KR100228606B1 - 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DNA 및 RNA의 화학적 합성에 있어 염기에 불안정한 5'-하이드록실 보호 그룹으로서의 단실에톡시카보닐 그룹의 용도 및 적절한 합성 방법에 관한 것이다.
단실 보호 그룹의 감지가 용이하고 부반응 없이도 뉴클레오트디의 당 잔기로부터의 제거가 용이하다면 올리고뉴클레오티드를 매우 소량에서도 고수율로 합성할 수 있다.

Description

올리고뉴클레오티드의 화학적 합성방법
모노뉴클레오티드의 화학적 중축합은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 제조시 중요한 방법이다.
DNA 또는 RNA의 화학적 합성시 근본적인 문제는 뉴클레오시드의 염기 및 당 잔기상의 아미노 및 하이드록실 그룹에 대한 적절한 보호 그룹을 찾는 것이다. 이러한 보호 그룹은 한편으로. 중축합 반응 조건하 즉, 포스포디에스테르 결합 형성 동안 안정해야 하며, 다른 한편으로, 포스포디에스테르 결합의 절단없이도 반응 말기에 다시 제거 가능할 정도로 충분히 불안정해야 한다(참조 : H.G. Khorana; Pure Appl. Chem. 17 (1968) 349).
RNA의 화학적 합성은 이의 리보오스 당 잔기에 2개의 하이드록실 그룹이 있고, 이들 모두가 보호되어야만 한다는 점에서 특히 어렵다. 더욱이, 각각의 중축합 단계전, 5'-하이드록실 그룹에 대한 보호 그룹은 다시 선택적으로 즉, 2'-하이드록실 보호 그룹의 제거없이, 제거되어야만 한다. 다른 한편으로, 2'-하이드록실 그룹에 대한 보호 그룹은, 특히 포스포디에스테르 결합의 특정의 절단 또는 이성체화를 수반하지 않는 조건하에 단지 RNA 합성 말기에 제거되어야 한다[참조; C.B. Reese, Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol 3, F. Eckstein & D.M.J. Lilley eds., Springer-Verlag, Weinheim].
2'-하이드록실 보호 그룹을 제거하지 않으면서 5'-하이드록실 보호 그룹을 선택적으로 제거하기 위한 한가지 시도는 염기에 불안정한 5'-하이드록실 보호 그룹을 산에 불안정한 2'-하이드록실 보호 그룹과 결합시킴으로써 달성될 수 있다[참조: Chr. Lehmann et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 2379-2390, No. 7]. 염기에 불안정한 5'-하이드록실 보호 그룹의 사용은 또한 DNA 합성시에도 유리한데, 이는 일반적으로 합성시 이미 형성된 포스포디- 및 -트리 에스테르 결합이 약한 비산성 가수분해 조건하에서 절단되지 않기 때문이다. 게다가. 문헌[참조: E. Sonveaux (1986), Bioorganic Chemistry 14, 286]에 기재된 바와 같이 뉴클레오티드의 탈퓨린화가 약한 비산성 가수 분해 조건하에서는 일어나지 않는다. DNA 뿐만 아니라 RNA 합성시 5'-하이드록실 보호 그룹에 또한 요구되는 것을 이 보호 그룹이 쉽게 포착될 수 있으며 고도로 감응성이어야 한다는 것이다. 이 방법을 통해, 각 반응단계에서의 전환율이 특히 우수해 질 수 있으며, 가능한 한 완전히 전환될 수 있다. 이로써 긴 올리고뉴클레오티드를 고수율로 제조할 수 있게 되었다. 또한, 이로써 나노몰(nM) 내지 피코몰(pM) 범위의 적은 양의 반응 혼합물을 사용하여 반응을 수행할 수 있게 되었다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러, 단실에톡시카보닐 그룹(Dans-EOC)이 화학적 올리고뉴클레오티드 합성시 염기에 불안정한 5'-하이드록실 보호 그룹으로서 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 다음에 관한 것이다;
1. 구조식(II)의 화합물을 클로로카보닐 공여체와 반응시킴을 포함하여 구조식(I)의 화합물을 제조하는 방법.
2. 일반식(IIIa) 또는 일반식(IIIb)의 화합물.
상기 식에서 R1은 수소이거나, 서로 독립적으로 구조식
의 그룹이고, B는
[여기서, R2는 각각의 경우, 서로 독립적으로 구조식
의 그룹이고, R3은 수소 또는이며, R4는또는이고, R5는 -OH 또는이고, Y는 H 또는 알킬(C1-C4), 특히 CH3, 또는이다]이다.
3. 구조식(I)의 화합물을 염기, 바람직하게는 피리딘, 또는 테트라하이드로푸란, 디옥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및/또는 아세토니트릴 및 하기 일반식(A)의 화합물로 이루어진 혼합물의 존재하에 일반식(IVa) 또는 일반식(IVb)의 적절한 화합물과 반응시켜 일반식(IIIa) 또는 일반식(IIIb)의 화합물을 제조하는 방법.
상기 식에서, R1및 B는 위에서 정의한 바와 같고. R20, R21및 R22는 동일하거나 독립적으로 상이하며. 수소 또는 C1-C4-알킬 그룹, 바람직하게는 트리메틸. 트리에틸 또는 디이소프로필 그룹이다.
4. 일반식 (Va) 또는 일반식 (Vb)의 화합물.
상기식에서, DancEOC, R1및 B는 위에서 정의한 바와 같고, R6및 R7은 동일하거나 독립적으로 상이하며 C1-C8-알킬, 바람직하게는 이소 프로필 또는 C5-C12, 바람직하게는 C8이하의 사이클로알킬 그룹, 벤질 또는 페닐 그룹이거나, 이들이 결합된 질소원자와 함께, 추가의 헤테로 원자와 치환체를 함유하거나 함유하지 않는 포화되거나 불포화된 헤테로사이클릭 환이며, R8은 구조식또는 CH3의 그룹, 또는 치환되지 않거나 서로 독립적으로, 할로겐, C1-C4-알킬, 니트로, 메톡시 또는 카복실 그룹에 의해 1회 이상 환-치환된 벤질 그룹, 바람직하게는 치환되지 않은 벤질 그룹 이다.
5. 일반식 (IIIa) 또는 일반식 (IIIb)의 화합물을, 일반식 (VI)의 Z가 염소인 경우 염기, 바람직하게는 피리딘 또는 테트라하이드로푸란, 디옥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및/또는 아세토니트릴과 C1-C4-트리 알킬아민, 바람직하게는 트리메틸-, 트리에틸- 또는 디이소프로필 에틸아민과의 혼합물의 존재하에 일반식(VI)의 화합물과 반응시키거나, 또는 일반식(VI)의 Z가 일반식 -NR9R10의 라디칼인 경우, 일반식(B)의 화합물 또는 테트라졸, 바람직하게는 테트라졸의 존재하에 일반식(VI)의 화합물 반응시켜 일반식(Va)또는 일반식 (Vb)의 화합물을 제조하는 방법.
상기식에서, R6, R7및 R8은 위에서 정의한 바와 같고, Z는 염소 또는 브롬이거나 일반식 -NR9R10의 라디칼(여기서, R9및 R10은 서로 독립적으로 R6의 정의와 동일하다)이며 R11, R12및 R13은 동일하거나 독립적으로 상이하고, C1-C4-알킬 그룹이며, X는 할로겐, 특히 염소이다.
