TW202246502A - 抑制中樞神經系統中的基因表現之組成物及方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供寡核苷酸結合體，其抑制或降低CNS中的標的基因表現。本文亦提供包括該寡核苷酸結合體之組成物及其用途，特別關於治療與CNS中的標的基因表現相關聯的疾病、失調及/或病症之用途。

Description

抑制中樞神經系統中的基因表現之組成物及方法
本揭示關於核酸-疏水性配體結合體及寡核苷酸-疏水性配體結合體。特定言之，本揭示關於核酸-脂質結合體及寡核苷酸-脂質結合體、製備彼等之方法、彼等之化學組態、及使用根據本文所提供的說明之結合核酸及寡核苷酸調節(例如抑制或降低)中樞神經系統(本文縮寫為「CNS」)中(例如CNS之細胞、組織或區域中)的標的基因表現之方法。本揭示亦提供包含本說明之結合體的醫藥上可接受的組成物及使用該組成物治療各種疾病或失調之方法。 相關申請案之交叉參考
本申請案主張在2021年1月28日申請之美國臨時專利申請案第63/142,877之優先權，將其內容併入本文以供參考。
以經修飾之核酸調節基因表現顯示作為實驗室之研究工具及臨床之治療方法的很大潛力。基於寡核苷酸或核酸之治療劑的幾種類別已處於臨床研究中，包括反義寡核苷酸(ASO)、短干擾RNA (siRNA)、雙股核酸(dsNA)、適配體、核糖酵素、外顯子跳躍和剪接體改變之寡核苷酸、免疫調節寡核苷酸、mRNA及CRISPR。在相關分子中的化學修飾扮演克服寡核苷酸治療劑挑戰的關鍵角色，包括改進核酸酶穩定性、RNA結合親和性及藥物動力學。已於過去三十年開發用於寡核苷酸的各種化學修飾策略，包括糖、核鹼基和磷酸二酯骨架之修飾以改進及優化性能及治療功效(Deleavey和Darma之Chem. Biol. 2012, 19(8): 937-54；Wan和Seth之J. Med. Chem. 2016, 59(21): 9645-67；及Egli和Manoharan, Acc. Chem. Res. 2019, 54(4):1036-47)。
由包含siRNA或雙股核酸(dsNA)的基於RNAi寡核苷酸之治療劑調介之治療性基因靜默供給可成藥的目標空間之相當多的擴展潛力及治療由其他藥物模式(例如抗體及/或小分子)在治療上無法接近的罕見疾病的可能性。抑制或降低在肝中特定的標的基因表現之基於RNAi寡核苷酸之治療劑已開發且目前於臨床使用中(Sehgal等人之(2013) Journal of Hepatology 59:1354-1359)。對RNAi寡核苷酸在肝外細胞、組織及器官(例如中樞神經系統或CNS)中的開發及臨床使用仍存在技術上的障礙。在CNS中由基於RNAi寡核苷酸之治療劑調介之治療性基因靜默對治療神經疾病受到特別的關注(Boudreau & Davidson (2010) Brain Research 1338: 112-21)。因此，在本技術中對成功開發新且有效的RNAi寡核苷酸以調節在肝外細胞、組織及/或器官中(例如CNS)的標的基因表現仍有持續需求。
哺乳動物CNS為複雜的組織系統，包括細胞、流體及化學物，彼等協調相互作用以賦予各種廣泛的功能，包括運動、引導、認知、言語、視覺和情感。不幸的是各種CNS疾病和失調為已知的(例如神經失調)且影響或紊亂一些或所有該等功能。用於CNS疾病和失調之治療通常僅限於小分子藥物、抗體及/或適應性或行為療法。對發開與不當的基因表現相關聯的CNS疾病和失調之治療仍有持續需求。因此，本揭示係指向調節(例如降低或抑制) CNS中的標的基因表現之組成物，該組成物包含寡核苷酸-配體結合體(例如RNAi寡核苷酸結合體)，該結合體包含一或多個疏水性部分。本揭示亦指向該寡核苷酸結合體之製備方法及使用和治療方法。
本申請案關於包含疏水性配體(包括但不限於金剛烷基和脂質結合體)之新穎核酸、寡核苷酸或其類似物。本揭示關於以調節細胞中的標的基因表現起作用之核酸-脂質結合體及寡核苷酸-脂質結合體及其製備和使用方法。不想受到理論的束縛，當親脂性/疏水性部分(諸如脂肪酸基團和金剛烷基)連接至該等高親水性核酸/寡核苷酸時，其實質地增強血漿蛋白結合且因此提高循環半生期。本文提供之結合核酸、寡核苷酸及其類似物為穩定的且結合至RNA標的以引發廣泛的肝外RNase H活性，且亦可用於剪接體轉換及RNAi。不想受到理論的束縛，併入疏水部分(諸如脂質)促成新穎的核酸、寡核苷酸或其類似物全身性遞送至許多組織中，包括但不限於CNS、肌肉、脂肪和腎上腺。
適合的核酸-疏水性配體結合體及寡核苷酸-疏水性配體結合體包括核酸抑制劑分子，諸如dsRNA抑制劑分子、dsRNAi抑制劑分子、反義寡核苷酸、miRNA、核糖酵素、安塔夠妙(antagomir)、適配體和單股RNAi抑制劑分子。本揭示特別提供核酸-脂質結合體、寡核苷酸-脂質結合體及其類似物，發現其作為細胞內RNA含量之調節劑的效用。本揭示之核酸抑制劑分子係通過多樣性機制組調節RNA表現，例如藉由RNA干擾(RNAi)。本文提供之核酸-疏水性配體結合體、寡核苷酸-疏水性配體結合體及其類似物的優點在於廣泛的藥理學活性是可能的，與細胞內RNA含量的調節一致。另外，本揭示提供使用有效量的本文所述之結合體以調節細胞內RNA含量來治療或改善疾病之方法。
本揭示關於經由RNA干擾(RNAi)來調節CNS中的標的基因表現之RNAi寡核苷酸結合體，其包含一或多個核酸-配體結合體單元。本揭示特別關於調節(例如降低或抑制) CNS中的標的基因表現之新穎的RNAi寡核苷酸結合體(其包含一或多個疏水性部分配體，包括但不限於脂質部分)、該RNAi寡核苷酸結合體之組成物及彼等之製備和使用方法。
本揭示至少部分地基於經長時段有效地降低CNS中的標的基因表現之RNAi寡核苷酸-脂質的發現。本文提供之示例性RNAi寡核苷酸-脂質結合體已證明在單次投予後持續數月降低CNS中的標的基因表現。再者，本文提供之示例性RNAi寡核苷酸-脂質結合體已證明在整個CNS的多個區域中具有藥理活性。不想受到理論的束縛，疏水性部分(例如脂質)促成RNAi寡核苷酸-脂質結合體遞送及分配至CNS中，藉此增加基因減弱的功效及持久性。此外，本揭示提供有效地降低CNS中的標的基因表現，而不降低肝中的標的基因表現之RNAi寡核苷酸-脂質結合體。因此，本揭示提供本文所述之藉由使用RNAi寡核苷酸-脂質結合體調節CNS中的標的基因表現來治療疾病或失調之方法及其醫藥上可接受的組成物。本揭示進一步提供使用RNAi寡核苷酸-脂質結合體製造藥劑之方法，該藥劑係藉由調節CNS中的標的基因表現來治療疾病或失調。
RNAi已迅速地發展成用於定向基因靜默之工具。在細胞中存在的RNAi機制可以許多方式增選以達成選定標的之基因表現減弱，即使在CNS中。根據本揭示且不想受到理論的束縛，將合成的siRNA引入細胞中，其直接負載至RISC中，或在較長的dsRNA (25至27個核苷酸)的例子中，先將其以切丁酶(Dicer)處理且接著負載至RISC中以達成基因靜默。以本揭示之各種實施態樣提供之RNAi療法非常適用於其中致病基因獲得反面或紊亂的‘功能獲得’效應之疾病和失調。以文獻連同本揭示之此等致病基因的鑑定容許設計RNAi寡核苷酸分子以靶向致病對偶基因且提供治療緩解。由本文提供的揭示靶向之疾病/失調類型包括但不限於：進行性核上神經麻痺症(PSP)、皮質基底節變性(CBD)、嗜銀顆粒病(Argyrophilic grain disease)(AGD)、球狀膠細胞tau蛋白病(Globular glial tauopathy)(GGT)、衰老相關性tau星形膠質細胞病(Aging-related tau astrogliopathy)(ARTAG)、家族性額顳葉失智症17 (FTD-17)、伴有呼吸衰竭的tau蛋白病、伴有癲癇發作的失智症、匹克氏症(Pick’s disease)、肌強直性失養症1型或2型(MD1或MD2)、唐氏(Down’s)症候群、痙攣性截癱(SP)、尼曼-匹克二氏病(Niemann-Pick disease) C型、路易氏體失智症(DLB)、路易氏體吞嚥困難、路易氏體病、橄欖體橋腦小腦萎縮、紋狀體黑質變性、夏-德雷格(Shy-Drager)症候群、脊髓性肌肉萎縮症V (SMAV)、亨汀頓氏(Huntington’s)舞蹈症(HD)、阿茲海默氏症、SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA10 (脊髓小腦性失調症第1、2、3、7或10型)、多系統萎縮症(MSA)、脊髓延髓性肌肉萎縮症(SBMA，甘迺迪氏症(Kennedy disease))、弗裏德賴希(Friedrich)運動失調、X染色體脆折症相關震顫/運動失調症候群(FXTAS)、X染色體脆折症候群(FRAXA)、X連鎖智力遲鈍(X-Linked Mental Retardation)(XLMR)、帕金森氏症、肌張力不全症、SBMA (脊髓延髓肌萎縮症)、神經性病變疼痛失調、脊髓損傷、齒狀核黑質紅核蒼白球丘腦底核萎縮症(Dentatorubral-pallidoluysian atrophy) (DRPLA)、隱性CNS失調、ALS (肌肉萎縮性脊髓側索硬化症)、M2DS (MECP2複製症候群)、FTD (額顳葉失智症)、普里昂疾病、成年發病型腦白質失養症、亞歷山大氏病(Alexander’s Disease)、克拉伯病(Krabbe Disease)、慢性創傷性腦病變、家族性腦中葉硬化症(Pelizaeus-Merzbacher disease)(PMD)、拉菲羅病、中風、類澱粉腦血管病變(CAA)及異染性白質失養症(MLD)。在一些實施態樣中，疾病或失調為PMD、脊髓損傷、中風、克拉伯病、MLD、SCA3、普里昂疾病、阿茲海默氏症、亞歷山大氏病、成年發病型腦白質失養症、MECP2複製症候群、夏馬杜三氏病(Charcot-Marie-Tooth)、多發性硬化症、甘迺迪氏症、亨汀頓氏舞蹈症、X連鎖腎上腺腦白質失養症或SCA1。在一些實施態樣中，疾病或失調為PMD。在一些實施態樣中，疾病或失調為脊髓損傷。在一些實施態樣中，疾病或失調為中風。在一些實施態樣中，疾病或失調為克拉伯病。在一些實施態樣中，疾病或失調為MLD。在一些實施態樣中，疾病或失調為SCA3。在一些實施態樣中，疾病或失調為普里昂疾病。在一些實施態樣中，疾病或失調為阿茲海默氏症。在一些實施態樣中，疾病或失調為亞歷山大氏病。在一些實施態樣中，疾病或失調為成年發病型腦白質失養症。在一些實施態樣中，疾病或失調為MECP2複製症候群。在一些實施態樣中，疾病或失調為夏馬杜三氏病。在一些實施態樣中，疾病或失調為多發性硬化症。在一些實施態樣中，疾病或失調為甘迺迪氏症。在一些實施態樣中，疾病或失調為亨汀頓氏舞蹈症。在一些實施態樣中，疾病或失調為X連鎖腎上腺腦白質失養症。在一些實施態樣中，疾病或失調為SCA1。
在一些實施態樣中，本揭示之核酸-疏水性配體結合體及其醫藥上可接受的組成物有效作為細胞內RNA含量及/或RNA功能之調節劑。包含一或多個脂質結合體之其此等核酸-脂質結合體係以式I-a表示：
Figure 02_image001
或其醫藥上可接受的鹽，其中各變型係如本文所定義及說明。
在特定的實施態樣中，核酸-配體結合體係以式I-b、I-c、I-Ib或I-Ic表示：
Figure 02_image003
Figure 02_image005
Figure 02_image007
Figure 02_image009
或其醫藥上可接受的鹽，其中各變型係如本文所定義及說明。
在另一態樣中，本揭示呈現以式II-a表示之寡核苷酸-配體結合體：
Figure 02_image011
或其醫藥上可接受的鹽，其中其中各變型係如本文所定義及說明。
在特定的實施態樣中，寡核苷酸-脂質結合體係以式II-b、II-c、II-Ib或II-Ic表示：
Figure 02_image013
Figure 02_image015
Figure 02_image017
Figure 02_image019
或其醫藥上可接受的鹽。
在特定的實施態樣中，上文揭示之實施態樣中任一者之寡核苷酸-配體結合體包含1至10個核酸-配體或核酸類似物-配體結合體單元。在一些實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體包含1、2或3個核酸-配體結合體單元。
在一些實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體包含長度為10至53個核苷酸之有義股及長度為15至53個核苷酸之反義股，其中寡核苷酸反義股具有與標的基因序列的至少15個連續的核苷酸互補的序列，且當寡核苷酸-結合體引入哺乳動物細胞中時，其降低標的基因表現。在一些實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體包含長度為9至30個核苷酸的核苷酸股。在一些實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體為單股。在一些實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體為雙股。
在寡核苷酸-配體結合體的特定實施態樣中，反義股的長度為19至27個核苷酸。在寡核苷酸-配體結合體的特定實施態樣中，有義股的長度為12至40個核苷酸。在寡核苷酸-配體結合體的特定實施態樣中，有義股係與反義股形成雙螺旋區域。在寡核苷酸-配體結合體的特定實施態樣中，互補的區域係與標的序列完全互補。
在寡核苷酸-配體結合體的特定實施態樣中，有義股包含在其3′端上如以下提出之主幹-環圈(stem-loop)：S 1-L-S 2，其中S 1係與S 2互補，且其中L形成介於S 1與S 2之間的長度為3至5個核苷酸的環圈。在寡核苷酸-配體結合體的特定實施態樣中，L為四鹼基環圈(tetraloop)，且L包含如GAAA所提出之序列。在一些實施態樣中，L為具有如5ʹ-GAAA-3ʹ所提出之核苷酸序列的四鹼基環圈。
在特定的實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體另外包含在2個核苷酸長度之反義股上的3′-突出序列。在特定的實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體另外包含一或多個核苷酸長度的3′-突出序列，其中3′-突出序列係存在於反義股、有義股或反義股及有義股上。
在特定的實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體包含至少一個經修飾之核苷酸，且其中經修飾之核苷酸包含2′-修飾。在一些實施態樣中，2′-修飾為選自下列之修飾：2′-胺基乙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基、2′-去氧-2′-氟、和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸(arabino)。
在寡核苷酸-配體結合體的特定實施態樣中，寡核苷酸的所有核苷酸皆經修飾。
在寡核苷酸-配體結合體的特定實施態樣中，寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯。在寡核苷酸-配體結合體的一些實施態樣中，至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。
在寡核苷酸-配體結合體之一些實施態樣中，反義股的5′-核苷酸之糖的4′-碳包含磷酸酯類似物。磷酸酯類似物為氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二醯基膦酸酯。
在一些態樣中，本揭示提供以式I-a表示之核酸-配體結合體：
Figure 02_image021
或其醫藥上可接受的鹽，其中： B為核鹼基或氫； R 1和R 2獨立為氫、鹵素、R A、-CN、-S(O)R、-S(O) 2R、-Si(OR) 2R、-Si(OR)R 2或-SiR 3，或 在同一碳上的R 1和R 2與彼等的中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之3員飽和或部分不飽和環： 各R A獨立為視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環； 各R獨立為氫、適合的保護基或視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環，或： 在同一原子上的兩個R基團與彼等的中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽和硫的雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或芳基環； L A獨立為PG 1或-L-配體； PG 1為氫或適合的羥基保護基； 各配體獨立為-(LC) n及/或金剛烷基； 各LC獨立為包含飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈之脂質結合體部分，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-置換； 各-Cy-獨立為視需要經取代之選自下列的二價環：伸苯基(phenylenyl)、8至10員雙環伸芳基(arylenyl)、4至7員飽和或部分不飽和伸碳環基(carbocyclylenyl)、4至11員飽和或部分不飽和螺伸碳環基、8至10員雙環飽和或部分不飽和伸碳環基、伸金剛烷基(adamantanenyl)、具有1至3個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和伸雜環基(heterocyclylenyl)、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至11員飽和或部分不飽和螺伸雜環基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之8至10員雙環飽和或部分不飽和伸雜環基、具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員飽和或部分不飽和伸雜芳基、或具有1至5個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之8至10員雙環伸雜芳基； n為1至10； L為共價鍵或二價飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、 -NR-、-N(R)-C(O)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O) 2-、   -P(O)OR-、-P(S)OR-、-V 1CR 2W 1-或
Figure 02_image023
置換； m為1至50； X 1、V 1和W 1獨立為-C(R) 2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或 -NR-； Z為-O-、-S-、-NR-或-CR 2-；且 PG 2為氫、亞磷醯胺酸酯(phosphoramidite)類似物或適合的保護基。
在一些態樣中，結合體係以式I-b或I-c表示：
Figure 02_image025
Figure 02_image027
或其醫藥上可接受的鹽；其中 L 1為共價鍵或二價飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、 -C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或
Figure 02_image029
置換； R 4為氫、R A或適合的胺保護基；且 R 5為金剛烷基或飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、  -C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-置換。
在一些態樣中，核酸-配體結合體係以式I-Ib或I-Ic表示：
Figure 02_image031
Figure 02_image033
或其醫藥上可接受的鹽；其中 B為核鹼基或氫； m為1至50； PG 1和PG 2獨立為氫、亞磷醯胺酸酯類似物或適合的保護基；且 R 5為金剛烷基或飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-O-、-C(O)NR-、  -NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-置換。
在前述或相關態樣之任一者中，R 5係選自
Figure 02_image035
Figure 02_image037
Figure 02_image039
在前述或相關態樣之任一者中，R 5係選自
Figure 02_image041
。
在一些態樣中，本揭示提供包含一或多個本文所述之核酸-配體結合體之寡核苷酸-配體結合體。在一些態樣中，寡核苷酸-配體結合體包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核酸-配體結合體。
在一些態樣中，本揭示提供包含一或多個以式II-a表示之核酸-配體結合體之寡核苷酸-配體結合體：
Figure 02_image043
或其醫藥上可接受的鹽，其中： B為核鹼基或氫； R 1和R 2獨立為氫、鹵素、R A、-CN、-S(O)R、-S(O) 2R、-Si(OR) 2R、-Si(OR)R 2或-SiR 3；或 在同一碳上的R 1和R 2與彼等的中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R A獨立為視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環； 各R獨立為氫、適合的保護基或視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環；或 在同一原子上的兩個R基團與彼等的中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽和硫的雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或芳基環； 各LC獨立為包含飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈之脂質結合體部分，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-置換； 各-Cy-獨立為視需要經取代之選自下列的二價環：伸苯基、8至10員雙環伸芳基、4至7員飽和或部分不飽和伸碳環基、4至11員飽和或部分不飽和螺伸碳環基、8至10員雙環飽和或部分不飽和伸碳環基、具有1至3個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和伸雜環基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至11員飽和或部分不飽和螺伸雜環基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之8至10員雙環飽和或部分不飽和伸雜環基、具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員飽和或部分不飽和伸雜芳基、或具有1至5個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之8至10員雙環伸雜芳基； n為1至10； L為共價鍵或二價飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、 -C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V 1CR 2W 1-或
Figure 02_image045
置換； m為1至50； X 1、V 1和W 1獨立為-C(R) 2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或 -NR-； Y為氫、適合的羥基保護基、
Figure 02_image047
或
Figure 02_image049
； R 3為氫、適合的保護基、適合的前藥或視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環； X 2為O、S或NR； X 3為-O-、-S-、-BH 2-或共價鍵； Y 1為連接至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′或3′末端的鍵聯基團； Y 2為氫、適合的保護基、亞磷醯胺酸酯類似物、連接至核苷、核苷酸或寡核苷酸之5′末端的核苷酸間鍵聯基團、或連接至撐體(solid support)的鍵聯基團；且 Z為-O-、-S-、-NR-或-CR 2-。
在前述或相關態樣之任一者中，寡核苷酸-配體結合體係以式II-b或II-c表示：
Figure 02_image051
Figure 02_image053
或其醫藥上可接受的鹽，其中： L 1為共價鍵、單價或二價飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或
Figure 02_image055
置換； R 4為氫、R A或適合的胺保護基；且 R 5為金剛烷基或飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、     -P(O)OR-或-P(S)OR置換。
在前述或相關態樣之任一者中，R 5係選自
Figure 02_image057
Figure 02_image059
Figure 02_image061
在一些態樣中，R 5係選自
Figure 02_image063
。
在一些態樣中，本揭示提供以式II-Ib或II-Ic表示之寡核苷酸-配體結合體：
Figure 02_image065
Figure 02_image067
或其醫藥上可接受的鹽；其中 B為核鹼基或氫； m為1至50； X 1為-O-或-S-； Y為氫、
Figure 02_image069
或
Figure 02_image071
； R 3為氫或適合的保護基； X 2為O或S； X 3為-O-、-S-或共價鍵； Y 1為連接至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′或3′末端的鍵聯基團； Y 2為氫、亞磷醯胺酸酯類似物、連接至核苷、核苷酸或寡核苷酸之5′末端的核苷酸間鍵聯基團、或連接至撐體的鍵聯基團； R 5為金剛烷基或飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-O-、-C(O)NR-、  -NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-置換；且 R為氫、適合的保護基或視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環。
在前述或相關態樣之任一者中，R 5係選自
Figure 02_image073
在前述或相關態樣之任一者中，R 5為
Figure 02_image075
。
在前述或相關態樣之任一者中，R 5為
Figure 02_image077
。
在前述或相關態樣之任一者中，R 5為
Figure 02_image079
。
在前述或相關態樣之任一者中，R 5為
Figure 02_image081
。
在前述或相關態樣之任一者中，R 5為
Figure 02_image083
。
在前述或相關態樣之任一者中，R 5為
Figure 02_image085
。
在前述或相關態樣之任一者中，R 5為
Figure 02_image087
。
在前述或相關態樣之任一者中，R 5為
Figure 02_image089
。
在前述或相關態樣之任一者中，R 5為
Figure 02_image091
。
在前述或相關態樣之任一者中，R 5為
Figure 02_image093
。
在前述或相關態樣之任一者中，寡核苷酸-配體結合體包含1至10個核酸-配體結合體單元。在一些態樣中，結合體包含1、2或3個核酸-配體結合體單元。
在前述或相關態樣之任一者中，寡核苷酸包含長度為10至53個核苷酸之有義股及長度為15至53個核苷酸之反義股，其中寡核苷酸反義股具有與標的基因序列之至少15個連續的核苷酸互補的序列，且當寡核苷酸-結合體引入哺乳動物細胞中時，其降低標的基因表現。
在前述或相關態樣之任一者中，核酸-配體結合體單元係存在於有義股中。在一些態樣中，反義股的長度為19至27個核苷酸。在一些態樣中，有義股的長度為12至40個核苷酸。
在前述或相關態樣之任一者中，有義股係與反義股形成雙螺旋區域。
在前述或相關態樣之任一者中，互補的區域係與標的序列完全互補。
在前述或相關態樣之任一者中，有義股包含在其3′端上如以下提出之主幹-環圈：S 1-L-S 2，其中S 1係S 2與互補，且其中L形成介於S 1與S 2之間的長度為3至5個核苷酸之環圈。在一些態樣中，L為四鹼基環圈。在一些態樣中，L包含如GAAA所提出之序列。在一些態樣中，L包含如5ʹ-GAAA-3ʹ所提出之核苷酸序列。在一些態樣中，L由如5ʹ-GAAA-3ʹ所提出之核苷酸序列組成。
在一些態樣中，本揭示提供用於降低中樞神經系統(CNS)中的標的mRNA表現之寡核苷酸-配體結合體，其包含(i)雙股寡核苷酸，其包含長度為15至30個核苷酸之反義股及長度為15至40個核苷酸之有義股，其中反義股及有義股各包含5ʹ端和3ʹ端，其中反義股及有義股形成雙螺旋區域，其中反義股具有與CNS中的標的mRNA之標的序列互補的區域，其中互補的區域的長度為至少15個連續的核苷酸，其中寡核苷酸包含主幹-環圈，及(ii)一或多個與主幹-環圈結合之脂質部分。
在前述或相關態樣之任一者中，脂質部分包含飽和C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22烴鏈。在一些態樣中，脂質部分包含不飽和C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22烴鏈，視需要地其中脂質部分包含C22:6。在一些實施態樣中，不飽和烴鏈包含至少一個雙鍵。例如，具有一個雙鍵之C18烴鏈被稱為C18:1，而具有兩個雙鍵之C18烴鏈被稱為C18:2。在一些態樣中，脂質部分包含不飽和C18烴鏈(例如C18:1)。在一些態樣中，脂質部分包含不飽和C22烴鏈(例如C22:6)。
在前述或相關態樣之任一者中，一或多個脂質部分包含飽和或不飽和C1-C50烴鏈。在一些態樣中，一或多個脂質部分包含飽和或不飽和C5-C25烴鏈。在一些態樣中，一或多個脂質部分包含飽和C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14烴鏈。在一些態樣中，寡核苷酸-配體結合體降低CNS中的標的mRNA表現，而不降低在CNS以外的標的mRNA表現，視需要地不降低在肝中的標的mRNA表現。在一些態樣中，標的mRNA表現在肝細胞中，其中相對於CNS細胞中的標的mRNA表現，寡核苷酸-配體結合體不實質地降低在肝細胞中的標的mRNA表現。在一些態樣中，標的mRNA表現在肝細胞中，其中寡核苷酸-配體結合體不降低肝細胞中的標的mRNA表現至與CNS的細胞中相同的程度。
在一些態樣中，本揭示提供用於降低CNS中的標的mRNA表現之寡核苷酸-配體結合體，其包含(i)雙股寡核苷酸，其包含長度為15至30個核苷酸之反義股及長度為15至40個核苷酸之有義股，其中反義股及有義股各包含5ʹ端和3ʹ端，其中反義股及有義股形成雙螺旋區域，其中反義股具有與CNS中的標的mRNA之標的序列互補的區域，其中互補的區域的長度為至少15個連續的核苷酸，其中寡核苷酸包含主幹-環圈；及(ii)一或多個與主幹-環圈結合之脂質部分，其中一或多個脂質部分係選自飽和或不飽和C8-C14烴鏈，其中在肝中的標的mRNA表現不降低至與CNS中相同或相似的水平。在一些態樣中，一或多個脂質部分為飽和或不飽和C8烴鏈。在一些態樣中，一或多個脂質部分為飽和或不飽和C9烴鏈。在一些態樣中，一或多個脂質部分為飽和或不飽和C10烴鏈。在一些態樣中，一或多個脂質部分為飽和或不飽和C11烴鏈。在一些態樣中，一或多個脂質部分為飽和或不飽和C12烴鏈。在一些態樣中，一或多個脂質部分為飽和或不飽和C13烴鏈。在一些態樣中，一或多個脂質部分為飽和或不飽和C14烴鏈。
在一些態樣中，有義股包含在其3ʹ端上的主幹-環圈。在一些態樣中，主幹-環圈包含以式：5ʹ-S1-L-S2-3ʹ表示之核苷酸序列，其中S1係與S2互補，且其中L形成介於S1與S2之間的環圈。在一些態樣中，S1及S2的長度為1至8個核苷酸。在一些態樣中，一或多個脂質部分係與S1之核苷酸結合。在一些態樣中，一或多個脂質部分係與S2之核苷酸結合。
在前述或相關態樣之任一者中，L的長度為3至5個核苷酸。在一些態樣中，L為四鹼基環圈，視需要地其中L的長度為4個核苷酸。在一些態樣中，L包含如5ʹ-GAAA-3ʹ所提出之核苷酸序列。在一些態樣中，L由如5ʹ-GAAA-3ʹ所提出之核苷酸序列組成。在一些態樣中，一或多個脂質部分係與L之核苷酸結合。
在前述或相關態樣之任一者中，L的長度為3個核苷酸且具有5ʹ至3ʹ之第一、第二及第三核苷酸，其中寡核苷酸-配體結合體包含一個脂質部分，且其中脂質部分係與L之第一、第二或第三核苷酸結合。在一些態樣中，L的長度為4個核苷酸且具有5ʹ至3ʹ之第一、第二、第三及第四核苷酸，其中寡核苷酸-配體結合體包含一個脂質部分，且其中脂質部分係與L之第一、第二、第三或第四核苷酸結合。在一些態樣中，脂質部分係與L之第二核苷酸結合。在一些態樣中，L由5ʹ-GAAA-3ʹ組成。在一些態樣中，脂質部分係與L之第二核苷酸結合。在一些態樣中，L的長度為5個核苷酸且具有5ʹ至3ʹ之第一、第二、第三、第四及第五核苷酸，其中寡核苷酸-配體結合體包含一個脂質部分，且其中脂質部分係與L之第一、第二、第三、第四或第五核苷酸結合。
在前述或相關態樣之任一者中，反義股的長度為19至27個核苷酸。在一些態樣中，反義股的長度為21至27個核苷酸。在一些態樣中，反義股的長度為22個核苷酸。
在前述或相關態樣之任一者中，有義股的長度為19至40個核苷酸。在一些態樣中，有義股的長度為36個核苷酸。
在前述或相關態樣之任一者中，雙螺旋區域的長度為至少19個核苷酸。在一些態樣中，雙螺旋區域的長度為至少20個核苷酸。在一些態樣中，雙螺旋區域的長度為21個核苷酸。
在前述或相關態樣之任一者中，寡核苷酸-配體結合體包含在兩個核苷酸長度之反義股上的3′-突出序列。在一些態樣中，寡核苷酸包含一或多個核苷酸長度的3′-突出序列，其中3′-突出序列係存在於反義股、有義股或反義股及有義股上。在一些態樣中，3′-突出序列係在反義股上。在一些態樣中，3’-突出序列的長度為兩個核苷酸。
在前述或相關態樣之任一者中，寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸。在一些態樣中，經修飾之核苷酸包含2′-修飾。在一些態樣中，2′-修飾為選自下列之修飾：2′-胺基乙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基、2′-去氧-2′-氟、和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸。在一些態樣中，寡核苷酸的所有核苷酸皆經修飾。
在前述或相關態樣之任一者中，寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些態樣中，至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。在前述或相關態樣之任一者中，寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷間鍵聯。在一些態樣中，至少一個經修飾之核苷間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。
在前述或相關態樣之任一者中，反義股的5′-核苷酸之糖的4′-碳包含磷酸酯類似物。在一些態樣中，磷酸酯類似物為氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二醯基膦酸酯。
在一些態樣中，本揭示提供包含本文所述之寡核苷酸-配體結合體及賦形劑之組成物。
在一些態樣中，本揭示提供包含本文所述之寡核苷酸-配體結合體及醫藥上可接受的載劑之醫藥組成物。
在其他態樣中，本揭示提供對個體遞送寡核苷酸-配體結合體之方法，該方法包含對個體投予本文所述之組成物。
在一些態樣中，本揭示提供降低或抑制由與個體之CNS相關聯的細胞群表現之個體的標的mRNA表現之方法，該方法包含對個體投予本文所述之寡核苷酸-配體結合體、本文所述之組成物或本文所述之醫藥組成物。在一些態樣中，與對照細胞群相比，與CNS相關聯的細胞群中的標的mRNA表現水平降低。在一些態樣中，與對照細胞群相比，位於CNS以外的細胞群中的標的mRNA表現水平未降低。在一些態樣中，位於CNS以外的細胞群係於肝中。
在其他態樣中，本揭示提供用於降低標的基因表現之寡核苷酸-配體結合體。在一些態樣中，標的基因係表現於CNS中。在一些態樣中，標的基因係與疾病或失調相關聯，視需要為神經疾病或失調。在一些態樣中，疾病或失調係選自進行性核上神經麻痺症(PSP)、皮質基底節變性(CBD)、嗜銀顆粒病(AGD)、球狀膠細胞tau蛋白病(GGT)、衰老相關性tau星形膠質細胞病(ARTAG)、家族性額顳葉失智症17 (FTD-17)、伴有呼吸衰竭的tau蛋白病、伴有癲癇發作的失智症、匹克氏症、肌強直性失養症1型或2型(MD1或MD2)、唐氏症候群、痙攣性截癱(SP)、尼曼-匹克二氏病C型、路易氏體失智症(DLB)、路易氏體吞嚥困難、路易氏體病、橄欖體橋腦小腦萎縮、紋狀體黑質變性、夏-德雷格症候群、脊髓性肌肉萎縮症V (SMAV)、亨汀頓氏舞蹈症(HD)、阿茲海默氏症、SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA10 (脊髓小腦性失調症第1、2、3、7或103型)、多系統萎縮症(MSA)、脊髓延髓性肌肉萎縮症(SBMA，甘迺迪氏症)、弗裏德賴希運動失調、X染色體脆折症相關震顫/運動失調症候群(FXTAS)、X染色體脆折症候群(FRAXA)、X連鎖智力遲鈍(XLMR)、帕金森氏症、肌張力不全症、SBMA (脊髓延髓肌萎縮症)、神經性病變疼痛失調、脊髓損傷、齒狀核黑質紅核蒼白球丘腦底核萎縮症(DRPLA)、隱性CNS失調和ALS (肌肉萎縮性脊髓側索硬化症)、M2DS (MECP2複製症候群)、FTD (額顳葉失智症)、普里昂疾病、成年發病型腦白質失養症、亞歷山大氏病、克拉伯病、慢性創傷性腦病變、家族性腦中葉硬化症(PMD)、拉菲羅病、中風、類澱粉腦血管病變(CAA)及異染性白質失養症(MLD)。
詳細說明
在一些態樣中，本揭示提供降低CNS中的標的基因表現之RNAi寡核苷酸結合體(例如RNAi寡核苷酸-脂質結合體)。在其他態樣中，本揭示提供使用本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其醫藥上可接受的組成物治療疾病或失調(例如神經疾病及/或由不當的基因表現)之方法。在其他態樣中，本揭示提供使用本文所述之RNAi寡核苷酸結合體製造用於治療疾病或失調的藥劑之方法。在其他態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體係藉由調節(例如抑制或降低)與CNS中的神經疾病或失調相關聯的標的基因表現而用於治療神經疾病或失調。在一些態樣中，本揭示提供藉由降低與CNS中(例如CNS之細胞、組織或區域中)的神經疾病或失調相關聯的標的基因表現來治療神經疾病或失調之方法。 RNAi寡核苷酸結合體
本揭示尤其提供降低CNS中的標的基因表現之RNAi寡核苷酸結合體(例如RNAi寡核苷酸-脂質結合體)。在一些實施態樣中，由本揭示提供之RNAi寡核苷酸結合體靶向編碼標的基因之mRNA。編碼標的基因且由本揭示之RNAi寡核苷酸結合體靶向之訊息RNA (mRNA)在本文稱為「標的mRNA」。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如體覺皮質區(SS皮質)、海馬區(HP)、紋狀體、額葉皮質、小腦、下視丘(HY)、頸脊髓(CSC)、胸脊髓(TSC)及/或腰脊髓(LSC)中)的標的基因表現。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如SS皮質、HP、HY、CSC、TSC/或LSC中)的標的基因表現，不降低在CNS以外的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如SS皮質、HP、HY、CSC、TSC及/或LSC中)的標的基因表現，不降低在肝中的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體不導致在肝中的標的mRNA表現降低至與CNS中相同或相似的水平。 mRNA標的序列
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體靶向包含標的mRNA之標的序列。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體靶向在標的mRNA內之標的序列。在一些實施態樣中，標的mRNA表現在CNS中。在一些實施態樣中，表現在CNS中的標的mRNA在本文稱為「CNS標的mRNA」。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體或其部分、片段或股(例如雙股寡核苷酸之反義股或引導股)結合或黏著(anneal)至包含標的mRNA之標的序列，藉此降低標的基因表現。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體係以降低活體內的標的基因表現為目的而靶向包含標的mRNA之標的序列。在一些實施態樣中，以靶向特定標的序列之RNAi寡核苷酸結合體降低的標的基因表現量及程度係與RNAi寡核苷酸結合體的效力互相關聯。在一些實施態樣中，以靶向特定標的序列之RNAi寡核苷酸結合體降低的標的基因表現量及程度係與以RNAi寡核苷酸結合體治療之患有與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症的個體或患者之治療效益量及程度互相關聯。
通過編碼標的基因之mRNA的核苷酸序列，包括多種不同物種(例如人類、食蟹獼猴、小鼠和大鼠)之mRNA及作為試管內和活體內測試結果的檢查，頃發現包含標的mRNA的特定核苷酸序列比其他核苷酸序列更適合於經RNAi寡核苷酸調介之降低且因此用作為本文之RNAi寡核苷酸結合體之標的序列。在一些實施態樣中，本文所述之RNAi寡核苷酸結合體(例如RNAi寡核苷酸-脂質結合體)或其部分或片段之有義股包含與包含標的mRNA之標的序列相似(例如具有不超過4個錯配)或相同的核苷酸序列。在一些實施態樣中，本文所述之雙股寡核苷酸之有義股的部分或區域包含：包含標的mRNA之標的序列。 RNAi寡核苷酸靶向序列
