JP4500540B2 - 化学的に合成された核酸の純度を決定し、かつ化学的に合成された核酸を精製するための方法および組成物 - Google Patents

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２００１年６月２９日出願の米国仮特許出願番号６０／３０２，１５３（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の優先権の利益を主張する。

［発明の分野］
本発明は、オリゴマー、特にオリゴヌクレオチドの化学的合成後に残る保護基の検出、同定、および定量に関し、そしてまたこのようなオリゴマーの精製に関する。

過去１０年間にわたって、固体支持体上のＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸の自動化された化学的合成が開発されてきた。これらの化学的プロセスは、ヌクレオチドの塩基である、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニンの環外アミンを保護し、かつＲＮＡのリボースの２’ＯＨをブロッキングすることによって合成させるための物質の使用を含む。合成の核酸生成物内の塩基は、固体支持体からの核酸の切断の際に脱保護される。しかし、塩基脱保護の程度は、容易に決定されない。

例えば、合成ＲＮＡの塩基脱保護の後、生成物は、リボース部分の２’ＯＨの保護として、２’ジメチルシリルｔｅｒｔ−ブチル基を依然として備える。この保護基は、ＲＮＡの化学および構造に影響しないように、化学的手段によって注意深く除去される。しかし、２’ＯＨの脱保護の程度は、容易に決定されない。核酸は、高圧液体クロマトグラフィーによって、またはゲル電気泳動によって精製される。しかし、合成におけるいくつかの所望されない生成物として、依然として１つ以上の保護基を備える完全な核酸配列、および全長配列と分離することが困難な、全長配列より短い（中断された）配列、特に５０ヌクレオチドより長いオリゴマーがある。現在のところ、各々の保護基（もしあれば）がどれいくらい多く、依然としてこの生成物中に残っているか、そしてこの生成物のどの程度の割合が全長であるかを決定するための簡単な方法はない。一般には、Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｅ．，Ｇｅｈｒｋｅ，Ｃ．Ｗ．，Ｋｕｏ，Ｋ．Ｃ．，およびＡｇｒｉｓ，Ｐ．Ｆ．（１９７９）Ｍａｊｏｒ ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ ｔＲＮＡ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１７３：２８１〜２９８；Ａｇｒｉｓ，Ｐ．Ｆ．，Ｔｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｇｅｈｒｋｅ，Ｃ．Ｗ．，Ｋｕｏ，Ｋ．Ｃ．，およびＲｉｃｅ，Ｒ．Ｈ．（１９８０）Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ Ｂａｓｅｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｔｏｐｉｃ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ．Ｊ；Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９４：２０５−２１２；Ｇｅｈｒｋｅ，Ｃ．Ｗ．，Ｋｕｏ，Ｋ．Ｃ．，ＭｃＣｕｎｅ，Ｒ．Ａ．，Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｋ．Ｏ．，およびＡｇｒｉｓ，Ｐ．Ｆ．（１９８１）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔＲＮＡｓ：ＲＰ−ＨＰＬＣ ｏｆ ｔＲＮＡ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２３０：２９７〜３０８；Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、第Ａ巻、Ｂ巻、およびＣ巻（Ｇｅｈｒｋｅ，Ｃ．Ｗ．，およびＫｕｏ，Ｋ．Ｃ．Ｔ．編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９９０；Ａｇｒｉｓ，Ｐ．Ｆ．，およびＳｉｅｒｚｐｕｔｏｗｓｋａ−Ｇｒａｃｚ，Ｈ．（１９９０）Ｔｈｒｅｅ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔＲＮＡ’ｓ ｂｙ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ．Ｉｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ（Ｇｅｈｒｋｅ，Ｃ．Ｗ．ａｎｄ Ｋｕｏ，Ｋ．Ｃ．Ｔ．，編），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，２２５〜２５３頁；Ａｇｒｉｓ，Ｐ．Ｆ．，Ｈａｙｄｅｎ，Ｊ．，Ｓｉｅｒｚｐｕｔｏｗｓｋａ−Ｇｒａｃｚ，Ｈ．，Ｄｉｔｓｏｎ，Ｓ．，Ｄｅｇｒｅｓ，Ｊ．Ａ．，Ｔｅｍｐｅｓｔａ，Ｍ．，Ｋｕｏ，Ｋ．Ｃ．，およびＧｅｈｒｋｅ，Ｃ．Ｗ．（１９９０）Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．を参照のこと。

保護基の除去が不完全であること、および簡便なアッセイがないことは、２つの産業について、および世界中の多くの研究者にとって問題である。（ｉ）現在、核酸配列合成生成物を、翌日配達によって提供している多くの会社は、その顧客に対して、その生成物が脱保護されている程度を告げることが困難である。（ｉｉ）製薬会社は、彼らが導入するか市販しようとしている、治療用または診断用のオリゴヌクレオチド生成物の純度、および／または長さについて、監督官庁に証明することが簡単ではない。従って、オリゴヌクレオチド生成物の純度を決定するため、および全長オリゴヌクレオチド生成物の割合を決定するための、簡便でかつ信頼できる技術が必要である。

本発明は、基板上に固定された複数の抗体を含む抗体マイクロアレイ、およびその使用に関する。この抗体マイクロアレイ上に固定された各々の抗体は、合成オリゴマーに特異的に結合し、この合成オリゴマーはそれ自体に共有結合している有機保護基を有する。この有機保護基が、この合成オリゴヌクレオチドに共有結合されていない場合、この抗体は、この合成オリゴヌクレオチドに結合しない。

本発明による抗体チップは、合成オリゴマーの不完全な脱保護を検出するために、および／または完全に脱保護された合成オリゴマーから保護された合成オリゴマーを分離するために、用いることができる。このような抗体チップはまた、合成オリゴマーの不完全な伸長を検出するために、および／または不完全な合成オリゴマーから全長オリゴマーを分離するために用いることができる。本明細書に記載される方法は、未結合のオリゴマー、またはオリゴヌクレオチドマイクロアレイのような基板に結合したオリゴマーのハイスループットアッセイにおいて有用であり得る。例えば、本発明による抗体チップ、およびこのような抗体チップを用いる方法は、ハイスループットアッセイにおいて、ＤＮＡチップを形成するために用いられるＤＮＡの不十分な脱保護または伸長を検出するために有用であり得る。

本発明の１つの態様は、抗体マイクロアレイを用いて合成試験オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護を検出する方法を含有する。この方法は、以下のステップを含む。
（ａ）基板上に固定された複数の抗体を含む抗体マイクロアレイを提供するステップであって、各々の抗体は、合成オリゴヌクレオチドに対して共有結合している有機保護基を有する合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合し、この有機保護基が合成オリゴヌクレオチドに対して共有結合されていない場合、この抗体は、この合成オリゴヌクレオチドに結合しないステップと、
（ｂ）合成試験オリゴヌクレオチドと、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体とを接触させるステップと、ならびに
（ｃ）抗体マイクロアレイ上に固定された抗体に対する合成試験オリゴヌクレオチドの結合を検出するステップであって、結合の存在が、合成試験オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護を示すステップ。

