JPH1129591A - 人工ヌクレアーゼ機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド、ならびに、その製造用の中間体、その製造方法および使用方法 - Google Patents
人工ヌクレアーゼ機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド、ならびに、その製造用の中間体、その製造方法および使用方法Info
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- JPH1129591A JPH1129591A JP19939097A JP19939097A JPH1129591A JP H1129591 A JPH1129591 A JP H1129591A JP 19939097 A JP19939097 A JP 19939097A JP 19939097 A JP19939097 A JP 19939097A JP H1129591 A JPH1129591 A JP H1129591A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸の鎖を任意の位置で特異的かつ効率的に
切断する機能を有する人工ヌクレアーゼを提供する。 【解決手段】 ２つのチミジンの糖類基同士を結合させ
るリン酸ジエステル結合基の少なくとも１つを、下記の
化学構造式のジオキシリン（Ｖ）テトラフェニルポルフ
ィリン基で置換した化学構造を有するオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド。
切断する機能を有する人工ヌクレアーゼを提供する。 【解決手段】 ２つのチミジンの糖類基同士を結合させ
るリン酸ジエステル結合基の少なくとも１つを、下記の
化学構造式のジオキシリン（Ｖ）テトラフェニルポルフ
ィリン基で置換した化学構造を有するオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、ＤＮＡ（デオキ
シリボ核酸）やＲＮＡ（リボ核酸）の核酸の鎖を特定位
置で特異的に切断するために用いられる人工ヌクレアー
ゼ機能を有する新規なオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド、ならびに、その新規オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドを製造する際の中間体、特に、新規オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの骨格となって人工ヌクレアーゼ機能を
発揮する機能性因子の部分を形成するための中間体、そ
の新規オリゴデオキシリボヌクレオチドを製造するため
の製造方法、および、その新規オリゴデオキシリボヌク
レオチドの使用方法、特に、新規オリゴデオキシリボヌ
クレオチドを用いて核酸の鎖を特定位置で特異的に切断
する方法に関する。
シリボ核酸）やＲＮＡ（リボ核酸）の核酸の鎖を特定位
置で特異的に切断するために用いられる人工ヌクレアー
ゼ機能を有する新規なオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド、ならびに、その新規オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドを製造する際の中間体、特に、新規オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの骨格となって人工ヌクレアーゼ機能を
発揮する機能性因子の部分を形成するための中間体、そ
の新規オリゴデオキシリボヌクレオチドを製造するため
の製造方法、および、その新規オリゴデオキシリボヌク
レオチドの使用方法、特に、新規オリゴデオキシリボヌ
クレオチドを用いて核酸の鎖を特定位置で特異的に切断
する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡは、生物の遺伝情報を司る生体高
分子であり、このＤＮＡを任意の位置で切断することが
できれば、医学、遺伝子工学、分子生物学などの各分野
において大きな進歩をもたらすことになる。例えば、医
学の分野では、生体内において宿主のＤＮＡにダメージ
を与えることなくＤＮＡウィルス等の外来ＤＮＡを選択
的に切断することが可能になり、また、医学および遺伝
子工学の分野では、宿主自身の疾病の原因となるＤＮＡ
遺伝子を選択的に切断することによる疾病治療が可能と
なる。このように、ＤＮＡを任意の位置で切断すること
の重要性が医学や遺伝子工学などの各分野で近年益々認
識され、そのための数多くの研究が行われてきた。
分子であり、このＤＮＡを任意の位置で切断することが
できれば、医学、遺伝子工学、分子生物学などの各分野
において大きな進歩をもたらすことになる。例えば、医
学の分野では、生体内において宿主のＤＮＡにダメージ
を与えることなくＤＮＡウィルス等の外来ＤＮＡを選択
的に切断することが可能になり、また、医学および遺伝
子工学の分野では、宿主自身の疾病の原因となるＤＮＡ
遺伝子を選択的に切断することによる疾病治療が可能と
なる。このように、ＤＮＡを任意の位置で切断すること
の重要性が医学や遺伝子工学などの各分野で近年益々認
識され、そのための数多くの研究が行われてきた。
【０００３】例えば、人工合成ヌクレアーゼの最初の例
として、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５４（１９７
９）ｐ．１２２６９には、１，１０−フェナンスロリン
−銅複合体が二本鎖ＤＮＡを効率的に切断することが報
告されている。その後、種々の研究が行われ、他に人工
ヌクレアーゼの例として、鉄−エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）錯体（ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン
・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．），１０４（１９８２）ｐ．３１３）、メタロポル
フィリン（プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），８３（１９８６）ｐ．５４６
９）、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナンスロリ
ンの複合体（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２３３
（１９８６）ｐ．９８４７）、およびアントラキノン誘
導体（ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・
ソサイエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１１
６（１９９４）ｐ．９８４７）が見出され、それらの物
質がＤＮＡ鎖に切断点を生じさせる機能を有しているこ
とが示されている。
として、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５４（１９７
９）ｐ．１２２６９には、１，１０−フェナンスロリン
−銅複合体が二本鎖ＤＮＡを効率的に切断することが報
告されている。その後、種々の研究が行われ、他に人工
ヌクレアーゼの例として、鉄−エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）錯体（ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン
・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．），１０４（１９８２）ｐ．３１３）、メタロポル
フィリン（プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），８３（１９８６）ｐ．５４６
９）、４，７−ジフェニル−１，１０−フェナンスロリ
ンの複合体（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２３３
（１９８６）ｐ．９８４７）、およびアントラキノン誘
導体（ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・
ソサイエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１１
６（１９９４）ｐ．９８４７）が見出され、それらの物
質がＤＮＡ鎖に切断点を生じさせる機能を有しているこ
とが示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、１，１
０−フェナンスロリン−銅複合体は、二本鎖ＤＮＡの塩
基間の重なりにインターカレート（介挿）するため、二
本鎖ＤＮＡの２以上の位置でＤＮＡ鎖の切断を生じてし
まう。また、鉄−ＥＤＴＡ錯体、メタロポルフィリン、
４，７−ジフェニル−１，１０−フェナンスロリンの複
合体、アントラキノン誘導体などは、活性酸素を生じた
結果によりＤＮＡ鎖を切断するものであり、このため、
ＤＮＡの特定の塩基配列内の特異的な位置でＤＮＡ鎖の
切断点を生じさせることは困難であった。このように、
現在まで、ＤＮＡの任意の特定位置において特異的かつ
効率的にＤＮＡ鎖を切断する機能を有する人工ヌクレア
ーゼは見出されていない。
０−フェナンスロリン−銅複合体は、二本鎖ＤＮＡの塩
基間の重なりにインターカレート（介挿）するため、二
本鎖ＤＮＡの２以上の位置でＤＮＡ鎖の切断を生じてし
まう。また、鉄−ＥＤＴＡ錯体、メタロポルフィリン、
４，７−ジフェニル−１，１０−フェナンスロリンの複
