リポヌクレオチド又はリポヌクレオチド誘導体の製造方法
技術分野
本発明は、 リポヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体の製造方法 に関する。
明 背景技術
遺伝子クローニングのプローブ、 遺伝書子発現解析用プローブ、 アンチ センスオリゴヌクレオチド、 R N A i等の様々な用途に用いられるオリ ゴリポ核酸 (オリゴ R N A ) は、 ホスホロアミダイ ト法によって化学合 成することができる。
ホスホロァミダイ ト法においては、 3,一 5 'ィンターヌクレオチド結 合の 2 '— 5 '結合への転位ゃヌクレオチド鎖の切断を防止するために、 ホスホロアミダイ トュニッ ト(モノマーュニッ ト)の 2 '位の水酸基( 2, 水酸基) を適切な保護基を用いて保護することが重要であり、 2 '水酸基 の保護基には、 5 ' 位の水酸基 ( 5 ' 水酸基)' の保護基の除去、 リン酸 ジエステルの保護基の除去、 核酸塩基の保護基の除去、 ヌク レオチド鎮 の固相担体からの切り出し等の条件下では安定して存在するが、 これら の条件とは異なる条件下において短時間に除去できるという特性が求め られる。
従来、 2 ' 水酸基の保護基としては、 例えば、 ァセタール系保護基、 シリル系保護基等が知られている。
しかしながら、 これまでのァセタール系保護基は、 5 ' 水酸基の保護 基の除去、リン酸ジエステルの保護基の除去、核酸塩基の保護基の除去、
ヌクレオチド鎖の固相担体からの切り出し等の条件下において安定して 存在することができなかったため、 3,一 5 'インターヌクレオチド結合 の 2,一 5 '結合への転位ゃヌクレオチド鎖の切断を防止することができ なかった。 例えば、 5 ' 水酸基の保護基として一般的に用いられる 4, 4'ージメ トキシトリチル基(DMT r基)は酸処理により除去可能であ るが、 これまでのァセタール系保護基も酸処理により除去可能であった ため、 ァセタール系保護基と DMT r基とを組み合わせて用いると、 D MT r基の脱離とともにァセタール系保護基の脱離が生じ、 3'— 5'ィ ンターヌクレオチド結合の 2,一 5,結合への転位ゃヌクレオチド鎖の切 断を防止することができなかった。 一方、 酸に対して安定であるァセタ ール系保護基として 2'—0— 1一 (2—シァノエトキシ) ェチル基 (C EE基) が知られていたが (Wolfgang Pfleiderer等, HELVETICA CHIMI CA ACTA, 第 81卷, 1545-1566頁, 1998年;特開平 7— 1 9 6 6 8 3号 公報)、 このァセタール系保護基は酸に対する安定性が高過ぎるため、 R NAを分解しないような酸性条件下では除去することができず、 2 ' 水 酸基の保護基としては不適当であると考えられていた。
このため、 現在、 2 ' 水酸基の保護基としては、 TBDMS等のシリ ル系の保護基が一般的に用いられている。 また、 DMT r基の脱保護条 件では安定であって、 DMT r基の! ^保護条件とは異なる酸性条件で除 去できるァセタール系保護基として、 1一 (2—フルオロフェニル) 一 4ーメ トキシピペリジン _ 4ーィル (F p m p ) 基や、 1一 (4一クロ 口フエニル) 一4—ェトキシピペリジン一 4ーィル (C p e p ) 基が開 発されている。
しかしながら、 T BDMS等のシリル系保護基は、 2 ' 水酸基への導 入効率が低い、 分子が嵩高いため立体障害となり縮合反応効率が低い等 の問題点がある。 ,
発明の開示
本発明は、 2 ' 水酸基へ効率よく導入できるとともに、 縮合反応にお いて立体障害となることがなく、 さらに、 5 ' 水酸基の保護基の除去、 リン酸ジエステルの保護基の除去、 核酸塩基の保護基の除去、 ヌクレオ チド鎖の固相担体からの切り出し等の条件下では安定して存在するが、 これらの条件とは異なる条件下において短時間に除去で.きる保護基によ つて 2 ' 水酸基が保護されたリボヌクレオチド誘導体を利用して、 リボ ヌクレオチド又はリポヌクレオチド誘導体を製造する方法を提供するこ とを目的とする。
上記課題を解決するために、 本発明は、 以下のリポヌクレオチド又は リポヌクレオチド誘導体の製造方法を提供する。
( 1 ) 次式 (Π ) :
Y Z
[式中、 Bは核酸塩基又はその誘導体を表し、 Xはォキソァニオン又はチ オア二オンを表し、 Y及び Zは互いに独立して水素原子、 固相担体又は 水酸基の保護基を表し、 R 1は水素原子又は置換基を有していてもよい
トリチル基若しくは 9—フエニルキサンテュル基を表し、 R 2、 R 3及び R 4は互いに独立して水素原子、 ハ τ=ξゲン原子又は置換基を有していて もよいアルキル基、 ァルケ-ル基、 アルキ-ル基、 シクロアルキル基、 シクロアルケ-ル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 アルコキ シ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボ-ル 基、 ァリールォキシカルポニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 ァ ノレキルチオカルボ二ノレ基、 アルコキシチォカルボ二ノレ基、 ァリールチオ カルボニル基、 ァラルキルチオカルボエル基、 ァリ一ルォキシチォカル ボエル基若しくはァラルキルォキシチォカルポエル基を表し、 R 5は電 子吸引基を表し、 ηは 1以上の整数を表す。]
で表されるリボヌクレオチド誘導体 (Π ) をフッ化物処理することによ り、
次式 ( I ) :
[式中、 Β、 X、 Y、 Z、 R 1及び ηは前記と同義である。]
で表されるリポヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体 ( I ) を製造
する工程を含む、 リボヌクレオチド又はリポヌクレオチド誘導体 ( I ) の製造方法。
(2)前記フッ化物としてテトラプチルアンモニゥムフルオリ ドを用いる 前記 ( 1) 記載の製造方法。
(3) 次式 (Π) :
[式中、 Bは核酸塩基又はその誘導体を表し、 Xはォキソァニオン又はチ オア二オンを表し、 Y及び Zは互いに独立して水素原子、 固相担体又は 水酸基の保護基を表し、 R 1は水素原子又は置換基を有していてもよい トリチル基若しくは 9一フエニルキサンテュル基を表し、 R2、 R3及び R4は互いに独立して水素原子、'ハロゲン原子又は置換基を有していて もよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアルキル基、 シク口ァノレケニノレ基、 ァリール基、 ァラルキノレ基、 アシノレ基、 アルコキ シ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボエル 基、 ァリールォキシカルボ二ル基、 ァラルキルォキシカルポニル基、 ァ ルキルチオカルボニル基、 アルコキシチォカルポュル基、 了リ一ルチオ
カルボ-ル基、 ァラルキルチオカルボ-ル基、 ァリールォキシチォカル ポ-ル基若しくはァラルキルォキシチォカルボ二ル基を表し、 R5は電 子吸引'基を表し、 nは 1以上の整数を表す。]
で表されるリボヌクレオチド誘導体 (Π) を、 無水溶媒中、 シリル化剤 存在下で第 3級アミン処理又はホスファゼン塩基処理した後、 中性条件 又は酸性条件下で加水分解することにより、
次式 ( I ) :
Y Z
[式中、 B、 X、 Y、 Z、 R 1及び ηは前記と同義である。]
で表されるリボヌクレオチド又はリポヌクレオチド誘導体 ( I ) を製造 する工程を含む、 リポヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体 ( I ) の製造方法。
(4) 前記第 3級ァミンとして 1, 8—ジァザビシクロ [5. 4. 0] — 7—ゥンデセンを用いる前記 (3) 記載の方法。
Y Z
[式中、 Bは核酸塩基又はその誘導体を表し、 Wは酸素原子又は硫黄原子 を表し、 Y及び Zは互いに独立して水素原子、 固相担体又は水酸基の保 護基を表し、 R 1は水素原子又は置換基を有していてもよいトリチル基 若しくは 9—フエニルキサンテュル基を表し、 R 2、 R 3及び R 4は互い に独立して水素原子、 ハロゲン原子又は置換基を有していてもよいアル キノレ基、 アルケニノレ基、 ァノレキエル基、 シクロアルキル基、 シクロアノレ ケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 アルコキシ基、 ァリ ールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボニル基、 ァ +リー ルォキシカルポニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオ カルボニル基、 アルコキシチォカルポニル基、 ァリ一ルチオカルボニル 基、 ァラルキルチオカルボュル基、 ァリ一ルォキシチォカルボ二ル基若 しくはァラルキルォキシチォカルボ二ル基を表し、 R 5は電子吸引基を 表し、 R 6はリン酸保護基を表し、 nは 1以上の整数を表す。] で表されるリボヌクレオチド誘導体 (ΠΙ ) をアンモニア処理又は第 1級 ァミ ン処理することにより、 前記リポヌクレオチド誘導体 (Π ) を製造
する工程を含む、 前記 (1 ) 〜 (4) のいずれかに記載の製造方法 c (6) 前記式 (HI) において Bで表される核酸塩基が、 次式:
[式中、 R 7はフエノキシァセチル基、 フエ-ルァセチル基、 ァセチル基 又はベンゾィル基を表し、 R8はィソプチリル基又はベンゾィル基を表 し、 R9はフエノキシァセチル基、 フエニルァセチル基、 ァセチル基又 はィソブチリル基を表し、 R 10は 2—シァノエチル基を表し、 R1 1はべ ンゾィル基、 4ーメ トキシベンゾィル基又は 4—メチルベンゾ,ィル基を 表し、. R12はジメチルアミノメチレン基を表す。]
で表される保護基を有する核酸塩基である前記 (5) 記載の製造方法。
(7) 酸処理により R 1で表される 5 ' 水酸基の保護基を除去する工程を
含む、 前記 (1 ) のいずれかに記載の製造方法。
( 8 ) 次式 (m ) :
