CN102574888A - 用于rna及其衍生物的合成的新型保护基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及下述通式(I)所示的保护基，该保护基在核酸合成循环的反应条件下稳定，空间位阻小，并且在使用氟化物离子作为碱的温和条件下能够离去。在通式(I)中，带*的氧原子表示核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物的2′-位羟基的氧原子；R1和R2均为氢原子，或者表示卤原子、C1-6烷基、或者C1-6卤代烷基；R3和R4表示氢原子、卤原子、C1-6烷基、或者C1-6卤代烷基；R5和R6表示卤原子、C1-6卤代烷基、氰基、或者硝基等。
Description
技术领域
本发明涉及能够在低聚核糖核酸等的化学合成中利用的新型的保护基。
背景技术
低聚核糖核酸具有各种各样的有用性，除了能够用作基因分析用的RNA探针之外，还能够用作反义RNA或RNAi等基因表达调节用医药用品的有效成分等。低聚核糖核酸通常可以使用亚磷酰胺化合物通过固相合成法来制造(J.Am.Chem.Soc.，109，7845，1987)，但由于构成核糖核酸的核糖核苷酸的β-D-核糖在2-位具有羟基(本说明书中，对于核糖核苷酸及其衍生物而言，将该羟基称为“2′-位羟基”，对于核糖核苷及其衍生物也同样称呼)，因此与脱氧核糖核酸(DNA)的制造方法不同，存在制造收率因该2′-位羟基的保护基的种类不同而受到很大影响的问题。
作为在低聚核糖核酸的制造中使用的2′-位羟基的保护基，已知上述出版物(J.Am.Chem.Soc.，109，7845，1987)中记载的叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)等甲硅烷基保护基。特别是，TBDMS通过在中性条件下与氟化物离子发生反应从而能够去除，因此在低聚核糖核酸的制造中是通用的。但是，在使用TBDMS作为2′-位羟基的保护基的情况下，在将3′-位羟基亚磷酰胺化时，TBDMS可能会转位到3′-位羟基。并且，由于TBDMS基的空间体积大，因此还具有因空间位阻而使生成核苷酸键合的缩合反应的效率降低的问题。
并且已知：通过将作为乙缩醛系保护基提供的1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)用作2′-位羟基的保护基(Helvetica Chimica Acta，81，1545，1998；Tetrahedorn Lett.，45，9529，2004)，从而能够有效地制造低聚核糖核酸(国际公开WO2005/23828)。但是，已知通常乙缩醛系保护基对酸不稳定，在长链合成时无法确保充分的稳定性，进而在脱保护时会在反应体系内生成丙烯腈，与核酸碱基部位产生副反应。并且，由于该保护基具有不对称中心，因此通过引入保护基，反应产物成为非对映混合物，还存在难以鉴定目标物的问题。
为了解决这样的问题，作为在低聚核糖核酸的制造中使用的2′-位羟基的保护基，有文献提出了-CH2-O-CH2-CH2-WG1所示的保护基(国际公开WO2006/22323：式中，WG1表示吸电子基)，上述出版物中具体示出了使用氰基作为WG1所示的吸电子基的保护基(-CH2-O-CH2-CH2-CN：该保护基有时被称为“CEM”)。该保护基具有下述特征：空间位阻小，在中性条件下与氟化物离子发生反应，从而能够去除。但是，在与氟化物离子发生反应时的去除效率不能充分令人满意，在保护基去除工序中需要严密地调节所使用的溶剂的含水率，还具有从制造成本方面考虑不优选的问题。此外已知，与CEE基同样地，脱保护时在反应体系内生成丙烯腈，与核酸碱基部位产生副反应，因此必须向反应体系内添加捕捉剂，从制造成本和对环境的影响的方面考虑也存在问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2006/22323
专利文献2：国际公开WO2005/23828
非专利文献
非专利文献1：J.Am.Chem.Soc.，109，7845，1987
非专利文献2：Helvetica Chimica Acta，81，1545，1998
非专利文献3：Tetrahedorn Lett.，45，9529，2004
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题在于提供在低聚核糖核酸的制造等中使用的核糖核苷、核糖核苷酸以及它们的衍生物的2′-位羟基的保护基。
更具体地说，本发明的课题在于提供上述保护基，其在核酸合成循环的反应条件下稳定，空间位阻小，并且在使用氟化物离子作为碱的温和条件下(Chem.Rev.，80，429，1980)、或在甲硅烷基化剂等亲核物质捕捉剂存在下或强碱性条件下能够离去。
用于解决课题的方案
为了解决上述课题，本发明人进行了深入研究，结果发现下述通式(I)所示的保护基具有以下优异的性质：在核酸合成循环的反应条件下稳定，空间位阻小，并且通过在温和的条件下利用氟化物离子进行处理能够极有效且在短时间内去除，另外即使在水的存在下也能够容易去除，在保护基去除工序中能够直接利用通常可获得的溶剂而无需在意含水率。另外还发现：即使在甲硅烷基化剂等亲核物质捕捉剂存在下、在强碱性条件下，也能够迅速进行去除。本发明是基于上述见解而完成的。
即，根据本发明，提供一种下述通式(I)所示的保护基，其为核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物的2′-位羟基的保护基：
(式中，带*的氧原子表示核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物的2′-位羟基的氧原子；R1和R2均为氢原子，或者各自独立地表示卤原子、C1-6烷基、或者C1-6卤代烷基；R3和R4各自独立地表示氢原子、卤原子、C1-6烷基、或者C1-6卤代烷基；R5和R6各自独立地表示卤原子、C1-6卤代烷基、氰基、或者硝基，或者R5和R6相互键合，表示具有或不具有氟原子取代基的9-芴基)。作为卤原子，优选氟原子，作为卤代烷基，优选氟代烷基。
根据上述发明的优选方式，提供R1和R2为氢原子的上述保护基；R3和R4为氢原子或氟原子的上述保护基；R3和R4均为氢原子的上述保护基；R5和R6为选自氟取代C1-6烷基、氰基、或者硝基的相同取代基的上述保护基；R5和R6为选自氟取代C1-6烷基或氰基的相同取代基的上述保护基；R5和R6为相同的氟取代C1-6烷基的上述保护基；R5和R6为相同的全氟C1-6烷基的上述保护基；以及R5和R6均为三氟甲基的上述保护基。
并且，根据上述发明的优选方式，提供核糖核苷酸的衍生物为亚磷酰胺化合物的上述保护基。
从本发明的另一观点来看，提供2′-位羟基的氧原子被上述保护基保护的核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物。
作为核糖核苷酸的衍生物的优选例，可以举出亚磷酰胺化合物，本发明还提供下述通式(II)所示的化合物作为被上述保护基所保护的特别优选的亚磷酰胺化合物：
(式中，B表示具有或不具有保护基的天然或非天然的核酸碱基；R1、R2、R3、R4、R5和R6与上述含义相同；R11表示具有或不具有取代基的三苯甲基(构成该三苯甲基的3个苯基中的2个苯基可以通过氧原子相互键合形成呫吨环)；R12和R13各自独立地表示C1-6烷基，或者R12和R13可以相互键合形成饱和5或6元环(该环具有或不具有1个或2个以上的氧原子或硫原子作为成环原子)；R14和R15各自独立地表示氢原子或C1-6烷基，R14可以与R13键合而形成5或6元环；R16表示吸电子性基团，或者在R14与R13键合形成5或6元环时表示吸电子基或氢原子，R17和R18表示氢原子或C1-6烷基，或者R16、R17和R18相互键合，并连同它们所键合的碳原子一起表示芳基)。
进而从另一观点来看，本发明提供使用上述亚磷酰胺化合物的低聚核糖核酸的制造方法以及由该制造方法所制造的低聚核糖核酸。并且，本发明还提供作为该制造方法中的制造用中间体而获得的固定于固相的具有上述保护基的低聚核糖核酸。
并且，根据本发明，提供一种包含下述通式(III)所示的化合物的试剂，其为用于保护核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物的2′-位羟基的试剂。
