JPS58180500A - Ｄｎａの化学的合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明ｉＪ：　ＤＮＡのようなオリゴヌクレオチドの化
学的合成に関する。

ＤＮＡはリン酸ジエステル結合により結合したデオキシ
リボース残基金倉む二本鎖重合体系分子である。４種の
塩基の１つ、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン
（Ｃ）またはグアニン（ｔＪ）が分子中の各糖残基に結
合［７ている。ＤＮＡは遺伝情報を含み、これ全伝達し
、生きている細胞はＤＮＡにコードされた情報を使用し
７てタンパク質を合成する。

この情報は４柚の塩基の配列により暗号化されて、含有
されている。

過去中年間の組換えＤＮＡ技術の進歩により、各柚の生
物学的活性タンパク質が現時点で、正帛ではこれを産生
しない微生物を遺伝学的に操作することにより、このよ
うな微生物で合成できる。

ソマトスタチン、インシュリン、チモシンおよびヒト生
長ホルモンのようなホルモンはこのような生産物の代表
例である。この遺伝子、ゾロープ（ｐｒｏｂｅ　）、リ
ンカ−（１ｉｎｋｅｒｓ　）、ゾライマー（ｐｒｉｍｅ
ｒ　）等の構成のだめのこの遺伝学的操作（ｇｅｎｅｔ
ｉｃ　ｅｎｇｉ、ｎｅｅｒｉｎｇ　）の基本的特徴とし
て、ＤＮＡ合成が１要であることは良く知られている。

数種の一般的方法がＤＮＡの化学的合成用に開発さねで
いる。第１の実用的方法は、いわゆるジエステル法であ
り、コラーナ氏およびその協力者により最初に開発され
た。この方法は８ｃｉｅｎｃθ２０３゜６１４〜６２５
（１９７９年）にまとめて記載さねでいる。この方法の
基本工程は２個の適切に保護されたデオキシヌクレオチ
ドを結合させて、リン酸ジエステル結合を有するジデオ
キシヌクレオチドを形成する工程である。主鎖の両末端
から保護基全除去することにより、この反応を繰返し、
主鎖を伸長できる。この方法の主要欠点は弁筒に遅いこ
とである。

速度および収率の点で利点を有する、さらに最近開発さ
ねた方法はＬｅｔｓｉｎｅｒ　　氏およびその協力者に
より紹介さねた、いわゆるトリエステル法であるＬ　Ｊ
、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　　８８　、５３１９
（１９６６年）；ｌ１ｌＩＪ、１乏、４８０１　（１９
６７年）］。ジエステル法とトリエステル法との基本的
相違点はトリエステル法では反応剤および生成物のボス
フェート原子上に余分の保護基が存在する点にある。ト
リエステル法では、縮合の直接生成物がリン酸のトリエ
ステルである。

この基本的トリエステル法は様々な研究者達により修正
さね、改良されている。Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ氏およびそ
の協力者により開発され、た亜リン酸トリエステル法は
このような改良法の１つである［　Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈ
ｅｍ、Ｓｏｃ、　　９７　＋６２７８〜６２７９（１９
７５年）；同、Ｌｌ、３６５５〜６６６１（１９７６年
）］。この研究は適切に保護されたヌクレオシド、メト
キ７ジクロルホスフィンのような２官能性亜リン酸エス
テル化剤（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙ　−］　ａｔｉｎｇ　ａ
ｇｅｎｔ　）　　および第２の保護されたヌクレオシド
の動台反応を包含している。

トリエステル法におけるもう１つのこのような改良法で
は、ポリペプチド生成用の固体和合成手順をオリゴヌク
レオチド合成に適用している。

これらの方法では、初めのヌクレオチドを７リカのよう
な無機固体支持材料に結合させ、次いでヌクレオチドを
いずれか所望の順序で段階的に付加する。たとえは、Ｂ
ｌｏｓｓｅｙおよびＮｅｃｋｅｒｓ編、ｌ　５ｏｌｉｄ
　Ｐｈａｓｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｊ　、　Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　１９７５年會径照できる。

亜リン酸トリエステル法とシリカ固体相法との組合せ法
もまた０ｇ１ｌｕｊ、ｅ氏およびその協力者により、［
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　（１９８０年）
。

４１５９頁；５ｃｉｅｎｃｅ２１４，２７ＣＪ〜２７４
頁（１９８１年）〕；およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ氏およ
びその協力者により［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ
ｔ、　２１　ｒ　７１９頁（１９８０年）、四ム、１８
５９〜１８６２頁（１９８１年）およびＪ　、Ａｍｅｒ
　、Ｃｈｅｍ　、Ｓｏｃ　、　１０３　。

６１８５〜３１９１頁（１９８１年）〕、別々に開発さ
れている。後者の方法はまたヨーロッパ特許出願３５．
７１９にも開示されている。これら２群の研究者達は彼
等の上記文献に報告されているように、その亜リン酸ト
リエステルシリカ固体相法をＤＮＡの自動合成に適応さ
せた。

亜リン酸トリエステル法に依然として存在する主要問題
の１つけホスホクロリダイト、ジメチルアミノホスホル
アミダイトおよびテトラゾリドのような反応性中間体反
応剤の不安定性にある。

ＤＮＡの化学的合成に関するさらに別の基礎的情報はＩ
　ｔａｋｕｒａ氏およびＲｉｇｇｓ氏による論文［５ｃ
ｉｅｎｃｅ　２０９　、１４０１〜１４０５頁（１９８
０年）］およびこの論文に引用された文献を参照するこ
とにより得ることができる。

本発明に従い、ＤＮＡのようなオリゴヌクレオチドが無
機固体支持材料の亜リン酸トリエステル法により、この
方法で２官能性亜リン酸エステル化剤を使用してヒンダ
ード（ｂｉｎｄｅｒｅｄ　）　　ソアルキルアミノヌク
レオ／ド亜リン酸エステル中間体反応剤を形成し、そし
てこのジアルキル基が全部で４〜６個の炭素原子を鳴す
るものを用いて、合成される。これらのヒンダード反応
剤の例には、ジエチル−、ジイソプロピル−およびメチ
ルジイソゾロビル−アミンヌクレオシド亜リン酸エステ
ルがある。

帥記Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ氏およびその協力者により記載
された既知のツメチルアミノヌクレオシド亜リン酸エス
テル中間体反応剤はヌクレオチド間リン酸エステル結合
の形成に有効であることが鉦明されている。この反応は
早（、そして固体支持体上における反応で良好な収率を
得ることができる。しかしながら、固体支持体を用いて
迅速な縮合速度を保持しながら、反応剤の安定性を増加
させる手段が望ましく、この手段が本発明の大型分子ヒ
ンダード誘導体を用いることにより、Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓの小型分子ジメチル誘導体に比較して予期されずに達
成された。

本発明で使用する中間体ジアルキルアミノヌクレオシド
亜リン酸エステル反応剤は次式Ｉで示すことができる： ２ 〔式中Ｂ−保論じたプリンまたはピリミジン塩基、Ｒ−
保護基、 Ｒ１＋Ｒ２＝全部で４〜６個の炭素原子数の７１ ルキシ、 Ｒ３−１〜６個の炭素原子を崩するアルキル、そして Ｘ＝ＨまたはＯＲ である〕。

上記式において、Ｒは、たとえはトリチル、メトキシト
リチル、ジメトキシトリチル、ビバリルイソプチルオキ
シ力ルボニル、ｔ−ブチル−ジメチルシリルおよび同様
の保護基のようないずれか慣用の保麹（ブロック）基で
あることができる。