[式中、 Bは核酸塩基又はその誘導体を表し、 Wは酸素原子又は硫黄原子 を表し、 Y及び Zは互いに独立して水素原子、 固相担体又は水酸基の保 護基を表し、 R 1は水素虜子又は置換基を有していてもよいトリチル基 若しくは 9—フエニルキサンテニル基を表し、 R 2、 R 3及び R 4は互い に独立して水素原子、 ハロゲン原子又は置換基を有していてもよいアル キル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアルキル基、 シクロアル ケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 アルコキシ基、 ァリ ールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルポニル基、 ァリー ノレォキシカノレポ二ノレ基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオ カルボエル基、 アルコキシチォカルポ-ル基、 ァリールチオカルボュル 基、 ァラルキルチオカルボニル基、 了リ一ルォキシチォカルボ二ル基若 しくはァラルキルォキシチォカルボ二ル基を表し、 R 5は電子吸引基を 表し、 R 6はリン酸保護基を表し、 nは 1以上の整数を表す。]
で表されるリポヌクレオチド誘導体 (m) を、 無水溶媒中、 シリル化剤 存在下で第 3級アミン処理又はホスファゼン塩基処理した後、 中性条件 又は酸性条件下で加水分解することにより、
次式 ( I ) :
R'
[式中、 B、 X、 Y、 Z、 R 1及び ηは前記と同義である。]
で表されるリボヌクレオチド ^まリ.ボヌクレオチド誘導体 ( I ) を製造 する工程を含む、 リポヌ レオチド又はリボヌクレオチド誘導体 ( I ) の製造方法。 '
(9) 前記第 3級ァミンとして 1 , 8—ジァザビシクロ [5. 4. 0] — 7—ゥンデセンを用いる前記 (8) 記載の方法。
(1 0) 酸処理により R1で表される 5 ' 水酸基の保護基を除去する工程 を含む、 前記 (8) 又は ( 9) 記載の製造方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 2,- 0- [1 -(2-シァノエトキシ)ェチル ]]- 3,, 5, - 0- (1, 1, 3, 3-テ
トライソプロピルジシロキサン- 1 , 3-ジィル)ゥリジン(2)の合成工程、 及び 2'- 0 - [1 -(2 -シァノ.エトキシ)ェチル ]]- 5'- 0 -(4, 4'-ジメ トキシト リチル) -ゥリジン(4)の合成工程を示す図である。
図 2は、 2'-0-[1-(2-シァノェトキシ)ェチル]]-5'-0-(4,4'-ジメ トキ シトリチル) -ゥリジン- 3' _ (2-シァノエチル- N,N -ジィソプロピルホスホ 口アミダイ ト)(5)の合成工程を示す図である。
図 3は、 液相法による保護されたゥリジル酸 2量体の合成工程を示す 図である。
図 4は、 ゥリジル酸 2量体の脱保護工程を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
上記式 ( 1 )、 (Π) 又は (ΙΠ) において、 Bで表される核酸塩基又は の誘導体は特に限定されるものではなく、核酸塩基としては、例えば、 シトシン、 ゥラシル等のピリ ミジン塩基、 アデニン、 グァニン等のプリ ン塩基が挙げられ、 核酸塩基の誘導体としては、 例えば、 5—メチルシ トシン、 5—ヒ ドロキシメチノレシトシン、 5—フノレオ口ゥラシノレ、 チォ ゥラシル、 6—ァザゥラシル、 5—ヒ ドロキシゥラシル、 2, 6一ジァ ミノプリン、 ァザアデニン、 ァザグァニン、 イソグァニン等の塩基アナ 口グが挙げられる。核酸塩基又はその誘導体は、例えば、ハロゲン原子、 アルキル基、 ハロアルキル基、 アルケニル基、 ノヽロアルケニル基、 アル キニル基、アミノ基、 アルキルァミノ基、水酸基、 ヒ ドロキシァミノ基、 アミ /ォキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、 ァリール基、 ァリールォキシ基、 シァノ基等の置換基を有していてもよ い。 核酸塩基又はその誘導体は保護基を有していてもよく、 ァミノ基の 保護基としては、 例えば、 ァセチル基、 プロピオニル基、 プチリル基、 ィソブチリル基等の脂肪族ァシル基;ベンゾィル基、 4一メチルベンゾ
イノレ基、 4ーメ トキシベンゾィル基、 フエ-ノレァセチル基、 フエノキシ ァセチル基、 4一 tert—ブチルフエノキシァセチル基、 4一イソプロピ ルフエノキシァセチル基等の芳香族ァシル基;ハロゲン原子、 アルキル 基、 アルキルォキシ基等の置換基を有する脂肪族ァシル基又は芳香族ァ シノレ基; 2—シァノエチル基、 2— ( p—-トロフエ-ル) ェチル基、 2— (ベンゼンスルホニル) ェチル基等の /3脱離による除去が可能な、 電子吸引基を有するェチル基; ジメチルァミノメチレン基、 ジブチルァ ミノメチレン基等のジアルキルァミノメチレン基; 2—シァノエトキシ カルボ-ル基、 2— ( p—-トロフエニル) エトキシカルポ-ノレ基、 2 ― (ベンゼンスルホ -ル) エトキシカルボニル基等の ]3脱離による除去 が可能な、電子吸引基を有するアルコキシカルボエル基等が挙げられる。
リポヌクレオチド誘導体 (m) が有する 2 ' 水酸基の保護基は、 核酸 塩基又はその誘導体が有する保護基の除去、 R 6で表されるリン酸保護 基の除去、 ヌクレオチド鎖の固相担体からの切り出し等の際に一般的に 用いられるアンモニア又は第 1級ァミンに対して安定であるが、 ァンモ エア又は第 1級アミンによる処理時間が長時間であると若干脱離するお それがある。 したがって、 上記式 (ΠΙ) において Bで表される核酸塩基 又はその誘導体が保護基を有する場合、 当該保護基は、 ヌクレオチド誘 導体 (m) のアンモユア'処理又は第 1級ァミン処理により、 R 6で表き れるリン酸保護基とともに短時間で I 去できることが好ましい。 このよ うな保護基としては、 例えば、 上記のような脂肪族ァシル基、 芳香族ァ シル基、 置換基を有する脂肪族ァシル基又は芳香族ァシル基、 ]3脱離に よる除去が可能な、 電子吸引基を有するェチル基、 ジアルキルアミノメ チレン基等が挙げられる。 このような保護基を有する核酸塩基又はその 誘導体を以下に例示する。
[式中、 R 7はフエノキシァセチル基、 フエニルァセチル基、 ァセチル基 又はベンゾィル基を表し、 R 8はィソブチリル基又はベンゾィル基を表 し、 R 9はフエノキシァセチル基、 フエニルァセチル基、 ァセチル基又 はィソプチリル基を表し、 R 1 °は 2—シァノエチル基を表し、 R 1 1はべ ンゾィル基、, 4ーメ トキシベンゾィル基又は 4一メチルベンゾィル基を 表し、 R 1 2はジメチルアミノメチレン基を表す。]
ゥラシル又はその誘導体に関しては通常保護基を必要としないが、 ベ ンゾィ /レ基、 4ーメ トキシベンゾィノレ基又は 4—メチノレベンゾィ/レ基を 導入することにより、 合成中間体の脂溶性及び結晶性が向上し、 シリカ ゲルカラムクロマトグラフィーによる精製や結晶化が容易になる。
Bで表される核酸塩基又はその誘導体が保護基として上記のような脂 肪族ァシル基、 芳香族ァシル基、 置換基を有する脂肪族ァシル基又は芳 香族ァシル基、 ;3脱離による除去が可能な、 電子吸引基を有するェチル 基、 ジアルキルアミノメチレン基等を有する場合、 当該保護基は、 アン モニァ処理又は第 1級ァミン処理により除去することができる。 また、
Bで表される核酸塩基又はその誘導体が保護基としてジメ トキシトリチ ル基、 モノメ トキシトリチル基等のトリチル基を有する場合、 当該保護 基は、 酸処理により除去することができる。 また、 Bで表される核酸塩 基又はその誘導体が保護基として上記のような 脱離による除去が可能 な電子吸引基を有するアルコキシカルボ-ル基を有する場合、 当該保護 基は、 第 3級アミン処理又はホスファゼン塩基処理により除去すること ができる。
上記式 ( 1 )、 ( Π ) 又は (LI ) には、 Bで表される核酸塩基又はその 誘導体が複数個含まれている力 S、これらは同一の種類であってもよいし、 異なる種類であってもよい。
上記式 ( 1 )、 ( Π ) 又は (ΠΙ ) において、 R 1で表される トリチル基 又は 9一フエニルキサンテュル基は置換基を有していてもよいし、 置換 基を有していなくてもよい。 なお、 R 1で表される トリチル基又は 9— フエエルキサンテニル ¾は 5 ' 水酸基の保護基であり、,当該保護基は、 酸処理により除去することができる。
トリチル基は、 3個のフエニル基のうち 1個以上に置換基を有するこ とができる。 トリチル基又は 9一フエニルキサンテュル基は、 フエニル 基の 2位、 3位又は 4位のいずれか 1以上に置換基を有することができ る。 トリチル基又は 9—フエニルキサンテュル基が複数の置換基を有す る場令、 置換基の種類は同一であってもよいし、 異なっていてもよい。
トリチル基又は 9一フエエルキサンテニル基が有する置換基は特に限
定されるものではなく、 その具体例としては、 メチル基、 ェチル基、 n 一プロピル基、 イソプロピル基、 n—プチル基、 イソブチル基、 s—ブ チノレ基、 t一プチノレ基、 n—ペンチノレ基、 イソペンチ/レ基、 t—ペンチ ル基、 ネオペンチル基等のアルキル基; メ トキシ基、 エトキシ基、 n— プロポキシ基、 イソプロポキシ基、 n—ブトキシ基、 イソブトキシ基、 s—ブトキシ基、 t一ブトキシ基等のアルコシキ基等が挙げられる。 置換基を有する トリチル基としては、 例えば、 4ーメ トキシトリチル 基、 4, 4 ' —ジメ トキシトリチル基、 4, 4,, 4 " ートリメ トキシ トリチル基、 4一メチルトリチル基、 4, 4 ' —ジメチルトリチル基等 が挙げられるが、 これらのうち、 4, 4 ' ージメ トキシトリチル基が好 ましい。 ,
置換基を有する 9 _フエニルキサンテュル基としては、 例えば、 9— ( 4 ' —メ トキシフエ -ノレ) キサンテニノレ基、 9一 ( 4 ' —メチノレフェェ ル) キサンテ ル基等が挙げられるが、 これらのうち、 9一 ( 4 ' —メ トキシフエニル) キサンテュル基が好ましい。
上記式 (Π ) 又は (ΙΠ ) において、 R 2、 R 3又は R 4で表されるハロ ゲン原子は特に限定されるものではなく、 その具体例と しては、 フッ素 原子、 塩素原子、 臭素原子等が挙げられる。
上記式 (Π ) 又は (ΠΙ ) において、 R 2、 R 3又は R 4で表されるアル キル基は特に限定されるものではなく、その具体例として ί 、メチル基、 ェチル基、 η—プロピル基、 イソプロピル基、 η—ブチル基、 イソブチ ル基、 s —ブチル基、 t一ブチル基、 η—ペンチル基、イソペンチル基、 t一ペンチル基、 ネオペンチル基等の炭素数 1〜 5の直鎖状又は分岐鎖 状のアルキル基が挙げられる。.
