ES2932295T3 - Acidos nucleicos para inhibir la expresión de LPA en una célula - Google Patents

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Lucas Bethge
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Adrien Weingaertner
Judith Hauptmann
Sibylle Dames
Steffen Schubert
Stephan Tenbaum
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Abstract

La presente invención se refiere a productos y composiciones y sus usos. En particular, la invención se refiere a productos de ácido nucleico que interfieren con la expresión del gen LPA o inhiben su expresión, preferentemente para su uso como tratamiento, prevención o reducción del riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares tales como enfermedad coronaria o estenosis aórtica o accidente cerebrovascular o cualquier otro trastorno. , patología o síndrome relacionado con niveles elevados de partículas Lp(a). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Ácidos nucleicos para inhibir la expresión de LPA en una célula
Campo de la invención
La presente invención se refiere a productos y composiciones y a sus usos. En particular, la invención se refiere a productos de ácido nucleico que interfieren con la expresión del gen LPA o que inhiben su expresión. Este tratamiento terapéutico reductor de la Lp(a) sirve para prevenir y reducir el riesgo de sufrir un ictus, ateroesclerosis, trombosis y enfermedades cardiovasculares tales como cardiopatía coronaria y estenosis de la válvula aórtica o cualquier otro trastorno, patología o síndrome relacionado con niveles elevados de partículas de Lp(a).
Antecedentes
Se ha demostrado que los ARN bicatenarios (ARNbc) capaces de unirse de manera complementaria al ARNm expresado pueden bloquear la expresión génica (Fire et al., 1998, Nature. 19 de febrero de 1998; 391(6669):806-11 y Elbashir et al., 2001, Nature. 24 de mayo de 2001; 411(6836):494-8) mediante un mecanismo que se ha denominado interferencia por ARN (iARN). Los ARNbc cortos dirigen el silenciamiento postranscripcional específico de los genes en muchos organismos, incluidos los vertebrados, y se han convertido en una herramienta útil para estudiar la función de los genes. La iARN está mediada por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, del inglés RNA induced silencing complex), una nucleasa multicomponente específica de secuencia que degrada los ARN mensajeros homólogos al desencadenante del silenciamiento cargado en el complejo RISC. Los ARN de interferencia (denominados en el presente documento ARNi) tales como los ARNip, los ARN antisentido y los microARN son oligonucleótidos que evitan la formación de proteínas mediante el silenciamiento génico, es decir, la inhibición de la traducción génica de la proteína a través de la degradación de las moléculas de ARNm. Los agentes silenciadores de genes son cada vez más importantes para aplicaciones terapéuticas en medicina.
De acuerdo con Watts y Corey en el Journal of Pathology (2012; Vol 226, p 365379) hay algoritmos que se pueden utilizar para diseñar desencadenantes del silenciamiento de ácidos nucleicos, pero todos estos tienen limitaciones importantes. Pueden ser necesarios varios métodos experimentales para identificar potentes ARNi, ya que los algoritmos no tienen en cuenta factores tales como la estructura terciaria del ARNm diana o la participación de las proteínas de unión al ARN. Por lo tanto, el descubrimiento de un potente desencadenante del silenciamiento de ácidos nucleicos con efectos colaterales mínimos es un proceso complejo. Para el desarrollo farmacéutico de estas moléculas altamente cargadas es necesario que se puedan sintetizar económicamente, distribuirse a los tejidos diana, entrar en las células y funcionar dentro de los límites aceptables de toxicidad.
Las partículas de Lp(a) son partículas heterogéneas de lipoproteínas de baja densidad que se expresan predominantemente en el hígado (Witztum y Ginsberg, J Lipid Res. marzo de 2016; 57(3):336-9). Están compuestos por apolipoproteína (a) (Apo(a) o Lp(a) codificada por el gen LPA) unida a una partícula similar a LDL a través del polipéptido ApoB. Los elevados niveles séricos de partículas de Lp(a) definidos genéticamente no se ven afectados por la dieta y el ejercicio y están asociados con un mayor riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares a través del potencial ateroesclerótico asociado (Alonso et al., Journal of the American College of Cardiology, vol. 63, n.° 19, 2014). En términos de diagnóstico y medicina preventiva, el nivel sérico de partículas de Lp(a) del paciente es un factor de riesgo genético independiente y altamente prevalente para cardiopatía coronaria y estenosis de la válvula aórtica (Saeedi y Frohlich, Clinical Diabetes and Endocrinology (2016) 2:7). Actualmente no existe una terapia de reducción de partículas de Lp(a) específica aprobada más allá de las medidas indirectas convencionales generales de reducción de LDL. En consecuencia, en la actualidad se necesitan métodos para el tratamiento eficaz, la prevención y la reducción del riesgo de padecer trastornos tales como, y asociados con, el ictus, la ateroesclerosis, la trombosis y las enfermedades cardiovasculares tales como la cardiopatía coronaria, estenosis de la válvula aórtica y otros trastornos, patologías o síndromes asociados aún no identificados. La presente invención aborda esta necesidad médica no satisfecha.
Tadin-Strapps et al., J. Cardiovasc. Trans. Res. (2015), 8;44-53 describe el desarrollo de ARNip de lipoproteína (a) para estudios de los mecanismo de acción en modelos de ateroesclerosis en primates no humanos.
Sumario de la invención
La invención proporciona un ácido nucleico para inhibir la expresión de LPA en una célula, que comprende al menos una región doble que comprende al menos una parte de una primera cadena y al menos una parte de una segunda cadena que es al menos parcialmente complementaria a la primera cadena, en donde dicha primera cadena es al menos parcialmente complementaria a al menos una parte de un ARN transcrito a partir del gen LPA, en donde dicha primera cadena comprende una secuencia de nucleótidos de
5' mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG 3' (SEQ ID NO: 165), y en donde dicha segunda cadena comprende un secuencia de nucleótidos de
5' mC mG mG mU mA mA fU fG fG mA mC mA mG mA mG mU mU (ps) mA (ps) mU 3' (SEQ ID NO: 163); en donde fA, fC, fG y fU indican ribonucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; mA, mC, mG y mU indican ribonucleótidos de 2-O-metilo; y (ps) indica un enlace fosforotioato.
La invención también proporciona una composición que comprende el ácido nucleico o el ácido nucleico conjugado de acuerdo con la invención y, opcionalmente, un excipiente fisiológicamente aceptable.
También se proporciona un ácido nucleico de acuerdo con la invención para su uso como medicamento.
También se proporciona un ácido nucleico o un ácido nucleico conjugado de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o síndrome y/o en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad, trastorno o síndrome.
También se incluye un método para preparar el ácido nucleico o el ácido nucleico conjugado de acuerdo con la invención.
El ácido nucleico o la composición que comprende el ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención puede utilizarse en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o síndrome. El tratamiento puede ser para prevenir y reducir el riesgo de padecer un ictus, ateroesclerosis, trombosis o enfermedades cardiovasculares tales como cardiopatía coronaria o estenosis de la válvula aórtica y cualquier otra enfermedad o patología asociada a niveles elevados de partículas que contienen Lp(a).
Descripción detallada
La presente invención se refiere a un ácido nucleico bicatenario y dirigido a un transcrito de ARN expresado de LPA y a composiciones del mismo. Estos ácidos nucleicos o ácidos nucleicos conjugados se pueden utilizar en el tratamiento y la prevención de varias enfermedades, trastornos y síndromes donde es deseable una expresión reducida del producto génico LPA.
La invención proporciona un ácido nucleico para inhibir la expresión de LPA en una célula, que comprende al menos una región doble que comprende al menos una parte de una primera cadena y al menos una parte de una segunda cadena que es al menos parcialmente complementaria a la primera cadena, en donde dicha primera cadena es al menos parcialmente complementaria a al menos una parte de un ARN transcrito a partir del gen LPA, en donde dicha primera cadena comprende una secuencia de nucleótidos de
5' mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG 3' (SEQ ID NO: 165), y en donde dicha segunda cadena comprende un secuencia de nucleótidos de
5' mC mG mG mU mA mA fU fG fG mA mC mA mG mA mG mU mU (ps) mA (ps) mU 3' (SEQ ID NO: 163); en donde fA, fC, fG y fU indican ribonucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; mA, mC, mG y mU indican ribonucleótidos de 2-O-metilo; y (ps) indica un enlace fosforotioato.
En algunas realizaciones, se proporciona un ácido nucleico para inhibir la expresión de LPA en una célula, que comprende al menos una región doble que comprende una primera cadena y una segunda cadena que es al menos parcialmente complementaria a la primera cadena, en donde dicha primera cadena es al menos parcialmente complementaria a al menos una parte de un ARN transcrito a partir del gen LPA, en donde dicha primera cadena comprende una secuencia de nucleótidos de
5' mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG 3' (SEQ ID NO: 165), y en donde dicha segunda cadena comprende un secuencia de nucleótidos de
5' mC mG mG mU mA mA fU fG fG mA mC mA mG mA mG mU mU (ps) mA (ps) mU 3' (SEQ ID NO: 163); en donde fA, fC, fG y fU indican ribonucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; mA, mC, mG y mU indican ribonucleótidos de 2-O-metilo; y (ps) indica un enlace fosforotioato.
Dichos ácidos nucleicos son capaces de reducir de manera eficaz la expresión de LPA en una célula y son muy estables. Preferentemente, el ácido nucleico de la invención es capaz de inhibir la expresión de LPA en una célula a un grado similar, tal como el mismo, o mayor al de los mismos ácidos nucleicos con un patrón de modificación diferente en condiciones comparables. De manera más específica, preferentemente, el ácido nucleico de la invención es capaz de inhibir la expresión de LPA en una célula en un 80, 90, 100, 105, 110 o más por ciento en comparación con el mismo ácido nucleico con un patrón de modificación diferente en condiciones comparables.
El ácido nucleico puede: a) tener extremos romos en ambos extremos; b) tener un saliente en un extremo y un extremo romo en el otro; o c) tener un saliente en ambos extremos. Preferentemente, el ácido nucleico tiene extremos romos en ambos extremos.
Estos ácidos nucleicos, entre otros, tienen la ventaja de ser activos en varias especies que son fundamentales para el desarrollo preclínico y clínico y/o de tener pocos efectos colaterales importantes, además de ser estables in vivo y tener una larga duración de acción. También comprenden relativamente pocos nucleótidos modificados de origen no natural pero, no obstante, son capaces de inhibir de manera eficaz el gen diana durante largos periodos de tiempo. El patrón de modificación específico con pocos nucleótidos modificados de origen no natural (nucleótidos modificados 2'F) también facilita su síntesis.
En algunas realizaciones, la primera cadena consiste en una secuencia de nucleótidos de
5' mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG 3' (SEQ ID NO: 165); en donde fA, fC, fG y fU indican ribonucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; mA, mC, mG y mU indican ribonucleótidos de 2-O-metilo; y (ps) indica un enlace fosforotioato.
En algunas realizaciones, la segunda cadena consiste en una secuencia de nucleótidos de
5' mC mG mG mU mA mA fU fG fG mA mC mA mG mA mG mU mU (ps) mA (ps) mU 3' (SEQ ID NO: 163); en donde fA, fC, fG y fU indican ribonucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro; mA, mC, mG y mU indican ribonucleótidos de 2-O-metilo; y (ps) indica un enlace fosforotioato.
El gen LPA comprende secuencias altamente repetitivas. Los ácidos nucleicos de la primera cadena con secuencias muy similares pueden, por lo tanto, tener una perfecta complementariedad de secuencias con regiones diana muy diferentes del ARNm.
En el presente documento, cuando se hace referencia a una secuencia de referencia que comprende o consiste en nucleótidos no modificados, esta referencia no se limita a la secuencia con nucleótidos no modificados. La misma referencia también abarca la misma secuencia de nucleótidos en la que uno, varios, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más, incluidos todos, los nucleótidos se modifican mediante modificaciones tales como 2'-OMe, 2'-F, un ligando, un enlazador, una modificación del extremo 3' o del extremo 5' o cualquier otra modificación. También se refiere a secuencias en las que dos o más nucleótidos están unidos entre sí mediante el enlace fosfodiéster natural o mediante cualquier otro enlace tal como un enlace fosforotioato o fosforoditioato.
Un ácido nucleico bicatenario es un ácido nucleico en el que la primera cadena y la segunda cadena se hibridan entre sí en al menos una parte de sus longitudes y, por lo tanto, son capaces de formar una región doble en condiciones fisiológicas, tales como en PBS a 37 °C a una concentración de 1 pM de cada cadena. Por ejemplo, una primera y una segunda cadena pueden hibridarse entre sí y, por lo tanto, formar una región doble en una región de al menos l5 nucleótidos, preferentemente 16, 17, 18 o 19 nucleótidos. Esta región doble comprende emparejamientos de bases de nucleótidos entre las dos cadenas, preferentemente basado en el emparejamiento de bases de Watson-Crick y/o en el emparejamiento de bases oscilantes (tal como el emparejamiento de bases GU). No es necesario que todos los nucleótidos de las dos cadenas de una región doble se emparejen entre sí para formar una región doble. Se aceptan un determinado número de emparejamientos incorrectos, eliminaciones o inserciones entre las secuencias de nucleótidos de las dos cadenas. También son posibles salientes en cualquiera de los extremos de la primera o la segunda cadena o nucleótidos no emparejados en cualquier extremo del ácido nucleico bicatenario. El ácido nucleico bicatenario puede ser un ácido nucleico bicatenario estable en condiciones fisiológicas y puede tener una temperatura de fusión (Tm) de 45 °C o más, preferentemente 50 °C o más y más preferentemente 55 °C o más, por ejemplo, en PBS a una concentración de 1 pM y cada una de la primera cadena y la segunda cadena pueden ser capaces de formar una región doble (es decir, son complementarias entre sí) a lo largo de i) al menos una parte de sus longitudes, preferentemente a lo largo de al menos 15 nucleótidos de ambas longitudes, ii) a lo largo de la longitud total de la primera cadena, iii) a lo largo de la longitud total de la segunda cadena y/o iv) a lo largo de la longitud total de la primera y la segunda cadena. Las cadenas que son complementarias entre sí en una determinada longitud significa que las cadenas pueden formar pares de bases entre sí, ya sea a través de Watson-Crick o emparejamiento de bases oscilantes, a lo largo de esa longitud. Cada nucleótido de la longitud no necesariamente tiene que ser capaz de formar pares de bases con su homólogo en la otra cadena a lo largo de toda la longitud dada siempre que se pueda formar un nucleótido bicatenario estable en condiciones fisiológicas. Sin embargo, esto es lo preferido.
Se pueden tolerar un determinado número de emparejamientos incorrectos, eliminaciones o inserciones entre la primera cadena (antisentido) y la secuencia diana, o entre la primera cadena y la segunda cadena (de sentido) en el contexto de ARNip y, en determinados casos, incluso tienen la posibilidad de aumentar la actividad.
Por ácido nucleico se entiende un ácido nucleico que comprende dos cadenas que comprenden nucleótidos, que es capaz de interferir con la expresión génica. La inhibición puede ser completa o parcial y da como resultado la regulación negativa de la expresión génica de una manera dirigida. El ácido nucleico comprende dos cadenas de polinucleótidos separadas; la primera cadena, que también puede ser una cadena guía; y una segunda cadena, que también puede ser una cadena pasajero. La primera cadena y la segunda cadena pueden ser parte de la misma molécula polinucleotídica que es autocomplementaria y que se 'pliega' para formar una molécula bicatenaria. El ácido nucleico puede ser una molécula de ARNip.
Los ácidos nucleicos pueden comprender ribonucleótidos, ribonucleótidos modificados, desoxinucleótidos, desoxirribonucleótidos o análogos de nucleótidos no nucleótidos que son capaces de imitar nucleótidos de tal manera que pueden 'emparejarse' con la base correspondiente en la secuencia diana o cadena complementaria. Dicho ácido nucleico puede comprender además una parte de ácido nucleico bicatenario o región doble formada por toda o una parte de la primera cadena (también conocida en la materia como cadena guía) y toda o una parte de la segunda cadena (también conocida en la materia como cadena pasajera). La región doble se define como que comienza con el primer par de bases formado entre la primera cadena y la segunda cadena y termina con el último par de bases formado entre la primera cadena y la segunda cadena, ambos inclusive.
Por región doble se entiende la región en dos oligonucleótidos complementarios o sustancialmente complementarios que forman pares de bases entre sí, ya sea mediante apareamiento de bases de Watson-Crick o de cualquier otra manera que permita un doble entre cadenas oligonucleotídicas que sean complementarias o sustancialmente complementarias. Por ejemplo, una cadena de oligonucleótidos que tiene 21 unidades de nucleótidos puede emparejarse con otro oligonucleótido de 21 unidades de nucleótidos, aunque solo 19 nucleótidos en cada cadena son complementarios o sustancialmente complementarios, de manera que la "región doble" consiste en 19 pares de bases. Los pares de bases restantes pueden existir como salientes en 5' y 3' o como regiones monocatenarias. Además, dentro de la región doble, no se requiere el 100% de complementariedad; se permite una complementariedad sustancial dentro de una región doble. Complementariedad sustancial se refiere a la complementariedad entre las cadenas de manera que sean capaces de hibridarse en condiciones biológicas. Se conocen bien en la materia técnicas para determinar empíricamente si dos cadenas son capaces de hibridarse en condiciones biológicas. Como alternativa, pueden sintetizarse dos cadenas y añadirse juntas en condiciones biológicas para determinar si se hibridan entre sí.
La parte de la primera cadena y de la segunda cadena que forman al menos una región doble pueden ser totalmente complementarias o ser al menos parcialmente complementarias entre sí.
Dependiendo de la longitud de un ácido nucleico, no se requiere necesariamente un emparejamiento perfecto en términos de complementariedad de bases entre la primera cadena y la segunda cadena. Sin embargo, las cadenas primera y segunda deben ser capaces de hibridarse en condiciones fisiológicas.
La complementariedad entre la primera cadena y la segunda cadena en la al menos una región doble puede ser perfecta en el sentido de que no hay emparejamientos incorrectos de nucleótidos o nucleótidos adicionales/eliminados en ninguna de las cadenas. Como alternativa, la complementariedad puede no ser perfecta. La complementariedad puede ser de aproximadamente un 70% a aproximadamente el 100%. De manera más específica, la complementariedad puede ser de al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 % o un 95 % y valores intermedios.
Como se divulga en el presente documento, "una parte de" como, por ejemplo, en "una región doble que comprende al menos una parte de una primera cadena" debe entenderse que significa que la región doble comprende al menos 10, preferentemente al menos 12, más preferentemente al menos 14, aún más preferentemente al menos 16, incluso más preferentemente al menos 18 y lo más preferentemente todos los nucleótidos de una secuencia de la cadena de referencia dada. La parte de la secuencia de referencia en la región doble es al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, aún más preferentemente al menos un 95 % y lo más preferentemente el 100% idéntica a la parte correspondiente de la secuencia de referencia. Como alternativa, el número de emparejamientos incorrectos de un solo nucleótido en relación con la parte de la secuencia de referencia es como máximo tres, preferentemente como máximo dos, más preferentemente como máximo uno y lo más preferentemente cero.
