KR102553382B1 - 세포에서 lpa의 발현을 저해하기 위한 핵산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생성물, 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 심혈관 질환, 예컨대, 관상동맥 심장 질환 또는 대동맥 협착증 또는 뇌졸중 또는 Lp(a)-함유 입자의 증가된 수준과 관련된 임의의 다른 장애, 병상 또는 증후군의 치료, 예방 또는 이를 앓을 위험의 감소에 사용하기 위한 LPA 유전자 발현을 방해하거나 이의 발현을 저해하는 핵산 생성물에 관한 것이다.

Description

세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산
본 발명은 생성물, 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 LPA 유전자 발현을 방해하거나 또는 이의 발현을 저해하는 핵산 생성물에 관한 것이다. 이러한 치료용 Lp(a) 강하 요법은 뇌졸중, 죽상경화증, 혈전증 및 심혈관 질환, 예컨대, 관상동맥 심장 질환 및 대동맥 협착증 또는 Lp(a)-함유 입자의 증가된 수준과 관련된 임의의 다른 장애, 병상(pathology) 또는 증후군을 예방하고, 이를 앓을 위험을 감소시키는 역할을 한다.
발현된 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 이중-가닥 RNA(double-stranded RNA: dsRNA)는 RNA 간섭(RNA interference: RNAi)이라 불리는 기전에 의해서 유전자 발현을 차단할 수 있다고 밝혀져 있다(Fire et a.l, 1998, Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11 및 Elbashir et al., 2001, Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8). 짧은 dsRNA는 척추동물을 비롯한 다수의 유기체에서 유전자-특이적 전사후 침묵(gene-specific, post-transcriptional silencing)을 유도하고, 유전자 기능을 연구하는데 유용한 도구가 되었다. RNAi는 RNA-유도된 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex: RISC)에 로딩된 침묵 촉발인자에 상동성인 메신저 RNA를 분해하는 서열-특이적 다중-성분 뉴클레아제인 RISC 복합체에 의해서 매개된다. 간섭 RNA(본 명세서에서 iRNA라 지칭), 예컨대, siRNA, 안티세컨드 가닥(antisecond strand) RNA, 및 마이크로-RNA는 유전자-침묵에 의해서, 즉, mRNA 분자의 분해를 통해서 단백질의 유전자 번역을 저해함으로써 단백질의 형성을 예방하는 올리고뉴클레오타이드이다. 유전자-침묵제(gene-silencing agent)는 의약에서 치료 응용에 상당히 중요해지고 있다.
문헌[Watts and Corey in the Journal of Pathology (2012; Vol 226, p 365-379)]에 따르면, 핵산 침묵 촉발인자를 설계하는데 사용될 수 있는 알고리즘이 존재하지만, 이들 모두는 심각한 한계를 갖는다. 효력있는 iRNA를 식별하기 위해서 다양한 실험 방법이 필요할 수 있는데, 그 이유는 알고리즘은 표적 mRNA의 3차 구조 또는 RNA 결합 단백질의 관여와 같은 인자를 고려하지 않기 때문이다. 따라서, 최소한의 오프-타깃 효과를 갖는 효력있는 핵산 침묵 촉발인자의 발견은 복잡한 과정이다. 이러한 고도로 충전된 분자의 약제 개발을 위해서, 이들은 경제적으로 합성되고, 표적 조직에 분포되고, 세포에 도입되고, 허용 가능한 독성 한계치 내에서 기능할 수 있는 것이 필요하다.
Lp(a)는 간에서 주로 발현되는 불균질 저밀도 지방단백질 입자이다(Witztum and Ginsberg, J Lipid Res. 2016 Mar;57(3):336-9). 그것은 ApoB 폴리펩타이드를 통해서 LDL에 연결되는 아포지방단백질(a)(LPA 유전자에 의해서 암호화되는 Apo(a))로 구성된다. 유전자적으로 정의되는 높은 Lp(a) 혈청 수준은 식이 및 운동에 의해서 영향을 받지 않고, 연관된 아테롬성 동맥경화증 가능성을 통해서 심혈관 질환을 앓을 위험 증가와 연관된다(Alonso et al., Journal of the American College of Cardiology Vol. 63, No. 19, 2014). 진단 및 예방 의약과 관련하여, Lp(a)의 환자의 혈청 수준은 관상동맥 심장 질환 및 대동맥 협착증에 대해서 상당히 우세하고, 독립적이고, 유전적인 위험 인자이다(Saeedi and Frohlich Clinical Diabetes and Endocrinology (2016) 2:7). 간접적인 표준 일반 LDL-저하 조치 외에 현재 승인된 특별한 Lp(a) 감소 요법은 존재하지 않는다. 따라서, 장애, 예컨대, 뇌졸중, 죽상경화증, 혈전증 및 심혈관 질환, 예컨대, 관상동맥 심장 질환, 대동맥 협착증 및 다른 비규정된 연관된 장애, 병상 또는 증후군과 연관된 장애를 효과적으로 치료하는 방법, 예방하는 방법 및 이를 앓을 위험을 감소시키는 방법이 현재 필요하다. 본 발명은 이러한 충족되지 않은 의학적 요구를 다룬다:
본 발명의 제1 양상은 세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산에 관한 것이며, 이러한 핵산은, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 가닥은 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 또는 73으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 핵산은 제1 가닥 내에 참조 서열 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 또는 73 중 임의의 하나 중 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 적어도 19개의 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 제1 가닥 서열에 포함된 참조 서열의 일부에 대해서 제1 가닥 서열 내의 단일 뉴클레오타이드 미스매치의 수는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개, 가장 바람직하게는 0이다.
제2 가닥은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 44, 64, 66, 68, 70, 72 또는 74의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
제1 가닥은 서열번호 5 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고/있거나 제2 가닥은 서열번호 6 및 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 각각 17 내지 35개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, 적어도 하나의 듀플렉스 영역은 10 내지 25개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 듀플렉스는 2개의 별개의 가닥을 포함할 수 있거나 또는 그것은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 단일 가닥을 포함할 수 있다.
핵산은 a) 양 단부 다에서 평활 단부(blunt ended)일 수 있거나; b) 하나의 단부에서 오버행을 갖고, 나머지에서 평활 단부를 가질 수 있거나; 또는 c) 양 단부 다에서 오버행을 가질 수 있다.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형되어, 변형된 뉴클레오타이드를 형성할 수 있다. 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형될 수 있다. 제1 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 적어도 제2 변형에 의해서 변형될 수 있고, 여기서 적어도 제2 변형은 하나 이상의 홀수 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하다. 하나 이상의 변형된 짝수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나에 근접할 수 있다.
제1 가닥 내의 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 본 발명의 핵산 내에서 변형될 수 있다. 제1 가닥 내의 복수의 짝수 뉴클레오타이드가 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 제1 가닥은 공통 변형(common modification)에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제1 가닥은 또한 제2의 상이한 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
제2 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 제1 가닥 상의 홀수 뉴클레오타이드의 변형과 상이한 변형에 의해서 변형될 수 있고/있거나 제2 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드의 동일한 변형에 의해서 변형될 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 변형된 짝수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 뉴클레오타이드에 근접할 수 있다. 제2 가닥의 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 공통 변형에 의해서 변형될 수 있고/있거나 복수의 짝수 뉴클레오타이드는 제1 가닥 홀수 뉴클레오타이드 상에 존재하는 동일한 변형에 의해서 변형될 수 있다. 제2 가닥 상의 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 제2 변형에 의해서 변형될 수 있고, 여기서 제2 변형은 제1 가닥 홀수 뉴클레오타이드의 변형과 상이하다.
제2 가닥은 공통 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는데, 이것은 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드의 변형과 상이한 제2 변형일 수 있다.
본 발명의 핵산에서, 제1 가닥 내의 홀수 뉴클레오타이드 각각 및 제2 가닥 내의 짝수 뉴클레오타이드 각각은 공통 변형으로 변형될 수 있고, 짝수 뉴클레오타이드 각각은 제2 변형으로 제1 가닥 내에서 변형될 수 있고, 홀수 뉴클레오타이드 각각은 제2 상이한 변형으로 제2 가닥 내에서 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산은 제2 가닥의 비변형되거나 또는 상이하게 변형된 뉴클레오타이드에 비해서 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해서 이동된 제1 가닥의 변형된 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
변형 및/또는 변형들은 각각 그리고 개별적으로 3'-말단 데옥시-티민, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-변형, 2'-아미노-변형, 2'-알킬-변형, 몰폴리노 변형, 포스포르아미데이트 변형, 5'-포스포로티오에이트기 변형, 5'-포스페이트 또는 5'-포스페이트 모방 변형 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아민기 변형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고/있거나 변형된 뉴클레오타이드는 잠금(locked) 뉴클레오타이드, 무염기성(abasic) 뉴클레오타이드 또는 비자연 염기 포함 뉴클레오타이드 중 임의의 하나일 수 있다. 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸일 수 있고/있거나 적어도 하나의 변형은 2'-F일 수 있다.
본 발명은 추가로 제2 양상으로서, 세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산을 제공하며, 이 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부, 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 가닥은 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 또는 73으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 제1 가닥의 뉴클레오타이드는 홀수 뉴클레오타이드 상의 제1 변형에 의해서 변형되고, 짝수 뉴클레오타이드 상의 제2 변형에 의해서 변형되고, 제2 가닥의 뉴클레오타이드는 짝수 뉴클레오타이드 상의 제3 변형에 의해서 변형되고, 홀수 뉴클레오타이드 상의 제4 변형에 의해서 변형되고, 여기서 적어도 제1 변형은 제2 변형과 상이하고, 제3 변형은 제4 변형과 상이하다. 제2 가닥은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 64, 66, 68, 70, 72 또는 74의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 제3 변형 및 제1 변형은 동일할 수 있고/있거나 제2 변형 및 제4 변형은 동일할 수 있다.
제1 변형은 2'OMe일 수 있고, 제2 변형은 2'F일 수 있다.
제2 양상의 핵산에서, 제1 가닥은 서열번호 5 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고 제2 가닥은 서열번호 6 및 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
서열 및 변형은 하기 표에 제시된 바와 같을 수 있고; 이것은 본 명세서에 제공된 바와 같은 표 1의 발췌를 기초로 하는 바람직한 서열을 나타낸다:
Figure 112020060356433-pct00001
여기서 특정 변형은 하기 번호로 제시된다:
1=2'F-dU,
2=2'F-dA,
3=2'F-dC,
4=2'F-dG,
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG.
본 발명의 핵산은 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 말단 1개, 2개 또는 3개의 3' 뉴클레오타이드 및/또는 1개, 2개 또는 3개의 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함할 수 있다. 그것은 제1 가닥 상의 3개의 말단 3' 각각 사이에 그리고 3개의 말단 5' 뉴클레오타이드 각각 사이에 2개의 포스포로티오에이트, 및 제2 가닥의 3' 단부의 3개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
이러한 핵산은 리간드에 접합될 수 있다.
본 발명은 제3 양상으로서, 세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산을 추가로 제공하며, 이러한 핵산은, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 가닥은 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 또는 73으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 핵산은 리간드에 접합되어 있다.
리간드는 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 모이어티 및 이의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함할 수 있고, 여기서 링커는 임의의 상기 양상에 정의된 바와 같은 서열에 GalNAc 모이어티를 접합한다. 링커는 2가 또는 3가 또는 4가 분지형 구조일 수 있다. 뉴클레오타이드는 본 명세서에 정의된 바와 같이 변형될 수 있다.
리간드는 하기 화학식 I을 포함할 수 있다:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
식 중,
S는 당류를 나타내고, 여기서 당류는 N-아세틸 갈락토사민이고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-이며, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)이며;
X2는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 또는 알킬렌 에터이고, 여기서 n은 1 내지 6이고;
A는 분지 단위이며;
X3은 브리징 단위를 나타내고;
여기서 본 발명에 따른 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)를 통해서 X3에 접합된다.
따라서 본 발명은 하기 구조식 중 하나를 갖는 접합된 핵산을 추가로 제공한다:
Figure 112020060356433-pct00002
Figure 112020060356433-pct00003
Figure 112020060356433-pct00004
Figure 112020060356433-pct00005
Figure 112020060356433-pct00006
여기서 Z는 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산을 나타낸다.
대안적으로, 본 발명은 하기 구조의 리간드에 접합될 수 있다:
Figure 112020060356433-pct00007
.
본 발명은 또한 세포에서 LPA 유전자의 발현을 저해하기 위한 접합체에 관한 것이며, 상기 접합체는 본 발명의 임의의 양상의 핵산을 포함하는 핵산 부분, 및 리간드 부분을 포함하며, 상기 핵산 부분은 제1 RNA 가닥의 적어도 일부 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 RNA 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 가닥은 상기 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 리간드 부분은 링커 모이어티, 바람직하게는 세린올-유래된 링커 모이어티 및 세포의 생체내 표적화를 위한 표적화 리간드를 포함하고, 하나 또는 두 RNA 가닥의 3' 단부 및/또는 5' 단부에만 접합되고, 여기서 제1 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않고, 여기서,
(i) 제2 RNA 가닥은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 여기서 (a) 제2 RNA 가닥은 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제1 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (b) 제1 RNA 가닥은 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (c) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되거나; 또는
(ii) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않거나, 또는
본 발명은 세포에서 LPA 유전자의 발현을 저해하기 위한 접합체에 관한 것이며, 상기 접합체는 핵산 부분, 및 리간드 부분을 포함하며, 상기 핵산 부분은 제1 RNA 가닥의 적어도 일부 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 RNA 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 가닥은 상기 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 리간드 부분은 링커 모이어티 및 세포의 생체내 표적화를 위한 표적화 리간드를 포함하고, 하나 또는 두 RNA 가닥의 3' 단부 및/또는 5' 단부에만 접합되고, 여기서 제1 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않고, 여기서,
(i) 제2 RNA 가닥은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 여기서 (a) 제2 RNA 가닥은 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제1 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (b) 제1 RNA 가닥은 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (c) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되거나; 또는
(ii) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않는다.
링커 모이어티는 예를 들어, 세린올-유래된 링커 모이어티 또는 본 명세서에 기재된 다른 링커 유형 중 하나일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 양상의 핵산 또는 접합된 핵산, 및 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한 질환, 장애 또는 증후군의 치료 및/또는 질환, 장애 또는 증후군을 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 임의의 양상에 따른 핵산 또는 접합된 핵산이 제공된다.
본 발명은 본 발명의 임의의 양상에 따른 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애 또는 증후군의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 핵산 또는 접합된 핵산은 대상체에게 피하로, 정맥내로 또는 임의의 다른 적용 경로를 사용하여, 예컨대, 경구, 직장 또는 복강내로 투여될 수 있다.
피하 적용 후, 본 발명은 목적하는 효과를 달성하는데 필요한 더 낮은 치료 용량을 달성하고, 원치 않는 부작용을 감소시키기 위해서, 간(간세포)에 조직 특이적 방식으로 전달되고, LPA를 특이적으로 표적화할 수 있다.
본 발명 또는 본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 약제학적 조성물은 질환, 장애 또는 증후군의 치료에 사용될 수 있다. 치료는 뇌졸중, 죽상경화증, 혈전증 또는 심혈관 질환, 예컨대, 관상동맥 심장 질환 또는 대동맥 협착증 및 증가된 수준의 Lp(a)-함유 입자와 연관된 임의의 다른 질환 또는 병상을 예방하고, 이를 앓을 위험을 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 또는 접합된 핵산의 제조 방법이 또한 포함된다.
본 발명은 이중 가닥이고, LPA의 발현된 RNA 전사물에 지향되는 핵산 및 이의 조성물에 관한 것이다. 이러한 핵산 또는 접합된 핵산은, LPA 유전자 생성물의 감소된 발현이 바람직한 다양한 질환, 장애 및 증후군의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 제1 양상은 세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산에 관한 것이며, 이러한 핵산은, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 가닥은 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 또는 73으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
핵산은 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 21의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 24의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 25의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 26의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 27의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 28의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 29의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 31의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 33의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 34의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 35의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 36의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 37의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 38의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 39의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 40의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 41의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 42의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 43의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 44의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 63의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 64의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 65의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 66의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 67의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 68의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 69의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 70의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 71의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 72의 뉴클레오타이드 서열을 포함함); 또는 서열번호 73의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 가닥(선택적으로 여기서 제2 가닥은 서열번호 74의 뉴클레오타이드 서열을 포함함)을 포함할 수 있다.
LPA 유전자는 고도로 반복적인 서열을 포함한다. 따라서 매우 유사한 서열을 갖는 제1 가닥 핵산은 mRNA의 매우 상이한 표적 영역과 상보성인 완벽한 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 관련 양상은 세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산이며, 여기서 핵산은 제1 가닥; 및 제2 가닥을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제2 가닥은 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성이고, 여기서 상기 제1 가닥은 참조 서열 서열번호 9, 5, 1, 3, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 또는 73 중 임의의 하나 중 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 적어도 19개의 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 여기서 제1 가닥 서열에 포함된 참조 서열의 일부에 대해서 제1 가닥 서열 내의 단일 뉴클레오타이드 미스매치 및/또는 결실 및/또는 삽입의 수는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개, 가장 바람직하게는 0개이다.
일 양상에서, 핵산의 제1 가닥은 참조 서열 중 임의의 하나, 바람직하게는 참조 서열 서열번호 9 및 5 중 임의의 하나 중 적어도 18개의 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 여기서 제1 가닥 서열에 포함된 참조 서열의 일부에 대해서 제1 가닥 서열 내의 단일-뉴클레오타이드 미스매치 및/또는 결실 및/또는 삽입의 수는 최대 1개, 바람직하게는 0개이다.
일 양상에서, 핵산의 제1 가닥은 참조 서열 서열번호 9 및 5 중 임의의 것 중 적어도 19개의 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
제1 (안티센스) 가닥과 표적 서열, 또는 제1 가닥과 제2 (센스) 가닥 간의 미스매치, 결실 또는 삽입의 특정 수는 siRNA와 관련하여 용인될 수 있고, 심지어는 특정 경우에 활성을 증가시킬 가능성을 가질 수 있다.
핵산이라는 것은 유전자 발현을 방해할 수 있는, 뉴클레오타이드를 포함하는 2개의 가닥을 포함하는 핵산을 의미한다. 저해는 완전하거나 또는 부분적일 수 있고, 표적화된 방식으로 유전자 발현을 하향 조절할 수 있다. 핵산은 2개의 별개의 폴리뉴클레오타이드 가닥, 즉, 가이드 가닥일 수도 있는 제1 가닥, 및 패신저(passenger) 가닥일 수도 있는 제2 가닥을 포함한다. 제1 가닥 및 제2 가닥은 다시 "접혀서" 이중 가닥 분자를 형성하는 자가 상보성인 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자의 부분일 수 있다. 핵산은 siRNA 분자일 수 있다.
핵산은 리보뉴클레오타이드, 변형된 리보뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 유사체, 표적 서열 또는 상보성 가닥 상의 상응하는 염기와 "쌍을 이룰 수 있도록" 뉴클레오타이드를 모방할 수 있는 비뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥(당업계에서 가이드 가닥으로도 공지됨)의 전부 또는 일부 및 제2 가닥(당업계에서 패신저 가닥으로도 공지됨)의 전부 또는 일부에 의해서 형성된 이중-가닥 핵산 부분 또는 듀플렉스 영역을 추가로 포함할 수 있다. 듀플렉스 영역은 제1 가닥과 제2 가닥 사이에 형성된 제1 염기 쌍에서 시작하고, 제1 가닥과 제2 가닥(이들 포함) 사이에 형성된 마지막 염기쌍에서 끝난다고 정의된다.
듀플렉스 영역은, 왓슨-크릭 염기 짝지움 또는 상보성 또는 실질적으로 상보성인 올리고뉴클레오타이드 가닥 사이에 듀플렉스 영역을 허용하는 임의의 다른 방식에 의해서 서로와 염기 쌍을 형성하는 2개의 상보성이거나 실질적으로 상보성인 올리고뉴클레오타이드 내의 영역을 의미한다. 예를 들어, 21개의 뉴클레오타이드 단위를 갖는 올리고뉴클레오타이드 가닥은 21개의 뉴클레오타이드 단위의 또 다른 올리고뉴클레오타이드와 염기 쌍을 이룰 수 있지만, 각각의 가닥 상의 19개의 뉴클레오타이드만 상보성 또는 실질적으로 상보성이어서, "듀플렉스 영역"은 19개의 염기 쌍으로 이루어진다. 남아있는 염기 쌍은 5' 오버행 및 3' 오버행으로서, 또는 단일 가닥 영역으로서 존재할 수 있다. 추가로, 듀플렉스 영역 내에서, 100% 상보성은 필요하지 않고, 실질적인 상보성이 듀플렉스 영역 내에서 허용 가능하다. 실질적인 상보성은, 생물학적 조건 하에서 어닐링될 수 있도록 하는 가닥 간의 상보성을 지칭한다. 두 가닥이 생물학적 조건 하에서 어닐링할 수 있는지를 경험적으로 결정하는 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 대안적으로, 두 가닥을 합성하고, 생물학적 조건 하에서 함께 첨가하여 그들이 서로 어닐링할 수 있는지를 결정할 수 있다.
적어도 하나의 듀플렉스 영역을 형성하는 제1 가닥 및 제2 가닥의 부분은 완전히 상보성일 수 있고, 서로와 적어도 부분적으로 상보성이다. 핵산의 길이에 따라서, 제1 가닥과 제2 가닥 간의 염기 상보성과 관련하여 완벽한 매치가 반드시 필요한 것은 아니다. 그러나, 제1 가닥 및 제2 가닥은 생리학적 조건 하에서 혼성화할 수 있어야 한다.
적어도 하나의 듀플렉스 영역에서 제1 가닥과 제2 가닥 간의 상보성은, 어느 가닥에서 뉴클레오타이드 미스매치 또는 추가적인/결실된 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다는 점에서 완벽할 수 있다. 대안적으로, 상보성은 완벽하지 않을 수 있다. 상보성은 약 70% 내지 약 100%일 수 있다. 보다 구체적으로, 상보성은 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 및 중간 값일 수 있다.
본 발명과 관련하여, 예를 들어 "제1 가닥의 적어도 일부를 포함하는 하나의 듀플렉스 영역"에서와 같은 "일부"는, 듀플렉스 영역이 주어진 참조 가닥 서열 중 적어도 10개, 바람직하게는 적어도 12개, 보다 바람직하게는 적어도 14개, 보다 더 바람직하게는 적어도 16개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모두를 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 듀플렉스 영역에서 참조 서열의 일부는 참조 서열의 상응하는 부분과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 100% 동일하다. 대안적으로, 참조 서열의 일부에 대해서 단일 뉴클레오타이드 미스매치의 수는 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 보다 바람직하게는 최대 1개, 가장 바람직하게는 0이다.
제1 가닥 및 제2 가닥은 각각 표 1에 열거된 서열 중 임의의 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함하는 상보성의 영역을 포함할 수 있다.
핵산은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 64, 66, 68, 70, 72 또는 74의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산의 사용은 제1 가닥의 모두 또는 일부와 표적 핵산의 일부 간의 듀플렉스 영역의 형성에 관여한다. 제1 가닥과 표적 서열 사이에 형성된 제1 염기 쌍에서 시작하고, 제1 가닥과 표적 서열(이들 포함) 사이에 형성된 마지막 염기 쌍에서 끝난다고 정의된, 제1 가닥과 듀플렉스 영역을 형성하는 표적 핵산의 일부는 표적 핵산 서열 또는 단순히 표적 서열이다. 제1 가닥과 제2 가닥 사이에 형성된 듀플렉스 영역은 제1 가닥과 표적 서열 사이에 형성된 듀플렉스 영역과 동일할 필요는 없다. 즉, 제2 가닥은 표적 서열과 상이한 서열을 가질 수 있지만; 제1 가닥은 적어도 생리 조건 하에서 제2 가닥 및 표적 서열 둘 다와 듀플렉스 구조를 형성할 수 있어야 한다.
제1 가닥과 표적 서열 간의 상보성은 완벽할 수 있다(두 핵산 내에 뉴클레오타이드 미스매치 또는 추가적인/결실된 뉴클레오타이드가 존재하지 않음).
제1 가닥과 표적 서열 간의 상보성은 완벽하지 않을 수 있다. 상보성은 약 70% 내지 약 100%일 수 있다. 보다 구체적으로, 상보성은 적어도 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 및 중간 값일 수 있다.
제1 가닥과 표적 서열의 상보성 서열 간의 동일성은 약 75% 내지 약 100% 범위일 수 있다. 보다 구체적으로, 상보성은 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 및 중간 값일 수 있되, 단 핵산은 LPA의 발현을 감소시키거나 저해할 수 있다.
제1 가닥과 표적 서열 간에 100% 미만의 상보성을 갖는 핵산은 제1 가닥과 표적 서열 간에 완벽한 상보성을 갖는 핵산과 동일한 수준까지 LPA의 발현을 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 그것은 완벽한 상보성을 갖는 핵산에 의해서 달성되는 감소 수준의 15% 내지 100%인 수준까지 LPA의 발현을 감소시킬 수 있다.
핵산은 각각 19 내지 25개 뉴클레오타이드 길이인 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함할 수 있다. 제1 가닥 및 제2 가닥은 상이한 길이를 가질 수 있다.
핵산은 15 내지 25개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 핵산은 17 내지 23개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 핵산은 17 내지 25개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 핵산은 23 내지 24개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 핵산은 19 내지 21개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 핵산은 21 내지 23개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다.
핵산은 19 내지 25개 뉴클레오타이드 염기 쌍으로 이루어진 포함할 수 있다. 듀플렉스 영역은 인접할 수 있는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 염기 쌍으로 이루어질 수 있다.
핵산은 서열번호 5 또는 서열번호 9의 제1 가닥 서열을 포함할 수 있다. 핵산은 서열번호 6 또는 서열번호 10의 제2 가닥 서열을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 RNA 간섭을 매개한다.
일 실시형태에서, 세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산은 제1 가닥, 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 가닥은 서열번호 9, 5, 1, 3, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 또는 73의 서열 중 임의의 것과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 적어도 19개의 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
추가 양상에서, 기재된 바와 같은 핵산 또는 접합된 핵산은 핵산 또는 접합된 핵산의 부재 하에서 관찰되는 발현에 비해서 LPA의 발현을 적어도 15% 감소시킬 수 있다. 상기 양상 중 임의의 것의 바람직한 특징이 이러한 양상에 또한 적용된다. 특히, LPA의 발현은 핵산 또는 접합된 핵산의 부재 하에서 또는 비-침묵 대조군의 존재 하에서 관찰되는 것보다 적어도 하기에 주어진 %로, 또는 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% 미만 또는 더 낮게 그리고 중간 값으로 감소될 수 있다.
핵산은 양 단부 다에서 평활 단부일 수 있거나; 하나의 단부에서 오버행을 갖고, 나머지 단부에서 평활 단부를 가질 수 있거나; 또는 양 단부 다에서 오버행을가질 수 있다.
"오버행"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 당업계에서의 이의 일반적인 통상적인 의미를 갖고, 즉, 이중 가닥 핵산에서 상보성 가닥의 말단 뉴클레오타이드를 지나서 연장된 핵산의 단일 가닥 부분이다. 용어 "평활 단부"는 말단 뉴클레오타이드(들)가 염기 쌍을 형성하는지의 여부와 관계 없이, 두 가닥 모두가 동일한 위치에서 종결되는 이중 가닥 핵산을 포함한다. 평활 단부에서의 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 뉴클레오타이드는 염기 쌍을 형성할 수 있다. 평활 단부에서의 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 뉴클레오타이드는 쌍을 형성하지 않을 수 있다. 평활 단부에서의 제1 가닥 및 제2 가닥의 2개의 말단 뉴클레오타이드는 염기 쌍을 형성할 수 있다. 평활 단부에서의 제1 가닥 및 제2 가닥의 2개의 말단 뉴클레오타이드는 쌍을 형성하지 않을 수 있다.
핵산은 한쪽 단부에 오버행 및 다른 쪽에는 평활 단부를 가질 수 있다. 핵산은 양 단부에 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 양 단부 다에서 평활 단부일 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 5'-단부 및 제2 가닥의 3'-단부 또는 제1 가닥의 3'-단부 및 제2 가닥의 5'-단부에서 평활 단부일 수 있다.
핵산은 3'- 또는 5'-단부에 오버행을 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상에 3'-오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥 상에 3'-오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상에 5'-오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥 상에 5'-오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 5'-단부 및 3'-단부 둘 다에 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥의 5'-단부 및 3'-단부 둘 다에 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상의 5' 오버행 및 제2 가닥 상의 3' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상의 3' 오버행 및 제2 가닥 상의 5' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상의 3' 오버행 및 제2 가닥 상의 3' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상의 5' 오버행 및 제2 가닥 상의 5' 오버행을 가질 수 있다.
제2 가닥 또는 제1 가닥의 3'-단부 또는 5' 단부의 오버행은 1, 2, 3, 4 및 5개 길이의 뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 선택적으로, 오버행은 뉴클레오타이드 1 또는 2개로 이루어질 수 있고, 이는 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있다.
비변형된 폴리뉴클레오타이드, 특히 리보뉴클레오타이드는 세포 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉬울 수 있고, 따라서, 변형/변형된 뉴클레오타이드가 본 발명의 핵산에 포함될 수 있다. 이러한 변형은 핵산을 뉴클레아제에 대해서 더 저항성이게 함으로써 핵산을 안정화시키는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 개선된 저항성은 핵산이 RNA 간섭을 매개하는 데 있어서 더 긴 시간 경과 동안 활성이게 하고, 핵산을 치료를 위해서 사용하려는 경우에 특히 바람직하다.
본 발명의 핵산의 제2 및/또는 제1 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 변형될 수 있다.
일반적으로 본 발명의 핵산의 변형은 네이티브 RNA 분자에 대해 고유한 시험관내 및 생체내 안정성 및 생체이용률을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 잠재적인 한계를 극복하는데 있어서 강력한 도구를 제공한다. 본 발명에 따른 핵산은 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 인간에서 인터페론 활성을 유도할 가능성을 또한 최소화할 수 있다. 변형은 표적 세포로의 핵산의 기능적 전달을 추가로 향상시킬 수 있다. 본 발명의 변형된 핵산은 제1 가닥 또는 제2 가닥 중 어느 하나 또는 둘 다의 하나 이상의 화학적으로 변형된 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 리보뉴클레오타이드는 염기, 당 또는 포스페이트 모이어티의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 리보핵산은 핵산 또는 염기의 유사체로의 치환 또는 삽입에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 핵산은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 제1 가닥에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 제2 가닥에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 듀플렉스 영역에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 듀플렉스 영역 외부, 즉 단일 가닥 영역에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 제1 가닥 상에 존재할 수 있고, 듀플렉스 영역 외부에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 제2 가닥 상에 존재할 수 있고, 듀플렉스 영역 외부에 존재할 수 있다. 제1 가닥의 3'-말단 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드일 수 있다. 제2 가닥의 3'-말단 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드일 수 있다. 제1 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드일 수 있다. 제2 가닥의 5'-말단 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 핵산은 1개의 변형된 뉴클레오타이드를 가질 수 있거나 본 발명의 핵산은 약 2 내지 4개의 변형된 뉴클레오타이드를 가질 수 있거나, 핵산은 약 4 내지 6개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 6 내지 8개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 8 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 10 내지 12개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 12 내지 14개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 14 내지 16개의 변형된 뉴클레오타이드 약 16 내지 18개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 18 내지 20개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 20 내지 22개의 변형된 뉴클레오타이드, 약 22 내지 24개의 변형된 뉴클레오타이드, 24 내지 26개의 변형된 뉴클레오타이드 또는 약 26 내지 28개의 변형된 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 각각의 경우에 상기 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산은 상기 변형된 뉴클레오타이드를 갖지 않는 것을 제외하고는 동일한 핵산과 비교할 때 활성도의 적어도 50%를 유지하거나 그 역도 마찬가지이다. 핵산은 상기 변형된 뉴클레오타이드가 없는 것을 제외하고는 동일한 핵산과 비교할 때 활성도의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 또는 중간 값을 유지할 수 있거나, 또는 상기 변형된 뉴클레오타이드가 없는 동일한 핵산의 활성도의 100%를 초과할 수 있다.
변형된 뉴클레오타이드는 퓨린 또는 피리미딘일 수 있다. 퓨린의 적어도 절반은 변형될 수 있다. 피리미딘의 적어도 절반은 변형될 수 있다. 퓨린의 전부가 변형될 수 있다. 피리미딘의 전부가 변형될 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오타이드, 잠금 뉴클레오타이드, 무염기성 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 몰폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트, 비자연 염기 포함 뉴클레오타이드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오타이드 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아마이드기에 연결된 말단 뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
핵산은 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 여기서 염기는 2-아미노아데노신, 2,6-다이아미노퓨린,이노신, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 슈도우라실, 2,4,6-트라이메톡시 벤젠, 3-메틸 우라실, 다이하이드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬사이티딘(예를 들어, 5-메틸사이티딘), 5-알킬우리딘(예를 들어, 리보티미딘), 5-할로우리딘(예를 들어, 5-브로모우리딘), 6-아자피리미딘, 6-알킬피리미딘(예를 들어 6-메틸우리딘), 프로핀, 쿠에소신(quesosine), 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 와이부토신(wybutosine), 와이부톡소신(wybutoxosine), 4-아세틸사이티딘, 5-(카복시하이드록시메틸)우리딘, 5'-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우리딘, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 1-메틸아데노신, 1-메틸이노신, 2,2-다이메틸구아노신, 3-메틸사이티딘, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸카보닐메틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-메틸티오-N6-아이소펜텐일아데노신, 베타-D-만노실쿠에오신, 우리딘-5-옥시아세트산 및 2-티오사이티딘으로부터 선택된다.