本発明の別の態様は、有機保護基を用いて調製された合成オリゴヌクレオチド混合物を精製する方法を包含する。方法は、抗体マイクロアレイを用い、かつ、
（ａ）完全に脱保護された合成オリゴヌクレオチド、部分的に脱保護された合成オリゴヌクレオチド、および／または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドを含む、合成オリゴヌクレオチド混合物を提供するステップであって、混合物は、少なくとも１つの部分的に、または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドであって、それに共有結合された保護基を有する合成オリゴヌクレオチドを有するステップと、
（ｂ）基板上に固定された複数の抗体を含む抗体マイクロアレイを提供するステップであって、各々の抗体は、合成オリゴヌクレオチドに共有結合されている有機保護基を有する合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合し、この有機保護基が合成オリゴヌクレオチドに対して共有結合されていない場合、抗体は、合成オリゴヌクレオチドに結合せず、複数の抗体は、少なくとも１つの部分的に、または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドに結合され得る少なくとも１つの抗体を含むステップと、
（ｃ）合成オリゴヌクレオチド混合物と、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体とを接触させて、これによって混合物由来の保護された合成オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体の少なくとも１つに結合されるステップであって、ここで合成オリゴヌクレオチド混合物中のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、複数の抗体に結合しないステップと、
（ｄ）抗体マイクロアレイ、および未結合の合成オリゴヌクレオチドを分離して、これによって、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体に結合された、任意の部分的に、および／または完全に保護された合成オリゴヌクレオチド（単数または複数）から、未結合の合成オリゴヌクレオチドを分離するステップと
を含む。

本発明のさらに別の態様は、抗体マイクロアレイを用いて、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを調製する方法を包含する。方法は、以下のステップ、
（ａ）有機保護基を用いて調製された合成オリゴヌクレオチド混合物を提供するステップであって、混合物は、完全に脱保護された合成オリゴヌクレオチド、部分的に脱保護された合成オリゴヌクレオチド、および／または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドを含み、混合物は、少なくとも１つの部分的に保護された、または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドであって、該合成オリゴヌクレオチドに共有結合された保護基を有する合成オリゴヌクレオチドを有するステップと、
（ｂ）第一の基板上に固定された複数の抗体を含む抗体マイクロアレイを提供するステップであって、各々の抗体は、合成オリゴヌクレオチドに共有結合されている有機保護基を有する合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合し、有機保護基が合成オリゴヌクレオチドに対して共有結合されていない場合、抗体は、合成オリゴヌクレオチドに結合せず、複数の抗体は、少なくとも１つの部分的に保護された、または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドに結合され得る少なくとも１つの抗体を含むステップと、
（ｃ）合成オリゴヌクレオチド混合物と、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体とを接触させて、これによって混合物由来の保護された合成オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体の少なくとも１つに結合されるステップであって、ここで合成オリゴヌクレオチド混合物中のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、複数の抗体に結合しないステップと、
（ｄ）抗体マイクロアレイ、および未結合の合成オリゴヌクレオチドを分離して、これによって、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体に結合された、任意の部分的に保護された、および／または完全に保護された合成オリゴヌクレオチド（単数または複数）から、未結合の合成オリゴヌクレオチドを分離するステップと、
（ｅ）第二の基板上に未結合の合成オリゴヌクレオチドを固定して、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを形成するステップと
を含む。

本発明のさらなる態様に従って、抗体を含浸させた（impregnated）オリゴヌクレオチドマイクロアレイが提供される。各々の抗体は、合成オリゴマーであって、それに共有結合している有機保護基を有する合成オリゴマーに特異的に結合する。この抗体は、オリゴヌクレオチドのアレイにそって基板上に固定される。いくつかの実施形態において、不完全な脱保護、および／または不十分な伸長の検出が所望される時点まで、この抗体は、カプセル化されてもよいし、または１つ以上のブロッキング基を用いて、この抗体上の結合部位をブロックしてもよい。いくつかの実施形態において、この抗体は、カプセルからのこの抗体の放出によって、またはこの抗体からの保護基の除去によって、所望の場合、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドと接触させられ得る。次いで、適切なアッセイを実施して、合成オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護、および／または合成オリゴヌクレオチドの不完全な伸長を決定することができる。

まとめると、本発明の抗体、抗体マイクロアレイ、抗体を含浸させたオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、および方法は、研究、治療、診断、および生体医科学における、オリゴヌクレオチドまたはペプチドに対する特定の適用とともに、有機合成プロセスにおいて用いられる保護基の定性的検出および定量的検出のためなどの、イムノアッセイにおいて有用である。本発明は、副生成物の混入から最終生成物を分離するためなどの、精製技術において用いることができる。本発明は、オリゴヌクレオチド合成およびペプチド合成の品質管理の過程において、例えば、遺伝子治療、アンチセンス、アンチジーン、および遺伝子発現制御用の薬品の品質管理において、保護基を含み得る生体医学ポリマーの品質管理において、ならびに合成オリゴマー（特に、オリゴヌクレオチド、またはペプチド）の精製およびキャラクタリゼーションのためのプローブまたはデバイスとして、用いることができる。本発明は、低容積の抗体を用いる場合でさえ、このような品質管理における高い感度、精製、およびイムノアッセイ技術を有利に提供する。さらに、本発明の使用は、例えば、不完全に脱保護された／不十分に伸長されたＤＮＡの量が少ない、改良ＤＮＡチップのような、改善されたオリゴヌクレオチド生成物を生成するのに有用であり得る。

１．一般的定義
「抗体（antibody）」とは、本明細書において用いる場合、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方をいい、任意の免疫グロブリン型の抗体（ＩｇＧ抗体、およびＩｇＭ抗体を含むがこれらに限定されない）をいう。これらには、その抗体の超可変領域または結合領域を保持する抗体フラグメントが含まれる。抗体は、任意の種由来であってよいが、代表的には哺乳動物（例えば、ウマ、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ）由来の抗体である。抗体は、公知の技術によって、ニトロセルロース、アガロース、ガラス、有機ポリマー（「プラスチック」）などのような固体支持体に結合されていても固定されていてもよく、公知の技術に従って、他の検出可能な官能基で標識されてもよく、そのような官能基と結合されてもよい。

