TW201741459A - 反義寡聚物及將其用於治療與酸性α－葡萄糖苷酶基因相關之疾病的方法 - Google Patents

反義寡聚物及將其用於治療與酸性α－葡萄糖苷酶基因相關之疾病的方法 Download PDF

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Abstract

本文之揭示內容係關於經修飾的反義寡核苷酸。本文所描述的核苷酸係10至40個核鹼基且包括與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1內的目標區域互補的靶向序列。該目標區域相較於該靶向序列包括至少一個額外的核鹼基，其中該至少一個額外的核鹼基在該靶向序列中不具有互補的核鹼基，且其中該至少一個額外的核鹼基對於該目標區域而言係內部的。

Description

反義寡聚物及將其用於治療與酸性α-葡萄糖苷酶基因相關之疾病的方法
本文之揭示內容係關於反義寡聚物和用於誘發外顯子包含以作為用於第II型肝醣蓄積病(GSD-II)(亦以龐培氏病、肝醣病II、酸性麥芽糖酶缺乏(AMD)、酸性α-葡萄糖苷酶缺乏、和溶酶體α-葡萄糖苷酶缺乏為人所知)的治療之相關組成物和方法，且更具體言之係關於誘發外顯子2之包含並從而回復酵素上有活性的由GAA基因編碼的酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)蛋白之水平。
選擇式剪接藉由自單一基因產生多種蛋白質而增加人類基因組之編碼潛力。不適當的選擇式剪接亦與數目越來越多的人類疾病有關。
GSD-II係導因於缺乏稱為酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的酵素之遺傳性體染色體隱性溶酶體儲存失調。GAA在體內的角色係降解肝醣。GAA活性水平減少或缺乏GAA活性會導致在受影響的組織(包括心臟、骨骼肌(包括該等涉及呼吸者)、肝臟、和神經系統)中肝醣之堆積。咸相信此肝醣之堆積在患有GSD-II的個體中會造成漸進的肌肉虛弱和呼吸 不足。GSD-II可於嬰兒、幼兒、或成人發生，且預後會基於發病之時間和症狀之嚴重性變化。臨床上，GSD-II可以嚴重性範圍在嚴重的(嬰兒的)至較溫和的晚發性成人形式之寬廣且連續的譜系呈現。患者最終由於呼吸不足而死亡。在疾病之嚴重性與殘餘的酸性α-葡萄糖苷酶活性之間有良好的關聯性，於該疾病之晚發形式中活性為正常之10-20%且於早發形式中小於2%。估計GSD-II全世界影響大約5,000至10,000人。
與疾病之成人發病形式有關的最常見之突變IVS1-13T>G。在超過成人發病GSD-II患者之三分之二中找到，此突變可在異型合子個體中賦予選擇性優點或係非常老的突變。具有此突變的成人發病GSD-II個體之廣大種族變化證明並沒有一共同的初始者。
GAA基因係由跨越約20kb的20個外顯子組成。3.4kb mRNA編碼分子量大約105kD的蛋白質。IVS1-13T>G突變導致喪失外顯子2(577個鹼基)，其含有起始AUG密碼子。
用於GSD-II的治療已包括藥物治療策略、飲食操縱、和骨髓移植，但無顯著的成功。近年來，酵素替代治療(ERT)已為GSD-II患者提供新希望。例如，Myozyme®(一種重組GAA蛋白質藥物)已於2006在美國和歐洲皆被核准用於患有GSD-II病的患者。Myozyme®依賴在GAA蛋白質之表面上的甘露糖-6-磷酸(M6P)來遞送至溶酶體。
最近反義技術(最常用於RNA向下調節)已被修改以以改變剪接過程。加工許多基因之初級基因轉錄物(前驅mRNA)涉及內含子之移除和外顯子之精確剪接，其中剪接供體位置被接至剪接受體位置。剪接係一個精確的過程，其涉及剪接供體和受體位置、和分支點(剪接受體 位置之上游)之協調辨識以及陽性外顯子剪接增強子(主要位於外顯子內)和陰性剪接模體(主要位於內含子中的剪接靜默子)之平衡。
可改變GAA前驅mRNA之剪接的有效劑可能對於改善GSD-II之治療係治療上有用的。
於一個方面，本文之揭示內容的特徵在於一種10至40個核鹼基的經修飾的反義寡核苷酸。該經修飾的反義寡核苷酸包括與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA內的目標區域(例如GAA之內含子1內，諸如SEQ ID NO：1內的目標區域)互補的靶向序列，其中該目標區域相較於該靶向序列包含至少一個額外的核鹼基，其中該至少一個額外的核鹼基在該靶向序列中不具有互補的核鹼基，且其中該至少一個額外的核鹼基對於該目標區域而言係內部的。該靶向區域和該靶向序列間的交互作用可否則為100%互補但亦可包括較低的互補閾值(例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)。該目標區域可包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之至少一者。視需要地，該目標區域可包括SEQ ID NO：4。視需要地，該目標區域可包括SEQ ID NO：5。該經修飾的反義寡核苷酸可於該靶向序列與該目標區域結合後促進在該GAA mRNA中的外顯子2之保留。該目標區域相較於該靶向序列可包括一至三個額外的核鹼基。然而，該目標區域中亦可存在超過三個額外的核鹼基。此外，該等額外的核鹼基可沿著該目標區域彼此分開。該經修飾的反義寡核苷酸相較於與SEQ ID NO：1內的目標區域 完全互補的第二反義寡核苷酸根據酵素活性測試可誘發GAA酵素活性至少二倍。該經修飾的反義寡核苷酸相較於與SEQ ID NO：1內的目標區域完全互補的第二反義寡核苷酸根據酵素活性測試可誘發GAA酵素活性至少三倍或至少四倍。
在另一個方面，本文之揭示內容特徵在於一種式(I)的反義寡聚物化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中：各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；Z係8至38的整數；各個Y係獨立地選自O和-NR4，其中各個R4係獨立地選自H、C1-C6烷基、芳烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)nNR5C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(=NH)NH2、和G，其中R5係選自H和C1-C6烷 基且n係1至5的整數；T係選自OH和以下式的部分： 其中：A係選自-OH、-N(R7)2、和R1，其中各個R7係獨立地選自H和C1-C6烷基，且R6係選自OH、-N(R9)CH2C(O)NH2、和以下式的部分： 其中：R9係選自H和C1-C6烷基；且R10係選自G、-C(O)-R11OH、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)mNR12C(=NH)NH2、和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(=NH)NH2，其中：m係1至5的整數，R11係式-(O-烷基)y-，其中y係3至10的整數且y個烷基基團之各者係獨立地選自C2-C6烷基；且R12係選自H和C1-C6烷基；R1之各者係獨立地選自：-N(R13)2，其中各個R13係獨立地選自H和C1-C6烷基； 式(II)之部分： 其中：R15係選自H、G、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)qNR18C(=NH)NH2、和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR18C(=NH)NH2，其中：R18係選自H和C1-C6烷基；且q係1至5的整數，且各個R17係獨立地選自H和甲基；和式(III)之部分： 其中：R19係選自H、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)rNR22C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(=NH)NH2-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR22C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)4NH2和G，其中：R22係選自H和C1-C6烷基；且r係1至5的整數，且R20係選自H和C1-C6烷基；或R19和R20與其等所接附的氮原子一起形成具有5至7個環原子且視需要地含有選自氧、氮、和硫之額外的雜原子之雜環基或雜芳基環；且 R2係選自H、G、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、硬脂醯基、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)-R23、-C(O)(CH2)sNR24C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR24C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(=NH)NH2、和以下式的部分： 其中，R23係式-(O-烷基)v-OH，其中v係3至10的整數且v個烷基基團之各者係獨立地選自C2-C6烷基；且R24係選自H和C1-C6烷基；s係1至5的整數；L係選自-C(O)(CH2)6C(O)-和-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-；且各個R25係式-(CH2)2OC(O)N(R26)2其中各個R26係式-(CH2)6NHC(=NH)NH2，其中G係選自以下者的細胞穿透性胜肽(「CPP」)和連接子部分：-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)CH2NH-CPP、和： 其中該CPP係於該CPP之羧基端藉由醯胺鍵接附至該連接子部分，且 其中G可出現一次或不存在。
於某些實施方式中，各個R1係-N(CH3)2。於一些實施方式中，約50-90%的R1基團係二甲基胺基(即-N(CH3)2)。於某些實施方式中，約66%的R1基團係二甲基胺基。
於一些非限制性實施方式中，該靶向序列係選自表2A-2C之序列，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。於一些非限制性實施方式中，各個R1係-N(CH3)2且該靶向序列係選自表2A-2C之序列，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
於一些本文之揭示內容之實施方式中，R1可係選自：
於某些實施方式中，T係選自：；；；和，且Y每次出現係O。於一些實施方式中，R2係選自H、G、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、和硬脂醯基。
於某些實施方式中，T係式： Y每次出現係O且R2係G。
於某些實施方式中，T係式： 且Y每次出現係O。
於某些實施方式中，T係式：，Y每次出現係O，各個R1係-N(CH3)2，且R2係H。
在另一個方面，本文之揭示內容之特徵在於一種式(VII)之反義寡聚物化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；Z係8至38的整數；T係選自： 各個R1係-N(R4)2，其中各個R4獨立地係C1-C6烷基；且R2係選自H、G、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、和硬脂醯基，其中G係選自以下者的細胞穿透性胜肽(「CPP」)和連接子部分：-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)CH2NH-CPP、和： 其中該CPP係於該CPP之羧基端藉由醯胺鍵接附至該連接子部分，和其中T係或R2係G。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之反義寡聚物之靶向序列(包括(例如)一些式(I)和(IV)之反義寡聚物之實施方式)係選自表2A-2C中概述的序列，如本文所描述的，和如以下者： I. a)SEQ ID NO：13(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC)，其中Z係22；b)SEQ ID NO：14(GCC AGA AGG AAG GC GAG AAA AGC X)，其中Z係22；c)SEQ ID NO：15(CCA GAA GGA AGG CGA GAA AAG CXC)，其中Z係22；d)SEQ ID NO：16(CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC XCC)，其中Z係22；e)SEQ ID NO：17(AGA AGG AAG GCG AGA AAA GCX CCA)，其中Z係22；f)SEQ ID NO：18(GAA GGA AGG CGA GAA AAG CXC CAG)，其中Z係22；g)SEQ ID NO：19(AAG GAA GGC GAG AAA AGC XCC AGC)，其中Z係22；h)SEQ ID NO：20(AGG AAG GCG AGA AAA GCX CCA GCA)，其中Z係22；i)SEQ ID NO：21(CGG CXC XCA AAG CAG CXC XGA GA)，其中Z係21；j)SEQ ID NO：22(ACG GCX CXC AAA GCA GCX CXG AG)，其中Z係21；k)SEQ ID NO：23(CAC GGC XCX CAA AGC AGC XCX GA)，其中Z係21；l)SEQ ID NO：24(XCA CGG CXC XCA AAG CAG CXC XG)，其中Z係21；m)SEQ ID NO：25(CXC ACG GCX CXC AAA GCA GCX CX)，其中Z係21；n)SEQ ID NO：26(ACX CAC GGC XCX CAA AGC AGC XC)，其中Z係21；o)SEQ ID NO：27(GCG GCA CXC ACG GCX CXC AAA GC)，其中Z係21；p)SEQ ID NO：28(GGC GGC ACX CAC GGC XCX CAA AG)，其中Z係21；q)SEQ ID NO：29(CGG CAC XCA CGG CXC XCA AAG CA)，其中Z係21；r)SEQ ID NO：30(GCA CXC ACG GCX CXC AAA GCA GC)，其中Z係21；s)SEQ ID NO：31(GGC ACX CAC GGC XCX CAA AGC AG)，其中Z係21；t)SEQ ID NO：32(CAC XCA CGG CXC XCA AAG CAG CX)，其中Z係21；u)SEQ ID NO：33(GCC AGA AGG AAG GCG AGA AAA GC)，其中Z係21； v)SEQ ID NO：34(CCA GAA GGA AGG CGA GAA AAG C)，其中Z係19；w)SEQ ID NO：35(CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC)，其中Z係19；x)SEQ ID NO：36(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA AG)，其中Z係21；y)SEQ ID NO：37(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA A)，其中Z係19；z)SEQ ID NO：38(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA)，其中Z係19；aa)SEQ ID NO：39(CGG CAC XCA CGGC XCX CAA AGC A)，其中Z係21；bb)SEQ ID NO：40(GCG GCA CXC ACGG CXC XCA AAG C)，其中Z係21；cc)SEQ ID NO：41(GGC GGC ACX CAC G GCX CXC AAA G)，其中Z係21；dd)SEQ ID NO：42(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GGC)，其中Z係22；ee)SEQ ID NO：43(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GC)，其中Z係21；ff)SEQ ID NO：44(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA C)，其中Z係20；gg)SEQ ID NO：45(GGC CAG AAG GAA GCG AGA AAA GC)，其中Z係21；hh)SEQ ID NO：46(GGC CAG AAG GAA CGA GAA AAG C)，其中Z係20；ii)SEQ ID NO：47(AGG AAG CGA GAA AAG CXC CAG CA)，其中Z係21；jj)SEQ ID NO：48(AGG AAC GAG AAA AGC XCC AGC A)，其中Z係20；kk)SEQ ID NO：49(CGG GCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA)，其中Z係22；ll)SEQ ID NO：50(CGC XCX CAA AGC AGC XCX GAG A)，其中Z係20；mm)SEQ ID NO：51(CCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA)，其中Z係19；nn)SEQ ID NO：52(GGC GGC ACX CAC GGG CXC XCA AAG)其中Z係22；oo)SEQ ID NO：53(GGC GGC ACX CAC GCX CXC AAA G)，其中Z係20；pp)SEQ ID NO：54(GGC GGC ACX CAC CXC XCA AAG)，其中Z係19；qq)SEQ ID NO：55(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GGC)，其中Z係22； rr)SEQ ID NO：56(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GC)，其中Z係21；ss)SEQ ID NO：57(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG C)，其中Z係20；和tt)SEQ ID NO：58(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACC)，其中Z係19，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)；II. a)SEQ ID NO：59(GGC CAG AAG GAA GGG CGA GAA AAG C)，其中Z係23；b)SEQ ID NO：60(CCA GAA GGA AGG GCG AGA AAA GCX C)，其中Z係23；c)SEQ ID NO：61(AAG GAA GGG CGA GAA AAG CXC CAG C)，其中Z係23；d)SEQ ID NO：62(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GGG C)，其中Z係23；e)SEQ ID NO：63(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GGG C)，其中Z係23；f)SEQ ID NO：64(AGA AGG AAG GGC GAG AAA AGC XCC A)，其中Z係23；g)SEQ ID NO：65(GCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA CAX C)，其中Z係23；h)SEQ ID NO：66(CXC XCA AAG CAG CXC XGA GAC AXC A)，其中Z係 23；i)SEQ ID NO：67(XCX CAA AGC AGC XCX GAG ACA XCA A)，其中Z係23；j)SEQ ID NO：68(CXC AAA GCA GCX CXG AGA CAX CAA C)，其中Z係23；k)SEQ ID NO：69(XCA AAG CAG CXC XGA GAC AXC AAC C)，其中Z係23；l)SEQ ID NO：70(CAA AGC AGC XCX GAG ACA XCA ACC G)，其中Z係23；m)SEQ ID NO：71(AAA GCA GCX CXG AGA CAX CAA CCG C)，其中Z係23；n)SEQ ID NO：72(AAG CAG CXC XGA GAC AXC AAC CGC G)，其中Z係23；o)SEQ ID NO：73(AGC AGC XCX GAG ACA XCA ACC GCG G)，其中Z係23；p)SEQ ID NO：74(GCA GCX CXG AGA CAX CAA CCG CGG C)，其中Z係23；和q)SEQ ID NO：75(CAG CXC XGA GAC AXC AAC CGC GGC X)，其中Z係23，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)；和III. a)SEQ ID NO：76(GCC AGA AGG AAG GGC GAG AAA AGC X)，其中Z係23；b)SEQ ID NO：77(CAG AAG GAA GGG CGA GAA AAG CXC C)，其中Z係23； c)SEQ ID NO：78(GAA GGA AGG GCG AGA AAA GCX CCA G)，其中Z係23；d)SEQ ID NO：79(AGG AAG GGC GAG AAA AGC XCC AGC A)，其中Z係23；e)SEQ ID NO：80(ACX CAC GGG GCX CXC AAA GCA GCX C)，其中Z係23；f)SEQ ID NO：81(GGCXCXCAAAGCAGCXCXGAGACAX)，其中Z係23；g)SEQ ID NO：82(GGC XCX CAA AGC AGC XCX GA)，其中Z係18；h)SEQ ID NO：83(GAG AGG GCC AGA AGG AAG GG)，其中Z係18；i)SEQ ID NO：84(XXX GCC AXG XXA CCC AGG CX)，其中Z係18；j)SEQ ID NO：85(GCG CAC CCX CXG CCC XGG CC)，其中Z係18；和k)SEQ ID NO：86(GGC CCX GGX CXG CXG GCX CCC XGC X)，其中Z係23，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82所組成之群組。於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、34-36、和59所組成之群組。於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、和34-36所組成之群組。於某些實施方式中，SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82之任一者中的X每次出現係T。
於一些實施方式(包括(例如)一些式(I)和(IV)之反義寡聚物之實施方式)中，該靶向序列係與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內的目標區域互補的。於一些實施方式中，該靶向序列係與人類GAA基因之外顯子2或內含子2中的目標區域 互補的。於種種實施方式(包括(例如)式(I)和(IV)之反義寡聚物之實施方式)中，該靶向序列係與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內的目標區域互補的，其中該目標區域相較於該靶向序列包含至少一個額外的核鹼基，其中該至少一個額外的核鹼基在該靶向序列中不具有互補的核鹼基，且其中該至少一個額外的核鹼基對於該目標區域而言係內部的。於某些實施方式中，該靶向序列包含選自SEQ ID NO：13-86的序列，如於本文之表2A-2C中顯示的。於某些實施方式中，該靶向序列包含選自表2A和2B的序列。於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82所組成之群組。此外，且關於本文之表2A-2C(或表2B和2C)中列出的序列，於某些實施方式中，選擇有100%互補性的序列且移除一或多個核鹼基(或供選擇地伴隨一或多個遺失的核鹼基合成其)以使得所得的序列於目標區域相較於其天然互補物具有一或多個遺失的核鹼基。除了一或多個核鹼基被移除的部分之外，設想到剩下的部分100%互補。然而，可存在減低水平的互補性係在本發明之範圍內。
於一些實施方式中，至少一個SEQ ID NO：13-86之X係T。於一些實施方式中，至少一個SEQ ID NO：13-86之X係U。於一些實施方式中，各個SEQ ID NO：13-86之X係T。於一些實施方式中，各個SEQ ID NO：13-86之X係U。於種種實施方式中，至少一個該靶向序列之X係T。於種種實施方式中，各個該靶向序列之X係T。於種種實施方式中，至少一個該靶向序列之X係U。於種種實施方式中，各個該靶向序列之X係U。
本文之揭示內容之此等和其他方面在參考以下詳細敘述和 所附圖式後會變得很明顯。本文所揭示的所有文獻特此以其等之完整內容以引用方式併入，如同各者係個別地併入。
圖1和2係描繪於掃描期間對種種PMO化合物找到的GAA酵素活性(酵素分析)之長條圖。Y軸代表相對於未經處理的對照組GAA酵素活性之增加倍數。「N」係論及於各個研究中所評估的重複之數目。水平虛線象徵在未經處理的細胞中GAA之活性水平。個別的化合物係以5μM和0.2μM給藥。水平虛線象徵在未經處理的細胞中GAA之活性水平。
圖3和4係描繪對於種種PMO化合物找到的酵素分析劑量反應之長條圖。Y軸代表相較於未經處理的對照組GAA酵素活性之增加倍數。個別的化合物係以5μM、1μM、0.2μM和0.4μM給藥。水平虛線象徵在未經處理的細胞中GAA之活性水平。
圖5-8係描繪對於種種PMO化合物找到的酵素分析劑量反應之長條圖。Y軸代表相較於未經處理的對照組GAA酵素活性之增加倍數。個別的化合物係以5μM、1μM、0.2μM和0.04μM給藥。水平虛線象徵在未經處理的細胞中GAA之活性水平。
圖9-14係描繪對於種種PMO化合物找到的酵素分析劑量反應之長條圖。Y軸代表相較於未經處理的對照組GAA酵素活性之增加倍數。個別的化合物係以5μM、1.6μM、0.5μM和0.16μM給藥。水平虛線象徵在未經處理的細胞中GAA之活性水平。
圖15a和15b係描繪對於種種PPMO化合物找到的酵素分析 劑量反應之長條圖。Y軸代表相較於未經處理的對照組GAA酵素活性之增加倍數。個別的化合物係以5μM、1.6μM、和0.5μM給藥。水平虛線象徵在未經處理的細胞中GAA之活性水平。
圖16係描繪對於種種PMO化合物找到的酵素分析劑量反應之長條圖。Y軸代表相較於未經處理的對照組GAA酵素活性之增加倍數。個別的化合物係以5μM給藥。水平虛線象徵在未經處理的細胞中GAA之活性水平。
圖17和18係描繪對於種種PPMO化合物找到的GAA酵素活性(酵素分析)之長條圖。Y軸代表相對於未經處理的對照組GAA酵素活性之增加倍數。個別的化合物係以5μM、1.6μM、和0.5μM給藥。水平虛線象徵在未經處理的細胞中GAA之活性水平。「N=9」係論及於各個研究中所評估的重複之數目。數據總結表顯示以μM計的EC50。
圖19係描繪種種PPMO化合物之EC50(以μM計)的數據總結表。
圖20-22係描繪對於種種PPMO化合物找到的GAA酵素活性(酵素分析)的長條圖。Y軸代表相對於未經處理的對照組GAA酵素活性之增加倍數。個別的化合物係以5μM、1.6μM、和0.5μM給藥。水平虛線象徵在未經處理的細胞中GAA之活性水平。數據總結表顯示以μM計的EC50
圖23係描繪種種PPMO化合物之EC50(以μM計)的數據總結表。
圖24-26係描繪對於種種PPMO化合物找到的GAA酵素活 性(酵素分析)之長條圖。Y軸代表相對於未經處理的對照組GAA酵素活性之增加倍數。個別的化合物係以5μM、1.6μM、和0.5μM給藥。水平虛線象徵在未經處理的細胞中GAA之活性水平。數據總結表顯示以μM計的EC50。
I.定義
除非另加界定，所有本文所使用的技術和科學術語具有與本文之揭示內容所屬技術領域中具有通常知識者所一般瞭解者相同的意義。雖然可將任何與該等本文所描述者相似或相等的方法和材料用於本文之揭示內容之標的之實現或測試，較佳的方法和材料被描述。為了本文之揭示內容之目的，以下界定以下術語。
用於本文中，慣詞「一個(a)」和「一個(an)」係論及一個或超過一個(即至少一個)該慣詞之文法客體。舉例而言，「一個元件」意謂一個元件或超過一個元件。
使用「約」係意謂相較於參考數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度變化差不多30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%的數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。
使用「編碼序列」係意謂任何對於基因之多肽產物之編碼有貢獻的核酸序列。相比之下，術語「非編碼序列」係論及任何對基因之多肽產物之編碼無直接貢獻的核酸序列。
於本文之揭示內容通篇中，除非前後文另有要求，字詞「包含(comprise)」、「包含(comprises)」、和「包含(comprising)」應被理解成意指包含所陳述的步驟或元件或步驟或元件之群組但不排除任何其他步驟或元件或步驟或元件之群組。
使用「由…組成」係意謂包括且限於接著語詞「由以下者組成」者：因此，語詞「由…組成」指示所列元件係需要或必須的，且不可存在其他元件。使用「基本上由…組成」係意謂包括任何該語詞後所列元件，且限於其他不會干擾或促成本文之揭示內容針對所列元件具體指明的活性或作用的元件。因此，語詞「基本上由xx組成」指示所列元件係需要或必須的，但其他元件係視需要的且可或可不存在，取決於其等是否實質上影響所列元件之活性或作用。
用於本文中，術語「接觸細胞」、「導入」或「遞送」包括藉由所屬技術領域中的例行方法將本文之揭示內容之寡聚物遞送至細胞中，該等方法例如為轉染(例如脂質體、磷酸鈣、聚乙亞胺)、電穿孔(例如核染(nucleofection))、微注射)。
用於本文中，術語「烷基」係意欲包括直鏈(即非支鏈或非環狀)、支鏈、環狀、或多環非芳香族烴基團，其視需要地經一或多個官能基取代。除非另外具體指明，「烷基」基團含有一個至八個，且較佳為一個至六個碳原子。C1-C6烷基，係意欲包括C1、C2、C3、C4、C5、和C6烷基基團。低碳數烷基係論及含有1至6個碳原子的烷基基團。烷基之實例包括(但不限於)甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、環丁基、戊基、異戊基三級戊基、環戊基、己基、異 己基、環己基、等等。烷基可係經取代或未經取代的。說明性經取代的烷基基團包括(但不限於)氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、3-氟丙基、羥甲基、2-羥乙基、3-羥丙基、苯甲基、經取代的苯甲基、苯乙基、經取代的苯乙基、等等。
用於本文中，術語「烷氧基」意謂一種烷基之次組，其中如以上界定且具有所指示數目之碳的烷基基團係通過氧橋接附。例如，「烷氧基」係論及基團-O-烷基，其中該烷基基團含有直鏈、支鏈、環狀構型的1至8個碳原子。「烷氧基」之實例包括(但不限於)甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、三級丁氧基、正丁氧基、s-戊氧基和類似者。
