CN116802295A - 用于抑制中枢神经系统中的基因表达的组合物和方法 - Google Patents

用于抑制中枢神经系统中的基因表达的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116802295A
CN116802295A CN202280012175.7A CN202280012175A CN116802295A CN 116802295 A CN116802295 A CN 116802295A CN 202280012175 A CN202280012175 A CN 202280012175A CN 116802295 A CN116802295 A CN 116802295A
Authority
CN
China
Prior art keywords
oligonucleotide
nucleotides
ligand conjugate
conjugate
length
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280012175.7A
Other languages
English (en)
Inventor
M·荣格
T·格里姆
王为民
B·D·布朗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dicerna Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Dicerna Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dicerna Pharmaceuticals Inc filed Critical Dicerna Pharmaceuticals Inc
Publication of CN116802295A publication Critical patent/CN116802295A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C12N2310/3125—Methylphosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01003—Aldehyde dehydrogenase (NAD+) (1.2.1.3)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本文提供了抑制或降低CNS中靶基因的表达的寡核苷酸缀合物。还提供了包含该寡核苷酸缀合物的组合物及其用途，特别是涉及治疗与CNS中靶基因表达相关的疾病、病症和/或状况的用途。

Description

用于抑制中枢神经系统中的基因表达的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年1月28日提交的第63/142,877号美国临时专利申请的优先权，该美国临时专利申请的内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及核酸-疏水性配体缀合物和寡核苷酸-疏水性配体缀合物。具体地，本公开涉及核酸-脂质缀合物和寡核苷酸-脂质缀合物、其制备方法、其化学构型，以及使用根据本文提供的说明书的缀合的核酸和寡核苷酸调节(例如，抑制或降低)中枢神经系统(本文中缩写为“CNS”)中(例如，CNS的细胞、组织或区域中)靶基因的表达的方法。本公开还提供了包含本说明书的缀合物的药学上可接受的组合物以及使用所述组合物治疗各种疾病或病症的方法。
背景技术
经修饰的核酸对基因表达的调节作为实验室中的研究工具和临床上的治疗方法显示出巨大潜力。数类基于寡核苷酸或核酸的治疗剂已处于临床研究阶段，包括反义寡核苷酸(ASO)、短干扰RNA(siRNA)、双链核酸(dsNA)、适体、核酶、外显子跳跃和剪接改变寡核苷酸、免疫调节寡核苷酸、mRNA和CRISPR。相关分子中的化学修饰在克服寡核苷酸治疗剂的挑战方面发挥着关键作用，包括提高核酸酶稳定性、RNA结合亲和力和药代动力学。在过去的三十年中，已经针对寡核苷酸开发了多种化学修饰策略，包括糖、核碱基和磷酸二酯骨架的修饰，以改善和优化表现和治疗效果(Deleavey和Darma,CHEM.BIOL.2012,19(8):937-54；Wan和Seth,J.MED.CHEM.2016,59(21):9645-67；以及Egli和Manoharan,ACC.CHEM.RES.2019,54(4):1036-47)。
由包含siRNA或双链核酸(dsNA)的基于RNAi寡核苷酸的治疗剂介导的治疗性基因沉默提供了显著扩展可成药靶点空间的潜力，以及治疗其他药物方式(例如，抗体和/或小分子)可能无法治疗的孤儿病的可能性。抑制或降低肝脏中特定靶基因的表达的基于RNAi寡核苷酸的治疗剂已经开发出来，并且目前正在临床使用(Sehgal等人,(2013)JOURNAL OFHEPATOLOGY 59:1354-1359)。用于肝外细胞、组织和器官(例如中枢神经系统或CNS)中的RNAi寡核苷酸的开发和临床应用仍然存在技术障碍。在CNS中由基于RNAi寡核苷酸的治疗剂介导的治疗性基因沉默对于治疗神经系统疾病特别有意义(Boudreau&Davidson(2010)BRAIN RESEARCH 1338:112-21)。因此，本领域持续需要成功开发新的且有效的RNAi寡核苷酸来调节肝外细胞、组织和/或器官(例如，CNS)中靶基因的表达。
发明内容
哺乳动物的CNS是一个复杂的组织系统，包括细胞、流体和化学物质，它们协同相互作用以实现多种功能，包括运动、导航、认知、言语、视觉和情感。遗憾的是，已知有多种CNS疾病和病症(例如，神经系统病症)，它们影响或破坏部分或全部这些功能。通常，对CNS疾病和病症的治疗局限于小分子药物、抗体和/或适应性或行为疗法。持续需要开发与不当基因表达相关的CNS疾病和病症的治疗。因此，本公开涉及包含寡核苷酸-配体缀合物(例如，RNAi寡核苷酸缀合物)的组合物，所述寡核苷酸-配体缀合物包含调节(例如，降低或抑制)CNS中的靶基因表达的一个或多个疏水性部分。本公开还涉及所述寡核苷酸缀合物的制备方法以及使用和治疗方法。
本申请涉及包含疏水性配体的新型核酸、寡核苷酸或其类似物，所述疏水性配体包括但不限于金刚烷基和脂质缀合物。本公开涉及核酸-脂质缀合物和寡核苷酸-脂质缀合物及其制备方法和用途，其功能是调节细胞中靶基因的表达。不受理论的束缚，亲脂性/疏水性部分，如脂肪酸和金刚烷基，当连接到这些高度亲水性的核酸/寡核苷酸时，显著增强血浆蛋白质结合，并因此延长循环半衰期。本文提供的缀合的核酸、寡核苷酸及其类似物是稳定的，并与RNA靶标结合以引发广泛的肝外RNA酶H活性，并且还可用于剪接转换和RNAi。不希望受理论束缚，诸如脂质等疏水性部分的并入促进了新型核酸、寡核苷酸或其类似物向包括但不限于CNS、肌肉、脂肪和肾上腺的若干组织中的全身递送。
合适的核酸-疏水性配体缀合物和寡核苷酸-疏水性配体缀合物包括核酸抑制剂分子，如dsRNA抑制剂分子、dsRNAi抑制剂分子、反义寡核苷酸、miRNA、核酶、antagomir、适体和单链RNAi抑制剂分子。特别是，本公开提供了核酸-脂质缀合物、寡核苷酸-脂质缀合物及其类似物，其可用作细胞内RNA水平的调节剂。本公开的核酸抑制剂分子通过多样化的一套机制调节RNA表达，例如通过RNA干扰(RNAi)。本文提供的核酸-疏水性配体缀合物、寡核苷酸-疏水性配体缀合物及其类似物的优点是可能具有广泛的药理学活性，与细胞内RNA水平的调节一致。另外，本公开提供了使用有效量的本文所述的缀合物通过调节细胞内RNA水平来治疗或改善疾病状况的方法。
本公开涉及包含一个或多个核酸-配体缀合物单元的RNAi寡核苷酸缀合物，其通过RNA干扰(RNAi)调节CNS中的靶基因表达。特别是，本公开涉及包含一个或多个疏水性部分配体(包括但不限于脂质部分)的新型RNAi寡核苷酸缀合物，其调节(例如，降低或抑制)CNS中的靶基因表达，本公开还涉及所述RNAi寡核苷酸缀合物的组合物，及其制备方法和用途。
本公开至少部分地基于RNAi寡核苷酸-脂质缀合物的发现，所述缀合物在延长的时间段内有效地降低CNS中的靶基因表达。已证明本文提供的示例性RNAi寡核苷酸-脂质缀合物在单次施用后导致CNS中靶基因表达的持续的数月降低。此外，本文提供的示例性RNAi寡核苷酸-脂质缀合物已在整个CNS的多个区域中证明了药理学活性。不受理论的束缚，疏水性部分(例如脂质)促进了RNAi寡核苷酸-脂质缀合物向CNS中的递送和分布，从而提高基因敲减的功效和持久性。此外，本公开提供了有效降低CNS中的靶基因表达而不降低肝脏中的靶基因表达的RNAi寡核苷酸-脂质缀合物。因此，本公开提供了通过使用本文所述的RNAi寡核苷酸-脂质缀合物及其药学上可接受的组合物调节CNS中的靶基因表达来治疗疾病或病症的方法。本公开进一步提供了使用RNAi寡核苷酸-脂质缀合物制备用于通过调节CNS中的靶基因表达来治疗疾病或病症的药物的方法。
RNAi作为一种定向基因沉默工具已得到迅速发展。细胞中存在的RNAi机制可以通过多种方式进行选择，以实现选定靶标的基因表达敲减，甚至在CNS中。根据本公开内容并且不受理论的束缚，将合成的siRNA引入细胞中，将其直接加载到RISC中，或者在较长dsRNA(25-27个核苷酸)的情况下，首先用切酶(Dicer)加工，然后加载到RISC中，以实现基因沉默。本公开的各个实施方案提供的RNAi疗法非常适合于其中致病基因获得负面或破坏性“功能获得”效应的疾病和病症。文献中对此类致病基因的鉴定连同本公开一起将允许设计RNAi寡核苷酸分子来靶向致病等位基因并提供治疗缓解。本文提供的公开内容所针对的疾病/病症的类型包括但不限于：进行性核上麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、嗜银颗粒病(AGD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、衰老相关的tau星形神经胶质病(ARTAG)、家族性额颞叶痴呆17(FTD-17)、Tau蛋白病伴呼吸衰竭、痴呆伴癫痫、皮克病(Pick’s disease)、强直性肌营养不良1或2(MD1或MD2)、唐氏综合征、痉挛性截瘫(SP)、C型Niemann-Pick病、路易体痴呆(DLB)、路易体吞咽困难、路易体病、橄榄体脑桥小脑萎缩、纹状体黑质变性、Shy-Drager综合征、脊髓性肌萎缩V(SMAV)、亨廷顿病(HD)、阿尔茨海默病、SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA10(1、2、3、7或10型脊髓小脑共济失调)、多系统萎缩(MSA)、脊髓和延髓肌肉萎缩(SBMA，肯尼迪病)、Friedrich共济失调、脆性X相关震颤/共济失调综合征(FXTAS)、脆性X综合征(FRAXA)、X连锁精神发育迟滞(XLMR)、帕金森病、张力障碍、SBMA(脊髓延髓肌萎缩)、神经性疼痛病症、脊髓损伤、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(DRPLA)、隐性CNS病症、ALS(肌萎缩侧索硬化)、M2DS(MECP2重复综合征)、FTD(额颞叶痴呆)、朊病毒病、成年发作型脑白质营养不良、Alexander病、Krabbe病、慢性创伤性脑病、Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)、Lafora病、卒中、脑淀粉样血管病(CAA)和异染性脑白质营养不良(MLD)。在一些实施方案中，该疾病或病症是PMD、脊髓损伤、卒中、Krabbe病、MLD、SCA3、朊病毒病、阿尔茨海默病、Alexander病、成年发作型脑白质营养不良、MECP2重复综合征、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth)、多发性硬化、肯尼迪病、亨廷顿病、X连锁肾上腺脑白质营养不良或SCA1。在一些实施方案中，该疾病或病症是PMD。在一些实施方案中，该疾病或病症是脊髓损伤。在一些实施方案中，该疾病或病症是卒中。在一些实施方案中，该疾病或病症是Krabbe病。在一些实施方案中，该疾病或病症是MLD。在一些实施方案中，该疾病或病症是SCA3。在一些实施方案中，该疾病或病症是朊病毒病。在一些实施方案中，该疾病或病症是阿尔茨海默病。在一些实施方案中，该疾病或病症是Alexander病。在一些实施方案中，该疾病或病症是成年发作型脑白质营养不良。在一些实施方案中，该疾病或病症是MECP2重复综合征。在一些实施方案中，该疾病或病症是腓骨肌萎缩症。在一些实施方案中，该疾病或病症是多发性硬化。在一些实施方案中，该疾病或病症是肯尼迪病。在一些实施方案中，该疾病或病症是亨廷顿病。在一些实施方案中，该疾病或病症是X连锁肾上腺脑白质营养不良。在一些实施方案中，该疾病或病症是SCA1。
在一些实施方案中，本公开的核酸-疏水性配体缀合物及其药学上可接受的组合物作为细胞内RNA水平和/或RNA功能的调节剂是有效的。包含一个或多个脂质缀合物的此类核酸-脂质缀合物由式I-a表示：
或其药学上可接受的盐，其中每个变量如本文所定义和描述。
在某些实施方案中，所述核酸-配体缀合物由式I-b、I-c、I-Ib或I-Ic表示：
或其药学上可接受的盐，其中每个变量如本文所定义和描述。
在另一方面，本公开提出了由式II-a表示的寡核苷酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中每个变量如本文所定义和描述。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸-脂质缀合物由式II-b、II-c、II-Ib或II-Ic表示：
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，任何以上公开的实施方案的寡核苷酸-配体缀合物包含1-10个核酸-配体或核酸类似物-配体缀合物单元。在一些实施方案中，所述寡核苷酸-配体缀合物包含1、2或3个核酸-配体缀合物单元。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸-配体缀合物包含长度为10-53个核苷酸的有义链和长度为15-53个核苷酸的反义链，其中所述反义寡核苷酸链具有与靶基因序列的至少15个连续核苷酸互补的序列，并且当将所述寡核苷酸缀合物引入哺乳动物细胞中时，降低靶基因的表达。在一些实施方案中，所述寡核苷酸-配体缀合物包含长度为9至30个核苷酸的核苷酸链。在一些实施方案中，所述寡核苷酸-配体缀合物是单链的。在一些实施方案中，所述寡核苷酸-配体缀合物是双链的。
在所述寡核苷酸-配体缀合物的某些实施方案中，所述反义链的长度为19至27个核苷酸。在所述寡核苷酸-配体缀合物的某些实施方案中，所述有义链的长度为12至40个核苷酸。在所述寡核苷酸-配体缀合物的某些实施方案中，所述有义链与所述反义链形成双链体区域。在所述寡核苷酸-配体缀合物的某些实施方案中，所述互补区域与靶序列完全互补。
在所述寡核苷酸-配体缀合物的某些实施方案中，所述有义链在其3’-端包含如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环。在所述寡核苷酸-配体缀合物的某些实施方案中，L为四环(tetraloop)，并且L包含表示为GAAA的序列。在一些实施方案中，L为具有表示为5’-GAAA-3’的核苷酸序列的四环。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸-配体缀合物进一步在反义链上包含长度为两个核苷酸的3’-突出端序列。在某些实施方案中，所述寡核苷酸-配体缀合物进一步包含长度为一个或多个核苷酸的3’-突出端序列，其中该3’-突出端序列存在于反义链上，有义链上，或反义链和有义链上。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸-配体缀合物包含至少一个经修饰的核苷酸，并且其中所述经修饰的核苷酸包含2’-修饰。在一些实施方案中，所述2’-修饰是选自2’-氨基乙基、2’-氟代、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-脱氧-2’-氟代和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖基(arabino)的修饰。
在所述寡核苷酸-配体缀合物的某些实施方案中，所述寡核苷酸的所有核苷酸均被修饰。
在所述寡核苷酸-配体缀合物的某些实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键合。在所述寡核苷酸-配体缀合物的一些实施方案中，所述至少一个经修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。
在所述寡核苷酸-配体缀合物的一些实施方案中，所述反义链的5’-核苷酸的糖的4’-碳包含磷酸酯类似物。所述磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。
在一些方面，本公开提供了由式I-a表示的核酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
B为核碱基或氢；
R1和R2独立地为氢、卤素、RA、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或者
同一碳上的R1和R2与它们的居间原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3元饱和或部分不饱和环；
每个RA独立地为任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地为氢、合适的保护基或任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环，或者：
同一原子上的两个R基团与它们的居间原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和的、部分不饱和的或杂芳基环；
LA独立地为PG1或-L-配体；
PG1为氢或合适的羟基保护基；
每个配体独立地为-(LC)n和/或金刚烷基；
每个LC独立地为包含饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；
每个-Cy-独立地为任选取代的二价环，该二价环选自亚苯基(phenylenyl)，8-10元二环亚芳基，4-7元饱和或部分不饱和亚碳环基，4-11元饱和或部分不饱和亚螺碳环基，8-10元二环饱和或部分不饱和亚碳环基，亚金刚烷基，具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-11元饱和或部分不饱和亚螺杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的8-10元二环饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元亚杂芳基，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元二环亚杂芳基；
n为1-10；
L为共价键或二价饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-N(R)-C(O)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V1CR2W1-或代替；
m为1-50；
X1、V1和W1独立地为-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
Z为-O-、-S-、-NR-或-CR2-；且
PG2为氢、亚磷酰胺类似物或合适的保护基。
在一些方面，所述缀合物由式I-b或I-c表示：
或其药学上可接受的盐；其中
L1为共价键或二价饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
R4为氢、RA或合适的胺保护基；且
R5为金刚烷基，或者饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
在一些方面，所述核酸-配体缀合物由式I-Ib或I-Ic表示：
或其药学上可接受的盐；其中
B为核碱基或氢；
m为1-50；
PG1和PG2独立地为氢、亚磷酰胺类似物或合适的保护基；且
R5为金刚烷基，或者饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
在任何前述或相关方面中，R5选自
在任何前述或相关方面中，R5选自
在一些方面，本公开提供了包含一个或多个本文所述的核酸-配体缀合物的寡核苷酸-配体缀合物。在一些方面，所述寡核苷酸-配体缀合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核酸-配体缀合物。
在一些方面，本公开提供了由式II-a表示的包含一个或多个核酸-配体缀合物的寡核苷酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
B为核碱基或氢；
R1和R2独立地为氢、卤素、RA、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；或者
同一碳上的R1和R2与它们的居间原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3-7元饱和或部分不饱和环；
每个RA独立地为任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地为氢、合适的保护基或任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；或者
同一原子上的两个R基团与它们的居间原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和的、部分不饱和的或杂芳基环；
每个LC独立地为包含饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-代替；
每个-Cy-独立地为任选取代的二价环，该二价环选自亚苯基，8-10元二环亚芳基，4-7元饱和或部分不饱和亚碳环基，4-11元饱和或部分不饱和亚螺碳环基，8-10元二环饱和或部分不饱和亚碳环基，具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-11元饱和或部分不饱和亚螺杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的8-10元二环饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元亚杂芳基，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元二环亚杂芳基；
n为1-10；
L为共价键或二价饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V1CR2W1-或代替；
m为1-50；
X1、V1和W1独立地为-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
Y为氢、合适的羟基保护基、
R3为氢、合适的保护基、合适的前药或任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
X2为O、S或NR；
X3为-O-、-S-、-BH2-或共价键；
Y1为与核苷、核苷酸或寡核苷酸的2’-或3’-末端附接的连接基团；
Y2为氢，合适的保护基，亚磷酰胺类似物，与核苷、核苷酸或寡核苷酸的5’-末端附接的核苷酸间连接基团，或与固相支持体附接的连接基团；且
Z为-O-、-S-、-NR-或-CR2-。
在任何前述或相关方面中，所述寡核苷酸-配体缀合物由式II-b或II-c表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
L1为共价键、单价或二价饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
R4为氢、RA或合适的胺保护基；且
R5为金刚烷基，或者饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR代替。
在任何前述或相关方面中，R5选自
在一些方面，R5选自
在一些方面，本公开提供了由式II-Ib或II-Ic表示的寡核苷酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐；其中
B为核碱基或氢；
m为1-50；
X1为-O-或-S-；
Y为氢、/>
R3为氢或合适的保护基；
X2为O或S；
X3为-O-、-S-或共价键；
Y1为与核苷、核苷酸或寡核苷酸的2’-或3’-末端附接的连接基团；
Y2为氢，亚磷酰胺类似物，与核苷、核苷酸或寡核苷酸的5’-末端附接的核苷酸间连接基团，或与固相支持体附接的连接基团；
R5为金刚烷基，或者饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；且
R为氢、合适的保护基或任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环。
在任何前述或相关方面中，R5选自
/>
在任何前述或相关方面中，R5为
在任何前述或相关方面中，R5为
在任何前述或相关方面中，R5为
在任何前述或相关方面中，R5为
在任何前述或相关方面中，R5为
在任何前述或相关方面中，R5为
在任何前述或相关方面中，R5为
在任何前述或相关方面中，R5为
在任何前述或相关方面中，R5为
在任何前述或相关方面中，R5为
在任何前述或相关方面中，所述寡核苷酸-配体缀合物包含1-10个核酸-配体缀合物单元。在一些方面，所述缀合物包含1、2或3个核酸-配体缀合物单元。
在任何前述或相关方面中，所述寡核苷酸包含长度为10-53个核苷酸的有义链和长度为15-53个核苷酸的反义链，其中所述反义寡核苷酸链具有与靶基因序列的至少15个连续核苷酸互补的序列，并且当将所述寡核苷酸缀合物引入哺乳动物细胞中时，降低靶基因表达。
在任何前述或相关方面中，所述核酸-配体缀合物单元存在于有义链中。在一些方面，反义链的长度为19至27个核苷酸。在一些方面，有义链的长度为12至40个核苷酸。
在任何前述或相关方面中，所述有义链与所述反义链形成双链体区域。
在任何前述或相关方面中，所述互补区域与靶序列完全互补。
在任何前述或相关方面中，所述有义链在其3’-端包含如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环。在一些方面，L为四环。在一些方面，L包含表示为GAAA的序列。在一些方面，L包含表示为5′-GAAA-3′的核苷酸序列。在一些方面，L由表示为5′-GAAA-3′的核苷酸序列组成。
在一些方面，本公开提供了用于降低中枢神经系统(CNS)中靶mRNA的表达的寡核苷酸-配体缀合物，其包含(i)双链寡核苷酸，其包含长度为15至30个核苷酸的反义链和长度为15至40个核苷酸的有义链，其中所述反义链和所述有义链各自包含5’端和3’端，其中所述反义链和所述有义链形成双链体区域，其中所述反义链具有与CNS中的靶mRNA中的靶序列互补的互补区域，其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，其中所述寡核苷酸包含茎-环；以及(ii)与所述茎-环缀合的一个或多个脂质部分。
在任何前述或相关方面中，所述脂质部分包含饱和的C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22烃链。在一些方面，所述脂质部分包含不饱和的C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22烃链，任选地其中所述脂质部分包含C22:6。在一些实施方案中，不饱和烃链包含至少一个双键。例如，具有一个双键的C18烃链被称为C18:1，而具有两个双键的C18烃链被称为C18:2。在一些方面，所述脂质部分包含不饱和的C18烃链(例如，C18:1)。在一些方面，所述脂质部分包含不饱和的C22烃链(例如，C22:6)。
在任何前述或相关方面中，所述一个或多个脂质部分包含饱和或不饱和的C1-C50烃链。在一些方面，所述一个或多个脂质部分包含饱和或不饱和的C5-C25烃链。在一些方面，所述一个或多个脂质部分包含饱和的C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14烃链。在一些方面，所述寡核苷酸-配体缀合物降低CNS中靶mRNA的表达，而不降低CNS外靶mRNA的表达，任选地不降低肝脏中靶mRNA的表达。在一些方面，所述靶mRNA在肝细胞中表达，其中相对于CNS细胞中靶mRNA的表达，所述寡核苷酸-配体缀合物基本上不降低肝细胞中靶mRNA的表达。在一些方面，所述靶mRNA在肝细胞中表达，其中所述寡核苷酸-配体缀合物不会将肝细胞中靶mRNA的表达降低至与CNS细胞中相同的水平。
在一些方面，本公开提供了用于降低CNS中靶mRNA的表达的寡核苷酸-配体缀合物，其包含(i)双链寡核苷酸，其包含长度为15至30个核苷酸的反义链和长度为15至40个核苷酸的有义链，其中所述反义链和所述有义链各自包含5’端和3’端，其中所述反义链和所述有义链形成双链体区域，其中所述反义链具有与CNS中的靶mRNA中的靶序列互补的互补区域，其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，其中所述寡核苷酸包含茎-环；以及(ii)与所述茎-环缀合的一个或多个脂质部分，其中所述一个或多个脂质部分选自饱和或不饱和的C8-C14烃链，其中肝脏中靶mRNA的表达不降低至与CNS中相同或类似的水平。在一些方面，所述一个或多个脂质部分是饱和或不饱和的C8烃链。在一些方面，所述一个或多个脂质部分是饱和或不饱和的C9烃链。在一些方面，所述一个或多个脂质部分是饱和或不饱和的C10烃链。在一些方面，所述一个或多个脂质部分是饱和或不饱和的C11烃链。在一些方面，所述一个或多个脂质部分是饱和或不饱和的C12烃链。在一些方面，所述一个或多个脂质部分是饱和或不饱和的C13烃链。在一些方面，所述一个或多个脂质部分是饱和或不饱和的C14烃链。
在一些方面，所述有义链在其3’端包含所述茎-环。在一些方面，所述茎-环包含由下式表示的核苷酸序列：5’-S1-L-S2-3’，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成环。在一些方面，S1和S2的长度为1至8个核苷酸。在一些方面，所述一个或多个脂质部分与S1的核苷酸缀合。在一些方面，所述一个或多个脂质部分与S2的核苷酸缀合。
在任何前述或相关方面中，L的长度为3至5个核苷酸。在一些方面，L为四环，任选地其中L的长度为4个核苷酸。在一些方面，L包含表示为5’-GAAA-3’的核苷酸序列。在一些方面，L由表示为5’-GAAA-3’的核苷酸序列组成。在一些方面，所述一个或多个脂质部分与L的核苷酸缀合。
在任何前述或相关方面中，L的长度为3个核苷酸，并且从5’至3’具有第一、第二和第三核苷酸，其中所述寡核苷酸-配体缀合物包含一个脂质部分，并且其中所述脂质部分与L的第一、第二或第三核苷酸缀合。在一些方面，L的长度为4个核苷酸，并且从5’至3’具有第一、第二、第三和第四核苷酸，其中所述寡核苷酸-配体缀合物包含一个脂质部分，并且其中所述脂质部分与L的第一、第二、第三或第四核苷酸缀合。在一些方面，所述脂质部分与L的第二核苷酸缀合。在一些方面，L由5’-GAAA-3’组成。在一些方面，所述脂质部分与L的第二核苷酸缀合。在一些方面，L的长度为5个核苷酸，并且从5’至3’具有第一、第二、第三、第四和第五核苷酸，其中所述寡核苷酸-配体缀合物包含一个脂质部分，并且其中所述脂质部分与L的第一、第二、第三、第四或第五核苷酸缀合。
在任何前述或相关方面中，所述反义链的长度为19至27个核苷酸。在一些方面，所述反义链的长度为21至27个核苷酸。在一些方面，所述反义链的长度为22个核苷酸。
在任何前述或相关方面中，所述有义链的长度为19至40个核苷酸。在一些方面，所述有义链的长度为36个核苷酸。
在任何前述或相关方面中，所述双链体区域的长度为至少19个核苷酸。在一些方面，所述双链体区域的长度为至少20个核苷酸。在一些方面，所述双链体区域的长度为21个核苷酸。
在任何前述或相关方面中，所述寡核苷酸-配体缀合物在反义链上包含长度为两个核苷酸的3’-突出端序列。在一些方面，所述寡核苷酸包含长度为一个或多个核苷酸的3’-突出端序列，其中所述3’-突出端序列存在于所述反义链上，所述有义链上，或所述反义链和有义链上。在一些方面，所述3’-突出端序列位于所述反义链上。在一些方面，所述3’-突出端序列的长度为两个核苷酸。
在任何前述或相关方面中，所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些方面，所述经修饰的核苷酸包含2’-修饰。在一些方面，所述2’-修饰是选自2’-氨基乙基、2’-氟代、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-脱氧-2’-氟代和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖基的修饰。在一些方面，所述寡核苷酸的所有核苷酸均被修饰。
在任何前述或相关方面中，所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键合。在一些方面，所述至少一个经修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。在任何前述或相关方面中，所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷间键合。在一些方面，所述至少一个经修饰的核苷间键合是硫代磷酸酯键。
在任何前述或相关方面中，所述反义链的5’-核苷酸的糖的4’-碳包含磷酸酯类似物。在一些方面，所述磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。
在一些方面，本公开提供了包含本文所述的寡核苷酸-配体缀合物和辅料的组合物。
在一些方面，本公开提供了包含本文所述的寡核苷酸-配体缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
在其他方面，本公开提供了将寡核苷酸-配体缀合物递送至受试者的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的组合物。
在一些方面，本公开提供了降低或抑制受试者中靶mRNA的表达的方法，所述靶mRNA由受试者中与CNS相关的细胞群体表达，该方法包括向受试者施用本文所述的寡核苷酸-配体缀合物、本文所述的组合物或本文所述的药物组合物。在一些方面，与对照细胞群体相比，与CNS相关的细胞群体中靶mRNA的表达水平降低。在一些方面，与对照细胞群体相比，位于CNS外的细胞群体中靶mRNA的表达水平不降低。在一些方面，所述位于CNS外的细胞群体处于肝脏中。
在进一步的方面，本公开提供了用于降低靶基因的表达的寡核苷酸-配体缀合物。在一些方面，靶基因在CNS中表达。在一些方面，靶基因与疾病或病症相关，任选地与神经疾病或病症相关。在一些方面，所述疾病或病症选自进行性核上麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、嗜银颗粒病(AGD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、衰老相关的tau星形神经胶质病(ARTAG)、家族性额颞叶痴呆17(FTD-17)、Tau蛋白病伴呼吸衰竭、痴呆伴癫痫、皮克病、强直性肌营养不良1或2(MD1或MD2)、唐氏综合征、痉挛性截瘫(SP)、C型Niemann-Pick病、路易体痴呆(DLB)、路易体吞咽困难、路易体病、橄榄体脑桥小脑萎缩、纹状体黑质变性、Shy-Drager综合征、脊髓性肌萎缩V(SMAV)、亨廷顿病(HD)、阿尔茨海默病、SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA10(1、2、3、7或103型脊髓小脑共济失调)、多系统萎缩(MSA)、脊髓和延髓肌肉萎缩(SBMA，肯尼迪病)、Friedrich共济失调、脆性X相关震颤/共济失调综合征(FXTAS)、脆性X综合征(FRAXA)、X连锁精神发育迟滞(XLMR)、帕金森病、张力障碍、SBMA(脊髓延髓肌萎缩)、神经性疼痛病症、脊髓损伤、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(DRPLA)、隐性CNS病症和ALS(肌萎缩侧索硬化)、M2DS(MECP2重复综合征)、FTD(额颞叶痴呆)、朊病毒病、成年发作型脑白质营养不良、Alexander病、Krabbe病、慢性创伤性脑病、Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)、Lafora病、卒中、脑淀粉样血管病(CAA)和异染性脑白质营养不良(MLD)。
附图说明
图1提供的图示描绘了设计用于在施用至小鼠CNS后抑制鼠Aldh2 mRNA表达的RNAi寡核苷酸(GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸)的功效。在雌性CD-1小鼠中脑室内(i.c.v.)施用在PBS中配制的100μg GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸后5天，相对于PBS处理的小鼠中Aldh2mRNA的百分比(％)，测量在来自不同CNS组织(如图所示)的样品中剩余的Aldh2 mRNA的％。
图2提供了描绘GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸在i.c.v.施用至小鼠CNS后的剂量响应的图示。在小鼠中i.c.v.施用在PBS中配制的250μg或500μg GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸后的不同时间点(如图所示)，相对于PBS处理的小鼠中Aldh2 mRNA的百分比(％)，测量在不同CNS组织(如图所示)中剩余的鼠Aldh2 mRNA的％。如图所示，在额叶皮质、海马体、下丘脑、纹状体、躯体感觉皮质和小脑中测定了Aldh2 mRNA的百分比(％)。
图3提供了小鼠大脑和脊髓区域的图示，以及描绘GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸在i.c.v.施用至小鼠CNS后的剂量响应的图示。在小鼠中i.c.v.施用在PBS中配制的250μg或500μgGalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸后的不同时间点(如图所示)，相对于PBS处理的小鼠中Aldh2 mRNA的百分比(％)，测量在不同CNS组织(如图所示)中剩余的鼠Aldh2 mRNA的％。如图所示，在颈部脊髓、胸部脊髓和腰部脊髓中测定了Aldh2 mRNA的百分比(％)。
图4提供的图示描绘了设计用于在施用至小鼠CNS后抑制鼠Aldh2 mRNA表达的RNAi寡核苷酸(GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸)的功效。在小鼠中鞘内(i.t.)施用在PBS中配制的500μgGalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸后7天，相对于PBS处理的小鼠中Aldh2mRNA的百分比(％)，测量在来自不同CNS组织(如图所示)的样品中剩余的Aldh2 mRNA的％。
图5提供了描绘GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸在施用至大鼠CNS后的剂量响应的图示。在大鼠中腰部i.t.施用在PBS中配制的1000μg或6000μg GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸后7天和28天(如图所示)，相对于PBS处理的大鼠中Aldh2 mRNA的百分比(％)，测量在不同CNS组织(如图所示)中剩余的大鼠Aldh2 mRNA的％。在额叶皮质、纹状体、海马体、脑干、脊髓区域SC1-SC8、C1-C7背根神经节(DRG)、T1-T12 DRG、L1-L6 DRG和肝脏中测定了Aldh2mRNA的百分比(％)。