본 명세서에 논의된 핵산은 비변형된 RNA뿐만 아니라 예를 들어, 효능을 개선시키도록 변형된 RNA 및 뉴클레오사이드 대용물의 중합체를 포함한다. 비변형된 RNA는 핵산의 성분, 즉, 당, 염기 및 포스페이트 모이어티가 자연에서 발생하는 것, 예를 들어, 인체에서 자연적으로 발생하는 것과 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 분자를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 성분, 즉 당, 염기 및 포스페이트 모이어티 중 하나 이상이 자연에서 발생하는 것과 상이한 뉴클레오타이드를 지칭한다. 그것이 변형된 뉴클레오타이드로 지칭되는 경우, 이는, 변형으로 인해, 그 용어는 뉴클레오타이드가 아닌 분자, 예를 들어, 리보포스페이트 골격이 가닥 사이의 혼성화를 허용하는 비-리보포스페이트 작제물로 교체된 폴리뉴클레오타이드 분자를 물론 포함할 것이고, 즉, 변형된 뉴클 레오타이드는 리보포스페이트 골격을 모방한다.
핵산 내에서 일어나는 하기에 기재된 변형 중 다수, 예컨대 염기, 또는 포스페이트 모이어티, 또는 포스페이트 모이어티의 비-연결 O의 변형이 폴리뉴클레오타이드 분자 내에서 반복될 것이다. 일부 경우에, 변형은 폴리뉴클 레오타이드 내의 모든 가능한 위치/뉴클레오타이드에서 일어날 것이지만, 다수의 경우에 그렇지 않을 것이다. 변형은 3' 또는 5' 말단 위치에서만 일어날 수 있고, 말단 영역에서만, 예컨대, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개의 뉴클레오타이드에서 일어날 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역, 또는 둘 다에서 일어날 수 있다. 변형은 본 발명의 핵산의 이중 가닥 영역에서만 일어날 수 있거나, 또는 본 발명의 핵산의 단일 가닥 영역에서만 일어날 수 있다. 비-연결 O 위치의 포스포로티오에이트 변형은 하나의 또는 양 말단에서만 일어날 수 있거나, 말단 영역에서만, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오타이드에서 일어날 수 있거나, 또는 듀플렉스 및/또는 단일 가닥 영역에서, 특히 말단에서 일어날 수 있다. 5' 단부 또는 3' 단부는 포스포릴화될 수 있다.
오버행 내에 특정 염기를 포함함으로써, 또는 단일 가닥 오버행 내에, 예를 들어 5' 또는 3' 오버행 내에, 또는 둘 다 내에 변형된 뉴클레오타이드를 포함함으로써 본 발명의 핵산의 안정성이 증가될 수 있다. 퓨린 뉴클레오타이드가 오버행 내에 포함될 수 있다. 3' 또는 5' 오버행 내의 염기 중 전부 또는 일부가 변형될 수 있다. 변형은 리보스 당의 2' OH 기에서의 변형을 사용하는 것, 리보뉴클레오타이드 대신 데옥시리보뉴클레오타이드를 사용하는 것, 및 포스페이트기에서의 변형, 예컨대 포스포로티오에이트 변형을 포함할 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성일 필요가 없다.
뉴클레아제는 핵산 포스포다이에스터 결합을 가수분해할 수 있다. 그러나, 핵산에 대한 화학적 변형은 개선된 특성을 부여할 수 있고, 올리고리보뉴클레오타이드를 뉴클레아제에 대해 더욱 안정적이게 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 변형된 핵산은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상(본 발명의 핵산의 5' 및 3' 말단에 있는 경우에도 연결로 지칭됨)의 변경, 예를 들어, 대체;
(ii) 리보스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어, 대체;
(iii) 포스페이트 모이어티의 "데포스포" 링커로의 대체;
(iv) 자연 발생 염기의 변형 또는 대체;
(v) 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형;
(vi) RNA의 3' 단부 또는 5' 단부의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트 기의 제거, 변형 또는 대체, 또는 모이어티, 예를 들어, 형광 표지 모이어티의 RNA의 3' 또는 5' 단부에 대한 접합.
대체, 변형, 변경이라는 용어는 자연 발생 분자와의 차이를 나타낸다.
구체적인 변형이 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스터, 히드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트라이에스터를 포함한다. 포스포로다이티오에이트는 비-연결 산소 둘 다가 황에 의해서 대체된다. 포스페이트 기 내의 1개, 각각 또는 둘 다의 비-연결 산소는 독립적으로 S, Se, B, C, H, N, 또는 OR(R은 알킬 또는 아릴임) 중 어느 하나일 수 있다.
포스페이트 링커는 연결 산소의 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌포스포네이트)로의 대체에 의해서 또한 변형될 수 있다. 대체는 말단 산소에서 일어날 수 있다. 비-연결 산소가 질소로 대체되는 것이 가능하다.
변형된 뉴클레오타이드는 당기의 변형을 포함할 수 있다. 2' 하이드록실기(OH)는 변형되거나 또는 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 대체될 수 있다.
"옥시"-2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 예를 들어, R〓H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; "잠금" 핵산(LNA)(여기서 2' 하이드록실은 예를 들어, 메틸렌 브리지에 의해서 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결됨); O-아민(아민=NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 다이헤테로아릴 아미노, 에틸렌 다이아민, 폴리아미노) 및 아미노알콕시, O(CH2)n아민(예를 들어, 아민=NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 다이헤테로아릴 아미노, 에틸렌 다이아민, 폴리아미노)을 포함한다.
"데옥시" 변형은 산소, 할로겐, 아미노(예를 들어, NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 다이헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아민(아민=NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 다이헤테로아릴 아미노), ―NHC(O)R(R=알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당), 사이아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알켄일 및 알킨일(이것은 예를 들어, 아미노 작용기로 선택적으로 치환될 수 있음)을 포함한다. 특정 실시형태의 다른 치환체는 2'-메톡시에틸, 2'-OCH3, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴 및 2'-플루오로를 포함한다. 당기는 리보스 내의 상응하는 탄소의 것과 반대의 입체화학 구성을 갖는 하나 이상의 탄소를 또한 함유할 수 있다. 따라서, 변형된 뉴클레오타이드는 아라비노스와 같은 당을 함유할 수 있다.
변형된 뉴클레오타이드는 "무염기성" 당을 또한 포함할 수 있고, 이것은 C-1'의 핵염기가 결핍되어 있다. 이러한 무염기성 당은 구성성분 당 원자 중 하나 이상에서의 변형을 추가로 함유할 수 있다.
2'-변형이 하나 이상의 포스페이트 링커 변형과 조합되어 사용될 수 있다(예를 들어, 포스포로티오에이트).
포스페이트기는 인 비함유 연결기에 의해서 개별적으로 대체될 수 있다.
포스페이트기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는 실록산, 카보네이트, 카복시메틸, 카바메이트, 아마이드, 티오에터, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아마이드, 티오폼아세탈, 폼아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌다이메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함한다. 특정 실시형태에서, 대체는 메틸렌카보닐아미노 및 메틸렌메틸이미노기를 포함할 수 있다.
포스페이트 링커 및 리보스 당은 뉴클레아제 저항성 뉴클레오타이드에 의해서 대체될 수 있다.
예는 몰폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘 및 펩타이드 핵산(PNA) 뉴클레오사이드 대용물을 포함한다. 특정 실시형태에서, PNA 대용물이 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 및 5' 단부가 변형될 수 있다. 이러한 변형은 분자의 3' 단부 또는 5' 단부 또는 양 단부에 존재할 수 있다. 이는 전체 말단 포스페이트 또는 포스페이트기의 원자 중 하나 이상의 변형 또는 대체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 및 5' 단부가 표지 모이어티, 예를 들어, 형광단(예를 들어, 피렌, TAMRA, 플루오레세인, Cy3 또는 Cy5 염료) 또는 보호기(예를 들어, 황, 규소, 붕소 또는 에스터를 기초로 함)와 같은 다른 기능성 분자 엔티티에 접합될 수 있다. 기능성 분자 엔티티는 포스페이트기 및/또는 링커를 통해 당에 부착될 수 있다. 링커의 말단 원자는 포스페이트기의 연결 원자 또는 당의 C-3' 또는 C-5' O, N, S 또는 C기에 연결되거나 또는 이를 대체할 수 있다. 대안적으로, 링커는 뉴클레오타이드 대용물(예를 들어, PNA)의 말단 원자에 연결되거나 이를 대체할 수 있다. 이러한 스페이서 또는 링커는 예를 들어, -(CH2)n-, -(CH2)nN-, -(CH2)nO-, -(CH2)nS-, -(CH2CH2O)nCH2CH2O-(예를 들어, n=3 또는 6임), 무염기성 당, 아마이드, 카복시, 아민, 옥시아민, 옥시이민, 티오에터, 다이설파이드, 티오유레아, 설폰아마이드 또는 몰폴리노, 또는 바이오틴 및 플루오레세인 시약을 포함할 수 있다. 3' 단부는 -OH기일 수 있다.
말단 변형의 다른 예는 염료, 인터칼레이팅제(intercalating agent)(예를 들어, 아크리딘), 가교제(예를 들어, 소랄렌(psoralene), 미토마이신 C), 포피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다환식 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 다이하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제, EDTA, 친유성 담체(예를 들어, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 다이하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판다이올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 다이메톡시트리틸 또는 페녹사진) 및 펩타이드 접합체(예를 들어, 안테나페디아(antennapedia) 펩타이드, Tat 펩타이드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, PEG(예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지된 마커, 효소, 합텐(예를 들어, 바이오틴), 수송/흡수 촉진제(예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 착물)를 포함한다.
활성을 조정하는 것 또는 분해에 대한 저항성을 조절하는 것을 포함하는 다수의 이유로 인해서 말단 변형이 부가될 수 있다. 활성을 조절하는데 유용한 말단 변형은 포스페이트 또는 포스페이트 유사체로의 5' 단부의 변형을 포함한다. 제1 가닥 또는 제2 가닥 상의 본 발명의 핵산은 5' 인산화될 수 있거나 또는 5' 프라임 말단에 포스포릴 유사체를 포함한다. 5'-포스페이트 변형은 RISC 매개 유전자 침묵과 상용성인 것을 포함한다. 적합한 변형은 하기를 포함한다: 5'-모노포스페이트 ((HO)2(O)P-O-5'); 5'-다이포스페이트((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트라이포스페이트((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-구아노신 캡(7-메틸화된 또는 비-메틸화된)(7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-아데노신 캡(Appp), 및 임의의 변형된 또는 비변형된 뉴클레오타이드 캡 구조(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-모노티오포스페이트(포스포로티오에이트; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-모노다이티오포스페이트(포스포로다이티오에이트; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-포스포로티올레이트((HO)2(O)P-S-5'); 산소/황 대체된 모노포스페이트, 다이포스페이트 및 트라이포스페이트의 임의의 추가적인 조합물(예를 들어, 5'-알파-티오트라이포스페이트, 5'-감마-티오트라이포스페이트 등), 5'-포스포르아미데이트((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-알킬포스포네이트(R=알킬=메틸, 에틸, 아이소프로필, 프로필 등, 예를 들어, RP(OH)(O)-O-5'-, (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'-바이닐포스포네이트, 5'-알킬에터포스포네이트(R=알킬에터=메톡시메틸(MeOCH2-), 에톡시메틸 등, 예를 들어, RP(OH)(O)-O-5'-).
본 발명의 핵산은 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 말단 단부 중 하나 이상에 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형을 포함할 수 있다. 선택적으로, 제1 가닥의 각각의 단부 또는 어느 하나의 단부가 1개 또는 2개 또는 3개의 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 제2 가닥의 각각의 단부 또는 어느 하나의 단부가 1개 또는 2개 또는 3개의 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
말단 변형은 분포를 모니터링하는데 또한 유용할 수 있고, 이러한 경우에, 부가될 기는 형광단, 예를 들어, 플루오레세인 또는 알렉사(Alexa) 염료를 포함할 수 있다. 말단 변형은 흡수를 향상시키는데 또한 유용할 수 있고, 이에 유용한 변형은 콜레스테롤을 포함한다. 말단 변형은 RNA 작용제를 또 다른 모이어티에 가교시키는데 또한 유용할 수 있다.
아데닌, 구아닌, 사이토신 및 우라실은 RNA에서 발견되는 가장 통상적인 염기이다. 이들 염기는 특성이 개선된 RNA를 제공하도록 변형 또는 대체될 수 있다. 예를 들어, 이들 염기 또는 합성 및 자연 핵염기(예를 들어, 이노신, 티민, 잔틴, 하이포크잔틴, 뉴불라린, 아이소구아니신 또는 투베르시딘) 및 상기 변형 중 어느 하나를 사용하여 뉴클레아제 저항성 올리고리보뉴클레오타이드가 제조될 수 있다. 대안적으로, 상기 염기 및 "만능 염기" 중 임의의 것의 치환된 또는 변형된 유사체가 사용될 수 있다. 예는 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로핀일 우라실 및 사이토신, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 5-할로우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노 알릴 우라실, 8-할로, 아미노, 티올, 티오알킬, 하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-트라이플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예컨대, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로핀일우라실 및 5-프로핀일사이토신, 다이하이드로우라실, 3-데아자-5-아자사이토신, 2-아미노퓨린, 5-알킬우라실, 7-알킬구아닌, 5-알킬 사이토신, 7-데아자아데닌, N6,N6-다이메틸아데닌, 2,6-다이아미노퓨린, 5-아미노-알릴-우라실, N3-메틸우라실, 치환된 1,2,4-트라이아졸, 2-피리디논, 5-나이트로인돌, 3-나이트로피롤, 5-메톡시우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메톡시카보닐메틸우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-메톡시카보닐메틸-2-티오우라실, 5-메틸아미노메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우라실, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N<4>-아세틸 사이토신, 2-티오사이토신, N6-메틸아데닌, N6-아이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-아이소펜텐일아데닌, N-메틸구아닌 또는 O-알킬화된 염기를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드 유사체"는 6 데스 아미노 아데노신(네불라린(Nebularine)), 4-Me-인돌, 3-나이트로피롤, 5-나이트로인돌, Ds, Pa, N3-Me 리보 U, N3-Me 리보T, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-에틸-dC, N3-Me dC를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 염기 쌍을 이루지 않은 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드 유사체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 염기 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드 유사체는 리보뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 그것은 데옥시리보뉴클레오타이드이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "말단 작용기"는 비제한적으로 할로겐, 알코올, 아민, 카복실, 에스터, 아마이드, 알데하이드, 케톤, 에터기를 포함한다.
특정 모이어티가 제1 가닥 또는 제2 가닥의 5' 말단에 연결될 수 있다. 이것은 무염기성 리보스 모이어티, 무염기성 데옥시리보스 모이어티, 변형 무염기성 리보스 및 무염기성 데옥시리보스 모이어티, 예컨대, 2' O 알킬 변형; 역전된 무염기성 리보스 및 무염기성 데옥시리보스 모이어티 및 이의 변형, C6-이미노-Pi; 거울 뉴클레오타이드, 예컨대, L-DNA 및 L-RNA; 5'OMe 뉴클레오타이드; 및 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대, 4',5'-메틸렌 뉴클레오타이드; 1-(β-D-에리트로퓨라노실)뉴클레오타이드; 4'-티오 뉴클레오타이드, 탄소환식 뉴클레오타이드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; 1,3-다이아미노-2-프로필 포스페이트, 3-아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 12-아미노도데실 포스페이트; 하이드록시프로필 포스페이트; 1,5-언하이드로헥시톨 뉴클레오타이드; 알파-뉴클레오타이드; 트레오-펜토퓨라노실 뉴클레오타이드; 비환식 3',4'-세코 뉴클레오타이드; 3,4-다이하이드록시부틸 뉴클레오타이드; 3,5-다이하이드록시펜틸 뉴클레오타이드, 5'-5'-역전된 무염기성 모이어티; 1,4-부탄다이올 포스페이트; 5'-아미노; 및 브리징 또는 비브리징 메틸포스포네이트 및 5'-머캅토 모이어티를 포함한다.
본 발명의 핵산은 하나 이상의 역전된 뉴클레오타이드, 예를 들어 역전된 티미딘 또는 역전된 아데닌을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Takei, et al., 2002. JBC 277 (26):23800-06] 참고).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 유전자 발현에 관한 용어 "저해하다", "하향 조절하다" 또는 "감소시키다"는 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 소단위를 암호화하는 등가의 RNA 분자(예를 들어, mRNA)의 수준, 또는 1종 이상의 단백질, 단백질 소단위의 활성도가 본 발명의 본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산 부재 하에서 또는 인간 전사물에 대한 상동성이 공지되어 있지 않은 siRNA 분자(본 명세서에서 비-침묵 대조군으로 지칭)를 참고로 관찰되는 것보다 낮게 감소된다는 것을 의미한다. 이러한 대조군은 본 발명의 분자와 유사한 방식으로 접합 및 변형될 수 있고, 동일한 경로에 의해 표적 세포 내로 전달될 수 있고; 예를 들어, 발현은 핵산 또는 접합된 핵산의 부재 또는 비-침묵 대조군의 존재 하에서 관찰되는 것의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% 또는 중간 값 또는 더 낮게 감소될 수 있다.
본 발명의 핵산은 무염기성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 용어 "무염기성"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 염기가 결핍되거나 또는 1' 위치의 염기 대신 다른 염기, 예를 들어, 3',3'-연결된 또는 5',5'-연결된 데옥시무염기성 리보스 유도체를 갖는 모이어티를 지칭한다.
핵산은 변형된 제2 가닥 및/또는 제1 가닥 상에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 교번하는 뉴클레오타이드는 변형되어 변형된 뉴클레오타이드를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 교번하는은 규칙적인 방식으로 하나 뒤에 또 다른 하나가 존재하는 것을 의미한다. 다시 말해서, 교번하는은 차례대로 반복적으로 존재하는 것을 의미한다. 예를 들어, 하나의 뉴클레오타이드가 변형되면, 다음의 인접한 뉴클레오타이드는 변형되지 않고, 그 다음의 인접한 뉴클레오타이드가 변형되고 그 등등이다. 하나의 뉴클레오타이드는 제1 변형으로 변형될 수 있고, 다음의 인접한 뉴클레오타이드는 제2 변형으로 변형될 수 있으며, 그 다음의 인접한 뉴클레오타이드는 제1 변형으로 변형되고 그 등등이고, 여기서 제1 변형 및 제2 변형은 상이하다.
본 발명의 핵산의 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형될 수 있고, 여기서 제1 가닥은 5'에서 3'로 번호 매겨지고, 가장 5'인 뉴클레오타이드가 제1 가닥의 뉴클레오타이드 번호 1이다. 용어 "홀수"는 본 명세서에 기재된 바와 같이 2로 나눌 수 없는 수를 의미한다. 홀수의 예는 1, 3, 5, 7, 9, 11 등이다. 본 발명의 핵산의 제1 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형될 수 있고, 여기서 제1 가닥은 5'에서 3'로 번호 매겨진다. 용어 "짝수"는 본 명세서에 기재된 바와 같이 2로 균일하게 나눌 수 있는 수를 의미한다. 짝수의 예는 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 등이다. 본 발명의 핵산의 제2 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형될 수 있고, 여기서 제2 가닥은 3'에서 5'로 번호 매겨지고, 가장 3'인 뉴클레오타이드가 제2 가닥의 뉴클레오타이드 번호 1이다. 본 발명의 핵산의 제2 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형될 수 있고, 여기서 제2가닥은 3'에서 5'로 번호 매겨진다.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형되어, 변형된 뉴클레오타이드를 형성할 수 있다. 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 변형될 수 있다. 제1 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 적어도 제2 변형에 의해서 변형될 수 있고, 여기서 적어도 제2 변형은 하나 이상의 홀수 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하다. 하나 이상의 변형된 짝수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나에 근접할 수 있다.
제1 가닥 내의 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 본 발명의 핵산 내에서 변형될 수 있다. 제1 가닥 내의 복수의 짝수 뉴클레오타이드가 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 제1 가닥은 공통 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제1 가닥은 또한 제2의 상이한 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
제2 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 제1 가닥 상의 홀수 뉴클레오타이드의 변형과 상이한 변형에 의해서 변형될 수 있고/있거나 제2 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드의 동일한 변형에 의해서 변형될 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 변형된 짝수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 뉴클레오타이드에 근접할 수 있다. 제2 가닥의 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 공통 변형에 의해서 변형될 수 있고/있거나 복수의 짝수 뉴클레오타이드는 제2 가닥 홀수 뉴클레오타이드 상에 존재하는 동일한 변형에 의해서 변형될 수 있다. 제2 가닥 상의 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 제2 변형에 의해서 변형될 수 있고, 여기서 제2 변형은 제1 가닥 홀수 뉴클레오타이드의 변형과 상이하다.
제2 가닥은 공통 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는데, 이것은 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드의 변형과 상이한 제2 변형일 수 있다.
본 발명의 핵산에서, 제1 가닥 내의 홀수 뉴클레오타이드 각각 및 제2 가닥 내의 짝수 뉴클레오타이드 각각은 공통 변형으로 변형될 수 있고, 짝수 뉴클레오타이드 각각은 제2 변형으로 제1 가닥 내에서 변형될 수 있고, 홀수 뉴클레오타이드 각각은 제2 변형으로 제2 가닥 내에서 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산은 제2 가닥의 비변형되거나 또는 상이하게 변형된 뉴클레오타이드에 비해서 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해서 이동된 제1 가닥의 변형된 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제1 가닥 내에서 변형될 수 있고, 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제2 가닥 내에서 변형될 수 있다. 어느 하나 또는 두 가닥 상의 교번하는 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제1 가닥 내에서 변형될 수 있고, 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제2 가닥 내에서 변형될 수 있다. 어느 하나 또는 두 가닥 상의 교번하는 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제1 가닥 내에서 변형될 수 있고, 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 공통 변형에 의해서 제2 가닥 내에서 변형될 수 있다. 어느 하나 또는 두 가닥 상의 교번하는 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제1 가닥 내에서 변형될 수 있고, 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 공통 변형에 의해서 제2 가닥 내에서 변형될 수 있다. 어느 하나 또는 두 가닥 상의 교번하는 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 각각은 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산은 가닥 중 하나 또는 둘 다에서 교번하는 변형의 적어도 2개의 영역을 포함하는 단일 또는 이중 가닥 작제물을 포함할 수 있다. 이들 교번하는 영역은 최대 약 12개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있지만, 바람직하게는 약 3 내지 약 10개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 교번하는 뉴클레오타이드의 영역은 본 발명의 핵산의 하나 또는 두 가닥의 말단에 위치될 수 있다. 핵산은 4개 내지 약 10개의 교번하는 뉴클레오타이드를 각각의 말단(3' 및 5')에 포함할 수 있고, 이러한 영역은 약 5개 내지 약 12개의 인접한 비변형된 뉴클레오타이드 또는 상이하게 또는 공통적으로 변형된 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다.
제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드는 변형될 수 있고, 짝수 뉴클레오타이드는 제2 변형으로 변형될 수 있다. 제2 가닥은 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드의 변형과 동일할 수 있는 공통 변형으로 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 제2 변형으로 또한 변형될 수 있다. 제2 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드는 서로, 그리고 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드의 변형과 동일한 변형을 갖는 뉴클레오타이드에 근접할 수 있다. 제1 가닥은 3' 단부 및 5' 단부의 2개의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 또한 포함할 수 있다. 제2 가닥은 5' 단부의 2개의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 또한 제2 가닥은 5' 단부에서 리간드에 접합될 수 있다.
본 발명의 핵산은 공통 변형으로 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함하는 제1 가닥을 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 제2 변형으로 변형될 수 있는 하나 이상의 뉴클레오타이드에 근접할 수 있다. 제2 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드는 근접할 수 있다. 제2 가닥은 제1 가닥의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 변형 중 하나와 동일할 수 있는 공통 변형으로 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 제2 변형으로 또한 변형될 수 있다. 제2 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오타이드는 근접할 수 있다. 제1 가닥은 3' 단부 및 5' 단부의 2개의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 또한 포함할 수 있다. 제2 가닥은 3' 단부의 2개의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 또한 제2 가닥은 5' 단부에서 리간드에 접합될 수 있다.
제1 가닥에서는 5'에서 3'로, 제2 가닥에서는 3'에서 5'로 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 및 25로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제1 가닥 상에서 변형에 의해 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제1 가닥 상에서 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제2 가닥 상에서 변형에 의해서 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제2 가닥 상에서 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 뉴클레오타이드는 본 발명의 핵산을 위해 제1 가닥에서는 5'에서 3'로, 제2 가닥에서는 3'에서 5'로 번호 매겨진다.
2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24으로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제1 가닥 상에서 변형에 의해서 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제1 가닥 상에서 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제2 가닥 상에서 변형에 의해서 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 번호 매겨진 뉴클레오타이드는 제2 가닥 상에서 제2 변형에 의해서 변형될 수 있다.
명백하게, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥이 25개 뉴클레오타이드 길이보다 짧으면, 예컨대 19개 뉴클레오타이드 길이이면, 20, 21, 22, 23, 24 및 25로 번호 매겨진 변형될 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다. 따라서 당업자는 상기 설명이 더 짧은 가닥에 적용된다는 것을 이해한다.
제1 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드는 공통 변형을 갖는 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오타이드와 쌍을 이룰 수 있다. 제1 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드는 상이한 변형을 갖는 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오타이드와 쌍을 이룰 수 있다. 제1 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드는 제2 가닥 상의 비변형된 뉴클레오타이드와 쌍을 이룰 수 있다. 제2 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드는 제1 가닥 상의 비변형된 뉴클레오타이드와 쌍을 이룰 수 있다. 다시 말해서, 예를 들어, 제2 가닥의 교번하는 영역 내의 모든 변형이 제1 가닥 내의 동일한 변형과 쌍을 이루도록, 또는 대안적으로 하나의 가닥의 교번하는 영역 내의 공통 변형이 다른 가닥 내의 유사하지 않은 변형(즉, 제2 변형 또는 추가 변형)과 쌍을 형성하면서 변형이 1개의 뉴클레오타이드만큼 오프셋될 수 있도록 교번하는 뉴클레오타이드는 2개의 가닥 상에서 정렬될 수 있다. 또 다른 선택은 각각의 가닥에 유사하지 않은 변형을 갖는 것이다.
공통 변형된 뉴클레오타이드가 서로 쌍을 이루지 않도록, 제1 가닥 상의 변형이 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오타이드에 비해서 1개의 뉴클레오타이드만큼 이동될 수 있다.
변형 및/또는 변형들은 각각 그리고 개별적으로 3'-말단 데옥시-티민, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-변형, 2'-아미노-변형, 2'-알킬-변형, 몰폴리노 변형, 포스포르아미데이트 변형, 5'-포스포로티오에이트기 변형, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방 변형 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아민기 변형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고/있거나 변형된 뉴클레오타이드는 잠금 뉴클레오타이드, 무염기성 뉴클레오타이드 또는 비자연 염기 포함 뉴클레오타이드 중 임의의 하나일 수 있다.
적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸일 수 있고/있거나 적어도 하나의 변형은 2'-F일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 추가 변형이 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상에 존재할 수 있다.
본 발명의 핵산은 가닥 단부 중 하나 또는 몇몇에 역전된 RNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 역전된 뉴클레오타이드는 핵산에 안정성을 제공한다. 바람직하게는, 핵산은 가닥 중 적어도 하나의 3' 단부 및/또는 제2 가닥의 5' 단부 중 하나 및 몇몇에서 적어도 역전된 뉴클레오타이드를 포함한다. 보다 바람직하게는, 핵산은 제2 가닥의 3' 단부에서 역전된 뉴클레오타이드를 포함한다. 가장 바람직하게는, 핵산은 제2 가닥의 3' 단부에서 역전된 RNA 뉴클레오타이드를 포함하고, 이러한 뉴클레오타이드는 바람직하게는 역전된 A이다. 역전된 뉴클레오타이드는 바람직하게는 나머지 가닥 내의 상응하는 뉴클레오타이드 반대에 오버행으로서가 아니라 가닥의 단부에 존재한다. 이러한 변형을 갖는 핵산은 안정적이고, 합성이 용이하다.
본 발명의 설명 전체에 걸쳐, "동일한 또는 공통 변형"은 임의의 뉴클레오타이드, 즉, 메틸기 또는 플루오로기와 같은 기로 변형된 A, G, C 또는 U에 대한 동일한 변형을 의미한다. 이는 동일한 뉴클레오타이드 상의 동일한 부가를 의미하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 2'F-dU, 2'F-dA, 2'F-dC, 2'F-dG가 모두 동일한 또는 공통 변형인 것으로 간주되고, 2'-OMe-rU, 2'-OMe-rA; 2'-OMe-rC; 2'-OMe-rG도 그러하다. 2'F 변형은 2'OMe 변형과 상이한 변형이다.
본 발명의 일부 대표적인 변형된 핵산 서열이 실시예에 제시된다. 이러한 예는 대표적이고 비제한적인 것으로 의도된다.
바람직하게는, 핵산은, 2'-O-메틸 변형 및 2'-F 변형으로 이루어진 군으로부터 각각 개별적으로 선택되는, 변형 및 제2 변형 또는 추가 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 제1 변형일 수 있는 2'-O-메틸(2'OMe)인 변형, 및 2'-F인 제2 변형을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 각각의 가닥 또는 두 가닥의 각각의 단부 또는 임의의 단부의 말단의 1, 2 또는 3개의 뉴클레오타이드 내에 또는 그 사이에 존재할 수 있는 포스포로티오에이트 변형 및/또는 데옥시 변형을 또한 포함할 수 있다.
본 발명은 추가 양상으로서, 세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산을 제공하며, 이 핵산은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 또는 73의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 제1 가닥의 뉴클레오타이드는 홀수 뉴클레오타이드 상의 제1 변형에 의해서 변형되고, 짝수 뉴클레오타이드 상의 제2 변형에 의해서 변형되고, 제2 가닥의 뉴클레오타이드는 짝수 뉴클레오타이드 상의 제3 변형에 의해서 변형되고, 홀수 뉴클레오타이드 상의 제4 변형에 의해서 변형되고, 여기서 적어도 제1 변형은 제2 변형과 상이하고, 제3 변형은 제4 변형과 상이하다. 제3 변형 및 제1 변형을 동일하거나 상이할 수 있고, 제2 및 제4 변형은 동일하거나 상이할 수 있다. 제1 변형 및 제2 변형은 서로 상이할 수 있고, 제3 변형 및 제4 변형은 서로 상이할 수 있다.
제2 가닥은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 64, 66, 68, 70, 72 또는 74의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 제1 가닥의 뉴클레오타이드는 홀수 뉴클레오타이드 상의 제1 변형에 의해서 변형될 수 있고, 짝수 뉴클레오타이드 상의 제2 변형으로 변형될 수 있고, 제2 가닥은 홀수 뉴클레오타이드 상에서 제2 변형으로 변형될 수 있고, 짝수 뉴클레오타이드 상에서 제1 변형으로 변형될 수 있다. 제1 변형은 2'OMe일 수 있고, 제2 변형은 2' F일 수 있다. 제1 가닥은 서열번호 5 또는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고/있거나 제2 가닥은 서열번호 6 또는 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 변형은 표 1에 언급된 바와 같은 것일 수 있다.
본 발명의 핵산은 리간드에 접합될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드, 특히 이중 가닥 핵산이 생체 내에서 세포에 효율적으로 전달되는 것이 중요하고, 이는 특이적 표적화 및 세포외 환경, 특히 혈청 단백질로부터의 실질적인 보호를 필요로 한다. 특이적 표적화를 달성하는 한 방법은 리간드를 핵산에 접합시키는 것이다. 리간드는 핵산을 필요한 표적 부위에 표적화하는 것을 돕는다. 접합된 분자가 상이한 수용체-매개 세포내이입 경로 또는 기능적으로 유사한 과정과 같은 기전에 의해 표적 세포에 의해 흡수되기 위해, 목적하는 수용체 분자에 대해 적절한 리간드를 접합시키는 것이 요구된다.
일례는 막 ASGR1 수용체 및 ASGR2 수용체의 다량체의 비를 변화시킴으로써 구성되는 아시알로당단백질 수용체 복합체(asialoglycoprotein receptor complex: ASGP-R)인데, 이것은 간세포에서 고도로 풍부하고, 본 명세서에 기재된 GalNAc 모이어티에 대해서 높은 친화도를 갖는다. 삼안테나형(antennary) 클러스터 글리코사이드의 최초의 개시 중 하나는 미국 특허 제US 5,885,968호에서였다. 3개의 GalNAc 리간드를 갖고 포스페이트기를 포함하는 접합체가 공지되어 있고, 문헌[Dubber et al. (Bioconjug. Chem. 2003 Jan-Feb;14(1):239-46]에 기술되어 있다. ASGP-R 복합체는 N-아세틸-D-갈락토실아민(GalNAc)에 대해서 D-Gal보다 50배 더 높은 친화도를 나타낸다.
