CN116761886A - 选择性递送寡核苷酸至胶质细胞 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于选择性降低胶质细胞中的靶RNA表达和/或所表达的蛋白质的水平的寡核苷酸，以及将此类寡核苷酸递送至胶质细胞中的相关方法。

Description

选择性递送寡核苷酸至胶质细胞

背景技术

神经系统由神经元和胶质细胞组成。神经元的主要功能在于产生和传播化学信号和电信号。胶质细胞的功能为调节神经元功能和信号传导，从而塑造和调节神经元特性和功能。在中枢神经系统(CNS)中，胶质细胞包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞和小胶质细胞。在周围神经系统中，主要胶质细胞包括许旺氏细胞(Schwann cell)、肠胶质细胞和卫星细胞。

胶质细胞与多种疾病过程有关。若干种神经变性疾病可能由有缺陷的胶质细胞功能引起。例如，星形胶质细胞功能障碍可能与肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏病(Huntington’s Disease)和帕金森氏病(Parkinson’s Disease)有关。少突胶质细胞的功能为在神经细胞的轴突上形成保护鞘，其可能与神经胶质瘤、精神分裂症、双相情感障碍和脑白质营养不良有关。小胶质细胞在大脑的免疫功能中发挥作用，并且引发可能促进阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease)、自闭症和精神分裂症的炎症反应。许旺氏细胞的功能障碍与吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre’syndrome)、恰克-马利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变相关。

一些涉及胶质细胞功能障碍的疾病与某些基因产物的表达相关。例如，亚历山大氏病(Alexander’s disease)为一种以髓鞘破坏为特征的脑白质营养不良形式，并且由胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)(一种在星形胶质细胞中表达的中间丝蛋白)基因中的常染色体功能获得性突变引起。GFAP的过表达和累积导致称为罗森塔尔纤维(Rosenthal fiber)的异常蛋白质沉积，其可能损害正常中间纤维的形成。

另一种与胶质细胞中异常基因产物的表达相关的疾病为ALS。ALS与编码铜锌超氧化物歧化酶1(SOD1)的基因中的突变相关。在ALS小鼠模型中，仅运动神经元中突变SOD1(mSOD1)的选择性表达不足以引起完全ALS症状(参见Pramatarova等人,J Neurosci.2001,21(10):3369-74)。然而，运动神经元中mSOD1的选择性耗尽影响发病和存活，但不会影响疾病进展，从而表明周围的胶质细胞参与影响变性。

鉴于与胶质细胞的功能障碍相关的多种疾病和病症，需要通过调节涉及与胶质细胞功能相关的疾病或病症的基因产物的表达来选择性靶向胶质细胞的治疗方法。

发明内容

本公开涉及如下出人意料的发现：与神经元细胞中表达的mRNA的表达降低相比，将干扰寡核苷酸(例如RNAi寡核苷酸)施用至哺乳动物神经系统中引起胶质细胞中表达的mRNA的水平选择性降低。本发明提供：可在寡核苷酸上存在或不存在GalNAc靶向部分的情况下实现胶质细胞中的选择性摄取和/或胶质细胞中表达的RNA的水平的选择性降低。

因此，在一个方面中，本公开提供一种选择性递送干扰寡核苷酸至胶质细胞的方法，详言之，其中所述选择性为相对于神经元细胞对胶质细胞的选择性。在一些实施方案中，选择性递送干扰寡核苷酸的方法包括使胶质细胞与干扰寡核苷酸接触，所述干扰寡核苷酸具有与靶RNA互补的区域，其中所述寡核苷酸能够降低靶RNA的表达。

在另一方面中，本公开提供一种选择性地降低胶质细胞中表达的RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的方法。在一些实施方案中，一种选择性地降低胶质细胞中表达的RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的方法包括使胶质细胞与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸具有与靶RNA互补的区域，其中所述寡核苷酸能够降低靶RNA的表达。

在一些实施方案中，互补区域与靶RNA的外显子互补。在一些实施方案中，互补区域与靶RNA的5’-非翻译区互补。在一些实施方案中，互补区域与靶RNA的3’-非翻译区互补。在一些实施方案中，互补区域与靶RNA的等位基因特异性序列，诸如多态性序列互补。

在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为12至60个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸具有长度为至少12个核苷酸的与靶RNA互补的区域。在一些实施方案中，与靶RNA互补的区域的长度为12至30个核苷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸为单链的。在一些实施方案中，寡核苷酸包含双链核酸(dsNA)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含RNA。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体，其中所述反义链包含与胶质细胞中表达的靶RNA互补的区域并且能够降低靶RNA的水平。

在一些实施方案中，有义链的长度为15至40个核苷酸。在一些实施方案中，反义链的长度为19至27个核苷酸。在一些实施方案中，有义链和反义链形成长度为至少12个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，有义链和反义链形成长度为12至30个核苷酸的双链体。

在一些实施方案中，有义链和反义链为分开的寡核苷酸。在一些实施方案中，有义链和反义链包含单一寡核苷酸。

在一些实施方案中，当有义链和反义链形成双链体时有义链或反义链具有长度为至多两个核苷酸的3’-突出端。优选地，反义链具有长度为至多2个核苷酸的3’-突出端。

在一些实施方案中，寡核苷酸还包含茎环序列，所述茎环序列包含序列区域S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L为当S1和S2形成双链体时在S1与S2之间形成的环，并且其中所述茎环序列连接至有义链的3’-端。在一些实施方案中，环L为五环、四环或三环。

在一些实施方案中，寡核苷酸还包含一个或多个靶向配体或靶向部分。在一些实施方案中，靶向配体或部分存在于寡核苷酸的茎环序列的环L上。在一些实施方案中，靶向配体或部分为GalNAc部分。在一些实施方案中，寡核苷酸不具有GalNAc部分。

在一些实施方案中，寡核苷酸的至少一个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸的一个或多个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，修饰包括糖部分、核苷间键联、5’-末端磷酸、核苷酸碱基、可逆修饰和如上所论述的一个或多个靶向部分的修饰。

在一些实施方案中，用寡核苷酸靶向的胶质细胞为星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞、肠胶质细胞或它们的混合物。在一些实施方案中，胶质细胞存在于受试者的中枢神经系统中。在一些实施方案中，胶质细胞存在于受试者的周围神经系统中。在一些实施方案中，靶向的胶质细胞存在于中枢神经系统的指定区域，例如额叶皮质、纹状体、躯体感觉皮质、海马体、下丘脑、小脑、脑干和/或脊髓。在一些实施方案中，胶质细胞存在于脊髓的指定区域，诸如颈脊髓、胸脊髓或腰脊髓。

在一些实施方案中，递送至胶质细胞的选择性或降低胶质细胞中表达的RNA的水平的选择性是与神经元细胞相比。在一些实施方案中，相对于神经元细胞对胶质细胞的选择性递送或胶质细胞中表达的RNA的水平的选择性降低为至少1.5倍或更多。在一些实施方案中，相对于神经元细胞对胶质细胞的选择性递送或胶质细胞中表达的RNA的水平的选择性降低为2倍或更大；2.5倍或更大；3倍或更大；3.5倍或更大；4倍或更大；4.5倍或更大；或5倍或更大。

在一些实施方案中，选择性递送干扰寡核苷酸或选择性降低胶质细胞中表达的RNA的水平的方法用于治疗与胶质细胞的功能障碍相关的病症或疾患，所述胶质细胞功能障碍诸如星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞和/或肠胶质细胞的功能障碍。

在一些实施方案中，选择性递送或选择性降低胶质细胞中表达的RNA的水平通过向受试者鞘内、脑室内、间质、舌下、静脉内或鼻内施用有效量的本文所述的寡核苷酸进行。

附图说明

并入本文中且构成本说明书一部分的附图说明某些实施方案，并且与书面描述一起用于提供本文公开的组合物和方法的某些方面的非限制性实例。

图1示出靶向GFAP和TUBB3 mRNA的siRNA的结构。四环序列GAAA经GalNAc部分修饰。

图2A和2B示出整个小鼠CNS中的细胞类型特异性Tubb3和Gfap mRNA表达。

图3示出在0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg单一皮下剂量的剂量下的GalXC-GFAP 30天筛选剂量反应，在皮下剂量后2天HDI，接着在皮下剂量后4天收获。

图4示出在0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg单一皮下剂量的剂量下的GalXC-TUBB3 30天筛选剂量反应，在皮下剂量后2天HDI，接着在皮下剂量后4天收获。

图5示出额叶皮质中星形胶质细胞特异性Gfap mRNA沉默和神经元特异性Tubb3mRNA沉默的GalXC siRNA药理学。

图6示出纹状体中星形胶质细胞特异性Gfap mRNA沉默和神经元特异性Tubb3mRNA沉默的GalXC siRNA药理学。

图7示出躯体感觉皮质中星形胶质细胞特异性Gfap mRNA沉默和神经元特异性Tubb3 mRNA沉默的GalXC siRNA药理学。

图8示出海马体中星形胶质细胞特异性Gfap mRNA沉默和神经元特异性Tubb3mRNA沉默的GalXC siRNA药理学。

图9示出下丘脑中星形胶质细胞特异性Gfap mRNA沉默和神经元特异性Tubb3mRNA沉默的GalXC siRNA药理学。

图10示出小脑中星形胶质细胞特异性Gfap mRNA沉默和神经元特异性Tubb3 mRNA沉默的GalXC siRNA药理学。

图11示出脑干中星形胶质细胞特异性Gfap mRNA沉默和神经元特异性Tubb3 mRNA沉默的GalXC siRNA药理学。

图12示出颈脊髓、胸脊髓和腰脊髓中神经元特异性Tubb3 mRNA沉默的GalXCsiRNA药理学。

图13示出腰脊髓中星形胶质细胞特异性Gfap mRNA沉默或神经元特异性Tubb3mRNA沉默的GalXC siRNA药理学，其中siRNA经GalNAc残基修饰或未经修饰。

具体实施方式

本公开涉及如下组合物和组合物的用途，所述组合物用于选择性递送干扰寡核苷酸至胶质细胞和选择性降低胶质细胞中表达的RNA的水平，包括选择性递送至受试者的神经系统中的胶质细胞或选择性降低胶质细胞中表达的靶RNA的水平。本公开出人意料地发现，与其它神经元细胞相比，使用本文公开的RNAi寡核苷酸可选择性递送和选择性降低胶质细胞中表达的RNA的水平。因此，下文详细描述寡核苷酸组合物，和所述寡核苷酸选择性递送至胶质细胞，以及所述寡核苷酸用于选择性降低胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的用途，诸如用于治疗与胶质细胞功能障碍相关的疾病或病症。

应当理解，包括附图的前述一般性描述和以下详细描述仅为示例性和说明性的，而非限制本公开。

本文中使用的章节标题仅出于组织的目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。

I.定义

关于本公开，除非另外具体定义，否则本文描述中使用的技术和科学术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。因此，以下术语旨在具有以下含义。

近似：如本文所用，术语“近似”或“约”当应用于一个或多个目标值时，是指与所叙述的参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另有规定或从上下文另外显而易见(除非此数值将超过可能值的100％)，否则术语“近似”或“约”是指处于在任一方向上(大于或小于)所叙述的参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小值以内的值的范围。

施用：如本文所用，术语“施用(administering)”或“施用(administration)”意指以药理学上有用(例如，以治疗受试者的疾患)的方式向受试者提供物质(例如，寡核苷酸)。

互补：如本文所用，术语“互补”是指核苷酸(例如，在相对核酸上或在单链核酸的相对区域上的两个核苷酸)之间的一种结构关系，所述结构关系允许所述核苷酸彼此形成碱基对。举例而言，一个核酸的嘌呤核苷酸与相对核酸的嘧啶核苷酸互补，所述两种核苷酸可通过彼此形成氢键而一起进行碱基配对。在一些实施方案中，互补核苷酸可按沃森-克里克(Watson-Crick)方式或按允许形成稳定双链体的任何其它方式进行碱基配对。在一些实施方案中，如本文所述，两个核酸可具有彼此互补而形成互补区域的核苷酸序列。

脱氧核糖核苷酸：如本文所用，术语“脱氧核糖核苷酸”是指与核糖核苷酸相比在戊糖的2’位置具有氢的核苷酸。经修饰的脱氧核糖核苷酸为除2’位置以外具有一个或多个原子修饰或取代的脱氧核糖核苷酸，所述一个或多个原子修饰或取代包括糖、磷酸基或碱基内部或本身的修饰或取代。

双链寡核苷酸：如本文所用，术语“双链寡核苷酸”是指实质上呈双链体形式的寡核苷酸。在一些实施方案中，在共价分开的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对。在一些实施方案中，在共价连接的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对。在一些实施方案中，由经折叠(例如，经由发夹)以提供一起碱基配对的核苷酸的互补反平行序列的单链核酸形成双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含彼此完全形成双链体的两个共价分开的核酸链。然而，在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分形成双链体，例如在一端或两端具有突出端的两个共价分开的核酸链。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分互补的核苷酸的反平行序列，并且因此可具有一个或多个错配，所述一个或多个错配可包括内部错配或末端错配。

双链体：如本文所用，术语“双链体”在关于核酸(例如，寡核苷酸)时是指经由核苷酸的两个反平行序列的互补碱基配对形成的结构。

赋形剂：如本文所用，术语“赋形剂”是指可包含于组合物中的非治疗剂，例如，以提供或有助于所需稠度或稳定作用。

胶质细胞：如本文所用，“胶质细胞”和“神经胶质细胞”在本文中可互换使用并且是指神经系统中提供支持或营养或者用于维持体内平衡的非神经元前体细胞和/或完全分化的细胞。胶质细胞的实例包括室管膜细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞和肠胶质细胞等。还已发现胶质细胞可调控神经放电率、大脑可塑性和免疫反应。

环：如本文所用，术语“环”是指核酸(例如，寡核苷酸)的未配对区域，其两侧为核酸的两个反平行区域，所述区域彼此充分互补，使得在适当杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中，在细胞中)，位于未配对区域两侧的两个反平行区域杂交形成双链体(称为“茎”)。

经修饰的核苷酸间键联：如本文所用，术语“经修饰的核苷酸间键联”是指与包含磷酸二酯键的参考核苷酸间键联相比具有一个或多个化学修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸为非天然存在的键联。通常，经修饰的核苷酸间键联赋予其中存在经修饰的核苷酸间键联的核酸一种或多种期望的特性。举例而言，经修饰的核苷酸可改善热稳定性、抗降解性、核酸酶抗性、溶解性、生物利用度、生物活性、降低免疫原性等。

经修饰的核苷酸：如本文所用，术语“经修饰的核苷酸”是指与选自以下的相应参考核苷酸相比具有一个或多个化学修饰的核苷酸：腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸苷脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸为非天然存在的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸在其糖、核碱基和/或磷酸基中具有一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有与相应参考核苷酸结合的一个或多个化学部分。通常，经修饰的核苷酸赋予其中存在经修饰的核苷酸的核酸一种或多种期望的特性。举例而言，经修饰的核苷酸可改善热稳定性、抗降解性、核酸酶抗性、溶解性、生物利用度、生物活性、降低免疫原性等。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸在核糖环的2’位置包含2’-O-甲基或2’-F取代。

切口四环结构：“切口四环结构”是指RNAi寡核苷酸的一种结构，其特征在于存在分开的有义(过客)和反义(引导)链，其中有义链具有与反义链互补的区域，使得两个链形成双链体，并且其中所述链中的至少一者(一般为有义链)从双链体延伸，其中所述延伸段含有四环和形成与四环相邻的茎区域的两个自互补序列，其中四环被配置为稳定由至少一个链的自互补序列形成的相邻茎区域。

神经元细胞：“神经元细胞”通常是指神经系统的结构和功能单元，并且存在于中枢和周围神经系统中。神经元细胞充当神经系统的传导细胞，接收和传输化学信号和/或电信号。三大类神经元细胞包括感觉神经元、运动神经元和中间神经元。在一些实施方案中，神经元细胞可通过特定神经元特异性的表达与非神经元胶质细胞区分开来，所述神经元特异性标志物包括例如但不限于：神经元特异性烯醇化酶(NSE或γ-烯醇化酶)；神经元核(NeuN或Fox3)；微管相关蛋白2(MAP-2)；微管蛋白βIII(TUBB3)；双皮质素(DCX)；和c-fos。在一些实施方案中，神经元细胞的临床标志物包括胆碱乙酰转移酶(ChAT)和酪氨酸羟化酶。还可使用中枢神经系统或周围神经系统的区域所特有的其它神经元细胞标志物，例如钙结合蛋白-D28K、钙视网膜蛋白和神经丝蛋白(NFP)。

寡核苷酸：如本文所用，术语“寡核苷酸”是指例如长度小于100个核苷酸的短核酸。寡核苷酸可包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸，包括例如经修饰的核糖核苷酸。寡核苷酸可为单链或双链。寡核苷酸可能具有或可能不具有双链体区域。作为一组非限制性实例，寡核苷酸可为但不限于小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、切丁酶底物干扰RNA(dsiRNA)、反义寡核苷酸、短siRNA或单链siRNA。在一些实施方案中，双链寡核苷酸为RNAi寡核苷酸。

突出端：如本文所用，术语“突出端”是指由一个链或区域延伸超出与所述一个链或区域形成双链体的互补链的末端所形成的末端非碱基配对核苷酸。在一些实施方案中，突出端在双链寡核苷酸的5’末端或3’末端包含从双链体区域延伸的一个或多个未配对核苷酸。在某些实施方案中，突出端为双链寡核苷酸的反义链或有义链上的3’或5’突出端。

磷酸酯类似物：如本文所用，术语“磷酸酯类似物”是指模拟磷酸基的静电和/或空间特性的化学部分。在一些实施方案中，磷酸酯类似物位于寡核苷酸的5’末端核苷酸处以代替常常易于酶促移除的5’-磷酸酯。在一些实施方案中，5’磷酸酯类似物含有磷酸酶抗性键联。磷酸酯类似物的实例包括5’膦酸酯，诸如5’亚甲基膦酸酯(5’-MP)和5’-(E)-乙烯基膦酸酯(5’-VP)。在一些实施方案中，寡核苷酸在5’末端核苷酸处的糖的4’-碳位置处具有磷酸酯类似物(称为“4’-磷酸酯类似物”)。4’-磷酸酯类似物的一个实例为氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子结合于糖部分(例如，在其4’-碳处)或其类似物(参见例如国际专利公布WO/2018/045317，其涉及磷酸酯类似物的内容以引用的方式并入本文中。已开发针对寡核苷酸的5’端的其它修饰(参见例如国际专利公布WO2011133871；美国专利第8,927,513号；和Prakash等人,Nucleic Acids Res.,2015,43(6):2993-3011，各文献中涉及磷酸酯类似物的内容以引用的方式并入本文中)。