图6提供的图示描绘了设计用于抑制人/猴ALDH2 mRNA表达的RNAi寡核苷酸(GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸)在施用至非人灵长类动物(NHP)的CNS后的功效。在食蟹猴中i.t.施用在PBS中配制的75mg GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸后28天，相对于PBS处理的NHP中ALDH2 mRNA的百分比(％)，测量在来自不同CNS组织(如图所示)的样品中剩余的ALDH2mRNA的％。
图7提供了描绘GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸在施用至NHP的CNS后的剂量响应的图示。在恒河猴中i.t.施用在PBS中配制的75mg、150mg或300mg GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸后28天，相对于PBS处理的NHP中ALDH2 mRNA的百分比(％)，测量在不同CNS组织(如图所示)中剩余的人/猴ALDH2 mRNA的％。在额叶皮质、海马体、颞叶皮质、小脑、脑干、颈部脊髓、胸部脊髓、腰部脊髓、背根神经节(DRG)和肝脏中测定了ALDH2 mRNA的百分比(％)。
图8提供的图示描绘了GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸在通过手术植入的腰部端口施用(输注)至NHP的CNS后的功效。在食蟹猴中i.t.施用在PBS中配制的75mg GalXC-ALDH2RNAi寡核苷酸后28天，相对于PBS处理的NHP中ALDH2 mRNA的百分比(％)，测量在不同CNS组织(如图所示)中剩余的人/猴ALDH2 mRNA的％。在额叶皮质、尾状核、海马体、中脑、顶叶皮质、枕叶皮质、丘脑、颞叶皮质、小脑、脑干、颈部脊髓、胸部脊髓、腰部脊髓、背根神经节(DRG)和肝脏中测定了ALDH2 mRNA的百分比(％)。
图9提供的图示描绘了GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸在施用至NHP的CNS后的功效。在食蟹猴中小脑延髓池内(i.c.m.)施用在PBS中配制的50mg GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸后28天，相对于PBS处理的NHP中ALDH2 mRNA的百分比(％)，测量在不同CNS组织(如图所示)中剩余的人/猴ALDH2 mRNA的％。在额叶皮质、尾状核、海马体、中脑、顶叶皮质、枕叶皮质、丘脑、颞叶皮质、小脑、脑干、颈部脊髓、胸部脊髓、腰部脊髓、背根神经节(DRG)和肝脏中测定了ALDH2 mRNA的百分比(％)。
图10A提供的图示描绘了一系列GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物(C8:0-C22:6)在施用至小鼠CNS后的功效。在雌性CD-1小鼠中i.c.v.施用在PBS中配制的250μgGalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物后7天，相对于PBS处理的小鼠中Aldh2 mRNA的百分比(％)，测量在不同CNS组织(如图所示)中剩余的鼠Aldh2 mRNA的％。在躯体感觉皮质(SS)、海马体(HP)、下丘脑(HY)、颈部脊髓(CSC)、胸部脊髓(TSC)和腰部脊髓(LSC)中测定了Aldh2mRNA的百分比(％)。
图10B提供的图示描绘了图10A中描述的相同小鼠的肝脏中Aldh2 mRNA的表达百分比(％)，所述小鼠通过i.c.v.施用接受GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物(C8:0-C18:0)。显示了相对于从仅施用PBS的小鼠收获的肝组织中Aldh2 mRNA的百分比(％)，在i.c.v.施用后7天收获的肝组织中剩余的鼠Aldh2 mRNA的百分比(％)。
图11提供的图示描绘了一系列GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物(C10:0-C18:2)在施用至小鼠CNS后的功效。在雌性C57BL/6小鼠中i.t.施用在PBS中配制的250μgGalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物后7天，相对于PBS处理的小鼠中Aldh2 mRNA的百分比(％)，测量在不同CNS组织(如图所示)中剩余的鼠Aldh2mRNA的％。在额叶皮质、海马体(HP)、脑干(BS)、颈部脊髓(CSC)、胸部脊髓(TSC)和腰部脊髓(LSC)中测定了Aldh2 mRNA的百分比(％)。
图12提供了经修饰的GalXC寡核苷酸的示意图。
图13提供了经修饰的脂质缀合的GalXC寡核苷酸的示意图。
具体实施方式
在一些方面，本公开提供了降低CNS中靶基因的表达的RNAi寡核苷酸缀合物(例如，RNAi寡核苷酸-脂质缀合物)。在其他方面，本公开提供了使用本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的组合物治疗疾病或病症(例如，神经疾病和/或由不当基因表达引起的)的方法。在其他方面，本公开提供了使用本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物制备用于治疗疾病或病症的药物的方法。在其他方面，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物用来通过调节(例如，抑制或降低)CNS中与神经疾病或病症相关的靶基因的表达来治疗神经疾病或病症。在一些方面，本公开提供了通过降低CNS中(例如，CNS的细胞、组织或区域中)与神经疾病或病症相关的靶基因的表达来治疗神经疾病或病症的方法。
RNAi寡核苷酸缀合物
本公开尤其提供了降低CNS中的靶基因表达的RNAi寡核苷酸缀合物(例如，RNAi寡核苷酸-脂质缀合物)。在一些实施方案中，本公开提供的RNAi寡核苷酸缀合物靶向编码靶基因的mRNA。编码靶基因并被本公开的RNAi寡核苷酸缀合物靶向的信使RNA(mRNA)在本文中被称为“靶mRNA”。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物降低CNS中(例如，躯体感觉皮质(SS皮质)、海马体(HP)、纹状体、额叶皮质、小脑、下丘脑(HY)、颈部脊髓(CSC)、胸部脊髓(TSC)和/或腰部脊髓(LSC)中)的靶基因表达。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物降低CNS中(例如，SS皮质、HP、HY、CSC、TSC和/或LSC中)的靶基因表达，而不降低CNS外的靶mRNA的表达。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物降低CNS中(例如，SS皮质、HP、HY、CSC、TSC和/或LSC中)的靶基因表达，而不降低肝脏中靶mRNA的表达。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物不导致肝脏中靶mRNA的表达降低至与CNS中相同或相似的水平。
mRNA靶序列
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物靶向包含靶mRNA的靶序列。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物靶向靶mRNA内的靶序列。在一些实施方案中，靶mRNA在CNS中表达。在一些实施方案中，在CNS中表达的靶mRNA在本文中被称为“CNS靶mRNA”。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物或其部分、片段或链(例如，双链寡核苷酸的反义链或指导链)与包含靶mRNA的靶序列结合或退火，从而降低靶基因表达。在一些实施方案中，为了在体内降低靶基因表达的目的，该RNAi寡核苷酸缀合物靶向包含靶mRNA的靶序列。在一些实施方案中，靶向特定靶序列的RNAi寡核苷酸缀合物降低靶基因表达的量或程度与该RNAi寡核苷酸缀合物的效力相关。在一些实施方案中，靶向特定靶序列的RNAi寡核苷酸缀合物降低靶基因表达的量或程度与用该RNAi寡核苷酸缀合物治疗的、患有与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的受试者或患者中治疗益处的量或程度相关。
通过检查编码靶基因的mRNA的核苷酸序列，包括多个不同物种(例如，人、食蟹猴、小鼠和大鼠)的mRNA的核苷酸序列，并且作为体外和体内测试的结果，已发现某些包含靶mRNA的核苷酸序列比其他序列更易发生RNAi寡核苷酸介导的降低，因此可用作本文RNAi寡核苷酸缀合物的靶序列。在一些实施方案中，本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物(例如，RNAi寡核苷酸-脂质缀合物)的有义链或其部分或片段包含与包含靶mRNA的靶序列相似(例如，具有不超过4个错配)或相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的双链寡核苷酸的有义链的部分或区域包含含有靶mRNA的靶序列。
RNAi寡核苷酸靶向序列
在一些实施方案中，本公开提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含靶向序列。如本文所用的，术语“靶向序列”是指具有与包含mRNA(例如，靶mRNA)的核苷酸序列互补的互补区域的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含靶向序列，该靶向序列具有与包含靶mRNA的靶序列的核苷酸序列互补的互补区域。在一些实施方案中，本公开提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含靶向序列，该靶向序列具有与包含CNS靶mRNA的靶序列的核苷酸序列互补的互补区域。靶向序列赋予RNAi寡核苷酸缀合物通过经由互补(Watson-Crick)碱基配对与包含靶mRNA的靶序列结合或退火而特异性靶向mRNA的能力。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物(或其链，例如，双链寡核苷酸的反义链或指导链)包含靶向序列，该靶向序列具有通过互补(Watson-Crick)碱基配对与包含靶mRNA的靶序列结合或退火的互补区域。靶向序列通常具有合适的长度和碱基含量，以使得RNAi寡核苷酸缀合物(或其链)能够与特定靶mRNA结合或退火，从而达到抑制靶基因表达的目的。在一些实施方案中，靶向序列的长度为至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约28、至少约29或至少约30个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列为至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度为约12至约30(例如，12至30、12至22、15至25、17至21、18至27、19至27或15至30)个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度为约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度为22个核苷酸。在在一些实施方案中，靶向序列的长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列的长度为24个核苷酸。
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含与包含靶mRNA的靶序列完全互补的靶向序列。在一些实施方案中，靶向序列与包含靶mRNA的靶序列部分互补。在一些实施方案中，靶向序列包含含有反义链的连续核苷酸区域。
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含与包含靶mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列，其中所述连续核苷酸序列的长度为约12至约30个核苷酸(例如，长度为12至30、12至28、12至26、12至24、12至20、12至18、12至16、14至22、16至20、18至20或18至19个核苷酸)。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物包含与包含靶mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列，其中所述连续核苷酸序列的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物包含与包含靶mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列，其中所述连续核苷酸序列的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物包含与包含靶mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列，其中所述连续核苷酸序列的长度为20个核苷酸。
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物包含与包含靶mRNA(例如，CNS靶mRNA)的连续核苷酸序列互补的靶向序列，其中所述连续核苷酸序列的长度为15个核苷酸。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物包含与包含靶mRNA(例如，CNS靶mRNA)的连续核苷酸序列互补的靶向序列，其中所述连续核苷酸序列的长度为19个核苷酸。
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列完全互补(例如，没有错配)，并且包含反义链的全长。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列完全互补(例如，没有错配)，并且包含反义链全长的一部分。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列完全互补(例如，没有错配)，并且包含反义链的10至20个核苷酸。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列完全互补(例如，没有错配)，并且包含反义链的15至19个核苷酸。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列完全互补(例如，没有错配)，并且包含反义链的15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸或22个核苷酸。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列完全互补(例如，没有错配)，并且包含反义链的19个核苷酸。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列完全互补(例如，没有错配)，并且包含反义链的20个核苷酸。
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列为部分互补(例如，具有不超过4个错配)，并且包含反义链的全长。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列为部分互补(例如，具有不超过4个错配)，并且包含反义链全长的一部分。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列为部分互补(例如，具有不超过4个错配)，并且包含反义链的10至20个核苷酸。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列为部分互补(例如，具有不超过4个错配)，并且包含反义链的15至19个核苷酸。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列为部分互补(例如，具有不超过4个错配)，并且包含反义链的15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸或22个核苷酸。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列为部分互补(例如，具有不超过4个错配)，并且包含反义链的19个核苷酸。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的靶向序列与包含靶mRNA的靶序列为部分互补(例如，具有不超过4个错配)，并且包含反义链的20个核苷酸。
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含与包含靶mRNA的相应靶序列具有一个或多个碱基对(bp)错配的靶向序列。在一些实施方案中，靶向序列与包含靶mRNA的相应靶序列具有1bp错配、2bp错配、3bp错配、4bp错配或5bp错配，条件是该靶向序列在适当杂交条件下与靶序列结合或退火的能力和/或该RNAi寡核苷酸缀合物抑制或降低靶基因表达的能力得以维持(例如，在生理条件下)。或者，在一些实施方案中，靶向序列与包含靶mRNA的相应靶序列包含不超过1bp、不超过2bp、不超过3bp、不超过4bp或不超过5bp的错配，条件是该靶向序列在适当杂交条件下与靶序列结合或退火的能力和/或该RNAi寡核苷酸缀合物抑制或降低靶基因表达的能力得以维持。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物包含与相应靶序列具有1个错配的靶向序列。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物包含与相应靶序列具有2个错配的靶向序列。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物包含与相应靶序列具有3个错配的靶向序列。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物包含与相应靶序列具有4个错配的靶向序列。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物包含与相应靶序列具有5个错配的靶向序列。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物包含与相应靶序列具有多于一个错配(例如，2、3、4、5个或更多个错配)的靶向序列，其中至少2个(例如，全部)错配是连续定位的(例如，连续的2、3、4、5个或更多个错配)，或者其中所述错配散布在整个靶向序列的任何位置。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物包含与相应靶序列具有多于一个错配(例如，2、3、4、5个或更多个错配)的靶向序列，其中至少2个(例如，全部)错配是连续定位的(例如，连续的2、3、4、5个或更多个错配)，或者其中至少一个或多个非错配的碱基对位于所述错配之间，或其组合。
寡核苷酸的类型
多种RNAi寡核苷酸类型和/或结构可用于在本文的方法中降低靶基因表达。本文或别处描述的任何RNAi寡核苷酸类型预期用作框架来掺入本文的靶向序列，以达到抑制或降低CNS中的相应靶基因表达的目的。
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物通过在切酶(Dicer)参与的上游或下游加入RNA干扰(RNAi)途径来抑制靶基因表达。例如，已经开发出RNAi寡核苷酸，其每条链具有约19-25个核苷酸的大小，并具有至少一个1至5个核苷酸的3’突出端(参见，例如，第8,372,968号美国专利)。还开发了更长的寡核苷酸，其被切酶加工以生成活性RNAi产物(参见，例如，第8,883,996号美国专利)。进一步的工作产生了延伸的双链寡核苷酸，其中至少一条链的至少一端延伸超出双链体靶向区域，包括其中一条链包含热力学稳定四环结构的结构(参见，例如，第8,513,207和8,927,705号美国专利，以及公开号为WO 2010/033225的国际专利申请)。此类结构可包括单链延伸(在分子的一侧或两侧)以及双链延伸。
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物在切酶参与(例如，切酶切割)的下游加入RNAi途径。在一些实施方案中，本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物是切酶底物。在一些实施方案中，在内源切酶加工后，产生能够降低靶mRNA(例如，CNS靶mRNA)表达的长度为19-23个核苷酸的双链核酸。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物在有义链的3’端具有突出端(例如，长度为1、2或3个核苷酸)。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物(例如，siRNA缀合物)包含与靶mRNA反义的21-核苷酸指导链和互补的过客链，其中这两条链退火以形成19-bp双链体和位于任一或两个3’端的2个核苷酸的突出端。还考虑了更长的寡核苷酸设计，包括具有23个核苷酸的指导链和21个核苷酸的过客链的寡核苷酸，其中在分子的右侧(过客链的3’端/指导链的5’端)具有平端，且在分子的左侧(过客链的5’端/指导链的3’端)具有两个核苷酸的3’-指导链突出端。在此类分子中，存在21bp双链体区域。参见，例如，第9,012,138、9,012,621和9,193,753号美国专利。
在一些实施方案中，本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物包含长度均在约17至26(例如，17至26、20至25或21-23)个核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施方案中，本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物包含长度均在约19-22个核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施方案中，有义链和反义链长度相等。在一些实施方案中，本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物包含有义链和反义链，使得在有义链或反义链上，或者在有义链和反义链两者上存在3’-突出端。在一些实施方案中，对于具有长度均在约21-23个核苷酸范围内的有义链和反义链的RNAi寡核苷酸缀合物，有义链、反义链或有义链和反义链两者上的3’突出端为1或2个核苷酸的长度。在一些实施方案中，RNAi寡核苷酸缀合物具有22个核苷酸的指导链和20个核苷酸的过客链，其中在分子的右侧(过客链的3’端/指导链的5’端)具有平端，且在分子的左侧(过客链的5’端/指导链的3’端)具有2个核苷酸的3’-指导链突出端。在此类分子中，存在20bp双链体区域。
与本文的组合物和方法一起使用的其他RNAi寡核苷酸设计包括：16-聚体siRNA(参见，例如，Nucleic Acids in Chemistry and Biology,Blackburn(编),ROYAL SOCIETYOF CHEMISTRY,2006)、shRNA(例如，具有19bp或更短的茎；参见，例如，Moore等人(2010)METHODS MOL.BIOL.629:141-58)、平端siRNA(例如，长度为19bp；参见，例如，Kraynack&Baker(2006)RNA 12:163-76)、不对称siRNA(aiRNA；参见，例如，Sun等人(2008)NAT.BIOTECHNOL.26:1379-82)、不对称较短双链体siRNA(参见，例如，Chang等人(2009)Mol.Ther.17:725-732)、叉siRNA(参见，例如，Hohjoh(2004)FEBS Lett.557:193-98)、单链siRNA(Elsner(2012)NAT.BIOTECHNOL.30:1063)、哑铃形环状siRNA(参见，例如，Abe等人(2007)J.AM.CHEM.SOC.129:15108-09)以及小的内部分段干扰RNA(siRNA；参见，例如，Bramsen等人(2007)Nucleic Acids Res.35:5886-97)。可以在一些实施方案中使用以降低或抑制靶基因表达的寡核苷酸结构的其他非限制性实例是微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和短siRNA(参见，例如，Hamilton等人(2002)EMBO J.21:4671-79；还参见公开号为2009/0099115的美国专利申请)。
另外，在一些实施方案中，本文中用于降低或抑制靶基因表达的RNAi寡核苷酸缀合物是单链的(ss)。此类结构可包括但不限于单链RNAi分子。最近的努力已经证明了单链RNAi分子的活性(参见，例如，Matsui等人(2016)MOL.THER.24:946-955)。然而，在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸-配体缀合物包含反义寡核苷酸(ASO)。反义寡核苷酸是具有核碱基序列的单链寡核苷酸，当以5’至3’方向书写或描绘时，该核碱基序列包含特定核酸的被靶向区段的反向互补序列并且被适当地修饰(例如，作为gapmer)以便诱导其靶RNA在细胞中的RNA酶H介导的切割，或者(例如，作为mixmer)以便抑制靶mRNA在细胞中的翻译。供此处使用的ASO可以以本领域已知的任何合适的方式进行修饰，包括，例如，如第9,567,587号美国专利中所示(包括，例如，长度，核碱基(嘧啶、嘌呤)的糖部分，以及核碱基的杂环部分的改变)。此外，数十年来，ASO已被用于降低特定靶基因的表达(参见，例如，Bennett等人(2017)ANNU.REV.PHARMACOL.57:81-105)。
核酸-配体缀合物的结构
在某些方面，本公开提供了由式I-a表示的核酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
B为核碱基或氢；
R1和R2独立地为氢、卤素、RA、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或者
同一碳上的R1和R2与它们的居间原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3元饱和或部分不饱和环；
每个RA独立地为任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地为氢、合适的保护基或任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环，或者：
同一原子上的两个R基团与它们的居间原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和的、部分不饱和的或杂芳基环；
LA独立地为PG1或-L-配体；
PG1为氢或合适的羟基保护基；
每个配体独立地为-(LC)n和/或金刚烷基；
每个LC独立地为包含饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；
每个-Cy-独立地为任选取代的二价环，该二价环选自亚苯基，8-10元二环亚芳基，4-7元饱和或部分不饱和亚碳环基，4-11元饱和或部分不饱和亚螺碳环基，8-10元二环饱和或部分不饱和亚碳环基，亚金刚烷基，具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-11元饱和或部分不饱和亚螺杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的8-10元二环饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元亚杂芳基，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元二环亚杂芳基；n为1-10；
L为共价键或二价饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-N(R)-C(O)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V1CR2W1-或代替；
m为1-50；
X1、V1和W1独立地为-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
Z为-O-、-S-、-NR-或-CR2-；且
PG2为氢、亚磷酰胺类似物或合适的保护基。
在某些实施方案中，所述核酸-配体缀合物由式I-b或I-c表示：
或其药学上可接受的盐；其中
L1为共价键或二价饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
R4为氢、RA或合适的胺保护基；且
R5为金刚烷基，或者饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
在一些实施方案中，核酸-配体缀合物由式I-Ib或I-Ic表示：
或其药学上可接受的盐；其中
B为核碱基或氢；
m为1-50；
PG1和PG2独立地为氢、亚磷酰胺类似物或合适的保护基；且
R5为金刚烷基，或者饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
在核酸-配体缀合物的某些实施方案中，R5选自
在核酸-配体缀合物的一些实施方案中，R5选自：
双链RNAi寡核苷酸缀合物
结构
在一些方面，本公开提供了由式II-a表示的包含一个或多个核酸-配体缀合物的寡核苷酸-配体缀合物或寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
B为核碱基或氢；
R1和R2独立地为氢、卤素、RA、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；或者
同一碳上的R1和R2与它们的居间原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3-7元饱和或部分不饱和环；
每个RA独立地为任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，
苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地为氢、合适的保护基或任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；或者
同一原子上的两个R基团与它们的居间原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和的、部分不饱和的或杂芳基环；
每个LC独立地为包含饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-代替；
每个-Cy-独立地为任选取代的二价环，该二价环选自亚苯基，8-10元二环亚芳基，4-7元饱和或部分不饱和亚碳环基，4-11元饱和或部分不饱和亚螺碳环基，8-10元二环饱和或部分不饱和亚碳环基，具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-11元饱和或部分不饱和亚螺杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的8-10元二环饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元亚杂芳基，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元二环亚杂芳基；
n为1-10；
L为共价键或二价饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V1CR2W1-或代替；
m为1-50；
X1、V1和W1独立地为-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
Y为氢、合适的羟基保护基、
R3为氢、合适的保护基、合适的前药或任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
X2为O、S或NR；
X3为-O-、-S-、-BH2-或共价键；
Y1为与核苷、核苷酸或寡核苷酸的2’-或3’-末端附接的连接基团；
Y2为氢，合适的保护基，亚磷酰胺类似物，与核苷、核苷酸或寡核苷酸的5’-末端附接的核苷酸间连接基团，或与固相支持体附接的连接基团；且
Z为-O-、-S-、-NR-或-CR2-。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸-配体缀合物(寡核苷酸缀合物)由式II-b或II-c表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
L1为共价键、单价或二价饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
R4为氢、RA或合适的胺保护基；且
R5为金刚烷基，或者饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、
-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR代替。
在寡核苷酸-配体缀合物的一些实施方案中，R5选自：
在寡核苷酸-配体缀合物的某些实施方案中，R5选自：
在一些实施方案中，R5为
在一些实施方案中，R5为
在一些实施方案中，R5为
在一些实施方案中，R5为
在一些实施方案中，R5为
在一些实施方案中，R5为
在一些实施方案中，R5为
在一些实施方案中，R5为
/>
在一些实施方案中，R5为
在一些实施方案中，R5为
在一些实施方案中，R5为
在一些实施方案中，R5为
在一些实施方案中，R5为
在一些实施方案中，R5为
在一些实施方案中，寡核苷酸-配体缀合物由式II-Ib或II-Ic表示：
或其药学上可接受的盐；其中
B为核碱基或氢；
m为1-50；
X1为-O-或-S-；
Y为氢、R3为氢或合适的保护基；
X2为O或S；
X3为-O-、-S-或共价键；
Y1为与核苷、核苷酸或寡核苷酸的2’-或3’-末端附接的连接基团；
Y2为氢，亚磷酰胺类似物，与核苷、核苷酸或寡核苷酸的5’-末端附接的核苷酸间连接基团，或与固相支持体附接的连接基团；
R5为金刚烷基，或者饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；且
R为氢、合适的保护基或任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环。
在寡核苷酸-配体缀合物的某些实施方案中，R5选自：
在某些实施方案中，所述寡核苷酸-配体缀合物包含一个或多个以上公开的实施方案中任一项的核酸-配体缀合物构型。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸-配体缀合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核酸-配体缀合物单元。
在一些方面，本公开提供了用于靶向靶mRNA(例如，在CNS中表达的靶mRNA)并抑制或降低靶基因表达(例如，经由RNAi途径)的RNAi寡核苷酸缀合物，其中该RNAi寡核苷酸缀合物是包含有义链(本文中也称为过客链)和反义链(本文中也称为指导链)的双链(ds)核酸分子。在一些实施方案中，有义链和反义链是单独的链，并且不是共价连接的。在一些实施方案中，有义链和反义链共价连接。在一些实施方案中，有义链和反义链形成双链体区域，其中有义链和反义链或其部分以互补方式(例如，通过Watson-Crick碱基配对)彼此结合或退火。
在一些实施方案中，有义链具有第一区域(R1)和第二区域(R2)，其中R2包含第一亚区(S1)、四环(L)或三环(triL)和第二亚区(S2)，其中L或triL位于S1与S2之间，并且其中S1和S2形成第二双链体(D2)。D2可以有不同的长度。在一些实施方案中，D2的长度为约1-6bp。在一些实施方案中，D2的长度为2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5或4-5bp。在一些实施方案中，D2的长度为1、2、3、4、5或6bp。在一些实施方案中，D2的长度为6bp。
在一些实施方案中，有义链的R1和反义链形成第一双链体(D1)。在一些实施方案中，D1的长度为至少约15(例如，至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21)个核苷酸。在一些实施方案中，D1的长度在约12至30个核苷酸的范围内(例如，12至30、12至27、15至22、18至22、18至25、18至27、18至30或21至30个核苷酸)。在一些实施方案中，D1的长度为至少12个核苷酸(例如，长度为至少12、至少15、至少20、至少25或至少30个核苷酸)。在一些实施方案中，D1的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，D1的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，D1的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，包含有义链和反义链的D1不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方案中，包含有义链和反义链的D1跨越有义链或反义链或两者的整个长度。在某些实施方案中，包含有义链和反义链的D1跨越有义链和反义链两者的整个长度。
应当理解，在一些实施方案中，在描述寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸缀合物)或其他核酸的结构时可以参考序列表中呈现的序列。在这样的实施方案中，与指定序列相比，实际的寡核苷酸或其他核酸可以具有一个或多个替代核苷酸(例如，DNA核苷酸的RNA对应物或RNA核苷酸的DNA对应物)和/或一个或多个经修饰的核苷酸和/或一个或多个经修饰的核苷酸间键合和/或一个或多个其他修饰，而仍然保留与指定序列基本相同或相似的互补性质。
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含25个核苷酸的有义链和27个核苷酸的反义链，当受到切酶作用时，其产生并入成熟RISC中的反义链。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物的有义链长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物的有义链长于25个核苷酸(例如，26、27、28、29或30个核苷酸)。
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物具有与另一5’端相比热力学稳定性较差的一个5’端。在一些实施方案中，提供了不对称RNAi寡核苷酸缀合物，其在有义链的3’端处包含平端并在反义链的3’端处包含3’-突出端。在一些实施方案中，反义链上的3’-突出端的长度为约1-8个核苷酸(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)。通常，RNAi寡核苷酸缀合物在反义(指导)链的3’端具有两个核苷酸的突出端。然而，其他突出端也是可能的。在一些实施方案中，突出端是包含1至6个核苷酸，任选地1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度的3’-突出端。然而，在一些实施方案中，突出端是包含1至6个核苷酸，任选地1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度的5’-突出端。
