JP2023130982A - ２’－ビニルｒｎａホスホロアミダイトユニットの開発 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、長鎖核酸合成に使用するための新規なホスホロアミダイトユニットを提供することを目的とする。【解決手段】本発明によれば、ホスホロアミダイト法に基づく核酸の化学合成に使用するための、２’位がビニル基で保護されたヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体、及び該誘導体を用いることを含む長鎖核酸を合成する方法が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、新規な２’－ビニルＲＮＡホスホロアミダイトユニット及び該ユニットを用いた長鎖ＲＮＡ合成法に関する。

近年、アンチセンスやｓｉＲＮＡなどに次ぐ核酸を利用した医薬として、より長鎖のＲＮＡを利用した薬剤研究が盛んに行われている。その一例として、数百から一万塩基を超えるような、セントラルドグマにおける中間遺伝物質である、ｍＲＮＡを利用したｍＲＮＡ医薬（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）が挙げられる。

医薬（又は医薬品）として作用する３０量体以下の短いＲＮＡ（アンチセンス分子／ｓｉＲＮＡ）は、工業的に大量合成が可能である。一方、Ｃｏｖｉｄ－１９などの感染症ワクチンとして注目されている、特定のタンパク質を発現することができるｍＲＮＡなどは、１６０塩基以上と鎖長が長いため、効率よく化学合成できる手法はない。

そのため、これらの長鎖ＲＮＡを医薬や汎用性の高い分子ツールとして利用するためには、高純度、かつ低コスト合成が可能な化学合成法の確立が必須である。

Chaudhary, N.; Weissman, D.; Whitehead, K. A. Nat. Rev. Drug. Discov. 2021, 20, 817-838. Xu, S.; Yang, K.; Li, R.; Zhang, L. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 6582 Sahin, U.; Kariko, K.; Tureci, O. Nat. Rev. Drug. Discov. 2014, 13, 759-780

本発明は、鎖長の長いＲＮＡを効率よく化学合成するための手段を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、長鎖ＲＮＡ合成を可能にする新規なホスホロアミダイトユニットを開発し、該ユニットを用いることによって、長鎖ＲＮＡの合成収率を向上させることに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は、新たに開発した２’水酸基を立体的に世界最小のビニル基で保護したホスホロアミダイトユニットを使用して、長鎖ＲＮＡを高収率で回収することを特徴とする。

すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］ホスホロアミダイト法に基づく核酸の化学合成に使用するための、２’位がビニル基で保護されたヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体。
［２］下記式：

〔式中、
Ｂは、天然核酸塩基又は保護基で保護された天然核酸塩基であり；
Ｒ_１は、水素原子又は水酸基の保護基であり；
Ｒ_２は、－Ｎ（Ｒ_４）_２（式中、Ｒ_４は、独立して、Ｃ_１～６アルキル基、または窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択される３個までのヘテロ原子を有する４～７員環のへテロシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルケニルである）、モルホリノ基、又はジアルキルアミノ基であり；
Ｒ_３は、２－シアノエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、ニトロフェニルエチル基、又は２－ニトロエチル基である〕
で表される、［１］に記載のヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体。
［３］Ｂが、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシルからなる群から選択される、［２］に記載のヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体。
［４］ホスホロアミダイト法に基づく核酸の化学合成において、［１］～［３］のいずれか１つに記載されるヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体を用いることを含む、長鎖核酸を合成する方法。
［５］（ａ）固相担体に結合させたヌクレオシドの５’又は３’水酸基を酸処理により除去する工程；
（ｂ）［１］～［３］のいずれか１つに記載のヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体を酸触媒で活性化し、縮合反応により固相担体上のヌクレオシドの５’又は３’水酸基と三価リン酸結合により連結させる工程；
（ｃ）未反応の該５’又は３’水酸基をキャッピングする工程；及び
（ｄ）該三価リン酸結合を酸化する工程
を含む反応サイクルを反復的に行うことを含む、［４］に記載の長鎖核酸を合成する方法。
［６］核酸がＲＮＡである、［４］又は［５］に記載の長鎖核酸を合成する方法。

本発明により、新たに開発したホスホロアミダイトユニットを提供することにより、長鎖核酸（好ましくはＲＮＡ）を高収率で得ることができる。

ビニル基の脱保護条件の検討を行った結果を示す。典型例として２’位をビニル基で保護した化合物を６０℃でｐＨ３．０、３．５、４．０、５．０酢酸水溶液もしくは水、４５℃でｐＨ３．０酢酸水溶液に晒し、試薬投入直後、１５／３０分、１／２／４／８／２４時間後に反応液を分注し、逆相ＨＰＬＣによる解析を行った。例としてｐＨ３．５で６０℃の経時変化の様子を示す。 図１のＨＰＬＣ結果から算出した、各ｐＨにおける脱保護割合（図１左上の化合物の減少率）をプロットしたグラフを示す。 ヌクレアーゼＰ_１を用いたリン酸ジエステル結合の転位反応を検証した結果を示す。Ａバッファ－：０．０３Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ、Ｂバッファー：ＣＨ_３ＣＮ；勾配：２０－２０％Ｂバッファー；流速：１ｍｌ／分。 ＮＭＲを用いたリン酸ジエステル結合の転移及び切断反応を検証した結果を示す。

本発明は、ホスホロアミダイト法による核酸合成法において、２’位をビニル基で保護したヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体（以下、単に「ホスホロアミダイトユニット」と称することがある）を使用することを特徴とし、これにより、従来より一般に使用されている２’位が他の保護基（例えば、ＴＢＤＭＳ、ＴＯＭ、ＣＥＭなど）で保護されたヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体と比較して、高収率で化学合成した長鎖核酸を得ることができる。本発明において「核酸」又は「核酸配列」とは、「ヌクレオチド」又は「ヌクレオチド配列」と同義に使用され、２塩基長（２ｍｅｒ又は２ｂｐ）以上のヌクレオチドを指し、オリゴヌクレオチド（＜１０^２ｂｐ）、遺伝子（１０^２～１０^３ｂｐ）、遺伝子クラスター（１０^３～１０^４ｂｐ）、ゲノム（＞１０^５ｂｐ）が含まれ得る。本発明では、化学合成の対象とする核酸は、ＤＮＡ（オリゴデオキシリボヌクレオチド）及びＲＮＡ（オリゴリボヌクレオチド）であり得るが、ビニル基により２’位の水酸基を保護することを目的とするため、核酸はＲＮＡが好ましい。

本発明は、２’位をビニル基で保護したホスホロアミダイトユニットを用いることにより高収率で長鎖核酸を合成することができる。本明細書で使用する場合、用語「長鎖」とは、核酸の長さとして、３０～３００ｍｅｒ、好ましくは５０～２００ｍｅｒを指す。また、本発明によれば、従来法と比較して、長鎖核酸の収率を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれ以上で向上させることができる。

本発明のホスホロアミダイトユニット及び該ホスホロアミダイトユニットを用いた長鎖合成法、概して、当該技術分野において当業者に公知である、例えば、ＰＣＡ法による遺伝子合成、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法による遺伝子クラスター合成に適用することができる。より具体的には、本発明の長鎖合成法は、公知のＣａｒｕｔｈｅｒｓらのホスホロアミダイト法、その改良法であるＫｏｓｔｅｒらのβ－シアノエチルホスホロアミダイト法又はそれらの改良法の原理に基づく。これらの公知の方法は、縮合反応に用いるヌクレオシド－３’－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体を、酸触媒を用いてそのＮ－Ｎ－ジイソプロピルアミノ基に対しプロトンを供与して活性化し、それにより固相担体上に固定された核酸（ヌクレオシド又はポリヌクレオチド）の５’－末端のヌクレオシドの５’－水酸基（５’－末端水酸基）との間で縮合反応を起こさせ、それらを三価リン酸結合により結合させること、及びその三価リン酸結合を酸化して安定な五価リン酸結合にすることに基づくものである。

本発明の長鎖合成法では、ヌクレオシド－３’－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体又はヌクレオシド－５’－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体の全部又は一部に、２’位がビニル基で保護された核酸を用いる点以外は、上記の公知のホスホロアミダイト法によるオリゴヌクレオチド合成法の各工程を実施することでよい。なお、ホスホロアミダイト誘導体を構成する核酸塩基としては、天然核酸塩基であり得、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はウラシルが挙げられる。

一般的に使用されているβ－シアノエチルホスホロアミダイト法による典型的なオリゴヌクレオチド固相合成サイクルを以下に示す。下記「Ｐｒｏ」は、２’位の水酸基の保護基を表す。

上記に示されるように、ホスホロアミダイト法は、（１）脱保護→（２）縮合（カップリング）→（３）キャッピング→（４）酸化の４工程を固相担体表面で連続的に繰り返し、１サイクル毎に１つの塩基を３’→５’の方向に伸長する。本発明では、ホスホロアミダイトによって核酸の３’位の水酸基を保護することにより、５’→３’の方向に塩基を伸長することができる。

ＤＮＡ合成におけるホスホロアミダイト法は、１５０塩基程度の長さの配列を安定的に合成できる手法であるが、ＲＮＡの合成においては最長でも１３０塩基程度で、実際に安定的に合成できる鎖長は６０塩基ほどとされている。この重大な差異の主な原因として、ホスホロアミダイトの２’－水酸基の保護基の存在が挙げられる。前提として、２’－保護基はオリゴヌクレオチド合成を通して安定である必要があり、ＤＭＴｒ基除去時の酸性条件や、塩基部脱保護や切り出し時の塩基性に影響を受けてはいけない。ＲＮＡは塩基性条件もしくは強酸性条件で、リン酸ジエステル結合の転位や、ヌクレオチド鎖切断等の重篤な副反応を起こすことが知られている（下記参照）。そのため、２’－保護基は合成中や切り出し条件で脱離しないことや、穏和な条件で脱保護可能である必要がある。

