BR112020009152A2 - ácidos nucleicos para inibição da expressão de lpa em uma célula - Google Patents

ácidos nucleicos para inibição da expressão de lpa em uma célula Download PDF

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Abstract

  A presente invenção refere-se a produtos e composições e seus usos. Em particular, a invenção refere-se a produtos de ácido nucleico que interferem na expressão do gene LPA ou inibem sua expressão para uso como tratamento, prevenção ou redução do risco de sofrer de doenças cardiovasculares, como doença arterial coronariana ou estenose aórtica ou acidente vascular cerebral ou qualquer outro distúrbio, patologia ou síndrome ligada a níveis elevados de partículas contendo Lp(a).

Description

“ÁCIDOS NUCLEICOS PARA INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO DE LPA EM UMA CÉLULA”
[001] A presente invenção refere-se a produtos e composições e seus usos. Particularmente, a invenção se relaciona a produtos de ácido nucleico que interferem na expressão do gene LPA ou inibem sua expressão. Essa terapia de redução de Lp(a) terapêutica serve para prevenir e reduzir o risco de sofrer acidente vascular cerebral, aterosclerose, trombose e doenças cardiovasculares, como doença cardíaca coronariana e estenose aórtica ou qualquer outro distúrbio, patologia ou síndrome ligada a níveis elevados de partículas contendo Lp(a).
FUNDAMENTOS
[002] Demonstrou-se que o RNA de fita dupla (dsRNA) capaz de ligar complementarmente o mRNA expresso é capaz de bloquear a expressão do gene (Fire et al., 1998, Nature. 19 de fevereiro de 1998; 391 (6669): 806-11 e Elbashir et al., 2001, Nature. 24 de maio de 2001; 411(6836):494-8) através de um mecanismo que foi denominado interferência de RNA (iRNA). Os dsRNAs curtos direcionam o silenciamento pós-transcricional específico do gene em muitos organismos, incluindo os vertebrados, e se tornaram uma ferramenta útil para o estudo da função do gene. O iRNA é mediado pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), uma nuclease multicomponente de sequência específica que degrada os RNAs mensageiros homólogos à gatilho de silenciamento carregada no complexo RISC. RNA interferente (denominado iRNA neste documento), tal como siRNAs, RNA de segunda fita e micro-RNA são oligonucleotídeos que impedem a formação de proteínas por silenciamento de genes, isto é, inibem a tradução de genes da proteína através da degradação de moléculas de mRNA. Os agentes silenciadores de genes estão se tornando cada vez mais importantes para aplicações terapêuticas na medicina.
[003] De acordo com Watts e Corey no Journal of Pathology (2012; Vol 226, p 365-379), existem algoritmos que podem ser usados para projetar gatilhos de silenciamento de ácidos nucleicos, mas todos eles têm limitações graves. Podem ser necessários vários métodos experimentais para identificar iRNAs potentes, pois os algoritmos não levam em conta fatores como a estrutura terciária do mRNA alvo ou o envolvimento de proteínas de ligação ao RNA. Portanto, a descoberta de um gatilho de silenciamento de ácido nucleico potente com efeitos mínimos fora do alvo é um processo complexo. Para o desenvolvimento farmacêutico dessas moléculas altamente carregadas, é necessário que elas possam ser sintetizadas de forma econômica, distribuídas nos tecidos alvo, entrar nas células e funcionar dentro dos limites aceitáveis de toxicidade.
[004] Lp(a) é uma partícula de lipoproteína heterogênea de baixa densidade expressa predominantemente no fígado (Witztum e Ginsberg, J. Lipid Res. 2016 Mar; 57(3):336-9). É composta pela Apolipoproteína(a) (Apo(a) codificada pelo gene LPA) ligada a LDL pelo polipeptídeo ApoB. Níveis séricos elevados de Lp(a) geneticamente definidos não são afetados pela dieta e pelo exercício e estão associados a maior risco de sofrer de doença cardiovascular através do potencial aterosclerótico associado (Alonso et al., Journal of American College of Cardiology Vol. 63, No. 19, 2014). Em termos de diagnóstico e medicina preventiva, o nível sérico de Lp(a) do paciente é um fator de risco genético independente e altamente prevalente para doença cardíaca coronariana e estenose aórtica (Saeedi and Frohlich Clinical Diabetes and Endocrinology (2016) 2:7). Atualmente, não existe uma terapia específica de redução de Lp(a) aprovada além das medidas de redução de LDL gerais indiretas padrão. Por conseguinte, atualmente são necessários métodos para tratamento eficaz, prevenção e redução do risco de sofrer de distúrbios similares e associados a acidente vascular cerebral, aterosclerose, trombose e doenças cardiovasculares como doença arterial coronariana, estenose aórtica e outros distúrbios, patologias ou síndromes associados ainda não identificados. A presente invenção trata dessa necessidade médica não atendida:
[005] Um primeiro aspecto da invenção refere-se a um ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a referida primeira fita compreende uma sequência nucleotídica selecionada das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73.
[006] Em uma modalidade, o ácido nucleico compreende na primeira fita uma sequência de pelo menos 15, preferencialmente pelo menos 16, mais preferencialmente pelo menos 17, mais preferencialmente pelo menos 18 e mais preferencialmente pelo menos 19 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de referência SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73.
[007] Em uma modalidade, o número de incompatibilidades de nucleotídeo único na sequência da primeira fita em relação à porção da sequência de referência que é compreendida na sequência da primeira fita é no máximo três, preferencialmente no máximo duas, mais preferencialmente no máximo uma e mais preferencialmente zero.
[008] A segunda fita pode compreender uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 44, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74.
[009] A primeira fita pode compreender a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 9 e/ou a segunda fita pode compreender a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 10.
[0010] A primeira fita e/ou a segunda fita podem ter, cada uma, 17- 35 nucleotídeos de comprimento e pelo menos uma região duplex pode ter 10- 25 nucleotídeos de comprimento. O duplex pode compreender duas fitas separadas ou pode compreender uma única fita que compreende a primeira fita e a segunda fita.
[0011] O ácido nucleico pode: a) possuir extremidades cegas nas duas extremidades; b) possuir overhang em uma extremidade e uma extremidade cega na outra; ou c) possuir overhang nas duas extremidades.
[0012] Um ou mais nucleotídeos na primeira e/ou na segunda fita podem ser modificados, para formar nucleotídeos modificados. Um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita podem ser modificados. Um ou mais dos nucleotídeos de números pares da primeira fita podem ser modificados por pelo menos uma segunda modificação, em que pelo menos a segunda modificação é diferente da modificação nos um ou mais nucleotídeos ímpares. Pelo menos um dos um ou mais nucleotídeos de números pares modificados pode ser adjacente a pelo menos um dos um ou mais nucleotídeos de números ímpares modificados.
[0013] Uma pluralidade de nucleotídeos de números ímpares na primeira fita pode ser modificada no ácido nucleico da invenção. Uma pluralidade de nucleotídeos de números pares da primeira fita pode ser modificada por uma segunda modificação. A primeira fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum. A primeira fita também pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação diferente.
[0014] Um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares da segunda fita pode ser modificado por uma modificação que é diferente da modificação dos nucleotídeos de números ímpares na primeira fita e/ou um ou mais dos nucleotídeos de números pares da segunda fita pode ser modificado pela mesma modificação que os nucleotídeos de números ímpares da primeira fita. Pelo menos um dos um ou mais nucleotídeos de números pares modificados da segunda fita pode ser adjacente a um dos um ou mais nucleotídeos de números ímpares modificados. Uma pluralidade de nucleotídeos de números ímpares da segunda fita pode ser modificada por uma modificação comum e/ou uma pluralidade de nucleotídeos de números pares pode ser modificada pela mesma modificação que está presente nos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita. Uma pluralidade de nucleotídeos de números ímpares da segunda fita pode ser modificada por uma segunda modificação, em que a segunda modificação é diferente da modificação dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita.
[0015] A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum, que pode ser uma segunda modificação que é diferente da modificação dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita.
[0016] No ácido nucleico da invenção, cada um dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita e cada um dos nucleotídeos de números pares na segunda fita pode ser modificado com uma modificação comum e, cada um dos nucleotídeos de números pares pode ser modificado na primeira fita com uma segunda modificação e cada um dos nucleotídeos de números ímpares pode ser modificado na segunda fita com uma segunda modificação diferente.
[0017] O ácido nucleico da invenção pode ter os nucleotídeos modificados da primeira fita deslocados por pelo menos um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos não modificados ou modificados de maneira diferente da segunda fita.
[0018] A modificação e/ou modificações podem cada uma e individualmente ser selecionadas do grupo que consiste em desoxitimina 3'- terminal, 2'-O-metil, uma modificação 2'-desoxi, uma modificação 2'-amino, uma modificação 2'-alquil, uma modificação de morfolino, uma modificação fosforamidato, modificação do grupo 5'-fosforotioato, uma modificação 5' fosfato ou mímico de 5' fosfato e uma derivação de colesteril ou uma modificação do grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico e/ou o nucleotídeo modificado podem ser qualquer um de um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natural compreendendo nucleotídeo.
Pelo menos uma modificação pode ser 2'-O-metil e/ou pelo menos uma modificação pode ser 2'-F.
[0019] A invenção fornece ainda, como um segundo aspecto, um ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula, compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73, em que os nucleotídeos da primeira fita são modificados por uma primeira modificação nos nucleotídeos de números ímpares e modificados por uma segunda modificação nos nucleotídeos de números pares e os nucleotídeos da segunda fita são modificados por uma terceira modificação nos nucleotídeos de números pares e modificados por uma quarta modificação nos nucleotídeos de números ímpares, em que pelo menos a primeira modificação é diferente da segunda modificação e a terceira modificação é diferente da quarta modificação. A segunda fita pode compreender uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74. A terceira modificação e a primeira modificação podem ser as mesmas e/ou a segunda modificação e a quarta modificação podem ser as mesmas.
[0020] A primeira modificação pode ser 2'OMe e a segunda modificação pode ser 2'F.
[0021] No ácido nucleico do segundo aspecto, a primeira fita pode compreender a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 9 e a segunda fita pode compreender a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 10.
[0022] A sequência e as modificações podem ser as mostradas na Tabela abaixo; que mostra sequências preferenciais com base em um extrato da Tabela 1, conforme fornecido neste documento: SEQ ID NO: 5 5‘ auaacucuguccauuacca 3‘ 6162717181736152736 SEQ ID NO: 6 5‘ ugguaauggacagaguuau 3‘ 1845261846364645161 SEQ ID NO: 9 5‘ auaacucuguccauuaccg 3‘ 6162717181736152738 SEQ ID NO:10 5‘ cgguaauggacagaguuau 3‘ 3845261846364645161 em que as modificações específicas são representadas pelos seguintes números 1=2´F-dU, 2=2‗F-dA, 3=2´F-dC, 4=2´F-dG, 5=2'-OMe-rU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG.
[0023] Um ácido nucleico da invenção pode compreender uma ligação fosforotioato entre o um, dois ou três nucleotídeos 3' e/ou um, dois ou três nucleotídeos 5' terminais da primeira e/ou da segunda fita. Pode compreender duas ligações fosforotioato entre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e entre cada um dos três 5' terminais na primeira fita, e duas ligações fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais da extremidade 3' da segunda fita.
[0024] Tal ácido nucleico pode ser conjugado a um ligante.
[0025] A invenção fornece, como um terceiro aspecto, um ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula, compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a referida primeira fita compreende uma sequência nucleotídica selecionada das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73 e em que o ácido nucleico é conjugado a um ligante.
[0026] O ligante pode compreender (i) uma ou mais frações N-acetil galactosamina (GalNAc) e seus derivados, e (ii) um ligante peptídico, em que o ligante peptídico conjuga as frações GalNAc a uma sequência conforme definido em quaisquer aspectos anteriores. O ligante peptídico pode ser uma estrutura ramificada bivalente ou trivalente ou tetravalente. Os nucleotídeos podem ser modificados como definido neste documento.
[0027] O ligante pode compreender a fórmula I: [S-X1-P-X2]3-A-X3- (I) em que: S representa um sacarídeo, em que o sacarídeo é N-acetil galactosamina; X1 representa C3-C6 alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato); X2 é alquileno ou um éter de alquileno de fórmula (-CH2)n-O-CH2-, onde n = 1- 6; A é uma unidade de ramificação; X3 representa uma unidade de formação de ponte; em que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é conjugado a X3 através de um fosfato ou fosfato modificado (de preferência um tiofosfato).
[0028] Portanto, a presente invenção fornece um ácido nucleico conjugado tendo uma das seguintes estruturas em que Z representa um ácido nucleico como definido anteriormente neste documento.
[0029] Alternativamente, um ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser conjugado com um ligante com a seguinte estrutura:
OH HO O H H HO O N N O NHAC Θ OH O P O O O OH O N HO H O H H N HO O N N O NHAC O O O O O NHAC HO O N N O H H HO OH
[0030] A presente invenção refere-se a um conjugado para inibir a expressão de um gene LPA em uma célula, o referido conjugado compreendendo uma porção de ácido nucleico e porções de ligante, a referida porção de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita de RNA e pelo menos uma porção de uma segunda fita de RNA que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrita a partir do referido gene LPA, as referidas porções de ligante compreendendo uma fração ligante, preferencialmente uma fração ligante derivada de serinol e um ligante de direcionamento para direcionamento in vivo de células e sendo conjugado exclusivamente às extremidades 3' e/ou 5' de uma ou ambas as fitas de RNA, em que a extremidade 5' da primeira fita de RNA não está conjugada, em que: (i) a segunda fita de RNA é conjugada na extremidade 5' ao ligante de direcionamento e em que (a) a segunda fita de RNA também é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da primeira fita de RNA não é conjugada; ou (b) a primeira fita de RNA é conjugada na extremidade 3' com o ligante de direcionamento e a extremidade 3' da segunda fita de RNA não é conjugada; ou (c) tanto a segunda fita de RNA quanto a primeira fita de RNA também são conjugadas nas extremidades 3' do ligante de direcionamento; ou (ii) a segunda fita de RNA e a primeira fita de RNA são conjugadas nas extremidades 3' do ligante de direcionamento e a extremidade 5' da segunda fita de RNA não é conjugada, ou a presente invenção refere-se a um conjugado para inibir a expressão de um gene LPA em uma célula, o referido conjugado compreendendo uma porção de ácido nucleico e porções de ligante, a referida porção de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita de RNA e pelo menos uma porção de uma segunda fita de RNA que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrita a partir do referido gene LPA, as referidas porções de ligantes compreendendo uma fração ligante e um ligante de direcionamento para direcionamento in vivo de células e sendo conjugado exclusivamente às extremidades 3' e/ou 5' de uma ou ambas as fitas de RNA, em que a extremidade 5' da primeira fita de RNA não está conjugada, em que: (i) a segunda fita de RNA é conjugada na extremidade 5' ao ligante de direcionamento e em que (a) a segunda fita de RNA também é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da primeira fita de RNA não é conjugada; ou (b) a primeira fita de RNA é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da segunda fita de RNA não é conjugada; ou (c) tanto a segunda fita de RNA quanto a primeira fita de RNA também são conjugadas nas extremidades 3' do ligante de direcionamento; ou (ii) a segunda fita de RNA e a primeira fita de RNA são conjugadas nas extremidades 3' do ligante de direcionamento e a extremidade 5' da segunda fita de RNA não é conjugada.
[0031] A fração ligante pode, por exemplo, ser uma fração ligante derivada de serinol ou um dos outros tipos de ligantes peptídico descritos neste documento.
[0032] A invenção também fornece uma composição compreendendo o ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de qualquer aspecto da invenção e um excipiente fisiologicamente aceitável.
[0033] Também é fornecido um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer aspecto da invenção para uso no tratamento de uma doença, distúrbio ou síndrome e/ou na fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença, distúrbio ou síndrome.
[0034] A invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de uma doença, distúrbio ou síndrome compreendendo a administração de uma composição compreendendo um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer aspecto da invenção a um indivíduo em necessidade de tratamento. O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado pode ser administrado ao sujeito por via subcutânea, intravenosa ou usando quaisquer outras vias de aplicação, tais como oral, retal ou intraperitoneal.
[0035] Após aplicação subcutânea, a invenção pode ser administrada de uma maneira específica para tecido ao fígado (hepatócitos) e direcionar-se especificamente ao LPA, a fim de reduzir efeitos colaterais indesejados e atingir uma dose terapêutica mais baixa necessária para alcançar o efeito desejado.
[0036] A invenção ou a composição farmacêutica compreendendo o ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção pode ser usada no tratamento de uma doença, distúrbio ou síndrome. O tratamento pode ser para prevenir e reduzir o risco de sofrer acidente vascular cerebral, aterosclerose, trombose ou doenças cardiovasculares, como doença arterial coronariana ou estenose aórtica e qualquer outra doença ou patologia associada a níveis elevados de partículas contendo Lp(a).
[0037] Um método para produzir o ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com a invenção também está incluído.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0038] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico que é de cadeia dupla e direcionado a uma transcrição de RNA expresso de LPA e suas composições. Estes ácidos nucleicos ou ácidos nucleicos conjugados podem ser utilizados no tratamento e prevenção de uma variedade de doenças, distúrbios e síndromes onde a expressão reduzida do produto do gene LPA é desejável.
[0039] Um primeiro aspecto da invenção refere-se a um ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a referida primeira fita compreende uma sequência nucleotídica selecionada das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73.
[0040] O ácido nucleico pode compreender uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 9, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 10; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 5 e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 6; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 1 e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 2; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 4 e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 4; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 7 e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 8; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 11, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 12; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 13 e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 14; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 15 e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 16; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 17 e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 18; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 19, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 20; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 21, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 22; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 23, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 24; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 25, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 26; ou uma primeira fita que compreende uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 27, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 28; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 29 e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 30; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 31, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 32; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 33, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 34; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 35 e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 36; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 37, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 38; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 39, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 40; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 41, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 42; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 43, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 44; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 63, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 64; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 65 e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 66; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 67, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 68; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 69, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 70; ou uma primeira fita que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 71, e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 72; ou uma primeira fita que compreende uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 73 e opcionalmente em que a segunda fita compreende uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 74.
[0041] O gene LPA compreende sequências altamente repetitivas. Os ácidos nucleicos da primeira fita com sequências muito semelhantes podem, portanto, ter complementaridade perfeita da sequência com regiões alvo muito diferentes do mRNA.
[0042] Um aspecto relacionado da invenção é um ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula, em que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região duplex que compreende: uma primeira fita; e uma segunda fita, em que a referida segunda fita é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de pelo menos 15, preferencialmente pelo menos 16, mais preferencialmente pelo menos 17, ainda mais preferencialmente pelo menos 18 e mais preferencialmente pelo menos 19 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de referência SEQ ID NO: 9, 5, 1, 3, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73, e em que o número de nucleotídeos únicos incompatíveis e/ou deleções e/ou inserções na primeira sequência de fitas em relação à porção da sequência de referência que é compreendida na primeira sequência de fitas é no máximo três, preferencialmente no máximo dois, mais preferencialmente no máximo um e mais preferencialmente zero.
[0043] Em um aspecto, a primeira fita do ácido nucleico compreende uma sequência de pelo menos 18 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de referência, preferencialmente de qualquer uma das sequências de referência SEQ ID NO: 9 e 5 e em que o número de nucleotídeos únicos incompatíveis e/ou deleções e/ou inserções na sequência da primeira fita em relação à porção da sequência de referência que está compreendida na sequência da primeira fita é no máximo uma e, preferencialmente, zero.
[0044] Em um aspecto, a primeira fita do ácido nucleico compreende uma sequência de pelo menos 19 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de referência SEQ ID NO: 9 e 5.
[0045] Um certo número de incompatibilidades, deleções ou inserções entre a primeira fita (antisense) e a sequência alvo ou entre a primeira fita e a segunda fita (sense) pode ser tolerado no contexto de siRNA e tem até mesmo, em certos casos, o potencial de aumentar a atividade.
[0046] Por ácido nucleico, entende-se um ácido nucleico compreendendo duas cadeias compreendendo nucleotídeos, capaz de interferir na expressão do gene. A inibição pode ser completa ou parcial e resulta na regulação negativa da expressão do gene de maneira direcionada. O ácido nucleico compreende duas fitas polinucleotídicas separadas; a primeira fita, que também pode ser uma fita guia; e uma segunda fita, que também pode ser uma fita passageira. A primeira fita e a segunda fita podem fazer parte da mesma molécula polinucleotídica que é autocomplementar que 'dobra' para trás para formar uma molécula de fita dupla. O ácido nucleico pode ser uma molécula de siRNA.
[0047] O ácido nucleico pode compreender ribonucleotídeos, ribonucleotídeos modificados, desoxinucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou análogos de nucleotídeos não nucleotídeos que são capazes de imitar nucleotídeos de modo que eles possam "parear" com a base correspondente na sequência alvo ou na fita complementar. O ácido nucleico pode compreender ainda uma porção de ácido nucleico de fita dupla ou região duplex formada por toda ou uma porção da primeira fita (também conhecida na técnica como fita guia) e toda ou uma porção da segunda fita (também conhecida na técnica como fita passageira). A região duplex é definida como começando com o primeiro par de bases formado entre a primeira fita e a segunda fita e terminando com o último par de bases formado entre a primeira fita e a segunda fita, inclusive.
[0048] Por região duplex, entende-se a região em dois oligonucleotídeos complementares ou substancialmente complementares que formam pares de bases um com o outro, seja por pareamento de bases de Watson-Crick ou de qualquer outra maneira que permita um duplex entre as fitas de oligonucleotídeos que sejam complementares ou substancialmente complementares. Por exemplo, uma fita de oligonucleotídeo com 21 unidades de nucleotídeo pode formar pares de bases com outro oligonucleotídeo de 21 unidades de nucleotídeo, mas apenas 19 nucleotídeos em cada fita são complementares ou substancialmente complementares, de modo que a "região duplex" consiste em 19 pares de bases. Os pares de bases restantes podem existir como overhangs 5 'e 3' ou como regiões de fita simples. Além disso, não é necessário 100% de complementaridade na região duplex; complementaridade substancial é permitida dentro de uma região duplex. Complementaridade substancial refere-se à complementaridade entre as fitas, de modo que elas sejam capazes de anelamento sob condições biológicas. Técnicas para determinar empiricamente se duas fitas são capazes de anelamento em condições biológicas são bem conhecidas na técnica.
Alternativamente, duas fitas podem ser sintetizadas e adicionadas juntas em condições biológicas para determinar se elas fazem um anelamento.
[0049] As porções da primeira fita e da segunda fita que formam pelo menos uma região duplex podem ser totalmente complementares e são pelo menos parcialmente complementares entre si. Dependendo do comprimento de um ácido nucleico, não é necessariamente exigida uma combinação perfeita em termos de complementaridade de bases entre a primeira fita e a segunda fita. No entanto, a primeira e segunda fitas devem ser capazes de hibridar em condições fisiológicas.
[0050] A complementaridade entre a primeira fita e a segunda fita em pelo menos uma região duplex pode ser perfeita, em que não há incompatibilidade de nucleotídeos ou nucleotídeos adicionais/deletados em qualquer fita. Alternativamente, a complementaridade pode não ser perfeita. A complementaridade pode ser de cerca de 70% a cerca de 100%. Mais especificamente, a complementaridade pode ser de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% e valores intermediários.
[0051] No contexto desta invenção, "uma porção de" como por exemplo em "uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita" deve ser entendida como significando que a região duplex compreende pelo menos 10, preferencialmente pelo menos 12, mais preferencialmente pelo menos 14, ainda mais preferencialmente pelo menos 16, ainda mais preferencialmente pelo menos 18 e mais preferencialmente todos os nucleotídeos de uma determinada sequência de fitas de referência. A porção da sequência de referência na região duplex é de pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% e mais preferencialmente 100% idêntica à porção correspondente da sequência de referência. Alternativamente, o número de incompatibilidades de nucleotídeo único em relação à porção da sequência de referência é no máximo três, preferencialmente no máximo dois, mais preferencialmente no máximo um e mais preferencialmente zero.
[0052] A primeira fita e a segunda fita podem, cada uma, compreender uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências listadas na Tabela 1.
[0053] O ácido nucleico pode compreender uma segunda sequência compreendendo uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74.
[0054] A utilização de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção envolve a formação de uma região duplex entre toda ou uma porção da primeira fita e uma porção de um ácido nucleico alvo. A porção do ácido nucleico alvo que forma uma região duplex com a primeira fita, definida como começando com o primeiro par de bases formado entre a primeira fita e a sequência alvo e terminando com o último par de bases formado entre a primeira fita e a sequência alvo, inclusive, é a sequência alvo de ácido nucleico ou simplesmente, sequência alvo. A região duplex formada entre a primeira fita e a segunda fita não precisa ser igual à região duplex formada entre a primeira fita e a sequência alvo. Ou seja, a segunda fita pode ter uma sequência diferente da sequência alvo; no entanto, a primeira fita deve ser capaz de formar uma estrutura duplex com a segunda fita e a sequência alvo, pelo menos sob condições fisiológicas.
[0055] A complementaridade entre a primeira fita e a sequência alvo pode ser perfeita (sem incompatibilidade de nucleotídeos ou nucleotídeos adicionais/deletados em qualquer ácido nucleico).
[0056] A complementaridade entre a primeira fita e a sequência alvo pode não ser perfeita. A complementaridade pode ser de cerca de 70% a cerca de 100%. Mais especificamente, a complementaridade pode ser de pelo menos 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% e valores intermediários.
[0057] A identidade entre a primeira fita e a sequência complementar da sequência alvo pode variar de cerca de 75% a cerca de 100%. Mais especificamente, a complementaridade pode ser de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% e valores intermediários, desde que um ácido nucleico seja capaz de reduzir ou inibir a expressão de LPA.
[0058] Um ácido nucleico com complementaridade inferior a 100% entre a primeira fita e a sequência alvo pode ser capaz de reduzir a expressão de LPA para o mesmo nível que um ácido nucleico com complementaridade perfeita entre a primeira fita e a sequência alvo. Alternativamente, pode ser capaz de reduzir a expressão de LPA para um nível que é de 15% a 100% do nível de redução alcançado pelo ácido nucleico com complementaridade perfeita.
[0059] O ácido nucleico pode compreender uma primeira fita e uma segunda fita com 19-25 nucleotídeos de comprimento cada. A primeira fita e a segunda fita podem ter comprimentos diferentes.
[0060] O ácido nucleico pode ter 15-25 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 17-23 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 17-25 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 23-24 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 19-21 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 21-23 pares de nucleotídeos de comprimento.
[0061] O ácido nucleico pode compreender uma região duplex que consiste em 19-25 pares de bases nucleotídicas. A região duplex pode consistir em 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 pares de bases, que podem ser contíguos.
[0062] O ácido nucleico pode compreender uma sequência de primeira fita da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 9. O ácido nucleico pode compreender uma sequência de segunda fita da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO:
10.
[0063] Preferencialmente, o ácido nucleico medeia a interferência de
RNA.
[0064] Em uma modalidade, o ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula compreende pelo menos uma região duplex que compreende uma primeira fita e uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de pelo menos 15, preferencialmente pelo menos 16, mais preferencialmente pelo menos 17, ainda mais preferencialmente pelo menos 18 e mais preferencialmente pelo menos 19 nucleotídeos com uma identidade de sequência de pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% e mais preferencialmente 100% de qualquer uma das sequências SEQ ID NOs: 9, 5, 1, 3, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73.
[0065] Em um aspecto adicional, o ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, conforme descrito, pode reduzir a expressão de LPA em pelo menos 15% em comparação com a expressão observada na ausência do ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado. Todas as características preferenciais de qualquer um dos aspectos anteriores também se aplicam a esse aspecto. Particularmente, a expressão de LPA pode ser reduzida para pelo menos as seguintes % ou menos de 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% ou menos e valores intermediários, além dos observados na ausência do ácido nucleico ou do ácido nucleico conjugado ou na presença de um controle sem silenciamento.
[0066] O ácido nucleico pode possuir extremidades cegas nas duas extremidades; possuir overhang em uma extremidade e uma extremidade cega na outra extremidade; ou possuir overhang nas duas extremidades.
[0067] Um "overhang", conforme usado neste documento, tem seu significado normal e habitual na técnica, isto é, uma porção de fita simples de um ácido nucleico que se estende além do nucleotídeo terminal de uma fita complementar em um ácido nucleico de fita dupla. O termo "extremidade cega"
inclui ácido nucleico de fita dupla, no qual ambas as fitas terminam na mesma posição, independentemente do(s) nucleotídeo(s) terminal(ais) ter(em) bases pareadas ou não. O nucleotídeo terminal de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega pode ter bases pareadas. O nucleotídeo terminal de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega pode não ser pareado. Os dois nucleotídeos terminais de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega podem ter bases pareadas. Os dois nucleotídeos terminais de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega podem não ser pareados.
[0068] O ácido nucleico pode possuir overhang em uma extremidade e uma extremidade cega na outra. O ácido nucleico pode possuir overhang nas duas extremidades. O ácido nucleico pode possuir extremidade cega nas duas extremidades. O ácido nucleico pode possuir uma extremidade cega na extremidade com a extremidade 5' da primeira fita e a extremidade 3' da segunda fita ou na extremidade 3' da primeira fita e na extremidade 5' da segunda fita.
[0069] O ácido nucleico pode compreender um overhang na extremidade 3 'ou 5'. O ácido nucleico pode possuir um overhang 3' na primeira fita. O ácido nucleico pode possuir um overhang 3'na segunda fita. O ácido nucleico pode possuir um overhang 5' na primeira fita. O ácido nucleico pode possuir um overhang 5'na segunda fita. O ácido nucleico pode possuir um overhang nas extremidades 5' e 3' da primeira fita. O ácido nucleico pode possuir um overhang na extremidade 5 'e na extremidade 3' da segunda fita. O ácido nucleico pode possuir um overhang 5 'na primeira fita e um overhang 3' na segunda fita. O ácido nucleico pode possuir um overhang 3' na primeira fita e um overhang 5' na segunda fita. O ácido nucleico pode possuir um overhang 3' na primeira fita e um overhang 3' na segunda fita. O ácido nucleico pode possuir um overhang 5' na primeira fita e um overhang 5' na segunda fita.
[0070] Um overhang na extremidade 3' ou na extremidade 5' na segunda fita ou na primeira fita pode ser selecionado de consistindo em 1, 2, 3,
4 e 5 nucleotídeos de comprimento. Opcionalmente, um overhang pode consistir de 1 ou 2 nucleotídeos, que podem ou não ser modificados.
[0071] Polinucleotídeos não modificados, particularmente ribonucleotídeos, podem ser propensos à degradação por nucleases celulares e, como tal, modificações/nucleotídeos modificados podem ser incluídos no ácido nucleico da invenção. Tais modificações podem ajudar a estabilizar o ácido nucleico, tornando-o mais resistente às nucleases. Esta resistência melhorada permite que os ácidos nucleicos sejam ativos na mediação da interferência de RNA por períodos mais longos e é especialmente desejável se os ácidos nucleicos forem ser utilizados para tratamento.
[0072] Um ou mais nucleotídeos na segunda e/ou primeira fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados.
[0073] As modificações do ácido nucleico da presente invenção geralmente fornecem uma ferramenta poderosa para superar possíveis limitações, incluindo, mas não se limitando a, estabilidade e biodisponibilidade in vitro e in vivo inerentes às moléculas de RNA nativas. O ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser modificado por modificações químicas. O ácido nucleico modificado também pode minimizar a possibilidade de induzir atividade de interferon em humanos. A modificação pode melhorar ainda mais a administração funcional de um ácido nucleico para uma célula alvo. O ácido nucleico modificado da presente invenção pode compreender um ou mais ribonucleotídeos quimicamente modificados de uma ou ambas da primeira fita ou da segunda fita. Um ribonucleotídeo pode compreender uma modificação química das frações de base, açúcar ou fosfato. O ácido ribonucleico pode ser modificado por substituição ou inserção com análogos de ácidos nucleicos ou bases.
[0074] Um ou mais nucleotídeos de um ácido nucleico da presente invenção podem ser modificados. O ácido nucleico pode compreender pelo menos um nucleotídeo modificado. O nucleotídeo modificado pode estar na primeira fita. O nucleotídeo modificado pode estar na segunda fita. O nucleotídeo modificado pode estar na região duplex. O nucleotídeo modificado pode estar fora da região duplex, isto é, em uma região de fita simples. O nucleotídeo modificado pode estar na primeira fita e pode estar fora da região duplex. O nucleotídeo modificado pode estar na segunda fita e pode estar fora da região duplex. O nucleotídeo 3' terminal da primeira fita pode ser um nucleotídeo modificado. O nucleotídeo 3' terminal da segunda fita pode ser um nucleotídeo modificado. O nucleotídeo 5' terminal da primeira fita pode ser um nucleotídeo modificado. O nucleotídeo 5' terminal da segunda fita pode ser um nucleotídeo modificado.
[0075] Um ácido nucleico da invenção pode ter 1 nucleotídeo modificado ou um ácido nucleico da invenção pode ter cerca de 2-4 nucleotídeos modificados, ou um ácido nucleico pode ter cerca de 4-6 nucleotídeos modificados, cerca de 6-8 nucleotídeos modificados, cerca de 8- 10 nucleotídeos modificados, cerca de 10-12 nucleotídeos modificados, cerca de 12-14 nucleotídeos modificados, cerca de 14-16 nucleotídeos modificados cerca de 16-18 nucleotídeos modificados, cerca de 18-20 nucleotídeos modificados, cerca de 20-22 nucleotídeos modificados, cerca de 20-22 nucleotídeos modificados, cerca de 22-24 nucleotídeos modificados, 24-26 nucleotídeos modificados ou cerca de 26-28 nucleotídeos modificados. Em cada caso, o ácido nucleico compreendendo os referidos nucleotídeos modificados retém pelo menos 50% de sua atividade em comparação com o mesmo ácido nucleico, mas sem os referidos nucleotídeos modificados ou vice- versa. O ácido nucleico pode reter 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% e valores intermediários de sua atividade em comparação com o mesmo ácido nucleico, mas sem os referidos nucleotídeos modificados ou podem ter mais de 100% da atividade do mesmo ácido nucleico sem os referidos nucleotídeos modificados.
[0076] O nucleotídeo modificado pode ser uma purina ou uma pirimidina. Pelo menos metade das purinas pode ser modificada. Pelo menos metade das pirimidinas pode ser modificada. Todas as purinas podem ser modificadas. Todas as pirimidinas podem ser modificadas. Os nucleotídeos modificados podem ser selecionados do grupo que consiste em um nucleotídeo de desoxitimina (dT) 3'-terminal, um nucleotídeo modificado em 2'-O-metil, um nucleotídeo modificado em 2', um nucleotídeo modificado em 2'-desoxi, um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo modificado em 2'-amino, um nucleotídeo modificado em 2'-alquil, um nucleotídeo morfolino, um fosforamidato, uma base não natural compreendendo nucleotídeo, um nucleotídeo compreendendo um grupo 5' fosforotioato, um nucleotídeo compreendendo um 5' fosfato ou mímico de 5' fosfato e um nucleotídeo terminal ligado a um derivado de colesteril ou a um grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico.
[0077] O ácido nucleico pode compreender um nucleotídeo compreendendo um nucleotídeo modificado, em que a base é selecionada de 2-aminoadenosina, 2,6-diaminopurina, inosina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenil, pseudouracila, 2, 4, 6-trimetoxi benzeno, 3-metil uracila, di-hidrouridina, naftil, aminofenil, 5-alquilcitidina (por exemplo, 5-metilcitidina), 5-alquiluridina (por exemplo, ribotimidina), 5-halouridina (por exemplo, 5-bromouridina), 6- azapirimidina, 6-alquilpirimidina (por exemplo, 6-metiluridina), propino, quesosina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, vibutosina, vibutoxosina, 4-acetilcitidina, 5- (carboxihidroximetil)uridina, 5'-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluridina, beta-D-galactosilqueosina, 1-metiladenosina, 1- metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 3-metilcitidina, 2-metiladenosina, 2- metilguanosina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metoxiaminometil-2- tiouridina, 5 -metilaminometiluridina, 5-metilcarbonilmetiluridina, 5- metiloxiuridina, 5-metil-2-tiouridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, beta-D- manosilqueosina, ácido uridina-5-oxiacético e 2-tiocitidina.
[0078] Os ácidos nucleicos discutidos neste documento incluem RNA não modificado, bem como RNA que foi modificado, por exemplo, para melhorar a eficácia, e polímeros de substituintes de nucleosídeos. O RNA não modificado refere-se a uma molécula em que os componentes do ácido nucleico, quais sejam: açúcares, bases e frações de fosfato, são iguais ou essencialmente iguais aos que ocorrem na natureza, por exemplo, como ocorrem naturalmente no corpo humano. O nucleotídeo modificado, como usado neste documento, refere-se a um nucleotídeo no qual um ou mais dos componentes dos nucleotídeos, quais sejam açúcares, bases e frações fosfato, são diferentes daqueles que ocorrem na natureza. Embora sejam chamados de nucleotídeos modificados, é claro que, devido à modificação, o termo também inclui moléculas que não são nucleotídeos, por exemplo, uma molécula polinucleotídica na qual a estrutura principal do ribofosfato é substituída por uma construção não ribofosfática que permite a hibridação entre fitas, isto é, os nucleotídeos modificados imitam a estrutura principal do ribofosfato.