在一些實施態樣中，由本揭示提供之RNAi寡核苷酸結合體包含靶向序列。如本文所使用之術語「靶向序列(targeting sequence)」係指具有與包含mRNA (例如標的mRNA)之核苷酸序列互補的區域之核苷酸序列。在一些實施態樣中，由本揭示提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有與包含標的mRNA之標的序列的核苷酸序列互補的區域之靶向序列。在一些實施態樣中，由本揭示提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有與包含CNS標的mRNA之標的序列的核苷酸序列互補的區域之靶向序列。靶向序列係藉由互補的(瓦生克立克(Watson-Crick))鹼基配結合或黏著至包含標的mRNA之標的序列而賦予RNAi寡核苷酸結合體特異性靶向mRNA的能力。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體(或其股，例如雙股寡核苷酸之反義股或引導股)包含藉由互補的(瓦生克立克)鹼基配結合或黏著至包含標的mRNA之標的序列的具有互補的區域之靶向序列。靶向序列通常具有適合的長度及鹼基含量，能夠以抑制標的基因表現為目的而使RNAi寡核苷酸結合體(或其股)結合或黏著至特定的標的mRNA。在一些實施態樣中，靶向序列的長度為至少約12、至少約13、至少約14、至少約15、至少約16、至少約17、至少約18、至少約19、至少約20、至少約21、至少約22、至少約23、至少約24、至少約25、至少約26、至少約27、至少約28、至少約29或至少約30個核苷酸。在一些實施態樣中，靶向序列為至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個核苷酸。在一些實施態樣中，靶向序列的長度為約12至約30 (例如12至30、12至22、15至25、17至21、18至27、19至27或15至30)個核苷酸。在一些實施態樣中，靶向序列的長度為約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施態樣中，靶向序列的長度為18個核苷酸。在一些實施態樣中，靶向序列的長度為19個核苷酸。在一些實施態樣中，靶向序列的長度為20個核苷酸。在一些實施態樣中，靶向序列的長度為21個核苷酸。在一些實施態樣中，靶向序列的長度為22個核苷酸。在一些實施態樣中，靶向序列的長度為23個核苷酸。在一些實施態樣中，靶向序列的長度為24個核苷酸。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含與包含標的mRNA之標的序列完全互補的靶向序列。在一些實施態樣中，靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列部分互補。在一些實施態樣中，靶向序列包含：包含反義股之連續的核苷酸區域。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含與包含標的mRNA之連續的核苷酸序列互補的靶向序列，其中連續的核苷酸序列的長度為約12至約30個核苷酸(例如長度為12至30、12至28、12至26、12至24、12至20、12至18、12至16、14至22、16至20、18至20或18至19個核苷酸)。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含與包含標的mRNA之連續的核苷酸序列互補的靶向序列，其中連續的核苷酸序列的長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含與包含標的mRNA之連續的核苷酸序列互補的靶向序列，其中連續的核苷酸序列的長度為19個核苷酸。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含與包含標的mRNA之連續的核苷酸序列互補的靶向序列，其中連續的核苷酸序列的長度為20個核苷酸。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含與包含標的mRNA (例如CNS標的mRNA)之連續的核苷酸序列互補的靶向序列，其中連續的核苷酸序列的長度為15個核苷酸。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含與包含標的mRNA (例如CNS標的mRNA)之連續的核苷酸序列互補的靶向序列，其中連續的核苷酸序列的長度為19個核苷酸。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列完全互補(例如不具有錯配)且包含全長反義股。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列完全互補(例如不具有錯配)且包含全長反義股的一部分。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列完全互補(例如不具有錯配)且包含反義股的10至20個核苷酸。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列完全互補(例如不具有錯配)且包含反義股的15至19個核苷酸。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列完全互補(例如不具有錯配)且包含反義股的15個核苷酸、16個核苷酸、17個核苷酸、18個核苷酸、19個核苷酸、20個核苷酸、21個核苷酸或22個核苷酸。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列完全互補(例如不具有錯配)且包含反義股的19個核苷酸。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列完全互補(例如不具有錯配)且包含反義股的20個核苷酸。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列部分互補(例如具有不超過4個錯配)且包含全長反義股。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列部分互補(例如具有不超過4個錯配)且包含全長反義股的一部分。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列部分互補(例如具有不超過4個錯配)且包含反義股的10至20個核苷酸。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列部分互補(例如具有不超過4個錯配)且包含反義股的15至19個核苷酸。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列部分互補(例如具有不超過4個錯配)且包含反義股的15個核苷酸、16個核苷酸、17個核苷酸、18個核苷酸、19個核苷酸、20個核苷酸、21個核苷酸或22個核苷酸。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列部分互補(例如具有不超過4個錯配)且包含反義股的19個核苷酸。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的靶向序列係與包含標的mRNA之標的序列部分互補(例如具有不超過4個錯配)且包含反義股的20個核苷酸。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含與包含標的mRNA之對應標的序列具有一或多個鹼基對(bp)錯配之靶向序列。在一些實施態樣中，靶向序列與包含標的mRNA之對應標的序列具有1個bp錯配、2個bp錯配、3個bp錯配、4個bp錯配或5個bp錯配，其先決條件為維持靶向序列在適當的雜交條件下結合或黏著至標的序列的能力及/或RNAi寡核苷酸結合體抑制或降低標的基因表現的能力(例如在生理條件下)。另一選擇地，在一些實施態樣中，靶向序列與包含標的mRNA之對應標的序列具有不超過1個、不超過2個、不超過3個、不超過4個或不超過5個bp錯配，其先決條件為維持靶向序列在適當的雜交條件下結合或黏著至標的序列的能力及/或RNAi寡核苷酸結合體抑制或降低標的基因表現的能力。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含與對應標的序列具有1個錯配之靶向序列。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含與對應標的序列具有2個錯配之靶向序列。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含與對應標的序列具有3個錯配之靶向序列。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含與對應標的序列具有4個錯配之靶向序列。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含與對應標的序列具有5個錯配之靶向序列。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含與對應標的序列具有超過一個錯配(例如2、3、4、5或更多個錯配)之靶向序列，其中錯配中至少2個(例如所有)係連續定位(例如2、3、4、5個或更多個錯配在一排中)，或其中錯配係散置在整個靶向序列的任何位置。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含與對應標的序列具有超過一個錯配(例如2、3、4、5或更多個錯配)之靶向序列，其中錯配中至少2個(例如所有)係連續定位(例如2、3、4、5個或更多個錯配在一排中)，或其中至少一或多個未錯配之鹼基對係位於錯配之間或其組合。 寡核苷酸類型
各種RNAi寡核苷酸類型及/或結構可於本文之方法中用於降低標的基因表現。本文或別處所述之RNAi寡核苷酸類型中任一者係以抑制或降低CNS中的對應標的基因表現為目的而考慮用作為併入本文之靶向序列的框架。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體係藉由與切丁酶參與之RNA干擾(RNAi)路徑上游或下游銜接來抑制標的基因表現。例如，已開發出各股具有約19至25個核苷酸大小與至少一個1至5個核苷酸的3′突出物之RNAi寡核苷酸(參見例如美國專利案號8,372,968)。亦已開發更長的寡核苷酸，其經切丁酶處理以產生活性RNAi產物(參見例如美國專利案號8,883,996)。進一步操作產生延長之雙股寡核苷酸，其中至少一個股的至少一端延伸至雙螺旋靶向區域外，其包括其中該等股中之一者包括熱力學穩定的四鹼基環圈之結構(參見例如美國專利案號8,513,207和8,927,705，以及國際專利申請公開案號WO 2010/033225)。此等結構可包括單股延伸(在分子的一側或兩側)以及雙股延伸。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體係與切丁酶參與(例如切丁酶切割)之RNAi路徑下游銜接。在一些實施態樣中，本文所述之RNAi寡核苷酸結合體為切丁酶受質。在一些實施態樣中，在內源性切丁酶處理後，產生能夠降低標的mRNA (例如CNS標的mRNA)表現之19至23個核苷酸長度的雙股核酸。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體在有義股的3′端具有突出物(例如1、2或3個核苷酸長度)。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體(例如siRNA結合體)包含21個核苷酸之引導股(其為標的mRNA之反義股)及互補的過客股(passenger strand)，其中使兩個股黏著以形成19個bp之雙螺旋及2個在任一或兩個3′端上之核苷酸突出物。亦考慮較長的寡核苷酸設計，其包括具有23個核苷酸之引導股及21個核苷酸之過客股之寡核苷酸，其中在分子右側(過客股之3′端/引導股之5′端)有鈍端及在分子左側(過客股之5′端/引導股之3′端)有兩個核苷酸3′-引導股突出物。在此等分子中，有21個bp之雙螺旋區域。參見例如美國專利案號9,012,138、9,012,621和9,193,753。
在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體包含有義股及反義股，兩者的長度範圍為約17至26 (例如17至26、20至25或21至23)個核苷酸。在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體包含有義股及反義股，兩者的長度範圍為約19至22個核苷酸。在一些實施態樣中，有義股及反義股具有相等的長度。在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體包含有義股及反義股，使得在有義股或反義股，或有義股及反義股兩者上有3′突出物。在一些實施態樣中，關於具有長度範圍皆為約21至23個核苷酸之有義股及反義股之RNAi寡核苷酸結合體，在有義股、反義股或有義股及反義股兩者上之3′突出物的長度為1或2個核苷酸。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體具有22個核苷酸之引導股及20個核苷酸之過客股，其中在分子右側(過客股之3′端/引導股之5′端)有鈍端及在分子左側(過客股之5′端/引導股之3′端)有兩個核苷酸3′-引導股突出物。在此等分子中，有20個bp之雙螺旋區域。
本文之組成物及方法使用之其他RNAi寡核苷酸設計包括：16-mer siRNA (參見例如Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Blackburn (編輯), Royal Society of Chemistry, 2006)、shRNA (例如具有19個bp或更短的主幹；參見例如Moore等人之(2010) Methods Mol. Biol. 629:141-58)、鈍siRNA (例如長度為19個bp；參見例如Kraynack & Baker (2006) RNA 12:163-76)、不對稱siRNA (aiRNA；參見例如Sun等人之(2008) Nat. Biotechnol .26:1379-82)、更短的不對稱雙螺旋siRNA (參見例如Chang等人之(2009) Mol. Ther. 17:725-732)、叉體siRNA (參見例如Hohjoh (2004) FEBS Lett. 557:193-98)、單股siRNA (Elsner (2012) Nat. Biotechnol .30:1063)、啞鈴狀圓形(dumbbell-shaped circular) siRNA (參見例如Abe等人之(2007) J. Am. Chem. Soc. 129:15108-09)及內部分段之小型干擾RNA (siRNA；參見例如Bramsen等人之(2007) Nucleic Acids Res. 35:5886-97)。可在一些實施態樣中用於降低或抑制標的基因表現之寡核苷酸結構的其他非限制性實例為微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)和短siRNA (參見例如Hamilton等人之(2002) EMBO J. 21:4671-79；亦參見美國專利申請案號2009/0099115)。
又在一些實施態樣中，用於降低或抑制標的基因表現的本文之RNAi寡核苷酸結合體為單股(ss)。此等結構可包括但不限於單股RNAi分子。最近的努力已證明單股RNAi分子之活性(參見例如Matsui等人之(2016) MOL. THER. 24:946-955)。然而，在一些實施態樣中，本文所述之寡核苷酸-配體結合體包含反義寡核苷酸(ASO)。反義寡核苷酸為具有核鹼基序列之單股寡核苷酸，當以5′至3′方向書寫或描述時，該序列包含特定核酸之靶向分段的反向互補且經適當地修飾(例如作為間隙體(gapmer))，以便誘導在細胞中的其靶RNA經RNaseH調介之切割、或(例如作為混合聚體(mixmer))以便抑制在細胞中的標的mRNA轉譯。本文使用之ASO可以本技術中已知的任何適合的方式修飾，包括例如美國專利案號9,567,587中所示(包括例如長度、核鹼基(嘧啶、嘌呤)之糖部分和核鹼基之雜環部分的變化)。再者，幾十年來已使用ASO降低特定的標的基因表現(參見例如Bennett等人之(2017) ANNU. REV. PHARMACOL. 57:81-105)。 核酸配體結合體之結構
在特定的態樣中，本揭示提供以式I-a表示之核酸-配體結合體：
Figure 02_image095
或其醫藥上可接受的鹽，其中： B為核鹼基或氫； R 1和R 2獨立為氫、鹵素、R A、-CN、-S(O)R、-S(O) 2R、-Si(OR) 2R、-Si(OR)R 2或-SiR 3，或 在同一碳上的R 1和R 2與彼等的中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之3員飽和或部分不飽和環； 各R A獨立為視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環； 各R獨立為氫、適合的保護基或視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環，或： 在同一原子上的兩個R基團與彼等的中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽和硫的雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或芳基環； L A獨立為PG 1或-L-配體； PG 1為氫或適合的羥基保護基； 各配體獨立為-(LC) n及/或金剛烷基； 各LC獨立為包含飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈之脂質結合體部分，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-置換； 各-Cy-獨立為視需要經取代之選自下列的二價環：伸苯基、8至10員雙環伸芳基、4至7員飽和或部分不飽和伸碳環基、4至11員飽和或部分不飽和螺伸碳環基、8至10員雙環飽和或部分不飽和伸碳環基、伸金剛烷基、具有1至3個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和伸雜環基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至11員飽和或部分不飽和螺伸雜環基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之8至10員雙環飽和或部分不飽和伸雜環基、具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員飽和或部分不飽和伸雜芳基、或具有1至5個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之8至10員雙環伸雜芳基； n為1至10； L為共價鍵或二價飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、 -NR-、-N(R)-C(O)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O) 2-、 -P(O)OR-、-P(S)OR-、-V 1CR 2W 1-或
Figure 02_image097
置換； m為1至50； X 1、V 1和W 1獨立為-C(R) 2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或 -NR-； Z為-O-、-S-、-NR-或-CR 2-；且 PG 2為氫、亞磷醯胺酸酯類似物或適合的保護基。
在特定的實施態樣中，核酸-配體結合體係以式I-b或I-c表示：
Figure 02_image099
Figure 02_image101
或其醫藥上可接受的鹽；其中 L 1為共價鍵或二價飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、 -C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或
Figure 02_image103
置換； R 4為氫、R A或適合的胺保護基；且 R 5為金剛烷基或飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、   -C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-置換。
在一些實施態樣中，核酸-配體結合體係以式I-Ib或I-Ic表示：
Figure 02_image105
Figure 02_image107
或其醫藥上可接受的鹽；其中 B為核鹼基或氫； m為1至50； PG 1和PG 2獨立為氫、亞磷醯胺酸酯類似物或適合的保護基；且 R 5為金剛烷基或飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-O-、-C(O)NR-、  -NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-置換。
在核酸-配體結合體的特定實施態樣中，R 5係選自
Figure 02_image109
Figure 02_image111
Figure 02_image113
在核酸-配體結合體之一些實施態樣中，R 5係選自：
Figure 02_image115
。 雙股 RNAi寡核苷酸結合體 結構
在一些態樣中，本揭示提供包含一或多種以式II-a表示之核酸-配體結合體之寡核苷酸-配體結合體或寡核苷酸結合體：
Figure 02_image117
或其醫藥上可接受的鹽，其中： B為核鹼基或氫； R 1和R 2獨立為氫、鹵素、R A、-CN、-S(O)R、-S(O) 2R、-Si(OR) 2R、-Si(OR)R 2或-SiR 3；或 在同一碳上的R 1和R 2與彼等的中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R A獨立為視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環； 各R獨立為氫、適合的保護基或視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環；或 在同一原子上的兩個R基團與彼等的中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽和硫的雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或芳基環； 各LC獨立為包含飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈之脂質結合體部分，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、    -C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-置換； 各-Cy-獨立為視需要經取代之選自下列的二價環：伸苯基、8至10員雙環伸芳基、4至7員飽和或部分不飽和伸碳環基、4至11員飽和或部分不飽和螺伸碳環基、8至10員雙環飽和或部分不飽和伸碳環基、具有1至3個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和伸雜環基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至11員飽和或部分不飽和螺伸雜環基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之8至10員雙環飽和或部分不飽和伸雜環基、具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員飽和或部分不飽和伸雜芳基、或具有1至5個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之8至10員雙環伸雜芳基； n為1至10； L為共價鍵或二價飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、   -C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V 1CR 2W 1-或
Figure 02_image119
置換； m為1至50； X 1、V 1和W 1獨立為-C(R) 2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或 -NR-； Y為氫、適合的羥基保護基、
Figure 02_image121
或
Figure 02_image123
； R 3為氫、適合的保護基、適合的前藥或視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環； X 2為O、S或NR； X 3為-O-、-S-、-BH 2-或共價鍵； Y 1為連接至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′或3′末端的鍵聯基團； Y 2為氫、適合的保護基、亞磷醯胺酸酯類似物、連接至核苷、核苷酸或寡核苷酸之5′末端的核苷酸間鍵聯基團、或連接至撐體的鍵聯基團；且 Z為-O-、-S-、-NR-或-CR 2-。
在特定的實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體(寡核苷酸結合體)係以式II-b或II-c表示：
Figure 02_image125
Figure 02_image127
或其醫藥上可接受的鹽，其中： L 1為共價鍵、單價或二價飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或
Figure 02_image129
置換； R 4為氫、R A或適合的胺保護基；且 R 5為金剛烷基或飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-O-、-C(O)NR-、  -NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-或-P(S)OR置換。
在寡核苷酸-配體結合體的一些實施態樣中，R 5係選自：
Figure 02_image131
Figure 02_image133
Figure 02_image135
在寡核苷酸-配體結合體的特定實施態樣中，R 5係選自：
Figure 02_image137
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image139
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image141
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image143
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image145
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image147
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image149
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image151
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image153
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image155
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image157
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image159
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image161
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image163
。
在一些實施態樣中，R 5為
Figure 02_image165
。
在一些實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體係以式II-Ib或II-Ic表示：
Figure 02_image167
Figure 02_image169
或其醫藥上可接受的鹽；其中 B為核鹼基或氫； m為1至50； X 1為-O-或-S-； Y為氫、
Figure 02_image171
或
Figure 02_image173
； R 3為氫或適合的保護基； X 2為O或S； X 3為-O-、-S-或共價鍵； Y 1為連接至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′或3′末端的鍵聯基團； Y 2為氫、亞磷醯胺酸酯類似物、連接至核苷、核苷酸或寡核苷酸之5′末端的核苷酸間鍵聯基團、或連接至撐體的鍵聯基團； R 5為金剛烷基或飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-O-、-C(O)NR-、  -NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-置換；且 R為氫、適合的保護基或視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環。
在寡核苷酸-配體結合體的特定實施態樣中，R 5係選自：
Figure 02_image175
Figure 02_image177
在特定的實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體包含一或多種上文揭示之實施態樣中任一者之核酸-配體結合體組態。
在特定的實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核酸-配體結合體單元。
在一些態樣中，本揭示提供用於靶向標的mRNA (例如在CNS中表現之標的mRNA)及抑制或降低標的基因表現(例如經由RNAi路徑)之RNAi寡核苷酸結合體，其中RNAi寡核苷酸結合體為包含有義股(在本文亦稱為過客股)及反義股(在本文亦稱為引導股)之雙股(ds)核酸分子。在一些實施態樣中，有義股及反義股為單獨的股且未經共價鍵聯。在一些實施態樣中，有義股及反義股係經共價建聯。在一些實施態樣中，有義股及反義股形成雙螺旋區域，其中有義股及反義股或其部分係以互補方式(例如藉由瓦生克立克鹼基配對)彼此結合或黏著。
在一些實施態樣中，有義股具有第一區(R1)及第二區(R2)，其中R2包含第一亞區(S1)、四鹼基環圈(L)或三鹼基環圈(三L)及第二亞區(S2)，其中L或三L係位在介於S1與S2之間，且其中S1及S2形成第二雙螺旋(D2)。D2可具有各種長度。在一些實施態樣中，D2長度為約1至6個bp。在一些實施態樣中，D2長度為2至6、3至6、4至6、5至6、1至5、2至5、3至5或4至5個bp。在一些實施態樣中，D2長度為1、2、3、4、5或6個bp。在一些實施態樣中，D2長度為6個bp。
在一些實施態樣中，有義股之R1及反義股形成第一雙螺旋(D1)。在一些實施態樣中，D1的長度為至少約15 (例如至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21)個核苷酸。在一些實施態樣中，D1的長度範圍為約12至30個核苷酸(例如長度為12至30、12至27、15至22、18至22、18至25、18至27、18至30、或21至30個核苷酸)。在一些實施態樣中，D1的長度為至少12個核苷酸(例如長度為至少12、至少15、至少20、至少25或至少30個核苷酸)。在一些實施態樣中，D1的長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施態樣中，D1的長度為19個核苷酸。在一些實施態樣中，D1的長度為20個核苷酸。在一些實施態樣中，包含有義股及反義股之D1不跨越該有義股及/或反義股的整個長度。在一些實施態樣中，包含有義股及反義股之D1跨越該有義股或反義股或兩者的整個長度。在特定的實施態樣中，包含有義股及反義股之D1跨越該有義股及反義股兩者的整個長度。
應理解在一些實施態樣中，在序列表中所呈示之序列可在說明寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸結合體)或其他核酸之結構時提及。在此等實施態樣中，當與指定序列相比時，實際的寡核苷酸或其他核酸可具有一或多個替代的核苷酸(例如DNA核苷酸之RNA對應體或RNA核苷酸之DNA對應體)及/或一或多個經修飾之核苷酸及/或一或多個經修飾之核苷酸間鍵聯及/或一或多個其他修飾，同時保留與指定序列基本上相同或相似互補性質。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含25個核苷酸有義股及27個核苷酸反義股，當以切丁酶起作用時，其得到併入成熟RISC中之反義股。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之有義股比27個核苷酸更長(例如28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸)。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之有義股比25個核苷酸更長(例如26、27、28、29或30個核苷酸)。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體具有一個5′端，當與其他5′端相比時，該5′端在熱力學上較不穩定。在一些實施態樣中，提供不對稱RNAi寡核苷酸結合體，其包含在有義股的3′端上之鈍端及在反義股的3′端上之3′-突出物。在一些實施態樣中，在反義股上之3′-突出物的長度為約1至8個核苷酸(例如長度為1、2、3、4、5、6、7或8個核苷酸)。RNAi寡核苷酸結合體通常在反義(引導)股的3′端上具有兩個核苷酸突出物。然而，其他突出物為可能的。在一些實施態樣中，突出物為3′-突出物，其包含介於1與6個核苷酸之間的長度，視需要為1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6個核苷酸，或1、2、3、4、5或6個核苷酸。然而，在一些實施態樣中，突出物為5′-突出物，其包含介於1與6個核苷酸之間的長度，視需要為1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6個核苷酸，或1、2、3、4、5或6個核苷酸。
在一些實施態樣中，在反義股的3′端上之兩個末端核苷酸係經修飾。在一些實施態樣中，在反義股的3′端上之兩個末端核苷酸係與標的mRNA (例如在CNS中表現之標的mRNA)互補。在一些實施態樣中，在反義股的3′端上之兩個末端核苷酸不與標的mRNA互補。在一些實施態樣中，在本文之RNAi寡核苷酸結合體之反義股的3′端上之兩個末端核苷酸未經配對。在一些實施態樣中，在本文之RNAi寡核苷酸結合體之反義股的3′端上之兩個末端核苷酸包含未配對之GG。在一些實施態樣中，在本文之RNAi寡核苷酸結合體之反義股的3′端上之兩個末端核苷酸不與標的mRNA互補。在一些實施態樣中，在RNAi寡核苷酸結合體的各3′端上之兩個末端核苷酸為GG。在雙股寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸結合體)的各3′端上之兩個末端GG核苷酸中之一或兩者通常不與標的mRNA互補。
在一些實施態樣中，在介於有義股與反義股之間有一或多個(例如1、2、3、4或5個)錯配。若在介於有義股與反義股之間有超過一個錯配，則彼等可連續定位(例如2、3或更多個在一排中)或散置於整個互補的區域內。在一些實施態樣中，有義股的3′端含有一或多個錯配。在一個實施態樣中，兩個錯配係在有義股的3′端併入。在一些實施態樣中，在本文之RNAi寡核苷酸結合體之有義股的3′端上之分段的鹼基錯配或去穩定化改進或增加RNAi寡核苷酸結合體之效力及/或功效。
在一些實施態樣中，本揭示提供包含RNAi寡核苷酸及脂質部分之RNAi寡核苷酸結合體。在一些實施態樣中，脂質部分係與RNAi寡核苷酸之有義股結合。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸包含主幹環圈。在一些實施態樣中，配體係與主幹環圈中的核苷酸中任一者結合。在一些實施態樣中，配體係與主幹環圈中自5’至3’之第一核苷酸結合。在一些實施態樣中，配體係與主幹環圈中自5’至3’之第二核苷酸結合。在一些實施態樣中，配體係與主幹環圈中自5’至3’之第三核苷酸結合。在一些實施態樣中，配體係與主幹環圈中自5’至3’之第四核苷酸結合。在一些實施態樣中，配體係與主幹環圈中的核苷酸中之一、二、三或四者結合。在一些實施態樣中，配體係與主幹環圈中的核苷酸中之三者結合。
在一些實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體包含36個核苷酸之有義股，該核苷酸的位置係自5’至3’以1至36編號。在一些實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體包含與36個核苷酸有義股的位置27結合之脂質。在一些實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體包含與36個核苷酸有義股的位置28結合之脂質。在一些實施態樣中，寡核苷酸結合體包含與36個核苷酸有義股的位置29結合之脂質。在一些實施態樣中，寡核苷酸結合體包含與36個核苷酸有義股的位置30結合之脂質。
在一些實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體包含15至30個核苷酸之反義股及15至40個核苷酸之有義股，其中有義股及反義股形成雙螺旋區域，其中反義股包含與CNS的組織或細胞中表現之標的序列互補的區域，其中有義股包含在其3ʹ端上之主幹-環圈，該主幹-環圈包含：包含4個核苷之四鹼基環圈，其中4個核苷中之一或多者係以式II-Ib表示：
Figure 02_image179
， 其中B係選自腺嘌呤和鳥嘌呤核鹼基，且其中R 5為烴鏈。在一些實施態樣中，m為1，X1為O，Y2為連接至核苷的5’末端之核苷酸間鍵聯基團， Y係以
Figure 02_image181
表示，Y1為連接至核苷酸的2’或3’末端之鍵聯基團，X2為O，X3為O，且R3為H。在一些實施態樣中，烴鏈為C8-C30烴鏈。在一些實施態樣中，烴鏈為C16烴鏈。在一些實施態樣中，C16烴鏈係以
Figure 02_image183
表示。在一些實施態樣中，四鹼基環圈的4個核苷係自5’至3’以1至4編號，且位置1係以式II-Ib表示。在一些實施態樣中，位置2係以式II-Ib表示。在一些實施態樣中，位置3係以式II-Ib表示。在一些實施態樣中，位置4係以式II-Ib表示。在一些實施態樣中，有義股為36個核苷酸，其位置係自5’至3’以1至36編號，其中主幹-環圈包含在位置21至36的核苷酸，且其中在位置27至30的一或多個核苷係以式II-Ib表示。在一些實施態樣中，反義股為22個核苷酸。 反義股
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之反義股被稱為「引導股」。例如，反義股係與經RNA誘導之靜默複合物(RISC)銜接且與 Argonaute蛋白(諸如Ago2)結合或與一或多個相似因子銜接或結合，且定向標的基因靜默，反義股被稱為引導股。在一些實施態樣中，與引導股互補的有義股被稱為「過客股」。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含長度為至多約50個核苷酸(例如長度為至多50、至多40、至多35、至多30、至多27、至多25、至多21、至多19、至多17、至多15或至多12個核苷酸)之反義股。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含長度為至少約12個核苷酸(例如長度為至少12、至少15、至少19、至少21、至少22、至少25、至少27、至少30、至少35或至少38個核苷酸)之反義股。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含長度範圍為約12至約40 (例如12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至30、15至28、17至22、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)個核苷酸之反義股。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含長度為15至30個核苷酸之反義股。在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體中任一者之反義股的長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含長度為22個核苷酸之反義股。 有義股
在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體包含長度為至多約50個核苷酸(例如長度為至多50、至多40、至多36、至多30、至多27、至多25、至多21、至多19、至多17或至多12 核苷酸個核苷酸)之有義股(或過客股)。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含長度為至少約12個核苷酸(例如長度為至少12、至少15、至少19、至少21、至少25、至少27、至少30、至少36或至少38個核苷酸)之有義股。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含長度範圍為約12至約50 (例如12至50、12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至21、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)個核苷酸之有義股。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含長度為15至50個核苷酸之有義股。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含長度為18至36個核苷酸之有義股。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸之有義股。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含長度為36個核苷酸之有義股。