上記式 (Π ) 又は (ΠΙ ) において、 R 2、, R 3又は R 4で表されるアル ケニル基は特に限定されるものではなく、 その具体例と しては、 ビニル
W 基、 ァリル基、 クロチル (2—ブテュル) 基、 イソプロぺ-ル (1ーメ チルビエル) 基等の炭素数 2〜 5のァルケ-ル基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (ΠΙ) において、 R2、 R3又は R4で表されるアル キニル基は特に限定されるものではなく、 その具体例としては、 ェチニ ル基、 1一プロビュル基、 プロパルギル基等の炭素数 2〜 5のアルキニ ル基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (EI) において、 R2、 R3又は R4で表されるシク 口アルキル基は特に限定されるものではなく、 その具体例としては、 シ クロプロ ピノレ、 シクロプチノレ、 シク口ペンチノレ、 シクロへキシノレ等の炭 素数 3〜 6のシク口アルキル基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (ΙΠ) において、 R2、 R3又は R4で表されるシク ロアルケエル基は特に限定されるものではなく、 その具体例としては、 シク口ペンテニル、 シクロへキセニル'等の炭素数 5〜 6のシクロアノレケ ニル基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (ΠΙ) において、 R2、 R 3又は R4で表されるァリ 一ル基は特に限定されるものではなく、 その具体例としては、 フエニル 基、 : —メ トキシフエニル基、 3, 5—ジメ トキシフエ二ル基、 p—ク ロロフエ二ノレ基、 p—フノレオ口フエ-/レ基、 3, 5—ジメチノレフエ二ノレ 基、 2, 4, 6—トリメチルフエニル基、 ナフチル基等の置換又は非置 換の芳香族炭化水素基; フ リル基、 チェニル基、 ピリジル基、 ピロリル 基、 ォキサゾリル基、 イソォキサゾリル基、 チアゾリル基、 イソチアゾ リル基、 ィミダゾリル基、 ピラゾリル基、 ピリ ミジニル基、 ピリダジニ ル基、 ビラリジニル基、 キノリル基、 イソキノリル基等の置換又は非置 換の芳香族複素環基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (ΙΠ) において、 R2、 R 3又は R 4で表されるァラ ルキル基は特に限定されるものではなく、 その具体例とレては、 ベンジ
ル基、 ひ-メチルベンジル基、 フエネチル基等のァラルキル基が挙げられ る。
上記式 (Π) 又は (III) において、 R2、 R3又は R4で表されるァシ ル基は特に限定されるも ではなく、その具体例としては、ァセチル基、 トリフルォロアセチル基、 プロピオエル基、 ブチリル基、 イソプチリル 基、 ビバロイル基等の炭素数 1〜 5の脂肪族ァシル基;ベンゾィル基、 3, 5—ジメチルベンゾィル基、 2 , 4, 6—トリメチルベンゾィル基、 2, 6—ジメ トキシベンゾィル基、 2, 4, 6— トリメ トキシベンゾィ ル基、 2, 6—ジイソプロポキシベンゾィル基、ナフチルカルボニル基、 アントリルカルポニル基等の芳香族ァシル基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (ΙΠ) において、 R2、 R3又は R4で表されるアル コキシ基は特に限定されるものではなく、 その具体例としては、 メ トキ シ基、 エトキシ基、 n—プロポキシ基、 イソプロポキシ基、 n—ブトキ シ基、 イソブトキシ基、 s—ブトキシ基、 tープトキシ基等の炭素数 1 〜 5の直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (ΠΙ) において、 R2、 R3又は R4で表されるァリ 一ルォキシ基は特に限定されるものではなく、 その具体例としては、 フ エノキシ基、 ナフチルォキシ基等のァリールォキシ基が挙げられる。 上記式 (Π) 又は (ΠΙ) において、 R2、 R3又は R4で表されるァラ ルキルォキシ基は特に限定されるものではなく、 その具体例としては、 ベンジルォキシ基、 フエネチルォキシ基等のァラルキルォキシ基が挙げ られる。
上記式 (Π) 又は (EDO において、 R2、 R3又は R4で表されるアル コキシ力ルポエル基は特に限定されるものではなく、 その具体例として は、 メ トキシカルボエル基、 ェトキシカルボエル基、 n—ブトキシカノレ ボニル基、 n一オタチノレオキシカノレポ-ル基等のァノレコキシカルボニル
基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (ΠΙ) において、 R2、 R3又は R4で表されるァリ ールォキシカルボ二ル基は特に限定されるものではなく、 その具体例し ては、 フエノキシカルボエル基、 ナフチルォキシカルボ-ル基等のァリ ールォキシカルボニル基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (ΙΠ) において、 R2、 R3又は R4で表されるァラ ルキルォキシカルボエル基は特に限定されるものではなく、 その具体例 としては、 ベンジルォキシカルボ-ル基、 フエネチルォキシカルボェノレ 基等のァラルキルォキシカルボニル基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (ΙΠ) において、 R2、 R3又は R4で表されるアル キルチオカルボ-ル基は特に限定されるものではなく、 その具体例と し ては、 メチノレチォカルボニル基、 ェチルチオカルポニル基、 n—プチノレ チォカノレポ二ノレ基、 n—ォクチノレチォカルボ二ノレ基等のァノレキノレチォ力 ルポニル基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (ΙΠ) において、 R2、 R3又は R4で表されるアル コキシチォカルポ二ル基は特に限定されるものではなく、 その具体例と しては、 メ トキシチォカノレポ二ノレ基、 エトキシチォカノレボニノレ基、. n― ブトキシチォカノレポ二/レ基、 n一オタチルォキシチォカノレポ-ノレ基等の アルコキシチォカルポニル基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (ΠΙ) において、 R2、 R3又は R4で表されるァリ 一ルチオカルボ二ル基は特に限定されるものではなく、 その具体例とし ては、 フエ-ルチオカルボニル基、 ナフチルチオカルボニル基等のァリ 一ルチオ ルボニル基が挙げられる。 ,
上記式 (Π) 又は (诅) において、 R2、 R3又は R4で表されるァラ ルキルチオカルボ二ル基は特に限定されるものではなく、 その具体例と しては、 ベンジルチオ力ルポ二ノレ基、 フエネチノレチォカノレポ二ノレ基等の
ァラルキルチオカルボニル基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (m) において、 R2、 R 3又は R4で表されるァリ 一ルォキシチォカルボ二ル基は特に限定されるものではなく、 その具体 例としては、 フエノキシチォカルボニル基、 ナフチルォキシチォカルボ -ル基等のァリ一ルォキシチォカルボエル基が挙げられる。
上記式 (Π) 又は (m) において、 R2、 R3又は R4で表されるァラ ルキルォキシチォカルボ-ル基は特に限定されるものではなく、 その具 体例としては、 ベンジルォキシチォカルボエル基、 フエネチルォキシチ ォカルボニル基等のァラルキルォキシチォ力ルポエル基が挙げられる。 上記式 (Π) 又は (ΙΠ) において、 R2、 R 3又は R4で表されるアル キル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアルキル基、 シクロアル ケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 アルコキシ基、 ァリ ールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボニル基、 アジ一 ルォキシカルポエル基、 ァラルキルォキシ力ルポエル基、 アルキルチオ カルポニル基、 ァノレコキシチォカノレポ-ル基、 了リ一ノレチォカノレポ二ノレ 基、 ァラルキルチオカルボ二ル基、 ァリ一ルォキシチォカルボ二ル基又 はァラルキルォキシチォカルボニル基は、置換基を有していてもよいし、 置換基を有していなくてもよい。
上記式 (Π) 又は (ΠΤ) において、 R2 (又は R3) と R4とは、 相互 に連結して、 R2 (又は R3) 及び R4がそれぞれ結合している炭素原子 と共同して環を形成してもよい。
上記式 (π) 又は (m) において、 R5で表される電子吸引基 (電子 求引基) は特に限定されるもので なく、 その具体例としては、 ァノ 基、 -トロ基、 p—二ト口フエ-ル基、 アルキルスルホニル基( えば、 メチノレスノレホニノレ基、 トリフルォロメチノレスノレホニノレ基、 ェチノレスノレホ ニル基等)、 ァリ一ルスルホニル基 (例えば、 フエニルスルホニノレ等)、
トリフルォロメチル基、ハロゲン原子、アルコキシ力ルポ二ノレ (例えば、 メ トキシカルポ二ノレ、 エトキシカルボニル等)、 ヒ ドロキシカルボ二ノレ、 ァリールォキシ力ルポエル (例えば、 フエノキシカルボニル等) 等が挙 げられるが、 シァノ基であることが好ましい。
上記式 (ΠΙ ) .において、 R 6で表されるリン酸保護基は特に限定され るものではなく、その具体例としては、メチル基、 2—シァノエチル基、 2一 (トリメチルシリル) ェチル基、 2― ( p—エトロフエニル) ェチ ノレ基等が挙げられるが、 これらのうち、 メチル基又は 2—シァノエチノレ 基が好ましい。
上記式 ( I ) 又は ( Π ) には、 Xで表されるォキソァニオン (〇— ) 又はチオア二オン (s _ ) が複数個含まれているが、 これらは同一種類 のァニオンであってもよいし、 異なる種類のァニオンであってもよい。 上記式 (m) には、 wで表される酸素原子又は硫黄厚子が複数個含ま れているが、 これらは同一種類の原子であってもよいし、 異なる種類の 原子であってもよい。
上記式 ( ι )、 ( π ) 又は (m ) において、 γ及び zで表される水酸基 の保護基は、 R 1で される 5 ' 水酸基の保護基が除去される条件下で 除去されない限り特に限定されるものではないが、その具体例と しては、 tーブチルジメチルシリル基、 tーブチルジフユエルシリル基等のシリ ル基; レブリニル基、 ァセチル基、 フエ-ルァセチル基、 フエノキシァ セチル基、 ブチリル基、 プロピオニル基、 ベンゾィル基等のァシル基; テトラヒ ドロピラエル、 テ トラヒ ド フラエル等の環状保護基; イソプ 口ピリデン基、 メ トキシメチリデン基、 ベンジリデン基等の 2, 3 ' — 環状ァセタール型保護基等が挙げられるが、 これらのうち、 フエノキシ ァセチル基又は tーブチルジフエニルシリル基が好ましい。 Y及ぴ Zが ともに水酸基の保護基を表す場合、 Y及び Zで表される水酸基の保護基
は同一種類であってもよいし、 異なる種類であってもよい。
Y及び zで表される氷酸基の保護基が上記のようなァシル基である場 合、 当該保護基は、 アンモニア^理又は第 1級ァミ ン処理により除去す ることができる。 また、 Y及び zで表される水酸基の保護基が上記のよ うな環状保護基、 2 ' 3 ' —環状ァセタール型保護基等である場合、 ギ 酸等の酸処理によって除去することができる。 また、 Y及び Zで表され る水酸基の保護基が上記のようなシリル基である場合、 当該保護基は、 テトラプチルアンモニゥムフルオリ ド (T B A F ) 等のフッ化物処理に より除去することができる。
上記式 ( ι )、 ( π ) 又は (m) において、 γ及び zで表される固相担 体は特に限定されるものではないが、 その具体例としては、 アミノアル キル化された高分子担体(例えばポリスチレン)、多孔性の球状グラスビ ーズ (control led pore glass: C P G )、 ポジエチレング]; :π—ノレ等力 S 挙げられる。ヌクレオチドの水酸基と Y及ぴ Zで表される固相担体とは、 直接結合していてもよいし、 コハク酸エステル、 シユウ酸エステル、 フ タル酸エステル、 4—カルポキシフエニル (ジイソプロピル) シリノレ基 (A. Kobori, et al. Chem. Lett. , 16-17 (2002) ) 等のスぺーサー (リ ンカー) を介して結合していてもよ ,、。 Y及び Zがともに固相担体を表 す場合、 Y及び Zで表される固相担体は同一種類であってもよいし、 異 なる種類であってもよい。
