 사용하여 탈보호하고, 상기 기재된 조건을 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 탈염, 어닐링 및 내독소 시험을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
주 - [Phos]는 인산화 5' 잔기를 나타내고; m은 m 바로 다음에 기재된 뉴클레오티드/뉴클레오시드 염기의 리보스에 있는 2' O-Me 기를 나타내고; f는 f 바로 다음에 기재된 뉴클레오티드/뉴클레오시드 염기의 리보스에 있는 2' 플루오로 기를 나타내고; *는 포스포로티오에이트 (PS)인 변형된 결합을 나타낸다.
실시예 4
표 2 - GalNAc-관능화 CPG 및 어닐링 프로토콜을 사용한 올리고 합성을 위한 상기 언급된 절차를 이용하여 합성된 예시적인 분자.
실시예 5
표 3 - GalNAc 대조군
실시예 6: 생물학적 검정
생체내 GalNAc-LDHA siRNA 접합체 유전자 녹다운의 평가
동물
모든 동물을 12시간/12시간 명/암 주기의 온도-제어 시설 (24℃)에서 개별적으로 수용하였다. 동물 프로토콜은 일라이 릴리 앤드 캄파니(Eli Lilly and Company) IACUC에 의해 승인되었다. 수컷, 대략 8주령, C57BL/6 마우스 (엔비고(Envigo))의 체중을 측정하고, 그룹당 6마리 동물의 처리 그룹으로 무작위화하였다. 동물을 피하 주사를 통해 PBS 또는 siRNA 접합체로 처리하였다. 투여 14일 후, 동물을 희생시키고 간 조직을 신속하게 절개하고 액체 질소에서 급속-동결시켰다.
RNA 단리 및 실시간 정량적 RT-PCR
트리졸(TRIzol) 시약 (암비온) 및 퓨어링크 프로(PureLink Pro) 96 총 RNA 정제 키트 (인비트로젠)를 사용하여 간 샘플로부터 총 RNA를 단리하였다. RNA 1 마이크로그램을 사용하여 고성능 cDNA 역전사 키트 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 정량적 실시간 PCR은 어플라이드 바이오시스템즈 퀀트스튜디오 7 플렉스 리얼-타임 PCR 시스템(QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System) (어플라이드 바이오시스템즈) 상에서 수행하였다. CT 값을 RPLP0 (Mm01974474_gH, 어플라이드 바이오시스템즈)에 대해 정규화하고, LDHA (Mm03646738_gI, 어플라이드 바이오시스템즈)에 대한 상대적 발현을 ΔΔCT 방법에 의해 계산하였다. 배수 변화는 비히클-처리된 동물에 대한 상대 발현을 정규화함으로써 계산하였다.
표 4: 마우스 1차 간세포에서의 LDHA mRNA의 녹다운
표 5 - 생체내 녹다운 데이터
GalNAc-LDHA siRNA 24시간 조직 노출 스크린
동물
모든 동물을 12시간/12시간 명/암 주기의 온도-제어 시설 (24℃)에서 개별적으로 수용하였다. 동물 프로토콜은 일라이 릴리 앤드 캄파니 IACUC에 의해 승인되었다. 수컷, 대략 8주령, C57BL/6 마우스 (엔비고)의 체중을 측정하고, 그룹당 5마리 동물의 처리 그룹으로 무작위화하였다. 동물을 피하 주사를 통해 PBS 비히클 또는 siRNA 접합체로 처리하였다. 투여 24시간 후, 동물을 희생시키고, 심장 천자 채혈을 통해 혈장 샘플을 수집하고, 간/신장 조직을 신속하게 절개하고, 액체 질소에서 급속-동결시켰다. siRNA 및 대사물의 조직 농도를 형광 검출과 커플링된 PNA 혼성화 및 음이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피 분석에 의해 결정하였다.
표 6 - 간 노출
표 7 - 신장 노출
실시예 7: 마우스 유전자의 시험관내 녹다운
마우스 1차 간세포 (MPH)를 새로이 단리하고, 코닝 플레이트 상에 웰당 15k로 플레이팅하고, PBS 중 siRNA 접합체를 각각의 웰에 첨가하였다. 마우스 1차 간세포에서 1000, 333, 111, 37, 12, 4, 1.37, 0.46, 0.15, 0.05, 및 0.017 nM 최종 GalNAc-접합된 듀플렉스 농도를 사용하여 용량 반응 실험을 수행하였다.
