JP2023548658A - グリア細胞へのオリゴヌクレオチドの選択的送達 - Google Patents
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Abstract
本開示は、グリア細胞における標的ＲＮＡの発現及び／又はグリア細胞で発現するタンパク質のレベルを選択的に低下させるためのオリゴヌクレオチド、ならびにそのようなオリゴヌクレオチドをグリア細胞に送達する関連方法に関する。【選択図】図１
Description
神経系は、神経細胞及びグリア細胞からなる。神経細胞は、主に化学的シグナル及び電気的シグナルを生成して伝達する役目を果たす。グリア細胞は、神経細胞の機能及びシグナル伝達を調節するように作用し、それによって神経細胞の特性及び機能を変化及び調節する。中枢神経系（ＣＮＳ）では、グリア細胞には、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞及び小グリア細胞が含まれる。末梢神経系では、主要なグリア細胞には、シュワン細胞、腸管グリア細胞、及び衛星細胞が含まれる。
グリア細胞は、様々な疾患プロセスに関与する。いくつかの神経変性病は、グリア細胞機能の欠陥に起因する場合がある。例えば、星状膠細胞機能不全は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、及びパーキンソン病に関与する場合がある。神経細胞の軸索で保護鞘を形成するように機能する希突起膠細胞は、神経膠腫、統合失調症、双極性障害、及び白質萎縮症に関与する場合がある。小グリア細胞は、脳内で免疫機能の役割を有し、アルツハイマー病、自閉症、及び統合失調症を助長する可能性のある炎症性応答を引き起こす。シュワン細胞の機能障害は、ギラン・バレー症候群、シャルコー・マリー・ツース病、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害に関連する。
グリア細胞機能不全に関わる一部の疾患は、特定の遺伝子産物の発現に関連する。例えば、アレキサンダー病は、ミエリン鞘の破壊を特徴とする白質萎縮症の形態であり、かつ星状膠細胞で発現する中間体フィラメントタンパク質であるグリア線維酸性タンパク（ＧＦＡＰ）の遺伝子における常染色体の機能獲得型変異が原因である。ＧＦＡＰの過剰発現及び蓄積は、ローゼンタール線維として知られている異常なタンパク質沈積物をもたらし、これにより、正常な中間線維の形成を損なう可能性がある。
グリア細胞における異常な遺伝子産物の発現に関連する別の疾患は、ＡＬＳである。ＡＬＳは、銅－亜鉛超酸化物不均化酵素１（ＳＯＤ１）をコードする遺伝子の変異に関連する。ＡＬＳのマウスモデルでは、変異したＳＯＤ１（ｍＳＯＤ１）を運動ニューロンで選択的に発現させただけでは、完全なＡＬＳ症状を引き起こすのに不十分である（Ｐｒａｍａｔａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００１，２１（１０）：３３６９－７４を参照されたい）。しかし、運動ニューロンにおけるｍＳＯＤ１の選択的激減は、発症及び生存に影響を与えるが、疾患進行に影響を与えず、これは、周囲のグリア細胞が変性への影響に関与していることを示唆している。
グリア細胞の機能不全に関連する多くの疾患及び障害を考慮すると、グリア細胞機能に関連する疾患又は障害に関与する遺伝子産物の発現を調節することでグリア細胞を選択的に標的とする治療アプローチが望ましい。
本開示は、哺乳動物の神経系への干渉オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）の投与が、神経細胞で発現するｍＲＮＡの発現の低下よりも、グリア細胞で発現するｍＲＮＡのレベルの選択的低下をもたらすという驚くべき発見に関する。本発明は、グリア細胞の選択的摂取及び／又はグリア細胞で発現するＲＮＡのレベルの選択的低下が、オリゴヌクレオチドにおけるＧａｌＮＡｃ標的化部位の存在の有無に関係なく実現し得ることを提示する。
したがって、一態様では、本開示は、特に神経細胞よりもグリア細胞に対して選択性が高い場合に干渉オリゴヌクレオチドをグリア細胞に選択的に送達する方法を提供する。いくつかの実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドの選択的送達の方法は、グリア細胞を、標的ＲＮＡに対する相補性領域を有する干渉オリゴヌクレオチドと接触させることを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの発現を低下させることができる。
別の態様では、本開示は、グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされるＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルを選択的に低下させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされるＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルを選択的に低下させる方法は、グリア細胞を、標的ＲＮＡに対する相補性領域を有するオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの発現を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、相補性領域は、標的ＲＮＡのエキソンに対するものである。いくつかの実施形態では、相補性領域は、標的ＲＮＡの５′非翻訳領域に対するものである。いくつかの実施形態では、相補性領域は、標的ＲＮＡの３′非翻訳領域に対するものである。いくつかの実施形態では、相補性領域は、標的ＲＮＡの対立遺伝子特異的配列、例えば多型配列に対するものである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２～６０ヌクレオチド（又は１２～６０ヌクレオチド長）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１２ヌクレオチドの、標的ＲＮＡに対する相補性領域を有する。いくつかの実施形態では、長さが１２～３０ヌクレオチドの、標的ＲＮＡに対する相補性領域。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、該センス鎖及び該アンチセンス鎖は、二重鎖を形成し、該アンチセンス鎖は、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、かつ標的ＲＮＡのレベルを低下させることができる。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、長さが１５～４０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが１９～２７ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、長さが少なくとも１２ヌクレオチドの二重鎖を形成する。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、長さが１２～３０ヌクレオチドの二重鎖を形成する。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、別々のオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一のオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖又はアンチセンス鎖は、センス鎖及びアンチセンス鎖が二重鎖を形成する場合、長さが最大２ヌクレオチドの３′オーバーハングを有する。好ましくは、アンチセンス鎖が、長さが最大２ヌクレオチドの３′オーバーハングを有する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列領域Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を含むステムループ配列を更に含み、Ｓ１は、Ｓ２と相補的であり、かつＬは、Ｓ１及びＳ２が二重鎖を形成する場合にＳ１とＳ２の間で形成するループであり、ステムループ配列は、センス鎖の３′末端に結合する。いくつかの実施形態では、ループＬは、ペンタループ、テトラループ又はトリループである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的化リガンド又は標的化部位を更に含む。いくつかの実施形態では、標的リガンド又は部位は、オリゴヌクレオチドのステムループ配列のループＬに存在する。いくつかの実施形態では、標的化リガンド又は部位は、ＧａｌＮＡｃ部位である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ部位を有していない。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドのうち１個以上が修飾される。いくつかの実施形態では、修飾は、糖部分、ヌクレオシド間結合、５′末端ホスフェート、ヌクレオチド塩基の修飾、可逆的修飾、及び上述したような１つ以上の標的化部位の修飾を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドによって標的とされるグリア細胞は、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、対象の中枢神経系に存在する。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、対象の末梢神経系に存在する。いくつかの実施形態では、標的とされるグリア細胞は、中枢神経系の特定の領域、例えば、前頭皮質、線条体、体性感覚皮質、海馬、視床下部、小脳、脳幹、及び／又は脊髄に存在する。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、頚髄、胸髄、又は腰髄などの脊髄の特定の領域に存在する。
いくつかの実施形態では、グリア細胞への送達の選択性又はグリア細胞で発現するＲＮＡのレベルの低下の選択性は、神経細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、選択的送達又はグリア細胞で発現するＲＮＡのレベルの選択的低下は、神経細胞よりも、グリア細胞に対して少なくとも１．５倍以上高い。いくつかの実施形態では、選択的送達又はグリア細胞で発現するＲＮＡのレベルの選択的低下は、神経細胞よりも、グリア細胞に対して２以上、２．５以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、又は５以上高い。
いくつかの実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドの選択的送達又はグリア細胞で発現するＲＮＡのレベルの選択的低下の方法は、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、及び／又は腸管グリア細胞の機能不全など、グリア細胞の機能不全に関連する障害又は病態を治療するために使用される。
いくつかの実施形態では、選択的送達又はグリア細胞で発現するＲＮＡレベルの選択的低下は、本明細書に記載の有効な量のオリゴヌクレオチドの対象への髄腔内、脳室内、間質内、舌下、静脈内、又は鼻腔内投与によるものである。
本明細書に援用され、かつ本明細書の一部を構成する添付図面は、特定の実施形態を例示するものであり、発明の詳細な説明と共に、本明細書に開示される組成物及び方法の特定の態様の非限定的な例を提供する役割を果たすものである。
本開示は、対象の神経系のグリア細胞への選択的送達、又は対象の神経系のグリア細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルの選択的低下を含む、干渉オリゴヌクレオチドの選択的送達及びグリア細胞で発現するＲＮＡのレベルの選択的低下のための組成物及びその組成物の使用に関する。本開示は、本明細書にて開示するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを使用することで、他の神経細胞と比べて、選択的に送達し、かつグリア細胞で発現するＲＮＡのレベルを選択的に低下するといった予想外の発見を提示する。したがって、以下に、グリア細胞機能不全に関連する疾患又は障害を治療するための、オリゴヌクレオチド組成物、及びオリゴヌクレオチドのグリア細胞への選択的送達、及びグリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のためのオリゴヌクレオチドの使用の詳細な説明を提示する。
図面を含む前述の概要の説明及び後述する詳細な説明の両方は、例示的及び説明的なものにすぎず、本開示を限定するものではないことを理解すべきである。
本明細書で使用される節の見出しは、構成目的のみのためであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
Ｉ．定義
本開示に関して、別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される。
本開示に関して、別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される。
およそ：本明細書で使用される場合、対象とする１つ以上の値に適用される「およそ」又は「約」という用語は、記載される基準値と同様の値を指す。特定の実施形態では、用語「およそ」又は「約」とは、別途記載のない限り又は別途内容から明らかでない限り（かかる数が可能な値の１００％を超え得る場合を除く）、述べられた基準値のいずれかの方向（上回る又は下回る）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下に含まれる値の範囲を指す。
投与する：本明細書で使用される場合、「投与する」又は「投与」という用語は、薬理学的に有用な形で（例えば、対象の状態を治療するために）対象に物質（例えば、オリゴヌクレオチド）を与えることを意味する。
相補的：本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、ヌクレオチド同士が互いに塩基対を形成することを可能にするヌクレオチド（例えば、２本の対向する核酸上又は一本の核酸鎖の対向する領域上の２個のヌクレオチド）間の構造的関係を指す。例えば、対向する核酸のピリミジンヌクレオチドと相補的である１つの核酸のプリンヌクレオチドは、互いに水素結合を形成することにより共に塩基対合し得る。いくつかの実施形態では、相補的なポリヌクレオチド鎖は、ワトソン・クリック型、又は、安定した二重鎖の形成を可能にする他の任意の形で塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態では、２本の核酸は、本明細書に記載されるように、互いに相補的であることで相補性領域を形成するヌクレオチド配列を有することができる。
デオキシリボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドと比較して、そのペントース糖の２′位に水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドは、糖、ホスフェート基又は塩基の修飾又は置換を含む、２′位以外の原子の１つ以上の修飾又は置換を有するデオキシリボヌクレオチドである。
二本鎖オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「二本鎖オリゴヌクレオチド」という用語は、実質的に二重鎖形態であるオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（複数可）の相補的な塩基対は、共有結合的に分離している核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（複数可）の相補的な塩基対は、共有結合的に連結している核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（複数可）の相補的な塩基対は、互いに塩基対を形成するヌクレオチドの相補的な逆平行配列となるように、折り畳まれた（例えば、ヘアピンを介して）一本の核酸鎖によって形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに完全な二重鎖を形成する、２つの共有結合的に分離している核酸鎖を含む。しかし、いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に二重鎖を形成する、例えば、一方の末端部で、又は両方の末端部でオーバーハングを有する、２つの共有結合的に分離している核酸鎖を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に相補的であり、ゆえに内在的なミスマッチ又は末端のミスマッチを含み得る１つ以上のミスマッチを有する場合がある、ヌクレオチドの逆平行配列を含む。
二重鎖：本明細書で使用される場合、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関して「二重鎖」という用語は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的な塩基対合により形成される構造を指す。
賦形剤：本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、例えば、所望の稠度又は安定化効果を与えるか又はこれらに寄与するために組成物中に含めることができる非治療的物質を指す。
グリア細胞：本明細書で使用される場合、「グリア細胞」及び「神経膠細胞」という用語は、本明細書では同じ意味で用いられ、恒常性を維持するために援助又は栄養を与えるか、恒常性を維持するように働く、神経系における非神経性前駆体及び／又は完全に分化した細胞を指す。グリア細胞の例としては、上衣細胞、希突起膠細胞、星状膠細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、及び腸管グリア細胞などが挙げられる。グリア細胞は、神経発火頻度、脳の適応性、及び免疫応答を調節することがこれまでに確認されている。
ループ：本明細書で使用される場合、「ループ」という用語は、互いに十分に相補的な核酸の２つの逆平行領域によって挟まれている核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の不対合領域であって、適切なハイブリダイゼーション条件下（例えば、ホスフェート緩衝液中、細胞内）で、不対合領域を挟んだ２つの逆平行領域がハイブリダイズして二重鎖（「ステム」と呼ばれる）を形成する、核酸の不対合領域を指す。
修飾ヌクレオチド間結合：本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド間結合」という用語は、ホスホジエステル結合を含む参照ヌクレオチド間結合と比較して１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、天然に存在しない結合である。典型的には、修飾ヌクレオチド間結合は、修飾ヌクレオチド間結合が存在する核酸に、１つ以上の望ましい特性を与える。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、バイオアベイラビリティ、生物活性、免疫原性の低下などを改善することができる。
修飾ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」という用語は、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド及びチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する参照ヌクレオチドと比較して、１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、及び／又はホスフェート基に１つ以上の化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドと結合された１つ以上の化学的部位を有する。典型的には、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に、１つ以上の望ましい特性を与える。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、バイオアベイラビリティ、生物活性、免疫原性の低下などを改善することができる。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース環の２′位に２′－Ｏ－メチル又は２′－Ｆ置換を含む。
ニックを有するテトラループ構造：「ニックを有するテトラループ構造」は、別々のセンス（パッセンジャー）鎖及びアンチセンス（ガイド）鎖の存在を特徴とするＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造であって、センス鎖はアンチセンス鎖に対する相補性領域を有することにより２つの鎖が二重鎖を形成し、鎖の少なくとも一方、一般的にセンス鎖が二重鎖から伸長し、伸長部分がテトラループとテトラループに隣接するステム領域を形成する２つの自己相補的配列とを含み、テトラループが、少なくとも一方の鎖の自己相補的配列によって形成された隣接するステム領域を安定化するように構成されているような、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造を指す。
神経細胞：「神経細胞」という用語は、一般的に、神経系の構造的及び機能的単位を指し、中枢神経系及び末梢神経系に存在する。神経系の伝導細胞として機能する神経細胞は、化学的シグナル及び／又は電気的シグナルを送受信する。神経細胞の３つの一般的な部類には、感覚ニューロン、運動ニューロン、及び介在ニューロンが含まれる。いくつかの実施形態では、神経細胞は、例として、限定はされないが、神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ又はγエノラーゼ）、神経核（ＮｅｕＮ又はＦｏｘ３）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ－２）、チューブリンβＩＩＩ（ＴＵＢＢ３）、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、及びｃ－ｆｏｓなどを含む特定の神経細胞特異的マーカーの発現によって非神経グリア細胞と区別される場合がある。いくつかの実施形態では、神経細胞の臨床マーカーとしては、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）及びチロシンヒドロキシラーゼが挙げられる。中枢神経系又は末梢神経系の領域に特異的なその他の神経細胞マーカー、例えば、カルビンジン－Ｄ２８Ｋ、カルレチニン、及びニューロフィラメントタンパク質（ＮＦＰ）も使用することができる。
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、長さが１００オリゴヌクレオチド未満の短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び／又は例えば、修飾リボヌクレオチドを含む修飾ヌクレオチドを含む場合がある。オリゴヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってよい。オリゴヌクレオチドは、二重鎖領域を有していても、有していなくてもよい。非限定的例のセットとして、オリゴヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短ｓｉＲＮＡ、又は一本鎖ｓｉＲＮＡであってもよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
オーバーハング：本明細書で使用される場合、「オーバーハング」という用語は、１つの鎖又は領域が、その１つの鎖又は領域が二重鎖を形成する相補鎖の末端を超えて伸長することから生じる末端の非塩基対ヌクレオチド（複数可）を指す。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、二本鎖オリゴヌクレオチドの５′末端又は３′末端で、二重鎖領域から伸長する１個以上の不対合ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、オーバーハングは、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖又はセンス鎖上の３′又は５′オーバーハングである。
ホスフェートアナログ：本明細書で使用される場合、「ホスフェートアナログ」という用語は、ホスフェート基の静電特性及び／又は立体特性を模倣する化学的部位を指す。いくつかの実施形態では、ホスフェートアナログは、しばしば酵素的除去を受けやすい５′ホスフェートの代わりにオリゴヌクレオチドの５′末端ヌクレオチドに配置される。いくつかの実施形態では、５′ホスフェートアナログはホスファターゼ耐性結合を含む。ホスフェートアナログの例としては、５′メチレンホスホネート（５′－ＭＰ）及び５′－（Ｅ）－ビニルホスホネート（５′－ＶＰ）などの５′ホスホネートが挙げられる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５′末端ヌクレオチドで糖の４′位の炭素にホスフェートアナログ（「４′ホスフェートアナログ」と呼ぶ）を有する。４′ホスフェートアナログの例には、オキシメチル基の酸素原子が糖部分に（例えば、その４′位の炭素で）結合したオキシメチルホスホネート、又はそのアナログがある（例えば、国際特許公報第ＷＯ／２０１８／０４５３１７号を参照されたく、そのホスフェートアナログに関連する内容は、参照により本明細書に援用される）。オリゴヌクレオチドの５′末端の他の修飾も開発されている（例えば、国際特許公報第ＷＯ２０１１１３３８７１号、米国特許第８，９２７，５１３号、Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１５，４３（６）：２９９３－３０１１を参照されたく、ホスフェートアナログに関するこれらのそれぞれの内容は、参照により本明細書に援用される）。
発現の低下：本明細書で使用される場合、ある遺伝子の「発現の低下」という用語又はその同義語は、適切な参照細胞又は対象と比較した、その遺伝子によってコードされるＲＮＡ転写産物又はタンパク質の量の減少、及び／又は細胞又は対象におけるその遺伝子の活性量の減少を指す。例えば、細胞を二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、標的ｍＲＮＡ配列と相補的なアンチセンス鎖を有するもの）で処理する行為は、二本鎖オリゴヌクレオチドで処理されていない細胞と比較して、ＲＮＡ転写産物、タンパク質、及び／又は酵素活性（例えば、標的遺伝子によってコードされる）の量の減少をもたらし得る。同様に、本明細書で使用される「発現の低下」は、遺伝子（例えば、標的遺伝子）の発現の低下をもたらす行為を指す。
相補性領域：本明細書で使用される場合、「相補性領域」という用語は、ヌクレオチドの逆平行配列（例えば、ｍＲＮＡ内の標的ヌクレオチド配列）と十分に相補的であることにより、例えば、ホスフェート緩衝液中、細胞内などの適当なハイブリダイゼーション条件下で２つのヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションを可能にするような、核酸のヌクレオチド配列（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド）を指す。相補性領域は、ヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ又はその一部内に存在する標的ヌクレオチド配列）と完全に相補的であり得る。例えば、ｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列と完全に相補的な相補性領域は、ミスマッチ又はギャップのない、ｍＲＮＡの対応する配列と相補的なヌクレオチドの連続した配列を有する。あるいは、相補性領域は、ヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ又はその一部に存在するヌクレオチド配列）と部分的に相補的であってもよい。例えば、ｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列と部分的に相補的な相補性領域は、ｍＲＮＡにおける対応する配列と相補的であるが、相補性領域が適切なハイブリダイゼーション条件下で、ｍＲＮＡとハイブリダイズする能力を維持することを前提として、ｍＲＮＡの対応する配列と比較して１つ以上のミスマッチ又はギャップ（例えば、１、２、３つ以上のミスマッチ又はギャップ）を含む、ヌクレオチドの連続した配列を有する。
リボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」という用語は、そのペントース糖として、２′位にヒドロキシル基を有するリボースを有するヌクレオチドを指す。修飾リボヌクレオチドとは、リボース、ホスフェート基又は塩基の修飾又は置換を含む、２′位以外の原子の１つ以上の修飾又は置換を有するリボヌクレオチドである。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」という用語は、（ａ）センス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部が、標的ｍＲＮＡの切断の際にアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼによって使用される二本鎖オリゴヌクレオチド、又は（ｂ）１本のアンチセンス鎖を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであって、そのアンチセンス鎖（又はそのアンチセンス鎖の一部）が、標的ｍＲＮＡの切断の際にＡｇｏ２エンドヌクレアーゼによって使用される一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを指す。
選択的低下：本明細書で使用される場合、ある遺伝子の「選択的低下」という用語又はその同義語は、適切な参照細胞又は対象と比較した、その遺伝子によってコードされるＲＮＡ転写物又はタンパク質の量の優先的減少及び／又は目的の細胞におけるその遺伝子の活性量の減少を指し、この際、目的の細胞のその遺伝子及び参照細胞又は対象におけるコンパレータ遺伝子は、同じ遺伝子又は異なる遺伝子である。いくつかの実施形態では、目的の細胞における遺伝子の発現は、目的の細胞に特異的であり、かつ参照細胞におけるコンパレータ遺伝子の発現は、参照細胞に特異的である。
鎖：本明細書で使用される場合、「鎖」という用語は、ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合）を介して互いに連結されたヌクレオチドの一本の連続した配列を指す。いくつかの実施形態では、鎖は、２つの自由末端、例えば、５′末端及び３′末端を有する。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である。「個人」又は「患者」という用語は、「対象」と同じ意味で用いられる場合がある。
合成：本明細書で使用される場合、「合成」という用語は、人工的に合成された（例えば、機械（例えば、固体核酸合成装置）を使用して）、又はその分子を通常生成する天然のソース（例えば、細胞又は生物）に由来していない核酸又は他の分子を指す。
標的化リガンド：本明細書で使用される場合、「標的化リガンド」という用語は、目的の組織又は細胞の同族分子（例えば、受容体）に選択的に結合される分子（例えば、炭化水素、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質）、及び目的の組織又は細胞に対して他の物質を標的化させる目的で別の物質と結合可能な分子を指す。例えば、いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、特定の細胞又は目的の細胞に対してオリゴヌクレオチドを標的化させる目的でオリゴヌクレオチドと結合され得る。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、細胞表面受容体に選択的に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、オリゴヌクレオチドと結合される場合に、細胞の表面に発現している受容体への選択的結合、ならびにオリゴヌクレオチド、標的化リガンド、及び受容体で構成される複合体の細胞によるエンドソーム内在化を介して、特定の細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、細胞内在化後、又は細胞内在化中に切断されて、それにより、細胞内で標的化リガンドからオリゴヌクレオチドを放出するようなリンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合される。
テトラループ：本明細書で使用される場合、「テトラループ」という用語は、ヌクレオチドのフランキング配列のハイブリダイゼーションによって形成される隣接する二重鎖の安定性を強化させるループを指す。安定性の増加は、ランダムに選択されたヌクレオチド配列からなる同等の長さのループのセットの平均として予想される隣接したステム二重鎖のＴmよりも高い、隣接したステム二重鎖の融解温度（Ｔm）の上昇として検出可能である。例えば、テトラループは、長さが少なくとも２塩基対の二重鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭのＮａＨＰＯ4中で、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、又は少なくとも７５℃の融解温度をもたらし得る。いくつかの実施形態では、テトラループは、スタッキング相互作用によって、隣接したステム二重鎖の塩基対を安定化させることができる。更に、テトラループ内のヌクレオチド間の相互作用としては、限定されるものではないが、非Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用を含む（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９０；３４６（６２８５）：６８０－２、Ｈｅｕｓ ａｎｄ Ｐａｒｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５３（５０１６）：１９１－４）。いくつかの実施形態では、テトラループは、３個～６個のヌクレオチドを含むか、又はそれからなり、典型的には４～５個のヌクレオチドである。特定の実施形態では、テトラループは、修飾されていても、されていなくてもよい（標的化部位と結合されていても、されていなくてもよい）、３個、４個、５個、又は６個のヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、テトラループは、４個のヌクレオチドからなる。任意のヌクレオチドが、テトラループにて使用されてよく、Ｃｏｒｎｉｓｈ－Ｂｏｗｄｅｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８５，１３：３０２１－３０３０に記載されているようなヌクレオチドに対する標準的なＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ記号が使用されてよい。例えば、文字「Ｎ」は、任意の塩基がその位置にあり得ることを意味するために使用することができ、文字「Ｒ」は、Ａ（アデニン）又はＧ（グアニン）がその位置にあり得ることを示すために使用することができ、「Ｂ」は、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、又はＴ（チミン）がその位置にあり得ることを示すために使用できる。テトラループの例としては、ＵＮＣＧファミリーのテトラループ（例、ＵＵＣＧ）、ＧＮＲＡファミリーのテトラループ（例、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられる（Ｗｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，１９９０，８７（２１）：８４６７－７１；Ａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９１，１９（２１）：５９０１－５）。ＤＮＡテトラループの例としては、ｄ（ＧＮＮＡ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、ｄ（ＧＮＲＡ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＧＮＡＢ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＣＮＮＧ）ファミリーのテトラループ、及びｄ（ＴＮＣＧ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。例えば、それらの関連する開示が参照により本明細書に援用される、Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（４８）：１４２８１－２９２；Ｓｈｉｎｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｐｐｏｎ Ｋａｇａｋｋａｉ Ｋｏｅｎ Ｙｏｋｏｓｈｕ，２０００，７８（２）：７３１を参照されたい。いくつかの実施形態では、テトラループは、ニックを有するテトラループ構造内に含まれる。
