JPH0694475B2 - ヌクレオシド誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なヌクレオシド誘
導体およびオリゴヌクレオチドを合成するためのその使
用に関するものである。

【０００２】さらに詳細には、本発明は、環外ＮＨ₂ 基
を有するピリミジンもしくはプリン塩基から生成される
ヌクレオシド誘導体、すなわちアデニン、グアニンもし
くはシトシンから生成され、特にオリゴヌクレオチドを
合成するために使用しうるヌクレオシドに関するもので
ある。

【０００３】

【従来の技術】オリゴヌクレオチドの合成は、燐酸基に
よりこれらのヌクレオシドを互いに結合させてＤＮＡ
（デオキシリボ核酸）鎖もしくはＲＮＡ（リボ核酸）鎖
を生成させることによりなっている。この結合におい
て、ヌクレオチド間の燐酸基はまだヌクレオシドの３′
位置におけるヒドロキシル基を他のヌクレオシドの５′
位置におけるヒドロキシル基と結合している。したがっ
て、合成反応に際しヌクレオシドの３′末端と５′末端
とのみが作用を受け、使用する核塩基（プリンもしくは
ピリミジン）はこの結合に際し関与してはならない。

【０００４】これらの塩基が環外ＮＨ₂ 基を含む場合、
オリゴヌクレオチドの合成に際しこれらの基を保護する
必要がある。何故なら、これらは極めて反応性が大きい
ため合成反応を阻害しうるからである。

【０００５】環外ＮＨ₂ 基のこの保護は次のことを満足
せねばならない；これは選択性でありかつ実施容易でな
ければならない；これは他のヌクレオシド部位に対する
反応性変化を誘発してはならずかつオリゴヌクレオチド
合成工程全体にわたり安定でなければならない；これは
合成されたオリゴヌクレオチドを破壊することなく緩和
な条件下で除去されうるものでなければならない。

【０００６】ヌクレオシドの環外ＮＨ₂ 基は特にしばし
ば、たとえばアデニンおよびシトシンの場合にはベンゾ
イルもしくはアニソイル基により［Ｈ．ＳＣＨＡＬＬＥ
Ｒ等、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティ
（１９６３）、第８５巻、第３８２１〜３８２７頁］或
いはグアニンの場合にはイソブチリル基により［Ｈ．Ｂ
ＵＣＨＩおよびＨ．ＫＨＯＲＡＮＡ、ジャーナル・モレ
キュラ・バイオロジー（１９７２）、第７２巻、第２５
１〜２８８頁］によりアミドとして保護されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】これらの保護基は、推
奨されているように合成の終了時に６０℃の温度にて１
７時間にわたる２８％アンモニアの作用により除去する
ことができる。しかしながら、プロトンのＮＭＲ分析が
示すところでは、これら条件下においてグアニンのイソ
ブチリル基の全部は除去されない。したがって、反応時
間を７２時間まで延長させるが６０℃の温度に保つこと
が好ましい。

【０００８】保護基を除去するためのこの方法は欠点を
有する。何故なら、使用する条件は、たとえば５，６−
ジヒドロチミジンの場合のようにアルカリ性媒体中で大
して安定でない修飾ヌクレオシドについて使用しうるに
は充分緩和できないからである。

【０００９】さらに、除去するのがより容易であり、特
に支持体上での合成方法によって不安定なヌクレオシド
からオリゴヌクレオチドを合成するためにとくに使用し
うる他のアシル基を用いる可能性についても研究が行な
われており、この方法は連鎖の第１ヌクレオシドを一般
にシリカよりなる支持体に固定し、次いでこの第１ヌク
レオシドに対し所望順序で他のヌクレオシドを固定する
縮合サイクルを順次に行なうことからなっている。除去
するのがより容易なアルシ基の使用は、より良好な保護
解除収支を得ることを可能にする。この点は極めて重要
である。何故なら、不完全に保護解除された塩基の存在
は、得られる生成物の使用に対し欠点となるからであ
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】したがって、本発明の目
的は、容易に除去しうるアシル型の保護基を有する新規
なヌクレオシド誘導体を提供することにある。

【００１１】本発明によるヌクレオシドの誘導体は、
式：

【００１２】

【化１３】

【００１３】から選択され、その環外ＮＨ基によってＣ
Ｏ基に結合される二価の基を示し、Ｒ¹ は水素原子また
はアルキル基を示し、Ｒ² は水素原子、アルキル基、ア
ルコキシ基およびアリールオキシ基を示し、これらはい
ずれも未置換またはＮＯ₂ 、ＣＮ、アルコキシ、アリー
ルオキシ、Ｃｌ、Ｆ、

【００１４】

【化１４】

【００１５】置換されていてもいなくてもよいアルキル
もしくはアリール、ＳＲ（ここでＲはアルキルもしくは
アリール基を示す）より成る群から選択される１個もし
くはそれ以上の基により置換され、ただしＢが基（II）
もしくは（III ）である場合のＲ¹ ＝ＨかつＲ² ＝ＣＨ
₃ およびＢが基（II）である場合のＲ¹ ＝Ｒ² ＝ＣＨ₃
を除き、Ｒ³ は水素原子、酸性媒体中において不安定な
基または式：

【００１６】

【化１５】

【００１７】（ここでＲ¹ およびＲ² は上記の意味を有
する）の基を示し、Ｒ⁴ は水素原子、含燐基または式：

【００１８】

【化１６】

【００１９】（ここでＲ¹ およびＲ² は上記の意味を有
する）の基を示し、Ｒ⁵ は水素原子またはＯＨ基を示
す］に相当する。

【００２０】たとえば、式（Ｉ）の化合物におけるＲ³
を構成するために使用しうる酸性媒体中にて不安定な基
は特にオリゴヌクレオチド合成で使用しうる基であり、
たとえば式：

【００２１】

【化１７】

【００２２】［式中、Ｒ⁶ 、Ｒ⁷ およびＲ⁸ は同一でも
異なってもよく水素原子、アルキル基もしくはアルコキ
シ基を示す］によるトリチル基、たとえばモノメトキシ
トリチル基または式（Ｖ）においてＲ⁶ およびＲ⁷ がメ
トキシ基を示しかつＲ⁸ が水素原子を示すトリチル基、
並びにビキシル基および９−フェニル−キサンテニル基
である。

【００２３】たとえば、式（Ｉ）の化合物におけるＲ⁴
を構成するために使用しうる含燐基もオリゴヌクレオチ
ド合成に使用しうる基であり、たとえば式：

【００２４】

【化１８】

【００２５】のホスホネート基である。

【００２６】本発明によれば、Ｒ⁵ が保護されたＯＨ基
を示す場合、このＯＨ保護基はリボヌクレオチドの合成
に従来使用されている基によつ構成される。

【００２７】したがって、本発明によるヌクレオシドの
誘導体は、（１）グアニン、シトシンもしくはアデニン
により構成される塩基と、（２）リボースもしくはデオ
キシリボースとの結合生成物であり、これらヌクレオシ
ドは少なくともその塩基の環外ＮＨ₂ 基にて式：

【００２８】

【化１９】

【００２９】の基により修飾されている。

【００３０】さらに、これらはデオキシリボースの３′
および５′位置またはリボースの２′，３′および５′
位置にて前記の同じ基において修飾することもでき、或
いはリボースもしくはデオキシリボースの３′および
５′位置は他の基によっても修飾することができ、これ
らの基はリボースもしくはデオキシリボースの５′位置
については不安定な基Ｒ³ でありかつ３′位置について
は含燐基Ｒ⁴ である。

【００３１】本発明に使用される式：

【００３２】

【化２０】

【００３３】のアシル基は、特にヌクレオシドの合成に
対し興味がある。何故なら、これらは操作の終了時にた
とえば使用する基に応じて室温にて２〜８時間のアンモ
ニア処理により容易に除去することができ、これにより
合成されている支持体上のポリヌクレオチドを支持体法
での合成を用いる場合に同時に遊離させうるからであ
る。