また、２’－水酸基はホスホロアミダイトがカップリングする反応部位に非常に近いため、立体的に大きい保護基であると鎖伸長反応に大きく干渉し、カップリング効率が低下してしまう。それ故、２’－保護基は３’－位に影響を及ぼしにくい立体構造の保護基が望ましい。加えて、２’－水酸基選択的に修飾基を導入することは難しく、通常は生成が困難な２’，３’－保護体を分離する必要がある（下記参照）。そのため、２’－選択的な修飾が可能な保護基が求められる。

これまでに、ＲＮＡ合成用に様々な２’－保護基が開発されてきたが、その中で最も広く使用されているのはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基である。ＴＢＤＭＳ基は、鎖伸長中に安定であるが、カップリング反応速度が極端に遅い（６００秒以上）問題が挙げられた。これは、ＴＢＤＭＳ基が嵩高い保護基であることに起因している。また、脱保護時にフッ化物イオンを使用するため、マイクロアレイ法やガラスビースを用いた合成に特別な注意を払う必要がある。他の保護基として、立体障害を少なくしたトリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）基はより短いカップリング時間（９０秒）で高いカップリング効率（９９．３％）を示している。さらに、酸で脱保護可能なビス（２－アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）基や、光で脱保護可能な（２－ニトロベンジル）オキシメチル（ＮＢＯＭ）基や、最も長鎖の合成の報告がある２－シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）基など様々な保護基が存在する（下記参照）。しかし、ＣＥＭ基であっても１３０塩基の合成しか行われておらず２０）、ｍＲＮＡ医薬や、Ｕ１ ｓｎＲＮＡの化学合成には不十分であると考えられる。

そこで本発明者らは上記の課題を解決すべく、全く新しい２’－保護基としてビニ
ル基の使用を検討した。ビニル基は、ＴＢＤＭＳ基やＣＥＭ等の保護基と比較して、立体的に最も小さい保護基であり、高いカップリング効率が見込めるため、ｍＲＮＡやＵ１ ｓｎＲＮＡのような長鎖ＲＮＡを合成できる可能性があると考えられた（下記参照）。

また、ビニル基は塩基性条件で安定であることと、０．４Ｍ酢酸程度の酸やテトラジンに対して不安定であることが報告されている。そのため、アンモニア水を用いる固相担体からの切り出し時に安定でありながら、非常に穏和な条件での脱保護が可能であると考えられる。このことから、前述のリン酸ジエステル結合の転位やヌクレオチド鎖切断等の副反応を起こさない有用な保護基であることが示唆される。加えて、Ｇａｌｌａｇｈｅｒら（Gallagher, W. P.; Deshpande, P. P.; Li, J.; Katipally, K.; Sausker, J. Org. Lett. 2015, 17, 14-17）により、２’，３’－メチルアセタールを経由したビニル基の２’－水酸基選択な導入法が報告されており、ホスホロアミダイトユニット自体も効率よく入手可能であることが予想し得る（下記参照）。

（１）２’位をビニル基で保護したヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体
本発明によれば、ホスホロアミダイト法に基づく核酸の化学合成に使用するための、５炭糖の２’位をビニル基で保護したヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体が提供される。ホスホロアミダイト法は、上記に概説した通りであり、従来のホスホロアミダイトユニットの全部又は一部を、本発明の２’位をビニル基で保護したヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体（ホスホロアミダイトユニット）に置換して使用される。

本発明のホスホロアミダイトユニットは、下記の一般式で表されることが好ましい。なお、式（Ｉ－１）で表される化合物は、２’位がビニル基で保護されたヌクレオチド－３’－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体であり、一方、式（Ｉ－２）で表される化合物は、２’位が保護基で保護されたヌクレオチド－５’－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体である。

上記式中、Ｂは、天然核酸塩基又は保護基で保護された天然核酸塩基であり得る。「天然核酸塩基」とは、通常の核酸配列に含まれる核酸塩基を指し、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシルが含まれる。「保護された天然核酸塩基」とは、天然核酸塩基中にアミノ基が存在する場合は、該アミノ基が保護基によって保護された核酸塩基を指す。「アミノ基を保護する基」には、限定されないが、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第３版、ＪＯＨＮ ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ出版（１９９９年）等に記載されている保護基であってもよい。「アミノ基の保護基」の例としては、例えば、ピバロイル基、ピバロイロキシメチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、ジメチルホルムアミジニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基等が挙げられる。

Ｒ_１は、水素原子又は水酸基の保護基であり得る。「水酸基の保護基」としては、上記の天然核酸塩基に存在する水酸基を保護基であってもよい。「水酸基を保護する保護基」には、限定されないが、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）、ニトロベンジル基、ニトロフェニルエチルエステル基（ＮＰＥ）、ジメトキシニトロベンジルエステル基（ＤＭＮＢ）、ブロモヒドロキシクマリン（Ｂｈｃ）基、ジメトキシベンゾイン基、２－ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＮＰＯＣ）基、２－ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）基、５’－（α－メチル－２－ニトロピペロニル）オキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）基、２－（２－ニトロ－４－エチル－５－チオフェニルフェニル）プロピルオキシカルボニル（ＰｈＳＮＰＰＯＣ）基、α－メチル－２－ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＭｅＮＶＯＣ）基、２，６－ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＤＮＢＯＣ）基、α－メチル－２，６－ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＭｅＤＮＢＯＣ）基、１－（２－ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＮＰＥＯＣ）基、１－メチル－１－（２－ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＭｅＮＰＥＯＣ）基、９－アントラセニルメチルオキシカルボニル（ＡＮＭＯＣ）基、１－ピレニルメチルオキシカルボニル（ＰＹＭＯＣ）基、３’－メトキシベンゾイニルオキシカルボニル（ＭＢＯＣ）基、３’，５’－ジメトキシベンゾイルオキシカルボニル（ＤＭＢＯＣ）基、７－ニトロインドリニルオキシカルボニル（ＮＩＯＣ）基、５，７－ジニトロインドリニルオキシカルボニル（ＤＮＩＯＣ）基、２－アントラキノニルメチルオキシカルボニル（ＡＱＭＯＣ）基、α，α－ジメチル－３，５－ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、５－ブロモ－７－ニトロインドリニルオシキカルボニル（ＢＮＩＯＣ）基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）基、２－シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）基、光機能性保護基（例えば、２－（４－エチル－２－ニトロ－５－チオフェニルフェニル）プロポキシカルボニル（ＳＰＯＣ）基）等が挙げられる。

Ｒ_２は、－Ｎ（Ｒ_４）_２（Ｒ_４は、独立して、Ｃ_１～６アルキル基、または窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択される３個までのヘテロ原子を有する４～７員環のへテロシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルケニルである）、モルホリノ基、又はジアルキルアミノ基であり得る。本明細書で使用される場合、用語「アルキル基」とは、直鎖、分枝鎖又は環状の１価の脂肪族飽和炭化水素基を指し、好ましくは炭素原子数１～６のアルキル基、より好ましは炭疽原子数１～３のアルキル基である。「アルキル基」としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。

Ｒ_３は、リン酸基の保護基であり、例えば、２－シアノエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、ニトロフェニルエチル基、又は２－ニトロエチル基であり得る。本発明では、保護基の脱離容易性の点から、酸性条件下では脱離しないが塩基性条件下で容易に脱離する保護基が好ましく、２－シアノエチル基がより好ましい。

これまでに、ホスホロアミダイト法を用いた核酸合成において使用されているホスホロアミダイトユニットでは、２’位の保護基としてシリル系（例えば、ＴＢＤＭＳ）、オキシメチレン系（例えば、ＴＯＭ）、又はオキシメチレンシアン系（例えば、ＣＥＭ）が使用されてきた。しかしながら、ＲＮＡ固有の性質に起因して、ＲＮＡ化学合成における２’－保護基の適切な選択は重要な課題である。ＲＮＡ鎖は、塩基性条件下においては不安定であることが知られ、塩基性条件下では２’－保護基の脱離に伴って、３’位から２’位へのリン酸基の転位が見られ、ＲＮＡ鎖が切断されることがある。また、ホスホロアミダイトユニットのカップリング反応において、保護された２’位部分が立体障害の原因となり、カップリング効率の低下、即ち、所望のＲＮＡ鎖の収率が低くなることがある。さらに、モノマーユニットの合成時における２’位の選択性が低くなり、精製を困難にさせることもある。

本発明のホスホロアミダイトユニットは、２’位の保護基である、従来のＴＢＤＭＳやＣＥＭなどとは異なり、分子の嵩高さが非常に小さいビニル基を使用するため、カップリング反応における立体障害を最小限に抑えることができる。また、穏和な条件下で脱保護をすることもでき、塩基性条件下であっても非常に安定である。さらに、モノマーユニット合成時の選択性が高い（９５％以上）こともまた特徴的である。

例えば、脱保護として、式（Ｉ－１）又は（Ｉ－２）中の置換基Ｒ_１にＳＰＯＣ基などの光機能性保護基を選択することにより、塩基性条件下で安定であるだけでなく、より穏和な条件下（すなわち、光照射）で容易に脱保護をすることが可能である。

後述する実施例１では、典型例として、天然核酸塩基としてウリジンを有し、２’位をビニル基で保護したモノマーユニットとして２’－Ｏ－ビニルウリジンを合成する手法を開示するが、これらの合成法に限定されず、所望の核酸塩基を有する該モノマーユニットを合成することは当業者に容易に理解される。実施例１の手法は、環状シリルエーテルを経由して、２’－Ｏ－ビニルウリジンを合成しているが、その他に、２’、３’－メチルアセタールを経由した合成法を用いてもよい。

