NO180419B - Oligonukleotider og anvendelse i oligonukleotidsyntese - Google Patents
Oligonukleotider og anvendelse i oligonukleotidsyntese Download PDFInfo
- Publication number
- NO180419B NO180419B NO951911A NO951911A NO180419B NO 180419 B NO180419 B NO 180419B NO 951911 A NO951911 A NO 951911A NO 951911 A NO951911 A NO 951911A NO 180419 B NO180419 B NO 180419B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- group
- dansyl
- synthesis
- hydroxy
- ch2c12
- Prior art date
Links
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 title claims description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 27
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- -1 4-(t-butyl)benzoyl Chemical group 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- CRBMHTNKUVJJFH-UHFFFAOYSA-N 2-[5-(dimethylamino)naphthalen-1-yl]sulfonylethanol Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(=O)(=O)CCO CRBMHTNKUVJJFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- HFRFFTOBSWLORF-UHFFFAOYSA-N 2-[5-(dimethylamino)naphthalen-1-yl]sulfonylethyl carbonochloridate;hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(=O)(=O)CCOC(Cl)=O HFRFFTOBSWLORF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 3
- HCUYBXPSSCRKRF-UHFFFAOYSA-N diphosgene Chemical compound ClC(=O)OC(Cl)(Cl)Cl HCUYBXPSSCRKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006068 polycondensation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical class [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- IPZJQDSFZGZEOY-UHFFFAOYSA-N dimethylmethylene Chemical compound C[C]C IPZJQDSFZGZEOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005740 oxycarbonyl group Chemical group [*:1]OC([*:2])=O 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- KYVBNYUBXIEUFW-UHFFFAOYSA-N 1,1,3,3-tetramethylguanidine Chemical compound CN(C)C(=N)N(C)C KYVBNYUBXIEUFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylpropanoyl chloride Chemical compound CC(C)(C)C(Cl)=O JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-Lutidine Substances CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDTFMPXQUSBYRL-UUOKFMHZSA-N 2-Aminoadenosine Chemical compound C12=NC(N)=NC(N)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O ZDTFMPXQUSBYRL-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 238000004679 31P NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 9beta-Ribofuranosyl-7-deazaadenin Natural products C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N L-xanthosine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- MRWXACSTFXYYMV-UHFFFAOYSA-N Nebularine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N Phosgene Chemical compound ClC(Cl)=O YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N Xanthosine Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000027832 depurination Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N nebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000001208 nuclear magnetic resonance pulse sequence Methods 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000005731 phosphitylation reaction Methods 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000006253 t-butylcarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(C(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- UVRNDTOXBNEQBA-UHFFFAOYSA-N trichloromethyl carbonochloridate Chemical compound ClC(=O)OC(Cl)(Cl)Cl.ClC(=O)OC(Cl)(Cl)Cl UVRNDTOXBNEQBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 description 1
- HDZZVAMISRMYHH-KCGFPETGSA-N tubercidin Chemical compound C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O HDZZVAMISRMYHH-KCGFPETGSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N xanthosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Den kjemiske polykondensasjonen av mononukleotider er en viktig metode for fremstilling av desoksyribonukleinsyre (DNA) eller ribonukleinsyre (ENA).
Et grunnleggende problem ved kjemisk syntese av DNA eller RNA er å finne frem til egnede beskyttelsesgrupper for amino- og hydroksygruppene til nukleosidbasene og sukkerrestene. Disse beskyttelsesgruppene må på den ene side være stabil under betingelsene ved polykondensasjonsreaksjoner, dvs. under dannelse av fosfodiesterbinding, og på en annen side må de være tilstrekkelig labile for at de ved slutten av reaksjonen kan spalte fosfodiesterbindingen, for igjen å kunne bli fjernet (H. G. Khorana; Pure Appl. Chem. 17 (1968) 349).
Særlig problematisk er den kjemiske syntese av RNA, da ribosesukkerresten bærer 2 hydroksygrupper, som begge må bli beskyttet. Beskyttelsesgruppen til 5'-hydroksygruppen må derfor før hvert polykondensasjonstrinn bli selektivt avspaltet, dvs. uten avspaltning av 2'-hydroksybeskyttelsesgruppen. Beskyttelsesgruppen til 2'-hydroksygruppen kan først på slutten av RNA-syntesen bli avspaltet, og riktignok under betingelser, som fører til mindre spalting eller isomeriser-ing av fosfodiesterbindingen (C. B. Reese, Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol 3 (F. Eckstein & D. M. J. Lilley eds.), Springer forlag, Weinheim).