[式中，R3、R4、R5、和R6与上述含义相同，R21表示羟基、R22-S-C(R1)(R2)-O-(式中，R22表示C1-6烷基，R1和R2与上述含义相同)、或者X-C(R1)(R2)-O-(式中，X表示离去基团，R1和R2与上述含义相同)]。作为离去基团，优选可以举出氯原子、溴原子、甲烷磺酰基等烷基磺酰基、或者对甲苯磺酰基等芳基磺酰基等。
另外提供一种方法，其为使用上述通式(III)所示的试剂对核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物的2′-位羟基进行保护的方法，该方法包括以下工序：使上述通式(III)所示的试剂与2′-位羟基被C1-6烷基硫甲基保护的核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物反应。
发明效果
上述通式(I)所示的保护基在核酸合成循环的反应条件下稳定，空间位阻小，并且在温和的条件下例如通过用氟化合物进行处理能够极其有效且在短时间内进行去除，因此作为核糖核苷、核糖核苷酸以及它们的衍生物的2′-位羟基的保护基具有理想的性质。并且，上述保护基在水的存在下也能够容易去除，在保护基去除工序中无需特别在意含水率，具有能够直接使用通常可获得的溶剂的优异性质，因此从制造成本的方面考虑具有所希望的性质。此外，即使在甲硅烷基化剂等亲核物质捕捉剂存在下、在强碱性条件下，也能够迅速进行去除，因此还具有通过对保护基的组合进行钻研而无需如现有方法那样以多阶段进行脱保护的优点。
具体实施方式
上述通式(I)中，带*的氧原子表示核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物的2′-位羟基的氧原子。
本说明书中，构成核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物的碱基没有特别限定，可以使用天然或非天然的任意的碱基。例如，可以使用胞嘧啶、尿嘧啶等嘧啶碱基；腺嘌呤、鸟嘌呤等嘌呤碱基。并且，作为碱基，还可以使用例如5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、5-羟基尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、或者异鸟嘌呤等修饰碱基。
上述碱基可以具有1个或2个以上的任意的取代基。取代基的种类、取代基的个数以及取代位置没有特别限定，存在2个以上的取代基时，它们可以相同，也可以不同。作为取代基，可以举出例如卤原子、桥氧基、硫代基、硝基、亚硝基、氰基、异氰基、氰酰基、硫氰酰基、异氰酰基、异硫氰酰基、羟基、硫烷基(sulfanyl)、羧基、硫烷基羰基、草酰基、中草酰基、硫代羧基、二硫代羧基、氨基甲酰基、硫代氨基甲酰基、磺基、氨磺酰基、亚磺基、胺亚磺酰基、次硫酸基、胺硫基、膦酰基、羟基膦酰基、C1～C6的烷基、C2～C6的链烯基(例如，乙烯基、烯丙基、1-丙烯基等)、C2～C6的炔基(例如，乙炔基、1-丙炔基等)、C1～C6的次烷基、C6～C10的芳基、C7～C12的芳烷基(例如，苄基、苯乙基、1-萘基甲基、2-萘基甲基等)、C7～C12的芳亚烷基(例如，苯亚甲基、苯亚乙基、1-萘基亚甲基、2-萘基亚甲基等)、C1～C6的烷氧基、C6～C10的芳氧基(例如，苯氧基、1-萘基氧基、2-萘基氧基等)、C7～C12的芳烷基氧基(例如，苄氧基、(1-萘基甲基)氧基、(2-萘基甲基)氧基等)、C1～C6的烷基硫基(例如，甲硫基、乙硫基等)、C6～C10的芳基硫基(例如，苯基硫基、1-萘基硫基、2-萘基硫基等)、C7～C12的芳烷基氧基硫基(例如，苄基硫基、(1-萘基甲基)硫基、(2-萘基甲基)硫基等)、C1～C6的烷酰基(例如，乙酰基、丙酰基、正丁酰基、新戊酰基等)、C6～C10的芳酰基(例如，苯甲酰基、1-萘甲酰基、2-萘甲酰基等)、C1～C6的烷基磺酰基(例如，甲烷磺酰基、乙烷磺酰基、丙烷磺酰基等)、C6～C10的芳基磺酰基(例如，苯磺酰基、1-萘磺酰基、2-萘磺酰基等)、C1～C6的烷氧基羰基、氨基、肼基、亚肼基、二氮烯基、脲酰基、硫脲基、胍基、甲脒基(カルバモイミドイル基)(脒基)、叠氮基、亚氨基、羟基氨基、羟基亚氨基、氨基氧基、重氮基、脲亚氨基、半卡腙基、脲羰基、脲乙酰基、环磷(phosphano)基、氧磷基、二氧磷基、氧硼基、甲硅烷基、甲锡烷基、氢硒基、氧化物基、杂芳基、或者杂芳基的双键的一部分或全部被置换成单键的部分饱和或完全饱和杂环基等，但不限定于此。
并且，上述示例的取代基还可以被1种或2种以上的其他取代基所取代。作为这样的例子，可以举出例如C1～C6的卤化烷基(例如，氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、二氟甲基、三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、五氟乙基等)、C1～C6的卤化烷氧基(例如，三氟甲氧基、五氟乙氧基等)、羧基取代C1～C6烷基(例如，羧甲基、羧乙基等)、C1～C6烷基取代氨基(例如，甲基氨基、乙基氨基等)等，但不限定于此。
作为核糖核苷，能够使用在D-核糖上键合了上述碱基的化合物，优选能够使用胞苷、尿苷、腺苷、或者鸟苷等，作为核糖核苷酸，能够使用在核糖核苷的3′位以酯键键合了磷酸的化合物，优选能够使用胞苷3′-磷酸、尿苷3′-磷酸、腺苷3′-磷酸、或者鸟苷3′-磷酸等。作为核糖核苷的衍生物，可以举出例如被保护的核糖核苷等，作为核糖核苷酸的衍生物，除了例如被保护的核糖核苷酸之外，还可以举出低聚核苷酸(例如包含2个至100个左右的核苷酸单元)、用于低聚核苷酸的合成的反应性核糖核苷酸化合物(例如固相合成中所用的亚磷酰胺化合物等)、低聚核苷酸的合成中的各种制造用中间体(例如固定于固相、且被1个以上的保护基所保护的核苷酸化合物或低聚核苷酸化合物)等，但不限定于此。并且，核糖核苷或核糖核苷酸的衍生物可以为具有1个或2个以上例如对上述碱基所说明的任意的取代基的化合物。取代基的种类、取代基的个数以及取代位置没有特别限定，存在2个以上取代基时，它们可以相同，也可以不同。
核糖核苷或核糖核苷酸具有保护基时，表示除了上述通式(I)所示的保护基以外，还具有1个或2个以上的任意的保护基，该保护基作为2′-位羟基以外的保护基使用。作为在核糖核苷或核糖核苷酸中能够利用的保护基，可以举出例如对氨基或羟基等进行保护的保护基，关于这些保护基，例如，可以参照Green等的Protective Groups inOrganic Synthesis(有机合成中的保护基)，第三版，1999，John Wiley & Sons，Inc.等成书。
通式(I)中，R1和R2均为氢原子，或者各自独立地表示卤原子、C1-6烷基、或者卤代C1-6烷基。本说明书中，烷基或具有烷基部分的取代基的烷基部分(例如氟取代C1-6烷基的烷基部分)可以是由直链状、支链状、环状、或者它们的组合所形成的烷基中的任一种。本说明书中，作为卤原子，可以是氟原子、氯原子、溴原子、或者碘原子中的任一种，作为R1和R2表示的卤原子，可以优选使用氟原子。作为R1和R2所表示的卤代C1-6烷基，可以优选使用氟取代C1-6烷基。作为氟取代C1-6烷基，可以使用在任意的位置具有1个或2个以上氟原子的C1-6烷基，优选可以使用全氟烷基，可以进一步优选使用三氟甲基、五氟乙基等。优选R1和R2均为氢原子，但也优选R1和R2均为卤代C1-6烷基的情况，或者R1和R2为相同的氟取代C1-6烷基、例如为三氟甲基。最优选R1和R2均为氢原子的情况。
R3和R4各自独立地表示氢原子、卤原子、C1-6烷基、或者卤代C1-6烷基。作为R3和R4所表示的卤原子，优选氟原子。作为R3和R4所以表示的卤代C1-6烷基，可以优选使用氟取代C1-6烷基。作为C1-6氟取代烷基，可以使用在任意的位置具有1个或2个以上氟原子的C1-6烷基，可以优选使用全氟烷基，可以进一步优选使用三氟甲基、五氟乙基等。优选R3和R4均为氢原子，但也优选R3和R4均为卤代C1-6烷基的情况，或者R3和R4为相同的氟取代C1-6烷基、例如为三氟甲基。最优选R3和R4均为氢原子的情况。
