JP2022526419A - 中枢神経系における遺伝子発現を阻害するための組成物及び方法 - Google Patents

中枢神経系における遺伝子発現を阻害するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、中枢神経系におけるＡＬＤＨ２または他の標的遺伝子の発現を低下させるうえで有用なＲＮＡオリゴヌクレオチド、組成物、及び方法の使用に関する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、神経疾患を治療する方法に使用される。中枢神経系で高い活性を有する安定なオリゴヌクレオチド誘導体が提供される。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許法１１９条（ｅ）の下、２０１９年４月４日出願の米国特許仮出願第６２／８２９，５９５号の利益を主張するものであり、当該出願の全容を参照によって本明細書に援用するものである。
本出願は、特定の標的ｍＲＮＡを分解するためのＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドの使用、特に神経学的状態の治療に関連する使用に関する。
配列表の参照
本出願は、配列表とともに電子形式で出願される。配列表は、２０２０年４月３日に作成された、400930-021WO_ST25.txtのファイル名のファイルとして提供され、そのサイズは１２８バイトである。この電子形式の配列表の情報を、本明細書に参照によりその全容にわたって援用する。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、複数のＲＮＡ－タンパク質相互作用が関与する天然の細胞プロセスである。その遺伝子サイレンシング活性は、１９個よりも長い二本鎖ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子が細胞に入ると活性化され、ｄｓＲＮＡと、同じ配列の一本鎖ＲＮＡ（内因性ｍＲＮＡ）の双方の分解を引き起こす。
より詳細には、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、翻訳の段階で、または特定の遺伝子の転写を妨害することによって遺伝子発現を阻害または活性化する。ＲＮＡｉの標的としては、ウイルス及びトランスポゾンからのＲＮＡが含まれ、ＲＮＡｉによる発現阻害は発生の調節及びゲノムの維持にも一定の役割を果たしている。ＲＮＡｉ経路は、酵素ダイサーが、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を２０～２５塩基対の短い断片に切断することによって開始される。次いで、ガイド鎖として知られる、各断片の２本の鎖のうちの１本が、ＲＮＡ誘導サイレンシング錯体（ＲＩＳＣ）に取り込まれる。ＲＩＳＣは、ＲＩＳＣを相補的なｍＲＮＡに導き、その後のエンドヌクレアーゼによる切断を行うための１本の一本鎖ＲＮＡの鎖である「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」（ｓｓＲＮＡ）フラグメントを取り込んだ多タンパク質複合体、具体的にはリボヌクレオタンパク質である。発見されると、アルゴノートと呼ばれるＲＩＳＣ内のタンパク質の１つが、ｍＲＮＡを活性化して切断する。
一般に、過去のＲＮＡｉ技術の使用における困難として、特定の遺伝子に影響するように十分に調整されていないガイド鎖の使用に関連するオフターゲット効果、標的遺伝子の遺伝子発現が望ましいと考えられる複数の臓器系への送達、及び肝細胞の特性がＲＮＡｉ技術の取り込みと有効性を促進する肝臓以外の臓器系にオリゴヌクレオチドを標的化する能力を有することがあった。
中枢神経系（「ＣＮＳ」）の病理に関して、神経変性または炎症性ＣＮＳ疾患の治療に現在使用されているほとんどの薬物療法は、病原性カスケードの下流に局在する分子を標的としている。したがって、それらの効果はしばしば特異的ではなく、疾患の調節に関して中程度であるかまたは単に効果がない。医療戦略に加えられる可能性のある他のアプローチは、疾患を調節または制御する異なる方法に焦点を当てたものである。これらの革新的な治療戦略の中に、ＲＮＡｉ技術を使用した、疾患の表現型を生じる、または直接寄与する遺伝子の「サイレンシング」がある。この治療手段を使用することの難しさは、特定の候補遺伝子を特定すること、ＣＮＳへの特異的標的化、治療効果の持続性、及び他の組織に影響を及ぼすおそれのあるＲＮＡｉモダリティのＣＮＳからの出口であった。
アルデヒドデヒドロゲナーゼ－２（ＡＬＤＨ２）遺伝子は、重要な生物学的に活性な酵素であるＡＬＤＨ２をコードしている。ＡＬＤＨ２は、アルデヒドの代謝と解毒に関与し、短鎖脂肪族アルデヒドを代謝し、アセトアルデヒドを酢酸塩に変換し、ヒトの肝臓で活性を示す。ＡＬＤＨ２は、４－ヒドロキシノネナール、３，４－ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、及び３，４－ジヒドロキシフェニルグリコアルデヒドなどの他の生体アルデヒドの代謝に関与していることが示されている。最近の研究により、ＡＬＤＨ２はＣＮＳでも発現しており、心臓脳血管系と中枢神経系に対する保護効果を示すことが示されている。ＡＬＤＨ２遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）は、神経変性疾患、認知障害、及び不安障害などのいくつかの神経疾患のリスクに関連していることが報告されている。ＣＮＳのＡＬＤＨ２遺伝子を除去または阻害すると、活性酵素の生物学的活性が防止または制限され、これを比較的簡単に測定することができる。
本開示の各態様は、対象の神経疾患を治療するためのオリゴヌクレオチド及び関連する方法に関する。いくつかの実施形態では、強力なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが、ＣＮＳにおけるそれらの選択的活性のために提供される。本発明において、ＣＮＳに投与されるオリゴヌクレオチドは、ＲＩＳＣ複合体に積み込まれ、その後、ＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡの切断を介して対象の中枢神経系におけるＡＬＤＨ２発現を阻害するうえで有効である、ＡＬＤＨ２標的化ガイド鎖を送達するのに有効である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、そのようなオリゴヌクレオチドベースのアプローチを用いた標的化に特に適したＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡの重要な領域（ホットスポットと呼ばれる）を標的化する（表５を参照）。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、修飾されたリン酸塩、ニックを有するテトラループ構造、及び／または活性、バイオアベイラビリティを向上させ、及び／または中枢神経系へのインビボ投与後の酵素分解の程度を最小限に抑える他の改変を有する。本発明による、ＡＬＤＨ２遺伝子標的化配列は、ＣＮＳにおけるｍＲＮＡの特異的分解を可能にし、それにより目的のタンパク質を分解またはその産生を阻害するような形で目的の遺伝子配列を標的とするガイド鎖で置き換えることができる。このタンパク質が機能獲得型病態の寄与因子である場合、ＲＩＳＣ複合体が標的ｍＲＮＡを切断する活性を維持している間、病態の負の側面が軽減または防止される。本発明の他のオリゴヌクレオチドをＣＮＳ中に投与することで、特定の標的遺伝子の発現を治療上有意な形で調節または阻害することができる。
本開示のいくつかの態様は、対象におけるＡＬＤＨ２の発現を低下させる方法であって、対象の脳脊髄液に、ヌクレオチド１５～３０個の長さのアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドを投与することを含み、アンチセンス鎖は、配列番号６０１～６０７のいずれか１つに記載されるＡＬＤＨ２の標的配列に対する相補性領域を有し、相補性領域は連続するヌクレオチド少なくとも１２個の長さである、方法を提供する。いくつかの実施形態では、相補性の領域は、ＡＬＤＨ２の標的配列に対して完全に相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド１９～２７個の長さである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド１５～４０個の長さのセンス鎖をさらに含み、センス鎖はアンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する。いくつかの実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド１９～４０個の長さである。
いくつかの実施形態では、二重鎖領域は、ヌクレオチド少なくとも１２個の長さである。いくつかの実施形態では、ＡＬＤＨ２に対する相補性領域は、連続したヌクレオチド少なくとも１３個の長さである。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号５９１～６００のいずれか１つに記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号５８１～５９０、６０８、及び６０９のいずれか１つに記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号５９１～６００のいずれか１つに記載される配列からなる。いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号５８１～５９０、６０８、及び６０９のいずれか１つに記載される配列からなる。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは２’修飾を含む。いくつかの実施形態では、２’修飾は、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－アミノジエトキシメタノール、２’－ａｄｅｍ、及び２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される修飾である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが修飾される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の３位と４位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及び／またはアンチセンス鎖の２１位と２２位のうちの１つ以上の間にホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の１位と２位、アンチセンス鎖の２位と３位、アンチセンス鎖の２０位と２１位、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位の間のそれぞれの間にホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドの糖の４’炭素は、リン酸アナログを含む。いくつかの実施形態では、リン酸アナログは、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートである。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の第１位に存在するウリジンがリン酸アナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖の１位に以下の構造を含む。
Figure 2022526419000001
いくつかの実施形態では、センス鎖は、その３’末端に、Ｓ1－ＬＳ2として示されるステムループ（ただし、Ｓ1は、Ｓ2と相補的であり、Ｌは、Ｓ1とＳ2との間にヌクレオチド３～５個の長さのループを形成する）を含む。いくつかの実施形態では、Ｌは、テトラループである。いくつかの実施形態では、Ｌは、ヌクレオチド４個の長さである。いくつかの実施形態では、Ｌは、ＧＡＡＡとして示される配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖上の２７～３０位のＧＡＡＡ配列のヌクレオチドのうちの１つ以上は、一価のＧａｌＮＡｃ部分に結合される。いくつかの実施形態では、センス鎖上の２７～３０位のＧＡＡＡ配列のヌクレオチドのそれぞれは、一価のＧａｌＮＡｃ部分に結合される。いくつかの実施形態では、センス鎖上の（２８～３０位の）ＧＡＡＡ配列のＡのそれぞれは、一価のＧａｌＮＡｃ部分に結合される。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、下記に示されるような［ａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－グアニジン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、グアニジンヌクレオチドに結合された一価のＧａｌＮＡｃを含む。
Figure 2022526419000002
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、下記に示されるような［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－アデニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、アデニンヌクレオチドに結合された一価のＧａｌＮＡｃを含む。
Figure 2022526419000003
いくつかの実施形態では、センス鎖上の２７～３０位のＧＡＡＡモチーフは、下記構造を含む：
Figure 2022526419000004
式中、
Ｌは、結合、クリックケミストリーハンドル、または、置換及び非置換アルキレン、置換及び非置換アルケニレン、置換及び非置換アルキニレン、置換及び非置換ヘテロアルキレン、置換及び非置換ヘテロアルケニレン、置換及び非置換ヘテロアルキニレン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、連続した共有結合された原子１～２０個の長さのリンカーを表し、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮである。
いくつかの実施形態では、Ｌは、アセタールリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｘは、Ｏである。
いくつかの実施形態では、センス鎖上の２７～３０位のＧＡＡＡ配列は、下記構造を含む。
Figure 2022526419000005
いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは、ＧａｌＮＡｃ部分に結合される（例えば、センス鎖上の２８～３０位において）。いくつかの実施形態では、各Ａに結合されたＧａｌＮＡｃ部分は、Ｇが修飾されていないかまたは糖部分に２’修飾を有する点を除いて、上記に示される構造を有する。いくつかの実施形態では、上記に示した構造の部分におけるように、ＧＡＡＡ配列中のＧは、２’－Ｏ－メチル修飾（例えば、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－メトキシエチル）を含み、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは、ＧａｌＮＡｃ部分に結合される。
いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－ＯＨを含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中のヌクレオチドのそれぞれは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは２’－ＯＨを含み、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を含み、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは２’－ａｄｅｍ修飾を含み、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖とセンス鎖とは共有結合していない。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、髄腔内、脳室内、腔内、または間質に投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、注射または注入によって投与される。
いくつかの実施形態では、対象は神経疾患を有する。いくつかの実施形態では、神経疾患は、神経変性疾患、認知障害、及び不安障害から選択される。
いくつかの実施形態では、対象のＡＬＤＨ２の発現を低下させる方法は、対象の脳脊髄液に、アンチセンス鎖とセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドを投与することを含み、
アンチセンス鎖は、ヌクレオチド２１個～２７個の長さであり、ＡＬＤＨ２に対する相補性領域を有し、
センス鎖は、その３’末端にＳ1－Ｌ－Ｓ2として示されるステムループを含み、ただし、Ｓ1はＳ2と相補的であり、ＬはＳ1とＳ2との間にヌクレオチド３～５個の長さのループを形成し、
アンチセンス鎖とセンス鎖とはヌクレオチド少なくとも１２個の長さの二重鎖構造を形成するが共有結合によって連結されていない。
いくつかの実施形態では、対象におけるＡＬＤＨ２の発現を低減する方法は、共有結合によって連結されていないアンチセンス鎖とセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドを対象の脳脊髄液に投与することを含み、
アンチセンス鎖は配列番号５９５に記載される配列を含み、センス鎖は配列番号５８５に記載される配列を含み、
センス鎖は、その３’末端にＳ1－Ｌ－Ｓ2として示されるステムループを含み、ただし、Ｓ1はＳ2と相補的であり、ＬはＧＡＡＡとして示される配列を含むテトラループであり、ＧＡＡＡ配列は、
（ｉ）ＧＡＡＡ配列中の各ＡがＧａｌＮＡｃ部分に結合され、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
（ｉｉ）ＧＡＡＡ配列中の各ＡがＧａｌＮＡｃ部分に結合され、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－ＯＨを含む、
（ｉｉｉ）ＧＡＡＡ配列中の各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
（ｉｖ）ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－ＯＨを含み、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
（ｖ）ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を含み、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、及び、
（ｖｉ）ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－アミノジエトキシメタノール修飾を含み、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、からなる群から選択される構造を含む。
いくつかの実施形態では、対象のＡＬＤＨ２の発現を低下させる方法は、共有結合によって連結されていないアンチセンス鎖とセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドを対象の脳脊髄液に投与することを含み、アンチセンス鎖は、配列番号５９５に記載される配列を含み、センス鎖は、配列番号６０９に記載される配列を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、体性感覚皮質、海馬、前頭皮質、線条体、視床下部、小脳、及び／または脊髄において検出可能な発現を減少させる。
本開示の他の態様は、対象における目的の遺伝子の発現を低下させる方法であって、対象の脳脊髄液に、ヌクレオチド１５～３０個の長さのアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドを投与することを含み、アンチセンス鎖は、ＣＮＳで発現する前記目的の遺伝子の標的配列に対する相補性領域を有し、相補性領域は連続したヌクレオチド少なくとも１２個の長さである、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ＡＬＤＨ２、アタキシン－１、アタキシン－３、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１、ＤＹＴ１、及びＳＯＤ１からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、体性感覚皮質、海馬、前頭皮質、線条体、視床下部、小脳、及び／または脊髄において検出可能な発現を減少させる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＣＮＳの外側のヌクレアーゼによって分解される要素をさらに含み、そのため、前記ヌクレオチドは、ＣＮＳの外側の組織では対象の目的の遺伝子の発現を低下させることはできない。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがＣＮＳから容易に出ることができないような修飾をさらに含む。
本開示の他の態様は、神経疾患を治療する方法であって、治療を要する対象の脳脊髄液に、ヌクレオチド１５～３０個の長さのアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドを投与することを含み、アンチセンス鎖は、配列番号６０１～６０７のいずれか１つに記載されるＡＬＤＨ２の標的配列に対する相補性領域を有し、相補性領域は連続するヌクレオチド少なくとも１２個の長さである、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、方法は、治療を要する対象の脳脊髄液に、アンチセンス鎖とセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドを投与することを含み、
アンチセンス鎖は、ヌクレオチド２１個～２７個の長さであり、ＡＬＤＨ２に対する相補性領域を有し、
センス鎖は、その３’末端にＳ1－Ｌ－Ｓ2として示されるステムループを含み、ただし、Ｓ1はＳ2と相補的であり、ＬはＳ1とＳ2との間にヌクレオチド３～５個の長さのループを形成し、
アンチセンス鎖とセンス鎖とはヌクレオチド少なくとも１２個の長さの二重鎖構造を形成するが共有結合によって連結されていない。
いくつかの実施形態において、神経疾患は、神経変性疾患である。いくつかの実施形態では、神経疾患は、不安障害である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、髄腔内、脳室内、腔内、または間質に投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、注射または注入によって投与される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、体性感覚皮質、海馬、前頭皮質、線条体、視床下部、小脳、及び／または脊髄において検出可能な発現を減少させる。
本開示の他の態様は、アンチセンス鎖とセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドであって、
アンチセンス鎖がヌクレオチド２１～２７個の長さであり、ＡＬＤＨ２に対する相補性領域を有し、
センス鎖が、その３’末端にＳ1－Ｌ－Ｓ2として示されるステムループを含み、ただし、Ｓ1はＳ2と相補的であり、Ｌはテトラループであり、ＧＡＡＡとして示される配列を含み、ＧＡＡＡ配列は、
（ｉ）ＧＡＡＡ配列中の各ＡがＧａｌＮＡｃ部分に結合され、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
（ｉｉ）ＧＡＡＡ配列中の各ＡがＧａｌＮＡｃ部分に結合され、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－ＯＨを含む、
（ｉｉｉ）ＧＡＡＡ配列中の各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
（ｉｖ）ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－ＯＨを含み、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
（ｖ）ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を含み、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、及び、
（ｖｉ）ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－ａｄｅｍ修飾を含み、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、からなる群から選択される構造を含み、
アンチセンス鎖とセンス鎖とがヌクレオチド少なくとも１２個の長さの二重鎖構造を形成するが共有結合によって連結されていない、オリゴヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号５９１～６００のいずれか１つに記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号５８１～５９０のいずれか１つに記載される配列を含む。これらのオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、対象のＡＬＤＨ２発現を低下させる方法は、対象の脳脊髄液に組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、神経疾患の治療を要する対象の神経疾患を治療する方法は、対象の脳脊髄液に組成物を投与することを含む。
本開示の他の態様は、対象における標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、対象の脳脊髄液にオリゴヌクレオチドを投与することを含み、オリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、
アンチセンス鎖は、ヌクレオチド２１個～２７個の長さであり、標的遺伝子に対する相補性領域を有し、
センス鎖は、その３’末端にＳ1－Ｌ－Ｓ2として示されるステムループを含み、ただし、Ｓ1はＳ2と相補的であり、ＬはＳ1とＳ2との間にヌクレオチド３～５個の長さのループを形成し、
アンチセンス鎖とセンス鎖とはヌクレオチド少なくとも１２個の長さの二重鎖構造を形成するが共有結合によって連結されていない。
いくつかの実施形態では、Ｌは、テトラループである。いくつかの実施形態では、Ｌは、ヌクレオチド４個の長さである。いくつかの実施形態では、Ｌは、ＧＡＡＡとして示される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは、ＧａｌＮＡｃ部分に結合される。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中のＧは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中のＧは、２’－ＯＨを含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各ヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは２’－ＯＨを含み、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を含み、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは２’－ａｄｅｍを含み、ＧＡＡＡ中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。
本明細書に組み込まれ、かつ本明細書の一部を構成する添付の図面は、特定の実施形態を例示するものであり、発明の詳細な説明と共に、本明細書に開示される組成物及び方法の特定の態様の非限定的な例を提供する役割を果たすものである。
