JPH0374398A - ホスホアミダイト化合物及びそれを用いたオリゴリボヌクレオチドの固相合成法 - Google Patents

ホスホアミダイト化合物及びそれを用いたオリゴリボヌクレオチドの固相合成法

Info

Publication number
JPH0374398A
JPH0374398A JP1210706A JP21070689A JPH0374398A JP H0374398 A JPH0374398 A JP H0374398A JP 1210706 A JP1210706 A JP 1210706A JP 21070689 A JP21070689 A JP 21070689A JP H0374398 A JPH0374398 A JP H0374398A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
protecting group
hydroxyl
formula
protecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP1210706A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2794461B2 (ja
Inventor
Hiroshi Takaku
洋 高久
Osamu Sakazume
坂爪 修
Shunichi Yamakage
山影 俊一
Takashi Ogawa
隆 小川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yuki Gosei Kogyo Co Ltd
Original Assignee
Yuki Gosei Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yuki Gosei Kogyo Co Ltd filed Critical Yuki Gosei Kogyo Co Ltd
Priority to JP1210706A priority Critical patent/JP2794461B2/ja
Publication of JPH0374398A publication Critical patent/JPH0374398A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2794461B2 publication Critical patent/JP2794461B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02PCLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は2′ −水酸基を新規な保護基すなわち2−ク
ロロエトキシエチル基で保護した一般式(式中、B′は
保護基を有することもある核酸塩基残基を、R1は水酸
基の保護基を、R2はリン酸の保護基を、Xは他のりボ
ヌクレオシドまたはりボヌクレオチドの糖部の水酸基と
反応する基を表わす) で示されるホスホアミダイト化合物および該ホスホアミ
ダイト化合物を用いるホスファイト法によるオリゴリボ
ヌクレオチドの固相合成法に関する。
〔従来の技術〕
近年の遺伝子工学の進展に伴い、遺伝子工学における重
要な素材であるオリゴヌクレオチド合成についても迅速
で収率のよい化学合成技術の開発が望まれている。
従来、オリゴヌクレオチドの化学合成法としては、■ヌ
クレオシドの3′ −水酸基にリン酸化剤を反応させて
得られるホスホアミダイト化合物と、他のヌクレオチド
の5′ −水酸基とを(3′→5′)インターヌクレオ
チド結合させるホスファイト法(ホスホアミダイト法と
もいう)、。
0リン酸の解離基の一部を保護してトリエステルにし、
他のヌクレオシドの5′ −水酸基とを縮合剤の存在下
に縮合させるホスホトリエステル法(リン酸トリエステ
ル法ともいう)が知られている。そしてこれらのなかで
特にホスファイト法は反応時間が短く、反応収率も優れ
ているため、自動合成機による合成反応に最も適した方
法とされており、現在固相法による自動合成機により鎖
長100程度までのデオキシリボ核酸(DNA)のオリ
ゴヌクレオチドが合成されている。
該方法に於ては、反応に関与しない塩基部のアミノ基、
糖部の水酸基は、反応時には保護基により保護しておく
ものであるが、2′ −位が水酸基であるリボ核酸(R
NA)の場合は、2′ −水酸基も保護する必要がある
。その2′ −水酸基の保護基とし′Cはトリチル基、
メトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、ベンゾイ
ル基、アセチル基、ピバロイル基、テトラヒドロピラニ
ル基、メトキシテトラヒドロピラニル基、0−ニトロベ
ンジル基、トリメチルシリル基、t−ブチルジメチルシ
リル基、イソブチルオキシカルボニル基が知られている
〔ジャーナル オブ ジ アメリカン ケミカル ソサ
イエテイー(Journal ofthe Ameri
can Chemical 5ociety)、 84
.4329(1962)および89.3366 (19
67) 、カナデアンジャーナル オブ ケミストリイ
(CanadianJournal of Chemi
stry) 、 56.2230(1979)、ヌクレ
イツク アシッド リサーチ(Nucleic Ac1
dsResearch) 、 1.1351(1974
)はか〕。
〔発明が解決すべき問題点〕
現在ホスファイト法によるオリゴリボヌクレオチド合成
のさいに用いるホスホアミダイト化合物の2′ −水酸
基の保護基としては前記の如き数多くの保護基が提案さ
れ、最近はテトラヒドロピラニル基、メトキシテトラヒ
ドロピラニル基が多く用いられている。
しかし、これらの保護基には、精製中に脱離してしまう
ものや、2′ −位から3′ −位に転移するものがあ
り、またオリゴリボヌクレオチド合成のさい、鎖長延長
時の酸処理で一部脱離してしまうものがあるほか、オリ
ゴリボヌクレオチド合成後の脱保護のさい、2′ −水