R5和R6各自独立地表示卤原子、卤代C1-6烷基、氰基、或者硝基。作为R5和R6所表示的卤原子，优选氟原子。作为R5和R6所表示的卤代C1-6烷基，可以优选使用氟取代C1-6烷基。作为氟取代C1-6烷基，可以使用在任意的位置具有1个或2个以上氟原子的C1-6烷基，可以优选使用全氟烷基，可以进一步优选使用三氟甲基、五氟乙基等。并且，R5和R6相互键合而表示9-芴基，该9-芴基可以在任意的位置具有1个以上氟原子。R5和R6优选为相同的氟取代C1-6烷基、优选为相同的全氟C1-6烷基、例如三氟甲基或五氟乙基，或者R5和R6还优选均为氰基、或者均为硝基。特别优选R5和R6为相同的全氟C1-6烷基、例如三氟甲基或五氟乙基的情况，最优选R5和R6均为三氟甲基的情况。具有相同的全氟C1-6烷基作为R5和R6的保护基可以对所保护的化合物赋予氟(fluorous)特性，容易进行产物的分离和精制，因此从工业方面考虑是有利的。
作为通式(I)所示的保护基的优选方式，可以举出R1和R2均为氢原子、R3和R4均为氢原子、且R5和R6为相同的氟取代C1-6烷基的保护基，作为更优选的方式，可以举出R1和R2均为氢原子、R3和R4均为氢原子、且R5和R6为相同的全氟C1-6烷基的保护基，作为特别优选的方式，可以举出R1和R2均为氢原子、R3和R4均为氢原子、且R5和R6均为三氟甲基的保护基，但本发明的保护基不限定于上述的特定方式。由于上述各保护基不具有不对称碳原子，因此在作为保护基引入时，反应产物不会形成非对映混合物，从容易鉴定目标物的方面考虑也有利。
将上述通式(I)所示的保护基引入到核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物的2′-位羟基的手段没有特别限定，通常希望在反应前用任意的保护基预先对2′-位羟基以外的反应性官能团进行保护。可以参照例如Green等的Protective Groups in OrganicSynthesis(有机合成中的保护基)，第三版，1999，John Wiley & Sons，Inc.等成书来适宜地选择和引入这样的保护基。
在上述通式(III)所示的化合物中，使用R21为羟基的化合物时，通常通过使上述通式(III)所示的化合物与2′-位羟基被C1-6烷基硫甲基保护的核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物反应，从而能够容易地进行上述保护基的引入。上述反应能够在无水条件下、在酸和N-碘琥珀酰亚胺(NIS)等氧化剂的存在下进行。例如，能够在四氢呋喃(THF)等醚系溶剂等非质子性溶剂的存在下、在作为脱水剂的分子筛(MS)的存在下进行反应，作为酸，能够使用例如三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐等酸。上述反应中，酮缩硫醇基中的烷硫基的硫原子在被碘化后，与上述通式(III)所示的醇化合物的羟基交换，提供引入了上述通式(I)所示的保护基的缩酮化合物。反应例如能够使用分子筛4A等以-50～-40℃左右的反应温度进行，通式(I)所示的保护基的导入手段不限定于上述特定的反应条件，本领域技术人员当然可以适宜选择。
并且，在上述通式(III)所示的化合物中，使用R21为羟基以外的基团的化合物时，能够根据通常的取代反应来进行反应。在R21为R22-S-C(R1)(R2)-O-所示的基团的情况下，能够在例如四氢呋喃等非质子性溶剂中在分子筛、三氟甲磺酸、N-碘琥珀酰亚胺等的存在下进行反应，在R21为X-C(R1)(R2)-O-所示的基团的情况下，能够在例如1，2-二氯乙烷等非质子性溶剂中在二丁基二氯化锡、二异丙基乙胺等的存在下进行反应，但并不限定于这些条件。
在上述通式(III)所示的化合物中，使用了R21为羟基的化合物的典型的反应工序例如下所示，但是本发明的范围不限定于下述反应路线所记载的方法。反应路线中，Me表示甲基，Et表示乙基，DIBAL表示二异丁基氢化铝，Ur表示尿嘧啶碱基，TMSOTf表示三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐，MS4A表示分子筛4A，THF表示四氢呋喃，NIS表示N-碘琥珀酰亚胺。并且，关于反应路线中的化合物(1)的制造方法，在实施例中示出了具体方法。
作为具有通式(I)所示的保护基的核糖核苷酸衍生物的优选例，可以举出上述通式(II)所示的亚磷酰胺化合物。通式(II)中的B与上述说明的核酸碱基相同，R1、R2、R3、R4、R5、和R6与上述说明相同。R11表示具有或不具有取代基的三苯甲基。作为三苯甲基具有取代基的情况，可以示例出在构成三苯甲基的1个以上的苯基、优选为2个或3个苯基的对位分别具有烷氧基、例如甲氧基等的情况，但不限定于该特定的方式。另外，构成该三苯甲基的3个苯基中的2个苯基可以通过氧原子相互键合，形成呫吨环。作为这样的例子，可以举出三苯甲基形成9-苯基呫吨-9-基(pixyl基)的情况，使用pixyl基的情况是优选的方式。
R12和R13各自独立地表示C1-6烷基。并且，R12和R13可以相互键合形成饱和的5或6元环。由R12和R13以及它们键合的氨基所形成的环可以具有1个或2个以上的氧原子或硫原子作为成环原子。作为所形成的饱和的环结构，可以举出例如吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、吗啉-1-基、或者硫代吗啉-1-基等，但不限定于此。
R14和R15各自独立地表示氢原子或C1-6烷基，优选为氢原子。R13和R14可以键合而形成5或6元环。在R12和R13相互键合而形成饱和的5或6元环的情况下，R13与R14也键合而形成5或6元环，其结果能够形成包含由R12和R13形成的环和由R13和R14形成的环的双环性基团。
作为R16所表示的吸电子性基团，可以举出例如氰基、硝基、烷基磺酰基、卤原子、或者氟取代C1-6烷基(例如三氟甲基等全氟C1-6烷基等)，但不限定于此。可以优选使用氰基作为R16。在R13与R14键合而形成5或6元环的情况下，R16表示吸电子基或氢原子，优选为氢原子。R17和R18表示氢原子或C1-6烷基，优选均为氢原子。
并且，R16、R17、和R18还优选相互键合，并连同它们所键合的碳原子一起表示芳基。作为芳基，能够使用取代或无取代的苯基等，作为取代苯基，能够使用例如卤素取代苯基、硝基苯基、三氟甲基苯基等，但不限定于此。作为芳基，可以优选使用无取代苯基。
本发明的亚磷酰胺化合物包含单纯或非单纯形态的任意的空间异构体(光学活性体或非对映异构体等)或空间异构体的任意的混合物等。并且，在本发明的亚磷酰胺形成盐的情况下，任意形态的盐也包含在本发明的范围内。此外，游离形态的化合物或任意的盐的水合物或溶剂化物也包含在本发明的范围内。
作为优选的亚磷酰胺化合物，可以举出R16、R17及R18相互键合、并连同它们所键合的碳原子一起形成苯基的下述式(IIA)所示的化合物，但亚磷酰胺化合物并不限定于下述化合物。式中的定义与上述含义相同。
以下示出通式(IIA)所包含的优选的亚磷酰胺化合物，但通式(IIA)所示的化合物并不限定于此(式中，Me表示甲基，Ph表示苯基)。
使用上述通式(II)所示的亚磷酰胺化合物，能够有效地制造低聚核糖核酸。
例如，国际公开WO2006/22323中具体示出了以下方法：该方法使用具有-CH2-O-CH2-CH2-WG1所示的保护基作为2′-位保护基的亚磷酰胺化合物来制造低聚核糖核酸。使用了上述通式(II)所示的亚磷酰胺化合物的低聚核糖核酸的制造可以根据上述国际公开WO2006/22323所公开的方法进行。将上述国际公开WO2006/22323的全部公开内容作为参照包含在本说明书的公开内容中。特别是，在上述国际公开的[0025]段至[0033]段，对于通式(3)所示的低聚核糖核酸，具体说明了工序A～工序G以及工序A～工序D的反复操作，除了本发明的亚磷酰胺化合物中的2′-位羟基的保护基的差异外，能够直接参照上述说明，使用本发明的亚磷酰胺化合物来制造低聚核糖核酸。并且，上述说明中的各术语的定义、例如[固相载体]、[衔接物]、[酸]等也可以直接参照。
另外，国际公开WO2005/23828中公开了使用通过1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)对2′-羟基进行了保护的核糖核苷酸来制造核糖核苷酸衍生物的方法，通过使用引入了上述通式(I)所示的保护基的核糖核苷酸衍生物，能够依据上述国际公开WO2005/23828所公开的方法制造各种各样的核糖核苷酸衍生物。将上述国际公开WO2005/23828的全部公开内容作为参照包含在本说明书的公开内容中。