ＣＤ－１マウス（２５ｇの雌）に目的のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの脳室内（ＩＣＶ）投与を行うための脳の各領域を示す。 右側脳室へのＦａｓｔＧｒｅｅｎ色素の直接注入後の脳室系全体にわたった色素の分布を示す。１０μＬのＦａｓｔＧｒｅｅｎ色素（滅菌ＰＢＳ中、２．５％）を、３３ＧのＮｅｕｒｏｓシリンジにより雌ＣＤ－１マウスの右側脳室に１μＬ／ｓで投与した。 各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの脳注射部位におけるＡＬＤＨ２発現を低下させる各オリゴヌクレオチドの活性を示す。各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドは、脳室内投与（１００μｇ用量、４ｍｇ ／ ｋｇに相当）により投与した。 各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの肝臓におけるＡＬＤＨ２発現を低下させる各オリゴヌクレオチドの活性を示す。各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドは、脳室内投与（１００μｇ用量、４ｍｇ ／ ｋｇに相当）により投与した。 各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの海馬におけるＡＬＤＨ２発現を低下させる各オリゴヌクレオチドの活性を示す。各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドは、脳室内投与（１００μｇ用量、４ｍｇ ／ ｋｇに相当）により投与した。 各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの体性感覚野におけるＡＬＤＨ２発現を低下させる各オリゴヌクレオチドの活性を示す。各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドは、脳室内投与（１００μｇ用量、４ｍｇ ／ ｋｇに相当）により投与した。 各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの線条体におけるＡＬＤＨ２発現を低下させる各オリゴヌクレオチドの活性を示す。各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドは、脳室内投与（１００μｇ用量、４ｍｇ ／ ｋｇに相当）により投与した。 各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの小脳におけるＡＬＤＨ２発現を低下させる各オリゴヌクレオチドの活性を示す。各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドは、脳室内投与（１００μｇ用量、４ｍｇ ／ ｋｇに相当）により投与した。 ＩＣＶ投与によってマウスに投与した１回の１００μｇ単回用量の各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドは、異なるＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（結合体または非結合体として）の髄腔内投与による評価基準の９００μｇ用量（ラットにおける）と比較して、ＡＬＤＨ２発現を減少させるうえで同様の活性を示したことを示す。 ＩＣＶ投与後の異なる脳領域におけるＡＬＤＨ２発現の低下における各ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの効力を示す。残存するＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡレベルを、５日後（１００μｇ用量の場合）または７日後（２５０μｇまたは５００μｇ用量の場合）に異なる脳領域で評価した。 様々な脳領域においてＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡ発現を低下させるＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの活性の用量反応（２５０μｇまたは５００μｇ）及び時間的経過（投与後２８日）を示す。データは、ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの単回ＩＣＶ注射後の脳全体にわたった持続的なサイレンシングを示す。 脊髄全体にわたったＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡ発現を低下させるＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの活性の用量反応（２５０μｇまたは５００μｇ）及び時間的経過（投与２８日後）を示す。データは、ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの単回ＩＣＶ注射後の脳全体にわたった持続的なサイレンシングを示す。 肝臓におけるＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡ発現を低下させるＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの活性の用量反応（１００μｇ、２５０μｇ、または５００μｇ）及び時間的経過（１００μｇでは投与７日後、２５０μｇまたは５００μｇでは投与２８日後）を示す。データは、ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの単回投与後の肝臓における持続的なサイレンシングを示す。 単回ボーラスＩＣＶ注射（２５０μｇまたは５００μｇ）後の別個の脳領域全体にわたったＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの２ヶ月間（５６日間）にわたる有効性を示す。 単回ボーラスＩＣＶ注射（２５０μｇまたは５００μｇ）後の脊髄全体にわたったＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの２ヶ月間（５６日間）にわたる有効性を示す。 ２５０μｇまたは５００μｇのＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの投与後にグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現上昇が観察されないことを示す神経毒性実験の結果を示す。ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドは、神経膠症（ＣＮＳ損傷に応じたグリア細胞の応答性変化）を誘発しなかった。 ボーラスＩＣＶ注射後の肝臓におけるＡＬＤＨ２発現を低下させる図２３に示される各ＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体の活性を示す。 脳の異なる領域におけるＡＬＤＨ２発現を低下させる図２３に示される各ＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体の活性を示す。データは、ＧａｌＮＡｃ結合が脳全体にわたった有効性に必要ではないことを示している。 ボーラスＩＣＶ注射後の前頭皮質におけるＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体への曝露量及びＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡのサイレンシングを示す。前頭皮質のグリア指数（グリア細胞と神経細胞との比、「ＧＮＲ」とも呼ばれる）は、１．２５である。 ボーラスＩＣＶ注射後の線条体におけるＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体への曝露量及びＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡのサイレンシングを示す。線条体におけるグリア指数（グリア細胞と神経細胞との比、「ＧＮＲ」とも呼ばれる）は、異なっている。 ボーラスＩＣＶ注射後の体性感覚皮質におけるＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体への曝露量及びＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡのサイレンシングを示す。体性感覚皮質のグリア指数（グリア細胞と神経細胞との比、「ＧＮＲ」とも呼ばれる）は、１．２５である。 ボーラスＩＣＶ注射後の海馬におけるＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体への曝露量及びＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡのサイレンシングを示す。海馬のグリア指数（グリア細胞と神経細胞との比、「ＧＮＲ」とも呼ばれる）は、１．２５である。 ボーラスＩＣＶ注射後の視床下部におけるＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体への曝露量及びＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡのサイレンシングを示す。視床下部のグリア指数（グリア細胞と神経細胞との比、「ＧＮＲ」とも呼ばれる）は、１．２５である。 ボーラスＩＣＶ注射後の小脳におけるＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体への曝露量及びＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡのサイレンシングを示す。小脳のグリア指数（グリア細胞と神経細胞との比、「ＧＮＲ」とも呼ばれる）は、０．２５である。 異なる脳領域にわたった各ＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体への相対的曝露量の要約を示す。 ボーラスＩＣＶ注射後の脊髄にわたったＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体への曝露量及びＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡのサイレンシングを示す。脊髄のグリア指数（グリア細胞と神経細胞との比、「ＧＮＲ」とも呼ばれる）は、約５である。 ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドのテトラループに用いられる異なるリンカーの構造を示す。 ＣＮＳで使用するためのオリゴヌクレオチド誘導体の例示的な構造を示す。図に示されるオリゴヌクレオチドは、ＡＬＤＨ２を標的とする。
いくつかの態様において、本開示は、細胞、特にＣＮＳにおけるＡＬＤＨ２発現を低下させるのに有効であるＡＬＤＨ２のｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドを提供する。本発明の担体オリゴヌクレオチド構造及びＣＮＳへの挿入により、神経疾患の治療が可能となる。したがって、関連する態様において、本開示は、中枢神経系における遺伝子発現を選択的に減少させることによって神経疾患を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＡＬＤＨ２標的化オリゴヌクレオチド誘導体は、中枢神経系におけるＡＬＤＨ２発現を減少させるために脳脊髄液に送達されるように設計される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されることとして、異なるオリゴヌクレオチドサイズ、多量体化及び／または分子量変化が、オリゴヌクレオチドがＣＮＳを離れる能力に影響を与える。オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼが少ないＣＮＳで選択的に機能する。オリゴヌクレオチドは最終的にＣＮＳからリンパ系に入ることができるが、ヌクレアーゼが豊富な環境に入ると分解されるため、ＣＮＳ外でのオフターゲット効果が防止される。これにより、ＣＮＳ内での活性を可能にし、他の組織でのオフターゲット効果を防ぐ「キルスイッチ」の効果的な操作が可能となる。
定義された用語の説明を含む、本開示のさらなる態様を以下に示す。
Ｉ．定義
ＡＬＤＨ２：本明細書で使用される場合、「ＡＬＤＨ２」という用語は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ２ファミリー（ミトコンドリア性）遺伝子を指す。ＡＬＤＨ２は、アルデヒドデヒドロゲナーゼファミリーのタンパク質に属するタンパク質をコードし、エタノールから酢酸エステル（酢酸）を合成するアルコール代謝の酸化的経路の２番目の酵素として機能する。ＡＬＤＨ２のホモログは、ヒト、マウス、ラット、非ヒト霊長類種、及びその他を含む広範な種で保存されている（例えば、ＮＣＢＩ ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：５５４８０を参照）。ＡＬＤＨ２は、例えば、ＡＬＤＨ１Ａ１を含む、他のアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子とも相同性を有する。ヒトでは、ＡＬＤＨ２は、それぞれが異なるアイソフォームＮＰ＿０００６８１．２（アイソフォーム１）及びＮＰ＿００１１９１８１８．１（アイソフォーム２）をコードする、少なくとも２つの転写産物、すなわちＮＭ＿０００６９０．３（変異体１）及びＮＭ＿００１２０４８８９．１（変異体２）をコードしている。転写変異体２は、転写変異体１と比較して５’コード領域のインフレームエクソンを欠いており、アイソフォーム１と比較して短いアイソフォーム（２）をコードしている。ＡＬＤＨ２の多型が同定されている（例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“ＡＬＤＨ２ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ａｌｃｏｈｏｌ－ｒｅｌａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒｓ ｉｎ Ａｓｉａｎｓ：ａ ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，”Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ．，２０１７，２４（１）：１９．Ｒｅｖｉｅｗを参照）。
およそ：本明細書で使用される場合、対象とする１つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、記載される基準値と同様の値を指す。特定の実施形態において、用語「およそ」または「約」とは、別途記載のない限り、または別途内容から明らかでない限り（かかる数値が可能な値の１００％を上回る場合を除く）、記載される基準値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下に含まれる値の範囲を指す。
投与する：本明細書で使用される場合、「投与する」または「投与」という用語は、薬理学的に有用な形で（例えば、対象の状態を治療するために）対象に物質（例えば、オリゴヌクレオチド）を与えることを意味する。いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドは、脳室内、脳腔内、くも膜下腔内、または間質注射もしくは注入によって、例えば、被験者の脳脊髄液に投与される。これは、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患の場合に特に当てはまる。化合物はまた、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８（６８９３）：３８－９（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、またはＸｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，２０（１０）：１００６－１０（ｖｉｒａｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）に記載される方法を含むがこれに限定されない、当該技術分野では周知の方法を用いたトランスフェクションまたは感染によって投与することもできる。
脳脊髄液：本明細書で使用される場合、「脳脊髄液」という用語は、脳及び脊髄を取り巻く液体を指す。脳脊髄液は一般的にくも膜と脳軟膜との間の空間を占める。さらに、脳脊髄液とは、一般的に、脳室の脈絡叢にある上衣細胞によって生成され、くも膜顆粒に吸収されると理解されている。
相補的：本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、ヌクレオチド同士が互いに塩基対を形成することを可能にするヌクレオチド（例えば、２本の対向する核酸上または一本の核酸鎖の対向する領域上の２個のヌクレオチド）間の構造的関係を指す。例えば、対向する核酸のピリミジンヌクレオチドに相補的である１本の核酸のプリンヌクレオチドは、互いに水素結合を形成することにより共に塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態では、相補的なポリヌクレオチド鎖は、ワトソン・クリック型、または、安定した二重鎖の形成を可能にする他の任意の形で塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態では、２本の核酸は、本明細書に記載されるように、互いに相補的であることで相補性領域を形成するヌクレオチド配列を有することができる。
デオキシリボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドと比較して、そのペントース糖の２’位に水素を有するヌクレオチドを指す。改変デオキシリボヌクレオチドとは、糖、リン酸基または塩基の修飾または置換を含む、２’位以外の原子の１つ以上の修飾または置換を有するデオキシリボヌクレオチドである。
二本鎖オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「二本鎖オリゴヌクレオチド」という用語は、実質的に二本鎖形態であるオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（複数可）の相補的塩基対合は、共有結合的に別個の核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（複数可）の相補的塩基対合は、共有結合によって連結された核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（複数可）の相補的塩基対合は、（例えば、ヘアピンを介して）折り畳まれることで、互いに塩基対合するヌクレオチドの相補的な逆平行配列を与える一本の核酸鎖から形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに完全に二重鎖を形成する２本の共有結合的に別個の核酸鎖を含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に二重鎖を形成する、例えば一方または両方の端部にオーバーハングを有する、２本の共有結合的に別個の核酸鎖を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に相補的であることで、内部ミスマッチまたは末端ミスマッチを含み得る１つ以上のミスマッチを有し得るヌクレオチドの逆平行配列を含む。
二重鎖：本明細書で使用される場合、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関して「二重鎖」という用語は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的な塩基対合により形成される構造を指す。
賦形剤：本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、例えば、所望の稠度または安定化効果を与えるかまたはこれらに寄与するために組成物中に含めることができる非治療的物質を指す。
ループ：本明細書で使用される場合、「ループ」という用語は、互いに十分に相補的な核酸の２つの逆平行領域によって挟まれている核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の不対合領域であって、適切なハイブリダイゼーション条件下（例えば、リン酸緩衝溶液中、細胞内）で、不対合領域を挟んだ２つの逆平行領域がハイブリダイズして二重鎖（「ステム」と呼ばれる）を形成する、核酸の不対合領域を指す。
修飾ヌクレオチド間結合：本明細書で使用される場合、「修飾されたヌクレオチド間結合」という用語は、ホスホジエステル結合を含む参照ヌクレオチド間結合と比較して１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、天然に存在しない結合である。一般的に、修飾ヌクレオチド間結合は、修飾ヌクレオチド間結合が存在する核酸に１つ以上の望ましい特性を与える。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、可溶性、バイオアベイラビリティ、生物活性、免疫原性の低下などを改善することができる。
修飾ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」という用語は、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド及びチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する参照ヌクレオチドと比較して１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、及び／またはリン酸基に１つ以上の化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドに結合された１つ以上の化学部分を有する。一般的に、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に１つ以上の望ましい特性を与える。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、可溶性、バイオアベイラビリティ、生物活性、免疫原性の低下などを改善することができる。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース環の２’位に２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｆ置換を有する。
ニックを有するテトラループ構造： 「ニックを有するテトラループ構造」は、別々のセンス（パッセンジャー）鎖とアンチセンス（ガイド）鎖の存在を特徴とするＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造であって、センス鎖はアンチセンス鎖との相補性領域を有することにより２つの鎖が二重鎖を形成し、鎖の少なくとも一方、一般的にセンス鎖が二重鎖から伸長し、伸長部分がテトラループとテトラループに隣接するステム領域を形成する２つの自己相補的配列とを含み、テトラループが、少なくとも一方の鎖の自己相補的配列によって形成された隣接するステム領域を安定化するように構成されているような、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造である。
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、オリゴヌクレオチド１００個未満の長さの短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び／または、例えば、修飾リボヌクレオチドを含む修飾ヌクレオチドを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってよい。オリゴヌクレオチドは、二重領域を有しても有さなくともよい。１組の非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、これらに限定されるものではないが、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短ｓｉＲＮＡ、または一本鎖ｓｉＲＮＡであってよい。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
オーバーハング：本明細書で使用される場合、「オーバーハング」という用語は、１つの鎖または領域が、その１つの鎖または領域が二重鎖を形成する相補鎖の末端を超えて延びていることから生じる末端の塩基対合していないヌクレオチド（複数可）を指す。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、二本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端の二本鎖領域から延びる１つ以上の対合していないヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、オーバーハングは、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはセンス鎖上の３’または５’オーバーハングである。
リン酸アナログ：本明細書で使用される場合、「リン酸アナログ」という用語は、リン酸基の静電特性及び／または立体特性を模倣する化学部分を指す。いくつかの実施形態では、リン酸アナログは、しばしば酵素的除去を受けやすい５’－リン酸の代わりにオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに配置される。いくつかの実施形態では、５’リン酸アナログはホスファターゼ耐性結合を含む。適当なリン酸アナログとしては、５’－メチレンホスホネート（５’－ＭＰ）、５’－（Ｅ）－ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）などの５’－ホスホネートが挙げられる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドの糖の４’位の炭素にリン酸アナログ（「４’－リン酸アナログ」と呼ばれる）を有する。４’－リン酸アナログの例として、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’炭素）に結合したオキシメチルホスホネートまたはそのアナログがある。例えば、２０１７年９月１日出願の国際公開第ＷＯ２０１８０４５３１７号、２０１６年９月２日出願の米国特許仮出願第６２／３８３，２０７号、及び２０１６年９月１２日出願の同第６２／３９３，４０１号を参照されたい。リン酸アナログに関するこれらのそれぞれの内容を本明細書に参照によって援用する。オリゴヌクレオチドの５’末端の他の修飾も開発されている（例えば、ＷＯ２０１１／１３３８７１、米国特許第８，９２７，５１３号、及びＰｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１５，４３（６）：２９９３－３０１１を参照されたい。リン酸アナログに関するこれらのそれぞれの内容を本明細書に参照によって援用する）。
発現の低下：本明細書で使用される場合、ある遺伝子の「発現の低下」という用語は、適切な参照細胞または対象と比較した、その遺伝子によってコードされるＲＮＡ転写産物またはタンパク質の量の減少、及び／または細胞または対象におけるその遺伝子の活性量の減少を指す。例えば、細胞を二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡ配列と相補的なアンチセンス鎖を有するもの）で処理する行為は、二本鎖オリゴヌクレオチドで処理されていない細胞と比較して、ＲＮＡ転写産物、タンパク質、及び／または酵素活性（例えば、ＡＬＤＨ２遺伝子によってコードされる）の量の減少をもたらし得る。同様に、本明細書で使用される「発現の低下」は、遺伝子（例えば、ＡＬＤＨ２）の発現の低下をもたらす行為を指す。
相補性領域：本明細書で使用される場合、「相補性領域」という用語は、ヌクレオチドの逆平行配列（例えば、ｍＲＮＡ内の標的ヌクレオチド配列）と十分に相補的であることにより、例えば、リン酸緩衝液中、細胞内などの適当なハイブリダイゼーション条件下で２つのヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションを可能にするような、核酸のヌクレオチド配列（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド）を指す。相補性領域は、ヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡまたはその部分内に存在する標的ヌクレオチド配列）と完全に相補的であってもよい。例えば、あるｍＲＮＡ内に存在するヌクレオチド配列に完全に相補的である相補性領域は、ミスマッチまたはギャップを含まない、そのｍＲＮＡ内の対応する配列に相補的である連続したヌクレオチドの配列を有する。あるいは、相補性領域は、ヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡまたはその部分内に存在するヌクレオチド配列）と部分に相補的であってもよい。例えば、あるｍＲＮＡ内に存在するヌクレオチド配列と部分的に相補的である相補性領域は、そのｍＲＮＡ内の対応する配列に相補的であるが、相補性領域が適当なハイブリダイゼーション条件下でそのｍＲＮＡとハイブリダイズすることが可能な状態に維持されるという条件の下で、そのｍＲＮＡ内の対応する配列と比較して１つ以上のミスマッチまたはギャップ（例えば、１個、２個、３個、またはそれ以上のミスマッチまたはギャップ）を含む連続したヌクレオチドの配列を有する。
リボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」という用語は、そのペントース糖として、２’位にヒドロキシル基を有するリボースを有するヌクレオチドを指す。改変リボヌクレオチドとは、リボース、リン酸基または塩基の修飾または置換を含む、２’位以外の原子の１つ以上の修飾または置換を有するリボヌクレオチドである。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」という用語は、（ａ）センス鎖（パッセンジャー）とアンチセンス鎖（ガイド）を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖またはアンチセンス鎖の一部がアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼによって標的ｍＲＮＡの切断に使用される二本鎖オリゴヌクレオチド、または（ｂ）１本のアンチセンス鎖を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンス鎖（またはそのアンチセンス鎖の一部）が、Ａｇｏ２エンドヌクレアーゼによって標的ｍＲＮＡの切断に使用される一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを指す。
鎖：本明細書で使用される場合、「鎖」という用語は、ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合）を介して互いに連結されたヌクレオチドの一本の連続した配列を指す。いくつかの実施形態では、鎖は、２つの自由端、例えば、５’末端と３’末端を有する。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。一実施形態では、対象は、ヒトである。「個人」または「患者」という用語は、「対象」と互換的に用いられる場合がある。
合成：本明細書で使用される場合、「合成」という用語は、人工的に合成された（例えば、機械（例えば、固体核酸合成装置）を使用して）、またはその分子を通常生成する天然のソース（例えば、細胞または生物）に由来していない核酸または他の分子を指す。
標的化リガンド：本明細書で使用される場合、「標的化リガンド」という用語は、目的の組織または細胞の同族分子（例えば、受容体）に選択的に結合する分子（例えば、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチドまたは脂質）、または、他の物質を目的の組織または細胞に標的化する目的で他の物質と結合させることが可能である分子を指す。例えば、いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、オリゴヌクレオチドを目的の特定の組織または細胞に標的化する目的でオリゴヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、細胞表面受容体に選択的に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、オリゴヌクレオチドに結合された場合、細胞の表面上に発現された受容体への選択的結合と、オリゴヌクレオチド、標的化リガンド及び受容体を含む複合体の細胞によるエンドソーム内在化を介して、特定の細胞内へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する。いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、細胞への内在化後、またはその間に切断されるリンカー を介してオリゴヌクレオチドに結合されることにより、オリゴヌクレオチドが細胞内で標的化リガンドから放出される。