글리코실화 단백질 또는 다른 올리고당의 말단 β-갈락토실 소단위를 특이적으로 인식하는 아시알로당단백질 수용체 복합체(ASGP-R)(Weigel, P.H. et. al., Biochim. Biophys. Acta. 2002 Sep 19;1572(2-3):341-63)는 약물 물질에 갈락토스 또는 갈락토사민을 공유 커플링시킴으로써 수용체 복합체를 발현하는 간의 간세포에 약물을 전달하기 위해서 사용될 수 있다(Ishibashi, S.; et. al., J Biol. Chem. 1994 Nov 11;269(45):27803-6). 또한, 표적화 모이어티의 반복에 의해 달성되는 다가 효과에 의해 결합 친화도가 유의하게 증가될 수 있다(Biessen EA, et al., J Med Chem. 1995 Apr 28;38(9):1538-46).
ASGPR-복합체는 말단 β-갈락토실 함유 당단백질을 세포의 엔도솜으로 활성 흡수하기 위한 매개인자이다. 따라서 ASGPR은 이러한 리간드 등, 예를 들어, 핵산에 접합된 약물 후보물질을 수용체-발현 세포 내에 표적화된 전달하기에 고도로 적합하다(Akinc et al., Mol Ther. 2010 Jul;18(7):1357-64).
보다 일반적으로 리간드는 표적 세포 상의 수용체 중 적어도 하나의 유형에 대해서 친화도를 갖도록 선택된 당류를 포함할 수 있다. 특히, 수용체는 포유동물 간 세포의 표면 상에 있고, 예를 들어, 이전에 기재된 간 아시알로당단백질 수용체 복합체(ASGP-R)이다.
당류는 N-아세틸 갈락토사민, 만노스, 갈락토스, 글루코스, 글루코사민 및 푸코스로부터 선택될 수 있다. 당류는 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc)일 수 있다.
따라서 본 발명에 사용하기 위한 리간드는 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 모이어티 및 이의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함할 수 있고, 여기서 링커는 임의의 상기 양상에 정의된 바와 같은 서열에 GalNAc 모이어티를 접합한다. 링커는 2가 또는 3가 또는 4가 분지형 구조일 수 있다. 뉴클레오타이드는 본 명세서에 정의된 바와 같이 변형될 수 있다.
"GalNAc"는 문헌에서 N-아세틸 갈락토사민으로 일반적으로 지칭되는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토피라노스를 지칭한다. "GalNAc" 또는 "N-아세틸 갈락토사민"에 대한 언급은 β-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스 둘 다를 포함한다. β-형태 둘 다: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스는 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 β-형태, 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스를 포함한다.
따라서 리간드는 GalNAc를 포함할 수 있다.
리간드는 하기 화학식 I의 화합물을 포함할 수 있다:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
식 중,
S는 당류를 나타내고, 여기서 당류는 N-아세틸 갈락토사민이고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-이며, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)이며;
X2는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 또는 알킬렌 에터이고, 여기서 n은 1 내지 6이고;
A는 분지 단위이며;
X3은 브리징 단위를 나타내고;
여기서 본 발명에 따른 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)를 통해서 X3에 접합된다.
화학식 I에서, 분지 단위 "A"는 3개의 당류 리간드를 수용하기 위해서 3개로 분지된다. 분지 단위는 리간드 및 핵산의 나머지 테더링된 부분에 공유 부착된다. 분지 단위는 알킬, 아마이드, 다이설파이드, 폴리에틸렌 글리콜, 에터, 티오에터 및 하이드록시아미노기로부터 선택된 기를 포함하는 분지형 지방족기를 포함할 수 있다. 분지 단위는 알킬기 및 에터기로부터 선택된 기를 포함할 수 있다.
분지 단위 A는 하기로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure 112020060356433-pct00008
여기서 각각의 A1은 독립적으로 O, S, C=O 또는 NH를 나타내고; 그리고
각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지 단위는 하기로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure 112020060356433-pct00009
여기서 각각의 A1은 독립적으로 O, S, C=O 또는 NH를 나타내고; 그리고
각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지 단위는 하기로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure 112020060356433-pct00010
여기서 A1은 O, S, C=O 또는 NH이고; 그리고
각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지 단위는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112020060356433-pct00011
.
분지 단위는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112020060356433-pct00012
.
분지 단위는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112020060356433-pct00013
.
선택적으로, 분지 단위는 탄소 원자만으로 이루어진다.
"X3" 부분은 브리징 단위이다. 브리징 단위는 선형이고, 분지 단위 및 핵산에 공유 결합된다.
X3은 -C1-C20 알킬렌-, -C2-C20 알켄일렌-, 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C1-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에터, -C(O)-C1-C20 알킬렌-, -C0-C4 알킬렌(Cy)C0-C4 알킬렌-(여기서 Cy는 치환된 또는 비치환된 5 또는 6원의 사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로사이클릴렌 또는 헤테로아릴렌 고리를 나타냄), -C1-C4 알킬렌-NHC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)NH-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-SC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)S-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-OC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)O-C1-C4 알킬렌-, 및 -C1-C6 알킬렌-S-S-C1-C6 알킬렌-으로부터 선택될 수 있다.
X3은 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C1-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에터일 수 있다. X3은 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C4-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에터일 수 있고, 여기서 상기 (C4-C20 알킬렌)은 Z에 연결된다. X3은 -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16-, 특히, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 여기서 각각의 경우에 -CH2-기는 A에 연결된다.
리간드는 하기 화학식 (II)의 화합물을 포함할 수 있다:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
식 중,
S는 당류를 나타내고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-이며, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)이며;
X2는 C1-C8 알킬렌이고;
A는 하기로부터 선택된 분지 단위이고:
Figure 112020060356433-pct00014
X3은 브리징 단위이며;
여기서 본 발명에 따른 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)를 통해서 X3에 접합된다.
분지 단위 A는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112020060356433-pct00015
분지 단위 A는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112020060356433-pct00016
여기서 X3은 질소 원자에 부착된다.
X3은 C1-C20 알킬렌일 수 있다. 바람직하게는, X3은 -C3H6-, -C4H8-, -C6H12- 및 -C8H16-, 특히 -C4H8-, -C6H12- 및 -C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
리간드는 하기 화학식 (III)의 화합물을 포함할 수 있다:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (III)
식 중,
S는 당류를 나타내고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-이며, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)이며;
X2는 화학식 -C3H6-O-CH2-의 알킬렌 에터이고;
A는 분지 단위이며;
X3은 -CH2-O-CH2-, -CH2-O-C2H4-, -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14- 및 -CH2-O-C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식의 알킬렌 에터이고, 여기서 각각의 경우에 -CH2-기는 A에 연결되고, 여기서 X3은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)에 의해서 본 발명에 따른 핵산에 접합된다.
분지 단위는 탄소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 분지 단위는 탄소이다.
X3은 -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14- 및 -CH2-O-C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, X3은 -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 양상 중 임의의 것의 경우, P가 변형된 포스페이트기를 나타내는 경우, P는 하기로 표현될 수 있다:
Figure 112020060356433-pct00017
여기서 Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 =O, =S, -O-, -OH, -SH, -BH3, -OCH2CO2, -OCH2CO2Rx, -OCH2C(S)ORx 및 -ORx를 나타내고, 여기서 Rx는 C1-C6 알킬을 나타내고, 여기서
Figure 112020060356433-pct00018
는 화합물의 나머지에 대한 부착을 나타낸다.
변형된 포스페이트는, 비-연결 산소 중 하나 이상이 대체된 포스페이트기를 의미한다. 변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스터, 히드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트라이에스터를 포함한다. 포스포로다이티오에이트는 비-연결 산소 둘 다가 황에 의해서 대체된다. 포스페이트 기 내의 1개, 각각 또는 둘 다의 비-연결 산소는 독립적으로 S, Se, B, C, H, N, 또는 OR(R은 알킬 또는 아릴임) 중 어느 하나일 수 있다.
포스페이트는 연결 산소의 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌포스포네이트)로의 대체에 의해서 또한 변형될 수 있다. 대체는 말단 산소에서 일어날 수 있다. 비-연결 산소가 질소로 대체되는 것이 가능하다.
예를 들어, Y1은 -OH를 나타낼 수 있고, Y2는 =O 또는 =S를 나타낼 수 있거나; 또는
Y1은 -O-를 나타낼 수 있고, Y2는 =O 또는 =S를 나타낼 수 있고;
Y1은 =O를 나타낼 수 있고, Y2는 -CH3, -SH, -ORx 또는 -BH3를 나타낼 수 있고;
Y1은 =S를 나타낼 수 있고, Y2는 -CH3, ORx 또는 -SH를 나타낼 수 있다.
당업자는 특정 예에서 Y1과 Y2 사이에 비편재화가 존재할 것임을 이해할 것이다.
바람직하게는, 변형된 포스페이트기는 티오포스페이트기이다. 티오포스페이트기는 바이티오포스페이트(즉, 여기서 Y1은 =S를 나타내고, Y2는 -S-를 나타냄) 및 모노티오포스페이트(즉, 여기서 Y1은 -O-를 나타내고, Y2는 =S를 나타내거나, 또는 여기서 Y1은 =O를 나타내고, Y2는 -S-를 나타냄)를 포함한다. 바람직하게는, P는 모노티오포스페이트이다. 본 발명자들은 포스페이트기 대신에 티오포스페이트기를 갖는 접합체가 생체내에서 개선된 효력 및 작용 기간을 갖는다는 것을 발견하였다.
P는 또한 에틸포스페이트일 수 있다(즉, 여기서 Y1은 =O를 나타내고, Y2는 OCH2CH3를 나타낸다).
당류는 표적 세포 상의 수용체 중 적어도 하나의 유형에 대해서 친화도를 갖도록 선택될 수 있다. 특히, 수용체는 포유동물 간 세포의 표면 상에 있고, 예를 들어, 간 아시알로당단백질 수용체 복합체(ASGP-R)이다.
상기 양상 중 임의의 것의 경우, 당류는 갈락토사민, 만노스, 갈락토스, 글루코스, 글루코사민 및 푸룩토스 중 하나를 갖는 N-아세틸로부터 선택될 수 있다. 전형적으로 본 발명에 사용될 리간드는 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc)을 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 화합물은 3개의 리간드를 가질 수 있는데, 이것은 각각 바람직하게는 N-아세틸 갈락토사민을 포함할 것이다.
"GalNAc"는 문헌에서 N-아세틸 갈락토사민으로 일반적으로 지칭되는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토피라노스를 지칭한다. "GalNAc" 또는 "N-아세틸 갈락토사민"에 대한 언급은 β-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스 둘 다를 포함한다. 특정 실시형태에서, β-형태 둘 다: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스는 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 β-형태, 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스를 포함한다.
Figure 112020060356433-pct00019
Figure 112020060356433-pct00020
Figure 112020060356433-pct00021
상기 화학식 (III)의 화합물 중 임의의 것에 대해서, X1은 (-CH2-CH2-O)(-CH2)2-일 수 있다. X1은 (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-일 수 있다. X1은 (-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-일 수 있다. 바람직하게는, X1은 (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-이다. 대안적으로, X1은 C3-C6 알킬렌을 나타낸다. X1은 프로필렌일 수 있다. X1은 부틸렌일 수 있다. X1은 펜틸렌일 수 있다. X1은 헥실렌일 수 있다. 바람직하게는 알킬은 선형 알킬렌이다. 특히, X1은 부틸렌일 수 있다.
화학식 (III)의 화합물의 경우, X2는 화학식 -C3H6-O-CH2-, 즉, C3 알콕시 메틸렌, 또는 -CH2CH2CH2OCH2-의 알킬렌 에터를 나타낸다.
본 발명은 하기 구조 중 하나를 갖는 접합된 핵산을 제공한다:
Figure 112020060356433-pct00022
Figure 112020060356433-pct00023
Figure 112020060356433-pct00024
Figure 112020060356433-pct00025
Figure 112020060356433-pct00026
여기서 Z는 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산이다.
화학식 (I), (II) 또는 (III)의 리간드는 제1 (안티센스) 가닥의 3'-단부에서 그리고/또는 제2 (센스) 가닥의 3'- 단부 및/또는 5'-단부에서 부착될 수 있다. 핵산은 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 하나를 초과하는 리간드를 포함할 수 있다. 그러나, 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 단일 리간드가 바람직한데, 그 이유는 단일의 그러한 리간드가 표적 세포에 대한 핵산의 효율적인 표적화에 충분하기 때문이다.
바람직하게는, 제1 (안티센스) 가닥의 5'-단부는 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 리간드에 부착되지 않는데, 그 이유는 이 위치에서의 리간드는 핵산의 생물학적 활성도를 잠재적으로 방해할 수 있기 때문이다.
따라서, 가닥의 5'-단부에 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 단일 리간드를 갖는 핵산이 3'-단부에 동일한 리간드를 갖는 동일한 핵산보다 합성이 더 용이하고, 더 저비용이다. 따라서, 바람직하게는 화학식 (I), (II) 또는 (III) 중 임의의 것의 단일 리간드는 핵산의 제2 가닥의 5'-단부에 공유 부착된다(이것과 접합된다).
일 실시형태에서, 핵산은 지질을 포함하는 리간드, 보다 바람직하게는 콜레스테롤을 포함하는 리간드에 접합된다.
본 발명의 접합체는 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 리간드 또는 리간드들에 접합된 본 명세서 개시된 바와 같은 임의의 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 세포에서 LPA 유전자의 발현을 저해하기 위한 접합체에 관한 것이며, 상기 접합체는 본 발명의 임의의 양상의 핵산을 포함하는 핵산 부분, 및 적어도 하나의 리간드 부분을 포함하며, 상기 핵산 부분은 제1 RNA 가닥의 적어도 일부 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 RNA 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 가닥은 상기 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 적어도 하나의 리간드 부분은 링커 모이어티, 바람직하게는 세린올-유래된 링커 모이어티 및 세포의 생체내 표적화를 위한 표적화 리간드를 포함하고, 하나 또는 두 RNA 가닥의 3' 단부 및/또는 5' 단부에만 접합되고, 여기서 제1 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않고, 여기서,
(i) 제2 RNA 가닥은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 여기서 (a) 제2 RNA 가닥은 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제1 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (b) 제1 RNA 가닥은 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (c) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되거나; 또는
(ii) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않는다.
본 발명의 실시형태에서, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥)은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제1 RNA 가닥(즉, 안티센스 가닥)은 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥)의 3' 단부는 접합되지 않아서, 도 40A에 도시된 바와 같은 개략적인 구조를 갖는 접합체가 형성된다.
본 발명의 실시형태에서, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥)은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥)은 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제1 RNA 가닥(즉, 안티센스 가닥)의 3' 단부는 접합되지 않아서, 도 40B에 도시된 바와 같은 개략적인 구조를 갖는 접합체가 형성된다.
본 발명의 실시형태에서, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥) 및 제1 RNA 가닥(즉, 안티센스 가닥) 둘 다는 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥)의 5' 단부는 접합되지 않아서, 도 40C에 도시된 바와 같은 개략적인 구조를 갖는 접합체가 형성된다.
본 발명의 실시형태에서, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥)은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥(즉, 센스 가닥) 및 제1 RNA 가닥(즉, 안티센스 가닥) 둘 다는 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되어, 도 40D에 도시된 바와 같은 개략적인 구조를 갖는 접합체가 형성된다.
상기 실시형태 중 임의의 하나에서,
Figure 112020060356433-pct00027
는 핵산 부분의 단부에 리간드를 접합한 링커를 나타내고; 리간드는 GalNAc 모이어티, 예컨대, GalNAc일 수 있고; 도 40E에 나타낸 바와 같은 개략적인 구조는 핵산 부분을 나타낸다.
이러한 개략적인 다이어그램은 제1 가닥 또는 제2 가닥 내의 뉴클레오타이드의 수에 제한되도록 의도되지도 않고, 다이어그램은 염기의 상보성에 대한 제한 또는 임의의 다른 제한 중 임의의 유형을 나타내지도 않는다.
리간드는 단량체 또는 다량체(예를 들어, 이량체, 삼량체 등)일 수 있다.
적합하게는, 따라서 리간드는 단일 표적화 리간드 모이어티, 예를 들어, 단일 GalNAc 모이어티를 함유하는 단량체이다.
대안적으로, 리간드는 이량체 리간드일 수 있고, 여기서 리간드 부분은 2개의 링커 모이어티, 예컨대, 세린올-유래된 링커 모이어티 또는 비-세린올 링커 모이어티를 포함하고, 각각은 단일 표적화 리간드 모이어티에 연결된다.
리간드는 삼량체 리간드일 수 있고, 여기서 리간드 부분은 3개의 링커 모이어티, 예컨대, 세린올-유래된 링커 모이어티 또는 비-세린올 링커 모이어티를 포함하고, 각각은 단일 표적화 리간드 모이어티에 연결된다.
2개 또는 3개의 세린올-유래된 링커 모이어티는 예를 들어, 하기에 나타낸 바와 같이 일렬로 연결될 수 있다:
Figure 112020060356433-pct00028
여기서 n은 1 또는 2이고, Y는 S 또는 O이다.
바람직하게는, 리간드는 단량체이다.
적합하게는, 접합된 RNA 가닥은 추가 링커를 포함하는 링커 모이어티를 통해서 표적화 리간드에 접합되고, 여기서 추가 링커는 포화, 비분지형 또는 분지형 C1-15 알킬쇄이거나, 이를 포함하고, 여기서 선택적으로 하나 이상의 탄소(예를 들어 1, 2 또는 3개의 탄소, 적합하게는 1 또는 2개, 특히 1개)는 O, N, S(O)p로부터 선택된 헤테로원자에 의해서 대체되고, 여기서 p는 0, 1 또는 2이고(예를 들어, CH2기는 O, 또는 NH, 또는 S, 또는 SO2로 대체되거나 쇄의 말단 또는 분지 상의 -CH3기는 OH 또는 NH2로 대체됨), 여기서 상기 쇄는 하나 이상의 옥소기(예를 들어 1 내지 3개, 예컨대, 1개의 기)에 의해서 선택적으로 치환된다.
적합하게는, 링커 모이어티는 세린올-유래된 링커 모이어티이다.
보다 적합하게는, 추가 링커는 포화된 비분지형 C1-15 알킬쇄를 포함하고, 여기서 하나 이상의 탄소(예를 들어 1, 2 또는 3개의 탄소, 적합하게는 1 또는 2개, 특히 1개)는 산소 원자에 의해서 대체된다.
보다 적합하게는, 추가 링커는 PEG-쇄를 포함한다.
보다 적합하게는, 추가 링커는 포화된 비분지형 C1-15 알킬쇄를 포함한다.
보다 적합하게는, 추가 링커는 포화된 비분지형 C1-6 알킬쇄를 포함한다.
보다 적합하게는, 추가 링커는 포화된 비분지형 C4 또는 C6 알킬쇄, 예를 들어, C4 알킬쇄를 포함한다.
실시형태에서,
Figure 112020060356433-pct00029
는 하기 화학식 (V)의 연결 모이어티이다:
Figure 112020060356433-pct00030
여기서 n, Y 및 L1은 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
따라서 실시형태에서, 표적화 리간드 부분은 하기 화학식 (VI)의 연결 모이어티이다:
Figure 112020060356433-pct00031
여기서 n, Y 및 L1은 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는,
Figure 112020060356433-pct00032
는 하기 화학식 (XIV)의 연결 모이어티이다:
Figure 112020060356433-pct00033
여기서 n, Y, R1 및 L은 하기에 정의되어 있고, L은 표적화 리간드, 예를 들어, GalNAc에 연결되고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는, 표적화 리간드 부분은 하기 화학식 (IV)의 연결 모이어티이다:
Figure 112020060356433-pct00034
여기서 n, Y, R1 및 L은 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는,
Figure 112020060356433-pct00035
는 하기 화학식 (VII)의 연결 모이어티이다:
Figure 112020060356433-pct00036
여기서 n, Y 및 L2는 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는, 표적화 리간드 부분은 하기 화학식 (VIII)의 연결 모이어티이다:
Figure 112020060356433-pct00037
여기서 n, Y 및 L2는 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는,
Figure 112020060356433-pct00038
는 하기 화학식 (IX)의 연결 모이어티이다:
Figure 112020060356433-pct00039
여기서 F, Y 및 L은 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는, 표적화 리간드 부분은 하기 화학식 (IXa)의 연결 모이어티이다:
Figure 112020060356433-pct00040
여기서 F, Y 및 L은 하기에 정의되어 있고, 포스포로-기의 O는 RNA 가닥의 말단 올리고뉴클레오사이드에 부착된다.
적합하게는, L은
Figure 112020060356433-pct00041
이다.
상기 구조 중 임의의 것에서, 적합하게는 리간드는 GalNAc 및 갈락토스 모이어티, 특히 GalNAc 모이어티로부터 선택된다. 대안적으로, GalNac는 또 다른 표적화 리간드, 예를 들어, 당류에 의해서 대체될 수 있다.
본 발명의 실시형태에서, 제1 RNA 가닥은 화학식 (X)의 화합물이고:
Figure 112020060356433-pct00042
여기서 b는 0 또는 1이고;
제2 RNA 가닥은 하기 화학식 (XI)의 화합물이다:
Figure 112020060356433-pct00043
식 중,
c 및 d는 독립적으로 0 또는 1이고;
Z1 및 Z2는 각각 제1 RNA 가닥 및 제2 RNA 가닥의 RNA 부분이며;
Y는 O 또는 S이고;
n은 0, 1, 2 또는 3이며;
L1은 리간드가 부착된 링커이고;
여기서 b + c + d는 2 또는 3이다.
적합하게는, 제1 RNA 가닥은 하기 화학식 (XV)의 화합물이고:
Figure 112020060356433-pct00044
(여기서 b는 0 또는 1임);
제2 RNA 가닥은 하기 화학식 (XVI)의 화합물이다:
Figure 112020060356433-pct00045
(식 중, c 및 d는 독립적으로 0 또는 1이고;
Z1 및 Z2는 각각 제1 RNA 가닥 및 제2 RNA 가닥의 RNA 부분이며;
Y는 O 또는 S이고;
R1은 H 또는 메틸이며;
n은 0, 1, 2 또는 3이며;
L은 화학식 (XV) 및 (XVId)에서 동일하거나 또는 상이하고,
-(CH2)r-C(O)-(여기서 r은 2 내지 12임);
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-(여기서 s는 1 내지 5임);
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-(여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임);
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-(여기서 u는 독립적으로 1 내지 5임); 및
-(CH2)v-NH-C(O)-(여기서 v는 2 내지 12임)로 이루어진 군으로부터 선택되고: 그리고
여기서 말단 C(O)(존재하는 경우)는 NH기에 부착되고;
여기서 b + c + d는 2 또는 3임).
적합하게는, 제1 RNA 가닥은 하기 화학식 (XII)의 화합물이고:
Figure 112020060356433-pct00046
(여기서 b는 0 또는 1임);
제2 RNA 가닥은 하기 화학식 (XIII)의 화합물이다:
Figure 112020060356433-pct00047
(식 중,
c 및 d는 독립적으로 0 또는 1이고;
Z1 및 Z2는 각각 제1 RNA 가닥 및 제2 RNA 가닥의 RNA 부분이며;
Y는 O 또는 S이고;
n은 0, 1, 2 또는 3이며;
L2는 화학식 (XII) 및 (XIII)에서 동일하거나 또는 상이하고, b, c 및 d에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티에서 동일하거나 또는 상이하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되거나:
Figure 112020060356433-pct00048
; 또는
n은 0이고, L2는
Figure 112020060356433-pct00049
이고, 말단 OH기는 존재하지 않아서 하기 모이어티를 형성하고:
Figure 112020060356433-pct00050
;
여기서
F는 포화된 분지형 또는 비분지형 (예컨대, 비분지형) C1-8알킬(예를 들어, C1-6알킬) 쇄이고, 여기서 탄소 원자 중 하나는 산소 원자로 선택적으로 대체되되, 단 상기 산소 원자는 적어도 2개의 탄소 원자에 의해서 또 다른 헤테로원자(예를 들어, O 또는 N 원자)로부터 분리되고;
L은 화학식 (I) 및 (II)에서 동일하거나 또는 상이하고,
-(CH2)r-C(O)-(여기서 r은 2 내지 12임);
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-(여기서 s는 1 내지 5임);
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-(여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임);
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-(여기서 u는 독립적으로 1 내지 5임); 및
-(CH2)v-NH-C(O)-(여기서 v는 2 내지 12임)로 이루어진 군으로부터 선택되고; 그리고
여기서 말단 C(O)(존재하는 경우)는 NH기에 부착되고;
여기서 b + c + d는 2 또는 3임).
GalNAc가 존재하는 상기 화학식 중 임의의 하나에서, GalNAc는 임의의 다른 표적화 리간드, 예컨대, 본 명세서에 언급된 것에 대해서 치환될 수 있다.
적합하게는, b는 0이고, c는 1이고, d는 1이거나; b는 1이고, c는 0이고, d는 1이거나; b는 1이고, c는 1이고, d는 0이거나; 또는 b는 1이고, c는 1이고, d는 1이다.
보다 적합하게는, b는 0이고, c는 1이고, d는 1이거나; b는 1이고, c는 0이고, d는 1이거나; 또는 b는 1이고, c는 1이고, d는 1이다.
가장 적합하게는, b는 0이고, c는 1이며, d는 1이다.
일 실시형태에서, Y는 O이다. 또 다른 실시형태에서, Y는 S이다.
일 실시형태에서, R1은 H 또는 메틸이다. 일 실시형태에서, R1은 H이다. 또 다른 실시형태에서, R1은 메틸이다.
일 실시형태에서, n은 0, 1, 2 또는 3이다. 적합하게는, n은 0이다.
일 실시형태에서, L은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
-(CH2)r-C(O)-(여기서 r은 2 내지 12임);
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-(여기서 s는 1 내지 5임);
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-(여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임);
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-(여기서 u는 독립적으로 1 내지 5임); 및
-(CH2)v-NH-C(O)-(여기서 v는 2 내지 12임);
여기서 말단 C(O)는 NH기에 부착된다.
적합하게는, L은 -(CH2)r-C(O)-이고, 여기서 r은 2 내지 12이다. 적합하게는, r은 2 내지 6이다. 보다 적합하게는, r은 4 또는 6, 예를 들어, 4이다.
적합하게는, L은
Figure 112020060356433-pct00051
이다.
예시적인 F 모이어티는 (CH2)1-6, 예를 들어, (CH2)1-4 예를 들어, CH2, (CH2)4, (CH2)5 또는 (CH2)6, 또는 CH2O(CH2)2-3, 예를 들어, CH2O(CH2)CH3를 포함한다.
적합하게는, L2는
Figure 112020060356433-pct00052
이다.
적합하게는, L2는
Figure 112020060356433-pct00053
이다.
적합하게는, L2는
Figure 112020060356433-pct00054
이다.
적합하게는, L2는
Figure 112020060356433-pct00055
이다.
적합하게는, n은 0이고, L2는
Figure 112020060356433-pct00056
이고,
말단 OH기는 존재하지 않아서 하기 모이어티가 형성된다:
Figure 112020060356433-pct00057
;
여기서 Y는 본 명세서 다른 곳에 정의된 바와 같다.
b, c 및 d에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티 내에서, L2는 전형적으로 동일하다. b, c 및 d에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티 사이에서, L2는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 실시형태에서, c에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티에서 L2는 d에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티에서의 L2와 동일하다. 실시형태에서, c에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티에서 L2는 d에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티에서의 L2와 동일하지 않다. 실시형태에서, b, c 및 d에 의해서 괄호 안에 제시된 모이어티에서 L2는, 예를 들어, 링커 모이어티가 세린올-유래된 링커 모이어티인 경우 동일하다.
세린올 유래된 링커 모이어티는 임의의 입체화학에서 세린올에 기초할 수 있고, 즉, L-세린 이성질체, D-세린 이성질체, 라세미체 세린 또는 입체이성질체의 다른 조합물로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 양상에서, 세린올-GalNAc 모이어티(SerGN)는 하기 입체화학을 갖고:
Figure 112020060356433-pct00058
즉, L-세린 이성질체로부터 유래된 (S)-세린올-아미다이트 또는 (S)-세린올 석신에이트 고체 지지된 빌딩 블록을 기재로 한다.
일 실시형태에서, 표적화된 세포는 간세포이다.
일반적인 합성 반응식: 1
예시적인 화합물은 하기에 기재된 방법 및 당업자에게 공지된 방법에 따라서 합성될 수 있다. 반응식은 특정 접합체의 합성을 예시하지만, 다른 청구된 접합체가 유사한 방법에 의해서 제조될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 올리고뉴클레오타이드 쇄 및 링커 빌딩 블록의 조립은 예를 들어, 포스포르아미다이트 방법을 적용한 고체상 합성에 의해서 수행될 수 있다. 고체상 합성은 염기 또는 변형된 빌딩 블록 로딩된 lcaa CPG로부터 출발할 수 있다. 포스포르아미다이트 합성 커플링 사이클은 1) DMT-제거, 2) 벤질티오테트라졸(BTT)일 수 있는 활성화제 및 요구되는 DMT-차폐된 포스포르아미다이트를 사용하는 쇄 연장, 3) 비-연장된 올리고뉴클레오타이드 쇄의 캡핑, 그 다음 아이오딘(포스포다이에스터 링키지가 바람직한 경우) 또는 EDITH(포스포로티오에이트 링키지가 바람직한 경우)에 의한 P(III)에서 P(V)로의 산화, 그리고 다시 캡핑(Cap/Ox/Cap 또는 Cap/Thio/Cap)으로 이루어진다. GalNAc 접합은 필요한 수의 아미노 변형된 링커 빌딩 블록이 부착된 사전 조립되고 정제된 올리고뉴클레오타이드에 대한 GalNAc-카복실산 빌딩 블록의 펩타이드 결합 형성에 의해서 달성될 수 있다. 필요한 빌딩 블록은 상업적으로 입수 가능하거나 하기에 기재된 바와 같이 합성된다. 모든 최종 단일 가닥 생성물을 AEX-HPLC에 의해서 분석하여 순도를 증명한다. 순도는 FLP%(전장 생성물 %) 단위로 제공되는데, 이것은 최종 생성물의 AEX-HPLC 분석의 UV-트레이스에서의 배정된 생성물 신호 하의 UV-면적의 백분율이다. 각각의 단일 가닥 생성물의 아이덴티티는 LC-MS 분석에 의해서 증명하였다.
신톤(Synthon)의 합성
반응식 1: DMT-세린올(TFA) 링커 신톤의 합성
Figure 112020060356433-pct00059
(S)-DMT-세린올(TFA)-포스포르아미다이트 7은 문헌에 공개된 방법에 따라서 (L)-세린 메틸 에스터 유도체 1로부터 합성할 수 있다(Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135).
(S)-DMT-세린올(TFA)-석신에이트 6은 촉매, 예컨대, DMAP의 존재 하에서 석신산 무수물을 사용하여 중간체 5의 전환에 의해서 제조할 수 있다.
고체 지지체, 예컨대, 조절 공극 유리(controlled pore glass: CPG) 지지체에 6을 로딩하여 커플링 시약, 예컨대, HBTU를 사용하여 고체 지지체, 예컨대, 아미노 변형된 네이티브 CPG 지지체(500A)에 대한 펩타이드 결합 형성을 달성할 수 있다. (S)-DMT-세린올(TFA)-석신에이트 6 및 커플링 시약, 예컨대, HBTU를 용매, 예컨대, CH3CN 중에 용해시킨다. 염기, 예컨대, 다이아이소프로필에틸아민을 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 2분 동안 교반한다. 고체 지지체, 예컨대, 네이티브 아미노-lcaa-CPG 지지체(500A, 3g, 아민 함량: 136u㏖/g)를 반응 혼합물에 첨가하고, 현탁액을 형성한다. 현탁액을 리스트-액션 진탕기(wrist-action shaker) 상에서 실온에서 16시간 동안 약하게 진탕하고, 이어서 여과시키고, 용매, 예컨대, DCM 및 EtOH로 세척한다. 지지체를 진공 하에서 2시간 동안 건조시킨다. 실온에서 아세트산 무수물/루티딘/N-메틸이미다졸과 교반함으로써 지지체 상의 미반응 아민을 캡핑할 수 있다. 지지체의 세척을 상기와 같이 반복할 수 있다. 고체 지지체를 진공 하에서 건조시켜 고체 지지체 10을 수득한다.
반응식 2: GalNAc 신톤 9 의 합성
Figure 112020060356433-pct00060
GalNAc 신톤 9의 합성을 문헌[Nair et al. (2014)]에 기재된 바와 같은 방법에 따라서 상업적으로 입수 가능한 퍼-아세틸화 갈락토스 아민 8로부터 출발하여 제조할 수 있다.