表达降低：如本文所用，术语基因的“表达降低”或其等效术语是指与适当参考细胞或受试者相比，细胞或受试者中由所述基因编码的RNA转录物或蛋白质的量减少和/或基因活性的量减少。举例而言，用双链寡核苷酸(例如，具有与靶mRNA序列互补的反义链的双链寡核苷酸)处理细胞的行为可使RNA转录物、蛋白质和/或酶促活性(例如由靶基因编码)的量与未用所述双链寡核苷酸处理的细胞相比有所减少。类似地，如本文所用的“降低表达”是指使基因(例如，靶基因)的表达降低的行为。

互补区域：如本文所用，术语“互补区域”是指核酸(例如，双链寡核苷酸)的核苷酸序列，其与核苷酸的反平行序列(例如，mRNA内的靶核苷酸序列)充分互补，以允许在适当杂交条件下，例如在磷酸盐缓冲液中、在细胞中等等，核苷酸的两个序列之间进行杂交。互补区域可与核苷酸序列(例如，mRNA或其部分内存在的靶核苷酸序列)完全互补。举例而言，与mRNA中存在的核苷酸序列完全互补的互补区域具有与mRNA中的相应序列互补而无任何错配或空位的连续核苷酸序列。可替代地，互补区域可与核苷酸序列(例如，mRNA或其部分中存在的核苷酸序列)部分地互补。举例而言，与mRNA中存在的核苷酸序列部分地互补的互补区域具有与mRNA中的相应序列互补，但与mRNA中的相应序列相比含有一个或多个错配或空位(例如，1个、2个、3个或更多个错配或空位)的连续核苷酸序列，前提条件为互补区域仍能够在适当杂交条件下与mRNA杂交。

核糖核苷酸：如本文所用，术语“糖核苷酸”核是指具有呈戊糖形式的核糖的核苷酸，在其2’位置处含有羟基。经修饰的核糖核苷酸为除2’位置以外具有一个或多个原子修饰或取代的核糖核苷酸，所述一个或多个原子修饰或取代包括核糖、磷酸基或碱基内部或本身的修饰或取代。

RNAi寡核苷酸：如本文所用，术语“RNAi寡核苷酸”是指(a)具有有义链(过客)和反义链(引导)的双链寡核苷酸，其中在靶mRNA的裂解中Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶使用反义链或反义链的一部分；或(b)具有单一反义链的单链寡核苷酸，其中在靶mRNA的裂解中Ago2核酸内切酶使用所述反义链(或所述反义链的一部分)。

选择性降低：如本文所用，基因表达的“选择性降低”或其等效术语是指与适当参考细胞或受试者相比，目标细胞中由所述基因编码的RNA转录物或蛋白质的量减少和/或基因活性的量减少，其中目标细胞中的基因和参考细胞或受试者中的比较基因为相同基因或不同基因。在一些实施方案中，目标细胞中基因的表达为目标细胞所特有的，而参考细胞中比较基因的表达为参考细胞所特有的。

链：如本文所用，术语“链”是指经由核苷酸间键联(例如，磷酸二酯键联、硫代磷酸酯键联)连接在一起的单一连续核苷酸序列。在一些实施方案中，链具有两个自由端，例如，5’端和3’端。

受试者：如本文所用，术语“受试者”意指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人类。在一些实施方案中，受试者为人或非人灵长类动物。术语“个体”或“患者”可与“受试者”互换使用。

合成：如本文所用，术语“合成”是指一种核酸或其它分子，其通过人工合成(例如，使用机器(例如，固态核酸合成器))或以其它方式不来源于通常产生所述分子的天然来源(例如，细胞或生物体)。

靶向配体：如本文所用，术语“靶向配体”是指选择性结合于目标组织或细胞的同源分子(例如，受体)，并且可与另一种物质缀合以达成将另一种物质靶向目标组织或细胞的目的的分子(例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质)。举例而言，在一些实施方案中，靶向配体可与寡核苷酸缀合以达成将寡核苷酸靶向目标特定组织或细胞的目的。在一些实施方案中，靶向配体选择性结合于细胞表面受体。因此，在一些实施方案中，当与寡核苷酸缀合时，靶向配体通过选择性结合于在细胞表面上表达的受体和包含寡核苷酸、靶向配体和受体的复合物被细胞内体内化来促进寡核苷酸递送至特定细胞中。在一些实施方案中，靶向配体经由接头与寡核苷酸缀合，所述接头在细胞内化之后或期间裂解，以使寡核苷酸在细胞中从靶向配体释放。

四环：如本文所用，术语“四环”是指增加由侧翼核苷酸序列杂交形成的相邻双链体的稳定性的环。当相邻茎双链体的解链温度(T_m)的增加高于对由随机选择的核苷酸序列组成的一组长度相当的环平均预期的相邻茎双链体的T_m时，稳定性的增加为可检测的。举例而言，四环可在10mM NaHPO₄中向包含长度为至少2个碱基对的双链体的发夹赋予至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃的解链温度。在一些实施方案中，四环可通过堆积相互作用来稳定相邻茎双链体中的碱基对。另外，四环中核苷酸之间的相互作用包括但不限于非沃森-克里克碱基配对、堆积相互作用、氢键合和接触相互作用(Cheong等人,Nature,1990,346(6285):680-2；Heus和Pardi,Science,1991,253(5016):191-4)。在一些实施方案中，四环包含3至6个核苷酸或由3至6个核苷酸组成且通常为4至5个核苷酸。在某些实施方案中，四环包含三个、四个、五个或六个核苷酸或由三个、四个、五个或六个核苷酸组成，所述核苷酸可经修饰或可未经修饰(例如，其可缀合于或可不缀合于靶向部分)。在一些实施方案中，四环由四个核苷酸组成。在四环中可使用任何核苷酸，并且可使用此类核苷酸的标准IUPAC-IUB符号，如Cornish-Bowden,Nucleic AcidsRes.1985,13:3021-3030中所述。例如，字母“N”可用于意指任何碱基可能位于所述位置，字母“R”可用于意指A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)可能位于所述位置，并且“B”可用于意指C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)或T(胸腺嘧啶)可能位于所述位置。四环的实例包括四环的UNCG家族(例如，UUCG)、四环的GNRA家族(例如，GAAA)和CUUG四环。(Woese等人,Proc Natl Acad Sci.USA.,1990,87(21):8467-71；Antao等人,Nucleic Acids Res.,1991,19(21):5901-5)。DNA四环的实例包括四环的d(GNNA)家族(例如，d(GTTA))、四环的d(GNRA)家族、四环的d(GNAB)家族、四环的d(CNNG)家族和四环的d(TNCG)四环家族(例如，d(TTCG))。参见例如Nakano等人,Biochemistry,2002,41(48):14281-292；Shinji等人,Nippon Kagakkai Koen Yokoshu,2000,78(2):731，所述文献的相关公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，四环含于切口四环结构内。

治疗(Treat)、治疗(treatment)或治疗(treating)：如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指获得所需的药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，所述作用可为预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于所述疾病的副作用而言，可为治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物，尤其是人的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患所述疾病但尚未诊断为患病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)缓解疾病，例如使疾病消退，例如完全或部分消除疾病的症状。

II.用于选择性递送和降低胶质细胞中的RNA和/或蛋白质表达的寡核苷酸

本公开涉及用于选择性递送干扰寡核苷酸或选择性降低胶质细胞中表达的靶RNA和/或蛋白质的水平的组合物和方法，详言之，选择性递送至受试者的神经系统中的胶质细胞或选择性降低胶质细胞中表达的靶RNA和/或蛋白质的水平。如上所论述，本文中显示，与在神经元细胞中特异性表达的靶mRNA的水平降低相比，将用GalNAc残基修饰的干扰RNA(RNAi)施用至神经系统中可出人意料地选择性降低在胶质细胞中特异性表达的靶mRNA的水平。在一些情况下，胶质细胞中表达的mRNA的降低的选择性几乎为神经元细胞中表达的mRNA的表达降低(例如降低约40％)的两倍(例如降低超过80％)。虽然已知寡核苷酸上的GalNAc配体目标为在肝脏中选择性摄取，但本申请中的结果显示，相对于神经元细胞中的靶RNA的水平的降低，此类经修饰的寡核苷酸选择性地降低胶质细胞中表达的靶RNA的水平。已知的GalNAc对肝脏去唾液酸糖蛋白受体的特异性和经GalNAc修饰的寡核苷酸的对比鲜明的选择性活性显示，可在不存在GalNAc配体下实现胶质细胞中的选择性摄取和/或胶质细胞中表达的RNA的水平的选择性降低。

a.寡核苷酸

在一些实施方案中，选择性递送干扰寡核苷酸的方法或选择性降低胶质细胞中表达的靶RNA的水平的方法包括使胶质细胞与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸能够降低胶质细胞中表达的RNA和/或蛋白质的水平。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含与胶质细胞中表达的靶RNA互补的区域。在一些实施方案中，互补区域的长度为至少12个核苷酸。在一些实施方案中，互补区域的长度为至少15个核苷酸。在一些实施方案中，互补区域的长度为至少19个核苷酸。在一些实施方案中，互补区域的长度为12至30个核苷酸。在一些实施方案中，互补区域的长度为19至23个核苷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少12个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为12至60个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为12至58个核苷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸为单链核酸。在一些实施方案中，寡核苷酸为双链核酸(dsNA)。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和反义链能够形成双链体，并且所述反义链包含与胶质细胞中表达的靶RNA序列互补的区域。在一些实施方案中，由有义链和反义链形成的双链体被称为第一双链体(D1)。在一些实施方案中，反义链可降低胶质细胞中表达的靶RNA的水平。

在一些实施方案中，有义链的长度为15至40个核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为19至40个核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为12至36个核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为17至36个核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为19至23个核苷酸。

在一些实施方案中，反义链的长度为至多50个核苷酸(例如长度至多40个、至多30个、至多27个、至多25个、至多21个或至多19个核苷酸)。在一些实施方案中，反义链的长度为12至36个核苷酸。在一些实施方案中，反义链的长度为17至36个核苷酸。在一些实施方案中，反义链的长度为15至30个核苷酸。在一些实施方案中，反义链的长度为19至29个核苷酸。在一些实施方案中，反义链的长度为19至27个核苷酸。在一些实施方案中，反义链的长度为21至27个核苷酸。在一些实施方案中，反义链的长度为21至23个核苷酸。

在一些实施方案中，由有义链和反义链形成的双链体也称为第一双链体或D1，长度可为12至30个核苷酸(例如12至30个、12至27个、15至25个、21至26个、18至30个或19至30个核苷酸)。在一些实施方案中，在寡核苷酸的有义链与反义链之间形成的双链体的长度为至少12个核苷酸(例如长度为至少12个、至少15个、至少20个或至少25个核苷酸)。在一些实施方案中，在寡核苷酸的有义链与反义链之间形成的双链体的长度为12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。在一些实施方案中，由有义链和反义链形成的双链体具有12-21个碱基对的长度。在一些实施方案中，双链体具有13至20个、14至20个、15至20个、16至20个、17至20个、18至20个或19至20个碱基对的长度。在一些实施方案中，双链体具有12至23个、12至22个、12至21个、12至20个、12至19个、12至18个、12至17个、12至16个、12至15个、12至14个或12至13个碱基对的长度。在一些实施方案中，双链体具有12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个碱基对的长度。在一些实施方案中，双链体区域的长度为至少19个碱基对。在一些实施方案中，双链体的长度为20个碱基对。在一些实施方案中，双链体的长度为21个碱基对。

在一些实施方案中，寡核苷酸具有有义链与反义链之间的互补区域。在一些实施方案中，互补区域的长度可为12至30个核苷酸。在一些实施方案中，有义链与反义链之间的互补区域为至少12个核苷酸长(例如至少12个、至少15个、至少20个或至少25个核苷酸长)。在一些实施方案中，有义链与反义链之间的互补区域的长度为12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。在一些实施方案中，有义链与反义链之间的互补区域的长度为12至30个、12至27个、12至22个、15至25个、15至23个、21至26个、20至23个、18至30个或19至30个核苷酸。

在一些实施方案中，具有有义链和反义链的寡核苷酸在有义链与反义链之间具有一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个)错配。在一些实施方案中，有义链和反义链可具有多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个等错配，前提条件为其维持在适当杂交条件下形成双链体的能力。在一些实施方案中，如果有义链与反义链之间存在超过一个错配，则所述错配的位置可为连续的(例如一排2个、3个或更多个)或可散布在整个互补区域内，前提条件为寡核苷酸维持在适当杂交条件下形成双链体的能力。在一些实施方案中，第一双链体(D1)含有一个或多个错配。

在一些实施方案中，反义序列与胶质细胞中表达的靶RNA互补的区域的长度为至少12个核苷酸。在一些实施方案中，反义序列与胶质细胞中表达的靶RNA互补的区域的长度为至少15个核苷酸。在一些实施方案中，反义序列与胶质细胞中表达的靶RNA互补的区域的长度为至少19个核苷酸。在一些实施方案中，序列与胶质细胞中表达的靶RNA互补的区域的长度为至少21个核苷酸。在一些实施方案中，互补区域的长度为至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个核苷酸。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有长度在12至30个(例如12至30个、12至22个、15至25个、17至21个、18至27个、19至27个或15至30个)核苷酸范围内的与靶RNA互补的区域。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有长度为12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸的与靶RNA互补的区域。

在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸包含与靶RNA上的序列完全互补的互补区域(例如在双链寡核苷酸的反义链上)。在一些实施方案中，寡核苷酸的互补区域(例如在双链寡核苷酸的反义链上)与长度在12至30个核苷酸(例如12至25个、12至20个、12至18个、12至16个、12至14个、14至20个、14至18个、14至16个、16至20个、16至18个或18至30个)范围内的靶RNA序列的核苷酸的连续序列互补。在一些实施方案中，寡核苷酸的互补区域(例如在双链寡核苷酸的反义链上)与长度为12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个连续核苷酸的靶RNA序列的核苷酸的连续序列互补。

在一些实施方案中，与靶RNA的相应序列相比，与靶RNA序列互补的区域可具有一个或多个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸的互补区域可具有多达1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个等错配，前提条件为其维持在适当杂交条件下与靶RNA序列形成互补碱基对的能力。可替代地，在一些实施方案中，寡核苷酸上的互补区域可具有至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个错配，前提条件为其维持在适当杂交条件下与靶RNA序列形成互补碱基对的能力。在一些实施方案中，如果互补区域中存在超过一个错配，则所述错配的位置可为连续的(例如一排2个、3个、4个或更多个)或可散布在整个互补区域内，前提条件为寡核苷酸维持在适当杂交条件下与靶RNA序列形成互补碱基对的能力。在一些实施方案中，反义链具有与靶RNA的序列的核苷酸错配以增强由具有多态性序列的基因的等位基因表达的RNA之间的差别，或增强降低靶RNA的表达的活性。

在一些实施方案中，寡核苷酸还包含茎环序列或结构，其中所述茎环序列或结构包含序列区域S1-L-S2，其中S1与S2互补并且能够形成第二双链体(D2)，并且其中L为当S1和S2形成第二双链体(D2)时形成的环。在一些实施方案中，有义链在其5’-端包含茎环序列或发夹。在一些实施方案中，反义链在其3’端包含茎环序列。优选地，在一些实施方案中，有义链在其3’-端包含茎环序列。在一些实施方案中，第二双链体D2可具有多种长度。在一些实施方案中，第二双链体/D2具有1-6个碱基对的长度。在一些实施方案中，第二双链体/D2具有2至6个、3至6个、4至6个、5至6个、1至5个、2至5个、3至5个或4至5个碱基对的长度。在一些实施方案中，第二双链体/D2具有1个、2个、3个、4个、5个或6个碱基对的长度。在一些实施方案中，S1序列包括靶RNA的序列并且S2序列包括靶RNA的反义序列，其中S1和S2形成双链体。在一些实施方案中，S1序列和S2序列为与靶RNA序列无关的人工序列。在一些实施方案中，第二双链体完全互补。在一些实施方案中，第二双链体可含有一个或多个错配。在一些实施方案中，S1和S2的序列经选择以稳定环L的形成。示例性S1序列为GCAGCC并且其相应S2序列为GGCUGC。

在一些实施方案中，茎环序列中的环L的长度可为至多30个核苷酸。在一些实施方案中，环L的长度为至多10个、15个、20个或25个核苷酸。在一些实施方案中，环L的长度为3至6个核苷酸、3至6个核苷酸、3至5个核苷酸或3至4个核苷酸。在一些实施方案中，环L为四环、五环或三环，如本文所述。在一些实施方案中，四环的长度为4个核苷酸。在一些实施方案中，L的序列经选择以稳定当S1和S2形成第二双链体时所形成的环结构。在一些实施方案中，L由核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或它们的混合物构成。在一些实施方案中，L的一个或多个核苷酸经修饰。如下文进一步描述，在一些实施方案中，L为阐述为UNCG、GAAA、CUUG、d(GNNA)、d(GNRA)、d(GNAB)、d(CNNG)和d(TNCG)的序列，其中N表示任何核苷酸。在一些实施方案中，其中N为U、A、C、G中的任一者并且R为G或A。在一些实施方案中，L为阐述为GAAA的序列。

在一些实施方案中，寡核苷酸具有一个或多个突出核苷酸。在一些实施方案中，突出核苷酸可在有义链或反义链上，或在有义链和反义链上。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为一个或多个核苷酸的3’-突出端。在一些实施方案中，长度为一个或多个核苷酸的3’-突出端存在于反义链、有义链、或反义链和有义链上。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为一个或多个核苷酸的5’-突出端序列。在一些实施方案中，长度为一个或多个核苷酸的5’-突出端存在于反义链、有义链、或反义链和有义链上。在一些实施方案中，寡核苷酸在其3’-末端包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或更多个单链核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸在其3’-末端包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个单链核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸在其5’-末端包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或更多个单链核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸在其5’-末端包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个单链核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含长度为一个或多个核苷酸的5’-突出端(例如在5’端处2个核苷酸的突出端)和长度为一个或多个核苷酸的3’突出端(例如在3’端处2个核苷酸的突出端)。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为1或2个核苷酸的3’-突出端序列，其中3’-突出端序列存在于有义链、反义链、或有义链和反义链两者上。在一些实施方案中，寡核苷酸具有23个核苷酸的反义链和21个核苷酸的有义链，其中有义链的3’-端和引导反义链的5’-端形成钝端，并且其中反义链具有2个核苷酸的3’突出端。在一些实施方案中，寡核苷酸具有22个核苷酸的反义链和20个核苷酸的有义链，其中有义链的3’-端和反义链的5’-端形成钝端，并且其中反义链具有2个核苷酸的3’突出端。

在一些实施方案中，本文提供的包含有义链和反义链的寡核苷酸具有不对称结构。在一些实施方案中，寡核苷酸具有不对称结构，其中有义链具有36个核苷酸的长度，并且反义链具有22个核苷酸的长度且在其3’-末端具有2个核苷酸的3’-突出端。在一些实施方案中，寡核苷酸具有不对称结构，其中有义链具有37个核苷酸的长度，并且反义链具有23个核苷酸的长度且在其3’-末端具有2个核苷酸的突出端。