治療、治療法、又は治療すること：本明細書で使用される場合、「治療」、「治療法」、又は「治療すること」という用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。その効果は、その疾患又は症状を完全に又は部分的に予防するという観点において予防的であり得、及び／又は疾患及び／又はその疾患に起因する副作用の部分的又は完全な治癒という観点において治療的であり得る。本明細書で使用される「治療法」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）その疾患にかかりやすいが、まだその疾患であると診断されていない対象における発病を予防すること、（ｂ）その疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、及び（ｃ）その疾患を軽減すること、例えば、その疾患の退行を引き起こすこと、その疾患の症状を完全に又は部分的に取り除くことを含む。
ＩＩ．選択的送達及びグリア細胞におけるＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現低下のためのオリゴヌクレオチド
本開示は、干渉オリゴヌクレオチドの選択的送達又はグリア細胞で発現する標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための組成物及び方法に関し、特に、対象の神経系のグリア細胞への選択的送達、又は該グリア細胞で発現する標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下に関する。上述のように、ＧａｌＮＡｃ残基で修飾した干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）の神経系への投与が、神経細胞で特異的に発現する標的ｍＲＮＡのレベルの低下と比較して、グリア細胞で特異的に発現する標的ｍＲＮＡのレベルの驚くべき選択的低下をもたらすことを本明細書で示す。場合によっては、グリア細胞で発現するｍＲＮＡの減少に対する選択性は、神経細胞で発現するｍＲＮＡの発現の低下（例えば、約４０％の低下）よりも、ほぼ２倍高い（例えば、８０％を超える低下）。オリゴヌクレオチド上のＧａｌＮＡｃリガンドは、肝臓における選択的取り込みのためにオリゴヌクレオチドを標的化させることが知られており、本出願の結果は、そのような修飾オリゴヌクレオチドが神経細胞における標的ＲＮＡのレベルの低下よりも、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを選択的に低下させることを示している。肝性のアシアロ糖タンパク受容体に対するＧａｌＮＡｃの既知の特異性及びＧａｌＮＡｃ修飾オリゴヌクレオチドの対照的な選択的活性は、グリア細胞における選択的取り込み及び／又はグリア細胞で発現するＲＮＡのレベルの選択的低下は、ＧａｌＮＡｃリガンドの存在を伴わずに実現できることを示している。
本開示は、干渉オリゴヌクレオチドの選択的送達又はグリア細胞で発現する標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための組成物及び方法に関し、特に、対象の神経系のグリア細胞への選択的送達、又は該グリア細胞で発現する標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下に関する。上述のように、ＧａｌＮＡｃ残基で修飾した干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）の神経系への投与が、神経細胞で特異的に発現する標的ｍＲＮＡのレベルの低下と比較して、グリア細胞で特異的に発現する標的ｍＲＮＡのレベルの驚くべき選択的低下をもたらすことを本明細書で示す。場合によっては、グリア細胞で発現するｍＲＮＡの減少に対する選択性は、神経細胞で発現するｍＲＮＡの発現の低下（例えば、約４０％の低下）よりも、ほぼ２倍高い（例えば、８０％を超える低下）。オリゴヌクレオチド上のＧａｌＮＡｃリガンドは、肝臓における選択的取り込みのためにオリゴヌクレオチドを標的化させることが知られており、本出願の結果は、そのような修飾オリゴヌクレオチドが神経細胞における標的ＲＮＡのレベルの低下よりも、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを選択的に低下させることを示している。肝性のアシアロ糖タンパク受容体に対するＧａｌＮＡｃの既知の特異性及びＧａｌＮＡｃ修飾オリゴヌクレオチドの対照的な選択的活性は、グリア細胞における選択的取り込み及び／又はグリア細胞で発現するＲＮＡのレベルの選択的低下は、ＧａｌＮＡｃリガンドの存在を伴わずに実現できることを示している。
ａ．オリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドの選択的送達の方法又はグリア細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを選択的に低下する方法は、グリア細胞を、グリア細胞で発現するＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルを低下させることができるオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドの選択的送達の方法又はグリア細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを選択的に低下する方法は、グリア細胞を、グリア細胞で発現するＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルを低下させることができるオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡに対する相補性領域を含む。いくつかの実施形態では、相補性領域は、長さが少なくとも１２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、相補性領域は、長さが少なくとも１５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、相補性領域は、長さが少なくとも１９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、相補性領域は、長さが１２～３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、相補性領域は、長さが１９～２３ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２～６０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２～５８ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、該センス鎖及び該アンチセンス鎖は、二重鎖を形成することができ、該アンチセンス鎖は、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡ配列に対する相補性領域を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖は、第１の二重鎖（Ｄ１）と呼ばれる。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを低下させることができる。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、長さが１５～４０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、センス鎖は、長さが１９～４０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、センス鎖は、長さが１２～３６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、センス鎖は、長さが１７～３６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、センス鎖は、長さが１９～２３ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが最大５０ヌクレオチド（例えば、長さが最大４０、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、又は最大１９ヌクレオチド）である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが１２～３６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが１７～３６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが１５～３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが１９～２９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが１９～２７ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが２１～２７ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが２１～２３ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖は、第１の二重鎖又はＤ１とも呼ばれ、長さが１２～３０ヌクレオチド（例えば、１２～３０、１２～２７、１５～２５、２１～２６、１８～３０、又は１９～３０ヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖の長さは、少なくとも１２ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、又は少なくとも２５ヌクレオチド長）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖の長さは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖によって形成される二重鎖は、長さが１２～２１塩基対である。いくつかの実施形態では、二重鎖は、長さが１３～２０、１４～２０、１５～２０、１６～２０、１７～２０、１８～２０、又は１９～２０塩基対である。いくつかの実施形態では、二重鎖は、長さが１２～２３、１２～２２、１２～２１、１２～２０、１２～１９、１２～１８、１２～１７、１２～１６、１２～１５、１２～１４、又は１２～１３塩基対である。いくつかの実施形態では、二重鎖は、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０塩基対長である。いくつかの実施形態では、二重鎖領域は、長さが少なくとも１９塩基対である。いくつかの実施形態では、二重鎖は、長さが２０塩基対である。いくつかの実施形態では、二重鎖は、長さが２１塩基対である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖との間に相補性領域を有する。いくつかの実施形態では、相補性領域は、長さが１２～３０ヌクレオチドである場合がある。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の相補性領域は、少なくとも１２ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、又は少なくとも２５ヌクレオチド長）である。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の相補性領域は、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の相補性領域は、長さが１２～３０、１２～２７、１２～２２、１５～２５、１５～２３、２１～２６、２０～２３、１８～３０又は１９～３０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖を有するオリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖との間に１つ以上（例えば、１、２、３、４、５つ）のミスマッチを有する。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、適切なハイブリダイゼーション条件下で二重鎖を形成する能力を維持することが前提で、最大１、最大２、最大３、最大４、最大５つなどのミスマッチを有することができる。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の２つ以上のミスマッチが存在する場合、それらは、オリゴヌクレオチドが適切なハイブリダイゼーション条件下で二重鎖を形成する能力を維持することが前提で、連続して配置されるか（例えば、２、３つ以上続けて）、又は相補性領域の全体を通して間隔を空けて配置されてよい。いくつかの実施形態では、第１の二重鎖（Ｄ１）は、１つ以上のミスマッチを含む。
いくつかの実施形態では、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡに対するアンチセンス配列の相補性領域は、長さが少なくとも１２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡに対するアンチセンス配列の相補性領域は、長さが少なくとも１５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡに対するアンチセンス配列の相補性領域は、長さが少なくとも１９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡに対する配列の相補性領域は、長さが少なくとも２１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、相補性領域は、長さが少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、長さが１２～３０（例えば、１２～３０、１２～２２、１５～２５、１７～２１、１８～２７、１９～２７、又は１５～３０）ヌクレオチドの範囲である、標的ＲＮＡに対する相補性領域を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドである、標的ＲＮＡに対する相補性領域を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書にて開示するオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ上の配列と完全に相補的な相補性領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上の）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの相補性領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上の）は、長さが１２～３０（例えば、１２～２５、１２～２０、１２～１８、１２～１６、１２～１４、１４～２０、１４～１８、１４～１６、１６～２０、１６～１８、又は１８～３０）ヌクレオチドの範囲の標的ＲＮＡ配列のヌクレオチドの連続した配列と相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの相補性領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上の）は、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３連続ヌクレオチドである、標的ＲＮＡ配列のヌクレオチドの連続した配列と相補的である。
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ配列に対する相補性領域は、標的ＲＮＡの対応する配列と比較して、１つ以上のミスマッチを有する場合がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下で標的ＲＮＡ配列と相補的な塩基対を形成する能力を維持することが前提で、最大１、最大２、最大３、最大４、最大５個などのミスマッチを有することができる。あるいは、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下で標的ＲＮＡ配列と相補的な塩基対を形成する能力を維持することが前提で、１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、又は５つ以下のミスマッチを有することができる。いくつかの実施形態では、相補性領域に２つ以上のミスマッチが存在する場合、それらは、オリゴヌクレオチドが適切なハイブリダイゼーション条件下で標的ＲＮＡ配列と相補的な塩基対を形成する能力を維持することが前提で、連続して配置されるか（例えば、２、３、４つ以上続けて）、又は相補性領域の全体を通して間隔を空けて配置されてよい。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、多型配列を伴う遺伝子の対立遺伝子によって発現するＲＮＡ間の区別を強化するか、又は標的ＲＮＡの発現を低下させる活性を強化するために、標的ＲＮＡの配列とのヌクレオチドミスマッチを有する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ステムループ配列又は構造物を更に含み、該ステムループ配列又は構造は、配列領域Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を含み、ここで、Ｓ１は、Ｓ２と相補的であり、かつ第２の二重鎖（Ｄ２）を形成することができ、Ｌは、Ｓ１及びＳ２が第２の二重鎖（Ｄ２）を形成する場合に形成される。いくつかの実施形態では、センス鎖は、その５′末端にステムループ配列又はヘアピンを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、その３′末端にステムループ配列を含む。好ましくは、いくつかの実施形態では、センス鎖は、その３′末端にステムループ配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の二重鎖Ｄ２は、様々な長さとすることができる。いくつかの実施形態では、第２の二重鎖／Ｄ２は、長さが１～６塩基対である。いくつかの実施形態では、第２の二重鎖／Ｄ２は、長さが２～６、３～６、４～６、５～６、１～５、２～５、３～５、又は４～５塩基対である。いくつかの実施形態では、第２の二重鎖／Ｄ２は、長さが１、２、３、４、５、又は６塩基対である。いくつかの実施形態では、Ｓ１配列は、標的ＲＮＡの配列及び標的ＲＮＡのＳ２配列アンチセンス配列を含み、ここで、Ｓ１及びＳ２は、二重鎖を形成する。いくつかの実施形態では、Ｓ１及びＳ２配列は、標的ＲＮＡ配列に関連のない人工配列である。いくつかの実施形態では、第２の二重鎖は、完全に相補的である。いくつかの実施形態では、第２の二重鎖は、１つ以上のミスマッチを含む場合がある。いくつかの実施形態では、Ｓ１及びＳ２の配列は、ループＬの形成を安定化するように選択される。例示的なＳ１配列は、ＧＣＡＧＣＣ及びその対応するＳ２配列ＧＧＣＵＧＣである。
いくつかの実施形態では、ステムループ配列におけるループＬは、長さが最大３０ヌクレオチドである場合がある。いくつかの実施形態では、ループＬは、長さが最大１０、１５、２０又は２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ループＬは、長さが３～６ヌクレオチド、３～６ヌクレオチド、３～５ヌクレオチド、又は３～４ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、Ｌは、本明細書に記載するようなテトラループ、ペンタループ、又はトリループである。いくつかの実施形態では、テトラループは、長さが４ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、Ｌの配列は、Ｓ１及びＳ２が第２の二重鎖を形成する場合に形成されるループ構造物を安定化させるために選択される。いくつかの実施形態では、Ｌは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、Ｌのヌクレオチドのうち１個以上が、修飾される。更に後述するように、いくつかの実施形態では、Ｌは、ＵＮＣＧ、ＧＡＡＡ、ＣＵＵＧ、ｄ（ＧＮＮＡ）、ｄ（ＧＮＲＡ） ｄ（ＧＮＡＢ）、ｄ（ＣＮＮＧ）、及びｄ（ＴＮＣＧ）と記載される配列であり、この際、Ｎは任意のヌクレオチドを表す。いくつかの実施形態では、ＮはＵ、Ａ、Ｃ、Ｇのうち任意の１つであり、Ｒは、Ｇ又はＡである。いくつかの実施形態では、Ｌは、ＧＡＡＡと記載される配列である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のオーバーハングのあるヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、オーバーハングのあるヌクレオチドは、センス鎖又はアンチセンス鎖上にあるか、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖上にある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１ヌクレオチド以上の３′オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、長さが１ヌクレオチド以上の３′オーバーハングは、アンチセンス鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖に存在する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１ヌクレオチド以上の５′オーバーハング配列を含む。いくつかの実施形態では、長さが１ヌクレオチド以上の５′オーバーハングは、アンチセンス鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖に存在する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、その３′末端に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８個以上の一本鎖ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、その３′末端に、２、３、４、５、６、７、８個以上の一本鎖ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、その５′末端に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８個以上の一本鎖ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、その５′末端に、２、３、４、５、６、７、８個以上の一本鎖ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、長さが１ヌクレオチド以上の５′オーバーハング（例えば、５′末端に２ヌクレオチドのオーバーハング）及び長さが１ヌクレオチド以上の３′オーバーハング（例えば、３′末端に２ヌクレオチドのオーバーハング）を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１又は２ヌクレオチドの３′オーバーハング配列を含み、該３′オーバーハング配列は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に存在する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖及び２１ヌクレオチドのセンス鎖を有し、センス鎖の３′末端及びガイドアンチセンス鎖の５′末端は、平滑末端を形成し、かつ、この際、アンチセンス鎖は、２ヌクレオチドの３′オーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２２ヌクレオチドのアンチセンス鎖及び２０ヌクレオチドのセンス鎖を有し、センス鎖の３′末端及びアンチセンス鎖の５′末端は、平滑末端を形成し、かつ、この際、アンチセンス鎖は、２ヌクレオチドの３′オーバーハングを有する。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、非対称構造を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが３６ヌクレオチドのセンス鎖、及びその３′末端に２ヌクレオチドの３′オーバーハングを有する長さが２２ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む非対称構造を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが３７ヌクレオチドのセンス鎖、及びその３′末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する長さが２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む非対称構造を有する。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、別々のオリゴヌクレオチドである。言い換えればセンス鎖及びアンチセンス鎖は、共有結合的に連結していない。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二本鎖が形成する際にセンス鎖とアンチセンス鎖との間にギャップ又はニックを含む二本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、該センス鎖は、構造物Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有するステムループ配列を更に含み、ニック又はギャップは、センス鎖のＳ２領域に存在する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、単一のオリゴヌクレオチドであり、ここで、センス鎖及びアンチセンス鎖は、共有結合的に連結され、単一のオリゴヌクレオチドを形成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、該センス鎖は、領域Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有するステムループ配列を更に含み、該アンチセンス鎖は、センス鎖と共有結合的に連結され、例えば、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド間結合によってセンス鎖のＳ２領域を連結される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ及び／又はヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの耐性を増強させ、ハイブリダイゼーション効率を増加させ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ安定性を強化させる手段を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、ホスファターゼ及び／又はヌクレアーゼに対するセンス鎖の耐性を増強させ、ハイブリダイゼーション効率を増加させ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ安定性を強化させる手段を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ホスファターゼ及び／又はヌクレアーゼに対するアンチセンス鎖の耐性を増強させ、ハイブリダイゼーション効率を増加させ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ安定性を強化させる手段を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンスは、ハイブリダイゼーション効率を増加させ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ安定性を強化させる、ホスファターゼ及び／又はヌクレアーゼに対する手段を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドがステムループ配列を含む場合、ステムループ配列は、ホスファターゼ及び／又はヌクレアーゼに対する耐性を増強させ、ハイブリダイゼーション効率を増加させ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ安定性を強化させる手段を含む。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ及び／又はヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの耐性を増強させ、ハイブリダイゼーション効率を増加させ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ安定性を強化させる手段は、とりわけ、更に本明細書に記載するように、糖残基、５′末端ホスフェート、ヌクレオシド間結合、及び核酸塩基に対する修飾を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドのうち少なくとも１つが修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドのうち１個以上が修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの実質的に全て（例えば、９０％以上）、又は全てのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の少なくとも１個のヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の少なくとも１個のヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上が修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の全てのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上が修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の少なくとも５′末端ヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の少なくとも３′末端ヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の少なくとも５′末端ヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の少なくとも３′末端ヌクレオチドが修飾される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの５′末端ホスフェートが、例えば、ホスファターゼ及びその他の酵素の作用を制限するために、ホスホロチオエート又は４′ホスホン酸アナログなどのホスフェートアナログで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の５′末端ホスフェートは、例えば、ホスホロチオエート又は４′ホスホン酸アナログなどのホスフェートアナログで修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の５′末端ホスフェートは、例えば、ホスホロチオエート又は４′ホスホン酸アナログなどのホスフェートアナログで修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の５′ヌクレオチドの糖の４′炭素は、ホスフェートアナログを含む。いくつかの実施形態では、ホスフェートアナログは、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニホスホネート（ｍａｌｏｎｙｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、更に本明細書に記載するような、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、定義付けられた領域又はパターンでオリゴヌクレオチドに存在する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、センス鎖の５′末端で１～４ヌクレオチドの範囲であるか、及び／又はセンス鎖の３′末端で１～４ヌクレオチドの範囲である。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、アンチセンス鎖の５′末端で１～４ヌクレオチドの範囲であるか、及び／又はアンチセンス鎖の３′末端で１～４ヌクレオチドの範囲である。
いくつかの実施形態では、センス鎖の（５′末端から）位置１及び位置２のヌクレオチド間のヌクレオチド間結合は、修飾ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の（５′末端から）位置１及び位置２、ならびに位置２及び位置３、更に任意選択で位置３及び位置４のヌクレオチド間のヌクレオチド間結合は、修飾ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３′末端の最後の２、好ましくは最後の３ヌクレオチド間のヌクレオチド間結合は、修飾ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエートである。例えば、長さが２２ヌクレオチドのアンチセンス鎖の場合、位置２０及び位置２１、ならびに位置２１及び位置２２のヌクレオチド間のヌクレオチド間結合は、修飾ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエートを有する。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、糖部分の修飾、例えば、２′修飾を含む。いくつかの実施形態では、２′修飾は、２′－フルオロ又は２′－Ｏ－メチルである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも５′末端ヌクレオチドは、２′－フルオロ又は２′－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも３′末端ヌクレオチドは、２′－フルオロ又は２′－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の少なくとも５′末端ヌクレオチドは、２′－フルオロ又は２′－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の少なくとも３′末端ヌクレオチドは、２′－フルオロ又は２′－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の少なくとも５′末端ヌクレオチドは、２′－フルオロ又は２′－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の少なくとも３′末端ヌクレオチドは、２′－フルオロ又は２′－Ｏ－メチルで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上は、糖部分の２′修飾を有する。いくつかの実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの全ては、糖部分の２′修飾を有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上は、糖部分の２′修飾を有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、糖部分の２′修飾を有する。糖部分のその他の２′修飾、例えば、２′－Ｏ－メチルの代わりについては、以下にてより詳細に説明する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの５０％未満から約１０％は、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する。いくつかの実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの５０％未満から約１０％は、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドの５０％未満から約１０％は、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する。前述の実施形態において、オリゴヌクレオチドの残りのヌクレオチドは、２′－Ｏ－プロパルギル、２′－Ｏ－プロピルアミン、２′－アミノ、２′－エチル、２′－アミノエチル（ＥＡ）、２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）、２′－Ｏ－メトキシエチル（２′－ＭＯＥ）、２′－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２′－Ｏ－ＮＭＡ）、及び２′－デオキシ－２′－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２′－ＦＡＮＡ）、好ましくは２－Ｏ－メチルで修飾された糖部分を有する。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、長さが１９～２１ヌクレオチドであり、かつヌクレオチド位置７～１１に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する１個以上のヌクレオチド～最大４個のヌクレオチドを有し、好ましくはヌクレオチド位置９、１０、１１に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する１個以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド位置９、１０、１１に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有する。前述の実施形態において、センススタンドの残りのヌクレオチドは、２′－Ｏ－プロパルギル、２′－Ｏ－プロピルアミン、２′－アミノ、２′－エチル、２′－アミノエチル（ＥＡ）、２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）、２′－Ｏ－メトキシエチル（２′－ＭＯＥ）、２′－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２′－Ｏ－ＮＭＡ）、及び２′－デオキシ－２′－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２′－ＦＡＮＡ）、好ましくは２－Ｏ－メチルで修飾された糖部分を有する。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが２１～２３ヌクレオチドであり、かつヌクレオチド位置１、２、３、５、６、７、１０、１４、及び１６に、好ましくは、ヌクレオチド位置２、５、６、１４、及び１６に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する１個以上のヌクレオチド～最大６個、最大５個、最大４個、又は最大３個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置５もしくは１４に、又はヌクレオチド位置５及び１４の両方に、少なくとも２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置２、５及び１４に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有し、及び任意選択でヌクレオチド位置１、３、６、７、１０、及び１６に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する最大３個のヌクレオチドを有する。前述の実施形態において、アンチセンス鎖の残りのヌクレオチドは、２′－Ｏ－プロパルギル、２′－Ｏ－プロピルアミン、２′－アミノ、２′－エチル、２′－アミノエチル（ＥＡ）、２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）、２′－Ｏ－メトキシエチル（２′－ＭＯＥ）、２′－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２′－Ｏ－ＮＭＡ）、及び２′－デオキシ－２′－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２′－ＦＡＮＡ）、好ましくは２－Ｏ－メチルで修飾された糖部分を有する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖及び鎖を含み、かつステムループ配列Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を更に含み、ここで、Ｌはテトラループ又はトリループである。いくつかの実施形態において、Ｓ１及びＳ２領域のヌクレオチドの全ては、２′－Ｏ－プロパルギル、２′－Ｏ－プロピルアミン、２′－アミノ、２′－エチル、２′－アミノエチル（ＥＡ）、２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）、２′－Ｏ－メトキシエチル（２′－ＭＯＥ）、２′－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２′－Ｏ－ＮＭＡ）、及び２′－デオキシ－２′－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２′－ＦＡＮＡ）、好ましくは２－Ｏ－メチルで修飾された糖部分を有する。いくつかの実施形態では、Ｌ配列の５′末端ヌクレオチドは、２′－Ｏ－メチルによる糖部分の修飾を有し、Ｌの残りのヌクレオチドは、更に後述するように標的化リガンドを有する。いくつかの実施形態では、Ｌ配列のヌクレオチドの全ては、標的化リガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃを有する。