El uso de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención implica la formación de una región doble entre la totalidad o una parte de la primera cadena y una parte de un ácido nucleico diana. La parte del ácido nucleico diana que forma una región doble con la primera cadena, definida como que comienza con el primer par de bases formado entre la primera cadena y la secuencia diana y que termina con el último par de bases formado entre la primera cadena y la secuencia diana, ambos inclusive, es la secuencia de ácido nucleico diana o simplemente, la secuencia diana. No es necesario que la región doble formada entre la primera cadena y la segunda cadena sea la misma que la región doble formada entre la primera cadena y la secuencia diana. Es decir, la segunda cadena puede tener una secuencia diferente de la secuencia diana; sin embargo, la primera cadena debe poder formar una estructura doble tanto con la segunda cadena como con la secuencia diana, al menos en condiciones fisiológicas.
La complementariedad entre la primera cadena y la secuencia diana puede ser perfecta (sin emparejamientos incorrectos de nucleótidos o nucleótidos adicionales/eliminados en ninguno de los ácidos nucleicos).
La complementariedad entre la primera cadena y la secuencia diana puede no ser perfecta. La complementariedad puede ser de aproximadamente un 70% a aproximadamente el 100%. De manera más específica, la complementariedad puede ser de al menos un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 % o un 95 % y valores intermedios.
La identidad entre la primera cadena y la secuencia complementaria de la secuencia diana puede variar de aproximadamente un 75 % a aproximadamente el 100 %. De manera más específica, la complementariedad puede ser de al menos un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 % o un 95 % y valores intermedios, siempre que un ácido nucleico sea capaz de reducir o inhibir la expresión de LPA.
Un ácido nucleico que tenga una complementariedad inferior al 100 % entre la primera cadena y la secuencia diana puede reducir la expresión de LPA al mismo nivel que un ácido nucleico que tiene una complementariedad perfecta entre la primera cadena y la secuencia diana. Como alternativa, puede ser capaz de reducir la expresión de LPA a un nivel que es del 15 % al 100 % del nivel de reducción alcanzado por el ácido nucleico con complementariedad perfecta.
Los ácidos nucleicos que son capaces de hibridarse en condiciones fisiológicas son ácidos nucleicos que son capaces de formar pares de bases, preferentemente pares de bases de Watson-Crick u oscilantes, entre al menos una parte de los nucleótidos opuestos en las cadenas para formar al menos una región doble. Dicho ácido nucleico bicatenario es preferentemente un ácido nucleico bicatenario estable en condiciones fisiológicas (por ejemplo, en PBS a 37 °C a una concentración de 1 pM de cada cadena), lo que significa que en dichas condiciones, las dos cadenas permanecen hibridadas entre sí. La Tm del nucleótido bicatenario es preferentemente de 45 °C o más, preferentemente de 50 °C o más y más preferentemente de 55 °C o más.
En algunas realizaciones, la segunda secuencia es capaz de hibridarse con la primera secuencia en condiciones fisiológicas y preferentemente el ácido nucleico es un ARNip que es capaz de inhibir la expresión de LPA a través de la ruta de la iARN.
Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden ser capaces de inhibir la expresión de LPA. La inhibición puede ser completa, es decir, 0 % de expresión restante en comparación con el nivel de expresión de LPA en ausencia del ácido nucleico de la invención. La inhibición de la expresión de LPA puede ser parcial, es decir, puede ser del 15 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o valores intermedios de la expresión de LPA en ausencia de un ácido nucleico de la invención. El nivel de inhibición puede medirse mediante la comparación de una muestra tratada con una muestra no tratada o con una muestra tratada con un control tal como, por ejemplo, un ARNip que no se dirige a LPA. La inhibición puede medirse mediante la medición de los niveles de proteínas y/o ARNm de LPA o de los niveles de un biomarcador o indicador que se correlaciona con la presencia o actividad de LPA. Puede medirse en células que se pueden haber tratado in vitro con un ácido nucleico descrito en el presente documento. Como alternativa, o además, la inhibición puede medirse en células, tales como hepatocitos, o en tejido, tal como tejido hepático, o en un órgano, tal como el hígado, o en un líquido corporal, tal como sangre, suero o linfa, o en cualquier otra parte del cuerpo que se haya extraído de un sujeto previamente tratado con un ácido nucleico divulgado en el presente documento. Preferentemente, la inhibición de la expresión de LPA se determina mediante la comparación del nivel de ARNm de LPA medido en células que expresan LPA después de 24 o 48 horas de tratamiento in vitro en condiciones ideales (véanse los ejemplos para concentraciones y condiciones adecuadas) con un ácido nucleico divulgado en el presente documento con el nivel de ARNm de LPA medido en las mismas células que no se trataron o se trataron de forma simulada o se trataron con un ácido nucleico de control.
Como se utiliza en el presente documento, el término "inhibir", "regular negativamente" o "reducir" con respecto a la expresión génica significa que la expresión del gen, o el nivel de moléculas de ARN o moléculas de ARN equivalentes que codifican una o más proteínas o subunidades de proteínas (por ejemplo, ARNm), o la actividad de una o más proteínas o subunidades de proteínas, se reduce por debajo de la observada en ausencia del ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención o en referencia a una molécula de ARNip sin homología conocida con los transcritos humanos (en el presente documento denominado control sin silenciamiento). Dicho control puede conjugarse y modificarse de manera análoga a la molécula de la invención y administrarse en la célula diana por la misma vía; por ejemplo, la expresión puede reducirse al 90 %, al 80 %, al 70 %, al 60 %, al 50 %, al 40 %, al 30 %, al 20 %, al 15 % o a valores intermedios o inferiores a los observados en ausencia del ácido nucleico o ácido nucleico conjugado o en presencia de un control sin silenciamiento.
El ácido nucleico puede comprender una primera cadena y una segunda cadena que tienen cada una de 19 a 25 nucleótidos de longitud. La primera cadena y la segunda cadena pueden tener diferentes longitudes.
La primera cadena y/o la segunda cadena pueden ser cada una de 19 a 25, preferentemente de 19 nucleótidos de longitud y al menos una región doble puede tener de 19 a 23 nucleótidos de longitud. La región doble puede comprender dos cadenas separadas o puede comprender una sola cadena que comprende la primera cadena y la segunda cadena.
La primera cadena puede tener una longitud de 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótidos. Lo más preferentemente, la primera cadena tiene 19 nucleótidos de longitud. La segunda cadena puede tener independientemente 19, 20, 21,22, 23 ó 24 nucleótidos de longitud. Más preferentemente, la segunda cadena tiene 19 nucleótidos de longitud.
El ácido nucleico puede tener una longitud de 23 a 24 pares de nucleótidos. El ácido nucleico puede tener una longitud de 19 a 21 pares de nucleótidos. El ácido nucleico puede tener una longitud de 21 a 23 pares de nucleótidos.
El ácido nucleico puede comprender una región doble que consiste en 19 a 25 pares de bases de nucleótidos. La región doble puede consistir en 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 pares de bases, que pueden ser contiguas. Preferentemente, la región doble consiste en 19 pares de bases.
Preferentemente, el ácido nucleico media la interferencia por ARN.
En una realización, el ácido nucleico o ácido nucleico conjugado como se describe puede reducir la expresión de LPA en al menos un 15 % en comparación con la expresión observada en ausencia del ácido nucleico o del ácido nucleico conjugado. En particular, la expresión de LPA puede reducirse al menos al siguiente % dado o menos del 90 %, el 80 %, el 70 %, el 60 %, el 50 %, el 40 %, el 30 %, el 20 %, el 15 % o menos, y valores intermedios, que la observada en ausencia del ácido nucleico o ácido nucleico conjugado o en presencia de un control sin silenciamiento.
El ácido nucleico puede tener un saliente en un extremo y un extremo romo en el otro. El ácido nucleico puede tener un saliente en ambos extremos. El ácido nucleico puede tener extremos romos en ambos extremos. El ácido nucleico puede tener extremos romos en el extremo con el extremo 5' de la primera cadena y el extremo 3' de la segunda cadena o en el extremo 3' de la primera cadena y el extremo 5' de la segunda cadena.
Un "saliente", como se utiliza en el presente documento, tiene su significado normal y habitual en la materia, es decir, una parte monocatenaria de un ácido nucleico que se prolonga más allá del nucleótido terminal de una cadena complementaria en un ácido nucleico bicatenario. La expresión "extremo romo" incluye ácido nucleico bicatenario por el que ambas cadenas terminan en la misma posición, independientemente de si el nucleótido o los nucleótidos terminales se emparejan por las bases. El nucleótido terminal de una primera cadena y de una segunda cadena en un extremo romo puede estar emparejado por la base. El nucleótido terminal de una primera cadena y de una segunda cadena en un extremo romo puede no estar emparejado. Los dos nucleótidos terminales de una primera cadena y una segunda cadena en un extremo romo pueden estar emparejados por las bases. Los dos nucleótidos terminales de una primera cadena y una segunda cadena en un extremo romo pueden no estar emparejados.
El ácido nucleico puede comprender un saliente en un extremo 3' o 5'. El ácido nucleico puede tener un saliente en 3' en la primera cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 3' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 5' en la primera cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 5' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' de la primera cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' de la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 5' en la primera cadena y un saliente en 3' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 3' en la primera cadena y un saliente en 5' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 3' en la primera cadena y un saliente en 3' en la segunda cadena. El ácido nucleico puede tener un saliente en 5' en la primera cadena y un saliente en 5' en la segunda cadena.
Un saliente en el extremo 3' o 5' de la segunda cadena o la primera cadena puede seleccionarse entre 1,2, 3, 4 y 5 nucleótidos de longitud. Opcionalmente, un saliente puede consistir en 1 o 2 nucleótidos, que pueden estar modificados o no.
Preferentemente, el ácido nucleico es un ARNip. Los ARNip son ARN de interferencia pequeños o de silenciamiento pequeños que pueden inhibir la expresión de un gen diana a través de la ruta de la interferencia por ARN (iARN). La inhibición ocurre a través de la degradación dirigida de las transcripciones de ARNm del gen diana después de la transcripción. El ARNip forma parte del complejo RISC. El complejo RISC se dirige específicamente al ARN diana mediante la complementariedad de secuencia de la primera cadena (antisentido) con la secuencia diana.
Preferentemente, el ácido nucleico media la interferencia por ARN (iARN). El ácido nucleico, o al menos la primera cadena del ácido nucleico, puede, por lo tanto, incorporarse preferentemente en el complejo RISC. Como resultado, el ácido nucleico, o al menos la primera cadena del ácido nucleico, es, por lo tanto, capaz de guiar el complejo RISC a un ARN diana específico con el que el ácido nucleico, o al menos la primera cadena del ácido nucleico, es al menos parcialmente complementario. Después, el complejo RISC escinde de manera específica este ARN diana y, como resultado, provoca la inhibición de la expresión del gen del que procede el ARN.
Modificaciones del ácido nucleico
Los polinucleótidos sin modificar, en particular los ribonucleótidos, pueden ser propensos a la degradación por nucleasas celulares, y, como tal, pueden utilizarse modificaciones/nucleótidos modificados. Dichos modificaciones pueden ayudar a estabilizar el ácido nucleico haciéndolo más resistente a las nucleasas. Esta resistencia mejorada permite que los ácidos nucleicos sean activos en la mediación de la interferencia por ARN durante períodos de tiempo más prolongados y, en especial, es deseable cuando los ácidos nucleicos se van a utilizar para un tratamiento.
En general, las modificaciones de los ácidos nucleicos proporcionan una herramienta poderosa para superar las posibles limitaciones que incluyen, pero sin limitación, la estabilidad in vitro e in vivo, y la biodisponibilidad inherente a las moléculas de ARN nativas. Los ácidos nucleicos pueden modificarse mediante modificaciones químicas. El ácido nucleico modificado también puede minimizar la posibilidad de inducir actividad interferón en seres humanos. La modificación puede potenciar adicionalmente la entrega funcional de un ácido nucleico a una célula diana. Un ribonucleótido puede comprender una modificación química de la base, el azúcar o los restos fosfato. El ácido ribonucleico puede modificarse mediante sustitución o inserción con análogos de ácidos nucleicos o bases.
Los nucleótidos modificados pueden seleccionarse entre el grupo que consiste en un nucleótido de desoxitimina (dT) del extremo 3', un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2', un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforoamidato, un nucleótido de base no natural, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato, un nucleótido que comprende un fosfato en 5' o mimético de fosfato en 5' y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o un grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico.
Los ácidos nucleicos pueden comprender un nucleótido que comprende un nucleótido modificado, en donde la base se selecciona entre 2-aminoadenosina, 2,6-diaminopurina, inosina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2,4,6-trimetoxibenceno, 3-metiluracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidina (por ejemplo, 5-metilcitidina), 5-alquiluridina (por ejemplo, ribotimidina), 5-halouridina (por ejemplo, 5-bromouridina), 6-azapirimidina, 6-alquilpirimidina (por ejemplo, 6-metiluridina), propina, quesosina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, wibutosina, wybutoxosina, 4-acetilcitidina, 5-(carboxihidroximetil)uridina, 5'-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluridina, p-D-galactosilqueosina, 1-metiladenosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 3-metilcitidina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, 5-metilaminometiluridina, 5-metilcarbonilmetiluridina, 5-metiloxiuridina, 5-metil-2-tiouridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, p-D-manosilqueosina, ácido uridina-5-oxiacético y 2-tiocitidina.
Los ácidos nucleicos que se analizan en el presente documento incluyen ARN sin modificar así como ARN que se ha modificado, por ejemplo, para mejorar la eficacia, y polímeros de sustitutos de nucleósido. El ARN sin modificar se refiere a una molécula en la que los componentes del ácido nucleico, en concreto, azúcares, bases y restos fosfato, son iguales o esencialmente iguales a los que se producen en la naturaleza, por ejemplo, los que se producen de forma natural en el cuerpo humano. El nucleótido modificado como se describe en el presente documento se refiere a un nucleótido en el que uno o más de los componentes del ácido nucleico, en concreto, azúcares, bases y restos fosfato, son diferentes de aquellos que se producen en la naturaleza. Aunque se les denomina nucleótidos modificados, por supuesto, debido a la modificación, el término también incluye moléculas que no son nucleótidos, por ejemplo, una molécula polinucleotídica en las que la cadena principal de ribofosfato se reemplaza por una construcción sin ribofosfato que permite la hibridación entre cadenas, es decir, los nucleótidos modificados imitan la cadena principal de ribofosfato.
Muchas de las modificaciones que se describen a continuación que se producen dentro de un ácido nucleico se repetirán dentro de una molécula de polinucleótido, tal como una modificación de una base, un resto fosfato o un O no enlazante de un resto fosfato. En algunos casos, la modificación se producirá en todas las posiciones/nucleótidos posibles en el polinucleótido, pero en muchos casos no se producirá. Una modificación solo puede producirse en una posición terminal en 3' o 5', solo puede producirse en regiones terminales, tal como en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de una cadena. Una modificación puede producirse en una región bicatenaria, una región monocatenaria o en ambas. Una modificación puede producirse solo en la región bicatenaria de un ácido nucleico o puede producirse solo en una región monocatenaria de un ácido nucleico. Una modificación con fosforotioato en una posición O no enlazante puede producirse solo en uno o en ambos extremos, puede producirse solo en una región terminal, por ejemplo, en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de un cadena, o puede producirse en regiones dobles y/o monocatenarias, en particular en los extremos. El extremo 5' o los extremos 3' pueden estar fosforilados.
La estabilidad de un ácido nucleico puede aumentarse incluyendo bases particulares en salientes o incluir nucleótidos modificados, en salientes monocatenarios, por ejemplo, en un saliente en 5' o 3', o en ambos. Los nucleótidos de purina pueden incluirse en salientes. Todas o algunas de las bases en un saliente en 3' o 5' pueden modificarse. Las modificaciones pueden incluir el uso de modificaciones en el grupo 2'-OH del azúcar ribosa, el uso de desoxirribonucleótidos, en lugar de ribonucleótidos, y modificaciones en el grupo fosfato, tales como modificaciones de fosforotioato. No es necesario que los salientes sean homólogos con la secuencia diana.
Las nucleasas pueden hidrolizar enlaces fosfodiéster de ácido nucleico. Sin embargo, las modificaciones químicas de los ácidos nucleicos pueden conferir propiedades mejoradas y pueden hacer que los oligorribonucleótidos sean más estables a las nucleasas.
Los términos reemplazo, modificación y alteración indican una diferencia con respecto a una molécula de origen natural.
Se analizan modificaciones específicas con más detalle a continuación.
Los ejemplos de grupos fosfato modificados incluyen fosforotioato, fosforoselenatos, fosfatos de borano, ésteres de fosfato de borano, fosfonatos de hidrógeno, fosforamidatos, fosfonatos de alquilo o arilo y fosfotriésteres. Los fosforoditioatos tienen ambos oxígenos no enlazantes reemplazados por azufre. Uno, cada uno o los dos oxígenos no enlazantes en el grupo fosfato pueden ser independientemente uno cualquiera de S, Se, B, C, H, N u OR (R es alquilo o arilo).
El enlazador de fosfato también puede modificarse mediante reemplazo de un oxígeno enlazante por nitrógeno (fosforamidatos puenteados), azufre (fosforotioatos puenteados) y carbono (fosfonatos de metileno puenteados). El reemplazo puede producirse en un oxígeno terminal. Es posible reemplazar los oxígenos no enlazantes por nitrógeno.
Un nucleótido modificado puede incluir la modificación de los grupos de azúcar. El grupo 2' hidroxilo (OH) puede modificarse o reemplazarse por varios sustituyentes "oxi" o "desoxi" diferentes.
Los ejemplos de modificaciones "oxi"-grupo 2' hidroxilo incluyen alcoxi o ariloxi (OR, por ejemplo, R=H, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar); polietilenglicoles (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; los ácidos nucleicos "bloqueados" (ANB) en los que el 2' hidroxilo se conecta, por ejemplo, mediante un puente de metileno, con el 4' carbono del mismo azúcar ribosa; O-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino, etilendiamina, poliamino) y aminoalcoxi, O(CH2)nAMINA, (por ejemplo, AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino, etilendiamina, poliamino).
Las modificaciones "desoxi" incluyen hidrógeno, halógeno, amino (por ejemplo, NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, diheteroarilamino o aminoácido); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino), -NHC(O)R (R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar), ciano; mercapto; alquiltio-alquilo; tioalcoxi; y alquilo, cicloalquilo, arilo, alquenilo y alquinilo, que pueden estar opcionalmente sustituidos con, por ejemplo, una funcionalidad amino. Otros sustituyentes de determinadas realizaciones incluyen 2'-metoxietilo, 2'-OCH3, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo y 2'-fluoro.
El grupo azúcar también puede contener uno o más carbonos que posean la configuración estereoquímica opuesta a la del carbono correspondiente en la ribosa. Por lo tanto, un nucleótido modificado puede contener un azúcar tal como arabinosa.
Los nucleótidos modificados también pueden incluir azúcares "abásicos", que carecen de una nucleobase en C-1'. Estos azúcares abásicos pueden contener además modificaciones en uno o más de los átomos de azúcar constituyentes.
Las modificaciones de 2' pueden usarse en combinación con una o más modificaciones del enlazador de fosfato (por ejemplo, fosforotioato).
Los grupos fosfato pueden reemplazarse de manera individual por enlazadores que no contengan fósforo.
Los ejemplos de restos que pueden reemplazar el grupo fosfato incluyen siloxano, carbonato, carboximetilo, carbamato, amida, tioéter, enlazador de óxido de etileno, sulfonato, sulfonamida, tioformacetal, formacetal, oxima, metilenimino, metilenmetilimino, metilenhidrazo, metilendimetilhidrazo y metilenoximetilimino. En determinadas realizaciones, los reemplazos pueden incluir los grupos metilencarbonilamino y metilenmetilimino.
