JP7245254B2 - 細胞におけるlpaの発現を抑制するための核酸 - Google Patents
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Description
1=2-F-dU、
2=2-F-dA、
3=2’F-dC、
4=2’F-dG、
5=2’-OMe-rU;
6=2’-OMe-rA;
7=2’-OMe-rC;
8=2’-OMe-rG。
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
を含み得、式中、
Sは、サッカライドであり、サッカライドはN-アセチルガラクトサミンであり;
X1は、C3-C6アルキレンまたは(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-であり、mは1、2、または3であり;
Pは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)であり;
X2は、式(-CH2)n-O-CH2-のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、n=1~6であり;
Aは、分岐ユニットであり、
X3は、架橋ユニットであり;
本発明による核酸は、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)を介してX3に結合される。
(i)第2のRNA鎖は、標的化リガンドに5’末端で結合され、(a)第2のRNA鎖はまた、標的化リガンドに3’末端でも結合され、第1のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(b)第1のRNA鎖は、3’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(c)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方はまた、3’末端で標的化リガンドに結合され;もしくは
(ii)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方は、3’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の5’末端は結合されず、または
本発明は、細胞中のLPA遺伝子の発現を抑制するための複合体に関し、上記複合体は核酸部分およびリガンド部分を含み、上記核酸部分は、第1のRNA鎖の少なくとも一部および第1の鎖に少なくとも部分的に相補的な第2のRNA鎖の少なくとも一部を含み、上記第1の鎖が上記LPA遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記リガンド部分がリンカー部分、および細胞のインビボ標的化のための標的化リガンドを含み、一方のまたは両方のRNA鎖の3’および/または5’末端のみに結合され、第1のRNA鎖の5’末端は結合されず、
(i)第2のRNA鎖は、標的化リガンドに5’末端で結合され、(a)第2のRNA鎖はまた、標的化リガンドに3’末端でも結合され、第1のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(b)第1のRNA鎖は、3’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(c)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方はまた、3’末端で標的化リガンドに結合され;もしくは
(ii)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方は、3’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の5’末端は結合されない。
(ii)変化、例えば、リボース糖の成分の置換、例えば、リボース糖上の2’ヒドロキシルの置換;
(iii)「デホスホ」リンカーによるホスフェート部分の置換;
(iv)天然の塩基の修飾または置換;
(v)リボースホスフェート骨格の置換または修飾;
(vi)RNAの3’末端または5’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置換または部分の結合、例えば、RNAの3’または5’末端への蛍光標識部分の結合。
例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチド核酸(PNA)ヌクレオシド代用物が挙げられる。特定の実施形態では、PNA代用物が使用され得る。
リガンドは、式Iの化合物:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
を含み得、式中、
Sは、サッカライドであり、ここでサッカライドはN-アセチルガラクトサミンであり;
X1は、C3-C6アルキレンまたは(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-であり、ここでmは1、2、または3であり;
Pは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)であり;
X2は、式(-CH2)n-O-CH2-のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、n=1~6であり;
Aは、分岐ユニットであり、
X3は、架橋ユニットであり;
本発明による核酸は、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)を介してX3に結合される。
X3は、-C1-C20アルキレン-、-C2-C20アルケニレン-、式(C1-C20アルキレン)-O-(C1-C20アルキレン)-のアルキレンエーテル、-C(O)-C1-C20アルキレン-、-C0-C4アルキレン(Cy)C0-C4アルキレン-(式中、Cyは置換もしくは非置換5員もしくは6員シクロアルキレン、アリーレン、ヘテロシクリレンまたはヘテロアリーレン環である)、-C1-C4アルキレン-NHC(O)-C1-C4アルキレン-、-C1-C4アルキレン-C(O)NH-C1-C4アルキレン-、-C1-C4アルキレン-SC(O)-C1-C4アルキレン-、-C1-C4アルキレン-C(O)S-C1-C4アルキレン-、-C1-C4アルキレン-OC(O)-C1-C4アルキレン-、-C1-C4アルキレン-C(O)O-C1-C4アルキレン-、および-C1-C6アルキレン-S-S-C1-C6アルキレン-から選択され得る。
X3は、式-(C1-C20アルキレン)-O-(C1-C20アルキレン)-のアルキレンエーテルであり得る。X3は、式-(C1-C20アルキレン)-O-(C4-C20アルキレン)-のアルキレンエーテルであり得、上記(C4-C20アルキレン)は、Zに結合される。X3は、-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-および-CH2-O-C8H16-、特に、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-および-CH2-O-C8H16-からなる群から選択され得、それぞれの場合で、-CH2-基はAに結合される。
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
を含み得、式中、
Sは、サッカライドであり;
X1は、C3-C6アルキレンまたは(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-であり、ここでmは1、2、または3であり;
Pは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)であり;
X2は、C1-C8アルキレンであり;
Aは;
から選択される分岐ユニットであり、X3は、架橋ユニットであり;
本発明による核酸は、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)を介してX3に結合される。
X3はC1-C20アルキレンであり得る。好ましくは、X3は、-C3H6-、-C4H8-、-C6H12-および -C8H16-、特に、-C4H8-、-C6H12-および-C8H16-からなる群から選択される。
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (III)
の化合物を含み得、式中、
Sは、サッカライドであり;
X1は、C3-C6アルキレンまたは(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-であり、ここでmは1、2、または3であり;
Pは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)であり;
X2は、式-C3H6-O-CH2-のアルキレンエーテルであり;
Aは、分岐ユニットであり、
X3は、-CH2-O-CH2-、-CH2-O-C2H4-、-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-、および-CH2-O-C8H16-からなる群から選択される式のアルキレンエーテルであり、それぞれの場合で、-CH2-基はAに結合され;
X3は、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)により本発明による核酸に結合される。
で表すことができ、式中、Y1およびY2は、それぞれ独立に、=O、=S、-O-、-OH、-SH、-BH3、-OCH2CO2、-OCH2CO2Rx、-OCH2C(S)ORx、および-ORxであり、式中、Rxは、C1-C6アルキルであり、
は、化合物の残りの部分への結合を示す。
例えば、Y1は-OHであり、Y2は=Oまたは=Sであり得;または
Y1は-O-であり、Y2は=Oまたは=Sであり得;
Y1は=Oであり、Y2は-CH3、-SH、-ORx、または-BH3であり得る。
(i)第2のRNA鎖は、標的化リガンドの5’末端に結合され、(a)第2のRNA鎖はまた、標的化リガンドの3’末端でも結合され、第1のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(b)第1のRNA鎖は、3’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(c)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方はまた、3’末端で標的化リガンドに結合され;もしくは
(ii)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方は、3’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の5’末端は結合されない。
2個または3個のセリノール由来リンカー部分は、直列に、例えば以下に示すように、結合され得る:
式中、nは1または2であり、YはSまたはOである。
は、式(XIV):
の結合部分であり、式中、n、Y、R1およびLは下記で定義され、Lは、標的化リガンド、例えば、GalNAcに結合され、ホスホロ基のOはRNA鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
の化合物であり、ここでbは0または1であり;および
第2のRNA鎖は、式(XI):
の化合物であり、式中、
cおよびdは、独立に0または1であり;
Z1およびZ2はそれぞれ、第1と第2のRNA鎖のRNA部分であり;
Yは、OまたはSであり;
nは、0、1、2または3であり;および
L1は、リガンドが結合されるリンカーであり;
およびb+c+dは、2または3である。
の化合物であり、ここでbは0または1であり;および
第2のRNA鎖は、式(XVI):
の化合物であり、式中、cおよびdは、独立に0または1であり;
式中、
Z1およびZ2はそれぞれ、第1と第2のRNA鎖のRNA部分であり;
Yは、OまたはSであり;
R1は、Hまたはメチルであり;
nは、0、1、2または3であり;および
Lは、式(XV)および(XVI)で同じまたは異なり、Lは、
-(CH2)r-C(O)-、r=2~12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2C(O)-、s=1~5;
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-、tは独立に1~5である;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-、uは独立に1~5である;および
-(CH2)v-NH-C(O)-、vは2~12である;
からなる群より選択され;
末端C(O)(存在する場合)は、NH基に結合され;
ここでb+c+dは、2または3である。
の化合物であり、ここでbは0または1であり;および
第2のRNA鎖は、式(XIII):
の化合物であり、式中、
cおよびdは、独立に0または1であり;
Z1およびZ2はそれぞれ、第1と第2のRNA鎖のRNA部分であり;
Yは、OまたはSであり;