En mulighet for selektiv avspaltning av 5'-hydroksybeskyttelsesgruppen uten avspaltning av 2'-hydroksybeskyttelsesgruppen er å oppnå en kombinasjon med en baselabil 5'-hydroksybeskyttelsesgruppe med en syrelabil 2'-hydroksybeskyttelsesgruppe (Chr. Lehmann et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 2379-2390, nr. 7). Anvendelse av en baselabil 5'-hydroksybeskyttelsesgruppe er også fordelaktig ved syntese av DNA, da under de milde betingelsene de ikke-sure hydrolysebetingelsene i syntesen med allerede dannede fosfodi- hhv. triesterbindingene generelt ikke blir spaltet. I tillegg blir det under de milde ikke-sure hydrolysebetingelsene omgått en depurinering av nukleotidet, som beskrevet av E. Sonveaux (E. Sonveaux (1986), Bioorganic Chemistry 14., 286 ). Et ytterligere krav på 5'-hydroksybeskyttelsesgruppen ved DNA- og også ved RNA-syntesen, er en lett og høyømfintlig påvisbarhet av beskyttelsesgruppen. På denne måten kan omsetningsgraden av det enkelte reaksjonstrinn bli fulgt spesielt godt og det kan bli oppnådd en mest mulig fullstendig omsetning. Derigjennom er det mulig å fremstille særlig lange oligonukleotider med høyt utbytte. Dette tillater også gjennom-føring av mindre synteseforsøk i nanomolare til pikomolare områder.
Det er nå overraskende funnet at dansyletoksykarbonylgruppen (Dans-EOC) kan bli anvendt som baselabil 5'-hydroksybeskyttelsesgruppe i kjemisk oligonukleotidsyntese.
Gjenstand for oppfinnelsen er således en forbindelse med formel (Illa) eller (Illb)
der DansEOC betyr en gruppe med formel:R<1> betyr hydrogen eller uavhengig av hverandre en gruppe med formel: B betyr der R<2> betyr uavhengig av hverandre en gruppe med formel
Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en forbindelse med formel (Illa) eller (Illb) i oligonukleotidsyntese.
Til innføring av dansyletoksykarbonylgruppen i nukleosidet blir 2-dansyletylklorformiathydroklorid omsatt med et nukleosid, og med dette blir i hvert nukleosid amino- hhv. hydroksy-funksjonen til nukleosidbasen beskyttet med egnede grupper. Som beskyttelsesgrupper egner seg f.eks. for 6-aminogruppen i adenin, t-butylkarbonyl, benzoyl-, 4-(t-butyl)benzoyl- eller para-nitrofenyletyloksykarbonylgruppe, særlig benzoyl- eller para-nitrofenyletyloksykarbonyl-gruppen.
For 2-aminogruppen til guanin egner seg f.eks. isobutyryl-, 4-(t-butyl)fenylacetyl- eller para-nitrofenyletyloksy-karbonyl-gruppen, særlig isobutyryl- eller para-nitrofenyl-etyloksykarbonyl-gruppen. 6-hydroksygruppen til guanin hhv. 4-hydroksygruppen til uracil blir generelt enten ubeskyttet eller de kan bli beskyttet med en para-nitrofenyletylgruppe. Ved cytosin blir 4-aminogruppen f.eks. beskyttet ved en benzoyl-, 4-(t-butyl)benzoyl- eller para-nitrofenyletyloksykarbonylgruppe, særlig benzoyl- eller para-nitroetyloksy-karbonyl-gruppen. Tymidin forblir generelt ubeskyttet. I uridin blir 3-N-gruppen f.eks. beskyttet med en Boe- eller anisoylgruppe.
