DE4029244A1

DE4029244A1 - Verfahren zur chemischen synthese von oligonukleotiden

Info

Publication number: DE4029244A1
Application number: DE4029244A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Prof Dr Dr Pfleiderer; Frank Bergmann
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1990-09-14
Filing date: 1990-09-14
Publication date: 1992-03-19
Also published as: ZA917306B

Description

Die chemische Polykondensation von Mononukleotiden ist eine wichtige Methode zur Herstellung von Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA).

Ein grundlegendes Problem bei der chemischen Synthese von DNS oder RNS ist das Auffinden geeigneter Schutzgruppen der Amino- und Hydroxy-Gruppen der Nukleosid-Basen und der Zuckerreste. Diese Schutzgruppen müssen einerseits unter den Bedingungen der Polykondensationreaktion, d.h. während der Bildung der Phosphodiester-Bindung, stabil sein und andererseits müssen sie genügend labil sein, um am Ende der Reaktion ohne die Phosphodiester-Bindung zu spalten wieder entfernt werden zu können (H.G. Khorana; Pure Appl. Chem. 17 (1968) 349).

Besonders problematisch ist die chemische Synthese von RNA, da der Ribose-Zuckerrest zwei Hydroxy-Gruppen trägt, die beide geschützt werden müssen. Die Schutzgruppe der 5′-Hydroxy-Gruppe muß dabei vor jedem Polykondensationsschritt selektiv, d.h. ohne Abspaltung der 2′-Hydroxy-Schutzgruppe wieder abgespalten werden. Die Schutzgruppe der 2′-Hydroxy-Gruppe hingegen darf erste am Ende der RNA-Synthese abgespalten werden, und zwar unter Bedingungen, die zu kleiner Spaltung oder Isomerierung der Phosphodiesterbindungen führt (C.B. Reese, Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol 3 (F. Eckstein & D. M. J. Lilley eds.) Springer-Verlag, Weinheim).

Eine Möglichkeit der selektiven Abspaltung der 5′-Hydroxy- Schutzgruppe ohne Abspaltung der 2′-Hydroxy-Schutzgruppe ist durch die Kombination einer basenlabilen 5′-Hydroxy- Schutzgruppe mit einer säurelabilen 2′-Hydroxy-Schutzgruppe zu erreichen (Chr. Lehmann et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 2379-2390, No. 7). Die Verwendung einer basenlabilen 5′-Hydroxy-Schutzgruppe ist auch bei der Synthese von DNA von Vorteil, da unter den milden nicht sauren Hydrolysebedingungen die in der Synthese bereits gebildeten Phosphordi- bzw. triesterbindungen im allgemeinen nicht gespalten werden. Zudem wird unter den milden nicht-sauren Hydrolysebedingungen eine Depurinierung der Nukleotide, wie sie bei E. Sonveaux (E. Sonveaux (1986), Bioorganic Chemistry 14, 286) beschrieben ist, umgangen. Eine weitere Anforderung an die 5′-Hydroxy-Schutzgruppe bei der DNA-, wie auch bei der RNA-Synthese, ist eine leichte und hochempfindliche Nachweisbarkeit der Schutzgruppe. Auf diese Weise kann der Umsetzungsgrad der einzelnen Reaktionsschritte besonders gut verfolgt und eine möglichst vollständige Umsetzung erreicht werden. Dadurch ist es möglich besonders lange Oligonukleotide mit hoher Ausbeute herzustellen. Dies erlaubt auch die Ausführung kleiner Synthese-Ansätze im nanomolaren bis picomolaren Bereich.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die Dansylethoxycarbonylgruppe (Dans-EOC) als basenlabile 5′-Hydroxy-Schutzgruppe in der chemischen Oligonukleotidsynthese eingesetzt werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist somit:

1. Ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel (II), mit einem Chlorcarbonyl-Donor umgesetzt wird.
2. Eine Verbindung der Formel (IIIa) oder (IIIb) worin bedeuten:
R¹ Wasserstoff oder unabhängig voneinander eine Gruppe der Formel und B bedeutet mit R² jeweils unabhängig voneinander eine Gruppe der Formel oder B bedeutet mit R³ Wasserstoff oder oder B bedeutet
3. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (IIIa) oder (IIIb) durch Umsetzung der Verbindung der Formel (I) mit einer entsprechenden Verbindung der Formel (IVa) oder (IVb) worin R¹ und B die obige Bedeutung haben, in Gegenwart einer Base, vorzugsweise Pyridin oder einer Mischung bestehend aus Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylenchlorid, Chloroform und/oder Acetonitril und einer Verbindung der FormelNR²⁰R²¹R²²worin R²⁰, R²¹ und R²² gleich oder unabhängig verschieden Wasserstoff oder die C₁-C₄-Alkyl-, vorzugsweise eine Trimethyl-, Triethyl- oder Diisopropyl-Gruppe bedeuten.
4. Eine Verbindung der Formel (Va) oder (Vb) worin
DansECO, R¹ und B die obengenannte Bedeutung haben und
R⁶, R⁷ gleich oder unabhängig verschieden eine C₁-C₈-Alkyl-, vorzugsweise eine Isopropyl- oder C₅-C₁₂-Cycloalkyl-Gruppe, vorzugsweise bis C₈, Benzyl oder Phenyl oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gesättigten oder ungesättigten heterocyclischen Ring, der gegebenenfalls weitere Heteroatome und Substituenten enthalten kann und R⁸ eine Gruppe der Formel oder eine Benzylgruppe, welche nicht substituiert oder einfach oder mehrfach ringsubstituiert, vorzugsweise nicht substituiert ist, wobei der oder die Substituenten unabhängig voneinander ein Halogen, eine C₁-C₄-Alkyl-, Nitro-, Methoxy- oder Carboxylgruppe ist.
5. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (Va) oder (Vb) durch Umsetzung der Verbindung der Formel (IIIa) oder (IIIb) mit einer Verbindung der Formel (VI) worin R₆, R₇ und R₈ die obige Bedeutung haben und Z Chlor oder Brom oder ein Rest der Formel -NR₉R₁₀, wobei für R₉ und R₁₀ unabhängig voneinander dieselben Reste infrage kommen wie für R₆, wenn Z gleich Chlor ist, in Gegenwart einer Base, vorzugsweise Pyridin oder einer Mischung von Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylenchlorid, Chloroform und/oder Acetonitril mit einem C₁-C₄-Trialkylamin, vorzugsweise einem Trimethyl-, Triethyl- oder Diisopropylethyl-Amin oder wenn Z ein Rest der Formel -NR₉R₁₀, dann in Gegenwart einer Verbindung der Formel [HNR₁₁R₁₂R₁₃]/⁽⁺⁾X^(-), wobei R₁₁, R₁₂, R₁₃ gleich oder unabhängig verschieden eine C₁-C₄-Alkyl-Gruppe und X= Halogen, insbesondere Chlor bedeuten, oder Tetrazol, vorzugsweise in Gegenwart von Tetrazol.
6. Ein Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotiden aus Verbindungen der Formel (Va) und oder (Vb), dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel (Va) oder (Vb)
- 1. mit einer Verbindung der Formel (VIIa) oder (VIIb) worin B und R₁ die obengenannte Bedeutung haben und G gleichbedeutend mit R₁ oder ein polymerer Träger ist, der über die 2′-Hydroxy- oder 3′-Hydroxy-Gruppe der Verbindung der Formel (VIIa) oder (VIIb) gebunden ist, umsetzt,
- 2. die erhaltenen Verbindungen oxidiert.
- 3. die Dansylethoxycarbonyl-Gruppe abspaltet,
- 4. die erhaltene Verbindung mit einer Verbindung der Formel (Va) oder (Vb) umsetzt und
- 5. die Reaktionsschritte 2-4 bis zur gewünschten Kettenlänge wiederholt.
7. Eine Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb) worin DansECO, R¹ und B die obengenannte Bedeutung haben und K⁽⁺⁾ ein Kation, insbesondere [HN(C₂H₅)₃]⁽⁺⁾ ist.
8. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb) durch Umsetzung einer Verbindung der Formel (IIIa) oder (IIIb) mit einer Verbindung der Formel (IX) PR₁₄R₁₅R₁₆ (IX)worin R₁₄, R₁₅, R₁₆ gleich oder unabhängig verschieden Wasserstoff oder eine C₁-C₈-Alkyl-, C₁-C₈-Fluoralkyl-, oder Aryl-Gruppe vorzugsweise eine 2,2,2-Trifluoroethyl-, 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propyl-, Ethyl- oder Phenyl-Gruppe in Gegenwart einer Base.
9. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb) durch Umsetzung einer Verbindung der Formel (IIIa) oder (IIIb) mit einer Verbindung der Formel (X) PR₁₇R₁₈R₁₉ (X)worin R₁₇, R₁₈, R₁₉ gleich oder unabhängig verschieden Chlor-, Brom oder eine C₁-C₈-Alkylamino- oder 1,2,4- Triazoylgruppe, vorzugsweise eine 1,2,4-Triazolylgruppe, in Gegenwart einer Base mit anschließender Hydrolyse.
10. Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotiden aus Verbindungen der Formel (VIIIa) und/oder (VIIIb), dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb)
- 1. mit einer Verbindung der Formel (VIIa) oder (VIIb) umsetzt,
- 2. die Dansylethoxycarbonyl-Gruppe abspaltet,
- 3. die erhaltene Verbindung mit einer Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb) umsetzt,
- 4. die Reaktionsschritte 2 und 3 bis zur gewünschten Kettenlänge wiederholt und
- 5. das erhaltene Oligonukleotid oxidiert.