nは、0、1、2または3であり;および
L2は、式(XII)および(XIII)で同じまたは異なり、L2は、b、cおよびdの括弧内の部分で同じまたは異なり、L2は、
からなる群より選択され;または
nは、0であり、L2は:
であり、末端OH基は、存在せず、その結果次の部分が形成され;
式中、
Fは、飽和分枝または非分枝(例えば、非分岐)C1-8アルキル(例えば、C1-6アルキル)鎖であり、炭素原子の1個が酸素原子で任意に置換されてもよいが、但し、上記酸素原子が、少なくとも2個の炭素原子により別のヘテロ原子(例えば、OまたはN原子)から離されることが条件であり;
Lは、式(I)および(II)で同じまたは異なり、Lは、
-(CH2)r-C(O)-、r=2~12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-、s=1~5;
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-、tは独立に1~5である;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-、uは独立に1~5である;および
-(CH2)v-NH-C(O)-、vは2~12である;
からなる群より選択され;
末端C(O)(存在する場合)は、NH基に結合され;
ここでb+c+dは、2または3である。
-(CH2)r-C(O)-、r=2~12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-、s=1~5;
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-、tは独立に1~5である;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-、uは独立に1~5である;および
-(CH2)v-NH-C(O)-、vは2~12である;
からなる群から選択され;
末端C(O)は、NH基に結合される。
すなわち、セリン異性体由来の(S)セリノールアミダイトまたは(S)セリノールスクシネート固体担持構成単位に基づく。
化合物例は、下記の方法および当業者に既知の方法に従って合成できる。スキームは、特定の複合体の合成を示すが、その他の請求複合体も類似の方法により調製し得ることが理解されよう。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築は、例えば、ホスホラミダイト法を適用する固相合成により実施され得る。固相合成は、塩基または修飾構成単位担持lcaa CPGから開始し得る。ホスホラミダイト合成カップリングサイクルは、1)DMT除去、2)必要とされるDMTマスクホスホラミダイトおよびベンジルチオテトラゾール(BTT)であり得る活性化剤を用いる鎖延長、3)非延長オリゴヌクレオチド鎖のキャッピング、続けて、ヨウ素(リン酸ジエステル結合が望ましい場合)またはEDITH(ホスホロチオエート結合が望ましい場合)によるP(III)からp(V)への酸化、および再度のキャッピング(Cap/Ox/CapまたはCap/Thio/Cap)、からなる。GalNAc複合化は、必要な数の結合されるアミノ修飾リンカー構成単位を有する、前に構築され精製されたオリゴヌクレオチドへのGalNAc-カルボン酸構成単位のペプチド結合形成により達成され得る。必要な構成単位は、商業的に入手でき、または合成については以下に記載する。全ての最終一本鎖生成物をAEX-HPLCにより分析して、それらの純度を検査した。純度は、%FLP(完全長生成物の%)で示し、これは、最終生成物のAEX-HPLC分析のUV出力における帰属生成物シグナル下のUV面積のパーセンテージである。それぞれの一本鎖生成物の確認をLC-MS分析により実施した。
スキーム1:DMT-セリノール(TFA)リンカーシントンの合成
i)トリフルオロ酢酸エチル、NEt3、MeOH、0℃、16時間、2:86% 5:90%、ii)DMTCL、ピリジン、0℃、16時間、74%、iii)LIBH4、EtOH/THF(1/1、v/v)、0℃、1時間、76%、iv)2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホラミダイト、EtNiPr2、CH2Cl2、56%、v)無水コハク酸、DMAP、ピリジン、RT、16時間、38%、vi)HBTU、DIEA、アミノ-lcaa CPG(500A)、RT、18時間、29%(26umol/g担持量)。
(vii)TMSOTf、DCM、ヘキセノール、viii)RuCl3、NaIO4、DCM、CH3CN、H2O、2ステップで46%。
GalNAcシントン9の合成は、商業的に入手できる過アセチル化ガラクトースアミン8から出発して、Nairら(2014)に記載の方法に従って調製できる。
固相合成後、GalNAc複合化は、HBTUなどのペプチドカップリング剤による、GalN(Ac4)-C4-酸(9)の予備活性化により達成された。その後、予備活性化酸9を11(例えば、A0264)中のアミノ基と反応させて、中間体GalN(Ac4)複合体を形成した。GalNAc部分中のヒドロキシルを保護するアセチル基は、メチルアミン処理により切断されて、目的化合物例12(例えば、A0268)を得て、これを、AEX-HPLCおよびSECによりさらに精製した。
セリノール以外のアミノ修飾構成単位は、種々の供給業者からから商業的に入手でき、セリノールの代わりに使用して、GalNAc複合化を可能にする反応性アミノ基を得ることができる。例えば、下表6に示す商業的に入手できる構成単位を用いて、10-1~10-3などのアミノ修飾剤担持CPGを使用すること、続けて上記のような配列アセンブリングおよび最終的にアミノ修飾剤の13-1、13-2または13-4などのホスホラミダイトのカップリングにより、非セリノール由来アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド14(スキーム5A)を得ることができる。
得られた前駆物質オリゴヌクレオチド14は、その後、GalN(Ac4)-C4-酸(9)と複合化されて、目的の化合物例15(スキーム6)を与えることができる。
基準複合体3~4における一本鎖三分岐GalNAc複合体の合成
三分岐GalNAcクラスター複合化SiRNAのオリゴヌクレオチド合成は、図14に概要が示される。オリゴヌクレオチド鎖構築は、化合物例のA0006におけるように、塩基担持担体、例えば、5’DMT-2’FdA(bz)-スクシネート-lcaa-CPGを用いて開始される。1)DMT除去、2)必要とされるDMTマスクホスホラミダイトを用いる鎖延長、3)非延長オリゴヌクレオチド鎖のキャッピング、続けてヨウ素またはEDITH(ホスホロチオエート結合が望ましい場合)によるP(III)からp(V)への酸化、および再度のキャッピング(Cap/Ox/CapまたはCap/Thio/Cap)、からなるホスホラミダイト合成カップリングサイクルは、完全長の生成物が得られるまで反復される。三価の三分岐GalNAcクラスターのオンカラム複合化に対しては、必要な三価の分岐アミダイトC4XLT-phosを用いる同じ合成サイクルと、続いてGalNAcアミダイトST23-phosを用いる別の合成サイクルラウウンドが適用された。この最後の合成装置ステップの完了時に、オリゴヌクレオチドが固体担体から切断され、追加の保護基がメチルアミン処理により除去され得る。粗生成物はその後、AEX-HPLCおよびSECによりそれぞれ精製された。
二本鎖複合体を得るために、個別の一本鎖がH2O中の60OD/mLの濃度に溶解される。両方の個別のオリゴヌクレオチドを反応容器に一緒に加えることができる。反応監視のために、滴定を行うことができる。第1の鎖は、260nmでのUV-吸収により測定して、第2の鎖に比べて25%過剰で添加される。上記反応混合物を、例えば、80℃に5分間加熱後、ゆっくり室温に冷却する。二本鎖形成をイオン対逆相HPLCにより監視し得る。残留一本鎖UV面積から、第2の鎖の必要量を計算し、反応混合物に添加できる。反応物を、例えば、80℃に再度加熱後、ゆっくり室温に冷却する。この手順を残留一本鎖の検出が10%未満になるまで反復できる。
化合物例は、下記の方法および当業者に既知の方法に従って合成できる。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築は、例えば、ホスホラミダイト法を適用して固相合成により実施され得る。GalNAc複合化は、必要な数の結合されたアミノ修飾リンカー構成単位を有する、以前に構築され精製されたオリゴヌクレオチドへのGalNAc-カルボン酸構成単位のペプチド結合形成により達成され得る。
i)トリフルオロ酢酸エチル、NEt3、MeOH、0℃、16時間、2:86% 5:90%、ii)DMTCL、ピリジン、0℃、16時間、74%、iii)LIBH4、EtOH/THF(1/1、v/v)、0℃、1時間、76%、iv)2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホラミダイト、EtNiPr2、CH2Cl2、56%、v)無水コハク酸、DMAP、ピリジン、RT、16時間、38%、vi)HBTU、DIEA、アミノ-lcaa CPG(500A)、RT、18時間、29%。
DMT-セリノール(TFA)-ホスホラミダイト7は、文献に発表された方法によりセリノール誘導体1から合成できる(Hoevelmann et al.Chem.Sci.,2016,7,128-135)。
(vii)TMSOTf、DCM、ヘキセノール、viii)RuCl3、NaIO4、DCM、CH3CN、H2O、2ステップで46%。
GalNAcシントン9の合成は、商業的に入手できる過アセチル化ガラクトースアミン8から出発して、Nair et al.J.Am.Chem.Soc.,2014,136(49),pp 16958-16961に記載の方法に従って調製できる。
(i)9、HBTU、DIPEA、DMSO;11、H2O、DMSO、DIPEA;その後活性化9、11;その後40%MeNH2、H2O
GalNAcシントン9の複合化は、上述のように、当業者に既知の標準的ペプチドカップリング条件を用いて、9をそれぞれのオリゴヌクレオチド鎖11のセリノールアミノ官能基にカップリングすることにより達成できる。例えば、それぞれのアミノ修飾前駆物質分子11をH2Oに溶解し、DMSOなどの極性溶媒(例えば、DMSO/H2O、2/1、v/v)を加え、続けて、DIPEAなどの塩基(例えば、総体積の2.5%)を加える。別の反応容器中でGalNAcシントン9の予備活性化を、DMSOなどの極性溶媒中で、DIPEAなどの8当量の塩基の存在下で、2当量(アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド中でアミノ官能基当たり)のカルボン酸成分を、2当量のHBTUなどのカップリング剤と反応させることにより実施できる。2分後に、活性化化合物9がそれぞれのアミノ修飾前駆物質分子11の溶液に添加される。反応の進行をLCMSまたはAEX-HPLCによりモニターできる。複合化反応の完結時(例えば、30分)に、粗生成物を10x iPrOH 0.1x2M NaClの添加により沈殿させて、遠心分離デカンテーションにより回収できる。アセチルヒドロキシ保護基を、40%MeNH2(500OD当たり1mL)などの塩基条件下で除去する。室温で15分後に、H2O(1:10 v/v)を加え、化合物12(例えば、図17に示すX0385B)を単離し、アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより再度精製し、その後、凍結乾燥する。
個別の一本鎖をH2O中の60OD/mLの濃度に溶解する。両方の個別のオリゴヌクレオチドを反応容器に一緒に加えることができる。反応監視のために、滴定を行うことができる。第1の鎖を、260nmでのUV-吸収により測定して、第2の鎖に比べて25%過剰で添加する。上記反応混合物を、例えば、80℃に5分間加熱後、ゆっくり室温に冷却する。二本鎖形成をイオン対逆相HPLCにより監視し得る。残留一本鎖UV面積から、第2の鎖の必要量を計算し、反応混合物に添加できる。反応系を、例えば、80℃に再度加熱後、ゆっくり室温に冷却する。この手順を、残留一本鎖の検出が10%未満になるまで反復できる。
(i)第2のRNA鎖は、標的化リガンドに5’末端で結合され、ここで(a)第2のRNA鎖はまた、標的化リガンドに3’末端で結合され、第1のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(b)第1のRNA鎖は、3’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(c)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方はまた、3’末端で標的化リガンドに結合され;もしくは
(ii)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方は、3’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の5’末端は結合されない。
1=2’F-dU、
2=2’-F-dA、
3=2’F-dC、
4=2’F-dG、
5=2’-OMe-rU;