[0079] Muitas das modificações descritas abaixo que ocorrem dentro de um ácido nucleico serão repetidas dentro de uma molécula polinucleotídica, como uma modificação de uma base, ou uma fração de fosfato, ou um O não ligado de uma fração de fosfato. Em alguns casos, a modificação ocorrerá em todas as posições/nucleotídeos possíveis no polinucleotídeo, mas em muitos casos não ocorrerá. Uma modificação pode ocorrer apenas na posição terminal 3' ou 5', somente nas regiões terminais, como em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5 ou 10 nucleotídeos de uma fita. Uma modificação pode ocorrer em uma região de fita dupla, em uma região de fita simples ou em ambas. Uma modificação pode ocorrer apenas na região de fita dupla de um ácido nucleico da invenção ou pode ocorrer apenas em uma região de fita simples de um ácido nucleico da invenção. Uma modificação de fosforotioato em uma posição O não ligada pode ocorrer apenas em um ou em ambos os terminais, pode ocorrer apenas em uma região do terminal, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos de uma fita, ou pode ocorrer em regiões duplex e/ou de fita simples, particularmente nos terminais. As extremidades 5' ou 3' podem ser fosforiladas.
[0080] A estabilidade de um ácido nucleico da invenção pode ser aumentada pela inclusão de bases específicas em overhangs, ou para incluir nucleotídeos modificados, em overhangs de fita simples, por exemplo, em um overhang de 5 'ou 3', ou em ambos. Os nucleotídeos de purina podem ser incluídos em overhangs. Todas ou algumas das bases em um overhang 3' ou 5' podem ser modificadas. As modificações podem incluir o uso de modificações no grupo 2' OH do açúcar ribose, o uso de desoxirribonucleotídeos, em vez de ribonucleotídeos, e modificações no grupo fosfato, como modificações de fosforotioato. Overhangs não precisam ser homólogos com a sequência alvo.
[0081] Nucleases podem hidrolisar ligações fosfodiéster de ácido nucleico. No entanto, modificações químicas nos ácidos nucleicos podem conferir propriedades melhoradas e, podem tornar os oligoribonucleotídeos mais estáveis às nucleases.
[0082] Os ácidos nucleicos modificados, conforme usados neste documento, podem incluir um ou mais de: (i) alteração, por exemplo, substituição, de um ou de ambos os oxigênios de fosfato não ligados e/ou de um ou mais dos oxigênios de fosfato de ligação (chamados de ligação mesmo que estejam no terminal 5' e 3' do ácido nucleico da invenção); (ii) alteração, por exemplo, substituição, de um constituinte do açúcar ribose, por exemplo, da hidroxila 2' no açúcar ribose; (iii) substituição da fração fosfato por ligantes peptídicos "defosfo"; (iv) modificação ou substituição de uma base de ocorrência natural; (v) substituição ou modificação da estrutura principal da ribose- fosfato; (vi) modificação da extremidade 3′ ou da extremidade 5′ do RNA, por exemplo, remoção, modificação ou substituição de um grupo fosfato terminal ou conjugação de uma fração, por exemplo, uma fração marcada com fluorescência, para a extremidade 3′ ou 5′ do RNA.
[0083] Os termos substituição, modificação, alteração indicam uma diferença em relação a uma molécula que ocorre naturalmente.
[0084] Modificações específicas são discutidas em mais detalhes abaixo.
[0085] Exemplos de grupos fosfato modificados incluem fosforotioato, fosforosselenatos, fosfatos de borano, ésteres de borano fosfato, fosfonatos de hidrogênio, fosforamidatos, fosfonatos de alquil ou aril e fosfotriésteres. Os fosforoditioatos têm ambos os oxigênios não ligados substituídos pelo enxofre. Um, cada um ou ambos os oxigênios não ligados no grupo fosfato pode ser independentemente qualquer um de S, Se, B, C, H, N ou OR (R é alquil ou aril).
[0086] O ligante de fosfato também pode ser modificado pela substituição de um oxigênio de ligação por nitrogênio (fosforamamidatos em ponte), enxofre (fosforotioatos em ponte) e carbono (metilenofosfonatos em ponte). A substituição pode ocorrer em um oxigênio terminal. É possível substituir os oxigênios não ligados por nitrogênio.
[0087] Um nucleotídeo modificado pode incluir modificação dos grupos de açúcar. O grupo hidroxila 2' (OH) pode ser modificado ou substituído por vários substituintes "oxi" ou "desoxi" diferentes.
[0088] Exemplos de modificações do grupo hidroxila "oxi" -2′ incluem alcoxi ou ariloxi (OR, por exemplo, R═H, alquil, cicloalquil, aril, aralquil, heteroaril ou açúcar); polietilenoglicóis (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; ácidos nucléicos "bloqueados" (LNA) nos quais a hidroxila 2' está conectada, por exemplo, por uma ponte de metileno, ao carbono 4' do mesmo açúcar ribose; O-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil, arilamino, diarilamina, heteroarilamino ou diheteroaril amino, etileno diamina, poliamino) e aminoalcoxi, O(CH2)nAMINA, (por exemplo, AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamina, heterociclil, arilamino, diarilamino, heteroarilamino ou diheteroaril amino, etileno diamina, poliamino).
[0089] As modificações "desoxi" incluem hidrogênio, halogênio, amino (por exemplo, NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, diheteroaril amino ou aminoácido); NH
(CH2CH2NH) nCH2CH2-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil, arilamino, diaril amino, heteroaril amino ou diheteroaril amino), — NHC (O) R (R = alquil, cicloalquil, aril, aralquil, heteroaril ou açúcar), ciano; mercapto; alquil-tio-alquil; tioalcoxi; e alquil, cicloalquil, aril, alquenil e alquinil, que podem ser opcionalmente substituídos com, por exemplo, uma funcionalidade amino. Outros substituintes de certas modalidades incluem 2'- metoxietil, 2'-OCH3, 2'-O-alil, 2'-C-alil e 2'-fluoro. O grupo açúcar também pode conter um ou mais átomos de carbono que possuem a configuração estereoquímica oposta à do carbono correspondente na ribose. Assim, um nucleotídeo modificado pode conter um açúcar como a arabinose.
[0090] Os nucleotídeos modificados também podem incluir açúcares "abásicos", que não possuem uma nucleobase em C-1'. Estes açúcares abásicos podem conter ainda modificações em um ou mais átomos de açúcar constituintes.
[0091] As modificações 2' podem ser usadas em combinação com uma ou mais modificações do ligante de fosfato (por exemplo, fosforotioato).
[0092] Os grupos fosfato podem ser substituídos individualmente por conectores que não contenham fósforo.
[0093] Exemplos de frações que podem substituir o grupo fosfato incluem siloxano, carbonato, carboximetil, carbamato, amida, tioéter, ligante de óxido de etileno, sulfonato, sulfonamida, tioformacetal, formalcetal, oxima, metilenoimino, metilenometilimino, metileno-hidrazo, metilenodimetil-hidrazo e metileno-oximetilimino. Em certas modalidades, as substituições podem incluir os grupos metileno-carbonilamino e metileno-metilimino.
[0094] O ligante de fosfato e o açúcar ribose podem ser substituídos por nucleotídeos resistentes à nuclease.
[0095] Exemplos incluem os substitutos de nucleosídeo de morfolino, ciclobutil, pirrolidina e ácido nucleico peptídico (PNA). Em certas modalidades, substitutos de PNA podem ser usados.
[0096] As extremidades 3' e 5' de um oligonucleotídeo podem ser modificadas. Tais modificações podem ocorrer na extremidade 3' ou na extremidade 5' ou em ambas as extremidades da molécula. Eles podem incluir modificação ou substituição de um fosfato terminal inteiro ou de um ou mais átomos do grupo fosfato. Por exemplo, as extremidades 3 'e 5' de um oligonucleotídeo podem ser conjugadas a outras entidades moleculares funcionais, como frações de marcação, por exemplo, fluoróforos (por exemplo, pireno, TAMRA, fluoresceína, corantes Cy3 ou Cy5) ou grupos de proteção (com base em, por exemplo, enxofre, silício, boro ou éster). As entidades moleculares funcionais podem ser ligadas ao açúcar através de um grupo fosfato e/ou de um ligante peptídico. O átomo terminal do ligante peptídico pode conectar ou substituir o átomo de ligação do grupo fosfato ou do grupo C- 3' ou C-5' O, N, S ou C do açúcar. Alternativamente, o ligante peptídico pode se conectar ou substituir o átomo terminal de um substituto de nucleotídeo (por exemplo, PNAs). Esses espaçadores ou ligantes peptídicos podem incluir, por exemplo, -(CH2)n—, —(CH2)nN—, -(CH2)nO—, —(CH2)nS—, — (CH2CH2O)nCH2CH2O— (por exemplo, n= 3 ou 6), açúcares abásicos, amida, carboxi, amina, oxiamina, oximina, tioéter, dissulfeto, tioureia, sulfonamida ou morfolino, ou reagentes de biotina e fluoresceína. A extremidade 3 'pode ser um grupo —OH.
[0097] Outros exemplos de modificações terminais incluem corantes, agentes intercalantes (por exemplo, acridinas), reticuladores (por exemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirina), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (por exemplo, fenazina, diidrofenazina), endonucleases artificiais, EDTA, carreadores lipofílicos, por exemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido 1-pireno butírico, dihidrotestosterona, 1,3-Bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxi-hexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecil, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3- (oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colênico, dimetoxitritil ou fenoxazina e conjugados de peptídeos (por exemplo, peptídeo antennapedia, peptídeo Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto,
PEG (por exemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquil, alquil substituído, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por exemplo, biotina), facilitadores de transporte/absorção (por exemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleases sintéticas (por exemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, agregados de imidazol, conjugados acridina-imidazol, complexos Eu3+ de tetra-azamacrociclos).
[0098] Modificações terminais podem ser adicionadas por vários motivos, inclusive para modular a atividade ou para modular a resistência à degradação. Modificações terminais úteis para modular a atividade incluem modificação da extremidade 5 'com fosfato ou análogos de fosfato. Os ácidos nucleicos da invenção, na primeira ou na segunda fita, podem ser fosforilados em 5' ou incluir um análogo de fosforila no terminal primário 5'. As modificações de 5'-fosfato incluem aquelas que são compatíveis com o silenciamento de genes mediado por RISC. Modificações adequadas incluem: 5'-monofosfato ((HO)2(O)P—O-5'); 5′-difosfato ((HO)2(O)P—O—P(HO)(O)—O-5'); 5′-trifosfato ((HO)2(O)P—O—(HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5′); cap de 5′-guanosina (7- metilada ou não-metilada) (7m-G-O-5′-(HO)(O)P—O—(HO)(O)P—O— P(HO)(O)—O-5'); cap de 5'-adenosina (Appp) e qualquer estrutura de cap de nucleotídeo modificada ou não modificada (N—O-5′-(HO)(O)P—O— (HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5'); 5'-monotiofosfato (fosforotioato; (HO)2(S)P— O-5'); 5′-monoditiofosfato (fosforoditioato; (HO)(HS)(S)P—O-5'), 5'-fosforotiolato ((HO)2(O)P—S-5'); qualquer combinação adicional de monofosfato, difosfato e trifosfatos substituídos por oxigênio/enxofre (por exemplo, 5'-alfa-tiotrifosfato, 5'-gama-tiotrifosfato, etc.), 5'-fosforamidatos ((HO)2(O)P—NH- 5', (HO)(NH2)(O)P—O-5'), 5'-alquilfosfonatos (R = alquil = metil, etil, isopropil, propil, etc., por exemplo, RP(OH)(O)—O-5′-, (OH)2(O)P-5′-CH2-), 5'vinilfosfonato, 5'-alquiléterfosfonatos (R = alquiléter = metoximetil (MeOCH2-), etoximetil, etc., por exemplo, RP(OH)(O)—O-5'-).
[0099] O ácido nucleico da presente invenção pode incluir uma ou mais modificações de fosforotioato em uma ou mais das extremidades terminais da primeira e/ou da segunda fita. Opcionalmente, cada uma ou uma das extremidades da primeira fita pode compreender um ou dois ou três nucleotídeos modificados com fosforotioato. Opcionalmente, cada ou qualquer uma das extremidades da segunda fita pode compreender um ou dois ou três nucleotídeos modificados com fosforotioato.
[00100] Modificações terminais também podem ser úteis para monitorar a distribuição e, nesses casos, os grupos a serem adicionados podem incluir fluoróforos, por exemplo, fluoresceína ou corante Alexa. Modificações terminais também podem ser úteis para melhorar a absorção, modificações úteis para isso incluem colesterol. Modificações terminais também podem ser úteis para reticular um agente de RNA a outra fração.
[00101] Adenina, guanina, citosina e uracila são as bases mais comuns encontradas no RNA. Essas bases podem ser modificadas ou substituídas para fornecer RNAs com propriedades melhoradas. Por exemplo, os oligoribonucleotídeos resistentes à nuclease podem ser preparados com essas bases ou com nucleobases sintéticas e naturais (por exemplo, inosina, timina, xantina, hipoxantina, nubularina, isoguanisina ou tubercidina) e qualquer uma das modificações acima. Alternativamente, análogos substituídos ou modificados de qualquer uma das bases acima e "bases universais" podem ser empregados. Exemplos incluem 2-aminoadenina, 6-metil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-propil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 5-halouracila e citosina, 5-propinil uracila e citosina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 5-halouracila, 5-(2- aminopropil)uracila, 5-amino alil uracila, 8-halo, amino, tiol, tioalquil, hidroxila e outras adeninas e guaninas substituídas em 8, 5-trifluorometil e outras uracilas e citosinas substituídos em 5, 7-metilguanina, pirimidinas substituídas em 5, 6- azapirimidinas e purinas substituídas em N-2, N-6 e O-6, incluindo 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina, di-hidrouracila, 3- deseaza-5-azacitosina, 2-aminopurina, 5-alquiluracila, 7-alquilguanina, 5-alquil citosina, 7-deseazaadenina, N6, N6-dimetiladenina, 2,6-diaminopurina, 5-
amino-alil-uracila, N3-metiluracila, 1,2,4-triazóis substituídos, 2-piridinona, 5- nitroindol, 3-nitropirrol, 5-metoxiuracila, ácido uracil-5-oxiacético, 5- metoxicarbonilmetiluracila, 5-metil-2-tiouracila, 5-metoxicarbonilmetil-2- tiouracila, 5-metilaminometil-2-tiouracila, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uracila, 3- metilcitosina, 5-metilcitosina, N<4 >-acetil citosina, 2-tiocitosina, N6- metiladenina, N6-isopentiladenina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, N- metilguaninas ou bases O-alquiladas.
[00102] Conforme usado neste documento, o termo "análogo de nucleotídeo não pareante" significa um análogo de nucleotídeo que inclui uma fração pareante de não base, incluindo, mas não se limitando a: 6 des amino adenosina (Nebularine), 4-Me-indole, 3-nitropirrol, 5 -nitroindol, Ds, Pa, N3-Me ribo U, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-etil-dC, N3-Me dC. Em algumas modalidades, o análogo de nucleotídeo pareante de não base é um ribonucleotídeo. Em outras modalidades, ele é um desoxirribonucleotídeo.
[00103] Como usado neste documento, o termo "grupo funcional terminal" inclui, sem limitação, grupos halogênio, álcool, amina, carboxílico, éster, amida, aldeído, cetona, éter.
[00104] Certas frações podem estar ligadas ao terminal 5' da primeira fita ou da segunda fita. Estes incluem a fração de ribose abásica, fração de desoxirribose abásica, frações de ribose abásica e de desoxirribose abásica modificadas, incluindo modificações 2‘ O alquil; frações de ribose abásica e desoxirribose abásica invertidas e suas modificações; C6-imino-Pi; um nucleotídeo espelho incluindo L-DNA e L-RNA; nucleotídeo 5'O-Me; e análogos de nucleotídeo incluindo nucleotídeo de 4',5'-metileno; 1-(β-D- eritrofuranosil)nucleotídeo; nucleotídeo de 4'-tio, nucleotídeo carbocíclico; 5'- amino-alquil fosfato; 1,3-diamino-2-propil fosfato, 3-aminopropil fosfato; 6- aminohexil fosfato; 12-aminododecil fosfato; hidroxipropil fosfato; nucleotídeo de 1,5-anidrohexitol; alfa-nucleotídeo; nucleotídeo de treo-pentofuranosil; nucleotídeo 3',4'-seco acíclico; nucleotídeo de 3,4-dihidroxibutil; nucleotídeo de
3,5-dihidroxipentil, fração abásica 5'-5' invertida; 1,4-butanodiol fosfato; 5'- amino; e frações de metilfosfonato e de 5'-mercapto com ou sem ponte.
[00105] Os ácidos nucleicos da invenção podem incluir um ou mais nucleotídeos invertidos, por exemplo timidina invertida ou adenina invertida (por exemplo, ver Takei, et al., 2002. JBC 277 (26):23800-06).
[00106] Como usado neste documento, o termo "inibir", "regular negativamente" ou "reduzir" com relação à expressão do gene significa a expressão do gene ou nível de moléculas de RNA ou moléculas de RNA equivalentes que codificam uma ou mais proteínas ou subunidades de proteínas (por exemplo, mRNA), ou a atividade de uma ou mais proteínas ou subunidades de proteínas é reduzida abaixo da observada na ausência de ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção ou em referência a uma molécula de siRNA sem homologia conhecida para transcrições de humanos (denominada controle sem silenciamento neste documento). Esse controle pode ser conjugado e modificado de maneira análoga à molécula da invenção e entregue na célula alvo pela mesma via; por exemplo, a expressão pode ser reduzida para 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% ou para valores intermediários ou inferiores aos observados na ausência do ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado ou na presença de um controle sem silenciamento.
[00107] O ácido nucleico da presente invenção pode compreender um nucleotídeo abásico. O termo "abásico", como usado neste documento, refere-se a frações que não possuem uma base ou que possuem outros grupos químicos no lugar de uma base na posição 1', por exemplo, um derivado de ribose desoxiabásica 3',3'-ligada ou 5',5'-ligada.
[00108] O ácido nucleico pode compreender um ou mais nucleotídeos na segunda e/ou primeira fita que são modificados. Nucleotídeos alternados podem ser modificados, para formar nucleotídeos modificados.
[00109] Alternar, como descrito neste documento, significa ocorrer um após o outro de maneira regular. Em outras palavras, alternar significa ocorrer seguida e repetidamente. Por exemplo, se um nucleotídeo é modificado, o próximo nucleotídeo contíguo não é modificado e o nucleotídeo contíguo seguinte é modificado e assim por diante. Um nucleotídeo pode ser modificado com uma primeira modificação, o próximo nucleotídeo contíguo pode ser modificado com uma segunda modificação e o nucleotídeo contíguo seguinte é modificado com a primeira modificação e assim por diante, em que a primeira e a segunda modificações são diferentes.
[00110] Um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados em que a primeira fita é numerada 5' a 3', com o nucleotídeo mais próximo de 5' sendo o nucleotídeo número 1 da primeira fita. O termo "número ímpar", conforme descrito neste documento, significa um número não divisível por dois. Exemplos de números ímpares são 1, 3, 5, 7, 9, 11 e assim por diante. Um ou mais dos nucleotídeos de números pares da primeira fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados, em que a primeira fita é numerada de 5' a 3'. O termo "número par", como descrito neste documento, significa um número que é divisível de forma exata por dois. Exemplos de números pares são 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e assim por diante. Um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares da segunda fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados em que a segunda fita é numerada de 3' a 5', com o nucleotídeo mais próximo de 3' sendo o nucleotídeo número 1 da segunda fita. Um ou mais dos nucleotídeos de números pares da segunda fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados, em que a segunda fita é numerada de 3' a 5'.
[00111] Um ou mais nucleotídeos na primeira e/ou na segunda fita podem ser modificados, para formar nucleotídeos modificados. Um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita podem ser modificados. Um ou mais dos nucleotídeos de números pares da primeira fita podem ser modificados por pelo menos uma segunda modificação, em que pelo menos a segunda modificação é diferente da modificação nos um ou mais nucleotídeos ímpares. Pelo menos um dos um ou mais nucleotídeos de números pares modificados pode ser adjacente a pelo menos um dos um ou mais nucleotídeos de números ímpares modificados.
[00112] Uma pluralidade de nucleotídeos de números ímpares na primeira fita pode ser modificada no ácido nucleico da invenção. Uma pluralidade de nucleotídeos de números pares da primeira fita pode ser modificada por uma segunda modificação. A primeira fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum. A primeira fita também pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação diferente.
[00113] Um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares da segunda fita pode ser modificado por uma modificação que é diferente da modificação dos nucleotídeos de números ímpares na primeira fita e/ou um ou mais dos nucleotídeos de números pares da segunda fita pode ser modificado pela mesma modificação que os nucleotídeos de números ímpares da primeira fita. Pelo menos um dos um ou mais nucleotídeos de números pares modificados da segunda fita pode ser adjacente a um dos um ou mais nucleotídeos de números ímpares modificados. Uma pluralidade de nucleotídeos de números ímpares da segunda fita pode ser modificada por uma modificação comum e/ou uma pluralidade de nucleotídeos de números pares pode ser modificada pela mesma modificação que está presente nos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita. Uma pluralidade de nucleotídeos de números ímpares da segunda fita pode ser modificada por uma segunda modificação, em que a segunda modificação é diferente da modificação dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita.
[00114] A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum, que pode ser uma segunda modificação que é diferente da modificação dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita.
[00115] No ácido nucleico da invenção, cada um dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita e cada um dos nucleotídeos de números pares na segunda fita pode ser modificado com uma modificação comum e, cada um dos nucleotídeos de números pares pode ser modificado na primeira fita com uma segunda modificação e cada um dos nucleotídeos de números ímpares pode ser modificado na segunda fita com a segunda modificação.
[00116] O ácido nucleico da invenção pode ter os nucleotídeos modificados da primeira fita deslocados por pelo menos um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos não modificados ou modificados de maneira diferente da segunda fita.
[00117] Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números ímpares pode ser modificado na primeira fita e um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números pares pode ser modificado na segunda fita. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas podem ser modificados por uma segunda modificação. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números pares pode ser modificado na primeira fita e um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números pares pode ser modificado na segunda fita. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas podem ser modificados por uma segunda modificação. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números ímpares pode ser modificado na primeira fita e um ou mais dos nucleotídeos de números ímpares pode ser modificado na segunda fita por uma modificação comum. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas podem ser modificados por uma segunda modificação. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números pares pode ser modificado na primeira fita e um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de números ímpares pode ser modificado na segunda fita por uma modificação comum. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas podem ser modificados por uma segunda modificação.
[00118] O ácido nucleico da invenção pode compreender construtos de fita simples ou dupla que compreendem pelo menos duas regiões de modificações alternadas em uma ou em ambas as fitas. Estas regiões alternadas podem compreender até cerca de 12 nucleotídeos, mas preferencialmente compreendem de cerca de 3 até cerca de 10 nucleotídeos. As regiões de nucleotídeos alternados podem estar localizadas nos terminais de uma ou de ambas as fitas do ácido nucleico da invenção. O ácido nucleico pode compreender de 4 a cerca de 10 nucleotídeos de nucleotídeos alternados em cada terminal (3' e 5') e essas regiões podem ser separadas por cerca de 5 a cerca de 12 nucleotídeos contíguos não modificados ou modificados de forma diferente ou comum.
[00119] Os nucleotídeos de números ímpares da primeira fita podem ser modificados e os nucleotídeos de números pares podem ser modificados com uma segunda modificação. A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação comum, que pode ser a mesma modificação dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita. Um ou mais nucleotídeos da segunda fita também podem ser modificados com a segunda modificação. Um ou mais nucleotídeos com a segunda modificação podem ser adjacentes um ao outro e a nucleotídeos com uma modificação que é a mesma que a modificação dos nucleotídeos de números ímpares da primeira fita. A primeira fita também pode compreender ligações de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extremidade 3' e na extremidade 5'. A segunda fita pode compreender uma ligação de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extremidade 5'. A segunda fita também pode ser conjugada a um ligante na extremidade 5'.
[00120] O ácido nucleico da invenção pode compreender uma primeira fita compreendendo nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação comum. Um ou mais desses nucleotídeos podem ser adjacentes a um ou mais nucleotídeos que podem ser modificados com uma segunda modificação. Um ou mais nucleotídeos com a segunda modificação podem ser adjacentes. A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação comum, que pode ser a mesma que uma das modificações de um ou mais dos nucleotídeos da primeira fita. Um ou mais nucleotídeos da segunda fita também podem ser modificados com a segunda modificação. Um ou mais nucleotídeos com a segunda modificação podem ser adjacentes. A primeira fita também pode compreender ligações de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extremidade 5' e na extremidade 3'. A segunda fita pode compreender uma ligação de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extremidade 3'. A segunda fita também pode ser conjugada a um ligante na extremidade 5'.
[00121] Os nucleotídeos numerados de 5' a 3' na primeira fita e 3' a 5' na segunda fita, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 e 25 podem ser modificados por uma modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma segunda modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 podem ser modificados por uma modificação na segunda fita. Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma segunda modificação na segunda fita. Os nucleotídeos são numerados de acordo com o ácido nucleico da presente invenção de 5' a 3' na primeira fita e 3' a 5' na segunda fita.
[00122] Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 podem ser modificados por uma segunda modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 podem ser modificados por uma modificação na segunda fita. Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma segunda modificação na segunda fita.
[00123] Claramente, se a primeira e/ou a segunda fita tiverem menos de 25 nucleotídeos de comprimento, como 19 nucleotídeos de comprimento, não haverá nucleotídeos numerados 20, 21, 22, 23, 24 e 25 a serem modificados. Uma pessoa versada na técnica entende a descrição acima para aplicar a fitas mais curtas, conforme o caso.
[00124] Um ou mais nucleotídeos modificados na primeira fita podem ser pareados a nucleotídeos modificados na segunda fita com uma modificação comum. Um ou mais nucleotídeos modificados na primeira fita podem ser pareados a nucleotídeos modificados na segunda fita com uma modificação diferente. Um ou mais nucleotídeos modificados na primeira fita podem ser pareados a nucleotídeos não modificados na segunda fita. Um ou mais nucleotídeos modificados na segunda fita podem ser pareados a nucleotídeos não modificados na primeira fita. Em outras palavras, os nucleotídeos alternados podem ser alinhados nas duas fitas, como, por exemplo, todas as modificações nas regiões alternadas da segunda fita são pareadas a modificações idênticas na primeira fita ou, alternativamente, as modificações podem ser deslocadas por um nucleotídeo com as modificações comuns nas regiões alternadas de uma fita pareando a modificações diferentes (ou seja, uma segunda ou mais modificações) na outra fita. Outra opção é ter modificações diferentes em cada uma das fitas.
[00125] As modificações na primeira fita podem ser deslocadas por um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos modificados na segunda fita, de modo que os nucleotídeos modificados comuns não estejam pareados um com o outro.
[00126] A modificação e/ou modificações podem cada uma e individualmente ser selecionadas do grupo que consiste em desoxitimina 3'- terminal, 2'-O-metil, uma modificação 2'-desoxi, uma modificação 2'-amino, uma modificação 2'-alquil, uma modificação morfolino, uma modificação fosforamidato, modificação do grupo 5'-fosforotioato, uma modificação 5' fosfato ou mímico de 5' fosfato e uma derivação de colesteril ou uma modificação do grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico e/ou o nucleotídeo modificado podem ser qualquer um de um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natural compreendendo nucleotídeo.
[00127] Pelo menos uma modificação pode ser 2'-O-metil e/ou pelo menos uma modificação pode ser 2'-F. Modificações adicionais, como as descritas neste documento, podem estar presentes na primeira e/ou na segunda fita.
[00128] O ácido nucleico da invenção pode compreender um nucleotídeo de RNA invertido em uma ou várias das extremidades da fita. Estes nucleotídeos invertidos fornecem estabilidade ao ácido nucleico. Preferencialmente, o ácido nucleico compreende pelo menos um nucleotídeo invertido em uma ou várias das extremidades 3' de pelo menos uma das fitas e/ou na extremidade 5' da segunda fita. Mais preferencialmente, o ácido nucleico compreende um nucleotídeo invertido na extremidade 3' da segunda fita. Mais preferencialmente, o ácido nucleico compreende um nucleotídeo de RNA invertido na extremidade 3' da segunda fita e este nucleotídeo é preferencialmente um A invertido. O nucleotídeo invertido preferencialmente está presente em uma extremidade de uma fita não como overhang, mas oposto a um nucleotídeo correspondente na outra fita. Um ácido nucleico com essa modificação é estável e fácil de sintetizar.
[00129] Ao longo da descrição da invenção, "modificação igual ou comum" significa a mesma modificação em qualquer nucleotídeo, seja A, G, C ou U modificado com um grupo como um grupo metil ou um grupo fluoro. Não significa a mesma adição no mesmo nucleotídeo. Por exemplo, 2'F-dU, 2'F-dA, 2'F-dC, 2'F-dG são todos considerados a mesma modificação ou modificação comum, assim como 2'-OMe-rU, 2'-OMe -rA; 2'-OMe-rC; 2'-OMe-rG. Uma modificação 2'F é uma modificação diferente de uma modificação 2'OMe.
[00130] Algumas sequências de ácidos nucleicos modificados representativas da presente invenção são mostradas nos exemplos. Esses exemplos têm a intenção de ser representativos e não limitativos.
[00131] Preferencialmente, o ácido nucleico pode compreender uma modificação e uma segunda ou mais modificações que são cada uma e individualmente selecionadas do grupo que compreende a modificação 2'-O- metil e modificação 2'-F. O ácido nucleico pode compreender uma modificação que é 2'-O-metil (2'OMe) que pode ser uma primeira modificação e uma segunda modificação que é 2'-F. O ácido nucleico da invenção também pode incluir uma modificação de fosforotioato e/ou uma modificação desoxi que pode estar presente nos ou entre os 1, 2 ou 3 nucleotídeos terminais de cada uma ou quaisquer das extremidades de cada uma ou de ambas as fitas.
[00132] A invenção fornece como um aspecto adicional, um ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula, compreendendo uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73, em que os nucleotídeos da primeira fita são modificados por uma primeira modificação nos nucleotídeos de números ímpares e modificados por uma segunda modificação nos nucleotídeos de números pares e nucleotídeos da segunda fita são modificados por uma terceira modificação nos nucleotídeos de números pares e modificados por uma quarta modificação nos nucleotídeos de números ímpares, em que pelo menos a primeira modificação é diferente da segunda modificação e a terceira modificação é diferente da quarta modificação. A terceira e primeira modificações podem ser iguais ou diferentes, a segunda e quarta modificações podem ser iguais ou diferentes. A primeira e a segunda modificações podem ser diferentes uma da outra e a terceira e quarta modificações podem ser diferentes uma da outra.
[00133] A segunda fita pode compreender uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74. Os nucleotídeos da primeira fita podem ser modificados por uma primeira modificação nos nucleotídeos de números ímpares e modificados com uma segunda modificação nos nucleotídeos de números pares, e a segunda fita pode ser modificada nos nucleotídeos de números ímpares com a segunda modificação e modificada com a primeira modificação nos nucleotídeos de números pares. A primeira modificação pode ser 2'OMe e a segunda modificação pode ser 2 'F. A primeira fita pode compreender a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 9 e/ou a segunda fita pode compreender a sequência nucleotídica da SEQ
ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 10. As modificações podem ser as apresentadas na Tabela 1.
[00134] O ácido nucleico da invenção pode ser conjugado a um ligante. A distribuição eficiente de oligonucleotídeos, em particular ácidos nucleicos de fita dupla da invenção, para células in vivo é importante e exige direcionamento específico e proteção substancial do ambiente extracelular, particularmente proteínas séricas. Um método para atingir um direcionamento específico é conjugar um ligante ao ácido nucleico. O ligante ajuda a direcionar o ácido nucleico para o sítio alvo necessário. É necessário conjugar ligantes apropriados para as moléculas receptoras desejadas, para que as moléculas conjugadas sejam absorvidas pelas células alvo por mecanismos tais como diferentes caminhos de endocitose mediada por receptor ou processos funcionalmente análogos.
[00135] Um exemplo é o complexo receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R) composto por razões variáveis de multímeros de receptores de membrana ASGR1 e ASGR2, que são altamente abundantes em hepatócitos e possuem alta afinidade com a fração GalNAc descrita neste documento. Uma das primeiras divulgações do uso de agrupamentos de glicosídeos triantenários como ligantes conjugados está na patente número US 5,885,968. Conjugados com três ligantes GalNAc e compreendendo grupos fosfato são conhecidos e são descritos em Dubber et al. (Bioconjug. Chem. 2003 Jan-Fev;14(1):239-46.). O complexo ASGP-R apresenta uma afinidade 50 vezes maior para N-acetil-D- galactosilamina (GalNAc) do que D-Gal.
[00136] O complexo receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R), que reconhece subunidades beta-galactosil especificamente terminais de proteínas glicosiladas ou outros oligossacarídeos (Weigel, PH et al., Biochim. Biophys. Acta. 2002 Set 19; 1572(2-3):341-63) pode ser usado para administrar um fármaco aos hepatócitos do fígado que expressam o complexo receptor por acoplamento covalente de galactose ou galactosamina à substância do fármaco (Ishibashi,S.; et. al., J Biol. Chem. 1994 Nov 11;269(45):27803-6).
Além disso, a afinidade de ligação pode ser significativamente aumentada pelo efeito multivalência, que é alcançado pela repetição da fração de direcionamento (Biessen EA, et al., J. Med. Chem. 1995 Abr 28;38(9):1538-
46.).
[00137] O complexo ASGP-R é um mediador para uma absorção ativa de glicoproteínas terminais contendo β-galactosil nos endossomos da célula. Assim, o ASGPR é altamente adequado para distribuição direcionada de candidatos a fármacos conjugados a tais ligantes como, por exemplo, ácidos nucleicos em células que expressam receptores (Akinc et al., Mol Ther. 2010 Jul;18(7):1357-64).
[00138] Mais geralmente, o ligante pode compreender um sacarídeo que é selecionado para ter uma afinidade por pelo menos um tipo de receptor em uma célula alvo. Em particular, o receptor está na superfície de uma célula hepática de mamífero, por exemplo, o complexo receptor de asialoglicoproteína hepática descrito anteriormente (ASGP-R).
[00139] O sacarídeo pode ser selecionado dentre N-acetil galactosamina, manose, galactose, glicose, glucosamina e fucose. O sacarídeo pode ser N-acetil galactosamina (GalNAc).
[00140] Um ligante a ser usado na presente invenção pode, portanto, compreender (i) uma ou mais frações N-acetil galactosamina (GalNAc) e seus derivados, e (ii) um ligante, em que o ligante conjuga as frações GalNAc a uma sequência conforme definido em quaisquer aspectos anteriores. O ligante pode ser uma estrutura ramificada bivalente ou trivalente ou tetravalente. Os nucleotídeos podem ser modificados como definido neste documento.
[00141] "GalNAc" se refere a 2-(Acetilamino)-2-desoxi-D- galactopiranose, comumente referida na literatura como N-acetil galactosamina. Referência a "GalNAc" ou "N-acetil galactosamina" inclui tanto a forma β-: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-β-D-galactopiranose quanto a forma α: 2- (Acetilamino)-2-desoxi-α-D-galactopiranose. Tanto a forma β: 2-(Acetilamino)-
2-desoxi-β-D-galactopiranose como a forma α: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-α-D- galactopiranose podem ser utilizadas indistintamente. Preferencialmente, os compostos da invenção compreendem a forma β, 2- (Acetilarnino)-2-desoxi-β- D-galactopiranose.
[00142] O ligante pode, portanto, compreender GalNAc.
[00143] O ligante pode compreender um composto da fórmula I: [S-X1-P-X2]3-A-X3- (I) em que: S representa um sacarídeo, em que o sacarídeo é N-acetil galactosamina; X1 representa C3-C6 alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato); X2 é alquileno ou um éter de alquileno de fórmula (-CH2)n-O-CH2-, onde n = 1- 6; A é uma unidade de ramificação; X3 representa uma unidade de formação de ponte; em que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é conjugado a X3 através de um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato).
[00144] Na fórmula I, a unidade de ramificação ―A‖ se ramifica em três, a fim de acomodar os três ligantes de sacarídeos. A unidade de ramificação é covalentemente ligada às porções aglutinadas restantes do ligante e do ácido nucleico. A unidade de ramificação pode compreender um grupo alifático ramificado compreendendo grupos selecionados a partir de grupos alquil, amida, dissulfeto, polietilenoglicol, éter, tioéter e hidroxiamino. A unidade de ramificação pode compreender grupos selecionados a partir de grupos alquil e éter.
[00145] A unidade de ramificação A pode ter uma estrutura selecionada dentre: e em que cada A1 representa, independentemente, O, S, C=O ou NH; e cada n representa, independentemente, um número inteiro de 1 a
20.
[00146] A unidade de ramificação pode ter uma estrutura selecionada dentre: e em que cada A1 representa, independentemente, O, S, C=O ou NH; e cada n representa, independentemente, um número inteiro de 1 a
20.
[00147] A unidade de ramificação pode ter uma estrutura selecionada dentre: e em que A1 é O, S, C=O ou NH; e cada n representa, independentemente, um número inteiro de 1 a
20.
[00148] A unidade de ramificação pode ter a estrutura: .
[00149] A unidade de ramificação pode ter a estrutura: .
[00150] A unidade de ramificação pode ter a estrutura: .
[00151] Opcionalmente, a unidade de ramificação consiste em apenas um átomo de carbono.
[00152] A porção "X3" é uma unidade de formação de ponte. A unidade de formação de ponte é linear e está ligada covalentemente à unidade de ramificação e ao ácido nucleico.