El enlazador de fosfato y el azúcar ribosa pueden reemplazarse por nucleótidos resistentes a nucleasas.
Los ejemplos incluyen los sustitutos de nucleósido morfolino, ciclobutilo, pirrolidina y ácido nucleico peptídico (ANP).
Los extremos 3' y 5' de un oligonucleótido pueden modificarse. Dichas modificaciones pueden estar en el extremo 3' o el extremo 5' o en ambos extremos de la molécula. Pueden incluir la modificación o el reemplazo de un fosfato terminal completo o de uno o más de los átomos del grupo fosfato. Por ejemplo, los extremos 3' y 5' de un oligonucleótido pueden conjugarse con otras entidades moleculares funcionales tales como restos de marcado, por ejemplo, fluoróforos (por ejemplo, pireno, TAMRA, fluoresceína, colorantes Cy3 o Cy5) o grupos protectores (basados, por ejemplo, en azufre, silicio, boro o éster). Las entidades moleculares funcionales pueden unirse al azúcar a través de un grupo fosfato y/o un enlazador. El átomo terminal del enlazador puede conectarse a o reemplazar el átomo de enlace del grupo fosfato o el grupo O, N, S o C C-3' o C-5' del azúcar. Como alternativa, el enlazador puede conectarse a o reemplazar el átomo terminal de un sustituto de nucleótido (por ejemplo, ANP). Estos espaciadores o enlazadores pueden incluir, por ejemplo, -(CH2V , -(CH2)nN-, -(CH2)nO-, -(CH2)nS-, -(CH2CH2O)nCH2CH2O-(por ejemplo, n = 3 o 6), azúcares abásicos, amida, carboxi, amina, oxiamina, oxiimina, tioéter, disulfuro, tiourea, sulfonamida o morfolino, o reactivos de biotina y fluoresceína. El extremo 3' puede ser un grupo -OH.
Otros ejemplos de modificaciones terminales incluyen colorantes, agentes intercalantes (por ejemplo, acridinas), reticulantes (por ejemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo, fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales, EDTA, vehículos lipófilos (por ejemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido 1-pireno butírico, dihidrotestosterona, 1,3-Bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina) y conjugados peptídicos (por ejemplo, péptido antennapedia, péptido Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ejemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina), facilitadores de transporte/absorción (por ejemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas (por ejemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, grupos imidazol, conjugados acridina-imidazol, complejos Eu3+ de tetraazamacrociclos).
Pueden añadirse modificaciones terminales por una serie de razones, que incluyen modular la actividad o modular la resistencia a la degradación. Las modificaciones terminales útiles para modular la actividad incluyen la modificación del extremo 5' con fosfato o análogos de fosfato. Los ácidos nucleicos en la primera o la segunda cadena, pueden estar fosforilados en 5' o incluir un análogo de fosforilo en el extremo 5' principal. Las modificaciones con 5'-fosfato incluyen aquellas que son compatibles con el silenciamiento génico mediado por RISC. Las modificaciones adecuadas incluyen: 5'-monofosfato ((HO)2(O)P-O-5'); 5'-difosfato ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-trifosfato ((HOMO)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); caperuza de 5'-guanosina (7-metilada o no metilada) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); caperuza de 5'-adenosina (Appp) y cualquier estructura de caperuza de nucleótido modificada o sin modificar (NO-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-monotiofosfato (fosforotioato; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-monoditiofosfato (fosforoditioato; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-fosforotiolato ((HO)2(O)P-S-5'); cualquier combinación adicional de monofosfato, difosfato y trifosfato sustituidos por oxígeno/azufre (por ejemplo, 5'-a-tiotrifosfato, 5'-ytiotrifosfato, etc.), 5'-fosforamidatos ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-alquilfosfonatos (R = alquilo = metilo, etilo, isopropilo, propilo, etc., por ejemplo, RP(OH)(O)-O-5'-, (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'vinilfosfonato, 5'-alquiléterfosfonatos (R = alquiléter = metoximetilo (MeOCH2-), etoximetilo, etc., por ejemplo, RP(OH)(0)-0-5'-).
Las modificaciones terminales también pueden ser útiles para controlar la distribución y en dichos casos los grupos que han de añadirse pueden incluir fluoróforos, por ejemplo, fluoresceína o un colorante Alexa. Las modificaciones terminales también pueden ser útiles para potenciar la captación, las modificaciones útiles para esto incluyen el colesterol. Las modificaciones terminales también pueden ser útiles para reticular un agente de ARN con otro resto.
La adenina, la guanina, la citosina y el uracilo son las bases más comunes que se encuentran en el ARN. Estas bases pueden modificarse o reemplazarse para proporcionar ARN que tengan propiedades mejoradas. Por ejemplo, pueden prepararse oligorribonucleótidos resistentes a nucleasas con estas bases o con nucleobases sintéticas y naturales (por ejemplo, inosina, timina, xantina, hipoxantina, nubularina, isoguanisina o tubercidina) y una cualquiera de las modificaciones anteriores. Como alternativa, pueden emplearse análogos sustituidos o modificados de cualquiera de las bases anteriores y "bases universales". Los ejemplos incluyen 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 5-halouracilo, 5-(2-aminopropil)uracilo, 5-amino alil uracilo, 8-halo, amino, tiol, tioalquilo, hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina, pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina, dihidrouracilo, 3-deaza-5-azacitosina, 2-aminopurina, 5-alquiluracilo, 7-alquilguanina, 5-alquilcitosina, 7-desazaadenina, N6,N6-dimetiladenina, 2,6-diaminopurina, 5-amino-alil-uracilo, N3-metiluracilo, 1,2,4-triazoles sustituidos, 2-piridinona, 5-nitroindol, 3-nitropirrol, 5-metoxiuracilo, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouracilo, 5-metilaminometil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uracilo, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N<4>-acetilcitosina, 2-tiocitosina, N6-metiladenina, N6-isopentiladenina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, N-metilguaninas o bases O-alquiladas.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "análogo de nucleótido no emparejado" significa un análogo de nucleótido que incluye un resto de emparejamiento que no es una base que incluye, pero sin limitación: 6 des amino adenosina (Nebularina), 4-Me-indol, 3-nitropirrol, 5-nitroindol, Ds, Pa, N3-Me ribo U, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-MedT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-metil-dC, N3-Me dC. Un análogo de nucleótido sin emparejamiento de bases puede ser un ribonucleótido. Como alternativa, puede ser un desoxirribonucleótido.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "grupo funcional terminal" incluye, sin limitación, los grupos halógeno, alcohol, amina, carboxílico, éster, amida, aldehido, cetona y éter.
Determinados restos pueden estar enlazados al extremo 5' de la primera cadena o de la segunda cadena. Estos incluyen un resto de ribosa abásica, un resto desoxirribosa abásica, modificaciones de ribosa abásica y restos desoxirribosa abásica que incluyen modificaciones con 2' O alquilo; restos de ribosa abásica invertida y desoxirribosa abásica y modificaciones de los mismos, C6-imino-Pi; un nucleótido espejo que incluye L-ADN y L-ARN; nucleótido de 5'OMe; y análogos de nucleótidos que incluyen nucleótido de 4',5'-metileno; 1-(p-D-eritrofuranosil)nucleótido; 4'-tio nucleótido, nucleótido carbocíclico; fosfato de 5'-amino-alquilo; fosfato de 1,3-diamino-2-propilo, fosfato de 3-aminopropilo; fosfato de 6-aminohexilo; fosfato de 12-aminododecilo; fosfato de hidroxipropilo; nucleótido de 1,5-anhidrohexitol; a-nucleótido; nucleótido de treo-pentofuranosilo; 3',4'-seco nucleótido acíclico; nucleótido de 3,4-dihidroxibutilo; nucleótido de 3,5-dihidroxipentilo, resto abásico invertido 5'-5'; fosfato de 1,4-butanodiol; 5'-amino; y metilfosfonato de unión y no de unión y restos 5'-mercapto.
El término "abásico", como se usa en el presente documento, se refiere a restos que carecen de una base o que tienen otros grupos químicos en lugar de una base en la posición 1', por ejemplo, un derivado de ribosa desoxiabásico unido 3',3' o unido 5',5'.
En una realización, en el caso de una primera y una segunda cadena parcialmente complementarias, el nucleótido en la segunda cadena que "corresponde a" una posición en la primera cadena puede no formar necesariamente un par de bases si esa posición es la posición en la que hay un emparejamiento incorrecto.
Se prefiere una primera y una segunda cadena que sean completamente complementarias en la región doble (ignorando cualquier región sobresaliente) y que no haya emparejamientos incorrectos en de la región bicatenaria del ácido nucleico.
Una ventaja de un ácido nucleico de acuerdo con la invención es que comprende relativamente pocos nucleótidos modificados de origen no natural pero, no obstante, es capaz de inhibir de manera eficaz el gen diana durante largos periodos de tiempo. Dicho ácido nucleico es más fácil de sintetizar que los ácidos nucleicos correspondientes con más nucleótidos de origen no natural (modificados 2'F).
Los ácidos nucleicos pueden incluir uno o más nucleótidos invertidos, por ejemplo, timidina invertida o adenina invertida (por ejemplo, véase Takei et al., 2002. JBC 277 (26):23800-06).
Los ácidos nucleicos pueden comprender un nucleótido de ARN invertido en uno o varios de los extremos de la cadena. Dichos nucleótidos invertidos proporcionan estabilidad al ácido nucleico.
Ligandos
El ácido nucleico de la invención puede conjugarse con un ligando. La administración eficaz de oligonucleótidos, en particular de ácidos nucleicos bicatenarios de la invención, a células in vivo es importante y requiere un direccionamiento específico y una protección sustancial del ambiente extracelular, en particular de las proteínas del suero. Un método para lograr un direccionamiento específico es conjugar un ligando con el ácido nucleico. El ligando ayuda a dirigir el ácido nucleico al sitio diana necesario. Existe una necesidad de conjugar ligandos adecuados para las moléculas receptoras deseadas con el fin de que las células diana absorban las moléculas conjugadas mediante mecanismos tales como diferentes rutas de endocitosis mediadas por receptores o procesos funcionalmente análogos.
Un ejemplo es el complejo del receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R, del inglés asialoglycoprotein receptor) compuesto por proporciones variables de multímeros de los receptores de membrana ASGR1 y ASGR2, que es muy abundante en los hepatocitos y tiene una gran afinidad por el resto GaINAc descrito en el presente documento. Una de las primeras divulgaciones del uso de glucósidos de grupos triantenarios como ligandos conjugados fue en la patente estadounidense número US 5.885.968. Los conjugados que tienen tres ligandos GaINAc y que comprenden grupos fosfato se conocen y se describen en Dubber et al. (Bioconjug. Chem. enero-febrero de 2003; 14(1):239-46). El complejo del ASGP-R muestra una afinidad 50 veces mayor por la N-acetil-D-galactosilamina (GalNAc) que por la D-Gal.
El complejo del receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R), que reconoce de manera específica subunidades de pgalactosilo terminales de proteínas glucosiladas u otros oligosacáridos (Weigel, P. H. et al., Biochim. Biophys. Acta.
19 de septiembre de 2002;1572(2-3):341-63), se puede utilizar para administrar un fármaco a los hepatocitos del hígado que expresan el complejo del receptor mediante el acoplamiento covalente de galactosa o galactosamina a la sustancia farmacológica (Ishibashi, S.; et al., J Biol. Chem. 11 de noviembre de 1994; 269(45):27803-6). Además, la afinidad de unión puede aumentarse significativamente por el efecto de valencia múltiple, que se logra mediante la repetición del resto de direccionamiento (Biessen E. A. et al., J Med Chem. 28 de abril de 1995; 38(9):1538-46.
El complejo del ASGP-R es un mediador para una captación activa de glucoproteínas que contienen p-galactosilo terminal en los endosomas de la célula. Por lo tanto, el ASGPR es muy adecuado para la administración dirigida de candidatos a fármacos conjugados con dichos ligandos como, por ejemplo, ácidos nucleicos en células que expresan receptores (Akinc et al., Mol Ther. Julio de 2010; 18(7):1357-64).
De manera más general, el ligando puede comprender un sacárido que se selecciona para que tenga afinidad por al menos un tipo de receptor en una célula diana. En particular, el receptor está en la superficie de una célula hepática de mamífero, por ejemplo, el complejo del receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R) hepática descrito antes.
El sacárido puede seleccionarse entre N-acetil galactosamina, manosa, galactosa, glucosa, glucosamina y fucosa. El sacárido puede ser N-acetil galactosamina (GaINAc).
Por lo tanto, un ligando para su uso en la presente invención puede comprender (i) uno o más restos de N-acetil galactosamina (GaINAc) y derivados de la misma, y (ii) un enlazador, en donde el enlazador conjuga los restos de GaINAc con una secuencia como se define en el presente documento. El enlazador puede ser una estructura ramificada bivalente, trivalente o tetravalente. Los nucleótidos pueden modificarse como se define en el presente documento.
"GalNAc" se refiere a 2-(Acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, habitualmente denominada en la bibliografía N-acetil galactosamina. La referencia a "GalNAc" o a "N-acetil galactosamina" incluye tanto la forma p: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa, como la forma a: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa. Tanto la forma p: 2(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa como la forma a: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa pueden utilizarse indistintamente. Preferentemente, los compuestos de la invención comprenden la forma p, 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa.
Por lo tanto, el ligando puede comprender GalNAc.
El ligando puede comprender un compuesto de fórmula (I):
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
en donde:
S representa un sacárido, en donde el sacárido es N-acetil galactosamina;
X1 representa alquileno C3-C6 o (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- en donde m es 1, 2 o 3;
P es un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato);
X2 es alquileno o un éter de alquileno de fórmula (-CH2VO-CH 2- donde n = 1 a 6;
A es una unidad de ramificación;
X3 representa una unidad de unión;
en donde un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está conjugado con X3 a través de un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato).
En la fórmula (I), la unidad de ramificación "A" se ramifica en tres con el fin de acomodar los tres ligandos sacarídicos. La unidad de ramificación se une de manera covalente a las partes ancladas restantes del ligando y el ácido nucleico. La unidad de ramificación puede comprender un grupo alifático ramificado que comprende grupos seleccionados entre los grupos alquilo, amida, disulfuro, polietilenglicol, éter, tioéter e hidroxiamino. La unidad de ramificación puede comprender grupos seleccionados entre grupos alquilo y éter.
La unidad de ramificación A puede tener una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000012_0001
en donde cada A1 representa independientemente O, S, C=O o NH; y
cada n representa independientemente un número entero de 1 a 20.
La unidad de ramificación puede tener una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000012_0002
en donde cada A1 representa independientemente O, S, C=O o NH; y cada n representa independientemente un número entero de 1 a 20.
La unidad de ramificación puede tener una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000013_0001
en donde Ai es O, S, C=O o NH; y
cada n representa independientemente un número entero de 1 a 20.
La unidad de ramificación puede tener la estructura:
Figure imgf000013_0002
La unidad de ramificación puede tener la estructura:
Figure imgf000013_0003
La unidad de ramificación puede tener la estructura:
Figure imgf000013_0004
Opcionalmente, la unidad de ramificación consiste en solo un átomo de carbono.
La parte "X3" es una unidad de unión. La unidad de unión es lineal y se une covalentemente a la unidad de ramificación y al ácido nucleico.
X3 se puede seleccionar de alquileno C1-C20, alquenileno C2-C20-, un éter de alquileno de fórmula -(alquileno C1-C20)-O-(alquileno C1-C20)-, -C(O)-alquileno C1-C20-, -alquileno C0-C4(Cy)alquileno C0-C4- en donde Cy representa un anillo cicloalquileno, arileno, heterociclileno o heteroarileno sustituido o sin sustituir de 5 o 6 miembros, -alquileno C1-C4-NHC(O)-alquileno C1-C4-, -alquileno C1-C4-C(O)NH-alquileno C1-C4-, -alquileno C1-C4-SC(O)-alquileno C1-C4-, -alquileno C1-C4-C(O)S-alquileno C1-C4-, -alquileno C1-C4-OC(O)-alquileno C1-C4-, -alquileno C1-C4-C(O)O-alquileno C1-C4- y -alquileno C1-C6-S-S-alquileno C6-C6-.
X3 puede ser un éter de alquileno de fórmula -(alquileno C1-C20)-O-(alquileno C1-C20)-. X3 puede ser un éter de alquileno de fórmula -(alquileno C1-C20)-O-(alquileno C4-C20)-, en donde dicho (alquileno C4-C20) se une a Z. X3 puede seleccionarse entre el grupo que consiste en -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- y H2-O-C8H16-, en especial -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- y H2-O-C8H16-, en donde en cada caso el grupo -CH2- se une a A.
El ligando puede comprender un compuesto de fórmula (II):
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
en donde:
S representa un sacárido;
X1 representa alquileno C3-C6 o (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- en donde m es 1, 2 o 3;
P es un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato);
X2 es alquileno C1-C8 ;
A es una unidad de ramificación seleccionada de:
Figure imgf000014_0001
n = 1 a 4 n = 1 a 4 X3 es una unidad de unión;.
en donde un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está conjugado con X3 a través de un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato)
La unidad de ramificación A puede tener la estructura:
Figure imgf000014_0002
La unidad de ramificación A puede tener la estructura:
Figure imgf000014_0003
en donde X3 se une al átomo de nitrógeno.
X3 puede ser alquileno C1-C20. Preferentemente, X3 se selecciona entre el grupo que consiste en -C3H6-, -C4H8--C 6H12-y -C8H16-, en especial -C4H8--C 6H12- y -C8Ha-.
El ligando puede comprender un compuesto de fórmula (III):
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (III)
en donde:
S representa un sacárido;
X1 representa alquileno C3-Ca o (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- en donde m es 1, 2 o 3;
P es un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato);
X2 es un éter de alquileno de fórmula -C3Ha-O-CH2-;
A es una unidad de ramificación;
X3 es un éter de alquileno de fórmula seleccionada del grupo que consiste en -CH2-O-CH2-, -CH2-O-C2H4-, -CH2-O-C3Ha-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-CaH12-, -CH2-O-C7H14- y -CH2-O-C8H16-, en donde en cada caso el grupo -CH2- se une a A,
y en donde X3 se conjuga con un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención mediante un fosfato o fosfato modificado (preferentemente un tiofosfato).
La unidad de ramificación puede comprender carbono. Preferentemente, la unidad de ramificación es carbono.
X3 puede seleccionarse entre el grupo que consiste en -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-y -CH2-O-C8H16-. Preferentemente, X3 se selecciona entre el grupo que consiste en -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- y -CH2-O-C8H16.
En algunas realizaciones, cuando P representa un grupo fosfato modificado, P se puede representar por:
Figure imgf000015_0001
en donde Y1 e Y2 representan cada uno independientemente =O, =S, -O-, -OH, -SH, -BH3, -OCH2CO2 , -OCH2CO2Rx, -OCH2C(S)ORx y -ORx, en donde Rx representa alquilo C1-C6 y en donde
Figure imgf000015_0002
indica unión al resto del compuesto.
Por fosfato modificado se entiende un grupo fosfato en donde se reemplaza uno o más de los oxígenos que no se unen. Los ejemplos de grupos fosfato modificados incluyen fosforotioato, fosforoselenatos, fosfatos de borano, ésteres de fosfato de borano, fosfonatos de hidrógeno, fosforamidatos, fosfonatos de alquilo o arilo y fosfotriésteres. Los fosforoditioatos tienen ambos oxígenos no enlazantes reemplazados por azufre. Uno, cada uno o los dos oxígenos no enlazantes en el grupo fosfato pueden ser independientemente uno cualquiera de S, Se, B, C, H, N u OR (R es alquilo o arilo).