いくつかの実施形態では、選択的送達又はグリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされるＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のためのオリゴヌクレオチドは、任意選択で１つ以上の標的化リガンド又は部位で修飾される。いくつかの実施形態では、選択的送達又はグリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされるＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のためのオリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的化リガンド又は部位を更に含む。いくつかの実施形態では、標的化リガンド又は部位は、炭化水素、アミノ糖、コレステロール、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質の一部（例えば、抗体又は抗体フラグメント）又は脂質から選択される。いくつかの実施形態では、標的化リガンド又は部位は、１つ以上のＧａｌＮＡｃ残基又は部位である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個以上のヌクレオチドは、それぞれ、別々の標的化リガンドに結合される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの１、２、３、４、５又は６個のヌクレオチドのそれぞれは、標的化リガンドに結合される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの２～４個のヌクレオチドは、それぞれ、別々の標的化リガンドに結合される。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端で２～４個のヌクレオチドに結合される（例えば、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖の５′又は３′末端の２～４ヌクレオチドのオーバーハング又は伸長部に結合される）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５′又は３′末端のいずれかでステムループ配列を含んでよく、かつステムのループの１、２、３、又は４個のヌクレオチドが、標的化リガンドに個別に結合されてよい。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃに結合されない。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一価のＧａｌＮＡｃに直接的又は間接的に結合される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２つ以上の一価のＧａｌＮＡｃに直接的又は間接的に結合される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２、３、又は４つの一価のＧａｌＮＡｃ部位に直接的又は間接的に結合され、かつ典型的には、３又は４つの一価のＧａｌＮＡｃ部位に結合される。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の二価のＧａｌＮＡｃ、三価のＧａｌＮＡｃ、又は四価のＧａｌＮＡｃ部位に結合される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個以上のヌクレオチドのそれぞれは、ＧａｌＮＡｃ部位に結合される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのテトラループの１、２、３、４、５又は６個のヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ部位に結合される。いくつかの実施形態では、テトラループの２～４個のヌクレオチドは、それぞれ、別々のＧａｌＮＡｃに結合される。いくつかの実施形態では、トリループの１～３個のヌクレオチドは、それぞれ、別々のＧａｌＮＡｃに結合される。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端で２～４個のヌクレオチドに結合される（例えば、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖の５′又は３′末端の２～４ヌクレオチドのオーバーハング又は伸長部に結合される）。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部位は、センス鎖のヌクレオチドに結合される。代表的実施形態において、４つのＧａｌＮＡｃ部位は、センス鎖のテトラループのヌクレオチドに結合され得、この際、各ＧａｌＮＡｃ部位は、１個のヌクレオチドに結合される。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、グアニジンヌクレオチドに結合した一価のＧａｌＮＡｃを含み、これは、［ａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ］また２′－アミノジエトキシメタノール－グアニジン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれ、以下のように表される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アデニンヌクレオチドに結合した一価のＧａｌＮＡｃを含み、これは、［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］また２′－アミノジエトキシメタノール－アデニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれ、以下のように表される。
いくつかの実施形態では、５′から３′方向のヌクレオチド配列ＧＡＡＡステムループ配列で構成されるループについて、例示的な修飾を以下に示す（Ｚ＝リンカー、Ｘ＝へテロ原子）。化学式中、
は、オリゴヌクレオチド鎖への結合点を表すために使用され、
式中、
Ｚは、置換及び非置換のアルキル、置換及び非置換のアルケニレン、置換及び非置換のアルキニレン、置換及び非置換のヘテロアルキレン、置換及び非置換のヘテロアルケニレン、置換及び非置換のヘテロアルキニレン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、連続した共有結合された原子１～２０個の長さの、結合、クリックケミストリーハンドル、又はリンカーを表し、かつＸは、Ｏ、Ｓ、又はＮである。
式中、
Ｚは、置換及び非置換のアルキル、置換及び非置換のアルケニレン、置換及び非置換のアルキニレン、置換及び非置換のヘテロアルキレン、置換及び非置換のヘテロアルケニレン、置換及び非置換のヘテロアルキニレン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、連続した共有結合された原子１～２０個の長さの、結合、クリックケミストリーハンドル、又はリンカーを表し、かつＸは、Ｏ、Ｓ、又はＮである。
いくつかの実施形態では、Ｚは、アセタールリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｘは、Ｏである。
いくつかの実施形態では、センス鎖のループＬの－ＡＡＡ－配列は、下記構造を含む。
いくつかの実施形態では、ループＬは、ＧＡＡＡと記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列内のＡのそれぞれは、ＧａｌＮＡｃ部位に結合される。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列内のＧは、２′－Ｏ－メチル修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列内のＧは、２′－ＯＨを含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列内のヌクレオチドのそれぞれは、２′－Ｏ－メチル修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列内のＡのそれぞれは、２′－ＯＨを含み、ＧＡＡＡ配列内のＧは、２′－Ｏ－メチル修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列内のＡのそれぞれは、２′－Ｏ－メトキシエチル修飾を含み、ＧＡＡＡ配列内のＧは、２′－Ｏ－メチル修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＡＡ配列内のＡのそれぞれは、２′－ａｄｅｍ修飾を含み、ＧＡＡＡ配列内のＧは、２′－Ｏ－メチル修飾を含む。
いくつかの実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドの選択的送達のための、又はグリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のためのオリゴヌクレオチドの非限定的例は、以下の構造を有し（５′から３′方向のセンス鎖からアンチセンス鎖を示す）、
又は
ここで、丸印のそれぞれは、ヌクレオチド間結合を介して接続しているヌクレオチドを表し、例示の構造においてテトラループとして示されているループ（Ｌ）は、ＧａｌＮＡｃ残基（ダイヤモンド形で表されている）に結合されたヌクレオチドを有する。センス鎖の番号は、センス鎖の５′末端から始まるが、アンチセンス鎖の番号は、ニック部位の次のヌクレオチド残基から始まる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、単一の連続したオリゴヌクレオチドであり（すなわち、ニック又はギャップがセンス鎖とアンチセンス鎖との間に存在しない）、かつ一本鎖又は二本鎖形態で存在し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、例示した構造に示すように、ニック又はギャップがセンス鎖とアンチセンス鎖との間に存在する場合、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖がセンス鎖の３′末端とアンチセンス鎖の５′末端との間の平滑末端で二重鎖を形成する場合、分離しているセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、それぞれ、長さが１７～３６ヌクレオチドの範囲のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、それらのセンス鎖の３′伸長部、及びアンチセンス鎖の３′末端の２ヌクレオチドのオーバーハング内でテトラループ構造を有する。いくつかの実施形態では、２ヌクレオチドの３′オーバーハングはＧＧである。概して、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の２個の末端ＧＧヌクレオチドのうち１つ又は両方は、標的ＲＮＡ配列と相補的であるか、又は相補的でない。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、それぞれ、長さが２０～２３ヌクレオチドの範囲のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、３′オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に形成され、長さが１又は２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖及び２１ヌクレオチドのセンス鎖を有し、センス鎖の３′末端及びアンチセンス鎖の５′末端は、平滑末端を形成し、かつ、この際、ガイド鎖は、２ヌクレオチドの３′オーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２２ヌクレオチドのアンチセンス鎖及び２０ヌクレオチドのセンス鎖を有し、センス鎖の３′末端及びアンチセンス鎖の５′末端は、平滑末端を形成し、かつ、この際、アンチセンス鎖は、２ヌクレオチドの３′オーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、３′オーバーハングは、アンチセンス鎖に形成され、長さが９ヌクレオチドである。例えば、オリゴヌクレオチドは、２２ヌクレオチドのアンチセンス（ガイド）鎖、及び２９ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有し、ここで、センス（パッセンジャー）鎖は、その３′末端でテトラループ構造を形成し、アンチセンス（ガイド）鎖は、９ヌクレオチドの３′オーバーハング（本明細書で「Ｎ－９」と呼ばれる）を有する。
例示した構造のオリゴヌクレオチドは、本明細書で更に詳細を記載するように、センス鎖、アンチセンス鎖、Ｓ１及びＳ２領域、ループ（Ｌ）、ならびにヌクレオチドオーバーハングの長さの変形、任意の標的化部位、ニック部位の位置、ヌクレオチドオーバーハングの位置、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの修飾のタイプ及び程度（センス鎖及び／又はアンチセンス鎖を含む）、ならびにセンス鎖及びアンチセンス鎖ならびにＳ１及びＳ２領域の相補性の程度の変形を有し得ることを理解すべきである。本明細書に記載の実施形態、変形、及び改変のそれぞれ、ならびにかかる実施形態、変形、及び改変の任意の組み合わせは、前述の例示的なオリゴヌクレオチド構造に適用される。
ｂ．グリア細胞標的ＲＮＡ配列
様々な実施形態では、アンチセンス鎖は、グリア細胞で発現する目的の標的ＲＮＡに対する相補性領域を有する。いくつかの実施形態では、目的のＲＮＡは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、対象の中枢神経系又は末梢神経系に存在する。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、又は腸管グリア細胞である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、又は腸管グリア細胞で発現するＲＮＡに対する相補性領域を有する。
様々な実施形態では、アンチセンス鎖は、グリア細胞で発現する目的の標的ＲＮＡに対する相補性領域を有する。いくつかの実施形態では、目的のＲＮＡは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、対象の中枢神経系又は末梢神経系に存在する。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、又は腸管グリア細胞である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、又は腸管グリア細胞で発現するＲＮＡに対する相補性領域を有する。
いくつかの実施形態では、目的の標的ＲＮＡは、グリア細胞の機能不全に関連した疾患又は障害に関連するＲＮＡ及び／又は対応するコードされたタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ及び／又は関連する疾患又は疾患は、例として、限定はされないが、アレキサンダー病（ＡｘＤ）に関するグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１１３１０１９．３；ＮＭ＿００１２４２３７６．２；ＮＭ＿００１３６３８４６．１；及びＮＭ＿００２０５５．５）；異染性白質萎縮症に関するプロサポシン（ＰＳＡＰ）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１０４２４６５．３；ＮＭ＿００１０４２４６６．３；及びＮＭ＿００２７７８．４）；シャルコー・マリー・ツース病に関する末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００３０４．４；ＮＭ＿００１２８１４５５．１；ＮＭ＿００１２８１４５６．２；ＮＭ＿００１３３０１４３．２；及びＮＭ＿１５３３２１．３）；成人期発症性白質萎縮症に関するラミンＢ１タンパク質（ＬＭＮＢ１）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１１９８５５７．２；及びＮＭ＿００５５７３．４）；アルツハイマー病に関するアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００４８４．４；ＮＭ＿００１１３６０１６．３；ＮＭ＿００１１３６１２９．３；ＮＭ＿００１１３６１３０．３；及びＮＭ＿００１１３６１３１．２）及び微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１１２３０６６．３；ＮＭ＿００１１２３０６７．３；ＮＭ＿００１２０３２５１．２；ＮＭ＿００１２０３２５２．１；及びＮＭ＿００５９１０．５）；ハンチントン病に関する超酸化物不均化酵素１（ＳＯＤ１）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００４５４．４）、染色体９オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ｏｒｆ７２）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１２５６０５４．２；ＮＭ＿０１８３２５．５；及びＮＭ＿１４５００５．６）及びハンチントン（ＨＴＴ）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００２１１１．８）；パーキンソン病に関するα－シヌクレイン（ＳＮＣＡ又はＡＳＹＮ）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００３４５．４；ＮＭ＿００１１４６０５４．２；ＮＭ＿００１１４６０５５．２；及びＮＭ＿００７３０８．２）及びダルダリン／ロイシンリッチ反復キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿１９８５７８．４）；癲癇に関するアデノシンキナーゼ（ＡＤＫ）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１１２３．３；ＮＭ＿００１２０２４４９．１；ＮＭ＿００１２０２４５０．１；及びＮＭ＿００１３６９１２３．１；ＮＭ＿００１３６９１２４．１）；脳卒中に関する腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００５９４．４）及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ７（ＥＲＫ５／ＭＡＰＫ７）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００２７４９．４；ＮＭ＿１３９０３２．３；ＮＭ＿１３９０３３．２；及びＮＭ＿１３９０３４．３）；外傷性脳損傷及び軸索損傷に関する腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００５９４．４）及びグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１１３１０１９．３；ＮＭ＿００１２４２３７６．２；ＮＭ＿００１３６３８４６．１；及びＮＭ＿００２０５５．５）；自閉症に関するＩＬ－１受容体２型（ＩＬ－１Ｒ２）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１２６１４１９．２；ＮＭ＿００４６３３．４；及びＮＭ＿１７３３４３．１）；多発性硬化症に関するインテグリンサブユニットアルファ４（ＣＤ４９ｄ）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００８８５．６；及びＮＭ＿００１３１６３１２．１）；グリア芽細胞腫及びグリア細胞癌に関するインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００６１８．５；ＮＭ＿００１１１１２８３．３；ＮＭ＿００１１１１２８４．２；及びＮＭ＿００１１１１２８５．３）、上皮成長因子（ＥＧＦ）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１１７８１３０．３；ＮＭ＿００１１７８１３１．３；ＮＭ＿００１３５７０２１．２；及びＮＭ＿００１９６３．６）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００６６０．７）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１０２５３６６．３；ＮＭ＿００１０２５３６７．３；ＮＭ＿００１０２５３６８．３；ＮＭ＿００１０２５３６９．３；及びＮＭ＿００１０２５３７０．３）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関する超酸化物不均化酵素１（ＳＯＤ１）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００４５４．４）、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１２５６０５４．２；ＮＭ＿０１８３２５．５；及びＮＭ＿１４５００５．６）及びＴＡＲ－ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ－４３）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００７３７５．３）；神経性炎症に関する腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００５９４．４）及び分化抗原群３８（ＣＤ３８）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１７７５．４）；脊髄小脳失調（１、３、５、７など）に関するアタキシン２（ＡＴＸＮ２）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１３１０１２１．１；ＮＭ＿００１３１０１２３．１；及びＮＭ＿００２９７３．４）、アタキシン３（ＡＴＸＮ３）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１１２７６９６．２；ＮＭ＿００１１２７６９７．２；ＮＭ＿００１１６４７７４．２；ＮＭ＿００１１６４７７６．２；及びＮＭ＿００１１６４７７７．２）、及びアタキシン７（ＡＴＸＮ７）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００３３３．３；ＮＭ＿００１１２８１４９．３；及びＮＭ＿００１１７７３８７．１）；進行性核上麻痺に関する微小管関連タンパク質タウ（ＴＡＵ／ＭＡＰＴ）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１１２３０６６．３；ＮＭ＿００１１２３０６７．３；ＮＭ＿００１２０３２５１．２；ＮＭ＿００１２０３２５２．１；及びＮＭ＿００５９１０．５）；原発性年齢関連性タウ異常症（ＰＡＲＴ）／神経原線維変化優性老人性痴呆に関するＴＡＵ／ＭＡＰＴ遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１１２３０６６．３；ＮＭ＿００１１２３０６７．３；ＮＭ＿００１２０３２５１．２；ＮＭ＿００１２０３２５２．１；及びＮＭ＿００５９１０．５）；前頭側頭型痴呆及び染色体１７が関連するパーキンソン症候群（ＦＴＤＰ－１７）に関するＴＡＵ／ＭＡＰＴ遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１１２３０６６．３；ＮＭ＿００１１２３０６７．３；ＮＭ＿００１２０３２５１．２；ＮＭ＿００１２０３２５２．１；及びＮＭ＿００５９１０．５）；ならびに末梢神経脱髄に関する早期増殖応答タンパク質２（ＥＧＲ２）遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００３９９．５；ＮＭ＿００１１３６１７７．３；ＮＭ＿００１１３６１７８．１；ＮＭ＿００１１３６１７９．３；及びＮＭ＿００１３２１０３７．２）、の発現が挙げられる。
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、プロセシングされた形態のＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、プロセシングされていない形態のＲＮＡである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡの５′非翻訳領域に対する相補性領域を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡのコード領域に対する相補性領域を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡのエキソンに対する相補性領域を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡの３′非翻訳領域に対する相補性領域を有する。概して、アンチセンス鎖によって標的とされるｍＲＮＡの５′非翻訳領域、３′非翻訳領域、及びエキソンの位置及び配列は、上記開示したＮＣＢＩの参照ｍＲＮＡ配列ごとにＮＣＢＩデータベースにおいて提示されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンス鎖は、ＲＮＡのスプライス部位に近い、又はスプライス部位における配列に対する相補性領域を有し、そこで標的とされる配列により、標的ＲＮＡの発現が低下又は調節される。
いくつかの実施形態では、グリア細胞におけるその過剰発現が疾患又は障害に関連するタンパク質又は遺伝子の変異型をコードする遺伝子が、発現の低下の対象となる。いくつかの実施形態では、これらには、例示として、限定はされないが、ＧＦＡＰ、ＰＭＰ２２、ＬＭＮＢ１、ＡＰＰ、ＭＡＰＴ、ＳＯＤ１、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＡＴＸＮ２、ＮＧ２、Ｃ９ＯＲＦ７２、ＡＴＸＮ３、ＡＴＸＮ７、ＨＴＴ、ＳＮＣＡ／ＡＳＹＮ、ＡＤＫ、ＴＮＦα、ＣＤ４９ｄ、ＴＤＰ－４３、及びＴＡＵ／ＭＡＰＴが挙げられる。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ配列内の変異を含む配列と完全に相補的であり、かつ、変異を含むＲＮＡの発現の低下に効果的である（例えば、Ｓｃｈｏｌｅｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，２００９，４（９）：ｅ７２３２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡは、変異のある対立遺伝子などＲＮＡの対立遺伝子特異的配列である（例えば、Ｂｏｎｇｉａｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，１２１（５）：５２５－５３６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、疾患関連変異に関連する一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に向けて標的化される。目的の遺伝子は、ホモ接合性形態又はヘテロ接合性形態であり得る。
さらなるオリゴヌクレオチドの特性、変形、及び変性の説明については、以下の章に記載する。本開示のオリゴヌクレオチドは、後述の実施形態、変形、及び改変のそれぞれ、ならびにかかる実施形態、変形、及び改変の組み合わせを含む。
ｃ．オリゴヌクレオチドの構造、変形、及び改変
ｉ．アンチセンス鎖
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ばれることがある。例えば、アンチセンス鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、アルゴノートタンパク質に結合できる場合、又は１つ以上の同様の因子に組み込まれ、又は結合して標的遺伝子を直接的にサイレンシングすることができる場合、アンチセンス鎖はガイド鎖と呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、ガイド鎖と相補性のあるセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ばれることがある。
ｉ．アンチセンス鎖
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ばれることがある。例えば、アンチセンス鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、アルゴノートタンパク質に結合できる場合、又は１つ以上の同様の因子に組み込まれ、又は結合して標的遺伝子を直接的にサイレンシングすることができる場合、アンチセンス鎖はガイド鎖と呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、ガイド鎖と相補性のあるセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ばれることがある。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが最大５０ヌクレオチド（例えば、長さが最大５０、最大４５、最大４０、最大３５、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、又は最大１２ヌクレオチド）のアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１２ヌクレオチド（例えば、長さが少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３５、又は少なくとも３８ヌクレオチド）であるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示するオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、長さが１２～５０、１２～４０、又は１２～３０（例えば、１２～５０、１２～４０、１２～３８、１２～３６、１２～３２、１２～３０、１２～２８、１２～２２、１２～２３、１５～２１、１５～２７、１７～２１、１７～２５、１９～２７、又は１９～３０）ヌクレオチドの範囲である。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示するオリゴヌクレオチドのうち任意の１つのアンチセンス鎖は、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、１９～２３ヌクレオチドの長さを含む場合がある。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、１９～２２ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチドの長さ、２２ヌクレオチドの長さ、２１ヌクレオチドの長さ、２０ヌクレオチドの長さ、又は１９ヌクレオチドの長さを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、２０～２２ヌクレオチドの長さを含む場合がある。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、２０～２１ヌクレオチドの長さ、又は２１～２２ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、２０ヌクレオチドの長さ、２１ヌクレオチドの長さ、又は２２ヌクレオチドの長さを含む。
本明細書で提供するような非対称構造のオリゴヌクレオチドは、その３′末端で任意の長さの一本鎖ヌクレオチド（すなわち、３′オーバーハング）を有するアンチセンス鎖を含んでよい。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、その３′末端で少なくとも２個の一本鎖ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、その３′末端に、少なくとも０、１、２、３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６個以上の一本鎖ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、その３′末端で２個の一本鎖ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、その３′末端で３個の一本鎖ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、その３′末端で４個の一本鎖ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、その３′末端で５個の一本鎖ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、その３′末端で６個の一本鎖ヌクレオチドを含む。
ｉｉ． センス鎖
本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、センス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが最大４０ヌクレオチド（例えば、長さが最大４０、最大３５、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、又は最大１２ヌクレオチド）のセンス鎖（又はパッセンジャー鎖）を有する場合がある。