在一些實施態樣中，有義股包含在其3ʹ端上之主幹-環圈結構。在一些實施態樣中，主幹-環圈係藉由股內鹼基配對來形成。在一些實施態樣中，有義股包含在其5ʹ端上之主幹-環圈結構。在一些實施態樣中，主幹為長度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個核苷酸之雙螺旋。在一些實施態樣中，主幹-環圈提供免於降解(例如酶降解)之RNAi寡核苷酸結合體、促成或改進靶向及/或遞送至靶細胞、組織或器官(例如肝)或兩者。例如，在一些實施態樣中，主幹-環圈之環圈提供包含一或多個修飾之核苷酸，該修飾促成、改進或增加靶向至標的mRNA (例如在CNS中表現之標的mRNA)、標的基因表現之抑制及/或遞送至靶細胞、組織或器官(例如CNS)或其組合。在一些實施態樣中，主幹-環圈本身或主幹-環圈之修飾不實質地影響RNAi寡核苷酸結合體之固有的基因表現抑制活性，但是促成、改進或增加RNAi寡核苷酸結合體對靶細胞、組織或器官(例如CNS)的穩定性(例如提供免於降解)及/或遞送。在特定的實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含有義股，其包含(例如在其3′端上)以如下提出之主幹-環圈：S1-L-S2，其中S1係與S2互補，且其中L形成介於S1與S2之間長度為至多約10個核苷酸(例如長度為3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸)的單股環圈。在一些實施態樣中，環圈(L)的長度為3個核苷酸。在一些實施態樣中，環圈(L)的長度為4個核苷酸。
在一些實施態樣中，四鹼基環圈包含序列5’-GAAA-3’。在一些實施態樣中，主幹環圈包含序列5’-GCAGCCGAAAGGCUGC-3’ (SEQ ID NO：15)。
在一些實施態樣中，具有如上述之結構S1-L-S2的主幹-環圈之環圈(L)為三鹼基環圈。在一些實施態樣中，三鹼基環圈包含核糖核苷酸、去氧核醣核苷酸、經修飾之核苷酸、遞送配體及其組合。
在一些實施態樣中，具有如上述之結構S1-L-S2的主幹-環圈之環圈(L)為四鹼基環圈(例如在切口型四鹼基環圈結構內)。在一些實施態樣中，四鹼基環圈包含核糖核苷酸、去氧核醣核苷酸、經修飾之核苷酸、遞送配體及其組合。
在一些實施態樣中，具有如上述之結構S1-L-S2的主幹-環圈之環圈(L)為如美國專利案號10,131,912 (併入本文以供參考)中所述之四鹼基環圈(例如在切口型四鹼基環圈結構內)。 雙螺旋長度
在一些實施態樣中，在介於有義股與反義股之間所形成的雙螺旋的長度為至少12 (例如至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21)個核苷酸。在一些實施態樣中，在介於有義股與反義股之間所形成的雙螺旋的長度範圍為12至30個核苷酸(例如長度為12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30個核苷酸)。在一些實施態樣中，在介於有義股與反義股之間所形成的雙螺旋長度為12、13、14、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施態樣中，在介於有義股與反義股之間所形成的雙螺旋不跨越有義股及/或反義股的整個長度。在一些實施態樣中，在介於有義股與反義股之間的雙螺旋跨越有義股或反義股的整個長度。在一些實施態樣中，在介於有義股與反義股之間的雙螺旋跨越有義股及反義股兩者的整個長度。 寡核苷酸端
在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體包含有義股及反義股，使得在有義股或反義股或有義股及反義股兩者上有3’-突出物。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體具有一個5’端，當與其他5’端相比時，該5’端在熱力學上較不穩定。在一些實施態樣中，提供不對稱RNAi寡核苷酸結合體，其包含在有義股的3’端上之鈍端及在反義股的3’端上之3’-突出物。在一些實施態樣中，在反義股上之3’-突出物的長度為約1至8個核苷酸(例如長度為1、2、3、4、5、6、7或8個核苷酸)。
RNAi之寡核苷酸通常在反義(引導)股的3′端上具有兩(2)個核苷酸突出物。然而，其他突出物為可能的。在一些實施態樣中，突出物為3′-突出物，其包含介於1與6個核苷酸之間的長度，視需要為1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6個核苷酸，或1、2、3、4、5或6個核苷酸。在一些實施態樣中，突出為5’突出物，其包含介於1與6個核苷酸之間的長度，視需要為1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6個核苷酸，或1、2、3、4、5或6個核苷酸。
在一些實施態樣中，使有義股及/或反義股的3’端或5’端之一或多個(例如2、3或4個)末端核苷酸經修飾。例如，在一些實施態樣中，使反義股的3’端之一或兩個末端核苷酸經修飾。在一些實施態樣中，使反義股的3’端上之最後一個核苷酸經修飾，例如包含2’修飾，例如2’-O-甲氧基乙基。在一些實施態樣中，在反義股的3’端上之最後一或兩個末端核苷酸係與標的互補。在一些實施態樣中，在反義股的3’端上之最後一或兩個末端核苷酸不與標的互補。
在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體包含在有義股的3’端上之主幹-環圈結構及包含在反義股的3’端上之兩個末端突出核苷酸。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含切口型四鹼基環圈結構，其中有義股的3’端包含主幹-四鹼基環圈結構及包含在反義股的3’端上之兩個末端突出核苷酸。在一些實施態樣中，兩個末端突出核苷酸為GG。反義股的兩個末端GG 核苷酸中之一或兩者通常不與標的互補。
在一些實施態樣中，有義股或反義股的5’端及/或3’端具有反向的帽端核苷酸。
在一些實施態樣中，在介於有義股及/或反義股的3’端或5’端之末端核苷酸之間提供一或多個(例如2、3、4、5、6個)經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施態樣中，在介於有義股及/或反義股的3’端或5’端上之突出核苷酸之間提供經修飾之核苷酸間鍵聯。 寡核苷酸修飾
在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體包含一或多個修飾。寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)可以各種方式修飾以改進或控制特異性、穩定性、遞送、生物可利用性、核酸酶降解抗性、免疫原性、鹼基配對性質、RNA分布和細胞攝取及與治療研究用途有關的其他特性。
在一些實施態樣中，修飾為經修飾之糖。在一些實施態樣中，修飾為5’-末端磷酸酯基團。在一些實施態樣中，修飾為經修飾之核苷間鍵聯。在一些實施態樣中，修飾為經修飾之鹼基。在一些實施態樣中，修飾為可逆式修飾。在一些實施態樣中，本文所述之寡核苷酸可包含本文所述之修飾中任一者或其任何組合。例如，在一些實施態樣中，本文所述之寡核苷酸包含至少一種經修飾之糖、5’-末端磷酸酯基團、至少一種經修飾之核苷間鍵聯、至少一種經修飾之鹼基及至少一種可逆式修飾。
在寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)上的修飾數量及那些核苷酸修飾的位置可能影響寡核苷酸的性質。例如，寡核苷酸可藉由將其與脂質奈米粒子(LNP)或類似載劑結合或將其包含在脂質奈米粒子(LNP)或類似載劑中而於活體內遞送。然而，當寡核苷酸未經LNP或類似載劑保護時，使至少一些核苷酸經修飾可能是有利的。因此，在一些實施態樣中，使寡核苷酸之所有或實質上所有的核苷酸經修飾。在一些實施態樣中，使超過一半的核苷酸經修飾。在一些實施態樣中，使少於一半的核苷酸經修飾。在一些實施態樣中，使構成寡核苷酸的所有核苷酸之糖部分在2’位置上經修飾。修飾可能為可逆的或不可逆的。在一些實施態樣中，如本文所揭示之寡核苷酸具有足以引起所欲特徵(例如防止酶降解、在活體內投予後靶向所欲細胞的能力及/或熱力學穩定性)的經修飾之核苷酸的數量及類型。 糖修飾
在一些實施態樣中，本文所述之RNAi寡核苷酸結合體包含經修飾之糖。在一些實施態樣中，經修飾之糖(在本文亦稱為糖類似物)包括經修飾之去氧核糖或核糖部分，其中例如一或多個修飾出現在糖的2′、3′、4′及/或5′碳位置上。在一些實施態樣中，經修飾之糖亦可包含非天然替代碳結構，諸如存在於鎖核酸(「LNA」；參見例如Koshkin等人之(1998) Tetrahedon 54:3607-30)、未鎖核酸(「UNA」；參見例如Snead等人之(2013) Mol. Ther-Nucl. Acids 2:e103)及橋連核酸(「BNA」；參見例如Imanishi & Obika (2002) Chem Commun. (Camb) 21:1653-59)中。
在一些實施態樣中，在糖中之核苷酸修飾包含2′-修飾。在一些實施態樣中，2′-修飾可為2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2′-氟(2′-F)、2′-胺基乙基(EA)、2′-O-甲基(2′-OMe)、2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)或2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸(2′-FANA)。在一些實施態樣中，修飾為2′-F、2′-OMe或2′-MOE。在一些實施態樣中，在糖中之修飾包含糖環之修飾，其可包含糖環的一或多個碳之修飾。例如，核苷酸的糖之修飾可包含將糖之2′-氧連結至糖之1′-碳或4′-碳，或將2′-氧經由伸乙基或亞甲基橋連結至1′-碳或4′-碳。在一些實施態樣中，經修飾之核苷酸具有缺乏2′-碳至3′-碳鍵之無環糖。在一些實施態樣中，經修飾之核苷酸具有硫醇基團，例如在糖之4′位置。
在一些實施態樣中，本文所述之RNAi寡核苷酸結合體包含至少約1個經修飾之核苷酸(例如至少1、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60或更多個)。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之有義股包含至少約1個經修飾之核苷酸(例如至少1、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35或更多個)。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之反義股包含至少約1個經修飾之核苷酸(例如至少1、至少5、至少10、至少15、至少20或更多個)。
在一些實施態樣中，使RNAi寡核苷酸結合體之有義股的所有核苷酸經修飾。在一些實施態樣中，使RNAi寡核苷酸結合體之反義股的所有核苷酸經修飾。在一些實施態樣中，使RNAi寡核苷酸結合體的所有核苷酸(亦即有義股及反義股兩者)經修飾。在一些實施態樣中，經修飾之核苷酸包含2′-修飾(例如2′-F或2′-OMe、2′-MOE和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸)。
在一些實施態樣中，本揭示提供具有不同的修飾圖案之RNAi寡核苷酸結合體。在一些實施態樣中，經修飾之RNAi寡核苷酸結合體包含具有如實施例及序列表中所提出之修飾圖案之有義股及具有如實施例及序列表中所提出之修飾圖案之反義股。
在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體包含具有經2′-F修飾的核苷酸之反義股。在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體包含具有經2′-F及2′-OMe修飾的核苷酸之反義股。在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體包含具有經2′-F修飾的核苷酸之有義股。在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體包含具有經2′-F及2′-OMe修飾的核苷酸之有義股。
在一些實施態樣中，本文所述之寡核苷酸包含有義股，該有義股的約10至25%、10%、11%、12%、13%、14% 15%、16%、17%、18%、19%或20%之核苷酸包含2’-氟修飾。在一些實施態樣中，有義股的約11%之核苷酸包含2-氟修飾。在一些實施態樣中，有義股的約20%之核苷酸包含2-氟修飾。在一些實施態樣中，本文所述之寡核苷酸包含反義股，該反義股的約25至35%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%或35%之核苷酸包含2’-氟修飾。在一些實施態樣中，反義股的約32%之核苷酸包含2’-氟修飾。在一些實施態樣中，寡核苷酸具有核苷酸，其中約15至25%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%或25%包含2’-氟修飾。在一些實施態樣中，寡核苷酸的約19%之核苷酸包含2’-氟修飾。在一些實施態樣中，寡核苷酸的約26%之核苷酸包含2’-氟修飾。
在一些實施態樣中，該等寡核苷酸之有義股的位置8、9、10或11中之一或多者經2′-F基團修飾。在一些實施態樣中，在該等寡核苷酸之有義股的位置1至7和12至20上的核苷酸之各者的糖部分經2′-OMe修飾。在一些實施態樣中，在該等寡核苷酸之有義股的位置1至7、12至27和29至36上的核苷酸之各者的糖部分經2′-OMe修飾。
在一些實施態樣中，該等寡核苷酸之有義股的位置3、5、8、10、12、13、15和17經2′-F基團修飾。在一些實施態樣中，在該等寡核苷酸之有義股的位置1、2、4、6、7、9、11、14、16、18至27和29至36上的核苷酸之各者的糖部分經2′-OMe修飾。
在一些實施態樣中，反義股具有3個在糖部分的2′-位置上經2′-F修飾之核苷酸。在一些實施態樣中，在反義股的位置2、5和14上的核苷酸及視需要地至多3個在反義股的位置1、3、7和10上的核苷酸之糖部分經2′-F修飾。在其他的實施態樣中，在反義股的位置2、5和14上的核苷酸之各者的糖部分經2′-F修飾。在其他的實施態樣中，在反義股的位置1、2、5和14上的核苷酸之各者的糖部分經2′-F修飾。在又其他的實施態樣中，在反義股的位置1、2、3、5、7和14上的核苷酸之各者的糖部分經2′-F修飾。在又另一實施態樣中，在反義股的位置1、2、3、5、10和14上的核苷酸之各者的糖部分經2′-F修飾。在另一實施態樣中，在反義股的位置2、3、5、7、10和14上的核苷酸之各者的糖部分經2′-F修飾。在一些實施態樣中，反義股具有9個在糖部分的2′-位置上經2′-F修飾之核苷酸。在特定的額外實施態樣中，在反義股的位置2、3、4、5、7、10、14、16和19上的核苷酸之各者的糖部分經2′-F修飾。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置2和14上的糖部分經2′-F修飾之反義股。在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置2、5和14上的糖部分經2′-F修飾之反義股。在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置1、2、5和14上的糖部分經2′-F修飾之反義股。在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置1、2、3、5、7和14上的糖部分經2′-F修飾之反義股。在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置1、2、3、5、10和14上的糖部分經2′-F修飾之反義股。在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置2、3、4、5、7、10、14、16和19上的糖部分經2′-F修飾之反義股。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在反義股的位置2、5和14上的核苷酸之各者的糖部分經2′-F修飾及反義股的其餘核苷酸之各者的糖部分經選自由下列組成之群組的修飾物修飾之反義股：2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2′-胺基乙基(EA)、2’-O-甲基(2′-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)和2’-去氧-2’-氟-β-d-阿拉伯核酸(2′-FANA)。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在反義股的位置2、3、4、5、7、10、14、16和19上的核苷酸之各者的糖部分經2′-F修飾及反義股的其餘核苷酸之各者的糖部分經選自由下列組成之群組的修飾物修飾之反義股：2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2′-胺基乙基(EA)、2’-O-甲基(2′-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)和2’-去氧-2’-氟-β-d-阿拉伯核酸(2′-FANA)。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在反義股的位置1、2、5和14上的核苷酸之各者的糖部分經2′-F修飾及反義股的其餘核苷酸之各者的糖部分經選自由下列組成之群組的修飾物修飾之反義股：2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2′-胺基乙基(EA)、2′-O-甲基(2′-OMe)、2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)、和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸(2′-FANA)。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在反義股的位置1、2、3、5、7和14上的核苷酸之各者的糖部分經2′-F修飾及反義股的其餘核苷酸之各者的糖部分經選自由下列組成之群組的修飾物修飾之反義股：2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2′-胺基乙基(EA)、2′-O-甲基(2′-OMe)、2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)、和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸(2′-FANA)。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在反義股的位置1、2、3、5、10和14上的核苷酸之各者的糖部分經2′-F修飾及反義股的其餘核苷酸之各者的糖部分經選自由下列組成之群組的修飾物修飾之反義股：2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2′-胺基乙基(EA)、2′-O-甲基(2′-OMe)、2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)、和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸(2′-FANA)。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在反義股的位置2、3、5、7、10和14上的核苷酸之各者的糖部分經2′-F修飾及反義股的其餘核苷酸之各者的糖部分經選自由下列組成之群組的修飾物修飾之反義股：2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2′-胺基乙基(EA)、2′-O-甲基(2′-OMe)、2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)、和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸(2′-FANA)。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在反義股的位置2、3、4、5、7、10、14、16和19上的核苷酸之各者的糖部分經2′-F修飾及反義股的其餘核苷酸之各者的糖部分經選自由下列組成之群組的修飾物修飾之反義股：2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2′-胺基乙基(EA)、2′-O-甲基(2′-OMe)、2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)、和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸(2′-FANA)。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22上的糖部分經2′-F修飾之反義股。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22上的糖部分經2′-OMe修飾之反義股。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22上的糖部分經選自由下列組成之群組的修飾物修飾之反義股：2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2’-胺基乙基(EA)、2′-O-甲基(2′-OMe)、2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)、和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸(2′-FANA)。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置8至11上的糖部分經2′-F修飾之有義股。在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置3、5、8、10、12、13、15和17上的糖部分經2′-F修飾之有義股。在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置1至7和12至17或12至20上的糖部分經2’OMe修飾之有義股。在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置1、2、4、6、7、9、11、14、16和18至20上的糖部分經2’OMe修飾之有義股。在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在有義股的位置1至7和12至17或12至20上的核苷酸之各者的糖部分經選自由下列組成之群組的修飾物修飾之有義股：2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2’-胺基乙基(EA)、2′-O-甲基(2′-OMe)、2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)、和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸(2′-FANA)。在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在有義股的位置1、2、4、6、7、9、11、14、16和18至20上的糖部分經選自由下列組成之群組的修飾物修飾之有義股：2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2’-胺基乙基(EA)、2′-O-甲基(2′-OMe)、2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)、和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸(2′-FANA)。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36上的糖部分經2′-F修飾之有義股。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36上的糖部分經2′-OMe修飾之有義股。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含具有在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36上的糖部分經選自由下列組成之群組的修飾物修飾之有義股：2′-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-胺基、2′-乙基、2’-胺基乙基(EA)、2′-O-甲基(2′-OMe)、2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、2′-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2′-O-NMA)、和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸(2′-FANA)。 5’-末端磷酸酯
在一些實施態樣中，本文所述之RNAi寡核苷酸結合體包含5’-末端磷酸酯。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之5′-末端磷酸酯基團增強與Ago2之相互作用。然而，包含5′-磷酸酯基團之寡核苷酸可易感受經由磷酸酶或其他酶之降解，該降解可限制其活體內生物可利用性。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含抵抗此降解之5′磷酸酯之類似物。在一些實施態樣中，磷酸酯類似物為氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二醯基膦酸酯或其組合。在特定的實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體股之5′端連接至模擬天然5′-磷酸酯基團之靜電及空間性質之化學部分(「磷酸酯模擬物」)。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體具有在糖之4′-碳位置上的磷酸酯類似物(稱為「4′-磷酸酯類似物」)。參見例如國際專利申請公開案號WO 2018/045317。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含在5′-末端核苷酸上的4′-磷酸酯類似物。在一些實施態樣中，磷酸酯類似物為氧甲基膦酸酯(其中氧甲基之氧原子結合至糖部分(例如在其4′-碳上))或其類似物。在其他的實施態樣中，4′-磷酸酯類似物為硫甲基膦酸酯或胺基甲基膦酸酯(其中硫甲基之硫原子或胺基甲基之氮原子結合至糖部分之4′-碳)或其類似物。在特定的實施態樣中，4′-磷酸酯類似物為氧甲基膦酸酯。在一些實施態樣中，氧甲基膦酸酯係以式-O-CH 2-PO(OH) 2、-O-CH 2-PO(OR) 2或-O-CH2-POOH(R)表示，其中R獨立地選自H、CH 3、烷基、CH 2CH 2CN、CH 2OCOC(CH 3) 3、CH 2OCH 2CH 2Si(CH 3) 3或保護基。在特定的實施態樣中，烷基為CH 2CH 3。更通常地，R獨立地選自H、CH 3或CH 2CH 3。在一些實施態樣中，R為CH3。在一些實施態樣中，4’-磷酸酯類似物為5’-甲氧基磷酸酯-4’-氧基。在一些實施態樣中，4’-磷酸酯類似物為4’-氧甲基膦酸酯。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體包含反義股，其包含在5′-末端核苷酸上的4′-磷酸酯類似物，其中5’-末端核苷酸包含以下結構：
Figure 02_image185
4’-O-單甲基膦酸酯-2’-O-甲基尿苷硫代磷酸酯 [Me膦酸酯-4O-mUs] 經修飾之核苷間鍵聯
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含包含經修飾之核苷間鍵聯。在一些實施態樣中，磷酸酯修飾或取代可得到包含至少約1個(例如至少1、至少2、至少3或至少5個)經修飾之核苷酸間鍵聯的寡核苷酸。在一些實施態樣中，本文所揭示之寡核苷酸中任一者包含約1至約10個(例如1至10、2至8、4至6、3至10、5至10、1至5、1至3、或1至2個)經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施態樣中，本文所揭示之寡核苷酸中任一者包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個經修飾之核苷酸間鍵聯。
經修飾之核苷酸間鍵聯可為二硫代磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯、磷酸三酯鍵聯、硫羰烷基(thionoalkyl)磷酸酯鍵聯、硫代烷基磷酸三酯鍵聯、亞磷醯胺酯鍵聯、膦酸酯鍵聯或硼烷磷酸酯鍵聯。在一些實施態樣中，如本文所揭示之寡核苷酸中任一者之至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。
在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體具有在有義股的位置1和2、反義股的位置1和2、反義股的位置2和3、反義股的位置3和4、反義股的位置20和21及反義股的位置21和22中之一或多者之間的硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施態樣中，本文所述之寡核苷酸具有在有義股的位置1和2、反義股的位置1和2、反義股的位置2和3、反義股的位置20和21及反義股的位置21和22各者之間的硫代磷酸酯鍵聯。
在一些實施態樣中，本文所述之寡核苷酸結合體包含肽核酸(PNA)。PNA為其中糖-磷酸酯骨架已經由N-(2-胺基乙基)甘胺酸單元組成之偽肽骨架置換之寡核苷酸模擬物。核鹼基係通過兩原子羧甲基間隔物連結至此骨架。在一些實施態樣中，本文所述之寡核苷酸結合體包含嗎啉基寡聚物(PMO)，其包含通過磷酸二醯胺酸酯(phosphorodiamidate)基團連結之亞甲嗎啉環的核苷酸間鍵聯骨架。 鹼基修飾
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含一或多個經修飾之核鹼基。在一些實施態樣中，經修飾之核鹼基(在本文亦稱為鹼基類似物)係在核苷酸糖部分之1′位置上連結。在特定的實施態樣中，經修飾之核鹼基為含氮鹼基。在特定的實施態樣中，經修飾之核鹼基不含有氮原子。參見例如美國專利申請公開案號2008/0274462。在一些實施態樣中，經修飾之核苷酸包含普適性鹼基。在一些實施態樣中，經修飾之核苷酸不含有核鹼基(無鹼基)。
在一些實施態樣中，普適性鹼基為位於經修飾之核苷酸中的核苷酸糖部分之1′位置上或核苷酸糖部分取代中的等效位置上之雜環部分，當存在於雙螺旋中時，其可與超過一種類型的鹼基相反定位而不實質地改變雙螺旋之結構。在一些實施態樣中，與靶核酸完全互補的參考用單股核酸(例如寡核苷酸)相比，含有普適性鹼基之單股核酸係與靶核酸形成雙螺旋，該雙螺旋具有比以互補的核酸所形成之雙螺旋更低的T m。在一些實施態樣中，當與其中普適性鹼基經鹼基置換以產生單一錯配之參考用單股核酸相比時，含有普適性鹼基之單股核酸係與靶核酸形成雙螺旋，該雙螺旋具有比以包含錯配鹼基的核酸所形成之雙螺旋更高的T m。
普適性結合核苷酸的非限制性實例包括但不限於肌酐、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚及/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(參見美國專利申請公開案號2007/0254362；Van Aerschot等人之(1995) Nucleic Acids Res .23:4363-4370；Loakes等人之(1995) Nucleic Acids Res .23:2361-66；及Loakes & Brown (1994) Nucleic Acids Res. 22:4039-43)。 靶向配體
在一些實施態樣中，希望將本揭示之寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸結合體)靶向一或多種細胞或一或多種器官。此種策略可助於避免在其他器官中的非所欲效應或避免對不會自寡核苷酸獲益的細胞、組織或器官過度的寡核苷酸損失。因此，在一些實施態樣中，使本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體經修飾以促成靶向及/或遞送至特定的組織、細胞或器官(例如促成結合體遞送至CNS)。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含至少一個與一或多個靶向配體結合之核苷酸(例如1、2、3、4、5、6或更多個核苷酸)。
在一些實施態樣中，靶向配體包含碳水化合物、胺糖、膽固醇、肽、多肽、蛋白質或蛋白質的一部分(例如抗體或抗體片段)或脂質。在一些實施態樣中，靶向配體為適配體。例如，靶向配體可為用於靶向腫瘤脈管系統或神經膠瘤細胞之RGD肽、靶向腫瘤脈管系統或基質瘤之CREKA肽、轉移、乳鐵蛋白或靶向在CNS脈管系統上表現的運鐵蛋白受體之適配體或靶向神經膠瘤細胞上的EGFR之抗EGFR 抗體。在特定的實施態樣中，靶向配體為一或多個GalNAc部分。
在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體的1或多個(例如1、2、3、4、5或6個)核苷酸各自與單獨的靶向配體結合。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體的2至4個核苷酸各自與單獨的靶向配體結合。在一些實施態樣中，靶向配體係與有義股或反義股中任一端上之2至4個核苷酸結合(例如靶向配體係與有義股或反義股的5′或3′端上之2至4個核苷酸突出物或延伸物結合)，使得靶向配體類似於牙刷的刷毛及RNAi寡核苷酸結合體類似於牙刷。例如，RNAi寡核苷酸結合體可包含在有義股的5′或3′端上之主幹-環圈且主幹之環圈的1、2、3或4個核苷酸可個別與靶向配體結合。在一些實施態樣中，由本揭示提供之RNAi寡核苷酸結合體包含在有義股的3′端上之主幹-環圈，其中主幹-環圈之環圈包含三鹼基環圈或四鹼基環圈，且其中構成三鹼基環圈或四鹼基環圈的3或4個核苷酸個別與靶向配體結合。
GalNAc為ASGPR的高親和性配體，其主要表現在肝細胞的竇狀表面上且具有結合、內化及隨後清除含有末端半乳糖或GalNAc殘基之循環糖蛋白(去唾液酸糖蛋白)的主要角色。GalNAc部分與本揭示之寡核苷酸的結合(間接或直接)可用於將該等寡核苷酸靶向在細胞上表現的ASGPR。在一些實施態樣中，本揭示之寡核苷酸係與至少一或多個GalNAc部分結合，其中GalNAc部分將寡核苷酸靶向在人類肝細胞(liver cell)(例如人類肝細胞(hepatocyte))上表現的ASGPR。在一些實施態樣中，GalNAc部分將寡核苷酸靶向肝。
在一些實施態樣中，本揭示之寡核苷酸係與單價GalNAc直接或間接結合。在一些實施態樣中，寡核苷酸係與一個以上的單價GalNAc直接或間接結合(亦即與2、3或4個單價GalNAc部分結合，且通常與3或4個單價GalNAc部分結合)。在一些實施態樣中，寡核苷酸係與一或多個二價GalNAc、三價GalNAc或四價GalNAc部分結合。
在一些實施態樣中，寡核苷酸的1或多個(例如1、2、3、4、5或6個)核苷酸各自與GalNAc部分結合。在一些實施態樣中，四鹼基環圈的2至4個核苷酸各自與單獨的GalNAc結合。在一些實施態樣中，三鹼基環圈的1至3個核苷酸各自與單獨的GalNAc結合。在一些實施態樣中，靶向配體係與有義股或反義股的任一端上之2至4個核苷酸結合(例如配體係與有義股或反義股的5′或3′端上之2至4個核苷酸突出物或延伸物結合)，使得GalNAc部分類似於牙刷的刷毛及寡核苷酸類似於牙刷。在一些實施態樣中，GalNAc部分係與有義股的核苷酸結合。例如，四(4)個GalNAc部分可與有義股的四鹼基環圈中之核苷酸結合，其中各GalNAc部分係與1個核苷酸結合。
在一些實施態樣中，四鹼基環圈為腺嘌呤及鳥嘌呤核苷酸之任何組合。
在一些實施態樣中，四鹼基環圈(L)具有經由本文所述之任何連結子連接至四鹼基環圈的任何一或多個鳥嘌呤核苷酸之單價GalNAc部分，如下文所描述(X=雜原子)：
Figure 02_image187
在一些實施態樣中，四鹼基環圈(L)具有經由本文所述之任何連結子連接至四鹼基環圈的任何一或多個腺嘌呤核苷酸之單價GalNAc，如下文所描述(X=雜原子)：
Figure 02_image189
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含連接至鳥嘌呤核苷酸之單價GalNAc，稱為[ademG-GalNAc]或2′-胺基二乙氧基甲醇-鳥嘌呤-GalNAc，如下文所描述：
Figure 02_image191
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體包含連接至腺嘌呤核苷酸之單價GalNAc，稱為[ademA-GalNAc]或2′-胺基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下文所描述：
Figure 02_image193
此結合的實例係以下文包含自5′至3′核苷酸序列GAAA之環圈顯示(L =連結子，X =雜原子)。此環圈可存在於例如表3或5中所列出及如圖12至13中所示之有義股的位置27至30上。在化學式中，使用
Figure 02_image195
說明與寡核苷酸股的連接點。
Figure 02_image197
可使用適當的方法或化學法(例如點擊化學法)連結靶向配位體至核苷酸。在一些實施態樣中，靶向配體係使用點擊連結子與核苷酸結合。在一些實施態樣中，使用縮醛系(acetal-based)連結子將靶向配體與本文所述之寡核苷酸中任一者的核苷酸結合。縮醛系連結子揭示於例如國際專利申請公開案號WO 2016/100401中。在一些實施態樣中，連結子為不穩定的連結子。然而，在其他的實施態樣中，連結子為穩定的。實例係以下文包含自5′至3′核苷酸GAAA之環圈顯示，其中GalNAc部分係使用縮醛連結子連接至環圈的核苷酸。此環圈可存在於例如表3或5中所列出及如圖12至13中所示之有義股中任一者的位置27至30上。在化學式中，
Figure 02_image199
為與寡核苷酸股的連接點。
Figure 02_image201
或
Figure 02_image203
如上述，可使用各種方法或化學合成技術(例如點擊化學法)連結靶向配位體至核苷酸。在一些實施態樣中，靶向配體係使用點擊連結子與核苷酸結合。在一些實施態樣中，使用縮醛系連結子將靶向配體與本文所述之寡核苷酸中任一者的核苷酸結合。縮醛系連結子揭示於例如國際專利申請公開案號WO 2016/100401中。在一些實施態樣中，連結子為不穩定的連結子。然而，在其他的實施態樣中，連結子為穩定的。
在一些實施態樣中，雙螺旋延伸物(例如長度為至多3、4、5或6個bp)係提供在介於靶向配體(例如GalNAc部分)與RNAi寡核苷酸結合體之間。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體不具有與其結合之GalNAc。 示例性RNAi寡核苷酸結合體
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含與一或多個脂質部分結合之寡核苷酸。在一些實施態樣中，一或多個脂質部分包含脂肪酸。在一些實施態樣中，脂肪酸為飽和脂肪酸。在一些實施態樣中，脂肪酸為不飽和脂肪酸。在一些實施態樣中，一或多個脂質部分包含烴鏈。在一些實施態樣中，烴鏈為飽和的。在一些實施態樣中，烴鏈為不飽和的。在一些實施態樣中，一或多個脂質部分包含長度為50個碳(C50)或更短(例如約50個碳(C50)、40個碳(C40)、30個碳(C30)、25個碳(C25)、22個碳(C22)、20個碳(C20)、18個碳(C18)、16個碳(C16)、14個碳(C14)、12個碳(C12)、10個碳(C10)、8個碳(C8)或6個碳(C6)的烴鏈。在一些實施態樣中，一或多個脂質部分包含16個碳至50個碳(例如C16至C50、C18至C50、C20至C50、C22至C50、C16、C18、C20或C22)的烴鏈。在一些實施態樣中，一或多個脂質部分包含15個或更少碳(例如C6至C15、C6至C14、C6至C12、C6至C10、C8至C14、C8至C12、C8至C10、C10至C14、C10至C12、C15、C14、C13、C12、C11、C10、C9、C8、C7或C6)的烴鏈。
