JP7245328B2 - 細胞におけるlpaの発現を抑制するための核酸 - Google Patents
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Description
本発明は、生成物および組成物およびそれらの使用に関する。特に、本発明は、LPA遺伝子発現を妨げる、またはその発現を抑制する核酸産物に関する。このような治療的Lp(a)低下療法は、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症ならびに冠状動脈性心疾患および大動脈弁狭窄症などの心臓血管疾患または高レベルのLp(a)粒子に関連するいずれかの他の障害、病態または症候群を罹患するリスクを防ぐまたは低減するように機能する。
非修飾ポリヌクレオチド、特に、リボヌクレオチドは、細胞内ヌクレアーゼにより分解される傾向があり得、従って、修飾/修飾ヌクレオチドは、本発明の核酸に含まれ得る。このような修飾は、核酸をヌクレアーゼに対してより高い耐性にすることによりそれらを安定化するのを助け得る。この向上された耐性は、核酸をより長い期間にわたりRNA干渉を媒介することにおいて活性であるようにさせ、核酸が治療に使用される場合に特に望ましい。
本明細書で使用される場合、修飾核酸は、下記の1種または複数を含んでよい。
(ii)変化、例えば、リボース糖の成分の置換、例えば、リボース糖上の2'ヒドロキシルの置換;
(iii)リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる置換;
(iv)天然の塩基の修飾または置換;
(v)リボースホスフェート骨格の置換または修飾;
(vi)RNAの3'末端または5'末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置換または部分の結合、例えば、RNAの3'または5'末端への蛍光標識部分の結合。
修飾リン酸基の例は、ホスホロチオエート、ホスホロセレン酸、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルを含む。ジチオリン酸は、硫黄により置換された両方の非結合酸素を有する。リン酸基中の1つ、それぞれのまたは両方の非結合酸素は独立に、S、Se、B、C、H、N、またはOR(Rはアルキルまたはアリール)のいずれか1つであり得る。
第1の鎖の5’末端から位置2および14のヌクレオチドが2’O-メチル修飾により修飾されず、および第1の鎖の位置11に対応する第2の鎖上のヌクレオチドが2’O-メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
第1の鎖の5’末端から位置2および14のヌクレオチドが2’O-メチル修飾により修飾されず、および第1の鎖の位置11および13に対応する第2の鎖上のヌクレオチドが2’O-メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
(i)好ましくは第2の鎖の3’末端で3’-3’結合の、逆位ヌクレオチド;
(ii)1つまたは複数のジチオリン酸結合;
(iii)第1の鎖の位置11または13に対応する第2の鎖のヌクレオチドであって、2’O-メチル修飾により修飾されず、好ましくはこれらの位置の一方または両方が2’フルオロ修飾を含む、第2の鎖のヌクレオチド;
(iv)全てのヌクレオチドの少なくとも80%が2’O-メチル修飾を有するヌクレオチドを含む核酸;
(v)2’フルオロ修飾を有する20%以下のヌクレオチドを含む核酸。
(vp)-N(po)[N(po)]n- (IV)
を含み得、式中、「vp」は、5’(E)ビニルホスホネートであり、「N」はヌクレオチドであり、「po」はリン酸ジエステル結合であり、nは1~(第1の鎖中のヌクレオチドの総数-2)であり、好ましくは、nは1~(第1の鎖中のヌクレオチドの総数-3)であり、より好ましくは、nは1~(第1の鎖中のヌクレオチドの総数-4)である。
(i)第1の鎖の末端の3個の3’ヌクレオチド間および末端の3個の5’ヌクレオチド間でホスホロチオエート結合を有する;
(ii)第2の鎖の3’末端ヌクレオチドまたは5’末端ヌクレオチド上のいずれかで三分岐リガンドに結合される;
(iii)三分岐リガンドに結合されたヌクレオチドの反対側の末端の第2の鎖の3個の末端ヌクレオチド間でホスホロチオエート結合を有する;および
(iv)第1および/または第2の鎖のヌクレオチド間の全ての残りの結合は、リン酸ジエステル結合である。
(i)第1の鎖の5’末端で末端5’(E)-ビニルホスホネートヌクレオチドを有する;
(ii)第1の鎖および第2鎖上の末端の3個の3’ヌクレオチド間および第2の鎖上の端末の3個の5’ヌクレオチド間でホスホロチオエート結合を有する;
(iii)第1および/または第2の鎖のヌクレオチド間の全ての残りの結合は、リン酸ジエステル結合である。
(i)修飾ヌクレオチド;
(ii)第1の鎖の5’末端から位置2および14での2’-OMe修飾ヌクレオチド以外の修飾ヌクレオチド、好ましくは2’-F修飾ヌクレオチド;
(iii)第1の鎖の5’末端から番号を付ける第1の鎖の奇数ヌクレオチドのそれぞれが2’-OMe修飾ヌクレオチドである;
(iv)第1の鎖の5’末端から番号を付ける第1の鎖の偶数ヌクレオチドのそれぞれが2’-F修飾ヌクレオチドである;
(v)第1の鎖の位置11または13に対応する第2の鎖のヌクレオチドが、2’-OMe修飾以外の修飾により修飾され、好ましくはこれらの位置の一方または両方が2’-F修飾を含む;
(vi)好ましくは第2の鎖の3’末端での3’-3’結合である、逆位ヌクレオチド;
(vii)1つまたは複数のホスホロチオエート結合;
(viii)1つまたは複数のホスホロジチオエート結合;および/または
(ix)第1鎖は、その5’末端に末端5’(E)ビニルホスホネートヌクレオチドを有し、この場合、末端5’(E)-ビニルホスホネートヌクレオチドは好ましくはウリジンであり、好ましくは、リン酸ジエステル結合により第1の鎖の第2のヌクレオチドに結合される。
本発明の核酸は、リガンドに結合され得る。オリゴヌクレオチド、特に本発明の二本鎖核酸の細胞への効率的インビボ送達は重要であり、特異的標的化および細胞外環境、特に血清タンパク質からの実質的保護が必要である。特異的標的化を達成する1つの方法は、リガンドを核酸に結合することである。リガンドは、必要とされる標的部位に核酸を標的化するのを助ける。結合された分子が異なる受容体依存性エンドサイトーシス経路または機能的に類似のプロセスなどの機序により標的細胞に取り込まれるように、目的の受容体分子に対する適切なリガンドを結合する必要がある。
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
の化合物を含み得、式中、
Sは、サッカライドであり、ここでサッカライドは、N-アセチルガラクトサミンであり;
X1は、C3-C6アルキレンまたは(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-であり、mは1、2、または3であり;
Pは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)であり;
X2は、式(-CH2)n-O-CH2-のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、n=1~6であり;
Aは、分岐ユニットであり、
X3は、架橋ユニットであり;
本発明による核酸は、リン酸または修飾リン酸(好ましくはチオリン酸)を介してX3に結合される。
分岐ユニットAは、
式中、各A1は独立に、O、S、C=OまたはNHであり;および
各nは、独立に1~20の整数である。
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
の化合物を含み得、式中、
Sは、サッカライドであり;
X1は、C3-C6アルキレンまたは(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-であり、mは1、2、または3であり;