本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、センス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが最大４０ヌクレオチド（例えば、長さが最大４０、最大３５、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、又は最大１２ヌクレオチド）のセンス鎖（又はパッセンジャー鎖）を有する場合がある。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１２ヌクレオチド（例えば、長さが少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３２、少なくとも３４、少なくとも３６、又は少なくとも３８ヌクレオチド）であるセンス鎖を有する場合がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２～４０（例えば、１２～４０、１２～３６、１２～３２、１２～２８、１５～４０、１５～３６、１５～３２、１５～２８、１７～２１、１７～２５、１７～３６、１９～２７、１９～３０、２０～４０、２２～４０、２５～４０、又は３２～４０）ヌクレオチドの範囲のセンス鎖を有する場合がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１２ヌクレオチド、長さが１３ヌクレオチド、長さが１４ヌクレオチド、長さが１５ヌクレオチド、長さが１６ヌクレオチド、長さが１７ヌクレオチド、長さが１８ヌクレオチド、長さが１９ヌクレオチド、長さが２０ヌクレオチド、長さが２１ヌクレオチド、長さが２２ヌクレオチド、長さが２３ヌクレオチド、長さが２４ヌクレオチド、長さが２５ヌクレオチド、長さが２６ヌクレオチド、長さが２７ヌクレオチド、長さが２８ヌクレオチド、長さが２９ヌクレオチド、長さが３０ヌクレオチド、長さが３１ヌクレオチド、長さが３２ヌクレオチド、長さが３３ヌクレオチド、長さが３４ヌクレオチド、長さが３５ヌクレオチド、長さが３６ヌクレオチド、長さが３７ヌクレオチド、長さが３８ヌクレオチド、長さが３９ヌクレオチド、又は長さが４０ヌクレオチドのセンス鎖を有する場合がある。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、その３′末端に、領域Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有するステムループ配列（又は構造）を更に含み、ここで、Ｓ１領域は、Ｓ２領域と相補的であり、かつ第２の二重鎖（Ｄ２）又はステムを形成することができ、かつＬは、Ｓ１及びＳ２がＤ２（ステム）を形成する場合に形成されるループである。いくつかの実施形態では、Ｓ１とＳ２との間で形成されるＤ２又はステムは、長さが少なくとも１（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６）塩基対である。いくつかの実施形態では、Ｄ２又はステムは、長さが２、３、４、Ｓ、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４ヌクレオチドの二重鎖である。いくつかの実施形態では、Ｓ１領域とＳ２領域との間で形成されるＤ２は、長さが１～６塩基対（例えば、長さが１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、３～６、４～６、又は５～６塩基対）の範囲である。
いくつかの実施形態では、Ｓ１とＳ２の間で形成されるループＬは、長さが最大１０ヌクレオチド（例えば、長さが３、４、Ｓ、６、７、８、９、又は１０ ヌクレオチド）である。いくつかの実施形態では、ループＬは、Ｓ１及びＳ２領域と接するテトラループ、ペンタループ、又はトリループ（ｔｒｉＬ）を含む。いくつかの実施形態では、テトラループ、ペンタループ、又はトリループは、センス鎖の３′末端にある。いくつかの実施形態では、テトラループ、ペンタループ、又はトリループは、センス鎖ではなくアンチセンス鎖の５′末端にある。
いくつかの実施形態では、トリループ、ペンタループ、又はテトラループなどのＬ内の任意数のヌクレオチドは、標的化リガンドに結合されてよい。いくつかの実施形態では、トリループは、リガンドに結合された１個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、トリループは、リガンドに結合された２個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、トリループは、リガンドに結合された３個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、トリループは、リガンドに結合された１～３個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、トリループは、リガンドに結合された１～２個のヌクレオチド、又はリガンドに結合された２～３個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、テトラループは、リガンドに結合された１個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テトラループは、リガンドに結合された２個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テトラループは、リガンドに結合された３個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テトラループは、リガンドに結合された４個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テトラループは、リガンドに結合された１～４個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テトラループは、リガンドに結合された１～３個のヌクレオチド、１～２個のヌクレオチド、２～４個のヌクレオチド、３～４個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、テトラループ又はトリループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びこれらの組み合わせを含む場合がある。ＲＮＡテトラループの非限定的例としては、ＵＮＣＧファミリーのテトラループ（例、ＵＵＣＧ）、ＧＮＲＡファミリーのテトラループ（例、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡテトラループの非限定的例としては、ｄ（ＧＮＮＡ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、ｄ（ＧＮＲＡ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＧＮＡＢ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＣＮＮＧ）ファミリーのテトラループ、及びｄ（ＴＮＣＧ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられるが、これらに限定されない。
ｉｉｉ．二重鎖の長さ
いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖は、長さが少なくとも１２（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖は、長さが１２～３０ヌクレオチド（例えば、長さが１２～３０、１２～２７、１２～２２、１５～２５、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、１９～３０又は２１～３０ヌクレオチド）の範囲である。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖は、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の全長に及ばない。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの全長に及ぶ。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方の全長に及ぶ。
いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖は、長さが少なくとも１２（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖は、長さが１２～３０ヌクレオチド（例えば、長さが１２～３０、１２～２７、１２～２２、１５～２５、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、１９～３０又は２１～３０ヌクレオチド）の範囲である。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖は、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間で形成される二重鎖は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の全長に及ばない。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの全長に及ぶ。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方の全長に及ぶ。
ｉｉｉ．オリゴヌクレオチド末端
いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、３′オーバーハングが、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれかで、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に存在する。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、他方の５′末端と比較して、熱力学的により不安定な５′末端を有する。いくつかの実施形態において、センス鎖の３′末端に平滑末端、及びアンチセンス鎖の３′末端にオーバーハングを含む非対称オリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３′オーバーハングは、長さが１～８ヌクレオチド（例えば、長さが１、２、３、４、５、６、７又は８ヌクレオチド）である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、３′オーバーハングが、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれかで、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に存在する。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、他方の５′末端と比較して、熱力学的により不安定な５′末端を有する。いくつかの実施形態において、センス鎖の３′末端に平滑末端、及びアンチセンス鎖の３′末端にオーバーハングを含む非対称オリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３′オーバーハングは、長さが１～８ヌクレオチド（例えば、長さが１、２、３、４、５、６、７又は８ヌクレオチド）である。
典型的には、ＲＮＡｉのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖の３′末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する。ただし、他のオーバーハングも可能である。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１～６ヌクレオチド、任意選択で１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５もしくは６ヌクレオチドの長さを含む３′オーバーハングである。ただし、いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１～６ヌクレオチド、任意選択で１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５もしくは６ヌクレオチドの長さを含む５′オーバーハングである。
いくつかの実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３′末端又は５′末端の１個以上の（例えば、２、３、４個の）末端ヌクレオチドが修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３′末端の１個又は２個の末端ヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３′末端の最後のヌクレオチドが、修飾され、例えば、２′修飾、例えば、２′－Ｏ－メトキシエチルを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３′末端の最後の１個又は２個の末端ヌクレオチドは、標的と相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３′末端の最後の１個又は２個のヌクレオチドは、標的と相補的でない。いくつかの実施形態では、センス鎖又はアンチセンス鎖の５′末端及び／又は３′末端は、逆向きキャップヌクレオチドを有する。
ｉｖ．ミスマッチ
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖との間に１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５つの）ミスマッチを有する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に２つ以上のミスマッチがある場合、それらは、連続して配置されるか（例えば、２、３つ以上続けて）、又は相補性領域の全体を通して間隔を空けて配置されてよい。いくつかの実施形態では、センス鎖の３′末端は、１つ以上のミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、２つのミスマッチが、センス鎖の３′末端に組み込まれる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３′末端のセグメントの塩基ミスマッチ又は不安定化により、おそらくダイサーによってプロセシングが促進されたことによって、ＲＮＡｉにおける合成二重鎖の効力が改善した。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖との間に１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５つの）ミスマッチを有する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に２つ以上のミスマッチがある場合、それらは、連続して配置されるか（例えば、２、３つ以上続けて）、又は相補性領域の全体を通して間隔を空けて配置されてよい。いくつかの実施形態では、センス鎖の３′末端は、１つ以上のミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、２つのミスマッチが、センス鎖の３′末端に組み込まれる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３′末端のセグメントの塩基ミスマッチ又は不安定化により、おそらくダイサーによってプロセシングが促進されたことによって、ＲＮＡｉにおける合成二重鎖の効力が改善した。
ｖ．一本鎖オリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの発現を低下させるためのオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。そのような構造としては、一本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない（例えば、Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１６，２４（５），９４６－９５５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡｉは、標的ＲＮＡに対する安定性及び有効性を高めるために修飾される。
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの発現を低下させるためのオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。そのような構造としては、一本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない（例えば、Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１６，２４（５），９４６－９５５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡｉは、標的ＲＮＡに対する安定性及び有効性を高めるために修飾される。
ただし、いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、５′から３′方向で記述される場合に特定の核酸の標的とされるセグメントの逆相補鎖を含み、かつ細胞内のその標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨによって媒介される切断を誘導するように（例えば、ギャップマーとして）又は細胞内のその標的ＲＮＡの翻訳を阻害するように（例えば、ミックスマーとして）、適切に修飾される。本開示における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において既知の任意の好適な方法で修飾することができ、そのような方法としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾（例えば、長さ、核酸塩基の糖部分（ピリミジン、プリン）、及び核酸塩基の複素環式部分の改変を含む）に関するその開示が参照により本明細書に援用される米国特許第９，５６７，５８７号で示されるようなものが挙げられる。更に、アンチセンス分子が、特定の標的遺伝子の発現を低下させるために使用される（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇｓ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，７：８１－１０５を参照されたい）。
ｉｖ．オリゴヌクレオチドの修飾
オリゴヌクレオチドは、特異性、安定性、送達性、バイオアベイラビリティ、ヌクレアーゼ分解に対する耐性、免疫原性、塩基対特性、ＲＮＡ分布及び細胞摂取、ならびに治療又は研究用途に関連する他の特徴を改善又は制御するために種々の方法によって修飾することができる（例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００９，３７：２８６７－２８８１；Ｂｒａｍｓｅｎ ａｎｄ Ｋｊｅｍｓ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１２，３：１－２２を参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の適切な修飾を含んでよい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、更に後述するように、その塩基（又は核酸塩基）、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）又はホスフェート基に修飾を有する。
オリゴヌクレオチドは、特異性、安定性、送達性、バイオアベイラビリティ、ヌクレアーゼ分解に対する耐性、免疫原性、塩基対特性、ＲＮＡ分布及び細胞摂取、ならびに治療又は研究用途に関連する他の特徴を改善又は制御するために種々の方法によって修飾することができる（例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００９，３７：２８６７－２８８１；Ｂｒａｍｓｅｎ ａｎｄ Ｋｊｅｍｓ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１２，３：１－２２を参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の適切な修飾を含んでよい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、更に後述するように、その塩基（又は核酸塩基）、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）又はホスフェート基に修飾を有する。
オリゴヌクレオチドの修飾の数、及びそれらのヌクレオチドの修飾の位置は、オリゴヌクレオチドの特性に影響を与え得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）又は類似の担体に結合させるか、又はその内部に封入することによってｉｎ ｖｉｖｏで送達され得る。しかし、オリゴヌクレオチドがＬＮＰ又は類似の担体によって保護されていない場合、少なくともその一部のヌクレオチドが修飾されることが有利となり得る。したがって、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドのいずれかの特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの全て又は実質的に全てのヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態では、ヌクレオチドの半数以上が修飾される。特定の実施形態では、ヌクレオチドの半数未満が修飾される。典型的には、ネイキッド送達で、全ての糖は、２′位で修飾される。これらの修飾は、可逆的又は不可逆である場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示するようなオリゴヌクレオチドは、所望の特徴（例えば、酵素による分解の阻止、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後に所望の細胞を標的とする能力、及び／又は熱力学的安定性など）を引き起こすのに十分な数及びタイプの修飾ヌクレオチドを有する。
ａ．糖の修飾
いくつかの実施形態では、修飾糖（本明細書では糖アナログとも呼ばれる）は、例えば、１つ以上の修飾が糖の２′、３′、４′、及び／又は５′位の炭素で生じるような修飾デオキシリボース、又はリボース部位を含む。いくつかの実施形態では、修飾糖はまた、ロック核酸（「ＬＮＡ」又は「二環式」）に存在するもの（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４：３６０７－３６３０を参照されたい）、アンロック核酸（「ＵＮＡ」又は「非環式」）に存在するもの（例えば、Ｓｎｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２０１３，２：ｅ１０３を参照されたい）、及びブリッジ核酸（「ＢＮＡ」）に存在するもの（例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ ａｎｄ Ｏｂｉｋａ，Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００２，１６５３－１６５９を参照されたい）など、非天然代替的炭素構造を含む場合がある。Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｓｎｅａｄら、ならびにＩｍａｎｉｓｈｉ及びＯｂｉｋａの糖の修飾に関するそれらの開示は、参照により本明細書に援用される。糖の修飾により、ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの耐性を増強させ、及び／又はハイブリダイゼーション効率を高めることができる。
いくつかの実施形態では、修飾糖（本明細書では糖アナログとも呼ばれる）は、例えば、１つ以上の修飾が糖の２′、３′、４′、及び／又は５′位の炭素で生じるような修飾デオキシリボース、又はリボース部位を含む。いくつかの実施形態では、修飾糖はまた、ロック核酸（「ＬＮＡ」又は「二環式」）に存在するもの（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４：３６０７－３６３０を参照されたい）、アンロック核酸（「ＵＮＡ」又は「非環式」）に存在するもの（例えば、Ｓｎｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２０１３，２：ｅ１０３を参照されたい）、及びブリッジ核酸（「ＢＮＡ」）に存在するもの（例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ ａｎｄ Ｏｂｉｋａ，Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００２，１６５３－１６５９を参照されたい）など、非天然代替的炭素構造を含む場合がある。Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｓｎｅａｄら、ならびにＩｍａｎｉｓｈｉ及びＯｂｉｋａの糖の修飾に関するそれらの開示は、参照により本明細書に援用される。糖の修飾により、ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの耐性を増強させ、及び／又はハイブリダイゼーション効率を高めることができる。
いくつかの実施形態では、糖のヌクレオチド修飾は、２′修飾を含む。いくつかの実施形態では、２′修飾は、とりわけ、２′－Ｏ－プロパルギル、２′－Ｏ－プロピルアミン、２′－アミノ、２′－エチル、２′－アミノエチル（ＥＡ）、２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）、２′－フルオロ（２′－Ｆ）、２′－Ｏ－メトキシエチル（２′－ＭＯＥ）、２′－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２′－Ｏ－ＮＭＡ）、２′－デオキシ－２′－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２′－ＦＡＮＡ）、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２′－フルオロ、２′－Ｏ－メチル、又は２′－Ｏ－メトキシエチルである。いくつかの実施形態では、糖の修飾は、糖環の修飾を含み、これは、糖環の１つ以上の炭素の修飾を含む場合がある。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の１′炭素もしくは４′炭素と連結された糖の２′酸素、又はエチレンもしくはメチレンブリッジを介して１′炭素もしくは４′炭素と連結された２′酸素を含んでよい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２′炭素と３′炭素とが結合していない非環式糖を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、例えば、糖の４′位にチオール基を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、糖部分で修飾された少なくとも１個（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０個以上）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、糖部分で修飾された少なくとも１個（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５個以上）のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、糖部分で修飾された少なくとも１個（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０個以上）のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖のヌクレオチドの全ては、糖部分の修飾を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、糖部分の修飾を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの全て（すなわち、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方）は、糖部分の修飾を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの糖部分の修飾は、２′修飾（例えば、２′－フルオロ、２′－Ｏ－メチル、２′－Ｏ－メトキシエチル、又は２′－デオキシ－２′－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸）を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの糖部分の修飾は、２′－フルオロ又は２′－Ｏ－メチルによる２′修飾を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの５０％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満から約１０％、約１２％、約１４％、約１８％、又は約２０％は、２′－Ｆ基で修飾された糖部分を有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドの５０％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満から約１０％、約１２％、約１４％、約１８％、又は約２０％は、２′－Ｆ基で修飾された糖部分を有する。いくつかの実施形態では、長さが１９～２１ヌクレオチドのセンス鎖は、２′－Ｆ基による糖部分の修飾を有する最大５個、好ましくは最大４個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、長さが２１～２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖は、２′－Ｆ基による糖部分の修飾を有する最大６個、好ましくは最大５個、より好ましくは最大３個のヌクレオチド有する。いくつかの実施形態では、長さが１９～２１ヌクレオチドのセンス鎖及び長さが２１～２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖を有するオリゴヌクレオチドは、２′－Ｆによる糖部分の修飾を有する最大で総数が４～１２、５～１１、又は６～１０個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の残りのヌクレオチドは、２′－Ｏ－プロパルギル、２′－Ｏ－プロピルアミン、２′－アミノ、２′－エチル、２′－アミノエチル（ＥＡ）、２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）、２′－Ｏ－メトキシエチル（２′－ＭＯＥ）、２′－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２′－Ｏ－ＮＭＡ）、２′－デオキシ－２′－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２′－ＦＡＮＡ）又はこれら組み合わせ、好ましくは２′－Ｏ－メチルにより糖部分で修飾される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの指定の位置でヌクレオチドの糖残基に修飾を有することができる。いくつかの実施形態では、センススタンド及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドの場合、センス鎖は、ヌクレオチド位置７、８、９、１０、及び１１に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドのうち１個以上を有し、好ましくはヌクレオチド位置９、１０、及び１１に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドのうち１個以上を有する。いくつかの実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド位置７、８、９、１０、及び１１に、２′－Ｆによる糖部分の修飾を有する２、３、４個、又は全てのヌクレオチドを有する。上記のように、いくつかの実施形態では、センス鎖は、２′－Ｆ基で修飾された糖部分を有する最大５個、好ましくは最大４個のヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、センス鎖が２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有する前述の実施形態のそれぞれでは、センス鎖の残りのヌクレオチドは、２′－Ｏ－プロパルギル、２′－Ｏ－プロピルアミン、２′－アミノ、２′－エチル、２′－アミノエチル（ＥＡ）、２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）、２′－Ｏ－メトキシエチル（２′－ＭＯＥ）、２′－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２′－Ｏ－ＮＭＡ）、２′－デオキシ－２′－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２′－ＦＡＮＡ）又はこれらの組み合わせ、好ましくは２′－Ｏ－メチルによる糖部分の修飾を有する。いくつかの実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド位置７、８、９、１０、及び１１に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドのうち１つ以上を含み、かつセンス鎖の残りのヌクレオチドは、２′－Ｏ－プロパルギル、２′－Ｏ－プロピルアミン、２′－アミノ、２′－エチル、２′－アミノエチル（ＥＡ）、２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）、２′－Ｏ－メトキシエチル（２′－ＭＯＥ）、２′－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２′－Ｏ－ＮＭＡ）、２′－デオキシ－２′－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２′－ＦＡＮＡ）又はこれらの組み合わせ、好ましくは２′－Ｏ－メチルで修飾された糖部分を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１９～２１ヌクレオチドのセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、ヌクレオチド位置８、９、１０及び１１に、又は好ましくはヌクレオチド位置９、１０、及び１１に、２′－Ｆによる糖部分の修飾を有するヌクレオチドを有し、センス鎖の残りの位置のヌクレオチドのそれぞれは、２′－Ｏ－メチルによる糖残基の修飾を有する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置１、２、３、５、６、７、１０、１４、及び１６に、好ましくはヌクレオチド位置２、３、５、６、７、１０及び１４のうち１つ以上に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドのうち１個以上を有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置５又は１４に、少なくとも２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置５及び１４に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置５に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有し、かつヌクレオチド位置１、２、３、６、７、１０、１４、及び１６に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する最大５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置１４に、２′－Ｆ修飾を有し、かつヌクレオチド位置１、２、３、６、７、１０、１４、及び１６に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する最大５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置５及び１４に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有し、かつヌクレオチド位置１、２、３、６、７、１０、及び１６に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する最大４個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置２、５、及び１４に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有し、かつ任意選択でヌクレオチド位置１、３、７、及び１０に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する最大３個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、位置２、５、及び１４のそれぞれに、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置１、２、５、及び１４のそれぞれに、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の位置１、２、３、５、７、及び１４の位置のそれぞれの糖部分は、２′－Ｆで修飾される。更に別の実施形態ではでは、アンチセンス鎖の位置１、２、３、５、１０、及び１４の位置のそれぞれの糖部分は、２′－Ｆで修飾される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の位置２、３、５、７、１０、及び１４の位置のそれぞれの糖部分は、２′－Ｆで修飾される。上記のように、いくつかの実施形態では、長さが２１～２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖は、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する最大６個、好ましくは最大５個、より好ましくは最大３個のヌクレオチド有する。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖が２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有する前述の実施形態のそれぞれでは、アンチセンス鎖の残りのヌクレオチドは、２′－Ｏ－プロパルギル、２′－Ｏ－プロピルアミン、２′－アミノ、２′－エチル、２′－アミノエチル（ＥＡ）、２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）、２′－Ｏ－メトキシエチル（２′－ＭＯＥ）、２′－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２′－Ｏ－ＮＭＡ）、２′－デオキシ－２′－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２′－ＦＡＮＡ）又はこれらの組み合わせ、好ましくは２′－Ｏ－メチルで修飾された糖部分を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置１、２、３、５、６、７、１０、１４、及び１６に、好ましくはヌクレオチド位置２、３、５、６、７、１０及び１４のうち１つ以上に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドのうち１個以上を有し、アンチセンス鎖の残りのヌクレオチドは、２′－Ｏ－プロパルギル、２′－Ｏ－プロピルアミン、２′－アミノ、２′－エチル、２′－アミノエチル（ＥＡ）、２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）、２′－Ｏ－メトキシエチル（２′－ＭＯＥ）、２′－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２′－Ｏ－ＮＭＡ）、２′－デオキシ－２′－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２′－ＦＡＮＡ）又はこれらの組み合わせ、好ましくは２′－Ｏ－メチルで修飾された糖部分を有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置２、５、及び１４に、２′－Ｆによる糖部分の修飾を有するヌクレオチドを有し、かつ任意選択でヌクレオチド位置１、３、６、７、及び１０に、２′－Ｆによる糖部分の修飾を有する最大３個のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖の残りのヌクレオチドは、２′－Ｏ－メチルによる糖部分の修飾を有する。