用於本文中，術語「芳基」當單獨使用或作為更大部分之一部份使用(如於「芳烷基」、「芳烷氧基」、或「芳氧基-烷基」)時係論及具有六個至十四個環原子的芳香族環基團，諸如苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基和2-蒽基。「芳基」環可含有一或多個取代基。術語「芳基」可與術語「芳基環」可互換地使用。「芳基」亦包括稠合多環芳香族環系統，其中芳香族環與一或多個環稠合。有用的芳基環基團之非限制性實例包括苯基、羥苯基、鹵苯基、烷氧苯基、二烷氧苯基、三烷氧苯基、伸烷基二氧苯基、萘基、菲基、蒽基、菲并和類似者、以及1-萘基、2-萘基、1-蒽基和2-蒽基。亦包括在術語「芳基」(如其被用於本文中)之範圍內者係其中芳香族環稠合至一或多個非芳香族環的基團，諸如於二氫茚基、啡啶基、或四氫萘基，其中接附之基或點係芳香族環。
術語「醯基」意謂C(O)R基團(其中R象徵H、烷基或芳基，如以上界定的)。醯基基團之實例包括甲醯基、乙醯基、苯甲醯基、苯 基乙醯基和相似的基團。
用於本文中，術語「同系物」意謂藉由相同化學基團之連續添加而有規率地不同的化合物。例如，化合物之同系物差異可在於一或多個-CH2-基團、胺基酸殘基、核苷酸、或核苷酸類似物之添加。
術語「細胞穿透性胜肽」(CPP)或「增強細胞攝取的胜肽部分」係可互換地使用且係論及陽離子細胞穿透性胜肽，亦稱為「運輸胜肽」、「載體胜肽」、或「胜肽轉導功能域」。如於本文中顯示的，該胜肽在給定細胞培養族群之細胞之約或至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%內具有誘發細胞穿透的能力且在全身性投予後於活體內於多個組織內允許巨分子轉位。於一些實施方式中，該等CPP係式-[(C(O)CHR'NH)m]R"其中R'係天然存在的胺基酸或其一-或二-碳同系物之側鏈，R"係選自氫或醯基，且m係至多50的整數。CPP亦可具有式-[(C(O)CHR'NH)m]Ra，其中R'係天然存在的胺基酸或其一-或二-碳同系物之側鏈，且其中Ra係選自氫、醯基、苯甲醯基、或硬脂醯基。任何結構之CPP可藉由「連接子」連接至反義寡聚物之3’或5’端，該連接子諸如為(例如)-C(O)(CH2)5NH-、-C(O)(CH2)2NH-、-C(O)(CH2)2NH-C(O)(CH2)5NH-、或-C(O)CH2NH-。其他CPP係所屬技術領域中廣為人知的且於(例如)美國申請案編號2010/0016215(其以其整體以引用方式併入)中揭示。於其他實施方式中，m係選自1至50的整數，其中當m係1時，該部分係單一胺基酸或其衍生物。
用於本文中，「胺基酸」係論及由一級胺基基團、羧酸基團、側鏈、和氫原子接附至其的碳原子組成的化合物。例如，術語「胺基酸」 包括(但不限於)甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、離胺酸和精胺酸。此外，用於本文中，「胺基酸」亦包括胺基酸之衍生物，諸如酯、和醯胺、和鹽、以及其他衍生物、包括具有在代謝後變成活性形式的醫藥性質之衍生物。據此，術語「胺基酸」應被理解成包括天然存在和非天然存在的胺基酸。
用於本文中「電子對」係論及未與其他原子鍵結或未被其他原子共享的電子之價對。
用於本文中，「相同性」係論及完全一致或構成保守性取代的胺基酸之百分比數目。相同性可使用諸如GAP的序列比較程式測定(Deveraux等人，1984,Nucleic Acids Research 12,387-395)。通過如此方式，與該等於本文中引用者長度類似或實質上不同的序列可藉由於排比中插入間隙來比較，如此間隙係(例如)藉由GAP所使用的比較演算法測定。
使用「經分離的」係意謂實質上或本質上不含於其天然狀態下正常會伴隨其的組份之材料。例如，用於本文中，「經分離的多核苷酸」、「經分離的寡核苷酸」、或「經分離的寡聚物」可論及自於天然發生的狀態下與其兩側相接的序列純化或移出的多核苷酸，例如自在基因組中鄰接其的序列移出的DNA片段。當有關細胞時，術語「分離」係論及自來源對象(例如患有多核苷酸重複疾病的對象)純化細胞(例如纖維母細胞、淋巴母細胞)。在mRNA或蛋白質之前後文中，「分離」係論及自來源(例如細胞)回收mRNA或蛋白質。
術語「調節」包括「增加」或「減少」一或多種可定量的參數，視需要地達所界定的及/或統計上顯著的量。使用「增加(increase)」或 「增加(increasing)」、「增強(enhance)」或「增強(enhancing)」、或「刺激(stimulate)」或「刺激(stimulating)」大體上係論及一或多種反義化合物或組成物在細胞或對象中產生或造成相較於由無反義化合物或對照組化合物造成的反應更大的生理反應(即下游功效)之能力。相關生理或細胞反應(活體內或試管內)對於所屬技術領域中具有通常知識者會是明顯的，且可包括在GAA編碼性前驅mRNA中外顯子2之包含的增加、或在需要其的細胞、組織、或對象中功能性GAA酵素之表現之增加。「增加的」或「增強的」量典型係「統計上顯著的」量，且可包括由無反義化合物(不存在一劑)或對照組化合物產生的量之1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多倍(例如500、1000倍)(包括在兩者間和超過1的所有整數和小數點(例如1.5、1.6、1.7. 1.8))的增加。術語「減少」或「抑制」可一般地關於一或多種反義化合物或組成物「減少」相關生理或細胞反應(諸如本文所描述的疾病或病況之症狀)(如根據診斷技術領域中例行的技術測量的)的能力。相關的生理或細胞反應(活體內或試管內)對於所屬技術領域中具有通常知識者而言會是明顯的，且可包括諸如龐培氏病的肝醣蓄積病之症狀或病理之減少，例如在一或多個組織中肝醣之堆積之減少。於一反應中，「減少」相較於由無反義化合物或對照組組成物產生的反應可係「統計上顯著的」，且可包括1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%減少，包括兩者間的所有整數。
用於本文中，「反義寡核苷酸」、「反義寡聚物」或「寡核苷 酸」係論及核苷酸、或核苷酸類似物之直鏈序列，其允許其核鹼基透過華特生-克里克鹼基配對與RNA中的目標序列雜合，以在該目標序列內形成寡聚物：RNA異源雙鏈(heteroduplex)。術語「反義寡核苷酸」、「經修飾的反義寡核苷酸」、「反義寡聚物」、「寡聚物」和「化合物」係可互換地使用以論及寡聚物。其環次單元可基於核糖或另一種五碳糖或(於某些實施方式中)N-啉基基團(參見以下N-啉基寡聚物之描述)。亦設想到者係胜肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、三環DNA寡聚物、三環硫代磷酸酯寡聚物、和2’-O-甲基寡聚物、以及其他所屬技術領域中已知的反義劑。
所包括者係非天然存在的寡聚物，或「寡核苷酸類似物」，其包括具有以下者的寡聚物(i)經修飾的主鏈結構，例如除了在天然存在的寡核苷酸和多核苷酸中找到的標準磷酸二酯連結以外的主鏈、及/或(ii)經修飾的糖部分，例如N-啉基部分而非核糖或去氧核糖部分。寡聚物類似物支撐能夠藉由華特生-克里克鹼基配對與標準多核苷酸鹼基氫鍵結的鹼基，其中該類似物主鏈呈現該等鹼基，其方式在該寡聚物類似物分子與標準多核苷酸(例如單股RNA或單股DNA)中的鹼基間以序列專一性方式容許如此氫鍵結。較佳的類似物係該等具有實質上不帶電的、含磷的主鏈者。
「核酸酶抗性」寡聚物係論及其等之主鏈於未經雜合或經雜合的形式對透過體內常見的細胞外和細胞內核酸酶(例如，透過諸如3’-外切核酸酶的外切核酸酶、內切核酸酶、RNA酶H)之核酸酶剪切實質上有抗性者；即，該寡聚物在該寡聚物所暴露至的體內之正常核酸酶條件下顯現極少的核酸酶剪切或無核酸酶剪切。「核酸酶抗性異源雙鏈」係論及透過反義寡聚物與其之互補目標之結合而形成的異源雙鏈，使得該異源雙鏈 對透過細胞內和細胞外核酸酶(其等能夠剪切雙股RNA/RNA或RNA/DNA複合物)的活體內降解係實質上抗性的。「異源雙鏈」係論及反義寡聚物和目標RNA之互補部分間的雙鏈。
用於本文中，「核鹼基」(Nu)、「鹼基配對部分」或「鹼基」係可互換地使用以論及在天然DNA或RNA中找到的嘌呤或嘧啶鹼基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、和鳥糞嘌呤)、以及天然存在的嘌呤和嘧啶之類似物，其賦予改善的特性，諸如對該寡聚物的結合親和力。例示性類似物包括次黃嘌呤(核苷肌苷之鹼基組份)；2,6-二胺基嘌呤；5-甲基胞嘧啶；經C5-丙炔基修飾的嘧啶；9-(胺基乙氧基)啡(G-鉗(G-clamp))和類似者。
鹼基配對部分之其他實例包括(但不限於)其等各自之胺基基團受醯基保護基保護的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鳥糞嘌呤和次黃嘌呤、2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2,6-二胺基嘌呤、氮雜胞嘧啶、嘧啶類似物，諸如假異胞嘧啶和假尿嘧啶和其他經修飾的核鹼基，諸如經8-取代的嘌呤、黃嘌呤、或次黃嘌呤(後兩者係天然降解產物)。亦設想到在Chiu和Rana,RNA,2003,9,1034-1048、Limbach等人Nucleic Acids Research,1994,22,2183-2196及Revankar和Rao,Comprehensive Natural Products Chemistry,vol.7,313中揭示的經修飾的核鹼基。
鹼基配對部分之其他實例包括(但不限於)大小擴張的核鹼基，其中已添加一或多個苯環。設想到在Glen Research目錄(www.glenresearch.com)；Krueger AT等人，Acc.Chem.Res.,2007,40, 141-150；Kool,ET,Acc.Chem.Res.,2002,35,936-943；Benner S.A.、等人，Nat.Rev.Genet.,2005,6,553-543；Romesberg,F.E.、等人，Curr.Opin.Chem.Biol.,2003,7,723-733；Hirao,I.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2006,10,622-627中描述的核鹼基置換對於本文所描述的寡聚物之合成而言係有用的。大小經擴張的核鹼基之實例係於以下顯示：
共價地連接至核糖、糖類似物或N-啉基的核鹼基構成核苷。「核苷酸」係由核苷加上一個磷酸基團組成。該磷酸基團使鄰接的核苷酸彼此共價地連結在一起以形成寡聚物。
若一寡聚物在生理條件下以實質上大於40℃或45℃，較佳係至少50℃，且典型係60℃-80℃或更高的Tm雜合至目標多核苷酸，則該寡聚物「專一性地雜合」至該目標。如此雜合較佳係對應於嚴苛雜合條件。於給定離子強度和pH，Tm係於其50%的目標序列雜合至互補多核苷酸的溫度。如此雜合可於該反義寡聚物和該目標序列之「幾乎的」或「實質上的」互補、以及於精確的互補下發生。
用於本文中「長度足夠的」係論及反義寡聚物或其靶向序列，其係與GAA內含子1、外顯子2、或內含子2之區域、或跨越前述者 之任一者的區域中的至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29、或至少30個或更多個，諸如8-40個，和諸如15-40個相連的核鹼基互補的。長度足夠的反義寡聚物具有至少最少數目的核苷酸以能夠與突變體RNA中的GAA前驅mRNA重複之區域專一性雜合。較佳地，長度足夠的寡聚物之長度係8至30個核苷酸。更佳地，長度足夠的寡聚物之長度係9至27個核苷酸。甚至更佳地，長度足夠的寡聚物之長度係15至40個核苷酸。
用於本文中，術語「序列一致性」或(例如)包含「與…50%一致的序列」係論及序列在一比較窗之範圍內在逐核苷酸基礎或逐胺基酸基礎上一致的程度。因此，「序列一致性之百分比」可藉由以下者計算：在比較窗之範圍內比較二個經最佳地排比的序列、測定於其相同的核酸鹼基(例如A、T、C、G、I)或相同的胺基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)於兩個序列皆發生的位置之數目以產生吻合的位置之數目、將吻合的位置之數目除以比較窗內的位置之總數(即窗大小)、和將結果乘上100以產生序列一致性之百分比。用於排比比較窗的最佳的序列之排比可藉由演算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics套裝軟體釋出版本7.0，Genetics Computer Group,575 Science Drive Madison,Wis.,USA中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)或藉由種種所選擇的方法之任一者產生的檢視和最佳排比(即在比較窗內產生最高的百分比相同性)執行。可參照如例如由 Altschul等人，Nucl.Acids Res.25：3389,1997所揭示的BLAST程式家族。
「對象」或「需要其的對象」包括哺乳動物對象，諸如人類對象。例示性哺乳動物對象患有GSD-II(或龐培氏病)或有患有GSD-II(或龐培氏病)之風險。用於本文中，術語「GSD-II」係論及第II型肝醣蓄積病(GSD-II或龐培氏病)，其係一種特徵往往在於受影響的個體中GAA蛋白質表現不足的人類體染色體隱性疾病。於某些實施方式中，對象在一或多個組織(例如心臟、骨骼肌、肝臟、和神經系統組織)中具有減少的GAA蛋白質之表現及/或活性。於一些實施方式中，該對象在一或多個組織(例如心臟、骨骼肌、肝臟、和神經系統組織)中具有增加的肝醣之堆積。於特別的實施方式中，該對象具有IVS1-13T>G突變或其他導致功能性GAA蛋白質之表現減少的突變(參見(例如)Zampieri等人，European J.Human Genetics.19：422-431,2011)。
用於本文中，術語「目標」係論及RNA區域，且特別係論及被GAA基因辨識的區域。在一個特殊的實施方式中，該目標係編碼GAA的前驅mRNA之內含子1(例如SEQ ID NO：1)內的區域，其引起促進外顯子2包含的訊號之抑制。於另一個實施方式中，該目標區域係GAA外顯子2之mRNA之區域。在進一步的實施方式中，該目標包含一或多個編碼GAA的前驅mRNA之內含子1之不連續的子區域。此等子區域包括(但不限於)由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3界定的序列。
術語「目標序列」係論及該寡聚物類似物所針對的目標RNA之部分，即該寡聚物類似物會藉由互補的序列之華特生-克里克鹼基配對與之雜合的序列。
術語「靶向序列」係與該RNA基因組中的「目標序列」互補的(意謂(此外)實質上地互補的)該寡聚物或寡聚物類似物中的序列。該反義寡聚物之整個序列(或僅僅部分)可與該目標序列互補。例如，於具有20-30個鹼基的寡聚物，約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、或29個可係與該目標區域互補的靶向序列。典型地，該靶向序列係由該寡聚物中相連的鹼基形成，但供選擇地可由當放置在一起(例如從該寡聚物之相反端)時可構成跨越該目標序列的序列之不相連的序列形成。
「靶向序列」對於該目標序列可具有「幾乎的」或「實質上的」互補性且仍對於本文之揭示內容之目的有功能，即仍係「互補的」。較佳地，於本文之揭示內容中利用的寡聚物類似物化合物相較於該目標序列在10個核苷酸中具有至多一個錯配，且較佳係在20個中至多一個錯配。供選擇地，所利用的反義寡聚物與如本文中指明的例示性靶向序列具有至少90%序列相同性，且較佳係至少95%序列相同性。
用於本文中，術語「TEG」或「三乙二醇尾」係論及綴合至該寡核苷酸(例如於其3’-或5’端)的三乙二醇部分。例如，於一些實施方式中，「TEG」包括其中(例如)式(I)、(VI)、或(VII)之化合物之T係式：
用於本文中，術語「定量(quantifying)」、「定量(quantification)」或其他相關字詞係論及測定核酸、多核苷酸、寡聚物、胜肽、多肽、或蛋白質在單位體積中的數量、質量、或濃度。
用於本文中，「治療」一對象(例如哺乳動物，諸如人類)或細胞係任何類型的意欲改變個體或細胞之自然過程而使用的介入。治療包括(但不限於)投予醫藥組成物，且可預防性地執行或在病理事件之起始或與致病因子接觸後執行。亦包括者係「預防性」治療，其可針對減低所治療的疾病或病況之進展之速率、延遲疾病或病況之開始、或減低其開始之嚴重性。「治療」或「預防」不必定指示完全根絕、治癒、或預防疾病或病況、或其相關症狀。
II.用於GAA之剪接調節的序列
某些實施方式係關於用於在細胞中相較於外顯子-2被刪除的GAA mRNA提高含外顯子2之編碼GAA的mRNA之水平的方法，其包含使該細胞與具有足夠的長度和互補性以專一性地雜合至GAA基因內的區域的反義寡聚物接觸，使得在該細胞中相較於外顯子-2被刪除的GAA mRNA含外顯子2的GAA mRNA之水平被提高。於一些實施方式中，該細胞係在一對象中，且該方法包含將該反義寡聚物投予至該對象。
可將反義寡聚物設計成會封阻或抑制或調節mRNA之轉譯或會抑制或調節前驅mRNA剪接加工、或誘發所靶向的mRNA之降解，且其可被稱為「針對」或「靶向」其與之雜合的目標序列。於某些實施方式中，該目標序列包括包括經預加工的mRNA之3’或5’剪接位置、分支 點、或其他涉及剪接之調節的序列的區域。該目標序列可位於外顯子內或位於內含子內或跨越內含子/外顯子連接點。
於某些實施方式中，該反義寡聚物對目標RNA(即剪接位置選擇被調節的RNA)具有足夠的序列互補性以以有效的方式封阻目標RNA之區域(例如前驅mRNA)。於例示性實施方式中，GAA前驅mRNA之如此封阻發揮調節剪接的功能，其係藉由遮蔽對於否則會調節剪接之天然蛋白質的結合位置及/或藉由改變所靶向的RNA之結構。於一些實施方式中，該目標RNA係目標前驅mRNA(例如GAA基因前驅mRNA)。
對目標RNA序列具有足夠的序列互補性以調節該目標RNA之剪接的反義寡聚物意謂該反義劑具有足以觸發對於否則會調節剪接的天然蛋白質之結合位置之遮蔽及/或改變所靶向的RNA之三維結構的序列。類似地，具有與目標RNA序列足夠互補以調節該目標RNA之剪接的序列的寡聚物試劑意謂該寡聚物試劑具有足以觸發對於否則會調節剪接的天然蛋白質之結合位置之遮蔽及/或改變所靶向的RNA之三維結構的序列。
於某些實施方式中，該反義寡聚物對人類GAA前驅mRNA之內含子1、人類GAA前驅mRNA之外顯子2、或人類GAA前驅mRNA之內含子2中的序列具有足夠的長度和互補性。亦包括者係與跨越人類GAA前驅mRNA之內含子1/外顯子2的區域或跨越人類GAA前驅mRNA之外顯子2/內含子2的區域互補的反義寡聚物。人類GAA基因之內含子1(SEQ ID NO：1)、外顯子2(SEQ ID NO：4)、和內含子2(SEQ ID NO：5)序列係於以下表1中顯示(所強調的靠近SEQ ID NO：1之3’端的T/G係以上描述的IVS1-13T>G突變；位於此位置的核苷酸係T或G)。
於某些實施方式中，將反義靶向序列設計成雜合至表1中所列的目標序列之一或多者之區域。可使所選反義靶向序列較短(例如約12個鹼基)或較長(例如約40個鹼基)且包括少數的錯配，只要該序列在與該目標序列雜合後互補性足以引起剪接調節，且視需要地與該RNA形成具 有45℃或更高的Tm的異源雙鏈。
於某些實施方式中，該目標序列與反義靶向序列間的互補之程度足以形成穩定的雙鏈。該反義寡聚物與該目標RNA序列互補之區域可短至8-11個鹼基，但可係12-15個鹼基或更長，例如10-40個鹼基、12-30個鹼基、12-25個鹼基、15-25個鹼基、12-20個鹼基、或15-20個鹼基，包括此等範圍間的所有整數。約14-15個鹼基之反義寡聚物一般係夠長以具有獨特的互補序列。於某些實施方式中，可能需要互補鹼基之最小長度以達成必要的結合Tm，如於本文中討論的。
於某些實施方式中，長至40個鹼基的寡聚物可係適合的，其中至少最小數目的鹼基(例如10-12個鹼基)係與目標序列互補。於一些實施方式中，細胞中的促進性或活性攝取於少於約30個鹼基的寡聚物長度被最佳化。對於PMO寡聚物(其於本文中進一步描述)，結合穩定性與攝取之最佳平衡一般係於18-25個鹼基的長度發生。包括在本文之揭示內容中者係由約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40個鹼基組成的反義寡聚物(例如PMO、PMO-X、PNA、LNA、2’-OMe)，其中至少約6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40個相連或非相連的鹼基係與表1之目標序列(例如SEQ ID NO：1-5，跨越SEQ ID NO：1/4或SEQ ID NO：4/5的序列)互補。
該反義寡聚物典型包含與在人類GAA基因之前驅mRNA序列之內含子1、外顯子2、或內含子2內或鄰接其的序列或區域足夠互補的 鹼基序列。於某些實施方式中，該等寡聚物係與SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3互補。理想地，反義寡聚物能夠有效地調節GAA前驅mRNA之異常剪接，並從而增加活性GAA蛋白質之表現。此需求在該寡聚物化合物具有以下能力時被視需要地滿足：被哺乳動物細胞活性地攝取，且一旦被攝取後，與該目標mRNA形成穩定的雙鏈(或異源雙鏈)(視需要具有大於約40℃或45℃的Tm)。
於某些實施方式中，反義寡聚物可與該目標序列100%互補，或可包括錯配(例如)以容納變體，只要該寡聚物與目標序列間形成的異源雙鏈足夠穩定以對抗細胞核酸酶之作用和其他可在活體內發生的降解之形式。因此，某些寡聚物在該寡聚物與該目標序列間可具有實質上的互補性，意謂約或至少約70%序列互補性，例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列互補性。本文中討論較不易受透過核酸酶之剪接影響的寡聚物主鏈。若存在，錯配典型於雜合雙鏈之末端區域相較於中央係較不去穩定性。所允許的錯配之數目會取決於該寡聚物之長度、該雙鏈中G：C鹼基對之百分比、和該(等)錯配在該雙鏈中的位置，根據被充分理解的雙鏈穩定性之原理。雖然如此反義寡聚物不必定與v目標序列100%互補，其有效於與該目標序列穩定且專一性地結合，使得該目標前驅RNA之剪接被調節。
寡聚物和目標序列間形成的雙鏈之穩定性係結合Tm和雙鏈對細胞酵素性剪接之易受影響性之函數。寡聚物對於互補序列RNA的Tm 可藉由習用方法測量，諸如該等由Hames等人，Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,1985,pp.107-108描述者或如於Miyada C.G.和Wallace R.B.,1987,Oligomer Hybridization Techniques,Methods Enzymol.Vol.154 pp.94-107描述的。於某些實施方式中，反義寡聚物可具有大於體溫且較佳係大於約45℃或50℃的結合Tm(對於互補序列RNA)。亦包括範圍在60-80℃或更高的Tm。根據廣為人知的原理，寡聚物之Tm(對於互補鹼基RNA雜合物)可藉由增加雙鏈中C：G配對鹼基之比率及/或藉由增加異源雙鏈之長度(以鹼基對計)來增加。同時，為了最佳化細胞攝取的目的，限制該寡聚物之大小可能係有利的。為了此理由，於長度25個鹼基或更短顯示高Tm(45-50℃或更高的)的化合物相較於該等對於高Tm值需要大於25個鹼基者一般係較佳的。
表2A、2B、和2C顯示與人類GAA基因之前驅mRNA序列互補的例示性靶向序列(以5’-至-3’方向)。
某些反義寡聚物因此包含以下者、由以下者組成、或基本上由以下者組成：表2A-2C中的序列或其變體或相連或非相連的部分。例如，某些反義寡聚物包含表2A-2C中列出的SEQ ID NO之任一者之約或至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、或27個相連或非相連的核苷酸。於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82所組成之群組。對於非相連的部分，可刪除插入的核苷酸。變體之進一步的實例包括在表2A-C中所列的SEQ ID NO之任一者之整個長度具有約或至少約70%序列一致性或相同性(例如)70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性或相同性的寡聚物。於一些實施方式中，包含如此變體序列、由如此變體序列組成、或基本上由如此變體序列組成的反義寡聚物或化合物之任一者會抑制GAA前驅mRNA中的ISS及/或ESS元件。於一些實施方式中，具有包含如此變體序列、由如此變體序列組成、或基本上由如此變體序列組成的靶向序列之反義寡聚物或化合物會抑制GAA前驅mRNA中的ISS及/或ESS元件。於一些實施方式中，具有包含如此變體序列、由如此變體序列組成、或基本上由如此變體序列組成的靶向序列的反義寡聚物或化合物會增加、增強、或促進成熟GAA mRNA中的外顯子2保留，視需要相較於對照組達至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、或65%或更高，根據本文所描述的實施例或方法之至少一者。於一些實施方式中，具有包含如此變體序列、由如此變體序列組成、或基本上由如此變體序列組成的靶向序列的反義寡聚物或化合物會在細胞中增加、增強、或促進GAA蛋白質表現，視需要相較於對照組達至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、或65%或更高，根據本文所描述的實施例或方法之至少一者。於一些實施方式中，包含如此 變體序列、由如此變體序列組成、或基本上由如此變體序列組成的反義寡聚物或化合物會在細胞中增加、增強、或促進GAA酵素性活性，視需要相較於對照組達至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、或65%或更高，根據本文所描述的實施例或方法之至少一者。如於本文中例示的，細胞(例如纖維母細胞)可獲得自具有IVS1-13T>G突變的患者。
於一些實施方式中，某些反義寡聚物包含以下者、由以下者組成、或基本上由以下者組成：如在表2B(或表2C)中詳述的序列或其變體或相連或非相連的部分。例如，某些反義寡聚物包含在表2B或2C中概述的SEQ ID NO之任一者之約或至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、或27個相連或非相連的核苷酸。對於非相連的部分，可刪除插入的核苷酸。變體之另外的實例包括於在表2B或2C中概述的SEQ ID NO之任一者之整個長度之範圍內具有約或至少約70%序列一致性或相同性，例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性或相同性的寡聚物。於一些實施方式中，具有包含如此變體序列、由如此變體序列組成、或基本上由如此變體序列組成的靶向序列的反義寡聚物或化合物會抑制GAA前驅mRNA中的ISS及/或ESS元件。於一些實施方式中，具有包含如此變體序列、由如此變體序列組成、或基本上由如此變體序列組成的靶向序列的反義寡聚物或化合物會在成熟GAA mRNA中增加、增強、或促進外顯子2保留，視需要相較於對照組達 至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、或65%或更高，根據本文所描述的實施例或方法之至少一者。於一些實施方式中，具有包含如此變體序列、由如此變體序列組成、或基本上由如此變體序列組成的靶向序列的反義寡聚物或化合物會在細胞中增加、增強、或促進GAA蛋白質表現，視需要相較於對照組達至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、或65%或更高，根據本文所描述的實施例或方法之至少一者。於一些實施方式中，包含如此變體序列、由如此變體序列組成、或基本上由如此變體序列組成的反義寡聚物或化合物會在細胞中增加、增強、或促進GAA酵素性活性，視需要相較於對照組達至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、或65%或更高，根據本文所描述的實施例或方法之至少一者。如於本文中例示的，細胞(例如纖維母細胞)可獲自具有IVS1-13T>G突變的患者。
於種種方面，提供反義寡聚物或化合物，其包含與人類GAA前驅mRNA之目標區域互補的(例如至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100%互補的)靶向序列，視需要地其中該靶向序列係如在表2A-2C之任一者中提出的。在另一個方面，提供反義寡聚物或化合物，其包含變體靶向序列(諸如該等本文所描述者之任一者)，其中該變體靶向序列與和在表2A-2C之任一者中提出的靶向序列之一或多者互補的(例如80%-100%互補的)人類前驅mRNA之目標區域結合。於一些實施方式中，該反義寡聚物或化合物與包含以下者的目標序列結合：人類GAA前驅mRNA(例如SEQ ID NO：1、2、或3之任一者或跨越由SEQ ID NO：1/4或SEQ ID NO：4/5界定的GAA前驅 mRNA剪接連接點的序列)之至少10個(例如至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40個)連續的鹼基。於一些實施方式中，該目標序列與在表2A-2C之任一者中提出的靶向序列之一或多者互補(例如至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100%互補)。於一些實施方式中，該目標序列與在表2A-2C之任一者中提出的靶向序列之一或多者之至少10個(例如至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28個)連續的鹼基互補(例如至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100%互補)。於一些實施方式中，該目標序列係由如在本文之表格之一或多者中提出的黏著位置(例如GAA-IVS1.SA.(-189,-165))界定。
反義寡聚物和其變體之活性可根據所屬技術領域中的例行技術分析。例如，所審視的RNA和蛋白質之剪接形式和表現水平可藉由各種各樣的用於偵測所轉錄的核酸或蛋白質之剪接形式及/或表現的廣為人知的方法之任一者評估。如此方法之非限制性實例包括RNA之經剪接形式之RT-PCR接著PCR產物之尺寸分離、核酸雜合方法，例如北方墨點轉漬法及/或核酸陣列之使用；核酸擴增方法；用於蛋白質之偵測的免疫學方法；蛋白質純化方法；且蛋白質功能或活性分析。
RNA表現水平可藉由以下者評估：自細胞、組織或生物體製備mRNA/cDNA(即所轉錄的多核苷酸)、和藉由雜合該mRNA/cDNA與為所分析的核酸之互補物、或其片段的參考多核苷酸。視需要地，可在與 互補的多核苷酸雜合前使用各種各樣的聚合酶連鎖反應或試管內轉錄方法之任一者擴增cDNA；較佳地，不擴增cDNA。亦可使用定量性PCR偵測一或多個轉錄物之表現以評估該(等)轉錄物之表現水平。
III.反義寡聚物化學
A.一般特性
本文之揭示內容之某些反義寡聚物與內含子性剪接靜默子元件或外顯子性剪接靜默子元件專一性地雜合。一些反義寡聚物包含在表2A-2C中提出的靶向序列、表2A-2C中的靶向序列之至少10個相連的核苷酸之片段、或與表2A-2C中的靶向序列有至少80%序列一致性的變體。特別的反義寡聚物由在表2A-2C中提出的靶向序列組成或基本上由在表2A-2C中提出的靶向序列組成。於一些實施方式中，該寡聚物係核酸酶抗性的。
於某些實施方式中，該反義寡聚物包含選自胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯N-啉基寡聚物(PMO)、胜肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚物、三環DNA寡聚物、三環硫代磷酸酯寡聚物、經2’O-Me修飾的寡聚物、或前述者之任何組合的非天然化學主鏈、及與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID.NO：1)(包括SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所鑑認的部分)、內含子2(SEQ ID.NO：5)、或外顯子2(SEQ ID.NO：4)內的區域互補的靶向序列。例如，於一些實施方式中，該靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。此外，和例如，該靶向序列係選自在表2A-2C中 概述的序列。於一些實施方式中，本文所描述的寡核苷酸具有在表4A-4C中提出的靶向序列。