Pは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)であり;
X2はC1-C8アルキレンであり;
Aは;
本発明による核酸は、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)を介してX3に結合される。
X3はC1-C20アルキレンであり得る。好ましくは、X3は、-C3H6-、-C4H8-、-C6H12-および -C8H16-、特に、-C4H8-、-C6H12-および-C8H16-からなる群から選択される。
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (III)
の化合物を含み得、式中、
Sは、サッカライドであり;
X1は、C3-C6アルキレンまたは(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-であり、mは1、2、または3であり;
Pは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)であり;
X2は、式-C3H6-O-CH2-のアルキレンエーテルであり;
Aは、分岐ユニットであり、
X3は、-CH2-O-CH2-、-CH2-O-C2H4-、-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-、および-CH2-O-C8H16-からなる群から選択される式のアルキレンエーテルであり、それぞれの場合で、-CH2-基はAに結合され;
X3は、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)により本発明による核酸に結合される。
分岐ユニットは、炭素を含み得る。好ましくは、分岐ユニットは炭素である。
X3は、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-、および-CH2-O-C8H16-からなる群から選択され得る。好ましくは、X3は、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-および-CH2-O-C8H16-からなる群より選択される。
Y1およびY2は、それぞれ独立に、=O、=S、-O-、-OH、-SH、-BH3、-OCH2CO2、-OCH2CO2Rx、-OCH2C(S)ORx、および-ORxであり、式中、Rxは、C1-C6アルキルであり、
例えば、Y1は-OHであり、Y2は=Oまたは=Sであり得;または
Y1は-O-であり、Y2は=Oまたは=Sであり得;
Y1は=Oであり、Y2は-CH3、-SH、-ORx、または-BH3であり得、
Y1は=Sであり、Y2は-CH3、-ORxまたは-SHであり得る。
当業者なら、特定の事例では、Y1とY2の間で非局在化が存在することを理解するであろう。
本発明は、下記の構造の内の1つを有する複合化核酸を提供する。
(i)第2のRNA鎖は、標的化リガンドの5’末端に結合され、(a)第2のRNA鎖はまた、標的化リガンドの3’末端でも結合され、第1のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(b)第1のRNA鎖は、3’末端で標的化リガンドに対し結合され、第2のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(c)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方はまた、3’末端で標的化リガンドに対し結合され;もしくは
(ii)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方は、3’末端で標的化リガンドに対し結合され、第2のRNA鎖の5’末端は結合されない。
リガンドは、単量体または多量体(例えば、二量体、三量体、など)であり得る。
あるいは、リガンドは、二量体リガンドであり得、このリガンド部分は、セリノール由来リンカー部分または非セリノールリンカー部分などの2つのリンカー部分を含み、それぞれが単一の標的化リガンド部分に結合する。
本発明のある実施形態では、第1のRNA鎖は、式(X):
第2のRNA鎖は、式(XI):
cおよびdは、独立に0または1であり;
Z1およびZ2は、それぞれ第1および第2のRNA鎖のRNA部分であり;
YはOまたはSであり;
nは0、1、2または3であり;および
L1は、リガンドが結合するリンカーであり;
およびb+c+dは、2または3である。
bは0または1であり;および
第2のRNA鎖は、式(XVI):
Z1およびZ2は、それぞれ第1および第2のRNA鎖のRNA部分であり;
YはOまたはSであり;
R1はHまたはメチルであり;
nは0、1、2または3であり;および
Lは、式(XV)および(XVI)で同じまたは異なり、Lは、
-(CH2)r-C(O)-、r=2~12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-、s=1~5;
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-、tは独立に1~5であり;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-、uは独立に1~5であり;および
-(CH2)v-NH-C(O)-、vは2~12である;
からなる群より選択され;末端C(O)(存在する場合)は、NH基に結合され;
およびb+c+dは、2または3である。
第2のRNA鎖は、式(XIII):
cおよびdは、独立に0または1であり;
Z1およびZ2は、それぞれ第1および第2のRNA鎖のRNA部分であり;
YはOまたはSであり;
nは0、1、2または3であり;および
L2は、式(XII)および(XIII)で同じまたは異なり、L2は、b、cおよびdの括弧内の部分で同じまたは異なり、L2は、下記からなる群より選択され:
nは0であり、L2は:
Fは、飽和分枝または非分枝(例えば、非分岐)C1-8アルキル(例えば、C1-6アルキル)鎖であり、炭素原子の1個が酸素原子で任意に置換されてもよいが、但し、上記酸素原子が、別のヘテロ原子(例えば、OまたはN原子)から少なくとも2個の炭素原子分だけ離されていることが条件である。
Lは、式(XII)および(XIII)で同じまたは異なり、Lは、
-(CH2)r-C(O)-、r=2~12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-、s=1~5;
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-、tは独立に1~5であり;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-、uは独立に1~5であり;および
-(CH2)v-NH-C(O)-、vは2~12であり;
からなる群より選択され;末端C(O)(存在する場合)は、NH基に結合され;
およびb+c+dは、2または3である。
-(CH2)r-C(O)-、r=2~12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-、s=1~5;
-(CH2)1-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-、tは独立に1~5であり;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-、uは独立に1~5であり;および
-(CH2)v-NH-C(O)-、vは2~12であり;
末端C(O)は、NH基に結合される。
本発明はまた、本発明の核酸または複合化核酸を含む組成物も提供する。
