ES2938193T3 - Acidos nucleicos para inhibir la expresión de LPA en una célula - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a productos y composiciones y sus usos. En particular, la invención se refiere a productos de ácido nucleico que interfieren con la expresión del gen LPA o inhiben su expresión para su uso como tratamiento, prevención o reducción del riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares tales como enfermedad coronaria o estenosis aórtica o accidente cerebrovascular o cualquier otro trastorno, patología o síndrome relacionado con el aumento de partículas que contienen Lp(a). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Ácidos nucleicos para inhibir la expresión de LPA en una célula
La presente invención se refiere a productos y composiciones y a sus usos. En particular, la invención se refiere a productos de ácido nucleico que interfieren con la expresión del gen LPA o que inhiben su expresión. Este tratamiento terapéutico reductor de la Lp(a) sirve para prevenir y reducir el riesgo de sufrir un ictus, ateroesclerosis, trombosis y enfermedades cardiovasculares tales como cardiopatía coronaria y estenosis de la válvula aórtica o cualquier otro trastorno, patología o síndrome relacionado con niveles elevados de partículas que contienen Lp(a).
Antecedentes
Se ha demostrado que el ARN bicatenario (ARNbc), capaz de unirse complementariamente al ARNm expresado, puede bloquear la expresión génica (Fire et al., 1998, Nature. 19 de febrero de 1998; 391(6669):806-11 y Elbashir et al., 2 0 0 1 , Nature. 24 de mayo de 2 0 0 1 ; 411(6836):494-8) mediante un mecanismo que se ha denominado interferencia por ARN (iARN). Los ARNbc cortos dirigen el silenciamiento postranscripcional específico de genes en muchos organismos, incluidos los vertebrados, y se han convertido en una herramienta útil para estudiar la función de los genes. La iARN está mediada por el complejo silenciador inducido por ARN (RISC, RNA-induced silencing complex), una nucleasa multicomponente específica de secuencia que degrada los ARN mensajeros homólogos al desencadenante del silenciamiento cargado en el complejo RISC. Los ARN de interferencia (denominados en el presente documento ARNi) tales como los ARNip, los ARN antisentido y los microARN son oligonucleótidos que evitan la formación de proteínas mediante el silenciamiento génico, es decir, la inhibición de la traducción génica de la proteína a través de la degradación de las moléculas de ARNm. Los agentes silenciadores de genes son cada vez más importantes para aplicaciones terapéuticas en medicina.
De acuerdo con Watts y Corey en el Journal of Pathology (2012; Vol 226, págs. 365-379) hay algoritmos que se pueden utilizar para diseñar desencadenantes del silenciamiento de ácidos nucleicos, pero todos estos tienen limitaciones importantes. Pueden ser necesarios varios métodos experimentales para identificar potentes ARNi, ya que los algoritmos no tienen en cuenta factores tales como la estructura terciaria del ARNm diana o la participación de las proteínas de unión al ARN. Por tanto, el descubrimiento de un potente desencadenante del silenciamiento de ácidos nucleicos con efectos colaterales mínimos es un proceso complejo. Para el desarrollo farmacéutico de estas moléculas altamente cargadas es necesario que se puedan sintetizar económicamente, distribuirse a los tejidos diana, entrar en las células y funcionar dentro de los límites aceptables de toxicidad.
Lp(a) es una partícula heterogénea de lipoproteína de baja densidad que se expresa predominantemente en el hígado (Witztum y Ginsberg, J Lipid Res. marzo de 2016; 57(3):336-9). Está compuesta por Apolipoproteína(a) (Apo(a) codificada por el gen LPA) unida al LDL a través del polipéptido ApoB. Los elevados niveles séricos de Lp(a) definidos genéticamente no se ven afectados por la dieta y el ejercicio y se asocian con un mayor riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares a través del potencial ateroesclerótico asociado (Alonso et al., Journal of the American College of Cardiology, vol. 63, n.° 19, 2014). En términos de medicina diagnóstica y preventiva, el nivel sérico de Lp(a) del paciente es un factor de riesgo genético altamente prevalente independiente para la cardiopatía coronaria y estenosis aórtica (Saeedi y Frohlich Clinical Diabetes and Endocrinology (2016) 2:7).
El documento WO 2017/059223 describe composiciones y métodos para inhibir la expresión génica de LPA.
Tadin-Strapps et al., J. of Cardiovasc. Trans. Res. (2015), 8;44-53, describe el desarrollo de ARNip de lipoproteína(a) para estudios de los mecanismo de acción en modelos de ateroesclerosis en primates no humanos.
El documento WO 2016/149020 describe agentes de interferencia de iARN para modular la expresión génica en varias aplicaciones, incluyendo las aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico, de validación de dianas y de descubrimiento genómico.
Actualmente no existe una terapia de reducción de Lp(a) específica aprobada más allá de las medidas indirectas convencionales generales de reducción de LDL. En consecuencia, actualmente se necesitan métodos para un tratamiento eficaz, prevención y reducción del riesgo de padecer trastornos tales como y asociados al ictus, aterosclerosis, trombosis y enfermedades cardiovasculares, tales como la cardiopatía coronaria, estenosis aórtica y otros trastornos, patologías o síndromes asociados todavía no identificados. La presente invención aborda esta necesidad médica no satisfecha.
La invención se refiere a un ácido nucleico para inhibir la expresión de LPA en una célula, que comprende al menos una región doble que comprende al menos una parte de una primera cadena y al menos una parte de una segunda cadena que es al menos parcialmente complementaria a la primera cadena, en donde dicha primera cadena es al menos parcialmente complementaria a al menos una parte de un ARN transcrito a partir del gen LPA, en donde dicha primera cadena comprende una secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 9.
En una realización, el número de emparejamientos incorrectos de un solo nucleótido en la secuencia de la primera cadena respecto a la parte de la secuencia de referencia que está comprendida en la secuencia de la primera cadena es como máximo tres, preferentemente como máximo dos, más preferentemente como máximo uno y lo más preferentemente cero.
La segunda cadena puede comprender la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 10.
La primera cadena puede tener una longitud de 19-35 nucleótidos y/o la segunda cadena puede tener una longitud de 17-35 nucleótidos y al menos una región doble puede tener una longitud de 10-25 nucleótidos. La región doble puede comprender dos cadenas separadas o puede comprender una sola cadena que comprende la primera cadena y la segunda cadena.
El ácido nucleico puede: a) tener extremos romos en ambos extremos; b) tener un saliente en un extremo y un extremo romo en el otro; o c) tener un saliente en ambos extremos.
Pueden modificarse uno o más nucleótidos en la cadena primera y/o segunda, para formar nucleótidos modificados. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos impares de la primera cadena. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos pares de la primera cadena mediante al menos una segunda modificación, en donde al menos la segunda modificación es diferente de la modificación en dichos uno o más nucleótidos impares. Al menos uno de dichos uno o más nucleótidos pares modificados puede ser adyacente a al menos uno de dichos uno o más nucleótidos impares modificados.
Puede modificarse una pluralidad de nucleótidos impares en la primera cadena en el ácido nucleico de la invención. Una pluralidad de nucleótidos pares en la primera cadena puede modificarse mediante una segunda modificación. La primera cadena puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican mediante una modificación común. La primera cadena también puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican mediante una segunda modificación diferente.
Uno o más de los nucleótidos impares de la segunda cadena pueden modificarse mediante una modificación que sea diferente de la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena y/o uno o más de los nucleótidos pares de la segunda cadena pueden modificarse mediante la misma modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena. Al menos uno de dichos uno o más nucleótidos pares modificados de la segunda cadena puede ser adyacente a dichos uno o más nucleótidos impares modificados. Una pluralidad de nucleótidos impares de la segunda cadena puede modificarse mediante una modificación común y/o una pluralidad de nucleótidos pares puede modificarse mediante la misma modificación que está presente en los nucleótidos impares de la primera cadena. Una pluralidad de nucleótidos impares en la segunda cadena puede modificarse mediante una segunda modificación, en donde la segunda modificación es diferente de la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena.
La segunda cadena puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican mediante una modificación común, que puede ser una segunda modificación que sea diferente de la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena.
En el ácido nucleico de la invención, cada uno de los nucleótidos impares en la primera cadena y cada uno de los nucleótidos pares en la segunda cadena pueden modificarse con una modificación común y cada uno de los nucleótidos pares puede modificarse en la primera cadena con una segunda modificación y cada uno de los nucleótidos impares puede modificarse en la segunda cadena con una segunda modificación diferente.
El ácido nucleico de la invención puede tener los nucleótidos modificados de la primera cadena desplazados por al menos un nucleótido con respecto a los nucleótidos sin modificar o modificados de manera diferente de la segunda cadena.
La modificación y/o modificaciones pueden seleccionarse cada una individualmente del grupo que consiste en desoxitimina 3'-terminal, 2'-O-metilo, una modificación con 2'-desoxi, una modificación con 2'-amino, una modificación con 2'-alquilo, una modificación con morfolino, una modificación con fosforamidato, una modificación con grupo 5'-fosforotioato, una modificación con fosfato en 5' o mimético de fosfato en 5' y un derivado de colesterilo o una modificación de grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico y/o el nucleótido modificado puede ser uno cualquiera de entre un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico o una base no natural que comprende nucleótido. Al menos una modificación puede ser 2'-O-metilo y/o al menos una modificación puede ser 2'-F.
En algunas realizaciones, los nucleótidos de la primera cadena se modifican mediante una primera modificación en los nucleótidos impares y se modifican mediante una segunda modificación en los nucleótidos pares y los nucleótidos de la segunda cadena se modifican mediante una tercera modificación en los nucleótidos pares y se modifican mediante una cuarta modificación los nucleótidos impares, en donde al menos la primera modificación es diferente de la segunda modificación y la tercera modificación es diferente de la cuarta modificación. La segunda cadena puede comprender la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 10. La tercera modificación y la primera modificación pueden ser las mismas y/o la segunda modificación y la cuarta modificación pueden ser las mismas.
La primera modificación puede ser 2'OMe y la segunda modificación puede ser 2'F.
En algunas realizaciones, la primera cadena puede comprender la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 9 y la segunda cadena puede comprender la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 10.
La secuencia y las modificaciones pueden ser como se muestra en la siguiente tabla, que muestra secuencias preferidas basadas en un extracto de la Tabla 1 como se proporciona en el presente documento:
Figure imgf000004_0001
en donde las modificaciones específicas están representadas por los siguientes números
1=2'F-dU,
2=2'F-dA,
3=2'F-dC,
4=2'F-dG,
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG.
Un ácido nucleico de la invención puede comprender un enlace fosforotioato entre uno, dos o tres nucleótidos 3' terminales y/o uno, dos o tres nucleótidos 5' de la primera y/o la segunda cadena. Puede comprender dos enlaces fosforotioato entre cada uno de los tres nucleótidos 3' terminales y entre cada uno de los tres nucleótidos 5' terminales de la primera cadena y dos enlaces fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales del extremo 3' de la segunda cadena.
Tal ácido nucleico puede conjugarse con un ligando.
El ligando puede comprender (i) uno o más restos de N-acetil-galactosamina (GalNAc) y derivados de la misma y (ii) un enlazador, en donde el enlazador conjuga los restos de GalNAc con una secuencia, como se define en cualquiera de los aspectos anteriores. El enlazador puede ser una estructura ramificada bivalente, trivalente o tetravalente. Los nucleótidos pueden modificarse como se define en el presente documento.
El ligando puede comprender la fórmula I:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
en donde:
S representa un sacárido, en donde el sacárido es N-acetil galactosamina;
X1 representa alquileno C3-C6 o (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- en donde m es 1, 2 o 3;
P es un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato);
X2 es alquileno o un éter de alquileno de fórmula (-CH2VO-CH 2- donde n = 1 a 6;
A es una unidad de ramificación;
X3 representa una unidad de unión;
en donde un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está conjugado con X3 a través de un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato).
Por tanto, la presente invención proporciona además un ácido nucleico conjugado que tiene una de las siguientes estructuras
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
en donde Z representa un ácido nucleico como se ha definido anteriormente en el presente documento.
Como alternativa, un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede conjugarse con un ligando de la siguiente estructura
Figure imgf000009_0002
En algunas realizaciones, la presente invención también se refiere a un conjugado para inhibir la expresión de un gen LPA en una célula, comprendiendo dicho conjugado una parte de ácido nucleico, que comprende el ácido nucleico de la invención y partes de ligando, dicha parte de ácido nucleico comprendiendo al menos una región doble que comprende al menos una parte de una primera cadena de ARN y al menos una parte de una segunda cadena de ARN que es complementaria al menos parcialmente de la primera cadena, en donde dicha primera cadena es complementaria al menos parcialmente de al menos una parte del ARN transcrito a partir del gen LPA, comprendiendo dichas partes de ligando un resto enlazador, preferentemente un resto enlazador procedente de serinol y un ligando de direccionamiento para el direccionamiento in vivo de células y estando conjugado exclusivamente con los extremos 3' y/o 5' de una o ambas cadenas de ARN, en donde el extremo 5' de la primera cadena de ARN no está conjugado, en donde:
(i) la segunda cadena de ARN está conjugada en el extremo 5' con el ligando de direccionamiento, y en donde (a) la segunda cadena de ARN también está conjugada en el extremo 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 3' de la primera cadena de ARN no está conjugado; o (b) la primera cadena de ARN está conjugada en el extremo 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 3' de la segunda cadena de ARN no está conjugado; o (c) tanto la segunda cadena de ARN como la primera cadena de ARN también están conjugadas en los extremos 3' con el ligando de direccionamiento; o
(ii) tanto la segunda cadena de ARN como la primera cadena de ARN están conjugadas en los extremos 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 5' de la segunda cadena de ARN no está conjugado o
la presente invención se refiere a un conjugado para inhibir la expresión de un gen LPA en una célula, comprendiendo dicho conjugado una parte de ácido nucleico de la invención y partes de ligando, dicha parte de ácido nucleico comprendiendo al menos una región doble que comprende al menos una parte de una primera cadena de ARN y al menos una parte de una segunda cadena de ARN que es complementaria al menos parcialmente de la primera cadena, en donde dicha primera cadena es complementaria al menos parcialmente de al menos una parte del ARN transcrito a partir del gen LPA, comprendiendo dichas partes de ligando un resto enlazador y un ligando de direccionamiento para el direccionamiento in vivo de células y estando conjugado exclusivamente con los extremos 3' y/o 5' de una o ambas cadenas de ARN, en donde el extremo 5' de la primera cadena de ARN no está conjugado, en donde:
(i) la segunda cadena de ARN está conjugada en el extremo 5' con el ligando de direccionamiento, y en donde (a) la segunda cadena de ARN también está conjugada en el extremo 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 3' de la primera cadena de ARN no está conjugado; o (b) la primera cadena de ARN está conjugada en el extremo 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 3' de la segunda cadena de ARN no está conjugado; o (c) tanto la segunda cadena de ARN como la primera cadena de ARN también están conjugadas en los extremos 3' con el ligando de direccionamiento; o
(ii) tanto la segunda cadena de ARN como la primera cadena de ARN están conjugadas en los extremos 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 5' de la segunda cadena de ARN no está conjugado.
El resto enlazador puede ser, por ejemplo, un resto enlazador derivado de serinol o uno de los otros tipos de enlazadores descritos en el presente documento.
La invención también proporciona una composición que comprende el ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de cualquier aspecto de la invención y un excipiente fisiológicamente aceptable.
También se proporciona un ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de acuerdo con cualquier realización de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o síndrome y/o en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad, trastorno o síndrome.
La invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o síndrome que comprende la administración de una composición que comprende un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado de acuerdo con cualquier realización de la invención a un individuo que necesita tratamiento. El ácido nucleico o ácido nucleico conjugado se puede administrar al sujeto por vía subcutánea, intravenosa o utilizando cualquier otra vía de aplicación tal como oral, rectal o intraperitoneal.
Después de la aplicación subcutánea, la invención puede suministrarse de una manera específica tisular al hígado (hepatocitos) y dirigirse específicamente al LPA, con el fin de reducir los efectos secundarios no deseados y lograr una menor dosis terapéutica necesaria para lograr el efecto deseado.
La invención o la composición que comprende el ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención puede utilizarse en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o síndrome. El tratamiento puede ser para prevenir y reducir el riesgo de padecer un ictus, ateroesclerosis, trombosis o enfermedades cardiovasculares tales como cardiopatía coronaria o estenosis de la válvula aórtica y cualquier otra enfermedad o patología asociada a niveles elevados de partículas que contienen Lp(a).
También se incluye un método para preparar el ácido nucleico o el ácido nucleico conjugado de acuerdo con la invención.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un ácido nucleico bicatenario y dirigido a un transcrito de ARN expresado de LPA y a composiciones del mismo. Estos ácidos nucleicos o ácidos nucleicos conjugados se pueden utilizar en el tratamiento y la prevención de varias enfermedades, trastornos y síndromes donde es deseable una expresión reducida del producto génico LPA.
La invención se refiere a un ácido nucleico para inhibir la expresión de LPA en una célula, que comprende al menos una región doble que comprende al menos una parte de una primera cadena y al menos una parte de una segunda cadena que es al menos parcialmente complementaria a la primera cadena, en donde dicha primera cadena es al menos parcialmente complementaria a al menos una parte de un ARN transcrito a partir del gen LPA, en donde dicha primera cadena comprende una secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 9 y opcionalmente, en donde la segunda cadena comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 10.
El gen LPA comprende secuencias altamente repetitivas. Los ácidos nucleicos de la primera cadena con secuencias muy similares pueden, por lo tanto, tener una perfecta complementariedad de secuencias con regiones diana muy diferentes del ARNm.
En algunas realizaciones, el número de emparejamientos incorrectos de un solo nucleótido y/o deleciones y/o inserciones en la secuencia de la primera cadena respecto a la parte de la secuencia de referencia que está comprendida en la secuencia de la primera cadena es como máximo tres, preferentemente como máximo dos, más preferentemente como máximo uno y lo más preferentemente cero.
Se pueden tolerar un determinado número de emparejamientos incorrectos, eliminaciones o inserciones entre la primera cadena (antisentido) y la secuencia diana, o entre la primera cadena y la segunda cadena (de sentido) en el contexto de ARNip y, en determinados casos, incluso tienen la posibilidad de aumentar la actividad.
Por ácido nucleico se entiende un ácido nucleico que comprende dos cadenas que comprenden nucleótidos, que es capaz de interferir con la expresión génica. La inhibición puede ser completa o parcial y da como resultado la regulación negativa de la expresión génica de una manera dirigida. El ácido nucleico comprende dos cadenas de polinucleótidos separadas; la primera cadena, que también puede ser una cadena guía; y una segunda cadena, que también puede ser una cadena pasajero. La primera cadena y la segunda cadena pueden ser parte de la misma molécula polinucleotídica que es autocomplementaria y que se 'pliega' para formar una molécula bicatenaria. El ácido nucleico puede ser una molécula de ARNip.
El ácido nucleico puede comprender ribonucleótidos, ribonucleótidos modificados, desoxinucleótidos, desoxirribonucleótidos o análogos de nucleótidos no nucleótidos que son capaces de imitar nucleótidos de tal manera que pueden 'emparejarse' con la base correspondiente en la secuencia diana o cadena complementaria. El ácido nucleico puede comprender además una parte de ácido nucleico bicatenario o región doble formada por toda o una parte de la primera cadena (también conocida en la técnica como cadena guía) y toda o una parte de la segunda cadena (también conocida en la materia como cadena pasajera). La región doble se define como que comienza con el primer par de bases formado entre la primera cadena y la segunda cadena y termina con el último par de bases formado entre la primera cadena y la segunda cadena, ambos inclusive.
Por región doble se entiende la región en dos oligonucleótidos complementarios o sustancialmente complementarios que forman pares de bases entre sí, ya sea mediante apareamiento de bases de Watson-Crick o de cualquier otra manera que permita un doble entre cadenas oligonucleotídicas que sean complementarias o sustancialmente complementarias. Por ejemplo, una cadena de oligonucleótidos que tiene 21 unidades de nucleótidos puede emparejarse con otro oligonucleótido de 21 unidades de nucleótidos, aunque solo 19 nucleótidos en cada cadena son complementarios o sustancialmente complementarios, de manera que la "región doble" consiste en 19 pares de bases. Los pares de bases restantes pueden existir como salientes en 5' y 3' o como regiones monocatenarias. Además, dentro de la región doble, no se requiere el 100% de complementariedad; se permite una complementariedad sustancial dentro de una región doble. Complementariedad sustancial se refiere a la complementariedad entre las cadenas de manera que sean capaces de hibridarse en condiciones biológicas. Se conocen bien en la materia técnicas para determinar empíricamente si dos cadenas son capaces de hibridarse en condiciones biológicas. Como alternativa, pueden sintetizarse dos cadenas y añadirse juntas en condiciones biológicas para determinar si se hibridan entre sí.
La parte de la primera cadena y la parte de la segunda cadena que forman al menos una región doble pueden ser totalmente complementarias y al menos parcialmente complementarias entre sí. Dependiendo de la longitud de un ácido nucleico, no se requiere necesariamente un emparejamiento perfecto en términos de complementariedad de bases entre la primera cadena y la segunda cadena. Sin embargo, las cadenas primera y segunda deben ser capaces de hibridarse en condiciones fisiológicas.
La complementariedad entre la primera cadena y la segunda cadena en la al menos una región doble puede ser perfecta en el sentido de que no hay emparejamientos incorrectos de nucleótidos o nucleótidos adicionales/eliminados en ninguna de las cadenas. Como alternativa, la complementariedad puede no ser perfecta. La complementariedad puede ser de aproximadamente un 70% a aproximadamente el 100%. De manera más específica, la complementariedad puede ser de al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 % o un 95 % y valores intermedios.
En el contexto de la presente invención, "una parte de" como, por ejemplo, en "una región doble que comprende al menos una parte de una primera cadena" debe entenderse que significa que la región doble comprende al menos 10, preferentemente al menos 12, más preferentemente al menos 14, aún más preferentemente al menos 16, incluso más preferentemente al menos 18 y lo más preferentemente todos los nucleótidos de una secuencia de la cadena de referencia dada. La parte de la secuencia de referencia en la región doble es al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, aún más preferentemente al menos un 95 % y lo más preferentemente el 100% idéntica a la parte correspondiente de la secuencia de referencia. Como alternativa, el número de emparejamientos incorrectos de un solo nucleótido en relación con la parte de la secuencia de referencia es como máximo tres, preferentemente como máximo dos, más preferentemente como máximo uno y lo más preferentemente cero.
La primera cadena y la segunda cadena pueden cada una comprender una región de complementariedad que comprenda al menos 15 nucleótidos contiguos que difieran en no más de 3 nucleótidos de cualquiera de las secuencias enumeradas en la Tabla 1.
El ácido nucleico puede comprender una segunda secuencia que comprenda una secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 10.
El uso de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención implica la formación de una región doble entre la totalidad o una parte de la primera cadena y una parte de un ácido nucleico diana. La parte del ácido nucleico diana que forma una región doble con la primera cadena, definida como que comienza con el primer par de bases formado entre la primera cadena y la secuencia diana y que termina con el último par de bases formado entre la primera cadena y la secuencia diana, ambos inclusive, es la secuencia de ácido nucleico diana o simplemente, la secuencia diana. No es necesario que la región doble formada entre la primera cadena y la segunda cadena sea la misma que la región doble formada entre la primera cadena y la secuencia diana. Es decir, la segunda cadena puede tener una secuencia diferente de la secuencia diana; sin embargo, la primera cadena debe poder formar una estructura doble tanto con la segunda cadena como con la secuencia diana, al menos en condiciones fisiológicas.
La complementariedad entre la primera cadena y la secuencia diana puede ser perfecta (sin emparejamientos incorrectos de nucleótidos o nucleótidos adicionales/eliminados en ninguno de los ácidos nucleicos).
La complementariedad entre la primera cadena y la secuencia diana puede no ser perfecta. La complementariedad puede ser de aproximadamente un 70% a aproximadamente el 100%. De manera más específica, la complementariedad puede ser de al menos un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 % o un 95 % y valores intermedios.
La identidad entre la primera cadena y la secuencia complementaria de la secuencia diana puede variar de aproximadamente un 75 % a aproximadamente el 100 %. De manera más específica, la complementariedad puede ser de al menos un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 % o un 95 % y valores intermedios, siempre que un ácido nucleico sea capaz de reducir o inhibir la expresión de LPA.
Un ácido nucleico que tenga una complementariedad inferior al 100 % entre la primera cadena y la secuencia diana puede reducir la expresión de LPA al mismo nivel que un ácido nucleico que tiene una complementariedad perfecta entre la primera cadena y la secuencia diana. Como alternativa, puede ser capaz de reducir la expresión de LPA a un nivel que es del 15 % al 100 % del nivel de reducción alcanzado por el ácido nucleico con complementariedad perfecta.
El ácido nucleico puede comprender una primera cadena y una segunda cadena que tienen cada una de 19 a 25 nucleótidos de longitud. La primera cadena y la segunda cadena pueden tener diferentes longitudes.
El ácido nucleico puede tener una longitud de 23 a 24 pares de nucleótidos. El ácido nucleico puede tener una longitud de 19 a 21 pares de nucleótidos. El ácido nucleico puede tener una longitud de 21 a 23 pares de nucleótidos.
El ácido nucleico puede comprender una región doble que consiste en 19 a 25 pares de bases de nucleótidos. La región doble puede consistir en 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 pares de bases, que pueden ser contiguas.
El ácido nucleico puede comprender una secuencia de segunda cadena del SEQ ID NO: 10.
Preferentemente, el ácido nucleico media la interferencia por ARN.
El ácido nucleico o ácido nucleico conjugado como se describe puede reducir la expresión de LPA en al menos un 15 % en comparación con la expresión observada en ausencia del ácido nucleico o del ácido nucleico conjugado. En particular, la expresión de LPA puede reducirse al menos al siguiente % dado o menos del 90 %, el 80 %, el 70 %, el 60 %, el 50 %, el 40 %, el 30 %, el 20 %, el 15 % o menos, y valores intermedios, que la observada en ausencia del ácido nucleico o ácido nucleico conjugado o en presencia de un control sin silenciamiento.
El ácido nucleico puede tener extremos romos en ambos extremos; tener un saliente en un extremo y un extremo romo en el otro extremo; o tener un saliente en ambos extremos.
Un "saliente", como se utiliza en el presente documento, tiene su significado normal y habitual en la materia, es decir, una parte monocatenaria de un ácido nucleico que se prolonga más allá del nucleótido terminal de una cadena complementaria en un ácido nucleico bicatenario. La expresión "extremo romo" incluye ácido nucleico bicatenario por el que ambas cadenas terminan en la misma posición, independientemente de si el nucleótido o los nucleótidos terminales se emparejan por las bases. El nucleótido terminal de una primera cadena y de una segunda cadena en un extremo romo puede estar emparejado por la base. El nucleótido terminal de una primera cadena y de una segunda cadena en un extremo romo puede no estar emparejado. Los dos nucleótidos terminales de una primera cadena y una segunda cadena en un extremo romo pueden estar emparejados por las bases. Los dos nucleótidos terminales de una primera cadena y una segunda cadena en un extremo romo pueden no estar emparejados.
El ácido nucleico puede tener un saliente en un extremo y un extremo romo en el otro. El ácido nucleico puede tener un saliente en ambos extremos. El ácido nucleico puede tener extremos romos en ambos extremos. El ácido nucleico puede tener extremos romos en el extremo con el extremo 5' de la primera cadena y el extremo 3' de la segunda cadena o en el extremo 3' de la primera cadena y el extremo 5' de la segunda cadena.
El ácido nucleico puede comprender un saliente en un extremo 3' o 5'. El ácido nucleico puede tener un saliente en 3' en la primera cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 3' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 5' en la primera cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 5' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' de la primera cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' de la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 5' en la primera cadena y un saliente en 3' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 3' en la primera cadena y un saliente en 5' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 3' en la primera cadena y un saliente en 3' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 5' en la primera cadena y un saliente en 5' en la segunda cadena.
Un saliente en el extremo 3' o 5' de la segunda cadena o la primera cadena puede seleccionarse entre 1,2, 3, 4 y 5 nucleótidos de longitud. Opcionalmente, un saliente puede consistir en 1 o 2 nucleótidos, que pueden estar modificados o no.
Los polinucleótidos sin modificar, en particular los ribonucleótidos, pueden ser propensos a la degradación por nucleasas celulares y como tales, las modificaciones/nucleótidos modificados pueden incluirse en el ácido nucleico de la invención. Dichos modificaciones pueden ayudar a estabilizar el ácido nucleico haciéndolo más resistente a las nucleasas. Esta resistencia mejorada permite que los ácidos nucleicos sean activos en la mediación de la interferencia por ARN durante períodos de tiempo más prolongados y, en especial, es deseable cuando los ácidos nucleicos se van a utilizar para un tratamiento.
Puede modificarse uno o más nucleótidos en las cadenas segunda y/o primera del ácido nucleico de la invención.
Las modificaciones del ácido nucleico de la presente invención generalmente proporcionan una herramienta poderosa para superar limitaciones potenciales, incluyendo, pero sin limitación, la estabilidad in vitro e in vivo, y la biodisponibilidad inherente a las moléculas de ARN nativas. El ácido nucleico de acuerdo con la invención puede modificarse mediante modificaciones químicas. El ácido nucleico modificado también puede minimizar la posibilidad de inducir actividad interferón en seres humanos. La modificación puede potenciar adicionalmente la entrega funcional de un ácido nucleico a una célula diana. El ácido nucleico modificado de la presente invención puede comprender uno o más ribonucleótidos modificados químicamente de una o las dos de entre la primera cadena o la segunda cadena. Un ribonucleótido puede comprender una modificación química de la base, el azúcar o los restos fosfato. El ácido ribonucleico puede modificarse mediante sustitución o inserción con análogos de ácidos nucleicos o bases.
Puede modificarse uno o más nucleótidos de un ácido nucleico de la presente invención. El ácido nucleico puede comprender al menos un nucleótido modificado. El nucleótido modificado puede estar en la primera cadena. El nucleótido modificado puede estar en la segunda cadena. El nucleótido modificado puede estar en la región doble. El nucleótido modificado puede estar fuera de la región doble, es decir, en una región monocatenaria. El nucleótido modificado puede estar en la primera cadena y puede estar fuera de la región doble. El nucleótido modificado puede estar en la segunda cadena y puede estar fuera de la región doble. El nucleótido 3'-terminal de la primera cadena puede ser un nucleótido modificado. El nucleótido 3'-terminal de la segunda cadena puede ser un nucleótido modificado. El nucleótido terminal en 5' de la primera cadena puede ser un nucleótido modificado. El nucleótido terminal en 5' de la segunda cadena puede ser un nucleótido modificado.