단일 가닥 세린올-유래된 GalNAc 접합체의 합성
반응식 3: 세린올-유래된 링커에 대한 올리고뉴클레오타이드 합성의 일반적인 절차
Figure 112020060356433-pct00061
3' 모노-GalNAc 접합된 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 화합물 A0264)의 올리고뉴클레오타이드 합성을 도 13에 제시하고, 반응식 3에 요약한다. (S)-DMT-세린올(TFA)-석신에이트-lcaa-CPG 10을 사용하여 실시예 화합물 A0264에서와 같이 합성을 시작한다. 추가적인 세린올 빌딩 블록이 필요한 경우, (S)-DMT-세린올(TFA) 아미다이트(7)를 적절한 고체상 합성 사이클에서 사용한다. 예를 들어, 화합물 A0329를 제조하기 위해서, 염기 서열이 완전히 조립된 후 추가의 세린올 아미다이트 커플링으로 쇄 조립을 완결한다. 추가로, 각각의 서열의 적절한 뉴클레오사이드가 적재된 고체 지지체로부터 5' 모노-GalNAc 접합된 올리고뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드 합성을 시작할 수 있다. 실시예 화합물 A0220에 이것은 2'fA일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 쇄는 이의 서열에 따라서 조립되고, 적절한 경우, 빌딩 블록(S)-DMT-세린올(TFA)-아미다이트(7)를 사용한다. 쇄 연장의 완결 시에, 포스포르아미다이트 합성 사이클의 단계 1)에서와 같이 마지막 커플링된 아미다이트 빌딩 블록의 보호 DMT기를 제거한다.
마지막 합성기 단계의 완결 시에, 아민으로의 처리, 예컨대, 40% 수성 메틸아민 처리에 의해서 단일 가닥을 고체 지지체로부터 절단할 수 있다. 임의의 남아있는 보호기가 또한 이 단계에서 제거되고, 메틸아민 처리는 또한 세린올 아미노 작용기를 해방시킨다. 이어서, 조 생성물을 각각 AEX-HPLC 및 SEC에 의해서 정제시켜 추가 GalNAc 접합을 위한 전구체 올리고뉴클레오타이드를 산출한다.
반응식 4: 세린올-유래된 전구체 올리고뉴클레오타이드의 GalNAc 접합 합성
Figure 112020060356433-pct00062
펩타이드 커플링 시약, 예컨대, HBTU에 의한 GalN(Ac4)-C4-산(9)의 사전 활성화에 의해서 사후 고체상 합성 GalNAc-접합을 달성하였다. 이어서, 사전 활성화된 산 9를 11(예를 들어 A0264) 내의 아미노-기와 반응시켜 중간체 GalN(Ac4)-접합체를 형성하였다. GalNAc-모이어티에서 하이드록실기를 보호하는 아세틸기를 메틸아민 처리에 의해서 절단시켜 목적하는 실시예 화합물 12(예를 들어 A0268)를 수득하였고, 이것을 AEX-HPLC 및 SEC에 의해서 추가로 정제시켰다.
단일 가닥 비-세린올-유래된 GalNAc 접합체의 합성
세린올 이외의 아미노 변형된 빌딩 블록은 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능하며, 이것을 세린올 대신에 사용하여 GalNAc 접합을 허용하는 반응성 아미노-기를 제공할 수 있다. 예를 들어, 하기 표 6에 제시된 상업적으로 입수 가능한 빌딩 블록을 사용하여, 아미노-변형된 로딩된 CPG, 예컨대, 10-1 내지 10-3을 사용하고, 그 다음 상기에 기재된 바와 같이 서열 조립하고, 마지막으로 아미노-변형제 포스포르아미다이트, 예컨대, 13-1, 13-2 또는 13-4를 커플링시킴으로써 비-세린올-유래된 아미노 변형된 전구체 올리고뉴클레오타이드 14(반응식 5A)를 제공할 수 있다.
예를 들어, 14(A0653)를 제조하기 위해서, GlyC3Am-CPG(10-2)를 GlyC3Am-아미다이트 13-2와 조합하여 사용하였다. 구조적으로 상이한 변형제를 사용하여 14를 제조할 수 있고, 예를 들어 A0651의 경우, C7Am-CPG를 제2 아미노 변형으로서 C6Am-아미다이트와 조합하여 사용하였다. 유사한 방식으로, 상업적으로 입수 가능한 아미노-변형제 로딩된 CPG 10-5 및 아미노-변형된 포스포르아미다이트 13-5를 사용하여 아미노-변형된 전구체 분자 14(A0655)를 합성할 수 있다.
Figure 112020060356433-pct00063
반응식 5: 올리고뉴클레오타이드 합성에 대한 일반적인 절차
Figure 112020060356433-pct00064
Figure 112020060356433-pct00065
이어서, 생성된 전구체 올리고뉴클레오타이드 14를 GalN(Ac4)-C4-산(9)과 접합시켜 목적하는 실시예 화합물 15를 산출하였다(반응식 6).
반응식 6: 전구체 올리고뉴클레오타이드의 GalNAc 접합 합성
Figure 112020060356433-pct00066
참조 접합체 3 내지 4에서의 단일 가닥 삼안테나형 GalNAc 접합체의 합성
삼안테나형 GalNAc-클러스터 접합된 siRNA의 올리고뉴클레오타이드의 합성을 도 14에 제시한다. 실시예 화합물 A0006에서와 같이 염기 로딩된 지지체, 예를 들어, 5'DMT-2'FdA(bz)-석신에이트-lcaa-CPG를 사용하여 올리고뉴클레오타이드 쇄 조립을 시작한다. 1) DMT-제거, 2) 요구된 DMT-차폐된 포스포르아미다이트를 사용한 쇄 연장, 3) 비-연장된 올리고뉴클레오타이드 쇄의 캡핑, 그 다음 아이오딘 또는 EDITH(포스포로티오에이트 링키지가 바람직한 경우)에 의한 P(III)에서 P(V)로의 산화 및 다시 캡핑(Cap/Ox/Cap 또는 Cap/Thio/Cap)으로 이루어진 포스포르아미다이트 합성 커플링 사이클은 생성물의 전장이 도달될 때까지 반복된다. 3가 삼안테나형 GalNAc 클러스터의 칼럼 접합을 위해서, 필요한 3가 분지형 아미다이트 C4XLT-phos를 사용하여 동일한 합성 사이클을 적용하고, 그 다음 GalNAc 아미다이트 ST23-phos를 사용하여 또 다른 라운드의 합성 사이클을 적용하였다. 이러한 마지막 합성기 단계의 완결 시에, 올리고뉴클레오타이드를 고체 지지체로부터 절단시키고, 메틸아민 처리에 의해서 추가 보호기를 제거할 수 있다. 이어서, 조 생성물을 각각 AEX-HPLC 및 SEC에 의해서 정제시켰다.
이중 가닥 형성의 일반적인 절차
이중 가닥 접합체를 수득하기 위해서, 개별 단일 가닥을 H2O 중에 60OD/㎖의 농도로 용해시킨다. 개별 올리고뉴클레오타이드 용액 둘 다를 함께 반응 용기에 첨가할 수 있다. 반응 모니터링을 위해서, 적정을 수행할 수 있다. 제1 가닥을 260nm에서의 UV-흡수에 의해서 결정되는 경우 제2 가닥보다 25% 과량으로 첨가한다. 반응 혼합물을 예를 들어, 80℃까지 5분 동안 가열시키고, 이어서 RT까지 서서히 냉각시킨다. 이중 가닥 형성을 이온 짝지움 역상 HPLC에 의해서 모니터링할 수 있다. 잔류하는 단일 가닥의 UV-면적으로부터 필요한 양의 제2 가닥을 계산하고, 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 반응을 예를 들어, 80℃까지 다시 가열시키고, RT까지 서서히 냉각시킨다. 10% 미만의 잔류하는 단일 가닥이 검출될 때까지 이러한 절차를 반복할 수 있다.
상기 방법(반응식 1 내지 반응식 6 및 도 13 및 도 14)을 쉽게 개작하여 GalNac를 또 다른 표적화 리간드, 예를 들어, 당류로 대체할 수 있다.
상기 양상 중 임의의 것에서, 사후 고체상 합성 접합 대신에, 미리 형성된 세린올(GN)-포스포르아미다이트를 제조하고, 이것을 칼럼 상 접합을 위해서 사용할 수 있다.
일반적인 합성 반응식: 2
예시적인 화합물은 하기에 기재된 방법 및 당업자에게 공지된 방법에 따라서 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 쇄 및 링커 빌딩 블록의 조립은 예를 들어, 포스포르아미다이트 방법을 적용한 고체상 합성에 의해서 수행될 수 있다. GalNAc 접합은 필요한 수의 아미노 변형된 링커 빌딩 블록이 부착된 사전 조립되고 정제된 올리고뉴클레오타이드에 대한 GalNAc-카복실산 빌딩 블록의 펩타이드 결합 형성에 의해서 달성될 수 있다.
반응식 1: DMT-세린올(TFA) 링커 신톤의 합성
Figure 112020060356433-pct00067
DMT-세린올(TFA)-포스포르아미다이트 7은 문헌에 공개된 방법에 따라서 세린올 유도체 1로부터 합성할 수 있다(Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135).
DMT-세린올(TFA)-석신에이트 6은 촉매, 예컨대, DMAP의 존재 하에서 석신산 무수물을 사용하여 중간체 5의 전환에 의해서 제조할 수 있다.
고체 지지체, 예컨대, CPG 지지체에 6을 로딩하여 커플링 시약, 예컨대, HBTU를 사용하여 고체 지지체, 예컨대, 아미노 변형된 네이티브 CPG 지지체(500A)에 대한 펩타이드 결합 형성을 달성할 수 있다. DMT-세린올(TFA)-석신에이트 6 및 커플링 시약, 예컨대, HBTU를 용매, 예컨대, CH3CN 중에 용해시킨다. 염기, 예컨대, 다이아이소프로필에틸아민을 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 2분 동안 교반한다. 고체 지지체, 예컨대, 네이티브 아미노-lcaa-CPG 지지체(500A, 3g, 아민 함량: 136마이크로몰/g)를 반응 혼합물에 첨가하고, 현탁액을 형성한다. 현탁액을 리스트-액션 진탕기(wrist-action shaker) 상에서 실온에서 16시간 동안 약하게 진탕하고, 이어서 여과시키고, 용매, 예컨대, DCM 및 EtOH로 세척한다. 지지체를 진공 하에서 2시간 동안 건조시킨다. 실온에서 아세트산 무수물/루티딘/N-메틸이미다졸과 교반함으로써 지지체 상의 미반응 아민을 캡핑할 수 있다. 지지체의 세척을 상기와 같이 반복할 수 있다. 고체 지지체를 진공 하에서 건조시켜 고체 지지체 10을 산출한다.
반응식 2: GalNAc 신톤 9 의 합성
Figure 112020060356433-pct00068
GalNAc 신톤 9의 합성을 문헌[Nair et al. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), pp 16958-16961]에 기재된 바와 같은 방법에 따라서 상업적으로 입수 가능한 퍼-아세틸화 갈락토스 아민 8로부터 출발하여 제조할 수 있다.
반응식 3: 일반적인 절차 of 올리고뉴클레오타이드 합성
Figure 112020060356433-pct00069
모든 올리고뉴클레오타이드는 AKTA 올리고파일로트 10 합성기 상에서 하기에 상세하게 기재된 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 합성할 수 있다.
3' 및 5' GalNAc 접합된 올리고뉴클레오타이드 전구체(예컨대, 화합물 X0385B-prec)의 올리고뉴클레오타이드 합성을 도 17에 제시하고, 반응식 3에 요약한다. 합성을 DMT-세린올(TFA)-석신에이트-lcaa-CPG 10을 사용하여 시작한다. 생성물의 전장이 도달될 때까지 포스포르아미다이트 합성 사이클을 적용한다. 쇄 연장의 완결 시에, 개별 합성 사이클에서 동일한 방식으로 마지막 커플링된 아미다이트 빌딩 블록의 보호 DMT기를 제거할 수 있다. 실시예 화합물 X0385B-prec(이것은 제2 가닥의 3' 단부 및 5' 단부에 세린올-유래된 링커 모이어티를 가짐)의 합성을 완결하기 위해서, 염기기 서열이 완전히 조립된 후 추가의 세린올 아미다이트 커플링을 사용하여 쇄 조립을 완결하였다.
마지막 합성기 단계의 완결 시에, 아민으로의 처리, 예컨대, 40% 수성 메틸아민에 의해서 단일 가닥을 고체 지지체로부터 절단할 수 있다. 임의의 남아있는 보호기가 또한 이 단계에서 제거되고, 메틸아민 처리는 또한 세린올 아미노 작용기를 해방시킨다. 생성된 조 올리고뉴클레오타이드를 구배, 예컨대, 염화나트륨 구배를 사용하여 AKTA Pure HPLC System 상의 이온 크로마토그래피(Resource Q, 6㎖, 지이 헬쓰케어사(GE Healthcare))에 의해서 정제시킬 수 있다. IEX 정제로부터의 과량의 염을 SEC에 의해서 제거하여 아미노 변형된 전구체 올리고뉴클레오타이드 11을 수득할 수 있다. 생성물 함유 분획을 풀링시키고, 크기 배제 칼럼(Zetadex, 이엠피 바이오테크사(EMP Biotech)) 상에서 탈염시키고, 동결건조시킨다.
반응식 4: GalNAc 접합에 대한 일반적인 절차
Figure 112020060356433-pct00070
당업자에게 공지된 표준 펩타이드 커플링 조건을 사용하여 각각의 올리고뉴클레오타이드 가닥 11의 세린올-아미노 작용기에 9를 커플링시킴으로써 상기에 기재된 바와 같은 GalNAc 신톤 9의 접합을 달성할 수 있다. 예를 들어, 각각의 아미노-변형된 전구체 분자 11을 H2O 중에 용해시키고, 극성 용매, 예컨대, DMSO(예를 들어 DMSO/H2O, 2/1, v/v)를 첨가하고, 그 다음 염기, 예컨대, DIPEA(예를 들어, 총 부피의 2.5%)를 첨가한다. 별개의 반응 용기에서, 2eq.(아미노-변형된 전구체 올리고뉴클레오타이드 내의 아미노 작용기당)의 카복실산 성분을 2eq.의 커플링 시약, 예컨대, HBTU와 8eq.의 염기, 예컨대, DIPEA의 존재 하에서, 극성 용매, 예컨대, DMSO 중에서 반응시킴으로써 GalNAc 신톤 9의 사전 활성화를 수행할 수 있다. 2분 후, 활성화된 화합물 9를 각각의 아미노-변형된 전구체 분자 11의 용액에 첨가한다. 반응 과정을 LCMS 또는 AEX-HPLC에 의해서 모니터링할 수 있다. 접합 반응의 완결 후(예를 들어 30분), 10× iPrOH 0.1× 2M NaCl을 첨가함으로써 조 생성물을 침전시키고, 원심분리 경사분리에 의해서 수거할 수 있다. 아세틸 하이드록시-보호기를 염기성 조건, 예컨대, 40% MeNH2(500OD당 1㎖) 하에서 제거한다. RT에서 15분 후, H2O(1:10 v/v)를 첨가하고, 화합물 12(예컨대, 도 17에 도시된 X0385B)를 단리시키고, 양이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 정제시키고, 이어서 동결건조시킨다.
이중 가닥 형성의 일반적인 절차
개별 단일 가닥을 H2O 중에 60OD/㎖의 농도로 용해시킨다. 개별 올리고뉴클레오타이드 용액 둘 다를 함께 반응 용기에 첨가할 수 있다. 반응 모니터링을 위해서, 적정을 수행할 수 있다. 제1 가닥을 260nm에서의 UV-흡수에 의해서 결정되는 경우 제2 가닥보다 25% 과량으로 첨가한다. 반응 혼합물을 예를 들어, 80℃까지 5분 동안 가열시키고, 이어서 RT까지 서서히 냉각시킨다. 이중 가닥 형성을 이온 짝지움 역상 HPLC에 의해서 모니터링할 수 있다. 잔류하는 단일 가닥의 UV-면적으로부터 필요한 양의 제2 가닥을 계산하고, 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 반응을 예를 들어, 80℃까지 다시 가열시키고, RT까지 서서히 냉각시킨다. 10% 미만의 잔류하는 단일 가닥이 검출될 때까지 이러한 절차를 반복할 수 있다.
상기 방법(반응식 1 내지 반응식 4 및 도 17)을 쉽게 개작하여 GalNac를 또 다른 표적화 리간드 예를 들어, 당류로 대체할 수 있다.
본 발명은 세포에서 LPA 유전자의 발현을 저해하기 위한 접합체에 관한 것이며, 상기 접합체는 핵산 부분, 및 리간드 부분을 포함하며, 상기 핵산 부분은 제1 RNA 가닥의 적어도 일부 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 RNA 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 가닥은 상기 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 리간드 부분은 링커 모이어티 및 세포의 생체내 표적화를 위한 표적화 리간드를 포함하고, 하나 또는 두 RNA 가닥의 3' 단부 및/또는 5' 단부에만 접합되고, 여기서 제1 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않고, 여기서,
(i) 제2 RNA 가닥은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 여기서 (a) 제2 RNA 가닥은 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제1 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (b) 제1 RNA 가닥은 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (c) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되거나; 또는
(ii) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않는다.
링커 모이어티는 예를 들어, 세린올-유래된 링커 모이어티 또는 본 명세서에 기재된 다른 링커 유형 중 하나일 수 있다.
본 발명은 또 다른 양상으로서, 세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산을 제공하며, 이러한 핵산은, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 가닥은 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 또는 73으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 핵산은 리간드에 접합되어 있다. 제2 가닥은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 64, 66, 68, 70, 72 또는 74의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 화학식 I의 리간드(상기에 제시된 바와 같음)에 접합된 서열번호 5 또는 서열번호 9 및 서열번호 6 또는 서열번호 10을 포함하고, 여기서 리간드는 상기에 기재된 바와 같은 핵산에 접합되고, 여기서 제1 가닥은 홀수 뉴클레오타이드 상에서 2'OMe 변형으로 변형되고, 짝수 뉴클레오타이드 상에서 2'F로 변형되고, 제2 가닥은 짝수 뉴클레오타이드 상에서 2'OMe로 변형되고, 홀수 뉴클레오타이드 상에서 2'F로 변형된다.
보다 바람직하게는, 핵산은 서열번호 5 또는 서열번호 9 및 서열번호 6 또는 서열번호 10을 포함하고, 여기서 핵산은 화학식 I의 리간드(하기에 제시된 바와 같음)에 접합되고, 추가로, 여기서 핵산은 본 명세서에 제공된 바와 같은 표 1의 내용 아래에 제시된 바와 같은 변형 패턴을 갖는다.
Figure 112020060356433-pct00071
여기서 특정 하기 변형은 번호로 표현된다:
1=2'F-dU,
2=2'-F-dA,
3=2'F-dC,
4=2'F-dG,
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG.
리간드는 GalNAc를 포함할 수 있고, 도 4A 또는 도 4B는 본 발명의 예를 추가로 예시한다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 의약으로서 또는 진단제로서 단독으로 또는 다른 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하나 이상의 핵산 접합체는 전달 비히클(예를 들어, 리포솜) 및/또는 부형제, 예컨대, 담체, 희석제와 조합될 수 있다. 다른 작용제, 예컨대, 보존제 및 안정화제가 또한 첨가될 수 있다. 핵산의 전달 방법은 당업계에 공지되어 있고, 당업자의 지식 범위 내이다.
본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산은 또한 별개로 또는 동시에, 예를 들어, 조합 단위 용량으로서 투여되는, 다른 치료 화합물과 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명은 또한 생리학적으로/약제학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대, 안정화제, 보존제, 희석제, 완충제 등 중에 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 의약 및 약제학적 조성물에 대한 투여량 수준은 일상적인 실험에 의해서 당업자에 의해서 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 단위 용량은 약 0.01㎎/㎏ 및 약 100㎎/㎏ 체중의 핵산 또는 접합된 핵산을 함유할 수 있다. 대안적으로, 용량은 10㎎/㎏ 내지 25㎎/㎏ 체중, 또는 1㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏ 체중, 또는 0.05㎎/㎏ 내지 5㎎/㎏ 체중, 또는 0.1㎎/㎏ 내지 5㎎/㎏ 체중, 또는 0.1㎎/㎏ 내지 1㎎/㎏ 체중, 또는 0.1㎎/㎏ 내지 0.5㎎/㎏ 체중, 또는 0.5㎎/㎏ 내지 1㎎/㎏ 체중일 수 있다. 투여량 범위는 또한 다른 파라미터, 예를 들어, 체표면적 등을 통해서 계산될 수 있다.
약제학적 조성물은 멸균 주사용 수성 현탁액 또는 용액 또는 동결건조 형태일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물 및 의약은 포유동물 대상체에게 약제학적 유효 용량으로 투여될 수 있다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 유인원 또는 원원류, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 마우스, 래트, 햄스터, 고슴도치 및 기니피그 또는 다른 관련 종으로부터 선택될 수 있다. 이를 기초로, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "LPA" 또는 "LPA" 라는 표현은 상기에 언급된 종 중 임의의 것의 핵산 또는 단백질을 나타내지만, 자연적으로 또는 인공적으로 발현되는 경우, 바람직하게는 이러한 표현은 인간 핵산 또는 단백질을 나타낸다.
본 발명의 추가 양상은 질환, 장애 또는 증후군의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산 또는 본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 치료는 뇌졸중, 죽상경화증, 혈전증 또는 심혈관 질환, 예컨대, 관상동맥 심장 질환 또는 대동맥 협착증 및 증가된 수준의 Lp(a)-함유 입자와 연관된 임의의 다른 질환 또는 병상을 예방하고, 이를 앓을 위험을 감소시킬 수 있다. 본 발명은 생리학적으로/약제학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대, 안정화제, 보존제, 희석제, 완충제 등 중에 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
약제학적 조성물은 멸균 주사용 수성 현탁액 또는 용액, 또는 동결건조된 형태일 수 있거나 또는 임의의 다른 적합한 갈렌(galenic) 담체 물질, 예컨대, 예컨대, 펠릿, 정제, 캡슐, 나노입자, 겔, 정제, 비드 또는 유사한 구조에 접착되거나, 흡수되거나, 포함될 수 있다.
본 명세서에 기재된 핵산은 LPA의 발현을 저해할 수 있다. 본 명세서에 기재된 핵산은 LPA의 발현을 부분적으로 저해할 수 있다. 저해는 완전할 수 있고, 즉, 본 발명의 핵산의 부재 하에서의 LPA의 발현 수준에 비해서 0%일 수 있다. LPA 발현의 저해는 부분적일 수 있고, 즉, 그것은 본 발명의 핵산의 부재 하에서의 LPA 발현의 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 중간 값일 수 있다. 저해는 대상체, 예컨대, 인간 환자에서 사용되는 경우 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주 또는 최대 3개월 지속될 수 있다. 본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산, 또는 이를 포함하는 조성물은 주 단위로 1회 또는 2회, 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 또는 8주마다의 치료를 포함하는 요법에서, 또는 상이한 투여 빈도, 예컨대, 상기에 언급된 간격의 조합을 갖는 요법에서의 사용을 위한 것일 수 있다. 핵산은 피하로, 정맥내로 또는 임의의 다른 적용 경로를 사용하여, 예컨대, 경구, 직장 또는 복강내로의 사용을 위한 것일 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산으로 치료되거나 이를 제공받는 세포 및/또는 대상체에서, LPA 발현은 미치료 세포 및/또는 대상체와 비교할 때 15% 내지 최대 100%의 범위, 그러나 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 또는 중간 값만큼 저해될 수 있다. 저해 수준은 LPA 발현 또는 과발현과 연관된 질환의 치료를 허용할 수 있거나, 또는 LPA 유전자 생성물의 기능 및 생리학적 역할을 추가로 조사하는 역할을 할 수 있다.
본 발명의 추가 양상은 질환, 장애 또는 증후군, 예컨대, 상기에 열거된 것 또는 Lp(a)의 증가된 수준과 연관된 추가의 병상을 치료하기 위한 의약 또는 LPA 발현의 저해가 바람직한 추가 치료 접근법의 제조에서의 본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산에 관한 것이다.
또한 본 발명에는 질환, 장애 또는 증후군, 예컨대, 상기에 열거된 것을 치료 또는 예방하는 방법이 포함되며, 이 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 (이러한 병상을 개선시키기 위해서) 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 핵산 조성물은 매주 2회 또는 매주 1회, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 또는 8주마다의 치료를 포함하는 요법에서, 또는 상이한 투여 빈도, 예컨대, 상기에 언급된 간격의 조합을 갖는 요법으로 투여될 수 있다. 핵산 또는 접합된 핵산은 피하로 또는 정맥내로 또는 다른 적용 경로를 사용하여, 예컨대, 경구, 직장 또는 복강내로의 사용을 위한 것일 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산은 또한 별개로 또는 동시에, 예를 들어, 조합 단위 용량으로서 투여되는, 다른 치료 화합물과 조합하여 사용하기 위해서 투여될 수 있다. 생물학적 활성 분자 엔티티, 예컨대, 펩타이드, 세포 또는 인공 리간드 또는 소분자 또는 대분자에 대한 분자 접합이 또한 가능하다.
본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산은 화학적 합성 또는 시험관내에서(예를 들어, 전사의 런 오프(run off)) 또는 생체내에서 핵산을 발현시키는 것을 비롯하여, 당업계에서의 일상적인 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 고체상 화학적 합성을 사용하거나 바이러스 유도체 또는 부분적 또는 완전 합성 발현 시스템을 비롯한 핵산-기반 발현 벡터를 사용한다. 일 실시형태에서, 발현 벡터를 사용하여, 시험관 내에서, 중간체 숙주 유기체 또는 세포 유형 내에서, 중간체 또는 최종 유기체 내에서, 또는 목적하는 표적 세포 내에서 본 발명의 핵산을 생산할 수 있다. 본 명세서에 기재된 핵산의 생산(합성 또는 효소에 의한 전사) 방법이 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명은 세포 RNA 간섭 기전을 통해서 LPA 유전자 전사물에 결합함으로써 LPA mRNA 분해를 매개하는 화학 분자 엔티티로 이루어진다. 본 발명의 분자 화합물은 아시알로당단백질 수용체 복합체(ASGPR)에 대한 특이적 결합을 통해서, 간세포-특이적 세포 흡수를 보장하는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 당 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는 것과 함께 접합체로서 사용될 수 있다. 본 발명은 하기에 언급되는 바와 같은 상이한 특성을 부여하는 다른 상이한 화학 구조에 연결될 수 있다. 핵산의 화학 변형 패턴의 사용은 혈청에서 뉴클레아제 안정성을 부여하고, 예를 들어, 피하 적용 경로를 실현 가능하게 만든다.
본 발명은 현재 입수 가능한 치료보다 더 양호한 안정성 프로파일을 잠재적으로 부여하는, 분자 및 조직-지향되는 전달 수준의 높은 특이성을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 본 발명의 임의의 양상에 따른 핵산을 제공하며, 여기서 제1 RNA 가닥은 말단 5' (E)-바이닐포스포네이트 뉴클레오타이드를 갖고, 말단 5' (E)-바이닐포스포네이트 뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 링키지에 의해서 제1 가닥 내의 제2 뉴클레오타이드에 연결된다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 1개 초과의 포스포다이에스터 링키지를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 적어도 말단 3개의 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포다이에스터 링키지를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 적어도 말단 4개의 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포다이에스터 링키지를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 하기 화학식 (XVII)를 포함할 수 있다:
Figure 112020060356433-pct00072
식 중, '(vp)-'는 5' (E)-바이닐포스포네이트이고, 'N'은 뉴클레오타이드이고, 'po'는 포스포다이에스터 링키지이고, n은 1 내지 (제1 가닥 내의 뉴클레오타이드의 총 수 - 2)이고, 바람직하게는 여기서 n은 1 내지 (제1 가닥 내의 뉴클레오타이드의 총 수 -3)이고, 보다 바람직하게는 여기서 n은 1 내지 (제1 가닥 내의 뉴클레오타이드의 총 수 -4)이다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트(ps) 링키지를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 말단 2개의 3' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지 또는 말단 3개의 3' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 가닥 내의 다른 뉴클레오타이드 사이의 링키지는 포스포다이에스터 링키지이다.
일 실시형태에서, 제1 가닥은 1개 초과의 포스포로티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
추가 실시형태에서, 제2 가닥은 말단 2개의 3' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지 또는 말단 3개의 3' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
또 다른 추가 실시형태에서, 제2 가닥은 말단 2개의 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지 또는 말단 3개의 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 말단 5' (E)-바이닐포스포네이트 뉴클레오타이드는 RNA 뉴클레오타이드이다.
말단 5' (E)-바이닐포스포네이트 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드이고, 여기서 5'-단부에서의 자연 포스페이트기는 E-바이닐포스포네이트로 대체되었고, 여기서 5' 포스포릴화된 가닥의 말단 뉴클레오타이드의 브리징 5'-산소 원자는 메틴일(-CH=)기로 대체된다:
Figure 112020060356433-pct00073
5'-단부에서 자연 포스페이트를 갖는 뉴클레오타이드
Figure 112020060356433-pct00074
5'-단부에서 E-바이닐포스포네이트를 갖는 뉴클레오타이드.
5' (E) 바이닐포스포네이트는 5' 포스페이트 모방체이다. 생물학적 모방체는 모방되는 본래 분자와 동일한 기능을 수행할 수 있거나 구조적으로 매우 유사한 분자이다. 본 발명의 내용에서, 5' (E) 바이닐포스포네이트는 정상 5' 포스페이트의 기능, 예를 들어, 효율적인 RISC 로딩 가능성을 모방한다. 또한, 이의 약간의 변경된 구조로 인해서, 5' (E) 바이닐포스포네이트는 5'-단부 뉴클레오타이드를 효소, 예컨대, 포스파타제에 의한 탈포스포릴화로부터 보호함으로써 그것을 안정화시킬 수 있다.
본 발명의 일 양상은 세포에서 표적 유전자의 발현을 저해하기 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산으로서, 이 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부, 및 상기 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하되, 상기 제1 가닥은 상기 표적 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 여기서 상기 제1 가닥은 RISC에 의한 핵산의 가공을 용이하게 하기 위해서 복수의 위치에서 변형된 뉴클레오타이드 또는 비변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 양상에서 "RISC에 의한 가공을 용이하게 한다"는 핵산이 RISC에 의해서 가공될 수 있고, 예를 들어, 존재하는 임의의 변형이 핵산이 RISC에 의해서 가공되는 것을 허용할 것이어서, 적합하게는 siRNA 활성이 일어날 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산, 여기서 제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않는다.
제1 가닥 상의 위치에 "상응하는" 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는 적합하게는 제1 가닥 상의 뉴클레오타이드와 염기 쌍을 이루는 뉴클레오타이드이다.
일 양상에서 제1 가닥의 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는 제1 가닥의 13번 위치와 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드이다.
일 양상에서 제1 가닥의 11번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는 제1 가닥의 11번 위치와 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드이다.
일 양상에서 제1 가닥의 12번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는 제1 가닥의 12번 위치와 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드이다.
이러한 명명법은 제2 가닥의 다른 위치에 적용될 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥이고, 평활 단부인 19량체 핵산에서, 제1 가닥의 13번 위치는 제2 가닥의 7번 위치와 쌍을 이룰 것이다. 제1 가닥의 11번 위치는 제2 가닥의 9번 위치와 쌍을 이룰 것이다. 이러한 명명법은 제2 가닥의 다른 위치에 적용될 수 있다.
제1 가닥의 13번 위치에 상응하는 뉴클레오타이드는 적합하게는 제2 가닥의 13번 위치이고, 이것은 제2 가닥의 3'로부터 계수하고, 이중 가닥 영역의 제1 뉴클레오타이드로부터 시작한다. 마찬가지로 제2 가닥의 11번 위치는 적합하게는 이중 가닥 영역의 제1 뉴클레오타이드로부터 시작하여, 제2 가닥의 3'로부터 11번째 뉴클레오타이드이다. 이러한 명명법은 제2 가닥의 다른 위치에 적용될 수 있다.
일 양상에서, 부분적으로 상보성인 제1 가닥 및 제2 가닥의 경우에, 제1 가닥 상의 위치"에 상응하는" 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는, 위치가 미스매치가 존재하는 위치인 염기 쌍을 본질적으로 형성할 수 있는 것은 아니지만, 명명법의 원칙은 여전히 적용된다.
듀플렉스 영역(임의의 오버행 영역을 무시함)에 대해서 완전히 상보성이고, 핵산의 이중 가닥 영역 내에 미스매치가 존재하지 않는 제1 가닥 및 제2 가닥이 바람직하다.
또한 하기가 바람직하다:
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 11번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 11번 및 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
일 양상에서 제1 가닥의 12번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않는다. 핵산에 대한 제한은 본 명세서에 기재된 임의의 다른 제한으로 인지될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양상은 제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 11번 및 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이다.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 11번 위치 또는 13번 위치, 또는 11번 위치 및 13번 위치, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형된, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 제1 가닥의 11번 위치 또는 13번 위치, 또는 11번 위치 및 13번 위치, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 제1 가닥의 11번 위치 또는 13번 위치, 또는 11번 위치 및 13번 위치, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형된, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오타이드 중 50% 초과가 2'-O-메틸 변형을 포함하고, 예컨대, 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서 측정되는 경우, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 중 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85% 초과 또는 그 초과가 2'-O-메틸 변형을 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오타이드 중 50% 초과가 자연 발생 RNA 변형을 포함하고, 예컨대, 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서 측정되는 경우, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 중 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85% 초과 또는 그 초과가 이러한 변형을 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산. 적합한 자연 발생 변형은 2 O' 메틸뿐만 아니라, 다른 2' 당 변형, 특히 2' H 변형을 포함하여, DNA 뉴클레오타이드를 생성한다.