在一些实施方案中，反义链3’端上的两个末端核苷酸被修饰。在一些实施方案中，反义链3’端上的两个末端核苷酸与靶mRNA(例如，在CNS中表达的靶mRNA)互补。在一些实施方案中，反义链3’端上的两个末端核苷酸不与靶mRNA互补。在一些实施方案中，本文RNAi寡核苷酸缀合物的反义链3’端上的两个末端核苷酸是不配对的。在一些实施方案中，本文RNAi寡核苷酸缀合物的反义链3’端上的两个末端核苷酸包含未配对的GG。在一些实施方案中，本文RNAi寡核苷酸缀合物的反义链3’端上的两个末端核苷酸不与靶mRNA互补。在一些实施方案中，RNAi寡核苷酸缀合物的每个3’端上的两个末端核苷酸是GG。通常，双链寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸缀合物)的每个3’端上的两个末端GG核苷酸之一或两者不与靶mRNA互补。
在一些实施方案中，在有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。如果在有义链与反义链之间存在多于一个错配，则它们可以连续定位(例如，连续的2个、3个或更多个)，或者散布在整个互补区域中。在一些实施方案中，有义链的3’端含有一个或多个错配。在一个实施方案中，在有义链的3’端处并入两个错配。在一些实施方案中，本文RNAi寡核苷酸缀合物的有义链3’端处的碱基错配或区段去稳定化改善或增加了该RNAi寡核苷酸缀合物的效力和/或功效。
在一些实施方案中，本公开提供了包含RNAi寡核苷酸和脂质部分的RNAi寡核苷酸缀合物。在一些实施方案中，该脂质部分与该RNAi寡核苷酸的有义链缀合。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸包含茎环。在一些实施方案中，配体与茎环中的任何核苷酸缀合。在一些实施方案中，配体与茎环中从5’至3’的第一核苷酸缀合。在一些实施方案中，配体与茎环中从5’至3’的第二核苷酸缀合。在一些实施方案中，配体与茎环中从5’至3’的第三核苷酸缀合。在一些实施方案中，配体与茎环中从5’至3’的第四核苷酸缀合。在一些实施方案中，配体与茎环中的一个、两个、三个或四个核苷酸缀合。在一些实施方案中，配体与茎环中的三个核苷酸缀合。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸-配体缀合物包含36个核苷酸的有义链，这些核苷酸的位置从5’至3’编号为1-36。在一些实施方案中，该寡核苷酸-配体缀合物包含与36个核苷酸的有义链的位置27缀合的脂质。在一些实施方案中，该寡核苷酸-配体缀合物包含与36个核苷酸的有义链的位置28缀合的脂质。在一些实施方案中，该寡核苷酸缀合物包含与36个核苷酸的有义链的位置29缀合的脂质。在一些实施方案中，该寡核苷酸缀合物包含与36个核苷酸的有义链的位置30缀合的脂质。
在一些实施方案中，寡核苷酸-配体缀合物包含15至30个核苷酸的反义链和15至40个核苷酸的有义链，其中有义链和反义链形成双链体区域，其中反义链包含与在CNS的组织或细胞中表达的靶序列互补的互补区域，其中有义链在其3’端包含茎-环，该茎-环包含含有4个核苷的四环，其中所述4个核苷中的一个或多个由式II-Ib表示：
其中B选自腺嘌呤和鸟嘌呤核碱基，并且其中R5为烃链。在一些实施方案中，m为1，X1为O，Y2为与核苷的5’末端附接的核苷酸间连接基团，
Y由表示，Y1为与核苷酸的2’或3’末端附接的连接基团，X2为O，X3为O，并且R3为H。在一些实施方案中，该烃链为C8-C30烃链。在一些实施方案中，该烃链为C16烃链。在一些实施方案中，该C16烃链由表示。在一些实施方案中，所述四环的4个核苷从5’至3’编号为1-4，并且位置1由式II-Ib表示。在一些实施方案中，位置2由式II-Ib表示。在一些实施方案中，位置3由式II-Ib表示。在一些实施方案中，位置4由式II-Ib表示。在一些实施方案中，有义链为36个核苷酸，这些核苷酸的位置从5’至3’编号为1-36，其中茎-环包含位置21-36处的核苷酸，并且其中位置27-30处的一个或多个核苷由式II-Ib表示。在一些实施方案中，反义链为22个核苷酸。
反义链
在一些实施方案中，RNAi寡核苷酸缀合物的反义链被称为“指导链”。例如，反义链与RNA诱导的沉默复合物(RISC)接合并与Argonaute蛋白如Ago2结合，或者与一种或多种类似因子接合或结合，并指导靶基因的沉默，该反义链被称为指导链。在一些实施方案中，与指导链互补的有义链被称为“过客链”。
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含长度为最多约50个核苷酸(例如，长度为最多50个、最多40个、最多35个、最多30个、最多27个、最多25个、最多21个、最多19个、最多17个、最多15个或最多12个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含长度为至少约12个核苷酸(例如，长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少22个、至少25个、至少27个、至少30个、至少35个或至少38个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含长度在约12至约40(例如，12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至30、15至28、17至22、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)个核苷酸范围内的反义链。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含长度为15至30个核苷酸的反义链。在一些实施方案中，本文公开的任一种RNAi寡核苷酸缀合物的反义链为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的长度。在一些实施方案中，RNAi寡核苷酸缀合物包含长度为22个核苷酸的反义链。
有义链
在一些实施方案中，本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物包含长度为最多约50个核苷酸(例如，长度为最多50个、最多40个、最多30个、最多27个、最多25个、最多21个、最多19个、最多17个或最多12个核苷酸)的有义链(或过客链)。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含长度为至少约12个核苷酸(例如，长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少25个、至少27个、至少30个、至少36个或至少38个核苷酸)的有义链。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含长度在约12至约50(例如，12至50、12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至21、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)个核苷酸范围内的有义链。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含长度为15至50个核苷酸的有义链。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含长度为18至36个核苷酸的有义链。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的有义链。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含长度为36个核苷酸的有义链。
在一些实施方案中，有义链在其3’端包含茎-环结构。在一些实施方案中，茎-环通过链内碱基配对而形成。在一些实施方案中，有义链在其5’端包含茎-环结构。在一些实施方案中，茎是长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎-环提供RNAi寡核苷酸缀合物免遭降解(例如，酶促降解)的保护，促进或改善向靶细胞、组织或器官(例如，肝脏)的靶向和/或递送，或以上两者。例如，在一些实施方案中，茎-环的环提供包含一个或多个修饰的核苷酸，所述修饰促进、改善或增加对靶mRNA(例如，在CNS中表达的靶mRNA)的靶向，靶基因表达的抑制，和/或向靶细胞、组织或器官(例如，CNS)的递送，或其组合。在一些实施方案中，茎-环本身或对茎-环的修饰基本上不影响RNAi寡核苷酸缀合物的固有基因表达抑制活性，但促进、改善或增加RNAi寡核苷酸缀合物的稳定性(例如，提供针对降解的保护)和/或其向靶细胞、组织或器官(例如，CNS)的递送。在某些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含有义链，该有义链包含(例如，在其3’端)如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为最多约10个核苷酸(例如，长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的单链环。在一些实施方案中，环(L)的长度为3个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为4个核苷酸。
在一些实施方案中，所述四环包含序列5’-GAAA-3’。在一些实施方案中，所述茎-环包含序列5’-GCAGCCGAAAGGCUGC-3’(SEQ ID NO:15)。
在一些实施方案中，具有如上所述的结构S1-L-S2的茎-环的环(L)是三环。在一些实施方案中，该三环包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸、递送配体及其组合。
在一些实施方案中，具有如上所述的结构S1-L-S2的茎-环的环(L)是四环(例如，在带缺口的四环结构内)。在一些实施方案中，该四环包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸、递送配体及其组合。
在一些实施方案中，具有如上所述的结构S1-L-S2的茎-环的环(L)是如第10,131,912号美国专利中所述的四环(例如，在带缺口的四环结构内)，该专利通过引用并入本文。
双链体长度
在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为至少12个(例如，至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个)核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方案中，有义链与反义链之间的双链体跨越有义链或反义链的整个长度。在一些实施方案中，有义链与反义链之间的双链体跨越有义链和反义链两者的整个长度。
寡核苷酸末端
在一些实施方案中，本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物包含有义链和反义链，使得在有义链或反义链上，或者在有义链和反义链两者上存在3’-突出端。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物具有与另一5’端相比热力学稳定性较差的一个5’端。在一些实施方案中，提供了不对称RNAi寡核苷酸缀合物，其在有义链的3’端处包含平端并在反义链的3’端处包含突出端。在一些实施方案中，反义链上的3’突出端的长度为1-8个核苷酸(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)。
通常，用于RNAi的寡核苷酸在反义(指导)链的3’端具有两(2)个核苷酸的突出端。然而，其他突出端也是可能的。在一些实施方案中，突出端是包含1至6个核苷酸，任选地1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度的3’-突出端。在一些实施方案中，突出端是包含1至6个核苷酸，任选地1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度的5’-突出端。
在一些实施方案中，有义链和/或反义链的3’端或5’端的一个或多个(例如，2、3或4个)末端核苷酸被修饰。例如，在一些实施方案中，反义链3’端的一个或两个末端核苷酸被修饰。在一些实施方案中，反义链3’端的最后一个核苷酸被修饰，例如包含2’修饰，例如2’-O-甲氧基乙基。在一些实施方案中，反义链3’端的最后一个或两个末端核苷酸与靶标互补。在一些实施方案中，反义链3’端的最后一个或两个核苷酸不与靶标互补。
在一些实施方案中，本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物在有义链的3’端包含茎-环结构并且在反义链的3’端包含两个末端突出核苷酸。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含带缺口的四环结构，其中有义链的3’端包含茎-四环结构，并在反义链的3’端包含两个末端突出核苷酸。在一些实施方案中，所述两个末端突出核苷酸是GG。通常，反义链的两个末端GG核苷酸之一或两者不与靶标互补。
在一些实施方案中，有义链或反义链的5’端和/或3’端具有反向帽核苷酸。
在一些实施方案中，在有义链和/或反义链的3’端或5’端的末端核苷酸之间提供一个或多个(例如，2、3、4、5、6个)经修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，在有义链和/或反义链的3’端或5’端处的突出核苷酸之间提供经修饰的核苷酸间键合。
寡核苷酸修饰
在一些实施方案中，本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物包含一个或多个修饰。寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以以多种方式进行修饰，以改善或控制特异性、稳定性、递送、生物利用度、核酸酶降解抗性、免疫原性、碱基配对性质、RNA分布和细胞摄取以及与治疗性研究用途相关的其他特征。
在一些实施方案中，该修饰是经修饰的糖。在一些实施方案中，该修饰是5’-末端磷酸酯基团。在一些实施方案中，该修饰是经修饰的核苷间键合。在一些实施方案中，该修饰是经修饰的碱基。在一些实施方案中，该修饰是可逆修饰。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸可包含本文所述的任一种修饰或其任何组合。例如，在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含至少一种经修饰的糖、5’-末端磷酸酯基团、至少一种经修饰的核苷间键合、至少一种经修饰的碱基和至少一种可逆修饰。
寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)上的修饰数目和这些核苷酸修饰的位置可影响寡核苷酸的性质。例如，可以通过将寡核苷酸与脂质纳米颗粒(LNP)或类似载体缀合或将其包围在脂质纳米颗粒(LNP)或类似载体中来在体内递送该寡核苷酸。然而，当寡核苷酸不受LNP或类似载体保护时，至少一些核苷酸被修饰可能是有利的。因此，在一些实施方案中，寡核苷酸的所有或基本上所有核苷酸均被修饰。在一些实施方案中，超过一半的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，少于一半的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，构成寡核苷酸的所有核苷酸的糖部分在2’位置被修饰。所述修饰可以是可逆的或不可逆的。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸具有足以产生所需特性(例如，针对酶促降解的保护、在体内施用后靶向所需细胞的能力和/或热力学稳定性)的修饰核苷酸数目和类型。
糖修饰
在一些实施方案中，本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物包含经修饰的糖。在一些实施方案中，经修饰的糖(本文中也称为糖类似物)包括经修饰的脱氧核糖或核糖部分，其中，例如，一个或多个修饰发生在糖的2’、3’、4’和/或5’碳位置处。在一些实施方案中，经修饰的糖还可以包括非天然替代碳结构，例如存在于锁定核酸(“LNA”；参见，例如，Koshkin等人(1998)TETRAHEDON 54:3607-30)、未锁定的核酸(“UNA”；参见，例如，Snead等人(2013)MOL.THER-NUCL.ACIDS2:e103)和桥连核酸(“BNA”；参见，例如，Imanishi&Obika(2002)CHEMCOMMUN.(CAMB)21:1653-59)中的那些结构。
在一些实施方案中，糖中的核苷酸修饰包括2’-修饰。在一些实施方案中，2’-修饰可以是2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氟代(2’-F)、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)或2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)。在一些实施方案中，该修饰是2’-F、2’-OMe或2’-MOE。在一些实施方案中，糖中的修饰包括糖环的修饰，其可以包括糖环的一个或多个碳的修饰。例如，核苷酸的糖的修饰可以包括糖的2’-氧与糖的1’-碳或4’-碳连接，或者2’-氧与1’-碳或4’-碳经由亚乙基或亚甲基桥连接。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有无环糖，其缺少2’-碳至3’-碳的键。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有硫醇基团，例如在糖的4’位置。
在一些实施方案中，本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个或更多个)。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物的有义链包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个或更多个)。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物的反义链包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个)。
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的有义链的所有核苷酸均被修饰。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物的反义链的所有核苷酸均被修饰。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物的所有核苷酸(即，有义链和反义链两者)均被修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含2’-修饰(例如，2’-F或2’-OMe、2’-MOE和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸)。
在一些实施方案中，本公开提供了具有不同修饰模式的RNAi寡核苷酸缀合物。在一些实施方案中，经修饰的RNAi寡核苷酸缀合物包含具有如实施例和序列表中阐述的修饰模式的有义链序列以及具有如实施例和序列表中阐述的修饰模式的反义链。
在一些实施方案中，本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物包含具有被2’-F修饰的核苷酸的反义链。在一些实施方案中，本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链包含被2’-F和2’-OMe修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物包含具有被2’-F修饰的核苷酸的有义链。在一些实施方案中，本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物包含有义链，该有义链包含被2’-F和2’-OMe修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含有义链，该有义链的约10-25％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的核苷酸包含2’-氟代修饰。在一些实施方案中，有义链的约11％的核苷酸包含2-氟代修饰。在一些实施方案中，有义链的约20％的核苷酸包含2-氟代修饰。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含反义链，该反义链的约25-35％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的核苷酸包含2’-氟代修饰。在一些实施方案中，反义链的约32％的核苷酸包含2’-氟代修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸的约15-25％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％的核苷酸包含2’-氟代修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸中约19％的核苷酸包含2’-氟代修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸中约26％的核苷酸包含2’-氟代修饰。
在一些实施方案中，对于这些寡核苷酸，有义链的位置8、9、10或11中的一个或多个被2’-F基团修饰。在一些实施方案中，对于这些寡核苷酸，有义链中位置1-7和12-20处的每个核苷酸处的糖部分被2’-OMe修饰。在一些实施方案中，对于这些寡核苷酸，有义链中位置1-7、12-27和29-36处的每个核苷酸处的糖部分被2’-OMe修饰。
在一些实施方案中，对于这些寡核苷酸，有义链的位置3、5、8、10、12、13、15和17中的一个或多个被2’-F基团修饰。在一些实施方案中，对于这些寡核苷酸，有义链中位置1、2、4、6、7、9、11、14、16、18-27和29-36处的每个核苷酸处的糖部分被2’-OMe修饰。
在一些实施方案中，反义链具有3个在糖部分的2’-位置处被2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链的位置2、5和14处的核苷酸以及任选地位置1、3、7和10处最多3个核苷酸处的糖部分被2’-F修饰。在其他实施方案中，反义链的位置2、5和14处的每个核苷酸处的糖部分被2’-F修饰。在其他实施方案中，反义链的位置1、2、5和14处的每个核苷酸处的糖部分被2’-F修饰。在另外其他的实施方案中，反义链的位置1、2、3、5、7和14处的每个核苷酸处的糖部分被2’-F修饰。在又一个实施方案中，反义链的位置1、2、3、5、10和14处的每个核苷酸处的糖部分被2’-F修饰。在另一个实施方案中，反义链的位置2、3、5、7、10和14处的每个核苷酸处的糖部分被2’-F修饰。在一些实施方案中，反义链具有9个在糖部分的2’-位置处被2’-F修饰的核苷酸。在某些另外的实施方案中，反义链的位置2、3、4、5、7、10、14、16和19处的每个核苷酸处的糖部分被2’-F修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置2和14处的糖部分被2’-F修饰。在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置2、5和14处的糖部分被2’-F修饰。在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置1、2、5和14处的糖部分被2’-F修饰。在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置1、2、3、5、7和14处的糖部分被2’-F修饰。在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置1、2、3、5、10和14处的糖部分被2’-F修饰。在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置2、3、4、5、7、10、14、16和19处的糖部分被2’-F修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置2、5和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置2、3、4、5、7、10、14、16和19处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置1、2、5和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置1、2、3、5、7和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置1、2、3、5、10和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置2、3、5、7、10和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置2、3、4、5、7、10、14、16和19处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22处的糖部分被2’-F修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22处的糖部分被2’-OMe修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22处的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含有义链，该有义链的位置8-11处的糖部分被2’-F修饰。在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含有义链，该有义链的位置3、5、8、10、12、13、15和17处的糖部分被2’-F修饰。在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含有义链，该有义链的位置1-7和12-17或12-20处的糖部分被2’OMe修饰。在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含有义链，该有义链的位置1、2、4、6、7、9、11、14、16和18-20处的糖部分被2’OMe修饰。在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含有义链，该有义链的位置1-7和12-17或12-20处的每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含有义链，该有义链的位置1、2、4、6、7、9、11、14、16和18-20处的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含有义链，该有义链的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36处的糖部分被2’-F修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含有义链，该有义链的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36处的糖部分被2’-OMe修饰。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含有义链，该有义链的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36处的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
5’-末端磷酸酯
在一些实施方案中，本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物包含5’-末端磷酸酯。在一些实施方案中，该RNAi寡核苷酸缀合物的5’-末端磷酸酯基团增强与Ago2的相互作用。然而，包含5’-磷酸酯基团的寡核苷酸可能容易经由磷酸酶或其他酶降解，这可能限制它们在体内的生物利用度。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含抵抗此类降解的5’磷酸酯类似物。在一些实施方案中，该磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯，或其组合。在某些实施方案中，RNAi寡核苷酸缀合物链的5’端附接至模拟天然5’-磷酸酯基团的静电和空间性质的化学部分(“磷酸酯模拟物”)。
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物在糖的4’-碳位置处具有磷酸酯类似物(称为“4’-磷酸酯类似物”)。参见，例如，公开号为WO 2018/045317的国际专利申请。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物在5’-末端核苷酸处包含4’-磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯，其中氧基甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4’-碳处)或其类似物。在其他实施方案中，4’-磷酸酯类似物是硫代甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫代甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子结合至糖部分或其类似物的4’-碳。在某些实施方案中，4’-磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯。在一些实施方案中，氧基甲基膦酸酯由式–O–CH2–PO(OH)2,–O–CH2–PO(OR)2或-O-CH2-POOH(R)表示，其中R独立地选自H、CH3、烷基、CH2CH2CN、CH2OCOC(CH3)3、CH2OCH2CH2Si(CH3)3或保护基。在某些实施方案中，该烷基是CH2CH3。更典型地，R独立地选自H、CH3或CH2CH3。在一些实施方案中，R为CH3。在一些实施方案中，该4’-磷酸酯类似物是5’-甲氧基膦酸酯-4’-氧基。在一些实施方案中，该4’-磷酸酯类似物是4’-氧基甲基膦酸酯。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物包含反义链，该反义链在5’-末端核苷酸处包含4’-磷酸酯类似物，其中5’-末端核苷酸包含以下结构：
4’-O-单甲基膦酸酯-2’-O-甲基尿苷硫代磷酸酯
[MePhosphonate-4O-mUs]
经修饰的核苷间键合
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含经修饰的核苷间键合。在一些实施方案中，磷酸酯修饰或取代产生包含至少约1个(例如，至少1个、至少2个、至少3个或至少5个)经修饰的核苷酸间键合的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸包含约1至约10个(例如，1至10、2至8、4至6、3至10、5至10、1至5、1至3或1至2个)经修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰的核苷酸间键合。
经修饰的核苷酸间键合可以是二硫代磷酸酯键、硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、硫代烷基膦酸酯键、硫代烷基磷酸三酯键、亚磷酰胺键、膦酸酯键或硼代磷酸酯(boranophosphate)键。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸的至少一个经修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的一个或多个之间具有硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的每一个之间具有硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸缀合物包含肽核酸(PNA)。PNA是寡核苷酸模拟物，其中糖-磷酸骨架已被由N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元组成的伪肽骨架代替。核碱基通过双原子羧甲基间隔基与该骨架连接。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸缀合物包含吗啉代寡聚体(PMO)，其包含通过磷酰二酰胺(phosphorodiamidate)基团连接的亚甲基吗啉环的核苷酸间键合骨架。
碱基修饰
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含一个或多个经修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的核碱基(本文中也称为碱基类似物)在核苷酸糖部分的1’位置处连接。在某些实施方案中，经修饰的核碱基是含氮碱基。在某些实施方案中，经修饰的核碱基不含氮原子。参见，例如，公开号为2008/0274462的美国专利申请。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含通用碱基。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸不含核碱基(无碱基的)。
在一些实施方案中，通用碱基是杂环部分，该杂环部分位于经修饰的核苷酸中核苷酸糖部分的1’位置处，或者位于核苷酸糖部分取代中的等同位置处，以至于当存在于双链体中时，其可以放置于超过一种类型的碱基的对面，而基本上不改变双链体的结构。在一些实施方案中，相比于与靶核酸完全互补的参考单链核酸(例如，寡核苷酸)，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，该双链体的Tm低于与互补核酸形成的双链体。在一些实施方案中，当与其中通用碱基已被碱基代替以生成单个错配的参考单链核酸相比时，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，该双链体的Tm高于与包含该错配碱基的核酸形成的双链体。
通用结合核苷酸的非限制性实例包括但不限于肌苷、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(参见公开号为2007/0254362的美国专利申请；Van Aerschot等人(1995)NUCLEIC ACIDS RES.23:4363-4370；Loakes等人(1995)NUCLEICACIDS RES.23:2361-66；以及Loakes&Brown(1994)NUCLEIC ACIDS RES.22:4039-43)。
靶向配体
在一些实施方案中，期望将本公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸缀合物)靶向一种或多种细胞或一种或多种器官。这样的策略可以帮助避免在其他器官中的不良影响，或避免寡核苷酸过度流失到不会从该寡核苷酸受益的细胞、组织或器官。因此，在一些实施方案中，本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物被修饰，以促进向特定组织、细胞或器官的靶向和/或递送(例如，促进缀合物向CNS的递送)。在一些实施方案中，RNAi寡核苷酸缀合物包含与一个或多个靶向配体缀合的至少一个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸)。
在一些实施方案中，靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白质或蛋白质的一部分(例如，抗体或抗体片段)或脂质。在一些实施方案中，靶向配体是适体(aptamer)。例如，靶向配体可以是用于靶向肿瘤脉管系统或神经胶质瘤细胞的RGD肽，用于靶向肿瘤脉管系统或基质的CREKA肽，用于靶向CNS脉管系统上表达的转铁蛋白受体的转铁蛋白、乳铁蛋白或适体，或用于靶向神经胶质瘤细胞上的EGFR的抗-EGFR抗体。在某些实施方案中，靶向配体是一个或多个GalNAc部分。
在一些实施方案中，本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物的1个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自与单独的靶向配体缀合。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物的2至4个核苷酸各自与单独的靶向配体缀合。在一些实施方案中，靶向配体与有义链或反义链任一端的2至4个核苷酸缀合(例如，靶向配体与有义链或反义链5’或3’端上的2至4个核苷酸的突出端或延伸部分缀合)，使得靶向配体类似于牙刷的刷毛，而RNAi寡核苷酸缀合物类似于牙刷。例如，RNAi寡核苷酸缀合物可在有义链的5’或3’端包含茎-环，并且该茎-环的环的1、2、3或4个核苷酸可单独地与靶向配体缀合。在一些实施方案中，本公开提供的RNAi寡核苷酸缀合物在有义链的3’端包含茎-环，其中该茎-环的环包含三环或四环，并且其中构成该三环或四环的3或4个核苷酸分别单独地与靶向配体缀合。
GalNAc是ASGPR的高亲和力配体，ASGPR主要在肝细胞的肝窦表面表达，并且在结合、内化及随后清除含有末端半乳糖或GalNAc残基的循环糖蛋白(脱唾液酸糖蛋白)方面起主要作用。GalNAc部分与本公开的寡核苷酸的缀合(间接的或直接的)可用来将这些寡核苷酸靶向细胞上表达的ASGPR。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸与至少一个或多个GalNAc部分缀合，其中所述GalNAc部分将该寡核苷酸靶向人肝脏细胞(例如，人肝细胞)上表达的ASGPR。在一些实施方案中，GalNAc部分将寡核苷酸靶向肝脏。
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸直接或间接地与单价GalNAc缀合。在一些实施方案中，寡核苷酸直接或间接地与多于一个单价GalNAc缀合(即，与2、3或4个单价GalNAc部分缀合，并且通常与3或4个单价GalNAc部分缀合)。在一些实施方案中，寡核苷酸与一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc部分缀合。
在一些实施方案中，寡核苷酸的1个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自与GalNAc部分缀合。在一些实施方案中，四环的2至4个核苷酸各自与单独的GalNAc缀合。在一些实施方案中，三环的1至3个核苷酸各自与单独的GalNAc缀合。在一些实施方案中，靶向配体与有义链或反义链任一端的2至4个核苷酸缀合(例如，配体与有义链或反义链5’或3’端上的2至4个核苷酸的突出端或延伸部分缀合)，使得GalNAc部分类似于牙刷的刷毛，而寡核苷酸类似于牙刷。在一些实施方案中，GalNAc部分与有义链的核苷酸缀合。例如，四(4)个GalNAc部分可以与有义链的四环中的核苷酸缀合，其中每个GalNAc部分与1个核苷酸缀合。
在一些实施方案中，所述四环是腺嘌呤和鸟嘌呤核苷酸的任意组合。
在一些实施方案中，所述四环(L)具有经由本文所述的任何连接体与该四环的任何一个或多个鸟嘌呤核苷酸附接的单价GalNAc部分，如下所示(X＝杂原子)：
在一些实施方案中，所述四环(L)具有经由本文所述的任何连接体与该四环的任何一个或多个腺嘌呤核苷酸附接的单价GalNAc，如下所示(X＝杂原子)：
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含与鸟嘌呤核苷酸附接的单价GalNAc，称为[ademG-GalNAc]或2’-氨基二乙氧基甲醇-鸟嘌呤-GalNAc，如下所示：