テトラループ：本明細書で使用される場合、「テトラループ」という用語は、ヌクレオチドの隣接配列同士のハイブリダイゼーションによって形成される隣接した二重鎖の安定性を高めるループを指す。安定性の増加は、ランダムに選択されたヌクレオチド配列からなる同等の長さのループのセットからの平均として予想される隣接したステム二重鎖のＴmよりも高い、隣接したステム二重鎖の融解温度（Ｔm）の上昇として検出可能である。例えば、テトラループは、少なくとも２塩基対の長さの二重鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭのＮａＨＰＯ4中で、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、または少なくとも７５℃の融解温度をもたらし得る。いくつかの実施形態では、テトラループは、スタッキング相互作用によって、隣接したステム二重鎖の塩基対を安定化させることができる。さらに、テトラループ内のヌクレオチド間の相互作用としては、これらに限定されるものではないが、非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用を含む（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９０；３４６（６２８５）：６８０－２、Ｈｅｕｓ ａｎｄ Ｐａｒｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５３（５０１６）：１９１－４）。いくつかの実施形態では、テトラループは、ヌクレオチド３個～６個を含むか、またはそれからなり、典型的にはヌクレオチド４～５個である。特定の実施形態において、テトラループは、３個、４個、５個、または６個のヌクレオチドを含むか、またはそれからなり、これらは、修飾されてもされなくてもよい（例えば、標的化部分と結合されてもされなくてもよい）。特定の実施形態では、テトラループは、ヌクレオチド４個からなる。テトラループでは任意のヌクレオチドを使用することができ、Ｃｏｒｎｉｓｈ－Ｂｏｗｄｅｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８５，１３：３０２１－３０３０に記載されるようにそのようなヌクレオチドの標準的なＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ記号を使用することができる。例えば、文字「Ｎ」は、任意の塩基がその位置にあり得ることを意味するために使用することができ、文字「Ｒ」は、Ａ（アデニン）またはＧ（グアニン）がその位置にあり得ることを示すために使用することができ、「Ｂ」は、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、またはＴ（チミン）がその位置にあり得ることを示すために使用できる。テトラループの例としては、ＵＮＣＧファミリーのテトラループ（例、ＵＵＣＧ）、ＧＮＲＡファミリーのテトラループ（例、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられる（Ｗｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，１９９０，８７（２１）：８４６７－７１；Ａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９１，１９（２１）：５９０１－５）。ＤＮＡテトラループの例としては、テトラループのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、テトラループのｄ（ＧＮＲＡ）ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、及びテトラループのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。例えば、それらの関連する開示について本明細書に参照により援用する、Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（４８）：１４２８１－２９２；Ｓｈｉｎｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｐｐｏｎ Ｋａｇａｋｋａｉ Ｋｏｅｎ Ｙｏｋｏｓｈｕ，２０００，７８（２）：７３１を参照されたい。いくつかの実施形態では、テトラループは、ニックを有するテトラループ構造内に含まれる。
治療：本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、既存の状態（例えば、疾患、障害）に関して対象の健康及び／または健康状態を改善する目的で、または状態が発生する可能性を防止または低下させるために、例えば対象に治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド）を投与することによって、治療を要する対象にケアを提供する行為を指す。いくつかの実施形態では、治療は、対象が有する状態（例えば、疾患、障害）の少なくとも１つの徴候、症状、または寄与因子の頻度または重症度を低減することを含む。
ＩＩ．オリゴヌクレオチドベースの阻害剤
ｉ．ＡＬＤＨ２を標的とするオリゴヌクレオチド
本明細書では、複数の異なる種（ヒト、カニクイザル、及びマウス）のｍＲＮＡを含むＡＬＤＨ２のｍＲＮＡを調べることにより、インビトロ及びインビボでの試験で特定された、ＣＮＳ内での強力なオリゴヌクレオチドが提供される。本明細書に記載されるように、かかるオリゴヌクレオチドを使用して、遺伝子活性（例えば、中枢神経系における）、この場合、ＡＬＤＨ２の活性を低下させることにより、神経疾患（例えば、神経変性疾患、認知障害、または不安障害）を有する対象において治療効果を得ることができる。本発明の方法及びオリゴヌクレオチドの標的とすることができる他の遺伝子としては、脊髄小脳失調症１型（アタキシン－１、及び／またはアタキシン－３）、β－アミロイド前駆体タンパク質遺伝子（ＡＰＰまたはＢＡＣＥ１）またはその変異体、ジストニア（ＤＹＴ１）、筋萎縮性側索硬化症「ＡＬＳ」またはルーゲーリック病（ＳＯＤ１）を引き起こす遺伝子として特定されているもの、及び中枢神経系の腫瘍につながる様々な遺伝子が挙げられる。例えば、本明細書では、付録Ａに示される表にも示されるような（例えば、配列番号５８５に記載される配列を含むセンス鎖と配列番号５９５に記載される配列を含むアンチセンス鎖）、配列番号５８１～５９０、６０８、及び６０９のいずれか１つに記載される配列を含む、またはそれからなるセンス鎖と、配列番号５９１～６００から選択される相補的配列を含む、またはそれからなるアンチセンス鎖とを有する強力なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが提供される。
これらの配列は、複数の異なるオリゴヌクレオチド構造（すなわち、フォーマット）に分類することができる。例えば、いくつかの実施形態では、配列は、長さがどちらもヌクレオチド１７～３６個の範囲であるセンス鎖とアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’伸長部分内にテトラループ構造を有し、アンチセンス鎖の３’末端に２個の末端オーバーハングヌクレオチドを有する、そのような配列を組み込んだオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、２個の末端オーバーハングヌクレオチドはＧＧである。典型的には、アンチセンス鎖の２個の末端ＧＧヌクレオチドの一方または両方は、標的と相補的ではない。
いくつかの実施形態では、長さがどちらもヌクレオチド２１～２３個の範囲であるセンス鎖とアンチセンス鎖を有するそのような配列を組み込んだオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、長さがヌクレオチド１個または２個である３’末端のオーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に付与することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド２３個のガイド鎖とヌクレオチド２１個のパッセンジャー鎖を有し、パッセンジャー鎖の３’末端とガイド鎖の５’末端とは平滑末端を形成し、ガイド鎖は、ヌクレオチド２個の３’末端のオーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、３’末端オーバーハングは、ヌクレオチド９個の長さを有するアンチセンス鎖上に与えられる。例えば、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド２２個のガイド鎖とヌクレオチド２９個のパッセンジャー鎖を有することができ、パッセンジャー鎖は、３’末端にテトラループ構造を形成し、ガイド鎖は、ヌクレオチド９個の３’末端オーバーハング（本明細書で「Ｎ－９」と呼ぶ）を有する。
いくつかの実施形態では、ＡＬＤＨ２のｍＲＮＡの特定の領域は、オリゴヌクレオチドを用いた阻害に対して他の領域よりも感受性が高いため、標的化のホットスポットであることが見出されている。いくつかの実施形態では、ＡＬＤＨ２のホットスポット領域は、配列番号６０１～６０７のいずれか１つに記載される配列を含むか、またはそれからなる。ＡＬＤＨ２のｍＲＮＡのこれらの領域は、ＡＬＤＨ２のｍＲＮＡ発現を阻害する目的で、本明細書で述べられるオリゴヌクレオチドを使用して標的化することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、細胞内のｍＲＮＡを標的とし、その発現を阻害する目的で、ＡＬＤＨ２のｍＲＮＡに対して相補的な領域（例えば、ＡＬＤＨ２のｍＲＮＡのホットスポット内の）を有するように設計される。相補性領域は一般に、ＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡの発現を阻害する目的でオリゴヌクレオチド（またはその鎖）のＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡへのアニーリングを可能とするうえで適当な長さ及び塩基含有量のものである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子内の目的の配列に少なくとも部分的に相補的である相補性領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上に）を含む。本発明によれば、かかる配列は、ＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡのホットスポット領域内にマッピングされる配列を含む、配列番号１～１４及び配列番号１７～２９０に記載されるものである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、配列１～１４及び配列番号１７～２９０と完全に相補的である相補性領域を（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上に）含む。いくつかの実施形態では、配列番号１～１４及び１７～２９０に示される配列の連続ヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドの相補性領域は、アンチセンス鎖の全長にわたる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１４及び配列番号１７～２９０のいずれか１つに記載される配列の連続ヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドの相補性領域は、アンチセンス鎖の全長の一部にわたる（例えば、アンチセンス鎖の３’末端の２個のヌクレオチドを除くすべて）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、配列５８１～５９０に記載される配列のヌクレオチド１～１９にわたるヌクレオチドの連続ストレッチと少なくとも部分的に（例えば、完全に）相補的である相補性領域を（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上に）含む。
いくつかの実施形態では、相補性領域の長さは、少なくともヌクレオチド１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド１２～３０個（例えば、１２～３０個、１２～２２個、１５～２５個、１７～２１個、１８～２７個、１９～２７個、または１５～３０個）の範囲の長さを有するＡＬＤＨ２との相補性領域を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個の長さを有する、ＡＬＤＨ２との相補性領域を有する。
いくつかの実施形態では、ＡＬＤＨ２との相補性領域は、ＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡの対応する配列と比較して１つ以上のミスマッチを有し得る。オリゴヌクレオチド上の相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する能力を維持するという条件の下、最大１個、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個といったミスマッチを有してもよい。あるいは、オリゴヌクレオチド上の相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する能力を維持するという条件の下、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下といったミスマッチを有してもよい。いくつかの実施形態では、相補性領域内に複数のミスマッチがある場合、オリゴヌクレオチドが適切なハイブリダイゼーション条件下でＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する能力を維持するという条件の下、ミスマッチは連続して配置されるか（例えば、２個、３個、４個、またはそれ以上が連続して）、または相補性の領域全体にわたって散在してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される二本鎖オリゴヌクレオチドは、付録Ａに示される表に示されるような（例えば、配列番号１に記載される配列を含むセンス鎖と、配列番号２９１に記載される配列を含むアンチセンス鎖）、配列番号１～１４及び配列番号１７～２９０のいずれか１つに記載される配列を有するセンス鎖と、配列番号２９１～３０４及び配列番号３０７～５８０から選択される相補的配列を含むアンチセンス鎖とを含むか、またはこれらからなる。
ｉｉ．オリゴヌクレオチド構造
ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡなどを含む、本開示の方法においてＡＬＤＨ２を標的化するのに有用なオリゴヌクレオチドの様々な構造が存在する。本明細書または他の場所に記載の構造のいずれかを、本明細書に記載される配列（例えば、配列番号６０１～６０７に示されるものなどのＡＬＤＨ２のホットポット配列）を組み込む、または標的化するためのフレームワークとして使用することができる。ＡＬＤＨ２発現を標的化する（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）ための二本鎖オリゴヌクレオチドは、一般に、互いに二本鎖を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖を有する。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖とは共有結合していない。しかしながら、いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖とは共有結合している。
いくつかの実施形態では、ＡＬＤＨ２発現の発現を低減するための二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関与する。例えば、各鎖がヌクレオチド１９～２５個のサイズを有し、少なくとも１つのヌクレオチド１～５個の３’末端オーバーハングを有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが開発されている（例えば、米国特許第８，３７２，９６８を参照）。ダイサーによってプロセシングされて活性ＲＮＡｉ産物を生ずるより長いオリゴヌクレオチドも開発されている（例えば、米国特許第８，８８３，９９６を参照）。さらなる研究により、一方の鎖が熱力学的に安定したテトラループ構造を有する構造を含む、少なくとも一方の鎖の少なくとも一方の端部が二重鎖の標的化領域を越えて伸長されている伸長二本鎖オリゴヌクレオチドが作製されている（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号及び米国特許第８，９２７，７０５号、並びにＷＯ２０１０／０３３２２５を参照。これらのオリゴヌクレオチドの開示内容を本明細書に参照により援用する）。かかる構造は、一本鎖伸長部（分子の片側または両側の）及び二本鎖伸長部を含むことができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド２１～２３個の範囲の長さを有することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の３’末端にオーバーハング（例えば、ヌクレオチド１、２、または３個の長さ）を有することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、標的ＲＮＡに対してアンチセンスであるヌクレオチド２１個のガイド鎖と、相補的なパッセンジャー鎖とを含むことができ、両方の鎖はアニールして１９ｂｐの二重鎖と一方または両方の３’末端にヌクレオチド２個のオーバーハングを形成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、標的ＲＮＡに対してアンチセンスであるヌクレオチド２２個のガイド鎖と、相補的なパッセンジャー鎖とを含むことができ、両方の鎖がアニールして１３ｂｐの二重鎖と一方または両方の３’末端にヌクレオチド９個のオーバーハングを形成する。例えば、それぞれの内容を関連する開示について本明細書に援用する米国特許第９，０１２，１３８号、同第９，０１２，６２１号、及び同第９，１９３，７５３号を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス／センス二重鎖を超えて伸長する領域を含むヌクレオチド３６個のセンス鎖を有し、伸長領域は、ステムが６塩基対の二重鎖であり、テトラループが４個のヌクレオチドを有するステム／テトラループ構造を有する。これらの実施形態の特定のものでは、テトラループのヌクレオチドのうちの３個または４個が、一価のＧａｌＮａｃリガンドにそれぞれ結合している。これらの実施形態の特定のものでは、テトラループのヌクレオチドのすべてが、一価のＧａｌＮａｃリガンドにそれぞれ結合している。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド２５個のセンス鎖と、ダイサー酵素が作用すると、成熟ＲＩＳＣに組み込まれるアンチセンス鎖を生じるヌクレオチド２７個のアンチセンス鎖とを含む。
組成物及び方法と共に使用するための他のオリゴヌクレオチド設計としては、１６マーｓｉＲＮＡ（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（ｅｄ．），Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６）、ｓｈＲＮＡ（例えば、１９ｂｐまたはそれよりも短いステムを有する；例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２０１０，６２９：１４１－１５８を参照）、平滑ｓｉＲＮＡ（例えば、長さ１９ｂｐのもの；例えば、Ｋｒａｙｎａｃｋ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，ＲＮＡ，２００６，１２：１６３－１７６を参照）、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｉＲＮＡ；例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，２６：１３７９－１３８２を参照）、非対称のより短い二重鎖ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２００９，１７（４）：７２５－３２を参照）、分岐型ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈｏｈｊｏｈ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００４，５５７（１－３）：１９３－１９８を参照）、一本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｅｌｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３０：１０６３）、亜鈴型環状ｓｉＲＮＡ（例えば、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，２００７，１２９：１５１０８－１５１０９）、及び低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ（ｓｉｓｉＲＮＡ；例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００７，３５（１７）：５８８６－５８９７を参照）が挙げられる。上記の参考文献のそれぞれを、文献中の関連する開示についてその全体を参照により援用する。ＡＬＤＨ２の発現を低減または阻害するためにいくつかの実施形態で使用することができるオリゴヌクレオチド構造のさらなる非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び短ｓｉＲＮＡがある（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２００２，２１（１７）：４６７１－４６７９；米国特許出願第２００９００９９１１５号も参照）。
ａ．アンチセンス鎖
いくつかの実施形態では、ＡＬＤＨ２を標的化するための本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２９１～３０４、３０７～５８０及び５９１～６００のいずれか１つに記載される配列を含むかまたはそれからなるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号２９１～３０４、３０７～５８０及び５９１～６００のいずれか１つに記載される配列の少なくとも１２個（例えば、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、または少なくとも２３個）の連続したヌクレオチドを含むかまたはそれからなるアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド最大４０個の長さ（例えば、ヌクレオチド最大４０個、最大３５個、最大３０個、最大２７個、最大２５個、最大２１個、最大１９個、最大１７個、または最大１２個の長さ）のアンチセンス鎖を有することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくともヌクレオチド１２個の長さ（例えば、少なくともヌクレオチド１２個、少なくとも１５個、少なくとも１９個、少なくとも２１個、少なくとも２５個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、または少なくとも３８個の長さ）のアンチセンス鎖を有することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド１２～４０個（例えば、１２～４０個、１２～３６個、１２～３２個、１２～２８個、１５～４０個、１５～３６個、１５～３２個、１５～２８個、１７～２１個、１７～２５個、１９～２７個、１９～３０個、２０～４０個、２２～４０個、２５～４０個、または３２～４０個）の範囲の長さのアンチセンス鎖を有することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド１９～２７個（例えば、１９～２７個、１９～２５個、１９～２３個、１９～２１個、２１～２７個、２１～２５個、２１～２３個、２３～２７個、２３～２５個、または２５～２７）の範囲の長さのアンチセンス鎖を有することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個の長さのアンチセンス鎖を有することができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ばれる場合がある。例えば、アンチセンス鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、アルゴノートタンパク質に結合できる場合、または１つ以上の同様の因子に組み込まれ、または結合して標的遺伝子を直接的にサイレンシングすることができる場合、アンチセンス鎖はガイド鎖と呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、ガイド鎖に相補的なセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ばれる場合がある。
ｂ．センス鎖
いくつかの実施形態では、ＡＬＤＨ２を標的化するための本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１～１４、１７～２９０、５８１～５９０、６０８、及び６０９のいずれか１つに記載されるセンス鎖配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号1～１４、17～２９０、５８１～５９０、６０８、及び６０９のいずれか１つに記載される配列の少なくとも１２個（例えば、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、または少なくとも２３個）の連続したヌクレオチドを含むかまたはそれからなるセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド最大４０個の長さ（例えば、ヌクレオチド最大４０個、最大３５個、最大３０個、最大２７個、最大２５個、最大２１個、最大１９個、最大１７個、または最大１２個の長さ）のセンス鎖（またはパッセンジャー鎖）を有することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくともヌクレオチド１２個の長さ（例えば、少なくともヌクレオチド１２個、少なくとも１５個、少なくとも１９個、少なくとも２１個、少なくとも２５個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、または少なくとも３８個の長さ）のセンス鎖を有することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド１２～４０個（例えば、１２～４０個、１２～３６個、１２～３２個、１２～２８個、１５～４０個、１５～３６個、１５～３２個、１５～２８個、１７～２１個、１７～２５個、１９～２７個、１９～３０個、２０～４０個、２２～４０個、２５～４０個、または３２～４０個）の範囲の長さのセンス鎖を有することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、または４０個の長さのセンス鎖を有することができる。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、３’末端にステムループ構造を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、５’末端にステムループ構造を含む。いくつかの実施形態では、ステムは、ヌクレオチド２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個の長さの二重鎖である。いくつかの実施形態では、ステムループは、分子を分解（例えば、酵素分解）からより効果的に保護し、標的細胞に送達するための標的化特性を促進する。例えば、いくつかの実施形態では、ループは、オリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害活性に大きく影響することなく修飾を行うことができるさらなるヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、本明細書では、センス鎖が、（例えば、その３’末端に）S1-L-S2として示されるステムループ（ただし、S1は、S2と相補的であり、Lは、S1とS2との間にヌクレオチド最大１０個の長さ（例えば、ヌクレオチド３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の長さ）のループを形成する）を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
いくつかの実施形態では、ステムループのループ（Ｌ）は、テトラループである（例えば、ニックを有するテトラループ構造内の）。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含むことができる。通常、テトラループは４～５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、ＧＡＡＡとして示される配列を含む。
ｃ．二重鎖の長さ
いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、ヌクレオチド少なくとも１２個（例えば、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、または少なくとも２１個）の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、ヌクレオチド１２～３０個（例えば、ヌクレオチド１２～３０個、１２～２７個、１２～２２個、１５～２５個、１８～３０個、１８～２２個、１８～２５個、１８～２７個、１８～３０個、１９～３０個または２１～３０個の長さ）の範囲の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、ヌクレオチド１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個の長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の全長にはわたらない。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの全長にわたる。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方の全長にわたる。
ｄ．オリゴヌクレオチド末端
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれか、またはセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に３’オーバーハングが存在する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドの一方の５’末端は、他方の５’末端と比較して熱力学的に不安定である。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端に平滑末端を、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有する非対称なオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖上の３’オーバーハングは、ヌクレオチド１～８個の長さ（例えば、ヌクレオチド１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個の長さ）である。
通常、ＲＮＡｉのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端にヌクレオチド２個のオーバーハングを有する。しかしながら、他のオーバーハングも可能である。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、ヌクレオチド１～６個の長さ、場合によりヌクレオチド１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、３～６個、３～５個、３～４個、４～６個、４～５個、５～６個、または１個、２個、３個、４個、５個、もしくは６個の長さを含む３’オーバーハングである。しかしながら、いくつかの実施形態では、オーバーハングは、ヌクレオチド１～６個の長さ、場合によりヌクレオチド１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個、３～６個、３～５個、３～４個、４～６個、４～５個、５～６個、または１個、２個、３個、４個、５個、または６個の長さを含む５’オーバーハングである。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖（本明細書では「Ｎ９」と呼ばれる）の３’末端にヌクレオチド９個のオーバーハングを有する。例示的なＮ９オリゴヌクレオチドは、配列番号６０８に記載される配列を有するセンス鎖と配列番号５９５に記載される配列を有するアンチセンス鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端の１つ以上（例えば、２個、３個、４個）の末端ヌクレオチドが修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の１個または２個の末端ヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後のヌクレオチドが修飾され、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルなどの２’修飾を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１個または２個の末端ヌクレオチドは、標的と相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１個または２個のヌクレオチドは、標的と相補的ではない。いくつかの実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端及び／または３’末端は、逆位キャップヌクレオチドを有する。