6. 일반식 (Va) 또는 일반식 (Vb)의 화합물을, (1) 일반식 (VIIa) 또는 일반식 (VIIb)의 화합물과 반응시키는 단계, (2) 생성된 화합물을 산화시키는 단계, (3) 단실에톡시카보닐 그룹을 제거하는 단계, (4) 생성된 화합물을 일반식(Va) 또는 일반식(Vb)의 화합물과 반응시키는 단계 및 (5) 필요한 쇄 길이 가 수득될 때까지 단계 (2) 내지 (4)를 반복하는 단계를 포함하여, 일반식 (Va) 및/또는 일반식 (Vb)의 화합물로부터 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법.
상기식에서, B 및 R1은 위에서 정의한 바와 같고, G는 R1과 동일하거나 일반식(VIIa) 또는 일반식(VIIb)의 화합물의 2'- 하이드록실 또는 3'-하이드록실 그룹을 통해 결합된 중합체성 지지체이다.
7. 일반식 (VIIIa) 또는 일반식(VIIIb)의 화합물.
상기식에서 DansEOC, R1및 B는 위에서 정의한 바와 같고, K(+)는 양이온, 특히 [HN(C2H5)3](+)이다.
8. 일반식 (IIIa) 또는 일반식 (IIIb)의 화합물을 일반식 (IX)의 화합물과 염기의 존재하에 반응시켜 일반식(VIIIa) 또는 일반식(VIIIb)의 화합물을 제조하는 방법.
상기식에서, R14, R15및 R16은 동일하거나 독립적으로 상이하고, 수소 또는 Cl-C8-알킬, C1-C8-플루오로알킬 또는 아릴 그룹 바람직하게는 2,2,2 - 트리플루오로에틸. 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로필, 에틸 또는 페닐 그룹이다.
9. 일반식(IIIa) 또는 일반식(IIIb)의 화합물을 염기의 존재하에 일반식 (X)의 화합물과 반응시킨 다음, 가수분해시켜 일반식(VIIIa) 또는 일반식 (VIIIb)의 화합물을 제조하는 방법.
상기식에서, R17, R18및 R19는 동일하거나 독립적으로 상이하고, 염소, 브롬 또는 C1-C8-알킬아미노 또는 1, 2, 4 - 트리아졸 그룹, 바람직하게는 1, 2, 4-트리아졸릴 그룹이다.
10. 일반식 (VIIIa) 또는 일반식 (VIIIb)의 화합물을 일반식 (VIIa) 또는 일반식(VIIb)의 화합물과 반응시키는 단계(1), 단실에톡시카보닐 그룹을 제거하는 단계(2), 생성된 화합물을 일반식(VIIIa)또는 일반식(VIIIb)의 화합물과 반응시키는 단계(3), 필요한 쇄 길이가 수득될 때까지 단계(2) 및 (3)을 반복하는 단계(4) 및 생성된 올리고뉴클레오티드를 산화시키는 단계(5)를 포함하여, 일반식 (VIIIa) 및/또는 일반식 (VIIIb)의 화합물로부터 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법 .
단실에톡시카보닐 그룹을 뉴클레오시드에 도입하기 위해, 2-단실에틸클로로포르메이트 하이드로클로라이드를 뉴클레오시드에 따라 뉴클레오시드 염기 중 아미노 및 하이드록실 그룹이 적합한 그룹에 의해 보호된 뉴클레오시드와 반응시킨다. 아데닌의 6-아미노 그룹에 대한 적합한 보호 그룹의 예는 t-부틸옥시카보닐, 벤조일, 4-(t-부틸)벤조일 또는 파라-니트로페닐에틸옥시카보닐 그룹, 특히 벤조일 또는 파라-니트로페닐에틸옥시카보닐 그룹이다.
구아닌의 2-아미노 그룹에 대한 적절한 보호 그룹의 예는 이소부티릴, 4-(t-부틸)페 닐아세틸 또는 파라-니트로페닐에틸옥시카보닐 그룹, 특히 이소부티릴 또는 파라-니트로페닐에틸옥시카보닐 그룹이다. 구아닌의 6-하이드록실 그룹 및 우라실의 4-하이드록실 그룹은 일반적으로 보호되지 않은 상태로 남아 있거나 파라-니트로페닐에틸 그룹에 의해 보호된다. 사이토신의 경우, 4-아미노 그룹은, 예를 들어, 벤조일, 4-(t-부틸)벤조일 또는 파라-니트로페닐에틸옥시카보닐 그룹, 특히 벤조일 또는 파라-니트로페닐에틸옥시카보닐 그룹에 의해 보호된다. 티미딘은 일반적으로 보호되지 않는 상태로 남는다. 우리딘의 3-N그룹은, 예를 들어, Boc 또는 아미소일 그룹에 의해 보호된다.
천연의 뉴클레오시드 염기 대신에 이의 아미노 또는 하이드록실 그룹이 상술된 보호 그룹에 의해 동일한 방법으로 보호될 수 있는 변형된 뉴클레오시드를 사용할 수 있다. 변형된 염기를 갖는 뉴클레오시드의 예는 이노신, 8-아자-7-데아자아데노신, 투베르시딘, 네불라린, 크산토신, 2-아미노아데노신 또는 피리도피리미딘 뉴클레오시드이다. 뉴클레오시드를 구입할 수 있고 각각의 보호 그룹의 도입은, 예를 들어, 문헌[참조: C. Lehmann et al.(1989), C.B. Beese (1989), "The Chemical Synthesis of O1igo and Polyribonucleotides", Nucleic Acids and Molecular Biology 3, F. Eckstein & D.M.J. Lilley (eds.), Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, E. Sonveaux (1986), Bioorganic Chemistry 14, 274-325 또는 E. Uhlmann and, A. Peyman(1990), Chenlical Reviews 90, 543-584, No. 4.]의 방법에 의해 수행될 수 있다.
리보뉴클레오티드가 사용되는 경우, 뉴클레오티드 염기의 하이드록실 및 아미노 그룹외에, 리보오스 잔기의 2'-하이드록실 그룹을 보호할 필요가 있다. 상술된 바와 같이, RNA를 합성하기 위해 5'-하이드록실 및 2'-하이드록실 보호 그룹의 적당한 조합을 선택함으로써, 2'-하이드록실 보호 그룹을 제거하지 않고 5'-하이드록실 보호 그룹을 선택적으로 제거하는 것은 중요하다.
본 발명에 이르러 산에 불안정한 2'-하이드록실 보호 그룹의 존재하에 비산성 조건하에서 5'-하이드록실 보호 그룹인 단실에톡시카보닐 그룹을 선택적으로 제거할 수 있게 되었다. 사용될 수 있는 산에 불안정한 2'-하이드록실 보호 그룹의 예는 4-메톡시-4-테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로피라닐, 1-부틸디메틸실릴, 2-니트로벤질, 1-(2-클로로-4-메틸페닐)-4-메톡시 -4-피페리디닐 또는 1-(2-플루오로페닐)-4-메톡시-4-피페리디닐 그룹이다. 단실에톡시카보닐 그룹은 바람직하게는 DBU(=1,5-디아자비사이클로[5.4.0] 운데크-5-엔)의 1 내지 3몰 당량, 바람직하게는 1.5 내지 2.5몰 당량의 비양성자성 극성 용매, 특히 아세토니트릴 또는 피리딘속에서 제거된다. 또 다른 방법으로서 염기 [예 : TMG(=Nl, N1, N2, N2테트라메틸구아니딘)] 또는 C1-C4-트리알킬아민(예 : 트리에틸아민)을 사용할 수 있다.