酸基の脱離が要因となるインターヌクレオチド結合の転
移あるいは切断、または2′ −水酸基の保護基の脱保
護試薬がリン酸と反応するなどの副反応が起こるなど不
満足な点が多い。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者らは、ホスファイト法によるオリゴリボヌクレ
オチドを合成するさい、鎖長延長時に脱離することなく
、また脱保護時に副反応を起こさない2′ −水酸基の
新規な保護基を得るべく検討を重ねた結果、本発明を完
成したものである。
すなわち、本発明はホスホアミダイト化合物として、−
数式CI) (式中、B′は保護基を有することもある核酸塩基残基
を、R1は水酸基の保護基を、R2はリン酸の保護基を
、Xは他のりボヌクレオシドまたはりボヌクレオチドの
糖部の水酸基と反応する基を表わす) で示されるように2′ −水酸基の保護基として、2−
クロロエトキシエチル基を選択したことにより所期の目
的を達成したものである。
−数式[I)で示されるホスホアミダイ)・化合物の塩
基部(アデニン、グアニン、シトシン)のアミノ基は、
ベンゾイル基、イソブチリル基で代表される保護基で保
護されているが、これ以外の保護基であってもよい。
5′ −水酸基の保護基R2としては通常の水酸基の保
護基であればよく、一般にはジメトキシトリチル基、テ
トラヒドロピラニル基、ベンゾイル基、トリメチルシリ
ル基などが用いられており、特にジメトキシトリチル基
が代表的な保護基である。なお、5′ −水酸基の保護
基は2′ −水酸基の保護基よりも緩和な条件で脱保護
するものが望ましい。
3′ −リン酸の保護基R2としては一般には置換基を
有することもあるアルキル基またはアリール基が用いら
れており、シアノエチル基が代表的な保護基である。
また他のヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖部の水酸
基と反応する基Xは、一般には3 4   3 NRR(RおよびR4は同一または異る基で、低級のア
ルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル
基であり、R3とR4の両末端かへテロ原子(窒素、酸
素または硫黄)を含みまたは含まずに結合して飽和複素
環を形成する)で示される基が用いられ、通常はジ低級
アルキルアミノ基が用いられており、特にジイソプロピ
ルアミノ基が代表的な保護基である。
従来、2′ −水酸基の保護基としてはテトラヒドロピ
ラニル基やエトキシエチル基が一般に多用されているが
、オリゴリボヌクレオチド合成操作中に、これらの2′
 −水酸基保護基は5′ −水酸基の保護基として汎用
されているジメトキシトリチル基の脱保護条件である強
酸性処理で、一部脱離するおそれがある。
本発明者は5′ −水酸基保護基の脱保護条件下でも安
定であり、かつ2′ −水酸基保護基自身が従来用いら
れているテトラヒドロピラニル基と同程度の条件で脱保
護できる2′ −水酸基の保護基としてアセタール基に
着目し検討した結果、2クロロエトキシエチル基を2′
 −水酸基の保護基として選択したものである。
2−クロロエトキシエチル基は5′ −水酸基保護基で
あるジメトキシトリチル基の脱保護条件でテトラヒドロ
ピラニル基よりも安定であり、またpH2,0の酸性条
件下で容易に脱保護するものである。
本発明のホスホアミダイト化合物の製造法は、下記の反
応式(1)および反応式(2)にその1例を示すように (以下余白)  0 OehZ 1) 1) 0 じ 1 (反応式中、B′は保護基を有することもある核酸塩基
残基、Etはエチル、iPrはイソプロピル、D M 
T rはジメトキシトリチルである)塩基部が保護され
ていることもあるリボヌクレオシド■例えばN6−ベン
ゾイルアデノシン、N2−イソブチリルグアノシン、N
4−イソブチリルシチジンまたはウリジンに、無水ピリ
ジン(反応式中、pyと省略)中で1,3−ジクロロ−
工、1、3,3−テトライソプロピルジシロキサン(反
応式中、TIPDSiC,Qと省略)を反応させて、3
′ −および5′ −水酸基を保護したりボヌクレオシ
ド■とした後、3′、5°−ジシリル体のりボヌクレオ
シド■を塩化メチレン中で、p−トルエンスルホン酸(
反応式中、TsOHと省略)またはピリジニウム−p−
トルエンスルホネート(反応式中、PPTsと省略)な
どの酸触媒の存在下に、2−クロロエチルビニルエーテ
ル■を反応させて、2′ −水酸基も保護したりボヌク
レオシド■とする。次いでこのリボヌクレオシド■にI
M−)リエチルアンモニウムハイドロゲンフルオライド
2 (反応式中、IM−TEAHFと省略)を作用させて脱
シリル化を行い2′ −水酸基を2−クロロエトキシエ
チル基で保護したりボヌクレオシド■とし、これにピリ
ジン中でジメトキシトリチルクロライド(反応式中、D
MTr(、Qと省略)を反応させて、5′ −水酸基も
ジメトキシトリチル基で保護したりボヌクレオシド■と
する。さらに、この5′ −〇−(ジメトキシトリチル
)−2′o−(2−クロロエトキシエチル)ヌクレオシ
ド■にアミダイト化剤■をテトラヒドロフラン(反応式
中、THFと省略)中でトリエチルアミン(反応式中、
Et3Nと省略)の存在下に反応させ、ホスホアミダイ
ト化合物■を得る。この反応で用いるアミダイト化剤■
としてはクロロ−2=シアノエトキシ=N、N −ジイ
ソプロピルアミノホスファンが代表的なものであり、リ
ボヌクレオシド■とアミダイト化剤■との反応はヌクレ
イツクアシッド リサーチ(Nuclelc Ac1d
s Re5earch) 。
12、4539 (1984)記載の方法により可能で
ある。
又、本発明は前記の方法によって得られたホス4 ホアミダイト化合物を用いたホスファイト法によるオリ
ゴリボヌクレオチドの固相合成法に関するものである。
オリゴリボヌクレオチドの固相合成法は、下記の反応式
(3)および反応式(4)にその1例を示すように (以下余白) 5 反 R′ ■ ■ (反応式中、B′は保護基を有することもある核酸塩基
残基、Etはエチル、DMTrはジメトキシトリチルで