合体、アントラキノン誘導体などは、活性酸素を生じた
結果によりＤＮＡ鎖を切断するものであり、このため、
ＤＮＡの特定の塩基配列内の特異的な位置でＤＮＡ鎖の
切断点を生じさせることは困難であった。このように、
現在まで、ＤＮＡの任意の特定位置において特異的かつ
効率的にＤＮＡ鎖を切断する機能を有する人工ヌクレア
ーゼは見出されていない。
【０００５】この発明は、このような事情の下でなされ
たものであり、核酸の鎖を任意の位置で特異的かつ効率
的に切断する機能を有する人工ヌクレアーゼを提供する
こと、ならびに、その人工ヌクレアーゼを製造するとき
の中間体を提供すること、その人工ヌクレアーゼを製造
するための製造方法を提供すること、および、その人工
ヌクレアーゼを用いて安易な条件で核酸の鎖を任意の特
定位置で特異的かつ効率的に切断する方法を提供するこ
とを目的とする。
たものであり、核酸の鎖を任意の位置で特異的かつ効率
的に切断する機能を有する人工ヌクレアーゼを提供する
こと、ならびに、その人工ヌクレアーゼを製造するとき
の中間体を提供すること、その人工ヌクレアーゼを製造
するための製造方法を提供すること、および、その人工
ヌクレアーゼを用いて安易な条件で核酸の鎖を任意の特
定位置で特異的かつ効率的に切断する方法を提供するこ
とを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】請求項１に係る発明は、
人工ヌクレアーゼ機能を有するオリゴデオキシリボヌク
レオチドが、２つのチミジンの糖類基同士を結合させる
リン酸ジエステル結合基の少なくとも１つを、化１で示
される構造式のジオキシリン（Ｖ）テトラフェニルポル
フィリン基で置換した化学構造を有するオリゴデオキシ
リボヌクレオチドであること、別の表現をすると、化５
で示される構造式の３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−
Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフ
ィリン基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドで
あることを特徴とする。
人工ヌクレアーゼ機能を有するオリゴデオキシリボヌク
レオチドが、２つのチミジンの糖類基同士を結合させる
リン酸ジエステル結合基の少なくとも１つを、化１で示
される構造式のジオキシリン（Ｖ）テトラフェニルポル
フィリン基で置換した化学構造を有するオリゴデオキシ
リボヌクレオチドであること、別の表現をすると、化５
で示される構造式の３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−
Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフ
ィリン基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドで
あることを特徴とする。
【０００７】
【化１】
【０００８】
【化５】
【０００９】請求項２に係る発明は、人工ヌクレアーゼ
機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの製造用
の中間体が、ジクロロリン（Ｖ）テトラフェニルポルフ
ィリンと過剰量のチミジンとから合成される、化２で示
される構造式の３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−
チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリ
ンであることを特徴とする。
機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの製造用
の中間体が、ジクロロリン（Ｖ）テトラフェニルポルフ
ィリンと過剰量のチミジンとから合成される、化２で示
される構造式の３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−
チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリ
ンであることを特徴とする。
【００１０】
【化２】
【００１１】請求項３に係る発明は、人工ヌクレアーゼ
機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの製造用
の中間体が、３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チ
ミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン
の誘導体である、化３で示される構造式（式中のＭＭＴ
ｒは、モノメトキシトリチル基を示す）の５’−Ｏ−モ
ノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”
−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポル
フィリンであることを特徴とする。
機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの製造用
の中間体が、３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チ
ミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン
の誘導体である、化３で示される構造式（式中のＭＭＴ
ｒは、モノメトキシトリチル基を示す）の５’−Ｏ−モ
ノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”
−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポル
フィリンであることを特徴とする。
【００１２】
【化３】
【００１３】請求項４に係る発明は、人工ヌクレアーゼ
機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの製造用
の中間体が、３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チ
ミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン
の誘導体である、化４で示される構造式（式中のＭＭＴ
ｒは、モノメトキシトリチル基を示す）の５’−Ｏ−モ
ノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”
−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポル
フィリン−３”−Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルホスホロアミダイトであることを特徴とす
る。
機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの製造用
の中間体が、３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チ
ミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン
の誘導体である、化４で示される構造式（式中のＭＭＴ
ｒは、モノメトキシトリチル基を示す）の５’−Ｏ−モ
ノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”
−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポル
フィリン−３”−Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルホスホロアミダイトであることを特徴とす
る。
【００１４】
【化４】
【００１５】請求項５に係る発明は、化６で示す反応式
によりジクロロリン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン
と過剰量のチミジンとから３’−Ｏ−チミジルオキシ
（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニ
ルポルフィリンを合成する工程と、３’−Ｏ−チミジル
オキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラ
フェニルポルフィリンと４−モノメトキシトリチルクロ
リドとの反応により５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−
３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキ
シ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンを生成する
工程と、５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−
チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン
（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンと１Ｈ−テトラゾー
ルと２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライ
ソプロピルホスホロジアミダイトとの反応により５’−
Ｏ−モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ
（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニ
ルポルフィリン−３”−Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピルホスホロアミダイトを生成する工程
と、任意の配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドを合成する工程と、前記オリゴデオキシリボヌクレオ
チドに５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チ
ミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）
テトラフェニルポルフィリン−３”−Ｏ−β−シアノエ
チル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトおよ
び１Ｈ−テトラゾールを加えて反応させる工程と、この
工程で得られたオリゴデオキシリボヌクレオチドを用い
て、任意の配列および任意の鎖長を有する定序配列オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドを合成する工程とを経るこ
とにより、人工ヌクレアーゼ機能を有するオリゴデオキ
シリボヌクレオチドを製造することを特徴とする。
によりジクロロリン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン
と過剰量のチミジンとから３’−Ｏ−チミジルオキシ
（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニ
ルポルフィリンを合成する工程と、３’−Ｏ−チミジル
オキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラ
フェニルポルフィリンと４−モノメトキシトリチルクロ
リドとの反応により５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−
３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキ
シ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンを生成する
工程と、５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−
チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン
（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンと１Ｈ−テトラゾー
ルと２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライ
ソプロピルホスホロジアミダイトとの反応により５’−
Ｏ−モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ
（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニ
ルポルフィリン−３”−Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピルホスホロアミダイトを生成する工程
と、任意の配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドを合成する工程と、前記オリゴデオキシリボヌクレオ
チドに５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チ
ミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）
テトラフェニルポルフィリン−３”−Ｏ−β−シアノエ
チル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトおよ
び１Ｈ−テトラゾールを加えて反応させる工程と、この
工程で得られたオリゴデオキシリボヌクレオチドを用い
て、任意の配列および任意の鎖長を有する定序配列オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドを合成する工程とを経るこ
とにより、人工ヌクレアーゼ機能を有するオリゴデオキ
シリボヌクレオチドを製造することを特徴とする。
【００１６】
【化６】
【００１７】請求項６に係る発明は、核酸の特定部位の
塩基配列に相補的な塩基配列を有し、かつ、２つのチミ
ジンの糖部分同士を結合させるリン酸ジエステル結合部
の少なくとも１つを、化１で示される構造式のジオキシ
リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンで置換した化学
構造を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを用い、
そのオリゴデオキシリボヌクレオチドと前記核酸とで二
本鎖を形成させ、これに光照射して、直接電子移動反応
により前記核酸の鎖を特定位置で切断することを特徴と
する。
塩基配列に相補的な塩基配列を有し、かつ、２つのチミ
ジンの糖部分同士を結合させるリン酸ジエステル結合部
の少なくとも１つを、化１で示される構造式のジオキシ
リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンで置換した化学
構造を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを用い、
そのオリゴデオキシリボヌクレオチドと前記核酸とで二
本鎖を形成させ、これに光照射して、直接電子移動反応
により前記核酸の鎖を特定位置で切断することを特徴と
する。
【００１８】
【化１】
【００１９】上記したように構成された請求項１に係る
発明のオリゴデオキシリボヌクレオチドでは、それに含
有されるリン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基の部
位が、直接電子移動反応を介してＤＮＡなどの核酸の鎖
を切断するような強力な酸化力を有している。
発明のオリゴデオキシリボヌクレオチドでは、それに含
有されるリン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基の部
位が、直接電子移動反応を介してＤＮＡなどの核酸の鎖
を切断するような強力な酸化力を有している。
【００２０】請求項２、請求項３および請求項４に係る
各発明の中間体はそれぞれ、請求項１に係る発明のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドを製造する際の中間体であ
り、請求項２に係る発明の中間体から請求項３に係る発
明の中間体が合成され、請求項３に係る発明の中間体か
ら請求項４に係る発明の中間体が合成され、請求項４に
係る発明の中間体を用いて請求項１に係る発明のオリゴ
デオキシリボヌクレオチドが合成される。これらの中間
体はそれぞれ、請求項１に係る発明のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの骨格となって人工ヌクレアーゼ機能を
発揮する機能性因子である３’−Ｏ−チミジルオキシ
（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニ
ルポルフィリン基の形成部分を有している。
各発明の中間体はそれぞれ、請求項１に係る発明のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドを製造する際の中間体であ
り、請求項２に係る発明の中間体から請求項３に係る発
明の中間体が合成され、請求項３に係る発明の中間体か
ら請求項４に係る発明の中間体が合成され、請求項４に
係る発明の中間体を用いて請求項１に係る発明のオリゴ
デオキシリボヌクレオチドが合成される。これらの中間
体はそれぞれ、請求項１に係る発明のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの骨格となって人工ヌクレアーゼ機能を
発揮する機能性因子である３’−Ｏ−チミジルオキシ
（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニ
ルポルフィリン基の形成部分を有している。
【００２１】請求項５に係る発明の製造方法によると、
請求項１に係る発明の、人工ヌクレアーゼ機能を有する
オリゴデオキシリボヌクレオチドが合成される。
請求項１に係る発明の、人工ヌクレアーゼ機能を有する
オリゴデオキシリボヌクレオチドが合成される。
【００２２】請求項１に係る発明のオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドにおける塩基配列を、鎖を切断しようとす
る核酸の、切断しようとする特定部位の塩基配列と相補
的関係を有するように合成し、請求項６に係る発明の方
法では、そのようなオリゴデオキシリボヌクレオチドを
用い、そのオリゴデオキシリボヌクレオチドと核酸とで
二本鎖を形成させる。このとき、オリゴデオキシリボヌ
クレオチドと相補的塩基配列を有する核酸とで熱安定性
二本鎖が形成され、これに光照射すると、直接光誘起電
子移動反応により核酸の鎖が切断される。このＤＮＡ鎖
などの切断は、オリゴデオキシリボヌクレオチドのリン
（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基が位置する部位に
対応する相補的部位であってグアニン塩基が存在する位
置で特異的に生じる。
ヌクレオチドにおける塩基配列を、鎖を切断しようとす
る核酸の、切断しようとする特定部位の塩基配列と相補
的関係を有するように合成し、請求項６に係る発明の方