ｅ．ミスマッチ
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖との間の１つ以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個）のミスマッチを有する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に複数のミスマッチが存在する場合、それらは連続して配置されるか（例えば、２個、３個、またはそれ以上が連続して）、または相補性の領域全体にわたって散在してもよい。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端が１つ以上のミスマッチを含む。一実施形態では、２個のミスマッチがセンス鎖の３’末端に組み込まれる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端のセグメントの塩基のミスマッチまたは不安定化は、おそらくはダイサーによるプロセシングを促進することにより、ＲＮＡｉにおける合成二重鎖の効力を改善した。
ｉｉｉ．一本鎖オリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＬＤＨ２発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。そのような構造には、これに限定されるものではないが、一本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが含まれ得る。最近の取り組みにより、一本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの活性が実証されている（例えば、Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１６，２４（５）：９４６－９５５）。ただし、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’～３’方向に書いた場合に特定の核酸の標的セグメントの逆方向の相補体を含み、細胞内でその標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨによって媒介される切断を誘導するように、または（例えば、ミクスマーとして）細胞内の標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように適当な修飾が行われた（例えば、ギャップマーとして）一本鎖オリゴヌクレオチドである。本開示で使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの改変（例えば、長さ、核酸塩基の糖部分（ピリミジン、プリン）、及び核酸塩基の複素環部分の改変を含む）に関するその開示について参照によって本明細書に援用する米国特許第９，５６７，５８７号に示されるものを含む、当該技術分野では周知の任意の適切な方法で改変することができる。また、アンチセンス分子は、特定の標的遺伝子の発現を低下させるために数十年にわたって使用されてきた （例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇｓ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０１７，５７：８１－１０５を参照）。
ｉｖ．オリゴヌクレオチドの改変
オリゴヌクレオチドは、特異性、安定性、送達、バイオアベイラビリティ、ヌクレアーゼ分解に対する耐性、免疫原性、塩基対合特性、ＲＮＡ分布及び細胞取り込み、ならびに治療または研究用途に関連する他の特性を改善または制御するために様々な方法で改変することができる （例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００９，３７：２８６７－２８８１；Ｂｒａｍｓｅｎ ａｎｄ Ｋｊｅｍｓ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１２，３：１－２２）。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の適当な改変を含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ヌクレオチドは、その塩基（または核酸塩基）、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）、またはリン酸基に改変を有する。
オリゴヌクレオチドの改変の数及びそれらのヌクレオチド改変の位置は、オリゴヌクレオチドの特性に影響を与え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）または同様の担体に結合するかまたはその内部に封入することによりインビボで送達することができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドがＬＮＰまたは同様の担体によって保護されていない場合（例えば、「裸の送達」）、少なくとも一部のヌクレオチドが改変されることが有利となりうる。したがって、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのいずれかの特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドのすべてまたはほぼすべてのヌクレオチドが改変される。特定の実施形態では、ヌクレオチドの半数超が改変される。特定の実施形態では、ヌクレオチドの半数未満が改変される。通常、裸の送達では、すべての糖の２’位が修飾される。これらの修飾は、可逆的または不可逆的であってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、所望の特性（例えば、酵素分解からの保護、インビボ投与後に所望の細胞を標的化する能力、及び／又は熱力学的安定性）を生じるのに十分な数及び種類の改変ヌクレオチドを有する。
ａ．糖の修飾
いくつかの実施形態では、修飾糖（本明細書では糖アナログとも呼ばれる）は、例えば、１つ以上の修飾が糖の２’、３’、４’、及び／または５’位の炭素に生じるような、修飾デオキシリボースまたはリボース部分を含む。いくつかの実施形態では、修飾糖は、ロック核酸（「ＬＮＡ」）（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４：３６０７－３６３０を参照）、非ロック核酸（「ＵＮＡ」）（例えば、Ｓｎｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２０１３，２：ｅ１０３を参照）、及び架橋核酸（「ＢＮＡ」）（例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ ａｎｄ Ｏｂｉｋａ，Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００２，１６５３－１６５９を参照）を含んでもよい。Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｎｅａｄ ｅｔ ａｌ．、及びＩｍａｎｉｓｈｉ ａｎｄ Ｏｂｉｋａを、糖修飾に関連するそれらの開示について参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの糖における改変は、２’－修飾を含む。特定の実施形態において、２’－修飾は、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、または２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸であってよい。典型的には、修飾は、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－ａｄｅｍ、または２’－アミノジエトキシメタノールである。しかしながら、オリゴヌクレオチドに使用するために開発された広範な２’位修飾を、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドに用いることができる。例えば, Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００９，３７：２８６７－２８８１を参照されたい。いくつかの実施形態では、糖の修飾は糖環の修飾を含み、糖環の１つ以上の炭素の修飾を含み得る。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の２’－炭素と１’炭素または４’炭素との間の結合を含み得る。例えば、結合は、エチレンまたはメチレン架橋を含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ヌクレオチドは、２’炭素と３’炭素との結合を欠く非環式糖を有する。いくつかの実施形態では、改変ヌクレオチドは、例えば、糖の４’位にチオール基を有する。
いくつかの実施形態では、末端の３’末端基（例えば、３’－ヒドロキシル）は、リン酸基または他の基であり、例えば、リンカー、アダプターまたは標識を結合するために、または別の核酸へのオリゴヌクレオチドの直接的連結に利用することができる。
ｂ．５’末端リン酸
オリゴヌクレオチドの５’末端リン酸基は、アルゴノート２との相互作用を促進することができる。しかしながら、５’－リン酸基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼまたは他の酵素による分解を受けやすく、インビボでのバイオアベイラビリティを制限する可能性がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、こうした分解に耐性のある５’リン酸のアナログを有する。いくつかの実施形態では、リン酸アナログは、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートであってよい。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端は、天然の５’－リン酸基（「リン酸模倣体」）の静電的及び立体的特性を模倣する化学部分に結合される（例えば、Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１５，４３（６）：２９９３－３０１１を参照。リン酸アナログに関連するその内容を参照によって本明細書に援用する）。５’末端に結合することができる多くのリン酸模倣物が開発されている（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号を参照、リン酸アナログに関連するその内容を参照によって本明細書に援用する）。オリゴヌクレオチドの５’末端に対する他の修飾も開発されてきた（例えば、ＷＯ２０１１／１３３８７１を参照、リン酸アナログに関連するその内容を参照によって本明細書に援用する）。特定の実施形態において、ヒドロキシル基は、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖の４’位の炭素にリン酸アナログを有する（４’リン酸アナログと呼ぶ）。例えば、国際公開第ＷＯ２０１８０４５３１７号、２０１６年９月２日出願の発明の名称が「４’－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｎａｌｏｇｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」である米国特許仮出願第６２／３８３，２０７号、及び、２０１６年９月１２日出願の発明の名称が「４’－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｎａｌｏｇｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」である同６２／３９３，４０１号を参照。リン酸アナログに関するこれらのそれぞれの内容を参照により本明細書に援用する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドに４’－リン酸アナログを含む。いくつかの実施形態では、リン酸アナログは、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’炭素）に結合したオキシメチルホスホネート、またはそのアナログである。他の実施形態では、４’－リン酸アナログは、チオメチル基の硫黄原子またはアミノメチル基の窒素原子が糖部分の４’炭素に結合したチオメチルホスホネートまたはアミノメチルホスホネート、またはそのアナログである。特定の実施形態において、４’－リン酸アナログは、オキシメチルホスホネートである。いくつかの実施形態では、オキシメチルホスホネートは、式：－Ｏ－ＣＨ2－ＰＯ（ＯＨ）2または－Ｏ－ＣＨ2－ＰＯ（ＯＲ）2により示され、式中、Ｒは、Ｈ、ＣＨ3、アルキル基、ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、ＣＨ2ＯＣＯＣ（ＣＨ3）3、ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓｉ（ＣＨ3）3、または保護基から独立して選択される。いくつかの実施形態では、アルキル基は、ＣＨ2ＣＨ3である。より一般的には、Ｒは独立して、Ｈ、ＣＨ3、またはＣＨ2ＣＨ3から選択される。
ｃ．修飾ヌクレオシド間結合
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、リン酸の修飾または置換は、少なくとも１個（例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、又は少なくとも５個）の修飾ヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを生じ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１～１２個 （例えば、１～１２個、１～１０個、２～１０個、２～８個、４～６個、３～１０個、５～１０個、１～５個、１～３個または１～２個）の修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の修飾ヌクレオチド間結合を含む。
修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオアルキルホスホトリエステル結合、ホスホロアミダイト結合、ホスホネート結合、またはボラノホスファート結合を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、Ｎ９オリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオチド９個の３’オーバーハングのヌクレオシド間結合のそれぞれは、修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエート結合）である。
ｄ．塩基の修飾
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾核酸塩基を有する。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基（本明細書では塩基アナログとも呼ばれる）は、ヌクレオチド糖部分の１’位置に連結される。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素塩基である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含まない。例えば、米国特許出願公開第２００８０２７４４６２号を参照されたい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。しかしながら、特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含まない（無塩基）。
いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基は、二重鎖中に存在する場合に二重鎖の構造を大きく変えることなく、複数の種類の塩基と対合させて配置することができる修飾ヌクレオチドのヌクレオチド糖部分の１’位、またはヌクレオチド糖部分置換の同等の位置に配置された複素環部分である。いくつかの実施形態では、標的核酸と完全に相補的である参照一本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的な核酸と形成される二重鎖よりも低いＴmを有する標的核酸と二重鎖を形成する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基が塩基に置き換えられて１個のミスマッチを生じている参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を含む核酸と形成される二重鎖よりも高いＴmを有する標的核酸と二重鎖を形成する。
ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例としては、イノシン、１－β－Ｄ－リボフラノシル－５－ニトロインドール、及び／または１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－ニトロピロールが挙げられる（米国特許出願公開第２００７０２５４３６２号（Ｑｕａｙらに付与）；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９５，２３（２１）：４３６３－７０；Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９５，２３（１３）：２３６１－６；Ｌｏａｋｅｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４，２２（２０）：４０３９－４３）。上記各文献を塩基修飾に関するそれらの開示について参照により本明細書に援用する）。
ｅ．可逆的修飾
標的細胞に到達する前にオリゴヌクレオチドをインビボ環境から保護するための特定の修飾を行うことができるが、これらの修飾は、標的細胞の細胞質ゾルに到達するとオリゴヌクレオチドの効力または活性を低下させる場合がある。分子が細胞の外側で望ましい特性を保持するような可逆的修飾を行い、その後、細胞の細胞質ゾル環境に入るときにこれを除去することができる。可逆的修飾は、例えば、細胞内酵素の作用によって、または細胞内の化学的条件によって（例えば、細胞内グルタチオンによる還元によって）除去することができる。
いくつかの実施形態では、可逆的修飾ヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分を含む。一般的に、核酸分子は、ヌクレオチド間二リン酸結合によって生じる負電荷をマスクし、細胞取り込み及びヌクレアーゼ耐性を改善するために、環状ジスルフィド部分によって化学的に修飾される。Ｔｒａｖｅｒｓａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．に最初に譲渡された米国特許出願公開第２０１１／０２９４８６９号（「Ｔｒａｖｅｒｓａ」）；Ｓｏｌｓｔｉｃｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｌｔｄ．に付与された国際公開第ＷＯ２０１５／１８８１９７号（「Ｓｏｌｓｔｉｃｅ」）；Ｍｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３２：１２５６－１２６３；Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．に付与された国際公開第ＷＯ２０１４／０８８９２０号を参照されたい。これらの文献のそれぞれを、かかる修飾のそれらの開示について参照によって援用する。ヌクレオチド間二リン酸結合のこの可逆的修飾は、細胞質ゾルの還元的環境（例えば、グルタチオン）によって細胞内で切断されるように設計されている。初期の例には、中和ホスホトリエステル修飾があり、細胞内で切断可能であることが報告されている（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５：９４０－９５０）。
いくつかの実施形態では、かかる可逆的修飾は、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ及び他の過酷な環境条件（例えば、ｐＨ）に曝露されるインビボ投与（例えば、血液及び／または細胞のリソソーム／エンドソーム区画を通過する輸送）における保護を与える。細胞外空間と比較してグルタチオン濃度が高い細胞の細胞質ゾル中に放出されると、修飾は逆転され、その結果、オリゴヌクレオチドが切断される。可逆的なグルタチオン感受性部分を使用することで、不可逆的な化学修飾を使用する利用可能な方法と比較して、目的のオリゴヌクレオチドに立体的により大きな化学基を導入することが可能である。これは、これらのより大きな化学基は細胞質ゾル中で除去されるため、細胞の細胞質ゾル内でのオリゴヌクレオチドの生物学的活性を妨げないためである。その結果、これらのより大きな化学基を、ヌクレアーゼ耐性、親油性、電荷、熱安定性、特異性、及び免疫原性の低下など、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに様々な利点を与えるように操作することができる。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分の構造は、その放出の反応速度論を改変するように操作することができる。
いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、ヌクレオチドの糖に結合される。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、修飾ヌクレオチドの糖の２’炭素に結合される。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドである場合、糖の５’炭素に配置される。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドである場合、糖の３’炭素に配置される。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、スルホニル基を含む。例えば、国際公開第ＷＯ２０１８０３９３６４号、及び２０１６年８月２３日出願の発明の名称が「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」である米国特許仮出願第６２／３７８，６３５号を参照されたい。これらの内容をその関連する開示について参照により本明細書に援用する。
ｖ．標的化リガンド
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドを、突然変異体または毒性遺伝子発現の低下が臨床的な利益をもたらしうるＣＮＳの１つ以上の細胞または細胞タイプに標的化することが望ましいと考えられる。かかる戦略は、他の臓器または細胞型における望ましくない作用を防止するうえで役立つものと考えられ、またはオリゴヌクレオチドの阻害的側面によって利するところのない細胞、組織または臓器へのオリゴヌクレオチドの不要な損失を防止するものと考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞または器官の標的化を促進する（例えば、ＣＮＳへのオリゴヌクレオチドの送達を促進する）ように修飾することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的化リガンドに結合されたヌクレオチドを含む。
標的化リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質の一部（例えば、抗体または抗体フラグメント）、または脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、アプタマーである。例えば、標的化リガンドは、腫瘍血管系または神経膠腫細胞を標的化するために使用されるＲＧＤペプチド、腫瘍血管系または腫瘍間質を標的化するためのＣＲＥＫＡペプチド、ＣＮＳ血管系上で発現されるトランスフェリン受容体を標的化するためのトランスフェリン、ラクトフェリン、もしくはアプタマー、または神経膠腫細胞上のＥＧＦＲを標的化するための抗ＥＧＦＲ抗体であってよい。特定の実施形態では、標的化リガンドは、１つ以上のＧａｌＮＡｃ部分である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５または６個）のヌクレオチドが、それぞれ別個の標的化リガンドに結合される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの２～４個のヌクレオチドが、それぞれ別個の標的化リガンドに結合される。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、センスまたはアンチセンス鎖のいずれかの端部の２～４個のヌクレオチドに結合される（例えば、リガンドはセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’または３’末端のヌクレオチド２～４個のオーバーハングまたは伸長部分に結合される）ため、標的化リガンドが歯ブラシの毛の部分に似ており、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに似た格好となっている。例えば、その関連する内容を本明細書に参照により援用するところの国際公開第ＷＯ２０１６／１００４０１号に記載されるように、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’または３’末端のいずれかにステムループを含むことができ、ステムのループの１、２、３または４個のヌクレオチドを標的化リガンドに個々に結合させることができる。
いくつかの実施形態では、ＡＬＤＨ２の発現を低下させるオリゴヌクレオチドを対象のＣＮＳの細胞に標的化することが望ましい。ＧａｌＮＡｃは、主として肝細胞の類洞表面で発現される、末端ガラクトースまたはＮ－アセチルガラクトサミン残基（アシアロ糖タンパク質）を含む循環糖タンパク質の結合、内在化、及びその後の排出に主要な役割を有するアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）の高親和性リガンドである。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドにＧａｌＮＡｃ部分を結合（間接的または直接的に）させて、これらの肝細胞で発現されるＡＳＧＰＲにこれらのオリゴヌクレオチドを標的化することができる。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分をＣＮＳに直接送達されるオリゴヌクレオチドと共に使用することもできる。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、一価のＧａｌＮＡｃに直接的または間接的に結合される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、複数の一価ＧａｌＮＡｃに直接的または間接的に結合される（すなわち、２、３、または４個の一価ＧａｌＮＡｃ部分に結合され、一般的には３個または４個の一価ＧａｌＮＡｃ部分に結合される）。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の二価ＧａｌＮＡｃ、三価ＧａｌＮＡｃ、または四価ＧａｌＮＡｃ部分に結合される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５または６個）のヌクレオチドが、それぞれＧａｌＮＡｃ部分に結合される。いくつかの実施形態では、ステムループのループ（Ｌ）の２～４個のヌクレオチドが、それぞれ別個のＧａｌＮＡｃに結合される。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、センスまたはアンチセンス鎖のいずれかの端部の２～４個のヌクレオチドに結合される（例えば、リガンドはセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’または３’末端のヌクレオチド２～４個のオーバーハングまたは伸長部分に結合される）ため、ＧａｌＮＡｃ部分が歯ブラシの毛の部分に似ており、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに似た格好となっている。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’または３’末端のいずれかにステムループを含むことができ、ステムのループの１、２、３または４個のヌクレオチドをＧａｌＮＡｃ部分に個々に結合させることができる。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のヌクレオチドに結合される。例えば、４個のＧａｌＮＡｃ部分をセンス鎖のテトラループ内のヌクレオチドに結合させることができ、その場合、各ＧａｌＮＡｃ部分は１個のヌクレオチドに結合される。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、下記に示されるような［ａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－グアニジン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、グアニジンヌクレオチドに結合された一価のＧａｌＮＡｃを含む。
Figure 2022526419000006
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、下記に示されるような［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－アデニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、アデニンヌクレオチドに結合された一価のＧａｌＮＡｃを含む。
Figure 2022526419000007
そのような結合の例を、５’～３’方向にヌクレオチド配列ＧＡＡＡを含むループについて下記に示す（Ｌ ＝リンカー、Ｘ ＝ヘテロ原子）。ステム結合点が示されている。いくつかの実施形態では、このようなループは、例えば、付録Ａに示され、また図２３に示されるような、ヌクレオチド３６個の長さのセンス鎖オリゴヌクレオチドの２７～３０位に存在し得る。化学式中、
Figure 2022526419000008
が、オリゴヌクレオチド鎖への結合点を表すために用いられている。
Figure 2022526419000009
いくつかの実施形態では、Ｌは、結合、クリックケミストリーハンドル、または、置換及び非置換アルキレン、置換及び非置換アルケニレン、置換及び非置換アルキニレン、置換及び非置換ヘテロアルキレン、置換及び非置換ヘテロアルケニレン、置換及び非置換ヘテロアルキニレン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、連続した共有結合された原子１～２０個の長さのリンカーを表し、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮである。いくつかの実施形態では、Ｌはアセタールリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｘは、Ｏである。