ある) 2′ −水酸基を2−クロロエトキシエチル基で、5′
 −水酸基をジメトキシトリチル基で保護したりボヌク
レオシド■と無水コハク酸■とを、ジメチルシアノピリ
ジン(反応式中、DMAPと省略)の存在下に、例えば
塩化メチレン中で反応させ、得られたりボヌクレオシド
[株]をジシクロへキシルカルボジイミド(反応式中、
DCCと省略)を用い、シラノール水酸基がアミノプロ
ピル化されたコントロールポアドグラス(反応式中、C
PGと省略)0に直接導入してCPG−リボヌクレオシ
ド縮合物0を得る。この反応はヌクレオチド アンド 
ヌクレオシド(Nucleotides &Nucle
osides)、 5.363 (1986)記載の方
法により可能である。
(以下余白) 7 /CH2CH3 H2°\ −O /CH2CH3 C 2\ −O 値 ホ 十 @ (反応式中、B′は保護基を有することもある核酸塩基
残基、Bは核酸塩基残基、Etはエチル、iPrはイソ
プロピル、DMTrはジメトキシトリチル、nは0また
は任意の正の整数である)次にCPG−リボヌクレオシ
ド縮合物0を1.5%ジクロロ酢酸(反応式中、DCA
と省略)塩化メチレン溶液で処理することにより、5′
水酸基の保護基であるジメトキシトリチル基を除去して
Oとした後、反応式(2)で得たホスホアミダイト化合
物■と5′ −水酸基フリーのCPGリボヌクレオシド
縮合物Oとを、縮合剤例えばIH−テトラゾールの存在
下にアセトニトリル溶媒中で縮合させ、次いで0.1M
ヨウ素−テトラヒドロフラン−ピリジン−水溶液で酸化
させてジリボヌクレオチドOとする。以後、この5′ 
−水酸基保護基の除去、ホスホアミダイト化合物■との
縮合、ヨウ素による酸化という操作を繰り返すことによ
り、所望する塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチド
tm得ることができる。次いでアルカリ性条件下に処理
することで固定相CPGより= 19 − 分離したオリゴリボヌクレオチドOとした後、常法によ
る脱保護処理、例えば濃アンモニア水処理による塩基部
保護基であるベンゾイル基、インブチリル基およびリン
酸部保護基のシアノエチル基の除去、次いで0.01N
塩酸処理により5′水酸基保護基であるジメトキシトリ
チル基および2′ −水酸基保護基である2−クロロエ
トキシエチル基を除去し、精製することにより目的とす
るオリゴリボヌクレオチド0を得るものである。
なお、これら反応式におけるリボヌクレオシドまたはり
ボヌクレオチドの保護基として、塩基部はベンゾイル基
またはイソブチリル基、リン酸部はシアノエチル基、5
′ −水酸基はジメトキシトリチル基を例示したが、こ
のほか周知の核酸合成に用いられている通常の保護基で
あっても差し支えない。
また、本発明のホスホアミダイト化合物を用いたホスフ
ァイト法によるオリゴリボヌクレオチドの固相合成は、
前記反応式(3)および反応式(4)の如くホスホアミ
ダイト化合物を順次縮合させるつn 1 手法のほか、あらかじめホスホアミダイ1〜化合物を用
いて合成したジリボヌクレオチドやトリリボヌクレオチ
ドなどのリボヌクレオヂドブロックを用いて縮合させる
ことも可能である。
〔実 施 例〕
以下、実施例d3よび実験例に一:り本発明を説明する
実験例 1 ウリジンに1,3−ジクロロ−1,1,3,3−テ1〜
ライソプロビルジシロキ4ノンを反応させて得られた3
、5−0−(テ1〜ライソプロピルオキυジシリル)ウ
リジン7.8241y (17,065mM)を無水ジ
クロロメタン85dに溶解し、水冷下に酸触媒ピリジニ
ウム−D −1−ル工ンスルボネー1へ2.99(+9
7(11,9mM)と2−クロ[」エチルビニルエーテ
ル17.3Inf!(170,6…ト1)を加えた後、
室温で1時間反応さlて、2′ −水酸基をクロ1]工
1〜ギシ1−デル化づる。反応の終了は薄層りIZJ7
1−グラノィーで確認する。反応終了後、水冷下に1〜
リ工ヂルアミン5mf!を加え、水洗ののち力((水硫
酸す1〜1戸ンムでイ42 機層を乾燥し、減圧で濃縮する。残渣にIM−トリエチ
ルアンモニウムハイドロゲンフルオライドーアセトニト
リル溶液40m1を加え、室温で1時間反応して脱シリ
ルした後、飽和炭酸ナトリウム水溶液で水解し、減圧濃
縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、
2′−〇(2−クロロエトキシエチル)ウリジン5.0
264g(L4.3tmM)を得た。収率84%。
元素分析 理論値(%)  : C44,50SH5,46、N7
.99実測値(%)  : C44,22、H5,77
、N7.64紫外吸収(nm) δ: 7.90(IH,ddJ5,6−9Hz、H−8
)5.72(IH,dJlo、2°−6Hz 、 H−
1’ )5.59(IH,dJ5,6−9H2,H−5
)5.35〜4.35 (3H,m、0H−3°、0H
−5’。
0−CH−0−) 3 4.29〜2.50(911,m、 +1−2“、 l
−1−3′、 H−4’ 、 t15ト5″、 −C九
−X2> 1.23〜0.86(3N、m、CH3〉(DMSO−
d6−CD30D−TMS)δ :  7.60(lt
l、ddJ5,6=911z、ロー6)5、55 (1
M、 dJl °、 2 ’ =611z、 1l−1
°〉5.38(IN、 dJ5.6=9tlz、 H−
5)4.71〜4.25(1ト1.m、−0−CM −
〇 −>4.01〜3.01 (9N、 m、 It−
2’ 、 ll−3’ 、 H−4°、115N−5″
、 −C町−X2> 0.96〜0.75(3H,m、  Cf−13>薄層
クロマ1〜グラフイ R(=0.25  (C1hC,Q2 : MeOH=
9:1(v/V))実験例 2 実験例1のウリジンの代わりにN4−イソブヂリルシヂ
ジンを、酸触媒として1)−1〜ルエンスルホン酸O1
5当量を用いたほかは、実験例1と同様の条イ1で1時
間反応させて、2′ −水酸基のクロロエトキシ」−デ
ル化を行った。反応終了後、実4 験例1と同様の後処理を行い、収率67%で2′0−(