6=2’-OMe-rA;
7=2’-OMe-rC;
8=2’-OMe-rG。
(vp)-N(po)[N(po)]n- (XVII)
を含み得、式中、「vp」は5’(E)ビニルホスホネートであり、「N」はヌクレオチドであり、「po」はリン酸ジエステル結合であり、nは1~(第1の鎖中のヌクレオチドの総数-2)であり、好ましくはnは1~(第1の鎖中のヌクレオチドの総数-3)であり、より好ましくはnは1~(第1の鎖中のヌクレオチドの総数-4)である。
第1の鎖の5’末端から位置2および14のヌクレオチドが2’O-メチル修飾により修飾されず、および第1の鎖の位置11に対応する第2の鎖上のヌクレオチドが2’O-メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
(i)好ましくは第2の鎖の3’末端での3’-3’結合である、逆位ヌクレオチド;
(ii)1つまたは複数のジチオリン酸結合;
(iii)第1の鎖の位置11または13に対応する第2の鎖のヌクレオチドが2’O-メチル修飾により修飾されず、好ましくはこれらの位置の一方または両方が2’フルオロ修飾を含む;
(iv)全てのヌクレオチドの少なくとも80%が2’-O-メチル修飾を有するヌクレオチドを含む核酸;
(v)核酸が20%以下の、2’フルオロ修飾を有するヌクレオチドを含む。
第1の鎖の5’末端から位置2および14のヌクレオチドが2’O-メチル修飾により修飾されず、および第2の鎖の5’末端からの位置7のヌクレオチドが2’O-メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸である。
各実施例で言及されるナンバリングは、上記実施例に特異的である。
実施例1
本明細書で機能的実施例のために使用される修飾および複合化されたSiRNA分子。
LPA-1038誘導体:
GalNAc-LPA-1038-L1
第1の鎖(配列番号119、配列番号5ベース)
OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA 3’
第2の鎖(配列番号120、配列番号6ベース)
5’[ST23(ps)]3 long trebler(ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3’
GalNAc-LPA-1038-L6
第1の鎖(配列番号121、配列番号5ベース)
OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA 3’
第2の鎖(配列番号122、配列番号6ベース)
5’[ST23(ps)]3 ST43(ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3’
FN(N=A、C、G、U)は、2’フルオロ、2’デオキシヌクレオシドを意味する。
OMeN(N=A、C、G、U)は、2’Oメチルヌクレオシドを意味する。
(ps)は、ホスホロチオエート結合を示す。
さらなる例は、LPA 1041誘導体である:
GalNAc-LPA-1041-L1
第1の鎖(配列番号123、配列番号9ベース)
5’ OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeG 3’
第2の鎖(配列番号124、配列番号10ベース)
5’[ST23(ps)]3 long trebler(ps)FC-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3’
GalNAc-LPA-1041-L6
第1の鎖(配列番号125、配列番号9ベース)
5’ OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeG 3’
第2の鎖(配列番号126、配列番号10ベース)
5´[ST23(ps)]3 ST43(ps)FC-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3’
FN(N=A、C、G、U)は、2’フルオロ、2’デオキシヌクレオシドを意味する。
OMeN(N=A、C、G、U)は、2’Oメチルヌクレオシドを意味する。
(ps)は、ホスホロチオエート結合を示す。
ST23およびST43は以下の通りである。
ST23は、GalNAc C4ホスホラミダイト(構造成分は下記の通り)である。
ST41は次の通りである。
ST43は次の通りであり、国際公開第2017/174657号に記載されている:
ヒトRT-4細胞におけるLPA mRNA発現の抑制についての非複合化siRNA分子(表1)のスクリーニング。
リポソームトランスフェクション複合体を、1.5μl RNAiMax(ThermoFisher)/80pmolの示したsiRNA分子の比で3重に調製した。複合体をそれぞれ、示した2.5nMおよび25nMの濃度に希釈した(値はペアにして明および暗灰色のバーとして示した)。内在的にLPAを発現するRT4ヒト膀胱移行細胞乳頭腫細胞を、示された濃度で予め播種したトランスフェクション複合体の上に、24ウェルフォーマットで125,000細胞/ウェルの濃度で播種した(リバーストランスフェクション)。トランスフェクションの24時間後に、全RNAをSpin Cell Mini Kit 250(Stratec)を用いて単離した。LPA mRNAレベルを、ハウスキーピング転写物としてのそれぞれの試料中のPPIB mRNA発現と比較して、qRT-PCRにより測定した。値を、未処理細胞中で検出されるLPA mRNAの量に対し正規化した(プレート内)。非サイレンシングsiRNA化合物を追加の対照としてトランスフェクトした。正規化した3回の繰り返し値の平均およびSDを示す。結果を図1に示す。
ヒトRT-4細胞におけるLPA mRNA発現に対する非複合化LPA標的化siRNA化合物の用量応答。
RT4ヒト膀胱移行細胞乳頭腫細胞を上述のようにリバーストランスフェクションし(実施例2)、標識した種々の非複合化siRNA化合物(表1)を用いて、示された濃度(100nM~0.2nMの範囲)で処理した。トランスフェクションの24時間後に、全RNAをSpin Cell Mini Kit 250(Stratec)を用いて単離した。LPA mRNAレベルを、ハウスキーピング転写物としてのそれぞれの試料中のPPIB mRNA発現と比較して、qRT-PCRにより測定した。値を、未処理細胞中で検出されるLPA mRNAの量に対し正規化した。バーは、それぞれのデータポイントに対する残留LPA mRNA発現を表す。結果を図2に示す。
受容体媒介取り込みにより送達された種々の投与量のGalNAc-L1 LPA-1038複合化SiRNA分子によるヒトおよびカニクイザル初代培養肝細胞中のLPA mRNA発現の抑制。
初代培養肝細胞(ThermoFisher)をコラーゲンコート96ウェルプレートに45,000細胞/ウェル(カニクイザル)および30,000細胞/ウェル(ヒト)の濃度で播種した。GalNAc-L1-複合化LPA-1038を示された濃度(nM)で播種直後に加えた。siRNA処理の24時間後に、全RNAをInviTrap RNA細胞HTS96ウェルキット(Stratec)を用いて単離した。LPA mRNAレベルを、ハウスキーピング転写物としてのそれぞれの試料中のアクチン(カニクイザル)またはApoB(ヒト)mRNA発現レベルと比較して、qRT-PCRにより測定した。値を、未処理細胞中のLPA発現に対し正規化した。残留LPA mRNAレベルの正規化した3回の繰り返し値の平均およびSDを黒色バーで示す。結果を図3に示す。
受容体媒介送達時の初代培養ヒト肝細胞中の示された種々のL6-GalNAc複合化siRNAによるヒト初代培養肝細胞中のLPA-mRNAのノックダウン。
初代培養ヒト肝細胞(ThermoFisher)をコラーゲンコート96ウェルプレートに30,000細胞/ウェルで播種した(96ウェルフォーマット)。非サイレンシング対照を含むGalNAc-L6-複合化siRNAを、2種の示された濃度で細胞播種の直後に加えた。siRNA処理の24時間後に、全RNAをInviTrap RNA細胞HTS96ウェルキット(Stratec)を用いて単離した。LPA mRNA発現レベルを、ハウスキーピング転写物としてのApoB mRNAと比較して、qRT-PCRにより測定した。値を、未処理細胞中のLPA mRNA発現に対し正規化し、残留LPA mRNAレベルをバーとしてペアにして表した(100nM 黒色バー、20nM 灰色バー)。正規化した3回の繰り返し値の平均およびSDを図5に示す。
化合物例を、下記の方法および当業者に既知の方法に従って合成した。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築を、ホスホラミダイト法を適用して固相合成により実施した。GalNAc複合化を、必要な数の結合されたアミノ修飾リンカー構成単位を有する、以前に構築され精製されたオリゴヌクレオチドに対するGalNAc-カルボン酸構成単位のペプチド結合形成により達成した。
化合物2~5および(S)-DMT-セリノール(TFA)-ホスホラミダイト7を、文献に発表された方法により合成した(Hoevelmann et al.Chem.Sci.,2016,7,128-135)。
ピリジン中の5の溶液に、無水コハク酸、続いてDMAPを加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。TLCにより判断して、全ての出発材料が消費された。反応物を濃縮した。粗製材料を、DCM(+1%トリエチルアミン)中の0%~5%メタノール勾配を用いて、シリカゲルでクロマトグラフ処理して、1.33gの6を得た(収率=38%)。m/z(ESI-):588.2(100%)、(C30H29F3NO8-としての計算値 [M-H]- 588.6)。1H-NMR:(400MHz,CDCl3)δ[ppm]=7.94(d,1H,NH),7.39-7.36(m,2H,CHアリール),7.29-7.25(m,7H,CHアリール),6.82-6.79(m,4H,CHアリール),4.51-4.47(m,1H),4.31-4.24(m,2H),3.77(s,6H,2xDMTr-OMe),3.66-3.60(m,16H,HNEt3 +),3.26-3.25(m,2H),2.97-2.81(m,20H,NEt3),2.50-2.41(4H,m),1.48-1.45(m,26H,HNEt3),1.24-1.18(m,29H,NEt3)。
(S)-DMT-セリノール(TFA)-スクシネート(159mg、270umol)およびHBTU(113mg、299umol)をCH3CN(10mL)に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、94μL、540umol)をその溶液に加え、混合物を2分間かきまぜた後、天然のアミノ-lcaa-CPG(500A、3g、アミノ含量:136umol/g)を加えた。懸濁物をwrist-action shaker上で16時間室温にて静かに振盪させた後、濾過し、DCMおよびEtOHで洗浄した。固体担体を減圧下で2時間乾燥させた。担体上の未反応アミンを無水酢酸/ルチジン/N-メチルイミダゾールと共に室温で撹拌することにより、キャップした。担体の洗浄を上記のように反復した。固体を減圧下で乾燥して、固体担体10を得た(3g、26umol/g担持量)。
GalNAcシントン9の合成は、Nair et al.J.Am.Chem.Soc.,2014,136(49),pp 16958-16961に記載の方法に従って実施した(2つのステップで46%収率)。
特徴付けるデータは、発表データと一致した。
全ての一本鎖オリゴヌクレオチドは、上記および図13および14に記載の反応条件に従って合成された。
複合体1~2および基準複合体1~2のための複合化一本鎖
GalNAcシントン(9)の複合化は、ペプチドカップリング剤を用いて、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖11のセリノールアミノ官能基にカップリングすることにより達成された。従って、それぞれのアミノ修飾前駆物質分子11をH2O(500OD/ml)に溶解し、DMSO(DMSO/H2O、2/1、v/v)を加え、続けて、DIPEA(総体積の2.5%)を加えた。別の反応容器中で、GalN(Ac4)-C4-酸(9)の予備活性化を、DMSO中の8当量のDIPEAの存在下で2当量(アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド11中のアミノ官能基当たり)のカルボン酸成分を2当量のHBTUと反応させることにより実施した。2分後に、予備活性化化合物9をそれぞれのアミノ修飾前駆物質分子の溶液に添加した。30分後に、反応の進行をLCMSまたはAEX-HPLCでモニターした。複合化反応の完結時に、粗生成物を10x iPrOH 0.1x2M NaClの添加により沈殿させ、遠心分離およびデカンテーションにより回収した。GalNAc部分中のアセチル化ヒドロキシル基を解放するために、得られたペレットを40%のMeNH2中に溶解し(1mL/500OD)、15分後、室温にてH2Oで希釈し(1:10)、アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより最終的に再度精製し、凍結乾燥して、最終生成物12を得た。