本文之揭示內容之反義寡聚物一般包含複數個核苷酸次單元，其等各自帶有一起形成或包含靶向序列(例如如以上討論者)的核鹼基。據此，於一些實施方式中，該反義寡聚物範圍在長度為約10至約40個次單元，更佳係約10至30個次單元，且典型係15-25個次單元。例如，本文之揭示內容之反義化合物之長度可係10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40個次單元、或範圍為10個次單元至40個次單元、10個次單元至30個次單元、14個次單元至25個次單元、15個次單元至30個次單元、17個次單元至30個次單元、17個次單元至27個次單元、10個次單元至27個次單元、10個次單元至25個次單元、和10個次單元至20個次單元。於某些實施方式中，該反義寡聚物之長度係約10個至約40個或約5個至約30個核苷酸。於一些實施方式中，該反義寡聚物之長度係約14個至約25個或約17個至約27個核苷酸。
於種種實施方式中，反義寡聚物可包含完全經修飾的主鏈，例如主鏈之100%經修飾(例如25聚體反義寡聚物之整個主鏈都以如本文所描述的主鏈修飾之任何組合修飾)。於種種實施方式中，反義寡聚物之主鏈之約100%至2.5%可經修飾。於種種實施方式中，反義寡聚物之主鏈之約99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、或2.5%、和兩者間的重複可經修飾。於其他實施方式中，反義寡聚物可包含如本文所描述的主鏈修 飾之任何組合。
於種種實施方式中，反義寡聚物可包含以下者、由以下者組成、或基本上由以下者組成：胺基磷酸酯N-啉基寡聚物和二胺基磷酸酯N-啉基寡聚物(PMO)、經硫代磷酸酯修飾的寡聚物、經2’O-甲基修飾的寡聚物、胜肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚物、經2’O-MOE修飾的寡聚物、經2’-氟基修飾的寡聚物、經2’O,4’C-伸乙基橋接的核酸(ENA)、三環DNA、三環DNA硫代磷酸酯核苷酸、經2’-O-[2-(N-甲基胺甲醯基)乙基]修飾的寡聚物、N-啉基寡聚物、與胜肽綴合的胺基磷酸酯N-啉基寡聚物(PPMO)、具有帶有以下者的磷原子的二胺基磷酸酯N-啉基寡聚物：(i)接至N-啉基環之氮原子的共價鍵、和(ii)接至(1,4-哌)-1-基取代基或接至經取代的(1,4-哌)-1-基的第二共價鍵(PMOplus)、及具有帶有以下者的磷原子的二胺基磷酸酯N-啉基寡聚物：(i)接至N-啉基環之氮原子的共價鍵和(ii)接至4-胺基哌啶-1-基(即APN)或4-胺基哌啶-1-基之衍生物(PMO-X)化學之環氮的第二共價鍵，包括前述者之任一者之組合。
於一些實施方式中，該反義寡聚物之主鏈係實質上不帶電的，且視需要地被辨識為活性或促進性跨細胞膜運輸之受質。於一些實施方式中，所有的核苷間連結皆係不帶電的。該寡聚物與該目標RNA形成穩定雙鏈的能力亦可與該主鏈之其他特徵有關，包括該反義寡聚物相對於該目標之長度和互補程度、G：C對A：T鹼基配對之比率、和任何錯配鹼基之位置。該反義寡聚物對抗細胞核酸酶之能力可促進該劑之存活和至細胞質的最終遞送。例示性反義寡聚物靶向序列係在表2A、2B、和2C中列出。
於某些實施方式中，該反義寡聚物具有至少一個於生理pH下帶正電或係陽離子性的核苷間連結。於一些實施方式中，該反義寡聚物具有至少一個展現介於約5.5和約12的pKa之核苷間連結。在進一步的實施方式中，該反義寡聚物含有約、至少約、或不超過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個展現介於約4.5和約12間的pKa的核苷間連結。於一些實施方式中，該反義寡聚物含有約或至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%展現介於約4.5和約12的pKa的核苷間連結。視需要地，該反義寡聚物具有至少一個具有鹼性氮和烷基、芳基、或芳烷基基團兩者的核苷間連結。於特殊的實施方式中，該(等)陽離子性核苷間連結包含4-胺基哌啶-1-基(APN)基團、或其衍生物。雖然不欲受限於任何理論，咸相信在該寡聚物中一或多個陽離子性連結(例如APN基團或APN衍生物)之存在會促進與在目標核苷酸中的帶負電的磷酸之結合。因此，在突變體RNA和含陽離子性連結的寡聚物間的異源雙鏈之形成可藉由離子吸引力和華特生-克里克鹼基配對兩者保持住。
於一些實施方式中，陽離子性連結之數目係至少2個且不超過總核苷間連結之約一半，例如約或不超過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個陽離子性連結。然而，於一些實施方式中，至多達全部的核苷間連結係陽離子性連結，例如總核苷間連結之約或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40個係陽離子性連結。於特別的實 施方式中，約19-20個次單元的寡聚物可具有2-10個(例如4-8個)陽離子性連結，且剩下的是不帶電的連結。於其他特別的實施方式中，14-15個次單元的寡聚物可具有2-7個(例如2、3、4、5、6、或7個)陽離子性連結且剩下的是不帶電的連結。該寡聚物中陽離子性連結之總數因此變化可在約1個至10個至15個至20個至30個或更多個(包括兩者間的所有整數)，且可散佈在該寡聚物各處。
於一些實施方式中，反義寡聚物可具有約或至多約1個陽離子性連結每2-5個或2、3、4、或5個不帶電的連結，諸如約4-5個或4個或5個每10個不帶電的連結。
某些實施方式包括含有約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%陽離子性連結的反義寡聚物。於某些實施方式中，若約25%的主鏈連結係陽離子性的，則可見到於反義活性之最佳的改善。於某些實施方式中，於小數目(例如10-20%)的陽離子性連結時或在陽離子性連結之數目範圍在50-80%(諸如約60%)時，可見到增強。
於一些實施方式中，該等陽離子性連結係沿著該主鏈散佈。如此寡聚物視需要地含有至少二個連續的不帶電的連結；即該寡聚物視需要地沿著其全長不具有完全交替的模式。於特殊的實例中，每一個或二個陽離子性連結係沿著主鏈由至少1、2、3、4、或5個不帶電的連結分開。
亦包括者係具有陽離子性連結之嵌段和不帶電的連結之嵌段的寡聚物。例如，不帶電的連結之中心嵌段之兩側可與陽離子性連結之嵌段連接，或反之亦然。於一些實施方式中，該寡聚物具有大約相等長度 的5’、3’和中心區域，且中心區域中陽離子性連結之百分比係大於陽離子性連結之總數的約50%、60%、70%、或80%。
於某些反義寡聚物中，陽離子性連結之大多數(例如70、75%、80%、90%的陽離子性連結)係分佈在靠近「中心區域」主鏈連結，例如最中間的6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個連結。例如，具有的16、17、18、19、20、21、22、23、或24聚體寡聚物的所有陽離子性連結之至少50%、60%、70%、或80%可位於8、9、10、11、或12個最中間的連結。
B.主鏈化學特徵
該等反義寡聚物可利用各種各樣的反義化學。寡聚物化學之實例包括(但不限於)胺基磷酸酯N-啉基寡聚物和二胺基磷酸酯N-啉基寡聚物(PMO)、經硫代磷酸酯修飾的寡聚物、經2’O-甲基修飾的寡聚物、胜肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚物、經2’O-MOE修飾的寡聚物、經2’-氟基修飾的寡聚物、經2’O,4’C-伸乙基橋接的核酸(ENA)、三環DNA、三環DNA硫代磷酸酯核苷酸、經2’-O-[2-(N-甲基胺甲醯基)乙基]修飾的寡聚物、N-啉基寡聚物、與胜肽綴合的胺基磷酸酯N-啉基寡聚物(PPMO)、具有帶有以下者的磷原子的二胺基磷酸酯N-啉基寡聚物：(i)接至N-啉基環之氮原子的共價鍵、和(ii)接至(1,4-哌)-1-基取代基或接至經取代的(1,4-哌)-1-基的第二共價鍵(PMOplus)、及具有帶有以下者的磷原子的二胺基磷酸酯N-啉基寡聚物：(i)接至N-啉基環之氮原子的共價鍵和(ii)接至4-胺基哌啶-1-基(即APN)或4-胺基哌啶-1-基 之衍生物(PMO-X)化學之環氮的第二共價鍵，包括前述者之任一者之組合。一般而言，因為PNA和LNA化學相較於經PMO和2’O-Me修飾的寡聚物具有相對高的目標結合力，所以其等可利用較短的靶向序列。可組合硫代磷酸酯和經2’O-Me修飾的化學以產生2’O-Me-硫代磷酸酯主鏈。參見(例如)PCT公開案編號WO/2013/112053和WO/2009/008725，其等特此以其等之完整內容以引用方式併入。
於一些實例中，諸如PMO的反義寡聚物可與細胞穿透性胜肽(CPP)綴合以促進細胞內遞送。與胜肽綴合的PMO被稱為PPMO且某些實施方式包括該等於PCT公開案編號WO/2012/150960(以其完整內容以引用方式併入本文中)中描述者。於一些實施方式中，可使用與(例如)如本文所描述的反義寡聚物之3’端綴合或連接的富精胺酸胜肽序列。於某些實施方式中，可使用與(例如)如本文所描述的反義寡聚物之5’端綴合或連接的富精胺酸胜肽序列。
1.胜肽核酸(PNA)
胜肽核酸(PNA)係DNA之類似物，其中其主鏈與去氧核糖主鏈係結構上同形，其係由嘧啶或嘌呤鹼基所接附的N-(2-胺基乙基)甘胺酸單元組成。含有天然嘧啶和嘌呤鹼基的PNA遵照華特生-克里克鹼基配對規則與互補的寡聚物雜合，且在鹼基對辨識的方面模仿DNA(Egholm,Buchardt等人1993)。PNA之主鏈係由胜肽鍵而非磷酸二酯鍵形成，使其等非常適合用於反義應用(參見以下結構)。其主鏈係不帶電的，造成展現大於正常熱穩定性的PNA/DNA或PNA/RNA雙鏈。PNA不會被被核酸酶或蛋 白酶辨識。PNA之非限制性實例係於以下描繪：
儘管有對於天然結構的根本結構改變，PNA能夠以螺旋形式與DNA或RNA序列專一性結合。PNA之特徵包括對互補DNA或RNA之高結合親和力、由單一鹼基錯配引起的去穩定化效果、對核酸酶和蛋白酶的抗性、獨立於鹽濃度的與DNA或RNA之雜合以及與同嘌呤DNA的三鏈形成。PANAGENETM已開發出其專有的Bts PNA單體(Bts；苯并噻唑-2-磺醯基基團)和專有的寡聚化方法。使用Bts PNA單體的PNA寡聚化係由去保護、偶合和封端之重複循環組成。PNA可使用任何所屬技術領域中已知的技術合成性地產生。參見(例如)美國專利案編號6,969,766、7,211,668、7,022,851、7,125,994、7,145,006和7,179,896。對於PNA之製備，亦參見美國專利案編號5,539,082；5,714,331；及5,719,262。對於PNA化合物之進一步教示可於Nielsen等人，Science,254：1497-1500,1991中找到。前述者之每一者皆以其完整內容以引用方式併入。
2.鎖核酸(LNA)
反義寡聚物化合物亦可含有「鎖核酸」次單元(LNA)。「LNA」 係一類稱為橋接核酸(BNA)的修飾之成員。BNA之特徵在於鎖住C30-內(北方)糖折疊中的核糖環之構形的共價連結。對於LNA而言，其橋接係由在2’-O和4’-C位置間的亞甲基組成。LNA增強主鏈預組織化和鹼基堆疊以增加雜合和熱穩定性。
LNA之結構可於(例如)以下者中找到：Wengel、等人，Chemical Communications(1998)455；Tetrahedron(1998)54：3607、和Accounts of Chem.Research(1999)32：301)；Obika、等人，Tetrahedron Letters(1997)38：8735；(1998)39：5401、和Bioorganic Medicinal Chemistry(2008)16：9230，其等特此以其等之完整內容以引用方式併入。LNA之非限制性實例係於以下描繪：
本文之揭示內容之化合物可併入一或多個LNA；於一些例子中，該等化合物可完全由LNA組成。用於個別LNA核苷次單元之合成和其等至寡聚物中之併入的方法係(例如)於以下者中描述：美國專利案編號7,572,582、7,569,575、7,084,125、7,060,809、7,053,207、7,034,133、6,794,499、和6,670,461，其等之每一者皆以其完整內容以引用方式併入。典型的次單元間連接子包括磷酸二酯和硫代磷酸酯部分；供選擇地，可利用非含磷的 連接子。進一步的實施方式包括含有其中各個LNA次單元係由DNA次單元分開的化合物之LNA。某些化合物係由交替的LNA和DNA次單元組成，其中的次單元間連接子係硫代磷酸酯。
經2’O,4’C-伸乙基橋接的核酸(ENA)係另一個BNA之類型之成員。非限制性實例係於以下描繪：
ENA寡聚物和其等之製備係於Obika等人，Tetrahedron Ltt 38(50)：8735(其特此以其完整內容以引用方式併入)描述。本文之揭示內容之化合物可併入一或多個ENA次單元。
3.硫代磷酸酯
「硫代磷酸酯」(或S-oligo)係正常DNA之變體，其中非橋接性氧之一被硫置換。硫代磷酸酯之非限制性實例係於以下描繪：
核苷酸間鍵之硫化會減少內切和外切核酸酶(包括5’至3’和3’至5’DNA POL 1外切核酸酶、核酸酶S1和P1、RNA酶、血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶)之作用。硫代磷酸酯係由二個主要的途徑製造： 藉由在膦酸氫化物上的元素硫之二硫化碳溶液之作用、或藉由以二硫化四乙基秋蘭姆(TETD)或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(BDTD)硫化亞磷酸三酯的方法(參見(例如)Iyer等人，J.Org.Chem.55,4693-4699,1990，其等特此以其等之完整內容以引用方式併入)。後者的方法躲避了元素硫不溶於大多數有機溶劑中和二硫化碳之毒性的問題。TETD和BDTD方法亦產生純度較高的硫代磷酸酯。
4.三環DNA和三環硫代磷酸酯核苷酸
三環DNA(tc-DNA)係一類受拘束的DNA類似物，其中各個核苷酸係藉由環丙烷環之導入來修飾以限制主鏈之構形可撓性並以最佳化扭轉角γ之主鏈幾何形狀。含同鹼基腺嘌呤和胸腺嘧啶tc-DNA與互補的RNA形成格外穩定的A-T鹼基對。三環DNA和其等之合成係在國際專利申請案公開編號WO 2010/115993(其等特此以其等之完整內容以引用方式併入)中描述。本文之揭示內容之化合物可併入一或多個三環DNA核苷酸；於一些例子中，該等化合物可完全由三環DNA核苷酸組成。
三環硫代磷酸酯核苷酸係具有硫代磷酸酯次單元間連結的三環DNA核苷酸。三環硫代磷酸酯核苷酸和其等之合成係於國際專利申請案公開編號WO 2013/053928(其等特此以其等之完整內容以引用方式併入)中描述。本文之揭示內容之化合物可併入一或多個三環DNA核苷酸；於一些例子中，該等化合物可完全由三環DNA核苷酸組成。三環DNA/三環硫代磷酸酯核苷酸之非限制性實例係於以下描繪：
5. 2’O-甲基、2’O-MOE、和2’-F寡聚物
「2’O-Me寡聚物」分子於核糖分子之2’-OH殘基帶有甲基基團。2’-O-Me-RNA顯示與DNA相同(或相似)的行為，但經保護對抗核酸酶降解。2’-O-Me-RNA亦可與硫代磷酸酯寡聚物(PTO)組合以用於進一步穩定化。2’O-Me寡聚物(磷酸二酯或硫代磷酸酯)可根據所屬技術領域中的例行技術合成(參見(例如)Yoo等人，Nucleic Acids Res.32：2008-16,2004，其特此以其完整內容以引用方式併入)。2’O-Me寡聚物之非限制性實例係於以下描繪：
2’O-Me寡聚物亦可包含硫代磷酸酯連結(2’O-Me硫代磷酸酯寡聚物)。與2’O-Me寡聚物相同，2’O-甲氧基乙基寡聚物(2’-O MOE)於核糖分子之2’-OH殘基帶有甲氧基乙基基團且係於Martin等人，Helv.Chim.Acta,78,486-504,1995(其等特此以其等之完整內容以引用方式 併入)中討論。2’O-MOE核苷酸之非限制性實例係於以下描繪：
與前面的經烷基化2’OH核糖衍生物相反，2’-氟基寡聚物於2’位置具有氟基取代2’OH。2’-F寡聚物之非限制性實例係於以下描繪：
2’-氟基寡聚物係進一步於WO 2004/043977(其特此以其完整內容以引用方式併入)中描述。本文之揭示內容之化合物可併入一或多個2’O-甲基、2’O-MOE、和2’-F次單元且可利用本文中描述的次單元間連結之任一者。於一些實例中，本文之揭示內容之化合物可完全由2’O-甲基、2’O-MOE、或2’-F次單元組成。本文之揭示內容之化合物之一個實施方式係完全由2’O-甲基次單元組成。
6. 2'-O-[2-(N-甲基胺甲醯基)乙基]寡核苷酸(MCE)
MCE係有用於本文之揭示內容之化合物中的經2’O修飾的核糖核苷之另一個實例。此處，2’OH被衍生成2-(N-甲基胺甲醯基)乙基部分以增加核酸酶抗性。MCE寡聚物之非限制性實例係於以下描繪：
MCE和其等之合成係於Yamada等人，J.Org.Chem.,76(9)：3042-53(其特此以其完整內容以引用方式併入)中描述。本文之揭示內容之化合物可併入一或多個MCE次單元。
7.立體特異性寡聚物
立體特異性寡聚物係該等各個含磷連結之立體化學係藉由合成方法固定以產生實質上純的單一寡聚物者。立體特異性寡聚物之非限制性實例係於以下描繪：
於以上的實例中，該寡聚物之各個磷具有相同的立體化學。另外的實例包括以上描述的寡聚物。例如，LNA、ENA、三環DNA、MCE、2’O-甲基、2’O-MOE、2’-F、和基於N-啉基的寡聚物可以諸如(例如)以下者的立體特異性含磷核苷間連結製備：硫代磷酸酯、磷酸二酯、胺基 磷酸酯、二胺基磷酸酯、或其他含磷核苷間連結。立體特異性寡聚物、如此寡聚物之製備方法、用於如此寡聚物之製備的手性受控合成、手性設計、和手性助劑係(例如)於WO2015107425、WO2015108048、WO2015108046、WO2015108047、WO2012039448、WO2010064146、WO2011034072、WO2014010250、WO2014012081、WO20130127858、和WO2011005761(其等之每一者皆特此以其完整內容以引用方式併入)詳述。
8.基於N- 啉基的寡聚物
基於N-啉基的寡聚物係論及包含支持核鹼基的N-啉基次單元且含有啉環取代核糖的寡聚物。例示性核苷間連結包括(例如)將一個N-啉基次單元的啉環氮連接至鄰接N-啉基次單元的4’環外碳的胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯核苷間連結。各個N-啉基次單元包含藉由鹼基特異性氫鍵與寡核苷酸中的鹼基有力地結合的嘌呤或嘧啶核鹼基。
基於N-啉基的寡聚物(包括反義寡聚物)係於(例如)以下者中詳述：美國專利案編號5,698,685；5,217,866；5,142,047；5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,521,063；5,506,337和繫屬美國專利申請案編號12/271,036；12/271,040；和PCT公開案編號WO/2009/064471和WO/2012/043730及Summerton等人1997,Antisense and Nucleic Acid Drug Development,7,187-195，其等特此以其等之完整內容以引用方式併入。在該寡聚物結構內，磷酸酯基團一般被稱為形成該寡聚物之「核苷間連結」。天然存在的RNA和DNA之核苷間連結係3’至5’磷酸二酯連結。「胺基磷酸酯」基團包含具有三個接附的氧原子和一個接附的氮原子之磷，而「二 胺基磷酸酯」基團包含具有二個接附的氧原子和二個接附的氮原子之磷。於本文所描述的基於N-啉基的寡聚物之不帶電或陽離子性次單元間連結中，一個氮總自主鏈伸出。於二胺基磷酸酯連結中，第二個氮典型係啉環結構中的環氮。
「PMO-X」係論及具有帶有以下者的磷原子的基於二胺基磷酸酯N-啉基的寡聚物：(i)接至啉環之氮原子的共價鍵和(ii)接至4-胺基哌啶-1-基(即APN)或4-胺基哌啶-1-基之衍生物之環氮的第二共價鍵。例示性PMO-X寡聚物係於PCT申請案編號PCT/US2011/38459和PCT公開案編號WO 2013/074834(其等特此以其等之完整內容以引用方式併入)中揭示。PMO-X包括「PMO-apn」或「APN」，其係論及包含至少一個其中磷原子係連接至N-啉基基團且連接至4-胺基哌啶-1-基(即APN)之環氮的核苷間連結之PMO-X寡聚物。於特別的實施方式中，包含如在表2A、2B、或2C中提出的靶向序列之反義寡聚物包含至少一個含APN連結或含APN衍生物連結。種種實施方式包括具有約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%含APN/APN衍生物連結的基於N-啉基的寡聚物，其中剩下的連結(若小於100%)係不帶電的連結，例如所有核苷間連結之約或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40者係含APN/APN衍生物連結。
於一些實施方式中，該反義寡聚物係式(I)之化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中：各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；Z係8至38的整數；各個Y係獨立地選自O和-NR4，其中各個R4係獨立地選自H、C1-C6烷基、芳烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)nNR5C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(=NH)NH2、和G，其中R5係選自H和C1-C6烷基且n係1至5的整數；T係選自OH和以下式的部分： 其中： A係選自-OH、-N(R7)2、和R1，其中各個R7係獨立地選自H和C1-C6烷基，且R6係選自OH、-N(R9)CH2C(O)NH2、和以下式的部分： 其中：R9係選自H和C1-C6烷基；且R10係選自G、-C(O)-R11OH、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)mNR12C(=NH)NH2、和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(=NH)NH2，其中：m係1至5的整數，R11係式-(O-烷基)y-，其中y係3至10的整數且y個烷基基團之各者係獨立地選自C2-C6烷基；且R12係選自H和C1-C6烷基；R1之各者係獨立地選自：-N(R13)2，其中各個R13係獨立地選自H和C1-C6烷基；式(II)之部分： 其中：R15係選自H、G、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)qNR18C(=NH)NH2、和 -C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR18C(=NH)NH2，其中：R18係選自H和C1-C6烷基；且q係1至5的整數，且各個R17係獨立地選自H和甲基；和式(III)之部分： 其中：R19係選自H、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)rNR22C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(=NH)NH2-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR22C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)4NH2和G，其中：R22係選自H和C1-C6烷基；且r係1至5的整數，且R20係選自H和C1-C6烷基；或R19和R20與其等所接附的氮原子一起形成具有5至7個環原子且視需要地含有選自氧、氮、和硫之額外的雜原子之雜環基或雜芳基環；且R2係選自H、G、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、硬脂醯基、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)-R23、-C(O)(CH2)sNR24C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR24C(=NH)NH2-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(=NH)NH2、和以下式的部分： 其中，R23係式-(O-烷基)v-OH，其中v係3至10的整數且v個烷基基團之各者係獨立地選自C2-C6烷基；且R24係選自H和C1-C6烷基；s係1至5的整數；L係選自-C(O)(CH2)6C(O)-和-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-；且各個R25係式-(CH2)2OC(O)N(R26)2，其中各個R26係式-(CH2)6NHC(=NH)NH2，其中G係選自以下者的細胞穿透性胜肽(「CPP」)和連接子部分：-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)CH2NH-CPP、和： 其中該CPP係於該CPP之羧基端藉由醯胺鍵接附至該連接子部分，且其中G可出現一次或不存在。
於一些實施方式中，R2係以下式的部分： 其中L係選自-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，且且各個R25係式-(CH2)2OC(O)N(R26)2，其中各個R26係式-(CH2)6NHC(=NH)NH2。如此部分係於美國專利案編號7,935,816(其係以其完整內容以引用方式併入本文中)中進一步描述。
於某些實施方式中，R2可包含以下描繪的部分之一：
於某些實施方式中，各個R1係-N(CH3)2。於一些實施方式中，約50-90%的R1基團係二甲基胺基(即-N(CH3)2)。於某些實施方式中，約66%的R1基團係二甲基胺基。
於一些非限制性實施方式中，該靶向序列係選自表2A-2C之序列，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。於一些非限制性實施方式中，各個R1係-N(CH3)2且該靶向序列係選自表2A-2C之序列，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
於一些本文之揭示內容之實施方式中，R1可係選自：
於一些實施方式中，至少一個R1係：
於某些實施方式中，T係選自： ；；；和，且Y每次出現係O。於一些實施方式中，R2係選自H、G、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、和硬脂醯基。
於種種實施方式中，T係選自：；；和，Y每次出現係O且R2係G。
於一些實施方式中，T係式： R6係式： Y每次出現係O且R2係G。
於某些實施方式中，T係式： Y每次出現係O且R2係G。於一些實施方式中，T係式： Y每次出現係O，各個R1係-N(CH3)2，且R2係G。
於某些實施方式中，T係式： 且Y每次出現係O。於一些實施方式中，T係式： Y每次出現係O，各個R1係-N(CH3)2，且R2係乙醯基。
於某些實施方式中，T係式：，Y每次出現係O，各個R1係-N(CH3)2，且R2係H。
於一些實施方式中，R2係選自H、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、和硬脂醯基。
於種種實施方式中，R2係選自H或G。在一個特殊的實施方式中，R2係G。於一些實施方式中，R2係H或醯基。於一些實施方式中，各個R1係-N(CH3)2。於一些實施方式中，R1之至少一者係-N(CH3)2。於某些實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2。
於一些實施方式中，G係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
於某些實施方式中，該CPP係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
在另一個方面，該反義寡聚物係式(Ia)之化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中：各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；Z係約13至約38的整數；各個Y係獨立地選自O和-NR4，其中各個R4係獨立地選自H、C1-C6烷基、芳烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)nNR5C(=NH)NH2、 -C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(=NH)NH2、和G，其中R5係選自H和C1-C6烷基且n係1至5的整數；T係選自OH和以下式的部分： 其中：A係選自-OH、-N(R7)2、和R1，其中：各個R7係獨立地選自H和C1-C6烷基，且R6係選自OH、-N(R9)CH2C(O)NH2、和以下式的部分： 其中：R9係選自H和C1-C6烷基；且R10係選自G、-C(O)-R11OH、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)mNR12C(=NH)NH2、和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(=NH)NH2，其中：m係1至5的整數，R11係式-(O-烷基)y-，其中y係3至10的整數且y個烷基基團之各者係獨立地選自C2-C6烷基；且R12係選自H和C1-C6烷基；R1之各者係獨立地選自： -N(R13)2，其中各個R13係獨立地選自H和C1-C6烷基；式(II)之部分： 其中：R15係選自H、G、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)qNR18C(=NH)NH2、和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR18C(=NH)NH2，其中：R18係選自H和C1-C6烷基；且q係1至5的整數；且各個R17係獨立地選自H和甲基；和式(III)之部分： 其中：R19係選自H、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)rNR22C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(=NH)NH2-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR22C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)4NH2和G，其中：R22係選自H和C1-C6烷基；且r係1至5的整數，且R20係選自H和C1-C6烷基；或R19和R20與其等所接附的氮原子一起形成具有5至7個環原子且視需要地含 有選自氧、氮、和硫之額外的雜原子之雜環基或雜芳基環；且R2係選自H、G、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、硬脂醯基、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)-R23、-C(O)(CH2)sNR24C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR24C(=NH)NH2-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(=NH)NH2、和以下式的部分： 其中，R23係式-(O-烷基)v-OH，其中v係3至10的整數且v個烷基基團之各者係獨立地選自C2-C6烷基；且R24係選自H和C1-C6烷基；s係1至5的整數；L係選自-C(O)(CH2)6C(O)-和-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-；且各個R25係式-(CH2)2OC(O)N(R26)2，其中各個R26係式-(CH2)6NHC(=NH)NH2，其中G係包含式-C(O)CH2NH-CPP的細胞穿透性胜肽(「CPP」)和連接子部分，其中CPP係式： 其中Ra係H或醯基，且其中G可出現一次或不存在。