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物包含与腺嘌呤核苷酸附接的单价GalNAc，称为[ademA-GalNAc]或2’-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所示：
下面针对从5’至3’包含核苷酸序列GAAA(L＝连接体，X＝杂原子)的环示出了这类缀合的实例。例如，这样的环可以存在于在表3或表5中列出并且如图12-13中所示的有义链的位置27-30处。在化学式中，用来描述与寡核苷酸链连接的连接点。/>
可以使用适当的方法或化学(例如，点击化学)将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方案中，使用点击连接体将靶向配体与核苷酸缀合。在一些实施方案中，使用基于缩醛的连接体将靶向配体与本文所述的任一种寡核苷酸的核苷酸缀合。基于缩醛的连接体例如在公开号为WO 2016/100401的国际专利申请中公开。在一些实施方案中，连接体是不稳定的连接体。然而，在其他实施方案中，连接体是稳定的。下面示出了从5’至3’包含核苷酸GAAA的环的实例，其中使用缩醛连接体将GalNAc部分附接至该环的核苷酸。例如，这样的环可以存在于在表3或表5中列出并且如图12-13中所示的任一有义链的位置27-30处。在化学式中，是与寡核苷酸链连接的连接点。/>
/>
如所提到的，可以使用各种适当的方法或化学合成技术(例如，点击化学)将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方案中，使用点击连接体将靶向配体与核苷酸缀合。在一些实施方案中，使用基于缩醛的连接体将靶向配体与本文所述的任一种寡核苷酸的核苷酸缀合。基于缩醛的连接体例如在公开号为WO 2016/100401的国际专利申请中公开。在一些实施方案中，连接体是不稳定的连接体。然而，在其他实施方案中，连接体是稳定的连接体。
在一些实施方案中，在靶向配体(例如，GalNAc部分)与RNAi寡核苷酸缀合物之间提供双链体延伸(例如，长度最多3、4、5或6bp)。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物不具有与之缀合的GalNAc。
示例性RNAi寡核苷酸缀合物
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物包含与一个或多个脂质部分缀合的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述一个或多个脂质部分包含脂肪酸。在一些实施方案中，该脂肪酸是饱和脂肪酸。在一些实施方案中，该脂肪酸是不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，所述一个或多个脂质部分包含烃链。在一些实施方案中，该烃链是饱和的。在一些实施方案中，该烃链是不饱和的。在一些实施方案中，所述一个或多个脂质部分包含长度为50个碳(C50)或更短(例如，约50个碳(C50)、40个碳(C40)、30个碳(C30)、25个碳(C25)、22个碳(C22)、20个碳(C20)、18个碳(C18)、16个碳(C16)、14个碳(C14)、12个碳(C12)、10个碳(C10)、8个碳(C8)或6个碳(C6))的烃链。在一些实施方案中，所述一个或多个脂质部分包含16个碳至50个碳(例如，C16-C50、C18-C50、C20-C50、C22-C50、C16、C18、C20或C22)的烃链。在一些实施方案中，所述一个或多个脂质部分包含15个碳或更短(例如，C6-C15、C6-C14、C6-C12、C6-C10、C8-C14、C8-C12、C8-C10、C10-C14、C10-C12、C15、C14、C13、C12、C11、C10、C9、C8、C7或C6)的烃链。
在一些实施方案中，所述一个或多个脂质部分包含C8烃链。在一些实施方案中，该C8烃链包含至少一个双键。在一些实施方案中，所述一个或多个脂质部分包含C10烃链。在一些实施方案中，该C10烃链是不饱和的(即，C10:0)。在一些实施方案中，该C10烃链包含至少一个双键。在一些实施方案中，所述一个或多个脂质部分包含C12烃链。在一些实施方案中，该C12烃链是不饱和的(即，C12:0)。在一些实施方案中，该C12烃链包含至少一个双键。在一些实施方案中，所述一个或多个脂质部分包含C14烃链。在一些实施方案中，该C14烃链是不饱和的(即，C14:0)。在一些实施方案中，该C14烃链包含至少一个双键。在一些实施方案中，所述一个或多个脂质部分包含C16烃链。在一些实施方案中，该C16烃链是不饱和的(即，C16:0)。在一些实施方案中，该C16烃链包含至少一个双键。在一些实施方案中，所述一个或多个脂质部分包含C18烃链。在一些实施方案中，该C18烃链是不饱和的(即，C18:0)。在一些实施方案中，该C18烃链包含至少一个双键(例如，C18:1、C18:2、C18:3、C18:4、C18:5或C18:6)。在一些实施方案中，该C18烃链包含两个双键(例如，C18:2)。在一些实施方案中，所述一个或多个脂质部分包含C22烃链。在一些实施方案中，该C22烃链包含至少一个双键(例如，C22:1、C22:2、C22:3、C22:4、C22:5或C22:6)。在一些实施方案中，所述一个或多个脂质部分包含C24烃链。在一些实施方案中，该C24烃链包含至少一个双键(例如，C24:1、C24:2、C24:3、C24:4、C24:5或C24:6)。
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸包含四环，其中该四环的至少一个核苷酸与C8脂质缀合。在一些实施方案中，该四环的第二核苷酸与C8脂质缀合。在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸包含四环，其中该四环的至少一个核苷酸与C10脂质缀合。在一些实施方案中，该四环的第二核苷酸与C10脂质缀合。在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸包含四环，其中该四环的至少一个核苷酸与C12脂质缀合。在一些实施方案中，该四环的第二核苷酸与C12脂质缀合。在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸包含四环，其中该四环的至少一个核苷酸与C14脂质缀合。在一些实施方案中，该四环的第二核苷酸与C14脂质缀合。在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸包含四环，其中该四环的至少一个核苷酸与C16脂质缀合。在一些实施方案中，该四环的第二核苷酸与C16脂质缀合。在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸包含四环，其中该四环的至少一个核苷酸与C18脂质(例如，C18:0、C18:1或C18:2)缀合。在一些实施方案中，该四环的第二核苷酸与C18脂质(例如，C18:0、C18:1或C18:2)缀合。在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸包含四环，其中该四环的至少一个核苷酸与C22脂质(例如，C22:0、C22:1、C22:2、C22:3、C22:4、C22:5或C22:6)缀合。在一些实施方案中，该四环的第二核苷酸与C22脂质(例如，C22:0、C22:1、C22:2、C22:3、C22:4、C22:5或C22:6)缀合。在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸包含四环，其中该四环的至少一个核苷酸与C24脂质(例如，C24:0、C24:1、C24:2、C24:3、C24:4、C24:5或C24:6)缀合。在一些实施方案中，该四环的第二核苷酸与C24脂质(例如，C24:0、C24:1、C24:2、C24:3、C24:4、C24:5或C24:6)缀合。
在一些实施方案中，RNAi寡核苷酸缀合物包含具有至少一个经修饰的核苷的核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸-配体缀合物包含反义链和有义链，其中每条链包含至少一个经修饰的核苷。
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物由下式表示，具有如表1所示的修饰：
有义链:
[mXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][ademX-TL][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX]
杂交至
反义链：
[MePhosphonate-4O-mXs][fXs][fXs][fX][fX][mX][fX][mX][mX]
[fX][mX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mXs][mX]
或者
有义链：
[mXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][ademX-C#][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX]
杂交至
反义链：
[MePhosphonate-4O-mXs][fXs][fXs][fX][fX][mX][fX][mX][mX]
[fX][mX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mXs][mX]
表1.修饰关键词
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸与如下所示的C8脂质缀合：
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸与如下所示的C10脂质缀合：
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸与如下所示的C12脂质缀合：
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸与如下所示的C14脂质缀合：
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸与如下所示的C16脂质缀合：
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸与如下所示的C18:0脂质缀合：
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸与如下所示的C18:1脂质缀合：
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸与如下所示的C18:2脂质缀合：
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸与如下所示的C22:0脂质缀合：
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物的寡核苷酸与如下所示的C22:6脂质缀合：
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物减少CNS中(例如，躯体感觉皮质(SS皮质)、海马体(HP)、纹状体、额叶皮质、小脑、下丘脑(HY)、颈部脊髓(CSC)、胸部脊髓(TSC)和/或腰部脊髓(LSC)中)的靶mRNA。
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物减少CNS中(例如，SS皮质、HP、HY、CSC、TSC和/或LSC中)的靶mRNA，而不降低CNS外的靶mRNA的表达。在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物减少CNS中(例如，SS皮质、HP、HY、CSC、TSC和/或LSC中)的靶mRNA，而不降低CNS外的靶mRNA的表达，不降低肝脏中的靶mRNA的表达。
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物包含四环，其中该四环的至少一个核苷酸与C8脂质缀合，其中该RNAi寡核苷酸缀合物减少CNS中(例如，SS皮质、HP、HY、CSC、TSC和/或LSC中)的靶mRNA，而不降低CNS外的靶mRNA的表达。在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物减少CNS中(例如，SS皮质、HP、HY、CSC、TSC和/或LSC中)的靶mRNA，而不降低CNS外的靶mRNA的表达，不降低肝脏中的靶mRNA的表达。在一些实施方案中，C8脂质与四环的第二核苷酸缀合。在一些实施方案中，该四环由5’-GAAA-3’组成。
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物包含四环，其中该四环的至少一个核苷酸与C10脂质缀合，其中该RNAi寡核苷酸缀合物减少CNS中(例如，SS皮质、HP、HY、CSC、TSC和/或LSC中)的靶mRNA，而不降低CNS外的靶mRNA的表达。在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物减少CNS中(例如，SS皮质、HP、HY、CSC、TSC和/或LSC中)的靶mRNA，而不降低CNS外的靶mRNA的表达，不降低肝脏中的靶mRNA的表达。在一些实施方案中，C10脂质与四环的第二核苷酸缀合。在一些实施方案中，该四环由5’-GAAA-3’组成。
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物包含四环，其中该四环的至少一个核苷酸与C12脂质缀合，其中该RNAi寡核苷酸缀合物减少CNS中(例如，SS皮质、HP、HY、CSC、TSC和/或LSC中)的靶mRNA，而不降低CNS外的靶mRNA的表达。在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物减少CNS中(例如，SS皮质、HP、HY、CSC、TSC和/或LSC中)的靶mRNA，而不降低CNS外的靶mRNA的表达，不降低肝脏中的靶mRNA的表达。在一些实施方案中，C12脂质与四环的第二核苷酸缀合。在一些实施方案中，该四环由5’-GAAA-3’组成。
在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物包含四环，其中该四环的至少一个核苷酸与C14脂质缀合，其中该RNAi寡核苷酸缀合物减少CNS中(例如，SS皮质、HP、HY、CSC、TSC和/或LSC中)的靶mRNA，而不降低CNS外的靶mRNA的表达。在一些实施方案中，所述RNAi寡核苷酸缀合物减少CNS中(例如，SS皮质、HP、HY、CSC、TSC和/或LSC中)的靶mRNA，而不降低CNS外的靶mRNA的表达，不降低肝脏中的靶mRNA的表达。在一些实施方案中，C14脂质与四环的第二核苷酸缀合。在一些实施方案中，该四环由5’-GAAA-3’组成。
提供核酸及其类似物的一般方法
包含本文所述的脂质缀合物的核酸及其类似物可以使用本领域已知的多种合成方法来制备，包括标准亚磷酰胺方法。任何亚磷酰胺合成方法均可用来合成本公开所提供的核酸。在某些实施方案中，在固相合成方法中使用亚磷酰胺来产生反应性中间体亚磷酸酯化合物，随后使用已知方法将其氧化以产生通常具有磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷酸间键合的膦酸酯修饰的寡核苷酸。本公开的寡核苷酸合成可以使用本领域已知的方法以任一方向进行：从5’至3’或从3’至5’。
在某些实施方案中，用于合成所提供的核酸的方法包括(a)将核苷或其类似物通过共价键附接至固相支持体；(b)将核苷亚磷酰胺或其类似物与步骤(a)的核苷或其类似物上的反应性羟基偶联，以在其间形成核苷酸间键，其中固相支持体上的任何未偶联的核苷或其类似物用加帽试剂进行加帽；(c)用氧化剂氧化所述核苷酸间键；以及(d)用后续核苷亚磷酰胺或其类似物迭代地重复步骤(b)至(c)以形成核酸或其类似物，其中至少步骤(a)的核苷或其类似物、步骤(b)的核苷亚磷酰胺或其类似物或者步骤(d)的至少一种后续核苷亚磷酰胺或其类似物包含本文所述的脂质缀合物部分。通常，重复偶联、加帽/氧化步骤和可选的脱保护步骤，直到寡核苷酸达到所需的长度和/或序列，之后将其从固相支持体上切割下来。在某些实施方案中，制备包含1-3个核酸或其类似物的寡核苷酸，所述核酸或其类似物在四环上包含脂质缀合物单元。
在下面的方案A中，描绘了特定的保护基、离去基团或转化条件，本领域普通技术人员将会理解，其他保护基、离去基团和转化条件也是合适的并被想到。在方案A中总体设想的需要额外保护基策略的某些反应性官能团(例如，-N(H)-、-OH等)也会被本领域普通技术人员想到并理解。此类基团和转化在March's Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,M.B.Smith and J.March,第5版,John Wiley&Sons,2001、COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS,(R.C.Larock,第2版,John Wiley&Sons,1999)和PROTECTING GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS,(T.W.Greene andP.G.M.Wuts,第3版,John Wiley&Sons,1999)中详细描述，其各自的全部内容特此通过引用并入本文。
在某些实施方案中，本公开的核酸及其类似物通常按照以下所示的方案A、方案A1和方案B制备：
方案A：本公开的配体缀合的寡核苷酸的合成
方案A1：本公开的脂质缀合的寡核苷酸的合成
如以上方案A和方案A1中所示，式I-1的核酸或其类似物与一个或多个配体/亲脂性化合物缀合，以形成包含一个或多个配体/脂质缀合物的式I或Ia化合物。通常，通过本领域已知的技术，通过串联或并联的在式I-1或I-1a的核酸或其类似物与一个或多个金刚烷基和/或亲脂性化合物(例如，脂肪酸)之间的酯化或酰胺化反应来进行缀合。然后可以将式I或Ia的核酸或其类似物脱保护以形成式I-2或I-2a的化合物，并用合适的羟基保护基(例如，DMTr)保护以形成式I-3或I-3a的化合物。在一方面，式I-3或I-3a的核酸-配体缀合物可以共价连接至固相支持体(例如，通过琥珀酸连接基团)，以形成包含一个或多个金刚烷基和/或脂质缀合物的式I-4或I-4a的固相支持体核酸-配体缀合物或其类似物。在另一方面，式I-3或I-3a的核酸-配体缀合物可以与P(III)形成试剂(例如，2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺)反应，以形成包含P(III)基团的式I-5或I-5a的核酸或其类似物。然后可以使式I-5或I-5a的核酸-配体缀合物或其类似物经历使用本领域已知且常用的制备寡核苷酸的方法进行的寡聚化形成条件。例如，式I-5或I-5a的化合物与带有5’-羟基的固相支持的核酸-配体缀合物或其类似物偶联。进一步的步骤可以包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和/或从固相支持体上切割，以提供各种核苷酸长度的寡核苷酸，包括一个或多个脂质缀合物核苷酸单元，由式II-1或II-Ia的化合物表示。B、E、L、配体、LC、n、PG1、PG2、PG4、R1、R2、R3、X、X1、X2、X3和Z中的每一个如上文所定义和本文所述。
方案B：本公开的寡核苷酸的合成后脂质缀合
如以上方案B中所示，可以将式I-1的核酸或其类似物脱保护以形成式I-6的化合物，用合适的羟基保护基(例如，DMTr)保护以形成式I-7的化合物，并与P(III)形成试剂(例如，2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺)反应，以形成包含P(III)基团的式I-8的核酸或其类似物。接下来，使式I-8的核酸或其类似物经历使用本领域已知且常用的制备寡核苷酸的方法进行的寡聚化形成条件。例如，式I-8的化合物与带有5’-羟基的固体支持的核酸或其类似物偶联。进一步的步骤可以包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和/或从固相支持体上切割，以提供由式II-2化合物表示的各种核苷酸长度的寡核苷酸。然后可以将式II-2的寡核苷酸与一个或多个配体例如金刚烷基或亲脂性化合物(例如，脂肪酸)缀合，以形成包含一个或多个配体缀合物的式II-1化合物。通常，通过本领域已知的技术，通过串联或并联的在式II-2的核酸或其类似物与一个或多个金刚烷基或脂肪酸之间的酯化或酰胺化反应来进行缀合。B、E、L、配体、LC、n、PG1、PG2、PG4、R1、R2、R3、X、X1、X2、X3和Z中的每一个如上文所定义和本文所述。
在某些实施方案中，本公开的核酸及其类似物按照以下所示的方案C和方案D制备：
方案C：本公开的脂质缀合的寡核苷酸的合成
如以上方案C中所示，对式C1的核酸或其类似物进行保护以形成式C2的化合物。然后将式C2的核酸或其类似物进行烷基化(例如，使用DMSO和乙酸通过Pummerer重排)以形成式C3的单硫缩醛化合物。接下来，式C3的核酸或其类似物与C4在适当条件(例如，温和的氧化条件)下偶联以形成式C5的核酸或其类似物。然后可以将式C5的核酸或其类似物脱保护以形成式C6的化合物，并在适当的酰胺形成条件(例如，HATU、DIPEA)下与式C7的配体(金刚烷基或亲脂性化合物(例如，脂肪酸))偶联，以形成包含本公开的脂质缀合物的式I-b的核酸-配体缀合物或其类似物。然后可以将式I-b的核酸-配体缀合物或其类似物脱保护以形成式C8的化合物，并用合适的羟基保护基(例如DMTr)保护以形成式C9的化合物。在一方面，式C9的核酸或其类似物可以共价连接至固相支持体(例如，通过琥珀酸连接基团)，以形成包含本公开的配体缀合物(金刚烷基或脂质部分)的式C10的固相支持核酸-配体缀合物或其类似物。在另一个方面，式C9的核酸-配体缀合物或其类似物可以与P(III)形成试剂(例如，2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺)反应，以形成包含P(III)基团的式C11的核酸-配体缀合物或其类似物。然后可以使式C11的核酸-配体缀合物或其类似物经历使用本领域已知且常用的制备寡核苷酸的方法进行的寡聚化形成条件。例如，式C11化合物与带有5’-羟基的固体支持的核酸-配体缀合物或其类似物偶联。进一步的步骤可以包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和/或从固相支持体上切割，以提供各种核苷酸长度的寡核苷酸，包括一个或多个金刚烷基和/或脂质缀合物核苷酸单元，由式II-b-3的化合物表示。B、E、L2、PG1、PG2、PG3、PG4、R1、R2、R3、R4、R5、X1、X2、X3、V、W和Z中的每一个如上文所定义和本文所述。
方案D：本公开的寡核苷酸的合成后脂质缀合
B、E、L2、PG1、PG2、PG3、PG4、R1、R2、R3、R4、R5、X1、X2、X3、V、W和Z中的每一个如上文所定义和本文所述。如以上方案D中所示，可以将式C5的核酸或其类似物选择性地脱保护以形成式D1的化合物，用合适的羟基保护基(例如，DMTr)保护以形成式D2的化合物，并与P(III)形成试剂(例如，2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺)反应以形成式D3的核酸或其类似物。接下来，使式D3的核酸或其类似物经历使用本领域已知且常用的制备寡核苷酸的方法进行的寡聚化形成条件。例如，式D3的化合物与带有5’-羟基的固体支持的核酸或其类似物偶联。进一步的步骤可以包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和/或从固相支持体上切割，以提供由式D4化合物表示的各种核苷酸长度的寡核苷酸。然后可以将式D4的寡核苷酸脱保护以形成式D5的化合物，并在适当的酰胺形成条件(例如，HATU、DIPEA)下与疏水性配体(例如，金刚烷基或亲脂性部分)偶联以形成式C7的化合物(例如，金刚烷基或脂肪酸)，以形成包含本公开的配体(例如，金刚烷基或脂肪酸)缀合物的式II-b-3的寡核苷酸。
本领域技术人员将会理解，存在于本公开的核酸或其类似物中的各种官能团，如脂族基团、醇、羧酸、酯、酰胺、醛、卤素和腈，可以通过本领域公知的技术相互转化，这些技术包括但不限于还原、氧化、酯化、水解、部分氧化、部分还原、卤化、脱水、部分水合和水合。参见，例如，“MARCH’S ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY”,(第5版,编者：Smith,M.B.andMarch,J.,John Wiley&Sons,New York:2001)，其各自的全部内容通过引用并入本文。此类相互转化可能需要一种或多种前述技术，并且用于合成本公开所提供的核酸的某些方法在下面的示例中描述。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备包含一个或多个脂质缀合物的寡核苷酸的方法，所述脂质缀合物单元由式II-a-1表示：
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-5a的核酸或其类似物：
或其盐，以及
(b)寡聚化所述式I-5a化合物以形成式II-1a化合物，其中B、E、L、LC、n、PG4、R1、R2、R3、X、X1、X2、X3、E和Z中的每一个如上文所定义和本文所述。
在上述步骤(b)中，寡聚化是指使用本领域已知且常用的制备寡核苷酸的方法来执行寡聚化形成条件。例如，式I-5a化合物与带有5’-羟基的固体支持的核酸或其类似物偶联。进一步的步骤可以包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和从固相支持体上切割，以提供各种核苷酸长度的寡核苷酸，由包含本公开的脂质缀合物的式II-Ia化合物表示。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备包含一个或多个脂质缀合物的寡核苷酸的方法，其进一步包括制备式I-5a的核酸或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式Ia的核酸或其类似物：
或其盐，
(b)将所述式Ia的核酸或其类似物脱保护以形成式I-2a化合物：
或其盐，
(c)保护所述式I-2的核酸或其类似物以形成式I-3a化合物：
或其盐，以及
(d)用P(III)形成试剂处理所述式I-3a的核酸或其类似物以形成式I-5a的核酸或其类似物，其中B、E、L、LC、n、PG4、R1、R2、R3、X、X1、X2、X3、E和Z中的每一个如上文所定义和本文所述。
在上述步骤(b)中，式Ia化合物的PG1和PG2包含可以在酸性条件下或用氟阴离子除去的甲硅烷基醚或环状亚甲硅烷基衍生物。提供氟阴离子以供除去硅基保护基的试剂的实例包括氢氟酸、氟化氢吡啶、三乙胺三氟化氢、四-N-丁基氟化铵等。
在上述步骤(c)中，式I-2a化合物用合适的羟基保护基保护。在某些实施方案中，用于保护式I-2a化合物的5’-羟基的保护基PG4包括酸不稳定的保护基，如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-氧杂蒽-9-基、9-(对甲苯基)-氧杂蒽-9-基、pixyl、2,7-二甲基pixyl等。在某些实施方案中，酸不稳定的保护基适合于使用例如二氯乙酸或三氯乙酸在酸敏感核酸或其类似物的溶液相和固相合成过程中的脱保护。
在上述步骤(d)中，用P(III)形成试剂处理式I-3a化合物，得到式I-5a化合物。在本公开的上下文中，P(III)形成试剂是反应生成磷(III)化合物的磷试剂。在一些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺或2-氰基乙基二氯磷酸酯。在某些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。普通技术人员将会认识到，式I-3a化合物的X1置换P(III)形成试剂中的离去基团在存在或不存在合适的碱的情况下实现。此类合适的碱是本领域公知的，并且包括有机碱和无机碱。在某些实施方案中，该碱是叔胺，如三乙胺或二异丙基乙胺。在其他实施方案中，使用N,N-二甲基磷氨基二氯化物作为P(V)形成试剂来进行上述步骤(d)。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备包含一个或多个脂质缀合物的寡核苷酸的方法，其进一步包括制备式Ia的核酸-脂质缀合物或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-1的核酸或其类似物：
或其盐，以及，
(b)将一个或多个亲脂性化合物与式I-1的核酸或其类似物缀合，以形成包含一个或多个脂质缀合物的式Ia的核酸或其类似物，其中：B、E、L、LC、n、PG1、PG2、R1、R2、X、X1和Z中的每一个如上文所定义和本文所述。
在上述步骤(b)中，式I-1a的核酸或其类似物与一个或多个亲脂性化合物缀合以形成包含一个或多个本公开的脂质缀合物的式Ia化合物。通常，通过本领域已知的技术，通过串联或并联的在式I-1a的核酸或其类似物与一个或多个脂肪酸之间的酯化或酰胺化反应来进行缀合。在某些实施方案中，在合适的酰胺形成条件下进行缀合，得到包含一个或多个脂质缀合物的式I化合物。合适的酰胺形成条件可包括使用本领域已知的酰胺偶联试剂，例如但不限于HATU、PyBOP、DCC、DIC、EDC、HBTU、HCTU、PyAOP、PyBrOP、BOP、BOP-Cl、DEPBT、T3P、TATU、TBTU、TNTU、TOTU、TPTU、TSTU或TDBTU。或者，亲脂性化合物的缀合可以通过本文表A中描述的任一种交叉偶联技术来完成。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备包含一个或多个脂质缀合物的寡核苷酸的方法，所述脂质缀合物单元由式II-1表示：
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式II-2的寡核苷酸：
或其盐，以及，
(b)将一个或多个亲脂性化合物与式II-2的寡核苷酸缀合，以形成包含一个或多个脂质缀合物的式II-1的寡核苷酸。在上述步骤(b)中，式II-2的寡核苷酸与一个或多个亲脂性化合物缀合，以形成包含一个或多个本公开的脂质缀合物的式II-1的寡核苷酸。
通常，通过本领域已知的技术，通过串联或并联的在式II-2的寡核苷酸与一个或多个脂肪酸之间的酯化或酰胺化反应来进行缀合。在某些实施方案中，在合适的酰胺形成条件下进行缀合，得到包含一个或多个脂质缀合物的式II-1的寡核苷酸。合适的酰胺形成条件可包括使用本领域已知的酰胺偶联试剂，例如但不限于HATU、PyBOP、DCC、DIC、EDC、HBTU、HCTU、PyAOP、PyBrOP、BOP、BOP-Cl、DEPBT、T3P、TATU、TBTU、TNTU、TOTU、TPTU、TSTU或TDBTU。或者，亲脂性化合物的缀合可以通过本文表A中描述的任一种交叉偶联技术来完成。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备包含由式II-2表示的单元的寡核苷酸的方法：
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I-8的核酸或其类似物：
或其盐，以及
(b)寡聚化所述式I-8化合物以形成式II-2化合物。
在上述步骤(b)中，寡聚化是指使用本领域已知且常用的制备寡核苷酸的方法来执行寡聚化形成条件。例如，式I-8化合物与带有5’-羟基的固体支持的核酸或其类似物偶联。进一步的步骤可以包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和从固相支持体上切割，以提供由式II-2化合物表示的各种核苷酸长度的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备包含一个或多个脂质缀合物的核酸或其类似物的方法，其进一步包括制备式I-8的核酸或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤：：
(a)提供式I-1的核酸或其类似物：
或其盐，
(b)将所述式I-1的核酸或其类似物脱保护以形成式I-6化合物：
或其盐，
(c)保护所述式I-6的核酸或其类似物以形成式I-7化合物：
或其盐，以及
(d)用P(III)形成试剂处理所述式I-7的核酸或其类似物以形成式I-8的核酸或其类似物。在上述步骤(b)中，式I-1化合物的PG1和PG2包含可以在酸性条件下或用氟阴离子除去的甲硅烷基醚或环状亚甲硅烷基衍生物。提供氟阴离子以供除去硅基保护基的试剂的实例包括氢氟酸、氟化氢吡啶、三乙胺三氟化氢、四-N-丁基氟化铵等。
在上述步骤(c)中，式I-6化合物用合适的羟基保护基保护。在某些实施方案中，用于保护式I-6化合物的5’-羟基的保护基PG4包括酸不稳定的保护基，如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-氧杂蒽-9-基、9-(对甲苯基)-氧杂蒽-9-基、pixyl、2,7-二甲基pixyl等。在某些实施方案中，酸不稳定的保护基适合于使用例如二氯乙酸或三氯乙酸在酸敏感核酸或其类似物的溶液相和固相合成过程中的脱保护。
在上述步骤(d)中，用P(III)形成试剂处理式I-7化合物，得到式I-8化合物。在本公开的上下文中，P(III)形成试剂是反应生成磷(III)化合物的磷试剂。在一些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺或2-氰基乙基二氯磷酸酯。在某些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。普通技术人员将会认识到，式I-7化合物的X1置换P(III)形成试剂中的离去基团在存在或不存在合适的碱的情况下实现。此类合适的碱是本领域公知的，并且包括有机碱和无机碱。在某些实施方案中，该碱是叔胺，如三乙胺或二异丙基乙胺。在其他实施方案中，使用N,N-二甲基二氯化磷作为P(V)形成试剂来进行上述步骤(d)。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备包含一个或多个金刚烷基和/或脂质部分的寡核苷酸-配体缀合物的方法，所述缀合物单元由式II-b-3表示：
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式C11的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，以及
(b)寡聚化所述式C11化合物，以形成式II-b-3化合物。在上述步骤(b)中，寡聚化是指使用本领域已知且常用的制备寡核苷酸的方法来执行寡聚化形成条件。例如，式C11化合物与带有5’-羟基的固体支持的核酸或其类似物偶联。进一步的步骤可以包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和从固相支持体上切割，以提供具有一个或多个核酸-配体缀合物单元的各种核苷酸长度的寡核苷酸-配体缀合物，其中每个单元由包含本公开的金刚烷基或脂质部分的式II-b-3化合物表示。
在一些实施方案中，用于制备包含一个或多个脂质缀合物的式II-b-3的寡核苷酸的方法进一步包括制备式C11的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤
(a)提供式I-b的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，
(b)将所述式I-b的核酸-配体缀合物或其类似物脱保护以形成式C8的化合物：
或其盐，
(c)保护所述式C8的核酸-配体缀合物或其类似物以形成式C9化合物：
或其盐，以及
(d)用P(III)形成试剂处理所述式C9的核酸-配体缀合物或其类似物以形成式C11的核酸或其类似物。在上述步骤(b)中，式I-b化合物的PG1和PG2包含可以在酸性条件下或用氟阴离子除去的甲硅烷基醚或环状亚甲硅烷基衍生物。提供氟阴离子以供除去硅基保护基的试剂的实例包括氢氟酸、氟化氢吡啶、三乙胺三氟化氢、四-N-丁基氟化铵等。
在上述步骤(c)中，式C8化合物用合适的羟基保护基保护。在某些实施方案中，用于保护式C8化合物的5’-羟基的保护基PG4包括酸不稳定的保护基，如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-氧杂蒽-9-基、9-(对甲苯基)-氧杂蒽-9-基、pixyl、2,7-二甲基pixyl等。在某些实施方案中，酸不稳定的保护基适合于使用例如二氯乙酸或三氯乙酸在酸敏感核酸或其类似物的溶液相和固相合成过程中的脱保护。
在上述步骤(d)中，用P(III)形成试剂处理式C9化合物，得到式C11化合物。在本公开的上下文中，P(III)形成试剂是反应生成磷(III)化合物的磷试剂。在一些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺或2-氰基乙基二氯磷酸酯。在某些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。普通技术人员将会认识到，式C9化合物的X1置换P(III)形成试剂中的离去基团在存在或不存在合适的碱的情况下实现。此类合适的碱是本领域公知的，并且包括有机碱和无机碱。在某些实施方案中，该碱是叔胺，如三乙胺或二异丙基乙胺。在其他实施方案中，使用N,N-二甲基二氯化磷作为P(V)形成试剂来进行上述步骤(d)。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备包含一个或多个核酸-配体缀合物单元的式II-b-3的寡核苷酸-配体缀合物的方法，每个核酸-配体缀合物单元包含一个或多个金刚烷基或脂质部分，该方法进一步包括制备式I-b的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式C6的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，以及，
(b)将亲脂性化合物与式C6的核酸或其类似物缀合，以形成包含一个或多个金刚烷基和/或脂质缀合物的式I-b的核酸-配体缀合物或其类似物。在上述步骤(b)中，在合适的酰胺形成条件下进行缀合，得到包含金刚烷基和/或脂质缀合物的式I-b化合物。合适的酰胺形成条件可包括使用本领域已知的酰胺偶联试剂，例如但不限于HATU、PyBOP、DCC、DIC、EDC、HBTU、HCTU、PyAOP、PyBrOP、BOP、BOP-Cl、DEPBT、T3P、TATU、TBTU、TNTU、TOTU、TPTU、TSTU或TDBTU。在某些实施方案中，酰胺形成条件包括HATU和DIPEA或TEA。
在某些实施方案中，式C6的核酸-配体缀合物或其类似物以盐形式(例如，富马酸盐)提供，并且在进行缀合步骤之前首先将其转化为游离碱(例如，使用碳酸氢钠)。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备包含一个或多个核酸-配体缀合物单元的式II-b-3的寡核苷酸-配体缀合物的方法，其进一步包括制备式C6的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式C1的核酸或其类似物：
或其盐，以及，
(b)保护所述式C1的核酸或其类似物以形成式C2化合物：
/>
或其盐，
(c)将所述式C2的核酸或其类似物进行烷基化以形成式C3化合物：
或其盐，
(d)用式C4化合物：
或其盐取代所述式C3的核酸或其类似物，以形成式C5化合物：
或其盐，