【００３４】本発明に使用される式：

【００３５】

【化２１】

【００３６】の保護基において、Ｒ¹ は水素原子または
アルキル基とすることができ、Ｒ² は水素原子、アルキ
ル基、アルコキシ基またはアリールオキシ基とすること
ができ、これらは適宜異なる基によって置換される。

【００３７】Ｒ¹ およびＲ² につき使用しうるアルキル
基は直鎖もしくは分枝鎖の基とすることができ、たとえ
ばメチル、エチルなどの基である。

【００３８】Ｒ² につき使用しうるアルコキシ基も直鎖
もしくは分枝鎖の基とすることができる。使用しうるア
リールオキシ基は特にベンゼン、ナフタレンおよびアン
トラセンから誘導される基（たとえばフェノキシ基）と
することができ、これらは１個もしくはそれ以上の上記
の置換基によって置換することができる。

【００３９】本発明によれば環外ＮＨ₂ 基の保護基は、
アルカリ処理に対し所望の耐性を得るため、使用する塩
基に応じて選択される。一般に使用する塩基がグアニン
である場合、Ｒ¹ は水素原子を示しかつＲ² はアルコキ
シ基または適宜置換されたアリールオキシ基を示す。た
とえば、基Ｒ² はフェノキシ基、メトキシ基または２−
クロルフェノキシ基とすることができる。

【００４０】使用する塩基がアデニンである場合、Ｒ¹
は好ましくは水素原子を示しかつＲ² は適宜置換された
アリールオキシ基、たとえばフェノキシ基を示す。

【００４１】塩基がシトシンである場合、基Ｒ¹ および
Ｒ² は好ましくは水素原子またはアルキル基、たとえば
メチル基である。

【００４２】上記保護基の使用により、本発明によりヌ
クレオシドを結合させて得られたオリゴヌクレオチドの
保護解除時間を短縮することが可能になる。何故なら、
この時間は以前に必要とされた１７〜７２時間でなく、
使用する基に応じて僅か２〜８時間としうるからであ
る。さらに、保護解除は室温で生ずるので緩和な反応条
件下で操作することが可能となり、これに対し従来は６
０℃まで加熱する必要があった。さらに、これらの一層
容易に除去しうる保護基の使用は、オリゴヌクレオチド
の合成に際し、より強力なアルカリ性条件に対し感受性
である修飾された核塩基を組込み、たとえば抗体に対し
て感受性であるリガンドを有するＤＮＡ断片を合成する
ことを可能にする。

【００４３】本発明はリボースから誘導されたヌクレオ
シドおよびデオキシリボースから誘導されたヌクレオシ
ドに適用されるが、好ましくはデオシリボースから誘導
されたヌクレオシド、すなわち式（Ｉ）においてＲ⁵ が
水素原子である誘導体につき使用される。

【００４４】本発明によるヌクレオシドの誘導体は、ベ
ンゾイルおよびアニソイル基をアデニンもしくはシトシ
ンに基づくヌクレオシドへ固定するために使用される方
法と同一の常法によって製造することができる。これら
の方法においてはグアニン、シトシンもしくはアデニン
のヌクレオシドから出発し、これを式：

【００４５】

【化２２】

【００４６】の酸クロライドまたは式：

【００４７】

【化２３】

【００４８】の酸無水物と反応させる。

【００４９】この反応に際し、酸クロライドもしくは無
水物はさらにリボースもしくはデオキシリボースの３′
および５′位置におけるヒドロキシル基と反応し、かく
して三重保護されたヌクレオシド誘導体が得られ、すな
わち式（Ｉ）において、Ｒ³およびＲ⁴ の両者が基：

【００５０】

【化２４】

【００５１】を示す誘導体が得られる。しかしながら、
３′および５′位置におけるこれらの基は選択的加水分
解によって除去することができ、これは式（Ｉ）におい
てＲ³およびＲ⁴ が水素原子を示すヌクレオシドの誘導
体を得ることを可能にする。

【００５２】予め得られたヌクレオシドの誘導体を適当
な溶媒中で対応の塩化トリチルと反応させることによ
り、式（Ｉ）においてＲ³ が式（Ｖ）のトリチル基、た
とえばジメトキシトリチル基を示しかつＲ⁴ が水素原子
を示すヌクレオシドの誘導体を製造することができる。

【００５３】式（Ｉ）においてＲ³ がトリチル基を示し
かつＲ⁴ が式（VI）の基または式（VII ）の基、或いは
式：

【００５４】

【化２５】

【００５５】［式中、Ｒ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³は同一でも
異なってもよくアルキル基、たとえばエチルである］の
基を示すヌクレオシドの誘導体は、式（Ｉ）においてＲ
³ がトリチル基を示しかつＲ⁴ が水素原子を示すヌクレ
オシドの誘導体から常法により製造することができる。

【００５６】Ｒ⁴ がたとえば式（VI）の基を示す場合、
このヌクレオシド誘導体を適当な溶媒中で４−クロルフ
ェニルホスホリルビストリアゾリデートと反応させる。
この４−クロルフェニルホスホリルビストリアゾリデー
トは、４−クロルフェニルジクロルホスフェートをジオ
キサン中のトリアゾールとトリエチルアミンとの懸濁物
へ添加して製造することができる。

【００５７】Ｒ⁴ がたとえば式（VII ）の基を示す場
合、ヌクレオシド誘導体をジイソプロピルエチルアミン
の存在下で適当な溶媒中にてβ−シアノエチル−モノク
ロル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−アミノホスホルアミダ
イトと反応させることができる。

【００５８】Ｒ⁴ がたとえば式：

【００５９】

【化２６】

【００６０】［式中、Ｒ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³は同一でも
異なってもよくアルキル基である］の基を示す場合、こ
のヌクレオシドの誘導体を２−クロル−（５，６−ａ）
−ベンゾ−［１，３−ジオキソ−２−ホスホル−４−イ
ノン］と反応させ、次いでたとえば酢酸トリエチルアン
モニウムのようなトリアルキルアンモニウム塩と反応さ
せることができる。

【００６１】これら３種の方法により得られるヌクレオ
シドの誘導体は、Ｒ⁴ が式（VI）の基である場合にはホ
スホトリエステル合成により、或いはＲ⁴ が式（VII ）
の基である場合にはホスホルアミダイト合成により、或
いはＲ⁴ が式：

【００６２】

【化２７】

【００６３】の基である場合にはＨ−ホスホネート合成
により、オリゴヌクレオチドの合成に使用することがで
きる。また、オリゴヌクレオチド連鎖の結合には他のヌ
クレオシドたとえばチミジンおよび２′−デオキシウリ
ジンに対応するもの、或いはアルカリ媒体中で不安定な
塩基を有するヌクレオシド、或いはアルカリ媒体中で不
安定な他のヌクレオシドを使用することができる。

【００６４】オリゴヌクレオチドを合成するための本発
明による方法は、（ｉ） ヌクレオシド誘導体もしくは
オリゴヌクレオチドに対し式：

【００６５】

【化２８】

【００６６】から選択され、その環外ＮＨ₂ 基によりＣ
Ｏ基に結合される二価の基を示し、Ｒ¹ は水素原子もし
くはアルキル基を示し、Ｒ² は水素原子、アルキル基、
アルコキシ基、アリールオキシ基を示し、これは未置換
またはＮＯ₂ 、ＣＮ、アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ
ｌ、Ｆ、

【００６７】

【化２９】

【００６８】アルキルもしくはアリール（これらは未置
換であっても置換されてもよい）、ＳＲ（ここでＲはア
ルキルもしくはアリール基を示す）から選択される１個
もしくはそれ以上の基により置換され、ただしＢが基
（II）もしくは（III ）である場合のＲ¹ ＝ＨかつＲ²
＝ＣＨ₃ およびＢが基（II）である場合のＲ¹ ＝Ｒ² ＝
ＣＨ₃ を除き、Ｒ³ は酸性媒体中で不安定な基を示し、
Ｒ⁴ は含燐基を示し、Ｒ⁵ は水素原子を示す］のヌクレ
オシド誘導体を縮合させる少なくとも１つの縮合サイク
ルと、（ii） 式：