Istedenfor de naturlige nukleosidbasene kan også modifiserte nukleosidbaser bli anvendt, deres amino- hhv. hydroksygrupper kan på analog måte bli beskyttet med de ovenfor nevnte beskyttelsesgruppene. Eksempler på nukleosider med modifiserte baser er inosin-, 8-aza-7-deazaadenosin-, tubercidin-, nebularin-, xantosin-, 2-aminoadenosin- eller pyridopyrimidin-nukleosid. Nukleosidene kan kjøpes og innføringen av enkelte beskyttelsesgrupper kan f.eks. foregå etter C. Lehmann et al. (1989), C. B. Reese (1989 ) ["The Chemical Synthesis of Oligo and Polyribonucleotides" in Nucleic Acids and Molecular Biology 3, F. Eckstein & D. M. J. Lilley (eds.), Springer forlag Berlin, Heidelberg], E. Sonveaux (1986), Bioorganic Chemistry 14, 274-325 eller E. Uhlmann & A. Peyman (1990), Chemical Reviews 90, 543-584, nr. 4 .
Ved anvendelse av ribonukleotider må ytterligere hydroksy- og aminogruppene til nukleotidbasene også 2'-hydroksygruppene til riboserestene bli beskyttet. Som allerede nevnt er det for RNS-syntesen viktig, ved valg av en egnet kombinasjon av 5'-hydroksy- og 2'-hydroksybeskyttelsesgruppe, selektivt å kunne fjerne 5'-hydroksybeskyttelsesgruppen, dvs. uten avspaltning av 2'-hydroksybeskyttelsesgruppen.
I nærvær av syrelabile 2'-hydroksybeskyttelsesgrupper, kan dansyletoksykarbonylgruppen som 5'-hydroksybeskyttelsesgruppe selektivt bli avspaltet under ikke-syrebetingelser. Som syrelabile 2'-hydroksybeskyttelsesgrupper kan det f.eks. bli anvendt 4-metoksytetrahydropyran-4-yl-, tetrahydropyranyl-, t-butyl-dimetylsilyl-, 2-nitrobenzyl-, l-(2-klor-4-metyl-fenyl)-4-metoksypiperidin-4-yl- eller l-(2-fluorfenyl)-4-metoksypiperidin-4-yl-gruppen. Avspaltingen av dansyletoksykarbonylgruppen blir fortrinnsvis gjennomført i et aprotisk polart oppløsningsmiddel, særlig acetonitril eller pyridin med hjelp av 1 til 3, fortrinnsvis 1,5 til 2,5 mol ekvivalenter DBU (= 1,5-diazobicyklo-[5.4.0]-undec-5-en ). Alterna-tivt kan andre baser som TMG (= N<1>N<1>N<2>N<2->tetrametylguanidin) eller C^-C4-trialkylamin, som f.eks. trietylamin, bli anvendt til avspaltning.
2-dansyletylklorformiat-hydroklorid som utgangsforbindelse til 5'-hydroksybeskyttelsesgruppen i ribose hhv. desoksy-riboserestene blir ved omsetning av 2-dansyletanol fremstilt med en klorkarbonyldonor, som f.eks. triklormetylklorformiat (difosgen) og/eller fosgen, fortrinnsvis triklormetylklorformiat i nærvær av et polart, aprotisk oppløsningsmiddel. I en foretrukket utførelsesform blir reaksjonen gjennomført i nærvær av et enkelt polart, aprotisk oppløsningsmiddel, særlig i nærvær av acetonitril. Molforholdet av 2-dansyletanol til klorkarbonyldonor er 0,5-1 til 1-2, fortrinnsvis 1 til 1-2, særlig 1 til 1,5-2. Reaksjonstemperaturen ligger i området fra -20°C til kokepunktet av reaksjonsblandingen, fortrinnsvis fra -5"C til +20°C, særlig fra 0°C til 5°C.
Prinsipielt er det to muligheter for å syntetisere oligonukleotider. For det første kan syntesen foregå i oppløsning, f.eks. etter den beskrevne måten til C. B. Reese (C. B. Reese
(1989) "The Chemical Synthesis of Oligo- and Poly-ribonucleo-tides" i Nucleic Acids and Molecular Biology (F. Eckstein & D. M. J. Lilley, eds.) 3, 164-181).
For det andre kan oligonukleotidsyntesen foregå på fastfase, f.eks. på nukleosid-funksjonalisert glass (K. P. Stengele & W. Pfleiderer (1989) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 21, 101, K. P. Stengele & W. Pfleiderer (1990) Tetrahedron Lett. 31, 2549 eller Chr. Lehmann et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 2379-2390, nr. 7). Generelt er fastfasesyntesen den foretrukkede metoden.