[00153] X3 pode ser selecionado dentre -C1-C20 alquileno-, -C2-C20 alquenileno-, um éter alquileno de fórmula -(C1-C20 alquileno)–O–(C1-C20 alquileno)-, -C(O)-C1-C20 alquileno-, -C0-C4 alquileno(Cy)C0-C4 alquileno- em que Cy representa um anel cicloalquileno, arileno, heterociclileno ou heteroarileno substituído ou não substituído de 5 ou 6 membros, -C1-C4 alquileno-NHC(O)-C1-C4 alquileno-, -C1-C4 alquileno-C(O)NH-C1-C4 alquileno-, - C1-C4 alquileno-SC(O)-C1-C4 alquileno-, -C1-C4 alquileno-C(O)S-C1-C4 alquileno-, -C1-C4 alquileno-OC(O)-C1-C4 alquileno-, -C1-C4 alquileno-C(O)O- C1-C4 alquileno- e -C1-C6 alquileno-S-S-C1-C6 alquileno-.
[00154] X3 pode ser um éter alquileno de fórmula -(C1-C20 alquileno)–O–(C1-C20 alquileno)-. X3 pode ser um éter alquileno de fórmula - (C1-C20 alquileno)–O–(C4-C20 alquileno)-, em que o referido (C4-C20 alquileno) está ligado a Z. X3 pode ser selecionado do grupo que consiste de -CH2-O- C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- e -CH2-O-C8H16-, especialmente -CH2-O- C4H8-, -CH2-O-C6H12- e -CH2-O-C8H16-, em que em cada caso o grupo -CH2- está ligado a A.
[00155] O ligante pode compreender um composto da fórmula (II): [S-X1-P-X2]3-A-X3- (II) em que: S representa um sacarídeo; X1 representa C3-C6 alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato); X2 é C1-C8 alquileno; A é uma unidade de ramificação selecionada dentre: n=1a4 n=1a4 X3 é uma unidade de formação de ponte; em que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é conjugado a X3 através de um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato).
[00156] A unidade de ramificação A pode ter a estrutura:
.
[00157] A unidade de ramificação A pode ter a estrutura: , em que X3 é ligado ao átomo de nitrogênio.
[00158] X3 pode ser C1-C20 alquileno. Preferencialmente, X3 é selecionado do grupo que consiste em -C3H6-, -C4H8-, -C6H12- e -C8H16-, especialmente -C4H8-, -C6H12- e -C8H16-.
[00159] O ligante pode compreender um composto da fórmula (III): [S-X1-P-X2]3-A-X3- (III) em que: S representa um sacarídeo; X1 representa C3-C6 alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato); X2 é um éter alquileno de fórmula -C3H6-O-CH2-; A é uma unidade de ramificação; X3 é um éter alquileno de fórmula selecionado do grupo que consiste em -CH2-O-CH2-, -CH2-O-C2H4-, -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, - CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14- e -CH2-O-C8H16-, em que em cada caso o grupo -CH2- está ligado a A, e em que X3 é conjugado com um ácido nucleico de acordo com a presente invenção por um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato).
[00160] A unidade de ramificação pode compreender carbono. Preferencialmente, a unidade de ramificação é carbono.
[00161] X3 pode ser selecionado do grupo que consiste em -CH2-O- C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-, e -CH2-O-C8H16-. Preferencialmente, X3 é selecionado do grupo que consiste em -CH2-O-C4H8-, - CH2-O-C6H12- e -CH2-O-C8H16.
[00162] Para qualquer um dos aspectos acima, quando P representa um grupo fosfato modificado, P pode ser representado por: em que Y1 e Y2 representam independentemente =O, =S, -O-, -OH, - SH, -BH3, -OCH2CO2, -OCH2CO2Rx, -OCH2C(S)ORx e –ORx, em que Rx representa C1-C6 alquil e em que indica ligação ao restante do composto.
[00163] Por fosfato modificado, entende-se um grupo fosfato em que um ou mais dos oxigênios não ligados são substituídos. Exemplos de grupos fosfato modificados incluem fosforotioato, fosforosselenatos, fosfatos de borano, ésteres de borano fosfato, fosfonatos de hidrogênio, fosforamidatos, fosfonatos de alquil ou aril e fosfotriésteres. Os fosforoditioatos têm ambos os oxigênios não ligados substituídos pelo enxofre. Um, cada um ou ambos os oxigênios não ligados no grupo fosfato pode ser independentemente qualquer um de S, Se, B, C, H, N ou OR (R é alquil ou aril).
[00164] O fosfato também pode ser modificado pela substituição de um oxigênio de ligação por nitrogênio (fosforamamidatos em ponte), enxofre (fosforotioatos em ponte) e carbono (metilenofosfonatos em ponte). A substituição pode ocorrer em um oxigênio terminal. É possível substituir os oxigênios não ligados por nitrogênio.
[00165] Por exemplo, Y1 pode representar -OH e Y2 pode representar = O ou = S; ou Y1 pode representar -O- e Y2 pode representar = O ou = S;
Y1 pode representar =O e Y2 pode representar –CH3, -SH, -ORx, ou –BH3 Y1 pode representar =S e Y2 pode representar –CH3, ORx ou –SH.
[00166] Será entendido pela pessoa versada na técnica que, em certos casos, haverá deslocalização entre Y1 e Y2.
[00167] Preferencialmente, o grupo fosfato modificado é um grupo tiofosfato. Os grupos tiofosfato incluem ditiofosfato (ou seja, quando Y 1 representar =S e Y2 representar –S-) e monotiofosfato (ou seja, quando Y1 representar -O- e Y2 representar =S, ou quando Y1 representar =O e Y2 representar –S-). Preferencialmente, P é um monotiofosfato. Os inventores descobriram que os conjugados com grupos tiofosfato em substituição de grupos fosfato têm potência e duração de ação melhoradas in vivo.
[00168] P também pode ser um etil fosfato (ou seja, quando Y1 representar =O e Y2 representar OCH2CH3).
[00169] O sacarídeo pode ser selecionado para ter uma afinidade por pelo menos um tipo de receptor em uma célula alvo. Em particular, o receptor está na superfície de uma célula hepática de mamífero, por exemplo, o complexo receptor de asialoglicoproteína hepática (ASGP-R).
[00170] Para qualquer um dos aspectos acima, o sacarídeo pode ser selecionado a partir de N-acetil com uma ou mais galactosamina, manose, galactose, glicose, glucosamina e frutose. Tipicamente, um ligante a ser usado na presente invenção pode incluir N-acetil galactosamina (GalNAc). Preferencialmente, os compostos da invenção podem ter 3 ligantes, em que cada um incluirá, de preferência, N-acetil galactosamina.
[00171] "GalNAc" se refere a 2-(Acetilamino)-2-desoxi-D- galactopiranose, comumente referida na literatura como N-acetil galactosamina. Referência a "GalNAc" ou "N-acetil galactosamina" inclui tanto a forma β-: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-β-D-galactopiranose quanto a forma α: 2- (Acetilamino)-2-desoxi-α-D-galactopiranose. Em certas modalidades, tanto a forma β: 2-(Acetilarnino)-2-desoxi-β-D-galactopiranose como a forma α: 2-
(Acetilamino)-2-desoxi-α-D-galactopiranose podem ser utilizadas indistintamente. Preferencialmente, os compostos da invenção compreendem a forma β, 2- (Acetilarnino)-2-desoxi-β-D-galactopiranose.
2-(Acetilamino)-2-Desoxi-D-galactopiranose 2-(Acetilamino)-2-Desoxi-β-D-galactopiranose 2-(Acetilamino)-2-Desoxi-α-D-galactopiranose
[00172] Para qualquer um dos compostos acima de fórmula (III), X1 pode ser (-CH2-CH2-O)(-CH2)2-. X1 pode ser (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-. X1 pode ser (-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-. Preferencialmente, X1 é (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-. Alternativamente, X1 representa C3-C6 alquileno. X1 pode ser propileno. X1 pode ser butileno. X1 pode ser pentileno. X1 pode ser hexileno. De preferência o alquil é um alquileno linear. Em particular, X1 pode ser butileno.
[00173] Para compostos de fórmula (III), X2 representa um éter alquileno de fórmula -C3H6-O-CH2- ou seja, C3 alcóxi metileno, ou – CH2CH2CH2OCH2-.
[00174] A invenção fornece um ácido nucleico conjugado com uma das seguintes estruturas:
OH OH OH HO ACHN OH O OH O O ACHN O O O O O O S P O OH O O OH S P O ACHN O OH O O O O O O S O Z O P O O O S O P O
O em que Z é um ácido nucleico como definido anteriormente neste documento.
[00175] Um ligante de fórmula (I), (II) ou (III) pode ser ligado na extremidade 3' da primeira fita (antisense) e/ou em qualquer uma das extremidades 3' e/ou 5' da fita (sense). O ácido nucleico pode compreender mais de um ligante de fórmula (I), (II) ou (III). No entanto, prefere-se um único ligante de fórmula (I), (II) ou (III) porque um único ligante é suficiente para um direcionamento eficiente do ácido nucleico para as células alvo.
[00176] Preferencialmente, a extremidade 5 'da primeira fita (antisense) não está ligada a um ligante de fórmula (I), (II) ou (III), uma vez que um ligante nessa posição pode potencialmente interferir na atividade biológica do ácido nucleico.
[00177] Um ácido nucleico com um único ligante de fórmula (I), (II) ou (III) na extremidade 5' de uma fita é mais fácil e, portanto, mais barato de sintetizar do que o mesmo ácido nucleico com o mesmo ligante na extremidade 3'. Portanto, preferencialmente, um único ligante de qualquer uma das fórmulas (I), (II) ou (III) é covalentemente ligado à (conjugado com) extremidade 5' da segunda fita do ácido nucleico.
[00178] Em uma modalidade, o ácido nucleico é conjugado a um ligante que compreende um lipídeo e, mais preferencialmente, um ligante que compreende um colesterol.
[00179] Um conjugado da invenção pode compreender qualquer ácido nucleico, como divulgado neste documento, conjugado a qualquer ligante ou ligantes como divulgado neste documento.
[00180] A presente invenção refere-se a um conjugado para inibir a expressão de um gene LPA em uma célula, o referido conjugado compreendendo uma porção de ácido nucleico, compreendendo o ácido nucleico de qualquer aspecto da invenção e pelo menos uma porção de ligante, a referida porção de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita de RNA e pelo menos uma porção de uma segunda fita de RNA que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrita a partir do referido gene LPA, as referidas porções de ligantes compreendendo uma fração ligante, preferencialmente uma fração ligante derivada de serinol e um ligante de direcionamento para direcionamento in vivo de células e sendo conjugado exclusivamente às extremidades 3' e/ou 5' de uma ou ambas as fitas de RNA, em que a extremidade 5' da primeira fita de RNA não está conjugada, em que: (i) a segunda fita de RNA é conjugada na extremidade 5' com o ligante de direcionamento e em que (a) a segunda fita de RNA também é conjugada na extremidade 3' com o ligante de direcionamento e a extremidade 3' da primeira fita de RNA não é conjugada; ou (b) a primeira fita de RNA é conjugada na extremidade 3' com o ligante de direcionamento e a extremidade
3' da segunda fita de RNA não é conjugada; ou (c) tanto a segunda fita de RNA quanto a primeira fita de RNA também são conjugadas nas extremidades 3' do ligante de direcionamento; ou (ii) a segunda fita de RNA e a primeira fita de RNA são conjugadas nas extremidades 3' do ligante de direcionamento e a extremidade 5' da segunda fita de RNA não é conjugada.
[00181] Em uma modalidade da presente invenção, a segunda fita de RNA (isto é, a fita sense) é conjugada na extremidade 5' a um ligante de direcionamento, a primeira fita de RNA (ou seja, a fita antisense) é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da segunda fita de RNA (isto é, a fita sense) não é conjugada, de modo que um conjugado com a estrutura esquemática, como mostrado na Figura 40A, é formado.
[00182] Em uma modalidade da presente invenção, a segunda fita de RNA (ou seja, a fita sense) é conjugada na extremidade 5 'ao ligante de direcionamento, a segunda fita de RNA (ou seja, a fita sense) também é conjugada na extremidade 3' do ligante de direcionamento e a extremidade 3 'da primeira fita de RNA (ou seja, a fita antisense) não é conjugada, de modo que um conjugado com a estrutura esquemática, como mostrado na Figura 40B, seja formado.
[00183] Em uma modalidade da presente invenção, tanto a segunda fita de RNA (ou seja, a fita sense) e a primeira fita de RNA (ou seja, a fita antisense) são conjugadas nas extremidades 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 5' da segunda fita de RNA (isto é, a fita sense) não é conjugada, de modo que um conjugado com a estrutura esquemática, como mostrado na Figura 40C, é formado.
[00184] Em uma modalidade da presente invenção, a segunda fita de RNA (ou seja, a fita sense) é conjugada na extremidade 5' ao ligante alvo e a segunda fita de RNA (ou seja, a fita sense) e a primeira fita de RNA (ou seja, a fita antisense) também são conjugados nas extremidades 3' ao ligante de direcionamento, de modo que um conjugado com a estrutura esquemática,
como mostrado na Figura 40D, seja formado.
[00185] Em qualquer uma das modalidades acima, indica o ligante que conjuga o ligante às extremidades da porção de ácido nucleico; o ligante pode ser uma fração de GalNAc tal como GalNAc; e a estrutura esquemática, como mostrado na Figura 40E, representa a porção de ácido nucleico.
[00186] Estes diagramas esquemáticos não se destinam a limitar o número de nucleotídeos na primeira ou na segunda fita, nem representam qualquer tipo de limitação da complementaridade das bases ou qualquer outra limitação.
[00187] Os ligantes podem ser monoméricos ou multiméricos (por exemplo, diméricos, triméricos, etc.).
[00188] Adequadamente, os ligantes são monoméricos, contendo assim uma única fração do ligante de direcionamento, por exemplo, uma única fração de GalNAc.
[00189] Alternativamente, os ligantes podem ser ligantes diméricos em que as porções de ligante compreendem duas frações ligantes, tais como frações ligantes derivadas de serinol ou frações ligantes não serinol, cada uma ligada a uma única fração de ligante de direcionamento.
[00190] Os ligantes podem ser ligantes triméricos em que as porções de ligante compreendem três frações ligantes, tais como frações ligantes derivadas de serinol ou frações ligantes não serinol, cada uma ligada a uma única fração de ligante de direcionamento.
[00191] As duas ou três frações ligantes derivadas de serinol podem ser ligadas em série, por exemplo, como mostrado abaixo: em que n é 1 ou 2 e Y é S ou O.
[00192] Preferencialmente, os ligantes são monoméricos.
[00193] Adequadamente, as fitas de RNA conjugadas são conjugadas a um ligante de direcionamento por meio de uma fração ligante incluindo um ligante adicional, em que o ligante adicional é ou compreende uma cadeia de C1-15 alquil saturada, não ramificada ou ramificada, em que opcionalmente um ou mais carbonos (por exemplo 1, 2 ou 3 carbonos, adequadamente 1 ou 2, em particular 1) é/são substituído(s) por um heteroátomo selecionado dentre O, N, S(O)p, em que p é 0, 1 ou 2 (por exemplo, um grupo CH2 é substituído por O, ou por NH, ou por S, ou por SO2 ou um grupo –CH3 no terminal da cadeia ou em uma ramificação é substituído por OH ou por NH2), em que a referida cadeia é opcionalmente substituída por um ou mais grupos oxo (por exemplo 1 a 3, como 1 grupo).
[00194] Adequadamente, a fração ligante é uma fração ligante derivada de serinol.
[00195] Mais adequadamente, o ligante adicional compreende uma cadeia de C1-15 alquil saturada e não ramificada, em que um ou mais carbonos (por exemplo 1, 2 ou 3 carbonos, adequadamente 1 ou 2, em particular 1) é/são substituídos por um átomo de oxigênio.
[00196] Mais adequadamente, o ligante adicional compreende uma cadeia PEG.
[00197] Mais adequadamente, o ligante adicional compreende uma cadeia C1-15 alquil saturada e não ramificada.
[00198] Mais adequadamente, o ligante adicional compreende uma cadeia C1-6 alquil saturada e não ramificada.
[00199] Mais adequadamente, o ligante adicional compreende uma cadeia C4 ou C6 alquil saturada, não ramificada, por exemplo, uma cadeia C4 alquil.
[00200] Em uma modalidade, é uma fração de ligação da fórmula (V):
(V) em que n, Y e L1 são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[00201] Assim, em uma modalidade, a porção de ligante de direcionamento é uma fração de ligação da fórmula (VI): (VI) em que n, Y e L1 são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[00202] Adequadamente, é uma fração de ligação da fórmula (XIV): (XIV) em que n, Y, R1 e L são definidos abaixo, L está conectado ao ligante de direcionamento, por exemplo, GalNAc e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[00203] Adequadamente, a porção de ligante de direcionamento é uma fração de ligação da fórmula (IV):
(IV) em que n, Y e R1 e L são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[00204] Adequadamente, é uma fração de ligação da fórmula (VII): (VII) em que n, Y e L2 são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[00205] Adequadamente, a porção de ligante de direcionamento é uma fração de ligação da fórmula (VIII): (VIII) em que n, Y e L2 são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[00206] Adequadamente, é uma fração de ligação da fórmula (IX): (IX)
em que F, Y e L são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA. Adequadamente, a porção de ligante de direcionamento é uma fração de ligação da fórmula (IXa): (IXa) em que F, Y e L são definidos abaixo e o O do grupo fósforo está ligado ao oligonucleosídeo terminal das fitas de RNA.
[00207] Adequadamente, L é: .
[00208] Em qualquer uma das estruturas acima, adequadamente os ligantes são selecionados a partir de frações de GalNAc e galactose, especialmente frações de GalNAc. Alternativamente, o GalNac pode ser substituído por outro ligante de direcionamento, por exemplo, um sacarídeo.
[00209] Em uma modalidade da invenção, a primeira fita de RNA é um composto da fórmula (X): (X) em que b é 0 ou 1; e a segunda fita de RNA é um composto de fórmula (XI):
(XI); em que: c e d são independentemente 0 ou 1; Z1 e Z2 são as porções de RNA da primeira e segunda fitas de RNA, respectivamente; Y é O ou S; n é 0, 1, 2 ou 3; e L1 é um ligante ao qual um ligante está ligado; e em que b + c + d é 2 ou 3. Adequadamente, a primeira fita de RNA é um composto da fórmula (XV)
(XV) em que b é 0 ou 1; e a segunda fita de RNA é um composto de fórmula (XVI):
(XVI);
em que c e d são independentemente 0 ou 1; em que: Z1 e Z2 são as porções de RNA da primeira e segunda fitas de RNA, respectivamente; Y é O ou S; R1 é H ou metil; n é 0, 1, 2 ou 3; e L é igual ou diferente nas fórmulas (XV) e (XVId) e é selecionado do grupo que consiste em: -(CH2)r-C(O)-, em que r = 2-12; -(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, em que s = 1-5; -(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, em que t é independentemente 1-5; -(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, em que u é independentemente 1-5; e -(CH2)v-NH-C(O)-, em que v é 2-12; e em que o C(O) terminal (se presente) está ligado ao grupo NH; e em que b + c + d é 2 ou 3.
[00210] Adequadamente, a primeira fita de RNA é um composto da fórmula (XII): (XII) em que b é 0 ou 1; e a segunda fita de RNA é um composto da fórmula (XIII):
(XIII); em que: c e d são independentemente 0 ou 1; Z1 e Z2 são as porções de RNA da primeira e segunda fitas de RNA, respectivamente; Y é O ou S; n é 0, 1, 2 ou 3; e L2 é igual ou diferente nas fórmulas (XII) e (XIII) e é igual ou diferente nas frações entre parênteses por b, c e d e é selecionado do grupo que consiste em:
; ;e ; ou n é 0 e L2 é:
e o grupo OH terminal está ausente, de modo que a seguinte fração é formada:
; em que F é uma cadeia C1-8 alquil ramificada ou não ramificada (como não ramificada) (por exemplo, alquil C1-6), em que um dos átomos de carbono é opcionalmente substituído por um átomo de oxigênio, desde que o referido átomo de oxigênio seja separado de outro heteroátomo (por exemplo, um átomo O ou N) por pelo menos 2 átomos de carbono; L é igual ou diferente nas fórmulas (I) e (II) e é selecionado do grupo que consiste em: -(CH2)r-C(O)-, em que r = 2-12; -(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, em que s = 1-5; -(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, em que t é independentemente 1-5; -(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, em que u é independentemente 1-5; e -(CH2)v-NH-C(O)-, em que v é 2-12; e em que o C(O) terminal (se presente) está ligado ao grupo NH; e em que b + c + d é 2 ou 3.
[00211] Em qualquer uma das fórmulas acima, quando GalNAc está presente, o GalNAc pode ser substituído por qualquer outro ligante de direcionamento, como os mencionados neste documento.
[00212] Adequadamente, b é 0, c é 1 e d é 1; b é 1, c é 0 e d é 1; b é 1, c é 1 e d é 0; ou b é 1, c é 1 e d é 1.
[00213] Mais adequadamente, b é 0, c é 1 e d é 1; b é 1, c é 0 e d é 1; ou b é 1, c é 1 e d é 1.
[00214] Mais adequadamente, b é 0, c é 1 e d é 1.
[00215] Em uma modalidade, Y é O. Em outra modalidade, Y é S.
[00216] Em uma modalidade, R1 é H ou metil. Em uma modalidade, R1 é H. Em outra modalidade, R1 é metil.
[00217] Em uma modalidade, n é 0, 1, 2 ou 3. Adequadamente, n é
0.
[00218] Em uma modalidade, L é selecionado do grupo que consiste em: -(CH2)r-C(O)-, em que r = 2-12; -(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, em que s = 1-5; -(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, em que t é independentemente 1-5;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, em que u é independentemente 1-5; e -(CH2)v-NH-C(O)-, em que v é 2-12; em que o C(O) terminal está ligado ao grupo NH.
[00219] Adequadamente, L é -(CH2)r-C(O)-, em que r = 2-12. Adequadamente, r = 2-6. Mais adequadamente, r = 4 ou 6, por exemplo, 4.
[00220] Adequadamente, L é: .
[00221] Frações F de exemplo incluem (CH2)1-6 por exemplo (CH2)1-4 por exemplo CH2, (CH2)4, (CH2)5 ou (CH2)6, ou CH2O(CH2)2-3, por exemplo CH2O(CH2)CH3. Adequadamente, L2 é: . Adequadamente, L2 é: . Adequadamente, L2 é: . Adequadamente, L2 é: .
[00222] Adequadamente, n é 0 e L2 é:
e o grupo OH terminal está ausente, de modo que a seguinte fração é formada: ; em que Y é como definido em outra parte neste documento.
[00223] Dentro da fração entre colchetes por b, c e d, L2 é tipicamente o mesmo. Entre frações entre colchetes por b, c e d, L2 pode ser igual ou diferente. Em uma modalidade, L2 na fração entre colchetes por c é o mesmo que L2 fração entre colchetes em d. Em uma modalidade, L2 na fração entre colchetes por c não é o mesmo que L2 na fração entre colchetes por d. Em uma modalidade, o L2 nas frações entre colchetes por b, c e d é o mesmo, por exemplo, quando a fração ligante é uma fração ligante derivada de serinol.
[00224] As frações ligantes derivadas de serinol podem ser baseadas em serinol em qualquer estereoquímica, ou seja, derivadas do isômero L-serina, D-serina, uma serina racêmica ou outra combinação de isômeros. Em um aspecto preferido da invenção, a fração serinol-GalNAc (SerGN) possui a seguinte estereoquímica: L-Serina Porções Ligantes derivadas de Serinol Blocos de Construção de (S)-Serinol ou seja, é baseado em um bloco de construção suportado sólido (S)- serinol-amidita ou (S)-serinol-succinato derivado do isômero L-serina.
[00225] Em uma modalidade, as células alvo são hepatócitos. Esquemas gerais de síntese: 1
[00226] Os compostos de exemplo podem ser sintetizados de acordo com os métodos descritos abaixo e conhecidos do versado na técnica. Embora os esquemas ilustrem a síntese de conjugados particulares, será entendido que outros conjugados reivindicados podem ser preparados por métodos análogos. A montagem da cadeia oligonucleotídica e dos blocos ligantes pode, por exemplo, ser realizada por síntese em fase sólida, aplicando a metodologia de fosforamidita. A síntese em fase sólida pode começar a partir de um CPG lcaa carregado com blocos de construção modificados ou base. O ciclo de acoplamento da síntese de fosforamidita consiste em 1) remoção de DMT, 2) alongamento da cadeia usando a fosforamidita mascarada com DMT e um ativador, que pode ser benziltiotetrazol (BTT), 3) capeamento de cadeias oligonucleotídicas não alongadas, seguido de oxidação da P(III) a P(V) por iodo (se for desejável ligação fosfodiéster) ou EDITH (se for desejável ligação fosforotioato) e novamente capeamento (Cap/Ox/Cap ou Cap/Tio/Cap). A conjugação de GalNAc pode ser alcançada pela formação da ligação peptídica de um bloco de construção de ácido GalNAc-carboxílico ao oligonucleotídeo previamente montado e purificado, possuindo o número necessário de blocos de construção de ligantes modificados por amino. Os blocos de construção necessários estão disponíveis comercialmente ou a síntese é descrita abaixo. Todos os produtos finais de fita simples foram analisados por AEX-HPLC para provar sua pureza. A pureza é dada em % de FLP (% de produto de comprimento completo), que é a porcentagem da área UV sob o sinal do produto atribuído no traço UV da análise AEX-HPLC do produto final. A identidade dos respectivos produtos de fita simples foi comprovada por análise de LC-MS. Síntese de Síntons
Esquema 1: Síntese de síntons ligantes de DMT-serinol(TFA) DMT-Serinol(TFA)-succinato 6 i) trifluoroacetato de etila, NEt3, MeOH, 0°C, 16h, 2: 86% 5: 90%, ii) DMTCl, piridina, 0°C, 16h, 74%, iii) LiBH4, EtOH/THF (1/1, v/v), 0°C, 1h, 76%, iv) fosforamidita de 2‐cianoetil‐N,N‐diisopropilcloro, EtNiPr2, CH2Cl2, 56%, v) anidrido succínico, DMAP, piridina, RT, 16h, 38%, vi) HBTU, DIEA, amino-lcaa CPG (500A), RT, 18h, 29% (26 umol/g carregamento).
[00227] O (S)-DMT-serinol(TFA)-fosforamidita 7 pode ser sintetizado a partir do derivado do éster metílico da (L)-serina 1 de acordo com os métodos publicados na literatura (Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135).
[00228] O (S)-DMT-serinol(TFA)-succinato 6 pode ser produzido por conversão do intermediário 5 com anidrido succínico na presença de um catalisador como DMAP.
[00229] O carregamento de 6 a um suporte sólido, como um suporte de vidro de poro controlado (CPG), pode ser obtida por formação de ligação peptídica a um suporte sólido, como um suporte de CPG nativo modificado por amino (500A), usando um reagente de acoplamento, como HBTU. O (S)-DMT- Serinol(TFA)-succinato 6 e um reagente de acoplamento como HBTU são dissolvidos em um solvente como CH3CN. Uma base, como diisopropiletilamina, é adicionada à solução e a mistura reacional é agitada durante 2 min. Um suporte sólido tal como um suporte nativo de amino-lcaa- CPG (500 A, 3 g, teor de amina: 136 umol/g) é adicionado à mistura reacional e se forma uma suspensão. A suspensão é agitada suavemente a temperatura ambiente em um agitador de pulso durante 16 h, depois filtrada e lavada com solvente como DCM e EtOH. O suporte é seco sob vácuo durante 2 h. As aminas que não reagiram no suporte podem ser tapadas por agitação com anidrido acético/lutidina/N-metilimidazol a temperatura ambiente. A lavagem do suporte pode ser repetida como acima. O suporte sólido é seco sob vácuo para produzir suporte sólido 10. Esquema 2: Síntese do sínton GalNAc 9 GalN(Ac4)-C4-ácido 9 (vii) TMSOTf, DCM, hexenol, viii) RuCl3, NaIO4, DCM, CH3CN, H2O, 46% em duas etapas.
[00230] A síntese do sínton GalNAc 9 pode ser preparada de acordo com métodos descritos em Nair et al. (2014), a partir de galactose amina per-acetilada disponível comercialmente 8. Síntese de conjugados GalNAc derivados de serinol de fita simples Esquema 3: Procedimento geral da síntese de oligonucleotídeos para ligantes derivados de serinol
Etapas fita oligonucleo- 13 (ver Figura 13) tídica )
[00231] A síntese de oligonucleotídeos de oligonucleotídeos conjugados a 3' mono-GalNAc (como o composto A0264) é descrita na Figura 13 e resumida no Esquema 3. A síntese é iniciada usando (S)-DMT- Serinol(TFA)–succinato-lcaa-CPG 10 como no composto A0264 de exemplo. Caso sejam necessários blocos de construção de serinol adicionais, a amidita (S)-DMT-serinol(TFA) (7) é usada no ciclo de síntese da fase sólida apropriado. Por exemplo, para fazer o composto A0329, o conjunto da cadeia é finalizado com um acoplamento de serinol amidita adicional após a sequência de base estar totalmente montada. Além disso, a síntese de oligonucleotídeos de oligonucleotídeos conjugados com 5' mono-GalNAc pode ser iniciada a partir de um suporte sólido carregado com o nucleosídeo apropriado de sua respectiva sequência. No composto A0220 de exemplo este pode ser 2'fA. A cadeia oligonucleotídica é montada de acordo com sua sequência e, conforme apropriado, é usado o bloco de construção (S)-DMT-serinol(TFA)-amidita (7). Após a conclusão do alongamento da cadeia, o grupo DMT protetor do último bloco de construção de amidita acoplada é removido, como na etapa 1) do ciclo de síntese de fosforamidita.
[00232] Após a conclusão da última etapa do sintetizador, as fitas simples podem ser cortadas do suporte sólido por tratamento com uma amina como tratamento com metilamina 40% aq. Quaisquer grupos protetores restantes também são removidos nesta etapa e o tratamento com metilamina também libera a função amino do serinol. Os produtos em bruto foram então purificados cada um por AEX-HPLC e SEC para produzir o oligonucleotídeo precursor para posterior conjugação de GalNAc.
Esquema 4: Síntese da conjugação GalNAc de oligonucleotídeos precursores derivados de serinol fita oligonucleo- tídica
[00233] Após a síntese em fase sólida, a conjugação de GalNAc foi alcançada pela pré-ativação do ácido GalN(Ac4)-C4-ácido (9) por um reagente de acoplamento peptídico, como HBTU. O ácido pré-ativado 9 foi então reagido com os grupos amino em 11 (por exemplo, A0264) para formar os GalN(Ac4)- conjugados intermediários. Os grupos acetil que protegem os grupos hidroxila nas frações GalNAc foram cortados por tratamento com metilamina para produzir os compostos 12 de exemplo desejados (por exemplo, A0268), que foram posteriormente purificados por AEX-HPLC e SEC.Síntese de Conjugados de GalNAc não derivada de serinol de fita simples
[00234] Os blocos de construção modificados por amino que não o serinol estão disponíveis comercialmente em vários fornecedores e podem ser usados em vez do serinol para fornecer grupos amino reativos que permitem a conjugação de GalNAc. Por exemplo, os blocos de construção disponíveis comercialmente, mostrados na Tabela 6 abaixo, podem ser usados para fornecer oligonucleotídeos precursores modificados por amino não derivados de serinol 14 (Esquema 5A) usando CPG carregado com modificador de amino como 10-1 a 10-3 seguido pela montagem de sequência conforme descrito acima e finalmente acoplamento de fosforamiditas modificadoras de amino como 13-1, 13-2 ou 13-4.
[00235] Por exemplo, para produzir 14 (A0653) GlyC3Am-CPG (10- 2) foi usado em combinação com GlyC3Am-Amidita 13-2. Modificadores estruturalmente diferentes podem ser usados para fazer 14, por exemplo, para A0651 C7Am-CPG foi usado em combinação com C6Am-Amidita como segunda modificação de amino. De um modo semelhante, o CPG 10-5 carregado com modificador de amino disponível comercialmente e a fosforamidita 13-5 modificada com amino podem ser usados para sintetizar moléculas precursoras modificadas com amino 14 (A0655). Tabela 6: Blocos de construção disponíveis comercialmente C3Am-CPG (10-1) é: GlyC3Am-CPG (10-2) é: C7Am-CPG (10-3) é: PipAm-CPG (10-5) é: C3Am-Phos (13-1) é: GlyC3Am-Phos (13-2) é: C6Am-Phos (13-4) é: PipAm-Phos (13-5) é: Esquema 5: Procedimento geral para síntese de oligonucleotídeos
Etapas fita 13 13) (ver Figura oligonucleotídica ) Acetonitrila ausente, Etapas adicionais ausente,
fita oligonucleo- tídica ausente, ausente,
ou fita oligonucleotídica ausente, ausente,
ausente, ausente, ausente,
Etapas fita (ver Figura13) 13) oligonucleotídica Acetonitrila Etapas adicionais fita oligonucleotídica
[00236] Os oligonucleotídeos precursores resultantes 14 podem então ser conjugados com GalN(Ac4)-C4-ácido (9) para produzir os compostos 15 de exemplo desejados (Esquema 6). Esquema 6: Síntese da conjugação GalNAc de oligonucleotídeos precursores fita oligonucleotídica ausente, ausente, ou fita oligonucleotídica ausente, ausente, ou fita oligonucleotídica Síntese dos conjugados GalNAc de tri-antenários de fita simples nos conjugados de referência 3-4
[00237] A síntese de oligonucleotídeos do siRNA conjugado com GalNAc-aglomerado tri-antenário é descrita na Figura 14. O conjunto da cadeia oligonucleotídica é iniciado usando suporte carregado com base, por exemplo, 5'DMT-2'FdA(bz)-succinato-lcaa-CPG como no composto A0006 de exemplo. Ciclo de acoplamento da síntese de fosforamidita que consiste em 1) remoção de DMT, 2) alongamento da cadeia usando a fosforamidita necessária mascarada com DMT, 3) capeamento de cadeias oligonucleotídicas não alongadas, seguido de oxidação da P(III) em P(V) ou Iodo ou EDITH (se for desejável a ligação fosforotioato) e novamente o nivelamento (Cap/Ox/Cap ou Cap/Tio/Cap) é repetido até atingir o comprimento total do produto. Para a conjugação na coluna de um aglomerado de GalNAc tri-antenário trivalente, o mesmo ciclo de síntese foi aplicado com o uso da amidita necessária de ramificação trivalente C4XLT-phos seguido por outra rodada do ciclo de síntese usando a amidita GalNAc ST23-phos. Após a conclusão desta última etapa do sintetizador, o oligonucleotídeo foi clivado do suporte sólido e grupos protetores adicionais podem ser removidos por tratamento com metilamina. Os produtos em bruto foram então purificados cada um por AEX-HPLC e SEC. Procedimento geral de formação de fita dupla
[00238] A fim de obter os conjugados de fita dupla, fitas simples são dissolvidas em uma concentração de 60 OD/mL em H2O. Ambas as soluções oligonucleotídicas individuais podem ser adicionadas juntas a um vaso reacional. Para o monitoramento da reação, uma titulação pode ser realizada. A primeira fita é adicionada em excesso de 25% sobre a segunda fita, conforme determinado por absorção de UV a 260 nm. A mistura reacional é aquecida, por exemplo, a 80°C durante 5 minutos e depois arrefecida lentamente à RT. A formação de fita dupla pode ser monitorada por HPLC de fase reversa de pareamento de íons. A partir da área UV da fita simples residual, a quantidade necessária da segunda fita pode ser calculada e adicionada à mistura reacional. A reação é aquecida, por exemplo, à 80°C novamente e lentamente resfriada à RT. Este procedimento pode ser repetido até que menos de 10% da fita simples residual seja detectado.
[00239] O processo acima (incluindo os Esquemas 1-6 e Figuras 13 e 14) pode ser facilmente adaptado para substituir GalNac por outro ligante de direcionamento, por exemplo, um sacarídeo.
[00240] Em qualquer um dos aspectos acima, em vez da conjugação pós-síntese em fase sólida, é possível fazer uma fosforamidita pré-formada de Serinol (GN) e usá-la para a conjugação em coluna.
Esquemas gerais de síntese: 2
[00241] Os compostos de exemplo podem ser sintetizados de acordo com os métodos descritos abaixo e conhecidos do versado na técnica. A montagem da cadeia oligonucleotídica e dos blocos ligantes pode, por exemplo, ser realizada por síntese em fase sólida, aplicando a metodologia de fosforamidita. A conjugação de GalNAc pode ser alcançada pela formação da ligação peptídica de um bloco de construção de ácido GalNAc-carboxílico ao oligonucleotídeo previamente montado e purificado, possuindo o número necessário de blocos de construção de ligantes modificados por amino. Esquema 1: Síntese de síntons ligantes de DMT-serinol(TFA) DMT-Serinol(TFA)-succinato 6 i) trifluoroacetato de etila, NEt3, MeOH, 0°C, 16h, 2: 86% 5: 90%, ii) DMTCl, piridina, 0°C, 16h, 74%, iii) LiBH4, EtOH/THF (1/1, v/v), 0°C, 1h, 76%, iv) fosforamidita de 2‐cianoetil‐N,N‐diisopropilcloro, EtNiPr2, CH2Cl2, 56%, v) anidrido succínico, DMAP, piridina, RT, 16h, 38%, vi) HBTU, DIEA, amino-lcaa
CPG (500A), RT, 18h, 29%.
[00242] O DMT-serinol(TFA)-fosforamidita 7 pode ser sintetizado a partir do derivado de serinol 1 de acordo com os métodos publicados na literatura (Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135).
[00243] O DMT-serinol(TFA)-succinato 6 pode ser produzido por conversão do intermediário 5 com anidrido succínico na presença de um catalisador como DMAP.