바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상에 2'-O-메틸 변형이 아닌 2'-변형을 갖는 뉴클레오타이드를 20% 이하, 예컨대, 15% 이하, 예컨대, 10% 이하로 포함하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
바람직하게는 두 가닥의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상에 2'-플루오로 변형을 20% 이하(예컨대, 15% 이하 또는 10% 이하)로 포함하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치 및 제1 가닥의 11번, 또는 13번, 또는 11번 및 13번, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드를 제외한, 모든 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형된, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산. 바람직하게는 2'-O-메틸로 변형되지 않은 뉴클레오타이드는 2' 위치에서 플루오로로 변형된다.
핵산의 뉴클레오타이드 모두가 당의 2' 위치에서 변형된 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이 바람직하다. 바람직하게는 이들 뉴클레오타이드는 변형이 2'-O-메틸 변형이 아닌 2'-플루오로 변형으로 변형된다.
본 발명의 핵산은 2' 위치에서 2' H로 변형된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 따라서, 핵산 내에 DNA 뉴클레오타이드를 갖는다. 본 발명의 핵산은 제1 가닥의 5' 단부로부터 계수하여 제1 가닥의 2번 위치 및/또는 14번 위치에서 DNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 11번, 또는 13번, 또는 11번 및 13번, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 DNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일 양상에서 본 발명의 핵산당 하나 이하의 DNA가 존재한다.
본 발명의 핵산은 하나 이상의 LNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 제1 가닥의 5' 단부로부터 계수하여 제1 가닥의 2번 위치 및/또는 14번 위치에서 LNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 11번, 또는 13번, 또는 11번 및 13번, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 LNA를 포함할 수 있다.
일 양상에서 핵산은 교번하는 2-O 메틸 변형 및 2 플루오로 변형으로 제1 가닥 상에서 변형되고, 2번 및 14번 위치(5' 단부로부터 시작)는 2'-플루오로로 변형된다. 바람직하게는 제2 가닥은 제1 가닥의 11번, 또는 13번, 또는 11번 및 13번, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드에서 2'-플루오로 변형으로 변형된다. 바람직하게는 제2 가닥은 상보성(이중 가닥) 영역의 제1 위치에서 시작하여 3' 단부로부터 계수하여 11번 내지 13번 위치에서 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 나머지 변형은 자연 발생 변형, 바람직하게는 2'-O-메틸이다.
일 양상에서 본 발명의 핵산은 5'-5' 링키지 또는 3'-3' 링키지, 바람직하게는 제2 가닥의 3' 단부에서 3'-3' 링키지를 사용하여, 하나 이상의 역전된 리보뉴클레오타이드, 바람직하게는 역전된 아데닌을 포함한다.
일 양상에서 핵산은 하나 이상의 포스포로다이티오에이트 링키지, 예컨대, 1, 2, 3 또는 4개의 포스포로다이티오에이트 링키지를 포함한다. 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서 각각 하나씩 최대 4개의 포스포로다이티오에이트 링키지가 존재한다.
핵산의 특징 모두는 본 명세서에 개시된 본 발명의 다른 양상 모두와 조합될 수 있다.
특히, 제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 핵산은 하기 중 하나 이상 또는 모두를 포함하는 SiRNA 분자인 핵산이 바람직하다:
(i) 제2 가닥의 3' 단부에서 역전된 뉴클레오타이드, 바람직하게는 3'-3' 링키지;
(ii) 하나 이상의 포스포로다이티오에이트 링키지;
(iii) 제1 가닥 중 11번 또는 13번 위치에 상응하는 제2 가닥 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않음(바람직하게는 여기서 이들 위치 중 하나 또는 둘 다는 2'-플루오로 변형을 포함함);
(iv) 핵산은 2'-O-메틸 변형을 갖는 모든 뉴클레오타이드 중 적어도 80%를 포함함;
(v) 핵산은 2'-플루오로 변형을 갖는 뉴클레오타이드를 20% 이하 포함함.
또한 본 발명에는 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산이 제공되며, 여기서 제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드 및 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 및/또는 9번, 또는 7번 내지 9번 위치에서의 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 나머지 뉴클레오타이드 중 적어도 90%는 2'-O 메틸 변형되고, 또 다른 자연 발생 2'-변형을 포함한다.
오버행을 갖지 않는, 평활 이중 가닥의 19 염기 핵산에 대한 구체적인 바람직한 예는 다음과 같다:
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 및 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 내지 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 및/또는 9번, 또는 7번 내지 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형된, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 및/또는 9번 또는 7번 내지 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형되지 않은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 및/또는 9번 또는 7번 내지 9번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'플루오로 변형으로 변형된, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오타이드 중 50% 초과가 2'-O-메틸 변형을 포함하고, 예컨대, 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서 측정되는 경우, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 중 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85% 초과 또는 그 초과가 2'-O-메틸 변형을 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오타이드 중 50% 초과가 자연 발생 RNA 변형을 포함하고, 예컨대, 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서 측정되는 경우, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 중 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85% 초과 또는 그 초과가 이러한 변형을 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산. 적합한 자연 발생 변형은 2 O' 메틸뿐만 아니라, 다른 2' 당 변형, 특히 2' H 변형을 포함하여, DNA 뉴클레오타이드를 생성한다.
바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상에 2'-O-메틸 변형이 아닌 2'-변형을 갖는 뉴클레오타이드를 20% 이하, 예컨대, 15% 이하, 예컨대, 10% 이하로 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
바람직하게는 두 가닥의 총 뉴클레오타이드의 백분율로서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상에 2'-플루오로 변형을 20% 이하(예컨대, 15% 이하 또는 10% 이하)로 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치 및 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 및/또는 9번 위치를 제외하고, 모든 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형된 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산. 바람직하게는 2'-O-메틸로 변형되지 않는 뉴클레오타이드는 2' 위치에서 플루오로로 변형된다.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치 및 제2 가닥의 5' 단부로부터의 7번 내지 9번 위치를 제외하고, 모든 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형으로 변형된 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산. 바람직하게는 2'-O-메틸로 변형되지 않는 뉴클레오타이드는 2' 위치에서 플루오로로 변형된다.
20개의 염기 쌍 듀플렉스 영역을 포함하는 핵산의 경우, 제2 가닥은 바람직하게는 각각 제1 가닥의 13번, 12번 및 11번 위치에 상응하는 듀플렉스의 5' 단부로부터 계수하여 뉴클레오타이드 8 또는 9 또는 10에서 2'-O-메틸기를 갖지 않는다.
21개의 염기 쌍 듀플렉스 영역을 포함하는 핵산의 경우, 제2 가닥은 바람직하게는 각각 제1 가닥의 13번, 12번 및 11번 위치에 상응하는 듀플렉스의 5' 단부로부터 계수하여 뉴클레오타이드 9 또는 10 또는 11에서 2'-O-메틸기를 갖지 않는다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 모든 변형된 서열의 비변형된 서열에 관한 것이다.
본 발명을 이제 하기 비제한적인 도면 및 실시예를 참고로 기재할 것이다.
도면
도 1은 인간 RT-4 세포에서 LPA mRNA 발현의 저해에 대한 비-접합된 siRNA 분자 스크린의 결과를 나타낸 도면.
도 2A 및 도 2B는 인간 RT-4 세포에서 LPA mRNA 발현에 대한 비-접합된 LPA-표적화 siRNA 분자의 용량 반응을 나타낸 도면.
도 3은 수용체-매개된 흡수에 의해서 전달되는 상이한 용량의 GalNAc-L1 LPA-1038 접합된 siRNA 분자에 의한 인간 및 시노몰거스 1차 간세포에서의 LPA mRNA 발현의 저해를 나타낸 도면.
도 4A 및 도 4B는 각각 예시된 올리고뉴클레오타이드가 접합된 상이한 L1 및 L6 링커를 갖는 GalNAc 리간드의 구조의 예를 나타낸 도면.
도 5는 수용체-매개된 흡수에 의해서 전달되는 1차 인간 간세포에서 나타나는 L6-접합된 GalNAc siRNA에 의해서 매개된 LPA-mRNA의 넉다운의 대표적인 예를 나타낸 도면.
도 6은 접합체 1을 도시한 도면.
도 7은 접합체 2를 도시한 도면.
도 8은 접합체 3을 도시한 도면.
도 9는 참조 접합체 1을 도시한 도면.
도 10은 참조 접합체 2를 도시한 도면.
도 11은 참조 접합체 3을 도시한 도면.
도 12는 참조 접합체 4를 도시한 도면.
도 6 내지 도 12 및 도 19 내지 도 30 각각에서, 상부 가닥은 안티센스 가닥이고, 하부 가닥은 센스 가닥이다. 또한, 핵산과 리간드 부분 사이의 연결을 보다 명확히 나타내기 위해서, 각각의 접합된 가닥의 단부에서의 뉴클레오타이드는 완전하게 도시된다.
도 13은 3' 모노-GalNAc 접합된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드이고, 접합체 1 및 접합체 3의 합성에서의 출발 물질인 A0268의 합성을 나타낸 도면. (ps)는 포스포로티오에이트 링키지를 나타낸다.
도 14는 참조 접합체 4의 합성을 위해서 사용되는 5' 삼안테나형 GalNAc 접합된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드인 A0006의 합성을 나타낸 도면. (ps)는 포스포로티오에이트 링키지를 나타낸다.
도 15는 TTR 넉다운의 시험관내 결정을 도시한 도면. 특히, 도 15A는 참조 접합체(RC) 1 및 3뿐만 아니라 미처리 대조군 "UT"에 의한 TTR 넉다운의 시험관내 결정을 나타낸 도면; 도 15B는 참조 접합체(RC) 2 및 3뿐만 아니라 미처리 대조군 "UT"에 의한 TTR 넉다운의 시험관내 결정을 나타낸 도면; 도 15C는 참조 접합체 1, 2 및 3뿐만 아니라 RC3 및 미처리 대조군 "UT"에 의한 TTR 넉다운의 시험관내 결정을 나타낸 도면; 참조 접합체 1 및 2는 비교 접합체를 나타낸다. 참조 접합체 3은 비-표적화 GalNAc siRNA를 나타내고, "미처리"("UT")는 미처리 세포를 나타낸다. RC3 및 UT 둘 다는 음성 대조군이다. mRNA 수준은 PtenII에 대해서 정규화되었다.
도 16은 1㎎/㎏으로의 s.c. 처리 7, 14, 및 27일 후에 n=4의 c57BL/6 마우스 코호트에서의 혈청 TTR의 시간 경과를 나타낸 도면- 접합체 1 내지 3, 참조 접합체(RC) 1, 2 및 4 및 모의 처리된(PBS) 개체.
도 17은 3' 및 5' GalNAc 접합된 올리고뉴클레오타이드 전구체(예컨대, 화합물 X0385B-prec)의 올리고뉴클레오타이드 합성을 도시한 도면.
도 18은 1차 시노몰거스 간세포에서의 5' 제2 가닥에서의 삼안테나형 GalNAc 단위와 비교할 때 제2 가닥에 접합된 2개의 단일 GalNAc 단위를 갖는 LPA 표적화 siRNA에 대한 넉다운의 동일한 용량 반응을 도시한 도면.
도 19A은 접합체 4를 도시한 도면. 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결된다. 세린올-GalNAc-링커는 포스포다이에스터 결합을 통해서 센스 가닥의 3' 단부 및 5' 단부에 접합된다.
도 19B는 접합체 5를 도시한 도면. 안티센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결된다. 세린올-GalNAc-링커는 포스포로티오에이트 결합을 통해서 센스 가닥의 3' 단부 및 5' 단부에 접합된다.
도 20은 접합체 6을 도시한 도면. 안티센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결된다. 세린올-GalNAc-링커는 포스포다이에스터 결합을 통해서 센스 가닥의 3' 단부 및 5' 단부에 접합된다.
도 21은 접합체 7을 도시한 도면. 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결된다. 세린올-GalNAc-링커는 포스포로티오에이트 결합을 통해서 센스 가닥의 3' 단부 및 5' 단부에 접합된다. 세린올-GalNAc-링커는 포스포로티오에이트 결합을 통해서 서로에 연결된다.
도 22는 접합체 8을 도시한 도면. 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결된다. GalNAc-C6-아미노-변형제 링커는 센스 가닥의 5' 단부에서 접합되고, GalNAc-C7-아미노-변형제 링커는 센스 가닥의 3' 단부에서 접합된다.
도 23은 접합체 9를 도시한 도면. 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결된다. GalNAc-GlyC3-아미노-변형제 링커는 센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서 접합된다.
도 24는 접합체 10을 도시한 도면. 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결되고, 센스 가닥은 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결된다. GalNAc-피페리딜-아미노-변형제 링커는 센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서 접합된다.
도 25는 접합체 11을 도시한 도면. 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결된다. GalNAc-C3-아미노-변형제 링커는 센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서 접합된다.
도 26은 접합체 12를 도시한 도면. 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결된다. GalNAc-C6-아미노-변형제 링커는 센스 가닥의 5' 단부에서 접합되고, GalNAc-GlyC3-아미노-변형제 링커는 센스 가닥의 3' 단부에서 접합된다.
도 27은 RNA 서열만 상이한 접합체 15, 16, 18 및 19를 도시한 도면. 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 각각의 접합체에서의 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결된다. 세린올-GalNAc-링커는 포스포로티오에이트 결합을 통해서 센스 가닥의 3' 단부 및 5' 단부에 접합된다.
도 28은 RNA 서열만 상이한 참조 접합체 5 및 참조 접합체 9를 도시한 도면. 안티센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부 및 센스 가닥의 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 두 접합체에서 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결된다. 삼량체 GalNAc-링커는 두 접합체에서의 센스 가닥의 5' 단부에 포스포로티오에이트 결합을 통해서 접합된다.
도 29는 RNA 서열만 상이한 참조 접합체 6 및 참조 접합체 7을 도시한 도면. 안티센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부 및 센스 가닥의 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 두 접합체에서 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결된다. 삼량체 GalNAc-링커는 두 접합체에서의 센스 가닥의 5' 단부에 포스포로티오에이트 결합을 통해서 접합된다.
도 30은 참조 접합체 8을 도시한 도면. 안티센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부 및 센스 가닥의 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 각각의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 링커에 의해서 연결된다. 삼량체 GalNAc-링커는 센스 가닥의 5' 단부에 포스포로티오에이트 결합을 통해서 접합된다.
도 31은 TTR 넉다운의 시험관내 결정을 도시한 도면. 특히, 도 31A는 "Luc"(참조 접합체 3)뿐만 아니라 미처리 대조군 "UT"와 비교할 때 접합체 4, 5, 6 및 2에 의한 TTR 넉다운의 시험관내 결정을 나타낸 도면; 도 31B는 "Luc"(참조 접합체 3)뿐만 아니라 미처리 대조군 "UT"와 비교할 때 접합체 7 및 2에 의한 TTR 넉다운의 시험관내 결정을 나타낸 도면; Luc 또는 참조 접합체 3(RC3)은 비-표적화 GalNAc siRNA를 나타내고, "미처리"("UT")는 미처리 세포를 나타낸다. RC3 및 UT 둘 다는 음성 대조군이다. mRNA 수준은 PtenII에 대해서 정규화되었다.
도 32는 TTR 넉다운의 시험관내 결정을 도시한 도면. 특히, 도 32A는 "Luc"(참조 접합체 3)뿐만 아니라 미처리 대조군 "UT"와 비교할 때 접합체 8, 9, 10, 11 및 2에 의한 TTR 넉다운의 시험관내 결정을 나타낸 도면; 도 32B는 "Luc"(참조 접합체 3)뿐만 아니라 미처리 대조군 "UT"와 비교할 때 접합체 12 및 2에 의한 TTR 넉다운의 시험관내 결정을 나타낸 도면; Luc 또는 참조 접합체 3은 비-표적화 GalNAc siRNA를 나타내고, "미처리"("UT")는 미처리 세포를 나타낸다. RC3 및 UT 둘 다는 음성 대조군이다. mRNA 수준은 PtenII에 대해서 정규화되었다.
도 33은 대조군과 비교할 때 접합체 19에 의한 LPA mRNA 넉다운의 시험관내 결정을 나타낸 도면. Ctr은 비-표적화 GalNAc siRNA를 나타내고, "미처리"("UT")는 미처리 세포를 나타낸다. Ctr 및 UT 둘 다는 음성 대조군이다. mRNA 수준은 ACTB에 대해서 정규화되었다.
도 34는 1㎎/㎏으로의 s.c. 처리 14, 28, 및 42일 후에 n=6의 c57BL/6 마우스 코호트에서의 Aldh2 간 mRNA 수준의 시간 경과를 나타낸 도면- 접합체 15, 참조 접합체(RC) 6 및 모의 처리된(PBS) 개체. mRNA 수준은 Pten에 대해서 정규화되었다.
도 35는 1㎎/㎏으로의 s.c. 처리 14, 28, 및 42일 후에 n=6의 c57BL/6 마우스 코호트에서의 Aldh2 간 mRNA 수준의 시간 경과를 나타낸 도면- 접합체 16, 참조 접합체(RC) 7 및 모의 처리된(PBS) 개체. mRNA 수준은 Pten에 대해서 정규화되었다.
도 36은 1㎎/㎏으로의 s.c. 처리 14, 28, 및 42일 후에 n=6의 c57BL/6 마우스 코호트에서의 Tmprss6 간 mRNA 수준의 시간 경과를 나타낸 도면- 접합체 18, 참조 접합체(RC) 8 및 모의 처리된(PBS) 개체. mRNA 수준은 Pten에 대해서 정규화되었다.
도 37은 3일에 걸쳐서 37℃에서 접합체 4, 5, 6, 7 및 2 및 미처리 대조군(UT)의 혈청 안정성을 나타낸 도면.
도 38은 3일에 걸쳐서 37℃에서 접합체 8, 9, 10, 11, 12 및 2 및 미처리 대조군(UT)의 혈청 안정성을 나타낸 도면.
도 39는 수용체-매개된 흡수에 의해서 전달되는 상이한 용량의 GalNAc-L6 커플링된 siRNA에 의한 인간 1차 간세포에서의 LPA mRNA 발현의 저해를 나타낸 도면.
도 40은 링커를 통해서 리간드와 접합된 핵산의 다양한 실시형태의 개략적인 표현을 나타낸 도면.
실시예
각각의 실시예에서 언급된 번호는 상기 실시예에 대해서 구체적이다.
실시예 1
본 명세서에서 기능성 실시예에 대해서 사용된 변형 및 접합된 siRNA 분자.
LPA -1038 유도체:
GalNAc-LPA-1038-L1
제1 가닥(서열번호 119, 서열번호 5에 기초함)
OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA 3'
제2 가닥(서열번호 120, 서열번호 6에 기초함)
5'[ST23 (ps)]3 긴 트레블러(long trebler)(ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3'
GalNAc-LPA-1038-L6
제1 가닥(서열번호 121, 서열번호 5에 기초함)
OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA 3'
제2 가닥(서열번호 122, 서열번호 6에 기초함)
5'[ST23 (ps)]3 ST43 (ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3'
FN(N=A, C, G, U)은 2'-플루오로, 2' 데옥시뉴클레오사이드를 나타낸다.
OMeN(N=A, C, G, U)은 2'-O-메틸 뉴클레오사이드를 나타낸다.
(ps)는 포스포로티오에이트 링키지를 나타낸다.
ST23 및 ST43는 하기와 같다.
추가 실시예는 LPA 1041 유도체이다:
GalNAc-LPA-1041-L1
제1 가닥(서열번호 123, 서열번호 9에 기초함)
5' OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeG 3'
제2 가닥(서열번호 124, 서열번호 10에 기초함)
5'[ST23 (ps)]3 긴 트레블러 (ps) FC-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3'
GalNAc-LPA-1041-L6
제1 가닥(서열번호 125, 서열번호 9에 기초함)
5' OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeG 3'
제2 가닥(서열번호 126, 서열번호 10에 기초함)
5'[ST23 (ps)]3 ST43 (ps) FC-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3'
FN(N=A, C, G, U)은 2'-플루오로, 2' 데옥시뉴클레오사이드를 나타낸다.
OMeN(N=A, C, G, U)은 2'-O-메틸 뉴클레오사이드를 나타낸다.
(ps)는 포스포로티오에이트 링키지를 나타낸다.
ST23 및 ST43는 하기와 같다.
ST23은 GalNac C4 포스포르아미다이트(하기와 같은 구조 성분)이다.
Figure 112020060356433-pct00075
ST41은 하기와 같다:
Figure 112020060356433-pct00076
ST43은 하기와 같고, WO2017/174657에 기재된 바와 같다:
Figure 112020060356433-pct00077
모든 올리고뉴클레오타이드는 상업적인 올리고뉴클레오타이드 제조사(바이오스프링사(Biospring)(독일 프랑크프루트 소재) 또는 리보바이오사(RiboBio)(중국 광동 광저우 소재))로부터 입수하였거나 또는 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 AKTA 올리고파일로트 합성기(인 하우스) 상에서 합성하였다. 상업적으로 입수 가능한 고체 지지체 및 2'-O-메틸 RNA 포스포르아미다이트, 2'플루오로 DNA 포스포르아미다이트(모두 표준 보호) 및 상업적으로 입수 가능한 긴 트레블러 포스포르아미다이트(글렌 리서치사(Glen research))를 사용하였다. 무수 아세토나이트릴 중의 포스포르아미다이트의 0.1M 용액을 사용하여 합성을 수행하였고, 벤질티오테트라졸(BTT)을 활성화제(아세토나이트릴 중의 0.3M)로서 사용하였다. 모든 다른 시약은 상업적으로 입수 가능한 표준 시약이었다.
각각의 GalNac 신톤(예를 들어, ST23, ST41 또는 ST43)의 접합은 표준 포스포르아미다이트 커플링 조건 하에서 올리고쇄의 5' 단부에 대한 각각의 포스포르아미다이트의 커플링에 의해서 달성하였다. 포스포로티오에이트를 표준 상업적으로 입수 가능한 티올화 시약(EDITH, 링크 테크놀로지즈사(Link technologies))을 사용하여 도입하였다.
단일 가닥을 메틸아민(40% 수성)을 사용하여 CPG에 의해서 절단하고, 생성된 조 올리고뉴클레오타이드를 염화나트륨 구배를 사용하여 AKTA Pure HPLC System 상의 이온 크로마토그래피(Resource Q, 6㎖, 지이 헬쓰케어사)에 의해서 정제시켰다. 생성물 함유 분획을 풀링시키고, 크기 배제 칼럼(Zetadex, 이엠피 바이오테크사) 상에서 탈염시키고, 동결건조시켰다.
어닐링을 위해서, 동일 몰량의 각각의 단일 가닥을 물 중에 용해시키고, 80℃까지 5분 동안 가열시켰다. RT까지 서서히 냉각시킨 후, 생성된 듀플렉스를 동결건조시켰다.
생성된 핵산(siRNA)의 서열을 하기 표 1에 제시한다.
Figure 112020060356433-pct00078
Figure 112020060356433-pct00079
Figure 112020060356433-pct00080
실시예 2
인간 RT-4 세포에서 LPA mRNA 발현의 저해에 대한 비-접합된 siRNA 분자(표 1)의 스크리닝.
리포솜 형질주입 복합체를 1.5㎕의 RNAiMax(써모피셔사(ThermoFisher))/80p㏖의 제시된 siRNA 분자의 비로 3회 반복물로 제조하였다. 복합체를 각각 2,5nM 및 25nM의 제시된 농도로 희석시켰다(값은 밝은 회색 막대 및 더 어두운 회색 막대로서 쌍으로 나타낸다). LPA를 내인적으로 발현하는 RT4 인간 방광 이행 세포 유두종 세포를 제시된 농도로 이미 플레이팅된 형질주입 복합체(역 형질주입)의 상부 상에 24-웰 포맷으로 웰당 125.000개 세포의 밀도로 시딩하였다. 형질주입 24시간 후 총 RNA를 Spin Cell Mini Kit 250(스트라테크사(Stratec))을 사용하여 단리시켰다. 하우스키핑 전사물로서의 각각의 샘플에서 PPIB mRNA 발현에 대해서 qRT-PCR에 의해서 LPA mRNA 수준을 결정하였다. 값을 미처리 세포(플레이트내)에서 검출된 LPA mRNA의 양에 대해서 값을 정규화시켰다. 비-침묵 siRNA 화합물을 추가 대조군으로서 형질주입시켰다. 정규화된 3회 반복 값의 평균 및 SD를 나타낸다. 결과를 도 1에 나타낸다.
실시예 3
인간 RT-4 세포에서 LPA mRNA 발현에 대한 비-접합된 LPA-표적화 siRNA 화합물의 용량 반응.
RT4 인간 방광 이행 세포 유두종 세포를 상기에 기재된 바와 같이 역으로 형질주입시키고(실시예 2), 표시된 바와 같은 상이한 -접합된 siRNA 화합물(표 1)로 제시된 농도(범위 100nM 내지 0.2nM)로 처리하였다. 형질주입 24시간 후 총 RNA를 Spin Cell Mini Kit 250(스트라테크사)을 사용하여 단리시켰다. 하우스키핑 전사물로서의 각각의 샘플에서 PPIB mRNA 발현에 대해서 qRT-PCR에 의해서 LPA mRNA 수준을 결정하였다. 값을 미처리 세포에서 검출된 LPA mRNA의 양에 대해서 값을 정규화시켰다. 막대는 각각의 데이터 지점에 대해서 남아있는 LPA mRNA 발현을 나타낸다. 결과를 도 2에 나타낸다.
실시예 4
수용체-매개된 흡수에 의해서 전달되는 상이한 용량의 GalNAc-L1 LPA-1038 접합된 siRNA 분자에 의한 인간 및 시노몰거스 1차 간세포에서의 LPA mRNA 발현의 저해.
1차 간세포(써모피셔사)를 콜라겐-코팅된 96-웰 플레이트 상에 웰당 45,000개 세포(시노몰거스) 및 웰당 30,000개 세포(인간)의 밀도로 플레이팅하였다. GalNAc-L1-접합된 LPA-1038을 제시된 농도(nM)로 플레이팅한 직후에 첨가하였다. siRNA 처리 24시간 후 전체 RNA를 InviTrap RNA 세포 HTS 96웰 키트(스트라테크사)를 사용하여 단리시켰다. 하우스키핑 전사물로서의 각각의 샘플에서 액틴(시노몰거스) 또는 APOB(인간) mRNA 수준에 대해서 qRT-PCR에 의해서 LPA mRNA 수준을 결정하였다. 값을 미처리 세포에서 LPA 발현에 대해서 값을 정규화시켰다. 남아있는 LPA mRNA 수준의 정규화된 3회 반복 값의 평균 및 SD를 흑색 막대로 나타낸다. 결과를 도 3에 나타낸다.
실시예 5
수용체-매개된 전달 시에 1차 인간 간세포에서 상이한 제시된 L6-GalNAc 접합된 siRNA에 의한 인간 1차 간세포에서의 LPA-mRNA의 넉다운
1차 인간 간세포(써모피셔사)를 콜라겐-코팅된 96-웰 플레이트 상에 웰(96웰 포맷)당 30,000개 세포로 플레이팅하였다. 비-침묵 대조군을 포함하는 GalNAc-L6-접합된 siRNA를 2개의 제시된 농도로 세포 플레이팅 직후에 첨가하였다. siRNA 처리 24시간 후 전체 RNA를 InviTrap RNA 세포 HTS 96웰 키트(스트라테크사)를 사용하여 단리시켰다. 하우스키핑 전사물로서의 APOB mRNA에 대해서 qRT-PCR에 의해서 LPA mRNA 발현 수준을 결정하였다. 값을 미처리 세포에서의 LPA mRNA 발현에 대해서 정규화시키고, 남아있는 LPA mRNA 수준을 막대로 나타내었다(100nM 흑색 막대, 20nM 회색 막대). 정규화된 3회 반복 값의 평균 및 SD를 도 5에 나타낸다.
실시예 6 - 접합체의 합성
실시예 화합물을 하기에 기재된 방법 및 당업자에게 공지된 방법에 따라서 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드 쇄 및 링커 빌딩 블록의 조립을 포스포르아미다이트 방법을 적용한 고체상 합성에 의해서 수행하였다. 필요한 수의 아미노 변형된 링커 빌딩 블록이 부착된 사전 조립되고 정제된 올리고뉴클레오타이드에 대한 GalNAc-카복실산 빌딩 블록의 펩타이드 결합 형성에 의해서 GalNAc 접합을 달성하였다.
올리고뉴클레오타이드 합성, 탈보호 및 정제는 당업계에 공지된 표준 절차에 따랐다.
모든 올리고뉴클레오타이드를 AKTA 올리고파일로트 합성기 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 합성하였다. 상업적으로 입수 가능한 고체 지지체 및 2'O-메틸 RNA 포스포르아미다이트, 2'플루오로, 2'데옥시 RNA 포스포르아미다이트(모두 표준 보호, 켐젠스사(ChemGenes), 링크테크사(LinkTech)) 및 상업적으로 입수 가능한 3'-아미노 변형제 TFA 아미노 C-6 lcaa CPG 500Å(켐젠스사)을 사용하였다. 사전 아세틸화된 갈락토스 아민 8은 상업적으로 입수 가능하다.
보조 시약을 이엠피 바이오테크사로부터 구매하였다. 무수 아세토나이트릴 중의 포스포르아미다이트의 0.1M 용액을 사용하여 합성을 수행하였고, 벤질티오테트라졸(BTT)을 활성화제(아세토나이트릴 중의 0.3M)로서 사용하였다. 커플링 시간은 15분이었다. Cap/OX/Cap 또는 Cap/Thio/Cap 사이클을 적용하였다(Cap: Ac2O/NMI/루티딘/아세토나이트릴, 산화제: 피리딘/H2O 중의 0.1M I2). 포스포로티오에이트를 표준 상업적으로 입수 가능한 티올화 시약(EDITH, 링크 테크놀로지즈사)을 사용하여 도입하였다. 톨루엔 중의 3% 다이클로로아세트산으로의 처리에 의해서 DMT 절단을 달성하였다. 프로그래밍된 합성 사이클의 완결 시에, 다이에틸아민(DEA) 세척을 수행하였다. 모든 올리고뉴클레오타이드를 DMT-오프 모드로 합성하였다.
염기-로딩된 (S)-DMT-세린올(TFA)-석신에이트-lcaa-CPG 10 또는 (S)-DMT-세린올(TFA) 포스포르아미다이트 7(합성을 문헌[Hoevelmann et al. (Chem. Sci., 2016, 7, 128-135)]에 기재된 바와 같이 수행하였음)을 사용함으로써 세린올-유래된 링커 모이어티의 부착을 달성하였다. 각각의 트레블러 아미다이트 유도체(C4XLT-phos), 그 다음 GalNAc 아미다이트(ST23-phos)의 연속적인 커플링에 의해서 삼안테나형 GalNAc 클러스터(ST23/C4XLT)를 도입하였다.
단일 가닥을 40% 수성 메틸아민 처리에 의해서 CPG를 절단하였다. 생성된 조 올리고뉴클레오타이드를 염화나트륨 구배를 사용하여 AKTA Pure HPLC System 상의 이온 크로마토그래피(Resource Q, 6㎖, 지이 헬쓰케어사)에 의해서 정제시켰다. 생성물 함유 분획을 풀링시키고, 크기 배제 칼럼(Zetadex, 이엠피 바이오테크사) 상에서 탈염시키고, 동결건조시켰다.
개별 단일 가닥을 H2O 중에 60OD/㎖의 농도로 용해시켰다. 개별 올리고뉴클레오타이드 용액 둘 다를 함께 반응 용기에 첨가하였다. 더 용이한 반응 모니터링을 위해서, 적정을 수행하였다. 제1 가닥을 260nm에서의 UV-흡수에 의해서 결정되는 경우 제2 가닥보다 25% 과량으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃까지 5분 동안 가열시키고, 이어서 RT까지 서서히 냉각시켰다. 이중 가닥 형성을 이온 짝지움 역상 HPLC에 의해서 모니터링하였다. 잔류하는 단일 가닥의 UV-면적으로부터 필요한 양의 제2 가닥을 계산하고, 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응을 80℃까지 다시 가열시키고, RT까지 서서히 냉각시켰다. 10% 미만의 잔류하는 단일 가닥이 검출될 때까지 이러한 절차를 반복하였다.
화합물 2 내지 10 의 합성
화합물 2 내지 5 및 (S)-DMT-세린올(TFA)-포스포르아미다이트 7을 문헌(Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135)에 공개된 방법에 따라서 합성하였다.
(S)-4-(3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)-2-(2,2,2-트라이플루오로아세트아미도)프로폭시)-4-옥소부탄산(6).
피리딘 중의 5의 용액에 석신산 무수물, 그 다음 DMAP를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC에 의해서 판단되는 바와 같이, 모든 출발 물질이 소모되었다. 반응을 농축시켰다. 조 물질을 DCM(+ 1% 트라이에틸아민) 중의 0%에서 5% 메탄올로의 구배를 사용한 실리카겔에서 크로마토그래피시켜 1.33g의 6(수율 = 38%)을 제공하였다. m/z (ESI-): 588.2 (100%), (C30H29F3NO8- [M-H]-에 대한 계산치 588.6). 1 H-NMR: (400 MHz, CDCl3)　δ　[ppm] = 7.94 (d, 1H, NH), 7.39 - 7.36 (m, 2H, CH아릴), 7.29 - 7.25 (m, 7H, CH아릴), 6.82-6.79 (m, 4H, CH아릴), 4.51 - 4.47 (m, 1H), 4.31 - 4.24 (m, 2H), 3.77 (s, 6H, 2xDMTr-OMe), 3.66 - 3.60 (m, 16H, HNEt3 +), 3.26 - 3.25 (m, 2H), 2.97 - 2.81 (m, 20H, NEt3), 2.50-2.41 (4H, m), 1.48 - 1.45 (m, 26H, HNEt3 +), 1.24 - 1.18 (m, 29H, NEt3).