「結合（binding）」とは、オリゴマーに対する抗体の選択的結合に関して、本明細書において用いる場合、当分野におけるその通常の意味を有する。概して、イムノアッセイ、または親和性精製技術において有用な区別を行うためには、抗体は、少なくとも約Ｋ_d＝１０^-6、１０^-7、または１０^-8Ｍの親和性で、保護された前記オリゴマーに結合しなければならい。そして、約Ｋ_d＝１０^-2、１０^-3、または１０^-4Ｍ以下の親和性で、保護されていない前記オリゴマーに結合しなければならない。

「オリゴマー（oligomer）」とは、本明細書において用いる場合、下記のような、合成オリゴヌクレオチド、および合成オリゴペプチド（ＤＮＡおよびＲＮＡのような天然に存在する形態の合成オリゴマーを含む）、ならびに改変された化学骨格をいう。オリゴヌクレオチドは現在、本発明を実施するのに好ましく、そして本発明は主に、本明細書において、オリゴヌクレオチドに関して説明される。しかし、本明細書において記載される方法および技術はまた、オリゴペプチド、オリゴ糖など（すなわち、合成のための保護基を必要とする、任意の合成によって生成されたポリマー）にも応用することが可能である。

「ヌクレオチド（nucleotide）」とは、本明細書において用いる場合、オリゴヌクレオチドのサブユニットであって、五炭糖、窒素の複素環式塩基（代表的には、この五炭糖の１位置に結合した）、およびリン酸塩、またはリン酸基（代表的には、この五炭糖の５’位置に結合した）を含むが、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドには存在しないか、または３’位置に結合していると考えられるサブユニットをいう。これらの構造は、周知である。例えば、Ａ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０９−３２０を参照のこと。「ヌクレオシド（nucleoside）」とは、代表的には、リン酸もリン酸基もない、ヌクレオチドをいう。

「保護基（protecting group）」とは、本明細書において用いる場合、当分野におけるその通常の意味を有し、そして化学的な部分、官能基、または置換基であって、ある分子に関与する化学反応（代表的には有機合成において）の前に、その分子中の原子に結合するか、代表的には共有結合し、それによってその原子（その保護基が結合される）においてその化学反応が避けられるものをいう。代表的には、保護基は、次いで、最終生成物の調製のために、中間分子から化学的に除去されるが、除去技術は、完全に成功するわけではなく、最終生成物の部分的な脱保護しか生じない（すなわち、その分子上に残留する少なくとも１つの保護基が存在する）場合もある。保護基は、本明細書に記載のとおり、抗体を生成し、または試験する目的で意図的に分子上に残されていてもよい。

「脱保護（deprotection）」、または「脱保護された（deprotected）」とは、本明細書において用いる場合、分子からの化学的なオリゴヌクレオチド合成の間に使用された保護基がないことをいう。このような保護基は以下に記載される。このような保護基の存在によって、この保護基が連鎖停止（chain terminating）する場合、オリゴヌクレオチドの不十分な伸長が示されるかもしれない。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドは、理想的には完全に脱保護されるが、本発明を使用して、このようなオリゴヌクレオチドの部分的または不完全な脱保護（すなわち、オリゴヌクレオチドにおける、下記のような少なくとも１つの保護基の存在）を検出する。

「塩基（base）」とは、オリゴヌクレオチドに関して、本明細書において用いる場合、プリン（例えば、アデニン、グアニン）、またはピリミジン（例えば、ウラシル、チミン、シトシン）のいずれかの誘導体である、窒素の複素環式塩基をいう。ピリミジン塩基は、環式窒素の１位によって五炭糖に結合される。プリン塩基は、環式窒素の９位によって五炭糖に結合される。好ましい塩基は、グアニン、アデニン、およびシトシンのような遊離のアミノ基を含む塩基である（次いで、保護基は、この遊離のアミノ基上の水素の１つまたは両方の置換によって、遊離のアミノ基に共有結合される）。しかし、本発明は、標準であっても、またはまれには改変されていても、任意のプリン、またはピリミジン塩基（オリゴヌクレオチドにおけるその合成の間の保護のための遊離のアミノ基、または保護を必要とする他の基を含む）とともに用いることができる。標準の、およびまれには改変された塩基の例は、以下の表１に示されるヌクレオチドセット中に見出される塩基である。

Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６，１４８（１９９８）を参照のこと。

出願人らは、本明細書に引用される全ての米国特許参考文献の開示は、その全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

２．保護基
詳細な保護基は、合成されているオリゴマー、およびそのオリゴマーが合成される方法論に依存する。

オリゴヌクレオチドの合成について、適切な保護基としては、アルキル基、アリール基、アルキルアリール基、アリールアルキル基が挙げられる。これらは、Ｎ、Ｏ、またはＳのような１つ以上のヘテロ原子を含んでもよく、そして置換されても、されなくても（例えば、カルボニル基）よい。保護基の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。アセチル；イソブチリル；２−（ｔ−ブチルジフェニル−シリルオキシメチル）ベンゾイル；ナフタロイル；イソ−ブチリルオキシカルボニル；レブニリル；フルオレニルメトキシカルボニル；２−ニトロチオフェニル；２，２，２−トリクロロ−ｔ−ブトキシカルボニル，エトキシカルボニル；ベンジルオキシカルボニル；ｐ−ニトロフェニル−エチルオキシカルボニル；Ｎ’Ｎ−ジメチルホルムアミジン；ホルミル；ベンゾイル，トルイル；２，４−６−トリメチルベンゾイル；アニソイル；２，４−ジメチルフェニル；２，４，６−トリメチルフェニル；トリフェニルチオメチル；ピボールオイルオキシメチル（ｐｉｖｏｌｏｉｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）；ｔ−ブトキシカルボニル；ｐ−ニトロフェニルエチル；メトキシエトキシメチル；ブチルチオカルボニル；２−メチル−ピリジン−５−イル；２−ニトロチオフェニル；２，４−ジニトロチオフェニル；２−ニトロ−４−メチルチオフェニル；ｐ−ニトロフェニルスルホニルエチル；５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン；チオフェニル；β−シアノエチル；フェニルエチル；ｐ−ニトロフェニルエチル；ピリジルエチル；２−Ｎ−メチルイミダゾリルフェニル；メチル；アリル；トリクロロエチル；ジベンゾイル；ｐ−ニトロフェニルエトキシカルボニル；ベンゾイル、およびそれらの置換された誘導体；２（アセトオキシメチル）ベンゾイル；４，４’，４”−ｔｒｉｓ−（ベンジルオキシ）トリチル；５−メチルピリジノ−２−イル；フェニルチオエチル；ジフェニルカルバモイル（ｄｉｐｅｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）；３，４−ジメトキシベンジル；３−クロロフェニル；２−ニトロフェニル；９−フェニルキサンテン−９−イル；９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル；９−（ｐ−オクタデシルオキシフェニル）キサンテン−９−イル；「架橋された（ｂｒｉｄｇｅｄ）」ビス−ジメトキシトリチル基；フタロイル；スクシニル；ベンゼンスルホニルエトキシカルボニル；４，４’，４”−ｔｒｉｓ（ｂｅｖｕｌｉｎｙｌｏｘｙ）トリチル；ｐ−フェニルアゾフェニルオキシカルボニル；ｏ−置換ベンゾイル；４，４’４”−ｔｒｉｓ−（４，５−ジクロロファリミジン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈａｌｉｍｉｄｉｎ））トリチル；レベニリル（ｌｅｖｅｌｉｎｙｌ）；アルキルオキシ、およびアリールオキシアセチル；１，３−ベンゾジチオール−２−イル；テトラヒドロフラニル；［２−（メチルチオ）フェニル］チオメチル；１−（２−クロロエチオキシ）エチル；１−［（２−フルオロ−フェニル］４−メトキシピペリジン−４−イル；４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル；（１−メチル−１−メトキシ）エチル；テトラヒドロピラニル；３−メトキシ−１，５−ジカルボメトキシペンタン−３−イル；２−ニトロベンジル；ベンジル；４−ニトロフェニルエチル−スルホニル；ｔ−ブチルジメチルシリル；４−メトキシベンジル；３，４−ジメトキシベンジル；９−ｐ−メトキシフェニルチオキサンテン−９−イル；式Ｘ¹Ｘ²Ｘ³Ｃ−の化合物であって、ここでＸ¹、Ｘ²、およびＸ³が、各々独立して、フェニル，ｐ−モノメトキシフェニル、ｏ−モノメトキシフェニル、ビフェニル、ｐ−フルオロフェニル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メチルフェニル、ｐ−ニトロフェニルなどからなる群より選択される化合物。

