TW202228729A

TW202228729A - 選擇性遞送寡核苷酸至膠細胞

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Publication number: TW202228729A
Application number: TW110137436A
Authority: TW
Inventors: 邁爾奧斯本; 特拉維斯格里姆
Original assignee: 美商戴瑟納製藥股份有限公司
Priority date: 2020-10-08
Filing date: 2021-10-08
Publication date: 2022-08-01
Also published as: CN116761886A; EP4225919A1; AR124275A1; US20240294907A1; AU2021356639A1; MX2023004109A; JP2023548658A; AU2021356639A9; WO2022077024A1; CA3194697A1; IL301940A; KR20230104880A

Abstract

本揭示案係關於用於選擇性降低膠細胞中之標靶RNA表現及/或所表現之蛋白質之水準的寡核苷酸，以及將此類寡核苷酸遞送至膠細胞中之相關方法。

Description

選擇性遞送寡核苷酸至膠細胞

神經系統由神經元及膠細胞組成。神經元之主要功能係產生及傳播化學信號及電信號。膠細胞之功能係調節神經元功能及信號傳導，從而塑造及調節神經元特性及功能。在中樞神經系統(CNS)中，膠細胞包括星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞及微膠細胞。在周圍神經系統中，主要膠細胞包括許旺氏細胞(Schwann cell)、腸膠細胞及衛星細胞。

膠細胞與多種疾病過程有關。若干種神經退化性疾病可能由有缺陷之膠細胞功能引起。例如，星狀細胞功能障礙可能與肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、亨廷頓氏病(Huntington’s Disease)及帕金森氏病(Parkinson’s Disease)有關。寡樹突細胞之功能係在神經細胞之軸突上形成保護鞘，其可能與神經膠瘤、精神分裂症、雙極性障礙及腦白質失養症有關。微膠細胞在大腦之免疫功能中發揮作用，且引發可能促進阿茲海默氏病(Alzheimer’s Disease)、自閉症及精神分裂症之發炎反應。許旺氏細胞之功能障礙與格巴二氏症候群(Guillain-Barre’ syndrome)、查-馬利-圖氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)及慢性發炎性脫髓鞘性多發性神經病變有關。

一些涉及膠細胞功能障礙之疾病與某些基因產物之表現有關。例如，亞歷山大氏病(Alexander’s disease)係一種以髓鞘破壞為特徵之腦白質失養症形式，由膠質原纖維酸性蛋白(GFAP) (一種在星狀細胞中表現之中間絲蛋白)基因中之體染色體功能獲得性突變引起。GFAP之過度表現及積累導致稱為羅森塔爾纖維(Rosenthal fiber)之異常蛋白質沉積，此可能會損害正常中間纖維之形成。

另一種與膠細胞中異常基因產物表現相關之疾病為ALS。ALS與編碼銅鋅超氧化物歧化酶1 (SOD1)之基因突變有關。在ALS小鼠模型中，僅運動神經元中突變SOD1 (mSOD1)之選擇性表現不足以引起完全ALS症狀(參見Pramatarova等人, J Neurosci. 2001, 21(10):3369-74)。然而，運動神經元中mSOD1之選擇性耗盡會影響發病及存活，但不會影響疾病進展，此表明周圍之膠細胞參與影響退化。

鑑於與膠細胞功能障礙相關之多種疾病及病症，需要藉由調節涉及與膠細胞功能相關之疾病或病症之基因產物的表現來選擇性靶向膠細胞的治療方法。

本揭示案係關於如下意外之發現：與神經元細胞中所表現之mRNA的表現降低相比，將干擾寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)投與哺乳動物神經系統中引起膠細胞中所表現之mRNA的水準選擇性降低。本發明提供：可在寡核苷酸上存在或不存在GalNAc靶向部分之情況下實現膠細胞中之選擇性攝取及/或膠細胞中所表現之RNA之水準的選擇性降低。

因此，在一個態樣中，本揭示案提供一種選擇性遞送干擾寡核苷酸至膠細胞之方法，詳言之，其中該選擇性係相對於神經元細胞對膠細胞之選擇性。在一些實施例中，選擇性遞送干擾寡核苷酸之方法包括使膠細胞與干擾寡核苷酸接觸，該干擾寡核苷酸具有與標靶RNA互補之區域，其中該寡核苷酸能夠降低標靶RNA之表現。

在另一態樣中，本揭示案提供一種選擇性地降低膠細胞中所表現之RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質的水準的方法。在一些實施例中，一種選擇性地降低膠細胞中所表現之RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質的水準的方法包括使膠細胞與寡核苷酸接觸，該寡核苷酸具有與標靶RNA互補之區域，其中該寡核苷酸能夠降低標靶RNA之表現。

在一些實施例中，互補區域係與標靶RNA之外顯子互補。在一些實施例中，互補區域係與標靶RNA之5'-未轉譯區互補。在一些實施例中，互補區域係與標靶RNA之3'-未轉譯區互補。在一些實施例中，互補區域係與標靶RNA之對偶基因特異性序列，諸如多態性序列互補。

在一些實施例中，寡核苷酸之長度為12個至60個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸具有長度為至少12個核苷酸之與標靶RNA互補之區域。在一些實施例中，與標靶RNA互補之區域之長度為12個至30個核苷酸。

在一些實施例中，寡核苷酸為單股的。在一些實施例中，寡核苷酸包含雙股核酸(dsNA)。在一些實施例中，寡核苷酸包含RNA。

在一些實施例中，寡核苷酸包含有義股及反義股，其中該有義股與該反義股形成雙鏈體，其中反義股包含與膠細胞中所表現之標靶RNA互補之區域且能夠降低標靶RNA之水準。

在一些實施例中，有義股之長度為15個至40個核苷酸。在一些實施例中，反義股之長度為19個至27個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股形成長度為至少12個核苷酸之雙鏈體。在一些實施例中，有義股與反義股形成長度為12個至30個核苷酸之雙鏈體。

在一些實施例中，有義股及反義股為分開之寡核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股包含單一寡核苷酸。

在一些實施例中，當有義股與反義股形成雙鏈體時有義股或反義股具有長度為至多兩個核苷酸之3'-懸垂物。較佳地，反義股具有長度為至多2個核苷酸之3'-懸垂物。

在一些實施例中，寡核苷酸進一步包含莖環序列，該莖環序列包含序列區域S1-L-S2，其中S1與S2互補，且其中L為當S1與S2形成雙鏈體時在S1與S2之間形成的環，且其中該莖環序列附接於有義股之3'-末端。在一些實施例中，環L為五環、四環或三環。

在一些實施例中，寡核苷酸進一步包含一或多個靶向配位體或靶向部分。在一些實施例中，靶向配位體或部分存在於寡核苷酸之莖環序列之環L上。在一些實施例中，靶向配位體或部分為GalNAc部分。在一些實施例中，寡核苷酸不具有GalNAc部分。

在一些實施例中，寡核苷酸之至少一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，寡核苷酸之一或多個核苷酸經修飾。在一些實施例中，修飾包括糖部分、核苷間鍵聯、5'-端磷酸、核苷酸鹼基、可逆修飾及如上所論述之一或多個靶向部分的修飾。

在一些實施例中，用寡核苷酸靶向之膠細胞為星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞、腸膠細胞或其混合物。在一些實施例中，膠細胞存在於個體之中樞神經系統中。在一些實施例中，膠細胞存在於個體之周圍神經系統中。在一些實施例中，靶向之膠細胞存在於中樞神經系統之指定區域，例如額葉皮質、紋狀體、體感覺皮質、海馬迴、下視丘、小腦、腦幹及/或脊髓。在一些實施例中，膠細胞存在於脊髓之指定區域，諸如頸脊髓、胸脊髓或腰脊髓。

在一些實施例中，遞送至膠細胞之選擇性或降低膠細胞中所表現之RNA之水準的選擇性係與神經元細胞相比。在一些實施例中，相對於神經元細胞對膠細胞之選擇性遞送或膠細胞中所表現之RNA之水準之選擇性降低為至少1.5倍或更多。在一些實施例中，相對於神經元細胞對膠細胞之選擇性遞送或膠細胞中所表現之RNA之水準之選擇性減少為2倍或更大；2.5倍或更大；3倍或更大；3.5倍或更大；4倍或更大；4.5倍或更大；或5倍或更大。

在一些實施例中，選擇性遞送干擾寡核苷酸或選擇性降低膠細胞中所表現之RNA之水準的方法用於治療與膠細胞功能障礙相關之病症或疾患，該膠細胞功能障礙諸如星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞及/或腸膠細胞之功能障礙。

在一些實施例中，選擇性遞送或選擇性降低膠細胞中所表現之RNA之水準係藉由向個體鞘內、腦室內、間質、舌下、靜脈內或鼻內投與有效量之本文所述之寡核苷酸。

本揭示案係關於如下組合物及組合物之用途，該等組合物用於選擇性遞送干擾寡核苷酸至膠細胞及選擇性降低膠細胞中所表現之RNA之水準，包括選擇性遞送至個體神經系統中之膠細胞或選擇性降低膠細胞中所表現之標靶RNA之水準。本揭示案意外地發現，與其他神經元細胞相比，使用本文揭示之RNAi寡核苷酸可選擇性遞送及選擇性降低膠細胞中所表現之RNA之水準。因此，下文詳細描述寡核苷酸組合物，及該等寡核苷酸選擇性遞送至膠細胞，以及該等寡核苷酸用於選擇性降低膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的用途，諸如用於治療與膠細胞功能障礙相關之疾病或病症。

應當理解，包括圖式之前述一般性描述及以下詳細描述僅為示例性及說明性的，而非限制本揭示案。

本文中使用之章節標題僅出於組織之目的，且不應被解釋為限制所描述之主題。 I. 定義

關於本揭示案，除非另有具體定義，否則本文描述中使用之技術及科學術語將具有所屬領域普通技術人員通常理解之含義。因此，以下術語旨在具有以下含義。

近似：如本文所用，術語「近似」或「約」當應用於一或多個所關注之值時，係指與所敘述之參考值類似之值。在某些實施例中，除非另有規定或自上下文另外顯而易見(除非此數值將超過可能值之100%)，否則術語「近似」或「約」係指處於在任一方向上(大於或小於)所敘述之參考值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小值以內之值的範圍。

投與：如本文所用，術語「投與」或「投藥」意謂以藥理學上有用(例如，以治療個體之疾患)之方式向個體提供物質(例如，寡核苷酸)。

互補：如本文所用，術語「互補」係指核苷酸(例如，在相對核酸上或在單股核酸之相對區域上的兩個核苷酸)之間的一種結構關係，該結構關係允許該等核苷酸彼此形成鹼基對。舉例而言，一個核酸之嘌呤核苷酸與相對核酸之嘧啶核苷酸互補，該兩種核苷酸可藉由彼此形成氫鍵而一起進行鹼基配對。在一些實施例中，互補核苷酸可按瓦生-克立克(Watson-Crick)方式或按允許形成穩定雙鏈體之任何其他方式進行鹼基配對。在一些實施例中，如本文所述，兩個核酸可具有彼此互補而形成互補區域的核苷酸序列。

去氧核糖核苷酸：如本文所用，術語「去氧核糖核苷酸」係指與核糖核苷酸相比在戊糖之2'位置具有氫之核苷酸。經修飾之去氧核糖核苷酸為除2'位置以外具有一或多個原子修飾或取代之去氧核糖核苷酸，該一或多個原子修飾或取代包括糖、磷酸基或鹼基內部或本身之修飾或取代。

雙股寡核苷酸：如本文所用，術語「雙股寡核苷酸」係指實質上呈雙鏈體形式之寡核苷酸。在一些實施例中，在共價分開之核酸股之核苷酸的反平行序列之間形成雙股寡核苷酸之雙鏈體區域之互補鹼基配對。在一些實施例中，在共價連接之核酸股之核苷酸的反平行序列之間形成雙股寡核苷酸之雙鏈體區域之互補鹼基配對。在一些實施例中，由經折疊(例如，經由髮夾)以提供一起鹼基配對之核苷酸之互補反平行序列的單股核酸形成雙股寡核苷酸之雙鏈體區域之互補鹼基配對。在一些實施例中，雙股寡核苷酸包含彼此完全形成雙鏈體之兩股共價分開之核酸。然而，在一些實施例中，雙股寡核苷酸包含部分形成雙鏈體，例如在一末端或兩末端具有懸垂物之兩股共價分開之核酸。在一些實施例中，雙股寡核苷酸包含部分互補之核苷酸之反平行序列，且因此可具有一或多個錯配，該一或多個錯配可包括內部錯配或末端錯配。

雙鏈體：如本文所用，術語「雙鏈體」在關於核酸(例如，寡核苷酸)時係指經由核苷酸之兩個反平行序列之互補鹼基配對形成之結構。

賦形劑：如本文所用，術語「賦形劑」係指可包含於組合物中之非治療劑，例如，以提供或有助於所需稠度或穩定作用。

膠細胞：如本文所用，「膠細胞」及「神經膠細胞」在本文中可互換使用且係指神經系統中提供支持或營養或者用於維持體內平衡之非神經元前驅細胞及/或完全分化之細胞。膠細胞之實例包括室管膜細胞、寡樹突細胞、星狀細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞及腸膠細胞等。亦已發現膠細胞可調節神經放電率、大腦可塑性及免疫反應。

環：如本文所用，術語「環」係指核酸(例如，寡核苷酸)之未配對區域，其兩側為核酸之兩個反平行區域，該等區域彼此充分互補，使得在適當雜交條件下(例如，在磷酸鹽緩衝液中，在細胞中)，位於未配對區域兩側之兩個反平行區域雜交形成雙鏈體(稱為「莖」)。

經修飾之核苷酸間鍵聯：如本文所用，術語「經修飾之核苷酸間鍵聯」係指與包含磷酸二酯鍵之參考核苷酸間鍵聯相比具有一或多個化學修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，經修飾之核苷酸為非天然存在之鍵聯。通常，經修飾之核苷酸間鍵聯賦予其中存在經修飾之核苷酸間鍵聯之核酸一種或多種期望之特性。舉例而言，經修飾之核苷酸可改善熱穩定性、抗降解性、核酸酶抗性、溶解性、生物可用度、生物活性、降低免疫原性等。

經修飾之核苷酸：如本文所用，術語「經修飾之核苷酸」係指與選自以下之相應參考核苷酸相比具有一或多個化學修飾之核苷酸：腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤去氧核糖核苷酸、鳥嘌呤去氧核糖核苷酸、胞嘧啶去氧核糖核苷酸及胸苷去氧核糖核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸為非天然存在之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸在其糖、核鹼基及/或磷酸基中具有一或多個化學修飾。在一些實施例中，經修飾之核苷酸具有與相應參考核苷酸結合之一或多個化學部分。通常，經修飾之核苷酸賦予其中存在經修飾之核苷酸之核酸一種或多種期望之特性。舉例而言，經修飾之核苷酸可改善熱穩定性、抗降解性、核酸酶抗性、溶解性、生物可用度、生物活性、降低免疫原性等。在某些實施例中，經修飾之核苷酸在核糖環之2'位置包含2'-O-甲基或2'-F取代。

帶缺口之四環結構：「帶缺口之四環結構」係指RNAi寡核苷酸之一種結構，其特徵在於存在分開之有義(過客)及反義(嚮導)股，其中有義股具有與反義股互補之區域，使得兩股形成雙鏈體，且其中該等股中之至少一者(一般為有義股)自雙鏈體延伸，其中該延伸段含有四環及形成與四環相鄰之莖區域之兩個自互補序列，其中四環經組態以穩定由至少一股之自互補序列形成之相鄰莖區域。

神經元細胞：「神經元細胞」通常係指神經系統之結構及功能單元，且存在於中樞及周圍神經系統中。神經元細胞充當神經系統之傳導細胞，接收及傳輸化學信號及/或電信號。三大類神經元細胞包括感覺神經元、運動神經元及中間神經元。在一些實施例中，神經元細胞可藉由特定神經元特異性標記物之表現與非神經元膠細胞區分開來，該等神經元特異性標記物包括例如但不限於：神經元特異性烯醇化酶(NSE或γ-烯醇化酶)；神經元核(NeuN或Fox3)；微管相關蛋白2 (MAP-2)；微管蛋白β III (TUBB3)；雙皮質素(DCX)；及c-fos。在一些實施例中，神經元細胞之臨床標記物包括膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)及酪胺酸羥化酶。亦可使用係中樞神經系統或周圍神經系統之區域所特有的其他神經元細胞標記物，例如鈣結合蛋白-D28K、鈣視網膜蛋白及神經絲蛋白(NFP)。

寡核苷酸：如本文所用，術語「寡核苷酸」係指例如長度小於100個核苷酸之短核酸。寡核苷酸可包含核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或經修飾之核苷酸，包括例如經修飾之核糖核苷酸。寡核苷酸可為單股或雙股。寡核苷酸可能具有或可能不具有雙鏈體區域。作為一組非限制性實例，寡核苷酸可為但不限於小干擾RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、切丁酶受質干擾RNA (dsiRNA)、反義寡核苷酸、短siRNA或單股siRNA。在一些實施例中，雙股寡核苷酸為RNAi寡核苷酸。

懸垂物：如本文所用，術語「懸垂物」係指由一股或區域延伸超出與該一股或區域形成雙鏈體之互補股的末端所形成的末端非鹼基配對核苷酸。在一些實施例中，懸垂物在雙股寡核苷酸之5'端或3'端包含自雙鏈體區域延伸之一或多個未配對核苷酸。在某些實施例中，懸垂物為雙股寡核苷酸之反義股或有義股上之3'或5'懸垂物。

磷酸酯類似物：如本文所用，術語「磷酸酯類似物」係指模擬磷酸基之靜電及/或空間特性之化學部分。在一些實施例中，磷酸酯類似物位於寡核苷酸之5'端核苷酸處以代替常常易於酶促移除之5'-磷酸酯。在一些實施例中，5'磷酸酯類似物含有磷酸酶抗性鍵聯。磷酸酯類似物之實例包括5'膦酸酯，諸如5'亞甲基膦酸酯(5'-MP)及5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'-VP)。在一些實施例中，寡核苷酸在5'端核苷酸處之糖之4'-碳位置處具有磷酸酯類似物(稱為「4'-磷酸酯類似物」)。4'-磷酸酯類似物之一個實例為氧甲基膦酸酯，其中氧甲基之氧原子結合於糖部分(例如，在其4'-碳處)或其類似物(參見例如國際專利公開案WO/2018/045317，其涉及磷酸酯類似物之內容以引用之方式併入本文中。已開發針對寡核苷酸之5'末端之其他修飾(參見例如國際專利公開案WO2011133871；美國專利第8,927,513號；及Prakash等人, Nucleic Acids Res., 2015, 43(6):2993-3011，各文獻中涉及磷酸酯類似物之內容以引用之方式併入本文中)。

表現降低：如本文所用，術語基因之「表現降低」或其等效術語係指與適當參考細胞或個體相比，細胞或個體中由該基因編碼之RNA轉錄物或蛋白質之量減少及/或基因活性之量減少。舉例而言，用雙股寡核苷酸(例如，具有與標靶mRNA序列互補之反義股之雙股寡核苷酸)處理細胞之行為可使RNA轉錄物、蛋白質及/或酶促活性(例如由標靶基因編碼)之量與未經該雙股寡核苷酸處理之細胞相比有所減少。類似地，如本文所用之「降低表現」係指使基因(例如，標靶基因)之表現降低之行為。

互補區域：如本文所用，術語「互補區域」係指核酸(例如，雙股寡核苷酸)之核苷酸序列，其與核苷酸之反平行序列(例如，mRNA內之標靶核苷酸序列)充分互補，以允許在適當雜交條件下，例如在磷酸鹽緩衝液中、在細胞中等等，核苷酸之兩個序列之間進行雜交。互補區域可與核苷酸序列(例如，mRNA或其部分內存在之標靶核苷酸序列)完全互補。舉例而言，與mRNA中存在之核苷酸序列完全互補之互補區域具有與mRNA中之相應序列互補而無任何錯配或間隙之相連核苷酸序列。可替代地，互補區域可與核苷酸序列(例如，mRNA或其部分中存在之核苷酸序列)部分地互補。舉例而言，與mRNA中存在之核苷酸序列部分地互補之互補區域具有與mRNA中之相應序列互補，但與mRNA中之相應序列相比含有一或多個錯配或間隙(例如，1個、2個、3個或更多個錯配或間隙)之相連核苷酸序列，前提條件為互補區域仍能夠在適當雜交條件下與mRNA雜交。

核糖核苷酸：如本文所用，術語「核糖核苷酸」係指具有呈戊糖形式之核糖之核苷酸，在其2'位置處含有羥基。經修飾之核糖核苷酸為除2'位置以外具有一或多個原子修飾或取代之核糖核苷酸，該一或多個原子修飾或取代包括核糖、磷酸基或鹼基內部或本身之修飾或取代。