Zur Einführung der Dansylethoxycarbonylgruppe in das Nukleosid wurde 2-Dansylethylchloroformiat mit einem Nukleosid umgesetzt, bei dem je nach Nukleosid die Amino- bzw. Hydroxy-Funktionen der Nukleosidbase durch geeignete Gruppen geschützt sind. Als Schutzgruppen eignen sich beispielsweise für die 6-Aminogruppe von Adenin die t-Butylcarbonyl, Benzoyl-, 4-(t-Butyl)-benzoyl- oder para- Nitrophenylethyloxycarbonyl-Gruppe, insbesondere die Benzoyl- oder die para-Nitrophenylethyloxycarbonyl-Gruppe.

Für die 2-Aminogruppe von Guanin eignen sich beispielsweise die Isobutyryl-, 4-(t-Butyl)-phenylacetyl- oder para- Nitrophenylethyloxycarbonyl-Gruppe, insbesondere die Isobutyryl- oder die para-Nitrophenylethyloxycarbonyl- Gruppe. Die 6-Hydroxy-Gruppe von Guanin bzw. die 4-Hydroxy- Gruppe von Uracil bleiben im allgemeinen entweder ungeschützt oder sie werden durch eine para- Nitrophenylethyl-Gruppe geschützt. Bei Cytosin wird die 4-Amino-Gruppe beispielsweise durch eine Benzoyl-, 4-(t-Butyl)-benzoyl- oder para-Nitrophenylethyloxycarbonyl- Gruppe, insbesondere die Benzoyl- oder die para-Nitroethyloxycarbonyl-Gruppe geschützt. Thymidin bleibt im allgemeinen ungeschützt.

Anstelle der natürlichen Nukleosid-Basen können auch modifizierte Nukleosid-Basen verwendet werden, deren Amino- bzw. Hydroxy-Gruppen in analoger Weise durch die oben erwähnten Schutzgruppen geschützt werden können. Beispiele für Nucleoside mit modifizierten Basen sind Inosin-, 8-Aza-7-deazaadenosin-, Tubercidin-, Nebularin-, Xanthosin-, 2-Aminoadenosin- oder Pyridopyrimidin- Nucleoside. Die Nukleoside sind käuflich und die Einführung der einzelnen Schutzgruppen kann beispielsweise nach C. Lehmann et al. (1989), C. B. Reese (1989) ["The Chemical Synthesis of Oligo and Polyribonucleotides" in Nucleic Acids and Molecular Biology 3, F. Eckstein & D. M. J. Lilley (eds.), Springer Verlag Berlin, Heidelberg], E. Sonveaux (1986), Bioorganic Chemistry 14, 274-325 oder E. Uhlmann & A. Peyman (1990), Chemical Reviews 90, 543-584, No. 4 erfolgen.

Bei der Verwendung von Ribonukleotiden muß zusätzlich zu der Hydroxy- und Aminogruppe der Nukleotidbasen auch die 2′-Hydroxygruppe des Riboserestes geschützt werden. Wie bereits erwähnt, ist es für die RNS-Synthese wichtig, durch die Wahl einer geeigneten Kombination von 5′-Hydroxy- und 2′-Hydroxyschutzgruppe die 5′-Hydroxyschutzgruppe selektiv, d.h. ohne Abspaltung der 2′-Hydroxyschutzgruppe, entfernen zu können.

In Anwesenheit von säurelabilen 2′-Hydroxyschutzgruppen, kann nun die Dansylethoxycarbonylgruppe als 5′-Hydroxyschutzgruppe selektiv unter nicht-sauren Bedingungen abgespalten werden. Als säurelabile 2′-Hydroxyschutzgruppen können beispielsweise die 4-Methoxytetrahydropyran-4-yl-, Tetrahydropyranyl-, t-Butyl-dimethylsilyl-, 2-Nitrobenzyl-, 1-(2-Chloro-4- methylphenyl)-4-methoxypiperidin-4-yl-, 1-(2-Fluorophenyl)- 4-methoxypiperidin-4-yl- oder die t-Butyloxycarbonyl-Gruppe verwendet werden. Die Abspaltung der Dansylethoxycarbonylgruppe wird vorzugsweise in einem aprotischen polaren Lösemittel, insbesondere Acetonitril oder Pyridin mit Hilfe von 1 bis 3, vorzugsweise 1,5 bis 2,5 Moläquivalente DBU (=1,5-Diazobicyclo-[5.4.0]-undec- 5-en) durchgeführt. Alternativ können andere Basen wie TMG (=N¹N¹N²N²-Tetramethylguanidin) oder C₁-C₄-Trialkylamine, wie beispielsweise Triethylamin zur Abspaltung eingesetzt werden.