2’−クロロエトキシエチル)−N4(イソブチリル)
シチジンを得た。
紫外吸収(nm) δ: 9.50(LH,brs、 −N H1bu)7
.60(LH,ddJ5.8−8Hz、H−6)7.0
8(王H,dJ5,8−8Hz、H−5)5.50(l
H,dJlo、2°−6Hz 、 H−1’ )4.8
0(LH,m、 −0−CH−0−)4.10〜2.7
0(9H,m、H−2°、H−3’ 、H−4’、H−
5’ 。
H−5” 、−CH2−X2 2.55〜1.70(LH,m、 −CH−)1.70
〜0.52(9H,m、  CHs X 3 )薄層ク
ロマトグラフィー Rf=0.28 (CH2C(12: Me OH−9
: 1 (v/v)) 実験例 3 実験例1のウリジンの代わりにN6−ペンシイ5 ルアデノシンを、酸触媒としてp−)ルエンスルホン酸
0.5当量を用いたほかは、実験例1と同様の条件で1
時間反応させて、2′ −水酸基のクロロエトキシエチ
ル化を行った。反応終了後、実験例1と同様の後処理を
行い、収率83%で2’−o−(2〜クロロエトキシエ
チル)N6− (ベンゾイル)アデノシンを得た。
紫外吸収(nm) Meoll     He’ll λ   280、λ   263 axmin 1H−核磁気共鳴吸収(DMSO−d6−D20)δ:
 9.42(2H,s、H−8,H−2)8.90〜7
.60(5H,m、Ar−H)6.90(LH,cll
l’、2’−8Hz、J(−1’)6.29(IH,s
、 −0−CH−0−)5.80〜3.90(9H,m
、H−2′、H−3°、H−4°、+1−5’。
11−5°’ 、−CH2−X2) 1.89(3H,d、 −CH3) 薄層クロマトグラフィ Rf=0.33 (CH2Cρ2 : M e OH=
 9 : 1 (v/v)) 6 実験例 4 実験例1のウリジンの代わりにN2−イソブチリルグア
ノシンを、酸触媒としてピリジニウムニル−トルエンス
ルホネート3.0当量を用いたほかは、実験例1と同様
の条件で72時間反応させて、2′ −水酸基のクロロ
エトキシエチル化を行った。反応終了後、実験例1と同
様の後処理を行い、収率70%で2′ −〇−(2−ク
ロロエトキシエチル)−N−(イソブチリル)グアノシ
ンを得た。
紫外吸収(nm) MeOHMeOH λ   280.259.255、λ 、  270.
230maX                   
[111nlH−核磁気共鳴吸収(DMSO−d6−D
20)δ: 8 、20 (IH、s 、 H−8)5
.90(ill、dJlo、 2 ’ −611z 、
 It−1’ )5.25〜2.6(ill(、m、 
−0−CH−0−H−2°、H−3°、 H−4’ 、
 H−5’ 、 H−5”CH2−X2.−CH−) 1.40〜1.01(9H,m、  CH3)7 薄層クロマトグラフィー Rf=0.3(CH2C,Q 2:MeOH−9: 1
 (v/v)) 実施例 1 実験例1で合成した2′ −水酸基保護基が2クロロエ
トキシエチル基(第1表ではCEEと省略)である2’
−o−(2−クロロエトキシエチル)ウリジンおよび2
′ −水酸基保護基がブトキシエチル基(第1表ではB
Eと省略)、イソプロポキシエチル基(第1表ではIP
Eと省略)、エトキシエチル基(第1表ではEEと省略
)、テトラヒドロピラニル基(第1表ではTHPと省略
)であるウリジンを用い、1.5%ジクロロ酢酸および
0.01N塩酸で処理した時の各2′ −水酸基保護基
の脱離する時間を測定した。脱離時間は使用した各2′
 −水酸基保護基の50%および99%が脱離した時間
とした。結果は第1表に示すように2−クロロエトキシ
エチル基がきわめて良好な安定性を示した。
第   1   表 実施例 2 実験例3で得た2’−o−(2−クロロエトキ− ジエチル)−N  (ベンゾイル)アデノシンを常法に
従いピリジン中でジメトキシトリチルクロライドと反応
させる。得られた5′ −0−(ジメトキシトリチル)
−2’  −o−(2−クロロエト− キシエチル)−N   (ベンゾイル)アデノシン1.
5801g (1,97mM)に無水テトラヒトC77
ランを加え、減圧濃縮することで完全に無水にした後、
無水テトラヒドロフラン14m1に溶解し、ジイソプロ
ピルエチルアミンの共存下に、窒素雰囲気下、クロロ−
2−シアノエトキシ−N、N −ジイソプロピルアミノ
ホスファン0゜84m1 (4mM)を加え、室8 温で1時間反応させる。反応の終了を薄層クロマトグラ
フィーで確認後、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗
浄する。有機層を無水硫酸す) IJウムで乾燥後、減
圧濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製
する。精製物を少量の塩化メチレンに溶解し、−60°
Cで石油エーテルで再沈殿し、減圧乾燥を行うことによ
り、5′o−(ジメトキシトリチル)−2′ −〇−(
2クロロエトキシエチル)−N6−(ベンゾイル)アデ
ノシン−3’−o−(2−シアノエチル)N、N −ジ
イソプロピルホスホアミダイト1.4943g(1,5
2mM)を得た。収率77%。
31P−核磁気共鳴吸収(CDC,Q 3゜85%H3
P04) δ : 15L83.15L、29.151.04.1
50.67薄層クロマトグラフィー Rf=0.76 (C)I2C設2: EtOAc :
E t 3N =45:45:10(v/v/v))実
施例 3 実験例1で得た2’  −o−(2−クロロエトキシエ
チル)ウリジンを用い、実施例2と同様の反応を行い、
5’−o−(ジメトキシトリチル)2’−o−(2−ク
ロロエトキシエチル)ウリジン−3’−o−(2−シア
ノエチル)−N、Nジイソプロピルホスホアミダイトを
収率75%で得た。
31P−核磁気共鳴吸収(CDC!Q 3゜85%H3
P04) δ: 151.22.151.10.150.52薄層
クロマトグラフィ Rf=0.84 (CH2C,Q 2: E t OA
c :E t 3N =45:45:10(V/V/V