(e)将所述式C5的核酸或其类似物脱保护以形成式C6的核酸-配体缀合物或其类似物。在上述步骤(b)中，式C2的PG1和PG2基团与它们的居间原子一起形成环状二醇保护基，如环状缩醛或缩酮。此类基团包括亚甲基、亚乙基、亚苄基、亚异丙基、亚环己基和亚环戊基、亚甲硅烷基衍生物如二叔丁基甲硅烷基亚基(di-t-butylsilylene)和1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷基亚基(1,1,3,3-tetraisopropylidisiloxanylidene)、环状碳酸酯、环状硼酸酯和基于环腺苷单磷酸(即cAMP)的环状单磷酸酯衍生物。在某些实施方案中，环状二醇保护基是由式C1的二醇与1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷在碱性条件下反应制备的1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷基亚基。
在上述步骤(c)中，式C2的核酸或其类似物在酸性条件下用DMSO和乙酸酐的混合物进行烷基化。在某些实施方案中，当-V-H为羟基时，DMSO和乙酸酐的混合物在乙酸的存在下通过Pummerer重排原位形成乙酸(甲基硫基)甲酯，其然后与式C2的核酸或类似物的羟基反应，以提供式C3的单硫缩醛官能化片段核酸或其类似物。
在上述步骤(d)中，用式C4的核酸或其类似物取代式C3的核酸或其类似物的硫甲基，得到式C4的核酸或其类似物。在某些实施方案中，取代在温和氧化和/或酸性条件下发生。在一些实施方案中，V为氧。在一些实施方案中，温和氧化试剂包括元素碘和过氧化氢的混合物、尿素过氧化氢复合物、硝酸银/硫酸银、溴酸钠、过二硫酸铵、过二硫酸四丁基铵、氯胺T、/>II、次氯酸钠或碘酸钾/高碘酸钠。在某些实施方案中，温和氧化剂包括N-碘代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-氯代琥珀酰亚胺、1,3-二碘-5,5-二甲基乙内酰脲、三溴化吡啶鎓、一氯化碘或其络合物等。通常在温和氧化条件下使用的酸包括硫酸、对甲苯磺酸、三氟甲磺酸、甲磺酸和三氟乙酸。在某些实施方案中，温和氧化剂包括N-碘代琥珀酰亚胺和三氟甲磺酸的混合物。
在上述步骤(e)中，除去式C5的核酸-配体缀合物或其类似物的PG3和可选的R4(当R4为合适的胺保护基时)，得到式C6的核酸-配体缀合物或其类似物，或其盐。在一些实施方案中，PG3和/或R4包含可在酸性或碱性条件下去除的氨基甲酸酯衍生物。在某些实施方案中，式C5的核酸-配体缀合物或其类似物的保护基(例如，PG3和R4两者或独立地PG3或R4之一)通过酸水解除去。应当理解，在酸水解式C5的核酸-配体缀合物或其类似物的保护基后，形成其式C6的盐。例如，当通过用酸如盐酸处理除去式C5的核酸-配体缀合物或其类似物的酸不稳定保护基时，所得的胺化合物将以其盐酸盐形式形成。本领域普通技术人员将会认识到，多种酸可用于除去酸不稳定的氨基保护基，因此考虑了式C6的核酸或其类似物的多种盐形式。
在其他实施方案中，式C5的核酸或其类似物的保护基(例如，PG3和R4两者或独立地PG3或R4之一)通过碱水解除去。例如，Fmoc和三氟乙酰基保护基可以通过用碱处理来除去。本领域普通技术人员将会认识到，多种碱可用于除去碱不稳定的氨基保护基。在一些实施方案中，碱是哌啶。在一些实施方案中，碱是1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)。在某些实施方案中，式C5的核酸-配体缀合物或其类似物在碱性条件下脱保护，随后用酸处理以形成式C6的盐。在某些实施方案中，该酸是富马酸，式C6的盐是富马酸盐。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备包含一个或多个核酸-配体缀合物的寡核苷酸-配体缀合物的方法，所述核酸-配体缀合物单元由式II-b-3表示：
或其药学上可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式D5的寡核苷酸：
或其盐，以及，
(b)将一个或多个金刚烷基或亲脂性化合物与式D5的寡核苷酸缀合，以形成包含一个或多个核酸-配体缀合物单元的式II-b-3的寡核苷酸-配体缀合物。在上述步骤(b)中，在合适的酰胺形成条件下进行缀合，得到包含金刚烷基或脂质缀合物的式D5化合物。合适的酰胺形成条件可包括使用本领域已知的酰胺偶联试剂，例如但不限于HATU、PyBOP、DCC、DIC、EDC、HBTU、HCTU、PyAOP、PyBrOP、BOP、BOP-Cl、DEPBT、T3P、TATU、TBTU、TNTU、TOTU、TPTU、TSTU或TDBTU。在某些实施方案中，酰胺形成条件包括HATU和DIPEA或TEA。
在一些实施方案中，本公开提供了制备包含由式D5表示的单元的寡核苷酸-配体缀合物的方法：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式D4的核酸-配体缀合物或其类似物：
或其盐，以及
(b)将所述式D4化合物脱保护以形成式D5化合物。在上述步骤(b)中，除去式D4的寡核苷酸的PG3和可选的R4(当R4为合适的胺保护基时)，得到式D5的寡核苷酸-配体缀合物或其盐。在一些实施方案中，PG3和/或R4包含可在酸性或碱性条件下去除的氨基甲酸酯衍生物。在某些实施方案中，式D4的寡核苷酸-配体缀合物的保护基(例如，PG3和R4两者或独立地PG3或R4之一)通过酸水解除去。应当理解，在酸水解式D4的寡核苷酸-配体缀合物的保护基后，形成其式D5的盐。例如，当通过用酸如盐酸处理除去式D4的寡核苷酸的酸不稳定保护基时，所得的胺化合物将以其盐酸盐形式形成。本领域普通技术人员将会认识到，多种酸可用于除去酸不稳定的氨基保护基，因此考虑了式D5的核酸-配体缀合物单元或其类似物的多种盐形式。
在其他实施方案中，式D4的寡核苷酸-配体缀合物的保护基(例如，PG3和R4两者或独立地PG3或R4之一)通过碱水解除去。例如，Fmoc和三氟乙酰基保护基可以通过用碱处理来除去。本领域普通技术人员将会认识到，多种碱可用于除去碱不稳定的氨基保护基。在一些实施方案中，碱是哌啶。在一些实施方案中，碱是1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备包含一个或多个核酸-配体缀合物单元与一个或多个金刚烷基和/或脂质部分的寡核苷酸-配体缀合物的方法，所述缀合物单元由式D4表示：
或药学上的其可接受的盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式D3的核酸或其类似物：
或其盐，以及
(b)寡聚化所述式D3化合物以形成式D4化合物，
在上述步骤(b)中，寡聚化是指使用本领域已知且常用的制备寡核苷酸的方法来执行寡聚化形成条件。例如，式D3的核酸或其类似物与带有5’-羟基的固体支持的核酸或其类似物偶联。进一步的步骤可以包括一个或多个脱保护、偶联、亚磷酸酯氧化和从固相支持体切割，以提供各种核苷酸长度的寡核苷酸，由包含本公开的金刚烷基或脂质缀合物的式D4化合物表示。
在一些实施方案中，本公开提供了用于制备包含一个或多个脂质缀合物的核酸或其类似物的方法，其进一步包括制备式D3的核酸或其类似物：
或其盐，所述方法包括以下步骤：
(a)提供式C5的核酸或其类似物：
或其盐，
(b)将所述式C5的核酸或其类似物脱保护以形成式D1化合物：
或其盐，
(c)保护所述式D1的核酸或其类似物以形成式D2的核酸或其类似物：
或其盐，以及
(d)用P(III)形成试剂处理所述式D2的核酸或其类似物以形成式D3的核酸或其类似物。在上述步骤(b)中，式C5的核酸或其类似物的PG1和PG2包含可以在酸性条件下或用氟阴离子除去的甲硅烷基醚或环状亚甲硅烷基衍生物。提供氟阴离子以供除去硅基保护基的试剂的实例包括氢氟酸、氟化氢吡啶、三乙胺三氟化氢、四-N-丁基氟化铵等。
在上述步骤(c)中，式D1的核酸或其类似物用合适的羟基保护基保护。在某些实施方案中，用于保护式D1化合物的5’-羟基的保护基PG4包括酸不稳定的保护基，如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-氧杂蒽-9-基、9-(对甲苯基)-氧杂蒽-9-基、pixyl、2,7-二甲基pixyl等。在某些实施方案中，酸不稳定的保护基适合于使用例如二氯乙酸或三氯乙酸在酸敏感核酸或其类似物的溶液相和固相合成过程中的脱保护。
在上述步骤(d)中，用P(III)形成试剂处理式D2的核酸或其类似物，得到式D3化合物。在本公开的上下文中，P(III)形成试剂是反应生成磷(III)化合物的磷试剂。在一些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺或2-氰基乙基二氯磷酸酯。在某些实施方案中，P(III)形成试剂是2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。普通技术人员将会认识到，式D2化合物的X1置换P(III)形成试剂中的离去基团在存在或不存在合适的碱的情况下实现。此类合适的碱是本领域公知的，并且包括有机碱和无机碱。在某些实施方案中，该碱是叔胺，如三乙胺或二异丙基乙胺。在其他实施方案中，使用N,N-二甲基二氯化磷作为P(V)形成试剂来进行上述步骤(d)。
制剂
已经开发了各种制剂来促进寡核苷酸的使用。例如，可以使用使降解最小化、促进递送和/或摄取、或为制剂中的寡核苷酸提供另一种有益性质的制剂将寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸缀合物)递送至受试者或细胞环境。在一些实施方案中，本文提供了包含降低靶mRNA(例如，在CNS中表达的靶mRNA)表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸缀合物)的组合物。可以适当地配制这样的组合物，使得当施用于受试者时，无论是施用到靶细胞的直接环境中还是全身施用，都有足够部分的寡核苷酸进入细胞以降低靶基因表达。可以使用任何种类的合适的寡核苷酸制剂来递送寡核苷酸以降低如本文所公开的靶基因表达。在一些实施方案中，将寡核苷酸配制在缓冲溶液如磷酸盐缓冲盐溶液、脂质体、胶束结构和壳体中。
具有阳离子脂质的寡核苷酸制剂可用来促进寡核苷酸向细胞中的转染。例如，可以使用阳离子脂质，如lipofectin、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如，聚赖氨酸)。合适的脂质包括Oligofectamine、Lipofectamine(Life Technologies)、NC388(RibozymePharmaceuticals,Inc.，Boulder，Colo.)或FuGene 6(Roche)，所有这些都可以根据制造商的说明来使用。
因此，在一些实施方案中，制剂包含脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，辅料包含脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微粒、纳米球或纳米颗粒，或者可以以其他方式配制以供施用至有需要的受试者的细胞、组织、器官或身体(参见，例如，Remington:THE SCIENCEAND PRACTICE OF PHARMACY,第22版,Pharmaceutical Press,2013)。
在一些实施方案中，本文的制剂包含辅料。在一些实施方案中，辅料为组合物赋予活性成分的改善的稳定性、改善的吸收、改善的溶解度和/或治疗增强。在一些实施方案中，辅料是缓冲剂(例如，柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或媒介物(例如，缓冲溶液、凡士林、二甲亚砜或矿物油)。在一些实施方案中，将寡核苷酸冻干以延长其保质期，然后在使用(例如，施用至受试者)前制成溶液。因此，包含任一种本文所述寡核苷酸的组合物中的辅料可以是冻干保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)或塌陷温度调节剂(例如，葡聚糖、FicollTM或明胶)。同样，本文的寡核苷酸可以以其游离酸的形式提供。
在一些实施方案中，将药物组合物配制为与其预期的给药途径相容。给药途径的实例包括肠胃外(例如，静脉内、肌肉内、腹膜内、皮内、皮下)、口服(例如，吸入)、经皮(例如，局部)、经粘膜和直肠给药。在一些实施方案中，将药物组合物配制用于递送至中枢神经系统(例如，鞘内、硬膜外)。在一些实施方案中，将药物组合物配制用于递送至眼睛(例如，眼科、眼内、结膜下、玻璃体内、眼球后、前房内)。
适合注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(当水溶性时)或分散体以及用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。在许多情况下，优选地在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。无菌注射溶液可以如下制备：根据需要将所需量的寡核苷酸与上文列举的成分中的一种或其组合引入所选溶剂中，随后过滤除菌。
在一些实施方案中，组合物可含有至少约0.1％或更多的治疗剂(例如，本文的RNAi寡核苷酸缀合物)，尽管活性成分的百分比可在总组合物的重量或体积的约1％至约80％之间或更多。制备此类药物制剂的本领域技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、给药途径、产品保质期以及其他药理学考虑因素等因素，并且因此，多种剂量和治疗方案可能是可取的。
使用方法
降低靶基因表达
在一些实施方案中，本公开提供了用于使细胞或细胞群体接触或向其递送有效量的本文任何RNAi寡核苷酸缀合物以降低靶基因表达(例如，降低CNS中的靶基因的表达)的方法。在一些实施方案中，通过测量细胞中靶mRNA、由靶mRNA编码的蛋白质或靶基因(mRNA或蛋白质)活性的量或水平的降低来确定靶基因表达的降低。这些方法包括本文描述的和本领域普通技术人员已知的那些方法。在一些实施方案中，本公开提供了用于使一个或多个CNS区域中的细胞或细胞群体接触或向其递送有效量的本文任何RNAi寡核苷酸缀合物以降低CNS中的靶基因表达的方法。在一些实施方案中，CNS区域包括但不限于大脑、前额叶皮质、额叶皮质、运动皮质、颞叶皮质、顶叶皮质、枕叶皮质、躯体感觉皮质、海马体、尾状核、纹状体、苍白球、丘脑、中脑、大脑脚盖、黑质、脑桥、脑干、小脑白质、小脑、齿状核、髓质、颈部脊髓、胸部脊髓、腰部脊髓、颈部背根神经节、胸部背根神经节、腰部背根神经节、骶部背根神经节、结状神经节、股神经、坐骨神经、腓肠神经、杏仁核、下丘脑、壳核、胼胝体和颅神经。
在一些实施方案中，本公开提供了用于降低受试者的CNS中靶mRNA的表达的方法，其包括施用一种或多种本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物。在一些实施方案中，该方法包括躯体感觉皮质(SS皮质)中靶mRNA的表达降低。在一些实施方案中，该方法包括海马体(HP)中靶mRNA的表达降低。在一些实施方案中，该方法包括纹状体中靶mRNA的表达降低。在一些实施方案中，该方法包括额叶皮质中靶mRNA的表达降低。在一些实施方案中，该方法包括小脑中靶mRNA的表达降低。在一些实施方案中，该方法包括下丘脑(HY)中靶mRNA的表达降低。在一些实施方案中，该方法包括颈部脊髓(CSC)中靶mRNA的表达降低。在一些实施方案中，该方法包括胸部脊髓(TSC)中靶mRNA的表达降低。在一些实施方案中，该方法包括腰部脊髓(LSC)中靶mRNA的表达降低。
本文提供的方法可用于任何合适的细胞类型。在一些实施方案中，细胞是表达靶mRNA的任何细胞。在一些实施方案中，细胞是从受试者获得的原代细胞。在一些实施方案中，该原代细胞已经历有限次数的传代，使得该细胞基本上保持其天然表型性质。在一些实施方案中，寡核苷酸所递送至的细胞是离体或体外的(即，可以被递送至培养中的细胞或细胞所在的生物体)。
在一些实施方案中，使用本领域已知的核酸递送方法将本文公开的RNAi寡核苷酸缀合物递送至细胞或细胞群体，所述方法包括但不限于注射含有RNAi寡核苷酸缀合物的溶液或药物组合物，用被RNAi寡核苷酸缀合物覆盖的颗粒轰击，将细胞或细胞群体暴露于含有RNAi寡核苷酸缀合物的溶液，或在RNAi寡核苷酸缀合物的存在下对细胞膜进行电穿孔。可以使用本领域已知的用于将寡核苷酸递送至细胞的其他方法，例如脂质介导的载体转运、化学介导的转运和阳离子脂质体转染如磷酸钙等。
在一些实施方案中，靶基因表达的降低通过评价与靶基因表达相关的细胞或细胞群体的一种或多种分子、性质或特性的测定或技术来确定，或者通过评价直接指示细胞或细胞群体中的靶基因表达(例如，靶mRNA或蛋白质)的分子的测定或技术来确定。在一些实施方案中，通过将与RNAi寡核苷酸缀合物接触的细胞或细胞群体中的靶基因表达与对照细胞或细胞群体(例如，未与该RNAi寡核苷酸缀合物接触或与对照RNAi寡核苷酸缀合物接触的细胞或细胞群体)进行比较来评价本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物降低靶基因表达的程度。在一些实施方案中，预先确定对照细胞或细胞群体中靶基因表达的对照量或水平，使得不需要在进行测定或技术的每次情况下都测量对照量或水平。预先确定的水平或值可以采取多种形式。在一些实施方案中，预先确定的水平或值可以是单个截断值，如中值或平均值。
在一些实施方案中，本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物接触或递送至细胞或细胞群体导致靶基因表达的降低。在一些实施方案中，靶基因表达的降低是相对于未与该RNAi寡核苷酸缀合物接触或与对照RNAi寡核苷酸缀合物接触的细胞或细胞群体中靶基因表达的对照量或水平而言的。在一些实施方案中，靶基因表达的降低是相对于靶基因表达的对照量或水平约1％或更低、约5％或更低、约10％或更低、约15％或更低、约20％或更低、约25％或更低、约30％或更低、约35％或更低、约40％或更低、约45％或更低、约50％或更低、约55％或更低、约60％或更低、约70％或更低、约80％或更低或者约90％或更低。在一些实施方案中，靶基因表达的对照量或水平是尚未与本文的RNAi寡核苷酸缀合物接触的细胞或细胞群体中靶mRNA和/或蛋白质的量或水平。在一些实施方案中，在任何有限的时间段或时间量(例如，分钟、小时、天、周、月)之后评估根据本文的方法将RNAi寡核苷酸缀合物递送至细胞或细胞群体的效果。例如，在一些实施方案中，在使RNAi寡核苷酸缀合物接触或递送至细胞或细胞群体后至少约4小时、约8小时、约12小时、约18小时、约24小时；或至少约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约21天、约28天、约35天、约42天、约49天、约56天、约63天、约70天、约77天或约84天或更长时间，在细胞或细胞群体中测定靶基因表达。在一些实施方案中，在使RNAi寡核苷酸缀合物接触或递送至细胞或细胞群体后至少约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月或更长时间，在细胞或细胞群体中测定靶基因表达。
基因表达的组织特异性调节
在一些实施方案中，本公开提供了用于使本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物接触或递送至细胞或细胞群体的方法，其中所述细胞或细胞群体存在于受试者的一种或多种靶组织中。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物，其中该缀合物分布至受试者的一种或多种靶组织，并且其中该缀合物接触或递送至所述一种或多种靶组织内的细胞或细胞群体。
如本文所用的，“靶组织”是指受试者的组织，其中该组织内的细胞或细胞群体降低的靶基因表达提供了一种或多种期望的生理结局。在一些实施方案中，靶基因在一种或多种靶组织内的细胞或细胞群体中具有异常表达，其中该异常表达促成受试者中的疾病或病症的病理学。在一些实施方案中，靶组织内的细胞或细胞群体降低的靶基因表达起到治疗、减轻、预防或缓解受试者中的疾病或病症的作用。
尽管RNAi寡核苷酸缀合物在靶组织内的分布和/或功能对于降低位于靶组织内的细胞或细胞群体内的靶基因表达是理想的，但是该缀合物向非靶组织的分布和/或功能具有造成有害影响的可能性。例如，缀合物向非靶组织的分布可能限制其向靶组织分布的可用性，这继而限制了缀合物用于降低位于靶组织内的细胞或细胞群体内的靶基因表达的效力和/或活性。作为另一个例子，虽然靶组织可能具有靶基因的异常表达并且将受益于降低的靶基因表达来恢复正常生理机能，但是非靶组织可能需要靶基因的表达来行使正常的生理功能。在这种情况下，缀合物在非靶组织内的分布和/或功能将以导致不期望的或有害的病理学的方式损害靶基因的表达。因此，对于许多体内治疗情况，将RNAi寡核苷酸分布至受试者的靶组织，同时限制其在受试者的一种或多种非靶组织(例如，肝脏)内的分布和/或功能是有益的。
在一些实施方案中，本公开提供了用于降低或抑制受试者中与一种或多种靶组织相关的细胞群体中靶基因的表达的方法，其包括施用本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物或其药物组合物。在一些实施方案中，该方法包括将RNAi寡核苷酸缀合物分布至受试者的一种或多种靶组织，而最小程度地分布至受试者的一种或多种非靶组织。在一些实施方案中，使RNAi寡核苷酸缀合物接触或递送至在受试者的一种或多种靶组织中存在的细胞或细胞群体，而最小程度地接触或递送至在受试者的一种或多种非靶组织中存在的细胞或细胞群体。在一些实施方案中，靶基因的表达在一种或多种靶组织中降低，而在一种或多种非靶组织中没有降低至相同或相似的水平。
在一些实施方案中，所述方法导致(i)相对于靶基因的对照表达，一种或多种靶组织中的细胞或细胞群体的靶基因表达降低；并且(ii)相对于靶基因的对照表达，一种或多种非靶组织中的细胞或群体的靶基因表达基本等同。在一些实施方案中，靶基因的对照表达对应于来自未与该RNAi寡核苷酸缀合物接触或与对照RNAi寡核苷酸缀合物接触的等同组织的细胞或细胞群体中靶基因的表达量或水平。在一些实施方案中，靶基因表达的降低被测量为从靶基因转录的靶mRNA或由靶基因编码的蛋白质的量或水平的降低。在一些实施方案中，所述方法导致(i)相对于对照，一种或多种靶组织中靶mRNA的表达降低；并且(ii)相对于对照，一种或多种非靶组织中靶mRNA的表达基本等同。在一些实施方案中，所述方法导致(i)相对于对照，一种或多种靶组织中靶蛋白的水平降低；并且(ii)相对于对照，一种或多种非靶组织中靶蛋白的水平基本等同。
在一些实施方案中，本公开提供了用于降低或抑制受试者中与CNS相关的细胞群体中靶基因的表达的方法，其包括施用本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物或其药物组合物。在一些实施方案中，该方法包括将RNAi寡核苷酸缀合物分布至受试者的CNS，而最小程度地分布至受试者的一种或多种非靶组织(例如，肝脏)。在一些实施方案中，使RNAi寡核苷酸缀合物接触或递送至在受试者的CNS中存在的细胞或细胞群体，而最小程度地接触或递送至在受试者的一种或多种非靶组织(例如，肝脏)中存在的细胞或细胞群体。在一些实施方案中，靶基因的表达在受试者的CNS中降低，而在一种或多种非靶组织(例如，肝脏)中没有降低至相同水平。
在一些实施方案中，靶基因的表达在CNS中降低，而在一种或多种非靶组织中没有降低至相同水平。在一些实施方案中，所述一种或多种非靶组织包括肝组织。在一些实施方案中，所述方法导致(i)相对于靶基因的对照表达，CNS的细胞或细胞群体中靶基因的表达降低；并且(ii)相对于靶基因的对照表达，一种或多种非靶组织的细胞或细胞群体中靶基因的表达基本等同。在一些实施方案中，靶基因的对照表达对应于来自未与该RNAi寡核苷酸缀合物接触或与对照RNAi寡核苷酸缀合物接触的等同组织的细胞或细胞群体中靶基因的表达量或水平。在一些实施方案中，所述方法导致(i)相对于靶基因的对照表达(例如，未与该RNAi寡核苷酸缀合物接触或与对照RNAi寡核苷酸缀合物接触的CNS的细胞或细胞群体中靶基因的表达)，CNS的细胞或细胞群体中靶基因的表达降低；并且(ii)相对于靶基因的对照表达(例如，未与该RNAi寡核苷酸缀合物接触或与对照RNAi寡核苷酸缀合物接触的肝脏的细胞或细胞群体中靶基因的表达)，肝脏的细胞或细胞群体中靶基因的表达基本等同。在一些实施方案中，所述方法导致相对于靶基因的对照表达，CNS的细胞或细胞群体中靶基因的表达为约1％或更低、约5％或更低、约10％或更低、约15％或更低、约20％或更低、约25％或更低、约30％或更低、约35％或更低、约40％或更低、约45％或更低、约50％或更低、约55％或更低、约60％或更低、约70％或更低、约80％或更低，或约90％或更低。在一些实施方案中，肝脏中靶基因的表达与靶基因的对照表达相当(例如，具有不超过约±30％、约±25％、约±20％、约±15％、约±10％、约±5％、约±4％、约±3％、约±2％或约±1％的差异)。在一些实施方案中，CNS中靶基因表达的降低被测量为从靶基因转录的靶mRNA或由靶基因编码的蛋白质的量或水平的降低。
治疗方法
本公开提供了用作药物的寡核苷酸，特别是供治疗与CNS相关的疾病、病症和状况的方法中使用的寡核苷酸。本公开还提供了用于或可经改变用于治疗将会受益于降低(例如，CNS中的)靶基因表达的受试者(例如，患有与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的人)的RNAi寡核苷酸缀合物。在一些方面，本公开提供了用于或经改变用于治疗患有与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的受试者的RNAi寡核苷酸缀合物。本公开还提供了用于或可经改变用于制备治疗与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的药物或药物组合物的RNAi寡核苷酸缀合物。在一些实施方案中，使用或可经改变使用的RNAi寡核苷酸缀合物靶向mRNA并降低靶基因表达(例如，经由RNAi途径)。在一些实施方案中，使用或可经改变使用的RNAi寡核苷酸缀合物靶向mRNA并降低靶mRNA、蛋白质和/或活性的量或水平。
另外，在本文方法的一些实施方案中，选择患有或易患与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的受试者来用本文的RNAi寡核苷酸缀合物进行治疗。在一些实施方案中，所述方法包括选择具有与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的标志物(例如，生物标志物)或倾向于具有该标志物(例如，但不限于，靶mRNA、蛋白质或其组合)的个体。同样地，并且如下文所详述，本公开提供的方法的一些实施方案包括诸如以下的步骤：测量或获得靶基因表达标志物的基线值，然后将这样获得的值与一个或多个其他基线值或在向受试者施用RNAi寡核苷酸缀合物后获得的值进行比较，以评估治疗的有效性。
本公开还提供了用本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物治疗患有、疑似患有或有风险发展为与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的受试者的方法。在一些方面，本公开提供了使用本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物治疗或减弱与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的发作或进展的方法。在其他方面，本公开提供了使用本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物在患有与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的受试者中实现一种或多种治疗益处的方法。在本文方法的一些实施方案中，通过施用治疗有效量的任意一种或多种本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物来治疗受试者。在一些实施方案中，治疗包括降低(例如，CNS中的)靶基因表达。在一些实施方案中，对受试者进行治疗性治疗。在一些实施方案中，对受试者进行预防性治疗。
在本文方法的一些实施方案中，将本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物或包含该RNAi寡核苷酸缀合物的药物组合物施用至患有与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得该受试者中的靶基因表达降低，从而治疗该受试者。在一些实施方案中，受试者中靶mRNA的量或水平降低。在一些实施方案中，受试者中由靶mRNA编码的蛋白质的量或水平降低。
在本文方法的一些实施方案中，将本文提供的RNAi寡核苷酸缀合物或包含该RNAi寡核苷酸缀合物的药物组合物施用至患有与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该RNAi寡核苷酸缀合物或药物组合物之前的靶基因表达相比，该受试者中的靶基因表达降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受该RNAi寡核苷酸缀合物或药物组合物或接受对照RNAi寡核苷酸缀合物、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中的靶基因表达相比，该受试者中的靶基因表达降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的RNAi寡核苷酸缀合物或包含该RNAi寡核苷酸缀合物的药物组合物施用至患有与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该RNAi寡核苷酸缀合物或药物组合物之前的靶mRNA的量或水平相比，该受试者中靶mRNA的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受该RNAi寡核苷酸缀合物或药物组合物或接受对照RNAi寡核苷酸缀合物、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中靶mRNA的量或水平相比，该受试者中靶mRNA的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的RNAi寡核苷酸缀合物或包含该RNAi寡核苷酸缀合物的药物组合物施用至患有与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该RNAi寡核苷酸缀合物或药物组合物之前由靶基因编码的蛋白质的量或水平相比，该受试者中由靶基因编码的蛋白质的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受该RNAi寡核苷酸缀合物或药物组合物或接受对照RNAi寡核苷酸缀合物、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中由靶基因编码的蛋白质的量或水平相比，该受试者中由靶基因编码的蛋白质的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的RNAi寡核苷酸缀合物或包含该RNAi寡核苷酸缀合物的药物组合物施用至患有与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该RNAi寡核苷酸缀合物或药物组合物之前靶基因活性的量或水平相比，该受试者中靶基因活性的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受该RNAi寡核苷酸缀合物或药物组合物或接受对照RNAi寡核苷酸缀合物、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中靶基因活性的量或水平相比，该受试者中靶基因活性的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
用于测定受试者中或来自受试者的样品中的靶基因表达、靶mRNA的量或水平、由靶基因编码的蛋白质的量或水平和/或靶基因活性的量或水平的合适方法是本领域已知的。此外，本文提出的实施例说明了用于测定靶基因表达的示例性方法。
在一些实施方案中，在从受试者获得或分离的细胞、细胞群体或组(例如，类器官)、器官(例如，CNS)、血液或其成分(例如，血浆)、组织(例如，脑组织)、样品(例如，CSF样品或脑活检样品)或任何其他生物材料中，靶基因表达、靶基因mRNA的量或水平、由靶基因编码的蛋白质的量或水平、靶基因活性的量或水平、或其任何组合降低。在一些实施方案中，在从受试者获得或分离的超过一种类型的细胞、超过一组细胞、超过一种器官(例如，脑和一种或多种其他器官)、超过一种血液成分(例如，血浆和一种或多种其他血液成分)、超过一种类型的组织(例如，脑组织和一种或多种其他类型的组织)、超过一种类型的样品(例如，脑活检样品和一种或多种其他类型的活检样品)中，靶基因表达、靶基因mRNA的量或水平、由靶基因编码的蛋白质的量或水平、靶基因活性的量或水平、或其任何组合降低。
在一些实施方案中，所述方法提供一种或多种靶组织(例如，CNS)中的细胞或细胞群体中靶基因表达的降低，同时维持一种或多种非靶组织(例如，肝脏)中的细胞或细胞群体中的靶基因表达。在一些实施方案中，一种或多种非靶组织内的靶基因表达有助于受试者的正常生理功能。在一些实施方案中，所述方法提供差异性靶基因表达，使得靶组织中的非常规靶基因表达得到降低，以治疗、减轻或缓解与靶基因相关的疾病或病症，而不诱导会导致生理功能破坏的非靶组织中靶基因的调节异常。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗与靶基因相关的疾病、病症或状况的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的RNAi寡核苷酸缀合物或其药物组合物，其中(i)与靶基因表达的对照量或水平相比，该受试者的靶组织(例如，CNS)中靶基因表达的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％；并且(ii)一种或多种非靶组织(例如，肝脏)中靶基因表达的量或水平与靶基因的对照表达水平相当(例如，具有不超过约±30％、约±25％、约±20％、约±15％、约±10％、约±5％、约±4％、约±3％、约±2％或约±1％的差异)。
在一些实施方案中，与未接受所述RNAi寡核苷酸缀合物或药物组合物或接受对照RNAi寡核苷酸缀合物、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中靶mRNA的量或水平相比，所述受试者中靶mRNA的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
与靶基因表达相关的疾病、病症或状况的实例包括但不限于进行性核上麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、嗜银颗粒病(AGD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、衰老相关的tau星形神经胶质病(ARTAG)、家族性额颞叶痴呆17(FTD-17)、Tau蛋白病伴呼吸衰竭、痴呆伴癫痫、皮克病、强直性肌营养不良1或2(MD1或MD2)、唐氏综合征、痉挛性截瘫(SP)、C型Niemann-Pick病、路易体痴呆(DLB)、路易体吞咽困难、路易体病、橄榄体脑桥小脑萎缩、纹状体黑质变性、Shy-Drager综合征、脊髓性肌萎缩V(SMAV)、亨廷顿病(HD)、阿尔茨海默病、SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA10(1、2、3、7或10型脊髓小脑共济失调)、多系统萎缩(MSA)、脊髓和延髓肌肉萎缩(SBMA，肯尼迪病)、Friedrich共济失调、脆性X相关震颤/共济失调综合征(FXTAS)、脆性X综合征(FRAXA)、X连锁精神发育迟滞(XLMR)、帕金森病、张力障碍、SBMA(脊髓延髓肌萎缩)、神经性疼痛病症、脊髓损伤、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(DRPLA)、隐性CNS病症、ALS(肌萎缩侧索硬化)、M2DS(MECP2重复综合征)、FTD(额颞叶痴呆)、朊病毒病、成年发作型脑白质营养不良、Alexander病、Krabbe病、慢性创伤性脑病、Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)、Lafora病、卒中、脑淀粉样血管病(CAA)和异染性脑白质营养不良(MLD)。
在一些实施方案中，靶基因可以是来自任何哺乳动物如人的靶基因。任何基因可以按照本文所述的方法进行沉默。
本文所述的方法通常涉及向受试者施用治疗有效量的本文的RNAi寡核苷酸缀合物，即能够产生期望的治疗结果的量。治疗上可接受的量可以是能够治疗性地治疗疾病或病症的量。针对任一受试者的适当剂量将取决于某些因素，包括受试者的体型、体表面积、年龄、待施用的组合物、组合物中的活性成分、施用时间和途径、一般健康状况以及同时施用的其他药物。
在一些实施方案中，经肠(例如，口服、通过胃饲管、通过十二指肠饲管、经由胃造口术或经直肠)、肠胃外(例如，皮下注射、静脉内注射或输注、动脉内注射或输注、骨内输注、肌肉内注射、脑内注射、脑室内注射、鞘内)、局部(例如，表皮、吸入、通过滴眼剂或通过粘膜)或通过直接注射到靶器官(例如，受试者的大脑)中向受试者施用本文的任一种组合物。
在一些实施方案中，将本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物鞘内施用至脑脊液(CSF)中(例如，注射或输注到蛛网膜下腔内的体液中)。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物的鞘内施用以推注到蛛网膜下腔中的方式进行。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物的鞘内施用以输注到蛛网膜下腔中的方式进行。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物的鞘内施用经由进入蛛网膜下腔的导管进行。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物的鞘内施用经由泵进行。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物的鞘内施用经由可植入泵进行。在一些实施方案中，经由作为储库运行或起作用的可植入装置进行施用。
在一些实施方案中，将本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物鞘内施用至小脑延髓池(也称为大池)中。向小脑延髓池内的鞘内施用被称为“脑池内施用”或“小脑延髓池内(i.c.m.)施用”。在一些实施方案中，将本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物鞘内施用至腰部脊髓的蛛网膜下腔中。向腰部脊髓的蛛网膜下腔内的鞘内施用被称为“腰部鞘内(i.t.)施用”。在一些实施方案中，将本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物鞘内施用至颈部脊髓的蛛网膜下腔中。向颈部脊髓的蛛网膜下腔内的鞘内施用被称为“颈部鞘内(i.t.)施用”。在一些实施方案中，将本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物鞘内施用至胸部脊髓的蛛网膜下腔中。向胸部脊髓的蛛网膜下腔内的鞘内施用被称为“胸部鞘内(i.t.)施用”。在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物通过脑室内注射或输注到脑室中施用。向脑室空间内的脑室内施用被称为“脑室内(i.c.v.)施用”。在一些实施方案中，使用Ommaya储库通过脑室内注射或输注施用本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物。
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物每年一次、每6个月一次、每4个月一次、每季度一次(每三个月一次)、每两个月一次(每两月一次)、每月一次或每周一次施用。在一些实施方案中，每周或以两周或三周的间隔施用本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物。在一些实施方案中，每天施用本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物。在一些实施方案中，向受试者施用一个或多个负荷剂量的本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物，随后施用一或多个维持剂量的该RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物。