法では、そのようなオリゴデオキシリボヌクレオチドを
用い、そのオリゴデオキシリボヌクレオチドと核酸とで
二本鎖を形成させる。このとき、オリゴデオキシリボヌ
クレオチドと相補的塩基配列を有する核酸とで熱安定性
二本鎖が形成され、これに光照射すると、直接光誘起電
子移動反応により核酸の鎖が切断される。このＤＮＡ鎖
などの切断は、オリゴデオキシリボヌクレオチドのリン
（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基が位置する部位に
対応する相補的部位であってグアニン塩基が存在する位
置で特異的に生じる。
【００２３】
【発明の実施の形態】以下、この発明の好適な実施形態
について説明する。
について説明する。
【００２４】この発明に係る人工ヌクレアーゼ機能を有
するオリゴデオキシリボヌクレオチドは、５’−Ｏ−モ
ノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”
−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポル
フィリンから合成される任意の配列を有し、３’−Ｏ−
チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン
（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基を含有する。すな
わち、このオリゴデオキシリボヌクレオチドは、２つの
チミジンの糖類基同士を結合させるリン酸ジエステル結
合基の少なくとも１つをジオキシリン（Ｖ）テトラフェ
ニルポルフィリン基で置換した以下の（１）、（２）ま
たは（３）の式で示す構造を有しており、あるいは、そ
れらの構造を有する２つもしくは３つのオリゴデオキシ
リボヌクレオチドの結合体である。
するオリゴデオキシリボヌクレオチドは、５’−Ｏ−モ
ノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”
−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポル
フィリンから合成される任意の配列を有し、３’−Ｏ−
チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン
（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基を含有する。すな
わち、このオリゴデオキシリボヌクレオチドは、２つの
チミジンの糖類基同士を結合させるリン酸ジエステル結
合基の少なくとも１つをジオキシリン（Ｖ）テトラフェ
ニルポルフィリン基で置換した以下の（１）、（２）ま
たは（３）の式で示す構造を有しており、あるいは、そ
れらの構造を有する２つもしくは３つのオリゴデオキシ
リボヌクレオチドの結合体である。
【００２５】 ＮpＮp・・・・・ＴPＴp・・・・・ＮpＮ …（１）p ＮpＮp・・・・・ＴPＴp・・・・・ＮpＮ …（２）p ＮpＮp・・・・・ＴPＴp・・・・・ＮpＮp …（３） 上記式中、Ｎはアデノシン、チミジン、グアノシンおよ
びシチジンのうちの任意のヌクレオシド、Ｔはチミジ
ン、pはリン酸ジエステル結合基、Pはジオキシリン
（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基をそれぞれ示す。
びシチジンのうちの任意のヌクレオシド、Ｔはチミジ
ン、pはリン酸ジエステル結合基、Pはジオキシリン
（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基をそれぞれ示す。
【００２６】上記したような構造を有するオリゴデオキ
シリボヌクレオチドは、３’−Ｏ−チミジルオキシ
（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニ
ルポルフィリン基が、人工ヌクレアーゼ機能を発揮する
機能性因子として作用し、リン（Ｖ）テトラフェニルポ
ルフィリン基の強力な酸化力により、直接電子移動反応
を介してＤＮＡなどの核酸の鎖を切断する。
シリボヌクレオチドは、３’−Ｏ−チミジルオキシ
（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニ
ルポルフィリン基が、人工ヌクレアーゼ機能を発揮する
機能性因子として作用し、リン（Ｖ）テトラフェニルポ
ルフィリン基の強力な酸化力により、直接電子移動反応
を介してＤＮＡなどの核酸の鎖を切断する。
【００２７】上記した化学構造のオリゴデオキシリボヌ
クレオチドを合成するには、例えば、まず、ジクロロリ
ン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンと過剰量のチミジ
ンとの反応により、３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−
Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフ
ィリンを合成する。次に、得られた３’−Ｏ−チミジル
オキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラ
フェニルポルフィリンを４−モノメトキシトリチルクロ
リドと反応させることにより、５’−Ｏ−モノメトキシ
トリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミ
ジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンを
生成する。次に、生成された５’−Ｏ−モノメトキシト
リチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジ
ルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンと１
Ｈ−テトラゾールおよび２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト
との反応により５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’
−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リ
ン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン−３”−Ｏ−β−
シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダ
イトを生成する。そして、ＤＮＡ自動合成機により常法
に従って、任意の配列を有するオリゴデオキシリボヌク
レオチドを合成し、この合成されたオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドに５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’
−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リ
ン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン−３”−Ｏ−β−
シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダ
イトおよび１Ｈ−テトラゾールを加えて反応させる。最
後に、得られたオリゴデオキシリボヌクレオチドを用い
て、任意の配列および任意の鎖長を有する定序配列オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドを合成する。この合成の具
体的方法については、後述する。
クレオチドを合成するには、例えば、まず、ジクロロリ
ン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンと過剰量のチミジ
ンとの反応により、３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−
Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフ
ィリンを合成する。次に、得られた３’−Ｏ−チミジル
オキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラ
フェニルポルフィリンを４−モノメトキシトリチルクロ
リドと反応させることにより、５’−Ｏ−モノメトキシ
トリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミ
ジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンを
生成する。次に、生成された５’−Ｏ−モノメトキシト
リチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジ
ルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンと１
Ｈ−テトラゾールおよび２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト
との反応により５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’
−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リ
ン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン−３”−Ｏ−β−
シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダ
イトを生成する。そして、ＤＮＡ自動合成機により常法
に従って、任意の配列を有するオリゴデオキシリボヌク
レオチドを合成し、この合成されたオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドに５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’
−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リ
ン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン−３”−Ｏ−β−
シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダ
イトおよび１Ｈ−テトラゾールを加えて反応させる。最
後に、得られたオリゴデオキシリボヌクレオチドを用い
て、任意の配列および任意の鎖長を有する定序配列オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドを合成する。この合成の具
体的方法については、後述する。
【００２８】上記したようなオリゴデオキシリボヌクレ
オチドを用いてＤＮＡ鎖を切断するには、ＤＮＡ鎖の切
断しようとする部位の塩基配列と相補的な塩基配列を有
するように、３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チ
ミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン
基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成す
る。そして、合成されたオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドと切断しようとするＤＮＡとで熱安定性二本鎖を形成
させ、これに光照射する。これにより、直接光誘起電子
移動反応によってＤＮＡ鎖が特定位置で切断される。こ
のＤＮＡ鎖の切断は、オリゴデオキシリボヌクレオチド
のリン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基が位置する
部位に対応する相補的部位に存在するグアニン塩基の位
置で特異的に生じる。
オチドを用いてＤＮＡ鎖を切断するには、ＤＮＡ鎖の切
断しようとする部位の塩基配列と相補的な塩基配列を有
するように、３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チ
ミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン
基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成す
る。そして、合成されたオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドと切断しようとするＤＮＡとで熱安定性二本鎖を形成
させ、これに光照射する。これにより、直接光誘起電子
移動反応によってＤＮＡ鎖が特定位置で切断される。こ
のＤＮＡ鎖の切断は、オリゴデオキシリボヌクレオチド
のリン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基が位置する
部位に対応する相補的部位に存在するグアニン塩基の位
置で特異的に生じる。
【００２９】
【実施例】以下、上記した各物質の具体的合成例などに
ついて説明する。
ついて説明する。
【００３０】
【実施例】以下、上記した各物質の具体的合成例などに
ついて説明する。
ついて説明する。
【００３１】〔３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−
チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリ
ンの合成例〕ジクロロリン（Ｖ）テトラフェニルポルフ
ィリン５０８ｍｇ（６７７μｍｏｌ）を減圧下で乾燥ピ
リジンとの共沸により乾燥させたものを、チミジン３．
２５ｍｇ（１３．４ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン溶液１０
ｍｌに加え、この溶液をアルゴンガス気流下において還
流させた。還流を開始してから１３時間後に、反応液を
冷却させ、減圧下において溶媒を留去した。続いて、残
渣をクロロフルム（ＣＨＣｌ3）／メタノール（ＭｅＯ
Ｈ）（＝４：１）の混合溶媒に溶解させ、過剰量（不
溶）のチミジンを濾過して除去した。そして、濾液の溶
媒を留去した後に、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー（溶媒：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ＝９：１）および逆相
液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）（溶媒：ＭｅＯＨ
／０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ
７．０）＝６：４）により精製した。これにより、３５
％の収率で３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミ
ジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンが
得られた。
チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリ
ンの合成例〕ジクロロリン（Ｖ）テトラフェニルポルフ
ィリン５０８ｍｇ（６７７μｍｏｌ）を減圧下で乾燥ピ
リジンとの共沸により乾燥させたものを、チミジン３．
２５ｍｇ（１３．４ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン溶液１０
ｍｌに加え、この溶液をアルゴンガス気流下において還
流させた。還流を開始してから１３時間後に、反応液を
冷却させ、減圧下において溶媒を留去した。続いて、残
渣をクロロフルム（ＣＨＣｌ3）／メタノール（ＭｅＯ
Ｈ）（＝４：１）の混合溶媒に溶解させ、過剰量（不
溶）のチミジンを濾過して除去した。そして、濾液の溶
媒を留去した後に、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー（溶媒：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ＝９：１）および逆相
液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）（溶媒：ＭｅＯＨ
／０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ
７．０）＝６：４）により精製した。これにより、３５
％の収率で３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミ
ジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンが
得られた。
【００３２】〔５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’
−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リ
ン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンの合成例〕上記の
３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキ
シ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン７７．３ｍ
ｇ（６６．５μｍｏｌ）を乾燥ピリジンとの共沸により
乾燥させた後、これをチミジンの５’−水酸基の典型的
な保護基としてのモノメトキシトリチルクロリド２０７
ｍｇ（６７１μｍｏｌ）の乾燥ピリジン溶液１．３ｍｌ
に溶解させ、反応混合物をアルゴンガス気流下において
６０℃の温度で１．５時間加温した。反応後、溶媒を留
去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：Ｃ
ＨＣｌ3／ＭｅＯＨ＝８：１（０．５％ピリジンを含
む））により精製分離した。これにより、５７％の収率
で５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジ
ルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テト
ラフェニルポルフィリンが５４．５ｍｇ得られた。
−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リ
ン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンの合成例〕上記の
３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキ
シ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン７７．３ｍ
ｇ（６６．５μｍｏｌ）を乾燥ピリジンとの共沸により
乾燥させた後、これをチミジンの５’−水酸基の典型的
な保護基としてのモノメトキシトリチルクロリド２０７
ｍｇ（６７１μｍｏｌ）の乾燥ピリジン溶液１．３ｍｌ
に溶解させ、反応混合物をアルゴンガス気流下において
６０℃の温度で１．５時間加温した。反応後、溶媒を留
去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：Ｃ