在一些实施方案中，有义链和反义链为分开的寡核苷酸。换言之，有义链和反义链未共价连接。在一些实施方案中，有义链和反义链为当呈双链形式时在有义链与反义链之间含有空位或切口的双链寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链还包含具有结构S1-L-S2的茎环序列，其中切口或空位在有义链的S2区域中。

在一些实施方案中，寡核苷酸为单一寡核苷酸，其中有义链和反义链共价连接以形成单一寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链还包含具有区域S1-L-S2的茎环序列，并且其中反义链共价连接至有义链，例如反义链通过核苷酸间键联连接至有义链的S2区域。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含用于增加寡核苷酸对磷酸酶和/或核酸酶的抗性、提高杂交效率和/或增强体内稳定性的手段。在一些实施方案中，有义链包含用于增加有义链对磷酸酶和/或核酸酶的抗性、提高杂交效率和/或增强体内稳定性的手段。在一些实施方案中，反义链包含用于增加反义链对磷酸酶和/或核酸酶的抗性、提高杂交效率和/或增强体内稳定性的手段。在一些实施方案中，有义链和反义链两者均包含用于磷酸酶和/或核酸酶、提高杂交效率和/或增强体内稳定性的手段。在寡核苷酸包含茎环序列的一些实施方案中，茎环序列包含用于增加对磷酸酶和/或核酸酶的抗性、提高杂交效率和/或增强体内稳定性的手段。在一些实施方案中，用于增加对磷酸酶和/或核酸酶的抗性、提高杂交效率和/或增强体内稳定性的手段包括对糖残基、5’-末端磷酸酯、核苷间键联和核碱基的修饰等，如本文中进一步描述。

在一些实施方案中，寡核苷酸的至少一个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸的一个或多个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸的实质上所有(例如90％或更大)或所有核苷酸经修饰。在一些实施方案中，有义链的至少一个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，反义链的至少一个核苷酸经修饰。在一些实施方案中，有义链的至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多核苷酸经修饰。在一些实施方案中，有义链的所有核苷酸经修饰。在一些实施方案中，反义链的至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多核苷酸经修饰。在一些实施方案中，反义链的所有核苷酸经修饰。在一些实施方案中，有义链的至少5’-末端核苷酸经修饰。在一些实施方案中，有义链的至少3’-末端核苷酸经修饰。在一些实施方案中，反义链的至少5’-末端核苷酸经修饰。在一些实施方案中，反义链的至少3’-末端核苷酸经修饰。

在一些实施方案中，寡核苷酸的5’-末端磷酸酯例如经磷酸酯类似物(诸如硫代磷酸酯或4’-膦酸酯类似物)修饰，例如以限制磷酸酶和其它酶的作用。在一些实施方案中，有义链的5’-末端磷酸酯例如经磷酸酯类似物(诸如硫代磷酸酯或4’-膦酸酯类似物)修饰。在一些实施方案中，反义链的5’-末端磷酸酯例如经磷酸酯类似物(诸如硫代磷酸酯或4’-膦酸酯类似物)修饰。在一些实施方案中，反义链的5’-核苷酸的糖的4’-碳包含磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物为氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键联，如本文中进一步描述。在一些实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸间键联为硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸间键联存在于寡核苷酸上限定区域中或模式中。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸间键联在有义链的5’-端的1至4个核苷酸内，和/或在有义链的3’-端的1至4个核苷酸内。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸间键联在反义链的5’-端的1至4个核苷酸内，和/或在反义链的3’-端的1至4个核苷酸内。

在一些实施方案中，介于有义链(在5’-末端)的位置1与2的核苷酸之间的核苷酸间键联为经修饰的核苷酸间键联，例如硫代磷酸酯。在一些实施方案中，介于反义链(在5’-末端)的位置1与2和位置2与3和任选地位置3与4的核苷酸之间的核苷酸间键联为经修饰的核苷酸间键联，例如硫代磷酸酯。在一些实施方案中，介于反义链的3’-端处的最后2个、优选最后3个核苷酸之间的核苷酸间键联为经修饰的核苷酸间键联，例如硫代磷酸酯。举例而言，对于长度为22个核苷酸的反义链，介于位置20与21和位置21与22的核苷酸之间的核苷酸间键联具有经修饰的核苷酸间键联，例如硫代磷酸酯。

在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含糖部分的修饰，例如2’-修饰。在一些实施方案中，2’-修饰为2’-氟或为2’-O-甲基。在一些实施方案中，寡核苷酸的至少5’-末端核苷酸经2’-氟或2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸的至少3’-末端核苷酸经2’-氟或2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，有义链的至少5’-末端核苷酸经2’-氟或2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，有义链的至少3’-末端核苷酸经2’-氟或2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，反义链的至少5’-末端核苷酸经2’-氟或2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，反义链的至少3’-末端核苷酸经2’-氟基或2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，有义链的至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多核苷酸具有糖部分的2’修饰。在一些实施方案中，有义链的所有核苷酸具有糖部分的2’-修饰。在一些实施方案中，反义链的至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多核苷酸具有糖部分的2’修饰。在一些实施方案中，反义链的所有核苷酸具有糖部分的2’-修饰。下文更详细地描述糖部分的其它2’-修饰，例如代替2’-O-甲基。

在一些实施方案中，寡核苷酸的少于50％至约10％核苷酸具有经2’-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，有义链的少于50％至约10％核苷酸具有经2’-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，反义链的少于50％至约10％核苷酸具有经2’-F修饰的糖部分。在上述实施方案中，寡核苷酸的剩余核苷酸具有经以下修饰的糖部分：2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)，优选地2-O-甲基。

在一些实施方案中，有义链的长度为19至21个核苷酸，并且在核苷酸位置7至11处具有糖部分经2’-F修饰的一个或多个核苷酸，至多4个核苷酸，优选地在核苷酸位置9、10、11处具有糖部分经2’-F修饰的一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，有义链在核苷酸位置9、10、11处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在上述实施方案中，有义链的剩余核苷酸具有经以下修饰的糖部分：2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)，优选地2-O-甲基。

在一些实施方案中，反义链的长度为21至23个核苷酸，并且在核苷酸位置1、2、3、5、6、7、10、14和16，优选地核苷酸位置2、5、6、14和16处具有糖部分经2’-F修饰的一个或多个核苷酸，至多6个、至多5个、至多4个或至多3个核苷酸。在一些实施方案中，反义链至少在核苷酸位置5或14或核苷酸位置5和14两者处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链在核苷酸位置2、5和14处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸，并且任选地在核苷酸位置1、3、6、7、10和16处具有至多3个核苷酸。在上述实施方案中，反义链的剩余核苷酸具有经以下修饰的糖部分：2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)，优选地2-O-甲基。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和链，并且还包含茎环序列S1-L-S2，其中L为四环或三环。在一些实施方案中，S1和S2区域的所有核苷酸具有经以下修饰的糖部分：2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)，优选地2-O-甲基。在一些实施方案中，L序列的5’-末端核苷酸具有糖部分经2’-O-甲基的修饰，并且L的剩余核苷酸具有靶向配体，如下文进一步描述。在一些实施方案中，L序列的所有核苷酸具有靶向配体，例如GalNAc。

在一些实施方案中，用于选择性递送或选择性降低胶质细胞中表达的RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的寡核苷酸任选地经一个或多个靶向配体或部分修饰。在一些实施方案中，用于选择性递送或选择性降低胶质细胞中表达的RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的寡核苷酸还包含一个或多个靶向配体或部分。在一些实施方案中，靶向配体或部分选自碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白质或蛋白质的一部分(例如抗体或抗体片段)、或脂质。在一些实施方案中，靶向配体或部分为一个或多个GalNAc残基或部分。

在一些实施方案中，寡核苷酸的一个或多个核苷酸各自缀合于分开的靶向配体。在一些实施方案中，寡核苷酸的1个、2个、3个、4个、5个或6个核苷酸各自缀合于靶向配体。在一些实施方案中，寡核苷酸的2至4个核苷酸各自缀合于分开的靶向配体。在一些实施方案中，靶向配体缀合于有义链或反义链的任一端处的2至4个核苷酸(例如配体缀合于有义链或反义链的5’或3’端上的2至4个核苷酸突出端或延伸段)。举例而言，寡核苷酸可在有义链的5’或3’端包含茎环序列并且茎的环的1个、2个、3个或4个核苷酸可单独缀合于靶向配体。

在一些实施方案中，寡核苷酸不缀合于GalNAc。在某些实施方案中，寡核苷酸直接或间接缀合于单价GalNAc。在一些实施方案中，寡核苷酸直接或间接缀合于超过一个单价GalNAc。在一些实施方案中，寡核苷酸直接或间接缀合于2个、3个或4个单价GalNAc部分，并且通常缀合于3个或4个单价GalNAc部分。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸缀合于一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc部分。

在一些实施方案中，寡核苷酸的一个或多个核苷酸各自缀合于GalNAc部分。在一些实施方案中，寡核苷酸的四环的1个、2个、3个、4个、5个或6个核苷酸缀合于GalNAc部分。在一些实施方案中，四环的2至4个核苷酸各自缀合于分开的GalNAc。在一些实施方案中，三环的1至3个核苷酸各自缀合于分开的GalNAc。在一些实施方案中，靶向配体缀合于有义链或反义链的任一端处的2至4个核苷酸(例如配体缀合于有义链或反义链的5’或3’端上的2至4个核苷酸突出端或延伸段)。在一些实施方案中，GalNAc部分缀合于有义链的核苷酸。在一个示例性实施方案中，四个GalNAc部分可缀合于有义链的四环中的核苷酸，其中各GalNAc部分缀合于一个核苷酸。

在一些实施方案中，本文中的寡核苷酸包含连接至胍核苷酸的单价GalNAc，称为[ademG-GalNAc]或2’-氨基二乙氧基甲醇-胍-GalNAc，如下所描绘：

在一些实施方案中，寡核苷酸包含连接至腺嘌呤核苷酸的单价GalNAc，称为[ademA-GalNAc]或2’-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所描绘：

在一些实施方案中，下文显示从5’至3’包含核苷酸序列GAAA(Z＝接头，X＝杂原子)茎环序列的环的示例性修饰。在化学式中，用于描述与寡核苷酸链的连接点：

其中：

Z表示键、点击化学手柄或长度为1至20(包括1和20)个连续共价键合原子的接头，所述接头选自由以下组成的组：取代的和未取代的亚烷基、取代的和未取代的亚烯基、取代的和未取代的亚炔基、取代的和未取代的亚杂烷基、取代的和未取代的亚杂烯基、取代的和未取代的亚杂炔基以及它们的组合；并且X为O、S或N。

在一些实施方案中，Z为缩醛接头。在一些实施方案中，X为O。

在一些实施方案中，有义链上的环L的-AAA-序列包含如下结构：

在一些实施方案中，环L包含阐述为GAAA的序列。在一些实施方案中，GAAA序列中的各A缀合于GalNAc部分。在一些实施方案中，GAAA序列中的G包含2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，GAAA序列中的G包含2’-OH。在一些实施方案中，GAAA序列中的各核苷酸包含2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，GAAA序列中的各A包含2’-OH且GAAA序列中的G包含2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，GAAA序列中的各A包含2’-O-甲氧基乙基修饰并且GAAA序列中的G包含2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，GAAA序列中的各A包含2’-adem修饰并且GAAA序列中的G包含2’-O-甲基修饰。

在一些实施方案中，用于选择性递送干扰寡核苷酸或用于选择性降低胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的寡核苷酸的非限制性实例具有以下结构(从有义链至反义链5’→3’示出)：

其中各圆形表示经由核苷酸间键联连接的核苷酸，并且在所示出的结构中显示为四环的环(L)具有缀合于GalNAc残基的核苷酸(由菱形表示)。有义链的编号从有义链的5’-端开始，而反义链的编号从切口位点后的核苷酸残基开始。

在一些实施方案中，寡核苷酸为单一连续寡核苷酸(即在有义链与反义链之间不存在切口或空位)并且可以单链或双链形式存在。在一些实施方案中，寡核苷酸包含分开的有义链和反义链，例如，当有义链与反义链之间存在切口或空位时，如所示出的结构所示，或在有义链和反义链形成双链体，在有义链的3’末端与反义链的5’末端之间具有钝端的情况下。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含各自长度在17至36个核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸在其有义链的3’延伸段内具有四环结构，并且在反义链的3’端具有2个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，2个核苷酸的3’突出端为GG。一般而言，在一些实施方案中，反义链的两端GG核苷酸中的一个或两个不与靶RNA序列互补。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含各自长度在20至23个核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施方案中，长度为1个或2个核苷酸的3’突出端提供于有义链、反义链或有义链和反义链两者上。在一些实施方案中，寡核苷酸具有23个核苷酸的反义链和21个核苷酸的有义链，其中有义链的3’-端和反义链的5’-端形成钝端并且其中引导链具有两个核苷酸的3’突出端。在一些实施方案中，寡核苷酸具有22个核苷酸的反义链和20个核苷酸的有义链，其中有义链的3’-端和反义链的5’-端形成钝端并且其中反义链具有两个核苷酸的3’突出端。在一些实施方案中，长度为9个核苷酸的3’突出端提供于反义链上。举例而言，寡核苷酸可具有22个核苷酸的反义(引导)链和29个核苷酸的过客链，其中有义(过客)链在其末端3’端形成四环结构并且反义(引导)链具有9个核苷酸的3’突出端(本文中称为“N-9”)。

应了解，所示出的结构的寡核苷酸可在有义链、反义链、S1和S2区域、环(L)和核苷酸突出端的长度方面具有变化，并且在任选的靶向部分、切口位点的位置、核苷酸突出端的位置、寡核苷酸(包括有义链和/或反义链)的核苷酸的修饰类型和程度以及有义链和反义链以及S1区域和S2区域的互补程度方面具有变化，如本文中进一步详细描述。本文所述的各实施方案、变化和修饰以及此类实施方案、变化和修饰的任何组合适用于上述示例性寡核苷酸结构。

b.胶质细胞靶RNA序列

在多个实施方案中，反义链具有与胶质细胞中表达的目标靶RNA互补的区域。在一些实施方案中，目标RNA包含编码目标蛋白质的mRNA。在一些实施方案中，胶质细胞存在于受试者的中枢神经系统或周围神经系统中。在一些实施方案中，胶质细胞为星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞或肠胶质细胞。在一些实施方案中，反义链具有与星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞或肠胶质细胞中表达的RNA互补的区域。

在一些实施方案中，目标靶RNA为与涉及胶质细胞的功能障碍的疾病或病症相关的RNA和/或相应编码的蛋白质。在一些实施方案中，靶RNA和/或相关疾病或病症包括(例如且不限于)以下的表达：胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)基因(例如参考mRNA序列：NM_001131019.3；NM_001242376.2；NM_001363846.1；和NM_002055.5)，亚历山大氏病(AxD)；鞘脂激活蛋白原(PSAP)基因(例如参考mRNA序列：NM_001042465.3；NM_001042466.3；和NM_002778.4)，异染性脑白质营养不良；周围髓鞘蛋白22(PMP22)基因(例如参考mRNA序列：NM_000304.4；NM_001281455.1；NM_001281456.2；NM_001330143.2；和NM_153321.3)，恰克-马利-杜斯氏病；核纤层蛋白(lamin)B1蛋白(LMNB1)基因(例如参考mRNA序列：NM_001198557.2；和NM_005573.4)，成人发作型脑白质营养不良；淀粉样蛋白前体蛋白(APP)基因(例如参考mRNA序列：NM_000484.4；NM_001136016.3；NM_001136129.3；NM_001136130.3；和NM_001136131.2)，和微管相关蛋白τ(MAPT)基因(例如参考mRNA序列：NM_001123066.3；NM_001123067.3；NM_001203251.2；NM_001203252.1；和NM_005910.5)，阿尔茨海默氏病；超氧化物歧化酶1(SOD1)基因(例如参考mRNA序列NM_000454.4)、染色体9开放阅读框72(C9orf72)基因(例如参考mRNA序列：NM_001256054.2；NM_018325.5；和NM_145005.6)和亨廷顿(Huntington，HTT)基因(例如参考mRNA序列：NM_002111.8)，亨廷顿氏病；α-突触核蛋白(SNCA或ASYN)基因(例如参考mRNA序列：NM_000345.4；NM_001146054.2；NM_001146055.2；和NM_007308.2)和震颤素(dardarin)/富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)基因(例如参考mRNA序列：NM_198578.4)，帕金森氏病；腺苷激酶(ADK)基因(例如参考mRNA序列：NM_001123.3；NM_001202449.1；NM_001202450.1；和NM_001369123.1；NM_001369124.1)，癫痫；肿瘤坏死因子α(TNFα)基因(例如参考mRNA序列：NM_000594.4)和促分裂原激活蛋白激酶7(ERK5/MAPK7)基因(例如参考mRNA序列：NM_002749.4；NM_139032.3；NM_139033.2；和NM_139034.3)，中风；肿瘤坏死因子α(TNFα)基因(例如参考mRNA序列：NM_000594.4)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)基因(例如参考mRNA序列：NM_001131019.3；NM_001242376.2；NM_001363846.1；和NM_002055.5)，外伤性脑损伤和轴突损伤；IL-1受体类型2(IL-1R2)基因(例如参考mRNA序列；NM_001261419.2；NM_004633.4；和NM_173343.1)，自闭症；整联蛋白亚基α4(CD49d)基因(例如参考mRNA序列：NM_000885.6；和NM_001316312.1)，多发性硬化症；胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因(例如参考mRNA序列：NM_000618.5；NM_001111283.3；NM_001111284.2；和NM_001111285.3)、表皮生长因子(EGF)基因(例如参考mRNA序列：NM_001178130.3；NM_001178131.3；NM_001357021.2；和NM_001963.6)、转化生长因子β(TGF-β)基因(例如参考mRNA序列：NM_000660.7)和血管内皮生长因子(VEGF)基因(例如参考mRNA序列：NM_001025366.3；NM_001025367.3；NM_001025368.3；NM_001025369.3；和NM_001025370.3)，成胶质细胞瘤和胶质细胞癌；超氧化物歧化酶1(SOD1)基因(例如参考mRNA序列NM_000454.4)、C9orf72基因(例如参考mRNA序列：NM_001256054.2；NM_018325.5；和NM_145005.6)和TAR-DNA结合蛋白(TDP-43)基因(例如参考mRNA序列：NM_007375.3)，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)；肿瘤坏死因子α(TNFα)基因(例如参考mRNA序列：NM_000594.4)和分化簇38(CD38)基因(例如参考mRNA序列：NM_001775.4)，神经炎症；共济失调蛋白2(ATXN2)基因(例如参考mRNA序列：NM_001310121.1；NM_001310123.1；和NM_002973.4)、共济失调蛋白3(ATXN3)基因(例如参考mRNA序列：NM_001127696.2；NM_001127697.2；NM_001164774.2；NM_001164776.2；和NM_001164777.2)和共济失调蛋白7(ATXN7)基因(例如参考mRNA序列：NM_000333.3；NM_001128149.3；和NM_001177387.1)，脊髓小脑性共济失调(1、3、5、7等)；微管相关蛋白τ(TAU/MAPT)基因(例如参考mRNA序列：NM_001123066.3；NM_001123067.3；NM_001203251.2；NM_001203252.1；和NM_005910.5)，进行性核上神经麻痹症；TAU/MAPT基因(例如参考mRNA序列：NM_001123066.3；NM_001123067.3；NM_001203251.2；NM_001203252.1；和NM_005910.5)，原发性年龄相关的τ蛋白病变(PART)/神经原纤维缠结优势型痴呆；TAU/MAPT基因(例如参考mRNA序列：NM_001123066.3；NM_001123067.3；NM_001203251.2；NM_001203252.1；和NM_005910.5)，涉及染色体17的额颞痴呆和帕金森症(FTDP-17)；和早期生长反应蛋白2(EGR2)基因(例如参考mRNA序列：NM_000399.5；NM_001136177.3；NM_001136178.1；NM_001136179.3；和NM_001321037.2)，周围神经脱髓鞘。