2-Dansylethylchloroformiat als Ausgangsverbindung der 5′-Hydroxy-Schutzgruppe des Ribose- bzw. Desoxyriboserestes wurde durch Umsetzung von 2-Dansylethanol mit einem Chlorcarbonyl-Donor, wie beispielsweise Trichlormethylchloroformiat, Diphosgen und/oder Phosgen, vorzugsweise Trichlormethylchloroformiat in Gegenwart eines polaren, aprotischen Lösemittels hergestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wurde die Reaktion in Gegenwart eines einzigen polaren, aprotischen Lösemittels, insbesondere in Gegenwart von Acetonitril, durchgeführt. Das Molverhältnis von 2-Dansylethanol zu dem Chlorcarbonyl- Donor war 0,5-1 zu 1-2, vorzugsweise 1 zu 1-2, insbesondere 1 zu 1,5-2. Die Reaktionstemperatur lag in einem Bereich von -20°C bis zum Siedepunkt der Reaktionsmischung, vorzugsweise von -5°C bis +20°C, insbesondere von 0°C bis 5°C.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren fällt das 2-Dansylethylchloroformiat als ein reines und durch die Elementaranalyse in seiner Zusammensetzung bestätigtes Produkt an. Dies ist deshalb so überraschend, weil A. Takadate et al. (A. Takadate et al. (1983) Yakugaku Zasshi 103, 982-966) durch Umsetzung von 2-Dansylethanol mit Trichlormethylchloroformiat ein Produkt erhielten, dessen Schmelzpunkt um ca. 20°C niedriger ist als das in dem genannten Verfahren synthetisierte Produkt. 2-Dansylethanol kann beispielsweise nach S. Goya et al. (1981) (S. Goya et al. (1981) Yakugaku Zasshi 101, 1164) hergestellt werden.

Die Umsetzung von 2-Dansylethylchloroformiat mit dem geschützten Nukleosid kann beispielsweise analog der Umsetzung mit 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid nach C. Lehmann et al. (1989) in Gegenwart einer Base durchgeführt werden. Als Base eignen sich organische Basen, insbesondere Pyridin oder eine Mischung bestehend aus Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylenchlorid, Chloroform und/oder Acetonitril und einer Verbindung der Formel

NR²⁰R²¹R²²

worin R²⁰, R²¹ und R²² gleich oder unabhängig verschieden Wasserstoff oder eine C₁-C₄-Alkyl-, vorzugsweise eine Trimethyl-, Triethyl- oder Diisopropyl-Gruppe bedeuten, verwendet wird. Wird dabei als Substrat ein 2′-geschütztes Ribonukleosid verwendet, so entsteht ein Produktgemisch bestehend aus dem Dansylethyloxycarbonyl-Ribonukleosid und dem Bis-Dansylethyloxycarbonyl-Ribonukleosid als Nebenprodukt. Dieses Produktgemisch kann direkt in der nachfolgenden Phosphorylierungsreaktion eingesetzt werden. Vorzugsweise kann das Gemisch auch beispielsweise mittels Flash- Chromatographie gereinigt werden. Das abgetrennte Bis- Dansylethyloxycarbonyl-Ribonukleosid kann dann anschließend beispielsweise mit DBU in das Dansyl-freie Ribonukleosid gespalten werden, das wiederum als Ausgangsverbindung für die Dansylierungsreaktion verwendet werden kann.

Zum Aufbau 2′5′-verknüpfte Oligoribonucleotide, welche zum Beispiel als Tri- oder Tetraadenylat die Proteinbiosynthese inhibieren (Kerr, I. M. & Brown, R. E. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 256-260), kann man ein entsprechend der obigen Beschreibung geschütztes Nukleosid mit einer freien 2′-Hydroxygruppe in analoger Weise mit 2-Dansylethylchloroformiat umsetzen.

Das dansylierte Nukleosid mit der noch freien 2′- oder 3′-Hydroxygruppe am Zuckerrest wird im allgemeinen phosphityliert. Als Phosphitylierungsreagenz kann beispielsweise eine Verbindung der Formel (VI)

verwendet werden worin bedeuten:
R₆, R₇ gleich oder unabhängig verschieden C₁-C₈-Alkyl-, vorzugsweise eine Isopropyl- oder C₅-C₁₂-Cycloalkyl-Gruppe, vorzugsweise bis C₈, eine Benzyl oder eine Phenyl-Gruppe oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gesättigten oder ungesättigten heterocyclischen Ring, der gegebenenfalls weitere Heteroatome und Substituenten enthalten kann R⁸ eine Gruppe der Formel

oder eine Benzylgruppe, welche nicht substituiert oder einfach oder mehrfach ringsubstituiert, vorzugsweise nicht substituiert ist, wobei der oder die Substituenten unabhängig voneinander beispielsweise ein Halogen, eine C₁-C₄-Alkyl-, Nitro-, Methoxy- oder Carboxylgruppe ist.

Z Chlor, Brom oder ein Rest der Formel -NR₉R₁₀, wobei R₉, R₁₀ gleich oder unabhängig verschieden eine C₁-C₈-Alkyl-, vorzugsweise eine Isopropyl- oder C₅-C₁₂-Cycloalkyl-Gruppe, vorzugsweise bis C₈, eine Benzyl- oder eine Phenyl-Gruppe bedeuten.

Vorzugsweise wurde als Phosphitylierungsreagenz eine Verbindung der Formel (VII) mit Z=Chlor, R₆ und R₇ je ein Isopropylrest und R₈ gleich eine Gruppe der Formel

verwendet.

Die Reaktion wurde im allgemeinen in einem organischen Lösemittel wie Tetrahydrofuran oder Methylenchlorid, vorzugsweise Methylenchlorid, in Anwesenheit von 1 bis 8, vorzugsweise 1 bis 6, insbesondere 1 bis 4 Moläquivalente einer organischen Base wie Pyridin oder eine Mischung von Tetrahydrofuran (THF), Dioxan, Methylenchlorid, Chloroform und/oder Acetonitril und einem C₁-C₄-Trialkylamin, vorzugsweise einem Trimethyl-, Triethyl- oder Diisopropylethyl-Amin, insbesondere Diisopropylethyl-Amin durchgeführt. Ist Z ein Rest der Formel -NR₉R₁₀, so wurde die Reaktion vorzugsweise in Anwesenheit einer Verbindung der Formel [HNR₁₁R₁₂R₁₃]⁽⁺⁾X^(-), wobei R₁₁, R₁₂, R₁₃ gleich oder unabhängig verschieden eine C₁-C₄-Alkyl-Gruppe und X^(-)=Halogenid, insbesondere ein Chlorid, oder ein Tetrazolid bedeuten, oder Tetrazol, vorzugsweise in Gegenwart von Tetrazol, durchgeführt. Das Molverhältnis von dansyliertem Nukleosid zu Phosphitylierungsreagenz betrug 1 zu 1-4 vorzugsweise 1 zu 2-4, insbesondere 1 zu 2,5-3,5.

Die so gewonnenen Verbindungen der Formel (Va) oder (Vb) können anschließend für die Oligonukleotidsynthese eingesetzt werden. Hierbei sind die Zuckerreste der Nukleotide für die DNA-Synthese Desoxyribose, für die RNA-Synthese Ribose, aber es können auch Gemische aus Desoxyribose und Ribose für die Synthese eines Oligonukleotids bestehend aus regelmäßig oder unregelmäßig angeordneten Desoxyribose- und Ribosezuckerresten sein. Ferner kann das Oligonukleotid regelmäßig oder unregelmäßig aus Mononukleotiden der Formel (Va) und (Vb) aufgebaut sein. Die Oligo- bzw. Polynukleotidsynthese kann auf analoger Weise nach der Phosphoramidit-Methode, wie beispielsweise bei Chr. Lehmann et al. (1989) beschrieben, durchgeführt werden.