Un ácido nucleico de la invención puede tener 1 nucleótido modificado o un ácido nucleico de la invención puede tener aproximadamente 2-4 nucleótidos modificados o un ácido nucleico puede tener aproximadamente 4-6 nucleótidos modificados, aproximadamente 6-8 nucleótidos modificados, aproximadamente 8-10 nucleótidos modificados, aproximadamente 10-12 nucleótidos modificados, aproximadamente 12-14 nucleótidos modificados, aproximadamente 14-16 nucleótidos modificados, aproximadamente 16-18 nucleótidos modificados, aproximadamente 18-20 nucleótidos modificados, aproximadamente 20-22 nucleótidos modificados, aproximadamente 22-24 nucleótidos modificados, 24-26 nucleótidos modificados o aproximadamente 26-28 nucleótidos modificados. En cada caso, el ácido nucleico que comprende dichos nucleótidos modificados conserva al menos un 50 % de su actividad, en comparación con el mismo ácido nucleico pero sin dichos nucleótidos modificados o viceversa. El ácido nucleico puede conservar un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 100 % y valores intermedios de su actividad, en comparación con el mismo ácido nucleico pero sin dichos nucleótidos modificados o puede tener más de un 100 % de la actividad del mismo nucleótido sin dichos nucleótidos modificados.
El nucleótido modificado puede ser una purina o una pirimidina. Al menos la mitad de las purinas pueden modificarse.
Al menos la mitad de las pirimidinas pueden modificarse. Todas las purinas pueden modificarse. Todas las pirimidinas pueden modificarse. Los nucleótidos modificados pueden seleccionarse del grupo que consiste en un nucleótido de desoxitimina (dT) 3'-terminal, un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2', un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforoamidato, un nucleótido de base no natural, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato, un nucleótido que comprende un fosfato en 5' o mimético de fosfato en 5' y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o un grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico.
El ácido nucleico puede comprender un nucleótido que comprenda un nucleótido modificado, en donde la base se selecciona entre 2-aminoadenosina, 2,6-diaminopurina, inosina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2,4,6-trimetoxibenceno, 3-metiluracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidina (por ejemplo, 5-metilcitidina), 5-alquiluridina (por ejemplo, ribotimidina), 5-halouridina (por ejemplo, 5-bromouridina), 6-azapirimidina, 6-alquilpirimidina (por ejemplo, 6-metiluridina), propina, quesosina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, wibutosina, wybutoxosina, 4-acetilcitidina, 5-(carboxihidroximetil)uridina, 5'-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluridina, p-D-galactosilqueosina, 1-metiladenosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 3-metilcitidina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, 5-metilaminometiluridina, 5-metilcarbonilmetiluridina, 5-metiloxiuridina, 5-metil-2-tiouridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, p-D-manosilqueosina, ácido uridina-5-oxiacético y 2-tiocitidina.
Los ácidos nucleicos que se analizan en el presente documento incluyen ARN sin modificar así como ARN que se ha modificado, por ejemplo, para mejorar la eficacia, y polímeros de sustitutos de nucleósido. El ARN sin modificar se refiere a una molécula en la que los componentes del ácido nucleico, en concreto, azúcares, bases y restos fosfato, son iguales o esencialmente iguales a los que se producen en la naturaleza, por ejemplo, los que se producen de forma natural en el cuerpo humano. El nucleótido modificado como se describe en el presente documento se refiere a un nucleótido en el que uno o más de los componentes de los nucleótidos, en concreto, azúcares, bases y restos fosfato, son diferentes de aquellos que se producen en la naturaleza. Aunque se les denomina nucleótidos modificados, por supuesto, debido a la modificación, el término también incluye moléculas que no son nucleótidos, por ejemplo, una molécula polinucleotídica en las que la cadena principal de ribofosfato se reemplaza por una construcción sin ribofosfato que permite la hibridación entre cadenas, es decir, los nucleótidos modificados imitan la cadena principal de ribofosfato.
Muchas de las modificaciones que se describen a continuación que se producen dentro de un ácido nucleico se repetirán dentro de una molécula de polinucleótido, tal como una modificación de una base, un resto fosfato o un O no enlazante de un resto fosfato. En algunos casos, la modificación se producirá en todas las posiciones/nucleótidos posibles en el polinucleótido, pero en muchos casos no se producirá. Una modificación solo puede producirse en una posición terminal en 3' o 5', solo puede producirse en regiones terminales, tal como en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de una cadena. Una modificación puede producirse en una región bicatenaria, una región monocatenaria o en ambas. Una modificación puede producirse solo en la región bicatenaria de un ácido nucleico de la invención o puede producirse solo en una región monocatenaria de un ácido nucleico de la invención. Una modificación con fosforotioato en una posición O no enlazante puede producirse solo en uno o en ambos extremos, puede producirse solo en una región terminal, por ejemplo, en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de un cadena, o puede producirse en regiones dobles y/o monocatenarias, en particular en los extremos. El extremo 5' o los extremos 3' pueden estar fosforilados.
La estabilidad de un ácido nucleico de la invención puede aumentarse incluyendo bases particulares en salientes o incluir nucleótidos modificados, en salientes monocatenarios, por ejemplo, en un saliente en 5' o 3', o en ambos. Los nucleótidos de purina pueden incluirse en salientes. Todas o algunas de las bases en un saliente en 3' o 5' pueden modificarse. Las modificaciones pueden incluir el uso de modificaciones en el grupo 2'-OH del azúcar ribosa, el uso de desoxirribonucleótidos, en lugar de ribonucleótidos, y modificaciones en el grupo fosfato, tales como modificaciones de fosforotioato. No es necesario que los salientes sean homólogos con la secuencia diana.
Las nucleasas pueden hidrolizar enlaces fosfodiéster de ácido nucleico. Sin embargo, las modificaciones químicas de los ácidos nucleicos pueden conferir propiedades mejoradas y pueden hacer que los oligorribonucleótidos sean más estables a las nucleasas.
Los ácidos nucleicos modificados, como se utilizan en el presente documento, pueden incluir uno o más de:
(i) alteración, por ejemplo, reemplazo, de uno o los dos oxígenos de fosfato no enlazantes y/o de uno o más de los oxígenos de fosfato enlazantes (denominados enlazantes incluso si están en el extremo 5' y 3' del ácido nucleico de la invención);
(ii) alteración, por ejemplo, reemplazo, de un constituyente del azúcar ribosa, por ejemplo, del hidroxilo en 2' en el azúcar ribosa;
(iii) reemplazo del resto de fosfato con enlazadores "desfosfo";
(iv) modificación o reemplazo de una base de origen natural;
(v) reemplazo o modificación de la cadena principal de ribosa-fosfato;
(vi) modificación del extremo 3' o del extremo 5' del ARN, por ejemplo, eliminación, modificación o reemplazo de un grupo fosfato terminal o conjugación de un resto, por ejemplo, un resto marcado con fluorescencia, en el extremo 3' o 5' del ARN.
Los términos reemplazo, modificación y alteración indican una diferencia con respecto a una molécula de origen natural.
Se analizan modificaciones específicas con más detalle a continuación.
Los ejemplos de grupos fosfato modificados incluyen fosforotioato, fosforoselenatos, fosfatos de borano, ésteres de fosfato de borano, fosfonatos de hidrógeno, fosforamidatos, fosfonatos de alquilo o arilo y fosfotriésteres. Los fosforoditioatos tienen ambos oxígenos no enlazantes reemplazados por azufre. Uno, cada uno o los dos oxígenos no enlazantes en el grupo fosfato pueden ser independientemente uno cualquiera de S, Se, B, C, H, N u OR (R es alquilo o arilo).
El enlazador de fosfato también puede modificarse mediante reemplazo de un oxígeno enlazante por nitrógeno (fosforamidatos puenteados), azufre (fosforotioatos puenteados) y carbono (fosfonatos de metileno puenteados). El reemplazo puede producirse en un oxígeno terminal. Es posible reemplazar los oxígenos no enlazantes por nitrógeno.
Un nucleótido modificado puede incluir la modificación de los grupos de azúcar. El grupo 2' hidroxilo (OH) puede modificarse o reemplazarse por varios sustituyentes "oxi" o "desoxi" diferentes.
Los ejemplos de modificaciones "oxi"-grupo 2' hidroxilo incluyen alcoxi o ariloxi (OR, por ejemplo, R=H, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar); polietilenglicoles (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; los ácidos nucleicos "bloqueados" (ANB) en los que el 2' hidroxilo se conecta, por ejemplo, mediante un puente de metileno, con el 4' carbono del mismo azúcar ribosa; O-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino, etilendiamina, poliamino) y aminoalcoxi, O(CH2)nAMINA, (por ejemplo, AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino, etilendiamina, poliamino).
Las modificaciones "desoxi" incluyen hidrógeno, halógeno, amino (por ejemplo, NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, diheteroarilamino o aminoácido); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino), -NHC(O)R (R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar), ciano; mercapto; alquiltio-alquilo; tioalcoxi; y alquilo, cicloalquilo, arilo, alquenilo y alquinilo, que pueden estar opcionalmente sustituidos con, por ejemplo, una funcionalidad amino. Otros sustituyentes de determinadas realizaciones incluyen 2'-metoxietilo, 2'-OCH3, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo y 2'-fluoro. El grupo azúcar también puede contener uno o más carbonos que posean la configuración estereoquímica opuesta a la del carbono correspondiente en la ribosa. Por lo tanto, unos nucleótidos modificados pueden contener un azúcar tal como arabinosa.
Los nucleótidos modificados también pueden incluir azúcares "abásicos", que carecen de una nucleobase en C-1'. Estos azúcares abásicos pueden contener además modificaciones en uno o más de los átomos de azúcar constituyentes.
Las modificaciones de 2' pueden usarse en combinación con una o más modificaciones del enlazador de fosfato (por ejemplo, fosforotioato).
Los grupos fosfato pueden reemplazarse de manera individual por enlazadores que no contengan fósforo.
Los ejemplos de restos que pueden reemplazar el grupo fosfato incluyen siloxano, carbonato, carboximetilo, carbamato, amida, tioéter, enlazador de óxido de etileno, sulfonato, sulfonamida, tioformacetal, formacetal, oxima, metilenimino, metilenmetilimino, metilenhidrazo, metilendimetilhidrazo y metilenoximetilimino. En determinadas realizaciones, los reemplazos pueden incluir los grupos metilencarbonilamino y metilenmetilimino.
El enlazador de fosfato y el azúcar ribosa pueden reemplazarse por nucleótidos resistentes a nucleasas.
Los ejemplos incluyen los sustitutos de nucleósido morfolino, ciclobutilo, pirrolidina y ácido nucleico peptídico (ANP). En determinadas realizaciones, pueden usarse sustitutos de ANP.
Los extremos 3' y 5' de un oligonucleótido pueden modificarse. Dichas modificaciones pueden estar en el extremo 3' o el extremo 5' o en ambos extremos de la molécula. Pueden incluir la modificación o el reemplazo de un fosfato terminal completo o de uno o más de los átomos del grupo fosfato. Por ejemplo, los extremos 3' y 5' de un oligonucleótido pueden conjugarse con otras entidades moleculares funcionales tales como restos de marcado, por ejemplo, fluoróforos (por ejemplo, pireno, TAMRA, fluoresceína, colorantes Cy3 o Cy5) o grupos protectores (basados, por ejemplo, en azufre, silicio, boro o éster). Las entidades moleculares funcionales pueden unirse al azúcar a través de un grupo fosfato y/o un enlazador. El átomo terminal del enlazador puede conectarse a o reemplazar el átomo de enlace del grupo fosfato o el grupo O, N, S o C C-3' o C-5' del azúcar. Como alternativa, el enlazador puede conectarse a o reemplazar el átomo terminal de un sustituto de nucleótido (por ejemplo, ANP). Estos espaciadores o enlazadores pueden incluir, por ejemplo, -(CH2V , -(CH2)nN-, -(CH2)nO-, -(CH2)nS-, -(CH2CH2O)nCH2CH2O-(por ejemplo, n = 3 o 6), azúcares abásicos, amida, carboxi, amina, oxiamina, oxiimina, tioéter, disulfuro, tiourea, sulfonamida o morfolino, o reactivos de biotina y fluoresceína. El extremo 3' puede ser un grupo -OH.
Otros ejemplos de modificaciones terminales incluyen colorantes, agentes intercalantes (por ejemplo, acridinas), reticulantes (por ejemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo, fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales, EDTA, vehículos lipófilos (por ejemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido 1-pireno butírico, dihidrotestosterona, 1,3-Bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina) y conjugados peptídicos (por ejemplo, péptido antennapedia, péptido Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ejemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina), facilitadores de transporte/absorción (por ejemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas (por ejemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, grupos imidazol, conjugados acridina-imidazol, complejos Eu3+ de tetraazamacrociclos).
Pueden añadirse modificaciones terminales por una serie de razones, que incluyen modular la actividad o modular la resistencia a la degradación. Las modificaciones terminales útiles para modular la actividad incluyen la modificación del extremo 5' con fosfato o análogos de fosfato. Los ácidos nucleicos de la invención, en la primera o segunda cadena, pueden estar fosforilados en 5' o incluir un análogo de fosforilo en el extremo 5' principal. Las modificaciones con 5'-fosfato incluyen aquellas que son compatibles con el silenciamiento génico mediado por RISC. Las modificaciones adecuadas incluyen: 5'-monofosfato ((HO)2(O)P-O-5'); 5'-difosfato ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-trifosfato ((HO)2(O)P-O-(h O)(O)P-OP(HO)(O)-O-5'); protección de 5'-guanosina (7-metilada o no metilada) (7m-G-O-5-(HO)(O)P-O--(HO)(O)P--O--P(HO)(O)--O-5'); caperuza de 5'-adenosina (Appp) y cualquier estructura de caperuza de nucleótido modificada o sin modificar (N--O-5'-(HO)(O)P--O--(HO)(O)P--O--P(HO)(O)-O-5'); 5'-monotiofosfato (fosforotioato; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-monoditiofosfato (fosforoditioato; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-fosforotiolato ((HO)2(O)P-S-5'); cualquier combinación adicional de monofosfato, difosfato y trifosfato sustituidos por oxígeno/azufre (por ejemplo, 5'-a-tiotrifosfato, 5'-Y-tiotrifosfato, etc.), 5'-fosforamidatos ((HO)2(O)P-NH-5', (Ho)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-alquilfosfonatos (R = alquilo = metilo, etilo, isopropilo, propilo, etc., por ejemplo, RP(OH)(O)-O-5'-, (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'vinilfosfonato, 5'-alquiléterfosfonatos (R = alquiléter = metoximetilo (MeOCH2-), etoximetilo, etc., por ejemplo, RP(OH)(O)-O-5'-).
El ácido nucleico de la presente invención puede incluir una o más modificaciones de fosforotioato en uno o más de los extremos terminales de la primera y/o la segunda cadena. Opcionalmente, cada uno o cualquiera de los extremos de la primera cadena puede comprender uno o dos o tres nucleótidos modificados con fosforotioato. Opcionalmente, cada uno de los extremos de la segunda cadena puede comprender uno o dos o tres nucleótidos modificados con fosforotioato.
Las modificaciones terminales también pueden ser útiles para controlar la distribución y en dichos casos los grupos que han de añadirse pueden incluir fluoróforos, por ejemplo, fluoresceína o un colorante Alexa. Las modificaciones terminales también pueden ser útiles para potenciar la captación, las modificaciones útiles para esto incluyen el colesterol. Las modificaciones terminales también pueden ser útiles para reticular un agente de ARN con otro resto.
La adenina, la guanina, la citosina y el uracilo son las bases más comunes que se encuentran en el ARN. Estas bases pueden modificarse o reemplazarse para proporcionar ARN que tengan propiedades mejoradas. Por ejemplo, pueden prepararse oligorribonucleótidos resistentes a nucleasas con estas bases o con nucleobases sintéticas y naturales (por ejemplo, inosina, timina, xantina, hipoxantina, nubularina, isoguanisina o tubercidina) y una cualquiera de las modificaciones anteriores. Como alternativa, pueden emplearse análogos sustituidos o modificados de cualquiera de las bases anteriores y "bases universales". Los ejemplos incluyen 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 5-halouracilo, 5-(2-aminopropil)uracilo, 5-amino alil uracilo, 8-halo, amino, tiol, tioalquilo, hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina, pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina, dihidrouracilo, 3-deaza-5-azacitosina, 2-aminopurina, 5-alquiluracilo, 7-alquilguanina, 5-alquilcitosina, 7-desazaadenina, N6,N6-dimetiladenina, 2,6-diaminopurina, 5-amino-alil-uracilo, N3-metiluracilo, 1,2,4-triazoles sustituidos, 2-piridinona, 5-nitroindol, 3-nitropirrol, 5-metoxiuracilo, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouracilo, 5-metilaminometil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uracilo, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N<4>-acetilcitosina, 2-tiocitosina, N6-metiladenina, N6-isopentiladenina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, N-metilguaninas o bases O-alquiladas.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "análogo de nucleótido no emparejado" significa un análogo de nucleótido que incluye un resto de emparejamiento que no es una base que incluye, pero sin limitación: 6 des amino adenosina (Nebularina), 4-Me-indol, 3-nitropirrol, 5-nitroindol, Ds, Pa, N3-Me ribo U, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-MedT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-metil-dC, N3-Me dC. En algunas realizaciones, el análogo de nucleótido sin emparejamiento por las bases es un ribonucleótido. En otras realizaciones es un desoxirribonucleótido.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión, "grupo funcional terminal" incluye, sin limitación, un halógeno, alcohol, amina, carboxílico, éster, amida, aldehído, cetona, grupos éter.
Determinados restos pueden estar enlazados al extremo 5' de la primera cadena o de la segunda cadena. Estos incluyen un resto de ribosa abásica, un resto desoxirribosa abásica, modificaciones de ribosa abásica y restos desoxirribosa abásica que incluyen modificaciones con 2' O alquilo; restos de ribosa abásica invertida y desoxirribosa abásica y modificaciones de los mismos, C6-imino-Pi; un nucleótido espejo que incluye L-ADN y L-ARN; nucleótido de 5'OMe; y análogos de nucleótidos que incluyen nucleótido de 4',5'-metileno; 1-(p-D-eritrofuranosil)nucleótido; 4'-tio nucleótido, nucleótido carbocíclico; fosfato de 5'-amino-alquilo; fosfato de 1,3-diamino-2-propilo, fosfato de 3-aminopropilo; fosfato de 6-aminohexilo; fosfato de 12-aminododecilo; fosfato de hidroxipropilo; nucleótido de 1,5-anhidrohexitol; a-nucleótido; nucleótido de treo-pentofuranosilo; 3',4'-seco nucleótido acíclico; nucleótido de 3,4-dihidroxibutilo; nucleótido de 3,5-dihidroxipentilo, resto abásico invertido 5'-5'; fosfato de 1,4-butanodiol; 5'-amino; y metilfosfonato de unión y no de unión y restos 5'-mercapto.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden incluir uno o más nucleótidos invertidos, por ejemplo, timidina invertida o adenina invertida (por ejemplo, véase Takei et al., 2002. JBC 277 (26):23800-06).
Como se utiliza en el presente documento, el término "inhibir", "regular negativamente" o "reducir" con respecto a la expresión génica significa que la expresión del gen, o el nivel de moléculas de ARN o moléculas de ARN equivalentes que codifican una o más proteínas o subunidades de proteínas (por ejemplo, ARNm), o la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteínas, se reduce por debajo de la observada en ausencia del ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención o en referencia a una molécula de ARNip sin homología conocida con los transcritos humanos (en el presente documento denominado control sin silenciamiento). Dicho control puede conjugarse y modificarse de manera análoga a la molécula de la invención y administrarse en la célula diana por la misma vía; por ejemplo, la expresión puede reducirse al 90 %, al 80 %, al 70 %, al 60 %, al 50 %, al 40 %, al 30 %, al 20 %, al 15 % o a valores intermedios o inferiores a los observados en ausencia del ácido nucleico o ácido nucleico conjugado o en presencia de un control sin silenciamiento.
El ácido nucleico de la presente invención puede comprender un nucleótido abásico. El término "abásico", como se usa en el presente documento, se refiere a restos que carecen de una base o que tienen otros grupos químicos en lugar de una base en la posición 1', por ejemplo, un derivado de ribosa desoxiabásico unido 3',3' o unido 5',5'.
El ácido nucleico puede comprender uno o más nucleótidos en las cadenas segunda y/o primera que se modifican. Pueden modificarse nucleótidos alternos, para formar nucleótidos modificados.
Alternos, como se describe en el presente documento, significa que se produce uno tras otro de manera regular. En otras palabras, alternos significa que se produce a su vez repetidamente. Por ejemplo, si se modifica un nucleótido, el siguiente nucleótido contiguo no se modifica y el siguiente nucleótido contiguo se modifica y así sucesivamente. Un nucleótido puede estar modificado con una primera modificación, el siguiente nucleótido contiguo puede modificarse con una segunda modificación y el siguiente nucleótido contiguo se modifica con la primera modificación y así sucesivamente, donde las modificaciones primera y segunda son diferentes.
Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos impares de la primera cadena del ácido nucleico de la invención, en donde la primera cadena se numera de 5' a 3', siendo el nucleótido más 5' el nucleótido número 1 de la primera cadena. El término "impar", como se describe en el presente documento, significa un número no divisible entre dos. Son ejemplos de números impares 1, 3, 5, 7, 9, 11 y así sucesivamente. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos pares de la primera cadena del ácido nucleico de la invención, en donde la primera cadena se numera de 5' a 3'. El término "par" como se describe en el presente documento significa un número que es divisible uniformemente por dos. Son ejemplos de números pares 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y así sucesivamente. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos impares de la segunda cadena del ácido nucleico de la invención, en donde la segunda cadena se numera de 3' a 5', siendo el nucleótido más 3' el nucleótido número 1 de la segunda cadena. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos pares de la segunda cadena del ácido nucleico de la invención, en donde la segunda cadena se numera de 3' a 5'.
Pueden modificarse uno o más nucleótidos en la cadena primera y/o segunda, para formar nucleótidos modificados. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos impares de la primera cadena. Pueden modificarse uno o más de los nucleótidos pares de la primera cadena mediante al menos una segunda modificación, en donde al menos la segunda modificación es diferente de la modificación en dichos uno o más nucleótidos impares. Al menos uno de dichos uno o más nucleótidos pares modificados puede ser adyacente a al menos uno de dichos uno o más nucleótidos impares modificados.
Puede modificarse una pluralidad de nucleótidos impares en la primera cadena en el ácido nucleico de la invención. Una pluralidad de nucleótidos pares en la primera cadena puede modificarse mediante una segunda modificación. La primera cadena puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican mediante una modificación común. La primera cadena también puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican mediante una segunda modificación diferente.
Uno o más de los nucleótidos impares de la segunda cadena pueden modificarse mediante una modificación que sea diferente de la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena y/o uno o más de los nucleótidos pares de la segunda cadena pueden modificarse mediante la misma modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena. Al menos uno de dichos uno o más nucleótidos pares modificados de la segunda cadena puede ser adyacente a dichos uno o más nucleótidos impares modificados. Una pluralidad de nucleótidos impares de la segunda cadena puede modificarse mediante una modificación común y/o una pluralidad de nucleótidos pares puede modificarse mediante la misma modificación que está presente en los nucleótidos impares de la primera cadena. Una pluralidad de nucleótidos impares en la segunda cadena puede modificarse mediante una segunda modificación, en donde la segunda modificación es diferente de la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena.
La segunda cadena puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican mediante una modificación común, que puede ser una segunda modificación que sea diferente de la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena.
En el ácido nucleico de la invención, cada uno de los nucleótidos impares en la primera cadena y cada uno de los nucleótidos pares en la segunda cadena pueden modificarse con una modificación común y, cada uno de los nucleótidos pares puede modificarse en la primera cadena con una segunda modificación y cada uno de los nucleótidos impares puede modificarse en la segunda cadena con la segunda modificación.
El ácido nucleico de la invención puede tener los nucleótidos modificados de la primera cadena desplazados por al menos un nucleótido con respecto a los nucleótidos sin modificar o modificados de manera diferente de la segunda cadena.
Uno o más o cada uno de los nucleótidos impares pueden modificarse en la primera cadena y uno o más o cada uno de los nucleótidos pares pueden modificarse en la segunda cadena. Uno o más o cada uno de los nucleótidos alternos en una de las dos o las dos cadenas pueden modificarse mediante una segunda modificación. Uno o más o cada uno de los nucleótidos pares pueden modificarse en la primera cadena y uno o más o cada uno de los nucleótidos pares pueden modificarse en la segunda cadena. Uno o más o cada uno de los nucleótidos alternos en una de las dos o las dos cadenas pueden modificarse mediante una segunda modificación. Uno o más o cada uno de los nucleótidos impares pueden modificarse en la primera cadena y uno o más de los nucleótidos impares pueden modificarse en la segunda cadena mediante una modificación común. Uno o más o cada uno de los nucleótidos alternos en una de las dos o las dos cadenas pueden modificarse mediante una segunda modificación. Uno o más o cada uno de los nucleótidos pares pueden modificarse en la primera cadena y uno o más o cada uno de los nucleótidos impares pueden modificarse en la segunda cadena mediante una modificación común. Uno o más o cada uno de los nucleótidos alternos en una de las dos o las dos cadenas pueden modificarse mediante una segunda modificación.
El ácido nucleico de la invención puede comprender construcciones monocatenarias o bicatenarias que comprendan al menos dos regiones de modificaciones alternas en una o ambas cadenas. Estas regiones alternas pueden comprender hasta aproximadamente 12 nucleótidos, pero preferentemente comprenden de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 nucleótidos. Las regiones de nucleótidos alternos pueden ubicarse en los extremos de una o ambas cadenas del ácido nucleico de la invención. El ácido nucleico puede comprender de 4 a aproximadamente 10 nucleótidos de nucleótidos alternos en cada extremo (3' y 5') y estas regiones pueden estar separadas por aproximadamente 5 a aproximadamente 12 nucleótidos contiguos no modificados o modificados de manera diferente o común.
Pueden modificarse los nucleótidos impares de la primera cadena y los nucleótidos pares pueden modificarse con una segunda modificación. La segunda cadena puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican con una modificación común, que puede ser la misma modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena. También se pueden modificar uno o más nucleótidos de la segunda cadena con la segunda modificación. Uno o más nucleótidos con la segunda modificación pueden ser adyacentes entre sí y con nucleótidos que tengan una modificación que sea la misma que la modificación de los nucleótidos impares de la primera cadena. La primera cadena también puede comprender enlaces de fosforotioato entre los dos nucleótidos en el extremo 3' y en el extremo 5'. La segunda cadena puede comprender un enlace de fosforotioato entre los dos nucleótidos en el extremo 5'. La segunda cadena también puede conjugarse con un ligando en el extremo 5'.
El ácido nucleico de la invención puede comprender una primera cadena que comprenda nucleótidos adyacentes que se modifican con una modificación común. Uno o más de dichos nucleótidos pueden estar adyacentes a uno o más nucleótidos que pueden estar modificados con una segunda modificación. Uno o más nucleótidos con la segunda modificación pueden ser adyacentes. La segunda cadena puede comprender nucleótidos adyacentes que se modifican con una modificación común, que puede ser igual a una de las modificaciones de uno o más nucleótidos de la primera cadena. También se pueden modificar uno o más nucleótidos de la segunda cadena con la segunda modificación. Uno o más nucleótidos con la segunda modificación pueden ser adyacentes. La primera cadena también puede comprender enlaces de fosforotioato entre los dos nucleótidos en el extremo 5' y en el extremo 3'. La segunda cadena puede comprender un enlace de fosforotioato entre los dos nucleótidos en el extremo 3'. La segunda cadena también puede conjugarse con un ligando en el extremo 5'.
Los nucleótidos numerados de 5' a 3' en la primera cadena y 3' a 5' en la segunda cadena, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23 y 25 pueden modificarse mediante una modificación en la primera cadena. Los nucleótidos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 pueden modificarse mediante una segunda modificación en la primera cadena. Los nucleótidos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 pueden modificarse mediante una modificación en la segunda cadena. Los nucleótidos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 pueden modificarse mediante una segunda modificación en la segunda cadena. Los nucleótidos están numerados para el ácido nucleico de la presente invención de 5' a 3' en la primera cadena y 3' y 5' en la segunda cadena.
Los nucleótidos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 pueden modificarse mediante una modificación en la primera cadena. Los nucleótidos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 pueden modificarse mediante una segunda modificación en la primera cadena. Los nucleótidos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 pueden modificarse mediante una modificación en la segunda cadena. Los nucleótidos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 pueden modificarse mediante una segunda modificación en la segunda cadena.
Evidentemente, si la primera y/o la segunda cadena tienen una longitud inferior a 25 nucleótidos, tal como 19 nucleótidos de longitud, no hay nucleótidos numerados 20, 21, 22, 23, 24 y 25 por modificar. El experto en la materia entiende que la descripción anterior se aplica a cadenas más cortas, en consecuencia.
Uno o más nucleótidos modificados en la primera cadena pueden emparejarse con nucleótidos modificados en la segunda cadena que tengan una modificación común. Uno o más nucleótidos modificados en la primera cadena pueden emparejarse con nucleótidos modificados en la segunda cadena que tengan una modificación diferente. Uno o más nucleótidos modificados en la primera cadena pueden emparejarse con nucleótidos no modificados en la segunda cadena. Uno o más nucleótidos modificados en la segunda cadena pueden emparejarse con nucleótidos no modificados en la primera cadena. En otras palabras, los nucleótidos alternos pueden estar alineados en las dos cadenas tal como, por ejemplo, todas las modificaciones de las regiones alternas de la segunda cadena se emparejan con modificaciones idénticas de la primera cadena o, como alternativa, las modificaciones pueden compensarse con un nucleótido con las modificaciones comunes de las regiones alternas de una cadena emparejadas con modificaciones diferentes (es decir, una segunda modificación o modificación adicional) en la otra cadena. Otra opción es tener modificaciones diferentes en cada una de las cadenas.
Las modificaciones de la primera cadena pueden estar desplazadas por un nucleótido en relación con los nucleótidos modificados de la segunda cadena, de manera que los nucleótidos modificados comunes no se emparejan entre sí.
La modificación y/o modificaciones pueden seleccionarse cada una individualmente del grupo que consiste en desoxitimina 3'-terminal, 2'-O-metilo, una modificación con 2'-desoxi, una modificación con 2'-amino, una modificación con 2'-alquilo, una modificación con morfolino, una modificación con fosforamidato, una modificación con grupo 5'-fosforotioato, una modificación con fosfato en 5' o mimético de fosfato en 5' y un derivado de colesterilo o una modificación de grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico y/o el nucleótido modificado puede ser uno cualquiera de entre un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico o una base no natural que comprende nucleótido.