後述する実施例２では、上記で作製した２’－Ｏ－ビニルウリジンを出発原料として、ホスホロアミダイトユニットを合成する手法を開示する。

（２）長鎖核酸合成
本発明によれば、本発明のホスホロアミダイトユニットを用いて、長鎖核酸を合成する方法が提供される。なお、当業者に理解されるように、核酸配列中に核酸を導入する数及び核酸の種類は、合成の目的とする核酸配列に応じて適宜、決定することができる。また、上記の通り、ホスホロアミダイト法は、固相担体上で（１）脱保護→（２）縮合（カップリング）→（３）キャッピング→（４）酸化の４工程を連続的に行うものであるが、１塩基分の鎖伸長反応を完了する過程を１サイクルとし、それを目的の鎖長に達するまで繰り返し行うことにより、目的の核酸配列を得ることができる。

当業者に理解されるように、核酸配列の固相合成に使用される固相担体として、種々の形態及び組成を有することができ、天然に存在する材料（天然材料）、合成により修飾された天然材料、又は合成材料から得ることができる。例えば、シリコン；ガラス（例えば、微小多孔質ガラス、多孔質ガラス（例えば、コントロールポアドガラス（ＣＰＧ）など）；金属（例えば、金、プラチナなど）；フェライトを芯にグリシンメタクリレートで表面を覆った磁性ビーズ；プラスチック（例えば、ポリエチレングリコール樹脂、シリカゲル樹脂、ポリテトラフルオロエチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）；多糖（例えば、アガロース、デキストラン、ニトロセルロースなど）；ポリアクリルアミド；ポリビニルアルコール；ヒドロキシエチルメタクリレートとメチルメタクリレートとのコポリマーなどが挙げられる。固相担体の形状としては、板状（基板状）、ビーズ状、糸状、球状、多角形状、粉末状など、任意の形状のものであってもよい。また、固相担体は、任意の形態で用いることができるが、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置等では、カラム等の容器に充填した形態で用いることが好ましい。また、上記と関連して、使用される固相担体として、従来よりＤＮＡチップ及び遺伝子検出用マイクロアレイを製造するために用いられているものを特に制限なく用いることができる。

ヌクレオシドの固相担体上への固定は、常法により行うことができ、例えば、好ましくはリンカーを介して行うことができる。具体的には、ヌクレオシドを固定した固相担体は、固相担体上のシラノール水酸基にアミノプロピル基等のアミノアルキル基が導入されたものにヌクレオシド－３’－Ｏ－サクシニル体が結合されたものでもよい。あるいは、保護ヌクレオシドにＱリンカーを用いて固相担体に導入したものでもよいし、ヌクレオシドのアミダイト体を固相担体ユニバーサルサポートに導入したものも公知技術として本発明において利用することができる。

以下、前述のホスホロアミダイト法の反応工程を、典型例を用いて簡単に説明する。
（ａ）脱保護工程
固相担体上に固定された核酸（オリゴヌクレオチド又はヌクレオシド）を酸処理することにより、その核酸の５’－末端のヌクレオシドの５’－水酸基（以下、単に「５’－水酸基」とも呼ぶ）の保護基を酸性条件下で脱離（脱保護）させ、この５’－水酸基を遊離状態とする。５’－水酸基の保護基は、限定されないが、一般的にはジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）である。５’－水酸基からのジメトキシトリチル基の脱離は、限定されはないが、好ましくは、３％トリクロロ酢酸－ジクロロメタン溶液又は３％ジクロロ酢酸－ジクロロメタン溶液を用いることができる。

（ｂ）縮合工程（カップリング工程）
上記脱保護工程で脱保護された５’－水酸基を有する固相担体上の核酸に、次に該核酸に連結させるべきヌクレオシド－３’－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体と、活性化剤である酸触媒とを添加する。この結果、ヌクレオシド－３’－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体は、酸触媒により活性化され、それに固相担体上の核酸の遊離５’－水酸基が反応して、両者は縮合反応により連結されることになる。この縮合反応により生じる結合は、三価のリン酸結合である。

酸触媒としては、限定されないが、１Ｈ－テトラゾール、５’－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール、ベンチルチオ－１Ｈ－テトラゾール、ジシアノイミダゾール、サッカリン／１－メチルイミダゾールなどの公知の酸触媒（活性化剤）を使用することができる。酸触媒は、アセトニトリル等の溶媒に溶解させた溶液として添加することが好ましく、その酸触媒溶液は０．１Ｍ～０．４５Ｍ、好ましくは０．２５Ｍ～０．４５Ｍで調製したものを用いることができるが、この濃度に限定されるものではなく、当業者が適宜調節可能である。

（ｃ）キャッピング工程
上記縮合工程後、固相担体上のヌクレオシドの未反応の５’－水酸基を、脱保護工程で脱保護するものとは別の保護基で保護することにより、不活性化（すなわち、キャッピング）することができる。

ホスホロアミダイト法はこれまでに開発されたリン酸エステル縮合反応の中では最も活性があり、９８～９９％の５’－水酸基と反応する。その結果、固相担体上にはわずかに未反応の５’－水酸基を有するヌクレオシドが残存することになるが、これは次の鎖長伸長反応サイクルで伸長反応を生じると分離し難い不純物となるため、未反応の遊離な状態の５’－水酸基を有する未反応のヌクレオシド又はヌクレオチドを次のサイクルに持ち越さないようにする、キャッピングにより未反応の５’－水酸基を不活性化して伸長反応を停止させることが好ましい。

キャッピングは、公知の方法で行うことができるが、一般的には、その未反応の５’－水酸基をアセチル化することにより行うことが好ましい。未反応の５’－水酸基のアセチル化は、限定されないが、無水酢酸又は無水フェノキシ酢酸によるアセチル化を利用することができる。また、未反応の５’－水酸基のキャッピングには、非塩基不安定性試薬（例えば、ＵｎｉＣａｐ）を使用して達成され、脱保護後、ヌクレオチド配列上に遊離水酸基ではなくリン酸基を残すことができる。

上記の例において、未反応の５’－水酸基のキャッピングのためには、例えば、無水酢酸を含む溶液を、反応時に生じる酢酸と塩形成させるための塩基性触媒と共に固相担体に添加することが好ましい。無水酢酸を含む溶液と、塩基性触媒である１－メチルイミダゾール等を含む溶液は、別々に調製してキャッピング工程の際に用時調製することが好ましい。無水酢酸とともに添加される塩基性触媒としては、限定されないが、１－メチルイミダゾール、ピリジン、２，６－ルチジンなどが挙げられる。無水酢酸及び塩基性触媒は、各々、適切な溶媒（例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル等）に溶解した溶液として添加すればよい。

（ｄ）酸化工程
上記縮合工程で鎖伸長されたヌクレオチドの三価のリン酸結合を、酸化試薬を固相担体に添加することにより酸化し、安定な五価の正リン酸結合に変換する。三価のリン酸結合（三価リン酸トリエステル結合）は加水分解されやすく不安定なためである。酸化試薬としては、公知の酸化試薬を用いることができるが、例えば、ヨウ素を含む水性溶液又は過酸化物などを好適に使用することができる。具体例としては、０．０２Ｍヨウ素－ピリジン溶液を水性溶媒又は有機溶媒に溶解した溶液、例えば、ヨウ素－ピリジン－水－テトラヒドロフラン溶液、（１Ｓ）－（＋）－（１０－カンファースルホニル）オキサジリジン、ｔ－ブチルハイドロパーオキシド－メチレンクロリドなどの過酸化物を用いることができるが、これに限定されない。

核酸塩基の種類を変更して、上記工程（ａ）～（ｄ）を繰り返すことにより、所望の核酸配列を得ることができる。

上記のホスホロアミダイト法は、縮合反応はＰ－Ｎ結合を有するホスホロアミダイトユニットを活性化することにより行われ、反応も迅速にできることから、今日のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機に採用されている。

（３）２’－Ｏ－ビニル保護を利用したＲＮＡの合成後修飾
ビニル基を用いた核酸合成法の他にはない利点として、アルケンの反応性の高さを利用して、核酸合成後に修飾を加えることができる。飽和炭化水素エーテル系の２’－保護基は追加の反応を起こし難いが、末端アルケンであるビニル基は様々な付加反応し得る。本発明によれば、ビニル基に対してＵＶ照射下でジメトキシフェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）を反応させることで、チオール－エン－クリック反応により付加させることでき、また、ｐ－トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）触媒下でチオールやアルコールを反応させ、アセタール結合を介して修飾を加えることができる。このように本発明のアミダイトユニットは、分子内にビニル基を有することから、該ビニル基と、チオール、アルコール、又は他の任意の化合物との反応を介して様々な合成後修飾を行うことができる。

以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

本実施例で使用した試薬及び機器は以下の通りである。
有機合成試薬、有機溶媒
和光純薬工業、東京化成工業、関東化学、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｕｎａｋｏｓｈｉより購入した。
シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
順相ＴＬＣとしてＭｅｒｃｋ社製Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２４５を用いた。展開溶媒には、ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＣＨ_３ＯＨ系、ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＥｔＯＡｃ系、ｎ－ヘキサン：ＣＨ_２Ｃｌ_２系、ｎ－ヘキサン：ＥｔＯＡｃ系を用い、必要であればピリジンまたはトリエチルアミンを添加した。化合物の検出には、ＵＶ（２５４ｎｍ）、発色試薬として５％硫酸ＣＨ_３ＯＨ溶液、アニスアルデヒドを用いた。
シリカゲルカラムクロマトグラフィー
Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ－２００（和光純薬工業）、中性シリカゲル６０Ｎ（関東化学）、Ｐｕｒｉｆ－Ｐａｃｋ－ＥＸ ＳＩ－２５（昭光サイエンス）を試料に対し、約１０－５０倍量を用いて精製した。溶出溶媒には、ＴＬＣで用いた展開溶媒と同様な混合溶媒や必要があればピリジンまたはトリエチルアミンを０．５－１．０％添加した。