Y及び Zで表される固相担体がコハク酸エステル、 シュゥ酸エステル 、 フタル酸エステル等のスぺーサーを介して水酸基と結合している場合 、 当該固相担体は、 アンモニア処理又は第 1級ァミン処理により除去す ることができる。
Y及び Zで表される固相担体が 4—カルボキシフエニル (ジィソプロ ピル) シリル基を介して水酸基と結合している場合、 当該固相担体は、
テトラブチルアンモニゥムフルオリ ド (TBAF) 等のフッ化物処理に より除去することができる。
上記式 (1)、 (Π) 又は (ΠΙ) において、 nは 1以上の整数である限 り特に限定されないが、 通常は 1 ~ 1 00の整数であり、 好ましくは 1 〜 30の整数である。 '
以下、 R1が置換基を有していてもよいトリチル基若しくは 9一フエ エルキサンテエル基であるリボヌクレオチド誘導体( I )、(π)又は(m) をそれぞれ 「リポヌクレオチド誘導体 ( I— 1 )」、 「リポヌクレオチド誘 導体 (Π— 1)J 又は 「リボヌクレオチド誘導体 (ΙΠ— 1)J といい、 R 1が水素原子であるリポヌクレオチド誘導体 (1)、 (Π) 又は (no を それぞれ 「リポヌクレオチド誘導体 ( I一 2)」、 「リポヌクレオチド誘導 体 (Π— 2)」 又は 「リポヌクレオチド誘導体 (ΙΠ— 2)」 という。
〔リポ核酸合成モノマーの製造〕
次式 ( a ) :
[式中、 Bは前記と同義である。]
で表されるリポヌクレオシド又はリボヌクレオシド誘導体 ( a) をピリ ジン、 N, N—ジメチルホルムアミ ド、 N—メチルピロリ ドン、 テトラ ヒ ドロフラン、 ァセ トニトリル等の有機溶媒に溶解し、 これに 1, 3— ジクロロー 1, 1, 3, 3—テトライソプロピルジシロキサン、 ジー te rt—プチルジク口口シラン又はジ一 tert—ブチルシリルビス (トリフル
ォロメタンスルホン酸) を添加するとともに、 発生する塩化水素やトリ フルォロメタンスルホン酸の捕捉剤としてピリジン、 トリエチルアミン 等を添加して反応させることにより、 次式 (b ) :
[式中、 Bは前記と同義であり、 R 1 3は 1, 1, 3, 3—テトライソプ 口ピルジシロキサン一 1, 3ージィル基又はジ一 tert—ブチルシランジ ィル基を表す。]
で表されるリボヌクレオシド誘導体 (b ) を製造することができる。 こ の際の反応温度は通常 0〜 4 0 °C、 好ましくは 1 5〜 2 5 °Cであり、 反 応時間は通常 1〜 1 2時間、'好ましくは 4〜 8時間である。 また、 1, 3—ジクロロー 1, 1, 3, 3—テトライソプロピルジシロキサン、 ジ 一 tert—プチルジクロロシラン又はジー tert—ブチルシリルビス (トリ フルォロメタンスルホン酸) の添加量は、 リボヌクレオシド又はリポヌ クレオシド誘導体 ( a ) に対して通常 1〜 2モル当量、 好ましくは 1〜 1 . 2モル当量であり、捕捉剤の添加量は、 リポヌクレオシド又はリボヌ クレオシド誘導体 (a ) に対して通常 1〜 2モル当量、 好ましくは 1〜 1 - 2モル当量である。
次いで、 リポヌクレオ、ンド誘導体 ( b ) を 1, 4一ジォキサン、. テト ラヒ ドロフラン、 トノレェン、 ァセトニトリル等の有機溶媒に溶解し、 こ れに次式 (c ) :
R
2 R
4
[式中、 R2、 R3、 R4及ぴ R5は前記と同義である。]
で表される化合物 (c) を添加するとともに、 触媒として: — トルエン スルホン酸水和物、 p— トルエンスルホン酸ピリジ-ゥム塩、 ト リ フノレ ォロ酢酸、 トリクロ口酢酸、 ジクロロ酢酸、 塩化水素、 硫酸等を添加し て反応させることにより、 次式 (d):
[式中、 B、 R2、 R3、 R4 R 5及び R 13は前記と同義である。] で表されるリポ クレオシド誘導体 (d) を製造することができる。 こ の際の反応温度は通常 0〜 40°C、 好ましくは 1 5〜 2 5°Cであり、 反 応時間は通常 1 0分間〜 1時間、 好ましくは 1 0〜20である。 また、 化合物 (c) の添加量は、 リポヌクレオシド誘導体 (b) に対して通常 1. 1 - 1 0モル当量、 好ましくは 1. 1〜 5モル当量であり、 触媒の添 加量は、 リポヌクレオシド誘導体 (b) に対して通常 0. 1〜 1 0モル当
量、 好ましくは 1. 1〜 5モル当量である。
次いで、 リポヌクレオ:ンド誘導体 (d) をテトラヒ ドロフラン、 1 , 4一ジォキサン、 ジクロロメタン、 ァセトニトリル等の有機溶媒に溶解 し、 フッ素化剤 (例えば、 テトラプチルアンモニゥムフルオリ ド、 トリ ェチルァミントリハイ ドロフルオリ ド、フッ化水素ピリジン等) と酸(例 えば、 酢酸、 塩酸、 硫酸) とを任意の混合比の混合試薬として反応させ ることにより、 次式 (e ) :
[式中、 B、 R2、 R3、 R4及び R5は前記と同義である。] . - で表されるリポヌクレオシド誘導体 ( e ) を製造することができる。 こ の際の反応温度は通常 0〜 40°C、 好ましくは 1 5〜 2 5°Cであり、 反 応時間は通常 1 5〜 20時間、好ましくは 1 6〜 1 8時間である。また、 混合試薬におけるフッ素化剤と酸との混合比は、 通常 1 : 1〜 1 : 2、 好ましくは 1 : 1 ~ 1 : 1. 5であり、 混合試薬の添加量は、 リボヌタレ オシド誘導体 (d) に対して通常 2〜 1 0モル当量、 好ましくは 3〜 5 モル当量である。
次いで、 リボヌクレオシド誘導体 (e ) を、 ピリジン等の有機溶媒に 溶解し、 これに Rl a— C 1 [式中、 R1 aは置換基を有していてもよいト リチル基若しくは 9 _フエニルキサンテュル基を表す。]を添加して反応
させることにより、 次式 ( f ) :
[式中、 Rl a、 R2、 R3、 R4及び R5は前記と同義である。]
で表されるリポヌクレオシド誘導体 (f ) を製造することができる。 こ の際の反応温度は通常 0〜 40°C、 好ましくは 1 5〜 25°Cであり、 反 応時間は通常 :〜 1 2時間、 好ましくは 6〜 8時間である。 また、 Rl a 一 C 1の添加量は、 リポヌクレオシド誘導体 (e) に対して通常 1〜 2 モル当量、 好ましくは 1〜 1. 1モル当量である。
こうして製造されたリボヌクレオシド誘導体 ( f ) は、 リボ核酸合成 モノマーであるリポヌ ^レオシド誘導体 (h) を製造するにあたっての 中間体である。
次いで、 リポヌクレオシド誘導体 ( f ) を、 ジクロロメタン、 テトラ ヒ ドロフラン、 1 , 4一ジォキサン、 ジクロロメタン、 ァセ トニトリノレ 等の有機溶媒に溶解し、,これに次式 (g) :
[式中、 R 5は前記と同義であり、 R 14及ぴ R 1 5は同一の又は異なるァ ルキル基を表す。]
で表される化合物 (g) 及び亜リン酸化剤 (例えば、 2—シァノエチル — N, N—ジイソプロピノレホスホロクロリダイ ト、 メチルー N, N—ジ ィソプロピルホスホロクロリダイ ト等) を添加して反応させることによ り、 次式 ( h ) :
[式中、 Rl a、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R14及び R15は前記と同義 である。]
で表されるリボヌクレオシド誘導体 (h) を製造することができる。 こ の際の反応温度は通常 0〜 2 5 °C、 好ましくは 1 5〜 2 5 °Cであり、 反 応時間は通常!:〜 3時間、 好ましくは 2〜 3時間である。 また、 化合物
(g) の添加量は、 リポヌクレオシド誘導体 ( f ) に対して通常 1〜 2モ ル当量、好ましくは 1〜 1. 1モル当量であり、亜リン酸化剤の添加量は、 リボヌクレオシド誘導体 ( f ) に対して通常 1〜 2モル当量、 好ましく は 1〜: L . 1モル当量である。
上記式 (g) 及ぴ (h)'において、 R 14及び R 15で表されるアルキル 基は特に限定されるものではなく、 その具体例としては、 メチル基、 ェ チル基、 n—プロピル基、 イソプロピル基、 n—ブチル基、 イソプチル 基、 s—プチル基、 t一プチル基、 n—ペンチル基、 イソペンチル基、 t一ペンチル基、 ネオペンチル基等の炭素数 1〜 5の直鎖状又は分岐鎖 状のアルキル基が挙げられるが、 これらのうち、 ェチル基又はイソプロ ピル基が好ましい。 R 14及び R 15で表されるアルキル基は同一であって もよいし、 異なっていてもよい。 また、 R 14及び R 15で表されるアルキ ル基が一体となって環を形成していてもよい。
こう して製造されたリボヌクレオシド誘導体 (h) は、 リポ核酸合成 のモノマーとなる。
〔リポヌクレオチド誘導体 (ΙΠ— 1) の製造〕
(工程 1) 5 ' 水酸基の脱保護
常法に従って得られる次式 ( i ) :
[式中、 B、 R
l a、 Y及び Zは前記と同義である。]
で表されるリポヌクレオシド誘導体 ( i ) を酸処理することにより、 R l aで表される 5 '水酸基の保護基を除去し、 5'水酸基の脱保護を行う。 この際、 酸処理は、 例えば、 トリフルォロ酢酸、 ジクロロ酢酸、 トリク 口口酢酸等を 1〜 5 %の濃度になるようにジクロロメタン、 クロ口ホル ム、 1, 2—ジクロロェタン等の有機溶媒に溶解した溶液を用いて行う ことができる。 当該溶液を用いた処理温度は通常 0〜40°C、 好ましく は 1 5〜25°Cであり、 処理時間は通常 0. 5〜 1 0分、 好ましくは 0. 5〜 1分である。
(工程 2) ホスホロアミダイ ト体の活性化及び縮合反応による鎖伸長 リボヌクレオシド誘導体 (h) にプロ トンを与えて活性化させ、 5' 水酸基を脱保護したリポヌクレオシド誘導体 ( i ) と縮合反応させる。 この際、 反応溶媒としては、 例えば、 ァセトニトリル、 テトラヒ ドロフ ラン、 ジクロロメタン等を用いることができ、 活性化剤と.しては、 例え ば、 1 H—テトラゾーノレ、 5—ェチノレチォテトラゾーノ 、 5—べンジノレ チォテトラゾーノレ、 5—二 ト ロフエニノレテトラゾーノレ、 3, 4—ジシァ ノイミダゾール、 3, 4—ジクロロイミダゾール、 3, 4—ジシァノィ ミダゾール、 ベンゾトリアゾールトリフラート、 イミダゾールトリフラ ート、 N—シァノメチルアンモユウム塩等を用いることができる。また、 反応温度は通常 0〜 40°C、 好ましくは 1 5〜25°Cであり、 反応時間 は通常 5〜 1.5分、 好ましくは 3〜 5分である。
縮合反応における活性化剤としては 1 H—テトラゾールが一般的に用 いられる。 伹し、 縮合反応では 2 ' 水酸基の保護基の立体障害による縮 合反応速度及び縮合反応収率の低下 問題となるので、 1 H—テトラゾ ールと比較して, 縮合反応速度及び縮合反応収率の向 φが期待できる活 性化剤 (例えば、 5—ェチルチオテトラゾール、 5—ベンジルチオテト
ラゾーノレ、 5 —二 ト ロフエュノレテトラゾーノレ、 3 , 4—ジシァノイ ミダ ゾーノレ、 3 , 4—ジクロ口イミダゾーノレ、 3 , 4—ジシァノイミダゾー ル、 ベンゾトリアゾールト リフラート、 イミダゾールト リ フラー ト、 N ーシァノメチルアンモニゥム塩等) を用いることが好ましい。 N—シァ ノメチルアンモ -ゥム塩と しては、 例えば、 N—シァノメチルジメチル アンモユウムテ トラフルォロホウ酸、 N—シァノメチルジメチルアンモ ニゥムへキサフルォロリン酸、 N—シァノメチルジメチルァンモニゥム トリ フノレオ口メタンスノレホン酸、 N—シァノメチノレジメチノレアンモユウ ムビス トリフルォロメタンスルホンィミ ド、 N—シァノメチルジメチノレ 過塩素酸、 N—シァノメチルピロリジンテトラフルォロホウ酸、 N —へ キサフルォロリン酸、 N—シァノメチルピロリジントリフノレオロメタン スルホン酸、 N—シァノメチルピロリジントリフルォロメタンスルホン イミ ド、 N—シァノメチルピロリジン過塩素酸、 N—シァノメチルピぺ リジンテトラフ/レオ口ホウ酸、 N—シァノメチルピペリジンへキサフノレ ォロリン酸、 N—シァノメチルピペリジントリフルォロメタンスルホン 酸、 N—シァノメチルピぺリジントリフルォロメタンスルホンィミ ド、 N—シァノメチルピペ ジン過塩素酸、 N—シァノメチルジィソ: ロピ ルアンモニゥムテトラフルォロホウ酸、 N—シァノメチルジィソプロピ ルアンモニゥムへキサフルォロリン酸、 N—シァノメチルジィソプロピ ルアンモニゥムトリフルォロメタンスルホン酸、 N—シァノメチルジィ ソプロピルアンモニゥムトリフルォロメタンスルホンィミ ド、 N—シァ ノメチルジィソプロピルアンモニゥム過塩素酸等を用いることができる 次いで、 必要に応じて、 未反応物の水酸基をキヤッビングする。 この 際、 キャップ化試薬と ては、 4ージメチルァミノピリジンや N—メチ ルイミダゾールをピリジン、 ァセトニトリル、 テトラヒ ドロフラン等の 任意の混合溶媒に 0 . 0 5 〜 1 Mの濃度になるように溶解した溶液と、