医薬組成物は、薬物または診断薬として、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の1種または複数核酸複合体は、送達担体(例えば、リポソーム)および/または担体、希釈剤などの賦形剤と組み合わせることができる。防腐剤および安定剤などの他の薬剤も添加できる。核酸の送達方法は、当技術分野において既知であり、当業者の知識の範囲内にある。
各実施例で言及されるナンバリングは、上記実施例に特異的である。
実施例1
機能的実施例のために使用されるいくつかの修飾および複合化SiRNA分子が本明細書で示される。
LPA-1038誘導体:
GalNAc-LPA-1038-L1
第1の鎖(配列番号119、配列番号5ベース)
OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA 3’
第2の鎖(配列番号120、配列番号6ベース)
5’[ST23(ps)]3ロングトレブラー(ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU3’
GalNAc-LPA-1038-L6
第1の鎖(配列番号121、配列番号5ベース)
OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA3’
第2の鎖(配列番号122、配列番号6ベース)
5’[ST23(ps)]3 ST43(ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU3’
FN(N=A、C、G、U)は、2’フルオロ、2’デオキシヌクレオシドを意味する。
OMeN(N=A、C、G、U)は、2'Oメチルヌクレオシドを意味する。
(ps)は、ホスホロチオエート結合を示す。
さらなる例は、LPA 1041誘導体である:
GalNAc-LPA-1041-L1
第1の鎖(配列番号123、配列番号9ベース)
5’ OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeG3’
第2の鎖(配列番号124、配列番号10ベース)
5’[ST23(ps)]3 ロングトレブラー(ps)FC-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU3’
GalNAc-LPA-1041-L6
第1の鎖(配列番号125、配列番号9ベース)
5’ OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeG3’
第2の鎖(配列番号126、配列番号10ベース)
5´[ST23(ps)]3 ST43(ps)FC-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU3’
FN(N=A、C、G、U)は、2’フルオロ、2’デオキシヌクレオシドを意味する。
OMeN(N=A、C、G、U)は、2'Oメチルヌクレオシドを意味する。
(ps)は、ホスホロチオエート結合を示す。
ヒトRT-4細胞におけるLPA mRNA発現の抑制に対する非複合化siRNA分子(表1)スクリーニング。
リポソームトランスフェクション複合体を、1.5μl RNAiMax(ThermoFisher)/80pmolの示したsiRNA分子の比で3通り調製した。複合体をそれぞれ、示した2.5nMおよび25nMの濃度に希釈した(値はペアにして明および暗灰色のバーとして示した)。内在性にLPAを発現しているRT4ヒト膀胱移行細胞乳頭腫細胞を、示した濃度で予め播種したトランスフェクション複合体の上に、24ウェルフォーマットで125,000細胞/ウェルの濃度で播種した(リバーストランスフェクション)。トランスフェクションの24時間後に、全RNAをSpin Cell Mini Kit 250(Stratec)を用いて単離した。LPA mRNAレベルを、ハウスキーピング転写物としてのそれぞれの試料中のPPIB mRNA発現と比較して、qRT-PCRにより測定した。値を未処理細胞中で検出されるLPA mRNAの量に対し正規化した(プレート内)。非サイレンシングsiRNA化合物を追加の対照としてトランスフェクトした。正規化した3回の繰り返し値の平均およびSDを示す。結果を図1に示す。
ヒトRT-4細胞における非複合化LPA標的化siRNA化合物のLPA mRNA発現に対する用量反応。
RT4ヒト膀胱移行細胞乳頭腫細胞を上述のようにリバーストランスフェクションし(実施例2)、標識した種々の非複合化siRNA化合物(表1)を用いて、示された濃度(100nM~0.2nMの範囲)で処理した。トランスフェクションの24時間後に、全RNAをSpin Cell Mini Kit 250(Stratec)を用いて単離した。LPA mRNAレベルを、ハウスキーピング転写物としてのそれぞれの試料中のPPIB mRNA発現と比較して、qRT-PCRにより測定した。値を未処理細胞中で検出されるLPA mRNAの量に対し正規化した。バーは、それぞれのデータポイントに対する残留LPA mRNA発現を表す。結果を図2に示す。
受容体媒介取り込みにより送達された種々の投与量のGalNAc-L1 LPA-1038複合化SiRNA分子によるヒトおよびカニクイザル初代培養肝細胞中のLPA mRNA発現の抑制。
初代培養肝細胞(ThermoFisher)をコラーゲンコート96ウェルプレートに45,000細胞/ウェル(カニクイザル)および30,000細胞/ウェル(ヒト)の濃度で播種した。GalNAc-L1-複合化LPA-1038を示された濃度(nM)で播種直後に加えた。siRNA処理の24時間後に、全RNAをInviTrap RNA細胞HTS96ウェルキット(Stratec)を用いて単離した。LPA mRNAレベルを、ハウスキーピング転写物としてのそれぞれの試料中のアクチン(カニクイザル)またはApoB(ヒト)mRNA発現レベルと比較して、qRT-PCRにより測定した。値を未処理細胞中のLPA発現に対し正規化した。残留LPA mRNAレベルの正規化した3回の繰り返し値の平均およびSDを黒色バーで示す。結果を図3に示す。
受容体媒介送達時の初代培養ヒト肝細胞中の種々の示されるL6-GalNAc複合化siRNAによるヒト初代培養肝細胞中のLPA-mRNAのノックダウン。
初代培養ヒト肝細胞(ThermoFisher)を30,000細胞/ウェルでコラーゲンコート96ウェルプレートに播種した(96ウェルフォーマット)。非サイレンシング対照を含むGalNAc-L6-複合化siRNAを、2種の示された濃度で細胞播種の直後に加えた。siRNA処理の24時間後に、全RNAをInviTrap RNA細胞HTS96ウェルキット(Stratec)を用いて単離した。LPA mRNA発現レベルを、ハウスキーピング転写物としてのApoB mRNAと比較して、qRT-PCRにより測定した。値を未処理細胞中のLPA mRNA発現に対し正規化し、残留LPA mRNAレベルをペアにしてバーとして表した(100nM 黒色バー、20nM 灰色バー)。正規化した3回の繰り返し値の平均およびSDを図4に示す。
マウス初代培養肝細胞を30,000細胞/ウェルの濃度で、コラーゲンプリコート96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific、#A1142803)に播種し、10nM~0.0001nMの範囲の濃度のsiRNA複合体で処理した。処理の24時間後、細胞を溶解しInviTrap(登録商標)RNA Cell HTS 96キット/C24x96preps(Stratec #7061300400)を用いて、製品プロトコルに従って、RNAを抽出した。TTRおよびハウスキーピングmRNA(PtenII)の転写物レベルをTaqMan分析により定量化した。
C57BL/6マウスを、0日目に1mg/kgのsiRNA複合体で皮下治療した。血清試料を眼窩洞出血により、7、14、および27日目に採取し、分析まで-20℃で貯蔵した。血清TTR定量化を、製造業者のプロトコル(試料希釈 1:8000または1:800)に従いMouse Prealbumin ELISA(ALPCO,41-PALMS/lot 22,2008003B)を用いて実施した。