χはＤＮＡオリゴヌクレオチドの場合ＶｉＨであり、そ
してＲＮＡオリゴヌクレオチドの場合はＯＲである。Ｒ
ＮＡでは、ＤＮＡのチミンピリミジン塩基の代りにウラ
フルを有する。

本発明で使用するヒンダードジアルキルアミンヌクレオ
チド亜リン酸エステルは従来既知のジメチル誘導体に比
較して、反応性を失うことなく実質的により大きい安定
性を示す。これらの増大した安定性は反応剤のストック
溶液を約１２〜２４時間保持することが望まれる自動的
遺伝子合成装置２ 画でこわらの反応剤を使用できるようにする。また、従
来技術のジメチル誘導体の代りに、ジエチルアミノヌク
レオシド亜すン酸エステルヲ使用すると、約５０〜１０
０％＾い一般的範囲でＤＮＡ収率が得られる。

ヒンダードジアルキルアミノヌクレオンド亜リン酸エス
テルは適切に保瑣したヌクレオシドまたはデオキシヌク
レオシドとそのアルコキシが好ましくはメトキシであり
、そしてハロが好ましくはクロルまたはブロモ、％にク
ロルであるジアルキルアミノアルコキシハロホスフィン
の過剰量との反応により容易に、製造できる。これらの
ホスフィン化合物の例には、ソエテルー、ジインゾロピ
ル−１およびメチルイソゾロビル−アミノメトキシクロ
ルホスフィンがある。加水分解処理した後に、所望の亜
リン酸エステル生成物は冷ヘキサンのような冷炭化水素
溶媒中に沈殿させる（友とえば、−７０°Ｃで）ことに
より単離できる。これらの亜リン酸エステル生成物は酸
感受性であるから、酸性不純物を含有しないようにして
保持すべきである。

上記反応に使用するジアルキルアミノアルコキシハロホ
スフィンは最初に、アルコキシジハロホスフィンを約２
倍モル過剰の相当するジアルキルアミンでアミノ化し、
次いでジアルキルアミノハロゲン化水素酸塩全除去する
ことによりＪｌｉｉ造できる。

初めにジアルキルアミノメトキシクロルホスフィンを、
次いでジアルキルアミノヌクレオシド亜リン酸エステル
を製造するに適する方法学的なより詳細な情報はＢｅａ
ｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓのＴｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２２　（２０）　、　１８５９
〜１８６２頁（１９８１年）を参照し、この文献に報告
されている当量のジメチルアミンの代りに全部で４〜６
個の炭素原子を有する大型分子ジアルキルアミンを当て
はめて参考にすることができる。

別法として、ジアルキルアミノメトキシクロルホスフィ
ンは当モル量のジクロルメトキシホスフィンとジアルキ
ルアミノトリメチルシランとを加熱することにより製造
できる。副生成物であるトリメチルクロルシランを蒸発
させた後に、所望の生成物を蒸留採取できる。

上記ヒンダードジアルキルアミノヌクレオンド亜リン酸
エステル反応剤は無機固体支持材料上のＩ’）ＮＡの亜
リン酸トリエステル合成法で、従来技術におけるこのよ
うな合成で使用されるジメチルアミンヌクレオシド亜リ
ン酸エステルの代りニ使用できる。この合成における本
発明による原則的に新規な特徴はヌクレオシドまたはオ
リゴヌクレオチドの６′−〇−結合を経て無機固体支持
体に共有結合したこのヌクレオシドまたはオリゴヌクレ
オチドの５’　−ＯＨ基をジメチルアミノヌクレオシド
亜リン酸エステルの代りに上記式Ｉのジアルキルアミノ
ヌクレオシド亜リン酸エステルと縮合させることを包含
する。

本発明のもう１つの態様に従い、固体相支持体と１〜で
、従来技術で慣用のシリカゲルの代りに、制御した有孔
ガラスを使用すると、ＤＮＡ合成にさらに別の利点が得
られることが背、い出された。たとえば、ジエチルアミ
ノヌクレオシド亜すン酸工５ ステルと組合せて制御した有孔ガラスを使用すると、シ
リカゲル支持体を相当するジメチルアミノヌクレオシド
亜リン酸エステルとともに使用することにより得られる
収率に比較して約１００％高い程度の収率が得られる。

制御した有孔ガラス（ＣＰＧ）は特に液クロマトグラフ
ィおよび関連技法で用いる支持材料として製造されでい
る。これはＣｏｒｎｊｎｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋｅ。

Ｃｏｒｎｊ、ｎｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　　により製造
され、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｎｎｐａｎ
ｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、１１］、１ｎｏｉ、ｓにより
販売されている。ＣＰＧはホウ酸塩とケイ酸塩とを分離
させるために加熱処理したホウ素ケイ酸塩原材料から製
造する。ホウ酸塩は材料から浴融されて多孔質構造が生
じる。溶融前に、材料をボールミル処理し、篩分けして
、最終メツツユ寸法にする。

たとえば、５〜１０．３７〜７４．７４〜１２５．１２
５〜１７７および１７７〜８４０ミクロンのような数種
の寸法のＣＰＧを入手できる。また、たとえば４０．１
００．２５０．５５０．１５００、および２５００オン
グストロームのような数種の６ 呼称孔寸法のものも入手できる。これらの製品のいずれ
も使用できる。ＣＰＧはプレーンな未処理ガラスとして
、または各種化合物に共有結合したものとして入手でき
る。特に望ましいＣＰＧは８０／１００のメツシュ寸法
（１２５〜１７７ミクロン）および５５０オングストロ
ームの呼称孔直径を有し、長鎖アルキルアミンは結合し
たＣＰＧである。

この材料はＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐ
ａｎｙから製品番号２４８７５として入手でき、次の一
般構造式を有するものと報告されている： （式中ＴＭＳはトリメチルシリルである）。

上記ＣＰＧ　８品の長鎖末端アルキルアミンアーム（δ
ｒｍ　）は約２０オングストロームの長さであると報告
さノ１ている。この製品はＣＰＧをグリコフェース（０
１ｙｃｏｐｈａｓｅ　）（グリセロール）被櫃し、次い
で１．６−ヘキサンジアミンでさらにデリビチゼーショ
ン（ｄｅｒｉｖｉｔｊｚａｔｉｏｎ　）　　して長鎖ス
ペーサーアーム全形成させることにより製造される。

さらに長い鎖長のスペーサーはより長いアルキル基を有
するアルキルジアミン、たとえば１．１２−ドデカンジ
アミンを用いるデリビチゼーションにより作ることがで
きる。側鎖ＯＴＭＳでケイ素原子から外側方向に数えた
、スペーサーの総鎖長がその鎖に少なくとも１５個の原
子を有するようなものが好ましい。この鎖は一般に炭素
、酸素および窒素を包含する。１５〜６０個程の原子の
使用が格別に適している。

ＤＮＡの亜リン酸トリエステル合成に使用するために、
固体支持体にヌクレオシドを結合させるには、慣用の手
段により行なうと都合がよい。この結合はデリビチゼー
ションした固体支持体をアミドまたはエステル形成を経
て、ジカルボン酸、たとえはコハク酸またはアジピン酸
、の半エステルを含有すべく変性されたヌクレオシドの
遊離カルボキシ基に結合させることにより達成できる。