於某些實施方式中，T係選自：；；；和，且Y每次出現係O。於一些實施方式中，R2係選自H、G、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、和硬脂醯基。
於種種實施方式中，T係選自：；；和，Y每次出現係O且R2係G。
於一些實施方式中，T係式： R6係式： Y每次出現係O且R2係G。
於某些實施方式中，T係式： Y每次出現係O且R2係G。於一些實施方式中，T係式： Y每次出現係O，各個R1係-N(CH3)2，且R2係G。
於某些實施方式中，T係式： 且Y每次出現係O。於一些實施方式中，T係式： Y每次出現係O，各個R1係-N(CH3)2，且R2係乙醯基。
於某些實施方式中，T係式：，Y每次出現係O，各個R1係-N(CH3)2，且R2係H。
於一些實施方式中，R2係選自H、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、和硬脂醯基。
於種種實施方式中，R2係選自H或G。在一個特殊的實施方式中，R2係G。於一些實施方式中，R2係H或醯基。於一些實施方式中，各個R1係-N(CH3)2。於一些實施方式中，R1之至少一者係-N(CH3)2。於某些實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2。
於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
於一些實施方式(包括(例如)式(I)和(Ia)之反義寡聚物之實施方式)中，該靶向序列係與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內的目標區域互補的。於種種實施方式(包括(例如)式(I)和(Ia)之反義寡聚物之實施方式)中，該靶向序列係與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1) 內的目標區域互補的，其中該目標區域相較於該靶向序列包含至少一個額外的核鹼基，其中該至少一個額外的核鹼基在該靶向序列中不具有互補的核鹼基，且其中該至少一個額外的核鹼基對於該目標區域而言係內部的。於某些實施方式中，該靶向序列包含選自SEQ ID NO：13-86的序列(如於本文之表2A-2C中顯示的)。於某些實施方式中，該靶向序列包含選自表2A和2B的序列。於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82所組成之群組。此外，和關於在本文之表2A-2C(或表2B和2C)中概述的序列，於某些實施方式中，選擇有100%互補性的序列且移除一或多個核鹼基(或供選擇地伴隨一或多個遺失的核鹼基合成其)以使得所得的序列於目標區域相較於其天然互補物具有一或多個遺失的核鹼基。除了一或多個核鹼基被移除的部分之外，設想到剩下的部分100%互補。然而，可存在減低水平的互補性係在本發明之範圍內。
於某些實施方式中，本文之揭示內容之反義寡聚物係式(IVa)之化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中：各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；Z係8至38的整數；T係選自OH和以下式的部分： 其中：A係選自-OH、-N(R7)2R8、和R1，其中：各個R7係獨立地選自H和C1-C6烷基，且R8係選自電子對和H，且R6係選自OH、-N(R9)CH2C(O)NH2、和以下式的部分： 其中：R9係選自H和C1-C6烷基；且R10係選自-C(O)-R11OH、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)mNR12C(=NH)NH2、和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(=NH)NH2，其中：m係1至5的整數，R11係式-(O-烷基)y-，其中y係3至10的整數且y個烷基基團之各者係獨立地選自C2-C6烷基；且R12係選自H和C1-C6烷基；R1之各者獨立地係-N(R13)2R14，其中各個R13係獨立地選自H和C1-C6烷基，且R14係選自電子對和H；且R2係選自H、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、硬脂醯基、和C1-C6烷基。
於某些實施方式中，T係選自：；；和，且Y每次出現係O。於一些實施方式中，R2係選自H、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、和硬脂醯基。
於種種實施方式中，T係選自：
於一些實施方式中，T係式：，且R6係式：
於某些實施方式中，T係式：
於一些實施方式中，R2係H、三苯甲基、或醯基。於一些實施方式中，R1之至少一個者係-N(CH3)2。於一些實施方式中，各個R1係-N(CH3)2。
於某些實施方式中，本文之揭示內容之反義寡聚物係式(IVb)之化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中：各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；Z係8至38的整數；T係選自以下式的部分： 其中R3係選自H和C1-C6烷基；R1之各者獨立地係-N(R4)2，其中各個R4係獨立地選自H和C1-C6烷基；且R2係選自H、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、硬脂醯基、和C1-C6烷基。
於種種實施方式中，R2係選自H或醯基。於一些實施方式中，R2係H。
於某些實施方式中，T係式：；且R2係氫。
於某些實施方式中，本文之揭示內容之反義寡聚物係式(IVc)之化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中：各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基； Z係8至38的整數；各個Y係O；各個R1係獨立地選自由以下者所組成之群組： 其中至少一個R1係-N(CH3)2。
於一些實施方式中，該靶向序列係選自SEQ ID NO：4至30、133至255、或296至342，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。於一些實施方式中，各個R1係-N(CH3)2。
於某些實施方式中，該反義寡聚物係式(V)之化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中：各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；且Z係8至38的整數。
於一些實施方式(包括(例如)式(IVa)、(IVb)、(IVc)和(V)之反義寡聚物之實施方式)中，該靶向序列係與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內的目標區域互補的。於種種實施方式(包括(例如)式(IVa)、(IVb)、(IVc)和(V)之反義寡聚物之實施方式)中，該靶向序列係與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內的目標區域互補的，其中該目標區域相較於該靶向序列包含至少一個額外的核鹼基，其中該至少一個額外的核鹼基在該靶向序列中不具有互補的核鹼基，且其中該至少一個額外的核鹼基對於該目標區域而言係內部的。於某些實施方式中，該靶向序列包含選自SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：86的序列，如於本文之表2A-2C中顯示的。於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82所組成之群組。於某些實施方式中，該靶向序列包含選自表2A-2C的序列。此外，和關於在本文之表2A-2C(或表2B和2C)中概述的序列，於某些實施方式中，選擇有100%互補性的序列且移除一或多個核鹼基(或供選擇地伴隨一或多個遺失的核鹼基合成其)以使得所得的序列於目標區域相較於其天然互補物具有一或多個遺失的核鹼基。除了一或多個核鹼基被移除的部分之外，設想到剩下的部分100%互補。然而，可存在減低水平的互補性係在本發明之範圍內。
於某些實施方式中，該反義寡聚物係式(VI)之化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基； Z係8至38的整數；T係選自： 各個R1係獨立地選自由以下者所組成之群組： R2係選自H、G、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、和硬脂醯基，其中G係選自以下者的細胞穿透性胜肽(「CPP」)和連接子部分：-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)CH2NH-CPP、和： 其中該CPP係於該CPP之羧基端藉由醯胺鍵接附至該連接子部分，且 其中T係或R2係G。
於某些實施方式中，T係式： 且R2係G。於某些實施方式中，R1之至少一者係-N(CH3)2。於一些實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2。於一些實施方式中，T係式：
於某些實施方式中，R1之至少一者係-N(CH3)2。於一些實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2。
於一些實施方式中，T係式： R2係G，且R1之各者係-N(CH3)2。
於某些實施方式中，R2係選自H、乙醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、和硬脂醯基且T係式：。於種種實施方式中，R2係乙醯基。於某些實施方式中，R1之至少一者係-N(CH3)2。於一些實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2。
於種種實施方式中，R2係選自H、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、和硬脂醯基。
於某些實施方式中，R2係乙醯基，T係式：，且R1之各者係-N(CH3)2。
於一些實施方式中，其中G係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
於一些實施方式中，該CPP係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
於某些實施方式中，該反義寡聚物係式(VII)之化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；Z係8至38的整數；T係選自： 各個R1係-N(R4)2，其中各個R4獨立地係C1-C6烷基；且R2係選自H、G、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、和硬脂醯基，其中G係選自以下者的細胞穿透性胜肽(「CPP」)和連接子部分：-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)CH2NH-CPP、和： 其中該CPP係於該CPP之羧基端藉由醯胺鍵接附至該連接子部分，且其中T係或R2係G。
於一些實施方式中，R1之至少一個者係-N(CH3)2。於某些實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2。
於某些實施方式中，T係式： 且R2係G。於一些實施方式中，R1之至少一個者係-N(CH3)2。於某些實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2。
於種種實施方式中，G係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
於某些實施方式中，該CPP係式： 其中Ra係選自H、乙醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
於某些實施方式中，該反義寡聚物係式(VIIa)之化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；Z係8至38的整數；T係選自： R1之各者係-N(R4)2，其中各個R4獨立地係C1-C6烷基；且G係選自以下者的細胞穿透性胜肽(「CPP」)和連接子部分：-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)CH2NH-CPP、和： 其中該CPP係於該CPP之羧基端藉由醯胺鍵接附至該連接子部分。
於一些實施方式中，R1之至少一個者係-N(CH3)2。於某些實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2。
於一些實施方式中，G係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
於種種實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2，G係式：，且Ra係乙醯基。
於某些實施方式中，該CPP係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。於種種實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2，該CPP係式：，且Ra係乙醯基。
於種種方面，本文之揭示內容之反義寡核苷酸包括式(VIIb)之化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中：其中各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；Z係8至38的整數；R1之各者係-N(R4)2，其中各個R4獨立地係C1-C6烷基；且G係選自以下者的細胞穿透性胜肽(「CPP」)和連接子部分：-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)CH2NH-CPP、和： 其中該CPP係於該CPP之羧基端藉由醯胺鍵接附至該連接子部分。
於一些實施方式中，R1之至少一個者係-N(CH3)2。於某些實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2。
於一些實施方式中，G係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
於種種實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2，G係式：，且Ra係乙醯基。
於某些實施方式中，該CPP係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。於種種實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2，該CPP係式： ，且Ra係乙醯基。
於種種方面，本文之揭示內容之反義寡核苷酸包括式(VIIc)之化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中：其中各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；Z係8至38的整數；且G係選自以下者的細胞穿透性胜肽(「CPP」)和連接子部分： -C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)CH2NH-CPP、和： 其中該CPP係於該CPP之羧基端藉由醯胺鍵接附至該連接子部分。
於一些實施方式中，G係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
於種種實施方式中，G係式：，且Ra係乙醯基。
於某些實施方式中，該CPP係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。於種種實施方式中，該CPP係式：，且Ra係乙醯基。
於種種方面，本文之揭示內容之反義寡聚物係式(VIId)之化合物： 其中：各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；Z係8至38的整數；R1之各者係-N(R4)2，其中各個R4獨立地係C1-C6烷基；且R2係選自H、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、乙醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基；且G係選自以下者的細胞穿透性胜肽(「CPP」)和連接子部分：-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)CH2NH-CPP、和： 其中該CPP係於該CPP之羧基端藉由醯胺鍵接附至該連接子部分。
於一些實施方式中，R1之至少一個者係-N(CH3)2。於某些實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2。
於一些實施方式中，G係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
於種種實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2，G係式：，且Ra係乙醯基。
於某些實施方式中，該CPP係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra 係乙醯基。於種種實施方式中，R1之各者係-N(CH3)2，該CPP係式：，且Ra係乙醯基。
於種種方面，本文之揭示內容之反義寡核苷酸包括式(VIIe)之化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中：各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；Z係8至38的整數； R2係選自H、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、乙醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基，；且G係選自以下者的細胞穿透性胜肽(「CPP」)和連接子部分：-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)CH2NH-CPP、和： 其中該CPP係於該CPP之羧基端藉由醯胺鍵接附至該連接子部分。
於一些實施方式中，G係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
於種種實施方式中，G係式：，且Ra係乙醯基。
於某些實施方式中，該CPP係式： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。於種種實施方式中，該CPP係式：，且Ra係乙醯基。
於一些實施方式(包括(例如)式(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之反義寡聚物之實施方式)中，該靶向序列係與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內的目標區域互補的。於種種實施方式(包括(例如)式(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之反義寡聚物之實施方式)中，該靶向序列係與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內的目標區域互補的，其中該目標區域相較於該靶向序列包含至少一個額外的核鹼基，其中該至少一個額外的核鹼基在該靶向序列中不具有互補的核鹼基，且其中該至少一個額外的核鹼基對於該目標區域而言係內部的。於某些實施方式中，該靶向序列包含選自SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：86(例如SEQ ID NO：13-58或59-75)的序列。於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82所組成之群組。於某些實施方式中，該靶向序列包含選自表2A-2C的序列。此外，和關於在本文之表2A-2C中概述的序列，於某些實施方式中，選擇有100%互補性的序列且移除一或多個核鹼基(或供選擇地伴隨一或多個遺失的核鹼基合成其)以使得所得的序列於目標區域相較於其天然互補物具有一或多個遺失的核鹼基。除了一或多個核鹼基被移除的部分之外，設想到剩下的部分100%互補。然而，可存在減低水平的互補性係在本發明之範圍內。
於本文所描述的反義寡聚物、方法、或組成物之任一者之一些實施方式中，Z係8至28、15至38、15至28、8至25、15至25、10至38、10至25、12至38、12至25、14至38、或14至25的整數。於本文所描述的反義寡聚物、方法、或組成物之任一者之一些實施方式中，Z係12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、或38。於本文所描述的反義寡聚物、方法、或組成物之任一者之一些實施方式中，Z係12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28。於本文所描述的反義寡聚物、方法、或組成物之任一者之一些實施方式中，Z係15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係8至28的整數。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物 (包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係15至38的整數。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係15至28的整數。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係8至25的整數。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係15至25的整數。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係10至38的整數。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係10至25的整數。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係12至38的整數。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、 (VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係12至25的整數。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係14至38的整數。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係14至25的整數。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、或38。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之經修飾的反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Z係15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、 (VIIe)、和(VIII)之化合物)之各個Nu係獨立地選自由腺嘌呤、鳥糞嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、次黃嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、經C5-丙炔基修飾的嘧啶、和9-(胺基乙氧基)啡所組成之群組。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之靶向序列係與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID.NO.1)、內含子2(SEQ ID.NO.60)、或外顯子2(SEQ ID.NO.61)內的目標區域中之10或更多個相連的核苷酸互補。於某些實施方式中，本文之揭示內容之反義寡聚物(包括式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、和(VIII)之化合物)之靶向序列包含選自表2A-2C之序列(如本文所描述的)的序列、係選自表2A-2C的序列(如本文所描述的)之至少12個相連的核苷酸之片段或係與選自表2A-2C的序列(如本文所描述的)具有至少90%序列一致性的變體(其中當取決於所提及的表格係適用時X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T))。於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82所組成之群組。
其他可根據本文之揭示內容使用的反義寡聚物/化學包括該等於以下專利案和專利公開案中描述者(其等之內容係以引用方式併入本文中)：PCT公開案編號WO/2007/002390；WO/2010/120820；且WO/2010/148249；美國專利案編號7,838,657；且美國申請案編號2011/0269820。
該反義寡核苷酸可藉由逐步固相合成利用所屬技術領域中 已知和在本文中引用的文獻中描述的方法製備。
C. PMO之CPP和富精胺酸胜肽綴合物(PPMO)
於某些實施方式中，該反義寡核苷酸係與細胞穿透性胜肽(在本文中稱為「CPP」)綴合。於一些實施方式中，該CPP係富精胺酸胜肽。術語「富精胺酸」係論及具有至少2個(且較佳係2、3、4、5、6、7、或8個)精胺酸殘基(各個視需要地由一或多個不帶電的疏水性殘基分開)且視需要含有約6-14胺基酸殘基的CPP。如在以下解釋的，CPP較佳係於其羧基端透過連接子(其亦可係一或多個胺基酸)與反義寡核苷酸之3’及/或5’端連結，且較佳亦於其胺基端藉由取代基Ra(其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、或硬脂醯基)加帽。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
如在以下表格中所見，用於本文中的CPP之非限制性實例包括-(RXR)4-Ra、R-(FFR)3-Ra、-B-X-(RXR)4-Ra、-B-X-R-(FFR)3-Ra、-GLY-R-(FFR)3-Ra、-GLY-R6-Ra和-R6-Ra，其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基，且其中R係精胺酸、X係6-胺基已酸、B係β-丙胺酸、F係苯丙胺酸且GLY(或G)係甘胺酸。該CPP「R6」係意欲指示通過醯胺鍵連接在一起的六(6)個精胺酸殘基之胜肽(而非單一取代基，例如R6)。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
例示性CPP係在表2D中(SEQ ID NO：6-12)提供。
CPP、其等之合成、和與寡聚物綴合之方法係在美國申請案公開編號2012/0289457及國際專利申請案公開編號WO 2004/097017、WO 2009/005793、和WO 2012/150960(其等之揭示內容係以其等之完整內容以引用方式併入本文中)中進一步描述。
於一些實施方式中，反義寡核苷酸包含取代基「G」，其被定義成CPP與連接子之組合。該連接子於該CPP羧基端將該CPP橋接至該寡核苷酸之3’端及/或5’端。於種種實施方式中，反義寡核苷酸可包含連接至該寡聚物之3’端的僅僅一個CPP。於其他實施方式中，反義寡核苷酸可包含連接至該寡聚物之5’端的僅僅一個CPP。
G內的連接子可包含(例如)1、2、3、4、或5個胺基酸。
於特殊的實施方式中，G係選自：-C(O)(CH2)5NH-CPP；-C(O)(CH2)2NH-CPP；-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP； -C(O)CH2NH-CPP、和式： 其中該CPP係於該CPP之羧基端藉由醯胺鍵接附至該連接子部分。
於種種實施方式中，該CPP係如以上界定和在表2D中所見的富精胺酸胜肽。於某些實施方式中，該富精胺酸CPP係-R6-Ra(即六個精胺酸殘基；SEQ ID NO：12)，其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。Ra係乙醯基。於種種實施方式中，該CPP係選自SEQ ID NO：6、7、或12，且該連接子係選自以上描述的基團。於一些實施方式中，該CPP係SEQ ID NO：12且該連接子係Gly。
於某些實施方式中，G係於本文之揭示內容之反義寡聚物之5’及/或3’端與該寡聚物共價鍵結的-C(O)CH2NH-R6-Ra，其中Ra係H、醯基、苯甲醯基、或硬脂醯基以加帽R6之胺基端。Ra係乙醯基。在此等非限制性實例中，該CPP係-R6-Ra且該連接子係-C(O)CH2NH-(即GLY)。此G=-C(O)CH2NH-R6-Ra之特別實例亦由以下結構例示： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於一些實施方式中，G係選自SEQ ID NO：3-6。於某些實施方式中，G係SEQ ID NO：6。於一些實 施方式中，Ra係乙醯基。
於種種實施方式中，該CPP係-R6-Ra，亦如以下式例示： 其中Ra係選自H、醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基。於某些實施方式中，該CPP係SEQ ID NO：XX。於一些實施方式中，Ra係乙醯基。
於一些實施方式中，該CPP係-(RXR)4-Ra，亦如以下式例示：
於種種實施方式中，該CPP係-R-(FFR)3-Ra，亦如以下式例示：
於種種實施方式中，G係選自：-C(O)(CH2)5NH-CPP；-C(O)(CH2)2NH-CPP；-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP；-C(O)CH2NH-CPP、和式： 其中該CPP係於該CPP之羧基端藉由醯胺鍵接附至該連接子部分，且其中該CPP係選自：、(-R-(FFR)3-Ra)、、(-(RXR)4-Ra)、或 、(-R6-Ra)。於一些實施方式中，Ra係乙醯基
於一些實施方式中，本文之揭示內容之反義寡聚物係選自以下者的式(VIII)之化合物： 和 或前述者之一之醫藥上可接受的鹽，其中：各個Nu係一起形成靶向序列的嘌呤或嘧啶鹼基配對部分；Z係8至38的整數； Ra係選自H、乙醯基、苯甲醯基、和硬脂醯基；且Rb係選自H、乙醯基、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、和4-甲氧基三苯甲基。
於一些實施方式(包括(例如)式(VIII)之反義寡聚物之實施方式)中，該靶向序列係與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內的目標區域互補的。