2-단실에틸 클로로포르메이트 하이드로클로라이드는, 비양성자성 극성 용매의 존재하에, 2-단실에탄올과 클로로카보닐 공여체 [예 : 트리클로로메틸 클로로포르메이트, (디포스겐) 및/또는 포스겐, 바람직하게는 트리클로로메틸 클로로포르메이트]를 반응시킴으로써 리보오스 또는 데옥시리보오스의 5'-하이드록실 보호 그룹에 대한 출발물질로서 제조된다. 바람직한 양태에서, 반응은 단일 비양성자성 극성 용매, 특히 아세토니트릴의 존재하에 수행된다. 2-단실에탄올 대 클로로카보닐 공여체의 몰비는 0.5 내지 1대 1 내지 2, 바람직하게는 1 대 1 내지 2, 특히 1 대 1.5 내지 2 이다. 반응온도는 -20내지 반응 혼합물의 비점, 바람직하게는 -5 내지 20, 특히 0 내지 5이다.
본 발명에 따르는 방법으로 조성이 원소분석으로 확인된 순수한 생성물로서 2-단실에틸 클로로포르메이트 하이드로클로라이드가 수득된다. 문헌[참조: A. Takadate et al.(1983) Yakugaku Zasshi 103, 982-966]에 의하면, 2-단실에탄올을 트리클로로메틸 클로로포르메이트와 반응시킴으로써 융점이 상기 방법에서 합성된 생성물보다 낮은, 약 20인 생성물이 수득되기 때문에 놀랍다. 2-단실에탄올은, 예를 들어, 문헌[참조: S. Goya et al (1981) Yakugaku Zasshi 101, 1164]의 방법으로 제조될 수 있다.
2-단실에틸 클로로포르메이트 하이드로클로라이드와 보호된 뉴클레오시드와의 반응은, 예를 들어, 염기의 존재하에 문헌[참조: C. Lehmann et al.(1989)]의 방법으로 9-플루오레닐메톡시카보닐 클로라이드와 반응시키는 것과 유사하다. 염기로서 적합한 것은 유기 염기, 특히 피리딘, 또는 테트라하이드로푸란, 디옥산, 메틸렌클로라이드, 클로로포름 및/또는 아세토니트릴 및 일반식 (4)의 화합물로 이루어진 혼합물이다.
상기식에서, R20, R21및 R22는 동일하거나 독립적으로 상이하고, 수소 또는 C1-C4-알킬, 바람직하게는 트리메틸, 트리에틸 또는 디이소프로필 그룹이다.
따라서, 사용된 물질이 2'-보호된 리보뉴클레오시드인 경우, 단실에틸옥시카보닐-리보뉴클레오시드와 부산물로서 비스-단실에틸옥시카보닐-리보뉴클레오시드로 이루어진 생성물의 혼합물이 수득된다. 상기 생성물의 혼합물은 후속 인산화 반응에 직접적으로 사용될 수 있다 혼합물을, 예를 들어, 섬광 크로마토그라피로 정제하는 것이 가능하고 바람직하다. 제거된 비스-단실에틸옥시카보닐-리보뉴클레오시드는, 예를 들어, DBU를 사용하여 단실화 반응용 출발물질로서 사용될 수 있는 단실-유리 리보뉴클레오시드로 계속 분해될 수 있다.
예를 들어, 트리- 또는 테트라아데닐레이트로서, 단백질 생합성을 억제하는 2',5'-결합된 올리고리보뉴클레오티드를 합성하기 위해 [참조: Kerr, I M & Brown, R. E. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 256-260], 상기 기술에 따라 보호되고 유리 2'-하이드록실 그룹을 갖는 뉴클레오시드를 2-단실에틸 클로로포르메이트 하이드로클로라이드와 유사한 방법으로서 반응시킬 수 있다.
당 잔기상에서 유리된 2'- 또는 3'-하이드록실 그룹을 갖는 단실화 뉴클레오시드는 일반적으로 포스피틸화된다. 포스피틸화제로서, 예를 들어 일반식(VI)의 화합물을 사용할 수 있다.
상기식에서, R6및 R7은 동일하거나 독립적으로 상이하고 C1-C8-알킬, 바람직하게는 이소프로필 또는 C5-C12, 바람직하게는 C8이하의 사이클로알킬 그룹, 벤질 또는 페닐 그룹이거나, 이들이 결합된 질소원자와 함께, 추가의 헤테로 원자 및 치환체를 함유하거나 함유하지 않는, 포하되거나 불포화된 헤테로사이클릭 환이며,
R8은 구조식또는 CH3의 그룹 또는 치환되지 않거나, 치환체는 서로 독립적으로, 할로겐, C1-C1-알킬, 니트로, 메톡시 또는 카복실 그룹에 의해 1회 이상 환-치환된 벤질 그룹, 바람직하게는 치환되지 않은 벤질 그룹이고, Z는 염소, 브롬 또는 일반식 -NR9R10의 라디칼(여기서 R9및 R10은 동일하거나 독립적으로 상이하고, C1-C8-알킬, 바람직하게는 이소프로필 또는 C5-C12, 바람직하게는 C8이하의 사이클로알킬 그룹, 벤질 또는 페닐 그룹이다)이다.
포스피틸화제로 바람직하게는 사용되는 화합물은 Z가 염소이고, R6및 R7이 각각 이소프로필 라디칼이며, R8이 구조식의 그룹인 일반식 (VII)의 화합물이다. 반응은 일반적으로 1 내지 8몰 당량, 바람직하게는 1내지 6몰 당량, 특히 1내지 4몰 당량의 유기 염기[예: 피리딘 또는 테트라하이드로푸란(THF), 디옥산, 메틸렌클로라이드, 클로로포름 및/또는 아세토니트릴의 혼합물 및 C1-C4-트리알킬아민, 바람직하게는 트리 메틸-, 트리에틸- 또는 디이소프로필 에틸-아민의 혼합물]의 존재하에 유기 용매(예: 테트라하이드로푸란 또는 메틸렌 클로라이드, 바람직하게는 메틸렌 클로라이드) 속에서 수행한다. Z가 일반식 -NR9R10의 라디칼인 경우, 반응은 바람직하게는 일반식 [HNR11R12R13](+)X(-)(B)의 화합물(여기서, R11, R12및 R13은 동일하거나 독립적으로 상이하고, C1-C4-알킬 그룹이며, X(-)는 할라이드, 특히 클로라이드 또는 테트라졸리드이다) 또는 테트라졸의 존재하, 바람직하게는 테트라졸의 존재하에 수행한다. 단실화 뉴클레오시드 대 포스피틸화제의 몰비는 1 대 1 내지 4, 바람직하게는 1 대 2 내지 4, 특히 1 대 2.5 내지 3.5 이다.
상기 방법으로 수득된 일반식(Va) 또는 일반식(Vb)의 화합물은 올리고 뉴클레오티드 합성을 위해 계속 사용될 수 있다. 여기에서, 뉴클레오티드의 당 잔기는 DNA합성용 데옥시리보오스 및 RNA합성용 리보오스이나, 규칙적으로 또는 불규칙적으로 배열된 데옥시리보오스 및 리보오스 당 잔기로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 데옥시리보오스와 리보오스의 혼합물도 또한 사용할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 일반식(Va) 및 일반식 (Vb)의 모노뉴클레모티드로 이루어진 규칙적이거나 불규칙적인 구조를 가질 수 있다. 올리고- 및 폴리-뉴클레오티드 합성은 문헌[참조: Chr. Lehmann et al.(1989)]에 기재된 포스포르아미디트 방법과 유사한 방법으로 수행될 수 있다.
올리고뉴클레오티드를 합성하는 데는 원칙적으로 2가지의 가능한 방법이 있다. 하나는, 합성을, 예를 들어, 문헌[참조, C.B Reese (1989), "The Chemical Synthesis of O1igo and Polyribonucleotides", Nucleic Acids and Molecular Biology 3, F. Eckstein & D.M.J. Lilley, eds., 3, 164-181]에 기재된 방법으로 용액 속에서 수행하는 것이다.