このジカルボン酸の鎖長は同体支持体とヌクレオシドと
の間のスペーサーアームの総鎖長に寄与できる。従って
、アジピン酸は１０個の原子をスペーサーに付与するこ
とになる。

９ 次例は本発明をさらに説明するものであって、本発明が
これらの詳細な例に制限されないものと理解されるべき
である。これらの例において、ＮＭＲは核磁気共鳴を、
そしてＴＬＣ’は薄層クロマトグラフィを意味する。

ジイソゾロピル−およびメチルイソゾロピル−アミノメ
トキシ−クロルホスフィンおよび次例でこれらから生成
さ１しる相当するヌクオレシド亜りん酸エステルは新規
化合物である。

例　　１ 無水ピリシン２００ｍ１中の２−デオキシアデノシンへ
（１ａ）（１水和物をピリシンとの蒸発により先ず乾燥
させる）　２０．０　ｇ（０，０８０モル）の攪拌した
懸濁液に、塩化ベンゾイル５６ｇ（０，４０モル）を１
５〜２０分間にわたり、滴下して加える。反応混合物を
２．５時間攪拌し、その後、０．０１Ｍ１−ＩＪエチル
アンモニウム重炭酸塩０ （ＴＥＡＢ　）　溶液２．Ｏｌ中に注ぎ入れ、ジクロル
メタン（３Ｘ　３００　ｒｎＪ　）で抽出する。有機相
を回転蒸発器で１４　Ｑ　ｍｌに濃縮し、次いでメタノ
ールで４００ｍ１に稀釈し、氷上で冷却させる。激しく
攪拌しながら、冷２Ｎ水酸化ナトリウム溶液（１：１メ
タノール／水）２４０ｍｌをこの水冷却した溶液に加え
、反応を１２〜１５分間続け、この時点で反応を中和さ
せるに十分なダウエックス（Ｄｏｗｅｘ■）５０Ｘ８イ
オン交換樹脂（ピリゾニウム形）を加える。樹脂を濾過
し、メタノールで洗浄し、次いで涙液を蒸発させる。生
成する油状残留物を温水２５　Ｏｒｎｌ中に取り入れ、
エーテル（２Ｘ　２５０　ｍｌ　）と振りまぜ、次いで
エーテルをアスピレータ−で除去する。冷却すると得ら
れる白色結晶生成物を戸数し、冷水で洗浄し、乾燥させ
て、生成物（２ａ）２０．３ｇ（７１％）を得る；融点
１１２〜１２１°Ｃ〔文献融点１１６〜１１５°Ｃ（５
ｃｈａｌｌｅｒ等１．Ｔ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ
、　８５　ｓ　３８２１頁（１９６３年〕）〕。

ＮＭＲ：δ（ＤＭＳＯｄ−６）　１１．１　（ｂｓ、　
ＩＨ）、８．７５（Ｓ、ＩＨ）、８．７０（ｓ、ＩＨ）
、　８．１（ｄｄ、　Ｊ−２，７ＨｚＪ　　２　Ｈ）、
７．５　（ｍ、３　Ｈ）、６．５　（ｔ、　Ｊ　＝Ｈｚ
、　　１Ｈ）、５．４（ｂｓ、ｉＨ）、５．１　　（ｂ
ｓ、　　ＩＨ）、４．５　（ｍ　、　　Ｉ　Ｈ）、６．
９（ｍ。

ＩＨ）、３．６（ｍ、２Ｈ）、２．８　（ｍ　、　　２
　Ｈ）。

トリエチルアミン１２．Ｃ１を含有するピリシン２５０
ｍ１中の２′−デオキシシトシン−ＨＯ２（１ｂ）２１
．０　ｇ（０，０８モル）の攪拌した懸濁液に、塩化ベ
ンゾイル５６．９　（０，４０モル）を１５分間にわた
り滴下して加える。反応混合物を室温で２．５時間攪拌
し、次いで０．０１　Ｍ　ＴＥＡＢ　２．０１３中に注
き入れる。ジクロルメタン（３Ｘ３０［］ｍｉで抽出し
、次いで蒸発させ、得られた白色固形物をＴＨＦに沼解
し、ＴＨＦ５００罰、メタノール７００ｍ１３および水
３００　ｍｌの溶液に加え、氷上で６℃に冷却させる。

激しく攪拌しながら、水冷２Ｎ水酸化ナトリウム溶液（
１：１メタノール／水）２００ｍｌを加え、攪拌を１０
分間続ける。ドーペックス■５０×８イオン交換樹脂（
ピリゾニウム形）で中和し、濾過した後に、溶液を６０
ｏＩ／Ｌｌに績縮する。

エーテル（２Ｘ３００ｍｌ−これはアスビレ〜ターによ
り除去する）と振りまぜた後に、溶液を冷却させ、戸数
し、乾燥させた後に、生成物（２ｂ）１９．０．９　（
７１％）を得る；融点１８０〜１８４°Ｃ〔文献融点１
９４℃（５ｃｈａｌｌｅｒの例１と同じ文献）〕。

ＮＭＲ：δ（ＤＭ８０　ａ−６）　８．４　（ａ　、　
Ｊ＝７Ｈｚ。

ＩＨ）、８．０　（ｄｄ　、　Ｊ　＝２＋８　Ｈｚ　、
２　Ｈ）、７．５（ｍ、３Ｈ）、７．３（ｄ、Ｊ＝７Ｈ
ｚ、ＩＨ）、６．１（ｔ、Ｊ−６Ｈ２，１Ｈ）、４．２
（ｍ、１Ｈ）、３−８　（ｍ　ｙ　Ｉ　Ｈ）、３．６（
ｍ、２Ｈ）、２．２（ｍ。

２Ｈ）。

Ｎ−２−インブチリル−２′−デオキシグアノシン（２
ｃ） 水浴中、ＯｏＣで攪拌した、無水ビリシン３００ｍ１中
の２′−デオキシグアノシン（１ｃ）２１ｇ（０，０７
８モル）の懸濁液に、塩化インブチリル８２．９　（０
，７８モル）を１．５時間にわたり加える。

反応混合物を０℃でさらに１時間攪拌し、０．０１６ Ｍ　ＴＥＡＢ　１．２１中に注ぎ入れ、ジクロルメタン
（３Ｘ２００ｍｌ）で抽出する。有機相を次いで１０％
炭酸ナトリウム溶液で逆抽出し、乾燥させ（硫酸す）　
ＩＪウム）、次いで３００　ｍｇに濃縮する。

水冷却しながら、冷メタノール５００ｍ１を、次いで２
Ｎ水酸化ナトリウム溶液（１：１メタノール／水）６０
ｏｉｇを加える。反応混合物を０００で２５分間攪拌し
、ドーペックス■５ｏ×８イオン交換樹脂（ビリゾニウ
ム形）で中和する。樹脂を濾過し、メタノールで洗浄し
、Ｆ液を蒸発させ、得られた白色固形物を沸とう水２５
０ｍ１に再溶解する。−夜にわたり冷却させ、得られた
結晶生成物（２ｃ）２０ｇ（７５％）を戸数し、乾燥さ
せる。融点＞３００℃。

ＮＭＲ：δ（ＤＭＦ３０ｄ−６）　１２．１　（ｂｓ　
、　ＩＨ）、１１．６（ｂｓ　、　ＩＨ）、８．２（ｓ
、ＩＨ）、６．２（ｔ　、Ｊ＝７Ｈｚ　、　１Ｈ）、５
．３　（ｄ　、　Ｊ　＝＝５Ｈｚ。