於種種實施方式(包括(例如)式(VIII)之反義寡聚物之實施方式)中，該靶向序列係與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內的目標區域互補的，其中該目標區域相較於該靶向序列包含至少一個額外的核鹼基，其中該至少一個額外的核鹼基在該靶向序列中不具有互補的核鹼基，且其中該至少一個額外的核鹼基對於該目標區域而言係內部的。於某些實施方式中，該靶向序列包含選自SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：86的序列(例如SEQ ID NO：13-58或59-75之任一者)。於某些實施方式中，該靶向序列包含選自表2A-2C的序列。於某些實施方式中，該靶向序列包含選自表2A和2B的序列。此外，和關於在本文之表2A-2C中概述的序列，於某些實施方式中，選擇有100%互補性的序列且移除一或多個核鹼基(或供選擇地伴隨一或多個遺失的核鹼基合成其)以使得所得的序列於目標區域相較於其天然互補物具有一或多個遺失的核鹼基。除了一或多個核鹼基被移除的部分之外，設想到剩下的部分100%互補。然而，可存在減低水平的互補性係在本發明之範圍內。。
於一些實施方式中，本文之揭示內容之反義寡聚物(包括(例如)式(I)、(Ia)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(VI)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、 (VIId)、(VIIe)、和(VIII)之反義寡聚物之一些實施方式)之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列(如本文所描述的)和如以下者：I.uu)SEQ ID NO：13(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC)，其中Z係22；vv)SEQ ID NO：14(GCC AGA AGG AAG GC GAG AAA AGC X)，其中Z係22；ww)SEQ ID NO：15(CCA GAA GGA AGG CGA GAA AAG CXC)，其中Z係22；xx)SEQ ID NO：16(CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC XCC)，其中Z係22；yy)SEQ ID NO：17(AGA AGG AAG GCG AGA AAA GCX CCA)，其中Z係22；zz)SEQ ID NO：18(GAA GGA AGG CGA GAA AAG CXC CAG)，其中Z係22；aaa)SEQ ID NO：19(AAG GAA GGC GAG AAA AGC XCC AGC)，其中Z係22；bbb)SEQ ID NO：20(AGG AAG GCG AGA AAA GCX CCA GCA)，其中Z係22；ccc)SEQ ID NO：21(CGG CXC XCA AAG CAG CXC XGA GA)，其中Z係21；ddd)SEQ ID NO：22(ACG GCX CXC AAA GCA GCX CXG AG)，其中Z係21；eee)SEQ ID NO：23(CAC GGC XCX CAA AGC AGC XCX GA)，其中Z係21；fff)SEQ ID NO：24(XCA CGG CXC XCA AAG CAG CXC XG)，其中Z係21；ggg)SEQ ID NO：25(CXC ACG GCX CXC AAA GCA GCX CX)，其中Z係21；hhh)SEQ ID NO：26(ACX CAC GGC XCX CAA AGC AGC XC)，其中Z係21；iii)SEQ ID NO：27(GCG GCA CXC ACG GCX CXC AAA GC)，其中Z係21； jjj)SEQ ID NO：28(GGC GGC ACX CAC GGC XCX CAA AG)，其中Z係21；kkk)SEQ ID NO：29(CGG CAC XCA CGG CXC XCA AAG CA)，其中Z係21；lll)SEQ ID NO：30(GCA CXC ACG GCX CXC AAA GCA GC)，其中Z係21；mmm)SEQ ID NO：31(GGC ACX CAC GGC XCX CAA AGC AG)，其中Z係21；nun)SEQ ID NO：32(CAC XCA CGG CXC XCA AAG CAG CX)，其中Z係21；ooo)SEQ ID NO：33(GCC AGA AGG AAG GCG AGA AAA GC)，其中Z係21；ppp)SEQ ID NO：34(CCA GAA GGA AGG CGA GAA AAG C)，其中Z係19；qqq)SEQ ID NO：35(CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC)，其中Z係19；rrr)SEQ ID NO：36(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA AG)，其中Z係21；sss)SEQ ID NO：37(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA A)，其中Z係19；ttt)SEQ ID NO：38(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA)，其中Z係19；uuu)SEQ ID NO：39(CGG CAC XCA CGGC XCX CAA AGC A)，其中Z係21；vvv)SEQ ID NO：40(GCG GCA CXC ACGG CXC XCA AAG C)，其中Z係21；www)SEQ ID NO：41(GGC GGC ACX CAC G GCX CXC AAA G)，其中Z係21；xxx)SEQ ID NO：42(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GGC)，其中Z係22；yyy)SEQ ID NO：43(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GC)，其中Z係21；zzz)SEQ ID NO：44(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA C)，其中Z係20；aaaa)SEQ ID NO：45(GGC CAG AAG GAA GCG AGA AAA GC)，其中Z係21；bbbb)SEQ ID NO：46(GGC CAG AAG GAA CGA GAA AAG C)，其中Z係20； cccc)SEQ ID NO：47(AGG AAG CGA GAA AAG CXC CAG CA)，其中Z係21；dddd)SEQ ID NO：48(AGG AAC GAG AAA AGC XCC AGC A)，其中Z係20；eeee)SEQ ID NO：49(CGG GCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA)，其中Z係22；ffff)SEQ ID NO：50(CGC XCX CAA AGC AGC XCX GAG A)，其中Z係20；gggg)SEQ ID NO：51(CCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA)，其中Z係19；hhhh)SEQ ID NO：52(GGC GGC ACX CAC GGG CXC XCA AAG)，其中Z係22；iiii)SEQ ID NO：53(GGC GGC ACX CAC GCX CXC AAA G)，其中Z係20；jjjj)SEQ ID NO：54(GGC GGC ACX CAC CXC XCA AAG)，其中Z係19；kkkk)SEQ ID NO：55(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GGC)，其中Z係22；llll)SEQ ID NO：56(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GC)，其中Z係21；mmmm)SEQ ID NO：57(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG C)，其中Z係20；和nnnn)SEQ ID NO：58(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACC)，其中Z係19，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)；II.r)SEQ ID NO：59(GGC CAG AAG GAA GGG CGA GAA AAG C)，其中Z係23；s)SEQ ID NO：60(CCA GAA GGA AGG GCG AGA AAA GCX C)，其中Z係 23；t)SEQ ID NO：61(AAG GAA GGG CGA GAA AAG CXC CAG C)，其中Z係23；u)SEQ ID NO：62(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GGG C)，其中Z係23；v)SEQ ID NO：63(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GGG C)，其中Z係23；w)SEQ ID NO：64(AGA AGG AAG GGC GAG AAA AGC XCC A)，其中Z係23；x)SEQ ID NO：65(GCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA CAX C)，其中Z係23；y)SEQ ID NO：66(CXC XCA AAG CAG CXC XGA GAC AXC A)，其中Z係23；z)SEQ ID NO：67(XCX CAA AGC AGC XCX GAG ACA XCA A)，其中Z係23；aa)SEQ ID NO：68(CXC AAA GCA GCX CXG AGA CAX CAA C)，其中Z係23；bb)SEQ ID NO：69(XCA AAG CAG CXC XGA GAC AXC AAC C)，其中Z係23；cc)SEQ ID NO：70(CAA AGC AGC XCX GAG ACA XCA ACC G)，其中Z係23；dd)SEQ ID NO：71(AAA GCA GCX CXG AGA CAX CAA CCG C)，其中Z係23； ee)SEQ ID NO：72(AAG CAG CXC XGA GAC AXC AAC CGC G)，其中Z係23；ff)SEQ ID NO：73(AGC AGC XCX GAG ACA XCA ACC GCG G)，其中Z係23；gg)SEQ ID NO：74(GCA GCX CXG AGA CAX CAA CCG CGG C)，其中Z係23；和hh)SEQ ID NO：75(CAG CXC XGA GAC AXC AAC CGC GGC X)，其中Z係23，，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)；和III.l)SEQ ID NO：76(GCC AGA AGG AAG GGC GAG AAA AGC X)，其中Z係23；m)SEQ ID NO：77(CAG AAG GAA GGG CGA GAA AAG CXC C)，其中Z係23；n)SEQ ID NO：78(GAA GGA AGG GCG AGA AAA GCX CCA G)，其中Z係23；o)SEQ ID NO：79(AGG AAG GGC GAG AAA AGC XCC AGC A)，其中Z係23；p)SEQ ID NO：80(ACX CAC GGG GCX CXC AAA GCA GCX C)，其中Z係23；q)SEQ ID NO：81(GGCXCXCAAAGCAGCXCXGAGACAX)，其中Z係23；r)SEQ ID NO：82(GGC XCX CAA AGC AGC XCX GA)，其中Z係18； s)SEQ ID NO：83(GAG AGG GCC AGA AGG AAG GG)，其中Z係18；t)SEQ ID NO：84(XXX GCC AXG XXA CCC AGG CX)，其中Z係18；u)SEQ ID NO：85(GCG CAC CCX CXG CCC XGG CC)，其中Z係18；和v)SEQ ID NO：86(GGC CCX GGX CXG CXG GCX CCC XGC X)，其中Z係23，，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82所組成之群組。於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、34-36、和59所組成之群組。於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、和34-36所組成之群組。於某些實施方式中，SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82之任一者中的X之各者係T。
於一些實施方式中，式(I)之反義寡聚物化合物之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列。於一些實施方式中，式(Ia)之反義寡聚物化合物之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列。於一些實施方式中，式(IVa)之反義寡聚物化合物之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列。於一些實施方式中，式(IVb)之反義寡聚物化合物之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列。於一些實施方式中，式(IVc)之反義寡聚物化合物之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列。於一些實施方式中，式(V)之反義寡聚物化合物之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列。於一些實施方式中，式(VI)之反義寡聚物化合物之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列。於一些實施方式中，式(VII)之反義寡聚物化合物之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列。於一些實施方式中，式(VIIa)之反義寡聚物化合物之靶向序 列係選自在表2A-2C中概述的序列。於一些實施方式中，式(VIIb)之反義寡聚物化合物之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列。於一些實施方式中，式(VIIc)之反義寡聚物化合物之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列。於一些實施方式中，式(VIId)之反義寡聚物化合物之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列。於一些實施方式中，式(VIIe)之反義寡聚物化合物之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列。於一些實施方式中，式(VIII)之反義寡聚物化合物之靶向序列係選自在表2A-2C中概述的序列。
於一些實施方式中，至少一個在表2A-2C中概述的序列之X係T。於一些實施方式中，至少一個在表2A-2C中概述的序列之X係U。於一些實施方式中，各個在表2A-2C中概述的序列之X係T。於一些實施方式中，各個在表2A-2C中概述的序列之X係U。於種種實施方式中，至少一個該靶向序列之X係T。於種種實施方式中，各個該靶向序列之X係T。於種種實施方式中，至少一個該靶向序列之X係U。於種種實施方式中，各個該靶向序列之X係U。
此外，於一些實施方式中，本文之揭示內容之反義寡聚物係式(XX)之化合物： 或其醫藥上可接受的鹽，其中：I.a)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：13(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC)，其中Z係22； b)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：14(GCC AGA AGG AAG GC GAG AAA AGC X)，其中Z係22；c)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：15(CCA GAA GGA AGG CGA GAA AAG CXC)，其中Z係22；d)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：16(CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC XCC)，其中Z係22；e)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：17(AGA AGG AAG GCG AGA AAA GCX CCA)，其中Z係22；f)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：18(GAA GGA AGG CGA GAA AAG CXC CAG)，其中Z係22；g)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：19(AAG GAA GGC GAG AAA AGC XCC AGC)，其中Z係22；h)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：20(AGG AAG GCG AGA AAA GCX CCA GCA)，其中Z係22；i)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：21(CGG CXC XCA AAG CAG CXC XGA GA)，其中Z係21；j)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：22(ACG GCX CXC AAA GCA GCX CXG AG)，其中Z係21；k)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：23(CAC GGC XCX CAA AGC AGC XCX GA)，其中Z係21；l)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：24(XCA CGG CXC XCA AAG CAG CXC XG)，其中Z係21； m)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：25(CXC ACG GCX CXC AAA GCA GCX CX)，其中Z係21；n)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：26(ACX CAC GGC XCX CAA AGC AGC XC)，其中Z係21；o)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：27(GCG GCA CXC ACG GCX CXC AAA GC)，其中Z係21；p)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：28(GGC GGC ACX CAC GGC XCX CAA AG)，其中Z係21；q)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：29(CGG CAC XCA CGG CXC XCA AAG CA)，其中Z係21；r)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：30(GCA CXC ACG GCX CXC AAA GCA GC)，其中Z係21；s)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：31(GGC ACX CAC GGC XCX CAA AGC AG)，其中Z係21；t)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：32(CAC XCA CGG CXC XCA AAG CAG CX)，其中Z係21；u)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：33(GCC AGA AGG AAG GCG AGA AAA GC)，其中Z係21；v)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：34(CCA GAA GGA AGG CGA GAA AAG C)，其中Z係19；w)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：35(CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC)，其中Z係19； x)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：36(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA AG)，其中Z係21；y)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：37(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA A)，其中Z係19；z)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：38(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA)，其中Z係19；aa)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：39(CGG CAC XCA CGGC XCX CAA AGC A)，其中Z係21；bb)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：40(GCG GCA CXC ACGG CXC XCA AAG C)，其中Z係21；cc)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：41(GGC GGC ACX CAC G GCX CXC AAA G)，其中Z係21；dd)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：42(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GGC)，其中Z係22；ee)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：43(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GC)，其中Z係21；ff)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：44(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA C)，其中Z係20；gg)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：45(GGC CAG AAG GAA GCG AGA AAA GC)，其中Z係21；hh)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：46(GGC CAG AAG GAA CGA GAA AAG C)，其中Z係20； ii)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：47(AGG AAG CGA GAA AAG CXC CAG CA)，其中Z係21；jj)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：48(AGG AAC GAG AAA AGC XCC AGC A)，其中Z係20；kk)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：49(CGG GCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA)，其中Z係22；ll)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：50(CGC XCX CAA AGC AGC XCX GAG A)，其中Z係20；mm)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：51(CCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA)，其中Z係19；nn)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：52(GGC GGC ACX CAC GGG CXC XCA AAG)，其中Z係22；oo)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：53(GGC GGC ACX CAC GCX CXC AAA G)，其中Z係20；pp)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：54(GGC GGC ACX CAC CXC XCA AAG)，其中Z係19；qq)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：55(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GGC)，其中Z係22；rr)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：56(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GC)，其中Z係21；ss)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：57(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG C)，其中Z係20；和 tt)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：58(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACC)，其中Z係19，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)；II.a)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：59(GGC CAG AAG GAA GGG CGA GAA AAG C)，其中Z係23；b)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：60(CCA GAA GGA AGG GCG AGA AAA GCX C)，其中Z係23；c)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：61(AAG GAA GGG CGA GAA AAG CXC CAG C)，其中Z係23；d)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：62(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GGG C)，其中Z係23；e)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：63(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GGG C)，其中Z係23；f)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：64(AGA AGG AAG GGC GAG AAA AGC XCC A)，其中Z係23；g)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：65(GCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA CAX C)，其中Z係23；h)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：66(CXC XCA AAG CAG CXC XGA GAC AXC A)，其中Z係23；i)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：67 (XCX CAA AGC AGC XCX GAG ACA XCA A)，其中Z係23；j)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：68(CXC AAA GCA GCX CXG AGA CAX CAA C)，其中Z係23；k)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：69(XCA AAG CAG CXC XGA GAC AXC AAC C)，其中Z係23；l)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：70(CAA AGC AGC XCX GAG ACA XCA ACC G)，其中Z係23；m)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：71(AAA GCA GCX CXG AGA CAX CAA CCG C)，其中Z係23；n)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：72(AAG CAG CXC XGA GAC AXC AAC CGC G)，其中Z係23；o)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：73(AGC AGC XCX GAG ACA XCA ACC GCG G)，其中Z係23；p)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：74(GCA GCX CXG AGA CAX CAA CCG CGG C)，其中Z係23；和q)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：75(CAG CXC XGA GAC AXC AAC CGC GGC X)，其中Z係23，，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)；和III.a)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：76(GCC AGA AGG AAG GGC GAG AAA AGC X)，其中Z係23； b)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：77(CAG AAG GAA GGG CGA GAA AAG CXC C)，其中Z係23；c)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：78(GAA GGA AGG GCG AGA AAA GCX CCA G)，其中Z係23；d)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：79(AGG AAG GGC GAG AAA AGC XCC AGC A)，其中Z係23；e)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：80(ACX CAC GGG GCX CXC AAA GCA GCX C)，其中Z係23；f)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：81(GGCXCXCAAAGCAGCXCXGAGACAX)，其中Z係23；g)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：82(GGC XCX CAA AGC AGC XCX GA)，其中Z係18；h)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：83(GAG AGG GCC AGA AGG AAG GG)，其中Z係18；i)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：84(XXX GCC AXG XXA CCC AGG CX)，其中Z係18；j)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：85(GCG CAC CCX CXG CCC XGG CC)，其中Z係18；和k)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：86(GGC CCX GGX CXG CXG GCX CCC XGC X)，其中Z係23，，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)；且其中Ra係H或乙醯基。