[00244] O carregamento de 6 a um suporte sólido, como um suporte de CPG, pode ser obtida por formação de ligação peptídica a um suporte sólido, como um suporte de CPG nativo modificado por amino (500A), usando um reagente de acoplamento, como HBTU. O DMT-Serinol(TFA)-succinato 6 e um reagente de acoplamento como HBTU são dissolvidos em um solvente como CH3CN. Uma base, como diisopropiletilamina, é adicionada à solução e a mistura reacional é agitada durante 2 min. Um suporte sólido tal como um suporte nativo de amino-lcaa-CPG (500 A, 3 g, teor de amina: 136 micromol/g) é adicionado à mistura reacional e se forma uma suspensão. A suspensão é agitada suavemente à temperatura ambiente em um agitador de pulso durante 16 h, depois filtrada e lavada com solvente como DCM e EtOH. O suporte é seco sob vácuo durante 2 h. As aminas que não reagiram no suporte podem ser tapadas por agitação com anidrido acético/lutidina/N-metilimidazol a temperatura ambiente. A lavagem do suporte pode ser repetida como acima. O suporte sólido é seco sob vácuo para produzir suporte sólido 10. Esquema 2: Síntese do sínton GalNAc 9 (vii) TMSOTf, DCM, hexenol, viii) RuCl3, NaIO4, DCM, CH3CN, H2O, 46% em duas etapas.
[00245] A síntese do sínton GalNAc 9 pode ser preparada de acordo com métodos descritos em Nair et al. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), pp 16958-16961, a partir de galactose amina per-acetilada disponível comercialmente 8. Esquema 3: Procedimento geral da síntese de oligonucleotídeos Etapas fita oligonucleotídica (ver Figura 17) 17)
[00246] Todos os oligonucleotídeos podem ser sintetizados em um sintetizador AKTA oligopilot 10 usando a química padrão de fosforamidita que é descrita em detalhes abaixo.
[00247] A síntese de oligonucleotídeos de precursores de oligonucleotídeos 3' e 5' conjugados com GalNAc (como o composto X0385B- prec) é descrita na Figura 17 e resumida no Esquema 3. A síntese é iniciada com DMT-Serinol(TFA)-succinato-lcaa-CPG 10. Um ciclo de síntese de fosforamidita é aplicado até o comprimento total do produto ser conseguido. Após a conclusão do alongamento da cadeia, o grupo DMT protetor do último bloco de amidita acoplado pode ser removido da mesma maneira que em cada ciclo de síntese individual. Para concluir a síntese do composto de X0385B- prec de exemplo (que tem uma fração ligante derivada de serinol nas extremidades 3' e 5' da segunda fita), a montagem da cadeia foi finalizada com um acoplamento adicional de amidita de serinol depois que a sequência base foi totalmente montada.
[00248] Após a conclusão da última etapa do sintetizador, as fitas simples podem ser cortadas do suporte sólido por tratamento com uma amina como metilamina 40% aq. Quaisquer grupos protetores restantes também são removidos nesta etapa e o tratamento com metilamina também libera a função amino do serinol. O oligonucleotídeo bruto resultante pode ser purificado por cromatografia de troca iônica (Recurso Q, 6 mL, GE Healthcare) em um sistema AKTA Pure HPLC usando um gradiente como um gradiente de cloreto de sódio. O excesso de sal da purificação de IEX pode ser removido por SEC para produzir o oligonucleotídeo precursor modificado por amino 11. As frações que contêm o produto são reunidas, dessalinizadas em uma coluna de exclusão de tamanho (Zetadex, EMP Biotech) e liofilizadas. Esquema 4: Procedimento geral para a conjugação de GalNAc (i) 9, HBTU, DIPEA, DMSO; 11, H2O, DMSO, DIPEA; então ativado 9, 11; depois MeNH2, H2O a 40%
[00249] A conjugação do sínton GalNAc 9, como descrito acima, pode ser conseguida através do acoplamento 9 à função serinol-amino da respectiva fita oligonucleotídica 11 utilizando condições padrão de acoplamento peptídico conhecidas pelo versado. Por exemplo, a molécula precursora modificada por amino 11 é dissolvida em H2O e um solvente polar como DMSO (por exemplo, DMSO/H2O, 2/1, v/v) é adicionado, seguido por uma base como DIPEA (por exemplo, 2,5% do volume total). Em um vaso reacional separado, a pré-ativação do sínton GalNAc 9 pode ser realizada por reação de 2 eq. (por função amino no oligonucleotídeo precursor modificado por amino) do componente ácido carboxílico com 2 eq. de um reagente de acoplamento como HBTU na presença de 8 eq. de uma base, como DIPEA, em um solvente polar como DMSO. Após 2 min, o composto 9 ativado é adicionado à solução da respectiva molécula precursora modificada por amino 11. O progresso da reação pode ser monitorado por LCMS ou AEX-HPLC. Após a conclusão da reação de conjugação (por exemplo, 30 minutos), o produto bruto pode ser precipitado pela adição de 10x iPrOH 0,1x 2M NaCl e coletado por decantação por centrifugação. Os grupos protetores de acetil hidroxi são removidos sob condições básicas, como MeNH2 a 40% (1 mL por 500 OD). Após 15 minutos a RT, H2O (1:10 v/v) é adicionado e o composto 12 (como X0385B mostrado na Figura 17) é isolado, purificado novamente por cromatografia de troca aniônica e exclusão de tamanho e depois liofilizado. Procedimento geral de formação de fita dupla
[00250] As fitas simples individuais são dissolvidas em uma concentração de 60 OD/mL em H2O. Ambas as soluções oligonucleotídicas individuais podem ser adicionadas juntas a um vaso reacional. Para o monitoramento da reação, uma titulação pode ser realizada. A primeira fita é adicionada em excesso de 25% sobre a segunda fita, conforme determinado por absorção de UV a 260 nm. A mistura reacional é aquecida, por exemplo, a 80°C durante 5 minutos e depois arrefecida lentamente à RT. A formação de fita dupla pode ser monitorada por HPLC de fase reversa de pareamento de íons. A partir da área UV da fita simples residual, a quantidade necessária da segunda fita pode ser calculada e adicionada à mistura reacional. A reação é aquecida, por exemplo, à 80°C novamente e lentamente resfriada à RT. Este procedimento pode ser repetido até que menos de 10% da fita simples residual seja detectado.
[00251] O processo acima (incluindo os Esquemas 1-4 e Figura 17) pode ser facilmente adaptado para substituir GalNac por outro ligante de direcionamento, por exemplo, um sacarídeo.
[00252] A presente invenção refere-se a um conjugado para inibir a expressão de um gene LPA em uma célula, o referido conjugado compreendendo uma porção de ácido nucleico e porções de ligante, a referida porção de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita de RNA e pelo menos uma porção de uma segunda fita de RNA que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrita a partir do referido gene LPA , as referidas porções de ligante compreendendo uma fração ligante e um ligante de direcionamento para direcionamento in vivo de células e sendo conjugado exclusivamente às extremidades 3' e/ou 5' de uma ou ambas as fitas de RNA, em que a extremidade 5' da primeira fita de RNA não está conjugada, em que: (i) a segunda fita de RNA é conjugada na extremidade 5' ao ligante de direcionamento, e em que (a) a segunda fita de RNA também é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da primeira fita de RNA não é conjugada; ou (b) a primeira fita de RNA é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da segunda fita de RNA não é conjugada; ou (c) tanto a segunda fita de RNA quanto a primeira fita de RNA também são conjugadas nas extremidades 3' ao ligante de direcionamento; ou (ii) a segunda fita de RNA e a primeira fita de RNA são conjugadas nas extremidades 3' do ligante de direcionamento e a extremidade 5' da segunda fita de RNA não é conjugada.
[00253] A fração ligante pode, por exemplo, ser uma fração ligante derivada de serinol ou um dos outros tipos de ligantes peptídicos descritos neste documento.
[00254] A invenção fornece, como outro aspecto, um ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula, compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a referida primeira fita compreende uma sequência nucleotídica selecionada das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73, em que o ácido nucleico é conjugado a um ligante. A segunda fita pode compreender uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44,
64, 66, 68, 70, 72 ou 74. Os nucleotídeos da primeira e/ou segunda fita podem ser modificados, conforme descrito neste documento.
[00255] De preferência, o ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 10 conjugado com um ligante de fórmula I (conforme estabelecido acima), em que o ligante é conjugado ao ácido nucleico conforme descrito e em que a primeira fita é modificada com uma modificação de 2'OMe nos nucleotídeos numerados ímpares e modificada com um 2'F nos nucleotídeos numerados pares, e a segunda fita é modificada com um 2'OMe nos nucleotídeos numerados pares e modificados com um 2'F nos nucleotídeos numerados ímpares.
[00256] Mais preferencialmente, o ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 10, em que o ácido nucleico é conjugado com um ligante de fórmula I (conforme estabelecido acima), e além disso, em que o ácido nucleico tem um padrão de modificação conforme mostrado abaixo, que é um extrato da Tabela 1 conforme fornecido neste documento. SEQ ID NO: 5 5‘ auaacucuguccauuacca 3‘ 6162717181736152736 SEQ ID NO: 6 5‘ ugguaauggacagaguuau 3‘ 1845261846364645161 SEQ ID NO: 9 5‘ auaacucuguccauuaccg 3‘ 6162717181736152738 SEQ ID NO: 10 5‘ cgguaauggacagaguuau 3‘ 3845261846364645161 em que as modificações específicas são representadas por números 1=2´F-dU, 2=2‗-F-dA, 3=2´F-dC, 4=2´F-dG, 5=2'-OMe-rU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG.
[00257] O ligante pode compreender GalNAc e a Figura 4A ou a Figura 4B ilustram ainda exemplos da presente invenção.
[00258] A presente invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo o ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção. As composições farmacêuticas podem ser usadas como medicamentos ou como agentes de diagnóstico, sozinhos ou em combinação com outros agentes. Por exemplo, um ou mais conjugados de ácido nucleico da invenção podem ser combinados com um veículo de distribuição (por exemplo, lipossomas) e/ou excipientes, como carreadores, diluentes. Outros agentes, como conservantes e estabilizadores, também podem ser adicionados. Os métodos para a distribuição de ácidos nucleicos são conhecidos na técnica e dentro do conhecimento do versado na técnica.
[00259] O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da presente invenção também pode ser administrado em combinação com outros compostos terapêuticos, administrados separadamente ou simultaneamente, por exemplo, como uma dose unitária combinada. A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais ácidos nucleicos ou ácidos nucleicos conjugados de acordo com a presente invenção em um excipiente fisiologicamente/farmaceuticamente aceitável, como um estabilizador, conservante, diluente, tampão e semelhantes.
[00260] Os níveis de dosagem para o medicamento e as composições farmacêuticas da invenção podem ser determinados pelos versados na técnica por experimentação de rotina. Em uma modalidade, uma dose unitária pode conter entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 100 mg/kg de peso corporal de ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado. Alternativamente, a dose pode ser de 10 mg/kg a 25 mg/kg de peso corporal, ou 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal, ou 0,05 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, ou 0,1 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, ou 0,1 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal, ou 0,1 mg/kg a 0,5 mg/kg de peso corporal, ou 0,5 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal. Os níveis de dosagem também podem ser calculados através de outros parâmetros, como, por exemplo, área da superfície corporal.
[00261] A composição farmacêutica pode ser uma suspensão ou solução aquosa injetável estéril, ou em uma forma liofilizada.
[00262] As composições farmacêuticas e medicamentos da presente invenção podem ser administrados a um sujeito mamífero em uma dose farmaceuticamente eficaz. O mamífero pode ser selecionado dentre um humano, um primata não humano, um símio ou prosimiano, um cachorro, um gato, um cavalo, gado, um porco, uma cabra, uma ovelha, um camundongo, um rato, um hamster, um ouriço e porquinho-da-índia, ou outras espécies relevantes. Nesta base, a expressão "LPA" ou ―LPA” conforme usado neste documento, denota ácido nucleico ou proteína em qualquer uma das espécies mencionadas acima, se nela expressa natural ou artificialmente, mas de preferência essa expressão indica ácidos nucleicos ou proteínas humanas.
[00263] Um aspecto adicional da invenção refere-se a um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção ou a composição farmacêutica compreendendo o ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção para uso no tratamento de uma doença, distúrbio ou síndrome. O tratamento pode ser para prevenir e reduzir o risco de sofrer acidente vascular cerebral, aterosclerose, trombose ou doenças cardiovasculares, como doença cardíaca coronária ou estenose aórtica e qualquer outra doença ou patologia associada a níveis elevados de partículas contendo Lp(a). A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais ácidos nucleicos ou ácidos nucleicos conjugados de acordo com a presente invenção em um excipiente fisiologicamente/farmaceuticamente aceitável, como um estabilizador, conservante, diluente, tampão e semelhantes.
[00264] A composição farmacêutica pode ser uma suspensão ou solução aquosa injetável estéril, ou em uma forma liofilizada ou aderida, absorvida ou incluída em ou em qualquer outra substância carreadora galênica adequada, como grânulos, comprimidos, cápsulas, nanopartículas, geis, comprimidos, esferas ou estruturas similares.
[00265] O ácido nucleico descrito neste documento pode ser capaz de inibir a expressão de LPA. O ácido nucleico descrito neste documento pode ser capaz de inibir parcialmente a expressão de LPA. A inibição pode ser completa, ou seja, 0% em comparação com o nível de expressão de LPA na ausência do ácido nucleico da invenção. A inibição da expressão de LPA pode ser parcial, ou seja, pode ser de 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou valores intermediários da expressão de LPA na ausência de um ácido nucleico da invenção. A inibição pode durar 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas ou até 3 meses, quando usada em um sujeito, como um paciente humano. Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção, ou composições incluindo o mesmo, pode ser usado em um regime que compreende tratamentos uma ou duas vezes por semana, toda semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada quatro semanas, a cada cinco semanas, a cada seis semanas, a cada sete semanas, ou a cada oito semanas, ou em regimes com frequência de dosagem variável, como combinações dos intervalos mencionados anteriormente. O ácido nucleico pode ser para uso subcutâneo, intravenoso ou usando qualquer outra via de aplicação, como oral, retal ou intraperitoneal.
[00266] Em células e/ou sujeitos tratados com ou recebendo o ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da presente invenção, a expressão de LPA pode ser inibida em comparação com células não tratadas e/ou sujeitos em um intervalo de 15% a 100%, mas pelo menos cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 100% ou valores intermediários. O nível de inibição pode permitir o tratamento de uma doença associada à expressão ou superexpressão de LPA , ou pode servir para investigar melhor as funções e papéis fisiológicos do produto do gene LPA.
[00267] Um aspecto adicional da invenção refere-se a um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença, distúrbio ou síndromes, como os listados acima ou patologias adicionais associadas a níveis elevados de Lp(a), ou abordagens terapêuticas adicionais onde a inibição da expressão de LPA é desejada.
[00268] Também está incluído na invenção um método de tratamento ou prevenção de uma doença, distúrbio ou síndrome, como os listados acima, compreendendo a administração de uma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, conforme descrito neste documento, a um indivíduo em necessidade de tratamento (para melhorar essas patologias). A composição de ácido nucleico pode ser administrada em um regime que compreende tratamentos duas vezes por semana, uma vez por semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada quatro semanas, a cada cinco semanas, a cada seis semanas, a cada sete semanas ou a cada oito semanas ou em regimes com frequência de dosagem variável, como combinações dos intervalos mencionados anteriormente. O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado pode ser para uso subcutâneo ou intravenoso ou outras vias de aplicação, tais como oral, retal ou intraperitoneal.
[00269] O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da presente invenção também pode ser administrado em combinação com outros compostos terapêuticos, administrados separadamente ou simultaneamente, por exemplo, como uma dose unitária combinada. Também é possível uma conjugação molecular com outras entidades moleculares biologicamente ativas, como peptídeos, ligantes celulares ou artificiais ou moléculas pequenas e grandes.
[00270] O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da presente invenção pode ser produzido usando métodos de rotina na técnica, incluindo síntese química ou expressão do ácido nucleico in vitro (por exemplo, transcrição "run-off") ou in vivo. Por exemplo, usando síntese química em fase sólida ou usando um vetor de expressão baseado em ácido nucleico, incluindo derivados virais ou sistemas de expressão parcialmente ou completamente sintéticos. Em uma modalidade, o vetor de expressão pode ser usado para produzir o ácido nucleico da invenção in vitro, dentro de um organismo hospedeiro intermediário ou tipo de célula, dentro de um organismo intermediário ou final ou dentro da célula alvo desejada. Os métodos para a produção (síntese ou transcrição enzimática) do ácido nucleico descrito neste documento são conhecidos dos versados na técnica.
[00271] A invenção consiste em entidades moleculares químicas que mediam a degradação do mRNA do LPA por ligação aos transcritos do gene LPA através de mecanismos de interferência de RNA celular. Os compostos moleculares inventados podem ser usados como conjugados com, mas não estão limitados a, uma fração de açúcar N-acetilgalactosamina (GalNAc) que garante a captação celular específica para hepatócitos, embora se ligue especificamente ao complexo receptor de asialoglicoproteína (ASGPR). A invenção pode ser ligada a outras estruturas químicas diferentes que conferem propriedades diferentes, como referido a seguir. A utilização de um padrão de modificação química dos ácidos nucleicos confere estabilidade à nuclease no soro e torna possível, por exemplo, a via de aplicação subcutânea.
[00272] A invenção é caracterizada por alta especificidade no nível de distribuição molecular e direcionada ao tecido, potencialmente conferindo um melhor perfil de segurança do que os tratamentos atualmente disponíveis.
[00273] A invenção também fornece um ácido nucleico de acordo com qualquer aspecto da invenção descrita neste documento, em que a primeira fita de RNA possui um nucleotídeo terminal (E)-vinilfosfonato 5', e o nucleotídeo terminal (E)-vinilfosfonato 5' está ligado ao segundo nucleotídeo na primeira fita por uma ligação fosfodiéster.
[00274] Em uma modalidade, a primeira fita pode incluir mais de 1 ligação fosfodiéster.
[00275] Em uma modalidade, a primeira fita pode compreender ligações fosfodiéster entre pelo menos os três nucleotídeos terminais 5'.
[00276] Em uma modalidade, a primeira fita pode compreender ligações fosfodiéster entre pelo menos os quatro nucleotídeos terminais 5'.
[00277] Em uma modalidade, a primeira fita pode compreender a fórmula (XVII): (vp)-N(po)[N(po)]n- (XVII) onde '(vp) -' é o (E)-vinilfosfonato 5', 'N' é um nucleotídeo, 'po' é uma ligação fosfodiéster e n é de 1 a (o número total de nucleotídeos na primeira fita - 2), preferencialmente em que n é de 1 a (o número total de nucleotídeos na primeira fita -3), mais preferencialmente em que n é de 1 a (o número total de nucleotídeos na primeira fita -4).
[00278] Em uma modalidade, a primeira fita pode incluir pelo menos uma ligação de fosforotioato (ps).
[00279] Em uma modalidade, a primeira fita pode ainda a compreender uma ligação de fosforotioato entre os dois nucleotídeos 3' terminais ou ligações de fosforotioato entre os três nucleotídeos 3' terminais.
[00280] Em uma modalidade, as ligações entre os outros nucleotídeos na primeira fita são ligações fosfodiéster.
[00281] Em uma modalidade, a primeira fita pode incluir mais de 1 ligação fosforotioato.
[00282] Ainda em uma modalidade, a segunda fita pode compreender uma ligação de fosforotioato entre os dois nucleotídeos 3' terminais ou ligações de fosforotioato entre os três nucleotídeos 3' terminais.
[00283] Em outra modalidade adicional, a segunda fita pode compreender uma ligação fosforotioato entre os dois nucleotídeos terminais 5' ou ligações fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais 5'.
[00284] Em uma modalidade, o nucleotídeo terminal (E)- vinilfosfonato 5' é um nucleotídeo RNA.
[00285] Um nucleotídeo terminal (E)-vinilfosfonato 5'é um nucleotídeo em que o grupo fosfato natural na extremidade 5' foi substituído por um E-vinilfosfonato, no qual o átomo de ponte de oxigênio 5' do nucleotídeo terminal da fita fosforilada 5‘ é substituída por um grupo metinil (-CH =): Nucleotídeos com fosfato natural na extremidade 5' Nucleotídeo com um E-vinilfosfonato na extremidade 5'
[00286] O (E) vinilfosfonato 5' é um imitador de fosfato 5'. Uma imitação biológica é uma molécula capaz de desempenhar a mesma função e é estruturalmente muito semelhante à molécula original que está sendo imitada. No contexto da presente invenção, o (E) vinilfosfonato 5' imita a função de um fosfato 5' normal, por exemplo, permitindo carregamento eficiente de RISC. Além disso, devido à sua estrutura ligeiramente alterada, o (E) vinilfosfonato 5' é capaz de estabilizar o nucleotídeo da extremidade 5', protegendo-o da desfosforilação por enzimas como as fosfatases.
[00287] Um aspecto da invenção é um ácido nucleico conforme divulgado neste documento para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do referido gene alvo, em que a referida primeira fita inclui nucleotídeos modificados ou nucleotídeos não modificados em uma pluralidade de posições para facilitar o processamento do ácido nucleico por RISC.
[00288] Em um aspecto, "facilitar o processamento por RISC" significa que o ácido nucleico pode ser processado por RISC, por exemplo, qualquer modificação presente permitirá que o ácido nucleico seja processado por RISC, adequadamente de modo que a atividade de siRNA possa ocorrer.
[00289] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e o nucleotídeo na segunda fita que corresponde à posição 13 da primeira fita não é modificada com uma modificação O-metil 2'.
[00290] Um nucleotídeo na segunda fita que "corresponde a" uma posição na primeira fita é adequadamente o nucleotídeo que forma um par de bases com esse nucleotídeo na primeira fita.
[00291] Em um aspecto, o nucleotídeo na segunda fita que corresponde à posição 13 da primeira fita é o nucleotídeo que forma um par de bases com a posição 13 da primeira fita.
[00292] Em um aspecto, o nucleotídeo na segunda fita que corresponde à posição 11 da primeira fita é o nucleotídeo que forma um par de bases com a posição 11 da primeira fita.
[00293] Em um aspecto, o nucleotídeo na segunda fita que corresponde à posição 12 da primeira fita é o nucleotídeo que forma um par de bases com a posição 12 da primeira fita.
[00294] Esta nomenclatura pode ser aplicada a outras posições da segunda fita. Por exemplo, em um ácido nucleico de 19-meros que é de fita dupla e de ponta cega, a posição 13 da primeira fita seria pareada com a posição 7 da segunda fita. A posição 11 da primeira fita seria pareada com a posição 9 da segunda fita. Esta nomenclatura pode ser aplicada a outras posições da segunda fita.
[00295] O nucleotídeo que corresponde à posição 13 da primeira fita é adequadamente a posição 13 da segunda fita, contando a partir de 3' da segunda fita, partindo do primeiro nucleotídeo da região de fita dupla. Da mesma forma, a posição 11 da segunda fita é adequadamente o 11o nucleotídeo a partir de 3' da segunda fita, iniciando no primeiro nucleotídeo da região de fita dupla. Esta nomenclatura pode ser aplicada a outras posições da segunda fita.
[00296] Em um aspecto, no caso de uma primeira e segunda fitas parcialmente complementares, o nucleotídeo na segunda fita que "corresponde a" uma posição na primeira fita pode não necessariamente formar um par de bases se essa posição for a posição em que há uma incompatibilidade, mas o princípio da nomenclatura ainda se aplica.
[00297] Preferida é uma primeira e segunda fita que são totalmente complementares sobre a região duplex (ignorando quaisquer regiões salientes) e não há incompatibilidades dentro da região de fita dupla do ácido nucleico.
[00298] Também preferidos são:
[00299] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e o nucleotídeo na segunda fita que corresponde à posição 11 da primeira fita não é modificada com uma modificação O-metil 2'.
[00300] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e os nucleotídeos na segunda fita que correspondem à posição 11 e 13 da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2'.
[00301] Em um aspecto, o nucleotídeo na segunda fita que corresponde à posição 12 da primeira fita não é modificado com uma modificação O-metil 2‘. Esta limitação no ácido nucleico pode ser vista com qualquer outra limitação descrita neste documento.
[00302] Portanto, outro aspecto da invenção é um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e os nucleotídeos na segunda fita que correspondem à posição 11 - 13 da primeira fita não são modificados com uma modificação O- metil 2'.
[00303] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e os nucleotídeos na segunda fita que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 e 13, ou 11-13 da primeira fita são modificados com uma modificação fluoro 2'.
[00304] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita são modificados com uma modificação fluoro 2' e os nucleotídeos na segunda fita que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 e 13 ou 11-13 da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2'.
[00305] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita são modificados com uma modificação fluoro 2' e os nucleotídeos na segunda fita que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 e 13, ou 11-13 da primeira fita são modificados com uma modificação fluoro 2'.
[00306] Um ácido nucleico, conforme divulgado neste documento, em que mais de 50% dos nucleotídeos da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação O-metil 2', como superior a 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, ou 85%, ou mais, da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação O-metil 2', preferencialmente medida como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeira e da segunda fita.
[00307] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que mais de 50% dos nucleotídeos da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação de RNA que ocorre naturalmente, tal como em que mais de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, ou 85% ou mais da primeira e/ou segunda fitas compreendem essa modificação, de preferência medida como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeira e da segunda fita. Modificações apropriadas que ocorrem naturalmente incluem, bem como O- metil 2', outras modificações de açúcar 2', em particular uma modificação H 2' resultando em um nucleotídeo de DNA.
[00308] Um ácido nucleico, conforme divulgado neste documento, compreendendo não mais que 20%, como não mais que 15%, como mais que 10%, de nucleotídeos que possuem modificações 2' que não são modificações O metil 2' na primeira e/ou segunda fita, de preferência como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeira e da segunda fitas.
[00309] Um ácido nucleico, conforme divulgado neste documento, compreendendo não mais que 20%, (como não mais que 15% ou não mais que 10%) de modificações de 2' fluoro na primeira e/ou segunda fita, preferencialmente como uma porcentagem do total de nucleotídeos de ambas as fitas.
[00310] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que todos os nucleotídeos são modificados com uma modificação O-metil 2', exceto as posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita e os nucleotídeos na segunda fita que correspondem à posição 11 ou 13, ou 11 e 13, ou 11-13 da primeira fita. Preferencialmente, os nucleotídeos que não são modificados com O-metil 2' são modificados com fluoro na posição 2'.
[00311] É preferido um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que todos os nucleotídeos do ácido nucleico são modificados na posição 2' do açúcar. De preferência, estes nucleotídeos são modificados com uma modificação 2'-fluoro em que a modificação não é uma modificação O-metil 2'.
[00312] Os ácidos nucleicos da invenção podem compreender um ou mais nucleotídeos modificados na posição 2' com um H 2' e, portanto, tendo um nucleotídeo de DNA dentro do ácido nucleico. Os ácidos nucleicos da invenção podem compreender nucleotídeos de DNA nas posições 2 e/ou 14 da primeira fita contando a partir da extremidade 5' da primeira fita. Os ácidos nucleicos podem compreender nucleotídeos de DNA na segunda fita que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 e 13, ou 11-13 da primeira fita.
[00313] Em um aspecto, não existe mais do que um DNA por ácido nucleico da invenção.
[00314] Os ácidos nucleicos da invenção podem compreender um ou mais nucleotídeos de LNA. Os ácidos nucleicos da invenção podem compreender nucleotídeos de LNA nas posições 2 e/ou 14 da primeira fita contando a partir da extremidade 5' da primeira fita. Os ácidos nucleicos podem compreender LNA na segunda fita que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 e 13, ou 11-13 da primeira fita.
[00315] Em um aspecto, o ácido nucleico é modificado na primeira fita com modificações 2-O metil alternadas e modificações 2 fluoro, e as posições 2 e 14 (a partir da extremidade 5') são modificadas com 2' fluoro. Preferencialmente, a segunda fita é modificada com modificações de 2' fluoro nos nucleotídeos da segunda fita, que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 ou 13 ou 11-13 da primeira fita. De preferência, a segunda fita é modificada com modificações de 2' fluoro nas posições 11-13, contando a partir da extremidade 3', começando na primeira posição da região complementar (fita dupla), e as modificações restantes são modificações que ocorrem naturalmente, preferencialmente O-metil 2‘.
[00316] Em um aspecto, o ácido nucleico da invenção compreende um ou mais ribonucleotídeos invertidos, preferencialmente uma adenina invertida, usando uma ligação 5'-5' ou uma ligação 3'-3', de preferência uma ligação 3'-3' na extremidade 3' da segunda fita.
[00317] Em um aspecto, o ácido nucleico compreende uma ou mais ligações de fosforoditioato, tais como ligações de 1, 2, 3 ou 4 fosforoditioato. De preferência, existem até 4 ligações de fosforoditioato, cada uma nas extremidades 5' e 3' da primeira e segunda fitas.
[00318] Todas as características dos ácidos nucleicos podem ser combinadas com todos os outros aspectos da invenção divulgados neste documento.
[00319] Em particular, são preferidos os ácidos nucleicos que são moléculas de SiRNA em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação de O-metil 2', e o ácido nucleico compreende um ou mais ou todos do: (i) um nucleotídeo invertido, de preferência uma ligação 3'-3' na extremidade 3' da segunda fita; (ii) uma ou mais ligações fosforoditioato; (iii) o nucleotídeo da segunda fita correspondente à posição 11 ou 13 da primeira fita não é modificado com uma modificação O-metil 2', preferencialmente em que uma ou ambas as posições compreendem uma modificação fluoro 2'; (iv) o ácido nucleico compreende pelo menos 80% de todos os nucleotídeos possuindo uma modificação 2'-O-metil; (v) o ácido nucleico compreende não mais que 20% de nucleotídeos que possuem modificações de fluoro 2'.
[00320] Também é fornecido pela presente invenção um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita e os nucleotídeos nas posições 7 e/ou 9, ou 7 - 9 da extremidade 5' da segunda fita é modificada com uma modificação de 2' fluoro e pelo menos 90% dos nucleotídeos restantes são modificados com 2'-O metil ou compreendem outra modificação 2' de que ocorre naturalmente.
[00321] Exemplos preferidos específicos, para um ácido nucleico de 19 bases de fita dupla cega, sem saliência, são:
[00322] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação de O-metil 2' e o nucleotídeo na posição 7 da extremidade 5' da segunda fita não é modificada com uma modificação O- metil 2'.
[00323] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação de O-metil 2' e o nucleotídeo na posição 9 da extremidade 5' da segunda a fita não é modificada com uma modificação O-metil 2'
[00324] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e os nucleotídeos na posição 7 e 9 da extremidade 5' da segunda a fita não são modificados com uma modificação O-metil 2'.
[00325] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação de O-metil 2' e os nucleotídeos na posição 7 - 9 da extremidade 5' da segunda a fita não são modificados com uma modificação O-metil 2'.
[00326] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita não são modificados com uma modificação O-metil 2' e os nucleotídeos nas posições 7 e/ou 9, ou 7-9 da extremidade 5' da segunda a fita não são modificados com uma modificação fluoro 2'.
[00327] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita são modificados com uma modificação 2' fluoro e os nucleotídeos nas posições 7 e/ou 9, ou 7 - 9 da extremidade 5' da segunda a fita não são modificados com uma modificação O-metil 2'.
[00328] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita são modificados com uma modificação 2' fluoro e os nucleotídeos nas posições 7 e/ou 9, ou 7-9 da extremidade 5' da segunda fita são modificados com uma modificação fluoro 2'.
[00329] Um ácido nucleico, conforme divulgado neste documento, em que mais de 50% dos nucleotídeos da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação O-metil 2', como superior a 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, ou 85%, ou mais, da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação O-metil 2', preferencialmente medida como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeira e da segunda fita.
[00330] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que mais de 50% dos nucleotídeos da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação de RNA que ocorre naturalmente, tal como em que mais de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, ou 85% ou mais da primeira e/ou segunda fitas compreendem essa modificação, de preferência medida como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeira e da segunda fita. Modificações apropriadas que ocorrem naturalmente incluem, bem como O- metil 2', outras modificações de açúcar 2', em particular uma modificação H 2' resultando em um nucleotídeo de DNA.
[00331] Um ácido nucleico, conforme divulgado neste documento, compreendendo não mais que 20%, como não mais que 15%, como mais que 10%, de nucleotídeos que possuem modificações 2' que não são modificações O metil 2' na primeira e/ou segunda fita, de preferência como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeira e da segunda fitas.
[00332] Um ácido nucleico, conforme divulgado neste documento, compreendendo não mais que 20%, (como não mais que 15% ou não mais que 10%) de modificações de 2' fluoro na primeira e/ou segunda fita,
preferencialmente como uma porcentagem do total de nucleotídeos de ambas as fitas.
[00333] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que todos os nucleotídeos são modificados com uma modificação O-metil 2', exceto as posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita e os nucleotídeos nas posições 7 e/ou 9 da extremidade 5' da segunda fita. Preferencialmente, os nucleotídeos que não são modificados com O-metil 2' são modificados com fluoro na posição 2'.
[00334] Um ácido nucleico conforme divulgado neste documento, em que todos os nucleotídeos são modificados com uma modificação O-metil 2', exceto as posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita e os nucleotídeos nas posições 7 - 9 da extremidade 5' da segunda fita. Preferencialmente, os nucleotídeos que não são modificados com O-metil 2' são modificados com fluoro na posição 2'.
[00335] Para um ácido nucleico compreendendo uma região duplex de 20 pares de bases, a segunda fita preferencialmente não possui um grupo O-metil 2' nos nucleotídeos 8 ou 9 ou 10 contados a partir da extremidade 5' do duplex correspondente às posições 13, 12 e 11 da primeira fita, respectivamente.
[00336] Para um ácido nucleico compreendendo uma região dúplex de 21 pares de bases, a segunda fita preferencialmente não possui um grupo O-metil 2' nos nucleotídeos 9 ou 10 ou 11 contando a partir da extremidade 5' do dúplex correspondente às posições 13, 12 e 11 da primeira fita, respectivamente.
[00337] A presente invenção também se refere às sequências não modificadas de todas as sequências modificadas divulgadas neste documento.
[00338] A invenção será descrita agora tendo como referência as Figuras e Exemplos não limitativos dispostos a seguir. Figuras
[00339] A Figura 1 mostra os resultados de uma pesquisa de molécula de siRNA não conjugada para inibição da expressão de mRNA de LPA em células RT-4 humanas.
[00340] As Figuras 2A e 2B mostram a resposta à dose de moléculas de siRNA direcionadas a LPA não conjugadas na expressão de mRNA de LPA em células humanas RT-4.
[00341] A Figura 3 mostra a inibição da expressão de mRNA de LPA em hepatócitos humanos e de cinomolgo primários por diferentes doses de moléculas de siRNA conjugado com GalNAc-L1 LPA-1038 distribuídos por captação mediada por receptor.
[00342] As Figuras 4A e 4B mostram exemplos da estrutura dos ligantes GalNAc com diferentes ligantes L1 e L6, respectivamente, aos quais os oligonucleotídeos exemplificados foram conjugados.
[00343] A Figura 5 mostra exemplos representativos do knockdown de LPA-mRNA por siRNAs de GalNAc conjugados com L6, indicados em hepatócitos humanos primários distribuídos por captação mediada por receptor.
[00344] A Figura 6 mostra o conjugado 1.
[00345] A Figura 7 mostra o conjugado 2.
[00346] A Figura 8 mostra o Conjugado 3.
[00347] A Figura 9 mostra o Conjugado de referência 1.
[00348] A Figura 10 representa o Conjugado de referência 2.
[00349] A Figura 11 representa o Conjugado de referência 3.
[00350] A Figura 12 representa o Conjugado de referência 4.
[00351] Em cada uma das Figuras 6-12 e 19-30, a fita superior é a fita antisense e a fita inferior é a fita sense. Além disso, para mostrar mais claramente a conexão entre as porções de ácido nucleico e ligante, o nucleotídeo na extremidade das respectivas fitas conjugadas é desenhado na íntegra.
[00352] A Figura 13 mostra a síntese de A0268, que é um oligonucleotídeo de fita simples conjugado com mono-GalNAc 3‘ e é a matéria- prima na síntese do Conjugado 1 e Conjugado 3. (ps) denota ligação fosforotioato.
[00353] A Figura 14 mostra a síntese de A0006, que é um oligonucleotídeo de fita simples conjugado com GalNAc tri-antenário 5' usado para a síntese do Conjugado de Referência 4. (ps) denota ligação fosforotioato.
[00354] A Figura 15 ilustra a determinação in vitro do knockdown de TTR. Em particular, a Figura 15A mostra a determinação in vitro do knockdown de TTR pelos Conjugados de Referência (RC) 1 e 3, bem como o controle não tratado "UT"; a Figura 15B mostra a determinação in vitro do knockdown de TTR pelos Conjugados de Referência (RC) 2 e 3, bem como o controle não tratado "UT"; e a Figura 15C mostra a determinação in vitro do knockdown de TTR pelos Conjugados 1, 2 e 3, bem como por RC3 e controle não tratado "UT". Os conjugados de referência 1 e 2 representam conjugados comparadores. O Conjugado de referência 3 representa um siRNA de GalNAc não direcionado e "não tratado" ("UT") representa células não tratadas. RC3 e UT são controles negativos. Os níveis de mRNA foram normalizados contra PtenII.
[00355] A Figura 16 mostra um curso no tempo da TTR sérica em coortes de camundongos c57BL/6 de n=4 aos 7, 14 e 27 dias após tratamento s.c. com 1mg/kg - Conjugados 1-3, Conjugados de Referência (RC) 1, 2 e 4 e indivíduos tratados com simulação (PBS).
[00356] A Figura 17 mostra a síntese de oligonucleotídeos de precursores de oligonucleotídeos 3' e 5' conjugados com GalNAc (como o composto X0385B-prec).
[00357] A Figura 18 mostra uma resposta de dose igual de knockdown para siRNA direcionado a LPA com duas unidades GalNAc únicas conjugadas com a segunda fita, em comparação com uma unidade GalNAc triantenária na segunda fita 5' em hepatócitos de cinomolgo primários.