El fosfato también se puede modificar mediante el reemplazo de un oxígeno enlazante por nitrógeno (fosforamidatos puenteados), azufre (fosforotioatos puenteados) y carbono (fosfonatos de metileno puenteados). El reemplazo puede producirse en un oxígeno terminal. Es posible reemplazar los oxígenos no enlazantes por nitrógeno.
Por ejemplo, Y1 puede representar -OH e Y2 puede representar =O o =S; o
Y1 puede representar -O' e Y2 puede representar =O o =S;
Y1 puede representar =O e Y2 puede representar -CH3, -SH, -ORx o -BH3
Y1 puede representar =S e Y2 puede representar -CH3 , ORx o -SH.
El experto en la materia comprenderá que en determinados casos habrá deslocalización entre Y1 e Y2.
Preferentemente, el grupo fosfato modificado es un grupo tiofosfato. Los grupos tiofosfato incluyen bitiofosfato (es decir, donde Y1 representa =S e Y2 representa -S‘) y monotiofosfato (es decir, donde Y1 representa -O‘ e Y2 representa =S, o donde Y1 representa =O e Y2 representa -S‘). Preferentemente, P es un monotiofosfato. Los inventores han descubierto que los conjugados que tienen grupos tiofosfato en reemplazo de los grupos fosfato tienen una potencia y duración de la acción in vivo mejoradas.
P también puede ser un fosfato de etilo (es decir, donde Y1 representa =O e Y2 representa OCH2CH3).
El sacárido puede seleccionarse para que tenga una afinidad por al menos un tipo de receptor en una célula diana. En particular, el receptor está en la superficie de una célula hepática de mamífero, por ejemplo, el complejo del receptor hepático de asialoglucoproteína (ASGP-R).
Para cualquiera de las realizaciones anteriores, el sacárido se puede seleccionar de N-acetilo con uno o más de galactosamina, manosa, galactosa, glucosa, glucosamina y fructosa. Normalmente, un ligando para usar en la presente invención puede incluir N-acetil galactosamina (GalNAc). Preferentemente, los compuestos de la invención pueden tener 3 ligandos, cada uno de los cuales incluirá preferentemente N-acetil galactosamina.
"GalNAc" se refiere a 2-(Acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, habitualmente denominada en la bibliografía N-acetil galactosamina. La referencia a "GalNAc" o a "N-acetil galactosamina" incluye tanto la forma p: 2-(Acetilamino) 2-desoxi-p-D-galactopiranosa, como la forma a: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa. En determinadas realizaciones, tanto la forma p: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa como la forma a: 2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa pueden utilizarse indistintamente. Preferentemente, los compuestos de la invención comprenden la forma p, 2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa.
Figure imgf000016_0001
2-(Acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa
Figure imgf000016_0002
2-(Acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa
Figure imgf000016_0003
2-(Acetilamino)-2-desoxi-a-D-galactopiranosa
Para cualquiera de los compuestos anteriores de fórmula (III), X1 puede ser (-CH2-CH2-O)(-CH2)2-. X1 puede ser (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-. X1 puede ser (-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-. Preferentemente, X1 es (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-. Como alternativa, X1 representa alquileno C3-C6. X1 puede ser propileno. X1 puede ser butileno. X1 puede ser pentileno. X1 puede ser hexileno. Preferentemente, el alquilo es un alquileno lineal. En particular, X1 puede ser butileno.
Para compuestos de fórmula (III), X2 representa un éter de alquileno de fórmula -C3H6-O-CH2-, es decir, alcoxi C3-metileno o -CH2CH2CH2OCH2-.
La invención proporciona un ácido nucleico conjugado que tiene una de las siguientes estructuras:
Figure imgf000017_0001

Figure imgf000018_0001

Figure imgf000019_0001

Figure imgf000020_0001
en donde Z es un ácido nucleico como se ha definido anteriormente en el presente documento y preferentemente está conjugado con el extremo 5' de la segunda cadena del ácido nucleico.
Preferentemente, el ácido nucleico conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000021_0001
en donde Z es un ácido nucleico como se define anteriormente en el presente documento y preferentemente está conjugado con el extremo 5' de la segunda cadena.
Un ligando de fórmula (I), (II) o (III) se puede unir en el extremo 3' de la primera cadena (antisentido) y/o en cualquiera de los extremos 3' y/o 5' de la segunda cadena (de sentido). El ácido nucleico puede comprender más de un ligando de fórmula (I), (II) o (III). Sin embargo, se prefiere un único ligando de fórmula (I), (II) o (III) porque un único ligando de este tipo es suficiente para el direccionamiento eficaz del ácido nucleico a las células diana. Preferentemente en ese caso, al menos los dos últimos, preferentemente al menos los últimos tres y más preferentemente al menos los últimos cuatro nucleótidos en el extremo del ácido nucleico al que está unido el ligando están unidos mediante un enlace fosfodiéster.
Preferentemente, el extremo 5' de la primera cadena (antisentido) no está unido a un ligando de fórmula (I), (II) o (III), ya que un ligando en esta posición puede potencialmente interferir con la actividad biológica del ácido nucleico.
Un ácido nucleico con un único ligando de fórmula (I), (II) o (III) en el extremo 5' de una cadena es más fácil y, por lo tanto, más barato de sintetizar que el mismo ácido nucleico con el mismo ligando en el extremo 3'. Preferentemente, por lo tanto, un único ligando de cualquiera de las fórmulas (I), (II) o (III) se une de manera covalente a (se conjuga con) el extremo 5' de la segunda cadena del ácido nucleico.
En una realización, el ácido nucleico se conjuga con un ligando que comprende un lípido y, más preferentemente, un ligando que comprende un colesterol.
Como alternativa, un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede conjugarse con un ligando de la siguiente estructura
Figure imgf000022_0001
Un conjugado de la divulgación puede comprender cualquier ácido nucleico como se divulga en el presente documento conjugado con cualquier ligando o ligandos como se divulga en el presente documento.
La presente invención también se refiere a un conjugado para inhibir la expresión de un gen LPA en una célula, comprendiendo dicho conjugado una parte de ácido nucleico, que comprende el ácido nucleico de la invención, y al menos una parte de ligando, comprendiendo dicha al menos una parte de ligando un resto enlazador, preferentemente un resto enlazador procedente de serinol, y un ligando de direccionamiento para el direccionamiento in vivo de células y estando conjugado exclusivamente con los extremos 3' y/o 5' de una o ambas cadenas de ARN, en donde el extremo 5' de la primera cadena de ARN no está conjugado, en donde:
(i) la segunda cadena de ARN está conjugada en el extremo 5' con el ligando de direccionamiento, y en donde (a) la segunda cadena de ARN también está conjugada en el extremo 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 3' de la primera cadena de ARN no está conjugado; o (b) la primera cadena de ARN está conjugada en el extremo 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 3' de la segunda cadena de ARN no está conjugado; o (c) tanto la segunda cadena de ARN como la primera cadena de ARN también están conjugadas en los extremos 3' con el ligando de direccionamiento; o
(ii) tanto la segunda cadena de ARN como la primera cadena de ARN están conjugadas en los extremos 3' con el ligando de direccionamiento y el extremo 5' de la segunda cadena de ARN no está conjugado.
Los ligandos pueden ser monoméricos o multiméricos (por ejemplo, diméricos, triméricos, etc.).
De manera adecuada, los ligandos son monoméricos, por lo tanto, contienen un único resto de ligando de direccionamiento, por ejemplo, un único resto GaINAc.
Como alternativa, los ligandos pueden ser ligandos diméricos en donde las partes de ligando comprenden dos restos enlazadores, tales como restos enlazadores procedentes de serinol o restos enlazadores no de serinol, cada uno unido a un único resto de ligando de direccionamiento.
Los ligandos pueden ser ligandos triméricos en donde las partes de ligando comprenden tres restos enlazadores, tales como restos enlazadores procedentes de serinol o restos enlazadores no de serinol, cada uno unido a un único resto de ligando de direccionamiento.
Los dos o tres restos enlazadores procedentes de serinol pueden estar enlazados en serie, por ejemplo, como se muestra a continuación:
Figure imgf000022_0002
en donde n es 1 o 2 e Y es S u O.
Preferentemente, los ligandos son monoméricos.
De manera adecuada, las cadenas de ARN conjugadas están conjugadas con un ligando de direccionamiento a través de un resto enlazador que incluye un enlazador adicional en donde el enlazador adicional es o comprende una cadena de alquilo C1-15 saturada no ramificada o ramificada, en donde opcionalmente uno o más carbonos (por ejemplo 1,2 o 3 carbonos, adecuadamente 1 o 2, en particular 1) se reemplaza(n) por un heteroátomo seleccionado de O, N, S(O)p, en donde p es 0, 1 o 2 (por ejemplo, un grupo CH2 se reemplaza por O, o por NH, o por S, o por SO2 o un grupo -CH3 en el extremo de la cadena o en una rama se reemplaza por OH o por NH2) en donde dicha cadena está opcionalmente sustituida por uno o más grupos oxo (por ejemplo de 1 a 3, tal como 1 grupo).
De manera adecuada, el resto enlazador es un resto enlazador procedente de serinol.
La expresión "resto enlazador procedente de serinol" significa que el resto enlazador comprende la siguiente estructura:
Figure imgf000023_0001
Un átomo de O de dicha estructura normalmente se une a una cadena de ARN y el átomo de N normalmente se une al ligando de direccionamiento.
De manera más adecuada, el enlazador adicional comprende una cadena de alquilo C1-15 saturada no ramificada en donde uno o más carbonos (por ejemplo, 1,2 o 3 carbonos, adecuadamente 1 o 2, en particular 1) se reemplaza(n) por un átomo de oxígeno.
De manera más adecuada, el enlazador adicional comprende una cadena de PEG.
De manera más adecuada, el enlazador adicional comprende una cadena de alquilo C1-15 saturada no ramificada. De manera más adecuada, el enlazador adicional comprende una cadena de alquilo C1-6 saturada no ramificada. De manera más adecuada, el enlazador adicional comprende una cadena de alquilo C4 o C6 saturada no ramificada, por ejemplo, una cadena de alquilo C4.
En una realización de la invención, la primera cadena de ARN es un compuesto de fórmula (X):
Figure imgf000023_0002
en donde b es 0 o 1; y
la segunda cadena de ARN es un compuesto de fórmula (XI):
Figure imgf000023_0003
en donde:
c y d son independientemente 0 o 1;
Zi y Z2 son las partes de ARN de la primera y segunda cadena de ARN, respectivamente;
Y es O u S; n es 0, 1, 2 o 3; y
Li es un enlazador al que se une un ligando;
y en donde b c d es 2 o 3.
De manera adecuada, la primera cadena de ARN es un compuesto de fórmula (XV)
Figure imgf000024_0001
en donde b es 0 o 1; y
la segunda cadena de ARN es un compuesto de fórmula (XVI):
Figure imgf000024_0002
en donde c y d son independientemente 0 o 1;
en donde:
Z1 y Z2 son las partes de ARN de la primera y segunda cadena de ARN, respectivamente;
Y es O u S;
R1 es H o metilo;
n es 0, 1,2 o 3; y
L es igual o diferente en las fórmulas (XV) y (XVI) y se selecciona del grupo que consiste en:
- (CH2)rC(O)-, en donde r = 2 a 12;
- (CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, en donde s = 1 a 5;
- (cH 2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, en donde t es independientemente 1 a 5;
- (CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, en donde u es independientemente 1 a 5; y
- (c H2)v-NH-C(o )-, en donde v es 2 a 12; y
en donde el C(O) terminal (si está presente) está unido al grupo NH; y en donde b c d es 2 o 3.
De manera adecuada, la primera cadena de ARN es un compuesto de fórmula (XII):
Figure imgf000025_0001
en donde b es 0 o 1; y
la segunda cadena de ARN es un compuesto de fórmula (XIII):
Figure imgf000025_0002
en donde:
c y d son independientemente 0 o 1;
Z1 y Z2 son las partes de ARN de la primera y segunda cadena de ARN, respectivamente;
Y es O u S;
n es 0, 1,2 o 3; y
L2 es igual o diferente en las fórmulas (XII) y (XIII) y es igual o diferente en los restos delimitados por b, c y d, y se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000025_0003
o
n es 0 y L2 es:
Figure imgf000025_0004
y el grupo OH terminal está ausente de modo que se forma el siguiente resto:
Figure imgf000025_0005
en donde
F es una cadena alquilo C1-8 (por ejemplo, alquilo C-i-a) saturada ramificada o no ramificada (tal como no ramificada) en donde uno de los átomos de carbono se reemplaza opcionalmente por un átomo de oxígeno siempre que dicho átomo de oxígeno esté separado de otro heteroátomo (por ejemplo, un átomo de O o N) por al menos 2 átomos de carbono;
L es igual o diferente en las fórmulas (XII) y (XIII) y se selecciona del grupo que consiste en:
- (CH2),C(O)-, en donde r = 2 a 12;
- (CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, en donde s = 1 a 5;
- (cH 2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, en donde t es independientemente 1 a 5;
- (CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, en donde u es independientemente 1 a 5; y
- (c H2)v-NH-C(o )-, en donde v es 2 a 12; y
en donde el C(O) terminal (si está presente) está unido al grupo NH; y en donde b c d es 2 o 3.
En una cualquiera de las fórmulas anteriores donde está presente GaINAc, el GaINAc puede sustituirse por cualquier otro ligando de direccionamiento, tal como los mencionados en el presente documento.
De manera adecuada, b es 0, c es 1 y d es 1; b es 1, c es 0 y d es 1; b es 1, c es 1 y d es 0; o b es 1, c es 1 y d es 1. De manera más adecuada, b es 0, c es 1 y d es 1; b es 1, c es 0 y d es 1; o b es 1, c es 1 y d es 1.
De la manera más adecuada, b es 0, c es 1 y d es 1.
En una realización, Y es O. En otra realización, Y es S.
En una realización, R1 es H o metilo. En una realización, R1 es H. En otra realización, R1 es metilo.
En una realización, n es 0, 1, 2 o 3. De manera adecuada, n es 0.
En una realización, L se selecciona del grupo que consiste en:
- (CH2)rC(O)-, en donde r = 2 a 12;
- (CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-, en donde s = 1 a 5;
- (CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-, en donde t es independientemente 1 a 5;
- (CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-, en donde u es independientemente 1 a 5; y
- (CH2)v-NH-C(O)-, en donde v es 2 a 12;
en donde el C(O) terminal está unido al grupo NH.
De manera adecuada, L es -(CH2)r-C(O)-, en donde r = 2 a 12. De manera adecuada, r = 2 a 6. De manera más adecuada, r = 4 o 6, por ejemplo, 4.
De manera adecuada, L es:
Figure imgf000026_0001
Los restos F ilustrativos incluyen (CH2)1-a, por ejemplo, (CH2)-m , por ejemplo, CH2 , (CH2K (CH2)5 o (CH2)a, o CH2O(CH2)2-3 , por ejemplo, CH2O(CH2)CHa.
De manera adecuada, L2 es:
Figure imgf000026_0002
De manera adecuada, L2 es:
Figure imgf000027_0001
De manera adecuada, L2 es:
Figure imgf000027_0002
De manera adecuada, L2 es:
Figure imgf000027_0003
De manera adecuada, n es 0 y L2 es:
Figure imgf000027_0004
en donde Y es como se define en otra parte en el presente documento.
Dentro del resto delimitado por b, c y d, L2 es normalmente el mismo. Entre los restos delimitados por b, c y d, L2 puede ser el mismo o diferente. En una realización, L2 en el resto delimitado por c es el mismo que el L2 en el resto delimitado por d. En una realización, L2 en el resto delimitado por c no es lo mismo que L2 en el resto delimitado por d. En una realización, el L2 en los restos delimitados por b, c y d es el mismo, por ejemplo, cuando el resto enlazador es un resto enlazador procedente de serinol.
Los restos enlazadores procedentes de serinol pueden estar basados en serinol en cualquier estereoquímica, es decir, procedentes del isómero L-serina, isómero D-serina, una serina racémica u otra combinación de isómeros. En un aspecto preferido de la invención, el resto serinol-GaINAc (SerGN) tiene la siguiente estereoquímica:
Figure imgf000028_0001
l
Bloques de construcción de (S)-serinol
es decir, se basa en un bloque de construcción con soporte sólido de (S)-serinol-amidita o (S)-serinol succinato procedente del isómero L-serina.
En una realización, las células diana son hepatocitos.
Particularmente preferido es un ácido nucleico en donde la primera cadena comprende, o consiste preferentemente en, la SEQ ID NO: 165 y la segunda cadena comprende opcionalmente, o consiste preferentemente en, la SEQ ID NO: 163. Este ácido nucleico se puede conjugar de manera adicional con un ligando. Aún más preferido es un ácido nucleico en donde la primera cadena comprende, o consiste preferentemente en, la SEQ ID NO: 165 y la segunda cadena opcionalmente comprende, o consiste preferentemente en, la SEQ ID NO: 164. El más preferido es un ARNip que consiste en la SEQ ID NO: 165 y la SEQ ID NO: 164. En una realización, el ácido nucleico es el conjugado 21. Composiciones, usos y métodos
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el ácido nucleico o el ácido nucleico conjugado de la invención. Las composiciones farmacéuticas pueden usarse como medicamentos o como agentes de diagnóstico, solos o en combinación con otros agentes. Por ejemplo, uno o más conjugados de ácido nucleico de la invención pueden combinarse con un vehículo de administración (por ejemplo, liposomas) y/o excipientes, tales como portadores y diluyentes. También pueden añadirse otros agentes tales como conservantes y estabilizantes. Se conocen en la materia y dentro del conocimiento del experto en la materia métodos para la administración de moléculas de ácido nucleico.
La invención también incluye una composición farmacéutica que comprende uno o más ácidos nucleicos o ácidos nucleicos conjugados de acuerdo con la presente invención en un excipiente fisiológica/farmacéuticamente aceptable, tal como un estabilizante, conservante, diluyente, tampón y similares.
La composición farmacéutica puede ser una suspensión o solución acuosa inyectable estéril, o estar en forma liofilizada o adherida, absorbida o incluida en cualquier otra sustancia portadora galénica adecuada, tal como gránulos, comprimidos, cápsulas, nanopartículas, geles, comprimidos, perlas o estructuras similares.