需要说明的是，在这些出版物所公开的方法中，还能够根据需要适宜选择反应试剂或反应条件，添加适宜的修饰或改变，当然这样的选择、修饰或改变是在本领域技术人员的日常创作活动的范围内能够容易进行的。
关于上述通式(I)所示的保护基的去除，可以通过与例如四丁基氟化铵等氟化合物发生反应而容易地进行。作为溶剂，能够使用例如四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、吡啶、二甲基亚砜等非质子性溶剂、或者它们的任意的混合物等，但不限定于此。对于所要去除的保护基，通常可以与1～500倍摩尔左右的氟化合物发生反应，反应在0℃～80℃左右的温度、优选在室温下进行数分钟～数小时左右。并且，为了去除上述通式(I)所示的保护基，还能够使用例如1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)等有机强碱或浓氨乙醇溶液等。
并且，为了去除低聚物合成时的保护基，除了上述与四丁基氟化铵等氟化物离子发生作用的方法外，在甲硅烷基化剂等亲核物质捕捉剂存在下与强碱发生作用的方法也是有效的。作为甲硅烷基化剂，可以举出N，O-双三甲基甲硅烷基乙酰胺(BSA)、N，O-双三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA)、氯三甲基硅烷、1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷等，但不限定于此。作为强碱，可以举出例如DBU、N-甲基吡咯烷、哌啶、三乙胺、二异丙基乙胺等，但不限定于此。另外作为溶剂，可以举出乙腈、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮等非质子性溶剂，但不限定于此。
实施例
以下，通过实施例来更具体地说明本发明，但本发明的范围不限定于下述实施例。
实施例中的简写符号如下。
ac：乙酰基
bz：苯甲酰基
BFEM：2-双(三氟甲基)乙氧基甲基
CPG：可控孔度玻璃
DBU：1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
DCA：二氯乙酸
DCM：二氯甲烷、CH2Cl2
DMTr：4，4′-二甲氧基三苯甲基
HCP：高交联聚苯乙烯
NIS：N-碘琥珀酰亚胺
pac：苯氧基乙酰基
TBS：叔丁基二甲基甲硅烷基
TBDPS：叔丁基二苯基甲硅烷基
TFA：三氟乙酸
TMSOTf：三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐
Z-NT：3-硝基-1H-1，2，4-三唑-1-羧酸苄酯
Me：甲基
OMe：甲氧基
例1
(a)2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)-3′，5′-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)尿苷(1u)
将2′-O-甲基硫甲基-3′，5′-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)尿苷(136.7mg，250μmol)(Journal of Fluorine Chemistry，24，pp.531-533，1984)用脱水甲苯反复共沸干燥，溶解于四氢呋喃(1.5mL)中。向该溶液中添加2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙醇(250μL，750μmol)和分子筛4A，将反应液冷却至-78℃。添加NIS(67.5mg，300μmmol)、TMSOTf(45μL，250μmmol)并搅拌10分钟后，将溶液升温至0℃，搅拌1小时。添加Et3N(75μl)而停止反应，用氯仿(25mL)稀释，用饱和Na2S2O3水溶液(25mL)、饱和NaHCO3水溶液(25mL)清洗，将有机层用Na2SO4干燥后，滤除Na2SO4并浓缩。利用硅胶柱色谱法(洗脱液；乙酸乙酯∶己烷＝1∶5)精制残渣，得到作为白色泡状固体的目标物(1u)(130mg，76％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.61(1H，brs)，7.90(1H，d，J＝8.1Hz)，5.73(1H，s)，5.70(1H，dd，J＝8.1，2.0Hz)，5.01(1H，d，J＝6.9Hz)，4.99(1H，d，J＝6.9Hz)，4.32-4.09(5H，m)，4.05-3.94(2H，m)，3.47-3.26(1H，m)，1.18-0.95(28H，m)
13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ163.7，150.2，139.1，123.1(2C，q，J＝286.1Hz)，101.8，94.7，89.0，81.7，78.3，68.0，61.3，59.2，48.7(1C，quintet，J＝27.9Hz)，17.4，17.3，17.3，17.2，16.9，16.8，16.8，16.7，13.2，13.1，12.8，12.5
MALDI TOF-MS m/z Calcd for(计算值)C26H42F6N2NaO8Si2 +[M+Na]+703.23，found(测值)703.90.
(b)2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)尿苷(2u)
向化合物(1u)(121mg，211μmol)的脱水四氢呋喃溶液(2mL)中添加Et3N·3HF(121μL，739μmol)、Et3N(53μL，380μmol)，于室温搅拌50分钟。将反应溶液减压干燥，溶解于氯仿和吡啶的混合溶剂(10mL，1∶1，v/v)中。用水清洗(3×3mL)后，用氯仿反萃水层(2×5mL)。将有机层合在一起用Na2SO4干燥后，滤除Na2SO4并浓缩，由此得到2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)尿苷。将粗精制的2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)尿苷用脱水吡啶反复共沸干燥，溶解于脱水吡啶(2mL)中。向溶液中添加DMTr-Cl(78.9mg，232μmol)，于室温搅拌15小时，用甲醇(500μL)使反应停止，进而搅拌30分钟。将溶液减压干燥，残渣溶解于氯仿(5mL)中，用5％NaHCO3水溶液清洗(3×5mL)。用氯仿反萃水层(3×5mL)，将有机层合在一起用Na2SO4干燥后，滤除Na2SO4，在减压下干燥。利用硅胶柱色谱法精制残渣(洗脱液；0～1.5％甲醇/二氯甲烷)，得到作为白色泡状固体的目标物(2u)(118mg，90％，2工序)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.68(1H，brs)，7.99(1H，d，J＝8.4Hz)，7.41-7.20(9H，m)，6.85(4H，d，J＝8.7Hz)，5.97(1H，d，J＝2.1Hz)，5.31(1H，dd，J＝8.4，2.1Hz)，5.07(1H，d，J＝7.2Hz)，4.89(1H，d，J＝7.2Hz)，4.52-4.42(1H，m)，4.26(1H，dd，J＝5.1，2.1Hz)，4.08-3.94(3H，m)，3.80(6H，s)，3.61(1H，dd，J＝11.4，2.1Hz)，3.53(1H，dd，J＝11.4，2.7Hz)，3.28-3.20(1H，m)，2.31(1H，d，J＝8.1Hz)
13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ162.7，158.8，158.8，150.0，144.2，139.8，135.2，135.0，130.2，130.1，128.1，128.1，127.3，122.9(2C，q，J＝280.6Hz)，113.3，102.3，95.3，87.8，87.3，80.1，68.8，61.8，61.3，55.3，48.9(1C，quintet，J＝27.9Hz)
MALDI TOF-MS m/z Calcd for C35H34F6N2NaO9 +[M+Na]+ 763.21，found 763.73.