適当な方法または化学的手法（例えば、クリックケミストリー）を用いて標的化リガンドをヌクレオチドに連結することができる。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、クリックリンカーを用いてヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、アセタールベースのリンカーを用いて標的化リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドに結合する。アセタールベースのリンカーが、例えば、国際公開第ＷＯ２０１６１００４０１号に開示されており、かかるリンカーに関連するその内容は、参照により本明細書に援用する。いくつかの実施形態では、リンカーは、不安定なリンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは安定している。「不安定なリンカー」とは、例えば酸性ｐＨによって切断され得るリンカーを指す。「安定したリンカー」とは、切断できないリンカーを指す。
ＧａｌＮＡｃ部分がアセタールリンカーを使用してループのヌクレオチドに結合されている、５’～３’方向にヌクレオチドＧＡＡＡを含むループの別の例を下記に示す。いくつかの実施形態では、このようなループは、例えば、付録Ａに示され、また図２３に示されるような、ヌクレオチド３６個の長さのセンス鎖オリゴヌクレオチドの２７～３０位に存在し得る。化学式中、
Figure 2022526419000010
は、オリゴヌクレオチド鎖への結合点である。
Figure 2022526419000011
いくつかの実施形態では、リンカーは、不安定なリンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは安定している。いくつかの実施形態では、二重鎖伸長部分（塩基対３、４、５、または６個以下の長さ）が、標的化リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）と二本鎖オリゴヌクレオチドとの間に配置される。
いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、図２３にコンジュゲートＡ及びコンジュゲートＢについて示されるように、配列ＧＡＡＡ中のＡのそれぞれに結合される。いくつかの実施形態では、各Ａに結合されたＧａｌＮＡｃ部分は、Ｇが修飾されていないかまたは糖部分に２’修飾を有する点を除いて、上記に示される構造を有する。いくつかの実施形態では、上記の構造に示されるように、ＧＡＡＡ配列中のＧは、２’修飾（例えば、２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－メトキシエチル）を含み、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは、ＧａｌＮＡｃ部分に結合される。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、結合されたＧａｌＮＡｃを有さない。本明細書では、ＧａｌＮＡｃの結合は神経細胞の取り込み及びオリゴヌクレオチド活性に必要ではないことが見出された。いくつかの実施形態では、非ＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドと比較して、高い活性を有する。
ｖｉ．オリゴヌクレオチド誘導体
本開示は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む広範なオリゴヌクレオチド誘導体であって、センス鎖が、ＧＡＡＡとして示されるＬ配列を含むテトラループを含み、センス鎖とアンチセンス鎖とが共有結合によって連結されていないオリゴヌクレオチド誘導体を提供する。異なる誘導体は、テトラループの異なるヌクレオチド修飾を有する。
いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各ＡはＧａｌＮＡｃ部分と結合され、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。この構造を含むオリゴヌクレオチドを、本明細書では「コンジュゲートＡ」と称する。
いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各ＡはＧａｌＮＡｃ部分と結合され、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－ＯＨを含む。この構造を含むオリゴヌクレオチドを、本明細書では「コンジュゲートＢ」と称する。
いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各ヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。この構造を含むオリゴヌクレオチドを、本明細書では「コンジュゲートＤ」と称する。コンジュゲートＤでは、ＧＡＡＡ配列中のどのヌクレオチドにもＧａｌＮＡｃが結合されていない。
いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは２’－ＯＨを含み、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。この構造を含むオリゴヌクレオチドを、本明細書では「コンジュゲートＥ」と称する。コンジュゲートＥでは、ＧＡＡＡ配列中のどのヌクレオチドにもＧａｌＮＡｃが結合されていない。
いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を含み (例えば、図２３を参照）、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。この構造を含むオリゴヌクレオチドを、本明細書では「コンジュゲートＦ」と称する。コンジュゲートＦでは、ＧＡＡＡ配列中のどのヌクレオチドにもＧａｌＮＡｃが結合されていない。
いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは２’－ａｄｅｍ修飾を含み、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。この構造を含むオリゴヌクレオチドを、本明細書では「コンジュゲートＦ」と称する。コンジュゲートＦでは、ＧＡＡＡ配列中のどのヌクレオチドにもＧａｌＮＡｃが結合されていない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド誘導体のいずれかにおいて、センス鎖は、配列番号５８１～５９０から選択される配列を含むことができ、アンチセンス鎖は、配列番号５９１～６００から選択される配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド誘導体は、共有結合によって連結されていないアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、アンチセンス鎖は配列番号５８５に記載される配列を含み、センス鎖は配列番号５９５に記載される配列を含み、センス鎖は、その３’末端にＳ１－Ｌ－Ｓ２として示されるステムループを含み、ただし、Ｓ１はＳ２と相補的であり、ＬはＧＡＡＡとして示される配列を含むテトラループであり、ＧＡＡＡ配列は、
（ｉ）ＧＡＡＡ配列中の各ＡがＧａｌＮＡｃ部分に結合され、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
（ｉｉ）ＧＡＡＡ配列中の各ＡがＧａｌＮＡｃ部分に結合され、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－ＯＨを含む、
（ｉｉｉ）ＧＡＡＡ配列中の各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
（ｉｖ）ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－ＯＨを含み、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
（ｖ）ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を含み、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、及び、
（ｖｉ）ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－ａｄｅｍ修飾を含み、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、からなる群から選択される構造を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド誘導体は、センス鎖にテトラループを含まない（例えば、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端とが平滑末端を形成し、センス鎖とアンチセンス鎖とは共有結合によって連結されていない）。この構造を含むオリゴヌクレオチドを、本明細書では「コンジュゲートＦ」と称する。例示的なコンジュゲートＦは、配列番号６０９に記載される配列を有するセンス鎖と、配列番号５９５に記載される配列を有するアンチセンス配列とを含んでよく、アンチセンス鎖とセンス鎖とは共有結合によって連結されていない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド誘導体は、２’－フルオロ及び２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート結合の異なる配置をさらに含み、及び／またはそれらのアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドに位置するリン酸アナログを含む。
ＩＩＩ．製剤
オリゴヌクレオチドの使用を促進するための様々な製剤が開発されている。例えば、オリゴヌクレオチドは、分解を最小限に抑え、送達及び／または取り込みを促進し、または製剤中のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を与える製剤を使用して対象または細胞環境に送達することができる。いくつかの実施形態では、本明細書では、ＡＬＤＨ２の発現を低下させるためのオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド）を含む組成物が提供される。かかる組成物は、標的細胞の隣接環境にまたは全身的に対象に投与された場合に、オリゴヌクレオチドの十分な部分が細胞に入ってＡＬＤＨ２発現を低下させるように適当に配合することができる。各種の適当なオリゴヌクレオチド製剤のいずれかを使用して、本明細書に開示されるＡＬＤＨ２を低減させるためのオリゴヌクレオチドを送達することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシド中に配合される。いくつかの実施形態では、裸のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートが、水または水溶液（例えば、ｐＨ調整された水）中に配合される。いくつかの実施形態では、裸のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートが、塩基性緩衝水溶液（例えば、ＰＢＳ）中に配合される。
カチオン性脂質を含むオリゴヌクレオチドの製剤を使用して、細胞内へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを促進することができる。例えば、リポフェクチン、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリカチオン性分子（例えば、ポリリシン）などのカチオン性脂質を使用することができる。適切な脂質としては、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、またはＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられ、これらはいずれも製造元の指示に従って使用することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、製剤は脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、賦形剤は、リポソーム、脂質、複合脂質、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、またはナノ粒子を含むか、または投与を要する対象の細胞、組織、臓器、若しくは身体に投与するための他の形で配合することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１３を参照）。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、賦形剤を含む薬学的に許容される担体と配合される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される製剤は、賦形剤または担体を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤または担体は、活性成分の改善された安定性、改善された吸収性、改善された溶解性及び／または治療増強効果を組成物に付与する。いくつかの実施形態では、賦形剤または担体は、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、または水酸化ナトリウム）、または溶媒（例えば、緩衝液、ペトロラタム、ジメチルスルホキシド、または鉱油）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、その貯蔵寿命を延ばすために凍結乾燥された後、使用（例えば、対象への投与）に先立って溶液とされる。したがって、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つを含む組成物中の賦形剤は、凍結乾燥保護剤（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、またはポリビニルピロリドン）、または崩壊温度調節剤（例えば、デキストラン、フィコール、またはゼラチン）とすることができる。
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように配合される。本開示のオリゴヌクレオチドは、対象の脳脊髄液に投与される。適当な投与経路としては、これらに限定されるものではないが、脳室内、腔内、髄腔内、または間質投与が挙げられる。
注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末が挙げられる。静脈内または皮下投与用では、適当な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ， Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒とすることができる。多くの場合、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、及び塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に加えることが好ましい。必要な量のオリゴヌクレオチドを選択された溶媒中に、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに加えた後、滅菌濾過を行うことによって滅菌注射液を調製することができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約０．１％以上の治療剤（例えば、ＡＬＤＨ２発現を低下させるためのオリゴヌクレオチド）を含み得るが、活性成分（複数可）の割合は、全組成物の重量または体積の約１％～約８０％とすることができる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の有効期間、及び他の薬理学的考慮事項などの要因は、かかる医薬製剤の調製の分野における当業者によって想到されるものであり、したがって、様々な投与量及び治療レジメンが望ましい場合がある。必要な量の活性化合物を適当な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに加えた後、滅菌濾過を行うことによって滅菌注射液を調製することができる。一般的に、分散液は、塩基性分散媒および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌溶媒に活性化合物を添加することによって調製される。滅菌注射液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及びフリーズドライであり、予め滅菌濾過したその溶液から有効成分と任意の更なる所望の成分の粉末が得られる。
ＩＶ．使用方法
ｉ．細胞内のＡＬＤＨ２発現の低下
いくつかの実施形態では、細胞内のＡＬＤＨ２の発現を低下させる目的で、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を細胞に送達するための方法が提供される。本明細書で提供される方法は、任意の適当な細胞タイプで有用である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＬＤＨ２を発現するあらゆる細胞である（例えば、肝細胞、マクロファージ、単球由来細胞、前立腺癌細胞、中枢神経系の細胞（例えば、ニューロンまたはグリア細胞）、内分泌組織、骨髄、リンパ節、肺、胆嚢、肝臓、十二指腸、小腸、膵臓、腎臓、胃腸管、膀胱、脂肪及び軟組織及び皮膚）。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から得られ、限られた数の継代を行っていてもよい初代細胞であり、それにより、細胞は天然の表現型特性を実質的に維持している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが送達される細胞は 、エクスビボまたはインビトロである （すなわち、培養中の細胞または細胞が存在する生物に送達することができる）。具体的な実施形態では、中枢神経系（ＣＮＳ）内のＡＬＤＨ２のみの発現を低下させる目的で、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を細胞に送達するための方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを含む溶液の注入、オリゴヌクレオチドで被覆した粒子によるボンバードメント、オリゴヌクレオチドを含む溶液への細胞または生物の曝露、またはオリゴヌクレオチドの存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む適当な核酸送達方法を使用して導入することができる。例えば、脂質媒介担体輸送、化学媒介輸送、及びリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなどの、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するための他の適当な方法を使用することもできる。
阻害の結果は、細胞または対象の１つ以上の特性を評価するための適当なアッセイによって、またはＡＬＤＨ２発現を示す分子（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）を評価する生化学的手法によって確認することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドがＡＬＤＨ２の発現のレベルを低下させる程度は、発現レベル（例えば、ＡＬＤＨ２のｍＲＮＡまたはタンパク質レベル）を適当なコントロール（例えば、オリゴヌクレオチドが送達されていない、またはネガティブコントロールが送達された細胞または細胞集団におけるＡＬＤＨ２の発現レベル）と比較することによって評価される。いくつかの実施形態では、ＡＬＤＨ２発現の適当なコントロールレベルを所定のレベルまたは値とすることで、コントロールレベルを毎回測定する必要をなくすことができる。所定のレベルまたは値は、様々な形態のものとすることができる。いくつかの実施形態では、所定のレベルまたは値は、中央値または平均などの単一のカットオフ値とすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの投与は、細胞内のＡＬＤＨ２発現のレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、ＡＬＤＨ２発現のレベルの低下は、ＡＬＤＨ２の適当なコントロールレベルと比較して、１％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、または９０％以下であり得る。適当なコントロールレベルは、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドと接触させられていない細胞または細胞集団におけるＡＬＤＨ２発現のレベルとすることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法による細胞へのオリゴヌクレオチドの送達の効果は、一定期間の後に評価される。例えば、ＡＬＤＨ２のレベルは、細胞内へのオリゴヌクレオチドの導入の少なくとも８時間、１２時間、１８時間、２４時間後、または、１、２、３、４、５、６、７、もしくは１４日後に分析することができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、細胞内でオリゴヌクレオチド（例えば、そのセンス及びアンチセンス鎖）を発現するように操作された導入遺伝子の形態で送達される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書に開示されるいずれかのオリゴヌクレオチドを発現するように操作された導入遺伝子を使用して送達される。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルスまたは単純ヘルペスウイルス）または非ウイルスベクター（例えば、プラスミドまたは合成ｍＲＮＡ）を使用して送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子を対象に直接注射することができる。
ｉｉ．治療方法
別の態様において、本開示は、対象の神経学的疾患を治療するためにＡＬＤＨ２の発現を低下させるための方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、治療を要する対象の脳脊髄液に本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つの有効量を投与することを含み得る。かかる治療法を用いて、例えば、中枢神経系（例えば、体性感覚野、海馬、前頭葉、線条体、視床下部、小脳、及び脊髄全体）におけるＡＬＤＨ２の発現を低下させることができる。本開示は、神経学的疾患のリスクを有する（または感受性を有する）対象を治療する予防的及び治療的方法の両方を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、神経疾患を治療するためのオリゴヌクレオチドの方法または使用を提供する。いくつかの実施形態では、神経疾患は、神経変性疾患、認知障害、または不安障害である。ＣＮＳにおけるＡＬＤＨ２発現に関連する例示的な疾患としては、とりわけ、老人性痴呆、ジスキネジア、アルツハイマー病（ＡＤ）、及びパーキンソン病（ＰＤ）が挙げられる。
特定の態様において、本開示は、対象に治療薬（例えば、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドをコードするベクターもしくは導入遺伝子）を投与することによって、対象における本明細書に記載される疾患または障害を予防するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療される対象は、例えば中枢神経系におけるＡＬＤＨ２タンパク質の量の低下から治療的な利益が得られる対象である。
本明細書に記載される方法は、一般的には、有効量のオリゴヌクレオチド、すなわち、望ましい治療結果を生じることができる量を対象に投与することを含む。治療許容量は、疾患または障害を治療することができる量とすることができる。任意の１人の対象に対する適当な投与量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される組成物、組成物中の活性成分（複数可）、投与の時間及び経路、一般的な健康状態、及び同時に投与されている他の薬剤を含む特定の因子に応じて決められる。
いくつかの実施形態では、対象は、例えば、注射または注入によって、本明細書に開示される組成物のいずれか１つを対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、脳室内、腔内、髄腔内、または間質投与によって送達される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの範囲（例えば、１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．５ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。
非限定的の一組の例として、本開示のオリゴヌクレオチドは、通常、年に１回、年に２回、四半期ごと（３ヶ月に１回）、隔月（２ヶ月に１回）、毎月、または毎週投与される。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、ヒトまたは非ヒト霊長類または他の哺乳動物の対象である。他の例示的な対象としては、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜、ならびにマウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの動物が挙げられる。
ｉｉｉ．細胞内の標的遺伝子発現の低下
いくつかの態様において、本開示は、対象における標的遺伝子の発現を低下させるためにオリゴヌクレオチド誘導体（例えば、コンジュゲートＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧ）を使用する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド誘導体（例えば、コンジュゲートＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧ）のいずれかを対象の脳脊髄液に投与することを含む。オリゴヌクレオチドのアンチセンス及びセンス鎖は、任意の標的遺伝子を標的化するように操作することができる。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド２１～２７個の長さであり、標的遺伝子に対する相補性領域を有する。
本明細書に記載される方法及びオリゴヌクレオチドの標的とすることができる他の遺伝子としては、脊髄小脳失調症１型（アタキシン－１、及び／またはアタキシン－３）、β－アミロイド前駆体タンパク質遺伝子（ＡＰＰまたはＢＡＣＥ１）またはその変異体、ジストニア（ＤＹＴ１）、筋萎縮性側索硬化症「ＡＬＳ」またはルーゲーリック病（ＳＯＤ１）を引き起こす遺伝子として特定されているもの、及び中枢神経系の腫瘍につながる様々な遺伝子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、ＡＬＤＨ２、アタキシン１、アタキシン３、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１、ＤＹＴ１、及びＳＯＤ１からなる群から選択される。
実施例
実施例１：中枢神経系（ＣＮＳ）へのＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの送達
中枢神経系（ＣＮＳ）は保護された環境である。脳脊髄液（ＣＳＦ）中の循環タンパク質含有量は血漿中の含有量の１％未満であり、ＣＳＦには内因的なヌクレアーゼ活性はほとんどない。ＣＮＳは、血液脳関門が免疫細胞の循環を妨げることから「免疫特権化」されている。ＣＳＦ中に投与されたオリゴヌクレオチドは 、ＣＳＦのバルク流によって分布し、組織中で長い半減期を有する（脳室内（ＩＣＶ）注入後、脳及び脊髄内で最大２００日）。神経細胞はオリゴヌクレオチドを容易に取り込む。ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのサイズ及び／または親油性は、ＣＳＦからのオリゴヌクレオチドの排除を減少させるように操作することができる。しかしながら、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、血液脳関門を通過しないため、ＣＮＳ内に直接投与する必要がある（例えば、髄腔内またはＩＣＶ注射）。オリゴヌクレオチドは リンパ系を介してＣＳＦから除去され、全身投与されたオリゴヌクレオチドと同じ懸案事項／制限の対象となる（例、腎毒性、血小板減少症）。本開示の一実施形態では、活性ガイド鎖は、ＣＮＳからの急速な排除から化合物を保護するために化学的に修飾されたより大きなオリゴヌクレオチド担体として調製される。オリゴヌクレオチド担体の化学的修飾としては、それぞれ、ガイド鎖がＲＩＳＣに積み込まれ、標的ｍＲＮＡを阻害するまでの間、分子全体を除去するＣＮＳの能力を低下または遅延させることを目的とした、単純に大きな分子サイズ、親油性、二量体化、電荷または極性の改変、分子量の増加が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳから排除されて別の身体コンパートメントに位置すると、ヌクレアーゼ及び他の分解分子が容易にアクセスできるように修飾されるため、ＣＮＳの外部のオリゴヌクレオチドは容易に分解される。これにより、オフターゲット効果が制限または防止される。
この実験では、ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドを、直接脳室内に注射することにより雌ＣＤ－１マウスの中枢神経系（ＣＮＳ）に投与した（図１）。右側脳室注射部位に注射されたＦａｓｔＧｒｅｅｍ色素が脳室系全体に分布していることが最初に示された（図２）。
ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドは、肝臓中のＡＬＤＨ２発現を減少させるのに効果的であるが、ＣＮＳコンパートメントからは速やかに除去される。Ｓ５８５－ＡＳ５９５－コンジュゲートＡオリゴヌクレオチドの２つの誘導体（Ｓ６０８－ＡＳ５９５－コンジュゲートＡ及びＳ６０８－ＡＳ５９５－コンジュゲートＡ－ＰＳテール）を、ＣＳＦ中での保持率を高めるように設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、２’－フルオロ及び２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート結合の組み合わせをさらに含み、及び／またはそれらのアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドに位置するリン酸アナログを含む。
アンチセンス鎖の３’部分に位置するホスホチオエート（ＰＳ）修飾ヌクレオチドは、ＣＳＦ中の保持と神経細胞取り込みを促進するものと予想された。取り込みの媒介におけるＰＳ修飾または非対称性の寄与を切り離すためのコントロールとして非ＰＳ修飾テールを含めた。
中枢神経系におけるＡＬＤＨ２の発現を減少させるＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチド（親分子及びその誘導体）の活性を調べるため、ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチド（親分子及び誘導体）を直接脳室内注射（ＩＣＶ）により（各群ｎ＝４）をマウスに投与し、マウスの脳の異なる領域における残存ＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡレベルを投与５日後に評価した。実験デザインを表１に示す。
表１ ＣＮＳ活性の実験デザイン
Figure 2022526419000012