在一些实施方案中，靶RNA为RNA的加工形式。在一些实施方案中，靶RNA为RNA的未加工形式。在一些实施方案中，寡核苷酸，例如反义链，具有与靶mRNA的5’-非翻译区互补的区域。在一些实施方案中，寡核苷酸，例如反义链，具有与靶mRNA的编码区互补的区域。在一些实施方案中，寡核苷酸，例如反义链，具有与靶mRNA的外显子互补的区域。在一些实施方案中，寡核苷酸，例如反义链，具有与靶mRNA的3’-非翻译区互补的区域。一般而言，用反义链靶向的mRNA的5’-非翻译区、3’-非翻译区和外显子的位置和序列提供于以上公开的各NCBI参考mRNA序列的NCBI数据库中。在一些实施方案中，寡核苷酸，例如反义链，具有与接近或位于RNA剪接接合处的序列互补的区域，其中靶向序列降低或调节靶RNA的表达。

在一些实施方案中，靶向编码在胶质细胞中的过表达与疾病或病症有关的蛋白质或基因的突变形式的基因以降低表达。在一些实施方案中，这些包括例如且不限于GFAP、PMP22、LMNB1、APP、MAPT、SOD1、C9orf72、ATXN2、NG2、C9ORF72、ATXN3、ATXN7、HTT、SNCA/ASYN、ADK、TNFα、CD49d、TDP-43和TAU/MAPT。在一些实施方案中，反义链与在靶mRNA序列中含有突变的序列完全互补并且有效降低含有突变的RNA的表达(参见例如Scholefield等人,PLOS One,2009,4(9):e7232)。在一些实施方案中，靶mRNA为RNA的等位基因特异性序列，诸如具有突变的等位基因(参见例如Bongianino等人,Circulation Research,2017,121(5):525-536)。在一些实施方案中，使反义链靶向与疾病相关突变相关的单核苷酸多态性(SNP)。目标基因可呈同型接合或异型接合形式。

在以下章节中描述寡核苷酸特征、变化和修饰的进一步描述。本公开的寡核苷酸包括以下描述的各实施方案、变化和修饰以及此类实施方案、变化和修饰的任何组合。

c.寡核苷酸结构、变化和修饰

i.反义链

在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链可称为“引导链”。举例而言，如果反义链可与RNA诱导的沉默复合物(RISC)接合且结合于Argonaute蛋白，或与一种或多种类似因子接合或结合，并且引导靶基因的沉默，则其可称为引导链。在一些实施方案中，与引导链互补的有义链可称为“过客链”。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为至多50个核苷酸(例如长度为至多50个、至多45个、至多40个、至多35个、至多30个、至多27个、至多25个、至多21个、至多19个、至多17个或至多12个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含长度为至少12个核苷酸(例如长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少25个、至少27个、至少30个、至少35个或至少38个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸的反义链的长度在12至50个、12至40个或12至30个(例如12至50个、12至40个、12至38个、12至36个、12至32个、12至30个、12至28个、12至22个、12至23个、15至21个、15至27个、17至21个、17至25个、19至27个或19至30个)核苷酸范围内。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸的反义链的长度为12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸。

在一些实施方案中，反义链可包含19-23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，反义链包含19-22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，反义链包含23个核苷酸的长度、22个核苷酸的长度、21个核苷酸的长度、20个核苷酸的长度或19个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，反义链可包含20-22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，反义链包含20-21个核苷酸的长度或21-22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，反义链包含20个核苷酸的长度、21个核苷酸的长度或22个核苷酸的长度。

具有如本文提供的不对称结构的寡核苷酸可包括在3’-末端(即3’-突出端)具有任何长度的单链核苷酸的反义链。在一些实施方案中，反义链在其3’-末端包括至少2个单链核苷酸。在一些实施方案中，反义链在其3’-末端包括至少0个、1个、2个、3个、至少4个、至少5个、至少6个或更多个单链核苷酸。在一些实施方案中，反义链在其3’-末端包括2个单链核苷酸。在一些实施方案中，反义链在其3’-末端包括3个单链核苷酸。在一些实施方案中，反义链在其3’-末端包括4个单链核苷酸。在一些实施方案中，反义链在其3’-末端包括5个单链核苷酸。在一些实施方案中，反义链在其3’-末端包括6个单链核苷酸。

ii.有义链

在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有长度为至多40个核苷酸(例如长度为至多40个、至多35个、至多30个、至多27个、至多25个、至多21个、至多19个、至多17个或至多12个核苷酸)的有义链(或过客链)。

在一些实施方案中，寡核苷酸可具有长度为至少12个核苷酸(例如长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少25个、至少27个、至少30个、至少32个、至少34个、至少36个或至少38个核苷酸)的有义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有长度在12至40个(例如12至40个、12至36个、12至32个、12至28个、15至40个、15至36个、15至32个、15至28个、17至21个、17至25个、17至36个、19至27个、19至30个、20至40个、22至40个、25至40个或32至40个)核苷酸范围内的有义链。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有长度为12个核苷酸、长度为13个核苷酸、长度为14个核苷酸、长度为15个核苷酸、长度为16个核苷酸、长度为17个核苷酸、长度为18个核苷酸、长度为19个核苷酸、长度为20个核苷酸、长度为21个核苷酸、长度为22个核苷酸、长度为23个核苷酸、长度为24个核苷酸、长度为25个核苷酸、长度为26个核苷酸、长度为27个核苷酸、长度为28个核苷酸、长度为29个核苷酸、长度为30个核苷酸、长度为31个核苷酸、长度为32个核苷酸、长度为33个核苷酸、长度为34个核苷酸、长度为35个核苷酸、长度为36个核苷酸、长度为37个核苷酸、长度为38个核苷酸、长度为39个核苷酸长度或长度为40个核苷酸的有义链。

在一些实施方案中，有义链在其3’-端还包含茎环序列(或结构)，所述茎环序列(或结构)具有区域S1-L-S2，其中S1区域与S2区域互补并且能够形成第二双链体(D2)或茎，并且其中L为当S1和S2形成D2(茎)时形成的环。在一些实施方案中，在S1与S2之间形成的D2或茎的长度为至少1个(例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个)碱基对。在一些实施方案中，D2或茎为长度为2个、3个、4个、S个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，在S1区域与S2区域之间形成的D2的长度在1-6个碱基对(例如长度为1-5个、1-4个、1-3个、1-2个、2-6个、3-6个、4-6个或5-6个碱基对)范围内。

在一些实施方案中，在S1与S2之间形成的环L的长度为至多10个核苷酸(例如长度为3个、4个、S个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸)。在一些实施方案中，环L包含接合S1和S2区域的四环、五环或三环(triL)。在一些实施方案中，四环、五环或三环在有义链的3’末端。在一些实施方案中，四环、五环或三环在反义链而非有义链的5’末端。

在一些实施方案中，诸如三环、五环或四环的L中的许多核苷酸可缀合于靶向配体。在一些实施方案中，三环包含1个缀合于配体的核苷酸。在一些实施方案中，三环包含2个缀合于配体的核苷酸。在一些实施方案中，三环包含3个缀合于配体的核苷酸。在一些实施方案中，三环包含1-3个缀合于配体的核苷酸。在一些实施方案中，三环包含1-2个缀合于配体的核苷酸或2-3个缀合于配体的核苷酸。

在一些实施方案中，四环包含1个缀合于配体的核苷酸。在一些实施方案中，四环包含2个缀合于配体的核苷酸。在一些实施方案中，四环包含3个缀合于配体的核苷酸。在一些实施方案中，四环包含4个缀合于配体的核苷酸。在一些实施方案中，四环包含1-4个缀合于配体的核苷酸。在一些实施方案中，四环包含缀合于配体的1-3个核苷酸、1-2个核苷酸、2-4个核苷酸或3-4个核苷酸。

在一些实施方案中，四环或三环可含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸以及它们的组合。RNA四环的非限制性实例包括(但不限于)UNCG家族四环(例如UUCG)、GNRA家族四环(例如GAAA)和CUUG四环。DNA四环的非限制性实例包括(但不限于)d(GNNA)家族四环(例如d(GTTA))、d(GNRA)家族四环、d(GNAB)家族四环、d(CNNG)家族四环和d(TNCG)家族四环(例如d(TTCG))。

iii.双链体长度

在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为至少12个(例如至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21)核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸(例如12至30个、12至27个、12至22个、15至25个、18至22个、18至25个、18至27个、18至30个、19至30个或21至30个核苷酸)范围内。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方案中，有义链与反义链之间的双链体跨越有义链或反义链的整个长度。在一些实施方案中，有义链与反义链之间的双链体跨越有义链和反义链两者的整个长度。

iii.寡核苷酸末端

在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中3’-突出端存在于有义链、或反义链、或有义链和反义链两者上。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸的一个5’-端在热力学上不如另一5’端稳定。在一些实施方案中，提供不对称寡核苷酸，其在有义链的3’-端包括钝端且在反义链的3’-端包括突出端。在一些实施方案中，反义链上的3’突出端的长度为1-8个核苷酸(例如长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个核苷酸)。

通常，RNAi的寡核苷酸在反义(引导)链的3’-端上具有两个核苷酸的突出端。然而，其它突出端为可能的。在一些实施方案中，突出端为长度介于1个与6个核苷酸之间，任选地1至5个、1至4个、1至3个、1至2个、2至6个、2至5个、2至4个、2至3个、3至6个、3至5个、3至4个、4至6个、4至5个、5至6个核苷酸，或1个、2个、3个、4个、5个或6个核苷酸的3’-突出端。然而，在一些实施方案中，突出端为长度介于1个与6个核苷酸之间，任选地1至5个、1至4个、1至3个、1至2个、2至6个、2至5个、2至4个、2至3个、3至6个、3至5个、3至4个、4至6个、4至5个、5至6个核苷酸，或1个、2个、3个、4个、5个或6个核苷酸的5’-突出端。

在一些实施方案中，有义链和/或反义链的3’-端或5’-端的一个或多个(例如2个、3个、4个)末端核苷酸经修饰。举例而言，在一些实施方案中，反义链的3’端的1个或2个末端核苷酸经修饰。在一些实施方案中，反义链的3’-端处的最后一个核苷酸经修饰，例如包含2’-修饰，例如2’-O-甲氧基乙基。在一些实施方案中，反义链的3’-端处的最后一个或两个末端核苷酸与靶标互补。在一些实施方案中，反义链的3’-端处的最后一个或两个核苷酸不与靶标互补。在一些实施方案中，有义链或反义链的5’-端和/或3’-端具有反向帽核苷酸。

iv.错配

在一些实施方案中，由有义链和反义链构成的寡核苷酸在有义链与反义链之间具有一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个)错配。如果有义链与反义链之间存在超过一个错配，则所述错配的位置可为连续的(例如一排2个、3个或更多个)或可散布在整个互补区域内。在一些实施方案中，有义链的3’-末端含有一个或多个错配。在一些实施方案中，两个错配合并在有义链的3’-末端。在一些实施方案中，在寡核苷酸的有义链的3’-端的碱基错配或区段不稳定提高RNAi中的合成双链体的效力，这可能是通过促进切丁酶加工。

v.单链寡核苷酸

在一些实施方案中，用于降低靶RNA表达的寡核苷酸为单链的。此类结构可包括但不限于单链RNAi寡核苷酸。(参见例如Matsui等人,Molecular Therapy,2016,24(5),946-955)。在一些实施方案中，单链RNAi经修饰以增强稳定性和针对靶RNA的有效性。

然而，在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸为反义寡核苷酸(ASO)。反义寡核苷酸为单链寡核苷酸，其核碱基序列在以5’至3’方向书写时包含特定核酸的靶向区段的反向互补序列并且经适当修饰(例如呈缺口聚物)以便诱导细胞中RNaseH介导的其靶RNA裂解或(例如呈混合聚物(mixmer))且抑制细胞中靶mRNA的翻译。用于本公开的反义寡核苷酸可以本领域中已知的任何合适的方式进行修饰，包括例如如美国专利第9,567,587号中所示，所述文献中关于反义寡核苷酸的修饰(包括例如长度、核碱基(嘧啶、嘌呤)的糖部分和核碱基的杂环部分的改变)的公开内容以引用的方式并入本文中。此外，反义分子用于降低特定靶基因的表达(参见例如Bennett等人,Pharmacology of Antisense Drugs,AnnualReview of Pharmacology and Toxicology,7:81-105)。

iv.寡核苷酸修饰

寡核苷酸可以多种方式进行修饰，以改善或控制特异性、稳定性、递送、生物利用度、抗核酸酶降解性、免疫原性、碱基配对特性、RNA分布和细胞吸收以及与治疗或研究用途有关的其它特征(参见例如Bramsen等人,Nucleic Acids Res.,2009,37:2867-2881；Bramsen和Kjems,Frontiers in Genetics,2012,3:1-22)。因此，在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸可包括一个或多个合适修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸在其碱基(或核碱基)、糖(例如核糖、脱氧核糖)或磷酸基中具有修饰，如下文进一步描述。

寡核苷酸上修饰的数目和那些核苷酸修饰的位置可能影响寡核苷酸的特性。举例而言，寡核苷酸可在体内通过将其缀合于脂质纳米粒子(LNP)或类似载体或将其包围在脂质纳米粒子(LNP)或类似载体中来递送。然而，当寡核苷酸未受到LNP或类似载体保护时，可能有利的是其至少一些核苷酸经修饰。因此，在本文提供的任一种寡核苷酸的某些实施方案中，寡核苷酸的所有或实质上所有核苷酸经修饰。在某些实施方案中，超过一半的核苷酸经修饰。在某些实施方案中，少于一半的核苷酸经修饰。通常，在裸递送下，每种糖在2’-位置处经修饰。这些修饰可为可逆或不可逆的。在一些实施方案中，如本文公开的寡核苷酸的经修饰的核苷酸的数目和类型足以引起所需特征(例如避免酶促降解、在体内施用之后靶向所需细胞的能力和/或热力学稳定性)。

a.糖修饰

在一些实施方案中，经修饰的糖(本文中也称为糖类似物)包括经修饰的脱氧核糖或核糖部分，例如其中一个或多个修饰发生在糖的2’、3’、4’和/或5’碳位置。在一些实施方案中，经修饰的糖也可包括非天然替代碳结构，诸如以下中存在的碳结构：锁核酸(“LNA”或“双环”)(参见例如Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54:3607-3630)、解锁核酸(“UNA”或“无环”)(参见例如Snead等人,Molecular Therapy-Nucleic Acids,2013,2:e103)和桥联核酸(“BNA”)(参见例如Imanishi和Obika,The Royal Society of Chemistry,Chem.Commun.,2002,1653-1659)。Koshkin等人、Snead等人以及Imanishi和Obika的涉及糖修饰的公开内容以引用的方式并入本文中。糖修饰可增加寡核苷酸对核酸酶的抗性和/或增强杂交效率。

在一些实施方案中，核苷酸糖修饰包含2’-修饰。在一些实施方案中，2’-修饰包括2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)、2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)或它们的组合等。在一些实施方案中，修饰为2’-氟、2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基。在一些实施方案中，糖修饰包含糖环的修饰，所述修饰可包含糖环的一个或多个碳的修饰。举例而言，核苷酸的糖修饰可包含连接至糖的1’-碳或4’-碳的糖的2’-氧，或经由亚乙基或亚甲基桥连接至1’-碳或4’-碳的2’-氧。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有缺乏2’-碳至3’-碳键的非环状糖。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸例如在糖的4’位置中具有硫醇基。

在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含至少一个在糖部分上经修饰的核苷酸(例如至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个或更多个)。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链包含至少一个在糖部分上经修饰的核苷酸(例如至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个或更多个)。在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链包含至少一个在糖部分上经修饰的核苷酸(例如至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个)。

在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链的所有核苷酸均具有糖部分的修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链的所有核苷酸均具有糖部分的修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸(即有义链和反义链两者)的所有核苷酸均具有糖部分的修饰。在一些实施方案中，核苷酸上糖部分的修饰包含2’-修饰(例如2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、或2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸)。在一些实施方案中，核苷酸上糖部分的修饰包含经2’-氟或2’-O-甲基的2’-修饰。

在一些实施方案中，有义链的少于50％、少于40％、少于35％、少于30％至约10％、约12％、约14％、约18％或约20％的核苷酸具有用2’-F基团修饰的糖部分。在一些实施方案中，反义链的少于50％、少于40％、少于35％、少于30％至约10％、约12％、约14％、约18％或约20％的核苷酸具有用2’-F基团修饰的糖部分。在一些实施方案中，长度为19至21个核苷酸的有义链具有至多5个、优选地至多4个用2’-F基团修饰糖部分的核苷酸。在一些实施方案中，长度为21至23个核苷酸的反义链具有至多6个、优选地至多5个、更优选地至多3个用2’-F基团修饰糖部分的核苷酸。在一些实施方案中，具有长度为19至21个核苷酸的有义链和长度为21至23个核苷酸的反义链的寡核苷酸具有至多总共4至12个、5至11个或6至10个用2’-F修饰糖部分的核苷酸。在一些实施方案中，有义链和反义链的剩余核苷酸在糖部分上经以下修饰：2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)、2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)或它们的组合，优选地2’-O-甲基。

在一些实施方案中，寡核苷酸可在寡核苷酸的限定位置处具有对核苷酸的糖残基的修饰。在一些实施方案中，对于包含有义链和反义链的寡核苷酸，有义链在核苷酸位置7、8、9、10和11处具有一个或多个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸，优选地在核苷酸位置9、10和11处具有一个或多个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，有义链在核苷酸位置7、8、9、10和11处有2个、3个、4个或所有核苷酸的糖部分经2’-F修饰。如上所述，在一些实施方案中，有义链具有至多5个、优选地至多4个其中糖部分经2’-F基团修饰的核苷酸。