カニクイザル初代培養肝細胞において、第2の鎖に結合した2つの単一GalNAcユニットを有するLPA標的化siRNAによるノックダウンは、第2の鎖の5’位置の三分岐GalNAcユニットの場合と比較して、同等の用量反応である。
データを図10に示す。
siRNA
mA、mU、mC、mG 2’-O-メチルRNA
fA、fU、fC、fG 2’-デオキシ-2’-フルオロRNA
(ps) ホスホロチオエート
(po) リン酸ジエステル
プライマー:
インビトロ実験
マウス初代培養肝細胞(Thermo Scientific:GIBCO Lot:#MC798)を解凍し、凍結保存培地を、5%FBS、1μMのデキサメタゾン、2mMのGlutaMax、1%のPenStrep、4mg/mlのヒト組換えインスリン、15mMのHEPESを補充したWilliams E培地と交換した。細胞密度を250000細胞/1mlに調節した。100μl/ウェルのこの細胞懸濁液をコラーゲンプリコート96ウェルプレートに播種した。試験品を各濃度に対し、同じ培地中で前希釈し(5倍濃縮)、この前希釈siRNAまたは培地のみの25μlを細胞に加えた。細胞を5%CO2下、37℃で培養した。処理の24時間後に、上清を廃棄し、細胞を冷PBSで洗浄し、250μlのRNAリシスバッファーS(Stratec)を加えた。15分の室温でのインキュベーション後、プレートを製造業者のプロトコルに従ってRNA単離を行うまで-80℃で貯蔵した。
mTTRおよびPTENマルチプレックスTaqMan分析のために、各治療群の10μlの単離RNAを、600nMのmTTR-プライマー、400nMのApoBプライマーおよび200nMの各プローブならびに0.2ユニットのRNAアーゼ阻害剤含有0.5ユニットのEuroscript II RTポリメラーゼを含む10μlのPCRマスターミックス(TAKYON low Rox)と混合した。48℃で10分のRTステップ、95℃で3分の初期変性ならびに95℃で10秒および60℃で1分の40サイクルにより、384ウェルプレート中でTaqMan分析を実施した。プライマーは、BHQ1、FAMおよびYYの内の2つを、配列のそれぞれの末端に1つずつ含む。
種々のsiRNA複合体のインビボ効力を比較するために、PBSに溶解した1mg/kgのsiRNAをC57BL/6マウスの肩甲部の皮下に投与した。n=6のコホートを、1日目に、Aldh2またはTmprss6を標的とするsiRNAで治療し、治療後の選択した時点で屠殺した。肝臓試料を、液体窒素中で急速凍結し、製造業者のマニュアルに従うInviTrap Spin Tissue RNA Mini Kit(stratec)でのRNA抽出まで、-80℃で貯蔵した。続けて、Aldh2、Tmprss6およびPtenの転写物レベルを上述のように定量した。
インビトロで肝臓細胞のエンドソーム/リソソームコンパートメント中のRNアーゼ安定性を調べるために、siRNAをスプラーグドーリーラットラット肝臓トリトソーム(Tebu-Bio,CatN.:R0610.LT,lot:1610405,pH:7.4,2.827Units/ml)中で0時間、4時間、24時間または72時間にわたりインキュベートした。酸性化環境を模擬するために、トリトソームを1:10で低pH緩衝剤(1.5M酢酸、1.5M酢酸ナトリウム pH4.75)と混合した。10μlのsiRNA(20μM)を30μlのこの酸性化トリトソームと混合後、37℃で示した時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、RNAを、生体液用の製品プロトコルに従いClarity OTX Starter Kit-Cartriges(Phenomenex CatNo:KSO-8494)で単離した。凍結乾燥RNAを30μlのH2O中で再構成し、4xローディングバッファーと混合し、分離、定性的半定量分析のために、5μlを20%TBE-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)にロードした。PAGEを120Vで2時間実施し、RNAを、臭化エチジウム染色とこれに続くBiorad Imaging systemを用いるデジタル画像化により可視化した。
化合物例を、下記の方法および当業者に既知の方法に従って合成した。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築を、ホスホラミダイト法を適用して固相合成により実施した。GalNAc複合化は、必要な数の結合されたアミノ修飾リンカー構成単位を有する、以前に構築され精製されたオリゴヌクレオチドへのGalNAc-カルボン酸構成単位のペプチド結合形成により達成された。
全てのオリゴヌクレオチドを、標準的ホスホラミダイト化学を用いて、AKTA oligopilot合成装置で合成した。商業的に入手できる固体担体および2'O-メチルRNAホスホラミダイト、2'フルオロ、2'デオキシRNAホスホラミダイト(全て標準的保護、ChemGenes,LinkTech)および商業的に入手できる3'-アミノ修飾剤TFAアミノC-6 lcaa CPG 500Å(Chemgenes)、Fmoc-アミノ-DMT C-7 CEホスホラミダイト(GlyC3Am)、3'-アミノ修飾剤C-3 lcaa CPG 500Å(C3Am)、Fmoc-アミノ-DMT C-3 CEDホスホラミダイト(C3Am)およびTFA-アミノC-6 CEDホスホラミダイト(C6Am)(Chemgenes)、3'-アミノ-修飾剤C7 CPG(C7Am)(Glen Research)、非ヌクレオシドTFAアミノホスホラミダイト(Pip)、非ヌクレオシドTFAアミノ固体担体(PipAm)(AM Chemicals)を使用した。過アセチル化ガラクトースアミン8は商業的に入手できる。
化合物2~5および(S)-DMT-セリノール(TFA)-ホスホラミダイト7を、文献に発表された方法により合成した(Hoevelmann et al.Chem.Sci.,2016,7,128-135)。
(S)-4-(3-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)-2-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)プロポキシ)-4-オキソブタン酸(6)。
ピリジン中の5の溶液に、無水コハク酸、続いてDMAPを加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。TLCにより判断して、全ての出発材料が消費された。反応物を濃縮した。粗製材料を、DCM(+1%トリエチルアミン)中の0%~5%メタノール勾配を用いて、シリカゲルでクロマトグラフ処理して、1.33gの6を得た(収率=38%)。m/z(ESI-):588.2(100%)、(C30H29F3NO8-としての計算値 [M-H]- 588.6)。1H-NMR:(400MHz,CDCl3)δ[ppm]=7.94(d,1H,NH),7.39-7.36(m,2H,CHアリール),7.29-7.25(m,7H,CHアリール),6.82-6.79(m,4H,CHアリール),4.51-4.47(m,1H),4.31-4.24(m,2H),3.77(s,6H,2xDMTr-OMe),3.66-3.60(m,16H,HNEt3 +),3.26-3.25(m,2H),2.97-2.81(m,20H,NEt3),2.50-2.41(4H,m),1.48-1.45(m,26H,HNEt3 +),1.24-1.18(m,29H,NEt3)。
(S)-DMT-セリノール(TFA)-スクシネート-lcaa-CPG(10)
GalNAcシントン9の合成を、Nair et al.J.Am.Chem.Soc.,2014,136(49),pp 16958-16961に記載の方法に従って実施した(2つのステップで46%収率)。
特徴付けるデータは、発表データと一致した。
全ての一本鎖オリゴヌクレオチドは、上記および図5および6に記載の反応条件に従って合成され、表3および4に概要が示されている。