* 用量100μgは4mg/kgに相当する。
これらの結果は、試験したすべてのＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドが、異なる脳領域及び肝臓におけるＡＬＤＨ２発現を減少させたことを示している（図３）。さらに、図４に示されるように、ＩＣＶ投与によってマウスに投与した１回の１００μｇ単回用量のＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドは、異なるＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（結合体または非結合体として）の髄腔内投与による評価基準の９００μｇ用量（ラットにおける）と比較して、ＡＬＤＨ２発現を減少させるうえで同様の活性を示した。
実施例２ ＣＮＳにおけるＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの用量反応
ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチド（Ｓ５８５－ＡＳ５９５－コンジュゲートＡ）を上記と同じアッセイを使用し、ただし、２つの異なる濃度（２５０μｇ及び５００μｇ）で試験した。ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドを ＩＣＶによりマウスに投与し、投与後７日目または２８日目に組織（線条体、皮質（体性感覚野及び前頭葉）、海馬、視床下部、小脳、脊髄）を採取した。各組織中に残存するＡＬＤＨ２のｍＲＮＡレベルを、ＲＴ－ＰＣＴを用いて評価した。各組織中のＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの量を、ＳＬ－ｑＰＣＴを使用して評価した。実験デザインを表２に示す。
表２ 用量反応実験のデザイン
Figure 2022526419000013
これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチド（Ｓ５８５－ＡＳ５９５－コンジュゲートＡ）が投与７日後にすべての脳及び脊髄領域でＡＬＤＨ２のｍＲＮＡレベルを有意に低下させたことを示している（図５）。ＥD５０は、すべての領域で１００μｇ未満である。図７には、５日目に得られた１００μｇ用量の結果も含まれている点に留意されたい。ＡＬＤＨ２のｍＲＮＡ発現の持続的なサイレンシングは、２５０μｇまたは５００μｇの用量のＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの単回ＩＣＶ注射の後、２８日間にわたって脳全体（図６）及び脊髄全体（図７）でも観察された。ＩＣＶ注射したＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドも、投与７日及び２８日後にＡＬＤＨ２発現レベルを低下させた（図８）。
実施例３ ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの効果のＣＮＳでの持続時間
単回ボーラスＩＣＶ注射後の脳及び脊髄におけるＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチド（Ｓ５８５－ＡＳ５９５－コンジュゲートＡ）の効果の持続時間の評価も行った。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドを、２５０μｇ及び５００μｇの２つの用量レベルで右側脳室へのＩＣＶ注入によってＣＤ－１雌マウス（６～８週齢）に投与した。注入の７、２８、及び５６日後にマウスを屠殺し、組織（線条体、皮質（体性感覚野及び前頭葉）、海馬、視床下部、脊髄）を採取した。各組織中に残存するＡＬＤＨ２のｍＲＮＡレベルを、ＲＴ－ＰＣＴを用いて評価した。実験計画を下記表３に示す。
表３ 持続性実験
Figure 2022526419000014
結果は、ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチド（Ｓ５８５－ＡＳ５９５－コンジュゲートＡ）のＡＬＤＨ２減少効果が、脳の異なる領域（図９）及び脊髄全体（図１０）で約３０日間持続したことを示している。３０日後、残存するＡＬＤＨ２のｍＲＮＡレベルは時間とともに増加したが、５６日の時点で、ノックダウン前のｍＲＮＡレベルにまでは上昇しなかった。
ＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチド（Ｓ５８５－ＡＳ５９５－コンジュゲートＡ）の神経毒性の評価も行った。２５０μｇまたは５００μｇのＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの投与後、Ｇｆａｐの発現上昇は観察されなかった（図１１）。神経膠症（ＣＮＳ損傷に応答したグリア細胞の応答性変化）は観察されず、忍容性を示した。本明細書に記載される結合化合物の毒性及び治療効果は、例えば、ＬＤ50（集団の５０％致死用量）またはＥＤ50（集団の５０％治療有効用量）を決定するための標準的な薬学的方法により細胞培養または実験動物で測定することができる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50の比として表すことができる。このスケールで高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用することもできるが、非感染細胞に傷害を与える可能性を最小限に抑え、それにより副作用を低減するためには、罹患組織の部位にそのような化合物を標的化する送達システムを設計するように配慮する必要がある。
実施例４ ＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体
ニューロンへの送達にＧａｌＮＡｃ結合が必要であるかどうかを判定し、中枢神経系（ＣＮＳ）でＡＬＤＨ２阻害活性を有するＧａｌＮＡｃ結合ＡＬＤＨ２オリゴヌクレオチドの構造変異体を特定するため、一群のＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体を設計した（コンジュゲートＡ～Ｇ、図２３）。すべての誘導体は、テトラループ構造の有無にかかわらず、センス鎖の５’末端に異なる構造を形成している。オリゴヌクレオチド誘導体のテトラループ部分における例示的な修飾ヌクレオチドを図２２に示す。加えて、いずれのオリゴヌクレオチドも、２’－フルオロ及び２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート結合の組み合わせをさらに含み、及び／またはアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドに位置するリン酸アナログを含んでいる。
コンジュゲートＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧは、ＧＡＡＡとして記載される配列を含むテトラループを含み、配列番号５８５に記載される配列を有するセンス鎖と配列番号５９５に記載される配列を有するアンチセンス鎖とを含んでいる。コンジュゲートＣはテトラループを含まず、センス鎖の３’とアンチセンス鎖の５’末端とが平滑末端を形成している。コンジュゲートＣは、配列番号６０９に記載される配列を有するセンス鎖と配列番号５９５に記載される配列を有するアンチセンス鎖とを含んでいる。
コンジュゲートＡでは、ＧＡＡＡ配列中の各ＡはＧａｌＮＡｃ部分と結合され、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含んでいる。
コンジュゲートＢでは、ＧＡＡＡ配列中の各ＡはＧａｌＮＡｃ部分と結合され、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－ＯＨを含んでいる。
コンジュゲートＤでは、ＧＡＡＡ配列中の各ヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を含んでいる。
コンジュゲートＥでは、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは２’－ＯＨを含み、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含んでいる。
コンジュゲートＦでは、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を含み、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含んでいる。
コンジュゲートＧでは、ＧＡＡＡ配列中の各Ａは２’－ａｄｅｍを含み、ＧＡＡＡ配列中のＧは２’－Ｏ－メチル修飾を含んでいる。
ＣＮＳにおけるＡＬＤＨ２発現を低下させる各誘導体の活性を評価した。ＣＤ－１雌マウス（６～８週齢、ｎ ＝ ４）に各ＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体を単回ボーラスＩＣＶ注射した。各誘導体は、ＩＣＶ注射により２００μｇを右側脳室に投与した。注入の１４日後にマウスを屠殺し、組織（体性感覚野、海馬、線条体、前頭皮質、小脳、視床下部、頸髄、胸髄、腰髄、肝臓）を採取した。組織中に残存するＡＬＤＨ２のｍＲＮＡレベルを、ＲＴ－ＰＣＴを用いて評価した。組織中のＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体の量を、ＳＬ－ｑＰＣＴを使用して評価した。実験デザインを表４に示す。
表４ ＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体の活性
Figure 2022526419000015