次の配列に対する修飾の凡例:
fは、2’フルオロ 2’デオキシリボヌクレオチドまたは2’-フルオロリボヌクレオチドを意味する(これらの用語は、互換性がある)。
mは、2’Oメチルリボヌクレオチドを意味する。
(ps)は、ホスホロチオエート結合を意味する。
Ser(GN)は、セリノール由来リンカー部分:
に結合されるGalNAc-C4構成単位であり、式中、O---は、酸素原子と、例えば、H、リン酸ジエステル結合またはホスホロチオエート結合の間の結合である。
C4XLTは:
であり;
ST23は:
である。
C4XLT-phosは:
であり;
ST23-phosは:
である。
アンチセンス鎖-STS16001AL33(配列番号127)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)3’
センス鎖-STS16001BL20(配列番号128)
5’Ser(GN)(ps)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA 3’
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BV1L42(配列番号130)
Ser(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)Ser(GN)
アンチセンス鎖-STS16001AL33(配列番号127)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)3’
センス鎖-STS16001BV1L42(配列番号130)
5’ Ser(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)Ser(GN)3´
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BL20(配列番号128)
Ser(GN)(ps)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
アンチセンス鎖-STS16001AL33(配列番号127)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)
センス鎖-STS16001V1B(配列番号131)
fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
アンチセンス鎖-STS18001A(A0130;配列番号132)
mU(ps)fC(ps)mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA(ps)fC(ps)mG
センス鎖-STS18001BL4(A0131、配列番号133)
[(ST23)(ps)]3 C4XLT(ps)fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC(ps)mG(ps)fA
アンチセンス鎖-STS16001AL33(配列番号127)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BL4(配列番号134)
5’[(ST23)(ps)]3 C4XLT(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
マウス初代培養肝細胞を30,000細胞/ウェルの濃度で、コラーゲンプリコート96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific、#A1142803)に播種し、10nM~0.0001nMの範囲の濃度にてsiRNA複合体で処理した。処理の24時間後、細胞を溶解しRNAを、製品プロトコルに従いInviTrap(登録商標)RNA Cell HTS 96キット/C24x96preps(Stratec #7061300400)を用いて抽出した。TTRおよびハウスキーピングmRNA(PtenII)の転写物レベルをTaqMan分析により定量化した。
C57BL/6マウスを0日目に1mg/kgのsiRNA複合体で皮下治療した。血清試料を眼窩洞出血により、7、14、および27日目に採取し、分析まで-20℃で貯蔵した。血清TTR定量化を、製造業者のプロトコル(試料希釈 1:8000または1:800)に従いMouse Prealbumin ELISA(ALPCO,41-PALMS/lot 22,2008003B)を用いて実施した。
化合物例を、下記の方法および当業者に既知の方法に従って合成した。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築は、ホスホラミダイト法を適用して固相合成により実施した。GalNAc複合化は、必要な数の結合アミノ修飾リンカー構成単位を有する、以前に構築され精製されたオリゴヌクレオチドへのGalNAc-カルボン酸構成単位のペプチド結合形成により達成された。
化合物2~5および(S)-DMT-セリノール(TFA)-ホスホラミダイト7を、文献に発表された方法により合成した(Hoevelmann et al.Chem.Sci.,2016,7,128-135)。
ピリジン中の5の溶液に、無水コハク酸、続いてDMAPを加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。TLCにより判断して、全ての出発材料が消費された。反応物を濃縮した。粗製材料を、DCM(+1%トリエチルアミン)中の0%~5%メタノール勾配を用いて、シリカゲルでクロマトグラフ処理して、1.33gの6を得た(収率=38%)。m/z(ESI-):588.2(100%)、(C30H29F3NO8-としての計算値 [M-H]- 588.6)。1H-NMR:(400MHz,CDCl3)δ[ppm]=7.94(d,1H,NH),7.39-7.36(m,2H,CHアリール),7.29-7.25(m,7H,CHアリール),6.82-6.79(m,4H,CHアリール),4.51-4.47(m,1H),4.31-4.24(m,2H),3.77(s,6H,2xDMTr-OMe),3.66-3.60(m,16H,HNEt3 +),3.26-3.25(m,2H),2.97-2.81(m,20H,NEt3),2.50-2.41(4H,m),1.48-1.45(m,26H,HNEt3 +),1.24-1.18(m,29H,NEt3)。
(S)-DMT-セリノール(TFA)-スクシネート(159mg、270umol)およびHBTU(113mg、299umol)をCH3CN(10mL)に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、94μL、540umol)をその溶液に加え、混合物を2分間かきまぜた後、天然のアミノ-lcaa-CPG(500A、3g、アミノ含量:136umol/g)を加えた。懸濁物を16時間wrist-action shaker上で室温にて静かに振盪させた後、濾過し、DCMおよびEtOHで洗浄した。固体担体を減圧下で2時間乾燥させた。担体上の未反応アミンを無水酢酸/ルチジン/N-メチルイミダゾールと共に室温で撹拌することにより、キャップした。担体の洗浄を上記のように反復した。固体を減圧下で乾燥して、固体担体10を得た(3g、26umol/g担持量)。
GalNAcシントン9の合成を、Nair et al.J.Am.Chem.Soc.,2014,136(49),pp 16958-16961に記載の方法に従って実施した(2つのステップで46%収率)。
特徴付けるデータは、発表データと一致した。
全ての一本鎖オリゴヌクレオチドは、上記および図13および14に記載の反応条件に従って合成された。
複合体1~2および基準複合体1~2のための複合化一本鎖
GalNAcシントン(9)の複合化は、ペプチドカップリング剤を用いて、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖11のセリノールアミノ官能基へのカップリングにより達成された。従って、それぞれのアミノ修飾前駆物質分子11をH2Oに溶解し(500OD/mL)、DMSO(DMSO/H2O、2/1、v/v)を加え、続けて、DIPEA(総体積の2.5%)を加えた。別の反応容器中で、GalN(Ac4)-C4-酸(9)の予備活性化を、DMSO中の8当量のDIPEAの存在下で2当量(アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド11中のアミノ官能基当たり)のカルボン酸成分を2当量のHBTUと反応させることにより実施した。2分後に、予備活性化化合物9がそれぞれのアミノ修飾前駆物質分子の溶液に添加された。30分後に、反応の進行をLCMSまたはAEX-HPLCでモニターした。複合化反応の完結時に、粗生成物を10x iPrOH 0.1x2M NaClの添加により沈殿させ、遠心分離およびデカンテーションにより回収した。GalNAc部分中のアセチル化ヒドロキシル基を解放するために、得られたペレットを40%のMeNH2中に溶解し(1mL/500OD)、15分後に室温にてH2Oで希釈し(1:10)、アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより最終的に再度精製し、凍結乾燥して、最終生成物12を得た。
次の配列に対する修飾の凡例:
fは、2’フルオロ 2’デオキシリボヌクレオチドまたは2’-フルオロリボヌクレオチドを意味する(これらの用語は、互換性がある)。
mは、2’Oメチルリボヌクレオチドを意味する。
(ps)は、ホスホロチオエート結合を意味する。
Ser(GN)は、セリノール由来リンカー部分:
に結合されたGalNAc-C4構成単位であり、式中、O---は、酸素原子と、例えば、H、リン酸ジエステル結合またはホスホロチオエート結合の間の結合である。
C4XLTは:
であり;
C6XLTは:
であり;
ST23は:
である。
C4XLT-phosは:
であり、
C6XLT-phosは:
であり;
ST23-phosは:
である。
カニクイザル初代培養肝細胞において第2の鎖の5’位置での三分岐GalNAcユニットの場合と比較した第2の鎖に結合された2つの単一GalNAcユニットを有するLPA標的化siRNAに対するノックダウンの同等の用量応答。
データを図18に示す。
インビトロ実験
マウス初代培養肝細胞(Thermo Scientific:GIBCO Lot:#MC798)を解凍し、凍結保存培地を、5%FBS、1μMのデキサメタゾン、2mMのGlutaMax、1%のPenStrep、4mg/mlのヒト組換えインスリン、15mMのHEPESを補充したWilliams E培地と交換した。細胞密度を250000細胞/1mlに調節した。100μl/ウェルのこの細胞懸濁液をコラーゲンプリコート96ウェルプレートに播種した。試験品を各濃度について、同じ培地中で前希釈し(5倍濃縮)、この前希釈siRNAまたは培地のみの25μlを細胞に加えた。細胞を5%CO2下、37℃で培養した。処理の24時間後に、上清を廃棄し、細胞を冷PBSで洗浄し、250μlのRNAリシスバッファー S(Stratec)を加えた。15分の室温でのインキュベーション後、プレートを製造業者のプロトコルに従ってRNA単離を行うまで-80℃で貯蔵した。
mTTRおよびPTENマルチプレックスTaqMan分析のために、各治療群の10μlの単離RNAを、600nMのmTTR-プライマー、400nMのApoBプライマーおよび200nMの各プローブならびに0.2ユニットのRNアーゼ阻害剤含有0.5ユニットのEuroscript II RTポリメラーゼを含む10μlのPCRマスターミックス(TAKYON low Rox)と混合した。TaqMan分析を、48℃で10分のRTステップ、95℃で3分の初期変性ならびに95℃で10秒および60℃で1分の40サイクルにより、384ウェルプレート中で実施した。プライマーは、BHQ1、FAMおよびYYの内の2つを、配列のそれぞれの末端で1つずつ含む。
種々のsiRNA複合体のインビボ効力を比較するために、PBSに溶解した1mg/kgのsiRNAをC57BL/6マウスの肩甲部の皮下に投与した。n=6のコホートを、1日目に、Aldh2またはTmprss6を標的とするsiRNAで治療し、治療後の選択した時点で屠殺した。肝臓試料を、液体窒素中で急速凍結し、製造業者のマニュアルに従うInviTrap Spin Tissue RNA Mini Kit(stratec)でのRNA抽出まで、-80℃で貯蔵した。続けて、Aldh2、Tmprss6およびPtenの転写物レベルを上述のように定量した。