在一些实施方案中，待治疗的受试者是人类或非人灵长类动物或其他哺乳动物受试者。其他示例性受试者包括家养动物，如狗和猫；牲畜，如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及诸如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠等动物。
试剂盒
在一些实施方案中，本公开提供了包含本文所述的本文RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物以及使用说明书的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含本文所述的本文RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物，以及包含该试剂盒和/或其任何组分的使用说明的包装插页。在一些实施方案中，该试剂盒在合适的容器中包含本文所述的本文RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物、一种或多种对照，以及各种缓冲液、试剂、酶和本领域公知的其他标准成分。在一些实施方案中，该容器包含至少一个小瓶、孔、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物放置于其中，并且在一些情况下，适当地等分。在提供附加组分的一些实施方案中，该试剂盒包含放置该组分的附加容器。试剂盒还可以包括用于容纳本文的RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物的装置，以及为了商业销售而严密限制的任何其他试剂。这样的容器可以包括其中保留有所需小瓶的注塑或吹塑的塑料容器。这些容器和/或试剂盒可以包括带有使用说明和/或警告的标签。
在一些实施方案中，试剂盒包含本文所述的本文RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物，以及药学上可接受的载体，或包含该RNAi寡核苷酸缀合物的药物组合物以及用于治疗有需要的受试者中与靶基因表达相关的疾病、病症或状况或延迟其进展的说明书。
在一些实施方案中，本公开提供了试剂盒，其包含本文所述的本文RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物和药学上可接受的载体，或包含该RNAi寡核苷酸缀合物的药物组合物，以及用于降低或抑制受试者中由与CNS相关的细胞群体表达的靶mRNA的表达的说明书。
在一些实施方案中，本公开提供了试剂盒，其包含本文所述的本文RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物和药学上可接受的载体，或包含该RNAi寡核苷酸缀合物的药物组合物，以及用于降低或抑制受试者中由与CNS相关的细胞群体表达的靶mRNA的表达，而在CNS外不会将靶mRNA的表达降低至相同水平的说明书。
在一些实施方案中，本公开提供了试剂盒，其包含本文所述的本文RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物和药学上可接受的载体，或包含该RNAi寡核苷酸缀合物的药物组合物，以及用于降低或抑制受试者中由与CNS相关的细胞群体表达的靶mRNA的表达，而在肝脏细胞中不会将靶mRNA的表达降低至相同水平的说明书。
在一些实施方案中，本公开提供了试剂盒，其包含本文所述的本文RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物和药学上可接受的载体，或包含该RNAi寡核苷酸缀合物的药物组合物，以及用于在受试者中降低或抑制CNS中靶mRNA的表达的说明书，其中靶mRNA与疾病或病症相关，任选地与神经疾病或病症相关。
在一些实施方案中，本公开提供了试剂盒，其包含本文所述的本文RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物和药学上可接受的载体，或包含该RNAi寡核苷酸缀合物的药物组合物，以及用于在受试者中降低或抑制CNS中靶mRNA的表达，而在CNS外不会将靶mRNA的表达降低至相同水平的说明书，其中靶mRNA与疾病或病症相关，任选地与神经疾病或病症相关。
在一些实施方案中，本公开提供了试剂盒，其包含本文所述的本文RNAi寡核苷酸缀合物或其组合物和药学上可接受的载体，或包含该RNAi寡核苷酸缀合物的药物组合物，以及用于在受试者中降低或抑制CNS中靶mRNA的表达，而在肝脏中不会将靶mRNA的表达降低至相同水平的说明书，其中靶mRNA与疾病或病症相关，任选地与神经疾病或病症相关。
其他实施方案
本公开涉及以下实施方案。在整个本节中，术语实施方案被缩写为“E”，后跟序号。例如，E1等同于实施方案1。
E1.由式I-a表示的核酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
B为核碱基或氢；
R1和R2独立地为氢、卤素、RA、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3，或者
同一碳上的R1和R2与它们的居间原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3元饱和或部分不饱和环；
每个RA独立地为任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地为氢、合适的保护基或任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环，或者：
同一原子上的两个R基团与它们的居间原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和的、部分不饱和的或杂芳基环；
LA独立地为PG1或-L-配体；
PG1为氢或合适的羟基保护基；
每个配体独立地为-(LC)n和/或金刚烷基；
每个LC独立地为包含饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；
每个-Cy-独立地为任选取代的二价环，该二价环选自亚苯基，8-10元二
环亚芳基，4-7元饱和或部分不饱和亚碳环基，4-11元饱和或部分不饱和亚螺碳环基，8-10元二环饱和或部分不饱和亚碳环基，亚金刚烷基，具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-11元饱和或部分不饱和亚螺杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的8-10元二环饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元亚杂芳基，或具
有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元二环亚杂芳基；n为1-10；
L为共价键或二价饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-NR-、-N(R)-C(O)-、-S-、
-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V1CR2W1-或代替；
m为1-50；
X1、V1和W1独立地为-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
Z为-O-、-S-、-NR-或-CR2-；且
PG2为氢、亚磷酰胺类似物或合适的保护基。
E2.E1的核酸-配体缀合物，其中所述缀合物由式I-b或I-c表示：
或其药学上可接受的盐；其中
L1为共价键或二价饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
R4为氢、RA或合适的胺保护基；且
R5为金刚烷基，或者饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
E3.由式I-Ib或I-Ic表示的核酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐；其中
B为核碱基或氢；
m为1-50；
PG1和PG2独立地为氢、亚磷酰胺类似物或合适的保护基；且
R5为金刚烷基，或者饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替。
E4.E3的核酸-配体缀合物，其中：
R5选自
E5.E4的核酸-配体缀合物，其中：R5选自
E6.包含一个或多个E1至E5中任一项的核酸-配体缀合物的寡核苷酸-配体缀合物。
E7.E6的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核酸-配体缀合物。
E8.由式II-a表示的包含一个或多个核酸-配体缀合物的寡核苷酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
B为核碱基或氢；
R1和R2独立地为氢、卤素、RA、-CN、-S(O)R、-S(O)2R、-Si(OR)2R、-Si(OR)R2或-SiR3；或者
同一碳上的R1和R2与它们的居间原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的3-7元饱和或部分不饱和环；
每个RA独立地为任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
每个R独立地为氢、合适的保护基或任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；或者
同一原子上的两个R基团与它们的居间原子一起形成具有0-3个独立地选自氮、氧、硅和硫的杂原子的4-7元饱和的、部分不饱和的或杂芳基环；
每个LC独立地为包含饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链的脂质缀合物部分，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-代替；
每个-Cy-独立地为任选取代的二价环，该二价环选自亚苯基，8-10元二环亚芳基，4-7元饱和或部分不饱和亚碳环基，4-11元饱和或部分不饱和亚螺碳环基，8-10元二环饱和或部分不饱和亚碳环基，具有1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-11元饱和或部分不饱和亚螺杂环基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的8-10元二环饱和或部分不饱和亚杂环基，具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元亚杂芳基，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元二环亚杂芳基；
n为1-10；
L为共价键或二价饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V1CR2W1-或代替；
m为1-50；
X1、V1和W1独立地为-C(R)2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-；
Y为氢、合适的羟基保护基、
R3为氢、合适的保护基、合适的前药或任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环；
X2为O、S或NR；
X3为-O-、-S-、-BH2-或共价键；
Y1为与核苷、核苷酸或寡核苷酸的2’-或3’-末端附接的连接基团；
Y2为氢，合适的保护基，亚磷酰胺类似物，与核苷、核苷酸或寡核苷酸的5’-末端附接的核苷酸间连接基团，或与固相支持体附接的连接基团；且
Z为-O-、-S-、-NR-或-CR2-。
E9.E8的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物由式II-b或II-c表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
L1为共价键、单价或二价饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或代替；
R4为氢、RA或合适的胺保护基；且
R5为金刚烷基，或者饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR代替。
E10.E9的寡核苷酸-配体缀合物，其中：
R5选自
E11.E9的寡核苷酸-配体缀合物，其中：
R5选自
E12.由式II-Ib或II-Ic表示的寡核苷酸-配体缀合物：
或其药学上可接受的盐；其中
B为核碱基或氢；
m为1-50；
X1为-O-或-S-；
Y为氢、/>
R3为氢或合适的保护基；
X2为O或S；
X3为-O-、-S-或共价键；
Y1为与核苷、核苷酸或寡核苷酸的2’-或3’-末端附接的连接基团；
Y2为氢，亚磷酰胺类似物，与核苷、核苷酸或寡核苷酸的5’-末端附接的核苷酸间连接基团，或与固相支持体附接的连接基团；
R5为金刚烷基，或者饱和或不饱和的直链或支链C1-50烃链，其中该烃链的0-10个亚甲基单元独立地被-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-代替；且
R为氢、合适的保护基或任选取代的基团，该任选取代的基团选自C1-6脂族基团，苯基，具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元饱和或部分不饱和杂环，以及具有1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-6元杂芳基环。
E13.E12的寡核苷酸-配体缀合物，其中：
R5选自
E14.E8-E13中任一项的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物包含1-10个核酸-配体缀合物单元。
E15.E8-E13中任一项的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述缀合物包含1、2或3个核酸-配体缀合物单元。
E16.E6-E15中任一项的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸包含长度为10-53个核苷酸的有义链和长度为15-53个核苷酸的反义链，其中所述反义寡核苷酸链具有与靶基因序列的至少15个连续核苷酸互补的序列，并且当将所述寡核苷酸缀合物引入哺乳动物细胞中时，降低基因表达。
E17.E16的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述核酸-配体缀合物单元存在于有义链中。
E18.E16的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述反义链的长度为19至27个核苷酸。
E19.E16的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述有义链的长度为12至40个核苷酸。
E20.E16-E19中任一项的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域。
E21.E16的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述互补区域与靶序列完全互补。
E22.E16至E21中任一项的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述有义链在其3’-端包含如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环。
E23.E22的寡核苷酸-配体缀合物，其中L为四环。
E24.E22的寡核苷酸-配体缀合物，其中L包含表示为GAAA的序列。
E25.E16至E24中任一项的寡核苷酸-配体缀合物，其进一步在反义链上包含长度为两个核苷酸的3’-突出端序列。
E26.E16至E24中任一项的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸进一步包含长度为一个或多个核苷酸的3’-突出端序列，其中所述3’-突出端序列存在于反义链上，有义链上，或反义链和有义链上。
E27.E16至E26中任一项的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。
E28.E27的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述经修饰的核苷酸包含2’-修饰。
E29.E28的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述2’-修饰是选自2’-氨基乙基、2’-氟代、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-脱氧-2’-氟代和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖基的修饰。
E30.E16至E26中任一项的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸均被修饰。
E31.E16至E30中任一项的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键合。
E32.E31的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述至少一个经修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。
E33.E16至E30中任一项的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述反义链的5’-核苷酸的糖的4’-碳包含磷酸酯类似物。
E34.E33的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。
E35.包含E16-E34中任一项的寡核苷酸-配体缀合物和辅料的组合物。
E36.将寡核苷酸-配体缀合物递送至受试者的方法，该方法包括向受试者施用E35的组合物。
E37.E16-E34中任一项的寡核苷酸-配体缀合物，其用于降低靶基因的表达。
E38.E37的寡核苷酸-配体缀合物，其中靶基因在CNS中表达。
E39.E38的寡核苷酸-配体缀合物，其中靶基因与疾病或病症相关，任选地与神经疾病或病症相关。
E40.E39的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述疾病或病症选自进行性核上麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、嗜银颗粒病(AGD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、衰老相关的tau星形神经胶质病(ARTAG)、家族性额颞叶痴呆17(FTD-17)、Tau蛋白病伴呼吸衰竭、痴呆伴癫痫、皮克病、强直性肌营养不良1或2(MD1或MD2)、唐氏综合征、痉挛性截瘫(SP)、C型Niemann-Pick病、路易体痴呆(DLB)、路易体吞咽困难、路易体病、橄榄体脑桥小脑萎缩、纹状体黑质变性、Shy-Drager综合征、脊髓性肌萎缩V(SMAV)、亨廷顿病(HD)、阿尔茨海默病、SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA10(1、2、3、7或103型脊髓小脑共济失调)、多系统萎缩(MSA)、脊髓和延髓肌肉萎缩(SBMA，肯尼迪病)、Friedrich共济失调、脆性X相关震颤/共济失调综合征(FXTAS)、脆性X综合征(FRAXA)、X连锁精神发育迟滞(XLMR)、帕金森病、张力障碍、SBMA(脊髓延髓肌萎缩)、神经性疼痛病症、脊髓损伤、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(DRPLA)、隐性CNS病症和ALS(肌萎缩侧索硬化)、M2DS(MECP2重复综合征)、FTD(额颞叶痴呆)、朊病毒病、成年发作型脑白质营养不良、Alexander病、Krabbe病、慢性创伤性脑病、Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)、Lafora病、卒中、脑淀粉样血管病(CAA)和异染性脑白质营养不良(MLD)。
定义
如本文所用的，“大约”或“约”当应用于一个或多个感兴趣的值时，是指与规定的参考值类似的值。在某些实施方案中，“约”是指落入规定参考值在任一方向上(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少之内的值范围，除非另有说明或从上下文中可以明显看出(该数字超过可能值的100％的情况除外)。
如本文所用的，“施用”、“给药”及类似用语是指以药理学上有用(例如，治疗受试者的状况)的方式向受试者提供物质(例如，RNAi寡核苷酸缀合物)。
如本文所用的，“脱唾液酸糖蛋白受体”或“ASGPR”是指由48kDa大亚基(ASGPR-1)和40kDa小亚基(ASGPR-2)形成的二分C型凝集素。ASGPR主要在肝细胞的肝窦表面表达，并且在结合、内化及随后清除含有末端半乳糖或GalNAc残基的循环糖蛋白(脱唾液酸糖蛋白)方面起主要作用。
如本文所用的，“减弱”、“减轻”及类似用语是指降低或有效阻止。作为非限制性实例，本文的一种或多种治疗可以降低或有效阻止受试者中与靶基因表达相关的疾病(例如，神经疾病或病症)的发作或进展。这种减弱可以通过以下事实来例证：例如，与靶基因表达相关的疾病的一个或多个方面(例如，症状，组织特征，以及细胞活性、炎症活性或免疫活性，等等)降低，该疾病的一个或多个方面没有可检测到的进展(恶化)，或者在受试者中没有可检测到的该疾病的方面(而这些方面本来预期是可检测到的)。
如本文所用的，“互补”是指两个核苷酸之间(例如，在两个相对的核酸上或在单条核酸链的相对区域上)的结构关系，其允许这两个核苷酸彼此形成碱基对。例如，与相对核酸的嘧啶核苷酸互补的一个核酸的嘌呤核苷酸可以通过彼此形成氢键而碱基配对在一起。在一些实施方案中，互补的核苷酸可以以Watson-Crick方式或以允许形成稳定双链体的任何其他方式碱基配对。在一些实施方案中，两个核酸可具有彼此互补的多个核苷酸的区域以形成互补区域，如本文所述。
如本文所用的，“CNS mRNA”和“CNS基因”是指由中枢神经系统的细胞或组织中的基因编码/表达的任何基因、mRNA和/或蛋白质。
如本文所用的，“脱氧核糖核苷酸”是指与核糖核苷酸相比，在其戊糖的2’位置处具有氢而不是羟基的核苷酸。经修饰的脱氧核糖核苷酸是具有除2’位置以外的原子的一个或多个修饰或取代的脱氧核糖核苷酸，包括糖、磷酸基团或碱基的修饰或取代，或者它们之中的修饰或取代。
如本文所用的，“双链寡核苷酸”或“ds寡核苷酸”是指基本上呈双链体形式的寡核苷酸。在一些实施方案中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对在共价分离的核酸链的反向平行核苷酸序列之间形成。在一些实施方案中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对在共价连接的核酸链的反向平行核苷酸序列之间形成。在一些实施方案中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对由折叠(例如，通过发夹)的单核酸链形成，以提供碱基配对在一起的互补反向平行核苷酸序列。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含彼此完全形成双链体的两条共价分离的核酸链。然而，在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分形成双链体的两条共价分离的核酸链(例如，在一端或两端具有突出端)。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分互补的反向平行核苷酸序列，因此可以具有一个或多个错配，其可以包括内部错配或末端错配。
如本文所用的，关于核酸(例如，寡核苷酸)的“双链体”是指通过两个反向平行的核苷酸序列的互补碱基配对形成的结构。
如本文所用的，“辅料”是指可包含在组合物中的非治疗剂，例如，以提供或有助于所需的稠度或稳定效果。
如本文所用的，“不稳定的连接体”是指可被切割(例如，通过酸性pH)的连接体。“相当稳定的连接体”是指不能被切割的连接体。
如本文所用的，“环”是指核酸(例如，寡核苷酸)的未配对区域，其侧翼为该核酸的两个反向平行区域，这两个区域彼此充分互补，使得在适当的杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中，在细胞中)，位于未配对区域侧翼的两个反向平行区域杂交形成双链体(称为“茎”)。
如本文所用的，“经修饰的核苷酸间键合”是指与包含磷酸二酯键的参考核苷酸间键合相比，具有一个或多个化学修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸是非天然存在的键合。通常，经修饰的核苷酸间键合赋予其中存在该经修饰的核苷酸间键合的核酸一种或多种期望的性质。例如，经修饰的核苷酸可以改善热稳定性、降解抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所用的，“经修饰的核苷酸”是指与选自腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的相应参考核苷酸相比，具有一个或多个化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸在其糖、核碱基和/或磷酸基团中具有一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有与相应的参考核苷酸缀合的一个或多个化学部分。通常，经修饰的核苷酸赋予其中存在该经修饰的核苷酸的核酸一种或多种期望的性质。例如，经修饰的核苷酸可以改善热稳定性、降解抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所用的，“带缺口的(nicked)四环结构”是指RNAi寡核苷酸(例如，包含RNAi寡核苷酸缀合物)的结构，其特征在于单独的有义(过客)链和反义(指导)链，其中有义链具有与反义链互补的互补区域，并且其中至少一条链，通常是有义链，具有被配置为稳定在该至少一条链内形成的相邻茎区的四环。
如本文所用的，“寡核苷酸”是指短核酸(例如，长度短于约100个核苷酸)。寡核苷酸可以是单链的(ss)或ds。寡核苷酸可以具有或不具有双链体区域。作为一组非限制性实例，寡核苷酸可以是但不限于小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、切酶底物干扰RNA(dsiRNA)、反义寡核苷酸、短siRNA或单链siRNA。在一些实施方案中，双链寡核苷酸是RNAi寡核苷酸。
如本文所用的，“突出端”是指末端非碱基配对核苷酸，其由一个链或区域延伸超出与该一个链或区域形成双链体的互补链的末端而产生。在一些实施方案中，突出端包含从双链寡核苷酸的5’末端或3’末端处的双链体区域延伸的一个或多个未配对的核苷酸。在某些实施方案中，突出端是双链寡核苷酸的反义链或有义链上的3’或5’突出端。
如本文所用的，“磷酸酯类似物”是指模拟磷酸酯基团的静电和/或空间性质的化学部分。在一些实施方案中，磷酸酯类似物位于寡核苷酸的5’末端核苷酸处，而不是通常容易被酶促去除的5’-磷酸酯。在一些实施方案中，5’磷酸酯类似物含有磷酸酶抗性连接。磷酸酯类似物的实例包括但不限于5’膦酸酯，如5’亚甲基膦酸酯(5’-MP)和5’-(E)-乙烯基膦酸酯(5’-VP)。在一些实施方案中，寡核苷酸在5’-末端核苷酸处的糖的4’-碳位置处具有磷酸酯类似物(称为“4’-磷酸酯类似物”)。4’-磷酸酯类似物的实例是氧基甲基膦酸酯，其中氧基甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4’-碳处)或其类似物。参见，例如，第62/383,207号美国临时专利申请(2016年9月2日提交)和第62/393,401号美国临时专利申请(2016年9月12日提交)。已经针对寡核苷酸的5’端开发了其他修饰(参见，例如，第WO 2011/133871号国际专利申请；第8,927,513号美国专利；和Prakash等人(2015)NUCLEIC ACIDSRES.43:2993-3011)。
如本文所用的，靶基因的“表达降低”是指RNA转录物(例如，靶mRNA)或由靶基因编码的蛋白质的量或水平的降低，和/或与适当的参考(例如，参考细胞、细胞群体、样品或受试者)相比，细胞、细胞群体、样品或受试者中该基因的活性量或水平的降低。例如，与未用双链寡核苷酸处理的细胞相比，使细胞与本文的寡核苷酸或缀合物(例如，包含反义链的RNAi寡核苷酸缀合物，该反义链具有与包含靶mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列)接触的行为可以导致靶mRNA、由靶基因编码的蛋白质和/或靶基因活性的量或水平降低(例如，通过RNAi途径对靶mRNA的失活和/或降解)。类似地，并且如本文所用的，“降低表达”是指导致靶基因的表达降低的行为。
如本文所用的，“靶基因表达的降低”是指与适当的参考(例如，参考细胞、细胞群体、样品或受试者)相比，细胞、细胞群体、样品或受试者中靶mRNA、由靶基因编码的蛋白质和/或靶基因活性的量或水平的降低。
如本文所用的，“互补区域”是指核酸(例如，本文所述的双链寡核苷酸或RNAi寡核苷酸缀合物)的核苷酸序列，其与反向平行核苷酸序列充分互补，以允许这两个核苷酸序列在适当的杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中、在细胞中等)杂交。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含具有与mRNA靶序列互补的互补区域的靶向序列。
如本文所用的，“核糖核苷酸”是指具有核糖作为其戊糖的核苷酸，其在其2’位置处含有羟基。经修饰的核糖核苷酸是具有除2’位置以外的原子的一个或多个修饰或取代的核糖核苷酸，包括核糖、磷酸基团或碱基的修饰或取代，或者它们之中的修饰或取代。
如本文所用的，“RNAi寡核苷酸”是指(a)具有有义(过客)链和反义(指导)链的双链寡核苷酸，其中反义链或反义链的一部分被Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶在靶mRNA(例如，在CNS中表达的靶mRNA)的切割中使用，或者(b)具有单反义链的单链寡核苷酸，其中该反义链(或该反义链的一部分)被Ago2核酸内切酶在靶mRNA(例如，在CNS中表达的靶mRNA)的切割中使用。
如本文所用的，“链”是指通过核苷酸间键合(例如，磷酸二酯键或硫代磷酸酯键)连接在一起的单个、连续的核苷酸序列。在一些实施方案中，链具有两个游离端(例如，5’端和3’端)。
如本文所用的，“受试者”是指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人。在一个实施方案中，受试者是人或NHP。此外，“个体”或“患者”可以与“受试者”互换使用。
如本文所用的，“合成的”是指(例如，使用机器(例如，固态核酸合成仪))人工合成的或另外并非源自通常产生该分子的天然来源(例如，细胞或生物体)的核酸或其他分子。
如本文所用的，“靶向配体”是指这样的分子(例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质)：其选择性地结合感兴趣的组织或细胞的同源分子(例如，受体)，并且可与另一种物质缀合以便将该另一种物质靶向感兴趣的组织或细胞。例如，在一些实施方案中，靶向配体可以与寡核苷酸缀合，以便将该寡核苷酸靶向特定感兴趣的组织或细胞。在一些实施方案中，靶向配体选择性地结合细胞表面受体。因此，在一些实施方案中，当靶向配体与寡核苷酸缀合时，通过与细胞表面上表达的受体的选择性结合和细胞对包含该寡核苷酸、靶向配体和受体的复合物的内体内化，促进该寡核苷酸向特定细胞中的递送。在一些实施方案中，靶向配体经由连接体与寡核苷酸缀合，该连接体在细胞内化之后或期间被切割，使得该寡核苷酸在细胞中从靶向配体上释放。
如本文所用的，“四环”是指增加通过核苷酸侧翼序列杂交形成的相邻双链体的稳定性的环。稳定性的增加可检测为相邻茎双链体的解链温度(Tm)的增加，该Tm高于由随机选择的核苷酸序列组成的一组相当长度的环平均预期的相邻茎双链体的Tm。例如，四环可以赋予包含长度至少为2个碱基对(bp)的双链体的发夹在10mM NaHPO4中至少约50℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约58℃、至少约60℃、至少约65℃或至少约75℃的Tm。在一些实施方案中，四环可以通过堆积相互作用稳定相邻茎双链体中的bp。另外，四环中核苷酸之间的相互作用包括但不限于非Watson-Crick碱基配对、堆积相互作用、氢键键合和接触相互作用(Cheong等人(1990)Nature346:680-682；Heus&Pardi(1991)SCIENCE 253:191-94)。在一些实施方案中，四环包含3至6个核苷酸或由3至6个核苷酸组成，并且通常为4至5个核苷酸。在某些实施方案中，四环包含3、4、5或6个核苷酸或由3、4、5或6个核苷酸组成，其可以被修饰或可以未被修饰(例如，其可以与靶向部分缀合或可以不与靶向部分缀合)。在一个实施方案中，四环由4个核苷酸组成。任何核苷酸都可以在四环中使用，并且此类核苷酸的标准IUPAC-IUB符号可以如Cornish-Bowden(1985)NUCLEIC ACIDS RES.13:3021-30中所述使用。例如，字母“N”可以用来表示任何碱基可以在该位置，字母“R”可以用来表示A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)可以在该位置，而“B”可以用来表示C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)、T(胸腺嘧啶)或U(尿嘧啶)可以在该位置。四环的实例包括UNCG家族的四环(例如，UUCG)、GNRA家族的四环(例如，GAAA)和CUUG四环(Woese等人(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87:8467-71；Antao等人(1991)NUCLEIC ACIDS RES.19:5901-05)。DNA四环的实例包括d(GNNA)家族的四环(例如，d(GTTA))、d(GNRA)家族的四环、d(GNAB)家族的四环、d(CNNG)家族的四环和d(TNCG)家族的四环(例如，d(TTCG))。参见，例如，Nakano等人(2002)BIOCHEM.41:4281-92；Shinji等人(2000)NIPPON KAGAKKAI KOEN YOKOSHU 78:731。在一些实施方案中，四环被包含在带缺口的四环结构内。
如本文所用的，“治疗”或“处理”是指向有需要的受试者提供医护的行为，例如，通过向受试者施用治疗剂(例如，本文的RNAi寡核苷酸缀合物)，以供改善受试者关于现有状况(例如，疾病、病症)的健康和/或福祉，或者预防或降低发生状况的可能性。在一些实施方案中，治疗涉及降低受试者所经历的状况(例如，疾病、病症)的至少一种体征、症状或促成因素的频率或严重性。
实施例
为了可以更充分地理解本文描述的发明，给出以下实施例。提供本申请中描述的实施例是为了说明本文提供的方法、组合物和系统，而不应以任何方式解释为限制其范围。
缩写
Ac：乙酰基
AcOH：乙酸
ACN：乙腈
Ad：金刚烷基
AIBN：2,2’-偶氮二异丁腈
Anhyd：无水的
Aq：水性
B2Pin2：双(频那醇)二硼-4,4,4’,4’,5,5,5’,5’-八甲基-2,2’-双(1,3,2-二氧硼杂环戊烷)
BINAP：2,2’-双(二苯基膦基)-1,1’-联萘
BH3：硼烷
Bn：苄基
Boc：叔丁氧羰基
Boc2O：二碳酸二叔丁酯
BPO：过氧化苯甲酰
nBuOH：正丁醇
CDI：羰基二咪唑
COD：环辛二烯
d：天
DABCO：1,4-重氮双环[2.2.2]辛烷
DAST：二乙基氨基三氟化硫
dba：二亚苄基丙酮
DBU：1,8-重氮双环[5.4.0]十一碳-7-烯
DCE：1,2-二氯乙烷
DCM：二氯甲烷
DEA：二乙胺
DHP：二氢吡喃
DIBAL-H：二异丁基氢化铝
DIPA：二异丙胺
DIPEA或DIEA：N,N-二异丙基乙胺
DMA：N,N-二甲基乙酰胺
DME：1,2-二甲氧基乙烷
DMAP：4-二甲基氨基吡啶
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DMP：戴斯-马丁氧化剂
DMSO-二甲亚砜
DMTr：4,4’-二甲氧基三苯甲基
DPPA：二苯基磷酰基叠氮化物
dppf：1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁
EDC或EDCI：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
ee：对映体过量
ESI：电喷雾电离
EA：乙酸乙酯
EtOAc：乙酸乙酯
EtOH：乙醇
FA：甲酸
h或hr：小时
HATU：N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐
HCl：盐酸
HPLC：高效液相色谱法
HOAc：乙酸
IBX：2-碘酰基苯甲酸
IPA：异丙醇
KHMDS：六甲基二硅氮化钾
K2CO3：碳酸钾
LAH：氢化铝锂
LDA：二异丙基氨基锂
L-DBTA：二苯甲酰基-L-酒石酸
m-CPBA：间氯过氧苯甲酸
M：摩尔浓度
MeCN：乙腈
MeOH：甲醇
Me2S：二甲硫醚
MeONa：甲醇钠
Mel：碘甲烷
min：分钟
mL：毫升
mM：毫摩尔浓度
mmol：毫摩尔
MPa：兆帕斯卡
MOMCl：甲基氯甲醚
MsCl：甲磺酰氯
MTBE：甲基叔丁基醚
nBuLi：正丁基锂
NaNO2：亚硝酸钠
NaOH：氢氧化钠
Na2SO4：硫酸钠
NBS：N-溴代琥珀酰亚胺
NCS：N-氯代琥珀酰亚胺
NFSI：N-氟代苯磺酰亚胺
NMO：N-甲基吗啉N-氧化物
NMP：N-甲基吡咯烷
NMR：核磁共振
℃：摄氏度
Pd/C：碳载钯
Pd(OAc)2：乙酸钯
PBS：磷酸盐缓冲盐水
PE：石油醚
POCl3：三氯氧磷
PPh3：三苯基膦
PyBOP：(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐Rel：相对
R.T.或rt：室温
s或sec：秒
sat：饱和的SEMCl：氯甲基-2-三甲基甲硅烷基乙基醚SFC：超临界流体色谱法
SOCl2：二氯化硫
tBuOK：叔丁醇钾
TBAB：四丁基溴化铵
TBAF：四丁基氟化铵
TBAI：四丁基碘化铵
TEA：三乙胺
Tf：三氟甲磺酸盐
TfAA、TFMSA或Tf2O：三氟甲磺酸酐
TFA：三氟乙酸
TIBSCl：2,4,6-三异丙基苯磺酰氯
TIPS：三异丙基甲硅烷基
THF：四氢呋喃
THP：四氢吡喃
TLC：薄层色谱法
TMEDA：四甲基乙二胺
pTSA：对甲苯磺酸
UPLC：超高效液相色谱法
wt：重量
Xantphos：4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基氧杂蒽
一般合成方法
以下实施例旨在说明本公开，而不应解释为对其进行限制。温度以摄氏度(℃)给出。如果没有另外提及，则所有蒸发均在减压下进行，优选在约15mmHg至100mmHg(＝20-133mbar)之间。最终产品、中间体和起始材料的结构通过标准分析方法确认，例如微量分析和光谱特征，例如MS、IR、NMR。所使用的缩写是本领域常规的缩写。
用于合成本公开的核酸或其类似物的所有起始材料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂都是可商购获得的或者可以通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法产生(METHODS OF ORGANIC SYNTHESIS,Thieme,第21卷(Houben-Weyl第4版.1952))。此外，本公开的核酸或其类似物可以通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法产生，如以下实施例所示。