(S)-DMT-세린올(TFA)-석신에이트-lcaa-CPG(10)
(S)-DMT-세린올(TFA)-석신에이트(159㎎, 270u㏖) 및 HBTU(113㎎, 299u㏖)를 CH3CN(10㎖) 중에 용해시켰다. 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 94㎕, 540u㏖)을 용액에 첨가하였고, 혼합물을 2분 동안 스월링(swirling)시키고, 그 다음 네이티브 아미노-lcaa-CPG(500A, 3g, 아민 함량: 136u㏖/g)를 첨가하였다. 현탁액을 리스트-액션 진탕기 상에서 실온에서 16시간 동안 약하게 진탕하고, 이어서 여과시키고, DCM 및 EtOH로 세척하였다. 고체 지지체를 진공 하에서 2시간 동안 건조시켰다. 실온에서 아세트산 무수물/루티딘/N-메틸이미다졸과 교반함으로써 지지체 상의 미반응 아민을 캡핑시켰다. 지지체의 세척을 상기와 같이 반복하였다. 고체를 진공 하에서 건조시켜 고체 지지체 10(3g, 26u㏖/g 로딩)을 산출하였다.
GalNAc 신톤(9)
GalNAc 신톤 9의 합성을 문헌[Nair et al. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), pp 16958-16961]에 기재된 바와 같이 수행하여, 2단계에 걸쳐서 46% 수율로 얻었다.
특징적인 데이터는 공개된 데이터와 일치하였다.
올리고뉴클레오타이드의 합성
모든 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 상기 및 도 13 및 도 14에 기재된 반응 조건에 따라서 합성하였다.
모든 최종 단일 가닥 생성물을 AEX-HPLC에 의해서 분석하여 순도를 증명한다. 순도는 FLP%(전장 생성물 %) 단위로 제공되는데, 이것은 최종 생성물의 AEX-HPLC 분석의 UV-트레이스에서의 배정된 생성물 신호 하의 UV-면적의 백분율이다. 각각의 단일 가닥 생성물(비-변형된, 아미노-변형된 전구체 또는 GalNAc 접합된 올리고뉴클레오타이드)의 아이덴티티는 LC-MS 분석에 의해서 증명하였다.
Figure 112020060356433-pct00081
5'1×NH2는 접합에 사용 가능한 유리 세린올 유래된 아미노기의 위치(5' 단부) 및 수(1×NH2)를 지칭하는 의미이다. 예를 들어, A0264 상의 1x3'NH2는 가닥 A0264의 3' 단부에서 GalNAc 신톤 9와 반응할 수 있는 유리 아미노기가 존재한다는 것을 의미한다. 3'5'1xNH2는 가닥의 3' 단부 및 5' 단부에서 GalNAc 링커 9와 반응할 수 있는 하나의 세린올-유래된 유리 아미노기가 존재한다는 것을 의미한다.
접합체 1 내지 3 및 참조 접합체 1 내지 2의 합성
접합체 1 내지 2 및 참조 접합체 1 내지 2에 대한 접합된 단일 가닥
펩타이드 커플링 시약을 사용하여 각각의 올리고뉴클레오타이드 가닥 11의 세린올-아미노 작용기에 커플링시킴으로써 GalNAc 신톤(9)의 접합을 달성하였다. 따라서, 각각의 아미노-변형된 전구체 분자 11을 H2O(500OD/㎖) 중에 용해시키고, DMSO(DMSO/H2O, 2/1, v/v)를 첨가하고, 그 다음 DIPEA(총 부피의 2.5%)를 첨가하였다. 별개의 반응 용기에서, 2eq.(아미노-변형된 전구체 올리고뉴클레오타이드 11 내의 아미노 작용기당)의 카복실산 성분을 2eq.의 HBTU와 8eq.의 DIPEA의 존재 하에서, DMSO 중에서 반응시킴으로써 GalN(Ac4)-C4-산(9)의 사전 활성화를 수행하였다. 2분 후, 사전 활성화된 화합물 9를 각각의 아미노-변형된 전구체 분자의 용액에 첨가하였다. 30분 후, 반응 과정을 LCMS 또는 AEX-HPLC에 의해서 모니터링하였다. 접합 반응의 완결 후, 10× iPrOH 및 0.1× 2M NaCl을 첨가함으로써 조 생성물을 침전시키고, 원심분리 경사분리에 의해서 수거하였다. GalNAc 모이어티 내의 아세틸화된 하이드록실기를 유리시키기 위해서, 생성된 펠릿을 40% MeNH2(500OD당 1㎖) 중에 용해시키고, RT에서 15분 후 H2O(1:10) 중에 용해시키고, 마지막으로 음이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 다시 정제시키고, 동결건조시켜 최종 생성물 12를 수득하였다.
Figure 112020060356433-pct00082
이중 가닥 형성
이중 가닥 형성을 상기에 기재된 방법에 따라서 수행하였다.
이중 가닥 순도는 이중 가닥 %로 제공되는데, 이것은 IP-RP-HPLC 분석의 UV-트레이스에서의 배정된 생성물 신호 하의 UV-면적의 백분율이다.
Figure 112020060356433-pct00083
서열
하기 서열에 대한 주요 변형:
f는 2'플루오로 2'데옥시리보뉴클레오타이드 또는 2'-플루오로 리보뉴클레오타이드(이 용어들은 상호 교환 가능함)를 나타내고,
m은 2'O 메틸 리보뉴클레오타이드를 나타내고,
(ps)는 포스포로티오에이트 링키지를 나타내고,
Ser(GN)은 세린올 유래된 링커 모이어티에 부착된 GalNAc-C4 빌딩 블록이다:
Figure 112020060356433-pct00084
여기서 O---는 산소 원자와 예를 들어, H, 포스포르다이에스터 링키지 또는 포스포로티오에이트 링키지 간의 링키지이다.
C4XLT는
Figure 112020060356433-pct00085
이고:
ST23은
Figure 112020060356433-pct00086
이고:
C4XLT(C4XLT-phos)뿐만 아니라 ST23(ST23-phos)의 포스포르아미다이트 유도체의 합성을 WO2017/174657에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.
C4XLT-phos:
Figure 112020060356433-pct00087
ST23-phos:
Figure 112020060356433-pct00088
접합체 1
안티센스 가닥 - STS16001AL33(서열번호 127)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3'
센스 가닥 - STS16001BL20(서열번호 128)
5' Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA 3'
접합체 2
안티센스 가닥 - STS16001A(서열번호 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
센스 가닥 - STS16001BV1L42(서열번호 130)
Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN)
접합체 3
안티센스 가닥 - STS16001AL33(서열번호 127)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3'
센스 가닥 - STS16001BV1L42(서열번호 130)
5' Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) 3'
참조 접합체 1
안티센스 가닥 - STS16001A(서열번호 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
센스 가닥 - STS16001BL20(서열번호 128)
Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
참조 접합체 2
안티센스 가닥 - STS16001AL33(서열번호 127)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN)
센스 가닥 - STS16001V1B(서열번호 131)
fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
참조 접합체 3
안티센스 가닥 - STS18001A(A0130; 서열번호 132)
mU (ps) fC (ps) mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA (ps) fC (ps) mG
센스 가닥 - STS18001BL4(A0131, 서열번호 133)
[(ST23) (ps)]3 C4XLT (ps) fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC (ps) mG (ps) fA
참조 접합체 4
안티센스 가닥 - STS16001AL33(서열번호 127)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
센스 가닥 - STS16001BL4(서열번호 134)
5'[(ST23) (ps)]3 C4XLT(ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
실시예 7 - 다양한 TTR siRNA GalNAc 접합체의 TTR 넉다운의 시험관내 결정
뮤린 1차 간세포를 콜라겐 사전 코팅된 96웰 플레이트(써모 피셔 사이언티픽사(Thermo Fisher Scientific), #A1142803) 내에 웰당 30,000개 세포의 세포 밀도로 시딩하고, 10nM 내지 0.0001nM의 범위의 농도의 siRNA-접합체로 처리하였다. 처리 24시간 후, 세포를 용해시키고, 제조사 프로토콜에 따라서 InviTrap(등록상표) RNA 세포 HTS 96 Kit/C24×96 프렙(스트라테크사 #7061300400)으로 RNA를 추출하였다. TTR 및 하우스키핑 mRNA(PtenII)의 전사물 수준을 TaqMan 분석에 의해서 정량하였다.
본 발명의 접합체, 접합체 1 내지 3으로의 처리 24시간 후 1차 뮤린 간세포에서의 표적 유전자 발현은, 도 15에 나타낸 바와 같이 음성 대조군에 비해서 접합체의 용량이 증가함에 따라서 표적 유전자 발현이 감소됨을 나타내었다(UT" 칼럼 및 참조 접합체 3 참고). 이는, 제1 가닥이 표적 유전자에 결합하고, 따라서 유전자 발현을 감소시킴을 나타낸다. 도 15는 또한 비교 접합체로서 작용하는 참조 접합체 1 및 2의 표적 유전자 발현 수준을 나타낸다. 도 15A 및 도 15C와 도 15B 및 도 15C에 제시된 데이터 간의 비교로부터 인지될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 접합체(접합체 1 내지 3)는 참조 접합체 1 및 2에 비해서 표적 유전자 발현을 감소시킨다. 0.01nM에서 가장 효과적인 접합체는 접합체 2인 것으로 보인다. 0.1nM, 0.5nM, 1nM 및 10nM에서 가장 효과적인 접합체는 접합체 3인 것으로 보인다.
실시예 8 - 마우스에서 혈청 TTR의 생체내 시간 경과
C57BL/6 마우스를 0일에 1㎎/㎏ siRNA-접합체로 s.c. 처리하였다. 혈청 샘플을 안구 비동 출혈(orbital sinus bleeding)에 의해서 7, 14 및 27일에 취하고, 분석 시까지 -20℃에서 저장하였다. 제조사 프로토콜(샘플 희석 1:8000 또는 1:800)에 따라서 Mouse Prealbumin ELISA(ALPCO, 41-PALMS/로트 22, 2008003B)를 사용하여 혈청 TTR 정량을 수행하였다.
1㎎/㎏의 접합체 1 내지 3, 참조 접합체 1, 2 및 4 및 모의 처리(PBS)로의 s.c. 처리 7, 14, 및 27일 후에 개체에서 n=4의 c57BL/6 마우스 코호트에서의 혈청 TTR의 시간 경과의 결과를 도 16에 나타낸다. 도 16에서의 데이터에 제시된 바와 같이, 본 발명의 접합체는 음성 대조군(PBS) 및 참조 접합체 1, 2, 특히 참조 접합체 4에 비해서 표적 유전자 발현의 감소에 특히 효과적이다. 접합체 2 및 3은 또한 참조 접합체 1, 2 및 4보다 더 효과적이다. 가장 효과적인 접합체는 접합체 2이다. 따라서, 참조 접합체 4와 비교할 때, 동일한 초기 넉 다운을 달성하기 위해서 접합체 3의 투여 수준은 약 3배 더 낮을 것이고, 또한 더 긴 기간의 넉 다운을 초래할 것이라고 예측될 수 있다.
실시예 9 - 접합체 2의 합성
예시적인 화합물을 하기에 기재된 방법 및 당업자에게 공지된 방법에 따라서 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드 쇄 및 링커 빌딩 블록의 조립을 포스포르아미다이트 방법을 적용한 고체상 합성에 의해서 수행하였다. 필요한 수의 아미노 변형된 링커 빌딩 블록이 부착된 사전 조립되고 정제된 올리고뉴클레오타이드에 대한 GalNAc-카복실산 빌딩 블록의 펩타이드 결합 형성에 의해서 GalNAc 접합을 달성하였다.
올리고뉴클레오타이드 합성, 탈보호 및 정제는 당업계에 공지된 표준 절차에 따랐다.
모든 올리고뉴클레오타이드를 AKTA 올리고파일로트 합성기 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 합성하였다. 상업적으로 입수 가능한 고체 지지체 및 2'O-메틸 RNA 포스포르아미다이트, 2'플루오로, 2'데옥시 RNA 포스포르아미다이트(모두 표준 보호, 켐젠스사, 링크테크사) 및 상업적으로 입수 가능한 3'-아미노 변형제 TFA 아미노 C-6 lcaa CPG 500Å(켐젠스사)을 사용하였다. 사전 아세틸화된 갈락토스 아민 8은 상업적으로 입수 가능하다.
보조 시약을 이엠피 바이오테크사로부터 구매하였다. 무수 아세토나이트릴 중의 포스포르아미다이트의 0.1M 용액을 사용하여 합성을 수행하였고, 벤질티오테트라졸(BTT)을 활성화제(아세토나이트릴 중의 0.3M)로서 사용하였다. 커플링 시간은 15분이었다. Cap/OX/Cap 또는 Cap/Thio/Cap 사이클을 적용하였다(Cap: Ac2O/NMI/루티딘/아세토나이트릴, 산화제: 피리딘/H2O 중의 0.1M I2). 포스포로티오에이트를 표준 상업적으로 입수 가능한 티올화 시약(EDITH, 링크 테크놀로지즈사)을 사용하여 도입하였다. 톨루엔 중의 3% 다이클로로아세트산으로의 처리에 의해서 DMT 절단을 달성하였다. 프로그래밍된 합성 사이클의 완결 시에, 다이에틸아민(DEA) 세척을 수행하였다. 모든 올리고뉴클레오타이드를 DMT-오프 모드로 합성하였다.
염기-로딩된 (S)-DMT-세린올(TFA)-석신에이트-lcaa-CPG 10 또는 (S)-DMT-세린올(TFA) 포스포르아미다이트 7(합성을 문헌[Hoevelmann et al. (Chem. Sci., 2016. 7, 128-135)]에 기재된 바와 같이 수행하였음)을 사용함으로써 세린올-유래된 링커 모이어티의 부착을 달성하였다. 각각의 트레블러 아미다이트 유도체(C4XLT-phos 또는 C6XLT-phos), 그 다음 GalNAc 아미다이트(ST23-phos)의 연속적인 커플링에 의해서 삼안테나형 GalNAc 클러스터(ST23/C4XLT 또는 ST23/C6XLT)를 도입하였다.
단일 가닥을 40% 수성 메틸아민 처리에 의해서 CPG를 절단하였다. 생성된 조 올리고뉴클레오타이드를 염화나트륨 구배를 사용하여 AKTA Pure HPLC System 상의 이온 크로마토그래피(Resource Q, 6㎖, 지이 헬쓰케어사)에 의해서 정제시켰다. 생성물 함유 분획을 풀링시키고, 크기 배제 칼럼(Zetadex, 이엠피 바이오테크사) 상에서 탈염시키고, 동결건조시켰다.
개별 단일 가닥을 H2O 중에 60OD/㎖의 농도로 용해시켰다. 개별 올리고뉴클레오타이드 용액 둘 다를 함께 반응 용기에 첨가하였다. 더 용이한 반응 모니터링을 위해서, 적정을 수행하였다. 제1 가닥을 260nm에서의 UV-흡수에 의해서 결정되는 경우 제2 가닥보다 25% 과량으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃까지 5분 동안 가열시키고, 이어서 RT까지 서서히 냉각시켰다. 이중 가닥 형성을 이온 짝지움 역상 HPLC에 의해서 모니터링하였다. 잔류하는 단일 가닥의 UV-면적으로부터 필요한 양의 제2 가닥을 계산하고, 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응을 80℃까지 다시 가열시키고, RT까지 서서히 냉각시켰다. 10% 미만의 잔류하는 단일 가닥이 검출될 때까지 이러한 절차를 반복하였다.
화합물 2 내지 10 의 합성
화합물 2 내지 5 및 (S)-DMT-세린올(TFA)-포스포르아미다이트 7을 문헌(Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135)에 공개된 방법에 따라서 합성하였다.
(S)-4-(3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)-2-(2,2,2-트라이플루오로아세트아미도)프로폭시)-4-옥소부탄산(6).
피리딘 중의 5의 용액에 석신산 무수물, 그 다음 DMAP를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC에 의해서 판단되는 바와 같이, 모든 출발 물질이 소모되었다. 반응을 농축시켰다. 조 물질을 DCM(+ 1% 트라이에틸아민) 중의 0%에서 5% 메탄올로의 구배를 사용한 실리카겔에서 크로마토그래시켜 1.33g의 6(수율 = 38%)을 제공하였다. m/z (ESI-): 588.2 (100%), (C30H29F3NO8- [M-H]-에 대한 계산치 588.6). 1 H-NMR: (400 MHz, CDCl3)　δ　[ppm] = 7.94 (d, 1H, NH), 7.39 - 7.36 (m, 2H, CH아릴), 7.29 - 7.25 (m, 7H, CH아릴), 6.82-6.79 (m, 4H, CH아릴), 4.51 - 4.47 (m, 1H), 4.31 - 4.24 (m, 2H), 3.77 (s, 6H, 2xDMTr-OMe), 3.66 - 3.60 (m, 16H, HNEt3 +), 3.26 - 3.25 (m, 2H), 2.97 - 2.81 (m, 20H, NEt3), 2.50-2.41 (4H, m), 1.48 - 1.45 (m, 26H, HNEt3 +), 1.24 - 1.18 (m, 29H, NEt3).
(S)-DMT-세린올(TFA)-석신에이트-lcaa-CPG(10)
(S)-DMT-세린올(TFA)-석신에이트(159㎎, 270u㏖) 및 HBTU(113㎎, 299u㏖)를 CH3CN(10㎖) 중에 용해시켰다. 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 94㎕, 540u㏖)을 용액에 첨가하였고, 혼합물을 2분 동안 스월링시키고, 그 다음 네이티브 아미노-lcaa-CPG(500A, 3g, 아민 함량: 136u㏖/g)를 첨가하였다. 현탁액을 리스트-액션 진탕기 상에서 실온에서 16시간 동안 약하게 진탕하고, 이어서 여과시키고, DCM 및 EtOH로 세척하였다. 고체 지지체를 진공 하에서 2시간 동안 건조시켰다. 실온에서 아세트산 무수물/루티딘/N-메틸이미다졸과 교반함으로써 지지체 상의 미반응 아민을 캡핑시켰다. 지지체의 세척을 상기와 같이 반복하였다. 고체를 진공 하에서 건조시켜 고체 지지체 10(3g, 26u㏖/g 로딩)을 산출하였다.
GalNAc 신톤(9)
GalNAc 신톤 9의 합성을 문헌[Nair et al. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), pp 16958-16961]에 기재된 바와 같이 수행하여, 2단계에 걸쳐서 46% 수율로 얻었다.
특징적인 데이터는 공개된 데이터와 일치하였다.
올리고뉴클레오타이드의 합성
모든 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 상기 및 도 13 및 도 14에 기재된 반응 조건에 따라서 합성하였다.
모든 최종 단일 가닥 생성물을 AEX-HPLC에 의해서 분석하여 순도를 증명한다. 순도는 FLP%(전장 생성물 %) 단위로 제공되는데, 이것은 최종 생성물의 AEX-HPLC 분석의 UV-트레이스에서의 배정된 생성물 신호 하의 UV-면적의 백분율이다. 각각의 단일 가닥 생성물(비-변형된, 아미노-변형된 전구체, C4XLT/ST23 또는 C6XLT/ST23 GalNAc 접합된 올리고뉴클레오타이드)의 아이덴티티는 LC-MS 분석에 의해서 증명하였다.
Figure 112020060356433-pct00089
접합체 1 내지 3 및 참조 접합체 1 내지 2의 합성
접합체 1 내지 2 및 참조 접합체 1 내지 2에 대한 접합된 단일 가닥
펩타이드 커플링 시약을 사용하여 각각의 올리고뉴클레오타이드 가닥 11의 세린올-아미노 작용기에 커플링시킴으로써 GalNAc 신톤(9)의 접합을 달성하였다. 따라서, 각각의 아미노-변형된 전구체 분자 11을 H2O(500OD/㎖) 중에 용해시키고, DMSO(DMSO/H2O, 2/1, v/v)를 첨가하고, 그 다음 DIPEA(총 부피의 2.5%)를 첨가하였다. 별개의 반응 용기에서, 2eq.(아미노-변형된 전구체 올리고뉴클레오타이드 11 내의 아미노 작용기당)의 카복실산 성분을 2eq.의 HBTU와 8eq.의 DIPEA의 존재 하에서, DMSO 중에서 반응시킴으로써 GalN(Ac4)-C4-산(9)의 사전 활성화를 수행하였다. 2분 후, 사전 활성화된 화합물 9를 각각의 아미노-변형된 전구체 분자의 용액에 첨가하였다. 30분 후, 반응 과정을 LCMS 또는 AEX-HPLC에 의해서 모니터링하였다. 접합 반응의 완결 후, 10× iPrOH 및 0.1× 2M NaCl을 첨가함으로써 조 생성물을 침전시키고, 원심분리 경사분리에 의해서 수거하였다. GalNAc 모이어티 내의 아세틸화된 하이드록실기를 유리시키기 위해서, 생성된 펠릿을 40% MeNH2(500OD당 1㎖) 중에 용해시키고, RT에서 15분 후 H2O(1:10) 중에 용해시키고, 마지막으로 음이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 다시 정제시키고, 동결건조시켜 최종 생성물 12를 수득하였다.
Figure 112020060356433-pct00090
이중 가닥 형성
이중 가닥 형성을 상기에 기재된 방법에 따라서 수행하였다.
이중 가닥 순도는 이중 가닥 %로 제공되는데, 이것은 IP-RP-HPLC 분석의 UV-트레이스에서의 배정된 생성물 신호 하의 UV-면적의 백분율이다.
Figure 112020060356433-pct00091
서열
하기 서열에 대한 주요 변형:
f는 2'플루오로 2'데옥시리보뉴클레오타이드 또는 2'-플루오로 리보뉴클레오타이드(이 용어들은 상호 교환 가능함)를 나타내고,
m은 2'O 메틸 리보뉴클레오타이드를 나타내고,
(ps)는 포스포로티오에이트 링키지를 나타내고,
Ser(GN)은 세린올 유래된 링커 모이어티에 부착된 GalNAc-C4 빌딩 블록이다:
Figure 112020060356433-pct00092
여기서 O---는 산소 원자와 예를 들어, H, 포스포르다이에스터 링키지 또는 포스포로티오에이트 링키지 간의 링키지이다.
C4XLT는
Figure 112020060356433-pct00093
이다.
C6XLT는
Figure 112020060356433-pct00094
이다.
ST23은
Figure 112020060356433-pct00095
이다.
C4XLT(C4XLT-phos), C6XLT (C6XLT-phos)뿐만 아니라 ST23(ST23-phos)의 포스포르아미다이트 유도체의 합성을 WO2017/174657에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.
C4XLT-phos:
Figure 112020060356433-pct00096
C6XLT-phos:
Figure 112020060356433-pct00097
ST23-phos:
Figure 112020060356433-pct00098
실시예 10
1차 시노몰거스 간세포에서의 5' 제2 가닥에서의 삼안테나형 GalNAc 단위와 비교할 때 제2 가닥에 접합된 2개의 단일 GalNAc 단위를 갖는 LPA 표적화 siRNA에 대한 넉다운의 동일한 용량 반응.
siRNA는 교번하는 2'-OMe/2'-F로 변형되고, 이것은 각각 5' 및 3' 말단의 2개의 인터뉴클레오타이드 링키지에서 2개의 포스포로티오에이트(PS) 인터뉴클레오타이드 링키지를 함유한다. 접합체 19에서 하나의 세린올-GalNAc 단위 각각은 PS-결합을 통해서 제2 가닥의 5' 및 3'에 부착된다. 접합체 20에서 제2 가닥의 2개의 말단 5' 인터뉴클레오타이드는 포스포다이에스터이고, 삼안테나형 GalNAc 링커는 PS 결합을 통해서 이러한 단부에 부착된다.
100, 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032 및 0.006nM의 siRNA로의 처리 24시간 후에 1차 시노몰거스 간세포에서 LPA 넉다운의 용량 반응을 평가하였다. 참조 대조군은 작제물 2이고, 비-표적화 대조군은 Cte라고 명명된다. 각각의 처리군에 대한 전사물 ct-값을 하우스 키핑 유전자 ACTB에 대한 전사물 ct 값(△ct) 및 ut라고 명명된 미처리 간세포(△△ct)에 대해서 정규화시켰다.
데이터를 도 18에 나타낸다.
Figure 112020060356433-pct00099
설명
mA, mU, mC, mG 2'-O-메틸 RNA
fA, fU, fC, fG 2'-데옥시-2'-플루오로 RNA
(ps) 포스포로티오에이트
(po) 포스포다이에스터
프라이머:
Figure 112020060356433-pct00100
일반적인 방법
시험관내 실험
1차 뮤린 간세포(써모 사이언티픽사: GIBCO 로트: #MC798)를 냉동하고, 저온 보존 배지를 5% FBS, 1μM 덱사메타손, 2mM GlutaMax, 1% PenStrep, 4㎎/㎖ 인간 재조합 인슐린, 15mM Hepes가 보충된 Williams E 배지로 교환하였다. 세포 밀도를 1㎖당 250000개 세포로 조정하였다. 웰당 100㎕의 이러한 세포 현탁액을 콜라겐 사전 코팅된 96웰 플레이트에 시딩하였다. 시험 물품을 각각의 농도에 대해서 동일한 배지(5회 농축됨) 중에 미리 희석시키고, 25㎕의 이러한 미리 희석된 siRNA 또는 배지 단독을 세포에 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 처리 24시간 후, 상청액을 버리고, 세포를 차가운 PBS 중에서 세척하고, 250㎕의 RNA- Lysis Buffer S(스트라테크사)를 첨가하였다. 실온에서 15분 인큐베이션 후, 플레이트를 제조사 프로토콜에 따라서 RNA 단리 시까지 -80℃에서 저장하였다.
TaqMan 분석
mTTR & PTEN MultiPlex TaqMan 분석을 위해서, 각각의 처리군에 대한 10㎕의 단리된 RNA를 600nM의 mTTR-프라이머, 400nM의 ApoB-프라이머 및 200nM의 각각의 프로브뿐만 아니라 0.2단위의 RNAse 저해제를 함유한 0.5단위의 Euroscript II RT 폴리머라제를 함유한 PCR 마스터믹스(TAKYON low Rox) 10㎕와 혼합하였다. 384-웰 플레이트에서 48℃에서 10분 RT 단계, 95℃에서 3분 초기 변성 및 10초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃의 40 사이클로 TaqMan 분석을 수행하였다. 프라이머는 서열의 각각의 단부에서 하나씩 BHQ1, FAM 및 YY 중 2개를 함유한다.
TMPRSS6 & ApoB MultiPlex TaqMan 분석을 위해서, 각각의 처리군에 대한 10㎕의 단리된 RNA를 800nM TMPRSS6 프라이머, 100nM의 ApoB 프라이머 및 200nM의 어느 하나의 프로브뿐만 아니라 0.2단위의 RNAse 저해제를 함유한 0.5단위의 Euroscript II RT 폴리머라제를 함유한 PCR 마스터믹스(TAKYON low Rox) 10㎕와 혼합하였다. 384-웰 플레이트에서 48℃에서 10분 RT 단계, 95℃에서 3분 초기 변성 및 10초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃의 40 사이클로 TaqMan 분석을 수행하였다.
생체내 실험
상이한 siRNA 접합체의 생체내 효력을 비교하기 위해서, PBS 중에 용해된 1㎎/㎏의 siRNA를 c57BL/6 마우스의 견갑골 영역에 피하로 주사하였다. n=6의 코호트를 1일에 siRNA 표적화 Aldh2 또는 Tmprss6으로 처리하고, 처리 후 선택된 시간 지점에 희생시켰다. 간 샘플을 액체 질소에서 스냅 동결시키고, 제조사 메뉴얼에 따라서 InviTrap Spin Tissue RNA Mini Kit(스트라테크사)로 RNA를 추출할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 그 다음, Aldh2, Tmprss6 및 Pten의 전사물 수준을 상기에 기재된 바와 같이 정량하였다.
트라이토솜 안정성 검정
시험관내에서 간 세포의 엔도솜/라이소솜 컴파트먼트에서의 RNAase 안정성에 대해서 프로빙하기 위해서, siRNA를 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트 간 트라이토솜(Tebu- Bio, CatN.: R0610.LT, 로트: 1610405, pH: 7.4, 2.827단위/㎖)에서 0시간, 4시간, 24시간 또는 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 산성 환경을 모방하기 위해서, 트라이토솜을 낮은 pH 완충제(1.5M 아세트산, 1.5M 아세트산나트륨 pH 4.75)와 1:10으로 혼합하였다. 30㎕의 이러한 산성화된 트라이토솜. 그 다음 10㎕의 siRNA(20μM)를 혼합하고, 37℃에서 제시된 시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, RNA를 생물학적 유체에 대한 제조사 프로토콜에 따라서 Clarity OTX Starter Kit-Cartriges(페노메넥스사(Phenomenex) 카탈로그 번호: KSO-8494)로 단리시켰다. 동결건조된 RNA를 30㎕의 H2O 중에서 재구성하고, 4×로딩 완충제와 혼합하고, 분리 정량 반-정량 분석을 위해서 5㎕를 20% TBE-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE) 상에 로딩하였다. PAGE를 120V에서 2시간 동안 전개시키고, RNA를 에티덤-브로마이드 염색에 의해서 가시화하고, 그 다음 Biorad Imaging system으로 디지털 영상화하였다.
실시예 11 - 접합체 3의 합성
예시적인 화합물을 하기에 기재된 방법 및 당업자에게 공지된 방법에 따라서 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드 쇄 및 링커 빌딩 블록의 조립을 포스포르아미다이트 방법을 적용한 고체상 합성에 의해서 수행하였다. 필요한 수의 아미노 변형된 링커 빌딩 블록이 부착된 사전 조립되고 정제된 올리고뉴클레오타이드에 대한 GalNAc-카복실산 빌딩 블록의 펩타이드 결합 형성에 의해서 GalNAc 접합을 달성하였다.
올리고뉴클레오타이드 합성, 탈보호 및 정제는 당업계에 공지된 표준 절차에 따랐다.
모든 올리고뉴클레오타이드를 AKTA 올리고파일로트 합성기 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 합성하였다. 상업적으로 입수 가능한 고체 지지체 및 2'O-메틸 RNA 포스포르아미다이트, 2'플루오로, 2'데옥시 RNA 포스포르아미다이트(모두 표준 보호, 켐젠스사, 링크테크사) 및 상업적으로 입수 가능한 3'-아미노 변형제 TFA 아미노 C-6 lcaa CPG 500Å(켐젠스사), Fmoc-아미노-DMT C-7 CE 포스포르아미다이트(GlyC3Am), 3'-아미노 변형제 C-3 lcaa CPG 500Å(C3Am), Fmoc-아미노-DMT C-3 CED 포스포르아미다이트(C3Am) 및 TFA-아미노 C-6 CED 포스포르아미다이트(C6Am)(켐젠스사), 3'-아미노-변형제 C7 CPG(C7Am)(글렌 리서치사), 비-뉴클레오사이드 TFA 아미노 포스포르아미다이트(Pip), 비-뉴클레오사이드 TFA 아미노 고체 지지체(PipAm)(에이엠 케미컬즈사(AM Chemicals))를 사용하였다. 사전 아세틸화된 갈락토스 아민 8은 상업적으로 입수 가능하다.
보조 시약을 이엠피 바이오테크사로부터 구매하였다. 무수 아세토나이트릴 중의 포스포르아미다이트의 0.1M 용액을 사용하여 합성을 수행하였고, 벤질티오테트라졸(BTT)을 활성화제(아세토나이트릴 중의 0.3M)로서 사용하였다. 커플링 시간은 15분이었다. Cap/OX/Cap 또는 Cap/Thio/Cap 사이클을 적용하였다(Cap: Ac2O/NMI/루티딘/아세토나이트릴, 산화제: 피리딘/H2O 중의 0.1M I2). 포스포로티오에이트를 표준 상업적으로 입수 가능한 티올화 시약(EDITH, 링크 테크놀로지즈사)을 사용하여 도입하였다. 톨루엔 중의 3% 다이클로로아세트산으로의 처리에 의해서 DMT 절단을 달성하였다. 프로그래밍된 합성 사이클의 완결 시에, 다이에틸아민(DEA) 세척을 수행하였다. 모든 올리고뉴클레오타이드를 DMT-오프 모드로 합성하였다.
염기-로딩된 (S)-DMT-세린올(TFA)-석신에이트-lcaa-CPG 10 또는 (S)-DMT-세린올(TFA) 포스포르아미다이트 7(합성을 문헌[Hoevelmann et al. (2016)]에 기재된 바와 같이 수행하였음)을 사용함으로써 세린올-유래된 링커 모이어티의 부착을 달성하였다. 각각의 트레블러 아미다이트 유도체(C4XLT-phos), 그 다음 GalNAc 아미다이트(ST23-phos)의 연속적인 커플링에 의해서 삼안테나형 GalNAc 클러스터(ST23/C4XLT)를 도입하였다.