Fordelene med oligonukleotidsyntesen av dansylerte mononukleotider etter fosforamidit- eller etter H-fosfonat-metoden er: a) lett påvisbarhet av dansylgruppen pga. dens sterke fluorescens ved 550 nm,
b) poly- hhv. oligonukleotidsyntese til pikomolområdet,
c) Fjerning av 5'-hydroksy-dansylbeskyttelsesgruppen uten avspaltning av andre hydroksybeskyttelsesgrupper på
nukleotidbasen eller på sukkerresten,
d) syntese av oligoribonukleotider og oligodesoksyribo-nukleotider, særlig av oligoribonukleotider, e) Fastfasesyntese av oligonukleotider i høyt utbytte og i stor kjedelengde.
En ytterligere fordel med anvendelse av 5'-hydroksydansyl-beskyttelsesgruppen ved RNA-syntese er at på slutten av syntesen kan 2'-hydroksygruppen i riboserestene bli beskyttet. Det således modifiserte oligoribonukleotidet er derfor generelt beskyttet mot hydrolyse av RNaser, men også mot mulige isomeriseringsreaksjoner og kan derfor bli stabilt lagret over lengre tidsrom. 2'-hydroksybeskyttelsesgruppen blir deretter avspaltet kort før bruk av RNA.
Avspaltningen fra bærer, så vel som spalting av amino- og hydroksy-beskyttelsesgruppen på de syntetiske oligo-nukleotidene, foregår etter generelt kjente metoder som f.eks. beskrevet av M. Gait (Hrsg.): 01igonucleotide Synthesis, a practical approach; IRL Press; Oxford 1984.
Følgende eksempler vil forklare oppfinnelsen nærmere. Det blir anvendt følgende forkortelser:
Eksempel 1
Omsetting av 2- dansyletanol med triklormetylklorformiat
Under isavkjøling og omrøring pipetteres 0,8 ml (1,32 g = 6,64 mmol) triklormetylklorformiat i 10 ml absolutt CH3CN. Deretter dryppes under isavkjøling og omrøring gjennom en serumkappe med en sprøyte 1 g (3,58 mmol) 2-dansyletanol oppløst i 5 ml absolutt CH3CN. Det omrøres i isbad ytterligere 5 timer. Det utfelte fargeløse faststoffet avsuges, vaskes med absolutt tetrahydrofuran og tørkes i høyvakuum. Det oppnås 1,135 g (3,00 mmol = 84 %) av et fargeløst faststoff med smeltepunkt 154-55°C.
Elementæranalyse gir:
Eksempel 2
Omsetning av 2'-0-(4-metoksytetrahydropyranylj-N^-benzoyladenosin med 2- dansylet. ylklorformiat- hydroklorid 2,43 g (5 mmol) 2'-O-Mthp-N^-Bz-adenosin koevaporeres 2 x med 30 ml absolutt pyridin hver gang, og løses deretter i 40 ml absolutt pyridin. Under isavkjøling og omrøring tilsettes deretter 2,46 g (6,5 mmol = 1,3 ekv. ) 2-dansyletyl-klorf ormiat-hydroklor id i fast form. Det omrøres i 1 t på isbad, hvorved etter ca. 0,5 t hydrokloridet er løst. Deretter stoppes det med 0,5 ml (8,8 mmol) glykol, innroteres, fortynnes med 200 ml CH2C12, vaskes med 200 ml mettet NaHC03-oppløsning, den vandige fasen ekstraheres 2 x med 100 ml CH2C12 hver gang, de forenede organiske fasene tørkes med Na2S04, avfiltreres og innroteres. Man koevaporer-er 2 x med hver gang 100 ml toluen og 2 x med hver gang 100 ml CH2C12. Det renses over en Si02-søyle (100 g, 23 x 3,5 cm). Det elueres med 0,5 1 CH2C12, 1 1 CH2Cl2/MeOH 100:1 og 1,5 1 CH2Cl2/lVIeOH 100:2 med f lammekromatograf i. De enkelte produktfraksjonene innroteres og tørkes i høyvakuum. Det oppnås 2,86 g (3,62 mmol = 72 %) 5'- og 0,47 g (0,43 mmol = 9 %) 3' , 5'-di-subst ituert produkt hver gang som et gult, sterkt fluorescerende skum. For elementaeranalyse bli 100, mg av det substituerte produktet ytterligere renset på en Si02-plate (40 x 20 cm) med CH2Cl2/MeOH 100:2.