インビトロで肝臓細胞のエンドソーム/リソソームコンパートメント中のRNアーゼ安定性を調べるために、siRNAをスプラーグドーリーラットラット肝臓トリトソーム(Tebu-Bio,CatN.:R0610.LT,lot:1610405,pH:7.4,2.827Units/ml)中で0時間、4時間、24時間または72時間にわたりインキュベートした。酸性化環境を模擬するために、トリトソームを1:10で低pH緩衝剤(1.5M酢酸、1.5M酢酸ナトリウム pH4.75)と混合した。次に、10μlのsiRNA(20μM)を30μlのこの酸性化トリトソームと混合し、37℃で示した時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、RNAを、生体液用の製品プロトコルに従いClarity OTX Starter Kit-Cartriges(Phenomenex CatNo:KSO-8494)で単離した。凍結乾燥RNAを30μlのH2O中で再構成し、4xローディングバッファーと混合し、5μlを分離、定性的半定量分析のための20%TBE-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)にロードした。PAGEを120Vで2時間実施し、RNAを、臭化エチジウム染色とこれに続くBiorad Imaging systemを用いるデジタル画像化により可視化した。
化合物例を、下記の方法および当業者に既知の方法に従って合成した。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築を、ホスホラミダイト法を適用して固相合成により実施した。GalNAc複合化は、必要な数の結合されたアミノ修飾リンカー構成単位を有する、以前に構築され精製されたオリゴヌクレオチドへのGalNAc-カルボン酸構成単位のペプチド結合形成により達成された。
化合物2~5および(S)-DMT-セリノール(TFA)-ホスホラミダイト7を、文献に発表された方法により合成した(Hoevelmann et al.Chem.Sci.,2016,7,128-135)。
ピリジン中の5の溶液に、無水コハク酸、続いてDMAPを加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。TLCにより判断して、全ての出発材料が消費された。反応物を濃縮した。粗製材料を、DCM(+1%トリエチルアミン)中の0%~5%メタノール勾配を用いて、シリカゲルでクロマトグラフ処理して、1.33gの6を得た(収率=38%)。m/z(ESI-):588.2(100%)、(C30H29F3NO8-としての計算値 [M-H]- 588.6)。1H-NMR:(400MHz,CDCl3)δ[ppm]=7.94(d,1H,NH),7.39-7.36(m,2H,CHアリール),7.29-7.25(m,7H,CHアリール),6.82-6.79(m,4H,CHアリール),4.51-4.47(m,1H),4.31-4.24(m,2H),3.77(s,6H,2xDMTr-OMe),3.66-3.60(m,16H,HNEt3 +),3.26-3.25(m,2H),2.97-2.81(m,20H,NEt3),2.50-2.41(4H,m),1.48-1.45(m,26H,HNEt3 +),1.24-1.18(m,29H,NEt3)。
(S)-DMT-セリノール(TFA)-スクシネート(159mg、270umol)およびHBTU(113mg、299umol)をCH3CN(10mL)に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、94μL、540umol)をその溶液に加え、混合物を2分間かきまぜた後、天然のアミノ-lcaa-CPG(500A、3g、アミノ含量:136umol/g)を加えた。懸濁物を16時間wrist-action shaker上で室温にて静かに振盪させた後、濾過し、DCMおよびEtOHで洗浄した。固体担体を減圧下で2時間乾燥させた。担体上の未反応アミンを、無水酢酸/ルチジン/N-メチルイミダゾールと共に室温で撹拌することによりキャップした。担体の洗浄を上記のように反復した。固体を減圧下で乾燥して、固体担体10を得た(3g、26umol/g担持量)。
GalNAcシントン9の合成を、Nair et al.J.Am.Chem.Soc.,2014,136(49),pp 16958-16961に記載の方法に従って実施した(2つのステップで46%収率)。
特徴付けるデータは、発表データと一致した。
全ての一本鎖オリゴヌクレオチドは、上記および図13および14に記載の反応条件に従って合成され、表10および11に概要が示される。
GalNAcシントン(9)の複合化は、ペプチドカップリング剤を用いて、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖11のセリノールアミノ官能基へのカップリングにより達成された。従って、それぞれのアミノ修飾前駆物質分子11をH2Oに溶解し(500OD/mL)、DMSO(DMSO/H2O、2/1、v/v)を加え、続けて、DIPEA(総体積の2.5%)を加える。別の反応容器中で、GalN(Ac4)-C4-酸(9)の予備活性化を、DMSO中の8当量のDIPEAの存在下で2当量(アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド11中のアミノ官能基当たり)のカルボン酸成分を2当量のHBTUと反応させることにより実施した。2分後に、予備活性化化合物9がそれぞれのアミノ修飾前駆物質分子の溶液に添加された。30分後に、反応の進行をLCMSまたはAEX-HPLCでモニターした。複合化反応の完結時に、粗生成物を10xiPrOHおよび0.1x2M NaClの添加により沈殿させ、遠心分離およびデカンテーションにより回収した。GalNAc部分中のアセチル化ヒドロキシル基を解放するために、得られたペレットを40%のMeNH2中に溶解し(1mL/500OD)、室温で15分後、H2Oで希釈し(1:10)、アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより最終的に再度精製し、凍結乾燥して、最終生成物12(表12)を得た。
GalNAcシントン(9)の複合化は、ペプチドカップリング剤を用いて、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖14のアミノ官能基へのカップリングにより達成された。従って、それぞれのアミノ修飾前駆物質分子14をH2O(500 OD/ml)に溶解し、DMSO(DMSO/H2O、2/1、v/v)を加え、続けて、DIPEA(総体積の2.5%)を加える。別の反応容器中で、GalN(Ac4)-C4-酸(9)の予備活性化を、DMSO中の8当量のDIPEAの存在下で2当量(アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド14中のアミノ官能基当たり)のカルボン酸成分を2当量のHBTUと反応させることにより実施した。2分後に、予備活性化化合物9がそれぞれのアミノ修飾前駆物質分子の溶液に添加された。30分後に、反応の進行をLCMSまたはAEX-HPLCでモニターした。複合化反応の完結時に、粗生成物を、10xiPrOHおよび0.1x2M NaClの添加により沈殿させ、遠心分離およびデカンテーションにより回収した。GalNAc部分中のアセチル化ヒドロキシル基を解放するために、得られたペレットを40%のMeNH2中に溶解し(1mL/500OD)、室温で15分後、H2Oで希釈し(1:10)、アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより最終的に再度精製し、凍結乾燥して、最終生成物15(表13)を得た。
二本鎖形成を上記の方法に従い実施した。
二本鎖純度は、%二本鎖で与えられ、これは、IP-RP-HPLC分析のUV出力における帰属生成物シグナル下のUV面積のパーセンテージである(表14)。
次の配列に対する修飾の凡例:
fは、2’フルオロ 2’デオキシリボヌクレオチドまたは2’-フルオロリボヌクレオチドを意味する(これらの用語は、互換性がある)。
mは、2’Oメチルリボヌクレオチドを意味する。
(ps)は、ホスホロチオエート結合を意味する。
FAM=6-カルボキシフルオレセイン
BHQ=Black Hole Quencher 1
YY=Yakima Yellow
Ser(GN)は、セリノール由来リンカー部分:
に結合されたGalNAc-C4構成単位であり、式中、O---は、酸素原子と、例えば、H、リン酸ジエステル結合またはホスホロチオエート結合の間の結合である。
GNは:
であり;
C4XLT(ST41としても知られる)は:
であり;
ST23は:
である;
C4XLT-phosは:
であり;
ST23-phosは:
である。
複合体1
アンチセンス鎖-STS16001AL33(配列番号127)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)3’
センス鎖-STS16001BL20(配列番号128)
5’Ser(GN)(ps)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA 3’
複合体2
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BV1L42(配列番号130)
Ser(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)Ser(GN)
複合体3
アンチセンス鎖-STS16001AL33(配列番号127)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)3’
センス鎖-STS16001BV1L42(配列番号130)
5’ Ser(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)Ser(GN)3´
複合体4
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BV1L75(配列番号142)
5’ Ser(GN)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA Ser(GN)3’
複合体5
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BV16L42(配列番号143)
5’ Ser(GN)(ps)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mA fA(ps)Ser(GN)3’
複合体6
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BV20L75(配列番号144)
5’ Ser(GN)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mA fA Ser(GN)3’
複合体7
アンチセンス鎖-(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BV1L94(配列番号145)
5’ Ser(GN)(ps)Ser(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)Ser(GN)(ps)Ser(GN)3’
複合体8
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
センス鎖-STS16001V1BL96(配列番号146)
5’ C6Am(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)C7Am(GN)3’
複合体9
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
センス鎖-STS16001V1BL97(配列番号147)
5’ GlyC3Am(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)GlyC3Am(GN)3’
複合体10
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
アンチセンス鎖-(配列番号148)
5’ PipAm(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)PipAm(GN)3’
複合体11
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
センス鎖-STS16001V1BL88(配列番号149)
5’ C3Am(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)C3Am(GN)3’
複合体12
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
5’ mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
センス鎖-STS16001V1BL87(配列番号150)
5’ C6Am(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)GlyC3Am(GN)3’
複合体15
アンチセンス鎖(配列番号151)
mU(ps)fC(ps)mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU(ps)fU(ps)mC
アンチセンス鎖(配列番号152)
Ser(GN)(ps)fG(ps)mA(ps)fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA(ps)mG(ps)fA(ps)Ser(GN)