))実施例 4 実験例2で得た2’−o−(2−クロロエトキ− ジエチル)−N  (イソブチリル)シチジンを用い、
実施例2と同様の反応を行い、5’−o−(ジメトキシ
トリチル)−2’  −o−(2−り− ロロエトキシエチル)−N  (イソブチリル)シチジ
ン−3’−o−(2−シアノエチル)N、N −ジイソ
プロピルホスホアミダイトを収率820 %で得た。
31P−核磁気共鳴吸収(CDCQ3゜85%HPO4
) δ: 151.68.151.25、L50.92.1
50.14薄層クロマトグラフィー R=0.58(CHC,Q   :EtOAc:f  
      22 E t 3N =45:45:10(V/V/V))実
施例 5 実験例4で得た2′ −〇−(2−クロロエトキシエチ
ル)−N2−(イソブチリル)グアノシンを用い、実施
例2と同様の反応を行い、5′0− (ジメトキシトリ
チル)−2’  −0−(2クロロエトキシエチル)−
N2〜 (イソブチリル)グアノシン−3’  −o−
(2−シアノエチル)N、N −ジイソプロピルホスホ
アミダイトを収率83%で得た。
3LP=核磁気共鳴吸収(CDC挑3゜85%H3P0
4) δ: 151.62.150.89、]、50.52.
150.221 薄層クロマトグラフィー R=0.43(CHC,Q   :EtOAc:f  
      22 E t 3N =45:45:10(V/V/V))実
施例 6 実験例2で得た2’−o−(2−クロロエトキ− ジエチル)−N  (イソブチリル)シチジンの5′ 
−水酸基をジメトキシトリチル化した後、塩化メチレン
中でジメチルシアノピリジンの存在下に無水コハク酸と
反応させ、さらにシラノール水酸基がアミノプロピル化
された固定化担体CPGと縮合させる。
次いで、第2表記載の操作手順に従い、この5’−o−
(ジメトキシトリチル)−2’  −o−一 (2−クロロエトキシエチル)−N  (イソブチリル
)シチジンと縮合したCPG (5μM)を、15%ジ
クロロ酢酸−塩化メチレン溶液で2分間処理することに
より5′ −水酸基の保護基であるジメトキシトリチル
基を除去しくステップ1)、塩化メチレンによる洗浄(
ステップ2)、アセ)・ニトリルによる洗浄(ステップ
3)ののち、真空2 3 乾燥により乾燥する(ステップ4)。次に、実施例2〜
5で得たりボタクレオチドホスホアミダイト0.4ml
 (200μM)を、縮合剤IH−テトラシル0.6m
l (400μM)の存在下に200分間反応せる(ス
テップ5)。綜合反応終了後アセトニトリルで洗浄(ス
テップ6)し、次いで0,1Mヨウ素を含むテトラヒド
ロフラン−ピリジン−水(44:3:3 (v/v/v
))溶液3mlを加えて2分間放置(ステップ7)した
後、アセトニトリルで洗浄(ステップ8)する。次に0
.1M4−ジメチルアミノピリジンを含むテトラヒドロ
フラン−無水酢酸(9:1 (v/v))溶液2mlを
加え1分間反応させた(ステップ9)後、塩化メチレン
で洗浄(ステップ王0)するという一連の操作を目的と
する鎖長まで繰り返すことで、塩基部、リン酸部、2′
 −水酸基、末端ヌクレオチドの5′ −水酸基を保護
基で保護したテトラヒメナr−RNAのbox9R部位
(塩基配列5UGUCGGUC’ )を合成した。第3
表に各縮合毎の収率および通算収率を示すが、いずれも
きわめて良好である。
第 3 表 (第3表において、C,GおよびUはオリゴリボヌクレ
オチドを形成する単位リボヌクレオチドを、その塩基残
基により表示したもので、塩基残基がCはシトシン、G
はグアニン、Uはウラシルである。また、HOは鎖端ヌ
クレオチドの末端5′ −水酸基であることを、D M
 T rは末端5′ −水酸基がジメトキシトリチル基
により保護されていることを示す。■−は固定化担体6 である。) 次に、反応容器内に濃アンモニア水を注入し、1時間放
置した後、反応容器内のアンモニア水を別の容器に移し
、58℃で8時間処理して、オリゴリボヌクレオチドと
固定相担体との分離、塩基部の保護基であるベンゾイル
基、イソブチリル基およびリン酸部の保護基であるシア
ノエチル基を除去する。次いで減圧濃縮し、残渣に0.
01N塩酸を加え、pH2に調整後、室温で36時間処
理して、2′ −水酸基の保護基である2−クロロエト
キシエチル基および鎖端リボヌクレオチドの5′水酸基
の保護基であるジメトキシメチル基を除去する。その後
、希アンモニア水で中和し、減圧濃縮後、高速液体クロ
マトグラフィー(カラム:Tskgel oligo 
−D N A  RP 、溶離液ニアセトニトリル(0
〜25%、25分)、流速:  1.0m17分)で精
製して全ての保護基を除去した高純度のテトラヒメナr
−RNAのbox9R部位(塩基配列7 実施例 7 実施例6と同様の操作手順を繰り返し、第4表記載の如
き収率で、保護基を有するテトラヒメナr−RNAのb
ox9R’部位(塩基配列5GACCGUCA” )を
得た。次いで実施例6と同様の脱保護処理および精製処
理を行い、全ての保護基を除去した高純度のテトラヒメ
ナr−RNAのbox9R’部位(塩基配列 GACC
GUCA3)660、D、 unitを得た。
第   4   表 (第4表において、C,G、UおよびAはオリゴリボヌ
クレオチドを形成する単位リボヌクレオチドを、その塩
基残基により表示したもので、塩基残基がAはアデニン
、C,GおよびUは第3表と同一である。また、HO、
D M T rおよび■−は第3表と同一の意味を表わ
す。) 〔発明の効果〕 ホスファイト法によるオリゴリボヌクレオチドを固相合
成するさい、2′ −水酸基を2−クロロエトキシエチ
ル基で保護したホスホアミダイト化合物を用いることに
より、鎖長延長時の5′水酸基保護基の除去条件である
酸処理においても2′ −水酸基保護基の脱離がなく、
またこの2′ −水酸基保護基の脱離に伴う縮合時また
はオリゴリボヌクレオチド合成後の脱保護時の副反応を
防止し得るものである。また2−クロロエトキシエチル
基の脱保護も従来のアセタールタイプの保護基と同条件
で完全に脱保護することができるので、高収率で高純度
のオリゴリボヌクレオチドの合成を可能とするものであ
る。
8 9