除非另有说明，否则所有反应均在氮气或氩气下进行。
质子NMR(1H NMR)在氘化溶剂中进行。在本文公开的某些核酸或其类似物中，一个或多个1H位移与残余proteo溶剂信号重叠；这些信号在下文提供的实验中尚未报告。
如以下实施例中所述，在某些示例性实施方案中，按照以下一般程序制备核酸或其类似物。应当理解，虽然一般方法描述了本公开的某些核酸或其类似物的合成，但是以下一般方法以及本领域普通技术人员已知的其他方法可以应用于所有核酸或其类似物以及这些核酸或其类似物中每一种的亚类和种类，如本文所述。
双链RNAi寡核苷酸的一般制备方法
寡核苷酸合成和纯化
以下实施例中描述的双链RNAi(dsRNA)寡核苷酸使用本文所述的方法来化学合成。一般而言，除了使用已知的亚磷酰胺合成(参见，例如，Hughes和Ellington(2017)COLDSPRING HARB PERSPECT BIOL.9(1):a023812；Beaucage S.L.,Caruthers M.H.STUDIES ONNUCLEOTIDE CHEMISTRY V:Deoxynucleoside Phosphoramidites—A New Class of KeyIntermediates for Deoxypolynucleotide Synthesis.TETRAHEDRON LETT.1981；22:1859–1862.doi:10.1016/S0040-4039(01)90461-7)之外，还使用针对19-23聚体siRNA描述的固相寡核苷酸合成方法(参见，例如，Scaringe等人(1990)NUCLEIC ACIDS RES.18:5433-5441和Usman等人(1987)J.AM.CHEM.Soc.109:7845-7845；另见，第5,804,683、5,831,071、5,998,203、6,008,400、6,111,086、6,117,657、6,353,098、6,362,323、6,437,117和6,469,158号美国专利)合成dsRNAi寡核苷酸。
按照标准方法(Integrated DNA Technologies；Coralville，IA)合成各条RNA链并进行HPLC纯化。例如，使用固相亚磷酰胺化学法合成RNA寡核苷酸，使用标准技术(Damha&Olgivie(1993)METHODS MOL.BIOL.20:81-114；Wincott等人(1995)NUCLEIC ACIDSRES.23:2677-2684)在NAP-5柱(Amersham Pharmacia Biotech；Piscataway，NJ)上脱保护并脱盐。使用离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)在Amersham Source 15Q柱(1.0cm×25cm；Amersham Pharmacia Biotech)上使用15min步进线性梯度纯化寡聚体。梯度从90:10缓冲液A:B到52:48缓冲液A:B变化，其中缓冲液A为100mM Tris pH 8.5，而缓冲液B为100mMTris pH 8.5，1M NaCl。在260nm处监测样品，并且将对应于全长寡核苷酸种类的峰收集、合并、在NAP-5柱上脱盐并冻干。
在Beckman PACE 5000(Beckman Coulter,Inc.；Fullerton，CA)上通过毛细管电泳(CE)测定每种寡聚体的纯度。CE毛细管的内径为100μm，并含有ssDNA 100R Gel(Beckman-Coulter))。通常，将约0.6nmol的寡核苷酸注入毛细管中，在444V/cm的电场中运行，并根据260nm处的UV吸光度进行检测。变性Tris-硼酸盐-7M-尿素电泳缓冲液购自Beckman-Coulter。获得了寡核糖核苷酸，经CE评估其纯度至少为90％，用于以下描述的实验中。在Voyager DETMBiospectometry Work Station(Applied Biosystems；Foster City，CA)上，按照制造商推荐的方案，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法验证化合物身份。获得了所有寡聚体的相对分子质量，通常在预期分子质量的0.2％以内。
双链体的制备
将单链RNA寡聚体重悬(例如，以100μM浓度)于由100mM乙酸钾、30mM HEPES组成的双链体缓冲液(pH 7.5)中。将互补的有义链和反义链以等摩尔量混合，以产生例如50μM双链体的最终溶液。将样品在RNA缓冲液(IDT)中加热至100℃持续5’，并在使用前冷却至室温。dsRNA寡核苷酸于-20℃储存。单链RNA寡聚体冻干储存或于-80℃储存在无核酸酶水中。
实施例1：2-(2-((((6aR,8R,9R,9aR)-8-(6-6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2,2,4,4-四异丙基四氢-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧杂二硅杂八环-9-基)氧基)甲氧基)乙氧基)乙烷-1-铵甲酸盐(1-6)的合成
在10℃下用吡啶(11mL，134.67mmol)和四异丙基二硅氧烷二氯化物(22.63mL，70.75mmol)处理化合物1-1(25.00g，67.38mmol)在20mL DMF中的溶液。将所得混合物在25℃搅拌3h并用20％柠檬酸(50mL)猝灭。用EtOAc(3X50 mL)萃取水层并将合并的有机层真空浓缩。将粗残余物从MTBE和正庚烷的混合物(1:15，320mL)中重结晶，得到呈白色油状固体的化合物1-2(37.20g，90％)。
用AcOH(20mL，317.20mmol)和Ac2O(15mL，156.68mmol)处理化合物1-2(37.00g，60.33mmol)在20mL DMSO中的溶液。将混合物在25℃搅拌15h。将反应用EtOAc(100mL)稀释并用饱和K2CO3(50mL)猝灭。用EtOAc(3X50 mL)萃取水层。将合并的有机层浓缩并用ACN(30mL)重结晶，得到呈白色固体的化合物1-3(15.65g，38.4％)。
在25℃下用Fmoc-氨基-乙氧基乙醇(11.67g，35.66mmol)处理化合物1-3(20.00g，29.72mmol)在120mL DCM中的溶液。搅拌该混合物得到澄清溶液，然后用分子筛(20.0g)、N-碘代琥珀酰亚胺(8.02g，35.66mmol)和TfOH(5.25mL，59.44mmol)处理。将混合物在30℃搅拌直至HPLC分析表明化合物1-3的消耗>95％。用TEA(6mL)猝灭反应并过滤。将滤液用EtOAc稀释，用饱和NaHCO3(2X100mL)、饱和Na2SO3(2X100mL)和水(2X100mL)洗涤，并真空浓缩，得到呈黄色固体的粗化合物1-4(26.34g，93.9％)，其直接用于下一步骤而无需进一步纯化。
在5℃下用DBU(7.00mL，45.08mmol)处理化合物1-4(26.34g，27.62mmol)在DCM/水的混合物(10:7，170mL)中的溶液。将混合物在5-25℃搅拌1h。然后分离有机层，用水(100mL)洗涤，并用DCM(130mL)稀释。将溶液用富马酸(7.05g，60.76mmol)和分子筛(26.34g)分四份处理。将混合物搅拌1h，浓缩，并从MTBE和DCM(5:1)的混合物中重结晶，得到呈白色固体的化合物1-6(14.74g，62.9％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)8.73(s,1H),8.58(s,1H),8.15-8.02(m,2H),7.65-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),6.52(s,2H),6.15(s,1H),5.08-4.90(m,3H),4.83-4.78(m,1H),4.15-3.90(m,3H),3.79-3.65(m,2H),2.98-2.85(m,6H),1.20-0.95(m,28H)。
实施例2：(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((2-(2-[脂质]-酰胺基乙氧基)乙氧基)甲氧基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(2-4a至2-4e)的合成
将化合物1-6(50.00g，59.01mmol)在150mL 2-甲基四氢呋喃中的溶液用冰冷的K2HPO4水溶液(6％，100mL)和盐水(20％，2X100 mL)洗涤。分离有机层，并在0℃下用己酸(10.33mL，82.61mmol)、HATU(33.66g，88.52mmol)和DMAP(10.81g，147.52mmol)处理。将所得混合物升温至25℃并搅拌1h。将溶液用水(2X100mL)、盐水(100mL)洗涤，并真空浓缩，得到粗残余物。硅胶急骤色谱法(1:1己烷/丙酮)得到呈白色固体的化合物2-1a(34.95g，71.5％)。
在10℃下用三乙胺三氟化氢(20.61mL，126.58mmol)逐滴处理化合物2-1a(34.95g，42.19mmol)和TEA(9.28mL，126.58mmol)在80mL THF中的混合物。将混合物升温至25℃并搅拌2h。将反应浓缩，溶解在DCM(100mL)中，并用饱和NaHCO3(5X20 mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机层真空浓缩，得到粗化合物2-2a(24.72g，99％)，其直接用于下一步骤而无需进一步纯化。
用N-甲基吗啉(18.54mL，168.67mmol)和DMTr-Cl(15.69g，46.38mmol)处理化合物2-2a(24.72g，42.18mmol)在50mL DCM中的溶液。将混合物在25℃搅拌2h并用饱和NaHCO3(50mL)猝灭。分离有机层，用水洗涤，浓缩，得到浆状粗品。硅胶急骤色谱法(1:1己烷/丙酮)得到呈白色固体的化合物2-3a(30.05g，33.8mmol，79.9％)。
在氮气氛下，用N-甲基吗啉(3.10mL，28.17mmol)和四唑(0.67mL，14.09mmol)处理化合物2-3a(25.00g，28.17mmol)在50mL DCM中的溶液。将双(二异丙基氨基)氯膦(9.02g，33.80mmol)逐滴添加至该溶液中，并将所得混合物在25℃搅拌4h。用水(15mL)猝灭反应，并用DCM(3X50 mL)萃取水层。将合并的有机层用饱和NaHCO3(50mL)洗涤，浓缩，得到粗固体，将其从DCM/MTBE/正己烷(1:4:40)的混合物中重结晶，得到呈白色固体的化合物2-4a(25.52g，83.4％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.25(s,1H),8.65-8.60(m,2H),8.09-8.02(m,2H),7.71(s,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.85-6.79(m,4H),6.23-6.20(m,1H),5.23-5.14(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.33-4.23(m,2H),3.90-3.78(m,1H),3.75(s,6H),3.74-3.52(m,3H),3.50-3.20(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.82-2.80(m,1H),2.65-2.60(m,1H),2.05-1.96(m,2H),1.50-1.39(m,2H),1.31-1.10(m,14H),1.08-1.05(m,2H),0.85-0.79(m,3H)；31PNMR(162MHz,d6-DMSO)149.43,149.18。
使用与以上针对化合物2-4a所述类似的程序制备化合物2-4b、2-4c、2-4d和2-4e。获得呈白色固体的化合物2-4b(25.50g，85.4％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.23(s,1H),8.65-8.60(m,2H),8.05-8.02(m,2H),7.73-7.70(m,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.89-6.80(m,4H),6.21-6.15(m,1H),5.23-5.17(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.40-4.21(m,2H),3.91-3.80(m,1H),3.74(s,6H),3.74-3.52(m,3H),3.50-3.20(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.83-2.79(m,1H),2.68-2.62(m,1H),2.05-1.97(m,2H),1.50-1.38(m,2H),1.31-1.10(m,18H),1.08-1.05(m,2H),0.85-0.78(m,3H)；31P NMR(162MHz,d6-DMSO)149.43,149.19。
获得呈灰白色固体的化合物2-4c(36.60g，66.3％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.22(s,1H),8.64-8.59(m,2H),8.05-8.00(m,2H),7.73-7.70(m,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.89-6.80(m,4H),6.21-6.15(m,1H),5.25-5.17(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.40-4.21(m,2H),3.91-3.80(m,1H),3.74(s,6H),3.74-3.50(m,3H),3.50-3.20(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.83-2.79(m,1H),2.68-2.62(m,1H),2.05-1.99(m,2H),1.50-1.38(m,2H),1.33-1.12(m,38H),1.08-1.05(m,2H),0.86-0.80(m,3H)；31P NMR(162MHz,d6-DMSO)149.42,149.17。
获得呈灰白色固体的化合物2-4d(26.60g，72.9％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.22(s,1H),8.64-8.59(m,2H),8.05-8.00(m,2H),7.73-7.70(m,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.33(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.89-6.80(m,4H),6.21-6.15(m,1H),5.22-5.17(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.40-4.21(m,2H),3.91-3.80(m,1H),3.74(s,6H),3.74-3.52(m,3H),3.50-3.20(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.83-2.79(m,1H),2.68-2.62(m,1H),2.05-1.99(m,2H),1.50-1.38(m,2H),1.35-1.08(m,38H),1.08-1.05(m,2H),0.85-0.79(m,3H)；31P NMR(162MHz,d6-DMSO)149.47,149.22。
获得呈白色固体的化合物2-4e(38.10g，54.0％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.21(s,1H),8.64-8.59(m,2H),8.05-8.00(m,2H),7.73-7.70(m,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.89-6.80(m,4H),6.21-6.15(m,1H),5.23-5.17(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.40-4.21(m,2H),3.91-3.80(m,1H),3.73(s,6H),3.74-3.52(m,3H),3.47-3.22(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.83-2.79(m,1H),2.68-2.62(m,1H),2.05-1.99(m,2H),1.50-1.38(m,2H),1.35-1.06(m,46H),1.08-1.06(m,2H),0.85-0.77(m,3H)；31P NMR(162MHz,d6-DMSO)149.41,149.15。
实施例3.GalXC RNAi寡核苷酸-脂质缀合物的合成
方案1.具有与四环缀合的单脂质(线性和分支的)的GalXC RNAi寡核苷酸-脂质缀合物的合成。通过酰胺偶联反应实现合成后缀合。
R1COOH基团代表脂肪酸C8:0、C10:0、C11:0、C12:0、C14:0、C16:0、C17:0、C18:0、C18:1、C18:2、C22:5、C22:0、C24:0、C26:0、C22:6、C24:1、二酰基C16:0或二酰基C18:1
通过固相合成制备合成有义1和反义1。
缀合的有义1a-1i的合成。
缀合的有义1a通过合成后缀合方法合成。在Eppendorf管1中，在室温下用HATU(1.52mg，4umol)处理辛酸(0.58mg，4umol)在DMA(0.75mL)中的溶液。在Eppendorf管2中，用DIPEA(1.39uL，8umol)处理寡聚(oligo)有义1(10.00mg，0.8umol)在H2O(0.25mL)中的溶液。将Eppendorf管1中的溶液添加至Eppendorf管2中，并使用ThermoMixer在室温下混合。在LC-MS分析表明反应完成后，将反应混合物用5mL水稀释，并使用100mM TEAA在ACN和H2O中的5-95％梯度，通过反相XBridge C18柱纯化。使用Genevac在减压下浓缩产物级分。使用Ultra-15Centrifugal(3K)将合并的残余溶剂对水(1X)、盐水(1X)和水(3X)透析。用水(3X 2mL)洗涤Amicon膜，然后将合并的溶剂冻干，得到缀合的有义1a的无定形白色固体(6.43mg，64％产率)。
使用与针对合成缀合的有义1a所述类似的程序制备缀合的有义1b-1i，并以42％-69％的产率获得。
双链体1a-1j的退火。
将缀合的有义1a(10mg，按重量测量)溶解于0.5mL去离子水中，以制备20mg/mL溶液。将反义1(10mg，按OD测量)溶解于0.5mL去离子水中，以制备20mg/mL溶液，该溶液用于缀合的有义链的滴定和双链体量的定量。基于缀合的有义和反义链的摩尔量的计算，将一定比例的所需反义1添加到缀合的有义1a溶液中。将所得混合物在95℃搅拌5min并冷却至室温。通过离子交换HPLC监测退火进程。根据退火进度，进一步添加数份比例的反义1以完成退火，纯度>95％。将溶液冻干以得到双链体1a(C8)，并且基于退火中消耗的反义链的摩尔量来计算其量。
使用与针对双链体1a(C8)退火所述相同的程序制备双链体1b-1i。
以下方案1-2描绘了在环上具有单脂质的带缺口的四环GalXC缀合物的合成。通过Cu催化的炔烃-叠氮化物环加成反应实现了合成后缀合。
有义1B和反义1B通过固相合成制备。
缀合的有义1j的合成。
在Eppendorf管1中，用脂质连接体叠氮化物(11.26mg，4umol)处理寡聚体(10.00mg，0.8umol)在DMA/H2O的3:1混合物(0.5mL)中的溶液。在Eppendorf管2中，将CuBr二甲硫醚(1.64mg，8umol)溶解在ACN(0.5mL)中。这两种溶液均通过向其中鼓泡N2脱气10min。然后将CuBrSMe2的ACN溶液添加到管1中，并将所得混合物在40℃搅拌。在LC-MS分析表明反应完成后，将反应混合物用0.5MEDTA(2mL)稀释，并使用Ultra-15Centrifugal(3K)对水(2X)透析。使用100mM TEAA在ACN(掺加有30％ IPA)和H2O中的5-95％梯度，通过反相XBridge C18柱纯化反应粗品。使用Genevac在减压下浓缩产物级分。使用/>Ultra-15Centrifugal(3K)将合并的残余溶剂对水(1X)、盐水(1X)和水(3X)透析。用水(3X 2mL)洗涤Amicon膜，并将合并的溶剂冻干，得到缀合的有义1j的无定形白色固体(6.90mg，57％产率)。
使用与针对双链体1a(C8)退火所述相同的程序制备双链体1j(PEG2K-二酰基C18)。
以下方案1-3描绘了使用合成后缀合方法合成在环上具有二脂质的带缺口的四环GalXC缀合物。
有义2和反义2通过固相合成制备。
使用与针对合成缀合的有义1a所述类似的程序，但使用10eq的脂质、10eq的HATU和20eq的DIPEA，制备缀合的有义2a和2b。
使用与针对双链体1a(C8)退火所述相同的程序制备双链体2a(2XC11)和2b(2XC22)。
以下方案1-4描绘了使用合成后缀合方法合成与单脂质缀合的完全硫代磷酸酯化茎-环的GalXC。
有义3和反义3通过固相合成制备。
使用与针对合成缀合的有义1a所述类似的程序制备缀合的有义3a，并以65％的产率获得。
使用与针对双链体1a(C8)退火所述相同的程序制备双链体3a(PS-C22)。
以下方案1-5描绘了使用合成后缀合方法合成与单脂质缀合的短有义链的GalXC。
有义4和反义4通过固相合成制备。
使用与针对合成缀合的有义1a所述类似的程序制备缀合的有义4a，并以74％的产率获得。
使用与针对双链体1a(C8)退火所述相同的程序制备双链体4a(SS-C22)。
以下方案1-6描绘了使用合成后缀合方法合成在环上与三金刚烷部分缀合的带缺口的四环GalXC。
有义5和反义5通过固相合成制备。
使用与针对合成缀合的有义1a所述类似的程序制备缀合的有义5a和5b，并以42％-73％的产率获得。
使用与针对双链体1a(C8)退火所述相同的程序制备双链体5a(3X金刚烷)和双链体5b(3X乙酰基金刚烷)。
以下方案1-7描绘了在环上与脂质缀合的带缺口的四环GalXC的固相合成实例。
缀合的有义6的合成。
使用商用寡核苷酸合成仪通过固相合成制备缀合的有义6。使用2’-修饰的核苷亚磷酰胺如2’-F或2’-OMe和2’-二乙氧基甲醇连接的脂肪酸酰胺核苷亚磷酰胺合成寡核苷酸。使用标准寡核苷酸合成方案在固相支持体上以3’至5’方向进行寡核苷酸合成。5-乙基硫基-1H-四唑(ETT)用作偶联反应的活化剂。碘溶液用于亚磷酸三酯氧化。3-(二甲基氨基亚甲基)氨基-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)用于形成硫代磷酸酯键。将合成的寡核苷酸用浓铵水溶液处理10h。从悬浮液中除去氨并通过过滤除去固相支持体残余物。将粗寡核苷酸用TEAA处理，分析，并通过强阴离子交换高效液相色谱法(SAX-HPLC)纯化。将级分合并，并使用Ultra-15Centrifugal(3K)对水(3X)、盐水(1X)和水(3X)透析。然后将剩余的溶剂冻干，得到所需的缀合的有义6。
使用与针对双链体1a(C8)退火所述相同的程序制备双链体6。方案8.通过合成后缀合方法合成在环上与一个金刚烷单元缀合的带缺口的四环GalXC。
缀合的有义7a和7b的合成
使用与合成缀合的有义5相同的方法或基本相似的方法获得缀合的有义7a和有义7b。
双链体7a和7b的合成实例
使用与双链体5的合成相同的方法或基本相似的方法获得双链体7a和双链体7b。
方案9.通过合成后缀合方法合成在环上与两个金刚烷单元缀合的带缺口的四环GalXC。
缀合的有义8a和8b的合成
使用与合成缀合的有义5相同的方法或基本相似的方法获得缀合的有义8a和有义8b。
双链体8a和8b的合成实例
使用与双链体5的合成相同的方法或基本相似的方法获得双链体8a和双链体8b。
以下方案1-10描绘了使用合成后缀合方法合成与单脂质缀合的短有义和短茎环的GalXC。
有义9a的合成
使用与合成缀合的有义5相同的方法或基本相似的方法获得缀合的有义9a。
双链体9a的合成实例
使用与双链体5的合成相同的方法或基本相似的方法获得双链体9a。
以下方案1-11描绘了使用合成后缀合方法合成在5’-端与单脂缀合的GalXC。
缀合的有义10a的合成
使用与合成缀合的有义5相同的方法或基本相似的方法获得缀合的有义10a。
双链体10a的合成实例
使用与双链体5的合成相同的方法或基本相似的方法获得双链体10a。
以下方案1-12a和1-12b描绘了使用合成后缀合方法合成在3’-端或5’-端具有与单脂质缀合的平端的GalXC。
/>
缀合的有义11a和12a的合成
使用与合成缀合的有义5相同的方法或基本相似的方法获得缀合的有义11a和12a。
双链体11a和12a的合成实例
使用与双链体5的合成相同的方法或基本相似的方法获得双链体11a和12a。
使用与双链体5的合成相同的方法或基本相似的方法获得缀合的双链体8D和双链体9D。
实施例4：GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸降低啮齿动物中枢神经系统中的基因表达
为了评价通过本文和/或实施例1-3中描述的一般方法生成的GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸降低中枢神经系统(CNS)中的靶基因表达的能力，通过脑室内(i.c.v.)或鞘内(i.t.)施用至脑脊液(CSF)中，用靶向鼠或大鼠Aldh2(本文中也称为“mALDH2”或“rALDH2”)mRNA的GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸处理小鼠或大鼠，并测定后续对啮齿动物(小鼠和大鼠)CNS中的Aldh2表达的影响。
简言之，生成了包含GalNAc缀合的带缺口的四环结构的RNAi寡核苷酸缀合物，其具有36-聚体过客链和22-聚体指导链，其核苷酸序列在表3中示出(下文称为“GalXC-ALDH2RNAi寡核苷酸”)。包含GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸的过客链和指导链的核苷酸序列各自包含不同模式的经修饰的核苷酸和硫代磷酸酯键，如图12所示和以下所示。构成GalXC-ALDH2RNAi寡核苷酸的四环的核苷酸中的三个各自与GalNAc部分缀合(CAS#14131-60-3；例如，关于GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸的通用结构和化学修饰模式的描绘见图12)。
有义(过客)链：
5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX[-mX-]10-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’。
杂交至：
反义(指导)链：
5’-[MePhosphonate-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’
(修饰关键词：表2)
表2.修饰关键词
符号 修饰/键合
mX 2’-O-甲基修饰的核苷酸
fX 2’-氟代修饰的核苷酸
-S- 硫代磷酸酯键
- 磷酸二酯键
[MePhosphonate-4O-mX] 5’-甲氧基膦酸酯-4-氧基修饰的核苷酸
ademX-GalNAc GalNAc缀合的核苷酸
表3中提供了包含GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸的有义链和反义链的核苷酸序列。
表3.GalNAc缀合的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸
有义链和反义链核苷酸序列
/>
小鼠脑室内(i.c.v.)施用
将表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸作为在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制的100μg(～4mg/kg)寡核苷酸的单剂量(n＝4)通过脑室内(i.c.v.)注射(10μl)施用到6-8周龄雌性CD-1小鼠的大脑中。对照组小鼠(n＝4)仅施用PBS。注射后五(5)天，处死小鼠。解剖并保存全脑、腰部脊髓和肝脏用于RT-qPCR分析。从躯体感觉皮质、纹状体、海马体、小脑和肝脏的组织样品中提取RNA，以通过qPCR测定鼠Aldh2 mRNA水平(相对于内源管家基因Hprt归一化，如图所示)。鼠Aldh2 mRNA的水平使用PrimeTimeTMqPCR Probe Assays(IDT)测定。qPCR使用PrimeTimeTMqPCR Probe Assays进行，该测定由引物对和鼠Aldh2 mRNA特异性的荧光标记的5’核酸酶探针组成。使用2-ΔΔCt(“delta-delta Ct”)方法(Livak和Schmittgen(2001)METHODS25:402–408)测定来自经处理的小鼠的样品中剩余的鼠Aldh2mRNA的百分比。
如图1所示，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸的i.c.v.施用降低了CNS中的靶基因表达，如通过比较用表3中提供的GalXC-ALDH2RNAi寡核苷酸处理的小鼠的样品中剩余的鼠Aldh2 mRNA百分比相对于用PBS处理的对照小鼠的样品中剩余的鼠Aldh2 mRNA百分比所确定的。该比较证实，相对于用PBS处理的对照小鼠，用表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸处理的小鼠的躯体感觉皮质、纹状体、海马体和小脑中鼠Aldh2 mRNA水平的降低是GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸的作用的结果。在用GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸处理的小鼠的肝脏中也观察到鼠Aldh2表达的抑制(图1)。这些结果表明，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸表现出在i.c.v.注射后降低CNS多个不同解剖区域中和肝脏中的靶基因表达的能力。
小鼠剂量范围和持久性
为了进一步证明通过本文和/或实施例1-3中描述的一般方法生成的GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸降低CNS中的靶基因表达的能力，将表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸作为在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制的250μg(10mg/kg)或500μg(20mg/kg)寡核苷酸的单剂量(n＝4)通过脑室内(i.c.v.)注射(10μl)施用到6-8周龄雌性CD-1小鼠的大脑中。对照组小鼠(n＝5)仅施用PBS。注射后二十一(21)、五十六(56)或八十四(84)天，处死小鼠。解剖并保存全脑和腰部脊髓用于RT-qPCR分析。从额叶皮质、海马体、下丘脑、纹状体、躯体感觉皮质、小脑、颈部脊髓、胸部脊髓和腰部脊髓的组织样品中提取RNA，以通过qPCR测定鼠Aldh2 mRNA水平(相对于内源管家基因Hprt归一化，如图所示)。鼠Aldh2 mRNA的水平使用PrimeTimeTMqPCR Probe Assays(IDT)测定。qPCR使用PrimeTimeTMqPCR Probe Assays进行，该测定由引物对和鼠Aldh2mRNA特异性的荧光标记的5’核酸酶探针组成。使用2-ΔΔCt(“delta-delta Ct”)方法(Livak和Schmittgen(2001)METHODS25:402–408)测定来自经处理的小鼠的样品中剩余的鼠Aldh2 mRNA的百分比。
如图2和图3所示，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸的i.c.v.施用以剂量依赖性方式降低了CNS中的靶基因表达，如通过比较用表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸处理的小鼠的组织样品中剩余的鼠Aldh2 mRNA百分比相对于用PBS处理的对照小鼠的样品中剩余的鼠Aldh2 mRNA百分比所确定的。在单剂量后至少60天(2个月)内，可测量到用GalXC-ALDH2RNAi寡核苷酸处理的小鼠的组织样品中鼠Aldh2 mRNA表达的降低(图2和图3)。这些进一步的结果证明，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸表现出在i.c.v.注射后以剂量依赖性方式降低CNS多个不同解剖区域中的靶基因表达的能力。此外，这些结果还证明，在单次施用后至少两(2)个月内，可测量到CNS中靶基因表达的降低，表明了GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸在CNS中提供延长的药效持久性的能力。
小鼠腰部鞘内(i.t.)施用
为了进一步证明通过本文和/或实施例1-3中描述的一般方法生成的GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸抑制CNS中的基因表达的能力，将表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸作为在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制的500μg(20mg/kg)寡核苷酸的单剂量(n＝10)通过腰部鞘内(i.t.)注射(10μl)施用到6-8周龄雌性CD-1小鼠的脊髓中。对照组小鼠(n＝10)仅施用PBS。注射后七(7)天，处死小鼠。解剖并保存全脑和腰部脊髓用于RT-qPCR分析。从额叶皮质、躯体感觉皮质、纹状体、海马体、下丘脑、小脑、颈部脊髓、胸部脊髓、腰部脊髓、背根神经节、肝脏和肾脏的组织样品中提取RNA，以通过qPCR测定鼠Aldh2 mRNA水平(相对于内源管家基因Hprt归一化，如图所示)。鼠Aldh2 mRNA的水平使用PrimeTimeTMqPCR Probe Assays(IDT)测定。qPCR使用PrimeTimeTMqPCR Probe Assays进行，该测定由引物对和鼠Aldh2mRNA特异性的荧光标记的5’核酸酶探针组成。使用2-ΔΔCt(“delta-delta Ct”)方法(Livak和Schmittgen(2001)METHODS25:402–408)测定来自经处理的小鼠的样品中剩余的鼠Aldh2mRNA的百分比。
如图4所示，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸的腰部i.t.施用降低了CNS中的靶基因表达，如通过比较用表3中提供的GalXC-ALDH2RNAi寡核苷酸处理的小鼠的组织样品中剩余的鼠Aldh2 mRNA百分比相对于用PBS处理的对照小鼠的样品中剩余的鼠Aldh2 mRNA百分比所确定的。这些结果证明，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸表现出在腰部i.t.注射后降低CNS多个不同解剖区域中的靶基因表达的能力。
大鼠剂量和耐久性
为了进一步证明通过本文和/或实施例1-3中描述的一般方法生成的GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸降低CNS中的靶基因表达的能力，将表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸作为在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制的1000μg(4mg/kg)或6000μg(24mg/kg)寡核苷酸的单剂量(n＝8)通过腰部鞘内(i.t.)注射(30μl)施用到雌性Sprague-Dawley大鼠的腰部脊髓中。
如图5所示，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸的腰部i.t.施用降低了CNS中的靶基因表达，如通过比较用表3中提供的GalXC-ALDH2RNAi寡核苷酸处理的大鼠的组织样品中剩余的大鼠Aldh2 mRNA百分比相对于用PBS处理的对照大鼠的样品中剩余的大鼠Aldh2 mRNA百分比所确定的。这些结果证明，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸表现出在大鼠中腰部i.t.注射后降低CNS多个不同解剖区域中的靶基因表达的能力。
实施例5：GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸抑制非人灵长类动物(NHP)中枢神经系统中的基因表达
为了进一步评价通过本文和/或实施例1-3中描述的一般方法生成的GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸降低中枢神经系统(CNS)中的靶基因表达的能力，通过脑室内(i.c.v.)或鞘内(i.t.)施用至脑脊液(CSF)中，用靶向ALDH2 mRNA的GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸处理NHP(食蟹猴(Macaca fascicularis)和恒河猴(Macaca mulatta)，并测定后续对NHP CNS中的ALDH2表达的影响。
NHP腰部鞘内(i.t.)施用
将表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸作为在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制的75mg寡核苷酸的单剂量通过腰部鞘内(i.t.)注射(3mL)施用到雄性食蟹猴NHP的腰椎中(食蟹猴；n＝3；平均体重3-3.5kg)。对照组食蟹猴NHP(n＝3)仅施用PBS。注射后二十八(28)天，处死食蟹猴NHP。解剖并保存全脑和腰部脊髓用于RT-qPCR分析。从额叶皮质、尾状核、海马体、小脑、颈部脊髓、胸部脊髓、腰部脊髓、背根神经节和肝脏的组织样品中提取RNA，以通过qPCR测定ALDH2 mRNA水平(相对于内源管家基因HPRT归一化，如图所示)。ALDH2 mRNA的水平使用PrimeTimeTMqPCR Probe Assays(IDT)测定。qPCR使用PrimeTimeTMqPCR ProbeAssays进行，该测定由引物对和ALDH2 mRNA特异性的荧光标记的5’核酸酶探针组成。使用2-ΔΔCt(“delta-delta Ct”)方法(Livak和Schmittgen(2001)METHODS25:402–08)测定来自经处理的NHP的样品中剩余的ALDH2mRNA的百分比。
如图6所示，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸的腰部i.t.施用降低了食蟹猴NHP的CNS中的靶基因表达，如通过比较用表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸处理的食蟹猴NHP的组织样品中剩余的ALDH2 mRNA百分比相对于用PBS处理的对照食蟹猴NHP的样品中剩余的ALDH2 mRNA百分比所确定的。这些结果证明，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸表现出在腰部i.t.注射后降低NHP CNS多个不同解剖区域中的靶基因表达的能力。