リサイクル分取ＨＰＬＣ
日本分析工業社製ＬＣ－９２０１またはＬＣ－５０６０にゲル濾過カラム（ＧＳ－３１０）を接続し用いた。溶出溶媒には、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ＣＨ_３ＣＮなどを用いた。
^１ Ｈ ＮＭＲスペクトル
Ｖａｒｉａｎ ＡＳ５００（５００ＭＨｚ）を用いた測定した。内部標準として、測定溶媒に由来するピークを基準とした。（ＤＭＳＯ：２．５０、ＣＤＣｌ_３：７．２６、ＣＤ_３ＯＤ：３．３１、ＣＤ_３ＣＮ：１．９４、ピリジン：８．７４ｐｐｍ）
^１３ Ｃ ＮＭＲスペクトル
Ｂｒｕｋｅｒ ｂｉｏｓｐｉｎ・ＡＶＮＣＥ ＩＩＩ ４００（１００ＭＨｚ）を用いて測定した。内部標準として、測定溶媒に由来するピークを基準とした。（ＤＭＳＯ：３９．５２、ＣＤＣｌ_３：７７．１６ｐｐｍ）
^３１ Ｐ ＮＭＲスペクトル
Ｂｒｕｋｅｒ ｂｉｏｓｐｉｎ・ＡＶＮＣＥ ＩＩＩ ４００（１６１ＭＨｚ）を用い測定した。８５％正リン酸を外部標準として用いた。
ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機、ＤＮＡオリゴマー
大日本精機のｎｓ－８ＩＩを使用した。必要な試薬は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｉｎｃ．より購入した。本論文において合成した修飾体ホスホロアミダイトユニットは、乾燥ＣＨ_３ＣＮ（０．１Ｍ）に溶解しＤＮＡ合成機に導入した。また、未修飾のオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入して用いた。

逆相－ＨＰＬＣ
Ｗａｔｅｒｓ ２６９５またはＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ２０５０Ｃ ３Ｄを接続して用いた。カラムは、ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｃ１８ ５μｍ（４．６×１５０ｍｍ）を用いた。分取精製は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＩＬ－１０ＡＰにＬＣ－６ＡＤ、ＣＢＭ－２０Ａ、ＳＰＤ－Ｍ２０Ａを接続し、カラムとしてＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ（１０×２５０ｍｍ）を用いた。カラム温度４０℃において、０．０３Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）に対し、ＣＨ_３ＣＮを加え、濃度勾配をかけて流した。
陰イオン交換ＨＰＬＣ
Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０３０Ｃ ３Ｄ ｐｌｕｓを接続して用いた。カラムは、ＤＩＯＮＥＸ社製ＤＮＡＰａｋ（商標）ＰＡ－１００（４×２５０ｍｍ）を用いた。分取精製は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＣＬ－１０にＬＣ－１０ＡＤ、ＣＴＯ－１０Ａ、ＳＰＤ－Ｍ１０Ａを接続して用いた。カラム温度５０℃において、溶出溶媒として２５ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．０）に対し、１Ｍ塩化ナトリウム－２５ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．０）を加え濃度勾配をかけて流した。分取した際には、必要に応じてＳｅｐ－ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｃ１８）を用いて脱塩操作を行った。
ゲル電気泳動撮影
フルオロ・イメージアナライザーＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の写真を撮影した。

実施例１：２’－Ｏ－ビニルウリジンの合成
本実施例では、２’－Ｏ－ビニル ３’－ホスホロアミダイトの合成に際し、その前駆体である２’－Ｏ－ビニルウリジンの合成を行った。ここでは、ウリジンの２’－水酸基をビニル化する手法として、２通りの経路を用いた。第１は、下記のスキーム１に示すような環状シリルエーテルを経由し、ビニル基を導入する経路を設計した。Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚらが報告したこのシリル保護基はヌクレオシド２’－水酸基選択的に修飾基を導入する手法として広く用いられている（Markiewicz, W. T.; Wiewiorowski, M. Nucleic Acids Res. 1978, 5, s185-s190）。また、ビニル化の方法としてＤｕｊａｒｄｉｎらの報告した、ブレンステッド酸を触媒とするエチルビニルエーテル（ＥＶＥ）を用いた２段階のビニル化反応（Dujardin, G.; Rossignol, S.; Brown, E. Tetrahedron lett. 1995, 36, 1653-1656）を採用した。

２つ目として、下記のスキーム２に示すような２’，３’－メチルアセタールを経由し、ビニル基を導入する経路を設計した。この経路は、Ｈｏｙｅらが報告した環状アセタールの開環を伴うビニル化反応（Rychnovsky, S. D.; Hoye, R. C. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 1753-1765）を元に、Ｇａｌｌａｇｈｅｒらがヌクレオシド２’－水酸基選択的なビニル基導入法として開発した反応（Gallagher, W. P., et al.、2015、前掲）を採用した。

（１）環状シリルエーテルを経由した、２’－Ｏ－ビニルウリジンの合成
環状シリルエーテルを経由したスキーム１での合成を試みた。ウリジンを出発原料に、Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚらの報告（前掲）に従い、１．２当量の１，３－ジクロロ－１，１，３，３－テトライソプロピルジシロキサンを用いて、３’，５’－水酸基を保護した化合物１－１を収率７２％で得た。次いで、（パラトルエンスルホン酸ピリジニウム）ＰＰＴＳ存在下で５．０当量のエチルビニルエーテルを反応させ、中間体化合物１－２を得たのちに、ルイス酸触媒として（トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル）ＴＭＳＯＴｆを４．０当量加えることでビニル基へと変換し、化合物１－３を２工程６１％の収率で合成した。最後に、Ｅｔ_３Ｎ－３ＨＦを１．３当量加え、シリル保護の脱保護を行うことで、目的物である２’－Ｏ－ビニルウリジン（化合物１－４）を収率８３％で合成した（下記の合成経路参照）。

（ａ）３’，５’－Ｏ－（１，１，３，３－テトライソプロピル－１，３－ジシロキサンジイル）ウリジンの合成

ウリジン（５．００ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（５ｍｌ）で３回共沸したのち、アルゴン雰囲気下で乾燥ピリジン（１００ｍｌ）に溶解させ、０℃で１０分間撹拌した。その後、１，３－ジクロロ－１，１，３，３－テトライソプロピルジシロキサン（７．８６ｍｌ、２４．６ｍｍｏｌ）を加え、０℃で２０時間反応させた。次に、水（５ｍｌ）を加え反応を停止させ、反応液にＥｔＯＡｃ（４００ｍｌ）を加え、水（４００ｍｌ）と飽和食塩水（４００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥した後、溶媒を減圧留去し粗精製物を得た。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｃ－２００，ｎ－ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、化合物１－１（７．１８ｇ、７２％）を得た。
¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 0.96-1.15 (m, 28H), 2.85 (d, J =1.4 Hz, 1H), 4.01 (dd, J = 13.2, 2.9 Hz, 1H), 4.09 (dt, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 4.15-4.22 (m, 2H), 4.40 (dd, J = 8.7, 5.0 Hz, 1H), 5.68 (dd, J = 8.5, 1.9 Hz, 1H), 5.72 (s, 1H), 7.65 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.04 (br-s, 1H).

（ｂ）３’，５’－Ｏ－（１，１，３，３－テトライソプロピル－１，３－ジシロキサンジイル）－２’－Ｏ－ビニルウリジンの合成

化合物１－１（７．１８ｇ，１４．８ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（３０．０ｍｌ）に溶解させた。次いで、エチルビニルエーテル（７．０７ｍｌ、７３．８ｍｍｏｌ）、ＰＰＴＳ（３７２ｍｇ，１．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１９時間撹拌した。その後、反応液にＣＨ_２Ｃｌ_２（４００ｍｌ）を加え、飽和重曹水（４００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥したのち、溶媒を減圧留去し、化合物１－２の粗精製物を得た。

得られた化合物１－２の粗製精物を乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（５９．２ｍｌ）に溶解させ、Ｅｔ_３Ｎ（１９．４ｍｌ、１４１ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１０分間撹拌した。その後、ＴＭＳＯＴｆ（１０．７ｍｌ，５９．２ｍｍｏｌ）を加えて０℃で２０時間反応させた。反応液にＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍｌ）を加え、ＮＨ_４ＯＡｃ（５．９３ｇ、７７．０ｍｍｏｌ）を含む水（７７ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥したのち、溶媒を減圧留去し粗精製物を得た。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｃ－２００、ｎ－ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、化合物１－３（４．６２ｇ、６１％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.88-1.16 (m, 28H), 3.97 (d, 1H), 4.14-4.19 (m, 2H), 4.22-4.31 (m, 3H), 4.57 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 5.69 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.76 (s, 1H), 6.52 (dd, J = 13.9, 6.4 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.46 (s, 1H).; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 12.7, 13.0, 13.3, 13.6, 16.9, 17.1, 17.1, 17.2, 17.4, 17.4, 17.5, 17.6, 59.6, 68.1, 81.9, 82.1, 88.8, 91.2, 101.9, 139.8, 150.0, 150.9, 163.5.; HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calcd for C₂₃H₄₀N₂NaO₇Si₂ 535.2266; found 535.2275.