いくつかの実施形態では、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２のステムループ配列を有するオリゴヌクレオチドの場合、ステム及び／又はループの１個以上のヌクレオチドは、糖部分の修飾を有する。いくつかの実施形態では、修飾には、標的化リガンドによる修飾は含まれない。いくつかの実施形態では、修飾は、２′－Ｏ－プロパルギル、２′－Ｏ－プロピルアミン、２′－アミノ、２′－エチル、２′－アミノエチル（ＥＡ）、２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）、２′－フルオロ（２′－Ｆ）、２′－Ｏ－メトキシエチル（２′－ＭＯＥ）、２′－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２′－Ｏ－ＮＭＡ）、２′－デオキシ－２′－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２′－ＦＡＮＡ）、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、糖部分の修飾は、２′－フルオロ、２′－Ｏ－メチル、又は２′－Ｏ－メトキシエチルである。いくつかの実施形態では、Ｓ１のヌクレオチドのうち１個以上～ヌクレオチドの最大全ては、糖部分の修飾を有する。いくつかの実施形態では、Ｓ２のヌクレオチドのうち１個以上～ヌクレオチドの最大全ては、糖部分の修飾を有する。いくつかの実施形態では、Ｓ１及びＳ２のヌクレオチドの全ては、糖部分の修飾、好ましくは２′－Ｏ－メチルによる修飾を有する。いくつかの実施形態では、ループＬの１個以上のヌクレオチドは、糖部分の修飾を有する。いくつかの実施形態では、ループ配列の５′ヌクレオチドは、糖部分の修飾を有する。いくつかの実施形態では、テトラループ、ペンタループ、又はトリループの場合、ループ配列の５′ヌクレオチドは、２′位に糖部分の修飾、好ましくは２′－Ｏ－メチルによる修飾を有し、かつループの残りのヌクレオチドは、標的化リガンドで修飾される。
ｂ．５′末端ホスフェート
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの５′末端ホスフェート基は、アルゴノート２との相互作用を高める。しかし、５′ホスフェート基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ又は他の酵素を介した分解を受けやすい場合があり、これによりｉｎ ｖｉｖｏでのオリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティが制限される可能性がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、そのような分解に耐性のある５′ホスフェートのアナログを含む。いくつかの実施形態では、ホスフェートアナログは、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートであってよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の５′末端は、天然の５′ホスフェート基の静電及び立体特性を模倣した化学的部位（「ホスフェート模倣体」）に結合される（例えば、Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１５，４３（６）：２９９３－３０１１を参照されたく、そのホスフェートアナログに関連する内容は、参照により本明細書に援用される）。５′末端に結合することができる多くのホスフェート模倣体がこれまでに開発されてきた（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号を参照されたく、そのホスフェートアナログに関連する内容は、参照により本明細書に援用される）。オリゴヌクレオチドの５′末端の他の修飾については、例えば、国際特許公報第ＷＯ２０１１／１３３８７１号に記載されており、そのホスフェートアナログに関連する内容は、参照により本明細書に援用される。特定の実施形態では、ヒドロキシル基が、オリゴヌクレオチドの５′末端に結合される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの５′末端ホスフェート基は、アルゴノート２との相互作用を高める。しかし、５′ホスフェート基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ又は他の酵素を介した分解を受けやすい場合があり、これによりｉｎ ｖｉｖｏでのオリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティが制限される可能性がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、そのような分解に耐性のある５′ホスフェートのアナログを含む。いくつかの実施形態では、ホスフェートアナログは、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートであってよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の５′末端は、天然の５′ホスフェート基の静電及び立体特性を模倣した化学的部位（「ホスフェート模倣体」）に結合される（例えば、Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１５，４３（６）：２９９３－３０１１を参照されたく、そのホスフェートアナログに関連する内容は、参照により本明細書に援用される）。５′末端に結合することができる多くのホスフェート模倣体がこれまでに開発されてきた（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号を参照されたく、そのホスフェートアナログに関連する内容は、参照により本明細書に援用される）。オリゴヌクレオチドの５′末端の他の修飾については、例えば、国際特許公報第ＷＯ２０１１／１３３８７１号に記載されており、そのホスフェートアナログに関連する内容は、参照により本明細書に援用される。特定の実施形態では、ヒドロキシル基が、オリゴヌクレオチドの５′末端に結合される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖の４′位の炭素にホスフェートアナログ（「４′ホスフェートアナログ」と呼ぶ）を有する。例えば、２０１７年９月１日に出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４９９０９、２０１６年９月２日に出願の表題「４′－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｎａｌｏｇｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」の米国仮出願第６２／３８３，２０７号、２０１６年９月１２日に出願の表題「４′－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｎａｌｏｇｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」の米国仮出願第６２／３９３，４０１号を参照されたく、そのホスフェートアナログに関する内容は、参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、５′末端ヌクレオチドに４′ホスフェートアナログを含む。いくつかの実施形態では、ホスフェートアナログは、オキシメチル基の酸素原子が糖部分又はそのアナログに（例えば、その４′炭素で）結合したオキシメチルホスホネートである。その他の実施形態では、４′ホスフェートアナログは、チオメチル基のイオウ原子又はアミノメチル基の窒素原子が、糖部分又はそのアナログの４′炭素に結合したチオメチルホスホネート又はアミノメチルホスホネートである。特定の実施形態では、４′ホスフェートアナログは、オキシメチルホスホネートである。いくつかの実施形態では、オキシメチルホスホネートは、式－Ｏ－ＣＨ2－ＰＯ（ＯＨ）2又はＯ－ＣＨ2－ＰＯ（ＯＲ）2で表され、式中、Ｒは、Ｈ、ＣＨ3、アルキル基、ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、ＣＨ2ＯＣＯＣ（ＣＨ3）3、ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓｉ（ＣＨ3）3、又は保護基から個別に選択される。特定の実施形態では、アルキル基は、ＣＨ2ＣＨ3である。より典型的には、Ｒは、Ｈ、ＣＨ3、又はＣＨ2ＣＨ3から個別に選択される。いくつかの実施形態では、５′末端修飾は、センス鎖に対するものである。いくつかの実施形態では、５′末端修飾は、アンチセンス鎖に対するものである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドに結合するホスフェートアナログは、メトキシホスホネート（ＭＯＰ）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドに結合するホスフェートアナログは、５′モノメチル保護ＭＯＰである。いくつかの実施形態では、ホスフェートアナログを含む以下のウリジンヌクレオチドが、例えばアンチセンス（ガイド）鎖の最初の位置で使用され得、
この修飾ヌクレオチドは、［ＭｅＰｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ－４Ｏ－ｍＵ］又は５′－メトキシ，ホスホネート－４′オキシ－２′－Ｏ－メチルウリジンと呼ばれる。
この修飾ヌクレオチドは、［ＭｅＰｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ－４Ｏ－ｍＵ］又は５′－メトキシ，ホスホネート－４′オキシ－２′－Ｏ－メチルウリジンと呼ばれる。
ｃ．修飾ヌクレオシド間結合
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含んでよい。いくつかの実施形態では、ホスフェート修飾又は置換により、少なくとも１つの（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも５つの）修飾ヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドが生じ得る。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示するオリゴヌクレオチドのうち任意の１つは、１～１０（例えば、１～１０、２～８、４～６、３～１０、５～１０、１～５、１～３又は１～２）個の修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示するオリゴヌクレオチドのうち任意の１つは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の修飾ヌクレオチド間結合を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含んでよい。いくつかの実施形態では、ホスフェート修飾又は置換により、少なくとも１つの（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも５つの）修飾ヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドが生じ得る。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示するオリゴヌクレオチドのうち任意の１つは、１～１０（例えば、１～１０、２～８、４～６、３～１０、５～１０、１～５、１～３又は１～２）個の修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示するオリゴヌクレオチドのうち任意の１つは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の修飾ヌクレオチド間結合を含む。
修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオンアルキルホスホトリエステル結合、ホスホラミダイト結合、ホスホネート結合又はボラノホスフェート結合であってよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド間結合は、以下の構造の４－Ｏ－メチレンホスホネート結合であり、
ここで、Ｒ1は、Ｈ又はＣ1－Ｃ4アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ1はメチルである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の位置１及び２（すなわち、５′末端領域）、アンチセンス鎖の位置１及び２、アンチセンス鎖の位置２及び３、アンチセンス鎖の位置３及び４（すなわち、５′末端領域）、アンチセンス鎖の位置２０及び２１、ならびにアンチセンス鎖の位置２１及び２２（すなわち、３′末端領域）のうち１つ以上におけるヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の位置１及び２、アンチセンス鎖の位置１及び２、アンチセンス鎖の位置２及び３、アンチセンス鎖の位置２０及び２１、ならびにアンチセンス鎖の位置２１及び２２のそれぞれにおけるヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を有する。
ｄ．塩基の修飾
いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾核酸塩基を有する。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基（本明細書では塩基アナログとも呼ばれる）は、ヌクレオチド糖部分の１′位に連結される。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素塩基である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含まない（例えば、米国特許公報第２００８０２７４４６２号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。しかし、特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含まない（無塩基である）。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾核酸塩基を有する。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基（本明細書では塩基アナログとも呼ばれる）は、ヌクレオチド糖部分の１′位に連結される。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素塩基である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含まない（例えば、米国特許公報第２００８０２７４４６２号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。しかし、特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含まない（無塩基である）。
いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基は、修飾ヌクレオチド内のヌクレオチド糖部分の１′位、又はヌクレオチド糖部分置換の同等の位置に配置された複素環式部位であり、これは、二重鎖中に存在する場合に二重鎖の構造を実質的に変化させることなく複数の種類の塩基と対合させて配置することができる。いくつかの実施形態では、標的核酸と完全に相補的である参照一本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的な核酸と形成される二重鎖よりも低いＴmを有する標的核酸と二重鎖を形成する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基が塩基に置き換えられて１つのミスマッチを生じている参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を含む核酸と形成される二重鎖よりも高いＴmを有する標的核酸と二重鎖を形成する。
ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的例としては、イノシン、１－β－Ｄ－リボフラノシル－５－ニトロインドール、及び／又は１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－ニトロピロールが挙げられる（米国特許公報第２００７０２５４３６２号；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９５，２３（２１）：４３６３－７０；Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９５，２３（１３）：２３６１－６；Ｌｏａｋｅｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４，２２（２０）：４０３９－４３を参照されたく、上記のそれぞれの塩基修飾に関するそれらの開示は、参照により本明細書に援用される）。
ｅ．可逆的修飾
標的細胞に達するまで、ｉｎ ｖｉｖｏ環境からオリゴヌクレオチドを保護するために、特定の修飾を作成することができるが、それらは、標的細胞の細胞質ゾルに一旦達すると、オリゴヌクレオチドの効力又は活性を低下させる場合がある。可逆的修飾は、分子が望ましい特性を細胞の外側で維持し、その後、細胞の細胞質ゾル環境に入ると除去されるように作成することができる。可逆的な修飾は、例えば、細胞内酵素の作用によって、又は細胞内部の化学的条件によって（例えば、細胞内グルタチオンによる低下を通して）除去され得る。
標的細胞に達するまで、ｉｎ ｖｉｖｏ環境からオリゴヌクレオチドを保護するために、特定の修飾を作成することができるが、それらは、標的細胞の細胞質ゾルに一旦達すると、オリゴヌクレオチドの効力又は活性を低下させる場合がある。可逆的修飾は、分子が望ましい特性を細胞の外側で維持し、その後、細胞の細胞質ゾル環境に入ると除去されるように作成することができる。可逆的な修飾は、例えば、細胞内酵素の作用によって、又は細胞内部の化学的条件によって（例えば、細胞内グルタチオンによる低下を通して）除去され得る。
いくつかの実施形態では、可逆的修飾ヌクレオチドは、グルタチオン感受性部位を含む。典型的には、核酸分子は、ヌクレオチド間二ホスフェート結合によって発生する負電荷をマスクして、細胞摂取及びヌクレアーゼ耐性を改善するために、環式ジスルフィド部位で化学的に修飾されている（米国特許公報第２０１１０２９４８６９号、国際特許公報第ＷＯ２０１５１８８１９７号、Ｍｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０１４，３２：１２５６－１２６３、国際特許公報第ＷＯ２０１４０８８９２０号を参照されたく、そのような修飾のそれらの開示は、参照により本明細書に援用される）。ヌクレオチド間二ホスフェート結合のこの可逆的修飾は、細胞質ゾルの還元環境（例えば、グルタチオン）によって細胞内で切断されるように設計される。以前の事例としては、細胞内部で切断可能であることが報告されている中和ホスホトリエステル修飾が挙げられる（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５：９４０－９５０）。
いくつかの実施形態では、このような可逆的修飾により、ヌクレアーゼ及び他の厳しい環境要因（例えば、ｐＨ）にオリゴヌクレオチドが曝されるであろうｉｎ ｖｉｖｏ投与（例えば、血液及び／又は細胞のリソソーム／エンドソームコンパートメントを介した輸送）中の保護が可能となる。細胞外空間と比較してグルタチオンのレベルが高い細胞の細胞質ゾルへの放出の際に、修飾が逆転し、結果的にオリゴヌクレオチドが切断される。可逆性グルタチオン感受性部位を使用することによって、不可逆性化学修飾を使用することで利用可能な選択肢と比較して、立体的に大きな化学基を目的のオリゴヌクレオチドに導入することが可能である。これらの大きな化学基は、細胞質ゾル内で除去され、ゆえに、細胞の細胞質ゾル内部でのオリゴヌクレオチドの生物学的活性を妨害するものであってはならない。結果として、これらの大きな化学基は、ヌクレアーゼ耐性、親油性、電荷、熱安定性、特異性、及び免疫原性の低下などの種々の利益をヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに与えるように操作され得る。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部位の構造は、その放出の動態を調節するように操作することができる。
いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部位は、ヌクレオチドの糖に結合される。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部位は、修飾ヌクレオチドの糖の２′炭素に結合される。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部位は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５′末端ヌクレオチドである場合、糖の５炭素に配置される。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部位は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３′末端ヌクレオチドである場合、糖の３炭素に配置される。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部位は、スルホニル基を含む（例えば、国際特許公報第ＷＯ２０１８０３９３６４号を参照されたく、その関連する開示の内容は、参照により本明細書に援用される）。
ｆ．標的化リガンド
いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞又は１つ以上の臓器に向けて本開示のオリゴヌクレオチドを標的化することが望ましい場合がある。そのような戦略は、他の臓器への望ましくない影響を回避することを助力することができるか、又はオリゴヌクレオチドによる利益が得られないであろう、細胞、組織又は臓器へのオリゴヌクレオチドの過度な損失を避けることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書にて開示するオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞又は臓器への標的化を促進する、例えば、肝臓へのオリゴヌクレオチド送達を促進するよう修飾され得る。特定の実施形態では、本明細書にて開示するオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を促進するように修飾され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的化リガンドに結合されたヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞又は１つ以上の臓器に向けて本開示のオリゴヌクレオチドを標的化することが望ましい場合がある。そのような戦略は、他の臓器への望ましくない影響を回避することを助力することができるか、又はオリゴヌクレオチドによる利益が得られないであろう、細胞、組織又は臓器へのオリゴヌクレオチドの過度な損失を避けることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書にて開示するオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞又は臓器への標的化を促進する、例えば、肝臓へのオリゴヌクレオチド送達を促進するよう修飾され得る。特定の実施形態では、本明細書にて開示するオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を促進するように修飾され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的化リガンドに結合されたヌクレオチドを含む。
標的化リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質の一部（例えば、抗体又は抗体フラグメント）、又は脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、アプタマーである。例えば、標的化リガンドは、血管系又は神経膠腫細胞を標的とするのに使用されるＲＧＤペプチド、腫瘍血管もしくは小孔を標的とし、ラクトフェリンを転写するＣＲＥＫＡペプチド、又はＣＮＳ血管系で発現するトランスフェリン受容体を標的とするアプタマー、又は神経膠腫細胞上のＥＧＦＲを標的とする抗ＥＧＦＲ抗体であってよい。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、１つ以上のＧａｌＮＡｃ部位である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個以上（例えば、１、２、３、４、５又は６個）のヌクレオチドは、それぞれ別々の標的化リガンドに結合される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの２～４個のヌクレオチドは、それぞれ、別々の標的化リガンドに結合される。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端で２～４個のヌクレオチドに結合され（例えば、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖の５′又は３′末端の２～４ヌクレオチドのオーバーハング又は伸長部に結合される）、この場合、標的化リガンドは歯ブラシの毛に似ており、オリゴヌクレオチドは歯ブラシに似ている。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５′又は３′末端のいずれかでステムループ配列を含んでよく、かつステムのループの１、２、３、又は４個のヌクレオチドが、標的化リガンドに個別に結合されてよい。
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、ＧａｌＮＡｃ部位である。ＧａｌＮＡｃは、主に肝細胞の類洞表面に発現し、かつ末端ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン残基（アシアロ糖タンパク）を含む循環糖タンパク質の結合、内在化、及びその後の排出において主要な役割を果たすアシアロ糖タンパク受容体（ＡＳＧＰＲ）に対する高親和性リガンドである。ＧａｌＮＡｃ部位のオリゴヌクレオチドへの結合（直接的結合又は間接的結合）を使用して、細胞で発現するＡＳＧＰＲに向けてこれらのオリゴヌクレオチドを標的化することができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一価のＧａｌＮＡｃに直接的又は間接的に結合される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２つ以上の一価のＧａｌＮＡｃに直接的又は間接的に結合される（すなわち、２、３、又は４つの一価のＧａｌＮＡｃ部位に結合され、かつ典型的には、３又は４つの一価のＧａｌＮＡｃ部位に結合される）。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の二価のＧａｌＮＡｃ、三価のＧａｌＮＡｃ、又は四価のＧａｌＮＡｃ部位に結合される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個以上（例えば、１、２、３、４、５又は６個）のヌクレオチドは、それぞれＧａｌＮＡｃ部位に結合される。いくつかの実施形態では、テトラループの２～４個のヌクレオチドは、それぞれ、別々のＧａｌＮＡｃに結合される。いくつかの実施形態では、トリループの１～３個のヌクレオチドは、それぞれ、別々のＧａｌＮＡｃに結合される。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端で２～４個のヌクレオチドに結合され（例えば、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖の５′又は３′末端の２～４ヌクレオチドのオーバーハング又は伸長部に結合される）、この場合、ＧａｌＮＡｃ部位は歯ブラシの毛に似ており、オリゴヌクレオチドは歯ブラシに似ている。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部位は、センス鎖のヌクレオチドに結合される。例えば、４つのＧａｌＮＡｃ部位が、センス鎖のテトラループのヌクレオチドに結合され得、この際、各ＧａｌＮＡｃ部位は、１個のヌクレオチドに結合される。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、グアニジンヌクレオチドに結合した一価のＧａｌＮＡｃを含み、これは、［ａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ］また２′－アミノジエトキシメタノール－グアニジン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれ、以下のように表される。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、アデニンヌクレオチドに結合した一価のＧａｌＮＡｃを含み、これは、［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］また２′－アミノジエトキシメタノール－アデニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれ、以下のように表される。
このような結合の例を、５′から３′方向のヌクレオチド配列ＧＡＡＡで構成されるループについて以下に示し（Ｚ＝リンカー、Ｘ＝へテロ原子）、ステムの結合点を示す。化学式中、
は、オリゴヌクレオチド鎖への結合点を表すために使用される。
は、オリゴヌクレオチド鎖への結合点を表すために使用される。
適切な方法又は化学反応（例えば、クリックケミストリー）を使用して、標的化リガンドをヌクレオチドに連結させることができる。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、クリックリンカーを使用してヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、アセタールベースのリンカーを用いて標的化リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドに結合する。アセタールベースのリンカーについては、例えば、国際特許公報第ＷＯ２０１６１００４０１号に開示されており、かかるリンカーに関連する内容は、参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、リンカーは、不安定なリンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは安定している。「不安定なリンカー」とは、例えば、酸性ｐＨによって切断することができるリンカーを指す。「安定したリンカー」とは、切断することができないリンカーを指す。
ＧａｌＮＡｃ部分がアセタールリンカーを使用してループのヌクレオチドに結合されている、５′から３′方向のヌクレオチドＧＡＡＡで構成されるループの例を下記に示す。化学式中、
は、オリゴヌクレオチド鎖への結合点である。
任意の適切な方法又は化学反応（例えば、クリックケミストリー）を使用して、標的化リガンドをヌクレオチドに連結させることができる。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、クリックリンカーを使用してヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、アセタールベースのリンカーを用いて標的化リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドに結合する。アセタールベースのリンカーについては、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１６１００４０１号に開示されており、かかるリンカーに関する内容は、参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、リンカーは、不安定なリンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは安定している。「完全に安定したリンカー」とは、切断することができないリンカーを指す。
ｇ．修飾パターン