全ての最終一本鎖生成物をAEX-HPLCにより分析して、それらの純度を証明した。純度は、%FLP(完全長生成物の%)で示され、これは、最終生成物のAEX-HPLC分析のUV出力における帰属生成物シグナル下のUV面積のパーセンテージである。それぞれの一本鎖生成物(非修飾、アミノ修飾、前駆物質またはGalNAc複合化オリゴヌクレオチド)の確認を、LC-MS分析により実施した。
GalNAcシントン(9)の複合化は、ペプチドカップリング剤を用いて、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖11のセリノールアミノ官能基へのカップリングにより達成された。従って、それぞれのアミノ修飾前駆物質分子11をH2Oに溶解し(500OD/mL)、DMSO(DMSO/H2O、2/1、v/v)を加え、続けて、DIPEA(総体積の2.5%)を加える。別の反応容器中を用いて、DMSO中の8当量のDIPEAの存在下で、2当量(アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド11中でアミノ官能基当たり)のカルボン酸成分を、2当量のHBTUと反応させることにより、GalN(Ac4)-C4-酸(9)の予備活性化を実施した。2分後に、予備活性化化合物9がそれぞれのアミノ修飾前駆物質分子の溶液に添加された。30分後に、反応の進行をLCMSまたはAEX-HPLCでモニターした。複合化反応の完結時、10x iPrOH 0.1x2M NaClの添加により粗生成物を沈殿させて、遠心分離およびデカンテーションにより回収した。GalNAc部分中のアセチル化ヒドロキシル基を解放するために、得られたペレットを40%のMeNH2中に溶解し(1mL/500OD)、室温で15分後、H2Oで希釈し(1:10)、アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより最終的に再度精製し、凍結乾燥して、最終生成物12(表5)を得た。
GalNAcシントン(9)の複合化は、ペプチドカップリング剤を用いて、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖14のアミノ官能基にカップリングすることにより達成された。従って、それぞれのアミノ修飾前駆物質分子14をH2Oに溶解し(500OD/mL)、DMSO(DMSO/H2O、2/1、v/v)を加え、続けて、DIPEA(総体積の2.5%)を加える。別の反応容器中で、GalN(Ac4)-C4-酸(9)の予備活性化を、DMSO中の8当量のDIPEAの存在下で2当量(アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド14中のアミノ官能基当たり)のカルボン酸成分を2当量のHBTUと反応させることにより実施した。2分後に、予備活性化化合物9がそれぞれのアミノ修飾前駆物質分子の溶液に添加された。30分後に、反応の進行をLCMSまたはAEX-HPLCでモニターした。複合化反応の完結時、10x iPrOH 0.1x2M NaClの添加により粗生成物を沈殿させて、遠心分離およびデカンテーションにより回収した。GalNAc部分中のアセチル化ヒドロキシル基を解放するために、得られたペレットを40%のMeNH2中に溶解し(1mL/500OD)、室温で15分後、H2Oで希釈し(1:10)、アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより最終的に再度精製し、凍結乾燥して、最終生成物15(表6)を得た。
次の配列に対する修飾の凡例:
fは、2’フルオロ 2’デオキシリボヌクレオチドまたは2’-フルオロリボヌクレオチドを意味する(これらの用語は、互換性がある)。
mは、2'Oメチルリボヌクレオチドを意味する。
(ps)は、ホスホロチオエート結合を意味する。
FAM=6-カルボキシフルオレセイン
BHQ=Black Hole Quencher 1
YY=Yakima Yellow
Ser(GN)は、セリノール由来リンカー部分:
GNは:
C4XLTは:
C6XLTは:
ST23は:
C4XLT-phosは:
C6XLT-phosは:
ST23-phosは:
アンチセンス鎖-STS16001AL33(配列番号127)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)3’
センス鎖-STS16001BL20(配列番号128)
5' Ser(GN)(ps)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA 3'
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BV1L42(配列番号130)
Ser(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)Ser(GN)
アンチセンス鎖-STS16001AL33(配列番号127)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)3’
センス鎖-STS16001BV1L42(配列番号130)
5' Ser(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)Ser(GN)3´
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BV1L75(配列番号142)
5’ Ser(GN)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA Ser(GN)3’
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BV16L42(配列番号143)
5’ Ser(GN)(ps)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mA fA(ps)Ser(GN)3’
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BV20L75(配列番号144)
5’ Ser(GN)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mA fA Ser(GN)3’
アンチセンス鎖-(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BV1L94(配列番号145)
5’ Ser(GN)(ps)Ser(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)Ser(GN)(ps)Ser(GN)3’
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
センス鎖-STS16001V1BL96(配列番号146)
5’ C6Am(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)C7Am(GN)3’
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
センス鎖-STS16001V1BL97(配列番号147)
5’ GlyC3Am(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)GlyC3Am(GN)3’
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
アンチセンス鎖-(配列番号148)
5’ PipAm(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)PipAm(GN)3’
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
センス鎖-STS16001V1BL88(配列番号149)