Al menos una modificación puede ser 2'-O-metilo y/o al menos una modificación puede ser 2'-F. Otras modificaciones, como se describe en el presente documento, pueden estar presentes en la primera y/o la segunda cadena.
El ácido nucleico de la invención puede comprender un nucleótido de ARN invertido en uno o varios de los extremos de la cadena. Dichos nucleótidos invertidos proporcionan estabilidad al ácido nucleico. Preferentemente, el ácido nucleico comprende al menos un nucleótido invertido en uno o varios del extremo 3' de al menos una de las cadenas y/o en el extremo 5' de la segunda cadena. Más preferentemente, el ácido nucleico comprende un nucleótido invertido en el extremo 3' de la segunda cadena. Lo más preferentemente, el ácido nucleico comprende un nucleótido de ARN invertido en el extremo 3' de la segunda cadena y este nucleótido es preferiblemente una A invertida. El nucleótido invertido está presente preferiblemente en un extremo de una cadena no como un saliente sino opuesto a un nucleótido correspondiente en la otra cadena. Un ácido nucleico con tal modificación es estable y fácil de sintetizar.
A lo largo de la descripción de la invención, "modificación igual o común" significa la misma modificación de cualquier nucleótido, ya sea A, G, C o U modificado con un grupo, tal como un grupo metilo o un grupo fluoro. No se entiende como la misma adición en el mismo nucleótido. Por ejemplo, 2'F-dU, 2'F-dA, 2'F-dC, 2'F-dG se considera que todas son igual o una modificación común, como son 2'-OMe-rU, 2'-OMe-rA; 2'-OMe-rC; 2'-OMe-rG. Una modificación 2'F es una modificación diferente a una modificación 2'OMe.
Algunas secuencias de ácidos nucleicos modificadas representativas de la presente invención se muestran en los ejemplos. Estos ejemplos pretenden ser representativos y no limitativos.
Preferentemente, el ácido nucleico puede comprender una modificación y una segunda o posterior modificación, que se seleccionan individualmente del grupo que comprende la modificación 2'-O-metilo y la modificación 2'-F. El ácido nucleico puede comprender una modificación que sea 2-O-metilo (2'OMe) que puede ser una primera modificación y una segunda modificación que sea 2'-F. El ácido nucleico de la invención también puede incluir una modificación de fosforotioato y/o una modificación de desoxi que puede estar presente en o entre los 1, 2 o 3 nucleótidos terminales de todos los extremos o de cualquier extremo de cada cadena o ambas cadenas.
En algunas realizaciones, los nucleótidos de la primera cadena se modifican mediante una primera modificación en los nucleótidos impares y se modifican mediante una segunda modificación en los nucleótidos pares y los nucleótidos de la segunda cadena se modifican mediante una tercera modificación en los nucleótidos pares y se modifican mediante una cuarta modificación los nucleótidos impares, en donde al menos la primera modificación es diferente de la segunda modificación y la tercera modificación es diferente de la cuarta modificación. Las modificaciones tercera y primera pueden ser iguales o diferentes, las modificaciones segunda y cuarta pueden ser iguales o diferentes. Las modificaciones primera y segunda pueden ser diferentes entre sí y las modificaciones tercera y cuarta pueden ser diferentes entre sí.
La segunda cadena puede comprender la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 10. Los nucleótidos de la primera cadena pueden modificarse mediante una primera modificación en los nucleótidos impares y modificarse con una segunda modificación en los nucleótidos pares y la segunda cadena puede modificarse en los nucleótidos impares con la segunda modificación y modificarse con la primera modificación en los nucleótidos pares. La primera modificación puede ser 2'OMe y la segunda modificación puede ser 2'F. Las modificaciones pueden ser las establecidas en la Tabla 1.
El ácido nucleico de la invención puede conjugarse con un ligando. La administración eficaz de oligonucleótidos, en particular de ácidos nucleicos bicatenarios de la invención, a células in vivo es importante y requiere un direccionamiento específico y una protección sustancial del ambiente extracelular, en particular de las proteínas del suero. Un método para lograr un direccionamiento específico es conjugar un ligando con el ácido nucleico. El ligando ayuda a dirigir el ácido nucleico al sitio diana necesario. Existe una necesidad de conjugar ligandos adecuados para las moléculas receptoras deseadas con el fin de que las células diana absorban las moléculas conjugadas mediante mecanismos tales como diferentes rutas de endocitosis mediadas por receptores o procesos funcionalmente análogos.
Un ejemplo es el complejo del receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R, del inglés asialoglycoprotein receptor) compuesto por proporciones variables de multímeros de los receptores de membrana ASGR1 y ASGR2, que es muy abundante en los hepatocitos y tiene una gran afinidad por el resto de GalNAc descrito en el presente documento. Una de las primeras divulgaciones del uso de glucósidos de grupos triantenarios como ligandos conjugados fue en la patente estadounidense número US 5.885.968. Los conjugados que tienen tres ligandos de GaINAc y que comprenden grupos fosfato se conocen y se describen en Dubber et al. (Bioconjug. Chem. enero-febrero de 2003; 14(1):239-46). El complejo del ASGP-R muestra una afinidad 50 veces mayor por la N-acetil-D-galactosilamina (GalNAc) que por la D-Gal.
El complejo del receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R), que reconoce de manera específica subunidades de pgalactosilo terminales de proteínas glucosiladas u otros oligosacáridos (Weigel, P. H. et al., Biochim. Biophys. Acta.
19 de septiembre de 2002;1572(2-3):341-63), se puede utilizar para administrar un fármaco a los hepatocitos del hígado que expresan el complejo del receptor mediante el acoplamiento covalente de galactosa o galactosamina a la sustancia farmacológica (Ishibashi, S.; et al., J Biol. Chem. 11 de noviembre de 1994; 269(45):27803-6). Además, la afinidad de unión puede aumentarse significativamente por el efecto de valencia múltiple, que se logra mediante la repetición del resto de direccionamiento (Biessen E. A. et al., J Med Chem. 28 de abril de 1995; 38(9):1538-46.
El complejo del ASGP-R es un mediador para una captación activa de glucoproteínas que contienen p-galactosilo terminal en los endosomas de la célula. Por lo tanto, el ASGPR es muy adecuado para la administración dirigida de candidatos a fármacos conjugados con dichos ligandos como, por ejemplo, ácidos nucleicos en células que expresan receptores (Akinc et al., Mol Ther. Julio de 2010; 18(7):1357-64).
De manera más general, el ligando puede comprender un sacárido que se selecciona para que tenga afinidad por al menos un tipo de receptor en una célula diana. En particular, el receptor está en la superficie de una célula hepática de mamífero, por ejemplo, el complejo del receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R) hepática descrito antes.
El sacárido puede seleccionarse entre N-acetil galactosamina, manosa, galactosa, glucosa, glucosamina y fucosa. El sacárido puede ser N-acetil galactosamina (GaINAc).
Por lo tanto, un ligando para su uso en la presente invención puede comprender (i) uno o más restos de N-acetil galactosamina (GaINAc) y derivados de la misma, y (ii) un enlazador, en donde el enlazador conjuga los restos de GalNAc con una secuencia, como se define en cualquiera de los aspectos anteriores. El enlazador puede ser una estructura ramificada bivalente, trivalente o tetravalente. Los nucleótidos pueden modificarse como se define en el presente documento.
"GalNAc" se refiere a 2-(Acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, habitualmente denominada en la bibliografía Nacetil galactosamina. La referencia a "GalNAc" o a "N-acetil galactosamina" incluye tanto la forma p: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa, como la forma a: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa. Tanto la forma p: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa como la forma a: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa pueden utilizarse indistintamente. Preferentemente, los compuestos de la invención comprenden la forma p, 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa.
Por lo tanto, el ligando puede comprender GalNAc.
El ligando puede comprender un compuesto de fórmula I:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
en donde:
S representa un sacárido, en donde el sacárido es N-acetil galactosamina;
X1 representa alquileno C3-C6 o (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2 - en donde m es 1, 2 o 3;
P es un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato);
X2 es alquileno o un éter de alquileno de fórmula (-CH2VO-CH 2- donde n = 1 a 6 ;
A es una unidad de ramificación;
X3 representa una unidad de unión;
en donde un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está conjugado con X3 a través de un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato).
En la fórmula I, la unidad de ramificación "A" se ramifica en tres con el fin de acomodar los tres ligandos sacarídicos. La unidad de ramificación se une de manera covalente a las partes ancladas restantes del ligando y el ácido nucleico. La unidad de ramificación puede comprender un grupo alifático ramificado que comprenda grupos seleccionados entre grupos alquilo, amida, disulfuro, polietilenglicol, éter, tioéter e hidroxiamino. La unidad de ramificación puede comprender grupos seleccionados entre grupos alquilo y éter.
La unidad de ramificación A puede tener una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000021_0001
en donde cada A1 representa independientemente O, S, C=O o NH; y
cada n representa independientemente un número entero de 1 a 2 0.
La unidad de ramificación puede tener una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000021_0002
en donde cada A1 representa independientemente O, S, C=O o NH; y
cada n representa independientemente un número entero de 1 a 2 0.
La unidad de ramificación puede tener una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000022_0001
en donde Ai es O, S, C=O o NH; y
cada n representa independientemente un número entero de 1 a 20.
La unidad de ramificación puede tener la estructura:
Figure imgf000022_0002
La unidad de ramificación puede tener la estructura:
Figure imgf000022_0003
La unidad de ramificación puede tener la estructura:
Figure imgf000022_0004
Opcionalmente, la unidad de ramificación consiste en solo un átomo de carbono.
La parte "X3" es una unidad de unión. La unidad de unión es lineal y se une covalentemente a la unidad de ramificación y al ácido nucleico.
X3 se puede seleccionar de alquileno C1-C20, alquenileno C2-C20-, un éter de alquileno de fórmula -(alquileno C1-C20)-O-(alquileno C1-C20)-, -C(O)-alquileno C1-C20-, -alquileno C0-C4(Cy)alquileno C0-C4- en donde Cy representa un anillo cicloalquileno, arileno, heterociclileno o heteroarileno sustituido o sin sustituir de 5 o 6 miembros, -alquileno C1-C4-NHC(O)-alquileno C1-C4-, -alquileno C1-C4-C(O)NH-alquileno C1-C4-, -alquileno C1-C4-SC(O)-alquileno C1-C4-, -alquileno C1-C4-C(O)S-alquileno C1-C4-, -alquileno C1-C4-OC(O)-alquileno C1-C4-, -alquileno C1-C4-C(O)O-alquileno C1-C4- y -alquileno C1-C6-S-S-alquileno C1-C6-.
X3 puede ser un éter de alquileno de fórmula -(alquileno C1-C20)-O-(alquileno C1-C20)-. X3 puede ser un éter de alquileno de fórmula -(alquileno C1-C20)-O-(alquileno C4-C20)-, en donde dicho (alquileno C4-C20) se une a Z. X3 puede seleccionarse entre el grupo que consiste en -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- y H2-O-C8H16-, en especial -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- y H2-O-C8H16-, en donde en cada caso el grupo -CH2- se une a A.
El ligando puede comprender un compuesto de fórmula (II):
[S-X1-Pp-X2]a-A-X3- (II)
en donde:
S representa un sacárido;
X1 representa alquileno C3-C6 o (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- en donde m es 1, 2 o 3;
P es un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato);
X2 es alquileno C1-C8 ;
A es una unidad de ramificación seleccionada de:
Figure imgf000023_0001
A1=O, NH A1 = O, NH A2 = NH, CH2, O
n = 1 a 4 n = 1 a 4
X3 es una unidad de unión;
en donde un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está conjugado con X3 a través de un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato)
La unidad de ramificación A puede tener la estructura:
Figure imgf000023_0002
La unidad de ramificación A puede tener la
Figure imgf000023_0003
Figure imgf000023_0004
en donde X3 se une al átomo de nitrógeno.
X3 puede ser alquileno C1-C20. Preferentemente, X3 se selecciona entre el grupo que consiste en -C3H6-, -C4H8-,-C6H12-y -C8H16-, especialmente -C4H8--C 6H12- y -C8H16-.
El ligando puede comprender un compuesto de fórmula (III):
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (III)
en donde:
S representa un sacárido;
X1 representa alquileno C3-C6 o (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- en donde m es 1, 2 o 3;
P es un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato);
X2 es un éter de alquileno de fórmula -C3H6-O-CH2-;
A es una unidad de ramificación;
X3 es un éter de alquileno de fórmula seleccionada del grupo que consiste en -CH2-O-CH2-, -CH2-O-C2H4-, -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14- y -CH2-O-C8H16-, en donde en cada caso el grupo -CH2- se une a A y en donde X3 se conjuga con un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención mediante un fosfato o fosfato modificado (preferiblemente un tiofosfato).
La unidad de ramificación puede comprender carbono. Preferentemente, la unidad de ramificación es carbono. X3 puede seleccionarse entre el grupo que consiste en -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-y -CH2-O-C8H16-. Preferentemente, X3 se selecciona entre el grupo que consiste en -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- y -CH2-O-C8H16.
Para cualquiera de los aspectos anteriores, cuando P representa un grupo fosfato modificado, P se puede representar por:
Figure imgf000024_0001
en donde Y1 e Y2 representan cada uno independientemente =O, =S, -O-, -OH, -SH, -BH3, -OCH2CO2 , -OCH2CO2Rx, -OCH2C(S)ORx y -ORx, en donde Rx representa alquilo C1-C6 y en donde
Figure imgf000024_0002
indica unión al resto del compuesto.
Por fosfato modificado se entiende un grupo fosfato en donde se reemplaza uno o más de los oxígenos que no se unen. Los ejemplos de grupos fosfato modificados incluyen fosforotioato, fosforoselenatos, fosfatos de borano, ésteres de fosfato de borano, fosfonatos de hidrógeno, fosforamidatos, fosfonatos de alquilo o arilo y fosfotriésteres. Los fosforoditioatos tienen ambos oxígenos no enlazantes reemplazados por azufre. Uno, cada uno o los dos oxígenos no enlazantes en el grupo fosfato pueden ser independientemente uno cualquiera de S, Se, B, C, H, N u OR (R es alquilo o arilo).
El fosfato también se puede modificar mediante el reemplazo de un oxígeno enlazante por nitrógeno (fosforamidatos puenteados), azufre (fosforotioatos puenteados) y carbono (fosfonatos de metileno puenteados). El reemplazo puede producirse en un oxígeno terminal. Es posible reemplazar los oxígenos no enlazantes por nitrógeno.
Por ejemplo, Y1 puede representar -OH e Y2 puede representar =O o =S; o
Y1 puede representar -O' e Y2 puede representar =O o =S;
Y1 puede representar =O e Y2 puede representar -CH3, -SH, -ORx o -BH3
Y1 puede representar =S e Y2 puede representar -CH3 , ORx o -SH.
El experto en la materia comprenderá que en determinados casos habrá deslocalización entre Y1 e Y2.
Preferentemente, el grupo fosfato modificado es un grupo tiofosfato. Los grupos tiofosfato incluyen bitiofosfato (es decir, donde Y1 representa =S e Y2 representa -S‘) y monotiofosfato (es decir, donde Y1 representa -O‘ e Y2 representa =S, o donde Y1 representa =O e Y2 representa -S‘). Preferentemente, P es un monotiofosfato. Los inventores han descubierto que los conjugados que tienen grupos tiofosfato en reemplazo de los grupos fosfato tienen una potencia y duración de la acción in vivo mejoradas.
P también puede ser un fosfato de etilo (es decir, donde Y1 representa =O e Y2 representa OCH2CH3).
El sacárido puede seleccionarse para que tenga una afinidad por al menos un tipo de receptor en una célula diana. En particular, el receptor está en la superficie de una célula hepática de mamífero, por ejemplo, el complejo del receptor hepático de asialoglucoproteína (ASGP-R).
Para cualquiera de los aspectos anteriores, el sacárido se puede seleccionar de N-acetilo con uno o más de galactosamina, manosa, galactosa, glucosa, glucosamina y fructosa. Normalmente, un ligando para usar en la presente invención puede incluir N-acetil galactosamina (GalNAc). Preferentemente, los compuestos de la invención pueden tener 3 ligandos, cada uno de los cuales incluirá preferentemente N-acetil galactosamina.
"GalNAc" se refiere a 2-(Acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, habitualmente denominada en la bibliografía N-acetil galactosamina. La referencia a "GalNAc" o a "N-acetil galactosamina" incluye tanto la forma p: 2-(Acetilamino)2-desoxi-p-D-galactopiranosa como la forma a: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa. En determinadas realizaciones, tanto la forma p: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa como la forma a: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa pueden utilizarse indistintamente. Preferentemente, los compuestos de la invención comprenden la forma p, 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa.
Figure imgf000025_0001
2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa
Para cualquiera de los compuestos anteriores de fórmula (III), X1 puede ser (-CH2-CH2-O)(-CH2)2-. X1 puede ser (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-. X1 puede ser (-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-. Preferentemente, X1 es (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-. Como alternativa, X1 representa alquileno C3-C6. X1 puede ser propileno. X1 puede ser butileno. X1 puede ser pentileno. X1 puede ser hexileno. Preferentemente, el alquilo es un alquileno lineal. En particular, X1 puede ser butileno.
Para compuestos de fórmula (III), X2 representa un éter de alquileno de fórmula -C3H6-O-CH2-, es decir, alcoxi C3-metileno o -CH2CH2CH2OCH2-.
La invención proporciona un ácido nucleico conjugado que tiene una de las siguientes estructuras:
Figure imgf000026_0001

Figure imgf000027_0001

Figure imgf000028_0001

Figure imgf000029_0001

Figure imgf000030_0001
en donde Z es un ácido nucleico como se ha definido anteriormente en el presente documento.
Un ligando de fórmula (I), (II) o (III) se puede unir en el extremo 3' de la primera cadena (antisentido) y/o en cualquiera de los extremos 3' y/o 5' de la segunda cadena (de sentido). El ácido nucleico puede comprender más de un ligando de fórmula (I), (II) o (III). Sin embargo, se prefiere un único ligando de fórmula (I), (II) o (III) porque un único ligando de este tipo es suficiente para el direccionamiento eficaz del ácido nucleico a las células diana.
Preferentemente, el extremo 5' de la primera cadena (antisentido) no está unido a un ligando de fórmula (I), (II) o (III), ya que un ligando en esta posición puede potencialmente interferir con la actividad biológica del ácido nucleico.
Un ácido nucleico con un único ligando de fórmula (I), (II) o (III) en el extremo 5' de una cadena es más fácil y, por lo tanto, más barato de sintetizar que el mismo ácido nucleico con el mismo ligando en el extremo 3'. Preferentemente, por lo tanto, un único ligando de cualquiera de las fórmulas (I), (II) o (III) se une de manera covalente a (se conjuga con) el extremo 5' de la segunda cadena del ácido nucleico.
En una realización, el ácido nucleico se conjuga con un ligando que comprende un lípido y, más preferentemente, un ligando que comprende un colesterol.
Un conjugado de la invención puede comprender cualquier ácido nucleico como se ha descrito en el presente documento conjugado con cualquier ligando o ligandos como se ha descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, la presente invención también se refiere a un conjugado para inhibir la expresión de un gen LPA en una célula, comprendiendo dicho conjugado una parte de ácido nucleico, que comprende el ácido nucleico de la invención, y al menos una parte de ligando, dicha parte de ácido nucleico comprendiendo al menos una región doble que comprende al menos una parte de una primera cadena de ARN y al menos una parte de una segunda cadena de ARN que es complementaria al menos parcialmente de la primera cadena, en donde dicha primera cadena es complementaria al menos parcialmente de al menos una parte del ARN transcrito a partir del gen LPA, comprendiendo dicha al menos una parte de ligando un resto enlazador, preferentemente un resto enlazador procedente de serinol, y un ligando de direccionamiento para el direccionamiento in vivo de células y estando conjugado exclusivamente con los extremos 3' y/o 5' de una o ambas cadenas de ARN, en donde el extremo 5' de la primera cadena de ARN no está conjugado, en donde:
(i) la segunda cadena de ARN está conjugada en el extremo 5' con el ligando de direccionamiento, y en donde (a) la segunda cadena de ARN también está conjugada en el extremo 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 3' de la primera cadena de ARN no está conjugado; o (b) la primera cadena de ARN está conjugada en el extremo 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 3' de la segunda cadena de ARN no está conjugado; o (c) tanto la segunda cadena de ARN como la primera cadena de ARN también están conjugadas en los extremos 3' con el ligando de direccionamiento; o
(ii) tanto la segunda cadena de ARN como la primera cadena de ARN están conjugadas en los extremos 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 5' de la segunda cadena de ARN no está conjugado.
En una realización de la presente invención, la segunda cadena de ARN (es decir, la cadena de sentido) se conjuga en el extremo 5' con un ligando de direccionamiento, la primera cadena de ARN (es decir, la cadena de antisentido) se conjuga en el extremo 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 3' de la segunda cadena de ARN (es decir, la cadena de sentido) no se conjuga, de modo que se forma un conjugado con la estructura esquemática como se muestra en la Figura 40A.
En una realización de la presente invención, la segunda cadena de ARN (es decir, la cadena de sentido) se conjuga en el extremo 5' con el ligando de direccionamiento, la segunda cadena de ARN (es decir, la cadena de sentido) se conjuga en el extremo 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 3' de la primera cadena de ARN (es decir, la cadena de antisentido) no se conjuga, de modo que se forma un conjugado con la estructura esquemática como se muestra en la Figura 40B.
En una realización de la presente invención, tanto la segunda cadena de ARN (es decir, la cadena de sentido) como la primera cadena de ARN (es decir, la cadena de antisentido) se conjugan en los extremos 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 5' de la segunda cadena de ARN (es decir, la cadena de sentido) no se conjuga, de modo que se forma un conjugado con la estructura esquemática como se muestra en la Figura 40C.
En una realización de la presente invención, la segunda cadena de ARN (es decir, la cadena de sentido) se conjuga en el extremo 5' con el ligando de direccionamiento y tanto la segunda cadena de ARN (es decir, la cadena de sentido) como la primera cadena de ARN (es decir, la cadena de antisentido) se conjugan también en los extremos 3' con el ligando de direccionamiento, de modo que se forma un conjugado con la estructura esquemática como se muestra en la Figura 40D.
En una cualquiera de las realizaciones anteriores, 'jx e x n / ¡ndica el enlazador que conjuga el ligando a los extremos de la parte del ácido nucleico; el ligando puede ser un resto de GalNAc, tal como GalNAc; y la estructura esquemática que se muestra en la Figura 40E representa la parte de ácido nucleico.
Estos diagramas esquemáticos no pretenden limitar el número de nucleótidos en la primera o segunda cadena, los diagramas tampoco representan ningún tipo de limitación a la complementariedad de las bases o cualquier otra limitación.
Los ligandos pueden ser monoméricos o multiméricos (por ejemplo, diméricos, triméricos, etc.).
De manera adecuada, los ligandos son monoméricos, por lo tanto, contienen un único resto de ligando de direccionamiento, por ejemplo, un único resto de GalNAc.
Como alternativa, los ligandos pueden ser ligandos diméricos en donde las partes de ligando comprenden dos restos enlazadores, tales como restos enlazadores derivados de serinol o restos enlazadores no de serinol, cada uno unido a un único resto de ligando de direccionamiento.
Los ligandos pueden ser ligandos triméricos en donde las partes de ligando comprenden tres restos enlazadores, tales como restos enlazadores derivados de serinol o restos enlazadores no de serinol, cada uno unido a un único resto de ligando de direccionamiento.
Los dos o tres restos enlazadores procedentes de serinol pueden estar enlazados en serie, por ejemplo, como se muestra a continuación:
Figure imgf000031_0001
en donde
Figure imgf000031_0002
Preferentemente, los ligandos son monoméricos.
De manera adecuada, las cadenas de ARN conjugadas están conjugadas con un ligando de direccionamiento a través de un resto enlazador que incluye un enlazador adicional en donde el enlazador adicional es o comprende una cadena de alquilo C1-15 saturada no ramificada o ramificada, en donde opcionalmente uno o más carbonos (por ejemplo 1 , 2 o 3 carbonos, adecuadamente 1 o 2, en particular 1) se reemplaza(n) por un heteroátomo seleccionado de O, N, S(O)p, en donde p es 0, 1 o 2 (por ejemplo, un grupo CH2 se reemplaza por O, o por NH, o por S, o por SO2 o un grupo -CH3 en el extremo de la cadena o en una rama se reemplaza por OH o por NH2) en donde dicha cadena está opcionalmente sustituida por uno o más grupos oxo (por ejemplo de 1 a 3, tal como 1 grupo).
De manera adecuada, el resto enlazador es un resto enlazador procedente de serinol.
De manera más adecuada, el enlazador adicional comprende una cadena de alquilo C1-15 saturada no ramificada en donde uno o más carbonos (por ejemplo, 1, 2 o 3 carbonos, adecuadamente 1 o 2, en particular 1) se reemplaza(n) por un átomo de oxígeno.
De manera más adecuada, el enlazador adicional comprende una cadena de PEG.
De manera más adecuada, el enlazador adicional comprende una cadena de alquilo C1-15 saturada no ramificada. De manera más adecuada, el enlazador adicional comprende una cadena de alquilo C1-6 saturada no ramificada. De manera más adecuada, el enlazador adicional comprende una cadena de alquilo C4 o C6 saturada no ramificada, por ejemplo, una cadena de alquilo C4.
En una realización, 'jx e x n / es un resto enlazante de fórmula (V):
Figure imgf000032_0001
en donde n, Y y L se definen a continuación y el O del grupo fósforo está unido al oligonucleósido terminal de las cadenas de ARN.
Por tanto, en una realización, la parte de ligando de direccionamiento es un resto enlazante de fórmula (VI):
Figure imgf000032_0002
en donde n, Y y L1 se definen a continuación y el O del grupo fósforo está unido al oligonucleósido terminal de las cadenas de ARN.
De manera adecuada,
Figure imgf000032_0003
es un resto enlazante de fórmula (XIV):
Figure imgf000033_0001
en donde n, Y, Ri y L se definen a continuación, L está conectado al ligando de direccionamiento, por ejemplo, GalNAc y el O del grupo fósforo está unido al oligonucleósido terminal de las cadenas de ARN.
De manera adecuada, la parte de ligando de direccionamiento es un resto enlazante de fórmula (IV):
Figure imgf000033_0002
en donde n, Y, R1 y L se definen a continuación y el O del grupo fósforo está unido al oligonucleósido terminal de las cadenas de ARN.
De manera adecuada,
es un resto enlazante de fórmula (VII):
Figure imgf000033_0003
en donde n, Y y L2 se definen a continuación y el O del grupo fósforo está unido al oligonucleósido terminal de las cadenas de ARN.
De manera adecuada, la parte de ligando de direccionamiento es un resto enlazante de fórmula (VIII):
Figure imgf000033_0004
en donde n, Y y L2 se definen a continuación y el O del grupo fósforo está unido al oligonucleósido terminal de las cadenas de ARN.
De manera adecuada,
es un resto enlazante de fórmula (IX):
Figure imgf000034_0001
en donde F, Y y L se definen a continuación y el O del grupo fósforo está unido al oligonucleósido terminal de las cadenas de ARN.
De manera adecuada, la parte de ligando de direccionamiento es un resto enlazante de fórmula (IXa):
Figure imgf000034_0002
en donde F, Y y L se definen a continuación y el O del grupo fósforo está unido al oligonucleósido terminal de las cadenas de ARN.
De manera adecuada, L es:
Figure imgf000034_0003
En cualquiera de las estructuras anteriores, de manera adecuada, los ligandos se seleccionan de restos de GalNAc y galactosa, especialmente restos de GalNAc. Como alternativa, GalNac puede reemplazarse por otro ligando de direccionamiento, por ejemplo, un sacárido.
En una realización de la invención, la primera cadena de ARN es un compuesto de fórmula (X):
Figure imgf000034_0004
en donde b es 0 o 1; y
la segunda cadena de ARN es un compuesto de fórmula (XI):
Figure imgf000035_0001
c y d son independientemente 0 o 1;
Zi y Z2 son las partes de ARN de la primera y segunda cadena de ARN, respectivamente;
Y es O u S;
n es 0, 1,2 o 3; y
Li es un enlazador al que se une un ligando;
y en donde b c d es 2 o 3.
De manera adecuada, la primera cadena de ARN es un compuesto de fórmula
Figure imgf000035_0002
en donde b es 0 o 1; y
la segunda cadena de ARN es un compuesto de fórmula (XVI):
Figure imgf000035_0003
en donde c y d son independientemente 0 o 1;
en donde:
Z1 y Z2 son las partes de ARN de la primera y segunda cadena de ARN, respectivamente;
Y es O u S;
R1 es H o metilo;
n es 0, 1,2 o 3; y
L es igual o diferente en las fórmulas (XV) y (XVId y se selecciona del grupo que consiste en:
-(CH2)r-C(O)-, en donde r = 2-12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, en donde s = 1-5;
-(cH 2)-CO-NH-(CH2)rNH-C(O)-, en donde t es independientemente 1-5;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, en donde u es independientemente 1-5; y
-(CH2)v-NH-C(O)-, en donde v es 2-12; y
en donde el C(O) terminal (si está presente) está unido al grupo NH;
y en donde b c d es 2 o 3.
De manera adecuada, la primera cadena de ARN es un compuesto de fórmula (XII):
Figure imgf000036_0001
en donde b es 0 o 1; y
la segunda cadena de ARN es un compuesto de fórmula (XIII):
Figure imgf000036_0002
en donde:
c y d son independientemente 0 o 1;
Z1 y Z2 son las partes de ARN de la primera y segunda cadena de ARN, respectivamente;
Y es O u S;
n es 0, 1,2 o 3; y
L2 es igual o diferente en las fórmulas (XII) y (XIII) y es igual o diferente en los restos delimitados por b, c y d, y se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000036_0003
o
n es 0 y L2 es:
Figure imgf000036_0004
y el grupo OH terminal está ausente de modo que se forma el siguiente resto:
Figure imgf000037_0001
en donde
F es una cadena alquilo C1-8 (por ejemplo, alquilo C-i-a) saturada ramificada o no ramificada (tal como no ramificada) en donde uno de los átomos de carbono se reemplaza opcionalmente por un átomo de oxígeno siempre que dicho átomo de oxígeno esté separado de otro heteroátomo (por ejemplo, un átomo de O o N) por al menos 2 átomos de carbono;
L es igual o diferente en las fórmulas (I) y (II) y se selecciona del grupo que consiste en:
-(CH2),-C(O)-, en donde r = 2-12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, en donde s = 1-5;
-(cH 2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, en donde t es independientemente 1-5;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, en donde u es independientemente 1-5; y
-(CH2)v-NH-C(O)-, en donde v es 2-12; y
en donde el C(O) terminal (si está presente) está unido al grupo NH;
y en donde b c d es 2 o 3.