Grundsätzlich gibt es zwei Möglichkeiten Oligonukleotide zu synthetisieren. Zum einen kann die Synthese in Lösung erfolgen, beispielsweise nach der von C. B. Reese beschriebenen Methode (C. B. Reese (1989) "The Chemical Synthesis of Oligo- and Poly-ribonucleotides" in Nucleic Acids and Molecular Biology (F. Eckstein & D. M. J. Lilley, eds.) 3, 164-181).

Zum anderen kann die Oligonukleotid-Synthese an der Festphase, beispielsweise an Nukleosid-funktionalisierten Glass, erfolgen. (K. P. Stengele & W. Pfleiderer (1989) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 21, 101, K. P. Stengele & W. Pfleiderer (1990) Tetrahedron Lett. 31, 2549 oder Chr. Lehmann et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 2379-2390, No. 7). Im allgemeinen ist die Festphasensynthese die bevorzugte Methode.

Hierbei wurde vorzugsweise die folgende Reaktionsfolge gewählt:

1. Umsetzung einer Verbindung der Formel (Va) oder (Vb) mit dem Nukleosid der Formel (VIIa) oder (VIIb) worin B und R¹ die obengenannte Bedeutung haben, und G gleichbedeutend mit R₁ oder ein polymerer Träger ist, der über die 2′-Hydroxy- oder 3′-Hydroxy-Gruppe der Verbindung der Formel (VIIa) oder (VIIb) gebunden ist, in Anwesenheit einer schwachen Säure, beispielsweise Tetrazol oder p-Nitrophenyltetrazol.
2. Abfangen nicht-umgesetzter Verbindungen der Formel (VIIa) oder (VIIb), beispielsweise mit Acetanhydrid.
3. Oxidation zum Phosphat, Phosphoramidat oder zum Thiophosphat, beispielsweise mit Jod, Schwefel oder Jod/ Amin
4. Abspaltung der Dansylethoxycarbonyl-Gruppe, beispielsweise mit DBU in Acetonitril.
5. Umsetzung der erhaltenen Träger-gebundenen Verbindung mit einer Verbindung der Formel (Va) oder (Vb).
6. Wiederholung der Reaktionsschritte 2 bis 6 zur gewünschten Kettenlänge des Oligonukleotids.

Die Verbindung der Formel (Va) oder (Vb) und (VIIa) oder (VIIb) wurden vorzugsweise bei -20 bis +100°C, insbesondere bei Raumtemperatur in Anwesenheit von beispielsweise Tetrazol oder para-Nitrophenyl-tetrazol als schwache Säuren umgesetzt. Die Oxidation erfolgte bei einer Temperatur von -80 bis 100°C, vorzugsweise bei -20 bis +60°C, in Anwesenheit von Jod, Schwefel oder Jod in Gegenwart eines Amins (A. Jäger et al. Biochemistry 27, 7237 (1988)). Wurde ein Gemisch aus Jod, Wasser und einer organischen Base wie Lutidin oder Pyridin verwendet, so erfolgte die Oxidation vorzugsweise bei Raumtemperatur. Wurde hingegen ein Gemisch aus elementarem Schwefel, Toluol und einer organischen Base verwendet, so erfolgte die Oxidation vorzugsweise bei 60°C.

Die synthetisierten Oligonukleotide bestanden im allgemeinen aus 2 bis ca. 200, vorzugsweise 2 bis 100, insbesondere 2 bis 20 Mononukleotiden.

Alternativ zur Phosphitylierung kann das dansylierte Nukleosid mit der noch freien 2′- oder 3′-Hydroxygruppe am Zuckerrest auch zum H-Phosphonat der Formel (VIIIa) oder (VIIIb) umgesetzt werden.

worin DansEOC, R¹ und B die obengenannte Bedeutung haben und K⁽⁺⁾ ein Kation, insbesondere [NH(C₂H₅)₃]⁽⁺⁾, ist. (R. Strömberg, Chem. Commun. 1987, 1; B. C. Froehler, P. G. Ng, M. D. Mattencci, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 5399; M. Tahalu et al., Chem. Lett. 1988, 1675).

Dabei wird im allgemeinen eine Verbindung der Formel (IIIa) oder (IIIb) mit einer Verbindung der Formel (IX) oder (X)

PR₁₄R₁₅R₁₆ (IX)

PR₁₇R₁₈R₁₉ (X)

worin R₁₄, R₁₅, R₁₆ gleich der unabhängig verschieden Wasserstoff oder eine C₁-C₈-Alkyl-, C₁-C₈-Fluoralkyl- oder Aryl-Gruppe und R₁₇, R₁₈, R₁₉ gleich oder unabhängig verschieden Chlor, Brom oder eine C₁-C₈-Alkylamino- oder eine 1,2,4-Triazolylgruppe bedeuten.

Vorzugsweise wurde das dansylierte Nukleosid mit Bis(2,2,2-Trifluoroethyl)H-phosphonat, Bis(1,1,1,3,3,3- hexafluoro-2-propyl)phosphonat, Triethylphosphit, Triphenylphosphit umgesetzt werden oder mit PCl₃, Tri(dialkylamino)phosphinen oder Tris(1,2,4-Triazoyl)phosphit, vorzugsweise Tris(1,2,4-Triazoyl)phosphit, besonders bevorzugt mit PCl₃ nach Aktivierung mit Imidazol/ Triethylamin mit anschließender Hydrolyse zum H-Phosphonat.

Die Reaktion wurde in einem organischen Lösemittel wie Tetrahydrofuran oder Methylenchlorid, vorzugsweise Methylenchlorid, in Anwesenheit von 1-50 Moläquivalenten, vorzugsweise 10-50, insbesondere 30-50 Moläquivalente einer organischen Base wie C₁-C₄-Trialkylamin oder N-C₁-C₄-Alkylmorpholin, vorzugsweise N-Methylmorpholin, durchgeführt. Das Molverhältnis von dansyliertem Nukleosid zum Phosphonilierungsreagenz betrug 1 zu 1-10, vorzugsweise 1 zu 2-8, insbesondere 1 zu 5 betragen.

Die so gewonnenen Verbindungen der Formel (VIIIa) oder (VIIIb) können anschließend für die Oligonukleotidsynthese eingesetzt werden. Hierbei sind die Zuckerreste der Nukleotide für die DNA-Synthese Desoxyribose, für die RNA-Synthese Ribose, aber es können auch Gemische aus Desoxyribose und Ribose für die Synthese eines Oligonukleotids bestehend aus regelmäßig oder unregelmäßig angeordneten Desoxyribose- und Ribosezuckerresten sein. Ferner kann das Oligonukleotid regelmäßig oder unregelmäßig aus Mononukleotiden der Formel (VIIIa) und (VIIIb) aufgebaut sein.

Die Oligonukleotidsynthese kann nach der H-Phosphonat-Methode, wie beispielsweise bei B. C. Froehler et al. (Froehler, B. C. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 5399-5407, No. 13) beschrieben, durchgeführt werden, wobei die saure Abspaltung der 5′-Hydroxy-Schutzgruppe durch die basische Abspaltung der Dansylethoxycarbonylgruppe ersetzt wird.

Grundsätzlich kann die Synthese entweder in Lösung, beispielsweise analog nach C. B. Reese (1989), oder an der Festphase, beispielsweise analog nach B. C. Froehler (1986) erfolgen. Im allgemeinen ist die Festphasensynthese bevorzugt.