無水酢酸、無水メ トキシ酢酸等とを適当な混合比(例えば 9 : 1〜 1 9 : 1) で混合した溶液を用いることができる。 当該溶液を用いた反応時間 は通常 0〜40°C、好ましくは 1 5〜2 5°Cであり、反応時間は通常 0. 5〜 5分、 好ましくは 0. 5〜 1分である。
(工程 3) 亜リン酸結合のリン酸トリエステル結合への酸化
亜リン酸結合のリン酸トリエステル結合への酸化は、 例えば、 ヨウ素 をピリジン、 水、 ァセトニト リル、 テトラヒ ドロフラン等の無機溶媒、 有機溶媒又はそれらの任意の混合溶媒に 0. 0 5〜2Mの濃度になるよ うに溶解した溶液や、 過酸化 t一ブチルアルコールをメチレンク口ライ ド、 トルエン等に溶解した溶液を用いて行うことができる。 当該溶液を 用いた反応時間は通常 0〜 40°C、 好ましくは 1 5〜25°Cであり、 反 応時間は通常 0. 5〜5分、 好ましくは 0.5〜1分である。
亜リン酸結合のリン酸トリエステル結合への酸化は、 酸化反応時に生 じる中間体の加水分解、 溶媒中の H20による縮合反応効率の低下等を 防止するために、 無水溶媒中で行うことが好ましい。 亜リン酸結合を無 水溶媒中でリン酸トリエステル結合へ酸化できる試薬としては、例えば、 過酸化 t一ブチルアルコール、 2一 (フエニルスルホ -ル) 一 3— ( 3 一二トロフエ-ノレ) ォキサジリジン、 2— (フエニノレスノレホェノレ) 一 3 一フエ二ルォキサジリジン、 ( 1 S) ― ( + ) —カンファースルフォニル ォキサジリジン、 .( 1 S) - ( + ) — 8, 8—ジクロロカンファースルフ ォニルォキサジリジン等を用いることができる。
上記工程 1〜 3により、 次式 ( j 一 1 ) :
[式中、 B、 Rl a、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 Y及び Zは前記と同 である。]
で表されるリボヌクレオチド誘導体 ( j 一 1) (ダイマー) を製造するこ とができる。
また、 上記工程 3において、 酸化反応の代わりに硫化反応を行うこと により、 次式 ( j 一 2) : '
[式中、 B、 R
l a、 R
2、 R
3、 R
4、 R
5、 R
6、 Y及び Zは前記と同義 である。]
で表されるリポヌクレオチド誘導体 ( j — 2) (ダイマー) を製造するこ とができる。 硫化反応は、 例えば、 硫黄、 Beaucage 試薬 (3 H— 1 , 2 一ベンゾジチオール一 3—オン一 1 , 1 _ジォキシド) 等を用いて行う ことができる。
次いで、 上記工程 1〜 3に従って、 リボヌクレオチド零導体 ( j 一 1 ) 又は ( j 一 2) (ダイマー) とリポヌクレオシド誘導体 (h) (モノマー) とを反応させることにより、 次式 (k) :
[式中、 B、 Rl a、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 W、 Y及び Zは前記と 同義である。 ]
で表されるリポヌクレオチド誘導体 (k) (トリマー) を製造することが できる。
同様にして上記工程 1〜 3を繰り返すことにより、 リポヌクレオチド 誘導体 (ΠΙ_ 1 ) (オリゴマー) を製造することができる。
上記工程 1〜 3は、 市販の核酸合成機を用いて行ってもよい。
〔リボヌクレオチド誘導体 (m— 2 ) の製造〕
リボヌクレオチド誘導体 (IE— 2 ) は、 リボヌクレオチド誘導体 (m - 1 ) を酸処理し、 R l aで表される 5 ' 水酸基の保護基を除去すること により製造することがで る。酸としては、例えば、 トリフルォロ酢酸、 ジクロロ酢酸、 トリクロ口酢酸等を用いることがでぎるが,、 ジクロロ酢 酸を用いることが好ましい。 酸処理は、 具体的には、 上記酸をジクロ口 メタン、 クロ口ホルム、 1 , 2—ジクロロェタン等に濃度が 1〜 5 %と なるように溶解した溶液を用いて行うことができる。 当該溶液を用いた 処理温度は通常 0〜 4 0 °C、 好ましくは 1 5〜 2 5 °Cであり、 処理時間 は通常 0 . 5〜5分、 好ましくは 0 . 5 ~ 1分である。
リポヌクレオチド誘導体 (ΠΙ— 1 ) において、 Bで表される核酸塩基 又はその誘導体が保護基としてジメ トキシトリチル基、 モノメ トキシト リチル基等のトリチル基を有する場合、 当該保護基は、 ヌクレオチド誘 導体 (ΠΙ— 1 ) の酸処理により、 R 1 aで表される 5 ' 水酸基の保護基と ともに除去される。
〔リポヌクレオチド誘導体 (Π— 1 ) の製造■〕 ■ '
リボヌクレオチド誘導体 (π— 1 ) は、 リポヌクレオチド誘導体 (m - 1 ) を塩基処理し、 R 6で表されるリン酸保護基を除去することによ り製造することができる。 塩基としては、 R 6で表されるリン酸保護基 は除去するが 2 ' 水酸基の保護基は除去しない塩基を用いることができ る。 このような塩基としては、 例えば、 アンモニア、 第 1級ァミン等が 用いることができ、 第 1級ァミンとしては、 例えば、 メチルァミン、 ェ チルァミン、 プロピルァミン等の第 1級アルキルァミンを用いることが できる。 塩基処理は、 具体的には、 上記塩基を水、 エタノールに濃度が 1 5〜3 0 %となるように溶解した溶液を用いて行うことができる。 当
該溶液を用いた処理温度は通常 0 〜 5 0 °C、 好ましくは 1 0 〜 2 5でで あり、 処理時間は通常 1 8時間、 好ましくは 1 〜 2時間である。
リボヌクレオチド誘導体 (HI— I ) において、 Bで表される核酸塩基 又はその誘導体が保護基としてァセチル基、 プロピオ-ル基、 プチリル 基、 イソプチリル基等の脂肪族ァシル基;ベンゾィル基、 4 _メチルベ ンゾィル基、 4—メ トキシベンゾィル基、 フエニルァセチル基、 フエノ キシァセチル基、 4 一 tert—ブチルフエノキシァセチル基、 4—イソプ 口ピルフエノキシァセチル基等の芳香族ァシル基;ハロゲン原子、 アル キル基、 アルキルォキシ基等の置換基を有する脂肪族ァシル基又は芳香 族ァシル基; 2—シァノエチル基、 2— ( p—- トロフエニル) ェチノレ 基、 2 — (ベンゼンスルホニル) ェチル基等の i3脱離による除去が可能 な、 電子吸引基を有するェチル基; ジメチルアミノメチレン基、 ジブチ ルァミノメチレン基等のジアルキルァミノメチレン基を有する場合、 当 該保護基は、 ヌクレオチド誘導体 (ΙΠ— 1 ) のアンモニア処理又は第 1 級ァミン処理により、 R 6で表されるリン酸保護基とともに除去される。
リポヌクレオチド誘導体 (ΙΠ _ 1 ) において、 Υ及び Ζで表される水 酸基の保護基がレブリニル基、 ァセチル基、 フエエルァセチル基、 フエ ノキシァセチル基、 プチリル基、 プロピオニル基、 ベンゾィル基等のァ シル基である場合、 当該保護基は、 ヌクレオチド誘導体 (m _ i ) のァ ンモエア処理又は第 i級ァミ ン処理により、 R 6で表されるリン酸保護 基とともに除去される。
リボヌクレオチド誘導体 (ΠΙ _ 1 ) において、 Υ及び Ζで表される固 相担体がコハク酸エステル、 シユウ酸エステル、 フタル酸エステノ 等の スぺーサーを介して水酸基と結合している場合、 当該固相担体は、 リポ ヌクレオチド誘導体 (m— 1 ) のアンモニア処理又は第 1級ァミン処理 により、 R 6で表されるリ ン酸保護基とともに除去される。
〔リポヌクレオチド誘導体 (Π— 2 ) の製造〕
( 1 ) 第 1の製造方法 ' , . ,
リポヌクレオチド誘導体 (π— 2 ) は、 リボヌクレオチ'ド誘導体 (m
- 2 ) を塩基処理し、 R 6で表されるリ ン酸保護基を除去することによ り製造することができる。 塩基処理.は、 〔リポヌクレオチド誘導体 (Π— 1 ) の製造〕 と同様に行うことができる。
リポヌクレオチド誘導体 (111— 2 ) において、 Bで表される核酸塩基 又はその誘導体がァセチル基、 プロピオニル基、 ブチリル基、 イソプチ リル基等の脂肪族ァシル基;ベンゾィル基、 4—メチルベンゾィル基、 4ーメ トキシベンゾィル基、 フエニルァセチル基、 フエノキシァセチノレ 基、 4一 tert—ブチルフエノキシァセチル基、 4一イソプロピルフエノ キシァセチル基等の芳香族ァシル基;ハロゲン原子、 アルキル基、 アル キルォキシ基等の置換基を有する脂肪族ァシル基又は芳香族ァシル基; 2—シァノエチノレ基、 2— ( p—ニトロフエニル) ェチノレ基、 2— (ベ ンゼンスルホニル) ェチル基等の 3脱離による除去が可能な、 電子吸引 基を有するェチル基; ジメチルァミノメチレン基、 ジブチルァミノメチ レン基等のジアルキルァミノ;^チレン基を有する場合、 当該保護基は、 ヌクレオチド誘導体 (ΠΙ ^ 2 ) のアンモニア処理又は第 1級ァミン処理 により、 R 6で表されるリン酸保護基とともに除去される。
リポヌクレオチド誘導体 (ffl— 2 ) において、 Y及び Zで表される水 酸基の保護基がレブリニル基、 ァセチル基、 フエニルァセチル基、 フエ ノキシァセチル基、 ブチリル基、 プロピオエル基、 ベ ゾィル基等のァ シル基である場合、 当該保護基は、 ヌクレオチド誘導体 (ΠΙ— 2 ) のァ ンモニァ処理又は第丄級ァミン処理により、 R 6で表されるリン酸保護 基とともに除去される。
リポヌクレオチド誘導体 (ΙΠ— 2 ) において、 Y及び Zで表される固
相担体がコハク酸エステル、 シユウ酸エステル、 フタル酸エステル奪の スぺーサーを介して水酸基と結合している場合、 当該固相担体は、 リポ ヌクレオチド誘導体 (ΙΠ— 2) のアンモニア処理又は第 1級ァミン処理 により、 R6で表されるリン酸保護基とともに除去される。
(2) 第 2の製造方法 ·
リポヌクレオチド誘導体 (Π— 2) は、 リボヌクレオチド誘導体 (Π 一 1 ) を酸処理し、 Rl aで表される 5 ' 水酸基の保護基を除去すること により製造することができる。 酸処理は、 〔リポヌクレオチド誘導体 (m 一 2) の製造〕 と同様にして行うことができる。
リポヌクレオチド誘導体 (Π— 1) において、 Bで表される核酸塩基 又はその誘導体が保護基としてジメ トキシトリチル基、 モノメ トキシト リチル基等のトリチル基を有する場合、 当該保護基は、 リポヌクレオチ ド誘導体 (Π— 1) の酸処理により、 Rl aで表される 5 ' 水酸基の保護 基とともに除去される。
〔リボヌクレオチド誘導体 ( 1— 1) の製造〕
( 1) 第 1の製造方法
リポヌクレオチド誘導体 ( 1— 1) は、 リボヌクレオチド誘導体 (Π 一 1 ) をフッ化物処理し、 2 ' 水酸基の保護基を除去することにより製 造することができる。 フッ化物と しては、 例えば、 テトラプチルアンモ ユウムフルオリ ド(TBAF)、 フッ化カリウムと 1 8 _クラゥンー 6 と の混合試薬等を用いることができるが、 TB AFを用いることが好まし い。 TBAFを用いると 2 ' 本酸基の保護基を短日き間で 去することが できるからである。 フッ化カリ ウムと 1 8—クラウン一 6 との混合試薬 を用いる場合、 クラウンエーテルにより力リゥムイオンが捕捉されてフ ッ化物イオンが遊.離し、 遊離したフッ化物イオンが、 T BAFの場合と 同様に 2 ' 水酸基の保護基を除去することができる。 フッ化物処理は、
具体的には、 T BAFをテトラヒ ドロフラン等に濃度が 0. 5〜 1 Mと なるように溶解した溶液等を用!/、て行うことができる。 当該溶液を用い た処理温度は通常 0〜 6 0°C、 好ましくは 1 5〜 2 5°Cであり、 処理時 間は通常 0. 1〜 3 0時間、 好ましくは 0. 2〜 0. 5時間である。
リボヌク レオチド誘導体 (H— 1) において、 Y及び Zで表される水 酸基の保護基が t—ブチルジメチルシリル基、 t一プチルジフエニルシ リル基等のシリル基である場合、 当該保護基は、 リポヌクレオチド誘導 体 (Π— 1) のフッ化物処理により、 2 ' 水酸基の保護基とともに除去 される。