＊全身用量の同等性：テトラループ構造の場合は約８ｍｇ／ ｋｇ、短縮二重鎖の場合は約１３．５ｍｇ／ｋｇ
図１２は、非ＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドが、２週間後に肝臓で不活性であることを示している。コンジュゲートＢは、おそらく高用量（８ｍｇ／ｋｇ相当）であるために、肝臓でまだ部分的に活性である。図１３は、ＧａｌＮＡｃ結合が脳全体にわたったオリゴヌクレオチドの有効性に必要ではないことを示している。
すべてのコンジュゲートは、前頭皮質（図１４）、線条体（図１５）、体性感覚皮質（図１６）、海馬（図１７）、視床下部（図１８）、小脳（図１９）、及び脊髄（図２１）全体にわたってＡＬＤＨ２のｍＲＮＡレベルを低下させるうえで効果的であった。異なる脳領域にわたった各ＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド誘導体の相対曝露量の要約を図２０に示す。
結果は、各非ＧａｌＮＡｃ結合ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが２週間後に肝臓で不活性であり、ＧａｌＮＡｃ結合が神経細胞の取り込みとコンジュゲートの有効性に必要ではないことを示している。いずれの誘導体も、脳と脊髄全体にわたってほぼ同等の分布を示した（ただし、一部のグループ間では絶対蓄積量に最大１０倍の差がみられた）。注入部位（体性感覚野及び海馬）の近傍では、非ＧａｌＮＡｃ結合コンストラクト（コンジュゲートＣ～Ｇ）で活性の上昇（２０～４０％）が観察された。注入部位（前頭皮質、線条体、視床下部、小脳、脊髄）から遠位では、ＧａｌＮＡｃ結合誘導体と非結合誘導体とで同等の活性が観察された。
一般的に、コンジュゲートＥ（２’－ＯＨ置換テトラループ）の有効性はより低くなっている。最も高い全体曝露量は、コンジュゲートＧ（２’－ａｄｅｍ置換テトラループ）及びコンジュゲートＦ（２’－ＭＯＥ置換テトラループ）で観察された。
ＡＬＤＨ２遺伝子の標的配列を表５に示す。
表５． ホットスポットの配列
Figure 2022526419000016
オリゴヌクレオチドの命名法の説明
本明細書に記載されるすべてのオリゴヌクレオチドは、ＳＮ1－ＡＳＮ2－ＭＮ3のいずれかが指定されている。以下の指定が適用される。
Ｎ1：センス鎖配列の配列識別番号
Ｎ2：アンチセンス鎖配列の配列識別番号
例えば、Ｓ２７－ＡＳ３１７は、配列番号２７に記載されるセンス配列と、配列番号３１７に記載されるアンチセンス配列とを有するオリゴヌクレオチドを表す。
参照文献
１．Ｆｉｒｅ Ａ． ａｎｄ Ｘｕ Ｓ，“Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ，” Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１（６６６９）：８０６－８１１．
２．Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．，“ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，” Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８：２４４－２５１．
３．Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡｉ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ，” Ｎａｔ Ｍｅｄ．，２００４，１０（８）：８１６－８２０．
本明細書に例示的に記載される開示は、本明細書に具体的に開示されない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の限定がない状態で適当に実施することができる。したがって、例えば、本明細書におけるそれぞれの場合において、「～を含む」、「～から本質的になる」、及び「～からなる」という用語のいずれかを、他の２つの用語のいずれかで置き換えることができる。使用した用語及び表現は、限定のためではなく、説明のための用語として用いられているものであり、かかる用語及び表現の使用においては、図示及び記載される特徴のいずれの均等物またはその部分も除外する意図はなく、むしろ、特許請求される発明の範囲内で様々な改変が可能であることが認識されよう。したがって、本発明は好ましい実施形態によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される概念の任意選択の特徴、改変及び変形は当業者によって実施することが可能であり、かかる改変及び変形は、説明文及び添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあることは理解されるべきである。
さらに、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群または他の代替物の群分けに関して記載されている場合、当業者には、本発明がマーカッシュ群または他の群の個々の要素または要素のサブグループに関しても記載されていることが認識されよう。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の構造を説明する際に配列表に示された配列を参照している場合がある点は理解されよう。かかる実施形態では、実際のオリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、記載された配列と本質的に同じまたは同様の相補的特性を保持しながら、記載された配列と比較して１つ以上の代替的ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドのＲＮＡ対応物またはＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ対応物）及び／または１つ以上の修飾ヌクレオチド及び／または１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合及び／または１つ以上の他の修飾を有し得る。
本発明の説明との関連での（特に下記の請求項との関連での）用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び同様の指示語の使用は、本明細書中で特に断らない限り、または文脈により明らかに矛盾のない限り、単数及び複数の両方を含むものと解釈されるべきである。「備える」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、「有する」（ｈａｖｉｎｇ）、及び「含む」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）なる用語は、特に断らない限りはオープンエンドタームとして（すなわち、「それらを含むがそれらに限定されない」ことを意味する）解釈されるべきである。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書で特に断らない限り、範囲内に含まれるそれぞれの別個の値を個々に記載する手軽な方法としての役割を果たすことを単に意図したものに過ぎず、それぞれの別個の値は、本明細書に恰も個々に記載されているものと同様にして本明細書に含まれるものである。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で特に断らない限り、または文脈により明らかに矛盾のない限り、任意の適当な順序で実施することができる。本明細書内に提供されるいずれか及びすべての実施例、または例示的文言（例えば、「など」）の使用は、本発明をより分かりやすく説明することを単に意図したものであり、特に主張されない限りは本発明の範囲を限定するものではない。いかなる本明細書の文言も、請求されていない要素を本発明の実施に不可欠なものとして示しているものと解釈されるべきではない。
本発明の実施形態は、本明細書に記載されている。これらの実施形態の変例は、上記の説明を読むことで当業者に明らかになり得る。
発明者は、当業者がかかる変形を適宜用いることを予期しており、また、発明者は、本発明が本明細書に具体的に記載されるのとは別の形で実施されることは想定している。したがって、本発明は、適用法が認めるように、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題のすべての改変物及び均等物を含むものである。さらに、それらのすべての可能な変例における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書で特に断らない限り、または文脈により明らかに矛盾のない限り、本発明に包含されるものである。当業者であれば、通常の実験以上のことを行うことなく、本明細書に記載される発明の特定の実施形態の多くの均等物が認識されるかまたは確認できるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。本願の全体にわたって引用されるすべての参考文献、特許、及び特許出願の内容を、参照により本明細書に援用する。