３．オリゴヌクレオチド
保護基を含み、かつ本発明の実施に用いることができる合成オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡおよびＲＮＡのような天然に存在する形態、ならびにホスホネート、ホスホルアミド、ホスホンアミド、亜リン酸塩、ホスフィンアミドなどのようなポリ（リン酸誘導体）、ポリ（イオウ誘導体）例えば、スルホン、スルホン酸塩、亜硫酸塩、スルホンアミド、スルフェンアミドなどのような、改変された骨格化学的性質を有するものの両方が挙げられる。本発明の抗体は、特定の「試薬」、または「ベンチマーク（benchmark）」のオリゴヌクレオチドに対するその抗体の選択的な結合によってキャラクタリゼーションされ得るが、同じ抗体がまた、同じ保護基を含む、種々の他のオリゴヌクレオチド（例えば、長い、または短いヌクレオチド）、または他の化合物にも結合され得るということが注目される。

例えば、オリゴヌクレオチド（それに対して抗体が選択的に結合する）は、３〜２０のヌクレオチドから構成されてもよく、そしてこのヌクレオチドのうちの１つが以下の式（Ｉ）：
による、保護されたヌクレオチドであって、
式中、
Ｒは、Ｈまたは保護基（例えば、ジメトキシトリチル）であり、ただしこれは、この保護されたヌクレオチドが、このオリゴヌクレオチドにおける５’末端ヌクレオチドではない場合、Ｒは、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であるという条件下であり、
Ｒ¹は、Ｈまたは保護基（例えば、βシアノエチル）であり、ただしこれは、この保護されたヌクレオチドが、このオリゴヌクレオチドにおける３’末端ヌクレオチドではない場合、Ｒ¹は、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であるという条件下であり、
Ｒ²は、Ｈまたは−ＯＲ³であり、
Ｒ³は、Ｈまたは保護基（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）であり、
塩基は、プリン塩基、またはピリミジン塩基であり、
Ｒ⁴は、前記塩基のアミノ基上の水素が置換された保護基であって、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ジメチルホルムアミジン（ｄｍｆ）、イソブチル（Ｉｂｕ）、フェノキシアセチル（Ｐａｃ）、およびイソプロピル−フェノキシアセチル（Ｉｐｒ−ｐａｃ）からなる群より選択される保護基であり、ただし、Ｒ、Ｒ¹、もしくはＲ³が、保護基である場合、またはこの塩基が、アミノ基を含まない場合、Ｒ⁴が、式（Ｉ）に存在しないという条件下であり、
さらにＲ、Ｒ¹、Ｒ³、およびＲ⁴のうち１つだけが、保護基であり、かつＲ、Ｒ¹、Ｒ³、およびＲ⁴のうちその他が、保護基でないという条件下である。

前述の１つの特定の実施形態において、抗体は、オリゴヌクレオチドであって、３〜２０ヌクレオチドからなり、かつ５’ヌクレオチドを有する、オリゴヌクレオチドに選択的に結合する抗体であってもよく、ここでこの５’ヌクレオチドは、以下の式（ＩＡ）：
による、保護されたヌクレオチドであり、
式中、
Ｒ⁵は、保護基（例えば、ジメトキシトリチル）であり、
Ｒ⁶は、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であり、
Ｒ⁷は、Ｈまたは−ＯＨであり、
塩基は、プリン塩基、またはピリミジン塩基である。

前述の別の特定の実施形態において、抗体は、オリゴヌクレオチドであって、３〜２０ヌクレオチドからなり、かつ３’ヌクレオチドを有する、オリゴヌクレオチドに選択的に結合する抗体であってもよく、ここでこの３’ヌクレオチドは、以下の式（ＩＢ）：
による、保護されたヌクレオチドであり、
式中、
Ｒ⁸は、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であり、
Ｒ⁹は、保護基（例えば、βシアノエチル）であり、
Ｒ¹⁰は、Ｈまたは−ＯＨであり、
塩基は、プリン塩基、またはピリミジン塩基である。

前述の別の特定の実施形態において、抗体は、３〜２０ヌクレオチドからなる、オリゴヌクレオチドに選択的に結合する抗体であってもよく、ここでこのヌクレオチドの１つは、以下の式（ＩＣ）：
による、保護されたヌクレオチドであり、
式中、
Ｒ¹¹は、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であり、
Ｒ¹²は、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であり、
Ｒ¹³は、−ＯＲ¹⁴であり、
Ｒ¹⁴は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルのような保護基であり、
塩基は、プリン塩基、またはピリミジン塩基である。

前述のさらなる別の特定の実施形態において、抗体は、３〜２０ヌクレオチドからなる、オリゴヌクレオチドに選択的に結合する抗体であってもよく、ここでこのヌクレオチドの１つは、以下の式（ＩＤ）：
による、保護されたヌクレオチドであり、
式中、
Ｒ¹⁵は、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であり、
Ｒ¹⁶は、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であり、
Ｒ¹⁷は、Ｈまたは−ＯＨであり、
塩基は、プリン塩基、またはピリミジン塩基であり、
Ｒ¹⁸は、アセチル、ベンゾイル、ジメチルホルムアミジン、イソブチリル、フェノキシアセチル、およびイソプロピル−フェノキシアセチルのような、この塩基のアミノ基に結合された保護基である。