RNAi 寡核苷酸：如本文所用，術語「RNAi寡核苷酸」係指(a)具有有義股(過客)及反義股(嚮導)之雙股寡核苷酸，其中在標靶mRNA之裂解中 Argonaute2 (Ago2)核酸內切酶使用反義股或反義股之一部分；或(b)具有單一反義股之單股寡核苷酸，其中在標靶mRNA之裂解中Ago2核酸內切酶使用彼反義股(或彼反義股之一部分)。

選擇性降低：如本文所用，基因表現之「選擇性降低」或其等效術語係指與適當參考細胞或個體相比，所關注之細胞中由該基因編碼之RNA轉錄物或蛋白質之量減少及/或基因活性之量減少，其中所關注之細胞中之基因與參考細胞或個體中之比較基因為相同基因或不同基因。在一些實施例中，所關注之細胞中基因之表現係所關注之細胞所特有的，而參考細胞中比較基因之表現係參考細胞所特有的。

股：如本文所用，術語「股」係指經由核苷酸間鍵聯(例如，磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵聯)連接在一起之單一相連核苷酸序列。在一些實施例中，股具有兩個自由末端，例如，5'末端及3'末端。

個體：如本文所用，術語「個體」意謂任何哺乳動物，包括小鼠、兔及人類。在一些實施例中，個體為人類或非人類靈長類動物。術語「個人」或「患者」可與「個體」互換使用。

合成：如本文所用，術語「合成」係指一種核酸或其他分子，其藉由人工合成(例如，使用機器(例如，固態核酸合成器))或以其他方式不來源於通常產生該分子之天然來源(例如，細胞或生物體)。

靶向配位體：如本文所用，術語「靶向配位體」係指選擇性結合於所關注之組織或細胞之同源分子(例如，受體)，且可與另一種物質結合以達成將另一種物質靶向所關注之組織或細胞之目的之分子(例如，碳水化合物、胺基糖、膽固醇、多肽或脂質)。舉例而言，在一些實施例中，靶向配位體可與寡核苷酸結合以達成將寡核苷酸靶向所關注之特定組織或細胞之目的。在一些實施例中，靶向配位體選擇性結合於細胞表面受體。因此，在一些實施例中，當與寡核苷酸結合時，靶向配位體經由選擇性結合於在細胞表面上表現之受體及包含寡核苷酸、靶向配位體及受體之複合物被細胞內體內化來促進寡核苷酸遞送至特定細胞中。在一些實施例中，靶向配位體經由連接子與寡核苷酸結合，該連接子在細胞內化之後或期間裂解，以使寡核苷酸在細胞中自靶向配位體釋放。

四環：如本文所用，術語「四環」係指增加由側翼核苷酸序列雜交形成之相鄰雙鏈體之穩定性的環。當相鄰莖雙鏈體之解鏈溫度(T _m)之增加高於對由隨機選擇之核苷酸序列組成的一組長度相當之環平均預期的相鄰莖雙鏈體之T _m時，穩定性之增加係可偵測的。舉例而言，四環可在10 mM NaHPO ₄中向包含長度為至少2個鹼基對之雙鏈體之髮夾賦予至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃之解鏈溫度。在一些實施例中，四環可藉由堆疊相互作用來穩定相鄰莖雙鏈體中之鹼基對。另外，四環中核苷酸之間的相互作用包括但不限於非瓦生-克立克鹼基配對、堆疊相互作用、氫鍵結及接觸相互作用(Cheong等人, Nature, 1990, 346(6285):680-2；Heus及Pardi, Science, 1991, 253(5016):191-4)。在一些實施例中，四環包含3個至6個核苷酸或由3個至6個核苷酸組成且通常為4個至5個核苷酸。在某些實施例中，四環包含三個、四個、五個或六個核苷酸或由三個、四個、五個或六個核苷酸組成，該等核苷酸可經修飾或可未經修飾(例如，其可結合於或可不結合於靶向部分)。在某些實施例中，四環由四個核苷酸組成。在四環中可使用任何核苷酸，且可使用此類核苷酸之標準IUPAC-IUB符號，如Cornish-Bowden, Nucleic Acids Res. 1985, 13:3021-3030中所述。例如，字母「N」可用於意謂任何鹼基可能位於該位置，字母「R」可用於意謂A (腺嘌呤)或G (鳥嘌呤)可能位於該位置，且「B」可用於意謂C (胞嘧啶)、G (鳥嘌呤)或T (胸腺嘧啶)可能位於該位置。四環之實例包括四環之UNCG家族(例如，UUCG)、四環之GNRA家族(例如，GAAA)及CUUG四環。(Woese等人, Proc Natl Acad Sci. USA., 1990, 87(21):8467-71；Antao等人, Nucleic Acids Res., 1991, 19(21):5901-5)。DNA四環之實例包括四環之d(GNNA)家族(例如，d(GTTA))、四環之d(GNRA)家族、四環之d(GNAB)家族、四環之d(CNNG)家族及四環之d(TNCG)四環家族(例如，d(TTCG))。參見例如Nakano等人, Biochemistry, 2002, 41(48):14281-292；Shinji等人, Nippon Kagakkai Koen Yokoshu, 2000, 78(2):731，該等文獻之相關揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，四環含於帶缺口之四環結構內。

治療 (Treat) 、治療 (treatment) 或治療 (treating)：如本文所用，術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」或「治療(treating)」係指獲得所需之藥理學及/或生理學作用。就完全或部分預防疾病或其症狀而言，該作用可為預防性額，及/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之副作用而言，可為治療性的。如本文所用，「治療」涵蓋對哺乳動物，尤其是人類之疾病之任何治療，且包括：(a)防止疾病在可能易患該疾病但尚未經診斷為患病之個體中發生；(b)抑制疾病，亦即阻止其發展；及(c)緩解疾病，例如使疾病消退，例如完全或部分消除疾病之症狀。 II. 用於選擇性遞送及降低膠細胞中之RNA及/或蛋白質表現的寡核苷酸

本揭示案係關於用於選擇性遞送干擾寡核苷酸或選擇性降低膠細胞中所表現之標靶RNA及/或蛋白質之水準的組合物及方法，詳言之，選擇性遞送至個體神經系統中之膠細胞或選擇性降低膠細胞中所表現之標靶RNA及/或蛋白質之水準。如上所論述，本文中顯示，與在神經元細胞中特異性表現之標靶mRNA之水準降低相比，將經GalNAc殘基修飾之干擾RNA (RNAi)投與至神經系統中可意外地選擇性降低在膠細胞中特異性表現之標靶mRNA之水準。在一些情況下，膠細胞中所表現之mRNA之選擇性降低幾乎為神經元細胞中所表現之mRNA之表現降低(例如降低約40%)的兩倍(例如降低超過80%)。雖然已知寡核苷酸上之GalNAc配位體目標係在肝臟中選擇性攝取，但本申請案中之結果顯示，相對於神經元細胞中之標靶RNA之水準的降低，此類經修飾之寡核苷酸選擇性地降低膠細胞中所表現之標靶RNA之水準。已知之GalNAc對肝臟去唾液酸糖蛋白受體之特異性及經GalNAc修飾之寡核苷酸的對比鮮明之選擇性活性顯示，可在不存在GalNAc配位體下實現膠細胞中之選擇性攝取及/或膠細胞中所表現之RNA之水準的選擇性降低。 a. 寡核苷酸

在一些實施例中，選擇性遞送干擾寡核苷酸之方法或選擇性降低膠細胞中所表現之標靶RNA之水準的方法包括使膠細胞與寡核苷酸接觸，該寡核苷酸能夠降低膠細胞中所表現之RNA及/或蛋白質之水準。

在一些實施例中，寡核苷酸包含與膠細胞中所表現之標靶RNA互補之區域。在一些實施例中，互補區域之長度為至少12個核苷酸。在一些實施例中，互補區域之長度為至少15個核苷酸。在一些實施例中，互補區域之長度為至少19個核苷酸。在一些實施例中，互補區域之長度為12個至30個核苷酸。在一些實施例中，互補區域之長度為19個至23個核苷酸。

在一些實施例中，寡核苷酸之長度為至少12個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為12個至60個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為12個至58個核苷酸。

在一些實施例中，寡核苷酸為單股核酸。在一些實施例中，寡核苷酸為雙股核酸(dsNA)。

在一些實施例中，寡核苷酸包含有義股及反義股，其中該有義股與該反義股能夠形成雙鏈體，且該反義股包含與膠細胞中所表現之標靶RNA序列互補之區域。在一些實施例中，由有義股與反義股形成之雙鏈體稱為第一雙鏈體(D1)。在一些實施例中，反義股可降低膠細胞中所表現之標靶RNA之水準。

在一些實施例中，有義股之長度為15個至40個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為19個至40個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為12個至36個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為17個至36個核苷酸。在一些實施例中，有義股之長度為19個至23個核苷酸。

在一些實施例中，反義股之長度為至多50個核苷酸(例如長度至多40個、至多30個、至多27個、至多25個、至多21個或至多19個核苷酸)。在一些實施例中，反義股之長度為12個至36個核苷酸。在一些實施例中，反義股之長度為17個至36個核苷酸。在一些實施例中，反義股之長度為15個至30個核苷酸。在一些實施例中，反義股之長度為19個至29個核苷酸。在一些實施例中，反義股之長度為19個至27個核苷酸。在一些實施例中，反義股之長度為21個至27個核苷酸。在一些實施例中，反義股之長度為21個至23個核苷酸。

在一些實施例中，由有義股與反義股形成之雙鏈體亦稱為第一雙鏈體或D1，長度可為12個至30個核苷酸(例如12個至30個、12個至27個、15個至25個、21個至26個、18個至30個或19個至30個核苷酸)。在一些實施例中，在寡核苷酸之有義股與反義股之間形成的雙鏈體之長度為至少12個核苷酸(例如長度為至少12個、至少15個、至少20個或至少25個核苷酸)。在一些實施例中，在寡核苷酸之有義股與反義股之間形成的雙鏈體之長度為12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個核苷酸。在一些實施例中，由有義股與反義股形成之雙鏈體具有12-21個鹼基對之長度。在一些實施例中，雙鏈體具有13個至20個、14個至20個、15個至20個、16個至20個、17個至20個、18個至20個或19個至20個鹼基對之長度。在一些實施例中，雙鏈體具有12個至23個、12個至22個、12個至21個、12個至20個、12個至19個、12個至18個、12個至17個、12個至16個、12個至15個、12個至14個或12個至13個鹼基對之長度。在一些實施例中，雙鏈體具有12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個鹼基對之長度。在一些實施例中，雙鏈體區域之長度為至少19個鹼基對。在一些實施例中，雙鏈體之長度為20個鹼基對。在一些實施例中，雙鏈體之長度為21個鹼基對。

在一些實施例中，寡核苷酸具有有義股與反義股之間的互補區域。在一些實施例中，互補區域之長度可為12個至30個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間的互補區域為至少12個核苷酸長(例如至少12個、至少15個、至少20個或至少25個核苷酸長)。在一些實施例中，有義股與反義股之間的互補區域的長度為12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個核苷酸。在一些實施例中，有義股與反義股之間的互補區域的長度為12個至30個、12個至27個、12個至22個、15個至25個、15個至23個、21個至26個、20個至23個、18個至30個或19個至30個核苷酸。

在一些實施例中，具有有義股及反義股之寡核苷酸在有義股與反義股之間具有一或多個(例如1個、2個、3個、4個、5個)錯配。在一些實施例中，有義股及反義股可具有多達1個、多達2個、多達3個、多達4個、多達5個等錯配，前提條件為其維持在適當雜交條件下形成雙鏈體之能力。在一些實施例中，若有義股與反義股之間存在超過一個錯配，則該等錯配之位置可為連續的(例如一排2個、3個或更多個)或可散佈在整個互補區域內，前提條件為寡核苷酸維持在適當雜交條件下形成雙鏈體之能力。在一些實施例中，第一雙鏈體(D1)含有一或多個錯配。

在一些實施例中，反義序列與膠細胞中所表現之標靶RNA互補之區域的長度為至少12個核苷酸。在一些實施例中，反義序列與膠細胞中所表現之標靶RNA互補之區域的長度為至少15個核苷酸。在一些實施例中，反義序列與膠細胞中所表現之標靶RNA互補之區域的長度為至少19個核苷酸。在一些實施例中，序列與膠細胞中所表現之標靶RNA互補之區域的長度為至少21個核苷酸。在一些實施例中，互補區域之長度為至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個或至少21個核苷酸。在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸具有長度在12個至30個(例如12個至30個、12個至22個、15個至25個、17個至21個、18個至27個、19個至27個或15個至30個)核苷酸範圍內的與標靶RNA互補之區域。在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸具有長度為12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個核苷酸的與標靶RNA互補之區域。

在一些實施例中，本文揭示之寡核苷酸包含與標靶RNA上之序列完全互補的互補區域(例如在雙股寡核苷酸之反義股上)。在一些實施例中，寡核苷酸之互補區域(例如在雙股寡核苷酸之反義股上)與長度在12個至30個核苷酸(例如12個至25個、12個至20個、12個至18個、12個至16個、12個至14個、14個至20個、14個至18個、14個至16個、16個至20個、16個至18個或18個至30個)範圍內的標靶RNA序列之核苷酸之相連序列互補。在一些實施例中，寡核苷酸之互補區域(例如在雙股寡核苷酸之反義股上)與長度為12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個或23個相連核苷酸的標靶RNA序列之核苷酸之相連序列互補。

在一些實施例中，與標靶RNA之相應序列相比，與標靶RNA序列互補之區域可具有一或多個錯配。在一些實施例中，寡核苷酸之互補區域可具有多達1個、多達2個、多達3個、多達4個、多達5個等錯配，前提條件為其維持在適當雜交條件下與標靶RNA序列形成互補鹼基對之能力。可替代地，在一些實施例中，寡核苷酸上之互補區域可具有至多1個、至多2個、至多3個、至多4個或至多5個錯配，前提條件為其維持在適當雜交條件下與標靶RNA序列形成互補鹼基對之能力。在一些實施例中，若互補區域中存在超過一個錯配，則該等錯配之位置可為連續的(例如一排2個、3個、4個或更多個)或可散佈在整個互補區域內，前提條件為寡核苷酸維持在適當雜交條件下與標靶RNA序列形成互補鹼基對之能力。在一些實施例中，反義股具有與標靶RNA之序列的核苷酸錯配以增強自具有多態性序列之基因之對偶基因表現的RNA之間的差別，或增強降低標靶RNA之表現之活性。

在一些實施例中，寡核苷酸進一步包含莖環序列或結構，其中該莖環序列或結構包含序列區域S1-L-S2，其中S1與S2互補且能夠形成第二雙鏈體(D2)，且其中L為當S1與S2形成第二雙鏈體(D2)時形成的環。在一些實施例中，有義股在其5'-末端包含莖環序列或髮夾。在一些實施例中，反義股在其3'末端包含莖環序列。較佳地，在一些實施例中，有義股在其3'-末端包含莖環序列。在一些實施例中，第二雙鏈體D2可具有多種長度。在一些實施例中，第二雙鏈體/D2具有1-6個鹼基對之長度。在一些實施例中，第二雙鏈體/D2具有2個至6個、3個至6個、4個至6個、5個至6個、1個至5個、2個至5個、3個至5個或4個至5個鹼基對之長度。在一些實施例中，第二雙鏈體/D2具有1個、2個、3個、4個、5個或6個鹼基對之長度。在一些實施例中，S1序列包括標靶RNA之序列且S2序列包括標靶RNA之反義序列，其中S1與S2形成雙鏈體。在一些實施例中，S1序列及S2序列為與標靶RNA序列無關之人工序列。在一些實施例中，第二雙鏈體完全互補。在一些實施例中，第二雙鏈體可含有一或多個錯配。在一些實施例中，S1及S2之序列經選擇以穩定環L之形成。示例性S1序列為GCAGCC且其相應S2序列為GGCUGC。

在一些實施例中，莖環序列中之環L之長度可為至多30個核苷酸。在一些實施例中，環L之長度為至多10個、15個、20個或25個核苷酸。在一些實施例中，環L之長度為3個至6個核苷酸、3個至6個核苷酸、3個至5個核苷酸或3個至4個核苷酸。在一些實施例中，環L為四環、五環或三環，如本文所述。在一些實施例中，四環之長度為4個核苷酸。在一些實施例中，L之序列經選擇以穩定當S1與S2形成第二雙鏈體時所形成的線結構。在一些實施例中，L由核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或其混合物構成。在一些實施例中，L之一或多個核苷酸經修飾。如下文進一步描述，在一些實施例中，L為闡述為UNCG、GAAA、CUUG、d(GNNA)、d(GNRA)、d(GNAB)、d(CNNG)及d(TNCG)之序列，其中N表示任何核苷酸。在一些實施例中，其中N為U、A、C、G中之任一者且R為G或A。在一些實施例中，L為闡述為GAAA之序列。

在一些實施例中，寡核苷酸具有一或多個懸垂核苷酸。在一些實施例中，懸垂核苷酸可在有義股或反義股上，或在有義股與反義股上。在一些實施例中，寡核苷酸包含長度為一或多個核苷酸之3'-懸垂物。在一些實施例中，長度為一或多個核苷酸之3'-懸垂物存在於反義股、有義股、或反義股與有義股上。在一些實施例中，寡核苷酸包含長度為一或多個核苷酸之5'-懸垂物序列。在一些實施例中，長度為一或多個核苷酸之5'-懸垂物存在於反義股、有義股、或反義股與有義股上。在一些實施例中，寡核苷酸在其3'-端包括至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個或更多個單股核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸在其3'-端包括2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或更多個單股核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸在其5'-端包括至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個或更多個單股核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸在其5'-端包括2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或更多個單股核苷酸。在一些實施例中，有義股包含長度為一或多個核苷酸之5'-懸垂物(例如在5'末端2個核苷酸之懸垂物)及長度為一或多個核苷酸之3'懸垂物(例如在3'末端2個核苷酸之懸垂物)。

在一些實施例中，寡核苷酸包含長度為1個或2個核苷酸之3'-懸垂物序列，其中3'-懸垂物序列存在於有義股、反義股、或有義股與反義股二者上。在一些實施例中，寡核苷酸具有23個核苷酸之反義股及21個核苷酸之有義股，其中有義股之3'-末端與嚮導反義股之5'-末端形成鈍端，且其中反義股具有2個核苷酸之3'懸垂物。在一些實施例中，寡核苷酸具有22個核苷酸之反義股及20個核苷酸之有義股，其中有義股之3'-末端與反義股之5'-末端形成鈍端，且其中反義股具有2個核苷酸之3'懸垂物。

在一些實施例中，本文提供之包含有義股及反義股之寡核苷酸具有不對稱結構。在一些實施例中，寡核苷酸具有不對稱結構，其中有義股具有36個核苷酸之長度，且反義股具有22個核苷酸之長度且在其3'-端具有2個核苷酸之3'-懸垂物。在一些實施例中，寡核苷酸具有不對稱結構，其中有義股具有37個核苷酸之長度，且反義股具有23個核苷酸之長度且在其3'-端具有2個核苷酸之懸垂物。

在一些實施例中，有義股及反義股為分開之寡核苷酸。換言之，有義股及反義股未經共價連接。在一些實施例中，有義股及反義股為當呈雙股形式時在有義股與反義股之間含有間隙或缺口之雙股寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包含有義股及反義股，其中有義股進一步包含具有結構S1-L-S2之莖環序列，其中缺口或間隙在有義股之S2區域中。

在一些實施例中，寡核苷酸為單一寡核苷酸，其中有義股與反義股共價連接以形成單一寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包含有義股及反義股，其中有義股進一步包含具有區域S1-L-S2之莖環序列，且其中反義股共價連接於有義股，例如反義股藉由核苷酸間鍵聯連接於有義股之S2區域。

在一些實施例中，寡核苷酸包含用於增加寡核苷酸對磷酸酶及/或核酸酶之抗性、提高雜交效率及/或增強活體內穩定性的手段。在一些實施例中，有義股包含用於增加有義股對磷酸酶及/或核酸酶之抗性、提高雜交效率及/或增強活體內穩定性的手段。在一些實施例中，反義股包含用於增加反義股對磷酸酶及/或核酸酶之抗性、提高雜交效率及/或增強活體內穩定性的手段。在一些實施例中，有義股與反義股二者均包含用於磷酸酶及/或核酸酶、提高雜交效率及/或增強活體內穩定性的手段。在寡核苷酸包括莖環序列之一些實施例中，莖環序列包含用於增加對磷酸酶及/或核酸酶之抗性、提高雜交效率及/或增強活體內穩定性的手段。在一些實施例中，用於增加對磷酸酶及/或核酸酶之抗性、提高雜交效率及/或增強活體內穩定性的手段包括對糖殘基、5'-端磷酸酯、核苷間鍵聯及核鹼基之修飾等，如本文中進一步描述。

在一些實施例中，寡核苷酸之至少一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，寡核苷酸之一或多個核苷酸經修飾。在一些實施例中，寡核苷酸之實質上所有(例如90%或更大)或所有核苷酸經修飾。在一些實施例中，有義股之至少一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，反義股之至少一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，有義股之至少5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多核苷酸經修飾。在一些實施例中，有義股之所有核苷酸經修飾。在一些實施例中，反義股之至少5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多核苷酸經修飾。在一些實施例中，反義股之所有核苷酸經修飾。在一些實施例中，有義股之至少5'-端核苷酸經修飾。在一些實施例中，有義股之至少3'-端核苷酸經修飾。在一些實施例中，反義股之至少5'-端核苷酸經修飾。在一些實施例中，反義股之至少3'-端核苷酸經修飾。