複合体16
アンチセンス鎖(配列番号153)
mA(ps)fU(ps)mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU(ps)fC(ps)mU
アンチセンス鎖(配列番号154)
Ser(GN)(ps)fA(ps)mG(ps)fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC(ps)mA(ps)fU(ps)Ser(GN)
複合体18
アンチセンス鎖(配列番号155)
mA(ps)fA(ps)mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU(ps)fG(ps)mA
アンチセンス鎖(配列番号156)
Ser(GN)(ps)fU(ps)mC(ps)fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG(ps)mU(ps)fU(ps)Ser(GN)
複合体19
アンチセンス鎖(配列番号135)
mA(ps)fU(ps)mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC(ps)fC(ps)mG
センス鎖(配列番号136)
Ser(GN)(ps)fC (ps) mG(ps)fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU(ps)mA(ps)fU(ps)Ser(GN)
基準複合体1
アンチセンス鎖-STS16001A(配列番号129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BL20(配列番号128)
Ser(GN)(ps)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
基準複合体2
アンチセンス鎖-STS16001AL33(配列番号127)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)
センス鎖-STS16001BV1(配列番号157)
fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
基準複合体3-「Luc」
アンチセンス鎖-STS18001A(A0130;配列番号132)
mU(ps)fC(ps)mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA(ps)fC(ps)mG
センス鎖-STS18001BL4(A0131、配列番号133)
[(ST23)(ps)]3 C4XLT(ps)fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC(ps)mG(ps)fA
基準複合体4
アンチセンス鎖-STS16001AL33(配列番号127)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
センス鎖-STS16001BL4(配列番号134)
5’[(ST23)(ps)]3 C4XLT(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
基準複合体5-「Ctr」
アンチセンス鎖(配列番号138)
mC(ps)fU(ps)mU fA mC fU mC fU mC fG mC fC mC fA mA fG mC(ps)fG(ps)mA
センス鎖(配列番号139)
[(ST23)(ps)]3(C6XLT)(ps)fU mC fG mC fU mU fG mG fG mC fG mA fG mA fG mU fA(ps)mA(ps)fG
基準複合体6
アンチセンス鎖(配列番号151)
mU(ps)fC(ps)mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU(ps)fU(ps)mC
センス鎖(配列番号158)
[ST23(ps)]3 ltrb(ps)fG mA fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA(ps)mG(ps)fA
基準複合体7
アンチセンス鎖(配列番号153)
mA(ps)fU(ps)mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU(ps)fC(ps)mU
チセンス鎖(配列番号159)
[ST23(ps)]3 ltrb(ps)fA mG fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC(ps)mA(ps)fU
基準複合体8
アンチセンス鎖(配列番号160)
mU(ps)fA(ps)mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU(ps)fG(ps)mA
センス鎖(配列番号161)
[ST23(ps)]3 ST41(ps)fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG(ps)mU(ps)fA
基準複合体9
アンチセンス鎖(配列番号135)
mA(ps)fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC(ps)fC(ps)mG
センス鎖(配列番号162)
[ST23(ps)]3 C6XLT(ps)fC mG fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU(ps)mA(ps)fU
複合体1~3
マウス初代培養肝細胞を30,000細胞/ウェルの濃度で、コラーゲンプリコート96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific、#A1142803)に播種し、10nM~0.0001nMの範囲の濃度のsiRNA複合体で処理した。処理の24時間後、細胞を溶解しRNAを製品プロトコルに従いInviTrap(登録商標)RNA Cell HTS 96キット/C24x96preps(Stratec #7061300400)を用いて抽出した。TTRおよびハウスキーピングmRNA(PtenII)の転写物レベルをTaqMan分析により定量化した。
一般的方法セクション中の「インビトロ実験」下の上記方法に従った。
本発明の複合体、複合体4~7による、0.01nM、0.1nM、0.5nM、1nMおよび10nMでの処理の24時間後のマウス初代培養細胞中の標的遺伝子発現は、図31に示すように、標的遺伝子発現が陰性対照(「UT」バーおよびLuc[基準複合体3]を参照)に比較して、複合体の用量が増加するに伴い減少することを示した。これは、第1の鎖が標的遺伝子に結合し、それにより遺伝子発現を低減させることを示す。
一般的方法セクション中の「インビトロ実験」下の上記方法に従った。
本発明の複合体、複合体8~12による、0.01nM、0.1nM、0.5nM、1nMおよび10nMでの処理の24時間後のマウス初代培養細胞中の標的遺伝子発現は、図32に示すように、標的遺伝子発現が陰性対照(「UT」バーおよびLuc[基準複合体3]を参照)に比較して、複合体の用量が増加するに伴い減少することを示した。これは、第1の鎖が標的遺伝子に結合し、それにより遺伝子発現を低減させることを示す。特に、複合体8、9、10および11は、0.01nMで最も効果的な複合体であることが以前に示された複合体2と同等であるまたは複合体2よりも良好であるように見える。
複合体1~3
C57BL/6マウスを、0日目に1mg/kgのsiRNA複合体で皮下治療した。血清試料を眼窩洞出血により、7、14、および27日目に採取し、分析まで-20℃で貯蔵した。血清TTR定量化を、製造業者のプロトコル(試料希釈 1:8000または1:800)に従いMouse Prealbumin ELISA(ALPCO,41-PALMS/lot 22,2008003B)を用いて実施した。
一般的方法セクション中の「インビボ実験」下の上記方法に従った。
1mg/kgの複合体15~16、基準複合体6および7による皮下治療後14、28および42日でのn=6のc57BL/6マウスコホート、ならびにモック治療(PBS)個体における血清Aldh2の経時変化の結果を、図34および35に示す。図34および35のデータにより示されように、本発明の複合体は、陰性対照(PBS)および基準複合体6および7にそれぞれ比べて、標的遺伝子発現の低減に特に効果的である。
一般的方法セクション中の「トリトソーム安定性アッセイ」下の上記方法に従った。
1.細胞中のLPAの発現を抑制するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部および第1の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第2の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも1つの二重鎖領域を含み、ここで上記第1の鎖がLPA遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここで上記第1の鎖が次の配列:配列番号9、1、3、5、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71または73または本明細書で開示のいずれかの配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸。
2.第2の鎖が、配列番号10、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、64、66、68、70、72または74または本明細書で開示のいずれかの配列のヌクレオチド配列を含む、記載1の核酸。
3.上記第1の鎖が、配列番号9または配列番号5のヌクレオチド配列を含む、記載1または記載2の核酸。
4.上記第2の鎖が、配列番号10または配列番号6のヌクレオチド配列を含む、記載1~3のいずれか1つの核酸。
5.上記第1の鎖および/または上記第2の鎖が、それぞれ17~35ヌクレオチド長である、記載1~4のいずれか1つの核酸。
6.少なくとも1つの二重鎖領域が、19~25個の連続ヌクレオチド塩基対からなる、記載1~5のいずれか1つの核酸。
7.記載1~6のいずれかの核酸であって、
a)両端で平滑末端であり;または
b)一端でオーバーハングを有し、他端で平滑末端を有し;または
c)両端でオーバーハングを有する、
核酸。
8.第1および/または第2の鎖上の1個または複数のヌクレオチドが、修飾されて、修飾ヌクレオチドを形成する、記載1~7のいずれかの核酸。
9.第1の鎖の1個または複数の奇数ヌクレオチドが、修飾される、記載8の核酸。
10.第1の鎖の1個または複数の偶数ヌクレオチドが、少なくとも第2の修飾により修飾され、少なくとも第2の修飾が、記載9の修飾とは異なる、記載9の核酸。
11.1個または複数の修飾された偶数ヌクレオチドの少なくとも1個が、1個または複数の修飾された奇数ヌクレオチドの少なくとも1個に隣接する、記載10の核酸。
12.複数の奇数ヌクレオチドが、修飾される、記載9~11のいずれか1つの核酸。
13.複数の偶数ヌクレオチドが、第2の修飾により修飾される、記載10~12のいずれかの核酸。
14.第1の鎖が、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含む、記載8~13のいずれかの核酸。
15.第1の鎖が、記載9の修飾とは異なる第2の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含む、記載9~14のいずれかの核酸。
16.第2の鎖の1個または複数の奇数ヌクレオチドが、記載9の修飾とは異なる修飾により修飾される、記載9~15のいずれかの核酸。
17.第2の鎖の1個または複数の偶数ヌクレオチドが、記載9の修飾により修飾される、記載9~15のいずれかの核酸。
18.第2の鎖の1個または複数の修飾された偶数ヌクレオチドの少なくとも1個が、第2の鎖の1個または複数の修飾された奇数ヌクレオチドに隣接する、記載16または17の核酸。
19.第2の鎖の複数の奇数ヌクレオチドが、共通の修飾により修飾される、記載16~18のいずれかの核酸。
20.複数の偶数ヌクレオチドが、記載9の修飾により修飾される、記載16~19のいずれかの核酸。
21.第2の鎖の複数の奇数ヌクレオチドが、第2の修飾により修飾され、第2の修飾が、記載9の修飾とは異なる、記載16~20のいずれかの核酸。
22.第2の鎖が、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含む、記載16~21のいずれかの核酸。
23.第2の鎖が、記載9の修飾とは異なる第2の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含む、記載16~22のいずれかの核酸。
24.第1の鎖中のそれぞれの奇数ヌクレオチドおよび第2の鎖中のそれぞれの偶数ヌクレオチドが、共通の修飾により修飾される、記載8~23のいずれかの核酸。
25.それぞれの偶数ヌクレオチドが、第2の修飾により第1の鎖中で修飾され、およびそれぞれの奇数ヌクレオチドが、第2の修飾により第2の鎖中で修飾される、記載24の核酸。