각각의 상업적으로 입수 가능한 아미노 변형된 빌딩 블록 CPG 또는 아미다이트의 사용에 의해서 아미노 변형된 모이어티(비-세린올-유래된 링커)의 부착을 달성하였다.
단일 가닥을 40% 수성 메틸아민 처리에 의해서 CPG를 절단하였다. 생성된 조 올리고뉴클레오타이드를 염화나트륨 구배를 사용하여 AKTA Pure HPLC System 상의 이온 크로마토그래피(Resource Q, 6㎖, 지이 헬쓰케어사)에 의해서 정제시켰다. 생성물 함유 분획을 풀링시키고, 크기 배제 칼럼(Zetadex, 이엠피 바이오테크사) 상에서 탈염시키고, 동결건조시켰다.
개별 단일 가닥을 H2O 중에 60OD/㎖의 농도로 용해시켰다. 개별 올리고뉴클레오타이드 용액 둘 다를 함께 반응 용기에 첨가하였다. 더 용이한 반응 모니터링을 위해서, 적정을 수행하였다. 제1 가닥을 260nm에서의 UV-흡수에 의해서 결정되는 경우 제2 가닥보다 25% 과량으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃까지 5분 동안 가열시키고, 이어서 RT까지 서서히 냉각시켰다. 이중 가닥 형성을 이온 짝지움 역상 HPLC에 의해서 모니터링하였다. 잔류하는 단일 가닥의 UV-면적으로부터 필요한 양의 제2 가닥을 계산하고, 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응을 80℃까지 다시 가열시키고, RT까지 서서히 냉각시켰다. 10% 미만의 잔류하는 단일 가닥이 검출될 때까지 이러한 절차를 반복하였다.
화합물 2 내지 10 의 합성
화합물 2 내지 5 및 (S)-DMT-세린올(TFA)-포스포르아미다이트 7을 문헌(Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135)에 공개된 방법에 따라서 합성하였다.
(S)-4-(3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)-2-(2,2,2-트라이플루오로아세트아미도)프로폭시)-4-옥소부탄산(6).
피리딘 중의 5의 용액에 석신산 무수물, 그 다음 DMAP를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC에 의해서 판단되는 바와 같이, 모든 출발 물질이 소모되었다. 반응을 농축시켰다. 조 물질을 DCM(+ 1% 트라이에틸아민) 중의 0%에서 5% 메탄올로의 구배를 사용한 실리카겔에서 크로마토그래시켜 1.33g의 6(수율 = 38%)을 제공하였다. m/z (ESI-): 588.2 (100%), (C30H29F3NO8- [M-H]-에 대한 계산치 588.6). 1 H-NMR: (400 MHz, CDCl3)　δ　[ppm] = 7.94 (d, 1H, NH), 7.39 - 7.36 (m, 2H, CH아릴), 7.29 - 7.25 (m, 7H, CH아릴), 6.82-6.79 (m, 4H, CH아릴), 4.51 - 4.47 (m, 1H), 4.31 - 4.24 (m, 2H), 3.77 (s, 6H, 2xDMTr-OMe), 3.66 - 3.60 (m, 16H, HNEt3 +), 3.26 - 3.25 (m, 2H), 2.97 - 2.81 (m, 20H, NEt3), 2.50-2.41 (4H, m), 1.48 - 1.45 (m, 26H, HNEt3 +), 1.24 - 1.18 (m, 29H, NEt3).
(S)-DMT-세린올(TFA)-석신에이트-lcaa-CPG(10)
(S)-DMT-세린올(TFA)-석신에이트(159㎎, 270u㏖) 및 HBTU(113㎎, 299u㏖)를 CH3CN(10㎖) 중에 용해시켰다. 다이아이소프로필에틸아민(DIPEA, 94㎕, 540u㏖)을 용액에 첨가하였고, 혼합물을 2분 동안 스월링시키고, 그 다음 네이티브 아미노-lcaa-CPG(500A, 3g, 아민 함량: 136u㏖/g)를 첨가하였다. 현탁액을 리스트-액션 진탕기 상에서 실온에서 16시간 동안 약하게 진탕하고, 이어서 여과시키고, DCM 및 EtOH로 세척하였다. 고체 지지체를 진공 하에서 2시간 동안 건조시켰다. 실온에서 아세트산 무수물/루티딘/N-메틸이미다졸과 교반함으로써 지지체 상의 미반응 아민을 캡핑시켰다. 지지체의 세척을 상기와 같이 반복하였다. 고체를 진공 하에서 건조시켜 고체 지지체 10(3g, 26u㏖/g 로딩)을 산출하였다.
GalNAc 신톤(9)
GalNAc 신톤 9의 합성을 문헌[Nair et al. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), pp 16958-16961]에 기재된 바와 같이 수행하여, 2단계에 걸쳐서 46% 수율로 얻었다.
특징적인 데이터는 공개된 데이터와 일치하였다.
올리고뉴클레오타이드의 합성
모든 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 상기 및 도 13 및 도 14에 기재된 반응 조건에 따라서 합성하였고, 표 10 및 표 11에 제시한다.
모든 최종 단일 가닥 생성물을 AEX-HPLC에 의해서 분석하여 순도를 증명한다. 순도는 FLP%(전장 생성물 %) 단위로 제공되는데, 이것은 최종 생성물의 AEX-HPLC 분석의 UV-트레이스에서의 배정된 생성물 신호 하의 UV-면적의 백분율이다. 각각의 단일 가닥 생성물(비-변형된, 아미노-변형된 전구체 또는 GalNAc 접합된 올리고뉴클레오타이드)의 아이덴티티는 LC-MS 분석에 의해서 증명하였다.
Figure 112020060356433-pct00101
5'1×NH2는 접합에 사용 가능한 유리 세린올 유래된 아미노기의 위치(5' 단부) 및 수(1×NH2)를 지칭하는 의미이다. 예를 들어, A0264 상의 1×3'NH2는 가닥 A0264의 3' 단부에서 GalNAc 신톤 9와 반응할 수 있는 유리 아미노기가 존재한다는 것을 의미한다. 3'5'1xNH2는 가닥의 3' 단부 및 5' 단부에서 GalNAc 링커 9와 반응할 수 있는 하나의 세린올-유래된 유리 아미노기가 존재한다는 것을 의미한다.
Figure 112020060356433-pct00102
유사하게, 3'5'1×NH2는 접합에 사용 가능한 유리 아미노기의 위치(3' 및 5' 단부) 및 수(각각 1×NH2)를 지칭하는 의미이다. 예를 들어, A0561 상의 3'5'1xNH2는 가닥 A0561의 3' 단부에서 GalNAc 신톤 9와 반응할 수 있는 2개의 유리 아미노기(3' 단부에 1개 및 5' 단부에 1개)가 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명의 특정 접합체 및 참조 접합체 1 내지 2의 합성
펩타이드 커플링 시약을 사용하여 각각의 올리고뉴클레오타이드 가닥 11의 세린올-아미노 작용기에 커플링시킴으로써 GalNAc 신톤(9)의 접합을 달성하였다. 따라서, 각각의 아미노-변형된 전구체 분자 11을 H2O(500OD/㎖) 중에 용해시키고, DMSO(DMSO/H2O, 2/1, v/v)를 첨가하고, 그 다음 DIPEA(총 부피의 2.5%)를 첨가하였다. 별개의 반응 용기에서, 2eq.(아미노-변형된 전구체 올리고뉴클레오타이드 11 내의 아미노 작용기당)의 카복실산 성분을 2eq.의 HBTU와 8eq.의 DIPEA의 존재 하에서, DMSO 중에서 반응시킴으로써 GalN(Ac4)-C4-산(9)의 사전 활성화를 수행하였다. 2분 후, 사전 활성화된 화합물 9를 각각의 아미노-변형된 전구체 분자의 용액에 첨가하였다. 30분 후, 반응 과정을 LCMS 또는 AEX-HPLC에 의해서 모니터링하였다. 접합 반응의 완결 후, 10× iPrOH 및 0.1× 2M NaCl을 첨가함으로써 조 생성물을 침전시키고, 원심분리 경사분리에 의해서 수거하였다. GalNAc 모이어티 내의 아세틸화된 하이드록실기를 유리시키기 위해서, 생성된 펠릿을 40% MeNH2(500OD당 1㎖) 중에 용해시키고, RT에서 15분 후 H2O(1:10) 중에 용해시키고, 마지막으로 음이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 다시 정제시키고, 동결건조시켜 최종 생성물 12를 수득하였다(표 12).
Figure 112020060356433-pct00103
본 발명의 특정 접합체의 합성
펩타이드 커플링 시약을 사용하여 각각의 올리고뉴클레오타이드 가닥 14의 아미노 작용기에 커플링시킴으로써 GalNAc 신톤(9)의 접합을 달성하였다. 따라서, 각각의 아미노-변형된 전구체 분자 14를 H2O(500OD/㎖) 중에 용해시키고, DMSO(DMSO/H2O, 2/1, v/v)를 첨가하고, 그 다음 DIPEA(총 부피의 2.5%)를 첨가하였다. 별개의 반응 용기에서, 2eq.(아미노-변형된 전구체 올리고뉴클레오타이드 14 내의 아미노 작용기당)의 카복실산 성분을 2eq.의 HBTU와 8eq.의 DIPEA의 존재 하에서, DMSO 중에서 반응시킴으로써 GalN(Ac4)-C4-산(9)의 사전 활성화를 수행하였다. 2분 후, 사전 활성화된 화합물 9를 각각의 아미노-변형된 전구체 분자의 용액에 첨가하였다. 30분 후, 반응 과정을 LCMS 또는 AEX-HPLC에 의해서 모니터링하였다. 접합 반응의 완결 후, 10× iPrOH 및 0.1× 2M NaCl을 첨가함으로써 조 생성물을 침전시키고, 원심분리 경사분리에 의해서 수거하였다. GalNAc 모이어티 내의 아세틸화된 하이드록실기를 유리시키기 위해서, 생성된 펠릿을 40% MeNH2(500OD당 1㎖) 중에 용해시키고, RT에서 15분 후 H2O(1:10) 중에 용해시키고, 마지막으로 음이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 다시 정제시키고, 동결건조시켜 최종 생성물 15를 수득하였다(표 13).
Figure 112020060356433-pct00104
이중 가닥 형성
이중 가닥 형성을 상기에 기재된 방법에 따라서 수행하였다.
이중 가닥 순도는 이중 가닥 %로 제공되는데, 이것은 IP-RP-HPLC 분석의 UV-트레이스에서의 배정된 생성물 신호 하의 UV-면적의 백분율이다(표 14).
Figure 112020060356433-pct00105
서열
하기 서열에 대한 주요 변형:
f는 2'플루오로 2'데옥시리보뉴클레오타이드 또는 2'-플루오로 리보뉴클레오타이드(이 용어들은 상호 교환 가능함)를 나타낸다.
m은 2'O 메틸 리보뉴클레오타이드를 나타낸다.
(ps)는 포스포로티오에이트 링키지를 나타낸다.
FAM = 6-카복시플루오레세인
BHQ = 블랙 홀 켄처(Black Hole Quencher) 1
YY = 야키마 옐로우(Yakima Yellow)
정의
Ser(GN)은 세린올 유래된 링커 모이어티에 부착된 GalNAc-C4 빌딩 블록이다:
Figure 112020060356433-pct00106
여기서 O---는 산소 원자와 예를 들어, H, 포스포르다이에스터 링키지 또는 포스포로티오에이트 링키지 간의 링키지이다.
GN는
Figure 112020060356433-pct00107
이다.
C4XLT(ST41라고도 공지됨)는
Figure 112020060356433-pct00108
이다.
ST23은
Figure 112020060356433-pct00109
이다.
C4XLT(C4XLT-phos)뿐만 아니라 ST23(ST23-phos)의 포스포르아미다이트 유도체의 합성을 WO2017/174657에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.
C4XLT-phos:
Figure 112020060356433-pct00110
ST23-phos:
Figure 112020060356433-pct00111
Figure 112020060356433-pct00112
접합체 1
안티센스 가닥 - STS16001AL33(서열번호 127)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3'
센스 가닥 - STS16001BL20(서열번호 128)
5' Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA 3'
접합체 2
안티센스 가닥 - STS16001A(서열번호 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
센스 가닥 - STS16001BV1L42(서열번호 130)
Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN)
접합체 3
안티센스 가닥 - STS16001AL33(서열번호 127)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3'
센스 가닥 - STS16001BV1L42(서열번호 130)
5' Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) 3'
접합체 4
안티센스 가닥 - STS16001A(서열번호 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
센스 가닥 - STS16001BV1L75(서열번호 142)
5' Ser(GN) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA Ser(GN) 3'
접합체 5
안티센스 가닥 - STS16001A(서열번호 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
센스 가닥 - STS16001BV16L42(서열번호 143)
5' Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mA fA (ps) Ser(GN) 3'
접합체 6
안티센스 가닥 - STS16001A(서열번호 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
센스 가닥 - STS16001BV20L75(서열번호 144)
5' Ser(GN) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mA fA Ser(GN) 3'
접합체 7
안티센스 가닥 - (서열번호 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
센스 가닥 - STS16001BV1L94(서열번호 145)
5' Ser(GN) (ps) Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) (ps) Ser(GN) 3'
접합체 8
안티센스 가닥 - STS16001A(서열번호 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
센스 가닥 - STS16001V1BL96(서열번호 146)
5' C6Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) C7Am(GN) 3'
접합체 9
안티센스 가닥 - STS16001A(서열번호 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
센스 가닥 - STS16001V1BL97(서열번호 147)
5' GlyC3Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) GlyC3Am(GN) 3'
접합체 10
안티센스 가닥 - STS16001A(서열번호 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
센스 가닥(서열번호 148)
5' PipAm(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) PipAm(GN) 3'
접합체 11
안티센스 가닥 - STS16001A(서열번호 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
센스 가닥 - STS16001V1BL88(서열번호 149)
5' C3Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) C3Am(GN) 3'
접합체 12
안티센스 가닥 - STS16001A(서열번호 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
센스 가닥 - STS16001V1BL87(서열번호 150)
5' C6Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) GlyC3Am(GN) 3'
접합체 15
안티센스 가닥(서열번호 151)
mU (ps) fC (ps) mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU (ps) fU (ps) mC
센스 가닥(서열번호 152)
Ser(GN) (ps) fG (ps) mA (ps) fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA (ps) mG (ps) fA (ps) Ser(GN)
접합체 16
안티센스 가닥(서열번호 153)
mA (ps) fU (ps) mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU (ps) fC (ps) mU
센스 가닥(서열번호 154)
Ser(GN) (ps) fA (ps) mG (ps) fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC (ps) mA (ps) fU (ps) Ser(GN)
접합체 18
안티센스 가닥(서열번호 155)
mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA
센스 가닥(서열번호 156)
Ser(GN) (ps) fU (ps) mC (ps) fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU (ps) Ser(GN)
접합체 19
안티센스 가닥(서열번호 135)
mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG
센스 가닥(서열번호 136)
Ser(GN) (ps) fC (ps) mG (ps) fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU (ps) mA (ps) fU (ps) Ser(GN)
참조 접합체 1
안티센스 가닥 - STS16001A(서열번호 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
센스 가닥 - STS16001BL20(서열번호 128)
Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
참조 접합체 2
안티센스 가닥 - STS16001AL33(서열번호 127)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN)
센스 가닥 - STS16001BV1(서열번호 157)
fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
참조 접합체 3 - "Luc"
안티센스 가닥 - STS18001A (A0130, 서열번호 132)
mU (ps) fC (ps) mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA (ps) fC (ps) mG
센스 가닥 - STS18001BL4(A0131, 서열번호 133)
[(ST23) (ps)]3 C4XLT (ps) fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC (ps) mG (ps) fA
참조 접합체 4
안티센스 가닥 - STS16001AL33(서열번호 127)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
센스 가닥 - STS16001BL4(서열번호 134)
5'[(ST23) (ps)]3 C4XLT(ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
참조 접합체 5 - "Ctr"
안티센스 가닥(서열번호 138)
mC (ps) fU (ps) mU fA mC fU mC fU mC fG mC fC mC fA mA fG mC (ps) fG (ps) mA
센스 가닥(서열번호 139)
[(ST23) (ps)]3 (C6XLT) (ps) fU mC fG mC fU mU fG mG fG mC fG mA fG mA fG mU fA (ps) mA (ps) fG
참조 접합체 6
안티센스 가닥(서열번호 151)
mU (ps) fC (ps) mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU (ps) fU (ps) mC
센스 가닥(서열번호 158)
[ST23 (ps)]3 ltrb (ps) fG mA fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA (ps) mG (ps) fA
참조 접합체 7
안티센스 가닥(서열번호 153)
mA (ps) fU (ps) mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU (ps) fC (ps) mU
센스 가닥(서열번호 159)
[ST23 (ps)]3 ltrb (ps) fA mG fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC (ps) mA (ps) fU
참조 접합체 8
안티센스 가닥(서열번호 160)
mU (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA
센스 가닥(서열번호 161)
[ST23 (ps)]3 ST41 (ps)fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fA
참조 접합체 9
안티센스 가닥(서열번호 135)
mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG
센스 가닥(서열번호 162)
[ST23 (ps)]3 C6XLT (ps) fC mG fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU (ps) mA (ps) fU
실시예 12 - 다양한 TTR siRNA GalNAc 접합체의 TTR 넉다운의 시험관내 결정
접합체 1 내지 3
뮤린 1차 간세포를 콜라겐 사전 코팅된 96웰 플레이트(써모 피셔 사이언티픽사(Thermo Fisher Scientific), #A1142803) 내에 웰당 30,000개 세포의 세포 밀도로 시딩하고, 10nM 내지 0.0001nM의 범위의 농도의 siRNA-접합체로 처리하였다. 처리 24시간 후, 세포를 용해시키고, 제조사 프로토콜에 따라서 InviTrap(등록상표) RNA 세포 HTS 96 Kit/C24×96 프렙(스트라테크사 #7061300400)으로 RNA를 추출하였다. TTR 및 하우스키핑 mRNA(PtenII)의 전사물 수준을 TaqMan 분석에 의해서 정량하였다.
본 발명의 접합체, 접합체 1 내지 3으로의 0.01nM, 0.1nM, 0.5nM, 1nM 및 10nM에서의 처리 24시간 후 1차 뮤린 간세포에서의 표적 유전자 발현은, 도 15에 나타낸 바와 같이 음성 대조군에 비해서 접합체의 용량이 증가함에 따라서 표적 유전자 발현이 감소됨을 나타내었다(UT" 칼럼 및 참조 접합체 3 참고). 이는, 제1 가닥이 표적 유전자에 결합하고, 따라서 유전자 발현을 감소시킴을 나타낸다. 도 15는 또한 비교 접합체로서 작용하는 참조 접합체 1 및 2의 표적 유전자 발현 수준을 나타낸다. 도 15A 및 도 15C와 도 15B 및 도 15C에 제시된 데이터 간의 비교로부터 인지될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 접합체(접합체 1 내지 3)는 참조 접합체 1 및 2에 비해서 표적 유전자 발현을 감소시킨다. 0.01nM에서 가장 효과적인 접합체는 접합체 2인 것으로 보인다. 0.1nM, 0.5nM, 1nM 및 10nM에서 가장 효과적인 접합체는 접합체 3인 것으로 보인다.
접합체 4 내지 7
일반적인 방법 섹션에서 "시험관내 실험" 하의 상기에 기재된 방법은 하기와 같았다.
본 발명의 접합체, 접합체 4 내지 7로의 0.01nM, 0.1nM, 0.5nM, 1nM 및 10nM에서의 처리 24시간 후 1차 뮤린 간세포에서의 표적 유전자 발현은, 도 31에 나타낸 바와 같이 음성 대조군에 비해서 접합체의 용량이 증가함에 따라서 표적 유전자 발현이 감소됨을 나타내었다(UT" 칼럼 및 Luc[참조 접합체 3] 참고). 이는, 제1 가닥이 표적 유전자에 결합하고, 따라서 유전자 발현을 감소시킴을 나타낸다.
시험관내 데이터는, 표적 유전자 발현을 감소시키는 효능을 유지시키면서, 접합체 4 내지 7에서 센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에 제공되는 하나 또는 2개의 세린올-유래된 링커 모이어티와 관련하여, 말단 뉴클레오타이드와 링커 사이, 및/또는 센스 가닥 내의 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트(PS) 결합의 수는 달라질 수 있다는 것을 나타낸다.
접합체 8 내지 12 및 19
일반적인 방법 섹션에서 "시험관내 실험" 하의 상기에 기재된 방법은 하기와 같았다.
본 발명의 접합체, 접합체 8 내지 12로의 0.01nM, 0.1nM, 0.5nM, 1nM 및 10nM에서의 처리 24시간 후 1차 뮤린 간세포에서의 표적 유전자 발현은, 도 32에 나타낸 바와 같이 음성 대조군에 비해서 접합체의 용량이 증가함에 따라서 표적 유전자 발현이 감소됨을 나타내었다(UT" 칼럼 및 Luc[참조 접합체 3] 참고). 이는, 제1 가닥이 표적 유전자에 결합하고, 따라서 유전자 발현을 감소시킴을 나타낸다. 특히, 접합체 8, 9, 10 및 11은 0.01nM에서 가장 효과적인 접합체인 것으로 이미 밝혀진 접합체 2와 대등하거나 또는 더 양호한 것으로 보인다.
접합체 19는 또한 도 33에 나타난 바와 같이, 음성 대조군과 비교할 때 표적 유전자 발현을 감소시키는 것으로 나타났다("UT" 칼럼 및 비-표적화 siRNA이고, 참조 접합체 5라고도 지칭되는 Ctr 참고). 이는, 제1 가닥이 표적 유전자에 결합하고, 따라서 유전자 발현을 감소시킴을 나타낸다.
접합체 8 내지 12 및 19에 대한 시험관내 데이터는, 구조적으로 다양하고, 센스 가닥의 양 말단에서 접합된 다수의 링커가 표적 유전자 발현 감소에 효과적임을 나타낸다. 접합체 8 내지 12 및 19는 참조 접합체 3(접합체 8 내지 12의 경우)인 "Luc", 참조 접합체 5(접합체 19의 경우)인 "Ctr" 및 미처리 대조군보다 표적 유전자 발현을 보다 효과적으로 감소시킨다.
실시예 13 - 마우스에서 혈청 Ttr , Aldh2 및 Tmprss6 의 생체내 시간 경과
접합체 1 내지 3
C57BL/6 마우스를 0일에 1㎎/㎏ siRNA-접합체로 s.c. 처리하였다. 혈청 샘플을 안구 비동 출혈에 의해서 7, 14 및 27일에 취하고, 분석 시까지 -20℃에서 저장하였다. 제조사 프로토콜(샘플 희석 1:8000 또는 1:800)에 따라서 Mouse Prealbumin ELISA(ALPCO, 41-PALMS/로트 22, 2008003B)를 사용하여 혈청 TTR 정량을 수행하였다.
1㎎/㎏의 접합체 1 내지 3, 참조 접합체 1, 2 및 4 및 모의 처리(PBS)로의 s.c. 처리 7, 14, 및 27일 후에 개체에서 n=4의 c57BL/6 마우스 코호트에서의 혈청 TTR의 시간 경과의 결과를 도 16에 나타낸다. 도 16에서의 데이터에 제시된 바와 같이, 본 발명의 접합체는 음성 대조군(PBS) 및 참조 접합체 1, 2, 특히 참조 접합체 4에 비해서 표적 유전자 발현의 감소에 특히 효과적이다. 접합체 2 및 3은 또한 참조 접합체 1, 2 및 4보다 더 효과적이다. 가장 효과적인 접합체는 접합체 2이다. 따라서, 참조 접합체 4와 비교할 때, 동일한 초기 넉 다운을 달성하기 위해서 접합체 2의 투여 수준은 약 3배 더 낮을 것이고, 또한 더 긴 기간의 넉 다운을 초래할 것이라고 예측될 수 있다.
보다 구체적으로, 접합체 2는 야생형 마우스에서 동일몰의 용량에서 참조 접합체 4와 비교할 때 7일에 혈청에서 3배 더 낮은 표적 단백질 수준을 초래하였고, 27일에 혈청에서 4배 더 낮은 표적 단백질 수준을 초래하였다. 추가로, 접합체 2는 동일몰량의 참조 접합체 4에 의한 36% 감소와 비교할 때, 단일 주입 후 27일째에 표적 혈청 단백질의 85% 감소를 초래하였다.
접합체 15 내지 18
일반적인 방법 섹션에서 "생체내 실험" 하의 상기에 기재된 방법은 하기와 같았다.
1㎎/㎏의 접합체 15 및 16, 참조 접합체 6 및 7, 및 모의 처리(PBS)로의 s.c. 처리 14, 28 및 42일 후에 개체에서 n=6의 c57BL/6 마우스 코호트에서 혈청 Aldh2의 시간 경과의 결과를 도 34 및 도 35에 나타낸다. 도 34 및 도 35에서의 데이터에 제시된 바와 같이, 본 발명의 접합체는 각각 음성 대조군(PBS) 및 참조 접합체 6 및 7에 비해서 표적 유전자 발현의 감소에 특히 효과적이다.
1㎎/㎏의 접합체 18, 참조 접합체 8 및 모의 처리(PBS)로의 s.c. 처리 14, 28 및 42일 후에 개체에서 n=6의 c57BL/6 마우스 코호트에서 혈청 Tmprss6의 시간 경과의 결과를 도 36에 나타낸다. 도 36에서의 데이터에 제시된 바와 같이, 본 발명의 접합체는 음성 대조군(PBS) 및 참조 접합체 8에 비해서 표적 유전자 발현의 감소에 특히 효과적이다.
종합적으로, 생체내 데이터는, 제2 가닥의 양 말단에서 접합된 다양한 실시예 링커가 생체내에서 표적 유전자 발현의 감소에 효과적임을 나타낸다. 링커의 배치는 제2 가닥의 5' 말단에서 삼안테나형 GalNAc-링커 대조군과 비교할 때 생체내에서 효력 접합체를 개선시킨다(참조 접합체 6, 7 및 8).
실시예 14 - 혈청 안정성 연구
일반적인 방법 섹션에서 "트라이토솜 안정성 검정" 하의 상기에 기재된 방법은 하기와 같았다.
도 37은 접합체 2, 4, 5, 6 및 7과 관련한 혈청 안정성 연구로부터의 결과를 나타낸다. 도 38은 접합체 2, 8, 9, 10, 11 및 12의 혈청 안정성을 나타낸다.
시험된 본 발명의 모든 접합체는 대조군에 비해서 혈청에서 더 안정적이다.
모든 시험된 접합체는 제2 가닥의 5' 단부에 각각 하나의 GalNAc 링커 및 3' 단부에 나머지 것을 함유한다. 달리 다르게 제시되지 않는 한, siRNA는 교번하는 2'-OMe/2'-F로 변형되고, 이것은 각각 5' 및 3' 말단의 2개의 인터뉴클레오타이드 링키지에서 2개의 포스포로티오에이트(PS) 인터뉴클레오타이드 링키지를 함유한다.
접합체 4에서, 세린올-GalNAc 단위는 포스포다이에스터 결합을 통해서 부착된다. 접합체 5에서, 세린올-GalNAc 단위는 PS를 통해서 접합되는 반면, 제2 가닥 내의 모든 인터뉴클레오타이드 링키지는 포스포다이에스터이다. 접합체 6에서 제2 가닥은 PS를 함유하지 않는다. 접합체 7에서 2개의 세린올-GalNAc 단위는 각각의 제2 가닥 말단에 부착되고, 각각의 단부에서 PS-결합을 통해서 서로에 부착된다. 접합체 8에서 제2 가닥의 5'에서의 C6-아미노-변형제 및 3' 단부에서의 C7-아미노-변형제는 리간드 부착을 위해서 적용되었다. 접합체 9에서 Gly-C3-아미노-변형제, 접합체 10에서 피페리딜-아미노-변형제, 접합체 11에서 C3-아미노-변형제 및 접합체 2에서 세린올-GalNAc 단위는 제2 가닥의 양 단부에 대한 접합을 위해서 링커로서 사용되었다. 접합체 2에서 양 말단 인터뉴클레오타이드뿐만 아니라 뉴클레오타이드-세린올 결합은 PS이다. 접합체 12에서 제2 가닥의 5'에서의 C6-아미노-변형제 및 3' 단부에서의 GlyC3-아미노-변형제는 리간드 부착을 위해서 적용되었다. "ut"는 다른 샘플이 정규화된 미처리 샘플을 나타낸다. "Luc"는 비-표적화 대조군으로서 사용된 siRNA 표적화 루시퍼라제(참조 접합체 3)를 나타내는데, 이것은 표적 mRNA 수준을 감소시키지 않는다.
데이터는, 혈청에서 안정성을 유지하면서, 센스 가닥의 5' 단부 및 3' 단부에 제공되는 세린올-유래된 링커 모이어티와 관련하여, 말단 뉴클레오타이드와 링커 사이, 및/또는 센스 가닥 내의 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트(PS) 결합의 수는 달라질 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 15
수용체-매개된 전달 시에 1차 인간 간세포에서 상이한 제시된 L6-GalNAc 접합된 siRNA에 의한 인간 1차 간세포에서의 LPA-mRNA의 넉다운
Figure 112020060356433-pct00113
1차 인간 간세포(써모피셔사)를 콜라겐-코팅된 96-웰 플레이트 상에 웰(96웰 포맷)당 30,000개 세포로 플레이팅하였다. GalNAc-L6-접합된 siRNA를 제시된 농도로 세포 플레이팅 직후에 첨가하였다. siRNA로의 처리 24시간 후 전체 RNA를 InviTrap RNA 세포 HTS 96웰 키트(스트라테크사)를 사용하여 단리시켰다. 하우스키핑 전사물로서의 APOB mRNA에 대해서 qRT-PCR에 의해서 LPA mRNA 발현 수준을 결정하였다. 값을 미처리 세포에서 LPA mRNA 발현에 대해서 값을 정규화시켰다. 정규화된 3회 반복 값의 평균 및 SD를 도 39에 나타낸다. IC50- 값 및 최대 저해는 4-파라미터 비선형 회귀 곡선 피트를 사용하여 추정하였다.
본 발명의 진술
1. 세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산으로서, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 상기 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하되, 상기 제1 가닥은 상기 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열번호 9, 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 또는 73 또는 본 명세서에 개시된 임의의 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
2. 진술 1에 있어서, 제2 가닥은 서열번호 10, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 64, 66, 68, 70, 72 또는 74 또는 본 명세서에 개시된 임의의 서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
3. 진술 1 또는 진술 2에 있어서, 상기 제1 가닥은 서열번호 9 또는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
4. 진술 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
5. 진술 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 가닥 및/또는 상기 제2 가닥은 각각 17 내지 35개의 뉴클레오타이드 길이인, 핵산.
6. 진술 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 듀플렉스 영역은 19 내지 25개의 연속되는 뉴클레오타이드 염기 쌍으로 이루어지는, 핵산.
7. 진술 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서,
a) 양 단부 다에서 평활 단부이거나; 또는
b) 하나의 단부에서는 오버행을 갖고, 나머지에서는 평활 단부를 갖거나; 또는
c) 양 단부 다에서 오버행을 갖는, 핵산.
8. 진술 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형되어 변형된 뉴클레오타이드를 형성하는, 핵산.
9. 진술 8에 있어서, 제1 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 변형된, 핵산.
10. 진술 9에 있어서, 제1 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 적어도 제2 변형에 의해서 변형되고, 적어도 제2 변형은 진술 9의 변형과 상이한, 핵산.
11. 진술 10에 있어서, 하나 이상의 변형된 짝수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나에 근접하는, 핵산.
12. 진술 9 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 변형된, 핵산.
13. 진술 10 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 복수의 짝수 뉴클레오타이드는 제2 변형에 의해서 변형된, 핵산.
14. 진술 8 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥은 공통 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산.
15. 진술 9 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥은 진술 9의 변형과 상이한 제2 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산.
16. 진술 9 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥의 홀수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 진술 9의 변형과 상이한 변형에 의해서 변형된, 핵산.
17. 진술 9 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥의 짝수 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 진술 9의 변형에 의해서 변형된, 핵산.
18. 진술 16 또는 17에 있어서, 제2 가닥의 하나 이상의 변형된 짝수 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 제2 가닥의 하나 이상의 변형된 홀수 뉴클레오타이드에 근접하는, 핵산.
19. 진술 16 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥의 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 공통 변형에 의해서 변형된, 핵산.
20. 진술 16 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 복수의 짝수 뉴클레오타이드는 진술 9에 따른 변형에 의해서 변형된, 핵산.
21. 진술 16 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥 상의 복수의 홀수 뉴클레오타이드는 제2 변형에 의해서 변형되고, 제2 변형은 진술 9의 변형과 상이한, 핵산.
22. 진술 16 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥은 공통 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산.
23. 진술 16 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥은 진술 9의 변형과 상이한 제2 변형에 의해서 변형된 근접한 뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산.
24. 진술 8 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 내의 홀수 뉴클레오타이드 각각 및 제2 가닥 내의 짝수 뉴클레오타이드 각각은 공통 변형에 의해서 변형된, 핵산.