在一些實施例中，寡核苷酸之5'-端磷酸酯例如經磷酸酯類似物(諸如硫代磷酸酯或4'-膦酸酯類似物)修飾，例如以限制磷酸酶及其他酶之作用。在一些實施例中，有義股之5'-端磷酸酯例如經磷酸酯類似物(諸如硫代磷酸酯或4'-膦酸酯類似物)修飾。在一些實施例中，反義股之5'-端磷酸酯例如經磷酸酯類似物(諸如硫代磷酸酯或4'-膦酸酯類似物)修飾。在一些實施例中，反義股之5'-核苷酸之糖的4'-碳包含磷酸酯類似物。在一些實施例中，磷酸酯類似物為氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二醯基膦酸酯。

在一些實施例中，寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯，如本文中進一步描述。在一些實施例中，至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯存在於寡核苷酸上界定區域中或模式中。在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯在有義股之5'-末端之1個至4個核苷酸內，及/或在有義股之3'-末端之1個至4個核苷酸內。在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯在反義股之5'-末端之1個至4個核苷酸內，及/或在反義股之3'-末端之1個至4個核苷酸內。

在一些實施例中，介於有義股(在5'-末端)之位置1與2之核苷酸之間的核苷酸間鍵聯為經修飾之核苷酸間鍵聯，例如硫代磷酸酯。在一些實施例中，介於反義股(在5'-末端)之位置1與2及位置2與3及視情況位置3與4之核苷酸之間的核苷酸間鍵聯為經修飾之核苷酸間鍵聯，例如硫代磷酸酯。在一些實施例中，介於反義股之3'-末端處的最後2個、較佳最後3個核苷酸之間的核苷酸間鍵聯為經修飾之核苷酸間鍵聯，例如硫代磷酸酯。舉例而言，對於長度為22個核苷酸之反義股，介於位置20與21及位置21與22之核苷酸之間的核苷酸間鍵聯具有經修飾之核苷酸間鍵聯，例如硫代磷酸酯。

在一些實施例中，經修飾之核苷酸包含糖部分之修飾，例如2'-修飾。在一些實施例中，2'-修飾為2'-氟或為2'-O-甲基。在一些實施例中，寡核苷酸之至少5'-端核苷酸經2'-氟或2'-O-甲基修飾。在一些實施例中，寡核苷酸之至少3'-端核苷酸經2'-氟或2'-O-甲基修飾。在一些實施例中，有義股之至少5'-端核苷酸經2'-氟或2'-O-甲基修飾。在一些實施例中，有義股之至少3'-端核苷酸經2'-氟或2'-O-甲基修飾。在一些實施例中，反義股之至少5'-端核苷酸經2'-氟或2'-O-甲基修飾。在一些實施例中，反義股之至少3'-端核苷酸經2'-氟基或2'-O-甲基修飾。在一些實施例中，有義股之至少5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多核苷酸具有糖部分之2'修飾。在一些實施例中，有義股之所有核苷酸具有糖部分之2'-修飾。在一些實施例中，反義股之至少5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多核苷酸具有糖部分之2'修飾。在一些實施例中，反義股之所有核苷酸具有糖部分之2'-修飾。下文更詳細地描述糖部分之其他2'-修飾，例如代替2'-O-甲基。

在一些實施例中，寡核苷酸之少於50%至約10%核苷酸具有經2'-F修飾之糖部分。在一些實施例中，有義股之少於50%至約10%核苷酸具有經2'-F修飾之糖部分。在一些實施例中，反義股之少於50%至約10%核苷酸具有經2'-F修飾之糖部分。在上述實施例中，寡核苷酸之剩餘核苷酸具有經以下修飾之糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺基、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)，較佳地2-O-甲基。

在一些實施例中，有義股之長度為19個至21個核苷酸，且在核苷酸位置7至11處具有糖部分經2'-F修飾之一或多個核苷酸，至多4個核苷酸，較佳地在核苷酸位置9、10、11處具有糖部分經2'-F修飾之一或多個核苷酸。在一些實施例中，有義股在核苷酸位置9、10、11處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在上述實施例中，有義股之剩餘核苷酸具有經以下修飾之糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺基、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)，較佳地2-O-甲基。

在一些實施例中，反義股之長度為21至23個核苷酸，且在核苷酸位置1、2、3、5、6、7、10、14及16，較佳地核苷酸位置2、5、6、14及16處具有糖部分經2'-F修飾之一或多個核苷酸，至多6個、至多5個、至多4個或至多3個核苷酸。在一些實施例中，反義股至少在核苷酸位置5或14或核苷酸位置5與14二者處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股在核苷酸位置2、5及14處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸，且視情況在核苷酸位置1、3、6、7、10及16處具有至多3個核苷酸。在上述實施例中，反義股之剩餘核苷酸具有經以下修飾之糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺基、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)，較佳地2-O-甲基。

在一些實施例中，寡核苷酸包含有義股及股，且進一步包含莖環序列S1-L-S2，其中L為四環或三環。在一些實施例中，S1及S2區域之所有核苷酸具有經以下修飾之糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺基、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)，較佳地2-O-甲基。在一些實施例中，L序列之5'-端核苷酸具有糖部分經2'-O-甲基之修飾，且L之剩餘核苷酸具有靶向配位體，如下文進一步描述。在一些實施例中，L序列之所有核苷酸具有靶向配位體，例如GalNAc。

在一些實施例中，用於選擇性遞送或選擇性降低膠細胞中所表現之RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的寡核苷酸視情況經一或多個靶向配位體或部分修飾。在一些實施例中，用於選擇性遞送或選擇性降低膠細胞中所表現之RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的寡核苷酸進一步包含一或多個靶向配位體或部分。在一些實施例中，靶向配位體或部分係選自碳水化合物、胺基糖、膽固醇、肽、多肽、蛋白質或蛋白質一部分(例如抗體或抗體片段)、或脂質。在一些實施例中，靶向配位體或部分為一或多個GalNAc殘基或部分。

在一些實施例中，寡核苷酸之一或多個核苷酸各自結合於分開之靶向配位體。在一些實施例中，寡核苷酸之1個、2個、3個、4個、5個或6個核苷酸各自結合於靶向配位體。在一些實施例中，寡核苷酸之2個至4個核苷酸各自結合於分開之靶向配位體。在一些實施例中，靶向配位體結合於有義股或反義股之任一末端處的2個至4個核苷酸(例如配位體結合於有義股或反義股之5'或3'末端上的2個至4個核苷酸懸垂物或延伸段)。舉例而言，寡核苷酸可在有義股之5'或3'末端包含莖環序列且莖環之1個、2個、3個或4個核苷酸可個別地結合於靶向配位體。

在一些實施例中，寡核苷酸不結合於GalNAc。在某些實施例中，寡核苷酸直接或間接結合於單價GalNAc。在一些實施例中，寡核苷酸直接或間接結合於超過一個單價GalNAc。在一些實施例中，寡核苷酸直接或間接結合於2個、3個或4個單價GalNAc部分，且通常結合於3個或4個單價GalNAc部分。在一些實施例中，本揭示案之寡核苷酸結合於一或多個二價GalNAc、三價GalNAc或四價GalNAc部分。

在一些實施例中，寡核苷酸之一或多個核苷酸各自結合於GalNAc部分。在一些實施例中，寡核苷酸之四環之1個、2個、3個、4個、5個或6個核苷酸結合於GalNAc部分。在一些實施例中，四環之2個至4個核苷酸各自結合於分開之GalNAc。在一些實施例中，三環之1個至3個核苷酸各自結合於分開之GalNAc。在一些實施例中，靶向配位體結合於有義股或反義股之任一末端處的2個至4個核苷酸(例如配位體結合於有義股或反義股之5'或3'末端上的2個至4個核苷酸懸垂物或延伸段)。在一些實施例中，GalNAc部分結合於有義股之核苷酸。在一示例性實施例中，四個GalNAc部分可結合於有義股之四環中之核苷酸，其中各GalNAc部分結合於一個核苷酸。

在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含附連至胍核苷酸之單價GalNAc，稱為[ademG-GalNAc]或2'-胺基二乙氧基甲醇-胍-GalNAc，如下所描繪：

。

在一些實施例中，寡核苷酸包含附連至腺嘌呤核苷酸之單價GalNAc，稱為[ademA-GalNAc]或2'-胺基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所描繪：

。

在一些實施例中，下文顯示自5'至3'包含核苷酸序列GAAA (Z = 連接子，X = 雜原子)莖環序列之環的示例性修飾。在化學式中，

用於描述附接至寡核苷酸股之點：

其中： Z表示鍵、點擊化學手柄或長度為1至20 (包括1及20)個連續共價鍵結原子之連接子，該連接子選自由以下組成之群：經取代及未經取代之伸烷基、經取代及未經取代之伸烯基、經取代及未經取代之伸炔基、經取代及未經取代之伸雜烷基、經取代及未經取代之伸雜烯基、經取代及未經取代之伸雜炔基及其組合；且X為O、S或N。

在一些實施例中，Z為縮醛連接子。在一些實施例中，X為O。

在一些實施例中，有義股上之環L之-AAA-序列包含如下結構：

。

在一些實施例中，環L包含闡述為GAAA之序列。在一些實施例中，GAAA序列中之各A結合於GalNAc部分。在一些實施例中，GAAA序列中之G包含2'-O-甲基修飾。在一些實施例中，GAAA序列中之G包含2'-OH。在一些實施例中，GAAA序列中之各核苷酸包含2'-O-甲基修飾。在一些實施例中，GAAA序列中之各A包含2'-OH且GAAA序列中之G包含2'-O-甲基修飾。在一些實施例中，GAAA序列中之各A包含2'-O-甲氧基乙基修飾且GAAA序列中之G包含2'-O-甲基修飾。在一些實施例中，GAAA序列中之各A包含2'-adem修飾且GAAA序列中之G包含2'-O-甲基修飾。

在一些實施例中，用於選擇性遞送干擾寡核苷酸或用於選擇性降低膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的寡核苷酸的非限制性實例具有以下結構(自有義股至反義股5'→3'示出)：

其中各圓形表示經由核苷酸間鍵聯連接之核苷酸，且在所示出之結構中示為四環的環(L)具有結合於GalNAc殘基之核苷酸(由菱形表示)。有義股之編號自有義股之5'-末端開始，而反義股之編號自缺口位點後之核苷酸殘基開始。

在一些實施例中，寡核苷酸為單一連續寡核苷酸(亦即在有義股與反義股之間不存在缺口或間隙)且可呈單股或雙股形式存在。在一些實施例中，寡核苷酸包含分開之有義股及反義股，例如，當有義股與反義股之間存在缺口或間隙時，如所示出之結構所示，或在有義股與反義股形成雙鏈體，在有義股之3'端與反義股之5'端之間具有鈍端的情況下。

在一些實施例中，寡核苷酸包含各自長度在17個至36個核苷酸範圍內之有義股及反義股。在一些實施例中，寡核苷酸在其有義股之3'延伸段內具有四環結構，且在反義股之3'末端具有2個核苷酸之懸垂物。在一些實施例中，2個核苷酸之3'懸垂物為GG。一般地，在一些實施例中，反義股之兩端GG核苷酸中之一個或兩個不與標靶RNA序列互補。

在一些實施例中，寡核苷酸包含各自長度在20個至23個核苷酸範圍內之有義股及反義股。在一些實施例中，長度為1個或2個核苷酸之3'懸垂物提供於有義股、反義股或有義股與反義股二者上。在一些實施例中，寡核苷酸具有23個核苷酸之反義股及21個核苷酸之有義股，其中有義股之3'-末端與反義股之5'-末端形成鈍端且其中嚮導股具有兩個核苷酸之3'懸垂物。在一些實施例中，寡核苷酸具有22個核苷酸之反義股及20個核苷酸之有義股，其中有義股之3'-末端與反義股之5'-末端形成鈍端且其中反義股具有兩個核苷酸之3'懸垂物。在一些實施例中，長度為9個核苷酸之3'懸垂物提供於反義股上。舉例而言，寡核苷酸可具有22個核苷酸之反義(嚮導)股及29個核苷酸之過客股，其中有義(過客)股在其3'末端形成四環結構且反義(嚮導)股具有9個核苷酸之3'懸垂物(本文中稱為「N-9」)。

應瞭解，所示出之結構之寡核苷酸可在有義股、反義股、S1及S2區域、環(L)及核苷酸懸垂物之長度方面具有變化，且在視情況存在之靶向部分、缺口位點之位置、核苷酸懸垂物之位置、寡核苷酸(包括有義股及/或反義股)之核苷酸之修飾類型及程度以及有義股與反義股及S1區域與S2區域之互補程度方面具有變化，如本文中進一步詳細描述。本文所述之各實施例、變化及修飾以及此類實施例、變化及修飾之任何組合適用於上述示例性寡核苷酸結構。 b. 膠細胞標靶RNA序列

在多個實施例中，反義股具有與膠細胞中所表現的所關注之標靶RNA互補之區域。在一些實施例中，所關注之RNA包含編碼所關注之蛋白質之mRNA。在一些實施例中，膠細胞存在於個體之中樞神經系統或周圍神經系統中。在一些實施例中，膠細胞為星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞或腸膠細胞。在一些實施例中，反義股具有與星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞或腸膠細胞中所表現之RNA互補之區域。

在一些實施例中，所關注之標靶RNA為與涉及膠細胞功能障礙之疾病或病症相關之RNA及/或相應編碼之蛋白質。在一些實施例中，標靶RNA及/或相關疾病或病症包括(例如且不限於)以下之表現：膠質原纖維酸性蛋白( GFAP)基因(例如參考mRNA序列：NM_001131019.3；NM_001242376.2；NM_001363846.1；及NM_002055.5)，亞歷山大氏病(AxD)；鞘脂激活蛋白原(prosaposin， PSAP)基因(例如參考mRNA序列：NM_001042465.3；NM_001042466.3；及NM_002778.4)，異染性腦白質失養症；周圍髓鞘蛋白22 ( PMP22)基因(例如參考mRNA序列：NM_000304.4；NM_001281455.1；NM_001281456.2；NM_001330143.2；及NM_153321.3)，查-馬利-圖氏病；lamin B1蛋白( LMNB1)基因(例如參考mRNA序列：NM_001198557.2；及NM_005573.4)，成人發作型腦白質失養症；澱粉樣蛋白前驅蛋白( APP)基因(例如參考mRNA序列：NM_000484.4；NM_001136016.3；NM_001136129.3；NM_001136130.3；及NM_001136131.2)，及微管相關蛋白τ ( MAPT)基因(例如參考mRNA序列：NM_001123066.3；NM_001123067.3；NM_001203251.2；NM_001203252.1；及NM_005910.5)，阿茲海默氏病；超氧化物歧化酶1 ( SOD1)基因(例如參考mRNA序列NM_000454.4)、染色體9開讀框72 ( C9orf72)基因(例如參考mRNA序列：NM_001256054.2；NM_018325.5；及NM_145005.6)及亨廷頓(Huntington， HTT)基因(例如參考mRNA序列：NM_002111.8)，亨廷頓氏病；α-突觸核蛋白( SNCA或 ASYN)基因(例如參考mRNA序列：NM_000345.4；NM_001146054.2；NM_001146055.2；及NM_007308.2)及震顫素(dardarin)/富白胺酸重複激酶2 ( LRRK2)基因(例如參考mRNA序列：NM_198578.4)，帕金森氏病；腺苷激酶( ADK)基因(例如參考mRNA序列：NM_001123.3；NM_001202449.1；NM_001202450.1；及NM_001369123.1；NM_001369124.1)，癲癇；腫瘤壞死因子α ( TNFα)基因(例如參考mRNA序列：NM_000594.4)及促分裂原活化蛋白激酶7 ( ERK5/MAPK7)基因(例如參考mRNA序列：NM_002749.4；NM_139032.3；NM_139033.2；及NM_139034.3)，中風；腫瘤壞死因子α ( TNFα)基因(例如參考mRNA序列：NM_000594.4)及膠質原纖維酸性蛋白( GFAP)基因(例如參考mRNA序列：NM_001131019.3；NM_001242376.2；NM_001363846.1；及NM_002055.5)，外傷性腦損傷及軸突損傷；IL-1受體類型2 ( IL-1R2)基因(例如參考mRNA序列；NM_001261419.2；NM_004633.4；及NM_173343.1)，自閉症；整聯蛋白次單元α 4 (CD49d)基因(例如參考mRNA序列：NM_000885.6；及NM_001316312.1)，多發性硬化症；胰島素樣生長因子1 ( IGF-1)基因(例如參考mRNA序列：NM_000618.5；NM_001111283.3；NM_001111284.2；及NM_001111285.3)、表皮生長因子( EGF)基因(例如參考mRNA序列：NM_001178130.3；NM_001178131.3；NM_001357021.2；及NM_001963.6)、轉型生長因子β ( TGF-β)基因(例如參考mRNA序列：NM_000660.7)及血管內皮生長因子( VEGF)基因(例如參考mRNA序列：NM_001025366.3；NM_001025367.3；NM_001025368.3；NM_001025369.3；及NM_001025370.3)，神經膠母細胞瘤及膠細胞癌；超氧化物歧化酶1 ( SOD1)基因(例如參考mRNA序列NM_000454.4)、 C9orf72基因(例如參考mRNA序列：NM_001256054.2；NM_018325.5；及NM_145005.6)及TAR-DNA結合蛋白( TDP-43)基因(例如參考mRNA序列：NM_007375.3)，肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)；腫瘤壞死因子α ( TNFα)基因(例如參考mRNA序列：NM_000594.4)及分化簇38 ( CD38)基因(例如參考mRNA序列：NM_001775.4)，神經發炎；共濟失調蛋白2 ( ATXN2)基因(例如參考mRNA序列：NM_001310121.1；NM_001310123.1；及NM_002973.4)、共濟失調蛋白3 ( ATXN3)基因(例如參考mRNA序列：NM_001127696.2；NM_001127697.2；NM_001164774.2；NM_001164776.2；及NM_001164777.2 )及共濟失調蛋白7 ( ATXN7)基因(例如參考mRNA序列：NM_000333.3；NM_001128149.3；及NM_001177387.1)，脊髓小腦性失調症(1、3、5、7等)；微管相關蛋白τ ( TAU/ MAPT)基因(例如參考mRNA序列：NM_001123066.3；NM_001123067.3；NM_001203251.2；NM_001203252.1；及NM_005910.5)，進行性核上神經麻痹症； TAU/ MAPT基因(例如參考mRNA序列：NM_001123066.3；NM_001123067.3；NM_001203251.2；NM_001203252.1；及NM_005910.5)，原發性年齡相關之τ蛋白病變(PART)/神經原纖維纏結優勢型癡呆； TAU/ MAPT基因(例如參考mRNA序列：NM_001123066.3；NM_001123067.3；NM_001203251.2；NM_001203252.1；及NM_005910.5)，涉及染色體17之額顳癡呆與帕金森症(FTDP-17)；及早期生長反應蛋白2 ( EGR2)基因(例如參考mRNA序列：NM_000399.5；NM_001136177.3；NM_001136178.1；NM_001136179.3；及NM_001321037.2)，周圍神經脫髓鞘。

在一些實施例中，標靶RNA為RNA之加工形式。在一些實施例中，標靶RNA為RNA之未加工形式。在一些實施例中，寡核苷酸，例如反義股，具有與標靶mRNA之5'-未轉譯區互補之區域。在一些實施例中，寡核苷酸，例如反義股，具有與標靶mRNA之編碼區互補之區域。在一些實施例中，寡核苷酸，例如反義股，具有與標靶mRNA之外顯子互補之區域。在一些實施例中，寡核苷酸，例如反義股，具有與標靶mRNA之3'-未轉譯區互補之區域。一般地，用反義股靶向之mRNA之5'-未轉譯區、3'-未轉譯區及外顯子的位置及序列提供於以上揭示之各NCBI參考mRNA序列的NCBI資料庫中。在一些實施例中，寡核苷酸，例如反義股，具有與接近或位於RNA剪接接合處之序列互補之區域，其中靶向序列降低或調節標靶RNA之表現。

在一些實施例中，靶向編碼在膠細胞中之過度表現與疾病或病症有關之蛋白質或基因的突變形式的基因以降低表現。在一些實施例中，此等包括例如且不限於 GFAP、 PMP22、 LMNB1、 APP、 MAPT、 SOD1、 C9orf72、 ATXN2、NG2、C9ORF72、 ATXN3、 ATXN7、 HTT、 SNCA/ASYN、 ADK、 TNFα、 CD49d、 TDP-43及 TAU/ MAPT。在一些實施例中，反義股與在標靶mRNA序列中含有突變之序列完全互補且有效降低含有突變之RNA之表現(參見例如Scholefield等人, PLOS One, 2009, 4(9):e7232)。在一些實施例中，標靶mRNA為RNA之對偶基因特異性序列，諸如具有突變之對偶基因(參見例如Bongianino等人, Circulation Research, 2017, 121(5):525-536)。在一些實施例中，反義股靶向與疾病相關突變相關之單核苷酸多態性(SNP)。所關注之基因可呈同型接合或異型接合形式。