(c)2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)尿苷3′-O-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)(3u)
在化合物(2u)(259mg，350μmol)、N，N-二异丙基乙胺(183μL，1.05mmol)的二氯甲烷溶液(3.5mL)中滴加2-氰基乙基N，N-二异丙基氯亚磷酰胺(166mg，700μmol)。搅拌1小时后，添加乙酸乙酯(35mL)，用5％NaHCO3溶液(3×35mL)进行清洗。用乙酸乙酯反萃水层(1×30mL)，将有机层合在一起用Na2SO4干燥后，滤除Na2SO4，在减压下干燥。利用硅胶柱色谱法(洗脱液；乙酸乙酯∶己烷＝3∶7、含有0.5％吡啶)精制残渣。收集含有3u的级分，用5％NaHCO3溶液(3×35mL)清洗。用乙酸乙酯反萃水层(1×30mL)，将有机层合在一起用Na2SO4干燥后，滤除Na2SO4并在减压下干燥，从而得到作为白色泡状固体的目标物(3u)(279mg，85％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.64(1H，brs)，8.00(0.5H，d，J＝8.4Hz，非对映体)，7.96(0.5H，d，J＝8.4Hz，非对映体)，7.44-7.21(9H，m)，6.88-6.80(4H，m)，6.00(1H，d，J＝2.7Hz)，5.28(0.5H，d，J＝8.4Hz，非对映体)，5.22(0.5H，d，J＝8.4Hz，非对映体)，5.00(0.5H，d，J＝6.9Hz，非对映体)，4.92(0.5H，d，J＝7.2Hz，非对映体)，4.89(0.5H，d，J＝7.2Hz，非对映体)，4.87(0.5H，d，J＝6.9Hz，非对映体)，4.62-4.50(1H，m)，4.40-4.34(1H，m)，4.21(1H，dd，J＝17.7，6.9Hz)，4.10(1H，dt，J＝11.0，4.5Hz)，4.03-3.23(8H，m)，3.80(6H，2s，非对映体)，2.63(1H，t，J＝6.0Hz，非对映体)，2.43(1H，t，J＝6.2Hz，非对映体)，1.22-110(11H，m)，1.02(3H，d，J＝6.9Hz)
13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ163.4，158.7，150.4，150.4，144.2，144.0，139.8，135.1，135.0，135.0，134.8，130.2，127.9，127.9，127.2，123.1(2C，q，J＝284.9Hz)，117.5，117.3，113.2，102.3，95.1，94.9，88.2，88.0，87.1，87.0，82.4，82.1，82.0，78.4，78.2，78.2，70.6，70.3，70.1，69.9，61.7，61.5，61.0，61.0，58.3，58.0，57.8，55.2，55.2，48.6(1C，quintet，J＝27.9Hz)，43.3，43.2，43.1，43.1，24.6，24.5，24.4，24.3，20.3，20.2，20.1
31PNMR(121.5MHz，CDCl3)δ152.1(0.5P，s，非对映体)，150.8(0.5P，s，非对映体)
ESI TOF-MS m/z Calcd for C44H52F6N4O10P+[M+H]+ 941.33，found 941.45.
例2
(a)N6-乙酰基-2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)-3′，5′-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)腺苷(1a)
不使用2′-O-甲基硫甲基-3′，5′-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)尿苷而使用N6-乙酰基-2′-O-甲基硫甲基-3′，5′-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)腺苷，利用与化合物(1u)同样的方法合成本化合物。收率为65％(白色泡状固体)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.63(1H，s)，8.55(1H，brs)，8.32(1H，s)，6.08(1H，s)，5.10(1H，d，J＝7.2Hz)，4.96(1H，d，J＝7.2Hz)，4.67(1H，dd，J＝9.6，4.5Hz)，4.48(1H，d，J＝4.5Hz)，4.34-4.14(3H，m)4.08-3.96(2H，m)，3.53-3.38(1H，m)，2.62(3H，s)，1.16-0.92(28H，m)
13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ170.4，152.3，150.1，149.2，140.75，123.0(2C，q，J＝281.8Hz)，122.3，95.0，88.7，81.5，78.1，69.0，61.4，59.5，49.0(1C，quintet，J＝27.9Hz)，25.7，17.4，17.3，17.2，17.0，16.9，16.9，16.8，13.3，12.9，12.8，12.6
MALDI TOF-MS m/z Calcd for C29H45F6N5NaO7Si2 +[M+Na]+ 768.27，found768.81.
(b)N6-乙酰基-2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)腺苷(2a)
不使用化合物(1u)而使用化合物(1a)，利用与化合物(2u)同样的方法合成本化合物。收率为81％(两步、白色泡状固体)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.15(1H，brs)，8.59(1H，s)，8.24(1H，s)，7.47-7.15(9H，m)，6.79(4H，d，J＝8.7Hz)，6.23(1H，d，J＝4.5Hz)，4.93(1H，t，J＝4.5Hz)，4.86(2H，s)，4.62-4.54(1H，m)，4.30-4.24(1H，m)，3.94(1H，dd，J＝11.0，5.1Hz)，3.83(1H，dd，J＝11.0，4.5Hz)，3.76(6H，s)，3.55(1H，dd，J＝10.8，3.0Hz)，3.45(1H，dd，J＝10.8，3.9Hz)，3.26-3.10(1H，m)，3.08(1H，d，J＝5.4Hz)，2.59(3H，s)
13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ170.5，158.6，152.4，150.8，149.2，144.3，141.4，135.5，135.4，130.0，128.1，127.9，127.7，127.0，122.8(2C，q，J＝281.5Hz)，122.1，113.2，95.8，87.1，86.8，84.0，80.1，70.4，62.8，61.7，55.2，48.8(1C，quintet，J＝27.9Hz)，25.7
MALDI TOF-MS m/z Calcd for C38H37F6N5NaO8 +[M+Na]+ 828.24，found 828.83.
(c)N6-乙酰基-2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)腺苷3′-O-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)(3a)
不使用化合物(2u)而使用化合物(2a)，利用与化合物(3u)同样的方法合成本化合物。收率为70％(白色泡状固体)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.83(1H，brs)，8.59(1H，s)，8.23(0.5H，s，非对映体)，8.23(0.5H，s，非对映体)，7.48-7.10(9H，m)，6.86-6.72(4H，m)，6.21(0.5H，d，J＝4.8Hz，非对映体)，6.17(0.5H，d，J＝5.1Hz，非对映体)，5.06-4.62(4H，m)，4.44-4.30(1H，m)，3.86-3.50(5H，m)，3.78(3H.s，非对映体)，3.77(3H，s，非对映体)，3.44-3.32(1H，m)，3.30-3.08(1H，m)，2.64-2.56(1H，m，非对映体)，2.60(1.5H，s，非对映体)，2.42-2.32(1H，m，非对映体)，2.35(1.5H，s，非对映体)，114-1.00(14H，m)
13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ170.4，158.6，152.3，150.9，149.2，144.4，144.3，141.7，141.6，135.5，135.4，135.4，130.1，130.1，128.2，128.2，127.8，127.0，122.8(2C，q，J＝282.9Hz)，122.1，117.5，117.3，113.1，95.2，87.4，87.3，86.7，86.7，83.8，83.2，83.2，78.0，77.7，77.6，71.5，71.4，71.3，71.1，62.5，61.5，58.5，58.3，58.0，57.8，55.2，55.2，48.7(1C，quintet，J＝27.9Hz)，43.4，43.2，43.1，25.6，24.7，24.6，24.4，20.3，20.2，20.2，20，1
31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ151.7(0.5P，s，非对映体)，151.6(0.5P，s，非对映体)
ESI TOF-MS m/z Calcd for C47H55F6N7O9P+[M+H]+ 1006.37，found 1006.39.