ＨＣｌ3／ＭｅＯＨ＝８：１（０．５％ピリジンを含
む））により精製分離した。これにより、５７％の収率
で５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジ
ルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テト
ラフェニルポルフィリンが５４．５ｍｇ得られた。
【００３３】〔５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’
−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リ
ン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン−３”−Ｏ−β−
シアノエチルホスホロアミダイトの合成例〕上記の５’
−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキ
シ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェ
ニルポルフィリン３０．１ｍｇ（２１．０μｍｏｌ）の
乾燥塩化メチレン（ＣＨ2Ｃｌ2）溶液０．１ｍｌに、１
Ｈ−テトラゾール１．５ｍｇ（２１．４μｍｏｌ）の乾
燥アセトニトリル（ＭｅＣＮ）溶液０．１ｍｌおよび２
−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロ
ピルホスホロジアミダイト６．７０μｌ（２１．０μｍ
ｏｌ）を加え、反応混合物をアルゴンガス気流下におい
て室温で撹拌した。２時間後に、溶媒を減圧下で留去し
た。これにより、５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−
３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキ
シ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン−３”−Ｏ
−β−シアノエチルホスホロアミダイトが定量的に得ら
れた。
−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リ
ン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン−３”−Ｏ−β−
シアノエチルホスホロアミダイトの合成例〕上記の５’
−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキ
シ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェ
ニルポルフィリン３０．１ｍｇ（２１．０μｍｏｌ）の
乾燥塩化メチレン（ＣＨ2Ｃｌ2）溶液０．１ｍｌに、１
Ｈ−テトラゾール１．５ｍｇ（２１．４μｍｏｌ）の乾
燥アセトニトリル（ＭｅＣＮ）溶液０．１ｍｌおよび２
−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロ
ピルホスホロジアミダイト６．７０μｌ（２１．０μｍ
ｏｌ）を加え、反応混合物をアルゴンガス気流下におい
て室温で撹拌した。２時間後に、溶媒を減圧下で留去し
た。これにより、５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−
３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキ
シ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン−３”−Ｏ
−β−シアノエチルホスホロアミダイトが定量的に得ら
れた。
【００３４】〔テトラフェニルポルフィリンを結合させ
たオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成例〕ＤＮＡ自
動合成機を使用して固相法により、任意の配列を有する
オリゴデオキシリボヌクレオチドを常法に従って合成し
た（２．０μｍｏｌスケール）。この後、合成されたオ
リゴデオキシリボヌクレオチドを固相担体に結合させ、
５’−末端の保護基を除去したオリゴデオキシリボヌク
レオチドをＤＮＡ自動合成機用反応カラムにより取り出
し、これを約２ｍｌのフィルター付きガラス容器へ移
し、乾燥ＭｅＣＮで洗浄した。続いて、これに、３０μ
ｍｏｌの５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−
チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン
（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン−３”−Ｏ−β−シ
アノエチルホスホロアミダイトのＣＨ2Ｃｌ2溶液０．１
ｍｌおよび１Ｈ−テトラゾール１０．５ｍｇ（１５０μ
ｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液０．１ｍｌを加え、アルゴン気
流下において室温で１３時間撹拌した。反応終了後に、
濾過法により反応液を除去し、残留物を乾燥ＭｅＣＮで
洗浄し、常法に従ってヨウ素により酸化反応を１０分間
行った。再び、濾過法により反応液を除去し、残留物を
乾燥ＭｅＣＮで洗浄し、乾燥後に、ポルフィリンブロッ
クを結合させたオリゴデオキシリボヌクレオチド結合固
相担体をＤＮＡ自動合成機用反応カラムへ移し、そのカ
ラムをＤＮＡ自動合成機にセットして、自動合成によ
り、任意の配列および任意の鎖長を有するオリゴデオキ
シリボヌクレオチドを合成した。これにより、例えば塩
基配列が５’−ＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴPＴＴＴＡＡＡＴ
ＡＴＴ−３’或いは５’−ＴＴＡＴＡＡＣＣＣＴPＴＣ
ＣＣＡＡＴＡＴＴ−３’（Ｔ：チミン、Ａ：アデニン、
Ｃ：シトシン、P：ジオキシリン（Ｖ）テトラフェニル
ポルフィリン基）などである定序配列オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドが合成された。
たオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成例〕ＤＮＡ自
動合成機を使用して固相法により、任意の配列を有する
オリゴデオキシリボヌクレオチドを常法に従って合成し
た（２．０μｍｏｌスケール）。この後、合成されたオ
リゴデオキシリボヌクレオチドを固相担体に結合させ、
５’−末端の保護基を除去したオリゴデオキシリボヌク
レオチドをＤＮＡ自動合成機用反応カラムにより取り出
し、これを約２ｍｌのフィルター付きガラス容器へ移
し、乾燥ＭｅＣＮで洗浄した。続いて、これに、３０μ
ｍｏｌの５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−
チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン
（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン−３”−Ｏ−β−シ
アノエチルホスホロアミダイトのＣＨ2Ｃｌ2溶液０．１
ｍｌおよび１Ｈ−テトラゾール１０．５ｍｇ（１５０μ
ｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液０．１ｍｌを加え、アルゴン気
流下において室温で１３時間撹拌した。反応終了後に、
濾過法により反応液を除去し、残留物を乾燥ＭｅＣＮで
洗浄し、常法に従ってヨウ素により酸化反応を１０分間
行った。再び、濾過法により反応液を除去し、残留物を
乾燥ＭｅＣＮで洗浄し、乾燥後に、ポルフィリンブロッ
クを結合させたオリゴデオキシリボヌクレオチド結合固
相担体をＤＮＡ自動合成機用反応カラムへ移し、そのカ
ラムをＤＮＡ自動合成機にセットして、自動合成によ
り、任意の配列および任意の鎖長を有するオリゴデオキ
シリボヌクレオチドを合成した。これにより、例えば塩
基配列が５’−ＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴPＴＴＴＡＡＡＴ
ＡＴＴ−３’或いは５’−ＴＴＡＴＡＡＣＣＣＴPＴＣ
ＣＣＡＡＴＡＴＴ−３’（Ｔ：チミン、Ａ：アデニン、
Ｃ：シトシン、P：ジオキシリン（Ｖ）テトラフェニル
ポルフィリン基）などである定序配列オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドが合成された。
【００３５】上記した合成例によって得られたジオキシ
リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基を有する定序
配列オリゴデオキシリボヌクレオチドは、それと相補的
なオリゴデオキシリボヌクレオチドとでハイブリッドを
形成し、このハイブレッドは、明確な融点を持つ。例え
ば、５’−ＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴPＴＴＴＡＡＡＴＡＴ
Ｔ−３’と３’−ＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡ
ＴＡＡ−５’とで形成されるハイブリッドは、２９℃の
融点を示し、５’−ＴＴＡＴＡＡＣＣＣＴPＴＣＣＣＡ
ＡＴＡＴＴ−３’と３’−ＡＡＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＧ
ＧＴＴＡＴＡＡ−５’（Ｇ：グアニン）とで形成される
ハイブリッドは、３１℃の融点を示す。また、それらの
ハイブリッドは、ＣＤスペクトルにおいて、ジオキシリ