リポヌクレオチド誘導体 (Π— 1) において、 Y及ぴ Zで表される固 相担体が 4一カルボキシフエニル (ジイソプロピル) シリル基を介して 水酸基と結合している場合、 当該固相担体は、 リボヌク レオチド誘導体 (Π— 1 )のフッ化物処理により、 2 '水酸基の保護基とともに除される。 (2) 第 2の製造方法
リボヌクレオチド誘導体 ( 1— 1) は、 リボヌクレオチド誘導体 (Π 一 1) を、 無水溶媒中、 シリル化剤存在下で塩基処理した後、 中性条件 下で加水分解し、 2 ' 水酸基の保護基を除去することにより製造するこ とができる。 塩基としては、 例えば、 第 3級ァミン等の有機塩基、 ホス ファゼン塩基 (Schwesinger 塩基) 等を用いることができる。 なお、 第 1級アミン又は第 2級アミンとシリル化剤とを併用すると、 対応するシ リルアミンへと変換され、 第 1級アミン又は第 2級アミンの塩基性が極 端に減少するため有効ではないと考えられる。 第 3級ァミンとしては、 例えば、 1 , 8一ジァザビシク口 [5. 4. 0 ] 一 7—ゥンデセン (D B U)、 ジイソズロピルェチルァミン、 ト リェチルァミン、 ト リブチルァ ミン、 N—メチルビペリジン等を用いることができるが、 DBUを用い ることが好ましい。 DBUを用いると 2 ' 水酸基の保護基を短時間で除
去することができるからである。 ホスファゼン塩基としては、 例えば、
2 - t e r t一プチルイミノ一 2—ジェチルァミノー 1, 3—ジメチル 一 1, 3, 2—ジァザホスホリナン、 '( t e r t—プチルイミノ) トリス (ジメチルァミノ) ホスホラン、 t e r t—プチルトリス [トリス (ジメ チルァミノ) ホスホラ-リデン] ホスホリミディック トリアミ ド等を用 いることができる。 シリル化剤としては、 例えば、 N, O—ピス トリメ チルシリルァセトアミ ド> N , O—ビス トリメチルシリ トリフルォロ ァセトアミ ド、 Ν, Ο—ビス トリメチルシリルべンズアミ ド等のトリメ チルシリル化剤を用いることができる。 無水溶媒としては、 例えば、 ァ セトニトリル、 ニトロメタン、 テ トラヒ ドロフラン、 ジメチルホルムァ ミ ド等を用いることができる。 塩基処理は、 具体的には、 1, 8—ジァ ザビシクロ [ 5 . 4 . 0 ] 一 7一ゥンデセン ( D B U ) をァセトュ トリ ル等に濃度が 0 . 5〜1 Μとなるように溶解した溶液等を用いて行うこ とができる。 当該溶液を用いた処理温度は通常 0〜 6 0 °C、 好ましくは 1 5〜 2 5 °Cであり、 処理時間は通常 0 . 1〜 3 0時間、 好ましくは 0 . 2〜0 . 5時間である。 加水分解は、 塩基処理の後、 中性条件下で行う。 加水分解は、 例えば、 塩基処理後の反応溶媒に酸を加えて中和し、 反応 溶媒中に残存する塩基を除去し; ^後に行う とができる。 酸は特に限定 されるものではないが、 例えば、 酢酸のァセトニトリル溶液、 塩化水素 のァセトニトリル溶液等を用いることができる。 酸による残存塩基の中 和は無水条件下で行う必要がある。
シリル化剤の不存在下で塩基処理を行うと、 脱保護された 2 ' 水酸基 がリン酸エステルのリン原子を求核攻撃し、 ヌクレオチド鎖の分解が生 じる。 そこで、 シリル化剤存在下 塩基処理を行う。 シ.リル化剤は、 2 ' 水酸基又は脱保護反応の中間体として生成する 2,一 O— 2—ヒ ドロキ シェチル基をシリル化することにより、 水酸基の隣接リン原子への攻擊
を抑制するので、 ヌクレオチド鎖の分解が防止される。
リポヌクレオチド誘導体 (Π— 1 ) を、 無水溶媒中、 シリル化剤存在 下で塩基処理することにより、 リン酸エステルはリン酸シリルエステル へと変換されるとともに、 2 '水酸基又は脱保護反応の中間体として生成 する 2 '— O— 2—ヒ ドロキシェチル基はシリル化される。リ ン酸シリル エステルは、 水を加えると、 直ちに加水分解されて遊離のリン酸エステ ルに変換される。 シリル化された 2 ' 水酸基は、 水を加えると、 隣接す る遊離したリン酸の分子内酸触媒作用で速やかに加水分解され、 遊離の 2 ' 水酸基に変換される。 脱保護反応の中間体として生成する 2 '- O- 2 -ヒ ドロキシェチル基がシリル化されて 2 -トリメチルシロキシェチル 基に変換されている場合、 当該シリルエーテルは極めて不安定なため、 水を加えると、直ちに加水分解され、不安定な 2 -ヒ ドロキシェチル基に 変換された後、 直ちにァセトアルデヒ ドの脱離を伴って分解し、 遊離の 2 ' 水酸基に変換される。 なお、 加水分解処理は酸性条件下で行うこと もできるが、 酸性条件下で加水分解処理を行うと R 1 aで表される 5 '水 酸基の保護基が除去され ので、 リポヌクレオチド誘導体 ( 1 — 1 ) の 製造方法では中性条件下で加水分解処理を行う。中性条件は通常 p H 7 . 0であり、 酸性条件は通常 p H 2 . 0— 6 . 9である。
リボヌクレオチド誘導体 (Π— 1 ) において、 Bで表される核酸又は その誘導体が有する保護基が 2—シァノエトキシカルボ-ル基、 2— ( p 一二 トロフエ二ノレ) エ トキシ力/レポ二ノレ基、 2— (ベンゼンスノレホニノレ) ェトキシカルボニル基等の 脱離による除去が可能な、 電子吸引基を有 するアルコキシカルボニル基である場合、 当該保護基は、 リポヌクレオ チド誘導体 (Π— 1 ) の第 3級ァミン処理又はホスファゼン塩基処理に より除去される。
( 3 ) 第 3の製造方法
リポヌクレオチド誘導体 ( 1— 1) は、 リボヌクレオチド誘導体 (m 一 1) を、 無水溶媒中、 シリル化剤存在下で塩基処理した後、 中性条件 下で加水分解し、 R 6で表されるリン酸保護基及び 2 ' 水酸基の保護基 を除去することにより製造することができる。 無水溶媒'中におけるシリ ル化剤存在下での塩基処理及び中性条件下での加水分解処理は、 上記第
2の製造方法と同様に行うことができる。
リボヌクレオチド誘導体 (ΙΠ— 1) において、 Bで表される核酸又は その誘導体が有する保護基が 2—シァノエトキシカルポ-ル基、 2—(p —ニ トロフエ二ノレ) エ トキシカノレポニル基、 2— (ベンゼンスノレホニノレ) ェトキシカルボ-ル基等の i3脱離による除去が可能な、 電子吸引基を有 するアルコキシカルボニル基である場合、 当該保護基は、 リボヌクレオ チド誘導体 (ΠΙ— 1) の第 3級ァミン処理又はホスファゼン塩基処理に より除去される。
〔リポヌクレオチド誘導体 ( I一 2) の製造〕
(1) 第 1の製造方法 .,
リボヌクレオチド誘導体 ( 1— 2) は、 リボヌクレオチド誘導体 (Π 一 2) をフッ化物処理し、 2 ' 水酸基の保護基を除去することにより製 造す.ることができる。 フッ化物処理は、 〔リボヌクレオチド誘導体 ( I一 1) の製造〕 と同様にして行うことができる。
リボヌクレオチド誘導^: (Π— 2) において、 Y及び Zで表される水 酸基の保護碁が t一プチルジメチルシリル基、: tーブチルジフエ-ルシ リル基等のシリル基である場合、 当該保護基は、 リボヌクレオチド誘導 体 (Π— 2) のフッ化物処理により、 2 ' 水酸基の保護基とともに除去 される。
リポヌクレオチド誘導体 (Π— 2) において、 Y及び Zで表される固 相担体が 4一力ルポキシフエニル (ジイソプロピル) シリル基を介して
水酸基と結合している場合、 当該固相担体は、 リポヌクレオチド誘導体 (Π— 2) のフッ化物処理により、 2, 水酸基の保護基とともに除去さ れる。
(2) 第 2の製造方法
リポヌクレオチド誘導体 ( 1— 2) は、 リボヌクレオチド誘導体 ( I - 1 ) を酸処理し、 Rl aで表される 5 ' 水酸基の保護基を除去すること により製造することができる。 この際、 ヌクレオチド鎖を分解しないよ うに酸処理を行うことが好ましく、 このような酸処理は、 例えば、 酢酸 等を水に濃度が 80 %となるように溶解した水溶液、 p H l . 5 ~ 2. 5 (好ましくは p H 2. 0) の水溶液 (例えば、 塩酸水溶液—ジォキサ ン混合溶液) 等を用いて行うことができる。 当該溶液を用いた処理温度 は通常 0〜50°C、 好ましくは 20〜30°Cであり、 処理時間は通常 1 0〜 1 20分、 好ましくは 20〜 40分である。
リポヌクレオチド誘導体 ( 1— 1) において、 Bで表される核酸塩基 又はその誘導体が保護基としてジメ トキシトリチル基、 モノメ トキシト リチル基等のトリチル基を有する場合、 当該保護基は、 リポヌクレオチ ド誘導体 ( I一 1 ) の酸処理により、 R13で表される 5 ' 水酸基の保護 基とともに除去される。
(3) 第 3の製造方法
リポヌクレオチド誘導体 ( 1— 2) は、 リ ヌ レオチド誘導体 (Π 一 2) を、 無水溶媒中、 シリル化剤存在下で塩基処理した後、 中性条件 又は酸性条件下で加水分解し、 2, 水酸基の保護基を除去することによ り製造することができる。.無水溶媒中におけるシリル化剤存在下での塩 基処理は、 〔リポヌクレオチド誘導 ( 1 - 1) の製造〕 と同様に行うこ とができる。 また、.加水分解処理は、 中性条件又は酸性条件下で加水分 解処理を行う点を除き、 〔リボヌクレオチド誘導体 ( 1— 1) の製造〕 と
同様に行うことができる。
ヌクレオチド鎖の 3 '末端の 2 '水酸基又は 3 '水酸基がシリル化され ている場合、 リン酸の隣接基の関与がないので、 中性条件下における加 水分解反応は遅いと考えられる。 したがって、 この場合には酸性条件下 で加水分解することが好ましい。
リポヌクレオチド誘導体 (Π— 2 ) において、 Bで表される核酸又は その誘導体が有する保護 ¾が 2—シァノエトキシカルボニル基、 2—(p 一エトロフエ二ノレ) エトキシカノレポ-ノレ基、 2― (ベンゼンスノレホニノレ) ' エトキシカルボニル基等の ]3脱離による除去が可能な、 電子吸引基を有 するアルコキシカルボニル基である場合、 当該保護基は、 リボヌクレオ チド誘導体 (Π— 2 ) の第 3級ァミン処理又はホスファゼン塩基処理に より除去される。
( 4 ) 第 4の製造方法
リポヌクレオチド誘導体 ( 1— 2 ) は、 リボヌクレオチド誘導体 (Π 一 1 ) を、 無水溶媒中、 シリル化剤存在下で塩基処理した後、 酸性条件 下で加水分解し、 2 ' 水酸基の保護基及び R 1 aで表される 5, 水酸基の 保護基を除去することにより製造することができる。 無水溶媒中におけ るシリル化剤存在下での塩基処理は、 _〔リポヌクレオチド誘導体( I一 1 ) の製造〕 .と同様に行うことがで る。 また、 加水分解処理は、 酸性条件 下で加水分解処理を行う点を除き、 〔リポヌクレオチド誘導体 ( I一 1 ) の製造〕 と同様に行うことができる。
リボヌクレオチド誘導体 (Π— 1 ) において、 Bで表される核酸又は その誘導体が有する保護基が 2—シァノエトキシカルボエル基、 2—(p 一-トロフエ-ノレ) ェトキシカノレポ二ノレ基、 2 ― (ベンゼンスノレホニノレ) ェトキシカルボニル基等の 脱離による除去が可能な、 電子吸引基を有 するアルコキシカルボニル基である場合、 当該保護基は、 ヌクレオチド
誘導体 (Π— 1) の第 3級ァミン処理又はホスファゼン塩基処理により 除去される。
(5) 第 5の製造方法
リボヌクレオチド誘導体 ( 1 - 2) は、 リポヌクレオチド誘導体 (m 一 2) を、 無水溶媒中、 シリル化剤存在下で塩基処理した後、 中性条件 又は酸性条件下で加水分解し、 R 6で表されるリン酸保護基及び 2 ' 水 酸基の保護基を除去することにより製造することができる。 無水溶媒中 におけるシリル化剤存在下での塩基処理は、 〔リポヌクレオチド誘導体 ( 1 - 1) の製造〕 と同様に行うことができる。 また、 加水分解処理は、 中性条件又は酸性条件下で加水分解処理を行う点を除き、〔リポヌクレオ チド誘導体 ( 1— 1) の製造〕 と同様に行うことができる。
リポヌクレオチド誘導体 (ΠΙ— 2) において、 Bで表される核酸又は その誘導体が有する保護基が 2—シァノエトキシカルボ-ル基、 2—(p —ニトロフエニル) エトキシカルポュル基、 2 - (ベンゼンス レホニノレ) ェトキシカルボ-ル基等の 3脱離による除去が可能な、 電子吸^基を有 するアルコキシカルポニル基である場合、 当該保護基は、 リポヌクレオ チド誘導体 (ΠΙ— 2) の第 3級ァミン処理又はホスファゼン塩基により 除 される。 .