Hierbei wurde vorzugsweise die folgende Reaktionsfolge gewählt:

1. Umsetzung einer Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb) mit dem Nukleosid-gebundenen polymeren Träger der Formel (VIIa) oder (VIIb) in Anwesenheit eines Säurechlorids, beispielsweise Pivaloylchlorid oder Adamantoylchlorid,
2. Abspaltung der Donsylethoxycarbonylgruppe, beispielsweise mit DBU,
3. Umsetzung der erhaltenen Verbindung mit einer Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb),
4. Wiederholung der Schritte 2 und 3 bis zur gewünschten Kettenlänge des Oligonukleotids,
5. Oxidation, zum Phosphat, Phosphoramidat oder zum Thiophosphat, beispielsweise mit Jod oder Schwefel oder Amin/CCl₄/Triphenylphosphin (Jäger et al. s. o.).

Die Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb) und (VIIa) und (VIIb) wurden vorzugsweise bei einer Temperatur von -20°C bis +100°C, insbesondere bei Raumtemperatur in Anwesenheit von beispielsweise Pivaloylchlorid als Säure umgesetzt. Die Oxidation erfolgte beispielsweise mit Jod in einem Lösemittelgemisch bestehend im allgemeinen aus Pyridin, N-Methylimidazol, Wasser, THF bei Raumtemperatur.

Die synthetisierte Oligonukletide nach der beschriebenen H-Phosphonatmethode bestanden im allgemeinen aus 2 bis ca. 200, vorzugsweise 2 bis 110, insbesondere 2 bis 40 Mononukleotiden.

Die Vorteile der Oligonukleotidsynthese aus dansylierten Mononukleotiden nach der Phosphoramidit- oder nach der H-Phosphonat-Methode sind

a) leichte Nachweisbarkeit der Dansylgruppe wegen ihrer starken Fluoreszenz bei 550 nm,
b) Poly- bzw. Oligonukleotidsynthese bis in den Picomol- Bereich,
c) Entfernen der 5′-Hydroxy-Dansylschutzgruppe ohne Abspaltung anderer Hydroxy-Schutzgruppen an der Nukleotid-Base oder am Zuckerrest,
d) Synthese von Oligoribonukleotiden und Oligodesoxy ribonukleosiden, insbesondere von Oligoribonukleotiden,
e) Festphasensynthese von Oligonukleotiden in hohen Ausbeuten und in großer Kettenlänge.

Ein weiterer Vorteil der Verwendung der 5′-Hydroxy- Dansylschutzgruppe bei der RNA-Synthese ist, daß am Ende der Synthese die 2′-Hydroxygruppen des Riboserestes geschützt bleiben können. Die so modifizierten Oligoribonukleoside sind dadurch im allgemeinen vor Hydrolyse durch RNasen, aber auch vor möglichen Isomerierungsreaktionen geschützt und können daher über lange Zeiten stabil gelagert werden. Die 2′-Hydroxyschutzgruppe wird im allgemeinen dann erst kurz vor Gebrauch der RNA abgespalten.

Die Abspaltung vom Träger, sowie die Spaltung der Amino- und Hydroxy-Schutzgruppen an den synthetisierten Oligonukleotiden erfolgte nach allgemein bekannten Methoden z. B. wie bei M. Gait (Hrsg.): Oligonucleotide Synthesis, a practical approach; IRL Press; Oxford 1984 beschrieben.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Als Abkürzungen wurden verwendet:

Bz
für Benzoyl
Mthp	für Methoxytetrahydropyranoyl
DansEOC	für Dansylethoxycarbonyl und
EE	für Eisessig

Beispiel 1 Umsetzung von 2-Dansylethanol mit Trichlormethylchloroformiat

Unter Eiskühlung und Rühren pipettiert man 0,8 ml (1,32 g= 6,64 mmol) Trichlormethylchloroformiat in 10 ml absolutem CH₃CN. Danach tropft man unter Eiskühlung und Rühren durch eine Serumkappe mit einer Spritze 1 g (3,58 mmol) 2-Dansylethanol in 5 ml absolutem CH₃CN gelöst zu. Man rührt im Eisbad 5 h weiter. Der ausgefallene farblose Feststoff wird abgesaugt, mit absolutem Tetrahydrofuran gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Man erhält 1,135 g (3,00 mmol=84%) eines farblosen Feststoffes vom Schmelzpunkt 154-55°.

Die Elementaranalyse ergibt:

Beispiel 2 Umsetzung von 2′-O-(4-Methoxytetrahydropyranoyl)-N⁶-Benzoyl- Adenosin mit 2-Dansylethylchloroformiat-Hydrochlorid

2,43 g (5 mmol) 2′-O-Mthp-N⁶-Bz-Adenosin werden 2× mit je 30 ml absolutem Pyridin koevaporiert, dann in 40 ml absolutem Pyridin gelöst. Unter Eiskühlung und Rühren werden dann 2,46 g (6,5 mmol=1,3 eq) 2-Dansylethylchloroformiat-Hydrochlorid in fester Form zugegeben. Man rührt 1 h im Eisbad, wobei nach ca. 0,5 h das Hydrochlorid gelöst ist. Danach stoppt man mit 0,5 ml (8,8 mmol) Glykol ab, rotiert ein, verdünnt mit 200 ml CH₂Cl₂, wäscht mit 200 ml gesättigter NaHCO₃-Lsg., extrahiert die wäßrige Phase 2× mit je 100 ml CH₂Cl₂, trocknet die vereinigten organischen Phasen mit Na₂SO₄, filtriert ab und rotiert ein. Man koevaporiert 2× mit je 100 ml Toluol und 2× mit je 100 ml CH₂Cl₂. Man reinigt über eine SiO₂-Säule (100 g, 23×3,5 cm). Man eluiert mit 0,5 l CH₂Cl₂, 1 l CH₂Cl₂/MeOH 100 : 1 und 1,5 l CH₂Cl₂/MeOH 100 : 2 mit Flash-Chromatographie. Die einzelnen Produktfraktionen werden einrotiert und im Hochvakuum getrocknet. Man erhält 2,86 g (3,62 mmol=72%) 5′- und 0,47 g (0,43 mmol=9%) 3′,5′-di-substituiertes Produkt jeweils als gelbe, stark fluoreszierende Schäume. Für die Elementar-Analyse werden 100 mg des disubstituierten Produktes nochmals über 1 SiO₂-Platte (40×20 cm) mit CH₂Cl₂/MeOH 100 : 2 gereinigt.

Analysendaten für 2′-O-(4-Methoxytetrahydropyranoyl)-5′-O- dansyl-ethoxycarbonyl-N⁶-benzoyl-adenosin a) Dünnschichtchromatographie

Die Dünnschichtchromatographie wurde auf Merck Kiegelgel 60 F₂₅₄ (Merck, Darmstadt) in CH₂CH₂/MeOH (95 : 5) durchgeführt und ein R_f-Wert von 0,48 berechnet.

b) UV-Spektroskopie in Methanol: c) Elementaranalyse d) NMR-Spektroskopie in CDCl₃ bei 250 MHz

9,03 s breit (1) NH, 8,81 s (1) H-8, 8,61 d (2) Dansyl-H-2, 8,35-8,30 m (2) Dansyl-H-4, Dansyl-H-8, 8,23 s (1) H-2, 8,03 d (2) 2H von o-Bz, 7,65-7,50 (5) 3H von Bz, Dansyl-H-3, Dansyl-H-7, 7,20 d (1) Dansyl-H-6, 6,20 d (1) H-1′, 5,13 t (1) H-2′, 4,52-4,32 m (6) CH₂OCO, H-3′, H-4′, H-5′, H-5′′, 3,72 t (2) SO₂CH₂, 3,77-3,43 m (4) CH₂OCH₂ (Mthp), um 2,90 s breit (1) 3′-OH, 2,89 s (6) NMe₂, 2,87 s (3) OCH₃, 1,95-1,55 m (4) CH₂CCH₂ (Mthp).