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、及びその他の酵素に対する耐性を増強させ、ハイブリダイゼーション安定性を強化又は維持し、標的化特異性をもたらし、かつ、必要に応じて、ＲＮＡサイレンシング処理を高める（例えば、ダイサー及びアルゴノートを介して）ように修飾される。いくつかの実施形態では、糖部分、５′末端ホスフェート、ヌクレオシド間結合、及び塩基の修飾、ならびに可逆的修飾、及び標的化リガンドを介した修飾のそれぞれは、定義した実施形態のオリゴヌクレオチド内に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、及びその他の酵素に対する耐性を増強させ、ハイブリダイゼーション安定性を強化又は維持し、標的化特異性をもたらし、かつ、必要に応じて、ＲＮＡサイレンシング処理を高める（例えば、ダイサー及びアルゴノートを介して）ように修飾される。いくつかの実施形態では、糖部分、５′末端ホスフェート、ヌクレオシド間結合、及び塩基の修飾、ならびに可逆的修飾、及び標的化リガンドを介した修飾のそれぞれは、定義した実施形態のオリゴヌクレオチド内に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、センス鎖の５′末端ホスフェートは、例えば、ホスホロチオエート又は４′ホスフェートアナログなどのホスフェートアナログで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖のヌクレオチド位置１及び２におけるヌクレオチドのヌクレオチド間結合は、例えば、ホスホロチオエート又は４′ホスフェートアナログで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の５′末端ホスフェートは、４′－Ｏ－メチルホスホネートで修飾される。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の５′末端ホスフェート又は５′末端ヌクレオチドのヌクレオチド間結合は、例えば、ホスホロチオエートで修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチド位置１及び２、ならびに２及び３、ならびに任意選択で３及び４におけるヌクレオチドのヌクレオチド間結合は、例えば、ホスホロチオエートで修飾される。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド位置７～１０に、好ましくはヌクレオチド位置９、１０、１１に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する１個以上～最大４個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド位置９、１０、１１に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有する。前述の実施形態において、センススタンドの残りのヌクレオチドは、２′－Ｏ－メチルで修飾された糖部分を有する。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置１、２、３、５、６、７、１０、１４、及び１６に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する１個以上～最大６個、最大５個、最大４個又は最大３個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置５もしくは１４に、又はヌクレオチド位置５及び１４の両方に、少なくとも２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置５に、少なくとも２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有し、かつ任意選択でヌクレオチド位置１、２、３、６、７、１０、１４、及び１６に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドの最大５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置１４に、少なくとも２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有し、かつ任意選択でヌクレオチド位置１、２、３、５、６、７、１０、１４、及び１６に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する最大５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置５及び１４に、少なくとも２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有し、かつ任意選択でヌクレオチド位置１、２、３、６、７、１０、及び１６に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有する最大４個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置２、５及び１４に、２′－Ｆで修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有する。前述の実施形態において、アンチセンス鎖の残りのヌクレオチドは、２′－Ｏ－メチルで修飾された糖部分を有する。
いくつかの実施形態では、以下の位置：センス鎖の位置１～７、又は１２～３６及び／又はアンチセンス鎖の位置１、６、８、９、１１～１３、又は１５～２２のうち１つ以上が、２′－Ｏ－メチルで修飾され、かつ以下の位置：センス鎖の位置８～１１及び／又はアンチセンス鎖の位置２、３、４、５、７、１０、又は１４のうち１つ以上が、２′－フルオロで修飾される。特定の実施形態では、センス鎖の位置１～７、又は１２～３６及びアンチセンス鎖の位置１、６、８、９、１１～１３、又は１５～２２が、２′－Ｏ－メチルで修飾され、かつセンス鎖の位置８～１１及びアンチセンス鎖の位置２、３、４、５、７、１０、又は１４が、２′－フルオロで修飾される。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖を有するオリゴヌクレオチドは、ステムループ配列Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を更に含み、ここで、Ｌはテトラループ、ペンタループ又はトリループである。いくつかの実施形態では、Ｓ１及びＳ２領域の１個以上～最大全てのヌクレオチドは、２′－Ｏ－メチル糖で修飾された糖部分を有する。いくつかの実施形態では、Ｌ配列の５′末端ヌクレオチドは、２′－Ｏ－メチルによる糖部分の修飾を有し、Ｌの残りのヌクレオチドは、標的化リガンドを有する。いくつかの実施形態では、Ｌ領域のヌクレオチドの全ては、標的化リガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃを有する。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、センス鎖及びアンチセンス鎖が二重鎖を形成する場合、１～２ヌクレオチドの３′オーバーハング、好ましくは２ヌクレオチドのオーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３′オーバーハングのヌクレオチドは、ヌクレオチド間結合の修飾、例えば、ホスホロチオエートを有する。例として、限定はされないが、長さが２２ヌクレオチドのアンチセンス鎖は、残基２０及び２１、ならびに２１及び２２の間に、ホスホロチオエート結合で修飾されたヌクレオシド間結合を有する。
いくつかの実施形態では、例として、限定はされないが、下記構造の例示的なオリゴヌクレオチド（例えば、長さが３６ヌクレオチドのセンス鎖、及び長さが２２ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、この際、センス鎖が、領域Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を含むステムループ配列を含むオリゴヌクレオチド）の場合のヌクレオチドの修飾のパターンは、次の通りである。
いくつかの実施形態では、例として、限定はされないが、下記構造の例示的なオリゴヌクレオチド（例えば、長さが３６ヌクレオチドのセンス鎖、及び長さが２２ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、この際、センス鎖が、領域Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を含むステムループ配列を含むオリゴヌクレオチド）の場合のヌクレオチドの修飾のパターンは、次の通りであり、
ここで、
である。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、修飾パターンのその他の変形を含み、糖部分の修飾、５′末端ホスフェートの修飾、ヌクレオシド間結合の修飾、塩基の修飾、可逆的修飾、及び本明細書に記載するような標的化リガンドを介した修飾が組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、表Ａから選択されるセンス鎖、アンチセンス鎖、又は二本鎖オリゴヌクレオチドである。
ＩＩＩ．医薬組成物
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの使用を促進する医薬組成物として調製される。例えば、オリゴヌクレオチドは、分解を最小限に抑えるか、送達及び／又は摂取を促進するか、又は別の有益な特性を製剤内のオリゴヌクレオチドに与える医薬組成物又は製剤を使用して、対象又は細胞環境に送達され得る。このような組成物は、対象に、標的細胞の隣接環境内部に、又は局部的領域もしくは臓器に投与される際に、あるいは、全身投与される際に、オリゴヌクレオチドの十分な部分が、細胞に入り標的ＲＮＡによってコードされた標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルを低下させるように、適切に製剤化することができる。オリゴヌクレオチドを含む種々の適切な医薬組成物の任意のものを使用して、グリア細胞におけるＲＮＡ及び／又はタンパク質発現の低下のためのオリゴヌクレオチドを送達することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの医薬組成物は、緩衝液（例えば、ホスフェート緩衝生理食塩水）、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの使用を促進する医薬組成物として調製される。例えば、オリゴヌクレオチドは、分解を最小限に抑えるか、送達及び／又は摂取を促進するか、又は別の有益な特性を製剤内のオリゴヌクレオチドに与える医薬組成物又は製剤を使用して、対象又は細胞環境に送達され得る。このような組成物は、対象に、標的細胞の隣接環境内部に、又は局部的領域もしくは臓器に投与される際に、あるいは、全身投与される際に、オリゴヌクレオチドの十分な部分が、細胞に入り標的ＲＮＡによってコードされた標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルを低下させるように、適切に製剤化することができる。オリゴヌクレオチドを含む種々の適切な医薬組成物の任意のものを使用して、グリア細胞におけるＲＮＡ及び／又はタンパク質発現の低下のためのオリゴヌクレオチドを送達することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの医薬組成物は、緩衝液（例えば、ホスフェート緩衝生理食塩水）、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドを含む。
カチオン性脂質を含むオリゴヌクレオチドの製剤を使用して、細胞内へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを促進することができる。例えば、リポフェクチン、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリカチオン性分子（例えば、ポリリシン）などのカチオン性脂質を使用することができる。適切な脂質としては、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、又はＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられ、これらはいずれも製造元の指示に従って使用することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、製剤は、脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、リポソーム、脂質、脂質複合体、ミクロスフィア、微小粒子、ナノスフィア、もしくはナノ粒子を含むか、又は他の形で、投与を必要とする対象の細胞、組織、臓器、又は身体への投与向けに製剤化され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１３を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本開示のオリゴヌクレオチド及び適切な賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、組成物の安定性を改善し、吸収を改善し、溶解性を改善し、及び／又は有効成分の治療的強化をもたらす。いくつかの実施形態では、賦形剤は、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、もしくは水酸化ナトリウム）、又は溶媒（例えば、緩衝溶液、ペトロラタム、ジメチルスルホキシド、又は鉱油）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、その貯蔵寿命を延長させるために凍結乾燥され、その後、使用（例えば、対象への投与）前に溶液化される。したがって、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、及び凍結乾燥保護剤（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、もしくはポリビニルピロリドン）である賦形剤、又は崩壊温度調整剤（例えば、デキストラン、フィコールもしくはゼラチン）を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、その目的の投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、髄腔内、脳室内、間質内、静脈内、鼻腔内、又は舌下投与に適合するように製剤化される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）もしくは分散液として製剤化されるようなもの、及び滅菌注射用溶液もしくは分散液の即時調製用の滅菌粉末などの、注射用途に適したものである。例えば、静脈内、髄腔内、脳室内、又は間質内向けの注射による投与の場合のいくつかの実施形態では、適切な担体又は賦形剤は、例として、限定はされないが、生理的食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）、又はホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど）、ならびにその好適な混合物を含有する溶剤又は分散媒であり得る。いくつかの実施形態では、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの、多価アルコールを組成物内に含めることが好ましい場合がある。滅菌注射用溶液は、選択された溶剤中に、必要とされる量のオリゴヌクレオチドを、必要に応じて上記列挙した成分の１つ又はそれらの組み合わせと共に加えて、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約０．１％の治療剤（例えば、グリア細胞で発現するＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド）を含有する。いくつかの実施形態では、有効成分（複数可）のパーセンテージは、組成物全体の重量又は体積の約１％～約８０％以上であってよい。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品保存寿命、ならびにその他の薬理学的考慮事項などの要因は、かかる医薬製剤の調製の分野における当業者によって想到されるものであり、したがって、様々な投与量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
いくつかの実施形態では、滅菌注射用溶液は、注射に適するように、適切な溶剤中に、必要とされる量の活性化合物を、上記列挙した賦形剤又は担体の１つ又はそれらの組み合わせと共に加えて、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。概して、分散液は、基本分散媒及び上記列挙したその他の好適な成分を含有する滅菌溶媒に活性化合物を加えることによって調製される。滅菌注射液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥法であり、予め滅菌濾過したその溶液から有効成分と任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。
ＩＶ．オリゴヌクレオチドの使用
別の態様では、本開示は、本開示のオリゴヌクレオチドのグリア細胞への選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、グリア細胞に対する選択性は、神経細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達の方法は、グリア細胞を、オリゴヌクレオチドと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、対象の神経系に存在する。いくつかの実施形態では、神経系におけるグリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法は、オリゴヌクレオチドを対象の神経系へ投与することを含む。いくつかの実施形態では、グリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法は、本明細書で更に論じるように、オリゴヌクレオチドを対象の神経の中枢神経系又は末梢神経系へ投与することを含む。
別の態様では、本開示は、本開示のオリゴヌクレオチドのグリア細胞への選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、グリア細胞に対する選択性は、神経細胞と比較したものである。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達の方法は、グリア細胞を、オリゴヌクレオチドと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、対象の神経系に存在する。いくつかの実施形態では、神経系におけるグリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法は、オリゴヌクレオチドを対象の神経系へ投与することを含む。いくつかの実施形態では、グリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法は、本明細書で更に論じるように、オリゴヌクレオチドを対象の神経の中枢神経系又は末梢神経系へ投与することを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法は、グリア細胞を、本明細書にて開示する有効な量のオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、標的ＲＮＡに対する相補性領域を含む。いくつかの実施形態では、グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法は、本開示の有効な量のオリゴヌクレオチドを対象の中枢神経系又は末梢神経系に投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、該オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの発現の低下に効力がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、任意のグリア細胞に適用可能である。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、又は腸管グリア細胞である。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、神経系に存在する、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、又は腸管グリア細胞である。いくつかの実施形態では、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、又は衛星細胞は、中枢神経系に存在する。いくつかの実施形態では、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、又は腸管グリア細胞は、末梢神経系に存在する。
いくつかの実施形態において、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、又は腸管グリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、星状膠細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、希突起膠細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、上衣細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、小グリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、シュワン細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、衛星細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、腸管グリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系における星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、又は衛星細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、中枢神経系は、脳及び脊髄を含む。いくつかの実施形態において、脳又は脳幹の局部的領域におけるグリア細胞を含む、脳又は脳幹におけるグリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、前頭皮質、線条体、体性感覚皮質、海馬、視床下部、又は小脳におけるグリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、脳橋又は髄質などの脳幹におけるグリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、脊髄の局部的領域を含む、対象の脊髄におけるグリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、頚髄、胸髄、又は腰髄におけるグリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。
いくつかの実施形態では、中枢神経系におけるグリア細胞は、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、又は衛星細胞である。したがって、いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系における星状膠細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系における希突起膠細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系における上衣細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系における小グリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系における衛星細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、対象の末梢神経系における星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、又は腸管グリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、末梢神経系におけるグリア細胞は、とりわけ、脳神経、脊髄神経、及び末梢神経に局在するものを含む。いくつかの実施形態では、末梢神経系におけるグリア細胞は、とりわけ、シュワン細胞、衛星細胞、及び腸管グリア細胞を含む。いくつかの実施形態において、末梢神経系におけるシュワン細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、末梢神経系における衛星細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、末梢神経系における腸管グリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの選択的送達のための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、又は腸管グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、星状膠細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、希突起膠細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、上衣細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、小グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、シュワン細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、衛星細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、腸管グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、グリア細胞の組み合わせで発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、対象の神経系におけるグリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系におけるグリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、中枢神経系は、脳及び脊髄を含む。いくつかの実施形態において、脳又は脳幹の局部的領域におけるグリア細胞を含む、脳又は脳幹におけるグリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、前頭皮質、線条体、体性感覚皮質、海馬、視床下部、又は小脳におけるグリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、脳橋又は髄質などの脳幹におけるグリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、脊髄の局部的領域を含む、対象の脊髄におけるグリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、頚髄、胸髄、又は腰髄におけるグリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。
いくつかの実施形態では、中枢神経系におけるグリア細胞は、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、又は衛星細胞である。特定の実施形態では、中枢神経系におけるグリア細胞は、星状膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、又は衛星細胞である。特定の実施形態では、グリア細胞は、星状膠細胞である。いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系における星状膠細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系における希突起膠細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系における上衣細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系における小グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系における衛星細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、対象の末梢神経系におけるグリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、末梢神経系におけるグリア細胞は、とりわけ、脳神経、脊髄神経、及び末梢神経に局在するものを含む。いくつかの実施形態では、末梢神経系におけるグリア細胞は、とりわけ、シュワン細胞、衛星細胞、及び腸管グリア細胞を含む。いくつかの実施形態において、末梢神経系におけるシュワン細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、末梢神経系における衛星細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、末梢神経系における腸管グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、対象の神経系におけるグリア細胞への選択的送達、又は該グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法は、対象に本開示の有効な量のオリゴヌクレオチドを投与することを含み、該投与は、有効な量のオリゴヌクレオチドを対象の神経系に送達するための手段によって行われる。
いくつかの実施形態において、対象の神経系におけるグリア細胞への選択的送達、又は該グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法は、対象に本開示の有効な量のオリゴヌクレオチドを髄腔内、脳室内、静脈内、間質内、舌下、又は鼻腔内投与することを含む。
いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系におけるグリア細胞への選択的送達、又は該グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法は、対象に本開示の有効な量のオリゴヌクレオチドを髄腔内投与することを含む。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、対象の脳又は脊髄に存在する。
いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系におけるグリア細胞への選択的送達、又は該グリア細胞における標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下の方法は、対象に本開示の有効な量のオリゴヌクレオチドを脳室内投与することを含む。
いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系におけるグリア細胞への選択的送達、又は該グリア細胞におけるＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下の方法は、対象に本開示の有効な量のオリゴヌクレオチドを間質内投与することを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、中枢神経系における局部的領域に間質内投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、前頭皮質、線条体、体性感覚皮質、海馬、視床下部、又は小脳に間質内投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、頚髄、胸髄、又は腰髄などの脊髄の局部的領域を含む脊髄に間質内投与される。
いくつかの実施形態において、対象の中枢神経系におけるグリア細胞への選択的送達、又は該グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下のための方法は、対象に本開示の有効な量のオリゴヌクレオチドを鼻腔内投与することを含む。鼻腔内投与は、嗅覚及び／又は三叉神経経路を介した、脳幹、小脳、脊髄、嗅球、ならびに皮質及び皮質下構造を含む中枢神経系の領域への輸送を利用する。
上記の投与経路に加えて、本開示のオリゴヌクレオチドは、三叉神経経路を介した中枢神経系への送達のために、舌下又は経皮投与することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、必要に応じて静脈内投与することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書にて開示するオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを含有する溶液の注射、オリゴヌクレオチドを被覆した粒子による砲撃、オリゴヌクレオチドを含有する組成物への細胞又は生物の曝露、又はオリゴヌクレオチドの存在下における細胞膜の電気穿孔法を含む、適切な核酸送達方法を使用して導入することができる。脂質によって媒介される担体輸送、化学物質によって媒介される輸送、及びカチオン性リポソームトランスフェクション、例えばリン酸カルシウムなど、細胞へオリゴヌクレオチドを送達するためのその他の適切な方法を使用することもできる。
阻害の効果は、細胞もしくは対象の１つ以上の特性を評価する適切なアッセイによって、又はＲＮＡ発現を示す分子（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）を評価する生化学的技術によって確認することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供のオリゴヌクレオチドが細胞、組織又は臓器で発現する標的ＲＮＡのレベルを低下させる程度は、発現レベル（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質レベル）を適切な対照（例えば、オリゴヌクレオチドが送達されていないか、又は陰性対照が送達された細胞又は細胞の集団におけるＲＮＡ発現のレベル）と比較することによって評価される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ発現の適切な対照レベルは、対照レベルを毎回測定しなくてもよいように、所定のレベル又は値であってよい。所定のレベル又は値は、様々な形態のものとすることができる。いくつかの実施形態では、所定のレベル又は値は、中央値又は平均などの単一のカットオフ値とすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するようなオリゴヌクレオチドの投与により、グリア細胞におけるＲＮＡ発現のレベルの低下がもたらされる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ発現のレベルの低下は、ＲＮＡの適切な対照レベルと比較して、１％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、又は９０％以下まで低下し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ発現のレベルの低下は、少なくとも５０％以下である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ発現のレベルの低下は、少なくとも７０％以下である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ発現のレベルの低下は、少なくとも８０％以下である。いくつかの実施形態では、適切な対照レベルは、本明細書に記載するようなオリゴヌクレオチドと接触していないか、又は陰性対照オリゴヌクレオチド（例えば、ランダムヌクレオチド配列）で処置されたグリア細胞又はグリア細胞の集団におけるＲＮＡ発現のレベルであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書にて開示する方法によるグリア細胞へのオリゴヌクレオチドの送達の効果は、一定期間の後に評価される。例えば、ＲＮＡのレベルは、細胞へのオリゴヌクレオチドの導入後、少なくとも８時間、１２時間、１８時間、２４時間；又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は１４日後に、細胞内で分析することができる。
いくつかの実施形態では、グリア細胞への選択的送達、又は該グリア細胞で発現するＲＮＡによってコードされるＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルの選択的低下は、神経細胞への選択的送達又は該神経細胞で発現するＲＮＡ及び／又はタンパク質の別のおそらく密接に関連する形態もしくは代替的形態の選択的低下と比較したものである。いくつかの実施形態では、選択性又は差異的なサイレンシングは、グリア細胞及び神経細胞の両方で発現する標的ＲＮＡの発現の％低下の比較に基づく。いくつかの実施形態では、選択性は、神経細胞特異的ＲＮＡの発現の％低下と比較した、グリア細胞特異的ＲＮＡの発現の％低下の比較に基づく。いくつかの実施形態では、神経細胞よりも高いグリア細胞に対する選択性は、少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２以上高い。いくつかの実施形態では、グリア細胞に対する選択性は、神経細胞よりも２以上、２．５以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、又は５以上高い。いくつかの実施形態では、選択性は、神経細胞と比較した、グリア細胞への本開示のオリゴヌクレオチドの送達に対するものである。いくつかの実施形態では、選択性は、神経細胞で特異的に発現するＲＮＡと比較した、グリア細胞で特異的に発現するＲＮＡの減少に対するものである。様々な実施形態では、コンパレータとして使用するための神経細胞で発現するＲＮＡ及び／又はタンパク質は、神経細胞マーカーについて本明細書で記載するような任意の神経細胞特異的マーカータンパク質とすることができる。神経細胞特異的マーカーとしては、とりわけ、神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ又はガンマエノラーゼ）、神経核（ＮｅｕＮ又はＦｏｘ３）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ－２）、チューブリンβＩＩＩ（ＴＵＢＢ３）、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、ｃ－ｆｏｓ、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、及びチロシンヒドロキシラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、グリア細胞と神経細胞との間の選択性の評価は、グリア細胞特異的ＲＮＡ発現及び神経細胞特異的ＲＮＡ発現と類似の％低下を生じる、肝細胞などの非神経細胞におけるｓｉＲＮＡを使用する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、細胞内でオリゴヌクレオチド（例えば、そのセンス鎖及びアンチセンス鎖）を発現するように操作された導入遺伝子の形態で送達される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書にて開示する任意のオリゴヌクレオチドを発現するように操作された導入遺伝子を使用して送達される。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ関連ウイルスもしくは単純ヘルペス）又は非ウイルスベクター（例えば、プラスミドもしくは合成ｍＲＮＡ）を使用して送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、対象に直接注射することができる。