En una cualquiera de las fórmulas anteriores donde está presente GalNAc, la GalNAc puede sustituirse por cualquier otro ligando de direccionamiento, tal como los mencionados en el presente documento.
De manera adecuada, b es 0, c es 1 y d es 1; b es 1, c es 0 y d es 1; b es 1, c es 1 y d es 0; o b es 1, c es 1 y d es 1. De manera más adecuada, b es 0, c es 1 y d es 1; b es 1, c es 0 y d es 1; o b es 1, c es 1 y d es 1.
De la manera más adecuada, b es 0, c es 1 y d es 1.
En una realización, Y es O. En otra realización, Y es S.
En una realización, R1 es H o metilo. En una realización, R1 es H. En otra realización, R1 es metilo.
En una realización, n es 0, 1, 2 o 3. De manera adecuada, n es 0.
En una realización, L se selecciona del grupo que consiste en:
-(CH2)r-C(O)-, en donde r = 2-12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, en donde s = 1-5;
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, en donde t es independientemente 1-5;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, en donde u es independientemente 1-5; y
-(CH2)v-NH-C(O)-, en donde v es 2-12;
en donde el C(O) terminal está unido al grupo NH.
De manera adecuada, L es -(CH2)r-C(O)-, en donde r = 2 a 12. De manera adecuada, r = 2 a 6. De manera más adecuada, r = 4 o 6, por ejemplo, 4.
De manera adecuada, L es:
Figure imgf000037_0002
Los restos F ilustrativos incluyen (CH2)1-6 , por ejemplo, (CH2)-m , por ejemplo, CH2 , (CH2K (CH2)5 o (CH2K o CH2O(CH2)2-3 , por ejemplo, CH2O(CH2)CHa.
De manera adecuada, L2 es:
Figure imgf000038_0001
De manera adecuada, L2 es:
Figure imgf000038_0002
De manera adecuada, L2 es:
Figure imgf000038_0003
De manera adecuada, L2 es:
Figure imgf000038_0004
De manera adecuada, n es 0 y L2 es:
Figure imgf000038_0005
y el grupo OH terminal está ausente de modo que se forma el siguiente resto:
Figure imgf000038_0006
en donde Y es como se define en otra parte en el presente documento.
Dentro del resto delimitado por b, c y d, L2 es normalmente el mismo. Entre los restos delimitados por b, c y d, L2 puede ser el mismo o diferente. En una realización, L2 en el resto delimitado por c es el mismo que el L2 en el resto delimitado por d. En una realización, L2 en el resto delimitado por c no es lo mismo que L2 en el resto delimitado por d. En una realización, el L2 en los restos delimitados por b, c y d es el mismo, por ejemplo, cuando el resto enlazador es un resto enlazador procedente de serinol.
Los restos enlazadores procedentes de serinol pueden estar basados en serinol en cualquier estereoquímica, es decir, procedentes del isómero L-serina, isómero D-serina, una serina racémica u otra combinación de isómeros. En un aspecto preferido de la invención, el resto serinol-GaINAc (SerGN) tiene la siguiente estereoquímica:
Figure imgf000039_0001
es decir, se basa en un bloque de construcción con soporte sólido de (S)-serinol-amidita o (S)-serinol succinato procedente del isómero L-serina.
En una realización, las células diana son hepatocitos.
Esquemas de síntesis general: 1
Los compuestos ilustrativos pueden sintetizarse de acuerdo con los métodos que se describen a continuación y los métodos conocidos por los expertos en la materia. Si bien los esquemas ilustran la síntesis de conjugados particulares, se entenderá que otros conjugados reivindicados pueden prepararse por métodos análogos. El ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos y los bloques de construcción enlazadores puede realizarse, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida aplicando la metodología de la fosforamidita. La síntesis en fase sólida puede comenzar a partir de una base o un bloque de construcción modificado cargado con Icaa CPG. El ciclo de acoplamiento de la síntesis de fosforamidita consiste en 1) eliminación de DMT, 2) elongación de la cadena usando la fosforamidita enmascarada con DMT requerida y un activador, que puede ser benciltiotetrazol (BTT), 3) protección con caperuza de cadenas de oligonucleótidos no elongadas, seguido de la oxidación del P(III) a P(V) mediante yodo (si se desea un enlace fosfodiéster) o EDITH (si se desea un enlace fosforotioato) y nuevamente protección con caperuza (Cap/Ox/Cap o Cap/Thio/Cap). La conjugación de GaINAc puede lograrse mediante la formación de enlaces peptídicos de un bloque de construcción de ácido carboxílico de GaINAc con el oligonucleótido purificado y ensamblado previamente que tenía unido el número necesario de bloques de construcción enlazadores modificados con amino. Los bloques de construcción necesarios están disponibles comercialmente o su síntesis se describe a continuación. Todos los productos monocatenarios finales se analizaron mediante AEX-HPLC para probar su pureza. La pureza se expresa en % FLP (% de producto de longitud completa, full length product) que es el porcentaje del área UV bajo la señal de producto asignada en el trazado UV del análisis AEX-HPLC del producto final. La identidad de los respectivos productos monocatenarios se demostró mediante análisis LC-MS.
Síntesis de sintones
Esquema 1: Síntesis de sintones enlazadores de DMT-serinol (TFA)
Figure imgf000040_0001
i) trifluoroacetato de etilo, NEta, MeOH, 0 °C, 16h, 2: 86 % 5: 90 %, ii) DMTCI, piridina, 0 °C, 16h, 74 %, iii) LiBH4, EtOH/THF (1/1, v/v), 0°C, 1h, 76%, iv) 2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforamidita, EtNiPr2, CH2Cl2, 56 %, v) anhídrido succínico, DMAP, piridina, TA, 16h, 38 %, vi) HBTU, DIEA, amino-ICAA CPG (500A), TA, 18h, 29 % (26 umol/g de carga).
(S)-DMT-Serinol(TFA)-fosforamidita 7 se puede sintetizar a partir del derivado de éster metílico de (L)-serina 1 según los métodos publicados en la bibliografía (Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135).
(S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato 6 se puede hacer por conversión del intermedio 5 con anhídrido succínico en presencia de un catalizador tal como DMAP.
La carga de 6 en un soporte sólido, tal como un soporte de vidrio de poro controlado (CPG), se puede lograr mediante la formación de enlaces peptídicos con un soporte sólido, tal como un soporte CPG nativo modificado con amino (500A), utilizando un reactivo de acoplamiento tal como HBTU. El (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato 6 y un reactivo de acoplamiento tal como HBTU se disuelve en un disolvente tal como CH3CN. Una base, tal como diisopropiletilamina, se añade a la solución y la mezcla de reacción se agita durante 2 min. Un soporte sólido, tal como un soporte amino-Icaa-CPG nativo (500 A, 3 g, contenido de amina: 136 umol/g) se añade a la mezcla de reacción y se forma una suspensión. La suspensión se agita suavemente a temperatura ambiente en un agitador de muñeca durante 16h, a continuación se filtra y se lava con disolvente, tal como DCM y EtOH. El soporte sólido se seca al vacío durante 2 h. Las aminas que no reaccionaron en el soporte pueden protegerse con caperuza mediante agitación con anhídrido acético/lutidina/N-metilimidazol a temperatura ambiente. El lavado del soporte se puede repetir como se indicó anteriormente. El soporte sólido se seca al vacío para producir un soporte sólido 10.
Esquema 2: Síntesis del sintón GalNAc 9
Figure imgf000040_0002
(vii) TMSOTf, DCM, hexenol, viii) RuCh, NalO4, DCM, CH3CN, H2O, 46 % en dos etapas.
La síntesis del sintón GalNAc 9 se puede preparar de acuerdo con los métodos descritos en Nair et al. (2014), a partir de amina de galactosa peracetilada 8 disponible comercialmente.
Síntesis de conjugados con GalNAc derivados de serinol monocatenarios
Esquema 3: Procedimiento general de síntesis de oligonucleótidos para enlazadores derivados de serinol
Figure imgf000041_0001
La síntesis de oligonucleótidos de oligonucleótidos conjugados con mono-GalNAc en 3' (tal como el compuesto A0264) se describe en la Figura 13 y se resume en el Esquema 3. La síntesis se inicia utilizando (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-Icaa-CPG 10 como en el compuesto de ejemplo A0264. En caso de que se necesiten bloques de construcción de serinol adicionales, se utiliza la amidita (S)-DMTserinol(TFA) (7) en el ciclo de síntesis en fase sólida adecuado. Por ejemplo, para hacer el compuesto A0329, el ensamblaje de la cadena se termina con un acoplamiento de amidita de serinol adicional después de que la secuencia de bases esté completamente ensamblada. Además, la síntesis de oligonucleótidos de oligonucleótidos conjugados con mono-GalNAc en 5' puede comenzar a partir de un soporte sólido cargado con el nucleósido apropiado de su secuencia respectiva. En el compuesto de ejemplo A0220 esto puede ser 2'fA. La cadena de oligonucleótidos se ensambla de acuerdo con su secuencia y según corresponda, se utiliza el bloque de construcción (S)-DMTserinol(TFA)-amidita (7). Una vez completada la elongación de la cadena, se elimina el grupo DMT protector del último bloque de construcción de amidita acoplado, como en la etapa 1) del ciclo de síntesis de fosforamidita.
Al completar la última etapa sintetizadora, las cadenas simples se pueden escindir del soporte sólido mediante tratamiento con una amina, tal como el tratamiento con metilamina ac. al 40 %. Cualquier grupo protector restante también se elimina en esta etapa y el tratamiento con metilamina también libera la función de amino serinol. A continuación, los productos brutos se purificaron mediante AEX-HPLC y SEC para producir el oligonucleótido precursor para la conjugación adicional con GalNAc.
Esquema 4: Síntesis de la conjugación con GalNAc de oligonucleótidos precursores derivados de serinol
Figure imgf000041_0002
La conjugación con GalNAc tras la síntesis en fase sólida se logró mediante la preactivación del ácido GalN(Ac4)-C4 (9) mediante un reactivo de acoplamiento peptídico, tal como HBTU. A continuación, el ácido preactivado 9 se hizo reaccionar con los grupos amino en 11 (por ejemplo, A0264) para formar los conjugados intermedios con GalN(Ac4). Los grupos acetilo que protegen a los grupos hidroxilo en los restos de GalNAc se escindieron mediante tratamiento con metilamina para producir los compuestos de ejemplo 12 deseados (por ejemplo, A0268), que fueron purificados adicionalmente mediante AEX-HPLC y SEC. Síntesis de conjugados con GalNAc monocatenarios no derivados del serinol
Los bloques de construcción modificados con amino distintos del serinol se comercializan por varios proveedores y se pueden usar en lugar del serinol para proporcionar grupos amino reactivos que permitan la conjugación con GalNAc.
Por ejemplo, los bloques de construcción disponibles en el mercado que se muestran en la Tabla 6 a continuación, se pueden usar para proporcionar oligonucleótidos precursores modificados con amino no derivados del serinol 14 (Esquema 5A), mediante el uso de CPG cargado con modificador de amino, tal como 10-1 a 10-3 seguido del ensamblaje de secuencias como se ha descrito anteriormente y finalmente el acoplamiento de fosforamiditas modificadores de amino, tales como 13-1, 13-2 o 13-4.
Por ejemplo, para hacer 14 (A0653) GlyC3Am-CPG (10-2) se utilizó junto con GlyC3Am-Amidita 13-2. Se pueden usar modificadores estructuralmente diferentes para hacer 14, por ejemplo, para A0651 C7Am-CPG se usó junto con C6Am-Amidita como segunda modificación amino. De manera similar, CPG cargado con modificador de amino disponible en el mercado 10-5 y fosforamidita modificada con amino 13-5 se puede utilizar para sintetizar moléculas precursoras modificadas con amino 14 (A0655).
Tabla 6: Blo ues de construcción dis onibles en el mercado
Figure imgf000042_0001
Esquema 5: Procedimiento general para la síntesis de oligonucleótidos
Figure imgf000043_0001
10-1, 10-2, 10-3 1.13. BTT. Acetonitrilo 10-1, Lba = CH2, LJa ausente, IXa = CH2, G = Fmoc 2. etapas adicionales 10-2, l_5a = CH2, L3a ausente, Lba = CH20(C H 2)3, G = TFA
10-3, Loa = CH2l Lja = CHZ, LSa= (CH2)4, G = Fmoc
Figure imgf000043_0002
A0653 L6a, L5b= CHZ, L3a, L3b ausente, Lba , Lbb = CH20(C H 2)3 A0563 L6a, L5b= CHZ, L3a, L3b ausente, LSa , Lsb = CH2
Figure imgf000043_0004
13-1, L5b = CH2, L3b ausente,LSCb = CH2, G = Fmoc 13-4, L3b = ausente, LSCb = (CH2)S, G = TFA
13-2, L5b = CH2, L3b ausente, LSCb = CH20<CH2)3, G = TFA
Figure imgf000043_0005
10-5 1. 13. BTT, Acetonitrilo 10-5, L53 = CH2, L3a = CH2, LSa= (CH2)6i G = TFA 2. etapas adicionales
Figure imgf000043_0003
H
13-5. L CH2, Ljd = CH2, Lscb = (CH2)s, G = TFA A0655: L5a, L5b = CH2, L3a, L3b = CH2, LSa , LSb = (CH2)S
A continuación, los oligonucleótidos precursores resultantes 14 se pueden conjugar con GalN(Ac4)-C4-ácido (9) para producir los compuestos de ejemplo deseados 15 (Esquema 6).
Esquema 6: Síntesis de la conjugación con GalNAc de oligonucleótidos precursores
Figure imgf000044_0001
La síntesis de oligonucleótidos de ARNip conjugado con grupo de GalNAc triantenario se describe en la Figura 14. El ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos se inicia utilizando un soporte cargado con base, por ejemplo, 5'DMT-2'FdA(bz)-succinato-Icaa-CPG como en el compuesto de ejemplo A0006. El ciclo de acoplamiento de síntesis de fosforamidita que consiste en 1) eliminación de DMT, 2) elongación de la cadena usando la fosforamidita enmascarada con DMT requerida, 3) protección con caperuza de cadenas de oligonucleótidos no elongadas, seguido de oxidación de P(III) a P(V), mediante yodo o EDITH (si se desea un enlace de fosforotioato) y nuevamente la protección con caperuza (Cap/Ox/Cap o Cap/Thio/Cap), se repite hasta que se logre la longitud total del producto. Para la conjugación en columna de un grupo de GalNAc triantenario trivalente, se aplicó el mismo ciclo de síntesis usando la amidita de ramificación trivalente necesaria C4XLT-phos, seguido de otra tanda del ciclo de síntesis utilizando la amidita GalNAc ST23-phos. Al completar esta última etapa sintetizadora, el oligonucleótido se escindió del soporte sólido y los grupos protectores adicionales pueden eliminarse mediante tratamiento con metilamina. A continuación, los productos brutos se purificaron mediante AEX-HPLC y SEC.
Procedimiento general de formación de doble cadena
Para obtener los conjugados bicatenarios, las cadenas simples individuales se disuelven en una concentración de 60 DO/ml en H2O. Ambas soluciones de oligonucleótidos individuales se pueden añadir juntas a un recipiente de reacción. Para controlar la reacción puede realizarse una titulación. La primera cadena se añadió en un exceso del 25 % sobre la segunda cadena, según lo determinado por la absorción UV a 260 nm. La mezcla de reacción se calentó, por ejemplo a 80 °C durante 5 min y a continuación, se enfrió lentamente a TA. La formación de cadena doble se controló mediante HPLC de fase inversa de emparejamiento de iones. A partir del área UV de la cadena simple residual se calculó la cantidad necesaria de la segunda cadena y se añadió a la mezcla de reacción. La reacción se calentó de nuevo, por ejemplo a 80 °C y se enfrió despacio a TA. Este procedimiento se repitió hasta que se detectó menos del 10 % de cadena simple residual.
El proceso anterior (incluidos los Esquemas 1-6 y las Figuras 13 y 14) se puede adaptar fácilmente para reemplazar GalNac con otro ligando de direccionamiento, por ejemplo, un sacárido.
En cualquiera de los aspectos anteriores, en lugar de la conjugación posterior a la síntesis en fase sólida, es posible hacer una Serinol(GN)-fosforamidita preformada y usarla para la conjugación en columna.
Esquemas de síntesis general: 2
Los compuestos ilustrativos pueden sintetizarse de acuerdo con los métodos que se describen a continuación y los métodos conocidos por los expertos en la materia. El ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos y los bloques de construcción enlazadores puede realizarse, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida aplicando la metodología de la fosforamidita. La conjugación de GaINAc puede lograrse mediante la formación de enlaces peptídicos de un bloque de construcción de ácido carboxílico de GaINAc con el oligonucleótido purificado y ensamblado previamente que tenía unido el número necesario de bloques de construcción enlazadores modificados con amino.
Esquema 1: Síntesis de sintones enlazadores de DMT-serinol (TFA)
Figure imgf000045_0001
i) trifluoroacetato de etilo, NEta, MeOH, 0 °C, 16h, 2: 86 % 5 : 90 %, ii) DMTCI, piridina, 0 °C, 16h, 74 %, iii) LiBH4, EtOH/THF (1/1, v/v), 0°C, 1h, 76%, iv) 2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforamidita, EtN;Pr2 , CH2Ch, 56 %, v) anhídrido succínico, DMAP, piridina, TA, 16h, 38 %, vi) HBTU, DIEA, amino-ICAA CPG (500A), TA, 18h, 29 %.
La DMT-Serinol(TFA)-fosforamidita 7 se puede sintetizar a partir del derivado del serinol 1 de acuerdo con los métodos publicados en la bibliografía (Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135).
El DMT-Serinol(TFA)-succinato 6 se puede hacer por conversión de intermedio 5 con anhídrido succínico en presencia de un catalizador tal como DMAP.
La carga de 6 en un soporte sólido, tal como un CPG, se puede lograr mediante la formación de enlaces peptídicos con un soporte sólido, tal como un soporte CPG nativo modificado con amino (500A), utilizando un reactivo de acoplamiento tal como HBTU. El DMT-Serinol(TFA)-succinato 6 y un reactivo de acoplamiento, tal como HBTU, se disuelve en un solvente tal como CH3CN. Una base, tal como diisopropiletilamina, se añade a la solución y la mezcla de reacción se agita durante 2 min. Un soporte sólido, tal como un soporte amino-Icaa-CPG nativo (500 A, 3 g, contenido de amina: 136 micromol/g) a la mezcla de reacción y se forma una suspensión. La suspensión se agita suavemente a temperatura ambiente en un agitador de muñeca durante 16h, a continuación, se filtra y se lava con disolvente, tal como DCM y EtOH. El soporte sólido se seca al vacío durante 2 h. Las aminas que no reaccionaron en el soporte pueden protegerse con caperuza mediante agitación con anhídrido acético/lutidina/N-metilimidazol a temperatura ambiente. El lavado del soporte se puede repetir como se indicó anteriormente. El soporte sólido se seca al vacío para producir un soporte sólido 10.
Esquema 2: Síntesis del sintón GalNAc 9
Figure imgf000046_0001
(vii) TMSOTf, DCM, hexenol, viii) RuCh, NalO4, DCM, CH3CN, H2O, 46 % en dos etapas.
La síntesis del sintón GalNAc 9 se puede preparar de acuerdo con los métodos descritos en Nair et al. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), págs. 16958-16961, comenzando a partir de amina de galactosa peracetilada 8 disponible en el mercado.
Esquema 3: Procedimiento general de síntesis de oligonucleótidos
Figure imgf000046_0002
Todos los oligonucleótidos se pueden sintetizar en un sintetizador AKTA oligopilot 10 utilizando la química de fosforamidita estándar que se describe en detalle a continuación.
La síntesis de oligonucleótidos de precursores de oligonucleótidos conjugados con GalNAc en 3' y 5' (tal como el compuesto X0385B-prec) se describe en la Figura 17 y se resume en el Esquema 3. La síntesis se inicia utilizando DMT-Serinol(TFA)-succinato-lcaa-CPG 10. Se aplica un ciclo de síntesis de fosforamidita hasta que se alcanza la longitud total del producto. Una vez completada la elongación de la cadena, el grupo DMT protector del último bloque de construcción de amidita acoplado se puede eliminar de la misma manera que en cada ciclo de síntesis individual. Para completar la síntesis del compuesto de ejemplo X0385B-prec (que tiene un resto enlazador derivado de serinol en los extremos 3' y 5' de la segunda cadena), el ensamblaje de la cadena se terminó con un acoplamiento de amidita de serinol adicional después de que la secuencia de bases estuviera completamente ensamblada.
Al completar la última etapa sintetizadora, las cadenas simples pueden escindirse del soporte sólido mediante tratamiento con una amina tal como metilamina ac. al 40 %. Cualquier grupo protector restante también se elimina en esta etapa y el tratamiento con metilamina también libera la función de amino serinol. El oligonucleótido bruto resultante puede purificarse mediante cromatografía de intercambio iónico (Resource Q, 6 ml, GE Healthcare) en un sistema de HPLC AKTA Pure utilizando un gradiente, tal como un gradiente de cloruro de sodio. El exceso de sal de la purificación IEX puede eliminarse mediante SEC para producir el oligonucleótido precursor modificado con amino 11. Las fracciones que contienen producto se agrupan, se desalan en una columna de exclusión por tamaño (Zetadex, EMP Biotech) y se liofilizan.
Esquema 4: Procedimiento general para la conjugación de GalNAc
Figure imgf000047_0001
(i) 9, HBTU, DIPEA, DMSO; 11, H2O, DMSO, DIPEA; a continuación, 9 activado, 11; a continuación, MeNH2 al 40 %, H2O
La conjugación del sintón GalNAc 9, como se ha descrito anteriormente, se puede lograr acoplando 9 a la función serinol-amino de la cadena respectiva de oligonucleótidos 11 usando condiciones estándar de acoplamiento de péptidos conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, se añade la molécula precursora modificada con amino 11 respectiva se disuelve en H2O y un disolvente polar como DMSO (por ejemplo, DMSO/H2O, 2/1, v/v), seguido de una base tal como DIPEA (por ejemplo, 2,5% del volumen total). En un recipiente de reacción separado puede realizarse la preactivación del sintón GalNAc 9 haciendo reaccionar 2 eq. (por función amino en el oligonucleótido precursor modificado con amino) del componente de ácido carboxílico con 2 eq. de un reactivo de acoplamiento tal como HBTU en presencia de 8 eq. de una base, tal como DIPEA, en un disolvente polar tal como DMSO. Después de 2 min el compuesto activado 9 se añade a la solución de la molécula precursora modificada con amino 11 respectiva. El progreso de la reacción se puede controlar mediante LCMS o AEX-HPLC. Una vez completada la reacción de conjugación (por ejemplo, 30 minutos), el producto bruto puede precipitarse mediante la adición de 10x /PrOH 0,1x NaCl 2M y recogerse por decantación por centrifugación. Los grupos protectores de acetil hidroxi se eliminan en condiciones básicas, tales como MeNH2 al 40 % (1 ml por DO 500). Después de 15 min a TA se añade H2O (1:10 v/v) y se aísla el compuesto 12 (tal como el X0385B que se muestra en la Figura 17), purificado de nuevo por intercambio aniónico y cromatografía de exclusión por tamaño y a continuación, se liofiliza.
Procedimiento general de formación de doble cadena
Las cadenas simples individuales se disuelven en una concentración de 60 DO/ml en H2O. Ambas soluciones de oligonucleótidos individuales se pueden añadir juntas a un recipiente de reacción. Para controlar la reacción puede realizarse una titulación. La primera cadena se añadió en un exceso del 25 % sobre la segunda cadena, según lo determinado por la absorción UV a 260 nm. La mezcla de reacción se calentó, por ejemplo a 80 °C durante 5 min y a continuación, se enfrió lentamente a TA. La formación de cadena doble se controló mediante HPLC de fase inversa de emparejamiento de iones. A partir del área UV de la cadena simple residual se calculó la cantidad necesaria de la segunda cadena y se añadió a la mezcla de reacción. La reacción se calentó de nuevo, por ejemplo a 80 °C y se enfrió despacio a TA. Este procedimiento se repitió hasta que se detectó menos del 10 % de cadena simple residual.
El proceso anterior (incluidos los Esquemas 1-4 y la Figura 17) se puede adaptar fácilmente para reemplazar GalNac con otro ligando de direccionamiento, por ejemplo, un sacárido.
En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a un conjugado para inhibir la expresión de un gen LPA en una célula, comprendiendo dicho conjugado una parte de ácido nucleico de la invención y partes de ligando, dicha parte de ácido nucleico comprendiendo al menos una región doble que comprende al menos una parte de una primera cadena de ARN y al menos una parte de una segunda cadena de ARN que es complementaria al menos parcialmente de la primera cadena, en donde dicha primera cadena es complementaria al menos parcialmente de al menos una parte del ARN transcrito a partir del gen LPA, comprendiendo dichas partes de ligando un resto enlazador y un ligando de direccionamiento para el direccionamiento in vivo de células y estando conjugado exclusivamente con los extremos 3' y/o 5' de una o ambas cadenas de ARN, en donde el extremo 5' de la primera cadena de ARN no está conjugado, en donde:
(i) la segunda cadena de ARN está conjugada en el extremo 5' con el ligando de direccionamiento, y en donde (a) la segunda cadena de ARN también está conjugada en el extremo 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 3' de la primera cadena de ARN no está conjugado; o (b) la primera cadena de ARN está conjugada en el extremo 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 3' de la segunda cadena de ARN no está conjugado; o (c) tanto la segunda cadena de ARN como la primera cadena de ARN también están conjugadas en los extremos 3' con el ligando de direccionamiento; o
(ii) tanto la segunda cadena de ARN como la primera cadena de ARN están conjugadas en los extremos 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 5' de la segunda cadena de ARN no está conjugado.
El resto enlazador puede ser, por ejemplo, un resto enlazador derivado de serinol o uno de los otros tipos de enlazadores descritos en el presente documento.
Preferentemente, el ácido nucleico comprendel SEQ ID NO: 9 y el SEQ ID NO: 10 conjugado con un ligando de fórmula I (como se ha establecido anteriormente), en donde el ligando se conjuga con el ácido nucleico, como se describe y en donde la primera cadena se modifica con una modificación 2'OMe en los nucleótidos impares y se modifica con 2'F en los nucleótidos pares y la segunda cadena se modifica con un 2'OMe en los nucleótidos pares y se modifica con un 2'F en los nucleótidos impares.
Más preferentemente, el ácido nucleico comprendel SEQ ID NO: 9 y el SEQ ID NO: 10, en donde el ácido nucleico está conjugado con un ligando de fórmula I (como se ha establecido anteriormente) y además, en donde el ácido nucleico tiene un patrón de modificación como se muestra a continuación, que es un extracto de la Tabla 1 como se proporciona en el presente documento.
Figure imgf000048_0001
en donde las modificaciones específicas se representan por números
1=2'F-dU,
2=2'-F-dA,
3=2'F-dC,
4=2'F-dG,
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG.
El ligando puede comprender GalNAc y la Figura 4A o la Figura 4B ilustran además ejemplos de la presente invención.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el ácido nucleico o el ácido nucleico conjugado de la invención. Las composiciones farmacéuticas pueden usarse como medicamentos o como agentes de diagnóstico, solos o en combinación con otros agentes. Por ejemplo, uno o más conjugados de ácido nucleico de la invención pueden combinarse con un vehículo de administración (por ejemplo, liposomas) y/o excipientes, tales como portadores y diluyentes. También pueden añadirse otros agentes tales como conservantes y estabilizantes. Se conocen en la materia y dentro del conocimiento del experto en la materia métodos para la administración de moléculas de ácido nucleico.
El ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la presente invención también se puede administrar en combinación con otros compuestos terapéuticos, ya sea administrado por separado o simultáneamente, por ejemplo, en forma de una dosis unitaria combinada. La invención también incluye una composición farmacéutica que comprende uno o más ácidos nucleicos o ácidos nucleicos conjugados de acuerdo con la presente invención en un excipiente fisiológica/farmacéuticamente aceptable, tal como un estabilizante, conservante, diluyente, tampón y similares.
Los expertos en la materia pueden determinar niveles de dosificación para el medicamento y las composiciones farmacéuticas de la invención mediante experimentación rutinaria. En una realización, una dosis unitaria puede contener entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de ácido nucleico o ácido nucleico conjugado. Como alternativa, la dosis puede ser de 10 mg/kg a 25 mg/kg de peso corporal, o de 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal, o de 0,05 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, o de 0,1 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, o de 0,1 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal, o de 0,1 mg/kg a 0,5 mg/kg de peso corporal, o de 0,5 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal. Los niveles de dosificación también se pueden calcular a través de otros parámetros tales como, por ejemplo, el área de la superficial corporal.
La composición farmacéutica puede ser una suspensión o solución acuosa inyectable estéril o en forma liofilizada.
Las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención pueden administrarse a un sujeto mamífero en una dosis farmacéuticamente eficaz. El mamífero puede seleccionarse de un ser humano, un primate no humano, un simio o prosimio, un perro, un gato, un caballo, ganado bovino, un cerdo, una cabra, una oveja, un ratón, una rata, un hámster, un erizo y un conejillo de Indias, u otras especies de relevancia. Por este motivo, la expresión "LPA" o "LPA" como se utiliza en el presente documento, indica ácido nucleico o proteína en cualquiera de las especies mencionadas anteriormente, si se expresa de forma natural o artificial, pero preferentemente esta expresión indica ácidos nucleicos o proteínas humanas.
Otro aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención o a la composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o síndrome. El tratamiento puede ser para prevenir y reducir el riesgo de padecer un ictus, ateroesclerosis, trombosis o enfermedades cardiovasculares tales como cardiopatía coronaria o estenosis de la válvula aórtica y cualquier otra enfermedad o patología asociada a niveles elevados de partículas que contienen Lp(a). La invención incluye una composición farmacéutica que comprende uno o más ácidos nucleicos o ácidos nucleicos conjugados de acuerdo con la presente invención en un excipiente fisiológica/farmacéuticamente aceptable, tal como un estabilizador, conservante, diluyente, tampón y similares.
La composición farmacéutica puede ser una suspensión o solución acuosa inyectable estéril, o estar en forma liofilizada o adherida, absorbida o incluida en cualquier otra sustancia portadora galénica adecuada, tal como gránulos, comprimidos, cápsulas, nanopartículas, geles, comprimidos, perlas o estructuras similares.