5´ C3Am(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)C3Am(GN)3´
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
センス鎖-STS16001V1BL87(配列番号150)
5´ C6Am(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)GlyC3Am(GN)3´
アンチセンス鎖(配列番号151)
mU(ps)fC(ps)mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU(ps)fU(ps)mC
センス鎖(配列番号152)
Ser(GN)(ps)fG(ps)mA(ps)fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA(ps)mG(ps)fA(ps)Ser(GN)
アンチセンス鎖(配列番号153)
mA(ps)fU(ps)mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU(ps)fC(ps)mU
センス鎖(配列番号154)
Ser(GN)(ps)fA(ps)mG(ps)fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC(ps)mA(ps)fU(ps)Ser(GN)
アンチセンス鎖(配列番号155)
mA(ps)fA(ps)mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU(ps)fG(ps)mA
センス鎖(配列番号156)
Ser(GN)(ps)fU(ps)mC(ps)fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG(ps)mU(ps)fU(ps)Ser(GN)
アンチセンス鎖(配列番号135)
mA(ps)fU(ps)mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC(ps)fC(ps)mG
センス鎖(配列番号136)
Ser(GN)(ps)fC(ps)mG(ps)fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU(ps)mA(ps)fU(ps)Ser(GN)
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BL20(配列番号128)
Ser(GN)(ps)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
アンチセンス鎖-STS16001AL33(配列番号127)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)
センス鎖-STS16001BV1(配列番号157)
fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
アンチセンス鎖-STS18001A(A0130、配列番号132)
mU(ps)fC(ps)mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA(ps)fC(ps)mG
センス鎖-STS18001BL4(A0131、配列番号133)
[(ST23)(ps)]3 C4XLT(ps)fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC(ps)mG(ps)fA
アンチセンス鎖-STS16001AL33(配列番号127)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BL4(配列番号134)
5’[(ST23)(ps)]3 C4XLT(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
アンチセンス鎖(配列番号138)
mC(ps)fU(ps)mU fA mC fU mC fU mC fG mC fC mC fA mA fG mC(ps)fG(ps)mA
センス鎖(配列番号139)
[(ST23)(ps)]3(C6XLT)(ps)fU mC fG mC fU mU fG mG fG mC fG mA fG mA fG mU fA(ps)mA(ps)fG
アンチセンス鎖(配列番号151)
mU(ps)fC(ps)mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU(ps)fU(ps)mC
センス鎖(配列番号158)
[ST23(ps)]3 ltrb(ps)fG mA fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA(ps)mG(ps)fA
アンチセンス鎖(配列番号153)
mA(ps)fU(ps)mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU(ps)fC(ps)mU
センス鎖(配列番号159)
[ST23(ps)]3 ltrb(ps)fA mG fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC(ps)mA(ps)fU
アンチセンス鎖(配列番号160)
mU(ps)fA(ps)mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU(ps)fG(ps)mA
センス鎖(配列番号161)
[ST23(ps)]3 ST41(ps)fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG(ps)mU(ps)fA
アンチセンス鎖(配列番号135)
mA(ps)fU(ps)mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC(ps)fC(ps)mG
センス鎖(配列番号162)
[ST23(ps)]3 C6XLT(ps)fC mG fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU(ps)mA(ps)fU
一般的方法セクションの「インビトロ実験」下での上記方法に従った。
一般的方法セクションの「インビトロ実験」下での上記方法に従った。
本発明の複合体、複合体8~12による、0.01nM、0.1nM、0.5nM、1nMおよび10nMでの処理の24時間後のマウス初代培養細胞中の標的遺伝子発現は、図12に示すように、標的遺伝子発現が陰性対照(「UT」バーおよびLuc[基準複合体3]を参照)に比較して、複合体の用量が増加するに伴い減少することを示した。これは、第1の鎖が標的遺伝子に結合し、それにより遺伝子発現を低減させることを示す。特に、複合体8、9、10および11は、0.01nMで最も効果的な複合体であることが以前に示された複合体2と同等であるまたは複合体2よりも良好であるように見える。
複合体19もまた、図13に示すように、陰性対照に比較して、標的遺伝子発現を低減することが示された(「UT」バーおよび非標的化siRNAであり、基準複合体5とも呼ばれるCtrを参照)。これは、第1の鎖が標的遺伝子に結合し、それにより遺伝子発現を低減させることを示す。
複合体15~18
一般的方法セクションの「インビボ実験」下での上記方法に従った。
一般的方法セクションの「トリトソーム安定性アッセイ」下での上記方法に従った。
図17は、複合体2、4、5、6および7に関する血清安定性試験から得られた結果を示す。図18は、複合体2、8、9、10、11および12の血清安定性を示す。
試験した本発明の全ての複合体は、対照に比べて、血清中でより安定である。