다른 하나는, 올리고뉴클레오티드 합성을 고형상, 예를 들어, 뉴클레오시드-작용화된 유리 [참조. K.P. Stengele & W. Pfleiderer (1989) Nucleic Acids Res. SymP. Ser. 21, 101, K.P. Stengele & W. Pfleiderer (1990) Tetrahedron Lett. 31, 2549 또는 Chr. Lehmann et al. (1989) Nucleic. Acids Res. 17, 2379-2390, No. 7]위에서 수행하는 것이다. 일반적으로 고형상 합성이 바람직한 방법이다.
상기 방법을 수행하기 위해, 다음의 반응 순서를 선택하는 것이 바람직하다:
1. 일반식 (Va) 또는 일반식 (Vb)의 화합물을 일반식 (VIIa) 또는 일반식 (VIIb)의 뉴클레오시드와 약산, 예를 들어, 테트라졸 또는 p-니트로페닐테트라졸의 존재하에 반응시키는 단계.
상기식에서, B 및 R1은 위에서 정의한 바와 같고, G 는 R1과 동일하거나 일반식(VIIa) 또는 (Vllb)의 화합물의 2'-하이드록실 또는 3'-하이드록실 그룹을 통해 결합된 중합체성 지지체이다.
2. 일반식 (VIIa) 또는 일반식 (VIIb)의 미반응 화합물을 무수 아세트산으로 트랩핑 (trapping)하는 단계.
3. 예를 들어, 요오드. 황 또는 요오드/아민을 사용하여 인산염, 포스포르아미데이트 또는 티오인산염으로 산화시키는 단계.
4. 단실에톡시카보닐 그룹을, 예를 들어, 아세토니트릴 중의 DBU를 사용하여 제거하는 단계.
5. 생성된 지지체 결합된 화합물을 일반식(Va) 또는 일반식(Vb)의 화합물과 반응시키는 단계.
6. 필요한 쇄 길이의 올리고뉴클레오티드를 수득하기 위해 반응 단계 2 내지 6을 반복하는 단계.
일반식 (Va) 또는 일반식(Vb) 및 일반식 (VIIa) 또는 일반식(VIIb)의 화합물을 바람직하게는 예를 들어, 약산인 테트라졸 또는 파라-니트로페닐테트라졸의 존재하에 -20 내지 100, 특히 실온에서 반응시킨다. 산화는 요오드, 황 또는 아민 존재하의 요오드의 존재하에 -80 내지 100, 바람직하게는 -20 내지 60의 온도에서 수행된다[참조: A. Jager et al ., Biochemistry 27, 7237 (1988)]. 요오드, 물 및 유기 염기(예 : 루티딘 또는 피리딘)의 혼합물이 사용되는 경우, 산화는 바람직하게는 실온에서 수행된다. 한편 황 원자, 톨루엔 및 유기 염기의 혼합물이 사용되는 경우, 산화는 바람직하게는 60에서 수행된다.
합성된 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 2 내지 약 200개, 바람직하게는 2 내지 100개, 특히 2 내지 20개의 모노뉴클레오티드로 구성된다. 포스피틸화의 또다른 방법으로서, 당 잔기에 여전히 유리된 2'-또는 3'-하이드록실 그룹을 갖는 단실화된 뉴클레오시드를 또한 일반식(VIIIa) 또는 일반식(VIIIb)의 H-포스포네이트로 전환시킬 수 있다[참조. R. Stromberg, Chem. Commun. 1987, 1; B.C. Froehler, P. G. Ng, M. D. Matteucci, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 5399; M. Tahalu et al., Chem. Lett 1988. 1675].
상기식에서, DansEOC, R1및 B는 위에서 정의한 바와 같고, K(+)는 양이온, 특히 [NH(C2H5)3](+)이다.
이는 일반적으로 일반식(IIIa) 또는 일반식(IIIb)의 화합물과 일반식 (IX) 또는 일반식 (X)의 화합물과의 반응을 수반한다.
상기식에서, R14, R15및 R16은 동일하거나 독립적으로 상이하고, 수소 또는 C1-C8-알킬, C1-C8-플루오로알킬 또는 아릴 그룹이며, R17, R18및 R19는 동일하거나 독립적으로 상이하고, 염소, 브롬 또는 C1-C8-알킬아미노 또는 1,2,4-트리아졸릴 그룹이다.
단실화된 뉴클레오시드는 바람직하게는 비스(2,2,2-트리플루오로에틸) H-포스포네이트, 비스(1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로필) H-포스포네이트, 트리에틸 포스파이트, 트리페닐 포스파이트, PCl3, 트리(디 알킬아미노)포스핀 또는 트리스(1,2,4-트리아졸릴)포스파이트, 바람직하게는 트리스(1,2,4-트리아졸릴)포스파이트와 반응시키고, 특히 바람직하게는 이미다졸/ 트리에틸아민으로 활성화시키고 계속 H-포스포네이트로 가수분해 시킨후, PCl3와 반응 시킨다.
반응은 1 내지 50몰 당량, 바람직하게는 10 내지 50몰 당량, 특히 30 내지 50몰 당량의 유기 염기(예: C1-C4-트리알킬아민 또는 N-C1-C4-알킬모르폴린, 바람직하게는 N-메틸모르폴린)의 존재하에 유기 용매(예: 테트라하이드로푸란 또는 메틸렌 클로라이드, 바람직하게는 메틸렌 클로라이드) 속에서 수행된다. 단실화된 뉴클레오시드 대 포스포닐화제의 몰비는 1 대 1 내지 10, 바람직하게는 1 대 2 내지 8, 특히 1 대 5이다.
상기 방법으로 수득된 일반식(VIIIa) 또는 일반식 (VIIIb)의 화합물은 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 계속 사용할 수 있다. 이를 수행하는데 있어서, 뉴클레오티드의 당 잔기는 DNA 합성의 경우 데옥시리보오스이고 및 RNA 합성의 경우 리보오스이나, 데옥시리보오스와 리보오스의 혼합물을 사용하여 규칙적으로 또는 불규칙적으로 배열된 데옥시리보오스 및 리보오스 당 잔기로 이루어진 올리고뉴클레어티드를 합성 사용할 수 있다. 또한 올리고뉴클레오티드는 일반식(VIIIa) 및 일반식(VIIIb)의 모노뉴클레오티드로 이루어진 규칙적이거나 불규칙적인 구조를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오티드 합성은 문헌[참조; B.C. Froehler et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 5399-5407, No. 13] 에 기재된 바와 같이 H-포스포네이트 방법으로 수행될 수 있는데, 여기서 5'-하이드록실 보호 그룹의 산 제거는 단실에톡시카보닐 그룹의 염기성 제거로서 달성된다.
합성은 주로, 예를 들어 문헌 [참조:C.B. Reese (1989)]의 방법과 동일하게, 용액 속에서, 또는 문헌[참조: B.C. Froehler(1986]의 방법과 동일하게, 고형 상에서 수행될 수 있다. 고형 상 합성이 통상적으로 바람직하다.
이를 위해 다음의 반응 순서가 바람직하게 선택된다.
1. 일반식 (VIIIa) 또는 일반식 (VIIIb)의 화합물을, 산 클로라이드, 예를 들어, 피발로일 클로라이드 또는 아다만토일 클로라이드의 존재하에 일반식 (VIIa) 또는 일반식(VIIb)의 뉴클레오시드-결합된 중합체성 지지체와 반응시키는 단계.
2. 예를 들어, DBU로 단실에톡시카보닐 그룹을 제거하는 단계.