従って、上記に示される構造において使用され得る保護された塩基の例としては、以下
のようなアデニン、グアニン、およびシトシンが挙げられるがこれらに限定されず、式中、Ｙ¹およびＹ²は、両方とも保護されていない塩基におけるＨであり、そしてＹ¹および／もしくはＹ²のいずれかまたは両方は、保護された基について、上記のような保護基（例えば、Ｐａｃ、Ｉｐｒ−ｐａｃ、Ｉｂｕ、Ｂｚ、Ａｃ、ｄｍｆ）である。同様に、改変されたヌクレオチドは、この改変において保護基を有し、これは化学的に反応性である。

本発明の１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸であり、そして保護基は、ペプチド核酸の合成において使用される保護基であり、これには、米国特許第６，１３３，４４４号に記載されるものが挙げられるがこれらに限定されない。

前述のさらに別の特定の実施形態において、抗体は、３〜２０ヌクレオチドからなる、オリゴヌクレオチドに選択的に結合する抗体であってもよく、ここでこのヌクレオチドの１つは、米国特許第５，７４４，１０１号、および米国特許第５，４８９，６７８号に記載のものを含むがこれらに限定されない感光性保護基を用いて保護される。

４．抗体
上記のように、本発明は、合成オリゴヌクレオチドに対して共有結合している有機保護基を有する合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合する、抗体（例えば、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体）を提供し、この有機保護基が合成オリゴヌクレオチドに対して共有結合されていない場合、この抗体は、合成オリゴヌクレオチドに結合しない。

この抗体は、公知の技術によって固体支持体上に固定され（または結合され）て、提供されてもよいし、または遊離の未結合型（例えば、凍結乾燥型、凍結型、水性キャリア中など）で提供されてもよい。抗体が固定されるか否かは、その抗体が用いられる特定のイムノアッセイ、または親和性精製技術に依存しており、そしてこのような技術について公知のパラメーターによって決定される。同様に、抗体は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）のような適切な検出基、ビオチンもしくはアビジンのような結合対のメンバー、放射性基または蛍光基（例えば、緑色蛍光タンパク質）と結合されても、コンジュゲートされてもよく、これも、公知の技術に従い、代表的には、抗体が用いられるイムノアッセイ形式に依存する。

５．イムノアッセイ方法
本発明は、イムノアッセイによって、合成オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護（依然として保護基を備える、中断された配列を含む）を検出する方法を提供する。概して、このようなイムノアッセイは、（ａ）合成オリゴヌクレオチドを上記のような抗体に接触させるステップと、次に（ｂ）このオリゴヌクレオチドに対するこの抗体の結合の有無を検出するステップであって、結合の存在は、この合成オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護を示すステップを包含する。異種イムノアッセイ（heterogeneous immunoassay）および同種イムノアッセイ（homogeneous immunoassay）を含む、任意の適切なアッセイ形式を使用することができる。例えば、イムノアッセイは、イムノドットブロットアッセイでもよいし、サンドイッチアッセイでもよい。脱保護のために試験されるオリゴヌクレオチドは、任意の適切な形態（例えば、溶液中）であっても、または固体支持体に固定されてもよい。

好ましい実施形態において、検出方法は、「ディップスティック（dip stick）」などを使用する。ここでは、試験オリゴヌクレオチドに対する抗体の結合は、公知のオリゴヌクレオチドのセット（全てが、共通の固体支持体上に固定される）に対する抗体の結合と比較される。イムノアッセイにおける合成オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護を決定するために有用である、そのような物品（図１０に例示されるような）は、以下を備える。（ａ）表面部分を有する、固体支持体（例えば、ニトロセルロースストリップ）２５であって、この表面部分は、その上に形成された、少なくとも２つの別個の領域２６、２７を有する、固体支持体２５。（ｂ）この離れた別個の領域のうちの１つに結合された第一のオリゴヌクレオチドであって、この第一のオリゴヌクレオチドは、そこに結合された保護基（例えば、少なくとも１つの保護基）を有する、第一のオリゴヌクレオチド、ならびに（ｃ）この離れた別個の領域のうちの別の領域に結合された第二のオリゴヌクレオチドであって、この第二のオリゴヌクレオチドは、そこに結合された保護基を有さない、第二のオリゴヌクレオチド。ここでこの第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は同じである。好ましい実施形態において、この物品はさらに以下を備える。（ｄ）この別個の領域２８のうちの別の領域に結合された第三のオリゴヌクレオチド。この第三のオリゴヌクレオチドはまた、それ自体に結合された上記の第一のオリゴヌクレオチドに対して結合された上記の保護基を有する。ここで、この第三のオリゴヌクレオチドは部分的に脱保護される（すなわち、そこ（この第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの境界間の中間）に共有結合された多数の保護基を、例えば、第一のオリゴヌクレオチドよりも、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つ以上の保護基、第一のオリゴヌクレオチドよりも少なくとも１０、２０、またはそれ以上の保護基まで、有する）、そしてここで、この第一、第二、および第三のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は同じである。当然ながら、種々の数の保護基を担持するなおさらなるオリゴヌクレオチドが、基板上に、さらなる分離されかつ別個の位置に（所望の場合）含まれてもよい。別々のオリゴヌクレオチドが結合される別個の領域は、ドットのような任意の形態であってもよい。

６．親和性精製方法
イムノアッセイに加えて、本発明はまた、部分的に脱保護されたオリゴヌクレオチド（完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを含む）（例えば、保護基を除去するために脱保護プロセスに供されたオリゴヌクレオチド、およびそうされていないオリゴヌクレオチドの両方）からの完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを分離するための、親和性精製技術を提供する。このような手順は、代表的には、（ａ）合成オリゴヌクレオチドの保護されたものおよび完全に脱保護されたものの混合物を上記のような抗体に接触させるステップであって、ここでこの保護された合成オリゴヌクレオチドは有機保護基を有し、これによってこの抗体は、有機保護基に選択的に共有結合され、その結果この保護された合成オリゴヌクレオチドは、抗体に結合するステップと、ならびに、次に（ｂ）完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドから抗体を分離するステップを包含する。抗体は、分離を容易にするために固体支持体上に固定されてもよい。保護された合成オリゴヌクレオチドは、部分的に保護された合成オリゴヌクレオチドであっても、または脱保護を受けていない完全に脱保護された合成オリゴヌクレオチドであってもよい。親和性クロマトグラフィーを含むがこれに限定されない任意の分離形式が用いられてもよい。