[00358] A Figura 19A representa o Conjugado 4. Os últimos três nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' das fitas antisense e sense são conectados por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo. Os ligantes serinol-GalNAc são conjugados através de uma ligação fosfodiéster à extremidade 3' e à extremidade 5' da fita sense.
[00359] A Figura 19B representa o conjugado 5. Os últimos três nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' das fitas antisense e sense são conectados por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo. Os ligantes serinol-GalNAc são conjugados através de uma ligação fosforotioato à extremidade 3' e à extremidade 5' da fita sense.
[00360] A Figura 20 mostra o conjugado 6. Os últimos três nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' das fitas antisense e sense são conectados por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo. Os ligantes serinol-GalNAc são conjugados através de uma ligação fosfodiéster à extremidade 3' e à extremidade 5' da fita sense.
[00361] A Figura 21 mostra o conjugado 7. Os últimos três nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' das fitas antisense e sense são conectados por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo. Os ligantes serinol-GalNAc são conjugados através de uma ligação fosforotioato à extremidade 3' e à extremidade 5' da fita sense. Os ligantes serinol-GalNAc são conectados uns aos outros através de uma ligação fosforotioato.
[00362] A Figura 22 representa o conjugado 8. Os últimos três nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' das fitas antisense e sense são conectados por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo. Um ligante GalNAc-C6-amino-modificador é conjugado na extremidade 5' da fita sense e um ligante GalNAc-C7-amino-modificador é conjugado na extremidade 3' da fita sense.
[00363] A Figura 23 mostra o conjugado 9. Os últimos três nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' das fitas antisense e sense são conectados por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo. Um ligante modificador de GalNAc-GlyC3-amino é conjugado nas extremidades 5' e 3' da fita sense.
[00364] A Figura 24 mostra o conjugado 10. Os últimos três nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' das fitas antisense e sense são conectados por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo e as fitas sense são conectadas por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo. Um ligante modificador de GalNAc-piperidil-amino é conjugado nas extremidades 5' e 3' da fita sense.
[00365] A Figura 25 mostra o conjugado 11. Os últimos três nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' das fitas antisense e sense são conectados por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo. Um ligante modificador de GalNAc-C3-amino é conjugado nas extremidades 5' e 3' da fita sense.
[00366] A Figura 26 mostra o conjugado 12. Os últimos três nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' das fitas antisense e sense são conectados por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo. Um ligante GalNAc-C6-amino-modificador é conjugado na extremidade 5' da fita sense e um ligante GalNAc-GlyC3-amino-modificador é conjugado na extremidade 3' da fita sense.
[00367] A Figura 27 mostra os Conjuntos 15, 16, 18 e 19 que diferem apenas pelas suas sequências de RNA. Os últimos três nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' das fitas antisense e sense são conectados por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo em cada conjugado. Os ligantes serinol-GalNAc são conjugados através de uma ligação fosforotioato à extremidade 3' e à extremidade 5' da fita sense.
[00368] A Figura 28 representa o conjugado de referência 5 e o conjugado de referência 9 que diferem apenas pelas suas sequências de RNA. Os últimos três nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' da fita antisense e 3' na fita sense são conectados por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo em ambos os conjugados. O ligante GalNAc trimérico é conjugado através de uma ligação fosforotioato à extremidade 5' da fita sense em ambos os conjugados.
[00369] A Figura 29 representa o conjugado de referência 6 e o conjugado de referência 7 que diferem apenas pelas suas sequências de RNA. Os últimos três nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' da fita antisense e 3' na fita sense são conectados por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo em ambos os conjugados. O ligante GalNAc trimérico é conjugado através de uma ligação fosforotioato à extremidade 5' da fita sense em ambos os conjugados.
[00370] A Figura 30 representa o conjugado de referência 8. Os últimos três nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' da fita antisense e na extremidade 3' na fita sense são conectados por um ligante de fosforotioato entre cada nucleotídeo. O ligante GalNAc trimérico é conjugado através de uma ligação fosforotioato à extremidade 5' da fita sense.
[00371] A Figura 31 ilustra a determinação in vitro do knockdown de TTR. Em particular, a Figura 31A mostra a determinação in vitro do knockdown de TTR pelos Conjugados 4, 5, 6 e 2 em comparação com "Luc" (Conjugado de Referência 3), bem como o controle não tratado "UT"; A Figura 31B mostra a determinação in vitro do knockdown de TTR pelos conjugados 7 e 2, em comparação com "Luc" (conjugado de referência 3), bem como o controle não tratado "UT". Luc ou Conjugado de referência 3 (RC3) representa um siRNA de GalNAc não direcionado e "não tratado" ("UT") representa células não tratadas. RC3 e UT são controles negativos. Os níveis de mRNA foram normalizados contra PtenII.
[00372] A Figura 32 ilustra a determinação in vitro do knockdown de TTR. Em particular, a Figura 32A mostra a determinação in vitro do knockdown de TTR pelos Conjugados 8, 9, 10 e 11 e 2 em comparação com "Luc" (Conjugado de Referência 3), bem como o controle não tratado "UT"; A Figura 32B mostra a determinação in vitro do knockdown de TTR pelos conjugados 12 e 2, em comparação com "Luc" (Conjugado de referência 3), bem como o controle não tratado "UT". Luc ou Conjugado de referência 3 representa um siRNA de GalNAc não direcionado e "não tratado" ("UT") representa células não tratadas. RC3 e UT são controles negativos. Os níveis de mRNA foram normalizados contra PtenII.
[00373] A Figura 33 ilustra a determinação in vitro do knockdown de LPA mRNA pelo Conjugado 19 em comparação com os controles. Ctr representa um siRNA de GalNAc não direcionado e "não tratado" ("UT") representa células não tratadas. Ctr e UT são controles negativos. O nível de mRNA foi normalizado contra ACTB.
[00374] A Figura 34 mostra um curso no tempo dos níveis de mRNA do fígado Aldh2 em coortes de camundongos c57BL/6 de n=6 aos 14, 28 e 42 dias após tratamento s.c. com 1mg/kg - Conjugado 15, Conjugado de Referência (RC) 6 e indivíduos tratados com simulação (PBS). O nível de mRNA foi normalizado contra Pten.
[00375] A Figura 35 mostra um curso no tempo dos níveis de mRNA do fígado Aldh2 em coortes de camundongos c57BL/6 de n=6 aos 14, 28 e 42 dias após o tratamento s.c. com 1mg/kg - Conjugado 16, Conjugado de Referência (RC) 7 e indivíduos tratados com simulação (PBS). O nível de mRNA foi normalizado contra Pten.
[00376] A Figura 36 mostra um curso no tempo dos níveis de mRNA do fígado Tmprss6 em coortes de camundongos c57BL/6 de n=6 aos 14, 28 e 42 dias após tratamento s.c. com 1mg/kg - Conjugado 18, Conjugado de Referência (RC) 8 e indivíduos tratados com simulação (PBS). O nível de mRNA foi normalizado contra Pten.
[00377] A Figura 37 mostra a estabilidade do soro dos Conjugados 4, 5, 6, 7 e 2 e controle não tratado (UT) a 37 °C durante 3 dias.
[00378] A Figura 38 mostra a estabilidade do soro dos Conjugados 8, 9, 10, 11, 12 e 2 e controle não tratado (UT) a 37 °C durante 3 dias.
[00379] A Figura 39 mostra a inibição da expressão de mRNA de LPA em hepatócitos humanos primários por diferentes doses de siRNAs acoplados a GalNAc-L6 distribuídos por captação mediada por receptor
[00380] A Figura 40 mostra representações esquemáticas de diversas modalidades de ácidos nucleicos conjugados com ligantes por meio de ligantes. Exemplos A numeração referida em cada exemplo é específica para o referido exemplo. Exemplo 1
[00381] Moléculas de siRNA modificadas e conjugadas usadas para exemplos funcionais neste documento. Derivados LPA-1038: GalNAc-LPA-1038-L1
[00382] Primeira fita (SEQ ID NO: 119, com base na SEQ ID NO 5)
[00383] OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG- FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA 3‘
[00384] Segunda fita (SEQ ID NO: 120, com base na SEQ ID NO SEQ ID NO 6)
[00385] 5´[ST23 (ps)]3 long trebler (ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA- OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA- (ps)-FU 3‘ GalNAc-LPA-1038-L6
[00386] Primeira fita (SEQ ID NO: 121, com base na SEQ ID NO 5)
[00387] OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG- FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA 3‘
[00388] Segunda fita (SEQ ID NO: 122, com base na SEQ ID NO 6)
[00389] 5´[ST23 (ps)]3 ST43 (ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA- FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3‘
[00390] FN (N=A, C, G, U) representa Fluoro 2´, Desoxinucleosídeos 2´
[00391] OMeN (N=A, C, G, U) denota 2´O Metil Nucleosídeos
[00392] (ps) indica uma ligação de fosforotioato
[00393] ST23 e ST43 são como abaixo.
Um outro exemplo são os derivados LPA 1041: GalNAc-LPA-1041-L1
[00394] Primeira fita (SEQ ID NO: 123, com base na SEQ ID NO 9)
[00395] 5‘ OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU- OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeG 3‘
[00396] Segunda fita (SEQ ID NO: 124, com base na SEQ ID NO 10)
[00397] 5´[ST23 (ps)]3 long trebler (ps) FC-OMeG-FG-OMeU-FA- OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA- (ps)-FU 3‘
[00398] GalNAc-LPA-1041-L6
[00399] Primeira fita (SEQ ID NO: 125, com base na SEQ ID NO 9)
[00400] 5‘ OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU- OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeG 3‘
[00401] Segunda fita (SEQ ID NO: 126, com base na SEQ ID NO 10)
[00402] 5´[ST23 (ps)]3 ST43 (ps) FC-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA- FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3‘
[00403] FN (N=A, C, G, U) representa Fluoro 2´, Desoxinucleosídeos 2´
[00404] OMeN (N=A, C, G, U) denota 2´O Metil Nucleosídeos
[00405] (ps) indica uma ligação de fosforotioato
[00406] ST23 e ST43 são como abaixo.
[00407] ST23 é uma fosforamidita GalNac C4 (componentes estruturais abaixo) ST23
Long trebler (STKS)
[00408] ST41 é o seguinte:
[00409] ST43 é o seguinte e como descrito em WO2017/174657: ST43
[00410] Todos os oligonucleotídeos foram obtidos de fabricantes comerciais de oligonucleotídeos (Biospring, Frankfurt, Alemanha ou RiboBio, Guangzhou, Guangdong, PRC) ou sintetizados em um sintetizador de oligopilot AKTA (internamente) usando química padrão de fosforamidita. Foram usados suporte sólido disponível comercialmente e fosforamiditas de RNA O-metil 2´, fosforamiditas de DNA Fluoro 2´ (toda a proteção padrão) e fosforamidita de long trebler disponível comercialmente (pesquisa de Glen). A síntese foi realizada usando soluções 0,1 M de fosforamidita em acetonitrila seca e benziltiotetrazol (BTT) foi usado como ativador (0,3 M em acetonitrila). Todos os outros reagentes eram reagentes padrão disponíveis comercialmente.
[00411] A conjugação do respectivo sínton GalNac (por exemplo, ST23, ST41 ou ST43) foi alcançada acoplando a respectiva fosforamidita à extremidade 5' da oligocadeia sob condições padrão de acoplamento de fosforamidita. Os fosforotioatos foram introduzidos usando reagentes de tiolação disponíveis comercialmente (EDITH, Link technologies).
[00412] As fitas simples foram cortadas do CPG usando metilamina (aquosa a 40%) e o oligonucleotídeo bruto resultante foi purificado por cromatografia de troca iônica (Recurso Q, 6 mL, GE Healthcare) em um sistema AKTA de HPLC Puro usando um gradiente de cloreto de sódio. As frações que contêm o produto foram reunidas, dessalinizadas em uma coluna de exclusão de tamanho (Zetadex, EMP Biotech) e liofilizadas.
[00413] Para o recozimento, quantidades equimolares das respectivas fitas únicas foram dissolvidas em água e aquecidas a 80°C durante 5 minutos. Após arrefecimento gradual à RT, o duplex resultante foi liofilizado.
[00414] As sequências dos ácidos nucleicos resultantes (siRNAs) são apresentadas na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Sequências de ácidos nucleicos não conjugados testadas quanto à inibição da expressão de mRNA de LPA. Sequências e padrão de modificação aplicado são indicados
SEQ ID siRNA ID fita Sequência Modificações NO: 53816162726 1 primeira fita 5‘ucguauaacaau 16284847 aaggggc 3‘ LPA-1014 47373516154 2 segunda fita 5‘gccccuuauugu 51616382 uauacga 3‘ 82526353545 3 primeira fita 5‘gauaacucuguc 37251637 cauuacc 3‘ LPA-1024 48162548272 4 segunda fita 5'gguaauggacag 82815253 aguuauc 3 ' 61627171817 5 LPA-1038 primeira fita 5‘auaacucugucc 36152736 auuacca 3‘
6 segunda fita 5‘ugguaauggaca 64645161 gaguuau 3‘ 52635354537 7 primeira fita 5‘uaacucugucca 25163745 uuaccgu 3‘ LPA-1040 27481625482 8 segunda fita 5‘acgguaauggac 72828152 agaguua 3‘ 61627171817 9 primeira fita 5‘auaacucugucc 36152738 auuaccg 3‘ LPA-1041 38452618463 10 segunda fita 5‘cgguaauggaca 64645161 gaguuau 3‘ 64625454735 11 primeira fita 5‘agaaugugccuc 38252635 gauaacu 3‘ LPA-1055 28152538284 12 segunda fita 5‘aguuaucgaggc 72725171 acauucu 3‘ 61627171817 13 primeira fita 5‘auaacucugucc 36172736 aucacca 3‘ LPA-1057 18454618463 14 segunda fita 5‘uggugauggaca 64645161 gaguuau 3‘ 61627171817 15 primeira fita 5‘auaacucugucc 36172735 aucaccu 3‘ LPA-1058 28454618463 16 segunda fita 5‘aggugauggaca 64645161 gaguuau 3‘ 5‘uaacucugucca 52635354537 17 LPA-1061 primeira fita uuaccau 3‘
18 segunda fita 5‘augguaauggac 72828152 agaguua 3‘ 61818371546 19 primeira fita 5‘augugccuugau 16271718 aacucug 3‘ LPA-1086 36464516172 20 segunda fita 5‘cagaguuaucaa 64836361 ggcacau 3‘ 64518454718 21 primeira fita 5‘aguuggugcugc 35172826 uucagaa 3‘ LPA-1099 15354628364 22 segunda fita 5‘uucugaagcagc 72736271 accaacu 3‘ 62526484835 23 primeira fita 5‘aauaaggggcug 47363648 ccacagg 3‘ LPA-1102 37181847283 24 segunda fita 5‘ccuguggcagccc 73715251 cuuauu 3‘ 52635354537 25 primeira fita 5‘uaacucugucca 25363725 ucaccau 3‘ LPA-1116 25481825482 26 segunda fita 5‘auggugauggac 72828152 agaguua 3‘ 61828371746 27 primeira fita 5‘augagccucgau 16271718 aacucug 3‘ LPA-1127 36464516174 28 segunda fita 5‘cagaguuaucga 64835361 ggcucau 3‘
29 primeira fita 5‘aaugagccucga 25263535 uaacucu 3‘ LPA-1128 28281525382 30 segunda fita 5‘agaguuaucgag 84717251 gcucauu 3‘ 62547153728 31 primeira fita 5‘aaugcuuccagg 46361517 acauuuc 3‘ LPA-1141 46261817354 32 segunda fita 5‘gaaauguccugg 82647251 aagcauu 3‘ 63645481846 33 primeira fita 5‘acagugguggag 46254547 aaugugc 3‘ LPA-1151 47272517173 34 segunda fita 5‘gcacauucuccac 63727181 cacugu 3‘ 81618183717 35 primeira fita 5‘guaugugccucg 46162717 auaacuc 3‘ LPA-1171 46451617464 36 segunda fita 5‘gaguuaucgagg 83636163 cacauac 3‘ 53825263535 37 primeira fita 5‘ucgauaacucug 45372536 uccauca 3‘ LPA-1177 18254827282 38 segunda fita 5‘ugauggacagag 81525382 uuaucga 3‘ 54536354827 39 primeira fita 5‘ugucacuggaca 25181817 LPA-1189 uuguguc 3‘ 5‘gacacaaugucc 46363625453 40 segunda fita agugaca 3‘
41 primeira fita 5‘cugggauccaug 48181627 guguaac 3‘ LPA-1244 45163637254 42 segunda fita 5‘guuacaccaugg 82537364 aucccag 3‘ 64618273628 43 primeira fita 5‘agaugaccaagc 35184728 uuggcag 3‘ LPA-1248 35473628351 44 segunda fita 5‘cugccaagcuug 84536171 gucaucu 3‘ Tabela 1
[00415] Tabela 1: As modificações dos nucleotídeos são representadas pelos seguintes números (coluna 4), 1=2´F-dU, 2=2‘F-dA, 3=2´F-dC, 4=2´F-dG, 5=2'-OMe-rU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG. Tabela 2: As sequências dos conjuntos de amplicons de LPA, APOB, beta-actina e PTEN qPCR que foram usadas para medir os níveis de mRNA são mostradas abaixo.
SEQ Gene Espécie Sequências ID NO: 5‘ AAGTGTCCTTGCGACGTCC 3‘ LPA: (superior) 45 5‘ CCTGGACTGTGGGGCTTT 3‘ LPA: (inferior) humano 46 5‘ CTGTTTCTGAACAAGCACCAACGGAGC 3‘ LPA: (sonda) 47 5‘ GTGTCCTCGCAACGTCCA 3‘ LPA (superior) 48 5‘ GACCCCGGGGCTTTG 3‘ LPA (inferior) Cinomolgo 49 5‘TGGCTGTTTCTGAACAAGCACCAATGG 3‘ LPA (sonda) 50 APOB (superior) humano 5‘ TCATTCCTTCCCCAAAGAGACC 3‘ 51
5‘ CACCTCCGTTTTGGTGGTAGAG 3‘ APOB (inferior) 52 5‘ CAAGCTGCTCAGTGGAGGCAACACATTA 3‘ APOB (sonda) 53 beta-actina 5‘ GCATGGGTCAGAAGGATTCCTAT 3‘ 54 (superior) 5‘ TGTAGAAGGTGTGGTGCCAGATT 3‘ beta-actina (inferior) humano 55 5‘ TCGAGCACGGCATCGTCACCAA 3‘ beta Actina (sonda) 56 beta-actina 5‘ AAGGCCAACCGCGAGAAG 3‘ 57 (superior) 5‘ AGAGGCGTACAGGGACAGCA 3‘ beta-actina (inferior) cinomolgo 58 5‘ TGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTAC 3‘ beta Actina (sonda) 59 5‘ AGATGTAGGCCGGGTGATCTTT 3‘ PPIB (superior) 60 5‘ GTAGCCAAATCCTTTCTCTCCTGT 3‘ PPIB (inferior) humano 61 5‘ TGTTCCAAAAACAGTGGATAATTTTGTGGCC 3‘ PPIB (sonda) 62 Tabela 2 Exemplo 2
[00416] Triagem de moléculas de siRNA não conjugadas (Tabela 1) para inibição da expressão de mRNA de LPA em células RT-4 humanas.
[00417] Os complexos de transfecção lipossômica foram preparados em triplicado na razão de 1,5 µL de RNAiMax (ThermoFisher)/80 pmol das moléculas de siRNA indicadas. O complexo foi diluído para as concentrações indicadas de 2,5nM e 25 nM, respectivamente (valores representados aos pares como barras cinza claras e mais escuras). As células RT4 de papiloma de células de transição da bexiga urinária humana que expressam LPA endogenamente foram semeadas a uma densidade de 125.000 células por poço em formato de 24 poços no topo de complexos de transfecção previamente plaqueados (transfecção reversa) na concentração indicada. 24 horas após a transfecção, o RNA total foi isolado usando o Spin Cell Mini Kit 250 (Stratec). Os níveis de mRNA de LPA foram determinados por qRT-PCR em relação à expressão de mRNA de PPIB nas respectivas amostras como transcrição housekeeping. Os valores foram normalizados para a quantidade de mRNA de LPA detectada em células não tratadas (intraplaca). Um composto de siRNA sem silenciamento foi transfectado como um controle adicional. As médias e SD dos valores triplicados normalizados são mostrados. Resultados são mostrados na Figura 1. Exemplo 3
[00418] Resposta da dose de compostos de siRNA direcionados a LPAnão conjugados na expressão de mRNA de LPA em células RT-4 humanas.
[00419] As células RT4 de papiloma de células de transição da bexiga urinária humana foram transfectadas reversamente como descrito acima (Exemplo 2) e tratadas na concentração indicada (faixa de 100 nM a 0,2 nM) com os diferentes compostos de siRNA não conjugados (Tabela 1) como marcados. 24 horas pós-transfecção, o RNA total foi isolado usando o Spin Cell Mini Kit 250 (Stratec). Os níveis de mRNA deLPA foram determinados por qRT- PCR em relação à expressão de mRNA de PPIB nas respectivas amostras como transcrição housekeeping. Os valores foram normalizados para a quantidade de mRNA de LPA detectada em células não tratadas. As barras representam a expressão de mRNA restante de LPA para cada ponto de dados. Os resultados são mostrados na Figura 2. Exemplo 4
[00420] A inibição da expressão de mRNA de LPA em hepatócitos humanos e de cinomolgo primários por diferentes doses de moléculas de siRNA conjugado com GalNAc-L1 LPA-1038 distribuídos por captação mediada por receptor.
[00421] Os hepatócitos primários (ThermoFisher) foram plaqueados em placas de 96 poços revestidas com colágeno, com densidades de 45.000 células por poço (cinomolgo) e 30.000 células por poço (humano). O LPA-1038 conjugado com GalNAc-L1 foi adicionado imediatamente após plaqueamento nas concentrações indicadas (nM). 24 horas após o tratamento com siRNA, o RNA total foi isolado usando o kit InviTrap célula de RNA HTS 96 poços (Stratec). Os níveis de mRNA deLPA foram determinados por qRT-PCR em relação aos níveis de mRNA de Actina (cinomolgo) ou APOB (humano) nas respectivas amostras, como transcrição housekeeping. Os valores foram normalizados para a expressão de LPA em células não tratadas. As médias e SD dos valores de triplicado normalizados dos níveis restantes de mRNA de LPA são mostrados como barras pretas. Os resultados são mostrados na Figura 3. Exemplo 5
[00422] A eliminação de LPA-mRNA em hepatócitos humanos primários pelos diferentes siRNAs conjugados com L6-GalNAc indicados em hepatócitos humanos primários após distribuição mediada por receptor.
[00423] Os hepatócitos humanos primários (ThermoFisher) foram plaqueados em placas de 96 poços revestidas com colágeno a 30.000 células por poço (formato de 96 poços). Os siRNAs conjugados com GalNAc-L6 incluindo um controle de não silenciamento foram adicionados imediatamente após o plaqueamento celular nas duas concentrações indicadas. 24 horas após o tratamento com siRNA, o RNA total foi isolado usando o kit InviTrap célula de RNA HTS 96 poços (Stratec). Os níveis de expressão de mRNA deLPA foram determinados por qRT-PCR em relação ao mRNA de APOB como transcrição housekeeping. Os valores foram normalizados para a expressão do mRNA de LPA em células não tratadas e os níveis restantes de mRNA de LPA representados aos pares como barras (barras pretas 100 nM, barras cinza 20 nM). As médias e SD dos valores triplicados normalizados são mostrados na Figura 5. Exemplo 6 - Síntese de conjugados
[00424] Os compostos de exemplo foram sintetizados de acordo com os métodos descritos abaixo e métodos conhecidos do versado na técnica. A montagem da cadeia oligonucleotídica e dos blocos ligantes foi realizada por síntese em fase sólida, aplicando a metodologia de fosforamidita. A conjugação de GalNAc foi alcançada pela formação da ligação peptídica de um bloco de construção de ácido GalNAc-carboxílico ao oligonucleotídeo previamente montado e purificado, possuindo o número necessário de blocos de construção de ligantes modificados por amino.
[00425] A síntese, desproteção e purificação de oligonucleotídeos seguiram procedimentos padrão que são conhecidos na técnica.
[00426] Todos os oligonucleotídeos foram sintetizados em um sintetizador de oligopilot AKTA usando química padrão de fosforamidita. Suporte sólido disponível comercialmente e fosforamiditas de RNA O-metil 2', Fluoro 2', fosforamiditas desoxi RNA 2' (toda a proteção padrão, ChemGenes, LinkTech) e modificador 3'-Amino TFA Amino C-6 lcaa CPG 500Å disponível comercialmente (Chemgenes) foram usados. A galactose amina per-acetilada 8 é disponível comercialmente.
[00427] Reagentes auxiliares foram adquiridos da EMP Biotech. A síntese foi realizada usando soluções 0,1 M de fosforamidita em acetonitrila seca e benziltiotetrazol (BTT) foi usado como ativador (0,3 M em acetonitrila). O tempo de acoplamento foi de 15 min. Foi aplicado um ciclo Cap/OX/ Cap ou Cap/Tio/Cap (Cap: Ac2O/NMI/Lutidina/Acetonitrila, Oxidador: 0,1M I2 em piridina/H2O). Os fosforotioatos foram introduzidos usando reagentes de tiolação disponíveis comercialmente (EDITH, Link technologies). A clivagem por DMT foi obtida por tratamento com ácido dicloroacético a 3% em tolueno. Após a conclusão dos ciclos de síntese programados, foi realizada uma lavagem com dietilamina (DEA). Todos os oligonucleotídeos foram sintetizados no modo DMT-off.
[00428] A fixação da fração ligante derivada de serinol foi obtida pelo uso de (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-lcaa-CPG 10 carregado com base ou de uma fosforamidita 7 (S)-DMT-Serinol(TFA) (síntese) foi realizada como descrito em Hoevelmann et al. (Chem. Sci., 2016, 7, 128-135)). Aglomerados de GalNAc tri-antenários (ST23/C4XLT) foram introduzidos por acoplamento sucessivo dos respectivos derivados de amidita trebler (C4XLT-phos), seguidos pela amidita GalNAc (ST23-phos).
[00429] As fitas simples foram cortadas do CPG em tratamento com metilamina 40% aq. O oligonucleotídeo bruto resultante foi purificado por cromatografia de troca iônica (Recurso Q, 6 mL, GE Healthcare) em um sistema AKTA Pure HPLC usando um gradiente de cloreto de sódio. As frações que contêm o produto foram reunidas, dessalinizadas em uma coluna de exclusão de tamanho (Zetadex, EMP Biotech) e liofilizadas.
[00430] As fitas simples individuais foram dissolvidas em uma concentração de 60 OD/mL em H2O. Ambas as soluções oligonucleotídicas individuais podem ser adicionadas em conjunto a um vaso reacional. Para facilitar o monitoramento da reação, foi realizada uma titulação. A primeira fita foi adicionada em excesso de 25% sobre a segunda fita, conforme determinado por absorção de UV a 260 nm. A mistura reacional foi aquecida, por exemplo, a 80°C durante 5 minutos e depois arrefecida lentamente à RT. A formação de fita dupla foi monitorada por HPLC de fase reversa de pareamento de íons. A partir da área UV da fita simples residual, a quantidade necessária da segunda fita foi calculada e adicionada à mistura reacional. A reação foi aquecida, por exemplo, a 80°C novamente e lentamente resfriada à RT. Este procedimento foi repetido até que menos de 10% da fita simples residual foi detectado. Síntese dos compostos 2-10
[00431] Os compostos 2 a 5 e (S)-DMT-serinol(TFA)-fosforamidita 7 foram sintetizados de acordo com os métodos publicados na literatura (Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135). Ácido (S)-4-(3-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-2-(2,2,2- trifluoroacetamido)propoxi)-4-oxobutanoico (6).
[00432] A uma solução de 5 em piridina foi adicionado anidrido succínico, seguido por DMAP. A mistura foi então agitada a temperatura ambiente durante a noite. Toda a matéria-prima foi consumida, conforme julgado pela TLC. A reação foi concentrada. O material bruto foi cromatografado em sílica gel usando um gradiente de 0% a 5% de metanol em DCM (+ 1% de trietilamina) para obter 1,33 g de 6 (rendimento = 38%). m/z (ESI-): 588,2 (100%), (calculado para C30H29F3NO8- [M-H]- 588,6). 1 H‐NMR: (400 MHz, CDCl3) δ [ppm] = 7,94 (d, 1H, NH), 7,39 - 7,36 (m, 2H, CHaryl), 7,29 - 7,25 (m, 7H, CHaryl), 6,82-6,79 (m, 4H, CHaryl), 4,51 – 4,47 (m, 1H), 4,31 – 4,24 (m, 2H), 3,77 (s, 6H, 2xDMTr‐OMe), 3,66 - 3,60 (m, 16H, HNEt3+), 3,26 - 3,25 (m, 2H), 2,97 – 2,81 (m, 20H, NEt3), 2,50-2,41 (4H, m), 1,48 – 1,45 (m, 26H, HNEt3+), 1,24 - 1,18 (m, 29H, NEt3). (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-lcaa-CPG (10)
[00433] O (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato (159 mg, 270 umol) e HBTU (113 mg, 299 umol) foram dissolvidos em CH3CN (10 mL). Foi adicionada diisopropiletilamina (DIPEA, 94 µL, 540 umol) à solução e a mistura foi agitada durante 2 min seguida por adição de amino-lcaa-CPG nativo (500 A, 3 g, teor de amina: 136 umol/g). A suspensão foi agitada suavemente a temperatura ambiente em um agitador de pulso durante 16 h, depois filtrada e lavada com DCM e EtOH. O suporte foi seco sob vácuo durante 2 h. As aminas que não reagiram no suporte foram tapadas por agitação com anidrido acético/lutidina/N-metilimidazol a temperatura ambiente. A lavagem do suporte foi repetida como acima. O sólido foi seco sob vácuo para dar suporte sólido 10 (carregamento de 3 g, 26 umol/g). Sínton GalNAc (9)
[00434] A síntese do sínton GalNAc 9 foi realizada como descrito em Nair et al. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), pp 16958-16961, em 46% de rendimento em duas etapas.
[00435] Os dados de caracterização correspondiam aos dados publicados. Síntese de Oligonucleotídeos
[00436] Todos os oligonucleotídeos de fita simples foram sintetizados de acordo com as condições de reação descritas acima e nas Figuras 13 e 14.
[00437] Todos os produtos finais de fita simples foram analisados por AEX-HPLC para provar sua pureza.
A pureza é dada em % de FLP (% de produto de comprimento completo), que é a porcentagem da área UV sob o sinal do produto atribuído no traço UV da análise AEX-HPLC do produto final.
A identidade dos respectivos produtos de fita simples (precursores não modificados, modificados por amino ou oligonucleotídeos conjugados com GalNAc) foi provada por análise por LC-MS.
Tabela 3: Oligonucleotídeos não conjugados de fita simples Produto Nome MW MW (ESI-) % de FLP (11) calc. encontrado (AEX- HPLC) (A0002) STS16001A 6943,3 Da 6943,0 Da 86,6% A0006 STS16001BL4 8387,5 Da 8387,5 Da 94,1% A0130 STS18001A 6259,9 Da 6259,8 Da 76,5% A0131 STS18001BL4 7813,2 Da 7813,1 Da 74,3% A0220 STS16001B-5'1xNH2 6982,2 Da 6982,1 Da 95,7% A0237 STS16001A 6943,3 Da 6943,3 Da 95,6% A0244 STS16001BV1 6845,2 Da 6844,9 Da 98,2% A0264 STS16001AV4-3'1xNH2 7112,4 Da 7112,2 Da 95,4% A0329 STS16001BV6-3'5'1xNH2 7183,3 Da 7183,2 Da 88,8% Os meios 5'1 x NH2 referem-se à posição (extremidade 5') e ao número (1 x NH2) de grupos amino derivados de serinol livre que estão disponíveis para conjugação.
Por exemplo, 1x3'NH2 em A0264 significa que existe um grupo amino livre que pode ser reagido com o sínton GalNAc 9 na extremidade 3' da fita A0264. 3'5'1xNH2 significa que existe um grupo amino livre derivado de serinol que pode ser reagido com o ligante GalNAc 9 na extremidade 3‘ e na extremidade 5' da fita.
Síntese dos conjugados 1-3 e conjugados de referência 1-2 Fitas simples conjugadas para conjugados 1-2 e conjugados de referência 1-2
[00438] A conjugação do sínton GalNac (9) foi conseguida por acoplamento à função serinol-amino da respectiva fita oligonucleotídica 11 , usando um reagente de acoplamento peptídico. Portanto, a respectiva molécula precursora modificada por amino 11 foi dissolvida em H2O (500 OD/mL) e DMSO (DMSO/H2O, 2/1, v/v) foi adicionado, seguido por DIPEA (2,5% do volume total). Em um vaso reacional separado, a pré-ativação do ácido GalN(Ac4)-C4 (9) foi realizada por reação de 2 eq. (por função amino no oligonucleotídeo 11precursor modificado por amino) do componente ácido carboxílico com 2 eq. de HBTU na presença de 8 eq. DIPEA no DMSO. Após 2 min, o composto 9 pré-ativado é adicionado à solução da respectiva molécula precursora modificada por amino. Após 30 min, o progresso da reação foi monitorado por LCMS ou AEX-HPLC. Após a conclusão da reação de conjugação, o produto bruto foi precipitado pela adição de 10x iPrOH e 0,1x 2M NaCl e coletado por centrifugação e decantação. Para libertar os grupos hidroxila acetilados nas frações GalNAc, o grânulo resultante foi dissolvido em MeNH2 a 40% (1 mL por 500 OD) e após 15 min a RT, diluído em H2O (1:10) e finalmente purificado novamente por troca aniônica e cromatografia de exclusão por tamanho e liofilizada para produzir o produto final 12. Tabela 4: Oligonucleotídeos conjugados a GalNAc de fita simples Produto Matéria- Nome MW MW (ESI-) % de FLP (12) prima calc. encontrado (AEX- HPLC) A0241 A0220 STS16001BL20 7285,5 Da 7285,3 Da 91,8% A0268 A0264 STS16001AV4L33 7415,7 Da 7415,4 Da 96,9% A0330 A0329 STS16001BV6L42 7789,8 Da 7789,8 Da 95,5% Formação de fita dupla
[00439] A formação de fita dupla foi realizada de acordo com os métodos descritos acima.
[00440] A pureza da fita dupla é dada em % de fita dupla, que é a porcentagem da área UV sob o sinal do produto atribuído no traço UV da análise IP-RP-HPLC. Tabela 5: Conjugados de ácido nucleico Produto Matérias-primas Nome % de fita dupla Primeira Segunda Fita Fita Ref. Conj. 1 A0237 A0241 STS16001L20 97,7% Ref. Conj. 2 A0268 A0244 STS16001L33 97,8% Ref. Conj. 3 A0130 A0131 STS18001L4 96,8% Ref. Conj. 4 (A0002) A0006 STS16001L4 90,1% Conjugado 1 A0268 A0241 STS16001L24 96,0% Conjugado 2 A0237 A0330 STS16001V1L42 98,5% Conjugado 3 A0268 A0330 STS16001V1L43 98,2% Sequências
[00441] Chave de modificações para as seguintes sequências: f denota desoxirribonucleotídeo 2´ de fluoro 2´ ou ribonucleotídeo de fluoro 2´ (os termos são intercambiáveis) m denota ribonucleotídeo O Metil 2´ (ps) denota ligação fosforotioato Ser(GN) é um bloco de construção GalNAc-C4 anexado à fração ligante derivada de serinol: em que O- é a ligação entre o átomo de oxigênio e, por exemplo, ligação H, ligação fosfodiéster ou ligação fosforotioato. C4XLT é:
ST23 é:
[00442] A síntese dos derivados de fosforamidita de C4XLT (C4XLT- phos), bem como ST23 (ST23-phos) pode ser realizada como descrito em WO2017/174657. C4XLT-phos: ST23-phos: Conjugado 1
[00443] Fita antisense - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
[00444] 5´ mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3´
[00445] Fita sense – STS16001BL20 (SEQ ID NO: 128)
[00446] 5´ Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA 3´ Conjugado 2
[00447] Fita antisense - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
[00448] mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
[00449] Fita sense - STS16001BV1L42 (SEQ ID NO: 130)
[00450] Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) Conjugado 3
[00451] Fita antisense - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
[00452] 5´ mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3´
[00453] Fita sense - STS16001BV1L42 (SEQ ID NO: 130)
[00454] 5´ Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) 3´ Conjugado de referência 1
[00455] Fita antisense - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
[00456] mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
[00457] Fita sense – STS16001BL20 (SEQ ID NO: 128)
[00458] Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA Conjugado de referência 2
[00459] Fita antisense - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
[00460] mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN)
[00461] Fita sense - STS16001V1B (SEQ ID NO: 131)
[00462] fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA Conjugado de Referência 3
[00463] Fita antisense - STS18001A (A0130; SEQ ID NO: 132)
[00464] mU (ps) fC (ps) mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA (ps) fC (ps) mG
[00465] Fita sense - STS18001BL4 (A0131, SEQ ID NO: 133)
[00466] [(ST23) (ps)]3 C4XLT (ps) fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC (ps) mG (ps) fA Conjugado de Referência 4
Fita antisense - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
[00467] mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
[00468] Fita sense - STS16001BL4 (SEQ ID NO: 134)
[00469] 5´[(ST23) (ps)]3 C4XLT(ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA Exemplo 7 – Determinação in vitro do knockdown de TTR de vários conjugados de TTR siRNA GalNAc
[00470] Hepatócitos murinos primários foram semeados em placas de 96 poços pré-revestidas com colágeno (Thermo Fisher Scientific, Nº A1142803) a uma densidade celular de 30.000 células por poço e tratados com conjugados de siRNA em concentrações variando de 10nM a 0,0001nM. As células após 24 horas de tratamento foram lisadas e o RNA extraído com InviTrap® RNA Cell HTS 96 Kit/C24 x 96 preps (Stratec Nº 7061300400) de acordo com o protocolo do fabricante. Os níveis de transcrição de TTR e de mRNA housekeeping (PtenII) foram quantificados por análise TaqMan.