Un aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico bicatenario de acuerdo con la invención que es capaz de inhibir la expresión de LPA, preferentemente en una célula, para su uso como medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención o a la composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o síndrome, preferentemente una enfermedad, trastorno o síndrome asociado con niveles elevados de partículas que contienen Lp(a). El tratamiento puede ser para prevenir y/o reducir el riesgo de padecer y/o para tratar un ictus, ateroesclerosis, trombosis o enfermedades cardiovasculares tales como cardiopatía coronaria o estenosis de la válvula aórtica y cualquier otra enfermedad o patología asociada a niveles elevados de partículas que contienen Lp(a). El tratamiento puede ser para prevenir y/o reducir el riesgo de padecer y/o para tratar una enfermedad cardiovascular ateroesclerótica, una enfermedad cerebrovascular ateroesclerótica, hiperlipidemia y dislipidemia, preferentemente en donde la enfermedad está asociada con niveles elevados de partículas que contienen Lp(a). El tratamiento puede ser para prevenir y/o reducir el riesgo de padecer y/o para tratar la estenosis de la válvula aórtica calcificada, accidente cerebrovascular isquémico, arteriopatía coronaria, arteriopatía periférica, aneurisma aórtico abdominal, insuficiencia cardíaca secundaria a miocardiopatía isquémica o hipercolesterolemia familiar, preferentemente en donde la enfermedad está asociada con niveles elevados de partículas que contienen Lp(a). Preferentemente, el tratamiento es para prevenir y/o reducir el riesgo de padecer y/o para tratar la estenosis de la válvula aórtica, tal como estenosis de la válvula aórtica calcificada o hipercolesterolemia familiar, preferentemente en cada caso cuando la enfermedad o trastorno está asociado con niveles elevados de partículas que contienen Lp(a). En general, un nivel deseable de partículas que contienen Lp(a) en el suero se describe como un nivel de menos de 14 mg/dl. Un nivel elevado de partículas que contienen Lp(a) es un nivel de al menos 14, preferentemente al menos 20, más preferentemente al menos 30, más preferentemente al menos 40 y lo más preferentemente al menos 50 mg/dl de partículas que contienen Lp(a) en el suero de un sujeto.
La invención incluye una composición farmacéutica que comprende uno o más ácidos nucleicos o ácidos nucleicos conjugados de acuerdo con la presente invención en un excipiente fisiológica/farmacéuticamente aceptable, tal como un estabilizador, conservante, diluyente, tampón y similares.
Las expresiones "partículas que contienen Lp(a)" y "partículas de Lp(a)" se utilizan indistintamente a lo largo de esta divulgación.
Las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención pueden administrarse a un sujeto mamífero en una dosis farmacéuticamente eficaz. El mamífero puede seleccionarse de un ser humano, un primate no humano, un simio o prosimio, un perro, un gato, un caballo, ganado bovino, un cerdo, una cabra, una oveja, un ratón, una rata, un hámster, un erizo y un conejillo de Indias, u otras especies de relevancia. Por este motivo, la expresión "LPA" o "LPA" como se utiliza en el presente documento, indica ácido nucleico o proteína en cualquiera de las especies mencionadas anteriormente, si se expresa de forma natural o artificial, pero preferentemente esta expresión indica ácidos nucleicos o proteínas humanas.
El ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la presente invención también se puede administrar en combinación con otros compuestos terapéuticos, ya sea administrado por separado o simultáneamente, por ejemplo, en forma de una dosis unitaria combinada. El agente terapéutico adicional se puede seleccionar del grupo que comprende un oligonucleótido, una molécula pequeña, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal y un péptido. Una conjugación molecular con otras entidades moleculares biológicamente activas, tales como péptidos, ligandos celulares o artificiales o moléculas pequeñas y grandes también es posible.
Los expertos en la materia pueden determinar niveles de dosificación para el medicamento y las composiciones farmacéuticas de la invención mediante experimentación rutinaria. En una realización, una dosis unitaria puede contener entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal de ácido nucleico o ácido nucleico conjugado. Como alternativa, la dosis puede ser de 10 mg/kg a 25 mg/kg de peso corporal, o de 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal, o de 0,05 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, o de 0,1 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, o de 0,1 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal, o de 0,1 mg/kg a 0,5 mg/kg de peso corporal, o de 0,5 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal. Como alternativa, la dosis puede ser de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 0,6 mg/kg a aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 0,7 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 0,8 mg/kg a aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 0,9 mg/kg a aproximadamente 3,5 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 3 mg/ kg de peso corporal, o aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, en donde "aproximadamente" es una desviación de hasta un 30 %, preferentemente hasta un 20 %, más preferentemente hasta un 10 %, aún más preferentemente hasta un 5 % y lo más preferentemente el 0 % del valor indicado. Los niveles de dosificación también se pueden calcular a través de otros parámetros tales como, por ejemplo, el área de la superficial corporal.
El ácido nucleico descrito en el presente documento puede inhibir la expresión de LPA. El ácido nucleico descrito en el presente documento puede inhibir parcialmente la expresión de LPA. La inhibición puede ser completa, es decir, 0 % en comparación con el nivel de expresión de LPA en ausencia del ácido nucleico de la invención. La inhibición de la expresión de LPA puede ser parcial, es decir, puede ser del 15 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o valores intermedios de la expresión de LPA en ausencia de un ácido nucleico de la invención. La inhibición puede durar 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas o hasta 3 meses, cuando se utiliza en un sujeto, tal como un paciente humano. Un ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la invención, o composiciones que incluyen el mismo, puede(n) ser para uso en un régimen que comprende tratamientos una o dos veces por semana, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada cinco semanas, cada seis semanas, cada siete semanas o cada ocho semanas, o en regímenes con frecuencia de dosificación variable, tal como combinaciones de los intervalos antes mencionados. El ácido nucleico puede ser para uso por vía subcutánea, intravenosa o utilizando cualquier otra vía de aplicación tal como oral, rectal o intraperitoneal, preferentemente para uso por vía subcutánea.
En células y/o sujetos tratados con, o que reciben, el ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la presente invención, la expresión de LPA se puede inhibir en comparación con las células y/o sujetos no tratados en un intervalo del 15 % al 100 %, pero al menos aproximadamente un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o el 100 % o valores intermedios. El nivel de inhibición puede permitir el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión o sobreexpresión de LPA, o puede servir para investigar más a fondo las funciones y papeles fisiológicos del producto génico l Pa .
El ácido nucleico o ácido nucleico conjugado de la presente invención se puede producir con métodos habituales en la materia, que incluyen síntesis química o expresión del ácido nucleico in vitro (por ejemplo, transcripción run-off) o in vivo. Por ejemplo, con síntesis química en fase sólida o con un vector de expresión basado en ácido nucleico que incluye derivados víricos o sistemas de expresión parcial o completamente sintéticos. En una realización, el vector de expresión se puede utilizar para producir el ácido nucleico de la invención en vitro, dentro de un organismo hospedador intermedio o tipo de célula, dentro de un organismo intermedio o final o dentro de la célula diana deseada. Los métodos para la producción (síntesis o transcripción enzimática) del ácido nucleico descrito en el presente documento se conocen por los expertos en la materia.
Figuras
En la figura 1 se muestran los resultados de un cribado de moléculas de ARNip no conjugadas para la inhibición de la expresión del ARNm de LPA en células RT-4 humanas.
En las figuras 2A y 2B se muestra la respuesta a la dosis de moléculas de ARNip dirigidas a LPA no conjugadas en la expresión del ARNm de LPA en células RT-4 humanas.
En la figura 3 se muestra la inhibición de la expresión del ARNm de LPA en hepatocitos primarios humanos y de macaco mediante diferentes dosis de moléculas de ARNip conjugadas con GaINAc-L1 LPA-1038 administradas mediante captación mediada por receptor.
En la figura 4 se muestran ejemplos representativos de la atenuación del ARNm de LPA mediante ARNip de GaINAc conjugados con L6 indicados en hepatocitos primarios humanos administrados mediante captación mediada por receptor.
En la figura 5 se muestra la síntesis de A0268, que es un oligonucleótido monocatenario conjugado con mono-GaINAc en 3' y es el material de partida en la síntesis del conjugado 1 y el conjugado 3. (ps) indica enlace de fosforotioato.
En la figura 6 se muestra la síntesis de A0006, que es un oligonucleótido monocatenario conjugado con GaINAc de tres antenas en 5' que se utiliza para la síntesis del conjugado de referencia 4. (ps) indica enlace de fosforotioato. En la figura 7 se ilustra la determinación in vitro de la atenuación de TTR. En particular, en la figura 7A se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los conjugados de referencia (CR) 1 y 3, así como el control sin tratamiento "ST"; En la figura 7B se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los conjugados de referencia (CR) 2 y 3, así como el control sin tratamiento "ST"; y en la figura 7C se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los conjugados 1, 2 y 3, así como mediante CR3 y el control sin tratamiento "ST". Los conjugados de referencia 1 y 2 representan conjugados de comparación. El conjugado de referencia 3 representa un ARNip de GaINAc no dirigido y "sin tratamiento" ("ST") representa células no tratadas. Tanto el CR3 como ST son controles negativos. Los niveles de ARNm se normalizaron frente a Ptenll. En la figura 8 se muestra la evolución temporal de TTR en suero en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 4 a los 7, 14 y 27 días después del tratamiento s.c. con 1 mg/kg - Conjugados 1 a 3, conjugados de referencia (CR) 1, 2 y 4 e individuos tratados de forma simulada (PBS).
En la figura 9 se muestra la síntesis de oligonucleótidos de precursores de oligonucleótidos conjugados con GaINAc en 3' y 5' (tal como el compuesto X0385B-prec).
En la figura 10 se muestra la misma respuesta a la dosis de atenuación para el ARNip dirigido a LPA con dos unidades individuales de GaINAc conjugadas con la segunda cadena en comparación con una unidad triantenaria de GaINAc en la segunda cadena en 5' en hepatocitos primarios de macaco.
En la figura 11 se ilustra la determinación in vitro de la atenuación de TTR. En particular, en la figura 11A se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los conjugados 4, 5, 6 y 2 en comparación con "Luc" (Conjugado de referencia 3) así como el control sin tratamiento "ST"; en la figura 11B se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los conjugados 7 y 2, en comparación con "Luc" (Conjugado de referencia 3) así como con el control sin tratamiento "ST". Luc o conjugado de referencia 3 (CR3) representa un ARNip de GaINAc no dirigido y "sin tratamiento" ("ST") representa células no tratadas. Tanto el CR3como ST son controles negativos. El nivel de ARNm se normalizó frente a Ptenll.
En la figura 12 se ilustra la determinación in vitro de la atenuación de TTR. En particular, en la figura 12A se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los conjugados 8, 9, 10, 11 y 2 en comparación con "Luc" (Conjugado de referencia 3) así como el control sin tratamiento "ST"; en la figura 12B se muestra la determinación in vitro de la atenuación de TTR mediante los conjugados 12 y 2, en comparación con "Luc" (Conjugado de referencia 3) así como con el control sin tratamiento "ST". Luc o conjugado de referencia 3 representa un ARNip de GaINAc no dirigido y "sin tratamiento" ("ST") representa células no tratadas. Tanto el CR3como ST son controles negativos. El nivel de ARNm se normalizó frente a Ptenll.
En la figura 13 se ilustra la determinación in vitro de la atenuación del ARNm de LPA mediante el conjugado 19 en comparación con los controles. Ctr representa un ARNip de GaINAc no dirigido y "sin tratamiento" ("ST") representa células no tratadas. Tanto Ctr como ST son controles negativos. Los niveles de ARNm se normalizaron frente a ACTB.
En la figura 14 se muestra una evolución temporal de los niveles del ARNm de Aldh2 hepático en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 6 a los 14, 28 y 42 días después del tratamiento s.c. con 1 mg/kg - Conjugado 15, conjugado de referencia (CR) 6 e individuos tratados de forma simulada (PBS). Los niveles de ARNm se normalizaron frente a Pten.
En la figura 15 se muestra una evolución temporal de los niveles del ARNm de Aldh2 hepático en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 6 a los 14, 28 y 42 días después del tratamiento s.c. con 1 mg/kg - Conjugado 16, conjugado de referencia (CR) 7 e individuos tratados de forma simulada (PBS). Los niveles de ARNm se normalizaron frente a Pten.
En la figura 16 se muestra una evolución temporal de los niveles del ARNm de Tmprss6 hepático en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 6 a los 14, 28 y 42 días después del tratamiento s.c. con 1 mg/kg - Conjugado 18, conjugado de referencia (CR) 8 e individuos tratados de forma simulada (PBS). Los niveles de ARNm se normalizaron frente a Pten.
En la figura 17 se muestra la estabilidad en suero de los conjugados 4, 5, 6, 7 y 2, y del control sin tratamiento (ST) a 37 °C durante 3 días.
En la figura 18 se muestra la estabilidad en suero de los conjugados 8, 9, 10, 11, 12 y 2, y del control sin tratamiento (ST) a 37 °C durante 3 días.
En la figura 19 se muestra la reducción en el ARNm de LPA en hepatocitos primarios humanos mediante el conjugado 21.
En la figura 20 se muestra la reducción en el ARNm de LPA en hepatocitos primarios de macaco mediante el conjugado 21.
En la figura 21 se muestra que el conjugado 21 no afecta el nivel de la expresión génica de APOB.
En la figura 22 se muestra que el conjugado 21 no afecta el nivel de la expresión génica de PLG.
En la figura 23 se muestra una evolución temporal de la inhibición de la Lp(a) en suero durante 29 días en macacos con diferentes dosis del conjugado 21.
En la figura 24 se muestra una curva de respuesta a la dosis del conjugado 21 que muestra la reducción de Lp(a) en suero el día 29 en macaco.
Ejemplos
La numeración a la que se hace referencia en cada ejemplo es específica para dicho ejemplo.
Ejemplo comparativo 1
Aquí se muestran varias moléculas de ARNip conjugadas y modificadas utilizadas para ejemplos funcionales.
Derivados de LPA-1038:
GaINAc-LPA-1038-L1
Primera cadena (SEQ ID NO: 119, basada en la SEQ ID NO: 5)
OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA 3'
Segunda cadena (SEQ ID NO: 120, basada en la SEQ ID NO: 6)
5'[ST23 (ps)]3 trebler largo (ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps )-OMeA-(ps)-FU 3'
GaINAc-LPA-1038-L6
Primera cadena (SEQ ID NO: 121, basada en la SEQ ID NO: 5)
OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA 3'
Segunda cadena (SEQ ID NO: 122, basada en la SEQ ID NO: 6)
5'[ST23 (ps)]3 ST43 (ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3'
FN (N=A, C, G, U) indica 2'Fluoro, 2' desoxinucleósidos
OMeN (N=A, C, G, U) indica nucleósidos 2'O metilo
(ps) indica un enlace fosforotioato
Otro ejemplo son los derivados de LPA-1041:
GaINAc-LPA-1041-L1
Primera cadena (SEQ ID NO: 123, basada en la SEQ ID NO: 9)
5' OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps) FC-(ps)-OMeG 3'
Segunda cadena (SEQ ID NO: 124, basada en la SEQ ID NO: 10)
5'[ST23 (ps)]3 trebler largo (ps) FC-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3'
GaINAc-LPA-1041-L6
Primera cadena (SEQ ID NO: 125, basada en la SEQ ID NO: 9)
5' OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeG 3'
Segunda cadena (SEQ ID NO: 126, basada en la SEQ ID NO: 10)
5'[ST23 (ps)]3 ST43 (ps) FC-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3'
FN (N=A, C, G, U) indica 2'Fluoro, 2' desoxinucleósidos
OMeN (N=A, C, G, U) indica nucleósidos 2'O metilo
(ps) indica un enlace fosforotioato
Todos los oligonucleótidos se obtuvieron de fabricantes comerciales de oligonucleótidos (Biospring, Frankfurt, Alemania, o RiboBio, Guangzhou, Guangdong, República Popular China) o sintetizado en un sintetizador oligopiloto AKTA (interno) usando química de fosforamidita convencional. Se usaron soporte sólido disponible en el mercado y fosforamiditas de 2'O-Metilo ARN, fosforamiditas de 2'fluoro ADN (todas con protección convencional) y fosforamiditas de trebler largo comercialmente disponibles (Glen research). La síntesis se realizó utilizando soluciones 0,1 M de la fosforamidita en acetonitrilo seco y se utilizó benciltiotetrazol (BTT) como activador (0,3 M en acetonitrilo). Todos los demás reactivos eran reactivos convencionales disponibles comercialmente.
La conjugación del respectivo sintón de GaINac (por ejemplo, ST23, ST41, ST43) se consiguió mediante el acoplamiento de la fosforamidita respectiva al extremo 5' de la oligocadena en condiciones convencionales de acoplamiento de fosforamidita. Se introdujeron fosforotioatos usando reactivos de tiolación convencionales disponibles en el mercado (EDITH, tecnologías Link).
Las cadenas individuales se separaron de la CPG usando metilamina (acuosa al 40 %) y el oligonucleótido bruto resultante se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico (Resource Q, 6 ml, GE Healthcare) en un sistema de HPLC AKTA Pure utilizando un gradiente de cloruro de sodio. Las fracciones que contenían producto se agruparon, se desalaron en una columna de exclusión por tamaño (Zetadex, EMP Biotech) y se liofilizaron.
Para la hibridación, se disolvieron en agua cantidades equimolares de las cadenas individuales respectivas y se calentaron a 80 °C durante 5 min. Después de enfriar gradualmente a TA, se liofilizó el dúplex resultante.
Las secuencias de los ácidos nucleicos resultantes (ARNip) se exponen en la tabla 1 a continuación.
Tabla 1: Secuencias de ácido nucleico no conjugadas analizadas para la inhibición de la expresión de ARNm de LPA. Se indican las secuencias y el patrón de modificación aplicado
Tabla 1
Figure imgf000032_0001
(continuación)
Figure imgf000033_0001
(continuación)
Figure imgf000034_0001
Tabla 1: Las modificaciones de los nucleótidos se representan con los siguientes números (columna 4), 1=2'F-dU, 2=2'F-dA, 3=2'F-dC, 4=2'F-dG, 5=2'-OMe-rU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG.
Tabla 2: A continuación se muestran las secuencias de conjuntos de amplicones de qPCR de LPA, ApoB, p-actina y PTEN que se utilizaron para medir los niveles de ARNm.
Tabla 2
Figure imgf000034_0002
Ejemplo comparativo 2
Cribado de moléculas de ARNip no conjugadas (Tabla 1) para la inhibición de la expresión del ARNm de LPA en células RT-4 humanas.
Los complejos de transfección liposomal se prepararon por triplicado en una proporción de 1,5 pl de RNAiMax (ThermoFisher)/80 pmol de las moléculas de ARNip indicadas. El complejo se diluyó a las concentraciones indicadas de 2,5 nM y 25 nM, respectivamente (valores representados por pares como barras grises claras y más oscuras). Las células de papiloma de células de transición de vejiga humana RT4 que expresan de manera endógena LPA se sembraron a una densidad de 125.000 células por pocillo en formato de 24 pocillos sobre complejos de transfección previamente sembrados (transfección inversa) a la concentración indicada. 24 horas después de la transfección, se aisló el ARN total con el Spin Cell Mini Kit 250 (Stratec). Los niveles del ARNm de LPA se determinaron mediante qRT-PCR en relación con la expresión del ARNm de PPIB en las muestras respectivas como transcripción de mantenimiento. Los valores se normalizaron a la cantidad de ARNm de LPA detectado en células no tratadas (intraplaca). Se transfectó un compuesto de ARNip sin silenciamiento como control adicional. Se muestran las medias y la DT de los valores normalizados por triplicado. Los resultados se muestran en la figura 1.
Ejemplo comparativo 3
Respuesta a la dosis de compuestos de ARNip dirigidos a LPA no conjugados en la expresión del ARNm de LPA en células RT-4 humanas.
Las células del papiloma de células transicionales de vejiga humana RT4 se transfectaron inversamente como se describe anteriormente (Ejemplo 2) y se trataron a la concentración indicada (intervalo de 100 nM a 0,2 nM) con los diferentes compuestos de ARNip no conjugados (Tabla 1) como se indica. 24 h después de la transfección, el ARN total se aisló con el Spin Cell Mini Kit 250 (Stratec). Los niveles del ARNm de LPA se determinaron mediante qRT-PCR en relación con la expresión del ARNm de PPIB en las muestras respectivas como transcripción de mantenimiento. Los valores se normalizaron a la cantidad de ARNm de LPA detectado en células no tratadas. Las barras representan la expresión del ARNm de LPA restante para cada función de datos. Los resultados se muestran en la figura 2.