ＩＨ）、４．９（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、ＩＨ）、４．４（ｂ
ｍ。

ＩＨ）、３．８（ｂｍ、１Ｈ）、３．５　（ｂｉ　、　
Ｊ　〜６Ｈｚ、２Ｈ）、２．７　（ｑ　、　Ｊ＝６Ｈｚ
　、　１Ｈ）、４ ２．３　（ｂｒｎ　、　　２Ｈ）、　１．１　（ｄ　、
Ｊ＝６Ｈ２，６Ｈ）。

例　　２ ５’−０−（４，４−ゾメ）・キシトリチル）−保膜無
水ピリシン３００　ｍｌｌ中のＮ−ベンゾイルデオキシ
アデノシン（２ａ）３６．９ｇ（０，１０４モル）およ
びジメトキシトリチルクロリド３８．８．９（０，１１
５モル）の浴液を室温で６時間攪拌する。

メタノール（２〜３ｍ１）を加え、溶媒を減圧で除去す
る。残留物を０．０１　Ｍ　）リエチルアンモニウム重
炭酸塩浴液約１００ｍＡ’中に取り入れ、ジクロルメタ
ン中に抽出し、抽出液を乾燥させ（硫酸ナトリウム）、
次いで蒸発させる。残留物を７：３ジクロルメタン／ア
セトン５０ｍ１に再溶解シ、シリカカートリッジを用い
、７：６ジクロルメタン／アセトンで溶出して、ウォー
タースプレゾ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｒｅｐ　）　ＬＣ−５
００上で５個の等しいバッチで精製する。集めた、生成
物を含有する留分を蒸発させ、クロロホルム１５　Ｑ　
ｍｌ、に再溶解し、次いで激しく攪拌したペンタン３．
０７中に滴下して加えるとさにより沈殿させる。生成物
をＰ取し、乾燥させ、’）　ａ　（５ｃｈａｌｌｅｒの
例１に記載の文献）５６．４．９　（８３％）を得る。

融点７１〜７５℃ＯＮＭＲ：δ（ＣＤ０１３）　９．３
　（ｂｓ　、　Ｉ　Ｈ）、８．７（ｓ。

ＩＨ）、８．１（ｓ、ＩＨ）、８．０　（ｄｄ　、　Ｊ
　：２．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．２−７．５（ｍ、１２Ｈ
）、６．７　（ＡＢのＢ、Ｊ＝７Ｈｚ、４Ｈ）、６．３
　（ｔ。

Ｊ：６Ｈ２，１Ｈ）、４．７（ｂｍ、ｉＨ）、４．２（
ｂｍ。

ＩＨ）、３．７（１３，６Ｈ）、３．４　（ｍ　、　２
　Ｈ）、２．６（ｍ、２Ｈ）。

無水ビリシン２５０ｍ１中のＮ−ベンゾイル−２７−ジ
オキシシトシン（２ｂ　）　２６．６ｇ（０，０８モル
）およびジメトキシトリチルクロリド２９．８　Ｆ（０
，０８８モル）の溶液を室温で２時間攪拌し、アデノシ
ン誘導体について上記した仕上げ処理およびクロマトグ
ラフィ（溶出溶剤−５５：　４５ジクロルメタン／アセ
トン）の後に、生成物を得る。収線：　３８．８　ｇ（
７７％）。融点１１６〜１２６°Ｃ〔文献融点１１９°
Ｑ　（５ｃｈａｌｌｅｒの例１に記載の文献〕〕。

ＮＭＲ：δ（ＣＤＣ１３）　９．２　（ｂｓ　、　Ｉ　
Ｈ）、８．３（ｄｙＪ　＝８Ｈｚ　、　ｌ　Ｈ）、７．
８　（ｄｄ　、　、Ｔ＝７Ｈｚ　、２Ｈ）、７．２−７
．５（ｍ、１３Ｈ）、６．８　（ＡＢのＢ　、　Ｊ＝８
Ｈｚ、４Ｈ）、６．３　（ｔ　ｒ　Ｊ−６Ｈｚ　ｐ　Ｉ
　Ｈ）、４．５　（ｂｍ　、　Ｉ　Ｈ）、４．２（ｂｍ
、ＩＨ）、３．７（Ｓ。

６Ｈ）、３．４　（ｍ　、　２　Ｈ）、２．８（ｍ、２
Ｈ）。

無水ピリシン２５０　ｒｎｌ中のＮ−インブチリループ
オキジグアノシン（２Ｃ）　２５．３　ｇ（０，０７５
モル）およびゾメトキシトリチルクロリド２８０．９　
（０，０８３モル）の浴液を室温で２時間攪拌し、次い
でアデノシン訪導体の場合と同様に仕上げ、単離して（
溶出浴剤−５５：４５ゾクロルメタン／ア七トン）、生
成物３２．！ｉ’（６７％）を得る。

融点１６６〜１４２°Ｃ０ ７ ＮＭＲ：　　δ　（ＣＤＣ１３）　　７．８　（ｓ　　
、　　ｉ　Ｈ）、　７．１−７−３　＜　ｍ　Ｉ　９　
Ｈ）、６．７　ＣＡＢのＢ、Ｊ＝８Ｈｚ。

４Ｈ）、６．１（ｉ、Ｊ＝６Ｈｚ、ＩＨ）、４．７（ｂ
ｍ。

ＩＨ）、４．２　（ｂｍ　、　　Ｉ　Ｈ）、５．７　（
Ｓ　　、　　６　Ｈ）、３．３（ｍ、２Ｈ）、２．４−
２．８　（ｍ　、　　３Ｈ）、１．２　（ｄ　　、　　
Ｊ＝６Ｈｚ　　、　　６Ｈ）。

５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン（６
ｄ） ピリシン３００　ｍｌ中のチミジンＣ１ｄ　）　２４．
２＆　（０，１０モル）およびジメトキシトリチルクロ
リド３７．５　ｇ（０，０１１モル）の溶液を室温で４
時間攪拌する。密謀を減圧で蒸発させ、がム状生成物を
ジクロルメタンに浴解し、０．０５Ｍトリエチルアンモ
ニウム重炭酸塩済液で抽出する（２回）。

有機相を乾燥させ（硫酸ナトＩＪウム）、蒸発させ、生
成する泡状残留物を沸とうベンゼン６００１ｎｌに浴解
する。−夜にわたって形成された結晶生成物をＰ取し、
ベンゼン２００＋１１７中で沸とうさぜる。

冷却した混合物を濾過し、乾燥させ、生成物（６ｄ）５
０．６．９　（９３％）を得る。融点１１９〜１２６°
０８ 〔文献融点１１６〜１１８°Ｑ　（５ｃｈａｌｌｅｒの
例１と同じ文献）〕。

ＮＭＲ：δ（ＣＤ０１３）　９．５　（ｓ　、１　Ｈ）
、７．５　（ｓ　。

ＩＨ）、７．２−７．４　（ｍ　、　９Ｈ）、６．８　
（Ｂ　ｏｆＡＢ　、　Ｊ＝８Ｈｚ　、　４Ｈ）、６．４
（ｔ、Ｊ−６Ｈ２゜ＩＨ）、４．５（ｍ、ＩＨ）、４．
０（ｍ、ＩＨ）、３−７　（ｓ　ｒ　６　Ｈ）、３．３
（ｍ、２Ｈ）、２．３（ｍ。