[00471] A expressão do gene alvo em hepatócitos murinos primários 24h após o tratamento com os conjugados da invenção, Conjugados 1-3, mostrou que a expressão do gene alvo diminui à medida que a dose do conjugado aumenta em comparação com os controles negativos (ver a coluna ―UT‖ e o Conjugado de Referência 3), conforme mostrado na Figura 15. Isso indica que a primeira fita está se ligando ao gene alvo, diminuindo assim a expressão gênica. A Figura 15 também mostra os níveis de expressão do gene alvo dos Conjugados de Referência 1 e 2 que atuam como conjugados comparadores. Como pode ser visto por meio de uma comparação entre os dados apresentados nas Figuras 15A e 15C e 15B e 15C, os conjugados da invenção (Conjugados 1-3) diminuem a expressão do gene alvo em comparação com os Conjugados de Referência 1 e 2. O conjugado mais eficaz a 0,01 nM parece ser o Conjugado 2. O conjugado mais eficaz a 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM e 10 nM parece ser o Conjugado 3.
Exemplo 8 - Curso de tempo in vivo da TTR sérica em camundongos
[00472] Os camundongos C57BL/6 foram tratados s.c. com 1 mg/kg de conjugados siRNA no dia 0. Amostras de soro foram coletadas nos dias 7, 14 e 27 por sangramento do seio orbital e armazenadas a -20 °C até a análise. A quantificação de TTR sérica foi realizada com uma ELISA de Pré-albumina de Camundongo (ALPCO, 41-PALMS/lote 22, 2008003B) de acordo com o protocolo do fabricante (diluição da amostra 1:8000 ou 1:800).
[00473] Os resultados do curso de tempo da TTR sérica em coortes de camundongos c57BL/6 de n=4 em 7, 14 e 27 dias após o tratamento s.c. com 1mg/kg de Conjugados 1-3, Conjugados de Referência 1, 2 e 4, e indivíduos tratados com simulação (PBS) são mostrados na Figura 16. Como indicado pelos dados na Figura 16, os conjugados da invenção são particularmente eficazes na redução da expressão do gene alvo em comparação com o controle negativo (PBS) e os Conjugados de Referência 1, 2 e, em particular, o Conjugado de Referência 4. Os Conjugados 2 e 3 também são mais eficazes do que os Conjugados de Referência 1, 2 e 4. O conjugado mais eficaz é o Conjugado 2. Assim, pode-se esperar que o nível de dosagem do Conjugado 3 seja cerca de três vezes menor para alcançar o mesmo knockdown inicial e também resultaria em maior duração do knockdown em comparação com o Conjugado de Referência 4. Exemplo 9 - Síntese dos conjugados 2
[00474] Os compostos de exemplo foram sintetizados de acordo com os métodos descritos abaixo e métodos conhecidos do versado na técnica. A montagem da cadeia oligonucleotídica e dos blocos ligantes foi realizada por síntese em fase sólida, aplicando a metodologia de fosforamidita. A conjugação de GalNAc foi alcançada pela formação da ligação peptídica de um bloco de construção de ácido GalNAc-carboxílico ao oligonucleotídeo previamente montado e purificado, possuindo o número necessário de blocos de construção de ligantes modificados por amino.
[00475] A síntese, desproteção e purificação de oligonucleotídeos seguiram procedimentos padrão que são conhecidos na técnica.
[00476] Todos os oligonucleotídeos foram sintetizados em um sintetizador de oligopilot AKTA usando química padrão de fosforamidita. Suporte sólido disponível comercialmente e fosforamiditas de RNA O-metil 2', Fluoro 2', fosforamiditas desoxi RNA 2' (toda a proteção padrão, ChemGenes, LinkTech) e modificador 3'-Amino TFA Amino C-6 lcaa CPG 500Å disponível comercialmente (Chemgenes) foram usados. A galactose amina per-acetilada 8 é disponível comercialmente.
[00477] Reagentes auxiliares foram adquiridos da EMP Biotech. A síntese foi realizada usando soluções 0,1 M de fosforamidita em acetonitrila seca e benziltiotetrazol (BTT) foi usado como ativador (0,3 M em acetonitrila). O tempo de acoplamento foi de 15 min. Foi aplicado um ciclo Cap/OX/ Cap ou Cap/Tio/Cap (Cap: Ac2O/NMI/Lutidina/Acetonitrila, Oxidador: 0,1M I2 em piridina/H2O). Os fosforotioatos foram introduzidos usando reagentes de tiolação disponíveis comercialmente (EDITH, Link technologies). A clivagem por DMT foi obtida por tratamento com ácido dicloroacético a 3% em tolueno. Após a conclusão dos ciclos de síntese programados, foi realizada uma lavagem com dietilamina (DEA). Todos os oligonucleotídeos foram sintetizados no modo DMT-off.
[00478] A fixação da fração ligante derivada de serinol foi obtida pelo uso de (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-lcaa-CPG 10 carregado com base ou de uma fosforamidita 7 (S)-DMT-Serinol(TFA) (síntese) foi realizada como descrito na literatura em Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135). Aglomerados de GalNAc tri-antenários (ST23/C4XLT ou ST23/C6XLT) foram introduzidos por acoplamento sucessivo dos respectivos derivados de amidita trebler (C4XLT-phos ou C6XLT-phos), seguidos pela amidita GalNAc (ST23- phos).
[00479] As fitas simples foram cortadas do CPG em tratamento com metilamina 40% aq. O oligonucleotídeo bruto resultante foi purificado por cromatografia de troca iônica (Recurso Q, 6 mL, GE Healthcare) em um sistema AKTA Pure HPLC usando um gradiente de cloreto de sódio. As frações que contêm o produto foram reunidas, dessalinizadas em uma coluna de exclusão de tamanho (Zetadex, EMP Biotech) e liofilizadas.
[00480] As fitas simples individuais foram dissolvidas em uma concentração de 60 OD/mL em H2O. Ambas as soluções oligonucleotídicas individuais podem ser adicionadas em conjunto a um vaso reacional. Para facilitar o monitoramento da reação, foi realizada uma titulação. A primeira fita foi adicionada em excesso de 25% sobre a segunda fita, conforme determinado por absorção de UV a 260 nm. A mistura reacional foi aquecida, por exemplo, a 80°C durante 5 minutos e depois arrefecida lentamente à RT. A formação de fita dupla foi monitorada por HPLC de fase reversa de pareamento de íons. A partir da área UV da fita simples residual, a quantidade necessária da segunda fita foi calculada e adicionada à mistura reacional. A reação foi aquecida, por exemplo, a 80°C novamente e lentamente resfriada à RT. Este procedimento foi repetido até que menos de 10% da fita simples residual foi detectado. Síntese dos compostos 2-10
[00481] Os compostos 2 a 5 e (S)-DMT-serinol(TFA)-fosforamidita 7 foram sintetizados de acordo com os métodos publicados na literatura (Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135). Ácido (S)-4-(3-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-2-(2,2,2- trifluoroacetamido)propoxi)-4-oxobutanoico (6).
[00482] A uma solução de 5 em piridina foi adicionado anidrido succínico, seguido por DMAP. A mistura foi então agitada a temperatura ambiente durante a noite. Toda a matéria-prima foi consumida, conforme julgado pela TLC. A reação foi concentrada. O material bruto foi cromatografado em sílica gel usando um gradiente de 0% a 5% de metanol em DCM (+ 1% de trietilamina) para obter 1,33 g de 6 (rendimento = 38%). m/z (ESI-): 588,2 (100%), (calculado para C30H29F3NO8- [M-H]- 588,6). 1 H‐NMR: (400 MHz, CDCl3) δ [ppm] = 7,94 (d, 1H, NH), 7,39 - 7,36 (m, 2H, CHaryl), 7,29
- 7,25 (m, 7H, CHaryl), 6,82-6,79 (m, 4H, CHaryl), 4,51 – 4,47 (m, 1H), 4,31 – 4,24 (m, 2H), 3,77 (s, 6H, 2xDMTr‐OMe), 3,66 - 3,60 (m, 16H, HNEt3+), 3,26 - 3,25 (m, 2H), 2,97 – 2,81 (m, 20H, NEt3), 2,50-2,41 (4H, m), 1,48 – 1,45 (m, 26H, HNEt3+), 1,24 - 1,18 (m, 29H, NEt3). (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-lcaa-CPG (10)
[00483] O (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato (159 mg, 270 umol) e HBTU (113 mg, 299 umol) foram dissolvidos em CH3CN (10 mL). Foi adicionada diisopropiletilamina (DIPEA, 94 µL, 540 umol) à solução e a mistura foi agitada durante 2 min seguida por adição de amino-lcaa-CPG nativo (500 A, 3 g, teor de amina: 136 umol/g). A suspensão foi agitada suavemente a temperatura ambiente em um agitador de pulso durante 16 h, depois filtrada e lavada com DCM e EtOH. O suporte foi seco sob vácuo durante 2 h. As aminas que não reagiram no suporte foram tapadas por agitação com anidrido acético/lutidina/N-metilimidazol a temperatura ambiente. A lavagem do suporte foi repetida como acima. O sólido foi seco sob vácuo para dar suporte sólido 10 (carregamento de 3 g, 26 umol/g). Sínton GalNAc (9)
[00484] A síntese do sínton GalNAc 9 foi realizada como descrito em Nair et al. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), pp 16958-16961, em 46% de rendimento em duas etapas.
[00485] Os dados de caracterização correspondiam aos dados publicados. Síntese de Oligonucleotídeos
[00486] Todos os oligonucleotídeos de fita simples foram sintetizados de acordo com as condições de reação descritas acima e nas Figuras 13 e 14.
[00487] Todos os produtos finais de fita simples foram analisados por AEX-HPLC para provar sua pureza. A pureza é dada em % de FLP (% de produto de comprimento completo), que é a porcentagem da área UV sob o sinal do produto atribuído no traço UV da análise AEX-HPLC do produto final. A identidade dos respectivos produtos de fita simples (precursores não modificados, modificados por amino ou oligonucleotídeos conjugados com GalNAc C4XLT/ST23 ou C6XLT/ST23) foi provada por análise por LC-MS. Tabela 7: Oligonucleotídeos não conjugados e conjugados em coluna de fita simples Produto MW MW (ESI-) % de FLP (11) calc. Encontrado (AEX-HPLC) X0385A 6315,0 Da 6314,6 Da 91,0% X0385B-prec 6593,1 Da 6593,1 Da 87,5% X038BA 6315,0 Da 6314,6 Da 91,0% X0386B-prec 6547,1 Da 6546,9 Da 87,5% X0383A 6315,0 Da 6314,5 Da 91,9% X0383B-prec 6508,8 Da 6508,6 Da 84,6% X0371A 6416,1 Da 6416,1 Da 88,4% X0371B-prec 6522,0 Da 6521,8 Da 91,9% X0320A 6143,8 Da 6143,7 Da 94,6% X0320B-prec 6665,0 Da 6664,8 Da 87,0% X0477A 6143,8 Da 6143,4 Da 85,6% X0477B-prec 6749,3 Da 6749,2 Da 83,1% X0027A 6416,1 Da 6415,8 Da 92,8% X0027B 7642,0 Da 7641,8 Da 88,2% Síntese dos conjugados 1-3 e conjugados de referência 1-2 Fitas simples conjugadas para conjugados 1-2 e conjugados de referência 1-2
[00488] A conjugação do sínton GalNac (9) foi conseguida por acoplamento à função serinol-amino da respectiva fita oligonucleotídica 11 , usando um reagente de acoplamento peptídico. Portanto, a respectiva molécula precursora modificada por amino 11 foi dissolvida em H2O (500 OD/mL) e DMSO (DMSO/H2O, 2/1, v/v) foi adicionado, seguido por DIPEA
(2,5% do volume total). Em um vaso reacional separado, a pré-ativação do ácido GalN(Ac4)-C4 (9) foi realizada por reação de 2 eq. (por função amino no oligonucleotídeo 11precursor modificado por amino) do componente ácido carboxílico com 2 eq. de HBTU na presença de 8 eq. DIPEA no DMSO. Após 2 min, o composto 9 pré-ativado é adicionado à solução da respectiva molécula precursora modificada por amino. Após 30 min, o progresso da reação foi monitorado por LCMS ou AEX-HPLC. Após a conclusão da reação de conjugação, o produto bruto foi precipitado pela adição de 10x iPrOH e 0,1x 2M NaCl e coletado por centrifugação e decantação. Para libertar os grupos hidroxila acetilados nas frações GalNAc, o grânulo resultante foi dissolvido em MeNH2 a 40% (1 mL por 500 OD) e após 15 min a RT, diluído em H2O (1:10) e finalmente purificado novamente por troca aniônica e cromatografia de exclusão por tamanho e liofilizada para produzir o produto final 12. Tabela 8: Oligonucleotídeos conjugados a GalNAc de fita simples Produto Matéria-prima MW MW (ESI-) % de FLP (12) (11) calc. encontrado (AEX-HPLC) X0385B X0385B-prec 7199,8 Da 7199,3 Da 93,2% X0386B X0386B-prec 7153,8 da 7153,0 Da 86,2% X0383B X0383B-prec 7115,5 Da 7115,4 Da 93,7% X0320B X0320B-prec 7271,7 Da 7271,7 Da 90,0% X0371B X0371B-prec 7128,8 Da 7128,3 Da 95,0% X0477B X0477B-prec 7356,0 Da 7355,7 Da 91.4% Formação de fita dupla
[00489] A formação de fita dupla foi realizada de acordo com os métodos descritos acima.
[00490] A pureza da fita dupla é dada em % de fita dupla, que é a porcentagem da área UV sob o sinal do produto atribuído no traço UV da análise IP-RP-HPLC. Tabela 9: Conjugados de ácido nucleico
Produto Matérias-Primas % de fita dupla Primeira Fita Segunda Fita X0385 X0385A X0385B 97,5% X0386 X0386A X0386B 96,9% X0383 X0383A X0383B 91,9% X0371 X0371A X0371B 97,7% X0027 X0027A X0027B 93,4% X0320 X0320A X0320B 98,6% X0477 X0477A X0477B 96,0% Sequências
[00491] Chave de modificações para as seguintes sequências: f denota desoxirribonucleotídeo 2´ de fluoro 2´ ou ribonucleotídeo de fluoro 2´ (os termos são intercambiáveis) m denota ribonucleotídeo O Metil 2´ (ps) denota ligação fosforotioato Ser(GN) é um bloco de construção GalNAc-C4 anexado à fração ligante derivada de serinol: em que O- é a ligação entre o átomo de oxigênio e, por exemplo, ligação H, ligação fosfodiéster ou ligação fosforotioato. C4XLT é: C6XLT é:
ST23 é:
[00492] A síntese dos derivados de fosforamidita de C4XLT (C4XLT- phos), C6XLT (C6XLT-phos) bem como ST23 (ST23-phos) pode ser realizada como descrito em WO2017/174657. C4XLT-phos: C6XLT-phos: ST23-phos: Exemplo 10
[00493] A resposta de dose igual de knockdown para siRNA direcionado a LPA com duas unidades GalNAc únicas conjugadas com a segunda fita, em comparação com uma unidade GalNAc triantenária na segunda fita 5' em hepatócitos de cinomolgo primários.
[00494] Os siRNAs são modificados com 2'-OMe/2'-F alternados e contêm, cada um, duas ligações internucleotídicas de fosforotioato (PS) em suas duas ligações internucleotídicas terminais 5' e 3'. No conjugado 19, uma unidade de serinol-GalNAc está cada uma ligada através de uma ligação PS aos 5' e 3' da segunda fita. No conjugado 20, os dois internucleotídeos terminais 5' da segunda fita são fosfodiésteres e um ligante triantenário de GalNAc é conectado por meio de uma ligação PS a essa extremidade.
[00495] A resposta à dose do knockdown de LPA nos hepatócitos de cinomolgo primários foi avaliada 24 horas após o tratamento com 100, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032 e 0,006 nM de siRNA. O controle de referência é o construto 2, o controle sem segmentação é chamado Cte. O valor de ct da transcrição para cada grupo de tratamento foi normalizado para o valor de ct da transcrição para o housekeeping gen ACTB (ct) e para hepatócitos não tratados, denominado ut (ct).
[00496] Dados são mostrados na Figura 18 Material e Métodos: siRNAs
SEQ ID nome lote fita sequência NO: 135 mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC X0373A mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG Conjugado 136 X0373 Ser(GN) (ps) fC (ps) mG (ps) fG mU fA mA fU mG 19 fG mA fC mA fG mA fG mU fU (ps) mA (ps) fU (ps) X0373B Ser(GN) 135 mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC Conjugado STS2041A mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG de STS2004 137 ST23 (ps) ST23 (ps) ST23 (ps) C6XLT (ps) fC mG Referência 1L6 STS2041B fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU 9 fU (ps) mA (ps) fU 138 X0125A mC (ps) fU (ps) mU fA mC fU mC fU mC fG mC fC Conjugado mC fA mA fG mC (ps) fG (ps) mA de 139 X0125 [(ST23) (ps)]3 (C6XLT) (ps) fU mC fG mC fU mU Referência X0125B fG mG fG mC fG mA fG mA fG mU fA (ps) mA (ps) 5 (CTR) fG Legenda mA, mU, mC, mG 2‗-O-Metil RNA fA, fU, fC, fG 2‘-desoxi-2‘-fluoro RNA (ps) fosforotioato (po) fosfodiéster
Primer:
SE
Q ID NO: fw GTGTCCTCGCAACGTCCA 48 rev GACCCCGGGGCTTTG 49
LPA sond BHQ1-TGGCTGTTTCTGAACAAGCACCAATGG- 140 a FAM fw GCATGGGTCAGAAGGATTCCTAT 54 ACT rev TGTAGAAGGTGTGGTGCCAGATT 55 B sond BHQ1-TCGAGCACGGCATCGTCACCAA-VIC 141 a Métodos Gerais Experiências in vitro
[00497] Os hepatócitos murinos primários (Thermo Scientific: GIBCO Lote: Nº MC798) foram descongelados e o meio de preservação de crio foi trocado pelo meio Williams E suplementado com FBS a 5%, 1 µM de dexametasona, 2 mM GlutaMax, PenStrep a 1%, 4mg/ml de insulina humana recombinante, 15mM Hepes. A densidade celular foi ajustada para 250000 células por 1 ml. 100 µl por poço desta suspensão de células foram semeados em placas de 96 poços pré-revestidas com colágeno. O artigo de teste foi pré- diluído no mesmo meio (5 vezes concentrado) para cada concentração e 25 µl deste siRNA ou meio pré-diluído foram adicionados apenas às células. As células foram cultivadas a 37°C e 5% de CO2. 24 horas após o tratamento, o sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas em PBS frio e foram adicionados 250 µL de RNA-Lysis Buffer S (Stratec). Após 15 min de incubação a temperatura ambiente, as placas foram armazenadas a -80°C até o isolamento do RNA de acordo com o protocolo do fabricante. Análise TaqMan
[00498] Para a análise mTTR e PTEN MultiPlex TaqMan, 10 µl de
RNA isolado para cada grupo de tratamento foram misturados com 10 µl de mastermix de PCR (TAKYON low Rox) contendo 600 nM de mTTR-primer, 400 nM de ApoB-primer e 200nM de cada sonda, bem como 0,5 unidades de Euroscript II RT polimerase com 0,2 unidades de inibidor de RNAse. A análise de TaqMan foi realizada em uma placa de 384 poços com uma etapa de RT de 10 minutos a 48°C, desnaturação inicial de 3 minutos a 95°C e 40 ciclos de 95°C durante 10 segundos e 60°C durante 1 minuto. Os primers contêm dois de BHQ1, FAM e YY, um em cada extremidade da sequência.
[00499] Para a análise TMPRSS6 e ApoB MultiPlex TaqMan, 10 µl de RNA isolado para cada grupo de tratamento foram misturados com 10 µl de mastermix de PCR (TAKYON low Rox) contendo 800 nM de primer TMPRSS6, 100 nM de primer ApoB e 200 nM de qualquer sonda, bem como 0,5 unidades de Euroscript II RT polimerase com 0,2 unidades de inibidor de RNAse. A análise de TaqMan foi realizada em uma placa de 384 poços com uma etapa de RT de 10 minutos a 48°C, desnaturação inicial de 3 minutos a 95°C e 40 ciclos de 95°C durante 10 segundos e 60°C durante 1 minuto. Experiências in vivo
[00500] Para comparar a potência in vivo de diferentes conjugados de siRNA, 1 mg/kg de siRNA dissolvido em PBS foi administrado subcutaneamente na região escapular de camundongos c57BL/6. Coortes de n = 6 foram tratadas com siRNA visando Aldh2 ou Tmprss6 no dia 1 e sacrificadas em momentos selecionados após o tratamento. As amostras de fígado foram congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas a - 80°C até o RNA de extração com o Mini Kit InviTrap Spin Tissue RNA (stratec), de acordo com o manual do fabricante. A seguir, os níveis de transcrição de Aldh2, Tmprss6 e Pten foram quantificados como descrito acima. Ensaio de estabilidade do tritossoma
[00501] Para investigar a estabilidade da RNAase no compartimento endossômico/lisossômico de células hepáticas in vitro o siRNA foi incubado durante 0 h, 4 h, 24 h ou 72 h em tritossomas hepáticos de ratos Sprague
Dawley (Tebu- Bio, CatN .: R0610.LT, lote: 1610405, pH: 7,4, 2,827 Unidades/ml). Para imitar o ambiente acidificado, os tritossomas foram misturados 1:10 com tampão de pH baixo (ácido acético 1,5M, acetato de sódio 1,5M, pH 4,75). 30 µL deste tritossoma acidificado. Após 10 µL de siRNA (20 µM) foram misturados e incubados pelos tempos indicados a 37°C. Após a incubação, o RNA foi isolado com o Clarity OTX Starter Kit-Cartriges (Phenomenex CatNº: KSO-8494) de acordo com o protocolo do fabricante para fluidos biológicos. O RNA liofilizado foi reconstituído em 30 µL de H2O, misturado com tampão de carregamento 4x e 5µl foram carregados em uma eletroforese em gel de 20% TBE-poliacrilamida (PAGE) para análise semi- quantitativa qualitativa de separação. O PAGE foi executado a 120 V durante 2 h e o RNA foi visualizado por coloração com brometo de etídio com subsequente geração de imagens digitais com um sistema Biorad Imaging. Exemplo 11 - Síntese de conjugados 3
[00502] Os compostos de exemplo foram sintetizados de acordo com os métodos descritos abaixo e métodos conhecidos do versado na técnica. A montagem da cadeia oligonucleotídica e dos blocos ligantes foi realizada por síntese em fase sólida, aplicando a metodologia de fosforamidita. A conjugação de GalNAc foi alcançada pela formação da ligação peptídica de um bloco de construção de ácido GalNAc-carboxílico ao oligonucleotídeo previamente montado e purificado, possuindo o número necessário de blocos de construção de ligantes modificados por amino.
[00503] A síntese, desproteção e purificação de oligonucleotídeos seguiram procedimentos padrão que são conhecidos na técnica.
[00504] Todos os oligonucleotídeos foram sintetizados em um sintetizador de oligopilot AKTA usando química padrão de fosforamidita. Suporte sólido comercialmente disponível e fosforamiditas de RNA O-metil 2´, fosforamiditas Fluoro 2', desoxi 2' RNA (toda a proteção padrão, ChemGenes, LinkTech) e modificador 3'-Amino TFA Amino C-6 lcaa CPG 500Å disponível comercialmente (Chemgenes), Fmoc-Amino-DMT C-7 CE fosforamidita
(GlyC3Am), Modificador 3'-Amino C-3 lcaa CPG 500Å (C3Am), Fmoc-Amino- DMT C-3 CED fosforamidita (C3Am) e TFA-Amino C-6 Fosforamidita CED (C6Am) (Chemgenes), 3'-amino-modificador C7 CPG (C7Am) (Glen Research), amino TFA não nucleosídico Amino fosforamidita (Pip), Amino não nucleosídico TFA Suporte sólido (PipAm) (AM Chemicals) foram usadas. A galactose amina per-acetilada 8 é disponível comercialmente.
[00505] Reagentes auxiliares foram adquiridos da EMP Biotech. A síntese foi realizada usando soluções 0,1 M de fosforamidita em acetonitrila seca e benziltiotetrazol (BTT) foi usado como ativador (0,3 M em acetonitrila). O tempo de acoplamento foi de 15 min. Foi aplicado um ciclo Cap/OX/ Cap ou Cap/Tio/Cap (Cap: Ac2O/NMI/Lutidina/Acetonitrila, Oxidador: 0,1M I2 em piridina/H2O). Os fosforotioatos foram introduzidos usando reagentes de tiolação disponíveis comercialmente (EDITH, Link technologies). A clivagem por DMT foi obtida por tratamento com ácido dicloroacético a 3% em tolueno. Após a conclusão dos ciclos de síntese programados, foi realizada uma lavagem com dietilamina (DEA). Todos os oligonucleotídeos foram sintetizados no modo DMT-off.
[00506] A fixação da fração ligante derivada de serinol foi obtida pelo uso de (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-lcaa-CPG 10 carregado com base ou de uma fosforamidita 7 (S)-DMT-Serinol(TFA) (síntese) foi realizada como descrito em Hoevelmann et al. (2016)). Aglomerados de GalNAc tri-antenários (ST23/C4XLT) foram introduzidos por acoplamento sucessivo dos respectivos derivados de amidita trebler (C4XLT-phos), seguidos pela amidita GalNAc (ST23-phos).
[00507] A fixação de frações amino modificadas (ligantes peptídicos não derivados de serinol) foi conseguida pelo uso do respectivo bloco de construção CPG ou amidita, modificado por amino, disponível comercialmente.
[00508] As fitas simples foram cortadas do CPG em tratamento com metilamina 40% aq. O oligonucleotídeo bruto resultante foi purificado por cromatografia de troca iônica (Recurso Q, 6 mL, GE Healthcare) em um sistema AKTA Pure HPLC usando um gradiente de cloreto de sódio. As frações que contêm o produto foram reunidas, dessalinizadas em uma coluna de exclusão de tamanho (Zetadex, EMP Biotech) e liofilizadas.
[00509] As fitas simples individuais foram dissolvidas em uma concentração de 60 OD/mL em H2O. Ambas as soluções oligonucleotídicas individuais podem ser adicionadas em conjunto a um vaso reacional. Para facilitar o monitoramento da reação, foi realizada uma titulação. A primeira fita foi adicionada em excesso de 25% sobre a segunda fita, conforme determinado por absorção de UV a 260 nm. A mistura reacional foi aquecida, por exemplo, a 80°C durante 5 minutos e depois arrefecida lentamente à RT. A formação de fita dupla foi monitorada por HPLC de fase reversa de pareamento de íons. A partir da área UV da fita simples residual, a quantidade necessária da segunda fita foi calculada e adicionada à mistura reacional. A reação foi aquecida, por exemplo, a 80°C novamente e lentamente resfriada à RT. Este procedimento foi repetido até que menos de 10% da fita simples residual foi detectado. Síntese dos compostos 2-10
[00510] Os compostos 2 a 5 e (S)-DMT-serinol(TFA)-fosforamidita 7 foram sintetizados de acordo com os métodos publicados na literatura (Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135). Ácido (S)-4-(3-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-2-(2,2,2- trifluoroacetamido)propoxi)-4-oxobutanoico (6).
[00511] A uma solução de 5 em piridina foi adicionado anidrido succínico, seguido por DMAP. A mistura foi então agitada a temperatura ambiente durante a noite. Toda a matéria-prima foi consumida, conforme julgado pela TLC. A reação foi concentrada. O material bruto foi cromatografado em sílica gel usando um gradiente de 0% a 5% de metanol em DCM (+ 1% de trietilamina) para obter 1,33 g de 6 (rendimento = 38%). m/z (ESI-): 588,2 (100%), (calculado para C30H29F3NO8- [M-H]- 588,6). 1 H‐NMR: (400 MHz, CDCl3) δ [ppm] = 7,94 (d, 1H, NH), 7,39 - 7,36 (m, 2H, CHaryl), 7,29 - 7,25 (m, 7H, CHaryl), 6,82-6,79 (m, 4H, CHaryl), 4,51 – 4,47 (m, 1H), 4,31 –
4,24 (m, 2H), 3,77 (s, 6H, 2xDMTr‐OMe), 3,66 - 3,60 (m, 16H, HNEt3+), 3,26 - 3,25 (m, 2H), 2,97 – 2,81 (m, 20H, NEt3), 2,50-2,41 (4H, m), 1,48 – 1,45 (m, 26H, HNEt3+), 1,24 - 1,18 (m, 29H, NEt3). (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-lcaa-CPG (10)
[00512] O (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato (159 mg, 270 umol) e HBTU (113 mg, 299 umol) foram dissolvidos em CH3CN (10 mL). Foi adicionada diisopropiletilamina (DIPEA, 94 µL, 540 umol) à solução e a mistura foi agitada durante 2 min seguida por adição de amino-lcaa-CPG nativo (500 A, 3 g, teor de amina: 136 umol/g). A suspensão foi agitada suavemente a temperatura ambiente em um agitador de pulso durante 16 h, depois filtrada e lavada com DCM e EtOH. O suporte foi seco sob vácuo durante 2 h. As aminas que não reagiram no suporte foram tapadas por agitação com anidrido acético/lutidina/N-metilimidazol a temperatura ambiente. A lavagem do suporte foi repetida como acima. O sólido foi seco sob vácuo para dar suporte sólido 10 (carregamento de 3 g, 26 umol/g). Sínton GalNAc (9)
[00513] A síntese do sínton GalNAc 9 foi realizada como descrito em Nair et al. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), pp 16958-16961, em 46% de rendimento em duas etapas.
[00514] Os dados de caracterização correspondiam aos dados publicados. Síntese de Oligonucleotídeos
[00515] Todos os oligonucleotídeos de fita simples foram sintetizados de acordo com as condições de reação descritas acima e nas Figuras 13 e 14, e estão descritos nas Tabelas 10 e 11.
[00516] Todos os produtos finais de fita simples foram analisados por AEX-HPLC para provar sua pureza. A pureza é dada em % de FLP (% de produto de comprimento completo), que é a porcentagem da área UV sob o sinal do produto atribuído no traço UV da análise AEX-HPLC do produto final. A identidade dos respectivos produtos de fita simples (precursores não modificados, modificados por amino ou oligonucleotídeos conjugados com GalNAc) foi provada por análise por LC-MS.
Tabela 10: Oligonucleotídeos não conjugados de fita simples Produto Nome MW MW (ESI-) % de FLP (11) calc. encontrado (AEX-HPLC) A0002 STS16001A 6943,3 Da 6943,0 Da 86,6% A0006 STS16001BL4 8387,5 Da 8387,5 Da 94,1% A0114 STS22006A 6143,8 Da 6143,7 Da 94,3% A0115 STS22006BL1 7855,1 Da 7855,1 Da 92,8% A0122 STS22009A 6260,9 Da 6260,6 Da 92,8% A0123 STS22009BL1 7783,0 Da 7782,9 Da 87,1% A0130 STS18001A 6259,9 Da 6259,8 Da 76,5% A0131 STS18001BL4 7813,2 Da 7813,1 Da 74,3% A0220 STS16001B-5'1xNH2 6982,2 Da 6982,1 Da 95,7% A0237 STS16001A 6943,3 Da 6943,3 Da 95,6% A0244 STS16001BV1 6845,2 Da 6844,9 Da 98,2% A0264 STS16001AV4- 7112,4 Da 7112,2 Da 95,4% 3'1xNH2 A0329 STS16001BV6- 7183,3 Da 7183,2 Da 88,8% 3'5'1xNH2 A0560 STS16001A 6943,3 Da 6943,3 Da 96,7% A0541 STS16001BV1- 7151,3 Da 7151,0 Da 85,6% 3'5'NH2 A0547 STS16001BV16- 7119,3 Da 7119,1 Da 89,9% 3'5'NH2 A0617 STS16001BV20- 7087,3Da 7086,7 Da 90,1% 3'5'NH2 A0619 STS16001BV1- 7521,3 Da 7521,3 Da 93,4% 3'5'2xNH2
A0680 STS16001A 6943,3 Da 6942,9 Da 91,2% A0514 STS22006A 6143,8 Da 6143,7 Da 94,6% A0516 STS22009BV11- 3'5'NH2 6665,0 Da 6664,8 Da 87,0% A0517 STS22009BV11- 3'5'NH2 6593,0 Da 6593,0 Da 86,0% A0521 STS12009BV1- 3'5'NH2 6437,7 Da 6437,8 Da 91,1% A0303 STS12209BL4 7665,0 Da 7664,9 Da 90,4% A0304 STS12209A 6393,1 Da 6392,9 Da 77,6% A0319 STS22009A 6260,9 Da 6260,5 Da 86,9% A0353 STS12009A 6416,1 Da 6416,1 Da 94,1% A0216 STS17001A 6178,8 Da 6178,7 Da 87,2% A0217 STS17001BL6 7937,2 Da 7937,2 Da 78,3% Os meios 5'1 x NH2 referem-se à posição (extremidade 5') e ao número (1 x NH2) de grupos amino derivados de serinol livre que estão disponíveis para conjugação.
Por exemplo, 1x3'NH2 em A0264 significa que existe um grupo amino livre que pode ser reagido com o sínton GalNAc 9 na extremidade 3' da fita A0264. 3'5'1xNH2 significa que existe um grupo amino livre derivado de serinol que pode ser reagido com o ligante GalNAc 9 na extremidade 3‘ e na extremidade 5' da fita.
Tabela 11: Oligonucleotídeos de fita simples com modificações 5' e 3' ProdutoNome 5'mod 3'mod MW MW (ESI-) % de FLP calc. encontrado (AEX-HPLC) A0561 STS16001BV C6Am GlyC3 7267,5 7267,5 Da 66,7% 1-3'5'1xNH2 Am Da A0563 STS16001BV C3Am C3Am 7183,4 7183,1 Da 75,1% 1-3'5'1xNH2 Da A0651 STS16001BV C6Am C7Am 7265,6 7265,2 Da 99,6%
1-3'5'1xNH2 Da A0653 STS16001BV GlyC3 GlyC3 7299,5 7299,3 Da 88,1% 1-3'5'1xNH2 Am Am Da A0655 STS16001BV PipAm PipAm 7517,7 7517,5 Da 89,8% 1-3'5'1xNH2 Da
[00517] Da mesma forma, 3'5'1 x NH2 refere-se à posição (extremidade 3' e 5') e número (1 x NH2 cada) de grupos amino livres que estão disponíveis para conjugação. Por exemplo, 3'5'1xNH2 em A0561 significa que há 2 grupos amino livres (1 na extremidade 3' E 1 na extremidade 5') que podem reagir com o sínton GalNAc 9 na extremidade 3' da fita A0561. Síntese de certos conjugados da invenção e conjugados de referência 1-2
[00518] A conjugação do sínton GalNac (9) foi conseguida por acoplamento à função serinol-amino da respectiva fita oligonucleotídica 11 , usando um reagente de acoplamento peptídico. Portanto, a respectiva molécula precursora modificada por amino 11 foi dissolvida em H2O (500 OD/mL) e DMSO (DMSO/H2O, 2/1, v/v) foi adicionado, seguido por DIPEA (2,5% do volume total). Em um vaso reacional separado, a pré-ativação do ácido GalN(Ac4)-C4 (9) foi realizada por reação de 2 eq. (por função amino no oligonucleotídeo 11precursor modificado por amino) do componente ácido carboxílico com 2 eq. de HBTU na presença de 8 eq. DIPEA no DMSO. Após 2 min, o composto 9 pré-ativado é adicionado à solução da respectiva molécula precursora modificada por amino. Após 30 min, o progresso da reação foi monitorado por LCMS ou AEX-HPLC. Após a conclusão da reação de conjugação, o produto bruto foi precipitado pela adição de 10x iPrOH e 0,1x 2M NaCl e coletado por centrifugação e decantação. Para libertar os grupos hidroxila acetilados nas frações GalNAc, o grânulo resultante foi dissolvido em MeNH2 a 40% (1 mL por 500 OD) e após 15 min a RT, diluído em H2O (1:10) e finalmente purificado novamente por troca aniônica e cromatografia de exclusão por tamanho e liofilizada para produzir o produto final 12 (Tabela 12).