Ejemplo comparativo 4
Inhibición de la expresión del ARNm de LPA en hepatocitos primarios humanos y de macaco mediante diferentes dosis de molécula de ARNip LPA-1038 conjugada con GaINAc-L1 administrada mediante captación mediada por receptor.
Los hepatocitos primarios (ThermoFisher) se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas de colágeno a densidades de 45.000 células por pocillo (de macaco) y 30.000 células por pocillo (humanas). Se añadió LPA-1038 conjugado con GaINAc-L1 inmediatamente después del cultivo en placas a las concentraciones indicadas (nM). 24 horas después del tratamiento con ARNip, se aisló el ARN total con el kit de 96 pocillos InviTrap RNA cell HTS (Stratec). Los niveles del ARNm de LPA se determinaron mediante qRT-PCR en relación con los niveles de ARNm de actina (macaco) o APOB (ser humano) en las muestras respectivas como transcripción de mantenimiento. Los valores se normalizaron a la expresión de LPA en células no tratadas. Las medias y la DT de los valores normalizados triplicados de los niveles del ARNm de LPA restantes se muestran como barras negras. Los resultados se muestran en la figura 3.
Ejemplo comparativo 5
Atenuación del ARNm de LPA en hepatocitos primarios humanos mediante los diferentes ARNip conjugados con L6-GaINAc indicados en hepatocitos primarios humanos tras la administración mediada por receptores.
Se sembraron hepatocitos primarios humanos (ThermoFisher) en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno a 30.000 células por pocillo (formato de 96 pocillos). Los ARNip conjugados con GaINAc-L6, incluido un control sin silenciamiento, se añadieron inmediatamente después de la siembra de células en las dos concentraciones indicadas.
24 horas después del tratamiento con ARNip, se aisló el ARN total con el kit de 96 pocillos InviTrap RNA cell HTS (Stratec). Los niveles de expresión del ARNm de LPA se determinaron mediante qRT-PCR en relación con el ARNm de APOB como transcripción de mantenimiento. Los valores se normalizaron a la expresión del ARNm de LPA en células no tratadas y los niveles del ARNm de LPA se representan por pares como barras (barras negras 100 nM, barras grises 20 nM). Las medias y la DT de los valores normalizados por triplicado se muestran en la figura 4.
Ejemplo comparativo 6 - Determinación in vitro de la atenuación de TTR de diversos conjugados de GalNAc de ARNip de TTR
Se sembraron hepatocitos primarios murinos en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con colágeno (Thermo Fisher Scientific, n.° A1142803) a una densidad celular de 30.000 células por pocillo y se trataron con conjugados de ARNip en concentraciones que variaban entre 10 nM y 0,0001 nM. 24 horas después del tratamiento, las células se lisaron y el ARN se extrajo con el kit InviTrap® RNA Cell HTS 96/C24 * 96 prep. (Stratec n.° 7061300400) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los niveles de transcripciones de TTR y ARNm de mantenimiento (PtenII) se cuantificaron mediante análisis TaqMan.
La expresión del gen diana en hepatocitos primarios murinos 24 horas después del tratamiento con los conjugados de la invención, conjugados 1 a 3, mostró que la expresión del gen diana disminuye a medida que aumenta la dosis del conjugado en comparación con los controles negativos (véase la columna "ST" y el conjugado de referencia 3), como se muestra en la figura 7. Esto indica que la primera cadena se une al gen diana, reduciendo así la expresión génica. En la figura 7 también se muestran los niveles de expresión del gen diana de los conjugados de referencia 1 y 2 que actúan como conjugados de comparación. Como puede observarse en una comparación entre los datos presentados en las figuras 7A y 7C, y 7B y 7C, los conjugados de la invención (Conjugados 1 a 3) disminuyen la expresión del gen diana en comparación con los conjugados de referencia 1 y 2. El conjugado más eficaz a 0,01 nM parece ser el conjugado 2. El conjugado más eficaz a 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM y 10 nM parece ser el conjugado 3.
Ejemplo comparativo 7 - Evolución temporal in vivo de TTR en suero en ratones
Se trataron s.c. ratones C57BL/6 con 1 mg/kg de conjugados de ARNip en el día 0. Se tomaron muestras de suero los días 7, 14 y 27 mediante sangrado del seno orbitario y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis. La cuantificación de TTR en suero se realizó con un ELISA de prealbúmina de ratón (ALPCO, 41-PALMS/lote 22, 2008003B) de acuerdo con el protocolo del fabricante (dilución de muestra 1:8000 o 1:800).
Los resultados de la evolución temporal de TTR en suero en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 4 a los 7, 14 y 27 días después del tratamiento s.c. con los conjugados 1 a 3 1 mg/kg, los conjugados de referencia 1, 2 y 4, y los individuos tratados de forma simulada (PBS) se muestran en la figura 8. Como indican los datos de la figura 8, los conjugados de la invención son particularmente eficaces para reducir la expresión del gen diana en comparación con el control negativo (PBS) y los conjugados de referencia 1, 2 y, en particular, con el conjugado de referencia 4. Los conjugados 2 y 3 también son más eficaces que los conjugados de referencia 1, 2 y 4. El conjugado más eficaz es el conjugado 2. Por lo tanto, se puede esperar que el nivel de dosificación del conjugado 3 sea unas tres veces menor para lograr la misma reducción inicial y también dé como resultado una mayor duración de la atenuación en comparación con el conjugado de referencia 4.
De manera más específica, el conjugado 2 dio como resultado un nivel de proteína diana en suero 3 veces más bajo en el día siete y un nivel de proteína diana en suero 4 veces más bajo en el día 27 en comparación con el conjugado de referencia 4 a una dosis equimolar en ratones de tipo silvestre. Además, el conjugado 2 dio como resultado una reducción del 85 % del nivel de proteína diana en suero el día 27 después de la inyección única, en comparación con una reducción del 36 % por cantidad equimolar del conjugado de referencia 4.
Ejemplo comparativo 8
Respuesta a la misma dosis de atenuación para el ARNip de direccionamiento de LPA con dos unidades individuales de GaINAc conjugadas con la segunda cadena en comparación con una unidad triantenaria de GaINAc en la segunda cadena en 5' en hepatocitos primarios de macaco.
Los ARNip se modifican mediante la alteración de 2'-OMe/2'-F y contienen cada uno dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato (PS) en sus dos enlaces internucleotídicos terminales 5' y 3'. En el conjugado 19, cada una de las unidades de serinol-GaINAc está unida a través de un enlace PS al 5' y al 3' de la segunda cadena. En el conjugado 20, los dos internucleótidos en 5' terminales de la segunda cadena son fosfodiésteres y un enlazador GaINAc triantenaria está unido mediante un enlace PS a este extremo.
La respuesta a la dosis de la atenuación de LPA en los hepatocitos primarios de macaco se evaluó 24 horas después del tratamiento con ARNip 100, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032 y 0,006 nM. El control de referencia es la construcción 2, el control sin direccionamiento se denomina Cte. El valor ct de la transcripción para cada grupo de tratamiento se normalizó al valor ct de la transcripción para el gen ACTB de mantenimiento (Act) y para los hepatocitos no tratados, llamado st (AAct).
Los datos se muestran en la figura 10
Material y métodos:
ARNip
Figure imgf000037_0001
 Leyenda
mA, mU, mC, mG ARN 2'-O-Metilo
fA, fU, fC, fG ARN de 2'-desoxi-2'-fluoro
(ps) fosforotioato
(po) fosfodiéster
Cebador:
SEQ ID NO
dir GTGTCCTCGCAACGTCCA 48
LPA inv GACCCCGGGGCTTTG 49
sonda BHQ1-TGGCTGTTTCTGAACAAGCACCAATGG-FAM 140 dir GCATGGGTCAGAAGGATTCCTAT 54
ACTB inv TGTAGAAGGTGTGGTGCCAGATT 55
sonda BHQ1-TCGAGCACGGCATCGTCACCAA-VIC 141
Métodos generales
Experimentos in vitro
Se descongelaron hepatocitos primarios murinos (Thermo Scientific: Lote GIBCO: n.° MC798) y se cambió el medio de crioconservación por medio Williams E complementado con FBS al 5 %, dexametasona 1 jM , Glutamax 2 mM, PenStrep al 1 %, insulina recombinante humana 4 mg/ml, Hepes 15 mM. La densidad celular se ajustó a 250000 células por 1 ml. Se sembraron 100 j l por pocillo de esta suspensión celular en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con colágeno. El artículo de prueba se diluyó previamente en el mismo medio (concentrado 5 veces) para cada concentración y se añadieron a las células 25 j l de este ARNip diluido previamente o solo medio. Las células se cultivaron a 37 °C y CO2 al 5 %. 24 h después del tratamiento, se descartó el sobrenadante y las células se lavaron en PBS frío y se añadieron 250 j l de tampón de lisis de ARN S (Stratec). Después de 15min de incubación a temperatura ambiente, las placas se almacenaron a -80 °C hasta el aislamiento del ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Análisis TaqMan
Para el análisis múltiple TaqMan de mTTR y PTEN, se mezclaron 10 j l de ARN aislado para cada grupo de tratamiento con 10 j l de mezcla maestra de PCR (TAKYON low Rox) que contenía cebador mTTR 6 0 0 nM, cebador ApoB 400 nM y 200 nM de cada sonda, así como 0,5 unidades de polimerasa Euroscript II RT con 0,2 unidades de inhibidor de ARNasa. El análisis TaqMan se realizó en una placa de 384 pocillos con una etapa de RT de 10 min a 48 °C, desnaturalización inicial de 3 min a 95 °C y 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 1 min. Los cebadores contienen dos de BHQ1, FAM e YY, una en cada extremo de la secuencia.
Para el análisis TaqMan multiplexado de TMPRSS6 y ApoB, se mezclaron 10 j l de ARN aislado para cada grupo de tratamiento con 10 j l de mezcla maestra de PCR (TAKYON low Rox) que contenía cebador TMPRSS6 800 nM, cebador ApoB 100 nM y 200 nM de cualquiera de las sondas, así como 0,5 unidades de polimerasa Euroscript II RT con 0,2 unidades de inhibidor de ARNasa. El análisis TaqMan se realizó en una placa de 384 pocillos con una etapa de RT de 10 min a 48 °C, desnaturalización inicial de 3 min a 95 °C y 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 1 min.
Experimentos in vivo
Para comparar la potencia in vivo de diferentes conjugados de ARNip se administró por vía subcutánea ARNip 1 mg/kg disuelto en PBS en la región escapular de ratones c57BL/6. Las cohortes de n = 6 se trataron con ARNip de direccionamiento de Aldh2 o Tmprss6 en el día 1 y se sacrificaron en puntos temporales seleccionados después del tratamiento. Las muestras de hígado se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta la extracción del ARN con el kit InviTrap Spin Tissue RNA Mini (Stratec) de acuerdo con el manual del fabricante. A continuación, se cuantificaron los niveles de transcripción de Aldh2, Tmprss6 y Pten como se describió anteriormente.
Ensayo de estabilidad en tritosomas
Para comprobar la estabilidad de la ARNasa en el compartimento endosómico/lisosómico de las células hepáticas in vitro se incubó ARNip durante 0 h, 4 h, 24 h o 72 h en tritosomas de hígado de rata Sprague Dawley (Tebu-Bio, n.° de catálogo: R0610.LT, lote: 1610405, pH: 7,4, 2,827 unidades/ml). Para imitar el entorno acidificado, los tritosomas se mezclaron 1:10 con tampón de pH bajo (ácido acético 1,5 M, acetato de sodio 1,5 M, pH 4,75). 30 j l de estos tritosomas acidificados. Después se mezclaron 10 j l de ARNip (20 jM ) y se incubaron durante los tiempos indicados a 37 °C. Después de la incubación, se aisló el ARN con los cartuchos del kit de inicio Clarity OTX (Phenomenex n.° de cat.: KSO-8494) de acuerdo con el protocolo del fabricante para líquidos biológicos. El ARN liofilizado se reconstituyó en 30 |jl de H2O, se mezclaron con tampón de carga 4* y se cargaron 5 j l en una electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) TBE al 20 % para el análisis semicuantitativo cualitativo de separación. La PAGE se ejecutó a 120 V durante 2 h y el ARN se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio con toma de imágenes digitales posteriores con un sistema de imágenes Biorad.
Ejemplo comparativo 9 - Síntesis de conjugados
Los compuestos ilustrativos se sintetizaron de acuerdo con los métodos que se describen a continuación y los métodos conocidos por los expertos en la materia. El ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos y los bloques de construcción enlazadores se realizó mediante síntesis en fase sólida aplicando la metodología de fosforamidita. La conjugación de GalNAc se logró mediante la formación de enlaces peptídicos de un bloque de construcción de ácido carboxílico de GalNAc con el oligonucleótido purificado y ensamblado previamente que tenía unido el número necesario de bloques de construcción enlazadores modificados con amino.
La síntesis, la desprotección y la purificación de oligonucleótidos siguieron los procedimientos convencionales que se conocen en la materia.
Todos los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador oligopiloto AKTA usando química convencional de fosforamidita. Se utilizaron soporte sólido disponible en el mercado y fosforamiditas de 2'O-Metilo ARN, 2'Fluoro, fosforamiditos de 2'desoxi ARN (toda la protección convencional, ChemGenes, LinkTech) y modificador 3'-Amino TFA Amino C-6 Icaa CPG 500Á (Chemgenes) comercialmente disponible, Fmoc-Amino-DMT C-7 CE fosforamidito (GlyC3Am), modificador 3'-amino C-3 Icaa Cp G 500Á (C3Am), Fmoc-Amino-DMT C-3 CED fosforamidita (C3Am) y TFA-Amino C-6 CED fosforamidita (C6Am) (Chemgenes), modificador 3'-Amino C7 CPG (C7Am) (Glen Research), TFA aminofosforamidito no nucleosídico (Pip), TFA amino no nucleosídico (PipAm) (AM Chemicals). La galactosa amina peracetilada 8 está disponible comercialmente.
Los reactivos auxiliares se adquirieron de EMP Biotech. La síntesis se realizó utilizando una solución 0,1 M de la fosforamidita en acetonitrilo seco y se utilizó benciltiotetrazol (BTT) como activador (0,3 M en acetonitrilo). El tiempo de acoplamiento fue de 15 min. Se aplicó un ciclo Cap/OX/Cap o Cap/Thio/Cap (Cap: Ac2O/NMI/lutidina/acetonitrilo, oxidante: I2 0,1 M en piridina/H2O). Se introdujeron fosforotioatos mediante reactivos de tiolación convencionales disponibles en el mercado (EDITH, tecnologías Link). La escisión de DMT se logró mediante el tratamiento con ácido dicloroacético al 3 % en tolueno. Al finalizar los ciclos de síntesis programados se realizó un lavado con dietilamina (DEA). Todos los oligonucleótidos se sintetizaron en modo DMT en suspensión.
La unión del resto enlazador procedente de serinol se logró mediante el uso de (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-Icaa-CPG 10 cargado con base o una fosforamidita de (S)-DMT-Serinol(TFA) 7 (la síntesis se realizó como se describe en la bibliografía de Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135). Los grupos de GalNAc de tres antenas (ST23/C4XLT o ST23/C6XLT) se introdujeron mediante el acoplamiento sucesivo de los respectivos derivados de amidita de trebler (C4XLT-phos o C6XLT-phos) seguidos de la amidita de GalNAc (ST23-phos).
La unión de restos modificados con amino (enlazadores no procedentes de serinol) se logró mediante el uso de los bloques de construcción CPG modificados con amino comercialmente disponibles o amidita.
Las cadenas se escindieron de la CPG en un tratamiento con metilamina ac. al 40 %. El oligonucleótido bruto resultante se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico (Resource Q, 6 ml, GE Healthcare) en un sistema de HPLC AKTA Pure utilizando un gradiente de cloruro de sodio. Las fracciones que contenían producto se agruparon, se desalaron en una columna de exclusión por tamaño (Zetadex, EMP Biotech) y se liofilizaron.
Las cadenas simples individuales se disolvieron en una concentración de 60 DO/ml en H2O. Ambas soluciones de oligonucleótidos individuales se añadieron juntas en un recipiente de reacción. Para facilitar el seguimiento de la reacción, se realizó una valoración. La primera cadena se añadió en un exceso del 25 % sobre la segunda cadena, según lo determinado por la absorción UV a 260 nm. La mezcla de reacción se calentó a 80 °C durante 5 min y después se enfrió lentamente a TA. La formación de doble cadena se controló mediante HPLC de fase inversa de emparejamiento de iones. A partir del área UV de la cadena única residual se calculó la cantidad necesaria de la segunda cadena y se añadió a la mezcla de reacción. La reacción se calentó de nuevo a 80 °C y se enfrió despacio a TA. Este procedimiento se repitió hasta que se detectó menos del 10 % de cadena única residual.
Síntesis de los compuestos 2 a 10
Los compuestos 2 a 5 y (S)-DMT-Serinol(TFA)-fosforamidita 7 se sintetizaron de acuerdo con los métodos publicados en la bibliografía (Hoevelmann et al. Chem. Sci., 2016,7, 128-135).
Ácido (S)-4-(3-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-2-(2,2,2-trifluoroacetamido)propoxi)-4-oxobutanoico (6).
A una solución de 5 en piridina se añadió anhídrido succínico, seguido de DMAP. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Todo el material de partida se consumió, según lo juzgado por TLC. La reacción se concentró. El material bruto se cromatografió en gel de sílice utilizando un gradiente del 0 % al 5 % de metanol en DCM (+ trietilamina al 1 %) para proporcionar 1,33 g de 6 (rendimiento = 38 %). m/z (ESI-): 588,2 (100 %), (calculado para C30H29F3NO8' [M-H]- 588,6). 1 H-NMR: (400 MHz, CDCl3) 8 [ppm] = 7,94 (d, 1H, NH), 7,39 - 7,36 (m, 2H, CHarilo), 7,29 -7,25 (m, 7H, CHarilo), 6,82-6,79 (m, 4H, CHarilo), 4,51 -4,47 (m, 1H), 4,31 -4,24 (m, 2H), 3,77 (s, 6H, 2xDMTr-OMe), 3,66 - 3,60 (m, 16H, HNEta+), 3,26 - 3,25 (m, 2H), 2,97 - 2,81 (m, 20H, NEta), 2,50-2,41 (4H, m), 1,48 - 1,45 (m, 26H, HNEts+), 1,24 -1,18 (m, 29H, NEts).
(S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato-Icaa-CPG (10)
El (S)-DMT-Serinol(TFA)-succinato (159 mg, 270 pmol) y HBTU (113 mg, 299 pmol) se disolvieron en CH3CN (10 ml). Se añadió diisopropiletilamina (DIPEA, 94 pl, 540 pmol) a la solución y la mezcla se agitó durante 2 min seguido de la adición de amino-Icaa-CPG natural (500 A, 3 g, contenido de amina: 136 mol/g). La suspensión se agitó suavemente a temperatura ambiente en un agitador de muñeca durante 16 h, después se filtró y se lavó con DCM y EtOH. El soporte sólido se secó al vacío durante 2 h. Las aminas que no reaccionaron en el soporte se protegieron mediante agitación con anhídrido acético/lutidina/N-metilimidazol a temperatura ambiente. El lavado del soporte se repitió como anteriormente. El sólido se secó al vacío para producir un soporte sólido 10 (3 g, carga de 26 pmol/g).