（ｃ）２’－Ｏ－ビニルウリジンの合成

化合物１－３を出発原料とする経路と、化合物１－５を出発原料とする経路の２通りの手法で合成した。

経路１：化合物１－３（４．６２ｇ、９．０１ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（６０．０ｍｌ）に溶解させ、Ｅｔ_３Ｎ（６．２１ｍｌ、４５．１ｍｍｏｌ）を加えて５分間撹拌した。そこへ、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（１．９１ｍｌ、１１．７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１９時間反応させた。その後、反応液にＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍｌ）を加え、水（２５０ｍｌ）で５回抽出した。次いで、水層を減圧留去し、化合物１－４の粗精製物を得た。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｃ－２００、ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ）で精製し、化合物１－４（２．０３ｇ，８３％）を得た。

経路２：化合物１－５（３００ｇ、１．１１ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（４．１１ｍｌ）に溶解させた。そこへ、Ｅｔ_３Ｎ（１．９４ｍｌ、１４．４ｍｍｏｌ）、ＴＭＳＯＴｆ（２．０１ｍｌ、１１．１ｍｍｏｌ）を順に加え、４５℃で７時間反応させた。その後、反応液を４．３Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ水溶液（５．１６ｍｌ）に滴下し、室温で２０分撹拌した。反応液にＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍｌ）を加え、水（５０ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥したのち、溶媒を減圧留去した。次いで、得られた抽出物をＴＨＦ（７．４０ｍｌ）に溶解させ、Ｅｔ_３Ｎ（１．４９ｍｌ、１１．１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（２３５μｌ、１．４４ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間反応させた。反応液にトリメチルエトキシシラン（１．３５ｍｌ、８．６６ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分撹拌したのち、溶媒を減圧留去した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳＩ－２５、ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ）で精製し、化合物１－４（２２９ｍｇ、６％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 3.54-3.71 (m, J = 51.6, 2H), 3.89 (dt, J = 4.2, 2.4 Hz, 1H), 4.07 (dd, J = 5.2, 1.6 Hz, 1H), 4.20 (q, J = 4.2 Hz, 1H), 4.33 (dd, J = 11.2, 1.6 Hz, 1H), 4.41 (t, J = 3.6 Hz, 1H), 5.20 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 5.37 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.66 (dd, J = 6.4, 1.6 Hz, 1H), 5.89 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.47 (dd, J = 11.2, 5.2 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 11.36 (s, 1H).; ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 60.2, 67.9, 80.2, 84.8, 86.3, 89.3, 101.9, 140.3, 150.4, 150.9, 163.0.; HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calcd for C₁₁H₁₄N₂NaO₆ 293.0744; found 293.0748.

（ｄ）２’，３’－Ｏ－エチリデンウリジンの合成

ウリジン（３．００ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）に乾燥ＣＨ_３ＣＮ（６．００ｍｌ）、Ｈ_２ＳＯ_４（４０．０μｌ、０．７５０μｍｏｌ）を加えて溶解させた。その後、乾燥ＣＨ_３ＣＮ（６．００ｍｌ）に溶解させたアセトアルデヒド（１．０３ｍｌ、１８．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２２時間撹拌した。析出した固体を吸引濾過し、ＣＨ_３ＣＮ（３００ｍｌ）で洗浄し、濾物を真空乾燥することで化合物１－５（３．０２ｇ、９１％）を得た。
¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 1.37 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 3.50-3.61 (m, 2H), 4.11 (q, J = 4.6 Hz, 1H), 4.66 (dd, J = 6.6, 3.2 Hz, 1H), 4.84 (dd, J = 6.6, 2.7 Hz, 1H), 5.09 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 5.15 (q, J = 4.8 Hz, 1H), 5.63 (dd, J = 8.0, 2.2 Hz, 1H), 5.81 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.81 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 11.39 (s, 1H).

（２）２’，３’－メチルアセタールを経由した２’－Ｏ－ビニルウリジンの合成
２’，３’－メチルアセタールウリジン（化合物１－５）を経由したスキーム２で２’－Ｏ－ビニルウリジンの合成を行った。ウリジンを出発原料として、１．５当量のアセトアルデヒドを反応させ、収率９１％で２’，３’－水酸基のアセタール化を行った。その後、１０当量のＴＭＳＯＴｆを加え、Ｅｔ_３Ｎ－３ＨＦで後処理することで２’－Ｏ－ビニルウリジンを７６％の収率で合成した（下記の合成経路参照）。

上記結果より、スキーム１では４工程３６％の収率で目的物が得られるのに対し、スキーム２では２工程６９％の収率で２´－Ｏ－ビニルウリジンを合成でき、２倍近い収率で目的物を合成することに成功した。また、スキーム１で用いる１，３－ジクロロ－１，１，３，３－テトライソプロピルジシロキサンは比較的高価な試薬であるため、スキーム１で２’－Ｏ－ビニルウリジンを合成すると合成コストも高くなってしまう。その一方で、スキーム２では比較的安価な試薬のみを用いるため、合成コストの面でも有用な経路を開拓したといえる。

過去に用いられてきた２’－水酸基保護基の導入効率は、ＴＯＭ基で４０－６０％、２－Ｎｂｏｍ基で３９％、２－（４－トリルスルホニル）エトキシメチル（ＴＥＭ）基で２６－３８％程度と報告されており、それらと比べても同等、もしくはそれ以上の高い効率で２’－水酸基保護ヌクレオシドを得られるとわかった。

実施例２：ＤＭＴｒ－２’－Ｏ－ビニルウリジン ３’－ホスホロアミダイトの合成
実施例１で合成した２’－Ｏ－ビニルウリジンを用いて、ＤＭＴｒ－２’－Ｏ－ビニルウリジン ３’－ホスホロアミダイトの合成を行った。下記のスキーム３に示すように、２’－Ｏ－ビニルウリジンを出発原料に、ピリジン溶媒下で１．２当量のＤＭＴｒ－Ｃｌを反応させ、化合物１－６を収率９５％で得た。次に、１Ｈ－テトラゾールを触媒として１．２当量のホスホロジアミダイトを用いてホスフィチル化することで、目的物であるＤＭＴｒ－２’－Ｏ－ビニルウリジン ３’－ホスホロアミダイトを収率８０％で得た。

（１）ＳＰＯＣ－２’－Ｏ－ビニルウリジン ３’－ホスホロアミダイトの合成
ＤＭＴｒアミダイトと同様に、２’－Ｏ－ビニルウリジンへ５’－水酸基保護基を導入する下記に示すような経路を設計し、合成を行った。２’－Ｏ－ビニルウリジンを出発原料に、ジクロロメタン－ピリジン混合溶媒下で１．０当量のＳＰＯＣ－Ｃｌを反応させた。その結果、驚くべきことに、５’－付加体（化合物１－９）ではなく３’－付加体（化合物１－９－３’）が主生成物として得られることがわかった（下記参照）。しかし、目的としている５’－付加体の収率が極めて低いため、下記経路はＳＰＯＣ－２’－Ｏ－ビニルウリジンを合成する経路としては適さないと考えられる。

そこで、新たに下記に示す２’，３’－メチルアセタールに対してＳＰＯＣ－Ｃｌを反応させる合成経路を設計した。この経路であれば、確実に５’－水酸基にＳＰＯＣを導入させることができ、より効率的にホスホロアミダイトを合成可能になると予測された。

下記のスキーム４に従い、ＳＰＯＣ－２’－Ｏ－ビニルウリジン ３’－ホスホロアミダイトの合成を行った。化合物１－５を出発原料に、ピリジン－ジクロロメタン混合溶媒下で１．２当量のＳＰＯＣ－Ｃｌを加え反応をかけ、化合物１－８を収率６５％で得た。その後、トリエチルアミン存在下で１０当量のＴＭＳＯＴｆを反応させ、化合物１－９を収率３２％で合成した。次いで、定法に従い、１．２当量のホスホロジアミダイトを用いてホスフィチル化し、収率３９％で目的物であるＳＰＯＣ－２’－Ｏ－ビニルウリジン ３’－ホスホロアミダイトを合成した。

（ａ）５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－ビニルウリジンの合成

化合物１－４（６５０ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１ｍｌ）で３回共沸した。その後、アルゴン雰囲気下で乾燥ピリジン（１４．２ｍｌ）に溶解させ、４，４’－ジメトキシトリメチルクロリド（９７８ｍｇ、２．８９ｍｍｏｌ）を加えて５時間撹拌した。その後、ＭｅＯＨ（３ｍｌ）を加え反応を停止させ、反応液にＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍｌ）を加え、飽和重曹水（１００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥したのち、溶媒を減圧留去し粗精製物を得た。次いで、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｃ－２００、ｎ－ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、化合物１－６（１．３１ｇ、９５％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 2.51 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 3.51 (qd, J = 11.2, 2.4 Hz, 2H), 3.73 (d, J = 1.5 Hz, 6H), 4.06 (dt, J = 7.4, 2.4 Hz, 1H), 4.24 (dd, J = 6.4, 2.4 Hz, 1H), 4.35 (dd, J = 5.0, 2.2 Hz, 1H), 4.45-4.57 (m, 2H), 5.26 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.93 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.52 (dd, J = 14.0, 6.8 Hz, 1H), 6.77-6.81 (m, 4H), 7.13-7.27 (m, 7H), 7.30-7.35 (m, 2H), 7.93 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 9.64 (br-s, 1H).; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 55.4, 61.6, 68.8, 81.5, 83.3, 87.3, 87.5, 92.3, 102.5, 113.4, 127.3, 128.2, 130.2, 135.2, 140.2, 144.4, 149.8, 150.3, 158.8, 163.6.; HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calcd for C₃₂H₃₂N₂NaO₈ 595.2051; found 595.2066.