【００６９】

【化３０】

【００７０】［式中、Ｒ¹ およびＲ² は上記の意味を有
する］の保護基を、たとえばオリゴヌクレオチドを室温
にてアンモニアと接触させることにより除去する工程と
からなっている。

【００７１】オリゴヌクレオチド合成は、溶液中での方
法或いは支持体上での合成法のいずれかによって行なう
ことができる。好ましくは、支持体上での合成法を使用
する。何故なら、これは結合に際し収率損失を生ずるこ
となくより不安定なヌクレオシドを使用するのに一層適
するからである。

【００７２】たとえば、本発明によるヌクレオシドはＤ
ＮＡもしくはＲＮＡ断片の合成に使用される塩基生成物
として興味ある用途を有する。さらに、これらは合成オ
リゴヌクレオチド中へ、特にＤＮＡ γ−放射線分解生
成物または光分解生成物に関する不安定な修飾塩基を組
み込むにも適している。本発明によるヌクレオシドによ
り、さらに抗ウィルス活性を有する新規な分子および新
規なＤＮＡプローブを得ることも可能である。

【００７３】

【実施例】以下、本発明をヌクレオシドの製造および使
用に関する実施例につき説明するが、これらのみに限定
されないことは明らかである。

【００７４】実施例１：（Ｎ₂ −フェノキシアセチル）
−２′−デオキシグアノシン（化合物１）の製造 １０８０ｍｇ（４ミリモル）の２′−デオキシグアノシ
ンを無水ピリジンの連続添加および蒸発によって乾燥さ
せ、次いでこれらを２０ｍｌの無水ピリジン中に懸濁さ
せ、次いでこの懸濁物をフラスコ中に導入した。このフ
ラスコを氷浴によって冷却し、かつこれへ６当量（４．
２５ｇ；２４ミリモル）のフェノキシアセチルクロライ
ドを０℃にて徐々に添加した。反応を室温にて９０分間
継続させた。反応媒体中に白色の塩化ピリジニウム沈殿
物が生じた一方、反応媒体は橙色から褐色となった。こ
れにより三重保護された出発ヌクレオシド誘導体、すな
わち式（Ｉ）においてＢが式（II）の基を示す誘導体
（Ｒ¹ が水素原子を示し、Ｒ² がフェノキシ基を示し、
Ｒ³ およびＲ⁴ がフェノキシアセチル基を示しかつＲ⁵
が水素原子を示すグアニン誘導体）を得た。

【００７５】次いで、過剰の酸塩化物を２ｍｌの２回蒸
留した水により０℃で分解して、反応媒体を可溶化させ
た。次いで、、これを１００ｍｌのクロロホルムで希釈
した。クロロホルム相を５０ｍｌの５％重炭酸ナトリウ
ム水溶液で４回洗浄して生成フェノキシ酢酸を除去し
た。次いで、クロロホルム相を硫酸ナトリウムで脱水
し、溶剤を蒸発させかつ橙色残留物を得た。これを１０
０ｍｌの０℃まで冷却されたピリジンに溶解させ、次い
で１００ｍｌの０．２Ｎソーダを０℃にて添加した。か
くして、３′および５′位置の選択的加水分解を２０分
間行なった。次いで、媒体を１００〜２００メッシュ
（０．０７４〜０．１４９ｍｍ）の粒子寸法を有するピ
リジニウム型の陽イオン交換樹脂ダウエックス５０Ｗ−
Ｘ８によって中和した。樹脂を濾過しかつ洗浄した後、
濾液を蒸発乾固させた。

【００７６】これに続いて、シリカカラム（直径３ｃ
ｍ、高さ１５ｃｍ）でのクロマトグラフィーによりクロ
ロホルム−メタノール濃度勾配によって溶出させ、生成
Ｎ₂ −フェノキシアセチル−２′−デオキシグアノシン
を単離した。求める生成物を含有するフラクションの蒸
発により２５０ｍｇのＮ−フェノキシアセチル−２′−
デオキシグアノシンを回収することができ、これは収率
１５％に相当した。

【００７７】得られた生成物の同定および純度を２５０
ＭＨｚでの核磁気共鳴、薄層クロマトグラフィーおよび
質量分析器によって監視し、次の結果が得られた：Ｒ_f
＝０．３６クロロホルム−メタノール移動混合物（容量
で８０／２０） （Ｍ＋Ｈ）分子ピーク（ｍ／ｅ：４０２−１３％）；フ
ェノキシアセチル化グアニン（ｍ／ｅ：２８６−５１
％）。

【００７８】実施例２：［Ｎ₂ −（２−クロルフェノキ
シ）−アセチル］−２′−デオキシグアノシン（化合物
２）の製造 １０８０ｍｇ（４ミリモル）の２′−デオキシグアノシ
ンを実施例１におけると同様に乾燥し、次いで２０ｍｌ
の無水ピリジン中に懸濁させかつ氷水浴中に入れたフラ
スコに導入した。これに続いて０℃で６当量（５．１
ｇ；２４ミリモル）の（２−クロルフェノキシ）−アセ
チルクロライドを徐々に添加した。反応を室温にて１５
０分間継続させた。反応媒体において緑色乃至栗色が出
現し、このようにして三重保護された出発ヌクレオシド
誘導体が生成され、すなわち式（Ｉ）においてＢが式
（II）の基を示す誘導体、すなわちＲ¹ が水素原子を示
し、Ｒ² が２−クロルフェノキシ基を示し、Ｒ³ および
Ｒ⁴ が２−クロルフェノキシ−アセチル基を示しかつＲ
⁵ が水素原子であるグアニン誘導体を生成した。

【００７９】過剰の酸クロライドを０℃にて２ｍｌの蒸
留水により分解して、反応媒体を可溶化させた。次い
で、これを１００ｍｌのクロロホルムで溶解させ、前記
クロロホルム相と同様に５０ｍｌの５％重炭酸ナトリウ
ム水溶液で４回洗浄してクロルフェノキシ酢酸を除去し
た。クロロホルム相を硫酸ナトリウムで脱水し、溶剤を
蒸発させかつこのようにして橙色残留物を得た。この残
留物を１００ｍｌのピリジン中に溶解し、得られた溶液
を氷水浴中に入れ、かつ０．２Ｎソーダ１００ｍｌをこ
れに加えて０．１Ｎの滴定値を有する混合物を得、ヌク
レオシドの３′および５′位置を選択的に２０分間で加
水分解することができた。次いで、この媒体をピリジニ
ウム型の実施例１に使用した陽イオン交換樹脂ダウエッ
クス５０Ｗ−Ｘ８によって中和した。この樹脂を濾過し
かつ洗浄し、次いで濾液を蒸発乾固させた。これにより
［Ｎ₂ −（２−クロルフェノキシ）−アセチル］−２′
−デオキシグアノシンが得られ、これはピリジン中にわ
すか可溶性であった。

【００８０】これをシリカカラム上でのクロマトグラフ
ィーによって精製し、その際クロロホルム−メタノール
濃度勾配を使用した。かくして、２２０ｍｇの化合物２
が単離され、これは収率１３％に相当した。この化合物
を薄層クロマトグラフィーおよび質量分析器によって特
性化し、次の結果が得られた：Ｒ_f ＝０．４、クロロホ
ルム−メタノール移動混合物（容量８０／２０）中、
（Ｍ＋Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ｅ：４３６−１７％）；
２−クロルフェノキシアセチル化グアニン（ｍ／ｅ：３
２０−４４％）。