於一些實施方式中，至少一個SEQ ID NO：13-86之X係T。於一些實施方式中，至少一個SEQ ID NO：13-86之X係U。於一些實施方式中，各個SEQ ID NO：13-86之X係T。於一些實施方式中，各個SEQ ID NO：13-86之X係U。於種種實施方式中，至少一個該靶向序列之X係T。於種種實施方式中，各個該靶向序列之X係T。於種種實施方式中，至少一個該靶向序列之X係U。於種種實施方式中，各個該靶向序列之X係U。
於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82所組成之群組。於一些實施方式中，至少一個SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82之X係T。於一些實施方式中，至少一個SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82之X係U。於一些實施方式中，各個SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82之X係T。於一些實施方式中，各個SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82之X係U。
於本文之揭示內容之反義寡聚物之一些實施方式(包括(例如)式(XX)之反義寡聚物)中，該反義寡聚物可係式(XXI)： 或其醫藥上可接受的鹽，其中：I.a)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：13(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC)，其中Z係22； b)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：14(GCC AGA AGG AAG GC GAG AAA AGC X)，其中Z係22；c)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：15(CCA GAA GGA AGG CGA GAA AAG CXC)，其中Z係22；d)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：16(CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC XCC)，其中Z係22；e)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：17(AGA AGG AAG GCG AGA AAA GCX CCA)，其中Z係22；f)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：18(GAA GGA AGG CGA GAA AAG CXC CAG)，其中Z係22；g)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：19(AAG GAA GGC GAG AAA AGC XCC AGC)，其中Z係22；h)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：20(AGG AAG GCG AGA AAA GCX CCA GCA)，其中Z係22；i)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：21(CGG CXC XCA AAG CAG CXC XGA GA)，其中Z係21；j)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：22(ACG GCX CXC AAA GCA GCX CXG AG)，其中Z係21；k)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：23(CAC GGC XCX CAA AGC AGC XCX GA)，其中Z係21；l)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：24(XCA CGG CXC XCA AAG CAG CXC XG)，其中Z係21； m)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：25(CXC ACG GCX CXC AAA GCA GCX CX)，其中Z係21；n)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：26(ACX CAC GGC XCX CAA AGC AGC XC)，其中Z係21；o)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：27(GCG GCA CXC ACG GCX CXC AAA GC)，其中Z係21；p)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：28(GGC GGC ACX CAC GGC XCX CAA AG)，其中Z係21；q)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：29(CGG CAC XCA CGG CXC XCA AAG CA)，其中Z係21；r)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：30(GCA CXC ACG GCX CXC AAA GCA GC)，其中Z係21；s)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：31(GGC ACX CAC GGC XCX CAA AGC AG)，其中Z係21；t)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：32(CAC XCA CGG CXC XCA AAG CAG CX)，其中Z係21；u)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：33(GCC AGA AGG AAG GCG AGA AAA GC)，其中Z係21；v)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：34(CCA GAA GGA AGG CGA GAA AAG C)，其中Z係19；w)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：35(CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC)，其中Z係19； x)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：36(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA AG)，其中Z係21；y)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：37(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA A)，其中Z係19；z)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：38(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA)，其中Z係19；aa)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：39(CGG CAC XCA CGGC XCX CAA AGC A)，其中Z係21；bb)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：40(GCG GCA CXC ACGG CXC XCA AAG C)，其中Z係21；cc)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：41(GGC GGC ACX CAC G GCX CXC AAA G)，其中Z係21；dd)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：42(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GGC)，其中Z係22；ee)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：43(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GC)，其中Z係21；ff)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：44(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA C)，其中Z係20；gg)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：45(GGC CAG AAG GAA GCG AGA AAA GC)，其中Z係21；hh)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：46(GGC CAG AAG GAA CGA GAA AAG C)，其中Z係20； ii)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：47(AGG AAG CGA GAA AAG CXC CAG CA)，其中Z係21；jj)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：48(AGG AAC GAG AAA AGC XCC AGC A)，其中Z係20；kk)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：49(CGG GCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA)，其中Z係22；ll)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：50(CGC XCX CAA AGC AGC XCX GAG A)，其中Z係20；mm)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：51(CCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA)，其中Z係19；nn)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：52(GGC GGC ACX CAC GGG CXC XCA AAG)，其中Z係22；oo)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：53(GGC GGC ACX CAC GCX CXC AAA G)，其中Z係20；pp)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：54(GGC GGC ACX CAC CXC XCA AAG)，其中Z係19；qq)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：55(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GGC)，其中Z係22；rr)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：56(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GC)，其中Z係21；ss)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：57(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG C)，其中Z係20；和 tt)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：58(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACC)，其中Z係19，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)；II.a)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：59(GGC CAG AAG GAA GGG CGA GAA AAG C)，其中Z係23；b)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：60(CCA GAA GGA AGG GCG AGA AAA GCX C)，其中Z係23；c)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：61(AAG GAA GGG CGA GAA AAG CXC CAG C)，其中Z係23；d)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：62(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GGG C)，其中Z係23；e)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：63(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GGG C)，其中Z係23；f)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：64(AGA AGG AAG GGC GAG AAA AGC XCC A)，其中Z係23；g)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：65(GCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA CAX C)，其中Z係23；h)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：66(CXC XCA AAG CAG CXC XGA GAC AXC A)，其中Z係23；i)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：67 (XCX CAA AGC AGC XCX GAG ACA XCA A)，其中Z係23；j)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：68(CXC AAA GCA GCX CXG AGA CAX CAA C)，其中Z係23；k)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：69(XCA AAG CAG CXC XGA GAC AXC AAC C)，其中Z係23；l)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：70(CAA AGC AGC XCX GAG ACA XCA ACC G)，其中Z係23；m)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：71(AAA GCA GCX CXG AGA CAX CAA CCG C)，其中Z係23；n)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：72(AAG CAG CXC XGA GAC AXC AAC CGC G)，其中Z係23；o)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：73(AGC AGC XCX GAG ACA XCA ACC GCG G)，其中Z係23；p)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：74(GCA GCX CXG AGA CAX CAA CCG CGG C)，其中Z係23；和q)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：75(CAG CXC XGA GAC AXC AAC CGC GGC X)，其中Z係23，，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)；和III.l)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：76(GCC AGA AGG AAG GGC GAG AAA AGC X)，其中Z係23； m)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：77(CAG AAG GAA GGG CGA GAA AAG CXC C)，其中Z係23；n)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：78(GAA GGA AGG GCG AGA AAA GCX CCA G)，其中Z係23；o)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：79(AGG AAG GGC GAG AAA AGC XCC AGC A)，其中Z係23；p)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：80(ACX CAC GGG GCX CXC AAA GCA GCX C)，其中Z係23；q)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：81(GGCXCXCAAAGCAGCXCXGAGACAX)，其中Z係23；r)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：82(GGC XCX CAA AGC AGC XCX GA)，其中Z係18；s)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：83(GAG AGG GCC AGA AGG AAG GG)，其中Z係18；t)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：84(XXX GCC AXG XXA CCC AGG CX)，其中Z係18；u)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：85(GCG CAC CCX CXG CCC XGG CC)，其中Z係18；和v)各個Nu係一起形成以下靶向序列(5’至3’)的核鹼基：SEQ ID NO：86(GGC CCX GGX CXG CXG GCX CCC XGC X)，其中Z係23，，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)；且其中Ra係H或乙醯基。
於一些實施方式中，至少一個SEQ ID NO：13-86之X係T。於一些實施方式中，至少一個SEQ ID NO：13-86之X係U。於一些實施方式中，各個SEQ ID NO：13-86之X係T。於一些實施方式中，各個SEQ ID NO：13-86之X係U。於種種實施方式中，至少一個該靶向序列之X係T。於種種實施方式中，各個該靶向序列之X係T。於種種實施方式中，至少一個該靶向序列之X係U。於種種實施方式中，各個該靶向序列之X係U。
於某些實施方式中，該靶向序列係選自由SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82所組成之群組。於一些實施方式中，至少一個SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82之X係T。於一些實施方式中，至少一個SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82之X係U。於一些實施方式中，各個SEQ ID NO：13-86之X係T。於一些實施方式中，各個SEQ ID NO：13、27-29、34-36、59、和82之X係U。
於一些實施方式中，該反義寡聚物係式(XXII)之化合物、或其醫藥上可接受的鹽，其係選自：
和 ，其中X每次出現係獨立地選自或。於一些實施方式中，各個X係T。於其他實施方式中，各個X係U。
於一些實施方式中，式(XXII)之反義寡聚物係式(XXIIa)，其中至少一個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIa)，其中至少一個X係T。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIa)，其中各個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIa)，其中各個X係T。
於一些實施方式中，式(XXII)之反義寡聚物係式(XXIIb)，其 中至少一個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIb)，其中至少一個X係T。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIb)，其中各個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIb)，其中各個X係T。
於一些實施方式中，式(XXII)之反義寡聚物係式(XXIIc)，其中至少一個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIc)，其中至少一個X係T。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIc)，其中各個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIc)，其中各個X係T。
於一些實施方式中，式(XXII)之反義寡聚物係式(XXIId)，其中至少一個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIId)，其中至少一個X係T。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIId)，其中各個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIId)，其中各個X係T。
於一些實施方式中，式(XXII)之反義寡聚物係式(XXIIe)，其中至少一個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIe)，其中至少一個X係T。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIe)，其中各個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIe)，其中各個X係T。
於一些實施方式中，式(XXII)之反義寡聚物係式(XXIIf)，其中至少一個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIf)，其中至少一個X係T。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIf)， 其中各個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIf)，其中各個X係T。
於一些實施方式中，式(XXII)之反義寡聚物係式(XXIIg)，其中至少一個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIg)，其中至少一個X係T。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIg)，其中各個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIg)，其中各個X係T。
於一些實施方式中，式(XXII)之反義寡聚物係式(XXIIh)，其中至少一個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIh)，其中至少一個X係T。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIh)，其中各個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIh)，其中各個X係T。
於一些實施方式中，式(XXII)之反義寡聚物係式(XXIIi)，其中至少一個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIi)，其中至少一個X係T。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIi)，其中各個X係U。於一些實施方式中，式(XXII)之化合物係式(XXIIi)，其中各個X係T。
於本文之揭示內容之反義寡聚物之一些實施方式(包括(例如)式(XXII)之反義寡聚物)中，該反義寡聚物係式(XXIII)之化合物、或其醫藥上可接受的鹽，其係選自：
和 。
於一些實施方式中，式(XXIII)之反義寡聚物係式(XXIIIa)。於一些實施方式中，式(XXIII)之反義寡聚物係式(XXIIIb)。於一些實施方式中，式(XXIII)之反義寡聚物係式(XXIIIc)。於一些實施方式中，式(XXIII)之反義寡聚物係式(XXIIId)。於一些實施方式中，式(XX)之反義寡聚物係式(XXIIIe)。於一些實施方式中，式(XXIII)之反義寡聚物係式(XXIIIf)。於一些實施方式中，式(XXIII)之反義寡聚物係式(XXIIIg)。於一些實施方式中，式(XXIII)之反義寡聚物係式(XXIIIh)。於一些實施方式中，式(XXIII)之反義寡聚物係式(XXIIIi)。
在另一個方面，本文之揭示內容之特徵在於式(XXIIa)至(XXIIi)之任一者之反義寡聚物化合物、或其醫藥上可接受的鹽，其中X每 次出現係獨立地選自或。於一些實施方式中，各個X係T。
在另一個方面，本文之揭示內容特徵在於式(XXIIIa)至(XXIIIi)之任一者之反義寡聚物化合物、或其醫藥上可接受的鹽。
D.具有鹼性氮核苷間連接子的PMO-X之製備
N-啉基次單元、經修飾的次單元間連結、和包含其等的寡聚物可如(例如)在美國專利案編號5,185,444、和7,943,762(其等係以其等之完整內容以引用方式併入)中描述地製備。該等N-啉基次單元可根據以下一般反應流程I製備。
參照反應流程1，其中B代表鹼基配對部分且PG代表保護 基，該等N-啉基次單元可如所顯示地自相對應的核糖核苷(1)製備。N-啉基次單元(2)可視需要地藉由與適合的保護基前驅物(例如三苯氯甲烷)反應來保護。3’保護基一般係於如於以下更詳細描述的固態寡聚物合成期間移除。該鹼基配對部分可被適當地保護以用於固相寡聚物合成。適合的保護基包括用於腺嘌呤和胞嘧啶的苯甲醯基、用於鳥糞嘌呤的苯乙醯基、和用於次黃嘌呤(I)的三甲基乙醯氧基甲基。三甲基乙醯氧基甲基基團可被導入至次黃嘌呤雜環鹼基之N1位置上。雖然未經保護的次黃嘌呤次單元，可被利用，當鹼基被保護時活化反應中的產率遠較優。其他適合的保護基包括該等在共同繫屬美國申請案編號12/271,040(其特此以其完整內容以引用方式併入)中揭示者。
3與經活化的磷化合物4之反應，產生具有所欲的連結部分5的N-啉基次單元。結構4之化合物可使用許多對於所屬技術領域中具有通常知識者係已知的方法製備。例如，如此化合物可藉由相對應的胺與氧氯化磷之反應製備。在此方面，胺起始材料可使用任何所屬技術領域中已知的方法(例如該等在實施例中和在美國專利案編號7,943,762中描述的方法)製備。
可將結構5之化合物用於固相自動化寡聚物合成以用於包含該等次單元間連結的寡聚物之製備。如此方法係所屬技術領域中廣為人知的。簡言之，可於5’端修飾結構5之化合物以含有接至固體撐體的連接子。例如，可藉由包含L11和L15的連接子將化合物5連接至固體撐體。
經修飾N-啉基次單元和N-啉基寡聚物之製備係在實施例中更詳細地描述。含有許多經修飾的連結的N-啉基寡聚物可使用本文 所描述的方法、所屬技術領域中已知的方法及/或在本文中以引用方式描述的方法製備。亦在實施例中描述者係如之前描述地製備的N-啉基寡聚物之整體修飾(參見(例如)PCT公開案WO2008036127)。
術語「保護基」係論及化學部分，其等封阻化合物之部分或所有反應性部分並預防如此部分參與化學反應直到該保護基被移除，例如該等在T.W.Greene,P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis，第3版John Wiley & Sons(1999)中列舉和描述的部分。當利用不同的保護基時，以下可能係有利的：各個(不同的)保護基可藉由不同的方式移除。在完全不同的反應條件下被切下的保護基允許此等保護基之差異性移除。例如，保護基可藉由酸、鹼、和氫解移除。諸如三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、縮醛和三級丁基二甲基矽基的基團係酸不穩定性且可在以Cbz基團(其等可藉由氫解移除)和Fmoc基團(其等係鹼不穩定性)保護的胺基基團之存在下被用於保護羧基和羥基反應性部分。在以諸如三級丁基胺甲酸酯的酸不穩定性基團封阻或以酸和鹼皆穩定性但可水解地移除的胺甲酸酯封阻的胺之存在下，羧酸部分可以諸如(不限於)甲基、或乙基的鹼不穩定性基團封阻，且羥基反應性部分可以諸如乙醯基的鹼不穩定性基團封阻。