在以下章節中描述寡核苷酸特徵、變化及修飾之進一步描述。本揭示案之寡核苷酸包括以下描述之各實施例、變化及修飾以及此類實施例、變化及修飾之任何組合。 c. 寡核苷酸結構、變化及修飾 i. 反義股

在一些實施例中，寡核苷酸之反義股可稱為「嚮導股」。舉例而言，若反義股可與RNA誘導之沉默複合物(RISC)嚙合且結合於 Argonaute蛋白，或與一或多種類似因子嚙合或結合，且引導標靶基因之沉默，則其可稱為嚮導股。在一些實施例中，與嚮導股互補之有義股可稱為「過客股」。

在一些實施例中，寡核苷酸包含長度為至多50個核苷酸(例如長度為至多50個、至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多27個、至多25個、至多21個、至多19個、至多17個或至多12個核苷酸)之反義股。在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包含長度為至少12個核苷酸(例如長度為至少12個、至少15個、至少19個、至少21個、至少25個、至少27個、至少30個、至少35個或至少38個核苷酸)之反義股。在一些實施例中，本文揭示之寡核苷酸之反義股的長度在12個至50個、12個至40個或12個至30個(例如12個至50個、12個至40個、12個至38個、12個至36個、12個至32個、12個至30個、12個至28個、12個至22個、12個至23個、15個至21個、15個至27個、17個至21個、17個至25個、19個至27個或19個至30個)核苷酸範圍內。在一些實施例中，本文揭示之任一種寡核苷酸之反義股的長度為12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個或50個核苷酸。

在一些實施例中，反義股可包含19-23個核苷酸之長度。在一些實施例中，反義股包含19-22個核苷酸之長度。在一些實施例中，反義股包含23個核苷酸之長度、22個核苷酸之長度、21個核苷酸之長度、20個核苷酸之長度或19個核苷酸之長度。

在一些實施例中，反義股可包含20-22個核苷酸之長度。在一些實施例中，反義股包含20-21個核苷酸之長度或21-22個核苷酸之長度。在一些實施例中，反義股包含20個核苷酸之長度、21個核苷酸之長度或22個核苷酸之長度。

具有如本文提供之不對稱結構的寡核苷酸可包括在3'-端(亦即3'-懸垂物)具有任何長度之單股核苷酸的反義股。在一些實施例中，反義股在其3'-端包括至少2個單股核苷酸。在一些實施例中，反義股在其3'-端包括至少0個、1個、2個、3個、至少4個、至少5個、至少6個或更多個單股核苷酸。在一些實施例中，反義股在其3'-端包括2個單股核苷酸。在一些實施例中，反義股在其3'-端包括3個單股核苷酸。在一些實施例中，反義股在其3'-端包括4個單股核苷酸。在一些實施例中，反義股在其3'-端包括5個單股核苷酸。在一些實施例中，反義股在其3'-端包括6個單股核苷酸。 ii. 有義股

在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包含有義股。在一些實施例中，寡核苷酸可具有長度為至多40個核苷酸(例如長度為至多40個、至多35個、至多30個、至多27個、至多25個、至多21個、至多19個、至多17個或至多12個核苷酸)之有義股(或過客股)。

在一些實施例中，寡核苷酸可具有長度為至少12個核苷酸(例如長度為至少12個、至少15個、至少19個、至少21個、至少25個、至少27個、至少30個、至少32個、至少34個、至少36個或至少38個核苷酸)之有義股。在一些實施例中，寡核苷酸可具有長度在12個至40個(例如12個至40個、12個至36個、12個至32個、12個至28個、15個至40個、15個至36個、15個至32個、15個至28個、17個至21個、17個至25個、17個至36個、19個至27個、19個至30個、20個至40個、22個至40個、25個至40個或32個至40個)核苷酸範圍內的有義股。在一些實施例中，寡核苷酸可具有長度為12個核苷酸、長度為13個核苷酸、長度為14個核苷酸、長度為15個核苷酸、長度為16個核苷酸、長度為17個核苷酸、長度為18個核苷酸、長度為19個核苷酸、長度為20個核苷酸、長度為21個核苷酸、長度為22個核苷酸、長度為23個核苷酸、長度為24個核苷酸、長度為25個核苷酸、長度為26個核苷酸、長度為27個核苷酸、長度為28個核苷酸、長度為29個核苷酸、長度為30個核苷酸、長度為31個核苷酸、長度為32個核苷酸、長度為33個核苷酸、長度為34個核苷酸、長度為35個核苷酸、長度為36個核苷酸、長度為37個核苷酸、長度為38個核苷酸、長度為39個核苷酸長度或長度為40個核苷酸之有義股。

在一些實施例中，有義股在3'-末端進一步包含莖環序列(或結構)，該莖環序列(或結構)具有區域S1-L-S2，其中S1區域與S2區域互補且能夠形成第二雙鏈體(D2)或莖，且其中L為當S1與S2形成D2 (莖)時形成的環。在一些實施例中，在S1與S2之間形成之D2或莖的長度為至少1個(例如至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個)鹼基對。在一些實施例中，D2或莖為長度為2個、3個、4個、S個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個或14個核苷酸之雙鏈體。在一些實施例中，在S1區域與S2區域之間形成的D2的長度在1-6個鹼基對(例如長度為1-5個、1-4個、1-3個、1-2個、2-6個、3-6個、4-6個或5-6個鹼基對)範圍內。

在一些實施例中，在S1與S2之間形成的環L的長度為至多10個核苷酸(例如長度為3個、4個、S個、6個、7個、8個、9個或10個核苷酸)。在一些實施例中，環L包含接合S1及S2區域之四環、五環或三環(triL)。在一些實施例中，四環、五環或三環在有義股之3'端。在一些實施例中，四環、五環或三環在反義股而非有義股之5'端。

在一些實施例中，諸如三環、五環或四環之L中之許多核苷酸可結合於靶向配位體。在一些實施例中，三環包含1個結合於配位體之核苷酸。在一些實施例中，三環包含2個結合於配位體之核苷酸。在一些實施例中，三環包含3個結合於配位體之核苷酸。在一些實施例中，三環包含1-3個結合於配位體之核苷酸。在一些實施例中，三環包含1-2個結合於配位體之核苷酸或2-3個結合於配位體之核苷酸。

在一些實施例中，四環包含1個結合於配位體之核苷酸。在一些實施例中，四環包含2個結合於配位體之核苷酸。在一些實施例中，四環包含3個結合於配位體之核苷酸。在一些實施例中，四環包含4個結合於配位體之核苷酸。在一些實施例中，四環包含1-4個結合於配位體之核苷酸。在一些實施例中，四環包含結合於配位體之1-3個核苷酸、1-2個核苷酸、2-4個核苷酸或3-4個核苷酸。

在一些實施例中，四環或三環可含有核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、經修飾之核苷酸及其組合。RNA四環之非限制性實例包括(但不限於) UNCG家族四環(例如UUCG)、GNRA家族四環(例如GAAA)及CUUG四環。DNA四環之非限制性實例包括(但不限於) d(GNNA)家族四環(例如d(GTTA))、d(GNRA)家族四環、d(GNAB)家族四環、d(CNNG)家族四環及d(TNCG)家族四環(例如d(TTCG))。 iii. 雙鏈體長度

在一些實施例中，在有義股與反義股之間形成的雙鏈體的長度為至少12個(例如至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個或至少21)核苷酸。在一些實施例中，在有義股與反義股之間形成的雙鏈體的長度在12-30個核苷酸(例如12個至30個、12個至27個、12個至22個、15個至25個、18個至22個、18個至25個、18個至27個、18個至30個、19個至30個或21個至30個核苷酸)範圍內。在一些實施例中，在有義股與反義股之間形成的雙鏈體的長度為12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個核苷酸。在一些實施例中，在有義股與反義股之間形成的雙鏈體不跨越有義股及/或反義股之整個長度。在一些實施例中，有義股與反義股之間的雙鏈體跨越有義股或反義股之整個長度。在一些實施例中，有義股與反義股之間的雙鏈體跨越有義股與反義股二者之整個長度。 iii. 寡核苷酸末端

在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸包含有義股及反義股，其中3'-懸垂物存在於有義股、或反義股、或有義股與反義股二者上。在一些實施例中，本揭示案之寡核苷酸的一個5'-末端在熱力學上不如另一5'末端穩定。在一些實施例中，提供不對稱寡核苷酸，其在有義股之3'-末端包括鈍端且在反義股之3'-末端包括懸垂物。在一些實施例中，反義股上之3'懸垂物的長度為1-8個核苷酸(例如長度為1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個核苷酸)。

通常，RNAi之寡核苷酸在反義(嚮導)股之3'-末端上具有兩個核苷酸之懸垂物。然而，其他懸垂物係可能的。在一些實施例中，懸垂物為長度介於1個與6個核苷酸之間，視情況1個至5個、1個至4個、1個至3個、1個至2個、2個至6個、2個至5個、2個至4個、2個至3個、3個至6個、3個至5個、3個至4個、4個至6個、4個至5個、5個至6個核苷酸，或1個、2個、3個、4個、5個或6個核苷酸的3'-懸垂物。然而，在一些實施例中，懸垂物為長度介於1個與6個核苷酸之間，視情況1個至5個、1個至4個、1個至3個、1個至2個、2個至6個、2個至5個、2個至4個、2個至3個、3個至6個、3個至5個、3個至4個、4個至6個、4個至5個、5個至6個核苷酸，或1個、2個、3個、4個、5個或6個核苷酸的5'-懸垂物。

在一些實施例中，有義股及/或反義股之3'-末端或5'-末端之一或多個(例如2個、3個、4個)末端核苷酸經修飾。舉例而言，在一些實施例中，反義股之3'末端之1個或2個末端核苷酸經修飾。在一些實施例中，反義股之3'-末端處的最後一個核苷酸經修飾，例如包含2'-修飾，例如2'-O-甲氧基乙基。在一些實施例中，反義股之3'-末端處的最後一個或兩個末端核苷酸與標靶互補。在一些實施例中，反義股之3-末端處的最後一個或兩個核苷酸不與標靶互補。在一些實施例中，有義股或反義股之5'-末端及/或3'-末端具有反向帽核苷酸。 iv. 錯配

在一些實施例中，由有義股及反義股構成之寡核苷酸在有義股與反義股之間具有一或多個(例如1個、2個、3個、4個、5個)錯配。若有義股與反義股之間存在超過一個錯配，則該等錯配之位置可為連續的(例如一排2個、3個或更多個)或可散佈在整個互補區域內。在一些實施例中，有義股之3'-端含有一或多個錯配。在一些實施例中，兩個錯配合併在有義股之3'-端。在一些實施例中，在寡核苷酸之有義股之3'-末端的鹼基錯配或區段不穩定提高RNAi中之合成雙鏈體之效力，此可能係經由促進切丁酶加工。 v. 單股寡核苷酸

在一些實施例中，用於降低標靶RNA表現之寡核苷酸為單股的。此類結構可包括但不限於單股RNAi寡核苷酸。(參見例如Matsui等人, Molecular Therapy, 2016, 24(5), 946-955)。在一些實施例中，單股RNAi經修飾以增強穩定性及針對標靶RNA之有效性。

然而，在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸為反義寡核苷酸(ASO)。反義寡核苷酸為單股寡核苷酸，其核鹼基序列在以5'至3'方向書寫時包含特定核酸之靶向區段之反向互補序列且經適當修飾(例如呈間隙聚物)以便誘導細胞中RNaseH介導之其標靶RNA裂解或(例如呈混合聚物(mixmer))且抑制細胞中標靶mRNA轉譯。用於本揭示案之反義寡核苷酸可以所屬領域中已知之任何合適方式進行修飾，包括例如如美國專利第9,567,587號中所示，該文獻中關於反義寡核苷酸之修飾(包括例如長度、核鹼基(嘧啶、嘌呤)之糖部分及核鹼基之雜環部分之改變)的揭示內容以引用之方式併入本文中。此外，反義分子用於降低特定標靶基因之表現(參見例如Bennett等人, Pharmacology of Antisense Drugs, Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 7:81-105)。 iv. 寡核苷酸修飾

寡核苷酸可以多種方式進行修飾，以改善或控制特異性、穩定性、遞送、生物可用度、抗核酸酶降解性、免疫原性、鹼基配對特性、RNA分佈及細胞吸收以及與治療或研究用途有關之其他特徵(參見例如Bramsen等人, Nucleic Acids Res., 2009, 37:2867-2881；Bramsen及Kjems, Frontiers in Genetics, 2012, 3:1-22)。因此，在一些實施例中，本揭示案之寡核苷酸可包括一或多個合適修飾。在一些實施例中，經修飾之核苷酸在其鹼基(或核鹼基)、糖(例如核糖、去氧核糖)或磷酸基中具有修飾，如下文進一步描述。

寡核苷酸上修飾之數目及彼等核苷酸修飾之位置可能影響寡核苷酸之特性。舉例而言，寡核苷酸可在活體內藉由將其結合於脂質奈米粒子(LNP)或類似載劑或將其包圍在脂質奈米粒子(LNP)或類似載劑中來遞送。然而，當寡核苷酸未受到LNP或類似載劑保護時，其至少一些核苷酸宜經修飾。因此，在本文提供之任一種寡核苷酸之某些實施例中，寡核苷酸之所有或實質上所有核苷酸經修飾。在某些實施例中，超過一半之核苷酸經修飾。在某些實施例中，少於一半之核苷酸經修飾。通常，在裸遞送下，每種糖在2'-位置處經修飾。此等修飾可為可逆或不可逆的。在一些實施例中，如本文揭示之寡核苷酸的經修飾之核苷酸的數目及類型足以引起期望特徵(例如避免酶促降解、在活體內投與之後靶向期望細胞之能力及/或熱力學穩定性)。 a. 糖修飾

在一些實施例中，經修飾之糖(本文中亦稱為糖類似物)包括經修飾之去氧核糖或核糖部分，例如其中一或多個修飾發生在糖之2'、3'、4'及/或5'碳位置。在一些實施例中，經修飾之糖亦可包括非天然替代碳結構，諸如以下中存在之碳結構：鎖核酸(「LNA」或「雙環」) (參見例如Koshkin等人, Tetrahedron, 1998, 54:3607-3630)、非鎖核酸(「UNA」或「無環」) (參見例如Snead等人, Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2013, 2:e103)及橋聯核酸(「BNA」) (參見例如Imanishi及Obika, The Royal Society of Chemistry, Chem. Commun., 2002, 1653-1659)。Koshkin等人、Snead等人以及Imanishi及Obika之涉及糖修飾之揭示內容以引用之方式併入本文中。糖修飾可增加寡核苷酸對核酸酶之抗性及/或增強雜交效率。

在一些實施例中，核苷酸糖修飾包含2'-修飾。在一些實施例中，2'-修飾包括2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺基、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-氟(2'-F)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)、2'-去氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)或其組合等。在一些實施例中，修飾為2'-氟、2'-O-甲基或2'-O-甲氧基乙基。在一些實施例中，糖修飾包含糖環之修飾，該修飾可包含糖環之一或多個碳之修飾。舉例而言，核苷酸之糖修飾可包含連接於糖之1'-碳或4'-碳的糖之2'-氧，或經由伸乙基或亞甲基橋連接於1'-碳或4'-碳之2'-氧。在一些實施例中，經修飾之核苷酸具有缺乏2'-碳至3'-碳鍵之非環狀糖。在一些實施例中，經修飾之核苷酸例如在糖之4'位置中具有硫醇基。

在一些實施例中，本文所述之寡核苷酸包含至少一個在糖部分上經修飾之核苷酸(例如至少1個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個或更多個)。在一些實施例中，寡核苷酸之有義股包含至少一個在糖部分上經修飾之核苷酸(例如至少1個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個或更多個)。在一些實施例中，寡核苷酸之反義股包含至少一個在糖部分上經修飾之核苷酸(例如至少1個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個或更多個)。

在一些實施例中，寡核苷酸之有義股之所有核苷酸均具有糖部分之修飾。在一些實施例中，寡核苷酸之反義股之所有核苷酸均具有糖部分之修飾。在一些實施例中，寡核苷酸(亦即有義股與反義股二者)之所有核苷酸均具有糖部分之修飾。在一些實施例中，核苷酸上糖部分之修飾包含2'-修飾(例如2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基、或2'-去氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸)。在一些實施例中，核苷酸上糖部分之修飾包含經2'-氟或2'-O-甲基之2'-修飾。

在一些實施例中，有義股之少於50%、少於40%、少於35%、少於30%至約10%、約12%、約14%、約18%或約20%之核苷酸具有經2'-F基團修飾之糖部分。在一些實施例中，反義股之少於50%、少於40%、少於35%、少於30%至約10%、約12%、約14%、約18%或約20%之核苷酸具有經2'-F基團修飾之糖部分。在一些實施例中，長度為19個至21個核苷酸之有義股具有至多5個、較佳地至多4個用2'-F基團修飾糖部分之核苷酸。在一些實施例中，長度為21個至23個核苷酸之反義股具有至多6個、較佳地至多5個、更佳地至多3個用2'-F基團修飾糖部分之核苷酸。在一些實施例中，具有長度為19個至21個核苷酸之有義股及長度為21個至23個核苷酸之反義股的寡核苷酸具有至多總共4個至12個、5個至11個或6個至10個用2'-F修飾糖部分之核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之剩餘核苷酸在糖部分上經以下修飾：2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺基、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)、2'-去氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)或其組合，較佳地2'-O-甲基。

在一些實施例中，寡核苷酸可在寡核苷酸之界定位置處具有對核苷酸之糖殘基的修飾。在一些實施例中，對於包含有義股及反義股之寡核苷酸，有義股在核苷酸位置7、8、9、10及11處具有一或多個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸，較佳地在核苷酸位置9、10及11處具有一或多個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，有義股在核苷酸位置7、8、9、10及11處有2個、3個、4個或所有核苷酸的糖部分經2'-F修飾。如上所述，在一些實施例中，有義股具有至多5個、較佳地至多4個其中糖部分經2'-F基團修飾之核苷酸。

在一些實施例中，對於有義股具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸的上述各實施例，有義股之剩餘核苷酸具有以下對糖部分之修飾：2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺基、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)、2'-去氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)或其組合，較佳地2'-O-甲基。在一些實施例中，有義股在核苷酸位置7、8、9、10及11處具有一或多個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸，且有義股之剩餘核苷酸具有經以下修飾之糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺基、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)、2'-去氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)或其組合，較佳地2'-O-甲基。在一些實施例中，寡核苷酸包含長度為19個至21個核苷酸之有義股，其中有義股在核苷酸位置8、9、10及11處或較佳在核苷酸位置9、10及11處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸，且有義股之剩餘位置處的各核苷酸具有2'-O-甲基對糖殘基之修飾。

在一些實施例中，寡核苷酸之反義股在核苷酸位置1、2、3、5、6、7、10、14及16處，較佳在核苷酸位置2、3、5、6、7、10及14中之一或多個位置處具有一或多個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股至少在核苷酸位置5或14處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股在核苷酸位置5及14處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股在核苷酸位置5處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸，且在核苷酸位置1、2、3、6、7、10、14及16處具有至多5個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股在核苷酸位置14處具有2'-F修飾，且在核苷酸位置1、2、3、6、7、10、14及16處具有至多5個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股在核苷酸位置5及14處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸，且在核苷酸位置1、2、3、6、7、10及16處具有至多4個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股在核苷酸位置2、5及14處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸，且視情況在核苷酸位置1、3、7及10處具有至多3個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股在位置2、5及14各位置處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股在核苷酸位置1、2、5及14各位置處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，在反義股之位置1、2、3、5、7及14各位置處之糖部分經2'-F修飾。在又一個實施例中，在反義股之位置1、2、3、5、10及14各位置處之糖部分經2'-F修飾。在另一個實施例中，在反義股之位置2、3、5、7、10及14各位置處之糖部分經2'-F修飾。如上所述，在一些實施例中，長度為21個至23個核苷酸之反義股具有至多6個、較佳至多5個、更佳至多3個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。

在一些實施例中，對於反義股具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸的上述各實施例，反義股之剩餘核苷酸具有經以下修飾之糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺基、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)、2'-去氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)或其組合，較佳地2'-O-甲基。在一些實施例中，寡核苷酸之反義股在核苷酸位置1、2、3、5、6、7、10、14及16處，較佳在核苷酸位置2、3、5、6、7、10及14中之一或多個位置處具有一或多個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸，且反義股之剩餘核苷酸具有經以下修飾之糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺基、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)、2'-去氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)或其組合，較佳地2'-O-甲基。在一些實施例中，反義股在核苷酸位置2、5及14處具有糖部分用2'-F修飾之核苷酸，且視情況在核苷酸位置1、3、6、7及10處具有至多3個其中糖部分用2'-F修飾之核苷酸，且反義股之剩餘核苷酸具有2'-O-甲基對糖部分之修飾。