初代培養ヒト(ロットHu1823)およびカニクイザル(ロットCY367)肝細胞および培地をLife Technologiesから調達した。製造業者により記載のように、初代培養肝細胞を解凍し、5%ウシ胎仔血清、DMSO中の1μMデキサメタゾン(DMSO最終濃度=0.01%)および3.6%v/vの解凍/播種カクテルA(Thermo Fisher Scientific、CM3000)を補充したウイリアムスE培地からなる播種培地(Life Technologies)に播種した
アンチセンス鎖-複合体21(配列番号165)
5’ mA(ps)fU(ps)mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC(ps)fC(ps)mG 3’
センス鎖-STS16001BL20(配列番号164)
5´ [ST23(ps)]3 C6XLT(ps)mC mG mG mU mA mA fU fG fG mA mC mA mG mA mG mU mU(ps)mA(ps)mU 3´
倍率変化=2-ΔΔCt。
特に断りのない限り、実施例で示される全ての値は、平均±SDを意味する。IC50値を、GraphPad Prism7でシグモイド型4パラメーター用量反応曲線を使い計算した。
複合体21のインビボ抗力を試験するために、雄カニクイザルを使って、薬力学的調査を実施した。動物を各群当り3匹の動物を含む4つの群に分類した。投与の前に、血清を調製して各動物に対しベースラインLp(a)レベルを確立した。1日目に、複合体21を0.9%生理食塩水中に配合し、各動物は、0.1、0.3、1.0および3.0mg/kgの投与量の複合体21の単回投与を受けた。
以下は、本発明の記載である。
1.細胞のLPAの発現を抑制するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部および第1の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第2の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも1つの二重鎖領域を含み、上記第1の鎖がLPA遺伝子から転写されたRNAの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記第1の鎖が次の配列:配列番号9、5、1、3、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41または43から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸。
2.上記第1の鎖が配列番号9のヌクレオチド配列を含み、任意選択で上記第2の鎖が配列番号10のヌクレオチド配列を含み、または上記第1の鎖が配列番号5のヌクレオチド配列を含み、任意選択で上記第2の鎖が配列番号6のヌクレオチド配列を含む、記載1の核酸。
3.細胞中のLPAの発現を抑制するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部および第1の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第2の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも1つの二重鎖領域を含み、上記第1の鎖が、LPA遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記第1の鎖が、次の配列:配列番号9または5から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸。
4.上記第1の鎖および/または上記第2の鎖が、それぞれ17~35ヌクレオチド長である、記載1~3のいずれかの核酸。
5.少なくとも1つの二重鎖領域が、17~25個、好ましくは19~25個の連続ヌクレオチド塩基対からなる、記載1~4のいずれかの核酸。
6.
a)両端で平滑末端であり;または
b)一端でオーバーハングを有し、他端で平滑末端を有し;または
c)両端でオーバーハングを有する、
記載1~5のいずれかの核酸。
7.第1および/または第2の鎖上の1個または複数のヌクレオチドが修飾されて、修飾ヌクレオチドを形成する、記載1~6のいずれかの核酸。
8.第1および/または第2の鎖の一方または両方の末端の1、2または3個の末端3’ヌクレオチド間および/または5’ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む、記載1~7のいずれかの核酸。
9.リガンドに結合される、記載1~8のいずれかの核酸。
10.リガンドが、(i)1個または複数のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分またはその誘導体、および(ii)リンカーを含み、リンカーが、少なくとも1個のGalNAc部分またはその誘導体を核酸に結合する、記載9の核酸。
11.核酸が、式(I):
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
の化合物を含むリガンドに結合され、式中、
Sは、サッカライドであり、好ましくはサッカライドはN-アセチルガラクトサミンであり;
X1は、C3-C6アルキレンまたは(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-であり、mは1、2、または3であり;
Pは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート、好ましくはチオホスフェートであり;
X2は、式(-CH2)n-O-CH2-のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、n=1~6であり;
Aは、分岐ユニットであり;
X3は、架橋ユニットであり;
記載1~8のいずれかで定義される核酸が、ホスフェートまたは修飾ホスフェート、好ましくはチオホスフェートを介してX3に結合される、
記載9~10のいずれかの核酸。
12.第1のRNA鎖は、式(X):
第2のRNA鎖は、式(XI):
cおよびdは、独立に0または1であり;
Z1およびZ2は、それぞれ第1および第2のRNA鎖のRNA部分であり;
YはOまたはSであり;
nは0、1、2または3であり;および
L1は、リガンドが結合するリンカーであり;および
b+c+dは、2または3である、記載9~10のいずれかの核酸。
13. 細胞のLPAの発現を抑制するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部および第1の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第2の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも1つの二重鎖領域を含み、上記第1の鎖がLPA遺伝子から転写されたRNAの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記第1の鎖が、配列番号9のヌクレオチド配列を含む、および好ましくはそれからなり、および任意選択で、上記第2の鎖が配列番号10のヌクレオチド配列を含む、および好ましくはそれからなる、核酸。
14.リガンドに結合され、次の構造:
15.第1の鎖上の3個の3’末端ヌクレオチドのそれぞれの間、および3個の5’末端ヌクレオチドのそれぞれの間で2つのホスホロチオエート結合、および第2の鎖の3’末端の3個の末端ヌクレオチド間で2つのホスホロチオエート結合を含み、リガンドが第2の鎖の5’末端に結合される、記載14の核酸。
16.リガンドに結合され、第1のRNA鎖が式(XV):
bは0または1であり;および
第2のRNA鎖は、式(XVI):
式中、
Z1およびZ2は、それぞれ第1および第2のRNA鎖のRNA部分であり;
YはOまたはSであり;
R1はHまたはメチルであり;
nは0、1、2または3であり;および
Lは、式(XV)および(XVI)で同じまたは異なり、およびLは、
-(CH2)q-、q=2~12;
-(CH2)r-C(O)-、r=2~12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-、s=1~5;