例3
(a)N4-乙酰基-2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)-3′，5′-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)胞苷(1c)
不使用2′-O-甲基硫甲基-3′，5′-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)尿苷而使用N4-乙酰基-2′-O-甲基硫甲基-3′，5′-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)胞苷，利用与化合物(1u)同样的方法合成本化合物。收率为62％(白色泡状固体)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.20(1H，brs)，8.31(1H，d，J＝7.5Hz)，7.41(1H，d，J＝7.5Hz)，5.77(1H，s)，5.12(1H，d，J＝6.9Hz)，4.98(1H，d，J＝6.9Hz)，4.32-3.94(7H，m)，3.50-3.34(1H，m)，2.24(3H，s)，1.11-0.88(28H，m)
13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ171.2，163.4，154.8，144.0，123.1(2C，q，J＝281.5Hz)，96.6，94.7，89.9，81.9，78.3，67.6，61.3，59.3，48.8(1C，quintet，J＝27.6Hz)，24.7，17.5，17.4，17.3，17.2，16.9，16.9，16.8，13.2，13.1，12.8，12.5
MALDI TOF-MS m/z Calcd for C28H45F6N3NaO8Si2 +[M+Na]+ 744.25，found744.97.
(b)N4-乙酰基-2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胞苷(2c)
不使用化合物(1u)而使用化合物(1c)，利用与化合物(2u)同样的方法合成本化合物。收率为94％(两步、白色泡状固体)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.34(1H，brs)，8.49(1H，d，J＝7.5Hz)，7.46-7.22(9H，m)，7.13(1H，d，J＝7.5Hz)，6.87(4H，d，J＝9.3Hz)，5.94(1H，s)，5.26(1H，d，J＝6.9Hz)，4.93(1H，d，J＝6.9Hz)，4.50-4.38(1H，m)，4.24(1H，d，J＝5.1Hz)，4.12-3.92(3H，m)，3.81(6H，s)，3.66(1H，dd，J＝11.3，3.0Hz)，3.54(1H，dd，J＝11.3，2.4Hz)，3.40-3.22(1H，m)，2.45(1H，d，J＝9.6Hz)，2.21(3H，s)
13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ170.7，162.9，158.7，158.7，155.0，144.6，144.2，135.4，135.2，130.1，128.1，128.1，127.2，122.9(2C，q，J＝285.2Hz)，113.3，96.9，94.9，89.5，87.1，82.9，79.8，67.8，61.5，60.7，55.2，48.8(1C，quintet，J＝27.9Hz)，24.7
MALDI TOF-MS m/z Calcd for C37H37F6N3NaO9 +[M+Na]+804.23，found 804.85.
(c)N4-乙酰基-2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)胞苷3′-O-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)(3c)
不使用化合物(2u)而使用化合物(2c)，利用与化合物(3u)同样的方法合成本化合物。收率为86％(白色泡状固体)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ10.35(1H，brs)，8.56(0.7H，d，J＝7.8Hz，非对映体)，8.49(0.3H，d，J＝7.8Hz，非对映体)，7.48-7.24(9H，m)，7.05(0.7H，d，J＝7.8Hz，非对映体)，6.95(0.3H，d，J＝7.8Hz，非对映体)，6.90-6.81(4H，m)，5.98(1H，s)，5.08-4.96(2H，m)，4.60-4.42(1H，m)，4.32-3.98(4H，m)，3.81(4.2H，s，非对映体)，3.80(1.8H，s，非对映体)，3.76-3.40(5H，m)，2.64-2.54(0.6H，m，非对映体e)，2.42(1.4H，t，J＝6.3Hz，非对映体)，2.23(2.1H，s，非对映体)，2.22(0.9H，s，非对映体)，1.21-0.96(14H，m)
13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ170.9，170.8，163.2，163.1，158.7，154.8，144.5，144.0，143.9，135.2，135.1，135.0，135.0，130.2，130.2，128.3，127.9，127.2，123.2(2C，q，J＝282.1Hz)，117.4，117.3，113.2，96.9，95.1，94.7，90.0，89.9，87.1，87.0，81.8，81.7，81.6，81.5，78.6，78.4，70.2，69.9，68.9，68.7，61.5，61.3，60.4，60.2，58.3，58.0，57.8，55.2，55.1，48.8(1C，quintet，J＝27.9Hz)，46.1，43.2，43.0，29.6，29.3，24.6，24.6，24.6，24.5，24.5，24.4，24.3，24.3，20.2，20.2，20.1
31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ152.4(0.3P，s，非对映体)，150.5(0.7P，s，非对映体)；ESI TOF-MS m/z Calcd for C46H55F6N5O10P+[M+H]+982.36，found 982.43.
例4
(a)N2-苯氧基乙酰基-2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)-3′，5′-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)鸟嘌呤核苷(1g)
不使用2′-O-甲基硫甲基-3′，5′-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)尿苷而使用N2-苯氧基乙酰基-2′-O-甲基硫甲基-3′，5′-O-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)鸟嘌呤核苷，利用与化合物(1u)同样的方法合成本化合物。收率为53％(白色泡状固体)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ11.85(1H，brs)，9.15(1H，brs)，8.06(1H，s)，7.36(2H，t，J＝7.8Hz)，7.10(1H，t，J＝7.8Hz)，6.97(2H，d，J＝7.8Hz)，5.94(1H，s)，5.08(1H，d，J＝7.2Hz)，5.00(1H，d，J＝7.2Hz)，4.71(2H，s)，4.55(1H，dd，J＝9.6，4.5Hz)，4.38-3.92(6H，m)，3.28-3.10(1H，m)，1.20-0.70(28H，m)
13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ169.6，156.4，155.2，146.7，146.3，136.7，130.0，123.1，122.9(2C，q，J＝281.5Hz)，114.8，94.8，87.5，81.4，78.8，68.8，67.1，61.4，59.5，48.8(1C，quintet，J＝27.9Hz)，17.4，17.3，17.2，17.0，16.9，16.9，16.8，13.3，13.0，12.9，12.6
MALDI TOF-MS m/z Calcd for C35H49F6N5NaO9Si2 +[M+Na]+ 876.29，found876.94.
(b)N2-苯氧基乙酰基-2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)鸟嘌呤核苷(2g)
不使用化合物(1u)而使用化合物(1g)，利用与化合物(2u)同样的方法合成本化合物。收率为64％(两步、白色泡状固体)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ11.82(1H，brs)，9.07(1H，brs)，7.84(1H，s)，7.46-7.14(11H，m)，7.08(1H，t，J＝7.5Hz)，6.91(2H，d，J＝7.5Hz)，6.79(4H，d，J＝8.7Hz)，6.05(1H，d，J＝5.4Hz)，4.83(2H，dd，J＝10.8，7.2Hz)，4.74(1H，t，J＝5.1Hz)，4.62(2H，s)，4.54-4.46(1H，m)，4.28-4.21(1H，m)，3.98(1H，dd，J＝11.1，5.4Hz)，3.82(1H，dd，J＝11.1，4.8Hz)，3.76(6H，s)，3.46(1H，dd，J＝10.8，3.0Hz)，3.40(1H，dd，J＝10.8，4.2Hz)，3.20-3.02(1H，m)，2.90(1H，brs)
13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ169.5，158.6，156.3，155.2，147.9，146.4，144.3，137.3，135.4，135.3，130.0，123.0，129.1，128.1，128.0，127.1，123.0，122.8(2C，q，J＝282.3 Hz)，114.8，113.2，113.1，95.8，86.8，85.7，84.1，80.4，70.7，66.8，63.3，61.7，55.2，48.7(1C，quintet，27.9Hz)
MALDI TOF-MS m/z Calcd for C44H41F6N5NaO10 +[M+Na]+ 936.26，found 937.01.