Sintón de GalNAc (9)
La síntesis del sintón de GalNAc 9 se realizó como se describe en Nair et al. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), págs.
16958-16961, en un rendimiento del 46 % en dos etapas.
Los datos de caracterización coincidieron con los datos publicados.
Síntesis de oligonucleótidos
Todos los oligonucleótidos monocatenarios se sintetizaron de acuerdo con las condiciones de reacción descritas anteriormente y en las figuras 5 y 6, y se describen en las tablas 3 y 4.
Todos los productos monocatenarios finales se analizaron mediante AEX-HPLC para probar su pureza. La pureza se expresa en % FLP (% de producto de longitud completa, full length product) que es el porcentaje del área Uv bajo la señal de producto asignada en el trazado UV del análisis AEX-HPLC del producto final. La identidad de los respectivos productos monocatenarios (precursores no modificados, modificados con amino u oligonucleótidos conjugados con GalNAc) se demostró mediante análisis LC-MS.
Tabla 3: Oligonucleótidos monocatenarios no conjugados
Producto (11) Nombre PM calc. PM (ESI) encontrado %FLP (AEX-HPLC) A0002 STS16001A 6943,3 Da 6943,0 Da 86,6 %
A0006 STS16001BL4 8387,5 Da 8387,5 Da 94,1 %
A0114 STS22006A 6143,8 Da 6143,7 Da 94,3 %
A0115 STS22006BL1 7855,1 Da 7855,1 Da 92,8 %
A0122 STS22009A 6260,9 Da 6260,6 Da 92,8 %
A0123 STS22009BL1 7783,0 Da 7782,9 Da 87,1 %
A0130 STS18001A 6259,9 Da 6259,8 Da 76,5 %
A0131 STS18001BL4 7813,2 Da 7813,1 Da 74,3 %
A0220 STS16001B-5'1xNH2 6982,2 Da 6982,1 Da 95,7 %
A0237 STS16001A 6943,3 Da 6943,3 Da 95,6 %
A0244 STS16001BV1 6845,2 Da 6844,9 Da 98,2 %
A0264 STS16001AV4-3'1xNH2 7112,4 Da 7112,2 Da 95,4 %
A0329 STS16001BV6-3'5'1xNH2 7183,3 Da 7183,2 Da 88,8 %
A0560 STS16001A 6943,3 Da 6943,3 Da 96,7 %
A0541 STS16001BV1-3'5'NH2 7151,3 Da 7151,0 Da 85,6 %
A0547 STS16001BV16-3'5'NH2 7119,3 Da 7119,1 Da 89,9 %
A0617 STS16001BV20-3'5'NH2 7087,3 Da 7086,7 Da 90,1 %
A0619 STS16001BV1-3'5'2xNH2 7521,3 Da 7521,3 Da 93,4 %
A0680 STS16001A 6943,3 Da 6942,9 Da 91,2 %
A0514 STS22006A 6143,8 Da 6143,7 Da 94,6 %
A0516 STS22009BV11-3'5'NH2 6665,0 Da 6664,8 Da 87,0 %
A0517 STS22009BV11-3'5'NH2 6593,0 Da 6593,0 Da 86,0 %
A0521 STS12009BV1-3'5'NH2 6437,7 Da 6437,8 Da 91,1 %
(continuación)
Producto (11) Nombre PM calc. PM (ESI) encontrado %FLP (AEX-HPLC) A0303 STS12209BL4 7665,0 Da 7664,9 Da 90,4 %
A0304 STS12209A 6393,1 Da 6392,9 Da 77,6 %
A0319 STS22009A 6260,9 Da 6260,5 Da 86,9 %
A0353 STS12009A 6416,1 Da 6416,1 Da 94,1 %
A0216 STS17001A 6178,8 Da 6178,7 Da 87,2 %
A0217 STS17001BL6 7937,2 Da 7937,2 Da 78,3 %
5'1 x NH2 se refiere a la posición (extremo 5') y el número (1 x NH2) de grupos amino procedentes de serinol libres que están disponibles para la conjugación. Por ejemplo, 1x3'NH2 en A0264 significa que hay un grupo amino libre que puede reaccionar con el sintón de GaINAc 9 en el extremo 3' de la cadena A0264. 3'5'1xNH2 significa que hay un grupo amino libre procedente del serinol que puede reaccionar con el enlazador de GaINAc 9 en el extremo 3' y el extremo 5' de la cadena.
Tabla 4: Oligonucleótidos monocatenarios con modificaciones en 5' y 3'
Producto Nombre 5'mod 3'mod PM calc. PM (ESI)
encontrado %FLP (AEX-HPLC) A0561 STS16001BV1-3'5'1xNH2 C6Am GlyC3Am 7267,5 Da 7267,5 Da 66,7 %
A0563 STS16001BV1-3'5'1xNH2 C3Am C3Am 7183,4 Da 7183,1 Da 75,1 %
A0651 STS16001BV1-3'5'1xNH2 C6Am C7Am 7265,6 Da 7265,2 Da 99,6 %
A0653 STS16001BV1-3'5'1xNH2 GlyC3Am GlyC3Am 7299,5 Da 7299,3 Da 88,1 %
A0655 STS16001BV1-3'5'1xNH2 PipAm PipAm 7517,7 Da 7517,5 Da 89,8 %
De forma similar, 3'5'1 x NH2 se refiere a la posición (extremo 3' y 5') y número (1 x NH2 cada uno) de grupos amino libres que están disponibles para la conjugación. Por ejemplo, 3'5'1xNH2 en A0561 significa que hay 2 grupos amino libres (1 en el extremo 3' y 1 en el extremo 5') que pueden reaccionar con el sintón de GaINAc 9 en el extremo 3' de la cadena A0561.
Síntesis de determinados conjugados y conjugados de referencia 1 a 2
La conjugación del sintón de GaINac (9) se logró mediante el acoplamiento a la función serinol-amino de la respectiva cadena de oligonucleótidos 11 utilizando un reactivo de acoplamiento peptídico. Por lo tanto, la respectiva molécula precursora modificada con amino 11 se disolvió en H2O (500 DO/ml) y se añadió DMSO (DMSO/H2O, 2/1, v/v), seguido de DIPEA (2,5 % del volumen total). En un recipiente de reacción separado se realizó la preactivación del ácido GaIN(Ac4)-C4 (9) haciendo reaccionar 2 eq. (por función amino en el oligonucleótido precursor modificado con amino 11) del componente de ácido carboxílico con 2 eq. de HBTU en presencia de 8 eq. de DIPEA en DMSO. Después de 2 min el compuesto preactivado 9 se añadió a la solución de la respectiva molécula precursora modificada con amino. Después de 30 min, el progreso de la reacción se controló mediante LCMS o AEX-HPLC. Una vez completada la reacción de conjugación, el producto bruto se precipitó mediante la adición de 10* iPrOH y NaCl 0,1* 2M y se recogieron mediante centrifugación y decantación. Para liberar los grupos hidroxilo acetilados en los restos de GaINAc, el sedimento resultante se disolvió en MeNH2 al 40 % (1 ml por 500 DO) y después de 15 min a TA se diluyó en H2O (1:10) y finalmente se purificó de nuevo mediante intercambio aniónico y cromatografía de exclusión por tamaño y se liofilizó para producir el producto final 12 (Tabla 5).
Tabla 5: Oligonucleótidos monocatenarios conjugados con GaINAc
Producto Material de Nombre PM calc. PM (ESI) %FLP (AEX-HPLC) (12) partida encontrado
A0241 A0220 STS16001BL20 7285,5 Da 7285,3 Da 91,8 %
A0268 A0264 STS16001AV4L33 7415,7 Da 7415,4 Da 96,9 %
A0330 A0329 STS16001BV6L42 7789,8 Da 7789,8 Da 95,5 %
A0544 A0541 STS16001BV1L75 7757,9 Da 7757,7 Da 93,3 %
A0550 A0547 STS16001BV16L42 7725,9 Da 7725,7 Da 88,5 %
A0620 A0617 STS16001BV20L75 7693,91 Da 7693,2 Da 90,9 %
A0622 A0619 STS16001BV1L94 8734,3 Da 8734,6 Da 82,9 %
A0519 A0516 STS22006BV11L42 7271,7 Da 7271,7 Da 90,0 %
A0520 A0517 STS22009BV11L42 7199,6 Da 7199,7 Da 92,9 %
A0522 A0521 STS12009BV1L42 7044,4 Da 7044,4 Da 96,0 %
A0603 A0602 STS20041BV1L42 7280,7 Da 7280,4 Da 93,4 %
Síntesis de determinados conjugados de la invención
La conjugación del sintón de GalNac (9) se logró mediante el acoplamiento a la función amino de la respectiva cadena de oligonucleótidos 14 utilizando un reactivo de acoplamiento peptídico. Por lo tanto, la respectiva molécula precursora modificada con amino 14 se disolvió en H2O (500 DO/ml) y se añadió DMSO (DMSO/H2O, 2/1, v/v), seguido de DIPEA (2,5 % del volumen total). En un recipiente de reacción separado se realizó la preactivación del ácido GaIN(Ac4)-C4 (9) haciendo reaccionar 2 eq. (por función amino en el oligonucleótido precursor modificado con amino 14) del componente de ácido carboxílico con 2 eq. de HBTU en presencia de 8 eq. de DIPEA en DMSO. Después de 2 min el compuesto preactivado 9 se añadió a la solución de la respectiva molécula precursora modificada con amino. Después de 30 min, el progreso de la reacción se controló mediante LCMS o AEX-HPLC. Una vez completada la reacción de conjugación, el producto bruto se precipitó mediante la adición de 10* iPrOH y NaCl 0,1* 2 M y se recogieron mediante centrifugación y decantación. Para liberar los grupos hidroxilo acetilados en los restos de GalNAc, el sedimento resultante se disolvió en MeNH2 al 40 % (1 ml por 500 DO) y después de 15 min a TA se diluyó en H2O (1:10) y finalmente se purificó de nuevo mediante intercambio aniónico y cromatografía de exclusión por tamaño y se liofilizó para producir el producto final 15 (Tabla 6).
Tabla 6: Oligonucleótidos monocatenarios conjugados con GalNAc
Producto (15) Material de
partida Nombre PM calc. PM (ESI)
encontrado %FLP (AEX-HPLC) A0562 A0561 STS16001BV1L87 7874,2 Da 7874,0 Da 82,7 %
A0564 A0563 STS16001BV1L88 7790,0 Da 7789,4 Da 90,4 %
A0652 A0651 STS16001BV1L96 7872,2 Da 7871,8 Da 94,6 %
A0654 A0653 STS16001BV1L97 7906,2 Da 7905,6 Da 89,9 %
A0656 A0655 STS16001BV1L98 8124,3 Da 8124,0 Da 93,6 %
Formación de doble cadena
La formación de doble cadena se realizó de acuerdo con los métodos descritos anteriormente.
La pureza de doble cadena se da en % de doble cadena, que es el porcentaje del área UV bajo la señal de producto asignada en el trazado UV del análisis IP-RP-HPLC (Tabla 7).
Tabla 7: Conjugados de ácido nucleico
Materiales de partida
Producto Nombre % de doble Primera cadena Segunda cadena cadena
Conj. de ref. 1 A0237 A0241 STS16001L20 97,7 %
Conj. de ref. 2 A0268 A0244 STS16001L33 97,8 %
Conj. de ref. 3 A0130 A0131 STS18001L4 96,8 %
Conj. de ref. 4 A0002 A0006 STS16001L4 90,1 %
Conj. de ref. 5 A0216 A0217 STS17001L6 88,4 % Conjugado 1 A0268 A0241 STS16001L24 96,0 % Conjugado 2 A0237 A0330 STS16001V1L42 98,5 % Conjugado 3 A0268 A0330 STS16001V1L43 98,2 % Conjugado 4 A0560 A0544 STS16001V1L75 92,5 % Conjugado 5 A0560 A0550 STS16001V16L42 95,3 % Conjugado 6 A0237 A0620 STS16001V20L75 97,8 % Conjugado 7 A0237 A0622 STS16001V1L94 93,7 % Conjugado 8 A0680 A0652 STS16001V1L96 98,4 % Conjugado 9 A0680 A0654 STS16001V1L97 95,8 % Conjugado 10 A0680 A0656 STS16001V1L98 97,6 % Conjugado 11 A0560 A0564 STS16001V1L88 95,0 % Conjugado 12 A0237 A0562 STS16001V1L87 96,8 % Conjugado 13 A0114 A0115 STS22006L1 85,6 % Conjugado 14 A0122 A0123 STS22009L1 96,4 %
(continuación)
Materiales de partida
Producto Nombre % de doble Primera cadena Segunda cadena cadena
Conj. de ref. 1 A0237 A0241 STS16001L20 97,7 % Conjugado 15 A0514 A0519 STS22006V11L42 98,6 % Conjugado 16 A0319 A0520 STS22009V11L42 97,0 % Conjugado 17 A0304 A0303 STS12209L4 93,0 % Conjugado 18 A0353 A0522 STS12009V1L42 98,0 % Conjugado 19 A0601 A0603 STS20041BL42 97,6 %
Secuencias
Claves de modificaciones para las siguientes secuencias:
f indica 2'Fluoro 2'desoxirribonucleótido o 2'-fluoro ribonucleótido (los términos son intercambiables) m indica 2'O Metil ribonucleótido
(ps) indica enlace de fosforotioato
Fa M = 6-Carboxifluoresceína
BHQ = Black Hole Quencher 1, desactivador oscuro 1
YY = Yakima Yellow, Amarillo Yakima
Definiciones
Ser(GN) es un bloque de construcción de GaINAc-C4 unido al resto enlazador procedente de serinol:
Figure imgf000043_0001
en donde el O— es el enlace entre el átomo de oxígeno y, por ejemplo, H, el enlace fosforodiéster o el enlace fosforotioato.
GN es:
Figure imgf000043_0002
C4XLT es:
Figure imgf000043_0003
C6XLT es:
Figure imgf000043_0004
ST23 es:
Figure imgf000044_0001
La síntesis de los derivados de fosforamidita de C4XLT (C4XLT-phos), C6XLT (C6XLT-phos) así como ST23 (ST23-phos) se puede realizar como se describe en el documento WO2017/174657.
C4XLT-phos:
Figure imgf000044_0002
C6XLT-phos:
Figure imgf000044_0003
ST23-phos:
Figure imgf000044_0004
Figure imgf000044_0005
en donde G = H (antes de la conjugación) o G = GN (después de la conjugación).
Conjugado 1
Cadena de antisentido - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3' Cadena de sentido - STS16001BL20 (SEQ ID NO: 128)
5' Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps)fA 3' Conjugado 2
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BV1L42 (SEQ ID NO: 130)
Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN)
Conjugado 3
Cadena de antisentido - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) 3' Cadena de sentido - STS16001BV1L42 (SEQ ID NO: 130)
5' Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) 3'
Conjugado 4
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BV1L75 (SEQ ID NO: 142)
5' Ser(GN) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA Ser(GN) 3' Conjugado 5
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BV16L42 (SEQ ID NO: 143)
5' Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mA fA (ps) Ser(GN) 3' Conjugado 6
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BV20L75 (SEQ ID NO: 144)
5' Ser(GN) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mA fA Ser(GN) 3'
Conjugado 7
Cadena de antisentido -(SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BV1L94 (SEQ ID NO: 145)
5' Ser(GN) (ps) Ser(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) Ser(GN) (ps) Ser(GN) 3'
Conjugado 8
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3' C a d e n a de sen tido - S T S 16001 V 1 B L 96 (S E Q ID NO: 146)
5' C6Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) C7Am(GN) 3'
Conjugado 9
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
Cadena de sentido - STS16001V1BL97 (SEQ ID NO: 147)
5' GlyC3Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) GlyC3Am(GN) 3'
Conjugado 10
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 148)
5' PipAm(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) PipAm(GN) 3'
Conjugado 11
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
Cadena de sentido - STS16001V1BL88 (SEQ ID NO: 149)
5' C3Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) C3Am(GN) 3'
Conjugado 12
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
5' mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU 3'
Cadena de sentido - STS16001V1BL87 (SEQ ID NO: 150)
5' C6Am(GN) (ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA (ps) GlyC3Am(GN) 3'
Conjugado 15
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 151)
mU (ps) fC (ps) mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU (ps) fU (ps) mC
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 152)
Ser(GN) (ps) fG (ps) mA (ps) fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA (ps) mG (ps) fA (ps) Ser(GN) Conjugado 16
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 153)
mA (ps) fU (ps) mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU (ps) fC (ps) mU
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 154)
Ser(GN) (ps) fA (ps) mG (ps) fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC (ps) mA (ps) fU (ps) Ser(GN) Conjugado 18
C a d e n a de a n tise n tid o (S E Q ID NO: 155)
mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 156)
Ser(GN) (ps) fU (ps) mC (ps) fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU (ps) Ser(GN) Conjugado 19
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 135) mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 136)
Ser(GN) (ps) fC (ps) mG (ps) fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU (ps) mA (ps) fU (ps) Ser(GN) Conjugado de referencia 1
Cadena de antisentido - STS16001A (SEQ ID NO: 129)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BL20 (SEQ ID NO: 128)
Ser(GN) (ps) fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (PS) fA
Conjugado de referencia 2
Cadena de antisentido - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU (ps) Ser(GN) Cadena de sentido - STS16001BV1 (SEQ ID NO: 157)
fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
Conjugado de referencia 3 - "Luc"
Cadena de antisentido - STS18001A (A0130, SEQ ID NO: 132)
mU (ps) fC (ps) mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA (ps) fC (ps) mG
Cadena de sentido -STS18001BL4 (A0131, SEQ ID NO: 133)
[(ST23) (ps) ]3 C4XLT (ps) fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC (ps) mG (ps) fA Conjugado de referencia 4
Cadena de antisentido - STS16001AL33 (SEQ ID NO: 127)
mU (ps) fU (ps) mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG (ps) fU (ps) mU
Cadena de sentido - STS16001BL4 (SEQ ID NO: 134)
5'[(ST23) (ps) ]3 C4XLT(ps) fA (ps) mA (ps) fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU (ps) mA (ps) fA
Conjugado de referencia 5 - "Ctr"
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 138)
mC (ps) fU (ps) mU fA mC fU mC fU mC fG mC fC mC fA mA fG mC (ps) fG (ps) mA
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 139)
[(ST23) (ps)]3 (C6XLT) (ps) fU mC fG mC fU mU fG mG fG mC fG mA fG mA fG mU fA (ps) mA (ps) fG Conjugado de referencia 6
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 151)
mU (ps) fC (ps) mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU (ps) fU (ps) mC
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 158)
[ST23 (ps)]3 Itrb (ps) fG mA fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA (ps) mG (PS) fA
Conjugado de referencia 7
C a d e n a de a n tise n tid o (S E Q ID NO: 153)
mA (ps) fU (ps) mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU (ps) fC (ps) mU
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 159)
[ST23 (ps)]3 Itrb (ps) fA mG fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC (ps) mA (ps) fU
Conjugado de referencia 8
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 160)
mU (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 161)
[ST23 (ps)]3 ST41 (ps)fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (PS) fA Conjugado de referencia 9
Cadena de antisentido (SEQ ID NO: 135)
mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG
Cadena de sentido (SEQ ID NO: 162)
[ST23 (ps)]3 C6XLT (ps) fC mG fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU (ps) mA (ps) fU Ejemplo comparativo 10 - Determinación in vitro de la atenuación de TTR de varios ARNip de TTR
Conjugados GalNAc
Conjugados 4 a 7
El método se describió anteriormente en "experimentos in vitro" en la sección de Método general.