在一些实施方案中，对于有义链具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸的上述各实施方案，有义链的剩余核苷酸具有以下对糖部分的修饰：2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)、2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)或它们的组合，优选地2’-O-甲基。在一些实施方案中，有义链在核苷酸位置7、8、9、10和11处具有一个或多个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸，并且有义链的剩余核苷酸具有经以下修饰的糖部分：2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)、2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)或它们的组合，优选地2’-O-甲基。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为19至21个核苷酸的有义链，其中有义链在核苷酸位置8、9、10和11处或优选在核苷酸位置9、10和11处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸，并且有义链的剩余位置处的各核苷酸具有2’-O-甲基对糖残基的修饰。

在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链在核苷酸位置1、2、3、5、6、7、10、14和16处，优选在核苷酸位置2、3、5、6、7、10和14中的一个或多个位置处具有一个或多个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链至少在核苷酸位置5或14处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链在核苷酸位置5和14处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链在核苷酸位置5处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸，并且在核苷酸位置1、2、3、6、7、10、14和16处具有至多5个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链在核苷酸位置14处具有2’-F修饰，并且在核苷酸位置1、2、3、6、7、10、14和16处具有至多5个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链在核苷酸位置5和14处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸，并且在核苷酸位置1、2、3、6、7、10和16处具有至多4个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链在核苷酸位置2、5和14处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸，并且任选地在核苷酸位置1、3、7和10处具有至多3个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链在位置2、5和14各位置处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链在核苷酸位置1、2、5和14各位置处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，在反义链的位置1、2、3、5、7和14各位置处的糖部分经2’-F修饰。在又一个实施方案中，在反义链的位置1、2、3、5、10和14各位置处的糖部分经2’-F修饰。在另一个实施方案中，在反义链的位置2、3、5、7、10和14各位置处的糖部分经2’-F修饰。如上所述，在一些实施方案中，长度为21至23个核苷酸的反义链具有至多6个、优选至多5个、更优选至多3个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。

在一些实施方案中，对于反义链具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸的上述各实施方案，反义链的剩余核苷酸具有经以下修饰的糖部分：2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)、2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)或它们的组合，优选地2’-O-甲基。在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链在核苷酸位置1、2、3、5、6、7、10、14和16处，优选在核苷酸位置2、3、5、6、7、10和14中的一个或多个位置处具有一个或多个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸，并且反义链的剩余核苷酸具有经以下修饰的糖部分：2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)、2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)或它们的组合，优选地2’-O-甲基。在一些实施方案中，反义链在核苷酸位置2、5和14处具有糖部分经2’-F修饰的核苷酸，并且任选地在核苷酸位置1、3、6、7和10处具有至多3个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸，并且反义链的剩余核苷酸具有2’-O-甲基对糖部分的修饰。

在一些实施方案中，对于具有S1-L-S2的茎环序列的寡核苷酸，茎和/或环的一个或多个核苷酸具有糖部分的修饰。在一些实施方案中，修饰不包括经靶向配体的修饰。在一些实施方案中，修饰为2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)、2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)或它们的组合。在一些实施方案中，糖部分的修饰为2’-氟、2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基。在一些实施方案中，S1的一个或多个核苷酸至所有核苷酸具有糖部分的修饰。在一些实施方案中，S2的一个或多个核苷酸至所有核苷酸具有糖部分的修饰。在一些实施方案中，S1和S2的所有核苷酸均具有糖部分的修饰，优选经2’-O-甲基的修饰。在一些实施方案中，环L的一个或多个核苷酸具有糖部分的修饰。在一些实施方案中，环序列的5’核苷酸具有糖部分的修饰。在一些实施方案中，对于四环、五环或三环，环序列的5’核苷酸在2’位置处具有糖部分的修饰，优选经2’-O-甲基的修饰，并且环的剩余核苷酸经靶向配体修饰。

b.5’末端磷酸酯

在一些实施方案中，寡核苷酸的5’-末端磷酸基增强与Argonaute2的相互作用。然而，包含5’-磷酸基的寡核苷酸容易经由磷酸酶或其它酶降解，这可限制寡核苷酸在体内的生物利用度。在一些实施方案中，寡核苷酸包括抵抗此类降解的5’磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物可为氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸链的5’端连接至模拟天然5’-磷酸基的静电和空间特性的化学部分(“磷酸酯模拟物”)(参见例如Prakash等人,Nucleic Acids Res.,2015,43(6):2993-3011，涉及磷酸酯类似物的内容以引用的方式并入本文中)。已研发许多可连接至5’端的磷酸酯模拟物(参见例如美国专利第8,927,513号，涉及磷酸酯类似物的内容以引用的方式并入本文中)。对寡核苷酸的5’端的其它修饰公开于例如国际专利公布WO 2011/133871中，涉及磷酸酯类似物的内容以引用的方式并入本文中。在某些实施方案中，羟基连接至寡核苷酸的5’端。

在一些实施方案中，寡核苷酸在糖的4’-碳位置处具有磷酸酯类似物(称为“4’-磷酸酯类似物”)。参见例如2017年9月1日提交的国际专利申请PCT/US2017/049909；2016年9月2日提交的标题为4’-磷酸酯类似物和包含其的寡核苷酸(4’-Phosphate Analogs andOligonucleotides Comprising the Same)的美国临时申请第62/383,207号和2016年9月12日提交的标题为4’-磷酸酯类似物和包含其的寡核苷酸(4’-Phosphate Analogs andOligonucleotides Comprising the Same)的美国临时申请第62/393,401号，各文献涉及磷酸酯类似物的内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸在5’-末端核苷酸处包含4’-磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物为氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子结合于糖部分(例如在其4’-碳处)或其类似物。在其它实施方案中，4’-磷酸酯类似物为硫甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子结合于糖部分的4’-碳或其类似物。在某些实施方案中，4’-磷酸酯类似物为氧甲基膦酸酯。在一些实施方案中，氧甲基膦酸酯由式-O-CH₂-PO(OH)₂或-O-CH₂-PO(OR)₂表示，其中R独立地选自H、CH₃、烷基、CH₂CH₂CN、CH₂OCOC(CH₃)₃、CH₂OCH₂CH₂Si(CH₃)₃或保护基。在某些实施方案中，烷基为CH₂CH₃。更通常，R独立地选自H、CH₃或CH₂CH₃。在一些实施方案中，5’-末端修饰是针对有义链。在一些实施方案中，5’-末端修饰是针对反义链。

在一些实施方案中，连接至寡核苷酸的磷酸酯类似物为甲氧基膦酸酯(MOP)。在一些实施方案中，连接至寡核苷酸的磷酸酯类似物为5’单甲基保护的MOP。在一些实施方案中，例如在反义(引导)链的第一位置处可使用包含磷酸酯类似物的以下尿苷核苷酸：

所述经修饰的核苷酸称为[Me膦酸酯-4O-mU]或5’-甲氧基膦酸酯-4’氧基-2’-O-甲基尿苷。

c.经修饰的核苷间键联

在一些实施方案中，寡核苷酸可包含经修饰的核苷间键联。在一些实施方案中，磷酸酯修饰或取代可产生包含至少一个(例如至少1个、至少2个、至少3个或至少5个)经修饰的核苷酸间键联的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸包含1至10个(例如1至10个、2至8个、4至6个、3至10个、5至10个、1至5个、1至3个或1至2)经修饰的核苷酸间键联。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个经修饰的核苷酸间键联。

经修饰的核苷酸间键联可为二硫代磷酸酯键联、硫代磷酸酯键联、磷酸三酯键联、硫羰基烷基膦酸酯键联、硫羰基烷基磷酸三酯键联、氨基磷酸酯键联、膦酸酯键联或硼烷磷酸酯键联。在一些实施方案中，寡核苷酸的至少一个经修饰的核苷酸间键联为硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，核苷酸间键联为以下结构的4-O-亚甲基膦酸酯键联：

其中R¹为H或C₁-C₄烷基。在一些实施方案中，R¹为甲基。

在一些实施方案中，寡核苷酸在以下位置中的一个或多个位置处具有核苷酸之间的硫代磷酸酯键联：有义链的位置1和2(即在5’-末端区域)、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4(即在5’-末端区域)、反义链的位置20和21、和反义链的位置21和22(即3’-末端区域)。在一些实施方案中，寡核苷酸在以下位置中的每一者处具有核苷酸之间的硫代磷酸酯键联：有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置20和21、和反义链的位置21和22。

d.碱基修饰

在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸具有一个或多个经修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的核碱基(本文中也称为碱基类似物)连接在核苷酸糖部分的1’位置处。在某些实施方案中，经修饰的核碱基为含氮碱基。在某些实施方案中，经修饰的核碱基不含氮原子(参见例如美国专利公布第20080274462号)。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含通用碱基。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸不含核碱基(无碱基)。

在一些实施方案中，通用碱基为位于经修饰的核苷酸中的核苷酸糖部分的1’位置或核苷酸糖部分取代中的等效位置处的杂环部分，当存在于双链体中时，其可与超过一种类型的碱基相对定位而不会实质上改变双链体的结构。在一些实施方案中，相较于与靶核酸完全互补的参考单链核酸(例如，寡核苷酸)，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成的双链体的T_m低于与互补核酸形成的双链体。然而，在一些实施方案中，与其中通用碱基已置换为某个碱基以产生单个错配的参考单链核酸相比，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成的双链体的T_m高于与包含错配碱基的核酸形成的双链体。

通用结合核苷酸的非限制性实例包括肌苷、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(美国专利公布第20070254362号；Van Aerschot等人,Nucleic Acids Res.,1995,23(21):4363-70；Loakes等人,Nucleic Acids Res.1995,23(13):2361-6；Loakes和Brown,Nucleic Acids Res.,1994,22(20):4039-43。前述各文献涉及碱基修饰的公开内容以引用的方式并入本文中)。

e.可逆修饰

虽然可进行某些修饰以在寡核苷酸到达靶细胞之前保护其免受体内环境的影响，但一旦寡核苷酸到达靶细胞的细胞质，其可能降低寡核苷酸的效力或活性。可进行可逆修饰，使得分子在细胞外保留所需的特性，然后在进入细胞的细胞质环境时移除掉。可例如通过细胞内酶的作用或通过细胞内部的化学条件(例如，经由细胞内谷胱甘肽的还原)来移除可逆修饰。

在一些实施方案中，经可逆修饰的核苷酸包含谷胱甘肽敏感性部分。通常，核酸分子已用环状二硫化物部分进行化学修饰，以掩蔽由核苷酸间二磷酸键联产生的负电荷且提高细胞摄取和核酸酶抗性(参见美国专利公布20110294869、国际专利公布WO2015188197；Meade等人,Nature Biotech.,2014,32:1256-1263；国际专利公布WO2014088920；各文献关于此类修饰的公开内容均以引用的方式并入)。核苷酸间二磷酸酯键联的这种可逆修饰经设计以由细胞质的还原环境(例如，谷胱甘肽)在细胞内裂解。早先的实例包括据报道在细胞内可裂解的中和磷酸三酯修饰(Dellinger等人,J.Am.Chem.Soc.,2003,125:940-950)。

在一些实施方案中，这种可逆修饰允许在寡核苷酸将暴露于核酸酶和其它严苛环境条件(例如，pH值)的体内施用期间(例如，运输经过血液和/或细胞的溶酶体/胞内体区室)加以保护。当释放至谷胱甘肽的水平高于细胞外间隙的细胞的细胞质中时，修饰逆转且结果产生裂解的寡核苷酸。与使用不可逆化学修饰可获得的选择相比，使用可逆谷胱甘肽敏感性部分，有可能将空间较大的化学基团引入目标寡核苷酸中。这些较大的化学基团将在细胞质中移除掉，并且因此不会干扰细胞的细胞质中寡核苷酸的生物活性。因此，可对这些较大的化学基团进行工程化以赋予核苷酸或寡核苷酸各种优点，诸如核酸酶抗性、亲脂性、电荷、热稳定性、特异性和降低的免疫原性。在一些实施方案中，可对谷胱甘肽敏感性部分的结构进行工程化以改变其释放动力学。

在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分连接至核苷酸的糖。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分连接至经修饰的核苷酸的糖的2’-碳。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分位于糖的5-碳上，尤其当经修饰的核苷酸为寡核苷酸的5’末端核苷酸时。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感性部分位于糖的3-碳上，尤其当经修饰的核苷酸为寡核苷酸的3’末端核苷酸时。在一些实施方案中，谷胱甘肽敏感部分包含磺酰基(参见例如国际专利公布WO2018039364，其相关公开内容以引用的方式并入本文中)。

f.靶向配体

在一些实施方案中，可能需要使本公开的寡核苷酸靶向一种或多种细胞或一种或多种器官。这种策略可帮助避免在其它器官中不合需要的作用，或者可避免寡核苷酸过度损失在不会得益于寡核苷酸的细胞、组织或器官。因此，在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸可经修饰以促进特定组织、细胞或器官的靶向，例如以促进寡核苷酸递送至肝脏。在某些实施方案中，本文公开的寡核苷酸可经修饰以促进寡核苷酸递送至肝脏的肝细胞。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与一个或多个靶向配体缀合的核苷酸。

靶向配体可包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白质或蛋白质的一部分(例如，抗体或抗体片段)。在一些实施方案中，靶向配体为适体。举例而言，靶向配体可为用于靶向脉管系统或神经胶质瘤细胞的RGD肽、靶向肿瘤脉管系统或造口(stoma)的CREKA肽、转铁蛋白、乳铁蛋白、或靶向在CNS脉管系统上表达的转铁蛋白受体的适体、或靶向神经胶质瘤细胞上的EGFR的抗EGFR抗体。在一些实施方案中，靶向配体为一个或多个GalNAc部分。

在一些实施方案中，寡核苷酸的1个或更多个(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个)核苷酸各自缀合于分开的靶向配体。在一些实施方案中，寡核苷酸的2至4个核苷酸各自缀合于分开的靶向配体。在一些实施方案中，靶向配体缀合于有义链或反义链的任一端处的2至4个核苷酸(例如配体缀合于有义链或反义链的5’或3’端上的2至4个核苷酸突出端或延伸段)，以使得靶向配体类似于牙刷的刷毛且寡核苷酸类似于牙刷。举例而言，寡核苷酸可在有义链的5’或3’端包含茎环序列并且茎的环的1个、2个、3个或4个核苷酸可单独地缀合于靶向配体。

在一些实施方案中，靶向配体为GalNAc部分。GalNAc为对去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)具有高亲合力的配体，ASGPR主要在肝细胞的血窦表面上表达，并且在含有末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基的循环糖蛋白(去唾液酸糖蛋白)的结合、内化和后续清除中起主要作用。GalNAc部分与寡核苷酸的缀合(间接或直接)可用于使这些寡核苷酸靶向在细胞上表达的ASGPR。

在一些实施方案中，寡核苷酸直接或间接缀合于单价GalNAc。在一些实施方案中，寡核苷酸直接或间接缀合于超过一个单价GalNAc(即缀合于2个、3个或4个单价GalNAc，并且通常缀合于3个或4个单价GalNAc部分)。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸缀合于一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc部分。

在一些实施方案中，寡核苷酸的1个或更多个(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个)核苷酸各自缀合于GalNAc部分。在一些实施方案中，四环的2至4个核苷酸各自缀合于分开的GalNAc。在一些实施方案中，三环的1至3个核苷酸各自缀合于分开的GalNAc。在一些实施方案中，靶向配体缀合于有义链或反义链的任一端处的2至4个核苷酸(例如配体缀合于有义链或反义链的5’或3’末上的2至4个核苷酸突出端或延伸段)，以使得GalNAc部分类似于牙刷的刷毛且寡核苷酸类似于牙刷。在一些实施方案中，GalNAc部分缀合于有义链的核苷酸。举例而言，四个GalNAc部分可缀合于有义链的四环中的核苷酸，其中各GalNAc部分缀合于一个核苷酸。

在一些实施方案中，本文中的寡核苷酸包含连接至胍核苷酸的单价GalNAc，称为[ademG-GalNAc]或2’-氨基二乙氧基甲醇-胍-GalNAc，如下所描绘：

在一些实施方案中，本文中的寡核苷酸包含连接至腺嘌呤核苷酸的单价GalNAc，称为[ademA-GalNAc]或2’-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所描绘。

下文显示从5’至3’包含核苷酸序列GAAA(Z＝接头，X＝杂原子)茎连接点的环的这种缀合的一个实例。在化学式中，用于描述与寡核苷酸链的连接点。

可使用适当方法或化学(例如点击化学)将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方案中，使用点击接头将靶向配体与核苷酸缀合。在一些实施方案中，使用基于缩醛的接头将靶向配体与本文所述的任一种寡核苷酸的核苷酸缀合。例如，在国际专利公布WO2016100401中公开基于缩醛的接头，其关于此类接头的内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，接头为不稳定接头。然而，在其它实施方案中，接头为稳定的。“不稳定接头”是指可例如通过酸性pH裂解的接头。“稳定接头”是指不可裂解的接头。

下文显示从5’至3’包含核苷酸GAAA的环的一个实例，其中使用缩醛接头将GalNAc部分连接至环的核苷酸。在化学式中，为与寡核苷酸链的连接点。

可使用任何适当方法或化学(例如点击化学)将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方案中，使用点击接头将靶向配体与核苷酸缀合。在一些实施方案中，使用基于缩醛的接头将靶向配体与本文所述的任一种寡核苷酸的核苷酸缀合。例如，在国际专利申请公布第WO2016100401号中公开基于缩醛的接头，其关于此类接头的内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，接头为不稳定接头。然而，在其它实施方案中，接头为稳定的。“相当稳定接头”是指不可裂解的接头。

g.修饰模式

在一些实施方案中，寡核苷酸经修饰以增加对磷酸酶、核酸酶和其它酶的抗性；增强或维持杂交稳定性；提供靶向特异性；并且适当时，增强RNA沉默加工(例如经由切丁酶和Argonaut)。在一些实施方案中，在限定实施方案中，糖部分、5’-末端磷酸酯、核苷间键联和碱基的每种修饰以及可逆修饰和经由靶向配体的修饰并入寡核苷酸中。

在一些实施方案中，有义链的5’-末端磷酸酯经磷酸酯类似物，例如经硫代磷酸酯或4’-磷酸酯类似物修饰。在一些实施方案中，有义链的核苷酸位置1和2处的核苷酸的核苷酸间键联例如经硫代磷酸酯或4’-磷酸酯类似物修饰。在一些实施方案中，有义链的5’-末端磷酸酯经4’-O-甲基膦酸酯修饰。

在一些实施方案中，反义链的5’-末端核苷酸的5’-末端磷酸酯或核苷酸间键联经例如硫代磷酸酯修饰。在一些实施方案中，反义链的核苷酸位置1和2以及2和3以及任选的位置3和4的核苷酸的核苷酸间键联经例如硫代磷酸酯修饰。