(c)N2-苯氧基乙酰基-2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)鸟嘌呤核苷3′-O-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)(3g)
不使用化合物(2u)而使用化合物(2g)，利用与化合物(3u)同样的方法合成本化合物。收率为51％(白色泡状固体)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.88(0.5H，s，非对映体)，7.87(0.5H，s，非对映体)，7.45-7.16(11H，m)，7.07(1H，t，J＝7.5Hz)，6.93(1H，d，J＝8.7Hz，非对映体)，6.88(1H，d，J＝8.7Hz，非对映体)，6.81(2H，d，J＝2.3Hz，非对映体)，6.78(2H，d，J＝2.3Hz，非对映体)，6.07(0.5H，d，J＝6.0Hz，非对映体)，6.01(0.5H，d，J＝6.3Hz，非对映体)，4.92-4.78(2H，m)，4.75-4.68(1H，m)，4.63-4.54(2H，m)，4.41-4.35(0.5H，m，非对映体)，4.32-4.35(0.5H，m，非对映体)，4.04-3.28(7H，m)，3.77(6H，s)，3.18-3.00(1H，m)，2.65(1H，t，J＝6.3Hz，非对映体)，2.35(1H，t，J＝6.3Hz，非对映体)，1.44-1.00(14H，m)
13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ169.7，169.5，158.6，156.5，156.5155.6，148.1，146.7，146.6，144.3，144.2，137.5，137.2，135.5，135.4，135.2，130.1，130.0，130.0，129.9，128.2，128.0，128.0，127.9，127.1，122.8(2C，q，J＝279.7Hz)，122.8，122.8，122.2，122.0，117.5，117.3，114.8，113.2，113.2，95.2，95.1，86.8，86.7，85.8，85.7，84.2，83.8，83.8，78.6，77.8，77.7，71.9，71.7，71.4，71.2，66.9，63.1，61.6，58.7，58.5，57.8，57.5，55.2，55.2，52.8，48.6(1C，quinted，J＝27.9Hz)，45.9，43.4，43.2，43.0，29.7，24.7，24.6，24.5，24.4，20.3，20.2，20.1，20.1
31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ151.7(0.5P，s，非对映体)，151.6(0.5P，s，非对映体)；ESI TOF-MS m/z Calcd for C53H59F6N7O11P+[M+H]+1114.39，found 1114.50.
例5
(a)5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-O-，3′-O-双(苄氧基羰基)尿苷(4u)
向5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)尿苷(300mg，500μmol)的二氯甲烷-5％NaHCO3水溶液(1∶1，v/v，5mL)中添加Z-NT(400mg，1.5mmol)和i-Pr2NEt(900μL，5.0mmol)，于室温搅拌1小时。将反应溶液用二氯甲烷(10mL)稀释，用5％NaHCO3水溶液清洗(3×10mL)。用二氯甲烷(10mL)反萃水层，将有机层合在一起用Na2SO4干燥后，滤除Na2SO4，在减压下干燥。利用硅胶柱色谱法精制残渣(洗脱液；0～2％甲醇/二氯甲烷)，得到作为白色泡状固体的目标物(4u)(370mg，93％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.91(1H，brs)，7.70(1H，d，J＝8.4Hz)，7.40-7.22(19H，m)，6.88-6.81(4H，m)，6.23(1H，d，J＝5.4Hz)，5.56-5.46(2H，m)，5.33-5.27(1H，m)，5.19(1H，d，J＝12.0Hz)，5.14(1H，d，J＝12.0Hz)，5.12(2H，s)，4.32-4.28(1H，m)，3.80(6H，s)，3.58-3.42(2H，m).
(b)2′-O-，3′-O-双(苄氧基羰基)尿苷(5u)
向化合物(4u)(370mg，460μmol)的二氯甲烷溶液(50mL)中添加DCA(1.5mL)，于室温搅拌10分钟，用5％NaHCO3水溶液清洗(3×50mL)。用二氯甲烷(10mL)反萃水层，将有机层合在一起用Na2SO4干燥后，滤除Na2SO4，在减压下干燥。利用硅胶柱色谱法精制残渣(洗脱液；0～4％甲醇/二氯甲烷)，得到作为白色泡状固体的目标物(5u)(200mg，87％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.48(1H，brs)，7.52(1H，d，J＝8.2Hz)，7.37-7.33(10H，m)，5.86(1H，d，J＝6.0Hz)，5.75(1H，d，J＝8.2Hz)，5.59(1H，dd，J＝6.0，5.4Hz)，5.45(1H，dd，J＝5.4，3.0Hz)，5.13(2H，s)，5.12(2H，d，J＝0.6Hz)，4.32-4.26(1H，m)，4.00-3.78(2H，m)，2.94-2.86(1H，m).
(c)2-氰基乙基5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)尿苷-3′-基2′-O，3′-O-双(苄氧基羰基)尿苷-5′-基磷酸酯(6uu)
将化合物(3u)(52.7mg，56μmol)和化合物(5u)(24.6mg，48μmol)用脱水甲苯进行反复共沸干燥，溶解于脱水乙腈(500μL)中。向反应液中添加四唑环(7.9mg，114μmol)，于室温反应3小时。接着向反应溶液中添加叔丁基过氧化氢(40μL，70％水溶液)，进而搅拌30分钟。将反应溶液用二氯甲烷(25mL)稀释，用5％NaHCO3水溶液清洗(2×25mL)。用二氯甲烷反萃(2×25mL)水层，将有机层合在一起用Na2SO4干燥后，滤除Na2SO4，在减压下干燥。利用硅胶柱色谱法精制残渣(洗脱液；0～4％甲醇/二氯甲烷、含有0.5％吡啶)，得到作为白色泡状固体的目标物(6uu)(52.9mg，81％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.65-9.50(2H，m)，7.78(1H，d，J＝7.8Hz)，7.40-7.15(19H，m)，7.09(1H，d，J＝8.1Hz)，6.90-6.80(4H，m)，6.01(1H，t，J＝4.8Hz)，5.82-5.52(2H，m)，5.51-5.42(2H，m)，5.34-5.26(1H，m)，5.16-4.98(4H，m)，4，96-4.78(2H，m)，4.64-4.54(1H，m)，4.44-3.90(9H，m)，3.82-3.52(6H，m)，3.64-3.46(2H，m)，3.34-3.14(1H，m)，2.80-2.52(2H，m)
31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ-1.5(0.5P，s，非对映体)，-1.7(0.5P，s，非对映体).
(d)2-氰基乙基2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)尿苷-3′-基2′-O，3′-O-双(苄氧基羰基)尿苷-5′-基磷酸酯(7uu)
向化合物(6uu)(52.9mg，39μmol)的二氯甲烷溶液(4mL)中添加DCA(120μL)，于室温搅拌15分钟，用5％NaHCO3水溶液清洗(2×5mL)。用二氯甲烷(5mL)反萃水层，将有机层合在一起用Na2SO4干燥后，滤除Na2SO4，在减压下干燥。利用硅胶柱色谱法精制残渣(洗脱液；1～4％甲醇/二氯甲烷)，得到作为白色泡状固体的目标物(7uu)(33.0mg，79％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ10.26-9.84(2H，m)，7.88(0.5H，d，J＝8.1Hz，非对映体)，7.85(0.5H，d，J＝8.7Hz，非对映体)，7.36-7.26(11H，m)，5.94(0.5H，d，J＝5.4Hz，非对映体)，5.91(0.5H，d，J＝4.8Hz，非对映体)，5.80-5.48(5H，m)，5.18-5.00(4H，m)，4.90-4.77(2H，m)，4.68-4.22(7H，m)，4.08-3.76(4H，m)，3.40-3.22(1H，m)，2.81-2.67(2H，m)，2.09(1H，brs)
31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ-0.9(0.5P，s，非对映体)，-2.5(0.5P，s，非对映体).