【００８１】生成物の純度は、２５０ＭＨｚにおける核
磁気共鳴での分析によって確認した。

【００８２】実施例３：（Ｎ₂ −メトキシアセチル）−
２′−デオキシグアノシン（化合物３）の製造 ５．４ｇ（２０ミリモル）のデオキシグアノシンを乾燥
し、次いで１００ｍｌの無水ピリジン中に懸濁させた。
０℃まで冷却し、次いで４．５当量（１０ｇ；９０ミリ
モル）のメトキシアセチルクロライドを徐々に添加し
た。反応を室温で３時間継続して三重保護された出発化
合物の誘導体、すなわち式（Ｉ）においてＢがグアニン
から誘導された式（II）の基を示し、Ｒ¹ が水素原子を
示し、Ｒ²がメトキシ基を示し、Ｒ³ およびＲ⁴ がメト
キシアセチル基を示しかつＲ⁵ が水素原子である誘導体
を生成させた。

【００８３】過剰の酸クロライドをメタノールにより３
０分間分解して、低沸点（１２９〜１３０℃）を有する
メチルメトキシアセテートを生成させた。溶剤を蒸発さ
せ、かつ残留物をクロロホルムで溶解させた。次いで、
これを５０％重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。クロ
ロホルム相を硫酸ナトリウムデ脱水し、次いで蒸発させ
て橙色残留物を得、これは三重保護された誘導体に相当
した。

【００８４】誘導体をシリカカラムクロマトグラフィー
（直径４ｃｍ、長さ１０ｃｍ）により精製し、その際ク
ロロホルム−メタノール濃度勾配を使用した。かくし
て、７ｇの三重保護された誘導体が回収され、これは収
率７３％に相当した。

【００８５】次いで、エステル基をトリエチルアミンと
ピリジンと水との混合物（容量で２０：２０：６０）に
より加水分解した。次いで、溶剤を蒸発させかつＮ₂ −
メトキシアセチル−２′−デオキシグアノシン（化合物
３）をシラン化したシリカカラムにおけるクロマトグラ
フィーによって精製し、その際水とアセトンとの混合物
（７０：３０ｖ／ｖ）で溶出を行なった。かくして３．
４ｇの生成物が得られ、これは収率５１％に相当した。
この生成物を２５０ＭＨｚにおける核磁気共鳴および質
量分析器によって検査し、次の結果を得た： （Ｍ−Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ｅ：３３８−１０％）；
メトキシアセチル化グアニン：（ｍ／ｅ：２２２−３１
％）。

【００８６】実施例４：（Ｎ₆ −フェノキシアセチル）
−２′−デオキシアデノシン（化合物４）の製造 １０２５ｍｇ（４ミリモル）のデオキシアデノシンを乾
燥させ、次いで２０ｍｌの無水蒸留ピリジン中に溶解さ
せ、かつ氷水浴中に入れたフラスコに導入した。これに
続いて、０℃のピリジン２０ｍｌ中に溶解させた８当量
の無水フェノキシ酢酸（９．４ｇ；３２ミリモル）を徐
々に添加した。反応を室温にて９０分間継続し、かつ黄
色の着色が徐々に出現した。このようにしてＢがアデニ
ンから誘導された式（IV）の基を示し、Ｒ¹ が水素原子
を示し、Ｒ² がフェノキシ基を示し、Ｒ³ およびＲ⁴ が
フェノキシアセチル基を示し、Ｒ⁵ が水素原子を示す式
（Ｉ）のヌクレオシド誘導体が生成した。

【００８７】過剰の酸無水物を次いで０℃にて３ｍｌの
蒸留水を添加することにより分解し、次いで反応媒体を
１００ｍｌのクロロホルムで希釈した。クロロホルム相
を５０ｍｌの５％重炭酸ナトリウム水溶液で４回洗浄
し、かつ溶剤を蒸発させて黄色残留物を得た。これを１
００ｍｌのピリジン中に溶解し、かつ溶液を氷水浴中に
入れた後、１００ｍｌの０．２Ｎソーダを０℃で添加し
てアデノシンの３′および５′位置を１５分間選択的に
加水分解した。次いで、媒体を実施例１に使用したピリ
ジニウム型の陽イオン交換樹脂ダウエックス５０Ｗ−Ｘ
８で中和した。樹脂を濾過しかつ洗浄し、次いで濾液を
蒸発乾固させた。

【００８８】これにより（Ｎ₆ −フェノキシアセチル）
−２′−デオキシアデノシン（化合物４）を得、これを
シリカカラムクロマトグラフィー（直径４ｃｍ、長さ１
０ｃｍ）により精製し、その際クロロホルム−メタノー
ル濃度勾配（１００−０〜９６−４）を使用した。求め
る生成物を含有するフラクションを次いで蒸発させ、か
つこのようにして１０１０ｍｇの白色粉末を得、これは
収率６５％に相当した。

【００８９】次いで、生成物を薄層クロマトグラフィー
と２５０ＭＨｚにおけるプロトンの核磁気共鳴と質量分
析器と特性化した。次の結果が得られた： Ｒ_f ：０．６６、クロロホルム−メタノール移動混合物
（容量で８０：２０）。

【００９０】２５０ＭＨｚにおけるプロトンの核磁気共
鳴：¹ Ｈ−ＮＭＲ（ピリジンｄ₅ ）：２．７−３．３（ｍ，
２Ｈ，Ｈ₂ ′，Ｈ₂ ″）；４．１−４．３５（ｍ，２
Ｈ，Ｈ₅ Ｈ₅ ″）；４．６（ｍ，Ｈ₄ ′）；５．２５
（ｍ，Ｈ₅ ′）；５．６５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ ）；７．
０（ｍ，Ｈ₁ ′）；６．９−７．４（ｍ，５Ｈ，Ｃ₆ Ｈ
₅ ）；８．７５および９．０５（ｓ，Ｈ2 およびＨ₈ ） 質量分析：（Ｍ＋Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ｅ：３８６−
１６％）；アセチル化フェノキシアデニン（ｍ／ｅ：２
７０−６６％）実施例５：（Ｎ₄ −イソブチリル）−２′−デオキシシ
チジン（化合物５）の製造 ４ミリモルのデオキシシチジンを乾燥させ、次いで１５
ｍｌの無水ピリジン中に溶解させ、かつ溶液を氷水浴入
れたフラスコに導入した。これに続いて６当量（２．５
ｍｌ；２４ミリモル）のイソブチリルクロライドを徐々
に添加した。反応を室温にて１２０分間継続し、媒体は
橙色に変化した。このようにして三重保護された出発ヌ
クレオシド誘導体、すなわち式（Ｉ）においてＢがシト
シンから誘導された式（III ）の基を示し、Ｒ¹ および
Ｒ² がメチル基を示し、Ｒ³ およびＲ⁴ がイソブチリル
基を示しかつＲ⁵ が水素原子を示す誘導体が生成した。

【００９１】過剰の酸クロライドを２ｍｌの２回蒸留し
た水で０℃にて分解し、かつ反応媒体を１００ｍｌのク
ロロホルムで希釈した。このクロロホルム相を５０ｍｌ
の重炭酸ナトリウム５％水溶液で４回洗浄して、精製し
たイソ酪酸を除去し、硫酸ナトリウムで脱水し、次いで
蒸発乾固させた。これにより橙色残留物が得られ、これ
を５ｍｌの０℃まで冷却されたピリジンに溶解した。こ
れに続いて、１００ｍｌの０．２Ｎソーダを０℃にて添
加し、デオキシリボースの３′および５′位置における
エステル基の選択加水分解反応を３０分間継続させた。
これに続いて、実施例１に使用したピリジニウム型のイ
オン交換樹脂ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８により媒体の中
和を行なった。これに続いて、樹脂を濾過しかつ洗浄
し、そしてこの濾液を蒸発乾固させた。

【００９２】精製をシリカカラムクロマトグラフィー
（直径４ｃｍ、長さ１０ｃｍ）によって行ない、その際
クロロホルム−メタノール濃度勾配（１００−０〜９５
−５）を用いた。溶剤を蒸発させ、かつこのようにして
６３０ｍｇのイソブチリル−デオキシシチジンにより構
成される白色粉末が得られ、これは収率５０％に相当し
た。

