DE69401136T2 - Modifizierte Oligodeoxyribonukleotide, ihre Herstellung und ihre therapeutische Verwendung - Google Patents

Modifizierte Oligodeoxyribonukleotide, ihre Herstellung und ihre therapeutische Verwendung

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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe neuer modifizierter Oligodesoxyribonucleotide, die eine hervorragende antivirale Aktivität aufweisen. Die Erfindung stellt auch Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung dieser Oligodesoxyribonucleotide für die Therapie und Prophylaxe viraler Infektionen und für die Inhibition der Proliferation neoplastischer Zellen bereit. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen bereit. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind besonders wirksam gegen das humane Immunschwächevirus (HIV), das nun allgemein als Ursache von AIDS angesehen wird.
  • Es ist bekannt, daß Oligodesoxyribonucleotide (Antisense-Oligodesoxyribonucleotide) mit einer Sequenz, die komplementär zu einem Gen ist, die funktionelle Expression dieses Gens inhibieren. Es ist auch darüber berichtet worden, daß Antisense-Oligodesoxyribonucleotide, die komplementär zu einem Virusgen oder einem Oncogen sind, die Replikation des Virus oder die Vervielfältigung der Zelle durch Inhibition der Funktion der entsprechenden Gene inhibieren können [P.C. Zamecnik, M.L. Stephenson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, (1) 280 (1978) und P.C. Zamecnik, J. Goodchild, Y. Taguchi, Sarin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, (6) 4143 (1986)].
  • Es wurde bisher angenommen, daß, damit ein Antisense-Oligodesoxyribonucleotide die gewünschte Aktivität zeigen kann, das Oligodesoxyribonucleotid zur Bildung eines stabilen Hybrids mit der Ziel-RNA oder -DNA in vivo imstande sein muß und daß es entsprechend eine Kettenlänge von 15 oder mehr Nucleotiden aufweisen sollte. Es ist jedoch bisher im allgemein nicht möglich gewesen, derartige Oligodesoxyribonucleotide in Ausbeuten und Reinheiten zu synthetisieren, die ihre praktische Verwendung ermöglichen würden. Ferner weisen die Antisense-Oligodesoxyribonucleotide keine ausreichende Aktivität auf, um die Replikation des Virus zu inhibieren oder die Vervielfältigung der Zellen zu inhibieren, so daß eine Verwendung für die Behandlung möglich wäre; ferner ist die Toxizität dieser Verbindungen gegenüber den normalen Zellen des Wirts relativ hoch.
  • Es sind zwar Oligodesoxyribonucleotide mit einer geringen Kettenlänge bekannt; es ist jedoch bisher angenommen worden, daß sie eine schlechte inhibitorische Aktivität aufweisen. Als Folge davon haben sich die meisten Forscher auf die Untersuchung von Oligodesoxyribonucleotiden mit längeren Ketten als denen in der vorliegenden Erfindung konzentriert. Obwohl also z.B. die PCT-Anmeldung WO 88/01544 (von der angenommen wird, daß sie in bezug auf die vorliegende Erfindung den nächsten Stand der Technik darstellt) in ihrem Schutzbereich Oligonucleotide mit einer recht geringen Zahl von 4 Baseneinheiten umfaßt, ist es in der Praxis klar, daß die einzigen Materialien, die getestet wurden, solche mit einer erheblich größeren Zahl von Einheiten, nämlich einer größeren Zahl als in der vorliegenden Erfindung, waren. Wir haben nun festgestellt, daß bestimmte modifizierte Oligodesoxyribonucleotide, die aus verschiedenen Basensequenzen bestehen und durch Einführung verschiedener Substituenten an ihren 5'- und/oder 3'-Enden hergestellt werden, eine hervorragende anti-AIDS- Virus-Aktivität zeigen und daß die Toxizität des Nucleotids gegenüber normalen Zellen des Wirtstiers gering ist. Ferner ist es ein wichtiger praktischer Gesichtspunkt, daß die erfindungsgemäßen modifizierten Oligodesoxyribonucleotide ohne weiteres unter Anwendung einfacher bekannter Techniken synthetisiert werden können.
    • Kurze Darstellung der Erfindung
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, eine Reihe neuer modifizierter Oligodesoxyribonucleotide bereitzustellen.
  • Eine weitere und speziellere Aufgabe der Erfindung besteht darin, solche modifizierten Oligodesoxyribonucleotide bereitzustellen, die die Fähigkeit aufweisen, die Replikation fremder Nucleinsäuren in normalen Zellen zu inhibieren und die daher zur Behandlung und Prophylaxe von viralen Infektionen unter Einschluß von AIDS sowie von Tumoren verwendet werden können.
  • Eine damit in Zusammenhang stehende Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verfahren zur Herstellung der neuen Oligodesoxyribonucleotidverbindungen sowie von Zwischenprodukten für die Verwendung bei den Herstellungsverfahren bereitzustellen.
  • Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
    • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind die modifizierten Oligodesoxyribonucleotide der Formel (1):
  • worin:
  • R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoffatomen, Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Arylgruppen gemäß der nachstehenden Definition und Anthrachinonylgruppen besteht, die unsubstituiert sind oder die mit mindestens einem Substituenten substituiert sind, der vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den nachstehend definierten Substituenten 1 besteht;
  • Z ein Kohlenstoffatom oder ein Siliciumatom darstellt;
  • oder
  • R&sub2;, R&sub3; und Z zusammen eine Fluorenyl- oder Xanthenylgruppe darstellen;
  • R&sub4; ein Wasserstoffatom, eine unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine substituierte Alkylgruppe, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist und die mit mindestens einem Substituenten substituiert ist, der vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den nachstehend definierten Substituenten 2 besteht, eine Arylgruppe gemäß der nachstehenden Definition oder eine Aralkylgruppe gemäß der nachstehenden Definition darstellt;
  • Y&sub1;, Y&sub3; und Y&sub4; unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Sauerstoffatomen, Schwefelatomen und Gruppen der Formel > NH besteht;
  • Y&sub2; ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, eine Gruppe der Formel > NH, eine Alkylengruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylengruppe darstellt;
  • X eine unsubstituierte Alkylengruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Alkylengruppe, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist und die mit mindestens einer Hydroxygruppe substituiert ist, darstellt;
  • m und n unabhängig jeweils 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 sind;
  • und
  • B ein Oligodesoxyribonucleotid mit einer Kettenlänge von 3 bis 9 darstellt;
  • die Arylgruppe eine aromatische carbocyclische Gruppe ist, die 6 bis 20 Ringkohlenstoffatome aufweist und die unsubstituiert ist oder die mit mindestens einem Substituenten substituiert ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den nachstehend definierten Substituenten 1 besteht;
  • die Aralkylgruppe eine Alkylgruppe ist, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist und die mit mindestens einer Arylgruppe gemäß der vorstehenden Definition substituiert ist;
  • die Substituenten 1 aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogenalkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogenatomen, Nitrogruppen, Cyanogruppen, Aminogruppen, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkylthiogruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Arylgruppen gemäß der vorstehenden Definition, Aryloxygruppen, bei denen der Arylanteil der vorstehenden Definition entspricht, und Aralkyloxygruppen, bei denen der Aralkylanteil der vorstehenden Definition entspricht, besteht, mit der Maßgabe, daß, wenn der Substituent 1 eine Arylgruppe oder eine Gruppe, die eine Arylgruppe enthält, darstellt, die mit einer weiteren Arylgruppe oder einer Gruppe, die eine Arylgruppe enthält, substituiert ist, die weitere Gruppe nicht selbst mit einer Arylgruppe oder einer Gruppe, die eine Arylgruppe enthält, substituiert ist; und
  • die Substituenten 2 aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Aminogruppen, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Halogenatomen besteht;
  • oder Salze davon,
  • mit der Maßgabe, daß, wenn Z ein Kohlenstoffatom darstellt, m-O, Y&sub1; ein Sauerstoffatom darstellt und R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; eine unsubstituierte oder substituierte Phenylgruppe darstellen, B nicht aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus CGTCACACAATA, ACGCTCAATT, AATTCACCGTG, GCTGTTGACT, ATTTTACCTCT, GGCGGTGATA, ATGAGCAC, AATTGTGC, TCATTATCA, CCGCCAGAG, GTAAAATAGTCA und ACACGCACGGTG besteht.
  • Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung für die Behandlung oder Prophylaxe viraler Infektionen bereit, die eine wirksame Menge mindestens eines Oligodesoxyribonucleotids umfaßt, wobei es sich bei dem Oligodesoxyribonucleotid um eine Verbindung der Formel (1') gemäß der Definition in Anspruch 34 handelt.
  • Die Erfindung stellt auch eine Verbindung der Formel (1') gemäß der Definition in Anspruch 34 für die Verwendung bei der Therapie bereit.
  • Die Erfindung stellt auch Verfahren und Zwischenprodukte für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen bereit, wobei die Verfahren nachstehend ausführlicher beschrieben werden.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die neuen, modifizierten Oligodesoxyribonucleotide der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in einer Form frei von Reaktionsnebenprodukten bereitgestellt.
  • In den erfindungsgemäßen Verbindungen kann es sich, wenn R&sub1;, R&sub2; oder R&sub3; eine Alkylgruppe darstellt, um eine gerade oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen handeln, und Beispiele umfassen Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, sek.-Butyl- und tert. Butylgruppen. Unter diesen Gruppen bevorzugen wir die tert.-Butylgruppe.
  • Wenn R&sub1;, R&sub2; oder R&sub3; eine Arylgruppe darstellt, dann kann es sich um eine aromatische carbocyclische Gruppe handeln, die 6 bis 20 Ringkohlenstoffatome, vorzugsweise 6 bis 16 Ringkohlenstoffatome, stärker bevorzugt 6 bis 10 Ringkohlenstoffatome und insbesondere 6 oder 10 Kohlenstoffatome aufweist und die unsubstituiert ist oder mit mindestens einem Substituenten substituiert ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den nachstehend definierten und durch Beispiele erläuterten Substituenten 1 besteht. Beispiele für die unsubstituierten Gruppen umfassen die Phenyl-, 1-Naphthyl-, 2-Naphthyl-, Phenanthren-4-yl-, Anthracen-9-yl-, Anthracen- 2-yl- und Pyrenylgruppen. Von diesen Gruppen sind die stärker bevorzugten Gruppen die Naphthyl- und Phenylgruppen, wobei die Phenylgruppe am stärksten bevorzugt ist. Bei den substituierten Gruppen kann es sich um beliebige dieser Gruppen handeln, und sie können mit einem oder mehreren der Substituenten 1, die nachstehend definiert und durch Beispiele erläutert werden, substituiert sein. Es gibt keine spezielle Beschränkung hinsichtlich der Zahl der Substituenten, mit der Ausnahme, daß eine derartige Beschränkung durch die Zahl der substituierbaren Positionen (z.B. 5 im Fall der Phenylgruppe oder 7 im Fall der Naphthylgruppen) und möglicherweise durch sterische Beschränkungen gegeben sein kann. Üblicherweise bevorzugen wir jedoch 1 bis 5 derartige Substituenten, insbesondere 1 bis 3 und ganz besonders 1 oder 2 Substituenten. Spezielle Beispiele für die Substituenten 1 umfassen:
  • Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie die Methyl-, Ethyl-, Propyl, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, sek.-Butyl- und tert.-Butylgruppen, von denen wir die Methyl- und tert.-Butylgruppen bevorzugen;
  • Halogenalkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie die Fluormethyl, Trifluormethyl-, Trichlormethyl-, 2,2,2-Trifluorethyl-, 2,2,2- Trichlorethyl-, 2-Fluorethyl-, 2-Chlorethyl-, 2-Iodethyl-, 3-Chlorpropyl-, 4-Fluorbutyl- und 6-Iodhexylgruppen, von denen wir die 2,2,2-Trichlorethyl- und Trifluormethylgruppen bevorzugen;
  • Halogenatome, wie Fluor-, Chlor-, Brom- und Iodatome, von denen wir die Chlor- und Fluoratome bevorzugen;
  • Nitrogruppen, Cyanogruppen, Aminogruppen;
  • Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie die Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy-, Isopropoxy-, Butoxy-, Isobutoxy-, sek.-Butoxy- und tert.-Butoxygruppen, von denen wir die Methoxy- und tert.-Butoxygruppen bevorzugen;
  • Alkylthiogruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie die Methylthio-, Ethylthio-, Propylthio-, Isopropylthio-, Butylthio-, Isobutylthio-, sek.- Butylthio- und tert.-Butylthiogruppen, von denen wir die Methylthio- und tert.-Butylthiogruppen bevorzugen;
  • Arylgruppen, wie sie vorstehend definiert und durch Beispiele erläutert wurden, und insbesondere die Phenylgruppe;
  • Aryloxygruppen, in denen der Arylteil so gewählt ist, wie er vorstehend definiert und durch Beispiele erläutert wurde, und insbesondere die Phenoxygruppe;
  • und Aralkyloxygruppen, in denen der Aralkylteil der vorstehenden Definition entspricht, wie die Benzyloxy- und Dibenzyloxybenzyloxygruppe [insbesondere die 3,5-Dibenzyloxybenzyloxygruppe].
  • Es ist darauf hinzuweisen, daß, während eine Arylgruppe (oder eine Gruppe, die eine Arylgruppe enthält) selbst mit einer weiteren derartigen Gruppe substituiert sein kann, hier eine Grenze für eine derartige weitere Substitution festgelegt wird, die darin besteht, daß, wenn der Substituent 1 eine Arylgruppe oder eine Gruppe, die eine Arylgruppe enthält, darstellt, die mit einer weiteren Arylgruppe oder einer Gruppe, die eine Arylgruppe enthält, substituiert ist, die weitere Gruppe nicht selbst mit einer Arylgruppe oder einer Gruppe, die eine Arylgruppe enthält, substituiert ist.
  • Spezielle Beispiele für derartige substituierte Arylgruppen umfassen die 4-Methylphenyl-, 4-tert.-Butylphenyl-, 2-Phenylphenyl-, 4-Phenylphenyl, 4-Fluorphenyl-, 2-Chlorphenyl-, 4-Chlorphenyl-, 4-Bromphenyl-, 4-Iodphenyl-, 2,4-Difluorphenyl-, 4-Nitrophenyl-, 4-tert.-Butoxyphenyl-, 4-Methoxyphenyl-, 4-Ethoxyphenyl-, 3-Phenoxyphenyl-, 4-Phenoxyphenyl-, 2- Benzyloxyphenyl-, 4-Benzyloxyphenyl-, 3,4-Dibenzyloxyphenyl-, 3,5-Dibenzyloxyphenyl und 3,5-Bis(3,5-dibenzyloxybenzyloxy)phenylgruppen. Von diesen substituierten und unsubstituierten Arylgruppen bevorzugen wir die Phenyl, 4-Methoxyphenyl-, 3,4-Dibenzyloxyphenyl-, 3,5-Dibenzyloxyphenyl- und 3,5 Bis(3,5-dibenzyloxybenzyloxy)phenylgruppen.
  • Wenn R&sub1;, R&sub2; oder R&sub3; eine Anthrachinonylgruppe darstellt, dann kann diese unsubstituiert sein oder sie kann mit einem oder mehreren Substituenten 1, wie sie vorstehend definiert und durch Beispiele erläutert wurden, substituiert sein. Wenn die Gruppe substituiert ist, dann kann sie mit mindestens einem Substituenten substituiert sein, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Substituenten 1, die vorstehend definiert und durch Beispiele erläutert wurden, besteht. Es gibt keine spezielle Beschränkung hinsichtlich der Zahl der Substituenten, mit der Ausnahme, daß eine derartige Beschränkung durch die Zahl der substituierbaren Positionen und möglicherweise durch sterische Beschränkungen gegeben sein kann. Wir bevorzugen 1 bis 5 derartige Substituenten, insbesondere 1 bis 3 Substituenten und ganz besonders 1 Substituenten. Beispiele für derartige Gruppen umfassen die 9,10-Anthrachinon-1-yl-, 9,10-Anthrachinon-2-yl-, 4- Methyl-9,10-anthrachinon-1-yl-, 5-Methoxy-9,10-anthrachinon-1-yl-, 7- Chlor-9,10-anthrachinon-1-yl-, 8-Fluor-9,10-anthrachinon-2-yl-, 6-Ethyl- 9,10-anthrachinon-2-yl-, 8-Ethoxy-9,10-anthrachinon-2-yl- und 6-Hydroxy-9,10-anthrachinon-1-ylgruppen. Von diesen bevorzugen wir die unsubstituierten Anthrachinonylgruppen.
  • Alternativ können R&sub2;, R&sub3; und Z zusammen eine Fluorenyl- oder Xanthenylgruppe darstellen, wobei es sich in diesem Fall vorzugsweise um eine Fluoren 9-yl- oder Xanthen-9-ylgruppe handelt.
  • Wenn R&sub4; eine Alkylgruppe darstellt, dann kann es sich um eine beliebige der Gruppen handeln, die vorstehend in bezug auf R&sub1; usw. durch Beispiele erläutert wurden; sie kann jedoch unsubstituiert oder substituiert sein. Wenn sie substituiert ist, dann ist sie mit mindestens einem der vorstehend definierten Substituenten 2 substituiert. Beispiele für derartige Substituenten 2 umfassen Aminogruppen, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Halogenatome, die den vorstehend in bezug auf die Substituenten 1 angegebenen Beispielen entsprechen können. Spezielle Beispiele für derartige substituierte und unsubstituierte Alkylgruppen umfassen die Methyl-, Ethyl-, 2-Aminoethyl-, 2-Methoxyethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, sek.-Butyl- und tert.-Butylgruppe. Von diesen bevorzugen wir die Methyl-, Ethyl-, 2-Aminoethyl-, 2-Methoxyethyl- und Propylgruppen.
  • Wenn R&sub4; eine Arylgruppe darstellt, dann kann es sich um eine beliebige der Arylgruppen handeln, die vorstehend als Beispiele in bezug auf R&sub1; usw. angegeben wurden, und es kann sich um eine substituierte oder unsubstituierte Gruppe handeln. Beispiele für derartige Gruppen umfassen: die Phenylgruppe; Alkylphenylgruppen, wie die 2-Methylphenyl- oder 3- Ethylphenylgruppe; halogenierte Phenylgruppen, wie die 2-Fluorphenyl-, 2- Chlorphenyl-, 4-Chlorphenyl-, 2-Bromphenyl- oder 2-Iodphenylgruppe; Nitrophenylgruppen, wie die 2-Nitrophenyl- oder 4-Nitrophenylgruppe; Alkoxyphenylgruppen, wie die 4-Methoxyphenyl- oder 4-Ethoxyphenylgruppe; Alkylthiophenylgruppen, wie die 4-Methylthiophenyl- oder 4-Ethylthiophenylgruppe; und die Naphthyl-, Phenanthrenyl-, Anthracenyl- und Pyrenylgruppen. Von diesen bevorzugen wir die unsubstituierten Phenyl-, halogenierten Phenyl- und Nitrophenylgruppen.
  • Wenn R&sub4; eine Aralkylgruppe darstellt, dann handelt es sich um eine Alkylgruppe, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist und die mit mindestens einer (und vorzugsweise 1, 2 oder 3, insbesondere 1) Arylgruppe substituiert ist, die so gewählt werden kann, wie es vorstehend definiert und durch Beispiele erläutert wurde. Beispiele für derartige Gruppen umfassen die Benzyl-, Methylbenzyl-, Ethylbenzyl-, Methoxybenzyl-, Ethoxybenzyl-, Fluorbenzyl-, Chlorbenzyl-, Brombenzyl-, Chlornaphthylmethyl-, Indenylmethyl-, Phenanthrenylmethyl-, Anthracenylmethyl-, Diphenylmethyl-, Triphenylmethyl-, 1-Phenethyl-, 2-Phenethyl-, 2,2-Diphenylethyl-, 2,2,2-Triphenylethyl-, 3,3,3-Triphenylpropyl-, 1-Naphthylethyl-, 2-Naphthylethyl-, 1- Phenylpropyl-, 2-Phenylpropyl-, 3-Phenylpropyl-, 1-Naphthylpropyl-, 2- Naphthylpropyl-, 3-Naphthylpropyl-, 1-Phenylbutyl-, 2-Phenylbutyl-, 3- Phenylbutyl-, 4-Phenylbutyl-, 1-Naphthylbutyl-, 2-Naphthylbutyl-, 3-Naphthylbutyl-, 4-Naphthylbutyl-, 1-Phenylpentyl-, 2-Phenylpentyl-, 3-Phenylpentyl-, 4-Phenylpentyl-, 5-Phenylpentyl-, 1-Naphthylpentyl-, 2-Naphthylpentyl-, 3-Naphthylpentyl-, 4-Naphthylpentyl-, 5-Naphthylpentyl-, 1-Phenylhexyl-, 2-Phenylhexyl-, 3-Phenylhexyl-, 4-Phenylhexyl-, 5-Phenylhexyl-, 6 Phenylhexyl-, 1-Naphthylhexyl-, 2-Naphthylhexyl-, 3-Naphthylhexyl-, 4-Naphthylhexyl-, 5-Naphthylhexyl- und 6-Naphthylhexylgruppen. Von diesen bevorzugen wir eine unsubstituierte Benzyl- oder 2-Phenethylgruppe.
  • Wenn Y&sub2; eine Alkylengruppe darstellt, dann kann es sich um eine Methylen-, Ethylen-, Propylen-, Tetramethylen- oder Pentamethylengruppe handeln. Von diesen bevorzugen wir eine Methylengruppe.
  • Y&sub1;, Y&sub3; und Y&sub4; stellen vorzugsweise jeweils ein Sauerstoffatom dar.
  • Y&sub2; stellt vorzugsweise ein Sauerstoff- oder Schwefelatom dar.
  • Z stellt vorzugsweise ein Kohlenstoffatom dar.
  • Wenn X eine gerade oder verzweigte Kette, die wahlweise mit einer Hydroxygruppe substituiert ist, darstellt, dann umfassen Beispiel eine Methylen-, Methylmethylen-, Ethylen-, Propylen-, Tetramethylen-, Methylethylen-, 1-Methyltrimethylen-, 2-Methyltrimethylen-, 2-Methyltetramethylen-, 3-Methyltrimethylen-, Pentamethylen-, Hexamethylen-, Heptamethylen-, Octamethylen-, Nonamethylen-, Decamethylen-, 2-Hydroxytrimethylen- oder 2-Hydroxytetramethylengruppe. Von diesen bevorzugen wir eine Methylen-, Methylmethylen-, Ethylen- oder Methylethylengruppe.
  • Die bevorzugten Werte für m und n sind jeweils eine ganze Zahl von bis 6. Wir bevorzugen insbesondere, daß m eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.
  • Das Oligodesoxyribonucleotid, das durch B dargestellt wird, weist vorzugsweise eine Kettenlänge von 4 bis 8 und insbesondere von 5 oder 6 auf. Ferner ist es bevorzugt, daß es sich bei dem vierten Desoxyribonucleotid vom 5'-Ende um Guanindesoxyribonucleotid handelt.
  • Die typischen bevorzugten erläuternden Oligodesoxyribonucleotide sind die in der fölgenden "α-Gruppe", und die stärker bevorzugten sind die in der folgenden "β-Gruppe", wobei die in der folgenden α- und β- Gruppe verwendeten Abkürzungen die folgende Bedeutung haben:
  • A: Adenindesoxyribonucleotid;
  • G: Guanindesoxyribonucleotid;
  • C: Cytosindesoxyribonucleotid;
  • T: Thymidindesoxyribonucleotid;
  • mC: 5-Methylcytosindesoxyribonucleotid; und
  • mG: O&sup6;-Methylguanindesoxyribonucleotid. Der Ausdruck "linkes Ende" bezeichnet ein 5'-Ende, und der Ausdruck "rechtes Ende" bezeichnet ein 3'-Ende, mit der Maßgabe, daß es sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende jedes Oligodesoxyribonucleotids keine Hydroxygruppe gibt. "α-Gruppe": "β-Gruppe":
  • Eine bevorzugte Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; am 5'-Ende wird durch eine Triphenylmethyloxy-, 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5-(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5-Bis[3,5-(dibenzyloxy)benzyloxy]benzyloxy-, tert.-Butyldiphenylsilyloxy-, Phenylfluorenyloxy- oder Phenylxanthenyloxygruppe und insbesondere eine Triphenylmethyloxy-, 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxy- oder 3,5(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe als Beispiele erläutert.
  • Eine bevorzugte Gruppe der Formel [P(O)(Y&sub2;R&sub4;)-Y&sub3;-(X-Y&sub4;)n]mH am 3'- Ende wird durch ein Wasserstoffatom, eine Methylphosphoryl-, 2-Chlorphenylphosphoryl-, -O-Methylthiophosphoryl-, Methylphosphonyl-, Methylthiophosphonyl-, Phenylphosphonyl-, 2-Hydroxyethylphosphoryl-, -O-(2-Hydroxyethyl)thiophosphoryl-, Phenylphosphoryl-, 4-Chlorphenylphosphoryl-, 2- Nitrophenylphosphoryl-, 4-Nitrophenylphosphoryl-, Ethylphosphoryl- oder Ethylthiophosphorylgruppe und insbesondere ein Wasserstoffatom, eine Methylphosphoryl-, 2-Chlorphenylphosphoryl-, -O-Methylthiophosphoryl-, Methylphosphonyl-, Methylthiophosphonyl-, Phenylphosphonyl-, 2-Hydroxyethylphosphoryl- oder -O-(2-Hydroxyethyl)thiophosphorylgruppe als Beispiele erläutert.
  • Zusammengefaßt sind die bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen diejenigen, in denen:
  • (1) die Kettenlänge von B 4 bis 8 beträgt;
  • (2) die Kettenlänge von B 5 oder 6 beträgt;
  • (3) die Kettenlänge von B 4 bis 8 beträgt und es sich bei dem vierten Desoxyribonucleotid vom 5'-Ende von B um Guanindesoxyribonucleotid handelt;
  • (4) es sich bei der Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; am 5'-Ende um eine Triphenylmethyloxy-, 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5-(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5-Bis[3,5-(dibenzyloxy)benzyloxy]benzyloxy-, tert.-Butyldiphenylsilyloxy-, Phenylfluorenyloxy- oder Phenylxanthenyloxygruppe handelt; es sich bei der Gruppe der Formel [P(O)(Y&sub2;R&sub4;)-Y&sub3;-(X-Y&sub4;)n]mH am 3'-Ende um ein Wasserstoffatom, eine Methylphosphoryl-, 2-Chlorphenylphosphoryl-, Methylthiophosphoryl-, Methylphosphonyl-, Methylthiophosphonyl-, Phenylphosphonyl-, 2-Hydroxyethylphosphoryl-, -O-(2-Hydroxyethyl)thiophosphoryl -, Phenylphosphoryl-, 4-Chlorphenylphosphoryl-, 2-Nitrophenylphosphoryl, 4-Nitrophenylphosphoryl-, Ethylphosphoryl- oder -O-Ethylthiophosphorylgruppe handelt; und es sich bei B um TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, GGGCGGGGC, TAGGAGG, TGGGAGGT, TGGGCGCAG, CCG, TCGGAGG, TGmCGAGG, CTGGGAGG, TGG, TGGGAmGG, TGGGAGA, AATGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG, CGCGG, CGGGT, TGGGC oder TGGGT handelt;
  • (5) es sich bei der Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; am 5'-Ende um eine Triphenylmethyloxy-, 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5-(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5bis[3,5-(dibenzyloxy)benzyloxy]benzyloxy-, tert.-Butyldiphenylsilyloxy-, Phenylfluorenyloxy oder Phenylxanthenyloxygruppe handelt; es sich bei der Gruppe der Formel [P(O)(Y&sub2;R&sub4;)-Y&sub3;-(X-Y&sub4;)n]mH am 3'-Ende um ein Wasserstoffatom, eine Methylphosphoryl-, 2-Chlorphenylphosphoryl-, Methylthiophosphoryl-, Methylphosphonyl-, Methylthiophosphonyl-, Phenylphosphonyl-, 2-Hydroxyethylphosphoryl-, -O-(2-Hydroxyethyl)thiophosphoryl-, Phenylphosphoryl-, 4-Chlorphenylphosphoryl-, 2-Nitrophenylphosphoryl-, 4-Nitrophenylphosphoryl-, Ethylphosphoryl- oder -O-Ethylthiophosphorylgruppe handelt; und des sich bei B um TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG oder CGCGG handelt;
  • (6) es sich bei der Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; am 5'-Ende um eine Triphenylmethyloxy-, 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5-(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5-Bis[3,5-(dibenzyloxy)benzyloxy]benzyloxy-, tert.-Butyldiphenylsilyloxy-, Phenylfluorenyloxy- oder Phenylxanthenyloxygruppe handelt; es sich bei der Gruppe der Formel [P(O)(Y&sub2;R&sub4;)-Y&sub3;-(X-Y&sub4;)n]mH am 3'-Ende um ein Wasserstoffatom, eine Methylphosphoryl-, 2-Chlorphenylphosphoryl-, -O-Methylthiophosphoryl-, Methylphosphonyl-, Methylthiophosphonyl-, Phenylphosphonyl-, 2-Hydroxyethylphosphoryl- oder -O-(2-Hydroxyethyl)thiophosphorylgruppe handelt; und es sich bei B um TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG oder CGCGG handelt;
  • (7) es sich bei der Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; am 5'-Ende um eine Triphenylmethyloxy-, 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxy- oder 3,5-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe handelt; es sich bei der Gruppe der Formel (P(O)(Y&sub2;R&sub4;)- Y&sub3;-(X-Y&sub4;)n]mH am 3'-Ende um ein Wasserstoffatom, eine Methylphosphoryl-, 2-Chlorphenylphosphoryl-, -O-Methylthiophosphoryl-, Methylphosphonyl-, Methylthiophosphonyl-, Phenylphosphonyl-, 2-Hydroxyethylphosphoryl-, -O-(2-Hydroxyethyl)thiophosphoryl-, Phenylphosphoryl-, 4-Chlorphenylphosphoryl-, 2-Nitrophenylphosphoryl-, 4-Nitrophenylphosphoryl-, Ethylphosphoryl oder -O-Ethylthiophosphorylgruppe handelt; und es sich bei B um TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG oder CGCGG handelt;
  • (8) es sich bei der Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; am 5'-Ende um eine Triphenylmethyloxy-, 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxy- oder 3,5-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe handelt; es sich bei der Gruppe der Formel [P(O)(Y&sub2;R&sub4;)- Y&sub3;-(X-Y&sub4;)n]mH am 3'-Ende um ein Wasserstoffatom, eine Methylphosphoryl-, 2-Chlorphenylphosphoryl, O-Methylthiophosphoryl-, Methylphosphonyl-, Methylthiophosphonyl-, Phenylphosphonyl-, 2-Hydroxyethylphosphoryl- oder -O-(2-Hydroxyethyl)thiophosphorylgruppe handelt; und es sich bei B um TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG oder CGCGG handelt.
  • Beispiele für die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in Tabelle 1 angegeben. Diese Beispiele dürfen nicht als die Erfindung beschränkend angesehen werden.
  • In der Tabelle werden die folgenden Abkürzungen verwendet, um bestimmte Gruppen zu bezeichnen:
  • 2-Anq Anthrachinon-2-yl
  • 2-Ant Anthracen-2-yl
  • 9-Ant Anthracen-9-yl
  • Bdbbp 3,5-Bis[3,5-(dibenzyloxy)benzyloxy]phenyl
  • Bu Butyl
  • tBu tert.-Butyl
  • Bz Benzyl
  • 3,4-Dbp 3,4-(Dibenzyloxy)phenyl
  • 3,5-Dbp 3,5-(Dibenzyloxy)phenyl
  • Decm Decamethylen [-(CH&sub2;)&sub1;&sub0;-]
  • Et Ethyl
  • Ete Ethylen [-CH&sub2;CH&sub2;-]
  • Hepm Heptamethylen [-(CH&sub2;)&sub7;-]
  • Hexm Hexamethylen [-(CH&sub2;)&sub6;-]
  • Hpr 2-Hydroxypropylen [-CH&sub2;C(OH)(CH&sub3;)-]
  • Me Methyl
  • Mee Methylen [-CH&sub2;-]
  • Nonm Nonamethylen [-(CH&sub2;)&sub9;-]
  • Npe Naphthalinyl (z.B. hat 2-Npe die Bedeutung Naphthalin-2-yl, oder 1-Npe hat die Bedeutung Naphthalin-1-yl]
  • Octm Octamethylen [-(CH&sub2;)&sub8;-]
  • Penm Pentamethylen [-(CH&sub2;)&sub5;-]
  • Ph Phenyl
  • Pha Phenanthrenyl [z.B. hat 4-Pha die Bedeutung Phenanthren-4-yl]
  • Phe 1,4-Phenylen
  • Pr Propyl
  • Pre Propylen [-CH&sub2;CH(CH&sub3;)-]
  • 1-Pyr Pyren-1-yl
  • Tetm Tetramethylen [-(CH&sub2;)&sub4;-]
  • Trim Trimethylen [-(CH&sub2;)&sub3;-]
  • Darüberhinaus wird die Sequenz, die durch "B" in Formel (1) dargestellt wird, durch die folgenden Codenummern identifiziert:
  • 1 TGGGAG
  • 2 TGGGA
  • 3 TGGGG
  • 4 TGGG
  • 5 TGGGAGG
  • 6 CGGGAGG
  • 7 TTGGAGG
  • 8 TTGGGAGG
  • 9 TGCGAGG
  • 10 GGGGAGG
  • 11 mCGGGAGG
  • 12 mCGmCGAGG
  • 13 CTGGGAGG
  • 14 GGGCGGGC
  • 15 TAGGAGG
  • 16 TGGGAGGT
  • 17 TGGGCGCAG
  • 18 CCG
  • 19 TCGGAGG
  • 20 TGmCGAGG
  • 21 GTGGGAGG
  • 22 TGG
  • 23 TGGGAmGG
  • 24 TGGGAGA
  • 25 mTGGGAGG
  • 26 TTGGGG
  • 27 TGGGGG
  • 28 CGGGG
  • 29 CGCGG
  • 30 CGGGT
  • 31 TGGGC
  • 32 TGGGT
  • Wenn eine Fluorenyl- oder Xanthenylgruppe in der Tabelle angegeben ist, dann wird diese durch R&sub2;, R&sub3; und Z zusammen dargestellt. Tabelle 1 Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung)
  • Von den vorstehend angegebenen Verbindungen sind die Verbindungen Nr. 1 bis 440, 454, 476, 586, 696, 806, 916, 1026, 1136, 1246, 1356, 1466, 1576, 1686, 1763, 1173, 1193, 1979, 1980, 1990 bis 1994, 2250 und 2326 bis 2906 bevorzugte Verbindungen.
  • Die stärker bevorzugten Verbindungen sind die Verbindungen Nr. 1 bis 110, 113, 221 bis 330, 333, 454, 1763, 1773, 1793, 1979, 1980, 1990 bis 1994, 2250 und 2334 bis 2906.
  • Die am stärksten bevorzugten Verbindungen sind die Verbindungen Nr. 1, 2, 3, 4, 12, 13, 14, 15, 2555, 2556, 2557, 2558, 2566, 2567, 2568, 2569, 2665, 2666, 2667, 2668, 2676, 2677, 2678 und 2679.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form von Salzen und insbesondere in Form von pharmazeutisch verträglichen Salzen mit Kationen vorliegen. Beispiele für geeignete Salze umfassen anorganische oder organische Salze, z.B. die mit Alkalimetallen, wie Natrium oder Kalium, Erdalkalimetallen, wie Calcium; Ammoniak; basischen Aminosäuren, wie Lysin oder Arginin; und Alkylaminen, wie Triethylamin. Bevorzugte Salze sind die Alkalimetallsalze, wie die Salze von Natrium oder Kalium.
  • Einige Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen werden durch die nachstehenden Reaktionsschemata erläutert.
  • Im allgemeinen können die Verbindungen der allgemeinen Formel (1) durch Kondensation eines geeigneten derivatisierten Nucleotids, bei dem es sich um das Nucleotid am 5'-Ende der gewünschten Verbindung handelt, mit einem geschützten Oligonucleotid, dem ein Nucleotid am 5'-Ende fehlt, hergestellt werden, wobei die Nucleotide des unvollständigen Oligonucleotids mit dem Nucleotid am 5'-Ende die entsprechende Nucleotidsequenz der gewünschten Oligodesoxyribonucleotidverbindung ergeben und wobei das geschützte unvollständige Nucleotid mit einem Polymerträger verknüpft ist. Typischerweise beinhaltet das Verfahren die Umsetzung einer Verbindung R¹R²R³Z-Y'-[5'-Endnucleotid] mit einer Verbindung [Schutzgruppe]-[unvollständiges Oligonucleotid]-Linker-Polymer.
  • Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, das die Kondensation einer Verbindung der nachstehenden Formel (2) mit einer Verbindung der Art [Schutzgruppe]-O-F-W umfaßt, wobei F das unvollständige Oligonucleotid darstellt und W den Linker und den Polymerträger darstellt. Unter Verwendung von DMT als Schutzgruppe umfassen Beispiele für Verbindungen zur Umsetzung mit der Verbindung (2) Verbindungen der Formeln: DMT-O-F-W&sub1; (3), DMT-O-F-W2a (4a), DMT-O-F-W2b (4b), DMT-O-F- W&sub3; (5), DMT-O-F-W4a (6a), DMT-O-F-W4b (6b), DMT-O-F-W4c (6c), DMT-O-F-W4d (6d), DMT-O-F-W5a (7a) und DMT-O-F-W5b (7b) gemäß Verfahren C-1, C-2 oder C-3. Der Reaktant (2), der bei dieser Reaktion verwendet wird, kann in geeigneter Weise nach Verfahren A-1 oder A-2 hergestellt werden, und die Reaktanten (3, 4a, 4b, 5, 6a bis 6d, 7a und 7b) können in geeigneter Weise nach den Verfahren B-1, B-2, B-3, B-4 oder B-5 hergestellt werden. Verfahren A-1 Stufe Verfahren A-2 Stufe Verfahren B-1 Stufe Schritte zur DNA-Synthese mit einem DNA-Syntheseautomaten Verfahren B-2 Stufe Verfahren B-3 Stufe Verfahren B-4 Stufe Verfahren B-5 Stufe Verfahren C-1 Stufe Verfahren C-2 Stufe Verfahren C-3 Stufe
  • In den verschiedenen Verbindungen der allgemeinen Formel (2) sind R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, Y&sub1; und Z wie für die allgemeine Formel (1) definiert; D' stellt eine Base dar, die unter den folgenden "5'-Basengruppen" oder den entsprechenden geschützten Basen ausgewählt ist, wobei es sich bei der Base um die Base an der 5'-Endgruppe der effektiven Basensequenz handelt (nachstehend als die "5'-Endgruppe der effektiven Basensequenz" oder einfach als die "5'-Endbase" bezeichnet), wobei die "5'-Basengruppe" Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder 5-Methylcytosin ist.