ン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基の無い相補系と
比較してほぼ同一のスペクトルが得られ、また、ポルフ
ィリンに関するＣＤスペクトルにおいては、４２９ｎｍ
付近で正ピークを、４４０ｎｍ付近で負ピークをそれぞ
れ示すが、ハイブリッドでは、１つの正ピークだけを示
し、ポルフィリンが相補的なオリゴヌクレオチドと直接
に相互作用していることが確認された。
リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基を有する定序
配列オリゴデオキシリボヌクレオチドは、それと相補的
なオリゴデオキシリボヌクレオチドとでハイブリッドを
形成し、このハイブレッドは、明確な融点を持つ。例え
ば、５’−ＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴPＴＴＴＡＡＡＴＡＴ
Ｔ−３’と３’−ＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡ
ＴＡＡ−５’とで形成されるハイブリッドは、２９℃の
融点を示し、５’−ＴＴＡＴＡＡＣＣＣＴPＴＣＣＣＡ
ＡＴＡＴＴ−３’と３’−ＡＡＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＧ
ＧＴＴＡＴＡＡ−５’（Ｇ：グアニン）とで形成される
ハイブリッドは、３１℃の融点を示す。また、それらの
ハイブリッドは、ＣＤスペクトルにおいて、ジオキシリ
ン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリン基の無い相補系と
比較してほぼ同一のスペクトルが得られ、また、ポルフ
ィリンに関するＣＤスペクトルにおいては、４２９ｎｍ
付近で正ピークを、４４０ｎｍ付近で負ピークをそれぞ
れ示すが、ハイブリッドでは、１つの正ピークだけを示
し、ポルフィリンが相補的なオリゴヌクレオチドと直接
に相互作用していることが確認された。
【００３６】〔オリゴデオキシリボヌクレオチドの切断
例（１）〕５’−ＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴPＴＴＴＡＡＡ
ＴＡＴＴ−３’と３’−ＡＡＴＡＴＴＴＡＡＧＡＡＡＴ
ＴＴＡＴＡＡ−５’とがハイブリッドを形成する条件
（それぞれのオリゴデオキシリボヌクレオチドのモル濃
度：２．５μＭの等モル濃度、緩衝液：１０ｍＭリン酸
ナトリウム（ｐＨ７．２）＋１５０ｍＭＮａＣｌ、７
℃）において、そのハイブリッドに対し、３９０ｎｍＵ
Ｖカットフィルターおよび水フィルターによって紫外線
および熱線を除外したキセノン光を照射し、高速液体ク
ロマトグラム（ＨＰＬＣ）（０．１Ｍ酢酸トリエチルア
ンモニウム（ｐＨ７．０）、０〜１８％アセトニトリル
線型濃度匂配、溶離液速度１．０ｍｌ／ｍｉｎ、溶離時
間５０ｍｉｎ）により分析を行った。溶離時間３０分で
現れるピーク（２８５ｎｍ、相補的オリゴヌクレオチ
ド）は、空気中とアルゴン中とで大きな差異が無く、そ
のピークは照射時間の経過と共に小さくなった。また、
反応物をピペリジンによって９０℃の温度で２０分間処
理することにより、新たな２つのピークが出現した。こ
れは、相補的なオリゴヌクレオチドの切断が１個所で起
こっていることを示し、また、空気中とアルゴン中とで
共に同様の結果が得られたことは、この光切断反応が距
離依存性の大きい直接電子移動（相補的オリゴヌクレオ
チドの特定の核酸塩基から励起ポルフィリンへの電子移
動）によって起こっていることを示唆するものである。
例（１）〕５’−ＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴPＴＴＴＡＡＡ
ＴＡＴＴ−３’と３’−ＡＡＴＡＴＴＴＡＡＧＡＡＡＴ
ＴＴＡＴＡＡ−５’とがハイブリッドを形成する条件
（それぞれのオリゴデオキシリボヌクレオチドのモル濃
度：２．５μＭの等モル濃度、緩衝液：１０ｍＭリン酸
ナトリウム（ｐＨ７．２）＋１５０ｍＭＮａＣｌ、７
℃）において、そのハイブリッドに対し、３９０ｎｍＵ
Ｖカットフィルターおよび水フィルターによって紫外線
および熱線を除外したキセノン光を照射し、高速液体ク
ロマトグラム（ＨＰＬＣ）（０．１Ｍ酢酸トリエチルア
ンモニウム（ｐＨ７．０）、０〜１８％アセトニトリル
線型濃度匂配、溶離液速度１．０ｍｌ／ｍｉｎ、溶離時
間５０ｍｉｎ）により分析を行った。溶離時間３０分で
現れるピーク（２８５ｎｍ、相補的オリゴヌクレオチ
ド）は、空気中とアルゴン中とで大きな差異が無く、そ
のピークは照射時間の経過と共に小さくなった。また、
反応物をピペリジンによって９０℃の温度で２０分間処
理することにより、新たな２つのピークが出現した。こ
れは、相補的なオリゴヌクレオチドの切断が１個所で起
こっていることを示し、また、空気中とアルゴン中とで
共に同様の結果が得られたことは、この光切断反応が距
離依存性の大きい直接電子移動（相補的オリゴヌクレオ
チドの特定の核酸塩基から励起ポルフィリンへの電子移
動）によって起こっていることを示唆するものである。
【００３７】〔オリゴデオキシリボヌクレオチドの切断
例（２）〕上記と同様の光反応条件により、５’−ＴＴ
ＡＴＡＡＡＴＴＴPＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴ−３’と３’
−ＡＡＴＡＴＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴＴＡＴＡＡ−５’と
からなる系で分析を行っても、上記と同様の結果が得ら
れた。これは、ポリフィリン近傍に２つのグアニン残基
があるのにもかかわらず、そのうちの１つを選択した光
反応であることを示唆している。
例（２）〕上記と同様の光反応条件により、５’−ＴＴ
ＡＴＡＡＡＴＴＴPＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴ−３’と３’
−ＡＡＴＡＴＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴＴＡＴＡＡ−５’と
からなる系で分析を行っても、上記と同様の結果が得ら
れた。これは、ポリフィリン近傍に２つのグアニン残基
があるのにもかかわらず、そのうちの１つを選択した光
反応であることを示唆している。
【００３８】
【発明の効果】請求項１に係る発明の、人工ヌクレアー
ゼ機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを用い
ると、核酸の鎖を任意の特定位置で特異的かつ効率的に
切断することが可能になる。そして、このオリゴデオキ
シリボヌクレオチドは、十分な安定性を有しており、こ
のため、様々な条件で使用することが可能である。
ゼ機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを用い
ると、核酸の鎖を任意の特定位置で特異的かつ効率的に
切断することが可能になる。そして、このオリゴデオキ
シリボヌクレオチドは、十分な安定性を有しており、こ
のため、様々な条件で使用することが可能である。
【００３９】請求項２、請求項３および請求項４に係る
各発明の中間体はそれぞれ、請求項１に係る発明のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドの骨格となって人工ヌクレ
アーゼ機能を発揮する機能性因子である３’−Ｏ−チミ
ジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テ
トラフェニルポルフィリン基の形成部分を有しており、
それらの中間体を順次経て、上記効果を奏する請求項１
に係る発明のオリゴデオキシリボヌクレオチドが得られ
る。
各発明の中間体はそれぞれ、請求項１に係る発明のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドの骨格となって人工ヌクレ
アーゼ機能を発揮する機能性因子である３’−Ｏ−チミ
ジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テ
トラフェニルポルフィリン基の形成部分を有しており、
それらの中間体を順次経て、上記効果を奏する請求項１
に係る発明のオリゴデオキシリボヌクレオチドが得られ
る。
【００４０】請求項５に係る発明の製造方法によると、
上記効果を奏する請求項１に係る発明の、人工ヌクレア
ーゼ機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが得
られる。
上記効果を奏する請求項１に係る発明の、人工ヌクレア
ーゼ機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドが得
られる。
【００４１】請求項６に係る発明の使用方法によると、
安易な条件で核酸の鎖を任意の特定位置で極めて特異的
かつ効率的に切断することができる。
安易な条件で核酸の鎖を任意の特定位置で極めて特異的
かつ効率的に切断することができる。
【００４２】そして、請求項１に係る発明のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを用いて請求項６に係る発明の方
法を、例えば生体内において適用すれば、宿主のＤＮＡ
にダメージを与えることなく、ＤＮＡウィルス等の外来
ＤＮＡを選択的に切断することができ、また、宿主自身
の疾病の原因となるＤＮＡ遺伝子に対して適用すれば、
原因遺伝子を選択的に切断することによる疾病治療が可
能になる。このように、この発明は、医学、遺伝子工
学、分子生物学などの各分野における進歩に大いに寄与
し得るものである。
キシリボヌクレオチドを用いて請求項６に係る発明の方
法を、例えば生体内において適用すれば、宿主のＤＮＡ
にダメージを与えることなく、ＤＮＡウィルス等の外来