【００９３】この生成物を薄層クロマトグラフィーと質
量分析器と２５０ＭＨｚにおけるプロトンの核磁気共鳴
によって特性化した。次の結果が得られた： Ｒ_f ：０．５５、クロロホルム−メタノール移動混合物
（８０：２０）、 質量分析（Ｍ＋Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ｅ＝２９８−１
１％）、イソブチリル化シトシン（ｍ／ｅ＝１８２−１
００％）、２５０ＭＨｚにおけるプロトンの核磁気共
鳴：¹ Ｈ−ＮＭＲ（メタノールｄ₄ ）：１．２（ｉｂのｄ，
６Ｈ，２（ＣＨ））、２．１５−２．６（ｍ，２Ｈ，Ｈ
₂ ′，Ｈ₂ ″），２．７（ｍ，Ｈ^ib）；３．７−３．９
（ｍ，２Ｈ，Ｈ₅ ′，Ｈ₅ ″）；４．０（ｍ，Ｈ₄ ）；
４．４（ｍ，Ｈ₃′）；６．２５（ｔ，Ｈ₁ ′）；７．
５および８．５（ｄ，Ｈ₅ およびＨ₆ ）実施例６：（Ｎ₄ −イソブチリル）−５′−（４，４′
−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシシチジン（化
合物６）の製造 ２．５ミリモルの化合物５を、無水ピリジンの連続添加
および蒸発によって乾燥させた。これを２５ｍｌのピリ
ジンで溶解させ、０℃まで冷却しかつ２．７５ミリモル
（１．１当量）の４，４′−ジメトキシトリチルクロラ
イドの２５ｍｌピリジン溶液（０℃）を添加した。反応
を５℃にて１７時間継続させ、次いで２ｍｌのメタノー
ルを反応媒体に添加した。３０分間後、溶剤を回転エバ
ポレータによって除去し、かつ油状残留物を１００ｍｌ
の酢酸エチルで溶解し、次いで５０ｍｌの５％ＮａＨＣ
Ｏ₃ 水溶液で３回洗浄し、かつ５０ｍｌの２回蒸留され
た水で１回洗浄した。次いで有機相を硫酸ナトリウムで
脱水しかつ濃縮した。シリカゲルカラムでの分画によ
り、得られた化合物６を分離し、これは式（Ｉ）におい
てＢがシトシンから誘導された式（III ）の基であり、
Ｒ¹ およびＲ² がメチル基であり、Ｒ³ が４，４′−ジ
メトキシトリチル基であり、Ｒ⁴ が水素原子でありかつ
Ｒ⁵ が水素原子である式（Ｉ）の誘導体に相当した。

【００９４】この化合物の物理化学的特性および反応収
率を第１表に示す。

【００９５】実施例７：（Ｎ₆ −フェノキシアセチル）
−５′−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デ
オキシアデノシン（化合物７）の製造 実施例６におけると同じ操作法を採用したが、ただし化
合物５の代りに化合物４の２．５mmolを使用し、このよ
うにして化合物７：（Ｎ₆ −フェノキシアセチル）−
５′−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デオ
キシアデノシン、すなわち式（Ｉ）においてＢが式（I
V）のアデニンから誘導された基を示し、Ｒ¹ が水素原
子であり、Ｒ² がフェノキシ基であり、Ｒ³ が４，４′
−ジメトキシトリチル基であり、Ｒ⁴ が水素原子であり
かつＲ⁵ が水素原子である化合物が生成された。

【００９６】化合物の反応収率および物理化学的特性を
第１表に示す。

【００９７】実施例８：（Ｎ₂ −メトキシアセチル）−
５′−（４，４′−ジメトキシトリチル−２′−デオキ
シグアノシン（化合物８）の製造 実施例６におけると同じ操作法を採用したが、ただし化
合物５の代りに２．５ミリモルの化合物３を使用した。

【００９８】これにより式（Ｉ）においてＢがグアニン
から誘導された式（II）基であり、Ｒ¹ が水素原子であ
り、Ｒ² がメトキシ基であり、Ｒ³ が４，４′−ジメト
キシトリチル基であり、Ｒ⁴ が水素原子でありかつＲ⁵
が水素原子である化合物８を得た。

【００９９】この化合物の反応収率および物理化学的特
性を第１表に示す。この表において、括弧内の文字は複
数のピーク、すなわちｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレッ
ト、ｔ＝トリプレット、ｑ＝クアドラプレットおよびｍ
＝マルチプレットを示す。

【０１００】実施例９：化合物９の製造 この実施例は、ポリヌクレオチドのホスホトリエステル
合成に使用される化合物８のホスホリル誘導体の製造を
示している。

【０１０１】３ミリモルの化合物８を、無水ピリジン
（５ｍｌつづ３回）の添加及び蒸発により乾燥した。残
留物を１５ｍｌのピリジンおよび無水ジオキサン３０ｍ
ｌ中の４．５ミリモルの４−クロルフェニルホスホリル
ビストリアゾリデートに溶解させた（４−クロルフェニ
ルホスホリルビストリアゾリデートは４．５ミリモルの
４−クロルフェニルジクロルホスフェートを３０ｍｌの
ジオキサン中における９ミリモルのトリアゾールと９．
３５ミリモルのトリエチルアミンとの懸濁物に添加して
得た）。反応を２０分間継続させ、次いで６ｍｌのＨ₂
Ｏ−トリエチルアミン混合物（容量で１：１）を添加す
ることにより停止させ、次いで反応媒体の容積を蒸発に
より５ｍｌまで濃縮した。これに続いてクロロホルム１
００ｍｌ溶解させ、かつ５０ｍｌのＮａＨＣＯ₃ 水溶液
で３回洗浄し、次いで１００ｍｌの水で洗浄した。クロ
ロホルム相を硫酸ナトリウムで脱水し、次いで蒸発乾固
させた。求める化合物をシリカゲルクロマトグラフィー
によって単離した。得られた生成物を次いで質量分析器
および核磁気共鳴にかけた。得られた反応収率および結
果を第２表に示す。

【０１０２】このように得られた化合物９は、式（Ｉ）
においてＢが式（II）のグアニンから誘導された基を示
し、Ｒ¹ が水素原子を示し、Ｒ² がメトキシ基を示し、
Ｒ³が４，４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ⁴ が
式（VI）の基を示しかつＲ⁵が水素原子を示すヌクレオ
シド誘導体であった。

【０１０３】実施例１０：化合物１０の製造 この実施例は、化合物７のホスホトリエステル合成に関
するホスホリル誘導体を製造するための実施例９と同様
な操作手順を採用し、その際２．５ミリモルの化合物８
の代りに２．５ミリモルの化合物７を使用した。これに
より化合物１０が得られ、これは式（Ｉ）においてＢが
アデニンから誘導された式（IV）の基を示し、Ｒ¹ が水
素原子を示し、Ｒ² がフェノキシ基を示し、Ｒ³ が４，
４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ⁴ が式（VI）の
基を示しかつＲ⁵ が水素原子を示す誘導体に相当する。

【０１０４】上記したように、得られた化合物の特性を
質量分析器および核磁気共鳴によって決定し、得られた
結果および反応収率を第２表に示す。

【０１０５】実施例１１：化合物１１の製造 この実施例においては、実施例９の操作手順を採用し
て、ホスホトリエステル合成につき使用した化合物６の
ホスホリル誘導体を製造し、その際３ミリモルの化合物
８の代りに３ミリモルの化合物６を使用した。

【０１０６】これにより式（Ｉ）の化合物１１が得ら
れ、ここでＢはシトシンから誘導される式（III ）基を
示し、Ｒ¹ およびＲ² はメチル基を示し、Ｒ³ は４，
４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ⁴ は式（VI）の
基を示しかつＲ⁵ は水素原子を示す。