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、2′−水酸基の保護基が2−クロロエトキシエチル
    基であることを特徴とする一般式〔 I 〕▲数式、化学
    式、表等があります▼〔 I 〕 (式中、B′は保護基を有することもある核酸塩基残基
    を、R^1は水酸基の保護基を、R^2はリン酸の保護
    基を、Xは他のリボヌクレオシドまたはリボヌクレオチ
    ドの糖部の水酸基と反応する基を表わす) で示されるホスホアミダイト化合物。 2、ホスファイト法によるオリゴリボヌクレオチドの固
    相合成法において、ホスホアミダイト化合物として、一
    般式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 (式中、B′は保護基を有することもある核酸塩基残基
    を、R^1は水酸基の保護基を、R^2はリン酸の保護
    基を、Xは他のリボヌクレオシドまたはリボヌクレオチ
    ドの糖部の水酸基と反応する基を表わす) で示される2′−水酸基の保護基が2−クロロエトキシ
    エチル基であるホスホアミダイト化合物を用いることを
    特徴とするオリゴリボヌクレオチドの固相合成法。
JP1210706A 1989-08-17 1989-08-17 ホスホアミダイト化合物及びそれを用いたオリゴリボヌクレオチドの固相合成法 Expired - Lifetime JP2794461B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP1210706A JP2794461B2 (ja) 1989-08-17 1989-08-17 ホスホアミダイト化合物及びそれを用いたオリゴリボヌクレオチドの固相合成法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP1210706A JP2794461B2 (ja) 1989-08-17 1989-08-17 ホスホアミダイト化合物及びそれを用いたオリゴリボヌクレオチドの固相合成法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0374398A true JPH0374398A (ja) 1991-03-28
JP2794461B2 JP2794461B2 (ja) 1998-09-03