25. 진술 24에 있어서, 짝수 뉴클레오타이드 각각은 제2 변형으로 제1 가닥에서 변형되고, 홀수 뉴클레오타이드 각각은 제2 변형으로 제2 가닥에서 변형된, 핵산.
26. 진술 8 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥의 변형된 뉴클레오타이드는 제2 가닥의 비변형되거나 또는 상이하게 변형된 뉴클레오타이드에 비해서 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해서 이동된, 핵산.
27. 진술 8 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 변형 및/또는 변형들은 각각 그리고 개별적으로 3'-말단 데옥시-티민, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-변형, 2'-아미노-변형, 2'-알킬-변형, 몰폴리노 변형, 포스포르아미데이트 변형, 5'-포스포로티오에이트기 변형, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방 변형 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아민기 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된, 핵산.
28. 진술 8 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 변형은 잠금 뉴클레오타이드, 무염기성 뉴클레오타이드 또는 비-자연 염기 포함 뉴클레오타이드 중 어느 하나인, 핵산.
29. 진술 8 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 여기서 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸인, 핵산.
30. 진술 8 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 여기서 적어도 하나의 변형은 2'-F인, 핵산.
31. 세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산으로서, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하되, 상기 제1 가닥은 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열번호 9, 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 또는 73으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제1 가닥의 뉴클레오타이드는 홀수 뉴클레오타이드 상의 제1 변형에 의해서 변형되고, 짝수 뉴클레오타이드 상의 제2 변형에 의해서 변형되고, 제2 가닥의 뉴클레오타이드는 짝수 뉴클레오타이드 상의 제3 변형에 의해서 변형되고, 홀수 뉴클레오타이드 상의 제4 변형에 의해서 변형되고, 적어도 제1 변형은 제2 변형과 상이하고, 제3 변형은 제4 변형과 상이한, 핵산.
32. 진술 31에 있어서, 제2 서열은 서열번호 10, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 64, 66, 68, 70, 72 또는 74의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
33. 진술 31 또는 32에 있어서, 제4 변형 및 제2 변형은 동일한, 핵산.
34. 진술 31 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 제1 변형 및 제3 변형은 동일한, 핵산.
35. 진술 31 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 제1 변형은 2'O-Me이고, 제2 변형은 2'F인, 핵산.
36. 진술 31 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥은 서열번호 9 또는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 가닥은 서열번호 10 또는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
37. 진술 31 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 하기에 도시된 바와 같은 서열 및 변형을 포함하는, 핵산:
Figure 112020060356433-pct00114
식 중, 특정 변형은 하기 번호로 표현된다:
1=2'F-dU,
2=2'F-dA,
3=2'F-dC,
4=2'F-dG,
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG.
38. 진술 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 리간드에 접합된, 핵산.
39. 진술 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 말단 1개, 2개 또는 3개의 3' 뉴클레오타이드 및/또는 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함하는, 핵산.
40. 진술 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 상의 3개의 말단 3' 각각 사이에 그리고 3개의 말단 5' 뉴클레오타이드 각각 사이에 2개의 포스포로티오에이트 링키지, 및 제2 가닥의 3' 단부의 3개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 링키지를 포함하는, 핵산.
41. 세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산으로서, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하되, 상기 제1 가닥은 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열번호 9, 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 또는 73으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 핵산은 리간드에 접합된, 핵산.
42. 진술 41에 있어서, 리간드는 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토사민(GalNac) 모이어티 및 이의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함하되, 링커는 GalNac 모이어티를 진술 41에 정의된 바와 같은 핵산에 접합시키는, 핵산.
43. 진술 41 또는 42에 있어서, 링커는 2가 또는 3가 또는 4가 분지형 구조일 수 있는, 핵산.
44. 진술 41 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레오타이드는 임의의 상기 진술에 정의된 바와 같이 변형된, 핵산.
45. 진술 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 하기 화학식 I을 포함하는 리간드에 접합되되:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
식 중,
S는 당류를 나타내고, 여기서 당류는 N-아세틸 갈락토사민이고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-이며, 여기서 m은 1, 2 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)이며;
X2는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 또는 알킬렌 에터이고, 여기서 n은 1 내지 6이고;
A는 분지 단위이며;
X3은 브리징 단위를 나타내고;
진술 1 내지 40 중 임의의 것에 정의된 바와 같은 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트(바람직하게는 티오포스페이트)를 통해서 X3에 접합된, 핵산.
46. 하기 구조 중 하나를 갖는 접합된 핵산:
Figure 112020060356433-pct00115
Figure 112020060356433-pct00116
Figure 112020060356433-pct00117
Figure 112020060356433-pct00118
Figure 112020060356433-pct00119
Z는 진술 1 내지 40 중 임의의 것에 따른다.
47. 진술 1 내지 40 중 임의의 것에 있어서, 하기 구조의 리간드에 접합된, 핵산:
Figure 112020060356433-pct00120
.
48. 임의의 상기 진술의 핵산 또는 접합된 핵산으로서, 듀플렉스는 별개의 가닥을 포함하는, 핵산 또는 접합된 핵산.
49. 임의의 상기 진술의 핵산 또는 접합된 핵산으로서, 듀플렉스는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 단일 가닥을 포함하는, 핵산 또는 접합된 핵산.
50. 임의의 상기 진술의 핵산 또는 접합된 핵산 및 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 조성물.
51. 질환 또는 병상의 예방 또는 치료 또는 이의 위험의 감소에 사용하기 위한 임의의 상기 진술에 따른, 핵산 또는 접합된 핵산.
52. 질환, 장애 또는 증후군의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에서의 임의의 상기 진술에 따른 핵산 또는 접합된 핵산의 용도.
53. 임의의 상기 진술에 따른 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애 또는 증후군의 치료 또는 예방 방법.
54. 진술 53에 있어서, 핵산 또는 접합된 핵산은 대상체에게 피하로, 정맥내로 또는 임의의 다른 적용 경로를 사용하여, 예컨대, 경구, 직장 또는 복강내로 투여되는, 방법.
55. 진술 52 내지 54에 있어서, 상기 질환 또는 병상은 심혈관 질환, 뇌졸중, 죽상경화증, 혈전증 또는 심혈관 질환, 예컨대, 관상동맥 심장 질환 또는 대동맥 협착증 및 증가된 수준의 Lp(a)-함유 입자와 연관된 임의의 다른 질환 또는 병상인, 용도 또는 방법.
56. 진술 55에 있어서, 심혈관 질환은 뇌졸중, 죽상경화증, 혈전증, 관상동맥 심장 질환 또는 대동맥 협착증 및 증가된 수준의 Lp(a)-함유 입자와 연관된 임의의 다른 질환 또는 병상인, 용도 또는 방법.
57. 진술 1 내지 49 중 어느 하나의 핵산 또는 접합된 핵산의 제조 방법.
58. LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산으로서, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 상기 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하되, 상기 제1 가닥은 상기 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, LPA의 발현은 동일한 시험 조건이지만 핵산 또는 접합된 핵산의 부재 하에서 또는 비-침묵 대조군의 존재 하에서 관찰된 발현 수준보다 적어도 15% 낮은 수준까지 감소된, 핵산.
59. LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산으로서, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 상기 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하되, 상기 제1 가닥은 상기 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열번호 9, 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 또는 73으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, LPA의 발현은 동일한 시험 조건이지만 핵산 또는 접합된 핵산의 부재 하에서 또는 비-침묵 대조군의 존재 하에서 관찰된 발현 수준보다 적어도 15% 낮은 수준까지 감소된, 핵산.
60. 세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산으로서, 제1 가닥의 적어도 일부, 및 상기 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하되, 상기 제1 가닥은 상기 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열번호 63, 65, 67 및 73으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 제1 RNA 가닥은 말단 5' (E)-바이닐포스포네이트 뉴클레오타이드를 갖는, 핵산.
본 발명의 다른 조항은 하기를 포함한다:
1. 세포에서 LPA 유전자의 발현을 저해하기 위한 접합체로서, 상기 접합체는 핵산 부분 및 리간드 부분을 포함하되, 상기 핵산 부분은 제1 RNA 가닥의 적어도 일부 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 RNA 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 상기 제1 가닥은 상기 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 리간드 부분은 세린올-유래된 링커 모이어티 및 세포의 생체내 표적화를 위한 표적화 리간드를 포함하고, 하나 또는 두 RNA 가닥의 3' 단부 및/또는 5' 단부에만 접합되고, 제1 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않고,
(i) 제2 RNA 가닥은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, (a) 제2 RNA 가닥은 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제1 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (b) 제1 RNA 가닥은 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (c) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되거나; 또는
(ii) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않거나,
또는
세포에서 LPA 유전자의 발현을 저해하기 위한 접합체로서, 상기 접합체는 핵산 부분 및 리간드 부분을 포함하되, 상기 핵산 부분은 제1 RNA 가닥의 적어도 일부 및 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 RNA 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하고, 상기 제1 가닥은 상기 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 리간드 부분은 링커 모이어티 및 세포의 생체내 표적화를 위한 표적화 리간드를 포함하고, 하나 또는 두 RNA 가닥의 3' 단부 및/또는 5' 단부에만 접합되고, 제1 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않고,
(i) 제2 RNA 가닥은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, (a) 제2 RNA 가닥은 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제1 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (b) 제1 RNA 가닥은 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않거나; 또는 (c) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되거나; 또는
(ii) 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않거나, 선택적으로
링커 모이어티는 세린올-유래된 링커 모이어티 또는 본 명세서에 기재된 다른 링커 유형 중 하나인, 접합체.
2. 조항 1에 있어서, 제2 RNA 가닥은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥은 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 그리고 제1 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않은, 접합체.
3. 조항 1에 있어서, 제2 RNA 가닥은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제1 RNA 가닥은 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 그리고 제2 RNA 가닥의 3' 단부는 접합되지 않은, 접합체.
4. 조항 1에 있어서, 제2 RNA 가닥은 5' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 또한 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합된, 접합체.
5. 조항 1에 있어서, 제2 RNA 가닥 및 제1 RNA 가닥 둘 다는 3' 단부에서 표적화 리간드에 접합되고, 제2 RNA 가닥의 5' 단부는 접합되지 않은, 접합체.
6. 조항 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 리간드는 단량체 리간드인, 접합체.
7. 조항 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 리간드는 GalNAc 및 갈락토스 모이어티, 특히 GalNAc 모이어티로부터 선택되는, 접합체.
8. 조항 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 접합된 RNA 가닥은 추가 링커를 포함하는 세린올-유래된 링커 모이어티를 통해서 표적화 리간드에 접합되되, 추가 링커는 포화, 비분지형 또는 분지형 C1-15 알킬쇄이거나, 이를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 탄소(예를 들어 1, 2 또는 3개의 탄소, 적합하게는 1 또는 2개, 특히 1개)는 O, N, S(O)p로부터 선택된 헤테로원자에 의해서 대체되고, p는 0, 1 또는 2이고(예를 들어, CH2기는 O, 또는 NH, 또는 S, 또는 SO2로 대체되거나 쇄의 말단 또는 분지 상의 -CH3기는 OH 또는 NH2로 대체됨), 상기 쇄는 하나 이상의 옥소기(예를 들어 1 내지 3개, 예컨대, 1개의 기)에 의해서 선택적으로 치환되는, 접합체.
9. 조항 8에 있어서, 추가 링커는 포화된 비분지형 C1-15 알킬쇄를 포함하되, 하나 이상의 탄소(예를 들어 1, 2 또는 3개의 탄소, 적합하게는 1 또는 2개, 특히 1개)는 산소 원자에 의해서 대체된, 접합체.
10. 조항 9에 있어서, 추가 링커는 PEG-쇄를 포함하는, 접합체.
11. 조항 8에 있어서, 추가 링커는 포화된 비분지형 C1-15 알킬쇄를 포함하는, 접합체.
12. 조항 11에 있어서, 추가 링커는 포화된 비분지형 C1-6 알킬쇄를 포함하는, 접합체.
13. 조항 12에 있어서, 추가 링커는 포화된 비분지형 C4 또는 C6 알킬 쇄, 예를 들어, C4 알킬 쇄를 포함하는, 접합체.
14. 조항 1 또는 진술 1에 있어서, 제1 RNA 가닥은 하기 화학식 (XV)의 화합물이고:
Figure 112020060356433-pct00121
(식 중, b는 0 또는 1임);
제2 RNA 가닥은 하기 화학식 (XVI)의 화합물인, 접합체:
Figure 112020060356433-pct00122
(식 중, c 및 d는 독립적으로 0 또는 1이고;
Z1 및 Z2는 각각 제1 RNA 가닥 및 제2 RNA 가닥의 RNA 부분이며;
Y는 O 또는 S이고;
R1은 H 또는 메틸이며;
n은 0, 1, 2 또는 3이며;
L은 화학식 (XV) 및 (XVI)에서 동일하거나 또는 상이하고,
-(CH2)q(여기서 q는 2 내지 12임);
-(CH2)r-C(O)-(여기서 r은 2 내지 12임);
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-(여기서 s는 1 내지 5임);
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-(여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임);
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-(여기서 u는 독립적으로 1 내지 5임); 및
-(CH2)v-NH-C(O)-(여기서 v는 2 내지 12임)로 이루어진 군으로부터 선택되고; 그리고
말단 C(O)(존재하는 경우)는 NH기에 부착되고;
b + c + d는 2 또는 3임).
15. 조항 14에 있어서, b는 0이고, c는 1이며, d는 1인, 접합체.
16. 조항 14에 있어서, b는 1이고, c는 0이며, d는 1인, 접합체.
17. 조항 14에 있어서, b는 1이고, c는 1이며, d는 0인, 접합체.
18. 조항 14에 있어서, b는 1이고, c는 1이며, d는 1인, 접합체.
19. 조항 14 내지 18 중 어느 하나에 있어서, Y는 O인, 접합체.
20. 조항 14 내지 18 중 어느 하나에 있어서, Y는 S인, 접합체.
21. 조항 14 내지 20 중 어느 하나에 있어서, R1은 H인, 접합체.
22. 조항 14 내지 20 중 어느 하나에 있어서, R1은 메틸인, 접합체.
23. 조항 14 내지 22 중 어느 하나에 있어서, n은 0인, 접합체.
24. 조항 14 내지 23 중 어느 하나에 있어서, L은 -(CH2)r-C(O)-이되, r은 2 내지 12인, 접합체.
25. 조항 24에 있어서, r은 2 내지 6인, 접합체.
26. 조항 25에 있어서, r은 4 내지 6, 예를 들어, 4인, 접합체.
27. 임의의 상기 조항에 있어서, 본 명세서에 개시된 임의의 특징 또는 특징의 조합을 갖는, 접합체.
Figure 112020060356433-pct00123
Figure 112020060356433-pct00124
Figure 112020060356433-pct00125
Figure 112020060356433-pct00126
Figure 112020060356433-pct00127
Figure 112020060356433-pct00128
Figure 112020060356433-pct00129
Figure 112020060356433-pct00130
Figure 112020060356433-pct00131
단일 서열은 하나 초과의 명칭을 가질 수 있다. 그러한 경우, 이들 명칭 중 하나를 요약 서열 표에 제공한다.
특정 링커 및 변형된 링키지, 예컨대, PS 및 [ST23 (ps)]3 ST41 (ps) 등이 가 RNA 서열에서 교시된 경우, 서열의 선택적인 부분이 존재하지만, 그 서열의 바람직한 실시형태이다.
하기 약어가 사용될 수 있다:
Figure 112020060356433-pct00132
Figure 112020060356433-pct00133
Figure 112020060356433-pct00134
SEQUENCE LISTING <110> Silence Therapeutics GmbH <120> Nucleic acids for inhibiting expression of LPA in a cell <130> WO/2019/092283 <140> PCT/EP2018/081106 <141> 2018-11-13 <150> EP17201449.0 <151> 2017-11-13 <150> EP18179175.7 <151> 2018-06-21 <150> GB1815915.2 <151> 2018-09-28 <160> 162 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 1 ucguauaaca auaaggggc 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 2 gccccuuauu guuauacga 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 3 gauaacucug uccauuacc 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 4 gguaauggac agaguuauc 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 5 auaacucugu ccauuacca 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 6 ugguaaugga cagaguuau 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 7 uaacucuguc cauuaccgu 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 8 acgguaaugg acagaguua 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 9 auaacucugu ccauuaccg 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 10 cgguaaugga cagaguuau 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 11 agaaugugcc ucgauaacu 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 12 aguuaucgag gcacauucu 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 13 auaacucugu ccaucacca 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 14 uggugaugga cagaguuau 19 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 15 auaacucugu ccaucaccu 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 16 aggugaugga cagaguuau 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 17 uaacucuguc cauuaccau 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 18 augguaaugg acagaguua 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 19 augugccuug auaacucug 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 20 cagaguuauc aaggcacau 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 21 aguuggugcu gcuucagaa 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 22 uucugaagca gcaccaacu 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 23 aauaaggggc ugccacagg 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 24 ccuguggcag ccccuuauu 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 25 uaacucuguc caucaccau 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 26 auggugaugg acagaguua 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 27 augagccucg auaacucug 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 28 cagaguuauc gaggcucau 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 29 aaugagccuc gauaacucu 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 30 agaguuaucg aggcucauu 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 31 aaugcuucca ggacauuuc 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 32 gaaauguccu ggaagcauu 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 33 acaguggugg agaaugugc 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 34 gcacauucuc caccacugu 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 35 guaugugccu cgauaacuc 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 36 gaguuaucga ggcacauac 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 37 ucgauaacuc uguccauca 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 38 ugauggacag aguuaucga 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 39 ugucacugga cauuguguc 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 40 gacacaaugu ccagugaca 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 41 cugggaucca ugguguaac 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 42 guuacaccau ggaucccag 19 <210> 43 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 43 agaugaccaa gcuuggcag 19 <210> 44 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 44 cugccaagcu uggucaucu 19 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 aagtgtcctt gcgacgtcc 19 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 cctggactgt ggggcttt 18 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 47 ctgtttctga acaagcacca acggagc 27 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 gtgtcctcgc aacgtcca 18 <210> 49 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 gaccccgggg ctttg 15 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 50 tggctgtttc tgaacaagca ccaatgg 27 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 tcattccttc cccaaagaga cc 22 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 cacctccgtt ttggtggtag ag 22 <210> 53 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 53 caagctgctc agtggaggca acacatta 28 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 gcatgggtca gaaggattcc tat 23 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 tgtagaaggt gtggtgccag att 23 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 56 tcgagcacgg catcgtcacc aa 22 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 57 aaggccaacc gcgagaag 18 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 58 agaggcgtac agggacagca 20 <210> 59 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 59 tgagaccttc aacaccccag ccatgtac 28 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 60 agatgtaggc cgggtgatct tt 22 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 61 gtagccaaat cctttctctc ctgt 24 <210> 62 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 62 tgttccaaaa acagtggata attttgtggc c 31 <210> 63 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 63 uuaacucugu ccauuaccg 19 <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 64 cgguaaugga cagaguuaa 19 <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 65 uuaacucugu ccauuaccc 19 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 66 ggguaaugga cagaguuaa 19 <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 67 uuaacucugu ccauuaccu 19 <210> 68 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 68 agguaaugga cagaguuaa 19 <210> 69 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 69 auaacucugu ccauuaccc 19 <210> 70 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 70 ggguaaugga cagaguuau 19 <210> 71 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 71 auaacucugu ccauuaccu 19 <210> 72 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 72 agguaaugga cagaguuau 19 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 73 uuaacucugu ccauuacca 19 <210> 74 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 74 ugguaaugga cagaguuaa 19 <210> 75 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 75 ucguauaaca auaaggggc 19 <210> 76 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 76 gccccuuauu guuauacga 19 <210> 77 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 77 gauaacucug uccauuacc 19 <210> 78 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 78 gguaauggac agaguuauc 19 <210> 79 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 79 auaacucugu ccauuacca 19 <210> 80 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 80 ugguaaugga cagaguuau 19 <210> 81 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 81 uaacucuguc cauuaccgu 19 <210> 82 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 82 acgguaaugg acagaguua 19 <210> 83 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 83 auaacucugu ccauuaccg 19 <210> 84 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 84 cgguaaugga cagaguuau 19 <210> 85 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 85 agaaugugcc ucgauaacu 19 <210> 86 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 86 aguuaucgag gcacauucu 19 <210> 87 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 87 auaacucugu ccaucacca 19 <210> 88 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 88 uggugaugga cagaguuau 19 <210> 89 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 89 auaacucugu ccaucaccu 19 <210> 90 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 90 aggugaugga cagaguuau 19 <210> 91 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 91 uaacucuguc cauuaccau 19 <210> 92 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 92 augguaaugg acagaguua 19 <210> 93 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 93 augugccuug auaacucug 19 <210> 94 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 94 cagaguuauc aaggcacau 19 <210> 95 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 95 aguuggugcu gcuucagaa 19 <210> 96 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 96 uucugaagca gcaccaacu 19 <210> 97 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 97 aauaaggggc ugccacagg 19 <210> 98 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 98 ccuguggcag ccccuuauu 19 <210> 99 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 99 uaacucuguc caucaccau 19 <210> 100 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 100 auggugaugg acagaguua 19 <210> 101 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 101 augagccucg auaacucug 19 <210> 102 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 102 cagaguuauc gaggcucau 19 <210> 103 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 103 aaugagccuc gauaacucu 19 <210> 104 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 104 agaguuaucg aggcucauu 19 <210> 105 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 105 aaugcuucca ggacauuuc 19 <210> 106 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 106 gaaauguccu ggaagcauu 19 <210> 107 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 107 acaguggugg agaaugugc 19 <210> 108 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 108 gcacauucuc caccacugu 19 <210> 109 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 109 guaugugccu cgauaacuc 19 <210> 110 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 110 gaguuaucga ggcacauac 19 <210> 111 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 111 ucgauaacuc uguccauca 19 <210> 112 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 112 ugauggacag aguuaucga 19 <210> 113 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 113 ugucacugga cauuguguc 19 <210> 114 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 114 gacacaaugu ccagugaca 19 <210> 115 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 115 cugggaucca ugguguaac 19 <210> 116 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 116 guuacaccau ggaucccag 19 <210> 117 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 117 agaugaccaa gcuuggcag 19 <210> 118 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 118 cugccaagcu uggucaucu 19 <210> 119 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 119 auaacucugu ccauuacca 19 <210> 120 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 120 ugguaaugga cagaguuau 19 <210> 121 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 121 auaacucugu ccauuacca 19 <210> 122 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 122 ugguaaugga cagaguuau 19 <210> 123 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 123 auaacucugu ccauuaccg 19 <210> 124 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 124 cgguaaugga cagaguuau 19 <210> 125 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 125 auaacucugu ccauuaccg 19 <210> 126 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 126 cgguaaugga cagaguuau 19 <210> 127 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 127 uuauagagca agaacacugu u 21 <210> 128 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 128 aacaguguuc uugcucuaua a 21 <210> 129 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 129 uuauagagca agaacacugu u 21 <210> 130 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 130 aacaguguuc uugcucuaua a 21 <210> 131 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 131 aacaguguuc uugcucuaua a 21 <210> 132 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 132 ucgaaguauu ccgcguacg 19 <210> 133 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 133 cguacgcgga auacuucga 19 <210> 134 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 134 aacaguguuc uugcucuaua a 21 <210> 135 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 135 auaacucugu ccauuaccg 19 <210> 136 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 136 cgguaaugga cagaguuau 19 <210> 137 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 137 cgguaaugga cagaguuau 19 <210> 138 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 138 cuuacucucg cccaagcga 19 <210> 139 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 139 ucgcuugggc gagaguaag 19 <210> 140 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 140 tggctgtttc tgaacaagca ccaatgg 27 <210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 141 tcgagcacgg catcgtcacc aa 22 <210> 142 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 142 aacaguguuc uugcucuaua a 21 <210> 143 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 143 aacaguguuc uugcucuaua a 21 <210> 144 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 144 aacaguguuc uugcucuaua a 21 <210> 145 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 145 aacaguguuc uugcucuaua a 21 <210> 146 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, 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summary sequence table at the end of the description <400> 151 ucuucuuaaa cugaguuuc 19 <210> 152 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 152 gaaacucagu uuaagaaga 19 <210> 153 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 153 auguagccga ggaucuucu 19 <210> 154 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 154 agaagauccu cggcuacau 19 <210> 155 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 155 aaccagaaga agcagguga 19 <210> 156 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 156 ucaccugcuu cuucugguu 19 <210> 157 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 157 aacaguguuc uugcucuaua a 21 <210> 158 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 158 gaaacucagu uuaagaaga 19 <210> 159 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 159 agaagauccu cggcuacau 19 <210> 160 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 160 uaccagaaga agcagguga 19 <210> 161 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 161 ucaccugcuu cuucuggua 19 <210> 162 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 162 cgguaaugga cagaguuau 19

Claims (28)

  1. 세포에서 LPA의 발현을 저해하기 위한 핵산으로서,
    제1 가닥의 적어도 일부, 및 상기 제1 가닥과 적어도 부분적으로 상보성인 제2 가닥의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하되, 상기 제1 가닥은 상기 LPA 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부와 적어도 부분적으로 상보성이고, 상기 제1 가닥은 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 가닥은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 가닥이 19 내지 35개의 뉴클레오타이드 길이이거나; 상기 제2 가닥이 17 내지 35개의 뉴클레오타이드 길이이거나; 상기 제1 가닥이 19 내지 35개의 뉴클레오타이드 길이이고 상기 제2 가닥이 17 내지 35개의 뉴클레오타이드 길이인, 핵산.
  4. 제3항에 있어서, 상기 적어도 하나의 듀플렉스 영역은 17 내지 25개의 연속되는 뉴클레오타이드 염기 쌍으로 이루어진 것인, 핵산.
  5. 제4항에 있어서, 상기 적어도 하나의 듀플렉스 영역은 19 내지 25개의 연속되는 뉴클레오타이드 염기 쌍으로 이루어진 것인, 핵산.
  6. 제4항에 있어서, 상기 핵산은,
    a) 양 단부에서 평활 단부(blunt ended)이거나; 또는
    b) 하나의 단부에서 오버행을 갖고, 나머지 단부에서 평활 단부를 갖거나; 또는
    c) 양 단부에서 오버행을 갖는, 핵산.
  7. 제1항에 있어서,
    (i) 제1 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 변형되거나,
    (ii) 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 변형되거나, 또는
    (iii) 상기 제1 가닥 및 상기 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 변형되어,
    변형된 뉴클레오타이드를 형성하는, 핵산.
  8. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 제1 가닥, 제2 가닥, 또는 제1 및 제2 가닥의 하나 또는 양 단부의, 말단 2개 또는 3개의 3' 뉴클레오타이드;
    말단 2개 또는 3개의 5' 뉴클레오타이드; 또는
    말단 2개 또는 3개의 3' 뉴클레오타이드 및 5' 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 링키지를 포함하는, 핵산.
  9. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 리간드에 접합된, 핵산.
  10. 제9항에 있어서, 상기 리간드는 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc) 모이어티 또는 이의 유도체 및 (ii) 링커를 포함하되, 상기 링커는 적어도 하나의 GalNAc 모이어티 또는 이의 유도체를 상기 핵산에 접합시키는, 핵산.
  11. 제9항에 있어서, 상기 핵산은 하기 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 리간드에 접합되되:
    [S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
    (식 중,
    S는 당류를 나타내고;
    X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-이되, m은 1, 2 또는 3이며;
    P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트이고;
    X2는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 또는 알킬렌 에터이되, n은 1 내지 6이며;
    A는 분지 단위이고;
    X3은 브리징 단위를 나타냄);
    여기서, 제1항에 정의된 바와 같은 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트를 통해서 X3에 접합된, 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 상기 당류는 N-아세틸 갈락토사민인, 핵산.
  13. 제11항에 있어서, 상기 변형된 포스페이트는 티오포스페이트인, 핵산.
  14. 제9항에 있어서, 상기 제1 RNA 가닥은 하기 화학식 (X)의 화합물이고:
    Figure 112023014990259-pct00135

    (식 중, b는 0 또는 1임);
    상기 제2 RNA 가닥은 하기 화학식 (XI)의 화합물인, 핵산:
    Figure 112023014990259-pct00136

    (식 중,
    c 및 d는 독립적으로 0 또는 1이고;
    Z1 및 Z2는 각각 제1 RNA 가닥 및 제2 RNA 가닥의 RNA 부분이며;
    Y는 O 또는 S이고;
    n은 0, 1, 2 또는 3이며;
    L1은 리간드가 부착된 링커이되;
    b + c + d는 2 또는 3임).
  15. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 리간드에 접합되고, 하기 구조를 갖는, 핵산:
    Figure 112023014990259-pct00181

    여기서, Z는 제1항에 따른 핵산이다.
  16. 제15항에 있어서, 상기 핵산은 상기 제1 가닥 상의 3개의 말단 3' 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고 3개의 말단 5' 뉴클레오타이드 각각 사이에 2개의 포스포로티오에이트 링키지, 및 상기 제2 가닥의 3' 단부의 3개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 링키지를 포함하되, 상기 리간드는 상기 제2 가닥의 5' 단부에 접합된, 핵산.
  17. 제2항에 있어서, 상기 핵산은 리간드에 접합되고, 하기 구조를 갖는 핵산:
    Figure 112023014990259-pct00182

    여기서, Z는 제2항에 따른 핵산이다.
  18. 제17항에 있어서, 상기 핵산은 상기 제1 가닥 상의 3개의 말단 3' 뉴클레오타이드 각각 사이에 그리고 3개의 말단 5' 뉴클레오타이드 각각 사이에 2개의 포스포로티오에이트 링키지, 및 상기 제2 가닥의 3' 단부의 3개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 링키지를 포함하되, 상기 리간드는 상기 제2 가닥의 5' 단부에 접합된, 핵산.
  19. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 리간드에 접합되되, 제1 RNA 가닥은 하기 화학식 (XV)의 화합물이고:
    Figure 112023014990259-pct00138

    (식 중, b는 0 또는 1임);
    제2 RNA 가닥은 하기 화학식 (XVI)의 화합물인, 핵산:
    Figure 112023014990259-pct00139

    (식 중, c 및 d는 독립적으로 0 또는 1이고;
    Z1 및 Z2는 각각 제1 RNA 가닥 및 제2 RNA 가닥의 RNA 부분이며;
    Y는 O 또는 S이고;
    R1은 H 또는 메틸이며;
    n은 0, 1, 2 또는 3이며;
    L은 화학식 (XV) 및 (XVI)에서 동일하거나 또는 상이하고,
    -(CH2)q(여기서 q는 2 내지 12임);
    -(CH2)r-C(O)-(여기서 r은 2 내지 12임);
    -(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-(여기서 s는 1 내지 5임);
    -(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-(여기서 t는 독립적으로 1 내지 5임);
    -(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-(여기서 u는 독립적으로 1 내지 5임); 및
    -(CH2)v-NH-C(O)-(여기서 v는 2 내지 12임)
    로 이루어진 군으로부터 선택되되;
    말단 C(O)는, 존재하는 경우, NH기에 부착되고;
    b + c + d는 2 또는 3임).
  20. 제1항에 있어서, 하기에 나타낸 바와 같은 서열 및 변형을 포함하는, 핵산:
    Figure 112023014990259-pct00140

    (식 중, 특정 변형은 하기 번호에 의해서 표시됨:
    1=2'F-dU,
    2=2'F-dA,
    3=2'F-dC,
    4=2'F-dG,
    5=2'-OMe-rU;
    6=2'-OMe-rA;
    7=2'-OMe-rC;
    8=2'-OMe-rG).
  21. 제1항에 있어서, 상기 제1 가닥의 5' 단부로부터의 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 그리고 상기 제1 가닥의 11번 위치 또는 13번 위치, 또는 11번 및 13번 위치, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 상기 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드는 2' 플루오로 변형으로 변형된 것인, 핵산.
  22. 제2항에 있어서, 상기 제1 가닥의 5' 단부로부터 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 그리고 상기 제1 가닥의 11번 위치, 또는 13번 위치, 또는 11번 및 13번 위치, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 상기 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2' 플루오로 변형으로 변형된 것인, 핵산.
  23. 제15항에 있어서, 상기 제1 가닥의 5' 단부로부터 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 그리고 상기 제1 가닥의 11번 위치, 또는 13번 위치, 또는 11번 및 13번 위치, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 상기 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2' 플루오로 변형으로 변형된 것인, 핵산.
  24. 제17항에 있어서, 상기 제1 가닥의 5' 단부로부터 2번 및 14번 위치에서의 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형으로 변형되고, 그리고 상기 제1 가닥의 11번 위치, 또는 13번 위치, 또는 11번 및 13번 위치, 또는 11번 내지 13번 위치에 상응하는 상기 제2 가닥 상의 뉴클레오타이드가 2' 플루오로 변형으로 변형된 것인, 핵산.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는, 심혈관 질환의 예방, 치료 또는 이의 위험 감소에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 조성물은 전달 비히클, 생리학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 희석제, 완충제 및 방부제 중 적어도 하나를 포함하는, 약제학적 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 뇌졸중, 죽상경화증, 혈전증, 관상동맥 심장 질환, 대동맥 협착증, 또는 Lp(a)-함유 입자의 증가된 수준과 연관된 임의의 다른 질환 또는 병상(pathology)인, 약제학적 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 상기 전달 비히클은 하나 이상의 리포솜인, 약제학적 조성물.
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