在一些實施態樣中，一或多個脂質部分包含C8烴鏈。在一些實施態樣中，C8烴鏈包含至少一個雙鍵。在一些實施態樣中，一或多個脂質部分包含C10烴鏈。在一些實施態樣中，C10烴鏈為不飽和的(亦即C10:0)。在一些實施態樣中，C10烴鏈包含至少一個雙鍵。在一些實施態樣中，一或多個脂質部分包含C12烴鏈。在一些實施態樣中，C12烴鏈為不飽和的(亦即C12:0)。在一些實施態樣中，C12烴鏈包含至少一個雙鍵。在一些實施態樣中，一或多個脂質部分包含C14烴鏈。在一些實施態樣中，C14烴鏈為不飽和的(亦即C14:0)。在一些實施態樣中，C14烴鏈包含至少一個雙鍵。在一些實施態樣中，一或多個脂質部分包含C16烴鏈。在一些實施態樣中，C16烴鏈為不飽和的(亦即C16:0)。在一些實施態樣中，C16烴鏈包含至少一個雙鍵。在一些實施態樣中，一或多個脂質部分包含C18烴鏈。在一些實施態樣中，C18烴鏈為不飽和的(亦即C18:0)。在一些實施態樣中，C18烴鏈包含至少一個雙鍵(例如C18:1、C18:2、C18:3、C18:4、C18:5或C18:6)。在一些實施態樣中，C18烴鏈包含兩個雙鍵(例如C18:2)。在一些實施態樣中，一或多個脂質部分包含C22烴鏈。在一些實施態樣中，C22烴鏈包含至少一個雙鍵(例如C22:1、C22:2、C22:3、C22:4、C22:5或C22:6)。在一些實施態樣中，一或多個脂質部分包含C24烴鏈。在一些實施態樣中，C24烴鏈包含至少一個雙鍵(例如C24:1、C24:2、C24:3、C24:4、C24:5或C24:6)。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸包含四鹼基環圈，其中四鹼基環圈的至少一個核苷酸係與C8脂質結合。在一些實施態樣中，四鹼基環圈的第二核苷酸係與C8脂質結合。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸包含四鹼基環圈，其中四鹼基環圈的至少一個核苷酸係與C10脂質結合。在一些實施態樣中，四鹼基環圈的第二核苷酸係與C10脂質結合。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸包含四鹼基環圈，其中四鹼基環圈的至少一個核苷酸係與C12脂質結合。在一些實施態樣中，四鹼基環圈的第二核苷酸係與C12脂質結合。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸包含四鹼基環圈，其中四鹼基環圈的至少一個核苷酸係與C14脂質結合。在一些實施態樣中，四鹼基環圈的第二核苷酸係與C14脂質結合。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸包含四鹼基環圈，其中四鹼基環圈的至少一個核苷酸係與C16脂質結合。在一些實施態樣中，四鹼基環圈的第二核苷酸係與C16脂質結合。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸包含四鹼基環圈，其中四鹼基環圈的至少一個核苷酸係與C18脂質(例如C18:0、C18:1或C18:2)結合。在一些實施態樣中，四鹼基環圈的第二核苷酸係與C18脂質(例如C18:0、C18:1或C18:2)結合。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸包含四鹼基環圈，其中四鹼基環圈的至少一個核苷酸係與C22脂質(例如C22:0、C22:1、C22:2、C22:3、C22:4、C22:5或C22:6)結合。在一些實施態樣中，四鹼基環圈的第二核苷酸係與C22脂質(例如C22:0、C22:1、C22:2、C22:3、C22:4、C22:5或C22:6)結合。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸包含四鹼基環圈，其中四鹼基環圈的至少一個核苷酸係與C24脂質(例如C24:0、C24:1、C24:2、C24:3、C24:4、C24:5或C24:6)結合。在一些實施態樣中，四鹼基環圈的第二核苷酸係與C24脂質(例如C24:0、C24:1、C24:2、C24:3、C24:4、C24:5或C24:6)結合。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含具有至少一個經修飾之核苷的核苷酸序列。在一些實施態樣中，寡核苷酸-配體結合體包含反義股及有義股，其中各股包含至少一個經修飾之核苷。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體係以下式表示，具有如表1中所示之修飾： 有義股： [mXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][ademX-TL][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX] 雜交至 反義股：[Me膦酸酯-4O-mXs][fXs][fXs][fX][fX][mX][fX] [mX][mX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mXs][mX] 或 有義股： [mXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][ademX-C#][mX][mX][mX][mX] [mX][mX][mX][mX] 雜交至 反義股：[Me膦酸酯-4O-mXs][fXs][fXs][fX][fX][mX][fX] [mX][mX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mXs][mX]
Figure 02_image205
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸係與如下所示之C8脂質結合：
Figure 02_image207
。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸係與如下所示之C10脂質結合：
Figure 02_image209
。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸係與如下所示之C12脂質結合：
Figure 02_image211
。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸係與如下所示之C14脂質結合：
Figure 02_image213
。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸係與如下所示之C16脂質結合：
Figure 02_image215
。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸係與如下所示之C18:0脂質結合：
Figure 02_image217
。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸係與如下所示之C18:1脂質結合：
Figure 02_image219
。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸係與如下所示之C18:2脂質結合：
Figure 02_image221
。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸係與如下所示之C22:0脂質結合：
Figure 02_image223
。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體之寡核苷酸係與如下所示之C22:6脂質結合：
Figure 02_image225
。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如體覺皮質區(SS皮質)、海馬區(HP)、紋狀體、額葉皮質、小腦、下視丘(HY)、頸脊髓(CSC)、胸脊髓(TSC)及/或腰脊髓(LSC)中)的標的mRNA。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如SS皮質、HP、HY、CSC、TSC及/或LSC中)的標的mRNA，而不降低在CNS以外的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如SS皮質、HP、HY、CSC、TSC及/或LSC中)的標的mRNA，而不降低在CNS以外的標的mRNA表現，不降低在肝中的標的mRNA表現。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含四鹼基環圈，其中四鹼基環圈的至少一個核苷酸係與C8脂質結合，其中RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如SS皮質、HP、HY、CSC、TSC及/或LSC中)的標的mRNA，而不降低在CNS以外的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如SS皮質、HP、HY、CSC、TSC及/或LSC中)的標的mRNA，而不降低在CNS以外的標的mRNA表現，不降低在肝中的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，C8脂質係與四鹼基環圈的第二核苷酸結合。在一些實施態樣中，四鹼基環圈由5ʹ-GAAA-3ʹ組成。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含四鹼基環圈，其中四鹼基環圈的至少一個核苷酸係與C10脂質結合，其中RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如SS皮質、HP、HY、CSC、TSC及/或LSC中)的標的mRNA，而不降低在CNS以外的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如SS皮質、HP、HY、CSC、TSC及/或LSC中)的標的mRNA，而不降低在CNS以外的標的mRNA表現，不降低在肝中的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，C10脂質係與四鹼基環圈的第二核苷酸結合。在一些實施態樣中，四鹼基環圈由5ʹ-GAAA-3ʹ組成。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含四鹼基環圈，其中四鹼基環圈的至少一個核苷酸係與C12脂質結合，其中RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如SS皮質、HP、HY、CSC、TSC及/或LSC中)的標的mRNA，而不降低在CNS以外的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如SS皮質、HP、HY、CSC、TSC及/或LSC中)的標的mRNA，而不降低在CNS以外的標的mRNA表現，不降低在肝中的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，C12脂質係與四鹼基環圈的第二核苷酸結合。在一些實施態樣中，四鹼基環圈由5ʹ-GAAA-3ʹ組成。
在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體包含四鹼基環圈，其中四鹼基環圈的至少一個核苷酸係與C14脂質結合，其中RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如SS皮質、HP、HY、CSC、TSC及/或LSC中)的標的mRNA，而不降低在CNS以外的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體降低CNS中(例如SS皮質、HP、HY、CSC、TSC及/或LSC中)的標的mRNA，而不降低在CNS以外的標的mRNA表現，不降低在肝中的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，C14脂質係與四鹼基環圈的第二核苷酸結合。在一些實施態樣中，四鹼基環圈由5ʹ-GAAA-3ʹ組成。 提供核酸及其類似物之通用方法
本文所述之包含脂質結合體之核酸及其類似物可使用本技術中已知的各種合成方法製得，包括標準的亞磷醯胺酸酯方法。任何亞磷醯胺酸酯合成方法可用於合成本揭示提供之核酸。在特定的實施態樣中，將亞磷醯胺酸酯用於固相合成方法以得出反應性中間物亞磷酸酯化合物，隨後將其使用已知的方法氧化以生產經膦酸酯修飾之寡核苷酸，通常具有磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。本揭示之寡核苷酸合成可使用本技術已知的方法以下列之任一方向執行：自5′至3′或自3′至5′。
在特定的實施態樣中，合成所提供之核酸之方法包含(a)將核苷或其類似物經由共價鍵聯連接至撐體；(b)將核苷亞磷醯胺酸酯或其類似物與步驟(a)的核苷或其類似物上的反應性羥基偶合以形成在彼等之間的核苷酸間鍵，其中將撐體上的任何未偶合之核苷或其類似物以封端試劑封端；(c)將該核苷酸間鍵以氧化劑氧化；及(d)以後來的核苷亞磷醯胺酸酯或其類似物反覆地重複步驟(b)至(c)以形成核酸或其類似物，其中至少步驟(a)的核苷或其類似物、步驟(b)的核苷亞磷醯胺酸酯或其類似物或步驟(d)後來的核苷亞磷醯胺酸酯或其類似物中至少一者包含如本文所述之脂質結合體部分。通常重複偶合、封端/氧化步驟及視需要的去保護步驟，直到寡核苷酸達成所欲長度及/或序列，隨後將其自撐體切割。在特定的實施態樣中，製備寡核苷酸，其包含在四鹼基環圈上的1至3個包含脂質結合體單元之核酸或其類似物。
在其中描述特定的保護基、脫離基或轉變條件的以下流程A中，本技術之普通技能者應意識到其他的保護團、脫離基及轉變條件亦為適合的且予以考慮。在流程A的分類中需要附加的保護基策略所設想之特定的反應性保護基(例如-N(H)-、-OH等)亦予以考慮且由那些本技術之普通技能者意識到。此等基團及轉變詳細地說明於 March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, M. B. Smith和J. March，第5版，John Wiley & Sons, 2001, Comprehensive Organic Transformations, (R. C. Larock，第2版，John Wiley & Sons, 1999)及Protecting Groups in Organic Synthesis, (T. W. Greene and P. G. M. Wuts，第3版，John Wiley & Sons, 1999)中，將各者的全文特此併入本文以供參考。
在特定的實施態樣中，本揭示之核酸及其類似物通常根據下文提出之流程A、流程A1和流程B製備：
Figure 02_image227
Figure 02_image229
如以上流程A和流程A1所描述，將式I-1之核酸或其類似物與一或多個配體/親脂性化合物結合以形成包含一或多個配體/脂質結合體之式I或Ia化合物。結合通常係通過本技術中已知的技術在式I-1或I-1a之核酸或其類似物與一或多個金剛烷基及/或親脂性化合物(例如脂肪酸)之間連續或並行的酯化或醯胺化反應來執行。接著可將式I或Ia之核酸或其類似物去保護以形成式I-2或I-2a化合物，且以適合的羥基保護基(例如DMTr)保護以形成式I-3或I-3a化合物。在一個態樣中，可將式I-3或I-3a之核酸-配體結合體共價連接至撐體(例如通過琥珀酸鍵聯基團)以形成包含一或多個金剛烷基及/或脂質結合體的式I-4或I-4a之撐體核酸-配體結合體或其類似物。在另一態樣中，可將式I-3或I-3a之核酸-配體結合體與P(III)形成試劑(例如 N, N-二異丙基氯亞磷醯胺酸2-氰乙酯)反應以形成包含P(III)基團的式I-5或I-5a之核酸或其類似物。接著式I-5或I-5a之核酸-配體結合體或其類似物可經受使用已知且常用的方法所執行之寡聚合形成條件以製備本技術之寡核苷酸。例如，將式I-5或I-5a化合物與攜有5’-羥基的固體支撐型核酸-配體結合體或其類似物偶合。其他步驟可包含一或多個去保護、偶合、亞磷酸酯氧化及/或自撐體切割以提供包括一或多個脂質結合體核苷酸單元的各種核苷酸長度之寡核苷酸，以式II-1或II-Ia化合物表示。B、E、L、配體、LC、n、PG 1、PG 2、PG 4、R 1、R 2、R 3、X、X 1、X 2、X 3和Z之各者係如上文所定義及如本文所述。
Figure 02_image231
如以上流程B所描述，可將式I-1之核酸或其類似物去保護以形成式I-6化合物，以適合的羥基保護基(例如DMTr)保護以形成式I-7化合物且與P(III)形成試劑(例如 N, N-二異丙基氯亞磷醯胺酸2-氰乙酯)反應以形成包含P(III)基團的式I-8之核酸或其類似物。接下來，式I-8之核酸或其類似物經受使用已知且常用的方法所執行之寡聚合形成條件以製備本技術之寡核苷酸。例如，將式I-8化合物與攜有5’-羥基的固體支撐型核酸或其類似物偶合。其他步驟可包含一或多個去保護、偶合、亞磷酸酯氧化及/或自撐體切割以提供各種核苷酸長度之寡核苷酸，以式II-2化合物表示。接著可將式II-2之寡核苷酸與一或多個配體(例如金剛烷基或親脂性化合物(例如脂肪酸))結合以形成包含一或多個配體結合體之式II-1化合物。結合通常係通過本技術中已知的技術在介於式II-2之核酸或其類似物與一或多個金剛烷基及/或脂肪酸之間連續或並行的酯化或醯胺化反應來執行。B、E、L、配體、LC、n、PG 1、PG 2、PG 4、R 1、R 2、R 3、X、X 1、X 2、X 3和Z之各者係如上文所定義及如本文所述。
在特定的實施態樣中，本揭示之核酸及其類似物係根據下文提出之流程C和流程D製備：
Figure 02_image233
如以上流程C所描述，將式C1之核酸或其類似物保護以形成式C2化合物。接著將C2之核酸或其類似物烷基化(例如使用DMSO及乙酸經由普梅雷爾(Pummerer)重排)以形成式C3之單硫縮醛化合物。接下來，將式C3之核酸或其類似物與C4在適當的條件下(例如溫和的氧化條件)偶合以形成式C5之核酸或其類似物。接著可將式C5之核酸或其類似物去保護以形成式C6化合物，且與式C7之配體(金剛烷基或親脂性化合物(例如脂肪酸))在適當的醯胺形成條件下(例如HATU、DIPEA)偶合以形成本揭示之包含脂質結合體的式I-b之核酸-配體結合體或其類似物。接著可將式I-b之核酸-配體結合體或其類似物去保護以形成式C8化合物且以適合的羥基保護基(例如DMTr)保護以形成式C9化合物。在一個態樣中，可將式C9之核酸或其類似物共價連接至撐體(例如通過琥珀酸鍵聯基團)以形成本揭示之包含配體結合體(金剛烷基或脂質部分)的式C10之撐體核酸-配體結合體或其類似物。在另一態樣中，將式C9之核酸-配體結合體或其類似物與P(III)形成試劑(例如 N, N-二異丙基氯亞磷醯胺酸2-氰乙酯)反應以形成包含P(III)基團的式C11之核酸-配體結合體或其類似物。接著式C11之核酸-配體結合體或其類似物可經受使用已知且常用的方法所執行之寡聚合形成條件以製備本技術之寡核苷酸。例如，將式C11化合物與攜有5’-羥基的固體支撐型核酸-配體結合體或其類似物偶合。其他步驟可包含一或多個去保護、偶合、亞磷酸酯氧化及/或自撐體切割以提供包括一或多個金剛烷基及/或脂質結合體核苷酸單元的各種核苷酸長度之寡核苷酸，以式II-b-3化合物表示。B、E、L 2、PG 1、PG 2、PG 3、PG 4、R 1、R 2、R 3、R 4、R 5、X 1、X 2、X 3、V、W和Z之各者係如上文所定義及如本文所述。
Figure 02_image235
B、E、L 2、PG 1、PG 2、PG 3、PG 4、R 1、R 2、R 3、R 4、R 5、X 1、X 2、X 3、V、W和Z之各者係如上文所定義及如本文所述。如以上流程D所描述，可將式C5之核酸或其類似物選擇性地去保護以形成式D1化合物，以適合的羥基保護基(例如DMTr)保護以形成式D2化合物，且與P(III)形成試劑(例如 N, N-二異丙基氯亞磷醯胺酸2-氰乙酯)反應以形成式D3之核酸或其類似物。接下來，將式D3之核酸或其類似物經受使用已知且常用的方法所執行之寡聚合形成條件以製備本技術之寡核苷酸。例如，將式D3化合物與攜有5’-羥基的固體支撐型核酸或其類似物偶合。其他步驟可包含一或多個去保護、偶合、亞磷酸酯氧化及/或自撐體切割以提供各種核苷酸長度之寡核苷酸，以式D4化合物表示。接著可將式D4之寡核苷酸去保護以形成式D5化合物，且與形成式C7化合物(例如金剛烷基或脂肪酸)之疏水性配體(例如金剛烷基或親脂性部分)在適當的醯胺形成條件下(例如HATU、DIPEA)偶合以形成本揭示之包含配體(例如金剛烷基或脂肪酸)結合體的式II-b-3之寡核苷酸。
熟習本技術領域者應意識到存在於本揭示之核酸或其類似物中的各種官能基(諸如脂族基團、醇、羧酸、酯、醯胺、醛、鹵素和腈)可以本技術中熟知的技術互相轉化，包括但不限於還原、氧化、酯化、水解、部分氧化、部分還原、鹵化、脫水、部分水合和水合。參見例如“March’s Advanced Organic Chemistry” (第5版，編輯：Smith, M.B.和March, J.，John Wiley & Sons, New York: 2001)，將各者的全文特此併入本文以供參考。此等互相轉化可能需要前述技術中之一或多者，且用於合成本揭示提供之核酸之特定方法係於下文的示例中說明。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於製備包含一或多個脂質結合體之寡核苷酸或其醫藥上可接受的鹽之方法，該脂質結合體單元係以式II-a-1表示：
Figure 02_image237
該方法包含步驟： (a)提供式I-5a之核酸或其類似物：
Figure 02_image239
或其鹽，及 (b)將該式I-5a化合物寡聚合以形成式II-1a化合物，其中B、E、L、LC、n、PG 4、R 1、R 2、R 3、X、X 1、X 2、X 3、E和Z之各者係如上文所定義及如本文所述。
在以上步驟(b)中，寡聚合係指使用已知且常用的方法執行寡聚合形成條件以製備本技術中之寡核苷酸。例如，將式I-5a化合物與與攜有5’-羥基的固體支撐型核酸或其類似物偶合。其他步驟可包含一或多個去保護、偶合、亞磷酸酯氧化及自撐體切割以提供本揭示之包含脂質結合體的各種核苷酸長度之寡核苷酸，以式II-1a化合物表示。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於製備包含一或多個脂質結合體之寡核苷酸或其鹽之方法，進一步包含製備式I-5a之核酸或其類似物：
Figure 02_image241
該方法包含步驟： (a)提供式Ia之核酸或其類似物：
Figure 02_image243
或其鹽， (b)將該式Ia之核酸或其類似物去保護以形成式I-2a化合物：
Figure 02_image245
或其鹽， (c)將該式I-2之核酸或其類似物保護以形成式I-3a化合物：
Figure 02_image247
或其鹽，及 (d)將該式I-3a之核酸或其類似物以P(III)形成試劑處理以形成式I-5a之核酸或其類似物，其中B、E、L、LC、n、PG 4、R 1、R 2、R 3、X、X 1、X 2、X 3、E和Z之各者係如上文所定義及如本文所述。
在以上步驟(b)中，式Ia化合物之PG 1和PG 2包含矽醚或環矽烯衍生物，其可在酸性條件下或以氟陰離子移除。提供氟陰離子以移除基於矽之保護基的試劑之實例包括氫氟酸、氟化氫吡啶、三乙胺三氟化氫、氟化四- N-丁基銨及類似者。
在以上步驟(c)中，將式I-2a化合物以適合的羥基保護基保護。在特定的實施態樣中，用於保護式I-2a化合物之5’-羥基的保護基PG 4包括酸不穩定性保護基，諸如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-二苯并哌喃-9-基、9-(對甲苯基)-二苯并哌喃-9-基、9-苯基呫噸-9-基(pixyl)、2,7-二甲基-9-苯基呫噸-9-基及類似者。在特定的實施態樣中，酸不穩定性保護基適合於酸敏感性核酸或其類似物之溶液相及固相兩者合成期間使用例如二氯乙酸或三氯乙酸去保護。
在以上步驟(d)中，將式I-3a化合物以P(III)形成試劑處理以供給式I-5a化合物。在本揭示之上下文中，P(III)形成試劑係為了磷(III)化合物而反應之磷試劑。在一些實施態樣中，P(III)形成試劑為 N, N-二異丙基氯亞磷醯胺酸2-氰乙酯或二氯磷酸2-氰乙酯(2-cyanoethyl phosphorodichloridate)。在特定的實施態樣中，P(III)形成試劑為 N, N-二異丙基氯亞磷醯胺酸2-氰乙酯。本技術之普通技能者應認知以式I-3a化合物之X 1置換P(III)形成試劑中的脫離基係在或不在適合的鹼存在下達成。此等適合的鹼為本技術中所熟知且包括有機鹼和無機鹼。在特定的實施態樣中，鹼為三級胺，諸如三乙胺或二異丙基乙胺。在其他的實施態樣中，以上步驟(d)係使用 N, N-二甲基胺基膦醯二氯化物(phosphoramic dichloride)作為P(V)形成試劑來執行。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於製備包含一或多個脂質結合體之寡核苷酸或其鹽之方法，進一步包含製備式Ia之核酸-脂質結合體或其類似物：
Figure 02_image249
該方法包含步驟： (a)提供式I-1之核酸或其類似物：
Figure 02_image251
或其鹽，及 (b)將一或多個親脂性化合物與式I-1之核酸或其類似物結合以形成包含一或多個脂質結合體的式Ia之核酸或其類似物，其中：B、E、L、LC、n、PG 1、PG 2、R1、R 2、X、X 1和Z之各者係如上文所定義及如本文所述。
在以上步驟(b)，式I-1a之酸或其類似物係與一或多個親脂性化合物結合以形成本揭示之包含一或多個脂質結合體的式Ia化合物。結合通常係通過本技術中已知的技術在介於式I-1a之核酸或其類似物與一或多個脂肪酸之間連續或並行的酯化或醯胺化反應來執行。在特定的實施態樣中，結合係在適合的醯胺形成條件下執行以供給包含一或多個脂質結合體之式I化合物。適合的醯胺形成條件可包括使用本技術中已知的醯胺偶合試劑，諸如但不限於HATU、PyBOP、DCC、DIC、EDC、HBTU、HCTU、PyAOP、PyBrOP、BOP、BOP-Cl、DEPBT、T3P、TATU、TBTU、TNTU、TOTU、TPTU、TSTU或TDBTU。另一選擇地，親脂性化合物之結合可以本文表A中所述之交叉偶合技術中任一者完成。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於製備包含一或多個脂質結合體之寡核苷酸或其醫藥上可接受的鹽之方法，該脂質結合體單元係以式II-1表示：
Figure 02_image253
該方法包含步驟： (a)提供式II-2之寡核苷酸：
Figure 02_image255
或其鹽，及 (b)將一或多個親脂性化合物與式II-2之寡核苷酸結合以形成包含一或多個脂質結合體的式II-1之寡核苷酸。在以上步驟(b)中，將式II-2之寡核苷酸與一或多個親脂性化合物結合以形成本揭示之包含一或多個脂質結合體的式II-1之寡核苷酸。
結合通常係通過本技術中已知的技術在介於式II-2之寡核苷酸與一或多個脂肪酸之間連續或並行的酯化或醯胺化反應來執行。在特定的實施態樣中，結合係在適合的醯胺形成條件下執行以供給包含一或多個脂質結合體的式II-1之寡核苷酸。適合的醯胺形成條件可包括使用本技術中已知的醯胺偶合試劑，諸如但不限於HATU、PyBOP、DCC、DIC、EDC、HBTU、HCTU、PyAOP、PyBrOP、BOP、BOP-Cl、DEPBT、T3P、TATU、TBTU、TNTU、TOTU、TPTU、TSTU或TDBTU。另一選擇地，親脂性化合物之結合可以本文表A中所述之交叉偶合技術中任一者完成。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於製備以式II-2表示之包含單元的寡核苷酸或其醫藥上可接受的鹽之方法，
Figure 02_image257
該方法包含步驟： (a)提供式I-8之核酸或其類似物：
Figure 02_image259
或其鹽，及 (b)將該式I-8化合物寡聚合以形成式II-2化合物。
在以上步驟(b)中，寡聚合係指使用已知且常用的方法執行寡聚合形成條件以製備本技術中之寡核苷酸。例如，將式I-8化合物與攜有5’-羥基的固體支撐型核酸或其類似物偶合。其他步驟可包含一或多個去保護、偶合、亞磷酸酯氧化及自撐體切割以提供各種核苷酸長度之寡核苷酸，以式II-2化合物表示。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於製備包含一或多個脂質結合體之核酸或其類似物或其鹽之方法，進一步包含製備式I-8之核酸或其類似物：
Figure 02_image261
該方法包含步驟： (a)提供式I-1之核酸或其類似物：
Figure 02_image263
或其鹽， (b)將該式I-1之核酸或其類似物去保護以形成式I-6化合物：
Figure 02_image265
或其鹽， (c)將該式I-6之核酸或其類似物保護以形成式I-7化合物：
Figure 02_image267
或其鹽，及 (d)將該式I-7之核酸或其類似物以P(III)形成試劑處理以形成式I-8之核酸或其類似物。在以上步驟(b)中，式I-1化合物之PG 1和PG 2包含矽醚或環矽烯衍生物，其可在酸性條件下或以氟陰離子移除。提供氟陰離子以移除基於矽之保護基的試劑之實例包括氫氟酸、氟化氫吡啶、三乙胺三氟化氫、氟化四- N-丁基銨及類似者。
在以上步驟(c)中，將式I-6化合物以適合的羥基保護基保護。在特定的實施態樣中，用於保護式I-6化合物之5’-羥基的保護基PG 4包括酸不穩定性保護基，諸如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-二苯并哌喃-9-基、9-(對甲苯基)-二苯并哌喃-9-基、9-苯基呫噸-9-基、2,7-二甲基-9-苯基呫噸-9-基及類似者。在特定的實施態樣中，酸不穩定性保護基適合於酸敏感性核酸或其類似物之溶液相及固相兩者合成期間使用例如二氯乙酸或三氯乙酸去保護。
在以上步驟(d)中，將式I-7化合物以P(III)形成試劑處理以供給式I-8化合物。在本揭示之上下文中，P(III)形成試劑係為了磷(III)化合物而反應之磷試劑。在一些實施態樣中，P(III)形成試劑為 N, N-二異丙基氯亞磷醯胺酸2-氰乙酯或二氯磷酸2-氰乙酯。在特定的實施態樣中，P(III)形成試劑為 N, N-二異丙基氯亞磷醯胺酸2-氰乙酯。本技術之普通技能者應認知以式I-7化合物之X 1置換P(III)形成試劑中的脫離基係在或不在適合的鹼存在下達成。此等適合的鹼為本技術中所熟知且包括有機鹼和無機鹼。在特定的實施態樣中，鹼為三級胺，諸如三乙胺或二異丙基乙胺。在其他的實施態樣中，以上步驟(d)係使用 N, N-二甲基胺基膦醯二氯化物作為P(V)形成試劑來執行。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於製備包含一或多個金剛烷基及/或脂質部分之寡核苷酸-配體結合體或其醫藥上可接受的鹽之方法，該結合體單元係以式II-b-3表示：
Figure 02_image269
該方法包含步驟： (a)提供式C11之核酸-配體結合體或其類似物：
Figure 02_image271
或其鹽，及 (b)將該式C11化合物寡聚合以形成式II-b-3化合物。在以上步驟(b)中，寡聚合係指使用已知且常用的方法執行寡聚合形成條件以製備本技術中之寡核苷酸。例如，將式C11化合物與攜有5’-羥基的固體支撐型核酸或其類似物偶合。其他步驟可包含一或多個去保護、偶合、亞磷酸酯氧化及自撐體切割以提供具有一或多個核酸-配體結合體單元的各種核苷酸長度之寡核苷酸-配體結合體，其中各單元係以本揭示之包含金剛烷基或脂質部分之式II-b-3化合物表示。
在一些實施態樣中，用於製備包含一或多個脂質結合體的式II-b-3之寡核苷酸之方法另外包含製備式C11之核酸-配體結合體或其類似物或其鹽：
Figure 02_image273
該方法包含步驟： (a)提供式I-b之核酸-配體結合體或其類似物：
Figure 02_image275
或其鹽， (b)將該式I-b之核酸-配體結合體或其類似物去保護以形成式C8化合物：
Figure 02_image277
或其鹽， (c)將該式C8之核酸-配體結合體或其類似物保護以形成式C9化合物：
Figure 02_image279
或其鹽，及 (d)將該式C9之核酸-配體結合體或其類似物以P(III)形成試劑處理以形成式C11之核酸或其類似物。在以上步驟(b)中，式I-b化合物之PG 1和PG 2包含矽醚或環矽烯衍生物，其可在酸性條件下或以氟陰離子移除。提供氟陰離子以移除基於矽之保護基的試劑之實例包括氫氟酸、氟化氫吡啶、三乙胺三氟化氫、氟化四- N-丁基銨及類似者。
在以上步驟(c)中，將式C8化合物以適合的羥基保護基保護。在特定的實施態樣中，用於保護式C8化合物之5’-羥基的保護基PG 4包括酸不穩定性保護基，諸如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-二苯并哌喃-9-基、9-(對甲苯基)-二苯并哌喃-9-基、9-苯基呫噸-9-基、2,7-二甲基-9-苯基呫噸-9-基及類似者。在特定的實施態樣中，酸不穩定性保護基適合於酸敏感性核酸或其類似物之溶液相及固相兩者合成期間使用例如二氯乙酸或三氯乙酸去保護。
在以上步驟(d)中，將式C9化合物以P(III)形成試劑處理以供給式C11化合物。在本揭示之上下文中，P(III)形成試劑係為了磷(III)化合物而反應之磷試劑。在一些實施態樣中，P(III)形成試劑為 N, N-二異丙基氯亞磷醯胺酸2-氰乙酯或二氯磷酸2-氰乙酯。在特定的實施態樣中，P(III)形成試劑為 N, N-二異丙基氯亞磷醯胺酸2-氰乙酯。本技術之普通技能者應認知以式C9化合物之X 1置換P(III)形成試劑中的脫離基係在或不在適合的鹼存在下達成。此等適合的鹼為本技術中所熟知且包括有機鹼和無機鹼。在特定的實施態樣中，鹼為三級胺，諸如三乙胺或二異丙基乙胺。在其他的實施態樣中，以上步驟(d)係使用 N, N-二甲基胺基膦醯二氯化物作為P(V)形成試劑來執行。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於製備包含一或多個各包含一或多個金剛烷基或脂質部分之核酸-配體結合體單元的式II-b-3之寡核苷酸-配體結合體或其鹽之方法，進一步包含製備式I-b之核酸-配體結合體或其類似物：
Figure 02_image281
該方法包含步驟： (a)提供式C6之核酸-配體結合體或其類似物：
Figure 02_image283
或其鹽，及 (b)將親脂性化合物與式C6之核酸或其類似物結合以形成包含一或多個金剛烷基及/或脂質結合體的式I-b之核酸-配體結合體或其類似物。在以上步驟(b)中，結合係在適合的醯胺形成條件下執行以供給包含金剛烷基及/或脂質結合體之式I-b化合物。適合的醯胺形成條件可包括使用本技術中已知的醯胺偶合試劑，諸如但不限於HATU、PyBOP、DCC、DIC、EDC、HBTU、HCTU、PyAOP、PyBrOP、BOP、BOP-Cl、DEPBT、T3P、TATU、TBTU、TNTU、TOTU、TPTU、TSTU或TDBTU。在特定的實施態樣中，醯胺形成條件包含HATU和DIPEA或TEA。
在特定的實施態樣中，式C6之核酸-配體結合體或其類似物係以鹽形式(例如反丁烯二酸鹽)提供且在執行結合步驟前先轉化成游離鹼(例如使用碳酸氫鈉)。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於製備包含一或多個核酸-配體結合體單元的式II-b-3之寡核苷酸-配體結合體或其鹽之方法，進一步包含製備式C6之核酸-配體結合體或其類似物：
Figure 02_image285
該方法包含步驟： (a)提供式C1之核酸或其類似物：
Figure 02_image287
或其鹽，及 (b)保護該式C1之核酸或其類似物以形成式C2化合物：
Figure 02_image289
或其鹽， (c)將該式C2之核酸或其類似物烷基化以形成式C3化合物：
Figure 02_image291
或其鹽， (d)將該式C3之核酸或其類似物以式C4化合物：
Figure 02_image293
或其鹽取代以形成式C5化合物：
Figure 02_image295
或其鹽， (e)將該式C5之核酸或其類似物去保護以形成式C6之核酸-配體結合體或其類似物。在以上步驟(b)中，將式C2之PG 1和PG 2基團與彼等中間原子一起形成環狀二醇保護基，諸如環狀縮醛或縮酮。此等基團包括亞甲基、亞乙基、苯亞甲基、亞異丙基、亞環己基和亞環戊基、矽烯衍生物(諸如二-三級丁基矽烯和1,1,3,3-四異丙基二亞矽氧烷基(disiloxanylidene))、環狀碳酸、環狀硼酸和基於環狀腺苷單磷酸(亦即cAMP)之環狀單磷酸衍生物。在特定的實施態樣中，環狀二醇保護基為自式C1之二醇與1,3-二氯-1,1,3,3-四異丙基二矽氧烷在鹼性條件下反應所製備之1,1,3,3-四異丙基二亞矽氧烷基。
在以上步驟(c)中，將式C2之核酸或其類似物在酸性條件下以DMSO與乙酸酐之混合物烷基化。在特定的實施態樣中，當-V-H為羥基時，DMSO與乙酸酐之混合物在乙酸的存在下經由普梅雷爾重排當場形成乙酸(甲硫基)甲酯，接著將其與式C2之核酸或其類似物的羥基反應以提供式C3之經單硫縮醛官能化之片段核酸或其類似物。
在以上步驟(d)中，使用式C4之核酸或其類似物取代式C3之核酸或其類似物的甲硫基以供給式C4之核酸或其類似物。在特定的實施態樣中，取代係在溫和的氧化及/或酸性條件下發生。在一些實施態樣中，V為氧。在一些實施態樣中，溫和的氧化試劑包括元素碘與過氧化氫之混合物、尿素過氧化氫複合物、硝酸銀/硫酸銀、溴酸鈉、過氧二硫酸銨、過氧二硫酸四丁基銨、Oxone®、氯胺T、Selectfluor®、Selectfluor® II、次氯酸鈉或碘酸鉀/過碘酸鈉。在特定的實施態樣中，溫和的氧化劑包括N-碘琥珀醯亞胺、N-溴琥珀醯亞胺、N-氯琥珀醯亞胺、1,3-二碘-5,5-二甲基尿囊素、三溴化吡啶鎓、一氯化碘或其複合物等。通常在溫和的氧化條件下使用之酸包括硫酸、對甲苯磺酸、三氟甲磺酸、甲磺酸和三氟乙酸。在特定的實施態樣中，溫和的氧化試劑包括N-碘琥珀醯亞胺與三氟甲磺酸之混合物。
在以上步驟(e)中，移除式C5之核酸-配體結合體或其類似物的PG 3及視需要的R 4(當R 4為適合的胺保護基時)以供給式C6之核酸-配體結合體或其類似物或其鹽。在一些實施態樣中，PG 3及/或R 4包含可在酸性或鹼性條件下移除的胺甲酸酯衍生物。在特定的實施態樣中，式C5之核酸-配體結合體或其類似物的保護基(例如PG 3和R 4兩者或獨立的PG 3或R 4中任一者)係以酸水解移除。應意識到在式C5之核酸-配體結合體或其類似物的保護基經酸水解後，形成其式C6之鹽。例如，當式C5之核酸-配體結合體或其類似物的酸不穩定性保護基係以酸(諸如氫氯酸)處理而移除時，則所得胺化合物會以其鹽酸鹽形成。本技術之普通技能者應認知各種廣泛的酸有用於移除酸不隱定性胺基保護基且因此予以考慮式C6之核酸或其類似物的各種廣泛的鹽形式。
在其他的實施態樣中，式C5之核酸或其類似物的保護基(例如PG 3和R 4兩者或獨立的PG 3或R 4中任一者)係以鹼水解移除。例如，Fmoc及三氟乙醯基保護基可以鹼處理而移除。本技術之普通技能者應認知各種廣泛的鹼有用於移除鹼不隱定性胺基保護基。在一些實施態樣中，鹼為哌啶。在一些實施態樣中，鹼為1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)。在特定的實施態樣中，式C5之核酸-配體結合體或其類似物係在鹼性條件下去保護，隨後以酸處理以形成式C6之鹽。在特定的實施態樣中，酸為反丁烯二酸，式C6之鹽為反丁烯二酸鹽。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於製備包含一或多個核酸-配體結合體之寡核苷酸-配體結合體或其醫藥上可接受的鹽之方法，該核酸-配體結合體單元係以式II-b-3表示：
Figure 02_image297
該方法包含步驟： (a)提供式D5之寡核苷酸：
Figure 02_image299
或其鹽，及 (b)將一或多個金剛烷基或親脂性化合物與式D5之寡核苷酸結合以形成包含一或多個核酸-配體結合體單元的式II-b-3之寡核苷酸-配體結合體。在以上步驟(b)中。結合係在適合的醯胺形成條件下執行以供給包含金剛烷基或脂質結合體之式D5化合物。適合的醯胺形成條件可包括使用本技術中已知的醯胺偶合試劑，諸如但不限於HATU、PyBOP、DCC、DIC、EDC、HBTU、HCTU、PyAOP、PyBrOP、BOP、BOP-Cl、DEPBT、T3P、TATU、TBTU、TNTU、TOTU、TPTU、TSTU或TDBTU。在特定的實施態樣中，醯胺形成條件包含HATU和DIPEA或TEA。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於製備包含以式D5表示之單元的寡核苷酸-配體結合體或其鹽之方法：
Figure 02_image301
該方法包含步驟： (a)提供式D4之核酸-配體結合體或其類似物：
Figure 02_image303
或其鹽，及 (b)將該式D4化合物去保護以形成式D5化合物。在以上步驟(b)中，移除式D4之寡核苷酸的PG 3及視需要的R 4(當R 4為適合的胺保護基時)以供給式D5之寡核苷酸-配體結合體或其鹽。在一些實施態樣中，PG 3及/或R 4包含可在酸性或鹼性條件下移除的胺甲酸酯衍生物。在特定的實施態樣中，式D4之寡核苷酸-配體結合體的保護基(例如PG 3和R 4兩者或獨立的PG 3或R 4中任一者)係以酸水解移除。應意識到在式D4之寡核苷酸-配體結合體的保護基經酸水解後，形成其式D5之鹽。例如，當式D4之寡核苷酸的酸不穩定性保護基係以酸(諸如氫氯酸)處理而移除時，則所得胺化合物會以其鹽酸鹽形成。本技術之普通技能者應認知各種廣泛的酸有用於移除酸不隱定性胺基保護基且因此予以考慮式D5之核酸-配體結合體單元或其類似物的各種廣泛的鹽形式。
在其他的實施態樣中，式D4之寡核苷酸-配體結合體的保護基(例如PG 3和R 4兩者或獨立的PG 3或R 4中任一者)係以鹼水解移除。例如，Fmoc及三氟乙醯基保護基可以鹼處理而移除。本技術之普通技能者應認知各種廣泛的鹼有用於移除鹼不隱定性胺基保護基。在一些實施態樣中，鹼為哌啶。在一些實施態樣中，鹼為1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於製備包含一或多個核酸-配體結合體單元之寡核苷酸-配體結合體或其醫藥上可接受的鹽之方法，該結合體單元具有一或多個金剛烷基及/或脂質部分，該結合體單元係以式D4表示：
Figure 02_image305
該方法包含步驟： (a)提供式D3之核酸或其類似物：
Figure 02_image307
或其鹽，及 (b)將該式D3化合物寡聚合以形成式D4化合物。
在以上步驟(b)中，寡聚合係指使用已知且常用的方法執行寡聚合形成條件以製備本技術中之寡核苷酸。例如，將式D3之核酸或其類似物與攜有5’-羥基的固體支撐型核酸或其類似物偶合。其他步驟可包含一或多個去保護、偶合、亞磷酸酯氧化及自撐體切割以提供本揭示之包含金剛烷基或脂質結合體的各種核苷酸長度之寡核苷酸，以式D4化合物表示。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於製備包含一或多個脂質結合體的核酸或其類似物之方法，進一步包含製備式D3之核酸或其類似物：
Figure 02_image309
或其鹽，該方法包含步驟： (a)提供式C5之核酸或其類似物：
Figure 02_image311
或其鹽， (b)將該式C5之核酸或其類似物去保護以形成式D1化合物：
Figure 02_image313
或其鹽， (c)將該式D1之核酸或其類似物保護以形成式D2之核酸或其類似物：
Figure 02_image315
或其鹽，及 (d)將該式D2之核酸或其類似物以P(III)形成試劑處理形成式D3之核酸或其類似物。在以上步驟(b)中，式C5之核酸或其類似物的PG 1和PG 2包含矽醚或環矽烯衍生物，其可在酸性條件下或以氟陰離子移除。提供氟陰離子以移除基於矽之保護基的試劑之實例包括氫氟酸、氟化氫吡啶、三乙胺三氟化氫、氟化四- N-丁基銨及類似者。