【０１０７】実施例９および１０におけると同様に、得
られた生成物を質量分析器および該磁気共鳴によって検
査した。得られた反応収率および結果を第２表に示す。

【０１０８】実施例１２：化合物１２の製造 この実施例においては、オリゴヌクレオチドホスホルア
ミダイト合成につき使用した化合物８のホスホリル誘導
体を製造した。３ミリモルの化合物８をピリジン、トル
エンおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を一緒に蒸発
させて乾燥した。残留物を１２ミリモルのＮ，Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピルエチルアミンの存在下で１５ｍｌのＴＨ
Ｆに溶解させ、かつこれに続いて６ミリモルのβ−シア
ノエチル−モノクロル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ
ホスホルアミダイトを２分間かけて滴下した。５分間の
反応の後、このアミンの塩酸塩沈殿物が生成した。反応
を３５分間続行させかつ沈殿物を反応の終了時点で濾過
した。次いで、濾液を蒸発乾固させ、１５０ｍｌの酢酸
エチルに溶解させた。１０％のＮａ₂ ＣＯ₃ を含有する
氷冷した水溶液で洗浄を行なった。次いで、有機相を硫
酸ナトリウムで洗浄し、かつ蒸発乾固させた。

【０１０９】得られた化合物を寸法Ｂのメルク「ＬＯＢ
ＡＲ」カラムでの低圧クロマトグラフィーによって精製
し、その際ＣＨ₂ Ｃｌ₂ −ヘキサン−トリエチルアミン
（容量で７０：２０：１０）の混合物を溶出剤として使
用した。得られた化合物を最小量のジクロルメタンまた
は酢酸エチルで溶解させ、かつ−８０℃にてヘキサン中
で沈殿させた。この生成物を核磁気共鳴により分析し
た。得られた結果および反応収率を第３表に示す。

【０１１０】これにより式（Ｉ）に相当する化合物１２
が得られ、ここでＢはグアニンから誘導された式（II）
の基を示し、Ｒ¹ は水素原子を示し、Ｒ² はメトキシ基
を示し、Ｒ³ は４，４′−ジメトキシトリチル基を示
し、Ｒ⁴ は式（VII ）の基を示しかつＲ⁵ は水素原子を
示す。

【０１１１】実施例１３：化合物１３の製造 実施例１２におけると同様に、３ミリモルの化合物８の
代りに３ミリモルの化合物７を用いて化合物７のホスホ
リル誘導体を作成しかつこれをホスホルアミダイト合成
に使用することができる。さらに、得られた化合物につ
き核磁気共鳴によって分析を行なった。反応の収率およ
び結果を第３表に示す。

【０１１２】これにより化合物１３が得られ、この化合
物は式（Ｉ）においてＢがアデニンから誘導された式
（IV）の基であり、Ｒ¹ が水素原子であり、Ｒ² がフェ
ノキシ基であり、Ｒ³ が４，４′−ジメトキシトリチル
基であり、Ｒ⁴ が式（VII ）の基でありかつＲ⁵ が水素
原子である化合物に相当する。

【０１１３】実施例１４：化合物１４の製造 実施例１２におけると同様に３ミリモルの化合物８の代
りに３ミリモルの化合物６を用いて化合物６のホスホリ
ル誘導体を作成し、これはホスホルアミダイト合成に使
用することを目的とした。さらに得られた化合物を核磁
気共鳴により分析した。反応収率および得られた結果を
第３表に示す。

【０１１４】これにより化合物１４が得られ、これは式
（Ｉ）においてＢがシトシンから誘導された式（III ）
の基を示し、Ｒ¹ およびＲ² がメチル基を示し、Ｒ³ が
４，４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ⁴ が式（VI
I ）の基を示しかつＲ⁵ が水素原子を示す化合物に相当
する。

【０１１５】実施例１５：（Ｎ₆ −フェノキシアセチ
ル）−５′−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′
−デオキシグアノシン（化合物１５）の製造 実施例６におけると同じ操作手順を採用したが、化合物
５の代りに４ミリモルの化合物１を使用し、このように
して化合物１５を製造し、すなわちこの化合物は式
（Ｉ）においてＢが式（II）のグアニンから誘導された
基であり、Ｒ¹ が水素原子であり、Ｒ² がフェノキシ基
であり、Ｒ³ が４，４′−ジメトキシトリチル基であ
り、Ｒ⁴ が水素原子でありかつＲ⁵ が水素原子である化
合物に相当する。

【０１１６】反応収率は７０％であった。クロロホル
ム：メタノール混合物（９０：１０）におけるこの化合
物のＲ_f は０．４０であった。重水素化メタノールにお
けるこの分子の主プロトンの化学配位は次の数値を有し
た： Ｈ８：８．０７ ppm，Ｈ１′：６．４５ppm(t)，Ｈ
３′：４．７５ppm(m)，Ｈ，ジメトキシトリチルのＣＨ
₃ ：３．８６ppm(s)，Ｈ，フェノキシアセチルのＣ
Ｈ₂ ：５．０５ppm(s)。

【０１１７】実施例１６：化合物１６の製造 実施例１２におけると同様に３ミリモルの化合物８の代
りに３ミリモルの化合物１５を用いて化合物１５のホス
ホリル誘導体を作成し、これはホスホルアミダイト合成
につき使用する。最終生成物の収率は５０％であった。
この化合物は重水素化ピリジンにおいて１４６および１
４６．２ ppmに位置する３１ＰのＮＭＲタブレットを特
徴とする。重水素化アセトニトリルにおけるプロトンの
主ＮＭＲピークは、８．１２ ppm（ｓ，Ｈ８），６．４
５ ppm（ｔ，Ｈ１′），５．０５ppm（ｓ，ＣＨ₂ フェ
ノキシアセチル）および４．８８ ppm（ｍ，Ｈ３′）に
位置した。

【０１１８】ＦＡＢイオン源を用いる質量分析器によ
り、この生成物の分子ピークにつき９０３のｍ／ｅの数
値を観察することができた。

【０１１９】これにより化合物１６が得られ、これは式
（Ｉ）においてＢが式（II）グアニンから誘導された基
であり、Ｒ¹ が水素原子であり、Ｒ² がフェノキシ基で
あり、Ｒ³ が４，４′−ジメトキシトリチル基であり、
Ｒ⁴ が式（VII ）の含燐基でありかつＲ⁵ が水素原子で
ある化合物に相当する。

【０１２０】以下の実施例１７〜１９は、Ｈ−ホスホネ
ート法によってオリゴヌクレオチドを合成するために使
用する完全保護されたモノヌレオチドの製造を示してい
る。

【０１２１】実施例１７：化合物１７の製造 オリゴヌクレオチドを合成するための化合物１７を、Ｈ
−ホスホネート法により作成した。５ミリモルの化合物
７を５ｍｌの無水ジオサンと一緒に蒸発させて乾燥し、
かつこれを１５ｍｌの前記溶媒と５ｍｌの無水ピリジン
とに溶解させた。これに続いて、５ｍｌの１．２５Ｍ
２−クロル−（５，６−ａ）−ヘンゾ−［１，３−ジオ
キソ−２−ホスホル−４−イノン］または式：

【０１２２】

【化３１】

【０１２３】のサリチルクロルホスファイトを添加し、
かつ反応を室温にて１０分間継続させた。

【０１２４】これに続いて、０．５ｍｌの水を添加しか
つ加水分解を１０分間生ぜしめた。次いで、この混合物
を２５０ｍｌの１モル酢酸トリエチルアンモニウム水溶
液に注ぎ入れ、かつ所望生成物を２５０ｍｌのクロロホ
ルムで２回抽出した。有機相を無水酢酸ナトリウムで脱
水し、かつ回転エバポレータで濃縮した。このように得
られた残留物を、シリカゲルカラム（２００×４０ｍ
ｍ）上での高性能液体クロマトグラフィーによって精製
した。この生成物をクロロホルムにおける２％トリエチ
ルアミン混合物中でメタノール濃度を増大させた溶液
（０％メタノール：２５０ｍｌ；１％メタノール：２５
０ｍｌ；２％メタノール：２５０ｍｌ；３％メタノー
ル：２５０ｍｌ；５％メタノール：２５０ｍｌ；７％メ
タノール：５００ｍｌ）で溶出させた。求める生成物を
含有するフラクションを集め、かつ溶剤を蒸発させて生
成物を白色フォームとして得た。化合物１７の収率は５
５％であった。この化合物を核磁気共鳴により分析し、
かつ得られた結果を第４表に示す。