(e)2-氰基乙基2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)尿苷-3′-基尿苷-5′-基磷酸酯(8uu)
向化合物(7uu)(55.0mg，51.6μmol)的甲醇溶液(1.0mL)中添加20％Pd(OH)2/C(10mg)，在氢气氛下于室温剧烈搅拌整夜。用硅藻土过滤反应液，将滤液在减压下干燥，得到作为白色泡状固体的目标物(8uu)(40mg，97％)。
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ8.03(0.5H，d，J＝2.1Hz，非对映体s)，8.01(0.5H，d，J＝1.8Hz，非对映体s)，7.71(0.5H，d，J＝7.8Hz，非对映体s)，7.67(0.5H，d，J＝7.8Hz，非对映体s)，6.20-6.08(1H，m)，5.90-5.70(3H，m)，5.12-5.04(1H，m)，4.92-4.82(1H，m)，4.64-4.28(10H，m)，4.26-4.10(2H，m)，4.10-3.86(2H，m)，3.86-3.68(2H，m)，3.34-3.28(1H，m)，2.98-2.88(2H，m)，1.29(1H，brs)
MALDI TOF-MS m/z Calcd for C26H30F6N5NaO15P+[M+Na]+820.13，found 820.30.
例6
N6-乙酰基-2′-O-(2-三氟甲基-3，3，3-三氟丙烷氧基甲基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)腺苷3′-O-((3S，3aR)-3-苯基六氢吡咯[1，2-c][1，3，2]氧氮磷杂环戊烯-1-基)((Sp)-9a)
将化合物(2a)(163.8mg，200μmol)用脱水吡啶和脱水甲苯反复共沸干燥，制成脱水四氢呋喃溶液(600μL)。在-78℃下一边搅拌一边滴加Et3N(141μL，1mmol)和(3S，3aR)-1-氯-3-苯基六氢吡咯[1，2-c][1，3，2]氧氮磷杂环戊烯溶液(吡咯：ピロ一ロ；氧氮磷杂环戊烯：オキサザホスホ一ル)(0.5M四氢呋喃溶液；800μL，400μmol)。于室温搅拌40分钟后，将反应液注入冰冷的饱和NaHCO3水溶液(20mL)中，用氯仿(20mL)提取。将有机层用冰冷的饱和NaHCO3水溶液清洗(2×20mL)，将水层合在一起用氯仿(20mL)提取。将有机层合在一起用Na2SO4干燥后，滤除Na2SO4，在减压下干燥。利用硅胶柱色谱法精制残渣(洗脱液；乙酸乙酯∶己烷＝1∶3、含有0.5％Et3N)，得到作为白色泡状固体的目标物(Sp)-9a(130.4mg，63％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.58(1H，s)，8.23(1H，s)，7.50-7.12(14H，m)，6.80(4H，d，J＝9.0Hz)，6.21(1H，d，J＝4.2Hz)，5.77(1H，d，J＝6.3Hz)，5.04-4.86(1H，m)，4.82(1H，d，J＝7.2Hz)，4.69(1H，d，J＝7.2Hz)，4.44-4.32(1H，m)，3.92-3.36(5H，m)，3.78(6H，s)，3.18-2.98(2H，m)，2.61(3H，s)，1.80-1.50(2H，m)，1.34-0.78(4H，m)
31P NMR(121.5MHz，CDCl3)δ157.2.
例7
使用例1中得到的化合物(1u)或化合物(2u)，研究保护基的离去条件。底物浓度设为0.1M，反应编号4、5、7以及8的底物浓度设为10mM。在室温下进行反应，通过薄层色谱法确认反应的进行。反应条件和结果列于表1(表中，Me表示甲氧基，TBAF表示四丁基氟化铵，THF表示四氢呋喃，DBU表示1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，TMSCl表示三甲基甲硅烷基氯，EtOH表示乙醇，Et3N表示三乙胺，DCA表示二氯乙酸，DCM表示二氯甲烷，另外TFA表示三氟乙酸)。由表1所示的结果表明，对于本发明的保护基来说，通过与四丁基氟化铵等氟化合物发生作用能够在温和的条件下极快地进行去除、并且在酸性条件下稳定。
[表1]
工业实用性
上述通式(I)所示的保护基在核酸合成循环的反应条件下稳定，空间位阻小，并且在温和的条件下例如通过氟化合物进行处理能够极有效且在短时间内去除，因此作为核糖核苷、核糖核苷酸以及它们的衍生物的2′-位羟基的保护基具有理想的性质，能够用于工业上的核酸合成。
Claims (16)
1.一种保护基，其为核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物的2′-位羟基的保护基，该保护基如下述通式(I)所示：
式中，带*的氧原子表示核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物的2′-位羟基的氧原子；R1和R2均为氢原子，或者各自独立地表示卤原子、C1-6烷基、或者C1-6卤代烷基；R3和R4各自独立地表示氢原子、卤原子、C1-6烷基、或者C1-6卤代烷基；R5和R6各自独立地表示卤原子、C1-6卤代烷基、氰基、或者硝基，或者R5和R6相互键合，表示具有或不具有氟原子取代基的9-芴基。
2.如权利要求1所述的保护基，其中，R1和R2均为氢原子。
3.如权利要求1或2所述的保护基，其中，R3和R4均为氢原子。
4.如权利要求1至3的任一项所述的保护基，其中，R5和R6各自独立地为卤原子或氟取代C1-6烷基。
5.如权利要求1至3的任一项所述的保护基，其中，R5和R6为相同的氟取代C1-6烷基。
6.如权利要求1至3的任一项所述的保护基，其中，R5和R6为相同的全氟C1-6烷基。
7.如权利要求1至3的任一项所述的保护基，其中，R5和R6均为三氟甲基。
8.如权利要求1至7的任一项所述的保护基，其中，核糖核苷酸的衍生物为亚磷酰胺化合物。
9.核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物，其2′-位羟基的氧原子被权利要求1至7的任一项所述的保护基所保护。
10.如权利要求9所述的核糖核苷酸的衍生物，其为亚磷酰胺化合物。
11.如权利要求10所述的核糖核苷酸的衍生物，其中，亚磷酰胺化合物为下述通式(II)所示的化合物：
式中，B表示具有或不具有保护基的天然或非天然的核酸碱基；R1、R2、R3、R4、R5和R6与上述含义相同；R11表示具有或不具有取代基的三苯甲基，构成该三苯甲基的3个苯基中的2个苯基可以通过氧原子相互键合形成呫吨环；R12和R13各自独立地表示C1-6烷基，或者R12和R13可以相互键合形成饱和5或6元环，该环具有或不具有1个或2个以上的氧原子或硫原子作为成环原子；R14和R15各自独立地表示氢原子或C1-6烷基，R14可以与R13键合形成5或6元环；R16表示吸电子性基团，或者在R14与R13键合形成5或6元环时表示吸电子基或氢原子；R17和R18表示氢原子或C1-6烷基，或者R16、R17及R18相互键合，并连同它们所键合的碳原子一起表示芳基。
12.如权利要求11所述的亚磷酰胺化合物，其为下述式(IIA)所示的化合物：
式中的定义与上述含义相同。
13.一种低聚核糖核酸的制造方法，其使用权利要求11或12所述的亚磷酰胺化合物。
14.一种试剂，其为用于对核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物的2′-位羟基进行保护的试剂，该试剂包含下述通式(III)所示的化合物：
式中，R3、R4、R5和R6与上述含义相同；R21表示羟基、R22-S-C(R1)(R2)-O-或者X-C(R1)(R2)-O-，R22-S-C(R1)(R2)-O-中，R22表示C1-6烷基，R1和R2与上述含义相同，X-C(R1)(R2)-O-中，X表示离去基团，R1和R2与上述含义相同。
15.一种方法，其为权利要求1至8任一项所述保护基的引入方法，该方法包括使R21为羟基的权利要求13所述的试剂与2′-位羟基被C1-6烷基硫甲基保护的核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物进行反应的工序。
16.一种方法，其为权利要求1至8任一项所述保护基的引入方法，该方法包括使R21为羟基以外的基团的权利要求13所述的试剂与2′-位羟基未被保护的核糖核苷、核糖核苷酸、或者它们的衍生物进行反应的工序。
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