Analysendaten für 2′-O-(4-Methoxytetrahydropyranoyl)-3′,5′-O- bis-dansylethoxycarbonyl-N⁶-benzoyl-adenosin a) Dünnschichtchromatographie

Die Dünnschichtchromatographie wurde auf Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Darmstadt) in CH₂Cl₂/MeOH (100 : 1) durchgeführt und ein R_f-Wert von 0,35 berechnet.

9,05 s breit (1) NH, 8,83 s (1) H-8, 8,69-8,60 2 d (2) 2× Dansyl-H-2, 8,35-8,29 m (4) 2×Dansyl-H-4, Dansyl-H-8, 8,22 s (1) H-2, 8,03 d (2) 2H von o-Bz, 7,68-7,50 m (7) 3H von Bz, 2×Dansyl-H-3, 2×Dansyl-H-7, 7,24-7,18 2 zu t überlagerte d (2) 2×Dansyl-H-6, 6,13 d (1) H-1′, 5,32 t (1) H-2′, 5,13-5,11 (1) H-3′, 4,60-4,22 m (7) 2×CH₂OCO, H-4′, H-5′, H-5′′, 3,77-3,26 m (8) 2×SO₂CH₂, CH₂OCH₂ (Mthp), 2,89 s (6) MMe₂, 2,88 s (6) NMe₂, 2,63 s (3) OCH₃, 1,78-1,20 m (4) CH₂CCH₂ (Mthp).

Beispiel 3 Umsetzung von 2′-O-(4-Methoxytetrahydropyranoyl)-5′-O- dansylethoxycarbonyl-N⁶-benzoyl-adenosin mit Phosphorigsäurechlorid-2-(4-nitrophenyl)-ethylester-N,N- diisopropylamid

1 g (1,264 mmol) 2′-O-Mthp-5′-O-DansEOC-N⁶-Bz-Adenosin werden in 6 ml absolutes CH₂Cl₂ gelöst, dann werden 0,86 ml (0,65 g=5,03 mmol=4 eq) Hünigs Base und 0,84 g (2,528 mmol= 2 eq) Phosphorigsäurechlorid 2-(4-nitrophenyl)- ethylester-N,N-diisopropylamid zugegeben. Unter einer Stickstoffatmosphäre, abgedunkelt mit einer Alufolie, wird der Ansatz bei Raumtemperatur gerührt. Nach 1¼ h werden nochmals 0,42 g (1,264 mmol=1 eq) Phosphitylierungreagenz zugegeben. Nach insgesamt 2,5 h Rühren bei Raumtemperatur wird mit 75 ml CH₂Cl₂ verdünnt, mit 75 ml gesättigter NaHCO₃-Lsg. gewaschen, die wäßrige Phase 4× mit je 50 ml CH₂Cl₂ rückextrahiert, die vereinigten organischen Phasen über Na₂SO₄ getrocknet, abfiltriert und einrotiert. Man reinigt über eine SiO₂-Säule (30 g, 12×3 cm) mit Flash- Chromatographie: Man eluiert mit 250 ml CH₂Cl₂, 100 ml CH₂Cl₂/EE 100 : 1, 100 ml CH₂Cl₂/EE 100 : 2, 100 ml CH₂Cl₂/EE 100 : 3, 100 ml CH₂Cl₂/EE 100 : 5, 100 ml CH₂Cl₂/EE 100 : 7, 100 ml CH₂Cl₂/EE 9 : 1, 350 ml CH₂Cl₂/EE 4 : 1 (Reagenz), 100 ml CH₂Cl₂/EE 2 : 1 (Produkt), 100 ml CH₂Cl₂/EE 1 : 1 (Produkt), 100 ml CH₂Cl₂/EE 1 : 2 (Produkt) und 100 ml EE (Produkt).

Die Produktfraktionen werden einrotiert und im Hochvakuum getrocknet. Man erhält 0,955 g (0,878 mmol=70%) eines gelben, fluoreszierenden Schaumes.

Analysendaten a) Dünnschichtchromatographie

Die Dünnschichtchromatographie wurde auf Merck Kieselgel 60 F₂₅₄ in Toluol/Eisessig (1 : 6) durchgeführt und ein R_f-Wert von 0,50 berechnet.

b) UV-Spektroskopie in Methanol c) Elementaranalyse d) NMR-Spektroskopie 1. ³¹P-NMR in CDCl₃ bei 161,70 MHz

151,34 ppm s (31%)
149,47 ppm s (69%)

2. ¹H-NMR in CDCl₃ bei 250 MHz

9,07 s breit (1) NH, 8,83 u. 8,82 2s (1) H-8, 8,61 d (1) Dansyl-H-2, 8,35-8,29 m (2) Dansyl-H-4, Dansyl-H-8, 8,24 u. 8,22 s (1) H-2, 8,18-8,13 2d (2) 2H o zu Phenyl-NO₂, 8,03 d (2) 2H von o-Bz, 7,64-7,49 m (5) 3H von Bz, Dansyl-H-3, Dansyl-H-7, 7,45-7,38 2d (2) 2H m zu Phenyl-NO₂, 7,19 d (1) Dansyl-H-6, 6,23 u. 6,15 2d (1) H-1′, 5,20 u. 5,11 2t (1) H-2′, 4,48 t (2) CH₂OCO, 4,44-4,18 m (4) H-3′, H-4′, H-5′, H-5′′, 4,10-3,88 m (2) CH₂OP, 3,84-3,25 m (6) 2×CH (i-Pr). CH₂OCH₂ (Mthp), 3,71 t (2) SO₂CH₂, 3,06 t (2) CH₂-Phenyl-NO₂, 2,88 s (6) NMe₂, 2,66 u. 2,61 2s (3) OCH₃, 2,00-1,45 m (4) CH₂CCH₂ (Mthp, 1,26-1,12 überlagert d (12) 2×C(CH₃)₂ (i-Pr).

Beispiel 4 Automatische Oligoribonukleotid-Synthese mit 2′-O-(4- Methoxy-tetrahydropyranyl)-5′-O-dansylethoxycarbonyl- phosphitamiden. Herstellung des Decanucleotids (rAp)gT

Die Synthesen wurden mit einem 380 B DNA-Synthesizer (Applied Biosystems) durchgeführt.

Verwendete Säule: ABI-Standardsäule
Verwendetes Trägermaterial: LCAMA-CPG-Träger, der mit dem Nucleosid über 3′-Hydroxygruppe verbunden ist.
(Literatur: K. P. Stengele, W. Pfleiderer Nucleic Acids Res. Symp. ser. 21, 101 (1989); K. P. Stengele, W. Pfleiderer Tetrahedron Lett. 31, 2549 (1990).

Beladung mit Thymidin, das über die 3′-Hydroxy-Gruppe an den Träger gebunden ist; 19 µmol/g.
Ansatzgröße: ca. 0,6 µmol (Bestimmung durch Tritylabspaltung).