７．抗体の生成
抗体を作製する方法であって、この抗体は、合成オリゴヌクレオチドであって、それに共有結合する有機保護基を有する合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合する抗体であり、ここで、この有機保護基が合成オリゴヌクレオチドに対して共有結合されていない場合、この抗体は、この合成オリゴヌクレオチドに結合しない方法。この方法は、（ａ）合成オリゴヌクレオチドに共有結合されている有機保護基によって、固体粒子性支持体（そして、好ましくは、例えば、スクシニルリンカーによって、それに共有結合された）上に合成オリゴヌクレオチドを合成するステップと、そしてこの後に、固体支持体からオリゴヌクレオチドを除去しないステップと、および（ｂ）抗体を生成するのに十分な量で、固体支持体に結合した合成オリゴヌクレオチドを用いて動物を免疫するステップとを包含する。さらに、単一のヌクレオチドが、固体粒子性支持体に対して、そこに結合した有機保護基によって結合され、そして本明細書中上記のように用いられる。

この合成ステップは、公知の技術に従って、固体支持体上で実施され得る。この固体支持体は、合成の前に粒子型であってもよいし、合成の後に断片化されて粒子になってもよい。一般に、固体支持体は、ビーズであり、これは、完全に全体が固体であっても、多孔性であっても、変形可能であっても、硬性であってもよい。このビーズは、一般に、少なくとも１０μｍ、２０μｍ、または５０〜２５０μｍ、５００μｍ、または２０００μｍの直径であり、そして最も代表的には、５０〜２５０μｍの直径である。任意の好適な組成物が固体支持体に用いられてもよい。組成物としては、以下が挙げられる。セルロース、多孔性ガラス（pore-glass）、シリカゲル、ポリスチレンビーズ（例えば、ジビニルベンゼンで架橋されたポリスチレンビーズ）、グラフトコポリマービーズ、例えば、ポリエチレングリコール／ポリスチレン、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、ジメチルアクリルアミドビーズ、疎水性ポリマー（例えば、架橋ポリスチレン、またはフッ素化エチレンポリマー）（これに対して直鎖状ポリスチレンがグラフトされる）でコーティングされたガラス粒子のような組成物など。離れた別個の（separate discrete）固体支持体（例えば、粒子、またはビーズ）が使用される場合、それらは、一般に、総反応混合物の重量に対して約１〜９９％を含む。

好ましい実施形態において、合成ステップの後には、免疫ステップの前に固体支持体を断片化するステップ（例えば、粉砕による）が行われる。ポリクローナル抗体は、公知の技術に従って、動物の血清から収集されてもよいし、脾臓細胞が、動物から収集されてもよく、この脾臓細胞から複数のハイブリドーマ細胞株が生成され、次いで、抗体を生成する特別なハイブリドーマ細胞株が、複数のハイブリドーマ細胞株から単離される。

核酸、および他の合成に用いられる保護基に対する抗血清／ポリクローナル抗体、およびモノクローナル抗体の生成のための特別なプロトコールは、代表的には、以下のステップ、（ａ）保護基を有するかまたは有さないオリゴヌクレオチド、およびその他を調製するステップと、（ｂ）それらの調製物を用いて動物を免疫するステップと、（ｃ）保護基に対する抗体を提示するものを同定するために動物をスクリーニングするステップと、（ｄ）古典的な融合方法によりモノクローナル抗体を生成するステップと、（ｅ）必要に応じて、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂフラグメント、および抗体分子全体を生成（抗体工学による）するステップと、ならびに（ｆ）保護基に対するモノクローナル抗体を評価し、およびキャラクタリゼーションするステップを包含する。これらのステップの各々は、以下に詳細に記載される。

保護基を含む合成オリゴヌクレオチドは、当業者に公知の種々の方法において合成され得る。例えば、保護基を、細孔性ガラス（ＣＰＧ）ビーズに連結されている個々のヌクレオチドに結合することができる。例としては、以下である。
ＣＰＧビーズ−−−ｄＴ（ＤＭＴ基のみを有する）。

別の方法では、保護基は、ＣＰＧビーズに連結されているオリゴヌクレオチド鎖に結合されてもよい。例としては、以下が挙げられる。
Ｐａｃ−ｄＡ−−−Ｐａｃ−ｄＡ−−−ＣＰＧビーズ（Ｂｚ−ｄＣ、およびＩｂｕ−ｄＧを備える）；
Ｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ−−−Ｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ−−−ＣＰＧビーズ（Ｂｚ−ｄＣ、およびＩｂｕ−ｄＧを備える）；
Ａｃ−ｄＣ−−−Ａｃ−ｄＣ−−−ＣＰＧビーズ（Ｂｚ−ｄＣ、およびＩｂｕ−ｄＧを備える）；
ｄｍｆ−Ｇ−−−ｄｍｆ−Ｇ−−−ＣＰＧビーズ（Ｂｚ−ｄＣ、およびＩｂｕ−ｄＧを備える）；ならびに
上記の４つのオリゴヌクレオチドの混合物。

別の方法では、保護基は、部分的に脱保護されたオリゴヌクレオチド鎖に結合されていてもよい（脱保護の手順は、以下に記載される）。例としては、以下が挙げられる。
ポリ ｄＴ２０マー（ＤＭＴ基のみを有する）；
ポリ ｄＴ２０マー（シアノエチル基のみを有する）；
ポリ Ｉｂｕ−ｄＧ ２０マー（部分的に脱保護されている）；
ポリ Ｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ ２０マー（部分的に脱保護されている）；
ポリ Ｂｚ−ｄＣ ２０マー（部分的に脱保護されている）；
ポリ Ｐａｃ−ｄＡ ２０マー（部分的に脱保護されている）；および
ポリ Ａｃ−ｄＣ ２０マー（部分的に脱保護されている）。

本明細書において上記のように調製された合成オリゴヌクレオチドは、以下のように部分的に脱保護されてもよい。（ａ）合成ポリヌクレオチドに対して３０％の水酸化アンモニウム溶液を添加して、次いで種々の時間（５分、１０分、および３０分）室温でインキュベートする。（ｂ）処理されたオリゴマーのアンモニウム溶液を採取して、４℃に予め冷却された１：１希釈の酢酸中に添加して、酢酸に対するアンモニウムの比が１：４になるようにする。（ｃ）氷浴中で３０分間サンプルを保持する。（ｄ）ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃを用いてサンプルを乾燥させる。（ｅ）乾燥したペレットを水に溶解させる。（ｆ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを用いてサンプルを脱塩する。（ｇ）ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃを用いてサンプルを乾燥させる。そして（ｈ）この脱塩したサンプルを水に溶解させる。