Tabela 12: Oligonucleotídeos conjugados a GalNAc de fita simples Produto Matéria- Nome MW MW (ESI-) % de (12) Prima calc. encontrado FLP (AEX- HPLC) A0241 A0220 STS16001BL20 7285,5 Da 7285,3 Da 91,8% A0268 A0264 STS16001AV4L33 7415,7 Da 7415,4 Da 96,9% A0330 A0329 STS16001BV6L42 7789,8 Da 7789,8 Da 95,5% A0544 A0541 STS16001BV1L75 7757,9 Da 7757,7 Da 93,3% A0550 A0547 STS16001BV16L42 7725,9 Da 7725,7 Da 88,5% A0620 A0617 STS16001BV20L75 7693,91 7693,2 Da 90,9% Da A0622 A0619 STS16001BV1L94 8734,3 Da 8734,6 Da 82,9% A0519 A0516 STS22006BV11L42 7271,7 Da 7271,7 Da 90,0% A0520 A0517 STS22009BV11L42 7199,6 Da 7199,7 Da 92,9% A0522 A0521 STS12009BV1L42 7044,4 Da 7044,4 Da 96,0% A0603 A0602 STS20041BV1L42 7280,7 Da 7280,4 Da 93,4% Síntese de certos conjugados da invenção
[00519] A conjugação do sínton GalNac (9) foi conseguida por acoplamento à função serinol-amino da respectiva fita oligonucleotídica 14 , usando um reagente de acoplamento peptídico. Portanto, a respectiva molécula precursora modificada por amino 14 foi dissolvida em H2O (500 OD/mL) e DMSO (DMSO/H2O, 2/1, v/v) foi adicionado, seguido por DIPEA (2,5% do volume total). Em um vaso reacional separado, a pré-ativação do ácido GalN(Ac4)-C4 (9) foi realizada por reação de 2 eq. (por função amino no oligonucleotídeo 14precursor modificado por amino) do componente ácido carboxílico com 2 eq. de HBTU na presença de 8 eq. DIPEA no DMSO. Após 2 min, o composto 9 pré-ativado é adicionado à solução da respectiva molécula precursora modificada por amino. Após 30 min, o progresso da reação foi monitorado por LCMS ou AEX-HPLC. Após a conclusão da reação de conjugação, o produto bruto foi precipitado pela adição de 10x iPrOH e 0,1x 2M NaCl e coletado por centrifugação e decantação. Para libertar os grupos hidroxila acetilados nas frações GalNAc, o grânulo resultante foi dissolvido em MeNH2 a 40% (1 mL por 500 OD) e após 15 min a RT, diluído em H2O (1:10) e finalmente purificado novamente por troca aniônica e cromatografia de exclusão por tamanho e liofilizada para produzir o produto final 15 (Tabela 13). Tabela 13: Oligonucleotídeos conjugados a GalNAc de fita simples Produto Matéria- Nome MW MW (ESI-) % de (15) Prima calc. encontrado FLP (AEX- HPLC) A0562 A0561 STS16001BV1L87 7874,2 Da 7874,0 Da 82,7% A0564 A0563 STS16001BV1L88 7790,0 Da 7789,4 Da 90,4% A0652 A0651 STS16001BV1L96 7872,2 Da 7871,8 Da 94,6% A0654 A0653 STS16001BV1L97 7906,2 Da 7905,6 Da 89,9% A0656 A0655 STS16001BV1L98 8124,3 Da 8124,0 Da 93,6% Formação de fita dupla
[00520] A formação de fita dupla foi realizada de acordo com os métodos descritos acima.
[00521] A pureza da fita dupla é dada em % de fita dupla, que é a porcentagem da área UV sob o sinal do produto atribuído no traço UV da análise IP-RP-HPLC (Tabela 14). Tabela 14: Conjugados de ácido nucleico Produto Matérias-Primas Nome % de fita dupla Primeira Fita Segunda Fita Conj. Ref. 1 A0237 A0241 STS16001L20 97,7% Conj. Ref. 2 A0268 A0244 STS16001L33 97,8%
Conj. Ref. 3 A0130 A0131 STS18001L4 96,8% Conj. Ref. 4 A0002 A0006 STS16001L4 90,1% Conj. Ref. 5 A0216 A0217 STS17001L6 88,4% Conjugado 1 A0268 A0241 STS16001L24 96,0% Conjugado 2 A0237 A0330 STS16001V1L42 98,5% Conjugado 3 A0268 A0330 STS16001V1L43 98,2% Conjugado 4 A0560 A0544 STS16001V1L75 92,5% Conjugado 5 A0560 A0550 STS16001V16L42 95,3% Conjugado 6 A0237 A0620 STS16001V20L75 97,8% Conjugado 7 A0237 A0622 STS16001V1L94 93,7% Conjugado 8 A0680 A0652 STS16001V1L96 98,4% Conjugado 9 A0680 A0654 STS16001V1L97 95,8% Conjugado 10 A0680 A0656 STS16001V1L98 97,6% Conjugado 11 A0560 A0564 STS16001V1L88 95,0% Conjugado 12 A0237 A0562 STS16001V1L87 96,8% Conjugado 13 A0114 A0115 STS22006L1 85,6% Conjugado 14 A0122 A0123 STS22009L1 96,4% Conjugado 15 A0514 A0519 STS22006V11L42 98,6% Conjugado 16 A0319 A0520 STS22009V11L42 97,0% Conjugado 17 A0304 A0303 STS12209L4 93,0% Conjugado 18 A0353 A0522 STS12009V1L42 98,0% Conjugado 19 A0601 A0603 STS20041BL42 97,6% Sequências
[00522] Chave de modificações para as seguintes sequências: f denota desoxirribonucleotídeo 2´ de fluoro 2´ ou ribonucleotídeo de fluoro 2´ (os termos são intercambiáveis) m denota ribonucleotídeo O Metil 2´ (ps) denota ligação fosforotioato FAM = 6-Carboxifluoresceína BHQ = Black Hole Quencher 1
AA = Yakima Yellow Definições
[00523] Ser(GN) é um bloco de construção GalNAc-C4 anexado à fração ligante derivada de serinol: em que O- é a ligação entre o átomo de oxigênio e, por exemplo, ligação H, ligação fosfodiéster ou ligação fosforotioato. GN é: C4XLT (também conhecido como ST41) é: ST23 é:
[00524] A síntese dos derivados de fosforamidita de C4XLT (C4XLT- phos), bem como ST23 (ST23-phos) pode ser realizada como descrito em WO2017/174657. C4XLT-phos: ST23-phos:
C3Am é: ltrb é: GlyC3Am é: C6Am é: Pip Am é: C7Am é: em que G = H (pré-conjugação) ou G = GN (pós-conjugação). Conjugado 1
[00525] Fita antisense - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
[00526] 5´ mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3´
[00527] Fita sense – STS16001BL20 (SEQ ID NO: 128)
[00528] 5´ Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA 3´ Conjugado 2
[00529] Fita antisense - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
[00530] mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
[00531] Fita sense - STS16001BV1L42 (SEQ ID NO: 130)
[00532] Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) Conjugado 3
[00533] Fita antisense - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
[00534] 5´ mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3´
[00535] Fita sense - STS16001BV1L42 (SEQ ID NO: 130)
[00536] 5´ Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) 3´ Conjugado 4
[00537] Fita antisense - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
[00538] mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
[00539] Fita sense - STS16001BV1L75 (SEQ ID NO: 142)
[00540] 5´ Ser(GN) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU fG mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA Ser(GN)3‘ Conjugado 5 Fita antisense - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
[00541] mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
[00542] Fita sense - STS16001BV16L42 (SEQ ID NO: 143)
[00543] 5´ Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mA fA (ps) Ser(GN) 3´ Conjugado 6
[00544] Fita antisense - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
[00545] mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
[00546] Fita sense - STS16001BV20L75 (SEQ ID NO: 144)
[00547] 5´ Ser(GN) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mA fA Ser(GN) 3´ Conjugado 7 Fita antisense - (SEQ ID NO: 129)
[00548] mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
[00549] Fita sense - STS16001BV1L94 (SEQ ID NO: 145)
[00550] 5´ Ser(GN) (ps) Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) (ps) Ser(GN) 3´ Conjugado 8
[00551] Fita antisense - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
[00552] 5‗ mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3‗
[00553] Fita sense - STS16001V1BL96 (SEQ ID NO: 146)
[00554] 5‗ C6Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) C7Am(GN) 3´ Conjugado 9
[00555] Fita antisense - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
[00556] 5‗ mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3‗
[00557] Fita sense - STS16001V1BL97 (SEQ ID NO: 147)
[00558] 5´ GlyC3Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) GlyC3Am(GN) 3´ Conjugado 10
[00559] Fita antisense - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
[00560] 5´ mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3‗
[00561] Fita sense (SEQ ID NO: 148)
[00562] 5´ PipAm(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) PipAm(GN) 3´ Conjugado 11
[00563] Fita antisense - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
[00564] 5´ mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3‗
[00565] Fita sense - STS16001V1BL88 (SEQ ID NO: 149)
[00566] 5´ C3Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) C3Am(GN) 3´ Conjugado 12
[00567] Fita antisense - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
[00568] 5´ mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3‗
[00569] Fita sense - STS16001V1BL87 (SEQ ID NO: 150)
[00570] 5´ C6Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) GlyC3Am(GN) 3´ Conjugado 15
[00571] Fita antisense (SEQ ID NO: 151)
[00572] mU (ps) fC (ps) mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU (ps) fU (ps) mC
[00573] Fita sense (SEQ ID NO: 152)
[00574] Ser(GN) (ps) fG (ps) mA (ps) fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA (ps) mG (ps) fA (ps) Ser(GN) Conjugado 16
[00575] Fita antisense (SEQ ID NO: 153)
[00576] mA (ps) fU (ps) mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU (ps) fC (ps) mU
[00577] Fita sense (SEQ ID NO: 154)
[00578] Ser(GN) (ps) fA (ps) mG (ps) fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC (ps) mA (ps) fU (ps) Ser(GN) Conjugado 18
[00579] Fita antisense (SEQ ID NO: 155)
[00580] mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA
[00581] Fita sense (SEQ ID NO: 156) Ser(GN) (ps) fU (ps) mC (ps) fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU (ps) Ser(GN)
Conjugado 19
[00582] Fita antisense (SEQ ID NO: 135)
[00583] mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG
[00584] Fita sense (SEQ ID NO: 136)
[00585] Ser(GN) (ps) fC (ps) mG (ps) fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU (ps) mA (ps) fU (ps) Ser(GN) Conjugado de referência 1
[00586] Fita antisense - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
[00587] mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
[00588] Fita sense – STS16001BL20 (SEQ ID NO: 128)
[00589] Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA Conjugado de referência 2
[00590] Fita antisense - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
[00591] mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN)
[00592] Fita sense - STS16001BV1 (SEQ ID NO: 157)
[00593] fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA Conjugado de Referência 3 – ―Luc‖
[00594] Fita antisense - STS18001A (A0130, SEQ ID NO: 132)
[00595] mU (ps) fC (ps) mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA (ps) fC (ps) mG
[00596] Fita sense - STS18001BL4 (A0131, SEQ ID NO: 133)
[00597] [(ST23) (ps)]3 C4XLT (ps) fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC (ps) mG (ps) fA Conjugado de Referência 4
[00598] Fita antisense - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
[00599] mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
[00600] Fita sense - STS16001BL4 (SEQ ID NO: 134)
[00601] 5´[(ST23) (ps)]3 C4XLT(ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA Conjugado de Referência 5 – ―Ctr‖
[00602] Fita antisense (SEQ ID NO: 138)
[00603] mC (ps) fU (ps) mU fA mC fU mC fU mC fG mC fC mC fA mA fG mC (ps) fG (ps) mA
[00604] Fita sense (SEQ ID NO: 139)
[00605] [(ST23) (ps)]3 (C6XLT) (ps) fU mC fG mC fU mU fG mG fG mC fG mA fG mA fG mU fA (ps) mA (ps) fG Conjugado de Referência 6
[00606] Fita antisense (SEQ ID NO: 151)
[00607] mU (ps) fC (ps) mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU (ps) fU (ps) mC
[00608] Fita sense (SEQ ID NO: 158)
[00609] [ST23 (ps)]3 ltrb (ps) fG mA fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA (ps) mG (ps) fA Conjugado de Referência 7
[00610] Fita antisense (SEQ ID NO: 153)
[00611] mA (ps) fU (ps) mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU (ps) fC (ps) mU
[00612] Fita sense (SEQ ID NO: 159)
[00613] [ST23 (ps)]3 ltrb (ps) fA mG fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC (ps) mA (ps) fU Conjugado de Referência 8 Fita antisense (SEQ ID NO: 160)
[00614] mU (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA
[00615] Fita sense (SEQ ID NO: 161)
[00616] [ST23 (ps)]3 ST41 (ps)fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fA Conjugado de Referência 9 Fita antisense (SEQ ID NO: 135)
[00617] mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG
[00618] Fita sense (SEQ ID NO: 162)
[00619] [ST23 (ps)]3 C6XLT (ps) fC mG fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU (ps) mA (ps) fU Exemplo 12 – Determinação in vitro de knockdown de TTR de vários conjugados de TTR siRNA GalNAc Conjugados 1 a 3
[00620] Hepatócitos primários murinos foram semeados em placas de 96 poços pré-revestidas com colágeno (Thermo Fisher Scientific, # A1142803) a uma densidade celular de 30.000 células por poço e tratados com conjugados de siRNA em concentrações variando de 10nM a 0,0001nM. As células após 24 horas de tratamento foram lisadas e o RNA extraído com InviTrap® RNA Cell HTS 96 Kit/C24 x 96 preps (Stratec #7061300400) de acordo com o protocolo do fabricante. Os níveis de transcrição de TTR e de mRNA de manutenção (PtenII) foram quantificados por análise TaqMan.
[00621] A expressão do gene alvo em hepatócitos murinos primários 24h após o tratamento a 0,01 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1nM e 10nM com os conjugados da invenção, Conjugados 1-3, mostrou que a expressão do gene alvo diminui à medida que a dose do conjugado aumentou em comparação com os controles negativos (consulte a coluna ―UT‖ e o Conjugado de Referência 3), conforme mostrado na Figura 15. Isso indica que a primeira fita está se ligando ao gene alvo, diminuindo assim a expressão gênica. A Figura 15 também mostra os níveis de expressão do gene alvo dos Conjugados de Referência 1 e 2 que atuam como conjugados comparadores. Como pode ser visto por meio de uma comparação entre os dados apresentados nas Figuras 15A e 15C e 15B e 15C, os conjugados da invenção (Conjugados 1-3) diminuem a expressão do gene alvo em comparação com os Conjugados de Referência 1 e 2. O conjugado mais eficaz a 0,01 nM parece ser o Conjugado
2. O conjugado mais eficaz a 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM e 10 nM parece ser o Conjugado 3. Conjugados 4 a 7
[00622] O método descrito acima em "Experiências in vitro" na seção Método Geral foi seguido.
[00623] A expressão do gene alvo em hepatócitos murinos primários 24h após o tratamento a 0,01 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1nM e 10nM com os conjugados da invenção, Conjugados 4-7, mostrou que a expressão do gene alvo diminui à medida que a dose do conjugado aumentou em comparação com os controles negativos (consulte a coluna ―UT‖ e o Luc[Conjugado de Referência 3]), conforme mostrado na Figura 31. Isso indica que a primeira fita está se ligando ao gene alvo, diminuindo assim a expressão gênica.
[00624] Os dados in vitro mostram que, no contexto de uma ou duas frações de ligação derivadas de serinol sendo fornecidas nas extremidades 5 'e 3' da fita sense nos Conjugados 4-7, o número de ligações fosforotioato (PS) entre o nucleotídeo terminal e o ligante e/ou entre os três nucleotídeos terminais na fita sense pode variar enquanto a se mantém a eficácia para diminuir a expressão do gene alvo. Conjugados 8 a 12 e 19
[00625] O método descrito acima em "Experiências in vitro" na seção Método Geral foi seguido.
[00626] A expressão do gene alvo em hepatócitos murinos primários 24h após o tratamento a 0,01 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1nM e 10nM com os conjugados da invenção, Conjugados 8-12, mostrou que a expressão do gene alvo diminui à medida que a dose do conjugado aumentou em comparação com os controles negativos (consulte a coluna ―UT‖ e o Luc[Conjugado de
Referência 3]), conforme mostrado na Figura 32. Isso indica que a primeira fita está se ligando ao gene alvo, diminuindo assim a expressão gênica. Em particular, os Conjugados 8, 9, 10 e 11 parecem ser comparáveis a ou melhores do que o Conjugado 2, que anteriormente demonstrou ser o conjugado mais eficaz a 0,01 nM.
[00627] Também foi mostrado que o conjugado 19 diminui a expressão do gene alvo em comparação com os controles negativos (consulte a coluna ―UT‖ e Ctr, que é um siRNA não direcionado e que também é referido como Conjugado de Referência 5), como mostrado na Figura 33. Isso indica que a primeira fita está se ligando ao gene alvo, diminuindo assim a expressão gênica.
[00628] Os dados in vitro para os Conjugados 8-12 e 19 mostram que um vários ligantes que são estruturalmente diversos e que são conjugados em ambos os terminais da fita sense são eficazes na redução da expressão do gene alvo. Os Conjugados 8-12 e 19 diminuem a expressão do gene alvo com mais eficácia do que "Luc", que é o Conjugado de Referência 3 (para os Conjugados 8-12), "Ctr", que é o Conjugado de Referência 5 (para o Conjugado 19) e o controle não tratado. Exemplo 13 – Curso de tempo in vivo de Ttr sérica, Aldh2 e Tmprss6 em camundongos Conjugados 1 a 3
[00629] Os camundongos C57BL/6 foram tratados s.c. com 1 mg/kg de conjugados siRNA no dia 0. Amostras de soro foram coletadas nos dias 7, 14 e 27 por sangramento do seio orbital e armazenadas a -20 °C até a análise. A quantificação de TTR sérica foi realizada com um Mouse Prealbumin ELISA (ALPCO, 41-PALMS/lote 22, 2008003B) de acordo com o protocolo do fabricante (diluição da amostra 1:8000 ou 1:800).
[00630] Os resultados do decurso de tempo da TTR sérica em coortes de camundongos c57BL/6 de n=4 em 7, 14 e 27 dias após o tratamento s.c. com 1mg/kg de Conjugados 1-3, Conjugados de Referência 1, 2 e 4, e indivíduos tratados de forma simulada (PBS) são mostrados na Figura 16. Como indicado pelos dados na Figura 16, os conjugados da invenção são particularmente eficazes na redução da expressão do gene alvo em comparação com o controle negativo (PBS) e os Conjugados de Referência 1, 2 e, em particular, o Conjugado de Referência 4. Os Conjugados 2 e 3 também são mais eficazes do que os Conjugados de Referência 1, 2 e 4. O conjugado mais eficaz é o Conjugado 2. Assim, pode-se esperar que o nível de dosagem do Conjugado 2 seja cerca de três vezes menor para alcançar o mesmo knockdown inicial e também resultaria em maior duração do knockdown em comparação com o Conjugado de Referência 4.
[00631] Mais especificamente, o Conjugado 2 resultou em um nível de proteína alvo 3 vezes mais baixo no soro no dia sete e um nível de proteína alvo 4 vezes mais baixo no soro no dia 27 em comparação com o Conjugado de Referência 4 em dose equimolar em camundongos do tipo selvagem. Além disso, o Conjugado 2 resultou em redução de 85% do nível de proteína sérica alvo no dia 27 após a injeção única, em comparação com uma redução de 36% na quantidade equimolar do Conjugado de Referência 4. Conjugados 15 a 18
[00632] O método descrito acima em "experiências in vivo" na seção Método Geral foi seguido.
[00633] Os resultados do decurso de tempo de Aldh2 sérico em coortes de camundongos c57BL/6 de n=6 em 14, 28 e 42 dias após tratamento s.c. com 1mg/kg de Conjugados 15 e 16, Conjugados de Referência 6 e 7, e indivíduos tratados de forma simulada (PBS) indivíduos são mostrados nas Figuras 34 e 35. Como indicado pelos dados nas Figuras 34 e 35, os conjugados da invenção são particularmente eficazes na redução da expressão do gene alvo em comparação com o controle negativo (PBS) e os Conjugados de Referência 6 e 7, respectivamente.
[00634] Os resultados do decurso de tempo de Tmprss6 sérico em coortes de camundongos c57BL/6 de n = 6 em 14, 28 e 42 dias após o tratamento s.c. com 1mg/kg de Conjugado 18, Conjugado de Referência 8, e indivíduos tratados de forma simulada (PBS) são mostrados na Figura 36. Como indicado pelos dados na Figura 36, os conjugados da invenção são particularmente eficazes na redução da expressão do gene alvo em comparação com o controle negativo (PBS) e o Conjugado de Referência 8.
[00635] No geral, os dados in vivo mostram que uma variedade de exemplos de ligantes que são conjugados nos dois terminais da segunda fita são eficazes na diminuição da expressão do gene alvo in vivo. O posicionamento do ligante melhora os conjugados de potência in vivo em comparação com um controle de ligante GalNAc triantenário no terminal 5'da segunda fita (Conjugados de Referência 6, 7 e 8). Exemplo 14 – Estudos de Estabilidade Sérica
[00636] O método descrito acima em "Ensaio de estabilidade do tritossoma" na seção Método Geral foi seguido.
[00637] A Figura 37 mostra os resultados dos estudos de estabilidade sérica em relação aos Conjugados 2, 4, 5, 6 e 7. A Figura 38 mostra a estabilidade sérica dos Conjugados 2, 8, 9, 10, 11 e 12.
[00638] Todos os conjugados da invenção que foram testados são mais estáveis no soro em comparação com o controle.
[00639] Todos os conjugados testados contêm, cada um, uma unidade de ligante GalNAc na extremidade 5' e outra na extremidade 3' da segunda fita. Os siRNAs são modificados com 2'-OMe/2'-F alternante e contêm, cada um, duas ligações internucleotídicas de fosforotioato (PS) em suas duas ligações internucleotídicas terminais 5'e 3', a menos que indicado de forma diferente.
[00640] No Conjugado 4, as unidades de GalNAc serinol são ligadas através de uma ligação fosfodiéster. No Conjugado 5, as unidades de serinol- GalNAc são conjugadas via PS, enquanto que todas as ligações internucleotídicas na segunda fita são fosfodiésteres. No Conjugado 6, a segunda fita não contém PS. No Conjugado 7, duas unidades de serinol-
GalNAc estão ligadas a cada terminal da segunda fita e uma à outra através de uma ligação PS nas respectivas extremidades. No Conjugado 8, um modificador de amino-C6 na 5' e um modificador de amino-C7 na extremidade 3' da segunda fita foram aplicados para ligação do ligante. Modificadores de Gly-C3-amino no Conjugado 9, modificadores de piperidil-amino no Conjugado 10, modificadores de C3-amino no Conjugado 11 e unidades de serinol-GalNAc no Conjugado 2 foram usados como ligantes para conjugação a ambas as extremidades da segunda fita. No Conjugado 2, tanto os internucleotídeos terminais quanto as ligações de nucleotídeo-serinol são PS. No Conjugado 12, um modificador de amino-C6 na extremidade 5' e um modificador de amino- GlyC3 na extremidade 3' da segunda fita foram aplicados para ligação do ligante. "ut" indica uma amostra não tratada para a qual as outras amostras foram normalizadas. "Luc" indica um siRNA direcionado à Luciferase (Conjugado de Referência 3), que foi usado como controle não direcionado e não reduz os níveis de mRNA alvo.
[00641] Os dados mostram que, no contexto de uma fração ligante derivada de serinol sendo fornecida nas extremidades 5' e 3' da fita sense, o número de ligações fosforotioato (PS) entre o nucleotídeo terminal e o ligante e/ou entre os três nucleotídeos terminais na fita sense pode variar ao mesmo tempo em que mantém a estabilidade sérica. Exemplo 15
[00642] Knockdown de LPA-mRNA em hepatócitos primários humanos pelos diferentes siRNAs conjugados com L6-GalNAc indicados em hepatócitos humanos primários após distribuição mediada por receptor. Tabela 15: Sequências de ácidos nucleicos conjugados testadas quanto à inibição da expressão de mRNA de LPA. Sequências e padrão de modificação aplicado são indicados
SEQ ID do ID fita Sequência Modificações siRNA NO: primeira 5‘uuaacucugucc 5162717181736152738 63 LPA- fita auuaccg 3‗ 1301 segunda 5‘cgguaauggac 3845261846364645162 64 fita agaguuaa 3‗ primeira 5‘uuaacucugucc 5162717181736152737 65 LPA- fita auuaccc 3‗ 1302 segunda 5‘ggguaauggac 4845261846364645162 66 fita agaguuaa 3‗ primeira 5‘uuaacucugucc 5162717181736152735 67 LPA- fita auuaccu 3‗ 1303 segunda 5‘agguaauggac 2845261846364645162 68 fita agaguuaa 3‗ primeira 5‘auaacucugucc 6162717181736152737 69 LPA- fita auuaccc 3‗ 1304 segunda 5‘ggguaauggac 4845261846364645161 70 fita agaguuau 3‗ primeira 5‘auaacucugucc 6162717181736152735 71 LPA- fita auuaccu 3‗ 1305 segunda 5‘agguaauggac 2845261846364645161 72 fita agaguuau 3‗ primeira 5‘uuaacucugucc 5162717181736152736 73 LPA- fita auuacca 3‗ 1306 segunda 5‘ugguaauggac 1845261846364645162 74 fita agaguuaa 3‗ Tabela 15
[00643] Tabela 15: As modificações dos nucleotídeos são representadas pelos seguintes números (coluna 4), 1=2´F-dU, 2=2‘F-dA, 3=2´F-dC, 4=2´F-dG, 5=2'-OMe-rU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG.
[00644] Os hepatócitos humanos primários (ThermoFisher) foram plaqueados em placas de 96 poços revestidas com colágeno a 30.000 células por poço (formato de 96 poços). Os siRNAs conjugados com GalNAc-L6 foram adicionados imediatamente após o revestimento celular nas concentrações indicadas. 24 horas após o tratamento com siRNAs, o RNA total foi isolado usando o kit InviTrap RNA cell HTS 96 wells (Stratec). Os níveis de expressão de mRNA de LPA foram determinados por qRT-PCR em relação ao mRNA de APOB como transcrição de manutenção. Os valores foram normalizados para a expressão de mRNA de LPA em células não tratadas. As médias e o DP dos valores triplicados normalizados são mostrados na Figura 39. Os valores de IC50 e a inibição máxima foram estimados usando ajuste de curva de regressão não linear de quatro parâmetros.
Declarações da Invenção
1. Um ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula, compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a referida primeira fita compreende uma sequência nucleotídica selecionada das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 9, 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73 ou qualquer sequência divulgada neste documento.
2. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 1, em que a segunda fita compreende uma sequência nucleotídica das SEQ ID NO: 10, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74 ou qualquer sequência divulgada neste documento.
3. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 1 ou a declaração 2, em que a referida primeira fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO:9 ou da SEQ ID NO:5.
4. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 3, em que a referida segunda fita compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 10 ou da SEQ ID NO: 6.
5. Um ácido nucleico , de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 4, em que a referida primeira fita e/ou a referida segunda fita são de 17 a 35 nucleotídeos de comprimento.
6. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 5, em que pelo menos uma região dúplex consiste em de 19 a 25 pares de bases nucleotídicas consecutivos.
7. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer declaração anterior, que a) possui extremidade cega nas duas extremidades; ou b) possui um overhang em uma extremidade e a uma extremidade cega na outra; ou c) possui um overhang nas duas extremidades.
8. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer declaração anterior, em que um ou mais nucleotídeos na primeira e/ou na segunda fita são modificados para formar nucleotídeos modificados.
9. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 8, em que um ou mais dos nucleotídeos ímpares da primeira fita são modificados.
10. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 9, em que um ou mais dos nucleotídeos pares da primeira fita são modificados por pelo menos uma segunda modificação, em que a pelo menos segunda modificação é diferente da modificação da declaração 9.
11. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 10, em que pelo menos um ou mais nucleotídeos pares modificados é adjacente a pelo menos um ou mais nucleotídeos ímpares modificados.
12. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 9 a 11, em que uma pluralidade de nucleotídeos ímpares é modificada.
13.Um ácido nucleico , de acordo com as declarações 10 a 12, em que uma pluralidade de nucleotídeos pares é modificada por uma segunda modificação.
14. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 8 a 13, em que a primeira fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum.
15. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 9 a 14, em que a primeira fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação que é diferente da modificação da declaração 9.
16. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 9 a 15, em que um ou mais dos nucleotídeos ímpares da segunda fita são modificados por uma modificação diferente da modificação da declaração 9.
17. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 9 a 15, em que um ou mais dos nucleotídeos pares da segunda fita são modificados pela modificação da declaração 9.
18. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 16 ou 17, em que pelo menos um ou mais nucleotídeos pares modificados da segunda fita é adjacente a um ou mais nucleotídeos ímpares modificados da segunda fita.
19. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 16 a 18, em que uma pluralidade de nucleotídeos ímpares da segunda fita é modificada por uma modificação comum.
20. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 16 a 19, em que uma pluralidade de nucleotídeos pares é modificada por uma modificação de acordo com a declaração 9.
21. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 16 a 20, em que uma pluralidade de nucleotídeos ímpares na segunda fita é modificada por uma segunda modificação, em que a segunda modificação é diferente da modificação da declaração 9.
22. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 16 a 21, em que a segunda fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum.
23. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 16 a 22, em que a segunda fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação que é diferente da modificação da declaração 9.
24. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 8 a 23, em que cada um dos nucleotídeos ímpares na primeira fita e cada um dos nucleotídeos pares na segunda fita são modificados com uma modificação comum.
25. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 24, em que cada um dos nucleotídeos pares é modificado na primeira fita com uma segunda modificação e cada um dos nucleotídeos ímpares é modificado na segunda fita com uma segunda modificação.
26. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 8 a 25, em que os nucleotídeos modificados da primeira fita são deslocados por pelo menos um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos não modificados ou modificados de forma diferente da segunda fita.
27. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 8 a 26, em que a modificação e/ou modificações são, cada uma, individualmente selecionadas do grupo que consiste em desoxitimina 3'- terminal, 2'-O-metil, uma modificação 2'-desoxi, um modificação 2'-amino, uma modificação 2'-alquil, uma modificação morfolino, uma modificação fosforamidato, modificação do grupo 5'-fosforotioato, uma modificação 5' fosfato ou mímico de 5' fosfato e um derivado de colesteril ou uma modificação do grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico.
28. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 8 a 27, em que a modificação é qualquer um dentre um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natural compreendendo nucleotídeo.
29. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 8 a 28, em que pelo menos uma modificação é 2'-O-metil.
30. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 8 a 29, em que pelo menos uma modificação é 2'-F.
31. Um ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula, compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 9, 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73, em que os nucleotídeos da primeira fita são modificados por uma primeira modificação nos nucleotídeos de números ímpares e modificados por uma segunda modificação nos nucleotídeos de números pares e os nucleotídeos da segunda fita são modificados por uma terceira modificação nos nucleotídeos de números pares e modificados por uma quarta modificação nos nucleotídeos de números ímpares, em que pelo menos a primeira modificação é diferente da segunda modificação e a terceira modificação é diferente da quarta modificação.
32. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 31, em que a segunda sequência compreende uma sequência nucleotídica das SEQ ID NO: 10, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74.
33. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 31 ou 32, em que a quarta modificação e a segunda modificação são as mesmas.
34. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 31 a 33, em que a primeira modificação e a terceira modificação são as mesmas.
35. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 31 a 34, em que a primeira modificação é 2'O-Me e a segunda modificação é 2'F.
36. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 31 a 35, em que a primeira fita compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO:5 e a segunda fita compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:6.
37. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 31 a 36, compreendendo uma sequência e modificações conforme mostrado abaixo: SEQ ID NO: 5 5‘ auaacucuguccauuacca 3‘ 6162717181736152736 SEQ ID NO: 6 5‘ ugguaauggacagaguuau 3‘ 1845261846364645161 SEQ ID NO: 9 5‘ auaacucuguccauuaccg 3‘ 6162717181736152738 SEQ ID NO: 10 5‘ cgguaauggacagaguuau 3‘ 3845261846364645161 em que, as modificações específicas são representadas por números 1=2´F-dU, 2=2‗F-dA, 3=2´F-dC, 4=2´F-dG, 5=2'-OMe-rU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG.
38. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 37, conjugado a um ligante.
39. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 38, compreendendo uma ligação fosforotioato entre um, dois ou três nucleotídeos 3' e/ou nucleotídeos 5' terminais da primeira e/ou da segunda fita.
40. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 39, compreendendo duas ligações fosforotioato entre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e entre cada um dos três nucleotídeos 5' terminais na primeira fita e duas ligações fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais da extremidade 3' da segunda fita.
41. Um ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula, compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a referida primeira fita compreende uma sequência nucleotídica selecionada das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 9, 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73 e em que o ácido nucleico é conjugando a um ligante.
42. Um ácido nucleico, de acordo com a declaração 41, em que o ligante compreende (i) uma ou mais frações de N-acetil galactosamina (GalNac) e seus derivados e (ii) um ligante, em que o ligante conjuga as frações de GalNac a um ácido nucleico conforme definido na declaração 41.
43. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 41 ou 42, em que o ligante pode ser uma estrutura ramificada bivalente ou trivalente ou tetravalente.
44. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 41 a 43, em que os nucleotídeos são modificados conforme definido em qualquer uma das declarações anteriores.
45. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer declaração anterior,
que é conjugado a um ligante compreendendo a fórmula I: [S-X1-P-X2]3-A-X3- (I) em que: S representa um sacarídeo, em que o sacarídeo é N-acetil galactosamina; X1 representa C3-C6 alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato); X2 é alquileno ou um éter de alquileno da fórmula (-CH2)n-O-CH2-, onde n = 1- 6; A é uma unidade de ramificação; X3 representa uma unidade de formação de ponte; em que um ácido nucleico, conforme definido em quaisquer das declarações 1 a 40, é conjugado a X3 através de um fosfato ou fosfato modificado (preferencialmente um tiofosfato).
46. Um ácido nucleico conjugado tendo uma das seguintes estruturas
OH OH OH HO ACHN OH O OH O O ACHN O O O O O O S P O OH O O OH S P O ACHN O OH O O O O O O S O Z O P O O O S O P O
O em que Z é um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 40.
47. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 40, que é conjugado a um ligante da seguinte estrutura
OH HO O H H HO O N N O NHAC Θ OH O P O O O OH O N HO H O H H N HO O N N O NHAC O O O O O NHAC HO O N N O H H HO OH
48. Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, de acordo com qualquer declaração anterior, em que o duplex compreende fitas separadas.
49. Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, de acordo com qualquer declaração anterior, em que o duplex compreende uma única fita compreendendo uma primeira fita e uma segunda fita.
50. Uma composição que compreende um ácido nucleico ou um ácido nucleico conjugado, de acordo com qualquer declaração anterior, e um excipiente fisiologicamente aceitável.
51. Um ácido nucleico ou um ácido nucleico conjugado, de acordo com qualquer declaração anterior, para uso na prevenção ou tratamento ou redução do risco de uma doença ou patologia.
52. Uso de um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, de acordo com qualquer declaração anterior, na fabricação de um medicamento para prevenir ou tratar uma doença, distúrbio ou síndrome.
53. Um método para prevenir ou tratar uma doença, distúrbio ou síndrome compreendendo a administração de uma composição compreendendo um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, de acordo com qualquer declaração anterior, a um indivíduo que precisa de tratamento.
54. O método da declaração 53, em que o ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado é administrado ao sujeito por via subcutânea, intravenosa ou usando quaisquer outras vias de aplicação, tais como oral, retal ou intraperitoneal.
55. Um uso ou método, de acordo com as declarações 52 a 54, em que a referida doença ou patologia é uma doença cardiovascular, um acidente vascular cerebral, aterosclerose, trombose ou doenças cardiovasculares, como doença arterial coronariana ou estenose aórtica e qualquer outra doença ou patologia associada a níveis elevados de partículas contendo Lp(a).
56. Um uso ou método, de acordo com a declaração 55, em que a doença cardiovascular é acidente vascular cerebral, aterosclerose, trombose, uma doença arterial coronariana ou estenose aórtica e qualquer outra doença ou patologia associada a níveis elevados de partículas contendo Lp(a).
57. Um processo para produzir um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 49.
58. Um ácido nucleico para inibir a expressão de LPA compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a expressão de LPA é reduzida a níveis que são pelo menos 15% inferiores aos níveis de expressão observados nas mesmas condições de teste, mas na ausência do ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado ou na presença de um controle não silenciador.
59. Um ácido nucleico para inibir a expressão de LPA compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre as seguintes sequências: SEQ ID NOs: 9, 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73, em que a expressão do LPA é reduzida a níveis pelo menos 15% inferiores aos níveis de expressão observados nas mesmas condições de teste, mas na ausência do ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado ou na presença de um controle não silenciador.
60. Um ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre as seguintes sequências: SEQ ID NO: 63, 65, 67 e 73, em que a a primeira fita de RNA possui um nucleotídeo de (E)-vinilfosfonato de terminal 5'.
[00645] Outras cláusulas da invenção incluem:
1. Um conjugado para inibir a expressão de um gene LPA em uma célula, o referido conjugado compreendendo uma porção de ácido nucleico e porções de ligante, a referida porção de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita de RNA e pelo menos uma porção de uma segunda fita de RNA que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do referido gene LPA, as referidas porções de ligantes compreendendo uma fração ligante derivada de serinol e um ligante de direcionamento para direcionamento in vivo de células e sendo conjugado exclusivamente às extremidades 3' e/ou 5' de uma ou ambas as fitas de RNA, em que a extremidade 5' da primeira fita de RNA não está conjugada, em que: (i) a segunda fita de RNA é conjugada na extremidade 5' ao ligante de direcionamento, e em que (a) a segunda fita de RNA também é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da primeira fita de RNA não é conjugada; ou (b) a primeira fita de RNA é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da segunda fita de RNA não é conjugada; ou (c) tanto a segunda fita de RNA quanto a primeira fita de RNA também são conjugadas nas extremidades 3' ao ligante de direcionamento; ou (ii) a segunda fita de RNA e a primeira fita de RNA são conjugadas nas extremidades 3' do ligante de direcionamento e a extremidade 5' da segunda fita de RNA não é conjugada, ou um conjugado para inibir a expressão de um gene LPA em uma célula, o referido conjugado compreendendo uma porção de ácido nucleico e porções de ligante, a referida porção de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita de RNA e pelo menos uma porção de uma segunda fita de RNA que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrita a partir do referido gene LPA, as referidas porções de ligantes compreendendo uma fração ligante e um ligante de direcionamento para direcionamento in vivo de células e sendo conjugado exclusivamente às extremidades 3' e/ou 5' de uma ou ambas as fitas de RNA, em que a extremidade 5' da primeira fita de RNA não está conjugada, em que: (i) a segunda fita de RNA é conjugada na extremidade 5' ao ligante de direcionamento, e em que (a) a segunda fita de RNA também é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da primeira fita de RNA não é conjugada; ou (b) a primeira fita de RNA é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da segunda fita de RNA não é conjugada; ou (c) tanto a segunda fita de RNA quanto a primeira fita de RNA também são conjugadas nas extremidades 3' ao ligante de direcionamento; ou (ii) a segunda fita de RNA e a primeira fita de RNA são conjugadas nas extremidades 3' do ligante de direcionamento e a extremidade 5' da segunda fita de RNA não é conjugada, opcionalmente em que a fração ligante é uma fração ligante derivada de serinol ou um dos outros tipos de ligantes descritos neste documento.