El ácido nucleico descrito en el presente documento puede inhibir la expresión de LPA. El ácido nucleico descrito en el presente documento puede inhibir parcialmente la expresión de LPA. La inhibición puede ser completa, es decir, 0 % en comparación con el nivel de expresión de LPA en ausencia del ácido nucleico de la invención. La inhibición de la expresión de LPA puede ser parcial, es decir, puede ser del 15 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o valores intermedios de la expresión de LPA en ausencia de un ácido nucleico de la invención. La inhibición puede durar 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas o hasta 3 meses, cuando se utiliza en un sujeto, tal como un paciente humano. Un ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención, o composiciones que incluyen el mismo, puede(n) ser para uso en un régimen que comprende tratamientos una o dos veces por semana, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada cinco semanas, cada seis semanas, cada siete semanas o cada ocho semanas, o en regímenes con frecuencia de dosificación variable, tal como combinaciones de los intervalos antes mencionados. El ácido nucleico puede ser para uso por vía subcutánea, intravenosa o utilizando cualquier otra vía de aplicación tal como oral, rectal o intraperitoneal.
En células y/o sujetos tratados con, o que reciben, el ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la presente invención, la expresión de LPA se puede inhibir en comparación con las células y/o sujetos no tratados en un intervalo del 15 % al 100 %, pero al menos aproximadamente un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o el 100 % o valores intermedios. El nivel de inhibición puede permitir el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión o sobreexpresión de LPA, o puede servir para investigar más a fondo las funciones y papeles fisiológicos del producto génico l Pa .
Otro aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o síndromes, tales como los enumerados anteriormente o patologías adicionales asociadas con niveles elevados de Lp(a) o enfoques terapéuticos adicionales donde se desea la inhibición de la expresión de LPA.
También se incluye en la invención un método para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o síndrome, tales como los enumeradas anteriormente, que comprende la administración de una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado, como se describe en el presente documento, a un individuo que necesita tratamiento (para mejorar dichas patologías). La composición de ácido nucleico se puede administrar en un régimen que comprende tratamientos dos veces por semana, una vez por semana, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada cinco semanas, cada seis semanas, cada siete semanas o cada ocho semanas o en regímenes con frecuencia de dosificación variable, tales como combinaciones de los intervalos antes mencionados. El ácido nucleico o ácido nucleico conjugado puede ser para uso por vía subcutánea o intravenosa u otras vías de aplicación tales como oral, rectal o intraperitoneal.
El ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la presente invención también se puede administrar para utilizar junto con otros compuestos terapéuticos, ya sean administrados por separado o simultáneamente, por ejemplo, en forma de una dosis unitaria combinada. Una conjugación molecular con otras entidades moleculares biológicamente activas, tales como péptidos, ligandos celulares o artificiales o moléculas pequeñas y grandes también es posible.
El ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la presente invención se puede producir con métodos habituales en la materia, que incluyen síntesis química o expresión del ácido nucleico in vitro (por ejemplo, transcripción run-off) o in vivo. Por ejemplo, con síntesis química en fase sólida o con un vector de expresión basado en ácido nucleico que incluye derivados víricos o sistemas de expresión parcial o completamente sintéticos. En una realización, el vector de expresión se puede utilizar para producir el ácido nucleico de la invención en vitro, dentro de un organismo hospedador intermedio o tipo de célula, dentro de un organismo intermedio o final o dentro de la célula diana deseada. Los métodos para la producción (síntesis o transcripción enzimática) del ácido nucleico descrito en el presente documento se conocen por los expertos en la materia.
La invención consiste en entidades moleculares químicas que median la degradación del ARNm de LPA al unirse a transcritos del gen LPA a través de mecanismos de interferencia de ARN celular. Los compuestos moleculares inventados pueden usarse como conjugados con, pero sin limitación, un resto de azúcar de N-acetilgalactosamina (GalNAc) que asegura la absorción celular específica de hepatocitos, a través de la unión específica al complejo receptor de asialoglicoproteína (ASGPR). La invención puede vincularse a otras estructuras químicas diferentes que confieren diferentes propiedades como se menciona a continuación. El uso de un patrón de modificación química de los ácidos nucleicos confiere estabilidad a la nucleasa en suero y hace factible, por ejemplo, la vía de aplicación subcutánea.
La invención se caracteriza por una alta especificidad a nivel de administración molecular y dirigida a tejidos, confiriendo potencialmente un mejor perfil de seguridad que los tratamientos actualmente disponibles.
La invención también proporciona un ácido nucleico de acuerdo con cualquier aspecto de la invención descrito en el presente documento, en donde la primera cadena de ARN tiene un nucleótido de (E)-vinilfosfonato en 5' terminal y el nucleótido de (E)-vinilfosfonato en 5' terminal está unido al segundo nucleótido en la primera cadena mediante un enlace fosfodiéster.
En una realización, la primera cadena puede incluir más de 1 enlace fosfodiéster.
En una realización, la primera cadena puede comprender enlaces fosfodiéster entre al menos los tres nucleótidos 5' terminales.
En una realización, la primera cadena puede comprender enlaces fosfodiéster entre al menos los cuatro nucleótidos 5' terminales.
En una realización, la primera cadena puede comprender la fórmula (XVII):
(vp)-N(po)[N(po)]n- (XVII)
donde '(vp)-' es el (E)-vinilfosfonato en 5', 'N' es un nucleótido, 'po' es un enlace fosfodiéster y n es de 1 a (el número total de nucleótidos en la primera cadena - 2), preferiblemente en donde n es de 1 a (el número total de nucleótidos en la primera cadena -3), más preferiblemente donde n es de 1 a (el número total de nucleótidos en la primera cadena -4).
En una realización, la primera cadena puede incluir al menos un enlace fosforotioato (ps).
En una realización, la primera cadena puede comprender además un enlace fosforotioato entre los dos nucleótidos 3' terminales o enlaces fosforotioato entre los tres nucleótidos 3' terminales.
En una realización, los enlaces entre los otros nucleótidos en la primera cadena son enlaces fosfodiéster.
En una realización, la primera cadena puede incluir más de 1 enlace fosforotioato.
En una realización adicional, la segunda cadena puede comprender un enlace fosforotioato entre los dos nucleótidos 3' terminales o enlaces fosforotioato entre los tres nucleótidos 3' terminales.
En otra realización adicional, la segunda cadena puede comprender un enlace fosforotioato entre los dos nucleótidos 5' terminales o enlaces fosforotioato entre los tres nucleótidos 5' terminales.
En una realización, el nucleótido (E)-vinilfosfonato en 5' terminal es un nucleótido de ARN.
Un nucleótido (E)-vinilfosfonato en 5' terminal es un nucleótido en donde el grupo fosfato natural en el extremo 5' se ha reemplazado por un E-vinilfosfonato, en el que el átomo de oxígeno puente en 5' del nucleótido terminal de la cadena fosforilada 5' se reemplaza con un grupo metinilo (-CH=):
Figure imgf000050_0001
Nucleótidos con un fosfato natural en el extremo 5'
Figure imgf000051_0001
El nucleótido con un E-vinilfosfonato en el (E)-vinilfosfonato en 5' terminal del extremo 5' es mimético del fosfato en 5'. Un imitador biológico es una molécula que es capaz de llevar a cabo la misma función y es estructuralmente muy similar a la molécula original que está siendo imitada. En el contexto de la presente invención, el vinilfosfonato (E) en 5' imita la función de un fosfato en 5' normal, por ejemplo, permitiendo una carga de RISC eficiente. Además, debido a su estructura ligeramente alterada, el vinilfosfonato (E) en 5' es capaz de estabilizar el nucleótido del extremo 5' protegiéndolo de la desfosforilación por enzimas como las fosfatasas.
Un aspecto de la invención es un ácido nucleico como se ha descrito en el presente documento para inhibir la expresión de un gen diana en una célula, que comprende al menos una región doble que comprende al menos una parte de una primera cadena y al menos una parte de una segunda cadena que es al menos parcialmente complementaria a la primera cadena, en donde dicha primera cadena es al menos parcialmente complementaria a al menos una parte del ARN transcrito a partir de dicho gen diana, en donde dicha primera cadena incluye nucleótidos modificados o nucleótidos sin modificar en una pluralidad de posiciones para facilitar el procesamiento del ácido nucleico por RISC.
En un aspecto, "facilitar el procesamiento por RISC" significa que el ácido nucleico se puede procesar mediante RISC, por ejemplo, cualquier modificación presente permitirá que el ácido nucleico sea procesado por RISC, de modo que pueda, convenientemente, tener lugar la actividad del ARNip.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2' y el nucleótido en la segunda cadena que se corresponde con la posición 13 de la primera cadena no se modifica con una modificación de O-metilo en 2'.
Un nucleótido en la segunda cadena que "se corresponde con" una posición en la primera cadena de manera adecuada es el nucleótido cuyas bases se aparean con ese nucleótido en la primera cadena.
En un aspecto, el nucleótido de la segunda cadena que se corresponde con la posición 13 de la primera cadena es el nucleótido que forma un par de bases con la posición 13 de la primera cadena.
En un aspecto, el nucleótido de la segunda cadena que se corresponde con la posición 11 de la primera cadena es el nucleótido que forma un par de bases con la posición 11 de la primera cadena.
En un aspecto, el nucleótido de la segunda cadena que se corresponde con la posición 12 de la primera cadena es el nucleótido que forma un par de bases con la posición 12 de la primera cadena.
Esta nomenclatura puede aplicarse a otras posiciones de la segunda cadena. Por ejemplo, en un ácido nucleico de 19-meros que es de bicatenario y extremos romos, la posición 13 de la primera cadena se emparejaría con la posición 7 de la segunda cadena. La posición 11 de la primera cadena se emparejaría con la posición 9 de la segunda cadena. Esta nomenclatura puede aplicarse a otras posiciones de la segunda cadena.
El nucleótido que se corresponde con la posición 13 de la primera cadena de manera adecuada es la posición 13 de la segunda cadena, contando desde el 3' de la segunda cadena, comenzando a partir del primer nucleótido de la región bicatenaria. Asimismo, la posición 11 de la segunda cadena de manera adecuada es el 11er nucleótido a partir del 3' de la segunda cadena, comenzando a partir del primer nucleótido de la región bicatenaria. Esta nomenclatura puede aplicarse a otras posiciones de la segunda cadena.
En un aspecto, en el caso de una primera y una segunda cadena parcialmente complementarias, el nucleótido en la segunda cadena que "se corresponde con" una posición en la primera cadena puede no formar necesariamente un par de bases si esa posición es la posición en la que hay un emparejamiento incorrecto, pero el principio de la nomenclatura aún se aplica.
Se prefiere una primera y una segunda cadena que sean completamente complementarias en la región doble (ignorando cualquier región sobresaliente) y que no haya emparejamientos incorrectos en de la región bicatenaria del ácido nucleico.
También se prefieren:
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena no están modificados con una modificación 2' O-metilo y el nucleótido en la segunda cadena que se corresponde con la posición 11 de la primera cadena no está modificado con una modificación 2' O-metilo.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2' y los nucleótidos en la segunda cadena que se corresponden con las posiciones 11 y 13 de la primera cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2'.
En un aspecto, el nucleótido de la segunda cadena que se corresponde con la posición 12 de la primera cadena no se modifica con una modificación de O-metilo en 2'. Esta limitación sobre el ácido nucleico puede observarse con cualquier otra limitación descrita en el presente documento.
Por tanto, otro aspecto de la invención es un ácido nucleico como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2' y los nucleótidos en la segunda cadena que se corresponden con las posiciones 11-13 de la primera cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2'.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2' y los nucleótidos en la segunda cadena que se corresponden con la(s) posición(ones) 11 o 13 u 11 y 13 u 11-13 de la primera cadena se modifican con una modificación fluoro en 2'.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena no se modifican con una modificación de fluoro en 2' y los nucleótidos en la segunda cadena que se corresponden con la(s) posición(ones) 11 o 13 u 11 y 13 u 11-13 de la primera cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2'.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena se modifican con una modificación de fluoro en 2' y los nucleótidos en la segunda cadena que se corresponden con la(s) posición(ones) 11 o 13 u 11 y 13 u 11-13 de la primera cadena se modifican con una modificación de fluoro en 2'.
Un ácido nucleico como se ha descrito en el presente documento en donde más de un 50 % de los nucleótidos de la primera y/o segunda cadena comprenden una modificación de O-metilo en 2', tal como más de un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 % o un 85 % o más, de la primera y/o segunda cadena comprenden una modificación de O-metilo en 2', preferentemente medida como un porcentaje de los nucleótidos totales tanto de la primera como de la segunda cadena.
Un ácido nucleico como se ha descrito en el presente documento en donde más de un 50 % de los nucleótidos de la primera y/o segunda cadena comprenden una modificación de ARN de origen natural, tal como en donde más de un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 % o un 85 % o más de la primera y/o segunda cadena comprende tal modificación, preferentemente medida como un porcentaje de los nucleótidos totales tanto de la primera como de la segunda cadena. Las modificaciones de origen natural incluyen de manera adecuada, así como la de 2 O' metilo, otras modificaciones de azúcares en 2', en particular, una modificación de H en 2' que da lugar a un nucleótido de ADN.
Un ácido nucleico como se ha descrito en el presente documento que comprende no más de un 20 %, tal como no más de un 15 %, tal como más de un 10 %, de nucleótidos que tienen modificaciones en 2' que no son modificaciones de O-metilo en 2' en la primera y/o segunda cadena, preferentemente como un porcentaje de los nucleótidos totales tanto de la primera como de la segunda cadena.
Un ácido nucleico como se ha descrito en el presente documento que comprende no más de un 20 %, (tal como no más del 15 % o no más del 10 %) de modificaciones fluoro en 2' en la primera y/o segunda cadena, preferentemente como porcentaje de los nucleótidos totales de ambas cadenas.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde todos los nucleótidos se modifican con una modificación de O-metilo en 2' excepto las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena y los nucleótidos en la segunda cadena que se corresponden con la(s) posición(ones) 11 o 13 u 11 y 13 u 11-13 de la primera cadena. Preferentemente, los nucleótidos que no se modifican con O-metilo en 2' se modifican con fluoro en la posición 2'.
Se prefiere un ácido nucleico como se describe en el presente documento en donde todos los nucleótidos del ácido nucleico se modifican en la posición 2' del azúcar. Preferentemente, estos nucleótidos se modifican con una modificación de 2'-fluoro cuando la modificación no es una modificación de O-metilo en 2'.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender uno o más nucleótidos modificados en la posición 2' con un H en 2' y por tanto, tener un nucleótido de ADN dentro del ácido nucleico. Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender nucleótidos de ADN en las posiciones 2 y/o 14 de la primera cadena, contando desde el extremo 5' de la primera cadena. Los ácidos nucleicos pueden comprender nucleótidos de ADN en la segunda cadena que se corresponden con la(s) posición(ones) 11 o 13 u 11 y 13 u 11-13 de la primera cadena.
En un aspecto, no hay más de un ADN por ácido nucleico de la invención.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender uno o más nucleótidos ANB. Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender nucleótidos ANB en las posiciones 2 y/o 14 de la primera cadena, contando desde el extremo 5' de la primera cadena. Los ácidos nucleicos pueden comprender ANB en la segunda cadena que se corresponden con la(s) posición(ones) 11 o 13 u 11 y 13 u 11-13 de la primera cadena.
En un aspecto, el ácido nucleico se modifica en la primera cadena alternando modificaciones de 2-O metilo y de 2 modificaciones de fluoro y las posiciones 2 y 14 (comenzando desde el extremo 5') se modifican con fluoro en 2'. Preferentemente, la segunda cadena se modifica con modificaciones de fluoro en 2' en los nucleótidos de la segunda cadena que se corresponden con la(s) posición(ones) 11 o 13 u 11 y 13 u 11-13 de la primera cadena. Preferentemente, la segunda cadena se modifica con modificaciones de fluoro en 2' en las posiciones 11-13, contando desde el extremo 3' comenzando en la primera posición de la región (bicatenaria) complementaria y las modificaciones restantes son modificaciones de origen natural, preferentemente, de O-metilo en 2'.
En un aspecto, el ácido nucleico de la invención comprende uno o más ribonucleótidos invertidos, preferentemente una adenina invertida, utilizando un enlace de 5'-5' o un enlace de 3'-3', preferentemente un enlace 3'-3' en el extremo 3' de la segunda cadena.
En un aspecto, el ácido nucleico comprende uno o más enlaces fosforoditioato, tal como 1,2, 3 o 4 enlaces fosforoditioato. Preferentemente hay hasta 4 enlaces fosforoditioato, uno en cada uno de los extremos 5' y 3' de la primera y de la segunda cadena.
Todas las características de los ácidos nucleicos se pueden combinar con todos los demás aspectos de la invención divulgada en el presente documento.
En particular, se prefieren los ácidos nucleicos que son moléculas de ARNip en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena no están modificados con una modificación de O-metilo en 2' y el ácido nucleico comprende uno o más o todos de:
(i) un nucleótido invertido, preferentemente un enlace 3'-3' en el extremo 3' de la segunda cadena;
(ii) uno o más enlaces fosforoditioato;
(iii) el nucleótido de la segunda cadena que se corresponde con la posición 11 o 13 de la primera cadena no está modificado con una modificación de O-metilo en 2', preferentemente, en donde una o ambas de estas posiciones comprenden una modificación de fluoro en 2';
(iv) el ácido nucleico comprende al menos un 80 % de todos los nucleótidos que tienen una modificación 2'-O-metilo;
(v) el ácido nucleico comprende no más de un 20 % de los nucleótidos que tienen modificaciones de fluoro en 2'.
La presente invención también proporciona un ácido nucleico como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena y los nucleótidos en las posiciones 7 y/o 9 o 7 - 9 del extremo 5' de la segunda cadena se modifican con una modificación de fluoro en 2' y al menos un 90 % de los nucleótidos restantes se modifican con 2'-O metilo o comprenden otra modificación de origen natural en 2'.
Los ejemplos específicos preferidos, para un ácido nucleico de 19 bases bicatenario romo, sin saliente, son:
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2' y el nucleótido en la posición 7 del extremo 5' de la segunda cadena no se modifica con una modificación 2' O-metilo.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2' y el nucleótido en la posición 9 del extremo 5' de la segunda cadena no se modifica con una modificación de O-metilo en 2'.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2' y los nucleótidos en las posiciones 7 y 9 del extremo 5' de la segunda cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2'.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2' y los nucleótidos en las posiciones 7 - 9 del extremo 5' de la segunda cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2'.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2' y los nucleótidos en las posiciones 7 y/o 9 o 7-9 del extremo 5' de la segunda cadena se modifican con una modificación de fluoro en 2'.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena se modifican con una modificación de fluoro en 2' y los nucleótidos en las posiciones 7 y/o 9 o 7-9 del extremo 5' de la segunda cadena no se modifican con una modificación de O-metilo en 2'.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena se modifican con una modificación de fluoro en 2' y los nucleótidos en las posiciones 7 y/o 9 o 7 - 9 del extremo 5' de la segunda cadena se modifican con una modificación de fluoro en 2'.
Un ácido nucleico como se ha descrito en el presente documento en donde más de un 50 % de los nucleótidos de la primera y/o segunda cadena comprenden una modificación de O-metilo en 2', tal como más de un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 % o un 85 % o más, de la primera y/o segunda cadena comprenden una modificación de O-metilo en 2', preferentemente medida como un porcentaje de los nucleótidos totales tanto de la primera como de la segunda cadena.
Un ácido nucleico como se ha descrito en el presente documento en donde más de un 50 % de los nucleótidos de la primera y/o segunda cadena comprenden una modificación de ARN de origen natural, tal como en donde más de un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 % o un 85 % o más de la primera y/o segunda cadena comprende tal modificación, preferentemente medida como un porcentaje de los nucleótidos totales tanto de la primera como de la segunda cadena. Las modificaciones de origen natural incluyen de manera adecuada, así como la de 2 O' metilo, otras modificaciones de azúcares en 2', en particular, una modificación de H en 2' que da lugar a un nucleótido de ADN.
Un ácido nucleico como se ha descrito en el presente documento que comprende no más de un 20 %, tal como no más de un 15 %, tal como más de un 10 %, de nucleótidos que tienen modificaciones en 2' que no son modificaciones de O-metilo en 2' en la primera y/o segunda cadena, preferentemente como un porcentaje de los nucleótidos totales tanto de la primera como de la segunda cadena.
Un ácido nucleico como se ha descrito en el presente documento que comprende no más de un 20 %, (tal como no más del 15 % o no más del 10 %) de modificaciones fluoro en 2' en la primera y/o segunda cadena, preferentemente como porcentaje de los nucleótidos totales de ambas cadenas.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde todos los nucleótidos se modifican con una modificación de O-metilo en 2' excepto las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena y los nucleótidos en las posiciones 7 y/o 9 del extremo 5' de la segunda cadena. Preferentemente, los nucleótidos que no se modifican con O-metilo en 2' se modifican con fluoro en la posición 2'.
Un ácido nucleico, como se ha descrito en el presente documento, en donde todos los nucleótidos se modifican con una modificación de O-metilo en 2' excepto las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena y los nucleótidos en las posiciones 7 - 9 del extremo 5' de la segunda cadena. Preferentemente, los nucleótidos que no se modifican con O-metilo en 2' se modifican con fluoro en la posición 2'.
Para un ácido nucleico que comprende una región doble de 20 pares de bases, la segunda cadena preferentemente no tiene un grupo de O-metilo en 2' en los nucleótidos 8 o 9 o 10, contando desde el extremo 5' del dúplex correspondiente a las posiciones 13, 12 y 11 de la primera cadena, respectivamente.
Para un ácido nucleico que comprende una región doble de 21 pares de bases, la segunda cadena preferentemente no tiene un grupo de O-metilo en 2' en los nucleótidos 9 o 10 u 11, contando desde el extremo 5' del dúplex correspondiente a las posiciones 13, 12 y 11 de la primera cadena, respectivamente.
La presente invención también se refiere a las secuencias sin modificar de todas las secuencias modificadas divulgadas en el presente documento.
La invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitantes.
Figuras
En la Figura 1 se muestran los resultados de un cribado de moléculas de ARNip no conjugadas para la inhibición de la expresión del ARNm de LPA en células RT-4 humanas.
En las Figuras 2A y 2B se muestra la respuesta a la dosis de moléculas de ARNip dirigidas a LPA no conjugadas en la expresión del ARNm de LPA en células RT-4 humanas.
En la Figura 3 se muestra la inhibición de la expresión del ARNm de LPA en hepatocitos primarios humanos y de macaco mediante diferentes dosis de moléculas de ARNip conjugadas con GaINAc-L1 LPA-1038 administradas mediante captación mediada por receptor.
Las Figuras 4A y 4B muestran ejemplos de la estructura de los ligandos de GalNAc con diferentes enlazadores L1 y L6, respectivamente, a los que se conjugaron los oligonucleótidos ejemplificados.
En la Figura 5 se muestran ejemplos representativos de la atenuación del ARNm de LPA mediante ARNip de GaINAc conjugados con L6 indicados en hepatocitos primarios humanos suministrados mediante captación mediada por receptor.
En la Figura 6 se representa el Conjugado 1.
En la Figura 7 se representa el Conjugado 2.
En la Figura 8 se representa el Conjugado 3.
En la Figura 9 se representa el Conjugado de referencia 1.
En la Figura 10 se representa el Conjugado de referencia 2.
En la Figura 11 se representa el Conjugado de referencia 3.
En la Figura 12 se representa el Conjugado de referencia 4.
En cada una de las Figuras 6-12 y 19-30, la cadena superior es la cadena de antisentido y la cadena inferior es la cadena de sentido. Además, para mostrar más claramente la conexión entre las partes de ácido nucleico y ligando, el nucleótido al final de las cadenas conjugadas respectivas se dibuja en su totalidad.
En la Figura 13 se muestra la síntesis de A0268, que es un oligonucleótido monocatenario conjugado con mono-GaINAc en 3' y es el material de partida en la síntesis del Conjugado 1 y el Conjugado 3. (ps) indica enlace de fosforotioato.
En la Figura 14 se muestra la síntesis de A0006, que es un oligonucleótido monocatenario conjugado con GaINAc triantenario en 5' utilizado para la síntesis del Conjugado de referencia 4. (ps) indica enlace de fosforotioato.
En la Figura 15 se ilustra la determinación in vitro de la atenuación de TTR. En particular, en la Figura 15A se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los Conjugados de referencia (CR) 1 y 3, así como el control sin tratamiento "ST"; en la Figura 15B se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los Conjugados de referencia (CR) 2 y 3, así como el control sin tratamiento "ST"; y en la Figura 15C se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los Conjugados 1, 2 y 3, así como mediante CR3 y el control sin tratamiento "ST". Los Conjugados de referencia 1 y 2 representan conjugados de comparación. El Conjugado de referencia 3 representa un ARNip de GaINAc no dirigido y "sin tratamiento" ("ST") representa células no tratadas. Tanto el CR3 como ST son controles negativos. Los niveles de ARNm se normalizaron frente a Ptenll.
En la Figura 16 se muestra la evolución temporal de TTR en suero en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 4 a los 7, 14 y 27 días después del tratamiento s.c. con 1 mg/kg; Conjugados 1-3, Conjugados de referencia (CR) 1,2 y 4 e individuos tratados de forma simulada (PBS).
En la Figura 17 se muestra la síntesis de oligonucleótidos de precursores de oligonucleótidos conjugados con GaINAc en 3' y 5' (tal como el compuesto X0385B-prec).
En la Figura 18 se muestra la misma respuesta a la dosis de atenuación para el ARNip dirigido a LPA con dos unidades individuales de GaINAc conjugadas con la segunda cadena en comparación con una unidad triantenaria de GaINAc en la segunda cadena en 5' en hepatocitos primarios de macaco.
En la Figura 19A se representa el Conjugado 4. Los últimos tres nucleótidos en los extremos 5' y 3' de las cadenas de antisentido y de sentido están conectados por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido. Los enlazadores de serinol-GalNAc se conjugan a través de un enlace fosfodiéster al extremo 3' y al extremo 5' de la cadena de sentido.
En la Figura 19B se representa el Conjugado 5. Los últimos tres nucleótidos en los extremos 5' y 3' de las cadenas de antisentido están conectados por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido. Los enlazadores de serinol-GalNAc se conjugan a través de un enlace fosforotioato al extremo 3' y al extremo 5' de la cadena de sentido.
En la Figura 20 se representa el Conjugado 6. Los últimos tres nucleótidos en los extremos 5' y 3' de las cadenas de antisentido están conectados por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido. Los enlazadores de serinol-GalNAc se conjugan a través de un enlace fosfodiéster al extremo 3' y al extremo 5' de la cadena de sentido. En la Figura 21 se representa el Conjugado 7. Los últimos tres nucleótidos en los extremos 5' y 3' de las cadenas de antisentido y de sentido están conectados por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido. Los enlazadores de serinol-GalNAc se conjugan a través de un enlace fosforotioato al extremo 3' y al extremo 5' de la cadena de sentido. Los enlazadores de serinol-GalNAc están conectados entre sí a través de un enlace fosforotioato.
En la Figura 22 se representa el Conjugado 8. Los últimos tres nucleótidos en los extremos 5' y 3' de las cadenas de antisentido y de sentido están conectados por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido. Un enlazador modificador de amino GalNAc-C6 se conjuga en el extremo 5' de la cadena de sentido y un enlazador modificador de amino GalNAc-C7 se conjuga en el extremo 3' de la cadena de sentido.
En la Figura 23 se representa el Conjugado 9. Los últimos tres nucleótidos en los extremos 5' y 3' de las cadenas de antisentido y de sentido están conectados por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido. Un enlazador modificador de amino GalNAc-GlyC3 se conjuga en los extremos 5' y 3' de la cadena sentido.
En la Figura 24 se representa el Conjugado 10. Los últimos tres nucleótidos en los extremos 5' y 3' de las cadenas de antisentido y de sentido están conectados por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido y las cadenas de sentido están conectadas por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido. Un enlazador modificador de GalNAc-piperidil-amino se conjuga en los extremos 5' y 3' de la cadena de sentido.
En la Figura 25 se representa el Conjugado 11. Los últimos tres nucleótidos en los extremos 5' y 3' de las cadenas de antisentido y de sentido están conectados por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido. Un enlazador modificador de amino GalNAc-C3 se conjuga en los extremos 5' y 3' de la cadena de sentido.
En la Figura 26 se representa el Conjugado 12. Los últimos tres nucleótidos en los extremos 5' y 3' de las cadenas de antisentido y de sentido están conectados por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido. Un enlazador modificador de amino GalNAc-C6 se conjuga en el extremo 5' de la cadena de sentido y un enlazador modificador de amino GalNAc-C3 se conjuga en el extremo 3' de la cadena de sentido.
En la Figura 27 se representan los Conjugados 15, 16, 18 y 19, que se diferencian únicamente por sus secuencias de ARN. Los últimos tres nucleótidos en los extremos 5' y 3' de las cadenas de antisentido y de sentido están conectados por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido en cada conjugado. Los enlazadores de serinol-GalNAc se conjugan a través de un enlace fosforotioato al extremo 3' y al extremo 5' de la cadena de sentido.
En la Figura 28 se representa el Conjugado de referencia 5 y el Conjugado de referencia 9, que se diferencian únicamente por sus secuencias de ARN. Los últimos tres nucleótidos en los extremos 5' y 3' de la cadena de antisentido y el extremo 3' de la cadena de sentido están conectados por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido en ambos conjugados. El enlazador trimérico GalNAc se conjuga a través de un enlace de fosforotioato al extremo 5' de la cadena de sentido en ambos conjugados.
En la Figura 29 se representa el Conjugado de referencia 6 y el Conjugado de referencia 7, que se diferencian únicamente por sus secuencias de ARN. Los últimos tres nucleótidos en los extremos 5' y 3' de la cadena de antisentido y el extremo 3' de la cadena de sentido están conectados por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido en ambos conjugados. El enlazador trimérico GalNAc se conjuga a través de un enlace de fosforotioato al extremo 5' de la cadena de sentido en ambos conjugados.
En la Figura 30 se representa el Conjugado de referencia 8. Los últimos tres nucleótidos en los extremos 5' y 3' de la cadena de antisentido y el extremo 3' de la cadena con sentido están conectados por un enlazador de fosforotioato entre cada nucleótido. El enlazador trimérico GalNAc se conjuga a través de un enlace de fosforotioato al extremo 5' de la cadena de sentido.
En la Figura 31 se ilustra la determinación in vitro de la atenuación de TTR. En particular, en la Figura 31A se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los Conjugados 4, 5, 6 y 2 en comparación con "Luc" (Conjugado de referencia 3) así como el control sin tratamiento "ST"; en la Figura 31B se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los Conjugados 7 y 2, en comparación con "Luc" (Conjugado de referencia 3) así como con el control sin tratamiento "ST". Luc o Conjugado de referencia 3 (CR3) representa un ARNip de GaINAc no dirigido y "sin tratamiento" ("ST") representa células no tratadas. Tanto el CR3como ST son controles negativos. El nivel de ARNm se normalizó frente a Ptenll.