Analysedata for 2'-0-(4-metoksytetrahydropyranyl)-5'-0-dansyl- etoksykarbonyl- N^- benzoyl- adenosin
a) Tynnsj iktskromatograf i
Tynnsjiktskromatografi ble gjennomført på Schleicher og
Schull kiselgel F 1500/LS 254 i CH2Cl2/Me0H (95:5) og en Rf-verdi ble beregnet til 0,48.
b) UV- spektroskopi i metanol:
c ) Elementæranalyse
d) NMR- spektroskopi i CDCI3 ved 250 MHz
9,03 s bredde (1) NH, 8,81 s (1) H-8, 8,61 d (2) dansyl-H-2, 8,35-8,30 m (2) dansyl-H-4, dansyl-H-8, 8,23 s (1) H-2, 8,03 d (2) 2 H av o-Bz, 7,65-7,50 m (5) 3 H av Bz, dansyl-H-3, dansyl-H-7, 7,20 d (1) dansyl-H-6, 6,20 d (1) H-l', 5,13 t (1) H-2', 4,52-4,32 m (6) CH20C0, H-3', H-4', H-5', H-5'', 3,72 t (2) S02CH2, 3,77-3,43 m (4) CH20CH2 (Mthp), til 2,90 s bredde (1) 3'-0H, 2,89 s (6) NMe2, 2,87 s (3) 0CH3, 1,95-1,55 m (4) CH2CCH2 (Mthp)
Analysedata for 2'-0-(4-metoksytetrahydropyranyl)-3',5'-0-bis- dansyletoksykarbonyl- N^- benzoyl- adenosin
a) Tynns. i iktskromatograf i
Tynnsjiktskromatografi ble gjennomført på kiselgel F
1500/LS 254 (Schleicher & Schiill) i CH2Cl2/MeOH (100:2) og en Rf-verdi ble beregnet til 0,35.
b) UV- spektroskopi i metanol:
c ) Elementæranalyse
d ) NMR- spektroskopi
1 CDCI3 ved 250 MHz
9,05 s bredde (1) NH, 8,83 s (1) H-8, 8,69-8,60 2 d (2)
2 x dansyl-H-2, 8,35-8,29 m (4) 2 x dansyl-H-4, 2 x
dansyl-H-8, 8,22 s (1) H-2, 8,03 d (2) 2 H av o-Bz, 7,68-7,50 m (7) 3 H av Bz, 2 x dansyl-H-3, 2 x dansyl-H-7, 7,24-7,18 2 til t overlagret d (2) 2 x dansyl-H-6, 6,13 d (1) H-l', 5,32 t (1) H-2', 5,13-5,11 m (l) H-3' , 4,60-4,22 m (7) 2 x CH20C0, H-4 ' , H-5', H-5", 3,77-3,26 m (8)
2 x S02CH2, CH20CH2 (Mthp), 2,89 s (6) MMe2, 2,88 s (6) MMe2, 2,63 s (3) 0CH3, 1,78-1,20 m (4) CH2CCH2 (Mthp)
Eksempel 3
Omsetning av 2'-0-(4-metoksytetrahydropyranyl)-5'-0-dansyl-etoksykarbonyl-N^-benzoyl-adenosin med fosforsyreklorid-2-(4-nitrofenyl)- etylester- N, N- di isopropylamid
1 g (1,264 mmol) 2'-O-Mthp-5'-0-DansE0C-N<6->Bz-adenosin oppløses i 6 ml absolutt CH2C12, deretter tilsettes 0,86 ml (0,65 g = 5,03 mmol = 4 ekv.) Hunigs-base og 0,84 g (2,528 mmol = 2 ekv.) fosforsyreklorid-2-(4-nitrofenyl )-etylester-N,N-diisopropylamid. Under en nitrogenatmosfære, avskjermet med en alufolie, omrøres forsøket ved romtemperatur. Etter 1 1/4 t tilsettes ytterligere 0,42 g (1,264 mmol = 1 ekv.) fosfittyleringsreagens. Etter samlet 2,5 timers omrøring ved romtemperatur fortynnes det med 75 ml CH2C12, vaskes med 75 ml mettet NaHC03-oppløsning, den vandige fasen tilbakeekstraheres 4 x med 50 ml CH2C12 hver gang, de forenede organiske fasene tørkes over Na2S04, filtreres av og innroteres. Man renser over en Si02-søyle (30 g, 12 x 3 cm) med flammekromatografi: det elueres med 250 ml CH2C12, 100 ml CH2C12/EE 100:1, 100 ml CH2C12/EE 100:2, 100 ml CH2C12/EE 100:3, 100 ml CH2C12/EE 100:5, 100 ml CH2C12/EE 100:7, 100 ml CH2C12/EE 9:1, 350 ml CH2C12/EE 4:1 (reagens), 100 ml CH2C12/EE 2:1 (produkt), 100 ml CH2C12/EE 1:1 (produkt), 100 ml CH2C12/EE 1:2 (produkt) og 100 ml EE (produkt).