（ｂ）５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－ビニルウリジン ３’－（２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルホスホルアミダイト）の合成

化合物１－６（１．１５ｇ、２．００ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２ｍｌ）で３回、乾燥トルエン（２ｍｌ）で３回、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍｌ）で３回共沸した。その後、アルゴン雰囲気下で乾燥ＣＨ_３ＣＮ（２０．０ｍｌ）に溶解させ、ジイソプロピルアミン（２２６μＬ、１．６０ｍｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（１１５ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ）を加え、１分間撹拌したのちに、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（７６２μＬ、２．４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。次いで、反応溶液にＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍｌ）を加え、飽和重曹水（２００ｍｌ）で５回洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた粗精製物をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｃ－２００、ｎ－ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１％Ｅｔ_３Ｎ含有）で溶出し、目的物を含むフラクションを回収し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をゲル濾過カラムに移し、ＣＨ_３ＣＮを溶出溶媒としてリサイクル分取を行った。その後、粗精製物をジシソプロピルエーテル－ジエチルエーテル（ｖ／ｖ １：２）に溶解させ、２％Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液で５回洗浄し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥後、溶媒を減圧留去することで化合物１－７（１．２４ｇ、８０％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.98-1.23 (m, 12H), 2.41 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 2.63 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 3.41-3.72, 3.83-4.00 (m, 6H), 3.79 (d, J = 3.3 Hz, 6H), 4.16-4.21 (m, 1H), 4.28 (dd, J = 25.0, 7.1 Hz, 1H), 4.42-4.53 (m, 2H), 4.55-4.75 (m, 1H), 5.27 (dd, J = 8.0, 6.4 Hz, 1H), 6.01 (dd, J = 9.0, 2.1 Hz, 1H), 6.55 (ddd, J = 14.0, 6.5, 2.0 Hz, 1H), 6.81-6.91 (m, 4H), 7.21-7.34 (m, 7H), 7.40 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 8.01 (dd, J = 21.5, 8.2 Hz, 1H), 9.70 (br-s, 1H).; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 20.4, 24.7, 43.4, 55.3, 58.3, 61.1, 69.6, 80.3, 81.4, 82.5, 87.2, 88.2, 90.8, 102.4, 113.3, 117.6, 127.3, 128.1, 128.3, 130.3, 135.1, 140.1, 144.3, 150.5, 158.8, 163.7.; ³¹P NMR (161 MHz, CDCl₃) δ 150.8, 150,9.; HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calcd for C₄₁H₄₉N₄NaO₉P 795.3129; found 795.3123.

（ｃ）２’，３’－Ｏ－エチリデン－５’－Ｏ－［２－（４－エチル－２－ニトロ－５－チオフェニルフェニル）プロポキシカルボニル］ウリジンの合成

トリホスゲン（３５６ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（３．００ｍｌ）に溶解させ、０℃で１０分間撹拌した。そこへ、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（４．５０ｍｌ）と２，６－ルチジン（１７５μｌ、１．５０ｍｍｏｌ）に溶解させた２－（４－エチル－２－ニトロ－５－チオフェニルフェニル）プロパノール（３５６ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下し、０℃で２時間反応させた。その後、溶媒を減圧留去し、２－（４－エチル－２ニトロ－５－チオフェニルフェニル）プロピルクロロホルメートの粗精製物を得た。

次いで、化合物１－５（４８６ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２ｍｌ）で３回共沸したのち、アルゴン雰囲気下で乾燥ピリジン（８．００ｍｌ）に溶解させ、０℃で１０分間撹拌した。そこへ、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（５．００ｍｌ）に溶解させた２－（４－エチル－２－ニトロ－５－チオフェニルフェニル）プロピルクロロホルメートの粗精製物を１０分間かけて滴下したのち４－ジメチルアミノピリジン（９．１６ｍｇ、７５．０μｍｏｌ）を加え、０℃で２０時間反応させた。反応液にＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍｌ）を加え、飽和重曹水（２００ｍｌ）、飽和食塩水（２００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥したのち、溶媒を減圧留去した。その後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳＩ－２５、ｎ－ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製し、化合物１－８（６０２ｍｇ，６５％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.07 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.29 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 1.47 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.78 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.73 (sext, J = 6.8 Hz, 1H), 3.88-4.14 (m, 2H), 4.24-4.34 (m, 2H), 4.35-4.42 (m, 1H), 4.71-4.78 (m, 1H), 4.91 (dt, J = 7.4, 2.0 Hz, 1H), 5.21 (q, J = 4.7 Hz, 1H), 5.67 (dd, J = 26.8, 8.0 Hz, 1H), 5.73 (s, 1H), 6.86 (s, 1H), 7.27 (dd, J = 9.8, 8.2 Hz, 1H), 7.42 (br-s, 5H), 7.68 (s, 1H), 9.46 (br-d, J = 7.9 Hz, 1H).; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 13.6, 17.3, 19.9, 26.2, 32.8, 67.4, 72.0, 81.5, 84.9, 85.1, 94.1, 102.9, 106.0, 124.2, 127.5, 129.1, 130.0, 131.9, 133.8, 135.0, 141.6, 142.1, 143.9, 147.7, 150.2, 154.5, 163.4.; HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calcd for C₂₉H₃₁N₃NaO₁₀S 636.1622; found 636.1634.

（ｄ）５’－Ｏ－［２－（４－エチル－２－ニトロ－５－チオフェニルフェニル）プロポキシカルボニル］－２’－Ｏ－ビニルウリジンの合成

化合物１－４を出発原料とする経路と、化合物１－８を出発原料とする経路の２通りの手法で合成した。

経路１：トリホスゲン（１３２ｍｇ、４４４μｍｏｌ）を乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（２．００ｍｌ）に溶解させ、０℃で１０分間撹拌した。そこへ、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（３．５５ｍｌ）と２，６－ルチジン（６４．７μｌ、５５５μｍｏｌ）に溶解させた２－（４－エチル－２－ニトロ－５－チオフェニルフェニル）プロパノール（１７６ｍｇ、５５５μｍｏｌ）を１０分間かけて滴下し、０℃で３時間反応させた。溶媒を減圧留去し、２－（２－ニトロ－４－エチル－５－チオフェニルフェニル）プロピルクロロホルメートの粗精製物を得た。

次いで、化合物１－４（１５０ｍｇ、５５５μｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１ｍｌ）で３回共沸したのち、アルゴン雰囲気下で乾燥ピリジン（２．９６ｍｌ）に溶解させ、－２０℃で１０分間撹拌した。そこへ、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１．８５ｍｌ）に溶解させた２－（２－ニトロ４－エチル－５－チオフェニルフェニル）プロピルクロロホルメートの粗精製物を１０分間かけて滴下したのち、４－ジメチルアミノピリジン（３．３９ｍｇ、２７．８μｍｏｌ）を加え、－２０℃で３時間反応させた。反応液にＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍｌ）を加え、飽和重曹水（５０ｍｌ）、飽和食塩水（５０ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥したのち、溶媒を減圧留去した。その後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳＩ－２５、ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＥｔＯＡｃ）で精製し、化合物１－９（６２．７ｍｇ，１８％）を得た。

経路２：化合物１－８（３．１４ｇ，５．１２ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（３ｍｌ）で３回、乾燥トルエン（３ｍｌ）で３回、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｍｌ）で３回共沸したのち、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１９．０ｍｌ）に溶解させた。そこへ、Ｅｔ_３Ｎ（８．９３ｍｌ、６６．６ｍｍｏｌ）、ＴＭＳＯＴｆ（９．２７ｍｌ、５１．２ｍｍｏｌ）を順に加え、４５℃で６時間反応させた。その後、反応液を４．３Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ水溶液（２３．８ｍｌ）に滴下し、室温で２０分撹拌した。反応液にＣＨ_２Ｃｌ_２（３００ｍｌ）を加え、水（３００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥したのち、溶媒を減圧留去した。次いで、得られた抽出物をＴＨＦ（３４．１ｍｌ）に溶解させ、Ｅｔ_３Ｎ（６．８７ｍｌ、５１．２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミントリヒドロフロリド（１．０８ｍｌ、６．６６ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間反応させた。反応液にトリメチルエトキシシラン（６．２４ｍｌ、３９．９ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分撹拌したのち、溶媒を減圧留去した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳＩ－２５、ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＥｔＯＡｃ）で精製し、化合物１－９（９９０ｍｇ、３２％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 1.05 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.20 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 2.75 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 3.53 (sext, J = 6.5 Hz, 1H), 3.97-4.05 (m, 2H), 4.05-4.09 (m, 1H), 4.10-4.20 (m, 2H), 4.20-4.27 (m, 1H), 4.29-4.38 (m, 1H), 4.50 (q, J = 4.7 Hz, 1H), 5.53 (ddd, J = 13.8, 8.1, 1.7 Hz, 1H), 5.59 (dd, J = 6.2, 2.0 Hz, 1H), 5.84 (t, J = 3.3 Hz, 1H), 6.47 (dd, J = 14.1, 6.6 Hz, 1H), 7.07 (s, 1H), 7.37-7.51 (m, 5H), 7.60 (dd, J = 11.2, 8.1 Hz, 1H), 7.81 (s, 1H), 11.42 (s, 1H).; ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 13.6, 17.1, 25.5, 32.4, 67.0, 68.3, 70.9, 79.2, 80.7, 87.6, 89.4, 102.1, 124.0, 128.4, 128.7, 130.0, 131.6, 132.5, 134.6, 140.5, 141.7, 142.0, 147.8, 150.2, 150.8, 153.9, 162.9.; HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calcd for C₂₉H₃₁N₃NaO₁₀S 636.1622; found 636.1636.