２Ｈ）、Ｃ３（ｓ＋３Ｈ）。

例　　６ ピリシン５　ｍｌ中の５’−（４，４’−ジメトキシト
リチル）ヌクレオシド（３）　２．５ミリモル、４−ジ
メチルアミノビリジン０．３１．９　（２，５ミリモル
）および無水コハク酸（）、２５ｇ（２，５ミリモル）
の浴液を室温で２４時間攪拌する。水（１ｍｌ）を加え
、浴液を蒸発させる。トルエン（１０ＩＩＬｌ）ヲ加え
、トルエンを蒸発させ、残留物をジクロルメタンに浴解
し、水冷１０％クエン酸溶液で抽出しく２回）、乾燥さ
せ（硫酸ナトリウム）、次いで１０ｍ１の容量に凝縮す
る。１：１ペンタン／水１５０ｍＡ中に沈殿させ、次い
で高減圧下に乾燥させることにより定量的収率の生成物
が得られる。

ＮＭＲによっては検出が極めて困難であるが、ＴＬＣ（
１，０％水水子アセトニトリル検出では均質生成物であ
るほどの最後の痕跡量のペンタンを除去する。この方法
をヌクレオシド６ａ、６ｂ、６Ｃおよび６ｄに対して行
なった。

例　　４ ６−アミツゾロビルトリエトキシシランｉ５ｍＡを含廟
するトルエン２５０ｍ１中のシリカゾル〔フラクトシＪ
ｌ／　（Ｆｒａｃｔｏｓｉｌ悄２００−飽和臭化リチウ
ノ・浴液上で２４時間放置する〕２５ｇの懸濁液を室温
で１２時間振りまぜ、次いで１８時間加熱還流する。シ
リカを濾過により単離し、次いでトルエン、メタノール
および１：１メタノール／水で洗浄する。１：１メタノ
ール／水中で一夜にわたり振りませた後に、シリカをメ
タノールおよびエーテルで洗浄１〜、次いで乾燥させる
。シリカを次いで無水ピリシン５３ｍｇにｌ１ｌｉし、
トリメチルクロルシラン１５ｍ１を加え、混合物を一夜
にわたり振りまぜる。シリカを沖過により単離し、メタ
ノールおよびエーテルで洗浄し、次いで先ず通気により
、次に減圧で乾燥させ、下記の例５で使用する。

例　　５ ヌクレオシド官能化シリカの製造 □ ヒＩＪシンＱ、６ｍｌを含有する無水ジオキサ２６ｍｌ
中の３′−サクシノイル−５′−ジメトキシトリチルヌ
クレオシド１．０ミリモル、ジシクロへキシルカルｄ？
　ソイミド２２０＋ｖ（１ｏミリモル）およヒル−ニト
ロフェノール１４ｏＴｎｙ（１，０ミリモル）ノ浴液を
室温で２時間攪拌する。尿素沈殿を遠心分離により除去
し、−１ｍ１液をトリエチルアミン１１ｆＬｌ含有ＤＭ
Ｆ　ｉ　ｍｌ中のアミノプロフィルシリカ２．５ｇの懸
濁液に移す。この混合物を２時間振りまぜる。

シリカを遠心分離により単離し、ＤＭＦ　（４回）、１ ＴｎＦ（３回）、メタノール（６回）およびエーテル（
６回）で洗浄する。乾燥後に、シリカにビリシン５ｍｌ
および無水酢酸２ｍｌを加え、反応を６０分間、時々振
りまぜながら進行さぜ、その後、メタノール（ｘ５）お
よびエーテル（ｘ２）で洗浄し、次いで吸入乾燥させる
。この再現できる方法で得られた官能化シリカは酸によ
り放出されたトリチルカチオンの可視スペクトルにおい
て、４９７ｎｍで定量分析により測定して、シリカ１ｙ
当り８０〜１１０μモルのヌクレオシド負荷を有する。

この官能化シリカを下記の例８および１２の固体支持体
として使用した。

例　　６ ジアルキルアミノメトキシクロルホスフィンの製造 エーテル４００ｍｌ中のメトキシジクロルホスフィン［
Ｍａｒｔｉｎ等のＪ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　７２
．４５８４頁（１９５０年）〕１１３３ｇ１モル）の溶
液にシアルキルアミン（２モル）を−１０°で機械的に
攪拌しながら１時間番こわたって滴下して加える。

２ 反応混合物を１時間さらに攪拌し、混合物を次いで沖過
し、塩をエーテルで良く洗浄し、エーテルを大気圧で蒸
留する。＼質実へへ蒸留（２回）すると生成物が得られ
る。

ジメチルアミノ：沸点４０〜４２°（１３ｍｍ　）ＮＭ
Ｒ：　”１ｐδ１７９．５ゾエチルアミノ：沸点８７〜
８９°（１８ｍｍ　）　ＮＭＲ：　”ｌｐδ１７９．３
ジイソゾロビルアミノ：沸点８６〜８６°（１２ｍｍ　
）　ＮＭＲ：３１ｐδ１８０．８イソゾロピルメチルア
ミノ：沸点６２〜６４°（１２ｍｍ　）　ＮＭＲ：３１
ｐδ１７６．８ 後の２生成物は新規生成物である。

例　　７ 乾燥窒素雰囲気下に室温で攪拌した、乾燥酸不含有ＴＨ
Ｆ１Ｑ　ｍｌ中の保護したヌクレオシｒ（６）５ミリモ
ルの溶液に、ジイソゾロビルエチルアミン４．３ｍ１Ｃ
２５ミリモル）を加え、次いで１０〜１５ミリモルのジ
メチルアミノメトキシクロルホスフィン（１，３ｍｌ　
＞　、ジエチルアミノメトキシクロルホスフィン（１，
５１ｕｌ）、ジイソプロビルメトキシクロルホスフィン
（１，５ｄ）またはメチルイソゾロビルメトキシクロル
ホスフィン（１，５１１１１）のどれかを１〜２分間に
わたって滴下して加える。

反応温度は〜４０℃に上昇する。室温で１５分間攪拌し
た後に、反応混合物を酸を含有しない酢酸エチル５Ｑｍ
ｌで稀釈し、１０％炭酸ナトリウム浴液で抽出する（４
回）。有機留分を乾燥させ（硫酸ナトリウム）、減圧蒸
発させ、次いで酸を含有しない酢酸エチル１０ｍ１に再
浴解する。−７０°Ｇに維持し、激しく攪拌されている
ヘキサン３００　ｍｌ中に沈殿させることにより得られ
た生成物をＦ取し、−７０００のへキサン（３００ｍＡ
）で洗浄する。

冷たいうちに、生成物がそのまま残っているフィルター
を減圧デシケータ−に移し、高減圧下に２４時間乾燥さ
せる。収率は生成物の”　ｌｐ　ＮＭＲにより、および
メタノール中１％ｔ−ブチルヒドロパーオキシドで酸化
した生成物のＴＬＣ（１：　１酢酸エチル／　ＴＨＦ　
）により、確認した純度で典型的に９０％を超える。保
護したヌクレオシドろａｌｂ、ｃ、およびｄを使用する
結果を第１表にまとめて示す。