  • Verfahren B-1 beinhaltet die Herstellung einer Verbindung (3), der ein Nucleotidfragment vom 5'-Ende der effektiven Sequenz fehlt und die unter Verwendung von Glas mit kontrollierten Poren (nachstehend als CPG bezeichnet), das einen Linker, gebunden an ein geschütztes Nucleosid, das für die DNA-Synthese der 3'-Endgruppe der effektiven Basensequenz (nachstehend bezeichnet als 3'-Endnucleosid) verwendet werden kann, umfaßt, und unter Verwendung einer Nucleotideinheit, die für einen DNA-Syntheseautomaten in den Handel gebracht wird (nachstehend als Nucleotideinheit bezeichnet), synthetisiert wird.
  • Verfahren B-2 beinhaltet die Herstellung einer Verbindung (4a), die ein um ein Nucleotid vom 5'-Ende zu kurzes Fragment der effektiven Sequenz aufweist und die durch Schützen einer endständigen Hydroxygruppe eines C&sub2;-C&sub1;&sub0;-Alkylendiols mit Hydroxygruppen an den endständigen Positionen oder eines Alkylendiols mit geschützten Hydroxy- oder Aminogruppen mit einer Dimethoxytritylgruppe (DMT-Gruppe), Umsetzen der anderen Hydroxygruppe mit Bernsteinsäureanhydrid unter Bildung eines Bernsteinsäuremonoesters, Binden einer Carboxylgruppe des Monoesters an CPG, Entfernen der endständigen DMT-Gruppe und schließlich Umsetzung einer Nucleotideinheit mit dem CPG-gebundenen Alkylenalkohol (4-6) in regulärer Abfolge in einem DNA-Syntheseautomaten synthetisiert wird; und die Herstellung einer Verbindung (4b) durch Umsetzen des CPG-gebundenen Alkylenalkohols (46) zu einem 3'-Endnucleosid-Phosphorthioat, das an CPG (4-7) trägergebunden ist, gemäß einem herkömmlichen Verfahren, das bei der Herstellung eines Thioatnucleotids in einem DNA-Syntheseautomaten angewandt wird, und anschließende Umsetzung mit einer Nucleotideinheit in der gleichen Weise wie vorstehend.
  • Verfahren B-3 beinhaltet die Herstellung einer Verbindung (5), die ein um ein Nucleotid vom 5'-Ende zu kurzes Fragment der effektiven Sequenz aufweist und die durch Kondensation des 3'-Endnucleosidphosphonats, das durch Umsetzung einer Hydroxygruppe an der 3'-Position des 3'-Endnucleosids mit Phosphonsäure unter Bildung einer Esterverknüpfung hergestellt wird, mit einem CPG-gebundenen Ethylenglycol (5-1), das unter Verwendung von Bernsteinsäureanhydrid in Verfahren B-2 hergestellt wurde, Umsetzung mit einem Alkylamin unter Bildung eines 3'-Endnucleosid-Phosphoramidits, das an CPG trägergebunden ist (5-4) und schließliche Umsetzung mit einer Nucleotideinheit in einer regulären Abfolge in einem DNA- Syntheseautomaten synthetisiert wird.
  • Verfahren B-4 beinhaltet die Herstellung einer bekannten Verbindung (6-3) [M. Durand et al., Nucleic Acids Res., 18, 6353 (1990)] durch Schützen einer Hydroxygruppe von Hexaethylenglycol mit einer DMT-Gruppe und Umsetzung der anderen Hydroxygruppe mit einem Reagenz zur Herstellung einer Phosphoramiditgruppe.
  • Anschließend kann analog zu dem unter Verfahren B-3 beschriebenen Verfahren ein CPG-gebundenes, DMT-geschütztes Glycol (6-6) durch Kondensation des Hexaethylenglycols, das mit einer DMT-Gruppe geschützt ist (6- 2), mit CPG unter Verwendung von Bernsteinsäure hergestellt werden.
  • Nach Entfernung der DMT-Gruppe von dem CPG-gebundenen, DMT-geschützten Glycol (6-6) in einem DNA-Syntheseautomaten wird das Glycol mit einer Nucleotideinheit umgesetzt, um die gewünschte Verbindung (6a), die ein um ein Nucleotid vom 5'-Ende zu kurzes Fragment der effektiven Sequenz enthält, zu erhalten. Das an CPG trägergebundene Glycol, das durch Entfernung der DMT-Gruppe von dem CPG-gebundenen, DMT-geschützten Glycol (6-6) in einem DNA-Syntheseautomaten erhalten wird, wird einmal, zweimal oder dreimal mit dem Phosphoramidit umgesetzt, gefolgt von einer Umsetzung mit einer Nucleotideinheit, die ein um ein Nucleotid vom 5'-Ende zu kurzes Fragment der effektiven Basensequenz umfaßt, um eine Verbindung der Formel (6b), (6c) oder (6d) herzustellen.
  • Verfahren B-5 beinhaltet die Herstellung einer Verbindung (7-3) durch Entfernung der Schutzgruppe (DMT-Gruppe) von einem im Handel erhältlichen, geschützten 2'-Desoxynucleosid, das an CPG durch einen linker trägergebunden ist (nachstehend bezeichnet als D"'-CPG) und Umsetzung mit (2-Cyanoethoxy)-2-(2'-O-4,4'-dimethoxytrityloxyethylsulfonyl)ethoxy-N,N'- diisopropylaminophosphin (7-1), wie es von T. Horn et al. in Tetrahedron Letters, 27, 4705 (1986) beschrieben wurde; die Herstellung einer Verbindung (7-5) durch Entfernung der DMT-Schutzgruppe aus der Verbindung (7-3), die vorstehend hergestellt wurde, und der Kondensation der von der Schutzgruppe befreiten Verbindung mit einer Verbindung (7-4), die ein Aryl- oder Alkylphosphat der Hydroxygruppe an der 3'-Position des 3'-Endnucleosids aufweist, unter Verwendung eines Kondensationsmittels; und die Herstellung einer Verbindung (7a) durch Umsetzung der Verbindung (7-5), die vorstehend hergestellt wurde, mit einer Nucleotideinheit, die ein um ein Nucleotid vom 5'-Ende zu kurzes Fragment der effektiven Sequenz umfaßt.
  • Auf ähnliche Weise wie vorstehend kann eine Verbindung (7-7) durch Umsetzung einer Verbindung (7-3), die von der DMT-Gruppe befreit ist, mit einer Verbindung (7-6), die eine Alkyl- oder Arylphosphoramitidgruppe an der 3'-Position des 3'-Endnucleosids aufweist, und analoge Behandlung zur Synthese eines Phosphorsäuretriesters oder eines Phosphorthioattriesters in einem DNA-Syntheseautomaten hergestellt werden. Das auf diese Weise erhaltenen Produkt wird mit einer Nucleotideinheit in einer regulären Abfolge umgesetzt, um eine Verbindung (7a) mit einem um ein Nucleotid vom 5'-Ende zu kurzen Fragment der effektiven Basensequenz herzustellen.
  • Verfahren C-1 beinhaltet die Herstellung der gewünschten Verbindung der allgemeinen Formel (1) durch Umsetzung einer Verbindung (2) mit einem Phosphitylierungsmittel unter Bildung eines 3'-Phosphatderivats (8), Umsetzung des auf diese Weise erhaltenen Produkts mit den einzelnen Oligomeren der Formeln (3, 4a, 4b, 5, 6a bis 6d, 7a und 7b), die an CPG trägergebunden sind und nach den Verfahren B-1 bis B-5 hergestellt wurden, nach Entfernung der DMT-Schutzgruppe, Oxidation des kondensierten Produkts durch ein Oxidationsmittel, Abspaltung der Nucleotidkette von dem CPG und schließlich Entfernung der Schutzgruppe mit Ausnahme der Substituentengruppe, die an das Kohlenstoffatom an der 5'-Position des 5'-Endnucleosids gebunden ist.
  • Verfahren C-2 beinhaltet die Herstellung der gewünschten Verbindung (1) durch Umsetzung einer Verbindung (2) mit einem Phosphorylierungsmittel unter Bildung eines 3'-Phosphorsäurederivats (9), Kondensation des Produkts mit den einzelnen Verbindungen der Formeln (3, 4a, 4b, 5, 6a bis 6d, 7a und 7b) nach Entfernung nur der DMT-Schutzgruppe unter Bildung einer Phosphorsäuretriesterverknüpfung, Abspaltung der Nucleotidkette von dem CPG, Entfernung der Schutzgruppe mit Ausnahme der Substituentengruppe, die an das Kohlenstoffatom an der 5'-Position des 5'-Endnucleosids gebunden ist, und schließlich Reinigung nach herkömmlichen Verfahren.
  • Verfahren C-3 beinhaltet die Herstellung der gewünschten Verbindung (1) durch Einführung einer Phosphonsäuregruppe in die 3'-Position einer Verbindung (2) zur Herstellung einer Verbindung (10), Kondensation des Prudukts mit den einzelnen Verbindungen der Formeln (3, 4a, 4b, 5, 6a bis 6d, 7a und 7b) unter Verwendung eines Säurehalogenids in Gegenwart einer Base, Oxidation des kondensierten Produkts durch ein Oxidationsmittel unter Bildung einer Phosphorsäurediesterverknüpfung, Abspaltung des Nucleotids von CPG, Entfernung der Schutzgruppe mit Ausnahme der Substituentengruppe, die an das Kohlenstoffatom an der 5'-Position des 5'-Endnucleosids gebunden ist, und schließlich Reinigung nach herkömmlichen Verfahren.
  • Die Verfahren A bis C werden nachstehend ausführlich erläutert.
  • In den Reaktionsschemata, die unter den Verfahren A bis C zusammengefaßt sind, haben R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, Z, Y&sub1;, Y&sub2;, Y&sub3;, Y&sub4;, X, n, m und B die vorstehenden Definitionen; A&sub1; stellt eine Tritylgruppe (Tr-Gruppe), eine Monomethoxytritylgruppe (MMT-Gruppe) oder eine Dimethoxytritylgruppe (DMT-Gruppe) dar, die allgemein zum Schutz speziell einer primären Hydroxygruppe eines Nucleosids verwendet wird; und A&sub2; stellt eine trisubstituierte Silylgruppe, wie eine tert.-Butyldimethylsilylgruppe (TBDMS- Gruppe) oder eine Triisopropylsilylgruppe (TIPS-Gruppe); eine Trihalogenethoxycarbonylgruppe, wie eine Trichlorethoxycarbonylgruppe (Troc-Gruppe); oder eine Aralkyloxycarbonylgruppe, wie eine Benzyloxycarbonylgruppe (Z-Gruppe), dar.
  • D' stellt eine Base des 5'-Endnucleotids dar, bei dem eine Aminogruppe mit einer Acylgruppe zur Synthese von DNA mit der effektiven Basensequenz geschützt ist; D" stellt eine Basengruppe eines Nucleotids am 3'-Ende dar; und D"' stellt eine Basengruppe einer wahlweisen Nucleotideinheit dar, die bei der DNA-Synthese verwendet wird, das heißt eine Base, die aus der 5'-Basengruppe oder den entsprechenden geschützten Basen ausgewählt ist.
  • F ist ein Oligonucleotidteil mit einem um ein Nucleotid vom 5'-Ende zu kurzen Fragment der effektiven Sequenz und stellt einen Basenteil oder das entsprechende, mit einer Schutzgruppe am Phosphorsäureteil geschützte Oligonucleotid dar, das allgemein für die DNA-Synthese verwendet wird, das jedoch keinerlei Hydroxygruppe an der 5'-Position des 5'-Endnucleosids und an den 3'-Positionen des 3'-Endnucleosids enthält. V stellt eine Schutzgruppe des Phosphorsäureteils im Fall der DNA-Synthese dar.
  • U stellt eine Aminogruppe eines Amiditteils dar. W&sub1; bis W&sub5; stellen Fragmente von CPG zu einem Sauerstoffatom einer Hydroxygruppe an der 3'- Position des 3'-Endnucleotids des Oligonucleotids (F) der schließlich gewünschten Verbindung gemäß dem Verfahren, das unter Verfahren B-1 bis B-5 beschrieben wird, dar. l ist eine ganze Zahl von 1 bis 9; E stellt ein Wasserstoffatom oder eine wahlweise geschützte Hydroxy- oder Aminogruppe dar; und K stellt ein Sauerstoff- oder Schwefelatom dar.
  • R&sub5; stellt eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Phenyl-, Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy-, Butoxy-, Cyanoethyloxy- oder wahlweise substituierte Phenyloxygruppe dar.
  • Jede der nachstehenden Stufen wird im folgenden ausführlicher erläutert. Für den Fall, daß eine Stufe in Analogie zu einem für eine vorhergehende Stufe beschriebenen Verfahren durchgeführt werden kann, wird die erste Stufe als repräsentativ erläutert.
    • Stufen 1, 8 und 18
  • In diesem Stufen kann eine Verbindung (2-2), in der nur eine Hydroxygruppe an der 5'-Position selektiv geschützt ist, durch Umsetzung einer Verbindung (2-1) mit einem Hydroxyschutzreagenz in einem inerten Lösungsmittel hergestellt werden. Wenn es sich bei dem Basenteil um A, G oder C handelt, dann werden die in der Base enthaltenen Aminogruppen durch Acylierung in der vorhergehenden Stufe geschützt, und die schützende Reaktion kann auf eine als solche bekannte Weise durchgeführt werden, z.B. in Analogie zu dem in J. Am. Chem. Soc., 104, 1316 (1982) beschriebenen Verfahren. Als Aminoschutzgruppen kommen allgemein niedere aliphatische Acyl- oder aromatische Acylgruppen in Betracht. Beispiele für Acylgruppen umfassen: niedere aliphatische Acylgruppen, wie eine Formyl-, Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Isobutyryl-, Pentanoyl-, Pivaloyl-, Valeryl oder Isovalerylgruppe; und aromatische Acylgruppen, wie eine Benzoyl, 4-Acetoxybenzoyl-, 4-Methoxybenzoyl-, 4-Methylbenzoyl- oder 1- Naphthoylgruppe; für den Fall, daß es sich bei dem Basenteil um A oder C handelt, wird eine Benzoylgruppe bevorzugt, und für den Fall, daß es sich bei dem Basenteil um G handelt, wird eine Isobutyrylgruppe bevorzugt.
  • Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel umfassen: aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol oder Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, Dichlorethan, Chlorbenzol oder Dichlorbenzol; Ester, wie Ethylformat, Ethylacetal, Propylacetat, Butylacetat oder Diethylcarbonat; Ether, wie Diethylether, Diisopropylether, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyethan oder Diethylenglycoldimethylether; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron oder Cyclohexanon; Nitroverbindungen, wie Nitroethan oder Nitrobenzol; Nitrile, wie Acetonitril oder Isobutyronitril; Amide, wie Formamid, Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid oder Sulfolan; aliphatische tertiäre Amine, wie Trimethylamin, Triethylamin oder N- Methylmorpholin; und aromatische Amine, wie Pyridin oder Picolin; stärker bevorzugt sind halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere Dichlormethan) und Amide (insbesondere DMF).
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des für die schützende Reaktion zu verwendenden Reagenzes, sofern es für einen spezifischen Schutz einer Hydroxygruppe an der 5'-Position verwendet werden kann und unter sauren oder neutralen Bedingungen entfernt werden kann. Beispiele für bevorzugte schützende Reagenzien umfassen Triarylmethylhalogenide, wie Tritylchlorid, Monomethoxytritylchlorid oder Dimethoxytritylchlorid.
  • Wenn es sich bei dem schützenden Reagenz um ein Triarylmethylhalogenid handelt, dann wir die Reaktion normalerweise in Gegenwart einer Base durchgeführt.
  • Beispiele für geeignete Basen umfassen: Heterocyclische Amine, wie Pyridin, Dimethylaminopyridin oder Pyrrolidinopyridin; aliphatische tertiäre Amine, wie Trimethylamin oder Triethylamin; bevorzugt sind organische Basen (insbesondere Pyridin, Dimethylaminopyridin und Pyrrolidinopyridin).
  • Wenn organische Amine als ein Lösungsmittel verwendet werden, dann ist es nicht erforderlich, ein anderes, Säure auffangendes Mittel zu verwenden, da die organischen Amine selbst als Säure auffangende Mittel wirken.
  • Die Reaktionstemperatur variiert abhängig von der Beschaffenheit des Ausgangsmaterials und des verwendeten Lösungsmittels sowie anderer Reaktionsbedingungen; die Reaktion wird jedoch normalerweise bei einer Temperatur von 0 bis 150ºC und vorzugsweise von 20 bis 100ºC durchgeführt.
  • Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert abhängig von der Beschaffenheit der Ausgangsmaterialien und des verwendeten Lösungsmittels sowie der Reaktionstemperatur; die Reaktion ist jedoch normalerweise in einer Zeitspanne von 1 bis 100 Stunden und vorzugsweise von 2 bis 24 Stunden abgeschlossen.
  • Nach Abschluß der Reaktion kann die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, z.B. indem man das Reaktionsgemisch in Wasser gießt, mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Benzol, Ether oder Ethylacetat, extrahiert und schließlich das Lösungsmittel aus dem Extrakt abdestilliert. Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann für die nachfolgende Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet werden; wenn es jedoch gewünscht ist, kann das Produkt nach herkömmlichen Verfahren, z.B. durch verschiedene chromatographische Techniken oder Umkristallisieren, gereinigt werden.
    • Stufe 2
  • In dieser Stufe kann eine Verbindung (2-3) durch Umsetzung einer Verbindung (2-2) mit einem Hydroxyschutzreagenz in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels hergestellt werden.
  • Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel umfassen: aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol oder Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, Dichlorethan, Chlorbenzol oder Dichlorbenzol; Ester, wie Ethylformat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Diethylcarbonat; Ether, wie Diethylether, Diisopropylether, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyethan oder Diethylenglycoldimethylether; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron oder Cyclohexanon; Nitroverbindungen, wie Nitroethan oder Nitrobenzol; Nitrile, wie Acetonitril oder Isobutyronitril; Amide, wie Formamid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid oder Sulfolan; stärker bevorzugt sind Ether (insbesondere Tetrahydrofuran), halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere Dichlormethan), aromatische Kohlenwasserstoffe (insbesondere Toluol) und Amide (insbesondere DMF).
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Hydroxyschutzreagenzes, sofern die Schutzgruppe getrennt von der Schutzgruppe an der 5'-Position entfernt werden kann. Beispiele für derartige Schutzreagenzien umfassen: Silylhalogenide, wie tert.-Butyldimethylsilylchlorid oder Triisopropylsilylchlorid; Halogenalkoxycarbonylhalogenide, wie Trichlorethoxycarbonylchlorid; und Aralkyloxycarbonylhalogenide, wie Benzyloxycarbonylchlorid.
  • Wenn es sich bei dem Schutzreagenz um ein Silylhalogenid, ein Halogenalkoxycarbonylhalogenid oder ein Aralkyloxycarbonylhalogenid handelt, dann wird die Reaktion zum Schützen normalerweise in Gegenwart einer Base durchgeführt.
  • Beispiele für bevorzugte Basen umfassen organische Basen (insbesondere Triethylamin, Pyridin, N-Methylmorpholin, DBU und Imidazol).
  • Die Reaktionstemperatur variiert abhängig von der Beschaffenheit des Reagenzes, der Ausgangsverbindung und des Lösungsmittels sowie anderer Reaktionsbedingungen; die Reaktion wird jedoch normalerweise bei einer Temperatur von -20 bis 105ºC und vorzugsweise bei -10 bis 50ºC durchgeführt.
  • Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert abhängig von der Beschaffenheit der Ausgangsverbindung und dem verwendeten Lösungsmittel sowie der Reaktionstemperatur; normalerweise ist die Reaktion jedoch in einer Zeitspanne von 1 bis 100 Stunden und vorzugsweise von 1 bis 24 Stunden abgeschlossen.
  • Nach Abschluß der Reaktion kann die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden. Ein Beispiel für eine derartige Technik umfaßt: Gießen des Reaktionsgemisches in Wasser; Extrahieren mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Benzol, Ether oder Ethylacetat; und schließlich Abdestillieren des Lösungsmittels aus dem Extrakt. Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann normalerweise für die anschließende Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet werden; wenn es jedoch gewünscht ist, kann das Produkt nach verschieden chromatographischen Techniken, durch Umkristallisieren oder dergleichen, gereinigt werden.
    • Stufen 3, 11, 22 und 25
  • In diesen Stufen können die Verbindungen (2-4), (4-6), (6-7) und (6- 9) durch Umsetzung der Verbindungen (2-3), (4-5), (6-6) und (6-8) mit einem Mittel zur Entfernung der Schutzgruppen in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels umgesetzt werden, um selektiv die Hydroxyschutzgruppe an der 5'-Position zu entfernen.
  • Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel umfassen: aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol oder Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, Dichlorethan, Chlorbenzol oder Dichlorbenzol; Ester, wie Ethylformat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat oder Diethylcarbonat; Ether, wie Diethylether, Diisopropylether, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyethan oder Diethylenglycoldimethylether; Alkohole, wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol, tert.-Butanol, Isoamylalkohol, Diethylenglycol, Glycerin, Octanol, Cyclohexanol oder Methylcellosolve; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron oder Cyclohexanon; Nitroverbindungen, wie Nitroethan oder Nitrobenzol; Nitrile, wie Acetonitril oder Isobutyronitril; Amide, wie Formamid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid; und Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid oder Sulfolan; stärker bevorzugt sind Alkohole (insbesondere Methanol und Ethanol) sowie Dichlormethan und für den Fall, daß Essigsäure das Mittel zur Entfernung der Schutzgruppe ist, ein Gemisch aus Essigsäure und Wasser.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Mittels zur Entfernung der Schutzgruppen, sofern es normalerweise für eine herkömmliche Entfernung der Schutzgruppen verwendet werden kann. Wenn die Schutzgruppe eine Triarylmethylgruppe ist, dann kann sie unter Verwendung von Säuren, wie Essigsäure, Dichloressigsäure, Trifluoressigsäure oder Salzsäure, oder von Lewis-Säuren, wie Zinkbromid, und vorzugsweise unter Verwendung von Essigsäure, Dichloressigsäure oder Trifluoressigsäure entfernt werden.
  • Die Reaktionstemperatur variiert abhängig von der Beschaffenheit des Reagenzes, der Ausgangsverbindung und des verwendeten Lösungsmittels sowie anderen Reaktionsbedingungen; normalerweise wird die Reaktion jedoch bei einer Temperatur von -10 bis 100ºC und vorzugsweise bei 0 bis 50ºC durchgeführt. Die für die Reaktion erforderliche Zeitspanne variiert abhängig von der Beschaffenheit der Ausgangsverbindung und des verwendeten Lösungsmittels sowie der Reaktionstemperatur; normalerweise ist die Reaktion jedoch in einer Zeitspanne von 1 Minuten bis 50 Stunden und vorzugsweise von 1 Minute bis 24 Stunden abgeschlossen.
  • Nach Abschluß der Reaktion kann die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden. In Stufe 3 umfaßt ein Beispiel für eine derartige Technik: Neutralisieren des Reaktionsgemisches; Gießen des Reaktionsgemisches in Wasser; Extrahieren mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Benzol, Ether oder Ethylacetat; und Abdestillieren des Lösungsmittels aus dem Extrakt. Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann normalerweise bei der anschließenden Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet werden; wenn es jedoch gewünscht ist, kann das Produkt durch verschiedene chromatographische Techniken, Umkristallisieren oder dergleichen gereinigt werden. In den Stufen 11, 22 und 25 umfaßt ein Beispiel für eine derartige Technik: Abtrennung der gewünschten Verbindung durch Filtration und Waschen mit Methylenchlorid.
    • Stufen 4 und 6
  • In diesen Stufen kann eine Verbindung (2-6) oder (2) durch Umsetzung einer Verbindung (2-4) oder (2-1) mit einer Verbindung (2-5) (in der Formel bezeichnet Hal ein Halogenatom) in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels und einer Base hergestellt werden. Beispiele für das in der Verbindung (2-5) verwendete Halogen sind Chlor, Brom oder Iod und vorzugsweise Chlor oder Brom.
  • Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel umfassen: aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol oder Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, Dichlorethan, Chlorbenzol oder Dichlorbenzol; Ester, wie Ethylformat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat oder Diethylcarbonat; Ether, wie Diethylether, Diisopropylether, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyethan oder Diethylenglycoldimethylether; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron oder Cyclohexanon; Nitroverbindungen, wie Nitroethan oder Nitrobenzol; Nitrile, wie Acetonitril oder Isobutyronitril; Amide, wie Formamid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid; und Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid oder Sulfolan; stärker bevorzugt sind Ether (insbesondere Tetrahydrofuran), Ketone (insbesondere Aceton), halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere Dichlormethan), Amide (insbesondere DMF) und aromatische Amine (insbesondere Pyridin).
  • Beispiele für bevorzugte Basen umfassen: organische Basen (insbesondere Triethylamin, Pyridin, N-Methylmorpholin, DBU und dergleichen Basen), Alkalimetallhydride (insbesondere Natriumhydrid) und Alkalimetallcarbonate (insbesondere Natriumcarbonat und Lithiumcarbonat), und für den Fall, daß Z in der Verbindung (2-5) ein Siliciumatom ist, ist Imidazol die am stärksten bevorzugte organische Base.
  • Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders kritisch; die Reaktion wird jedoch normalerweise bei einer Temperatur von 0 bis 100ºC und vorzugsweise von 20 bis 60ºC durchgeführt.
  • Die für die Reaktion erforderliche Zeit liegt normalerweise im Bereich von 5 Minuten bis 30 Stunden. Wenn die Reaktion bei 50ºC durchgeführt wird, dann ist sie in einer Zeitspanne von 10 Stunden abgeschlossen.
  • Nach Abschluß der Reaktion kann die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, z.B. durch Neutralisieren des Reaktionsgemisches, Abfiltrieren gegebenenfalls vorhandener unlöslicher Materialien, Zugabe von Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, Abtrennen der organischen Schicht, die die gewünschte Verbindung enthält, Waschen des Extrakts mit Wasser, Trocknen des Extrakts über wasserfreiem Magnesiumsulfat oder dergleichen und schließlich Abdestillieren des Lösungsmittels. Die auf diese Weise erhaltene gewünschte Verbindung kann, falls dies erforderlich ist, nach herkömmlichen Verfahren, z.B. durch Umkristallisieren, erneutes Fällen, Chromatographie oder dergleichen gereinigt werden.
    • Stufe 5
  • In dieser Stufe kann eine Verbindung (2) durch Umsetzung einer Verbindung (2-6) mit einem Mittel zur Entfernung der Schutzgruppen in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels hergestellt werden.
  • (1) Wenn es sich bei der Hydroxyschutzgruppe an der 3'-Position um eine Silylgruppe handelt, dann kann diese normalerweise durch Behandlung mit einer Verbindung, die zur Bildung eines Fluoridions imstande ist, wie Tetrabutylammoniumfluorid, entfernt werden.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt. Bevorzugte Beispiele umfassen Ether, wie Tetrahydrofuran oder Dioxan.
  • Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders kritisch; die Reaktion wird jedoch normalerweise bei einer Temperatur von -30 bis 100ºC und vorzugsweise von 0 bis 30ºC durchgeführt.
  • Die für die Reaktion erforderliche Zeitspanne liegt normalerweise im Bereich von 5 Minuten bis 30 Stunden. Wenn die Reaktion bei 20ºC durchgeführt wird, dann ist sie in einer Zeitspanne von 10 Stunden abgeschlossen.
  • Nach Abschluß der Reaktion kann die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, z.B. durch Neutralisation des Reaktionsgemisches, Abfiltrieren gegebenenfalls vorhandener unlöslicher Materialien, Zugabe von Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, Abtrennen der organischen Schicht, die die gewünschte Verbindung enthält, Waschen des Extrakts mit Wasser, Trocknen des Extrakts über wasserfreiem Magnesiumsulfat oder dergleichen und schließlich Abdestillieren des Lösungsmittels. Das auf diese Weise erhaltene gewünschte Produkt kann gegebenenfalls nach herkömmlichen Verfahren gereinigt werden, z.B. durch Umkristallisieren, erneutes Fällen, Chromatographie oder dergleichen.
  • Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann, falls dies erforderlich ist, weiter durch herkömmliche Maßnahmen, z.B. durch Umkristallisieren, erneutes Fällen, Chromatographie oder dergleichen, gereinigt werden.
  • (2) Wenn es sich bei der Hydroxyschutzgruppe an der 3'-Position um eine Halogenalkoxycarbonylgruppe handelt, dann kann diese normalerweise durch Behandlung mit Zinkstaub entfernt werden.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt. Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel umfassen Essigsäure, Alkohole oder Gemische aus Wasser und einem oder mehreren dieser Lösungsmittel.
  • Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders kritisch; die Reaktion wird jedoch normalerweise bei einer Temperatur von 0 bis 100ºC und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt.
  • Die für die Reaktion erforderliche Zeit liegt normalerweise im Bereich von 5 Minuten bis 30 Stunden. Wenn die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt wird, dann ist sie in einer Zeitspanne von 10 Stunden abgeschlossen
  • Nach Abschluß der Reaktion kann die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, z.B. durch Neutralisieren des Reaktionsgemisches oder Abfiltrieren gegebenenfalls vorhandener unlöslicher Materialien, Zugabe von Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, Abtrennen der organischen Schicht, die die gewünschte Verbindung enthält, Waschen des Extrakts mit Wasser, Trocknen über wasserfrei em Magnesiumsulfat oder dergleichen und schließlich Abdestillieren des Lösungsmittels. Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsprodukt kann weiter nach herkömmlichen Verfahren gereinigt werden, z.B. durch Umkristallisieren, erneutes Fällen, Chromatographie oder dergleichen.
  • (3) Wenn es sich bei der Hydroxyschutzgruppe an der 3'-Position um eine Aralkyloxycarbonylgruppe handelt, dann kann diese normalerweise durch katalytische Reduktion oder Oxidation entfernt werden.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des für die Reduktion verwendbaren Katalysators, sofern er üblicherweise bei einer katalytischen Reduktion verwendet werden kann. Beispiele für bevorzugte Katalysatoren umfassen Palladium auf künstlicher Kohle, Raney- Nickel, Platinoxid, Platinschwarz, Rhodium auf Aluminiumoxid, eine Kombination aus Triphenylphosphin und Rhodiumchlorid und Palladium auf Bariumsulfat.
  • Der Wasserstoffdruck, unter dem die Reaktion durchgeführt wird, ist nicht besonders kritisch; normalerweise wird die Reaktion jedoch im Bereich von 1 bis 10 atmosphärischen Drucken durchgeführt.
  • Die Reaktionstemperatur und die für die Reaktion erforderliche Zeit variieren abhängig von der Beschaffenheit der Ausgangsverbindung und des verwendeten Lösungsmittels sowie dem Typ des Katalysators und anderen Reaktionsbedingungen; üblicherweise wird die Reaktion jedoch bei einer Temperatur von 0 bis 100ºC durchgeführt und ist in einer Zeitspanne von 5 Minuten bis 24 Stunden abgeschlossen.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des bei der Entfernung der Schutzgruppen durch Oxidation zu verwendenden Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt. Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel sind Gemische aus Wasser und einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln.
  • Beispiele für bevorzugte organische Lösungsmittel umfassen: Ketone, wie Aceton; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan, Chloroform oder Kohlenstofftetrachlorid; Nitrile, wie Acetonitril; Ether, wie Diethylether, Tetrahydrofuran oder Dioxan; Amide, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid; und Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Oxidationsmittels, sofern es bei üblichen Oxidationen verwendet werden kann. Bevorzugte Beispiele sind Kaliumpersulfat, Natriumpersulfat, Cerammoniumnitrat (CAN) und 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-p-benzochinon (DDQ).
  • Die Reaktionstemperatur und die für die Reaktion erforderliche Zeit variieren abhängig von der Beschaffenheit der Ausgangsverbindung und des Lösungsmittels sowie dem Typ des verwendeten Katalysators und anderen Reaktionsbedingungen; die Reaktion wird jedoch normalerweise bei einer Temperatur von 0 bis 150ºC durchgeführt und ist in einer Zeitspanne von 10 Minuten bis 24 Stunden abgeschlossen.
  • Die Hydroxyschutzgruppe kann auch durch Behandlung mit Alkalimetallen, wie Lithiumetall oder Natriummetall, in flüssigem Ammoniak oder Alkoholen, wie Methanol oder Ethanol, bei einer Temperatur von -78 bis -20ºC entfernt werden.
  • Ferner kann die Schutzgruppe durch Verwendung von einer Kombination aus Aluminiumchlorid und Natriumiodid oder Alkylsilylhalogeniden, wie Trimethylsilyliodid, in einem Lösungsmittel entfernt werden.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt. Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel sind Nitrile, wie Acetonitril, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan oder Chloroform, und Gemische von zwei oder mehr dieser Lösungsmittel.
  • Die Reaktionstemperatur und die für die Reaktion erforderliche Zeit variieren abhängig von der Beschaffenheit der Ausgangsverbindung und des Lösungsmittels sowie anderen Reaktionsbedingungen; die Reaktion wird jedoch normalerweise bei einer Temperatur von 0 bis 50ºC durchgeführt und ist in einer Zeitspanne von 5 Minuten bis 3 Tagen abgeschlossen.
  • Wenn das Substrat ein Schwefelatom enthält, dann kann die Entfernung der Schutzgruppen vorzugsweise unter Verwendung einer Kombination aus Aluminiumchlorid und Natriumiodid erzielt werden.
  • Nach Abschluß der Reaktion kann die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, z.B. durch Neutralisieren des Reaktionsgemisches oder Abfiltrieren gegebenenfalls vorhandener unlöslicher Materialien, Zugabe von Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Ethylacetat, Abtrennen der organischen Schicht, die die gewünschte Verbindung enthält, Waschen des Extrakts mit Wasser, Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat oder dergleichen und schließlich Abdestillieren des Lösungsmittels Die auf diese Weise erhaltene gewünschte Verbindung kann, falls dies erforderlich ist, weiter nach herkömmlichen Verfahren gereinigt werden, z.B. durch Umkristallisieren, erneutes Fällen, Chromatographie oder dergleichen.
    • Stufen 7, 12, 14, 11, 23, 26, 28, 30, 33 und 35
  • In diesen Stufen können die CPG-gebundenen Oligodesoxyribonucleotide (3), (4a), (4b), (5), (6a) bis (6d), (7a) und (7b) durch Verwendung von CPG-gebundenen Nucleosiden, die die 3'-Endnucleoside der effektiven Basensequenz umfassen, Wiederholen der Verlängerungsstufe der DNA-Kette in einem DNA-Syntheseautomaten und schließlich Herstellung eines um ein Nucleotid vom 5'-Ende zu kurzen Fragments der effektiven Sequenz hergestellt werden.
  • Die Verlängerung der DNA-Kette in einem DNA-Syntheseautomaten wird anhand des "Phosphoramidit"-Ansatzes erläutert; es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß dieses Verfahren zur Beschreibung und nicht zur Beschränkung dient.
  • In Stufe 7 wird im Handel erhältliches, CPG-gebundenes D" (3-1) mit einem Reagenz zur Entfernung der DNT-Schutzgruppe in einem DNA-Syntheseautomaten behandelt, um die 5'-terminale DMT-Gruppe zu entfernen, und anschließend wird es mit einer Nucleotideinheit, die im Handel für einen DNA-Syntheseautomaten erhältlich ist, kondensiert, gefolgt von der Bildung einer Phosphonsäuretriesterverknüpfung, die anschließend unter Verwendung eines geeigneten Oxidationsmittels zu einem Phosphorsäuretriester oxtdiert wird. Nach Synthese eines um ein Nucleotid vom 5'-Ende zu kurzen Fragments der effektiven Sequenz durch Wiederholung dieser Stufen wird ein CPG-gebundenes ODN (3) mit einer 5'-terminalen DMT-Gruppe hergestellt. Das CPG-gebundene ODN der gewünschten Nucleotidbasensequenz, dessen 5'-Ende mit einer DMT-Gruppe geschützt ist, kann gemäß dem Verfahren, über das H. Koster et al. in Nucleic Acid Res., 12, 4539 (1984) berichten, oder nach dem modifizierten Verfahren unter Verwendung eines Syntheseautomaten auf der Basis eines Phosphoramiditverfahrens, z.B. Modell 380B (ein Produkt von Applied Biosystems Inc.) oder Cyclon Plus (ein Produkt von MilliGen/Biosearch), hergestellt werden.
  • Die Basengruppe der Nucleotideinheit, die für die Synthese von ODN zu verwenden ist, ist mit einer Acylgruppe geschützt. Beispiele für bevorzugte Acylgruppen sind eine Benzoylgruppe für den Fall, daß es sich bei der Basengruppe um A oder C handelt, und eine Isobutyrylgruppe für den Fall, daß es sich um G handelt.
  • Beispiele für die sauren Substanzen, die als Katalysator bei der Kondensationsreaktion der Stufe verwendet werden, umfassen saure Substanzen unter Einschluß von Tetrazolen und vorzugsweise Tetrazol.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt. Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel sind Acetonitril und Tetrahydrofuran.
  • Die Reaktion wird bei einer Temperatur von -30 bis 50ºC und normalerweise bei Raumtemperatur durchgeführt.
  • Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert abhängig von der Reaktionstemperatur; die Reaktion ist jedoch in einer Zeitspanne von 1 Minute bis 20 Stunden abgeschlossen. Wenn die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt wird, dann ist sie innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des in diesen Stufen verwendeten Oxidationsmittels, sofern es bei herkömlichen Oxidationen als Oxidationsmittel verwendet werden kann. Beispiele für bevorzugte Oxidationsmittel umfassen: anorganische Metalloxidationsmittel einschließlich Manganoxide, wie Kaliumpermanganat oder Mangandioxid; Rutheniumoxide, wie Rutheniumtetraoxid; Selenverbindungen, wie Selendioxid; Eisenverbindungen, wie Eisen(III)-chlorid; Osmiumverbindungen, wie Osmiumtetraoxid; Silberverbindungen, wie Silberoxid; Quecksilberverbindungen, wie Quecksilber(II)-acetat; Bleiverbindungen, wie Bleioxid oder Bleitetraoxid; Chromsäureverbindungen, wie Kaliumchromat, ein Komplex aus Chromsulfat und Schwefelsäure oder ein Komplex aus Chromsäure und Pyridin; Cerverbindungen, wie Cerammoniumnitrat (CAN); anorganische Oxidationsmittel einschließlich Halogenmoleküle, wie Chlor-, Brom- oder Iodmoleküle; Periodate, wie Natriumperiodat; Ozon; Wasserstoffperoxid; Stickstoffverbindungen, wie salpetrige Säure; Chlorverbindungen, wie Kaliumchlorit oder Natriumchlorit; Perschwefelsäureverbindungen, wie Kaliumpersulfat oder Natriumpersulfat; organische Oxidationsmittel einschließlich Reagenzien, die bei der DMSO-Oxidation verwendet werden (ein Komplex aus Dimethylsulfoxid und Dicyclohexylcarbodiimid, Oxalylchlorid, Essigsäureanhydrid oder Phosphorpentaoxid oder ein Komplex aus Pyridin und Schwefeltrioxid); Peroxide, wie tert.-Butylhydroperoxid; stabile Kationen, wie das Triphenylmethylkation; Succinimide, wie N-Bromsuccinimid; Hypochlorsäureverbindungen, wie tert.-Butylhypochlorit; Azodicarbonsäureverbindungen, wie Azodicarboxylat; eine Kombination aus Triphenylphosphin und Disulfiden, wie Dimethyldisulfid oder Diphenyldisulfid; Salpetrigsäureester, wie Methylnitrit; Tetrahalogenkohlenstoffe, wie Tetrabrommethan; Chinone, wie 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-p-benzochinon (DDQ); und vorzugsweise Iod.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt. Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel umfassen: aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol oder Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan oder Chloroform; Ether, wie Ether, Tetrahydrofuran, Dioxan oder Dimethoxyethan; Amide, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid; Alkohole, wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol oder Isoamylalkohol; verdünnte Säuren, wie wäßrige Schwefelsäure; verdünnte Basen, wie eine wäßrige Lösung von Natriumhydroxid; Wasser; Ketone, wie Aceton oder Methylethylketon; heterocyclische Amine, wie Pyridin; und Nitrile, wie Acetonitril; bevorzugt sind heterocyclische Amine (insbesondere Pyridin), Nitrile (insbesondere Acetonitril), Ether (insbesondere Tetrahydrofuran) und halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere Dichlormethan).