En la Figura 32 se ilustra la determinación in vitro de la atenuación de TTR. En particular, en la Figura 32A se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los Conjugados 8, 9, 10, 11 y 2 en comparación con "Luc" (Conjugado de referencia 3) así como el control sin tratamiento "ST"; en la Figura 32B se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los Conjugados 12 y 2, en comparación con "Luc" (Conjugado de referencia 3) así como con el control sin tratamiento "ST". Luc o Conjugado de referencia 3 representa un ARNip de GaINAc no dirigido y "sin tratamiento" ("ST") representa células no tratadas. Tanto el CR3como ST son controles negativos. El nivel de ARNm se normalizó frente a Ptenll.
En la Figura 33 se ilustra la determinación in vitro de la atenuación del ARNm de LPA mediante el Conjugado 19 en comparación con los controles. Ctr representa un ARNip de GaINAc no dirigido y "sin tratamiento" ("ST") representa células no tratadas. Tanto Ctr como ST son controles negativos. Los niveles de ARNm se normalizaron frente a ACTB.
En la Figura 34 se muestra una evolución temporal de los niveles del ARNm de Aldh2 hepático en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 6 a los 14, 28 y 42 días después del tratamiento s.c. con 1mg/kg - Conjugado 15, Conjugado de referencia (CR) 6 e individuos tratados de forma simulada (PBS). Los niveles de ARNm se normalizaron frente a Pten.
En la figura 35 se muestra una evolución temporal de los niveles del ARNm de Aldh2 hepático en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 6 a los 14, 28 y 42 días después del tratamiento s.c. con 1mg/kg - Conjugado 16, Conjugado de referencia (CR) 7 e individuos tratados de forma simulada (PBS). Los niveles de ARNm se normalizaron frente a Pten.
En la Figura 36 se muestra una evolución temporal de los niveles del ARNm de Tmprss6 hepático en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 6 a los 14, 28 y 42 días después del tratamiento s.c. con 1mg/kg - Conjugado 18, Conjugado de referencia (CR) 8 e individuos tratados de forma simulada (PBS). Los niveles de ARNm se normalizaron frente a Pten.
En la Figura 37 se muestra la estabilidad en suero de los conjugados 4, 5, 6, 7 y 2 y del control sin tratamiento (ST) a 37 °C durante 3 días.
En la Figura 38 se muestra la estabilidad en suero de los conjugados 8, 9, 10, 11, 12 y 2 y del control sin tratamiento (ST) a 37 °C durante 3 días.
En la Figura 39 se muestra la inhibición de la expresión de ARNm de LPA en hepatocitos primarios humanos por diferentes dosis de ARNip acoplados a GalNAc-L6 administradas mediante captación mediada por receptor. En la Figura 40 se muestra representaciones esquemáticas de varias realizaciones de ácidos nucleicos conjugados con ligandos a través de enlazadores.
Ejemplos
La numeración a la que se hace referencia en cada ejemplo es específica para dicho ejemplo.
Las moléculas de ARNip que comprenden el SEQ ID NO: 9 (incluyendo el SEQ ID NO: 125 o el SEQ ID NO: 135, basadas en el SEQ ID NO: 9) están dentro del alcance de la invención. Los otros ARNip descritos se proporcionan para un contexto útil.
Ejemplo 1
Moléculas de ARNip modificadas y conjugadas usadas para ejemplos funcionales en el presente documento.
Derivados de LPA-1038:
GalNAc-LPA-1038-L1
Primera cadena (SEQ ID NO: 119, basada en el SEQ ID NO: 5)
OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA 3'
Segunda cadena (SEQ ID NO: 120, basada en el SEQ ID NO: 6)
5'[ST23 (ps)]3 trebler largo (ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps )-OMeA-(ps)-FU 3'
GalNAc-LPA-1038-L6
Primera cadena (SEQ ID NO: 121, basada en el SEQ ID NO: 5)
OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA 3'
Segunda cadena (SEQ ID NO: 122, basada en el SEQ ID NO: 6)
5'[ST23 (ps)]3 ST43 (ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3'
FN (N=A, C, G, U) indica 2'Fluoro, 2' desoxinucleósidos
OMeN (N=A, C, G, U) indica nucleósidos 2'O metilo
(ps) indica un enlace fosforotioato
ST23 y ST43 son los siguientes.
Otro ejemplo son los derivados de LPA-1041:
GalNAc-LPA-1041-L1
Primera cadena (SEQ ID NO: 123, basada en el SEQ ID NO: 9)
5' OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeG 3'
Segunda cadena (SEQ ID NO: 124, basada en el SEQ ID NO: 10)
5'[ST23 (ps)]3 trebler largo (ps) FC-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3'
GalNAc-LPA-1041-L6
Primera cadena (SEQ ID NO: 125, basada en el SEQ ID NO: 9)
5' OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeG 3'
Segunda cadena (SEQ ID NO: 126, basada en el SEQ ID NO: 10)
5'[ST23 (ps)]3 ST43 (ps) FC-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3'
FN (N=A, C, G, U) indica 2'Fluoro, 2' desoxinucleósidos
OMeN (N=A, C, G, U) indica nucleósidos 2'O metilo
(ps) indica un enlace fosforotioato
ST23 y ST43 son los siguientes.
ST23 es una fosforamidita GalNac C4 (componentes de la estructura como se muestra a continuación)
Figure imgf000058_0001
Trebler largo (STKS)
ST41 es el siguiente:
Figure imgf000058_0002
ST43 es el siguiente y como se describe en el documento WO2017/174657:
Figure imgf000058_0003
Todos los oligonucleótidos se obtuvieron de fabricantes comerciales de oligonucleótidos (Biospring, Frankfurt, Alemania, o RiboBio, Guangzhou, Guangdong, República Popular China) o sintetizado en un sintetizador oligopiloto AKTA (interno) usando química de fosforamidita convencional. Se usaron un soporte sólido y fosforamiditas de 2'O-Metil ARN, fosforamiditas de 2'fluoro ADN (todas con protección convencional) disponibles en el mercado y fosforamiditas de trebler largo disponible en el mercado (Glen research). La síntesis se realizó utilizando soluciones 0,1 M de la fosforamidita en acetonitrilo seco y se utilizó benciltiotetrazol (BTT) como activador (0,3 M en acetonitrilo). Todos los demás reactivos eran reactivos convencionales disponibles comercialmente.
La conjugación del respectivo sintón de GaINac (por ejemplo, ST23, ST41, ST43) se consiguió mediante el acoplamiento de la fosforamidita respectiva al extremo 5' de la oligocadena en condiciones convencionales de acoplamiento de fosforamidita. Se introdujeron fosforotioatos usando reactivos de tiolación convencionales disponibles en el mercado (EDITH, tecnologías Link).
Las cadenas individuales se separaron de la CPG usando metilamina (acuosa al 40 %) y el oligonucleótido bruto resultante se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico (Resource Q, 6 ml, GE Healthcare) en un sistema de HPLC AKTA Pure utilizando un gradiente de cloruro de sodio.
Las fracciones que contenían producto se agruparon, se desalaron en una columna de exclusión por tamaño (Zetadex, EMP Biotech) y se liofilizaron.
Para la hibridación, se disolvieron en agua cantidades equimolares de las cadenas individuales respectivas y se calentaron a 80 °C durante 5 min. Después de enfriar gradualmente a TA, se liofilizó el dúplex resultante.
Las secuencias de los ácidos nucleicos resultantes (ARNip) se exponen en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1: Secuencias de ácido nucleico no conjugadas analizadas para la inhibición de la expresión de ARNm de LPA. Se indican las secuencias y el patrón de modificación aplicado
Tabla 1
Figure imgf000059_0001
continuación
Figure imgf000060_0002
Tabla 1: Las modificaciones de los nucleótidos se representan con los siguientes números (columna 4), 1=2'F-dU, 2=2'F-dA, 3=2'F-dC, 4 = 2'F-dG, 5=2'-OMe-rU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG.
Tabla 2: Las secuencias de los conjuntos de amplicones de qPCR de LPA, APOB, beta-actina y PTEN que se usaron para medir los niveles de ARNm se muestran a continuación.
Tabla 2
Figure imgf000060_0001
continuación
Figure imgf000061_0001
Ejemplo 2
Cribado de moléculas de ARNip no conjugadas (Tabla 1) para la inhibición de la expresión del ARNm de LPA en células RT-4 humanas.
Los complejos de transfección liposomal se prepararon por triplicado en una proporción de 1,5 ^l de RNAiMax (ThermoFisher)/80 pmol de las moléculas de ARNip indicadas. El complejo se diluyó a las concentraciones indicadas de 2,5 nM y 25 nM, respectivamente (valores representados por pares como barras grises claras y más oscuras). Las células de papiloma de células de transición de vejiga humana RT4 que expresan de manera endógena LpA se sembraron a una densidad de 125.000 células por pocillo en formato de 24 pocillos sobre complejos de transfección previamente sembrados (transfección inversa) a la concentración indicada. 24 horas después de la transfección, se aisló el ARN total con el Spin Cell Mini Kit 250 (Stratec). Los niveles del ARNm de LPA se determinaron mediante qRT-PCR en relación con la expresión del ARNm de PPIB en las muestras respectivas como transcripción de mantenimiento. Los valores se normalizaron a la cantidad de ARNm de LPA detectado en células no tratadas (intraplaca). Se transfectó un compuesto de ARNip sin silenciamiento como control adicional. Se muestran las medias y la DT de los valores normalizados por triplicado. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Ejemplo 3
Respuesta a la dosis de compuestos de ARNip dirigidos a LPA no conjugados en la expresión del ARNm de LPA en células RT-4 humanas.
Las células del papiloma de células transicionales de vejiga humana RT4 se transfectaron inversamente como se describe anteriormente (Ejemplo 2) y se trataron a la concentración indicada (intervalo de 100 nM a 0,2 nM) con los diferentes compuestos de ARNip no conjugados (Tabla 1) como se indica. 24 h después de la transfección, el ARN total se aisló con el Spin Cell Mini Kit 250 (Stratec). Los niveles del ARNm de LPA se determinaron mediante qRT-PCR en relación con la expresión del ARNm de PPIB en las muestras respectivas como transcripción de mantenimiento. Los valores se normalizaron a la cantidad de ARNm de LPA detectado en células no tratadas. Las barras representan la expresión del ARNm de LPA restante para cada función de datos. Los resultados se muestran en la Figura 2.
Ejemplo comparativo 4
Inhibición de la expresión del ARNm de LPA en hepatocitos primarios humanos y de macaco mediante diferentes dosis de molécula de ARNip LPA-1038 conjugada con GaINAc-L1 administrada mediante captación mediada por receptor.
Los hepatocitos primarios (ThermoFisher) se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas de colágeno a densidades de 45.000 células por pocillo (de macaco) y 30.000 células por pocillo (humanas). Se añadió LPA-1038 conjugado con GaINAc-L1 inmediatamente después del cultivo en placas a las concentraciones indicadas (nM). 24 horas después del tratamiento con ARNip, se aisló el ARN total con el kit de 96 pocillos InviTrap RNA cell HTS (Stratec). Los niveles del ARNm de LPA se determinaron mediante qRT-PCR en relación con los niveles de ARNm de actina (macaco) o APOB (ser humano) en las muestras respectivas como transcripción de mantenimiento. Los valores se normalizaron a la expresión de LPA en células no tratadas. Las medias y la DT de los valores normalizados triplicados de los niveles del ARNm de LPA restantes se muestran como barras negras. Los resultados se muestran en la Figura 3.
Ejemplo 5
Atenuación del ARNm de LPA en hepatocitos primarios humanos mediante los diferentes ARNip conjugados con L6-GaINAc indicados en hepatocitos primarios humanos tras la administración mediada por receptores.
Se sembraron hepatocitos primarios humanos (ThermoFisher) en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno a 30.000 células por pocillo (formato de 96 pocillos). Los ARNip conjugados con GaINAc-L6, incluido un control sin silenciamiento, se añadieron inmediatamente después de la siembra de células en las dos concentraciones indicadas.
24 horas después del tratamiento con ARNip, se aisló el ARN total con el kit de 96 pocillos InviTrap RNA cell HTS (Stratec). Los niveles de expresión del ARNm de LPA se determinaron mediante qRT-PCR en relación con el ARNm de APOB como transcripción de mantenimiento. Los valores se normalizaron a la expresión del ARNm de LPA en células no tratadas y los niveles del ARNm de LPA se representan por pares como barras (barras negras 100 nM, barras grises 20 nM). Las medias y la DT de los valores normalizados por triplicado se muestran en la Figura 5.
Ejemplo comparativo 6 - Síntesis de conjugados
Los compuestos ilustrativos se sintetizaron de acuerdo con los métodos que se describen a continuación y los métodos conocidos por los expertos en la materia. El ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos y los bloques de construcción enlazadores se realizó mediante síntesis en fase sólida aplicando la metodología de fosforamidita. La conjugación de GaINAc se logró mediante la formación de enlaces peptídicos de un bloque de construcción de ácido carboxílico de GaINAc con el oligonucleótido purificado y ensamblado previamente que tenía unido el número necesario de bloques de construcción enlazadores modificados con amino.
La síntesis, la desprotección y la purificación de oligonucleótidos siguieron los procedimientos convencionales que se conocen en la materia.
Todos los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador oligopiloto AKTA usando química convencional de fosforamidita. Se usaron un soporte sólido disponible en el mercado y fosforamiditas de 2'O-Metil ARN, 2'Fluoro, fosforamiditas de 2'desoxi ARN (toda la protección estándar, ChemGenes, LinkTech) y 3'-Amino Modifier TFA Amino C-6 Icaa CPG 500Á (Chemgenes) disponible en el mercado. La galactosa amina peracetilada 8 está disponible comercialmente.
Los reactivos auxiliares se adquirieron de EMP Biotech. La síntesis se realizó utilizando una solución 0,1 M de la fosforamidita en acetonitrilo seco y se utilizó benciltiotetrazol (BTT) como activador (0,3 M en acetonitrilo). El tiempo de acoplamiento fue de 15 min. Se aplicó un ciclo Cap/OX/Cap o Cap/Thio/Cap (Cap: Ac2O/NMI/lutidina/acetonitrilo, oxidante: I2 0,1 M en piridina/H2O). Se introdujeron fosforotioatos mediante reactivos de tiolación convencionales disponibles en el mercado (EDITH, tecnologías Link). La escisión de DMT se logró mediante el tratamiento con ácido dicloroacético al 3 % en tolueno. Al finalizar los ciclos de síntesis programados se realizó un lavado con dietilamina (DEA). Todos los oligonucleótidos se sintetizaron en modo DMT en suspensión.
La unión del resto enlazador procedente de serinol se logró mediante el uso de (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-Icaa-CPG 10 cargado con base o una fosforamidita de (S)-DMT-Serinol(TFA) 7 (la síntesis se realizó como se describe en Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016, 7, 128-135)). Los grupos de GaINAc triantenarios (ST23/C4XLT) se introdujeron mediante el acoplamiento sucesivo de los respectivos derivados de amidita de trebler (C4XLT-phos) seguidos de la amidita de GaINAc (ST23-phos).
Las cadenas se escindieron de la CPG en un tratamiento con metilamina ac. al 40 %. El oligonucleótido bruto resultante se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico (Resource Q, 6 ml, GE Healthcare) en un sistema de HPLC AKTA Pure utilizando un gradiente de cloruro de sodio.
Las fracciones que contenían producto se agruparon, se desalaron en una columna de exclusión por tamaño (Zetadex, EMP Biotech) y se liofilizaron.
Las cadenas simples individuales se disolvieron en una concentración de 60 DO/ml en H2O. Ambas soluciones de oligonucleótidos individuales se añadieron juntas en un recipiente de reacción. Para facilitar el seguimiento de la reacción, se realizó una valoración. La primera cadena se añadió en un exceso del 25 % sobre la segunda cadena, según lo determinado por la absorción UV a 260 nm. La mezcla de reacción se calentó a 80 °C durante 5 min y después se enfrió lentamente a TA. La formación de doble cadena se controló mediante HPLC de fase inversa de emparejamiento de iones. A partir del área UV de la cadena única residual se calculó la cantidad necesaria de la segunda cadena y se añadió a la mezcla de reacción. La reacción se calentó de nuevo a 80 °C y se enfrió despacio a TA. Este procedimiento se repitió hasta que se detectó menos del 10 % de cadena única residual.
Síntesis de los compuestos 2 a 10
Los compuestos 2 a 5 y (S)-DMT-Serinol(TFA)-fosforamidita 7 se sintetizaron de acuerdo con los métodos publicados en la bibliografía (Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135).
Ácido (S)-4-(3-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-2-(2,2,2-trifluoroacetamido)propoxi)-4-oxobutanoico (6).
A una solución de 5 en piridina se añadió anhídrido succínico, seguido de DMAP. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Todo el material de partida se consumió, según lo juzgado por TLC. La reacción se concentró. El material bruto se cromatografió en gel de sílice utilizando un gradiente del 0 % al 5 % de metanol en DCM (+ trietilamina al 1 %) para proporcionar 1,33 g de 6 (rendimiento = 38 %). m/z (ESI-): 588,2 (100 %), (calculado para C30H29F3NO8' [M-H]- 588,6). 1 H-NMR: (400 MHz, CDCl3) 8 [ppm] = 7,94 (d, 1H, NH), 7,39 - 7,36 (m, 2H, CHarilo), 7,29 -7,25 (m, 7H, CHarilo), 6,82-6,79 (m, 4H, CHarilo), 4,51 -4,47 (m, 1H), 4,31 -4,24 (m, 2H), 3,77 (s, 6H, 2xDMTr-OMe), 3,66 - 3,60 (m, 16H, HNEta+), 3,26 - 3,25 (m, 2H), 2,97 - 2,81 (m, 20H, NEta), 2,50-2,41 (4H, m), 1,48 - 1,45 (m, 26H, HNEts+), 1,24 -1,18 (m, 29H, NEts).
(S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-Icaa-CPG (10)
El (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato (159 mg, 270 pmol) y HBTU (113 mg, 299 pmol) se disolvieron en CH3CN (10 ml). Se añadió diisopropiletilamina (DIPEA, 94 pl, 540 pmol) a la solución y la mezcla se agitó durante 2 min seguido de la adición de amino-Icaa-CPG nativo (500 A, 3 g, contenido de amina: 136 mol/g). La suspensión se agitó suavemente a temperatura ambiente en un agitador de muñeca durante 16 h, después se filtró y se lavó con DCM y EtOH. El soporte sólido se secó al vacío durante 2 h. Las aminas que no reaccionaron en el soporte se protegieron mediante agitación con anhídrido acético/lutidina/N-metilimidazol a temperatura ambiente. El lavado del soporte se repitió como anteriormente. El sólido se secó al vacío para producir un soporte sólido 10 (3 g, carga de 26 pmol/g).
Sintón de GalNAc (9)
La síntesis del sintón de GalNAc 9 se realizó como se describe en Nair et al. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), págs.
16958-16961, en un rendimiento del 46 % en dos etapas.
Los datos de caracterización coincidieron con los datos publicados.
Síntesis de oligonucleótidos
Todos los oligonucleótidos monocatenarios se sintetizaron de acuerdo con las condiciones de reacción descritas anteriormente y en las Figuras 13 y 14.
Todos los productos monocatenarios finales se analizaron mediante AEX-HPLC para probar su pureza. La pureza se expresa en % FLP (% de producto de longitud completa, full length product) que es el porcentaje del área Uv bajo la señal de producto asignada en el trazado UV del análisis AEX-HPLC del producto final. La identidad de los respectivos productos monocatenarios (sin modificar, precursores modificados con amino u oligonucleótidos conjugados con GalNAc) se probó mediante análisis LC-MS.
Tabla 3: Oligonucleótidos monocatenarios no conjugados
Producto (11) Nombre PM calc. PM (ESI)
encontrado %FLP (AEX-HPLC) A0002 STS16001A 6943,3 Da 6943,0 Da 86,6 %
A0006 STS16001BL4 8387,5 Da 8387,5 Da 94,1 %
A0130 STS18001A 6259,9 Da 6259,8 Da 76,5 %
A0131 STS18001BL4 7813,2 Da 7813,1 Da 74,3 %
A0220 STS16001B-5'1 XNH2 6982,2 Da 6982,1 Da 95,7 %
A0237 STS16001A 6943,3 Da 6943,3 Da 95,6 %
A0244 STS16001BV1 6845,2 Da 6844,9 Da 98,2 %
A0264 STS16001AV4-3'1xNH2 7112,4 Da 7112,2 Da 95,4 %
A0329 STS16001BV6-3'5'1xNH2 7183,3 Da 7183,2 Da 88,8 %
5'1 x NH2 se refiere a la posición (extremo 5') y el número (1 x NH2) de grupos amino procedentes de serinol libres que están disponibles para la conjugación. Por ejemplo, 1x3'NH2 en A0264 significa que hay un grupo amino libre que puede reaccionar con el sintón de GalNAc 9 en el extremo 3' de la cadena A0264. 3'5'1xNH2 significa que hay un grupo amino libre procedente del serinol que puede reaccionar con el enlazador de GalNAc 9 en el extremo 3' y el extremo 5' de la cadena.
Síntesis de Conjugados 1-3 y Conjugados de referencia 1-2
Cadenas simples conjugadas para los Conjugados 1-2 y los Conjugados de referencia 1-2
La conjugación del sintón de GaINac (9) se logró mediante el acoplamiento a la función serinol-amino de la respectiva cadena de oligonucleótidos 11 utilizando un reactivo de acoplamiento peptídico. Por tanto, la respectiva molécula precursora modificada con amino 11 se disolvió en H2O (500 DO/ml) y se añadió DMSO (DMSO/H2O, 2/1, v/v), seguido de DIPEA (2,5 % del volumen total). En un recipiente de reacción separado se realizó la preactivación del ácido GaIN(Ac4)-C4 (9) haciendo reaccionar 2 eq. (por función amino en el oligonucleótido precursor modificado con amino 11) del componente de ácido carboxílico con 2 eq. de HBTU en presencia de 8 eq. de DIPEA en DMSO. Después de 2 min el compuesto preactivado 9 se añadió a la solución de la respectiva molécula precursora modificada con amino. Después de 30 min, el progreso de la reacción se controló mediante LCMS o AEX-HPLC. Una vez completada la reacción de conjugación, el producto bruto se precipitó mediante la adición de 10* iPrOH y NaCl 0,1* 2M y se recogieron mediante centrifugación y decantación. Para liberar los grupos hidroxilo acetilados en los restos de GalNAc, el sedimento resultante se disolvió en MeNH2 al 40 % (1 ml por 500 DO) y después de 15 min a TA se diluyó en H2O (1:10) y finalmente se purificó de nuevo mediante intercambio aniónico y cromatografía de exclusión por tamaño y se liofilizó para producir el producto final 12.
Tabla 4: Oligonucleótidos monocatenarios conjugados con GalNAc
Producto Material de
(12) partida Nombre PM calc. PM (ESI)
encontrado %FLP (AEX-HPLC) A0241 A0220 STS16001BL20 7285,5 Da 7285,3 Da 91,8 %
A0268 A0264 STS16001AV4L33 7415,7 Da 7415,4 Da 96,9 %
A0330 A0329 STS16001BV6L42 7789,8 Da 7789,8 Da 95,5 %
Formación de doble cadena
La formación de doble cadena se realizó de acuerdo con los métodos descritos anteriormente.
La pureza de doble cadena se da en % de doble cadena, que es el porcentaje del área UV bajo la señal de producto asignada en el trazado UV del análisis IP-RP-HPLC.
Tabla 5: Conjugados de ácido nucleico
Materiales de partida
Producto Primera Segunda Nombre % de doble
cadena
cadena cadena
Conj. de ref.
1 A0237 A0241 STS16001L20 97,7 %
Conj. de ref.
2 A0268 A0244 STS16001L33 97,8 %
Conj. de ref.
3 A0130 A0131 STS18001L4 96,8 %
Conj. de ref.
4 A0002 A0006 STS16001L4 90,1 %
Conjugado 1 A0268 A0241 STS16001L24 96,0 %
Conjugado 2 A0237 A0330 STS16001V1L42 98,5 %
Conjugado 3 A0268 A0330 STS16001V1L43 98,2 %
Secuencias
Claves de modificaciones para las siguientes secuencias:
f indica 2'Fluoro 2'desoxirribonucleótido o 2'-fluoro ribonucleótido (los términos son intercambiables) m indica 2'O Metil ribonucleótido
(ps) indica enlace de fosforotioato
Ser(GN) es un bloque de construcción de GaINAc-C4 unido al resto enlazador procedente de serinol:
Figure imgf000065_0001
en donde el O— es el enlace entre el átomo de oxígeno y, por ejemplo, H, el enlace fosforodiéster o el enlace fosforotioato.
C4XLT es:
Figure imgf000065_0002
ST23 es:
Figure imgf000065_0003
La síntesis de los derivados de fosforamidita de C4XLT (C4XLT-phos), así como de ST23 (ST23-phos), se puede realizar como se describe en el documento WO2017/174657.
C4XLT-phos:
Figure imgf000065_0004
ST23-phos:
Figure imgf000065_0005
Conjugado 1
Cadena de antisentido - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3' Cadena de sentido - STS16001BL20 (SEQ ID NO: 128)
5' Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps)fA 3' Conjugado 2
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BV1L42 (SEQ ID NO: 130)
Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN)
Conjugado 3
Cadena de antisentido - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3' Cadena de sentido - STS16001BV1L42 (SEQ ID NO: 130)
5' Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) 3'
Conjugado de referencia 1
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BL20 (SEQ ID NO: 128)
Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
Conjugado de referencia 2
Cadena de antisentido - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) Cadena de sentido - STS16001V1B (SEQ ID NO: 131)
fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
Conjugado de referencia 3
Cadena de antisentido - STS18001A (A0130; SEQ ID NO: 132)
mU (ps) fC (ps) mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA (ps) fC (ps) mG
Cadena de sentido -STS18001BL4 (A0131, SEQ ID NO: 133)
[(ST23) (ps) ]3 C4XLT (ps) fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC (ps) mG (ps) fA Conjugado de referencia 4
Cadena de antisentido - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BL4 (SEQ ID NO: 134)
5'[(ST23) (ps) ]3 C4XLT(ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
Ejemplo comparativo 7 - Determinación in vitro de la atenuación de TTR de diversos conjugados de GalNAc de ARNip de TTR
Se sembraron hepatocitos primarios murinos en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con colágeno (Thermo Fisher Scientific, n.° A1142803) a una densidad celular de 30.000 células por pocillo y se trataron con conjugados de ARNip en concentraciones que variaban entre 10 nM y 0,0001 nM. 24 horas después del tratamiento, las células se lisaron y el ARN se extrajo con el kit InviTrap® RNA Cell HTS 96/C24 * 96 prep. (Stratec n.° 7061300400) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los niveles de transcripciones de TTR y ARNm de mantenimiento (PtenII) se cuantificaron mediante análisis TaqMan.
La expresión del gen diana en hepatocitos primarios murinos 24 horas después del tratamiento con los conjugados de la invención, Conjugados 1 a 3, mostró que la expresión del gen diana disminuye a medida que aumenta la dosis del conjugado en comparación con los controles negativos (véase la columna "ST" y el Conjugado de referencia 3), como se muestra en la Figura 15. Esto indica que la primera cadena se une al gen diana, reduciendo así la expresión génica. En la Figura 15 también se muestran los niveles de expresión del gen diana de los Conjugados de referencia 1 y 2 que actúan como conjugados de comparación. Como puede observarse en una comparación entre los datos presentados en las Figuras 15A y 15C y 15B y 15C, los conjugados de la invención (Conjugados 1 a 3) disminuyen la expresión del gen diana en comparación con los Conjugados de referencia 1 y 2. El conjugado más eficaz a 0,01 nM parece ser el Conjugado 2. El conjugado más eficaz a 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM y 10 nM parece ser el Conjugado 3. Ejemplo comparativo 8 - Evolución temporal in vivo de TTR en suero en ratones
Se trataron s.c. ratones C57BL/6 con 1 mg/kg de conjugados de ARNip en el día 0. Se tomaron muestras de suero los días 7, 14 y 27 mediante sangrado del seno orbitario y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis. La cuantificación de TTR en suero se realizó con un ELISA de prealbúmina de ratón (ALPCO, 41-PALMS/lote 22, 2008003B) de acuerdo con el protocolo del fabricante (dilución de muestra 1:8000 o 1:800).
Los resultados de la evolución temporal de TTR en suero en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 4 a los 7, 14 y 27 días después del tratamiento s.c. con los Conjugados 1 a 3 1 mg/kg, los Conjugados de referencia 1, 2 y 4 y los individuos tratados de forma simulada (PBS) se muestran en la Figura 16. Como indican los datos de la Figura 16, los conjugados de la invención son particularmente eficaces para reducir la expresión del gen diana en comparación con el control negativo (PBS) y los Conjugados de referencia 1, 2 y en particular, con el Conjugado de referencia 4. Los Conjugados 2 y 3 también son más eficaces que los Conjugados de referencia 1, 2 y 4. El conjugado más eficaz es el Conjugado 2. Por lo tanto, se puede esperar que el nivel de dosificación del Conjugado 3 sea unas tres veces menor para lograr la misma reducción inicial y también dé como resultado una mayor duración de la atenuación en comparación con el Conjugado de referencia 4.
Ejemplo comparativo 9 - Síntesis de conjugados 2
Los compuestos ilustrativos se sintetizaron de acuerdo con los métodos que se describen a continuación y los métodos conocidos por los expertos en la materia. El ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos y los bloques de construcción enlazadores se realizó mediante síntesis en fase sólida aplicando la metodología de fosforamidita. La conjugación de GaINAc se logró mediante la formación de enlaces peptídicos de un bloque de construcción de ácido carboxílico de GaINAc con el oligonucleótido purificado y ensamblado previamente que tenía unido el número necesario de bloques de construcción enlazadores modificados con amino.
La síntesis, la desprotección y la purificación de oligonucleótidos siguieron los procedimientos convencionales que se conocen en la materia.
Todos los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador oligopiloto AKTA usando química convencional de fosforamidita. Se usaron un soporte sólido disponible en el mercado y fosforamiditas de 2'O-Metil ARN, 2'Fluoro, fosforamiditas de 2'desoxi ARN (toda la protección estándar, ChemGenes, LinkTech) y 3'-Amino Modifier TFA Amino C-6 Icaa CPG 500A (Chemgenes) disponible en el mercado. La galactosa amina peracetilada 8 está disponible comercialmente.
Los reactivos auxiliares se adquirieron de EMP Biotech. La síntesis se realizó utilizando una solución 0,1 M de la fosforamidita en acetonitrilo seco y se utilizó benciltiotetrazol (BTT) como activador (0,3 M en acetonitrilo). El tiempo de acoplamiento fue de 15 min. Se aplicó un ciclo Cap/OX/Cap o Cap/Thio/Cap (Cap: Ac2O/NMI/lutidina/acetonitrilo, oxidante: I2 0,1 M en piridina/H2O). Se introdujeron fosforotioatos mediante reactivos de tiolación convencionales disponibles en el mercado (EDITH, tecnologías Link). La escisión de DMT se logró mediante el tratamiento con ácido dicloroacético al 3 % en tolueno. Al finalizar los ciclos de síntesis programados se realizó un lavado con dietilamina (DEA). Todos los oligonucleótidos se sintetizaron en modo DMT en suspensión.