La expresión del gen diana en hepatocitos primarios murinos 24 horas después del tratamiento a 0,01 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM y 10 nM con los conjugados de la invención, los conjugados 4 a 7, mostró que la expresión del gen diana disminuye a medida que aumenta la dosis del conjugado en comparación con los controles negativos (véase la columna "ST" y Luc [Conjugado de referencia 3]), como se muestra en la figura 11. Esto indica que la primera cadena se une al gen diana, reduciendo así la expresión génica.
Los datos in vitro muestran que en el contexto de uno o dos restos enlazadores procedentes de serinol que se proporcionan en los extremos 5' y 3' de la cadena de sentido en los conjugados 4 a 7, el número de enlaces de fosforotioato (PS) entre el nucleótido terminal y el enlazador, y/o entre los tres nucleótidos terminales en la cadena de sentido, puede variarse manteniendo la eficacia para disminuir la expresión del gen diana.
Conjugados 8 a 12 y 19
El método se describió anteriormente en "experimentos in vitro" en la sección de Método general.
La expresión del gen diana en hepatocitos primarios murinos 24 horas después del tratamiento a 0,01 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM y 10 nM con los conjugados de la invención, los conjugados 8 a 12, mostró que la expresión del gen diana disminuye a medida que aumenta la dosis del conjugado en comparación con los controles negativos (véase la columna "ST" y Luc [Conjugado de referencia 3]), como se muestra en la figura 12. Esto indica que la primera cadena se une al gen diana, reduciendo así la expresión génica. En particular, Los conjugados 8, 9, 10 y 11 parecen ser comparables o mejores que el conjugado 2, que previamente demostró ser el conjugado más eficaz a 0,01 nM. También se demostró que el conjugado 19 disminuía la expresión del gen diana en comparación con los controles negativos (véase la columna "ST" y Ctr, que es un ARNip sin direccionamiento y también denominado conjugado de referencia 5), como se muestra en la figura 13. Esto indica que la primera cadena se une al gen diana, reduciendo así la expresión génica.
Los datos in vitro para los conjugados 8 a 12 y 19 muestran que una serie de enlazadores que son estructuralmente diversos y que están conjugados en ambos extremos de la cadena de sentido son eficaces para disminuir la expresión del gen diana. Los conjugados 8 a 12 y 19 disminuyen la expresión del gen diana de manera más eficaz que "Luc", que es el conjugado de referencia 3 (para los conjugados 8 a 12), "Ctr", que es el conjugado de referencia 5 (para el conjugado 19) y el control sin tratamiento.
Ejemplo comparativo 11 - Evolución temporal in vivo de Ttr, Aldh2 y Tmprss6en suero en ratones
Conjugados 15 a 18
El método se describió anteriormente en "experimentos vivo" en la sección de Método general.
Los resultados de la evolución temporal de Aldh2 en suero en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 6 a los 14, 28 y 42 días después del tratamiento s.c. con 1 mg/kg de los conjugados 15 y 16, los conjugados de referencia 6 y 7, y los individuos tratados de forma simulada (PBS) se muestran en las figuras 14 y 15. Como se sugiere por los datos de las figuras 14 y 15, los conjugados de la invención son particularmente eficaces para reducir la expresión del gen diana en comparación con el control negativo (PBS) y los conjugados de referencia 6 y 7 respectivamente.
Los resultados de la evolución temporal de Tmprss6 en suero en cohortes de ratones c57BL/6 de n = 6 a los 14, 28 y 42 días después del tratamiento s.c. con 1 mg/kg del conjugado 18, el conjugado de referencia 8 y los individuos tratados de forma simulada (PBS) se muestran en la figura 16. Como indican los datos de la figura 16, los conjugados de la invención son particularmente eficaces para reducir la expresión del gen diana en comparación con el control negativo (PBS) y el conjugado de referencia 8.
En general, los datos in vivo muestran que varios enlazadores ilustrativos que se conjugan en ambos extremos de la segunda cadena son eficaces para disminuir la expresión del gen diana in vivo. El posicionamiento del enlazador mejora la potencia in vivo de los conjugados, en comparación con un control de enlazador GaINAc triantenario en el extremo 5' de la segunda cadena (Conjugados de referencia 6, 7 y 8).
Ejemplo comparativo 12 - Estudios de estabilidad en suero
Se siguió el método descrito anteriormente en "Ensayo de estabilidad en tritosomas" en la sección Método general.
En la figura 17 se muestran los resultados de los estudios de estabilidad en suero con respecto a los conjugados 2, 4, 5, 6 y 7. E la figura 18 se muestra la estabilidad en suero de los conjugados 2, 8, 9, 10, 11 y 12.
Todos los conjugados de la invención que se probaron son más estables en suero en comparación con el control.
Todos los conjugados probados contienen cada uno una unidad enlazadora de GalNAc en el extremo 5' y otra en el extremo 3' de la segunda cadena. Los ARNip se modifican mediante la alteración de 2'-OMe/2'-F y contienen cada uno dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato (PS) en sus dos enlaces internucleotídicos terminales 5' y 3', a menos que se indique se otro modo.
En el conjugado 4, las unidades de serinol-GalNAc se unen mediante un enlace fosfodiéster. En el conjugado 5, las unidades de serinol-GalNAc se conjugan a través de PS, mientras que todos los enlaces entre nucleótidos en la segunda cadena son fosfodiésteres. En el conjugado 6, la segunda cadena no contiene PS. En el conjugado 7, dos unidades de serinol-GalNAc están unidas a cada extremo de la segunda cadena y entre sí a través de enlaces PS en los extremos respectivos. En el conjugado 8, se aplicaron un modificador de amino C6 en 5' y un modificador de amino C7 en el extremo 3' de la segunda cadena para la unión del ligando. En conjugado 9 se utilizaron modificadores Gly-C3-amino, en el conjugado 10 modificadores piperidil-amino, en el conjugado 11 modificadores de amino C3 y en el conjugado 2 unidades serinol-GaINAc como enlazadores para la conjugación a ambos extremos de la segunda cadena. En el conjugado 2, tanto los internucleótidos terminales como los enlaces nucleótido-serinol son PS. En el conjugado 12, se aplicaron un modificador de amino C6 en el extremo 5' y un modificador de amino GlyC3 en el extremo 3' de la segunda cadena para la unión del ligando. "st" indica una muestra sin tratamiento a la que se normalizaron las otras muestras. "Luc" indica un ARNip dirigido a luciferasa (Conjugado de referencia 3), que se utilizó como control no dirigido y que no reduce los niveles de ARNm diana.
Los datos muestran que en el contexto de un resto enlazador procedente de serinol que se proporciona en los extremos 5' y 3' de la cadena de sentido, el número de enlaces de fosforotioato (PS) entre el nucleótido terminal y el enlazador, y/o entre los tres nucleótidos terminales en la cadena de sentido, se puede variar manteniendo la estabilidad en suero.
Ejemplo 13
Los hepatocitos primarios humanos (Lote Hu1823) y de macaco (Lote CY367), y el medio se obtuvieron de Life Technologies. Tal como lo describe el fabricante, los hepatocitos primarios se descongelaron y se sembraron en placas que consistían en medio E de Williams (Life Technologies), complementado con suero fetal bovino al 5%, dexametasona 1 pM en DMSO (concentración final de DMSO = 0,01 %) y Thawing/Plating Cocktail-A al 3,6 % v/v (Thermo Fisher Scientific, CM3000).
Se sembraron hepatocitos primarios humanos en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno I (Life Technologies) a una densidad de 30.000 células por pocillo. Se sembraron hepatocitos de macaco a una densidad de 45.000 células por pocillo. El conjugado 21 y un ARNip conjugado con GaINAc de control se diluyeron en serie 5 veces en un intervalo de concentración de 0,006 a 100 nM y se añadieron inmediatamente después de sembrar en medios de sembrado. A continuación, las placas se incubaron a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 % durante 24 horas. Posteriormente, las células se lisaron y el ARN se aisló utilizando el método descrito a continuación.
Secuencias del conjugado 21
Cadena antisentido - Conjugado 21 (SEQ ID NO: 165)
5' mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG 3'
Cadena de sentido - STS16001BL20 (SEQ ID NO: 164)
5' [ST23 (ps)]3 C6XLT (ps) mC mG mG mU mA mA fU fG fG mA mC mA mG mA mG mU mU (ps) mA (ps) mU 3'
El ARN total se extrajo con el kit de 96 pocillos InviTrap HTS (Stratec Molecular GmbH, Berlín, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con los siguientes cambios en el protocolo: Después de la última etapa de lavado, las placas se centrifugaron a 6.000 rpm durante veinte minutos. Posteriormente, la placa de unión a ARN se colocó encima de una placa de elución y el ARN se eluyó mediante dos rondas de adición de 30 pl de tampón de elución e incubación durante dos minutos a temperatura ambiente, seguido de un minuto de centrifugación a 1.000 rpm. Se realizó una etapa de elución final mediante centrifugación a 1700g (4000 rpm) durante 3 minutos. El ARN se almacenó a -80 °C.
Se utilizaron diez pl de solución de ARN para el análisis de la expresión génica mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) realizada con conjuntos/secuencias de amplicón para LPA, ACTB (Eurogentec Deutschland GmbH, Colonia, Alemania), APOB y PLG (BioTez GmbH, Berlín, Alemania).
Las reacciones de RT-qPCR se llevaron a cabo con un ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, parte de Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.) usando protocolos convencionales para RT-PCR (48 °C 30 min, 95 °C 10 min, 40 ciclos a 95 °C 15 s seguido de 60 °C 1 min).
En hepatocitos primarios, los análisis de LPA y PLG se realizaron en ensayos simples (cebadores: 300 nM, sonda: 100 nM). Se ejecutaron APOB (200 nm) y A c Tb (300 nM) en un ensayo múltiple mediante la adición de 100 nM de cada sonda a la mezcla convencional.
Los datos se calcularon mediante el uso del método CT comparativo, también conocido como método 2'ññCt (Livak y Schmittgen, 2001 y Schmittgen y Livak, 2008). Aquí la cantidad de ARNm de APOB, LPA o PLG normalizado a la referencia endógena de ACTB en relación con un calibrador (control sin tratamiento) viene dada por la fórmula
Factor de cambio = 2-ññCt.
A menos que se indique de otro modo, todos los valores presentados en el ejemplo se refieren a la media ± DT. Los valores de CI50 se calcularon utilizando una curva de respuesta a la dosis de 4 parámetros sigmoidales en GraphPad Prism 7.
En la figura 19 se muestra la atenuación del ARNm de LPA por el conjugado 21 a través de la captación mediada por receptor en hepatocitos primarios humanos 24 horas después del tratamiento con ARNip (CI50 = 3,6 nM). Los niveles de expresión del ARNm de LPA se normalizaron a ACTB y en relación con las células tratadas con un control de ARNip sin direccionamiento medido mediante RT-qPCR. Los datos se presentan como la media ± DT de un solo experimento. En la figura 20 se muestra la atenuación del ARNm de LPA por el conjugado 21 a través de la captación mediada por receptor en hepatocitos primarios de macaco 24 horas después del tratamiento con ARNip (CI50 = 0,7 nM). Los niveles de expresión del ARNm de LPA se normalizaron a ACTB y en relación con las células tratadas con un control de ARNip sin direccionamiento medido mediante RT-qPCR. Los datos se presentan como la media ± DT de un solo experimento.
En la figura 21 se muestra la atenuación del ARNm de APOB por el conjugado 21 a través de la captación mediada por receptor en hepatocitos primarios humanos 24 horas después del tratamiento con ARNip. Los niveles de expresión del ARNm de APOB se normalizaron a ACTB y en relación con las células tratadas con un control de ARNip sin direccionamiento medido mediante RT-qPCR. Los datos se presentan como la media ± DT de un solo experimento.
En la figura 22 se muestra la atenuación del ARNm de PLG por el conjugado 21 a través de la captación mediada por receptor en hepatocitos primarios humanos 24 horas después del tratamiento con ARNip. Los niveles de expresión del ARNm de PLG se normalizaron a ACTB y en relación con las células tratadas con un control de ARNip sin direccionamiento medido mediante RT-qPCR. Los datos se presentan como la media ± DT de un solo experimento.
El conjugado 21 alcanza elevados niveles de inhibición del ARNm de LPA sin afectar los niveles de los ARNm de APOB y PLG.
Ejemplo 14
Para probar la eficacia del conjugado 21 in vivo, se utilizaron macacos machos para realizar un estudio farmacodinámico. Los animales se agruparon en 4 grupos, 3 animales por grupo. Antes de la dosificación, se preparó suero para establecer el nivel de referencia de Lp(a) para cada animal. El día 1, se formuló el conjugado 21 en solución salina al 0,9 % y cada animal recibió una dosis única del conjugado 21 en dosis de 0,1, 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg.
Se tomaron muestras seriadas durante 29 días y se midieron los niveles de Lp(a) mediante ELISA (Mercodia, n.° de catálogo 10-1106-01, lote: 27736; Uppsala, Suecia). Todos los valores se normalizaron a los valores de referencia para cada animal individual tomados antes de la dosificación y presentados como un porcentaje del nivel inicial (Figura 23). Las dosis de 1,0 y 3,0 mg/kg mostraron una marcada reducción de los niveles de Lp(a) en suero (69,4 y 77,3 % después de 29 días, respectivamente). El efecto dependiente de la dosis da como resultado una DE50 de 0,56 mg/kg (Figura 24). Estos datos indican que se puede lograr una reducción significativa y sostenida de la Lp(a) en suero mediante una sola dosis del conjugado 21. Basándose en estos datos, se esperaría que la dosificación fuera poco frecuente, no más a menudo que una vez cada dos meses.
Figure imgf000052_0001
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_ _ _
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
Figure imgf000058_0001
Una sola secuencia puede tener más de un nombre. En esos casos, uno de esos nombres se da en la tabla sumario de secuencias.
Cuando se muestran enlazadores específicos o enlaces modificados dentro de una secuencia de ARN, tales como (ps) y [ST23 (ps)]3 ST41 (ps), etc., éstos son partes opcionales de la secuencia, pero son una realización preferida de esa secuencia.
Pueden utilizarse las siguientes abreviaturas, particularmente en las secuencias enumeradas:
Figure imgf000059_0001
(continuación)
Figure imgf000060_0001

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico para inhibir la expresión de LPA en una célula, que comprende al menos una región doble que comprende al menos una parte de una primera cadena y al menos una parte de una segunda cadena que es al menos parcialmente complementaria a la primera cadena, en donde dicha primera cadena es al menos parcialmente complementaria a al menos una parte de ARN transcrito a partir del gen LPA, en donde dicha primera cadena comprende una secuencia de nucleótidos de
5' mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG 3' (SEQ ID NO: 165), y en donde dicha segunda cadena comprende un secuencia de nucleótidos de
5' mC mG mG mU mA mA fU fG fG mA mC mA mG mA mG mU mU (ps) mA (ps) mU 3' (SEQ ID NO: 163); en donde fA, fC, fG y fU indican ribonucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro;
mA, mC, mG y mU indican ribonucleótidos de 2'-O-metilo; y
(ps) indica un enlace de fosforotioato.
2. El ácido nucleico de las reivindicación 1, en donde la primera cadena consiste en una secuencia de nucleótidos de 5' mA (ps) fU (ps) mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC (ps) fC (ps) mG 3' (SEQ ID NO: 165);
en donde fA, fC, fG y fU indican ribonucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro;
mA, mC, mG y mU indican ribonucleótidos de 2'-O-metilo; y
(ps) indica un enlace de fosforotioato.
3. El ácido nucleico de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde la segunda cadena consiste en una secuencia de nucleótidos de
5' mC mG mG mU mA mA fU fG fG mA mC mA mG mA mG mU mU (ps) mA (ps) mU 3' (SEQ ID NO: 163);
en donde fA, fC, fG y fU indican ribonucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro;
mA, mC, mG y mU indican ribonucleótidos de 2'-O-metilo; y
(ps) indica un enlace de fosforotioato.
4. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ácido nucleico está conjugado con un ligando.
5. El ácido nucleico de la reivindicación 4, en donde el ligando comprende (i) uno o más restos de N-acetil galactosamina (GalNAc) o derivados del mismo y (ii) un enlazador, en donde el enlazador conjuga el al menos un resto de GalNAc o derivado del mismo con el ácido nucleico.
6. El ácido nucleico de cualquier reivindicación anterior, en donde el ácido nucleico está conjugado con un ligando que comprende un compuesto de fórmula (I):
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
en la que:
S representa un sacárido, preferentemente en donde el sacárido es N-acetil galactosamina;
X1 representa alquileno C3-C6 o (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- en donde m es 1, 2 o 3;
P es un fosfato o un fosfato modificado, preferentemente un tiofosfato;
X2 es alquileno o un éter de alquileno de fórmula (-CH2VO-CH 2- donde n = 1 a 6;
A es una unidad de ramificación;
X3 representa una unidad de unión;
en donde un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 está conjugado con X3 a través de un fosfato o un fosfato modificado, preferentemente un tiofosfato, y el ácido nucleico preferentemente está conjugado con X3 a través del extremo 5' de la segunda cadena.
7. El ácido nucleico de cualquier reivindicación anterior, en donde el ácido nucleico está conjugado con un ligando y tiene la siguiente estructura
Figure imgf000092_0001
en la que Z es un ácido nucleico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior y el ligando está preferentemente conjugado con el extremo 5' de la segunda cadena.
8. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde la segunda cadena comprende una secuencia de nucleótidos de
5' [ST23 (ps)]3 C6XLT (ps) mC mG mG mU mA mA fU fG fG mA mC mA mG mA mG mU mU (ps) mA (ps) mU 3' (SEQ ID NO: 164);
en donde fA, fC, fG y fU indican ribonucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro;
mA, mC, mG y mU indican ribonucleótidos de 2'-O-metilo;
(ps) indica un enlace de fosforotioato; y
[ST23 (ps)]3 C6XLT (ps) indica
Figure imgf000092_0002
9. El ácido nucleico de la reivindicación 8, en donde la segunda cadena consiste en una secuencia de nucleótidos de 5' [ST23 (ps)]3 C6XLT (ps) mC mG mG mU mA mA fU fG fG mA mC mA mG mA mG mU mU (ps) mA (ps) mU 3' (SEQ ID NO: 164);
en donde fA, fC, fG y fU indican ribonucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro;
mA, mC, mG y mU indican ribonucleótidos de 2-O-metilo;
(ps) indica un enlace de fosforotioato; y
[ST23 (ps)]3 C6XLT (ps) indica
Figure imgf000093_0001
10. Una composición que comprende un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y, opcionalmente, un vehículo de administración y/o un excipiente fisiológicamente aceptables y/o un portador y/o un diluyente y/o un tampón y/o un conservante, para su uso como medicamento.
11. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicha composición es para uso en la prevención o el tratamiento o la reducción del riesgo de padecer una enfermedad o una patología, en donde la enfermedad o la patología son una enfermedad cardiovascular.
12. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la enfermedad cardiovascular es ictus, ateroesclerosis, trombosis, cardiopatía coronaria o estenosis de la válvula aórtica y/o cualquier otra enfermedad o patología asociadas a niveles elevados de partículas de Lp(a).
13. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y que comprende además un vehículo de administración y/o un excipiente fisiológicamente aceptable y/o un portador y/o un diluyente.
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