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-、tは独立に1~5であり;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-、uは独立に1~5であり;および
-(CH2)v-NH-C(O)-、vは2~12であり;
存在する場合、末端C(O)はNH基に結合され;
およびb+c+dは、2または3である、記載13の核酸。
17.以下に示す配列および修飾を含む、記載13~16のいずれかの核酸:
式中、特定の修飾は、下記番号で示される:
1=2'F-dU、
2=2’F-dA、
3=2'F-dC、
4=2'F-dG、
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG。
18.第1の鎖の5’末端から位置2および14のヌクレオチドが、2’フルオロ修飾により修飾され、および第1の鎖の位置11、または13、または11および13、または11~13に対応する第2の鎖上のヌクレオチドが、2’フルオロ修飾により修飾される、記載13~16のいずれかの核酸。
19.薬物としての使用のための、好ましくは疾患または病態の予防または治療またはリスク低減のための、記載1~18のいずれかの核酸および任意選択で、送達担体および/または生理学的に許容可能な賦形剤および/または担体および/または希釈剤および/または緩衝液および/または保存剤を含む組成物であって、疾患または病態が好ましくは、心臓血管疾患であり、心臓血管疾患が好ましくは、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症、冠状動脈性心疾患または大動脈弁狭窄症および/または高レベルのLp(a)含有粒子に関連するいずれか他の疾患または病態である、組成物。
20.記載1~18のいずれかの核酸を含み、送達ビークル、好ましくはリポソームおよび/または生理学的に許容可能な賦形剤および/または担体および/または希釈剤をさらに含む医薬組成物。
21.疾患または病態の予防または治療またはリスク低減のための、記載1~18のいずれかの核酸または記載20の医薬組成物の使用であって、疾患または病態が好ましくは、心臓血管疾患であり、心臓血管疾患が好ましくは、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症、冠状動脈性心疾患または大動脈弁狭窄症および高レベルのLp(a)含有粒子に関連するいずれか他の疾患または病態である、使用。
22.記載1~18のいずれかの核酸を含む組成物または記載19~20の組成物を、治療を必要としている個体に投与することを含む、疾患、障害または症候群を予防または治療する方法であって、好ましくは核酸または組成物が、皮下に、静脈内にまたは経口、直腸または腹腔内経路などのいずれか他の適用経路を用いて対象に投与される、方法。
Claims (15)
- 細胞中のLPAの発現を抑制するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部および前記第1の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第2の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも1つの二重鎖領域を含み、前記第1の鎖が、LPA遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、前記第1の鎖が、
5’ mA(ps)fU(ps)mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC(ps)fC(ps)mG 3’ (配列番号165)
のヌクレオチド配列を含み、前記第2の鎖が、
5’ mC mG mG mU mA mA fU fG fG mA mC mA mG mA mG mU mU(ps) mA(ps) mU 3’(配列番号163)
のヌクレオチド配列を含み、
fA、fC、fGおよびfUは、2’-デオキシ2’-フルオロリボヌクレオチドを意味し、
mA、mC、mGおよびmUは、2’-O-メチルリボヌクレオチドを意味し、かつ
(ps)は、ホスホロチオエート結合を意味する、核酸。 - 前記第1の鎖が、
5’ mA(ps)fU(ps)mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC(ps)fC(ps)mG 3’ (配列番号165)
のヌクレオチド配列からなり、
fA、fC、fGおよびfUは、2’-デオキシ2’-フルオロリボヌクレオチドを意味し、
mA、mC、mGおよびmUは、2’-O-メチルリボヌクレオチドを意味し、かつ
(ps)は、ホスホロチオエート結合を意味する、請求項1に記載の核酸。 - 前記第2の鎖が、
5’ mC mG mG mU mA mA fU fG fG mA mC mA mG mA mG mU mU(ps) mA(ps) mU 3’(配列番号163)
のヌクレオチド配列からなり、
fA、fC、fGおよびfUは、2’-デオキシ2’-フルオロリボヌクレオチドを意味し、
mA、mC、mGおよびmUは、2’-O-メチルリボヌクレオチドを意味し、かつ
(ps)は、ホスホロチオエート結合を意味する、請求項1または2に記載の核酸。 - リガンドに結合されている、請求項1~3のいずれか1項に記載の核酸を含む、複合化核酸。
- 前記リガンドが、(i)1個または複数のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分、および(ii)リンカーを含み、前記リンカーが、前記核酸に少なくとも1個のGalNAc部分を結合する、請求項4に記載の複合化核酸。
- 前記核酸が、式(I):
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
の化合物を含むリガンドに結合され、式中、
Sは、N-アセチルガラクトサミンであり;
X1は、C3-C6アルキレンまたは(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-を表し、mは、1、2、または3であり;
Pは、ホスフェートまたはチオホスフェートであり;
X2は、n=1~6である式(-CH2)n-O-CH2-のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり;
Aは、分岐ユニットであり;
X3は、架橋ユニットを表し;
前記核酸が、ホスフェートまたはチオホスフェートを介してX3に結合されている、請求項4または5に記載の複合化核酸。 - 前記核酸が、前記第2の鎖の5’末端を介してX 3 に結合されている、請求項6に記載の複合化核酸。
- 前記リガンドが、前記核酸の前記第2の鎖の5’末端に結合されている、請求項8に記載の複合化核酸。
- 薬物として使用するための、請求項1~11のいずれか1項に記載の核酸または複合化核酸、および任意選択で送達担体および/または生理学的に許容可能な賦形剤および/または担体および/または希釈剤および/または緩衝液および/または保存剤を含む組成物。
- 前記組成物は、疾患または病態の予防または治療またはリスク低減に使用するための組成物であって、前記疾患または病態が心臓血管疾患である、請求項12に記載の組成物。
- 前記心臓血管疾患が、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症、冠状動脈性心疾患若しくは大動脈弁狭窄症、または高レベルのLp(a)粒子に関連するいずれか他の疾患または病態である、請求項13に記載の組成物。
- 請求項1~11のいずれか1項に記載の核酸または複合化核酸を含みかつ送達担体および/または生理学的に許容可能な賦形剤および/または担体および/または希釈剤をさらに含む、医薬組成物。
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