Produktfraksjonen innroteres og tørkes i høyvakuum. Det oppnås 0,955 g (0,878 mmol = 70 56) av et gult, fluorescerende skum.
Analysedata
a) Tynnsj iktskromatograf i
Tynnsjiktskromatografi hie gjennomført på Schleicher og
Schull F 1500/LS 254 kiselgel i toluen/EE (1:6) og en Rf-verdi ble beregnet til 0,50.
b) UV- spektroskopi i metanol:
c) Elementæranal<y>se
d) NMR- spektroskopi
1. 31P- NMR i CDClq ved 161, 70 MHz
2. ^- H- NMR i CDClq ved 25 0 MHz 9,07 s bredt (1) NH, 8,83 u. 8,82 2 s (1) H-8, 8,61 d (1) dansyl-H-2, 8,35-8,29 m (2) dansyl-H-4, dansyl-H-8, 8,24 u. 8,22 2 s (1) H-2, 8,18-8,13 2 d (2) 2 H o til fenyl-N02, 8,03 d (2) 2 H av o-Bz, 7,64-7,49 m (5) 3 H av Bz, dansyl-H-3, dansyl-H-7, 7,45-7,38 2 d (2) 2 H m til fenyl-N02, 7,19 d (1) dansyl-H-6, 6,23
u. 6,15 2 d (1) H-l', 5,20 u. 5,11 2 t (1) H-2', 4,48 t (2) CH20C0, 4,44-4,18 m (4) H-3', H-4 ' , H-5', H-5'', 4,10-3,88 m (2) CH20P, 3,84-3,25 m (6) 2 x CH (i-Pr). CH20CH2 (Mthp), 3,71 t (2) S02<C>H2, 3,06 t (2) CH2-fenyl-N02, 2,88 s (6) NMe2, 2,66 u. 2,61 2 s (3) 0CH3, 2,00-1,45 m (4) CH2CCH2 (Mthp), 1,26-1,12 overlagret d (12) 2 x C(CH3)2 (i-Pr)
Eksempel 4
Automatisk oligoribonukleotidsyntese med 2 '- 0-( 4- metoksy-tetrahydropyranyl ) - 5 ' - 0 - dan syletoksykarbonylf osf i tt amider .
Fremstilling av dekanukleotider ( rAp)gT
Syntesene blir gjennomført med en 380 B DNA-syntetiserer (Applied Biosystems).
Anvendt søyle: ABI-standardsøyle
Anvendt bærermateriale: LCAMA-CPG-bærer, som er forbundet med nukleosidet over 3'-hydroksygruppen.
(Litteratur: K. P. Stengele, W. Pfleiderer Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 21, 101 (1989 ); K. P. Stengele, W. Pfleiderer Tetrahedron Lett. 31, 2549 (1990)).
Belastning med tymidin, som er bundet over 3'-hydroksygruppen til bæreren: 19 jjmol/g
Forsøksstørrelse: ca. 0,6 umol (bestemmelse ved trityl-avspalting).