在一些实施方案中，有义链在核苷酸位置7至10，优选地核苷酸位置9、10、11处具有一个或多个，至多4个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，有义链在核苷酸位置9、10、11处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在上述实施方案中，有义链的剩余核苷酸具有经2’-O-甲基修饰的糖部分。

在一些实施方案中，反义链在核苷酸位置1、2、3、5、6、7、10、14和16处具有一个或多个、至多6个、至多5个、至多4个或至多3个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链至少在核苷酸位置5或14或核苷酸位置5与14两者处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链至少在核苷酸位置5处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸，并且任选地在核苷酸位置1、2、3、6、7、10、14和16处具有至多5个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链至少在核苷酸位置14处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸，并且任选地在核苷酸位置1、2、3、5、6、7、10、14和16处具有至多5个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链至少在核苷酸位置5和14处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸，并且任选地在核苷酸位置1、2、3、6、7、10和16处具有至多4个其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，反义链在核苷酸位置2、5和14处具有其中糖部分经2’-F修饰的核苷酸。在上述实施方案中，反义链的剩余核苷酸具有经2’-O-甲基修饰的糖部分。

在一些实施方案中，以下位置中的一个或多个经2’-O-甲基修饰：有义链的位置1-7或12-36和/或反义链的位置1、6、8、9、11-13或15-22；并且其中以下位置中的一个或多个经2’-氟修饰：有义链的位置8-11和/或反义链的位置2、3、4、5、7、10或14。在某些实施方案中，有义链的位置1-7或12-36和反义链的位置1、6、8、9、11-13或15-22经2’-O-甲基修饰；并且有义链的位置8-11和反义链的位置2、3、4、5、7、10或14经2’-氟修饰。

在一些实施方案中，具有有义链和反义链的寡核苷酸进一步含有茎环序列S1-L-S2，其中L为四环、五环或三环。在一些实施方案中，S1和S2区域的一个或多个、多达所有核苷酸具有经2’-O-甲基修饰的糖部分。在一些实施方案中，L序列的5’-末端核苷酸具有2’-O-甲基对糖部分的修饰，并且L的剩余核苷酸具有靶向配体。在一些实施方案中，L区域的所有核苷酸具有靶向配体，例如GalNAc。

在一些实施方案中，当有义链和反义链形成双链体时反义链具有1至2个核苷酸的3’突出端，优选2个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，反义链的3’突出端的核苷酸具有核苷酸间键联的修饰，例如硫代磷酸酯。举例而言且不限制，长度为22个核苷酸的反义链在残基20与21以及21与22之间具有经硫代磷酸酯键联修饰的核苷间键联。

在一些实施方案中，举例而言且不限制，对于以下结构的示例性寡核苷酸(例如长度为36个核苷酸的有义链和长度为22个核苷酸的反义链，其中有义链含有包含区域S1-L-S2的茎环序列)，核苷酸的修饰模式如下：

在一些实施方案中，举例而言且不限制，对于以下结构的示例性寡核苷酸(例如长度为36个核苷酸的有义链和长度为22个核苷酸的反义链，其中有义链含有包含区域S1-L-S2的茎环序列)，核苷酸的修饰模式如下：

其中：

在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸包括并入如本文所述的糖部分的修饰、5’-末端磷酸酯的修饰、核苷间键联的修饰、碱基的修饰、可逆修饰和经由靶向配体的修饰的修饰模式的其它变化。

在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸为选自表A的有义链、反义链或双链寡核苷酸。

III.药物组合物

在一些实施方案中，寡核苷酸被制备成药物组合物以促进寡核苷酸的使用。举例而言，可使用药物组合物或制剂将寡核苷酸递送至受试者或细胞环境，所述药物组合物或制剂将降解减至最少、促进递送和/或摄取或为制剂中的寡核苷酸提供另一种有益特性。可适当地配制此类组合物，使得当施用于受试者时，施用至靶细胞的直接环境或施用至局部区域或器官，或者当全身施用时，足够部分的寡核苷酸进入细胞以降低靶RNA和/或由靶RNA编码的蛋白质的水平。包含寡核苷酸的多种合适的药物组合物中的任一种可用于递送寡核苷酸以降低胶质细胞中的RNA和/或蛋白质表达。在一些实施方案中，寡核苷酸的药物组合物包含缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、脂质粒、胶束结构和壳体。

具有阳离子脂质的寡核苷酸制剂可用于促进寡核苷酸转染至细胞中。举例而言，可使用阳离子脂质，诸如脂质粒、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如聚赖氨酸)。合适脂质包括Oligofectamine、Lipofectamine(Life Technologies)、NC388(RibozymePharmaceuticals公司,Boulder,Colo.)或FuGene 6(Roche)，所有所述脂质均可根据制造商的说明书使用。

因此，在一些实施方案中，制剂包含脂质纳米粒子。在一些实施方案中，赋形剂包含脂质粒、脂质、脂质复合物、微球、微粒子、纳米球或纳米粒子，或者可以其它方式配制用于施用至有需要的受试者的细胞、组织、器官或身体(参见例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第22版,Pharmaceutical Press,2013)。

在一些实施方案中，药物组合物包含本公开的寡核苷酸和合适赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂赋予组合物改善的稳定性、改善的吸收、改善的溶解性和/或活性成分的治疗增强。在一些实施方案中，赋形剂为缓冲剂(例如柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或媒介物(例如缓冲溶液、矿脂、二甲亚砜或矿物油)。在一些实施方案中，将寡核苷酸冻干以延长其保质期，然后在使用(例如施用于受试者)前制成溶液。因此，在一些实施方案中，药物组合物包含本文所述的寡核苷酸和作为冻干保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)或坍塌温度调节剂(例如，葡聚糖、聚蔗糖或明胶)的赋形剂。

在一些实施方案中，将药物组合物配制成与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮、经粘膜和直肠施用。在一些实施方案中，将药物组合物配制成与鞘内、脑室内、间质、静脉内、鼻内或舌下施用相容。

在一些实施方案中，药物组合物适用于注射用途，诸如配制为无菌水溶液(其中水溶性)或分散液，以及临用方制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在通过注射施用的一些实施方案中，例如对于静脉内、鞘内、脑室内或间质，合适载体或赋形剂包括(举例而言且不限制)生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF,Parsippany,N.J.,USA)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇及其类似物)和其合适混合物的溶剂或分散介质。在一些实施方案中，可能优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。无菌可注射溶液可通过将所需量的寡核苷酸并入根据需要具有上述列举的成分中的一种或组合的选定溶剂中来制备，随后过滤除菌。

在一些实施方案中，药物组合物含有至少约0.1％的治疗剂(例如，靶向胶质细胞中表达的RNA的寡核苷酸)。在一些实施方案中，活性成分的百分比可为总组合物的重量或体积的约1％至约80％或更多。制备此类药物制剂领域的技术人员将考虑诸如溶解性、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其它药理学考虑等因素，因此，多种剂量和治疗方案可能合乎需要。

在一些实施方案中，无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物并入如适于注射，具有上述列举的赋形剂或载体中的一种或组合的选定溶剂中来制备，随后过滤除菌。一般而言，分散液通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备，所述载体含有碱性分散介质和来自上文列举的成分的其它合适成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。

IV.寡核苷酸的用途

在另一方面中，本公开提供一种用于将本公开的寡核苷酸选择性递送至胶质细胞的方法。在一些实施方案中，对胶质细胞的选择性是与神经元细胞相比。在一些实施方案中，选择性递送本公开的寡核苷酸的方法包括使胶质细胞与寡核苷酸接触。在一些实施方案中，胶质细胞存在于受试者的神经系统中。在一些实施方案中，用于将本公开的寡核苷酸选择性递送至神经系统中的胶质细胞的方法包括向受试者的神经系统施用寡核苷酸。在一些实施方案中，用于将本公开的寡核苷酸选择性递送至胶质细胞的方法包括向受试者的神经中枢神经系统或周围神经系统施用寡核苷酸，如本文中进一步论述。

在一些实施方案中，本公开提供一种用于选择性降低胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的方法。在一些实施方案中，用于选择性降低胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的方法包括使胶质细胞与有效量的本文公开的寡核苷酸接触，其中寡核苷酸包含有义链和反义链，并且其中反义链包含与靶RNA互补的区域。在一些实施方案中，用于选择性降低胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的方法包括向受试者的中枢神经系统或周围神经系统施用有效量的本文公开的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含有义链和反义链，并且其中反义链包含与靶RNA互补的区域，其中寡核苷酸有效降低靶RNA的表达。

在一些实施方案中，本文提供的方法适用于任何胶质细胞类型。在一些实施方案中，胶质细胞为星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞或肠胶质细胞。在一些实施方案中，胶质细胞为神经系统中存在的星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞或肠胶质细胞。在一些实施方案中，星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞或卫星细胞存在于中枢神经系统中。在一些实施方案中，星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞或肠胶质细胞存在于周围神经系统中。

在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞或肠胶质细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至星形胶质细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至少突胶质细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至室管膜细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至小胶质细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至许旺氏细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至卫星细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至肠胶质细胞。

在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至受试者中枢神经系统中的星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞或卫星细胞。在一些实施方案中，中枢神经系统包括脑和脊髓。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至脑或脑干中的胶质细胞，包括脑或脑干的局部区域中的胶质细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至额叶皮质、纹状体、躯体感觉皮质、海马体、下丘脑或小脑中的胶质细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至脑干，诸如脑桥或延髓中的胶质细胞。

在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至受试者的脊髓，包括脊髓的局部区域中的胶质细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至颈脊髓、胸脊髓或腰脊髓中的胶质细胞。

在一些实施方案中，中枢神经系统中的胶质细胞为星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞或卫星细胞。因此，在一些实施方案中，方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至受试者的中枢神经系统中的星形胶质细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至受试者的中枢神经系统中的少突胶质细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至受试者的中枢神经系统中的室管膜细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至受试者的中枢神经系统中的小胶质细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至受试者的中枢神经系统中的卫星细胞。

在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至受试者的周围神经系统中的星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞或肠胶质细胞。在一些实施方案中，周围神经系统中的胶质细胞包括位于颅神经、脊神经和周围神经等中的那些胶质细胞。在一些实施方案中，周围神经系统中的胶质细胞包括许旺氏细胞、卫星细胞和肠胶质细胞等。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至周围神经系统中的许旺氏细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至周围神经系统中的卫星细胞。在一些实施方案中，所述方法提供本公开的寡核苷酸选择性递送至周围神经系统中的肠胶质细胞。

在一些实施方案中，所述方法提供星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞或肠胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供星形胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供少突胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供室管膜细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供小胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供许旺氏细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供卫星细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供肠胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供胶质细胞混合物中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。

在一些实施方案中，所述方法提供受试者的神经系统中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供受试者的中枢神经系统中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，中枢神经系统包括脑和脊髓。在一些实施方案中，所述方法提供脑或脑干中的胶质细胞，包括脑或脑干的局部区域中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供额叶皮质、纹状体、躯体感觉皮质、海马体、下丘脑或小脑中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供诸如脑桥或延髓的脑干中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。

在一些实施方案中，所述方法提供受试者的脊髓，包括脊髓的局部区域中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供颈脊髓、胸脊髓或腰脊髓中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。

在一些实施方案中，中枢神经系统中的胶质细胞为星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞或卫星细胞。在某些实施方案中，中枢神经系统中的胶质细胞为星形胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞或卫星细胞。在某些实施方案中，胶质细胞为星形胶质细胞。在一些实施方案中，所述方法提供受试者的中枢神经系统中的星形胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供受试者的中枢神经系统中的少突胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供受试者的中枢神经系统中的室管膜细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供受试者的中枢神经系统中的小胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供受试者的中枢神经系统中的卫星细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。

在一些实施方案中，所述方法提供受试者周围神经系统中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，周围神经系统中的胶质细胞包括位于颅神经、脊神经和周围神经等中的那些胶质细胞。在一些实施方案中，周围神经系统中的胶质细胞包括许旺氏细胞、卫星细胞和肠胶质细胞等。在一些实施方案中，所述方法提供周围神经系统中的许旺氏细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供周围神经系统中的卫星细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。在一些实施方案中，所述方法提供周围神经系统中的肠胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的选择性降低。

在一些实施方案中，用于选择性递送至受试者的神经系统中的胶质细胞或选择性降低在受试者的神经系统中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的方法包括向受试者施用有效量的本公开的寡核苷酸，其中所述施用是通过用于向受试者神经系统递送有效量的寡核苷酸的方式。

在一些实施方案中，用于选择性递送至受试者的神经系统中的胶质细胞或选择性降低在受试者的神经系统中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的方法包括经鞘内、脑室内、静脉内、间质、舌下或鼻内向受试者施用有效量的本文公开的寡核苷酸。

在一些实施方案中，选择性递送至受试者的中枢神经系统中的胶质细胞或选择性降低受试者的中枢神经系统中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的方法包括经鞘内向受试者施用有效量的本公开的寡核苷酸。在一些实施方案中，胶质细胞在受试者的脑或脊髓中。

在一些实施方案中，选择性递送至受试者的中枢神经系统中的胶质细胞或选择性降低受试者的中枢神经系统中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的方法包括经脑室内向受试者施用有效量的本公开的寡核苷酸。

在一些实施方案中，选择性递送至受试者的中枢神经系统中的胶质细胞或选择性降低受试者的中枢神经系统中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的方法包括经间质向受试者施用有效量的本公开的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸经间质施用至中枢神经系统中的局部区域。在一些实施方案中，寡核苷酸经间质施用至额叶皮质、纹状体、躯体感觉皮质、海马体、下丘脑或小脑。在一些实施方案中，寡核苷酸经间质施用至脊髓，包括脊髓的局部区域，诸如颈脊髓、胸脊髓或腰脊髓。

在一些实施方案中，选择性递送至受试者的中枢神经系统中的胶质细胞或选择性降低受试者的中枢神经系统中的胶质细胞中表达的靶RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平的方法包括经鼻内向受试者施用有效量的本公开的寡核苷酸。鼻内施用利用经由嗅觉和/或三叉神经路径输送至中枢神经系统区域，包括脑干、小脑、脊髓、嗅球以及皮质和皮质下结构。

除以上施用途径外，本公开的寡核苷酸可经舌下或透皮施用以经由三叉神经路径递送至中枢神经系统。在一些实施方案中，适当时，寡核苷酸可经静脉内施用。

在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸可使用适当核酸递送方法引入，所述方法包括注射含有寡核苷酸的溶液、通过由寡核苷酸覆盖的粒子轰击、将细胞或生物体暴露于含有寡核苷酸的组合物或在寡核苷酸存在下细胞膜进行电穿孔。可使用其它适用于递送寡核苷酸至细胞的方法，诸如脂质介导的载体输送、化学介导的输送和阳离子脂质粒转染，诸如磷酸钙和其它。

可通过评估细胞或受试者的一种或多种特性的适当测定或通过评估指示RNA表达的分子(例如RNA、蛋白质)的生物化学技术证实抑制作用。在一些实施方案中，通过将表达水平(例如mRNA或蛋白质水平)与适当对照物(例如尚未递送寡核苷酸或已递送阴性对照物的细胞或细胞群体中的RNA表达水平)进行比较来评估本文提供的寡核苷酸使在细胞组织或器官中表达的靶RNA的水平降低的程度。在一些实施方案中，RNAi表达的适当对照水平可为预先确定的水平或值，以便不需要每次测量对照水平。预先确定的水平或值可采用多种形式。在一些实施方案中，预先确定的水平或值可为单个截止值，诸如中值或平均值。

在一些实施方案中，如本文所述的寡核苷酸的施用引起胶质细胞中的RNA表达水平降低。在一些实施方案中，RNA表达水平降低可为与RNA的适当对照水平相比较，降低至1％或更低、5％或更低、10％或更低、15％或更低、20％或更低、25％或更低、30％或更低、35％或更低、40％或更低、45％或更低、50％或更低、55％或更低、60％或更低、70％或更低、80％或更低、或90％或更低。在一些实施方案中，RNA表达水平降低为至少50％或更低。在一些实施方案中，RNA表达水平降低为至少70％或更低。在一些实施方案中，RNA表达水平降低为至少80％或更低。在一些实施方案中，适当对照水平可为尚未与如本文所述的寡核苷酸接触或尚未用阴性对照寡核苷酸(例如随机核苷酸序列)处理的胶质细胞或胶质细胞群体中的RNA表达水平。在一些实施方案中，在有限时期之后评估根据本文公开的方法将寡核苷酸递送至胶质细胞的作用。举例而言，可在寡核苷酸引入至细胞中之后至少8小时、12小时、18小时、24小时，或至少一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天或十四天分析细胞中的RNA水平。

在一些实施方案中，选择性递送至胶质细胞或选择性降低胶质细胞中表达的RNA和/或由所述RNA编码的蛋白质的水平与选择性递送至神经元细胞或选择性降低神经元细胞中表达的RNA和/或蛋白质的另一、或许密切相关或替代形式比较。在一些实施方案中，选择性或差异性沉默是基于在胶质细胞与神经元细胞两者中皆表达的靶RNA的表达的降低％的比较。在一些实施方案中，选择性是基于胶质细胞特异性RNA的表达降低％与神经元细胞特异性RNA的表达降低％比较。在一些实施方案中，对胶质细胞的选择性相对于神经元细胞为至少1.2倍；1.3倍；1.4倍；1.5倍；1.6倍、1.7倍、1.8倍；1.9倍或2倍或更高。在一些实施方案中，对胶质细胞的选择性相对于神经元细胞为2倍或更大；2.5倍或更大；3倍或更大；3.5倍或更大；4倍或更大；4.5倍或更大；或5倍或更大。在一些实施方案中，选择性是用于与神经元细胞相比，将本公开的寡核苷酸递送至胶质细胞。在一些实施方案中，选择性是用于与在神经元细胞中特异性表达的RNA相比，降低在胶质细胞中特异性表达的RNA。在多个实施方案中，用作比较物的神经元细胞中表达的RNA和/或蛋白质可为任何神经元特异性标志物蛋白质，诸如本文针对神经元细胞标志物所述。这些神经元特异性标志物包括神经元特异性烯醇酶(NSE或γ-烯醇酶)；神经元核(NeuN或Fox3)；微管相关蛋白2(MAP-2)；微管蛋白βIII(TUBB3)；双皮质素(DCX)；c-fos；胆碱乙酰转移酶(ChAT)；和酪氨酸羟化酶等。在一些实施方案中，评估胶质细胞与神经元细胞之间的选择性使用siRNA，所述siRNA在例如肝细胞的非神经元细胞中引起的胶质细胞特异性RNA表达和神经元细胞特异性RNA表达降低％类似。

在一些实施方案中，寡核苷酸以经工程化以在细胞中表达寡核苷酸(例如其有义链和反义链)的转基因形式递送。在一些实施方案中，使用经工程化以表达本文公开的任何寡核苷酸的转基因递送寡核苷酸。可使用病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、痘病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒)或非病毒载体(例如质粒或合成mRNA)递送转基因。在一些实施方案中，转基因可直接注射至受试者。