3. 생성된 화합물을 일반식 (VIIIa) 또는 일반식(VIIIb)의 화합물과 반응시키는 단계.
4. 필요한 올리고뉴클레오티드의 쇄 길이가 수득될 때까지 단계 2 및 3을 반복하는 단계.
5. 예를 들어, 요오드 또는 황 또는 아민/CCl4/트리페닐포스핀을 사용하여 인산염, 포스포르아미데미트 또는 티오인산염으로 산화시키는 단계[참조: Jagar et al., 상기 참조].
일반식 (VIIIa) 또는 일반식 (VIIIb)의 화합물과 일반식 (VIIa) 및 일반식(VIIb)의 화합물을, 예를 들어, 산인 피발로일 클로라이드의 존재하에 -20 내지 100, 특히 실온에서 반응시키는 것이 바람직하다. 산화는, 예를 들어, 실온에서, 일반적으로 피리딘, N-메틸이미다졸, 물, THF로 이루어진 용매 혼합물 속에서 요오드를 사용하여 수행된다.
기술된 H-포스포네이트 방법으로 합성된 올리고뉴클레오티드는 통상 2 내지 약 200개, 바람직하게는 2 내지 110개, 특히 2 내지 40개의 모노뉴클레오티드로 구성된다.
포스포르아미디트 또는 H-포스포네이트 방법에 의해, 단실화된 모노뉴클레오티드로부터 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법에 있어서의 이점은, a) 550nm에서 단실 그룹의 강한 형광성으로 인하여 이를 용이하게 검출할 수 있고, b) pM 범위에서까지 폴리- 및 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있으며, c) 뉴클레오티드 염기 또는 당 잔기에서 다른 하이드록실 보호 그룹의 제거없이 5'-하이드록실 단실 보호 그룹을 제거할 수 있고, d) 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 특히 올리고리보뉴클레오티드를 합성하며, e)고수율 및 장쇄 길이로서 올리고뉴클레오티드를 고형상에서 합성한다는 점이다.
RNA 합성시 5'-하이드록실 단실 보호 그룹의 사용의 또 다른 잇점은 리보오스 잔기의 2'-하이드록실 그룹이 합성 말기에 보호된 채로 잔류될 수 있다는 점이다. 따라서, 이러한 방식으로 변형된 올리고리보뉴클레오티드는 RNAase에 의한 가수분해로부터뿐 아니라 가능한 이성체화 반응에서도 보호됨으로써 장기간에 걸쳐 안정하게 저장될 수 있다. 통상적으로 2'-하이드록실 보호 그룹은 단지 RNA의 사용 직전에 제거된다.
지지체로부터의 제거 및 합성된 올리고뉴클레오티드에서의 아미노 및 하이드록실 보호 그룹의 절단은 문헌[참조; M. Gait (ed.): O1igonucleotide Synthesis, a practical approach; IRL Press; Oxford 1984]에 기재된 통상의 방법으로 수행된다.
본 발명을 다음의 실시예로서 좀더 기술하고자 한다. 다음의 약어가 사용된다;
Bz : 벤조일,
Mthp : 메톡시 테트라하이드로피라닐,
DansEOC : 단실에톡시카보닐,
EA : 에틸아세테미트.
[실시예 1]
[2-단실에탄올과 트리클로로메틸 클로로포르메이트의 반응]
얼음 속에서 냉각시키고 교반하면서, 트리클로로메틸 클로로포르메이트 0.8㎖(1.32g=6.64mmol)를 무수 CH3CN 10ml에 속으로 피펫팅한다. 이어서, 얼음 속에서 냉각시키고 교반하면서, 무수 CH3CN 5ml에 용해된 2-단실에탄올 1g(3.58mmol)을 격벽을 통해 주사기로 적가한다. 혼합물을 빙욕 속에서 5시간 동안 추가로 교반한다. 침전된 무색 고체를 흡입 여과하고 무수 테트라하이드로푸란으로 세척한 다음, 고진공하에 건조시킨다. 융점 이 154 내지 155인 무색 고체 1.135g (3.00mmol=84%)이 수득된다. 원소분석은 하기와 같다:
[실시예 2]
[2'-0-(4-메톡시테트라하이드로피라닐)-N6-벤조일-아데노신과 2-단실에틸 클로로포르메이트 하이드로클로라이드의 반응]
2'-0-Mthp-N6-Bz-아데노신 2.43g(5mmol)을 매회 무수 피리딘 30ml로 각각 2회 공증발시킨 후 무수 피리딘 40㎖에 용해시킨다. 이어서 얼음 속에서 냉각시키고 교반하면서 2-단실에틸 클로로포르 메이트 하이드로클로라이드 2.46g(6.5mmol=1.3당량)을 고형으로 가한다. 혼합물을 빙욕 속에서 1시간 동안 교반하면, 약 0.5시간후 하이드로클로 라이드가 용해된다, 이어서, 글리콜 0.5㎖(8.8mmol)로 반응을 중지시키고, 혼합물을 회전 증발기 속에서 농축시킨 다음 CH2Cl2200㎖로 희석하고 NaHCO3포화 용액 200㎖로 세척한 다음, 수성 상을 매회 CH2Cl2100㎖로 2회 추출하고, 합한 유기 상을 Na2SO4로 건조시킨 다음, 여과하고 회전 증발기 속에서 농축시킨다, 이들을 매회 톨루엔 100㎖ 및 CH2Cl2100㎖로 2회 공증발시킨다. SiO2컬럼(100g 23x3.5㎝)에서 정제한다. 섬광 크로마토그래피 용출을, CH2Cl20.5ℓ, CH2C12/MeOH(100 : 1) 1 ℓ 및 CH2C12/MeOH(100 : 2) 1.5ℓ로 수행한다. 각 생성물 분획을 회전 증발기에서 농축시키고 고진공하에 건조시킨다. 5'-치환된 생성물 2.86g(3.62mmol=72%) 및 3', 5'-이치환된 생성물 0.47g(0.43mmol=9%)을 각각의 경우 황색의, 고형광성 발포체로 수득한다. 원소분석을 위해 이치환된 생성물 100㎎을 CH2C12/Me0H(100 : 2)로 SiO2플레이트(40×20cm) 위에서 재정제한다.
[2'-0-(4-메톡시테트라하이드로피라닐)-5'-0-단실에톡시카보닐-N6-벤조일아데노신의 분석 데이터]
a) 박층 크로마토그래피
박층 크로마토그래피를 CH2C12/Me0H(95:5) 중 슐라이허운트 쉴 (Schleicher und Schull) 실리카겔 F1500/LS 254에서 수행하면, 0.48의 Rf 값이 계산된다.
b) 에탄올중의 UV 분광학
c) 원소분석
d) 250MHz에서 CDCl3중의 분광학
[2'-0-(4-메톡시테트라하이드로피라닐)-3',5'-비스-0-단실에톡시카보닐-N6-벤조일아데노신의 분석 데이터]
a) 박층 크로마토그래피
박층 크로마토그래피를 CH2C12/Me0H(100:1) 중 실리카겔 F1500/LS 254(슐라이허 운트 쉴)에서 수행하면, 0.35의 Rf 값이 계산된다.
b) 메탄올중의 UV 분광학
c) 원소분석
d) 250MHz에서 CDCl3중의 NMR 분광학
[실시예 3]
[2'-0-(4-메톡시테트라하이드로피라닐)-5'-0-단실에톡시카보닐-N6-벤조일아데노신과 2-(4-니트로페닐)에틸 디이소프로필포스포르 아미도클로리디트의 반응]
2'-0-Mthp-5'-0-dansEOC-N6-Bz-아데노신 1g(1.264mmol)을 무수 CH2Cl26ml에 용해시킨 다음, 휘니그(Hing) 염기 0.86ml(0.65g=5.03mmol=4당량) 및 2-(4-니트로페닐)에틸디이소프로필포스포르아미도클로리디트 및 0.84g(2.528mmol=2 당량)을 가한다. 혼합물을 질소 대기하 실온에서 교반하고 알루미늄 호일로 나서 광선을 차단시킨다. 1 1/4 시간후, 추가량의 포스피틸화제 0.42g(1.264mmol=1 당량)을 가한다. 실온에서 총 2.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 CH2Cl275ml로 희석하고 NaHCO3포화 용액 75ml로 세척한 다음, 수성 상을 매회 CH2Cl250ml로 4회 역추출시키고, 합한 유기 상을 Na2SO4로 건조시킨 다음, 여과하고 회전 증발기 속에서 농축시킨다.