Family

ID=16593752

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1210706A Expired - Lifetime JP2794461B2 (ja) 1989-08-17 1989-08-17 ホスホアミダイト化合物及びそれを用いたオリゴリボヌクレオチドの固相合成法

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2794461B2 (ja)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2682112A1 (fr) * 1991-10-08 1993-04-09 Commissariat Energie Atomique Procede de synthese d'acide ribonucleique (arn) utilisant un nouveau reactif de deprotection.
EP0661291A1 (de) * 1993-12-17 1995-07-05 Hoechst Aktiengesellschaft Festphasensynthese von Oligoribonucleotiden
WO2005023828A1 (ja) * 2003-09-02 2005-03-17 Takeshi Wada リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体の製造方法
WO2006022323A1 (ja) 2004-08-26 2006-03-02 Nippon Shinyaku Co., Ltd. ホスホロアミダイト化合物及びオリゴrnaの製法
WO2012073857A1 (ja) * 2010-11-30 2012-06-07 株式会社キラルジェン 2'-o-修飾rna
US9605019B2 (en) 2011-07-19 2017-03-28 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
US9617547B2 (en) 2012-07-13 2017-04-11 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant
US9695211B2 (en) 2008-12-02 2017-07-04 Wave Life Sciences Japan, Inc. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
US9744183B2 (en) 2009-07-06 2017-08-29 Wave Life Sciences Ltd. Nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
US9982257B2 (en) 2012-07-13 2018-05-29 Wave Life Sciences Ltd. Chiral control
US10144933B2 (en) 2014-01-15 2018-12-04 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
US10428019B2 (en) 2010-09-24 2019-10-01 Wave Life Sciences Ltd. Chiral auxiliaries