在一些實施例中，對於具有S1-L-S2之莖環序列之寡核苷酸，莖及/或環之一或多個核苷酸具有糖部分之修飾。在一些實施例中，修飾不包括經靶向配位體之修飾。在一些實施例中，修飾為2'-O-炔丙基、2'-O-丙基胺基、2'-胺基、2'-乙基、2'-胺基乙基(EA)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-氟(2'-F)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O-NMA)、2'-去氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)或其組合。在一些實施例中，糖部分之修飾為2'-氟、2'-O-甲基或2'-O-甲氧基乙基。在一些實施例中，S1之一或多個核苷酸至所有核苷酸具有糖部分之修飾。在一些實施例中，S2之一或多個核苷酸至所有核苷酸具有糖部分之修飾。在一些實施例中，S1及S2之所有核苷酸均具有糖部分之修飾，較佳經2'-O-甲基之修飾。在一些實施例中，環L之一或多個核苷酸具有糖部分之修飾。在一些實施例中，環序列之5'核苷酸具有糖部分之修飾。在一些實施例中，對於四環、五環或三環，環序列之5'核苷酸在2'位置處具有糖部分之修飾，較佳經2'-O-甲基之修飾，且環之剩餘核苷酸經靶向配位體修飾。 b. 5'端磷酸酯

在一些實施例中，寡核苷酸之5'-端磷酸基增強與Argonaute 2之相互作用。然而，包含5'-磷酸基之寡核苷酸容易經由磷酸酶或其他酶降解，此可限制寡核苷酸在活體內之生物可用度。在一些實施例中，寡核苷酸包括抵抗此類降解之5'磷酸酯類似物。在一些實施例中，磷酸酯類似物可為氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二醯基膦酸酯。在某些實施例中，寡核苷酸股之5'末端附接於模擬天然5'-磷酸基之靜電及空間特性的化學部分(「磷酸酯模擬物」) (參見例如Prakash等人, Nucleic Acids Res., 2015, 43(6): 2993-3011，涉及磷酸酯類似物之內容以引用之方式併入本文中)。已研發許多可附接於5'末端之磷酸酯模擬物(參見例如美國專利第8,927,513號，涉及磷酸酯類似物之內容以引用之方式併入本文中)。對寡核苷酸之5'末端的其他修飾揭示於例如國際專利公開案WO 2011/133871中，涉及磷酸酯類似物之內容以引用之方式併入本文中。在某些實施例中，羥基附接於寡核苷酸之5'末端。

在一些實施例中，寡核苷酸在糖之4'-碳位置處具有磷酸酯類似物(稱為「4'-磷酸酯類似物」)。參見例如2017年9月1日申請之國際專利申請案PCT/US2017/049909；2016年9月2日申請之標題為4'-磷酸酯類似物及包含其之寡核苷酸(4'-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same)的美國臨時申請案第62/383,207號及2016年9月12日申請之標題為4'-磷酸酯類似物及包含其之寡核苷酸(4'-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same)的美國臨時申請案第62/393,401號，各文獻涉及磷酸酯類似物之內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸在5'-端核苷酸處包含4'-磷酸酯類似物。在一些實施例中，磷酸酯類似物為氧甲基膦酸酯，其中氧甲基之氧原子結合於糖部分(例如在其4'-碳處)或其類似物。在其他實施例中，4'-磷酸酯類似物為硫甲基膦酸酯或胺基甲基膦酸酯，其中硫甲基之硫原子或胺基甲基之氮原子結合於糖部分之4'-碳或其類似物。在某些實施例中，4'-磷酸酯類似物為氧甲基膦酸酯。在一些實施例中，氧甲基膦酸酯由式-O-CH ₂-PO(OH) ₂或-O-CH ₂-PO(OR) ₂表示，其中R獨立地選自H、CH ₃、烷基、CH ₂CH ₂CN、CH ₂OCOC(CH ₃) ₃、CH ₂OCH ₂CH ₂Si (CH ₃) ₃或保護基。在某些實施例中，烷基為CH ₂CH ₃。更通常，R獨立地選自H、CH ₃或CH ₂CH ₃。在一些實施例中，5'-端修飾係針對有義股。在一些實施例中，5'-端修飾係針對反義股。

在一些實施例中，附連至寡核苷酸之磷酸酯類似物為甲氧基膦酸酯(MOP)。在一些實施例中，附連至寡核苷酸之磷酸酯類似物為5'單甲基保護之MOP。在一些實施例中，例如在反義(嚮導)股之第一位置處可使用包含磷酸酯類似物之以下尿苷核苷酸：

，該經修飾之核苷酸稱為[Me膦酸酯-4O-mU]或5'-甲氧基膦酸酯-4'氧基-2'-O-甲基尿苷。 c. 經修飾之核苷間鍵聯

在一些實施例中，寡核苷酸可包含經修飾之核苷間鍵聯。在一些實施例中，磷酸酯修飾或取代可產生包含至少一個(例如至少1個、至少2個、至少3個或至少5個)經修飾之核苷酸間鍵聯的寡核苷酸。在一些實施例中，本文揭示之任一種寡核苷酸包含1個至10個(例如1個至10個、2個至8個、4個至6個、3個至10個、5個至10個、1個至5個、1個至3個或1個至2)經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，本文揭示之任一種寡核苷酸包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個經修飾之核苷酸間鍵聯。

經修飾之核苷酸間鍵聯可為二硫代磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯、磷酸三酯鍵聯、硫羰基烷基膦酸酯鍵聯、硫羰基烷基磷酸三酯鍵聯、胺基磷酸酯鍵聯、膦酸酯鍵聯或硼烷磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，寡核苷酸之至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，核苷酸間鍵聯為以下結構之4-O-亞甲基膦酸酯鍵聯：

，其中R ¹為H或C ₁-C ₄烷基。在一些實施例中，R ¹為甲基。

在一些實施例中，寡核苷酸在以下位置中之一或多個位置處具有核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯：有義股之位置1及2 (亦即在5'-端區域)、反義股之位置1及2、反義股之位置2及3、反義股之位置3及4 (亦即在5'-端區域)、反義股之位置20及21、及反義股之位置21及22 (亦即3'-端區域)。在一些實施例中，寡核苷酸在以下位置中之每一者處具有核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯：有義股之位置1及2、反義股之位置1及2、反義股之位置2及3、反義股之位置20及21、及反義股之位置21及22。 d. 鹼基修飾

在一些實施例中，本文提供之寡核苷酸具有一或多個經修飾之核鹼基。在一些實施例中，經修飾之核鹼基(本文中亦稱為鹼基類似物)連接在核苷酸糖部分之1'位置處。在某些實施例中，經修飾之核鹼基為含氮鹼基。在某些實施例中，經修飾之核鹼基不含氮原子(參見例如美國專利公開案第20080274462號)。在一些實施例中，經修飾之核苷酸包含通用鹼基。在某些實施例中，經修飾之核苷酸不含核鹼基(無鹼基)。

在一些實施例中，通用鹼基為位於經修飾之核苷酸中之核苷酸糖部分之1'位置或核苷酸糖部分取代中之等效位置處的雜環部分，當存在於雙鏈體中時，其可與超過一種類型之鹼基相對定位而不會實質上改變雙鏈體之結構。在一些實施例中，相較於與標靶核酸完全互補之參考單股核酸(例如，寡核苷酸)，含有通用鹼基之單股核酸與標靶核酸形成之雙鏈體的T _m低於與互補核酸形成之雙鏈體。然而，在一些實施例中，與其中通用鹼基已置換為某個鹼基以產生單個錯配之參考單股核酸相比，含有通用鹼基之單股核酸與標靶核酸形成之雙鏈體的T _m高於與包含錯配鹼基之核酸形成之雙鏈體。

通用結合核苷酸之非限制性實例包括肌苷、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚及/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(美國專利公開案第20070254362號；Van Aerschot等人, Nucleic Acids Res., 1995, 23(21):4363-70；Loakes等人, Nucleic Acids Res. 1995, 23(13):2361-6；Loakes及Brown, Nucleic Acids Res., 1994, 22(20):4039-43。前述各文獻涉及鹼基修飾之揭示內容以引用之方式併入本文中)。 e. 可逆修飾

雖然可進行某些修飾以在寡核苷酸到達標靶細胞之前保護其免受活體內環境之影響，但一旦寡核苷酸到達標靶細胞之胞質，其可能降低寡核苷酸之效力或活性。可進行可逆修飾，使得分子在細胞外保留所需之特性，然後在進入細胞之胞質環境時移除掉。可例如藉由細胞內酶之作用或藉由細胞內部之化學條件(例如，經由細胞內麩胱甘肽之還原)來移除可逆修飾。

在一些實施例中，經可逆修飾之核苷酸包含麩胱甘肽敏感性部分。通常，核酸分子已用環狀二硫化物部分進行化學修飾，以遮蔽由核苷酸間二磷酸鍵聯產生之負電荷且提高細胞攝取及核酸酶抗性(參見美國專利公開案20110294869、國際專利公開案WO2015188197；Meade等人, Nature Biotech., 2014,32:1256-1263；國際專利公開案WO2014088920；各文獻關於此類修飾之揭示內容均以引用之方式併入)。核苷酸間二磷酸酯鍵聯之此種可逆修飾經設計以由胞質之還原環境(例如，麩胱甘肽)在細胞內裂解。早先之實例包括據報導在細胞內可裂解之中和磷酸三酯修飾(Dellinger等人, J. Am. Chem. Soc., 2003, 125:940-950)。

在一些實施例中，此類可逆修飾允許在寡核苷酸將暴露於核酸酶及其他嚴苛環境條件(例如，pH值)的活體內投與期間(例如，運輸經過血液及/或細胞之溶酶體/胞內體區室)加以保護。當釋放至麩胱甘肽之水準高於細胞外空隙的細胞胞質中時，修飾逆轉且結果產生裂解之寡核苷酸。與使用不可逆化學修飾可獲得之選擇相比，使用可逆麩胱甘肽敏感性部分，有可能將空間較大之化學基團引入所關注之寡核苷酸中。此等較大之化學基團將在胞質中移除掉，且因此不會干擾細胞胞質液中寡核苷酸之生物活性。因此，可對此等較大之化學基團進行工程改造以賦予核苷酸或寡核苷酸各種優點，諸如核酸酶抗性、親脂性、電荷、熱穩定性、特異性及降低之免疫原性。在一些實施例中，可對麩胱甘肽敏感性部分之結構進行工程改造以改變其釋放動力學。

在一些實施例中，麩胱甘肽敏感性部分附接於核苷酸之糖。在一些實施例中，麩胱甘肽敏感性部分附接於經修飾之核苷酸之糖的2'-碳。在一些實施例中，麩胱甘肽敏感性部分位於糖之5-碳上，尤其當經修飾之核苷酸為寡核苷酸之5'端核苷酸時。在一些實施例中，麩胱甘肽敏感性部分位於糖之3-碳上，尤其當經修飾之核苷酸為寡核苷酸之3'端核苷酸時。在一些實施例中，麩胱甘肽敏感部分包含磺醯基(參見例如國際專利公開案WO2018039364，其相關揭示內容以引用之方式併入本文中)。 f. 靶向配位體

在一些實施例中，可能需要使本揭示案之寡核苷酸靶向一或多種細胞或一或多種器官。此類策略可幫助避免在其他器官中不合需要之作用，或者可避免寡核苷酸過度損失在不會得益於寡核苷酸之細胞、組織或器官。因此，在一些實施例中，本文揭示之寡核苷酸可經修飾以促進特定組織、細胞或器官之靶向，例如以促進寡核苷酸遞送至肝臟。在某些實施例中，本文揭示之寡核苷酸可經修飾以促進寡核苷酸遞送至肝臟之肝細胞。在一些實施例中，寡核苷酸包含與一或多個靶向配位體結合之核苷酸。

靶向配位體可包含碳水化合物、胺基糖、膽固醇、肽、多肽、蛋白質或蛋白質一部分(例如，抗體或抗體片段)。在一些實施例中，靶向配位體為適體。舉例而言，靶向配位體可為用於靶向脈管系統或神經膠瘤細胞之RGD肽、靶向腫瘤脈管系統或造口(stoma)之CREKA肽、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、或靶向在CNS脈管系統上表現之轉鐵蛋白受體之適體、或靶向神經膠瘤細胞上之EGFR之抗EGFR抗體。在一些實施例中，靶向配位體為一或多個GalNAc部分。

在一些實施例中，寡核苷酸之1個或更多個(例如1個、2個、3個、4個、5個或6個)核苷酸各自結合於分開之靶向配位體。在一些實施例中，寡核苷酸之2個至4個核苷酸各自結合於分開之靶向配位體。在一些實施例中，靶向配位體結合於有義股或反義股之任一末端處的2個至4個核苷酸(例如配位體結合於有義股或反義股之5'或3'末端上的2個至4個核苷酸懸垂物或延伸段)，以使得靶向配位體類似於牙刷之刷毛且寡核苷酸類似於牙刷。舉例而言，寡核苷酸可在有義股之5'或3'末端包含莖環序列且莖環之1個、2個、3個或4個核苷酸可個別地結合於靶向配位體。

在一些實施例中，靶向配位體為GalNAc部分。GalNAc為對去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)具有高親合力之配位體，ASGPR主要在肝細胞之血竇表面上表現，且在含有末端半乳糖或N-乙醯半乳糖胺殘基之循環糖蛋白(去唾液酸糖蛋白)之結合、內化及後續清除中起主要作用。GalNAc 部分與寡核苷酸之結合(間接或直接)可用於將此等寡核苷酸靶向在細胞上表現之ASGPR。

在一些實施例中，寡核苷酸直接或間接結合於單價GalNAc。在一些實施例中，寡核苷酸直接或間接結合於超過一個單價GalNAc (亦即結合於2個、3個或4個單價GalNAc，且通常結合於3個或4個單價GalNAc部分)。在一些實施例中，本揭示案之寡核苷酸結合於一或多個二價GalNAc、三價GalNAc或四價GalNAc部分。

在一些實施例中，寡核苷酸之1個或更多個(例如1個、2個、3個、4個、5個或6個)核苷酸各自結合於GalNAc部分。在一些實施例中，四環之2個至4個核苷酸各自結合於分開之GalNAc。在一些實施例中，三環之1個至3個核苷酸各自結合於分開之GalNAc。在一些實施例中，靶向配位體結合於有義股或反義股之任一末端處的2個至4個核苷酸(例如配位體結合於有義股或反義股之5'或3'末端上的2個至4個核苷酸懸垂物或延伸段)，以使得GalNAc部分類似於牙刷之刷毛且寡核苷酸類似於牙刷。在一些實施例中，GalNAc部分結合於有義股之核苷酸。舉例而言，四個GalNAc部分可結合於有義股之四環中之核苷酸，其中各GalNAc部分結合於一個核苷酸。

。

在一些實施例中，本文中之寡核苷酸包含附連至腺嘌呤核苷酸之單價GalNAc，稱為[ademA-GalNAc]或2'-胺基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所描繪。 E

下文顯示自5'至3'包含核苷酸序列GAAA (Z = 連接子，X = 雜原子)莖附接點之環的此類結合之一實例。在化學式中，

用於描述附接至寡核苷酸股之點。

可使用適當方法或化學(例如點擊化學)將靶向配位體連接至核苷酸。在一些實施例中，使用點擊連接子將靶向配位體與核苷酸結合。在一些實施例中，使用基於縮醛之連接子將靶向配位體與本文所述之任一種寡核苷酸之核苷酸結合。例如，在國際專利公開案WO2016100401中揭示基於縮醛之連接子，其關於此類連接子之內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，連接子為不穩定連接子。然而，在其他實施例中，連接子為穩定的。「不穩定連接子」係指可例如通過酸性pH裂解之連接子。「穩定連接子」係指不可裂解之連接子。

下文顯示自5'至3'包含核苷酸GAAA之環的一實例，其中使用縮醛連接子將GalNAc部分附接於環之核苷酸。在化學式中，

為附接至寡核苷酸股之點。

可使用任何適當方法或化學(例如點擊化學)將靶向配位體連接至核苷酸。在一些實施例中，使用點擊連接子將靶向配位體與核苷酸結合。在一些實施例中，使用基於縮醛之連接子將靶向配位體與本文所述之任一種寡核苷酸之核苷酸結合。例如，在國際專利申請公開案第WO2016100401號中揭示基於縮醛之連接子，其關於此類連接子之內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，連接子為不穩定連接子。然而，在其他實施例中，連接子為穩定的。「相當穩定連接子」係指不可裂解之連接子。 g. 修飾模式

在一些實施例中，寡核苷酸經修飾以增加對磷酸酶、核酸酶及其他酶之抗性；增強或維持雜交穩定性；提供靶向特異性；且適當時，增強RNA沉默加工(例如經由切丁酶及Argonaut)。在一些實施例中，在界定實施例中，糖部分、5'-端磷酸酯、核苷間鍵聯及鹼基之每種修飾以及可逆修飾及經由靶向配位體之修飾併入寡核苷酸中。

在一些實施例中，有義股之5'-端磷酸酯經磷酸酯類似物，例如經硫代磷酸酯或4'-磷酸酯類似物修飾。在一些實施例中，有義股之核苷酸位置1及2處之核苷酸的核苷酸間鍵聯例如經硫代磷酸酯或4'-磷酸酯類似物修飾。在一些實施例中，有義股之5'-端磷酸酯經4'-O-甲基膦酸酯修飾。

在一些實施例中，反義股之5'-端核苷酸之5'-端磷酸酯或核苷酸間鍵聯經例如硫代磷酸酯修飾。在一些實施例中，反義股之核苷酸位置1及2以及2及3以及視情況位置3及4之核苷酸的核苷酸間鍵聯經例如硫代磷酸酯修飾。

在一些實施例中，有義股在核苷酸位置7至10，較佳地核苷酸位置9、10、11處具有一或多個，至多4個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，有義股在核苷酸位置9、10、11處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在上述實施例中，有義股之剩餘核苷酸具有經2'-O-甲基修飾之糖部分。

在一些實施例中，反義股在核苷酸位置1、2、3、5、6、7、10、14及16處具有一或多個、至多6個、至多5個、至多4個或至多3個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股至少在核苷酸位置5或14或核苷酸位置5與14二者處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股至少在核苷酸位置5處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸，且視情況在核苷酸位置1、2、3、6、7、10、14及16處具有至多5個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股至少在核苷酸位置14處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸，且視情況在核苷酸位置1、2、3、5、6、7、10、14及16處具有至多5個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股至少在核苷酸位置5及14處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸，且視情況在核苷酸位置1、2、3、6、7、10及16處具有至多4個其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股在核苷酸位置2、5及14處具有其中糖部分經2'-F修飾之核苷酸。在上述實施例中，反義股之剩餘核苷酸具有經2'-O-甲基修飾之糖部分。

在一些實施例中，以下位置中之一或多個經2'-O-甲基修飾：有義股之位置1-7或12-36及/或反義股之位置1、6、8、9、11-13或15-22；且其中以下位置中之一或多個經2'-氟修飾：有義股之位置8-11及/或反義股之位置2、3、4、5、7、10或14。在某些實施例中，有義股之位置1-7或12-36及反義股之位置1、6、8、9、11-13或15-22經2'-O-甲基修飾；且有義股之位置8-11及反義股之位置2、3、4、5、7、10或14經2'-氟修飾。

在一些實施例中，具有有義股及反義股之寡核苷酸進一步含有莖環序列S1-L-S2，其中L為四環、五環或三環。在一些實施例中，S1及S2區域之一或多個、多達所有核苷酸具有經2'-O-甲基修飾之糖部分。在一些實施例中，L序列之5'-端核苷酸具有2'-O-甲基對糖部分之修飾，且L之剩餘核苷酸具有靶向配位體。在一些實施例中，L區域之所有核苷酸具有靶向配位體，例如GalNAc。

在一些實施例中，當有義股與反義股形成雙鏈體時反義股具有1個至2個核苷酸之3'懸垂物，較佳2個核苷酸之懸垂物。在一些實施例中，反義股之3'懸垂物之核苷酸具有核苷酸間鍵聯之修飾，例如硫代磷酸酯。舉例而言且不限制，長度為22個核苷酸之反義股在殘基20與21以及21與22之間具有經硫代磷酸酯鍵聯修飾之核苷間鍵聯。

在一些實施例中，舉例而言且不限制，對於以下結構之示例性寡核苷酸(例如長度為36個核苷酸之有義股及長度為22個核苷酸之反義股，其中有義股含有包含區域S1-L-S2之莖環序列)，核苷酸之修飾模式如下：

其中：

在一些實施例中，本揭示案之寡核苷酸包括併入如本文所述之糖部分之修飾、5'-端磷酸酯之修飾、核苷間鍵聯之修飾、鹼基之修飾、可逆修飾及經由靶向配位體之修飾的修飾模式之其他變化。