2. O conjugado, de acordo com a cláusula 1, em que a segunda fita de RNA é conjugada na extremidade 5' ao ligante de direcionamento, a segunda fita de RNA também é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da primeira fita de RNA não é conjugada.
3. O conjugado, de acordo com a cláusula 1, em que a segunda fita de RNA é conjugada na extremidade 5' ao ligante de direcionamento, a primeira fita de RNA é conjugada na extremidade 3' ao ligante de direcionamento e a extremidade 3' da segunda fita de RNA não é conjugada.
4. O conjugado, de acordo com a cláusula 1, em que a segunda fita de RNA é conjugada na extremidade 5' ao ligante de direcionamento e tanto a segunda fita de RNA quanto a primeira fita de RNA também são conjugadas nas extremidades 3' ao ligante de direcionamento.
5. O conjugado, de acordo com a cláusula 1, em que tanto a segunda fita de RNA quanto a primeira fita de RNA são conjugadas nas extremidades 3' ao ligante de direcionamento, e a extremidade 5' da segunda fita de RNA não é conjugada.
6. O conjugado, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 5, em que os ligantes são ligantes monoméricos.
7. O conjugado, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 6, em que os ligantes são selecionados a partir de frações de GalNAc e galactose, especialmente frações de GalNAc.
8. O conjugado, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 7, em que as fitas de RNA conjugadas são conjugadas a um ligante de direcionamento por meio de uma fração ligante derivada de serinol, incluindo um ligante adicional, em que o ligante adicional é ou compreende uma cadeia de C1-15- alquila saturada, não ramificada ou ramificada, em que opcionalmente um ou mais carbonos (por exemplo 1, 2 ou 3 carbonos, adequadamente 1 ou 2, em particular 1) é/são substituído(s) por um heteroátomo selecionado dentre O, N, S(O)p, em que p é 0, 1 ou 2 (por exemplo, um grupo CH2 é substituído por O, ou por NH, ou por S, ou por SO2 ou um grupo –CH3 no terminal da cadeia ou em uma ramificação é substituído por OH ou por NH2), em que a referida cadeia é opcionalmente substituída por um ou mais grupos oxo (por exemplo 1 a 3, como 1 grupo).
9. O conjugado, de acordo com a cláusula 8, em que o ligante adicional compreende uma cadeia de C1-15 alquila saturada e não ramificada, em que um ou mais carbonos (por exemplo 1, 2 ou 3 carbonos, adequadamente 1 ou 2, em particular 1) é/são substituídos por um átomo de oxigênio.
10. O conjugado, de acordo com a cláusula 9, em que o ligante adicional compreende uma cadeia de PEG.
11. O conjugado, de acordo com a cláusula 8, em que o ligante adicional compreende uma cadeia de C1-15 alquila saturada e não ramificada.
12. O conjugado, de acordo com a cláusula 11, em que o ligante adicional compreende uma cadeia de C1-6 alquila saturada e não ramificada.
13. O conjugado, de acordo com a cláusula 12, em que o ligante adicional compreende uma cadeia de C4 ou C6 alquila saturada e não ramificada, por exemplo, uma cadeia de C4 alquila.
14. O conjugado, de acordo com a cláusula 1 ou a declaração 1, em que a primeira fita de RNA é um composto de fórmula (XV):
(XV) em que b é 0 ou 1; e a segunda fita de RNA é um composto de fórmula (XVI):
(XVI); em que c e d são independentemente 0 ou 1; em que: Z1 e Z2 são as porções de RNA da primeira e segunda fitas de RNA, respectivamente; Y é O ou S; R1 é H ou metil; n é 0, 1, 2 ou 3; e L é igual ou diferente nas fórmulas (XV) e (XVI) e é selecionado do grupo que consiste em: -(CH2)q-, em que q = 2-12; -(CH2)r-C(O)-, em que r = 2-12; -(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, em que s = 1-5; -(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, em que t é independentemente 1-5; -(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, em que u é independentemente 1-5; e -(CH2)v-NH-C(O)-, em que v é 2-12; e em que o C(O) terminal (se presente) está ligado ao grupo NH;
e em que b + c + d é 2 ou 3.
15. O conjugado, de acordo com a cláusula 14, em que b é 0, c é 1 e d é 1.
16. O conjugado, de acordo com a cláusula 14, em que b é 1, c é 0 e d é 1.
17. O conjugado, de acordo com a cláusula 14, em que b é 1, c é 1 e d é 0.
18. O conjugado, de acordo com a cláusula 14, em que b é 1, c é 1 e d é 1.
19. O conjugado, de acordo com qualquer uma das cláusulas 14-18, em que Y é O.
20. O conjugado, de acordo com qualquer uma das cláusulas 14-18, em que Y é S.
21. O conjugado, de acordo com qualquer uma das cláusulas 14-20, em que R1 é H.
22. O conjugado, de acordo com qualquer uma das cláusulas 14-20, em que R1 é metil.
23. O conjugado, de acordo com qualquer uma das cláusulas 14-22, em que n é 0.
24. O conjugado, de acordo com qualquer uma das cláusulas 14-23, em que L é -(CH2)r-C(O)-, em que r = 2-12.
25. O conjugado, de acordo com a cláusula 24, em que r = 2-6.
26. O conjugado, de acordo com a cláusula 25, em que r = 4 ou 6, por exemplo, 4.
27. O conjugado, de acordo com qualquer cláusula anterior, com qualquer característica ou combinação de características divulgadas neste documento.
SEQ ID Nome Sequência (5'-3') Contraparte da NO Sequência Não Modificada (5'-3')
UCGUAUAACAAU UCGUAUAACAAU 1 LPA-1014 primeira fita
AAGGGGC AAGGGGC
GCCCCUUAUUG GCCCCUUAUUGU 2 LPA-1014 segunda fita
UUAUACGA UAUACGA
GAUAACUCUGU GAUAACUCUGUC 3 LPA-1024 primeira fita
CCAUUACC CAUUACC
GGUAAUGGACA GGUAAUGGACAG 4 LPA-1024 segunda fita
GAGUUAUC AGUUAUC
AUAACUCUGUC AUAACUCUGUCC 5 LPA-1038 primeira fita
CAUUACCA AUUACCA
UGGUAAUGGAC UGGUAAUGGACA 6 LPA-1038 segunda fita
AGAGUUAU GAGUUAU
UAACUCUGUCC UAACUCUGUCCA 7 LPA-1040 primeira fita
AUUACCGU UUACCGU
ACGGUAAUGGA ACGGUAAUGGAC 8 LPA-1040 segunda fita
CAGAGUUA AGAGUUA
AUAACUCUGUC AUAACUCUGUCC 9 LPA-1041 primeira fita
CAUUACCG AUUACCG
CGGUAAUGGAC CGGUAAUGGACA 10 LPA-1041 segunda fita
AGAGUUAU GAGUUAU
AGAAUGUGCCU AGAAUGUGCCUC 11 LPA-1055 primeira fita
CGAUAACU GAUAACU
AGUUAUCGAGG AGUUAUCGAGGC 12 LPA-1055 segunda fita
CACAUUCU ACAUUCU
AUAACUCUGUC AUAACUCUGUCC 13 LPA-1057 primeira fita
CAUCACCA AUCACCA
UGGUGAUGGAC UGGUGAUGGACA 14 LPA-1057 segunda fita
AGAGUUAU GAGUUAU
AUAACUCUGUC AUAACUCUGUCC 15 LPA-1058 primeira fita
CAUCACCU AUCACCU
AGGUGAUGGAC AGGUGAUGGACA 16 LPA-1058 segunda fita
AGAGUUAU GAGUUAU
UAACUCUGUCC UAACUCUGUCCA 17 LPA-1061 primeira fita
AUUACCAU UUACCAU
AUGGUAAUGGA AUGGUAAUGGAC 18 LPA-1061 segunda fita
CAGAGUUA AGAGUUA
AUGUGCCUUGA AUGUGCCUUGAU 19 LPA-1086 primeira fita
UAACUCUG AACUCUG
CAGAGUUAUCA CAGAGUUAUCAA 20 LPA-1086 segunda fita
AGGCACAU GGCACAU
AGUUGGUGCUG AGUUGGUGCUG 21 LPA-1099 primeira fita
CUUCAGAA CUUCAGAA
UUCUGAAGCAG UUCUGAAGCAGC 22 LPA-1099 segunda fita
CACCAACU ACCAACU
AAUAAGGGGCU AAUAAGGGGCUG 23 LPA-1102 primeira fita
GCCACAGG CCACAGG
CCUGUGGCAGC CCUGUGGCAGCC 24 LPA-1102 segunda fita
CCCUUAUU CCUUAUU
UAACUCUGUCC UAACUCUGUCCA 25 LPA-1116 primeira fita
AUCACCAU UCACCAU
AUGGUGAUGGA AUGGUGAUGGAC 26 LPA-1116 segunda fita
CAGAGUUA AGAGUUA
AUGAGCCUCGA AUGAGCCUCGAU 27 LPA-1127 primeira fita
UAACUCUG AACUCUG 28 LPA-1127 segunda fita CAGAGUUAUCG CAGAGUUAUCGA
AGGCUCAU GGCUCAU
AAUGAGCCUCG AAUGAGCCUCGA 29 LPA-1128 primeira fita
AUAACUCU UAACUCU
AGAGUUAUCGA AGAGUUAUCGAG 30 LPA-1128 segunda fita
GGCUCAUU GCUCAUU
AAUGCUUCCAG AAUGCUUCCAGG 31 LPA-1141 primeira fita
GACAUUUC ACAUUUC
GAAAUGUCCUG GAAAUGUCCUGG 32 LPA-1141 segunda fita
GAAGCAUU AAGCAUU
ACAGUGGUGGA ACAGUGGUGGAG 33 LPA-1151 primeira fita
GAAUGUGC AAUGUGC
GCACAUUCUCC GCACAUUCUCCA 34 LPA-1151 segunda fita
ACCACUGU CCACUGU
GUAUGUGCCUC GUAUGUGCCUCG 35 LPA-1171 primeira fita
GAUAACUC AUAACUC
GAGUUAUCGAG GAGUUAUCGAGG 36 LPA-1171 segunda fita
GCACAUAC CACAUAC
UCGAUAACUCU UCGAUAACUCUG 37 LPA-1177 primeira fita
GUCCAUCA UCCAUCA
UGAUGGACAGA UGAUGGACAGAG 38 LPA-1177 segunda fita
GUUAUCGA UUAUCGA
UGUCACUGGAC UGUCACUGGACA 39 LPA-1189 primeira fita
AUUGUGUC UUGUGUC
GACACAAUGUC GACACAAUGUCC 40 LPA-1189 segunda fita
CAGUGACA AGUGACA
CUGGGAUCCAU CUGGGAUCCAUG 41 LPA-1244 primeira fita
GGUGUAAC GUGUAAC
GUUACACCAUG GUUACACCAUGG 42 LPA-1244 segunda fita
GAUCCCAG AUCCCAG
AGAUGACCAAG AGAUGACCAAGC 43 LPA-1248 primeira fita
CUUGGCAG UUGGCAG
CUGCCAAGCUU CUGCCAAGCUUG 44 LPA-1248 segunda fita
GGUCAUCU GUCAUCU
AAGTGTCCTTGC AAGTGTCCTTGC 45 LPA: (superior) humano
GACGTCC GACGTCC
CCTGGACTGTG CCTGGACTGTGG 46 LPA: (inferior) humano
GGGCTTT GGCTTT
CTGTTTCTGAAC CTGTTTCTGAACA 47 LPA: (sonda) humano AAGCACCAACG AGCACCAACGGA
GAGC GC LPA (superior) GTGTCCTCGCAA GTGTCCTCGCAA 48 cynomolgus CGTCCA CGTCCA LPA (inferior) GACCCCGGGGC GACCCCGGGGCT 49 cynomolgo TTTG TTG
TGGCTGTTTCTG TGGCTGTTTCTG LPA (sonda) 50 AACAAGCACCAA AACAAGCACCAA cynomolgus
TGG TGG APOB (superior) TCATTCCTTCCC TCATTCCTTCCCC 51 humano CAAAGAGACC AAAGAGACC
CACCTCCGTTTT CACCTCCGTTTT 52 APOB (inferior) humano
GGTGGTAGAG GGTGGTAGAG
CAAGCTGCTCAG CAAGCTGCTCAG 53 APOB (sonda) humano TGGAGGCAACA TGGAGGCAACAC
CATTA ATTA beta-Actina (superior) GCATGGGTCAG GCATGGGTCAGA 54 humano AAGGATTCCTAT AGGATTCCTAT beta-Actina (inferior) TGTAGAAGGTGT TGTAGAAGGTGT 55 humano GGTGCCAGATT GGTGCCAGATT beta-Actina (sonda) TCGAGCACGGC TCGAGCACGGCA 56 humano ATCGTCACCAA TCGTCACCAA beta-Actina (superior) AAGGCCAACCG AAGGCCAACCGC 57 cynomolgus CGAGAAG GAGAAG beta-Actina (inferior) AGAGGCGTACA AGAGGCGTACAG 58 cynomolgus GGGACAGCA GGACAGCA
TGAGACCTTCAA TGAGACCTTCAA beta-Actina (sonda) 59 CACCCCAGCCAT CACCCCAGCCAT cynomolgus
GTAC GTAC PPIB (superior) AGATGTAGGCC AGATGTAGGCCG 60 humano GGGTGATCTTT GGTGATCTTT
GTAGCCAAATCC GTAGCCAAATCC 61 PPIB (inferior) humano
TTTCTCTCCTGT TTTCTCTCCTGT
TGTTCCAAAAAC TGTTCCAAAAACA 62 PPIB (sonda) humano AGTGGATAATTT GTGGATAATTTTG
TGTGGCC TGGCC
UUAACUCUGUC UUAACUCUGUCC 63 LPA-1301 primeira fita
CAUUACCG AUUACCG
CGGUAAUGGAC CGGUAAUGGACA 64 LPA-1301 segunda fita
AGAGUUAA GAGUUAA
UUAACUCUGUC UUAACUCUGUCC 65 LPA-1302 primeira fita
CAUUACCC AUUACCC
GGGUAAUGGAC GGGUAAUGGACA 66 LPA-1302 segunda fita
AGAGUUAA GAGUUAA
UUAACUCUGUC UUAACUCUGUCC 67 LPA-1303 primeira fita
CAUUACCU AUUACCU
AGGUAAUGGAC AGGUAAUGGACA 68 LPA-1303 segunda fita
AGAGUUAA GAGUUAA 69 LPA-1304 primeira fita AUAACUCUGUC AUAACUCUGUCC
CAUUACCC AUUACCC
GGGUAAUGGAC GGGUAAUGGACA 70 LPA-1304 segunda fita
AGAGUUAU GAGUUAU
AUAACUCUGUC AUAACUCUGUCC 71 LPA-1305 primeira fita
CAUUACCU AUUACCU
AGGUAAUGGAC AGGUAAUGGACA 72 LPA-1305 segunda fita
AGAGUUAU GAGUUAU
UUAACUCUGUC UUAACUCUGUCC 73 LPA-1306 primeira fita
CAUUACCA AUUACCA
UGGUAAUGGAC UGGUAAUGGACA 74 LPA-1306 segunda fita
AGAGUUAA GAGUUAA SEQ ID NO: 1 538161627261628 UCGUAUAACAAU 75 modificada 4847 AAGGGGC SEQ ID NO: 2 473735161545161 GCCCCUUAUUGU 76 modificada 6382 UAUACGA SEQ ID NO: 3 825263535453725 GAUAACUCUGUC 77 modificada 1637 CAUUACC SEQ ID NO: 4 481625482728281 GGUAAUGGACAG 78 modificada 5253 AGUUAUC SEQ ID NO: 5 616271718173615 AUAACUCUGUCC 79 modificada 2736 AUUACCA SEQ ID NO: 6 184526184636464 UGGUAAUGGACA 80 modificada 5161 GAGUUAU SEQ ID NO: 7 526353545372516 UAACUCUGUCCA 81 modificada 3745 UUACCGU SEQ ID NO: 8 274816254827282 ACGGUAAUGGAC 82 modificada 8152 AGAGUUA SEQ ID NO: 9 616271718173615 AUAACUCUGUCC 83 modificada 2738 AUUACCG
SEQ ID NO: 10 384526184636464 CGGUAAUGGACA 84 modificada 5161 GAGUUAU SEQ ID NO: 11 646254547353825 AGAAUGUGCCUC 85 modificada 2635 GAUAACU SEQ ID NO: 12 281525382847272 AGUUAUCGAGGC 86 modificada 5171 ACAUUCU SEQ ID NO: 13 616271718173617 AUAACUCUGUCC 87 modificada 2736 AUCACCA SEQ ID NO: 14 184546184636464 UGGUGAUGGACA 88 modificada 5161 GAGUUAU SEQ ID NO: 15 616271718173617 AUAACUCUGUCC 89 modificada 2735 AUCACCU SEQ ID NO: 16 284546184636464 AGGUGAUGGACA 90 modificada 5161 GAGUUAU SEQ ID NO: 17 526353545372516 UAACUCUGUCCA 91 modificada 3725 UUACCAU SEQ ID NO:18 254816254827282 AUGGUAAUGGAC 92 modificada 8152 AGAGUUA SEQ ID NO: 19 618183715461627 AUGUGCCUUGAU 93 modificada 1718 AACUCUG SEQ ID NO: 20 364645161726483 CAGAGUUAUCAA 94 modificada 6361 GGCACAU SEQ ID NO: 21 645184547183517 AGUUGGUGCUG 95 modificada 2826 CUUCAGAA SEQ ID NO: 22 153546283647273 UUCUGAAGCAGC 96 modificada 6271 ACCAACU SEQ ID NO: 23 625264848354736 AAUAAGGGGCUG 97 modificada 3648 CCACAGG 98 SEQ ID NO: 24 371818472837371 CCUGUGGCAGCC modificada 5251 CCUUAUU SEQ ID NO: 25 526353545372536 UAACUCUGUCCA 99 modificada 3725 UCACCAU SEQ ID NO: 26 254818254827282 AUGGUGAUGGAC 100 modificada 8152 AGAGUUA SEQ ID NO: 27 618283717461627 AUGAGCCUCGAU 101 modificada 1718 AACUCUG SEQ ID NO: 28 364645161746483 CAGAGUUAUCGA 102 modificada 5361 GGCUCAU SEQ ID NO: 29 625464735382526 AAUGAGCCUCGA 103 modificada 3535 UAACUCU SEQ ID NO: 30 282815253828471 AGAGUUAUCGAG 104 modificada 7251 GCUCAUU SEQ ID NO: 31 625471537284636 AAUGCUUCCAGG 105 modificada 1517 ACAUUUC SEQ ID NO: 32 462618173548264 GAAAUGUCCUGG 106 modificada 7251 AAGCAUU SEQ ID NO: 33 636454818464625 ACAGUGGUGGAG 107 modificada 4547 AAUGUGC SEQ ID NO: 34 472725171736372 GCACAUUCUCCA 108 modificada 7181 CCACUGU SEQ ID NO: 35 816181837174616 GUAUGUGCCUCG 109 modificada 2717 AUAACUC SEQ ID NO: 36 464516174648363 GAGUUAUCGAGG 110 modificada 6163 CACAUAC SEQ ID NO: 37 538252635354537 UCGAUAACUCUG 111 modificada 2536 UCCAUCA SEQ ID NO: 38 182548272828152 UGAUGGACAGAG 112 modificada 5382 UUAUCGA
SEQ ID NO: 39 545363548272518 UGUCACUGGACA 113 modificada 1817 UUGUGUC SEQ ID NO: 40 463636254537281 GACACAAUGUCC 114 modificada 8272 AGUGACA SEQ ID NO: 41 718482537254818 CUGGGAUCCAUG 115 modificada 1627 GUGUAAC SEQ ID NO: 42 451636372548253 GUUACACCAUGG 116 modificada 7364 AUCCCAG SEQ ID NO: 43 646182736283518 AGAUGACCAAGC 117 modificada 4728 UUGGCAG SEQ ID NO: 44 354736283518453 CUGCCAAGCUUG 118 modificada 6171 GUCAUCU OMeA-(ps)-FU- (ps)-OMeA-FA- OMeC-FU-OMeC- GalNAc-LPA-1038-L1 FU-OMeG-FU- AUAACUCUGUCC 119 primeira fita OMeC-FC-OMeA- AUUACCA FU-OMeU-FA- OMeC-(ps)-FC- (ps)-OMeA [ST23 (ps)]3 trebler longo (ps)FU-OMeG-FG- OMeU-FA-OMeA- GalNAc-LPA-1038-L1 UGGUAAUGGACA 120 FU-OMeG-FG- segunda fita GAGUUAU OMeA-FC-OMeA- FG-OMeA-FG- OMeU-FU-(ps)- OMeA-(ps)-FU
OMeA-(ps)-FU- (ps)-OMeA-FA- OMeC-FU-OMeC- GalNAc-LPA-1038-L6 FU-OMeG-FU- AUAACUCUGUCC 121 primeira fita OMeC-FC-OMeA- AUUACCA FU-OMeU-FA- OMeC-(ps)-FC- (ps)-OMeA [ST23 (ps)]3 ST43 (ps)FU-OMeG-FG- OMeU-FA-OMeA- GalNAc-LPA-1038-L6 FU-OMeG-FG- UGGUAAUGGACA 122 segunda fita OMeA-FC-OMeA- GAGUUAU FG-OMeA-FG- OMeU-FU-(ps)- OMeA-(ps)-FU OMeA-(ps)-FU- (ps)-OMeA-FA- OMeC-FU-OMeC- GalNAc-LPA-1041-L1 FU-OMeG-FU- AUAACUCUGUCC 123 primeira fita OMeC-FC-OMeA- AUUACCG FU-OMeU-FA- OMeC-(ps)-FC- (ps)-OMeG [ST23 (ps)]3 trebler longo (ps) GalNAc-LPA-1041-L1 CGGUAAUGGACA 124 FC-OMeG-FG- segunda fita GAGUUAU OMeU-FA-OMeA- FU-OMeG-FG-
OMeA-FC-OMeA- FG-OMeA-FG- OMeU-FU-(ps)- OMeA-(ps)-FU OMeA-(ps)-FU- (ps)-OMeA-FA- OMeC-FU-OMeC- GalNAc-LPA-1041-L6 FU-OMeG-FU- AUAACUCUGUCC 125 primeira fita OMeC-FC-OMeA- AUUACCG FU-OMeU-FA- OMeC-(ps)-FC- (ps)-OMeG [ST23 (ps)]3 ST43 (ps) FC-OMeG- FG-OMeU-FA- OMeA-FU-OMeG- GalNAc-LPA-1041-L6 CGGUAAUGGACA 126 FG-OMeA-FC- segunda fita GAGUUAU OMeA-FG-OMeA- FG-OMeU-FU- (ps)-OMeA-(ps)-
FU mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG UUAUAGAGCAAG 127 STS16001AL33 mA fA mC fA mC AACACUGUU fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) Ser(GN) (ps) fA AACAGUGUUCUU 128 STS16001BL20 mA fC mA fG mU GCUCUAUAA fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG UUAUAGAGCAAG 129 STS16001A mA fA mC fA mC AACACUGUU fU mG (ps) fU (ps) mU Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU
AACAGUGUUCUU 130 STS16001BV1L42 fU mC fU mU fG
GCUCUAUAA mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU
AACAGUGUUCUU 131 STS16001V1B fU mC fU mU fG
GCUCUAUAA mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA mU (ps) fC (ps) mG fA mA fG mU
UCGAAGUAUUCC 132 STS18001A fA mU fU mC fC
GCGUACG mG fC mG fU mA (ps) fC (ps) mG [(ST23) (ps)]3 CGUACGCGGAAU 133 STS18001BL4 C4XLT (ps) fC mG ACUUCGA fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC (ps) mG (ps) fA [(ST23) (ps)]3 C4XLT(ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG
AACAGUGUUCUU 134 STS16001BL4 mU fG mU fU mC
GCUCUAUAA fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC
AUAACUCUGUCC 135 X0373A fU mG fU mC fC
AUUACCG mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG Ser(GN) (ps) fC (ps) mG (ps) fG mU fA mA fU mG
CGGUAAUGGACA 136 X0373B fG mA fC mA fG
GAGUUAU mA fG mU fU (ps) mA (ps) fU (ps) Ser(GN) ST23 (ps) ST23 (ps) ST23 (ps) C6XLT (ps) fC mG CGGUAAUGGACA 137 STS2041B fG mU fA mA fU GAGUUAU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU
(ps) mA (ps) fU mC (ps) fU (ps) mU fA mC fU mC
CUUACUCUCGCC 138 X0125A fU mC fG mC fC
CAAGCGA mC fA mA fG mC (ps) fG (ps) mA [(ST23) (ps)]3 (C6XLT) (ps) fU mC fG mC fU mU UCGCUUGGGCG 139 X0125B fG mG fG mC fG AGAGUAAG mA fG mA fG mU fA (ps) mA (ps) fG BHQ1-
TGGCTGTTTCTG Sonda baseada na TGGCTGTTTCTG 140 AACAAGCACCAA SEQ ID NO: 50 AACAAGCACCAA
TGG TGG-FAM BHQ1- Sonda baseada na TCGAGCACGGC TCGAGCACGGCA 141 SEQ ID NO: 56 ATCGTCACCAA- TCGTCACCAA
VIC Ser(GN) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC
AACAGUGUUCUU 142 STS16001BV1L75 fU mU fG mC fU
GCUCUAUAA mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA Ser(GN) Ser(GN) (ps) fA AACAGUGUUCUU 143 STS16001BV16L42 mA fC mA fG mU GCUCUAUAA fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mA fA (ps) Ser(GN) Ser(GN) fA mA fC mA fG mU fG mU
AACAGUGUUCUU 144 STS16001BV20L75 fU mC fU mU fG
GCUCUAUAA mC fU mC fU mA fU mA fA Ser(GN) Ser(GN) (ps) Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU
AACAGUGUUCUU 145 STS16001BV1L94 fU mC fU mU fG
GCUCUAUAA mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) (ps) Ser(GN) C6Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU
AACAGUGUUCUU 146 STS16001V1BL96 fU mC fU mU fG
GCUCUAUAA mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) C7Am(GN) GlyC3Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC AACAGUGUUCUU 147 STS16001V1BL97 mA fG mU fG mU GCUCUAUAA fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) GlyC3Am(GN) PipAm(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU Conjugado 10 segunda AACAGUGUUCUU 148 fU mC fU mU fG fita GCUCUAUAA mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) PipAm(GN) C3Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU
AACAGUGUUCUU 149 STS16001V1BL88 fU mC fU mU fG
GCUCUAUAA mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) C3Am(GN) C6Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU
AACAGUGUUCUU 150 STS16001V1BL87 fU mC fU mU fG
GCUCUAUAA mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) GlyC3Am(GN) mU (ps) fC (ps) mU fU mC fU mU Conjugado 15 fita UCUUCUUAAACU 151 fA mA fA mC fU antisense GAGUUUC mG fA mG fU mU (ps) fU (ps) mC
Ser(GN) (ps) fG (ps) mA (ps) fA mA fC mU fC mA Conjugado 15 fita GAAACUCAGUUU 152 fG mU fU mU fA sense AAGAAGA mA fG mA fA (ps) mG (ps) fA (ps) Ser(GN) mA (ps) fU (ps) mG fU mA fG mC Conjugado 16 fita AUGUAGCCGAGG 153 fC mG fA mG fG antisense AUCUUCU mA fU mC fU mU (ps) fC (ps) mU Ser(GN) (ps) fA (ps) mG (ps) fA mA fG mA fU mC Conjugado 16 fita AGAAGAUCCUCG 154 fC mU fC mG fG antisense GCUACAU mC fU mA fC (ps) mA (ps) fU (ps) Ser(GN) mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA Conjugado 18 fita AACCAGAAGAAG 155 fA mG fA mA fG antisense CAGGUGA mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA Ser(GN) (ps) fU (ps) mC (ps) fA Conjugado 18 fita UCACCUGCUUCU 156 mC fC mU fG mC sense UCUGGUU fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps)
mU (ps) fU (ps) Ser(GN) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU
AACAGUGUUCUU 157 STS16001BV1 fU mC fU mU fG
GCUCUAUAA mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA [ST23 (ps)]3 ltrb (ps) fG mA fA mA Conjugado 6 de fC mU fC mA fG GAAACUCAGUUU 158 Referência fita sense mU fU mU fA mA AAGAAGA fG mA fA (ps) mG (ps) fA [ST23 (ps)]3 ltrb (ps) fA mG fA mA Conjugado 7 de fG mA fU mC fC AGAAGAUCCUCG 159 Referência fita sense mU fC mG fG mC GCUACAU fU mA fC (ps) mA (ps) fU mU (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA Conjugado 8 fita UACCAGAAGAAG 160 fA mG fA mA fG antisense CAGGUGA mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA [ST23 (ps)]3 ST41 (ps)fU mC fA mC Conjugado 8 de UCACCUGCUUCU 161 fC mU fG mC fU Referência fita sense UCUGGUA mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU
(ps) fA [ST23 (ps)]3 C6XLT (ps) fC mG Conjugado 9 de fG mU fA mA fU CGGUAAUGGACA 162 Referência fita sense mG fG mA fC mA GAGUUAU fG mA fG mU fU (ps) mA (ps) fU Chave 1 = 2'F-dU 2 = 2'F-dA 3 = 2'F-dC 4 = 2'F-dG 5 = 2'OMe- rU 6 = 2'OMe- rA 7 = 2'OMe- rC 8 = 2'OMe- rG RNA mA, mU, mC, mG, OMeA, OMeU, OMeC, OMeG – 2‗-OMe RNA fA, fU, fC, fG, FA, FU, FG, FC – 2‘deoxy-2‗-F (ps) - fosforotioato (vp) - Vinil-(E)-fosfonato ivA, ivC, ivU, ivG - RNA invertido (3'-3')
[00646] Uma única sequência pode ter mais de um nome. Nesses casos, um desses nomes é fornecido na tabela de sequência resumida.
[00647] Onde ligantes específicos e/ou ligações modificadas são ensinados em uma sequência de RNA, tal como PS e [ST23 (ps)]3 ST41 (ps) etc, estas são partes opcionais da sequência, mas são uma modalidade preferida dessa sequência.
[00648] As seguintes abreviações podem ser usadas: FAM 6-Carboxifluoresceína BHQ Black Hole Quencher 1 ST23 ST41/C4XLT ST43-fos/C6XLT Trebler longo/ltrb/STKS (fosforamidita) Ser(GN) (fosforamidita) C3Am(GN) GlyC3Am(GN)
C6Am(GN)
C7Am(GN)
PipAm(GN)

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES
1. Ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a referida primeira fita compreende uma sequência nucleotídica selecionada das seguintes sequências: SEQ ID NO: 9, 5, 1, 3, 7, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 ou 43.
2. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida primeira fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 9, e, opcionalmente, em que a referida segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 10; ou em que a referida primeira fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 5, e, opcionalmente, em que a referida segunda fita compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 6.
3. Ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a referida primeira fita compreende uma sequência nucleotídica selecionada das seguintes sequências: SEQ ID NO: 63, 65, 67, 69, 71 ou 73.
4. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a referida primeira fita e/ou a referida segunda fita têm, cada uma, 17-35 nucleotídeos de comprimento.
5. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma região duplex consiste em 17-25, preferencialmente 19-25, pares de bases nucleotídicas consecutivas.
6. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico: a) possui extremidade cega nas duas extremidades; ou b) possui um overhang em uma extremidade e a uma extremidade cega na outra; ou c) possui um overhang nas duas extremidades.
7. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que um ou mais nucleotídeos na primeira e/ou na segunda fita são modificados, para formar nucleotídeos modificados.
8. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende uma ligação fosforotioato entre o um, dois ou três nucleotídeos 3' e/ou nucleotídeos 5' terminais de uma ou ambas as extremidades da primeira e/ou da segunda fita.
9. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é conjugado a um ligante.
10. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende (i) uma ou mais porções de N-acetil galactosamina (GalNAc) ou seus derivados, e (ii) um ligante peptídico, em que o ligante peptídico conjuga pelo menos uma porção de GalNAc ou seu derivado ao ácido nucleico.
11. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é conjugado a um ligante compreendendo um composto de fórmula (I): [S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
em que: S representa um sacarídeo, preferencialmente em que o sacarídeo é N-acetil galactosamina; X1 representa C3-C6 alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-, em que m é 1, 2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado, preferencialmente um tiofosfato; X2 é alquileno ou um éter de alquileno de fórmula (-CH2)n-O- CH2-, onde n = 1- 6; A é uma unidade de ramificação; X3 representa uma unidade de formação de ponte; em que um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, é conjugado a X3 através de um fosfato ou fosfato modificado, preferencialmente um tiofosfato.
12. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelo fato de que a primeira fita de RNA é um composto de fórmula (X): (X) em que b é 0 ou 1; e a segunda fita de RNA é um composto de fórmula (XI): (XI);
em que: c e d são independentemente 0 ou 1; Z1 e Z2 são as porções de RNA da primeira e segunda fitas de RNA, respectivamente; Y é O ou S; n é 0, 1, 2 ou 3; e L1 é um ligante peptídico ao qual um ligante está ligado; e em que b + c + d é 2 ou 3.
13. Ácido nucleico para inibir a expressão de LPA em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de RNA transcrito a partir do gene LPA, em que a referida primeira fita compreende, e preferencialmente consiste na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 9 e, opcionalmente, em que a referida segunda fita compreende e, preferencialmente consiste na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 10.
14. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é conjugado a um ligante e possui a seguinte estrutura:
em que Z é um ácido nucleico conforme definido na reivindicação 13.
15. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende duas ligações fosforotioato entre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e entre cada um dos três 5' terminais na primeira fita, e duas ligações fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais da extremidade 3' da segunda fita e em que o ligante é conjugado à extremidade 5' da segunda fita.
16. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é conjugado a um ligante, em que a primeira fita de RNA é um composto de fórmula (XV):
(XV) em que b é 0 ou 1; e a segunda fita de RNA é um composto de fórmula (XVI):
(XVI); em que c e d são independentemente 0 ou 1; em que: Z1 e Z2 são as porções de RNA da primeira e segunda fitas de RNA, respectivamente; Y é O ou S; R1 é H ou metil; n é 0, 1, 2 ou 3; e L é igual ou diferente nas fórmulas (XV) e (XVI) e é selecionado do grupo que consiste em: -(CH2)q, em que q = 2-12; -(CH2)r-C(O)-, em que r = 2-12; -(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, em que s = 1-5; -(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, em que t é independentemente 1-5; -(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, em que u é independentemente 1-5; e -(CH2)v-NH-C(O)-, em que v é 2-12; e em que o terminal C(O), se presente, está ligado ao grupo NH; e em que b + c + d é 2 ou 3.
17. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência e modificações conforme mostrado abaixo: SEQ ID NO: sequência modificações 9 5’ AUAACUCUGUCCAUUACCG 3 6162717181736152738 10 5’ CGGUAAUGGACAGAGUUAU 3’ 3845261846364645161 em que, as modificações específicas são representadas por números 1=2´F-dU, 2=2‘F-dA, 3=2´F-dC, 4=2´F-dG, 5=2'-OMe-rU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG.
18. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos nas posições 2 e 14 da extremidade 5' da primeira fita são modificados com uma modificação 2'- fluoro, e os nucleotídeos na segunda fita, que correspondem à posição 11, ou 13, ou 11 e 13, ou 11-13 da primeira fita, são modificados com uma modificação 2'-fluoro.
19. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, e, opcionalmente, um veículo de administração e/ou um excipiente fisiologicamente aceitável e/ou um carreador e/ou um diluente e/ou um tampão e/ou um conservante, para uso como um medicamento, preferencialmente para a prevenção ou tratamento ou redução do risco de uma doença ou patologia, em que a doença ou patologia é preferencialmente uma doença cardiovascular, em que a doença cardiovascular é preferencialmente um acidente vascular cerebral, aterosclerose, trombose, doença arterial coronariana ou estenose aórtica e/ou qualquer outra doença ou patologia associada a níveis elevados de partículas contendo Lp(a).
20. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, e compreende ainda um veículo de administração, preferencialmente lipossomos e/ou um excipiente fisiologicamente aceitável e/ou um carreador e/ou um diluente.
21. Uso de um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou uma composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 20, para a prevenção ou tratamento ou redução do risco de uma doença ou patologia, caracterizado pelo fato de que a doença ou patologia é preferencialmente uma doença cardiovascular, em que a doença cardiovascular é, preferencialmente, um acidente vascular cerebral, aterosclerose, trombose, uma doença arterial coronariana ou estenose aórtica e qualquer outra doença ou patologia associada a níveis elevados de partículas contendo Lp(a).
22. Método para prevenir ou tratar uma doença, distúrbio ou síndrome, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma composição compreendendo um ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 19-20, a um indivíduo necessitando de tratamento, preferencialmente em que o nucleico ácido ou composição é administrado ao sujeito por via subcutânea, intravenosa ou usando quaisquer outra vias de aplicação, como oral, retal ou intraperitoneal.
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