ＤＮＡを選択的に切断することができ、また、宿主自身
の疾病の原因となるＤＮＡ遺伝子に対して適用すれば、
原因遺伝子を選択的に切断することによる疾病治療が可
能になる。このように、この発明は、医学、遺伝子工
学、分子生物学などの各分野における進歩に大いに寄与
し得るものである。
Claims (6)
- 【請求項１】 ２つのチミジンの糖類基同士を結合させ
るリン酸ジエステル結合基の少なくとも１つを、化１で
示される構造式のジオキシリン（Ｖ）テトラフェニルポ
ルフィリン基で置換した化学構造を有する、人工ヌクレ
アーゼ機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド。 【化１】 - 【請求項２】 ジクロロリン（Ｖ）テトラフェニルポル
フィリンと過剰量のチミジンとから合成される、化２で
示される構造式の３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ
−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィ
リンからなる、人工ヌクレアーゼ機能を有するオリゴデ
オキシリボヌクレオチドの製造用の中間体。 【化２】 - 【請求項３】 ３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−
チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリ
ンの誘導体である、化３で示される構造式（式中のＭＭ
Ｔｒは、モノメトキシトリチル基を示す）の５’−Ｏ−
モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ
（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニ
ルポルフィリンからなる、人工ヌクレアーゼ機能を有す
るオリゴデオキシリボヌクレオチドの製造用の中間体。 【化３】 - 【請求項４】 ３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−
チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリ
ンの誘導体である、化４で示される構造式（式中のＭＭ
Ｔｒは、モノメトキシトリチル基を示す）の５’−Ｏ−
モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ
（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニ
ルポルフィリン−３”−Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピルホスホロアミダイトからなる、人工ヌ
クレアーゼ機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドの製造用の中間体。 【化４】 - 【請求項５】 ジクロロリン（Ｖ）テトラフェニルポル
フィリンと過剰量のチミジンとから３’−Ｏ−チミジル
オキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラ
フェニルポルフィリンを合成する工程と、 ３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−チミジルオキ
シ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリンと４−モノ
メトキシトリチルクロリドとの反応により５’−Ｏ−モ
ノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”
−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポル
フィリンを生成する工程と、 ５’−Ｏ−モノメトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジル
オキシ（５”−Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラ
フェニルポルフィリンと１Ｈ−テトラゾールと２−シア
ノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホ
スホロジアミダイトとの反応により５’−Ｏ−モノメト
キシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−Ｏ−
チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフィリ
ン−３”−Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロ
ピルホスホロアミダイトを生成する工程と、 任意の配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを
合成する工程と、 前記オリゴデオキシリボヌクレオチドに５’−Ｏ−モノ
メトキシトリチル−３’−Ｏ−チミジルオキシ（５”−
Ｏ−チミジルオキシ）リン（Ｖ）テトラフェニルポルフ
ィリン−３”−Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソ
プロピルホスホロアミダイトおよび１Ｈ−テトラゾール
を加えて反応させる工程と、 この工程で得られたオリゴデオキシリボヌクレオチドを
用いて、任意の配列および任意の鎖長を有する定序配列
オリゴデオキシリボヌクレオチドを合成する工程とから
なる、人工ヌクレアーゼ機能を有するオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの製造方法。 - 【請求項６】 核酸の特定部位の塩基配列に相補的な塩
基配列を有し、かつ、２つのチミジンの糖部分同士を結
合させるリン酸ジエステル結合部の少なくとも１つを、
化１で示される構造式のジオキシリン（Ｖ）テトラフェ
ニルポルフィリンで置換した化学構造を有するオリゴデ
オキシリボヌクレオチドと、前記核酸とで二本鎖を形成
させ、これに光照射して、直接電子移動反応により前記
核酸の鎖を特定位置で切断する、人工ヌクレアーゼ機能
を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの使用方法。 【化１】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19939097A JPH1129591A (ja) | 1997-07-08 | 1997-07-08 | 人工ヌクレアーゼ機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド、ならびに、その製造用の中間体、その製造方法および使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19939097A JPH1129591A (ja) | 1997-07-08 | 1997-07-08 | 人工ヌクレアーゼ機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド、ならびに、その製造用の中間体、その製造方法および使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1129591A true JPH1129591A (ja) | 1999-02-02 |
Family
ID=16406989
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19939097A Pending JPH1129591A (ja) | 1997-07-08 | 1997-07-08 | 人工ヌクレアーゼ機能を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド、ならびに、その製造用の中間体、その製造方法および使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1129591A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001016151A1 (fr) * | 1999-08-27 | 2001-03-08 | Japan Science And Technology Corporation | Acide nucleique a photocouplage reversible et phosphoroamidite |
-
1997
- 1997-07-08 JP JP19939097A patent/JPH1129591A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001016151A1 (fr) * | 1999-08-27 | 2001-03-08 | Japan Science And Technology Corporation | Acide nucleique a photocouplage reversible et phosphoroamidite |
| US6593088B1 (en) | 1999-08-27 | 2003-07-15 | Japan Science And Technology Corporation | Reversible photocoupling nucleic acid and phosphoroamidite |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
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