Syntesesyklus:
1. Kondensasjon med 0,5 M tetrazol og 0,1 M 2'-0-(4-metoksy-tetrahydropyranyl )-5 ' -O-dansyletoksy-karbonyl-N^-benzoyladenosin-3'-0-fosfittamid i absolutt acetonitril etter følgende pulsrekkefølge: 2. Kapping av ikke-omsatt nukleotid med acetanhydrid/- lutidin/THF (1:1:3) og 6,5 £ dimetylaminopyridin (DMAP) i TEF 3. Oksidasjon med ^-oppløsning (1,269 g I2/2O ml HgO/lO ml pyridin/100 ml THF) 4. Dansyletoksykarbonylavspalting med 0,1 M DBU i acetonitril i 2 x 30 s og 8 x 10 s. pulsstrøm med mellom-sjaltet 1 s "reverse flushes".
Eluatet fra 4. trinn blir samlet og kondensasjonsutbyttet bestemt på bakgrunn av dannet 5-dimetylamino-naftyl-1-vinylsulfon ved hjelp av fluorescensmikroskopi (impuls: 368 nm; emisjon: 526 nm).
Det gjennomsnittlige trinnvise utbyttet utgjør ca. 98 %.
Mellom de enkelte trinnene 1-4 foregår de vanlige vaske-trinnene med acetonitril så vel som "blokk- hhv. reverse flushes".
Eksempel 5
Syntese av 5'- O- dansyletoksykarbonylbeskyttede H- fosfonater 10,75 ekvivalenter imidazol oppløses i 5 ml absolutt metylenklorid, avkjøles deretter med is/koksalt og deretter blandes den avkjølte oppløsningen med 3,5 ekvivalenter PCI3 og 11,25 ekvivalenter trietylamin. Det omrøres 15 min under avkjøling og tilsettes 0,25 mmol (1 ekvivalent) 2'-0-(4-metoksytetrahydropyranyl)-5'-0-dansyl-etoksykarbonyl-N^-benzoyladenosin eller 0,25 mmol 2'-0-(4-metoksytetrahydro-pyranyl )-5 ' -O-dansyletoksykarbonyl-N^-para-nitrofenyletyl-oksykarbonyladenosin (koevaporeres 1 x med acetonitril) i 5 ml absolutt metylenklorid i løpet av 10 min dråpevis under omrøring.
Deretter fjernes isbadet og det omrøres ytterligere 15 min ved romtemperatur. Deretter ristes reaksjonsoppløsningen med 10 ml 1 M trietylammonium-bikarbonat. Fasene skilles, den vandige fasen ekstraheres med 10 ml CHgClg, de forenede organiske fasene tørkes over Na2S04, avfiltreres og roteres til et gult, fluorescerende skum. Man renser over en kort kiselgelsøyle (flammekronratografi) med en CHgClg/MeOH-gradient.
Eksempel 6
Automatisk oligoribonukleotidsyntese med 2'- 0-( 4- metoksy-tetrahvdropyranyl)- 5'- O- dansyletoksykarbonylribonukleosid- 3'-0- H- fosfonater. Fremstilling av ( rAp)gT
Syntesen gjennomføres med en 380 B DNA-syntetiserer (Applied Biosystems).
Anvendt søyle: ABI-standardsøyle
Anvendt bærermateriale: LCAMA-CPG-bærer
(Litteratur: K. P. Stengele, W. Pfleiderer Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 21, 101 (1989 ); K. P. Stengele, W. Pfleiderer Tetrahedron Lett. 31, 2549 (1990)).
Belastning med tymidin, som er bundet over 3'-hydroksygruppen til bæreren: 19 umol/g
Forsøksstørrelse: ca. 0,6 jjmol (bestemmelse ved trityl-avspalting).