（ｅ）５’－Ｏ－［２－（４－エチル－２－ニトロ－５－チオフェニルフェニル）プロポキシカルボニル］－２’－Ｏ－ビニルウリジン ３’－（２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルホスホルアミダイト）の合成

２－シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイトを使用する経路と、２－シアノエチル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを使用する経路の２通りの手法で合成した。

経路１：化合物１－９（２２８ｍｇ、３７１μｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１ｍｌ）で３回、乾燥トルエン（１ｍｌ）で３回、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍｌ）で３回共沸した。その後、アルゴン雰囲気下で乾燥ＣＨ_３ＣＮ（３．７１ｍｌ）に溶解させ、ジイソプロピルアミン（４１．９μＬ、２９７μｍｏｌ）、１Ｈ－テトラゾール（２１．４ｍｇ、２９７μｍｏｌ）を加え、１分間撹拌したのちに、２－シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１４１μＬ、４４５μｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。次いで、反応溶液にＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍｌ）を加え、飽和重曹水（１００ｍｌ）で５回洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた粗精製物をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｃ－２００、ｎ－ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１％Ｅｔ_３Ｎ含有）で溶出し、目的物を含むフラクションを回収し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をゲル濾過カラムに移し、ＣＨ_３ＣＮを溶出溶媒としてリサイクル分取を行った。その後、粗精製物をジイソプロピルエーテル－ジエチルエーテル（ｖ／ｖ １：２）に溶解させ、２％Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液で５回洗浄し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥後、溶媒を減圧留去することで化合物１－１０（１１６ｍｇ、３９％）を得た。

経路２：化合物１－９（２２８ｍｇ，３７１μｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１ｍｌ）で３回、乾燥トルエン（１ｍｌ）で３回、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍｌ）で３回共沸した。その後、アルゴン雰囲気下で乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（３．７１ｍｌ）に溶解させ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３１０μＬ、１．７８ｍｍｏｌ）、２－シアノチル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（９９μＬ、４４５μｍｏｌ）を順に加え、室温で６時間撹拌した。次いで、反応溶液にＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍｌ）を加え、飽和重曹水（１００ｍｌ）で５回洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた粗精製物をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｃ－２００、ｎ－ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１％Ｅｔ_３Ｎ含有）で溶出し、目的物を含むフラクションを回収し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をゲル濾過カラムに移し、ＣＨ_３ＣＮを溶出溶媒としてリサイクル分取を行った。その後、粗精製物をジイソプロピルエーテル－ジエチルエーテル（ｖ／ｖ １：２）に溶解させ、２％Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液で５回洗浄し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥後、溶媒を減圧留去することで化合物１－１０（１１７ｍｇ、３９％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.03-1.22 (m, 15H), 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 2.56-2.68 (m, 2H), 2.75-2.84 (m, 2H), 3.53-4.20 (m, 9H), 4.23-4.51 (m, 6H), 5.53-5.70 (m, 1H), 5.87-5.90 (m, 1H), 6.46 (ddd, J = 27.0, 14.0, 6.5 Hz, 1H), 6.87 (s, 1H), 7.42 (br-s, 5H), 7.48 (dd, J = 18.6, 8.2 Hz, 1H), 7.67 (br-s, 1H), 9.15 (br-s, 1H).; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 1.1, 8.2, 13.6, 17.2, 20.5, 24.7, 26.2, 29.8, 32.7, 43.5, 58.0, 58.8, 66.0, 69.6, 70.3, 72.3, 79.3, 80.4, 81.1, 89.1, 90.7, 102.9, 117.8, 124.2, 127.3, 129.1, 130.0, 131.9, 133.8, 134.8, 140.0, 141.8, 144.1, 147.8, 150.4, 154.4, 163.1.; ³¹P NMR (161 MHz, CDCl₃) δ 150.7, 150.8, 150,9, 151.0.; HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calcd for C₃₈H₄₈N₅NaO₁₁PS 836.2701; found 836.2712.

（ｆ）［２－シアノエチル ５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－ビニルウリジル］－（３’－５’）－（３’－Ｏ－アセチルチミジン）の合成

化合物１－７（７７．３ｍｇ，１００μｍｏｌ）、３’－Ｏ－アセチルチミジン（２８．４ｍｇ、１００μｍｏｌ）乾燥ピリジン（１ｍｌ）で３回、乾燥トルエン（１ｍｌ）で３回、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍｌ）で３回共沸した。その後、アルゴン雰囲気下で乾燥ＣＨ_３ＣＮ（１．００ｍｌ）に溶解させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｅｖｅｓ ３Ａ（２０．０ｍｇ）を加え、室温で２０分間撹拌したのちに、１Ｈ－テトラゾール（２８．８ｍｇ、４００μｍｏｌ）を加え、室温で３０分間反応させ、中間体化合物１－１１を得た。次いで、反応溶液に５．５Ｍ ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドデカン溶液（３６．４μｌ、２００μｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌したのち、５％Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３水溶液（２ｍｌ）を添加することで反応を停止させた。反応溶液にＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍｌ）を加え、５％Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３水溶液（５０ｍｌ）で３回洗浄し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた粗精製物をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｃ－２００、ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ、１％ピリジン含有）で精製し、化合物１－１２（３７．６ｍｇ、３９％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.88 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 2.08 (d, J = 5.6 Hz, 3H), 2.16-2.42 (m, 2H), 2.48-2.68 (m, 1H), 2.73 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 3.45-3.55 (m, 1H), 3.68 (dd, J = 27.1, 10.3 Hz, 1H), 3.79 (dd, J = 5.5, 1.6 Hz, 6H), 3.91-4.33 (m, 5H), 4.33-4.41 (m, 2H), 4.48 (ddd, J = 13.7, 11.2, 2.3 Hz, 1H), 4.63-4.76 (m, 1H), 5.13-5.33 (m, 3H), 5.97 (dd, J = 21.0, 2.8 Hz, 1H), 6.29 (ddd, J = 31.4, 8.6, 5.8 Hz, 1H), 6.54 (ddd, J = 14.4, 8.1, 6.6 Hz, 1H), 6.81-6.87 (m, 4H), 7.18-7.39 (m, 9H), 7.83 (dd, J = 8.2, 3.5 Hz, 1H), 9.53 (br-d, J = 31.6 Hz, 1H), 9.78 (br-d, J = 22.0 Hz, 1H).; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 12.5, 19.7, 21.0, 36.9, 55.4, 61.2, 62.7, 67.9, 73.7, 73.9, 79.6, 81.6, 82.5, 84.9, 87.6, 87.9, 92.0, 102.9, 111.9, 113.5, 116.3, 127.5, 128.2, 128.4, 130.4, 130.4, 134.8, 135.2, 139.7, 144.0, 150.1, 150.6, 159.0, 163.3, 163.8, 170.6.; ³¹P NMR (161 MHz, CDCl₃) δ -2.7, -2.4.; HRMS (ESI) m/z: [M+Na]⁺ calcd for C₄₇H₅₀N₅NaO₁₆P 994.2882; found 994.2904.

（ｇ）（２’－Ｏ－ビニルウリジル）－（３’－５’）－（３’－Ｏ－アセチルチミジン）の合成

化合物１－１２を出発原料として液相合成する経路と、チミジンユニットが担持された固相担体を出発原料として固相合成する２通りの経路で合成した。

経路１：化合物１－１２（１００ｍｇ、１０３μｍｏｌ）に２８％アンモニア水－ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ １：１、５．００ｍｌ）を加え、室温で３時間撹拌し、０．１Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ水溶液（３ｍｌ）で反応液を希釈し、減圧留去することで化合物１－１３の粗精製物を得た。その後、ｐＨ４．５酢酸水溶液（３ｍｌ）を添加し、４０℃で４時間反応をかけた。次いで、２８％アンモニア水（１ｍｌ）を加えて反応を停止させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＳＩ－２５、ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ、１％Ｅｔ_３Ｎ含有）で精製し、化合物１－１４（３０．０ｍｇ、５１％）を得た。

経路２：５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－デオキシチミジンが担持されたＣＰＧ（１μｍｏｌ）を出発原料として、ＲＮＡ自動合成機を用いて化合物１－１０をカップリングさせることで合成した。鎖伸長サイクルは表１に示すものを適用し、カップリング時間は３０秒もしくは３６０秒で行った。

合成後、固相担体にジオキサン－Ｈ_２Ｏ中の０．１Ｍ ＮａＯＨ（ｖ／ｖ １：１）（１ｍＬ）を加え、室温で５時間撹拌し、固相担体からの切り出しとリン酸部の脱保護を行った。固相担体を濾過により除去したのち、Ｃ－１８ Ｓｅｐ－Ｐａｋカートリッジを用いて脱塩を行った。逆相ＨＰＬＣを用いて精製し化合物１－１４（６３０ｎｍｏｌ、６３％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 1.92 (s, 3H), 2.14-2.34 (m, 2H), 3.88 (qd, J = 12.7, 2.2 Hz, 2H), 3.97-4.01 (m, 1H), 4.04-4.16 (m, 3H), 4.25-4.29 (m, 1H), 4.43 (dd, J = 14.0, 1.8 Hz, 1H), 4.50 (dt, J = 5.9, 3.1 Hz, 1H), 4.61 (br-t, J = 4.0 Hz, 1H), 4.76 (ddd, J = 8.1, 6.2, 5.1 Hz, 1H), 5.67 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.33 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 6.56 (dd, J = 14.0, 6.5 Hz, 1H), 7.81 (br-s, 1H), 8.18 (d, J = 8.1 Hz, 1H).; ³¹P NMR (161 MHz, CD₃OD) δ -0.6.; HRMS (ESI) m/z: [M-H]^- calcd for C₂₁H₂₆N₄O₁₃P 573.1239; found 573.1242.