在以上步驟(c)中。將式D1之核酸或其類似物以適合的羥基保護基保護。在特定的實施態樣中，用於保護式D1化合物之5’-羥基的保護基PG 4包括酸不穩定性保護基，諸如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基、4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-二苯并哌喃-9-基、9-(對甲苯基)-二苯并哌喃-9-基、9-苯基呫噸-9-基、2,7-二甲基-9-苯基呫噸-9-基及類似者。在特定的實施態樣中，酸不穩定性保護基適合於酸敏感性核酸或其類似物之溶液相及固相兩者合成期間使用例如二氯乙酸或三氯乙酸去保護。
在以上步驟(d)中，將式D2之核酸或其類似物以P(III)形成試劑處理以供給式D3化合物。在本揭示之上下文中，P(III)形成試劑係為了磷(III)化合物而反應之磷試劑。在一些實施態樣中，P(III)形成試劑為 N, N-二異丙基氯亞磷醯胺酸2-氰乙酯或二氯磷酸2-氰乙酯。在特定的實施態樣中，P(III)形成試劑為 N, N-二異丙基氯亞磷醯胺酸2-氰乙酯。本技術之普通技能者應認知以式D2化合物之X 1置換P(III)形成試劑中的脫離基係在或不在適合的鹼存在下達成。此等適合的鹼為本技術中所熟知且包括有機鹼和無機鹼。在特定的實施態樣中，鹼為三級胺，諸如三乙胺或二異丙基乙胺。在其他的實施態樣中，以上步驟(d)係使用 N, N-二甲基胺基膦醯二氯化物作為P(V)形成試劑來執行。 調配物
已開發出各種調配物以促成寡核苷酸的使用。例如，寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸結合體)可使用調配物遞送至個體或細胞環境，該調配物使降解減至最低、促成遞送及/或攝取或對調配物中的寡核苷酸提供另一有益的性質。在一些實施態樣中，本文提供包含寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸結合體)之組成物，其降低標的mRNA (例如在CNS中表現之標的mRNA)的表現。可適當地調配此等組成物，當投予個體之靶細胞的直接環境中或全身性投予時，使得足夠部分的寡核苷酸進入細胞中以降低標的基因表現。任何多樣適合的寡核苷酸調配物可用於遞送寡核苷酸以降低標的基因表現，如本文所揭示。在一些實施態樣中，寡核苷酸係於緩衝溶液中調配，諸如經磷酸鹽緩衝之鹽水溶液、脂質體、微胞結構和蛋白殼。
寡核苷酸與陽離子脂質之調配物可用於促成寡核苷酸轉染至細胞中。例如，可使用陽離子脂質(諸如lipofectin)、陽離子甘油衍生物及聚陽離子分子(例如聚離胺酸)。適合的脂質包括寡非他命(Oligofectamine)、脂染胺(Lipofectamine)(Life Technologies)、NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Colo.)或FuGene 6 (Roche)，全部可根據製造商的用法說明使用。
因此，在一些實施態樣中，調配物包含脂質奈米粒子。在一些實施態樣中，賦形劑包含脂質體、脂質、脂質複合物、微球、微粒、奈米球或奈米粒子，或可以其他方式調配以投予有其需要的個體之細胞、組織、器官或身體(參見例如Remington: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY，第22版，Pharmaceutical Press, 2013)。
在一些實施態樣中，本文之調配物包含賦形劑。在一些實施態樣中，賦形劑賦予組成物改進的穩定性、改進的吸收、改進的溶解度及/或治療性增強的活性成分。在一些實施態樣中，賦形劑為緩衝劑(例如檸檬酸鈉、磷酸鈉、tris鹼或氫氧化鈉)或媒劑(例如緩衝溶液、石蠟脂、二甲亞碸或礦物油)。在一些實施態樣中，將寡核苷酸凍乾以延長其儲存壽命且接著在使用(例如投予個體)前製成溶液。因此，在包含本文所述之寡核苷酸中任一者之組成物中的賦形劑可為凍乾保護劑(例如甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯啶酮)或陷縮溫度修飾劑(例如葡聚糖、Ficoll™或明膠)。同樣地，本文之寡核苷酸可以其游離鹼的形式提供。
在一些實施態樣中，醫藥組成物經調配而與其意欲投予途徑相容。投予途徑的實例包括非經腸(例如靜脈內、肌內、腹膜內、皮內、皮下)、經口(例如吸入)、經皮(例如局部)、經黏膜及直腸投予。在一些實施態樣中，醫藥組成物經調配而用於遞送至中樞神經系統(例如鞘內、硬膜外)。在一些實施態樣中，醫藥組成物經調配而用於遞送至眼睛(例如眼用、眼內、結膜下、玻璃體內、眼球後、眼前房內)。
適合於注射使用之醫藥組成物包括無菌水溶液(在水溶性的情況下)或分散液及用於即時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。適合於靜脈內投予之載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL™ (BASF，Parsippany, N.J.)或經磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)。載劑可為溶劑或含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇及類似者)及其適合的混合物之分散介質。在許多例子中，較佳的是包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)、氯化鈉於組成物中。無菌可注射溶液之製備可藉由將所需量的寡核苷酸依需要與上文列舉的成分中之一者或組合併入選定的溶劑中，隨後無菌過濾。
在一些實施態樣中，組成物可含有至少約0.1%之治療劑(例如本文之RNAi寡核苷酸結合體)或更多，儘管活性成分的百分比可介於總組成物重量或體積的約1%至約80%或更多之間。諸如溶解度、生物可利用性、生物半生期、投予途徑、產品儲存壽命以及其他藥理學考量的因素係由熟習製備此等醫藥調配物之技術領域者予以考慮，且就此而論，可能需要各種劑量及治療方案。 使用方法 降低標的基因表現
在一些實施態樣中，本揭示提供令有效量的本文之RNAi寡核苷酸結合體中任一者接觸或遞送至細胞或細胞群以降低標的基因表現(例如降低CNS中的標的基因表現)之方法。在一些實施態樣中，標的基因表現的降低係藉由測量細胞中降低的標的mRNA、以標的mRNA編碼之蛋白質或標的基因(mRNA或蛋白質)活性的量或水平來確定。該方法包括那些本文所述及本技術之普通技能者已知的方法。在一些實施態樣中，本揭示提供令有效量的本文之RNAi寡核苷酸結合體中任一者接觸或遞送至CNS中之一或多個區域中的細胞或細胞群以降低CNS中的標的基因表現之方法。在一些實施態樣中，CNS之區域包括但不限於大腦、前額葉皮質、額葉皮質、運動皮質、顳葉皮質、頂葉皮質、枕葉皮質、體覺皮質區、海馬區、尾狀核、紋狀體、蒼白球、丘腦、中腦、蓋膜(tegmentum)、黑質、橋腦、腦幹、小腦白質、小腦、齒狀核、延腦、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、頸髓節背根神經節、胸背根神經節、腰背根神經節、薦椎背根神經節、核狀神經節(nodose ganglia)、股神經、坐骨神經、腓腸神經、扁桃體、下視丘、殼核、胼胝體及腦神經。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於降低個體之CNS中的標的mRNA表現之方法，其包含投予一或多種本文所述之RNAi寡核苷酸結合體。在一些實施態樣中，該方法包含降低體覺皮質區(SS皮質)中的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，該方法包含降低海馬區(HP)中的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，該方法包含降低紋狀體中的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，該方法包含降低額葉皮質中的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，該方法包含降低小腦中的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，該方法包含降低下視丘(HY)中的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，該方法包含降低頸脊髓(CSC)中的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，該方法包含降低胸脊髓(TSC)中的標的mRNA表現。在一些實施態樣中，該方法包含降低腰脊髓(LSC)中的標的mRNA表現。
本文提供之方法有用於任何適當的細胞類型。在一些實施態樣中，細胞為表現標的mRNA的任何細胞。在一些實施態樣中，細胞為自個體獲得的初代細胞。在一些實施態樣中，初代細胞經歷有限的傳代次數，使得細胞實質上維持天然的表型性質。在一些實施態樣中，經寡核苷酸遞送之細胞係於活體外或試管內(亦即可遞送至培養中的細胞或細胞所在之生物體)。
在一些實施態樣中，本文所揭示之RNAi寡核苷酸結合體係使用本技術中已知的核酸遞送方法遞送至細胞或細胞群，該方法包括但不限於注射含有RNAi寡核苷酸結合體之溶液或醫藥組成物、藉由以RNAi寡核苷酸結合體覆蓋之粒子撞擊、細胞或細胞群暴露於含有RNAi寡核苷酸結合體之溶液中或在RNAi寡核苷酸結合體存在下的細胞膜電穿孔。可使用本技術中已知用於遞送寡核苷酸至細胞之其他方法，諸如經脂質調介之載體運輸、經化學品調介之運輸和陽離子脂質體轉染(諸如磷酸鈣)及其他方法。
在一些實施態樣中，標的基因表現的降低可藉由評估與標的基因表現相關聯的細胞或細胞群之一或多種分子、性質或特徵的檢定或技術或藉由評估直接表明細胞或細胞群中的標的基因表現之分子(例如標的mRNA或蛋白質)的檢定或技術來測定。在一些實施態樣中，本文提供之RNAi寡核苷酸結合體降低標的基因表現的程度係藉由比較與RNAi寡核苷酸結合體接觸之細胞或細胞群與對照細胞或細胞群(例如不與RNAi寡核苷酸結合體接觸或與對照的RNAi寡核苷酸結合體接觸之細胞或細胞群)中的標的基因表現來評估。在一些實施態樣中，預測定在對照細胞或細胞群中的標的基因表現之對照量或水平，使得不需在執行檢定或技術的每一情況下測量對照量或水平。預測定之水平或值可採用各種形式。在一些實施態樣中，預測定之水平或值可為單一截止值，諸如中位數或平均值。
在一些實施態樣中，令本文所述之RNAi寡核苷酸結合體接觸或遞送至細胞或細胞群導致標的基因表現降低。在一些實施態樣中，標的基因表現的降低係相對於未與RNAi寡核苷酸結合體接觸或與對照的RNAi寡核苷酸結合體接觸之細胞或細胞群中的標的基因表現之對照量或水平。在一些實施態樣中，相對於標的基因表現之對照量或水平，標的基因表現的降低為約1%或更低、約5%或更低、約10%或更低、約15%或更低、約20%或更低、約25%或更低、約30%或更低、約35%或更低、約40%或更低、約45%或更低、約50%或更低、約55%或更低、約60%或更低、約70%或更低、約80%或更低、或約90%或更低。在一些實施態樣中，標的基因表現之對照量或水平為未曾與本文之RNAi寡核苷酸結合體接觸之細胞或細胞群中的標的mRNA及/或蛋白質之量或水平。在一些實施態樣中，根據本文之方法遞送RNAi寡核苷酸結合體至細胞或細胞群之效應係在任何有限的時間段或時間量後(例如分鐘、小時、天、週、月)評定。例如，在一些實施態樣中，標的基因表現係在RNAi寡核苷酸結合體接觸或遞送至細胞或細胞群後至少約4小時、約8小時、約12小時、約18小時、約24小時；或至少約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約21天、約28天、約35天、約42天、約49天、約56天、約63天、約70天、約77天、或約84天或更久於細胞或細胞群中測定。在一些實施態樣中，標的基因表現係在RNAi寡核苷酸結合體接觸或遞送至細胞或細胞群後至少約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、或約6個月或更久於細胞或細胞群中測定。 基因表現之組織特異性調節
在一些實施態樣中，本揭示提供令本文所述之RNAi寡核苷酸結合體接觸或遞送至細胞或細胞群之方法，其中細胞或細胞群係存在於個體的一或多個標的組織中。在一些實施態樣中，該方法包含對個體投予本文所述之RNAi寡核苷酸結合體，其中結合體係分布至個體的一或多個標的組織中，且其中結合體係接觸或遞送至一或多個標的組織內的細胞或細胞群。
如本文所使用之「標的組織」係指個體的組織，其中降低在組織內的細胞或細胞群之標的基因表現提供一或多種所欲生理結果。在一些實施態樣中，標的基因在一或多個標的組織內的細胞或細胞群中具有異常表現，其中異常表現促成個體之疾病或失調的病理狀態。在一些實施態樣中，降低在標的組織內的細胞或細胞群之標的基因表現達成治療、減輕、預防或緩解個體之疾病或失調的功能。
儘管RNAi寡核苷酸結合體在標的組織內的分布及/或功能為降低駐留在標的組織內的細胞或細胞群內之標的基因表現所希望的，但是結合體的分布及/或功能對非標的組織具有引起有害效應的可能性。例如，結合體分布至非標的組織可能限制其分布至標的組織的可用性，其進而限制結合體用於降低駐留在標的組織內的細胞或細胞群內之標的基因表現的效力及/或活性。作為另一實例，雖然標的組織可能具有異常的標的基因表現且能自降低的標的基因表現獲益而恢復正常的生理狀態，但是非標的組織可能為了正常的生理功能而需要標的基因表現。在此等環境下，結合體在非標的組織內的分布及/或功能係以導致非所欲或有害的病理狀態之方式損害標的基因表現。因此，對許多活體內治療情況，有益的是將RNAi寡核苷酸分布至個體的標的組織，同時限制其在個體的一或多個非標的組織(例如肝)內的分布及/或功能。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於降低或抑制與個體之一或多個標的組織相關聯的細胞群中的標的基因表現之方法，其包含投予本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其醫藥組成物。在一些實施態樣中，該方法包含令RNAi寡核苷酸結合體分布至個體之一或多個標的組織，而極少分布至個體的一或多個非標的組織。在一些實施態樣中，令RNAi寡核苷酸結合體接觸或遞送至存在於個體之一或多個標的組織中的細胞或細胞群，而極少接觸或遞送至存在於個體之一或多個非標的組織中的細胞或細胞群。在一些實施態樣中，將一或多個標的組織中的標的基因表現降低，而不在一或多個非標的組織中降低至相同或相似的水平。
在一些實施態樣中，該方法導致(i)相對於對照的標的基因表現而降低一或多個標的組織中之細胞或細胞群的標的基因表現；及(ii)相對於對照的標的基因表現而實質上與一或多個非標的組織中之細胞或細胞群的標的基因表現相等。在一些實施態樣中，對照的標的基因表現係對應於來自未與RNAi寡核苷酸結合體接觸或與對照的RNAi寡核苷酸結合體接觸的相等組織之細胞或細胞群中的標的基因表現之量或水平。在一些實施態樣中，標的基因表現的降低係以自標的基因或以標的基因編碼之蛋白質轉錄的標的mRNA降低之量或水平來測量。在一些實施態樣中，該方法導致(i)相對於對照物而降低一或多個標的組織中的標的mRNA表現；及(ii)相對於對照物而實質上與一或多個非標的組織中的標的mRNA表現相等。在一些實施態樣中，該方法導致(i)相對於對照物而降低一或多個標的組織中的靶蛋白水平；及(ii)相對於對照物而實質上與一或多個非標的組織中的靶蛋白水平相等。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於降低或抑制與個體之CNS相關聯的細胞群中的標的基因表現之方法，其包含投予本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其醫藥組成物。在一些實施態樣中，該方法包含令RNAi寡核苷酸結合體分布至個體之CNS，而極少分布至個體的一或多個非標的組織(例如肝)。在一些實施態樣中，令RNAi寡核苷酸結合體接觸或遞送至存在於個體之CNS中的細胞或細胞群，而極少接觸或遞送至存在於個體之一或多個非標的組織(例如肝)中的細胞或細胞群。在一些實施態樣中，將個體之CNS中的標的基因表現降低，而不在一或多個非標的組織(例如肝)中降低至相同的水平。
在一些實施態樣中，將CNS中的標的基因表現降低，而不在一或多個非標的組織中降低至相同的水平。在一些實施態樣中，一或多個非標的組織包含肝組織。在一些實施態樣中，該方法導致(i)相對於對照的標的基因表現而降低CNS之細胞或細胞群中的標的基因表現；及(ii)相對於對照的標的基因表現而實質上與一或多個非標的組織之細胞或細胞群中的標的基因表現相等。在一些實施態樣中，對照的標的基因表現係對應於來自未與RNAi寡核苷酸結合體接觸或與對照的RNAi寡核苷酸結合體接觸的相等組織之細胞或細胞群中的標的基因表現之量或水平。在一些實施態樣中，該方法導致(i)相對於對照的標的基因表現(例如在未與RNAi寡核苷酸結合體接觸或與對照的RNAi寡核苷酸結合體接觸的CNS之細胞或細胞群中的標的基因表現)而降低CNS之細胞或細胞群中的標的基因表現；及(ii)相對於對照的標的基因表現(例如在未與RNAi寡核苷酸結合體接觸或與對照的RNAi寡核苷酸結合體接觸的肝之細胞或細胞群中的標的基因表現)而實質上與肝之細胞或細胞群中的標的基因表現相等。在一些實施態樣中，該方法導致CNS之細胞或細胞群中的標的基因表現相對於對照的標的基因表現而為約1%或更低、約5%或更低、約10%或更低、約15%或更低、約20%或更低、約25%或更低、約30%或更低、約35%或更低、約40%或更低、約45%或更低、約50%或更低、約55%或更低、約60%或更低、約70%或更低、約80%或更低、或約90%或更低。在一些實施態樣中，在肝中的標的基因表現相當於對照的標的基因表現(例如具有不超過約±30%、約±25%、約±20%、約±15%、約±10%、約±5%、約±4%、約±3%、約±2%或約±1%之差異)。在一些實施態樣中，在CNS中的標的基因表現降低係以自標的基因或以標的基因編碼之蛋白質轉錄的標的mRNA之降低的量或水平來測量。 治療方法
本揭示提供用作為藥劑，特別用於治療與CNS相關聯的疾病、失調及病症之方法之寡核苷酸。本揭示亦提供用於或可適合用於治療能自降低標的基因表現(例如在CNS中)而獲益的個體(例如患有與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症的人類)之RNAi寡核苷酸結合體。在一些態樣中，本揭示提供用於或可適合用於治療患有與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症的個體之RNAi寡核苷酸結合體。本揭示亦提供用於或可適合用於製造藥劑或醫藥組成物之RNAi寡核苷酸結合體，該藥劑或醫藥組成物係用於治療與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體用於或可適合用於靶向mRNA及降低標的基因表現(例如經由RNAi路徑)。在一些實施態樣中，RNAi寡核苷酸結合體用於或可適合用於靶向mRNA及降低標的mRNA、蛋白質及/或活性之量或水平。
另外，在本文之方法的一些實施態樣中，選出患有或易患有與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症的個體以本文之RNAi寡核苷酸結合體治療。在一些實施態樣中，該方法包含選出具有或易具有與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症之標記(例如生物標記)(諸如但不限於標的mRNA、蛋白質或其組合)的個體。同樣地及如下文之詳述，以本揭示提供之方法的一些實施態樣包括以下步驟：諸如測量或獲得標的基因表現之標記的基線值，且接著比較此獲得的值與一或多個其他基線值或在對個體投予RNAi寡核苷酸結合體後獲得的值以評定治療有效性。
本揭示亦提供以本文提供之RNAi寡核苷酸結合體治療患有、疑似患有與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症或處於發展出該等疾病、失調或病症之風險的個體之方法。在一些態樣中，本揭示提供使用本文提供之RNAi寡核苷酸結合體治療或減弱與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症的發作或進展之方法。在其他態樣中，本揭示提供使用本文提供之RNAi寡核苷酸結合體在患有與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症的個體中達成一或多種治療效益之方法。在本文之方法的一些實施態樣中，個體係藉由投予治療有效量的本文提供之RNAi寡核苷酸結合體中任何一或多者來治療。在一些實施態樣中，治療包含降低標的基因表現(例如在CNS中)。在一些實施態樣中，個體係經治療性治療。在一些實施態樣中，個體係經預防性治療。
在本文之方法的一些實施態樣中，將本文提供之RNAi寡核苷酸結合體或包含RNAi寡核苷酸結合體之醫藥組成物投予患有與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症的個體，使得降低個體的標的基因表現，藉此治療個體。在一些實施態樣中，降低個體的標的mRNA之量或水平。在一些實施態樣中，降低個體的以標的mRNA編碼之蛋白質之量或水平。
在本文之方法的一些實施態樣中，將本文提供之RNAi寡核苷酸結合體或包含RNAi寡核苷酸結合體之醫藥組成物投予患有與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症之個體，使得與投予RNAi寡核苷酸結合體或醫藥組成物前的標的基因表現相比時，個體的標的基因表現降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%。在一些實施態樣中，當與未接受RNAi寡核苷酸結合體或醫藥組成物、或接受對照的RNAi寡核苷酸結合體、醫藥組成物或治療之個體(例如參考或對照個體)的標的基因表現相比時，個體的標的基因表現降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%。
在本文之方法的一些實施態樣中，將本文之RNAi寡核苷酸結合體或包含RNAi寡核苷酸結合體之醫藥組成物投予患有與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症之個體，使得與投予RNAi寡核苷酸結合體或醫藥組成物前的標的mRNA之量或水平相比時，個體的標的mRNA之量或水平降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%。在一些實施態樣中，當與未接受RNAi寡核苷酸結合體或醫藥組成物、或接受對照的RNAi寡核苷酸結合體、醫藥組成物或治療之個體(例如參考或對照個體)的標的mRNA之量或水平相比時，個體的標的mRNA之量或水平降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%。
在本文之方法的一些實施態樣中，將本文之RNAi寡核苷酸結合體或包含RNAi寡核苷酸結合體之醫藥組成物投予患有與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症的個體，使得與投予RNAi寡核苷酸結合體或醫藥組成物前以標的基因編碼之蛋白質之量或水平相比時，個體以標的基因編碼之蛋白質之量或水平降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%。在一些實施態樣中，當與未接受RNAi寡核苷酸結合體或醫藥組成物、或接受對照的RNAi寡核苷酸結合體、醫藥組成物或治療之個體(例如參考或對照個體)以標的基因編碼之蛋白質之量或水平相比時，個體以標的基因編碼之蛋白質之量或水平降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%。
在本文之方法的一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或包含RNAi寡核苷酸結合體之醫藥組成物投予患有與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症的個體，使得與投予RNAi寡核苷酸結合體或醫藥組成物前的標的基因活性之量或水平相比時，個體的標的基因活性之量或水平降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%。在一些實施態樣中，當與未接受RNAi寡核苷酸結合體或醫藥組成物、或接受對照的RNAi寡核苷酸結合體、醫藥組成物或治療之個體(例如參考或對照個體)的標的基因活性之量或水平相比時，個體的標的基因活性之量或水平降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%。
適合於測定個體或來自個體之樣品的標的基因表現、標的mRNA之量或水平、以標的基因編碼之蛋白質之量或水平及/或標的基因活性之量或水平之方法為本技術中已知。再者，本文所提出之樣品例證用於測定標的基因表現之示例性方法。
在一些實施態樣中，標的基因表現、標的基因mRNA之量或水平、以標的基因編碼之蛋白質之量或水平、標的基因活性之量或水平或其任何組合在自個體獲得或分離之細胞、細胞群或細胞群組(例如類器官)、器官(例如CNS)、血液或其部分(例如血漿)、組織(例如腦組織)、樣品(例如CSF樣品或腦生檢樣品)或任何其他生物學材料中降低。在一些實施態樣中，標的基因表現、標的基因mRNA之量或水平、以標的基因編碼之蛋白質之量或水平、標的基因活性之量或水平或其任何組合在自個體獲得或分離之超過一種類型的細胞、超過一種細胞群組、超過一種器官(例如腦和一或多種其他器官)、超過一種血液部分(例如血漿和一或多種其他血液部分)、超過一種類型的組織(例如腦組織和一或多種其他類型的組織)、超過一種類型的樣品(例如腦生檢樣品和一或多種其他類型的生檢樣品)中降低。
在一些實施態樣中，該方法提供用於降低一或多個標的組織(例如CNS)之細胞或細胞群中的標的基因表現，同時維持一或多個非標的組織(例如肝)之細胞或細胞群中的標的基因表現之方法。在一些實施態樣中，在一或多個非標的組織內的標的基因表現促成個體之正常的生理功能。在一些實施態樣中，該方法提供於差別的標的基因表現，使得標的組織中之不規則的標的基因表現降低以治療、減輕或緩解與標的基因相關聯的疾病或失調，而不誘導非標的組織中的標的基因異常調節，其能導致紊亂的生理功能。
在一些實施態樣中，本揭示提供用於治療與標的基因相關聯的疾病、失調或病症之方法，其包含對有其需要的個體投予本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其醫藥組成物，其中(i)與對照的標的基因表現之量或水平相比，在個體之標的組織(例如CNS)中的標的基因表現之量或水平降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%；及(ii)在一或多個非標的組織(例如肝)中的標的基因表現之量或水平相當於對照的標的基因表現水平(例如具有不超過約±30%、約±25%、約±20%、約±15%、約±10%、約±5%、約±4%、約±3%、約±2%或約±1%之差異)。
在一些實施態樣中，當與未接受RNAi寡核苷酸結合體或醫藥組成物、或接受對照的RNAi寡核苷酸結合體、醫藥組成物或治療之個體(例如參考或對照個體)的標的mRNA之量或水平相比時，個體的標的mRNA之量或水平降低至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或大於99%。
與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症的實例包括但不限於進行性核上神經麻痺症(PSP)、皮質基底節變性(CBD)、嗜銀顆粒病(AGD)、球狀膠細胞tau蛋白病(GGT)、衰老相關性tau星形膠質細胞病(ARTAG)、家族性額顳葉失智症17 (FTD-17)、伴有呼吸衰竭的tau蛋白病、伴有癲癇發作的失智症、匹克氏症、肌強直性失養症1型或2型(MD1或MD2)、唐氏症候群、痙攣性截癱(SP)、尼曼-匹克二氏病C型、路易氏體失智症(DLB)、路易氏體吞嚥困難、路易氏體病、橄欖體橋腦小腦萎縮、紋狀體黑質變性、夏-德雷格症候群、脊髓性肌肉萎縮症V (SMAV)、亨汀頓氏舞蹈症(HD)、阿茲海默氏症、SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA10 (脊髓小腦性失調症第1、2、3、7或10型)、多系統萎縮症(MSA)、脊髓延髓性肌肉萎縮症(SBMA，甘迺迪氏症)、弗裏德賴希運動失調、X染色體脆折症相關震顫/運動失調症候群(FXTAS)、X染色體脆折症候群(FRAXA)、X連鎖智力遲鈍(XLMR)、帕金森氏症、肌張力不全症、SBMA (脊髓延髓肌萎縮症)、神經性病變疼痛失調、脊髓損傷、齒狀核黑質紅核蒼白球丘腦底核萎縮症(DRPLA)、隱性CNS失調、ALS (肌肉萎縮性脊髓側索硬化症)、M2DS (MECP2複製症候群)、FTD (額顳葉失智症)、普里昂疾病、成年發病型腦白質失養症、亞歷山大氏病、克拉伯病、慢性創傷性腦病變、家族性腦中葉硬化症(PMD)、拉菲羅病、中風、類澱粉腦血管病變(CAA)及異染性白質失養症(MLD)。
在一些實施態樣中，標的基因可為來自任何哺乳動物(諸如人類)之標的基因。任何基因可根據本文所述之方法靜默。
本文所述之方法通常涉及對個體投予治療有效量的本文之RNAi寡核苷酸結合體，亦即能夠產生所欲治療結果的量。治療可接受的量可為可以治療性治療疾病或失調之量。適合於任何一位個體的劑量將取決於特定的因素而定，包括個體的身型、體表面積、年齡、欲投予之組成物、組成物中的活性成分、投予時間和途徑、一般健康及同時投予之其他藥物。
在一些實施態樣中，對個體經以下方式投予本文之組成物中任一者：經腸(例如經口、藉由胃飼管、藉由十二指腸飼管、經由胃造口術或經直腸)、非經腸(例如皮下注射、靜脈內注射或輸注、動脈內注射或輸注、骨內輸注、肌內注射、腦內注射、腦室內注射、鞘內)、經局部(例如皮上、吸入、經由眼藥水或通過黏膜)或藉由直接注射至靶器官(例如個體之腦部)。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物係經鞘內投予腦脊髓液(CSF)中(例如注射或輸注至蛛網膜下腔內的流體中)。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物的鞘內投予係以單次快速注射至蛛網膜下腔中執行。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物的鞘內投予係以輸注至蛛網膜下腔中執行。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物的鞘內投予係經由導管至蛛網膜下腔中執行。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物的鞘內投予係經由泵執行。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物的鞘內投予係經由可植入泵執行。在一些實施態樣中，投予係經由以貯庫操作或起作用的可植入裝置執行。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物係經鞘內投予小腦延髓池(亦稱為腦大池)。經鞘內投予腦大池中被稱為「腦池內投予」或「腦池內大池(intracisternal magna)(i.c.m.)投予」。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物係經鞘內投予腰脊髓之蛛網膜下腔中。經鞘內投予腰脊髓之蛛網膜下腔中被稱為「腰鞘內(i.t.)投予」。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物係經鞘內投予頸脊髓之蜘蛛網膜下腔中。經鞘內投予頸脊髓之蛛網膜下腔中被稱為「頸鞘內(i.t.)投予」。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物係經鞘內投予胸脊髓之蛛網膜下腔中。經鞘內投予胸脊髓之蛛網膜下腔中被稱為「胸鞘內(i.t.)投予」。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物係經腦室內注射或輸注投予腦室中。經腦室內投予腦室腔中被稱為「腦室內(i.c.v.)投予」。在一些實施態樣中，使用奧莫耶(Ommaya)貯庫經腦室內注射或輸注投予本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物。
在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物係每年投予一次、每6個月投予一次、每4個月投予一次、每季投予一次(每三個月投予一次)、每兩月投予一次(每兩個月投予一次)、每個月投予一次或每週投予一次。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物係每週或以兩週或三週之間隔投予。在一些實施態樣中，本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物係每天投予。在一些實施態樣中，對個體投予本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物的一或多個負載劑量，後續投予RNAi寡核苷酸結合體或其組成物的一或多個維持劑量。
在一些實施態樣中，欲治療的個體為人類或非人類靈長類動物或其他哺乳動物個體。其他示例性個體包括家養動物，諸如狗和貓；家畜，諸如馬、牛、豬、綿羊、山羊和雞；及動物，諸如小鼠、大鼠、天竺鼠及倉鼠。 套組
在一些實施態樣中，本揭示提供包含本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物及用法說明之套組。在一些實施態樣中，套組包含本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物及含有套組及/或其任何組分的用法說明之包裝插頁。在一些實施態樣中，套組包含本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物、一或多種對照物及各種緩衝劑、試劑、酶和本技術中熟知的其他標準成分於適合的容器中。在一些實施態樣中，容器包含至少一個小瓶、孔、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器裝置，將本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物放入其中，且在一些實例中經適當地等分。在一些實施態樣中，在提供附加組分的情況下，套組含有將此組分放入其中的附加容器。套組亦可包括嚴格限制用於商業銷售的含有本文之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物及任何其他試劑之裝置。此等容器可包括注射或吹模成型塑膠容器，所欲小瓶保留於其中。容器及/或套組可包括具有用法說明及/或警語之標籤。
在一些實施態樣中，套組包含本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物及醫藥上可接受的載劑、或包含RNAi寡核苷酸結合體之醫藥組成物及用法說明，其係用於治療有其需要的個體之與標的基因表現相關聯的疾病、失調或病症或延遲其進展。
在一些實施態樣中，本揭示提供套組，其包含本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物及醫藥上可接受的載劑、或包含RNAi寡核苷酸結合體之醫藥組成物及用法說明，其係用於降低或抑制與CNS相關聯的細胞群表現之個體的標的mRNA表現。
在一些實施態樣中，本揭示提供套組，其包含本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物及醫藥上可接受的載劑、或包含RNAi寡核苷酸結合體之醫藥組成物及用法說明，其係用於降低或抑制與CNS相關聯的細胞群表現之個體的標的mRNA表現，而不降低在CNS以外的標的mRNA表現至相同的程度。
在一些實施態樣中，本揭示提供套組，其包含本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物及醫藥上可接受的載劑、或包含RNAi寡核苷酸結合體之醫藥組成物及用法說明，其係用於降低或抑制與CNS相關聯的細胞群表現之個體的標的mRNA表現，而不降低在肝細胞中的標的mRNA表現至相同的程度。
在一些實施態樣中，本揭示提供套組，其包含本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物及醫藥上可接受的載劑、或包含RNAi寡核苷酸結合體之醫藥組成物及用法說明，其係用於降低或抑制個體之CNS中的標的mRNA表現，其中標的mRNA係與疾病或失調，視需要地與神經疾病或失調相關聯。
在一些實施態樣中，本揭示提供套組，其包含本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物及醫藥上可接受的載劑、或包含RNAi寡核苷酸結合體之醫藥組成物及用法說明，其係用於降低或抑制個體之CNS中的標的mRNA表現，而不降低在CNS以外的標的mRNA表現至相同的程度，其中標的mRNA係與疾病或失調，視需要地與神經疾病或失調相關聯。
在一些實施態樣中，本揭示提供套組，其包含本文所述之RNAi寡核苷酸結合體或其組成物及醫藥上可接受的載劑、或包含RNAi寡核苷酸結合體之醫藥組成物及用法說明，其係用於降低或抑制個體之CNS中的標的mRNA表現，而不降低在肝細胞中的標的mRNA表現至相同的程度，其中標的mRNA係與疾病或失調，視需要地與神經疾病或失調相關聯。 其他的實施態樣
本揭示關於以下的實施態樣。在此整篇章節中，條件實施態樣縮寫成「E」，隨後為一序號。例如，E1相當於實施態樣1。
E1. 以式I-a表示之核酸-配體結合體：
Figure 02_image317
或其醫藥上可接受的鹽，其中： B為核鹼基或氫； R 1和R 2獨立為氫、鹵素、R A、-CN、-S(O)R、-S(O) 2R、-Si(OR) 2R、-Si(OR)R 2或-SiR 3，或 在同一碳上的R 1和R 2與彼等的中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之3員飽和或部分不飽和環： 各R A獨立為視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環； 各R獨立為氫、適合的保護基或視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環，或： 在同一原子上的兩個R基團與彼等的中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽和硫的雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或芳基環； L A獨立為PG 1或-L-配體； PG 1為氫或適合的羥基保護基； 各配體獨立為-(LC) n及/或金剛烷基； 各LC獨立為包含飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈之脂質結合體部分，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-置換； 各-Cy-獨立為視需要經取代之選自下列的二價環：伸苯基、8至10員雙環伸芳基、4至7員飽和或部分不飽和伸碳環基、4至11員飽和或部分不飽和螺伸碳環基、8至10員雙環飽和或部分不飽和伸碳環基、伸金剛烷基、具有1至3個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和伸雜環基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至11員飽和或部分不飽和螺伸雜環基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之8至10員雙環飽和或部分不飽和伸雜環基、具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員飽和或部分不飽和伸雜芳基、或具有1至5個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之8至10員雙環伸雜芳基； n為1至10； L為共價鍵或二價飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、 -NR-、-N(R)-C(O)-、-S-、-C(O)-、-S(O)-、-S(O) 2-、   -P(O)OR-、-P(S)OR-、-V 1CR 2W 1-或
Figure 02_image319
置換； m為1至50； X 1、V 1和W 1獨立為-C(R) 2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或 -NR-； Z為-O-、-S-、-NR-或-CR 2-；且 PG 2為氫、亞磷醯胺酸酯類似物或適合的保護基。
E2. E1之核酸-配體結合體，其中結合體係以式I-b或I-c表示：
Figure 02_image321
Figure 02_image323
或其醫藥上可接受的鹽；其中 L 1為共價鍵或二價飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、 -C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、     -S(O) 2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或
Figure 02_image325
置換； R 4為氫、R A或適合的胺保護基；且 R 5為金剛烷基或飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、  -C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-或-P(S)OR-置換。
E3. 以式I-Ib或I-Ic 表示之核酸-配體結合體：
Figure 02_image327
Figure 02_image329
或其醫藥上可接受的鹽；其中 B為核鹼基或氫； m為1至50； PG 1和PG 2獨立為氫、亞磷醯胺酸酯類似物或適合的保護基；且 R 5為金剛烷基或飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、     -P(O)OR-或-P(S)OR-置換。 E4. E3之核酸-配體結合體，其中： R 5係選自
Figure 02_image331
E5. E4之核酸-配體結合體，其中： R 5係選自
Figure 02_image333
。
E6. 包含E1至E5中任一者之一或多個核酸-配體結合體之寡核苷酸-配體結合體。
E7. E6之寡核苷酸-配體結合體，其中結合體包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核酸-配體結合體。