付録Ａ：
Figure 2022526419000017


Figure 2022526419000018

Figure 2022526419000019

Figure 2022526419000020

Figure 2022526419000021

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Figure 2022526419000023

Figure 2022526419000024

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Figure 2022526419000027

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Figure 2022526419000031

Figure 2022526419000032

Claims (73)

  1. アンチセンス鎖とセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドであって、
    前記アンチセンス鎖がヌクレオチド２１～２７個の長さであり、ＡＬＤＨ２に対する相補性領域を有し、
    前記センス鎖が、その３’末端にＳ1－Ｌ－Ｓ2として示されるステムループを含み、Ｓ1はＳ2と相補的であり、Ｌはテトラループであり、ＧＡＡＡとして示される配列を含み、前記ＧＡＡＡ配列は、
    （ｉ）ＧＡＡＡ配列中の各ＡがＧａｌＮＡｃ部分に結合され、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
    （ｉｉ）ＧＡＡＡ配列中の各ＡがＧａｌＮＡｃ部分に結合され、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－ＯＨを含む、
    （ｉｉｉ）ＧＡＡＡ配列中の各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
    （ｉｖ）ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－ＯＨを含み、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
    （ｖ）ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を含み、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、及び、
    （ｖｉ）ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－ａｄｅｍ修飾を含み、ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
    からなる群から選択される構造を含み、
    前記アンチセンス鎖と前記センス鎖とがヌクレオチド少なくとも１２個の長さの二重鎖構造を形成するが共有結合によって連結されていない、前記オリゴヌクレオチド。
  2. 前記アンチセンス鎖が、配列番号５９１～６００のいずれか１つに記載される配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 前記センス鎖が、配列番号５８１～５９０のいずれか１つに記載される配列を含む、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 請求項１～３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  5. 対象におけるＡＬＤＨ２の発現を低下させる方法であって、対象の脳脊髄液に、ヌクレオチド１５～３０個の長さのアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号６０１～６０７のいずれか１つに記載されるＡＬＤＨ２の標的配列に対する相補性領域を有し、前記相補性領域は連続するヌクレオチド少なくとも１２個の長さである、前記方法。
  6. 前記相補性領域が、前記ＡＬＤＨ２の標的配列に対して完全に相補的である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド１９～２７個の長さである、請求項５または６に記載の方法。
  8. ＡＬＤＨ２に対する前記相補性領域が連続するヌクレオチド少なくとも１３個の長さである、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記アンチセンス鎖が、配列番号５９１～６００のいずれか１つに記載される配列を含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記アンチセンス鎖が、配列番号５９１～６００のいずれか１つに記載される配列からなる、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項５～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記修飾ヌクレオチドが、２’修飾を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記２’修飾が、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－ａｄｅｍ、２’－アミノジエトキシメタノール、及び２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される修飾である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが修飾されている、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項５～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記アンチセンス鎖が、５’ヌクレオチドの糖の４’炭素にリン酸アナログを含む、請求項５～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記リン酸アナログが、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートである、請求項１７に記載の方法。
  19. 対象におけるＡＬＤＨ２の発現を低下させる方法であって、対象の脳脊髄液に、ヌクレオチド１５～３０個の長さのアンチセンス鎖と、ヌクレオチド１５～４０個の長さのセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記センス鎖は前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、前記アンチセンス鎖は、配列番号６０１～６０７のいずれか１つに記載されるＡＬＤＨ２の標的配列に対する相補性領域を有し、前記相補性領域は連続するヌクレオチド少なくとも１２個の長さである、前記方法。
  20. 前記センス鎖が、ヌクレオチド１９～４０個の長さである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記二重鎖領域が、ヌクレオチド少なくとも１２個の長さである、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. ＡＬＤＨ２に対する前記相補性領域が連続するヌクレオチド少なくとも１３個の長さである、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド１９～２７個の長さである、請求項１９または２２に記載の方法。
  24. 前記アンチセンス鎖が、配列番号５９１～６００のいずれか１つに記載される配列を含む、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記センス鎖が、配列番号５８１～５９０、６０８、及び６０９のいずれか１つに記載される配列を含む、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記アンチセンス鎖が、配列番号５９１～６００のいずれか１つに記載される配列からなる、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記センス鎖が、配列番号５８１～５９０、６０８、及び６０９のいずれか１つに記載される配列からなる、請求項１９～２３及び請求項２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記センス鎖が、その３’末端に、Ｓ1－Ｌ－Ｓ2として示されるステムループ配列を含み、Ｓ1は、Ｓ2と相補的であり、Ｌは、Ｓ1とＳ2との間にヌクレオチド３～５個の長さのループを形成する、請求項１９～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. Ｌが、テトラループである、請求項２８に記載の方法。
  30. Ｌが、ヌクレオチド４個の長さである、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. Ｌが、ＧＡＡＡとして示される配列を含む、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記ＧＡＡＡ配列中の少なくとも１つのヌクレオチドがＧａｌＮＡｃ部分に結合されている、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ＧＡＡＡ配列中の各ＡがＧａｌＮＡｃ部分に結合されている、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記アンチセンス鎖と前記センス鎖とが共有結合によって連結されていない、請求項１９～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１９～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記修飾ヌクレオチドが、２’修飾を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記２’修飾が、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－ａｄｅｍ、２’－アミノジエトキシメタノール、及び２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される修飾である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが修飾されている、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項１９～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記アンチセンス鎖が、５’ヌクレオチドの糖の４’炭素にリン酸アナログを含む、請求項１９～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記リン酸アナログが、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートである、請求項４１に記載の方法。
  43. 請求項３１に記載の前記ＧＡＡＡ配列中のＧが、２’－Ｏ－メチル修飾を含む、請求項３５～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 請求項３１に記載の前記ＧＡＡＡ配列中のＧが、２’－ＯＨを含む、請求項３５～４２のいずれか１項に記載の方法。
  45. 請求項３１に記載の前記ＧＡＡＡ配列中の各ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾を含む、請求項３５～４２のいずれか１項に記載の方法。
  46. 請求項３１に記載の前記ＧＡＡＡ配列において、前記ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－ＯＨを含み、前記ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、請求項３５～４２のいずれか１項に記載の方法。
  47. 請求項３１に記載の前記ＧＡＡＡ配列において、前記ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を含み、前記ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、請求項３５～４２のいずれか１項に記載の方法。
  48. 請求項３１に記載の前記ＧＡＡＡ配列において、前記ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－ａｄｅｍ修飾を含み、前記ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、請求項３５～４２のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記オリゴヌクレオチドが、髄腔内、脳室内、腔内、または間質に投与される、請求項５～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記オリゴヌクレオチドが、注射または注入により投与される、請求項５～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記対象が神経疾患を有する、請求項５～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記神経疾患が、神経変性疾患、認知障害、及び不安障害から選択される、請求項５１に記載の方法。
  53. 対象におけるＡＬＤＨ２の発現を低下させる方法であって、前記対象の脳脊髄液に、アンチセンス鎖とセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドを投与することを含み、
    前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド２１個～２７個の長さであり、ＡＬＤＨ２に対する相補性領域を有し、
    前記センス鎖は、その３’末端にＳ1－Ｌ－Ｓ2として示されるステムループを含み、Ｓ1はＳ2と相補的であり、ＬはＳ1とＳ2との間にヌクレオチド３～５個の長さのループを形成し、
    前記アンチセンス鎖と前記センス鎖とはヌクレオチド少なくとも１２個の長さの二重鎖構造を形成するが共有結合によって連結されていない、前記方法。
  54. 対象におけるＡＬＤＨ２の発現を低減する方法であって、共有結合によって連結されていないアンチセンス鎖とセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドを対象の脳脊髄液に投与することを含み、
    前記アンチセンス鎖は配列番号５９５に記載される配列を含み、前記センス鎖は配列番号５８５に記載される配列を含み、
    前記センス鎖は、その３’末端にＳ1－Ｌ－Ｓ2として示されるステムループを含み、Ｓ1はＳ2と相補的であり、ＬはＧＡＡＡとして示される配列を含むテトラループであり、前記ＧＡＡＡ配列は、
    （ｉ）前記ＧＡＡＡ配列中の各ＡがＧａｌＮＡｃ部分に結合され、前記ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
    （ｉｉ）前記ＧＡＡＡ配列中の各ＡがＧａｌＮＡｃ部分に結合され、前記ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－ＯＨを含む、
    （ｉｉｉ）前記ＧＡＡＡ配列中の各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
    （ｉｖ）前記ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－ＯＨを含み、前記ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
    （ｖ）前記ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を含み、前記ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、及び、
    （ｖｉ）前記ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－ａｄｅｍ修飾を含み、前記ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
    からなる群から選択される構造を含む、前記方法。
  55. 対象におけるＡＬＤＨ２の発現を低下させる方法であって、共有結合によって連結されていないアンチセンス鎖とセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドを対象の脳脊髄液に投与することを含み、
    前記アンチセンス鎖が、配列番号５９５に記載される配列を含み、前記センス鎖が、配列番号６０９に記載される配列を含む、前記方法。
  56. 前記オリゴヌクレオチドが、体性感覚皮質、海馬、前頭皮質、線条体、視床下部、小脳、及び／または脊髄における検出可能なＡＬＤＨ２の発現を低下させる、請求項５～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. ＡＬＤＨ２発現に関連した神経疾患を治療する方法であって、治療を要する対象の脳脊髄液に、ヌクレオチド１５～３０個の長さのアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号６０１～６０７のいずれか１つに記載されるＡＬＤＨ２の標的配列に対する相補性領域を有し、前記相補性領域は連続するヌクレオチド少なくとも１２個の長さである、前記方法。
  58. ＡＬＤＨ２発現に関連した神経疾患を治療する方法であって、治療を要する対象の脳脊髄液に、アンチセンス鎖とセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドを投与することを含み、
    前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド２１個～２７個の長さであり、ＡＬＤＨ２に対する相補性領域を有し、
    前記センス鎖は、その３’末端にＳ1－Ｌ－Ｓ2として示されるステムループを含み、Ｓ1はＳ2と相補的であり、ＬはＳ1とＳ2との間にヌクレオチド３～５個の長さのループを形成し、
    前記アンチセンス鎖と前記センス鎖とはヌクレオチド少なくとも１２個の長さの二重鎖構造を形成するが共有結合によって連結されていない、前記方法。
  59. 前記神経疾患が、神経変性疾患である、請求項５７または５８に記載の方法。
  60. 前記神経疾患が、不安障害である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記オリゴヌクレオチドが、髄腔内、脳室内、腔内、または間質に投与される、請求項５７～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記オリゴヌクレオチドが、注射または注入により投与される、請求項５７～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記オリゴヌクレオチドが、体性感覚皮質、海馬、前頭皮質、線条体、視床下部、小脳、及び／または脊髄における検出可能なＡＬＤＨ２の発現を低下させる、請求項５７～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 対象における標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、前記対象の脳脊髄液にオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、
    前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド２１個～２７個の長さであり、前記標的遺伝子に対する相補性領域を有し、
    前記センス鎖は、その３’末端にＳ1－Ｌ－Ｓ2として示されるステムループを含み、Ｓ1はＳ2と相補的であり、ＬはＳ1とＳ2との間にヌクレオチド３～５個の長さのループを形成し、
    前記アンチセンス鎖と前記センス鎖とはヌクレオチド少なくとも１２個の長さの二重鎖構造を形成するが共有結合によって連結されていない、前記方法。
  65. Ｌが、テトラループである、請求項６４に記載の方法。
  66. Ｌが、ヌクレオチド４個の長さである、請求項６５に記載の方法。
  67. Ｌが、ＧＡＡＡとして示される配列を含む、請求項６４～６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記ＧＡＡＡ配列が、以下、
    （ｉ）前記ＧＡＡＡ配列中の各ＡがＧａｌＮＡｃ部分に結合されている、
    （ｉｉ）前記ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
    （ｉｉｉ）前記ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－ＯＨを含む、
    （ｉｖ）前記ＧＡＡＡ配列中の各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
    （ｖ）前記ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－ＯＨを含み、前記ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
    （ｖｉ）前記ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を含み、前記ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、及び、
    （ｖｉｉ）前記ＧＡＡＡ配列中の各Ａが２’－ａｄｅｍを含み、前記ＧＡＡＡ配列中のＧが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、
    から選択される構造を含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 対象における目的の標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、前記対象の脳脊髄液に、ヌクレオチド１５～３０個の長さのアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記アンチセンス鎖は、ＣＮＳで発現される前記目的の遺伝子の標的配列に対する相補性領域を有し、前記相補性領域は連続したヌクレオチド少なくとも１２個の長さである、前記方法。
  70. 前記標的遺伝子が、ＡＬＤＨ２、アタキシン１、アタキシン３、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１、ＤＹＴ１、及びＳＯＤ１からなる群から選択される、請求項６４～６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 前記オリゴヌクレオチドが、体性感覚皮質、海馬、前頭皮質、線条体、視床下部、小脳、及び／または脊髄における前記標的遺伝子の発現を低下させる、請求項６４～７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記オリゴヌクレオチドが、ＣＮＳの外側のヌクレアーゼによって分解される要素をさらに含み、そのため、前記ヌクレオチドがＣＮＳの外側の組織では対象の目的の遺伝子の発現を低下させることはできない、請求項６４～７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. 前記オリゴヌクレオチドが、ＣＮＳから容易に出ることができないような修飾をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
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