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2682112A1 (fr) * 1991-10-08 1993-04-09 Commissariat Energie Atomique Procede de synthese d'acide ribonucleique (arn) utilisant un nouveau reactif de deprotection.
EP0661291A1 (de) * 1993-12-17 1995-07-05 Hoechst Aktiengesellschaft Festphasensynthese von Oligoribonucleotiden
US5652358A (en) * 1993-12-17 1997-07-29 Hoechst Aktiengesellschaft Solid-phase synthesis of oligoribonucleotides
JP4580870B2 (ja) * 2003-09-02 2010-11-17 株式会社キラルジェン リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体の製造方法
WO2005023828A1 (ja) * 2003-09-02 2005-03-17 Takeshi Wada リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体の製造方法
JPWO2005023828A1 (ja) * 2003-09-02 2006-11-02 猛 和田 リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体の製造方法
JP2010265304A (ja) * 2003-09-02 2010-11-25 Chiralgen Ltd リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体の製造方法
JPWO2006022323A1 (ja) * 2004-08-26 2008-05-08 日本新薬株式会社 ホスホロアミダイト化合物及びオリゴrnaの製法
JP5157168B2 (ja) * 2004-08-26 2013-03-06 日本新薬株式会社 ホスホロアミダイト化合物及びオリゴrnaの製法
US8691970B2 (en) 2004-08-26 2014-04-08 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Phosphoramidite compound and method for producing oligo-RNA
WO2006022323A1 (ja) 2004-08-26 2006-03-02 Nippon Shinyaku Co., Ltd. ホスホロアミダイト化合物及びオリゴrnaの製法
US9695211B2 (en) 2008-12-02 2017-07-04 Wave Life Sciences Japan, Inc. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
US10329318B2 (en) 2008-12-02 2019-06-25 Wave Life Sciences Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
US9744183B2 (en) 2009-07-06 2017-08-29 Wave Life Sciences Ltd. Nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
US10307434B2 (en) 2009-07-06 2019-06-04 Wave Life Sciences Ltd. Nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
US10428019B2 (en) 2010-09-24 2019-10-01 Wave Life Sciences Ltd. Chiral auxiliaries
JP6093924B2 (ja) * 2010-11-30 2017-03-15 株式会社Wave Life Sciences Japan 2’−o−修飾rna
JP2016175933A (ja) * 2010-11-30 2016-10-06 株式会社Wave Life Sciences Japan 2’−o−修飾rna
JPWO2012073857A1 (ja) * 2010-11-30 2014-05-19 株式会社キラルジェン 2’−o−修飾rna
WO2012073857A1 (ja) * 2010-11-30 2012-06-07 株式会社キラルジェン 2'-o-修飾rna
US9605019B2 (en) 2011-07-19 2017-03-28 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
US10280192B2 (en) 2011-07-19 2019-05-07 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
US9617547B2 (en) 2012-07-13 2017-04-11 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant
US9982257B2 (en) 2012-07-13 2018-05-29 Wave Life Sciences Ltd. Chiral control
US10590413B2 (en) 2012-07-13 2020-03-17 Wave Life Sciences Ltd. Chiral control
US10144933B2 (en) 2014-01-15 2018-12-04 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator

Also Published As

Publication number Publication date
JP2794461B2 (ja) 1998-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4580870B2 (ja) リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体の製造方法
US5264566A (en) Method for in vitro oligonucleotide synthesis using H-phosphonates
Singh et al. Synthesis of 2'-amino-LNA: a novel conformationally restricted high-affinity oligonucleotide analogue with a handle
US5278302A (en) Polynucleotide phosphorodithioates
JP4402454B2 (ja) Lnaホスホラミダイトの製造法
EP1792909A1 (en) Synthesis of polynucleotides
JPH11510790A (ja) オリゴヌクレオチド合成のための改良された方法
EP3004131B1 (en) Phosphoramidite building blocks for sugar-conjugated oligonucleotides
WO1989011486A1 (en) Nucleoside and polynucleotide thiophosphoramidite and phosphorodithioate compounds and processes
JPH0374398A (ja) ホスホアミダイト化合物及びそれを用いたオリゴリボヌクレオチドの固相合成法
CA2370478A1 (en) N-acylphosphoramidites and their use in oligonucleotide synthesis
US5859233A (en) Synthons for synthesis of oligonucleotide N3-P5 phosphoramidates
US5552539A (en) Process for the synthesis of ribonucleic acid (RNA) using a novel deprotection reagent
JPH0787982A (ja) 修飾オリゴデオキシリボヌクレオチド
US5674856A (en) Modified oligodeoxyribonucleoditides
WO1990012022A1 (en) Polynucleotide phosphorodithioates as therapeutic agents for retroviral infections
WO2004085454A1 (en) Silylated oligonucleotide compounds
JP4709959B2 (ja) ヌクレオシドホスホロアミダイト化合物
JP3983691B2 (ja) オリゴヌクレオチドの化学的合成法
EP0463712A2 (en) Polynucleotide phosphorodithioates as therapeutic agents for retroviral infections
JP2023130982A (ja) 2’-ビニルrnaホスホロアミダイトユニットの開発
JPH06135988A (ja) ヌクレオシド誘導体
EP4186914A1 (en) Method for producing polynucleotides
PL221806B1 (pl) Sposób wprowadzania acetalowych i acetaloestrowych grup ochronnych oraz związki do realizacji tego sposobu
Tsukamoto et al. Strategies useful for the chemical synthesis of oligonucleotides and related compounds

Legal Events

Date Code Title Description
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080626

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080626

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090626

Year of fee payment: 11

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100626

Year of fee payment: 12

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100626

Year of fee payment: 12