Ａ　　　　　６ａ　　　　　　１４７．１．１４７．０
　　　８５−９０％米米未来　　　１４８．８．１４８
．６　　＞９５％キ８ａ　　　１４Ｂ、２．１４８．０
　　＞９５％Ｃ（Ｓｂ　　　１４７．８．１４６．８　
８０−８５％７ｂ　　　１４９．４．１４９．１　　９
２％８ｂ　　　１４８．３．１４８．０　　＞９５％Ｇ
　　　６Ｃ１４６，５，１４６，３８５−９０％７ｃ　
　　１４８．０．１４８．２　　＞９５％８ｃ　　　１
４８．４．１４８．１　　＞９５％’Ｉ’　　　６ｄ　
　　１４７．３．１４６．５　８５−９０％７ｄ　　　
１４８．７．１４８．１　　９５％８ｄ　　　１４８．
１．１４７．９　　＞９５％１９ｄ　　　１４７．１、
’Ｉ４．６．７　　＞９２％５ ６−シメチルアナログ ７＝ゾエチルアナログ 未来原料ヌクレオシドは含有しないが、加水分解した物
質（この共鳴は８〜２０　ｐｐｍに見える）１０〜１５
％で汚染されている生成物。さらにまた、少量の加水分
解したクロル亜リン酸エステルが１７　ｐｐｍに現われ
る。

キ　生成物は原料ヌクレオシドおよび加水分解した生成
物を含有しないが、加水分解したクロル曲リン酸エステ
ル６〜５％が残存する。

（δ＝　１５　ｐｐｍ　） 例　　８ 前記の固体支持体（反応図式Ｉにおいて■で表わす）上
におけるＤＮＡの合成をその茎部（ｓｔｅｍ）にテフロ
ン（Ｔｅｆｌ、ｏｎ■）のストップコックを有スる中程
度の多孔度の１５ｍ／３焼結がラスロートを用６ いて最迅速に行なう。このロートをｐ適用フラスコのゴ
ム栓を経て配置するこきにより、系を各工程における密
謀除去の目的で減圧機番こ連結できる。

所望のＤＮＡの針に応じて５０〜１００ｒｎ９のヌクレ
オシド−シリカ（ヌクレオシド５〜１０μｍｏｌに相当
する）をロートに装入し、第２表に規定した順序で処理
する。各工程毎に、ロートはおだやかにかきまぜて、そ
の内容物を混合する。ヌクレオシドシリカ５および各後
続のトリチル保護した残貿物の脱トリチル化は５％メタ
ノールを含有するニトロメタン中の飽和ＺｎＢ　ｒ　２
を用いて迅速に行ない、生成物１０（反応図式Ｉ）を生
成する；しかしながら、完全な脱保護基を確保するため
に、工程１〜６（第２表）をＺｎＢｒ２処理によりオレ
ンジ色がもはや現われなくなるまで繰返す。メタノール
、ＴＨＦおよびアセトニトリルで洗浄した後ｔこ、ロー
トに、ラバーセラムストッパー（ｒｕｂｂｅｒｓｅｒｕ
ｍ　５ｔｏｐｐｅｒ　）で閉鎖した頂上部に注入口を有
しそしてロート内容物全体ｌこ不活性がスブランケット
を付与するための横手装入口を有する閉鎖集成部品で栓
をする。次いで、乾燥アルゴン雰囲気下ζこ、水素化カ
ルシウムから新たに蒸留したアセトニｌ−ＩＩル５　ｍ
ｌをセラムストッパーで栓をした注入口を経て注射器に
より加える。溶媒をシリカが完全に乾燥させずに、減圧
で沖去する。乾燥アセトニトリル０．２５ｍ１中のヌク
レオシド亜リン酸エステル（４５〜９０〜．１０〜２０
当量）を注射器により加え、次いで乾燥アセトニトリル
０．５〜０−７５ｍ１ｊ中の昇華テトラゾール（１５〜
３０１Ｗ、１０〜２０当量）を注入添加する。混合物を
１０分間、時々かきまぜ、その後濾過し、加水分解的に
洗浄し、生成物１１（反応図式■）を生成させる。生成
物１２（反応図式Ｉ）を生成するリン酸エステルへの酸
化はＩ２を用いて行なう。アセトニトリルおよびＴＨＦ
’で順次洗浄した後に、無水酢酸をジメチルアミノピリ
ジンの存在下にキャップに加え、縮合工程で反応しなか
った全ての５′ヒドロキシル基を非反応性にする。メタ
ノールでおよびニトロメタンで洗浄した後の試料はもう
１つの合成ラウンド用の用意が整っている。反応処理０
１→ノ°イクルは全部で〜２５分を要し、一度に操作し
た６個はどの多くの反応容器を要求する。縮合効率は各
説トリチル化工程の分光光度計による吸光度測定により
ほば進定できる。各縮合に必要な龍ＩＪン酸エステルの
鎗は変更でき、反応上の湿度に依存して変わる。注意深
く制御した条件下に、１０当ｋが通常、９０〜９５％の
収率にとって十分である。

所望の配列順序が達成され鬼、最後のヌクレオチドを加
え、脱トリチル化したならば、このＤＮＡを、そのリン
酸メチル基を１：２＋２チオフエノール／トリエチルア
ミン／ゾオキサン２．Ｑｍｌを用いて４５分間室温で除
去することにより、脱保護化する。シリカを次いで濃水
酸化アンモニウム’１．Ｑｍｌ中に２．５時間懸濁し、
ＤＮＡを支持体から採取する。上計液を５０℃で２０時
間加熱して、塩基保護基を除去する。生成する溶液を次
いで冷却させ、注意深く減圧蒸発させて、粗製ＤＮＡを
得る。

この生成物を下記例９で精製する。

９ 第２表 （２５分／サイクル） 反応剤または溶媒　　　　　　　　　容量　時間ン ２、メタノール洗浄　　　　　　　　　　　　　　２　
Ｍ６、ニトロメタン洗浄　　　　　　　　　　　　　２
　Ｍ４オレンジ色がもはや現われなくなるまで１〜６を
繰返す ５、メタノール洗浄　　　　　　　　　　　　　　２　
Ｍ６、アセトニトリル洗浄　　　　　　　　　　　　５
　ＭＺセラムストッパー（ｓｅｒｕｍ　５ｔｏｐｐｅｒ
）ロート／アルゴン ８乾燥アセトニトリル洗浄　　　　　　　　　２Ｘ２Ｍ
９１０〜２０当重亜リン酸エステル＋　　　　　０．２
４Ｍ１０〜２０当量テトラゾール　　　　　　　　０．
５０１Ｍ　　４分１０．１：２：２　２，６−ルチジン
／水／　　　５　Ｍ　　１分子ＨＦ １ １１、　［］、２２ＭＩ２／２、６−ルチジン／水／　
　　　５　　ｍ１３ＨＦ １２、アセトニトリル洗浄　　　　　　　　　　　５ｍ
１１３、ＴＨＦ洗浄　　　　　　　　　　　　　　　５
　　ｒｒｒｅ１４．０．５Ｍジメチルアミノピリジン／
ＴＨＦ’　　　１　　ｍｌ　　　２分＋１＝１無水酢Ｈ
／２．６−ルチジン　　　［］、５＋ｎｇ１５、メタノ
ール洗浄　　　　　　　　　　　　　５　　ｍ１１６ニ
トロメタン洗浄　　　　　　　　　　　　５　　ｔｎｌ
支持体および生長鎖中の各後続のヌクレオシド（工程１
〜４）からの５′−ヒドロキシル保獲基の脱トリチル化
の改善されたそして好適な方法はジクロルメタン中のジ
クロル酢酸の２％（重量／容量）浴液による２分間処理
および後続の上記工程５および６と同じ洗浄を包含する
。ジクロル酢酸の代りに、約１．２〜約１．８、好まし
くは約１．５のｐＫを有するその他のプロチック酸を使
用できる。