RNA를 지모 리서치(Zymo Research)로부터의 퀵(Quick)-RNA 96 키트를 사용하여 플레이팅된 세포로부터 직접 단리하였다. 최종 정제 및 용리된 RNA를 즉시 사용하거나 동결 저장한다. cDNA를 인비트로젠으로부터의 패스트 어드밴스드 RT 마스터 믹스(Fast Advanced RT Master Mix) 및 퀀트스튜디오 7 플렉스 리얼-타임 PCR 시스템 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))을 사용하여 37℃에서 30분, 95℃에서 5분, 및 4℃ 유지로 인큐베이션하여 정제된 RNA로부터 합성하였다. cDNA를 사용하여 퀀트스튜디오 7 플렉스 리얼-타임 PCR 시스템 (라이프 테크놀로지스)을 사용하여 하기 파라미터를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다: 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 40 사이클의 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분.
하기 마우스 표적 유전자 HPRT, LDHA, 및 DPP4 (라이프 테크놀로지스)에 대한 RT-PCR 검정 및 IC50 계산의 결과를 표 8에 제시한다. 녹다운 수준은 비히클 단독과 비교한 상대적 녹다운을 나타내고, 샘플 간의 비교를 위해 마우스 Rplp0 (라이프 테크놀로지스)에 대해 추가로 정규화하였다. IC50를 XLFit을 사용하여 4-파라미터 피트 모델을 사용하여 계산하였다. 이들 결과는 3종의 상이한 유전자의 80-97% 녹다운으로 본원에 개시된 전달 모이어티의 효과적인 녹다운을 입증한다.
표 8 - 본원에 개시된 GalNAc를 포함하는 신규 전달 모이어티에 접합된 siRNA로의 마우스 1차 간세포에서의 IC50 및 최대 녹다운 백분율 데이터
SEQUENCE LISTING
<110> Eli Lilly and Company
<120> NOVEL THERAPEUTIC DELIVERY MOIETIES AND USES THEREOF
<130> X22934
<150> 63/214,555
<151> 2021-06-24
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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caaguugagu accuccuuau u 21
Claims (25)
- R에 접합된 화학식 I을 포함하는 화합물로서,
여기서 R은 임의로 링커를 통해 화학식 I에 접합되고, R은 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 관심 유전자에 대한 상보성 영역을 포함하고, 안티센스 가닥은 15 내지 40개의 뉴클레오티드 길이인 화합물. - 제1항에 있어서, 화학식 I이 링커를 통해 R에 접합된 것인 화합물.
- 제2항에 있어서, 링커가 연결 지점 A 및 B를 갖는 화학식 II의 링커를 포함하거나 링커가 연결 지점 C 및 D를 갖는 화학식 III을 포함하는 것인 화합물:
여기서 연결 지점 A 또는 연결 지점 C가 화학식 I에 접합된다. - 제2항 또는 제3항에 있어서, 링커가 연결 지점 B 또는 연결 지점 D에 포스페이트 기를 추가로 포함하며, 포스페이트 기가 R에 접합된 것인 화합물.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 연결 지점 C 및 D를 갖는 화학식 III의 링커를 포함하며,
여기서 연결 지점 C가 화학식 I에 접합되는 것인 화합물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 유전자에 대한 상보성 영역이 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드 길이인 화합물.
- 제6항에 있어서, R이 센스 가닥을 추가로 포함하고, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이의 상보성 영역을 형성하는 것인 화합물.
- 제7항에 있어서, 화학식 I이 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 접합된 것인 화합물.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 화학식 I이 안티센스 가닥에 접합된 것인 화합물.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 화학식 I이 센스 가닥에 접합된 것인 화합물.
- 제10항에 있어서, 화학식 I이 센스 가닥의 3' 말단 뉴클레오티드에 접합된 것인 화합물.
- 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 적어도 18개의 뉴클레오티드 길이의 상보성 영역을 형성하는 것인 화합물.
- 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 센스 가닥과 적어도 15개의 뉴클레오티드의 상보성 영역을 형성하는 것인 화합물.
- 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 독립적으로 18 내지 23개의 뉴클레오티드 길이인 화합물.
- 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 독립적으로 21 내지 23개의 뉴클레오티드 길이인 화합물.
- 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 2개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는 것인 화합물.
- 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥이 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 화합물.
- 제7항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드가 2' 플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오티드, 또는 O-메톡시에틸 변형된 뉴클레오티드인 화합물.
- 제7항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥이 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 센스 가닥의 각각의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 화합물.
- 제7항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 1개 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 화합물.
- 제7항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 또는 안티센스 가닥이 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 것인 화합물.
- 제7항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 연결인 화합물.
- 제7항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥의 5' 뉴클레오티드가 인산화되거나 포스페이트 유사체를 포함하는 것인 화합물.
- 제7항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥의 5' 뉴클레오티드가 비닐포스포네이트 기를 포함하는 것인 화합물.
- 제7항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 siRNA인 화합물.
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