La unión del resto enlazador procedente de serinol se logró mediante el uso de (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-Icaa-CPG 10 cargado con base o una fosforamidita de (S)-DMT-Serinol(TFA) 7 (la síntesis se realizó como se describe en la bibliografía de Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135). Los grupos de GaINAc triantenarios (ST23/C4XLT o ST23/C6XLT) se introdujeron mediante el acoplamiento sucesivo de los respectivos derivados de amidita de trebler (C4XLT-phos o C6XLT-phos) seguidos de la amidita de GaINAc (ST23-phos).
Las cadenas se escindieron de la CPG en un tratamiento con metilamina ac. al 40 %. El oligonucleótido bruto resultante se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico (Resource Q, 6 ml, GE Healthcare) en un sistema de HPLC AKTA Pure utilizando un gradiente de cloruro de sodio. Las fracciones que contenían producto se agruparon, se desalaron en una columna de exclusión por tamaño (Zetadex, EMP Biotech) y se liofilizaron.
Las cadenas simples individuales se disolvieron en una concentración de 60 DO/ml en H2O. Ambas soluciones de oligonucleótidos individuales se añadieron juntas en un recipiente de reacción. Para facilitar el seguimiento de la reacción, se realizó una valoración. La primera cadena se añadió en un exceso del 25 % sobre la segunda cadena, según lo determinado por la absorción UV a 260 nm. La mezcla de reacción se calentó a 80 °C durante 5 min y después se enfrió lentamente a TA. La formación de doble cadena se controló mediante HPLC de fase inversa de emparejamiento de iones. A partir del área UV de la cadena única residual se calculó la cantidad necesaria de la segunda cadena y se añadió a la mezcla de reacción. La reacción se calentó de nuevo a 80 °C y se enfrió despacio a TA. Este procedimiento se repitió hasta que se detectó menos del 10 % de cadena única residual.
Síntesis de los compuestos 2 a 10
Los compuestos 2 a 5 y (S)-DMT-Serinol(TFA)-fosforamidita 7 se sintetizaron de acuerdo con los métodos publicados en la bibliografía (Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135).
Ácido (S)-4-(3-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-2-(2,2,2-trifluoroacetamido)propoxi)-4-oxobutanoico (6).
A una solución de 5 en piridina se añadió anhídrido succínico, seguido de DMAP. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Todo el material de partida se consumió, según lo juzgado por TLC. La reacción se concentró. El material bruto se cromatografió en gel de sílice utilizando un gradiente del 0 % al 5 % de metanol en DCM (+ trietilamina al 1 %) para proporcionar 1,33 g de 6 (rendimiento = 38 %). m/z (ESI-): 588,2 (100 %), (calculado para C30H29F3NO8' [M-H]- 588,6). 1 H-NMR: (400 MHz, CDCl3) 8 [ppm] = 7,94 (d, 1H, NH), 7,39 - 7,36 (m, 2H, CHarilo), 7,29 - 7,25 (m, 7H, CHarilo), 6,82-6,79 (m, 4H, CHarilo), 4,51 - 4,47 (m, 1H), 4,31 - 4,24 (m, 2H), 3,77 (s, 6H, 2xDMTr-OMe), 3,66 - 3,60 (m, 16H, HNEta+), 3,26 - 3,25 (m, 2H), 2,97 - 2,81 (m, 20H, NEta), 2,50-2,41 (4H, m), 1,48 - 1,45 (m, 26H, HNEt3+), 1,24 -1,18 (m, 29H, NEt3).
(S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-Icaa-CPG (10)
El (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato (159 mg, 270 pmol) y HBTU (113 mg, 299 pmol) se disolvieron en C ^C N (10 ml). Se añadió diisopropiletilamina (DIPEA, 94 pl, 540 pmol) a la solución y la mezcla se agitó durante 2 min seguido de la adición de amino-Icaa-CPG nativo (500 A, 3 g, contenido de amina: 136 mol/g). La suspensión se agitó suavemente a temperatura ambiente en un agitador de muñeca durante 16 h, después se filtró y se lavó con DCM y EtOH. El soporte sólido se secó al vacío durante 2 h. Las aminas que no reaccionaron en el soporte se protegieron mediante agitación con anhídrido acético/lutidina/N-metilimidazol a temperatura ambiente. El lavado del soporte se repitió como anteriormente. El sólido se secó al vacío para producir un soporte sólido 10 (3 g, carga de 26 pmol/g).
Sintón de GalNAc (9)
La síntesis del sintón de GalNAc 9 se realizó como se describe en Nair et al. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), págs.
16958-16961, en un rendimiento del 46 % en dos etapas.
Los datos de caracterización coincidieron con los datos publicados.
Síntesis de oligonucleótidos
Todos los oligonucleótidos monocatenarios se sintetizaron de acuerdo con las condiciones de reacción descritas anteriormente y en las Figuras 13 y 14.
Todos los productos monocatenarios finales se analizaron mediante AEX-HPLC para probar su pureza. La pureza se expresa en % FLP (% de producto de longitud completa, full length product) que es el porcentaje del área Uv bajo la señal de producto asignada en el trazado UV del análisis AEX-HPLC del producto final. La identidad de los respectivos productos monocatenarios (sin modificar, precursores modificados con amino u oligonucleótidos conjugados con GalNAc de C4XLT/ST23 o C6XLT/ST23) se probó mediante análisis LC-MS.
Tabla 7: Oligonucleótidos monocatenarios no conjugados y conjugados en columna Producto (11) PM calc. PM (ESI) encontrado %FLP (AEX-HPLC)
X0385A 6315, 0 Da 6314,6 Da 91,0 %
X0385B-prec 6593 1 Da 6593,1 Da %
X038BA 6315, 0 Da 6314,6 Da 91,0 %
X0386B-prec 6547 1 Da 6546,9 Da 87,5 %
X0383A 6315, 0 Da 6314,5 Da 91,9 %
X0383B-prec 8 Da 6508,6 Da 84,6 %
X0371A 6416, 1 Da 6416,1 Da 88,4 %
X0371B-prec 0 Da 6521,8 Da 91,9 %
X0320A 6143 8 Da 6143,7 Da 94,6 %
X0320B-prec 6665 0 Da 6664,8 Da %
X0477A 6143 8 Da 6143,4 Da %
X0477B-prec 6749 3 Da 6749,2 Da 83,1 %
X0027A 6416, 1 Da 6415,8 Da 92,8 %
X0027B 0 Da 7641,8 Da %
Síntesis de Conjugados 1-3 y Conjugados de referencia 1-2
Cadenas monocatenarias conjugadas para los Conjugados 1-2 y los Conjugados de referencia 1-2
La conjugación del sintón de GalNac (9) se logró mediante el acoplamiento a la función serinol-amino de la respectiva cadena de oligonucleótidos 11 utilizando un reactivo de acoplamiento peptídico. Por tanto, la respectiva molécula precursora modificada con amino 11 se disolvió en H2O (500 DO/ml) y se añadió DMSO (DMSO/H2O, 2/1, v/v), seguido de DIPEA (2,5 % del volumen total). En un recipiente de reacción separado se realizó la preactivación del ácido GaIN(Ac4)-C4 (9) haciendo reaccionar 2 eq. (por función amino en el oligonucleótido precursor modificado con amino 11) del componente de ácido carboxílico con 2 eq. de HBTU en presencia de 8 eq. de DIPEA en DMSO. Después de 2 min el compuesto preactivado 9 se añadió a la solución de la respectiva molécula precursora modificada con amino. Después de 30 min, el progreso de la reacción se controló mediante LCMS o AEX-HPLC. Una vez completada la reacción de conjugación, el producto bruto se precipitó mediante la adición de 10* /PrOH y NaCl 0,1* 2M y se recogieron mediante centrifugación y decantación. Para liberar los grupos hidroxilo acetilados en los restos de GalNAc, el sedimento resultante se disolvió en MeNH2 al 40 % (1 ml por 500 DO) y después de 15 min a TA se diluyó en H2O (1:10) y finalmente se purificó de nuevo mediante intercambio aniónico y cromatografía de exclusión por tamaño y se liofilizó para producir el producto final 12.
Tabla 8: Oligonucleótidos monocatenarios conjugados con GalNAc
Producto (12) Material de partida PM calc. PM (ESI)
(11) encontrado %FLP (AEX-HPLC) X0385B X0385B-prec 7199,8 Da 7199,3 Da 93,2 %
X0386B X0386B-prec 7153,8 Da 7153,0 Da 86,2 %
X0383B X0383B-prec 7115,5 Da 7115,4 Da 93,7 %
X0320B X0320B-prec 7271,7 Da 7271,7 Da 90,0 %
X0371B X0371B-prec 7128,8 Da 7128,3 Da 95,0 %
X0477B X0477B-prec 7356,0 Da 7355,7 Da 91,4 %
Formación de doble cadena
La formación de doble cadena se realizó de acuerdo con los métodos descritos anteriormente.
La pureza de doble cadena se da en % de doble cadena, que es el porcentaje del área UV bajo la señal de producto asignada en el trazado UV del análisis IP-RP-HPLC.
Tabla 9: Conjugados de ácido nucleico
Materiales de partida % de doble
Producto Primera Segunda cadena
cadena cadena
X0385 X0385A X0385B 97,5 %
X0386 X0386A X0386B 96,9 %
X0383 X0383A X0383B 91,9 %
X0371 X0371A X0371B 97,7 %
X0027 X0027A X0027B 93,4 %
X0320 X0320A X0320B 98,6 %
X0477 X0477A X0477B 96,0 %
Secuencias
Claves de modificaciones para las siguientes secuencias:
f indica 2'Fluoro 2'desoxirribonucleótido o 2'-fluoro ribonucleótido (los términos son intercambiables) m indica 2'O Metil ribonucleótido
(ps) indica enlace de fosforotioato
Ser(GN) es un bloque de construcción de GaINAc-C4 unido al resto enlazador procedente de serinol:
Figure imgf000069_0001
en donde el O— es el enlace entre el átomo de oxígeno y, por ejemplo, H, el enlace fosforodiéster o el enlace fosforotioato.
C4XLT es:
Figure imgf000070_0001
C6XLT es:
Figure imgf000070_0002
ST23 es:
Figure imgf000070_0003
La síntesis de los derivados de fosforamidita de C4XLT (C4XLT-phos), C6XLT (C6XLT-phos), así como de ST23 (ST23-phos), se puede realizar como se describe en el documento WO2017/174657.
C4XLT-phos:
Figure imgf000070_0004
C6XLT-phos:
Figure imgf000070_0005
ST23-phos:
Figure imgf000070_0006
Ejemplo 10
Respuesta a la misma dosis de atenuación para el ARNip de direccionamiento de LPA con dos unidades individuales de GaINAc conjugadas con la segunda cadena en comparación con una unidad triantenaria de GaINAc en la segunda cadena en 5' en hepatocitos primarios de macaco.
Los ARNip se modifican mediante la alteración de 2'-OMe/2'-F y contienen cada uno dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato (PS) en sus dos enlaces internucleotídicos terminales 5' y 3'. En el Conjugado 19, cada una de las unidades de serinol-GaINAc está unida a través de un enlace PS al 5' y al 3' de la segunda cadena. En el Conjugado 20, los dos internucleótidos en 5' terminales de la segunda cadena son fosfodiésteres y un enlazador GaINAc triantenaria está unido mediante un enlace PS a este extremo.
La respuesta a la dosis de la atenuación de LPA en los hepatocitos primarios de macaco se evaluó 24 horas después del tratamiento con ARNip 100, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032 y 0,006 nM. El control de referencia es la construcción 2, el control sin direccionamiento se denomina Cte. El valor ct de la transcripción para cada grupo de tratamiento se normalizó al valor ct de la transcripción para el gen ACTB de mantenimiento (Act) y para los hepatocitos no tratados, llamado st (AAct).
Los datos se muestran en la Figura 18
Material y métodos:
ARNi
Figure imgf000071_0001
Leyenda
mA, mU, mC,
ARN 2'-O-Metil
mG
fA, fU, fC, fG ARN de 2'-desoxi-2'-fluoro
(ps) fosforotioato
(po) fosfodiéster
Cebador:
SEQ ID NO:
dir G T G TC C TC G C A A C G TC C A 48
LPA inv G AC C C C G G G G C TTTG 49
sonda B H Q 1 -TG G C T G TTTC T G A A C A A G C A C C A A T G G-FAM 140 dir G C A TG G G TC A G A A G G A TTC C TA T 54
ACTB inv T GT AG A AG G T GT G G TG CCAG ATT 55
sonda BHQ1-TCGAGCACGGCATCGTCACCAA-VIC 141
Métodos generales
Experimentos in vitro
Se descongelaron hepatocitos primarios murinos (Thermo Scientific: Lote GIBCO: n.°MC798) y se cambió el medio de crioconservación por medio Williams E complementado con FBS al 5 %, dexametasona 1 pM, Glutamax 2 mM, PenStrep al 1 %, insulina recombinante humana 4 mg/ml, Hepes 15 mM. La densidad celular se ajustó a 250000 células por 1 ml. Se sembraron 100 pl por pocillo de esta suspensión celular en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con colágeno. El artículo de prueba se diluyó previamente en el mismo medio (concentrado 5 veces) para cada concentración y se añadieron a las células 25 pl de este ARNip diluido previamente o solo medio. Las células se cultivaron a 37 °C y CO2 al 5 %. 24 h después del tratamiento, se descartó el sobrenadante y las células se lavaron en PBS frío y se añadieron 250 |jl de tampón de lisis de ARN S (Stratec). Después de 15min de incubación a temperatura ambiente, las placas se almacenaron a -80 °C hasta el aislamiento del ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Análisis TaqMan
Para el análisis múltiple TaqMan de mTTR y PTEN, se mezclaron 10 j l de ARN aislado para cada grupo de tratamiento con 10 j l de mezcla maestra de PCR (TAKYON low Rox) que contenía cebador mTTR 600 nM, cebador ApoB 400 nM y 200 nM de cada sonda, así como 0,5 unidades de polimerasa Euroscript II RT con 0,2 unidades de inhibidor de ARNasa. El análisis TaqMan se realizó en una placa de 384 pocillos con una etapa de RT de 10 min a 48 °C, desnaturalización inicial de 3 min a 95 °C y 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 1 min. Los cebadores contienen dos de BHQ1, FAM e YY, una en cada extremo de la secuencia.
Para el análisis TaqMan multiplexado de TMPRSS6 y ApoB, se mezclaron 10 j l de ARN aislado para cada grupo de tratamiento con 10 j l de mezcla maestra de PCR (TAKYON low Rox) que contenía cebador TMPRSS6 800 nM, cebador ApoB 100 nM y 200 nM de cualquiera de las sondas, así como 0,5 unidades de polimerasa Euroscript II RT con 0,2 unidades de inhibidor de ARNasa. El análisis TaqMan se realizó en una placa de 384 pocillos con una etapa de RT de 10 min a 48 °C, desnaturalización inicial de 3 min a 95 °C y 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 1 min.
Experimentos in vivo
Para comparar la potencia in vivo de diferentes conjugados de ARNip se administró por vía subcutánea ARNip 1 mg/kg disuelto en PBS en la región escapular de ratones c57BL/6. Las cohortes de n = 6 se trataron con ARNip de direccionamiento de Aldh2 o Tmprss6 en el día 1 y se sacrificaron en puntos temporales seleccionados después del tratamiento. Las muestras de hígado se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta la extracción del ARN con el kit InviTrap Spin Tissue RNA Mini (Stratec) de acuerdo con el manual del fabricante. A continuación, el nivel de transcripción de Aldh2, Tmprss6 y Pten se cuantificó como se ha descrito anteriormente.
Ensayo de estabilidad en tritosomas
Para comprobar la estabilidad de la ARNasa en el compartimento endosómico/lisosómico de las células hepáticas in vitro se incubó ARNip durante 0 h, 4 h, 24 h o 72 h en tritosomas de hígado de rata Sprague Dawley (Tebu-Bio, n.° de catálogo: R0610.LT, lote: 1610405, pH: 7,4, 2,827 unidades/ml). Para imitar el entorno acidificado, los tritosomas se mezclaron 1:10 con tampón de pH bajo (ácido acético 1,5 M, acetato de sodio 1,5 M, pH 4,75). 30 j l de estos tritosomas acidificados. Después se mezclaron 10 j l de ARNip (20 jM ) y se incubaron durante los tiempos indicados a 37 °C. Después de la incubación, se aisló el ARN con los cartuchos del kit de inicio Clarity OTX (Phenomenex n.° de cat.: KSO-8494) de acuerdo con el protocolo del fabricante para líquidos biológicos. El ARN liofilizado se reconstituyó en 30 j l de H2O, se mezclaron con tampón de carga 4* y se cargaron 5 j l en una electroforesis en gel de TBE-poliacrilamida (PAGE) al 20 % para el análisis semicuantitativo cualitativo de separación. La PAGE se ejecutó a 120 V durante 2 h y el ARN se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio con toma de imágenes digitales posteriores con un sistema de imágenes Biorad.
Ejemplo 11 - Síntesis de conjugados 3
Los compuestos ilustrativos se sintetizaron de acuerdo con los métodos que se describen a continuación y los métodos conocidos por los expertos en la materia. El ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos y los bloques de construcción enlazadores se realizó mediante síntesis en fase sólida aplicando la metodología de fosforamidita. La conjugación de GaINAc se logró mediante la formación de enlaces peptídicos de un bloque de construcción de ácido carboxílico de GaINAc con el oligonucleótido purificado y ensamblado previamente que tenía unido el número necesario de bloques de construcción enlazadores modificados con amino.
La síntesis, la desprotección y la purificación de oligonucleótidos siguieron los procedimientos convencionales que se conocen en la materia.
Todos los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador oligopiloto AKTA usando química convencional de fosforamidita. Se usaron un soporte sólido disponible en el mercado y fosforamiditas de 2'O-Metil ARN, 2'Fluoro, fosforamiditas de 2'desoxi ARN (toda la protección estándar, ChemGenes, LinkTech) y 3'-Amino Modifier TFA Amino C-6 Icaa CPG 500Á (Chemgenes), Fmoc-Amino-DMT C-7 CE fosforamidita (GlyC3Am), Modificador 3'-amino C-3 Icaa CPG 500Á (C3Am), Fmoc-Amino-DMT C-3 CED fosforamidita (C3Am) y TFA-Amino C-6 CED fosforamidita (C6Am) (Chemgenes) disponibles en el mercado, 3'-Amino-Modifier C7 CPG (C7Am) (Glen Research), TFA aminofosforamidita no nucleosídico (Pip), soporte sólido amino TFA no nucleosídico (PipAm) (AM Chemicals). La galactosa amina peracetilada 8 está disponible comercialmente.
Los reactivos auxiliares se adquirieron de EMP Biotech. La síntesis se realizó utilizando una solución 0,1 M de la fosforamidita en acetonitrilo seco y se utilizó benciltiotetrazol (BTT) como activador (0,3 M en acetonitrilo). El tiempo de acoplamiento fue de 15 min. Se aplicó un ciclo Cap/OX/Cap o Cap/Thio/Cap (Cap: Ac2O/NMI/lutidina/acetonitrilo, oxidante: I2 0,1 M en piridina/H2O). Se introdujeron fosforotioatos mediante reactivos de tiolación convencionales disponibles en el mercado (EDITH, tecnologías Link). La escisión de DMT se logró mediante el tratamiento con ácido dicloroacético al 3 % en tolueno. Al finalizar los ciclos de síntesis programados se realizó un lavado con dietilamina (DEA). Todos los oligonucleótidos se sintetizaron en modo DMT en suspensión.
La unión del resto enlazador procedente de serinol se logró mediante el uso de (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-Icaa-CPG 10 cargado con base o una fosforamidita de (S)-DMT-Serinol(TFA) 7 (la síntesis se realizó como se describe en la bibliografía de Hoevelmann et al. (2016)). Los grupos de GaINAc triantenarios (ST23/C4XLT) se introdujeron mediante el acoplamiento sucesivo de los respectivos derivados de amidita de trebler (C4XLT-phos) seguidos de la amidita de GaINAc (ST23-phos).
La unión de restos modificados con amino (enlazadores no procedentes de serinol) se logró mediante el uso de los bloques de construcción CPG modificados con amino comercialmente disponibles o amidita.
Las cadenas se escindieron de la CPG en un tratamiento con metilamina ac. al 40 %. El oligonucleótido bruto resultante se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico (Resource Q, 6 ml, GE Healthcare) en un sistema de HPLC AKTA Pure utilizando un gradiente de cloruro de sodio. Las fracciones que contenían producto se agruparon, se desalaron en una columna de exclusión por tamaño (Zetadex, EMP Biotech) y se liofilizaron.
Las cadenas simples individuales se disolvieron en una concentración de 60 DO/ml en H2O. Ambas soluciones de oligonucleótidos individuales se añadieron juntas en un recipiente de reacción. Para facilitar el seguimiento de la reacción, se realizó una valoración. La primera cadena se añadió en un exceso del 25 % sobre la segunda cadena, según lo determinado por la absorción UV a 260 nm. La mezcla de reacción se calentó a 80 °C durante 5 min y después se enfrió lentamente a TA. La formación de doble cadena se controló mediante HPLC de fase inversa de emparejamiento de iones. A partir del área UV de la cadena única residual se calculó la cantidad necesaria de la segunda cadena y se añadió a la mezcla de reacción. La reacción se calentó de nuevo a 80 °C y se enfrió despacio a TA. Este procedimiento se repitió hasta que se detectó menos del 10 % de cadena única residual.
Síntesis de los compuestos 2 a 10
Los compuestos 2 a 5 y (S)-DMT-Serinol(TFA)-fosforamidita 7 se sintetizaron de acuerdo con los métodos publicados en la bibliografía (Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135).
Ácido (S)-4-(3-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-2-(2,2,2-trifluoroacetamido)propoxi)-4-oxobutanoico (6).
A una solución de 5 en piridina se añadió anhídrido succínico, seguido de DMAP. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Todo el material de partida se consumió, según lo juzgado por TLC. La reacción se concentró. El material bruto se cromatografió en gel de sílice utilizando un gradiente del 0 % al 5 % de metanol en DCM (+ trietilamina al 1 %) para proporcionar 1,33 g de 6 (rendimiento = 38 %). m/z (ESI-): 588,2 (100 %), (calculado para C30H29F3NO8' [M-H]- 588,6). 1 H-NMR: (400 MHz, CDCl3) 8 [ppm] = 7,94 (d, 1H, NH), 7,39 - 7,36 (m, 2H, CHarilo), 7,29 - 7,25 (m, 7H, CHarilo), 6,82-6,79 (m, 4H, CHarilo), 4,51 - 4,47 (m, 1H), 4,31 - 4,24 (m, 2H), 3,77 (s, 6H, 2xDMTr-OMe), 3,66 - 3,60 (m, 16H, HNEta+), 3,26 - 3,25 (m, 2H), 2,97 - 2,81 (m, 20H, NEta), 2,50-2,41 (4H, m), 1,48 - 1,45 (m, 26H, HNEts+), 1,24 -1,18 (m, 29H, NEts).
(S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-Icaa-CPG (10)
El (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato (159 mg, 270 pmol) y HBTU (113 mg, 299 pmol) se disolvieron en CH3CN (10 ml). Se añadió diisopropiletilamina (DIPEA, 94 pl, 540 pmol) a la solución y la mezcla se agitó durante 2 min seguido de la adición de amino-Icaa-CPG nativo (500 A, 3 g, contenido de amina: 136 mol/g). La suspensión se agitó suavemente a temperatura ambiente en un agitador de muñeca durante 16 h, después se filtró y se lavó con DCM y EtOH. El soporte sólido se secó al vacío durante 2 h. Las aminas que no reaccionaron en el soporte se protegieron mediante agitación con anhídrido acético/lutidina/N-metilimidazol a temperatura ambiente. El lavado del soporte se repitió como anteriormente. El sólido se secó al vacío para producir un soporte sólido 10 (3 g, carga de 26 pmol/g).
Sintón de GaINAc (9)
La síntesis del sintón de GaINAc 9 se realizó como se describe en Nair et al. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), págs.
16958-16961, en un rendimiento del 46 % en dos etapas.
Los datos de caracterización coincidieron con los datos publicados.
Síntesis de oligonucleótidos
Todos los oligonucleótidos monocatenarios se sintetizaron de acuerdo con las condiciones de reacción descritas anteriormente y en las Figuras 13 y 14 y se describen en las Tablas 10 y 11.
Todos los productos monocatenarios finales se analizaron mediante AEX-HPLC para probar su pureza. La pureza se expresa en % FLP (% de producto de longitud completa, full length product) que es el porcentaje del área UV bajo la señal de producto asignada en el trazado UV del análisis AEX-HPLC del producto final. La identidad de los respectivos productos monocatenarios (sin modificar, precursores modificados con amino u oligonucleótidos conjugados con GalNAc) se probó mediante análisis LC-MS.
Tabla 10: Oligonucleótidos monocatenarios no conjugados
Producto (11) Nombre PM calc. PM (ESI)
encontrado %FLP (AEX-HPLC) A0002 STS16001A 6943,3 Da 6943,0 Da %
A0006 STS16001BL4 8387,5 Da 8387,5 Da 94,1 %
A0114 STS22006A 6143,8 Da 6143,7 Da 94,3 %
A0115 STS22006BL1 7855,1 Da 7855,1 Da 92,8 %
A0122 STS22009A 6260,9 Da 6260,6 Da 92,8 %
A0123 STS22009BL1 7783,0 Da 7782,9 Da 87,1 %
A0130 STS18001A 6259,9 Da 6259,8 Da 76,5 %
A0131 STS18001BL4 7813,2 Da 7813,1 Da 74,3 %
A0220 STS16001B-5'1xNH2 6982,2 Da 6982,1 Da 95,7 %
A0237 STS16001A 6943,3 Da 6943,3 Da 95,6 %
A0244 STS16001BV1 6845,2 Da 6844,9 Da 98,2 %
A0264 STS16001AV4-3'1xNH2 7112,4 Da 7112,2 Da 95,4 %
A0329 STS16001BV6-3'5'1xNH2 7183,3 Da 7183,2 Da 88,8 %
A0560 STS16001A 6943,3 Da 6943,3 Da 96,7 %
A0541 STS16001BV1-3'5'NH2 7151,3 Da 7151,0 Da 85,6 %
A0547 STS16001BV16-3'5'NH2 7119,3 Da 7119,1 Da 89,9 %
A0617 STS16001BV20-3'5'NH2 7087,3 Da 7086,7 Da 90,1 %
A0619 STS16001BV1-3'5'2xNH2 7521,3 Da 7521,3 Da 93,4 %
A0680 STS16001A 6943,3 Da 6942,9 Da 91,2 %
A0514 STS22006A 6143,8 Da 6143,7 Da 94,6 %
A0516 STS22009BV11-3'5'NH2 6665,0 Da 6664,8 Da %
A0517 STS22009BV11-3'5'NH2 6593,0 Da 6593,0 Da %
A0521 STS12009BV1-3'5'NH2 6437,7 Da 6437,8 Da 91,1 %
A0303 STS12209BL4 7665,0 Da 7664,9 Da %
A0304 STS12209A 6393,1 Da 6392,9 Da 77,6 %
A0319 STS22009A 6260,9 Da 6260,5 Da 86,9 %
A0353 STS12009A 6416,1 Da 6416,1 Da 94,1 %
A0216 STS17001A 6178,8 Da 6178,7 Da 87,2 %
A0217 STS17001BL6 7937,2 Da 7937,2 Da 78,3 %
5'1 x NH2 se refiere a la posición (extremo 5') y el número (1 x NH2) de grupos amino procedentes de serinol libres que están disponibles para la conjugación. Por ejemplo, 1x3'NH2 en A0264 significa que hay un grupo amino libre que puede reaccionar con el sintón de GaINAc 9 en el extremo 3' de la cadena A0264. 3'5'1xNH2 significa que hay un grupo amino libre procedente del serinol que puede reaccionar con el enlazador de GaINAc 9 en el extremo 3' y el extremo 5' de la cadena.
Tabla 11: Oligonucleótidos monocatenarios con modificaciones en 5' y 3' Producto Nombre 5'mod 3'mod PM calc. PM (ESI)
encontrado %FLP (AEX-HPLC) A0561 STS16001BV1 -3'5'1xNH2 C6Am GlyC3Am 7267,5 Da 7267,5 Da 66,7 %
A0563 STS16001BV1 -3'5'1xNH2 C3Am C3Am 7183,4 Da 7183,1 Da 75,1 %
(continuación)
Producto Nombre 5'mod 3'mod PM calc. PM (ESI) %FLP (AEX-HPLC) encontrado
A0651 STS16001BV1 -3'5'1xNH2 C6Am C7Am 7265,6 Da 7265,2 Da 99,6 %
A0653 STS16001BV1 -3'5'1xNH2 GlyC3Am GlyC3Am 7299,5 Da 7299,3 Da 88,1 %
A0655 STS16001BV1 -3'5'1xNH2 PipAm PipAm 7517,7 Da 7517,5 Da 89,8 %
De forma similar, 3'5'1 x NH2 se refiere a la posición (extremo 3' y 5') y número (1 x NH2 cada uno) de grupos amino libres que están disponibles para la conjugación. Por ejemplo, 3'5'1xNH2 en A0561 significa que hay 2 grupos amino libres (1 en el extremo 3' y 1 en el extremo 5') que pueden reaccionar con el sintón de GaINAc 9 en el extremo 3' de la cadena A0561.
Síntesis de ciertos conjugados de la invención y de los Conjugados de referencia 1-2
La conjugación del sintón de GaINac (9) se logró mediante el acoplamiento a la función serinol-amino de la respectiva cadena de oligonucleótidos 11 utilizando un reactivo de acoplamiento peptídico. Por lo tanto, la respectiva molécula precursora modificada con amino 11 se disolvió en H2O (500 DO/ml) y se añadió DMSO (DMSO/H2O, 2/1, v/v), seguido de DIPEA (2,5 % del volumen total). En un recipiente de reacción separado se realizó la preactivación del ácido GaIN(Ac4)-C4 (9) haciendo reaccionar 2 eq. (por función amino en el oligonucleótido precursor modificado con amino 11) del componente de ácido carboxílico con 2 eq. de HBTU en presencia de 8 eq. de DIPEA en DMSO. Después de 2 min el compuesto preactivado 9 se añadió a la solución de la respectiva molécula precursora modificada con amino. Después de 30 min, el progreso de la reacción se controló mediante LCMS o AEX-HPLC. Una vez completada la reacción de conjugación, el producto bruto se precipitó mediante la adición de 10* iPrOH y NaCl 0,1* 2M y se recogieron mediante centrifugación y decantación. Para liberar los grupos hidroxilo acetilados en los restos de GaINAc, el sedimento resultante se disolvió en MeNH2 al 40 % (1 ml por 500 DO) y después de 15 min a TA se diluyó en H2O (1:10) y finalmente se purificó de nuevo mediante intercambio aniónico y cromatografía de exclusión por tamaño y se liofilizó para producir el producto final 12 (Tabla 12).