在一些實施例中，本揭示案之寡核苷酸為選自表A之有義股、反義股或雙股寡核苷酸。表A：圖1中描繪之寡核苷酸的序列及修飾資訊

GalXC 過客:嚮導	修飾模式(5'至3')	經修飾之序列(5'至3')	相應未修飾之序列(5'至3')

GalXC-GFAP 位置654 (Mm)	{MS}MMMMMMFFFFMMMMMMMMMMMMMMMM[adem-GalNAc][adem-GalNAc][adem-GalNAc]MMMMMM	[mUs][mU][mG][mG][mA][mG][mA][fG][fA][fA][fA][mG][mG][mU][mU][mG][mA][mA][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]	UUGGAGAGAAAGGUUGAAUAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO. 1)
{Me膦酸酯-4O-MS}{FS}{FS}FFMFMMFMMMFMMMMM{MS}{MS}M	[Me膦酸酯-4O-MUs][fAs][fUs][fU][fC][mA][fA][mC][mC][fU][mU][mU][mC][fU][mC][mU][mC][mC][mA][mAs][mGs][mG]	UAUUCAACCUUUCUCUCCAAGG (SEQ ID NO. 2)

GalXC-GFAP 位置1147 (Mm)	{MS}MMMMMMFFFFMMMMMMMMMMMMMMMM[adem-GalNAc][adem-GalNAc][adem-GalNAc]MMMMMM	[mAs][mG][mG][mA][mU][mC][mU][fA][fC][fU][fC][mA][mA][mC][mG][mU][mU][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]	AGGAUCUACUCAACGUUAAAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO. 3)
{Me膦酸酯-4O-MS}{FS}{FS}FFMFMMFMMMFMMMMM{MS}{MS}M	[Me膦酸酯-4O-MUs][fUs][fUs][fA][fA][mC][fG][mU][mU][fG][mA][mG][mU][fA][mG][mA][mU][mC][mC][mUs][mGs][mG]	UUUAACGUUGAGUAGAUCCUGG (SEQ ID NO. 4)

GalXC-TUBB3 位置445 (Mm)	{MS}MMMMMMFFFFMMMMMMMMMMMMMMMM[adem-GalNAc][adem-GalNAc][adem-GalNAc]MMMMMM	[mAs][mG][mU][mG][mU][mG][mA][fG][fA][fA][fU][mU][mG][mU][mG][mA][mC][mU][mG][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]	AGUGUGAGAAUUGUGACUGAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO. 5)
{Me膦酸酯-4O-MS}{FS}{FS}FFMFMMFMMMFMMMMM{MS}{MS}M	[Me膦酸酯-4O-MUs][fCs][fAs][fG][fU][mC][fA][mC][mA][fA][mU][mU][mC][fU][mC][mA][mC][mA][mC][mUs][mGs][mG]	UCAGUCACAAUUCUCACACUGG (SEQ ID NO. 6)

GalXC-TUBB3 位置1211 (Mm/Mf)	{MS}MMMMMMFFFFMMMMMMMMMMMMMMMM[adem-GalNAc][adem-GalNAc][adem-GalNAc]MMMMMM	[mAs][mG][mA][mA][mC][mA][mG][fC][fA][fG][fC][mU][mA][mC][mU][mU][mC][mG][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]	AGAACAGCAGCUACUUCGUAGCAGCCGAAAGGCUGC (SEQ ID NO. 7)
{Me膦酸酯-4O-MS}{FS}{FS}FFMFMMFMMMFMMMMM{MS}{MS}M	[Me膦酸酯-4O-MUs][fAs][fCs][fG][fA][mA][fG][mU][mA][fG][mC][mU][mG][fC][mU][mG][mU][mU][mC][mUs][mGs][mG]	UACGAAGUAGCUGCUGUUCUGG (SEQ ID NO. 8)

在表A之修飾模式中： “M”係指經2'-OMe修飾之核苷酸； “F”係指經2'-F修飾之核苷酸； “S”係指具有3'-硫代磷酸酯鍵聯之核苷酸； “{MS}”係指具有3'-硫代磷酸酯鍵聯之經2'-OMe修飾之核苷酸； “{FS}”係指具有3'-硫代磷酸酯鍵聯之經2'-F修飾之核苷酸； “[adem-GalNAc]”係指具有2'-GalNAc結合物之核苷酸：

； “[Me膦酸酯-4O-MS]”係指具有3'-硫代磷酸酯鍵聯之經5'-膦酸酯-4'-氧基-2'-OMe修飾之核苷酸：

。

在表A之經修飾之序列中： “[mN]”係指經2'-OMe修飾之核苷酸； “[fN]”係指經2'-F修飾之核苷酸； “[mNs]”係指具有3'-硫代磷酸酯鍵聯之經2'-OMe修飾之核苷酸； “[fNs]”係指具有3'-硫代磷酸酯鍵聯之經2'-F修飾之核苷酸； “[ademA-GalNAc]”係指具有2'-GalNAc結合物之A核苷酸：

； “[Me膦酸酯-4O-mUs]”係指具有3'-硫代磷酸酯鍵聯之5'-膦酸酯-4'-氧基-2'-OMe尿苷：

。 III. 醫藥組合物

在一些實施例中，寡核苷酸製備成醫藥組合物以促進寡核苷酸之使用。舉例而言，可使用醫藥組合物或調配物將寡核苷酸遞送至個體或細胞環境，該醫藥組合物或調配物將降解減至最少、促進遞送及/或攝取或為調配物中之寡核苷酸提供另一種有益特性。可適當地調配此類組合物，使得當投與個體時，投與標靶細胞之直接環境或投與局部區域或器官，或當全身投與時，足夠部分之寡核苷酸進入細胞以降低標靶RNA及/或由標靶RNA編碼之蛋白質之水準。包含寡核苷酸之多種合適之醫藥組合物中之任一種可用於遞送寡核苷酸以降低膠細胞中之RNA及/或蛋白質表現。在一些實施例中，寡核苷酸之醫藥組合物包含緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、脂質體、膠束結構及殼體。

具有陽離子脂質之寡核苷酸調配物可用於促進寡核苷酸轉染至細胞中。舉例而言，可使用陽離子脂質，諸如脂質體、陽離子甘油衍生物及聚陽離子分子(例如聚離胺酸)。合適脂質包括Oligofectamine、Lipofectamine (Life Technologies)、NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals公司, Boulder, Colo.)或FuGene 6 (Roche)，所有該等脂質均可根據製造商之說明使用。

因此，在一些實施例中，調配物包含脂質奈米粒子。在一些實施例中，賦形劑包含脂質體、脂質、脂質複合物、微米球、微米粒子、奈米球或奈米粒子，或者可以其他方式調配用於投與有需要之個體之細胞、組織、器官或身體(參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版, Pharmaceutical Press, 2013)。

在一些實施例中，醫藥組合物包含本揭示案之寡核苷酸及合適賦形劑。在一些實施例中，賦形劑賦予組合物改善之穩定性、改善之吸收、改善之溶解性及/或活性成分之治療增強。在一些實施例中，賦形劑為緩衝劑(例如檸檬酸鈉、磷酸鈉、tris鹼或氫氧化鈉)或媒劑(例如緩衝溶液、礦脂、二甲亞碸或礦物油)。在一些實施例中，將寡核苷酸凍乾以延長其保存期限，然後在使用(例如投與個體)前製成溶液。因此，在一些實施例中，醫藥組合物包含本文所述之寡核苷酸及作為凍乾保護劑(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯啶酮)或坍塌溫度調節劑(例如，葡聚醣、聚蔗糖或明膠)之賦形劑。

在一些實施例中，將醫藥組合物調配成與其預期投藥途徑相容。投藥途徑之實例包括非經腸，例如靜脈內、皮內、皮下、口服(例如吸入)、經皮、經黏膜及直腸投藥。在一些實施例中，將醫藥組合物調配成與鞘內、腦室內、間質、靜脈內、鼻內或舌下投藥相容。

在一些實施例中，醫藥組合物適用於注射用途，諸如調配為無菌水溶液(其中水溶性)或分散液，以及臨用方製備無菌注射溶液或分散液之無菌粉末。在藉由注射投藥之一些實施例中，例如對於靜脈內、鞘內、腦室內或間質，合適載劑或賦形劑包括(舉例而言且不限制)生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J., USA)或磷酸鹽緩衝鹽水 (PBS)。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其合適混合物之溶劑或分散介質。在一些實施例中，可能較佳在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)、氯化鈉。無菌可注射溶液可藉由將所需量之寡核苷酸併入根據需要，具有上述列舉之成分中之一種或組合之選定溶劑中來製備，隨後過濾除菌。

在一些實施例中，醫藥組合物含有至少約0.1%之治療劑(例如，靶向膠細胞中所表現之RNA之寡核苷酸)。在一些實施例中，活性成分之百分比可為總組合物之重量或體積之約1％至約80％或更多。製備此類醫藥調配物領域之技術人員將考慮諸如溶解性、生物可用度、生物半衰期、投藥途徑、產品保存期限以及其他藥理學考慮等因素，因此，多種劑量及治療方案可能合乎需要。

在一些實施例中，無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性化合物併入如適於注射，具有上述列舉之賦形劑或載劑中之一種或組合的選定溶劑中來製備，隨後過濾除菌。一般地，分散液藉由將活性化合物摻入無菌媒劑中來製備，該載劑含有鹼性分散介質及來自上文列舉之成分之其他合適成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，此產生活性成分加上來自其先前無菌過濾溶液之任何其他所需成分的粉末。 IV. 寡核苷酸之用途

在另一態樣中，本揭示案提供一種用於將本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至膠細胞之方法。在一些實施例中，對膠細胞之選擇性係與神經元細胞相比。在一些實施例中，選擇性遞送本揭示案之寡核苷酸之方法包括使膠細胞與寡核苷酸接觸。在一些實施例中，膠細胞存在於個體之神經系統中。在一些實施例中，用於將本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至神經系統中之膠細胞的方法包括向個體之神經系統投與寡核苷酸。在一些實施例中，用於將本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至膠細胞之方法包括向個體之神經中樞神經系統或周圍神經系統投與寡核苷酸，如本文中進一步論述。

在一些實施例中，本揭示案提供一種用於選擇性降低膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的方法。在一些實施例中，用於選擇性降低膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的方法包括使膠細胞與有效量之本文揭示之寡核苷酸接觸，其中寡核苷酸包含有義股及反義股，且其中反義股包含與標靶RNA互補之區域。在一些實施例中，用於選擇性降低膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的方法包括向個體之中樞神經系統或周圍神經系統投與有效量之本文揭示之寡核苷酸，其中寡核苷酸包含有義股及反義股，且其中反義股包含與標靶RNA互補之區域，其中寡核苷酸有效降低標靶RNA之表現。

在一些實施例中，本文提供之方法適用於任何膠細胞類型。在一些實施例中，膠細胞為星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞或腸膠細胞。在一些實施例中，膠細胞為神經系統中存在之星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞或腸膠細胞。在一些實施例中，星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞或衛星細胞存在於中樞神經系統中。在一些實施例中，星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞或腸膠細胞存在於周圍神經系統中。

在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞或腸膠細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至星狀細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至寡樹突細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至室管膜細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至微膠細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至許旺氏細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至衛星細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至腸膠細胞。

在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至個體中樞神經系統中之星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞或衛星細胞。在一些實施例中，中樞神經系統包括腦及脊髓。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至腦或腦幹中之膠細胞，包括腦或腦幹之局部區域中之膠細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至額葉皮質、紋狀體、體感覺皮質、海馬迴、下視丘或小腦中之膠細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至腦幹，諸如腦橋或延髓中之膠細胞。

在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至個體之脊髓，包括脊髓之局部區域中之膠細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至頸脊髓、胸脊髓或腰脊髓中之膠細胞。

在一些實施例中，中樞神經系統中之膠細胞為星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞或衛星細胞。因此，在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至個體中樞神經系統中之星狀細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至個體中樞神經系統中之寡樹突細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至個體中樞神經系統中之室管膜細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至個體中樞神經系統中之微膠細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至個體中樞神經系統中之衛星細胞。

在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至個體周圍神經系統中之星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞或腸膠細胞。在一些實施例中，周圍神經系統中之膠細胞包括位於顱神經、脊神經及周圍神經等中之彼等膠細胞。在一些實施例中，周圍神經系統中之膠細胞包括許旺氏細胞、衛星細胞及腸膠細胞等。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至周圍神經系統中之許旺氏細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至周圍神經系統中之衛星細胞。在一些實施例中，方法提供本揭示案之寡核苷酸選擇性遞送至周圍神經系統中之腸膠細胞。

在一些實施例中，方法提供星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞或腸膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供星狀細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供寡樹突細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供室管膜細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供微膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供許旺氏細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供衛星細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供腸膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供膠細胞混合物中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。

在一些實施例中，方法提供個體神經系統中之膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供個體中樞神經系統中之膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，中樞神經系統包括腦及脊髓。在一些實施例中，方法提供腦或腦幹中之膠細胞，包括腦或腦幹之局部區域中之膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供額葉皮質、紋狀體、體感覺皮質、海馬迴、下視丘或小腦中之膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供諸如腦橋或延髓之腦幹中之膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。

在一些實施例中，方法提供個體脊髓，包括脊髓之局部區域中之膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供頸脊髓、胸脊髓或腰脊髓中之膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。

在一些實施例中，中樞神經系統中之膠細胞為星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞或衛星細胞。在某些實施例中，中樞神經系統中之膠細胞為星狀細胞、室管膜細胞、微膠細胞或衛星細胞。在某些實施例中，膠細胞為星狀細胞。在一些實施例中，方法提供個體中樞神經系統中之星狀細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供個體中樞神經系統中之寡樹突細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供個體中樞神經系統中之室管膜細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供個體中樞神經系統中之微膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供個體中樞神經系統中之衛星細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。

在一些實施例中，方法提供個體周圍神經系統中之膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，周圍神經系統中之膠細胞包括位於顱神經、脊神經及周圍神經等中之彼等膠細胞。在一些實施例中，周圍神經系統中之膠細胞包括許旺氏細胞、衛星細胞及腸膠細胞等。在一些實施例中，方法提供周圍神經系統中之許旺氏細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供周圍神經系統中之衛星細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。在一些實施例中，方法提供周圍神經系統中之腸膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的選擇性降低。

在一些實施例中，用於選擇性遞送至個體神經系統中之膠細胞或選擇性降低在個體神經系統中之膠細胞中表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的方法包括向個體投與有效量之本揭示案之寡核苷酸，其中該投與係藉由用於向個體神經系統遞送有效量之寡核苷酸的方式。

在一些實施例中，用於選擇性遞送至個體神經系統中之膠細胞或選擇性降低在個體神經系統中之膠細胞中表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的方法包括經鞘內、腦室內、靜脈內、間質、舌下或鼻內向個體投與有效量之本文揭示之寡核苷酸。

在一些實施例中，選擇性遞送至個體中樞神經系統中之膠細胞或選擇性降低個體中樞神經系統中之膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的方法包括經鞘內向個體投與有效量之本揭示案之寡核苷酸。在一些實施例中，膠細胞在個體之腦或脊髓中。

在一些實施例中，選擇性遞送至個體中樞神經系統中之膠細胞或選擇性降低個體中樞神經系統中之膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的方法包括經腦室內向個體投與有效量之本揭示案之寡核苷酸。

在一些實施例中，選擇性遞送至個體中樞神經系統中之膠細胞或選擇性降低個體中樞神經系統中之膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的方法包括經間質向個體投與有效量之本揭示案之寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸經間質投與中樞神經系統中之局部區域。在一些實施例中，寡核苷酸經間質投與額葉皮質、紋狀體、體感覺皮質、海馬迴、下視丘或小腦。在一些實施例中，寡核苷酸經間質投與脊髓，包括脊髓之局部區域，諸如頸脊髓、胸脊髓或腰脊髓。

在一些實施例中，選擇性遞送至個體中樞神經系統中之膠細胞或選擇性降低個體中樞神經系統中之膠細胞中所表現之標靶RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準的方法包括經鼻內向個體投與有效量之本揭示案之寡核苷酸。鼻內投與利用經由嗅覺及/或三叉神經路徑輸送至中樞神經系統區域，包括腦幹、小腦、脊髓、嗅球及皮質及皮質下結構。

除以上投與途徑外，本揭示案之寡核苷酸可經舌下或透皮投與以經由三叉神經路徑遞送至中樞神經系統。在一些實施例中，適當時，寡核苷酸可經靜脈內投與。

在一些實施例中，本文揭示之寡核苷酸可使用適當核酸遞送方法引入，該等方法包括注射含有寡核苷酸之溶液、藉由經寡核苷酸覆蓋之粒子轟擊、將細胞或生物體暴露於含有寡核苷酸之組合物或在寡核苷酸存在下細胞膜進行電穿孔。可使用其他適用於遞送寡核苷酸至細胞之方法，諸如脂質介導之載劑輸送、化學介導之輸送及陽離子脂質體轉染，諸如磷酸鈣及其他。

可藉由評估細胞或個體之一或多種特性之適當分析或藉由評估指示RNA表現之分子(例如RNA、蛋白質)的生物化學技術證實抑制作用。在一些實施例中，藉由將表現水準(例如mRNA或蛋白質水準)與適當對照物(例如尚未遞送寡核苷酸或已遞送陰性對照物之細胞或細胞群體中之RNA表現水準)進行比較來評估本文提供之寡核苷酸使在細胞組織或器官中表現之標靶RNA之水準降低的程度。在一些實施例中，RNAi表現之適當對照水準可為預先確定之水準或值，以便每次不需要量測對照水準。預先確定之水準或值可採用多種形式。在一些實施例中，預先確定之水準或值可為單個截止值，諸如中值或平均值。

在一些實施例中，如本文所述之寡核苷酸之投與引起膠細胞中之RNA表現水準降低。在一些實施例中，RNA表現水準降低可為與RNA之適當對照水準相比較，降低至1%或更低、5%或更低、10%或更低、15%或更低、20%或更低、25%或更低、30%或更低、35%或更低、40%或更低、45%或更低、50%或更低、55%或更低、60%或更低、70%或更低、80%或更低、或90%或更低。在一些實施例中，RNA表現水準降低為至少50%或更低。在一些實施例中，RNA表現水準降低為至少70%或更低。在一些實施例中，RNA表現水準降低為至少80%或更低。在一些實施例中，適當對照水準可為尚未與如本文所述之寡核苷酸接觸或尚未用陰性對照寡核苷酸(例如隨機核苷酸序列)處理之膠細胞或膠細胞群體中的RNA表現水準。在一些實施例中，在有限時期之後評定根據本文揭示之方法將寡核苷酸遞送至膠細胞之作用。舉例而言，可在寡核苷酸引入至細胞中之後至少8小時、12小時、18小時、24小時，或至少一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天或十四天分析細胞中之RNA水準。

在一些實施例中，選擇性遞送至膠細胞或選擇性降低膠細胞中所表現之RNA及/或由該RNA編碼之蛋白質之水準係與選擇性遞送至神經元細胞或選擇性降低神經元細胞中所表現之RNA及/或蛋白質之另一、或許密切相關或替代形式比較。在一些實施例中，選擇性或差異性沉默係基於在膠細胞與神經元細胞二者中皆表現之標靶RNA之表現的降低%之比較。在一些實施例中，選擇性係基於膠細胞特異性RNA之表現降低%與神經元細胞特異性RNA之表現降低%比較。在一些實施例中，對膠細胞之選擇性相對於神經元細胞為至少1.2倍；1.3倍；1.4倍；1.5倍；1.6倍、1.7倍、1.8倍；1.9倍或2倍或更高。在一些實施例中，對膠細胞之選擇性相對於神經元細胞為2倍或更大；2.5倍或更大；3倍或更大；3.5倍或更大；4倍或更大；4.5倍或更大；或5倍或更大。在一些實施例中，選擇性係用於與神經元細胞相比，將本揭示案之寡核苷酸遞送至膠細胞。在一些實施例中，選擇性係用於與在神經元細胞中特異性表現之RNA相比，降低在膠細胞中特異性表現之RNA。在多個實施例中，用作比較物之神經元細胞中所表現之RNA及/或蛋白質可為任何神經元特異性標記物蛋白質，諸如本文針對神經元細胞標記物所述。此等神經元特異性標記物包括神經元特異性烯醇酶(NSE或γ-烯醇酶)；神經元核(NeuN或Fox3)；微管相關蛋白2 (MAP-2)；微管蛋白β III (TUBB3)；雙皮質素(DCX)；c-fos；膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)；及酪胺酸羥化酶等。在一些實施例中，評定膠細胞與神經元細胞之間的選擇性使用siRNA，該等siRNA在例如肝細胞之非神經元細胞中引起的膠細胞特異性RNA表現及神經元細胞特異性RNA表現降低%類似。

在一些實施例中，寡核苷酸呈經工程改造以在細胞中表現寡核苷酸(例如其有義股及反義股)之轉殖基因形式遞送。在一些實施例中，使用經工程改造以表現本文揭示之任何寡核苷酸之轉殖基因遞送寡核苷酸。可使用病毒載體(例如腺病毒、逆轉錄病毒、痘瘡病毒、痘病毒、腺相關病毒或單純皰疹病毒)或非病毒載體(例如質體或合成mRNA)遞送轉殖基因。在一些實施例中，轉殖基因可直接注射至個體。