CH2Cl2250㎖, CH2C12/EA(100:1) 100㎖, CH2Cl2/EA(100:2) 100ml, CH2Cl2/EA (100:3) 100㎖, CH2Cl2/EA(100:5) 100㎖, CH2Cl2/EA(100:7) 100㎖, CH2Cl2/EA(9: 1) 100㎖, CH2Cl2/EA(4:1)(시약) 350㎖, CH2Cl2/EA(2:1) (생성물) 100㎖, CH2Cl2/EA(1: 1)(생성물) 100㎖, CH2Cl2/EA(1:2) (생성물) 100㎖ 및 EA(생성물) 100㎖로 용출시켜 SiO2컬럼 (30g, 12×3cm)에서 섬광 크로마토그래피하여 정제한다.
생성물 분획을 회전 증발기 속에서 농축시키고 고진공하에서 건조시킨다. 황색형광성 발포제 0.955g(0.878mmol= 70%)을 수득한다.
[분석데이타]
a) 박층 크로마토그래피
박층 크로마토그래피를 톨루엔/EA(1:6)중 슐라이허 운트 쉴 실리카겔 F150O/LS 254에서 수행하면, 0.50의 Rf 값이 계산된다.
b) 메탄올중의 UV 분광학
c) 원소분석
d) NMR 분광학
1. 161.70 ㎒에서 CDCl3중의31P-NMR
2. 250㎒에서 CDCl3중의1H-NMR
[실시예 4]
[2'-0-(4-메톡시테트라하이드로피리딜)-5'-0-단실에톡시카보닐포스포르아미드트를 사용한 올리고리보뉴클레오티드 자동 합성]
[데카뉴클레오티드 (rAp)9T의 제조]
합성을 380 B DNA 합성기[어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosy stems)]로 수행한다.
사용된 컬럼 : ABI 표준 컬럼
사용된 지지체 물질 : 3'-하이드록실 그룹을 통해 뉴클레오시드에 결합된 LCAMA-CPG 지지체[참조: K.P. Stengele, W. Pfleiderer Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 21, 101 (1989); K. P. stengele, W. Pfleiderer Tetrahedron Lett. 31, 2549 (1990) ] .
3'-하이드록실 그룹을 통해 지지체에 결합된 티미딘의 로딩 ; 19㎛ol/g
배치 크기 : 약 0.6㎛mol(트리틸 제거로 측정)
합성 사이클 :
1. 하기 펄스(pulse) 순서에 따라 무수 아세토니트릴 중의 0.5M 테트라졸과 0. 1M 2'-0-(4-메톡시테트라하이드로피라닐 )-5'-0-단실에톡시카보닐-N6-벤조일아데노신 3'-0-포스포르아미디트의 축합:
테트라졸 8초
포스포르아미디트 + 테트라졸 4초
테트라졸 3초
포스포르아미디트 + 테트라졸 3초
테트라졸 3초
웨이팅 (Waiting) 단계 60초
포스포르아미디트 + 테트라졸 3초
테트라졸 3초
웨이팅 단계 700초
2. THF 중의 미반응 뉴를레오티드의 무수 아세트산/루티딘/THF(1:1:3) 및 6.5% 디메틸아미노피리딘(DMAP)을 사용한 캡핑,
유동(flow-through) 20초
웨이팅 단계 30초
3. I2용액을 사용한 산화(I21.269g/H2O 20㎖/피리딘 10㎖/THF 100㎖),
유동 30초
웨이팅 단계 30초
4.1초의 역 플러쉬(flush)가 삽입된 2×30초 및 8x10초 펄스 유동 중 아세토니트릴 중의 0.1M DBU를 사용한 단실에톡시카보닐의 제거.
제4단계로부터의 용출물을 수거하고, 형광성 분광학을 사용하여 형성된 5-디에틸아미노-1-나프틸 비닐 설폰을 기준으로 하여 축합 수율을 측정한다(여기: 368nm : 방출. 526nm) .
평균 단계 수율은 약 98%이다.
각각의 단계 1 내지 4 사이에 아세토니트릴을 사용한 통상의 세척 단계 및 차단 및 역 플러쉬 반응을 수행한다.
[실시예 5]
[5'-0-단실에톡시카보닐 보호된 H-포스포네이트의 합성]
이미다졸 10.75 당량을 무수 메틸렌 클로라이드 5㎖에 용해시킨 다음, 얼음/염화나트륨으로 냉각시키고, 연속적으로 PCl33.5당량 및 트리에틸아민 11.25당량을 냉각된 용액에 가한다. 15분 동안 냉각시키면서 혼합물을 교반한 후, 무수 메틸렌클로라이드 5㎖ 중의 2'-0-(4-메톡시테트라하이드로피라닐)-5'-0-단실메톡시카보닐-N6-벤조일아데노신 0.25mmol(1당량) 또는 2'-0-(4-메톡시테트라하이드로피라닐)-5'-0-단실에톡시카보닐-N6-파라-니트로페닐 에틸옥시카보닐아데노신(아세토니트릴로 1회 공증발시킨 것) 0.25mmol을 10분에 걸쳐 교반하면서 적가한다.
이어서, 빙욕을 제거하고 혼합물을 실온에서 15분 동안 추가로 교반한다. 반응 용액을 1M 트리에틸암모늄 중탄산염 10㎖와 함께 진탕하여 연속적으로 추출한다. 상을 분리하고, 수성 상을 CH2C1210㎖로 추출한 다음, 합한 유기 상을 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과한 다음, 회전 증발기 속에서 농축시켜 황색 형광성 발포체를 수득한다. 이를 CH2C12/MeOH 구배의 단(短) 실리카겔 컬럼(섬광 크로마토그래피) 상에서 정제한다.
[실시예 6]
[2'-0-(4-메톡시테트라하이드로피라닐)-5'-0-단실에톡시카보닐리보뉴클레오티드 3'-O-H-포스포네이트를 사용한 올리고리보뉴클레오티드 자동 합성]
(rAp)gT의 제조
합성은 380 B DNA 합성기(어플라이드 바이오시스템즈)로 수행한다.
사용된 컬럼 : ABI 표준 컬럼
사용된 지지체 물질 : LCAMA-CPG 지지체
[참조: K.P. Stengele. W. Pfleiderer Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 21, 101 (1989); K.P. Stengele, W. Pfleiderer Tetrahedron Lett. 31, 2549 (1990)].