Synthesezyklus:

1. Kondensation mit 0,5 M Tetrazol und 0,1 m 2′-O-(4- Methoxy-tetrahydropyranyl)-5′-O-dansylethoxy-carbonyl-N⁶- benzoyl-adensoin-3′-O-phosphitamid in absolutem Acetonitril gemäß folgender Pulsfolge:

2. Capping von nicht-umgesetzten Nukleotid mit Acetanhydrid/Lutidin/THF (1 : 1 : 3) und 6,5% Dimethyl aminopyridin (DMAP) in THF

Durchfluß\|20 sec.
Warteschritt	30 sec.

3. Oxidation mit I₂-Lösung (1,269 g I₂/20 ml H₂O/10 ml Pyridin/100 ml THF)

Durchfluß\|30 sec.
Warteschritt	30 sec.

4. Dansylethoxycarbonyl-Abspaltung mit 0,1 M DBU in Acetonitril in 2×30 sec. und 8×10 sec. gepulsten Flüssen mit dazwischengeschalteten 1 sec. "reverse flushes".

Die Eluate aus dem 4. Schritt wurde gesammelt und die Kondensationsausbeuten anhand des gebildeten 5-Dimethylamino-naphthalin-1-vinylsulfons mittels Fluoreszenzspektroskopie (Anregung: 368 nm; Emission: 526 nm) bestimmt.

Die durchschnittliche stufenweise Ausbeute betrug ca. 98%.

Zwischen den einzelnen Schritten 1-4 erfolgten die üblichen Waschschritte mit Acetonitril sowie die "block- bzw. reverse flushes".

Beispiel 5 Synthese von 5′-O-Dansylethoxycarbonyl-geschützten H-Phosphonaten

10,75 Äquivalente Imidazol werden in 5 ml absoluten Methylenchlorid gelöst, dann mit Eis/Kochsalz gekühlt und anschließend die gekühlte Lösung mit 3,5 Äquivalente PCl₃ und 11,25 Äquivalente Triethylamin versetzt. Man rührt 15 Minuten unter Kühlung und gibt dann 0,25 mmol (1 Äquivalent) 2′-O-(4-Methoxytetrahydropyranoyl)-5′-O-dansyl ethoxycarbonyl-N⁶-benzoyladenosin oder 0,25 mmol 2′-O-(4-Methoxytetrahydropyranoyl)-5′-O-dansyl ethoxycarbonyl-N⁶-para-nitrophenylethyloxycarbonyladenosin (1× mit Acetonitril koevaporiert) in 5 ml absolutem Methylenchlorid innerhalb von 10 min tropfenweise unter Rühren zu.

Danach wird das Eisbad entfernt und weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Reaktionslösung mit 10 ml 1 M Triethylammonium-bikarbonat ausgeschüttelt. Man trennt die Phasen, extrahiert die wäßrige Phase mit 10 ml CH₂Cl₂ trocknet die vereinigten organischen Phasen über Na₂SO₄, filtriert ab und rotiert zu einem gelben, fluoreszierenden Schaum ein. Man reinigt über eine kurze Kieselgel-Säule (Flash-Chromatographi) mit einem CH₂Cl₂/MeOH-Gradienten.

Beispiel 6 Automatische Oligoribonukleotid-Synthese mit 2′-O-(4- Methoxy-tetrahydropyranyl)-5′-O-dansylethoxycarbonyl ribonucleosid-3′-O-H-phosphonaten. Herstellung von (rAp)gT

Verwendete Säule: ABI-Standardsäule Verwendetes Trägermaterial: LCAMA-CPG-Träger (Literatur: K. P. Stengele, W. Pfleiderer Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 21, 101 (1989); K. P. Stengele, W. Pfleiderer Tetrahedron Lett. 31, 2549 (1990).
Beladung mit Thymidin, das über die 3′-Hydroxy-Gruppe an den Träger gebunden ist, 19 mol/g.
Ansatzgröße: ca. 0,6 mol (Bestimmung durch Tritylabpaltung).

Synthesezyklus:

1. Waschen mit absolutem Pyridin/Acetonitril (1 : 1)
2. Umsetzung mit 2′-O-(4-Methoxytetrahydropyranyl)-5′-O- dansylethoxycarbonyl-H-phosphonat (10 mM) und Pivaloylchlorid (50 mM) in absolutem Pyridin/Acetonitril (1 : 1)
3. Waschen mit absolutem Acetonitril (45 Sekunden)
4. Dansylethoxycarbonyl-Abspaltung mit 0,1 M DBU in Acetonitril (2 Minuten)
5. Wiederholung der Schritte 1 bis 4 bis gewünschte Kettenlänge erreicht
6. Dansylethoxycarbonyl-Abspaltung mit 0,1 M DBU in Acetonitril (2 Minuten) und Sammeln der Eluate
7. Oxidation mit J₂ (0,1 M) in Pyridin/N-Methylimidazol/ Wasser/THF (5/1/5/90) (2,5 Minuten) oder mit J₂ (0,1 M) in Triethylamin/Wasser/THF (5/5/90) (2,5 Minuten)
Die Oxidation zum Thiophosphat oder Phosphoramidat wurde auch wie in Uhlmann & Peyman (1990) beschrieben, durchgeführt.

Die Eluate aus dem 6. Schritt werden gesammelt und die Kondensationsausbeuten anhand des gebildeten 5-Dimethylamino-naphthalin-1-vinylsulfons mittels Fluoreszenzspektroskopie (Anregung: 368 nm; Emission: 526 nm) bestimmt.

Die durchschnittliche stufenweise Ausbeute beträgt ca. 98%.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel (II), mit einem Chlorcarbonyl-Donor umgesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Chlorcarbonyl-Donor Trichlormethylchloroformiat, Diphosgen und/oder Phosgen, vorzugsweise Trichlormethylchloroformiat, ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Gegenwart eines polaren, aprotischen Lösemittels erfolgt.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Acetonitril oder Pyridin als Lösemittel eingesetzt wird.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis von der Verbindung der Formel (I) zu dem Chlorcarbonyl-Donor 0,5-1 zu 1-2, vorzugsweise 1 zu 1-2, insbesondere 1 zu 1,5-2 ist.

6. Verwendung der Verbindung der Formel (I) als Reagenz zum Schutz der Hydroxy-Gruppe in der Oligonukleotidsynthese.

7. Verbindung der Formel (IIIa) oder (IIIb) worin bedeuten: DansEOC eine Gruppe der Formel R¹ Wasserstoff oder unabhängig voneinander eine Gruppe der Formel und B bedeutet mit R² jeweils unabhängig voneinander eine Gruppe der Formel oder B bedeutet mit R³ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder und R⁴ jeweils unabhängig voneinander eine Gruppe der Formel oder B bedeutet Y = H, CH₃ (oder: n-Alkyl C₁-C₄)
mit R₅ jeweils unabhängig voneinander

8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (IIIa) oder (IIIb) durch Umsetzung der Verbindung der Formel (I) mit einer entsprechenden Verbindung der Formel (IVa) oder (IVb) worin R¹ und B die obige Bedeutung haben, in Gegenwart einer Base.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Base Pyridin oder einer Mischung bestehend aus Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylenchlorid, Chloroform und/oder Acetonitril und einer Verbindung der Formel NR²⁰R²¹R²²worin R²⁰, R²¹ und R²² gleich oder unabhängig verschieden Wasserstoff oder eine C₁-C₄-Alkyl-, vorzugsweise eine Trimethyl-, Triethyl- oder Diisopropyl-Gruppe bedeuten, verwendet wird.