  • Die Reaktion wird bei einer Temperatur von -50 bis 100ºC durchgeführt. Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert hauptsächlich abhängig von der Reaktionstemperatur sowie der Beschaffenheit der Ausgangsverbindung und des Lösungsmittels; die Reaktion wird jedoch üblicherweise bei einer Temperatur von -50 bis 100ºC durchgeführt und ist normalerweise in einer Zeitspanne von 30 Minuten bis 15 Stunden abgeschlossen. Die vorstehend beschriebene Oxidationsreaktion kann durch Zugabe eines Phasentransferkatalysators, wie Triethylbenzylammoniumchlorid oder Tributylbenzylammoniumbromid, beschleunigt werden.
  • Die Stufen 12, 14, 17, 23, 26, 28, 30, 33 und 35 sind ähnlich.
    • Stufen 9 und 20
  • In diesen Stufen kann ein Halbester einer Dicarbonsäure durch Umsetzung einer freien Hydroxygruppe einer Verbindung (4-2) oder (6-2) mit einem Anhydrid einer Dicarbonsäure, wie Bernsteinsäureanhydrid, in Gegenwart eines basischen Katalysators hergestellt werden.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit der verwendeten Dicarbonsäure. Bevorzugte Dicarbonsäuren sind Säuren mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, und die am stärksten bevorzugten Dicarbonsäuren sind Bernsteinsäure und Glutarsäure. Beispiele für geeignete basische Katalysatoren umfassen: Aminopyridine, wie Dimethylaminopyridin oder Pyrrolidinopyridin; tertiäre Amine, wie Trimethylamin oder Triethylamin; Natriumhydrogencarbonat; und Alkalimetalicarbonate, wie Kaliumcarbonat; am stärksten bevorzugt sind Dimethylaminopyridin oder Pyrrolidinopyridin.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt und zum Lösen des Ausgangsmaterials in einem gewissen Ausmaß imstande ist. Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel umfassen: aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol oder Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan oder Chloroform; Ether, wie Ether, Tetrahydrofuran, Dioxan oder Dimethoxyethan; Amide, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid; Alkohole, wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol oder Isoamylalkohol; verdünnte Säuren, wie wäßrige Schwefelsäure; verdünnte Basen, wie eine wäßrige Lösung von Natriumhydroxid; Wasser; Ketone, wie Aceton oder Methylethylketon; heterocyclische Amine, wie Pyridin; und Nitrile, wie Acetonitril; stärker bevorzugt sind Nitrile (insbesondere Acetonitril), Ether (insbesondere Tetrahydrofuran) und halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere Dichlormethan).
  • Die Reaktion wird bei einer Temperatur von -50 bis 100ºC durchgeführt. Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert hauptsächlich abhängig von der Reaktionstemperatur sowie der Beschaffenheit der Ausgangsverbindung und des verwendeten Lösungsmittels; normalerweise ist die Reaktion jedoch in einer Zeitspanne von 30 Minuten bis 15 Stunden abgeschlossen.
    • Stufen 10 und 21
  • In diesen Stufen können die gewünschten Verbindungen (4-5) und (6-6) durch Umsetzung der Bernsteinsäurehalbester (4-3) und (6-4), die in den Stufen 9 und 20 hergestellt wurden, mit Phenolen, wie Pentachlorphenol, in Gegenwart eines Kondensationsmittels unter Bildung eines aktivierten Esters und anschließende Umsetzung des Produkts mit den CPG-Aminen (4-4) und (6-5) in Gegenwart einer Base hergestellt werden.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlicher der Beschaffenheit der bei dieser Reaktion verwendeten Phenole. Beispiele für bevorzugte Phenole sind Pentachlorphenol und 4-Nitrophenol.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt und zum Lösen des Ausgangsmaterials in einem gewissen Ausmaß Imstande ist. Beispiele für geeignete Lösungsmittel umfassen: Amide wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid; Ketone, wie Aceton oder Methylethylketon; heterocyclische Amine, wie Pyridin; und Nitrile, wie Acetonitril; bevorzugt sind Amide, wie Dimethylformamid.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit der verwendeten Base, sofern sie als Base bei einer üblichen Reaktion verwendet werden kann. Beispiele für bevorzugte Basen umfassen: organische Basen, wie Triethylamin, Tributylamin, Diisopropylethylamin; N-Methylmorpholin, Pyridin, 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin, N,N-Dimethylanilin, N,N-Diethylanilin, 1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en, 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (DABCO) oder 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU); stärker bevorzugt sind organische Basen, insbesondere Triethylamin, Pyridin, N-Methylmorpholin und DBU.
  • Die Reaktion wird bei einer Temperatur von -50 bis 100ºC durchgeführt Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert hauptsächlich abhängig von der Reaktionstemperatur sowie der Beschaffenheit der Ausgangsverbindung und des verwendeten Lösungsmittels; wenn die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt wird, dann ist sie jedoch normalerweise in einer Zeitspanne von 30 bis 50 Stunden abgeschlossen.
    • Stufen 13 und 32
  • in Stufe 13 kann das CPG-gebundene Nucleosid (4-7), das eine Thioatgruppe enthält, durch Umsetzung einer Verbindung (4-6), die in Stufe 11 hergestellt wurde, mit einem im Handel erhältlichen 5'-O-DMT-Nucleosid- 3'-phosphoramidit-Reagenz in einem DNA-Syntheseautomaten und anschließende Umsetzung mit einem Reagenz zur Thioatbildung hergestellt werden.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Reagenzes zur Thioatbildung, sofern es zur Bildung einer Thioatgruppe durch Umsetzung mit dreiwertigem Phosphor imstande ist. Beispiele für bevorzugte Reagenzien zur Thioatbildung umfassen zusätzlich zu Schwefel Tetraethylthiuramdisulfid (TETD) (ein Produkt von Applied Biosystems Inc.) und Beaucage-Reagenz (ein Produkt von MilliGen/Biosearch). Die gewünschte Verbindung (4-7), in der das 3'-Endnucleosid der effektiven Basensequenz an CPG über eine Thioatgruppe trägergebunden ist, kann durch Behandlung mit Tetraethylthiuramdisulfid (TETD) gemäß dem in Tetrahedron letters, 32, 3005 (1991) angegebenen Verfahren oder mit Beaucage- Reagenz gemäß dem in J. Am. Chem. Soc., 112, 1253 (1990) angegebenen Verfahren oder einem modifizierten Verfahren hergestellt werden.
  • In Stufe 32 kann das CPG-gebundene Nucleosid (7-7) mit einer Phosphorsäuretriester- oder Thioatgruppe durch Umsetzung einer Verbindung (7-3) mit einem Phosphoramidit-Reagenz, gefolgt von einer Behandlung auf herkömmliche Weise oder mit einem Mittel zur Thioatbildung, hergestellt werden.
    • Stufe 15
  • In dieser Stufe kann eine CPG-gebundene Verbindung (5-3) mit einer Phosphonsäurediestergruppe durch Umsetzung einer CPG-gebundenen Verbindung (5-1), die von der DMT-Gruppe befreit wurde und die in Analogie zu der Herstellung der CPG-gebundenen Verbindung (4-6) erhalten wurde, mit einer im Handel erhältlichen Phosphonsäuremonoesterverbindung (5-2) in Gegenwart eines Kondensationsmittels und eines Säure auffangenden Mittels hergestellt werden. Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Kondensationsmittels, sofern es ein Säureanhydrid mit einem Phosphonsäuremonoester bilden kann. Beispiele für bevorzugte Kondensationsmittel umfassen: Adamantan-1-carbonylchlorid und Pivaloylchlorid. Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Mittels zum Auffangen von Säure, sofern es als Mittel zum Auffangen von Säure verwendet werden kann, wenn eine Acylierung unter Verwendung eines Säurechlorids durchgeführt wird. Beispiele für bevorzugte, Säure auffangende Mittel umfassen allgemein aromatische Amine, wie Pyridin. Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt. Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel umfassen Nitrile, wie wasserfreies Acetonitril. Wenn die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt wird, dann ist sie in einer Zeitspanne von 5 bis 60 Minuten abgeschlossen.
    • Stufe 16
  • In dieser Stufe wird die Phosphonsäurediestergruppe einer CPG-gebundenen Verbindung (5-3) in eine Phosphoramidatgruppe durch Umsetzung mit einem Alkylamin und Kohlenstofftetrachlorid umgewandelt. Unter Alkylamin sind die gewünschten Alkylamine zu verstehen. Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt. Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel umfassen normale unpolare Lösungsmittel, wie Kohlenstofftetrachlorid. Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders kritisch, und die Reaktion wird normalerweise bei einer Temperatur von -50 bis 100ºC durchgeführt. Wenn die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt wird, dann ist sie in einer Zeitspanne von 1 bis 10 Stunden abgeschlossen.
    • Stufen 19 und 36
  • In diesen Stufen können die 3'-Phosphorsäurederivate (6-3) und (8) durch Umsetzung von Verbindungen (6-2) und (2) mit Chlorphosphoramidit (6-3'), das als Phosphitylierungsmittel verwendet wird, in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels und eines Säure auffangenden Mittels hergestellt werden. Das bei der Definition der Verbindung (6-3') verwendete Symbol U bezeichnet eine Dialkylaminogruppe, wie eine Diethylamino- oder Diisopropylaminogruppe, oder eine heterocyclische Gruppe mit 1 oder 2 Sauerstoff- und/oder Stickstoffatomen im Ring. Das bei der Definition der Verbindung (6-3') verwendete Symbol V kann eine beliebige Gruppe bedeuten, sofern sie nach der Bildung einer Phosphatbindung entfernt werden kann. Beispiele für derartige Gruppen umfassen vorzugsweise niedere Alkoxygruppen, wie eine Methoxygruppe, und Cyanoalkyloxygruppen, wie eine Cyanoethyloxygruppe. Unter der Verbindung (6-3') sind insbesondere Phosphine, wie Chlormorpholinomethoxyphosphin, Chlormorpholinocyanoethoxyphosphin, Chlordimethylaminomethoxyphosphin, Chlordimethylaminocyanoethoxyphosphin, Chlordiisopropylaminomethoxyphosphin und Chlordiisopropylaminocyanoethoxyphosphin, und vorzugsweise Chlormorpholinomethoxyphosphin, Chlormorpholinocyanoethoxyphosphin, Chlordiisopropylaminomethoxyphosphin und Chlordiisopropylaminocyanoethoxyphosphin zu verstehen.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt. Bevorzugte Lösungsmittel sind Ether, wie Tetrahydrofuran, Diethylether oder Dioxan. Beispiele für Säure auffangende Mittel umfassen: heterocyclische Amine, wie Pyridin oder Dimethylaminopyridin, und aliphatische Amine, wie Trimethylamin, Triethylamin oder Diisopropylethylamin, und vorzugsweise aliphatische Amine (insbesondere Diisopropylethylamin).
  • Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders kritisch; die Reaktion wird jedoch normalerweise bei einer Temperatur von -50 bis 50ºC und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt.
  • Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert abhängig von der Beschaffenheit der Ausgangsverbindung und des Reagenzes sowie der Reaktionstemperatur; normalerweise ist die Reaktion jedoch in einer Zeitspanne von 5 Minuten bis 30 Stunden abgeschlossen. Wenn die Reaktion vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt wird, dann ist sie in einer Zeitspanne von 30 Minuten abgeschlossen.
  • Die gewünschte Verbindung kann aus dem Reaktionsgemisch z.B. durch Neutralisation des Gemisches oder Abfiltrieren gegebenenfalls vorhandener unlöslicher Materialien, Zugabe von Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Ethylacetat, Abtrennen der organischen Schicht, die die gewünschte Verbindung enthält, Waschen des Extrakts mit Wasser, Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat oder dergleichen und schließlich Abdestillieren des Lösungsmittels gewonnen werden.
  • Die auf diese Weise erhaltene gewünschte Verbindung kann, falls es erforderlich ist, weiter nach herkömmlichen Verfahren gereinigt werden, und sie kann gegebenenfalls weiter nach herkömmlichen Verfahren, z.B. durch Umkristallisieren, erneutes Fällen, Chromatographie oder dergleichen, gereinigt werden.
    • Stufe 24
  • In dieser Stufe kann eine CPG-gebundene Verbindung (6-8) mit einer Phosphorsäuretriestergruppe in Analogie zu dem in Stufe 7 beschriebenen Verfahren hergestellt werden, wobei jedoch die Verbindung (6-3) anstelle einer Nucleosidphosphoramiditverbindung als Nucleotideinheit in einem DNA-Syntheseautomaten verwendet wird.
    • Stufen 27 und 29
  • In diesen Stufen können CPG-gebundene Verbindungen (6-10 und 6-11) mit 2 oder 3 Phosphorsäuretriestergruppen aus einer CPG-gebundenen Verbindung (6-9), die in Stufe 25 hergestellt wurde, durch Behandlung in Analogie zu dem in Stufe 24 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
    • Stufe 31
  • In dieser Stufe kann eine CPG-gebundene Verbindung (1-3) mit einer 4,4'-Dimethoxytrityloxyethylsulfonylethoxygruppe durch Behandlung einer im Handel erhältlichen CPG-gebundenen Verbindung (7-2), die von der 5'- DMT-Gruppe befreit wurde, mit (2-Cyanoethoxy)-2-[2'-O-(4,4-Dimethoxytrityloxyethylsulfonyl]ethoxy-N,N-diisopropylaminophosphin (7-1) [T. Horn et. al., Tetrahedron Letters, 27, 4105 (1986)] in Analogie zu dem in Stufe 24 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
    • Stufe 34
  • In dieser Stufe kann eine CPG-gebundene Verbindung (7-5) durch Entfernen der DNT-Schutzgruppe von der CPG-gebundenen Verbindung (7-3), die in Stufe 31 hergestellt wurde, und anschließende Kondensation mit einem Nucleotid (7-4) mit einer DMT-Gruppe an der 5'-Position und einer Alkylphosphat-, Phenylphosphat-, Alkylphosphonat- oder Phenylphosphonatgruppe an der 3'-Position unter Verwendung eines Kondensationsmittels hergestellt werden.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt. Bevorzugte Lösungsmittel sind aromatische Amine, wie Pyridin. Als Kondensationsmittel kommen Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Mesitylensulfonylchlorid (Ms-Cl), Triisopropylbenzolsulfonylchlorid, Mesitylensulfonyltriazol (MST), Mesitylensulfonyl-3-nitrotriazol (MSNT), Triisopropylbenzolsulfonyltetrazol (TPS-Te), Triisopropylbenzolsulfonylnitrolmidazol (TPS-NI) und Triisopropylbenzolsulfonylpyridyltetrazol in Frage; bevorzugt sind MSN, TPS-Te und TPS-NI.
  • Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders kritisch; die Reaktion wird jedoch bei einer Temperatur von -10 bis 100ºC durchgeführt. Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert abhängig von der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels und der Reaktionstemperatur. Wenn die Reaktion bei Raumtemperatur unter Verwendung von Pyridin als Lösungsmittel durchgeführt wird, dann ist sie in einer Zeitspanne von 30 Minuten abgeschlossen.
    • Stufe 31
  • In dieser Stufe kann das Endprodukt (1) durch Kondensation der Verbindung (8), die in Stufe 36 hergestellt wurde, mit einem CPG-gebundenen ODN (3, 4a, 4b, 5, 6a bis 6d, 7a oder 7b), das in einem DNA-Syntheseautomaten hergestellt und bei dem nur die 5'-terminale DMT-Schutzgruppe entfernt wurde, unter Verwendung eines sauren Katalysators zur Bildung eines Phosphittriesters, Oxidation unter Verwendung eines geeigneten Oxidationsmittels zur Herstellung eines Phosphorsäuretriesters, Abspaltung von CPG, Entfernung der Schutzgruppen und schließlich Reinigung hergestellt werden.
  • Als saurer Katalysator, der bei der Kondensationsreaktion verwendet wird, kommen saure Substanzen, wie Tetrazole, in Betracht. Bevorzugt ist Tetrazol.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Oxidationsmittels, sofern es als Oxidationsmittel bei Oxidationsreaktionen verwendet werden kann. Beispiele für bevorzugte Oxidationsmittel umfassen: anorganische Metalloxide einschließlich Manganoxide, wie Kaliumpermanganat oder Mangandioxid; Rutheniumoxide, wie Rutheniumtetraoxid; Selenoxide, wie Selendioxid; Eisenverbindungen, wie Eisen(III)-chlorid; Osmiumverbindungen, wie Osmiumtetraoxid; Silberverbindungen, wie Silberoxid; Quecksilberverbindungen, wie Quecksilberacetat; Bleioxidverbindungen, wie Bleioxid oder Bleitetraoxid; Chromsäureverbindungen, wie Kaliumchromat, ein Komplex aus Chromsäure und Schwefelsäure oder ein Komplex aus Chromsäure und Pyridin; und Cerverbindungen, wie Cerammoniumnitrat (CAN); anorganische Oxidationsmittel einschließlich Halogenmoleküle, wie Chlor-, Brom- oder Iodmoleküle; Periodate, wie Natriumperiodat; Ozon; Wasserstoffperoxid; Stickstoffverbindungen, wie salpetrige Säure; Chlorverbindungen, wie Natriumchlorit; Persulfatverbindungen, wie Kaliumpersulfat oder Natriumpersulfat; und organische Oxidationsmittel unter Einschluß von Reagenzien, die bei der DMSO-Oxidation verwendet werden (eine Kombination aus Dimethylsulfoxid und Dicyclohexylcarbodiimid, Oxalylchlorid, Essigsäureanhydrid oder Phosphorpentachlorid oder ein Komplex aus Pyridin und Schwefelsäureanhydrid); Peroxide, wie tert. Butylhydroperoxid; stabile Kationen, wie das Triphenylmethylkation; Succinimide, wie N-Bromsuccinimid; Hypochlorsäureverbindungen, wie tert.- Butylhypochlorit; Azodicarbonsäureverbindungen, wie Azodicarboxylat; eine Kombination aus Disulfiden, wie Dimethyldisulfid, Diphenyldisulfid oder Dipyridyldisulfid und Triphenylphosphin; Nitrite, wie Methylnitrit; tetrahalogenierte Verbindungen, wie Tetrabrommethan; und Chinonverbindungen, wie 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-p-benzochinon (DDQ); stärker bevorzugt ist Iod.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt und zum Lösen der Ausgangsmaterialien in einem gewissen Ausmaß imstande ist. Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel umfassen: aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol oder Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan oder Chloroform; Ether, wie Ether, Tetrahydrofuran, Dioxan oder Dimethoxyethan; Amide, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid; Alkohole, wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol oder Isoamylalkohol; verdünnte Säuren, wie wäßrige Schwefelsäure; verdünnte Basen, wie eine wäßrige Lösung von Natriumhydroxid; Wasser; Ketone, wie Aceton oder Methylethylketon; heterocyclische Amine, wie Pyridin; Nitrile, wie Acetonitril; bevorzugt sind heterocyclische Amine (insbesondere Pyridin), Nitrile (insbesondere Acetonitril), Ether (insbesondere Tetrahydrofuran) und halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere Dichlormethan).
  • Die Reaktion wird bei einer Temperatur von -50 bis 100ºC durchgeführt. Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert hauptsächlich abhängig von der Reaktionstemperatur und der Beschaffenheit der Ausgangsverbindung in einer Zeitspanne von 30 Minuten bis 15 Stunden. Die vorstehend beschriebene Oxidationsreaktion wird durch Zugabe eines Phasentransferkatalysators, wie Triethylbenzylammoniumchlorid oder Tributylbenzylammoniumbromid, beschleunigt.
    • Stufe 38
  • In dieser Stufe kann ein Zwischenprodukt, nämlich ein Mononucleotid (9), durch Umsetzung einer Verbindung (2) mit einem Phosphorylierungsmittel, z.B. Bistriazolid, in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels und Zugabe von Wasser, gefolgt von einer Aufarbeitung, hergestellt werden.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt. Das Lösungsmittel wird normalerweise unter aromatischen Aminen, wie Pyridin, gewählt. Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit von V, das bei der Definition des Phosphorylierungsmittels verwendet wird, sofern es unter den Bedingungen der Entfernung einer Schutzgruppe der Basengruppe nach Abschluß der Kondensationsreaktion in Stufe 39 entfernt werden kann. V bezeichnet üblicherweise eine o-Chlorphenoxygruppe.
  • Die Reaktionstemperatur ist zwar nicht besonders kritisch; die Reaktion wird jedoch bei einer Temperatur von -20 bis 100ºC und üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt. Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert abhängig von der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels und der Reaktionstemperatur. Wenn die Reaktion bei Raumtemperatur unter Verwendung von Pyridin als Lösungsmittel durchgeführt wird, dann ist sie Innerhalb einer Zeitspanne von einer Stunde abgeschlossen.
    • Stufe 39
  • In dieser Stufe kann das Endprodukt (1) durch Kondensation eines Mononucleotids (9) mit einem CPG-gebundenen ODN (3, 4a, 4b, 5, 6a bis 6d, 7a oder 7b) mit Schutzgruppen an der Base und den Phosphorsäuregruppen, das in einem DNA-Syntheseautomaten hergestellt und dessen 5'-terminale DMT-Gruppe entfernt wurde, hergestellt werden, und zwar durch Verwendung eines Kondensationsmittels zur Bildung einer Phosphorsäuretriestergruppe, Abspaltung vom CPG nach herkömmlichen Verfahren, Entfernen der Schutzgruppen und schließlich Reinigen. Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt.
  • Beispiele für Kondensationsmittel umfassen: Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Mesitylensulfonylchlorid (Ms-Cl), Triisopropylbenzolsulfonylchlorid, Mesitylensulfonyltriazol (MST), Mesitylensulfonyl-3-nitrotriazol (MSNT), Triisopropylbenzolsulfonyltetrazol (TPS-Te), Triisopropylbenzolsulfonylnitrolmidazol (TPS-NI) und Triisopropylbenzolsulfonylpyridyltetrazol; bevorzugt werden MSNT, TPS-Te und TPS-NI.
  • Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders kritisch; die Reaktion wird jedoch bei einer Temperatur von -10 bis 100ºC und üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt. Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert zwar abhängig von der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels und der Reaktionstemperatur; wenn die Reaktion bei Raumtemperatur unter Verwendung von Pyridin als Lösungsmittel durchgeführt wird, dann ist sie doch in einer Zeitspanne von 30 Minuten abgeschlossen.
  • Die Abspaltung des ODN vom CPG-gebundenen ODN und die Entfernung der Schutzgruppen mit Ausnahme des 5'-terminalen Substituenten werden gemäß Verfahren, die als solche bekannt sind, durchgeführt [J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 (1981)]. Das Reaktionsgemisch, das die Verbindungen der allgemeinen Formel (1) enthält, wird nach herkömmlichen Reinigungstechniken, z.B. verschiedenen chromatographischen Techniken unter Einschluß der Umkehrphasen- und der Ionenaustausch-Chromatographie (was die Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie umfaßt), unter Bildung der Verbindungen mit der allgemeinen Formel (1) gereinigt.
    • Stufe 40
  • In dieser Stufe wird Tris(1,2,4-triazolyl)phosphit, das zuvor aus Phosphortrichlorid und 1,2,4-Triazol nach dem Verfahren hergestellt wird, über das B. C. Freohler, P. G. Ng und M. D. Matteucci in Nucleic Acids Res., 14, 5399 (1986) berichten, mit einer Verbindung (2) in einem inerten Lösungsmittel umgesetzt, und die Reaktion wird durch Zugabe von Wasser beendet, gefolgt von einer Aufarbeitung zur Herstellung eines Nucleosid-3'-H-phosphonats (10). Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist ein halogenierter Kohlenwasserstoff, wie Dichlormethan. Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders kritisch; die Reaktion wird jedoch bei einer Temperatur von -20 bis 100ºC und üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt.
  • Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert abhängig von der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels und der Reaktionstemperatur. Wenn die Reaktion bei Raumtemperatur unter Verwendung von Dichlormethan als Lösungsmittel durchgeführt wird, dann ist sie in einer Zeitspanne von 30 Minuten abgeschlossen.
    • Stufe 41
  • In dieser Stufe kann das Endprodukt (1) durch Umsetzung des Nucleosid-3'-H-phosphonats (10), das in Stufe 40 hergestellt wurde, mit einem CPG-gebundenen ODN (3, 4a, 4b, 5, 6a bis 6d, 7a oder 7b) mit Schutzgruppen an den Base- und Phosphorsäuregruppen, das in einem Syntheseautomaten synthetisiert und bei dem nur die 5'-terminale DMT-Schutzgruppe entfernt wurde, hergestellt werden, und zwar durch Verwendung eines Kondensationsmittels, wie Pivaloylchlorid, in Gegenwart eines Säure auffangenden Mittels unter Bildung einer H-Phosphonsäurediesterbindung, Umwandlung der H- Phosphonsäuregruppe in eine Phosphorsäurediestergruppe unter Verwendung eines Oxidationsmittels, Abspalten des ODN vom CPG-gebundenen ODN und gleichzeitige Entfernung der Schutzgruppe der Basengruppe unter basischen Bedingungen und schließlich Reinigen. Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des verwendeten Lösungsmittels, sofern es keine ungünstige Wirkung auf die Reaktion ausübt. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist wasserfreies Acetonitril. Beispiele für Kondensationsmittel umfassen Säurechloride und Phosphor(V)-chlorid; bevorzugt ist Pivaloylchlorid.
  • Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Beschaffenheit des für die Oxidation der H-Phosphonsäuregruppe des ODN zur Phosphorsäurediestergruppe verwendeten Oxidationsmittel, sofern es als Oxidationsmittel bei Oxidationsreaktionen verwendet werden kann. Beispiele für geeignete Oxidationsmittel umfassen: anorganische Metalloxide einschließlich Manganoxide, wie Kaliumpermanganat und Mangandioxid; Rutheniumoxide, wie Rutheniumtetraoxid; Selenoxide, wie Selendioxid; Eisenverbindungen, wie Eisen(III)-chlorid; Osmiumverbindungen, wie Osmiumtetraoxid; Silberverbindungen, wie Silberoxid; Quecksilberverbindungen, wie Quecksilberacetat; Bleioxidverbindungen, wie Bleioxid oder Bleitetraoxid; Chromsäureverbindungen, wie Kaliumchromat, ein Komplex aus Chromsäure und Schwefelsäure oder ein Komplex aus Chromsäure und Pyridin; und Cerverbindungeil, wie Cerammoniumnitrat (CAN); anorganische Oxidationsmittel einschließlich Halogenmoleküle, wie Chlor-, Brom- oder Iodmoleküle; Periodate, wie Natriumperiodat; Ozon; Wasserstoffperoxid; Stickstoffverbindurigen, wie salpetrige Säure; Chlorverbindungen, wie Natriumchlorit; und Persulfatverbindungen, wie Kaliumpersulfat oder Natriumpersulfat; und organische Oxidationsmittel unter Einschluß von Reagenzien, die bei der DMSO-Oxidation verwendet werden (eine Kombination aus Dimethylsulfoxid und Dicyclohexylcarbodiimid, Oxalylchlorid, Essigsäureanhydrid oder Phosphorpentachlorid oder ein Komplex aus Pyridin und Schwefelsäureanhydrid); Peroxide, wie tert.-Butylhydroperoxid; stabile Kationen, wie das Triphenylmethylkation; Succinimide, wie N-Bromsuccinimid; Hypochlorsäureverbindungen, wie tert.-Butylhypochlorit; Azodicarbonsäureverbindungen, wie Azodicarboxylat; eine Kombination von Disulfiden, wie Dimethyldisulfid, Diphenyldisulfid oder Dipyridyldisulfid, und Triphenylphosphin; Nitrite, wie Methylnitrit; tetrahalogenierte Verbindungen, wie Tetrabrommethan; und Chinonverbindungen, wie 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-p-benzochinon (DDQ); stärker bevorzugt ist Iod.
  • Als das Säure auffangende Mittel kommen heterocyclische Amine, wie Pyridin oder Dimethylaminopyridin, und aliphatische Amine, wie Trimethylamin, Triethylamin oder Diisopropylethylamin, in Betracht; bevorzugt sind aliphatische Amine (insbesondere Diisopropylethylamin). Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders kritisch; die Reaktion wird jedoch normalerweise bei einer Temperatur von -50 bis 50ºC und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt.
  • Die für die Reaktion erforderliche Zeit variiert abhängig von der Beschaffenheit der Ausgangsverbindung und des verwendeten Lösungsmittels sowie der Reaktionstemperatur; normalerweise ist die Reaktion jedoch in einer Zeitspanne von 5 Minuten bis 30 Stunden abgeschlossen. Wenn die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt wird, dann ist sie vorzugsweise in einer Zeitspanne von 30 Minuten abgeschlossen.
  • Die Abspaltung des ODN vom CPG-gebundenen ODN und die Entfernung der Schutzgruppen mit Ausnahme des 5'-terminalen Substituenten werden nach Verfahren durchgeführt, die als solche bekannt sind [J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 (1981)].
  • Das Reaktionsgemisch, das die Verbindungen der allgemeinen Formel (1) enthält, wird nach herkömmlichen Relnigungstechniken, z.B. verschiedenen chromatographischen Techniken unter Einschluß der Umkehrphasen- und der Ionenaustauschchromatographie (was die Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie umfaßt) unter Bildung der Verbindungen der allgemeinen Formel (1) gereinigt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein neues Verfahren für die Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden und Oligodesoxyribonucleotidderivaten bereit. Die neuen Oligodesoxyribonucleotide der Formel (11), die nach dem neuen Verfahren hergestellt werden, umfassen typischerweise die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel (1). Ferner stellt die vorhegende Erfindung zur Verwendung bei dem neuen Verfahren neue Zwischenprodukte bereit, die nachstehend genauer definiert werden.
  • In der folgenden Beschreibung ist ein anderer Satz von Definitionen für die Substituentengruppen gewählt; die Übereinstimmung zwischen den entsprechenden Definitionen ist jedoch ohne weiteres ersichtlich. So ist z.B. die Ähnlichkeit zwischen der Substituentengruppe R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z- für die Verbindungen der allgemeinen Formel (1) und der Substituentengruppe R&sup4;R&sup5;R&sup6;Z-, die für die eingesetzten und nach dem neuen Verfahren hergestellten Verbindungen angegeben wird, ersichtlich. Darüberhinaus ist es erforderlich, zu erkennen, daß Gruppen, die mit tiefgestellten Indizes angegeben sind, wie R&sub1;, R&sub2;, Y&sub1;, usw., nicht immer identisch mit Gruppen sind, die mit hochgestellten Indizes angegeben sind, wie R¹, R², Y¹, usw.
  • Gemäß diesem Aspekt der Erfindung beinhaltet das erfindungsgemäß bereitgestellte Verfahren die Herstellung eines Oligodesoxyribonucleotids mit einem substituierten Phosphat am 3'-Ende. Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung neue Linkerverbindungen für die Verwendung mit Polymerträgern bei der Herstellung von Festphasenmaterialien für die Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden bereit. Die Festphasenmaterialien können eine geschützte Hydroxygruppe am Ende des Linkers zum Polymerträgen aufweisen, wobei dann die Schutzgruppe entfernt und die Umsetzung unter Addition von Nucleotiden erfolgen kann.
  • So stellt die vorliegende Erfindung z.B. Linkerverbindungen, wie die folgenden Verbindungen (12), bereit, mit denen Polymerträger geschützte Festphasenmaterialien (14) ergeben können, von denen die Schutzgruppen unter Bildung der Verbindungen (22) entfernt werden können und die anschließend zu den Verbindungen (24), (25) und (27) mit addierten Nucleotiden reagieren können.
  • Gemäß einem Aspekt dient das vorliegende Verfahren der Herstellung einer Verbindung, die durch die allgemeine Formel (11) dargestellt wird:
  • [worin R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und eine Gruppe Z (worin R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; gleich oder verschieden voneinander sein können und jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine wahlweise substituierte Arylgruppe oder eine wahlweise substituierte Anthrachinonylgruppe darstellen; Z ein Kohlenstoff- oder Siliciumatom darstellt; R&sup5;, R&sup6; und Z zusammen eine Fluorenylgruppe oder eine Xanthenylgruppe darstellen können; oder R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und Z zusammen ein Wasserstoffatom darstellen können); R&sup7; ein Wasserstoffatom, eine wahlweise substituierte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine wahlweise substituierte Arylgruppe oder wahlweise substituierte Aralkylgruppe darstellt; Y² gleich oder verschieden sein kann und ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder eine NH- Gruppe darstellt; Y³ ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, eine NH-Gruppe, eine Alkylengruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylengruppe darstellt; X³ ein Sauerstoff- oder Schwefelatom darstellt; und D ein Oligodesoxyribonucleotid mit einer Kettenlänge von 2 bis 30 darstellt, mit der Maßgabe, daß die Hydroxygruppen am 5'- und 3'-Ende nicht in D eingeschlossen sind];
  • wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
  • Umsetzung einer Verbindung, die durch die Formel (12) dargestellt wird:
  • [worin R¹, R² und R³ gleich oder verschieden voneinander sein können und jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen; X¹ eine Gruppe -S-, -SO- oder -SO&sub2; darstellt; A eine Gruppe -(CH&sub2;)h- (worin h eine ganze Zahl von 1 bis 16 ist), eine Gruppe -(CH&sub2;)hO- (worin h eine ganze Zahl von 1 bis 16 ist), eine Gruppe -(CH&sub2;)j-O-CO-(CH&sub2;)k- (worin j eine positive ganze Zahl ist, k den Wert 0 hat oder eine positive ganze Zahl ist und j + k den Wert 2 bis 16 hat) oder eine Gruppe -(CH&sub2;)j-NH-CO-(CH&sub2;)k- (worin j eine positive ganze Zahl ist, k den Wert 0 hat oder eine positive ganze Zahl ist und j + k den Wert 2 bis 16 hat), eine Gruppe -(CH&sub2;)j-S-CO-(CH&sub2;)k- (worin j eine positive ganze Zahl ist, k den Wert 0 hat oder eine positive ganze Zahl ist und j + k den Wert 2 bis 16 hat) oder eine Gruppe (CH&sub2;)n-O-CO-CH&sub2;(OCH&sub2;CH&sub2;)p-OCH&sub2;- (worin n eine positive ganze Zahl ist, p den Wert 0 hat oder eine positive ganze Zahl ist und j + k den Wert 2 bis 100 hat) darstellt; und Y¹ eine Hydroxygruppe, eine wahlweise substituterte Phenyloxygruppe oder eine Ethyloxygruppe, die mit einem Halogen substituiert sein kann, darstellt; mit der Maßgabe, daß j verschieden von der ganzen Zahl 2 ist, wenn A eine Gruppe der Formel -(CH&sub2;)j-O-CO-(CH&sub2;)k- darstellt]
  • mit einem polymeren Material, das durch die allgemeine Formel (13) dargestellt wird:
  • [worin X² ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder eine NH-Gruppe darstellt; und P ein polymeres Material darstellt]
  • (mit der Maßgabe, daß in dem Fall, daß Y¹ in der allgemeinen Formel (12) eine Hydroxygruppe ist, die Verbindung der allgemeinen Formel (12) mit einem Carbonsäure-Aktivierungsmittel vor der Umsetzung mit dem polymeren Matertal (13) umgesetzt wird), unter Bildung eines polymeren Materials, das durch die allgemeine Formel (14) dargestellt wird:
  • [worin R¹, R², R³, X¹, A, X² und P die gleiche Bedeutung haben, wie sie vorstehend definiert wurde]; und
  • Unterwerfen des resultierenden polymeren Materials der Formel (14) einer DNA-Kettenverlängerungsbehandlung unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten.
  • Dieses erfindungsgemäße Verfahren wird in den folgenden Flußdiagrammen gezeigt. Stufe Stufe Stufe
  • In den vorstehenden Flußdiagrammen haben R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R&sup7;, X¹, X², X³, P, Y¹, Y², Y³, A und Z die gleichen Bedeutungen, wie sie vorstehend definiert wurden (in den Verbindungen, die von Verbindung (11) verschieden sind, stellen R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und Z zusammen jedoch kein Wasserstoffatom dar). R8a stellt eine Methylgruppe oder eine Cyanoethylgruppe dar; R8b stellt eine Phenylgruppe, die wahlweise mit einer Chlorgruppe substituiert ist, dar; R&sup8; stellt eine Methylgruppe, eine Cyanoethylgruppe oder eine Phenylgruppe, die wahlweise mit einer Chlorgruppe substituiert ist, dar; R9a stellt ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxygruppe mit einer Schutzgruppe dar; X stellt ein Halogenatom (vorzugsweise Chlor, Brom und Iod) dar; A¹ stellt eine Alkylengruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen dar; m ist eine ganze Zahl von 1 bis 14; n ist eine ganze Zahl von 1 bis 28; B, B' und B" stellen jeweils die Basengruppe eines Adeninnucleotids, eines Guaninnucleotids, eines Thyminnucleotids, eines Uracilnucleotids oder eines Cytosinnucleotids dar, das jeweils an den Basen- und Phosphatgruppen geschützt ist (die Nucleotide sollten so gewählt sein, daß sie eine gewünschte Basensequenz ergeben); mit der Maßgabe, daß B' die Basengruppe des 3'-terminalen Nucleotids von 0 mit der gewünschten Basensequenz darstellt und B" die Basengruppe des 5'-terminalen Nucleotids von D mit der gewünschten Basensequenz darstellt; D stellt das gewünschte Oligodesoxyribonucleotid dar (mit der Maßgabe, daß die 5'-terminale Hydroxygruppe und die 3'-terminale Hydroxygruppe nicht eingeschlossen sind); Q stellt eine Halogenalkylgruppe, eine Halogenphenylgruppe oder eine Nitrophenylgruppe, wie eine 2,2,2-Trichlorethylgruppe, 2,2- Dichlorethylgruppe, 2-Chlorethylgruppe, 2,2,2-Tribromethylgruppe, 2,2- Dibromethylgruppe, 2-Bromethylgruppe, 2-Nitrophenylgruppe, 4-Nitrophenylgruppe, 2,4-Dinitrophenylgruppe, 2,4,5-Trichlorphenylgruppe oder 2,3,4,5,6-Pentachlorphenylgruppe (und vorzugsweise eine Trichlorethylgruppe oder eine o-Nitrophenylgruppe) dar; V stellt eine niedere Alkylgruppe (vorzugsweise eine Methyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppe und insbesondere eine Isopropylgruppe) dar.
  • Als nächstes wird jede Stufe ausführlich beschrieben.
    • Stufe 1
  • Diese Stufe dient der Herstellung einer Verbindung (11) durch Umsetzung von 2-Mercaptoethanol (16) mit einer omega-Halogencarbonsäure (15) in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines Säurebindungsmittels.
  • Das einsetzbare Lösungsmittel ist nicht besonders beschränkt, sofern es die Reaktion nicht beeinträchtigt, und es umfaßt aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid und Chloroform; Ether, wie Ether, Tetrahydrofuran, Dioxan und Dimethoxyethan; Amide, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid und Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid; Alkohole, wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol und Isoamylalkohol; verdünnte Säuren, wie wäßrige Schwefelsäure; verdünnte Basen, wie wäßriges Natriumhydroxid; Wasser; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon; heterocyclische Amine, wie Pyridin; und Nitrile, wie Acetonitril; bevorzugt sind Ketone, wie Aceton, und Alkohole, wie Ethanol und Propanol.
  • Das einsetzbare Säurebindungsmittel umfaßt Alkalimetallcarbonate, wie Kaliumcarbonat und Natriumcarbonat; Alkalimetallhydrogencarbonate, wie Natriumhydrogencarbonat; Alkalimetallhydroxide, wie Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid; und organische Amine, wie Triethylamin; bevorzugt werden Alkalimetalicarbonate (insbesondere Kaliumcarbonat).
  • Reaktionstemperatur und Reaktionszeit variieren abhängig vom Lösungsmittel, vom eingesetzten Säurebindungsmittel usw.; die Reaktion wird unter Rückfluß bei Erwärmen für 8 Stunden durchgeführt, wenn Kaliumcarbonat verwendet wird.
  • Nach Abschluß der Reaktion wird die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch nach herkömmlichem Verfahren isoliert.
  • Z.B. wird das Reaktionsgemisch in geeigneter Weise neutralisiert und unlösliche Materialien, sofern solche vorhanden sind, werden durch Filtration entfernt. Ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel, wie Ethylacetat, wird zum Reaktionsgemisch gegeben. Nachdem das resultierende Gemisch mit Wasser gewaschen worden ist, wird die organische Schicht, die die gewünschte Verbindung enthält, abgetrennt und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Anschließend wird das Lösungsmittel verdampft, wobei man die gewünschte Verbindung erhält.
  • Die auf diese Weise erhaltene gewünschte Verbindung kann ferner nach herkömmlichen Verfahren, z.B. durch Umkristallisieren, erneutes Fällen, Chromatographie und dergleichen, gereinigt werden, falls dies erforderlich ist.
    • Stufe 2
  • Diese Stufe dient der Herstellung einer Verbindung (18), die der Verbindung (17) entspricht, deren Hydroxygruppe geschützt ist, durch Umsetzung der Verbindung (17) mit einem schützenden Reagenz, das unter sauren Bedingungen in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines Säurebindungsmittels entfernt werden kann (vorzugsweise Dimethoxytritylchlorid).
  • Das einsetzbare Lösungsmittel ist nicht besonders beschränkt, solange es die Reaktion nicht beeinträchtigt und die Ausgangsmaterialien bis zu einem gewissen Grad lösen kann; es umfaßt aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid und Chloroform; Ether, wie Ether, Tetrahydrofuran, Dioxan und Dimethoxyethan; Amide, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid und Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon; heterocyclische Amine, wie Pyridin; und Nitrile, wie Acetonitril; bevorzugt werden heterocyclische Amine (insbesondere Pyridin).
  • Das einsetzbare schützende Reagenz umfaßt Tritylhalogenide, wie Tritylchlorid, Monomethoxytritylchlorid, Dimethoxytritylchlorid und Trimethoxytritylchlorid; bevorzugt ist Dimethoxytritylchlorid.
  • Das einsetzbare Säurebindungsmittel ist nicht besonders beschränkt, sofern es die Reaktion nicht beeinträchtigt und das Produkt und die Ausgangsmaterialien nicht zersetzt, und vorzugsweise umfaßt es aromatische Amine, wie Pyridin und Dimethylaminopyridin.
  • Die Reaktionstemperatur und die Reaktionszeit variieren zwar abhängig von der Art des schützenden Reagenzes und des eingesetzten Säurebindungsmittels; die Reaktion wird jedoch bei Raumtemperatur für 2 Stunden durchgeführt, wenn Dimethoxytritylchlorid als schützendes Reagenz und Pyridin als Lösungsmittel und auch als Säurebindungsmittel verwendet werden.
  • Nach Abschluß der Reaktion wird die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch nach herkömmlichen Verfahren isoliert.
  • Z.B. wird nach geeigneter Neutralisierung des Reaktionsgemisches und Entfernung gegebenenfalls vorhandener unlöslicher Materialien durch Filtration ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel, wie Ethylacetat, zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Nach Waschen des resultierenden Gemisches mit Wasser wird die organische Schicht, die die gewünschte Verbindung enthält, abgetrennt und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Anschließend wird das Lösungsmittel verdampft, wobei man die gewünschte Verbindung erhält.
  • Die auf diese Weise erhaltene gewünschte Verbindung kann weiter nach herkömmlichen Verfahren, wie durch Umkristallisleren, erneutes Fällen, Chromatographie und dergleichen, gereinigt werden, falls dies erforderlich ist.
    • Stufe 3
  • Diese Stufe dient der Herstellung der Verbindung (18) durch Umsetzung einer Verbindung (19) mit einem Dicarbonsäureanhydrid (20) in einem inerten Lösungsmittel.
  • Das einsetzbare Lösungsmittel ist nicht besonders beschränkt, sofern es die Reaktion nicht beeinträchtigt und die Ausgangsmaterialien bis zu einem gewissen Grad lösen kann, und es umfaßt aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid und Chloroform; Ether, wie Ether, Tetrahydrofuran, Dioxan und Dimethoxyethan; Amide, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid und Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon; heterocyclische Amine, wie Pyridin; und Nitrile, wie Acetonitril; bevorzugt sind halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid.
  • Das einsetzbare Säurebindungsmittel umfaßt Pyridine, wie Pyridin, Dimethylaminopyridin und 4-Pyrrolidinopyridin; bevorzugt ist Dimethylaminopyridin.
  • Das einsetzbare Dicarbonsäureanhydrid ist zwar nicht besonders beschränkt, sofern es sich um ein Anhydrid einer α,omega-Alkyldicarbonsäure mit 3 his 16 Kohlenstoffatomen handelt; bevorzugt ist jedoch Bernsteinsäureanhydrid.
  • Die Reaktionstemperatur und die Reaktionszeit variieren abhängig von der Art des Säureanhydrids, des eingesetzten Säurebindungsmittels usw.; Die Reaktion wird jedoch bei Raumtemperatur für 30 Minuten durchgeführt, wenn Bernsteinsäureanhydrid verwendet wird und wenn Dimethylaminopyridin als Säurebindungsmittel verwendet wird.
  • Nach Abschluß der Reaktion wird die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch nach herkömmlichen Verfahren isoliert.
  • Z.B. wird nach geeigneter Neutralisation des Reaktionsgemisches und Entfernung gegebenenfalls vorhandener unlöslicher Materialien durch Filtration ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel, wie Ethylacetat, zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Nach Waschen des resultierenden Gemisches mit Wasser wird die organische Schicht, die die gewünschte Verbindung enthält, abgetrennt und über wasserfrei em Magnesiumsulfat getrocknet. Anschließend wird das Lösungsmittel verdampft, wobei man die gewünschte Verbindung erhält.
  • Die auf diese Weise erhaltene gewünschte Verbindung kann weiter nach herkömmlichen Verfahren, wie durch Umkristallisieren, erneutes Fällen, Chromatographie und dergleichen, gereinigt werden, falls dies erforderlich ist.
    • Stufe 4
  • Diese Stufe dient der Herstellung eines aktiven Esters (12) durch Umsetzung der Carboxylgruppe der Verbindung (18), die eine freie Carboxylgruppe aufweist, mit einem Esterbildungsreagenz, gefolgt von einer Umsetzung mit einem wahlweise substituierten Phenol.
  • Das einsetzbare Lösungsmittel ist nicht besonders beschränkt, sofern es die Reaktion nicht beeinträchtigt, und es umfaßt aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, Dichlorethan, Chlorbenzol und Dichlorbenzol; Ester, wie Ethylformat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat und Diethylcarbonat; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron und Cyclohexanon; Nitroverbindungen, wie Nitroethan und Nitrobenzol; Nitrile, wie Acetonitril und Isobutyronitril; Amide, wie Formamid, Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid und Hexamethylphosphorsäuretriamid; und Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid und Sulforan; bevorzugt sind halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere Methylenchlorid) und Amide (insbesondere Dimethylformamid).
  • Das einsetzbare Phenol ist nicht besonders beschränkt, solange es als ein aktiver Ester verwendet werden kann, und es umfaßt 4-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, 2,4,5-Trichlorphenol, Pentachlorphenol und 2,3,5,6-Tetrafluorphenol; bevorzugt ist Pentachlorphenol.
  • Das einsetzbare Esterbildungsreagenz umfaßt z.B. N-Hydroxyverbindungen, wie N-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxybenzotriazol und N-Hydroxy-5-norbornen 2,3-dicarboxyimid; Diimidazolverbindungen, wie 1,1'-Oxalyldiimidazol und N,N'-Carbonyldiimidazol; Disulfidverbindungen, wie 2,2'-Dipyridyldisulfid; Bernsteinsäureverbindungen, wie N,N'-Disuccinimidylcarbonat; Phosphinsäurechloridverbindungen, wie N,N'-Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinsäurechlorid; Oxalatverbindungen, wie N,N'-Disuccinimidyloxalat (DSO), N,N-Diphthallmidyloxalat (DPO), N,N'-Bis(norbornenylsuccinimidyl)oxalat (BNO), 1,1'-Bis(benzotriazolyl)oxalat (BBTO), 1,1'-Bis(6-chlorbenzotriazolyl)oxalat (BCTO) und 1,1'-Bis(6-trifluormethylbenzotriazolyl)oxalat (BTBO); und Carbodiimide, wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC); bevorzugt sind Dimidazolverbindungen und Carbodiimide (insbesondere DCC).
  • Die Reaktionstemperatur und die Reaktionszeit variieren zwar abhängig von der Art des Esterbildungsreagenzes und des eingesetzten Lösungsmittels; die Reaktion wird jedoch bei 0 bis 100ºC für 5 bis 50 Stunden durchgeführt, und insbesondere wenn Pentachlorphenol und DCC in DMF verwendet werden, dann wird die Reaktion bei Raumtemperatur für 18 Stunden durchgeführt.
  • Nach Abschluß der Reaktion wird die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch nach herkömmlichen Verfahren isoliert.
  • Z.B. wird nach geeigneter Neutralisierung des Reaktionsgemisches und Entfernung gegebenenfalls vorhandener unlöslicher Materialien durch Filtration ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel, wie Ethylacetat, zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Nach Waschen des resultierenden Gemisches mit Wasser wird die organische Schicht, die die gewünschte Verbindung enthält, abgetrennt und über wasserfreiern Magnesiumsulfat getrocknet. Anschließend wird das Lösungsmittel verdampft, wobei man die gewünschte Verbindung erhält.
  • Die auf diese Weise erhaltene gewünschte Verbindung kann weiter nach herkömmlichen Verfahren, wie durch Umkristallisieren, erneutes Fällen, Chromatographie und dergleichen, gereinigt werden, falls dies erforderlich ist.
    • Stufe 5
  • Diese Stufe dient der Herstellung einer Verbindung (12) durch Umsetzung der Verbindung (19) mit einer Verbindung (21) in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines Säurebindungsmittels.
  • Das einsetzbare Lösungsmittel ist nicht besonders beschränkt, sofern es die Reaktion nicht beeinträchtigt, und es umfaßt aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, Dichlorethan, Chlorbenzol und Dichlorbenzol; Ester, wie Ethylformat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat und Diethylcarbonat; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron und Cyclohexanon; Nitroverbindungen, wie Nitroethan und Nitrobenzol; Nitrile, wie Acetonitril und Isobutyronitril; Amide, wie Formamid, Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid und Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid und Sulforan; bevorzugt sind halogenierte Kohlenwasserstoffe, insbesondere Methylenchlorid.
  • Das einsetzbare Säurebindungsmittel umfaßt organische Basen, wie Triethylamin, Tributylamin, Diisopropylethylamin, N-Methylmorpholin, Pyridin, 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin, N,N-Dimethylanilin, N,N-Diethylanilin, 1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en, 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (DABCO) und 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU); bevorzugt werden organische Basen, insbesondere Pyridin und N-Methylmorpholin.
  • Die Reaktionstemperatur und die Reaktionszeit variieren zwar abhängig von der Art des eingesetzten Säurebindungsmittels; die Reaktion wird jedoch üblicherweise bei 10 bis 40ºC für 1 bis 5 Stunden durchgeführt.
  • Nach Abschluß der Reaktion wird die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch nach herkömmlichen Verfahren isoliert.
  • Z.B. wird nach geeigneter Neutralisierung des Reaktionsgemisches und Entfernung gegebenenfalls vorhandener unlöslicher Materialien ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel, wie Ethylacetat, zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Nachdem das resultierende Gemisch mit Wasser gewaschen worden ist, wird die organische Schicht, die die gewünschte Verbindung enthält, abgetrennt und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Anschließend wird das lösungsmittel verdampft, wobei man die gewünschte Verbindung erhält.
  • Die auf diese Weise erhaltene gewünschte Verbindung kann nach herkömmlichen Verfahren, wie Umkristallisieren, erneutes Fällen, Chromatographie und dergleichen, weiter gereinigt werden, falls dies erforderlich ist.
    • Stufe 6
  • Diese Stufe dient der Herstellung eines Polymerderivats (14), das als Träger für die Synthese eines Oligonucleotids eingesetzt werden kann, durch Umsetzung der Verbindung (12), die eine aktivierte Carboxylgruppe enthält und in Stufe 5 erhalten wurde, mit einem polymeren Material (13), wie einem Glas mit kontrollierten Poren (CPG), an das eine Aminogruppe, eine Hydroxygruppe, eine Sulfhydrylgruppe oder dergleichen über eine Alkylengruppe in einem inerten Lösungsmittel gebunden wurden.
  • Das in dieser Stufe einsetzbare polymere Material (13) ist zwar nicht besonders beschränkt, solange es üblicherweise als ein Träger verwendet werden kann; die Teilchengröße, die Oberfläche der dreidimensionalen Netzstruktur, der Anteil der Stellen mit hydrophilen Gruppen, die chemische Zusammensetzung, die Druckbeständigkeit und dergleichen des Trägers sollten jedoch untersucht werden.
  • Der einsetzbare Träger umfaßt Polysaccharidderivate, wie Cellulose, Dextran und Agarose; synthetische Polymere, wie Polyacrylamidgel, Polystyrolharze und Polyethylenglycol; und anorganische Materialien, wie Silicagel, poröses Glas und Metalloxide, für die, ohne Beschränkung hierauf, kommerziell erhältliche Träger, wie Aminopropyl-CPG und Langketten- Aminoalkyl-CPG (hergestellt von CPG Inc.); Cosmosil-NH&sub2; und Cosmosil-Diol (hergestellt von Nakarai Tesuku); CPC-Silica Carrler Silane Coated, Aminopropyl-CPG-550A, Aminopropyl-CPG-1400A und Polyethylenglycol-5000-monomethylether (hergestellt von Furuka Co.), p-Alkoxybenzylalkoholharz, Aminomethylharz und Hydroxymethylharz (hergestellt von Kokusan Kagaku K.K.); und Polyethylenglycol-14000-monomethylether (hergestellt von Union Carbide), typische Beispiele sind.
  • Ferner umfaßt die funktionelle Gruppe, die an den Träger gebunden ist, vorzugsweise eine Aminogruppe, eine Sulfhydrylgruppe und eine Hydroxygruppe.
  • Das einsetzbare Lösungsmittel ist nicht besonders beschränkt, solange es die Reaktion nicht beeinträchtigt und die Ausgangsmaterialien in einem gewissen Ausmaß lösen kann, und es umfaßt vorzugsweise aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol; halogenierte Kohlenwasserstüffe, wie Methylenchlorid, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, Dichlorethan, Chlorbenzol und Dichlorbenzol; Ester, wie Ethylformat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat und Diethylcarbonat; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron und Cyclohexanon; Nitroverbindungen, wie Nitroethan und Nitrobenzol; Nitrile, wie Acetonitril und Isobutyronitril; Amide, wie Formamid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid und Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid und Sulforan; bevorzugt sind halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere Methylenchlorid) und Amide (insbesondere Dimethylformamid)
  • Die Reaktionstemperatur beträgt üblicherweise -20 bis 150ºC und vorzugsweise 0 bis 50ºC.
  • Die Reaktionszeit variiert zwar abhängig von den Ausgangsmaterialien, dem Lösungsmittel und der gewählten Reaktionstemperatur; üblicherweise beträgt sie jedoch 1 bis 200 Stunden und vorzugsweise 24 bis 100 Stunden.
  • Nach Abschluß der Reaktion wird die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch nach herkömlichen Verfahren isoliert.
  • Z.B. wird der gewünschte polymere Träger durch Filtration aus dem Reaktionsgemisch gewonnen, mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, gewaschen und unter verringertem Druck getrocknet, wobei man die gewünschte Verbindung erhält.
    • Stufe 7
  • Diese Stufe dient der Herstellung einer Verbindung (22) durch Umsetzung der Verbindung (14) mit einem Reagenz zur Entfernung der Schutzgruppe in einem inerten Lösungsmittel, um selektiv die Schutzgruppe der Hydroxygruppe zu entfernen.
  • Die Stufen 7 bis 11 werden üblicherweise in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt.
  • Das einsetzbare Lösungsmittel umfaßt aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, Dichlorethan, Chlorbenzol und Dichlorbenzol; Ester, wie Ethylformat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat und Diethylcarbonat; Ether, wie Diethylether, Diisopropylether, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethoxyethan und Diethylenglycoldimethylether; Alkohole, wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n- Butanol, Isobutanol, tert.-Butanol, Isoamylalkohol, Diethylenglycol, Glycerin, Octanol, Cyclohexanol und Methylcellosolve; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron und Cyclohexanon; Nitroverbindungen, wie Nitroethan und Nitrobenzol; Nitrile, wie Acetonitril und Isobutyronitril; Amide, wie Formamid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid und Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid und Sulforan; stärker bevorzugt sind Alkohole (insbesondere Methanol und Ethanol) und Methylenchlorid und, wenn Essigsäure als Reagenz zur Entfernung der Schutzgruppe verwendet wird, ist ein Gemisch aus Essigsäure und Wasser eingeschlossen.
  • Das einsetzbare Reagenz zur Entfernung der Schutzgruppe ist nicht besonders beschränkt, solange es üblicherweise verwendet wird; wenn die Schutzgruppe eine Triarylmethylgruppe ist, dann können Essigsäure, Dichloressigsäure, Trifluoressigsäure, Hypochlorsäure und eine Lewis-Säure, wie Zinkbromid, als Beispiele genannt werden; vorzugsweise werden Essigsäure, Dichloressigsäure und Trifluoressigsäure verwendet.
  • Die Reaktionstemperatur variiert zwar abhängig von dem Reagenz, den Ausgangsmaterialien und dem eingesetzten Lösungsmittel; üblicherweise beträgt sie jedoch -10 bis 100ºC und vorzugsweise 0 bis 50ºC.
  • Die Reaktionszeit variiert zwar abhängig von den Ausgangsmaterialien, dem Lösungsmittel und der gewählten Reaktionstemperatur; üblicherweise beträgt sie jedoch 1 Minute bis 50 Stunden und vorzugsweise 1 Minute bis 24 Stunden.
  • Nach Abschluß der Reaktion wird die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch nach herkömmlichen Verfahren isoliert.
  • Üblicherweise wird der polymere Träger durch Filtration aus dem Reaktionsgemisch gewonnen, mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, gewaschen und unter verringertem Druck getrocknet, wobei man die gewünschte Verbindung erhält.
    • Stufe 8
  • Diese Stufe dient der Herstellung einer Verbindung (24) durch Umsetzung einer Verbindung (23), (23') oder (23"), die eine Dimethoxytritylgruppe an der 5'-Hydroxygruppe aufweist, in der die Basengruppe die des 3'-Endes der gewünschten Basensequenz ist und in der die 3'-Hydroxygruppe über den Phosphor eine gewünschte Alkoxy-, Phenyloxy-, Aralkyloxy-, Alkyl-, Aralkyl- oder Phenylgruppe daran gebunden aufweist, mit dem polymeren Material (22), gefolgt von einer Thioatbildung oder Alkylaminierung (falls erforderlich), um eine solche Verbindung (24) zu erhalten, die die gewünschte 3'-terminale Nucleotideinheit, gebunden an ein polymeres Material, wie CPG, aufweist.
  • Die Verbindungen (23), (23') und (23"), die einsetzbar sind, werden nachstehend beschrieben.
  • (a) Wenn die Verbindung (23) in dieser Stufe umgesetzt wird, dann wird ein saures Material eingesetzt.
  • Das einsetzbare saure Material umfaßt Materialien, wie Tetrazol und dergleichen und vorzugsweise Tetrazol. Das in der Oxidationsreaktion dieser Stufe einsetzbare Oxidationsmittel ist zwar nicht besonders beschränkt, solange es bei Oxidationsreaktionen verwendbar ist; es umfaßt vorzugsweise jedoch anorganische Metalloxidationsmittel, wie Manganoxide, z.B. Kaliumpermanganat und Mangandioxid; Rutheniumoxide, z.B. Rutheniumtetraoxid; Selenverbindungen, z.B. Selendioxid; Eisenverbindungen, z.B. Eisen(III)-chlorid; Osmiumverbindungen, z.B. Osmiumtetraoxid; Silberverbindungen, z.B. Silberoxid; Quecksilberverbindungen, z.B. Quecksilberacetat; Bleioxidverbindungen, z.B. Bleioxid und Bleitetraoxid; Chromsäureverbindungen, z.B. Kaliumchromat, ein Chromsäure-Schwefelsäure-Komplex und ein Chromsäure-Pyridin-Komplex; und Cerverbindungen, z.B. Cerammoniumnitrat (CAN); anorganische Oxidationsmittel, wie Halogenmoleküle, z.B. Chlormoleküle, Brommoleküle und Iodmoleküle; Periodsäuren, z.B. Natriumperiodat; Ozon; wäßriges Wasserstoffperoxid; Stickstoffverbindungen, z.B. salpetrige Säure; Chlorsäureverbindungen, z.B. Kaliumchlorit und Natriumchlorit; und Perschwefelsäureverbindungen, z.B. Kaliumpersulfat und Natriumpersulfat; und organische Oxidationsmittel, wie Reagenzien, die für die DMSO-Oxidation einsetzbar sind (ein Komplex aus Dimethylsulfoxid und Dicyclohexylcarbodiimid, Oxalylchlorid, Essigsäureanhydrid oder Phosphorpentaoxid oder ein Komplex aus Pyridin-Schwefelsäureanhydrid); Peroxide, z.B. tert.-Butylhydroperoxid; stabile Kationen, z.B. das Triphenylmethylkation; Succinimide, z.B. N-Bromsuccinimid; Hypochlorsäureverbindungen, z.B. tert.-Butylhypochlorit; Azodicarbonsäureverbindungen, z.B. Azodicarbonsäureester; Disulfide, z.B. Dimethyldisulfid, Diphenyldisulfid und Dipyridyldisulfid und Triphenylphosphin; Salpetrigsäureester, z.B. Methylnitrit; Kohlenstofftetrahalogenide, z.B. Methantetrabromid; und Chinonverbindungen, z.B. 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-p-benzochinon (DDQ); bevorzugt ist Iod. Das einsetzbare Lösungsmittel ist nicht besonders beschränkt, sofern es die Reaktion nicht beeinträchtigt und die Ausgangsmaterialien in einem gewissen Ausmaß lösen kann, und es umfaßt aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid und Chloroform; Ether, wie Ether, Tetrahydrofuran, Dioxan und Dimethoxyethan; Amide, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid und Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon; heterocyclische Amine, wie Pyridin; und Nitrile, wie Acetonitril; bevorzugt sind heterocyclische Amine (insbesondere Pyridin), Nitrile (insbesondere Acetonitril), Ether (insbesondere Tetrahydrofuran) und halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere Methylenchlorid).
  • Die Reaktion wird bei -50 bis 100ºC durchgeführt. Die Reaktionszeit variiert zwar hauptsächlich abhängig von der Reaktionstemperatur, den Typen der Ausgangsverbindungen und dem eingesetzten Lösungsmittel; üblicherweise beträgt sie jedoch 5 Minuten bis 15 Stunden.
  • (b) Das Lösungsmittel, das eingesetzt wird, wenn die Verbindung (23') umgesetzt wird, ist nicht besonders beschränkt, sofern es die Reaktion nicht beeinträchtigt, und ein aromatisches Amin, wie Pyridin, wird vorzugsweise verwendet.
  • Für den Fall, daß die Verbindung (23') umgesetzt wird, wird üblicherweise ein Kondensationsmittel verwendet.
  • Die Kondensationsmittel, die eingesetzt werden können, umfassen Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Mesitylensulfonsäurechlorid (Ms-Cl), Triisopropylbenzolsulfonsäurechlorid, Mesitylensulfonsäuretriazolid (MST), Mesitylensulfonsäure-3-nitrotriazolid (MSNT), Triisopropylbenzolsulfonsäuretetrazolid (TPS-Te), Triisopropylbenzolsulfonsäurenitroimidazolid (TPS- NI) und Triisopropylbenzolsulfonsäurepyridyltetrazolid; bevorzugt sind MSNT, TPS-Te und TPS-NI. Die Reaktionstemperatur ist zwar nicht besonders auf den Bereich von -10 bis 100ºC beschränkt; die Reaktion wird jedoch üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Reaktionszeit variiert zwar abhängig vom Lösungsmittel und der gewählten Reaktionstemperatur; sie beträgt jedoch 30 Minuten für den Fall, daß die Reaktion bei Raumtemperatur unter Verwendung von Pyridin als Lösungsmittel für die Reaktion durchgeführt wird.
  • (c) Das Lösungsmittel, das eingesetzt werden kann, wenn die Verbindung (23") umgesetzt wird, ist nicht besonders beschränkt, sofern es die Reaktion nicht beeinträchtigt; bevorzugt wird jedoch wasserfreies Acetonitril verwendet. Als das Reagenz, das als Kondensationsmittel verwendet wird, werden Säurechloride von Carbonsäuren und Phosphorsäure verwendet, und vorzugsweise wird Pivaloylchlorid verwendet.
  • Das Oxidationsmittel für die Oxidation des Oligonucleotids mit der H-Phosphonatbindung zu einem Phosphodiestertyp-Oligonucleotid ist zwar nicht besonders beschränkt, solange es üblicherweise für Oxidationsreaktianen verwendet wird; vorzugsweise umfaßt es jedoch anorganische Metalloxidaliansmittel, wie Manganoxide, z.B. Kaliumpermanganat und Mangandioxid; Rutheniumoxide, z.B. Rutheniumtetraoxid; Selenverbindungen, z.B. Selendiaxid; Eisenverbindungen, z.B. Eisen(III)-chlorid; Osmiumverbindungen, z.B. Osmiumtetraoxid; Silberverbindungen, z.B. Silberoxid; Quecksilberverbindungen, z.B. Quecksilberacetat; Bleiverbindungen, z.B. Bleioxid und Bleitetraoxid; Chromsäureverbindungen, z.B. Kaliumchromat, ein Chromsäure Schwefelsäure-Komplex und ein Chromsäure-Pyridin-Komplex; und Cerverbindungen, z.B. Cerammoniumnitrat (CAN); anorganische Oxidationsmittel, wie Halogenmoleküle, z.B. Chlormoleküle, Brommoleküle und Iodmoleküle; Periodsäuren, z.B. Natriumperiodat; Ozon; wäßriges Wasserstoffperoxid; Stickstoffverbindungen, wie salpetrige Säure; Chlorsäureverbindungen, z.B. Kaliumchlorit und Natriumchlorit; und Perschwefelsäureverbindungen, z.B. Kaliumpersulfat und Natriumpersulfat; und organische Oxidationsmittel, wie Reagenzien, die für die DMSO-Oxidation einsetzbar sind (ein Komplex aus Dimethylsulfoxid und Dicyclohexylcarbodiimid, Oxalylchlorid, Essigsäureanhydrid oder Phosphorpentaoxid oder ein Komplex aus Pyridin-Schwefelsäureanhydrid); Peroxide, z.B. tert.-Butylhydroperoxid; stabile Kationen, z.B. das Triphenylmethylkation; Succinimide, z.B. N- Bromsuccinimid; Hypochlorsäureverbindungen, z.B. tert.-Butylhypochlorit; Azodicarbonsäureverbindungen, z.B. Methyldiodicarboxylat; Disulfide, z.B. Dimethyldisulfid, Diphenyldisulfid und Dipyridyldisulfid und Triphenylphosphin; Salpetrigsäureester, z.B. Methylnitrit; Kohlenstofftetrahalogenide, z.B. Methantetrabromid; und Chinonverbindungen, z.B. 2,3-Dichlor- 5,6-dicyano-p-benzochinon (DDQ); bevorzugt werden Iodmoleküle.
  • Das einsetzbare Säurebindungsmittel umfaßt heterocyclische Amine, wie Pyridin und Dimethylaminopyridin; und aliphatische Amine, wie Trimethylamin, Triethylamin und Diisopropylethylamin; bevorzugt werden heterocyciische Amine (insbesondere Pyridin). Die Reaktionstemperatur ist zwar nicht besonders beschränkt; sie beträgt jedoch üblicherweise -50 bis 50ºC und vorzugsweise Raumtemperatur.
  • Die Reaktionszeit kann zwar abhängig von den Ausgangsmaterialien, dem Reagenz, der gewählten Temperatur und dergleichen variieren; üblicherweise beträgt sie jedoch 5 Minuten bis 30 Stunden und vorzugsweise 30 Minuten, wenn die Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt wird.
  • Die Thioatbildung, die gegebenenfalls in dieser Stufe durchgeführt wird, wird wie folgt durchgeführt: Nachdem die Verbindung (23) an die Verbindung (22) gebunden worden ist, wird ein Thioatbildungsreagenz umgesetzt, um eine Thioatbildung anstelle der Oxidation mit Iodmolekülen oder dergleichen durchzuführen und eine Verbindung (24) zu erhalten, bei der es sich um einen polymeren Träger, wie CPG, mit einer Thioatbindung handelt.
  • Das Reagenz für die Thioatbildung ist nicht ist nicht besonders beschränkt, solange es ein Thioat durch Reaktion mit dreiwertigem Phosphor bilden kann, und es umfaßt vorzugsweise Schwefel und auch Tetraethylthiuramdisulfid (TETD), das von Applied Biosystems erhältlich ist, und Beaucage-Reagenz, das von MilliGen/Biosearch erhältlich ist. Im Fall der Verwendung des erstgenannten Reagenzes können das Verfahren, das aus der Literatur bekannt ist (Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991)) oder eine Variation davon ohne Beschränkung angewandt werden, und im Fall des letztgenannten Reagenzes können das Verfahren, das in einer bekannten Literaturstelle offenbart ist (J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)) oder eine Variation davon ohne Beschränkung angewandt werden.
  • Die Alkylaminierung, die gegebenenfalls in dieser Stufe durchgeführt wird, kann wie folgt durchgeführt werden: Nachdem die Verbindung (23") an die Verbindung (22) gebunden wurde, wie es vorstehend beschrieben wurde, wird ein gewünschtes Alkylamin damit bei Raumtemperatur anstelle des Oxidationsmittels, wie Iodmoleküle, umgesetzt. Gemäß diesem Verfahren kann eine Verbindung (24), in der das 3'-terminale Nucleotid mit der gewünschten Basensequenz an ein polymeres Material, wie CPG, durch eine Phosphoramidatbindung gebunden ist, erhalten werden.
    • Stufe 9
  • Diese Stufe wird durch 1) Behandlung des polymeren Materials (24), das in Stufe 8 erhalten wurde, mit einer Säure zur Eliminierung der DMT- Gruppe, 2) Umsetzung des auf diese Weise behandelten polymeren Materials mit einem Amiditreagenz und einem Säurekatalysator, 3) Unterwerfen des resultierenden Materials einer Oxidationsreaktion unter Verwendung eines Oxidationsmittels und 4) Unterwerfen der nicht umgesetzten Gruppe einer Maskierungsreaktion unter Verwendung von Essigsäureanhydrid durchgeführt. In dieser Stufe werden die vorstehenden Verfahrensschrltte 1) bis 4) wiederholt, um eine Verbindung (25) zu erhalten, an die nur das 5'-terminale Nucleotid mit der gewünschten Basensequenz noch nicht gebunden ist. Die Verlängerungsreaktion der DNA-Kette in einem DNA-Syntheseautomaten, der in dieser Stufe eingesetzt wird, wird z.B. gemäß einer Variation des Verfahrens von Stec (J. Am. Chem. Soc., 106, 6077-6089 (1984)) unter Anwendung der Phosphoramiditmethode unter Verwendung von Applied Biosystems Modell 380B oder der Phosphoramiditmethode (Methode von H. Koester et al., in Nucleic Acids Res., 12, 4539 (1984)) unter Verwendung des Cyclone-Plus-DNA-Syntheseautomaten von MilliGen/Biosearch durchgeführt, wobei das Verfahren jedoch nicht darauf beschränkt ist.
    • Stufe 10
  • Diese Stufe dient der Herstellung eines polymeren Materials (27), das die gewünschte Basensequenz und Substituenten aufweist und auch eine Schutzgruppe behält, durch Eliminierung der 5'-terminalen DMT-Gruppe des polymeren Materials (25), das in Stufe 9 erhalten wurde, gemäß den Verfahren in Stufe 7, gefolgt von der gleichen Behandlung wie in Stufe 8 unter Verwendung der Verbindungen (26), (26') und (26"), wie es nachstehend beschrieben wird, anstelle der Verbindungen (23), (23') und (23").
  • Die Verbindungen (26,), (26') und (26") sind jeweils ein 2'-Desoxyribonucleosid mit einer Basengruppe, in der das 5'-terminale Nucleotid der gewünschten Basensequenz geschützt ist, oder ein Ribonucleosid mit einer geschützten Hydroxygruppe an der 2'-Position, wobei sich eine gewünschte modifizierende Gruppe an der 5'-Position befindet. Ferner weist die Verbindung (26) an der 3'-Position eine Phosphoramiditbindung unter Einschluß der Schutzgruppe der Phosphatgruppe, die für eine normale DNA- Synthese verwendet werden soll, auf. Entsprechend weist die Verbindung (26') eine Phosphodiesterbindung auf, und die Verbindung (26") weist eine H-Phosphonatbindung auf.
    • Stufe 11
  • Diese Stufe dient der Herstellung eines gewünschten Oligonucleotids (11) durch Abspaltung des Oligonucleotidanteils vom polymeren Material (21), der von dem geschützten polymeren Material, das in Stufe 10 erhalten wurde, getragen wird und die gewünschte Basensequenz und Substituenten am 5'- und am 3'-Ende aufweist, und Eliminierung der Schutzgruppen, die von den Substituenten am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende verschieden sind. Die Eliminierung der Schutzgruppen kann nach bekannten Verfahren durchgeführt werden (J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 (1981)).
  • Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsgemisch, das die Verbindung der allgemeinen Formel (11) enthält, wird durch eine übliche Reinigungs behandlung, die für die Reinigung von Nucleinsäuren anwendbar ist, gereinigt, z.B. durch verschiedene chromatographlsche Techniken, wie Umkehrphasen und/oder Ionenaustausch-Chromatographie (unter Einschluß der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) oder dergleichen, wobei man die Verbindung mit der allgemeinen Formel (11) erhält.
    • Stufe 12
  • Diese Stufe dient der Herstellung eines Halbesters einer Dicarbonsäure, d.h. der Verbindung (15), die das Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung ist, durch Umsetzung der freien Hydroxygruppe einer Verbindung (29) oder der freien Sulfhydrylgruppe einer Verbindung (30) mit einem Dicarbonsäureanhydrid, wie einer Verbindung (28), in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines basischen Katalysators.
  • Das einsetzbare Dicarbonsäureanhydrid ist nicht besonders beschränkt und umfaßt vorzugsweise Dicarbonsäureanhydride mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen und insbesondere Bernsteinsäureanhydrid oder Glutarsäureanhydrid. Der einsetzbare basische Katalysator umfaßt vorzugsweise Aminopyridine, wie Dimethylaminopyridin und Pyrrolidinopyridin, tertiäre Amine, wie Trimethylamin und Triethylamin, und Carbonate von Alkalimetallen, wie Natriumhydragencarbonat und Kaliumcarbonat. Am Stärksten bevorzugt sind Dimethylaminopyridin und Pyrrolidinopyridin.
  • Das einsetzbare Lösungsmittel ist nicht besonders beschränkt, sofern es die Reaktion nicht beeinträchtigt und die Ausgangsmaterialien in einem gewissen Ausmaß lösen kann, und es umfaßt vorzugsweise aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid und Chloroform; Ether, wie Ether, Tetrahydrofuran, Dioxan und Dimethoxyethan; Amide, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid und Hexamethylphosphorsäuretriamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxtd; Alkohole, wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, Isobutanol und Isoamylalkohol; verdünnte Säuren, wie wäßrige Schwefelsäure; verdünnte Basen, wie wäßriges Natriumhydroxid; Wasser; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon; heterocyclische Amine, wie Pyridin; und Nitrile, wie Acetonitril; bevorzugt sind Nitrile (insbesondere Acetonitril), Ether (insbesondere Tetrahydrofuran) und halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere Methylenchlorid).
  • Die Reaktion wird bei -50 bis 100ºC durchgeführt. Die Reaktionszeit variiert zwar abhängig von der Reaktionstemperatur, der Art der Ausgangsmaterialien und dem eingesetzten Lösungsmittel; sie beträgt jedoch üblicherweise 30 Minuten bis 15 Stunden.
  • Nach Abschluß der Reaktion wird die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch durch herkömmliche Verfahren gewonnen.
  • Z.B. wird nach geeigneter Neutralisierung des Reaktionsgemisches und Entfernung gegebenenfalls vorhandener unlöslicher Materialien durch Filtration ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel, wie Ethylacetat, zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Nach Waschen des resultierenden Gemisches mit Wasser wird die organische Schicht, die die gewünschte Verbindung enthält, abgetrennt und über wasserfrei em Magnesiumsulfat getrocknet. Anschließend wird das Lösungsmittel verdampft, wobei man die gewünschte Verbindung erhält.
  • Die auf diese Weise erhaltene gewünschte Verbindung kann ferner nach herkömmlichen Verfahren, wie Umkristallisieren, erneutes Fällen, Chromatographie und dergleichen, weiter gereinigt werden, falls dies erforderlich ist.
    • Stufe 13
  • Diese Stufe dient der Herstellung einer Verbindung (18) durch Umsetzung einer Verbindung (19) mit einer Dicarbonsäure (31) in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines Esterbildungsreagenzes.
  • Das einsetzbare Lösungsmittel ist nicht besonders beschränkt, sofern es die Reaktion nicht beeinträchtigt, und es umfaßt aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol und Xylol; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, Dichlorethan, Chlorbenzol und Dichlorbenzol; Ester, wie Ethylformat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat und Diethylcarbonat; Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon, Isophoron und Cyclohexanon; Nitroverbindungen, wie Nitroethan und Nitrobenzol; Nitrile, wie Acetonitril und Isobutyronitril; Amide, wie Formamid, Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid und Hexamethylphosphorsäuretriamid; und Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid und Sulforan; bevorzugt sind halogenierte Kohlenwasserstoffe (insbesondere Methylenchlorid) und Amide (insbesondere Dimethylformamid).
  • Das einsetzbare Esterbildungsreagenz umfaßt z.B. N-Hydroxyverbindungen, wie N-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxybenzotriazol und N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid; Diimidazolverbindungen, wie 1,1'-Oxalyldiimidazol und N,N'-Carbonyldiimidazol; Disulfidverbindungen, wie 2,2'-Dipyridyldisulfid; Bernsteinsäureverbindungen, wie N,N'-Disuccinimidylcarbonat; Phosphinsäurechloridverbindungen, wie N,N'-Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinsäurechlorid; Oxalatverbindungen, wie N,N'-Disuccinimidyloxalat (DSO), N,N-Diphthalimidyloxalat (DPO), N,N'-Bis(norbornenylsuccinimidyl)oxalat (BNO), 1,1'-Bis(benzotriazolyl)oxalat (BBTO), 1,1'-Bis(6-chlorbenzotriazolyl)oxalat (BCTO) und 1,1'-Bis(6-trifluormethylbenzotriazolyl)oxalat (BTBO); und Carbodiimide, wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC); bevorzugt sind Diimidazolverbindungen und Carbodiimide (insbesondere DCC).
  • Die Reaktionstemperatur und die Reaktionszeit variieren zwar abhängig von der Art des Esterbildungsreagenzes und des eingesetzten Lösungsmittels; die Reaktion wird jedoch bei 0 bis 100ºC für 5 bis 50 Stunden durchgeführt.
  • Nach Abschluß der Reaktion wird die gewünschte Verbindung aus dem Reaktionsgemisch nach herkömmlichen Verfahren isoliert.
  • Z.B. wird nach geeigneter Neutralisierung des Reaktionsgemisches und Entfernung gegebenenfalls vorhandener unlöslicher Materialien durch Filtration ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel, wie Ethylacetat, zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Nach Waschen des resultierenden Gemisches mit Wasser wird die organische Schicht, die die gewünschte Verbindung enthält, abgetrennt und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Anschließend wird das Lösungsmittel verdampft, wobei man die gewünschte Verbindung erhält.
  • Die auf diese Weise erhaltene gewünschte Verbindung kann weiter nach herkömmlichen Verfahren, wie durch Umkristallisleren, erneutes Fällen, Chromatographie und dergleichen, gereinigt werden, falls diese erforderlich ist.
  • Nach dem neuen erfindungsgemäßen Verfahren kann ein modifiziertes Oligonucleotid mit einem gewünschten Substituenten am 3'-Ende des Oligonucleotids über Phosphat leicht in einem DNA-Syntheseautomaten synthetisiert werden, wobei das modifizierte Oligonucleotid in hoher Reinheit und in einer großen Menge unter Anwendung einfacher Reinigungsverfahren bei niedrigen Kosten bereitgestellt wird. Nützliche Oligonucleotide mit einem Substituenten am 3'-Ende werden in der japanischen Patentanmeldung Hei-3- 301744 (die entsprechende europäische Patentanmeldung wurde als EP-A- 558749 veröffentlicht) beschrieben und weisen eine anti-AIDS-Aktivität auf.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen eine spezifische cytopathische Aktivität gegen das AIDS-Virus (HIV-1) und können spezifisch die Proliferation des Virus in infizierten Zellen inhibieren. Dementsprechend können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und Prävention von AIDS verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun konkret durch Erläuterung der nachstehenden Beispiele erklärt. In den folgenden Beispielen sind "Inertsil", "YMC Pack A-312" und "Cosmosil" Marken.
    • Testbeisplel 1: Messung der anti-HIV-1-Aktivität von modifizierten Oligodesoxyribonucleotiden
  • Die anti-HIV-1-Aktivität wurde nach dem Verfahren von Pauel et al. gemessen (R. Pauel et al., J. Virological Methods, 20, 309-321 (1988)). Zusammengefaßt wurden MT-4-Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase für 5 Minuten bei 150 × g zentrifugiert. Das erhaltene Zellpellet wurde in Kulturmedium suspendiert und mit HIV-1 (Typ IIIB) für 1 Stunde bei 37ºC in einer Konzentration von 10 CCID&sub5;&sub0; infiziert. HIV-1-Infizierte MT- 4-Zellen wurden durch Zentrifugation in RPMI-1640-Kulturmedium mit einem Gehalt an 10% fötalen Kälberserum (nachstehend als "Serumkulturmedium" bezeichnet) erhalten.
  • HIV-1-Infizierte MT-4-Zellen und nicht mit HIV-1 Infizierte MT-4- Zellen wurden in Serumkulturmedium suspendiert, so daß jeweils eine Konzentration an 4 × 10&sup5; Zellen/ml erzielt wurde. 100 µl einer zuvor hergestellten Lösung einer schrittweise verdünnten Probeverbindung (gelöst in Serumkulturmedium) wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 98 Vertiefungen gegeben. Anschließend wurden 100 µl der einzelnen vorstehend genannten Zellsuspenslonen in die einzelnen Vertiefungen der Mikrotiterplatten gegeben, und die Zellen wurden für 6 Tage in Gegenwart von 5% Kohlendloxidgas kultiviert.
  • Als eine Kontrolle wurden mit HIV-1 Infizierte MT-4-Zellen und nicht mit HIV-1 infizierte MT-4-Zellen, zu denen keine Probeverbindung gegeben wurde, auf die gleiche Weise kultiviert.
  • Nach der Kultivierung wurde die Zahl der lebenden Zellen auf der Basis des MTT-Verfahrens (3-(4,5-Dimethylthlazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Verfahrens) gemessen (L. M. Green et al., J. Immunol. Methods, 70, 257-268 (1984)). Anschließend wurde die cytopathische Aktivität von HIV-1 gemessen. Mit der cytopathischen Aktivität von mit HIV-1 infizierten MT-4-Zellen, zu denen keine Probeverbindung gegeben wurde, als 100% und der cytopathischen Aktivität von nicht mit HIV-1 (Typ IIIB) infizierten MT-4-Zellen, zu denen keine Probeverbindung gegeben wurde, als 0% wurde die Konzentration der Probe, die die cytopathische Aktivität von mit HIV-1 infizierten MT-4-Zellen um 50% Inhibierte (IC&sub5;&sub0;), berechnet. Die Cytotoxizität der Probeverbindung wurde als die Konzentration bestimmt, die die Vermehrung von nicht mit HIV-1 infizierten MT-4-Zellen um 50% inhibierte (CC&sub5;&sub0;). Die Ergebnisse dieser Messungen sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2
  • Entsprechend wurde durch die Testergebnisse definitiv gezeigt, daß alle modifizierten Oligodesoxyribonucleotide, die in Tabelle 2 angegeben sind, eine ausgeprägte anti-(HIV-1)-Aktivität bei einer Konzentration von weniger als 10 µg/ml aufweisen.
  • Sofern nichts anderes angegeben ist, bezeichnet die in den folgenden chemischen Strukturen verwendete Basensequenz (z.B. TGGGAGG) das Triethylaminsalz des entsprechenden Oligodesoxyribonucleotids, das sowohl an der 5'-Position als auch an der 3'-Position keine Hydroxygruppe aufweist.
  • Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert. In den Beispielen wird bei allen mesh-Größen der Tyler-Standard angewandt, und kernmagnetische Resonanzspektren wurden unter Verwendung Trimethylsilan als interner Standard erhalten, was durch die Abkürzung "TMS" angegeben ist. Die Mengen an Oligodesoxyribonucleotidderivaten, die in den einzelnen Beispielen hergestellt wurden, wurden mittels der optischen Dichte bei 260 nm [OD(260 nm)] gemessen.
    • Beispiel 1 1(a) 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • 969 mg (2 mmol) 5'-O-Tritylthymidin [J. Am. Chem. Soc., 80, 6212 (1958)] wurden dreimal durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet; anschließend wurden sie in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst. 1,39 ml (8 mmol) N,N-Diisopropyl-N-ethylamin und 0,822 ml (4 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N- diisopropylchlorphosphoramidit wurden anschließend zu der Lösung gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten unter einer Argonatmosphäre gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde der resultierende Niederschlag vom Reaktionsgemisch abfiltriert, und das Filtrat wurde vom Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck befreit. Der resultierende Rückstand wurde in 100 ml Ethylacetat gelöst, und die Lösung wurde zweimal mit jeweils 50 ml einer eisgekühlten 10%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat gewaschen. Die Lösung wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet; anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 40 g Silicagel (70 bis 230 mesh) unter Verwendung eines Gemisches aus Methylenchlorid, Ethylacetat und Triethylamin im Volumenverhältnis 45 : 45 : 10 als Eluent gereinigt, wobei man 1,35 g (Ausbeute: 98%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,62; 7,57 (zusamen 1H, zwei Singuletts);
  • 7,46 - 7,20 (15H, Multiplett);
  • 6,46 - 6,37 (1H, Multiplett);
  • 4,68 (1H, breites Singulett);
  • 4,19; 4,15 (zusamen 1H, zwei breite Singuletts);
  • 3,90 - 3,30 (6H, Multiplett);
  • 2,63 - 2,28 (4H, Multiplett);
  • 1,47 (3H, Singulett);
  • 1,3 - 1,00 (12H, Multiplett). 1(b) Eine Verbindung der Formel 1(b):
  • Die Synthese erfolgte unter Verwendung eines Cyclone Plus (Marke) DNA/RNA-Syntheseautomaten, der von MilliGen/Biosearch (eine Abteilung von Millipore Ltd., Japan) hergestellt wird. In den Syntheseautomaten wurden die chemischen Reagenzien entsprechend den Nucleotidresten in der vorstehenden Formel 1(b) eingefüllt, um das vorstehende Oligonucleotid zu synthetisieren. Eine Programmpatrone für das Amiditverfahren wurde in die Maschine eingesetzt. Die Synthese wurde in einem Maßstab von 15 µmol durchgeführt. In diesem Fall wurde eine 35 mM Acetonitrillösung von 5'-O- Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] anstelle einer 2- Cyanoethylphosphoramiditlösung, die Thymidin entspricht, verwendet. Die Reaktionssäule war eine Säule für eine Reaktion im Maßstab von 15,0 µmol, die mit 5 µmol G-CPG [d.h. Guanindesoxyribonucleosid (G), gekuppelt an Glas mit kontrollierten Poren (CPG)] gepackt war. Die Konzentration an Nucleotid auf dem Glasfüllstoff betrug 35 bis 44 µmol/g, und der CPG- Füllstoff wies eine mittlere Porengröße von 50 nm auf. Die gewünschte Basensequenz TGGGAG wurde eingegeben (wie es üblich ist, umfaßt die hier angegebene Basensequenz wie die Basensequenzen, auf die später Bezug genommen wird, die Base, die an das CPG gekuppelt worden ist), und das Programm wurde ohne Säurebehandlung nach der Bindungsbildung mit dem endständigen T durchgeführt, wobei man ein Derivat erhielt, bei dem das gewünschte geschützte Oligonucleotid an das Glas mit kontrollierten Poren (CPG) gekuppelt war. Dieses wurde im Vakuum getrocknet, aus der Säule entnommen und in etwa 10 ml 29%igen wäßrigen Ammoniak getaucht. Man ließ es dann bei Raumtemperatur für 2 Tage in einem verschlosseneit Behälter reagieren. Am Ende dieser Zeit wurde das CPG durch Filtration entfernt und zweimal mit jeweils 10 ml Wasser gewaschen; das Filtrat und die Waschlösungen wurden anschließend vereinigt. Das vereinigte Gemisch wurde dann dreimal mit jeweils 30 ml Diethylether gewaschen; anschließend wurden der Ammoniak und der Diethylether durch Verdampfen im Vakuum entfernt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde auf etwa 3 ml durch Eindampfen unter verringertem Druck eingeengt, und die eingeengte Lösung wurde mit Hilfe eines Millipore-Filters (0,45 µm) filtriert. Das Filtrat wurde in drei Portionen geteilt, und jede Portion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durch eine 20,0 × 250 mm Säule mit Inertsil PREP-ODS (Marke), die zuvor mit 0,1 M wäßrigem Triethylammoniumacetatpuffer (TEM) (pH-Wert: 7,3) mit einem Gehalt an 20 Vol.-% Acetonitril äquilibriert worden war, gereinigt und durch ultraviolettes licht bei 254 nm überwacht. Das gewünschte Produkt wurde unter Anwendung des Gradientenelutionsverfahrens mit 0,1 M TEAA mit einem Gehalt an Acetonitril in Konzentrationen im Bereich vom 20 bis 50 Vol.-% mit einem linearen Gradienten von 8 ml/Minute in einer Zeitspanne von 30 Minuten eluiert. Nach 17,2 Minuten eluierte Fraktionen wurden aufgefangen, und die Lösung wurde vom Acetonitril durch Eindampfen unter verringertem Druck befreit; anschließend wurde die resultierende wäßrige Lösung lyophilisiert. Das auf diese Weise erhaltene Produkt wurde in 50 ml Wasser gelöst und erneut lyophilisiert, wobei man 94,8 OD (260 nm) der Verbindung der Formel 1(b) als amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
  • Retentionszeit: 23,3 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 1,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten, linearer Gradient; 1 ml/Minute; 254 nm).
    • Beispiel 2 (2a) 5'-Tritylamino-5'-desoxythymidin
  • 557 mg Tritylchlorid wurden zu einer Lösung von 560 mg (2 mmol) 3'- O-Acetyl-5'-amino-5'-desoxythymidin [das nach dem Verfahren hergestellt worden war, über das J. P. Horwitz et al. in J. Org. Chem., 27, 3045 (1962) berichten] in 20 ml trockenem Pyridin gegeben, und das resultierende Gemisch wurde unter Rückfluß für 1 Stunde unter Feuchtigkeitsausschluß erwärmt. Nachdem das Verschwinden des Ausgangsmaterials durch Dünnschichtchromatographie (unter Verwendung von Methylenchlorid mit einem Gehalt an 5 Vol.-% Methanol als Entwicklungslösungsmittel) festgestellt worden war, wurde das Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde mit jeweils 10 ml Methanol und Wasser gemischt, und anschließend wurde das Gemisch durch Destillation unter verringertem Druck eingeengt. Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt, und anschließend wurde der Rückstand in 30 ml Ethylacetat gelöst. Die resultierende Lösung wurde mit jeweils 20 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid, 0,2 N wäßriger Salzsäure und einer 5%igen wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat gewaschen. Die organische Lösung wurde dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und die Lösung wurde anschließend unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 30 ml Methanol, das mit Ammoniakgas gesättigt war, gelöst, und der Kolben, der die Lösung enthielt, wurde dicht verschlossen. Man ließ ihn dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Am Ende dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch vom Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck befreit, und der Rückstand wurde in 10 ml Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wurde mittels Säulenchromatographie durch Silicagel unter Verwendung von Methylenchlorid mit einem Gehalt an 5 Vol.-% Methanol als Eluent gereinigt. Fraktionen, die die gewünschte Verbindung enthielten, wurden vereinigt und unter verringertem Druck zur Trockene eingeengt. Durch Lyophilisieren des Rückstands aus Benzol erhielt man 338 mg der Titelverbindung als weißes Pulver.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,38 (1H, breites Singulett);
  • 7,48 - 7,18 (15H, Multiplett);
  • 7,04 (1H, Multiplett);
  • 6,67 (1H, Triplett, J = 6,60 Hz);
  • 4,35 - 4,29 (1H, Multiplett);
  • 4,01 - 3,95 (1H, Multiplett);
  • 2,62 - 2,06 (5H, Multiplett);
  • 1,84 (3H, Singulett).
    • 2(b) 5'-Tritylamino-5'-desoxythymidin-2-cyanoethyl-N,N,-diisopropylphosphoramidit
  • 0,15 g (0,31 mmol) 5'-Tritylamino-5'-desoxythymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und anschließend in 2 ml Methylenchlorid gelöst. 0,23 ml (1,2 mmol) N,N-Diisopropyl-N-ethylamin wurden dann zu der resultierenden Lösung gegeben; anschließend wurden 0,08 ml (0,36 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit innerhalb einer Zeitspanne von 2 Minuten unter einem Stickstoffstrom zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur für 60 Minuten gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde durch Dünnschichtchromatographie bestätigt, daß die Ausgangsverbindung verschwunden war, und das Reaktionsgemisch wurde mit 30 ml Ethylacetat verdünnt. Die resultierende organische Lösung wurde mit einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat und mit einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid in dieser Reihenfolge gewaschen. Die organische Schicht wurde durch 1PS (Marke) Filterpapier (Whatman) filtriert, und das Filtrat wurde vom Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck befreit. Der resultierende Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 15 g Silicagel (70 bis 230 mesh) unter Verwendung von Ethylacetat als Eluent gereinigt, wobei man 0,19 g (Ausbeute: 89%) der Titelverbindung als schaumige Substanz erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,50 - 7,19 (15H, Multiplett);
  • 7,15; 7,06 (zusammen 1H, zwei Singuletts);
  • 6,30 - 6,26 (1H, Multiplett);
  • 4,55 - 4,35 (1H, Multiplett);
  • 4,12 - 4,07 (1H, Multiplett);
  • 3,84 - 3,53 (4H, Multiplett);
  • 2,64 - 2,09 (6H, Multiplett);
  • 1,86; 1,84 (zusammen 3H, zwei Singuletts);
  • 1,19 - 1,10 (12H, Multiplett). 2(c) Eine Verbindung der Formel 2(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-Tritylamino-5'-desoxythymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in Herstellungsbeispiel 2(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM wäßriger Trimethylammoniumhydrogencarbonatpuffer (TEAB), pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm). Das Eluat wurde auf eine Wetse ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 168 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm, Eluent A: 0,1 M TEAA, pH- Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol -% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 19,20 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 3 3(a) 5'-O-Benzhydrylthymidin
  • 350 mg (8 mmol) Natriumhydrid (als 55%ige (Gew./Gew.) Dispersion in Mineralöl) wurden zu einer Lösung von 1,426 g (4 mmol) 3'-O-[(1,1-Dimethylethyl)dimethylsilyl]thymidin [Can. J. Chem., 56, 2768 (1978)] in 8 ml Tetrahydrofuran unter einer Argonatmosphäre gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei 60ºC für 2 Stunden gerührt. Dann ließ man es auf Raumtemperatur abkühlen. Eine Lösung von 988 mg (4 mmol) Benzylbromid in 2 ml Tetrahydrofuran wurde anschließend tropfenwelse zu dem Gemisch gegeben, gefolgt von 300 mg (2 mmol) Natriumiodid. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei Raumtemperatur für 17 Stunden gerührt. Anschließend wurde es vom Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck befreit. Das Konzentrat wurde in 50 ml Ethylacetat verdünnt, und die resultierende Lösung wurde zweimal mit jeweils 50 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen. Sie wurde dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in 4 ml Tetrahydrofuran gelöst, und 4 ml einer 1 M Tetrahydrofuranlösung von Tetrabutylammoniumfluorid wurden zu der Lösung gegeben. Das resultierende Gemisch wurde anschließend bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde in 50 ml Ethylacetat gelöst. Die resultierende Lösung wurde zweimal mit jeweils 50 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen. Das Gemisch wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 60 g Silicagel (230 bis 400 mesh) unter Anwendung des Gradientenelutionsverfahrens mit Methylenchlorid mit einem Gehalt an 1 bis 2,5 Vol.-% Methanol als Eluent gereinigt, wobei man 377,7 mg (Ausbeute: 23%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 9,85 (1H, breites Singulett);
  • 1,56 (1H, Singulett);
  • 7,38 - 7,20 (10H, Multiplett);
  • 6,45 (1H, Triplett; J = 6,92 Hz);
  • 5,40 (1H, Singulett);
  • 4,62 - 4,58 (1H, Multiplett);
  • 4,17 - 4,15 (1H, Multiplett);
  • 3,75 - 3,58 (2H, Multiplett);
  • 2,47 - 2,22 (2H, Multiplett);
  • 1,36 (3H, Singulett). 3(b) 5'-O-Benzhydrylthymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • 204,2 mg (0,5 mmol) 5'-O-Benzhydrylthymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden dreimal durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und anschließend in 2,5 ml Tetrahydrofuran gelöst. 0,348 ml (2 mmol) N,N-Diisopropyl-N-ethylamin und 0,223 ml (1 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit wurden zu der Lösung unter einer Argonatmosphäre gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch von Niederschlägen durch Filtration befreit, und das Filtrat wurde durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde in 50 ml Ethylacetat gelöst, und die resultierende Lösung wurde zweimal mit jeweils 50 ml einer eisgekühlten 10%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat gewaschen und über wasserfrei em Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde dann durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie mittels 30 g Silicagel (70 bis 230 mesh) unter Verwendung von Methylenchlorid, Ethylacetat und Triethylamin im Volumenverhältnis von 45 : 45 : 10 als Eluent gereinigt. Fraktionen, die die Titelverbindung enthielten, wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde abdestilllert. Das gleiche chromatographlsche Verfahren wurde wiederholt, wobei man 213,4 mg (Ausbeute: 70%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,55; 7,51 (zusammen 1H, zwei Singuletts);
  • 7,43 - 7,22 (10H, Multiplett);
  • 6,48 - 6,42 (1H, Multiplett);
  • 5,44; 5,42 (zusammen 1H, zwei Singuletts);
  • 4,13 - 4,64 (1H, Multiplett)
  • 4,25; 4,19 (zusammen 1H, zwei breite Singuletts);
  • 3,90 - 3,55 (6H, Multiplett);
  • 2,68 - 2,24 (4H, Multiplett);
  • 1,39 (3H, Singulett);
  • 1,30 - 1,10 (12H, Multiplett). 3(c) Eine Verbindung der Formel 3(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben. wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-Benzhydrylthymidin-2-cyanoethyl- N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3, Eluent B: Acetonitril; 15 T 45 Vol.- % B, 30 Minuten, linearer Gradient; 7 ml/Minute; 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 20,2 Minuten eluiert wurden, wurden vereinigt und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 76 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
  • Retentionszeit: 17,3 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA; pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 10 T 40 Vol.-% B, 30 Minuten, linearer Gradient; 2 ml/Minute; 254 nm).
    • Beispiel 4 Eine Verbindung der Formel 4(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Eingabe der Basensequenz TGGGAGG in den DNA/RNA-Syntheseautomaten, der in Beispiel 1(b) beschrieben wird, wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Eine Aufarbeitung ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, ergab 180 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionsiett von 18,22 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
    • Beispiel 5 5(a) 5'-O-[(1,1-Dimethylethyl)diphenylsilyl]thymidin
  • 1,43 ml (5,5 mmol) tert.-Butyldiphenylsilylchlorid wurden zu einer Lösung von 1,21 g (5 mmol) Thymidin und 0,749 g (11 mmol) Imidazol in 10 ml Dimethylformamid unter einer Argonatmosphäre gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 140 Minuten gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der resultierende Feststoff wurde in 100 ml Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wurde dann fünfmal mit jeweils 100 ml Wasser gewaschen. Die Lösung wurde anschließend über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet; dann wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 100 g Silicagel (70 bis 230 mesh) unter Anwendung des Gradientenelutionsverfahrens mit Methylenchlorid mit einem Gehalt an 0,5 bis 3 Vol.-% Methanol als Eluent gereinigt, wobei man 1,5 g (Ausbeute: 62%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 10,52 (1H, breites Singulett);
  • 7,73 - 7,32 (10H, Multiplett);
  • 7,57 (1H, Singulett);
  • 6,53 - 6,47 (1H, Multiplett);
  • 4,63 (1H, breites Singulett);
  • 4,48 (1H, breites Singulett);
  • 4,11 (1H, breites Singulett);
  • 4,04 - 3,85 (2H, Multiplett);
  • 2,58 - 2,16 (2H, Multiplett);
  • 1,59 (3H, Singulett);
  • 1,10 (9H, Singulett).
    • 5(b) 5'-O-[(1,1-Dimethylethyl)diphenylsilyl]thymidin-2-cyanoethyl- N,N-diisopropylphosphoramidit
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 3(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 240 mg (0,5 mmol) 5'-O-[(1,1-Dimethylethyl)diphenylsilyl]thymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden 254,4 mg (Ausbeute: 74,1% der Titelverbindung erhalten.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,69 - 7,36 (11H, Multiplett);
  • 6,43 - 6,38 (1H, Multiplett);
  • 4,70 - 4,62 (1H, Multiplett);
  • 4,16 - 4,09 (1H, Multiplett);
  • 4,04 - 3,55 (6H, Multiplett);
  • 2,67 - 2,15 (4H, Multiplett);
  • 1,61 (3H, Singulett);
  • 1,22 - 1,05 (12H, Multiplett). 5(c) Eine Verbindung der Formel 5(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-[(1,1-Dimethylethyl)diphenylsilyl]thymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O- Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule (Inertsil PREP- ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B; 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 22,4 Minuten eluiert wurden, wurden vereinigt und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 54 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
  • Retentionszeit: 22,0 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol -% B, 30 Minuten, linearer Gradient; 1 ml/Minute; 254 nm).
    • Beispiel 6 6(a) 5'-O-(3,5-Dibenzyloxybenzyl)thymidin
  • 175 mg (4 mmol) Natriumhydrid (als eine 55%ige (Gew./Gew.) Dispersion in Mineralöl) wurden zu einer Lösung von 713 mg (2 mmol) 3'-O-[(1,1- Dimethylethyl)dimethylsilyl]thymidin [Can. J. Chem., 56, 2768 (1978)] in 4 ml Tetrahydrofuran unter einer Argonatmosphäre gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei 60ºC für 2 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit ließ man das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen. Anschließend wurde eine lösung von 767 mg (2 mmol) 3,5-Dibenzyloxybenzylbromid [Chem. Ber., 102, 2887 (1969)] in 1 ml Tetrahydrofuran tropfenweise zugegeben. 149,9 mg (1 mmol) Natriumiodid wurden anschließend zu dem resultierenden Gemisch gegeben; anschließend wurde das Gemisch bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde in 50 ml Ethylacetat gelöst. Die resultierende Lösung wurde zweimal mit jeweils 50 ml 0,01 N wäßriger Salzsäure gewaschen. Die Lösung wurde dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet; anschließend wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 100 g Silicagel (230 bis 400 mesh) unter Anwendung des Gradientenelutionsverfahrens mit Methylenchlorid mit einem Gehalt an 0,5 bis 3 Vol.-% Methanol als Eluent gereinigt, wobei man 637,3 mg eines Gemisches erhielt, das 3'-O-[(1,1-Dimethylethyl)dimethylsilyl]-5'-O-(3,5-dibenzyloxybenzyl)thymidin enthielt.
  • Die Gesamtmenge dieses Gemisches wurde in 1,93 ml Tetrahydrofuran gelöst. 1,93 ml einer 1 M Tetrahydrofuranlösung von Tetrabutylammoniumfluorid wurden zu der Lösung gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der resultierende Rückstand wurde in 50 ml Ethylacetat gelöst. Diese Lösung wurde zweimal mit jeweils 50 ml gesättigter wißriger Lösung von Natriumchlorid gewaschen. Die Lösung wurde anschließend über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wurde mittels Chromatographie durch 30 g Silicagel (230 bis 400 mesh) unter Anwendung des Gradientenelutionsverfahrens mit Methylenchlorid mit einem Gehalt an 1 bis 3 Vol.-% Methanol als Eluent gereinigt, wobei man 258,5 mg (Ausbeute: 23,7%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,87 (1H, Singulett);
  • 7,52 (1H, Singulett);
  • 7,43 - 6,52 (13H, Multiplett);
  • 6,37 (1H, Triplett, J = 6,75 Hz);
  • 5,03 (4H, Singulett);
  • 4,51 (2H, Dublett, J = 3,30 Hz);
  • 4,50 - 4,44 (1H, Multiplett);
  • 4,06 - 4,03 (1H, Multiplett);
  • 3,17 - 3,63 (2H, Multiplett);
  • 2,32 - 2,12 (2H, Multiplett);
  • 1,67 (3H, Singulett).
    • 6(b) 5'-O-(3,5-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • Nach einem ähnlichen Verfahren dem, das in Beispiel 3(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 258,5 mg (0,475 mmol) 5'-O-(3,5-Dibenzyloxybenzyl)thymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden 307,7 mg (87%) der Titelverbindung erhalten.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 1,56; 7,53 (zusammen 1H, zwei Singuletts);
  • 1,42 - 6,56 (13H, Multiplett);
  • 6,40 (1H, Triplett, J = 6,60 Hz);
  • 5,02 (4H, Singulett);
  • 4,67 - 4,58 (1H, Multiplett);
  • 4,53; 4,51 (zusammen 2H, zwei Singuletts);
  • 4,23; 4,17 (zusammen 1H, zwei breite Singuletts);
  • 3,90 - 3,52 (6H, Multiplett);
  • 2,68 - 2,53 (2H, Multiplett);
  • 2,49 - 2,12 (2H, Multiplett);
  • 1,65 (3H, Singulett);
  • 1,18 (12H, Dublett, J = 5,94 Hz). 6(c) Eine Verbindung der Formel 6(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,5-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit (hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung erhalten. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.- % B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 19,8 Minuten eluiert wurden, wurden vereinigt und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 64,6 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
  • Retentionszeit: 22,8 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten, linearer Gradient; 1 ml/Minute, 254 nm).
    • Beispiel 7 1(a) 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin
  • 713 mg (2 mmol) 3'-O-[(1,1-Dimethylethyl)dimethylsilyl]thymidin [Can. J. Chem., 56, 2768 (1978)] wurden in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst, und 115 mg (4 mmol) Natriumhydrid (als eine 55%ige (Gew./Gew.) Dispersion in Mineralöl) wurden zu der resultierenden Lösung unter einer Argonatmosphäre gegeben. Das Gemisch wurde dann bei 60ºC für 2 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde die Temperatur des Gemisches auf Raumtemperatur verringert, und dann wurden 678 mg (2 mmol) 3,4-Dibenzyloxybenzylchlorid zugegeben, gefolgt von 149,9 mg (1 mmol) Natriumiodid. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 19 Stunden und anschließend bei 60ºC für 5 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wurde in 50 ml Ethylacetat gelöst. Die resultierende Lösung wurde zweimal mit jeweils 50 ml 0,01 N wäßriger Salzsäure gewaschen; sie wurde dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 4 ml Tetrahydrofuran gelöst, und 4 ml einer 1 M Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran wurden zur der Lösung gegeben. Das Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde in 50 ml Ethylacetat gelöst. Die resultierende Lösung wurde zweimal mit jeweils 50 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und über wasserfrei em Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde dann durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde auf eine Chromatographiesäule [LiChroprep (Marke) Si60, 40 bis 63 µm, Größe C, Merck] aufgetragen und unter Anwendung des Gradientenelutionsverfahrens mit Methylenchlorid mit einem Gehalt an 1 bis 4 Vol.-% Methanol eluiert, wobei man 345,4 mg (Ausbeute: 31,7%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,26 (1H, Singulett);
  • 7,50 (1H, Singulett);
  • 7,47 - 7,28 (10H, Multiplett);
  • 6,91 - 6,79 (3H, Multiplett);
  • 6,36 (1H, Triplett, J = 6,75 Hz);
  • 5,17 (4H, Singulett);
  • 4,47; 4,45 (zusammen 2H, zwei Singuletts);
  • 4,41 - 4,36 (1H, Multiplett);
  • 4,04 - 4,01 (1H, Multiplett);
  • 3,72 - 3,56 (2H, Multiplett);
  • 2,31 - 2,05 (2H, Multiplett);
  • 1,62 (3H, Singulett).
    • 7(b) 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • 271,7 mg (0,499 mmol) 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin (hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden dreimal durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet; anschließend wurden sie in 2,5 ml Tetrahydrofuran gelöst. 0,348 ml (2 mmol) N,N-Diisopropyl-N-ethylamin und 0,223 ml (1 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit wurden zu der resultierenden Lösung gegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre für 2 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 50 ml Ethylacetat gelöst, und die resultierende Lösung wurde zweimal mit jeweils 50 ml einer eisgekühlten 10%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der resultierende Rückstand wurde auf eine Säule aufgetragen, die 30 g (70 bis 230 mesh) Silicagel enthielt. Er wurde dann mit etnem Gemisch aus Methylenchlorid, Ethylacetat und Triethylamin im Volumenverhältnis von 45 : 45 : 10 eluiert. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereinigt, das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der resultierende Rückstand wurde auf eine Säule aufgetragen, die 30 g (70 bis 230 mesh) Silicagel enthielt. Er wurde dann mit einem Gemisch aus Methylenchlorid, Ethylacetat und Triethylamin im Volumenverhältnis von 6 : 3 : 1 eluiert, wobei man 286,9 mg (Ausbeute: 77%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (C0Cl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,07 (1H, breites Singulett);
  • 7,53; 7,51 (zusammen 1H, zwei Singuletts);
  • 7,45 - 7,25 (10H, Multiplett);
  • 6,92 - 6,81 (3H, Multiplett);
  • 6,37 (1H, Triplett, J = 6,60 Hz);
  • 5,15 (4H, Singulett);
  • 4,62 - 4,53 (1H, Multiplett);
  • 4,47 (2H, Singulett);
  • 4,22; 4,14 (zusammen 1H, zwei breite Singuletts);
  • 3,90 - 3,53 (6H, Multiplett);
  • 2,68 - 2,53 (2H, Multiplett);
  • 2,47 - 2,05 (2H, Multiplett);
  • 1,58 (3H, Singulett);
  • 1,17 (12H, Dubletts, J = 5,94 Hz). 7(c) Eine Verbindung der Formel 1(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde dann in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 254 nm) gereinigt.
  • Fraktionen, die nach 22,5 Minuten eluiert wurden, wurden vereinigt und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 55,7 OD (260 nm) der Titelverbindung als amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
  • Retentionszeit: 13,6 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten, linearer Gradient; 2 ml/Minute; 254 nm).
    • Beispiel 8 Eine Verbindung der Formel 8(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es im vorstehenden Beispiel 7(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin- 2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit, unter Verwendung einer Säule, die mit 5 µmol A-CPG [d.h. Adenindesoxyribonucleosid (A), gekuppelt an Glas mit kontrollierten Poren] gepackt war, und unter Eingabe der Basensequenz TGGGA in den Syntheseautomaten wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule [Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA; pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 23,3 Minuten eluiert wurden, wurden vereinigt und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 86,2 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 256 nm
  • Retentionszeit: 14,2 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 1,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten, linearer Gradient; 2 ml/Minute, 254 nm).
    • Beispiel 9 Eine Verbindung der Formel 9(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in vorstehendem Beispiel 7(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin- 2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit und unter Eingabe der Basensequenz TGGG in den Syntheseautomaten wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 1,3; Eluent B: Acetonitril; 25 T 55 Vol.- % B, 30 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 19,5 Minuten eluiert wurden, wurden vereinigt und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 77,5 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
  • Retentionszeit: 14,8 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 1,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten, linearer Gradient; 2 ml/Minute; 254 nm).
    • Beispiel 10 Eine Verbindung der Formel 10(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es im vorstehenden Beispiel 7(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin- 2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit und unter Eingabe der Basensequenz TGGGG in den Syntheseautomaten wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 1,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.- % B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 22,9 Minuten eluiert wurden, wurden vereinigt und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 19,8 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
  • Retentionszeit: 14,1 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 1,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.% B, 30 Minuten, linearer Gradient; 2 ml/Minute; 254 nm).
    • Beispiel 11 11(a) 5'-O-[(Pyren-1-yl)methyl]thymidin
  • Ein Gemisch aus 875 mg Natriumhydrid (als eine 55%ige (Gew./Gew.) Dispersion im Mineralöl) in 5 ml Dimethylsulfoxid wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt, und anschließend wurde eine Lösung von 2,42 g (10 mmol) Thymidin in 5 ml Dimethylsulfoxid tropfenweise zu dem resultierenden Gemisch gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Anschließend wurde eine Suspension von 2,51 g (10 mmol) 1-(Chlormethyl)pyren (Acta Chem. Scand., 10, 1362 (1956)] in 15 ml Dimethylsulfoxid zugegeben. Das Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur für 90 Minuten gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch in 100 ml Eiswasser gegossen, und das wäßrige Gemisch wurde mit 100 ml Ethylacetat und dann 100 ml Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wurde über wasserfrei em Magnesiumsulfat getrocknet, und dann wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 150 g Silicagel (230 bis 400 mesh) unter Anwendung des Gradientenelutionsverfahrens mit einem Gemisch aus Methylenchlorid mit einem Gehalt an bis 4 Vol -% Methanol als Eluent gereinigt, wobei man 292,4 mg (Ausbeute: 6,4%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (hexadeuteriertes Dimethylsulfoxid, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,44 - 8,07 (9H, Multiplett);
  • 1,44 (1H, Singulett);
  • 6,19 (1H, Triplett, J = 6,75 Hz);
  • 5,33 (1H, Dublett, J = 5,4 Hz);
  • 5,29 (2H, Singulett);
  • 4,37 - 4,30 (1H, Multiplett);
  • 4,00 - 3,96 (1H, Multiplett);
  • 3,92 - 3,79 (2H, Multiplett);
  • 2,10 - 2,04 (2H, Multiplett);
  • 1,20 (3H, Singulett).
    • 11(b) 5'-O-[(Pyren-1-yl)methyl]thymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • 91,3 mg (0,2 mmol) 5'-O-[(Pyren-1-yl)methyl]-thymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden dreimal durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet; anschließend wurden sie in 2 ml Tetrahydrofuran suspendiert. 139 µl (0,8 mmol) N,N-Diisopropyl-Methylamin und 89 µl (0,4 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit wurden zu der Suspension unter einer Argonatmosphäre gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Am Ende dieser Zeit wurden die Niederschläge durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde vom Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck befreit. Der Rückstand wurde in 20 ml Ethylacetat gelöst, und die resultierende Lösung wurde zweimal mit jeweils 20 ml einer eisgekühlten 10%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat gewaschen. Die Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 30 g Silicagel (70 bis 230 mesh) unter Verwendung eines Gemisches aus Methylenchlorid, Ethylacetat und Triethylamin im Volumenverhältnis 6 : 3 : 1 als Eluent gereinigt, wobei man 100,2 mg (Ausbeute: 76%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,36 - 7,99 (9H, Multiplett);
  • 7,50; 7,46 (zusammen 1H, zwei Singuletts);
  • 6,35 (1H, Triplett, J = 6,60 Hz);
  • 5,38 - 5,22 (2H, Multiplett);
  • 4,60 - 4,50 (1H, Multiplett);
  • 4,25 - 4,17 (1H, Multiplett);
  • 4,01 - 3,77 (2H, Multiplett);
  • 3,73 - 3,44 (4H, Multiplett);
  • 2,78 - 2,09 (4H, Multiplett);
  • 1,31; 1,29 (zusammen 3H, zwei Singuletts);
  • 1,10 - 1,05 (12H, Multiplett). 11(c) Eine Verbindung der Formel 11(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-[(Pyren-1-yl)methyl]-thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.- % B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 15,4 Minuten eluiert wurden, wurden vereinigt und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 80 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 243 nm
  • Retentionszeit: 16,4 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA; pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 254 nm).
    • Beispiel 12 12(a) O-Dimethoxytritylethylenglycol
  • 3,1 g (50 mmol) Ethylenglycol wurden durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und anschließend in 40 ml Pyridin gelöst. 3,38 g (10 mmol) 4,4'-Dimethoxytritylchlorid wurden zu der Lösung gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Nachdem das Verschwinden des Ausgangsmaterials durch Dünnschichtchromatographie bestätigt worden war, wurden 5 ml Methanol zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und das Gemisch wurde dann auf etwa die Hälfte seines Volumens durch Destillation unter verringertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde in 100 ml Methylenchlorid gelöst, und die resultierende Lösung wurde mit einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat gewaschen. Die organische Lösung wurde durch ein 1PS-Filterpapier (Whatman) filtriert, und das Filtrat wurde vom Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck befreit. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 100 g Silicagel (70 bis 230 mesh) unter Verwendung von Methylenchlorid mit einem Gehalt an 1 Vol.-% Methanol als Eluent gereinigt, wobei man 1,97 g der Titelverbindung als eine gummiartige Substanz erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,45 - 6,82 (13H, Multiplett);
  • 3,79 (6H, Singulett);
  • 3,75 (2H, Triplett, J = 4,95 Hz);
  • 3,25 (2H, Triplett, J = 4,62 Hz);
  • 1,95 (1H, Triplett). 12(b) Eine Verbindung der Formel 12(b):
  • 0,18 g (0,5 mmol) O-Dimethoxytritylethylenglycol [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und dann in 2 ml Methylenchlorid gelöst. 75 mg (0,75 mmol) Bernsteinsäureanhydrid und 92 mg (0,75 mmol) 4- (Dimethylamino)pyridin wurden dann zu der Lösung gegeben, und das resultierende Gemisch wurde für 1 Stunde gerührt. Nachdem das Verschwinden des Ausgangsmaterials durch Dünnschichtchromatographie bestätigt worden war, wurde das Reaktionsgemisch mit Methylenchlorid verdünnt, und die verdünnte Lösung wurde mit einer 0,5 M wäßrigen Lösung von Kaliumdihydrogenphosphat (pH-Wert: 5,0) und mit Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, wobei man O-Dimethoxytritylethylenglycolmonosuccinat erhielt.
  • Die Gesamtmenge dieser Verbindung wurde durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und anschließend in 3.ml Dimethylformamid gelöst. 0,16 g (0,75 mmol) Pentachlorphenol und 0,16 mg (0,75 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid wurden dann zu der Lösung gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 42 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit wurden unlösliche Materialien abfiltriert, und das Filtrat wurde durch Destillation unter verringertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit Benzol gemischt, und die resultierenden unlöslichen Materialien wurden erneut abfiltriert. Anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt.
  • 0,25 g (0,2 mmol) des Rückstands, der hergestellt wurde, wie es vorstehend beschrieben wurde, wurden in 4 ml Dimethylformamid gelöst, und 60 µl (0,44 mmol) Triethylamin und 2,0 g (3-Aminopropyl)-CPG (mit einem Gehalt an 0,129 mollg Aminogruppen) wurden zu der Lösung gegeben. Man ließ das resultierende Gemisch dann bei Raumtemperatur für 36 Stunden stehen. Am Ende dieser Zeit wurde der CPG-Träger durch Filtration aufgefangen, mit Methylenchlorid gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Der CPG-Träger wurde mit jeweils 10 ml an "Cap A"- und "Cap B"-Lösung (Millipore Ltd., Japan) gemischt, und man ließ das Gemisch für 10 Minuten stehen, um alle Aminogruppen, die nicht umgesetzt verblieben waren, zu acetylieren. Das Reaktionsprodukt wurde dann mit Pyridin und Methylenchlorid in dieser Reihenfolge gewaschen; anschließend wurde es im Vakuum getrocknet, wobei man die Titelverbindung der Formel 12(b) erhielt. Die "Cap A"-Lösung ist ein Gemisch aus Essigsäureanhydrid und Tetrahydrofuran im Volumenverhältnis 1 9, und die "Cap B"-Lösung ist ein Gemisch aus N-Methylimidazol und Tetrahydrofuran im Volumenverhältnis 1 : 4.
  • Der Anteil der von O-Dimethoxytritylethylenglycol abgeleiteten Reste, die in die Verbindung von Beispiel 12(b) eingeführt wurden, wurde quantitativ wie folgt analysiert. Ein Gemisch aus 9,6 mg der Verbindung von Beispiel 12(b) und eine "Deblock"-Lösung (eine Lösung aus Dichloressigsäure in Methylenchlorid; Millipore Ltd., Japan) wurde für 3 Minuten geschüttelt, und anschließend wurde ausreichend Methylenchlorid zu der Lösung gegeben, um ein Gesamtvolumen von 20 ml zu erzielen. 0,4 ml dieser Lösung wurden in ein Teströhrchen überführt und für die Messung herangezogen Die Probenlösung wurde vom Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck befreit, und der Rückstand wurde in einem Gemisch aus Perchlorsäure und Ethanol im Volumenverhältnis 3 : 2 gelöst. Die Extinktion des Dimethoxytritylkations in der Lösung wurde bei 500 nm bestimmt.
  • Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die Menge an eingeführten Dimethoxytritylgruppen 40,0 µmol/g betrug. 12(c) Eine Verbindung der Formel 12(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 125 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 12(b) gepackt war und unter Eingabe der Basensequenz TGGGAGZ (in der Z ein Dummycode ist, wie er in Beispiel 17 erklärt wird) in den Syntheseautomaten wurde die Titelverbindung unter Verwendung des DNA/RNA-Syntheseautomaten, der in Beispiel 1(b) beschrieben wird, hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 165 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil 005, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.- % B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,76 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 13 Eine Verbindung der Formel 13(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 12(c) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 151 mg (5 mmol) 3'-Amino-ON-CPG (Marke für ein Produkt von Clontech) wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Produkt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 165 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH- Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten, linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,76 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
    • Beispiel 14 Eine Verbindung der Formel 14(a):
  • Ein Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 12(c) beschrieben wird, wurde wiederholt, jedoch mit der folgenden Modifikation. Die Verbindung von Beispiel 12(b) wurde zuerst mit Guanindesoxyribonucleotid-β-amidit an der 3'-terminalen Position gekuppelt, und die Säule wurde dann aus dem Syntheseautomaten ohne Oxidation durch eine Oxidationslösung entnommen. 5 ml einer Acetonitrillösung von Tetraethylthiuramdisulfid (TETD) (Applied Biosystems) wurden dann zu der Säule gegeben, die man dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen ließ. Die Säule wurde anschließend mit Acetonitril gewaschen und in den Syntheseautomaten eingesetzt.
  • In der Reinigungsstufe wurde die Chromatographie durch eine Umkehrphasensilicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) durchgeführt Durch Aufarbeitung auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, erhielt man 33 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,92 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 15 15(a) 5'-O-Trityl-N-benzoyl-2'-desoxycytidin
  • 3,31 g (10 mmol) N-Benzoyl-2'-desoxycytidin wurden zu 25 ml Pyridin gegeben, und anschließend wurden 3,07 g (11 mmol) Tritylchlorid zu der Suspension gegeben. Die resultierende Suspension wurde bei 100ºC für 1 Stunde gerührt; anschließend ließ man sie auf Raumtemperatur abkühlen. Das Pyridin wurde dann durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde in einem Gemisch aus Ethylacetat und gesättigter wäßriger Lösung von Natriumchlorid gelöst. Die organische Schicht wurde abgetrennt und zweimal mit jeweils einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen. Die Lösung wurde dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet; anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch Silicagel (Lober-Säule Si-60, Größe C) unter Anwendung des Gradientenelutionsverfahrens mit Gemischen aus Methanol und Methylenchlorid im Bereich von 2 : 98 bis 5 : 95, bezogen auf das Volumen, als Eluent gereinigt, wobei man 1,47 g (Ausbeute: 26%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,72 (1H, breites Singulett);
  • 8,26 (1H, Dublett, J = 7,3 Hz);
  • 7,89 (1H, Dublett, J = 7,3 Hz);
  • 7,26 - 7,64 (20H, Multiplett);
  • 6,29 (1H, Triplett, J = 5,9 Hz);
  • 4,48 - 4,53 (1H, Multiplett);
  • 4,12 - 4,16 (1H, Multiplett);
  • 3,42 - 3,57 (2H, Multiplett);
  • 2,23 - 2,77 (2H, Multiplett);
  • 2,51 (1H, breites Singulett).
    • 15(b) 5'-O-Trityl-N-benzoyl-2'-desoxycytidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • 402 mg (0,7 mmol) 5'-O-Trityl-N-benzoyl-2'-desoxycytidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und anschließend in 3,5 ml Methylenchlorid gelöst. 60 mg (0,35 mmol) Diisopropylammoniumtetrazolid wurden zu der Lösung gegeben. 245 pl (0,77 mmol) 2-Cyanoethyl- N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit wurden dann tropfenweise unter einer Argonatmosphäre zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3,5 Stunden unter der gleichen Atmosphäre gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Methylenchlorid durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wurde mit einer 10%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat und mit einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Lösung wurde dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet; anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 23 g Silicagel (10 bis 230 mesh) unter Verwendung von Ethylacetat als Eluent gereinigt, wobei man 331 mg (Ausbeute: 62%) der Titelverbindung als eine schaumartige Substanz erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,87 (1H, breites Singulett);
  • 8,52 und 8,43 (1H, Dublett, J = 7,3 Hz);
  • 8,12 und 8,11 (1H, Dublett, J = 7,3 Hz);
  • 1,23 - 7,86 (20H, Multiplett);
  • 6,49 - 6,55 (1H, Multiplett);
  • 4,79 - 4,91 (1H, Multiplett);
  • 4,46 - 4,47 (1H, Multiplett);
  • 3,60 - 4,10 (6H, Multiplett);
  • 2,46 - 3,08 (4H, Multiplett);
  • 1,29 - 1,40 (12H, Multiplett). 15(c) Eine Verbindung der Formel 15(c):
  • Ein Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß eine 35 mM Acetonitrillösung der Verbindung von Beispiel 15(b) in die Amiditflasche (bezeichnet als "X") gegeben wurde und daß die Basensequenz XGGGG in den Syntheseautomaten eingegeben wurde. Die 90%ige wäßrige Formamidlösung, die Titelverbindung enthielt und auf diese Weise erhalten wurde, wurde auf 95ºC für 5 Minuten erwärmt und anschließend unmittelbar auf Eis abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in vier Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil PREP-ODS 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,0; Eluent B: Acetonitril; 10 bis 60 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 260 nm; Säulentemperatur: 60ºC) gereinigt. Fraktionen, die nach 20,9 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefangen auf eine Weise ähnlich der, die Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 68 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
  • Retentionszeit: 13,25 Minuten
  • [durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS-2; 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 bis 60 Vol.% B, 20 Minuten, linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm)).
    • Beispiel 16 16(a) Eine Verbindung der Formel 16(a):
  • 0,26 g (0,5 mmol) O-Dimethoxytritylhexaethylenglycol [Nucleic Acids Res., 18, 6353 (1990)] wurden durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und dann in 2 ml Methylenchlorid gelöst. 75 mg (0,75 mmol) Bernsteinsäureanhydrid und 92 mg (0,75 mmol) 4-(Dimethylamino)pyridin wurden anschließend zu der Lösung gegeben, und das resultierende Gemisch wurde für 2 Stunden gerührt. Nachdem der Abschluß der Reaktion durch Dünnschichtchromatographie bestätigt worden war, wurde das Reaktionsgemisch mit Methylenchlorid verdünnt, und das verdünnte Gemisch wurde mit 0,5 M wäßriger Lösung von Kaliumdihydrogenphosphat (pH-Wert: 5,0) und mit Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die organische Schicht wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, wobei man O-Dimethoxytritylhexaethylenglycolmonosuccinat erhielt.
  • Die Gesamtmenge dieses Produkts wurde durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und dann in 3 ml Dimethylformamid gelöst. 0,23 g (0,37 mmol) Pentachlorphenol und 0,12 g (0,56 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid wurden zu der Lösung gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde unlösliches Material, das ausgefallen war, abfiltriert, und das Filtrat wurde durch Verdampfen unter verringertem Druck vom Lösungsmittel betreit. Der Rückstand wurde in Benzol gelöst, und das resultierende unlösliche Material wurde erneut abfiltriert; anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt.
  • 30 µl (0,22 mmol) Triethylamin und 1,0 g (3-Aminopropyl)-CPG (mit einem Gehalt an 0,129 mmol/g Aminogruppen) wurden dann zu einer Lösung von 0,23 g (0,18 mmol) des Rückstands in 5 ml Dimethylformamid gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden stehengelassen. Am Ende dieser Zeit wurde der CPG-Träger durch Filtration gewonnen und mit Methylenchlorid gewaschen; anschließend wurde er im Vakuum getrocknet. Um die nicht umgesetzt verbliebenen Aminogruppen zu acetylieren, wurde der CPG-Träger mit jeweils 3 ml "Cap A"- und "Cap B"-Lösung (Millipore Ltd., Japan) gemischt, und man ließ das Gemisch für 10 Minuten stehen. Das Reaktionsprodukt wurde dann mit Pyridin und mit Methylenchlorid in dieser Reihenfolge gewaschen; anschließend wurde es im Vakuum getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhielt.
  • Die Menge an O-Dimethoxytritylhexaethylenglycolresten, die in die Verbindung von Beispiel 16(a) eingeführt wurden, wurde wie folgt bestimmt. Die Verbindung (9,7 mg) von Beispiel 16(a) wurde genau abgemessen, und eine "Deblock"-Lösung (eine Methylenchloridlösung von Dichloressigsäure; Millipore Ltd., Japan) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde für 3 Minuten geschüttelt, und anschließend wurde ausreichend Methylenchlorid zugegeben, um 20 ml zu erzielen. 0,4 ml davon wurden in ein Teströhrchen überführt, und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. 3 ml eines Gemisches aus Perchlorsäure und Ethanol im Volumenverhältnis 3 : 2 wurden zu dem Rückstand gegeben, und die Extinktion (ε = 71700) des Dimethoxytritylkations bei 500 nm wurde gemessen.
  • Die eingeführte Menge an Dimethoxytr4tylgruppen betrug 59,1 µmol/g. 16(b) Eine Verbindung der Formel 16(b):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 12(c) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 85 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 16(a) gepackt war, wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Produkt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH- Wert: 1,5; 5 T 50 Vol.-% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Durch Aufarbeiten auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, wurde die Titelverbindung der Formel 16(b) mit 151 OD (260 nm) als amorpher Feststoff erhalten. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.- % B; 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,50 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 17 Eine Verbindung der Formel 17(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 85 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 16(a) gepackt war, und unter Verwendung einer 35 mM Acetonitrillösung von O-Dimethoxytritylhexaethylenglycol-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit) [Nucleic Acids Res., 18, 6353 (1990)], die in die Amiditflasche gegeben wurde (und hier als "X" bezeichnet wird], und durch Eingabe der Basensequenz TGGGAGXZ in den Syntheseautomaten wurde die Titelverbindung hergestellt. In diesem Beispiel und an anderen Stellen hat X die vorstehende Definition, und Z stellt einem Dummycode dar, d.h. einen Code, der in den Syntheseautomaten eingegeben wird, wobei jedoch keine tatsächliche Base eingegeben wird; bei Eingabe des Dummycodes in den Syntheseautomaten kann einer beliebiger der Codes A, G, C, T oder X eingegeben werden, was jedoch nicht dazu führt, daß eine Base an die Sequenze addiert wird. Das Produkt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkherphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15cm; 50 mM TEAB; pH-Wert: 7,5; T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Durch Aufarbeiten auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, wurde die Titelverbindung mit 136 OD (260 nm) als amorpher Feststoff erhalten. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,32 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 18 Eine Verbindung der Formel 18(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 17 beschrieben wird, jedoch unter Eingabe der Basensequenz TGGGAGXXZ (in der X und Z die gleiche Definition wie in Beispiel 11 aufweisen) in den Syntheseautomaten wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Produkt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 5 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 136 OD (260 nm) der Titelverbindung der Formel 18(a) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 nm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH- Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,20 aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
    • Beispiel 19 Eine Verbindung der Formel 19(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 17 beschrieben wird, jedoch unter Eingabe der Basensequenz TGGGAGXXXZ (in der X und Z wie in Beispiel 17 definiert sind) in den Syntheseautomaten wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 5 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 110 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 17,99 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 20 Eine Verbindung der Formel 20(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 2(c) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 85 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 16(a) gepackt war und unter Eingabe der Basensequenz TGGGAGZ (in der Z wie in Beispiel 17 definiert ist) in den DNA/RNA- Syntheseautomaten, der in Beispiel 1(b) beschrieben wird, wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Produkt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB; pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 177 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 1,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 19,10 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 21 21(a) Eine Verbindung der Formel 21(a):
  • Eine Lösung von 250 mg 5'-Phosphat-ON (Marke für ein Produkt von Clontech) in 5,2 ml Acetonitril und eine Säule, die mit 15 µmol C-CPG (Millipore Ltd., Japan) gepackt war, wurden in dem DNA/RNA-Syntheseautomaten, der in Beispiel 1(b) beschrieben wird, verwendet, um die Titelverbindung quantitativ herzustellen. 21(b) Eine Verbindung der Formel 21(b):
  • 5 ml einer "Deblock"-Lösung (Millipore Ltd., Japan) wurden in eine Säule gegeben, die mit einem Filter ausgestattet und mit 115 mg (4 µmol) der Verbindung von Beispiel 21(a) gepackt war. Man ließ die Säule dann für 1 Minute stehen; anschließend wurde sie mit 5 ml Methylenchlorid gewaschen und dann mit einer Deblock-Lösung für 1 Minute behandelt. Das Gemisch wurde dann mit 5 ml Methylenchlorid und 5 ml Pyridin in dieser Reihenfolge gewaschen; anschließend erfolgte eine azeotrope Destillation mit Pyridin. Eine Lösung von 20 mg Triethylammonium-5'-O-dimethoxytrityl-2-N- isobutyryl-2'-desoxyguanosin-3'-O-(2-chlorphenyl)-phosphat [Nucleic Acids Res., 8, 5461 (1980)] in 0,5 ml Pyridin wurde dann zu dem der Destillaten unterzogenen Produkt gegeben; anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Eine Lösung von 40 mg 2,4,6-Trimethylbenzolsulfonyl-3-nitrotriazol in 0,5 ml Pyridin wurde zu dem Rückstand gegeben, und das resultierende Gemisch wurde für 30 Minuten auf 40ºC erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend dreimal mit jeweils 5 ml Pyridin gewaschen, und anschließend wurden 2,5 ml "Cap A"-Lösung (Millipore Ltd., Japan) und 2,5 ml "Cap B"-Lösung (Millipore Ltd., Japan) zu dem Gemisch gegeben. Das Gemisch wurde für 3 Minuten stehengelassen; anschließend wurde es dreimal mit jeweils 5 ml Methylenchlorid gewaschen, wobei man die Titelverbindung erhielt. 21(c) Eine Verbindung der Formel 21(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 115 mg (4 mmol) der Verbindung von Beispiel 21(b) gepackt war, und unter Verwendung von Thymindesoxyribonucleotid-β-amidit (Millipore Ltd., Japan) anstelle von 5'- O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 5 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Anschließend wurde es auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 85 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 50 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 21,5 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 22 22(a) Triethylammonium-5'-O-dimethoxytrityl-2-N-isobutyryl-2'-desoxyguanosin-3'-O-phenylphosphat
  • 0,8 g (11,55 mmol) 1,2,4-Triazol wurden durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und anschließend in 10 ml Dioxan suspendiert. 0,52 ml (3,5 mmol) Phenylphosphordichloridat wurden zu der Suspension gegeben, gefolgt von 1,0 ml (7,35 mmol) Triethylamin, und zwar unter Eiskühlung und Rühren; anschließend ließ man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen. Das Gemisch wurde für 2 Stünden gerührt; anschließend wurde das abgeschiedene Hydrochlorid abfiltriert, wobei man eine Dioxanlösung mit einem Gehalt an 0,35 mol/ml Phenylphosphorbis(triazolidat) erhielt.
  • 1 ml (0,35 mmol) der Dioxanlösung von Phenylphosphorbls(triazolidat), das hergestellt wurde, wie es vorstehend beschrieben wurde, wurde zu 0,15 g (0,23 mmol) 5'-O-Dimethoxytrityl-2-N-isobutyryl-2'-desoxyguanosin [Methods Enzymol., 65, 610 (1980)] gegeben, und das resultierende Gemisch wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur geruhrt. Am Ende dieser Zeit wurden etwa 10 ml 30 volumenprozentiges wäßriges Pyridin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 30 ml Methylenchlorid extrahiert, und der Extrakt wurde mit 0,1 M TEAB gewaschen. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der resultierende Rückstand wurde in 1 ml Methylenchlorid gelöst und mit 30 ml eines Gemisches aus Hexan und Diethylether im Volumenverhältnis 1 : 1 mit einem Gehalt an 1 Vol.-% Triethylamin verrieben, wobei man 81 mg (Ausbeute: 40%) der Titelverbindung als ein Pulver erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 12,07 (1H, breites Singulett);
  • 9,67 (1H, breites Singulett);
  • 7,80 - 7,64 (1H, Multiplett);
  • 7,47 - 6,91 (18H, Multiplett);
  • 6,12 - 6,10 (1H, Multiplett);
  • 5,48 - 5,45 (1H, Multiplett);
  • 4,64 - 4,58 (1H, Multiplett);
  • 4,28 (1H, Multiplett);
  • 3,74 (6H, Singulett);
  • 3,38 - 3,18 (2H, Multiplett);
  • 2,98 - 2,89 (6H, Multiplett);
  • 2,73 - 2,51 (2H, Multiplett);
  • 2,34 - 2,29 (1H, Multiplett);
  • 1,25 - 1,19 (9H, Multiplett);
  • 1,12 - 0,99 (6H, Multiplett). 22(b) Eine Verbindung der Formel 22(b):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 21(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 143 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 21(a) und der Verbindung von Beispiel 22(a) wurde die Titelverbindung erhalten. 22(c) Eine Verbindung der Formel 22(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 143 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 22(b) gepackt war, wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde anschließend mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB; pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 66 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 1,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,22 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
    • Beispiel 23 Eine Verbindung der Formel 23(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch. unter Verwendung einer Säule, die mit 115 mg (4 µmol) der Verbindung von Beispiel 21(b) gepackt war, wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB; pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 56 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,38 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
    • Beispiel 24 24(a) Eine Verbindung der Formel 24(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 21(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 143 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 21(a) und unter Verwendung von Triethylammonium-5'-0-dimethoxytrityl-2-N-isobutyryl-2'-desoxyguanosin-3'-(4-chlorphenyl)phosphat [Methods Enzymol., 65, 610 (1980)] wurde die Titelverbindung erhalten. 24(b) Eine Verbindung der Formel 24(b):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 143 mg (4 µmol) der Verbindung von Beispiel 24(a) gepackt war, wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB; pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 55 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetanitril; 10 T 60 Vol.% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigt, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,55 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
    • Beispiel 25 DMT-O-TGGGAG-OH
  • Die gewünschte Basensequenz (5'-TGGGAG-3') wurde in einen Syntheseautomaten 380B (ein Produkt von Applied Biosystems Inc.) eingegeben, und eine Säule (1 µmol-Maßstab) mit Glas mit kontrollierten Poren, das an das entsprechende Nucleosid (2'-Desoxyguanosin) am 3'-Ende gebunden war, wurde damit verbunden. Die Synthese wurde in einem Maßstab von 1 µmol durchgeführt. Die Vorrichtung wurde so eingestellt, daß die DMT-Schutzgruppe nach Abschluß der Reaktion nicht entfernt wurde, und das Produkt mit der DMT-Gruppe wurde automatisch von dem Harz befreit, wobei man ein Oligodesoxyribonucleotid als eine Ammoniaklösung erhielt. Diese Lösung wurde in einem Fläschchen dicht verschlossen und für 8 Stunden auf 55ºC erwärmt, und der Ammoniak wurde in einem Stickstoffstrom verdampft. Der resultierende Rückstand wurde in einer kleinen Menge 0,1 M TEAA (pH-Wert: 7,0) gelöst. Diese Lösung wurde durch einen Millipore-Filter (0,2 µm) filtriert, und das Filtrat wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Cosmosil 5C18-AR, 20 × 250 mm) unter den nachstehend angegebenen Bedingungen gereinigt. Fraktionen, die nach 13,5 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefangen und vom Lösungsmittel (Acetonitril) durch Destillation unter verringertem Druck befreit; es folgte eine Lyophilisierung, wobei man 800 µg der Titelverbindung erhielt.
  • Elutionszeit: 17,0 Minuten
    • Bedingungen für die präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie:
  • Pufferlösung A: 0,1 M Triethylammoniumacetatpuffer (pH-Wert: 7,0);
  • Pufferlösung B: 100% Acetonitril;
  • Durchflußgeschwindigkeit: 9 ml/min
    • Beispiele 26 bis 81
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 25 beschrieben wird, wurden die Verbindungen der Beispiele 26 bis 81 synthetisiert. Die Namen der Verbindungen und ihre Elutionszeiten sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Tabelle 3 (Fortsetzung) Tabelle 3 (Fortsetzung)
    • Beispiel 82 82(a) Eine Verbindung der Formel 82(a):
  • Die erforderlichen Reagenzien für die Synthese, wie sie ausführlich nachstehend angegeben sind, wurden einem Cyclone (Marke) Plus DNA/RNA- Syntheseautomaten von Milligen/Biosearch (Millipore Ltd., Japan) zugeführt. Außerdem war eine Programmpatrone für das Amiditverfahren (15 µmol) installiert. Es wurde eine ungefähr 35 mM Acetonitrillösung von 5'- O-Dimethoxytrityl-2-N-isobutyryl-2'-desoxyguanosin-3'-O-(methyl-N,N-diisopropylphosphoramidit) (Sigma) anstelle des β-Cyanoethylamidits, das Guanosin entspricht, verwendet. Unter Verwendung einer leeren Säule (15,0 µmol), die mit 143 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 21(a) gepackt war, Eingabe der Basensequenz GX in den Syntheseautomaten und Abarbeiten des Programms ohne Säurebehandlung nach Bindung der Base G wurde die Titelverbindung erhalten. 82(b) Eine Verbindung der Formel 82(b):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 143 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 82(a) gepackt war, wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Produkt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH- Wert: 1,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde anschließend auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 66 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil 005, 6 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 17,54 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 83 83(a) Eine Verbindung der Formel 83(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 82(a) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 143 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 21(a) wurde die Titelverbindung hergestellt. Genauer gesagt wurde die Säule nach Kupplung mit 5'-O-Dimethoxytrityl-2-N-isobutyryl-2'-desoxyguanosin-3'-O-(methyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit aus dem DNA/RNA- Syntheseautomaten ohne Oxidation durch eine Oxidationslösung entnomen. 5 ml einer Acetonitrillösung von Tetraethylthiuramdisulfid (TETD) (Applied Biosystems) wurden in die Säule gegeben, und man ließ die Säule bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehen. Die Säule wurde anschließend mit Acetonitril gewaschen und in dem Syntheseautomaten installiert. 83(b) Eine Verbindung der Formel 83(b):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 143 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 83(a) gepackt war, wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 111 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient, 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 17,72 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 84 84(a) Eine Verbindung der Formel 84(a):
  • Die erforderlichen Reagenzien für die Synthese, die nachstehend ausführlich angegeben werden, wurden einem Cyclone (Marke) Plus DNA/RNA-Syntheseautomaten von Milligen/Biosearch (Millipore Ltd., Japan) zugeführt. Ebenfalls installiert wurde eine Programmpatrone für das Amiditverfahren (15 µmol). Es wurde eine ungefähr 35 mM Tetrahydrofuranlösung von Desoxyguanosin-(N-iBu)-methylphosphonamidit (American Bionetic Inc.) anstelle einer Lösung des β-Cyanoethylamidits, das Guanosin entsprach, verwendet. Unter Verwendung einer leeren Säule (15,0 µmol), die mit 143 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 21(a) als fester Träger gepackt war, Eingabe der Basensequenz GZ (in der Z wie in Beispiel 17 definiert ist) und Abarbeiten des Programms ohne Säurebehandlung nach Bindung der Base G wurde die Titelverbindung erhalten. 84(b) Eine Verbindung der Formel 84(b):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 143 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 84(a) gepackt war, wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 159 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,03 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 85 85(a) Eine Verbindung der Formel 85(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 84(a) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 143 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 21(a) gepackt war, wurde die Titelverbindung hergestellt. Genauer gesagt wurde die Säule nach Kupplung mit Desoxyguanosin-(N-iBu)methylphosphonamidit aus dem Syntheseautomaten ohne Oxidation durch eine Oxidationslösung entnommen, und anschließend wurden 5 ml einer Acetonitrillösung von Tetraethylthiuramdisulfid (TETD) (Applied Biosysteins) in die Säule gegeben. Die Säule wurde dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen; anschließend wurde sie mit Acetonitril gewaschen und wieder in den Syntheseautomaten eingesetzt. 85(b) Eine Verbindung der Formel 85(b):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 143 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 85(a) gepackt war, wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 124 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 min; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,07 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 86 Eine Verbindung der Formel 86(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 143 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 21(a) gepackt war und unter Eingabe der Basensequenz TGGGAGZ (in der Z wie in Beispiel 11 definiert ist) in den DNA/RNA-Syntheseautomaten, der in Beispiel 1(b) beschrieben wird, wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 54 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: 15 T 65 Vol.-% Acetonitril, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 15,20 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
    • Beispiel 81 Eine Verbindung der Formel 81(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 86 beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer Säule, die mit 143 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 21(a) gepackt war, wurde die Titelverbindung hergestellt. Genauer gesagt wurde die Säule nach der ersten Kupplung mit G- β-Amidit am 3'-Ende aus dem DNA/RNA-Syntheseautomaten ohne Oxidation durch eine Oxidationslösung entnommen. 5 ml einer Acetonitrillösung von Tetraethylthiuramdisulfid (TETD) (Applied Biosystems) wurden in die Säule gegeben, und man ließ die Säule 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen; anschließend wurde sie mit Acetonitril gewaschen und in den Syntheseautomaten eingesetzt.
  • Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB; pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 136 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,02 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 88 Eine Verbindung der Formel 88(a):
  • Ionenaustauscherharz Dowex 50W-X2 (Marke für ein Produkt von Dow Chemical Co.; H-Form; etwa 1 ml) wurde in eine Säule gepackt, und 3 ml 20% (Vol./Vol.) wäßriges Pyridin wurden durch die Säule geleitet, die anschließend mit Wasser gewaschen wurde, um die Pyridinium-Form des Harzes in der Säule herzustellen. Nach einem ähnlichen Verfahren, jedoch unter Verwendung von 3 ml einer 1N wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid wurde die Natrium-Form des Harzes in einer anderen Säule hergestellt. Die Verbindung von Beispiel 1(b) mit 21 OD wurde nacheinander auf eine Kombination der Säule mit dem Harz in der Pyridinium-Form und der Säule mit dem Harz in der Natrium-Form in dieser Reihenfolge aufgegeben, und anschließend wurden die Säulen mit Wasser eluiert, wobei man die Titelverbindung (ein Natriumsalz) mit 27 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,12 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 256 nm
    • Beispiel 89 Eine Verbindung der Formel 89(a):
  • Ionenaustauscherharz Dowex 50W-X2 (Marke für ein Produkt von Dow Chemical Co.; H-Form; etwa 1 ml) wurde in eine Säule gepackt, und 3 ml 20% (Vol./Vol.) wäßriges Pyridin wurden durch die Säule geleitet, die dann mit Wasser gewaschen wurde, um die Pyridinium-Form des Harzes in der Säule herzustellen. Nach einem ähnlichen Verfahren, jedoch unter Verwendung von 3 ml einer 1N wäßrigen Lösungs von Kaliumhydroxid wurde die Kalium-Form des Harzes in einer anderen Säule hergestellt. Die Verbindung von Beispiel 1(b) mit 27 OD wurde nacheinander auf eine Kombination aus der Säule mit dem Harz in der Pyridinium-Form und der Säule mit dem Harz in der Kalium-Form aufgegeben, und die Säulen wurden mit Wasser eluiert, wobei man die Titelverbindung (ein Kaliumsalz) mit 21 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 18,18 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 90 Eine Verbindung der Formel 90(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 14(a) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in Beispiel 7(b) beschrieben wlrdj anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N- diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 10 T 50 % Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 119 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 19,20 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 91 Eine Verbindung der Formel 91(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 82(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in Beispiel 7(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N- diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 20 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 50 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M mM, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten, linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 19,15 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 92 Eine Verbindung der Formel 92(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 22(c) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in Beispiel 7(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N- diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB; pH-Wert: 7,5; 15 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde anschließend auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 67 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 19,51 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
    • Beispiel 93 Eine Verbindung der Formel 93(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 16(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in Beispiel 7(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N- diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 15 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 96 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 19,26 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 94 Eine Verbindung der Formel 94(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 12(c) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit (hergestellt, wie es in Beispiel 7(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N- diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 15 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde anschließend auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 97 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 19,16 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 95 Eine Verbindung der Formel 95(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 23(a) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in Beispiel 7(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N- diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5, 15 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 83 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 m; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten, linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 19,80 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
    • Beispiel 96 Eine Verbindung der Formel 96(a):
  • Ein Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 15(c) beschrieben wird, wurde wiederholt, wobei jedoch eine Säule, die mit 125 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 12(b) gepackt war, verwendet und die Basensequenz XGGGGZ (in der Z wie in Beispiel 17 definiert ist) in den Syntheseautomaten eingegeben wurde. Die 90%ige (Vol./Vol.) wäßrige Formamidlösung, die die Titelverbindung enthielt und die auf diese Weise erhalten wurde, wurde dann für 5 Minuten auf 95ºC erwärmt. Nach diesem Erwärmen wurde die Lösung rasch abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in vier Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,0; Eluent B: Acetonitril; 10 bis 60 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 260 nm; Säulentemperatur: 60ºC) gereinigt. Fraktionen, die nach 20,7 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefangen und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 79 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 253 nm
  • Retentionszeit: 13,22 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS-2; 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 bis 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm).
    • Beispiel 91 Eine Verbindung der Formel 97(a):
  • Ein Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß eine 35 mM Acetonitrillösung der Verbindung von Beispiel 15(b) in der Amiditflasche X verwendet wurde und daß die Basensequenz XGCGG in den Syntheseautomaten als Programm eingegeben wurde. die 90%ige wäßrige Formamidlösung, die die Titelverbindung enthielt und auf diese Weise erhalten wurde, wurde für 5 Minuten auf 95ºC erwärmt. Nach diesem Erwärmen wurde die Lösung rasch abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in vier Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,0; Eluent B: Acetonitril; 10 bis 60 Vol.-% B; 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 260 nm; Säulentemperatur 60 C) gereinigt. Fraktionen, die nach 21,7 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefangen und in einer Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei mau 123 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
  • Retentionszeit: 13,58 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS-2; 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 bis 60 Vol -% B, 20 Minuten, linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm).
    • Beispiel 98 Eine Verbindung der Formel 98(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 83(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in Beispiel 7(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N- diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch einen Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 15 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde anschließend auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 92 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 19,46 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 99 Eine Verbindung der Formel 99(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 86 beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)-thymidin- 2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in Beispiel 7(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1 × 15 cm; 50 mM TEAB; pH-Wert: 7,5; 15 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 43 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 19,12 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
    • Beispiel 100 Eine Verbindung der Formel 100(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 81 beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in Beispiel 7(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N- diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; 50 mM TEAB, pH-Wert: 7,5; 15 T 50% Acetonitril; linearer Gradient; 254 nm). gereinigt. Es wurde dann auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man die Titelverbindung mit 36 OD (260 nm) als einen amorphen Feststoff erhielt. Die Analyse mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 m; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 260 nm) zeigte, daß die Probe eine Retentionszeit von 19,11 Minuten aufwies.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
    • Beispiel 101 Eine Verbindung der Formel 101(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung einer 35 mM Acetonitrillösung von 5'-O- (3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in Beispiel 1(b) beschrieben wird] in der Amiditflasche X und Eingabe der Basensequenz XTGGGG in den Syntheseautomaten als Programm wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 25 T 55 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 19,8 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefangen und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 173,1 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
  • Retentionszeit: 15,1 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 1,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 2 ml/Minute; 254 nm).
    • Beispiel 102 Eine Verbindung der Formel 102(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(3,4-Dibenzyloxybenzyl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in Beispiel 7(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N- diisopropylphosphoramidit und Eingabe der Basensequenz TGGGGG in den Syntheseautomaten als Programm wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 25 T 55 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 17,4 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefangen und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 120,2 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
  • Retentionszeit: 13,1 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 1,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 2 ml/Minute; 254 nm).
    • Beispiel 103 103(a) 5'-O-[(Naphthalin-2-yl)methyl]thymidin
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 6(a) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 442 mg (2 mmol) 2-Brommethylnaphthalin wurden 253,1 mg (Ausbeute: 33%) der Titelverbindung erhalten.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,12 (1H, breites Singulett);
  • 1,88 - 7,43 (8H, Multiplett);
  • 0,40 (1H, Triplett, J = 6,75 Hz);
  • 4,76 (2H, Singulett);
  • 4,61 - 4,54 (1H, Multiplett);
  • 4,12 - 4,10 (1H, Multiplett);
  • 3,88 - 3,72 (2H, Multiplett);
  • 2,40 - 2,20 (2H, Multiplett);
  • 2,05 (1H, breites Singulett);
  • 1,58 (3H, Singulett).
    • 103(b) 5'-O-[(Naphthalin-2-yl)methyl]thymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 11(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 11 mg (0,2 mmol) 5'-O-[(Naphthalin-2- yl)methyl]thymidin (hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird) wurden 62,5 mg (Ausbeute: 54%) der Titelverbindung erhalten.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,88 - 7,43 (8H, Multiplett);
  • 6,39 (1H, Triplett, J = 7,26 Hz);
  • 4,75 (2H, breites Singulett);
  • 4,68 4,60 (1H, Multiplett);
  • 4,25; 4,20 (zusammen 1H, zwei breite Singuletts);
  • 3,90 - 3,53 (6H, Multiplett);
  • 2,68 - 2,18 (4H, Multiplett);
  • 1,57; 1,55 (zusammen 3H, zwei Singuletts);
  • 1,17 (12H, Dublett, J = 6,60 Hz). 103(c) Eine Verbindung der Formel 103(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-[(Naphthalin-2-yl)methyl]-thymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 12,8 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefangen und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 257,5 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
  • Retentionszeit: 13,9 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 10 T 40 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 2 ml/Minute; 254 nm).
    • Beispiel 104 104(a) 5'-O-(4-Phenylbenzyl)thymidin
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 6(a) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 405 mg (2 mmol) 4-Phenylbenzylchlorid wurden 387,8 mg (Ausbeute: 47%) der Titelverbindung erhalten.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3; + CD&sub3;OD, 4:1 (Vol./Vol.) TNS, 270 MHz), δ ppm:
  • 1,65 - 7,33 (10H, Multiplett);
  • 6,37 (1H, Triplett, J = 7,26 Hz);
  • 4,64 (2H, Singulett);
  • 4,55 - 4,48 (1H, Multiplett);
  • 4,13 - 4,09 (1H, Multiplett);
  • 3,87 - 3,70 (2H, Multiplett);
  • 2,38 - 2,15 (2H, Multiplett);
  • 1,63 (3H, Singulett).
    • 104(b) 5'-O-(4-Phenylbenzyl)thymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, wie es in Beispiel 11(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 82 mg (0,2 mmol) 5'-O-(4-Phenylbenzyl)thymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden 71,8 mg (Ausbeute: 59%) der Titelverbindung erhalten.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,62 - 7,34 (10H, Multiplett);
  • 6,40 (1H, Triplett, J = 6,60 Hz);
  • 4,70 - 4,60 (3H, Multiplett);
  • 4,27; 4,20 (zusammen 1H, zwei breite Singuletts);
  • 3,90 - 3,55 (6H, Multiplett);
  • 2,67 - 2,57 (2H, Multiplett);
  • 2,53 - 2,16 (2H, Multiplett);
  • 1,63 (3H, Singulett);
  • 1,19 (12H, Dublett, J = 6,60 Hz). 104(c) Eine Verbindung der Formel 104(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(4-Phenylbenzyl)thymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; Temperatur: 60ºC; 254 nm) gereinigt.
  • Fraktionen, die nach 16,1 Minuten eluiert wurden, wurden auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 281,8 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
  • Retentionszeit: 7,1 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 1,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 2 ml/Minute; 60ºC; 254 nm).
    • Beispiel 105 105(a) 5'-O-(2-Phenylbenzyl)thymidin
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 6(a) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 365 µl (2 mmol) 2-Phenylbenzylbromid wurden 133,2 mg (Ausbeute: 16%) der Titelverbindung erhalten.
  • ¹H kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,13 (1H, breites Singulett);
  • 7,50 - 7,28 (10H, Multiplett);
  • 6,34 (1H, Triplett, J = 6,75 Hz);
  • 4,57; 4,50 (2H, zwei Dubletts, J = 13,0 Hz);
  • 4,30 (1H, breites Singulett);
  • 3,98 (1H, breites Singulett);
  • 3,73 - 3,52 (2H, Multiplett);
  • 2,32 - 2,05 (2H, Multiplett);
  • 1,90 (1H, breites Singulett);
  • 1,51 (3H, Singulett).
    • 105(b) 5'-O-(2-Phenylbenzyl)thymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 11(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 82 mg (0,2 mmol) 5'-O-(2-Phenylbenzyl)thymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden 89,9 mg (Ausbeute: 73%) der Titelverbindung erhalten.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 1,51 - 7,29 (10H, Multiplett);
  • 6,36 (1H, Triplett, J = 7,92 Hz);
  • 4,55 - 4,45 (3H, Multiplett);
  • 4,19; 4,11 (zusammen 1H, zwei Singuletts);
  • 3,90 - 3,52 (6H, Multiplett);
  • 2,66 - 2,54 (2H, Multiplett),
  • 2,45 - 2,03 (2H, Multiplett);
  • 1,51 (3H, Singulett);
  • 1,19 (12H, Dublett, J = 6,60 Hz). 105(c) Eine Verbindung der Formel 105(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(2-Phenylbenzyl)thymidin-2'cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 60ºC, 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 14,8 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefangen und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 172,2 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 252 nm
  • Retentionszeit: 6,1 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 2 ml/Minute, 60ºC, 254 nm).
    • Beispiel 106 106(a) 3'-O-Triisopropylsilyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)thymidin
  • 1,485 g (2,73 mmol) 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)thymidin und 0,31 g (5,45 mmol) Imidazol wurden zuerst durch azeotrope Destillation unter verringertem Druck mit Pyridin getrocknet und dann in 6 ml Dimethylformamid gelöst. 875 pl (4,09 mmol) Triisopropylsilylchlorid wurden zu dieser Lösung gegeben, und das resultierende Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Am Ende dieser Zeit wurden 875 µl Triisopropylsilylchlorid und 0,37 g Imidazol zu dem Gemisch gegeben, das dann für einen Tag gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit 100 ml Ethylacetat verdünnt, und das verdünnte Gemisch wurde zweimal mit jeweils 100 ml einer 5%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfrei em Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 100 g Silicagel (70 bis 230 mesh) unter Verwendung von Methylenchlorid mit einem Gehalt an 0 bis 3 Vol.-% Methanol als Eluent gereinigt, wobei man 1,861 g (Ausbeute: 97%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,08 (1H, Singulett);
  • 7,67 (1H, Singulett);
  • 7,42 - 6,80 (13H, Multiplett);
  • 6,39 (1H, Triplett, J = 5,94 Hz);
  • 4,60 - 4,55 (1H, Multiplett);
  • 4,06 - 4,03 (1H, Multiplett);
  • 3,19 (6H, Singulett);
  • 3,53 - 3,26 (2H, Multiplett);
  • 2,42 - 2,18 (2H, Multiplett);
  • 1,50 (3H, Singulett);
  • 1,03 - 0,90 (21H, Multiplett).
    • 106(b) 3'-O-(Triisopropylsilyl)thymidin
  • 1,6 ml Trifluoressigsäure wurden tropfenweise zu einer Lösung von 1,861 g (2,655 mmol) 3'-O-Triisopropylsilyl-5'-O-(4,4-dimethoxytrityl)thymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] in 80 ml Chloroform gegeben, während auf einem Eisbad gekühlt und gerührt wurde. Das resultierende Gemisch wurde für 10 Minuten gerührt, und dann wurden 2 ml Pyridin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde zweimal mit jeweils 100 ml einer 5%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 50 g Silicagel (70 bis 230 mesh) unter Verwendung von Methylenchlorid mit einem Gehalt an 4 Vol.-% Methanol als Eluent gereinigt, wobei man 0,9965 g (Ausbeute: 94%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,17 (1H, breites Singulett);
  • 1,36 (1H, Singulett);
  • 6,12 (1H, Triplett, J = 5,94 Hz);
  • 4,63 - 4,59 (1H, Multiplett);
  • 4,03 - 4,00 (1H, Multiplett);
  • 3,96 - 3,74 (2H, Multiplett);
  • 2,48 (1H, breites Singulett);
  • 2,45 - 2,21 (2H, Multiplett);
  • 1,91 (3H, Singulett);
  • 1,15 - 1,00 (21H, Multiplett).
    • 106(c) 3'-O-Triisopropylsilyl-5'-O-[(4-benzyloxy)benzyl]thymidin
  • 88 mg (2 mmol) Natriumhydrid (als eine 55%ige (Gew./Gew.) Dispersion in Mineralöl) wurden zu einer Lösung von 398 mg (1 mmol) 3'-O-(Triisopropylsilyl)thymidin (hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] in 2,5 ml Tetrahydrofuran gegeben, und das resultierende Gemisch wurde für 2 Stunden bei 60ºC stehengelassen und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. 232 mg (1 mmol) 4-Benzyloxybenzylchlorid und 75 mg (0,5 mmol) Natriumiodid wurden zu dem Gemisch gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur und anschließend für 8 Stunden bei 55ºC gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde in 100 ml Ethylacetat gelöst. Die resultierende Lösung wurde zweimal mit jeweils 100 ml 0,01 N wäßriger Salzsäure gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 30 g Silicagel (230 bis 400 mesh) unter Verwendung von Methylenchlorid mit einem Gehalt an 1 bis 2 Vol.-% Methanol als Eluent gereinigt, wobei man 237 mg (Ausbeute: 40%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,00 (1H, breites Singulett);
  • 7,59 (1H, Singulett);
  • 1,48 - 6,90 (9H, Multiplett);
  • 6,36 (1H, Triplett, J = 6,60 Hz);
  • 5,07 (2H, Singulett);
  • 4,56 - 4,46 (1H, Multiplett);
  • 4,50 (2H, Singulett);
  • 4,07 - 4,03 (1H, Multiplett);
  • 3,80 - 3,60 (2H, Multiplett);
  • 2,33 - 2,08 (2H, Multiplett);
  • 1,56 (3H, Singulett);
  • 1,10 - 0,97 (21H, Multiplett).
    • 106(d) 5'-O-[(4-Benzyloxy)benzyl]thymidin
  • 1,5 ml einer 1 M Tetrahydrofuranlösung von Tetrabutylammoniumfluorid wurden zu einer Lösung von 237 mg (0,4 mmol) 3'-O-Triisopropylsilyl-5'-O- [(4-benzyloxy)benzyl]thymidin (hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (c) beschrieben wird] in 1,5 ml Tetrahydrofuran gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch durch Destillation unter verringertem Druck vom Lösungsmittel befreit, und der resultierende Rückstand wurde in 100 ml Ethylacetat gelöst. Diese Lösung wurde zweimal mit jeweils 100 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und anschließend über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 30 g Silicagel (230 bis 400 mesh) unter Verwendung von Methylenchlorid mit einem Gehalt an 1 bis 4 Vol.-% Methanol als Eluent gereinigt, wobei man 108,5 mg (Ausbeute: 61%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,11 (1H, breites Singulett);
  • 7,56 (1H, Singulett);
  • 7,47 - 6,93 (9H, Multiplett);
  • 6,38 (1H, Triplett, J = 1,26 Hz);
  • 5,06 (2H, Singulett);
  • 4,57 - 4,47 (1H, Multiplett);
  • 4,52 (2H, Singulett);
  • 4,10 - 4,06 (1H, Multiplett);
  • 3,80 - 3,64 (2H, Multlplett);
  • 2,38 - 2,15 (2H, Multlplett);
  • 1,67 (3H, Singulett).
    • 106(e) 5'-O-[(4-Benzyloxy)benzyl]thymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphormidit
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 11(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 88 mg (0,2 mmol) 5'-O-[(4-Benzyloxy)benzyl]thymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (d) beschrieben wird] wurden 104,8 mg (Ausbeute: 82%) der Titelverbindung erhalten.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,58; 7,56 (zusammen 1H, zwei Singuletts);
  • 7,46 - 6,93 (9H, Multiplett);
  • 6,37 (1H, Triplett, J = 6,60 Hz);
  • 5,06 (2H, Singulett);
  • 4,64 - 4,54 (1H, Multiplett);
  • 4,60; 4,59 (2H, zwei Singuletts);
  • 4,25 - 4,15 (1H, Multiplett);
  • 3,90 - 3,50 (6H, Multiplett);
  • 2,66 - 2,54 (2H, Multiplett);
  • 2,50 - 2,10 (2H, Multiplett);
  • 1,65 (3H, Singulett);
  • 1,18 (12H, Dublett, J = 7,26 Hz). 106(f) Eine Verbindung der Formel 106(f):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-[(4-Benzyloxy)benzyl]thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (e) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung synthetisiert. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 60 C, 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 17,0 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefangen und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 208,8 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
  • Retentionszeit: 8,1 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; wäßrige Lösung von 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten, linearer Gradient; 2 ml/Minute; 60ºC; 254 nm).
    • Beispiel 101 101(a) 5'-O-(9-Phenylxanthen-9-yl)thymidin
  • 585 mg (2 mmol) 9-Chlor-9-phenylxanthen wurden zu einer Lösung von 484 mg (2 mmol) Thymidin in 20 ml Pyridin gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt, während es vom Licht abgeschattet wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 200 ml Methylenchlorid verdünnt, und das verdünnte Gemisch wurde zweimal mit jeweils 200 ml einer 5%igen (Gew/Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 35 g Silicagel (70 bis 230 mesh) unter Verwendung von Methylenchlorid mit einem Gehalt von 0 bis 2,5 Vol.-% Methanol als Eluent gereinigt, wobei man 647,8 mg (Ausbeute: 65%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,33 (1H, breites Singulett);
  • 7,62 (1H, Singulett);
  • 7,45 - 7,02 (13H, Multiplett);
  • 6,36 (1H, Triplett, J = 5,94 Hz);
  • 4,49 - 4,41 (1H, Multiplett);
  • 4,02 - 3,96 (1H, Multiplett);
  • 3,29 - 3,12 (2H, Multiplett);
  • 2,52 - 2,24 (2H, Multiplett);
  • 1,99 (1H, Dublett, J = 3,96 Hz);
  • 1,67 (3H, Singulett).
    • 101(b) 5'-O-(9-Phenylxanthen-9-yl)thymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 11(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 100 mg (0,2 mmol) 5'-O-(9-Phenylxanthen-9-yl)thymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden 134,9 mg (Ausbeute: 99%) der Titelverbindung erhalten.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,03 (1H, breites Singulett);
  • 7,69; 7,64 (zusammen 1H, zwei Singuletts);
  • 7,40 - 7,03 (13H, Multiplett);
  • 6,40 - 6,32 (1H, Multiplett);
  • 4,58 - 4,47 (1H, Multiplett);
  • 4,15 - 4,05 (1H, Multiplett);
  • 3,90 - 3,10 (6H, Multiplett);
  • 2,82 - 2,28 (4H, Multiplett);
  • 1,63; 1,62 (zusammen 3H, zwei Singuletts);
  • 1,16 (12H, Dublett, J = 6,6 Hz). 101(c) Eine Verbindgng der Formel 101(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(9-Phenylxanthen-9-yl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung synthetisiert. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Dortion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH- Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten, linearer Gradient; 7 ml/Minute; 60ºC; 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 19,7 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefangen und in einer Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 145,6 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 249 nm
  • Retentionszeit: 10,9 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 2 ml/Minute; 60ºC, 254 nm).
    • Beispiel 108 108(a) 5'-O-(9-Phenylfluoren-9-yl)thymidin
  • 170 mg (2,4 mmol) 9-Brom-9-phenylfluoren wurden zu einer Lösung von 242 mg (1 mmol) Thymidin in 10 ml Pyridin gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei 100ºC für 8 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt, und das Konzentrat wurde in 100 ml Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wurde mit 100 ml einer 5%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat gewaschen und über wasserfrei em Natriumsulfat getrocknet.
  • Das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 30 g Silicagel (230 bis 400 mesh) unter Verwendung von Methylenchlorid mit einem Gehalt an 1 bis 2 Vol.-% Methanol als Eluent gereinigt, wobei man 194,2 mg (Ausbeute: 37%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,06 (1H, breites Singulett);
  • 7,76 (1H, Singulett);
  • 7,72 - 7,20 (13H, Multiplett);
  • 6,41 (1H, Triplett, J = 6,60 Hz);
  • 4,64 - 4,58 (1H, Multiplett);
  • 3,95 - 3,90 (1H, Multiplett);
  • 3,49 - 3,13 (2H, Multiplett);
  • 2,45 - 2,38 (2H, Multiplett);
  • 1,88 (1H, Dublett, J = 3,96 Hz);
  • 1,48 (3H, Singulett).
    • 108(b) 5'-O-(9-Phenylfluoren-9-yl)thymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 11(b) beschrieben wird, Jedoch unter Verwendung von 105 mg (0,2 mmol) 5'-O-(9-Phenylfluoren-9-yl)thymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden 110,8 mg (Ausbeute: 76%) der Titelverbindung erhalten.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 210 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,00 (1H, breites Singulett);
  • 7,80 (1H, Singulett);
  • 7,78 - 7,20 (13H, Multiplett);
  • 6,44 - 6,37 (1H, Multiplett);
  • 4,72 - 4,62 (1H, Multiplett);
  • 4,10 - 4,00 (1H, Multiplett);
  • 3,90 - 3,10 (6H, Multiplett);
  • 2,75 - 2,34 (4H, Multiplett);
  • 1,46; 1,45 (zusammen 3H, zwei Singuletts);
  • 1,18 (12H, Dublett, J = 6,60 Hz). 108(c) Eine Verbindung der Formel 108(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(9-Phenylfluoren-9-yl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung synthetisiert. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Dortion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH- Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 60ºC, 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 19,1 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefangen und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 291,2 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
  • Retentionszeit: 10,4 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 1,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 2 ml/Minute; 60ºC, 254 nm).
    • Beispiel 109 109(a) 5'(S-Triphenylmethyl)thio-5'-desoxythymidin-2-cyanoethyl-N,N- diisopropylphosphoramidit
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 11 (b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 100 mg (0,2 mmol) 5'-(S-Triphenylmethyl)thio-5'-desoxythymidin [B.S. Sproate, B. Beijer, P. Rider, P. Neuner, Nucleic Acids Res., 15, (12) 4837 (1987)] wurden 88 mg (Ausbeute: 62%) der Titelverbindung erhalten.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,45 - 7,18 (16H, Multiplett);
  • 6,23 - 6,17 (1H, Multiplett);
  • 4,31 - 4,20 (1H, Multiplett);
  • 4,11 - 4,00 (1H, Multiplett);
  • 3,85 - 3,43 (4H, Multiplett);
  • 2,62 - 1,98 (4H, Multiplett);
  • 1,56 (3H, Singulett);
  • 1,20 - 1,05 (12H, Multiplett). 109(b) Eine Verbindung der Formel 109(b):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-(S-Triphenylmethyl)thio-5'-desoxythymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit (hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung synthetisiert. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 15 cm; Eluent A: 50 mM TEAB, pH-Wert: 1,5; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, linearer Gradient; 254 nm) gereinigt. Es wurde anschließend auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 122,3 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
  • Retentionszeit: 19,0 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS, 6 × 150 m; Eluent. A: 0,1 M TEAA; pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 T 60 Vol.- % B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 60ºC; 260 nm).
    • Beispiel 110 Eine Verbindung der Formel 110(a):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-O-(9-Phenylfluoren-9-yl)thymidin-2- cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in Beispiel 108(b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl- N,N-diisopropylphosphoramidit und Eingabe der Basensequenz TGGGG in den Syntheseautomaten wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde in drei Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil PREP-ODS, 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetoriltril; 25 T 55 Vol.-% B; 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 60ºC; 254 nm) gereinigt. Fraktionen, die nach 14,6 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefangen und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 28,3 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 256 nm
  • Retentionszeit: 10,7 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,3; Eluent B: Acetonitril; 20 T 50 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 2 ml/Minute, 60ºCC; 254 nm).
    • Beispiel 111 Eine Verbindung der Formel 111(a):
  • Ein Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 15(c) beschrieben wird, wurde wiederholt, wobei jedoch eine Säule, die mit 125 mg (5 µmol) der Verbindung von Beispiel 12(b) gepackt war, verwendet und die Basensequenz XGCGGZ (in der Z wie in Beispiel 17 definiert ist) in den DNA/RNA-Syntheseautomaten eingegeben wurde, der in Beispiel 1(b) beschrieben wird. Die 90%ige wäßrige Formamidlösung, die die Titelverbindung erhielt und auf diese Weise erhalten wurde, wurde für 5 Minuten auf 95ºC erwärmt. Nach diesem Erwärmen wurde die Lösung rasch abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde in vier Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil PREP-ODS 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,0; Eluent B: Acetonitril; 10 bis 60 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm; Säulentemperatur 60ºC) gereinigt. Fraktionen, die nach 20,8 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefangen und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 82 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
  • Retentionszeit: 13,38 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS-2; 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 1,5; Eluent B: Acetonitril; 10 bis 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm).
    • Beispiel 112 112(a) 5'-[(3,4-Dibenzyloxy)benzylthio]-5'-desoxythymidin
  • 258 mg (1 µmol) 5'-Desoxy-5'-mercaptothymidin wurden zu 20 ml Aceton gegeben. 406 mg (1,2 mmol) 3,4-Dibenzyloxybenzylchlorid und 1 g wasserfreies Kaliumcarbonat wurden dann zu der Lösung unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. Das resultierende Gemisch wurde gerührt, während es unter Rückfluß für 1 Stunde erwärmt wurde. Am Ende dieser Zeit wurden Niederschläge vom Reaktionsgemisch abfiltriert, und das Filtrat wurde durch Destillation unter verringertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge Methylenchlorid gelöst und mittels Säulenchromatographie durch 10 g Silicagel unter Verwendung eines Gemisches aus Methanol und Methylenchlorid im Volumenverhältnis 5 : 95 als Eluent gereinigt, wobei man 452 mg der Titelverbindung als einen farblosen, karamellartigen Rückstand erhielt. Dieser Rückstand wurde aus Benzol lyophilislert, wobei man 180 mg (Ausbeute: 32%) der Titelverbindung als weiße Kristalle erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,26 (1H, Singulett);
  • 6,78 7,46 (14H, Multiplett);
  • 6,20 (1H, Triplett, J = 6,6 Hz);
  • 5,15 und 5,17 (zusammen 4H, zwei Singuletts);
  • 4,20 - 4,27 (1H, Multiplett);
  • 3,87 - 3,91 (1H, Multiplett);
  • 3,67 - 3,68 (2H, Multiplett);
  • 2,61 - 2,70 (2H, Multiplett);
  • 2,09 - 2,40 (2H, Multiplett);
  • 1,91 - 1,92 (3H, Multiplett).
    • 112(b) 5'-[(3,4-Dibenzyloxy)benzylthio]-5'-desoxythymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • 112 mg (0,2 mmol) 5'-[(3,4-Dibenzyloxy)benzylthio]-5'-desoxythymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und dann in 1 ml Methylenchlorid gelöst. 17 mg (0,1 mmol) Diisopropylammoniumtetrazolid wurden dann zu der Lösung gegeben. 70 µl (0,22 mmol) 2-Cyanoethyl- N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit wurden anschließend tropfenweise zu dem Gemisch unter einer Argonatmosphäre gegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden unter der gleichen Atmosphäre gerührt. Das Methylenchlorid wurde dann durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde in 10 ml Ethylacetat gelöst, und die Lösung wurde mit einer 10%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat und mit einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Lösung wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet; anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der resultierende Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 10 g Silicagel (70 bis 230 mesh) unter Verwendung von Ethylacetat als Eluent gereinigt, wobei man 115 mg (Ausbeute: 76%) der Titelverbindung als eine karamellartige Substanz erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,16 (1H, breites Singulett);
  • 6,76 - 7,45 (14H, Multiplett);
  • 6,23 - 6,29 (1H, Multiplett);
  • 5,14 - 51,6 (4H, Multiplett);
  • 4,38 - 4,46 (1H, Multiplett);
  • 4,08 - 4,16 (1H, Multiplett);
  • 3,50 - 3,90 (6H, Multiplett);
  • 2,09 - 2,80 (6H, Multiplett);
  • 1,91 - 1,93 (3H, Multiplett);
  • 1,08 - 1,58 (12H, Multiplett). 112(c) Eine Verbindung der Formel 112(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-[(3,4-Dibenzyloxy)benzylthio]-5'- desoxythymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O- Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 150 mm; Eluent A: 50 mM wäßriger Triethylammoniumhydrogencarbonatpuffer (TEAB); pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 15 bis 50 Vol.-% B; linearer Gradient; 260 nm) gereinigt. Die eluierten Fraktionen, die die Titelverbindung enthielten, wurden aufgefangen und auf Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 57 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 253 nm
  • Retentionszeit: 16,85 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil 005-2; 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 N TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 bis 60 Vol.-% B, 20 Minuten; linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm).
    • Beispiel 113 113(a) 5'-[(Anthracen-9-yl)methylthio]-5'-desoxythymidin
  • 258 mg (1 mmol) 5'-Desoxy-5'-mercaptothymidin wurden zu 20 ml Aceton gegeben. 272 mg (1,2 mmol) 9-Chlormethylanthracen und 1 g wasserfreies Kaliumcarbonat wurden dann zu der Lösung unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. Das resultierende Gemisch wurde anschließend gerührt, während es unter Rückfluß für 2 Stunden erwärmt wurde. Am Ende dieser Zeit wurden Niederschläge aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert, und das Filtrat wurde durch Destillation unter verringertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde aus 10 ml Ethanol kristallisiert, wobei man 156 mg (Ausbeute: 35%) der Titelverbindung als blaßgelbe Kristalle erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (hexadeuterlertes Dimethylsulfoxid, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,56 (1H, Singulett);
  • 8,40 (2H, Dublett, J = 8,1 Hz);
  • 8,09 (2H, Dublett, J = 8,2 Hz);
  • 7,51 - 7,61 (5H, Multiplett);
  • 6,24 - 6,28 (1H, Multiplett);
  • 5,43 (1H, breites Singulett);
  • 4,81 - 4,89 (2H, Multiplett);
  • 4,24 - 4,25 (1H, Triplett, J = 2,7 Hz);
  • 4,03 - 4.07 (1H, Multiplett);
  • 3,05 (2H, Dublett, J = 6,5 Hz);
  • 2,01 - 2,29 (2H, Multiplett);
  • 1,72 - 1,73 (3H, Multiplett).
    • 113(b) 5'-[(Anthracen-9-yl)methylthio]-5'-desoxythymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • 74 mg (0,165 mmol) 5'-[(Anthracen-9-yl)methylthio]-5'-desoxythymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und dann in 1 ml Tetrahydrofuran gelöst. 0,115 ml (0,659 mmol) N,N-Diisopropyl-N-ethylamin wurden zu der Lösung gegeben. 49 µl (0,22 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit wurden dann tropfenweise zu dem Gemisch unter einer Argonatmosphäre gegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1,75 Stunden unter der gleichen Atmosphäre gerührt. Das Tetrahydrofuran wurde dann durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde in 10 ml Ethylacetat gelöst, und die Lösung wurde mit einer 10%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat und mit einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 10 g Silicagel (70 bis 230 mesh) unter Verwendung von Ethylacetat als Eluent gereinigt, wobei man 85 mg (Ausbeute: 79%) der Titelverbindung als eine schaumartige Substanz erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,26 - 8,43 (10H, Multiplett);
  • 6,26 - 6,33 (1H, Multiplett;)
  • 4,74 - 4,93 (2H, Multiplett);
  • 4,32 - 4,42 (1H, Multiplett);
  • 4,20 - 4,28 (1H, Multiplett);
  • 3,49 - 3,80 (4H, Multiplett);
  • 2,89 - 3,11 (2H, Multiplett);
  • 1,93 - 2,68 (4H, Multiplett);
  • 1,71 - 1,76 (3H, Multiplett);
  • 1,08 - 1,22 (12H, Multiplett). 113(c) Line Verbindung der Formel 113(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-[(Anthracen-9-yl)methylthio]-5'-desoxythymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch etne Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 150 mm; Eluent A: 50 mM TEAB; pH-Wert: 1,5; Eluent B: Acetonitril; 15 bis 50 Vol.-% B; linearer Gradient; 260 nm) gereinigt. Die eluierten Fraktionen, die die Titelverbindung enthielten, wurden aufgefangen und aus eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 30 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 255 nm
  • Retentionszeit: 13,52 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS-2; 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 bis 60 Vol.-% B, 20 Minuten, linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm).
    • Beispiel 114 114(a) 5'-[(2-Naphthyl)methylthio]-5'-desoxythymidin
  • 258 mg (1 mmol) 5'-Desoxy-5'-mercaptothymidin wurden zu 20 ml Aceton gegeben. 265 mg (1,2 mmol) 2-Brommethylnaphthalin und 1 g wasserfreies Kaliumcarbonat wurden dann zu der Lösung unter einer Argonatmosphäre ge geben. Das resultierende Gemisch wurde gerührt, während es unter Rückfluß für 2 Stunden erwärmt wurde. Am Ende dieser Zeit wurden Niederschläge aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert, und das Filtrat wurde vom Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck befreit. Der Rückstand wurde aus 10 ml Ethanol kristallisiert, wobei man 100 mg (Ausbeute: 25%) der Titelverbindung, als weiße Kristalle erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (hexadeuteriertes Dimethyl sulfoxid, 210 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,84 - 7,90 (1H, breites Singulett);
  • 7,78 (1H, Singulett);
  • 7,46 - 7,53 (4H, Multiplett);
  • 6,16 - 6,19 (1H, Multiplett);
  • 5,34 (1H, Dublett, J = 4,4 Hz);
  • 4,14 - 4,19 (1H, Multiplett);
  • 3,92 - 3,99 (2H, Multiplett);
  • 3,83 - 3,87 (1H, Multiplett);
  • 2,62 - 2,18 (2H, Multiplett);
  • 2,02 - 2,23 (2H, Multiplett);
  • 1,15 - 1,79 (3H, Multiplett).
    • 114(b) 5'-(2-Naphthyl)methylthio]-5'-dosoxythymidin-2-cyanoethyl- N,N-diisopropylphosphoramidit
  • 79,7 mg (0,2 mmol) 5'-[(2-Naphthyl)methylthio]-5'-desoxythymidin [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden durch aleotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und dann in 2,5 ml Tetrahydrofuran gelöst. 0,084 ml (0,48 mmol) Diisopropylamin wurden dann in der Lösung gegeben. 54 pl (0,24 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit wurden anschließend tropfenwelse zu dem Gemisch unter einer Argonatmosphäre gegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur bei 1,75 Stunden unter der gleichen Atmosphäre gerührt.
  • Das Tetrahydrofuran wurde dann durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde in 10 ml Ethylacetat gelöst, und die Lösung wurde mit einer 10%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat und mit einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Lösung wurde dann über wasserfrei em Magnesiumsultat getrocknet, und anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 10 g Silicagel (70 bis 230 mesh) unter Verwendung von Ethylacetat als Eluent gereinigt, wobei man 67 mg (Ausbeute: 56%) der Titelverbindung als eine schaumartige Substanz erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 8,32 (1H, breites Singulett);
  • 7,26 - 7,85 (8H, Multiplett);
  • 6,27 (1H, Multiplett);
  • 4,38 - 4,46 (1H, Multiplett);
  • 4,11 - 4,19 (1H, Multiplett);
  • 3,93 - 3,95 (2H, Multiplett);
  • 3,47 - 3,90 (4H, Multiplett);
  • 2,10 - 2,88 (6H, Multiplett);
  • 1,62 - 1,90 (3H, Multiplett);
  • 1,10 - 1,21 (12H, Multiplett). 114(c) Eine Verbindung der Formel 114(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-((2-Naphthyl)methylthio]-5'-desoxythymidin-2cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Silicagelsäule (Präparative C18, Waters, 1,5 × 150 mm; Eluent A: 50 mM TEAB; pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 15 bis 50% Vol, % 13; linearer Gradient; 260 nm) gereinigt. Die eluierten Fraktionen, die die Titelverbindung enthielten, wurden aufgefangen und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 165 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 254 nm
  • Retentionszeit: 12,07 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Inertsil ODS-2; 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA, pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 10 bis 60 Vol.-% B, 20 Minuten, linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm).
    • Beispiel 115 115(a) 5'-{3,5-Bis[3,5(dibenzyloxy)benzyloxy]benzylthio}-5'-desoxythymidin
  • 258 mg (1 mmol) 5'-Desoxy-5'-mercaptothymidin wurden zu 20 ml Aceton gegeben 969 mq (1,2 mmol) 3,5-Bis[3,5-(Dibenzyloxy)benzyloxy]benzylbromid und 1 g wasserfreies Kaliumcarbonat wurden dann zu der Lösung unter einer Argonatmosphäre gegeben. Das resultierende Gemisch wurde gerührt, während es unter Rückfluß für 2 Stunden erwärmt wurde. Am Ende dieser Zeit wurden Niederschläge aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert, und das Filtrat wurden durch Destillation unter verringertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde aus Benzol lyophilisiert, wobei man 365 mg (Ausbeute; 37%) der Titelverbindung als ein weißes Pulver erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 210 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,99 (1H, breites Singulett);
  • 7,23 - 1,42 (21H, Multiplett);
  • 6,49 - 6,68 (9H, Multiplett);
  • 4,98 - 5,03 (12H, Multiplett);
  • 4,18 - 4,26 (1H, Multiplett);
  • 3,87 - 3,9] (1H, Multiplett);
  • 3,64 - 3,71 (2H, Multiplett);
  • 2,67 (2H, Dublett, J = 5,7 Hz);
  • 2,00 - 2,64 (2H, Multiplett);
  • 1,86 - 1,92 (3H, Multiplett).
    • 115(b) 5'-{3,5-Bis[3,5-(Dibenzyloxy)benzyloxy]benzylthio}-5'-desoxythymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit
  • 197 mg (0,2 mmol) 5'-{3,5815[3,5- (dibenzyloxy)benzyloxy]benzylthio)-5'-desoxythymidin (hergestellt, wie es in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben wird] wurden durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und dann in 1 ml Methylenchlorid gelöst. 0,017 g (0,1 mmol) Diisopropylammoniumtetrazolid wurden anschließend zu der Lösung gegeben. 70 µl (0,22 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit wurden anschließend tropfenweise zu dem Gemisch unter einer Argonatmosphäre gegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden unter der gleichen Atmosphäre gerührt. Das Tetrahydrofuran wurde dann durch Destillation unter verringertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde in 10 ml Ethylacetat gelöst, und die Lösung wurde mit einer 10%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Nitriumcarbonat und mit einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Lösung wurde dann über wasserfteiem Magnesiumsulfat getrocknet; anschließend wurde das Lösungsmittel durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie durch 10 g Silicagel (70 bis 230 mesh) unter Verwendung von Ethylacetat als Eluent gereinigt, wobei man 103 mg (Ausbeute: 43%) der Titelverbindung als eine karamellartige Substanz erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 210 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,27 - 7,44 (20H, Multiplett);
  • 6,51 - 6,69 (10H, Multiplett);
  • 4,98 - 5,05 (12H, Multiplett);
  • 4,44 - 4,51 (1H, Multiplett);
  • 4,13 - 4,18 (1H, Multiplett);
  • 3,47 - 3,87 (6H, Multiplett);
  • 2,17 - 2,84 (6H, Multiplett);
  • 1,92 (3H, Singulett);
  • 1,08 - 1,34 (12H, Multiplett). 115(c) Eine Verbindung der Formel 115(c):
  • Nach einem Verfahren ähnlich dem, wie es in Beispiel 1(b) beschrieben wird, jedoch unter Verwendung von 5'-{3,5-Bis[3,5-(dibenzyloxy)benzyloxy]benzylthio}-5'-desoxythymidin-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit [hergestellt, wie es der vorstehenden Stufe (b) beschrieben wird] anstelle von 5'-O-Tritylthymidin2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit wurde die Titelverbindung hergestellt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Chromatographie durch eine Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule (Inertsil PREP-ODS 20,0 × 250 mm; Eluent A: 0,1 M TEAA pH-Wert: 7,0; Eluent B: Acetonitril; 30 bis 100 Vol.-% B, 30 Minuten; linearer Gradient; 7 ml/Minute; 260 nm; Säulentemperatur 60ºC) gereinigt. Fraktionen, die nach 26,5 Minuten eluiert wurden, wurden aufgefatigen und auf eine Weise ähnlich der, die in Beispiel 1(b) beschrieben wird, aufgearbeitet, wobei man 86 OD (260 nm) der Titelverbindung als einen amorphen Feststoff erhielt.
  • Ultraviolettabsorptionsspektrum (H&sub2;O), lambdamax: 257 nm
  • Retentionszeit: 18,44 Minuten
  • Hochleistungsflüssigkeitschromatagraphie (Inertsil ODS-2; 6 × 150 mm; Eluent A: 0,1 N TEAA; pH-Wert: 7,5; Eluent B: Acetonitril; 40 bis 100 Vol.-% 13, 25 Minuten, linearer Gradient; 1 ml/Minute; 260 nm).
    • Herstellungsbeispiele
  • Die folgenden Herstellungsbeispiele erläutern die Herstellung von alternativen Ausgangsmaterialien für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbundungen.
    • Herstellungsbeispiel 1 2-[2-O-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethylsulfonyl]ethylmonosuccinat
  • 1,37 g (3,0 mmol) 2-[20-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethylsulfonyl]ethanol [Tetrahedron Lett. 21, 4105 (1986)] wurden durch azeotrope Destillation unter verringertem Druck mit Pyridin getrocknet und dann in 12 ml Methylenchlorid gelöst. 315 mg (3,15 mmol) Bernsteinsäureanhydrid und 384 mg (3,15 mmol) 4-(Dimethylamino)pyridin wurden zu der resultierenden Lösung gegeben, die dann für 30 Minuten gerührt wurde. Nachdem der Abschluß der Reaktion durch Dünnschichtchromatographie bestätigt worden war, wurden 80 ml Methylenchlorid zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Das resultierende Gemisch wurde dann mit 0,5 M wäßriger Lösung von Kaliumdihydrogenphosphat (pH-Wert: 5,0) und mit Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen, und die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde dann durch Destillation unter verringertem Druckentfernt, wobei man 1,60 g (Ausbeute: 96%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,40 - 6,83 (13H, Multiplett);
  • 4,58 - 4,53 (2H, Triplett, J = 5,94 Hz);
  • 3,19 (6H, Singulett);
  • 3,68 - 3,64 (2H, Triplett, J = 5,61 Hz);
  • 3,50 - 3,45 (2H, Triplett, J = 5,94 Hz);
  • 3,18 - 3,14 (2H, Triplett, J = 5,61 Hz);
  • 2,71 - 2,61 (4H, Multiplett).