E8. 包含一或多個以式II-a表示之核酸-配體結合體之寡核苷酸-配體結合體：
Figure 02_image335
或其醫藥上可接受的鹽，其中： B為核鹼基或氫； R 1和R 2獨立為氫、鹵素、R A、-CN、-S(O)R、-S(O) 2R、-Si(OR) 2R、-Si(OR)R 2或-SiR 3；或 在同一碳上的R 1和R 2與彼等的中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R A獨立為視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環； 各R獨立為氫、適合的保護基或視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環；或 在同一原子上的兩個R基團與彼等的中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽和硫的雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或芳基環； 各LC獨立為包含飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈之脂質結合體部分，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、    -C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-置換； 各-Cy-獨立為視需要經取代之選自下列的二價環：伸苯基、8至10員雙環伸芳基、4至7員飽和或部分不飽和伸碳環基、4至11員飽和或部分不飽和螺伸碳環基、8至10員雙環飽和或部分不飽和伸碳環基、具有1至3個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和伸雜環基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至11員飽和或部分不飽和螺伸雜環基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之8至10員雙環飽和或部分不飽和伸雜環基、具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員飽和或部分不飽和伸雜芳基、或具有1至5個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之8至10員雙環伸雜芳基； n為1至10； L為共價鍵或二價飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、 -C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、     -S(O) 2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-、-V 1CR 2W 1-或
Figure 02_image337
置換； m為1至50； X 1、V 1和W 1獨立為-C(R) 2-、-OR、-O-、-S-、-Se-或-NR-； Y為氫、適合的羥基保護基、
Figure 02_image339
或
Figure 02_image341
； R 3為氫、適合的保護基、適合的前藥或視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環； X 2為O、S或NR； X 3為-O-、-S-、-BH 2-或共價鍵； Y 1為連接至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′或3′末端的鍵聯基團； Y 2為氫、適合的保護基、亞磷醯胺酸酯類似物、連接至核苷、核苷酸或寡核苷酸之5′末端的核苷酸間鍵聯基團、或連接至撐體的鍵聯基團；且 Z為O-、-S-、-NR-或-CR 2-。
E9. E8之寡核苷酸-配體結合體，其中結合體係以式II-b或II-c表示：
Figure 02_image343
或其醫藥上可接受的鹽，其中： L 1為共價鍵、單價或二價飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-Cy-、-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、-P(O)OR-、-P(S)OR-或
Figure 02_image345
置換； R 4為氫、R A或適合的胺保護基；且 R 5為金剛烷基或飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、     -P(O)OR-或-P(S)OR置換。 E10. E9之寡核苷酸-配體結合體，其中： R 5係選自
Figure 02_image347
Figure 02_image349
Figure 02_image351
E11. E9之寡核苷酸-配體結合體，其中： R 5係選自
Figure 02_image353
。
E12. 以式II-Ib或II-Ic表示之寡核苷酸-配體結合體：
Figure 02_image355
Figure 02_image357
或其醫藥上可接受的鹽；其中 B為核鹼基或氫； m為1至50； X 1為-O-或-S-； Y為氫、
Figure 02_image359
或
Figure 02_image361
； R 3為氫或適合的保護基； X 2為O或S； X 3為-O-、-S-或共價鍵； Y 1為連接至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′或3′末端的鍵聯基團； Y 2為氫、亞磷醯胺酸酯類似物、連接至核苷、核苷酸或寡核苷酸之5′末端的核苷酸間鍵聯基團、或連接至撐體的鍵聯基團； R 5為金剛烷基或飽和或不飽和、直鏈或支鏈C 1-50烴鏈，其中烴鏈的0至10個亞甲基單元獨立地經-O-、-C(O)NR-、-NR-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O) 2-、     -P(O)OR-或-P(S)OR-置換；且 R為氫、適合的保護基或視需要地經取代之選自下列的基團：C 1-6脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、及具有1至4個獨立地選自氮、氧和硫的雜原子之5至6員雜芳基環。
E13. E12之寡核苷酸-配體結合體，其中： R 5係選自
Figure 02_image363
E14. E8至E13中任一者之寡核苷酸-配體結合體，其中結合體包含1至10個核酸-配體結合體單元。
E15. E8至E13中任一者之寡核苷酸-配體結合體，其中結合體包含1、2或3個核酸-配體結合體單元。
E16. E6至E15中任一者之寡核苷酸-配體結合體，其中寡核苷酸包含長度為10至53個核苷酸之有義股及長度為15至53個核苷酸之反義股，其中寡核苷酸反義股具有與標的基因序列的至少15個連續的核苷酸互補的序列，且當寡核苷酸-結合體引入哺乳動物細胞中時，其降低標的基因表現。
E17. E16之寡核苷酸-配體結合體，其中核酸-配體結合體單元係存在於有義股中。
E18. E16之寡核苷酸-配體結合體，其中反義股的長度為19至27個核苷酸。
E19. E16之寡核苷酸-配體結合體，其中有義股的長度為12至40個核苷酸。
E20. E16至E19中任一者之寡核苷酸-配體結合體，其中有義股與反義股形成雙螺旋區域。
E21. E16之寡核苷酸-配體結合體，其中互補的區域係與標的序列完全互補。
E22. E16至E21中任一者之寡核苷酸-配體結合體，其中有義股包含在其3′端上如以下提出之主幹-環圈：S 1-L-S 2，其中S 1係與S 2互補，且其中L形成介於S 1與S 2之間的長度為3至5個核苷酸的環圈。
E23. E22之寡核苷酸-配體結合體，其中L為四鹼基環圈。
E24. E22之寡核苷酸-配體結合體，其中L包含如GAAA所提出之序列。
E25. E16至E24中任一者之寡核苷酸-配體結合體，其另外包含在2個核苷酸長度之反義股上的3′-突出序列。
E26. E16至E24中任一者之寡核苷酸-配體結合體，其中寡核苷酸另外包含一或多個核苷酸長度的3′-突出序列，其中3′-突出序列係存在於反義股、有義股或反義股及有義股上。
E27. E16至E26中任一者之寡核苷酸-配體結合體，其中寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸。
E28. E27之寡核苷酸-配體結合體，其中經修飾之核苷酸包含2′-修飾。
E29. E28之寡核苷酸-配體結合體，其中2′-修飾為選自下列之修飾：2′-胺基乙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基、2′-去氧-2′-氟、和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸。
E30. E16至E26中任一者之寡核苷酸-配體結合體，其中寡核苷酸的所有核苷酸皆經修飾。
E31. E16至E30中任一者之寡核苷酸-配體結合體，其中寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯。
E32. E31之寡核苷酸-配體結合體，其中至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。
E33. E16至E30中任一者之寡核苷酸-配體結合體，其中反義股的5′-核苷酸之糖的4′-碳包含磷酸酯類似物。
E34. E33之寡核苷酸-配體結合體，其中磷酸酯類似物為氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二醯基膦酸酯。
E35. 一種組成物，其包含E16至E34中任一者之寡核苷酸-配體結合體及賦形劑。
E36. 一種遞送寡核苷酸-配體結合體至個體之方法，該方法包含對個體投予E35之組成物。
E37. E16至E34中任一者之寡核苷酸-配體結合體，其降低標的基因表現。
E38. E37之寡核苷酸-配體結合體，其中標的基因表現在CNS中。
E39. E38之寡核苷酸-配體結合體，其中標的基因係與疾病或失調，視需要地與神經疾病或失調相關聯。
E40. E39之寡核苷酸-配體結合體，其中疾病或失調係選自進行性核上神經麻痺症(PSP)、皮質基底節變性(CBD)、嗜銀顆粒病(AGD)、球狀膠細胞tau蛋白病(GGT)、衰老相關性tau星形膠質細胞病(ARTAG)、家族性額顳葉失智症17 (FTD-17)、伴有呼吸衰竭的tau蛋白病、伴有癲癇發作的失智症、匹克氏症、肌強直性失養症1型或2型(MD1或MD2)、唐氏症候群、痙攣性截癱(SP)、尼曼-匹克二氏病C型、路易氏體失智症(DLB)、路易氏體吞嚥困難、路易氏體病、橄欖體橋腦小腦萎縮、紋狀體黑質變性、夏-德雷格症候群、脊髓性肌肉萎縮症V (SMAV)、亨汀頓氏舞蹈症(HD)、阿茲海默氏症、SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA10 (脊髓小腦性失調症第1、2、3、7或103型)、多系統萎縮症(MSA)、脊髓延髓性肌肉萎縮症(SBMA，甘迺迪氏症)、弗裏德賴希運動失調、X染色體脆折症相關震顫/運動失調症候群(FXTAS)、X染色體脆折症候群(FRAXA)、X連鎖智力遲鈍(XLMR)、帕金森氏症、肌張力不全症、SBMA (脊髓延髓肌萎縮症)、神經性病變疼痛失調、脊髓損傷、齒狀核黑質紅核蒼白球丘腦底核萎縮症(DRPLA)、隱性CNS失調和ALS (肌肉萎縮性脊髓側索硬化症)、M2DS (MECP2複製症候群)、FTD (額顳葉失智症)、普里昂疾病、成年發病型腦白質失養症、亞歷山大氏病、克拉伯病、慢性創傷性腦病變、家族性腦中葉硬化症(PMD)、拉菲羅病、中風、類澱粉腦血管病變(CAA)及異染性白質失養症(MLD)。 定義
如本文所使用的如應用於一或多個關注值之「大約(approximately)」或「約(about)」係指類似於所述參考值的值。在特定的實施態樣中，「約」係指落在所述參考值之任一方向(大於或小於)的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小的值範圍內，除非另有其他陳述或另外自上下文清楚地看出(除了此數字會超過可能值的100%之情況)。
如本文所使用之「投予(administer、administering、administration)」及類似者係指以藥理學上可用的方式(例如治療個體之病症)對個體提供物質(例如RNAi寡核苷酸結合體)。
如本文所使用之「去唾液酸糖蛋白受體」或「ASGPR」係指由主要的48 kDa次單元(ASGPR-1)及次要的40 kDa次單元(ASGPR-2)所形成的二分C型凝集素。ASGPR主要表現在肝細胞的竇狀表面上且具有結合、內化及隨後清除含有末端半乳糖或GalNAc殘基之循環糖蛋白(去唾液酸糖蛋白)的主要角色。
如本文所使用之「減弱(attenuate、attenuating、attenuation)及類似者係指降低或有效地停止。作為非限制性實例，本文之治療中一或多者可降低或有效地停止個體之與標的基因表現相關聯的疾病(例如神經疾病或失調)之發作或進展。此減弱可由當原本可能預期到以下的狀況時來例證：例如個體之與標的基因表現相關聯的疾病中一或多個狀況(例如症狀、組織特徵及細胞、發炎或免疫學活性等)降低、疾病中一或多個狀況沒有可檢測的進展(惡化)或沒有可檢測的疾病狀況。
如本文所使用之「互補」係指介於兩個核苷酸(例如在兩個相對核酸上或在單一核酸股的相對區域上)之間的結構關係，其允許兩個核苷酸彼此形成鹼基對。例如，一個核酸之嘌呤核苷酸與相對核酸之嘧啶核苷酸為互補，彼等可藉由彼此形成氫鍵而一起鹼配對。在一些實施態樣中，互補的核苷酸可以瓦生克立克方式或以容許形成穩定的雙螺旋之任何其他方式鹼配對。在一些實施態樣中，兩個核酸可具有彼此互補以形成互補的區域的多個核苷酸區域，如本文所述。
如本文所使用之「CNS mRNA」及「CNS基因」係指以中樞神經系統之細胞或組織中的基因編碼/表現之任何基因、mRNA及/或蛋白質。
如本文所使用之「去氧核醣核苷酸」係指當與核糖核苷酸相比時，在其戊醣糖的2′位置上具有以氫代替羥基之核苷酸。經修飾之去氧核醣核苷酸為除了在2′位置以外具有一或多個原子修飾或取代之去氧核醣核苷酸，包括在糖、磷酸酯基團或鹼基中之修飾或取代或該等之修飾或取代。
如本文所使用之「雙股寡核苷酸」或「ds寡核苷酸」係指實質上呈雙螺旋形式之寡核苷酸。在一些實施態樣中，雙股寡核苷酸之雙螺旋區域的互補鹼基配對係在介於共價的單獨核酸股之核苷酸的反平行序列之間形成。在一些實施態樣中，雙股寡核苷酸之雙螺旋區域的互補鹼基配對係在介於共價連結之核酸股之核苷酸的反平行序列之間形成。在一些實施態樣中，雙股寡核苷酸之雙螺旋區域的互補鹼基配對係自經折疊(例如經由髮夾)以提供一起鹼基配對之核苷酸的互補反平行序列之單一核酸股形成。在一些實施態樣中，雙股寡核苷酸包含彼此完全成雙螺旋之兩個共價的單獨核酸股。然而，在一些實施態樣中，雙股寡核苷酸包含部分成雙螺旋之兩個共價的單獨核酸股(例如在一或兩端上具有突出物)。在一些實施態樣中，雙股寡核苷酸包含部分互補之核苷酸的反平行序列，且因此可具有一或多個可包括內部錯配或端錯配之錯配。
如本文提及核酸(例如寡核苷酸)所使用之「雙螺旋」係指通過核苷酸的兩個反平行序列之互補鹼基配對所形成之結構。
如本文所使用之「賦形劑」係指可包含在組成物中以例如提供或促成所欲稠度或穩定效應的非治療劑。
如本文所使用之「不穩定的連結子」係指可切割(例如藉由過酸性pH)之連結子。「相當穩定的連結子」係指不可切割之連結子。
如本文所使用之「環圈」係指以核酸的兩個彼此充分互補的反平行區域為側接之核酸(例如寡核苷酸)的未配對區域，使得成為未配對區域之側接的兩個反平行區域在適當的雜交條件下(例如在磷酸鹽緩衝液中、在細胞中)雜交以形成雙螺旋(稱為「主幹」)。
如本文所使用之「經修飾之核苷酸間鍵聯」係指當與包含磷酸二酯鍵的參考核苷酸間鍵聯相比時，具有一或多個化學修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施態樣中，經修飾之核苷酸為非天然生成之鍵聯。經修飾之核苷酸間鍵聯通常賦予其中有經修飾之核苷酸間鍵聯存在的核酸之一或多個所欲性質。例如，經修飾之核苷酸可改進熱穩定性、抗降解性、核酸酶抗性、溶解度、生物可利用性、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所使用之「經修飾之核苷酸」係指當與選自：腺嘌呤核醣核苷酸、鳥嘌呤核醣核苷酸、胞嘧啶核醣核苷酸、脲嘧啶核醣核苷酸、腺嘌呤去氧核醣核苷酸、鳥嘌呤去氧核醣核苷酸、胞嘧啶去氧核醣核苷酸和胸苷去氧核醣核苷酸之對應的參考核苷酸相比時，具有一或多個化學修飾之核苷酸。在一些實施態樣中，經修飾之核苷酸為非天然生成之核苷酸。在一些實施態樣中，經修飾之核苷酸具有一或多個在其糖、核鹼基及/或磷酸酯基團中的化學修飾。在一些實施態樣中，經修飾之核苷酸具有一或多個與對應的參考核苷酸結合之化學部分。經修飾之核苷酸通常賦予其中有經修飾之核苷酸存在的核酸之一或多個所欲性質。例如，經修飾之核苷酸可改進熱穩定性、抗降解性、核酸酶抗性、溶解度、生物可利用性、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所使用之「切口型四鹼基環圈結構」係指以單獨的有義(過客)股及反義(引導)股為特徵的RNAi寡核苷酸(例如包含RNAi寡核苷酸結合體)之結構，其中有義股具有與反義股互補的區域，且其中股中至少一者(通常為有義股)具有經配置之四鹼基環圈以穩定在至少一個股內所形成之相鄰的主幹區域。
如本文所使用之「寡核苷酸」係指短核酸(例如長度少於約100個核苷酸)。寡核苷酸可為單股(ss)或ds。寡核苷酸可具有或可不具有雙螺旋區域。作為一組非限制性實例，寡核苷酸可為但不限於小干擾RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、切丁酶受質干擾RNA (dsiRNA)、反義寡核苷酸、短siRNA或單股siRNA。在一些實施態樣中，雙股寡核苷酸為RNAi寡核苷酸。
如本文所使用之「突出物」係指自延伸超出互補股之末端的一個股或區域生成之末端非鹼基配對核苷酸，該一個股或區域係與互補股形成雙螺旋。在一些實施態樣中，突出物包含自雙股寡核苷酸的5′末端或3′末端上之雙螺旋區域延伸的一或多個未配對之核苷酸。在特定的實施態樣中，突出物為雙股寡核苷酸之反義股或有義股上的3′或5′突出物。
如本文所使用之「磷酸酯類似物」係指模擬磷酸酯基團的靜電及/或空間性質之化學部分。在一些實施態樣中，磷酸酯類似物係代替經常易感受酶移除的5′-磷酸酯而位於寡核苷酸之5′末端核苷酸上。在一些實施態樣中，5′磷酸酯類似物含有抗磷酸酶鍵聯。磷酸酯類似物的實例包括但不限於5′膦酸酯，諸如5′亞甲基膦酸酯(5′-MP)和5′-(E)-乙烯基膦酸酯(5′-VP)。在一些實施態樣中，寡核苷酸具有在5′-末端核苷酸之糖的 4′-碳位置上之磷酸酯類似物(稱為「4′-磷酸酯類似物」)。4′-磷酸酯類似物的實例為氧甲基膦酸酯，其中氧甲基之氧原子係結合糖部分(例如在其4′-碳上)或其類似物。參見例如美國臨時專利申請案號62/383,207 (在2016年9月2日申請)及62/393,401 (在2016年9月12日申請)中。已開發出寡核苷酸之5′端的其他修飾(參見例如國際專利申請案號WO 2011/133871；美國專利案號8,927,513；及Prakash等人之(2015) Nucleic Acids Res .43:2993-3011)。
如本文所使用之標的基因「表現降低」係指當與適當的參考物(例如參考細胞、細胞群、樣品或個體)相比時，減少RNA轉錄本(例如標的mRNA)或以標的基因編碼之蛋白質之量或水平及/或減少細胞、細胞群、樣品或個體中的基因活性之量或水平。例如，當與未經雙股寡核苷酸處理之細胞相比時，令細胞與本文之寡核苷酸或結合體(例如RNAi寡核苷酸結合體，其包含具有與包含標的mRNA之核苷酸序列互補的核苷酸序列之反義股)接觸的作為可導致標的mRNA、以標的基因編碼之蛋白質及/或標的基因活性之量或水平減少(例如經由RNAi路徑之標的mRNA失活及/或降解)。同樣地且如本文所使用之「降低表現」係指導致標的基因表現降低的作為。
如本文所使用之「標的基因表現降低」係指當與適當的參考物(例如參考細胞、細胞群、樣品或個體)相比時，減少細胞、細胞群、樣品或個體中的標的mRNA、以標的基因編碼之蛋白質及/或標的基因活性之量或水平。
如本文所使用之「互補的區域」係指與核苷酸之反平行序列充分互補的核酸之核苷酸序列(例如本文所述之雙股寡核苷酸或RNAi寡核苷酸結合體)，以允許在適當的雜交條件下(例如在磷酸鹽緩衝液中、在細胞中等)在介於兩個核苷酸序列之間雜交。在一些實施態樣中，本文之寡核苷酸包含具有與mRNA標的序列互補的區域之靶向序列。
如本文所使用之「核醣核苷酸」係指具有核糖作為其戊醣糖之核苷酸，在其2′位置上含有羥基。經修飾之核醣核苷酸為除了在2′位置以外具有一或多個原子修飾或取代之核醣核苷酸，包括在核糖、磷酸酯基團或鹼基中或核糖、磷酸酯基團或鹼基之修飾或取代。
如本文所使用之「RNAi寡核苷酸」係指(a)具有有義(過客)股及反義(引導)股之雙股寡核苷酸，其中反義股或反義股之部分係藉由 Argonaute2 (Ago2)核酸內切酶而用於切割標的mRNA (例如在CNS中表現之標的mRNA)或(b)具有單一反義股之單股寡核苷酸，其中該反義股(或該反義股之部分)係藉由Ago2核酸內切酶用於切割標的mRNA (例如在CNS中表現之標的mRNA)。
如本文所使用之「股」係指通過核苷酸間鍵聯(例如磷酸二酯鍵聯或硫代磷酸酯鍵聯)而連結在一起的核苷酸之單一連續序列。在一些實施態樣中，股具有兩個游離端(例如5′端和3′端)。
如本文所使用之「個體」意指任何哺乳動物，包括小鼠、兔及和人類。在一個實施態樣中，個體為人類或NHP。而且，「個人」或「患者」可與「個體」互換使用。
如本文所使用之「合成」係指經人工合成(例如使用機器(例如固態核酸合成器))或除此之外不自正常地產生分子的天然來源(例如細胞或生物體)衍生之核酸或其他分子。
如本文所使用之「靶向配體」係指選擇性地結合至關注的組織或細胞之同源分子(例如受體)及出於靶向其他物質至關注的組織或細胞之目的而與另一物質可結合的分子(例如碳水化合物、胺基糖、膽固醇、多肽或脂質)。例如，在一些實施態樣中，靶向配體可出於靶向寡核苷酸至關注的特定組織或細胞之目的而與寡核苷酸結合。在一些實施態樣中，靶向配體選擇性地結合至細胞表面受體。因此，在一些實施態樣中，當靶向配體與寡核苷酸結合時，靶向配體係通過選擇性地結合至表現在細胞表面上的受體及以包含寡核苷酸、靶向配體和受體的複合細胞之核內體內化而促成寡核苷酸遞送至特定細胞中。在一些實施態樣中，靶向配體係經由連結子與寡核苷酸結合，該連結子係在細胞內化後或期間切割，使得寡核苷酸在細胞中自靶向配體釋放。
如本文所使用之「四鹼基環圈」係指增加由核苷酸之側接序列雜交所形成之相鄰的雙螺旋的穩定性之環圈。增加的穩定性係以相鄰的主幹雙螺旋增加的熔融溫度(T m)檢測，其比來自由隨機選擇的核苷酸序列組成之一組長度可相比的環圈之相鄰的主幹雙螺旋所預期之平均T m高。例如，四鹼基環圈可於10 mM NaHPO 4中賦予包含至少2個鹼基對(bp)長度的雙螺旋之髮夾至少約50℃、至少約55℃、至少約56℃、至少約58℃、至少約60℃、至少約65℃或至少約75℃之T m。在一些實施態樣中，四鹼基環圈可藉由堆疊相互作用而使相鄰的主幹雙螺旋之bp穩定。另外，在四鹼基環圈的核苷酸之中的相互作用包括但不限於非瓦生克立克鹼基配對、堆疊相互作用、氫鍵結和接觸相互作用(Cheong等人之(1990) Nature346:680-682；Heus & Pardi (1991) Science 253:191-94)。在一些實施態樣中，四鹼基環圈包含或由3至6個核苷酸組成，且通常為4至5個核苷酸。在特定的實施態樣中，四鹼基環圈包含或由3、4、5或6個核苷酸組成，其可經或可不經修飾(例如其可與或可不與靶向部分結合)。在一個實施態樣中，四鹼基環圈由4個核苷酸組成。任何核苷酸可用於四鹼基環圈中且可使用此等核苷酸之標準的IUPAC-IUB符號，如Cornish-Bowden (1985) Nucleic Acids Res. 13:3021-30中所述。例如，可使用字母「N」意指任何鹼基可於該位置中，可使用字母「R」顯示A (腺嘌呤)或G (鳥嘌呤)可於該位置中，及可使用「B」顯示C (胞嘧啶)、G (鳥嘌呤)、T (胸腺嘧啶)或U (脲嘧啶)可於該位置中。四鹼基環圈的實例包括四鹼基環圈之UNCG家族(例如UUCG)、四鹼基環圈之GNRA家族(例如GAAA)和CUUG四鹼基環圈(Woese等人之(1990) Proc. Natl. Acad. Sci . USA87:8467-71；Antao等人之(1991) Nucleic Acids Res. 19:5901-05)。DNA四鹼基環圈的實例包括四鹼基環圈之d(GNNA)家族(例如d(GTTA))、四鹼基環圈之d(GNRA)家族、四鹼基環圈之d(GNAB)家族、四鹼基環圈之d(CNNG)家族和四鹼基環圈之d(TNCG)家族(例如d(TTCG))。參見例如Nakano等人之(2002) Biochem .41:4281-92；Shinji等人之(2000) Nippon Kagakkai Koen Yokoshu 78:731。在一些實施態樣中，四鹼基環圈包含在切口型四鹼基環圈結構內。
如本文所使用之「治療(treat或treating)」係指出於改進有關現有病症(例如疾病、失調)的個體之健康及/或安康或預防或減少病症發生的可能性之目的而對有其需要的個體提供護理之作為，例如對個體投予治療劑(例如本文之RNAi寡核苷酸結合體)。在一些實施態樣中，治療涉及降低個體所經歷之病症(例如疾病、失調)的至少一種徵兆、症狀或促成因素之頻率或嚴重性。
為了可以更充分地理解本文所述之本發明，提出以下實施例。以本申請所述之實施例係以例證本文提供之方法、組成物及系統而給出，且不應以任何方式解釋成限制彼等的範圍。 縮寫
Ac： 乙醯基
AcOH： 乙酸
ACN： 乙腈
Ad： 金剛烷基
AIBN： 2,2'-偶氮雙異丁腈
Anhyd： 無水
Aq： 水性
B 2Pin 2： 雙(頻哪醇基)二硼-4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-二(1,3,2-二氧硼雜環戊烷)
BINAP： 2,2'-雙(二苯膦基)-1,1'-聯萘
BH 3： 硼烷
Bn： 苯甲基
Boc： 三級丁氧基羰基
Boc 2O： 二碳酸二-三級丁酯
BPO： 過氧化苯甲醯
nBuOH： 正丁醇
CDI： 羰基二咪唑
COD： 環辛二烯
d： 天
DABCO： 1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷
DAST： 三氟化二乙胺基硫
dba： 二苯亞甲基丙酮
DBU： 1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯
DCE： 1,2-二氯乙烷
DCM： 二氯甲烷
DEA： 二乙胺
DHP： 二氫吡喃
DIBAL-H： 二異丁基氫化鋁
DIPA： 二異丙胺
DIPEA或DIEA： N,N-二異丙基乙胺
DMA： N,N-二甲基乙醯胺
DME： 1,2-二甲氧基乙烷
DMAP： 4-二甲基胺基吡啶
DMF： N,N-二甲基甲醯胺
DMP： 迪斯-馬丁高碘烷 (Dess-Martin periodinane)
DMSO： 二甲亞碸
DMTr： 4,4’-二甲氧基三苯甲基
DPPA： 疊氮磷酸二苯酯
dppf： 1,1’-雙(二苯膦基)二茂鐵
EDC或EDCI： 1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽
ee： 鏡像異構物超越量
ESI： 電噴灑游離
EA： 乙酸乙酯
EtOAc： 乙酸乙酯
EtOH： 乙醇
FA： 甲酸
h或hrs： 小時
HATU： N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸鹽
HCl： 氫氯酸
HPLC： 高效能液相層析術
HOAc： 乙酸
IBX： 2-碘醯基苯甲酸
IPA： 異丙醇
KHMDS： 六甲基二矽氮化鉀
K 2CO 3： 碳酸鉀
LAH： 氫化鋰鋁
LDA： 二異丙基胺化鋰
L-DBTA： 二苯甲醯基-L-酒石酸
m-CPBA： 間氯過苯甲酸
M： 莫耳濃度
MeCN： 乙腈
MeOH： 甲醇
Me 2S： 二甲硫
MeONa： 甲醇鈉
MeI： 碘甲烷
min： 分鐘
mL： 毫升
mM： 毫莫耳濃度
mmol： 毫莫耳
MPa： 百萬帕斯卡
MOMCl： 甲基氯甲醚
MsCl： 甲磺醯氯
MTBE： 甲基三級丁醚
nBuLi： 正丁基鋰
NaNO 2： 亞硝酸鈉
NaOH： 氫氧化鈉
Na 2SO 4： 硫酸鈉
NBS： N-溴琥珀醯亞胺
NCS： N-氯琥珀醯亞胺
NFSI： N-氟苯磺醯亞胺
NMO： N-甲基嗎啉N-氧化物
NMP： N-甲基吡咯啶
NMR： 核磁共振
oC： 攝氏度
Pd/C： 鈀/碳
Pd(OAc) 2： 乙酸鈀
PBS： 經磷酸鹽緩衝之鹽水
PE： 石油醚
POCl 3： 磷醯氯
PPh 3： 三苯膦
PyBOP： (苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶基鏻六氟磷酸鹽
Rel： 相對
R.T.或rt： 室溫
s或sec： 秒
sat： 飽和
SEMCl： 氯甲基-2-三甲基矽基乙醚
SFC： 超臨界流體層析術
SOCl 2： 二氯化硫
tBuOK： 三級丁醇鉀
TBAB： 溴化四丁基銨
TBAF： 氟化四丁基銨
TBAI： 碘化四丁基銨
TEA： 三乙胺
Tf： 三氟甲磺酸酯
TfAA、TFMSA或Tf 2O： 三氟甲磺酸酐
TFA： 三氟乙酸
TIBSCl： 2,4,6-三異丙基苯磺醯氯
TIPS： 三異丙基矽基
THF： 四氫呋喃
THP： 四氫吡喃
TLC： 薄層層析術
TMEDA： 四甲基乙二胺
pTSA： 對甲苯磺酸
UPLC： 超效能液相層析術
wt： 重量
Xantphos： 4,5-雙(二苯膦基)-9,9-二甲基二苯并哌喃
通用合成方法
以下的實施例旨在例證本揭示且不應被解釋為對其的限制。溫度係以攝氏度(C)給出。如沒有另外提及，則所有的蒸發皆在減壓下執行，較佳地介於約15 mm Hg與100 mm Hg (= 20至133毫巴)之間。最終產物、中間物及起始材料的結構係以標準的分析方法確認，例如微量分析和光譜特徵，例如MS、IR、NMR。所使用的縮寫為那些本技術常規的縮寫。
用於合成本揭示之核酸或其類似物的所有起始材料、建構單元、試劑、酸、鹼、脫水劑、溶劑及催化劑係於市場上取得或可以本技術之普通技能者已知的有機合成方法生產(Methods of Organic Synthesis, Thieme, Volume 21 (Houben-Weyl 4th Ed. 1952))。再者，本揭示之核酸或其類似物可以本技術之普通技能者已知的如以下實施例所示之有機合成方法生產。
所有的反應皆在氮氣或氬氣下進行，除非另有其他陳述。
質子NMR ( 1H NMR)係在氘化溶劑中進行。在本文所揭示之特定核酸或其類似物中，一或多個 1H位移係與殘留的蛋白溶劑(proteo solvent)信號重疊；該等信號未於下文提供之實驗中報告。
如以下實施例所描述，在特定的示例性實施態樣中，核酸或其類似物係根據以下的通用程序製備。應意識到儘管通用方法描述本揭示之特定核酸或其類似物的合成，但是以下的通用方法及本技術之普通技能者已知的其他方法可應用於如本文所述之所有核酸或其類似物及該等核酸或其類似物中之各者的子類別和種類。 製備雙股RNAi寡核苷酸之通用方法 寡核苷酸合成及純化
在以下實施例中所述之雙股RNAi (dsRNA)寡核苷酸係使用本文所述之方法經化學合成。除了使用已知的亞磷醯胺酸酯合成(參見例如Hughes和Ellington之(2017) Cold Spring Harb Perspect Biol .9(1):a023812；Beaucage S.L.、Caruthers M.H.之Studies on Nucleotide Chemistry V: Deoxynucleoside Phosphoramidites-A New Class of Key Intermediates for Deoxypolynucleotide Synthesis. Tetrahedron Lett. 1981;22:1859-1862. doi: 10.1016/ S0040-4039(01)90461-7)以外，dsRNAi寡核苷酸通常亦使用如用於19-23mer siRNA之固相寡核苷酸合成方法合成(參見例如Scaringe等人之(1990) Nucleic Acids Res .18:5433-5441和Usman等人之(1987) J. Am. Chem . Soc.109:7845-7845；亦參見美國專利案號5,804,683；5,831,071；5,998,203；6,008,400；6,111,086；6,117,657；6,353,098；6,362,323；6,437,117和6,469,158)。
各個RNA股係根據標準方法合成及經HPLC純化(Integrated DNA Technologies；Coralville, IA)。例如，RNA寡核苷酸係使用固相亞磷醯胺酸酯化學合成、去保護及在NAP-5管柱(Amersham Pharmacia Biotech；Piscataway, NJ)上使用標準技術脫鹽(Damha & Olgivie (1993) Methods Mol. Biol. 20:81-114；Wincott等人之(1995) Nucleic Acids Res. 23:2677-2684)。寡聚物係使用離子交換高效能液相層析術(IE-HPLC)在Amersham Source 15Q管柱(1.0 cm×25 cm；Amersham Pharmacia Biotech)上使用15 min步進式線性梯度純化。梯度係自90：10之緩衝劑A：B變化至52：48之緩衝劑A：B，其中緩衝劑A為100 mM Tris pH 8.5及緩衝劑B為100 mM Tris pH 8.5、1M NaCl。在260 nm下監測樣品且收集對應於全長寡核苷酸種類之峰、匯集、在NAP-5管柱上脫鹽且凍乾。
各寡聚物的純度係以毛細管電泳(CE)在Beckman PACE 5000 (Beckman Coulter, Inc.；Fullerton, CA)上測定。CE毛細管具有100 μm內徑且含有ssDNA 100R凝膠(Beckman-Coulter)。通常將約0.6 nmol之寡核苷酸注射至毛細管中，在444 V/cm之電場中電泳且在260 nm檢測UV吸光度。變性Tris-硼酸鹽-7 M-脲電泳緩衝劑係自Beckman-Coulter購得。獲得寡核糖核苷酸，其以CE評定為至少90%純度，用於下述實驗中。化合物同一性係以基質輔助雷射脫附游離飛行時間(MALDI-TOF)質譜法在Voyager DE™ Biospectometry工作站(Applied Biosystems；Foster City, CA)上遵照製造商的建議方案驗證。獲得所有寡聚物之相對分子質量，通常在預期分子質量之0.2%內。 製備雙螺旋
將單股RNA寡聚物再懸浮(例如以100 μM濃度)於100 mM乙酸鉀、30 mM HEPES，pH 7.5組成之雙螺旋緩衝劑中。將互補的有義股及反義股以等莫耳量混合以產出例如50 μM雙螺旋最終溶液。將樣品針對5′在RNA緩衝劑(IDT)中加熱至100℃且容許在使用前冷卻至室溫。將ds RNA寡核苷酸儲存在-20℃下。將單股RNA寡聚物凍乾儲存或在無核酸酶水中儲存於-80℃下。 實施例 1 ： 2-(2-((((6aR,8R,9R,9aR)-8-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-2,2,4,4- 四異丙基四氫 -6H- 呋喃并 [3,2-f][1,3,5,2,4] 三氧雜二矽辛因基 (disilocin)-9- 基 ) 氧基 ) 甲氧基 ) 乙氧基 ) 乙烷 1- 甲酸銨 (1-6) 的合成
Figure 02_image365
將20 mL之DMF中的化合物1-1 (25.00 g，67.38 mmol)之溶液在10℃下以吡啶(11 mL，134.67 mmol)及四異丙基二矽氧烷二氯化物(22.63 mL，70.75 mmol)處理。將所得混合物在25℃下攪拌3 h且以20%之檸檬酸(50 mL)淬滅。將水層以EtOAc (3X50 mL)萃取且將合併的有機層在真空中濃縮。將粗製殘留物自MTBE與正庚烷之混合物(1：15，320 mL)再結晶以供給成為白色油性固體的化合物1-2 (37.20 g，90%)。
將20 mL之DMSO中的化合物1-2 (37.00 g，60.33 mmol)之溶液以AcOH (20 mL，317.20 mmol)及Ac 2O (15 mL，156.68 mmol)處理。將混合物在25℃下攪拌15 h。將反應以EtOAc (100 mL)稀釋且以sat. K 2CO 3(50 mL)淬滅。將水層以EtOAc (3X50 mL)萃取。將合併的有機層濃縮且以ACN (30 mL)再結晶以供給成為白色固體的化合物1-3 (15.65 g，38.4%)。
將120 mL之DCM中的化合物1-3 (20.00 g，29.72 mmol)之溶液在25℃下以Fmoc-胺基-乙氧基乙醇(11.67 g，35.66 mmol)處理。將混合物攪拌以供給透明溶液且接著以4Å分子篩(20.0 g)、 N-碘琥珀醯亞胺(8.02 g，35.66 mmol)及TfOH (5.25 mL，59.44 mmol)處理。將混合物在30℃下攪拌，直到HPLC分析表明化合物1-3的消耗＞95%。將反應以TEA (6 mL)淬滅且過濾。將過濾物以稀釋EtOAc，以sat. NaHCO 3(2X100 mL)、sat. Na 2SO 3(2X100 mL)及水(2X100 mL)清洗且在真空中濃縮，以供給成為黃色固體的粗製化合物1-4 (26.34 g，93.9%)，將其直接用於下一步驟而無需進一步純化。
將DCM/水之混合物(10：7，170 mL)中的化合物1-4 (26.34 g，27.62 mmol)之溶液在5℃下以DBU (7.00 mL，45.08 mmol)處理。將混合物在5至25℃下攪拌1 h。接著將有機層分離，以水(100 mL)清洗且以DCM (130 mL)稀釋。將溶液以反丁烯二酸(7.05 g，60.76 mmol)及4Å分子篩(26.34 g)分四部分處理。將混合物攪拌1 h，濃縮且自MTBE與DCM之混合物(5：1)再結晶以供給成為白色固體的化合物1-6 (14.74 g，62.9%)： 1H NMR (400 MHz, d 6 -DMSO) 8.73 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.15-8.02 (m, 2H), 7.65-7.60 (m, 1H), 7.59-7.51 (m, 2H),  6.52 (s, 2H), 6.15(s, 1H), 5.08-4.90 (m, 3H), 4.83-4.78 (m, 1H), 4.15-3.90 (m, 3H), 3.79-3.65 (m, 2H), 2.98-2.85 (m, 6H), 1.20-0.95 (m, 28H)。 實施例 2 ：二異丙基亞磷醯胺酸 (2R,3R,4R,5R)-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 )-4-((2-(2-[ 脂質 ]- 醯胺基乙氧基 ) 乙氧基 ) 甲氧基 ) 四氫呋喃 -3- 基 (2- 氰乙基 ) 酯 (2-4a 至 2-4e) 的合成
Figure 02_image367
將150 mL之2-甲基四氫呋喃中的化合物1-6 (50.00 g，59.01 mmol)之溶液以冰冷水性K 2HPO 4(6%，100 mL)及鹽水(20%，2X100 mL)清洗。將有機層分離且在0℃下以己酸(10.33 mL，82.61 mmol)、HATU (33.66 g，88.52 mmol)及DMAP (10.81 g，147.52 mmol)處理。將所得混合物溫熱至25℃且攪拌1 h。將溶液以水(2X100 mL)、鹽水(100 mL)清洗且在真空中濃縮以供給粗製殘留物。以矽膠上的快速層析術(1：1之己烷/丙酮)給出成為白色固體的化合物2-1a (34.95 g，71.5%)。
將80 mL之THF中的化合物2-1a (34.95 g，42.19 mmol)與TEA (9.28 mL，126.58 mmol)之混合物在10℃下以三乙胺三氟化氫(20.61 mL，126.58 mmol)逐滴處理。將混合物溫熱至25℃且攪拌2 h。將反應濃縮，溶解在DCM (100 mL)中且以sat. NaHCO 3(5X20 mL)及鹽水(50 mL)清洗。將有機層在真空中濃縮以供給粗製化合物2-2a (24.72 g，99%)，將其直接用於下一步驟而無需進一步純化。
將50 mL之DCM中的化合物2-2a (24.72 g，42.18 mmol)之溶液以 N-甲基嗎啉(18.54 mL，168.67 mmol)及DMTr-Cl (15.69 g，46.38 mmol)處理。將混合物在25℃下攪拌2 h且以sat. NaHCO 3(50 mL)淬滅。將有機層分離，以水清洗，濃縮以供給漿狀粗製物。以矽膠上的快速層析術(1：1之己烷/丙酮)給出成為白色固體的化合物2-3a (30.05 g，33.8 mmol，79.9%)。
將50 mL之DCM中的化合物2-3a (25.00 g，28.17 mmol)之溶液在氮氣氛下以 N-甲基嗎啉(3.10 mL，28.17 mmol)及四唑(0.67 mL，14.09 mmol)處理。將雙(二異丙基胺基)氯膦(9.02 g，33.80 mmol)逐滴添加至溶液中且將所得混合物在25℃下攪拌4 h。將反應以水(15 mL)淬滅且將水層以DCM (3X50 mL)萃取。將合併的有機層以sat. NaHCO 3(50 mL)清洗，濃縮以供給粗製固體，將其自DCM/MTBE/正己烷之混合物(1：4：40)再結晶以供給成為白色固體的化合物2-4a (25.52 g，83.4%)： 1H NMR (400 MHz, d 6 -DMSO) 11.25 (s, 1H), 8.65-8.60 (m, 2 H), 8.09-8.02 (m, 2H), 7.71 (s, 1H), 7.67-7.60 (m, 1H), 7.59-7.51 (m, 2H), 7.38-7.34 (m, 2H), 7.30-7.25 (m, 7H), 6.85-6.79 (m, 4H), 6.23-6.20 (m, 1H), 5.23-5.14 (m, 1H), 4. 80-4.69 (m, 3H), 4.33-4.23 (m, 2H), 3.90-3.78 (m, 1H), 3.75 (s, 6H), 3.74-3.52 (m, 3H), 3.50-3.20 (m, 6H), 3.14-3.09 (m, 2H), 3.09 (s, 1H), 2.82-2.80 (m, 1H), 2.65-2.60 (m, 1H), 2.05-1.96 (m, 2H), 1.50-1.39 (m, 2H), 1.31-1.10 (m, 14H), 1.08-1.05 (m, 2 H), 0.85-0.79 (m, 3H)； 31P NMR (162 MHz, d 6 -DMSO) 149.43, 149.18。