本明細書のいくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、グリア細胞で発現する任意のＲＮＡを選択的に標的とすることができる。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、目的の標的ＲＮＡの発現の低下に効力がある。上述のように、いくつかの実施形態では、目的の標的ＲＮＡは、グリア細胞におけるその発現がグリア細胞機能不全による疾患又は障害に関連するものを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、アレキサンダー病（ＡｘＤ）に関連するＧＦＡＰ遺伝子；異染性白質萎縮症／クラッベ病に関連するＰＳＡＰ遺伝子；シャルコー・マリー・ツース病に関連するＰＭＰ２２遺伝子；成人期発症性白質萎縮症に関連するＬＭＮＢ１遺伝子；アルツハイマー病に関連するＡＰＰ遺伝子及びＴＡＵ（ＭＡＰＴ）遺伝子；ハンチントン病に関連するＳＯＤ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子、及びＨＴＴ遺伝子；パーキンソン病に関連するＳＮＣＡもしくはＡＳＹＮ遺伝子及びＬＲＲＫ２２遺伝子；癲癇に関連するＡＤＫ遺伝子；脳卒中に関連するＴＮＦα遺伝子及びＥＲＫ５／ＭＡＰＫ７遺伝子；外傷性脳損傷及び軸索損傷に関連するＴＮＦα遺伝子及びＧＦＡＰ遺伝子；自閉症に関連するＩＬ－１Ｒ２遺伝子；多発性硬化症に関連するＣＤ４９ｄ遺伝子；グリア芽細胞腫及びグリア細胞癌に関連するＩＧＦ－１遺伝子、ＥＧＦ遺伝子、ＴＧＦ－β遺伝子、及びＶＥＧＦ遺伝子；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連するＳＯＤ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子、及びＴＤＰ－４３遺伝子；神経性炎症に関連するＴＮＦα遺伝子及びＣＤ３８遺伝子；脊髄小脳失調に関連するＡＴＸＮ２遺伝子、ＡＴＸＮ３遺伝子、及びＡＴＸＮ７遺伝子；進行性核上麻痺に関連するＴＡＵ（ＭＡＰＴ）遺伝子；原発性年齢関連性タウ異常症（ＰＡＲＴ）／神経原線維変化優性老人性痴呆に関連するＴＡＵ（ＭＡＰＴ）遺伝子；前頭側頭型痴呆及び染色体１７が関連するパーキンソン症候群（ＦＴＤＰ－１７）に関連するＴＡＵ（ＭＡＰＴ）遺伝子；ならびに末梢神経脱髄に関連するＥＧＲ２遺伝子、の発現ＲＮＡに対する相補性領域を含む。
いくつかの実施形態では、コードが書き込まれたタンパク質の変異型を含有する遺伝子の発現が、発現の低下の対象となる。いくつかの実施形態では、その過剰発現が疾患又は障害の原因又は徴候に関連する遺伝子が、発現の低下の対象となる。いくつかの実施形態では、その発現が疾患又は障害に関連するタンパク質の変異型をコードする遺伝子（複数可）が、発現の低下の対象となる。いくつかの実施形態では、その発現が疾患又は障害に関連する変異又は遺伝子を含む遺伝子としては、例として、限定はされないが、ＧＦＡＰ（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，６９（６）：１４１３を参照）；ＰＭＰ２２（例えば、Ｒｏｂａｇｌｉａ－Ｓｃｈｌｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，２００２，１２５（１０）：２２１３－２２２１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，２０１３，４７（２）：６７３－９８を参照）；ＬＭＮＢ１（例えば、Ｐａｄｉａｔｈ，Ｑ．Ｓ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０１９，７（４１）：１－６を参照）；ＡＰＰ（例えば、Ｋａｔｓｕｒａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１６，４（１）：ｅ１２６６５を参照）；ＴＡＵ／ＭＡＰＴ（例えば、Ｌｅ Ｇｕｅｎｎｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．，２０１７，２２（８）：１１１９－１１２５を参照）；ＳＯＤ１（例えば、Ｍａｓｓｅｎｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ （ＢＢＡ）－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１８，１８６４（１２）：３７７１－３７８５を参照）、Ｃ９ｏｒｆ７２（例えば、Ｂａｌｅｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ．，２０１８，１４（９）：５４４－５５８を参照）、ＡＴＸＮ２（例えば、Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ （Ｂａｓｅｌ），２０１７，８（６）：１５７を参照）、ＡＴＸＮ３（例えば、Ｎｅｖｅｓ－Ｃａｒｖａｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，２０１５，２４（１）：１００－１１７を参照）、ＡＴＸＮ７（例えば、Ｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０１５，３５（１０）：１７７７－１７８７を参照）；ＨＴＴ（例えば、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２００５，１７１（６）：１００１－１０１２を参照）；ＳＮＣＡ／ＡＳＹＮ（例えば、Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．，２０１５，６（１１）：ｅ１９９４を参照）；ＡＤＫ（例えば、Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ，２０１１，５３（１）：８５８－６６を参照）、ＴＮＦα（例えば、Ｗｅｌｓｅｒ－Ａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ．，２０１３，６３（１）：４７－５３を参照）；ＣＤ４９ｄ（例えば、Ｌｉｍｍｒｏｔｈ，Ｖ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０１４，８３（２０）：１７８０－１７８８を参照）；又はＴＤＰ－４３（例えば、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．，２０１６，１２（９）：１１４０－１１４９を参照）の遺伝子が挙げられる。対応する疾患又は障害及び参照ｍＲＮＡについては、上述した通りである。
さらなる態様では、本発明は、グリア細胞における標的遺伝子の発現が原因の又はそれが関連する疾患又は疾患を発症するリスクを有する対象を治療するための方法に関する。いくつかの実施形態では、影響を受ける可能性のある疾患又は障害は、例として、限定はされないが、ＧＦＡＰ遺伝子の発現に関連するアレキサンダー病（ＡｘＤ）；ＰＳＡＰ遺伝子の発現に関連する異染性白質萎縮症／クラッベ病；ＰＭＰ２２遺伝子の発現に関連するシャルコー・マリー・ツース病；ＬＭＮＢ１遺伝子の発現に関連する成人期発症性白質萎縮症；ＡＰＰ遺伝子の発現に関連するアルツハイマー病；ＳＯＤ１遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０００４５４．４）、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子（例えば、参照ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１２５６０５４．２；ＮＭ＿０１８３２５．５；ＮＭ＿１４５００５．６）、及びＨＴＴ遺伝子の発現に関連するハンチントン病；ＳＮＣＡ／ＡＳＹＮ遺伝子及びＬＲＲＫ２２遺伝子の発現に関連するパーキンソン病；ＡＤＫ遺伝子の発現に関連する癲癇；ＴＮＦα遺伝子及びＥＲＫ５／ＭＡＰＫ７遺伝子の発現に関連する脳卒中及びその影響；ＴＮＦα遺伝子及びＧＦＡＰ遺伝子の発現に関連する外傷性脳損傷及び軸索損傷及びその影響；ＩＬ－１Ｒ２遺伝子の発現に関連する自閉症；ＣＤ４９ｄ遺伝子の発現に関連する多発性硬化症；ＩＧＦ－１遺伝子、ＥＧＦ遺伝子、ＴＧＦ－β遺伝子、及びＶＥＧＦ遺伝子の発現に関連するグリア芽細胞腫及びグリア細胞癌；ＳＯＤ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子、及びＴＤＰ－４３遺伝子の発現に関連する筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；ＴＮＦα遺伝子及びＣＤ３８遺伝子の発現に関連する神経性炎症；ＡＴＸＮ２遺伝子、ＡＴＸＮ３遺伝子、及びＡＴＸＮ７遺伝子の発現に関連する脊髄小脳失調；ＴＡＵ（ＭＡＰＴ）遺伝子の発現に関連する進行性核上麻痺；ＴＡＵ（ＭＡＰＴ）遺伝子の発現に関連する原発性年齢関連性タウ異常症（ＰＡＲＴ）／神経原線維変化優性老人性痴呆；ＴＡＵ（ＭＡＰＴ）遺伝子の発現に関連する前頭側頭型痴呆及び染色体１７が関連するパーキンソン症候群（ＦＴＤＰ－１７）；ならびにＥＧＲ２遺伝子の発現に関連する末梢神経脱髄が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、有効な量のオリゴヌクレオチド、すなわち、望ましい治療結果を生じることができる量を対象に投与することを含む。治療上許容可能な量は、疾患又は障害を治療できる量とすることができる。任意の１人の対象に対する適切な投薬量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、組成物中の有効成分（複数可）、投与時間及び投与経路、全身の健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含む特定の因子に応じて決められる。
非限定的な例のセットとして、本開示のオリゴヌクレオチドは、典型的には四半期ごと（３ヶ月ごとに１回）、隔月（２ヶ月ごとに１回）、毎月、又は毎週投与される。例えば、オリゴヌクレオチドは、１週間ごと、又は２週間もしくは３週間の間隔で投与されてよい。オリゴヌクレオチドは、毎日投与されてよい。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、ヒトもしくは非ヒト霊長類又はその他の哺乳動物対象である。他の例示的な対象としては、イヌ及びネコなどの飼いならされた哺乳類；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及びニワトリなどの家畜；ならびにマウス、ラット、モルモット、及びハムスターなどのその他の哺乳動物が挙げられる。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、患者と呼ばれる。
ｉｉ．選択的送達及び／又はグリア細胞で発現する標的ＲＮＡの選択的低下のための干渉オリゴヌクレオチドのスクリーニングの方法
さらなる態様では、本開示は、グリア細胞又は神経細胞に対して選択性のあるオリゴヌクレオチドのスクリーニングの方法を提供する。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、神経細胞よりもグリア細胞に対して選択性のあるオリゴヌクレオチドを特定するためのものである。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、グリア細胞よりも神経細胞に対して選択性のあるオリゴヌクレオチドを特定するためのものである。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを低下させることができる。様々な実施形態では、試験したオリゴヌクレオチドは、神経細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、神経細胞と比較してグリア細胞において高レベルで発現するＲＮＡのレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、グリア細胞と比較して神経細胞において高レベルで発現するＲＮＡのレベルを低下させることができる。
さらなる態様では、本開示は、グリア細胞又は神経細胞に対して選択性のあるオリゴヌクレオチドのスクリーニングの方法を提供する。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、神経細胞よりもグリア細胞に対して選択性のあるオリゴヌクレオチドを特定するためのものである。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、グリア細胞よりも神経細胞に対して選択性のあるオリゴヌクレオチドを特定するためのものである。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを低下させることができる。様々な実施形態では、試験したオリゴヌクレオチドは、神経細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、神経細胞と比較してグリア細胞において高レベルで発現するＲＮＡのレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、グリア細胞と比較して神経細胞において高レベルで発現するＲＮＡのレベルを低下させることができる。
いくつかの実施形態では、グリア細胞又は神経細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを選択的に低下させるオリゴヌクレオチドのスクリーニングの方法は、
グリア細胞及び神経細胞を、候補オリゴヌクレオチドと接触させることであって、該候補オリゴヌクレオチドは、該グリア細胞及び該神経細胞の両方で発現する標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、該オリゴヌクレオチドは、該標的ＲＮＡの発現を低下させることができる、接触させることと、
グリア細胞及び神経細胞の標的ＲＮＡのレベルを測定して、標的ＲＮＡの発現のレベルに対する任意の差異的な効果を判別することと、を含む。
グリア細胞及び神経細胞を、候補オリゴヌクレオチドと接触させることであって、該候補オリゴヌクレオチドは、該グリア細胞及び該神経細胞の両方で発現する標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、該オリゴヌクレオチドは、該標的ＲＮＡの発現を低下させることができる、接触させることと、
グリア細胞及び神経細胞の標的ＲＮＡのレベルを測定して、標的ＲＮＡの発現のレベルに対する任意の差異的な効果を判別することと、を含む。
いくつかの実施形態では、グリア細胞又は神経細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを選択的に低下させるオリゴヌクレオチドのスクリーニングの方法は、
候補オリゴヌクレオチドを対象の神経系に投与することであって、該候補オリゴヌクレオチドは、該神経系のグリア細胞及び神経細胞の両方で発現する標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、該オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの発現を低下させることができる、投与することと、
グリア細胞及び神経細胞の標的ＲＮＡのレベルを測定して、標的ＲＮＡの発現のレベルに対する任意の差異的な効果を判別することと、を含む。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物である。
候補オリゴヌクレオチドを対象の神経系に投与することであって、該候補オリゴヌクレオチドは、該神経系のグリア細胞及び神経細胞の両方で発現する標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、該オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの発現を低下させることができる、投与することと、
グリア細胞及び神経細胞の標的ＲＮＡのレベルを測定して、標的ＲＮＡの発現のレベルに対する任意の差異的な効果を判別することと、を含む。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物である。
いくつかの実施形態では、神経細胞における標的ＲＮＡのレベルの低下よりもグリア細胞における標的ＲＮＡのレベルのより大きな低下を示すオリゴヌクレオチドは、グリア細胞に対して選択性があると判断される。いくつかの実施形態では、神経細胞よりもグリア細胞に対するオリゴヌクレオチドの選択性は、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５又は５以上高い。
いくつかの実施形態では、グリア細胞における標的ＲＮＡのレベルの低下よりも神経細胞における標的ＲＮＡのレベルのより大きな低下を示すオリゴヌクレオチドは、神経細胞に対して選択性があると判断される。いくつかの実施形態では、グリア細胞よりも神経細胞に対するオリゴヌクレオチドの選択性は、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５又は５以上高い。
いくつかの実施形態では、候補オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載するような一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）を含み、ここで、該ｄｓＮＡは、リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、候補オリゴヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、該センス鎖及び該アンチセンス鎖は、二重鎖を形成し、該アンチセンス鎖は、標的ＲＮＡに対する相補性領域を有し、該オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのレベルを低下させることができる。
いくつかの実施形態では、候補オリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的化リガンドで修飾される。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、炭化水素、アミノ糖、コレステロール、脂質、ペプチド、又はこれらの組み合わせのうち１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、本明細書で詳細に記載するような１つ以上のＧａｌＮＡｃ部位を含む。
いくつかの実施形態では、候補オリゴヌクレオチドは、対象の神経系に投与され、グリア細胞及び神経細胞における標的ＲＮＡのレベルを判別するための測定は、神経系の全体にわたって、又は神経系の局部的領域に分布するグリア細胞及び神経細胞における標的ＲＮＡのレベルを測定することによって評価される。いくつかの実施形態では、検査されるグリア細胞は、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞又はこれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、グリア細胞又は神経細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを選択的に低下させる干渉オリゴヌクレオチドのスクリーニングの方法は、
グリア細胞を、第１の候補オリゴヌクレオチドと接触させることであって、該第１の候補オリゴヌクレオチドは、グリア細胞で発現する第１の標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、該第１のオリゴヌクレオチドは、第１の標的ＲＮＡの発現のレベルを低下させることができる、接触させることと、
神経細胞を、第２の候補オリゴヌクレオチドと接触させることであって、該第２の候補オリゴヌクレオチドは、神経細胞で発現する第２の標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、該第２のオリゴヌクレオチドは、第２の標的ＲＮＡの発現のレベルを低下させることができる、接触させることと、
グリア細胞における第１の標的ＲＮＡのレベル及び神経細胞における第２の標的ＲＮＡのレベルを測定して、第１の標的ＲＮＡ及び第２の標的ＲＮＡの任意の差異的な低下を判別することと、を含む。
グリア細胞を、第１の候補オリゴヌクレオチドと接触させることであって、該第１の候補オリゴヌクレオチドは、グリア細胞で発現する第１の標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、該第１のオリゴヌクレオチドは、第１の標的ＲＮＡの発現のレベルを低下させることができる、接触させることと、
神経細胞を、第２の候補オリゴヌクレオチドと接触させることであって、該第２の候補オリゴヌクレオチドは、神経細胞で発現する第２の標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、該第２のオリゴヌクレオチドは、第２の標的ＲＮＡの発現のレベルを低下させることができる、接触させることと、
グリア細胞における第１の標的ＲＮＡのレベル及び神経細胞における第２の標的ＲＮＡのレベルを測定して、第１の標的ＲＮＡ及び第２の標的ＲＮＡの任意の差異的な低下を判別することと、を含む。
いくつかの実施形態では、グリア細胞又は神経細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを選択的に低下させるオリゴヌクレオチドのスクリーニングの方法は、
第１の候補オリゴヌクレオチドを第１の対象の神経系に投与することであって、該第１の候補オリゴヌクレオチドは、グリア細胞で発現する第１の標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、該第１のオリゴヌクレオチドは、該第１の標的ＲＮＡの発現を低下させることができる、投与することと、
第２の候補オリゴヌクレオチドを第２の対象の神経系に投与することであって、該第２の候補オリゴヌクレオチドは、神経細胞で発現する第２の標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、該第１のオリゴヌクレオチドは、該第１の標的ＲＮＡの発現のレベルを低下させることができる、投与することと、
第１の対象及び第２の対象の神経系のグリア細胞における第１の標的ＲＮＡ及び神経細胞における第２の標的ＲＮＡのレベルを測定することであって、該第１の対象及び該第２の対象は同じ種である、測定することと、を含む。
第１の候補オリゴヌクレオチドを第１の対象の神経系に投与することであって、該第１の候補オリゴヌクレオチドは、グリア細胞で発現する第１の標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、該第１のオリゴヌクレオチドは、該第１の標的ＲＮＡの発現を低下させることができる、投与することと、
第２の候補オリゴヌクレオチドを第２の対象の神経系に投与することであって、該第２の候補オリゴヌクレオチドは、神経細胞で発現する第２の標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、該第１のオリゴヌクレオチドは、該第１の標的ＲＮＡの発現のレベルを低下させることができる、投与することと、
第１の対象及び第２の対象の神経系のグリア細胞における第１の標的ＲＮＡ及び神経細胞における第２の標的ＲＮＡのレベルを測定することであって、該第１の対象及び該第２の対象は同じ種である、測定することと、を含む。
いくつかの実施形態では、第１の候補オリゴヌクレオチド及び第２の候補オリゴヌクレオチドは、対応する標的ＲＮＡに対する相補性領域に関してのみ異なる。いくつかの実施形態では、グリア細胞で発現する標的ＲＮＡは、グリア細胞で特異的に発現する。いくつかの実施形態では、神経細胞で発現する標的ＲＮＡは、神経細胞で特異的に発現する。本明細書で使用される場合、「特異的に発現する」とは、別の細胞と比較して、ある細胞においてより高いレベルで発現するＲＮＡについて言及するものである。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、別の細胞における発現よりも、ある細胞で、１．５、２、３、４、５、６、８、１０倍以上、より特異的に発現する。
候補オリゴヌクレオチドが、他の細胞タイプよりも、ある細胞タイプに対してより高い選択性を示す場合、標的ＲＮＡのレベルのより大きな低下（例えば、％低下）は、他の細胞の標的ＲＮＡのレベルの低下よりも、ある細胞で観察されるはずである。
いくつかの実施形態では、神経細胞における標的ＲＮＡのレベルの低下よりもグリア細胞における標的ＲＮＡのレベルのより大きな低下を示すオリゴヌクレオチドは、グリア細胞に対して選択性があると判断される。いくつかの実施形態では、神経細胞よりもグリア細胞に対するオリゴヌクレオチドの選択性は、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５又は５以上高い。
いくつかの実施形態では、グリア細胞における標的ＲＮＡのレベルの低下よりも神経細胞における標的ＲＮＡのレベルのより大きな低下を示すオリゴヌクレオチドは、神経細胞に対して選択性があると判断される。いくつかの実施形態では、グリア細胞よりも神経細胞に対するオリゴヌクレオチドの選択性は、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５又は５以上高い。
いくつかの実施形態では、第１の候補オリゴヌクレオチド及び第２の候補オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載するような一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、第１の候補オリゴヌクレオチド及び第２の候補オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）を含み、ここで、該ｄｓＮＡは、リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１の候補オリゴヌクレオチドは、第１のセンス鎖及び第１のアンチセンス鎖を含み、ここで、該第１のセンス鎖及び該第２のアンチセンス鎖は、第１の二重鎖を形成し、該第１のアンチセンス鎖は、グリア細胞で発現する第１の標的ＲＮＡに対する相補性領域を有し、かつ第１の標的ＲＮＡの発現を低下させることができる。いくつかの実施形態では、第２の候補オリゴヌクレオチドは、第２のセンス鎖及び第２のアンチセンス鎖を含み、ここで、該第２のセンス鎖及び該第２のアンチセンス鎖は、第２の二重鎖を形成し、該第２のアンチセンス鎖は、神経細胞で発現する第２の標的ＲＮＡに対する相補性領域を有し、かつ標的ＲＮＡの発現を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の候補オリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的化リガンドで修飾される。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、炭化水素、アミノ糖、コレステロール、脂質、ペプチド、又はこれらの組み合わせのうち１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、本明細書で詳細に記載するような１つ以上のＧａｌＮＡｃ部位を含む。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の候補オリゴヌクレオチドは、対象の神経系に投与され、グリア細胞及び神経細胞における標的ＲＮＡのレベルを判別するための測定は、神経系の全体にわたって、又は神経系の局部的領域に分布するグリア細胞及び神経細胞における標的ＲＮＡのレベルを測定することによって評価される。いくつかの実施形態では、検査されるグリア細胞は、例示として、限定はされないが、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞又はこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、神経細胞は、例示として、限定はされないが、運動ニューロン、感覚ニューロン、介在ニューロン及びこれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書に記載の本発明を、より完全に理解できるように、以下の実施例を記載する。本出願に記載されている実施例は、本明細書で提供する方法、組成物、及びシステムを説明するために提供するものであり、多少なりともそれらの範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。
実施例１：細胞タイプ特異的標的化ｓｉＲＮＡの特定
特定の細胞亜集団における遺伝子サイレンシングのレベルを評価するために、神経細胞又は星状膠細胞特異的遺伝子を標的とするＧａｌＸＣ ｓｉＲＮＡを特定する必要があった。Ｔｕｂｂ３及びＧｆａｐのｍＲＮＡを、利用可能なＲＮＡ配列データの広範囲の調査後に選択した。ＴＵＢＢ３すなわちチューブリンβ３クラスＩＩＩは、βチューブリンファミリーのメンバーであり、微小管構築に関与する。Ｔｕｂｂ３のｍＲＮＡは、神経細胞で主に発現する。ＧＦＡＰすなわちグリア線維性酸性タンパク質は、成熟星状膠細胞における主要な中間体フィラメントタンパク質の１つであり、しばしば、発達中の他の非神経細胞タイプと星状膠細胞とを区別するマーカーとして使用される。研究向けに準備したｓｉＲＮＡ分子の配列及び構造を図１に示す。結果として、各標的の発現は、図２Ａ及び図２Ｂに示すように、それぞれ、神経細胞及び星状膠細胞に対してより特異的である。
特定の細胞亜集団における遺伝子サイレンシングのレベルを評価するために、神経細胞又は星状膠細胞特異的遺伝子を標的とするＧａｌＸＣ ｓｉＲＮＡを特定する必要があった。Ｔｕｂｂ３及びＧｆａｐのｍＲＮＡを、利用可能なＲＮＡ配列データの広範囲の調査後に選択した。ＴＵＢＢ３すなわちチューブリンβ３クラスＩＩＩは、βチューブリンファミリーのメンバーであり、微小管構築に関与する。Ｔｕｂｂ３のｍＲＮＡは、神経細胞で主に発現する。ＧＦＡＰすなわちグリア線維性酸性タンパク質は、成熟星状膠細胞における主要な中間体フィラメントタンパク質の１つであり、しばしば、発達中の他の非神経細胞タイプと星状膠細胞とを区別するマーカーとして使用される。研究向けに準備したｓｉＲＮＡ分子の配列及び構造を図１に示す。結果として、各標的の発現は、図２Ａ及び図２Ｂに示すように、それぞれ、神経細胞及び星状膠細胞に対してより特異的である。
ＧｆａｐのｍＲＮＡを標的とするＧａｌＸＣ－ｓｉＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを行うことによって生成した（図３）。Ｔｕｂｂ３のｍＲＮＡを標的とするＧａｌＸＣ－ｓｉＲＮＡ分子を類似のｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを行うことによって生成した（図４）。一例として、１日目に、動物に０～３ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＴＵＢＢ３を皮下注射し、４日目にＴｕｂｂ３のｍＲＮＡを発現するプラスミドを静脈内注射した（ＣＤ－１、メス、群あたりｎ＝５）。５日目に、ＲＴ－ｑＰＣＲによって肝臓におけるＴｕｂｂ３のｍＲＮＡレベルを分析した。各スクリーニングによる最上位の配列は、約１ｍｇ／ｋｇ範囲のＥＤ５０値を示し、マウスのＣＮＳ及びＰＮＳでの評価のために選択した。
実施例２：ＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡによるＣＮＳにおける神経細胞亜集団の選択的標的化
ＧａｌＸＣ－ＴＵＢＢ３及びＧａｌＸＣ－ＧＦＡＰ薬理作用について、脳及び脊髄における神経細胞及び星状膠細胞で評価した。ＧａｌＸＣ－ＴＵＢＢ３又はＧａｌＸＣ－ＧＦＡＰのいずれかを同量で、ボーラスｉ．ｃ．ｖ．注射によって投与し、１週間後にＣＮＳ全体にわたるＴｕｂｂ３及びＧｆａｐのｍＲＮＡレベルを測定した。ＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡの両方は、同じ化学的組成物を有し、肝臓においてＨＤＩによって評価する際に同じ相対的なＥＤ５０を有する。ＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡは、驚くべきことに、Ｔｕｂｂ３のｍＲＮＡ標的とするように操作された類似の化学的組成物の同等の効力のあるＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡと比較して、脳の全ての領域にわたって、ＧｆａｐのｍＲＮＡを非常に大きな程度までサイレンシングすることができる。脳及び脊髄全体にわたって、細胞タイプ間で効力の予想外の著しい差異が観察され、これにより、ＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡは、ＣＮＳへの注入後、星状膠細胞を選択的に標的とする能力があることが明瞭に実証された。
ＧａｌＸＣ－ＴＵＢＢ３及びＧａｌＸＣ－ＧＦＡＰ薬理作用について、脳及び脊髄における神経細胞及び星状膠細胞で評価した。ＧａｌＸＣ－ＴＵＢＢ３又はＧａｌＸＣ－ＧＦＡＰのいずれかを同量で、ボーラスｉ．ｃ．ｖ．注射によって投与し、１週間後にＣＮＳ全体にわたるＴｕｂｂ３及びＧｆａｐのｍＲＮＡレベルを測定した。ＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡの両方は、同じ化学的組成物を有し、肝臓においてＨＤＩによって評価する際に同じ相対的なＥＤ５０を有する。ＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡは、驚くべきことに、Ｔｕｂｂ３のｍＲＮＡ標的とするように操作された類似の化学的組成物の同等の効力のあるＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡと比較して、脳の全ての領域にわたって、ＧｆａｐのｍＲＮＡを非常に大きな程度までサイレンシングすることができる。脳及び脊髄全体にわたって、細胞タイプ間で効力の予想外の著しい差異が観察され、これにより、ＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡは、ＣＮＳへの注入後、星状膠細胞を選択的に標的とする能力があることが明瞭に実証された。
前頭皮質（図５）：星状膠細胞で特異的に発現する遺伝子であるＧｆａｐを標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡにより、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入した後、前頭皮質において最大９０％の遺伝子サイレンシングが可能である（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。神経細胞で特異的に発現する遺伝子であるＴｕｂｂ３を標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡでは、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入した後、約１０～３０％の遺伝子サイレンシングにとどまる（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。
線条体（図６）：Ｇｆａｐを標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡにより、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入して１週間後、驚くべきことに、線条体において最大８０％の遺伝子サイレンシングが可能である（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。一方で、Ｔｕｂｂ３を標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡでは、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入して１週間後、約０～２５％の遺伝子サイレンシングにとどまる（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。
体性感覚皮質（図７）：Ｇｆａｐを標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡにより、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入して１週間後、体性感覚皮質において最大７５％の遺伝子サイレンシングが可能である（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。これに対して、Ｔｕｂｂ３を標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡでは、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入して１週間後、約０～１０％の遺伝子サイレンシングにとどまる（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。