(6) 第 6の製造方法 .
リポヌクレオチド誘導体 ( I一 2), は、 リボヌクレオチド誘導体 (m
- 1) を、 無水溶媒中、 シリル化剤存在下で塩基処理した後、 酸性条件 下で加水分解し、 Rl aで表される 5 ' 水酸基の保護基、 R6で表される リン酸保護基及び 2 ' 水酸基の保護基を除去することにより製造するこ とができる。無水溶媒中における リル化剤 在下での塩基処理は、〔リ ポヌクレオチド誘導体 ( 1— 1) の製造〕 と同様に行うことができる。 また、加水分解処理は、 酸性,条件下で加水分解処理を行う点を除き、 〔リ
ポヌクレオチド誘導体 ( 1 — 1) の製造〕 と同様に行うことができる。 リポヌクレオチド誘導体 (ΠΙ— 1)'において、 Bで表される核酸又は その誘導体が有する保護基が 2—シァノエトキシカルボ二ル基、 2—(p 一二トロフエニル) ェ トキシカノレポ-ノレ基、 2一 (ベンゼンスノレホニノレ) ェトキシカルポ-ル基等の ] 3脱離による除去が可能な、 電子吸引基を有 するアルコキシカルボニル基である場合、 当該保護基は、 リポヌクレオ チド誘導体 (ΙΠ_ 1 ) の 3級ァミン処理又.はホスファゼン塩基処理に より除去される。
リボヌクレオチド誘導体 ( 1— 1) 及び ( 1— 2) の製造にあたり、 核酸塩基又はその誘導体の保護基、 R6で表されるリン酸保護基及び 2 ' 水酸基の保護基が除去されたヌクレオチド鎖が塩基性条件下に置かれる と、 ヌクレオチド鎖が分解してしまう。 核酸塩基又はその誘導体の保護 基、 ヌクレオチド鎖の 3 ' 末端の 2'一水酸基又は 3 ' 水酸基の保護基及 び R6で表されるリン酸保護基の除去が塩基処理により行われる場合、 核酸塩基又はその誘導体の保護基、 ヌクレオチド鎖の 3 ' 末端の 2 ' 水 酸基又は 3 ' 水酸基の保護基及ぴ R 6で表されるリン酸保護基の除去を 2 ' 水酸基の保護基の除去よりも後に行うと、 核酸塩基又はその誘導体 の保護基、 R6で表されるリン酸保護基及び 2 ' 水酸基の保護基が除去 されたヌクレオチド鎖が塩基性条件下に置かれることになり、 ヌクレオ チド が分解してしまう.。 したがって、 核酸塩基又はそ.の誘導体の保護 基、 ヌクレオチド鎖の 3 ' 末端の 2 ' 水酸基又は 3 ' 水酸基の保護基及 び R6で表されるリン酸保護基の除去が塩基処理により行われる場合、 当該塩基処理は、 2 ' 水酸基の保護基の除去 J りも前に行うことが好ま しい。 上記の製造方法によれば、 核酸塩基又はその誘導体の保護基、 ヌ クレオチド鎖の 3, 末端の 2, 水酸基又は 3 ' 水酸基の保護基及び R 6 で表されるリン酸保護基の除去を、 2 ' 水酸基の保護基の除去よりも前
に行うことができるので、 ヌクレオチド鎖は分解されず、 リポヌクレオ チド誘導体( I 一 1)及び( I一 2).を効率よく製造することができる。
R6で表されるリン酸保護基及ぴ 2 ' 水酸基の保護基は、 Rl aで表さ れる 5 ' 水酸基の保護基の除去条件 (酸性条件) 下では安定して存在す ることができる。 したがって、 リボヌクレオチド誘導体 ( 1 — 1 ) 及び ( 1 - 2) の製造にあたり、 Rl aで表される 5 ' 水酸基の保護基の除去 を行う時点は特に限定されるものではなく、 核酸塩基又はその誘導体の 保護基、 ヌクレオチド鎖の 3 ' 末端の 2 ' 水酸基又は 3 ' 水酸基の保護 基、 R6で表されるリン酸保護基及び 2 ' 水酸基の保護基の除去を行う 前であってもよいし、 これらの除去を行った後であってもよいし、 これ らの除去を行う間であってもよいが、核酸塩基又はその誘導体の保護基、 ヌクレオチド鎖の 3 ' 末端の 2 ' 水酸基又は 3 ' 水酸基の保護基及ぴ R 6で表されるリン酸保護基の除去を行う前であることが好ましい。 R1 a で表される 5'水酸基の保護基の除去により脱保護された 5 '水酸基がリ ン酸エステル結合を攻撃し、 ヌクレオチド鎖が切断されることを防止す るためである。 ..
リボヌクレオチド又はリポヌクレオチド誘導体の精製は、 C 8〜C 1 8の逆相カラムク口マトグ フィー、 C 8〜C 1 8逆相カートリ ッジカ ラム、 陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、 陰イオン交換カラムク ロマトグラフィ一等の方法を単独で用いることにより、 又は高速液体ク ロマトグラフィー装置と組み合わせて用いることにより行うことができ る。 , , ,
. 以下、 実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。
〔実施例 1〕 2'- 0- [1- (2-シァノエトキシ)ェチル ]]-3', 5, -0- (1, 1, 3, 3 - テトライソプロピルジシロキサン- 1 , 3 -ジィル)ゥリジン(2)の合成 本実施例の合成工程を図 1に示す。
45mlの 1,4-ジォキサンに溶解させた 3,,5'- 0_(1, 1, 3, 3-テトライソプ 口ピルジシロキサン- 1, 3-ジィル)ゥリジン(1) (1.41g, 3mmol)に対し、ビ エルォキシプロパン二トリル(9.92g, 30mmol)、 p-トルエンスルホン酸- 水和物(630mg, 3.3mmol)を加え撹拌した。反応は 10分で完結し、過剰量 のピリジンを加え反応を終了させた。 反応系を濃縮後ジクロロメタンで 希釈し有機層を飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液で洗浄した。 有機層を分 離後、 無水硫酸ナトリウムで乾燥、 シリカゲルカラム (塩化メチレン、 メタノール) にて精製した。 目的物(2) (1.60g, 2.8mmol)は 2種類のジァ ステレオマーの混合物であり、 収率 94°/。で得られた。 なお、 核酸塩基と して、 ゥリジンの代わりにァセチル化アデニン、 ァセチル化シトシン、 ァセチル化グァニンを用いた場合の収率は、 それぞれ 96°/。、 97°/。、 65%で あった。
XH NMR (CDC13) 58.84 (1H, br. s, H- N(3)); 7.92 (1H, d, H- C(6)) ; 5.72 (1H, d, H - C(5)) ; 5.67(1H, d, H-C(l')); 5.13 (1H, m, MeCH(O) 2) ; 4.30-3.71 (7H, m, C¾CH20, H— C(2'), H - C(3,), H— C(4,), H-C(5,);
2.65 (2H, m, CH2CH20); 1.44 (3H, d, MeCH (0)2) ;- 1.10 - 0.86 (28H, m, 4
Me2CH)。
〔実施例 2〕 2, -0- [ 1_ (2-シァノエトキシ)ェチル]] -5, -0- (4, 4, -ジメ トキ シトリチル) -ゥリジン(4)の合成
本実施例の合成工程を図 1に示す。
2,- 0 - [1 -(2 -シァノエトキシ)ェチル ]]- 3,, 5' - 0- (1, 1, 3, 3-テトライソ プロピルジシロキサン- 1, 3-ジィル)ゥリジン(2) (568mg, lmmol)を 5ml のテトラヒ ドロフランに溶解させ、そこへ 1Mテトラプチルアンモニゥム フルオリ ド及ぴ 1.2M酢酸のテ トラヒ ドロフラン溶液を 5ml加えて 17時 間室温で反応を行った。 反応溶液を減圧濃縮レたオイル状の残渣を少量 の塩化メチレンに溶解させ、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー (塩
化メチレン、 メタノール) によって精製し副生したテトラプチルアンモ ニゥム酢酸塩を取り除いた。溶出してきた 2'- 0- [1-(2-シァノエトキシ) ェチル]ゥリジン(3)を濃縮した後、 ピリジンによって共沸乾燥し、 さら に 15mlのピリジンを加えた。 そこへ、 4, 4' -0-ジメ トキシトリチルクロ リ ド(367rag, 1. lramol)を加え、 反応を開始した。 8 時間室温で反応させ た溶液に水を加え反応を終了した。 反応後の溶液を減圧濃縮し、 ジクロ 口メタンに溶解させた。 有機層を飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液で 2回 洗浄後、 無水硫酸ナトリゥムで乾燥した。 硫酸ナトリ ゥムを濾過して取 り除き、 ろ液を減圧濃縮した。 さらにシリカゲルカラムクロマトグラフ ィー(1%ピリジン、 塩化メチレン、 メタノール)によって精製を行い、 目 的の 2, - 0-[1 -(2 -シァノェトキシ)ェチル] - 5' -0- (4, 4, -ジメ トキシトリ チル) -ゥリジン(4) (543mg, 0.85mmol)を 2種類のジァステレオマーの混 合物として収率 85%で得た。 なお、 核酸塩基として、 ゥリジンの代わり にァセチル化アデニン、 ァセチル化シトシン、 ァセチル化グァニンを用 いた場合の収率は、 それぞれ 96°/。、 90°/。、 93%であった。
¾ NMR (CDC13) δ 8.63 (1Η, br. s, H_N(3)); 8.00 (1H, d, H— C(6)); 7.40-6.83 (13H, m, DMTr ) 5.96 (1H, d, H - C(l,)); 5.32 - 5.27 (1H, d, H - C(5)); 5.20-5.05 (1H, m, MeCH(0)2); 4.49-4.43 (1H, m, H- C(2,)): 4.39 - 4.23(1H, m, H— C(3,) 4.07 - 4.05 (1H, m, H— C(4,)); 3.96 - 3.71(8 H, m, H - C(5,), MeO); 2.66 - 2.57 (2H, m, CH2CH20); 1.43 (3H, d, MeCH (0)2)。
〔実施例 3〕 2' -0- [1- (2 -シァノエトキシ)ェチル]] -5' -0- (4, 4' -ジメ トキ シトリチル) -ゥリジン- 3,-(2-シァノエチル- Ν,Ν-ジィソプロピルホスホ 口アミダイ ト)(5)の合成