为了进一步评价表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸降低NHP中枢神经系统(CNS)中的靶基因表达的能力，通过腰部鞘内(i.t.)注射(3mL)到腰椎中，向恒河猴(M.mulatta；n＝3)施用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制的75mg、150mg或300mg寡核苷酸的剂量。对照组恒河猴NHP(n＝3)仅施用PBS。注射后二十八(28)天，处死恒河猴NHP。解剖并保存全脑和腰部脊髓用于RT-qPCR分析。从额叶皮质、海马体、颞叶皮质、小脑、脑干、颈部脊髓、胸部脊髓、腰部脊髓、背根神经节(DRG L1-L6)和肝脏的组织样品中提取RNA，以通过qPCR测定ALDH2 mRNA水平(相对于内源管家基因HPRT和PPIB归一化，如图所示)。ALDH2mRNA的水平使用PrimeTimeTMqPCR Probe Assays(IDT)测定。qPCR使用PrimeTimeTMqPCRProbe Assays进行，该测定由引物对和ALDH2 mRNA特异性的荧光标记的5’核酸酶探针组成。使用2-ΔΔCt(“delta-delta Ct”)方法(Livak和Schmittgen(2001)METHODS25:402–408)测定来自经处理的NHP的样品中剩余的ALDH2 mRNA的百分比。
如图7所示，GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸的腰部i.t.施用以剂量相关的方式降低了恒河猴NHP的CNS中的靶基因表达，如通过比较用表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸处理的恒河猴NHP的组织样品中剩余的ALDH2 mRNA百分比相对于用PBS处理的对照恒河猴NHP的样品中剩余的ALDH2 mRNA百分比所确定的。这些结果证明，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸表现出在腰部i.t.注射后在NHP CNS的多个不同解剖区域中以剂量相关的方式降低靶基因表达的能力。
为了进一步评价表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸降低NHP中枢神经系统(CNS)中的靶基因表达的能力，通过腰部鞘内(i.t.)注射(3mL)到腰椎中，向食蟹猴NHP(M.fascicularis；n＝3)施用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制的75mg寡核苷酸的剂量。对照组食蟹猴NHP(n＝3)仅施用PBS。在处理之前，通过手术将导管和端口植入每个NHP中，以允许将配制的寡核苷酸或PBS对照溶液缓慢(约15min)输注到腰部鞘内空间中。注射后二十八(28)天，处死食蟹猴NHP。解剖并保存全脑和腰部脊髓用于RT-qPCR分析。从额叶皮质、尾状核、海马体、中脑、顶叶皮质、枕叶皮质、丘脑、颞叶皮质、小脑、脑干、颈部脊髓、胸部脊髓、腰部脊髓、背根神经节(DRG L1-L6)和肝脏的组织样品中提取RNA，以通过qPCR测定ALDH2mRNA水平(相对于内源管家基因GAPDH和RPL23归一化，如图所示)。ALDH2 mRNA的水平使用PrimeTimeTMqPCR Probe Assays(IDT)测定。qPCR使用PrimeTimeTMqPCR Probe Assays进行，该测定由引物对和ALDH2 mRNA特异性的荧光标记的5’核酸酶探针组成。使用2-ΔΔCt(“delta-delta Ct”)方法(Livak和Schmittgen(2001)METHODS 25:402–408)测定来自经处理的NHP的样品中剩余的ALDH2 mRNA的百分比。如图8所示，GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸的腰部i.t.施用以剂量依赖性方式降低了食蟹猴NHP的CNS中的靶基因表达，如通过比较用表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸处理的食蟹猴NHP的组织样品中剩余的ALDH2 mRNA百分比相对于用PBS处理的对照食蟹猴NHP的样品中剩余的ALDH2 mRNA百分比所确定的。这些结果证明，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸表现出在腰部i.t.注射后在NHP CNS的多个不同解剖区域中以剂量依赖性方式降低靶基因表达的能力。
NHP小脑延髓池内(i.c.m.)施用
将表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸作为在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制的75mg寡核苷酸的单剂量通过腰部鞘内(i.t.)注射(3mL)施用到雄性食蟹猴的腰椎中(n＝3；平均体重3-3.5kg)。对照组NHP(n＝3)仅施用PBS。注射后二十八(28)天，处死NHP。解剖并保存全脑和腰部脊髓用于RT-qPCR分析。从额叶皮质、尾状核、海马体、小脑、颈部脊髓、胸部脊髓、腰部脊髓、背根神经节和肝脏的组织样品中提取RNA，以通过qPCR测定ALDH2 mRNA水平(相对于内源管家基因Hprt归一化，如图所示)。ALDH2 mRNA的水平使用PrimeTimeTMqPCRProbe Assays(IDT)测定。qPCR使用PrimeTimeTMqPCR Probe Assays进行，该测定由引物对和ALDH2mRNA特异性的荧光标记的5’核酸酶探针组成。使用2-ΔΔCt(“delta-delta Ct”)方法(Livak和Schmittgen(2001)METHODS25:402–08)测定来自经处理的NHP的样品中剩余的ALDH2 mRNA的百分比。
如图9所示，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸的腰部i.t.施用抑制了CNS中的基因表达，如通过比较用表3中提供的GalXC-ALDH2RNAi寡核苷酸处理的食蟹猴NHP的组织样品中剩余的Aldh2 mRNA百分比相对于用PBS处理的对照食蟹猴NHP的样品中剩余的Aldh2mRNA百分比所确定的。这些结果证明，GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸表现出在腰部i.t.注射后抑制CNS多个不同解剖区域中的基因表达的能力。
综合起来，实施例4-5中提供的结果表明，相对于用PBS处理的对照动物，在用表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸处理后，动物(啮齿动物和NHP)的CNS中Aldh2或ALDH2mRNA水平的降低可归因于CNS中GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸对Aldh2或ALDH2mRNA的RNAi介导的沉默(RNA干扰)。
实施例6：脂质缀合的RNAi寡核苷酸抑制啮齿动物中枢神经系统中的基因表达
为了评价通过本文和/或实施例1-3中描述的一般方法生成的脂质缀合的RNAi寡核苷酸降低中枢神经系统(CNS)中的靶基因表达的能力，通过脑室内(i.c.v.)或鞘内(i.t.)施用至脑脊液(CSF)中，用靶向鼠Aldh2(本文中也称为“mALDH2”)mRNA的脂质缀合的RNAi寡核苷酸处理小鼠，并测定后续对啮齿动物(小鼠)CNS中的Aldh2表达的影响。
简言之，生成了靶向鼠Aldh2并包含脂质缀合的带缺口的四环结构的RNAi寡核苷酸-脂质缀合物，其具有36-聚体过客链和22-聚体指导链，其核苷酸序列在表3中示出(下文称为“GalXC-ALDH2RNAi寡核苷酸-脂质缀合物”)。包含RNAi寡核苷酸-脂质缀合物的过客链和指导链的核苷酸序列各自包含不同模式的经修饰的核苷酸和硫代磷酸酯键，如图13所示和以下所示。各个脂质部分与构成RNAi寡核苷酸-脂质缀合物的四环的核苷酸之一缀合，如实施例1-3中所述，特别是实施例3中显示的方案1。脂质部分的结构在表4中提供。如果存在的话，双键的数目在冒号后提及，例如，具有1个双键的C18烃链是C18:1，具有6个双键的C22烃链是C22:6。
表4.示例性脂质部分的结构
*HC＝烃
将表5中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物作为在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制的250μg(10μL；25mg/mL；4mg/kg)寡核苷酸-脂质缀合物的单剂量分别通过脑室内(i.c.v.)注射施用到6至8周龄雌性CD-1小鼠(n＝4)的大脑中，或通过腰部鞘内(i.t.)注射施用到8至10周龄雌性C57BL/6小鼠(n＝4)的脊椎中。对照组小鼠(n＝4)仅施用PBS。注射后七(7)天，处死小鼠。解剖并保存全脑和腰部脊髓用于RT-qPCR分析。从躯体感觉皮质(SS皮质)、海马体(HP)、纹状体、额叶皮质、小脑、下丘脑(HY)、颈部脊髓(CSC)、胸部脊髓(TSC)和腰部脊髓(LSC)的组织样品中提取RNA，以通过qPCR测定Aldh2 mRNA水平(相对于内源管家基因Hprt归一化，如图所示)。还从通过i.c.v.注射施用GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物或PBS的小鼠中收获肝脏，并从肝脏中提取RNA用于RT-qPCR分析。Aldh2mRNA的水平使用PrimeTimeTMqPCR Probe Assays(IDT)测定。qPCR使用PrimeTimeTMqPCRProbe Assays进行，该测定由引物对和Aldh2 mRNA特异性的荧光标记的5’核酸酶探针组成。使用2-ΔΔCt(“delta-delta Ct”)方法(Livak和Schmittgen(2001)METHODS25:402–08)测定来自经处理的小鼠的样品中剩余的Aldh2mRNA的百分比。
如图10A和图11所示，GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物的i.c.v.施用(图10A)或i.t.施用(图11)降低了CNS中的靶基因表达，如通过比较用所示GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物处理的小鼠的组织样品中剩余的鼠Aldh2 mRNA百分比相对于用PBS处理的对照小鼠的样品中剩余的鼠Aldh2 mRNA百分比所确定的。此外，如图10A所示，所有通过i.c.v.施用在小鼠中测试的GalXC-ALDH2RNAi寡核苷酸-脂质缀合物均将CNS中的Aldh2靶基因表达降低至与对照GalNAc缀合的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸(GalXC-ALDH2)相似或更大的程度。这些结果证明，GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物表现出在i.c.v.或i.t.施用后降低CNS多个不同解剖区域中的靶基因表达的能力。此外，综合起来，这些结果证明，相对于GalNAc缀合的RNAi寡核苷酸，疏水性部分(例如，脂质)与RNAi寡核苷酸的缀合提高了RNAi寡核苷酸-脂质缀合物降低CNS中的靶基因表达的能力，使其在神经疾病或病症的治疗性治疗中是有用的。
对于通过i.c.v.注射施用GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物的小鼠，评价肝脏中的靶基因表达，如通过施用给定GalXC-ALDH2RNAi寡核苷酸-脂质缀合物的小鼠的肝脏样品中的鼠Aldh2 mRNA百分比相对于对照小鼠的肝脏样品中的鼠Aldh2 mRNA百分比来测量的。如图10B所示，仅在施用具有较长脂质尾(即，C16或C18)的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物的小鼠中观察到肝脏中Aldh2靶基因表达的降低。相反，相对于对照小鼠，施用具有较短脂质尾(即，C10、C12或C14)的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物的小鼠的肝脏中Aldh2靶基因表达没有降低。这些数据综合起来证明，具有较长脂质尾的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物降低CNS和肝脏两者中的Aldh2靶基因表达，而具有较短脂质尾的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物足够全面地降低CNS中的Aldh2靶基因表达而不影响肝脏中的靶基因表达。这样的效果允许以组织特异性方式对靶基因表达进行治疗性操作，这在靶基因在CNS中异常表达但在肝脏中具有正常生理功能所需的表达的疾病背景中是有用的。这些数据证明，具有较短脂质尾的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂质缀合物可用于降低CNS中靶基因的异常表达，而不会对肝脏中靶基因的生理上正常的表达带来有害的降低。
表5.GalNAc缀合的和脂质缀合的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸：未修饰的和经修饰的有义链和反义链核苷酸序列
/>
GalNAc缀合的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸：
有义(过客)链：
5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX]10-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’
杂交至：
反义(指导)链：
5’-[MePhosphonate-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’
脂质缀合的(辛酸C8:0)GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸：
有义(过客)链：
5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX]10-[ademX-C8]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’。
杂交至：
反义(指导)链：
5’-[MePhosphonate-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’
脂质缀合的(癸酸C10:0)GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸：
有义(过客)链：
5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX]10-[ademX-C10]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’。
杂交至：
反义(指导)链：
5’-[MePhosphonate-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’
脂质缀合的(癸酸C12:0)GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸：
有义(过客)链：
5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX]10-[ademX-C12]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’。
杂交至：
反义(指导)链：
5’-[MePhosphonate-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’
脂质缀合的(肉豆蔻酸C14:0)GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸：
有义(过客)链：
5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX]10-[ademX-C14]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’。
杂交至：
反义(指导)链：
5’-[MePhosphonate-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’
脂质缀合的(棕榈酸C16:0)GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸：
有义(过客)链：
5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX]10-[ademX-C16]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’。
杂交至：
反义(指导)链：
5’-[MePhosphonate-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’
脂质缀合的(硬脂酸C18:0)GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸：
有义(过客)链：
5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX]10-[ademX-C18]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’。
杂交至：
反义(指导)链：
5’-[MePhosphonate-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’
脂质缀合的(油酸C18:1)GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸：
有义(过客)链：
5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX]10-[ademX-C18-OLE]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’。
杂交至：
反义(指导)链：
5’-[MePhosphonate-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’
脂质缀合的(亚油酸C18:2)GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸：
有义(过客)链：
5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX]10-[ademX-C18-LIN]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’。
杂交至：
反义(指导)链：
5’-[MePhosphonate-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’
脂质缀合的(二十二烷酸C22:0)GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸：
有义(过客)链：
5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX]10-[ademX-C22]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’。
杂交至：
反义(指导)链：
5’-[MePhosphonate-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’
脂质缀合的(二十二碳六烯酸C22:6)GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸：
有义(过客)链：
5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX]10-[ademX-C22-DHA]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’。
杂交至：
反义(指导)链：
5’-[MePhosphonate-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’
(修饰关键词：表6)
表6.修饰关键词
符号 修饰/键合
mX 2’-O-甲基修饰的核苷酸
fX 2’-氟代修饰的核苷酸
-S- 硫代磷酸酯键
- 磷酸二酯键
[MePhosphonate-4O-mX] 5’-甲氧基膦酸酯-4-氧基修饰的核苷酸
ademX-GalNAc GalNAc缀合的核苷酸
ademX-C8 脂质(C8:0)缀合的核苷酸
ademX-C10 脂质(C10:0)缀合的核苷酸
ademX-C12 脂质(C12:0)缀合的核苷酸
ademX-C14 脂质(C14:0)缀合的核苷酸
ademX-C16 脂质(C16:0)缀合的核苷酸
ademX-C18 脂质(C18:0)缀合的核苷酸
ademX-C18-OLE 脂质(C18:1)缀合的核苷酸
ademX-C18-LIN 脂质(C18:2)缀合的核苷酸
ademX-C22 脂质(C22:0)缀合的核苷酸
ademX-C22-DHA 脂质(C22:6)缀合的核苷酸
序列表
/>
/>
/>

Claims (46)

1.用于降低中枢神经系统(CNS)中靶mRNA的表达的寡核苷酸-配体缀合物，其包含：
(i)双链寡核苷酸，其包含长度为15至30个核苷酸的反义链和长度为15至40个核苷酸的有义链，其中所述反义链和所述有义链各自包含5’端和3’端，其中所述反义链和所述有义链形成双链体区域，其中所述反义链具有与CNS中的靶mRNA中的靶序列互补的互补区域，其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，其中所述寡核苷酸包含茎-环；以及
(ii)与所述茎-环缀合的一个或多个脂质部分。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述有义链在其3’端包含所述茎-环。
3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述茎-环包含由下式表示的核苷酸序列：5’-S1-L-S2-3’，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成环。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中S1和S2的长度为1至8个核苷酸。
5.根据权利要求3或4所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述一个或多个脂质部分与S1的核苷酸缀合。
6.根据权利要求3或4所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述一个或多个脂质部分与S2的核苷酸缀合。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中L的长度为3至5个核苷酸。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中L为四环，任选地其中L的长度为4个核苷酸。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中L包含表示为5’-GAAA-3’的核苷酸序列。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述一个或多个脂质部分与L的核苷酸缀合。
11.根据权利要求3或4所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中L的长度为3个核苷酸，并且从5’至3’具有第一、第二和第三核苷酸，其中所述寡核苷酸-配体缀合物包含一个脂质部分，并且其中所述脂质部分与L的第一、第二或第三核苷酸缀合。
12.根据权利要求3或4所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中L的长度为4个核苷酸，并且从5’至3’具有第一、第二、第三和第四核苷酸，其中所述寡核苷酸-配体缀合物包含一个脂质部分，并且其中所述脂质部分与L的第一、第二、第三或第四核苷酸缀合。
13.根据权利要求12所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中L由5’-GAAA-3’组成。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述脂质部分与L的第二核苷酸缀合。
15.根据权利要求3或4所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中L的长度为5个核苷酸，并且从5’至3’具有第一、第二、第三、第四和第五核苷酸，其中所述寡核苷酸-配体缀合物包含一个脂质部分，并且其中所述脂质部分与L的第一、第二、第三、第四或第五核苷酸缀合。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述反义链的长度为19至27个核苷酸。
17.根据权利要求1-16所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述反义链的长度为21至27个核苷酸，任选地其中所述反义链的长度为22个核苷酸。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述有义链的长度为19至40个核苷酸，任选地其中所述有义链的长度为36个核苷酸。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述双链体区域的长度为至少19个核苷酸。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述双链体区域的长度为至少20个核苷酸，任选地其中所述双链体区域的长度为21个核苷酸。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述互补区域的长度为至少19个连续核苷酸。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸包含长度为一个或多个核苷酸的3’-突出端序列，其中所述3’-突出端序列存在于所述反义链上，所述有义链上，或所述反义链和有义链上。
23.根据权利要求22所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述3’-突出端序列位于所述反义链上，并且其中所述3’-突出端序列的长度为两个核苷酸。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。
25.根据权利要求24所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述经修饰的核苷酸包含2’-修饰。
26.根据权利要求25所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述2’-修饰是选自2’-氨基乙基、2’-氟代、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-脱氧-2’-氟代和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖基的修饰。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸均被修饰。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键合。
29.根据权利要求28所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述至少一个经修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述反义链的5’-核苷酸的糖的4’-碳包含磷酸酯类似物。
31.根据权利要求30所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述一个或多个脂质部分包含饱和或不饱和的C1-C50烃链。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述一个或多个脂质部分包含饱和或不饱和的C5-C25烃链。
34.根据权利要求33所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述一个或多个脂质部分包含饱和的C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14烃链。
35.根据权利要求34所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述寡核苷酸-配体缀合物降低CNS中靶mRNA的表达，而不降低CNS外靶mRNA的表达，任选地不降低肝脏中靶mRNA的表达。
36.根据权利要求34或35所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述靶mRNA在肝细胞中表达，并且其中所述寡核苷酸-配体缀合物不将肝细胞中靶mRNA的表达降低至与CNS细胞中相同或相似的水平。
37.根据权利要求33所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述脂质部分包含饱和的C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22烃链。
38.根据权利要求33所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述脂质部分包含不饱和的C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22烃链，任选地其中所述脂质部分包含C22:6。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述靶基因与疾病或病症相关，任选地与神经疾病或病症相关。
40.根据权利要求39所述的寡核苷酸-配体缀合物，其中所述疾病或病症选自进行性核上麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、嗜银颗粒病(AGD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、衰老相关的tau星形神经胶质病(ARTAG)、家族性额颞叶痴呆17(FTD-17)、Tau蛋白病伴呼吸衰竭、痴呆伴癫痫、皮克病、强直性肌营养不良1或2(MD1或MD2)、唐氏综合征、痉挛性截瘫(SP)、C型Niemann-Pick病、路易体痴呆(DLB)、路易体吞咽困难、路易体病、橄榄体脑桥小脑萎缩、纹状体黑质变性、Shy-Drager综合征、脊髓性肌萎缩V(SMAV)、亨廷顿病(HD)、阿尔茨海默病、SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA10(1、2、3、7或103型脊髓小脑共济失调)、多系统萎缩(MSA)、脊髓和延髓肌肉萎缩(SBMA，肯尼迪病)、Friedrich共济失调、脆性X相关震颤/共济失调综合征(FXTAS)、脆性X综合征(FRAXA)、X连锁精神发育迟滞(XLMR)、帕金森病、张力障碍、SBMA(脊髓延髓肌萎缩)、神经性疼痛病症、脊髓损伤、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(DRPLA)、隐性CNS病症、ALS(肌萎缩侧索硬化)、M2DS(MECP2重复综合征)、FTD(额颞叶痴呆)、朊病毒病、成年发作型脑白质营养不良、Alexander病、Krabbe病、慢性创伤性脑病、Pelizaeus-Merzbacher病(PMD)、Lafora病、卒中、脑淀粉样血管病(CAA)和异染性脑白质营养不良(MLD)。
41.用于降低CNS中靶mRNA的表达的寡核苷酸-配体缀合物，其包含
(i)双链寡核苷酸，其包含长度为15至30个核苷酸的反义链和长度为15至40个核苷酸的有义链，其中所述反义链和所述有义链各自包含5’端和3’端，其中所述反义链和所述有义链形成双链体区域，其中所述反义链具有与CNS中的靶mRNA中的靶序列互补的互补区域，其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，其中所述寡核苷酸包含茎-环；以及
(ii)与所述茎-环缀合的一个或多个脂质部分，其中所述一个或多个脂质部分选自饱和或不饱和的C8-14烃链，
其中肝脏中靶mRNA的表达不降低至与CNS中相同或相似的水平。
42.药物组合物，其包含根据权利要求1-41中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物和药学上可接受的载体。
43.降低或抑制受试者中靶mRNA的表达的方法，所述靶mRNA由受试者中与CNS相关的细胞群体表达，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1-41中任一项所述的寡核苷酸-配体缀合物或根据权利要求42所述的药物组合物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中与对照细胞群体相比，与CNS相关的细胞群体中所述靶mRNA的表达水平降低。
45.根据权利要求44所述的方法，其中与对照细胞群体相比，位于CNS外的细胞群体中所述靶mRNA的表达水平不降低。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述位于CNS外的细胞群体处于肝脏中。
CN202280012175.7A 2021-01-28 2022-01-28 用于抑制中枢神经系统中的基因表达的组合物和方法 Pending CN116802295A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163142877P 2021-01-28 2021-01-28
US63/142,877 2021-01-28
PCT/US2022/014346 WO2022165201A1 (en) 2021-01-28 2022-01-28 Compositions and methods for inhibiting gene expression in the central nervous system

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116802295A true CN116802295A (zh) 2023-09-22

Family

ID=82652781

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280012175.7A Pending CN116802295A (zh) 2021-01-28 2022-01-28 用于抑制中枢神经系统中的基因表达的组合物和方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20240117351A1 (zh)
EP (1) EP4284933A1 (zh)
JP (1) JP2024505035A (zh)
CN (1) CN116802295A (zh)
AR (1) AR124713A1 (zh)
TW (1) TW202246502A (zh)
WO (1) WO2022165201A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024097821A1 (en) * 2022-11-02 2024-05-10 Sanegene Bio Usa Inc. Nucleotide-based enhancement agent for rna delivery and therapy

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009100351A2 (en) * 2008-02-08 2009-08-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Delivery of rnai constructs to oligodendrocytes
EP3865576A1 (en) * 2014-12-15 2021-08-18 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Ligand-modified double-stranded nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022165201A1 (en) 2022-08-04
US20240117351A1 (en) 2024-04-11
AR124713A1 (es) 2023-04-26
JP2024505035A (ja) 2024-02-02
EP4284933A1 (en) 2023-12-06
TW202246502A (zh) 2022-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020244546B2 (en) Chiral control
JP2021502120A (ja) 細胞におけるｌｐａの発現を抑制するための核酸
CN115210377A (zh) 寡核苷酸组合物及其方法
JP7245328B2 (ja) 細胞におけるｌｐａの発現を抑制するための核酸
AU2010264274B2 (en) Novel drugs for inhibition of gene expression
JP2018520683A (ja) 多標的単一体コンジュゲート
AU2019395341A1 (en) Chemically-modified RNAi constructs and uses thereof
KR20220069103A (ko) 최소 플루오린 함량을 갖는 작은 간섭 rna의 화학적 변형
JP2023053352A (ja) アンチセンスオリゴマー化合物
TW202228729A (zh) 選擇性遞送寡核苷酸至膠細胞
US20240117351A1 (en) Compositions and methods for inhibiting gene expression in the central nervous system
JP7394392B2 (ja) 核酸複合体
TW202333750A (zh) ＲＮＡｉ寡核苷酸共軛體
US20240124875A1 (en) Rnai conjugates and uses thereof
TW202321449A (zh) 用於寡核苷酸劑的基於寡核苷酸的遞送載體及其使用方法
CN117597444A (zh) 用于靶向中枢神经系统的神经元的脂质缀合
TW202308662A (zh) 用於靶定中樞神經系統的神經元之脂質結合物
EP3549610A1 (en) Nucleic acid conjugates
TW202335674A (zh) 靶定中樞神經系統的星狀細胞之脂質結合物
TW202340462A (zh) 靶定中樞神經系統的寡樹突細胞之脂質結合物
US20230416742A1 (en) Compositions and methods for inhibiting mapt expression
US20230416743A1 (en) Compositions and methods for inhibiting snca expression
CN113166759B (zh) 经化学修饰的RNAi构建体及其用途
WO2024040041A1 (en) Regulation of activity of rnai molecules
WO2023245061A2 (en) Lipid conjugates for the delivery of therapeutic agents to cns tissue

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination