KR100318796B1 - 변성올리고데옥시리보뉴클레오티드,그의제조방법및그의치료적용도 - Google Patents

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가와무라 요시부미
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Abstract

인간일 수도 있는 비루스 감염된 포유류의 처리 또는 예방을 위한 화합물을 제공한다. 화합물은 올리고데옥시리보핵산 유도체 및 이러한 화합물을 제조하는 신규 방법도 또한 더 일반적으로 유용한 중간체의 제조방법과 함께 제공된다. 일반식 (1) 의 활성 화합물 또는 그의 염.
[식중, R1, R2및 R3는 수소원자, 알킬기, 정의된 바와 같은 아릴기 및 정의된 바와 같은 안트라퀴노닐기 이고 ; Z 은 탄소 또는 규소를 나타내며 ; 또는 R2, R3및 Z 은 함께 플루오레닐 또는 크산테닐기를 나타내고 ; R4는 수소원자, 정의된 바와 같은 알킬기, 정의된 바와 같은 아릴기이고 ; Y1, Y3및 Y4는 산소, 황 또는 >NH 이고 ; Y2는 산소, 황, >NH, 알킬렌 또는 페닐렌이고 ; X 는 정의된 바와 같은 알킬렌기이고 ; m 및 n 은 0 ∼ 10 이고 ; B 는 사슬 길이 3 ∼ 9 의 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다.]

Description

변성 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 그의 제조방법 및 그의 치료적 용도
본 발명은 뛰어난 항 - 비루스 활성을 갖는 신규의 변성 올리고데옥시리보뉴클레오티드계에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 비루스감염을 치료 및 예방하고 종양세포의 증식을 억제하기 위해, 상기 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 사용한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기화합물의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 화합물은, 현재 AIDS의 원인인 것으로 일반적으로 인정되고 있는 인간 면역 결핍 비루스 (HIV) 에 대해 특히 유효하다.
유전자에 대해 상보적인 서열을 가진 올리고데옥시리보뉴클레오티드 (안티센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드) 는 그 유전자의 기능적 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한, 비루스 유전자 또는 종양 유전자에 대해 상보적인 안티센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드는, 각각의 유전자의 기능을 억제함으로써, 비루스의 복제 또는 세포의 증식을 저지할 수 있는 것으로 보고되어 있다 [P.C. Zamecnik, M.L, Stephenson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, (1) 280 (1978) 및 P.C, Zamecnik, J. Goodchild, Y. Taguchi, Sarin, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 83,(6) 4143 (1986)]
종래에는, 안티센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 목적하는 활성을 나타내기 위해서는, 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 생체내에서 표적 RNA 또는 DNA 와 안정한 하이브리드를 형성할 수 있어야 하고, 따라서 15 이상의 뉴클레오티드의 사슬 길이를 가져야 한다고 생각되었었다. 그러나, 일반적으로, 일들을 실용화할 수 있는 수율과 순도로 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 합성할 수 없으며, 또한 안티센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 비루스의 복제를 억제하거나 세포의 증식을 억제하기 위해 충분한 활성을 갖고 있지 않으므로 이들을 치료용으로 사용할 수 없다; 또한, 숙주의 정상 세포에 대한 화합물의 독성이 비교적 높다.
짧은 사슬 길이를 가진 올리고데옥시뉴클레오티드가 알려져 있긴 하지만, 종래에는 이들이 빈약한 억제 활성을 갖는것으로 생각되었었다. 그 결과, 대부분의 연구자들은 본 발명의 것보다 더욱 긴 사슬을 가진 올리고데옥시리보뉴클레오티드에 대해서 연구를 집중하였다. 즉, 예를 들면, PCT 출원 제 WO 88/07544 호 (본 발명에 가장 근접한 선행 기술을 나타낸 것이라고 사료됨)는, 4개 정도로 적은 수의 염기 단위를 가진 올리고뉴클레오티드를 그의 범위내에 포함하고 있긴 하지만, 실제적으로는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 보다 더욱 큰 상당히 많은 수의 단위를 가진 올리고뉴클레오티드만을 시험한 것이 명백하다. 이제, 본 발명자들은, 다양한 치환기를 5' - 및/또는 3' - 말단 내에 도입함으로써 제조되고 각종 염기서열로 구성된 특정한 변성 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 뛰어난 항 - AIDS 비루스 활성을 나타낸다는 것과, 숙주 동물의 정상 세포에 대해 상기 뉴클레오티드의 독성이낮다는 것을 알아내었다. 또한, 실제적으로 중요한 사항은, 본 발명의 변성 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 단순한 공지의 기술을 사용하여 쉽게 합성할 수 있다는 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규의 변성 올리고데옥시리보뉴클레오티드계를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 더욱 특정한 목적은, 정상세포내에서 이물질 핵산의 복제를 억제하는 능력을 가지고, 따7라서 AIDS를 포함한 비루스 감염증 및 종양의 치료 및 예방을 위해 사용될수 있는, 상기 변성 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 관련된 목적은, 신규 올리고데옥시리보뉴클레오티드 화합물의 제조방법, 및 이 제조방법에서 사용하기 위한 중간체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 장점은 이하 상세한 설명에서 명백해질 것이다.
본 발명의 화합물은 하기 식(1)의 변성 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다;
[상기 식에서,
R1, R2및 R3는 수소원자, 탄소수1 내지 4의 알킬기, 하기 정의된 아릴기, 및 비치환되거나 하기 정의된 치환기 1 로 구성된 군에서 바람직하게 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환된 안트라퀴노닐기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고 ;
Z은 탄소원자 또는 규소원자를 나타내거나 ; 또는
R2, R3및 Z 은 함께 플루오레닐 또는 크산테닐기를 나타내며 ;
R4는 수소원자, 탄소수 1 내지 4의 비치환된 알킬기, 하기 정의된 치환기 2 로 구성된 군에서 바람직하게 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환된 탄소수 1 내지 4 의 치환된 알킬기, 하기 정의된 아릴기, 또는 하기 정의된 아르알킬기를 나타내고 ;
Y1, Y3및 Y4는 산소원자, 황원자 및 식 > NH의 기로 구성된 군으로 부터 바람직하게 선택되고 ;
Y2는 산소원자, 황원자, 식 > NH의 기, 탄소수 1 내지 4의 알킬렌기, 또는 페닐렌기를 나타내고 ;
X는 탄소수 1 내지 10 의 비치환된 알킬렌기, 또는 적어도 하나의 히드록시 기로 치환된 탄소수 1 내지 10 의 알키렌기를 나타내며 ;
m 및 n 은 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 10 의 정수이고 ;
B 는 3 내지 9 의 사슬길이를 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 나타내고 ;
상기 아릴기는 6 내지 20 개의 고리 탄소 원자를 갖고, 비치환되거나 하기 정의된 치환기 1 로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환된 방향족 카르보시클릭기이며 ;
상기 아르알킬기는 상기 정의된 적어도 하나의 아릴기로 치환된 탄소수 1 내지 4 의 알킬기이고 ;
상기 치환기 1 은 탄소수 1 내지 4 의 알킬기, 탄소수 1 내지 4의 할로알킬기, 할로겐원자, 니트로기, 시아노기, 아미노기, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기, 탄소수 1 내지 4 의 알킬티오기, 상기 정의된 아릴기, 아릴 부분이 상기 정의된 것과 같은 아릴옥시기, 및 아르알킬부분이 상기 정의된 것과 같은 아르알킬옥시기로 구성된 군에서 선택되고, 단, 상기 치환기 1 이 추가의 아릴기 또는 아릴기를 함유하는 기로 치환된 아릴기, 또는 아릴기를 함유하는 기를 나타내는 경우에, 추가의 기는 아릴기 또는 아릴기를 함유하는 기에 의해서는 자체로 치환되지 않으며 ;
상기 치환기 2 는 아미노기, 탄소수 1 내지 4 의 알콕시기 및 할로겐 원자로 구성된 군에서 선택된다.]
본 발명은 또한 상기 정의된 식(1)의 화합물인 적어도 1 종의 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 유효량을 함유하는 비루스 감염증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 정의된 식 (Ⅰ)의 화합물인 적어도 1 종의 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 유효량을 인간을 포함한 포유동물에 투여함을 특징으로 하는 인간을 포함한 포유 동물에서의 비루스 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 제조 방법 및 제조 중간체를 제공하며, 제조방법은 이하에서 더욱 상세히 설명된다.
본 발명의 신규의 변성 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 통상 반응 부산물이제거된 형태로 제공된다.
본 발명의 화합물에서, R1, R2또는 R3가 알킬기를 나타내는 경우, 이것은 탄소수 1 내지 4 의 직쇄 또는 분지쇄 알킬기일 수도 있고, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec -부틸 및 t- 부틸기가 예시된다. 이중에서, t - 부틸기가 바람직하다.
R1, R2또는 R3가 아릴기를 나타내는 경우, 이것은 6 내지 20 개 고리탄소원자, 더욱 바람직하게는 6 내지 16 개 고리탄소원자, 더욱더 바람직하게는 6 내지 10 개의 고리탄소원자, 가장 바람직하게는 6 또는 10개의 고리탄소원자를 갖고, 비치환되거나 하기 정의되고 예시된 치환기 1 로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환된 방향족 카르보시클릭기일 수도 있다. 비치환된 기의 예로는 페닐, 1 - 나프틸, 2 - 나프틸, 페난트렌 - 4 - 일, 안트라센 - 9 - 일, 안트라센 - 2 - 일 및 피레닐기가 예시된다. 이중에서, 나프틸 및 페닐기가 더욱 바람직하고, 페닐기가 가장 바람직하다. 치환된 기는 이들 기 중의 어느 하나 일 수도 있고 상기 정의되고 하기 예시된 치환기 1 의 하나 이상으로 치환될 수도 있다. 치환기의 수는, 치환가능한 위치의 수 (예를들면, 페닐기의 경우에는 5, 또는 나프틸기의 경우에는 7) 및 가능하다면 입체 장해에 의해 제한이 부여될 수도 있는 것 이외에는, 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 가장 통상적으로, 1 내지 5 개의 치환기가 바람직하고, 1 내지 3 개가 더욱 바람직하며, 1 또는 2 개의 치환기가 가장 바람직하다. 치환기 1의 특정예는 다음과 같다 ;
탄소수 1 내지 4 의 알킬기, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec - 부틸 및 t - 부틸기, 이중에서 바람직한 것은 메틸 및 t - 부틸기 ;
탄소수 1 내지 4 의 할로알킬기, 예를 들어 플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 트리클로로메틸, 2,2,2 - 트리플루오로에틸, 2,2,2 - 트리클로로에틸, 2 - 플루오로에틸, 2 - 클로로에틸, 2 - 요오도에틸, 3 - 클로로프로필 및 4 - 플루오로부틸 및 6 - 요오도헥실기, 이중에서 바람직한 것은 2,2,2 - 트리클로로에틸 및 트리클로로메틸기 ;
할로겐 원자, 예를들어 불소, 염소, 브롬 및 요오드 원자, 이중에서 바람직한 것은 염소 및 불소원자 ;
니트로기, 시아노기, 아미노기 ;
탄소수 1 내지 4의 알콕시기, 예를 들어 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시, sec - 부톡시 및 t - 부톡시기, 이중에서 바람직한 것은 메톡시 및 t - 부톡시기 ;
탄소수 1 내지 4 의 알킬티오기, 예를 들어 메틸티오, 에틸티오, 프로필티오, 이소프로필티오, 부틸티오, 이소부틸티오, sec - 부틸티오 및 t - 부틸티오기, 이중에서 바람직한 것은 메틸티오 및 t - 부틸티오기 ;
상기 정의 및 예시된 아릴기, 가장 바람직하게는 페닐기 ;
아릴부분이 상기 정의 및 예시된것과 같은 아릴옥시기, 가장 바람직하게는 페녹시기 ; 및
아르알킬 부분이 상기 정의된 것과 같은 아르알킬옥시기, 예를 들어 벤질옥시 및 디벤질옥시벤질옥시 [특히 3,5 -디벤질옥시벤질옥시기].
아릴기 (또는 아릴기를 함유하는 기) 가 그 자체로 추가의 기에 의해 치환될 수도 있지만, 그 추가의 치환에는 제한이 부여되며, 다시말해서, 상기 치환기 1 이 추가의 아릴기 또는 아릴기를 함유하는 기에 의해 치환된 아릴기 또는 아릴기를 함유하는 기를 나타내는 경우에는, 추가의 기가 아릴기 또는 아릴기를 함유하는 기에 의해 치환되지 않는다는 것을 관찰해야 한다.
치환된 아릴기의 특정예로는, 4 - 메틸페닐, 4 - t - 부틸페닐, 2 - 페닐페닐, 4 - 페닐페닐, 4 - 플루오로페닐, 2 - 클로로페닐, 4 - 클로로페닐, 4 - 브로모페닐, 4 - 요오도페닐, 2,4 - 디플루오로페닐, 4 - 니트로페닐, 4 - t - 부톡시페닐, 4 - 메톡시페닐, 4 - 에톡시페닐, 3 - 페녹시페닐, 4 -페녹시페닐, 2 - 벤질옥시페닐, 4 - 벤질옥시페닐, 3,4 - 디벤질옥시페닐, 3,5 - 디벤질옥시페닐 및 3,5 - 비스 (3,5 - 디벤질옥시벤질옥시) 페닐기가 예시된다. 치환 및 비치환된 아릴기 중에서, 페닐, 4 -메톡시페닐, 3,4 - 디벤질옥시페닐, 3,5 - 디벤질옥시페닐기 및 3,5 - 비스 (3,5 - 디벤질옥시벤질옥시) 페닐기가 바람직하다.
R1, R2또는 R3가 안트라퀴노닐기를 나타내는 경우, 이것은 비치환되거나 상기 정의 및 예시된 치환기 1 의 하나 이상으로 치환될 수도 있다. 기가 치환된다면, 이것은 상기 정의 및 예시된 치환기 1 로 구성된 군으로 부터 선택된 적어도 하나의 치환기에 의해 치환될 수도 있다. 치환기의 수는, 치환가능한 위치의 수 및가능하다면 입체 장해에 의해 부여 될 수도 있는것 이외에는 특별히 제한되지 않는다. 1 내지 5 개의 치환기가 바람직하고, 1 내지 3 개가 더욱 바람직하며, 1 개의 치환기가 가장 바람직하다. 이러한 기의 예로는 9,10 - 안트라퀴논 - 1 - 일, 9,10 - 안트라퀴논 - 2 - 일, 4 - 메틸 - 9,10 - 안트라퀴논 - 1 - 일, 5 - 메톡시 - 9,10 - 안트라퀴논 - 1 - 일, 7 - 클로로 - 9,10 - 안트라퀴논 - 1 - 일, 8 - 플루오로 - 9,10 - 안트라퀴논 - 2 - 일, 6 - 에틸 - 9, 10 - 안트라퀴논 - 2 - 일, 8 - 에톡시 - 9,10 - 안트라퀴논 - 2 - 일 및 6 - 히드록시 - 9,10 - 안트라퀴논 - 1 - 일기가 예시된다. 이중에서, 비치환된 안트라퀴노닐기가 바람직하다.
대안적으로는, R2, R3및 Z 이 함께 플루오레닐 또는 크산테닐기를 나타낼 수도 있으며, 이 경우에 이것은 바람직하게는 플루오렌 - 9 - 일 또는 크산텐 - 9 - 일 기이다.
R4가 알킬기를 나타내는 경우, 이것은 R1등과 관련하여 상기 예시된 것일 수도 있지만, 치환되거나 비치환될 수도 있다.
치환되면, 그것은 상기의 정의된 치환기 2 중 하나 이상에 의해 치환된다. 그런 치환기 2 의 예를 들면, 아미노기, 1 ∼ 4 개 탄소원자를 가진 알콕시기 및 할로겐 원자들이며, 이들은 상기 치환기 1 에 관하여 상기에 예시된 바와 같을 수 있다. 치환 및 치환되지 않은 알킬기의 특수한 예를 들면, 메틸, 에틸, 2 - 아미노에틸, 2 - 메톡시에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, s -부틸 및 t - 부틸기이다. 이 중, 메틸, 에틸, 2 - 아미노에틸, 2 - 메톡시에틸 및 프로필기를 선호한다.
R4가 아릴기일때, R4는 R1등에 관하여 상기에 예시된 아릴기일 수 있으며, 치환되거나 치환되지 않은 기일 수 있다. 그런 기는 하기의 예를 포함한다 ; 페닐기 ; 2 -메틸페닐 또는 3 - 에틸페닐기 같은 알킬페닐기 ; 2 - 플루오로페닐, 2 - 클로로페닐, 4 - 클로로페닐, 2 - 브로모페닐 또는 2 - 요오드페닐기 같은 할로겐화 페닐기 ; 2 - 니트로페닐 또는 4 - 니트로페닐기 같은 니트로페닐기 ; 4 - 메톡시페닐 또는 4 - 에톡시페닐 같은 알콕시페닐기 ; 4 - 메틸티오페닐 또는 4 - 에틸티오페닐기 같은 알킬티오페닐기 ; 및 나프틸, 페난트레닐, 안트라세닐과 피레닐기듣이다. 이중, 치환되지 않은 페닐, 할로겐화된 페닐 및 니트로페닐기를 선호한다.
R4가 아르알킬기일때, R4는 1 ∼ 4개의 탄소원자를 가지며 상기 정의 및 예시된 하나 이상의 (바람직하게는 1, 2 또는 3, 보다 바람직하게는 1) 아릴기에 의해 치환되는 알킬기이다. 그와같은 기의 예를 들면, 벤질, 메틸벤질, 에틸벤질, 메톡시벤질, 에톡시벤질, 플루오로벤질, 클로로벤질, 브로모벤질, 클로로나프틸메틸, 인데닐메틸, 페난트레닐메틸, 안트라세닐메틸, 디페닐메틸, 트리페닐메틸, 1 - 펜에틸, 2 - 펜에틸, 2,2 - 디페닐에틸, 2,2,2 - 트리페닐에틸, 3,3,3 - 트리페닐프로필, 1 - 나프틸에틸, 2 - 나프틸에틸, 1 - 페닐프로필, 2 - 페닐프로필, 3 - 페닐프로필, 1 - 나프틸프로필, 2 - 나프틸프로필, 3 - 나프틸프로필, 1 - 페닐부틸, 2 - 페닐부틸, 3 - 페닐부틸, 4 - 페닐부틸, 1 - 나프틸부틸, 2 - 나프틸부틸, 3 - 나프틸부틸, 4 - 나프틸부틸, 1 - 페닐펜틸, 2 - 페닐펜틸, 3 - 페닐펜틸, 4 - 페닐펜틸, 5 - 페닐펜틸, 1 - 나프틸펜틸, 2 - 나프틸펜틸, 3 - 나프틸펜틸, 4 - 나프틸펜틸, 5 - 나프틸펜틸, 1 - 페닐헥실, 2 - 페닐헥실, 3 - 페닐헥실, 4 - 페닐헥실, 5 - 페닐헥실, 6 - 페닐헥실, 1 - 나프틸헥실, 2 - 나프틸헥실, 3 - 나프틸헥실, 4 - 나프틸헥실, 5 - 나프틸헥실 및 6 - 나프틸헥실기들이다. 이중, 치환되지 않은 벤질 또는 2 - 펜에틸기가 바람직하다.
Y2가 알킬렌기일때, Y2는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 테트라메틸렌 또는 펜타메틸렌기일 수 있다. 이중, 메틸렌기가 바람직하다.
바람직하게는 Y1, Y3및 Y4각각은 산소원자를 나타낸다.
바람직하게는 Y2는 산소 또는 황원자를 나타낸다.
바람직하게는 Z 의 탄소원자를 나타낸다.
X 가 히드록시기로 치환될 수도 있는 직쇄 또는 측쇄일때, X 는 메틸렌, 메틸메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 테트라메틸렌, 메틸에틸렌, 1 - 메틸트리메틸렌, 2 -메틸트리메틸렌, 2 -메틸테트라메틸렌, 3 -메틸트리메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 헵타메틸렌, 옥타메틸렌, 노나메틸렌, 데카메틸렌, 2 - 히드록시트리메틸렌 또는 2 - 히드록시테트라메틸렌기이다. 이중, 메틸렌, 메틸메틸렌, 에틸렌 또는 메틸에틸기가 바람직한다, m 및 n 각각의 바람직한 값은 0 ∼ 6의 정수이다. 바람직하게는 m 은 0 ∼ 4의 정수이다.
B 로 표시한 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 바람직한 사슬 길이는 4 ∼ 8 이고, 보다 바람직하게는 5 또는 6 이다. 더군다나, 5' - 말단으로부터 4번째 데옥시리보뉴클레오티드는 구아닌데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
일반적으로 바람직한 실례의 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 하기의 "α 군" 의 것들이고, 보다 바람직하게는 하기의 "β 군"의 것들이며, 이때 하기의 α 및 β 에서 사용하는 약어는 하기와 같은 의미를 가진다;
A : 아데닌데옥시리보뉴클레오티드 ;
G : 구아닌데옥시리보뉴클레오티드 ;
C : 시토신데옥시리보뉴클레오티드 ;
T : 티민데옥시리보뉴클레오티드 ;
mC : 5 - 메틸시토신데옥시리보뉴클레오티드 ; 및
mG : O6- 메틸구아닌데옥시리보뉴클레오티드.
"왼쪽 말단" 이란 5' - 말단을 의미하고, "오른쪽 말단" 은 3' - 말단을 의미하는데, 단 각 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 5' - 및 3' - 말단 양쪽에 히드록시기가 없는 조건하에서이다.
"α 군" ; TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, GGGCGGGGC, TAGGAGG, TGGGAGGT, TGGGCGCAG, CCG, TCGGAGG, TGmCGAGG, CTGGGAGG, TGG, TGGGAmGG, TGGGAGA, AATGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG, CGCGG, CGGGT, TGGGC, TGGGT.
"β 군" ; TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG,TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG, CGCGG.
5' - 말단에서의 바람직한 식의 군 ; R1R2R3Z-Y1의 예를 들면, 트리페닐메틸옥시, 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - 비스 [3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시] 벤질옥시, t - 부틸디페닐실릴옥시, 페닐플루오레닐옥시 또는 페닐크산테닐옥시기이고, 보다 바람직하게는 트리페닐 - 메틸옥시, 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시 또는 3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시기이다.
3' - 말단에서의 바람직한 식, [P(0)(Y2R4)-Y3-(X-Y4)n]mH의 기는, 예를 들면, 수소원자, 메틸포스포릴, 2 -클로로페닐포스포릴, - 0 - 메틸티오포스포릴, 메틸포스포닐, 메틸티오포스포닐, 페닐포스포닐, 2 -히드록시에틸포스포릴, - 0 - (2 -히드록시에틸) 티오포스포릴, 페닐포스포릴, 4 - 클로로페닐포스포릴, 2 - 니트로페닐포스포릴, 4 - 니트로페닐포스포릴, 에틸포스포릴 또는 - 0 - 에틸티오포스포릴기이며 ; 보다 바람직하게는 수소원자, 메틸포스포릴, 2 - 클로로페닐포스포릴, - 0 -메틸티오포스포릴, 메틸포스포닐, 메틸티오포스포닐, 페닐포스포닐, 2 - 히드록시에틸포스포릴 또는 - 0 - (2 -히드록시에틸) 티오포스포릴기이다.
집합적으로, 본 발명의 바람직한 화합물들은 하기의 것들이다 ;
(1) B 의 사슬길이가 4 ∼ 8 이다 ;
(2) B 의 사슬길이가 5 또는 6이다 ;
(3) B 의 사슬길이는 4 ∼ 8이고, B 의 5' - 말단으로부터 4번째 데옥시리보뉴클레오티드는 구아닌데옥시리보뉴클레오티드 이다 ;
(4) 5' - 말단에서의 식 ; R1R2R3Z-Y1의 기는 트리페닐메틸옥시, 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - 비스 [3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시] 벤질옥시, t - 부틸디페닐실릴옥시, 페닐플루오레닐옥시 또는 페닐크산테닐옥시기이고 ; 3' - 말단에서의 식 [P(0)(Y2R4)-Y3- (X-Y4)n]mH의 기는 수소원자, 메틸포스포릴, 2 -클로로페닐포스포릴, - 0 -메틸티오포스포릴, 메틸포스포닐, 메틸티오포스포닐, 페닐포스포닐, 2 - 히드록시에틸포스포릴, - 0 - (2 - 히드록시에틸) 티오포스포릴, 페닐포스포릴, 4 - 클로로페닐포스포릴, 2 - 니트로페닐포스포릴, 4 - 니트로페닐포스포릴, 에틸포스포릴 또는 - 0 - 에틸티오포스포릴기이며 ; 및 B 는 TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, GGGCGGGGC, TAGGAGG, TGGGAGGT, TGGGCGCAG, CCG, TCGGAGG, TGmCGAGG, CTGGGAGG, TGG, TGGGAmGG, TGGGAGA, AATGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG, CGCGG, CGGGT, TGGGC 또는 TGGGT 이다. ;
(5) 5' - 말단에서의 식 ; R1R2R3Z-Y1의 기는 트리페닐메틸옥시, 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - 비스 [3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시] 벤질옥시, t - 부틸디페닐실릴옥시, 페닐플루오레닐옥시 또는 페닐크산테닐옥시기이고 ; 3' - 말단에서의 식의 군 ; [P(0)(Y2R4) - Y3- (X-Y4)n]mH는 수소원자, 메틸포스포릴, 2 - 클로로페닐포스포릴, - 0 - 메틸티오포스포릴, 메틸포스포닐, 메틸티오포스포닐, 페닐포스포닐, 2 -히드록시에틸포스포릴, - 0 - (2 - 히드록시에틸) 티오포스포릴, 페닐포스포릴, 4 -클로로페닐포스포릴, 2 - 니트로페닐포스포릴, 4 - 니트로페닐포스포릴, 에틸포스포릴 또는 - 0 - 에틸티오포스포릴기이며 ; 및 B 는 TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG 또는 CGCGG 이다. ;
(6) 5' - 말단에서의 식 ; R1R2R3Z-Y1의 기는 트리페닐메틸옥시, 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - 비스 [3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시] 벤질옥시, t - 부틸디페닐실릴옥시, 페닐플루오레닐옥시 또는 페닐크산테닐옥시기이고 ; 3' - 말단에서의 식의 군 ; [P(0) (Y2R4) - Y3- (X-Y4)n]mH는 수소원자, 메틸포스포릴, 2 - 클로로페닐포스포릴, - 0 - 메틸티오포스포릴, 메틸포스포닐, 메틸티오포스포닐, 페닐포스포닐, 2 - 히드록시에틸포스포릴 또는 - 0 - (2 - 히드록시에틸) 티오포스포릴기이고 ; 및 B 는 TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG 또는 CGCGG 이다 ;
(7) 5' - 말단에서의 식 ; R1R2R3Z-Y1의 기는 트리페닐메틸옥시, 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시 또는 3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시기이고 , 3' - 말단에서의 식 ; [P(0) (Y2R4) - Y3- (X-Y4)n]mH 의 기는 수소원자, 메틸포스포릴, 2 - 클로로페닐포스포릴, - 0 - 메틸티오포스포릴, 메틸포스포닐, 메틸티오포스포닐, 페닐포스포닐, 2 - 히드록시에틸포스포릴, - 0 - (2 - 히드록시에틸) 티오포스포릴, 페닐포스포릴, 4 - 클로로페닐포스포릴, 2 - 니트로페닐포스포릴, 4 - 니트로페닐포스포릴, 에틸포스포릴 또는 - 0 - 에틸티오포스포릴기이며 ; 및 B 는 TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG 또는 CGCGG 이다 ;
(8) 5' - 말단에서의 식 ; R1R2R3Z-Y1의 기는 트리페닐메틸옥시, 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시 또는 3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시기이고 ; 3' - 말단에서의 식 ; [P(0) (Y2R4) - Y3- (X-Y4)n]mH 의 기는 수소원자, 메틸포스포릴, 2 - 클로로페닐포스포릴, - 0 - 메틸티오포스포릴, 메틸포스포닐, 메틸티오포스포닐, 페닐포스포닐, 2 - 히드록시에틸포스포릴 또는 - 0 - (2 - 히드록시에틸) 티오포스포릴기이며 ; 및 B 는 TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG 또는 CGCGG이다.
본 발명의 화합물들의 실시예는 표 1 에 기재되어 있다. 상기 실시예들은 본 발명을 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.
표에서, 하기 약자는 특정기를 나타낸다.
그밖에, 식 (1) 에 "B" 로 표시된 서열은 하기 코드 번호와 동일하다.
또한, 플루오레닐 또는 크산테닐기가 표에 나타낼때, 이것은 R2, R3및 Z 으로 함께 나타낸다.
표 1
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상기의 화합물 중 바람직한 화합물의 번호는 1 ∼ 440, 454, 476, 586, 696, 806, 916, 1026, 1136, 1246, 1356, 1466, 1576, 1686, 1763, 1773, 1793, 1979, 1980, 1990 ∼ 1994, 2250 및 2326 ∼ 2906 이다.
보다 바람직한 화합물의 번호는 1 ∼ 110, 113, 221 ∼ 330, 333, 454, 1763, 1773, 1793, 1979, 1980, 1990 ∼ 1994, 2250 및 2334 ∼ 2906 이다.
가장 바람직한 화합물의 번호는 1, 2, 3, 4, 12, 13, 14, 15, 2555, 2556, 2557, 2558, 2566, 2567, 2568, 2569, 2665, 2666, 2667, 2668, 2676, 2677, 2678 및 2679 이다.
본 발명의 화합물들은 염의 형태, 특히 양이온과의 약제학적 수용가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 적절한 염의 예는 무기 또는 유기염을 포함하게 되는데, 예컨대, 나트륨이나 칼륨같은 알칼리 금속, 칼슘 같은 알칼리 토금속 ; 암모니아 ; 리신이나 아르기닌 같은 염기성 아미노산 ; 및 트리에틸아민 같은 알킬아민이다. 바람직한 염은 나트륨이나 칼륨같은 알칼리 금속염이다.
본 발명의 화합물들은 제조하기 위한 몇가지 방법을 하기의 반응도식으로 나타내었다.
일반적으로, 일반식 (1) 의 화합물은 목적 화합물의 5' - 말단에 있는 적절히 유도해 낸 뉴클레오티드를 5' - 말단 뉴클레오티드가 없는 보호된 올리고뉴클레오티드와 축합시켜 제조할 수 있으며, 결핍한 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드들은 상기의 5' - 말단뉴클레오티드와 함께 목적하는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 화합물의 적절한 뉴클레오티드 서열을 부여하며, 이때 보호된 결핍 뉴클레오티드는 중합체의 지지체에 연결되어 있다. 일반적으로 이 방법은 R1R2R3Z-Y' - [5'- 말단 뉴클레오티드] 화합물을 [보호기] - [결핍 뉴클레오티드] - 연결자 - 중합체의 화합물과 반응시키는 것을 포함한다.
보다 구체적으로, 본발명은 하기 식 (2) 의 화합물을 일종의 [보호기] - 0 - F - W [이때, F 는 결핍 올리고뉴클레오티드이고, W 는 연결자 및 중합체의 지지체임] 의 화합물과의 축합반응을 제공한다. 보호기로 DMT 를 사용하는 경우, 화합물 (2) 와 반응시키는 것을 포함하는 화합물의 예는 방법 C-1, C-2 또는 C-3 에 의해 하기식의 화합물을 포함하고 있다 ; DMT - 0 - F - W1(3), DMT - 0 - F - W2a(4a), DMT - 0 - F - W2b(4b), DMT - 0 - F - W3(5), DMT - 0 - F - W4a, (6a), DMT - 0 - F - W4b(6b), DMT - 0 - F - W4c(6c), DMT - 0 - F - W4d(6d), DMT - 0- F - W5a(7a) 및 DMT - 0 - F - W5b(7b). 본 발명에서 사용한 반응물 (2) 는 적절히 방법 A-1 또는 A-2에 의해 제조할 수 있고, 반응물 (3, 4a, 4b, 5, 6a ∼ 6d, 7a 및 7b)은 적절히 방법 B-1, B-2, B-3, B-4 또는 B-5 에 의해 제조할 수 있다.
방법 A - 1
방법 A - 2
방법 B - 1
방법 B - 2
방법 B - 3
방법 B - 4
방법 B - 5
방법 C - 1
방법 C - 2
방법 C - 3
일반식 (2) 의 각종 화합물에서, R1, R2, R3, Y1및 Z는 상기 일반식 (1) 에 대해 정의한 바와 동일하고; D' 는, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 5 - 메틸시토신과 같은 " 5' - 염기기 ", 또는 상기 유효염기 서열의 5' - 말단 부분의 염기 (이하, 상기 유효염기 서열의 5' - 말단부분 또는 간단히 5' - 말단 염기로 자칭함) 인 상응하는 보호염기로 부터 선택된 염기이다.
방법 B - 1 은, 상기 유효염기 서열의 3' - 말단부분의, DNA 합성용으로 사용가능한 보호 뉴클레오시드 (이하 3' - 말단 뉴클레오시드로 지칭함) 와 결합한 연결자 및 DNA 합성기용으로 시판되는 뉴클레오티드 단위 (이하 뉴클레오티드 단위로 지칭함) 를 포함하는 제어 세공유리(이하 CPG 로 지칭함)를 이용하여 합성된,상기 유효염기 서열의 5' 말단에서 1개의 뉴클레오티드 분절이 결핍한 화합물(3)의 제조방법에 관한 것이다.
방법 B - 2 는, 말단 위치에 히드록실기를 갖는 C2∼10알킬렌디올 또는 보호 히드록실기 또는 보호 아미노기를 갖는 알킬렌디올의 1 말단 히드록실기를 디메톡시트리틸 (DMT) 기로 보호하고, 그 외의 히드록실기를 숙신산무수물과 반응시켜 숙신산모노에스테르를 제조하고, 모노 에스테르의 카르복실기를 CPG 에 결합시키고, 말단 DMT 기를 제거하고, 최종적으로 DNA 합성기 상의 뉴클레오티드 단위를 CPG - 결합 알킬렌 알콜 (4 - 6) 와 정상 (regular) 서열로 반응시킴으로써 합성된, 상기 유효서열의 5' 말단으로 부터의 1 뉴클레오티드 단편을 갖는 화합물 (4a) 의 제조방법 ; 및 DNA 합성기 상의 티오산염 뉴클레오티드를 제조하는데 사용되는 통상적인 방법에 따라 CPG -결합 알킬렌 알콜 (4-6) 을 CPG (4-7) 에 의해 지지된 3' - 말단 뉴클레오시드 포스포로티오산염으로 변환시킨 다음 상기와 동일한 방법으로 뉴클레오티드 단위로 반응시킴으로써 화합물 (4b) 를 제조하는 방법에 관한 것이다.
방법 B - 3 는, 3' - 말단 뉴클레오시드의 3' - 위치의 히드록실기를 포스폰산과 반응시켜 에스테르 연결을 생성시킴으로써 제조된 3' - 말단 뉴클레오시드 포스폰산염을, 방법 B - 2 에서 숙신산 무수물을 사용하여 제조된 CPG - 결합 에틸렌 글리콜 (5-1) 로 축합하고, 알킬아민으로 반응시켜 CPG (5-4) 에 의해 지지된 3' - 말단 뉴클레오시드 포스포르아미디트를 제조한 다음, 최종적으로 DNA 합성기상의정상서열의 뉴클레오티드 단위와 반응시킴으로써 합성된, 상기 유효서열의 5' 말단으로 부터의 1 뉴클레오티드 단분절을 갖는 화합물 (5) 의 제조방법에 관한 것이다.
방법 B - 4 는 헥사에틸렌 글리콜의 1 히드록실기를 DMT 기로 보호하고 그 외의 히드록실기를 포스포르아미디트기 제조용 시약과 반응시킴으로써 공지의 화합물 (6-3) [M. Durand et al., Nucleic Acids Res., 18, 6353 (1990)] 의 제조방법에 관한 것이다.
이후에, 방법 B - 3 에 기재된 방법과 유사하게 CPG -결합 DMT -보호 글리콜 (6-6) 는 DMT 기로 보호된 상기 헥사에틸렌기 (6-2) 를 숙신산을 이용하여 CPG 로 축합함으로써 제조할 수 있다.
DNA 합성기상의 CPG - 결합 DMT - 보호 글리콜 (6-6) 로 부터 DMT 기를 제거한 후, 글리콜을 뉴클레오티드 단위와 반응시켜, 합성된 상기 유효서열의 5' 말단으로 부터의 1 뉴클레오티드 단분절을 갖는 목적 화합물 (6a) 을 수득한다. DNA 합성기상의 CPG - 결합 DMT - 보호 글리콜 (6-6) 로 부터 DMT기를 제거함으로써 수득된, CPG 상에 지지된 글리콜을 상기 포스포르아미디트와 1회, 2회 또는 3회 반응시킨 다음, 상기 유효염기 서열의 5' - 말단부터의 1 뉴클레오티드 단분절을 포함하는 뉴클레오티드 단위와 반응시켜, 일반식 (6b), (6c) 또는 (6d) 의 화합물을 각각 제조한다.
방법 B - 5 는, 연결기를 통해 CPG 에 의해 지지된 시판되는 보호 2' - 데옥시뉴클레오시드 (이하 D"'-CPG로 칭함) 로 부터 DMT 기를 탈보호하고, 문헌[Tetrahedron Letters, 27, 4705 (1986)] 에 호른 등 (T. Horn et al.) 에 의해 보고된 (2 - 시아노에톡시 ) - 2 - (2' - 0 - 4,4' - 디메톡시트리틸옥시에틸술포닐) 에톡시 - N,N - 디이소프로필아미노포스핀 (7-1) 과 반응시킴으로써 화합물 (7-3) 을 제조하는 방법 ; 상기와 같이 제조된 화합물 (7-3) 으로 부터 DMT 기를 탈보호하고 탈보호화합물을, 축합제를 이용하여 3' - 말단뉴클레오시드의 3' - 위치의 히드록실기의 아릴 또는 알킬인산염을 갖는 화합물로 축합함으로써 화합물 (7-5) 를 제조하는 방법 ; 및 상기 제조된 화합물 (7-5) 를, 합성된 상기 유효서열의 5' - 말단으로 부터의 1 뉴클레오티드 단편을 포함하는 뉴클레오티드 단위와 반응시킴으로써 화합물 (7a) 를 제조하는 방법에 관한 것이다.
상술한 것과 유사한 방법으로, 화합물 (7-7)은, DMT 기가 제거된 화합물 (7-3) 을 3' - 말단 뉴클레오시드의 3' - 위치에 알킬 또는 아릴 포스포르아미디트기를 갖는 화합물 (7-6) 과 반응시키고, DNA 합성기상에서 인산트리 에스테르 또는 포스포로티오산염트리에스테르의 합성과 유사하게 처리함으로써 화합물 (7-7) 을 제조할 수 있다. 상기와 같이 수득된 생성물을 정상서열의 뉴클레오티드 단위와 반응시켜, 상기 유효염기 서열의 5' - 말단으로 부터의 1 뉴클레오티드 단분절을 갖는 화합물 (7a) 를 제조한다.
방법 C - 1 은, 화합물 (2) 를 포스파이트화제와 반응시켜 3' - 포스파이트 유도체 (8) 을 제조하고, 상기와 같이 수득된 생성물을, DMT 기를 탈보호한 후에 방법 B - 1 ∼ B - 5 에서 제조되었으며 CPG 상에 지지된 일반식 (3, 4a, 4b, 5, 6a ∼ 6d, 7a 및 7b) 의 각각의 올리고머와 반응시키고, 축합 생성물을 산화제로산화시키고, CPG 로 부터의 뉴클레오티드 사슬을 절단하고, 최종적으로 5' - 말단뉴클레오시드의 5' - 탄소원자에 결합된 치환체부분을 제외한 보호기를 제거함으로써 일반식 (1) 의 목적 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
방법 C - 2 는, 화합물 (2) 를 포스포릴화제와 반응시켜 3' - 인산 유도체 (9) 를 제조하고, 생성물을 DMT 기만을 탈보호시킨 후 각 일반식 ; (3, 4a, 4b, 5, 6a ∼ 6d, 7a 및 7b)의 상기 화합물로 축합하여 인산트리에스테르 결합을 형성하고, CPG 로 부터의 뉴클레오티드 사슬을 절단하고, 5' - 말단 뉴클레오시드의 5' - 위치의 탄소원자에 결합된 치환체 부분을 제외한 보호기를 제거하고, 최종적으로 통상적인 방법에 의해 정제함으로써 목적 화합물 (1) 을 제조하는 방법에 관한 것이다.
방법 C - 3 는, 포스폰산기를 화합물 (2) 의 3' - 위치로 도입하여 화합물 (10) 를 제조하고, 염기의 존재하에 산할로겐화물을 이용함으로써 생성물을 각 일반식 ; (3, 4a, 4b, 5, 6a ∼ 6d, 7a 및 7b) 의 상기 화합물로 축합하고, 축합 생성물을 산화제에 의해 산화시켜 인산디에스테르 결합을 형성하고, CPG 로 부터의 뉴클레오티드를 절단하고, 5' - 말단 뉴클레오시드의 5' - 위치의 탄소원자에 결합된 치환체 부분을 제외한 보호기를 제거하고, 최종적으로 통상적인 방법에 의해 정제함으로써 목적 화합물 (1) 을 제조하는 방법에 관한 것이다.
방법 A ∼ 방법 C 는 하기와 같이 상세히 설명된다.
방법 A ∼ 방법 C 에 요약된 반응도에서, R1, R2, R3, R4, Z, Y1, Y2, Y3, Y4,X, n, m 및 B 는 상기 정의한 바와 같고 ; A1은 뉴클레오시드의 1차 히드록실기를 특정하게 보호하기 위해 일반적으로 사용되는, 트리틸 (Tr)기, 모노메톡시트리틸 (MMT) 기 또는 디메톡시트리틸 (DMT) 기이고 ; A2는 t - 부틸디메틸실릴 (TBDMS) 또는 트리이소프로필실릴 (TIPS) 기와 같은 3 - 치환 실릴기 ; 트리클로로에톡시카르보닐 (Troc) 기와 같은 트리할로게노에톡시카르보닐기 ; 또는 벤질옥시카르보닐 (Z) 기와 같은 아르알킬옥시카르보닐기이다.
D' 는 5' - 말단 뉴클레오티드의 염기, 상기 유효염기 서열의 DNA 합성용 아실기로 보호된 아미노기이고 ; D" 는 DNA 합성에 사용되는 임의의 뉴클레오티드 단위의 염기 부분, 즉 5' - 염기기 또는 상응하는 보호염기로 부터 선택된 염기이다.
F 는, 상기 유효서열의 5' 말단으로 부터의 1 뉴클레오티드 단분절을 갖는 올리고뉴클레오티드 부분이며 일반적으로 DNA 합성용으로 사용되지만 5' - 말단 뉴클레오시드의 5' - 위치 및 3' - 말단 뉴클레오시드의 3' - 위치의 히드록실기를 함유하지 않는, 염기부분, 또는 인산부분의 보호기로 보호된 상응하는 올리고뉴클레오티드이다. V 는 DNA 합성의 경우에 인산부분의 보호기이다. U 는 아미디트 부분의 아미노기이다. W1∼ W5는, CPG 부터의 단분절 내지 방법 B - 1 ∼ B - 5에 기재된 방법에 따른 최종 목적 화합물의 올리고뉴클레오티드 (F) 의 3' - 말단 뉴클레오티드의 3' - 위치의 히드록실기의 산소원자이다. ℓ은 1 ∼ 9의 정수이다 ; E 는 수소원자, 또는 임의로 보호된 히드록실기 또는 아미노기이고 ; K 는 산소 또는 황원자이다.
R5는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 페닐, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 시아노에틸옥시 또는 임의로 치환된 페닐옥시기이다.
하기 단계는 각각 하기에 더 상세히 설명된다. 각 단계가 선행단계에 기재된 방법과 유사하게 수행될 수 있는 경우에 제 1 단계를 대표예로서 설명한다.
[ 1, 8 및 18단계 ]
이들 단계에서, 5' - 위치의 히드록실기만이 선택적으로 보호된 화합물 (2-2) 는, 화합물 (2-1) 을 불활성 용매내에서 히드록시 보호시약과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 염기부분이 A, G 또는 C 일 경우, 염기내에 포함된 아미노기는 선행단계의 아실화에 의해 보호되며 보호반응은 그 자체가 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [J. Am. Chem. Soc., 104, 1316 (1982)]에 기재된 방법과 유사한 방법으로 수행할 수 있다. 아미노 보호기로서는 일반적으로 지방족 저급 아실기 또는 방향족 아실기를 들 수 있다. 아실기의 예에는 : 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 펜타노일, 피발로일, 발레릴 또는 이소발레릴기와 같은 지방족 저급 아실기; 및 벤조일, 4 - 아세톡시벤조일, 4 - 메톡시벤조일, 4 - 메틸벤조일 또는 1 -나프토일기와 같은 방향족 아실기가 포함되며 ; 염기부분이 A 또는 C 인 경우에는 벤조일기가 바람직하며 염기부분이 G 인 경우에는 이소부티릴기가 바람직하다.
바람직한 용매의 예에는 : 벤젠, 톨루엔 또는 크실렌과 같은 방향족 탄화수소 ; 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 클로로벤젠 또는 디클로로벤젠과 같은 할로겐화 탄화수소 ; 포름산에틸, 아세트산에틸, 아세트산프로필,아세트산부틸 또는 탄산디에틸과 같은 에스테르 ; 디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산, 디메톡시에탄 또는 디에틸렌 글리콜 디메틸 에테르와 같은 에테르 ; 아세톤, 메티에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 이소프론 또는 시클로헥산온과 같은 케톤 ; 니트로에탄 또는 니트로벤젠과 같은 니트로 화합물 ; 아세토니트릴 또는 이소부티로니트릴과 같은 니트릴 ; 포름아미드, 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 또는 헥사메틸인산 트리아미드와 같은 아미드; 디메틸술폭시드 또는 술폰란과 같은 술폭시드 ; 트리메틸아민, 트리에틸아민 또는 N - 메틸모르폴리과 같은 지방족 3차 아민 ; 및 피리딘 또는 피콜린과 같은 방향족아민이 포함되며 ; 더욱 바람직한 것은 할로겐화 탄화수소 (특히 디클로로메탄) 및 아미드 (특히 DMF) 이다.
5' - 위치의 히드록실기만의 특정보호에 사용될 수 있고 산성 또는 중성 조건하에서 제거할 수 있기만 하다면, 보호를 위해 사용되는 시약의 종류에는 특별한 제한이 없다. 바람직한 보호시약의 예에는, 염화트리틸, 염화 모노메톡시트리틸 또는 염화디메톡시트리틸과 같은 트리아릴메틸 할로겐화물이 포함된다.
보호시약이 트리아릴메틸 할로겐화물일 경우, 반응은 통상적으로 염기의 존재하에서 수행된다.
적절한 염기의 예에는 ; 피리딘, 디메틸아미노피리딘 또는 피롤리디노피리딘과 같은 헤테로고리아민 ; 및 트리메틸아민 또는 트리에틸아민과 같은 지방족 3차 아민이 포함되며 ; 바람직한 것은 유기염기(특히 피리딘, 디메틸아미노피리딘 및 피롤리디노피리딘) 이다.
유기아민이 용매로서 사용될 경우, 유기아민 자체가 탈산성화제로서 작용하므로 그외의 탈산성화제를 사용할 필요가 없다.
반응 온도는 출발물질 및 용매의 종류 및 그 외의 반응조건에 따라 변화하지만, 반응은 통상적으로 0 ∼ 150℃ , 바람직하게는 20 ∼ 100℃ 의 온도에서 수행된다.
반응에 필요한 시간은 사용된 출발물질 및 용매의 종류 뿐만 아니라 반응조건에 따라서 변화하지만, 반응은 통상적으로 1 ∼ 100시간, 바람직하게는 2 ∼ 24 시간 이내에 완료된다.
반응 완료후, 예를 들어 반응 혼합물을 물에 붓고, 벤젠, 에테르 또는 에틸 아세테이트와 같은 수 - 불혼화성 용매로 추출하고, 최종적으로 추출액으로 부터 용매를 유거함으로써, 반응 혼합물로 부터 목적 화합물을 분리할 수 있다. 상기와 같이 수득된 생성물을 추가로 정제하지 않고 다음 반응에 사용할 수 있지만, 필요에 따라 통상적인 방법, 예를들어 각종 크로마토그래피 또는 재결정과 같은 통상적인 방법에 의해 정제할 수 있다.
[ 2 단계 ]
이 단계에서, 화합물 (2-3) 은 화합물 (2-2_을 불활성 용매의 존재하에서 히드록실 - 보호 시약과 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
바람직한 용매의 예에는 ; 벤젠, 톨루엔 또는 크실렌과 같은 방향족 탄화수소 ; 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 클로로벤젠 또는 디클로로벤젠과 같은 할로겐화 탄화수소 ; 포름산에틸, 아세트산에틸, 아세트산프로필,아세트산부틸 또는 탄산디에틸과 같은 에스테르 ; 디에티에테르, 디이소프로필에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산, 디메톡시에탄 또는 디에틸렌 글리콜 디메틸에테르와 같은 에테르 ; 아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 이소프론 또는 시클로헥산온과 같은 케톤 ; 니트로에탄 또는 니트로벤젠과 같은 니트로 화합물 ; 아세토니트릴 또는 이소부티로니트릴과 같은 니트릴 ; 포름아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 또는 헥사메틸인산 트리아미드와 같은 아미드; 디메틸술폭시드 또는 술포란과 같은 술폭시드가 포함되며; 더욱 바람직한것은 에테르 (특히 테트라히드로푸란), 할로겐화 탄화수소 (특히 디클로로메탄), 방향족 탄화수소 (특히 톨루엔) 및 아미드 (특히 DMF) 이다.
보호기가 5' - 위치의 보호기와는 독립적으로 탈보호될 수 있기만 하면, 사용되는 히드록실 보호 시약의 종류에는 특별한 제한이 없다. 그러한 보호시약의 예에는 t - 부틸디메틸실릴 클로라이드 또는 트리이소프로필실릴클로라이드와 같은 실릴 할로겐화물 ; 트리클로로에톡시카르보닐 클로라이드와 같은 할로알콕시카르보닐 할로겐화물 ; 및 벤질옥시카르보닐 클로라이드와 같은 아르알킬옥시카르보닐 할로겐화물이 포함된다. 보호시약이 실릴 할라이드, 할로알콕시카르보닐 할라이드, 또는 아르알킬옥시카르보닐할라이드인 경우, 보호반응은 염기 존재하에서 통상적으로 수행된다.
바람직한 염기의 예로는, 유기 염기류 (특히 트리에틸아민, 피리딘, N - 메틸모르폴린, DBU 및 이미다졸) 을 포함한다.
반응온도는 시약, 출발물질 및 용매의 종류 및 다른 반응조건 등에 따라 달라지지만, 반응은 - 20° ∼ 150℃ , 바람직하게는 - 10°∼ 50℃ 에서 통상적으로 수행된다.
반응에 필요한 시간은 사용된 출발 화합물 및 용매의 종류 뿐만 아니라 반응 온도에 따라 변하지만, 반응은 통상적으로 1 ∼ 100 시간, 바람직하게는 1 ∼ 24 시간 내에 완결된다.
반응 종결후에, 소망하는 화합물을 반응 혼합물에서 분리해낼 수 있다. 이러한 기술의 한가지 예는 ; 반응 혼합물을 물에 쏟아붓고 ; 벤젠, 에테르 또는 에틸 아세테이트 등의 물 불혼화성 용매로 추출하며 ; 마지막으로 추출물에서 용매를 유거하는 것으로 이루어진다. 이렇게 수득한 생성물은 더 이상의 정제없이 통상적으로 순차적인 반응에 사용되지만, 필요한 경우, 여러가지 크로마토그래피, 재결정 등의 방법으로 정제 할 수 있다.
[ 3, 11, 22 및 25 단계 ]
이러한 단계들에서는 화합물 (2-3), (4-5), (6-6) 및 (6-8) 을 불화성 용매 중에서 탈보호시약과 반응시켜 5' - 위치에 있는 히드록시 보호기를 선택적으로 제거함으로써 화합물 (2-4), (4-6), (6-7) 및 (6-9) 를 제조할 수 있다.
바람직한 용매의 예로는 ; 벤젠, 톨루엔 또는 크실렌 같은 방향족 탄화수소류 ; 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 클로로벤젠 또는 디클로로벤젠 등의 할로겐화 탄화수소류 ; 포름산에틸, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 부틸 아세테이트 또는 디에틸 탄산염 등의 에스테르류 ; 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 테트라히드로 푸란, 디옥산, 디메톡시에탄 또는 디에틸렌 글리콜 디메틸 에테르 등의 에테르류 ; 메탄올, 에탄올, n - 프로판올, 이소프로판올, 7 - 부탄올, 이소부탄올, t - 부탄올, 이소아밀알콜, 디에틸렌 글리콜, 글리세린, 옥탄올, 시클로헥산올 또는 메틸 셀로솔브 등의 알콜류 ; 아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸 이소부틸케톤, 이소포론 또는 시클로헥사온 등의 케톤류 ; 니트로에탄 또는 니트로벤젠 등의 니트로 화합물류 ; 아세토니트릴 또는 이소부티로니트릴 등의 니트릴류 ; 포름아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 또는 헥사메틸인산 트리아미드등의 아미드류 ; 및 디메틸술폭시드 또는 술포란 등의 술폭시드류 ; 더욱 바람직하게는 알콜류 (특히 메탄올 및 메탄올) 및 디클로로메탄을 포함하고, 아세트산이 탈보호 시약인 경우, 아세트산과 물의 혼합물을 포함한다.
사용되는 탈보호 시약의 종류에는 특별한 제한이 없지만, 단 통상의 탈보호에 일반적으로 사용될 수 있어야 한다. 보호기가 트리아릴메틸기인 경우는 아세트산, 디클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 염산 등의 산 또는 브롬산 아연 등의 루이스산, 바람직하게는 아세트산, 디클로로아세트산 또는 트리클로로아세트산을 사용하여 제거할 수 있다.
반응온도는 사용되는 시약, 출발물질 및 용매의 종류 및 다른 반응 조건 등에 따라 달라지지만, 반응은 - 10°∼ 100℃, 바람직하게는 0°∼ 50℃ 의 온도에서 정상적으로 수행된다.
반응에 필요한 시간은 사용되는 출발물질 및 용매의 종류 뿐만 아니라 반응온도에 따라 달라지는데, 반응은 1분 ∼ 50시간, 바람직하게는 1분 ∼ 24 시간 내에 완결되는 것이 일반적이다.
반응의 완결후에, 소망하는 화합물을 반응 혼합물에서 분리해 낼 수 있다. 3 단계에서, 이러한 기술의 한가지 예는 ; 반응 혼합물을 중화시키고, 이것을 물에 붓고; 벤젠, 에테르 또는 아세테이트 등의 물 불혼화성 용매로 추출하며 ; 추출물에서 용매를 유거하는 것으로 이루어진다. 이렇게 수득한 생성물은 더이상의 정제없이 일반적으로 후속하는 반응에 사용될 수 있지만, 필요한 경우, 여러가지 크로마토그래피, 재결정 등의 방법으로 정제할 수 있다. 11, 22 및 25 단계에서, 이러한 기술의 한 예로는 ; 여과로 소망하는 화합물을 분리하고 염화 메틸렌을 세척하는 것으로 이루어진다.
[ 4 및 6 단계 ]
이러한 단계들에서는, 화합물 (2-6) 또는 (2)는 화합물 (2-4) 또는 (2-1) 을 화합물 (2-5) (식에서, Hal 은 할로겐 원자를 나타낸다) 와 불활성 용매 및 염기의 존재하에 반응시켜 제조할수 있다.
사용된 화합물 (2-5) 의 할라이드 부분은 예를 들자면, 염소, 브롬 또는 요오드이고, 바람직하게는 염소 또는 브롬 등이 있을 수 있다.
바람직한 용매의 예로는 ; 벤젠, 톨루엔 또는 크실렌같은 방향족 탄화수소류 ; 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 클로로벤젠 또는 디클로로벤젠등의 할로겐화 탄화수소류 ; 포름산 에틸, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 부틸 아세테이트 또는 디에틸 탄산염 등의 에스테르류 ; 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산, 디메톡시에탄 또는 디에틸렌 글리콜 디메틸 에테르등의 에테르류 ; 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤,이소포론 또는 시클로헥산온 등의 케론류; 니트로에탄 또는 니트로벤젠 등의 니트로 화합물류; 아세토니트릴 또는 이소부티로니트릴 등의 니트릴류 ; 포름아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 또는 헥사메틸인산 트리아미드 등의 아미드류 ; 및 디메틸 술폭시드 또는 술포란 등의 술폭시드류 ; 더욱 바람직하게는 에테르류 (특히 테트라히드로푸란), 케톤류 (특히 아세톤), 할로겐화 탄화수소 (특히 디클로로메탄), 아미드류 (특히 DMF) 및 방향족 아민류 (특히 피리딘) 를 포함한다.
바람직한 염기의 예로는 ; 유기 염기류 (특히 트리에틸아민, 피리딘, N - 메틸모르폴린, DBU 등의 염기), 알칼리 금속 수소화물 (특히 수소화나트륨) 및 알칼리금속 탄산염류 (특히 탄산나트륨 및 탄산리튬) 을 포함하고 화합물 (2-5) 의 Z 가 규소원자인 경우, 이미다졸이 가장 바람직한 유기 염기이다.
반응 온도가 특별히 중요하지는 않지만, 반응은 0°∼ 100℃ , 바람직하게는 20°∼ 60℃ 의 온도에서 통상적으로 수행된다. 반응에 필요한 시간은 통상적으로 5분 ∼ 30시간 범위이다. 반응이 50℃에서 수행될 때, 이것은 10 시간내에 완성된다.
이 반응의 종결후에, 소망하는 화합물을 반응 혼합물에서 분리해 낼 수 있는데 예를 들자면, 반응 혼합물을 적당하게 중화시키거나, 불용성 물질이 있다면 여거하고, 에틸아세트산염등의 물 및 물 - 불혼화성 유기용매를 첨가하고 ; 소망하는 물질을 함유하는 유기층을 분리하고 ; 추출물을 물로 세척하며 ; 추출물을 무수 황산 마그네슘 등으로 건조시킨 다음 마지막으로 용매를 유거시킬 수 있다. 이렇게수득한 원하는 화합물은, 필요한 경우, 재결정, 재침전, 크로마토그래피 등의 상법으로 정제할 수 있다.
[ 5 단계 ]
이 단계에서 화합물 (2) 는 화합물 (2-6) 을 탈보호기와 불활성 용매 중에서 반응시켜서 제조할 수 있다.
3' 위치의 히드록시 - 보호기가 실릴기인 경우, 일반적으로 테트라부틸 암모늄플루오라이드 같은 플루오라이드이온을 생성할 수 있는 화합물과의 처리로 제거할 수 있다.
사용되는 용매의 종류에는 특별한 제한이 없지만, 단 반응에 역영향을 주어서는 안된다. 바람직한 예로는 테트라히드로푸란이나 디옥산 같은 에테르류를 포함한다.
반응온도는 결정적이지는 않으나, - 30°∼ 100℃, 바람직하게는 0°∼ 30℃ 에서 일반적으로 수행된다.
반응에 필요한 시간은 일반적으로는 5분 ∼ 30 시간 사이에 분포해 있다. 반응이 20℃ 에서 수행될 경우, 10시간 이내에 반응이 완결된다.
반응 완결후, 소망하는 화합물을 반응혼합물에서 분리해 낼 수 있는데 예를 들자면, 반응 혼합물을 적당히 중화하거나 불용성 물질이, 만약 있다면, 여거하고, 에틸아세테이트 등의 물및 물 - 불혼화성 유기용매를 첨가하고 ; 소망하는 물질을 함유한 유기층을 분리하고 ; 추출물을 물로 세척하며 ; 추출물을 무수 황산마그네슘 등으로 건조시킨 다음 마지막으로 용매를 유거시킬 수 있다. 이렇게 수득한 목적하는 화합물은, 필요한 경우, 재결정, 재침전, 크로마토그래피 등의 상법으로 정제할 수 있다. 이렇게 수득된 소망하는 생성물은, 필요한 경우, 재결정, 재침전, 크로마토그래피 등의 상법으로 더 정제할 수 있다.
(2) 3' - 위치에 히드록시 -보호기가 할로알콕시카르보닐기인 경우, 일반적으로 아연분(Zinc dust)으로 처리하여 제거할 수 있다.
사용되는 용매의 종류에는 특별한 제한이 없지만, 단 반응에 역영향을 주어서는 안된다. 바람직한 예로는 아세트산, 알콜류 또는 물과 이런 용매들 하나 또는 2 이상의 혼합물을 포함한다. 반응 온도가 중요하지는 않으나 0°∼ 100℃, 바람직하게는 실온에서 수행될 수 있다. 반응에 필요한 시간은 일반적으로는 5분 ∼ 30시간 범위이다. 반응이 실온에서 수행될때, 이것은 10시간 내에 완결된다.
반응 완결후 목적하는 화합물을 반응 혼합물에서 분리해 낼 수 있는데 예를 들자면, 반응 혼합물을 적당히 중화시키고, 불용성 물질이 만약 있다면 여거하고, 에틸아세테이트 등의 물및 물 - 불혼화성 유기용매를 첨가하고 ; 소망하는 물질을 함유한 유기충을 분리하고 ; 추출물을 물로 세척하며 ; 추출물을 무수 황산마그네슘 등으로 건조시킨 다음 마지막으로 용매를 유거시킬 수 있다. 이렇게 수득한 반응 생성물은 재결정, 재침전, 크로마토그래피 등의 상법으로 더 정제할 수 있다.
(3) 3' - 위치에 히드록시 - 보호기가 있는 경우, 이것은 일반적으로 촉매 환원 또는 산화에 의해 제거될 수 있다.
환원에 사용가능한 촉매의 종류에는 특별한 제한이 없지만, 단, 이것이 촉매환원 반응에 일반적으로 사용될 수 있어야 한다. 바람직한 촉매로는 팔라듐 / 챠콜, 라니니켈, 산화백금, 플라티늄 블랙, 로듐/알루미나, 트리페닐포스파인 및 염화로듐의 조합물 및 팔라듐/황산바륨 등이 있을 수 있다. 반응이 수행될때, 수소압이 특별히 중요하지는 않지만 일반적으로 1 ∼ 10 대기압의 범위에서 반응이 수행된다.
반응 온도 및 반응에 필요한 시간은 사용되는 출발 물질 및 용매의 종류 및 촉매의 종류 및 다른 반응 조건들에 의해 변하지만, 반응은 0°∼ 100℃ 온도 범위에서 수행되고, 5분 ∼ 24 시간 내에 완성된다.
산화에 의한 탈보호에서 사용될 용매의 종류는 반응에 역 영향을 주지 않는다면 특별한 제한은 없다. 바람직한 용매는 물 및 1종 이상의 유기용매의 혼합물로 예시된다.
바람직한 유기용매는 : 아세톤 등의 케톤류 ; 디클로로메탄, 클로로포름 또는 사염화탄소 등의 할로겐화 탄화수소류, 아세토니트릴 등의 니트릴류 ; 디에틸 에테르, 테트라히드로푸란 또는 디옥산등의 에테르 ; 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 또는 헥사메틸인산트리아미드 등의 아미드 ; 디메틸술폭시드 등의 술폭시드를 포함한다.
사용되는 산화제의 종류에는 특별한 제한은 없지만, 단, 통상의 산화에 사용될 수 있어야 한다. 바람직한 예시로는 과황산칼륨, 과황산나트륨, 암모늄세륨 니트레이트 (CAN) 및 2,3 - 디클로로 - 5,6 - 디시아노 - p - 벤조퀴논 (DDQ) 등 이다.
반응시간과 반응에 필요한 시간은 출발물질 및 용매의 종류, 촉매의 종류 뿐만 아니라 사용된 촉매의 종류 및 다른 조건들에 의해 변하지만, 일반적으로 반응은 0°∼ 150℃ 온도에서 수행되고, 10분 ∼ 24시간 내에 완성된다.
히드록시 보호기는 액체 암모니아 또는 메탄올 또는 에탄올 같은 알콜류 중, - 78°∼ - 20℃ 의 온도에서 리튬금속 또는 나트륨금속 등의 알칼리 금속과 처리하여 제거한다.
또한 보호기는 염화알루미늄 및 요오드화 나트륨의 조합물 또는 트리메틸실릴요오드 같은 알킬실릴 할라이드를 용매중에서 사용하여 제거할 수도 있다.
사용되는 용매의 종류에 특별한 제한은 없지만, 단, 반응에 역영향을 주어서는 안된다. 바람직한 용매로는 예를 들면 아세토니트릴 같은 니트릴류, 디클로로메탄 또는 클로로포름 같은 할로겐화 탄화수소류 및 이러한 용매의 2 이상의 혼합물 등이 있을 수 있다.
반응 온도 및 반응에 필요한 시간은 출발화합물 및 용매의 종류 및 다른 조건들에 따라 변하지만, 일반적으로 반응은 0°∼ 50℃ 에서 수행되고, 5분 ∼ 3일 내에 완결된다.
기질이 황원자를 함유하고 있을때는 염화 알루미늄 및 요오드화 나트륨의 조합물을 사용하여 바람직하게 탄보호를 수행 할 수 있다. 반응의 종결후에, 소망하는 화합물을 반응 혼합물에서 분리하는데, 예를 들면, 반응 혼합물을 적당히 중화하거나 불용물이 있다면 여거하고, 물 및 에틸 아세 테이트 등의 물 및 물 - 불혼화성 유기용매를 첨가하고, 소망하는 화합물을 함유한 유기층을 분리하여 ; 물로 추출물을 세척하고 ; 무수황산 마그네슘 등으로 건조시킨 다음, 마지막으로, 용매를 유거시킨다. 이렇게 수득한 소망하는 화합물은, 필요하다면, 재경정, 재침전, 크로마토그래피 등의 상법으로 더 정제할 수 있다.
[ 7, 12, 14, 17, 23, 26, 28, 30, 33 및 35 단계 ]
이 단계에서, 상기 유효한 염기 서열의 3' - 말단 뉴클레오시드를 함유한 CPG - 결합 뉴크라레오시드를 사용하여, DNA 합성기 상의 DNA 사슬의 신장 단계를 반복하여, 마지막으로 상기 유효한 서열의 5' - 말단으로 부터의 1 개의 뉴클레오티드 단분절을 제조함으로써 CPG -결합 올리고데옥시리보뉴클레오티드 (3), (4a), (4b), (5), (6a) ∼ (6d), (7a) 및 (7b) 를 제조한다.
DNA 합성기 상의 DNA 사슬의 신장은 "포스포르아미디트" 접근법에 준하여 설명되지만 이 방법은 제한의 목적이 아니라 설명의 목적으로 이해된다.
시판중인 CPG - 결합 D" (3-1) 은 DNA 합성기 상의 DMT 기 비보호 시약으로 처리하여 5' - 말단 DMT 기를 제거하고, 시판되는 DNA 합성기에서 뉴클레오티드 단위로 응축한 후 인산 트리에스테르 결합을 형성시키고 그 다음에, 적절한 산화제를 사용하여 인산트리에스테르로 산화시킨다. 이 단계를 반복하여 상기 유효서열의 5' 말단으로 부터 1 개의 뉴클레오티드 단 분절을 합성한 후에, 5' - 말단 DMT 기를 가진 CPG - 결합 ODN(3) 을 제조한다. (H. Koster 등 (Nucleic Acid Res., 12, 4539 (1984)) 에 의해 공표된 방법 또는 예를 들어 모델 380B (Applied Biosystems Inc. 제조) 또는 시클론 플러스((Cyclon Plus) MilliGen / Biosearch 제조) 의 포스포르아미디트 법을 기준한 합성기를 사용하는 그의 수정된 방법에 따라서 DMT 기가 보호되어 있는 5' - 말단, 원하는 뉴클레오티드 염기서열의 CPG - 결합 ODN 을합성할 수 있다.
ODN 합성에 사용하는 뉴클레오티드 단위의 염기부분은 아실기로 보호시킨다. 바람직한 아실기의 예는 염기부분이 A 또는 C 인 경우에는 벤조일기 이고 염기부분이 G 인 경우에는 이소부티릴기이다.
응축반응단계에서 촉매로서 사용되는 산성물질의 예로는 테트라졸을 포함하는 산성 물질, 바람직하게는 테트라졸이 포함된다.
반응에 불리한 효과가 없다면, 사용되는 용매의 성질은 특별한 제한이 없다. 바람직한 용매의 예는 아세토니트릴 및 테트라히드로푸란이다.
반응은 -30℃ 내지 50℃ 의 온도에서, 통상 실온에서 수행된다.
반응에 요구되는 시간은 반응온도에 의존하여 변화되지만 반응은 1분 내지 20 시간의 기간 내에 완료된다. 반응이 실온에서 수행되는 경우, 10분 내에 완료된다.
산화제로서는 통상적 산화에 사용할 수 있는 산화제라면, 이 단계에서 사용되는 산화제의 성질에 특별한 제한은 없다. 바람직한 산화제의 예로 ; 과망간산칼륨 또는 이산화망간과 같은 망간산화물을 포함하는 무기금속산화제 ; 루테늄 테트라옥시드와 같은 루테늄 산화물 ; 셀레늄 디옥시드와 같은 셀레늄 화합물 ; 염화 제 2 철과 같은 철 화합물 ; 오스뮴테트라옥시드와 같은 오스뮴 화합물 ; 산화은과 같은 은 화합물 ; 아세트산 수은과 같은 수은 화합물 ; 산화납 및 사산화 납과 같은 납 산화 화합물 ; 크롬산 칼륨, 황산 크롬 및 황산의 착물 또는 크롬산 및 피리딘의 착물과 같은 크롬산 화합물 ; 세륨 암모늄 니트리트 (CAN) 과 같은 세륨 화합물 ; 염소, 브롬 또는 요오드 분자와 같은 할로겐 분자를 포함하는 무기 산화제 ; 소듐 퍼요오데이트와 같은 퍼요오데이트 ; 오존 ; 과산화수소 ; 아질산과 같은 아질산 화합물 ; 포타슘 클로리트 또는 소듐 클로리트와 같은 클로로우스산 화합물 ; 포타슘 퍼술페이트 또는 소듐 퍼술페이트와 같은 퍼술푸릭산 화합물 ; DMSO 산화에 사용되는 시약을 포함하는 유기 산화제 (디메틸술폭시드 및 디시클로 헥실카르보이미드의 착물, 옥살릴 클로라이드, 아세트산 무수물 또는 오산화인, 또는 피리딘 및 삼산화 황의 착물) ; t - 부틸 히드로퍼옥시드와 같은 퍼옥시드 ; 트리페닐메틸 양이온과 같은 안정한 양이온 ; N - 브로모숙신이미드와 같은 숙신 이미드 ; t - 부틸 하이포아염소산염과 같은 하이포아염소산 ; 아조디카르복실레이트와 같은 아조디카르복실산 화합물 ; 디메틸 디술피드 또는 디페닐 디술피드와 같은 디술피드와 트리페닐포스핀의 조합물; 메틸니트리트와 같은 아질산 에스테르 ; 테트라브로모메탄과 같은 테트라할로겐화탄소류 ; 2,3 - 디클로로 - 5,6 - 디시아노 - p - 벤조퀴논 (DDQ) 과 같은 퀴논류 ; 바람직하게는 요오드가 포함된다.
반응에 불리한 효과가 없다면 사용되는 용매의 특성에 특별한 제한은 없다. 바람직한 용매의 예로 : 벤젠, 톨루엔 또는 크실렌과 같은 방향족 탄화수소 ; 디클로로메탄 또는 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소 ; 에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산 또는 디메톡시 에탄과 같은 에테르 ; 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 또는 헥사메틸포스포릭 트리아미드와 같은 아미드 ; 디메틸술폭시드와 같은 술폭시드; 메탄올, 에탄올, 7 - 프로판올, 이소프로판올, 7 - 부탄올, 이소부탄올 또는 이소아밀 알콜과 같은 알콜 ; 황산 수용액과 같은 희석된 산 ; 수산화나트륨 수용액과 같은 희석된 염기 ; 물 ; 아세톤 또는 메틸에틸케톤과 같은 케톤 ; 피리딘과 같은 헤테로고리 아민 ; 아세토니트릴 등의 니트릴 ; 바람직하게는 헤테로고리 아민 (특히 피리딘), 니트릴 (특히 아세토니트릴), 에테르 (특히 테트라히드로푸란) 및 할로겐화 탄화수소 (특히 디클로로메탄) 가 포함된다.
반응은 - 50℃ 내지 100℃ 의 온도에서 수행된다. 반응에 요구되는 시간은 출발화합물의 성질 및 용매와 동시에 반응온도에 주로 의존하여 변화되지만 반응은 - 50°∼ 100℃ 의 온도에서 통상 30분 내지 15 시간의 기간에 완료된다. 상기 산화반응은 트리에틸벤질암모늄 클로라이드 또는 트리부틸벤질암모늄 브로마이드와 같은 상 - 전이 촉매를 가함으로써 가속된다.
12, 14, 17, 23, 26, 28, 30, 33 및 35 단계는 유사하다.
[ 9 및 20 단계 ]
이 단계에서는 화합물 (4-2) 또는 (6-2) 의 유리 히드록실기와 염기 촉매 존재하에서 숙신산 무수물과 같은 디카르복시산 무수물을 반응시켜 디카르복시산의 반 에스테르를 제조한다.
사용되는 디카르복시산의 성질에 특별한 제한은 없다. 바람직한 디카르복시산은 탄소수 2 내지 10 를 함유하는 것이며, 가장 바람직한 디카르복시산은 숙신산 또는 글루타르산이다.
적절한 염기 촉매의 예로 ; 디메틸아미노피리딘 또는 피롤리디노피리딘과 같은 아미노피리딘 ; 트리메틸아민 또는 트리에틸아민과 같은 t - 아민 ; 탄산수소나트륨 ; 및 탄산칼륨과 같은 알칼리 금속 탄산염 ; 가장 바람직하게는 디메틸아미노피리딘 또는 피롤리디노피리딘이 포함된다. 반응에 불리한 효과가 없으며 어느 한도 이상 초기물질을 용해시킬 수 있다면 사용되는 용매의 성질에 특별한 제한은 없다. 바람직한 용매의 예로 ; 벤젠, 톨루엔 또는 크실렌과 같은 방향족 탄화수소 ; 디클로로메탄 또는 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소; 에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산 또는 디메톡시 에탄과 같은 에테르, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 또는 헥사메틸포스포릭 트리아미드와 같은 아미드; 디메틸술폭시드와 같은 술폭시드 ; 메탄올, 에탄올, 7 -프로판올, 이소프로판올, 7 - 부탄올, 이소부탄올 또는 이소아밀 알콜과 같은 알콜; 황산수용액과 같은 희석된 산 ; 수산화나트륨 수용액과 같은 희석된 염기 ; 물 ; 아세톤 또는 메틸에틸 케톤과 같은 케톤 ; 피리딘과 같은 헤테로고리 아민 ; 및 아세토니트릴과 같은 니트릴 더욱 바람직하게는 니트릴 (특히 아세토니트릴), 에테르 (특히 테트라히드로푸란) 및 할로겐화 탄화수소 (특히 디클로로메탄) 가 포함된다.
반응은 - 50℃ 내지 100℃ 의 온도에서 수행된다. 반응에 요구되는 시간은 초기 화합물의 특성 및 사용된 용매와 동시에 반응온도에 주로 의존하여 변화되지만 통상 30 분 내지 15 시간의 기간에 완료된다.
[ 10 및 21 단계 ]
이 단계에서는 단계 9 및 20 에서 제조한 숙신산 (4-3) 및 (6-4)의 반에스테르를 응축제 존재하에서 펜타클로로페놀과 같은 페놀류와 반응시켜 제조하여 활성화된 에스테르를 제조한 다음 염기 존재하에 생성물을 CPG - 아민 (4-4) 과 반응시켜 원하는 화합물 (6-5) 를 제조한다.
이 반응에서 사용되는 페놀의 특성에 특별한 제한은 없다. 바람직한 페놀의 예는 펜타클로로페놀 및 4 - 니트로페놀이다.
반응에 불리한 효과가 없으며 어느 정도의 출발물질을 용해시킬 수 있으면 사용되는 용매의 특성에 특별한 제한은 없다. 적절한 용매의 예로 ; 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 또는 헥사메틸포스포릭 트리아미드와 같은 아미드 ; 디메틸술폭시드와 같은 술포시드 ; 아세톤 또는 메틸에틸 케톤과 같은 케톤 ; 피리딘과 같은 헤테로고리 아민 ; 및 아세토니트릴과 같은 니트릴 ; 바람직하게는 디메틸포름아미드와 같은 아미드가 포함된다.
통상적 반응에서, 염기로 사용되는 것이라면, 사용되는 염기의 특성에는 특별한 제한은 없다. 바람직한 염기의 예로 ; 트리에틸아민, 트리부틸아민, 디이소프로필에틸아민, N - 메틸모르폴린, 피리딘, 4 - (N,N -디메틸아미노) 피리딘, N,N - 디메틸아닐린, N,N - 디에틸아닐린, 1,5 - 디아자 비시클로 [4, 3, 0] 논 - 5 - 엔, 1,4 - 디아자비시클로 [2,2,2] 옥탄 (DABCO) 또는 1,8 - 디아자비시클로 [5,4,0] 운데크 - 7 - 엔 (DBU) ; 더 바람직하게는 유기염기, 특히 트리에틸아민, 피리딘, N - 메틸모르폴린 및 DBU 가 포함된다.
반응은 - 50℃ 내지 100℃ 의 온도에서 수행된다. 반응에 요구되는 시간은 주로 초기 화합물 또는 사용된 용매의 특성에 의존하여 변화하지만, 반응이 실온에서 수행되는 경우, 통상 30 내지 50 시간내에 완료된다.
[ 13 및 32 단계 ]
단계 13 에서 11 단계에서 제조한 화합물 (4-6) 을 DNA 합성기 상에서 시판중인 5' - 0 - DMT - 뉴클레오시드 - 3' - 포스포르아미디트 시약과 반응시킨 다음 티오화 시약과 반응시켜 티오에이트기를 함유한 CPG - 결합 뉴클레오시드 (4-7) 을 제조한다.
3가 인산과 반응하여 티오에이트기를 형성시킬 수 있다면, 사용되는 티오화 시약의 특성에 특별한 제한은 없다. 선호되는 티오화 시약의 예로는 ; 황과 함께, 테트라에틸티우람 디술피드 (TETD) (Applied Biosystems Inc. 제조) 및 뷰카즈 시약 (Beaucage) (MilliGen / Biosearch 제조) 이 포함된다. 문헌 「Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991)」에 보고된 절차를 기준한 테트라에틸티우람 디술피드 (TETD) 로 처리하거나, 또는 문헌 「J, Am, Chem. Soc., 112, 1253 (1990)」 에 보고된 절차를 기준한 뷰카즈 (Beaucage) 시약으로 처리하거나, 또는 그 변형된 절차를 기준하여 처리하여, 상기 유효염기 서열의 3' - 말단 뉴클레오시드가 티오에이트 기를 통하여 CPG 에 지지되어 있는 원하는 화합물 (4-7) 을 제조한다.
32 단계에서는 화합물 (7-3) 을 포스포르아미디트 시약과 반응시키고 난후 통상적 방법으로 처리하거나 또는 티오화 시약으로 처리하여 포스포릭 트리에스테르 또는 티오에이트 기를 함유한 CPG - 결합 뉴클레오시드 (7-7) 을 제조한다.
[ 15 단계 ]
이 단계에서는 CPG - 결합화합물 (4-6) 제조시 부수되어 수득된 DMT 기에서 유리된 CPG - 결합 화합물 (5-1) 을 응축제 및 탈산화제 존재하에 시판중인 포스폰산 모노에스테르 화합물 (5-2) 과 반응시켜 포스폰산 디에스테르기를 함유한 CPG - 결합 화합물 (5-3) 을 제조한다. 포스폰산 모노에스테르와 반응하여 산 무수물을형성할 수 있는 것이라면, 사용되는 웅축제에 특별한 제한은 없다. 바람직한 웅축제의 예로 아다만탄 - 1 - 카르보닐 클로라이드 및 피발로일 클로라이드가 포함된다. 산 염화물을 사용하여 아실화를 수행하는 경우 탈산화제로 사용될 수 있다면, 사용되는 탈산화제의 특성에 특별한 제한은 없다. 일반적으로, 바람직한 탈산화제의 예로는, 피리딘과 같은 방향족 아민이 포함된다. 반응에 불리한 효과가 없다면, 사용되는 용매의 특성에 특별한 제한은 없다. 바람직한 용매의 예로 무수아세토니트릴과 같은 니트릴이 포함된다. 반응이 실온에서 수행되는 경우, 5분 내지 60 분의 기간내에 완료된다.
[ 16 단계 ]
이 단계에서는 CPG - 결합화합물 (5-3) 의 포스폰산 디에스테르기를 알킬아민 및 사염화탄소와 반응시켜 포스포르이미데이트기로 전환시킨다. 알킬아민으로서 목적하는 알킬아민으로 이해되어진다. 반응에 불리한 효과가 없다면 사용되는 용매의 특성에 특별한 제한은 없다. 바람직한 용매의 예로는 통상 사염화탄소와 같은 비극성 용매가 포함된다. 반응온도는 특별히 필수적이지 않으며 반응은 통상 - 50° 내지 100℃의 온도에서 수행된다. 반응이 실온에서 수행되는 경우, 1 내지 10 시간의 기간내에 완료된다.
[ 19 및 36 단계 ]
이 단계에서는 화합물 (6-2) 및 (2) 를 불황성 용매 및 탈산화제의 존재하에 3가 인산화 시약으로서 사용되는 클로로포스포르아미디트 (6-3')과 반응시켜 3' - 인산 유도체 (6-3) 및 (8) 을 제조한다. 화합물 (6-3') 의 정의에서 사용된 U 는디메틸아미노 또는 디이소프로필아미노기와 같은 디알킬아미노기 또는 고리내에 1 또는 2 의 산소 및/또는 질소 원자를 함유한 헤테로고리 화합물을 의미한다. 인산염 결합을 형성시킨 후 제거될 수 있는 것이라면, 화합물 (6-3') 의 정의에 사용된 V 는 어떠한 것이어도 된다. 이러한 기의 예로는 바람직하게는 메톡시기와 같은 저급알콕시기 및 시아노에틸옥시기와 같은 시아노알킬옥시기가 포함된다. (6-3') 의 화합물로서 특히, 클로로모르폴리노메톡시포스핀, 클로로모르폴리노시아노에톡시포스핀, 클로로디메틸아미노메톡시포스핀, 클로로디메틸아미노시아노에톡시포스핀, 클로로디이소프로필아미노메톡시포스핀 및 클로로디이소프로필아미노시아노에톡시포스핀 ; 바람직하게는 클로로모르폴리노메톡시포스핀, 클로로모르폴리노시아노에톡시포스핀, 클로로디이소프로필아미노메톡시포스핀 및 클로로디이소프로필아미노시아노에톡시포스핀과 같은 포스핀이 알려져 있다.
반응에 불리한 효과가 없다면, 사용되는 용매의 특성에 특별한 제한은 없다. 바람직한 용매로는 테트라히드로푸란, 디에틸에테르 또는 디옥산과 같은 에테르가 있다. 탈산화제의 예로는 피리딘 또는 디메틸아미노피리딘과 같은 헤테로고리 아민 및 트리메틸아민, 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민과 같은 지방족 아민이 포함되며, 바람직하게는 지방족 아민 (특히 디이소프로필에틸아민) 이다.
반응 온도는 특별히 중요하지 않으나, 반응은 일반적으로 -50 ∼ 50℃, 바람직하게는 실온에서 행한다.
반응에 필요한 시간은 출발 화합물과 시약의 종류 및 반응 온도에 따라 다르나, 반응은 일반적으로 5 분 ∼ 30 시간에 종결된다. 반응이 실온에서 행해지는 것이 바람직하다면, 30 분 이내에 종결된다.
목적하는 화합물은 예를 들면, 반응 혼합물을 적당히 중화시키거나 불용성 물질이 존재한다면 여과 제거하고, 물과 에틸 아세테이트와 같은 물과 혼화 되지 않는 용매를 가하고, 목적하는 화합물을 함유하는 유기층을 분리하고, 추출물을 물로 세척하고, 무수 황산 마그네슘 등으로 건조시키고, 마지막으로 용매를 증류 제거함으로써 반응 혼합물로부터 회수할 수 있다.
이렇게 수득한 목적하는 화합물은 필요하다면, 재결정, 재침전, 크로마토그래피 등과 같은 통상적인 방법으로 더 정제할 수 있다.
[24 단계]
이 단계에서, 인산 트리에스테르기를 갖는 CPG - 결합 화합물 (6 - 8) 은, DNA 합성기 상에서 뉴클레오티드 단위로서 사용되는 뉴클레오시드 포스포르아미디트 화합물 대신에 화합물 (6-3) 을 사용하는 것을 제외하고는 단계 7 에 기재된 바와 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
[27 및 29 단계]
이 단계에서, 2 또는 3 개의 인산 트리에스테르기를 갖는 CPG - 결합 화합물 (6-10 및 6-11) 은, 24 단계에 기재된 방법으로 처리함으로써 25 단계에서 제조된 CPG - 결합 화합물 (6-9) 로 부터 제조할 수 있다.
[31 단계]
이 단계에서, 4, 4' - 디메톡시트리틸옥시에틸술포닐에톡시기를 갖는 CPG - 결합 화합물은 시판중인 5'- DMT 기가 없는 CPG - 결합 화합물 (7-2) 를 24 단계에기재된 바와 동일한 방법으로 (2 - 시아노에톡시) - 2 - [2'- 0 - (4, 4' - 디메톡시트리틸옥시에틸술포닐] 에톡시 - N, N - 디이소프로필아미노포스핀 (7-1)으로 처리함으로써 제조할 수 있다[T. Horn 등, Tetrahedron Letters, 27, 4705 (1986)].
[34 단계]
이 단계에서, CPG - 결합 화합물 (7-5) 은 31 단계에서 제조된 CPG - 결합 화합물 (7-3) 으로 부터 DMT 기를 탈보호시킨 후, 축합제를 사용하여 5' - 위치에 DMT 기 및 3' - 위치에 알킬 포스페이트, 페닐 포스페이트, 알킬 포스포네이트 또는 페닐 포스포네이트기를 갖는 뉴클레오티드 (7-4) 와 축합시킴으로써 제조할 수 있다.
반응에 역영향을 미치지 않는 한 사용되는 용매의 성질에 특별한 제한은 없다. 바람직한 용매는 피리딘과 같은 방향족아민이다. 축합제로서 디시 클로헥실카르보디이미드 (DCC), 메시틸렌술포닐 클로라이드 (MS - Cl), 트리이소프로필벤젠술포닐 클로라이드, 메시틸렌술포닐트리아졸 (MST), 메시틸렌술포닐 - 3 - 니트로트리아졸 (MSNT), 트리이소프로필벤젠술포닐테트라졸 (TPS-Te), 트리이소프로필벤젠술포닐니트로이미다졸 (TPS-NI) 및 트리이소프로필벤젠술포닐피리딜테트라졸을 들수 있으며, 바람직한 것은 MSN, TPS-Te 및 TPS-NI 이다.
반응 온도는 특별히 중요하지 않으나 반응은 -10 ∼ 100℃ 에서 수행된다. 반응에 필요한 시간은 사용되는 용매의 종류 및 반응 온도에 따라 다르다. 용매로서 피리딘을 사용하여 실온에서 반응을 수행하는 경우, 30 분 이내에 종결된다.
[37 단계]
이 단계에서, 최종생성물 (1) 은 DNA 합성기 상에서 합성되고 5' - 말단의 DMT 기만이 탈보호된 CPG - 결합 ODN (3, 4a, 4b, 5, 6a ∼ 6d, 7a 또는 7b)과 36 단계에서 제조된 화합물 (8) 을 축합시키고, 산 촉매를 사용하여 포스폰산 트리에스테르를 형성하고, 적당한 산화제를 사용하여 아인산 트리에스테르를 형성하고, CPG 로부터 절단하고, 보호기를 제거하고 마지막으로 정제함으로써 제조할 수 있다.
축합 반응에 사용되는 산 촉매로서, 테트라졸과 같은 산물질을 고려할 수 있으며, 바람직한 것은 테트라졸이다.
산화 반응에서 산화제로서 사용할 수 있는 한, 사용되는 산화제의 성질에 특별한 제한은 없다. 바람직한 산화제의 예로는 과망간 칼륨 또는 이산화망간과 같은 망간 산화물 ; 사산화루테늄과 같은 루테늄 산화물 ; 이산화셀레늄과 같은 산화셀레늄 ; 염화 제 2 철과 같은 철 화합물 ; 사산화 오스뮴과 같은 오스뮴 화합물 ; 산화은과 같은 은 화합물 ; 아세트산 수은과 같은 수은 화합물 ; 산화납 또는 사산화납과 같은 납 산화물 화합물 ; 크롬산 칼륨 ; 크롬산과 황산의 착체 또는 크롬산과 피리딘의 착체와 같은 크롬산 화합물 ; 및 세륨 암모늄 니트레이트 (CAN) 와 같은 세륨 화합물을 포함한 무기 금속 산화물 ; 염소, 브롬 또는 요오드 분자와 같은 할로겐 원자 ; 과요오드화 나트륨과 같은 과요오드화물 ; 오존 ; 과산화수소 아질산과 같은 아질산 화합물 ; 아염소산나트륨과 같은 아염소산 화합물 ; 및 과황산칼륨 또는 과황산나트륨과 같은 과황산 나트륨을 포함한 무기 산화제 ; 및 DMSO 산화반응에 사용되는 시약 (디메틸술폭시드와 디시클로헥실카르보디이미드, 옥살릴 클로라이드, 무수아세트산 또는 오염화인과의 혼합물 또는 피리딘과 무수 황산과의 착체) ; t - 부틸 히드로퍼옥사이드와 같은 과산화물 ; 트리페닐메틸 양이온과 같은 안정한 양이온 ; N - 브로모숙신이미드와 같은 숙신이미드 ; t - 부틸 하이포아염소산염과 같은 하이포아염소산 화합물 ; 아조디카르복실레이트와 같은 아조디카르복실산 화합물 ; 디메틸 디술피드, 디페닐 디술피드 또는 디피리딜 디술피드와 같은 디술피드와 트리페닐포스핀과의 혼합물 ; 메틸 니트리트와 같은 아질산염 ; 테트라브로모메탄과 같은 테트라할로겐화 화합물 ; 및 2, 3 - 디클로로 - 5, 6 - 디시아노 - p - 벤조퀴논 (DDQ) 과 같은 퀴논 화합물을 포함한 유기 산화제가 있으며, 더욱 바람직한 것은 요오드이다.
반응에 역영향을 미치지 않고 출발 물질을 어느정도 용해시킬 수 있는 한 사용되는 용매의 성질에 특별한 제한은 없다. 바람직한 용매의 예로는 벤젠, 톨루엔 또는 크실렌과 같은 방향족 탄화수소 ; 에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산 또는 디메톡시에탄과 같은 에테르 ; 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 또는 헥사메틸포스포르 트리아미드와 같은 아미드 ; 디메틸술폭시드와 같은 술폭시드 ; 메탄올, 에탄올, n -프로판올, 이소프로판올, n - 부탄올, 이소부탄올 또는 이소아밀 알콜과 같은 알콜 ; 황산 수용액과 같은 희석산 ; 수산화나트륨 수용액과 같은 희석염기 ; 물 ; 아세톤 또는 메틸에틸 케톤과 같은 케톤 ; 피리딘과 같은 헤테로시클릭 아민 ; 아세토니트릴과 같은 니트릴이 있으며, 바람직하게는 헤테로시클릭아민 (특히 피리딘), 니트릴 (특히 아세토니트릴), 에테르(특히 테트라히드로푸란) 및 할로겐화 탄화수소 (특히 디클로로메탄) 이다.
반응은 -50 ∼ 100℃ 에서 수행한다. 반응에 필요한 시간은 주로 반응 온도 및 출발 화합물의 성질에 따라 30 분 ∼ 15 시간내에서 변한다. 상기한 산화 반응은 트리에틸벤질암모늄 클로라이드 또는 트리부틸벤질암모늄 브로마이드와 같은 상 전이 촉매를 첨가함으로써 지속된다.
[38 단계]
이 단계에서, 중간체인 모노뉴클레오티드 (19) 는 화합물 (2) 와 비스트리아졸리드와 같은 포스포릴화제를 불활성 용매 존재하에 반응시키고 물을 첨가한 후 작용시킴으로써 제조할 수 있다.
반응에 역영향을 미치지 않는한, 사용되는 용매의 성질에 특별한 제한은 없다. 용매는 일반적으로 피리딘과 같은 방향족 아민으로부터 선택된다. 39 단계의 축합 반응 종결 후 염기부분의 보호기를 제거하는 조건하에서 제거될 수 있는 한, 포스포릴화제의 정의에서 사용된 V 의 성질에 특별한 제한은 없다. V 는 일반적으로 o - 클로로페녹시기를 나타낸다.
반응 온도는 특별히 중요하지 않으나, 반응은 일반적으로 -20 ∼ 100℃, 일반적으로 실온에서 행한다. 반응에 필요한 시간은 사용되는 용매의 성질 및 반응온도에 따라 다르다. 용매로서 피리딘을 사용하여 실온에서 반응을 수행하는 경우, 1 시간 이내에 종결된다.
[39 단계]
이 단계에서, 최종생성물 (1) 은 DNA 합성기 상에서 합성되고 5' - 말단 DMT 기가 탈보호된 CPG - 결합 ODN (3, 4a, 4b, 5, 6a ∼ 6d, 7a 또는 7b) 과 모노뉴클레오티드 (9) 를 축합시키고, 축합제를 사용하여 염기 및 인산 부분에 보호기를 갖게하여 트리에스테르기를 형성하고, 통상적인 방법으로 CPG 로 부터 절단하고, 보호기를 탈보호시키고, 마지막으로 정제함으로써 제조한다. 반응에 역영향을 미치지 않는 한, 사용되는 용매의 성질에 특별한 제한은 없다.
축합제의 예로는 디시클로카르보디이미드 (DCC), 메시틸렌술포닐클로라이드 (MS-Cl), 트리이소프로필벤젠술포닐 클로라이드, 메시틸렌술포닐트리아졸(MST), 메시틸렌술포닐 - 3 - 니트로트리아졸 (MSNT), 트리이소프로필벤젠술포닐테트라종 (TPS - Te), 트리이소프로필벤젠술포닐니트로이미다졸 (TPS-Nl) 및 트리이소프로필벤젠술포닐비리딜테트라졸이 있으며, 바람직한 것은 MSNT, TPS - Te 및 TPS-NI 이다.
반응 온도는 특별히 중요하지 않으나, 반응은 -10 ∼ 100℃, 일반적으로 실온에서 행한다. 반응에 필요한 시간은 사용되는 용매의 성질 및 반응 온도에 따라 다르나, 용매로서 피리딘을 사용하여 실온에서 반응을 행하는 경우, 30 분 이내에 종결된다.
CPG - 결합 ODN 으로부터의 ODN 의 절단과 5' - 말단 치환체를 제회한 보호기의 제거는 그 자체 공지의 방법 [J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 (1981)] 에 따라 행한다.
일반식 (1) 의 화합물을 함유하는 반응 혼합물은 통상적인 정제방법, 예를 들면 역상 및 이온교환 크로마토그래피를 포함한 여러가지 크로마토그래피 (고속 액체 크로마토그래피 포함) 로 정제하여 상기 일반식 (1)의 화합물을 제조한다.
[40 단계]
이 단계에서 문헌 [B. C. Freohler, P. G. Ng 및 M. D. Matteucci, Nucleic Acids Res., 14, 5399 (1986)] 에 보고된 방법에 따라 삼염화인 및 1, 2, 4 - 트리아졸로부터 미리 제조된 트리스 (1, 2, 4 - 트리아졸릴) 포스파이트를 불확성 용매 중에서 화합물 (2) 와 반응시키고 물을 가한 후 작용시켜 반응을 중지시킴으로써 뉴클레오시드 3'- H - 포스포네이트 (10) 을 제조한다. 반응에 역영향을 미치지 않는 한, 사용되는 용매의 성질에 특별한 제한은 없다. 바람직한 용매는 디클로로메탄과 같은 할로겐화 탄화수소이다. 반응 온도는 특별히 중요하지 않으나 -20 ∼ 100℃, 일반적으로 실온에서 반응을 행한다.
반응에 필요한 시간은 사용되는 용매의 성질 및 반응온도에 따라 다르다. 용매로서 디클로로메탄을 사용하여 실온에서 반응을 행하는경우, 30 분 이내로 종결된다.
[41 단계]
이 단계에서, 최종생성물 (1) 은 합성기상에서 합성되고 5' - 말단 DMT 기만이 탈보호된 CPG - 결합 ODN (3, 4a, 4b, 5, 6a ∼ 6d, 7a 또는 7b) 과 40 단계에서 제조된 뉴클레오시드 3' - H - 포스포네이트 (10) 을 반응시키고, 탈산제의 존재하에 피발로일 클로라이드와 같은 축합제를 사용하여 염기 및 인산 부분에 보호기를 갖게하여 H - 포스폰산 디에스테르 결합을 형성하고, CPG - 결합 ODN 으로부터 ODN 을 절단하고 동시에 염기성 조건하에서 염기의 보호기를 제거하고 마지막으로 정제함으로써 제조할 수 있다. 반응에 역영향을 미치지 않는한, 사용되는 용매의 성질에 특별한 제한은 없다. 축합제의 예로는 산 클로라이드 및 인산 클로라이드가 있으며, 바람직한 것은 피발로일 클로라이드이다.
산화 반응에서 산화제로서 사용할 수 있는 한, ODN의 H -인산기를 인산디에스테르기로 산화시키는데 사용되는 산화제의 성질에 특별한 제한은 없다. 적당한 산화제의 예로는 과망간산 칼륨 또는 이산화망간과 같은 망간 산화물 ; 사산화루테늄과 같은 루테늄 산화물 ; 이산화셀레늄과 같은 셀레늄 산화물 ; 염화 제 2철과 같은 철 화합물 ; 사산화오스뮴과 같은 오스뮴 화합물 ; 산화은과 같은 은 화합물 ; 아세트산수은과 같은 수은 화합물 ; 산화납 또는 사산화납과 같은 납 산화물 화합물 ; 크롬산칼륨, 크롬산과 황산과의 착체 또는 크롬산과 피리딘과의 착체와 같은 크롬산 화합물 ; 및 세륨 암모늄 니트레이트 (CAN) 와 같은 세륨 화합물을 포함한 무기 금속 산화물 ; 염소, 브롬 또는 요오드분자와 같은 할로겐 분자 ; 과요오드화나트륨과 같은 과요오드화물 ; 오존 ; 과산화수소 ; 아질산과 같은 아질산 화합물 ; 아염소산나트륨과 같은 아염소산 화합물 ; 및 과황산칼륨 또는 과황산나트륨과 같은 과황산 나트륨을 포함한 무기 산화제 ; 및 DMSO 산화반응에 사용되는 시약 (디메틸술폭시드와 디시클로헥실카르보디이미드, 옥살릴 클로라이드, 무수아세트산 또는 오염화인과의 혼합물 또는 피리딘과 무수황산과의 착체) ; t - 부틸 히드로퍼옥사이드와 같은 과산화물 ; 트리페닐메틸 양이온과 같은 안정한 양이온 ; N - 브로모숙신이미드와 같은 숙신이미드 ; t - 부틸 하이포아염소산염과 같은 하이포아염소산 화합물 ; 아조디카르복실레이트와 같은 아조디카르복실산 화합물 ; 디메틸 디술피드, 디페닐 디술피드 또는 디피리딜 디술피드와 같은 디술피드와 트리페닐포스핀과의 혼합물 ; 메틸 니트리트와 같은 아질산염 ; 테트라브로모메탄과 같은 테트라할로겐화 화합물 ; 및 2, 3 - 디클로로 - 5, 6 - 디시아노 - p - 벤조퀴논 (DDQ) 과 같은 퀴논 화합물을 포함한 유기산화제가 있으며, 더욱 바람직한 것은 요오드이다.
사용되는 탈산제로는, 피리딘 또는 디메틸아미노피리딘과 같은 헤테로시클릭아민 및 트리메틸아민, 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민과 같은 지방족 아민을 고려할 수 있으며, 바람직한 것은 지방족아민 (특히 디이소프로필에틸아민) 이다. 반응 온도는 특별히 중요하지 않으나 반응은 일반적으로 -50 ∼ 50℃, 바람직하게는 실온에서 행한다.
반응에 필요한 시간은 사용되는 출발 화합물 및 용매의 성질과 반응 온도에 따라 다르나, 반응은 일반적으로 5 분 ∼ 30 시간이다. 반응을 실온에서 행하는 경우, 30 분 이내에 종결되는 것이 바람직하다.
CPG - 결합 0DN 으로부터의 ODN 의 절단과 5' - 말단 치환체를 제외한 보호기의 제거는 그 자체 공지의 방법 [J. Am. Chem, Soc., 103, 3185 (1981)] 에 따라 행한다.
일반식 (1) 의 화합물을 함유하는 반응 혼합물은 통상적인 정제방법, 예를 들면 역상 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함한 여러가지 크로마토그래피 (고속 액체 크로마토그래피 포함) 로 정제하여 상기 일반식 (1) 의 화합물을 제조한다.
본 발명은 또한 올리고데옥시리보뉴클레오티드 및 올리고데옥시리보뉴클레오티드 유도체의 신규 합성법을 제공한다. 신규 방법에 의해 제조된 식(11) 의 신규올리고데옥시리보뉴클레오티드는 통상 일반식 (1) 의 신규 화합물을 포함한다. 또한, 본 발명은 신규 방법에 사용되는 신규 중간체 화합물을 제공하며, 이것은 더욱 구체적으로 정의될 것이다.
이하 기술에서는, 상이한 정의가 치환기에 대해 사용되지만, 각 정의 사이의 부합성은 쉽게 인지될 수 있다. 즉, 예를 들면, 신규 방법에 의해 제조 사용된 화합물에 대하여 나타낸 치환기 R4R5R6Z - 와 일반식 (1) 의 화합물의 치환기 R1R2R3Z - 사이에는 유사성이 있음을 알 수 있다. 또한, R1, R2, Y1등과 같이 아랫침자로 나타낸 기는 R1, R2, Y1등과 같이 윗첨자로 나타낸 기와 항상 동일한 것은 아님을 주목해야 한다.
본 발명의 이러한 국면에서, 본 발명에 의해 제공되는 방법은 3' - 말단에 치환 포스페이트를 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 제조하는 것을 포함한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 합성용 고상물질 제조시 중합체 지지체와 병용되는 신규 링커 화합물을 제공한다. 고상 물질은 중합체 지지체에 링커의 말단에서 보호된 히드록시기를 가질 수 있고, 이것은 탈보호되어 반응됨으로써 뉴클레오티드를 첨가할 수 있다.
따라서, 예를 들면, 본 발명은 하기 화합물 (12) 과 같은 링커 화합물을 제공하는데, 이것은 중합체 지지체와 함께 보호된 고상물질 (14) 을 제공할 수 있으며 화합물 (22) 로 탈보호된 후 뉴클레오티드 첨가 반응에 의해 화합물 (24), (25)및 (27) 로 된다.
한 국면에서는, 본 방법은 하기 식 (12) 의 화합물을 하기 일반식 (13) 의 중합체 물질과 반응시켜 (단, 일반식 (12)의 Y1가 히드록실기일 경우는 일반식 (12) 의 화합물을 중합체 물질 (13) 과 반응시키기 전 카르복실산 활성화제와 반응시킨다) 하기 일반식 (14) 의 중합체 물질을 형성한 후 생성된 식 (14) 의 중합체 물질을 DNA 합성기를 사용하여 DNA 사슬 연장처리시킴을 특징으로 하는 하기 식(11) 의 화합물의 제조방법이다.
[상기 식중,
R4, R5및 R6은 서로 동일하거나 상이하며, 각각은 수소원자, 탄소수 1 ∼ 4 의 알킬기, 임의로 치환된 아릴기 또는 임의로 치환된 안트라퀴노닐기이고 ; Z 는 탄소 또는 규소원자이며 ; R5, R6및 Z 는 함께 플루오레닐기 또는 크산테닐기를 나타낼 수 있거나 ; 또는 R4, R5, R6및 Z 는 함께 수소원자를 나타낼 수 있으며 ;
R7은 수소원자, 임의로 치환된 탄소수 1 ∼ 4의 알킬기, 임의로 치환된 아릴기 또는 임의로 치환된 아르알킬기이고 ;
Y2은 동일하거나 상이하며, 산소원자, 황원자 또는 NH 기이며 ;
Y3은 산소원자, 황원자, NH 기, 탄소수 1 ∼ 4의 알킬렌기 또는 페닐렌기이고 ;
X3은 산소 또는 황원자이며 ;
D 는 사슬길이 2 ∼ 30 의 올리고데옥시리보뉴클레오티드이고, 단 5' - 및 3' - 말단의 히드록실기는 D 에 포함되지 않으며 ;
R1, R2및 R3은 서로 동일하거나 상이하며, 각각은 수소원자 또는 탄소수 1 ∼ 4 의 알콕시기이고 ;
X1은 기 - S -, - SO - 또는 - SO2이며 ;
A는 기 -(CH2)h- (식중, h 는 1 ∼ 16의 정수), 기 -(CH2)hO- (식중, h 는 1 ∼ 16의 정수), 기 -(CH2)j-O-CO-(CH2)k- (식중, j는 양의 정수, k는 0 또는 양의 정수, j + k는 2 ∼ 16) 또는 기 -(CH2)j-NH-CO-(CH2)k- (식중, j는 양의 정수, k 는 0 또는 양의 정수, j + k는 2 ∼ 16), 기 -(CH2)j-S-CO-(CH2)k- (식중, j 는 양의 정수, k 는 0 또는 양의 정수, j + k 는 2 ∼ 16) 또는 기 -(CH2)n-O-CO-CH2(OCH2CH2)p-OCH2- (식중, n 은 양의 정수, p 는 0 또는 양의 정수, j + k 는 2 ∼ 100)이고 ;
Y1은 히드록실기, 임의로 치환된 페닐옥시기 또는 할로겐으로 치환될 수 있는 에틸옥시기이며 ;
X2은 산소원자, 황원자 또는 NH 기이고 ;
P 는 중합체 물질을 나타낸다]
본 발명의 상기 방법을 하기 작업공정도에 나타낸다.
상기 작업공정도에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, X1, X2, X3, P, Y1, Y2, Y3, A 및 Z는 상기 정의된 바와 같다 (그러나, 화합물 (11) 이외의 화합물에서는 R4, R5, R6및 Z 는 함께 수소원자를 나타내지 않는다). R8a는 메틸기 또는 시아노에틸기이고 ; R8b는 클로로기로 임의로 치환된 페닐기이며 ; R8은 메틸기, 시아노에틸기또는 클로로기로 임의로 치환된 페닐기이고 ; R9a는 수소원자 또는 보호기를 갖는 수소기이며 ; X 는 할로겐원자 (바람직하게는 염소, 브롬 및 요오드)이고 ; A1은 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기이며 ; m 은 1 ∼ 14 의 정수이고 ; n 은 1 ∼ 28 의 정수이며 ; B, B' 및 B"은 각각 염기가 보호된 아데닌 뉴클레이티드, 구아닌 뉴클레오티드, 티민 뉴클레오티드, 우라실 뉴클레오티드 및 시토신 뉴클레오티드의 염기 부분 및 포스페이트 부분 (이들은 원하는 염기서열을 제공하도록 선택되어야 한다) 을 나타내고, 단 B' 은 원하는 염기서열을 갖는 D 의 3' - 말단 뉴클레오티드의 염기부분이며, B" 은 원하는 염기서열을 갖는 D 의 5' - 말단 뉴클레오티드의 염기부분이고, D 는 원하는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 (단, 5' - 말단 히드록실기 및 3' - 말단 히드록실기는 포함되지 않는다) 이며 ; Q 는 할로게노알킬기, 할로게노페닐기 또는 니트로페닐기, 예컨대 2, 2, 2 - 트리클로로에틸기, 2, 2 -디클로로에틸기, 2 -클로로에틸기, 2, 2, 2 -트리브로모에틸기, 2, 2 -디브로모에틸기, 2 - 브로모에틸기, 2 - 니트로페닐기, 4 - 니트로페닐기, 2, 4 - 디니트로페닐기, 2, 4, 5 - 트리클로로페닐기 및 2, 3, 4, 5, 6 - 펜타클로로페닐기 (바람직하게는 트리클로로에틸기 및 오르토니트로페닐기) 이고 ; V 는 저급 알킬기(바람직하게는 메틸, 에틸 및 이소프로필기, 특별하게는 이소프로필기) 이다.
이하에서는 각 단계를 상세히 기술한다.
(1 단계)
이 단계는 2 - 메르캅토에탄올 (16) 을 비활성 용매중에서 산 결합제 존재하에 ω - 할로게노카르복실산 (15) 과 반응시켜 화합물 (17) 을 제조하는 것이다.
사용 가능한 용매로는 반응에 영향을 주지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 벤젠, 톨루엔 및 크실렌 등의 방향족 탄화수소류 ; 염화메틸렌 및 클로로포름등의 할로겐화 탄화수소류 ; 에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산 및 디메톡시에탄 등의 에테르류 ; 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 및 헥사메틸포스포로트리아미드등의 아미드류 ; 디메틸 술폭시드 등의 술폭시드류 ; 메탄올, 에탄올, n - 프로판올, 이소프로판올, n - 부탄올, 이소부탄올 및 이소아밀 알콜 등의 알콜류 ; 수성 황산 등의 희석산 ; 수성 수산화나트륨 등의 희석 염기 ; 물 ; 아세톤, 메틸 에틸 케톤 등의 케톤류 ; 피리딘 등의 복소환 아민류 ; 및 아세토니트릴 등의 니트릴류가 포함되며, 바람직한 것은 아세톤 등의 케톤류 및 메탄올 및 프로판올 등의 알콜류이다.
사용가능한 산 결합제로는 탄산칼륨 및 탄산나트륨 등의 알칼리 금속 탄산염 ; 탄산수소나트륨 등의 알칼리 금속 탄산수소염 ; 수산화나트륨 및 수산화칼륨 등의 알칼리 금속 수산화물 ; 및 트리에틸아민 등의 유기 아민류가 포함되며, 바람직한것은 알칼리 금속 탄산염, 특별하게는 탄산칼륨이다.
반응온도 및 반응시간은 사용된 용매, 산 결합제 등에 따라 다르고, 탄산칼륨 사용시는 환류하에서 8 시간 가열하에 반응이 수행된다.
반응종료후, 목적 화합물은 상법으로 반응 혼합물로 부터 단리한다.
예를 들면, 반응 혼합물을 적절히 중화하고, 불용물이 존재하면 여거하고, 반응 혼합물에 에틸 아세테이트 등의 수 - 불혼화성 유기용매를 가한다. 생성 혼합물을 물로 세척한 후, 목적 화합물을 함유하는 유기층을 분리하여 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨 다음 용매를 증발시켜 목적 화합물을 수득한다.
이렇게 수득한 목적 화합물은 재결정, 재침전, 크로마토그래피 등의 상법으로 필요에 따라 더 정제할 수 있다.
(2 단계)
이 단계는 화합물 (17) 을 보호제와 반응시켜 히드록실기가 보호된 화합물 (17) 에 상응하는 화합물 (18) 의 제조방법이며, 상기 보호제 (바람직하게는 디메톡시트리틸 클로라이드) 는 산 결합제 존재하에 비활성 용매중에서 산성 조건하에 제거될 수 있다.
사용 가능한 용매로는 반응에 영향을 주지 않고 출발물질을 어느 정도 용해할 수 있기만 하면 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 벤젠, 톨루엔 및 크실렌 등의 방향족 탄화수소류 ; 염화메틸렌 및 클로로포름 등의 할로겐화탄화수소류 ; 에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산 및 디메톡시에탄 등의 에테르류 ; 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 및 헥사메틸포스포로트리아미드 등의 아미드류 ; 디메틸 술폭시드 등의 술폭시드류 ; 아세톤, 메틸 에틸 케톤 등의 케톤류 ; 피리딘 등의 복소환 아민류 ; 및 아세토니트릴 등의 니트릴류가 포함되며, 바람직한 것은 복소환 아민류 (특히 피리딘) 이다.
사용 가능한 보호제로는 트리틸 클로라이드, 모노메톡시트리틸 클로라이드, 디메톡시트리틸 클로라이드 및 트리메톡시트리틸 클로라이드, 바람직하게는 디메톡시트리틸 클로라이드가 포함된다.
사용 가능한 산 결합제로는 반응에 영향을 주지 않고 생성물 및 출발물질을 분해하지 않으면 특별히 제한되지 않으며, 바람직한 것으로는 피리딘 및 디메틸아미노피리딘 등의 방향족 아민류가 포함된다.
반응온도 및 반응시간은 사용된 보호제 및 산 결합제의 종류에 따라 다르지만, 디메톡시트리틸 클로라이드를 보호제로 사용하고 피리딘을 용매로 및 또한 산 결합제로 사용한 경우에는 실온에서 2 시간 반응을 수행한다.
반응 종료후, 목적 화합물은 반응 혼합물로부터 상법으로 단리한다.
예를들면, 반응 혼합물을 적절히 중화한 후, 불용물이 존재하면 여거하고, 반응 혼합물에 에틸 아세테이트 등의 수 - 불혼화성 유기용매를 가한다. 반응 혼합물을 물로 세척한 후, 목적 화합물을 함유하는 유기층을 분리하여 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고 용매를 증발시켜 목적 화합물을 수득한다.
이로써 얻어진 원하는 화합물은 필요시에 재결정, 재침전, 크로마토그래피와 같은 통상적인 과정에 의하여 추가로 정제시킬 수 있다.
(3 단계)
이 단계는 화합물 (19) 를 불활성 용매하에 디카르복실산 무수물 (20) 과 반응시켜 화합물 (18) 를 제조하기 위한 것이다.
사용 가능한 용매는 반응에 영향을 주지 않고 출발물질을 어느 정도 용해시킬 수만 있으면 특정하지 않으며, 이의 예로는 벤젠, 톨루엔, 크실렌과 같은 방향족 탄화수소 ; 메틸렌 클로라이드 및 클로로포름과 같은 할로겐화 탄화수소 ; 에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산 및 디메톡시에탄과 같은 에테르 ; 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 및 헥사메틸포스포로트라아미드와 같은 아미드 ; 디메틸 술폭시드와 같은 술폭시드 ; 아세톤, 메틸 에틸 케톤과 같은 케톤 ; 피리딘과 같은 헤테로사이클 아민 및 아세토니트릴과 같은 니트릴이 있으며, 특히 메틸렌 클로라이드인 할로겐화 탄화수소가 바람직하다.
사용 가능한 산 결합제는 피리딘, 디메틸아미노피리딘 및 4 - 피롤리디노피리딘과 같은 피리딘, 바람직하게는 디메틸아미노피리딘이다.
사용 가능한 디카르복실산 무수물은 탄소원자수 3 ∼ 16 의 α, ω - 알킬디카르복실산의 무수물이기만 하면 특정하지 않으며, 숙신산 무수물이 바람직하다,
반응 온도 및 반응시간은 사용되는 산 무수물, 산 결합제 등의 종류에 의존하여 변하지만, 숙신산 무수물을 사용하고 산 결합제로서 디메틸아미노피리딘을 사용한다면 실온에서 30 분 동안 반응을 수행한다.
반응 완결후, 원하는 화합물을 통상적인 과정에 의하여 반응 혼합물로부터 분리시킨다.
예컨대, 반응 혼합물을 대략적으로 중화시키고, 존재하면 불용성 물질을 여과로 제거한 다음, 에틸 아세테이트와 같은 수 - 불혼화성 유기 용매를 반응 혼합물에 첨가한다. 얻어진 혼합물을 물로 세척한후, 원하는 화합물을 함유하는 유기층을 분리하고 무구 황산 마그네슘상에서 건조시킨 다음, 용매의 증발로 원하는 화합물을 얻는다.
이로써 얻어진 원하는 화합물은 필요시에 재결정, 재침전, 크로마토그래피 등과 같은 통상적인 과정에 의하여 추가로 정제시킬 수 있다.
(4 단계)
이 단계는 유리카르복실기를 갖는 화합물 (18) 의 카르복실기와 에스테르형성제와 반응시킨 다음, 치환 가능한 페놀과 반응시켜 활성 에스테르 (12) 를 형성시키기 위한 것이다.
사용 가능한 용매는 반응에 영향을 주지 않으면 특정하지 않으며, 이의 예로는 벤젠, 톨루엔, 크실렌과 같은 방향족 탄화수소 ;메틸렌클로라이드, 클로로포름, 사염화탄소 및 디클로로벤젠과 같은 할로겐화 탄화수소 ; 에틸 포르메이트, 에틸 아세데이트, 프로필 아세테이트, 부틸 아세테이트 및 디에틸 카르보네이트와 같은 에스테르 ; 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 이소포론 및 시클로헥사논과 같은 케톤 ; 니트로에탄 및 니트로벤젠과 같은 니트로 화합물 ; 아세토니트릴 및 이소부틸 니트릴과 같은 니트릴 ; 포름아미드, 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트 아미드 및 헥사메틸 포스포로트리아미드와 같은 아미드 ; 디메틸 술폭시드 및 술포란과 같은 술폭시드가 있으며 특히 메틸렌 클로라이드인 할로겐화 탄화수소 및 특히 디메틸포름아미드인 아미드가 바람직하다.
사용 가능한 페놀은 활성 에스테르로서 사용될 수만 있으면 특정하지 않지만, 이의 예로는 4 - 니트로페놀, 2, 4 - 디니트로페놀, 2, 4, 5 - 트리클로로페놀, 펜타클로로페놀 및 2, 3, 5, 6 - 테트라플루오로페놀이 있고, 펜타클로로페놀이 바람직하다.
사용 가능한 에스테르 형성제의 예로는 N - 히드록시숙신이미드, 1 - 히드록시벤조트리아졸 및 N - 히드록시 - 5 - 노르보르넨 - 2, 3 - 디카르복시이미드와같은 N - 히드록시 화합물 ; 1, 1' - 옥살릴디이미다졸 및 N, N' - 카르보닐디이미다졸과 같은 디이미다졸 화합물 ; 2, 2' - 디피리딜디술피드와 같은 디술피드 화합물 ; N, N' - 디숙신이미딜카르보네이트와 같은, 숙신산 화합물 ; N, N' - 비스 (2 - 옥소 - 3 - 옥사졸리디닐) 포스핀클로라이드와 같은 포즈핀 클로라이드 화합물 ; N, N' - 디숙신이미딜 옥살레이트 (DSO), N, N - 디프탈이미딜 옥살레이트(DPO), N, N' - 비스 (벤조트리아졸릴) 옥살레이트 (BBTO), 1, 1' - 비스 (6 - 클로로벤조트리아졸릴) 옥살레이트 (BCTO) 및 1, 1' - 비스 (6 - 트리플루오로메틸벤조트리아졸릴) 옥살레이트 (BTBO) 와 같은 옥살레이트 화합물 ; 및 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) 와 같은 카르보디이미드가 있으며, 디이미다졸 화합물과 특히 DCC 인 카르보디이미드가 바람직하다.
반응 온도 및 반응시간은 사용되는 에스테르 형성제 및 용매의 종류에 의존하여 변하지만, 0 ∼ 100℃ 에서 5 ∼ 50 시간동안 반응을 수행하며, 특히 펜타클로로페놀 및 DCC 를 DMF 중에 사용한다면 실온에서 18 시간 동안 반응을 수행한다.
반응 완결후, 원하는 화합물을 통상적인 과정에 의하여 반응 혼합물로부터 분리시킨다.
예컨대, 반응 혼합물을 대략적으로 중화시키고, 존재하면 불용성 물질을 여과로 제거한 다음, 에틸 아세테이트와 같은 수 - 불혼화성 유기 용매를 반응 혼합물에 첨가한다. 얻어진 혼합물을 물로 세척한 후, 원하는 화합물을 함유하는 유기층을 분리하고 무수 황산 마그네슘상에서 건조시킨 다음, 용매의 증발로 원하는 화합물을 얻는다.
이로써 얻어진 원하는 화합물은 필요시에 재결정, 재침전, 크로마토그래피 등과 같은 통상적인 과정에 의하여 추가로 정제시킬 수 있다.
(5 단계)
이 단계는 화합물 (19) 를 산 결합제의 존재하에서 불활성 용매하에 화합물 (21) 과 반응시켜 화합물 (12) 를 제조하기 위한 것이다.
사용가능한 용매는 반응에 영향을 주지 않으며 특정하지 않으며, 이의 예로는 벤젠, 톨루엔, 크실렌과 같은 방향족 탄화수소 ; 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 사염화 탄소, 디클로로에탄, 클로로벤젠 및 디클로로벤젠과 같은 할로겐화 탄화수소 ; 에틸 포르메이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 부틸 아세테이트 및 디에틸 카르보네이트와 같은 에스테르 ; 아세톤, 메틸 에틸케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 이소포론 및 시클로헥사논과 같은 케톤 ; 니트로에탄 및 니트로벤젠과 같은 니트로 화합물 ; 아세토니트릴 및 이소부틸 니트릴과 같은 니트릴 ; 포름아미드, 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 및 헥사메틸포스포로트리아미드와 같은 아미드 ; 디메틸 술폭시드 및 술포란과 같은 술폭시드가 있으며 특히 메틸렌 클로라이드인 할로겐화 탄화수소가 바람직하다.
사용 가능한 산 결합제의 예로는 유기 염기, 예컨대 트리에틸아민, 트리부틸아민, 디이소프로필에틸아민, N - 메틸모르폴린, 피리딘, 4 - (N, N - 디메틸아미노) 피리딘, N, N - 디메틸아닐린, N, N - 디에틸아닐린, 1, 5 - 디아자비시클로 [4. 3. 0] 논 - 5 - 엔, 1, 4 - 디아자비시클로 [2. 2. 2] 옥탄 (DABCO) 및 1, 8 - 디아자비시클로 [5. 4. 0] 운데크 - 7 - 엔 (DBU) 가 있으며, 특히 바람직한 유기염기는 피리딘 및 N - 메틸모르폴린이다.
반응 온도 및 반응시간은 사용되는 산 결합제의 종류에 의존하여 변하지만, 보통 10 ∼ 40℃ 에서 1 ∼ 5시간 동안 반응을 수행한다.
반응 완결후, 원하는 화합물을 통상적인 과정에 의하여 반응 혼합물로부터 분리시킨다.
예컨대, 반응 혼합물을 대략적으로 중화시키고, 존재하면 불용성 물질을 여과로 제거한 다음, 에틸 아세테이트와 같은 수 - 불혼화성 유기 용매를 반응 혼합물에 첨가한다. 얻어진 혼합물을 물로 세척한후, 원하는 화합물을 함유하는 유기층을 분리하고 무수 황산 마그네슘상에서 건조시킨 다음, 용매의 증발로 원하는 화합물을 얻는다.
이로써 얻어진 원하는 화합물은 필요시에 재결정, 재침전, 크로마토그래피 등과 같은 통상적인 과정에 의하여 추가로 정제시킬 수 있다.
(6 단계)
이 단계는 5 단계에서 얻어진 활성화된 카르복실기를 갖는 화합물 (12) 를 알킬렌기를 통하여 아미노기, 히드록실기, 술프히드릴기 등이 결합되는 조절 세공유리 (CPG) 와 같은 중합체성 물질 (13) 과 불활성 용매하에 반응시켜 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위한 담체로서 사용가능한 중합체 유도체 (14)의 제조를 위한 것이다.
이 단계에서 사용 가능한 중합체 유도체 (13) 은 보통 담체로서 사용할 수만 있으면 특정하지 않으며, 담체의 입자크기, 3 차원 망상 구조의 표면적, 친수성기부위의 비율, 화학조성, 내압성 등이 조사되어야만 한다.
사용 가능한 담체의 예로는 셀룰로스, 덱스트린 및 아가로스와 같은 폴리사카리드 유도체 ; 폴리아크릴아미드 겔, 폴리스티렌 수지 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 합성 중합체 ; 및 실리카겔, 세공 유리 및 금속 산화물과 같은 무기물이 있고, 시중에서 구입가능한 대표적인 비한정 예로는 아미노프로필 - CPG 및 장쇄 아미노알킬 - CPG (CPG Inc. 제조) ; 코스모실 NH2및 코스모실 디올 (Nakarai Tesuku 제조) ; CPC - 실리카 캐리어 실란 피복물, 아미노프로필 - CPG - 550A, 아미노프로필 - CPG - 1400A 및 폴리에틸렌 글리콜 5000 모노메틸 에테르 (Furuka Co. 제조), p - 알콕시벤질 알콜 수지, 아미노메틸 수지 및 히드록시메틸 수지 (Kokusan Kagaku K. K. 제조) ; 및 폴리에틸렌 글리콜 14000 모노메틸 에테르 (Union Carbidi 제조) 가 있다.
또한, 담체와 결합되는 작용성기의 바람직한 예로는 아미노기, 술프히드릴기 및 히드록실기이다.
사용가능한 용매는 반응에 영향을 주지 않고 출발물질을 어느 정도 용해시킬 수만 있으면 특정하지 않으며, 이의 예로는 벤젠, 톨루엔, 크실렌과 같은 방향족 탄화수소 ; 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 클로로벤젠 및 디클로로벤젠과 같은 할로겐화탄화수소 ; 에틸 포르메이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 부틸 아세테이트 및 디에틸 카르보네이트와 같은 에스테르 ; 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 이소포론 및 시클로헥사논과 같은케톤 ; 니트로에탄 및 니트로벤젠과 같은 니트로 화합물 ; 아세토니트릴 및 이소부틸 니트릴과 같은 니트릴 ; 포름아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 및 헥사메틸포스포로트리아미드와 같은 아미드 ; 디메틸 술폭시드 및 술포란과 같은 술폭시드가 있으며 특히 메틸렌 클로라이드인 할로겐화 탄화수소 및 특히 디메틸포름아미드인 아미드가 바람직하다.
반응 온도는 보통 -20 ∼ 150℃, 바람직하게는 0 ∼ 50℃ 범위이다.
반응 시간은 사용되는 출발물질, 용매, 반응 온도 등에 의존하여 변하지만, 보통 1 ∼ 200 시간, 바람직하게는 24 ∼ 100 시간동안 반응을 수행한다.
반응 완결후, 원하는 화합물을 통상적인 과정에 의하여 반응 혼합물로부터 분리시킨다.
예컨대, 원하는 중합체성 담체를 반응 혼합물로부터 여과하여 회수하고, 메틸렌 클로라이드와같은 유기용매로 세척한 다음 감압하에 건조시켜 원하는 화합물을 얻는다.
(7 단계)
이 단계는 화합물 (14) 를 불활성 용매하에 탈보호제와 반응시켜 히드록실기의 보호기를 선택적으로 제거하여 화합물 (22) 를 제조하기 위한 것이다.
부언하면, 7 단계 ∼ 11 단계는 보통 DNA 합성기에서 보통 수행된다.
바람직하게 사용가능한 용매의 예로는 벤젠, 톨루엔, 크실렌과같은 방향족 탄화수소 ; 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 클로로벤젠 및 디클로로벤젠과 같은 할로겐화 탄화수소 ; 에틸 포르메이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 부틸 아세테이트 및 디에틸 카르보네이트와 같은 에스테르 ; 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산, 디메톡시에탄 및 디에틸렌 글리콜 디메틸 에테르와 같은 에테르 ; 메탄올, 에탄올, n - 프로판올, 이소프로판올, n - 부탄올, 이소부탄올, t - 부탄올, 이소아밀 알콜, 디에틸렌 글리콜, 글리세롤, 옥탄올, 시클로헥산올 및 메틸셀로솔브와 같은 알콜 ; 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 이소포론 및 시클로헥사논과 같은 케톤 ; 니트로에탄 및 니트로벤젠과 같은 니트로화합물 ; 아세토니트릴 및 이소부틸 니트릴과 같은 니트릴 ; 포름아미드, 디메틸 포름아미드, 디메틸아세트아미드 및 헥사메틸 포스포로트리아미드와 같은 아미드 ; 디메틸 술폭시드 및 술포란과 같은 술폭시드가 있으며, 더욱 바람직한 것은 특히 메탄올과 에탄올인 알콜 및 메틸렌 클로라이드가 있으며, 아세트산이탈보호제로 사용될 경우, 아세트산과 물의 혼합물이 사용될 수 있다.
사용가능한 탈보호제는 통상적으로 사용되는 것이기만 하면 특정하지 않으며, 만일 보호기가 트리아릴메틸기인 경우에 아세트산, 디클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 염산 및 브롬화 아연과 같은 루이스산이 예시될 수 있으며, 바람직하게는 아세트산, 디클로로아세트산 및 트리플루오로아세트산이 사용될 수 있다.
반응 온도는 사용되는 시약, 출발물질 및 용매에 좌우되어 변하지만, 이는 보통 -10 ∼ 100℃, 바람직하게는 0 ∼ 50℃ 범위이다.
반응 시간은 사용되는 출발 물질, 용매 및 반응 온도에 좌우되어 변하지만, 이는 보통 1 분 ∼ 50 시간, 바람직하게는 1 분 ∼ 24 시간 범위이다.
반응 완결후, 원하는 화합물을 통상적인 과정에 의하여 반응 혼합물로 부터 분리한다.
예를 들면, 중합체성 담체를 반응 혼합물로부터 여과에 의하여 회수하고 메틸렌 클로라이드와같은 유기 용매로 세척한 다음 감압하에 건조시켜 원하는 화합물을 얻는다.
(8 단계)
이 단계는 5' - 히드록시기에 디메톡시트리틸기를 갖고, 염기부는 바람직한 염기서열의 3' - 말단의 염기부이고, 3' - 히드록시기는 거기에 결합된 인을 통해 바람직한 알킬옥시, 페닐옥시, 아르알킬옥시, 알킬, 아르알킬 또는 페닐기를 갖는 화합물 (23), (23') 또는 (23") 를 중합성 물질 (22) 와 반응시켜 화합물 (24) 를 제조하고, 필요하다면 티오화 또는 알킬아민화시켜 CPG 와 같은 중합성 물질과 결합된 바람직한 3' - 말단 뉴클레오티드 단위를 갖는 상기 화합물 (24) 를 수득하기 위한 것이다.
사용 가능한 화합물 (23), (23') 및 (23") 는 각각 하기에 상술한다.
(a) 이 단계에서 화합물 (28) 이 반응하는 경우, 산성 물질이 사용된다.
사용 가능한 산성 물질은 테트라졸 등과 같은 것, 바람직하기로는 테트라졸을 포함한다. 이 단계의 산화 반응에 사용 가능한 산화제는 산화 반응에 통상적으로 사용되는 것인한 특별히 제한되지 않으나, 바람직하기로는 과망간산칼륨 및 이산화망간과 같은 산화망간 ; 사산화류테늄과 같은 산화 루테늄 ; 이산화 셀레늄과 같은 셀레늄 화합물 ; 염화 제이철과 같은 철 화합물 ; 사산화 오스뮴과 같은 오스뮴 화합물 ; 산화은과 같은 은 화합물 ; 아세트산 수은과 같은 수은 화합물 ; 산화 납 및 사산화 납과 같은 산화납 화합물 ; 크롬산 칼륨, 크롬산 - 황산 착물 및 크롬산 - 피리딘 착물과 같은 크롬산 화합물 ; 및 질산암모늄 세륨 (CAW) 과 같은 세륨 화합물과 같은 무기 금속 산화제 ; 염소분자, 브롬분자 및 요오드 분자와 같은 할로겐 분자 ; 과요오드산 나트륨과 같은 과요오드산 ; 오존 ; 과산화수소 수용액 ; 아질산과 같은 아질산 화합물 ; 아염소산 칼륨 및 아염소산 나트륨과 같은 아염소산 화합물 ; 및 과황산 칼륨 및 과황산 나트륨과 같은 과황산 화합물과 같은 무기 산화제 ; 및 DMSO 산화 반응에 사용가능한 시약 (디메틸술폭시드 및 디시클로헥실카르보디이미드, 옥살릴클로라이드, 아세트산 무수물 또는 오산화인의 착물 또는 피리딘 - 황산 무수물의 착물) ; t - 부틸 히드로퍼옥시드와 같은 퍼옥시드 ; 트리페닐메틸 양이온과 같은 안정한 양이온 ; N - 브로모숙신이미드와 같은 숙신이미드 ; t - 부틸 차아염소산과 같은 차아염소산 화합물 ; 아조디카르복실산 에스테르와 같은 아조디카르복실산 화합물 ; 디메틸디술피드, 디페닐 디술피드 및 디피리딜 디술피드와 같은 디술피드 및 트리페닐포스핀 ; 아질산 메틸과 같은 아질산 에스테르 ; 메탄 테트라브로마이드와 같은 카르본 테트라할라이드 및 2, 3 - 디클로로 - 5, 6 - 디시아노 - p - 벤조퀴논 (DDQ) 과 같은 퀴논화합물과 같은 유기산화제, 바람직하게는 요오드분자를 포함한다. 사용 가능한 용매는 반응에 영향을 주지 않고 출발 물질을 어느 정도까지 용해시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 벤젠, 톨루엔 및 크실렌과 같은 방향족 탄화수소 ; 염화메틸렌 및 클로로포름과 같은 할로겐화된 탄화수소 ; 에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산 및 디메톡시에탄과 같은 에테르 ; 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아피드 및 헥사메틸포스포로트리아미드와 같은 아미드 ; 디메틸술폭시드와 같은 술폭시드 ; 아세톤, 메틸 에틸 케톤과 같은 케톤 ; 피리딘과 같은 헤테로시클릭아민 ; 및 아세토니트릴과 같은 니트릴, 바람직하게는 헤테로시클릭아민 (특히, 피리딘), 니트릴 (특히, 아세토니트릴), 에테르 (특히, 테트라히드로푸란) 및 할로겐화된 탄화수소 (특히, 염화메틸렌)을 포함한다.
반응은 -50 ∼ 100℃ 에서 수행하고, 반응 시간은 반응 온도, 출발 화합물의 유형 및 사용된 용매에 주로 의존하나, 통상 5 분 ∼ 15 시간이다.
(b) 화합물 (23') 가 반응하는 경우 사용되는 용매는 반응에 영향을 주지 않는 한 특별한 제한되지 않고, 피리딘과 같은 방향족 아민이 바람직하게 사용된다.
화합물 (23') 가 반응하는 경우, 축합제가 통상 사용된다.
사용가능한 축합제는 디클로로카르보디이미드 (DCC), 메시틸렌술폰산클로라이드 (Ms-Cl), 트리이소프로필벤젠술폰산 클로라이드, 메시틸렌술폰산 트리아졸라이드 (MST), 메시틸렌술폰산 - 3 - 니트로트리아졸라이드 (MSNT), 트리이소프로필벤젠술폰산 테트라졸라이드 (TPS-Te), 트리이소프로필벤젠술폰산 니트로이미다졸라이드 (TPS-NT) 및 트리이소프로필벤젠술폰산 피리딜테트라졸라이드, 바람직하게는 MSNT, TPS-Te 및 TPS-NI 를 포함한다. 반응온도는 -10 ∼ 100℃ 의 범위내에서 특별히 제한되지 않으나, 통상 실온에서 반응을 수행한다. 반응시간은 사용되는 용매 및 반응 온도에 따라 다양하나, 반응 용매로서 피리딘을 사용하여 실온에서 반응을 수행하는 경우는 30 분이다.
(c) 화합물 (23") 이 반응되는 경우, 사용 가능한 용매는 반응에 영향을 미치지 않는 한 특별히 제한되지 않으나, 무수 아세토니트릴이 바람직하게 사용된다. 축합제로서 사용되는 반응제로서, 카르복실산 및 인산의 산 염화물을 사용하고, 바람직하게는 피발로일 클로라이드를 사용한다. H - 포스포네이트 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포스포디에스테르형 올리고뉴클레오티드로 산화시키기 위한 산화제는 산화반응에 통상 사용되는 것인 한 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 과망간산 칼륨 및 이산화망간과 같은 산화 망간 ; 사산화류테늄과 같은 산화 루테늄 ; 이산화 셀레늄과 같은 셀레늄 화합물 ; 염화 제이철과 같은 철 화합물 ; 사산화 오스뮴과 같은 오스뮴 화합물 ; 산화은과 같은 은 화합물 ; 아세트산 수은과 같은 수은 화합물 ; 산화 납 및 사산화 납과 같은 산화납 화합물 ; 크롬산 칼륨, 크롬산 - 황산 착물 및 크롬산 - 피리딘 착물과 같은 크롬산 화합물 ; 및 질산암모늄 세륨 (CAW) 과 같은 세륨 화합물과 같은 무기 금속 산화제 ; 염소분자, 브롬분자 및 요오드 분자와 같은 할로겐 분자 ; 과요오드산 나트륨과 같은 과요오드산 ; 오존 ; 과산화수소 수용액 ; 아질산과 같은 아질산 화합물 ; 아염소산 칼륨 및 아염소산 나트륨과 같은 아염소산 화합물 ; 및 과황산 칼륨 및 과황산 나트륨과 같은 과황산 화합물과 같은 무기 산화제 ; 및 DMSO 산화 반응에 사용가능한 시약 (디메틸술폭시드 및 디시클로헥실카르보디이미드, 옥살릴클로라이드, 아세트산 무수물 또는 오산화인의 착물 또는 피리딘 - 황산 무수물의 착물) ; t - 부틸 히드로퍼옥시드와 같은 퍼옥시드 ; 트리페닐메틸 양이온과 같은 안정한 양이온 ; N - 브로모숙신이미드와 같은 숙신이미드 ; t - 부틸 차아염소산과 같은 차아염소산 화합물 ; 아조디카르복실산 메틸과 같은 아조디카르복실산 화합물 ; 디메틸디술피드, 디페닐 디술피드 및 디피리딜디술피드와 같은 디술피드 및 트리페닐포스핀 ; 아질산 메틸과 같은 아질산 에스테르 ; 메탄 테트라브로마이드와 같은 카르본 테트라할라이드 및 2, 3 - 디클로로 - 5, 6 - 디시아노 - p - 벤조퀴논 (DDQ) 과 같은 퀴논화합물과 같은 유기산화제, 바람직하게는 요오드분자를 포함한다.
사용 가능한 산 결합제는 피리딘 및 디메틸 아미노피리딘과같은 헤테로시클릭아민 및 트리메틸아민, 트리에틸아민 및 디이소프로필 에틸아민과 같은 지방족아민, 바람직하게는 헤테로시클릭 아민 (특히, 피리딘) 을 포함한다. 반응 온도는 특별히 제한되지 않으나, 통상 -50 ∼ 50℃, 바람직하게는 실온이다.
반응 시간은 사용되는 출발 물질, 반응시약, 온도 등에 따라 다르나, 실온에서 반응이 수행되는 경우 통상 5분 ∼ 30 시간, 바람직하게는 30 분이다.
필요하다면, 이 단계에서 수행되는 티오화 반응은 하기와 같이 수행한다 ; 화합물 (23) 을 화합물 (22) 에 결합시킨 다음, 요오드 분자 등과의 산화 반응 대신에 티오화를 수행하기 위해 티오화 반응 시약을 반응시켜 CPG 와 같은 티오에이트 결합을 갖는 중합성 담체인 화합물 (24) 를 수득한다.
티오화 반응용 시약은 삼가 아인산 이온과의 반응으로 티오에이트를 형성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 바람직하게는 황과 또한 어플라이드 바이오시스템으로 부터 구입 가능한 테트라에틸 티우룸 디술피드 (TETD) 및 밀리겐 / 바이오서치로 부터 구입 가능한 Beaucage 시약을 포함한다. 전자를 사용하는 경우에, 공지 문헌 [Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991)] 에 기재된 방법 또는 그 유사 방법을, 후자의 경우에는 공지 문헌[J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)] 에 기재된방법 또는 그 유사 방법을 비제한적으로 사용할 수 있다.
필요하다면 이 단계에서 수행되는 알킬아민화 반응은 하기와 같이 수행될 수 있다 :
화합물 (23") 를 전술한 화합물 (22) 에 결합시킨 다음, 요오드 분자와 같은 산화제 대신에 실온에서 바람직한 알킬아민을 함께 반응시킨다. 이 방법에 따라, 바람직한 염기 서열을 갖는 3' - 말단 뉴클레오티드가 포스포르아미데이트 결합을 통해 CPG와 같은 중합성 물질과 결합된 화합물 (24) 을 수득할 수 있다.
(9 단계)
이 단계는 1) 단계 8 에서 수득된 중합성 물질 (24)를 산과 반응시켜 DMT 기를 제거하고, 2) 상기 처리된 중합성 물질을 아미다이트 시약 및 산 촉매와 반응시키고, 3) 산화제를 사용하여 생성물질에 대해 산화 반응을 수행하고, 4) 미반응 부분은 아세트산 무수물을 사용하여 캐핑 반응시켜 수행한다. 이 단계에서, 상기 절차 1) ∼ 4) 를 반복하여 바람직한 염기 서열을 갖는 5' - 말단 뉴클레오티드만이 결합되어 있지 않는 화합물 (25) 를 수득한다. 이 단계에서 사용되는 DNA 합성기 상에서의 DNA 사슬 확장 반응은 Applied Biosystems Model 380B 를 사용하는 포스포르아미다이트법을 이용하는 Stec 의 방법 (J. Am. Chem. Soc., 106, 6077 ∼ 6089, (1984)) 또는 Milli Gen/Biosearch의 Cyclone Plus DNA 합성기를 사용하는 포스포로아미다이트법 (H. Koester et, al. 의 방법, Nucleic Acids Res., 12, 4539 (1984)) 의 변형으로 수행되나, 이 방법에 제한되지는 않는다.
(10 단계)
이 단계는 7 단계의 방법에 따라 9 단계에서 수득한 중합성 물질 (25) 의 5' - 말단 DMT 기를 제거한 다음, 화합물 (23), (23') 및 (23") 대신에 하기한 바와 같은 화합물 (26), (26') 및 (26") 를 사용하여 8 단계에서와 동일한 처리를 하여, 바람직한 염기서열 및 치환체를 갖고, 또한 보호기를 보유하는 중합성물질 (27) 을 제조하기 위한 것이다.
화합물 (26), (26') 및 (26") 각각은 목적 염기 서열의 5' - 말단 뉴클레오티드가 보호된 염기 부분을 갖는 2' - 데옥시리보뉴클레오시드 또는 5' - 위치에 바람직한 변형기를 갖고, 2' - 위치에 보호된 히드록실기를 갖는 리보뉴클레오시드이다. 또한, 화합물 (26) 은 3' - 위치에 통상의 DNA 합성에 사용되는 인산염 부분의 보호기를 포함하는 포스포로아미다이트 결합을 갖는다. 마찬가지로, 화합물 (26') 은 포스포디에스테르 결합을, 화합물 (26") 은 H - 포스포네이트 결합을 갖는다.
(11 단계)
이 단계는 10 단계에서 수득되고, 5' - 및 3' - 말단에 목적 염기 서열 및 치환체를 갖는 보호된 중합성 물질에 대해 수행되는, 중합성 물질 (27) 로부터의 올리고뉴클레오티드 부분의 분해 반응 및 5' - 말단 및/또는 3' - 말단의 바람직한 치환체 이외의 보호기의 제거반응에 의해 목적하는 올리고뉴클레오티드 (11) 을 제조하기 위한 것이다. 보호기의 제거 반응은 공지 방법 [J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 (1981)] 에 의해 수행될 수 있다.
일반식 (11) 의 화합물을 함유하는 상기 수득된 반응 혼합물을 핵산 정제를위해 사용 가능한 통상의 정제 처리, 예를들어 역상 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 (고성능 액체 크로마토그래피포함) 등과 같은 다양한 크로마토그래피로 정제하여 일반식 (11) 의 화합물을 수득한다.
(12 단계)
이 단계는 염기성 촉매의 존재하 불활성 용매내에서 화합물 (29) 의 유리 히드록실기 또는 화합물 (30) 의 유리 술프히드릴기를 화합물 (28) 과 같은 디카르복실산 무수물과 반응시켜 본원 발명의 출발 물질인 디카르복실산의 하프(half) 에스테르 즉, 화합물 (15) 를 제조하기 위한 것이다.
사용 가능한 디카르복실산 무수물은 특별히 제한되지 않고, 바람직히게는 탄소수 1 ∼ 16 의 디카르복실산 무수물, 보다 바람직하게는 숙신산 무수물 또는 글루타르산 무수물을 포함한다. 사용 가능한 염기성 촉매는 바람직하게는 디메틸아미노피리딘 및 피롤리디노피리딘과 같은 아미노피리딘, 트리메틸아민 및 트리에틸아민과 각은 삼차 아민 및 탄산수소 나트륨 및 탄산 칼륨과 같은 알칼리 금속의 탄산염, 보다 바람직하게는 디메틸아미노피리딘 및 피롤리디노피리딘을 포함한다.
사용 가능한 용매는 반응에 영향을 주지 않고 출발 물질을 어느 정도까지 용해시킬 수 있는한 특별히 제한되지 않고, 바람직하게는 벤젠, 톨루엔 및 크실렌과 같은 방향족 탄화수소 ; 염화메틸렌 및 클로로포름과 같은 할로겐화된 탄화수소 ; 에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산 및 디메톡시에탄과 같은 에테르 ; 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 및 헥사메틸포스포로트리아미드와 같은 아미드 ; 디메틸술폭시드와 같은 술폭시드 ; 메탄올, 에탄올, n - 프로판올, 이소프로판올, n - 부탄올, 이소부탄올 및 이소아밀알콜과 같은 알콜 황산 수용액과 같은 희석산 ; 수산화나트륨 수용액과 같은 희석 염기 ; 물 ; 아세톤, 메틸 에틸 케톤과 같은 케톤 ; 피리딘과 같은 헤테로시클릭아민 ; 및 아세토니트릴과 같은 니트릴, 바람직하게는 니트릴 (특히, 아세토니트릴), 에테르 (특히, 테트라히드로푸란) 및 할로겐화된 탄화수소 (특히, 염화 메틸렌) 을 포함한다.
반응은 -50 ∼ 100℃ 에서 수행하고, 반응시간은 반응 온도, 출발물질의 종류 및 사용된 용매에 따라 다르나, 통상 30 분 ∼ 15 시간이다. 반응 종결후, 통상적인 방법으로 목적 화합물을 반응 혼합물로부터 수거한다.
예를 들어, 반응 혼합물을 적절하게 중화시킨 다음, 존재하는 경우 불용성 물질을 여과로 제거하고, 에틸 아세테이트와 같은 수불혼화성 유기 용매를 반응 혼합물에 가한다. 반응 혼합물을 물로 세척한 다음, 목적 화합물을 함유하는 유기층을 분리하고, 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨 다음, 용매를 증발시켜 목적 화합물을 수득한다.
상기 수득한 목적 화합물을 필요하다면 재결정, 재침전, 크로마토그래피와 같은 통상적인 방법으로 더 정제할 수도 있다.
(13 단계)
이 단계는 에스테르 형성 시약의 존재하 불활성 용매내에서 화합물 (19)을 디카르복실산 (31) 과 반응시켜 화합물 (18) 을 제조하기 위한 것이다.
사용 가능한 용매는 반응에 영향을 주지 않는 한 특별히 제한되지 않고, 벤젠, 톨루엔 및 크실렌과 같은 방향족 탄화수소 ; 염화 메틸렌, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 클로로벤젠 및 디클로로벤젠과 같은 할로겐화된 탄화수소 ; 에틸 포르메이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 부틸 아세테이트 및 디에틸 카르보네이트와 같은 에스테르 ; 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 이소포론 및 시클로헥사논과 같은 케톤 ; 니트로에탄 및 니트로벤젠과 같은 니트로 화합물 ; 아세토니트릴 및 이소부티로니트릴과 같은 니트릴 ; 포름아미드, 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 및 헥사메틸포스포로트리아미드와 같은 아미드 ; 및 디메틸술폭시드 및 술포란과 같은 술폭시드, 바람직하게는 할로겐화된 탄화수소 (특히, 염화 메틸렌)및 아미드(특히, 디메틸포름아미드) 를 포함한다.
사용 가능한 에스테르 형성 시약은 예를 들어 N - 히드록시숙신이미드, 1 - 히드록시벤조트리아졸 및 N - 히드록시 - 5 - 노르보르넨 - 2, 3 - 디카르복시이미드와 같은 N - 히드록시 화합물 ; 1, 1' - 옥살릴디이미다졸 및 N, N' - 카르보닐디이미다졸과 같은 디이미다졸 화합물 ; 2, 2' - 디피리딜디술피드와 같은 디술피드 화합물 ; N, N' - 디숙신이미딜 카르보네이트와 같은 숙신산 화합물 ; N, N' - 비스 (2 - 옥소 - 3 - 옥사졸리디닐) 포즈피닉 클로라이드와 같은 포스피닉 클로라이드 화합물 ; N, N' - 디숙신이미딜옥살레이트 (DSO), N, N - 디프탈이미딜옥살레이트 (DPO), N, N' - 비스 (노르보르네닐숙신이미딜) 옥살레이트 (BNO), 1, 1' - 비스 (벤조트리아졸릴) 옥살레이트 (BBTO), 1, 1' - 비스 (6 - 클로로벤조트리아졸릴) 옥살레이트 (BCTO) 및 1, 1' - 비스 (6 - 트리플루오로메틸벤조트리아졸릴) 옥살레이트 (BTBO) 와 같은 옥살레이트 화합물 ; 및 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) 와 같은 카르보디이미드, 바람직하게는 디이미다졸 화합물 및 카르보디이미드 (특히, DCC) 를 포함한다.
반응 온도 및 반응 시간은 사용되는 에스테르 형성 시약 및 용매의 종류에 따라 다르나, 0 ∼ 100℃ 에서 5 ∼ 50 시간 동안 반응이 수행된다.
반응 종결후, 통상적인 방법에 의해 반응 혼합물로 부터 목적 화합물을 분리한다.
예를 들어, 반응 혼합물을 적절히 중화시키고, 존재한다면, 불용성 물질을 여과로 제거한 후, 에틸 아세테이트와 같은 수불혼화성 유기 용매를 반응 혼합물에 가한다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 목적 화합물을 함유하는 유기층을 분리하고, 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨 다음, 용매를 증발시켜 목적 화합물을 수득한다.
상기 수득한 목적 화합물을 필요하다면 재결정, 재침전, 크로마토그래피와 같은 통상적인 방법으로 더 정제할 수도 있다.
본 발명의 새로운 방법에 따라, 포스페이트를 통해 올리고뉴클레오티드의 3' - 말단에 원하는 치환체를 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 DNA 합성기상에서 쉽게 합성할 수 있어, 적은 비용의 간단한 정제 방법을 사용하여 다량의 고순도 변형 올리고뉴클레오티드를 제공할 수 있다, 3' - 말단에 치환체를 갖는 유용한 올리고뉴클레오티드는 항 AIDS 활성을 갖고 일본국 특허 출원 평성 제 301744 호에 기재되어 있다.
본 발명의 화합물은 AIDS 비루스 (HIV-1) 에 대한 특정 세포병리학적 활성을 보이고, 특별히 감염 세포내의 비루스의 증식을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 AIDS 의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.
본 발명을 하기 실시예들의 상술로써 구체적으로 설명한다.
시험예 1 ; 변형된 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 항 HIV-1 활성측정
Pauel 등 (R. Pauel et al., J. virological Methods 20,309 ∼ 321 (1988))의 방법으로 항 HIV-1 활성을 측정한다. 요약하면, 대수 성장기의 MT-4 세포를 5 분간 150 × g 로 원심분리한다. 수득한 세포펠렛을 배지에 현탁하고 10 CCID50의 농도, 37℃ 에서 1 시간동안 HIV-1 (ⅢB 형)로 감염시킨다. HIV-1 감염 MT-4 세포를 10 % 소태아 혈청을 함유하는 RPMT - 1640 배지 (이하, "혈청 배지" 라 칭함) 내에서 원심분리하여 수득한다.
HIV-1 감염 MT-4 세포 및 비- HIV - 1 감염 MT-4 세포를 혈청 배지에 현탁하여 각각 4 × 105cells/ml 의 농도가 되게한다. 미리 제조된 단계적으로 희석된 시료 화합물 (혈청 배지에 용해) 의 용액 100 ㎕ 를 98 웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 넣는다. 이어서, 전술한 세포 현탁액 각 100 ㎕ 를 마이크로타이터 플레이트에 가하고, 세포를 5 % 이산화탄소 기체의 존재하 6 일 동안 배양한다.
대조로서, 시료 화합물을 가하지 않은 HIV - 1 감염 MT-4 세포 및 비 - HIV-1 감염 MT-4 세포를 동일한 방법으로 배양한다.
배양후, MTT (3 - (4, 5 - 디메틸티아졸 - 2 - 일) - 2, 5 - 디페닐테트라졸륨 브로마이드) 법 (L.M. Green et al., J, Immunol, Methods, 70, 257 ∼ 268 (1984)) 을 기초로하여 생존세포수를 측정한다. 이어서, HIV-1 의 세포병리학적 활성을 측정한다. 시료 화합물을 가하지 않은 HIV - 1 감염 MT - 4 세포의 세포 병리학적 활성을 100 % 로 하고, 시료 화합물을 가하지 않은 비 - HIV- 1, (ⅢB 형) 감염 MT - 4 세포의 세포병리학적 활성을 0 % 로 하여, 50 % (IC50) 으로 HIV-1 감염 MT-4 세포의 세포 병리학적 활성을 억제하는 시료의 농도를 계산한다. 비 - HIV - 1 감염 MT-4 세포의 증식을 50 % (CC50)으로 억제하는 농도로서 시료 화합물의 세포독성을 측정한다. 이 측정 결과를 표 2 에 나타낸다.
[표 2]
표 2 에 나열된 모든 변형 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 10 ㎍/ml 이하의 농도의 특히 강력한 항 HIV-1 활성을 갖고 있음을 상기 시험 결과에 의해 명백히 알수 있다.
특별한 언급이 없는한, 하기 화학 구조의 사용되는 염기 서열 (예를 들어 TGGGAGG) 은 5' - 위치 및 3' - 위치 모두에서 히드록시기를 갖지 않는 적절한 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 트리에틸아민염을 나타낸다.
본원 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상술한다. 실시예에서, 모든 메쉬크기는 타일러 표준을 사용하였고, 핵자기 공명 스펙트럼은 내부 표준으로서 트리메틸실란 (" TMS "로 약칭함)을 사용하여 수득하였다. 각 실시예에서 제조된 올리고데옥시리보뉴클레오티드 유도체의 양은 260 nm 의 광학 밀도 [OD(260 nm)] 로 측정하였다.
실시예 1
1(a) 5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N, N - 디이소프로필포스포르아미디트
5' - 0 - 트리틸티미딘 (J. Am. Chem. Soc., 80, 6212 (1958)] 969 mg (2 mmol) 을 피리딘으로 공비 증류하여 세번 건조시킨 다음, 테트라히드로푸란 10 ml 에 용해시켰다. N,N - 디이소프로필 - N - 에틸아민 1.39 ml (8 mmol) 및 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필 클로로 포스포르아미디트 0.822 ml (4 mmol) 을 상기 용액에 가하고, 생성 혼합물을 아르곤 분위기하에서 30 분간 실온에서 교반한다. 교반 종결후, 생성된 침전물을 반응 혼합물로 부터 여거하고, 감압하에 증류하여여액으로 부터 용매를 제거한다.
생성 잔류물을 에틸 아세테이트 100 ml 에 용해시키고, 용액을 빙냉한 10 % w/v 탄산 나트륨 수용액 50 ml 로 두번 세척한다. 이어서, 용액을 황산 나트륨 무수물로 건조시킨 다음, 감압하에 중류하여 용매를 제거한다. 용리액으로서 염화 메틸렌, 에틸 아세테이트 및 트리에틸아민 45 : 45 : 10 부피비의 혼합물을 사용하여 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 40 g 을 통한 컬럼 크로마토그래피로 생성 잔류물을 정제하여 표제 화합물 1.35 g (수율 98 %) 을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 7.62, 7.57 (모두 1H, 2a ; 7.46 ∼ 7.20 (15H,m) ; 6.46 ∼ 6.37 (1H, m) ; 468 (1H, brs) ; 4.19, 4.15 (모두 1H, 2brs) ; 3.90 ∼ 3.30 (6H,m) ; 2.63 ∼ 2.28 (4H,m) ; 1.47 (3H,s) ; 1.23 ∼ 1.00 (12H,m).
1(b) 식 1(b) 의 화합물 ;
밀리겐 / 바이오서치 (일본국 밀리포어사의 부서) 에서 제조한 Cyclone Plus (상표명)을 사용하여 합성 반응을 수행한다. Cyclone Plus 내로 상기식 1(b)의 뉴클레오티드 잔기에 상응하는 화학 반응 물질을 층진하여 상기 올리고뉴클레어티드를 합성한다. 아미디트법에 대한 프로그램 카트리지를 기계에 삽입한다. 15 μmol 스캐일로 합성을 수행한다. 이 경우, 티미딘에 상응하는 2 - 시아노에틸 포스포르아미디트 용액 대신에 5' - 0 - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 (상기 단계 (a) 에 기재된 것과 같이 제조) 의 35 mM 아세토니트릴 용액을 사용한다. 반응 컬럼은 5 μmol 의 G - CPG [즉, 조절 포어 유리 (CPG)와 결합된 구아닌데옥시리보뉴클레오시드(G)] 로 충진된 15.0 μmol 스캐일의 반응을 위한 컬럼이다, 유리 필터상의 뉴클레오티드의 농도는 35 ∼ 44 μmol / g이고, CPG 충진제 50 nm 의 평균 공극 크기를 갖는다. 바람직한 염기 서열 TGGGAG (통상, 본 실시예 및 이후에서 언급된 염기 서열은 CPG 와 결합된 염기를 포함한다) 을 넣고, 말단 T와 결합 형성후 산처리 없이 프로그램을 진행시켜 목적하는 보호된 올리고뉴클레오티드가 조절된 공극 유리 (CPG) 와 결합된 유도체를 수득한다. 이를 진공 건조시키고, 컬럼으로 부터 제거하고 29 % 수성 암모니아 약 10 ml에 침수시킨다. 이어서, 밀봉 용기내에서 약 2 일 동안 실온에서 반응시킨다. 반응 종료후, 여과로써 CPG를 제거하고 물 10 ml 로 두번 세척한후 ; 여액 및 세척액을 합친다. 이어서, 합친 혼합물을 디에틸 에테르 30 ml 로 세번 세척한 다음, 진공 증발로 암모니아 및 디에틸 에테르를 제거한다. 생성된 수용액을 감압하에 증발시켜 약 3 ml 로 농축시키고, 농축 용액을 밀리포어 필터 (0.45 ㎛) 를 사용하여 여과한다. 여액을 3 부분으로 나누고, 각 부분을 미리 0.1M 수성 트리에틸 암모늄 아세테이트 완충액 (TEAA) (pH 7.3) 으로 평형화 시키고, 아세토니트릴 20 부피 % 를 함유하고 254 nm 의 자외선 광으로 모니터는 20.0 × 250 mm 컬럼 Inertsil PREP - ODS (상표명) 을 통한 역상 고성능액체 크로마토그래피로 정제한다. 30분간에 걸쳐 8 ml / 분의 선형 구배로, 20 내지 50 부피 % 농도의 아세토니트릴을 함유하는 0.1 M TEAA 를 사용한 구배 용리법으로 목적 생성물을 용리한다. 17.2 분후 용리 분획을 수거하고, 감압하에 증발시켜 아세토니트릴로부터 용액을 분리한 다음, 생성된 수용액을 동결 건조한다. 상기 수득한 생성물을 물 50 ml 에 용해시키고 다시 동결 건조하여 무정형 고체로서 94.8 OD (260 nm) 의 식 1(b) 의 화합물을 수득한다. UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm 254.
체류시간 ; 23.3 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC - Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리액 A ; 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30 분, 선형구배 ; 1 ml / 분 254 nm).
실시예 2
2(a) 5' - 트리틸아미노 - 5' - 데옥시티미딘
트리틸 클로라이드 557 mg 을 무수 피리딘 20 ml 에 용해된 3' - 0 - 아세틸 - 5' - 아미노 - 5' - 데옥시티미딘 [J.P. Horwitz등, J. Org. Chem., 27, 3045 (1962) 에 기재된 방법으로 제조] 560 mg (2 mmol)의 용액에 가하고, 생성 혼합물을 수분을 제거하면서 1 시간 동안 환류하에 가열한다. 박층 크로마토그래피 (전개 용매로서 5 부피 % 의 메탄올을 함유하는 염화 메틸렌 사용)로써 출발 화합물의 소실이 확인된 후, 감압하에 중류하여 반응 혼합물로 부터 용매를 제거한다. 생성된 잔류물을 메탄올 및 물 각각 10 ml 과 혼합한 다음, 혼합물을 감압하에 증류하여 농축한다. 이 조작을 세번 반복한 다음, 잔류물을 에틸 아세테이트 30 ml 에 용해시키고, 생성 용액을 염화 나트륨 포화 수용액, 0.2N 염산 수용액 및 5 % 탄산 수소 나트륨 수용액 각 20 ml 로 세척한다. 이어서, 유기 용액은 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨 다음, 용액을 감압하에서 증발 건조시킨다. 잔류물을 암모니아 기체로 포화된 메탄올 30 ml 에 용해시키고, 용액이 든 플라스크를 단단히 잠근다. 이어서, 실온에서 밤새 정치시킨다. 그후, 감압하에 증류하여 반응 혼합물을 용매로 부터 분리해내고, 잔류물을 염화 메틸렌 10 ml 에 용해시킨다. 용리액으로서 메탄올 5 부피 % 를 함유하는 염화 메틸렌을 사용하여 실리카겔을 통한 컬럼 크로마토그래피로 용액을 정제한다. 목적 화합물을 함유하는 분획들을 합치고, 감압하에 증발 건조시킨다. 벤젠으로 잔류물을 동결 건조하여 백색 분말로서 표제 화합물 338 mg 을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.38 (1H, brs) ; 7.48 ∼ 7.18 (15H, m) ; 7.04 (1H,m) ; 6.67 (1H, t, J=6,60Hz) ; 4.35 ∼ 4.29 (1H,m) ; 4.01 ∼ 3.95(1H,m) ; 2.62 ∼ 2,06 (5H,m) ; 1.84 (3H,s).
2(b) 5' - 트리틸아미노 - 5' - 데옥시티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
5' - 트리틸아미노 - 5' - 데옥시티미딘 [상기 단계 (a) 에 기재된 것과 같이 제조] 0.15 g (0.31 mmol) 을 피리딘으로 공비 증류하여 건조시킨 다음, 염화메틸렌 2 ml 에 용해시킨다. 이어서, N,N - 디이소프로필 - N - 에틸아민 0.23 ml (1.2 mmol) 을 생성 용액에 가한 다음, 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필클로로포스포르아미디트 0.08 ml (0.36 mmol) 을 질소 기류하에 2 분간 가하였다. 생성 혼합물을 60 분간 실온에서 교반한다. 교반 종결후, 박층 크로마토그래피로 출발 화합물이 사라진 것을 확인하고, 반응 혼합물을 에틸아세테이트 30 ml 로 희석한다. 생성된 유기 용액을 탄산 수소 나트륨 포화수용액에 이어 염화 나트륨 포화 수용액으로 세척한다. 유기충을 IPS (상표명) 여과지 (와트만) 를 통해 여과하고, 감압하에 증류시켜 여액을 용매로 부터 분리한다. 생성 잔류물을 용리액으로서 에틸아세테이트를 사용하여 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 15 g 을 통한 컬럼 크로마토그래피로 정제한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 7.50 ∼ 7.19 (15H, m) ; 7.15, 7.06 (모두 1H, 2s) ; 6.30 ∼ 6.26 (1H,m) ; 4.55 ∼ 4.35(1H,m) ; 4.12 ∼ 4.07 (1H,m) ; 3.84 ∼ 3.53 (4H,m) ; 2.64 ∼ 2.09 (6H,m) ; 1.86, 1.84 (모두 3H, 2s) ; 1.19 ∼ 1.10(12H, m).
2(c) 식 2(c) 의 화합물 :
5' - 0 - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - 트리틸아미노 - 5' - 데옥시티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [제조예 2(b) 에 기재된 것과 같이 제조] 를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 (preparative C18, Waters, 1.5 × 15 cm ; 50 mM 수성 트리메틸암모늄 히드로겐 카르보네이트 완충액 (TEAB), pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 을 통한 크로마토그래피로 정제한다. 용리액에 대해 실시예 1(b)에 기재된 것과 유사한 방법으로 작용시켜 무정형 고체로서 168 OD (260 nm) 의 표제 화합물을 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 × 150 mm ; 용리액 A ; 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; B 10 → 60 부피 % B, 20분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 에 의한 분석 결과는 시료의 체류 시간이 19.20 분이었다. UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254
실시예 3
3(a) 5' - O - 벤즈히드릴티미딘
수소화 나트륨 (광물유 중의 55 % w/w 분산액) 350 mg (8 mmol) 을 아르곤 대기하에서 테트라히드로푸란 8 ml 에 용해된 3' - O - [(1,1 -디메틸에틸) 디메틸실릴] 티미딘 [Can, J. Chem., 56, 2768 (1978)] 1.426 g (4 mmol) 의 용액에 가하고, 생성 혼합물을 2시간 동안 60℃ 에서 교반한 다음, 실온으로 냉각시킨다. 테트라히드로푸란 2 ml 에 용해된 벤질 브로마이드 988 mg (4 mmol) 용액을 혼합물에 적가한 후, 요오드화 나트륨 300 mg (2 mmol) 을 적가한다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 17 시간 동안 교반한후, 감압하에 증류하여 용매로 부터 분리한다. 농축물을 에틸 아세테이트 50 ml 에 용해시키고, 생성용액을 염화 나트륨 포화 수용액 50 ml 로 두번 세척한다, 이어서, 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고, 감압하에 용매를 유거한다. 잔류물을 테트라히드로푸란 4 ml 에 용해시키고, 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 1M 테트라히드로 푸란 용액 4 ml 을 상기 용액에 가한다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반한다. 교반후, 감압하에 중류하여 용매를 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트 50 ml 에 용해시킨다. 생성 용액을 염화 나트륨 포화 수용액 50 ml 로 두번 세척한다. 혼합물을 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고, 감압 증류하여 용매를 제거한다. 용리액으로서 1 ∼ 2.5 부피 % 의 메탄올을 함유하는 염화 메틸렌을 사용하여 구배 용리법으로 실리카겔(230 - 400 메쉬) 60 g 을 통한 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 표제 화합물 377.7 mg (수율 23 %) 을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 9.85 (1H, brs) ; 7.56 (1H, s) ; 7.38 ∼ 7.20 (10H, m) ; 6.45 (1H, t, J=6.92Hz) ; 5.40 (1H,s) ; 4.62 ∼ 4.58 (1H,m) ; 4.17 ∼ 4.15(1H,m) ; 3.75 ∼ 3.58 (2H, m) ; 2.47 ∼ 2.22 (2H, m) ; 1.36 (3H,s).
3(b) 5'-O-벤즈히드릴티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
5' - O - 벤즈히드릴티미딘 [상기 단게 (a) 에 기재된 것과 같이 제조] 204, 2 mg (0.5 mmol) 을 피리딘으로 공비 증류하여 세번 건조한 다음, 테트라히드로푸란 2.5 ml 에 용해시킨다. 이 용액에 N,N - 디이소프로필 - N - 에틸아민 0.348 ml (2 mmol) 및 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필클로로포스포르아미디트 0.223 ml (1 mmol) 을 아르곤 분위기하에서 가하고, 생성 혼합물을 30 분간 실온에서 교반한다. 교반후, 여과하여 침전물로 부터 반응 혼합물을 분리해내고, 감압하에 증류하여 여액을 농축한다. 농축물을 에틸 아세테이트 50 ml 에 용해시키고, 생성 용액을 빙냉 10 % w/v 탄산 나트륨 수용액 50 ml 로 두번 세척한 다음, 무수 황산 나트륨으로 건조시킨다. 감압 증류하여 용매를 제거한다. 용리액으로서 45 : 45 : 10 부피비의 염화 메틸렌, 에틸 아세테이트 및 트리에틸아민의 혼합물율 사용하여, 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 30 g 을 통한 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제한다. 표제 화합물을 함유하는 분획을 합치고, 용매를 유기한다. 동일한 크로마토그래피절차를 반복하여 표제 화합물 213.4 mg (수율 70 %) 을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 7.55, 7.51 (모두IH, 2s) ; 7.43 ∼ 7.22 (10H, m) ; 6.48 ∼ 6.42 (1H, m) ; 5.44, 5.42 (모두 1H, 2s) ; 4.73 ∼ 4.64 (1H,m) ; 4.25, 4.19 (모두 1H, 2s) ; 3.90 ∼ 3.55 (6H, m) ; 2.68 ∼ 2.24 (4H,m) ; 1.39 (3H,s) ; 1.30∼1.10 (12H, m).
204.2 mg (0.5 mmol) 의 5' - O - 벤즈히드릴티미딘 [상기 단계 (a) 에서 기술된 바와 같이 제조] 을 피리딘과 함께 공비 증류로 3회 건조하고 그후 2.5 ml 의 테트라히드로푸란에 용해시킨다. 0.348 ml (2 mmol) 의 N,N-디이소프로필 - N - 에틸아민 및 0,223 ml (1 mmol) 의 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필클로로포스포르아미디트를 아르곤 대기하에서 용액에 가하고 수득한 혼합물은 30 분간 실온에서 교반한다. 교반후, 반응 혼합물은 여과에 의해 침전물로부터 제거하고 여액을 감압 증발로 농축한다. 농축물은 50 ml 의 에틸 아세테이트에 용해시키고 수득한 용액은 각기 50 ml 씩 빙냉 10 % w/v 탄산나트륨 수용액으로 2 회 세척하며 무수 황산 나트륨 상에서 건조시킨다. 그후 용매는 감압하에 증류제거한다. 잔류물은 용리액으로서 염화메틸렌, 에틸아세테이트 및 트리에틸아민의 45 : 45 : 10 부피 혼합물을 사용한 30 g 의 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 컬럼 크로마토그래피로 정제한다. 표제 화합물을 함유하는 분획을 혼합하고 용매는 유거한다. 동일한 크로마토그래피 공정을 반복하여 213.4 mg (수율 70 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NHR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TmS), δppm ; 7.55, 7.51 (모두 1H, 2s) ; 7.43 ∼ 7.22 (10H,m) ; 6.48 ∼ 6.42(1H,m) ; 5.44, 5,42 (모두 1H, 2s) ; 4.73 ∼ 4.64 (1H,m) ; 4.25, 4.19 (모두 1H, 2s) ; 3.90 ∼ 3.55 (6H, m) ; 2.68 ∼ 2.24 (4H,m) ; 1.39 (3H,s) ; 1.30 ∼ 1.10 (12H,m).
3(c) 식 3(c) 의 화합물 :
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필 포스포르아미디트 대신에 5' - O - 벤즈히드릴티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기 단계 (b) 에서 기술된 바와 같이 제조] 를 사용한다는 것만 제외하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 세 부분으로 나누고 각 부분을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 × 250 nm ; 용리액 A ; 0.1 M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 15 ∼ 45 부피 % B, 30분, 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 254 nm) 으로 정제한다. 20.2 분후에 용리된 분획을 혼합하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 무정형 고체로서 76 OD(260 nm) 의 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255
체류 시간 ; 17.3 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC - Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리액 A ; 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 10 → 40 부피 % B, 30 분, 선형구배 ; 2 ml / 분 ; 254nm).
실시예 4
식 4(a) 의 화합물;
실시예 1(b)에서 기술된 DNA / RNA 합성기에 염기 서열 TGGGAGG 를 투입한다는 것만 제외하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 표제 화합물을 제조한다. 반응 혼합물은 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Preparative C18, Waters, 1.5 × 15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 로 정제한다. 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 무정형 고체로서 180 OD (260 mm)의 표제 화합물을 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 × 150 mm ; 용리액 A ; 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 10 → 60 부피 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분; 260 nm) 분석은 시료가 18.22 분의 체류 시간을 갖는 것으로 나타났다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255.
실시예 5
5(a) 5' - O - [(1,1 - 디메틸에틸) 디페닐실릴] 티미딘
1.43 ml (5.5 mmol) 의 t - 부틸디페닐실릴 클로라이드를 아르곤 대기하에서 10 ml 의 디메틸포름아미드에 용해된 1.21 g (5 mmol) 의 티미딘 및 0.749 g(11 mmol) 의 이미다졸 용액에 가하고, 수득한 혼합물은 140 분간 실온에서 교반한다. 교반후, 용매를 감압 증류로 제거하고 수득한 잔류물은 100 ml 의 염화 메틸렌에 용해시킨다. 그후 용액을 각기 100 ml 의 물로 5 회 세척한다. 이어서 용액을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 그후 용매를 감압하에 유거한다. 잔류물은 용리액으로서 0.5 ∼ 3 부피 %의 메탄올을 함유하는 염화 메틸렌으로 구배 용리법을 사용하여 100 g 의 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 1.5 g (수율 62 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 10.52 (1H, brs) ; 7.73 ∼ 7.32 (10H, m) ; 7,57 (1H,s) ; 6.53 ∼ 6.47 (1H,m) ; 4.63 (1H, brs) ; 4.48 (1H, brs) ; 4.11 (1H, brs) ; 4.04 ∼ 3.85 (2H,m) ; 2.58 ∼ 2.16(2H,m) ; 1.59 (3H,s) ; 1.10 (9H,s).
5(b) 5' - O -[(1,1 - 디메틸에틸) 디페닐실릴] 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
240 mg (0.5 mmol) 의 5' - O - [(1,1 - 디메틸에틸) 디페닐실릴] 티미딘 [상기 간계 (a) 에서 기술된 바와 같이 제조] 를 사용한다는 것만 제외하고 실시예 3(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여, 254.4 mg (수율 74.7 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NHR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 7.69 ∼ 7.36 (11H,m) ; 6.42 ∼ 6.38 (1H,m) ; 4.70 ∼ 4.62 (1H,m) ; 4.16 ∼ 4.09 (1H,m) ; 4.04 ∼ 3.55 (6H,m) ; 2.67 ∼ 2.15 (4H,m) ; 1.61 (3H, s) ; 1.22 ∼ 1.05 (12H,m).
5(c) 식 5(c) 의 화합물 :
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - [(1,1 - 디메틸에틸) 디페닐실릴] 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기 단계 (b) 에서 기술된 바와 같이 제조] 를 사용한다는 것만 제외하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 세 부분으로 나누고 각 부분은 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 × 250 mm ; 용리액 A ; 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30 분 ; 선형구배 ; 7 ml / 분 ; 254 nm) 으로 크로마토그래피하여 정제한다. 22.4 분후 용리된 분획을 혼합하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 무정형 고체로서 54 OD (260 nm)의 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255.
체류시간 ; 22.0 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC - Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리액 A ; 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30분, 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 254 nm).
실시예 6
6(a) 5' - O - (3,5 - 디벤질옥시벤질) 티미딘
아르곤 대기하에서 4 ml 의 테트라히드로푸란에 용해된 713 mg (2 mmol)의 3' - O - [1,1 - 디메틸에틸) 디메틸실릴] 티미딘 [Can. J, Chem., 56, 2768 (1978)] 용액에 175 mg (4 mmol) 의 수소화 나트륨 (광물성유 중 55 % w/w 분산) 을 가하고 수득한 혼합물은 2 시간 60℃ 에서 교반한다. 교반후, 혼합물을 실온까지 냉각하고, 그후 1 ml 의 테트라히드로푸란에 용해된 767 mg (2 mmol) 의 3,5 - 디벤질옥시벤질 브로마이드 [Chem. Ber., 102, 2887 (1969)] 를 적가한다. 이어서 149.9 mg (1 mmol) 의 요오드화 나트륨을 수득한 혼합물에 가하고, 그후 혼합물은 실온에서 16 시간 교반한다. 교반후, 용매를 감압증류로 제거하고, 잔류물은 50 ml 의 에틸 아세테이트에 용해하고 수득한 용액은 각기 50 ml 의 0.01 N 염산 수용액으로 2 회 세척한다. 이어서 용액은 무수 황산 마그네슘 상에서 건조하고, 그후 용매는 감압하에 유거한다. 잔류물은 용리액으로서 0.5 ∼ 3 부피 % 의 메탄올을 함유하는 염화 메틸렌으로 구배 용리법을 사용하여 100 g 의 실리카겔 (230 - 400 메쉬) 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 3' - O - [(1,1 - 디메틸에틸) 디메틸실릴] - 5' - O - (3,5 - 디벤질옥시벤질) 티미딘을 함유하는 혼합물 637.3 mg 을 수득한다.
이들 모두를 1.93 ml 의 테트라히드로푸란에 용해한다. 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 1M 테트라히드로푸란 용액 1.93 ml 를 용액에 가하고 수득한 혼합물은 30 분간 실온에서 교반한다. 교반후 용매를 감압 증류를 제거하고, 수득한 잔류물은 50 ml 의 에틸 아세테이트에 용해한다. 용액은 각기 50 ml 의 포화 염화 나트륨 수용액으로 2 회 세척한다, 그후 용액은 무수 황산 마그네슘 상에서 건조시키고 용매는 감압하에 유기하고 잔류물은 용리액으로서 1 ∼ 3 부피 % 의 메탄올을 함유하는 염화 메틸렌으로 구배 용리법을 사용하여 30 g 의 실리카겔 (230 - 400 메쉬) 크로마토그래피로 정제하여 258.5 mg (수율 23.7 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 7.87 (1H, s) ; 7.52 (1H,s) ; 7.43 ∼ 6.52 (13H, m) ; 6.37 (1H, t, J=6.75Hz) ; 5.03 (4H,s) ; 4.51 (2H, d, J=3.30Hz) ; 4.50 ∼ 4.44 (1H,m) ; 4.06 ∼ 4.03 (1H,m) ; 3.77 ∼ 3.63 (2H,m) ; 2.32 ∼ 2.12 (2H,m) ; 1.67 (3H,s).
6(b) 5' - O - (3,5 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
258.5 mg (0.475 mmol) 의 5' - O - (3,5 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 [상기 단계 (a) 에서 기술된 바와 같이 제조] 를 사용한다는 것만 제외하고 실시예 3(b)에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 307,7 mg (87 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 7.56, 7.53 (모두 1H, 2s) ; 7.42 ∼ 6.56 (13H.m) ; 6.40 (1H, t, J=6.60Hz) ; 5.02 (4H,s) ; 4.67 ∼ 4.58 (1H,m) ; 4.53, 4.51 (모두 2H, 2s) ; 4.23, 4.17 (모두 1H, 2brs) ; 3.90 ∼ 3.52 (6H,m) ; 2.68 ∼ 2.53 (2H,m) ; 2.49 ∼ 2.12 (2H,m) ; 1.65 (3H,s) ; 1.18 (12H, d, J=5.94Hz).
6(c) 식 6(c) 의 화합물 :
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - (3,5 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기 단계 (b) 에서 기술된 바와 같이 제조] 를 사용한다는 것만 제외하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여, 표제화합물을 수득한다. 반응 생성물을 세 부분으로 나누고, 각 부분은 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 × 250 mm ; 용리액 A ; 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30 분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 254 nm) 크로마토그래피로 정제한다. 19.8 분후의 용리된 분획을 혼합하고 실시예 1(b)에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 무정형 고체로서 64.6 OD (260 nm) 의 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255.
체류시간 ; 22.8 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC - Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리액 A ; 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30분, 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 254 nm).
실시예 7
7(a) 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘
713 mg (2 mmol) 의 3' - O - [(1,1 - 디메틸에틸) 디메틸실릴] 티미딘 [Can. J. Chem., 56, 2768 (1978)] 을 5 ml 의 테트라히드로푸란에 용해하고, 아르곤대기하에서 175 mg (4 mmol) 의 수소화 나트륨 (광물성 유중에서 55 % w/w 분산)을 수득한 용액에 가한다. 그후 혼합물은 60℃ 에서 2시간 교반한다. 교반후, 혼합물의 온도는 실온까지 감소시키고 이어서 678 mg (2 mmol)의 3,4 - 디벤질옥시벤질 클로라이드를 가한후 149.9 mg (1 mmol) 의 요오드화 나트륨을 가하고 수득한혼합물은 실온에서 19 시간 교반한후 60℃ 에서 5 시간 교반한다, 교반후 용매를 감압하에 유거하고 잔류물은 50 ml 의 아세트산 에틸에 용해한다. 수득한 용액을 각기 50 ml 의 0.01 N 염산 수용액으로 2회 세척하고 ; 그후 무수 황산 마그네슘 상에서 건조한다. 용매는 감압하에 증류 제거한다. 잔류물은 4 ml 의 테트라히드로푸란에 용해시키고 테트라히드로푸란에 용해된 1M 의 테트라부틸암모늄 플루오라이드 용액 4 ml 를 용액에 가한다. 그후 혼합물을 실온에서 2 시간 교반한다. 교반후, 용매를 감압 증류로 제거하고 잔류물은 50 ml 의 에틸 아세테이트에 용해한다, 수득한 용액은 각기 50 ml 의 염화 나트륨 포화 수용액으로 2 회 세척하고 무수 황산 마그네슘 상에서 건조한다. 그후 용매는 감압 증류로 제거하고 잔류를 온 크로마토그래피 컬럼 [Lichroprep (등록상표) Si60, 40-63 ㎛, Groβe C, Merck] 에 걸고 1 ∼ 4 부피 % 의 메탄올을 함유하는 염화 메틸렌으로 구배 용리법을 사용한 용리를 수행하여 345.4 mg (수율 31.7 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.26 (1H,s) ; 7.50 (1H,s) ; 7.47 ∼ 7.28 (10H, m) ; 6.91 ∼ 6.79 (3H,m) ; 6.36 (1H, t, J=6.75Hz) ; 5.17 (4H,s) ; 4.47, 4.45 (모두 2H, 2s) ; 4.41 ∼ 4.36 (1H,m) ; 4.04 ∼ 4.01 (1H,m) ; 3.72 ∼ 3.56 (2H,m) ; 2.31 ∼ 2.05 (2H,m) ; 1.62 (3H,s).
7(b) 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
271.7 mg (0.499 mmol) 의 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 [상기단계 (a) 에서 기술된 바와 같이 제조]을 피리딘으로 공비 증류하여 3회 건조한후, 2.5 ml 의 테트라히드로푸란에 용해한다. 0.348 ml (2 mmol)의 N,N - 디이소프로필 - N - 에틸아민 및 0.223 ml (1 mmol) 의 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필 클로로 포스포르아미디트를 수득한 용액에 가하고 혼합물은 2 시간 동안 아르곤 대기하 실온에서 교반한다. 교반후, 용매를 감압 증류로 제거한다. 잔류물을 50 ml 의 에틸 아세테이트에 용해하고 수득한 용액은 50 ml 의 빙냉 10 % w/v 탄산 나트륨 수용액으로 2회 세척하고 이어서 무수 황산 나트륨 상에서 건조한다. 용매를 감압하에서 증류 제거하고, 수득한 잔류물은 30 g (70 - 230 메쉬) 의 실리카겔을 함유하는 컬럼에 걸어준다. 그후 염화 메틸렌, 아세트산 에틸 및 트리에틸아민의 45 : 45 : 10 부피 혼합물로 용리한다. 소망하는 생성물을 함유하는 분획을 혼합하고, 용매는 감압 증류로 제거하고, 수득한 잔류물은 30 g (70 - 230 메쉬) 의 실리카겔을 함유하는 컬럼에 적용한다. 그후 염화 메틸렌, 아세트산 에틸 및 트리에틸아민의 6: 3 : 1 부피 혼합물로 용리하여 286.9 mg (수율 77 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.07 (1H, brs) ; 7.53, 7.51 (모두 1H, 2s) ; 7.45 ∼ 7.25 (10H,m) ; 6.92 ∼ 6.81 (3H,m) ; 6.37 (1H, t, J=6.60Hz) ; 5.15 (4H,s) ; 4.62 ∼ 4,53 (1H, m) ; 4.47 (2H,s) ; 4.22, 4.14 (모두 1H, 2s) ; 3.90 ∼ 3.53 (6H, m) ; 2.68 ∼ 2.53 (2H,m) 2.47 ∼ 2.05 (2H, m) ; 1.58 (3H, S) ; 1.17 (12H, d, J=5.94Hz).
7(c) 식 7(c) 의 화합물 :
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 (상기 단계 (b)에 기재된 바와 같이 제조) 를 사용하는 것 이외에는 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 세 부분으로 나누고 각 부분을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 × 250 nm ; 용리액 A ; 0.1 M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30 분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 254 nm) 에 의한 크로마토그래피로 정제한다. 22.5 분 뒤에 용리된 분획을 혼합하고고 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 실시하여 무정형 고체 물질로서 55.7 OD (260 nm) 인 표제 화합물을 수득하다. UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmax nm ; 254.
체류 시간 ; 13.6 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC - Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리액 A ; 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30 분, 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 254 nm).
실시예 8
식 8(a) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필 포스포르아미디트 대신에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기 실시예 7(b) 에 기재된 바와 같이 제조]를 사용하는것 이외에는 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 5 μmol 의 A-CPG [즉, 조절 공작 유리에 연결된 아데닌데옥시리보뉴클레오시드 (A)] 로 충진된 컬럼을 사용하고 합성기에 염기 서열 TGGGA를 넣음으로써 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 세 부분으로 나누고 각 부분을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 × 250 nm ; 용리액 A ; 0.1 M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30 분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 254 nm) 에 의한 크로마토그래피로 정제한다. 23.3 분 뒤에 용리된 분획을 조합하고 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 실시하여 무정형 고체 물질로서 86.2 OD (260 nm) 인 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 256
체류 시간 ; 14.2 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC - Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리액 A; 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30분, 선형 구배 ; 2 ml / 분 ; 254 nm).
실시예 9
식 9(a) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필 포스포르아미디트대신에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기 실시예 7(b) 에 기재된 바와 같이 제조]를 사용하는 것 이외에는 실시예 1(b)에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 합성기에 염기 서열 TGGG 를 넣음으로써 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 세 부분으로 나누고 각 부분을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 × 250 mm ; 용리액 A : 0.1 M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 25 → 50 부피 % B, 30 분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 254 nm)에 의한 크로마토그래피로 정제한다. 19.5 분 뒤에 용리된 분획을 혼합하고 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 실시하여 무정형 고체 물질로서 77.5 OD(260 nm) 인 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255
체류 시간 ; 14.8 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC - Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30분, 선형 구배 ; 2 ml / 분 ; 254 nm).
실시예 10
화학식 10(a) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필 포스포르아미디트 대신에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기 실시예 7(b) 에 기재된 바와 같이 제조] 를 사용하는 것 이외에는 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 합성기예 염기 서열 TGGGG 를 넣음으로써 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 세 부분으로 나누고 각 부분을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 × 250 nm ; 용리액 A ; 0.1 M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 254 nm)에 의한 크로마토그래피로정제한다. 22.9 분 뒤에 용리된 분획을 조합하고 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 실시하여 무정형 고체 물질로서 19.82 OD (260 nm) 인 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254.
체류 시간 ; 14.1 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC - Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30분, 선형 구배 ; 2 ml / 분 ; 254 nm).
실시예 11
11(a) 5' - O - [(피렌 - 1 - 일) 메틸] 티미딘
5 ml 의 디메틸술폭시드 중의 수소화 나트륨 (광물성유에서 55 % w/w 분산) 875 mg 의 혼합물을 질소 대기하에 상온에서 30 분 동안 교반한 뒤, 5 ml 의 디메틸술폭시드 중의 티미딘 2.42 g (10 mmol)의 용액을 생성혼합물에 적가한다. 혼합물을 상온에서 30 분 동안 교반한 뒤, 15 ml 의 디메틸술폭시드 중의 1 - (클로로매틸) 피렌 [Acta Chem. Scand., 10, 1362 (1956)] 2.51 g (10 mmol) 의 현탁액을 첨가한다. 그뒤, 혼합물을 상온에서 96 분 동안 교반한다. 교반후, 반응 혼합물을 100 ml 의 빙수에 붓고, 그 수성 혼합물을 100 ml 의 에틸 아세테이트로 추출한뒤에 100 ml 의 염화 메틸렌으로 추출한다. 추출물을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조한뒤, 용매를 감압하에 증류 제거한다. 잔류물은 용리액 0 내지 4부피 %의 메탄올을 함유하는 염화 메틸렌의 혼합물로 구배 용리법을 사용하여 150 g 의 실리카겔 (230 ∼ 400 메쉬) 를 통한 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 292,4 mg (수율 6.4%) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (d6-DMSO, 270 MHz, TMS), δ ppm ; 8.44 ∼ 8.07 (9H, m) ; 7.44 (1H,s) ; 6.19 (1H, t, J=6.75Hz) ; 5.33 (1H, d, J=5.4Hz) ; 5.29 (2H,s) ; 4.37 ∼ 4.30 (1H,m) ; 4.00 ∼ 3.96 (1H,m) ; 3.92 ∼ 3.79 (2H,m) ; 2.10 ∼ 2.04 (2H, m) ; 1.20 (3H,s).
11(b) 5' - O - [(피렌 - 1 - 일) 메틸] 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
91.3 mg (0.2 mmol) 의 5' - O - [(피렌 - 1 - 일) 메틸] 티디딘 (상기 단계(a) 에 기재된 것처럼 제조) 를 피리딘과 공비 증류로 3 번 건조한 뒤, 2 ml 의 테트라히드로푸란에 현탁한다. 139 μl (0.8 mmol) 의 N,N - 디이소프로필 - N - 에틸아민 및 89 μl (0.4 mmol) 의 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필클로로포스포르아미디트를 아르곤 대기하에 현탁액에 첨가한 뒤, 생성 혼합물을 상온에서 30 분 동안 교반한다. 이 시간이 종결된 뒤, 침전물을 여과로 제거하고, 침전물에서 감압 증류로 용매를 제거한다. 잔류물을 20 ml 의 에틸 아세테이트 속에 용해시키고 반응 용액을 두번, 매번 빙냉된 10 % w/v의 탄산 나트륨 수용액 20 ml 로 세척한다. 용액을 무수 황산 나트륨상에서 건조한 뒤, 용매를 감압 증류 제거한다. 생성 잔류물을 용리액으로 6 : 3 : 1 부피 혼합물의 염화 메틸렌, 에틸 아세테이트 및 트리에틸아민을 사용하여 30 g 의 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 를 통한 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 100.2 mg (수율 76 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.36 ∼ 7.99 (9H, m) ; 7.50, 7.46 (모두 1H, 2s) ; 6.35 (1H, t, J=6.60Hz) ; 5.38 ∼ 5.22 (2H,m) ; 4,6 ∼ 4.50 (1H, m) ; 4.25 ∼ 4.17 (1H,m) ; 4.01 ∼ 3.77 (2H,m) ; 3.73 ∼ 3.44 (4H,m) ; 2.78 ∼ 2.09 (4H,m) ; 1.31, 1.29 (모두 3H, 2s) ; 1.10 ∼ 1.05 (12H,m).
11(c) 식 11(c) 의 화합물 :
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미드트 대신에 5' - O - [(피렌 - 1 - 일) 메틸] 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 (상기 단계 (b) 에 기재된 것처럼 제조) 를 사용하는 것 이외에 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물은 세 부분으로 나누고 각 부분을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 × 250 nm ; 용리액 A : 0.1 M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30 분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 254 nm) 에 의한 크로마토그래피로 정제한다. 15.4 분 후에 용리된 분획을 혼합하고 실시예1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 실시하여 무정형 고체 물질로서 80 OD (260 nm) 인 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 243.
체류 시간 ; 16.4 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC - Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 20 → 50 부피 % B, 30분, 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 254 nm).
실시예 12
12(a) O - 디메톡시트리틸 에틸렌 글리콜
3.1 g (50 mmol)의 에틸렌 글리콜을 피리딘과 공비 증류로 건조한 뒤에 40 ml 의 피리딘에 용해시킨다. 3.38 g (10 mmol)의 4,4' - 디메톡시트리틸클로리드를 용액에 첨가하고 생성 혼합물온 상온에서 2 시간 동안 교반한다. 출발 화합물이 없어진 것이 박층 크로마토그래피로 확증된 뒤에 5 ml 의 메탄올을 반응 혼합물에 가하고 혼합물을 감압 증류로 그 부피의 약 반으로 농축한다. 농축액을 100 ml 의 염화 메틸렌에 용해시키고 생성 용액을 탄산 수소 나트륨 포화 수용액으로 세척한다. 유기 용액을 1 PS 필터 종이 (Whatman) 으로 여과하고, 여액에서 용매를 감압 증류로 제거한다. 잔류물을 용리액로서 1 부피 % 의 메탄올을 함유하는 염화 메틸렌을 사용하여 100 g 의 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 를 통한 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 고무상 물질로서 표제 화합물을 1.97 g 을 수득한다.
1NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm : 7.45 ∼ 6.82 (13H,m) ; 3.79 (6H,s) ; 3.75 (2H, t, J=4.95Hz) ; 3.25 (2H, t, J=4.62Hz) ; 1.95 (1H, t).
12(b) 식 12(b) 의 화합물 ;
0.18 (0.5 mmol) 의 O - 디메톡시트리틸에틸렌 글리콜 (상기 단계 (a) 에 기재된 것처럼 제조) 을 피리딘과 공비 증류로 건조한 뒤에 2 ml 의 염화 메틸렌에 용해시킨다. 그 뒤에 75 mg (0.75 mmol)의 숙신산 무수물 및 92 mg (0.75 mmol) 의 4 - (디메틸아미노) 피리딘을 용액에 첨가하고 생성 혼합물을 1 시간 동안 교반한다. 출발 물질이 사라진 것이 박층 크로마토그래피로 확증된 후, 반응 혼합물을 염화 메틸렌으로 희석하고, 희석된 용액을 0.5 M 의 인산 이수소칼륨 (pH 5.0) 수용액 및 물로 차례로 세척한다. 유기층을 무수 황산 나트륨 상에 건조하고, 용매를 감압 증류 제거하여 O - 디메톡시트리틸 에틸렌 글리콜 모노숙신산염을 수득한다.
이 화합물 전부를 피리딘과 공비 증류로 건조한뒤 3 ml 의 디메틸포름아미드에 용해시킨다. 그 뒤에 0.16 g (0.75 mmol) 의 펜타클로로페논 및 0.16 g (0.75 mmol)의 1,3 - 디시클로헥실카르보디이미드를 용액에 첨가하고, 생성 혼합물을 상온에서 42 시간 동안 교반한다. 이 반응 시간이 종결된 뒤, 불용성 물질을 여과 제거하고, 여액을 감압 증류로 농축한다. 잔류물을 벤젠과 혼합하고, 생성 불용성 물질을 다시 여과 제거한 뒤, 용매를 감압증류로 제거한다.
상기와 같이 생성된 0.25 g (0.2 mmol) 의 잔류물을 4 ml 의 디메틸포름 아미드에 용해시키고, 이 용액에 60 μl (0.44 mmol)의 트리에틸아민 및 2.0 g 의 (3 - 아미노프로필) - CPG (0.129 mmol / g 의 아미노기 함유) 를 가한다. 이어서, 생성된 혼합물을 실온에서 36 시간 동안 정치시킨다. 이후에, CPG 담체를 여과에 의해 수집하고, 염화 메틸렌으로 세척한 후 진공하에 건조시킨다. CPG 담체를 캡 (cap) A 및 B 용액 (Millipore Ltd. Japan 제조) 각기 10 ml 와 혼합하고 반응하기 위해 남아 있는 아미노기를 아세틸화 하기 위해 10 분간 정치시킨다. 이어서, 반응 생성물을 피리딘 및 염화 메틸렌의 순서로 세척한 후, 진공하에 건조시켜 일반식 12(b) 에 표제 화합물을 수득한다. 캡 A 용액은 무수 아세트산과 테트라히드로푸란과의 1 : 9 부피비의 혼합물이며 캡 B 용액은 N - 메틸이미다졸과 테트라히드로푸란과의 1 : 4 부피비의 혼합물이다.
실시예 12(b) 의 화합물에 도입된 O - 디메톡시트리틸 에틸텐 글리콜로 부터 유도된 잔류물의 비율을 하기와 같이 정량적으로 분석한다. 실시예 12(b) 의 화합물 9.6 mg 및 데블록 용액 (염화 메틸렌 중의 디클로로아세트산 용액 ; Millipore Ltd. Japan 제조) 를 3분간 진탕한 후 충분량의 염화 메틸렌을 용액에 가하여 총 부피를 20 ml 로 한다, 이 용액 0.4 ml 를 시험관에 넣고 측정용으로 사용한다. 감압하의 증류에 의해 시료 용액으로 부터 용매를 제거하고, 잔류물을 과염소산과 에탄올의 3 : 2 부피의 혼합물에 용해시킨다. 용액중의 디메톡시트리틸 양이온의 흡광도를 500 nm 에서 측정한다.
그 결과, 도입된 디메톡시트리틸의 양이 40.0 μmol / g 임을 알아내었다.
12(c) 식 12(c) 의 화합물 :
125 mg (5 μmol) 의 실시예 12(b) 의 화합물을 사용하고 합성기에 염기서열 TGGGAGZ (여기서, Z 는 실시예 17 에서 설명한 바와 같이 더미 코드이다) 를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1(b) 에 기재된 바와 동일한 방법을 행하여, 실시예 1(b) 에 기재된 바와 같은 DNA / RNA 합성기를 사용하여 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm)로 정제하고 실시예 1(b) 와 동일한 방법을 행하여 무정형 고체로서 165 OD (260 nm)의 표제 화합물을 수득한다. 역상 고기능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A : 0.1M TEAA ; pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 부피 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 의 분석은 시료의 체류 시간이 18.76 분임을 나타낸다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254.
실시예 13
식 13(a) 의 화합물 :
151 mg (5 μmol) 의 3' - 아미노 - ON CPG (Clontech 사의 등록상표) 을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 12(c) 에 기재된 바와 동일한 방법을 행하여 표제 화합물을 제조한다. 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Preparative C18, Waters, 1.5 ×15cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 ∼ 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 로 정제하고 실시예 1(b)와 동일한 방법을 행하여 무정형 고체로서 165 OD (260 nm) 의 표제 화합물을 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 부피 % B, 20 분 ; 선형 구배 1 ml/분 ; 260 nm) 로 분석하여 시료의 체류시간이 18.76 분임을 알아내었다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255.
실시예 14
식 14(a) 의 화합물
하기의 수정을 하였다는 것만 제외하고는 실시예 12(c) 와 동일한 방법을 반복한다. 실시예 12(b)의 화합물을 먼저 말단의 3' - 위치에 구아닌데옥시리보뉴클레오티드-β-아미디트를 커플링 시킨후 산화 용액에 의한 산화 없이 합성기로 부터 제거한다. 이어서, 컬럼에 테트라에틸티우람 디술피드 (TETD) 의 아세토니트릴 용액 (Applied Biosystems 사 제조) 5 ml 를 가한후, 실온에서 15 분간 정치시킨다. 이어서, 컬럼을 아세토니트릴로 세척하고 합성기에 넣는다. 정제 단계에서, 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 를 행한다. 실시예 1(b) 에 기재된 바와 동일한 방법을 행하여, 무정형 고체로서 33 OD (260 nm) 의 표제 화합물을 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 부피 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml 분 ; 260 nm) 분석은 시료의 체류 시간이 18.92 분임을 나타낸다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 254.
실시예 15
15(a) 5' - O - 트리틸 - N - 벤조일 - 2' - 데옥시티딘
3.31 g (10 mmol) 의 N - 벤조일 - 2' - 데옥시티딘을 25 ml 의 피리딘에 가한후, 현탁액에 3.07 g (11 mmol) 의 트리틸 클로라이드를 현탁액에 가한다. 생성된 현탁액을 100℃ 에서 1 시간 동안 교반한 후, 실온까지 냉각시킨다. 이어서, 피리딘을 감압하에 증류에 의해 제거한다. 생성된 잔류물을 에틸아세테이트와 염화 나트륨 포화 수용액의 혼합물에 용해시킨다. 유기층을 분리하고, 매번 염화 나트륨 포화 수용액으로 2 회 세척한다. 이어서, 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 감압하의 증류에 의해 제거한다. 생성된 잔류물을 용리액으로서 2 : 98 → 5 : 95 부피의 메탄올과 염화 메틸렌의 혼합물로 구배 용리법을 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Lober 컬럼 Si - 60, 사이즈 C) 로 정제하여 1.47 g (수율 26 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.72 (1H, brs) ; 8.26 (1H, d, J=7.3Hz) ; 7.89 (1H, d, J=7.3Hz) ; 7.26 ∼ 7.64 (2OH,m) ; 6.29 (1H, t, J=5.9Hz) ; 4.48 ∼ 4.53 (1H,m) ; 4.12 ∼ 4.16 (1H,m) ; 3.42 ∼ 3.57 (2H,m) ; 2.23 ∼ 2.77 (2H,m) ; 2.51 (1H, brs).
15(b) 5' - O - 트리틸 - N - 벤조일 - 2' - 데옥시티딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
402 mg (0.7 mmol) 의 5' - O - 트리틸 - N - 벤조일 - 2' - 데옥시티딘 (상기한 (a) 단계에서와 같이 제조) 을 피리딘을 사용한 공비 증류에 의해 건조시킨 후 3.5 ml 의 염화 메틸렌에 용해시킨다. 용액에 60 mg (0.35 mmol) 의 디이소프로필암모늄 테트라졸리드를 가한다. 이어서, 아르곤 대기하에서 245 μl (0.77 mmol) 의 2 - 시아노에틸 N,N,N',N' - 테트라이소프로필포스포로디아미드트를 적가한다. 생성된 혼합물을 동일한 대기하에서 실온에서 3.5 시간동안 교반한다. 이어서, 염화 메틸렌을 감압하에 증류에 의해 제거한다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 용액을 탄산 나트륨 10 % w/v 수용액 및 염화 나트륨 포화 수용액의 순서로 세척한다. 이어서, 용액을 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨후, 감압하의 증류에 의해 용매를 제거하고 잔류물을 용리액으로서 에틸 아세테이트를 사용하는 23 g 의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (70 - 230 메쉬) 로 정제하여 포말상 물질로서 337 mg (수율 62 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.87 (1H, brs) ; 8.52 및 8.43 (1H, d, J=7.3Hz) ; 8.12 및 8.11 (1H, d, J=7.3Hz) ; 7.23 ∼ 7.86 (20H, m) ; 6.49 ∼ 6.55 (1H, m) ; 4.79 ∼ 4.91 (1H, m) ; 4.46 ∼ 4.47 (1H, m) ; 3.60 ∼ 4.10 (6H, m) ; 2.46 ∼ 3.08 (4H, m) ; 1.29 ∼ 1.40 (12H, m).
15(c) 식 15(c) 의 화합물 :
아미디트 병 (이하, " X " 라 한다) 에 실시예 15(b) 의 화합물의 35 mM 아세토니트릴 용액을 넣고 염기 서열 XGGGG 를 합성기에 넣는 것을 제외하고는 실시예 1(b) 에 기재된 바와 동일한 방법을 행한다. 이렇게 수득한 표제 화합물을 함유하는 90 % 포름아미드 수용액을 95℃ 에서 5 분간 가열한후 얼음으로 즉시 냉각시킨다. 반응 혼합물을 4 부분으로 나누고 각각을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil PREP - ODS 20.0 ×250 mm ; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.0 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 ∼ 60 부피 % B, 30분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 260 nm ; 컬럼 온도 60℃) 로 정제한다. 20.9 분후 용리된 분획을 수집하고 실시예 1(b) 와 동일한 방법을 행하여 무정형 고체로서 68 OD (260 nm) 의 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254.
체류 시간 ; 13.25 분
[고성능 액체 크로마토그래피로 행함 (Inertsil ODS - 2 ; 6 ×150 mm ; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 ∼ 60 부피 % B, 20분, 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm).]
실시예 16
16(a) 식 16(a) 의 화합물 :
0.26 g (0.5 mmol) 의 O - 디메톡시트리틸 헥사에틸렌 글리콜 [Nucleic Acids Res., 18, 6353 (1990)] 을 피리딘을 사용한 공비 증류로 건조시킨 후 2 ml 의 염화 메틸렌에 용해시킨다. 75 mg (0.75 mmol)의 무수 숙신산과 92 mg (0.75 mmol) 의 4 - (디메틸아미노) 피리딘을 용액에 가하고, 생성된 혼합물을 2 시간 동안 교반한다. 반응의 종결을, 박층 크로마토그래피로 확인한후, 반응 혼합물을 염화 메틸렌으로 희석하고 희석된 혼합물을 0.5 M 인산이수소칼륨 수용액 (pH 5.0) 및 물의 순서로 세척한다. 이어서, 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조시키고, 용매를 감압하의 증류에 의해 제거하여 O - 디메톡시트리틸 헥사에틸렌 글리콜 모노숙시네이트를 수득한다.
이 생성물 전체를 피리딘을 사용한 공비 증류로 건조시킨 후 3 ml 의 디메틸포름아미드에 용해시킨다. 0.23 g (0.37 mmol) 의 펜타클로로페놀 및 0.12 g (0.56 mmol) 의 1,3 - 디시클로헥실카르보디이미드를 용액에 가하고 생성된 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반한다. 이후에, 침전된 불용성 물질을 여과 제거하고, 감압하의 증발에 의해 여과액으로 부터 용매를 제거한다. 잔류물을 벤젠에 용해시키고, 생성된 불용성 물질을 다시 여과제거한 후, 용매를 감압하의 증류에 의해 제거한다.
30 μl (0.22 mmol) 의 트리에틸아민 및 1.0 g 의 (3 - 아미노프로필) - CPG (0.129 g mmol / g 의 아미노기 함유) 를 5 ml 의 디메틸포름아미드 중의 0.23 g (0.18 mmol) 의 잔류물 용액에 가하고 생성된 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 정치시킨다. 이어서, CPG 담체를 여과에 의해 수집하고 염화 메틸렌으로 세척한후 진공하에 건조시킨다. 남아 있는 미반응의 아미노기를 아세틸화 하기 위하여, CPG 담체를 3 ml 의 각각의 캡 A 및 B 용액(Millipore Ltd., Japan 제조) 과 혼합하고 혼합물을 10 분간 정치시킨다. 이어서, 반응생성물을 피리딘과 염화 메틸렌의 순서로 세척한 후, 진공하에 건조시켜 표제 화합물을 제조한다.
실시예 16(a) 의 화합물에 도입된 O - 디메톡시트리틸 헥사에틸렌 글리콜 잔류물의 양을 하기와 같이 측정한다. 실시예 16(a)의 화합물 (9.7 mg) 을 정확히 측정하고 여기에 데블록 용액 (디클로로아세트산의 염화 메틸렌 용액 ; Millipor Ltd., Japan 제조) 을 가한다. 혼합물을 3 분간 진탕한 후 충분양의 염화 메틸렌을 가하여 20 ml 로 한다. 이 0.4 ml 를 시험관에 취하고 감압하의 증류에 의해 용매를 제거한다. 잔류물에 과염소산과 에탄올의 3 : 2 부피의 혼합물 3 ml 를 가하고, 500 nm 에서 디메톡시트리틸 양이온의 흡광도 (ε = 71.700) 를 측정한다.
도입된 디메톡시트리틸기의 양은 59.1 μmol / g 이다.
16(b) 식 16(b) 의 화합물 :
실시예 16(a) 의 화합물 85 mg (5 μmol) 을 채운 컬럼을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 12(c) 에 기재된 바와 동일한 방법을 행하여, 표제 화합물을 제조한다. 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 × 15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 5 → 50 부피 %, 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 로 정제한다. 실시예 1(b) 와 동일한 방법을 행하여, 151 OD (260 nm) 의 식 16(b) 의 표제 화합물을 무정형 고체로서 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 부피 % B ; 20분 ; 선형 구배 ; 1 ml/분 ; 260 nm) 에 의한 분석은 샘플의 체류 시간이 18.50 분임을 나타낸다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254.
실시예 17
식 17(a) 의 화합물 ;
실시예 16(a) 의 화합물 85 mg (5 μmol) 으로 충진한 컬럼과 아미디트 병에 충진된 O - 디메톡시트리틸 헥사에틸렌 글리콜 O - (2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필 포스포르아미디트) [Nucleic Acids Res., 18, 6353 (1990)] (여기서는 " X " 라고 명명된다) 를 사용하고 염기 서열 TGGGAGXZ 를 합성기에 입력한다는 것만 제외하고 실시예 1(b) 에서 기재된 것과 동일한 방법으로 수행해 표제 화합물을 제조하였다. 이 실시예 및 다른 곳에서, X 는 상기 정의한 바이며 Z 는 더미 코드를 나타내는데 이것은, 합성기에 입력되는 코드로 실제 염기를 입력하는 것이 아니며 ; 합성기에 더미코드 입력시, A, G, C, T 또는 X 의 어느코드나 입력 가능하지만, 서열에 첨가되는 염기가 되진 않는다. 생성물은 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 5 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 를 사용해 정제했다. 실시예 1(b) 에서 기재된 것과 동일한 방법을 수행하여, 136 OD(260 nm) 를 갖는 무정형 고체의 표제 화합물을 수득하였다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴, 10 ∼ 60 부피 % B, 20분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 에 의한 분석으로 시료가 18.32 분의 체류시간을 가지고 있음을 알아냈다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 254.
실시예 18
식 18(a) 의 화합물 :
염기 서열 TGGGAGXXZ (여기서 X 및 Z 는 실시예 17 에서 정의된 바와 동일하다) 을 합성기에 입력시키고, 실시예 17 에서 기재된 것과 동일한 방법으로 수행해 표제 화합물을 제조하였다. 생성물은 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 5 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 를 이용하여 정제하였다. 그리고 실시예 1(b) 에 기재된 것과 동일한 방법을 수행하여 136 OD (260 nm) 의 식 18(a) 의 표제 화합물을 무정형 고체로 수득하였다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 × 150 nm ; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 ; 아세토니트릴 ; 10 → 60 % B 부피 % B, 20분 ; 선형 구배 ; 1 ml /분 ; 260 nm) 에 의한 분석으로 시료의 체류 시간이 18.20 분임을 밝혔다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 255.
실시예 19
식 19(a) 의 화합물 :
염기 서열 TGGGAGXXXZ (여기서 X 및 Z 는 실시예 17 에서 정의된 바와 동일하다) 을 합성기에 입력시키고, 실시예 17 에서 기재된 것과 동일한 방법으로 수행해 표제 화합물을 제조하였다. 반응 생성물은 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 5 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 를 이용하여 정제하였다. 그리고 실시예 1(b) 에 기재된 것과 동일한 방법을 수행하여 110 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 무정형 고체로 수득하였다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피(Inertsil ODS, 6 ×150 nm ; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 ; 아세토니트릴 ; 10 → 60 부피 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 에 의한 분석으로 시료의 체류 시간이 17.99 분임을 밝혔다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 254.
실시예 20
식 20(a) 의 화합물 ;
실시예 16(a) 의 화합물 85 mg (5 μmol) 으로 충진된 컬럼을 사용하고, 염기 서열 TGGGAGZ (여기서 Z 는 실시예 17 에서 정의된 바와 동일하다) 을 실시예 1(b) 에서 기재한 DNA / RNA 합성기에 입력시켜서, 실시예 2(c) 에서 기재된 것과 동일한 방법으로 수행해 표제 화합물을 제조하였다. 생성물은 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 를 이용하여 정제하였다. 그리고 실시예 1(b)에 기재된 것과 동일한 방법을 수행하여 177 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 무정형 고체로 수득하였다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A ; 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 ; 아세토니트릴 ; 10 → 60 부피 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 에 의한 분석으로 시료의 체류 시간이 19.10 분임을 밝혔다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254.
실시예 21
21(a) 식 21(a) 의 화합물 ;
5.2 ml 의 아세토니트릴에 용해된 5' - 포스페이트 ON (Clontech 상품의 등록상표) 250 mg 의 용액 및 15 μmol 의 C-CPG (Millipore Ltd., Japan) 로 충진된 컬럼을 실시예 1(b) 에 기재된 DNA / RNA 합성기에 사용하여 정량적으로 표제 화합물을 정량적으로 제조하였다.
21(b) 식 21(b) 의 화합물 :
실시예 21(a) 화합물 115 mg (4 μmol) 으로 충진된 필터 - 부착 컬럼에 데블록 (deblock) 용액 (Millipore Ltd., Japan) 5 ml 를 첨가하였다. 그리고 일분간 방치후에 메틸렌클로라이드 5 ml 로 세척하고, 데블록 용액으로 일분간 처리하였다. 혼합물을 메틸렌 클로라이드 5 ml 및 피리딘 5 ml 로 차례로 세척한 뒤에 피리딘으로 공비 중류하였다. 그리고 트리에틸암모늄 5' - O - 디메톡시트리틸 - 2 - N - 이소부티릴 - 2' - 데옥시구아노신 - 3' - O - (2 - 클로로페닐) 포스페이트 [Nucleic Acids Res., 8, 5461 (1980)] 20 mg 의 피리딘 0.5 ml 용액을 증류액에 첨가한뒤, 용매를 감압 증류로 제거하였다. 2.4.6 - 트리메틸벤젤술로닐 - 3 - 니트로트리아졸 40 mg 의 피리딘 0.5 ml 용액을 잔류물에 첨가하고 생성되는 혼합물을 30 분 동안 40℃ 까지 가열하였다. 그리고 반응 혼합물을 세번, 각각 5 ml 의 피리딘으로 세척하고, 캡 A 용액(Millipore Ltd., Japan) 2.5 ml 및 캡 B 용액 (Millipore Ltd., Japan) 2.5 ml 를 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 3 분 동안 방치한 후, 각각 메틸렌 클로라이드 5 ml 로 세번 세척하여 표제 화합물을 수득하였다.
21(c) 식 21(c) 의 화합물 ;
실시예 21(b) 의 화합물 115 mg (4 μmol) 로 충진된 컬럼 및 5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신 티민데옥시리보뉴클레오티드 - β - 아미디트 (Millipore Ltd., Japna) 을 사용하였다는 것만 제외하고 실시예 1(b) 에서 기재된 것과 동일한 방법으로 수행해 표제 화합물을 제조하였다. 반응 생성물은 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 5 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 를 이용하여 정제하였다. 그리고 실시예 1(b)에 기재된 것과 동일한 방법을 수행하여 85 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 무정형 고체로 수득하였다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 nm ; 용리액 A ; 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 10 → 50 부피 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml /분 ; 260 nm)에 의한 분석으로 시료의 체류시간이 21.5 분임을 밝혔다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 254.
실시예 22
22(a) 트리에틸암모늄 5' - O - 디메톡시트리틸 - 2 - N - 이소부티릴 - 2' - 데옥시구아노신 - 3' - O - 페닐포스페이트
1.2.4 - 트리다졸 0.8 g (11.55 mmol) 을 피리딘으로 공비 증류를 수행해 건조시키고 난후 디옥산 10 ml 속에 현탁하였다. 이 현탁액에 페닐포스포로디클로리데이트 0.52 ml (3.5 mmol) 을 첨가하고, 트리에틸아민 1.0 ml (7.35 mmol) 을 빙냉 및 교반하에서 첨가하고 그후 온도는 실온까지 상승시켰다. 혼합물을 2 시간 동안 교반한 후, 침전되는 염화 수소를 여거하여 페닐 포스포로비스 (트리아졸리데이트) 0.35 mmol/ ml 를 함유한 디옥산 용액을 생산하였다.
상기 기재한 방법으로 제조한 페닐 포스포로비스 (트리아졸리데이트) 의 디옥산 용액 1 ml (0.35 mmol) 을 5' - O - 디메톡시트리틸 - 2 - N - 이소부티릴 - 2' - 데옥시구아노신 [Methods Enymol., 65, 610 (1980)] 0.15 g (0.23 mmol) 에 첨가하고 생성되는 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 마지막에 30 % 부피의 피리딘 수용액 약 10 ml 를 첨가하였다. 그리고 반응 혼합물을 메틸텐 클로라이드 30 ml 로 추출하여 추출물을 0.1M TEAB 로 세척하였다. 용매는 감압 증류로 제거하고, 생성되는 잔여물을 메틸렌클로라이드 1 ml 에 용해시켜 1 부피 % 로 트리에틸아민을 함유한 1 : 1 부피비의 헥산 및 디에틸에테르의 혼합물 30 ml 로 분쇄해서 분말상의 표제 화합물 81 mg (수율 40 %)을 수득하였다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 12.07 (1H, brs) ; 9.67 (1H, brs) ; 7.80 ∼ 7.64 (1H,m) ; 7.47 ∼ 6.91 (18H,m) ; 6.12 ∼ 6.10 (1H,m); 5.48 ∼ 5.45 (1H,m) ; 4,64 ∼ 4.58 (1H,m) ; 4.28 (1H,m) ; 3.74 (6H,s) ; 3.38 ∼ 3.18 (2H,m) ; 2.98 ∼ 2.89 (6H,m) ; 2.73 ∼ 2.51 (2H,m) ; 2.34 ∼ 2.29 (1H, m) ; 1.25 ∼ 1.19 (9H,m) ; 1.12 ∼ 0.99 (6H,m).
22(b) 식 22(b) 의 화합물 :
실시예 21(a) 의 화합물 및 실시예 22(a)의 화합물 143 mg (5 μmol) 을 사용하여 실시예 21(b)에서 기재된 것과 동일한 방법을 수행해 표제 화합물을 수득했다.
22(c) 식 22(c) 의 화합물 :
실시예 22(b) 의 화합물 143 mg (5 μmol) 으로 충진된 컬럼을 사용하여 실시예 1(b) 에서 기재된 것과 동일한 방법을 수행해 표제 화합물을 제조하였다. 반응 생성물은 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 를 이용하여 정제하였다, 그리고 실시예 1(b) 에 기재된 것과 동일한 방법을 수행하여 66 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 무정형 고체로 수득하였다. 역상 고성능 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 부피 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml /분 ; 260 nm) 에 의한 분석으로 시료의 체류시간이 18.22 분임을 밝혔다,
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255.
실시예 23
식 23 (a) 의 화합물 ;
실시예 21(b) 의 화합물 115 mg (4 μmol) 로 충진된 컬럼을 사용하는 것이외는 실시예 1(b) 에 기재된 바와 유사한 방법으로 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 × 15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형구배 ; 254 nm)로 정제한다. 이어서, 실시예 1(b) 에 기재된 바와 유사한 방법으로 처리하여 56 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 비정질 고체로 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 용량 % B, 20 분 ; 성형구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 로 분석한 결과 시료의 체류시간은 18.38 분이었다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255.
실시예 24
24(a) 식 24 (a) 의 화합물 :
143 mg (5 μmol) 의 실시예 21(a) 의 화합물 및 트리에틸암노늄 5' - O - 디메톡시트리틸 - 2 - N - 이소부티릴 - 2' - 데옥시구아노신 - 3' - (4 - 클로로페닐) 포스페이트 [Methods Enzymol., 65, 610 (1980)] 를 사용하는 것 이외는 실시예 21(b) 에 기재된 바와 유사한 방법으로 표제 화합물을 수득한다.
24(b) 식 24(b) 의 화합물 :
실시예 24(a) 의 화합물 143 mg (4 μmol) 로 패킹된 컬럼을 사용하는 것이외는 실시예 1(b)에 기재된 바와 유사한 방법으로 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 × 15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 로 정제한다. 이어서, 실시예 1(b) 에 기재된 바와 유사한 방법으로 처리하여 55 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 비정질 고체로 수득한다. 역상 고속 액체 크로마토그래피 (Intersil ODS, 6 ×150 nm ; 용리액 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 용량 % B, 20분 ; 선형 구배 ; 1 m / 분 ; 260 nm)로 분석한 결과 시료의 체류시간은 18.55 분이었다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255.
실시예 25
DMT - O - TGGGAG - OH
목적 염기 서열 (5' - TGGGAG- 3') 을 380B 합성기 (Applied Biosystems Inc. 제품) 에 넣고, 3' - 말단에서 상응하는 뉴클레오시드 (2' - 데옥시구아노신) 와 결합된 제어된 유공 유리 컬럼 (1 μmol 크기) 을 연결시킨다. 1 μmol 크기로 합성을 수행한다. 반응 완료후 DMT 기를 탈보호시키지 않도록 장치를 설비하고, DMT 기를 갖는 생성물을 수지에서 자동 유리시켜 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 암모니아 용액으로 수득한다. 이 용액을 바이알에 밀봉하여 55 ℃ 에서 8 시간 가열하고, 질소 기류중 암모니아를 증발제거한다. 생성 잔류물을 소량의 0.1 M TEAA (pH 7.0) 에 용해한다. 이 용액을 밀리포어 필터 (0.2 ㎛) 로 여과하고, 여액을 역상 고속 액체 크로마토그래피 (Cosmosil 5C18-AR, 20 ×250 mm) 로 하기 조건하에 정제한다. 13.5 분후 용리된 분획을 수거하여 용매 (아세토니트릴) 를 감압 유거한후 동결건조시켜 표제 화합물 800 ㎍ 을 수득한다.
용리시간 : 17.0 분
정제 고속 액체 크로마토그래피 조건 :
완충액 A : 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액 (pH 7.0) ;
완충액 B : 100 % 아세토니트릴 ;
유속 ; 9 ml / 분
실시예 26 ∼ 38
실시예 25 에 개재된 바와 유사한 방법으로 실시예 26 ∼ 38 의 화합물을 합성한다. 화합물의 명칭 및 그 용리시간은 표 3 에 명시한다.
표 3
표 3(계속)
표 3(계속)
실시예 82
82(a) 식 82(a) 의 화합물 ;
이하 상세된 바와 같은 필요한 합성 시약을 Cyclone (상품명) 플러스 DNA / RNA 합성기 (Milligen / biosearch, Millipore Ltd., Japan) 에 공급한다. 또한,아미디트법 (15 μmol) 용 프로그램 카트리지를 설치한다. 구아노신에 상응하는 β - 시아노에틸 아미디트 대신 5' - O - 디메톡시트리틸 - 2 - N - 이소부티릴 - 2' - 데옥시구아노신 - 3' - O - (메틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트) (Sigma) 약 35 mM 아세토니트릴 용액을 사용한다. 실시예 21(a) 의 화합물143 mg (5 μmol)로 패킹된 빈 컬럼 (15.0 μmol) 을 사용하고, 염기서열 GX 을 합성기에 넣고, 염기 G 와 결합후 산처리를 하지 않는 프로그램을 실시하여 표제 화합물을 수득한다.
82(b) 식 (82(b) 의 화합물 :
실시예 82(a) 의 화합물 143 mg (5 μmol) 로 패킹된 컬럼을 사용하는 것이외는 실시예 1(b) 에 기재된 바와 유사한 방법으로 표제 화합물을 제조한다. 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형구배 ; 254 nm) 로 정제한다. 이어서, 실시예 1(b) 에 기재된 바와 유사한 방법으로 처리하여 66 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 비정질 고체로 수득한다. 역상 고속액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×250 nm ; 용리액 A : 0.1 M TEAA, PH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 용량 % B, 20분 ; 선형구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 로 분석한 결과 시료의 체류시간은 17.54 분 이었다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 254.
실시예 83
83(a) 식 83(a) 의 화합물 ;
실시예 21(a) 의 화합물 143 mg (5 μmol) 을 사용하는 것 이외는 실시예 82(a) 에 기재된 바와 유사한 방법으로 표제 화합물을 제조한다. 상세하게는 5' - O - 디메톡시트리틸 - 2 - N - 이소부티릴 - 2' - 데옥시구아노신 - 3' - O - (메틸 N,N - 디이소프로필) 포스포르아미디트와 커플링한 후, 컬럼을 산화용액으로 산화시키지 않고 DNA / RNA 합성기에서 제거한다. 테트라에틸티우람디술피드 (TETD) (Applied Biosystems) 의 아세토니트릴 용액 5 ml 을 컬럼에 가하고 컬럼을 실온에서 15분간 방치한다. 이어서, 컬럼을 아세토니트릴로 세척하고 합성기에 설치한다.
83(b) 식 83(b) 의 화합물 ;
실시예 83(a) 의 화합물 143 mg (5 μmol) 로 패킹된 컬럼을 사용하는 것 이외는 실시예 1(b) 에 기재된 바와 유사한 방법으로 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 × 15 cm, 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 로 정제한다, 이어서, 실시예 1(b) 에 기재된 바와 유사한 방법으로 처리하여 111 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 비정질 고체로 수득한다. 역상 고속 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 용량 % B, 20분, 선형 구배, 1 ml / 분 ; 260 nm) 로 분석한 결과 시료의 체류시간은 17.72분 이었다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 254.
실시예 84
84(a) 식 84(a) 의 화합물 ;
하기 상세히 기재한 바와 같은 합성에 요구되는 시약을 밀리겐 / 바이오서치 (Milligen / bioserch) 의 시클로 (Cyclone, 상표명) 플러스 (Plus) DNA / RNA 합성기 (Millipore Ltd., Japan) 에 공급한다. 아미디트법용 프로그램 카트리지 (15 μmol) 도 주입한다. 구아노신에 상응하는 β - 시아노에틸 아미디트 용액 대신에 데옥시구아노신 (N-iBu) 메틸 포스폰아미디트 (American Bionetic Inc.) 의 테트라히드로푸란 용액 약 35 mM을 사용한다. 고형 담체로서 실시예 21(a) 의 화합물 143 mg (5 μmol) 이 충진된 공 컬럼 (15.0 μmol) 을 사용하고, 염기서열 GZ (Z 는 실시예 17 에서 정의한 바와 같음) 를 투입하고, 염기 G 와 결합한 후 산처리를 하지 않고 프로그램을 수행하여, 표제 화합물을 수득한다.
84(b) 식 84(b) 의 화합물 ;
실시예 84(a) 의 화합물 143 mg (5 μmol) 로 충진된 컬럼을 사용하는 것을 제외하고 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법을 수행하여, 표제 화합물을 제조한다. 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 에 의해 반응 생성물을 정제한다. 다음. 이를 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 처리하여, 159 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 비결정형 고체로서 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 용적 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 m / 분 ; 260 nm)로 분석한 결과 샘플의 체류시간은 18.03 분이다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254.
실시예 85
85(a) 식 85(a) 의 화합물 :
실시예 21(a) 의 화합물 143 mg (5 μmol) 로 충진된 컬럼을 이용하는 것을 제외하고 실시예 84(a) 에 기재된 것과 유사한 방법을 수행하여, 표제 화합물을 제조한다. 더 구체적으로는, 데옥시구아노신 (N - iBu) 메틸 포스폰아미디트로 커플링한 후, 산화용액에 의해 산화하지 않고 합성기로부터 컬럼을 분리한 다음 테트라에틸티우람 디술피드 (TETD) (Applied Biosystems) 의 아세토니트릴 용액 5 ml 를 컬럼에 첨가한다. 컬럼을 실온에서 15 분간 방치한 후, 아세토니트릴로 세척하고 합성기내에 다시 주입한다.
85(b) 식 85(b) 의 화합물 ;
실시예 85(a) 의 화합물 143 mg (5 μmol) 로 충진된 컬럼을 이용하는 것을 제외하고 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법을 수행하여, 표제 화합물을 제조한다. 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 × 15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 에 의해 반응 생성물을 정제한다. 다음, 이를 실시예 1 (b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 처리하여, 124 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 비결정형 고체로서 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 용적 % B, 20 분 ; 직선 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 로 분석한 결과, 샘플의 체류 시간은 18.07 분이다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 254.
실시예 86
식 86(a) 의 화합물 ;
실시예 21(a) 의 화합물 143 mg (5 μmol) 으로 충진된 컬럼을 사용하고 염기서열 TGGGAGZ (Z 는 실시예 17 에서 정의한 바와 같음) 을 실시예 1(b) 에 기재된 DNA / RNA 합성기로 투입하는 것을 제외하고 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법을 수행하여, 표제 화합물을 제조한다. 역상 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 에 의해 반응 생성물을 정제한다. 다음, 이를 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 처리하여, 54 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 비결정형 고체로서 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A ; 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 15 → 65 용적 %, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 로 분석한 결과, 샘플의 체류시간은 15.20 분이다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 255.
실시예 87
식 87(a) 의 화합물 ;
실시예 21(a) 의 화합물 143 mg (5 μmol) 으로 충진된 컬럼을 사용하는 것을 제외하고 실시예 86 에 기재된 것과 유사한 방법을 수행하여, 표제 화합물을 제조한다. 더 구체적으로, 먼저 3' - 말단에서 G - β -아미디트로 커플링한 후, 산화 용액에 의해 산화시키지 않고 DNA / RNA 합성기로 부터 컬럼을 분리한다, 테트라에틸티우람 디술피드 (TETD) (Applied Biosystems) 의 아세토니트릴 용액 5 ml 를 컬럼에 첨가하고, 컬럼을 실온에서 15 분간 방치한 후, 이를 아세토니트릴로 세척하여 합성기에 주입한다.
역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 20 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 에 의해 반응 생성물을 정제한다. 다음, 이를 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 처리하여, 136 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 비결정형 고체로서 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 부피 % B, 20분 ; 선형 구배 ; 1 ml /분 , 260 nm) 에 의해 분석한 결과 샘플의 체류시간은 18.02 분이다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 254.
실시예 88
식 88(a) 의 화합물 ;
도웩스 (Dowex) 50W-X2 이온 교환 수지 (Dow Chemical Co. 제품의 상표명 ; H - 형 ; 약 1 ml) 를 컬럼에 충진시키고, 20 % v/v 수성 피리딘을 컬럼에 통과시킨 다음, 이를 물로 세척하여 컬럼내에서 수지의 피리디늄 형태를 제조한다. 1N 수산화 나트륨 수용액 3 ml 를 사용하는 것을 제외하고 유사한 방법을 사용하여, 다른 컬럼내에서 수지의 나트륨 형태를 제조한다. 27 OD 를 갖는 실시예 1(b) 의 화합물을 피리디늄 - 형 수지 컬럼 및 나트륨 - 형 수지컬럼의 배합물에 이 순서대로 연속적으로 가한 다음, 컬럼을 물로 용리하여, 27 OD (260nm) 를 갖는 표제 화합물 (나트륨염) 을 비결정형 고체로서 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 nm ; 용리액 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 ∼ 60 용적 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml /분 ; 260 nm)로 분석한 결과, 샘플의 체류시간은 18.12 분이다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 256.
실시예 89
식 89(a) 의 화합물 :
도웩스 50W - X2 이온 교환 수지 (Dow Chemical Co. 제품의 상표명 ; H - 형; 약 1 ml) 를 컬럼에 충진시키고, 20 % v/v 수성 피리딘 3 ml 을 컬럼에 통과시킨 다음, 이를 물로 세척하여 컬럼내에서 수지의 피리디늄 형태를 제조한다. 1N 수산화 나트륨 수요액 3 ml 를 사용하는 것을 제외하고 유사한 방법을 사용하여, 다른 컬럼내에서 수지의 나트륨 형태를 제조한다. 27 OD 를 갖는 실시예 1(b) 의 화합물을 피리디늄 - 형 수지 컬럼 및 나트륨 - 형 수지컬럼의 배합물에 연속적으로 가하고, 컬럼을 물로 세척하여, 표제 화합물 (칼륨염 ; 27 OD (260 nm) 를 가짐 )을 비결정형 고체로서 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 nm ; 용리액 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 용적 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 로 분석한 결과, 샘플의 체류시간은 18.18 분이다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254.
실시예 90
식 90(a) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 - 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 - 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [실시예 7(b) 에 기재된 대로 제조] 를 사용하는 것을 제외하고 실시예 14(a) 에 기재된 것과 유사한 방법을 수행하여, 표제 화합물을 제조한다. 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 10 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 에 의해 반응 생성물을 정제한다. 다음, 이를 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 처리하여, 119 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 비결정형 고체로서 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 용적 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 로 분석한 결과, 샘플의 체류시간은 19.20 분이다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254.
실시예 91
식 91(a) 의 화합물
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 - 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [실시예 7(b) 에 기재된 대로 제조] 를 사용하는 것을 제외하고 실시예 82(b) 에 기재된 것과 유사한 방법을 수행하여, 표제 화합물을 제조한다. 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 10 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 에 의해 반응 생성물을 정제한다. 다음, 이를 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 처리하여, 50 OD (260 nm) 를 갖는 표제 화합물을 비결정형 고체로서 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리액 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 용적 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 로 분석한 결과, 샘플의 체류시간은 19.15 분이다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 254.
실시예 92
식 92(a) 의 화합물 ;
실시예 22(c) 에 기술된 과정과 유사하게 진행하지만, 5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 (실시예 7(b) 에서 기술된 바와 같이 제조됨) 를 사용하여, 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 가역상 실리카겔 컬럼 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 15 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 을 통한 크로마토그래피로 정제한다. 무정형 고체로서 67 OD (260 nm)인 표제화합물을 얻는다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 부피 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 에 의한 분석 결과, 이러한 시료는 19.51 분의 체류 시간을 갖는 것으로 나타났다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 255.
실시예 93
식 93(a) 의 화합물 ;
실시예 16(b) 에 기술된 과정과 유사하게 진행하지만, 5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 (실시예 7(b) 에서 기술된 바와같이 제조됨) 를 사용하여, 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 15 ∼ 50 % 아세토니트릴 ; 선형 기울기 ; 254 nm) 을 통한 크로마토그래피로 정제한다. 무정형 고체로서 96 OD (260 nm) 인 표제 화합물을 얻는다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 용적 % B, 20분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 에 의한 분석 결과, 이러한 시료는 19.26 분의 체류 시간을 갖는 것으로 나타났다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 254.
실시예 94
식 94(a) 의 화합물 ;
실시예 12(c) 에 기술된 과정과 유사하게 진행하지만, 5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 (실시예 7(b) 에서 기술된 바와 같이 제조됨) 를 사용하여, 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 15 → 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 을 통한 크로마토그래피로 정제한다. 무정형 고체로서 97 OD (260 nm) 인 표제 화합물을 얻는다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 용적 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 에 의한 분석 결과, 이러한 시료는 19.16 분의 체류 시간을 갖는 것으로 나타났다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 254.
실시예 95
식 95(a) 의 화합물 ;
실시예 23(a) 에 기술된 과정과 유사하게 진행하지만, 5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 (실시예 7(b) 에서 기술된 바와 같이 제조됨) 를 사용하여, 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 15 ∼ 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 을 통한 크로마토그래피로 정제한다. 무정형 고체로서 83 OD (260 nm) 인 표제 화합물을 얻는다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 × 150 mm ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리제 B ; 아세토니트릴 ; 10 → 60 용적 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 에 의한 분석 결과, 이러한 시료는 19.80 분의 체류 시간을 갖는 것으로 나타났다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 255.
실시예 96
식 96(a) 의 화합물 ;
실시예 15(c) 에 기술된 과정과 유사하게 반복하지만, 125 mg (5 μmol)의 실시예 12(b) 의 화합물로 충전된 컬럼을 사용하고 염기 서열 XGGGGZ (여기서 Z 는 실시예 17 에서 정의한 바와 같다) 를 합성기에 주입한다. 이로써 얻어진 표제 화합물을 함유하는 90 % v/v 포름아미드 수용액을 95℃ 에서 5 분 동안 가열시킨다. 가열후, 용액을 급냉시킨다. 이어서 반응 혼합물을 4 분획으로 분리하고 각각을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil PREP - ODS 20.0 × 250 mm ; 용리제 A ; 0.1 M TEAA, pH 7.0 ; 용리제 B ; 아세토니트릴 ; 10 내지 60 용적 % B, 30 분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 260 nm ; 컬럼 온도 60℃) 로 정제한다.
20.7 분후 용리된 분획을 수거하고 실시예 1(b) 에 기술된 방법과 유사하게 행하여 무정형 고체로서 79 OD (260 nm)의 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트림 (H2O), λmaxnm ; 253.
체류시간 ; 13.22 분
고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS - 2 ; 6 × 150 nm ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 10 ∼ 60 용적 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm).
실시예 97
식 97(a) 의 화합물 ;
실시예 1(b) 에 기술된 과정과 유사하게 반복하지만, 아미디트 병 X 에 실시예 15(b) 의 화합물의 35 mM 아세토니트릴 용액을 서열 XGCGG 를 프로그램으르서 합성기에 주입한다. 이로써 얻어진 표제 화합물을 함유하는 90 % v/v 포름아미드 수용액을 95℃ 에서 5 분 동안 가열시킨다. 가열후, 용액을 급냉시킨다. 이어서 반응 혼합물을 4 분획으로 분리하고 각각을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil PREP - ODS 20.0 ×250 mm ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.0 ; 용리제 B ; 아세토니트릴 ; 10 ∼ 60 용적 % B, 30분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 260 nm ; 컬럼 온도 60℃) 로 정제한다.
21.7 분후 용리된 분획을 수거하고 실시예 1(b) 에 기술된 방법과 유사하게 행하여 무정형 고체로서 123 OD (260 nm) 의 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255,
체류시간 ; 13.58분
고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS - 2 ; 6 × 150 nm ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리제 B ; 아세토니트릴 ; 10 ∼ 60 용적 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm).
실시예 98
식 98(a) 의 화합물 ;
실시예 83(c) 에 기술된 과정과 유사하게 진행하지만, 5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 (실시예 7(b) 에서 기술된 바와 같이 제조됨) 를 사용하여, 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 15∼50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 을 통한 크로로마토그래피로 정제한다. 무정형 고체로서 92 OD (260 nm) 인 표제 화합물을 얻는다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 × 150 mm ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리제 B ; 아세토니트릴 ; 10 ∼ 60 용적 % B, 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 에 의한 분석 결과, 이러한 시료는 19.46 분의 체류 시간을 갖는 것으로 나타났다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254.
실시예 99
식 99(a) 의 화합물 ;
실시예 86 에 기술된 과정과 유사하게 진행하지만, 5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미틸 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 (실시예 7(b) 에서 기술된 바와같이 제조됨) 를 사용하여, 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 (Preparative C18, Waters, 1.5 × 15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 15 ∼ 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 을 통한 크로마토그래피로 정제한다. 그뒤, 실시예 1(b) 에 기재된 바와 유사한 방법으로 실시하여 무정형 고체로서 43 OD (260 nm) 인 표제 화합물을 얻는다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리제 A ; 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 10 ∼ 60 용적 % B, 20 분 ;선형 구배 , 1 ml / 분 ; 260 nm) 에 의한 분석 결과, 이러한 시료는 19.12 분의 체류 시간을 갖는 것으로 나타났다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 254.
실시예 100
식 100(a) 의 화합물 ;
실시예 87 에 기술된 과정과 유사하게 진행하지만, 5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 (실시예 7(b) 에서 기술된 바와 같이 제조됨) 를 사용하여, 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 15 ∼ 50 % 아세토니트릴 ; 선형 구배 ; 254 nm) 을 통한 크로마토그래피로 정제한다. 무정형 고체로서 36 OD (260 nm) 인 표제 화합물을 얻는다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.5 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 10 ∼ 60 용적 % B, 20분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm) 에 의한 분석 결과, 이러한 시료는 19.11 분의 체류 시간을 갖는 것으로 나타났다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255.
실시예 101
식 101(a) 의 화합물 ;
실시예 1(b) 에서 기술된 과정과 유사하게 진행하지만, 아미디트 병 X 내에 5' - O - (3,4 - 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 (실시예 7(b) 에서 기술된 바와 같이 제조됨) 의 35 mM 아세토니트릴 용액을 사용하고 프로그램으로서 염기 서열 XTGGGG 를 합성기에 주입하여, 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 3 분획으로 분리한 후, 각각을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 ×250 mm ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 25 ∼ 55 용적 % B, 30분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 254 nm) 로 정제한다. 19.8 분후 용리된 분획을 수거하여 실시예 1(b) 에 기술된 방법과 유사하게 행한 다음, 무정형 고체로서 173.1 OD (260 nm) 의 표제 화합물을 얻는다.
UV 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 255
체류시간 ; 15.1 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리제 A ; 0.1 M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B ; 아세토니트릴 ; 20 ∼ 50 용적 % B, 30분 ; 선형 구배 ; 2 ml / 분 ; 254 nm).
실시예 102
하기 일반식 102(a) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신 5' - O - (3,4 디벤질옥시벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [실시예 7(b) 에 기재된 대로 제조함] 를 사용하고, 염기 배열 TGGGGG 를 프로그램대로 합성기에 넣는은 것을 제외하고는 상기 실시예 1(b) 와 동일한 과정을 실시하여 표제 화합물을 수득하였다. 반응 생성물을 세부분으로 분할하고, 각각을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 × 256 mm ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 25 → 55 용적 % B, 30분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 254 nm) 에 의해 정제하였다. 17.4 분 이후에 용출된 부분을 모아서 실시예 1(b) 에 기재된 방법과 동일하게 실시하여 무정형 고체의 표제 화합물 120.2 OD (260 nm) 를 수득하였다.
UV 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254.
체류시간 ; 13.1 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 20 ∼ 50 용적 % B, 30 분 ; 선형 구배 ; 2 ml / 분 ; 254 nm).
실시예 103
103(a) 5' - O - [(나프탈렌 - 2 - 일) 메틸)] 티미딘
442 mg (2 mmol) 의 2 - 브로모메틸나프탈렌을 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 6(a) 에 기재된 방법과 동일한 과정을 실시하여 253.1 mg (수율 33 %) 의 표제 화합물을 수득하였다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δ ppm ; 8.12 (1H, brs) ; 7.88 ∼ 7.43 (8H,m), 6.40 (1H, t, J=6.75Hz) ; 4,76 (2H,s) ; 4.61 ∼ 4.54 (1H,m) ; 4.12 ∼ 4.10 (1H,m) ; 3.88 ∼ 3.72 (2H,m) ; 2.40 ∼ 2.20 (2H,m) ; 2.05 (1H, brs) ; 1.58 (3H,s).
103(b) 5' - O - [(나프탈렌 - 2 - 일) 메틸] 티미딘
2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
77 mg (0.2 mmol) 의 5' - O - [(나프탈렌 - 2 - 일) 메틸] 티미딘 [상기 (a) 단계에 기재된 대로 제조함] 을 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 11(b) 에 기재된 방법과 동일하게 실시하여 62.5 mg (수율 54 %) 의 표제 화합물을 수득하였다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δ ppm 7.88 ∼ 7.43 (8H,m) ; 6.39 (1H, t, J=7.26Hz) ; 4.75 (2H, brs) ; 4.68 ∼ 4.60 (1H,m) ; 4,25, 4.20 (둘다 1H, 두개의 brs) ; 3.90 ∼ 3.53 (6H,m) ; 2.68 ∼ 2.18 (4H,m) ; 1 57, 1.55 (둘다 3H, 두개의 s) ; 1.17 (12H, d, J=6.60Hz).
103(c) 식 103(c) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포라이미디트 대신 5' - O - [(나프탈렌 - 2 - 일) 메틸] 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기 (b) 단계에 기재된 대로 제조함] 를 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 1(b) 에 기재된 방법과 동일하게 실시하여 표제 화합물을 제조하였다. 반응 생성물을 세부분으로 분할하고, 각 부분을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 ×250 mm ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 20 ∼ 50 용적 % B, 30분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 254 nm) 에 의해 정제하였다. 12.8 분 이후에 용출된 부분을 모아 상기 실시예 1(b) 에 기재된 방법과 동일하게 실시하여 무정형 고체의 표제 화합물 257.5 OD (260 nm) 를 수득하였다.
UV 스팩트럼 (H2O), λmaxnm ; 255.
체류시간 ; 13.9 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 10 ∼ 40 용적 % B, 30 분 ; 선형 구배 ; 2 ml / 분 ; 254 nm).
실시예 104
104(a) 5' - O - (4 - 페닐벤질) 티미딘
405 mg (2 mmol) 의 4 - 페닐벤질 염화물을 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 6(a) 에 기재된 방법과 동일하게 실시하여 387.8 mg (수율 47 %) 의 표제 화합물을 수득하였다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3+ CD3OD, 4 ; 1 v/v, TMS, 270 MHz), δ ppm ; 7.65 ∼ 7.33 (10H,m) ; 6.37 (1H, t, J=7.26Hz) ; 4.64 (2H,s) ; 4.55 ∼ 4.48 (1H,m) ; 4.13 ∼ 4.09 (1H,m) ; 3.87 ∼ 3.70 (2H,m) ; 2.38 ∼ 2.15 (2H,m) ; 1.63 (3H,s).
104(b) 5' - O - (4 - 페닐벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
82 mg (0.2 mmol) 의 5' - O - (4 - 페닐벤질) 티미딘 [상기의 (a) 단계에 기재된 대로 제조함] 을 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 11(b) 에 기재된 방법과 동일하게 실시하여 71.8 mg (수율 59 %) 의 표제 화합물을 수득하였다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 7.62 ∼ 7.34 (10H,m) ; 6.40 (1H, t, J=6.60Hz) ; 4.70 ∼ 4.60 (3H,m) ; 4.27, 4.20 (둘다 1H, 두개의 brs) ; 3.90 ∼ 3.55 (6H,m) ; 2.67 ∼ 2.57 (2H,m) ; 2.53 ∼ 2.16 (2H,m) ; 1.63(3H,s) ; 1.19 (12H, d, J=6.60Hz).
104(c) 식 104(c) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신 5' - O - (4 - 페닐벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기의 (b) 단계에 기재된 대로 제조함] 를 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 1(b) 에 기재된 방법과 동일하게 실시하여 표제 화합물을 제조하였다. 반응 생성물을 세부분으로 분할하고, 각 부분을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 ×250 mm ; 용리제 A : 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 20 ∼ 50 용적 % B, 30 분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 온도 60℃ ; 254 nm) 에 의해 정제하였다. 16.1 분 이후에 용출된 부분을 모아서 실시예 1(b) 에 기재된 방법과 동일하게 실시하여 무정형 고체의 표제 화합물 281.8 OD (260 nm) 를 수득하였다.
UV 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255.
체류시간 ; 7.1 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리제 A : 0.1 M TEAA. pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 20 ∼ 50 용적 % B, 30 분 ; 선형 구배 ; 2 ml /분 ; 254 nm).
실시예 105
105(a) 5' - O - (2 - 페닐벤질) 티미딘
365 μl (2 mmol) 의 2 - 페닐벤질 브롬화물을 사용하는 점을 제외하고는 상기 실시예 6(a) 에 기재된 방법과 동일하게 실시하여 133.2 mg (수율 16 %) 의 표제 화합물을 수득하였다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.13 (1H, brs) ; 7.50 ∼ 7.28 (10H,m) ; 6.34 (1H, t, J=6.75Hz) ; 4.57, 4,50 (2H, 2 개의 d, J=13.0Hz) ; 4.30 (1H, brs) ; 3.98 (1H, brs) ; 3.73 ∼ 3.52 (2H,m) ; 2.32 ∼ 2.05 (2H,m) ; 1.90 (1H, brs) ; 1.51 (3H,s).
105(b) 5' - O - (2 - 페닐벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
82 mg (0.2 mmol) 의 5' - O - (2 - 페닐벤질) 티미딘 [상기의 (a) 단계에 기재된 대로 제조함] 을 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 11(b) 에 기재된 방법과 동일하게 실시하여 89.9 mg (수율 73 %) 의 표제 화합물을 수득하였다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 7.51 ∼ 7.29 (10H,m) ; 6.36 (1H, t, J=7.92Hz) ; 4.55 ∼ 4.45 (3H,m) ; 4.19, 4.11 (둘다 1H, 2개의 s) ; 3.90 ∼ 3.52 (6H,m) ; 2.66 ∼ 2.54 (2H,m) ; 2.45 ∼ 2.03 (2H,m) ; 1.51 (3H,s) ; 1.19 (12H, d, J=6.60Hz).
105(c) 식 105(c) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신 5' - O - (2 - 페닐벤질) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기의 (b) 단계에 기재된 대로 제조함] 를 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 1(b) 에 기재된 방법과 동일하게 실시하여 표제 화합물을 제조하였다. 반응 생성물을 세부분으로 분할하고, 각 부분을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 ×250 mm ; 용리제 A : 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 20 ∼ 50 용적 % B, 30 분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 온도 60℃ ; 254 nm) 에 의해 정제하였다. 14.8 분 이후에 용출된 부분을 모아서 실시예 1(b) 에 기재된 방법과 동일하게 실시하여 무정형 고체의 표제 화합물 172.2 OD (260 nm) 를 수득하였다.
UV 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 252.
체류시간 ; 6.1 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC-Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리제 A : 0.1 M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 20 ∼ 50 용적 % B, 30 분 ; 선형 구배 ; 2 ml / 분 ; 60℃ ; 254 nm).
실시예 106
106(a) 3' - O - 트리이소프로필실릴 - 5' - O - (4,4' - 디메톡시트리틸) 티미딘
1.485 g (2.73 mmol) 의 5' - O - (4,4' - 디메톡시트리틸) 티미딘 및 0.37 g (5.45 mmol) 의 이미다졸을 우선 감압하에 피리딘과 함께 공비 증류에 의해 건조시킨후, 6 ml 의 디메틸포름아미드에서 용해시킨다. 이 용액에 875 μl (4.09 mmol) 의 트리이소프로필살릴 염화물을 부가하고, 생성한 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 교반 말기에 875 μl 의 트리이소프로필실릴 염화물 및 0.37 g 의 이미다졸을 상기 혼합물에 부가한 후, 만 1 일을 교반하였다. 그후 반응 혼합물을 100 ml 의 에틸 아세트산염으로 희석시키고, 희석시킨 혼합물을 2 번 세척하는데, 매번 100 ml 의 탄산 수소 나트륨 5 % w/v 수용액으로 세척한다. 유기층은 무수의 황산 나트륨상에 건조시키고, 용매는 감압하에 증류 제거하였다. 생성된 잔사물을, 용리제으로 0 ∼ 3 용적 % 의 메탄올을 함유하는 메틸렌 염화물을 사용하고 100 g 의 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 을 통과하는 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하여 표제 화합물 1.861 g (수율 97 %) 을 수득하였다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.08 (1H,s) ; 7.67 (1H,s) ; 7.42 ∼ 6.80 (13H,m) ; 6.39 (1H, t, J=5.94Hz) ; 4.60 ∼ 4.55 (1H,m) ; 4.06 ∼ 4.03 (1H,m) ; 3.79 (6H,s) ; 3.53 ∼ 3.26 (2H,m) ; 2.42 ∼ 2.18 (2H,m) ; 1.50 (3H,s) ; 1.06 ∼ 0.90 (21H,m).
106(b) 3' - O - (트리이소프로필실릴) 티미딘
1.6 ml 의 트리플루오로아세트산을 80 ml 의 클로로포름에서 1.861 g (2.655 mmol) 의 3' - O - 트리이소프로필실릴 - 5' - O - (4,4' - 디메톡시트리틸) 티미딘 [상기의 (a) 단계에 기재된 대로 제조함] 용액에 적가하면서 빙욕에서 냉각시키고 교반하였다. 생성된 혼합물을 10 분 동안 교반한 후, 2 ml 피리딘을 부가하였다. 반응 혼합물을 2 번 세척하였으며, 매번 탄산 수소 나트륨의 5 % w/v 수용액 100 ml 로 세척하였고 무수의 황산 나트륨상에서 건조시켰다. 용매를 감압하에 증류 제거하고, 생성된 잔사물을 용리제으로 4 용적 % 메탄올을 함유하는 메틸렌 염화물을 사용하고 50 g 의 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 을 통과하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 0.9965 g (수율 94 %) 을 수득하였다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.17 (1H, brs) ; 7.36 (1H,s) ; 6.12 (1H, t, J=5.94Hz) ; 4.63 ∼ 4.59 (1H,m) ; 4.03 ∼ 4.00 (1H,m) ; 3.96 ∼ 3.74 (2H,m) ; 2.48 (1H, brs) ; 2.45 ∼ 2.21 (2H,m) ; 1.91 (3H,s) ; 1.15 ∼ 1.00 (21H,m).
106(c) 3' - O - 트리이소프로필실릴 - 5' - O -[(4 - 펜질옥시) 벤질] 티미딘
88 mg (2 mmol) 의 수소화 나트륨 (광물성 기름에서의 55 % w/v 분산액으로)을 2.5 ml 의 테트라히드로푸란에서 398 mg (1 mmol)의 3' - O - (트리이소프로필실릴) 티미딘 [상기의 (b) 단계에 기재된 대로 제조함] 용액에 부가하고, 생성된혼합물을 60℃ 에서 2 시간 동안 지속시킨 후 실온으로 냉각시켰다. 232 mg (1 mmol) 의 4 - 벤질옥시벤질 염화물 및 75 mg (0.5 mmol) 의 요오드화 나트륨을 상기 혼합물에 부가한 후, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 55℃ 에서 8 시간 동안 다시 교반하였다. 교반 말기에, 용매를 감압하에 증류제거하고, 이것이 끝나면, 용매를 감압하에 증류제거하고, 잔류물을 100 ml 의 에틸 아세테이트에 용해시킨다. 얻어진 용액을 매회 100 ml 의 0.01 N 수성 염산으로 2 회 세척한다. 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고, 용매를 감압하에 중류제거한다. 얻어진 잔류물을, 1 ∼ 2 용적 % 의 메탄올을 함유하는 염화 메틸렌을 용리제로 사용하여, 30 g 의 실리카겔 (230 - 400 메쉬) 을 통한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 237 mg (수율 40 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.00 (1H,brs) ; 7.59 (1H, s) ; 7.48 ∼ 6.90 (9H, m) ; 6.36 (1H, t, J=6.60Hz) ; 5.07 (2H, s) ; 4.56 ∼ 4.46 (1H,) ; 4.50 (2H,s) ; 4.07 ∼ 4.03 (1H,m) ; 3.80 ∼ 3.60 (2H,m) ; 2.33 ∼ 2.08 (2H,m) ; 1.56 (3H, s) ; 1.10 ∼ 0.97 (21H,m).
106(d) 5' - O - [(4 - 벤질옥시) 벤질] 티미딘
테트라부틸 암모늄 플루오라이드의 1M 테트라히드로푸란 용액 1.5 ml 를, 테트라히드로푸란 1 ml 중의 3' - O - 트리이소프로필실릴 - 5' - O - [(4 - 벤질옥시) 벤질] 티미딘 [상기 단계 (c) 에 기재된 것과 같이 제조됨] 237 mg (0.4 밀리몰) 의 용액에 첨가하고, 얻어진 혼합물을 실온에서 3 시간 교반한다. 교반이 끝나면, 반응 혼합물로 부터 용매를 감압 증류에 의해 제거하고, 얻어진 잔류물을 100 ml 의 에틸 아세테이트에 용해시킨다. 이 용액을 매회 100 ml 의 포화 염화 나트륨 수용액으로 2회 세척한 다음, 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 감압하에 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을, 1 ∼ 4 용적 % 의 메탄올을 함유하는 염화 메틸렌을 용리제로서 사용하여, 30 g 의 실리카겔 (230 - 400 메쉬) 을 통한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 108.5 mg (수율 61 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.11 (1H, brs) ; 7.56 (1H, s) ; 7.47 ∼ 6.93 (9H, m) ; 6.38 (1H, t, J=7.26Hz) ; 5.06 (2H, s) ; 4.57 ∼ 4.47 (1H, m) ; 4.52 (2H, s) ; 4.10 ∼ 4.06 (1H,m) ; 3.80 ∼ 3.64 (2H,m) ; 2.38 ∼ 2.15 (2H,m) ; 1.67 (3H,s).
106(e) 5' - O - [(4 - 벤질옥시) 벤질] 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
88 mg (0.2 밀리몰) 의 5' - O - [(4 - 벤질옥시) 벤질] 티디민 [상기 단계(d) 에 기재된 바와 같이 제조됨] 을 사용하는 것 이외에는 실시예 11(b) 에 기재된 것과 유사한 절차에 따라서, 104.8 mg (수율 82 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 7.58, 7.56 (둘다 1H, 2개의 s) ; 7.46 ∼ 6.93 (9H, m) ; 6.37 (1H, t, J=6.60Hz) ; 5.06 (2H, s) ; 4.64 ∼ 4.54 (1H,m) ; 4.60, 4.59 (2H, 2s) ; 4.25 ∼ 4.15 (1H,m) ; 3.90 ∼ 3.50 (6H,m) ; 2.66 ∼ 2.54 (2H,m) ; 2.50 ∼ 2.10 (2H, m) ; 1.65 (3H, s) ; 1.18 (12H, d, J=7.26Hz).
106(f) 식 106(f) 의 화합물
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - [(4 - 벤질옥시) 벤질] 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필 포스포르아미디트 [상기 단계 (e) 에 기재된 바와 같이 제조됨] 를 사용하는 것 이외에는 실시예 1(b)에 기재된 것과 유사한 절차에 따라서 표제 화합물을 합성한다. 반응 생성물을 3 분량으로 나누고, 각각의 분량을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 ×250 mm ; 용리제 A : 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 20 → 50 용적 % B, 30 분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 60℃ ; 254 nm) 에 의해 정제한다. 17.0 분후에 용출된 분획을 수집하고, 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 처리하여, 무정형 고체로서의 표제 화합물 208.8 OD (260 nm) 을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254.
체류시간 ; 8.1 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC - Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 0.1MTEAA 의 수용액, pH 7.3 ; 용리제 B ; 아세토니트릴 ; 20 ∼ 50 용적 % B, 30 분, 선형 구배 ; 2 ml / 분 ; 60℃ ; 254 nm).
실시예 107
107(a) 5' - O - (9 - 페닐크산텐 - 9 - 일) 티미딘
피리딘 20 ml 중의 티미딘 484 mg (2 mmol)의 용액에 585 mg (2 밀리몰)의 9 - 클로로 - 9 - 페닐크산텐을 첨가하고, 얻어진 혼합물을 빛을 차단한 채로 실온에서 1 시간 동안 교반한다. 이어서, 반응 혼합물을 200 ml 의 염화 메틸렌으로 희석하고, 희석된 혼합물을 매회 200 ml 의 5 % w/v 탄산 수소 나트륨 수용액으로 2회 세척한다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조시키고, 용매를 감압하에 증류제거한다. 잔류물을, 0 내지 2.5 용적 % 의 메탄올을 함유한 염화 메틸렌을 용리제로서 사용하여, 35 g 의 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 을 통한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써 647.8 mg (수율 65%) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.33 (1H, brs) ; 7.62 (1H, s) ; 7.45 ∼ 7.02 (13H, m) ; 6,36 (1H, t, J=5.94Hz) ; 4.49 ∼ 4.41 (1H,m) ; 4.02 ∼ 3.96(1H, m) ; 3.29 ∼ 3.12 (2H, m) ; 2.52 ∼ 2.24 (2H, m) ; 1.99 (1H, d, J=3.96Hz) ; 1.67 (3H, s).
107(b) 5' - O - (9 - 페닐크산텐 - 9 - 일) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
100 mg (0.2 밀리몰) 의 5' - O - (9 - 페닐크산텐 - 9 - 일) 티미딘 [상기단계 (a) 에 기재된 바와 같이 제조됨] 을 사용하는 것 이외에는 실시예 11(b) 에 기재된 것과 유사한 절차에 따라서, 134.9 mg (수율 99 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm 8.03 (1H, brs) ; 7.69, 7.64 (둘다 1H, 2 개의 s) ; 7.40 ∼ 7.03 (13H,m) ; 6.40 ∼ 6.32 (1H,m) ; 4.58 ∼ 4.47 (1H,m) ; 4.15 ∼ 4.05 (1H,m) ; 3.90 ∼ 3.10 (6H, m) ; 2.82 ∼ 2.28 (4H, m) ; 1.63, 1.62 (둘다 3H, 2개의 s) ; 1.16 (12H, d, J=6.6Hz).
107(c) 식 107(c) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - (9 - 페닐크산텐 - 9 - 일) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기 단계 (b) 에 기재된 것과 같이 제조됨] 를 사용하는 것 이외에는 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 절차에 따라서 표제 화합물을 합성한다. 반응 생성물을 3 분량으로 나누고, 각각의 분량을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 ×250 mm ; 용리제 A : 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 20 ∼ 50 용적 % B, 30분 ; 선형 구배 ; 7 ml /분 ;60℃ ; 254 nm) 에 의해 정제한다. 19.7 분후에 용출된 분획을 수집하고, 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 처리하여, 무정형 고체로서의 표제 화합물 145.6 OD (260 nm) 를 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 249.
체류시간 ; 10.9 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC - Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리제 A : 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 20 - 50 용적 % B, 30분 ; 선형 구배 ; 2 ml / 분 ; 60℃ ; 254 nm).
실시예 108
108(a) 5' -O - (9 - 페닐플루오렌 - 9 - 일) 티미딘
770 mg (2.4 밀리몰) 의 9 - 브로모 - 9 - 페닐플루오렌을 피리딘 10 ml 중의 티미딘 242 mg (1 밀리몰) 의 용액에 첨가하고, 얻어진 혼합물을 100 ℃ 에서 8 시간 동안 교반한다. 교반이 끝나면, 반응 혼합물을 감압하에 증발 농축시키고, 농축물을 100 ml 의 염화 메틸렌에 용해시킨다. 용액을 100 ml 의 탄산수소 나트륨 5 % w/v 수용액으로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조시킨다. 용매를 감압하에 증류제거하고, 얻어진 잔류물을, 1 ∼ 3 용적 % 의 메탄올을 함유한 염화 메틸렌을 용리제로서 사용하여, 30 g 의 실리카겔 (230 - 400 메쉬) 을 통한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써, 194.2 mg (수율 37 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.06 (1H, brs) ; 7.76(1H,s) ; 7.72 ∼ 7.20 (13H, m) ; 6.41 (1H, t, J=6.60Hz) ; 4.64 ∼ 4.58 (1H,m) ; 3.95 ∼ 3.90 (1H, m) ; 3.49 ∼ 3.13 (2H,m) ; 2.45 ∼ 2,38 (2H,m) ; 1.88 (1H, d, J=3.96Hz) ; 1.48 (3H, s).
108(b) 5' - O - (9 - 페닐플루오렌 - 9 - 일) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
105 mg (0.2 밀리몰) 의 5' - O - (9 - 페닐플루오로렌 - 9 - 일) 티미딘 [상기 단계 (a) 에 기재된 바와 같이 제조됨] 을 사용하는 것 이외에는 실시예 11(b) 에 기재된 것과 유사한 절차에 따라서, 110.8 mg (수율 76 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.00 (1H, brs) ; 7.80 (1H, s) ; 7.78 ∼ 7.20 (13H,m) ; 6.44 ∼ 6.37(1H,m) ; 4.72 ∼ 4.62 (1H,m) ; 4.10 ∼ 4.00 (1H, m) ; 3.90 ∼ 3.10 (6H,m) ; 2.75 ∼ 2.34 (4H,m) ; 1.46, 1.45 (둘다 3H, 2개의 s) ; 1.18 (12H, d, J=6.60Hz)
108(c) 식 108(c) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트대신에 5' - O - (9 - 페닐플루오렌 - 9 - 일) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기 단계 (b) 에 기재된 것과 같이 제조됨] 을 사용하는 것 이외에는 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 절차에 따라서 표제 화합물을 합성한다. 반응 생성물을 3 분량으로 나누고 각각의 분량을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil PREP - ODS, 20.0 ×250 nm ; 용리 A : 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 20 - 50 용적 % B, 30분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 60℃ ; 254 nm) 에 의해 정제한다. 19.1 분후에 용출된 분획을 수집하고 실시예 1(b) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 처리하여 무정형 고체로서의 표제 화합물 291.2 OD (260 nm) 를 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255.
체류시간 ; 10.4 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC - Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리제 A : 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 20 - 50 용적 % B, 30분 ; 선형 구배 ; 2 ml / 분 ; 60℃ ; 254 nm)
실시예 109
109(a) 5' - (S - 트리페닐메틸) 티오 - 5' - 데옥시티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포프아미디트
100 mg (0.2 밀리몰) 의 5' - (S - 트리페닐메틸) 티오 - 5' - 데옥시티미딘 [B.S. Sproate, B. Beijer, P. Rider. P. Neuner, Nucleie Acids Res., 15, (12)4837 (1987)] 을 사용하는 것 이외에는 실시예 11(b) 에 기재된 것과 유사한 절차에 따라서, 88 mg (수율 62 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 7.45 ∼ 7.18 (16H,m) ; 6.23 ∼ 6.17 (1H, m) ; 4.31 ∼ 4.20 (1H,m) ; 4.11 ∼ 4.00 (1H,m) ; 3.85 ∼ 3.43 (4H,m) ; 2.62 ∼ 1.98 (4H,m) ; 1.56 (3H, s) ; 1.20 ∼ 1.05 (12H,m).
109(b) 식 109(b) 의 화합물
5' - O - 트리틸미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - (S - 트리페닐메틸) 티오 5' - 데옥시티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기 단계 (a) 에서 기술된 것과 같이 제조] 를 사용하였다는 것만 제외하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 표제 화합물이 합성된다. 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 ×15 cm ; 용리제 A : 50 mM TEAB, pH 7.5 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 20 → 50 % B (용적), 선형 구배 ; 254 nm) 를 통한 크로마토그래피로 정제한 후에 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 무정형 고체로서 122.3 OD (260 nm) 의 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm : 254
체류시간 ; 19.0 분
고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS, 6 ×150 mm ; 용리제 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 10 → 60 % B (용적), 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 60℃ ; 260 nm)
실시예 110
식 110(a) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - O - (9 - 페닐플루오렌 - 9 - 일) 티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [실시예 108(b) 에 기술된 바와 같이 제조] 를 사용하고 합성기에 염기 서열 TGGGG 를 넣는다는 것만을 제외하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여, 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 3 부분으로 분할하고, 각 부분은 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 정제한다. (Inertsil PREP - ODS, 20.0 ×250 mm ; 용리제 A : 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 25 → 55 % B (용적), 30분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 60℃ ; 254 nm). 14.6 분후에 용리된 분획을 수집하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을수행하여 무정형 고체로서 28.3 OD (260 nm) 의 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 256.
체류시간 ; 10.7 분
고성능 액체 크로마토그래피 (YMC - Pack A-312, S-5, 120A, ODS ; 용리제 A : 0.1M TEAA, pH 7.3 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 20 → 50 % B (용적), 30 분 ; 선형 구배 ; 2 ml / 분 ; 60℃ ; 254 nm)
실시예 111
식 111(a) 의 화합물 ;
실시예 12(b) 화합물 125 mg (5 μmol) 로 컬럼을 채우고 염기 서열 XGCGGZ (식중 Z 은 실시예 17 에서 정의된 것과 같다) 을 실시예 1(b) 에서 기술된 DNA / RNA 합성기에 넣었다는 것만 제외하고 실시예 15(c) 에 기재된 것과 유사한 방법으로 수행한다. 이와 같이 하여 수득된 표제 화합물을 함유하는 90 % 포름아미드 수용액을 95℃ 에서 5 분간 가열한다. 가열후, 용액을 서서히 냉각한다. 반응 혼합물을 4 부분으로 분할하고 각각을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil PREP - ODS 20.0 ×250 mm ; 용리제 A : 0.1M TEAA pH 7.0 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ;10 ∼ 60 % B (용적), 30 분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 260 nm ; 컬럼 온도 60℃)로 정제한다. 20.8 분 후에 용리된 분획을 수집하고 실시예 1(b)에서 기술된것과 유사한 방법을 수행하여 무정형 고체로서 82 OB (260 nm) 의 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254.
체류 시간 ; 13.38분
고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS - 2 ; 6 ×150 nm , 용리제 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 10 ∼ 60 m B (용적), 20분, 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm)
실시예 112
112(a) 5' - [(3,4 디벤질옥시) 벤질티오] - 5' 데옥시티미딘
258 mg (1 mmol) 의 5' - 데옥시 - 5' - 메르캅토티미딘을 20 ml 의 아세톤에 가한다. 406 mg (1.2 mmol) 의 3,4 - 디벤질옥시벤질클로라이드 및 1 g 의 무수 탄산 칼륨을 그후 질소 대기하에서 용액에 가한다. 수득한 혼합물은 1 시간 동안 환류하 가열하면서 교반한다. 교반한 침전물을 반응 혼합물로부터 여과하고, 여액은 감압 증류로 여액을 용매로 부터 유리한다. 잔류물은 소량의 염화 메틸렌으로 용해시키고 용리제으로서 메탄올 및 염화 메틸렌의 5 : 95 용적 혼합물을 사용한 10 g 의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 캐러멜상 잔류물을 수득한다. 이 잔류물은 벤젠으로 동결 건조하여 백색 결정으로서 180 mg (수율 32 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.26 (1H, brs) ; 6.78 ∼ 7.46 (14H, m) ; 6.20 (1H, t, J=6.6Hz) ; 5.15 & 5.17 (둘다 4H, 2 개의 s) ; 4.20 ∼ 4.27 (1H,m) ; 3.78 ∼ 3.91 (1H,m) ; 3.67 ∼ 3.68 (2H,m) ; 2.61 ∼ 2.70 (2H,m) ; 2.09 ∼ 2.40 (2H,m) ; 1.91 ∼ 1.92 (3H,m).
112(b) 5' - [(3,4 - 디벤질옥시) 벤질티오] - 5' - 데옥시티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
112 mg (0.2 mmol) 의 5' - [(3,4 - 디벤질옥시) 벤질티오] - 5' - 데옥시티미딘 (상기 단계 (a) 에서 기술된 바와 같이 제조] 을 피리딘으로 공비 중류하여 건조시키고 그후 1 ml 의 염화 메틸렌에 용해한다. 그후 17 mg (0.1 mmol)의 디이소프로필암모늄 테트라졸리드를 용액에 가한다. 그후 70 μl (0.22 mmol) 의 2 - 시아노에틸 N,N,N', N' - 테트라이소프로필포스포로디아미디트를 혼합물에 아르곤 대기하에서 적가한다. 수득한 혼합물을 동일한 대기하에서 3 시간 동안 실온에서 교반한다. 염화 메틸렌을 그후 감압 증류로 제거한다. 수득한 잔류물은 10 ml 의 에틸 아세테이트에 용해시키고 용액은 10 % w/v 탄산 나트륨 수용액 및 염화 나트륨 포화 수용액 순으로 세척한다. 그 수용액을 무수 황산 나트륨 상에서 건조시킨 후 용매는 감압 증류로 제거하고 수득한 잔류물은 용리제으로서 에틸 아세테이트를 사용한 10 g 의 실리카겔 170 ∼ 230 메쉬) 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 캐러멜상 물질로서 115 mg (수율 76 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.16 (1H, brs) ; 6.76 ∼ 7.45 (14H, m) ; 6.23 ∼ 6.29 (1H,m) ; 5.14 ∼ 5.16 (4H,m) ; 4.38 ∼ 4.46 (1H,m) ; 4.08 ∼ 4.16 (1H,m) ; 3.50 ∼ 3.90 (6H,m) ; 2.09 ∼ 2.80 (6H,m) ; 1.91 ∼ 1.93 (3H,m) ; 1.08 ∼ 1.58 (12H,m).
112(c) 식 112(c) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 - 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - [(3,4 - 디벤질옥시) 벤질티오] - 5' - 데옥시티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기 단계 (b) 에서 기재된 바와 같이 제조] 를 사용하였다는 것만 제외하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparative C18, Waters, 1.5 × 150 mm ; 용리제 A : 50 mM 수성트리에틸 암모늄 탄산 수소 완충액 (TEAB) ; pH 7.5 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 15 ∼ 50 % B (용적) ; 선형 구배 ; 260 nm) 으로 정제한다. 표제 화합물을 함유하는 용리된 분획을 수집하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법으로 수행하여 무정형 고체로서 57 OD (260 nm) 의 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 253.
체류시간 ; 16.85 분
고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS-2 ; 6 ×150 nm ; 용리제 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 10 ∼ 60 % B (용적), 20 분 ; 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm).
실시예 113
113(a) 5' - [(안트라센 - 9 - 일) 메틸티오] - 5' - 데옥시티미딘
258 mg (1 mmol) 의 5' - 데옥시 - 5' - 메르캅토티미딘을 20 ml 의 아세톤에 가한다. 그후 272 mg (1.2 mmol) 의 9 - 클로로메틸안트라센 및 1 g 의 무수 탄산 칼륨을 질소 대기하에서 용액에 가한다. 그후 수득한 혼합물을 2 시간 동안 환류하에 가열하면서 교반한다. 침전물을 반응 혼합물로 부터 여거하고 여액은 감압 증류로 용매로 부터 제거한다. 잔류물을 10 ml 의 에탄올로 결정화하여 담황색 결정으로서 156 mg (수율 35 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (d6-DMSO, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.56 (1H,s) ; 8.40 (2H,d, J=8.7Hz) ; 8.09 (2H, d, J=8.2Hz) ; 7.51 ∼ 7.61 (5H, m) ; 6.24 ∼ 6.28 (1H,m) ; 5.43 (1H, brs) ; 4.87 ∼ 4.89 (2H,m) ; 4.24 ∼ 4.25 (1H, t, J=2,7Hz) ; 4.03 ∼ 4.07 (1H, m) ; 3.05 (2H, d, J=6.5Hz) ; 2.07 ∼ 2.29 (2H,m) ; 1.72 ∼ 1.73 (3H,m).
113(b) 5' [(안트라센 - 9 - 일) 메틸티오] - 5' - 데촉시티미딘 -2- 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
74 mg (0.165 mmol) 의 5' - [(안트라센 - 9 - 일) 메틸티오] - 5' - 데옥시티미딘 [상기 단계 (a) 에서 기술된 바와 같이 제조] 을 피리딘으로 공비 증류로 건조하고 그후 1 ml 의 테트라히드로푸란에 용해한다. 0.115 ml (0.659 mmol) 의 N,N - 디이소프로필 - N - 에틸아민을 용액에 가한다. 그후 아르곤 대기하에서 49 μl (0.22 mmol) 의 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필클로로포스포르아미디트를 혼합물에 적가한다. 수득한 혼합물을 동일한 대기하에서 1.75 시간 동안 실온에서 교반한다. 그후 테트라히드로푸란은 감압 증류로 제거한다. 수득한 잔류물을 10 ml 의 에틸 아세테이트에 용해시키고, 용액은 1 % w/v 탄산 나트륨 수용액 및 염화 나트륨 포화 수용액 순으로 세척한다. 용액은 무수 황산 나트륨 상에서 건조하고 그후 용매는 감압하에 증류 제거하고 잔류물은 용리제으로서 에틸 아세테이트를 사용한 10 g 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 컬럼 크로마토그래피하여 포말상 물질로서 표제 화합물 85 mg (수율 79 %)을 수득한다.
1H NHR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 7.26 ∼ 8.43 (10H,m) ; 6.26 ∼ 6.33 (1H,m) ; 4.74 ∼ 4.93 (2H,m) ; 4.32 ∼ 4.42 (1H,m) ; 4.20 ∼ 4.28 (1H,m) ; 3.49 ∼ 3.80 (4H,m) ; 2.89 ∼ 3.11 (2H,m) ; 1.93 ∼ 2.68 (4H,m) ; 1.71 ∼ 1.76 (3H,m) ; 1.08 ∼ 1.22 (12H,m).
113(c) 식 113(c) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - [(안트라센 - 9 - 일) 메틸티오] - 5' - 데옥시티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기 단계 (b) 에서 기술된 바와 같이 제조] 를 사용하였다는 것만 제외하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Preparstive C18, Waters, 1.5 × 150 mm 용리제 A : 5 mM TEAB ; pH 7.5 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 15 ∼ 50 % B (용적) ; 선형 구배 ; 260 nm) 로 정제한다. 표제 화합물을 함유하는 용리된 분획을 수집하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 무정형 고체로서 30 OD(260 nm) 의 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 255.
체류시간 ; 13.52 분
고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS - 2 ; 6 × 150 nm ; 용리제 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리제 B : 아세토니트릴 ; 10 ∼ 60 % B (용적), 20 분, 선형구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm).
실시예 114
114(a) 5' - [(2 - 나프틸) 메틸티오] - 5' - 데옥시티미딘
258 mg (1 mmol) 의 5' - 데옥시 - 5' - 메르캅토티미딘을 20 ml 의 아세톤에 가한다. 265 mg (1.2 mmol) 의 2 - 브로모메틸나프탈렌 및 1 g의 무수 탄산 칼륨을 아르곤 대기하에서 용액에 가한다. 수득한 혼합물을 2 시간 동안 환류하에 가열하면서 교반한다. 교반후, 침전물을 반응 혼합물로부터 여거하고, 여액은 감압 증류로 용매를 제거한다. 잔류물은 10 ml 의 에탄올로 결정화 하여 백색 결정으로서 100 mg (수율 25 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (d6-DMSO, 270 MHz, TMS), δppm ; 7.84 ∼ 7.90 (1H, brs) ; 7.78 (1H, s) ; 7.46 ∼ 7.53 (4H,m) ; 6.16 ∼ 6.19 (1H,m) ; 5.34 (1H, d, J=4.4Hz) ; 4.14 ∼ 4.19 (1H,m) ; 3.92 ∼ 3.99 (2H,m) ; 3.83 ∼ 3.87(1H,m) ; 2.62 ∼ 2.78 (2H,m) ; 2.02 ∼ 2.23 (2H,m) ; 1.75 ∼ 1.79 (3H,m)
114(b) 5' - [(2 - 나프틸) 메틸티오] - 5' - 데옥시티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
79.7 mg (0.2 mmol) 의 5' - [(2 - 나프틸) 메틸티오] - 5' - 데옥시티미딘 [상기 단계 (a) 에서 기술된 바와 같이 제조] 을 피리딘과 함께 공비 증류로 건조하고 그후 2.5 ml 의 테트라히드로푸란에 용해한다. 0.084 ml (0.48 mmol) 의 디이소프로필아민을 그후 용액에 가한다. 이어서 아르곤 대기하에서 54 μl (0.24 mmol) 의 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필클로로포스포르아미디트를 혼합물에적가한다. 수득한 혼합물을 동일한 기압하에서 1.75 시간 동안 실온에서 교반한다. 그후 테트라히드로푸란을 감압 증류로 제거한다. 수득한 잔류물을 10 ml 의 에틸 아세테이트에 용해시키고 용액은 10 % w/v 탄산 나트륨 수용액 및 염화 나트륨 포화 수용액 순으로 세척한다. 이어서 용액을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조하고, 그후 용매는 감압하에 유거하고 용리제로서 에틸 아세테이트를 사용하여 10 g 의 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 포말상 물질로서 67 mg (수율 56 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δppm ; 8.32 (1H,brs); 7.26 ∼ 7.85 (8H, m) ; 6.27 (1H,m) ; 4.38 ∼ 4.46(1H,m) ; 4.11 ∼ 4.19 (1H,m) ; 3.93 ∼ 3.95 (2H,m) ; 3.47 ∼ 3.90 (4H,m) ; 2.10 ∼ 2.88 (6H,m) ; 1.62 ∼ 1.90 (3H,m); 1.10 ∼ 1.21 (12H, m).
114(c) 식 114(c) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5' - [(2 - 나프틸) 메틸티오] - 5' - 데옥시티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포라미티드 [상기 단계 (b) 에 기재된 대로 제조] 를 사용한다는 것만 제외하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여, 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물은 역상 실리카겔 컬럼 (Preparative C18, Waters, 1.5×150 mm ; 용리액 A : 50 mM TEAB ; pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 15∼50 % B (부피) ; 선형구배 ; 260 nm) 크로마토그래피로 정제한다. 표제 화합물을 함유하는 용리된 분획을 수집하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 동일한 방법을 수행하여 무정형 고체로서 165 OD (260 nm) 의 표제 화합물을 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 254.
체류 시간 ; 12.07 분
고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil ODS - 2 ; 6 ×150 nm ; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B : 아세토니트릴 ; 10 ∼ 60 % B (부피), 20 분, 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm).
실시예 115
115(a) 5' - {3,5 - 비스 [3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시] 벤질티오} - 5' - 데옥시티미딘
258 mg (1 mmol) 의 5' - 데옥시 - 5' - 메르캅토티미딘을 20 ml 의 아세톤에 가한다. 969 mg (1.2 mmol)의 3,5 - 비스 [3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시] 벤질브로마이드 및 1 g 의 무수 탄산 칼륨을 그후 아르곤 대기하에서 용액에 가한다. 수득한 혼합물은 2 시간 동안 환류하에 가열하면서 교반한다. 교반후, 침전물은 반응 혼합물로 부터 여거하고, 여액은 감압 증류로 용매로부터 제거한다. 잔류물은 벤젠으로부터 냉동 건조하여 백색 분말로서 365 mg (수율 37 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δ ppm ; 7.99 (1H, brs) ; 7.23 ∼ 7.42 (21H,m) ; 6.49 ∼ 6.68 (9H,m) ; 4.98 ∼ 5.03 (12H,m) ; 4.18 ∼ 4.26 (1H,m) ; 3.87 ∼ 3.91 (1H,m) ; 3.64 ∼ 3.71 (2H,m) ; 2.67 (2H, d, J=5.7Hz) ; 2.00 ∼ 2.64 (2H,m) ; 1.86 ∼ 1.92 (3H,m).
115(b) 5' - {3,5 - 비스 [3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시] 벤질티오} - 5' - 데옥시티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트
197 mg (0.2 mmol) 의 5' - {3,5 - 비스 [3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시] 벤질티오} - 5' - 데옥시티미딘 [상기 단계 (a) 에서 기술된 바와 같이 제조] 을 피리딘으로 공비 증류하여 건조하고 그후 1 ml 의 염화 메틸렌에 용해한다. 그후 0.017 g (0.1 mmol) 의 디이소프로필 암모늄 테트라졸리드를 용액에 가한다. 아르곤 대기하에서 2 - 시아노에틸 N,N,N',N' - 테트라이소프로필포스포로디아미디트 70 μl (0.22 mmol) 을 그후 혼합물에 적가한다. 수득한 혼합물은 동일한 대기하에서 3 시간 실온에서 교반한다. 그후 테트라히드로푸란을 감압 증류로 제거한다. 수득한 잔류물은 10 ml 의 에틸 아세테이트에 용해하고, 용액은 10 % w/v 탄산 나트륨 수용액 및 염화 나트륨 포화 수용액 순으로 세척한다. 이어서 용액을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조하고, 그후 용매는 감압 증류로 제거하고, 잔류물은 용리액으로서 에틸 아세테이트를 사용한 10 g 의 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 캐러멜상 물질 표제 화합물 103 mg (수율 43 %) 을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δ ppm ; 7.27 ∼ 7.44 (20H,m) ; 6.51 ∼ 6.69 (10H,m) ; 4.98 ∼ 5.05 (12H,m) ; 4.44 ∼ 4.51 (1H,m) ; 4.13 ∼ 4.18 (1H,m) ; 3.47 ∼ 3.87 (6H,m) ; 2.17 ∼ 2.84 (6H,m) ; 1.92 (3H,s) ; 1.08 ∼ 1.34 (12H,m).
115(c) 식 115(c) 의 화합물 ;
5' - O - 트리틸티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 대신에 5'- {3,5 - 비스 [3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시] 벤질티오] - 5' - 데옥시티미딘 2 - 시아노에틸 N,N - 디이소프로필포스포르아미디트 [상기 단계 (b) 에 기재된 대로 제조] 를 사용한다는 것만 제외하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 표제 화합물을 제조한다. 반응 생성물을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil PREP - ODS 20.0 ×250 mm ; 용리액 A ; 0.1M TEAA pH 7.0; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 30 ∼ 100 % B (부피), 30 분 ; 선형 구배 ; 7 ml / 분 ; 260 nm ; 컬럼 온도 60℃) 로 정제한다. 26.5 분 후에 용리된 분획을 수집하고 실시예 1(b) 에서 기술된 것과 유사한 방법을 수행하여 무정형 고체로서 표제화합물 86 OD (260 nm) 를 수득한다.
UV 흡수 스펙트럼 (H2O), λmaxnm ; 257.
체류 시간 ; 18.44 분
고성능 액체 크로마토그래피 (Inertsil OBS - 2 ; 6 × 150 nm ; 용리액 A : 0.1M TEAA, pH 7.5 ; 용리액 B ; 아세토니트릴 ; 40 ∼ 100 % B (부피), 25 분, 선형 구배 ; 1 ml / 분 ; 260 nm).
제조예
하기 제조예는 본 발명의 화합물의 제조를 위한 다른 출발 물질의 제조를 나타낸다.
제조예 1
2 - [2 - O - (4,4' - 디메톡시트리틸옥시) 에틸술포닐] 에틸 모노숙시네이트
1.37 g (3.0 mmol) 의 2 - [2 - O - (4,4' - 디메톡시트리틸옥시) 에틸술포닐] 에탄올 [Tetrahedron Lett. 27, 4705 (1986)] 을 피리딘으로 감압하에 공비 증류로 건조하고 이어서 12 ml 의 염화 메틸렌에 용해시킨다. 315 mg (3.15 mmol) 의 숙신산 무수물 및 384 mg (3.15 mmol) 의 4 - (디메틸아미노) 피리딘을 수득한 용액에 가하고 그후 30 분간 교반한다. 박층 크로마토그래피로 반응 완결을 확인한후, 80 ml 의 염화 메틸렌을 반응 혼합물에 가한다. 이어서 수득한 혼합물을 0.5 M 인산 이수소 칼륨 수용액 (pH 5.0) 및 물 순서로 세척하고, 유기층은 무수 황산 나트륨상에서 건조한다. 이어서 용매를 감압증류로 제거하여 1.60 g (수율 96 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1H NMR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δ ppm ; 7 40 ∼ 6.83 (13H,m) ; 4.58 ∼ 4.53 (2H, t, J=5.94Hz) ; 3.79 (6H,s) ; 3.68 ∼ 3.64 (2H,t, J=5.61H2) ; 3.50 ∼ 3.45 (2H. t, J=5.94Hz) ; 3.18 ∼ 3.14 (2H, t, J=5.61Hz) ; 2.71 ∼ 2.61 (4H,m).
제조예 2
식 2(p) 의 화합물 ;
1.60 g (2.87 mmol) 의 2 - [2 - O - 4,4' - 디메톡시트리틸옥시) 에틸술포닐] 에틸 모노숙시네이트 (제조예 1 에서 기술된 바와 같이 제조) 를 18 ml 의 디메틸포름아미드에 용해하고 0.96 g (3.6 mmol)의 펜타클로로페논 및 0.96 g (4.5 mmol) 의 1.3 - 디시클로헥실카르보디이미드를 수득한 용액에 가하고 이것을 18 시간 동안 교반한다. 침전된 불용물을 여과로 분리하고 용매는 감압 증발로 여액으로 부터 제거한다. 벤젠을 잔류물에 가하고 침전된 불용물을 여과로 더 분리한다. 용매는 다시 감압 증발로 여액으로 부터 제거한다.
잔류물 (0.16 g, 0.2 mmol) 을 4 ml 의 디메틸포름아미드에 용해시키고 15μl (0.11 mmol) 의 트리에틸아민 및 1.0 g 의 아미노프로필 - CPG (85.7 μmol / g 의 아미노기를 거기에 도입한다) 를 용액에 가하고 그후 실온에서 24 시간 동안 방치한다. 그후, CPG 담체는 여과로 수집하고, 염화 메틸렌으로 세척하고 이어서 감압 증발로 건조한다. 캡 A 및 B 용액 (Nippon Millipor Limited) 각기 5 ml 를 CPG 담체에 가하고 혼합물은 5 분간 방치한다. 그후 혼합물을 피리딘 및 염화 메틸렌 순으로 세척하고 감압하에서 증발로 제거하여 표제 화합물을 수득한다.
표제 화합물에 도입되는 제조예 1 의 화합물의 양은 하기 방법에 따라 측정된다. 데블록 (deblock) 용액 (염화 메틸렌에 있는 3 부피 % 디클로로아세트산 용액) 을 11.4 mg 의 표제 화합물에 가하고, 혼합물은 3 분간 진탕한후, 충분한 염화 메틸렌을 가하여 총 20 ml 의 양이 되도록 한다. 0.4 ml 의 용매를 유거한 후, 에탄올 중에 있는 과염소산 3 : 2 부피 용액 3 ml 을 잔류물에 가하고 500 nm 에서 디메톡시트리틸 양이온의 흡수를 측정한다 (ε = 71700).
도입한 디메톡시트리틸 기의 양은 53.1 μmol /g 이다.
제조예 3
2- [2 - O - (4,4' - 디메톡시트리틸옥시) 에틸술포닐] 에틸 2,2,2 - 트리클로로에톡시카르보네이트
1.1 g (2.4 mmol) 의 2 - [2 - O - 4,4' - 디메톡시트리틸옥시) 에틸술포닐] 에탄올 [Tetrahedron Lett. 27, 4705 (1986)] 을 피리딘으로 감압하에 공비 중류하여 건조하고 이어서 12 ml 의 염화 메틸렌에 용해한다. 0.35 ml (2.6 mmol) 의 2,2,2 - 트리클로로에톡시카르보닐 클로라이드를 용액에 가하고, 그후 2 시간 동안교반한다. 박층 크로마토그래피로 반응 완결을 확인한후, 반응 혼합물은 100 ml 의 염화 메틸렌 및 100 ml 의 5 % w/v 탄산 수소 나트륨 수용액의 혼합물에 부어 상 분리를 수행한다. 유기층은 5 % w/v 탄산 수소 나트륨 수용액으로 세척하고, 그후 수집하여 무수 황산 나트륨 상에서 건조한다. 이어서 용매는 감압 증류로 제거하고 잔류물은 역상 컬럼 크로마토그래피(Preparative C18, Waters, ø 2.2 ×7.0 cm, 용매 ; 60 % v/v 수성 아세토니트릴)로 정제하여 무정형 분말로서 표제 화합물 1.35 g (수율; 89 %) 을 수득한다.
1H NMR 스택트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δ ppm ; 7.41 ∼ 6.83 (13H,m) ; 4.75 (2H, s) ; 4.70 ∼ 4.66 (2H, t, J=5.94Hz) ; 3.80 (6H,s) ; 3.68 ∼ 3.64 (2H, t, J=5.28Hz) ; 3.61 ∼ 3.56 (2H, t, J=6.27 Hz) ; 3.23 ∼ 3.19 (2H, t, J=5.28Hz).
제조예 4
식 4(p) 의 화합물 :
0.126 g (0.2 mmol) 의 2 - [2 - O - (4,4' - 디메톡시트리틸옥시) 에틸술포닐] 에틸 2,2,2 - 트리클로로에톡시카르보네이트 (제조예 3 에서 기술된 바와 같이 제조) 를 5 ml 의 디메틸포름아미드에 용해시키고 15 μl (0.11 mmol) 의 트리에틸아민 및 1.0 g 의 아미노프로필 - CPG (85.7 μmol / g 의 아미노기를 거기에 도입한다) 을 수득한 용액에 가하고 1 % v/v 디메틸포름아미드중 트리에틸아민 용액으로 세척한다. 그후 혼합물은 4 일간 실온에서 방치한다. 그후, CPG 담체를 여과로 수집하고 염화 메틸렌으로 세척한후 감압 증발로 건조한다. 캡 A 및 B 용액 (Nippon Millipore Limited) 각 5 ml 를 CPG 담체에 가하고 혼합물은 5 분간 방치한다. 혼합물을 피리딘 및 염화 메틸렌 순으로 세척하고 감압 증발로 건조하여 표제 화합물을 수득한다.
표제 화합물에 도입된 제조예 3 의 화합물의 양은 하기 방법에 따라 측정한다. 데블록 용액 (염화 메틸렌에 용해된 3 % v/v 디클로로아세트산 용액, Nippon Millipore Limited) 을 표제 화합물 11.4 mg 에 가하고 혼합물을 3 분간 진탕한 후, 충분한 염화 메틸렌올 20 ml 의 총량이 되도록 가한다. 0.4 ml 의 용매를 유거한 후 에탄올에 용해된 과염소산 3 : 2 부피 용액 3 ml 를 잔류물에 가하고 500 nm 에서 디메톡시트리틸 양이온의 흡수도를 측정한다 (ε = 71700).
도입된 디메톡시트리틸 기의 양은 24.0 μmol / g 이었다.
제조예 5
식 5(p) 의 화합물 ;
1.60 g (2.87 mmol) 의 2 - [2 - O - (4,4' - 디메톡시트리틸옥시) 에틸술포닐] 에틸 모노숙시네이트 (제조예 1 에서 기술된 바와 같이 제조) 를 18 ml 의 디메틸포름아미드에 용해하고, 0.96 g (3.6 mmol) 의 펜타클로로페놀 및 0.96 g (4.5 mmol) 의 1,3 - 디시클로헥실카르보디이미드를 용액에 가한다. 그후 수득한 혼합물을 18 시간 동안 실온에서 교반한다. 교반후, 침전물을 반응 혼합물로 부터 여거하고, 여액은 감압 증류로 용매로 부터 유리한다. 벤젠을 잔류물에 가한다. 수득한 침전물을 여거하고, 여액은 다시 감압 증류로 용매로부터 다시 유리한다. 1.0 g (0.92 mmol)의 잔류물이 하기 단계에서 사용된다.
이 잔류물 1.0 g (0.92 mmol), 트리에틸아민 75 μl (0.55 mmol) 및 코스모실 150 NH2- 300 (실리카겔 표면 1 g 당 450 μmol 의 아미노기를 갖는다 ; Nacalai Tesque Co. Ltd 제조) 을 디메틸포름아미드 20 ml 에 가한다. 수득한 혼합물을 그후 실온에서 20 시간 교반한다. 소망하는 담체, 즉 치환 코스모실 150 NH2- 300 을 수집하고 염화 메틸렌으로 세척하고 감압 증발로 건조한다. 캡 A 및 B 용액 (Nippon Millipore Limited) 각각 10 ml 를 담체에 가하고, 혼합물을 10 분간 실온에서 방치한다. 그후 혼합물을 피리딘 및 염화 메틸렌 순으로 세척하고 감압 증발로 건조하여 표제 화합물을 수득한다.
표제 화합물에 도입되는 제조예 1 의 화합물의 양은 하기 방법에 따라 측정한다. 데블록 용액 (염화 메틸렌에 용해된 3 % v/v 디클로로아세트산 용액, Nippon Millipore Limited) 을 5.4 mg 의 표제 화합물에 가하고, 혼합물을 3 분간 진탕한후 충분한 염화 메틸렌을 총량 20 ml 가 되도록 가한다. 0.4 ml 의 용매를 감압하에 유거하고 에탄올에 용해된 과염소산의 3 : 2 부피 용액 3 ml 를 잔류물에 가하고 500 nm 에서 디메톡시트리틸 양이온의 흡광도를 측정한다 (ε = 71700).
도입한 디메톡시트리틸기의 양은 51.8 μmol / g 인 것으로 나타났다.
제조예 6
식 6(p) 의 화합물 ;
18 ml 의 디메틸포름아미드에 1.60 g (2.87 mmol) 의 2 - [2 - O - (4,4' - 디메톡시트리틸옥시) 에틸술포닐] 에틸 모노숙시네이트 (제조예 1 에서 기술된 바와 같이 제조) 를 용해시키고 0.96 g (3.6 mmol) 의 펜타클로로페놀 및 0.96 g (4.5 mmol) 의 1,3 - 디시클로헥실 카르보디이미드를 용액에 가한다. 그후 수득한 혼합물을 실온에서 18 시간 교반한다. 교반후, 침전물은 반응 혼합물로부터 여거하고 여액을 감압 증류하여 용매를 제거한다. 벤젠을 잔류물에 가한다. 수득한 침전물은 여거하고 여액을 감압 증류하여 용매를 제거한다. 0.48 g (0.6 mmol)의 잔류물이 하기 단계에서 사용된다.
이 잔류물 0.48 g (0.6 mmol), 4 - (디메틸아미노) 피리딘 110 mg (0.9 mmol) 및 1.0 g 의 p - 알콜시벤질 알콜 수지 (실리카겔 표면 1 g 당 0.9 mmol 의 아미노기 ; Kokusan Kagaku Co. Ltd.) 를 15 ml 의 디메틸포름아미드에 가하고 수득한 혼합물을 실온에서 25 시간 교반한다. 교반후, 소망하는 담체, 즉 치환 p -알콕시벤질 알콜 수지를 수집하고, 염화 메틸렌, 메탄올, 및 디에틸에테르 순으로 세척하고 감압 증발로 건조한다. 캡 A 및 B 용액 (Nippon Millipore Limited) 각 10 ml 를 담체에 가하고 혼합물은 15 분간 방치한다. 그후 혼합물은 염화 메틸렌, 메탄올 및 디에틸에테르 순으로 세척하고 감압 증발로 건조하여 표제 화합물을 수득한다.
표제 화합물에 도입되는 제조예 1 의 화합물의 양은 하기 방법으로 측정된다. 데블록 용액 (염화 메틸렌에 용해된 3 % v/v 디클로로아세트신 용액, Nippon Millipore Limited) 을 10.6 mg 의 표제 화합물에 가하고, 혼합물은 3분간 교반한 후 충분한 염화 메틸렌을 가하여 20 ml 의 총량이 되도록 한다. 0.4 ml 의 용매를 유거하고 이어서 에탄올에 용해된 과염소산 3 : 2 부피 용액 6 ml 를 잔류물에 가하고 500 nm 에서 디메톡시트리틸 양이온의 흡광도를 측정한다 (ε = 71700).
도입되는 디메톡시트리틸 기의 양은 302 μmol / g 인 것으로 나타났다.
제조예 7
식 7(p) 의 화합물 ;
9.9 g (3.3 mmol) 의 폴리 (옥시에틸렌) 디글리콜을 피리딘으로 공비 증류하여 건조하고 그후 10 ml 의 염화 메틸렌에 용해한다. 226 mg (1.1 mmol)의 1,3 - 디시클로헥실카르보디이미드를 용액에 빙냉하면서 가한다. 그후 수득한 혼합물을15 분간 빙냉하면서 교반한다. 교반후 0.5 g (1.1 mmol)의 2 - [2 - O - (4,4' - 디메톡시트리틸옥시) 에틸술포닐] 에탄올 [Tetrahedron Lett., 27, 4705 (1986)] 및 0.13 g (1.1 mmol) 의 4 - (디메틸아미노) 피리딘을 함유하는 2 ml 의 염화 메틸렌 용액을 상기 용액에 가한다. 수득한 혼합물을 실온에서 18 시간 교반한다. 침전물을 여거한다. 그후 반응 혼합물은 감압 증발로 50 ml 까지 농축한다. 그후 500 ml 의 차가운 디에틸 에테르를 농축 용액에 가하고 수득한 침전물을 수집하고 감압 증발로 건조한다. 수득한 침전물을 용리액으로서 메탄올 대 염화 메틸렌의 2 : 8 부피 혼합물을 사용하여 200 g 의 실리카겔 (70 - 230 메쉬) 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 2.77 g (수율 72 %) 의 표제 화합물을 수득한다.
1HNR 스펙트럼 (CDCl3, 270 MHz, TMS), δ ppm ; 7.09 ∼ 7.43 (m) ; 6.81 ∼ 6.88 (m) ; 4.58 ∼ 4.64 (m) ; 3.65 (s) ; 3.50 ∼ 3.53 (m) ; 3.46 ∼ 3.49 (m) ; 3.31 ∼ 3.34 (m).
제조예 8
식 8(p) 의 화합물 ;
0.7 g (0.2 mmol) 의 제조예 7 의 화합물을 6 ml 의 염화 메틸렌에 용해하고 63 mg (0.24 mmol) 의 펜타클로로페놀 및 64 mg (0.3 mmol) 의 1,3 - 디시클로헥실카르보디이미드를 함유하는 디메틸포름아미드 용액 2 ml 를 빙냉하면서 용액에 가한다. 그후 수득한 용액을 실온에서 7 일간 교반한다. 교반후 침전물을 반응 혼합물로 부터 여거하고, 여액은 감압 증류하여 용매를 제거한다. 수득한 잔류물은 10 ml 의 염화 메틸렌에 용해한다. 용액에 100 ml 의 디에틸 에테르를 빙냉하면서 가하고 수득한 침전물을 여거한다. 여액은 감압 증류로 용매를 제거한다. 여액, 37 mg (0.3 mmol) 의 4 - (디메틸아미노) 피리딘 및 0.25 g 의 p - 알콕시벤질알콜 수지 (1 g 의 실리카겔 표면당 0.9 mmol 의 아미노기를 갖는다 ; Kokusan Kagaku Co. Ltd 제조) 를 6 ml 의 디메틸포름아미드에 가한다. 수득한 혼합물을 실온에서 24 시간 방치한다. 소망하는 담체, 즉 치환 p - 알콕시벤질알콜수지를 수집하고 피리딘, 염화 메틸렌 및 디에틸 에테르 순으로 세척하고 감압 증발로 건조한다. 캡 A 및 B 용액 (Nippon Millipore Limited) 각 10 ml 를 담체에 가하고 혼합물은 15 분간 방치한다. 그후 혼합물을 염화 메틸렌, 메탄올 및 디에틸에테르 순으로 세척하고 감압 증발로 건조하여 표제 화합물을 수득한다.
표제 화합물에 도입된 제조예 1 의 화합물의 양은 하기 방법으로 측정한다. 데블록 용액 (염화 메틸렌에 용해된 3 % v/v 디클로로아세트산 용액, Nippon Millipore Limited) 을 6.7 mg의 표제 화합물에 가하고 혼합물을 3 분간 진탕한후 충분한 염화 메틸렌을 가하여 총량이 20 ml 가 되도록 한다. 감압 증류로 0.4 ml 의 용매를 제거하고 이어서 에탄올에 용해된 과염소산 3 : 2 부피 용액 20 ml 를 잔류물에 가하고 500 nm 에서 디메톡시트리틸 양이온의 흡광도를 측정한다 (ε = 71700).
도입된 디메톡시트리틸 기의 양은 16 μmol / g 인 것으로 나타났다.
제형예 1
주사제
실시예 25 의 화합물 1.5 중량 % 를 프로필렌 글리콜 10 부피 % 에서 교반하고, 충분한 양의 주사액용 물을 가하여 필요로 하는 최종 부피가 되게 하고 살균하여 주사제를 제조한다.
제형예 2
입제
각기 100 mg의 성분을 함유하는 입제는 상기 항목 제 1 내지 4 의 분쇄 혼합물을 항목 5 내지 8 의 예비 과립 혼합물에 가하고 이어서 적당한 타정기 상에서 생성된 혼합물을 압축하여 제조된다.
제형예 3
캡슐제
통상의 방법에 따라 상기 성분 200 mg 을 함유하는 캡슬을 적당한 혼합기에서 성분의 혼합물을 분쇄하고, 스크린을 통해 혼합물을 통과시키고 최종적으로 잘 혼합하여 제조된다.
제형예 4
경질 캡슐제
100 mg 의 실시예 25의 분말 화합물, 150 mg 의 락토스, 50 mg 와 셀룰로스 및 6 mg 의 스테아르산 마그네슘을 혼합하고, 상기 혼합물을 표준 2 - 조각 경질 젤라틴 캡슐에 충진하고 세척한 후 최종적으로 건조하여 단위 캡슐을 제조한다.
제형제 5
연질 캡슐제
소화성 오일 (대두유, 면실유, 또는 올리브유 등) 에 실시예 25 의 화합물을 혼합하고, 모터 펌프로 적당한 젤라틴 캡슐에 이 혼합물을 충진하고 세척하고 최종적으로 건조하여 100 mg의 유효 성분을 함유하는 연질 캡슐이 제조된다.
제형예 6
입제
통상적인 방법에 따라, 실시예 25의 화합물 100 mg, 콜로이드 이산화 규소 0.2 mg, 스테아르산 마그네슘 5 mg, 미세 결정성 셀룰로스 275 mg, 전분 11 mg 및 락토스 98.8 mg 의 혼합물을 입제화 하여 입제를 제조한다.
[서열표]
서열 동정 번호 : 1
서열 길이 : 4
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
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서열 : TGGG
서열 동정 번호 : 2
서열 길이 : 5
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
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서열 : TGGGG
서열 동정 번호 : 3
서열 길이 : 5
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : TGGGA
서열 동정 번호 : 4
서열 길이 : 6
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
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안티 - 센스 : 없음
서열 : TGGGAG
서열 동정 번호 : 5
서열 길이 : 7
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : TGGGAGG
서열 동정 번호 : 6
서열 길이 : 7
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
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서열 : CGGGAGG
서열 동정 번호 : 7
서열 길이 : 7
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : TTGGAGG
서열 동정 번호 : 8
서열 길이 : 7
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
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서열 : TGCGAGG
서열 동정 번호 : 9
서열 길이 : 7
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
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서열 : GGGGAGG
서열 동정 번호 : 10
서열 길이 : 7
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
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서열 : mCGGGAGG
서열 동정 번호 : 11
서열 길이 : 7
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
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서열 : mCGmCGAGG
서열 동정 번호 : 12
서열 길이 : 8
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : TTGGGAGG
서열 동정 번호 : 13
서열 길이 : 8
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : CTGGGAGG
서열 동정 번호 : 14
서열 길이 : 5
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
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서열 : CTCGT
서열 동정 번호 : 15
서열 길이 : 5
서열형 : 핵산
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형태 : 선형
가정 서열 : 없음
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서열 : CTCGC
서열 동정 번호 : 16
서열 길이 : 5
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서열 : CTCGG
서열 동정 번호 : 17
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서열 : CGGGT
서열 동정 번호 : 18
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서열 : CGGGC
서열 동정 번호 : 19
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가닥형 : 단일
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서열 : CGGGG
서열 동정 번호 : 20
서열 길이 : 5
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
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서열 : CGCGT
서열 동정 번호 : 21
서열 길이 : 5
서열형 : 핵산
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서열 : CGCGC
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서열 길이 : 5
서열형 : 핵산
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형태 : 선형
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서열 : CGCGG
서열 동정 번호 : 23
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서열형 : 핵산
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서열 : TTGGC
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서열 : TTGGG
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서열 : TTCGA
서열 동정 번호 : 28
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서열 : TTCGT
서열 동정 번호 : 29
서열 길이 : 5
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가닥형 : 단일
형태 : 선형
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서열 : TTCGC
서열 동정 번호 : 30
서열 길이 : 5
서열형 : 핵산
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형태 : 선형
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서열 : TTCGG
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가닥형 : 단일
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서열 : TGGGT
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형태 : 선형
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서열 : TGGGC
서열 동정 번호 : 33
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서열 : TGCGT
서열 동정 번호 : 35
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서열 : TGCGC
서열 동정 번호 : 36
서열 길이 : 5
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가닥형 : 단일
형태 : 선형
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서열 : TGCGG
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서열 : CTGGT
서열 동정 번호 : 38
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서열 : CTGGC
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서열 : CTCG
서열 동정 번호 : 40
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서열 : TTCG
서열 동정 번호 : 41
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형태 : 선형
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서열 : CTGG
서열 동정 번호 : 42
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서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
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서열 : CGCG
서열 동정 번호 : 43
서열 길이 : 4
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
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서열 : TGCG
서열 동정 번호 : 44
서열 길이 : 4
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
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서열 : CGGG
서열 동정 번호 : 45
서열 길이 : 4
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
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서열 : TTGG
서열 동정 번호 : 46
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서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
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서열 : GGGCGGGGC
서열 동정 번호 : 47
서열 길이 : 7
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
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서열 동정 번호 : 48
서열 길이 : 8
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : TGGGAGGT
서열 동정 번호 : 49
서열 길이 : 9
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : TGGGCGCAG
서열 동정 번호 : 50
서열 길이 : 3
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : CCG
서열 동정 번호 : 51
서열 길이 : 7
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : TCGGAGG
서열 동정 번호 : 52
서열 길이 : 7
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : TGmCGAGG
서열 동정 번호 : 53
서열 길이 : 8
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : GTGGGAGG
서열 동정 번호 : 54
서열 길이 : 3
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : TGG
서열 동정 번호 : 55
서열 길이 : 7
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : TGGGAmGG
서열 동정 번호 : 56
서열 길이 : 7
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : TGGGAGA
서열 동정 번호 : 57
서열 길이 : 9
서열형 : 핵산
가닥형 : 단일
형태 : 선형
가정 서열 : 없음
안티 - 센스 : 없음
서열 : AATGGGAGG

Claims (33)

  1. 하기 일반식 (1) 의 화합물 또는 그의 염.
    [상기 식에서,
    R1, R2및 R3는 수소원자, 탄소수 1 내지 4 의 알킬기, 하기 정의된 아릴기, 및 비치환되거나 하기 정의된 치환기 1 로 구성된 군에서 선택되는 1 종 이상의 치환기로 치환된 안트라퀴노닐기로 구성된 군으로 부터 독립적으로 선택되고 ;
    Z 은 탄소원자 또는 규소원자를 나타내거나 ; 또는
    R2, R3및 Z은 함께 플루오레닐 또는 크산테닐기를 나타내며 ;
    R4는 수소원자, 탄소수 1 내지 4 의 비치환된 알킬기, 하기 정의된 치환기 2 로 구성된 군에서 선택되는 1 종 이상의 치환기로 치환된 탄소수 1 내지 4 의 치환된 알킬기, 하기 정의된 아릴기, 또는 하기 정의된 아르알킬기를 나타내고 ;
    Y1, Y3및 Y4는 산소원자, 황원자 및 식 > NH의 기로 구성된 군으로 부터 독립적으로 선택되고 ;
    Y2는 산소원자, 황원자, 식 > NH 의 기, 탄소수 1 내지 4 의 알킬렌기, 또는 페닐렌기를 나타내고 ;
    X는 탄소수 1 내지 10 의 비치환된 알킬렌기, 또는 1 종 이상의 히드록시 기로 치환된 탄소수 1 내지 10 의 알킬렌기를 나타내며 ;
    m 및 n 은 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 10 의 정수이고 ; B 는 3 내지 9 의 사슬길이를 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 나타내고 ;
    상기 아릴기는 6 내지 20 개의 고리 탄소 원자를 갖고, 비치환되거나 하기 정의된 치환기 1 로 구성된 군에서 선택되는 1 종 이상의 치환기로 치환된 방향족 카르보시클릭기이며 ;
    상기 아르알킬기는 상기 정의된 1 종 이상의 아릴기로 치환된 탄소수 1 내지 4 의 알킬기이고 ;
    상기 치환기 1 은 탄소수 1 내지 4 의 알킬기, 탄소수 1 내지 4 의 할로알킬기, 할로겐원자, 니트로기, 시아노기, 아미노기, 탄소수 1 내지 4 의 알콕시기, 탄소수 1 내지 4 의 알킬티오기, 상기 정의된 아릴기, 아릴부분이 상기 정의된 것과 같은 아릴옥시기, 및 아르알킬 부분이 상기 정의된 것과 같은 아르알킬옥시기로 구성된 군에서 선택되고, 단, 상기 치환기 1 이 추가의 아릴기 또는 아릴기를 함유하는 기로 치환된 아릴기, 또는 아릴기를 함유하는 기를 나타내는 경우에, 추가의 기는 아릴기 또는 아릴기를 함유하는 기에 의해서는 자체로 치환되지 않으며 ;
    상기 치환기 2 는 아미노기, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기 및 할로겐 원자로 구성된 군에서 선택된다.]
  2. 제 1 항에 있어서, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 B 가 5 또는 6 의 사슬 길이를 갖는 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기가 트리페닐메틸옥시, 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - 비스 [3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시] 벤질옥시, t - 부틸디페닐실릴옥시, 페닐플루오레닐옥시 및 페닐크산테닐옥시기로 구성된 군으로 부터 선택되고 ;
    식 [P(O)(Y2R4) - Y3- (X - Y4)n]mH 의 기가 수소원자, 메틸포스포릴, 2 - 클로로페닐포스포릴, -O- 메틸티오포스포릴, 메틸포스포닐, 메틸티오포스포닐, 페닐포스포닐, 2 - 히드록시에틸포스포릴, -O-(2 - 히드록시에틸) 티오포스포릴, 페닐포스포릴, 4 - 클로로페닐포스포릴, 2 - 니트로페닐포스포릴, 4 - 니트로페닐포스포릴, 에틸포스포릴 및 -O - 에틸티오포스포릴기로 구성된 군으로 부터 선택되고 ; 및 B 는 TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, GGGCGGGGC, TAGGAGG, TGGGAGGT, TGGGCGCAG, CCG, TCGGAGG, TGmCGAGG, CTGGGAGG, TGG, TGGGAmGG, TGGGAGA, AATGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG, CGCGG, CGGGT, TGGGC 및 TGGGT 로 구성된 군으로 부터 선택되는 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z-Y1의 기가 트리페닐메틸옥시, 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - 비스 [3,5 - (디벤질옥시)벤질옥시] 벤질옥시, t - 부틸디페닐실릴옥시, 페닐플루오레닐옥시 및 페닐크산테닐옥시기로 구성된 군으로 부터 선택되고 ;
    식 [P(O)(Y2R4)-Y3-(X-Y4)n]mH 의 기가 수소원자, 메틸포스포릴, 2 - 클로로페닐포스포릴, -O- 메틸피오포스포릴, 메틸포스포닐, 메틸티오포스포닐, 페닐포스포닐, 2 - 히드록시에틸포스포릴, -O- (2 -히드록시에틸) 티오포스포릴, 페닐포스포릴, 4 - 클로로페닐포스포릴, 2 - 니트로페닐포스포릴, 4 - 니트로페닐포스포릴, 에틸포스포릴 및 -O- 에틸티오포스포릴기로 구성된 군으로부터 선택되고 ; 및 B 는 TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG 및 CGCGG 로 구성된 군으로 부터 선택되는 화합물.
  5. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z-Y1의 기가 트리페닐메틸옥시, 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시, 3,5 - 비스 [3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시] 벤질옥시, t - 부틸디페닐실릴옥시, 페닐플루오레닐옥시 및 페닐크산테닐옥시기로 구성된 군으로 부터 선택되고 ;
    식 [P(O)(Y2R4) - Y3- (X - Y4)n]mH 의 기는 수소원자, 메틸포스포릴, 2 - 클로로페닐포스포릴, -O- 메틸티오포스포릴, 메틸포스포닐, 메틸티오포스포닐, 페닐포스포닐, 2 - 헤드록시에틸포스포릴, 및 -O-(2 - 히드록시에틸) 티오포스포릴기로 구성된 군으로 부터 선택되며 ; 및 B 는 TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG,CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG 및 CGCGG 로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물.
  6. 제 1항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기가 트리페닐메틸옥시, 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시 및 3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시기로 구성된 군으로 부터 선택되고 ; 식 [P(O)(Y2R4) - Y3- (X - Y4)n]mH 의 기는 수소원자, 메틸포스포릴, 2 - 클로로페닐포스포릴, -O- 메틸티오포스포릴, 메틸포스포닐, 메틸티오포스포닐, 페닐포스포닐, 2 - 히드록시에틸포스포릴, -O-(2-히드록시에틸) 티오포스포릴, 페닐포스포릴, 4 - 클로로페닐포스포릴, 2 - 니트로페닐포스포릴, 4 - 니트로페닐포스포릴, 에틸포스포릴 및 - O - 에틸티오포스포릴기로 구성된 군으로 부터 선택되고 ; 및 B 는 TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG 및 CGCGG 로 구성된 군으로 부터 선택되는 화합물.
  7. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z-Y1의 기가 트리페닐메틸옥시, 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시 및 3,5 - (디벤질옥시) 벤질옥시기로 구성된 군으로 부터 선택되고 ; 식 [P(O)(Y2R4) -Y3- (X - Y4)n]mH 의 기는 수소원자, 메틸포스포릴, 2 - 클로로페닐포스포릴, -O- 메틸티오포스포릴, 메틸포스포닐, 메틸티오포스포닐, 페닐포스포닐, 2 - 히드록시에틸포스포릴 및 -O-(2- 히드록시에틸) 티오포스포릴기로 구성된군으로부터 선택되고 ; 및 B 는 TGGGAG, TGGGA, TGGGG, TGGG, TGGGAGG, CGGGAGG, TTGGAGG, TTGGGAGG, TGCGAGG, GGGGAGG, mCGGGAGG, mCGmCGAGG, CTGGGAGG, TTGGGG, TGGGGG, CGGGG 및 CGCGG로 구성된 군으로 부터 선택되는 화합물.
  8. 제 1 항에서 정의된 1 종 이상의 화합물을 유효량 함유하는 AIDS 비루스 (HIV-1 비루스) 감염의 치료 또는 예방을 위한 조성물.
  9. 하기 일반식 (12), (14), (22), (24), (25) 또는 (27) 의 화합물 :
    [식중 ;
    R1, R2및 R3은 서로 동일하거나 상이하며, 각각 수소원자 또는 탄소수1 4의알콕시기를 나타내고;
    R4, R5및 R6은 동일하거나 상이하며 각각 수소원자, 탄소수 1 4 의 알킬기, 임의로 치환된 아릴기 또는 임의로 치환된 안트라퀴노닐기를 나타내고 ;
    Z 은 탄소 또는 규소 원자를 나타내며 ;
    R5, R6및 Z 은 함께 플루오레닐기 또는 크산테닐기를 나타낼 수 있거나 ; 또는
    R4, R5, R6및 Z 은 함께 수소원자를 나타낼 수 있으며 ;
    R7은 수소원자, 임의로 치환된 탄소수 1 4 의 알킬기, 임의로 치환된 아릴기 또는 임의로 치환된 아르알킬기를 나타내고 ;
    R8은 메틸기, 시아노에틸기 또는 클로로기로 임의로 치환된 페닐기를 나타내며 ;
    R8a는 메틸기 또는 시아노에틸기를 나타내며 ;
    R8b는 클로로기로 임의로 치환된 페닐기를 나타내며 ;
    R9a는 보호기를 갖는 수소기 또는 수소원자를 나타내며 ;
    A는 기 -(CH2)h- (식중, h 는 1 16의 정수), 기 - (CH2)hO- (식중, h는 1 16의 정수), 기 -(CH2)j-O-CO-(CH2)k- (식중, j 는 양의 정수, k 는 0 또는 양의 정수, j + k 는 2 16) 또는 기 -(CH2)j-NH-CO-(CH2)k- (식중, j 는 양의 정수, k 는 0 또는 양의 정수, j + k는 2 16), 기-(CH2)j-S-CO-(CH2)k(식중, j 는 양의 정수, k 는 0 또는 양의 정수, j + k 는 2 16) 또는 기 -(CH2)n-O-CO-CH2(OCH2CH2)p-OCH2- (식중, n 은 양의 정수, p 는 0 또는 양의 정수, j + k 는 2 100) 이고 ;
    B,B' 및 B" 는 염기 및 포스페이트 부분에서 보호된 아데닌 뉴클레오티드, 구아닌 뉴클레오티드, 티미딘 뉴클레오티드 또는 시토신 뉴클레오티드의 염기 부분을 각기 나타내고 ;
    P 는 중합체 물질을 나타내며 ;
    V 는 저급 알킬기를 나타내고 ;
    X 는 할로겐 원자를 나타내며 ;
    X1은 -S-, -SO- 또는 -SO2를 나타내고 ;
    X2는 산소 원자, 황 원자 또는 NH 기를 나타내고 ;
    X3는 산소 또는 황 원자를 나타내며 ;
    Y1은 히드록시기, 임의로 치환된 페닐옥시기 또는 할로겐으로 치환될 수 있는 에틸옥시기를 나타내고 ;
    Y2는 산소 원자, 황 원자 또는 NH 기를 나타내며 ;
    Y3는 산소원자, 황원자, NH기, 탄소수 1 4 의 알킬렌기 또는 페닐렌기를 나타낸다.]
  10. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시기를 나타내고 ; Y2는 산소원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; Y4는 산소원자를 나타내며 ; R4는 수소원자를 나타내고 ; X 는 에틸렌기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 1 을 나타내며; B 는 TGGGAG 를 나타내는 화합물.
  11. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시기를 나타내고 ; Y2는 황원자를 나타내며; Y3는 산소원자를 나타내고 ; Y4는 산소원자를 나타내며 ; R4는 수소원자를 나타내고 ; X 는 에틸렌기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 1 을 나타내며 ; B 는 TGGGAG 를 나타내는 화합물.
  12. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시기를 나타내고 ; m 은 0 을 나타내고 ; n 은 0 을 나타내며 ; B 는 TGGGAG 를 나타내는 화합물.
  13. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시기를 나타내고; Y2는 산소원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; R4는 메틸기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 0 을 나타내며 ; B 는 TGGGAG 를 나타내는 화합물.
  14. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 트리페닐메틸옥시기를 나타내고 ; Y2는 산소원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; Y4는 산소원자를 나타내며 ; R4는 수소원자를 나타내고 ; X는 에틸렌기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 1 을 나타내며 ; B 는 TGGGAG 를 나타내는 화합물.
  15. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 트리메틸페닐옥시기를 나타내고 ; Y2는 황원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; Y4는 산소원자를 나타내며 ; R4는 수소원자를 나타내고 ; X 는 에틸렌기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 1 을 나타내며 ; B 는 TGGGAG 를 나타내는 화합물.
  16. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 트리메틸페닐옥시기를 나타내고 ; m 은 0 을 나타내고 ; n 은 0 을 나타내며 ; B 는 TGGGAG 를 나타내는 화합물.
  17. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 트리메틸페닐옥시기를 나타내고 ; Y2는 산소원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; R4는 메틸기를 나타내고 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 0 을 나타내며 ; B 는 TGGGAG 를 나타내는 화합물.
  18. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시기를 나타내고 ; Y2는 산소원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; Y4는 산소원자를 나타내며 ; R4는 수소원자를 나타내고 ; X 는 에틸렌기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 1 을 나타내며 ; B 는 CGGGG 를 나타내는 화합물.
  19. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시기를 나타내고 ; Y2는 황원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; Y4는 산소원자를 나타내며 ; R4는 수소원자를 나타내고 ; X 는 에틸렌기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 1 을 나타내며 ; B 는 CGGGG 를 나타내는 화합물.
  20. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시기를 나타내고 ; m 은 0 을 나타내고 ; n 은 0 을 나타내며 ; B 는 CGGGG 를 나타내는 화합물.
  21. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시기를 나타내고 ; Y2는 산소원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; R4는 메틸기를 나타내고 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 0 을 나타내며 ; B 는 CGGGG 를 나타내는 화합물.
  22. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 트리페닐메틸옥시기를 나타내고 ; Y2는 산소원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; Y4는 산소원자를 나타내며 ; R4는 수소원자를 나타내고 ; X 는 에틸렌기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 1 을 나타내며 ; B 는 CGGGG 를 나타내는 화합물.
  23. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 트리페닐메틸옥시기를 나타내고 ; Y2는 황원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; Y4는 산소원자를 나타내며 ; R4는 수소원자를 나타내고 ; X 는 에틸렌기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 1 을 나타내며 ; B 는 CGGGG 를 나타내는 화합물.
  24. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 트리메틸페닐옥시기를 나타내고 ; m 은 0 을 나타내고 ; n 은 0 을 나타내며 ; B 는 CGGGG 를 나타내는 화합물.
  25. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 트리페닐메틸옥시기를 나타내고 ; Y2는 산소원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; R4는 메틸기를 나타내고 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 0 을 나타내며 ; B 는 CGGGG 를 나타내는 화합물.
  26. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시기를 나타내고 ; Y2는 산소원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; Y4는 산소원자를 나타내며 ; R4는 수소원자를 나타내고 ; X는 에틸렌기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 1 을 나타내며 ; B 는 CGCGG 를 나타내는 화합물.
  27. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시기를 나타내고 ; Y2는 황원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; Y4는 산소원자를 나타내며 ; R4는 수소 원자를 나타내고 ; X 는 에틸렌기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 1 을 나타내며 ; B 는 CGCGG 를 나타내는 화합물.
  28. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 3,4 - (디벤질옥시) 벤질옥시기를 나타내고 ; m 은 0 을 나타내고 ; n 은 0 을 나타내며 ; B 는 CGCGG 를 나타내는 화합물.
  29. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 3,4, - (디벤질옥시) 벤질옥시기를 나타내고 ; Y2는 산소원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; R4는 메틸기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 0 을 나타내며 ; B 는 CGCGG 를 나타내는 화합물.
  30. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 트리페닐메틸옥시기를 나타내고 ; Y2는 산소원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; Y4는 산소원자를 나타내며 ; R4는 수소원자를 나타내고 ; X 는 에틸렌기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 1 을 나타내며 ; B 는 CGCGG 를 나타내는 화합물.
  31. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 트리페닐메틸옥시기를 나타내고 ; Y2는 황원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; Y4는 산소원자를 나타내며 ; R4는 수소원자를 나타내고 ; X 는 에틸렌기를 나타내며 ; m 은 1 을 나타내고; n 은 1 을 나타내며 ; B 는 CGCGG 를 나타내는 화합물.
  32. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 트리메틸페닐옥시기를 나타내고, m 은 0 을 나타내고 ; n 은 0 을 나타내며 ; B 는 CGCGG 를 나타내는 화합물.
  33. 제 1 항에 있어서, 식 R1R2R3Z - Y1의 기는 트리메틸페닐옥시기를 나타내고 ; Y2는 산소원자를 나타내며 ; Y3는 산소원자를 나타내고 ; R4는 메틸기를 나타내고 ; m 은 1 을 나타내고 ; n 은 0 을 나타내며 ; B 는 CGCGG 를 나타내는 화합물.
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