羧酸和羥基反應性部分亦可以諸如苯甲基基團的可水解移除的保護基封阻，而胺基團可以諸如Fmoc的鹼不穩定性基團封阻。對於式(I)之化合物之合成特別有用的胺保護基係三氟乙醯胺。羧酸反應性部分可以諸如2,4-二甲氧基苯甲基的可氧化移除的保護基封阻，而共存的胺基基團可以氟化物不穩定性胺甲酸矽基酯封阻。
丙烯基封阻基在酸和鹼保護基之存在下係有用的，因為前者 係穩定的且隨後可藉由金屬或pi-酸催化劑移除。例如，經丙烯基封阻的羧酸可在酸不穩定性胺甲酸三級丁酯或鹼不穩定性醋酸胺保護基之存在下以經鈀(0)催化的反應去保護。保護基之又另一個形式係化合物或中間產物可與之接附的樹脂。只要殘基係接附至該樹脂，該官能基被封阻且無法反應。一旦自該樹脂釋放，該官能基可用於反應。
典型的封阻基/保護基係所屬技術領域中已知的且包括(但不限於)以下部分：
除非另加註記，所有的化學品皆係獲自Sigma-Aldrich-Fluka。苯甲醯基腺嘌呤核苷、苯甲醯基胞嘧啶核苷、和苯乙醯基鳥糞嘌呤核苷係獲自Carbosynth Limited,UK。
含有如本文所描述的進一步連結修飾的PMO、PMO+、PPMO、和PMO-X之合成係使用所屬技術領域中已知和在繫屬美國申請案編號12/271,036和12/271,040及PCT公開案編號WO/2009/064471(其等特此 以其等之完整內容以引用方式併入)中描述的方法完成。
具有3’三苯甲基修飾的PMO係實質上如在PCT公開案編號WO/2009/064471中描述地合成，除了忽略去三苯甲基步驟外。
IV.調配物
本文之揭示內容之化合物亦可與其他分子、分子結構或化合物之混合物混合、封膠囊、綴合或否則連結，成(例如)脂質體、靶向受體的分子、口部、直腸、外用或其他調配物，以用於協助攝取、分佈及/或吸收。教示如此攝取、分佈及/或吸收協助性調配物之製備的代表性美國專利案包括(但不限於)美國專利案編號5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，其等之每一者皆以引用方式併入本文中。
本文之揭示內容之反義化合物涵蓋任何醫藥上可接受的鹽、酯、或如此酯之鹽、或任何(在投予至動物(包括人類)後)能夠提供(直接地或間接地)生物活性的代謝物或其殘基的其他化合物。據此，例如，本文之揭示內容亦係關於本文之揭示內容之化合物之前藥和醫藥上可接受的鹽、如此前藥之醫藥上可接受的鹽、和其他生物相等物。
術語「前藥」指示以不活性形式製備的治療劑，其在體內或體內之細胞內藉由內生性酵素或其他化學物及/或條件之作用轉換成活性形 式(即藥物)。尤其，本文之揭示內容之寡聚物之前藥版本係根據在Gosselin等人之WO 93/24510(公開日1993年12月9日)中或在Imbach等人之WO 94/26764和美國專利案編號5,770,713中揭示的方法製備成SATE[(S-乙醯基-2-硫乙基)磷酸]衍生物。
術語「醫藥上可接受的鹽」係論及本文之揭示內容之化合物之生理上且醫藥上可接受的鹽：即保有親本化合物之所欲的生物活性且不給予其非所欲的毒性效果的鹽。對於寡聚物而言，醫藥上可接受的鹽和其等之用途之實例係在美國專利案編號6,287,860(其係以其完整內容併入本文中)中進一步描述。
本文之揭示內容亦包括包括本文之揭示內容之反義化合物的醫藥組成物和調配物。本文之揭示內容之醫藥組成物可基於所欲者係局部性或系統性治療和基於欲治療的區域以數種方式投予。投予可係外用的(包括眼部的和投予至黏膜，包括陰道和直腸遞送)、肺臟的(例如藉由粉末或氣溶膠之吸入或吹入，包括藉由噴霧器；氣管內的、鼻內的、表皮的和跨皮的)、口部的或非經腸的。非經腸投予包括靜脈內的、動脈內的、皮下的、腹膜內的或肌肉內的注射或灌注；或顱內的(例如鞘內的或室內的)投予。相信具有至少一個2′-O-甲氧基乙基修飾的寡聚物對於口部的投予會係特別有用的。用於外用投予的醫藥組成物和調配物可包括跨皮貼片、軟膏、洗劑、乳霜、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末。習用醫藥載劑、水性、粉末或油性基底、增稠劑和類似者可能係必須或所欲的。經塗覆的保險套、手套和類似者亦可能係有用的。
本文之揭示內容之醫藥調配物(其可便利地以單位劑型呈 現)可根據製藥工業中廣為人知的習用技術製備。如此技術包括使活性成分與醫藥載劑或賦形劑結合的步驟。一般而言，該等調配物係藉由以下者製備：使活性成分與液體載劑或細碎的固體載劑或兩者一致且親密地結合，並接著(若需要)成形產物。
本文之揭示內容之組成物可被調配成許多諸如(但不限於)以下者的可能劑型之任一者：錠劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿劑、軟凝膠、栓劑、和灌腸劑。本文之揭示內容之組成物亦可被調配成在水性、非水性或混合介質中的懸浮液。水性懸浮液可進一步含有增加該懸浮液之黏度的物質，包括(例如)羧基甲基纖維素鈉、山梨醇及/或右旋糖聚糖。該懸浮液亦可含有穩定劑。
本文之揭示內容之醫藥組成物包括(但不限於)溶液、乳劑、泡沫劑和含脂質體的調配物。本文之揭示內容之醫藥組成物和調配物可包含一或多種穿透增強劑、載劑、賦形劑或其他活性或非活性成分。
乳劑典型係一種液體以直徑通常超過0.1μm的微滴之形式分散在另一種液體中的非均質系統。乳劑可含有除了分散相以外的另外的組份、和可呈在水相、油相中的溶液或本身呈分開的相的活性藥物。微乳劑被包括作為本文之揭示內容之實施方式。乳劑和其等之用途係所屬技術領域中廣為人知的且係在美國專利案編號6,287,860(其係以其完整內容併入本文中)中進一步描述。
本文之揭示內容之調配物包括脂質體調配物。用於本文之揭示內容中，術語「脂質體」意謂由排列成一或多個球狀雙層的兩親性脂質所組成的囊胞。脂質體係單層或多層的囊胞，其具有由親脂性材料形成的 膜和含有欲遞送的組成物之水性內部。陽離子性脂質體係帶正電的脂質體，咸相信其等會與帶負電的DNA分子交互作用以形成穩定的複合物。咸相信pH敏感性或帶負電的脂質體會將DNA而非複合物捕捉於其中。陽離子性和非陽離子性脂質體兩者皆已被用於將DNA遞送至細胞。
脂質體亦包括「立體穩定化的」脂質體，而立體穩定化的脂質體係用於本文中論及以下者的術語：包含一或多種特化的脂質之脂質體，該特化的脂質當被併入至脂質體中時造成相較於缺乏如此特化的脂質之脂質體循環壽命增加。立體穩定化的脂質體之實例係該等其中該脂質體之形成囊胞的脂質部分之部分包含一或多種醣脂或係以一或多種親水性聚合物(諸如聚乙二醇(PEG)部分)衍生化者。脂質體和其等之用途係在美國專利案編號6,287,860(其係以其完整內容併入本文中)中進一步描述。
本文之揭示內容之醫藥調配物和組成物亦可包括介面活性劑。介面活性劑在藥物產品、調配物中和在乳劑中的使用於所屬技術領域中係廣為人知的。介面活性劑和其等之用途係在美國專利案編號6,287,860(其係以其完整內容併入本文中)中進一步描述。
於一些實施方式中，本文之揭示內容利用種種穿透增強劑以引起核酸(特別是寡聚物)之有效遞送。除了協助非親脂性藥物穿過細胞膜的擴散外，穿透增強劑亦增強親脂性藥物之滲透性。穿透增強劑可被分類為屬於五個寬廣的類別之一，即介面活性劑、脂肪酸、膽鹽、螯合劑、和非螯合性非介面活性劑。穿透增強劑和其等之用途係在美國專利案編號6,287,860(其係以其完整內容併入本文中)中進一步描述。
所屬技術領域中具有通常知識者會認知到調配物係根據其 等之意欲的用法(即投予之途徑)例行地設計。
供外用投予之用的調配物包括該等其中本文之揭示內容之寡聚物與外用遞送劑(諸如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和介面活性劑)混合者。脂質和脂質體包括中性(例如二油醯基磷脂醯基DOPE乙醇胺、二肉豆蔻醯基磷脂醯基膽鹼DMPC、二硬脂醯基磷脂醯基膽鹼)陰性(例如二肉豆蔻醯基磷脂醯基甘油DMPG)和陽離子性(例如二油醯基四甲基胺基丙基DOTAP和二油醯基磷脂醯基乙醇胺DOTMA)。
對於外用或其他投予而言，本文之揭示內容之寡聚物可被封膠囊在脂質體內或可與其形成複合物(特別是與陽離子性脂質體)。供選擇地，寡聚物可與脂質(特別是與陽離子性脂質)複合。脂肪酸和酯、其等之醫藥上可接受的鹽、和其等之用途係在美國專利案編號6,287,860(其係以其完整內容併入本文中)中進一步描述。外用的調配物係在1999年5月20日提申的美國專利申請案序號09/315,298(其係以其完整內容以引用方式併入本文中)中詳細描述。
供口部投予之用的組成物和調配物包括粉末或顆粒劑、微米微粒、奈米微粒、在水或非水性介質中的懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、藥包(sachet)、錠劑或微錠劑(minitablet)。增稠劑、矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑可能係所欲的。口部調配物係該等其中本文之揭示內容之寡聚物係連結一或多種穿透增強劑、介面活性劑和螯合劑投予者。介面活性劑包括脂肪酸及/或其酯或鹽、膽酸及/或其鹽。膽酸/鹽和脂肪酸和其等之用途係在美國專利案編號6,287,860(其係以其完整內容併入本文中)中進一步描述。於一些實施方式中，本文之揭示內容提供穿透增強 劑之組合，例如脂肪酸/鹽與膽酸/鹽組合。例示性組合係月桂酸、癸酸和UDCA之鈉鹽。進一步的穿透增強劑包括聚氧乙烯-9-月桂醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟醚。本文之揭示內容之寡聚物可以包括經噴霧乾燥的粒子之顆粒形式口部遞送，或複合以形成微米或奈米粒子。寡聚物複合劑和其等之用途係在美國專利案編號6,287,860(其係以其完整內容併入本文中)中進一步描述。用於寡聚物的口部調配物和其等之製備係在美國申請案序號09/108,673(1998年7月1日提申)、09/315,298(1999年5月20日提申)和10/071,822(2002年2月8日提申)(其等之每一者皆以其等之完整內容以引用方式併入本文中)中詳細描述。
供非經腸、鞘內或室內投予之用的組成物和調配物可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑和其他適合的添加劑，諸如(但不限於)穿透增強劑、載劑化合物和其他醫藥上可接受的載劑或賦形劑。
本文之揭示內容之某些實施方式提供含有一或多種寡聚化合物和一或多種藉由非反義機制起作用的其他化學治療劑的醫藥組成物。如此化學治療劑之實例包括但不限於癌症化學治療藥物，諸如柔紅黴素(daunorubioin)、道諾黴素(daunomycin)、放線菌素、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、依索比星(esorubicin)、博萊黴素、馬磷醯胺(mafosfamide)、依弗醯胺(ifosfamide)、胞嘧啶阿糖胞苷(Cytosine arabinoside)、雙氯乙基亞硝基脲(bis-chloroethylnitrosurea)、白消安(busulfan)、絲裂黴素C、放線菌素D、光輝黴素(mithramycin)、強體松、羥基助孕酮、睾固酮、他莫昔芬(tamoxifen)、達卡巴仁(dacarbazine)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌(mitoxantrone)、 安吖啶(amsacrine)、氮芥苯丁酸、甲基環己基亞硝基脲、氮芥、黴法蘭(melphalan)、環磷醯胺、6-巰嘌呤、6-硫鳥糞嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氮胞嘧啶核苷、羥基脲、去氧柯福黴素(deoxyco-formycin)、4-羥基過氧環磷醯胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟去氧尿苷(5-FUdR)、胺甲喋呤(MTX)、秋水仙鹼、紫杉醇、長春新鹼、長春花鹼、依妥普賽(etoposide)(VP-16)、三甲曲沙(trimetrexate)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、拓普替康(topotecan)、吉西他濱(gemcitabine)、坦尼坡賽(teniposide)、順鉑和乙菧酚(DES)。當與本文之揭示內容之化合物一起使用時，如此化學治療劑可個別地使用(例如5-FU和寡聚物)、依序地使用(例如5-FU和寡聚物一段時間接著為MTX和寡聚物)、或與一或多種其他如此化學治療劑組合使用(例如5-FU、MTX和寡聚物、或5-FU、放射性治療和寡聚物)。抗發炎藥物(包括但不限於非類固醇抗發炎藥物和皮質類固醇)和抗病毒藥物(包括但不限於ribivirin、vidarabine、阿昔洛韋(acyclovir)和更昔洛韋(ganciclovir))亦可在本文之揭示內容之組成物中組合。反義化合物與其他非反義藥物之組合亦落入本文之揭示內容之範圍內。二或多種經組合的化合物可被一起或依序地使用。
在另一個相關的實施方式中，本文之揭示內容之組成物可含有一或多種靶向第一核酸的反義化合物(特別是寡聚物)和一或多種靶向第二核酸目標的另外的反義化合物。供選擇地，本文之揭示內容之組成物可含有二或多種靶向相同核酸目標的不同區域的反義化合物。反義化合物之數個實例係所屬技術領域中已知的。二或多種組合的化合物可被一起或依序地使用。
V.使用之方法
某些實施方式係關於為了治療目的(例如治療具有GSD-II的對象)使用本文之揭示內容之反義寡聚物增加含外顯子2的GAA mRNA及/或蛋白質之表現的方法。據此，於一些實施方式中，本文之揭示內容提供治療患有GSD-II或具有發展出GSD-II的風險的個體之方法，其包含將有效量的本文之揭示內容之反義寡聚物投予至該對象。於一些實施方式中，包含具有長度和互補性足以與酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA內的區域專一性地雜合的核苷酸序列的反義寡聚物，其中該反義寡聚物與該區域之結合會增加在該對象之細胞及/或組織中的含外顯子2的GAA mRNA之水平。例示性反義靶向序列係在本文之表2A-2C中顯示。
亦包括者係用於製備供治療第II型肝醣蓄積病(GSD-II；龐培氏病)之用的醫藥品的反義寡聚物，其包含長度和互補性足以與酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA內的區域專一性地雜合的核苷酸序列，其中該反義寡聚物與該區域之結合會增加含外顯子2的GAA mRNA之水平。
於治療GSD-II的方法或用於治療GSD-II的醫藥品之一些實施方式中，該反義寡聚物化合物包含：選自胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯N-啉基寡聚物(PMO)、胜肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚物、三環DNA寡聚物、三環硫代磷酸酯寡聚物、經2’O-Me修飾的寡聚物、或前述者之任何組合的非天然化學主鏈；和與人類酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID. NO：1)、內含子2(SEQ ID.NO：60)、或外顯子2(SEQ ID.NO：61)內的區域互補的靶向序列。
如於以上記錄的，「GSD-II」係論及第II型肝醣蓄積病(GSD-II或龐培氏病)，其係一種人類體染色體隱性疾病，其特徵往往在於在受影響的個體中GAA蛋白質表現不足。所包括者係具有嬰兒GSD-II的對象和該等具有該疾病之晚發形式者。
於某些實施方式中，對象在一或多個組織(包括心臟、骨骼肌、肝臟、和神經系統組織)中GAA蛋白質之表現及/或活性減少(例如，相對於健康的對象或較早的時間點)。於一些實施方式中，該對象在一或多個組織(包括心臟、骨骼肌、肝臟、和神經系統組織)中肝醣之堆積增加(例如，相對於健康的對象或較早的時間點)。於特別的實施方式中，該對象具有至少一個IVS1-13T>G突變(亦稱為c.336-13T>G)，可能與其他導致功能性GAA蛋白質之表現減少的突變組合。用於GSD-II中的分子遺傳測試之總結係在以下表3中顯示。
某些實施方式係關於如本文所描述地增加細胞、組織、及/或對象中的含外顯子2的GAA mRNA或蛋白質之表現之方法。於一些實例中，含外顯子2的GAA mRNA或蛋白質係增加達約或至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%，其係相對於對照組，例如對照組細胞/對象、無該反義寡聚物的對照組組成物、缺乏治療、及/或較早的時間點。亦包括者係相對於健康的對照組之水平維持含的GAA mRNA或蛋白質之表現的方 法。
一些實施方式係關於如本文所描述地增加功能性/活性GAA蛋白質之表現細胞、組織、及/或對象的方法。於某些實例中，功能性/活性GAA蛋白質之水平增加達約或至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%，其係相對於對照組，例如對照組細胞/對象、無該反義寡聚物的對照組組成物、缺乏治療、及/或較早的時間點。亦包括者係相對於健康的對照組之水平維持功能性/活性GAA蛋白質之表現的方法。
特殊的實施方式係關於如本文所描述地減少一或多個細胞、組織、及/或對象中的肝醣之堆積的方法。於某些實例中，肝醣之堆積減少達約或至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%，其係相對於對照組，例如對照組細胞/對象、無該反義寡聚物的對照組組成物、缺乏治療、及/或較早的時間點。亦包括者係在細胞、組織、及/或對象中維持正常或否則健康的肝醣水平(例如無症狀的水平或與GSD-II之症狀減少相關的水平)的方法。
亦包括者係在需要其的對象中減少一或多種GSD-II之症狀的方法。特殊的實例包括嬰兒的GSD-II之症狀，諸如心臟肥大、低張症、心肌病、左心室流出閉塞、呼吸窘迫、動作遲緩/肌肉虛弱、和進食困難/無法掙扎。其他實例包括晚發GSD-II之症狀，諸如肌肉虛弱(例如骨骼肌虛 弱，包括漸進的肌肉虛弱)、咳嗽障礙、復發性胸部感染、低張症、延遲的動作里程碑、吞嚥或咀嚼困難、和肺活量減低或呼吸不足。
可將本文之揭示內容之反義寡聚物投予至對象以治療(預防性地或治療性地)GSD-II。與如此治療連結，可考慮藥物基因體學(即對於在個體之基因型與該個別對外來化合物或藥物之反應間的關係之研究)。治療劑之代謝之差異可由於改變在醫藥活性藥物之劑量與血液濃度間的關係而導致嚴重的毒性或治療的失敗。
因此，醫師或臨床醫師在決定是否投予一治療劑以及定制使用一治療劑的治療之劑量及/或治療攝生法時可考慮應用於相關的藥物基因體學研究中獲得的知識。
該反義寡聚物至該目標核酸之有效的遞送係治療的一個方面。反義寡聚物遞送之途徑包括(但不限於)種種的全身性途徑，包括口部和非經腸途徑，例如靜脈內的、皮下的、腹膜內的、和肌肉內的、以及吸入、跨皮的和外用的遞送。適當的途徑可由所屬技術領域中具有通常知識者決定，以對於受治療的對象之狀況為適當。血管或血管外的循環、血液或淋巴系統、和腦脊髓液係一些可導入該RNA的非限制性位置。可利用直接CNS遞送，例如可使用大腦內的腦室的或鞘內的投予作為投予之途徑。
於特殊的實施方式中，該(等)反義寡聚物係藉由肌肉內的注射(IM)投予至該對象，即其等係肌肉內地投予或遞送。肌肉內的注射位置之非限制性實例包括手臂之三角肌、腿之外股肌肉、和髀部之腹臀肌(ventrogluteal muscle)、和臀部之背臀肌(dorsogluteal muscle)。於特別的實施方式中，PMO、PMO-X、或PPMO係藉由IM投予。
於某些實施方式中，該需要其的對象如在中樞神經系統組織中的肝醣堆積。實例包括其中中樞神經系統病理促成GSD-II中的呼吸不足之實例(參見(例如)DeRuisseau等人，PNAS USA.106：9419-24,2009)。據此，本文所描述的反義寡聚物可藉由任何技術領域中認可的方法遞送至一對象之神經系統，例如其中該對象具有涉及CNS的GSD-II。例如，可使用本文之揭示內容之反義寡聚物之周圍血液注射以藉由擴散性及/或主動方式將該等試劑遞送至周圍神經元。供選擇地，可修飾該等反義寡聚物以促進血腦屏障(BBB)之跨越以達成該等試劑至中樞神經系統(CNS)之神經元細胞之遞送。近期於反義寡聚物技術和遞送策略的特殊進展已擴大反義寡聚物於神經元失調之用途的範圍(參見(例如)Forte,A.、等人2005.Curr.Drug Targets 6：21-29；Jaeger,L.B.、和W.A.Banks.2005.Methods Mol.Med.106：237-251；Vinogradov,S.V.、等人2004.Bioconjug.Chem.5：50-60；前述者係以引用方式以其等之完整內容併入本文中)。例如，本文之揭示內容之反義寡聚物可以胜肽核酸(PNA)化合物之形式生產。各PNA試劑已被鑑認為會跨越BBB(Jaeger,L.B.、和W.A.Banks.2005.Methods Mol.Med.106：237-251)。已描述以(例如)激脈劑治療一對象以促進跨越BBB之運輸(同上)。將本文之揭示內容之反義寡聚物連繫至跨越BBB活性地運輸的劑亦可被用作為遞送機制。將反義劑與諸如碘苯六醇的對比劑一起投予(例如分開地、同時地、在相同的調配物中)亦可促進跨越BBB的遞送，如在PCT公開案編號WO/2013/086207(以其完整內容以引用方式併入)中描述的。
於某些實施方式中，本文之揭示內容之反義寡聚物可藉由跨 皮的方法遞送(例如透過將該反義寡聚物併入至(例如)乳劑中，而如此反義寡聚物視需要被包裝至脂質體中)。如此遞送之跨皮和乳劑/脂質體介導性方法係在所屬技術領域中針對反義寡聚物之遞送描述(例如在美國專利案編號6,965,025(其之內容係以其等之完整內容以引用方式併入本文中)中)。
本文所描述的反義寡聚物亦可透過可植入裝置遞送。如此裝置之設計係技術領域中認可的程序，而(例如)合成性植入物設計係在(例如)美國專利案編號6,969,400(其之內容係以其等之完整內容以引用方式併入本文中)中描述。
可使用技術領域中認可的技術(例如轉染、電穿孔、融合、脂質體、膠態聚合性粒子和病毒和非病毒載體以及其他所屬技術領域中已知的方法)將反義寡聚物導入至細胞中。所挑選的遞送之方法會至少取決於寡聚物之化學、欲治療的細胞和該等細胞之位置且對所屬技術領域中具有通常知識者而言會是明顯的。例如，局部化可藉由在表面上有特殊的標記以指引其的脂質體、直接注射至含有目標細胞的組織中、特殊的受體介導性攝取、或類似者來達成。
如所屬技術領域中已知的，反義寡聚物可使用(例如)以下者遞送：涉及脂質體介導性攝取、脂質綴合物、聚離胺酸介導性攝取、奈米粒子介導性攝取、和受體介導性胞吞作用的方法、以及其他遞送之非胞吞性模式，諸如微注射、可滲透化(例如鏈球菌溶血素-O可滲透化、陰離子胜肽可滲透化)、電穿孔、和種種所屬技術領域中已知的遞送之非侵入性非胞吞性方法(參照Dokka和Rojanasakul,Advanced Drug Delivery Reviews 44, 35-49，其係以其完整內容以引用方式併入)。
該等反義寡聚物可在任何生理上及/或醫藥上可接受的便利媒劑或載劑中投予。如此組成物可包括各種各樣所屬技術領域中具有通常知識者所利用的標準醫藥上可接受的載劑之任一者。實例包括(但不限於)食鹽水、磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)、水、水性乙醇、乳劑，諸如油/水乳劑或三酸甘油酯乳劑、錠劑和膠囊。適合的生理上地可接受的載劑之選擇會基於所選的投予之模式變化。「醫藥上可接受的載劑」係意欲包括任何和所有與醫藥投予相容的溶劑、分散介質、塗層、抗細菌和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑、和類似者。如此介質和劑對於醫藥活性物質之用途係所屬技術領域中廣為人知的。設想到任何習用介質或劑在該等組成物中之用途，除了與活性化合物不相容的者外。亦可將補充性活性化合物併入至該等組成物中。
本文之揭示內容之化合物(例如反義寡聚物)一般可以自由酸或自由鹼之形式利用。供選擇地，本文之揭示內容之化合物可以酸或鹼加成鹽之形式使用。本文之揭示內容之自由胺基化合物之酸加成鹽可藉由所屬技術領域中廣為人知的方法製備，且可自有機和無機酸形成。適合的有機酸包括順丁烯二酸、延胡索酸、苯甲酸、抗壞血酸、琥珀酸、甲磺酸、醋酸、三氟醋酸、草酸、丙酸、酒石酸、水楊酸、檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸、苦杏仁酸、肉桂酸、天門冬胺酸、硬脂酸、棕櫚酸、羥乙酸、麩胺酸、和苯磺酸。
適合的無機酸包括氫氯酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、和硝酸。鹼加成鹽包括該等與羧酸陰離子形成的鹽且包括與諸如該等選自以下者的 有機和無機陽離子形成的鹽：鹼金屬和鹼土金屬(例如，鋰、鈉、鉀、鎂、鋇和鈣)、以及銨離子和其經取代的衍生物(例如，二苯甲基銨、苯甲基銨、2-羥乙基銨、和類似者)。因此，術語「醫藥上可接受的鹽」係意欲涵蓋任何和所有可接受的鹽形式。
此外，前藥亦被包括在本文之揭示內容之前後文中。前藥係任何當如此前藥被投予至患者時活體內釋放化合物的共價鍵結的載體。前藥一般係藉由以以下方式修飾官能基來製備：使得該修飾係藉由例行操作切下或活體內被切下而產生親本化合物。前藥包括(例如)本文之揭示內容之化合物，其中羥基、胺或氫硫基基團係鍵結至任何當投予至患者時切下以形成羥基、胺或氫硫基基團的基團。因此，前藥之代表性實例包括(但不限於)本文之揭示內容之反義寡聚物之醇和胺官能基之醋酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物。此外，在羧酸(-COOH)之實例中，可利用酯，諸如甲酯、乙酯、和類似者。
於一些實例中，可利用脂質體以促進該反義寡聚物至細胞中的攝取(參見(例如)Williams,S.A.,Leukemia 10(12)：1980-1989,1996；Lappalainen等人，Antiviral Res.23：119,1994；Uhlmann等人，antisense oligomers：a new therapeutic principle,Chemical Reviews，第90卷，No.4,25第544-584頁，1990；Gregoriadis,G.第14章，Liposomes,Drug Carriers in Biology and Medicine,pp.287-341,Academic Press,1979)。亦可使用水凝膠作為用於反義寡聚物投予的媒劑，例如如在WO 93/01286中描述的。供選擇地，該等寡聚物可以微球或微粒子的形式投予。(參見(例如)Wu,G.Y.和Wu,C.H.,J.Biol.Chem.262：4429-4432,30 1987)。供選擇地，與該反義寡聚物複合的充氣體的微泡之 使用可增強至目標組織的遞送，如在美國專利案編號6,245,747中描述的。亦可使用持續釋放組成物。此等可包括呈成形製品(諸如薄膜或微膠囊)之形式的半透性聚合基質。
在一個實施方式中，該反義寡聚物係在適合的醫藥載劑中投予至展現溶酶體儲存失調之症狀的哺乳動物對象，例如人類或家畜。在該方法之一個方面，該對象係人類對象，例如被診斷為具有GSD-II(龐培氏病)的患者。在一個較佳的實施方式中，該反義寡聚物被包含在醫藥上可接受的載劑中，且係口部地遞送。在另一個較佳的實施方式中，該寡聚物被包含在醫藥上可接受的載劑中，且係靜脈內地(i.v.)遞送。
在一個實施方式中，該反義化合物係以有效於造成至少200-400nM反義寡聚物的峰值血液濃度的量和方式投予。典型地，投予一或多劑的反義寡聚物，一般係於定期的間隔，共一至二週的期間。用於口部投予之較佳劑量係約1-1000mg寡聚物每70kg。於一些例子中，可能需要大於1000mg寡聚物/患者的劑量。對於i.v.投予而言，較佳的劑量係約0.5mg至1000mg寡聚物每70kg。該反義寡聚物可以定期的間隔投予一段短時間，例如每日投予共二週或更少。然而，於一些例子中，該寡聚物係間歇地投予一段較長的時間。投予後可接著抗生素或其他治療性治療之投予(或與抗生素或其他治療性治療之投予同時發生)。可基於受治療的對象之免疫分析、其他生物化學測試和生理檢查結果指示地調整治療攝生法(劑量、頻率、途徑、等等)。
使用本文之揭示內容之反義寡聚物的活體內有效的治療攝生法可根據持續期間、劑量、頻率和投予之途徑、以及受治療的對象狀況 (即預防性投予對應局部或全身性感染而投予)改變。據此，如此活體內治療往往會需要藉由對於正在治療的失調之特別類型為適當的測試來監視，和於劑量或治療攝生法的相對應調整，以達成最佳的治療結果。
治療可(例如)藉由所屬技術領域中已知的疾病之一般指標監視。活體內投予的本文之揭示內容之反義寡聚物之效力可從於該反義寡聚物之投予之前、期間、和之後自一對象取得的生物樣本(組織、血液、尿液等等)測定。如此樣本之分析包括(1)監視與目標和非目標序列形成的異源雙鏈之存在或不存在，使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的程序，例如電泳凝膠移動性分析；(2)監視突變體mRNA相對於參考正常mRNA或蛋白質的量，如由諸如RT-PCR、北方墨點轉漬法、ELISA或西方墨點轉漬法之標準技術測定的。
於一些實施方式中，該反義寡聚物被哺乳動物細胞活性地攝取。在進一步的實施方式中，該反義寡聚物可與如本文所描述的運輸部分(例如運輸胜肽或CPP)綴合以促進如此攝取。
VI.給藥
咸相信治療組成物之調配和其等隨後的投予(給藥)係落入所屬技術領域中的技術之範圍內。給藥係基於欲治療的疾病狀態之嚴重性和反應性，而治療之過程持續數日至數月，或直到達成治癒或達成疾病狀態之減低。最佳的給藥排程表可從患者身體內之藥物堆積之測量結果計算。具有通常知識者可輕易地決定最佳劑量、給藥方法學和重複頻率。最佳劑量可基於個別寡聚物之相對效力變化，且一般可基於被發現在試管內 和活體內動物模型中係有效的EC50估計。一般而言，劑量係0.01μg至100g每kg的體重，且可被每日、每週、每月或每年給予一次或多次，或甚至每2至20年給予一次。所屬技術領域中具有通常知識者可基於所測量得的藥物在體液或組織中的滯留時間和濃度輕易地估計用於給藥的重複頻率。在成功的治療後，以下者可能係所欲的：使患者經歷維持治療以預防疾病狀態之復發，其中該寡聚物係以維持劑量投予，該劑量範圍在0.01μg至100g每kg的體重，每日一或多次，至每20年一次。
雖然本文之揭示內容已根據其某些特殊實施方式明確地描述，以下實施例僅係用於闡明本文之揭示內容而非意欲限制其。於在本申請案中引用的文獻、專利案、專利申請案、GenBank編號、和類似者之每一者皆以其完整內容以引用方式併入本文中。
VII.實施例
實施例1
反義靶向序列之設計
設計反義寡聚物靶向序列以用於與在人類GAA基因中的IVS1-13T>G突變有關的治療性剪接切換應用。此處，預期到剪接切換寡聚物會抑制內含子性和外顯子性剪接靜默子元件(分別為ISS和ESS元件)並從而促進在成熟GAA mRNA中的外顯子2保留。正常或接近正常的GAA表現之回復接著會允許功能性酵素被合成，從而將臨床利益提供給GSD-II患者。
因此將某些反義靶向序列設計成遮蔽剪接靜默子元件(在GAA基因之外顯子2內或在其兩側的內含子內)。有潛力的靜默子元件目標之非限制性實例包括hnRNPA1模體(TAGGGA)、Tra2-β模體、和9G8模體。亦利用內含子1和2(分別為IVS1和IVS2)mRNA之電腦模擬二級結構分析(mFold)以鑑認可提供適合的反義目標序列的長距離交互作用。得自此分析的反義靶向序列係在本文之表2A-2C中顯示。
包含如在表2A-2C中提出的靶向序列的例示性寡聚物係以PMO及/或PPMO(與CPP(諸如富精胺酸CPP)綴合的寡聚物)的形式製備。如於以下描述的，此等反義寡聚物係使用如亦於以下實施例2中描述的核染方案導入至衍生自GSD-II患者的纖維母細胞中。
實施例2
材料和方法
GSD-II細胞。在具有10% FBS的Eagle氏MEM中根據標準方案培養來自具有GSD-II的個體的衍生自患者的纖維母細胞或淋巴球(Coriell細胞系GM00443和GM11661)。在實驗前約3-5日繼代細胞且細胞於轉染或核染時係大約80%匯合。