10. Verwendung einer Verbindung der Formel (IIIa) oder (IIIb) in der Oligonukleotidsynthese.

11. Verbindung der Formel (Va) oder (Vb) worin
DansEOC, R¹ und B die obengenannte Bedeutung haben und
R⁶, R⁷ gleich oder unabhängig verschieden eine C₁-C₈- Alkyl-, vorzugsweise eine Isopropyl- oder C₅-C₁₂- Cycloalkyl-Gruppe, vorzugsweise bis C₈, eine Benzyl oder Phenyl-Gruppe oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gesättigten oder ungesättigten heterocyclischen Ring, der gegebenenfalls weitere Heteroatome und Substituenten enthalten kann und
R⁸ eine Gruppe der Formel oder eine Benzylgruppe, welche nicht substituiert oder einfach oder mehrfach ringsubstituiert, vorzugsweise nicht substituiert ist, wobei der oder die Substituenten unabhängig voneinander ein Halogen, eine C₁-C₄-Alkyl-, Nitro-, Methoxy- oder Carboxylgruppe ist.

12. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (Va) oder (Vb) durch Umsetzung der Verbindung der Formel (IIIa) oder (IIIb) mit einer Verbindung der Formel (VI) worin R₆, R₇ und R₈ die obige Bedeutung haben und Z Chlor oder Brom oder ein Rest der Formel -NR₉R₁₀, wobei R₉, R₁₀ gleich oder unabhängig verschieden eine C₁-C₈- Alkyl-, vorzugsweise eine Isopropyl- oder C₅-C₁₂- Cycloalkyl-Gruppe, vorzugsweise bis C₈, eine Benzyl- oder eine Phenyl-Gruppe, vorzugsweise Chlor ist, in Gegenwart einer Base.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Base Pyridin oder eine Mischung von Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylenchlorid, Chloroform und/oder Acetonitril mit einem C₁-C₄-Trialkylamin, vorzugsweise einem Trimethyl-, Triethyl- oder Diisopropylethyl-Amin oder wenn Z ein Rest der Formel -NR₉R₁₀, dann in Gegenwart einer Verbindung der Formel [HNR₁₁R₁₂R₁₃]/⁽⁺⁾X^(-), wobei R₁₁, R₁₂, R₁₃ gleich oder unabhängig verschieden eine C₁-C₄-Alkyl-Gruppe und X=Halogen, insbesondere Cl bedeuten, oder Tetrazol, vorzugsweise in Gegenwart von Tetrazol, verwendet wird.

14. Verwendung einer Verbindung der Formeln (Va) oder (Vb) in der Oligonukleotidsynthese.

15. Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotiden aus Verbindungen der Formel (Va) und/oder (Vb), dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel (Va) oder (Vb)

1. mit einer Verbindung der Formel (VIIa) oder (VIIb), worin B und R₁ die obengenannte Bedeutung haben, und G gleichbedeutend mit R₁ oder ein polymerer Träger ist, der über die 2′-Hydroxy- oder 3′-Hydroxy-Gruppe der Verbindung der Formel (VIIa) oder (VIIb) gebunden ist, umsetzt,
2. die erhaltene Verbindungen oxidiert.
3. die Dansylethoxycarbonyl-Gruppe abspaltet,
4. die erhaltene Verbindung mit einer Verbindung der Formel (Va) oder (Vb) umsetzt und
5. die Reaktionsschritte 2-4 bis zur gewünschten Kettenlänge wiederholt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel (Va) oder (Vb) und (VIIa) oder (VIIb) bei einer Temperatur von -20 bis +100°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, umsetzt.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Anwesenheit einer schwachen Säure erfolgt.

18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Anwesenheit von Tetrazol oder p-Nitrophenyltetrazol erfolgt.

19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidation mit Jod, Schwefel oder Jod in Gegenwart eines Amins durchgeführt wird.

20. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxidation bei einer Raumtemperatur von -80 bis +100°C, vorzugsweise bei -20 bis +60°C, insbesondere bei Raumtemperatur durchführt.

21. Dansylethoxycarbonyl-geschützte Oligonukleotide, hergestellt aus mindestens einer Verbindung der Formel (Va) und/oder (Vb).

22. Oligonukleotide, hergestellt aus mindestens einer Verbindung der Formel (Va) und/oder (Vb).

23. Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb) worin DansEOC, R¹ und B die obengenannte Bedeutung haben und K⁺ ein Kation, insbesondere [HN(C₂H₅)₃]⁽⁺⁾ ist.

24. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb) durch Umsetzung einer Verbindung der Formel (IIIa) oder (IIIb) mit einer Verbindung der Formel (IX) PR₁₄R₁₅R₁₆ (IX)worin R₁₄, R₁₅, R₁₆ gleich oder unabhängig verschieden Wasserstoff oder eine C₁-C₈-Alkyl-, C₁-C₈-Fluoralkyl- oder Aryl-Gruppe, vorzugsweise eine 2,2,2-Trifluorethyl-, 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2- propyl-, Ethyl- oder Phenyl-Gruppe, in Gegenwart einer Base

25. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb) durch Umsetzung einer Verbindung der Formel (IIIa) oder (IIIb) mit einer Verbindung der Formel (X) PR₁₇R₁₈R₁₉ (X)worin R₁₇R₁₈R₁₉ gleich oder unabhängig verschieden Chlor-, Brom- oder eine C₁-C₈-Alkylamino- oder eine 1,2,4-Triazoylgruppe, vorzugsweise eine 1,2,4-Triazolylgruppe, in Gegenwart einer Base mit anschließender Hydrolyse.

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß als Base C₁-C₄-Trialkylamin oder N-C₁-C₄-Alkylmorpholin, vorzugsweise N-Methylmorpholin verwendet wird.

27. Verwendung einer Verbindung der Formeln (VIIIa) oder (VIIIb) in der Oligonukleotidsynthese.

28. Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotiden aus Verbindungen der Formel (VIIIa) und/oder (VIIIb), dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb)

1. mit einer Verbindung der Formel (VIIa) oder (VIIb) umsetzt,
2. die Dansylethoxycarbonyl-Gruppe abspaltet,
3. die erhaltene Verbindung mit einer Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb) umsetzt,
4. die Reaktionsschritte 2 und 3 bis zur gewünschten Kettenlänge wiederholt und
5. das erhaltene Oligonukleotid oxidiert.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel (VIIIa) oder (VIIIb) und (VIIa) oder (VIIb) bei einer Temperatur von -20 bis +100°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, umsetzt.

30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Anwesenheit eines Säurehalogenids, vorzugsweise eines Säurechlorids, erfolgt.

31. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Anwesenheit von Pivaloylchlorid oder Adamantoylchlorid erfolgt.

32. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 28 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidation mit Jod, Schwefel oder einem Amin in Gegenwart von Triphenylphosphin/CCl₄ durchgeführt wird.

33. Dansylethoxycarbonyl-geschützte Oligonukleotide, hergestellt aus mindestens einer Verbindung der Formel (VIIIa) und/oder (VIIIb).

34. Oligonukleotide, hergestellt aus mindestens einer Verbindung der Formel (VIIIa) und/oder (VIIIb).