在本文中之一些實施例中，本揭示案之寡核苷酸可選擇性地靶向膠細胞中所表現之任何RNA。在一些實施例中，本揭示案之寡核苷酸之反義股包含與膠細胞中所表現之標靶RNA互補之區域，其中寡核苷酸有效降低所關注之標靶RNA之表現。如上所論述，在一些實施例中，所關注之標靶RNA包括在膠細胞中之表現與具有膠細胞功能障礙之疾病或病症有關的RNA。在一些實施例中，寡核苷酸之反義股包含與以下之表現之RNA互補的區域：與亞歷山大氏病(AxD)相關之 GFAP基因；與異染性白質失養症/克拉培氏病(Krabbe Disease)相關之 PSAP基因；與查-馬利-圖氏病相關之 PMP22基因；與成人發作型腦白質失養症相關之 LMNB1基因；與阿茲海默氏病相關之 APP基因及 TAU(MAPT)基因；與亨廷頓氏病相關之 SOD1基因、 C9orf72基因及 HTT基因；與帕金森氏病相關之 SNCA或 ASYN基因及 LRRK2基因；與癲癇相關之 ADK基因；與中風相關之 TNFα基因及 ERK5/MAPK7基因；與外傷性腦損傷及軸突損傷相關之 TNFα基因及 GFAP基因；與自閉症相關之 IL-1R2基因；與多發性硬化症相關之 CD49d基因；與神經膠母細胞瘤及膠細胞癌相關之 IGF-1基因、 EGF基因、 TGF-β基因及 VEGF基因；與肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)相關之 SOD1基因、 C9orf72基因及 TDP-43基因；與神經發炎相關之 TNFα基因及 CD38基因；與脊髓小腦性失調症相關之 ATXN2基因、 ATXN3基因及 ATXN7基因；與進行性核上神經麻痹症相關之 TAU(MAPT)基因；與原發性年齡相關之τ蛋白病變(PART)/神經原纖維纏結優勢型癡呆相關之 TAU(MAPT)基因；與涉及染色體17之額顳癡呆與帕金森症(FTDP-17)相關之 TAU(MAPT)基因；及與周圍神經脫髓鞘相關之 EGR2基因。

在一些實施例中，靶向含有編碼之蛋白質之突變形式的基因之表現以降低表現。在一些實施例中，靶向過度表現與疾病或病症之病因或表現有關的基因以降低表現。在一些實施例中，靶向編碼表現與疾病或病症有關之蛋白質之突變形式的基因以降低表現。在一些實施例中，含有突變之基因或過度表現與疾病或病症有關之基因包括(舉例而言且不限制)以下之基因： GFAP(參見例如Rodriguez等人, American Journal of Human Genetics, 2001, 69(6):1413)； PMP22(參見例如Robaglia-Schlupp等人, Brain, 2002, 125(10):2213-2221；Li等人, Mol Neurobiol., 2013, 47(2):673-98)； LMNB1(參見例如Padiath, Q.S., Cell Dev. Biol., 2019, 7(41):1-6)； APP(參見例如Katsurabayashi等人, Physiological Reports, 2016, 4(1):e12665)； TAU/ MAPT(參見例如Le Guennec等人, Mol Psychiatry., 2017, 22(8):1119-1125； SOD1(參見例如Massenzio等人, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, 2018, 1864(12):3771-3785)、 C9orf72(參見例如Balendra等人, Nat Rev Neurol., 2018, 14(9):544-558)、 ATXN2(參見例如Ostrowski等人, Genes (Basel), 2017, 8(6):157)、 ATXN3(參見例如Neves-Carvalho等人, Hum Mol Genet, 2015, 24(1):100-117)、 ATXN7(參見例如Lan等人, Mol Cell Biol., 2015, 35(10):1777-1787)； HTT(參見例如Shin等人, J Cell Biol., 2005, 171(6):1001-1012)； SNCA/ASYN(參見例如Oliveira等人, Cell Death Dis., 2015, 6(11):e1994)； ADK(參見例如De Groot等人, Epilepsia, 2011, 53(1):858-66)、 TNFα(參見例如Welser-Alves等人, Neurochem Int., 2013, 63(1):47-53)； CD49d(參見例如Limmroth, V., Neurology, 2014, 83(20):1780-1788)；或 TDP-43 (參見例如Lu等人, Int J Biol Sci., 2016, 12(9):1140-1149)。上文描述相應疾病或病症及參考mRNA。

在另一態樣中，本發明係關於一種用於治療患有由膠細胞中標靶基因之表現引起或與其相關之疾病或處於顯現該疾病風險下之個體的方法。在一些實施例中，可受影響之疾病或病症包括(舉例而言且不限制)：與 GFAP基因之表現相關之亞歷山大氏病(AxD)；與 PSAP基因之表現相關之異染性白質失養症/克拉培氏病；與 PMP22基因之表現相關之查-馬利-圖氏病；與 LMNB1基因之表現相關之成人發作型腦白質失養症；與 APP基因之表現相關之阿茲海默氏病；與 SOD1基因(例如參考mRNA序列NM_000454.4)、 C9orf72基因(例如參考mRNA序列：NM_001256054.2；NM_018325.5；NM_145005.6)及 HTT基因之表現相關之亨廷頓氏病；與 SNCA/ASYN基因及 LRRK2基因之表現相關之帕金森氏病；與 ADK基因之表現相關之癲癇；與 TNFα基因及 ERK5/MAPK7基因之表現相關之中風及其影響；與 TNFα基因及 GFAP基因之表現相關之外傷性腦損傷及軸突損傷及其影響；與 IL-1R2基因之表現相關之自閉症；與 CD49d基因之表現相關之多發性硬化症；與 IGF-1基因、 EGF基因、 TGF-β基因及 VEGF基因之表現相關之神經膠母細胞瘤及膠細胞癌；與 SOD1基因、 C9orf72基因及 TDP-43基因之表現相關之肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)；與 TNFα基因及 CD38基因之表現相關之神經發炎；與 ATXN2基因、 ATXN3基因及 ATXN7基因之表現相關之脊髓小腦性失調症；與 TAU(MAPT)基因相關之進行性核上神經麻痹症；與 TAU(MAPT)基因之表現相關之原發性年齡相關之τ蛋白病變(PART)/神經原纖維纏結優勢型癡呆；與 TAU(MAPT)基因之表現相關之涉及染色體17之額顳癡呆與帕金森症(FTDP-17)；及與 EGR2基因之表現相關之周圍神經脫髓鞘。

在一些實施例中，本文所述之方法包括向個體投與有效量，亦即能夠產生期望治療結果之量之寡核苷酸。治療學上可接受之量可為可治療疾病或病症之量。任一個體之適當劑量將視某些因素而定，該等因素包括個體體型、體表面積、年齡、有待投與之特定組合物、組合物中之活性成分、投藥時間及途徑、總體健康及並行投與之其他藥物。

作為一組非限制性實例，本揭示案之寡核苷酸通常將一季一次(每三個月一次)、雙月一次(每兩個月一次)、每月一次或每週一次投與。舉例而言，寡核苷酸可每週或以兩週或三週之時間間隔投與。可每日投與寡核苷酸。

在一些實施例中，有待治療之個體為人類或非人類靈長類動物或其他哺乳動物個體。其他示例性個體包括家養哺乳動物，諸如犬及貓；家畜，諸如馬、牛、豬、綿羊、山羊及雞；及其他哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、豚鼠及倉鼠。在一些實施例中，人類個體稱為患者。 ii. 對用於選擇性遞送及/或選擇性降低膠細胞中所表現之標靶RNA之干擾寡核苷酸進行篩選的方法

在另一態樣中，本揭示案提供一種篩選對膠細胞或神經元細胞具有選擇性之寡核苷酸的方法。在一些實施例中，該篩選係用於鑑定相對於神經元細胞對膠細胞具有選擇性之寡核苷酸。在一些實施例中，該篩選係用於鑑定相對於膠細胞對神經元細胞具有選擇性之寡核苷酸。在多個實施例中，寡核苷酸可降低膠細胞中所表現之標靶RNA之水準。在多個實施例中，所測試之寡核苷酸可降低神經元細胞中所表現之標靶RNA之水準。在一些實施例中，寡核苷酸可降低與神經元細胞相比在膠細胞中以更高水準表現之RNA之水準。在一些實施例中，寡核苷酸可降低與膠細胞相比在神經元細胞中以更高水準表現之RNA之水準。

在一些實施例中，一種對選擇性地降低膠細胞或神經元細胞中所表現之標靶RNA之水準的寡核苷酸進行篩選的方法，其包括：使膠細胞及神經元細胞與候選寡核苷酸接觸，其中該候選寡核苷酸包含與在膠細胞與神經元細胞二者中皆表現之標靶RNA互補之區域，其中該寡核苷酸能夠降低標靶RNA之表現；及量測膠細胞及神經元細胞中之標靶RNA之水準以確定對標靶RNA表現水準之任何差異性作用。

在一些實施例中，對選擇性地降低膠細胞或神經元細胞中所表現之標靶RNA之水準的寡核苷酸進行篩選的方法包括：向個體之神經系統投與候選寡核苷酸，其中該候選寡核苷酸包含與該神經系統之膠細胞及神經元細胞二者中皆表現之標靶RNA互補之區域，其中該寡核苷酸能夠降低標靶RNA之表現；及量測膠細胞及神經元細胞中之標靶RNA之水準以確定對標靶RNA表現水準之任何差異性作用。在一些實施例中，個體為非人類哺乳動物。

在一些實施例中，顯示膠細胞中標靶RNA水準之降低程度比神經元細胞中標靶RNA水準之降低程度大的寡核苷酸經鑑定為對膠細胞具有選擇性。在一些實施例中，寡核苷酸對膠細胞之選擇性相對於神經元細胞為至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5或更大。

在一些實施例中，顯示神經元細胞中標靶RNA水準之降低程度比膠細胞中標靶RNA水準之降低程度大的寡核苷酸經鑑定為對神經元細胞具有選擇性。在一些實施例中，寡核苷酸對神經元細胞之選擇性相對於膠細胞為至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5或更大。

在一些實施例中，候選寡核苷酸包含單股RNA或DNA，諸如本文所述。

在一些實施例中，寡核苷酸包含雙股核酸(dsNA)，其中該dsNA包含核糖核苷酸。在一些實施例中，候選寡核苷酸包含有義股及反義股，其中該有義股與該反義股形成雙鏈體，且其中該反義股具有與標靶RNA互補之區域且該寡核苷酸能夠降低標靶RNA之水準。

在一些實施例中，候選寡核苷酸經一或多個靶向配位體修飾。在一些實施例中，靶向配位體包含碳水化合物、胺基糖、膽固醇、脂質、肽或其混合物中之一或多者。在一些實施例中，靶向配位體包含一或多個GalNAc部分，如本文中詳細描述。

在向個體神經系統投與候選寡核苷酸之一些實施例中，藉由量測遍佈神經系統或神經系統之局部區域中之膠細胞及神經元細胞中標靶RNA之水準，評定用於測定膠細胞及神經元細胞中標靶RNA之水準的量測。在一些實施例中，檢查之膠細胞為星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞、腸膠細胞或其組合。

在一些實施例中，對選擇性地降低膠細胞或神經元細胞中所表現之標靶RNA之水準的寡核苷酸進行篩選的方法包括：使膠細胞與第一候選寡核苷酸接觸，其中該第一候選寡核苷酸包含與膠細胞中所表現之第一標靶RNA互補之區域，其中該第一寡核苷酸能夠降低第一標靶RNA表現之水準；使神經元細胞與第二候選寡核苷酸接觸，其中該第二候選寡核苷酸包含與神經元細胞中所表現之第二標靶RNA互補之區域，其中該第二寡核苷酸能夠降低第二標靶RNA表現之水準；及量測膠細胞中之第一標靶RNA及神經元細胞中之第二標靶RNA的水準且確定第一標靶RNA及第二標靶RNA之任何差異性減少。

在一些實施例中，對選擇性地降低膠細胞中所表現之標靶RNA之水準的寡核苷酸進行篩選的方法包括：向第一個體之神經系統投與第一候選寡核苷酸，其中該第一候選寡核苷酸包含與膠細胞中所表現之第一標靶RNA互補之區域，其中該第一寡核苷酸能夠降低該第一標靶RNA表現之水準；向第二個體之神經系統投與第二候選寡核苷酸，其中該第二候選寡核苷酸包含與神經元細胞中所表現之第二標靶RNA互補之區域，其中該第一寡核苷酸能夠降低該第一標靶RNA表現之水準；及量測該第一個體及該第二個體之神經系統中膠細胞中之第一標靶RNA及神經元細胞中之第二標靶RNA的水準，其中該第一個體及該第二個體係相同物種。

在一些實施例中，第一候選寡核苷酸及第二候選寡核苷酸之不同之處僅在於與相應標靶RNA互補之區域。在一些實施例中，膠細胞中所表現之標靶RNA在膠細胞中特異性表現。在一些實施例中，神經元細胞中所表現之標靶RNA在神經元細胞中特異性表現。如本文所用，「特異性表現」係指在一種細胞中之表現水準與另一種細胞相比更大的RNA。在一些實施例中，標靶RNA在一種細胞中特異性表現，比在另一種細胞中之表現大1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍或更大。

若候選寡核苷酸顯示對一種細胞類型之選擇性比另一種細胞類型大，則應觀測到在一種細胞中之標靶RNA水準之降低程度(例如降低%)比在另一種細胞中之標靶RNA水準之降低程度大。

在一些實施例中，第一候選寡核苷酸及第二候選寡核苷酸包含單股RNA或DNA，諸如本文所述。

在一些實施例中，第一候選寡核苷酸及第二候選寡核苷酸包含雙股核酸(dsNA)，其中該dsNA包含核糖核苷酸。在一些實施例中，第一候選寡核苷酸包含第一有義股及第一反義股，其中該第一有義股與該第二反義股形成第一雙鏈體，且其中該第一反義股具有與膠細胞中所表現之第一標靶RNA互補之區域且能夠降低第一標靶RNA之水準。在一些實施例中，第二候選寡核苷酸包含第二有義股及第二反義股，其中該第二有義股與該第二反義股形成第二雙鏈體，且其中該第二反義股具有與神經元細胞中所表現之第二標靶RNA互補之區域且能夠降低標靶RNA之表現。

在一些實施例中，第一及第二候選寡核苷酸經一或多個靶向配位體修飾。在一些實施例中，靶向配位體包含碳水化合物、胺基糖、膽固醇、脂質、肽或其混合物中之一或多者。在一些實施例中，靶向配位體包含一或多個GalNAc部分，如本文中詳細描述。

在一些實施例中，向個體神經系統投與第一及第二候選寡核苷酸，藉由量測遍佈神經系統或在神經系統之局部區域中之膠細胞及神經元細胞中標靶RNA之水準，評定用於測定膠細胞及神經元細胞中標靶RNA之水準的量測。在一些實施例中，檢查之膠細胞包括(舉例而言且不限制)星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞、腸膠細胞及其組合。在一些實施例中，神經元細胞包括(舉例而言且不限制)運動神經元、感覺神經元、中間神經元及其組合。

為能夠更全面地理解本文所述之發明，闡述以下實例。提供本申請案中所述之實例以說明本文提供之方法、組合物及系統且不應理解為以任何方式限制其範疇。實例實例1：細胞類型特異性靶向siRNA之鑑定

為評估特定細胞亞群中之基因沉默水準，需要鑑定靶向神經元或星狀細胞特異性基因之GalXC siRNA。在全面審查可用之RNA-seq資料後選擇Tubb3及Gfap mRNA。TUBB3或微管蛋白β 3類別III，係β微管蛋白家族之成員，參與微管組裝。Tubb3 mRNA主要在神經元中表現。GFAP或膠質原纖維酸性蛋白係成熟星狀細胞中之主要中間絲蛋白之一，通常用作在發育過程中區分星狀細胞與其他非神經元細胞類型之標記物。為研究而製備之siRNA分子之序列及結構示於圖1中。因此，每個標靶之表現分別係神經元及星狀細胞高度特有的，如圖2A及圖2B所示。

藉由進行活體內篩選產生靶向Gfap mRNA之GalXC-siRNA分子(圖3)。藉由進行活體內篩選產生靶向Tubb3 mRNA之GalXC-siRNA分子(圖4)。例如，動物在第1天皮下注射 0-3 mg/kg GalXC-TUBB3，且在第4天靜脈內注射表現Tubb3 mRNA之質體(CD-1，雌性，每組n = 5)。在第5天藉由RT-qPCR在肝臟中分析Tubb3 mRNA水準。來自各篩選之頂部序列之ED50值在約1 mg/kg範圍內，且選擇用於在小鼠CNS及PNS中進行評估。實例2：GalXC siRNA在CNS中對神經細胞亞群之選擇性靶向

在腦及脊髓中之神經元及星狀細胞中評估GalXC-TUBB3及GalXC-GFAP之藥理學。藉由快速側腦室注射來投與等效劑量之GalXC-TUBB3或GalXC-GFAP，一週後量測整個CNS之Tubb3及Gfap mRNA水準。兩種GalXC siRNA具有相同化學組成，且如藉由肝臟中之HDI所評估，具有相同之相對ED50。與經設計以靶向Tubb3 mRNA的具有相似化學組成之同等效力之GalXC siRNA相比，GalXC siRNA意外地能夠在腦所有區域更大程度地使Gfap mRNA沉默。在整個大腦及脊髓中觀測到之細胞類型之間效力的意外顯著差異清楚地表明，GalXC siRNA在輸注至CNS後能夠選擇性靶向星狀細胞。

額葉皮質(圖5)：靶向Gfap (一種在星狀細胞中特異性表現之基因)之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，能夠使額葉皮質中使多達90%基因沉默。靶向Tubb3 (一種在神經元中特異性表現之基因)之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，僅能夠使約10-30%基因沉默。

紋狀體(圖6)：靶向Gfap之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，一週意外地能夠使紋狀體中多達80%基因沉默。另一方面，靶向Tubb3之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，一週僅能夠使約0-25%基因沉默。

體感覺皮質(圖7)：靶向Gfap之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，一週能夠使體感覺皮質中多達75%基因沉默。而靶向Tubb3之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，一週僅能夠使約0-10%基因沉默。

海馬迴(圖8)：靶向Gfap之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，一週能夠使海馬迴中多達80%基因沉默。靶向Tubb3之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，一週僅能夠使約0-25%基因沉默。

下視丘(圖9)：靶向Gfap之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，一週能夠使下視丘中多達80%基因沉默。靶向Tubb3之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，一週僅能夠使約0-25%基因沉默。

小腦(圖10)：靶向Gfap之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，一週能夠使小腦中多達95%基因沉默。靶向Tubb3之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，一週僅能夠使約0-40%基因沉默。

腦幹(圖11)：靶向Gfap之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，一週能夠使腦幹中多達90%基因沉默。靶向Tubb3之GalXC siRNA，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，一週僅能夠使約0-30%基因沉默。

脊髓(圖12)：靶向Tubb3之GalXC siRNA (一種在神經元中特異性表現之基因)，在單次推注500 µg至右側腦室(n=4隻小鼠/組，CD1，雌性，4-6週齡)後，一週能夠使約0-25%基因沉默。在此化學組態中，即使標靶基因在膠細胞與神經元細胞類型中皆表現，在推注至腦脊髓液後，在脊髓神經元(運動神經元、中間神經元等)中將不會預期出現基因沉默。此減輕治療神經膠質疾病時對神經元毒性或生存力之任何擔憂。實例3：缺乏GalNAc靶向配位體之siRNA對神經細胞亞群之選擇性靶向

該研究檢查GaNAc殘基在將siRNA靶向神經元及膠細胞中之作用。在圖13之圖A中，GalXC-GFAP-1147 (GalNAc)係標準GalXC化學物質，具有三個附接之GalNAc部分，而GalXC-GFAP-1147 (無GalNAc)係一種類似分子，具有相同化學組成但缺少三個共軛之GalNAc糖。藉由腰椎鞘內注射至蛛網膜下腔(n = 5隻小鼠/組，C57BL/6，雌性，4-6週齡)，將GFAP特異性siRNA作為500 µg之單次推注投與。投與後一週，靶向Gfap mRNA之GalXC siRNA能夠使腰脊髓中之星狀細胞中多達70-75%基因沉默，此表明該等siRNA上缺少GalNAc部分不會降低此等寡核苷酸在鼠類腦中使其基因標靶沉默之能力。

在圖13之圖B中，GalXC-TUBB3-445 (GalNAc)係標準GalXC化學物質，具有三個附接之GalNAc部分，而GalXC-TUBB3-445 (無GalNAc)係一種類似分子，具有相同化學組成但缺少三個共軛之GalNAc糖。藉由腰椎鞘內注射至蛛網膜下腔(n = 5隻小鼠/組，C57BL/6，雌性，4-6週齡)，將TUBB特異性siRNA作為500 µg之單次推注投與。投與後一週，靶向Tubb3 mRNA之GalXC siRNA能夠使腰脊髓中之神經元中多達30-35%基因沉默，此表明缺少GalNAc部分不會降低此等寡核苷酸在鼠類腦中使其基因標靶沉默之能力。