GM00443纖維母細胞係來自一名30歲男性。成人形式；於三十幾歲發病；正常大小和量的GAA之mRNA，GAA蛋白質被抗體偵測到，但僅有9至26%的正常酸性-α-1,4葡萄糖苷酶活性；於CCR的繼代3；供體對象係異型合子，具有一個對偶基因在GAA基因之內含子1之接受位之位置13帶有T>G顛換，導致第一編碼外顯子被刪除的經選擇式剪接的轉錄 物[外顯子2(IVS1-13T>G)]。
GM11661纖維母細胞係來自一名38歲男性。異常肝臟功能測試；於身體活動期間腿部偶爾抽筋；早晨頭痛；對油膩食物不耐；腹部囊腫；纖維母細胞和WBC酸性-α-1,4葡萄糖苷酶活性不足；供體對象係化合物異型合子：對偶基因一在GAA基因之內含子1之接受位之位置13帶有T>G顛換(IVS1-13T>G)；所得的經選擇式剪接的轉錄物具有外顯子2(其含有起始密碼子)之符合讀框的刪除；對偶基因二帶有外顯子18之刪除。
核染方案。將反義PMO/PPMO(與富精胺酸胜肽綴合的PMO)製備成在無核酸酶水(未以DEPC處理)中的1-2mM儲備溶液，自其製作適當的稀釋以用於核染。將GSD-II細胞以胰蛋白酶處理，計數，以90g離心共10分鐘，並將1-5x105細胞每槽孔再懸浮在核染溶液P2(Lonza)中。接著將反義PMO溶液和細胞加至Nucleocuvette 16槽孔之條各個槽孔，並以程式EN-100脈衝。於室溫下培養細胞共10分鐘並將其以二重複轉移至12槽孔盤。於48個小時後使用GE Illustra 96離心套組按照製造商的建議方案自經處理的細胞分離全體RNA。於分析前將所回收的RNA儲存於-80℃下。
GAA RT-PCR。對於含外顯子2的mRNA之PCR偵測，自外顯子1(正向)至外顯子3(逆向)挑選引子序列。橫跨外顯子1-3的RT-PCR會產生大約1177個鹼基的全長擴增物。完整擴增物(~1177個鹼基)和缺少外顯子2(外顯子2係~578個鹼基)的~600個鹼基的轉錄物間的大小差異意謂對於較短的產物會有實質上的擴增偏好。此在分析反義寡聚物誘發全長轉錄物或含外顯子2的轉錄物之剪接的效力時會樹立高水準點。
使用SuperScript III單步驟RT-PCR系統(Invitrogen)執行逆轉錄酶PCR以擴增GAA對偶基因。逆轉錄400ng自經核染的細胞分離的全體RNA並以基因專一性引子擴增。
單步驟套組中提供的擴增溶液補充有經Cy5標記的dCTP(GE)以使得可藉由螢光顯像條帶。在預澆鑄的10%丙烯醯胺/TBE凝膠(Invitrogen)上跑膠經消化的樣本並在Typhoon Trio(GE)上使用633nm激發雷射和670nm BP 30發射濾器(焦平面在平台表面)顯像。使用ImageQuant(GE)分析凝膠以測定條帶之強度。將來自所有含外顯子2的條帶的強度加在一起以代表包含分析中的總外顯子2轉錄物水平。
供選擇地，在Caliper LabChip GX生物分析儀或Agilent 2200 Tape Station上分析PCR擴增產物(無補充的經Cy5標記的dCTP)以測定%外顯子包含。
GAA酵素分析&蛋白質樣本Wes。以在Lonza之P3核染溶液中的種種濃度之PMO核染未經轉形的衍生自患者的纖維母細胞(GM00443)並於37℃下以5% CO2培養共六日。以Hank氏經平衡鹽溶液(HBSS)洗滌細胞兩次，以未經緩衝的H2O溶胞，冷凍/解凍三次，並接著於1000rpm下振盪共1分鐘。使用Bio-Rad DCTM分析套組以定量總蛋白質濃度。對於酵素分析，組合細胞溶胞產物與在0.2M醋酸鹽緩衝液(pH 3.9或6.5)中的1.4mM 4-甲基繖形酮基α-D-葡萄哌喃糖苷(4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside)，於37℃下培養共三個小時，並接著於360nm激發和460nm發射下讀取螢光。使用4-甲基繖形酮產生標準曲線。
使用ProteinSimple® WesTM系統(12-230kDa主套組)執行對 GAA蛋白質的西方墨漬。將來自Abcam的兔抗GAA抗體[殖系EPR4716(2)]稀釋1：100並與稀釋1：5的來自Santa Cruz Biotechnology的小鼠抗GAPDH[殖系6c5]混合。以1：1組合來自ProteinSimple®的小鼠和兔二級抗體以混合。對於所有的GAA形式，使用ProteinSimple® Compass軟體以曲線下面積之形式定量GAA並對GAPDH標準化。
實施例3
反義PMO和PPMO之製備
反義PMO被設計成靶向人類GAA前驅mRNA(例如人類GAA前驅mRNA之內含子1)係如本文所描述地合成和用以處理衍生自GSD-II患者的纖維母細胞。
實施例4
反義寡聚物在衍生自GSD-II患者的纖維母細胞中誘發酸性α-葡萄糖苷酶之表現水平提高
藉由核染將以上描述的反義PMO和PPMO遞送至GM00443或GM11661細胞(參見以上(例如)材料和方法)。在於37℃下以5% CO2培養六日後，溶胞細胞並藉由以上描述的免疫分析測量在溶胞產物中的GAA活性或GAA蛋白質表現。一般而言，在以本文之揭示內容之反義寡核苷酸處理的細胞中的GAA酵素之蛋白質表現係高於在未經處理的細胞中的GAA表現水平(參見以下特別實驗結果)。此等結果指示本文之揭示內容之寡核苷酸在衍生自GSD-II患者的纖維母細胞中誘發GAA酵素之蛋白質表現水平提高。雖然不受限於任何理論或作用之機制，鑑於本文所描述的實驗結果，發明人相信本文之揭示內容之寡聚物抑制ISS及/或ESS元件並從而在成熟GAA mRNA中促進外顯子2保留。
如在以下實驗中詳述的，評估一系列變體PPMO和PMO寡核苷酸在來自具有龐培氏病的患者的細胞中增加GAA酵素之表現及/或活性之能力。該等變體寡核苷酸之靶向序列係與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內的目標區域互補的，其中該目標區域相較於該靶向序列包含一個、二個、三個、或四個額外的核鹼基，其中該等額外的核鹼基係胞嘧啶，且其中該一個、二個、三個、或四個額外的核鹼基在該靶向序列中不具有相對應互補核鹼基(因此，「-G」(鳥糞嘌呤)、「-2G」、「-3G」、或「-4G」註記)。該等額外的核鹼基對於該目標區域係內部的。令人意外的，發現到許多此等變體寡核苷酸與具有相對應 非變體靶向序列的寡核苷酸具有相同或相似的活性(參見(例如)圖10b和16)。在一些實例中，相較於具有相對應非變體靶向序列的寡核苷酸，具有變體靶向序列的寡核苷酸在患者細胞中在增加GAA酵素活性方面活性更強(參見(例如)圖16)。例如，如在圖16中顯示的，相較於具有與GAA100%互補的靶向序列的寡核苷酸(非變體)，二種具有少一個G殘基的變體靶向序列的不同寡核苷酸在自龐培氏症患者衍生的纖維母細胞中於增加GAA方面活性更強(圖16)。
實驗1
所挑選的寡核苷酸係以多種劑量(5μM、和0.2μM)在GM00443細胞中評估。在培養經核染的細胞共六日後，如以上製備溶胞產物並在溶胞產物中測量GAA酵素活性。如在圖1和2中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。
實驗2
在另一個實驗中，所挑選的寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1μM、0.2μM、和0.4μM)在GM00443細胞中評估。如在圖3和4中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。
實驗3
在另一個實驗中，所挑選的寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1μM、0.2μM、和0.04μM)在GM00443細胞中評估。如在圖5-8中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。
實驗4
在另一個實驗中，所挑選的寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、0.5μM、和0.16μM)在GM00443細胞中評估。如在圖9中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。
實驗5
在另一個實驗中，所挑選的寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、0.5μM、和0.16μM)在GM00443細胞中評估。如在圖10a中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。
實驗6
在另一個實驗中，所挑選的寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、0.5μM、和0.16μM)在GM11661細胞中評估。如在圖10b中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。
實驗7
在另一個實驗中，所挑選的寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、0.5μM、和0.16μM)在GM00443細胞中評估。如在圖11和12中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。
實驗8
在另一個實驗中，所挑選的寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、0.5μM、和0.16μM)在GM00443細胞中評估。如在圖13a中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。
實驗9
在另一個實驗中，所挑選的寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、0.5μM、和0.16μM)在GM11661細胞中評估。如在圖13b中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。
實驗10
在另一個實驗中，所挑選的寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、0.5μM、和0.16μM)在GM00443細胞中評估。如在圖14中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。
實驗11
在另一個實驗中，所挑選的PPMO寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、0.5μM、和0.16μM)在GM00443細胞中評估。如在圖15a中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。
實驗12
在另一個實驗中，所挑選的PPMO寡核苷酸係以多種劑量 (5μM、1.6μM、0.5μM、和0.16μM)在GM11661細胞中評估。如在圖15b中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。
實驗13
在另一個實驗中，所挑選的寡核苷酸係以5μM的單一劑量在GM00443細胞中評估。如在圖16中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。
實驗14
在另一個實驗中，所挑選的PPMO寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、和0.5μM)在GM00443細胞中評估。如在圖17中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。此外，EC50(μM)範圍在0.042至0.836。
實驗15
在另一個實驗中，所挑選的PPMO寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、和0.5μM)在GM11661細胞中評估。如在圖18中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆 展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。此外，EC50(μM)範圍在0.086至0.414。
實驗16
圖19提供在GM00443和GM11661細胞兩者中評估的所挑選的PPMO寡核苷酸之EC50(μM)值之表格式總結，基於三個實驗平均，N=9。
實驗17
在另一個實驗中，所挑選的PPMO寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、和0.5μM)在GM00443細胞中評估。如在圖20中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。此外，EC50(μM)範圍在0.149至0.896。
實驗18
在另一個實驗中，所挑選的PPMO寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、和0.5μM)在GM00443細胞中評估。如在圖21中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。此外，EC50(μM)範圍在0.100至0.550。
實驗19
在另一個實驗中，所挑選的PPMO寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、和0.5μM)在GM00443細胞中評估。如在圖22中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。此外，EC50(μM)範圍在0.025至0.675。
實驗20
圖23提供在GM00443和GM11661細胞兩者中評估的所挑選的PPMO寡核苷酸之EC50(μM)值之表格式總結，基於所有分析平均，N=9。
實驗21
在另一個實驗中，所挑選的PPMO寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、和0.5μM)在GM11661細胞中評估。如在圖24中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。此外，EC50(μM)範圍在0.144至0.630。
實驗22
在另一個實驗中，所挑選的PPMO寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、和0.5μM)在GM11661細胞中評估。如在圖25中顯 示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。此外，EC50(μM)範圍在0.128至0.763。
實驗23
在另一個實驗中，所挑選的PPMO寡核苷酸係以多種劑量(5μM、1.6μM、和0.5μM)在GM11661細胞中評估。如在圖26中顯示的，以所有所測試之濃度的此等化合物之各者處理的細胞之溶胞產物皆展現增加的GAA酵素活性，相較於在來自未經處理的細胞的溶胞產物中的GAA酵素活性水平。此外，EC50(μM)範圍在0.002至0.218。

Claims (20)

  1. 一種10至40個核鹼基的經修飾的反義寡核苷酸，其包含：與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內的目標區域互補的靶向序列，其中該目標區域相較於該靶向序列包含至少一個額外的核鹼基，其中該至少一個額外的核鹼基在該靶向序列中不具有互補的核鹼基，且其中該至少一個額外的核鹼基對於該目標區域而言係內部的。
  2. 根據申請專利範圍第1項的經修飾的反義寡核苷酸，其中該目標區域包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之至少一者。
  3. 根據申請專利範圍第1或2項的經修飾的反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸於該靶向序列與該目標區域結合後促進在該GAA mRNA中的外顯子2之保留。
  4. 根據申請專利範圍第1項的經修飾的反義寡核苷酸，其中該目標區域相較於該靶向序列包含一至三個額外的核鹼基。
  5. 根據申請專利範圍第1項的經修飾的反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸相較於與SEQ ID NO：1內的目標區域完全互補的第二反義寡核苷酸根據酵素活性測試誘發至少二倍或至少三倍或至少四倍的GAA酵素活性。
  6. 根據申請專利範圍第1項的經修飾的反義寡核苷酸，其中該靶向序列係選自SEQ ID NO：13-58之任一者。
  7. 根據申請專利範圍第1項的經修飾的反義寡核苷酸，其中該靶向序列係選自SEQ ID NO：13、33-38、45、46、和87-123之任一者。
  8. 根據申請專利範圍第1項的經修飾的反義寡核苷酸，其中該靶向序列係選自SEQ ID NO：13、27-29、或34-36之任一者。
  9. 一種式(I)的反義寡聚物化合物， 或其醫藥上可接受的鹽，其中：各個Nu係一起形成靶向序列的核鹼基；Z係8至38的整數；各個Y係獨立地選自O和-NR4，其中各個R4係獨立地選自H、C1-C6烷基、芳烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)nNR5C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR5C(=NH)NH2、和G，其中R5係選自H和C1-C6烷基且n係1至5的整數；T係選自OH和以下式的部分： 其中：A係選自-OH、-N(R7)2、和R1，其中各個R7係獨立地選自H和C1-C6烷基，且R6係選自OH、-N(R9)CH2C(O)NH2、和以下式的部分： 其中：R9係選自H和C1-C6烷基；且R10係選自G、-C(O)-R11OH、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)mNR12C(=NH)NH2、和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR12C(=NH)NH2，其中：m係1至5的整數，R11係式-(O-烷基)y-，其中y係3至10的整數且y個烷基基團之各者係獨立地選自C2-C6烷基；且R12係選自H和C1-C6烷基；R1之各者係獨立地選自：-N(R13)2，其中各個R13係獨立地選自H和C1-C6烷基；式(II)之部分： 其中： R15係選自H、G、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)qNR18C(=NH)NH2、和-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR18C(=NH)NH2，其中：R18係選自H和C1-C6烷基；且q係1至5的整數，且各個R17係獨立地選自H和甲基；和式(III)之部分： 其中：R19係選自H、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)rNR22C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR22C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)4NH2和G，其中：R22係選自H和C1-C6烷基；且r係1至5的整數，且R20係選自H和C1-C6烷基；或R19和R20與其等所接附的氮原子一起形成具有5至7個環原子且視需要地含有選自氧、氮、和硫之額外的雜原子之雜環基或雜芳基環；且R2係選自H、G、醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基、硬脂醯基、C1-C6烷基、-C(=NH)NH2、-C(O)-R23、-C(O)(CH2)sNR24C(=NH)NH2、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NR24C(=NH)NH2、-C(O)CH(NH2)(CH2)3NHC(=NH)NH2、和以下式的部分： 其中，R23係式-(O-烷基)v-OH，其中v係3至10的整數且v個烷基基團之各者係獨立地選自C2-C6烷基；且R24係選自H和C1-C6烷基；s係1至5的整數；L係選自-C(O)(CH2)6C(O)-和-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-；且各個R25係式-(CH2)2OC(O)N(R26)2，其中各個R26係式-(CH2)6NHC(=NH)NH2，其中G係選自以下者的細胞穿透性胜肽(「CPP」)和連接子部分：-C(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)(CH2)2NH-CPP、-C(O)(CH2)2NHC(O)(CH2)5NH-CPP、-C(O)CH2NH-CPP、和： 其中該CPP係於該CPP之羧基端藉由醯胺鍵接附至該連接子部分，且其中G可出現一次或不存在；且其中該靶向序列係選自由以下者所組成之群組：I.a)SEQ ID NO：13(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC)，其中Z係22； b)SEQ ID NO：14(GCC AGA AGG AAG GC GAG AAA AGC X)，其中Z係22；c)SEQ ID NO：15(CCA GAA GGA AGG CGA GAA AAG CXC)，其中Z係22；d)SEQ ID NO：16(CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC XCC)，其中Z係22；e)SEQ ID NO：17(AGA AGG AAG GCG AGA AAA GCX CCA)，其中Z係22；f)SEQ ID NO：18(GAA GGA AGG CGA GAA AAG CXC CAG)，其中Z係22；g)SEQ ID NO：19(AAG GAA GGC GAG AAA AGC XCC AGC)，其中Z係22；h)SEQ ID NO：20(AGG AAG GCG AGA AAA GCX CCA GCA)，其中Z係22；i)SEQ ID NO：21(CGG CXC XCA AAG CAG CXC XGA GA)，其中Z係21；j)SEQ ID NO：22(ACG GCX CXC AAA GCA GCX CXG AG)，其中Z係21；k)SEQ ID NO：23(CAC GGC XCX CAA AGC AGC XCX GA)，其中Z係21；l)SEQ ID NO：24(XCA CGG CXC XCA AAG CAG CXC XG)，其中Z係21；m)SEQ ID NO：25(CXC ACG GCX CXC AAA GCA GCX CX)，其中Z係21；n)SEQ ID NO：26(ACX CAC GGC XCX CAA AGC AGC XC)，其中Z係21；o)SEQ ID NO：27(GCG GCA CXC ACG GCX CXC AAA GC)，其中Z係21；p)SEQ ID NO：28(GGC GGC ACX CAC GGC XCX CAA AG)，其中Z係21；q)SEQ ID NO：29(CGG CAC XCA CGG CXC XCA AAG CA)，其中Z係21；r)SEQ ID NO：30(GCA CXC ACG GCX CXC AAA GCA GC)，其中Z係21；s)SEQ ID NO：31(GGC ACX CAC GGC XCX CAA AGC AG)，其中Z係21；t)SEQ ID NO：32(CAC XCA CGG CXC XCA AAG CAG CX)，其中Z係21；u)SEQ ID NO：33(GCC AGA AGG AAG GCG AGA AAA GC)，其中Z係21；v)SEQ ID NO：34(CCA GAA GGA AGG CGA GAA AAG C)，其中Z係19；w)SEQ ID NO：35(CAG AAG GAA GGC GAG AAA AGC)，其中Z係19； x)SEQ ID NO：36(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA AG)，其中Z係21；y)SEQ ID NO：37(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA A)，其中Z係19；z)SEQ ID NO：38(GGC CAG AAG GAA GGC GAG AAA)，其中Z係19；aa)SEQ ID NO：39(CGG CAC XCA CGGC XCX CAA AGC A)，其中Z係21；bb)SEQ ID NO：40(GCG GCA CXC ACGG CXC XCA AAG C)，其中Z係21；cc)SEQ ID NO：41(GGC GGC ACX CAC G GCX CXC AAA G)，其中Z係21；dd)SEQ ID NO：42(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GGC)，其中Z係22；ee)SEQ ID NO：43(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GC)，其中Z係21；ff)SEQ ID NO：44(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA C)，其中Z係20；gg)SEQ ID NO：45(GGC CAG AAG GAA GCG AGA AAA GC)，其中Z係21；hh)SEQ ID NO：46(GGC CAG AAG GAA CGA GAA AAG C)，其中Z係20；ii)SEQ ID NO：47(AGG AAG CGA GAA AAG CXC CAG CA)，其中Z係21；jj)SEQ ID NO：48(AGG AAC GAG AAA AGC XCC AGC A)，其中Z係20；kk)SEQ ID NO：49(CGG GCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA)，其中Z係22；ll)SEQ ID NO：50(CGC XCX CAA AGC AGC XCX GAG A)，其中Z係20；mm)SEQ ID NO：51(CCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA)，其中Z係19；nn)SEQ ID NO：52(GGC GGC ACX CAC GGG CXC XCA AAG)，其中Z係22；oo)SEQ ID NO：53(GGC GGC ACX CAC GCX CXC AAA G)，其中Z係20；pp)SEQ ID NO：54(GGC GGC ACX CAC CXC XCA AAG)，其中Z係19；qq)SEQ ID NO：55(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GGC)，其中Z係22；rr)SEQ ID NO：56(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GC)，其中Z係21；ss)SEQ ID NO：57(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG C)，其中Z係20； 和tt)SEQ ID NO：58(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACC)，其中Z係19，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)；II.a)SEQ ID NO：59(GGC CAG AAG GAA GGG CGA GAA AAG C)，其中Z係23；b)SEQ ID NO：60(CCA GAA GGA AGG GCG AGA AAA GCX C)，其中Z係23；c)SEQ ID NO：61(AAG GAA GGG CGA GAA AAG CXC CAG C)，其中Z係23；d)SEQ ID NO：62(GCG GGA GGG GCG GCA CXC ACG GGG C)，其中Z係23；e)SEQ ID NO：63(XGG GGA GAG GGC CAG AAG GAA GGG C)，其中Z係23；f)SEQ ID NO：64(AGA AGG AAG GGC GAG AAA AGC XCC A)，其中Z係23；g)SEQ ID NO：65(GCX CXC AAA GCA GCX CXG AGA CAX C)，其中Z係23；h)SEQ ID NO：66(CXC XCA AAG CAG CXC XGA GAC AXC A)，其中Z係23；i)SEQ ID NO：67(XCX CAA AGC AGC XCX GAG ACA XCA A)，其中Z係23；j)SEQ ID NO：68(CXC AAA GCA GCX CXG AGA CAX CAA C)，其中Z係23； k)SEQ ID NO：69(XCA AAG CAG CXC XGA GAC AXC AAC C)，其中Z係23；l)SEQ ID NO：70(CAA AGC AGC XCX GAG ACA XCA ACC G)，其中Z係23；m)SEQ ID NO：71(AAA GCA GCX CXG AGA CAX CAA CCG C)，其中Z係23；n)SEQ ID NO：72(AAG CAG CXC XGA GAC AXC AAC CGC G)，其中Z係23；o)SEQ ID NO：73(AGC AGC XCX GAG ACA XCA ACC GCG G)，其中Z係23；p)SEQ ID NO：74(GCA GCX CXG AGA CAX CAA CCG CGG C)，其中Z係23；和q)SEQ ID NO：75(CAG CXC XGA GAC AXC AAC CGC GGC X)，其中Z係23，其中X係選自尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)。
  10. 根據申請專利範圍第9項的反義寡聚物化合物，其中各個R1係-N(CH3)2。
  11. 根據申請專利範圍第9項的反義寡聚物化合物，R1係選自：
  12. 根據申請專利範圍第9-11項中之任一項的反義寡聚物化合物，其中T係選自：；；；和，且 Y每次出現係O。
  13. 一種10至40個核鹼基的經修飾的反義寡核苷酸之用途，其係用於製造用於治療第II型肝醣蓄積病的醫藥品，其中該經修飾的反義寡核苷酸包含與人類α葡萄糖苷酶(GAA)基因之前驅mRNA之內含子1(SEQ ID NO：1)內的目標區域互補的靶向序列，其中該目標區域相較於該靶向序列包含至少一個額外的核鹼基，其中該至少一個額外的核鹼基在該靶向序列中不具有互補的核鹼基，且其中該至少一個額外的核鹼基對於該目標區域而言係內部的，從而治療該對象。
  14. 根據申請專利範圍第13項的用途，其中該目標區域包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之至少一者。
  15. 根據申請專利範圍第13或14項的用途，其中該反義寡核苷酸於該靶向序列與該目標區域結合後促進在該GAA mRNA中的外顯子2之保留。
  16. 根據申請專利範圍第13項的用途，其中該目標區域相較於該靶向序列包含一至三個額外的核鹼基。
  17. 根據申請專利範圍第13項的用途，其中該反義寡核苷酸相較於與SEQ ID NO：1內的目標區域完全互補的第二反義寡核苷酸根據酵素活性測試誘發至少二倍或至少三倍或至少四倍的GAA酵素活性。
  18. 根據申請專利範圍第13項的用途，其中該靶向序列係選自SEQ ID NO：13-58之任一者。
  19. 根據申請專利範圍第13項的用途，其中該靶向序列係選自SEQ ID NO：13、33-38、45、46、和87-123之任一者。
  20. 根據申請專利範圍第13項的用途，其中該靶向序列係選自SEQ ID NO：13、27-29、或34-36之任一者。
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