    • Herstellungsbeispiel 2 Eine Verbindung der Formel 2(p):
  • 1,60 g (2,67 mmol) 2-[2-O-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethylsulfonyl]ethylmonosuccinat (hergestellt, wie es in Herstellungsbeispiel 1 beschrieben wird) wurden in 18 ml Dimethylformamid gelöst, und 0,96 g (3,6 mol) Pentachlorphenol und 0,96 g (4,5 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid wurden zu der resultierenden Lösung gegeben, die dann für 18 Stunden gerührt wurden. Unlösliche Materialien, die ausfielen, wurden durch Filtration abgetrennt, und das Lösungsmittel wurde aus dem Filtrat durch Verdampfen unter verringertem Druck entfernt. Benzol wurde zu dem Rückstand gegeben, und weitere unlösliche Materialien, die ausfielen, wurden durch Filtration abgetrennt. Das Lösungsmittel wurde aus dem Filtrat erneut durch Verdampfen unter verringertem Druck entfernt.
  • Der Rückstand (0,16 g, 0,2 mmol) wurde in 4 ml Dimethylformamid gelöst, und 15 µl (0,11 mmol) Triethylamin und 1,0 g Aminopropyl-CPG (85,7 µmol/g Aminogruppen waren darin eingeführt) wurden zu der Lösung gegeben, die dann für 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen wurde. Am Ende dieser Zeit wurde der CPG-Träger durch Filtration gewonnen, mit Methylenchlorid gewaschen und dann durch Verdampfen unter verringertem Druck getrocknet. Jeweils 5 ml "Cap A"- und "Cap B"-Lösung (Nippon Millipore Limited) wurden zu dem CPG-Träger gegeben, und das Gemisch wurde für 5 Minuten steheugelassen. Das Gemisch wurde dann mit Pyridin und mit Methylenchlorid in dieser Reihenfolge gewaschen und durch Verdampfen unter verringertern Druck getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhielt.
  • Die Menge der Verbindung von Herstellungsbeispiel 1, die in die Titelverbindung eingeführt wurde, wurde nach folgendem Verfahren bestimmt. Eine "Deblock"-Lösung (eine 3 volumenprozentige Lösung von Dichloressigsäure in Methylenchlorid; Nippon Millipore Limited) wurde zu 11,4 mg der Titelverbindung gegeben, und das Gemisch wurde für 3 Minuten geschüttelt; anschließend wurde ausreichend Methylenchlorid zugegeben, um eine Gesamtmenge von 20 ml zu erzielen. 0,4 ml des Lösungsmittels wurden abdestilliert, und anschließend wurden 3 ml einer Lösung im Volumenverhältnis 3 2 von Perchlorsäure in Ethanol zu dem Rückstand gegeben, und die Extinktion des Dimethoxytritylkations bei 500 nm wurde gemessen (ε = 71700).
  • Die Menge der eingeführten Dimethoxytritylgruppen betrug 53,1 µmol/g.
    • Herstellungsbeispiel 3 2-[2-O-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethylsulfonyl]ethyl-2,2,2-trichlorethoxycarbonat
  • 1,1 g (2,4 mmol) 2-[2-O-(4,4-Dimethoxytrityloxy)ethylsulfonyl]ethanol [Tetrahedron Lett. 27, 4105 (1986)] wurden durch azeotrope Destillation unter verringertem Druck mit Pyridin getrocknet und dann in 12 ml Methylenchlorid gelöst. 0,35 ml (2,6 mmol) 2,2,2-Trichlorethoxycarbonylchlorid wurden zu der Lösung gegeben, die dann für 2 Stunden gerührt wurde. Nachdem der Abschluß der Reaktion durch Dünnschichtchromatographie bestätigt worden war, wurde das Reaktionsgemisch in ein Gemisch aus 100 ml Methylenchlorid und 100 ml einer 5%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat gegossen, um eine Phasentrennung zu erreichen. Die organischen Schichten wurden mit einer 5%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat gewaschen, und sie wurden dann aufgefangen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde anschließend durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mittels Umkehrphasen-Säulenchromatographie (Präpavative C18, Waters, φ 2,2 × 7,0 cm, Lösungsmittel: 60% (Vol./Vol.) wäßriges Acetonitril) gereinigt, wobei man 1,35 g (Ausbeute: 89%) der Titelverbindung als eine amorphes Pulver erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,41 - 6,83 (13H, Multiplett);
  • 4,15 (2H, Singulett);
  • 4,10 - 4,66 (2H, Triplett, J = 5,94 Hz);
  • 3,80 (6H, Singulett);
  • 3,68 - 3,64 (2H, Triplett, J = 5,28 Hz);
  • 3,56 (2H, Triplett, J = 6,27 Hz);
  • 3,23 - 3,19 (2H, Triplett, J 5,28 Hz).
    • Herstellungsbeispiel 4 Eine Verbindung der Formel 4(p):
  • 0,126 g (0,2 mmol) 2-[2-O-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethylsulfonyl]ethyl-2,2,2-trichlorethoxycarbonat (hergestellt, wie es in Herstellungsbeispiel 3 beschrieben wird) wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst, und 15 µl (0,11 mmol) Triethylamin und 1,0 g Aminopropyl-CPG (85,7 µmol/g Aminogruppen waren darin eingeführt) wurden zu der resultierenden Lösung gegeben und mit einer 1%igen (Vol./Vol.) Lösung von Triethylamin in Dimethylformamid gewaschen. Das Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur für 4 Tage stehengelassen. Am Ende dieser Zeit wurde der CPG-Träger durch Filtration gewonnen und mit Methylenchlorid gewaschen; anschließend wurde er durch Verdampfen unter verringertem Druck getrocknet. 5 ml jeweils an "Cap A"- und "Cap B"-Lösung (Nippon Millipore Limited) wurden zu dem CPG- Träger gegeben, und das Gemisch wurde für 5 Minuten stehengelassen. Das Gemisch wurde dann mit Pyridin und mit Methylenchlorid in dieser Reihenfolge gewaschen und durch Verdampfen unter verringertem Druck getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhielt.
  • Die Menge der Verbindung von Herstellungsbeispiel 3, die in die Titelverbindung eingeführt wurde, wurde nach folgendem Verfahren bestimmt. Eine "Deblock"-Lösung (eine 3%ige (Vol./Vol.) Lösung von Dichloressigsäure in Methylenchlorid; Nippon Millipore Limited) wurde zu 11,4 mg der Titelverbindung gegeben, und das Gemisch wurde für 3 Minuten geschüttelt; anschließend wurde ausreichend Methylenchlorid zugegeben, um eine Gesamtmenge von 20 ml zu erzielen. 0,4 ml des Lösungsmittels wurden abdestilliert, und anschließend wurden 3 ml einer Lösung im Volurnenverhältnis 3 : 2 von Perchlorsäure in Ethanol zu dem Rückstand gegeben, und die Extinktion des Dimethoxytritylkations bei 500 nm wurde gemessen (ε =71100).
  • Die Menge der eingeführten Dimethoxytritylgruppen betrug 24, µmol/g.
    • Herstellungsbeispiel 5 Eine Verbindung der Formel 5(p):
  • 1,60 g (2,87 mmol) 2-[2-O-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethylsulfonyl]ethylmonosuccinat (hergestellt, wie es in Herstellungsbeispiel 1 beschrieben wird) wurden in 18 ml Dimethylformamid gelöst, und 0,96 g (3,6 mol) Pentachlorphenol und 0,96 g (4,5 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid wurden zu der Lösung gegeben. Das resultierende Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit wurden Niederschläge aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert, und das Filtrat wurde durch Destillation unter verringertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Benzol wurde zu dem Rückstand gegeben. Die resultierenden Niederschläge wurden abfiltriert, und das Filtrat wurde erneut durch Destillation unter verringertem Druck vom Lösungsmittel befreit. 1,0 g (0,92 mmol) des Rückstands wurden in der folgenden Stufe verwendet.
  • 1,0 g (0,92 mmol) dieses Rückstands, 75 µl (0,55 mmol) Triethylamin und Cosmosil 150 NH&sub2;-300 (mit 450 µmol Aminogruppen pro 1 g Silicageloberfläche; hergestellt von Nacalai Tesque Co. Ltd.) wurden zu 20 ml Dimethylformamid gegeben. Das resultierende Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur für 20 Stunden gerührt. Der gewünschte Träger, nämlich substituiertes Cosmosil 150 NH&sub2;-300 wurde aufgefangen, mit Methylenchlorid gewaschen und durch Verdampfen unter verringertem Druck getrocknet. Jeweils 10 ml an "Cap A"- und "Cap B"-Lösung (Nippon Millipore Limited) wurden zu dem Träger gegeben, und das Gemisch wurde für 10 Stunden stehengelassen. Das Gemisch wurde dann mit Pyridin und mit Methylenchlorid in dieser Reihenfolge gewaschen und durch Verdampfen unter verringertem Druck getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhielt.
  • Die Menge der Verbindung aus Herstellungsbeispiel 1, die in die Titelverbindung eingeführt wurde, wurde nach folgendem Verfahren bestimmt. Eine "Deblock"-Lösung (eine 3%ige (Vol./Vol.) Lösung von Dichloressigsäure in Methylenchlorid; Nippon Millipore Limited) wurde zu 5,4 mg der Titelverbindung gegeben, und das Gemisch wurde für 3 Minuten geschüttelt; anschließen wurde ausreichend Methylenchlorid zugegeben, um eine Gesamtmenge von 20 ml zu erzielen. 0,4 ml des Lösungsmittels wurden unter verringertem Druck abdestilliert, und 3 ml einer Lösung im Volumenverhältnis 3 : 2 von Perchlorsäure in Ethanol wurden zu dem Rückstand gegeben, und die Extinktion des Dimethoxytritylkations bei 500 nm wurde gemessen (ε = 71700).
  • Es wurde festgestellt, daß die Menge an eingeführten Dimethoxytritylgruppen 51,8 µmol/g betrug.
    • Herstellungsbeispiel 6 Eine Verbindung der Formel 6(p):
  • 1.60 g (2,87 mmol) 2-(2-O-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethylsulfonyl]ethylmonosuccinat (hergestellt, wie es in Herstellungsbeisplel 1 beschrieben wird) wurden in 18 ml Dimethylformamid gelöst, und 0,96 g (3,6 mmol) Pentachlorphenol und 0,96 g (4,5 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid wurden zu der Lösung gegeben. Das resultierende Gemisch wurde dann für 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Am Ende dieser Zeit wurden Niederschläge aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert, und das Filtrat wurde durch Destillation unter verringertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Benzol wurde zu dem Rückstand gegeben. Die resultierenden Niederschläge wurden abfiltriert, und das Filtrat wurde durch Destillation unter verringertem Druck vom Lösungsmittel befreit. 0,48 g (0,6 mmol) des Rückstands wurden in der folgenden Stufe verwendet.
  • 0,48 g (0,6 mmol) dieses Rückstands, 110 mg (0,9 mmol) 4-(Dimethylamino)pyridin und 1,0 g eines p-Alkoxybenzylalkoholharzes (mit 0,9 mmol Aminogruppen pro 1 g Silicageloberfläche; hergestellt von Kokusan Kagaku Co. Ltd.) wurden zu 15 ml Dimethylformamid gegeben, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 25 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit wurde der gewünschte Träger, nämlich das substituierte p-Alkoxybenzylalkoholharz, gewonnen, mit Methylenchlorid, mit Methanol und mit Diethylether in dieser Reihenfolge gewaschen und durch Verdampfen unter verringertem Druck getrocknet. 10 ml jeweils an "Cap A"- und "Cap B"- Lösung (Nippon Millipore Limited) wurden zu dem Träger gegeben, und das Gemisch wurde für 15 Minuten stehengelassen. Das Gemisch wurde dann mit Methylenchlorid, mit Methanol und mit Diethylether in dieser Reihenfolge gewaschen und durch Verdampfen unter verringertem Druck getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhielt.
  • Die Menge der Verbindung aus Herstellungsbeispiel 1, die in die Titelverbindung eingeführt wurde, wurde nach folgendem Verfahren bestimmt. Eine "Deblock"-Lösung (eine 3%ige (Vol./Vol.) Lösung von Dichloressigsäure in Methylenchlorid; Nippon Mililpore Limited) wurde zu 10,6 mg der Titelverbindung gegeben, und das Gemisch wurde für 3 Minuten geschüttelt; anschließend wurde ausreichend Methylenchlorid zugegeben, um eine Gesamtmenge von 20 ml zu erzielen. 0,4 ml des Lösungsmittels wurden abdestilliert, und anschließend wurden 6 ml einer Lösung im Volumenverhältnis 3 : 2 von Perchlorsäure in Ethanol zu dem Rückstand gegeben, und die Extinktion des Dimethoxytritylkations bei 500 nm wurde gemessen (ε =71700).
  • Es wurde festgestellt, daß die Menge eingeführten Dimethoxytritylgruppen 302 µmol/g betrug.
    • Herstellungsbeispiel 7 Eine Verbindung der Formel 7(p):
  • 9,9 g (3,3 mmol) Poly(oxyethylen)diglycol wurden durch azeotrope Destillation mit Pyridin getrocknet und dann in 10 ml Methylenchlorid gelöst. 226 mg (1,1 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid wurden dann zu der Lösung unter Eiskuhlung gegeben. Das resultierende Gemisch wurde dann unter Eiskühlung für 15 Minuten gerührt. Am Ende dieser Zeit wurden 2 ml einer Methylenchloridlösung mit einem Gehalt an 0,5 g (1,1 mmol) 2-(2-O- (4,4-Dimethoxytritylaxy)ethylsulfanyl]ethanal [Tetrahedron Lett., 27, 4705 (1986)] und 0,13 g (1,1 mmol) 4-(Dimethylamino)pyridin zu der Lösung gegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Niederschläge wurden abfiltriert. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf 50 ml durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt. 500 ml kalter Diethylether wurden dann zu der eingeengten Lösung gegeben, und die erhaltenen Niederschläge wurden gewonnen und durch Verdampfen unter verringertem Druck getrocknet. Die resultierenden Niederschläge wurden in Methylenchlorid gelöst und mittels Säulenchromatagraphie durch 200 g Silicagel (10 bis 230 mesh) unter Verwendung eines Gemisches aus Methanol und Methylenchlorid im Volumenverhältnis 2 : 8 als Eluent gereinigt, wobei man 2,77 g; (Ausbeute: 72%) der Titelverbindung erhielt.
  • ¹H-kernmagnetisches Resonanzspektrum (CDCl&sub3;, 270 MHz, TMS), δ ppm:
  • 7,09 - 1,43 (Multiplett);
  • 6,81 - 6,88 (Multiplett);
  • 4,58 - 4,64 (Multiplett);
  • 3,65 (Singulett);
  • 3,50 - 3,53 (Multiplett);
  • 3,46 - 3,49 (Multiplett);
  • 3,31 - 3,34 (Multiplett).
    • Herstellungsbeispiel 8 Eine Verbindung der Formel 8(p):
  • 0,7 g (0,2 mmol) der Verbindung aus Herstellungsbeispiel 7 wurden in 6 ml Methylenchlorid gelöst, und 2 ml einer Dimethylformamidlösung mit einem Gehalt an 63 mg (0,24 mmol) Pentachlorphenol und 64 mg (0,3 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid wurden unter Eiskühlung zu der Lösung gegeben. Die resultierende Lösung wurde dann bei Raumtemperatur für 7 Tage gerührt. Am Ende dieser Zeit wurden Niederschläge aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert, und das Filtrat wurde durch Destillation unter verringertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der resultierende Rückstand wurde in 10 ml Methylenchlorid gelöst. 100 ml Diethylether wurden zu der Lösung unter Eiskühlung gegeben, und die resultierenden Niederschläge wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde durch Destillation unter verringertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Das Filtrat, 31 mg (0,3 mmol) 3-(Dimethylamino)pyridin und 0,25 g eines p-Alkoxybenzylalkohalharzes (mit 0,9 mmol Aminogruppen pro 1 g Silicageloberfläche; hergestellt von Kokusan Kagaku Co. Ltd) wurden zu 6 ml Dimethylformamid gegeben. Das resultierende Gemisch wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Der gewünschte Träger, nämlich ein substituiertes p-Alkoxybenzylalkoholharz, wurde gewonnen, mit Pyridin, mit Methylenchlorid und mit Diethylether in dieser Reihenfolge gewaschen und durch Verdampfen unter verringertem Druck getrocknet. Jeweils 10 ml "Cap A"- und "Cap B"-Lösung (Nippon Millipore Limited) wurden zu dem Träger gegeben, und das Gemisch wurde für 15 Minuten stehengelassen. Das Gemisch wurde dann mit Methylenchlorid, mit Methanol und mit Triethylether in dieser Reihenfolge gewaschen und durch Verdampfen unter verringertem Druck getrocknet, wobei man die Titelverbindung erhielt.
  • Die Menge der Verbindung aus Herstellungsbeisplel 1, die in die Titelverbindung eingeführt wurde, wurde nach folgendem Verfahren bestimmt. Eine "Deblock"-Lösung (eine 3%ige (Vol.-/Vol.) Lösung von Dichloressigsäure in Methylenchlorid; Nippon Millipore Limited) wurde zu 6,7 mg der Titelverbindung gegeben, und das Gemisch wurde für 3 Minuten geschüttelt; anschließend wurde ausreichend Methylenchlorid zugegeben, um eine Gesamt menge von 20 ml zu erzielen. 0,4 ml des Lösungsmittels wurden durch Destillation unter verringertem Druck entfernt, und anschließend wurden 20 ml einer Lösung im Volumenverhältnis 3 : 2 von Perchlorsäure in Ethanol zu dem Rückstand gegeben, und die Extinktion des Dimethoxytritylkations bei 500 nm wurde gemessen (ε =71700).
  • Es wurde festgestellt, daß die Menge der eingeführten Dimethoxytritylgruppen 16 µmol/g betrug.
    • Formulierungsbeispiel 1 Injektionsformulierung
  • Eine Injektionsformulierung wurde durch Rühren von 1,5 Gew.-% der Verbindung aus Beispiel 25 in 10 Vol.-% Propylenglycol, Zugabe einer ausreichenden Menge Wasser für Injektionen, so daß das erforderliche Endvolumen erzielt wurde, und Sterilisieren hergestellt.
    • Formulierungsbeispiel 2 Tablettenformulierung
  • Tabletten, die jeweils 100 mg der Bestandteile enthielten, wurden hergestellt, indem ein gemahlenes Gemisch der vorstehenden Bestandteile Nr. 1 bis 4 zu einem vorgranulierten Gemisch der Bestandteile Nr. 5 bis 8 gegeben und dann das auf diese Weise hergestellte Gemisch in einer geeigneten Tablettiermaschine komprimiert wurde.
    • Formulierungsbeispiel 3 Kapselformulierung
  • Auf herkömmliche Weise wurden Kapseln, die 200 mg der vorstehenden Bestandteile enthielten, durch Pulverisieren eines Gemisches der Bestandteile in einem geeigneten Mischer, Sieben des Gemisches und schließlich gründliches Mischen hergestellt.
    • Formulierungsbeispiel 4 Hartkapselformulierung
  • Einheitskapseln wurden durch Mischen von 100 mg der pulverförmigen Verbindung aus Beispiel 25, 150 mg Lactose, 50 mg Cellulose und 6 mg Magnesiumstearat, Einfüllen des vorstehenden Gemisches in zweiteilige Standard-Hartgelatinekapseln, Waschen und schließlich Trocknen hergestellt.
    • Formulierungsbeispiel 5 Weichkapselformulierung
  • Welchkapseln, die 100 mg des aktiven Bestandtells enthielten, wurden durch Mischen der Verbindung von Beispiel 25 in einem verdaubaren Öl (wie Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl oder Olivenöl), Einfüllen dieses Gemisches in geeignete Gelatinekapseln mittels einer Motorpumpe, Waschen und schließlich Trocknen hergestellt.
    • Formulierungsbeispiel 6 Tablettenformulierung
  • Auf herkömmliche Weise wurden Tabletten durch Granulieren eines Gemisches von 100 mg der Verbindung aus Beispiel 25, 0,2 mg kolloidalem Siliciumdioxid, 5 mg Magnesiumstearat, 215 mg feiner kristalliner Cellulose, 11 mg Stärke und 98,8 mg Lactose hergestellt.
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Claims (36)

1. Verbindung der allgemeinen Formel (1):
worin:
R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhingig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoffatomen, Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Arylgruppen gemäß der nachstehenden Definition und Anthrachinonylgruppen besteht, die unsubstituiert sind oder die mit mindestens einem Substituenten substituiert sind, der vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den nachstehend definierten Substituenten 1 besteht;
Z ein Kohlenstoffatom oder ein Siliciumatom darstellt;
oder
R&sub2;, R&sub3;, und Z zusammen eine Fluorenyl- oder Xanthenylgruppe darstellen;
R&sub4; ein Wasserstoffatom, eine unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine substituierte Alkylgruppe, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist und die mit mindestens einem Substituenten substituiert ist, der vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den nachstehend definierten Substituenten Z besteht, eine Arylgruppe gemaß der nachstehenden Definition oder eine Aralkylgruppe gemäß der nachstehenden Definition darstellt;
Y&sub1;, Y&sub3; und Y&sub4; unabhingig aus der Gruppe ausgewahlt sind, die aus Sauerstoffatomen, Schwefelatomen und Gruppen der Formel > NH besteht;
Y&sub2; ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, eine Gruppe der Formel > NH, eine Alkylengruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylengruppe darstellt;
X eine unsubstituierte Alkylengruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Alkylengruppe, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist und die mit mindestens einer Hydroxygruppe substituiert ist, darstellt;
m und n unabhängig jeweils 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 sind;
und
B ein Oligodesoxyribonucleotid mit einer Kettenlänge von 3 bis 9 darstellt;
die Arylgruppe eine aromatische carbocyclische Gruppe ist, die 6 bis 20 Ringkohlenstoffatome aufweist und die unsubstituiert ist oder die mit mindestens einem Substituenten substituiert ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den nachstehend definierten Substituenten 1 besteht;
die Aralkylgruppe eine Alkylgruppe ist, die 1 bis 4 Kohlenstoffatom aufweist und die mit mindestens einer Arylgruppe gemäß der vorstehenden Definition substituiert ist;
die Substituenten 1 aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogenalkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogenatomen, Nitrogruppen, Cyanogruppen, Aminogruppen, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkylthiogruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Arylgruppen gemäß der vorstehenden Definition, Aryloxygruppen, bei denen der Arylanteil der vorstehenden Definition entspricht, und Aralkyloxygruppen, bei denen der Aralkylanteil der vorstehenden Definition entspricht, besteht, mit der Maßgabe, daß, wenn der Substituent 1 eine Arylgruppe oder eine Gruppe, die eine Arylgruppe enthält, darstellt, die mit einer weiteren Arylgruppe oder einer Gruppe, die eine Arylgruppe enthält, substituiert ist, die weitere Gruppe nicht selbst mit einer Arylgruppe oder einer Gruppe, die eine Arylgruppe enthält, substituiert ist; und
die Substituenten 2 aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Aminogruppen, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Halogenatomen besteht;
oder ein Salz davon,
mit der Maßgabe, daß, wenn Z ein Kohlenstoffatom darstellt, m=0, Y&sub1; ein Sauerstoffatom darstellt und R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; eine unsubstituierte oder substituierte Phenylgruppe darstellen, B nicht aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus CGTGACACAATA, ACGCTCAATT, AATTCACGGTG, GCTGTTGACT, ATTTTACCTCT, GGCGGTGATA, ATGAGCAC, AATTGTGC, TCATTATCA, CCGCCAGAG, GTAAAATAGTCA und ACACGCACGGTG besteht.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, wobei das Oligodesoxyribonucleotid B eine Kettenlänge von 4 bis 8 aufweist.
3. Verbindungen nach Anspruch 2, wobei das Oligodesoxyribonucleotid B eine Kettenlänge von 5 oder 6 aufweist.
4. Verbindungen nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem vierten Desoxyribonucleotid vom 5'-terminalen Ende von B um Guanindesoxyribonucleotid handelt.
5. Verbindungen nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Triphenylmethyloxy-, 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5-(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5- Bis[3,6-(dibenzyloxy)benzyloxy]benzyloxy-, tert.-Butyldiphenylsilyloxy-, Phenylfluorenyloxy- und Phenylxanthenyloxygruppe besteht; die Gruppe der Formel [P(O)(Y&sub2;R&sub4;)-Y&sub3;-(X-Y&sub4;)n]mH aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Wasserstoffatom, einer Methylphosphoryl-, 2-Chlorphenylphosphoryl-, -O-Methylthiophosphoryl-, Methylphosphonyl-, Methylthiophosphonyl-, Phenylphosphonyl-, 2-Hydroxyethylphosphoryl-, -O-(2-Hydroxyethyl)thiophosphoryl , Phenylphosphoryl-, 4-Chlorphenylphosphoryl-, 2-Nitrophenylphosphoryl-, 4-Nitrophenylphosphoryl-, Ethylphosphoryl- und -O-Ethylthiophosphorylgruppe besteht; und B aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, GGGCGGGGC, TAGGAGG, TGGGAGGT, TGGGCGCAG, CCG, TCGGAGG, TGmCGAGG, CTGGGAGG, TGG, TGGGAmGG, TGGGAGA, AATGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG, CGCGG, CGGGT, TGGGC und TGGGT besteht.
6. Verbindungen nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Triphenylmethyloxy-, 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5-(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5- Bis(3,5-(dibenzyloxy)benzyloxylbenzyloxy-, tert.-Butyldiphenylsilyloxy-, Phenylfluorenyloxy- und Phenylxanthenyloxygruppe besteht; die Gruppe der Formel [P(O)(Y&sub2;R&sub4;)-Y&sub3;-(X-Y&sub4;)n]mH aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Wasserstoffatom, einer Methylphosphoryl-, 2-Chlorphenylphosphoryl-, -O-Methylthiophosphoryl-, Methylphosphoryl-, Methylthiophosphonyl-, Phenylphosphonyl-, 2-Hydroxyethylphosphoryl-, -O-(2-Hydroxyethyl)thiophosphoryl-, Phanylphosphoryl-, 4-Chlorphenylphosphoryl-, 2-Nitrophenylphosphoryl-, 4-Nitrophenylphosphoryl-, Ethylphosphoryl- und -O-Ethylthiophosphorylgruppe besteht; und B aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGGGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, MCGMCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG und CGCGG besteht.
1. Verbindungen nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Triphenylmethyloxy-, 3,4(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5-(Dibenzyloxy)benzyloxy-, 3,5- Bis[3,5-(dibenzyloxy)benzyloxy]benzyloxy-, tert.-Butyldiphenylsilyloxy-, Phenylfluorenyloxy- und Phenylxanthenyloxygruppe besteht; die Gruppe der Formel [P(O)(Y&sub2;R&sub4;)-Y&sub3;-(X-Y&sub4;)n]mH aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Wasserstoffatom, einer Methylphosphoryl-, 2-Chlorphenylphosphoryl-, -O-Methylthiophosphoryl-, Methylphosphonyl-, Methylthiophosphonyl-, Phenylphosphonyl-, 2-Hydroxyethylphosphoryl- und -O-(2-Hydroxyethyl)thiophosphorylgruppe besteht; und B aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, GTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG und CGCGG besteht.
8. Verbindungen nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Triphenylmethyloxy-, 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxy- und 3,5-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe besteht; die Gruppe der Formel [P(O)(Y&sub2;R&sub4;)-Y&sub3;-(X-Y&sub4;)n]mH aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Wasserstoffatom, einer Methylphosphoryl-, 2-Chlorphenylphosphoryl-, -O-Methylthiophosphoryl-, Methylphosphonyl-, Methylthiophosphonyl-, Phenylphosphonyl-, 2-Hydroxyethylphosphoryl-, -O-(2-Hydroxyethyl)thiophosphoryl-, Phenylphosphoryl-, 4-Chlorphenylphosphoryl-, 2-Nitrophenylphosphoryl-, 4-Nitrophenylphosphoryl-, Ethylphosphoryl- und O-Ethylthiophosphorylgruppe besteht; und B aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG und CGCGG besteht.
9. Verbindungen nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Triphenylmethyloxy-, 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxy- und 3,5-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe besteht; die Gruppe der Formel [P(O)(Y&sub2;R&sub4;)-Y&sub3;-(X-Y&sub4;)n]mH aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Wasserstoffatom, einer Methylphosphoryl-, 2-Chlorphenylphosphoryl-, -O-Methylthiophosphoryl-, Methylphosphonyl-, Methylthiophosphonyl-, Phenylphosphonyl-, 2-Hydroxyethylphosphoryl- und -O-(2-Hydroxyethyl)thiophosphorylgruppe besteht; und B aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG und CGCGG besteht.
10. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub4; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; ein Wasserstoffatom darstellt; X eine Ethylengruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 1 hat; und B TGGGAG darstellt.
11. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Schwefelatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub4; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; ein Wasserstoffatom darstellt; X eine Ethylengruppe darstellt; in den Wert 1 hat; n den Wert 1 hat; und B TGGGAG darstellt.
12. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe darstellt; m den Wert 0 hat; n den Wert 0 hat; und B TGGGAG darstellt.
13. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; eine Methylgruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 0 hat; und B TGGGAG darstellt.
14. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine Triphenylmethyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub4; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; ein Wasserstoffatom darstellt; X eine Ethylengruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 1 hat; und B TGGGAG darstellt.
15. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine Triphenylmethyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Schwefelatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub4; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; ein Wasserstoffatom darstellt; X eine Ethylengruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 1 hat; und B TGGGAG darstellt.
16. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine Triphenylmethyloxygruppe darstellt; m den Wert 0 hat; n den Wert 0 hat; und B TGGGAG darstellt.
11. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine Triphenylmethyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; eine Methylgruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 0 hat; und B TGGGAG darstellt.
18. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub4; ein Sauerstoffatoin darstellt; R&sub4; ein Wasserstoffatom darstellt; X eine Ethylengruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 1 hat; und B CGGGG darstellt.
19 Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Schwefelatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub4; ein Sauerstoffafom darstellt; R&sub4; ein Wasserstoffatom darstellt; X eine Ethylengruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 1 hat; und B CGGGG darstellt.
20. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe darstellt; m den Wert hat, n den Wert 0 hat; und B CGGGG darstellt.
21. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; eine Methylgruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 0 hat; und B CGGGG darstellt.
22. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine Triphenylmethyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub4; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; ein Wasserstoffatom darstellt; X eine Ethylengruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 1 hat; und B CGGGG darstellt.
23. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine Triphenylmethyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Schwefelatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub4; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; ein Wasserstoffatom darstellt; X eine Ethylengruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 1 hat;und B CGGGG darstellt.
24. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine Triphenylmethyloxygruppe darstellt; m den Wert 0 hat; n den Wert 0 hat; und B CGGGG darstellt.
25. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine Triphenylmethyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; eine Methylgruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 0 hat; und B CGGGG darstellt.
26. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub4; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; ein Wasserstoffatom darstellt; X eine Ethylengruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 1 hat; und B CGCGG darstellt.
27. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Schwefelatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub4; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; ein Wasserstoffatom darstellt; X eine Ethylengruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 1 hat; und B CGCGG darstellt.
28. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine 3,4-(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe darstellt; m den Wert 0 hat; n den Wert 0 hat; und B CGCGG darstellt.
29. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine 3,4(Dibenzyloxy)benzyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; eine Methylgruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 0 hat; und B CGCGG darstellt.
30. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine Triphenylmethyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub4; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; ein Wasserstoffatom darstellt; X eine Ethylengruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 1 hat; und B CGCGG darstellt.
31. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine Triphenylmethyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Schwefelatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub4; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; ein Wasserstoffatom darstellt; X eine Ethylengruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 1 hat; und B CGCGG darstellt.
32. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine Triphenylmethyloxygruppe darstellt; m den Wert 0 hat; n den Wert 0 hat; und B CGCGG darstellt.
33. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gruppe der Formel R&sub1;R&sub2;R&sub3;Z-Y&sub1; eine Triphenylmethyloxygruppe darstellt; Y&sub2; ein Sauerstoffatom darstellt; Y&sub3; ein Sauerstoffatom darstellt; R&sub4; eine Methylgruppe darstellt; m den Wert 1 hat; n den Wert 0 hat; und B CGCGG darstellt.
34. Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe viraler Infektionen, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel (1'):
worin:
R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoffatomen, Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohienstoffatomen, Arylgruppen gemäß der nachstehenden Definition und Anthrachinonylgruppen besteht, die unsubstituiert sind oder die mit mindestens einem Substituenten substituiert sind, der vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den nachstehend definierten Substituenten 1 besteht;
Z ein Kohlenstoffatom oder ein Siliciumatom darstellt;
oder
R&sub2;, R&sub3;, und Z zusammen eine Fluorenyl- oder Xanthenylgruppe darstellen;
die Substituenten 2 aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Aminogruppen, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Halogenatomen besteht;
oder eines Salzes davon umfaßt.
35. Verbindung der allgemeinen Formel (1') gemäß der Definition in Anspruch 34 oder Salz davon für die Verwendung in der Therapie.
36. Verbindung der folgenden allgemeinen Formeln (12), (14), (22), (24), (25) oder (27):
R&sub4; ein Wasserstoffatom, eine unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine substituierte Alkylgruppe) die 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist und die mit mindestens einem Substituenten substituiert ist, der vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den nachstehend definierten Substituenten 2 besteht, eine Arylgruppe gemäß der nachstehenden Definition oder eine Aralkylgruppe gemäß der nachstehenden Definition darstellt;
Y&sub1;, Y&sub3; und Y&sub4; unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Sauerstoffatomen, Schwefelatomen und Gruppen der Formel > NH besteht;
Y&sub2; ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, eine Gruppe der Formel > NH, eine Alkylengruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylengruppe darstellt;
X eine unsubstituierte Alkylengruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Alkylengruppe, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist und die mit mindestens einer Hydroxygruppe substituiert ist, darstellt;
m und n unabhängig jeweils 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 sind;
und
B ein Oligodesoxyribonucleotid mit einer Kettenlänge von 3 bis 9 darstellt;
die Arylgruppe eine aromatische carbocyclische Gruppe ist, die 6 bis 20 Ringkohlenstoffatome aufweist und die unsubstituiert ist oder die mit mindestens einem Substituenten substituiert ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den nachstehend definierten Substituenten 1 besteht;
die Aralkylgruppe eine Alkylgruppe ist, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist und die mit mindestens einer Arylgruppe gemäß der vorstehenden Definition substituiert ist;
die Substituenten 1 aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogenalkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogenatomen, Nitrogruppen, Cyanogruppen, Aminogruppen, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkylthiogruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Arylgruppen gemäß der vorstehenden Definition, Aryloxygruppen, bei denen der Arylantell der vorstehenden Definition entspricht, und Aralkyloxygruppen, bei denen der Aralkylanteil der vorstehenden Definition entspricht, besteht, mit der Maßgabe, daß, wenn der Substituent 1 eine Arylgruppe oder eine Gruppe, die eine Arylgruppe enthält, daßstellt, die mit einer weiteren Arylgruppe oder einer Gruppe, die eine Arylgruppe enthält, substituiert ist, die weitere Gruppe nicht selbst mit einer Arylgruppe oder einer Gruppe, die eine Arylgruppe enthält, substituiert ist; und
worin
R¹, R² und R³ gleich oder verschieden voneinander sein können und jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen;
R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; gleich oder verschieden sein können und jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine wahlweise substituierte Arylgruppe oder eine wahlweise substituierte Anthrachinonylgruppe darstellen;
Z ein Kohlenstoff- oder Siliciumatom darstellt;
R&sup5;, R&sup6; und Z zusammen eine Fluorenylgruppe oder eine Xanthenylgruppe darstellen können; oder
R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und Z zusammen ein Wasserstoffatom darstellen;
R&sup7; ein Wasserstoffatom, eine wahlweise substituierte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine wahlweise substituierte Arylgruppe oder eine wahlweise substituierte Aralkylgruppe darstellt;
R&sup8; eine Methylgruppe, eine Cyanoethylgruppe oder eine Phenylgruppe, die wahlweise mit einer Chlorgruppe substituiert ist, darstellt;
R8a eine Methylgruppe oder eine Cyanoethylgruppe darstellt;
R8b eine Phenylgruppe, die wahlweise mit einer Chlorgruppe substituiert ist, darstellt;
R9a ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxygruppe mit einer Schutzgruppe darstellt;
A eine Gruppe -(CH&sub2;)h- (worin h eine ganze Zahl von 1 bis 16 ist), eine Gruppe (CH&sub2;)hO- (worin h eine ganze Zahl von 1 bis 16 ist), eine Gruppe (CH&sub2;)j-O-CO-(CH&sub2;)k- (worin j eine positive ganze Zahl ist, k den Wert 0 hat oder eine positive ganze Zahl ist und j + k den Wert 2 bis 16 hat) oder eine Gruppe -(CH&sub2;)j-NH-CO-(CH&sub2;)k- (worin j eine positive ganze Zahl ist, k den Wert 0 hat oder eine positive ganze Zahl ist und j + k den Wert 2 bis 16 hat), eine Gruppe -(CH&sub2;)j-S-CO-(CH&sub2;)k (worin j eine positive ganze Zahl ist, k den Wert 0 hat oder eine positive ganze Zahl ist und j + k den Wert 2 bis 16 hat) oder eine Gruppe -(CH&sub2;)n-O-CO- CH&sub2;(OCH&sub2;CH&sub2;)p-OCH&sub2;- (worin n eine positive ganze Zahl ist, p den Wert 0 hat oder eine positive ganze Zahl ist und j + k den Wert 2 bis 100 hat) darstellt;
B, B' und B'' jeweils die Basengruppe von Adeninnucleotid, Guaninnucleotid, Thymidinnucleotid oder Cytosinnucleotid darstellen, die an den Basen und Phosphatgruppen geschützt sind;
P ein Polymeres Material darstellt;
X ein Halogenatom darstellt;
X¹ eine Gruppe -S-, -SO- oder -SO&sub2; darstellt;
X² ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder eine NH-Gruppe darstellt;
X³ ein Sauerstoff- oder Schwefelatom darstellt;
Y&sub1; eine Hydroxylgruppe, eine wahlweise substituierte Phenyloxygruppe oder Ethyloxygruppe, die mit einem Halogen substituiert sein kann, darstellt;
Y&sub2; ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder eine NH-Gruppe darstellt;
Y³ ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, eine NH-Gruppe, eine Alkylengruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylengruppe darstellt;
mit der Maßgabe, daß für Verbindungen der allgemeinen Formeln (12) oder (14), in denen A eine Gruppe der Formel -(CH&sub2;)j-O-CO-(CH&sub2;)k darstellt, j einen anderen Wert als die ganze Zahl Z aufweist.
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