3'-하이드록실 그룹을 통해 지지체에 결합된 티미딘의 로딩 ; 19㎛mol/g
배치 크기 : 약 0.61μmol(트리틸 제거로 측정)
합성 사이클 :
1. 무수 피리딘/아세토니트릴(1:1)로 세척,
2. 무수 피리딘/아세토니트릴(1:1) 중의 2'-0-(4-메톡시테트라하이드로 피라닐)-5'-0-단실에톡시카보닐 H-포스포네이트(10mM) 및 피발로일 클로라이드(50mM)의 반응,
3. 무수 아세토니트릴로 세척(45초),
4. 아세토니트릴 중의 0.1M DBU로 단실에톡시카보닐의 제거(2분),
5. 필요한 쇄 길이가 될 때까지 단계 1내지 4를 반복,
6. 아세토니트릴 중의 0.1M DBU 로 단실에톡시카보닐을 제거(2분)하고 용출물을 수거,
7. 피리딘/N-메틸이미다졸/물/THF(5/1/5/90) 중의 I2(0.1M)(2.5분) 또는 트리에틸아민/물/THF/(5/5/90) 중의 I2(0.1M) (2.5분)로 산화.
또한, 티오인산염 또는 포스포르아미데이트로의 산화를 문헌[참조 : Uhlmann & Peyman(1990)] 에 기재된 바와 같이 수행한다.
제6단계로부터의 용출물을 수거하고 축합 수율을 형광 분광학을 사용하여 형성된 5-디메틸아미노-1-나프틸 비닐설폰을 기준으로 하여 측정한다(여기 : 368nm; 방출 : 526nm).
평균 단계 수율은 약 98%이다.

Claims (63)

  1. 구조식(II)의 화합물을 클로로카보닐 공여체와 반응시킴을 포함하여, 구조식(I)의 화합물을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 클로로카보닐 공여체가 트리클로로메틸 클로로포르메이트, 디포스겐 및 포스겐으로부터 선택된 하나 이상의 물질인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 반응이 비양성자성 극성 용매의 존재하에 수행되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 아세토니트릴 또는 피리딘이 용매로서 사용되는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 일반식(I)의 화합물 대 클로로카보닐 공여체의 몰 비가 0.5 내지 1 대 1 내지 2인 방법.
  6. 구조식(I)의 화합물을 하이드록실 그룹을 보호하는데 사용함을 특징으로 하여 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법.
  7. 일반식(IIIa) 또는 일반식(IIIb)의 화합물.
    상기식에서, DansEOC는 구조식의 그룹이고, R1은 수소이거나, 서로 독립적으로 구조식
    의 그룹이며, B는
    [여기서, R2는 각각 독립적으로
    이고, R3은 서로 독립적으로 수소 또는이며, R4는 서로 독립적으로또는이고, Y는 H 또는 CH3(또는 n-알킬 C1-C4)이고, R5는 서로 독립적으로 -OH,,또는이다]이다.
  8. 제1항에 따른 구조식(I)의 화합물을 염기의 존재하에 일반식(IVa) 또는 일반식(IVb)의 적절한 화합물과 반응시킴을 포함하여, 제7항에 정의된 일반식(IIIa) 또는 일반식(IIIb)의 화합물을 제조하는 방법.
    상기 식에서 R1및 B는 제7항에서 정의한 바와 동일하다.
  9. 제8항에 있어서, 피리딘, 또는 테트라하이드로푸란, 디옥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및 아세토니트릴중에서 선택된 하나 이상의 물질과 일반식(A)의 화합물로 이루어진 혼합물이 염기로서 사용되는 방법.
    상기 식에서, R20, R21및 R22는 동일하거나 각각 상이하고. 수소 또는 C1-C4-알킬이다.
  10. 일반식(IIIa) 또는 일반식(IIIb)의 화합물을 사용함을 특징으로 하여 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법.
  11. 일반식 (Va) 또는 일반식 (Vb)의 화합물.
    상기식에서 DansEOC, R1및 B는 제7항에서 정의한 바와 동일하고, R6및 R7은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하며 C1-C8-알킬, C5-C12사이클로알킬 그룹, 벤질 또는 페닐 그룹이거나, 이들이 결합된 질소원자와 함께 추가의 헤테로 원자와 치환체를 함유하거나 함유하지 않는 포화 또는 불포화 헤테로사이클릭 환이고, R8은 구조식또는 CH3의 그룹이거나 치환되지 않거나 서로 독립적으로 할로겐, C1-C4-알킬, 니트로, 메톡시 또는 카복실 그룹에 의해 1회 이상 환-치환된 벤질 그룹이다.
  12. 제7항에서 정의된 일반식 (IIIa) 또는 일반식(IIIb)의 화합물을 염기의 존재하에 일반식(VI)의 화합물과 반응시킴을 포함하여, 제11항에서 정의된 일반식(Va) 또는 일반식(Vb)의 화합물을 제조하는 방법.
    상기 식에서 R6, R7, 및 R8은 제11항에서 정의한 바와 동일하고, Z는 염소 또는 브롬, 또는 일반식 -NR9R10의 라디칼(여기서. R9및 R10은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고 C1-C8-알킬, C5-C12사이클로알킬 그룹, 벤질, 또는 페닐그룹이다)이다.
  13. 제12항에 있어서, 피리딘 또는 테트라하이드로푸란, 디옥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및 아세토니트릴중에서 선택된 하나 이상의 물질과 C1-C4-트리알킬아민과의 혼합물이 염기로서 사용되거나 Z가 일반식 -NR9R10(여기서, R9및 R10은 제12항에서 정의한 바와 동일하다)의 라디칼인 경우, 일반식(B)의 화합물 또는 테트라졸이 존재하는 방법.
    상기 식에서, R11, R12및 R13은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고, C1-C4-알킬 그룹이고, X는 할로겐이다.
  14. 일반식(Va) 또는 일반식(Vb)의 화합물을 사용함을 특징으로 하여 올리고 뉴클레오티드를 합성하는 방법.
  15. (1) 제11항에서 정의된 일반식(Va) 또는 일반식(Vb)의 화합물을 일반식 (VIIa) 또는 일반식 (VIIb)의 화합물과 반응시키는 단계, (2) 생성된 화합물을 산화시키는 단계, (3) 단실에톡시카보닐 그룹을 제거하는 단계, (4) 생성된 화합물을 일반식(Va) 또는 일반식(Vb)의 화합물과 반응시키는 단계 및 (5) 필요한 쇄 길이가 수득될 때까지 반응 단계 (2) 내지 (4)를 반복하는 단계를 포함하여, 일반식 (Va), 일반식(Vb)의 화합물 또는 이들 두 화합물로부터 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법.
    상기식에서, R1및 B는 제7항에서 정의한 바와 동일하고, G는 R1과 동일하거나 일반식(VIIa) 또는 일반식(VIIb)의 화합물의 2'- 하이드록실 또는 3'-하이드록실 그룹을 통해 결합된 중합체성 지지체이다.
  16. 제15항에 있어서, 일반식(Va) 또는 일반식(Vb)의 화합물과 일반식(VIIIa) 또는 일반식(VIIIb)의 화합물을 -20 내지 100에서 반응시키는 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 반응이 약산의 존재하에 수행되는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 반응이 테트라졸 또는 p-니트로페닐 테트라졸의 존재하에 수행되는 방법.
  19. 제15항 또는 제16항에 있어서, 산화반응이 요오드, 황, 또는 아민의 존재하의 요오드를 사용하여 수행되는 방법.
  20. 제15항 또는 제16항에 있어서, 산화반응이 -80 내지 100에서 수행되는 방법.
  21. 제11항에서 정의된 하나 이상의 일반식(Va)의 화합물, 일반식(Vb)의 화합물 또는 이들 두 화합물로부터 제조된 단실에톡시카보닐-보호된 올리고뉴클레오티드.
  22. 일반식(VIIIa) 또는 (VIIIb)의 화합물.
    상기식에서, DansEOC, R1및 B는 제7항에서 정의한 바와 동일하고, K(+)는 양이온이다.