下記例１６はこの改善された脱トリチル化工程をＤＮＡ
合成に使用する例である。

例　　９ ２ ＤＮＡ精製 粗製ＤＮＡ残留物をＧ−５０カラム緩衝ｉ（２５ｍＭ　
　ト　リ　ス　−　ＨＣ’　、　ｐ’　＝　　７．６　
　＋　１　０　０　　ｍＭ　　Ｎａ（Ｊ　　）２５０〜
３００μｌに再懸濁し、同じ緩衝液で平衡にした１Ｑ〃
Ｌｌ（）−５０−４０セフアデツクス（８ｅｐｈａｄθ
Ｘ■）カラム上ｌこ装入する。試料を溶出し、１ｍｌ貿
分を採取する。各留分について２６０ｎＩｎで光学一度
を読み取った後に、吸光性物質を含有する最初の４つの
カラム留分を所望のＤＮＡ生成物について、ポリアクリ
ルアミド　ｒルミ気泳動により試験する二カラム留分の
適量（約１０．Ｄ。

単位、通常４０〜６０μｌ）を０°Ｃに冷却する。

５容計の無水エタノールを加え、試料を次いでドライア
イス上ｌこ２０〜６０分間置く。遠心分離〔エツペンド
ルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　）　５４１２で６分間〕し
た後に、上澄液をデカンテーションにより除去し、次に
残りの溶媒を減圧で除去する。残留物を０．０１％ブロ
モフェノールブルーおよび０．０１％キシレンシアツー
ルを含有する１　０μｌホ）Ｉｉムアミド中に再ＷＡ１
１ｉｌする。１００℃で１分間加熱した後に、試料を氷
上で冷却し、次に７Ｍ尿素を含有する２０％ポリアクリ
ルアミドデル（１４０ｘ１６０Ｘ　１．５　ｍｍ、　８
　ｍｍｍススロット上に装入する。試料を６００■でア
ノードに向って電気泳動させる。２０％アクリルアミド
上で、ブロモフェノールブルーはＤＮＡクーマーと共泳
動（Ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｅｓ　）　Ｌ、他方キシレンシ
アツールは２５−マーとともに泳動する（所望のＤＮＡ
が不明瞭である場合にその染料は排除する）。ＤＮＡは
プリンクマンポリグラム（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｐｏｌｙ
ｇｒａｍ　）　ＣＥＬ　３　Ｑ　Ｑポリエチレンイミン
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）板上での短波長ＵＶ増
形影法より目で見えるようにする。

予備規模電気泳動は次のとおりにして行なう：ＤＮＡ　
３．５０．Ｄ、単位を含有するＧ−５０力ラム留分の適
量を上記のとおりにしてエタノール５谷量により沈殿さ
せる。遠心分離〔エツペンドルフ５４１２中で６分間、
またはペックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ　）　Ｊ　２−２１
で１０Ｋｒｐｍで４５分間）した後に、上澄液をデカン
テーションして除き、次いで残りのエタノールを減圧で
除去する。乾燥したＤＮＡをポルムアミド４０μｌ十適
切なトラッカー（ｔｒａｃｋｅｒ　）染料（１種または
それ以上）中に再懸濁する。ＩＤＯ’Ｏで１分間処理し
た後に、試料を２０％アクリルアミドｒル（１４０Ｘ１
６０Ｘ　１．５　ｍｍ、　３５　ｍｍ　Ｉｌｌスロット
）上に装入する。

電気泳動後に、ＤＮＡは膠増影法により目で見えるよう
にする。所望のＤＮＡ帯を含むアクリルアミドのプラグ
を切り取り、３ｍ１Ｂ−Ｄ使い捨て注射器（針無し）に
より１．５ｍｌエツペンドルフ管中に抽出する。カラム
緩衝液＋０．１％ＳＤＳを加え（〜１．０ｆｆｌｌ）、
試料を一夜にわたり抽出する。アクリルアミド片をがラ
スウールに通す涙過により除去する。さらにカラム緩衝
液（１，０ｒｆｌ／ｌ’）を用いてアクリルアミドを洗
浄する。Ｐ液を２１ｎｌｎ−ブチルアルコールで２回抽
出し、ＤＮＡを上記のとおりにエタノール沈殿させる。

この精製生成物を１ｍｌ　Ｇ　−５０緩衝液に再懸濁し
、２６０ｎｍにおけるＯ、Ｄ、を測定する（　ｉ　０．
Ｄ、単位＝６５γＤＮＡ　）。

ＣＢ−Ｄ＝ペクトンゾキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ５ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　））　。

例１０ 上記例で製造したシアルキルアミノヌクレオシド亜リン
酸エステルの安定性を、それらのアセトニトリル中にお
ける半減挙動を試験することにより評価した。結果を第
６表に示す；この表は次の安定順序を示している： ６ 第３表 室温におけるアセトニトリル中での ヌクレオシド亜リン酸エステルの安定性ＤＭＴ−ｄＣ”
−／／　　　　　８　　　３０　　＞６日２ＤＭＴ−ｄ
（）１ｂ−＃　　　　　　　　４８１　＞６日ＤＭＴ−
ｄＴ　−ｔｔ　　　　　　　　６日　〉６日　　　〉６
日１、この数値は沈殿した分解生成物としての推定値で
ある。

２．６４時間後にスペクトルの変化はない。

６、半減期は１４６〜１４８　ｐｐｍで亜リン酸エステ
ルピークが消失し、３１ｐＮＭＲスペクトルの０〜２０
　ｐｐｍに分解生成物が現われることにより決定した。

沼液は亜すン酸エステル中約０．０５　Ｍであった。

Ｘ−シアルキルアミノ基 Ｍｅ−メチル Ｅｔ＝ｔｔル １Ｐｒ−イソプロピル ｂｚ−ベンゾイル ｔｏｌ二〇−トルイル 例１１ ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ　）　３　ｍｇおよびピ
リシン２廐中のＣＰＧ　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｕｍｂｅｒ　２４８７５　）　２．
０１７　％ＤＭＴ　−ｄＮ−サクシニルエステル（例６
の化合物４　’）　０．４２５ｇ、１−エチル−６−（
６−ジメチルアミノ−プロピル）カルボシイミド塩酸塩
（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ　）　
Ｏ−６００Ｅ／および４−ジメチルアミノビリジン０．
０３０　ｇの懸濁液を１８時間おだやかに振りまぜ、そ
の後沢過し、ＤＭＦおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ
　）で洗浄する。支持体を次に無氷酢酸２ｍｌを含有す
るピリシン４　ｍｉｄ中に再懸濁し、２時間振りまぜる
。沖過し、ＴＨＦで洗浄した後に、支持体を減圧で乾燥
させる。この再現できるやり方で得られた官能化したＣ
ＰＧは酸により放出されたトリチルカチオンの可視スペ
クトルで４９８ｎｍにおける定量により決定して、ＣＰ
ｏｌｇ当りヌクレオシド約４０μモルの荷重を有した。