化合物2-4b、2-4c、2-4d和2-4e係使用與上文以化合物2-4a所述之類似程序製備。獲得成為白色固體的化合物2-4b (25.50 g，85.4%)： 1H NMR (400 MHz, d 6 -DMSO) 11.23 (s, 1H), 8.65-8.60 (m, 2 H), 8.05-8.02 (m, 2H), 7.73-7.70 (m, 1H), 7.67-7.60 (m, 1H), 7.59-7.51 (m, 2H), 7.38-7.34 (m, 2H), 7.30-7.25 (m, 7H), 6.89-6.80 (m, 4H), 6.21-6.15 (m, 1H), 5.23-5.17 (m, 1H), 4. 80-4.69 (m, 3H), 4.40-4.21 (m, 2H), 3.91-3.80 (m, 1H), 3.74 (s, 6H), 3.74-3.52 (m, 3H), 3.50-3.20 (m, 6H), 3.14-3.09 (m, 2H), 3.09 (s, 1H), 2.83-2.79 (m, 1H), 2.68-2.62 (m, 1H), 2.05-1.97 (m, 2H), 1.50-1.38 (m, 2H), 1.31-1.10 (m, 18H), 1.08-1.05 (m, 2H), 0.85-0.78 (m, 3H)； 31P NMR (162 MHz, d 6 -DMSO) 149.43, 149.19。
獲得成為灰白色固體的化合物2-4c (36.60 g，66.3%)： 1H NMR (400 MHz, d 6 -DMSO) 11.22 (s, 1H), 8.64-8.59 (m, 2H), 8.05-8.00 (m, 2H), 7.73-7.70 (m, 1H), 7.67-7.60 (m, 1H), 7.59-7.51 (m, 2H), 7.38-7.34 (m, 2H), 7.30-7.25 (m, 7H), 6.89-6.80 (m, 4H), 6.21-6.15 (m, 1H), 5.25-5.17 (m, 1H), 4.80-4.69 (m, 3H), 4.40-4.21 (m, 2H), 3.91-3.80 (m, 1H), 3.74 (s, 6H), 3.74-3.50 (m, 3H), 3.50-3.20 (m, 6H), 3.14-3.09 (m, 2H), 3.09 (s, 1H), 2.83-2.79 (m, 1H), 2.68-2.62 (m, 1H), 2.05-1.99 (m, 2H), 1.50-1.38 (m, 2H), 1.33-1.12 (m, 38H), 1.08-1.05 (m, 2 H), 0.86-0.80 (m, 3H)； 31P NMR (162 MHz, d 6 -DMSO) 149.42, 149.17。
獲得成為灰白色固體的化合物2-4d (26.60 g，72.9%)： 1H NMR (400 MHz, d 6 -DMSO) 11.22 (s, 1H), 8.64-8.59 (m, 2H), 8.05-8.00 (m, 2H), 7.73-7.70 (m, 1H), 7.67-7.60 (m, 1H), 7.59-7.51 (m, 2H), 7.38-7.33 (m, 2H), 7.30-7.25 (m, 7H), 6.89-6.80 (m, 4H), 6.21-6.15 (m, 1H), 5.22-5.17 (m, 1H), 4.80-4.69 (m, 3H), 4.40-4.21 (m, 2H), 3.91-3.80 (m, 1H), 3.74 (s, 6H), 3.74-3.52 (m, 3H), 3.50-3.20 (m, 6H), 3.14-3.09 (m, 2H), 3.09 (s, 1H), 2.83-2.79 (m, 1H), 2.68-2.62 (m, 1H), 2.05-1.99 (m, 2H), 1.50-1.38 (m, 2H), 1.35-1.08 (m, 38H), 1.08-1.05 (m, 2 H), 0.85-0.79 (m, 3H)； 31P NMR (162 MHz, d 6 -DMSO) 149.47, 149.22。
獲得成為白色固體的化合物2-4e (38.10 g，54.0%)： 1H NMR (400 MHz, d 6 -DMSO) 11.21 (s, 1H), 8.64-8.59 (m, 2H), 8.05-8.00 (m, 2H), 7.73-7.70 (m, 1H), 7.67-7.60 (m, 1H), 7.59-7.51 (m, 2H), 7.38-7.34 (m, 2H), 7.30-7.25 (m, 7H), 6.89-6.80 (m, 4H), 6.21-6.15 (m, 1H), 5.23-5.17 (m, 1H), 4.80-4.69 (m, 3H), 4.40-4.21 (m, 2H), 3.91-3.80 (m, 1H), 3.73 (s, 6H), 3.74-3.52 (m, 3H), 3.47-3.22 (m, 6H), 3.14-3.09 (m, 2H), 3.09 (s, 1H), 2.83-2.79 (m, 1H), 2.68-2.62 (m, 1H), 2.05-1.99 (m, 2H), 1.50-1.38 (m, 2H), 1.35-1.06 (m, 46H), 1.08-1.06 (m, 2 H), 0.85-0.77 (m, 3H)； 31P NMR (162 MHz, d 6 -DMSO) 149.41, 149.15。 實施例 3 ： GalXC RNAi 寡核苷酸 - 脂質結合體的合成流程1. 具有與四鹼基環圈結合之單脂質(直鏈和支鏈)之GalXC RNAi寡核苷酸-脂質結合體的合成。合成後結合係通過醯胺偶合反應實現。
Figure 02_image369
R 1COOH基團表示脂肪酸C8:0、C10:0、C11:0、C12:0、C14:0、C16:0、C17:0、C18:0、C18:1、C18:2、C22:5、C22:0、C24:0、C26:0、C22:6、C24:1、二醯基C16:0或二醯基C18:1
Figure 02_image371
合成有義股1及反義股1係以固相合成法製備。 經結合之有義股1a-1i的合成
經結合之有義股1a係通過合成後結合方法合成。在離心管1中，將DMA (0.75 mL)中的辛酸(0.58 mg，4 umol)之溶液在rt下以HATU (1.52 mg，4 umol)處理。在離心管2中，將H 2O (0.25 mL)中的寡有義股1 (10.00 mg，0.8 umol)之溶液以DIPEA (1.39 uL，8 umol)處理。將離心管1中的溶液添加至離心管2中且使用ThermoMixer在rt下混合。在以LC-MS分析表明反應完成後，將反應混合物以5 mL之水稀釋且以反相XBridge C18管柱使用ACN中的100 mM TEAA及H 2O之5至95%梯度純化。將產物流份使用Genevac在減壓下濃縮。將合併的殘留溶劑使用Amicon® Ultra-15 Centrifugal (3K)對水(1 X)、鹽水(1 X)及水(3 X)透析。將Amicon薄膜以水(3 X 2 mL)清洗且接著將合併的溶劑凍乾以供給非晶形白色固體的經結合之有義股1a (6.43 mg，64%之產率)。
經結合之有義股1b-1i係使用與合成經結合之有義股1a所述之類似程序製備且以42%至69%之產率獲得。 黏著雙螺旋1a-1j
將經結合之有義股1a (10 mg，以重量測量)溶解在0.5 mL之去離子水中以製備20 mg/mL之溶液。將反義股1 (10 mg，以OD測量)溶解在0.5 mL之去離子水中以製備20 mg/mL之溶液，使用其滴定經結合之有義股且量化雙螺旋量。基於經結合之有義股及反義股兩者之莫耳量的計算，將一定比例的所需反義股1添加至經結合之有義股1a溶液中。將所得混合物在95℃下攪拌5 min且容許冷卻至rt。黏著進度係以離子交換HPLC監測。基於黏著進度，進一步添加若干比例的反義股1以完成純度＞95%之黏著。將溶液凍乾以供給雙螺旋1a (C8)且其量係基於黏著所消耗的反義股之莫耳量計算。
雙螺旋1b-1i係使用與黏著雙螺旋1a (C8)所述之相同程序製備。
以下流程1-2描述在環圈上具有單一脂質之切口型四鹼基環圈GalXC結合體的合成。合成後結合係通過經Cu催化之炔-疊氮化物環加成反應實現。
Figure 02_image373
流程1-2
有義股1B及反義股1B係以固相合成法製備。 經結合之有義股1j的合成
在離心管1中，將DMA/H 2O的3：1之混合物(0.5 mL)中的寡(10.00 mg，0.8 umol)之溶液以脂質連結子疊氮化物(11.26 mg，4 umol)處理。在離心管2中，將CuBr二甲硫(1.64 mg，8 umol)溶解在ACN (0.5 mL)中。將兩個溶液以起泡的N 2通過10 min而脫氣。接著將CuBrSMe 2之ACN溶液添加至離心管1中且將所得混合物在40℃下攪拌。在以LC-MS分析表明反應完成後，將反應混合物以0.5 M EDTA (2 mL)稀釋且使用Amicon® Ultra-15 Centrifugal (3K)對水(2 X)透析。將反應粗製物以反相XBridge C18管柱使用ACN中的100 mM TEAA (摻入30%之IPA)及H 2O之5至95%梯度純化。將產物流份使用Genevac在減壓下濃縮。將合併的殘留溶劑使用Amicon® Ultra-15 Centrifugal (3K)對水(1 X)、鹽水(1 X)及水(3 X)透析。將Amicon薄膜以水(3 X 2 mL)清洗且接著將合併的溶劑凍乾以供給非晶形白色固體的經結合之有義股1j (6.90 mg，57%之產率)。
雙螺旋1j (PEG2K-二醯基C18)係使用與黏著雙螺旋1a (C8)所述之相同程序製備。
以下流程1-3描述在環圈上具有二脂質之切口型四鹼基環圈GalXC結合體的合成，其係使用合成後結合方法。
Figure 02_image375
流程1-3 有義股2及反義股2係以固相合成法製備。
經結合之有義股2a和2b係使用與合成經結合之有義股1a所述之類似程序，但是以10 eq之脂質、10 eq之HATU及20 eq之DIPEA製備。
雙螺旋2a (2XC11)和2b (2XC22)係使用與黏著雙螺旋1a (C8)所述之相同程序製備。
以下流程1-4描述與單一脂質結合之完全硫代磷酸化主幹-環圈之GalXC的合成，其係使用合成後結合方法。
Figure 02_image377
流程1-4 有義股3及反義股3係以固相合成法製備。
經結合之有義股3a係使用與合成經結合之有義股1a所述之類似程序製備且以65%之產率獲得。
雙螺旋3a (PS-C22)係使用與黏著雙螺旋1a (C8)所述之相同程序製備。
以下流程1-5描述與單一脂質結合之短有義股之GalXC的合成，其係使用合成後結合方法。
Figure 02_image379
流程1-5 有義股4及反義股4係以固相合成法製備。
經結合之有義股4a係使用與合成經結合之有義股1a所述之類似程序製備且以74%之產率獲得。
雙螺旋4a (SS-C22)係使用與黏著雙螺旋1a (C8)所述之相同程序製備。
以下流程1-6描述在環圈上與三金剛烷部分結合之切口型四鹼基環圈GalXC的合成，其係使用合成後結合方法。
Figure 02_image381
流程1-6 有義股5及反義股5係以固相合成法製備。
經結合之有義股5a和5b係使用與合成經結合之有義股1a所述之類似程序製備且以42%至73%之產率獲得。
雙螺旋5a (3X金剛烷)和雙螺旋5b (3X乙醯基金剛烷)係使用與黏著雙螺旋1a (C8)所述之相同程序製備。
以下流程1-7描述在環圈上與脂質結合之切口型四鹼基環圈GalXC的固相合成法之實例。
Figure 02_image383
流程1-7 經結合之有義股6的合成
經結合之有義股6係使用市售的寡合成器以固相合成法製備。寡核苷酸係使用經2’-修飾之核苷亞磷醯胺酸酯合成，諸如使用經2’-F或2’-OMe和2'-二乙氧基甲醇連結之脂肪酸醯胺核苷亞磷醯胺酸酯。寡核苷酸合成係使用標準的寡核苷酸合成方案以3’至5’方向在撐體上進行。5-乙硫基-1H-四唑(ETT)係用作為偶合反應之活化劑。碘溶液係用於亞磷酸三酯氧化反應。3-(二甲基胺基亞甲基)胺基-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)係用於形成硫代磷酸酯鍵聯。將合成之寡核苷酸以濃縮水性銨處理10 h。自懸浮液移除氨且以過濾移除撐體殘留物。將粗製寡核苷酸以TEAA處理、分析且將其以強陰離子交換高效能液相層析術(SAX-HPLC)純化。將流份合併且使用Amicon® Ultra-15 Centrifugal (3K)對水(3 X)、鹽水(1 X)及水(3 X)透析。接著將殘留溶劑凍乾以供給所欲經結合之有義股6。
雙螺旋6係使用與黏著雙螺旋1a (C8)所述之相同程序製備。 流程8. 在環圈上與一個金剛烷單元結合之切口型四鹼基環圈GalXC的合成，其係經由合成後結合方法。
Figure 02_image385
流程1-8 經結合之有義股7a和7b的合成
經結合之有義股7a和有義股7b係使用與合成經結合之有義股5相同的方法或實質上類似的方法獲得。 雙螺旋7a和7b的合成實施例
雙螺旋7a和雙螺旋7b係使用與合成雙螺旋5相同的方法或實質上類似的方法獲得。
流程9. 在環圈上與兩個金剛烷單元結合之切口型四鹼基環圈GalXC的合成，其係經由合成後結合方法。
Figure 02_image387
流程1-9 經結合之有義股8a和8b的合成
經結合之有義股8a和有義股8b係使用與合成經結合之有義股5相同的方法或實質上類似的方法獲得。 雙螺旋8a和8b的合成實施例
雙螺旋8a和雙螺旋8b係使用與合成雙螺旋5相同的方法或實質上類似的方法獲得。
以下流程1-10描述與單一脂質結合之短有義股及短主幹環圈之GalXC的合成，其係使用合成後結合方法。
Figure 02_image389
流程1-10 有義股9a的合成
經結合之有義股9a係使用與合成經結合之有義股5相同的方法或實質上類似的方法獲得。 雙螺旋9a的合成實施例
雙螺旋9a係使用與合成雙螺旋5相同的方法或實質上類似的方法獲得。
以下流程1-11描述在5’端上與單一脂質結合之GalXC的合成，其係使用合成後結合方法。
Figure 02_image391
流程1-11 經結合之有義股10a的合成
經結合之有義股10a係使用與合成經結合之有義股5相同的方法或實質上類似的方法獲得。 雙螺旋10a的合成實施例
雙螺旋10a係使用與合成雙螺旋5相同的方法或實質上類似的方法獲得。
以下流程1-12a和1-12b描述在3’端或5’端上與單一脂質結合之具有鈍端之GalXC的合成，其係使用合成後結合方法。
Figure 02_image393
流程1-12a
Figure 02_image395
流程1-12b 經結合之有義股11a和12a的合成
經結合之有義股11a和12a係使用與合成經結合之有義股5相同的方法或實質上類似的方法獲得。 雙螺旋11a和12a的合成實施例
雙螺旋11a和12a係使用與合成雙螺旋5相同的方法或實質上類似的方法獲得。
結合體雙螺旋8D和雙螺旋9D係使用與合成雙螺旋5相同的方法或實質上類似的方法獲得。 實施例 4 ：經 GalNAc- 結合之 RNAi 寡核苷酸降低囓齒動物之中樞神經系統中的基因表現
為了評估以本文及/或實施例1至3中所述之通用方法所產生的經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸降低中樞神經系統(CNS)中的標的基因表現的能力，將小鼠或大鼠以經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸處理，其係經由腦室內(i.c.v.)或鞘內(i.t.)投予腦脊髓液(CSF)中而靶向鼠類或大鼠 Aldh2(另一選擇為本文之「mALDH2」或「rALDH2」) mRNA，且測定對囓齒動物(小鼠和大鼠) CNS中的 Aldh2表現之後續效應。
簡言之，產生包含具有36-mer過客股及22-mer引導股的經GalNAc-結合之切口型四鹼基環圈結構之RNAi寡核苷酸結合體(下文之「GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸」)，其核苷酸序列於表3中提出。構成GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸之過客股及引導股的核苷酸序列各包含不同圖案的經修飾之核苷酸及硫代磷酸酯鍵聯，如圖12所描述及如下所示。構成GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸之四鹼基環圈的核苷酸中之三者各自與GalNAc部分結合(CAS#14131-60-3；例如參見用於描述經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸的通用結構及化學修飾圖案之圖12)。 有義(過客)股：5’-mX- S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX[-mX-] 10-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’ 雜交至： 反義(引導)股：5’-[Me膦酸酯-4O-mX]- S-fX- S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX- S-mX- S-mX-3’ (修飾關鍵：表2)
Figure 02_image397
構成GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸之核苷酸序列有義股及反義股提供於表3中。
Figure 02_image399
小鼠腦室內(i.c.v.)投予
將表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸以經磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中調配的100 µg (~4 mg/kg)之寡核苷酸單一劑量(n = 4)投予，其係經由腦室內(i.c.v.)注射(10 µl)至6至8週齡雌性CD-1小鼠的腦中。小鼠之對照組(n = 4)僅投予PBS。在注射後五(5)天，將小鼠犧牲。解剖且保存全腦、腰脊髓及肝用於RT-qPCR分析。自體覺皮質區、紋狀體、海馬區、小腦和肝之組織樣品提取RNA，以qPCR測定鼠類 Aldh2mRNA含量(如所示，標準化成內源性管家基因 Hprt)。鼠類 Aldh2mRNA含量係使用PrimeTime™ qPCR探針檢定法(IDT)測定。qPCR係使用由引子對及對鼠類 Aldh2mRNA具有特異性的經螢光標記之5′核酸酶探針組成之PrimeTime™ qPCR探針檢定法執行。在來自經處理之小鼠的樣品中殘留的鼠類 Aldh2mRNA百分比係使用2 -ΔΔCt(「delta-delta Ct」)方法(Livak and Schmittgen (2001) Methods 25:402-408)測定。
如圖1中所示，以i.c.v.投予之經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸降低CNS中的標的基因表現，如藉由在經表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸處理之小鼠的樣品中殘留的鼠類 Aldh2mRNA百分比相對於經PBS處理之對照小鼠的樣品中殘留的鼠類 Aldh2mRNA百分比之比較來確定。此比較確認相對於經PBS處理之對照小鼠，在經表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸處理之小鼠的體覺皮質區、紋狀體、海馬區和小腦中的鼠類 Aldh2mRNA含量降低為GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸之效應的結果。亦在經GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸處理之小鼠的肝中觀察到抑制的鼠類 Aldh2表現(圖1)。該等結果證明經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸在以i.c.v.注射後展現降低CNS的多個不同解剖區域及肝中之標的基因表現的能力。 小鼠劑量範圍及持久性
為了進一步證明以本文及/或實施例1至3中所述之通用方法所產生的經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸降低CNS中的標的基因表現的能力，將表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸以經磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中調配的250 µg (10 mg/kg)或500 µg (20 mg/kg)之寡核苷酸單一劑量(n = 4)投予，其係經由腦室內(i.c.v.)注射(10 µl)至6至8週齡雌性CD-1小鼠的腦中。小鼠之對照組(n = 5)僅投予PBS。在注射後二十一(21)、五十六(56)或八十四(84)天，將小鼠犧牲。解剖且保存全腦及腰脊髓用於RT-qPCR分析。自額葉皮質、海馬區、下視丘、紋狀體、體覺皮質區、小腦、頸脊髓、胸脊髓和腰脊髓之組織樣品提取RNA，以qPCR測定鼠類 Aldh2mRNA含量(如所示，標準化成內源性管家基因 Hprt)。鼠類 Aldh2mRNA含量係使用PrimeTime™ qPCR探針檢定法(IDT)測定。qPCR係使用由引子對及對鼠類 Aldh2mRNA具有特異性的經螢光標記之5′核酸酶探針組成之PrimeTime™ qPCR探針檢定法執行。在來自經處理之小鼠的樣品中殘留的鼠類 Aldh2mRNA百分比係使用2 -ΔΔCt(「delta-delta Ct」)方法(Livak and Schmittgen (2001) Methods 25:402-408)測定。
如圖2和圖3中所示，以i.c.v.投予之經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸係以劑量依賴方式降低CNS中的標的基因表現，如藉由在經表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸處理之小鼠的組織樣品中殘留的鼠類 Aldh2mRNA百分比相對於經PBS處理之對照小鼠的樣品中殘留的鼠類 Aldh2mRNA百分比之比較來確定。降低在經GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸處理之小鼠的組織樣品之鼠類 Aldh2mRNA表現可在單一劑量後至少60天(2個月)測得(圖2和圖3)。該等進一步的結果證明經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸在以i.c.v.注射後展現以劑量依賴方式降低CNS之多個不同解剖區域中的標的基因表現的能力。再者，該等結果證明降低CNS中的標的基因表現可在單一投予後至少兩(2)個月測得，表明經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸在CNS中提供延長的藥效學持久性的能力。 小鼠腰鞘內(i.t.)投予
為了進一步證明以本文及/或實施例1至3中所述之通用方法所產生的經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸降低CNS中的標的基因表現的能力，將表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸以經磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中調配的500 µg (20 mg/kg)之寡核苷酸單一劑量(n = 10)投予，其係經由腰鞘內(i.t.)注射(10 µl)至6至8週齡雌性CD-1小鼠的脊髓中。小鼠之對照組(n = 10)僅投予PBS。在注射後七(7)天，將小鼠犧牲。解剖且保存全腦及腰脊髓用於RT-qPCR分析。自額葉皮質、體覺皮質區、紋狀體、海馬區、下視丘、小腦、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、背根神經節、肝和腎之組織樣品提取RNA，以qPCR測定鼠類 Aldh2mRNA含量(如所示，標準化成內源性管家基因 Hprt)。鼠類 Aldh2mRNA含量係使用PrimeTime™ qPCR探針檢定法(IDT)測定。qPCR係使用由引子對及對鼠類 Aldh2mRNA具有特異性的經螢光標記之5′核酸酶探針組成之PrimeTime™ qPCR探針檢定法執行。在來自經處理之小鼠的樣品中殘留的鼠類 Aldh2mRNA百分比係使用2 -ΔΔCt(「delta-delta Ct」)方法(Livak and Schmittgen (2001) Methods 25:402-408)測定。
如圖4中所示，以腰i.t.投予之經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸降低CNS中的標的基因表現，如藉由在經表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸處理之小鼠的組織樣品中殘留的鼠類 Aldh2mRNA百分比相對於經PBS處理之對照小鼠的樣品中殘留的鼠類 Aldh2mRNA百分比之比較來確定。該等結果證明經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸在以腰i.t.注射後展現降低CNS之多個不同解剖區域中的標的基因表現的能力。 大鼠劑量及持久性
為了進一步證明以本文及/或實施例1至3中所述之通用方法所產生的經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸降低CNS中的標的基因表現的能力，將表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸以經磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中調配的1000 µg (4 mg/kg)或6000 μg (24 mg/kg)之寡核苷酸單一劑量(n = 8)投予，其係經由腰鞘內(i.t.)注射(30 µl)至雌性Sprague-Dawley大鼠的腰脊髓中。
如圖5中所示，以腰i.t.投予之經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸降低CNS中的標的基因表現，如藉由在經表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸處理之大鼠的組織樣品中殘留的大鼠 Aldh2mRNA百分比相對於經PBS處理之對照大鼠的樣品中殘留的大鼠 Aldh2mRNA百分比之比較來確定。該等結果證明經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸在大鼠中以腰i.t.注射後展現降低CNS之多個不同解剖區域中的標的基因表現的能力。 實施例 5 ：經 GalNAc- 結合之 RNAi 寡核苷酸抑制在非人類靈長類動物 (NHP) 之中樞神經系統中的基因表現
為了進一步評估以本文及/或實施例1至3中所述之通用方法所產生的經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸降低中樞神經系統(CNS)中的標的基因表現的能力，將NHP (食蟹獼猴(食蟹獼猴 (Macaca fascicularis))和恆河(恆河獼猴( Macaca mulatta))獼猴)以經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸處理，其係經由腦室內(i.c.v.)或鞘內(i.t.)投予腦脊髓液(CSF)中而靶向 ALDH2mRNA且測定對NHP CNS中的 ALDH2表現之後續效應。 NHP腰鞘內(i.t.)投予
將表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸以經磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中調配的75 mg之寡核苷酸單一劑量投予，其係經由腰鞘內(i.t.)注射(3 mL)至雄性食蟹獼猴NHP (食蟹獼猴；n = 3；平均重量3至3.5 kg)的腰椎中。食蟹獼猴NHP之對照組(n = 3)僅投予PBS。在注射後二十八(28)天，將食蟹獼猴NHP犧牲。解剖且保存全腦和腰脊髓用於RT-qPCR分析。自額葉皮質、尾狀核、海馬區、小腦、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、背根神經節和肝之組織樣品提取RNA，以qPCR測定 ALDH2mRNA含量(如所示，標準化成內源性管家基因 HPRT)。 ALDH2mRNA含量係使用PrimeTime™ qPCR探針檢定法(IDT)測定。qPCR係使用由引子對及對 ALDH2mRNA具有特異性的經螢光標記之5′核酸酶探針組成之PrimeTime™ qPCR探針檢定法執行。在來自經處理之NHP的樣品中殘留的 ALDH2mRNA百分比係使用2 -ΔΔCt(「delta-delta Ct」)方法(Livak and Schmittgen (2001) Methods 25:402-08)測定。
如圖6中所示，以腰i.t.投予之經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸降低食蟹獼猴NHP之CNS中的標的基因表現，如藉由在經表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸處理之食蟹獼猴NHP的組織樣品中殘留的 ALDH2mRNA百分比相對於經PBS處理之對照食蟹獼猴NHP的樣品中殘留的 ALDH2mRNA百分比之比較來確定。該等結果證明經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸在以腰i.t.注射後展現降低NHP CNS之多個不同解剖區域中的標的基因表現的能力。
為了進一步評估表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸降低NHP之中樞神經系統(CNS)中的標的基因表現的能力，將恆河獼猴(恆河獼猴；n = 3)以經磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中調配的75 mg、150 mg或300 mg之寡核苷酸劑量投予，其係經由腰鞘內(i.t.)注射(3 mL)至腰椎中。恆河獼猴NHP之對照組(n = 3)僅投予PBS。在注射後二十八(28)天，將恆河獼猴NHP犧牲。解剖且保存全腦和腰脊髓用於RT-qPCR分析。自額葉皮質、海馬區、顳葉皮質、小腦、腦幹、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、背根神經節(DRGs L1-L6)和肝之組織樣品提取RNA，以qPCR測定 ALDH2mRNA含量(如所示，標準化成內源性管家基因 HPRT和 PPIB)。 ALDH2mRNA含量係使用PrimeTime™ qPCR探針檢定法(IDT)測定。qPCR係使用由引子對及對 ALDH2mRNA具有特異性的經螢光標記之5′核酸酶探針組成之PrimeTime™ qPCR探針檢定法執行。在來自經處理之NHP的樣品中殘留的 ALDH2mRNA百分比係使用2 -ΔΔCt(「delta-delta Ct」)方法(Livak and Schmittgen (2001) Methods 25:402-408)測定。
如圖7中所示，以腰i.t.投予之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸係以劑量相關方式降低恆河獼猴NHP之CNS中的標的基因表現，如藉由在經表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸處理之恆河獼猴NHP的組織樣品中殘留的 ALDH2mRNA百分比相對於經PBS處理之對照恆河獼猴NHP的樣品中殘留的 ALDH2mRNA百分比之比較來確定。該等結果證明經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸在以腰i.t.注射後展現以劑量相關方式降低NHP CNS之多個不同解剖區域中的標的基因表現的能力。
為了進一步評估表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸降低NHP之中樞神經系統(CNS)中的標的基因表現的能力，將食蟹獼猴NHP (食蟹獼猴；n = 3)以經磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中調配的75 mg之寡核苷酸劑量投予，其係經由腰鞘內(i.t.)注射(3 mL)至腰椎中。食蟹獼猴NHP之對照組(n = 3)僅投予PBS。在治療前，將導管及端口經手術植入各NHP中以容許經調配之寡核苷酸或PBS對照溶液緩慢(~15 min.)輸注至腰鞘內空間中。在注射後二十八(28)天，將食蟹獼猴NHP犧牲。解剖且保存全腦和腰脊髓用於RT-qPCR分析。自額葉皮質、尾狀核、海馬區、中腦、頂葉皮質、枕葉皮質、丘腦、顳葉皮質、小腦、腦幹、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、背根神經節(DRGs L1-L6)和肝之組織樣品提取RNA，以qPCR測定 ALDH2mRNA含量(如所示，標準化成內源性管家基因 GAPDH和 RPL23)。 ALDH2mRNA含量係使用PrimeTime™ qPCR探針檢定法(IDT)測定。qPCR係使用由引子對及對 ALDH2mRNA具有特異性的經螢光標記之5′核酸酶探針組成之PrimeTime™ qPCR探針檢定法執行。在來自經處理之NHP的樣品中殘留的 ALDH2mRNA百分比係使用2 -ΔΔCt(「delta-delta Ct」)方法(Livak and Schmittgen (2001) Methods 25:402-408)測定。如圖8中所示，以腰i.t.投予之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸係以劑量依賴方式降低食蟹獼猴NHP之CNS中的標的基因表現，如藉由在經表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸處理之食蟹獼猴NHP的組織樣品中殘留的 ALDH2mRNA百分比相對於經PBS處理之對照食蟹獼猴NHP的樣品中殘留的 ALDH2mRNA百分比之比較來確定。該等結果證明經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸在以腰i.t.注射後展現以劑量依賴方式降低NHP CNS之多個不同解剖區域中的標的基因表現的能力。 NHP小腦延髓池內(i.c.m.)投予
將表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸以經磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中調配的75 mg之寡核苷酸單一劑量投予，其係經由腰鞘內(i.t.)注射(3 mL)至雄性食蟹獼猴(n = 3；平均重量3至3.5 kg)的腰椎中。NHP之對照組(n = 3)僅投予PBS。在注射後二十八(28)天，將NHP犧牲。解剖且保存全腦和腰脊髓用於RT-qPCR分析。自額葉皮質、尾狀核、海馬區、小腦、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、背根神經節和肝之組織樣品提取RNA，以qPCR測定 ALDH2mRNA含量(如所示，標準化成內源性管家基因 Hprt)。 ALDH2mRNA含量係使用PrimeTime™ qPCR探針檢定法(IDT)測定。qPCR係使用由引子對及對 ALDH2mRNA具有特異性的經螢光標記之5′核酸酶探針組成之PrimeTime™ qPCR探針檢定法執行。在來自經處理之NHP的樣品中殘留的 ALDH2mRNA百分比係使用2 -ΔΔCt(「delta-delta Ct」)方法(Livak and Schmittgen (2001) Methods 25:402-08)測定。
如圖9中所示，以腰i.t.投予之經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸抑制CNS中的基因表現，如藉由在經表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸處理之食蟹獼猴NHP的組織樣品中殘留的 Aldh2mRNA百分比相對於經PBS處理之對照食蟹獼猴NHP的樣品中殘留的 Aldh2mRNA百分比之比較來確定。該等結果證明經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸在以腰i.t.注射後展現抑制CNS的多個不同解剖區域中的基因表現的能力。
總的來說，在實施例4至5中提供的結果表明相對於經PBS處理之對照動物，在經表3中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸處理後降低在動物(囓齒動物和NHP)之CNS中的 Aldh2 或 ALDH2mRNA含量可歸因於GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸在CNS中經RNAi調介之 Aldh2或 ALDH2mRNA靜默(RNA干擾）。 實施例 6 ：經脂質結合之 RNAi 寡核苷酸抑制在囓齒動物之中樞神經系統中的基因表現
為了評估以本文及/或實施例1至3中所述之通用方法所產生的經脂質結合之RNAi寡核苷酸降低中樞神經系統(CNS)中的標的基因表現的能力，將小鼠以經脂質結合之RNAi寡核苷酸處理，其係經由腦室內(i.c.v.)或鞘內(i.t.)投予腦脊髓液(CSF)中而靶向鼠類 Aldh2(另一選擇為本文之「mALDH2」) mRNA，且測定對囓齒動物(小鼠) CNS中的 Aldh2表現之後續效應。
簡言之，產生靶向鼠類 Aldh2且包含具有36-mer過客股及22-mer引導股的經脂質結合之切口型四鹼基環圈結構之RNAi寡核苷酸-脂質結合體(下文之「GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體」)，其核苷酸序列於表3中提出。包含RNAi寡核苷酸-脂質結合體之過客股及引導股的核苷酸序列各包含不同圖案的經修飾之核苷酸及硫代磷酸酯鍵聯，如圖13所描述及如下所示。將各種脂質部分與包含RNAi寡核苷酸-脂質結合體之四鹼基環圈的核苷酸中之一者結合，如實施例1至3所述，尤其以實施例3所示之流程1。脂質部分之結構提供於表4中。若有雙鍵存在，則在冒號之後表示雙鍵的數量，例如具有一個雙鍵的C18烴鏈為C18:1，具有6個雙鍵的C22烴鏈為C22:6。
Figure 02_image401
將表5中提供的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體以經磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中調配的250 µg (10 µL；25 mg/mL；4 mg/kg)之寡核苷酸-脂質結合體單一劑量投予，其係經由腦室內(i.c.v.)注射至6至8週齡雌性CD-1小鼠的腦中(n = 4)或經由腰鞘內(i.t.)注射至8至10週齡雌性C57BL/6小鼠的腰椎中(n = 4)。小鼠之對照組(n = 4)僅投予PBS。在注射後七(7)天，將小鼠犧牲。解剖且保存全腦和腰脊髓用於RT-qPCR分析。自體覺皮質區(SS皮質)、海馬區(HP)、紋狀體、額葉皮質、小腦、下視丘(HY)、頸脊髓(CSC)、胸脊髓(TSC)和腰脊髓(LSC)之組織樣品提取RNA，以qPCR測定 Aldh2mRNA含量(如所示，標準化成內源性管家基因 Hprt)。亦自以i.c.v注射投予GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體或PBS的小鼠收穫肝且提取來自肝的RNA用於RT-qPCR分析。 Aldh2mRNA含量係使用PrimeTime™ qPCR探針檢定法(IDT)測定。qPCR係使用由引子對及對 Aldh2mRNA具有特異性的經螢光標記之5′核酸酶探針組成之PrimeTime™ qPCR探針檢定法執行。在來自經處理之小鼠的樣品中殘留的 Aldh2mRNA百分比係使用2 -ΔΔCt(「delta-delta Ct」)方法(Livak and Schmittgen (2001) Methods 25:402-08)測定。
如圖10A和圖11中所示，以i.c.v.投予(圖10A)或i.t.投予(圖11)之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體降低CNS中的標的基因表現，如藉由在經指示之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體處理之小鼠的組織樣品中殘留的鼠類 Aldh2mRNA百分比相對於經PBS處理之對照小鼠的樣品中殘留的鼠類 Aldh2mRNA百分比之比較來確定。再者，如圖10A中所示，在經由i.c.v.投予之小鼠中測試的所有GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體降低CNS中的 Aldh2標的基因表現，其程度類似或大於對照的經GalNAc-結合之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸(GalXC-ALDH2)。該等結果證明GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體在i.c.v.或i.t.投予後展現降低CNS之多個不同解剖區域中的標的基因表現的能力。再者，總的來說，該等結果證明相對於經GalNAc-結合之RNAi寡核苷酸，以疏水性部分(例如脂質)與RNAi寡核苷酸之結合改進RNAi寡核苷酸-脂質結合體降低CNS中的標的基因表現的能力，使其可用於神經疾病或病症的治療性治療。