26.第1の鎖の修飾ヌクレオチドが、第2の鎖の非修飾のまたは異なって修飾されたヌクレオチドに対し少なくとも1個のヌクレオチドだけシフトされる、記載8~25のいずれか1つの核酸。
27.修飾(単数または複数)がそれぞれ個別に、3’-末端デオキシチミン、2’-O-メチル、2’-デオキシ修飾、2’-アミノ修飾、2’-アルキル修飾、モルホリノ修飾、ホスホラミデート修飾、5’-ホスホロチオエート基修飾、5’-リン酸または5’-リン酸模倣物修飾およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基修飾からなる群より選択される、記載8~26のいずれか1つの核酸。
28.修飾が、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチドまたは非天然塩基含有ヌクレオチドのいずれか1つである、記載8~27のいずれか1つの核酸。
29.少なくとも1つの修飾が、2’-O-メチルである、記載8~28のいずれか1つの核酸。
30.少なくとも1つの修飾が、2’-Fである、記載8~29のいずれか1つの核酸。
31.細胞中のLPAの発現を抑制するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部および第1の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第2の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも1つの二重鎖領域を含み、ここで上記第1の鎖がLPA遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここで上記第1の鎖が次の配列:配列番号9、1、3、5、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71または73から選択されるヌクレオチド配列を含み、ここで第1の鎖のヌクレオチドが奇数ヌクレオチド上で第1の修飾により修飾され、および偶数ヌクレオチド上で第2の修飾により修飾され、および第2の鎖のヌクレオチドが偶数ヌクレオチド上で第3の修飾により修飾され、および奇数ヌクレオチド上で第4の修飾により修飾され、ここで少なくとも第1の修飾が、第2の修飾と異なり、第3の修飾が、第4の修飾と異なる、核酸。
32.第2の配列が、配列番号10、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、64、66、68、70、72または74のヌクレオチド配列を含む、記載31の核酸。
33.第4の修飾および第2の修飾が、同じである、記載31または32の核酸。
34.第1の修飾および第3の修飾が、同じである、記載31~33のいずれか1つの核酸。
35.第1の修飾が、2’O-Meであり、第2の修飾が、2’Fである、記載31~34のいずれか1つの核酸。
36.第1の鎖が、配列番号9および配列番号5のヌクレオチド配列を含み、および第2の鎖が、配列番号10および配列番号6のヌクレオチド配列を含む、記載31~35のいずれか1つの核酸。
37.以下に示す配列および修飾を含む、記載31~36のいずれか1つの核酸:
1=2’F-dU、
2=2-F-dA、
3=2’F-dC、
4=2’F-dG、
5=2’-OMe-rU;
6=2’-OMe-rA;
7=2’-OMe-rC;
8=2’-OMe-rG。
38.リガンドに結合される、記載1~37のいずれか1つの核酸。
39.第1および/または第2の鎖の末端の1、2または3個の3’ヌクレオチドおよび/または5’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、記載1~38のいずれか1つの核酸。
40.第1の鎖上の3個の末端3’ヌクレオチドのそれぞれの間、および3個の末端5’ヌクレオチドのそれぞれの間の2つのホスホロチオエート結合、および第2の鎖の3個の3’末端のヌクレオチド間の2つのホスホロチオエート結合を含む、記載1~39のいずれか1つの核酸。
41.細胞中のLPAの発現を抑制するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部および第1の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第2の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも1つの二重鎖領域を含み、ここで上記第1の鎖がLPA遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここで上記第1の鎖が次の配列:配列番号9、1、3、5、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71または73から選択されるヌクレオチド配列を含み、ここでリガンドに結合される、核酸。
42.リガンドが、(i)1個または複数のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分およびその誘導体、および(ii)リンカー、を含み、ここでリンカーが、記載41で定義の核酸にGalNAc部分を結合する、記載41の核酸。
43.リンカーが、二価または三価または四価の分岐構造体である、記載41または42のいずれかの核酸。
44.ヌクレオチドが、記載1~43のいずれかで定義のように修飾される、記載41~43のいずれかの核酸。
45.記載1~44のいずれかの核酸であって、式I:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
を含むリガンドに結合され、式中、
Sは、サッカライドであり、ここでサッカライドは、N-アセチルガラクトサミンであり;
X1は、C3-C6アルキレンまたは(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-であり、ここでmは、1、2、または3であり;
Pは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)であり;
X2は、式(-CH2)n-O-CH2-のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、ここでn=1~6であり;
Aは、分岐ユニットであり、
X3は、架橋ユニットであり;
ここで記載1~40のいずれかで定義される核酸が、ホスフェートまたは修飾ホスフェート(好ましくはチオホスフェート)を介してX3に結合される、核酸。
46.次の構造:
の1つを有する複合化核酸であって、Zは、記載1~40のいずれかの核酸である、複合化核酸。
47.次の構造のリガンドに結合される、記載1~40のいずれかの核酸:
48.二重鎖が、別々の鎖を含む、記載1~47のいずれかの核酸または複合化核酸。
49.二重鎖が、第1の鎖および第2の鎖を含む一本鎖を含む、記載1~48のいずれかの核酸または複合化核酸。
50.記載1~49のいずれかの核酸または複合化核酸および生理学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
51.疾患または病態の予防または治療またはこれらのリスクの低減での使用のための記載1~50のいずれかの核酸または複合化核酸。
52.疾患、障害または症候群を予防または治療するための薬物の製造における記載1~51のいずれかの核酸または複合化核酸の使用。
53.治療を必要とする個体への記載1~52のいずれかの核酸または複合化核酸を含む組成物の投与を含む疾患、障害または症候群を治療または予防する方法。
54.核酸または複合化核酸が、皮下に、静脈内にまたは経口、直腸または腹腔内などのいずれか他の適用経路を用いて対象に投与される、記載53の方法。
55.上記疾患または病態が、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症または冠状動脈性心疾患または大動脈弁狭窄症などの心臓血管疾患および高いレベルのLp(a)含有粒子に関連するいずれか他の疾患または病態である、記載52~54の使用または方法。
56.心臓血管疾患が、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症または冠状動脈性心疾患または大動脈弁狭窄症任意および高いレベルのLp(a)含有粒子に関連するいずれか他の疾患または病態である、記載55の使用または方法。
57.記載1~49のいずれか1つの核酸または複合化核酸を作製するためのプロセス。
58.LPAの発現を抑制するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部および第1の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第2の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも1つの二重鎖領域を含み、ここで上記第1の鎖がLPA遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここでLPAの発現が、同じ試験条件であるが、核酸または複合化核酸の非存在下または非サイレンシング対照の存在下で観察される発現レベルよりも少なくとも15%低いレベルに低減される、核酸。
59.LPAの発現を抑制するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部および第1の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第2の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも1つの二重鎖領域を含み、ここで上記第1の鎖がLPA遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここで上記第1の鎖が次の配列:配列番号9、1、3、5、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71または73から選択されるヌクレオチド配列を含み、ここでLPAの発現が、同じ試験条件であるが、核酸または複合化核酸の非存在下または非サイレンシング対照の存在下で観察される発現レベルよりも少なくとも15%低いレベルに低減される、核酸。
60.細胞中のLPAの発現を抑制するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部および第1の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第2の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも1つの二重鎖領域を含み、ここで上記第1の鎖がLPA遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここで上記第1の鎖が次の配列:配列番号63、65、67および73から選択されるヌクレオチド配列を含み、ここで第1のRNA鎖が、末端5’(E)ビニルホスホネートヌクレオチドを有する、核酸。
1.細胞中のLPA遺伝子の発現を抑制するための複合体であって、上記複合体は核酸部分およびリガンド部分を含み、上記核酸部分は、第1のRNA鎖の少なくとも一部および第1の鎖に少なくとも部分的に相補的な第2のRNA鎖の少なくとも一部を含み、ここで上記第1の鎖が上記LPA遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記リガンド部分がセリノール由来リンカー部分、および細胞のインビボ標的化のための標的化リガンドを含み、一方または両方のRNA鎖の3’および/または5’末端のみに結合され、ここで第1のRNA鎖の5’末端は結合されず、ここで
(i)第2のRNA鎖は、標的化リガンドに5’末端で結合され、ここで(a)第2のRNA鎖はまた、標的化リガンドに3’末端でも結合され、第1のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(b)第1のRNA鎖は、3’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(c)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方はまた、3’末端で標的化リガンドに結合され;もしくは
(ii)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方は、3’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の5’末端は結合されない、
複合体
または
細胞中のLPA遺伝子の発現を抑制するための複合体であって、上記複合体は核酸部分およびリガンド部分を含み、上記核酸部分は、第1のRNA鎖の少なくとも一部および第1の鎖に少なくとも部分的に相補的な第2のRNA鎖の少なくとも一部を含み、ここで上記第1の鎖が上記LPA遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記リガンド部分がリンカー部分、および細胞のインビボ標的化のための標的化リガンドを含み、一方または両方のRNA鎖の3’および/または5’末端のみに結合され、ここで第1のRNA鎖の5’末端は結合されず、ここで