【０１２５】これにより化合物１７が得られ、これはＢ
がアデニンから誘導された式（IV）の基を示し、Ｒ¹ が
水素原子を示し、Ｒ² がフェノキシ基を示し、Ｒ³ が
４，４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ⁴ が式：

【０１２６】

【化３２】

【０１２７】の含燐基を示しかつＲ⁵ が水素原子を示す
式（Ｉ）に相当する。

【０１２８】実施例１８：化合物１８の製造 実施例１７におけると同様に５ミリモルの化合物７の代
りに５ミリモルの化合物１５を用いたＨ−ホスホネート
法により化合物１５のホスホリル誘導体を作成し、これ
はオリゴヌクレオチド合成を目的とする。反応収率は４
８％であり、かつ得られた生成物を核磁気共鳴によって
分析した。得られた結果を第４表に示す。

【０１２９】これにより化合物１８が得られ、これはＢ
がグアニンから誘導された式（II）の基を示し、Ｒ¹ が
水素原子を示し、Ｒ² がフェノキシ基を示し、Ｒ³ が
４，４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ⁴ が式：

【０１３０】

【化３３】

【０１３１】の含燐基を示しかつＲ⁵ が水素原子を示す
式（Ｉ）に相当する。

【０１３２】実施例１９：化合物１９の製造 実施例１７におけると同様に５ミリモルの化合物７の代
りに５ミリモルの化合物５を使用してＨ−ホスホネート
法により化合物１５のホスホリル誘導体を作成し、これ
をオリゴヌクレオチドを合成するために使用した。反応
収率は６２％であり、かつ得られた生成物を核磁気共鳴
によって分析した。得られた結果を第４表に示す。

【０１３３】これにより化合物１９が得られ、これはＢ
がシトシンから誘導された式（III）の基を示し、Ｒ¹
およびＲ² がメチル基を示し、Ｒ³ が４，４′−ジメト
キシトリチル基を示し、Ｒ⁴ が式：

【０１３４】

【化３４】

【０１３５】の含燐基を示しかつＲ⁵ が水素原子を示す
式（Ｉ）に相当する。

【０１３６】実施例２０ この実施例は次の配列： ｄ（ＡＡＴＴＣＡＧＡＴＵＴＧＡＴＣＡＴ）ＡＧＲＥ−
ＡＧＲＥ を有するオリゴヌクレオチドを合成するための化合物
９，１０および１１を示している。この配列において、
Ａはアデニンを用いて生成されたヌクレオチドを示し、
Ｃはシトシンを用いて生成されたヌクレオチドを示し、
かつＧはグアニンを用いて生成されたヌクレオチドであ
り、Ｔはチミンを用いて生成されたヌクレオチドであ
り、かつＵはグラシルを用いて生成されたヌクレオシド
を示す。

【０１３７】この合成を行なうため、それぞれグアニ
ン、アデニンおよびシトシンに対応する化合物９，１０
および１１並びにチミンおよびウラシルに対応するもの
を使用した。後者は、それぞれ実施例６〜１１における
と同じ操作手順を用いて４，４′−ジメトキシトリチル
基および式（VI）の基により夫々５′および３′位置に
おけるヒドロキシル基を保護することにより対応のヌク
レオシドから得た。

【０１３８】合成は、連鎖の５′末端を含む５０ｍｇ
（すなわち約１．５〜３モル）の支持体（ピアス(pierc
e)社の「調節気孔ガラス」）と、１縮合サイクル当り２
５ｍｇの実施例９〜１１で得られたヌクレオシド誘導体
と、約８〜１５当量を示すチミジンおよび２′−デオキ
シウリジン対応物（ｓｙｎｔｈｏｎ）と、１縮合サイク
ル当り２５ｍｇ（すなわちヌクレオシドに対し２当量）
のメシチレンスルホニルクロライドにより構成される活
性剤とを用いて、バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）
ＳＡＭ ＯＮＥオートマトン（ａｕｔｏ ｍａｔｏｎ）
により行なった。

【０１３９】各縮合サイクルは以下の工程を採る。

【０１４０】脱トリチル化：ＣＨ₂ Ｃｌ₂ における２％
トリクロル酢酸、２分間； 洗 浄 ： ＣＨ₃ ＣＮ、１分間； 乾 燥 ： 無水ＣＨ₃ ＣＮ、６分間； 縮 合 ： ＣＨ₃ ＣＮ／１−メチルイミダゾール混合
物（容量で８５：１５）におけるモノマーヌクレオシド
誘導体およびメシチレンスルホニルクロライド、１５分
間；及び 洗 浄 ： ＣＨ₃ ＣＮ、６分間。

【０１４１】かくして、これら縮合サイクルの後に、共
有結合したオリゴヌクレオチドを含有するシリカゲルが
得られた。これを全てパイレックスフラスコに移し、次
いで２８％アンモニアを添加しかつ室温にて８時間放置
した。このようにしてオリゴヌクレオチドを支持体から
遊離させ、その際本発明の目的を構成する保護基を除去
した。

【０１４２】次いで、上澄液を除去しかつシリカを１ｍ
ｌの２回蒸留された水で３回洗浄した。溶剤を蒸発さ
せ、かつ残留物を０．５ｍｌの水に溶解し、次いでセフ
ァデックスＧ２５カラム（直径１ｃｍ、高さ７ｃｍ）に
て分画した。２５４ｎｍにて紫外光の吸収を示すフラク
ションを集め、かつ凍結乾燥した。

【０１４３】Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼを用いる
燐３２の標識によりかつポリアクリルアミドゲル上での
電気泳動により、得られた充分な長さの合成ＤＮＡ断片
を検査した。対応するストリップを切断しかつ化合物を
溶出させ、生物学的用途を目的として化合物を生成する
ことができる。

【０１４４】同様にして、次の配列を有するオリゴヌク
レオチドの製造を行なった： −ｄ（ＡＡＴＴＣＡＧＡＵＣＴＧＡＴＣＡＴ）、 −ｄ（ＡＡＴＴＣＡＧＵＴＣＴＧＡＴＣＡＴ）、 −ｄ（ＡＡＴＴＣＡＵＡＴＣＴＧＡＴＣＡＴ）、および −ｄ（ＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧ）。

【０１４５】ここでも、良好な結果が得られると共に、
常温にてアンモニア中で緩和な条件下において保護基が
除去された。

【０１４６】実施例２１ この実施例においては、ホスホルアミダイト合成を用い
て長さ１５ヌクレオチドの単独重合体を合成するため化
合物１２，１３および１４を使用した。

【０１４７】合成を実施例２０におけると同じバイオサ
ーチＳＡＭ ＯＮＥオートマトンを用いて行ない、かつ
次の試薬量を用いた：ポリヌクレオチド連鎖の末端３′
を含む実施例１５で使用した５０ｇ（すなわち１．５〜
３モル）の支持体；１縮合サイクル当り２０ｍｇの化合
物１２，１３もしくは１４（２０〜２５当量）；および
１サイクル当り１５ｍｇ（ヌクレオチドに対し２当量）
の５−パラニトロフェニルテトラゾールにより構成され
る活性剤。

【０１４８】各縮合サイクルは次の工程で構成した： 脱トリチル化：ＣＨ₂ Ｃｌ₂ における２％トリクロル酢
酸、９０秒； 洗浄：ＣＨ₃ ＣＮ、１分間； 乾燥：無水ＣＨ₃ ＣＮ：無水ジメチルホルムアミド（９
０：１０）、３分間； 縮合：ＣＨ₃ ／ＣＮ：ジメチルホルムアミド混合物（９
０：１０）におけるヌクレオシド誘導体＋活性剤、３分
間； 酸化：テトラヒドロフラン：水：ルチジン（８９．５：
１０：０．５）における０．４５％沃素、１分間； 不完全連鎖の延長を停止させるべく、反応しなかったヒ
ドロキシル基の遮蔽。無水ＣＨ₃ ＣＮにおける無水酢酸
と１−メチルイミダゾールとの混合物、２分間； 洗浄：ＣＨ₃ ＣＮ、３分間。