  23. 제7항에서 정의된 일반식 (IIIa) 또는 일반식 (IIIb)의 화합물을 염기의 존재하에 일반식(IX)의 화합물과 반응시킴을 포함하여, 제22항에서 정의된 일반식(VIIIa) 또는 일반식(VIIIb)의 화합물을 제조하는 방법.
    상기식에서, R14, R15및 R16은 서로 독립적으로 동일하거나 상이하고 수소 또는 C1-C8-알킬, C1-C3-플루오로알킬 또는 아릴 그룹이다.
  24. 제7항에서 정의된 일반식(IIIa) 또는 일반식(IIIb)의 화합물을 염기의 존재하에 일반식 (X)의 화합물과 반응시킨 다음. 가수분해시킴을 포함하여, 제22항에서 정의된 일반식(VIIIa) 또는 일반식 (VIIIb)의 화합물을 제조하는 방법.
    상기식에서, R17, R18및 R19는 동일하거나 상이하고, 염소, 브롬 또는 C1-C8-알킬아미노 또는 1, 2, 4 - 트리아졸 그룹이다.
  25. 제23항에 있어서 C1-C4-트리알킬아민 또는 N-C1-C4-알킬 모르폴린이 염기로서 사용되는 방법.
  26. 일반식 (VIIIa) 또는 일반식 (VIIIb)의 화합물을 사용함을 특징으로 하여 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법.
  27. 제22항에서 정의된 일반식 (VIIIa) 또는 일반식 (VIIIb)의 화합물을, 제15항에서 정의된 일반식 (VIIa) 또는 일반식(VIIb)의 화합물과 반응시키는 단계(1), 단실에톡시카보닐 그룹을 제거하는 단계(2), 생성된 화합물을 일반식(VIIIa)또는 일반식(VIIIb)의 화합물과 반응시키는 단계(3), 필요한 쇄 길이가 수득될 때까지 반응단계(2) 및 (3)을 반복하는 단계(4), 및 생성된 올리고뉴클레오티드를 산화시키는 단계(5)를 포함하여, 일반식(VIIIa)의 화합물, 일반식(VIIIb)의 화합물 또는 이들 두 화합물로부터 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법 .
  28. 제27항에 있어서, 일반식(VIIIa) 또는 일반식(VIIIb)의 화합물과 일반식(VIIa) 또는 일반식(VIIb)의 화합물을 -20 내지 100에서 반응시키는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 반응이 산 할라이드의 존재하에 수행되는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 반응이 피발로일 클로라이드 또는 아다만탄카보닐 클로라이드의 존재하에 수행되는 방법.
  31. 제27항 또는 제28항에 있어서, 산화반응이 요오드, 황, 또는 트리페닐 포스핀/CCl4 존재하의 아민을 사용하여 수행되는 방법.
  32. 제22항에서 정의된 하나 이상의 일반식(VIIIa)의 화합물, 일반식(VIIIb)의 화합물 또는 이들 두 화합물로부터 제조된 단실에톡시카보닐 보호된 올리고뉴클레오티드.
  33. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아세토니트릴 또는 피리딘이 용매로서 사용되는 방법.
  34. 제2항에 있어서, 클로로카보닐 공여체가 트리클로로메틸 클로로포르메이트인 방법.
  35. 제3항에 있어서, 일반식(I)의 화합물 대 클로로카보닐 공여체의 몰비가 0.5 내지 1대 1 내지 2인 방법.
  36. 제4항에 있어서, 일반식(I)의 화합물 대 클로로카보닐 공여체의 몰비가 0.5 내지 1대 1 내지 2인 방법.
  37. 제5항에 있어서, 일반식(I)의 화합물 대 클로로카보닐 공여체의 몰비가 1대 1 내지 2인 방법.
  38. 제5항에 있어서, 일반식(I)의 화합물 대 클로로카보닐 공여체의 몰비가 1대 1.5 내지 2인 방법.
  39. 제9항에 있어서, 일반식(A)의 화합물에서의 R20, R21, R22가 동일하거나 각각 상이하고 트리메틸, 트리에틸 또는 디이소프로필 그룹인 방법.
  40. 제11항에 있어서, R6및 R7이 동일하거나 서로 상이하고 이소프로필 또는 C8이하의 사이클로알킬 그룹이며, R8이 치환되지 않은 벤질 그룹인 화합물.
  41. 제12항에 있어서, 일반식(VI)의 화합물에서의 Z가 염소인 방법.
  42. 제12항에 있어서, 일반식(VI)의 화합물의 Z에 대한 정의에서 R9및 R10이 동일하거나 서로 상이하고, 이소프로필 또는 C8이하의 사이클로알킬 그룹인 방법.
  43. 제13항에 있어서, C1-C4-트리알킬아민이 트리메틸아민, 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민이고 Z가 일반식 -NR9R10(여기서 R9및 R10은 제12항에서 정의한 바와 동일하다)의 라디칼인 경우에 테트라졸이 존재하며, 일반식(B)의 화합물에서의 X가 Cl인 방법.
  44. 제16항에 있어서, 반응이 실온에서 수행되는 방법.
  45. 제15항 또는 제16항에 있어서, 반응이 테트라졸 또는 p-니트로페닐테트라졸의 존재하에서 수행되는 방법.
  46. 제17항에 있어서, 산화 반응이 요오드 황, 또는 아민의 존재하의 요오드를 사용하여 수행되는 방법.
  47. 제17항에 있어서, 산화 반응이 -80 내지 100에서 수행되는 방법.
  48. 제18항에 있어서, 산화 반응이 요오드, 황 또는 아민 존재하의 요오드를 사용하여 수행되는 방법.
  49. 제18항에 있어서, 산화 반응이 -80 내지 100에서 수행되는 방법.
  50. 제19항에 있어서, 산화 반응이 -80 내지 100에서 수행되는 방법.
  51. 제20항에 있어서, 산화 반응이 -20 내지 60에서 수행되는 방법.
  52. 제20항에 있어서, 산화 반응이 실온에서 수행되는 방법.
  53. 제22항에 있어서, K(+)가 [NH(C2H5)3](+)인 화합물.
  54. 제23항에 있어서, 일반식(IX)의 화합물에서의 R14, R15및 R16이 동일하거나 각각 상이하고, 2,2,2-트리플루오로에틸, 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-플로필, 에틸, 또는 페닐 그룹인 방법.
  55. 제24항에 있어서, 일반식(X)의 화합물에서의 R17, R18및 R19가 서로 동일하거나 각각 상이하고 1,2,4-트리아졸릴 그룹인 방법.
  56. 제24항에 있어서, C1-C4-트리알킬아민 또는 N-C1-C4-알킬모르폴린이 염기로서 사용되는 방법법.
  57. 제25항에 있어서, 염기로서 사용되는 N-C1-C4-알킬모르폴린이 N-메틸모르폴린인 방법.
  58. 제56항에 있어서, 염기로서 사용되는 N-C1-C4-알킬모르폴린이 N-메틸모르폴린인 방법.
  59. 제28항에 있어서, 산화 반응이 실온에서 수행되는 방법.
  60. 제29항에 있어서, 반응이 산 클로라이드의 존재하에 수행되는 방법.
  61. 제27항 또는 제28항에 있어서, 반응이 피발로일 클로라이드 또는 아다만탄카보닐 클로라이드의 존재하에서 수행되는 방법.
  62. 제29항에 있어서 산화 반응이 요오드, 황, 또는 트리페닐포스핀/CCl4, 존재하의 아민을 사용하여 수행되는 방법.
  63. 제30항에 있어서 산화 반응이 요오드, 황, 또는 트리페닐포스핀/CCl4존재하의 아민을 사용하여 수행되는 방법.
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