この官能化したＣＰ（）を下記例１２の固体ＣＰＧ支持
体として使用した。

例１２ ＤＮＡ合成 前記した方法を使用する多数のＤＮＡ合成はヒンダード
シアルキルアミノヌクレオシド亜リン酸エステルおよび
ＣＰＧ固体支持体が、ジメチルアミノヌクレオシド亜す
ン酸エステルおよびシリカ支持体と比較した場合に、優
れていることを再現曲番こ示した。下記はこれらの改善
を例示するものである。

Ａ０次の２３−マーを製造する実験はシリカ支持体上の
ジメチルアミノヌクレオシド亜すン酸工９ ステルを使用する数回の操作で生成物の生成に失敗した
； しかしながら、シリカ支持体上で相当するジエチルアミ
ノヌクレオシド亜すン酸エステルを使用すると、生成物
の５％収率が得られ、この生成物は単離し、精製すると
、生物学的に活性であることを示した。

５’ＣＣＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧ
”’Ｂ、特異ｍ　−ＲＮ８の単離用のゾローブである次
の１４−マーをシリカ（１）およびＣＰＧ　（Ｉ［）支
持体上でジエチルアミノヌクレオシド亜リン酸エステル
を用いて合成した： ５′ＡＣＡＴＴＣＣＡＡＣＴＣＡＴ”　　　　　（１）
Ｇ ■の総合収率は１８％であるのに対し、■の総合収率は
６５％であった。

０ ＣＰ（）による改善された収率（最終脱トリチル化によ
り分析して）に加えて、■のＤＮＡは３２ｐでラベルし
た試料に対するゲル電気泳動により測定して、配列順序
失敗の少ない所望の生成物をより多く含有した。

Ｃ，Ｍ−１３に配列するサンが−（Ｓａｎｇｅｒ　）の
ジデオキシ用プライマーである２種の１７−マーのもう
１つのＤＮＡ合成において、逆行プライマー（ｒｅｖｅ
ｒｓｓ　ｐｒｉｍｅｒ　）をシリカ（曹）上で、そして
前進プライ？　−（ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　）
をＣＴＧ　（ＩＶ）上で、ジエチルアミノメトキシヌク
レオシド亜リン酸エステルを用いて合成した。

Ｓａｎｇｅｒ氏等のＰＮＡ８　Ｕ８Ａ、−ム４　（ｎＬ
　５４６３〜５４６７頁（１９７７年）参照。

５’　ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ、ＣＴＡ、ＴＧＡＣ３’　
　　　　　　（厘）””’　ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧ
ＣＣＡＩＴ　６′（ＩＶ）ＣＰＧ上でのＩＶの製造は閣
よりも定量的に高く、そして副生成物としての配列順序
失敗が少ないこことを示した。

Ｄ、　　ＣＰＧ上の次の１０−マー（Ｖ’）の合成にお
いて、ジエチル−およびジイソプロピル−ヌクレオシド
亜すン酸エステルはそれぞれ約４０％の収率をもたらし
、そして均等な品質のＤＮＡを生成させた。これはジエ
チル−およびジイソプロビル同族体の相対的に均等な有
効性を示している。

５’ＧＣ）ＡＡＴＴＣＴＴＴ　３’　　　　　　（Ｖ　
）例１６ もう１つのＤＮＡ合成において、下記の１７−マー（■
）を上記例１２に記載の方法に実質的に従うが、脱トリ
チル化剤としてＺｎＢｒ２の代りに、上記例８の終りに
記載したようにジクロル酢酸（ｐＫ　１−５　）を使用
して、Ｃ’ＰＧ固体支持体上で製造した。総合成時間は
杓子に減少し、収率はこの改良脱トリチル化工程により
約１００％増加した。

５’ＧＴＣＡＴＡ（）ＧＴＧＴＴＴＣＣＴＧ６′（Ｖｌ
）前記記載を読んだ後に、各種のその他の例が本発明の
精神および範囲から逸脱することなく当業者により実施
でき、そして全てのこのような例は特許請求の範囲内に
包含されるものとする。

代理人　浅　村　　　晧 外４名 ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　ヌレクオンドまたはオリゴヌクレオチドの６
   ′−〇−結合を経て無機固体支持体に共有結合させたこ
   のヌレクオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’−ＯＨ
   基を次式 〔式中Ｂ＝保護したプリンまたはピリミジン塩基、Ｒ＝
   保護基、 Ｒ１＋Ｒ２＝炭素原子の総数が４〜６個であるアルキル
   、 Ｒ３＝１〜６個の炭素原子を有するアルキル、 そして、 Ｘ＝ＨまたはＯＲ である〕 で示されるヒンダード亜リン酸ジアルキルアミノヌクレ
   オシドと縮合させる工程からなるオリゴヌクレオチドの
   製造方法。 （２）　　ジアルキルアミノ基がジエチルアミン基であ
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （３）　　ジアルキルアミノ基がジイソゾロビル基であ
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （４）　　ジアルキルアミノ基がメチルイソゾロビル基
   である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （５）Ｒがトリチル保論基である特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 （６）　　無機固体支持体がシリカである特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。 （７）無機固体支持体が制御した有孔ガラスである特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 （８）　　無機固体支持体を七〇主鎖に少なくとも１５
   個α）原子を有する長鎖スペーサーを経てヌクレオシド
   またＣ」オリゴヌクレオシドに結合させる特許請求の範
   囲ｍ１項に記載の方法。 （９）ジアルキルアミノ基がジエチルであり、そして無
   機固体支持体がその主鎖に少なくとも１５個の原子を有
   する長釦スペーザ−を廟する制御した有孔ガラスである
   特ｙ＋−ｈ求の範囲第１項に記載の方法。 θ０）　ジアルキルアミノ基がジイソゾロビル基であり
   、そして無機固体支持体が七〇主鎖に少なくとも１５個
   の原子を有する長鎖スペーサーを有する制御した有孔ガ
   ラスである特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ０υ　ジアルキルアミノ基がメチルイソゾロビル基であ
   り、そ１〜で無機固体支持体が七〇主鎖に少なくとも１
   ５個の原子を有する長鎖スペーサーを有する制御した有
   孔ガラスである特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （１２１ジイソゾロビルアミノメトギシクロルホスフイ
   ン。 （１３）　　メチルイソプロピルアミノメトキシクロル
   ホスフィン。 （＋４１　　亜すン酸ソイソプロビルアミノヌクレオシ
   ド。 （１５Ｉ　　亜リン酸メチルイソプロピルアミノヌクレ
   オシド。 （Ｉｕ）　　ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの
   ６′−〇−結合を結で無機同体支持体に共有結合させた
   このヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’　−
   ＯＨ基を次式 〔式中Ｂ−保論じたプリンまたはピリミジン塩基、Ｒ−
   保護基、 Ｒ，、Ｒ２およびＲ３−１〜６個の炭素原子を有するア
   ルキル、 そして Ｘ　＝　ＨｉたＦｉＯＲ である〕 で示されるＺＵ＜リン酸ジアルキルアミノヌクレオシド
   と動台させる工程を含み、この際に、無機固体支持体を
   そり主鎖に少なくとも１５個の原子を有する長鎖スペー
   サーを経てヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結
   合させる、オリゴヌクレオチドの製造方法。 ０′ｔ）　　保護基がトリチル基であり、そして保護し
   たヌクレオシド残基の脱トリチル化全約１．２〜約１．
   ８のｐＫ　　を有するプロチック酸による処理により行
   なう％Ｗｌ：訪求の範囲第１項に記載の方法。 ０８）　　プロチック酸が約１．５のｐＫ　　を有する
   ジクロル酢酸である％許趙求の範囲第１７項に記載の方
   法。