(i)第2のRNA鎖は、標的化リガンドに5’末端で結合され、ここで(a)第2のRNA鎖はまた、標的化リガンドに3’末端でも結合され、第1のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(b)第1のRNA鎖は、3’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の3’末端は結合されず;または(c)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方はまた、3’末端で標的化リガンドに結合され;もしくは
(ii)第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方は、3’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の5’末端は結合されず、任意選択で、
ここでリンカー部分は、セリノール由来リンカー部分または本明細書で記載の他のリンカータイプの1つである、
複合体。
2.第2のRNA鎖は、5’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖は、3’末端でも標的化リガンドに結合され、第1のRNA鎖の3’末端は、結合されない、項目1に記載の複合体。
3.第2のRNA鎖は、5’末端で標的化リガンドに結合され、第1のRNA鎖は、3’末端でも標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の3’末端は、結合されない、項目1に記載の複合体。
4.第2のRNA鎖は、5’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方は、3’末端でも標的化リガンドに結合される、項目1に記載の複合体。
5.第2のRNA鎖および第1のRNA鎖の両方は、3’末端で標的化リガンドに結合され、第2のRNA鎖の5’末端は、結合されない、項目1に記載の複合体。
6.リガンドが、単量体リガンドである、項目1~5のいずれか1つに記載の複合体。
7.リガンドが、GalNAcおよびガラクトース部分、特にGalNAc部分から選択される、項目1~6のいずれか1つに記載の複合体。
8.複合化RNA鎖が、追加のリンカーを含むセリノール由来リンカー部分を介して標的化リガンドに結合され、ここで追加のリンカーは、飽和非分岐または分岐C1-15アルキル鎖であるか、またはこれを含み、ここで任意選択で1個または複数の炭素(例えば、1、2または3個の炭素、好適には1個または2個、特に1個)が、O、N、S(O)pから選択されるヘテロ原子により置換されここでpは0、1または2であり、(例えば、CH2基が、鎖の末端にてOで、またはNHで、またはSで、またはSO2で置換され、または分岐部上の-CH3基が、OHでまたはNH2で置換される)、ここで上記鎖は、1個または複数のオキソ基(例えば、1~3個、1個の基など)で任意に置換される、項目1~7のいずれか1つに記載の複合体。
9.追加のリンカーが、飽和非分岐C1-15アルキル鎖を含み、ここで1個または複数の炭素(例えば、1、2または3個の炭素、好適には1個または2個、特に1個)が、酸素原子により置換される、項目8に記載の複合体。
10.追加のリンカーが、PEG鎖を含む、項目9に記載の複合体。
11.追加のリンカーが、飽和非分岐鎖C1-15アルキル鎖を含む、項目8に記載の複合体。
12.追加のリンカーが、飽和非分岐鎖C1-6アルキル鎖を含む、項目11に記載の複合体。
13.追加のリンカーが、飽和非分岐C4またはC6アルキル鎖、例えばC4アルキル鎖を含む、項目12に記載の複合体。
14.第1のRNA鎖が、式(XV):
第2のRNA鎖が、式(XVI):
の化合物であり、ここでcおよびdは独立に、0または1であり;
式中、
Z1およびZ2は、それぞれ第1と第2のRNA鎖のRNA部分であり;
Yは、OまたはSであり;
R1は、Hまたはメチルであり;
nは、0、1、2または3であり;および
Lは、式(XV)および(XVI)中で同じでありまたは異なり、かつ
-(CH2)q-、q=2~12;
-(CH2)r-C(O)-、r=2~12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-、s=1~5;
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-、tは、独立に1~5である;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-、uは、独立に1~5である;および
-(CH2)v-NH-C(O)-、vは2~12である;
からなる群より選択され、ここで末端C(O)(存在する場合)は、NH基に結合され;
ここでb+c+dは、2または3である、項目1または記載1の複合体。
15.bは0であり、cは1であり、dは1である、項目14に記載の複合体。
16.bは1であり、cは0であり、dは1である、項目14に記載の複合体。
17.bは1であり、cは1であり、dは0である、項目14に記載の複合体。
18.bは1であり、cは1であり、dは1である、項目14に記載の複合体。
19.YはOである、項目14~18のいずれか1つに記載の複合体。
20.YはSである、項目14~18のいずれか1つに記載の複合体。
21.R1はHである、項目14~20のいずれか1つに記載の複合体。
22.R1はメチルである、項目14~20のいずれか1つに記載の複合体。
23.nは0である、項目14~22のいずれか1つに記載の複合体。
24.Lは-(CH2)r-C(O)-であり、rは2~12である、項目14~23のいずれか1つに記載の複合体。
25.rは2~6である、項目24に記載の複合体。
26.rは4または6、例えば、4である、項目25に記載の複合体。
27.本明細書で開示のいずれかの特徴または特徴の組み合わせを有する、項目1~26のいずれかに記載の複合体。
Claims (20)
- 細胞中のLPAの発現を抑制するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部および第1の鎖に対し実質的に相補的である第2の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも1つの二重鎖領域を含み、前記第1の鎖が、配列番号9のヌクレオチド配列を含み、前記核酸がRNA干渉を媒介し得、任意選択で前記第2の鎖が配列番号10のヌクレオチド配列を含む、核酸。
- 前記第1の鎖が、19~35ヌクレオチド長であり、かつ/または前記第2の鎖が、17~35ヌクレオチド長である、請求項1に記載の核酸。
- 前記少なくとも1つの二重鎖領域が、17~25個の連続ヌクレオチド塩基対からなり、任意選択で19~25個の連続ヌクレオチド塩基対からなる、請求項1または2に記載の核酸。
- 前記核酸が、
a)両端で平滑末端である;または
b)一端でオーバーハングを有しかつ他端で平滑末端を有する;または
c)両端でオーバーハングを有する、
請求項1~3のいずれか1項に記載の核酸。 - 前記第1および/または第2の鎖上の1個または複数のヌクレオチドが、修飾されて、修飾ヌクレオチドを形成する、請求項1~4のいずれか1項に記載の核酸。
- 第1のおよび/または第2の鎖の一方または両方の末端の末端2または3個の3’ヌクレオチドおよび/または5’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の核酸。
- リガンドに結合されている、請求項1~6のいずれか1項に記載の核酸を含む、複合化核酸。
- 前記リガンドが、(i)1個または複数のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分、および(ii)リンカーを含み、前記リンカーが、前記核酸に少なくとも1個のGalNAc部分を結合する、請求項7に記載の複合化核酸。
- 前記リガンドが、式(I):
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
(式中、
Sは、N-アセチルガラクトサミンであり;
X1は、C3-C6アルキレンまたは(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-であり、mは、1、2、または3であり;
Pは、ホスフェートまたはチオホスフェートであり;
X2は、式(-CH2)n-O-CH2-のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、n=1~6であり;
Aは、分岐ユニットであり;
X3は、架橋ユニットであり;
前記核酸が、ホスフェートまたはチオホスフェートを介してX3に結合されている)
の化合物を含む、請求項7または8に記載の複合化核酸。 - 前記核酸が、前記第1の鎖上の3個の末端3’ヌクレオチドのそれぞれの間および3個の末端5’ヌクレオチドのそれぞれの間のホスホロチオエート結合、および前記第2の鎖の3’末端の3個の末端ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含み、かつ前記リガンドが、前記第2の鎖の5’末端に結合されている、請求項11に記載の複合化核酸。
- リガンドに結合されている請求項1に記載の核酸を含む複合化核酸であって、前記第1のRNA鎖が、式(XV):
前記第2のRNA鎖が、式(XVI):
式中、
Z1およびZ2は、それぞれ前記第1および第2のRNA鎖のRNA部分であり;
Yは、OまたはSであり;
R1は、Hまたはメチルであり;
nは、0、1、2または3であり;かつ
Lは、式(XV)および(XVI)中で同じであるか異なり、かつ
-(CH2)q-、(ここでq=2~12である);
-(CH2)r-C(O)-、(ここでr=2~12である);
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-、(ここでs=1~5である);
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-、(ここでtは、独立に1~5である);
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-CO-、(ここでuは、独立に1~5である);および
-(CH2)v-NH-C(O)-、(ここでvは、2~12である);
からなる群より選択され、末端C(O)は、存在する場合、前記NH基に結合され;かつ
b+c+dは、2または3である、
複合化核酸。 - 前記第1の鎖は、
6162717181736152738
で表される修飾された核酸配列を含み、かつ
前記第2の鎖は、
3845261846364645161
で表される修飾された核酸配列を含み、
前記の番号は、下記の修飾された核酸を示す:
1=2’F-dU、
2=2’F-dA、
3=2’F-dC、
4=2’F-dG、
5=2’-OMe-rU;
6=2’-OMe-rA;
7=2’-OMe-rC;
8=2’-OMe-rG、
請求項1に記載の核酸または請求項11~13のいずれか1項に記載の複合化核酸。 - 前記第1の鎖の5’末端から位置2および14のヌクレオチドが、2’フルオロ修飾により修飾され、かつ前記第1の鎖の位置11、または13、または11および13、または11~13に対応する前記第2の鎖上のヌクレオチドが、2’フルオロ修飾により修飾されている、請求項1に記載の核酸または請求項11~13のいずれか1項に記載の複合化核酸。
- 薬物としての使用のための、請求項1~15のいずれか1項に記載の核酸または複合化核酸および任意選択で送達担体および/または生理学的に許容可能な賦形剤および/またはキャリアおよび/または希釈剤および/または緩衝液および/または保存剤を含む組成物。
- 疾患または病態の予防または治療またはリスク低減のための、請求項16に記載の組成物であって、前記疾患または病態が、心臓血管疾患または高レベルのLp(a)含有粒子に関連する他の疾患または病態である、組成物。
- 前記心臓血管疾患が、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症、冠状動脈性心疾患または大動脈弁狭窄症である、請求項17に記載の組成物。
- 請求項1~15のいずれか1項に記載の核酸または複合化核酸を含みかつ送達担体、および/または生理学的に許容可能な賦形剤および/またはキャリアおよび/または希釈剤をさらに含む医薬組成物。
- 前記送達担体がリポソームである、請求項19に記載の医薬組成物。
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Citations (1)
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US20110110886A1 (en) * | 2008-06-13 | 2011-05-12 | Yale University | Small molecule inhibitors of autotaxin and methods of use |
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