在本文中的一些实施方案中，本公开的寡核苷酸可选择性地靶向胶质细胞中表达的任何RNA。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸的反义链包含与胶质细胞中表达的靶RNA互补的区域，其中寡核苷酸有效降低目标靶RNA的表达。如上所论述，在一些实施方案中，目标靶RNA包括在胶质细胞中的表达与具有胶质细胞功能障碍的疾病或病症有关的RNA。在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链包含与以下的表达的RNA互补的区域：与亚历山大氏病(AxD)相关的GFAP基因；与异染性脑白质营养不良/克拉伯病(Krabbe Disease)相关的PSAP基因；与恰克-马利-杜斯氏病相关的PMP22基因；与成人发作型脑白质营养不良相关的LMNB1基因；与阿尔茨海默氏病相关的APP基因和TAU(MAPT)基因；与亨廷顿氏病相关的SOD1基因、C9orf72基因和HTT基因；与帕金森氏病相关的SNCA或ASYN基因和LRRK2基因；与癫痫相关的ADK基因；与中风相关的TNFα基因和ERK5/MAPK7基因；与外伤性脑损伤和轴突损伤相关的TNFα基因和GFAP基因；与自闭症相关的IL-1R2基因；与多发性硬化症相关的CD49d基因；与成胶质细胞瘤和胶质细胞癌相关的IGF-1基因、EGF基因、TGF-β基因和VEGF基因；与肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)相关的SOD1基因、C9orf72基因和TDP-43基因；与神经炎症相关的TNFα基因和CD38基因；与脊髓小脑性失调症相关的ATXN2基因、ATXN3基因和ATXN7基因；与进行性核上神经麻痹症相关的TAU(MAPT)基因；与原发性年龄相关的τ蛋白病变(PART)/神经原纤维缠结优势型痴呆相关的TAU(MAPT)基因；与涉及染色体17的额颞痴呆和帕金森症(FTDP-17)相关的TAU(MAPT)基因；和与周围神经脱髓鞘相关的EGR2基因。

在一些实施方案中，靶向含有编码的蛋白质的突变形式的基因的表达以降低表达。在一些实施方案中，靶向过表达与疾病或病症的病因或表达有关的基因以降低表达。在一些实施方案中，靶向编码表达与疾病或病症有关的蛋白质的突变形式的基因以降低表达。在一些实施方案中，含有突变的基因或过表达与疾病或病症有关的基因包括(举例而言且不限制)以下的基因：GFAP(参见例如Rodriguez等人,American Journal of HumanGenetics,2001,69(6):1413)；PMP22(参见例如Robaglia-Schlupp等人,Brain,2002,125(10):2213-2221；Li等人,Mol Neurobiol.,2013,47(2):673-98)；LMNB1(参见例如Padiath,Q.S.,Cell Dev.Biol.,2019,7(41):1-6)；APP(参见例如Katsurabayashi等人,Physiological Reports,2016,4(1):e12665)；TAU/MAPT(参见例如Le Guennec等人,MolPsychiatry.,2017,22(8):1119-1125；SOD1(参见例如Massenzio等人,Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-Molecular Basis of Disease,2018,1864(12):3771-3785)、C9orf72(参见例如Balendra等人,Nat Rev Neurol.,2018,14(9):544-558)、ATXN2(参见例如Ostrowski等人,Genes(Basel),2017,8(6):157)、ATXN3(参见例如Neves-Carvalho等人,Hum Mol Genet,2015,24(1):100-117)、ATXN7(参见例如Lan等人,Mol Cell Biol.,2015,35(10):1777-1787)；HTT(参见例如Shin等人,J Cell Biol.,2005,171(6):1001-1012)；SNCA/ASYN(参见例如Oliveira等人,Cell Death Dis.,2015,6(11):e1994)；ADK(参见例如De Groot等人,Epilepsia,2011,53(1):858-66)、TNFα(参见例如Welser-Alves等人,Neurochem Int.,2013,63(1):47-53)；CD49d(参见例如Limmroth,V.,Neurology,2014,83(20):1780-1788)；或TDP-43(参见例如Lu等人,Int J Biol Sci.,2016,12(9):1140-1149)。上文描述相应疾病或病症和参考mRNA。

在另一方面中，本发明涉及一种用于治疗患有由胶质细胞中靶基因的表达引起或与其相关的疾病或处于发展所述疾病风险下的受试者的方法。在一些实施方案中，可受影响的疾病或病症包括(举例而言且不限制)：与GFAP基因的表达相关的亚历山大氏病(AxD)；与PSAP基因的表达相关的异染性脑白质营养不良/克拉伯病；与PMP22基因的表达相关的恰克-马利-杜斯氏病；与LMNB1基因的表达相关的成人发作型脑白质营养不良；与APP基因的表达相关的阿尔茨海默氏病；与SOD1基因(例如参考mRNA序列NM_000454.4)、C9orf72基因(例如参考mRNA序列：NM_001256054.2；NM_018325.5；NM_145005.6)和HTT基因的表达相关的亨廷顿氏病；与SNCA/ASYN基因和LRRK2基因的表达相关的帕金森氏病；与ADK基因的表达相关的癫痫；与TNFα基因和ERK5/MAPK7基因的表达相关的中风及其影响；与TNFα基因和GFAP基因的表达相关的外伤性脑损伤和轴突损伤及其影响；与IL-1R2基因的表达相关的自闭症；与CD49d基因的表达相关的多发性硬化症；与IGF-1基因、EGF基因、TGF-β基因和VEGF基因的表达相关的成胶质细胞瘤和胶质细胞癌；与SOD1基因、C9orf72基因和TDP-43基因的表达相关的肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)；与TNFα基因和CD38基因的表达相关的神经炎症；与ATXN2基因、ATXN3基因和ATXN7基因的表达相关的脊髓小脑性失调症；与TAU(MAPT)基因相关的进行性核上神经麻痹症；与TAU(MAPT)基因的表达相关的原发性年龄相关的τ蛋白病变(PART)/神经原纤维缠结优势型痴呆；与TAU(MAPT)基因的表达相关的涉及染色体17的额颞痴呆和帕金森症(FTDP-17)；和与EGR2基因的表达相关的周围神经脱髓鞘。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括向受试者施用有效量，即能够产生期望治疗结果的量的寡核苷酸。治疗学上可接受的量可为可治疗疾病或病症的量。任一受试者的适当剂量将取决于某些因素，所述因素包括受试者体型、体表面积、年龄、待施用的特定组合物、组合物中的活性成分、施用时间和途径、总体健康和并行施用的其它药物。

作为一组非限制性实例，本公开的寡核苷酸通常将一季一次(每三个月一次)、双月一次(每两个月一次)、每月一次或每周一次施用。举例而言，寡核苷酸可每周或以两周或三周的时间间隔施用。可每日施用寡核苷酸。

在一些实施方案中，待治疗的受试者为人或非人灵长类动物或其它哺乳动物受试者。其它示例性受试者包括家养哺乳动物，诸如犬和猫；家畜，诸如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；和其它哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。在一些实施方案中，人受试者被称为患者。

ii.对用于选择性递送和/或选择性降低胶质细胞中表达的靶RNA的干扰寡核苷酸进行筛选的方法

在另一方面中，本公开提供一种筛选对胶质细胞或神经元细胞具有选择性的寡核苷酸的方法。在一些实施方案中，所述筛选是用于鉴定相对于神经元细胞对胶质细胞具有选择性的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述筛选是用于鉴定相对于胶质细胞对神经元细胞具有选择性的寡核苷酸。在各种实施方案中，寡核苷酸可降低胶质细胞中表达的靶RNA的水平。在各种实施方案中，所测试的寡核苷酸可降低神经元细胞中表达的靶RNA的水平。在一些实施方案中，寡核苷酸可降低与神经元细胞相比在胶质细胞中以更高水平表达的RNA的水平。在一些实施方案中，寡核苷酸可降低与胶质细胞相比在神经元细胞中以更高水平表达的RNA的水平。

在一些实施方案中，一种对选择性地降低胶质细胞或神经元细胞中表达的靶RNA的水平的寡核苷酸进行筛选的方法，所述方法包括：

使胶质细胞和神经元细胞与候选寡核苷酸接触，其中所述候选寡核苷酸包含与在胶质细胞与神经元细胞两者中皆表达的靶RNA互补的区域，其中所述寡核苷酸能够降低靶RNA的表达；以及

测量胶质细胞和神经元细胞中的靶RNA的水平以确定对靶RNA表达水平的任何差异性作用。

在一些实施方案中，对选择性地降低胶质细胞或神经元细胞中表达的靶RNA的水平的寡核苷酸进行筛选的方法包括：

向受试者的神经系统施用候选寡核苷酸，其中所述候选寡核苷酸包含与所述神经系统的胶质细胞和神经元细胞两者中皆表达的靶RNA互补的区域，其中所述寡核苷酸能够降低靶RNA的表达；以及

测量胶质细胞和神经元细胞中的靶RNA的水平以确定对靶RNA表达水平的任何差异性作用。在一些实施方案中，受试者为非人哺乳动物。

在一些实施方案中，显示胶质细胞中靶RNA水平的降低程度比神经元细胞中靶RNA水平的降低程度大的寡核苷酸被鉴定为对胶质细胞具有选择性。在一些实施方案中，寡核苷酸对胶质细胞的选择性相对于神经元细胞为至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍或更大。

在一些实施方案中，显示神经元细胞中靶RNA水平的降低程度比胶质细胞中靶RNA水平的降低程度大的寡核苷酸倍鉴定为对神经元细胞具有选择性。在一些实施方案中，寡核苷酸对神经元细胞的选择性相对于胶质细胞为至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍或更大。

在一些实施方案中，候选寡核苷酸包含单链RNA或DNA，诸如本文所述。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含双链核酸(dsNA)，其中所述dsNA包含核糖核苷酸。在一些实施方案中，候选寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体，并且其中所述反义链具有与靶RNA互补的区域并且所述寡核苷酸能够降低靶RNA的水平。

在一些实施方案中，候选寡核苷酸经一个或多个靶向配体修饰。在一些实施方案中，靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、脂质、肽或它们的混合物中的一者或多者。在一些实施方案中，靶向配体包含一个或多个GalNAc部分，如本文中详细描述。

在向受试者的神经系统施用候选寡核苷酸的一些实施方案中，通过测量遍布神经系统或神经系统的局部区域中的胶质细胞和神经元细胞中靶RNA的水平，评估用于测定胶质细胞和神经元细胞中靶RNA的水平的测量。在一些实施方案中，所检查的胶质细胞为星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞、肠胶质细胞或它们的组合。

在一些实施方案中，对选择性地降低胶质细胞或神经元细胞中表达的靶RNA的水平的寡核苷酸进行筛选的方法包括：

使胶质细胞与第一候选寡核苷酸接触，其中所述第一候选寡核苷酸包含与胶质细胞中表达的第一靶RNA互补的区域，其中所述第一寡核苷酸能够降低第一靶RNA表达的水平；

使神经元细胞与第二候选寡核苷酸接触，其中所述第二候选寡核苷酸包含与神经元细胞中表达的第二靶RNA互补的区域，其中所述第二寡核苷酸能够降低第二靶RNA表达的水平；以及

测量胶质细胞中的第一靶RNA和神经元细胞中的第二靶RNA的水平并且确定第一靶RNA和第二靶RNA的任何差异性减少。

在一些实施方案中，对选择性地降低胶质细胞中表达的靶RNA的水平的寡核苷酸进行筛选的方法包括：

向第一受试者的神经系统施用第一候选寡核苷酸，其中所述第一候选寡核苷酸包含与胶质细胞中表达的第一靶RNA互补的区域，其中所述第一寡核苷酸能够降低所述第一靶RNA表达的水平；

向第二受试者的神经系统施用第二候选寡核苷酸，其中所述第二候选寡核苷酸包含与神经元细胞中表达的第二靶RNA互补的区域，其中所述第一寡核苷酸能够降低所述第一靶RNA表达的水平；以及

测量所述第一受试者和所述第二受试者的神经系统中胶质细胞中的第一靶RNA和神经元细胞中的第二靶RNA的水平，其中所述第一受试者和所述第二受试者为相同物种。

在一些实施方案中，第一候选寡核苷酸和第二候选寡核苷酸的不同之处仅在于与相应靶RNA互补的区域。在一些实施方案中，胶质细胞中表达的靶RNA在胶质细胞中特异性表达。在一些实施方案中，神经元细胞中表达的靶RNA在神经元细胞中特异性表达。如本文所用，“特异性表达”是指在一种细胞中的表达水平与另一种细胞相比更大的RNA。在一些实施方案中，靶RNA在一种细胞中特异性表达，比在另一种细胞中的表达大1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍或更大。

如果候选寡核苷酸显示对一种细胞类型的选择性比另一种细胞类型大，则应观察到在一种细胞中的靶RNA水平的降低程度(例如降低％)比在另一种细胞中的靶RNA水平的降低程度大。

在一些实施方案中，显示胶质细胞中靶RNA水平的降低程度比神经元细胞中靶RNA水平的降低程度大的寡核苷酸被鉴定为对胶质细胞具有选择性。在一些实施方案中，寡核苷酸对胶质细胞的选择性相对于神经元细胞为至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍或更大。

在一些实施方案中，显示神经元细胞中靶RNA水平的降低程度比胶质细胞中靶RNA水平的降低程度大的寡核苷酸被鉴定为对神经元细胞具有选择性。在一些实施方案中，寡核苷酸对神经元细胞的选择性相对于胶质细胞为至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍或更大。

在一些实施方案中，第一候选寡核苷酸和第二候选寡核苷酸包含单链RNA或DNA，诸如本文所述。

在一些实施方案中，第一候选寡核苷酸和第二候选寡核苷酸包含双链核酸(dsNA)，其中所述dsNA包含核糖核苷酸。在一些实施方案中，第一候选寡核苷酸包含第一有义链和第一反义链，其中所述第一有义链和所述第二反义链形成第一双链体，并且其中所述第一反义链具有与胶质细胞中表达的第一靶RNA互补的区域并且能够降低第一靶RNA的水平。在一些实施方案中，第二候选寡核苷酸包含第二有义链和第二反义链，其中所述第二有义链和所述第二反义链形成第二双链体，并且其中所述第二反义链具有与神经元细胞中表达的第二靶RNA互补的区域并且能够降低靶RNA的表达。

在一些实施方案中，第一和第二候选寡核苷酸经一个或多个靶向配体修饰。在一些实施方案中，靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、脂质、肽或它们的混合物中的一者或多者。在一些实施方案中，靶向配体包含一个或多个GalNAc部分，如本文中详细描述。

在一些实施方案中，向受试者的神经系统施用第一和第二候选寡核苷酸，通过测量遍布神经系统或在神经系统的局部区域中的胶质细胞和神经元细胞中靶RNA的水平，评估用于测定胶质细胞和神经元细胞中靶RNA的水平的测量。在一些实施方案中，所检查的胶质细胞包括(举例而言且不限制)星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞、肠胶质细胞以及它们的组合。在一些实施方案中，神经元细胞包括(举例而言且不限制)运动神经元、感觉神经元、中间神经元以及它们的组合。

为了能够更全面地理解本文所述的发明，阐述以下实施例。提供本申请中所述的实施例以说明本文提供的方法、组合物和系统且不应理解为以任何方式限制其范围。

实施例

实施例1：细胞类型特异性靶向siRNA的鉴定

为评估特定细胞亚群中的基因沉默水平，需要鉴定靶向神经元或星形胶质细胞特异性基因的GalXC siRNA。在全面审查可用的RNA-seq数据后选择Tubb3和Gfap mRNA。TUBB3或微管蛋白β3类别III，为β微管蛋白家族的成员，参与微管组装。Tubb3 mRNA主要在神经元中表达。GFAP或胶质原纤维酸性蛋白为成熟星形胶质细胞中的主要中间丝蛋白之一，通常用作在发育过程中区分星形胶质细胞与其它非神经元细胞类型的标志物。为研究而制备的siRNA分子的序列和结构示于图1中。因此，每个靶标的表达分别为神经元和星形胶质细胞高度特有的，如图2A和图2B所示。

通过进行体内筛选产生靶向Gfap mRNA的GalXC-siRNA分子(图3)。通过进行体内筛选产生靶向Tubb3 mRNA的GalXC-siRNA分子(图4)。例如，动物在第1天皮下注射0-3mg/kgGalXC-TUBB3，并且在第4天静脉内注射表达Tubb3 mRNA的质粒(CD-1，雌性，每组n＝5)。在第5天通过RT-qPCR在肝脏中分析Tubb3 mRNA水平。来自各筛选的顶部序列的ED50值在约1mg/kg范围内，并且选择用于在小鼠CNS和PNS中进行评估。

实施例2：GalXC siRNA在CNS中对神经细胞亚群的选择性靶向

在脑和脊髓中的神经元和星形胶质细胞中评估GalXC-TUBB3和GalXC-GFAP的药理学。通过快速侧脑室注射来施用等效剂量的GalXC-TUBB3或GalXC-GFAP，一周后测量整个CNS的Tubb3和Gfap mRNA水平。两种GalXC siRNA具有相同化学组成，并且如通过肝脏中的HDI所评估，具有相同的相对ED50。与经设计以靶向Tubb3 mRNA的具有相似化学组成的同等效力的GalXC siRNA相比，GalXC siRNA出人意料地能够在脑所有区域更大程度地使GfapmRNA沉默。在整个大脑和脊髓中观察到的细胞类型之间效力的意外显著差异清楚地表明，GalXC siRNA在输注至CNS后能够选择性靶向星形胶质细胞。

额叶皮质(图5)：靶向Gfap(一种在星形胶质细胞中特异性表达的基因)的GalXCsiRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后，能够使额叶皮质中多达90％基因沉默。靶向Tubb3(一种在神经元中特异性表达的基因)的GalXCsiRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后，仅能够使约10％-30％基因沉默。

纹状体(图6)：靶向Gfap的GalXC siRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后一周出人意料地能够使纹状体中多达80％基因沉默。另一方面，靶向Tubb3的GalXC siRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后一周仅能够使约0％-25％基因沉默。

躯体感觉皮质(图7)：靶向Gfap的GalXC siRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后一周能够使躯体感觉皮质中多达75％基因沉默。而靶向Tubb3的GalXC siRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后一周仅能够使约0％-10％基因沉默。

海马体(图8)：靶向Gfap的GalXC siRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后一周能够使海马体中多达80％基因沉默。靶向Tubb3的GalXCsiRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后一周仅能够使约0％-25％基因沉默。

下丘脑(图9)：靶向Gfap的GalXC siRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后一周能够使下丘脑中多达80％基因沉默。靶向Tubb3的GalXCsiRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后一周仅能够使约0％-25％基因沉默。

小脑(图10)：靶向Gfap的GalXC siRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后一周能够使小脑中多达95％基因沉默。靶向Tubb3的GalXCsiRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后一周仅能够使约0％-40％基因沉默。