【０１４９】同じ化合物（化合物１２，１３もしくは１
４）を用いて行なった１４回の縮合サイクルの後、合成
された生成物を含む支持体をパイレックスフラスコに移
し、かつ２ｍｌの２８％アンモニアを添加した。フラス
コを室温にて８時間保ち、これにより本発明の目的を構
成する保護基を除去することができた。

【０１５０】次いで、上澄液を溶解し、かつシリカを１
ｍｌの２回蒸留された水で３回洗浄し、次いで溶剤を回
転エバポレータで排除した。粗製残留物を０．５ｍｌの
水に溶解させ、これをセファデックスＧ２５ゲル上での
クロマトグラフィーによって精製した。２５４ｎｍにて
吸光するフラクションを集め、その含有量をＴ４−ポリ
ヌクレオチドキナーゼによる燐３２標識の後にポリアク
リルアミドゲル上での電気泳動によって分析した。

【０１５１】かくして、３種の合成された単独重合体は
所望の長さを有し、かつこれらはそれぞれｄ（Ａ₁₅），
ｄ（Ｃ₁₅）およびｄ（Ｇ₁₅）に対応することを確認する
ことができた。

【０１５２】実施例２２：Ｈ−ホスホネート法によるオ
リゴヌクレオチドの製造 この実施例は、つぎの配列： ５′ｄ（ＡＴＧＡＴＣＴＡＣＴ）３′ を有するオリゴヌクレオチドを合成するための化合物１
７，１８および１９の使用を示している。

【０１５３】この配列においてＡ，Ｇ，ＣおよびＴは実
施例２０の配列におけると同じヌクレオチドを示す。

【０１５４】結合を行なうため化合物１７，１８および
１９をそれぞれアデニン，グアニンおよびシトシンに対
応するシントン（ｓｙｎｔｈｏｎ）、並びにチミンに対
応するシントンとして使用した。後者は５′機能を４，
４′−ジメトキシトリチル基で保護しかつ３′機能を
式：

【０１５５】

【化３５】Ｈ−Ｐ−Ｏ（Ｃ₂ Ｈ₅ ）₃ ＮＨ⁺ の含燐基で保護することによりチミジンから得られ、そ
の際アデニンのＨ−ホスホネート誘導体につき前記した
と同じ操作手順を用いた。

【０１５６】結合はバイオサーチＳＡＭ ＯＮＥオート
マトンを用いて行ない、その際次のものを使用した：
４，４′−ジメトキシトリチル基により５′位置が保護
された１μモルのチミジンでグラフトされた支持体から
なる、設計者により予備状態調節されたカラム；１縮合
サイクル当り８ｍｇのヌクレオシド誘導体１７，１８お
よび１９並びに約１０モル当量の対応するチミジン誘導
体および１縮合サイクル当り６μｌ、すなわち５０モル
当量の活性剤として使用されるトリメチルアセチルクロ
ライド。

【０１５７】各縮合サイクルの工程は次の通りである：
ジクロルメタン３ｍｌ中の２％トリクロル酢酸、１分
間；アセトニトリルによる洗浄、３ｍｌ；ピリジン：ア
セトニトリル混合物１：１、すなわち３ｍｌによる乾
燥；縮合：ピリジン−アセトニトリル混合物２ｍｌにお
けるヌクレオシド誘導体および活性剤、１分間；３ｍｌ
のピリジン−アセトニトリル混合物による洗浄；３ｍｌ
のアセトニトリルによる洗浄。

【０１５８】縮合サイクルが終了した後、２％沃素溶液
をピリジン：水混合物９８：２（３ｍｌ）中へ通すこと
により、ヌクレオチド間の燐酸化を生ぜしめた。これに
続いて、ピリジンとアセトニトリルとの混合物（５ｍ
ｌ）およびアセトニトリル（３ｍｌ）で洗浄し、次いで
上記と同様に脱トリチル化した。

【０１５９】これにより、共有結合したポリヌクレオチ
ドからなるシリカゲルが得られた。これを全てパイレッ
クスフラスコに移し、２ｍｌの２８％アンモニアを添加
し、かつ常温にて２時間放置した。かくしてオリゴヌク
レオチドが支持体から遊離され、その間本発明の目的を
構成する保護基を除去した。次いで、上澄液を溶解さ
せ、シリカを１ｍｌの２回蒸留した水で３回洗浄し、溶
剤を蒸発させかつ残留物を０．５ｍｌの水で溶解させ
た。これに続いて、セファデックスＧ２５カラム（直径
１ｃｍ、高さ７ｃｍ）での分画を行ない、次いで２５４
ｎｍにて紫外光の吸収を有するフラクションを合し、か
つこれを凍結乾燥した。

【０１６０】合成された生成物の正確な長さを放射性燐
３２標識によって検査し、その際Ｔ４−ポリヌクレオチ
ドキナーゼを使用し、次いでポリアクリルアミドゲルで
の電気泳動にかけた。

【０１６１】

【表１】

【０１６２】

【表２】

【０１６３】

【表３】

【０１６４】

【表４】

【０１６５】

【化３６】

【０１６６】

【化３７】

【０１６７】

【化３８】

【０１６８】

【化３９】

【０１６９】

【化４０】

【０１７０】

【化４１】

【０１７１】

【化４２】

【０１７２】

【化４３】

【０１７３】

【化４４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ；ＶＯＬ．37 （ＮＯ２），ＰＰ363−369（1981)

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式： 【化１】 ［式中、Ｒ³ は水素原子、オリゴヌクレオチド合成に使
   用される酸性媒体中において不安定な基、または式： 【化２】 の基を示し、Ｒ⁴ は水素原子、オリゴヌクレオチド合成
   に使用される含燐基または式： 【化３】 の基を示し、Ｒ⁵ は水素原子またはＯＨもしくは保護Ｏ
   Ｈ基を示す］を有するヌクレオシド誘導体。
2. 【請求項２】 Ｒ³ が式： 【化４】 （式中、Ｒ⁶ 、Ｒ⁷ およびＲ⁸ は同一でも異なってもよ
   く水素原子、アルキル基もしくはアルコキシ基を示す）
   のトリチル基、および９−フェニルキサンテニル基より
   なる群から選択される請求項１記載のヌクレオシド誘導
   体。
3. 【請求項３】 Ｒ⁴ が式： 【化５】 の基よりなる群から選択される請求項１記載のヌクレオ
   シド誘導体。
4. 【請求項４】 Ｒ³ およびＲ⁴ が水素原子を示す請求項
   １記載のヌクレオシド誘導体。
5. 【請求項５】 Ｒ³ が基： 【化６】 を示し、かつＲ⁴ が水素原子を示す請求項１記載のヌク
   レオシド誘導体。
6. 【請求項６】 Ｒ⁵ が水素原子を示す請求項１〜５のい
   ずれかに記載のヌクレオシド誘導体。
7. 【請求項７】 Ｒ³ が基： 【化７】 を示し、かつＲ⁴ が基： 【化８】 を示す請求項１記載のヌクレオシド誘導体。
8. 【請求項８】 Ｒ³ が基： 【化９】 を示し、かつＲ⁴ が基： 【化１０】 を示す請求項１記載のヌクレオシド誘導体。
9. 【請求項９】 Ｒ³ が基： 【化１１】 を示し、かつＲ⁴ が基： 【化１２】 を示す請求項１記載のヌクレオシド誘導体。
10. 【請求項１０】 Ｒ⁵ が水素原子を示す請求項７〜９の
    いずれかに記載のヌクレオシド誘導体。