本明細書において上記されるように調製した合成オリゴヌクレオチドは、任意の適切な技術によって完全に脱保護されてもよい。特定の技術の１つは、以下のとおりである。（ａ）合成ポリヌクレオチドに対して、３０％の水酸化アンモニウム溶液を添加して、次いで６５℃で、６時間インキュベートする。（ｂ）ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃを用いてサンプルを乾燥させる。（ｃ）乾燥したペレットを水に溶解させる。（ｄ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを用いてサンプルを脱塩する。そして（ｅ）ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃを用いてサンプルを乾燥させる。（ｆ）脱塩したサンプルを水に溶解させる。

部分的に脱保護されたオリゴヌクレオチド、および完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを、任意の適切な手段によって、さらなる用途のために、または手順を確認するためにキャラクタリゼーションしてもよい。この手段としては、ゲル電気泳動、尿素アクリルアミドゲル電気泳動、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる５’末端標識、ＨＰＬＣ分析、質量分析法などが挙げられるがこれらに限定されない。

適切なキャリア（例えば、滅菌生理食塩水溶液）中に含まれた上記のオリゴヌクレオチドの非経口注射によって、上記のオリゴヌクレオチドを用いて、適切な動物を免疫することができる。注射は、任意の適切な経路によって行われてもよい。この経路としては、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、などが挙げられるがこれらに限定されない。適切な動物は代表的には、マウス、ウサギ、ラットなどを含む、哺乳動物である。

特定の実施形態において、モノクローナル抗体の生成のためには、若齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスが用いられる。そしてこの抗原材料の注射の時間経過は以下である。
初日 初回注射
１４日目 初回ブースト
２８日目 二回目ブースト
注入の４日前 最終ブースト
所望の場合、さらなる注射を使用してもよい。抗原の量は、１回あたり各々のマウスについて、５０μｇ〜１００μｇの保護されていないオリゴヌクレオチド（コントロール抗体として）、または保護されたオリゴヌクレオチドであり得る。好ましくは、オリゴヌクレオチド合成のための支持体として用いられるビーズ、または他の個体支持体が、動物に注射される場合、このビーズ、または粒子は、水に懸濁されて、次いで、マウスに注射される。ヌクレオチド溶液を用いる場合、この溶液を完全フロイントアジュバント、または不完全フロイントアジュバントと混合して、マウスに注射する。

ポリクローナル抗体は、公知の技術に従って、上記のように免疫または接種された動物から、またはこの動物から回収された脾臓細胞、この脾臓細胞から生成されたハイブリドーマ細胞株、および所望の抗体の生成のためにスクリーニングされたハイブリドーマ細胞株から（これも公知の技術に従って）回収することができる。

３’末端または５’末端においてビオチン分子を有するか、または有さない（下記のようにＥＬＩＳＡアッセイのために）オリゴヌクレオチドを、標準的な技術に従って合成してもよい。例は、以下のとおりである。
ポリＩｂｕ−ｄＧ ２０マー（ビオチンあり、またはなし）；
ポリＩｂｕ−ｄＡ ２０マー（ビオチンあり、またはなし）；
ポリＩｂｕ−ｄＣ ２０マー（ビオチンあり、またはなし）；
ポリＩｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ ２０マー（ビオチンあり、またはなし）；
ポリＢｚ−ｄＣ ２０マー（ビオチンあり、またはなし）；
ポリＢｚ−ｄＡ ２０マー（ビオチンあり、またはなし）；
ポリｄＴ ２０マー（ビオチンあり、またはなし）；
ポリＰａｃ−ｄＡ ２０マー（ビオチンあり、またはなし）；
ポリＡｃ−ｄＣ ２０マー（ビオチンあり、またはなし）；および
ポリｄｍｆ−Ｇ ２０マー（ビオチンあり、またはなし）。

上記のように生成した抗体は、その結合特性を決定するために、任意の適切な技術（ウエスタンブロット、およびイムノドットブロットが挙げられるがこれらに限定されない）によってキャラクタリゼーションされ得る。

ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の使用に加えて、本発明は、組み換えＤＮＡ、または「抗体工学（antibody engineering）」技術による抗体の生成を意図する。例えば、ハイブリドーマ細胞から単離したｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、そして抗体全体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦａｂ、またはＦａｂフラグメント）をコードする配列を単離して、適切な発現ベクターに挿入し、そしてこの発現ベクターを宿主細胞（ここでこの抗体をコードする単離されたｃＤＮＡを発現する）に挿入してもよい。

モノクローナルＦａｂフラグメントは、当業者に公知の組み換え技術によって大腸菌において生成してもよい。例えば、Ｗ．Ｈｕｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６，１２７５〜８１（１９８９）を参照のこと。

８．抗体のスクリーニング
保護基特異的抗体のためのスクリーニング血清、およびハイブリドーマ細胞培養培地は、以下のように実施され得る。

Ａ．血清
１．固体支持体に（直接、またはオリゴマーを介して）コンジュゲートされた保護基を接種されることになるマウスから、標準的な方法によって、免疫前（免疫に先立って）血清を収集する。
２．接種後の血清をまた、収集する。
３．ＥＬＩＳＡアッセイを実施する。ここでは、特定の保護基が、マイクロタイタープレートにコンジュゲートされたビオチン標識化オリゴヌクレオチド上に残る。他のマイクロタイタープレートウェルは、保護基を有さないコントロールのオリゴマー、または他の保護基を有するオリゴヌクレオチドを含む。二次抗体は、抗体の可視化のためにコンジュゲートされたフォスターゼを有するヤギ抗マウスＩｇＧである。
４．特定の保護基に対する正の活性を有するマウスを、ブーストして、ハイブリドーマの生成のために屠殺する。

Ｂ．ハイブリドーマ細胞培養培地
１．各々の脾臓ハイブリドーマ細胞生成物から、約１０００の培養物を生成する。
２．培養物を、マイクロタイタープレートウェル（９６ウェルプレート）中で増殖させる。
３．各々のウェルから培養培地を取り出して、上記のようなＥＬＩＳＡアッセイにおいて用いるが、ここでは、約１０００のマイクロタイタープレートウェルの各々が、このプレートにコンジュゲートされた保護されたオリゴヌクレオチドを含む。
４．正の活性を有する抗体を生成する培養物を、より大型の培養ウェル（２４ウェルマイクロタイタープレート）に移す。
５．より大容量の培養物由来の培養培地を、保護基に対する活性について再試験して、また特異性についてアッセイする。すなわち、保護基なしのコントロール、および他の保護基のコントロール。
６．陽性である培養物をクローニングアウト（希釈）して、再試験して、各々の最終培養物が、１つの細胞由来（すなわち、単一培養物（mono-culture））にならざるを得ないようになるまで、再度、クローニングアウトする。これらの最終培養物由来の培地を、特異性および親和性に関して、徹底的に評価する。ドットブロットアッセイを用いて、特異性および親和性を評価する。