本実施例の合成工程を図 2に示す。
2'.- 0- [卜(2-シァノエトキシ)ェチル ]]- 5,- 0 -(4,4'-ジメ トキシトリチ
ル)-ゥリジン(4) (644mg, lmmol)をピリジン及びトルエンで 3 回ずつ共 沸を行い乾燥させた。 5mlのジク口ロメタンに溶解させ 0°Cに冷却した。 そこへジィソプロピルェチルァミン及び亜リン酸化剤である 2-シァノ ェチノレ- N,N -ジィソプロピノレホスホロクロリダイ トのジクロ口メタン溶 液(447μ 1, 2mmol/5ml)を滴下した。 滴下後の反応溶液も室温に戻し、 1 時間反応を行った。 乾燥レたエタノールで反応を止め、 反応混合物をジ クロ口メタンで希釈した。 有機層をリン酸緩衝溶液(pH 7.0)で 5回洗浄 し、 有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、 さらに減圧濃縮を行った。 シ リカゲルカラムクロマトグラフィ一によつて精製を行い。 目的物(5) (69 2mg, 0.82mmol)は 4種類のジァステレオマーの混合物として収率 82%で 得られた。
NMR (CDC13) δ 8.65 (1H, br. s, H— N(3)) ; 8.04 - 7.97 (1H, m, H-C (6)); 7.40-6.80 (13H, m, DMTr) 5.96-5.93 (1H, m, H- C(l,)); 5.27—5. 06 (2H, m, MeCH(0)2, H-C (5)); 4.60-3.41 (12H, m, H-C (2' ) H-C (3 ,)) H-C (4' ) H— C(5,), MeO, CH2CH20, CH2CH20P); 2.69-2.55 (4H, m, CH 2CH20, CH2CH20P); 1.44-1.35 (3H, : m, MeCH(0) 2); 1.188-1.13 (12H, m,
(CH3)2CH); 1.04-1.00 (2H, m, (CH3) 2CH) ) ;
31P NMR (CDC13) δ 150.78, 150.22, 149.54, 148.97
〔実施例 4〕 液相法による保護されたゥリジル酸 2量体の合成
本実施例の合成工程を図 3に示す。
デシケーター中で乾燥させた 2', 3'- 0 -ビスフエノキシァセチルゥリ ジン(7) (24.4mg, 48/zmol)及び 2' -0- [1- (2-シァノエトキシ)ェチル]] - 5'-0-(4, 4' -ジメ トキシトリチル) -ゥリジン - 3,-(2-シァノエチル -Ν,Ν - ジィソプロピルホスホロァミダイ ト)(5) (47.4mg, 56 zraol)をァセ トニ トリルに溶解させ、そこへ 0.5M 1-Hテトラゾールのァセ トニトリル溶液 (H4^mol/228^ 1)を加えて室温で 3時間反応させた。 35.7μ1の反応溶
液に過酸化 t-プチルアルコールの水溶液(80r °/。)を加え 30分間撹拌した 反応液をジクロロメタンで希釈した後、 有機層を飽和炭酸水素ナトリウ ム水溶液で 2回洗浄、 硫酸ナトリウムで乾燥を行った。 硫酸ナトリウム を濾過によって取り除き、 濃縮乾燥した。 反応混合物をシリカゲルカラ ムク口マトグラフィ一(1%ピリジンを含む、ジクロロメタン、メタノ一ノレ) によって精製を行い目的の保護されたゥリジン 2量体(8) (60.5rag, 48 mol)を 4種類のジァステレオマーの混合物として定量的に得た。
NMR (CDC13) δ 9.88-9.70 (2Η, br. m, H- N(3) (up and low)); 7.85 -7.69 (2H, m, H-C (6) (up and low)); 7.38-6.78 (23H, m, DMTr, Phe 0) 606-5.91 (2H, m, H-C (5) (up and low) ) ; 5.76-5.48 (3H, m, MeCH (0)2, H-C(l' ) (up and low)); 4.60-3.41 (24H, m, H-C (2' ) H-C (3,)) H - C(4,) H-C(5') (up and low), MeO, CH2CH20, C CH20P, PheOAc) ; 2.6 9-2.55 (4H, m, CH2C¾0, CH2CH20P); 1. 2-1.25 (3H, m, MeCH(0)2); 31P MR (CDC13) δ -1.73, —1.99, —2.10, —2.13
〔実施例 5〕 ゥリジル酸 2量体の脱 護
, 本実施例の脱保護工程を図 4に示す。
保護されたゥリジン 2量体をジクロロメタンに溶解させ、 そこへジク ロロ酢酸 (最終濃度: 3%) を加え、 1 分間反応を行った。 飽和炭酸水素 ナトリゥム水溶液で 応を止め、 さらにジクロロメタン層を炭酸水素ナ トリゥム水溶液で 2回洗浄後、 有機層を無水硫酸ナトリゥムで乾燥させ た。有機層を濃縮乾固後、 25%アンモニア水とエタノールとの混合溶媒(混 合比 3 : 1) を.加え室温で 1時間撹拌を行った。 反応溶液を濃縮、 凍結乾 燥させた。そこへ、 1M テトラブチルアンモユウムフルオリ ドのテトラヒ ドロフラン溶液を加え、 室温で 2時間反応を行った。 反応溶液に酢酸ァ ンモユウム緩衝溶液を加え、 反応を終結させた。 反応混合物を水で希釈 した後、 水相をジクロロメタンで、 5 回洗浄を行った。 水相を濃縮乾燥
させ、 残渣を少量の酢酸アンモ-ゥム緩衝溶液に溶解させ逆相のシリ力 ゲルカラムクロマトグラフィーによって精製を行い、 目的のゥリジン 2 量体を得た。
〔実施例 6〕 固相法によるオリゴリポ核酸の合成
一般的なホスホロアミダイ ト法によるオリゴマーの合成法に準じて、 オリゴリポ核酸の合成を行った。 2,位又は 3,位の水酸基のうち、 一方を サクシ二ルリンカーを介して固相担体(CPG)に担持し、他方をァセチル基 で保護したゥリジン (1 /x mol) に対し、 0. 1M ゥリジンのモノマーュニ ットのァセトニトリル溶液 0. 2ml 活性化剤として 0. 5M テトラゾール のァセトニトリル溶液 0. 2mlを加え、反応時間 5分の条件で縮合させた。 さらに、 (i) ヨウ素 (2°/。)、 水 (2%)、 ピリジン (20%) のテ トラヒ ドロフ ラ.ン溶液による酸化、 (i i) 無水酢酸、 2, 6 -ルチジン ( 10%) のテトラヒ ドロフラン溶液、 及ぴトメチル- 1 - H-ィミダゾール (20%) のテトラヒ ド 口フラン溶液によるキャップ化、 (i ii) ジクロロ酢酸(3% (v/v) )のジク口 口メタン溶液による 5'水酸基の脱保護のサイクルを 9回繰り返した。平 均の縮合反応の収率は、 4, 4' -ジメ トキシトリチルカチオンによる定量に よって行い、 99. 5%であった。 28%アンモニア水とエタノール(3 : 1)の 合溶液によって、 固相担体からの切り出し、 及びリン原子上の脱保護を 行った。 目的物の溶液を凍結乾燥させ、 1M テトラブチルアンモニゥムフ ルオリ ドのテトラヒ ドロフラン溶液を加え 2,水酸基の脱保護を行った。 HPLC,によって精製を行い、 脱保護されたゥリジンの 10暈体を 95%の収 率で得ることができた。
〔実施例 7〕 2' - 0-1- (2-シァノ トキシ)ェチル基(CEE 基)の脱保護条件 及ぴ安定性の検討
2,-0- [1 -(2 -シァノエトキシ)ェチル ] ] -5' - 0 -(4, 4' -ジメ トキ ト リチ ル) -ゥリジン (4)における CEE基の脱保護,条件及び安定性を検討した。
CEE基の脱保護条件及び安定性は、 '試薬 (塩基) として、 0. 5M 1,8 -ジ ァザビシク口 [5. 4. 0] - 7-クンデセン(DBU)を含有するァセトニトリル溶 液(0. 5M DBU/MeCN) s 0. 5M 1, 8-ジァザビシク口 [5. 4. 0] - 7-ゥンデセン(D BU)及ぴ 0. 5M N, 0-ビス(トリメチルシリル)ァセトアミ ド (BSA) を含有 するァセトニトリル溶液(0. 5M DBU, 0. 5M BSA/MeCN) , 0. 5M テトラプチ ルアンモニゥムフルオリ ド(TBAF)のテトラヒ ドロフラン溶液(0. 5M TBAF /THF)、 25% 腿 3水溶液、 25% 丽3水溶液とェタノールの混合溶液(3: 1, v/ V) ( 25% 匪。水溶液 - EtOH (3 : 1, v/v) )、 2M NH3のエタノール溶液 (2M NH3 /EtOH) を用いて、 室温又は 55°Cにおける半減期 (分)' を求めることに より測定した。 なお、 反応混合物を薄層シリカゲル板(Merck F254)にキ ャビラリを用いてスポッ トし、 ジクロロメタンーメタノール(9 : 1, v/v) で展開した後、 紫外線照射下で出発物質と生成物のスポットの紫外吸収 強度を比較して、 両者が等しくなる時間を半減期とした。
結果を表 1に示す。
[表 1 ]
表 1に示すように、 CEE 基は、 リン酸ジエステルの保護基の除去、 核 酸塩基の保護基の除去、 ヌクレオチド鎖の固相担体からの切り出し等の 際に用いられる 25% 丽
3水溶液、 25% NH
3水溶液 -EtOH (3:l,v/v)、 2M NH
3/EtQHに対しては安定であるが、 0.5M DBU/MeCN, 0.5M TBAF/THFにより 容易に除去できた。 特に 0.5M TBAF/THFに り短時間に除去できた。 虔業上の利用の可能性 ' リボヌクレオチド誘導体 (Π) 又は (ΠΙ) ..における 2 ' 水酸基の保護 基は、 2 ' 水酸基へ効率よく導入できるとともに、 縮合反応において立 体障害となることがなく、 さらに、 5 ' 水酸基の保護基の除去、 リン酸 ジエステルの保護基の除 、 核酸塩基の保護基の除去、 ヌクレオチド鎖 の固相担体からの切り出し等の条件下では安定して存在するが これら の条件とは異なる条件下において短時間に除去することができるので、 リボ クレオチド誘導体.(π). 又は (m) を利用するこ.とにより リポ クレオチド誘導体 ( I ) を効率よく製造することができる。