海馬（図８）：Ｇｆａｐを標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡにより、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入して１週間後、海馬において最大８０％の遺伝子サイレンシングが可能である（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。Ｔｕｂｂ３を標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡでは、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入して１週間後、約０～２５％の遺伝子サイレンシングにとどまる（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。
視床下部（図９）：Ｇｆａｐを標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡにより、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入して１週間後、視床下部において最大８０％の遺伝子サイレンシングが可能である（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。Ｔｕｂｂ３を標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡでは、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入して１週間後、約０～２５％の遺伝子サイレンシングにとどまる（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。
小脳（図１０）：Ｇｆａｐを標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡにより、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入して１週間後、小脳において最大９５％の遺伝子サイレンシングが可能である（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。Ｔｕｂｂ３を標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡでは、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入して１週間後、約０～４０％の遺伝子サイレンシングにとどまる（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。
脳幹（図１１）：Ｇｆａｐを標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡにより、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入して１週間後、脳幹において最大９０％の遺伝子サイレンシングが可能である（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。Ｔｕｂｂ３を標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡでは、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入して１週間後、約０～３０％の遺伝子サイレンシングにとどまる（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。
脊髄（図１２）：神経細胞で特異的に発現する遺伝子であるＴｕｂｂ３を標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡでは、５００μｇを右側脳室に単回ボーラス注入して１週間後、約０～２５％の遺伝子サイレンシングが可能である（群あたりｎ＝４マウス、ＣＤ１、メス、４～６週齢）。この化学的構成では、脳脊髄液にボーラス注入した後、標的遺伝子がグリア細胞及び神経細胞の両方のタイプで発現している場合であっても、脊髄における神経細胞（運動ニューロン、介在ニューロンなど）では、遺伝子サイレンシングが起こらないと予想される。これにより、グリアに関する疾患を治療する際の神経細胞毒性又は生存率に関する任意の懸念事項が改善される。
実施例３：ＧａｌＮＡｃ標的化リガンドを含まないｓｉＲＮＡによる神経細胞亜集団の選択的標的化
本研究では、神経細胞及びグリア細胞に向けてｓｉＲＮＡを標的化させる際のＧａＮＡｃ残基の役割について検査した。図１３のパネルＡでは、ＧａｌＸＣ－ＧＦＡＰ－１１４７（ＧａｌＮＡｃ）は、３つの結合ＧａｌＮＡｃ部位を有する標準的なＧａｌＸＣ化学的性質を有し、一方でＧａｌＸＣ－ＧＦＡＰ－１１４７（ＧａｌＮＡｃなし）は、３つの結合ＧａｌＮＡｃ糖を含まないこと以外は同一の化学的性質を有する類似の分子である。５００μｇのＧＦＡＰ特異的ｓｉＲＮＡを、くも膜下腔への腰椎髄腔内注射による単回ボーラス注入で投与した（群あたりｎ＝５マウス、Ｃ５７ＢＬ／６、メス、４～６週齢）。ＧｆａｐのｍＲＮＡを標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡにより、投与の１週間後、腰髄における星状膠細胞において最大７０～７５％の遺伝子サイレンシングが可能であり、ＧａｌＮＡｃ部位が存在しないｓｉＲＮＡは、マウスの脳におけるそれらの遺伝子標的をサイレンシングするこれらのオリゴヌクレオチドの能力を低下させないことを示した。
本研究では、神経細胞及びグリア細胞に向けてｓｉＲＮＡを標的化させる際のＧａＮＡｃ残基の役割について検査した。図１３のパネルＡでは、ＧａｌＸＣ－ＧＦＡＰ－１１４７（ＧａｌＮＡｃ）は、３つの結合ＧａｌＮＡｃ部位を有する標準的なＧａｌＸＣ化学的性質を有し、一方でＧａｌＸＣ－ＧＦＡＰ－１１４７（ＧａｌＮＡｃなし）は、３つの結合ＧａｌＮＡｃ糖を含まないこと以外は同一の化学的性質を有する類似の分子である。５００μｇのＧＦＡＰ特異的ｓｉＲＮＡを、くも膜下腔への腰椎髄腔内注射による単回ボーラス注入で投与した（群あたりｎ＝５マウス、Ｃ５７ＢＬ／６、メス、４～６週齢）。ＧｆａｐのｍＲＮＡを標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡにより、投与の１週間後、腰髄における星状膠細胞において最大７０～７５％の遺伝子サイレンシングが可能であり、ＧａｌＮＡｃ部位が存在しないｓｉＲＮＡは、マウスの脳におけるそれらの遺伝子標的をサイレンシングするこれらのオリゴヌクレオチドの能力を低下させないことを示した。
図１３のパネルＢでは、ＧａｌＸＣ－ＴＵＢＢ３－４４５（ＧａｌＮＡｃ）は、３つの結合ＧａｌＮＡｃ部位を有する標準的なＧａｌＸＣ化学的性質を有し、一方でＧａｌＸＣ－ＴＵＢＢ３－４４５（ＧａｌＮＡｃなし）は、３つの結合ＧａｌＮＡｃ糖を含まないこと以外は同一の化学的性質を有する類似の分子である。５００μｇのＴＵＢＢ特異的ｓｉＲＮＡを、くも膜下腔への腰椎髄腔内注射による単回ボーラス注入で投与した（群あたりｎ＝５マウス、Ｃ５７ＢＬ／６、メス、４～６週齢）。Ｔｕｂｂ３のｍＲＮＡを標的とするＧａｌＸＣのｓｉＲＮＡにより、投与の１週間後、腰髄における神経細胞において最大３０～３５％の遺伝子サイレンシングが可能であり、ＧａｌＮＡｃ部位の不存在は、マウスの脳におけるそれらの遺伝子標的をサイレンシングするこれらのオリゴヌクレオチドの能力を低下させないことを示した。
神経細胞と比較した星状膠細胞に対するｓｉＲＮＡの差異的な標的化の管理は、ＧａｌＮＡｃ部位を含有又は非含有でｓｉＲＮＡが優先的にグリア細胞に送達され得ることを示した。
いくつかの実施形態では、配列表に提示する配列は、オリゴヌクレオチド又はその他の核酸の構造を説明する際に参照され得ることを理解すべきである。このような実施形態では、実際のオリゴヌクレオチド又はその他の核酸は、明記した配列と本質的に同じ又は類似の相補的特性を維持したまま、明記した配列と比較して、１つ以上の代替的ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドのＲＮＡ対応物又はＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ対応物）、及び／又は１つ以上の修飾ヌクレオチド、及び／又は１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合、及び／又は１つ以上のその他の修飾を有する場合がある。
本発明の説明に関連して、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、ならびに同様の指示語の使用は、本明細書中に特に記載がない限り、又は文脈により明らかに矛盾のない限り、単数及び複数の両方を含むものと解釈されるべきであることを理解すべきである。「備える」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、「有する」（ｈａｖｉｎｇ）、及び「含む」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）なる用語は、特に記載のない限り、非限定的用語として）解釈されるべきである（すなわち、「それらを含むがそれらに限定されない」ことを意味する）。
更に、本明細書の値の範囲の記載は、本明細書で特に記載がない限り、範囲内に含まれるそれぞれの別個の値を個々に記載する手軽な方法としての役割を果たすことを単に意図したものにすぎず、それぞれの別個の値は、本明細書にあたかも個々に記載されているものと同様にして本明細書に含まれるものである。本明細書に記載する全ての方法は、本明細書で特に記載がない限り、又は文脈により明らかに矛盾のない限り、任意の適当な順序で実施することができる。本明細書内で提供する全ての例、又は例示的文言（例えば、「など」）の使用は、本発明をより分かりやすく説明することを単に意図したものであり、特に主張されない限りは本発明の範囲を限定するものではない。
本出願に引用された公開文献、特許、特許出願、及び他の文献は全て、あたかも各個別の公開文献、特許、特許出願、又は他の文献があらゆる目的のために参照により援用されるように個別に示されるのと同じ範囲まで、あらゆる目的のために、それらの全体において参照により本明細書に援用される。
種々の特定の実施形態について、例示し、記載してきたが、種々の変更が本発明の精神及び範囲（複数可）から逸脱することなく行われ得ることを理解されよう。
Claims (107)
- 干渉オリゴヌクレオチドをグリア細胞に選択的に送達する方法であって、
グリア細胞を、前記グリア細胞で発現する標的ＲＮＡに対する相補性領域を含むオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、前記オリゴヌクレオチドが、前記標的ＲＮＡの発現を低下させることができることを特徴とする方法。 - 前記相補性領域が、少なくとも１２ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
- 前記相補性領域が、１２～３０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、一本鎖核酸である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖核（ｄｓＮＡ）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、１２～５８ヌクレオチド長である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、二重鎖を形成し、前記アンチセンス鎖が、前記グリア細胞で発現する標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、かつ前記標的ＲＮＡの発現を低下させることができる、請求項１に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、請求項７に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ｄｓＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
- 前記センス鎖が、１５～４０ヌクレオチド長である、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記アンチセンス鎖が、１９～２７ヌクレオチド長である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、少なくとも１２ヌクレオチド長の二重鎖を形成する、請求項７～１１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、別々のオリゴヌクレオチドである、請求項７～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、単一のオリゴヌクレオチドを含む、請求項７～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖が、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が二重鎖を形成する場合、最大６ヌクレオチド長の３′オーバーハングを有する、請求項７～１４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記アンチセンス鎖が、３′オーバーハングを有し、前記３′オーバーハングが、２ヌクレオチド長である、請求項１５に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列領域Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を含むステムループ配列を更に含み、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、かつＬが、Ｓ１及びＳ２が二重鎖を形成する場合にＳ１とＳ２の間で形成するループであり、前記ステムループ配列が、その３′末端で前記センス鎖に結合する、請求項７～１６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ループＬが、４ヌクレオチド長である、請求項１７に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上の標的化リガンドを更に含む、請求項７～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上の標的化リガンドを更に含み、前記標的化リガンドが、前記ステムループ配列の前記ループＬに存在する、請求項７～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記標的化リガンドが、ＧａｌＮＡｃ部位である、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ホスファターゼ及び／又はヌクレアーゼに対する前記オリゴヌクレオチドの耐性を増強させ、ハイブリダイゼーション効率を増加させ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ安定性を強化させる手段を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、又はこれらの組み合わせである、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、対象の神経系に存在する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、対象の中枢神経系に存在する、請求項２５に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、前頭皮質、線条体、体性感覚皮質、海馬、視床下部、小脳、脳幹、及び／又は脊髄に存在する、請求項２６に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、脊髄に存在する、請求項２７に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、頚髄、胸髄、及び／又は腰髄に存在する、請求項２８に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、対象の末梢神経系に存在する、請求項２５に記載の方法。
- 前記標的ＲＮＡが、神経細胞と比べて前記グリア細胞で特異的に発現する、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記相補性領域が、前記標的ＲＮＡにおけるエキソンに対するものである、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記相補性領域が、前記標的ＲＮＡの５′非翻訳領域に対するものである、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記相補性領域が、前記標的ＲＮＡの３′非翻訳領域に対するものである、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記相補性領域が、前記標的ＲＮＡの対立遺伝子特異的配列に対するものである、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記選択性が、神経細胞よりもグリア細胞に対して少なくとも約１．５高い、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記神経細胞よりもグリア細胞に対して高い選択性が、２以上、２．５以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、又は５以上高い、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記標的ＲＮＡが、ＧＦＡＰ遺伝子、ＰＳＡＰ遺伝子、ＰＭＰ２２遺伝子、ＬＭＮＢ１遺伝子、ＡＰＰ遺伝子、ＴＡＵ（ＭＡＰＴ）遺伝子、ＳＯＤ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子、ＨＴＴ遺伝子、ＳＮＣＡもしくはＡＳＹＮ遺伝子、ＬＲＲＫ２遺伝子、ＡＤＫ遺伝子、ＴＮＦα遺伝子、ＥＲＫ５／ＭＡＰＫ７遺伝子、ＩＬ－１Ｒ２遺伝子、ＣＤ４９ｄ遺伝子、ＩＧＦ－１、ＥＧＦ遺伝子、ＴＧＦ－β遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＴＤＰ－４３遺伝子、ＣＤ３８遺伝子、ＡＴＸＮ２遺伝子、ＡＴＸＮ３遺伝子、ＡＴＸＮ７遺伝子、又はＥＧＲ２遺伝子から発現するＲＮＡである、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、グリア癌細胞であり、前記標的ＲＮＡが、前記グリア癌細胞で発現が増加するＲＮＡである、請求項３８に記載の方法。
- 前記グリア癌細胞が、グリア芽細胞腫である、請求項３９に記載の方法。
- 前記標的ＲＮＡが、ＩＧＦ－１遺伝子、ＥＧＦ遺伝子、ＴＧＦ－β遺伝子、又はＶＥＧＦ遺伝子により前記グリア癌細胞で発現するＲＮＡである、請求項３９又は４０に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、対象に髄腔内、脳室内、間質内、舌下、又は鼻腔内投与される、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
- グリア細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを選択的に低下させる方法であって、
グリア細胞を、前記グリア細胞で発現する標的ＲＮＡに対する相補性領域を含むオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、前記オリゴヌクレオチドが、前記標的ＲＮＡの発現を低下させることができることを特徴とする方法。 - 前記相補性領域が、少なくとも１２ヌクレオチド長である、請求項４３に記載の方法。
- 前記相補性領域が、１２～３０ヌクレオチド長である、請求項４３に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、一本鎖核酸である、請求項４３～４５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖核（ｄｓＮＡ）である、請求項４３～４５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、１２～６０ヌクレオチド長である、請求項４３～４７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、二重鎖を形成し、前記アンチセンス鎖が、前記グリア細胞で発現する標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、かつ前記標的ＲＮＡの発現を低下させることができる、請求項４３に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、請求項４９に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ｄｓＮＡを含む、請求項４９に記載の方法。
- 前記センス鎖が、１５～４０ヌクレオチド長である、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記アンチセンス鎖が、１９～２７ヌクレオチド長である、請求項４９～５２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、少なくとも１２ヌクレオチド長の二重鎖を形成する、請求項４９～５３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、別々のオリゴヌクレオチドを含む、請求項４９～５４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、単一のオリゴヌクレオチドを含む、請求項４９～５４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖が、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が二重鎖を形成する場合、最大６ヌクレオチドの３′オーバーハングを有する、請求項４９～５６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記アンチセンス鎖の前記３′オーバーハングは、長さが２ヌクレオチドである、請求項５７に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列領域Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を含むステムループ配列を更に含み、Ｓ１が、Ｓ２と相補的であり、かつＬが、Ｓ１及びＳ２が二重鎖を形成する場合にＳ１とＳ２の間で形成するループであり、前記ステムループ配列が、その３′末端で前記センス鎖に結合する、請求項４９～５８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ループＬが、４ヌクレオチド長である、請求項５９に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上の標的化リガンドを更に含む、請求項４３～６０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上の標的化リガンドを更に含み、前記標的化リガンドが、前記ステムループ配列の前記ループＬに存在する、請求項５９～６０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記標的化リガンドが、ＧａｌＮＡｃ部位である、請求項６１～６２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ホスファターゼ及び／又はヌクレアーゼに対する前記オリゴヌクレオチドの耐性を増強させ、ハイブリダイゼーション効率を増加させ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ安定性を強化させる手段を含む、請求項４３～６３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項４３～６３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、又はこれらの組み合わせである、請求項４３～６４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、対象の神経系に存在する、請求項４３～６６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、対象の中枢神経系に存在する、請求項６７に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、前頭皮質、線条体、体性感覚皮質、海馬、視床下部、小脳、脳幹、及び／又は脊髄に存在する、請求項６８に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、脊髄に存在する、請求項６９に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、頚髄、胸髄、及び／又は腰髄に存在する、請求項７０に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、対象の末梢神経系に存在する、請求項６７に記載の方法。
- 前記標的ＲＮＡが、神経細胞と比べて前記グリア細胞で特異的に発現する、請求項４３～７２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記相補性領域が、前記標的ＲＮＡにおけるエキソンに対するものである、請求項４３～７３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記相補性領域が、前記標的ＲＮＡの５′非翻訳領域に対するものである、請求項４３～７３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記相補性領域が、前記標的ＲＮＡの３′非翻訳領域に対するものである、請求項４３～７３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記相補性領域が、前記標的ＲＮＡの対立遺伝子特異的配列に対するものである、請求項４３～７６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記選択性が、神経細胞よりもグリア細胞に対して少なくとも約１．５以上高い、請求項４３～７７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記神経細胞よりもグリア細胞に対して高い選択性が、２以上、２．５以上、３以上、３．５以上、４以上、４．５以上、又は５以上高い、請求項４３～７８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記標的ＲＮＡが、ＧＦＡＰ遺伝子、ＰＳＡＰ遺伝子、ＰＭＰ２２遺伝子、ＬＭＮＢ１遺伝子、ＡＰＰ遺伝子、ＴＡＵ（ＭＡＰＴ）遺伝子、ＳＯＤ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子、ＨＴＴ遺伝子、ＳＮＣＡもしくはＡＳＹＮ遺伝子、ＬＲＲＫ２遺伝子、ＡＤＫ遺伝子、ＴＮＦα遺伝子、ＥＲＫ５／ＭＡＰＫ７遺伝子、ＩＬ－１Ｒ２遺伝子、ＣＤ４９ｄ遺伝子、ＩＧＦ－１、ＥＧＦ遺伝子、ＴＧＦ－β遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＴＤＰ－４３遺伝子、ＣＤ３８遺伝子、ＡＴＸＮ２遺伝子、ＡＴＸＮ３遺伝子、ＡＴＸＮ７遺伝子、又はＥＧＲ２遺伝子から発現するＲＮＡである、請求項４３～７９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、グリア癌細胞であり、前記標的ＲＮＡが、前記グリア癌細胞で発現が増加するＲＮＡである、請求項６７～７９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記グリア癌細胞が、グリア芽細胞腫である、請求項８１に記載の方法。
- 前記標的ＲＮＡが、ＩＧＦ－１遺伝子、ＥＧＦ遺伝子、ＴＧＦ－β遺伝子、又はＶＥＧＦ遺伝子により、前記グリア癌細胞で発現するＲＮＡである、請求項８１又は８２に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、対象に髄腔内、脳室内、間質内、舌下、又は鼻腔内投与される、請求項４３～８３のいずれか１項に記載の方法。
- グリア細胞又は神経細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを選択的に低下させるオリゴヌクレオチドのスクリーニングの方法であって、
グリア細胞及び神経細胞を、候補オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、前記候補オリゴヌクレオチドが、前記グリア細胞及び前記神経細胞の両方で発現する標的ＲＮＡに対する相補性領域を含む、前記接触させる工程と、
グリア細胞及び神経細胞における標的ＲＮＡのレベルを測定して、標的ＲＮＡの発現のレベルに対する任意の差異的な効果を判別する工程と、を含むことを特徴とする記方法。 - グリア細胞又は神経細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを選択的に低下させるオリゴヌクレオチドのスクリーニングの方法であって、
候補オリゴヌクレオチドを対象の神経系に投与する工程であって、前記候補オリゴヌクレオチドは、神経系のグリア細胞及び神経細胞の両方で発現する標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、前記オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの発現を低下させることができる、前記投与することと、
グリア細胞及び神経細胞における標的ＲＮＡのレベルを測定して、標的ＲＮＡの発現のレベルに対する任意の差異的な効果を判別することと、を含む、前記方法。 - 前記オリゴヌクレオチドが、一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡを含む、請求項８５又は８６に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）を含み、前記ｄｓＮＡが、リボヌクレオチドを含む、請求項８５又は８６に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、二重鎖を形成し、前記アンチセンス鎖が、前記標的ＲＮＡに対する相補性領域を有し、前記オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡの発現のレベルを低下させることができる、請求項８８に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上の標的化リガンドを更に含む、請求項８５～８９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記標的化リガンドが、炭化水素、アミノ糖、コレステロール、脂質、又はペプチドを含む、請求項９０に記載の方法。
- 前記標的化リガンドが、ＧａｌＮＡｃ部位を含む、請求項９１に記載の方法。
- 前記測定が、神経系のグリア細胞及び神経細胞全体にわたって分布する標的ＲＮＡのレベルを判別することを含む、請求項８６～９２に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、又は腸管グリア細胞である、請求項８５～９３のいずれか１項に記載の方法。
- グリア細胞又は神経細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを選択的に低下させるオリゴヌクレオチドのスクリーニングの方法であって、
グリア細胞を、第１の候補オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、前記第１の候補オリゴヌクレオチドが、グリア細胞で発現する第１の標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、第１の標的ＲＮＡの発現のレベルを低下させることができる、前記接触させる工程と、
神経細胞を、第２の候補オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、前記第２の候補オリゴヌクレオチドが、神経細胞で発現する第２の標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第２の標的ＲＮＡの発現のレベルを低下させることができる、前記接触させる工程と、
グリア細胞における第１の標的ＲＮＡ及び神経細胞における第２の標的ＲＮＡのレベルを測定して、第１の標的ＲＮＡ及び第２の標的ＲＮＡの任意の差異的な低下を判別する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - グリア細胞又は神経細胞で発現する標的ＲＮＡのレベルを選択的に低下させるオリゴヌクレオチドのスクリーニングの方法であって、
第１の候補オリゴヌクレオチドを第１の対象の神経系に投与する工程であって、前記第１の候補オリゴヌクレオチドが、グリア細胞で発現する第１の標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の標的ＲＮＡの発現のレベルを低下させることができる、前記投与する工程と、
第２の候補オリゴヌクレオチドを第２の対象の神経系に投与する工程であって、前記第２の候補オリゴヌクレオチドが、神経細胞で発現する第２の標的ＲＮＡに対する相補性領域を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第２の標的ＲＮＡの発現のレベルを低下させることができる、前記投与する工程と、
前記第１の対象及び前記第２の対象の神経系のグリア細胞における第１の標的ＲＮＡ及び神経細胞における第２の標的ＲＮＡのレベルを測定する工程であって、前記第１の対象及び前記第２の対象が同じ種である、前記測定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記第１の候補オリゴヌクレオチド及び前記第２の候補オリゴヌクレオチドが、前記第１の標的ＲＮＡ又は前記第２の標的ＲＮＡに対する相補性領域のみが異なる、請求項９５又は９６に記載の方法。
- 前記グリア細胞で発現する第１の標的ＲＮＡが、グリア細胞で特異的に発現し、前記神経細胞で発現する第２の標的ＲＮＡが、神経細胞で特異的に発現する、請求項９５～９７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１の候補オリゴヌクレオチド及び前記第２の候補オリゴヌクレオチドのそれぞれが、一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡを含む、請求項９５～９８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１の候補オリゴヌクレオチド及び前記第２の候補オリゴヌクレオチドが、二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）を含み、前記ｄｓＮＡが、ＲＮＡを含む、請求項９５～９８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１の候補オリゴヌクレオチドが、第１のセンス鎖及び第１のアンチセンス鎖を含み、前記第１のセンス鎖及び前記第２のアンチセンス鎖が、第１の二重鎖を形成し、前記第１のアンチセンス鎖が、前記グリア細胞で発現する第１の標的ＲＮＡに対する相補性領域を有し、かつ、第１の標的ＲＮＡのレベルを低下させることができ、
前記第２の候補オリゴヌクレオチドが、第２のセンス鎖及び第２のアンチセンス鎖を含み、前記第２のセンス鎖及び前記第２のアンチセンス鎖が、第２の二重鎖を形成し、前記第２のアンチセンス鎖が、前記神経細胞で発現する前記第２の標的ＲＮＡに対する相補性領域を有し、かつ、第２の標的ＲＮＡのレベルを低下させることができる、請求項１００に記載の方法。 - 前記第１の候補オリゴヌクレオチド及び前記第２の候補オリゴヌクレオチドが、１つ以上の標的化リガンドを更に含む、請求項９５～１０１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記標的化リガンドが、炭化水素、アミノ糖、コレステロール、脂質、ペプチド、又はこれらの組み合わせのうち１つ以上を含む、請求項１０２に記載の方法。
- 前記標的化リガンドが、１つ以上のＧａｌＮＡｃ部位を含む、請求項１０３に記載の方法。
- 前記測定が、神経系の全体にわたって分布するグリア細胞における第１の標的ＲＮＡ及び神経細胞における第２の標的ＲＮＡのレベルを判別することを含む、請求項９５～１０４に記載の方法。
- 前記グリア細胞が、星状膠細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸管グリア細胞、及びこれらの組み合わせである、請求項９５～１０５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記神経細胞が、運動性ニューロン、感覚性ニューロン、介在ニューロン、及びこれらの組み合わせである、請求項９５～１０６のいずれか１項に記載の方法。
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