脑干(图11)：靶向Gfap的GalXC siRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后一周能够使脑干中多达90％基因沉默。靶向Tubb3的GalXCsiRNA，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后一周仅能够使约0％-30％基因沉默。

脊髓(图12)：靶向Tubb3的GalXC siRNA(一种在神经元中特异性表达的基因)，在单次推注500μg至右侧脑室(n＝4只小鼠/组，CD1，雌性，4-6周龄)后一周能够使约0％-25％基因沉默。在此化学构型中，即使靶基因在胶质细胞与神经元细胞类型中皆表达，在推注至脑脊髓液后，在脊髓神经元(运动神经元、中间神经元等)中将不会预期出现基因沉默。这减轻治疗神经胶质疾病时对神经元毒性或活力的任何担忧。

实施例3：缺乏GalNAc靶向配体的siRNA对神经细胞亚群的选择性靶向

此研究检查GaNAc残基在使siRNA靶向神经元和胶质细胞中的作用。在图13的图A中，GalXC-GFAP-1147(GalNAc)为标准GalXC化学物质，具有三个连接的GalNAc部分，而GalXC-GFAP-1147(无GalNAc)为一种类似分子，具有相同化学组成但缺少三个缀合的GalNAc糖。通过腰椎鞘内注射至蛛网膜下腔(n＝5只小鼠/组，C57BL/6，雌性，4-6周龄)，将GFAP特异性siRNA作为500μg的单次推注施用。施用后一周，靶向Gfap mRNA的GalXC siRNA能够使腰脊髓中的星形胶质细胞中多达70％-75％基因沉默，从而表明所述siRNA上缺少GalNAc部分不会降低这些寡核苷酸在鼠类脑中使其基因靶沉默的能力。

在图13的图B中，GalXC-TUBB3-445(GalNAc)为标准GalXC化学物质，具有三个连接的GalNAc部分，而GalXC-TUBB3-445(无GalNAc)为一种类似分子，具有相同化学组成但缺少三个缀合的GalNAc糖。通过腰椎鞘内注射至蛛网膜下腔(n＝5只小鼠/组，C57BL/6，雌性，4-6周龄)，将TUBB特异性siRNA作为500μg的单次推注施用。施用后一周，靶向Tubb3 mRNA的GalXC siRNA能够使腰脊髓中的神经元中多达30％-35％基因沉默，从而表明缺少GalNAc部分不会降低这些寡核苷酸在鼠类脑中使其基因靶沉默的能力。

与神经元相比，siRNA对星形胶质细胞的差异靶向的维持表明，siRNA可优先递送至有或无GalNAc部分的胶质细胞。

应当理解，在一些实施方案中，在描述寡核苷酸或其它核酸的结构时可参考序列表中呈现的序列。在此类实施方案中，实际寡核苷酸或其它核酸可具有一个或多个替代核苷酸(例如，DNA核苷酸的RNA对应物或RNA核苷酸的DNA对应部分)和/或一个或多个经修饰的核苷酸和/或一个或多个经修饰的核苷酸间键联和/或与指定序列相比的一个或多个其它修饰，同时保留与指定序列基本相同或相似的互补特性。

还应理解，除非本文另有指示或明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中使用的术语“一个/种(a/an)”和“所述”以及类似指代应解释为涵盖单数和复数。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。

此外，除非本文另有指示，否则本文对数值范围的引用仅旨在用作单独引用落入所述范围内的各单独值的速记方法，并且将各单独值并入说明书中，如同其在本文中单独引用一般。除非本文另有指示或明显与上下文相矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另有要求，否则本文中提供的所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明并且不对本发明的范围构成限制。

本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文献均以引用的方式整体并入本文中以达成所有目的，其引用程度如同单独指示各单独出版物、专利、专利申请或其它文献以引用的方式并入以达成所有目的一般。

尽管已示出和描述了各种特定实施方案，但应理解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种改变。

Claims (107)

1.一种将干扰寡核苷酸选择性递送至胶质细胞的方法，所述方法包括：

使胶质细胞与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸包含与所述胶质细胞中表达的靶RNA互补的区域，其中所述寡核苷酸能够降低所述靶RNA的表达。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述互补区域的长度为至少12个核苷酸。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述互补区域的长度为12至30个核苷酸。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸为单链核酸。

5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸为双链核酸(dsNA)。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度为12至58个核苷酸。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体，并且所述反义链包含与所述胶质细胞中表达的靶RNA互补的区域并且能够降低所述靶RNA的表达。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述寡核苷酸包含RNA。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述寡核苷酸包含dsNA。

10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述有义链的长度为15至40个核苷酸。

11.如权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述反义链的长度为19至27个核苷酸。

12.如权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述有义链和所述反义链形成长度为至少12个核苷酸的双链体。

13.如权利要求7至12中任一项所述的方法，其中所述有义链和所述反义链为分开的寡核苷酸。

14.如权利要求7至12中任一项所述的方法，其中所述有义链和所述反义链包含单一寡核苷酸。

15.如权利要求7至14中任一项所述的方法，其中当所述有义链和所述反义链形成双链体时，所述有义链或所述反义链具有长度为至多6个核苷酸的3’突出端。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述反义链具有3’突出端，并且其中所述3’突出端的长度为2个核苷酸。

17.如权利要求7至16中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸还包含茎环序列，所述茎环序列包含序列区域S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L为当S1和S2形成双链体时在S1与S2之间形成的环，并且其中所述茎环序列在所述有义链的3’端连接至所述有义链。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述环L的长度为四个核苷酸。

19.如权利要求7至18中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸还包含一个或多个靶向配体。

20.如权利要求17至18中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸还包含一个或多个靶向配体，其中所述靶向配体存在于所述茎环序列的所述环L上。

21.如权利要求19至20中任一项所述的方法，其中所述靶向配体为GalNAc部分。

22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含用于增加所述寡核苷酸对磷酸酶和/或核酸酶的抗性、提高杂交效率和/或增强体内稳定性的手段。

23.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。

24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述胶质细胞为星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞、肠胶质细胞或它们的混合物。

25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述胶质细胞存在于受试者的神经系统中。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述胶质细胞存在于受试者的中枢神经系统中。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述胶质细胞存在于额叶皮质、纹状体、躯体感觉皮质、海马体、下丘脑、小脑、脑干和/或脊髓中。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述胶质细胞存在于脊髓中。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述胶质细胞存在于颈脊髓、胸脊髓和/或腰脊髓中。

30.如权利要求25所述的方法，其中所述胶质细胞存在于受试者的周围神经系统中。

31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中与神经元细胞相比，所述靶RNA在所述胶质细胞中特异性表达。

32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述互补区域与所述靶RNA中的外显子互补。

33.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述互补区域与所述靶RNA的5’非翻译区互补。

34.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述互补区域与所述靶RNA的3’非翻译区互补。

35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述互补区域与所述靶RNA的等位基因特异性序列互补。

36.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中对胶质细胞的选择性相对于神经元细胞为至少约1.5倍。

37.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中对胶质细胞的选择性相对于神经元细胞为2倍或更大；2.5倍或更大；3倍或更大；3.5倍或更大；4倍或更大；4.5倍或更大；或5倍或更大。

38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述靶RNA为从以下表达的RNA：GFAP基因、PSAP基因、PMP22基因、LMNB1基因、APP基因、TAU(MAPT)基因、SOD1基因、C9orf72基因、HTT基因、SNCA或ASYN基因、LRRK2基因、ADK基因、TNFα基因、ERK5/MAPK7基因、IL-1R2基因、CD49d基因、IGF-1、EGF基因、TGF-β基因、VEGF基因、TDP-43基因、CD38基因、ATXN2基因、ATXN3基因、ATXN7基因或EGR2基因。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述胶质细胞为胶质癌细胞并且所述靶RNA为在所述胶质癌细胞中的表达增加的RNA。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述胶质癌细胞为成胶质细胞瘤。

41.如权利要求39或40所述的方法，其中所述靶RNA为所述胶质癌细胞中从所述IGF-1基因、EGF基因、TGF-β基因或VEGF基因表达的RNA。

42.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸经鞘内、脑室内、间质、舌下或鼻内施用于受试者。

43.一种选择性地降低胶质细胞中表达的靶RNA的水平的方法，所述方法包括：

使胶质细胞与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸包含与所述胶质细胞中表达的靶RNA互补的区域，其中所述寡核苷酸能够降低所述靶RNA的表达。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述互补区域的长度为至少12个核苷酸。

45.如权利要求43所述的方法，其中所述互补区域的长度为12至30个核苷酸。

46.如权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸为单链核酸。

47.如权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸为双链核酸(dsNA)。

48.如权利要求43至47中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度为12至60个核苷酸。

49.如权利要求43所述的方法，其中所述寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体，并且所述反义链包含与所述胶质细胞中表达的靶RNA互补的区域并且能够降低所述靶RNA的表达。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述寡核苷酸包含RNA。

51.如权利要求49所述的方法，其中所述寡核苷酸包含dsNA。

52.如权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述有义链的长度为15至40个核苷酸。

53.如权利要求49至52中任一项所述的方法，其中所述反义链的长度为19至27个核苷酸。

54.如权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述有义链和所述反义链形成长度为至少12个核苷酸的双链体。

55.如权利要求49至54中任一项所述的方法，其中所述有义链和所述反义链包含分开的寡核苷酸。

56.如权利要求49至54中任一项所述的方法，其中所述有义链和所述反义链包含单一寡核苷酸。

57.如权利要求49至56中任一项所述的方法，其中当所述有义链和所述反义链形成双链体时，所述有义链或所述反义链具有至多6个核苷酸的3’突出端。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述反义链上的所述3’突出端的长度为2个核苷酸。

59.如权利要求49至58中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸还包含茎环序列，所述茎环序列包含序列区域S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L为当S1和S2形成双链体时在S1与S2之间形成的环，其中所述茎环序列在所述有义链的3’端连接至所述有义链。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述环L的长度为四个核苷酸。

61.如权利要求43至60中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸还包含一个或多个靶向配体。

62.如权利要求59至60中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸还包含一个或多个靶向配体，其中所述靶向配体存在于所述茎环序列的所述环L上。

63.如权利要求61至62中任一项所述的方法，其中所述靶向配体为GalNAc部分。

64.如权利要求43至63中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含用于增加所述寡核苷酸对磷酸酶和/或核酸酶的抗性、提高杂交效率和/或增强体内稳定性的手段。

65.如权利要求43至63中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。

66.如权利要求43至64中任一项所述的方法，其中所述胶质细胞为星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞、肠胶质细胞或它们的混合物。

67.如权利要求43至66中任一项所述的方法，其中所述胶质细胞存在于受试者的神经系统中。

68.如权利要求67所述的方法，其中所述胶质细胞存在于受试者的中枢神经系统中。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述胶质细胞存在于额叶皮质、纹状体、躯体感觉皮质、海马体、下丘脑、小脑、脑干和/或脊髓中。

70.如权利要求69所述的方法，其中所述胶质细胞存在于脊髓中。

71.如权利要求70所述的方法，其中所述胶质细胞存在于颈脊髓、胸脊髓和/或腰脊髓中。

72.如权利要求67所述的方法，其中所述胶质细胞存在于受试者的周围神经系统中。

73.如权利要求43至72中任一项所述的方法，其中与神经元细胞相比，所述靶RNA在所述胶质细胞中特异性表达。

74.如权利要求43至73中任一项所述的方法，其中所述互补区域与所述靶RNA中的外显子互补。

75.如权利要求43至73中任一项所述的方法，其中所述互补区域与所述靶RNA的5’非翻译区互补。

76.如权利要求43至73中任一项所述的方法，其中所述互补区域与所述靶RNA的3’非翻译区互补。

77.如权利要求43至76中任一项所述的方法，其中所述互补区域与所述靶RNA的等位基因特异性序列互补。

78.如权利要求43至77中任一项所述的方法，其中对胶质细胞的选择性相对于神经元细胞为至少约1.5倍或更多。

79.如权利要求43至78中任一项所述的方法，其中对胶质细胞的选择性相对于神经元细胞为2倍或更大；2.5倍或更大；3倍或更大；3.5倍或更大；4倍或更大；4.5倍或更大；或5倍或更大。

80.如权利要求43至79中任一项所述的方法，其中所述靶RNA为从以下表达的RNA：GFAP基因、PSAP基因、PMP22基因、LMNB1基因、APP基因、TAU(MAPT)基因、SOD1基因、C9orf72基因、HTT基因、SNCA或ASYN基因、LRRK2基因、ADK基因、TNFα基因、ERK5/MAPK7基因、IL-1R2基因、CD49d基因、IGF-1、EGF基因、TGF-β基因、VEGF基因、TDP-43基因、CD38基因、ATXN2基因、ATXN3基因、ATXN7基因或EGR2基因。

81.如权利要求67至79中任一项所述的方法，其中所述胶质细胞为胶质癌细胞并且所述靶RNA为在所述胶质癌细胞中的表达增加的RNA。

82.如权利要求81所述的方法，其中所述胶质癌细胞为成胶质细胞瘤。

83.如权利要求81或82所述的方法，其中所述靶RNA为在所述胶质癌细胞中从所述IGF-1基因、EGF基因、TGF-β基因或VEGF基因表达的RNA。

84.如权利要求43至83中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸经鞘内、脑室内、间质、舌下或鼻内施用于受试者。

85.一种对选择性地降低胶质细胞或神经元细胞中表达的靶RNA的水平的寡核苷酸进行筛选的方法，所述方法包括：

使胶质细胞和神经元细胞与候选寡核苷酸接触，其中所述候选寡核苷酸包含与所述胶质细胞和所述神经元细胞两者中表达的靶RNA互补的区域；以及

测量胶质细胞和神经元细胞中的靶RNA的水平以确定对靶RNA表达水平的任何差异性作用。

86.一种对选择性地降低胶质细胞或神经元细胞中表达的靶RNA的水平的寡核苷酸进行筛选的方法，所述方法包括：

向受试者的神经系统施用候选寡核苷酸，其中所述候选寡核苷酸包含与所述神经系统的胶质细胞和神经元细胞两者中表达的靶RNA互补的区域，其中所述寡核苷酸能够降低靶RNA的表达；以及

测量胶质细胞和神经元细胞中的靶RNA的水平以确定对靶RNA表达水平的任何差异性作用。

87.如权利要求85或86所述的方法，其中所述寡核苷酸包含单链RNA或DNA。

88.如权利要求85或86所述的方法，其中所述寡核苷酸包含双链核酸(dsNA)，其中所述dsNA包含核糖核苷酸。

89.如权利要求88所述的方法，其中所述寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体，并且所述反义链具有与所述靶RNA互补的区域，并且其中所述寡核苷酸能够降低靶RNA表达的水平。

90.如权利要求85至89中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸还包含一个或多个靶向配体。

91.如权利要求90所述的方法，其中所述靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、脂质或肽。

92.如权利要求91所述的方法，其中所述靶向配体包含GalNAc部分。

93.如权利要求86至92所述的方法，其中所述测量包括测定遍布所述神经系统的胶质细胞和神经元细胞的靶RNA的水平。

94.如权利要求85至93中任一项所述的方法，其中所述胶质细胞为星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞或肠胶质细胞。

95.一种对选择性地降低胶质细胞或神经元细胞中表达的靶RNA的水平的寡核苷酸进行筛选的方法，所述方法包括：

使胶质细胞与第一候选寡核苷酸接触，其中所述第一候选寡核苷酸包含与胶质细胞中表达的第一靶RNA互补的区域，其中所述第一寡核苷酸能够降低第一靶RNA表达的水平；

使神经元细胞与第二候选寡核苷酸接触，其中所述第二候选寡核苷酸包含与神经元细胞中表达的第二靶RNA互补的区域，其中所述第二寡核苷酸能够降低第二靶RNA表达的水平；以及

测量胶质细胞中的第一靶RNA和神经元细胞中的第二靶RNA的水平并且确定第一靶RNA和第二靶RNA的任何差异性减少。

96.一种对选择性地降低胶质细胞或神经元细胞中表达的靶RNA的水平的寡核苷酸进行筛选的方法，所述方法包括：

向第一受试者的神经系统施用第一候选寡核苷酸，其中所述第一候选寡核苷酸包含与胶质细胞中表达的第一靶RNA互补的区域，并且其中所述第一寡核苷酸能够降低所述第一靶RNA表达的水平；

向第二受试者的神经系统施用第二候选寡核苷酸，其中所述第二候选寡核苷酸包含与神经元细胞中表达的第二靶RNA互补的区域，并且其中所述第二寡核苷酸能够降低所述第二靶RNA表达的水平；以及

测量所述第一受试者和所述第二受试者的神经系统中胶质细胞中的第一靶RNA和神经元细胞中的第二靶RNA的水平，其中所述第一受试者和所述第二受试者为相同物种。

97.如权利要求95或96所述的方法，其中所述第一候选寡核苷酸和所述第二候选寡核苷酸的不同之处仅在于与所述第一靶RNA或所述第二靶RNA互补的区域。

98.如权利要求95至97中任一项所述的方法，其中胶质细胞中表达的所述第一靶RNA在胶质细胞中特异性表达，并且神经元细胞中表达的所述第二靶RNA在神经元细胞中特异性表达。

99.如权利要求95至98中任一项所述的方法，其中所述第一候选寡核苷酸和所述第二候选寡核苷酸各自包含单链RNA或DNA。

100.如权利要求95至98中任一项所述的方法，其中所述第一候选寡核苷酸和所述第二候选寡核苷酸包含双链核酸(dsNA)，其中所述dsNA包含RNA。

101.如权利要求100所述的方法，其中

所述第一候选寡核苷酸包含第一有义链和第一反义链，其中所述第一有义链和所述第二反义链形成第一双链体，其中所述第一反义链具有与胶质细胞中表达的所述第一靶RNA互补的区域并且能够降低第一靶RNA的水平；并且

所述第二候选寡核苷酸包含第二有义链和第二反义链，其中所述第二有义链和所述第二反义链形成第二双链体，并且其中所述第二反义链具有与所述神经元细胞中表达的所述第二靶RNA互补的区域并且能够降低第二靶RNA的水平。

102.如权利要求95至101中任一项所述的方法，其中所述第一候选寡核苷酸和所述第二候选寡核苷酸还包含一个或多个靶向配体。

103.如权利要求102所述的方法，其中所述靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、脂质、肽或它们的混合物中的一者或多者。

104.如权利要求103所述的方法，其中所述靶向配体包含一个或多个GalNAc部分。

105.如权利要求95至104中任一项所述的方法，其中所述测量包括测定遍布所述神经系统的胶质细胞中的第一靶RNA和神经元细胞中的第二靶RNA的水平。

106.如权利要求95至105中任一项所述的方法，其中所述胶质细胞为星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、许旺氏细胞、卫星细胞、肠胶质细胞以及它们的组合。

107.如权利要求95至106中任一项所述的方法，其中神经元细胞为运动神经元、感觉神经元、中间神经元以及它们的组合。