在肝中的標的基因表現係以i.c.v.注射投予GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體之小鼠進行評估，如藉由在以給出之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體投予之小鼠的肝樣品中的鼠類 Aldh2mRNA百分比相對於對照小鼠之肝樣品中的鼠類 Aldh2mRNA百分比來測量。如圖10B中所示，僅在投予具有高碳脂質尾部(lipid tail)(亦即C16或C18)之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體的小鼠之肝中觀察到降低的 Aldh2標的基因表現。相反地，在投予具有低碳脂質尾部(亦即C10、C12或C14)之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體的小鼠相對於對照小鼠而未降低肝中的 Aldh2標的基因表現。該等數據共同證明雖然具有高碳脂質尾部的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體降低在CNS和肝兩者中的 Aldh2標的基因表現，但是具有低碳脂質尾部之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體足以多方面降低CNS中的 Aldh2標的基因表現而不影響肝中的標的基因表現。此效應提供以組織特異性方式治療性操縱標的基因表現，這在標的基因異常表現於CNS中，但在肝中具有正常的生理功能所需之表現的疾病背景中是有用的。該等數據證明具有低碳脂質尾部之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體可用於降低CNS中異常的標的基因表現，而不引出有害的降低肝中的標的基因之生理正常表現。
Figure 02_image403
經 GalNAc- 結合之 GalXC-ALDH2 RNAi 寡核苷酸： 有義 ( 過客 ) 股：5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX] 10-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’ 雜交至： 反義 ( 引導 ) 股：5’-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’ 經脂質 - 結合 ( 辛酸 C8:0) 之 GalXC-ALDH2 RNAi 寡核苷酸： 有義 ( 過客 ) 股：5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX] 10-[ademX-C8]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’. 雜交至： 反義 ( 引導 ) 股：5’-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’ 經脂質 - 結合 ( 癸酸 C10:0) 之 GalXC-ALDH2 RNAi 寡核苷酸： 有義 ( 過客 ) 股：5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX] 10-[ademX-C10]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’. 雜交至： 反義 ( 引導 ) 股：5’-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’ 經脂質 - 結合 ( 癸酸 C12:0) 之 GalXC-ALDH2 RNAi 寡核苷酸： 有義 ( 過客 ) 股：5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX] 10-[ademX-C12]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’. 雜交至： 反義 ( 引導 ) 股：5’-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’ 經脂質 - 結合 ( 十四酸 C14:0) 之 GalXC-ALDH2 RNAi 寡核苷酸： 有義 ( 過客 ) 股：5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX] 10-[ademX-C14]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’. 雜交至： 反義 ( 引導 ) 股：5’-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’ 經脂質 - 結合 ( 十六酸 C16:0) 之 GalXC-ALDH2 RNAi 寡核苷酸： 有義 ( 過客 ) 股：5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX] 10-[ademX-C16]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’. 雜交至： 反義 ( 引導 ) 股：5’-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’ 經脂質 - 結合 ( 十八酸 C18:0) 之 GalXC-ALDH2 RNAi 寡核苷酸： 有義 ( 過客 ) 股：5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX] 10-[ademX-C18]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’. 雜交至： 反義 ( 引導 ) 股：5’-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’ 經脂質 - 結合 ( 油酸 C18:1) 之 GalXC-ALDH2 RNAi 寡核苷酸： 有義 ( 過客 ) 股：5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX] 10-[ademX-C18-OLE]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’. 雜交至： 反義 ( 引導 ) 股：5’-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’ 經脂質 - 結合 ( 亞麻油酸 C18:2) 之 GalXC-ALDH2 RNAi 寡核苷酸： 有義 ( 過客 ) 股：5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX] 10-[ademX-C18-LIN]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’. 雜交至： 反義 ( 引導 ) 股：5’-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’ 經脂質 - 結合 ( 二十二酸 C22:0) 之 GalXC-ALDH2 RNAi 寡核苷酸： 有義 ( 過客 ) 股：5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX] 10-[ademX-C22]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’. 雜交至： 反義 ( 引導 ) 股：5’-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’ 經脂質 - 結合 ( 二十二碳六烯酸 C22:6) 之 GalXC-ALDH2 RNAi 寡核苷酸： 有義 ( 過客 ) 股：5’-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-[mX] 10-[ademX-C22-DHA]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’. 雜交至： 反義 ( 引導 ) 股：5’-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3’ (修飾關鍵：表6)
Figure 02_image405
Figure 02_image407
Figure 02_image409
Figure 02_image411
[圖1]提供描述經設計之RNAi寡核苷酸(GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸)在投予小鼠的CNS後抑制鼠類 Aldh2mRNA表現之功效的圖表。如所示，相對於經PBS處理之小鼠中的 Aldh2mRNA之%，測量在雌性CD-1小鼠中以PBS中調配的100 µg之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸經腦室內(i.c.v.)投予後5天殘留於來自各種CNS組織之樣品中的 Aldh2mRNA之百分比(%)。
[圖2]提供描述GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸在經i.c.v.投予小鼠的CNS後之劑量反應的圖表。如所示，相對於經PBS處理之小鼠中的 Aldh2mRNA之%，測量在小鼠中以PBS中調配的250 µg或500 µg之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸經i.c.v.投予後在各種時間點殘留於各種CNS組織中的鼠類 Aldh2mRNA之百分比(%)。 Aldh2mRNA之百分比(%)係在如所示之額葉皮質、海馬區、下視丘、紋狀體、體覺皮質區及小腦中測定。
[圖3]提供小鼠腦部及脊髓區域之描述，連同描述GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸在經i.c.v.投予小鼠的CNS後之劑量反應的圖表。如所示，相對於經PBS處理之小鼠中的 Aldh2mRNA之%，測量在小鼠中以PBS中調配的250 µg或500 µg之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸經i.c.v.投予後在各種時間點殘留於各種CNS組織中的鼠類 Aldh2mRNA之百分比(%)。 Aldh2mRNA之百分比(%)係在如所示之頸脊髓、胸脊髓及腰脊髓中測定。
[圖4]提供描述經設計之RNAi寡核苷酸(GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸)在投予小鼠的CNS後抑制鼠類 Aldh2mRNA表現之功效的圖表。如所示，相對於經PBS處理之小鼠中的 Aldh2mRNA之%，測量在小鼠中以PBS中調配的500 µg之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸經鞘內(i.t.)投予後7天殘留於來自各種CNS組織之樣品中的 Aldh2mRNA之百分比(%)。
[圖5]提供描述GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸在投予大鼠的CNS後之劑量反應的圖表。如所示，相對於經PBS處理之大鼠中的 Aldh2mRNA之%，測量在大鼠中以PBS中調配的1000 µg或6000 µg之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸經腰i.t.投予後，在7天和28天測量的殘留於各種CNS組織中的大鼠 Aldh2mRNA之百分比(%)。 Aldh2mRNA之百分比(%)係在額葉皮質、紋狀體、海馬區、腦幹、脊髓區SC1-SC8、C1-C7背根神經節(DRG)、T1-T12 DRG、L1-L6 DRG及肝中測定。
[圖6]提供描述經設計之RNAi寡核苷酸(GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸)在投予非人類靈長類動物(NHP)的CNS後抑制人類/猴子 ALDH2mRNA表現之功效的圖表。如所示，相對於經PBS處理之NHP中的 ALDH2mRNA之%，測量在食蟹獼猴中以PBS中調配的75 mg之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸經i.t.投予後28天殘留於來自各種CNS組織之樣品中的 ALDH2mRNA之百分比(%)。
[圖7]提供描述GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸在投予NHP的CNS後之劑量反應的圖表。如所示，相對於經PBS處理之NHP中的 ALDH2mRNA之%，測量在恆河獼猴中以PBS中調配的75 mg，150 mg或300 mg之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸經i.t.投予後28天殘留於各種CNS組織中的人類/猴子 ALDH2mRNA之百分比(%)。 ALDH2mRNA之百分比(%)係在額葉皮質、海馬區、顳葉皮質、小腦、腦幹、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、背根神經節(DRG)及肝中測定。
[圖8]提供描述GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸在通過經手術植入之腰椎端口投予(輸注) NHP的CNS後之功效的圖表。如所示，相對於經PBS處理之NHP中的 ALDH2mRNA之%，測量在食蟹獼猴中以PBS中調配的75 mg之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸經i.t.投予後28天殘留於各種CNS組織中的人類/猴子 ALDH2mRNA之百分比(%)。 ALDH2mRNA之百分比(%)係在額葉皮質、尾狀核、海馬區、中腦、頂葉皮質、枕葉皮質、丘腦、顳葉皮質、小腦、腦幹、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、根神經節(DRG)及肝中測定。
[圖9]提供描述GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸在投予NHP的CNS後之功效的圖表。如所示，相對於經PBS處理之NHP中的 ALDH2mRNA之%，測量在食蟹獼猴中以PBS中調配的50 mg之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸經小腦延髓池內(intra-cisterna magna)(i.c.m.)投予後28天殘留於各種CNS組織中的人類/猴子 ALDH2mRNA之百分比(%)。 ALDH2mRNA之百分比(%)係在額葉皮質、尾狀核、海馬區、中腦、頂葉皮質、枕葉皮質、丘腦、顳葉皮質、小腦、腦幹、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、背根神經節(DRG)及肝中測定。
[圖10A]提供描述一系列的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體(C8:0至C22:6)在投予小鼠的CNS後之功效的圖表。如所示，相對於經PBS處理之小鼠中的Aldh2 mRNA之%，測量在雌性CD-1小鼠中以PBS中調配的250 µg之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體經i.c.v.投予後7天殘留於各種CNS組織中的鼠類 Aldh2mRNA之百分比(%)。 Aldh2mRNA之百分比(%)係在體覺皮質區(SS)、海馬區(HP)、下視丘(HY)、頸脊髓(CSC)、胸脊髓(TSC)及腰脊髓(LSC)中測定。
[圖10B]提供描述在接受以i.c.v.投予之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體(C8:0至C18:0)的圖10A中所述之相同小鼠之肝中的 Aldh2mRNA表現之百分比(%)的圖表。相對於自僅投予PBS的小鼠收穫之肝組織中的 Aldh2mRNA之百分比(%)，顯示在經i.c.v.投予後7天殘留於收穫之肝組織中的鼠類 Aldh2mRNA之百分比(%)。
[圖11]提供描述一系列的GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體(C10:0至C18:2)在投予小鼠的CNS後之功效的圖表。如所示，相對於經PBS處理之小鼠中的 Aldh2mRNA之%，測量在雌性C57BL/6小鼠中以PBS中調配的250 µg之GalXC-ALDH2 RNAi寡核苷酸-脂質結合體經i.t.投予後7天殘留於各種CNS組織中的鼠類 Aldh2mRNA之百分比(%)。 Aldh2mRNA之百分比(%)係在額葉皮質、海馬區(HP)、腦幹(BS)、頸脊髓(CSC)、胸脊髓(TSC)及腰脊髓(LSC)中測定。
[圖12]提供經修飾之GalXC寡核苷酸的示意圖。
[圖13]提供經修飾之經脂質結合之GalXC寡核苷酸的示意圖。
 
<![CDATA[<110>  美商黛瑟納製藥公司(DICERNA PHARMACEUTICALS, INC.)]]>
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          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (29)..(29)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之]]>鹼基
          <![CDATA[<222>  (30)..(30)]]>
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          <br/>
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          <br/>
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (13)..(13)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-氟修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (14)..(14)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (15)..(15)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-氟修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (16)..(16)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (17)..(17)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-氟修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (18)..(18)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (19)..(19)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (20)..(20)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (21)..(21)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (22)..(22)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (23)..(23)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (24)..(24)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (25)..(25)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (26)..(26)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (27)..(27)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (28)..(28)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經脂質(C16:0)結合]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (29)..(29)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (30)..(30)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (31)..(31)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (32)..(32)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (33)..(33)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (34)..(34)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修]]&gt;<![CDATA[飾之鹼基
          <![CDATA[<222>  (35)..(35)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (36)..(36)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          gguggaugaa acucaguuua gcagccgaaa ggcugc                                 36
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<223>  合成建構]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  經由硫代磷酸酯連結]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-氟修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (4)..(4)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (5)..(5)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-氟修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (6)..(6)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾]]>之鹼基
          <![CDATA[<222>  (7)..(7)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-氟修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (9)..(9)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (10)..(10)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-氟修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (11)..(11)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (12)..(12)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-氟修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (13)..(13)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-氟修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (14)..(14)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (15)..(15)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-氟修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (16)..(16)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (17)..(17)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-氟修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (]]>18)..(18)
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222>  (19)..(19)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
          <![CDATA[<220>  ]]>
          <![CDATA[<221>  經修飾之鹼基]]>
          <![CDATA[<222]]>>  (20)..(20)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (21)..(21)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (22)..(22)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (23)..(23)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (24)..(24)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (25)..(25)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (26)..(26)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (27)..(27)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (28)..(28)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經脂質(C18:0)結合]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (29)..(29)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (30)..(30)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
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          gguggaugaa acucaguuua gcagccgaaa ggcugc                                 36
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          <br/>
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;222&gt;  (26)..(26)]]&gt;
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          <br/>
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
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          <br/>
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  經2'-O-甲基修飾]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;  ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;221&gt;  經修飾之鹼基]]&gt;
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          <![CDATA[<223>  經脂質(C22:6)結合]]>
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          <![CDATA[<220>  ]]>
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          <![CDATA[<222>  (30)..(30)]]>
          <![CDATA[<223>  經2'-O-甲基修飾]]>
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          <![CDATA[<400>  14]]>
          gguggaugaa acucaguuua gcagccgaaa ggcugc                                 36
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>  ]]>
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          <![CDATA[<400>  15]]>
          gcagccgaaa ggcugc                                                       16
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Claims (46)

  1. 一種降低中樞神經系統(CNS)中的標的mRNA表現之寡核苷酸-配體結合體，其包含 (i) 雙股寡核苷酸，其包含長度為15至30個核苷酸之反義股及長度為15至40個核苷酸之有義股，其中該反義股及該有義股各包含5ʹ端和3ʹ端，其中該反義股及該有義股形成雙螺旋區域，其中該反義股具有與CNS中的該標的mRNA之標的序列互補的區域，其中該互補的區域的長度為至少15個連續的核苷酸，其中該寡核苷酸包含主幹-環圈(stem-loop)；及 (ii) 一或多個與該主幹-環圈結合之脂質部分。
  2. 如請求項1之寡核苷酸-配體結合體，其中該有義股包含在其3ʹ端上之該主幹-環圈。
  3. 如請求項1或2之寡核苷酸-配體結合體，其中該主幹-環圈包含以式：5ʹ-S1-L-S2-3ʹ表示的核苷酸序列，其中S1係與S2互補，且其中L形成介於S1與S2之間的環圈。
  4. 如請求項3之寡核苷酸-配體結合體，其中S1及S2的長度為1至8個核苷酸。
  5. 如請求項3或4之寡核苷酸-配體結合體，其中該一或多個脂質部分係與S1之核苷酸結合。
  6. 如請求項3或4之寡核苷酸-配體結合體，其中該一或多個脂質部分係與S2之核苷酸結合。
  7. 如請求項3至6中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中L的長度為3至5個核苷酸。
  8. 如請求項3至7中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中L為四鹼基環圈(tetraloop)，視需要地其中L的長度為4個核苷酸。
  9. 如請求項3至8中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中L包含如5ʹ-GAAA-3ʹ所提出之該核苷酸序列。
  10. 如請求項3至9中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該一或多個脂質部分係與L之核苷酸結合。
  11. 如請求項3或4之寡核苷酸-配體結合體，其中L的長度為3個核苷酸且具有5ʹ至3ʹ第一、第二及第三核苷酸，其中該寡核苷酸-配體結合體包含一個脂質部分，且其中該脂質部分係與L之第一、第二或第三核苷酸結合。
  12. 如請求項3或4之寡核苷酸-配體結合體，其中L的長度為4個核苷酸且具有5ʹ至3ʹ第一、第二、第三及第四核苷酸，其中該寡核苷酸-配體結合體包含一個脂質部分，且其中該脂質部分係與L之第一、第二、第三或第四核苷酸結合。
  13. 如請求項12之寡核苷酸-配體結合體，其中L由5ʹ-GAAA-3ʹ組成。
  14. 如請求項11至13中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該脂質部分係與L之第二核苷酸結合。
  15. 如請求項3或4之寡核苷酸-配體結合體，其中L的長度為5個核苷酸且具有5ʹ至3ʹ第一、第二、第三、第四及第五核苷酸，其中該寡核苷酸-配體結合體包含一個脂質部分，且其中該脂質部分係與L之第一、第二、第三、第四或第五核苷酸結合。
  16. 如請求項1至15中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該反義股的長度為19至27個核苷酸。
  17. 如請求項1至16中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該反義股的長度為21至27個核苷酸，視需要地其中該反義股的長度為22個核苷酸。
  18. 如請求項1至17中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該有義股的長度為19至40個核苷酸，視需要地其中該有義股的長度為36個核苷酸。
  19. 如請求項1至18中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該雙螺旋區域的長度為至少19個核苷酸。
  20. 如請求項1至19中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該雙螺旋區域的長度為至少20個核苷酸，視需要地其中該雙螺旋區域的長度為21個核苷酸。
  21. 如請求項1至20中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該互補的區域的長度為至少19個連續的核苷酸。
  22. 如請求項1至21中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該寡核苷酸包含一或多個核苷酸長度的3′-突出序列，其中該3′-突出序列係存在於該反義股、該有義股或該反義股及該有義股上。
  23. 如請求項22之寡核苷酸-配體結合體，其中該3′-突出序列係在該反義股上，及其中該3ʹ-突出序列的長度為兩個核苷酸。
  24. 如請求項1至23中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸。
  25. 如請求項24之寡核苷酸-配體結合體，其中該經修飾之核苷酸包含2′-修飾。
  26. 如請求項25之寡核苷酸-配體結合體，其中該2′-修飾為選自下列之修飾：2′-胺基乙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基、2′-去氧-2′-氟、和2′-去氧-2′-氟-β-d-阿拉伯核酸(arabino)。
  27. 如請求項24至26中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該寡核苷酸的所有核苷酸皆經修飾。
  28. 如請求項1至27中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯。
  29. 如請求項28之寡核苷酸-配體結合體，其中該至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。
  30. 如請求項1至29中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該反義股的 5′-核苷酸之糖的 4′-碳包含磷酸酯類似物。
  31. 如請求項30之寡核苷酸-配體結合體，其中該磷酸酯類似物為氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二醯基膦酸酯。
  32. 如請求項1至31中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該一或多個脂質部分包含飽和或不飽和C1-C50烴鏈。
  33. 如請求項1至32中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該一或多個脂質部分包含飽和或不飽和C5-C25烴鏈。
  34. 如請求項33之寡核苷酸-配體結合體，其中該一或多個脂質部分包含飽和C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14烴鏈。
  35. 如請求項34之寡核苷酸-配體結合體，其中該寡核苷酸-配體結合體降低在CNS中的該標的mRNA表現而不降低在CNS以外的該標的mRNA表現，視需要地不降低在肝中的該標的mRNA表現。
  36. 如請求項34或35之寡核苷酸-配體結合體，其中該標的mRNA表現在肝細胞中，且其中該寡核苷酸-配體結合體不降低在肝細胞中的該標的mRNA表現至與CNS的細胞中相同或相似的水平。
  37. 如請求項33之寡核苷酸-配體結合體，其中該脂質部分包含飽和C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22烴鏈。
  38. 如請求項33之寡核苷酸-配體結合體，其中該脂質部分包含不飽和C16、C17、C18、C19、C20、C21或C22烴鏈，視需要地其中該脂質部分包含C22:6。
  39. 如請求項1至38中任一項之寡核苷酸-配體結合體，其中該標的基因係與疾病或失調相關聯，視需要為神經疾病或失調。
  40. 如請求項39之寡核苷酸-配體結合體，其中該疾病或失調係選自進行性核上神經麻痺症(PSP)、皮質基底節變性(CBD)、嗜銀顆粒病(Argyrophilic grain disease)(AGD)、球狀膠細胞tau蛋白病(Globular glial tauopathy)(GGT)、衰老相關性tau星形膠質細胞病(Aging-related tau astrogliopathy)(ARTAG)、家族性額顳葉失智症17 (FTD-17)、伴有呼吸衰竭的tau蛋白病、伴有癲癇發作的失智症、匹克氏症(Pick’s disease)、肌強直性失養症1型或2型(MD1或MD2)、唐氏(Down’s)症候群、痙攣性截癱(SP)、尼曼-匹克二氏病(Niemann-Pick disease) C型、路易氏體失智症(DLB)、路易氏體吞嚥困難、路易氏體病、橄欖體橋腦小腦萎縮、紋狀體黑質變性、夏-德雷格(Shy-Drager)症候群、脊髓性肌肉萎縮症V型 (SMAV)、亨汀頓氏(Huntington’s)舞蹈症(HD)、阿茲海默氏症、SCA1、SCA2、SCA3、SCA7、SCA10 (脊髓小腦性失調症第1、2、3、7或103型)、多系統萎縮症(MSA)、脊髓延髓性肌肉萎縮症(SBMA，甘迺迪氏症(Kennedy disease))、弗裏德賴希(Friedrich)運動失調、X染色體脆折症相關震顫/運動失調症候群(FXTAS)、X染色體脆折症候群(FRAXA)、X連鎖智力遲鈍(X-Linked Mental Retardation)(XLMR)、帕金森氏症、肌張力不全症、SBMA (脊髓延髓肌萎縮症)、神經性病變疼痛失調、脊髓損傷、齒狀核黑質紅核蒼白球丘腦底核萎縮症(Dentatorubral-pallidoluysian atrophy) (DRPLA)、隱性CNS失調和ALS (肌肉萎縮性脊髓側索硬化症)、M2DS (MECP2複製症候群)、FTD (額顳葉失智症)、普里昂疾病、成年發病型腦白質失養症、亞歷山大氏病(Alexander’s Disease)、克拉伯病(Krabbe Disease)、慢性創傷性腦病變、家族性腦中葉硬化症(Pelizaeus-Merzbacher disease)(PMD)、拉菲羅病(Lafora disease)、中風、類澱粉腦血管病變(CAA)及異染性白質失養症(MLD)。
  41. 一種用於降低CNS中的標的mRNA表現之寡核苷酸-配體結合體，其包含 (i) 雙股寡核苷酸，其包含長度為15至30個核苷酸之反義股及長度為15至40個核苷酸之有義股，其中該反義股及該有義股各包含5ʹ端和3ʹ端，其中該反義股及該有義股形成雙螺旋區域，其中該反義股具有與CNS中的標的mRNA之標的序列互補的區域，其中該互補的區域的長度為至少15個連續的核苷酸，其中該寡核苷酸包含主幹-環圈；及 (ii) 一或多個與該主幹-環圈結合之脂質部分，其中該一或多個脂質部分係選自飽和或不飽和C8-14烴鏈， 其中在肝中的該標的mRNA表現不降低至與CNS中相同或相似的水平。
  42. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至41中任一項之寡核苷酸-配體結合體及醫藥上可接受的載劑。
  43. 一種降低或抑制由與個體之CNS相關聯的細胞群表現之個體的標的mRNA表現之方法，其包含對該個體投予如請求項1至41中任一項之寡核苷酸-配體結合體或如請求項42之醫藥組成物。
  44. 如請求項43之方法，其中，與對照細胞群相比，該標的mRNA表現水平在與CNS相關聯的細胞群中降低。
  45. 如請求項44之方法，其中，與對照細胞群相比，該標的mRNA表現水平在位於CNS以外的細胞群中未降低。
  46. 如請求項45之方法，其中該位於CNS以外的細胞群係在肝中。
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