Tabla 12: Oligonucleótidos monocatenarios conjugados con GaINAc
Producto Material de Nombre PM calc. PM (ESI) %FLP (AEX-HPLC) (12) partida encontrado
A0241 A0220 STS16001BL20 7285,5 Da 7285,3 Da 91,8 %
A0268 A0264 STS16001AV4L33 7415,7 Da 7415,4 Da 96,9 %
A0330 A0329 STS16001BV6L42 7789,8 Da 7789,8 Da 95,5 %
A0544 A0541 STS16001BV1L75 7757,9 Da 7757,7 Da 93,3 %
A0550 A0547 STS16001BV16L42 7725,9 Da 7725,7 Da 88,5 %
A0620 A0617 STS16001BV20L75 7693,91 Da 7693,2 Da 90,9 %
A0622 A0619 STS16001BV1L94 8734,3 Da 8734,6 Da 82,9 %
A0519 A0516 STS22006BV11L42 7271,7 Da 7271,7 Da 90,0 %
A0520 A0517 STS22009BV11L42 7199,6 Da 7199,7 Da 92,9 %
A0522 A0521 STS12009BV1L42 7044,4 Da 7044,4 Da 96,0 %
A0603 A0602 STS20041BV1L42 7280,7 Da 7280,4 Da 93,4 %
Síntesis de determinados conjugados de la invención
La conjugación del sintón de GaINac (9) se logró mediante el acoplamiento a la función amino de la respectiva cadena de oligonucleótidos 14 utilizando un reactivo de acoplamiento peptídico. Por lo tanto, la respectiva molécula precursora modificada con amino 14 se disolvió en H2O (500 DO/ml) y se añadió DMSO (DMSO/H2O, 2/1, v/v), seguido de DIPEA (2,5 % del volumen total). En un recipiente de reacción separado se realizó la preactivación del ácido GaIN(Ac4)-C4 (9) haciendo reaccionar 2 eq. (por función amino en el oligonucleótido precursor modificado con amino 14) del componente de ácido carboxílico con 2 eq. de HBTU en presencia de 8 eq. de DIPEA en DMSO. Después de 2 min el compuesto preactivado 9 se añadió a la solución de la respectiva molécula precursora modificada con amino. Después de 30 min, el progreso de la reacción se controló mediante LCMS o AEX-HPLC. Una vez completada la reacción de conjugación, el producto bruto se precipitó mediante la adición de 10* /PrOH y NaCl 0,1* 2 M y se recogieron mediante centrifugación y decantación. Para liberar los grupos hidroxilo acetilados en los restos de GalNAc, el sedimento resultante se disolvió en MeNH2 al 40 % (1 ml por 500 DO) y después de 15 min a TA se diluyó en H2O (1:10) y finalmente se purificó de nuevo mediante intercambio aniónico y cromatografía de exclusión por tamaño y se liofilizó para producir el producto final 15 (Tabla 13).
Tabla 13: Oligonucleótidos monocatenarios conjugados con GalNAc
Producto (15) Material de
partida Nombre PM calc. PM (ESI)
encontrado %FLP (AEX-HPLC) A0562 A0561 STS16001BV1L87 7874,2 Da 7874,0 Da 82,7 %
A0564 A0563 STS16001BV1L88 7790,0 Da 7789,4 Da 90,4 %
A0652 A0651 STS16001BV1L96 7872,2 Da 7871,8 Da 94,6 %
A0654 A0653 STS16001BV1L97 7906,2 Da 7905,6 Da 89,9 %
A0656 A0655 STS16001BV1L98 8124,3 Da 8124,0 Da 93,6 %
Formación de doble cadena
La formación de doble cadena se realizó de acuerdo con los métodos descritos anteriormente.
La pureza de doble cadena se da en % de doble cadena, que es el porcentaje del área UV bajo la señal de producto asignada en el trazado UV del análisis IP-RP-HPLC (Tabla 14).
Tabla 14: Conjugados de ácido nucleico
Materiales de partida
Producto Nombre % de doble
Primera cadena Segunda cadena cadena
Conj. de ref. 1 A0237 A0241 STS16001L20 97,7 %
Conj. de ref. 2 A0268 A0244 STS16001L33 97,8 %
Conj. de ref. 3 A0130 A0131 STS18001 L4 96,8 %
Conj. de ref. 4 A0002 A0006 STS16001L4 90,1 %
Conj. de ref. 5 A0216 A0217 STS17001L6 88,4 %
Conjugado 1 A0268 A0241 STS16001L24 96,0 %
Conjugado 2 A0237 A0330 STS16001V1L42 98,5 %
Conjugado 3 A0268 A0330 STS16001V1L43 98,2 %
Conjugado 4 A0560 A0544 STS16001V1L75 92,5 %
Conjugado 5 A0560 A0550 STS16001V16L42 95,3 %
Conjugado 6 A0237 A0620 STS16001V20L75 97,8 %
Conjugado 7 A0237 A0622 STS16001V1L94 93,7 %
Conjugado 8 A0680 A0652 STS16001V1L96 98,4 %
Conjugado 9 A0680 A0654 STS16001V1L97 95,8 %
Conjugado 10 A0680 A0656 STS16001V1L98 97,6 %
Conjugado 11 A0560 A0564 STS16001V1L88 95,0 %
Conjugado 12 A0237 A0562 STS16001V1L87 96,8 %
Conjugado 13 A0114 A0115 STS22006L1 85,6 %
Conjugado 14 A0122 A0123 STS22009L1 96,4 %
Conjugado 15 A0514 A0519 STS22006V11L42 98,6 %
Conjugado 16 A0319 A0520 STS22009V11L42 97,0 %
Conjugado 17 A0304 A0303 STS12209L4 93,0 %
Conjugado 18 A0353 A0522 STS12009V1L42 98,0 %
Conjugado 19 A0601 A0603 STS20041BL42 97,6 %
Secuencias
Claves de modificaciones para las siguientes secuencias:
f indica 2'Fluoro 2'desoxirribonudeótido o 2'-fluoro ribonucleótido (los términos son intercambiables) m indica 2'O Metil ribonucleótido
(ps) indica enlace de fosforotioato
FAM = 6-Carboxifluoresceína
BHQ = Black Hole Quencher 1, desactivador oscuro 1
YY = Yakima Yellow, Amarillo Yakima
Definiciones
Ser(GN) es un bloque de construcción de GaINAc-C4 unido al resto enlazador procedente de serinol:
Figure imgf000077_0001
en donde el O— es el enlace entre el átomo de oxígeno y, por ejemplo, H, el enlace fosforodiéster o el enlace fosforotioato.
GN es:
Figure imgf000077_0002
C4XLT (también conocido como ST41) es:
Figure imgf000077_0003
ST23 es:
Figure imgf000077_0004
La síntesis de los derivados de fosforamidita de C4XLT (C4XLT-phos), así como de ST23 (ST23-phos), se puede realizar como se describe en el documento WO2017/174657.
C4XLT-phos:
Figure imgf000077_0005
ST23-phos:
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000078_0002
en donde G = H (antes de la conjugación) o G = GN (después de la conjugación).
Conjugado 1
Cadena de antisentido - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3' Cadena de sentido - STS16001BL20 (SEQ ID NO: 128)
5' Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps)fA 3' Conjugado 2
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BV1L42 (SEQ ID NO: 130)
Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN)
Conjugado 3
Cadena de antisentido - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3' Cadena de sentido - STS16001BV1L42 (SEQ ID NO: 130)
5' Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) 3'
Conjugado 4
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BV1L75 (SEQ ID NO: 142)
5' Ser(GN) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA Ser(GN) 3' C o n ju g a d o 5
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BV16L42 (SEQ ID NO: 143)
5' Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mA fA (ps) Ser(GN) 3' Conjugado 6
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BV20L75 (SEQ ID NO: 144)
5' Ser(GN) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mA fA Ser(GN) 3'
Conjugado 7
Cadena de antisentido -(SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BV1L94 (SEQ ID NO: 145)
5' Ser(GN) (ps) Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) (ps) Ser(GN) 3'
Conjugado 8
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
Cadena de sentido - STS16001V1BL96 (SEQ ID NO: 146)
5' C6Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) C7Am(GN) 3'
Conjugado 9
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
Cadena de sentido - STS16001V1BL97 (SEQ ID NO: 147)
5' GlyC3Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) GlyC3Am(GN) 3'
Conjugado 10
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 148)
5' PipAm(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) PipAm(GN) 3'
Conjugado 11
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
Cadena de sentido - STS16001V1BL88 (SEQ ID NO: 149)
5' C3Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) C3Am(GN) 3'
Conjugado 12
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
Cadena de sentido - STS16001V1BL87 (SEQ ID NO: 150)
5' C6Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) GlyC3Am(GN) 3'
C o n ju g a d o 15
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 151)
mU (ps) fC (ps) mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU (ps) fU (ps) mC
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 152)
Ser(GN) (ps) fG (ps) mA (ps) fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA (ps) mG (ps) fA (ps) Ser(GN) Conjugado 16
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 153)
mA (ps) fU (ps) mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU (ps) fC (ps) mU
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 154)
Ser(GN) (ps) fA (ps) mG (ps) fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC (ps) mA (ps) fU (ps) Ser(GN)
Conjugado 18
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 155)
mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 156)
Ser(GN) (ps) fU (ps) mC (ps) fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU (ps) Ser(GN)
Conjugado 19
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 135)
mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 136)
Ser(GN) (ps) fC (ps) mG (ps) fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU (ps) mA (ps) fU (ps) Ser(GN)
Conjugado de referencia 1
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001 BL20 (SEQ ID NO: 128)
Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
Conjugado de referencia 2
Cadena de antisentido - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) Cadena de sentido - STS16001 BV1 (SEQ ID NO: 157)
fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
Conjugado de referencia 3 - "Luc"
Cadena de antisentido - STS18001A (A0130, SEQ ID NO: 132)
mU (ps) fC (ps) mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA (ps) fC (ps) mG
Cadena de sentido -STS18001BL4 (A0131, SEQ ID NO: 133)
[(ST23) (ps)]3 C4XLT (ps) fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC (ps) mG (ps) fA
Conjugado de referencia 4
Cadena de antisentido - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BL4 (SEQ ID NO: 134)
5'[(ST23) (ps)]3 C4XLT(ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
Conjugado de referencia 5 - "Ctr"
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 138)
mC (ps) fU (ps) mU fA mC fU mC fU mC fG mC fC mC fA mA fG mC (ps) fG (ps) mA
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 139)
[(ST23) (ps)]3 (C6XLT) (ps) fU mC fG mC fU mU fG mG fG mC fG mA fG mA fG mU fA (ps) mA (ps) fG C o n ju g a d o de re fe re nc ia 6
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 151)
mU (ps) fC (ps) mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU (ps) fU (ps) mC
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 158)
[ST23 (ps)]3 Itrb (ps) fG mA fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA (ps) mG (ps) fA
Conjugado de referencia 7
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 153)
mA (ps) fU (ps) mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU (ps) fC (ps) mU
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 159)
[ST23 (ps)]3 Itrb (ps) fA mG fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC (ps) mA (ps) fU
Conjugado de referencia 8
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 160)
mU (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 161)
[ST23 (ps)]3 ST41 (ps)fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fA Conjugado de referencia 9
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 135)
mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 162)
[ST23 (ps)]3 C6XLT (ps) fC mG fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU (ps) mA (ps) fU Ejemplo 12 - Determinación in vitro de inactivación de TTR de diversos conjugados de GalNAc de ARNip de TTR
Conjugados 1 a 3
Se sembraron hepatocitos primarios murinos en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con colágeno (Thermo Fisher Scientific, n.° A1142803) a una densidad celular de 30.000 células por pocillo y se trataron con conjugados de ARNip en concentraciones que variaban entre 10 nM y 0,0001 nM. 24 horas después del tratamiento, las células se lisaron y el ARN se extrajo con el kit InviTrap® RNA Cell HTS 96/C24 * 96 prep. (Stratec n.° 7061300400) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los niveles de transcripciones de TTR y ARNm de mantenimiento (PtenII) se cuantificaron mediante análisis TaqMan.
La expresión del gen diana en hepatocitos primarios murinos 24 horas después del tratamiento a 0,01 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM y 10 nM con los conjugados de la invención, Conjugados 1 a 3, mostró que la expresión del gen diana disminuye a medida que aumenta la dosis del conjugado en comparación con los controles negativos (véase la columna "ST" y el Conjugado de referencia 3), como se muestra en la Figura 15. Esto indica que la primera cadena se une al gen diana, reduciendo así la expresión génica. En la Figura 15 también se muestran los niveles de expresión del gen diana de los Conjugados de referencia 1 y 2 que actúan como conjugados de comparación. Como puede observarse en una comparación entre los datos presentados en las Figuras 15A y 15C y 15B y 15C, los conjugados de la invención (Conjugados 1 a 3) disminuyen la expresión del gen diana en comparación con los Conjugados de referencia 1 y 2. El conjugado más eficaz a 0,01 nM parece ser el Conjugado 2. El conjugado más eficaz a 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM y 10 nM parece ser el Conjugado 3.
Conjugados 4 a 7
El método se describió anteriormente en "experimentos in vitro" en la sección de Método general.
La expresión del gen diana en hepatocitos primarios murinos 24 horas después del tratamiento a 0,01 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM y 10 nM con los conjugados de la invención, los conjugados 4 a 7, mostró que la expresión del gen diana disminuye a medida que aumenta la dosis del conjugado en comparación con los controles negativos (véase la columna "ST" y Luc [Conjugado de referencia 3]), como se muestra en la Figura 31. Esto indica que la primera cadena se une al gen diana, reduciendo así la expresión génica.
Los datos in vitro muestran que en el contexto de uno o dos restos enlazadores procedentes de serinol que se proporcionan en los extremos 5' y 3' de la cadena de sentido en los Conjugados 4 a 7, el número de enlaces de fosforotioato (PS) entre el nucleótido terminal y el enlazador, y/o entre los tres nucleótidos terminales en la cadena de sentido, puede variarse manteniendo la eficacia para disminuir la expresión del gen diana.
Conjugados 8 a 12 y 19
El método se describió anteriormente en "experimentos in vitro" en la sección de Método general.
La expresión del gen diana en hepatocitos primarios murinos 24 horas después del tratamiento a 0,01 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM y 10 nM con los conjugados de la invención, los Conjugados 8 a 12, mostró que la expresión del gen diana disminuye a medida que aumenta la dosis del conjugado en comparación con los controles negativos (véase la columna "ST" y Luc [Conjugado de referencia 3]), como se muestra en la Figura 32. Esto indica que la primera cadena se une al gen diana, reduciendo así la expresión génica. En particular, Los conjugados 8, 9, 10 y 11 parecen ser comparables o mejores que el conjugado 2, que previamente demostró ser el conjugado más eficaz a 0,01 nM.
También se demostró que el conjugado 19 disminuía la expresión del gen diana en comparación con los controles negativos (véase la columna "ST" y Ctr, que es un ARNip sin direccionamiento y también denominado Conjugado de referencia 5), como se muestra en la Figura 33. Esto indica que la primera cadena se une al gen diana, reduciendo así la expresión génica.
Los datos in vitro para los conjugados 8 a 12 y 19 muestran que una serie de enlazadores que son estructuralmente diversos y que están conjugados en ambos extremos de la cadena de sentido son eficaces para disminuir la expresión del gen diana. Los conjugados 8 a 12 y 19 disminuyen la expresión del gen diana de manera más eficaz que "Luc", que es el conjugado de referencia 3 (para los conjugados 8 a 12), "Ctr", que es el Conjugado de referencia 5 (para el conjugado 19) y el control sin tratamiento.
Ejemplo comparativo 13 - Evolución temporal in vivo de Ttr, A ldh2 y Tm prss6 en suero en ratones
Conjugados 1 a 3
Se trataron s.c. ratones C57BL/6 con 1 mg/kg de conjugados de ARNip en el día 0. Se tomaron muestras de suero los días 7, 14 y 27 mediante sangrado del seno orbitario y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis. La cuantificación de TTR en suero se realizó con un ELISA de prealbúmina de ratón (ALPCO, 41-PALMS/lote 22, 2008003B) de acuerdo con el protocolo del fabricante (dilución de muestra 1:8000 o 1:800).
Los resultados de la evolución temporal de TTR en suero en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 4 a los 7, 14 y 27 días después del tratamiento s.c. con los Conjugados 1 a 3 1mg/kg, los Conjugados de referencia 1, 2 y 4 y los individuos tratados de forma simulada (PBS) se muestran en la Figura 16. Como indican los datos de la Figura 16, los conjugados de la invención son particularmente eficaces para reducir la expresión del gen diana en comparación con el control negativo (PBS) y los Conjugados de referencia 1, 2 y en particular, con el Conjugado de referencia 4. Los Conjugados 2 y 3 también son más eficaces que los Conjugados de referencia 1,2 y 4. El conjugado más eficaz es el Conjugado 2. Por lo tanto, se puede esperar que el nivel de dosificación del Conjugado 2 sea unas tres veces menor para lograr la misma reducción inicial y también dé como resultado una mayor duración de la atenuación en comparación con el Conjugado de referencia 4.
De manera más específica, el Conjugado 2 dio como resultado un nivel de proteína diana en suero 3 veces más bajo en el día siete y un nivel de proteína diana en suero 4 veces más bajo en el día 27 en comparación con el conjugado de referencia 4 a una dosis equimolar en ratones de tipo silvestre. Además, el Conjugado 2 dio como resultado una reducción del 85 % del nivel de proteína diana en suero el día 27 después de la inyección única, en comparación con una reducción del 36 % por cantidad equimolar del Conjugado de referencia 4.
Conjugados 15 a 18
El método se describió anteriormente en "experimentos vivo" en la sección de Método general.
Los resultados de la evolución temporal de Aldh2 en suero en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 6 a los 14, 28 y 42 días después del tratamiento s.c. con 1 mg/kg de los Conjugados 15 y 16, los Conjugados de referencia 6 y 7 y los individuos tratados de forma simulada (PBS) se muestran en las Figuras 34 y 35. Como se sugiere por los datos de las figuras 34 y 35, los conjugados de la invención son particularmente eficaces para reducir la expresión del gen diana en comparación con el control negativo (PBS) y los conjugados de referencia 6 y 7 respectivamente.
Los resultados de la evolución temporal de Tmprss6 en suero en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 6 a los 14, 28 y 42 días después del tratamiento s.c. con 1 mg/kg del conjugado 18, el Conjugado de referencia 8 y los individuos tratados de forma simulada (PBS) se muestran en la Figura 36. Como indican los datos de la Figura 36, los conjugados de la invención son particularmente eficaces para reducir la expresión del gen diana en comparación con el control negativo (PBS) y el conjugado de referencia 8.
En general, los datos in vivo muestran que varios enlazadores ilustrativos que se conjugan en ambos extremos de la segunda cadena son eficaces para disminuir la expresión del gen diana in vivo. El posicionamiento del enlazador mejora la potencia in vivo de los conjugados, en comparación con un control de enlazador GalNAc triantenario en el extremo 5' de la segunda cadena (Conjugados de referencia 6, 7 y 8).
Ejemplo comparativo 14 - Estudios de estabilidad en suero
Se siguió el método descrito anteriormente en "Ensayo de estabilidad en tritosomas" en la sección Método general. En la Figura 37 se muestran los resultados de los estudios de estabilidad en suero con respecto a los Conjugados 2, 4, 5, 6 y 7. En la Figura 38 se muestra la estabilidad en suero de los Conjugados 2, 8, 9, 10, 11 y 12.
Todos los conjugados de la invención que se probaron son más estables en suero en comparación con el control. Todos los conjugados probados contienen cada uno una unidad enlazadora de GalNAc en el extremo 5' y otra en el extremo 3' de la segunda cadena. Los ARNip se modifican mediante la alteración de 2'-OMe/2'-F y contienen cada uno dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato (PS) en sus dos enlaces internucleotídicos terminales 5' y 3', a menos que se indique se otro modo.
En el Conjugado 4, las unidades de serinol-GalNAc se unen mediante un enlace fosfodiéster. En el Conjugado 5, las unidades de serinol-GalNAc se conjugan a través de PS, mientras que todos los enlaces entre nucleótidos en la segunda cadena son fosfodiésteres. En el Conjugado 6, la segunda cadena no contiene PS. En el Conjugado 7, dos unidades de serinol-GalNAc están unidas a cada extremo de la segunda cadena y entre sí a través de enlaces PS en los extremos respectivos. En el conjugado 8, se aplicaron un modificador de amino C6 en 5' y un modificador de amino C7 en el extremo 3' de la segunda cadena para la unión del ligando. En conjugado 9 se utilizaron modificadores Gly-C3-amino, en el conjugado 10 modificadores piperidil-amino, en el conjugado 11 modificadores de amino C3 y en el conjugado 2 unidades serinol-GaINAc como enlazadores para la conjugación a ambos extremos de la segunda cadena. En el conjugado 2, tanto los internucleótidos terminales como los enlaces nucleótido-serinol son PS. En el conjugado 12, se aplicaron un modificador de amino C6 en el extremo 5' y un modificador de amino GlyC3 en el extremo 3' de la segunda cadena para la unión del ligando. "st" indica una muestra sin tratamiento a la que se normalizaron las otras muestras. "Luc" indica un ARNip dirigido a luciferasa (Conjugado de referencia 3), que se utilizó como control no dirigido y que no reduce los niveles de ARNm diana.
Los datos muestran que en el contexto de un resto enlazador procedente de serinol que se proporciona en los extremos 5' y 3' de la cadena de sentido, el número de enlaces de fosforotioato (PS) entre el nucleótido terminal y el enlazador, y/o entre los tres nucleótidos terminales en la cadena de sentido, se puede variar manteniendo la estabilidad en suero.
Ejemplo comparativo 15
Atenuación del ARNm de LPA en hepatocitos primarios humanos mediante los diferentes ARNip conjugados con L6-GaINAc indicados en hepatocitos primarios humanos tras la administración mediada por receptores.
Tabla 15: Secuencias de ácido nucleico adicionales analizadas para la inhibición de la expresión de ARNm de LPA. Se indican las secuencias y el patrón de modificación aplicado
Tabla 15
Figure imgf000083_0001
continuación
Figure imgf000084_0001
_________________________ ________________________
Tabla 15: Las modificaciones de los nucleótidos se representan con los siguientes números (columna 4), 1=2'F-dU, 2=2'F-dA, 3=2'F-dC, 4 = 2'F-dG, 5=2'-OMe-rU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG.
Se sembraron hepatocitos primarios humanos (ThermoFisher) en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno a 30.000 células por pocillo (formato de 96 pocillos). Los ARNip conjugados con GaINAc-L6 se añadieron inmediatamente después de la siembra en placa de células en las concentraciones indicadas. 24 horas después del tratamiento con los ARNip, el ARN total se aisló utilizando el kit de 96 pocillos InviTrap RNA cell HTS (Stratec). Los niveles de expresión del ARNm de LPA se determinaron mediante qRT-PCR en relación con el ARNm de APOB como transcripción de mantenimiento. Los valores se normalizaron respecto a la expresión del ARNm de LPA en células no tratadas. Las medias y la DT de los valores normalizados por triplicado se muestran en la Figura 39. CI50- los valores y la inhibición máxima se estimaron usando un ajuste de curva de regresión no lineal de cuatro parámetros.
Figure imgf000085_0001
Figure imgf000086_0001
Figure imgf000087_0001
Figure imgf000088_0001
Figure imgf000089_0001
Figure imgf000090_0001
Figure imgf000091_0001
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Figure imgf000093_0001
Figure imgf000094_0001
Figure imgf000095_0001
_ _
Figure imgf000096_0001
Leyenda
1 = 2'F-dU
2 = 2'F-dA
3 = 2'F-dC
4 = 2'F-dG
5 = 2'OMe-rU
6 = 2'OMe-rA
7 = 2'OMe-rC
8 = 2'OMe-rG
mA, mU, mC, mG, OMeA, OMeU, OMeC, OMeG - 2'-OMe ARN
fA, fU, fC, fG, FA, FU, FG, FC - 2'desoxi-2'-F ARN
(ps) - fosforotioato
(vp) - Vinil-(E)-fosfonato
ivA, ivC, ivU, ivG - ARN invertido (3'-3')
Una sola secuencia puede tener más de un nombre. En esos casos, uno de esos nombres se da en la tabla sumario de secuencias.
Cuando se muestran enlazadores específicos o enlaces modificados dentro de una secuencia de ARN, tales como PS y [ST23 (ps)]3 ST41 (ps), etc., éstos son partes opcionales de la secuencia, pero son una realización preferida de esa secuencia. Pueden utilizarse las siguientes abreviaturas:
Figure imgf000097_0001
continuación
Figure imgf000098_0001

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico para inhibir la expresión de LPA en una célula, que comprende al menos una región doble que comprende al menos una parte de una primera cadena y al menos una parte de una segunda cadena que es al menos parcialmente complementaria a la primera cadena, en donde dicha primera cadena es al menos parcialmente complementaria a al menos una parte del ARN transcrito a partir del gen LPA, en donde dicha primera cadena comprende una secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 9 y opcionalmente en donde dicha segunda cadena comprende una secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 10.
2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde dicha primera cadena tiene una longitud de 19-35 nucleótidos y/o dicha segunda cadena tiene una longitud de 17-35 nucleótidos, opcionalmente en donde la al menos una región doble consiste en 17-25, preferentemente 19-25, pares de bases de nucleótidos consecutivos y además opcionalmente en donde el ácido nucleico:
a) tiene extremos romos en ambos extremos; o
b) tiene un saliente en un extremo y un extremo romo en el otro; o
c) tiene un saliente en ambos extremos.
3. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se modifican uno o más nucleótidos en la primera y/o segunda cadena, para formar nucleótidos modificados.
4. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ácido nucleico comprende un enlace fosforotioato entre los dos o tres nucleótidos 3' y/o 5' terminales de uno o ambos extremos de la primera y/o de la segunda cadena.
5. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ácido nucleico está conjugado con un ligando.
6. El ácido nucleico de la reivindicación 5, en donde el ligando comprende (i) uno o más restos de N-acetil galactosamina (GalNAc) o derivados de la misma y (ii) un enlazador, en donde el enlazador conjuga el al menos un resto de GalNAc o un derivado de la misma con el ácido nucleico.
7. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en donde el ácido nucleico está conjugado con un ligando que comprende un compuesto de fórmula (I):
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
en la que:
S representa un sacárido, preferentemente en donde el sacárido es N-acetil galactosamina;
X1 representa alquileno C3-C6 o (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- en donde m es 1, 2 o 3;
P es un fosfato o un fosfato modificado, preferentemente un tiofosfato;
X2 es alquileno o un alquilenéter de la fórmula (-CH2)n-O-CH2- donde n = 1-6;
A es una unidad de ramificación;
X3 representa una unidad de unión;
en donde un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 está conjugado con X3 a través de un fosfato o un fosfato modificado, preferentemente un tiofosfato.
8. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en donde la primera cadena de ARN es un compuesto de fórmula (X):
Figure imgf000099_0001
la segunda cadena de ARN es un compuesto de fórmula (XI):
Figure imgf000100_0001
en la que:
c y d son independientemente 0 o 1;
Zi y Z2 son las partes de ARN de la primera y la segunda cadena de ARN, respectivamente;
Y es O o S;
n es 0, 1, 2 o 3; y
Li es un enlazador al que se une un ligando; y
en donde b c d es 2 o 3.
9. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico está conjugado con un ligando y tiene la siguiente estructura
Figure imgf000100_0002
10. El ácido nucleico de la reivindicación 9, en donde el ácido nucleico comprende dos enlaces fosforotioato entre cada uno de los tres nucleótidos terminales 3' y entre cada uno de los tres nucleótidos terminales 5' de la primera cadena y dos enlaces fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales del extremo 3' de la segunda cadena y en donde el ligando está conjugado con el extremo 5' de la segunda cadena.
11. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico está conjugado con un ligando, en donde la primera cadena de ARN es un compuesto de fórmula (XV):
Figure imgf000101_0001
en la que b es 0 o 1; y
la segunda cadena de ARN es un compuesto de fórmula (XVI):
Figure imgf000101_0002
en la que c y d son independientemente 0 o 1;
en la que:
Z1 y Z2 son las partes de ARN de la primera y la segunda cadena de ARN, respectivamente;
Y es O o S;
R1 es H o metilo;
n es 0, 1, 2 o 3; y
L es igual o diferente en las fórmulas (XV) y (XVI) y se selecciona del grupo que consiste en:
-(CH2)q, en donde q = 2-12;
-(CH2)r-C(O)-, en donde r = 2-12;
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, en donde s = 1-5;
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, en donde t es independientemente 1-5;
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, en donde u es independientemente 1-5; y
-(CH2)v-NH-C(O)-, en donde v es 2-12; y
en donde el terminal C(O), sí está presente, está unido al grupo NH;
y en donde b c d es 2 o 3.
12. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 9-11, que comprende una secuencia y modificaciones tal como se muestra a continuación:
Figure imgf000101_0003
en donde, las modificaciones específicas están representadas por números
1=2'F-dU,
2=2'F-dA,
3=2'F-dC,
4=2'F-dG,
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG.
13. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 9-11, en donde los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 del extremo 5' de la primera cadena se modifican con una modificación de fluoro en 2' y los nucleótidos en la segunda cadena que se corresponden con la(s) posición(ones) 11 o 13 u 11 y 13 u 11-13 de la primera cadena se modifican con una modificación de fluoro en 2'.
14. Una composición que comprende un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y opcionalmente, un vehículo de administración y/o un excipiente fisiológicamente aceptable y/o un portador y/o un diluyente y/o un tampón y/o un conservante, para su uso como medicamento, preferentemente para la prevención o el tratamiento o la reducción del riesgo de una enfermedad o de una patología, en donde la enfermedad o la patología preferentemente son una enfermedad cardiovascular, en donde la enfermedad cardiovascular preferentemente es un accidente cerebrovascular, una ateroesclerosis, una trombosis, una cardiopatía coronaria o una estenosis de la válvula aórtica y/o cualquier otra enfermedad o patología asociadas a niveles elevados de partículas que contienen Lp(a).
15. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y que comprende además un vehículo de administración, preferentemente liposomas y/o un excipiente fisiológicamente aceptable y/o un portador y/o un diluyente.
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