実施例３：核酸合成条件下におけるＮＭＲを用いたビニル基の安定性試験
実施例１で合成した２’－Ｏ－ビニルウリジンを用いて、ホスホロアミダイト法での合成サイクルの各反応条件における、ビニル基の安定性をＮＭＲを用いて調査し、ビニル基が核酸合成の保護基として使用できるかどうかを確かめた。

化合物１－３（３５．９ｍｇ，７０．０μｍｏｌ）もしくは化合物１－４（１８．９ｍｇ，７０．０μｍｏｌ）に以下に示す試薬と重溶媒（７００μｌ）を加え、充分撹拌したのち、反応液をＮＭＲチューブに移し、試薬添加後５／１０／１５／２０／３０分、１／６／１２／２４時間の各時間で^１Ｈ ＮＭＲを測定した。但し、ＵＶ照射実験では、ミクロチューブへ入れた反応液にＬＥＤレーザーを底から２ｍｍの距離から照射し、２／４／６／１２／２４時間ごとにＮＭＲチューブへ移して測定した。３６５ｎｍレーザー強度：ＬＥＤ照射口から２ｍｍで９１ｍＷ／ｃｍ^２、Ｆｉｂｅｒ－Ｃｏｕｐｌｅｄ ＬＥＤ、３６５ｎｍ Ｍ３６５ＦＰ１（ＴＨＯＲ ＬＡＢＳ）。

下記の表２に示される各試薬におけるビニル基の安定性を示す各^１Ｈ ＮＭＲチャートを示さないが、安定性を評価した結果を同表にまとめた。

実施例４：ヌクレオチド二量体におけるビニル基の脱保護評価
実施例２で合成した化合物１－１４（１１．０μｇ、１９．２ｎｍｏｌ）にｐＨ３．０／３．５／４．０／５．０酢酸水溶液（１ｍｌ）もしくは水（１ｍｌ）を加え、６０℃に加熱した。その後、試薬投入直後／１５／３０分、１／２／４／８／２４時間後に４０μｌずつ分注し、０．１Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ水溶液（８０μｌ）で希釈した。次いで、分注したサンプルを逆相ＨＰＬＣで分析をし、化合物１－１４、１－１５のピーク面積比からビニル基脱保護の割合を算出した（図１参照）。

上記のＨＰＬＣ結果から算出した、各ｐＨにおける脱保護割合（化合物１－１４の減少率）をプロットしたグラフを図２に示す。

６０℃でｐＨを変化させた結果から、ｐＨ３．０では２時間以内に、ｐＨ３．５では８時間以内、ｐＨ４．０では２４時間以内に脱保護が完了し、ｐＨ５．０では２４時間で８割程度しか脱保護できないことがわかった（図２左）。このことから、ｐＨが３から５の間ではｐＨが低いほど早く脱保護され、その速度はｐＨが４．０よりも高い場合極端に下がるといえる。これまでＦｉｆｅによってビニルエーテルの加水分解のｐＨ依存性を調査した際にも、同様の反応速度変化をしていた（Fife, T. H. J. Am. Chem. Soc. 1965, 87, 1084-1089）ことからこの結果が妥当であると考えられる。このとき、ｐＨ５．０の条件よりも水を加えた条件の方が早く脱保護されている。これはヌクレオチド二量体のリン酸基由来の水素イオンによって、系中のｐＨが低くなったためであると考えられる。

さらに、ｐＨ３．０で温度を変化させた結果では、６０℃で２時間以内に脱保護が完了するのに対し、４５℃では８時間程度かかることがわかる（図２右）。このことから、４５－６０℃の間では温度が高いほど早く脱保護され、Ｋｒｅｓｇｅらの報告（Kresge, A. J.; Chiang, Y. J. Chem. Soc. B. Phys. Org. 1967, 58-61）と同様にビニル基の加水分解には熱依存性があるといえる。

以上より、ｐＨ ．０、６０℃の条件においてビニル基は最も早く脱保護され、２時間以内に反応が完結することがわかった。ビニル基は、過去に報告されてきたＴＢＤＭＳ基（Ｂｕ_４ＮＦ ４ｈ）やＣＥＭ基（Ｂｕ_４ＮＦ ５ｈ）、ＴＯＭ基（Ｂｕ_４ＮＦ ５ｈ以上）などと比べ、短時間で脱保護可能であるといえる。また、ＡＬＥ基（ＮＨ_２ＮＨ_２－Ｈ_２Ｏ １ｈ）等の比較的短時間で脱保護可能な保護基と同等の速度かつ、穏和な条件で反応が完結する有用な保護基である。

実施例５：ビニル基脱保護時のリン酸ジエステル結合の転位及び切断反応検証
オリゴヌクレオチドの２’－水酸基保護脱保護時に強い酸性または塩基性条件に晒すと、ヌクレオチド鎖切断やリン酸ジエステル結合の転位反応が起きることが知られている。一般的に、ｐＨ３－７の間であれば、そのような副反応は起きないとされているが、実際にどのような挙動を示すかは、基質によって異なるはずである。本実施例では、ビニル基を脱保護した際に副反応が起こらないかを酵素実験とＮＭＲによって調査した。

（１）ヌクレアーゼＰ_１を用いたリン酸ジエステル結合の転位反応検証
ヌクレアーゼＰ_１を用いてビニル基脱保護時の転位反応の有無を検証した。ヌクレアーゼＰ_１は３’－５’リン酸ジエステル結合のみを特異的に切断するヌクレアーゼで、ビニル基脱保護時に転位反応が起きて２’－５’結合が生成していた場合、ヌクレアーゼ活性は作用せず、転移化合物１－１５－２’が残存すると考えられる（下記参照）。

化合物１－１４（１１．０μｇ，１９．２ｎｍｏｌ）にｐＨ３．０酢酸水溶液（１ｍｌ）を加え、６０℃で反応させた。３時間後に反応液へ０．１Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ水溶液（２ｍｌ）を加え、溶媒を減圧留去し、化合物１－１５の粗精製物を得た。その後、化合物１－１５（４．３６μｇ、７．６８ｎｍｏｌ）にＲＮａｓｅ不含水（２４７μｌ）、５００ｍＭ ＮａＯＡｃ水溶液（２．５０μｌ）、ヌクレアーゼＰ_１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）（５０．０Ｕ、０．５００μｌ）を順に加え、３７℃で１６時間反応させた。ついで、７５℃で１０分間加熱しヌクレアーゼＰ_１を失活させ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５（３Ｋ）（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ Ｉｎｃ．）を用いて酵素の除去および脱塩を行った。得られた残渣を逆相ＨＰＬＣにて解析をすることで転位反応の有無を評価した（図３参照）。

化合物１－１５のピークがヌクレアーゼＰ_１による処理をすることで消失していることが確認できる。また、ヌクレアーゼＰ_１を加えた後にＴＴＰとウリジンと考えられる２つのピークの出現が観察できる。このことから、化合物１－１４をｐＨ３．０の酢酸水溶液で処理した場合、リン酸ジエステル結合の転位を起こさずに、ビニル基の脱保護が完了することが示唆された。

（２）ＮＭＲを用いたリン酸ジエステル結合の転位及び切断反応検証
次に、ビニル基脱保護時の副反応について、ＮＭＲを用いて検証を行った。上記酵素実験の場合と同様に、化合物１－１４（１０ｍｇ，１７．４μｍｏｌ）にｐＨ３．０酢酸水溶液（３ｍｌ）を加え、６０℃で撹拌した。その後、３／８／２４時間後に１ｍｌずつ分注し、２８％アンモニア水（５００μｌ）を加えて反応を停止させた。分注をサンプルの溶媒を減圧留去したのちに、^１Ｈ、^３１Ｐ ＮＭＲ測定をすることで転位反応の有無を評価した（図４参照）。

^１Ｈ ＮＭＲの結果では、化合物１－１４で確認できたビニル基の－ＣＨ＝Ｃのピークが３時間後に消失していることや、その他の箇所に転位や鎖切断を起こしたようなピークが確認できないことがわかる。また、^３１Ｐ ＮＭＲの結果からも、ピークがそれぞれ１本ずつしか観測できないことから、転位や鎖切断などの副反応は起きていないと考えられる。

以上より、ｐＨ３．０の酢酸水溶液であれば、リン酸ジエステル結合の転位やヌクレオチチド鎖切断等の副反応を起こさずに、ビニル基を脱保護可能であると結論づけられる。この結果は、Ｋｏｓｏｎｅｎらにより調査された、リン酸ジエステル結合の転位と鎖切断が起きるｐＨ（＜１．５）（Kosonen, M.; Hakala, K.; Lonnberg, H. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1998, 3, 663-670）と比較しても妥当であるといえる。

本発明は、新規に開発した２’位をビニル基で保護したＲＮＡホスホロアミダイトユニットを用いることによって、高収率、高純度かつ低コストで長鎖核酸を得ることができるため、医薬や汎用性の高い分子ツールとして応用することができる。

本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参考により全体として本明細書中に援用される。なお、例示の目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。

Claims (6)

1. ホスホロアミダイト法に基づく核酸の化学合成に使用するための、２’位がビニル基で保護されたヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体。
2. 下記式：
   〔式中、
   Ｂは、天然核酸塩基又は保護基で保護された天然核酸塩基であり；
   Ｒ_１は、水素原子又は水酸基の保護基であり；
   Ｒ_２は、－Ｎ（Ｒ_４）_２（式中、Ｒ_４は、独立して、Ｃ_１～６アルキル基、または窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択される３個までのヘテロ原子を有する４～７員環のへテロシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルケニルである）、モルホリノ基、又はジアルキルアミノ基であり；
   Ｒ_３は、２－シアノエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、ニトロフェニルエチル基、又は２－ニトロエチル基である〕
   で表される、請求項１に記載のヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体。
3. Ｂが、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシルからなる群から選択される、請求項２に記載のヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体。
4. ホスホロアミダイト法に基づく核酸の化学合成において、請求項１～３のいずれか１項に記載されるヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体を用いることを含む、長鎖核酸を合成する方法。
5. （ａ）固相担体に結合させたヌクレオシドの５’又は３’水酸基を酸処理により除去する工程；
   （ｂ）請求項１～３のいずれか１項に記載のヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体を酸触媒で活性化し、縮合反応により固相担体上のヌクレオシドの５’又は３’水酸基と三価リン酸結合により連結させる工程；
   （ｃ）未反応の該５’又は３’水酸基をキャッピングする工程；及び
   （ｄ）該三価リン酸結合を酸化する工程
   を含む反応サイクルを反復的に行うことを含む、請求項４に記載の長鎖核酸を合成する方法。
6. 核酸がＲＮＡである、請求項４又は５に記載の長鎖核酸を合成する方法。

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