與神經元相比，siRNA對星狀細胞之差異靶向之維持表明，siRNA可優先遞送至有或無GalNAc部分之膠細胞。

應當理解，在一些實施例中，在描述寡核苷酸或其他核酸之結構時可參考序列表中呈現之序列。在此類實施例中，實際寡核苷酸或其他核酸可具有一或多個替代核苷酸(例如，DNA核苷酸之RNA對應物或RNA核苷酸之DNA對應部分)及/或一或多個經修飾之核苷酸及/或一或多個經修飾之核苷酸間鍵聯及/或與指定序列相比之一或多個其他修飾，同時保留與指定序列基本相同或相似之互補特性。

亦應理解，除非本文另有指示或明顯與上下文相矛盾，否則在描述本發明之上下文中使用之術語「一(a/an)」及「該」以及類似指代應解釋為涵蓋單數與複數。除非另有說明，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應解釋為開放式術語(亦即，意謂「包括但不限於」)。

此外，除非本文另有指示，否則本文對數值範圍之引用僅旨在用作單獨引用落入該範圍內之各單獨值之速記方法，且將各單獨值併入說明書中，如同其在本文中單獨引用一般。除非本文另有指示或明顯與上下文相矛盾，否則本文所述之所有方法均可以任何合適之順序進行。除非另有要求，否則本文中提供之所有實例或示例性語言(例如，「諸如」)之使用僅旨在更好地闡明本發明且不對本發明之範疇構成限制。

本申請案中引用之所有出版物、專利、專利申請案及其他文獻均以引用之方式整體併入本文中以達成所有目的，其引用程度如同單獨指示各單獨出版物、專利、專利申請案或其他文獻以引用之方式併入以達成所有目的一般。

儘管已示出及描述各種特定實施例，但應當理解，在不脫離本發明之精神及範疇下可進行各種改變。

併入本文中且構成本說明書一部分之附圖說明某些實施例，且與書面描述一起用於提供本文揭示之組合物及方法之某些態樣的非限制性實例。

圖 1示出靶向GFAP及TUBB3 mRNA之siRNA之結構。四環序列GAAA經GalNAc部分修飾。圖 2A 及 2B示出整個小鼠CNS中之細胞類型特異性Tubb3及Gfap mRNA表現。圖 3示出在0.3 mg/kg、1 mg/kg及3 mg/kg單一皮下劑量之劑量下的GalXC-GFAP 30天篩選劑量反應，在皮下劑量後2天HDI，接著在皮下劑量後4天收穫。圖 4示出在0.3 mg/kg、1 mg/kg及3 mg/kg單一皮下劑量之劑量下的GalXC-TUBB3 30天篩選劑量反應，在皮下劑量後2天HDI，接著在皮下劑量後4天收穫。圖 5示出額葉皮質中星狀細胞特異性Gfap mRNA沉默及神經元特異性Tubb3 mRNA沉默之GalXC siRNA藥理學。圖 6示出紋狀體中星狀細胞特異性Gfap mRNA沉默及神經元特異性Tubb3 mRNA沉默之GalXC siRNA藥理學。圖 7示出體感覺皮質中星狀細胞特異性Gfap mRNA沉默及神經元特異性Tubb3 mRNA沉默之GalXC siRNA藥理學。圖 8示出海馬迴中星狀細胞特異性Gfap mRNA沉默及神經元特異性Tubb3 mRNA沉默之GalXC siRNA藥理學。圖9示出下視丘中星狀細胞特異性Gfap mRNA沉默及神經元特異性Tubb3 mRNA沉默之GalXC siRNA藥理學。圖 10示出小腦中星狀細胞特異性Gfap mRNA沉默及神經元特異性Tubb3 mRNA沉默之GalXC siRNA藥理學。圖 11示出腦幹中星狀細胞特異性Gfap mRNA沉默及神經元特異性Tubb3 mRNA沉默之GalXC siRNA藥理學。圖 12示出頸脊髓、胸脊髓及腰脊髓中神經元特異性Tubb3 mRNA沉默之GalXC siRNA藥理學。圖 13示出腰脊髓中星狀細胞特異性Gfap mRNA沉默或神經元特異性Tubb3 mRNA沉默之GalXC siRNA藥理學，其中siRNA經GalNAc殘基修飾或未經修飾。

Claims

一種將干擾寡核苷酸選擇性遞送至膠細胞之方法，其包括：使膠細胞與寡核苷酸接觸，該寡核苷酸包含與該膠細胞中所表現之標靶RNA互補之區域，其中該寡核苷酸能夠降低該標靶RNA之表現。
如請求項1之方法，其中該互補區域之長度為至少12個核苷酸。
如請求項1之方法，其中該互補區域之長度為12個至30個核苷酸。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該寡核苷酸為單股核酸。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該寡核苷酸為雙股核酸(dsNA)。
如請求項1至5中任一項之方法，其中該寡核苷酸之長度為12個至58個核苷酸。
如請求項1之方法，其中該寡核苷酸包含有義股及反義股，其中該有義股與該反義股形成雙鏈體，且該反義股包含與該膠細胞中所表現之標靶RNA互補之區域且能夠降低該標靶RNA之表現。
如請求項7之方法，其中該寡核苷酸包含RNA。
如請求項8之方法，其中該寡核苷酸包含dsNA。
如請求項7至9中任一項之方法，其中該有義股之長度為15個至40個核苷酸。
如請求項7至10中任一項之方法，其中該反義股之長度為19個至27個核苷酸。
如請求項7至11中任一項之方法，其中該有義股與該反義股形成長度為至少12個核苷酸之雙鏈體。
如請求項7至12中任一項之方法，其中該有義股及該反義股為分開之寡核苷酸。
如請求項7至12中任一項之方法，其中該有義股及該反義股包含單一寡核苷酸。
如請求項7至14中任一項之方法，其中當該有義股與該反義股形成雙鏈體時，該有義股或該反義股具有長度為至多6個核苷酸之3'懸垂物。
如請求項15之方法，其中該反義股具有3'懸垂物，且其中該3'懸垂物之長度為2個核苷酸。
如請求項7至16中任一項之方法，其中該寡核苷酸進一步包含莖環序列，該莖環序列包含序列區域S1-L-S2，其中S1與S2互補，且其中L為當S1與S2形成雙鏈體時在S1與S2之間形成的環，且其中該莖環序列在該有義股之3'末端附接於該有義股。
如請求項17之方法，其中該環L之長度為四個核苷酸。
如請求項7至18中任一項之方法，其中該寡核苷酸進一步包含一或多個靶向配位體。
如請求項17至18中任一項之方法，其中該寡核苷酸進一步包含一或多個靶向配位體，其中該靶向配位體存在於該莖環序列之該環L上。
如請求項19至20中任一項之方法，其中該靶向配位體為GalNAc部分。
如請求項1至21中任一項之方法，其中該寡核苷酸包含用於增加該寡核苷酸對磷酸酶及/或核酸酶之抗性、提高雜交效率及/或增強活體內穩定性的手段。
如請求項1至21中任一項之方法，其中該寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸。
如請求項1至23中任一項之方法，其中該膠細胞為星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞(Schwann cell)、衛星細胞、腸膠細胞或其混合物。
如請求項1至24中任一項之方法，其中該膠細胞存在於個體之神經系統中。
如請求項25之方法，其中該膠細胞存在於個體之中樞神經系統中。
如請求項26之方法，其中該膠細胞存在於額葉皮質、紋狀體、體感覺皮質、海馬迴、下視丘、小腦、腦幹及/或脊髓中。
如請求項27之方法，其中該膠細胞存在於脊髓中。
如請求項28之方法，其中該膠細胞存在於頸脊髓、胸脊髓及/或腰脊髓中。
如請求項25之方法，其中該膠細胞存在於個體之周圍神經系統中。
如請求項1至30中任一項之方法，其中與神經元細胞相比，該標靶RNA在該膠細胞中特異性表現。
如請求項1至31中任一項之方法，其中該互補區域係與該標靶RNA中之外顯子互補。
如請求項1至31中任一項之方法，其中該互補區域係與該標靶RNA之5'未轉譯區互補。
如請求項1至31中任一項之方法，其中該互補區域係與該標靶RNA之3'未轉譯區互補。
如請求項1至34中任一項之方法，其中該互補區域係與該標靶RNA之對偶基因特異性序列互補。
如請求項1至35中任一項之方法，其中對膠細胞之選擇性相對於神經元細胞為至少約1.5倍。
如請求項1至35中任一項之方法，其中對膠細胞之選擇性相對於神經元細胞為2倍或更大；2.5倍或更大；3倍或更大；3.5倍或更大；4倍或更大；4.5倍或更大；或5倍或更大。
如請求項1至37中任一項之方法，其中該標靶RNA為自以下表現之RNA： GFAP基因、 PSAP基因、 PMP22基因、 LMNB1基因、 APP基因、 TAU(MAPT)基因、 SOD1基因、 C9orf72基因、 HTT基因、 SNCA或 ASYN基因、 LRRK2基因、 ADK基因、 TNFα基因、 ERK5/MAPK7基因、 IL-1R2基因、 CD49d基因、 IGF-1、 EGF基因、 TGF-β基因、 VEGF基因、 TDP-43基因、 CD38基因、 ATXN2基因、 ATXN3基因、 ATXN7基因或 EGR2基因。
如請求項38之方法，其中該膠細胞為膠癌細胞且該標靶RNA為在該膠癌細胞中之表現增加之RNA。
如請求項39之方法，其中該膠癌細胞為神經膠母細胞瘤。
如請求項39或40之方法，其中該標靶RNA為該膠癌細胞中自該 IGF-1基因、 EGF基因、 TGF-β基因或 VEGF基因表現之RNA。
如請求項1至41中任一項之方法，其中該寡核苷酸係經鞘內、腦室內、間質、舌下或鼻內投與個體。
一種選擇性地降低膠細胞中所表現之標靶RNA之水準的方法，其包括：使膠細胞與寡核苷酸接觸，該寡核苷酸包含與該膠細胞中所表現之標靶RNA互補之區域，其中該寡核苷酸能夠降低該標靶RNA之表現。
如請求項43之方法，其中該互補區域之長度為至少12個核苷酸。
如請求項43之方法，其中該互補區域之長度為12個至30個核苷酸。
如請求項43至45中任一項之方法，其中該寡核苷酸為單股核酸。
如請求項43至45中任一項之方法，其中該寡核苷酸為雙股核酸(dsNA)。
如請求項43至47中任一項之方法，其中該寡核苷酸之長度為12個至60個核苷酸。
如請求項43之方法，其中該寡核苷酸包含有義股及反義股，其中該有義股與該反義股形成雙鏈體，且該反義股包含與該膠細胞中所表現之標靶RNA互補之區域且能夠降低該標靶RNA之表現。
如請求項49之方法，其中該寡核苷酸包含RNA。
如請求項49之方法，其中該寡核苷酸包含dsNA。
如請求項49至51中任一項之方法，其中該有義股之長度為15個至40個核苷酸。
如請求項49至52中任一項之方法，其中該反義股之長度為19個至27個核苷酸。
如請求項49至53中任一項之方法，其中該有義股與該反義股形成長度為至少12個核苷酸之雙鏈體。
如請求項49至54中任一項之方法，其中該有義股及該反義股包含分開之寡核苷酸。
如請求項49至54中任一項之方法，其中該有義股及該反義股包含單一寡核苷酸。
如請求項49至56中任一項之方法，其中當該有義股與該反義股形成雙鏈體時，該有義股或該反義股具有長度為至多6個核苷酸之3'懸垂物。
如請求項57之方法，其中該反義股上之該3'懸垂物之長度為2個核苷酸。
如請求項49至58中任一項之方法，其中該寡核苷酸進一步包含莖環序列，該莖環序列包含序列區域S1-L-S2，其中S1與S2互補，且其中L為當S1與S2形成雙鏈體時在S1與S2之間形成的環，其中該莖環序列在該有義股之3'末端附接於該有義股。
如請求項59之方法，其中該環L之長度為四個核苷酸。
如請求項43至60中任一項之方法，其中該寡核苷酸進一步包含一或多個靶向配位體。
如請求項59至60中任一項之方法，其中該寡核苷酸進一步包含一或多個靶向配位體，其中該靶向配位體存在於該莖環序列之該環L上。
如請求項61至62中任一項之方法，其中該靶向配位體為GalNAc部分。
如請求項43至63中任一項之方法，其中該寡核苷酸包含用於增加該寡核苷酸對磷酸酶及/或核酸酶之抗性、提高雜交效率及/或增強活體內穩定性的手段。
如請求項43至63中任一項之方法，其中該寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸。
如請求項43至64中任一項之方法，其中該膠細胞為星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞、腸膠細胞或其混合物。
如請求項43至66中任一項之方法，其中該膠細胞存在於個體之神經系統中。
如請求項67之方法，其中該膠細胞存在於個體之中樞神經系統中。
如請求項68之方法，其中該膠細胞存在於額葉皮質、紋狀體、體感覺皮質、海馬迴、下視丘、小腦、腦幹及/或脊髓中。
如請求項69之方法，其中該膠細胞存在於脊髓中。
如請求項70之方法，其中該膠細胞存在於頸脊髓、胸脊髓及/或腰脊髓中。
如請求項67之方法，其中該膠細胞存在於個體之周圍神經系統中。
如請求項43至72中任一項之方法，其中與神經元細胞相比，該標靶RNA在該膠細胞中特異性表現。
如請求項43至73中任一項之方法，其中該互補區域係與該標靶RNA中之外顯子互補。
如請求項43至73中任一項之方法，其中該互補區域係與該標靶RNA之5'未轉譯區互補。
如請求項43至73中任一項之方法，其中該互補區域係與該標靶RNA之3'未轉譯區互補。
如請求項43至76中任一項之方法，其中該互補區域係與該標靶RNA之對偶基因特異性序列互補。
如請求項43至77中任一項之方法，其中對膠細胞之選擇性相對於神經元細胞為至少約1.5倍或更多。
如請求項43至78中任一項之方法，其中對膠細胞之選擇性相對於神經元細胞為2倍或更大；2.5倍或更大；3倍或更大；3.5倍或更大；4倍或更大；4.5倍或更大；或5倍或更大。
如請求項43至79中任一項之方法，其中該標靶RNA為自以下表現之RNA： GFAP基因、 PSAP基因、 PMP22基因、 LMNB1基因、 APP基因、 TAU(MAPT)基因、 SOD1基因、 C9orf72基因、 HTT基因、 SNCA或 ASYN基因、 LRRK2基因、 ADK基因、 TNFα基因、 ERK5/MAPK7基因、 IL-1R2基因、 CD49d基因、 IGF-1、 EGF基因、 TGF-β基因、 VEGF基因、 TDP-43基因、 CD38基因、 ATXN2基因、 ATXN3基因、 ATXN7基因或 EGR2基因。
如請求項67至79中任一項之方法，其中該膠細胞為膠癌細胞且該標靶RNA為在該膠癌細胞中之表現增加之RNA。
如請求項81之方法，其中該膠癌細胞為神經膠母細胞瘤。
如請求項81或82之方法，其中該標靶RNA為在該膠癌細胞中自該 IGF-1基因、 EGF基因、 TGF-β基因或 VEGF基因表現之RNA。
如請求項43至83中任一項之方法，其中該寡核苷酸係經鞘內、腦室內、間質、舌下或鼻內投與個體。
一種對選擇性地降低膠細胞或神經元細胞中所表現之標靶RNA之水準的寡核苷酸進行篩選的方法，其包括：使膠細胞及神經元細胞與候選寡核苷酸接觸，其中該候選寡核苷酸包含與該膠細胞及該神經元細胞二者中皆表現之標靶RNA互補之區域；及量測膠細胞及神經元細胞中之標靶RNA之水準以確定對標靶RNA表現水準之任何差異性作用。
一種對選擇性地降低膠細胞或神經元細胞中所表現之標靶RNA之水準的寡核苷酸進行篩選的方法，其包括：向個體之神經系統投與候選寡核苷酸，其中該候選寡核苷酸包含與該神經系統之膠細胞及神經元細胞二者中皆表現之標靶RNA互補之區域，其中該寡核苷酸能夠降低標靶RNA之表現；及量測膠細胞及神經元細胞中之標靶RNA之水準以確定對標靶RNA表現水準之任何差異性作用。
如請求項85或86之方法，其中該寡核苷酸包含單股RNA或DNA。
如請求項85或86之方法，其中該寡核苷酸包含雙股核酸(dsNA)，其中該dsNA包含核糖核苷酸。
如請求項88之方法，其中該寡核苷酸包含有義股及反義股，其中該有義股與該反義股形成雙鏈體，且該反義股具有與該標靶RNA互補之區域，其中該寡核苷酸能夠降低標靶RNA表現之水準。
如請求項85至89中任一項之方法，其中該寡核苷酸進一步包含一或多個靶向配位體。
如請求項90之方法，其中該靶向配位體包含碳水化合物、胺基糖、膽固醇、脂質或肽。
如請求項91之方法，其中該靶向配位體包含GalNAc部分。
如請求項86至92之方法，其中該量測包括測定遍佈該神經系統之膠細胞及神經元細胞之標靶RNA的水準。
如請求項85至93中任一項之方法，其中該膠細胞為星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞或腸膠細胞。
一種對選擇性地降低膠細胞或神經元細胞中所表現之標靶RNA之水準的寡核苷酸進行篩選的方法，其包括：使膠細胞與第一候選寡核苷酸接觸，其中該第一候選寡核苷酸包含與膠細胞中所表現之第一標靶RNA互補之區域，其中該第一寡核苷酸能夠降低第一標靶RNA表現之水準；使神經元細胞與第二候選寡核苷酸接觸，其中該第二候選寡核苷酸包含與神經元細胞中所表現之第二標靶RNA互補之區域，其中該第二寡核苷酸能夠降低第二標靶RNA表現之水準；及量測膠細胞中之第一標靶RNA及神經元細胞中之第二標靶RNA的水準且確定第一標靶RNA及第二標靶RNA之任何差異性減少。
一種對選擇性地降低膠細胞或神經元細胞中所表現之標靶RNA之水準的寡核苷酸進行篩選的方法，其包括：向第一個體之神經系統投與第一候選寡核苷酸，其中該第一候選寡核苷酸包含與膠細胞中所表現之第一標靶RNA互補之區域，且其中該第一寡核苷酸能夠降低該第一標靶RNA表現之水準；向第二個體之神經系統投與第二候選寡核苷酸，其中該第二候選寡核苷酸包含與神經元細胞中所表現之第二標靶RNA互補之區域，且其中該第二寡核苷酸能夠降低該第二標靶RNA表現之水準；及量測該第一個體及該第二個體之神經系統中膠細胞中之第一標靶RNA及神經元細胞中之第二標靶RNA的水準，其中該第一個體及該第二個體係相同物種。
如請求項95或96之方法，其中該第一候選寡核苷酸與該第二候選寡核苷酸之不同之處僅在於與該第一標靶RNA或該第二標靶RNA互補之區域。
如請求項95至97中任一項之方法，其中膠細胞中所表現之該第一標靶RNA在膠細胞中特異性表現，且神經元細胞中所表現之該第二標靶RNA在神經元細胞中特異性表現。
如請求項95至98中任一項之方法，其中該第一候選寡核苷酸及該第二候選寡核苷酸各自包含單股RNA或DNA。
如請求項95至98中任一項之方法，其中該第一候選寡核苷酸及該第二候選寡核苷酸包含雙股核酸(dsNA)，其中該dsNA包含RNA。
如請求項100之方法，其中該第一候選寡核苷酸包含第一有義股及第一反義股，其中該第一有義股與該第二反義股形成第一雙鏈體，其中該第一反義股具有與膠細胞中所表現之該第一標靶RNA互補之區域且能夠降低第一標靶RNA之水準；且該第二候選寡核苷酸包含第二有義股及第二反義股，其中該第二有義股與該第二反義股形成第二雙鏈體，且其中該第二反義股具有與該神經元細胞中所表現之該第二標靶RNA互補之區域且能夠降低第二標靶RNA之水準。
如請求項95至101中任一項之方法，其中該第一候選寡核苷酸及該第二候選寡核苷酸進一步包含一或多個靶向配位體。
如請求項102之方法，其中該靶向配位體包含碳水化合物、胺基糖、膽固醇、脂質、肽或其混合物中之一或多者。
如請求項103之方法，其中該靶向配位體包含一或多個GalNAc部分。
如請求項95至104中任一項之方法，其中該量測包括測定遍佈該神經系統之膠細胞中之第一標靶RNA及神經元細胞中之第二標靶RNA的水準。
如請求項95至105中任一項之方法，其中該膠細胞為星狀細胞、寡樹突細胞、室管膜細胞、微膠細胞、許旺氏細胞、衛星細胞、腸膠細胞及其組合。
如請求項95至106中任一項之方法，其中神經元細胞為運動神經元、感覺神經元、中間神經元及其組合。