Syntesesyklus:
1. Vasking med absolutt pyridin/acetonitril (1:1)
2. Omsetning med 2'-0-(4-metoksytetrahydropyranyl)-5'-0-dansyletoksykarbonyl-H-fosfonat (10 mM) og pivaloylklorid (50 mM) i absolutt pyridin/acetonitril (1:1)
3. Vasking med absolutt acetonitril (45 s)
4. Dansyletoksykarbonylavspalting med 0,1 M DBU i acetonitril (2 min) 5. Gjentakelse av trinn 1 til 4 til ønsket kjedelengde blir oppnådd. 6. Dansyletoksykarbonylavspalting med 0,1 M DBU i acetonitril (2 min) og samling av eluatet 7. Oksidasjon med J2 (0,1 M) i pyridin/N-metylimidazol/- vann/THF (5/1/5/90) (2,5 min) eller med J2 (0,1 M) i trietylamin/vann/THF (5/5/90) (2,5 min)
Oksidasjonen til tiofosfat eller fosforamidat blir også gjennomført som beskrevet i Uhlmann & Peyman (1990). Eluatet fra det 6. trinnet blir samlet og kondensasjons-utbyttene på bakgrunn av dannet 5-dimetylamino-naftyl-1-vinylsulfoner blir bestemt ved hjelp av fluorescensmikroskopi (impuls: 368 nm; emisjon: 526 nm).
Det gjennomsnittlige trinnvise utbyttet utgjør ca. 98 %.
Claims (2)
1.
Forbindelse, karakterisert ved formel (Illa) eller (Illb)
der DansEOC betyr en gruppe med formel:
R<1> betyr hydrogen eller uavhengig av hverandre en gruppe
med formel:
B betyr
der R<2> betyr uavhengig av hverandre en gruppe med formel
2.
Anvendelse av en forbindelse med formel (Illa) eller (Illb) ifølge krav 1 i oligonukleotidsyntese.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO951911A NO180419C (no) | 1990-09-14 | 1995-05-15 | Oligonukleotider og anvendelse i oligonukleotidsyntese |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4029244A DE4029244A1 (de) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | Verfahren zur chemischen synthese von oligonukleotiden |
| DE4111363 | 1991-04-09 | ||
| NO913626A NO178333C (no) | 1990-09-14 | 1991-09-13 | Fremgangsmåte for fremstilling av mellomprodukter ved kjemisk syntese av oligonukleotider |
| NO951911A NO180419C (no) | 1990-09-14 | 1995-05-15 | Oligonukleotider og anvendelse i oligonukleotidsyntese |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO951911L NO951911L (no) | 1992-03-16 |
| NO951911D0 NO951911D0 (no) | 1995-05-15 |
| NO180419B true NO180419B (no) | 1997-01-06 |
| NO180419C NO180419C (no) | 1997-04-16 |
Family
ID=27435006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO951911A NO180419C (no) | 1990-09-14 | 1995-05-15 | Oligonukleotider og anvendelse i oligonukleotidsyntese |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NO (1) | NO180419C (no) |
-
1995
- 1995-05-15 NO NO951911A patent/NO180419C/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO951911L (no) | 1992-03-16 |
| NO180419C (no) | 1997-04-16 |
| NO951911D0 (no) | 1995-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0466773B1 (en) | Coumarin derivatives for use as nucleotide crosslinking reagents | |
| EP0219342B1 (en) | Method and reagents for in vitro oligonucleotide synthesis | |
| CA2372085C (en) | L-ribo-lna analogues | |
| US6222030B1 (en) | Solid phase synthesis of oligonucleotides using carbonate protecting groups and alpha-effect nucleophile deprotection | |
| CA2089668A1 (en) | Oligo (alpha-arabinofuranosyl nucleotides) and alpha-arabinofuranosyl precursors thereof | |
| EP0767657A1 (en) | Novel method of preparation of known and novel 2'-modified nucleosides by intramolecular nucleophilic displacement | |
| Wu et al. | N-Phenoxyacetylated guanosine and adenosine phosphoramidites in the solid phase synthesis of oligoribonucleotides: Synthesis of a ribozyme sequence | |
| US5606049A (en) | Method of preparing 2'-O-methyl cytidine monomers useful in oligomer synthesis | |
| NO178333B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av mellomprodukter ved kjemisk syntese av oligonukleotider | |
| NO180419B (no) | Oligonukleotider og anvendelse i oligonukleotidsyntese | |
| JP6853265B2 (ja) | 核酸に組み込むための５−（ｎ−保護−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンホスホロアミダイトの化合物及び合成方法 | |
| EP2053054A1 (en) | Method for introducing nucleic-acid-protecting group | |
| US6048975A (en) | Process for the chemical synthesis of oligonucleotides | |
| DE4029244A1 (de) | Verfahren zur chemischen synthese von oligonukleotiden | |
| Agrawal et al. | Synthesis of [15 N]-Labeled DNA Fragments |