Ｃ．ＥＬＩＳＡアッセイの代わりのドットブロットアッセイ
１．いくつかの保護基に対する抗体は、マイクロタイタープレートウェル環境中で試験するには取り扱いにくく、そしてドットブロットアッセイを用いて試験しなければならない。一例は、５’末端保護基であるジメチル−トリチル（ＤＭＴ）である。

２．ニトロセルロースメンブレン上のドットブロットアッセイは、ほとんどの目的について、本出願のいずれかに記載されるとおり実施する。しかし、利用可能な培地がわずかしかない、約１０００のマイクロタイターウェルによって、抗体生成を評価することは不可能である。従って、新規な適応を開発した。

ａ）ＵＶ架橋を用いて、ニトロセルロースに対するドットに保護されたオリゴヌクレオチドを付着させる。ＤＭＴを考慮すれば、このメンブレン上の５’−ＤＭＴの存在は、弱酸を用いたドットの処理（ドットが黄橙色（yellow-orange）に変わる）によって確認される。３’ビオチンの存在は、市販のアビジン染色によって確認できる。
ｂ）このメンブレンをブロッキングする（ドットブロットアッセイを参照のこと）。
ｃ）乾燥したメンブレンのドットに注意深く印しをつけ（鉛筆で）、メンブレンに「穴を開けて（punch）」打ち抜く。
ｄ）個々のドットを、個々のマイクロタイタープレートウェル中の細胞培養培地に加えて、インキュベートする。
ｅ）個々のドットを取り除いて、洗浄、二次抗体、ホスファターゼ反応、および発色（適切な試薬を含むマイクロタイタープレートを用いる）を行う。
ｆ）陽性であるドットを、もとのマイクロタイタープレートウェル培養物に対して関連付け（related back to）、それから、少量の培養培地を得た。
ｇ）Ｂに記載のとおり、さらなる培養およびクローニングを行う。

９．マイクロアレイの試験
本発明は、固体支持体上（例えば、マイクロアレイ）に固定されているオリゴヌクレオチドを、その上に合成されたオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護、または伸長について、試験、またはスクリーニングするために用いることができる。

本発明を実施するために用いられる固体支持体は代表的には、別個の固体支持体である。別個の固体支持体は、お互いから物理的に分離されてもよいし、単一の基板の表面部分上の別個の領域であってもよい。このような「チップ型（chip-type）」、または「ピン型（pin-type）」の固体支持体は、公知である。例えば、Ｐｉｒｒｕｎｇに対する、米国特許第５，１４３，８５４号、Ｅｌｌｍａｎに対する、米国特許第５，２８８，５１４号（ピンを基礎とする支持体）；Ｆｏｄｏｒらに対する、米国特許第５，５１０，２７０（チップを基礎とする支持体）を参照のこと。本発明を実施するために用いることができるオリゴヌクレオチドアレイ、およびこれを作製する方法のさらなる非限定的な例としては、米国特許第５，６３１，７３４号、米国特許第５，５９９，６９５号、米国特許第５，５９３，８３９号、米国特許第５，５７８，８３２号、米国特許第５，５１０，２７０号、米国特許第５，５７１，６３９号、米国特許第６，０５６，９２６号、米国特許第５，４４５，９３４号、および米国特許第５，７０３，２２３号に記載のものが挙げられるがこれらに限定されない。このようなデバイスは、本発明を実施するために、本明細書に記載のように用いることができる。

固体支持体または基板（これからアレイが形成される）は、ケイ素を含む任意の適切な材料から構成され得る。オリゴヌクレオチドは、マイクロアレイ上で、インサイチュで、モノマー（または個々のヌクレオチド）からインサイチュで重合されるか、または成長されてもよい（この場合、アレイ上でのオリゴヌクレオチドの不完全な脱保護、または伸長を検出するのに有用な、保護基を検出するための現在利用可能な技術はない。なぜなら、固体支持体を、分析用デバイスに通過させることができないからである）。またはオリゴヌクレオチドは、別々に重合されて、固体支持体上の適切な領域に結合されてもよい。アレイは、その上の異なる離れた、そして別個の領域に、多数の異なるオリゴヌクレオチドを含んでもよい。例としては、異なる離れた、そして別個の領域における、少なくとも１，０００個、少なくとも２，０００個、少なくとも１０，０００個、または少なくとも２０，０００個の異なるオリゴヌクレオチドが挙げられる。

概して、オリゴヌクレオチドアレイを、そこのオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護、または不十分な伸長についてスクリーニングする方法は、以下のステップを包含する。
（ａ）上記のようなオリゴヌクレオチドアレイを提供するステップと、
（ｂ）上記のような抗体を提供するステップ（すなわち、合成オリゴヌクレオチドに対して共有結合している有機保護基を有する合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合する抗体。この有機保護基が合成オリゴヌクレオチドに対して共有結合されていない場合、この抗体は、この合成オリゴヌクレオチドに結合しない）。好ましくは、この抗体は、保護基が、そのアレイによって実施されるオリゴヌクレオチドの有機合成の経過において使用される場合、この保護基を有するオリゴヌクレオチドに特異的に結合するものである。次に、
（ｃ）この抗体に対してこのオリゴヌクレオチドアレイを接触させて、これによってここにおけるオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護、または不十分な伸長の存在を検出するステップ。このような検出（定性的であっても定量的であってもよい）は、上記のような、任意の適切なイムノアッセイ技術によって実施することができる。

この方法において、ステップ（ｂ）から（ｃ）は、各々の繰り返しの際に異なる抗体を用いて、少なくとも１回繰り返されてもよい。その結果、このアレイ中のオリゴヌクレオチド上に存在し得る複数の異なる保護基が検出され得る。

好ましくは、１つ以上（例えば、複数）の離れた別個の領域におけるオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護（保護基の存在）が一旦検出されれば、この方法は、このアレイ上の少なくとも１つの離れた別個の位置（または複数の離れた別個の位置）におけるオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護、または不十分な伸長の存在を記録する記録または証印（indicia）を作製するステップを、さらに包含する。この証印は、不十分な脱保護（不十分な伸長を含む）の定性的または定量的な証印であってもよい。

前述の方法は、図１１に例示されるような修正可能な（correctable）オリゴヌクレオチドアレイを提供する。このアレイは、組み合わせて、以下を備える。
（ａ）基板３０であって、その上に固定された複数の異なるオリゴヌクレオチドを有し、この異なるオリゴヌクレオチドは、この基板上の異なる離れた別個の位置３１に固定されている基板３０、および
（ｂ）このアレイに関連する複数の証印であって、これらの証印は、複数の異なるオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護、または不十分な伸長の存在を記録し、この異なるオリゴヌクレオチドは、このアレイ上の離れた別個の位置に配置される、証印。これらの証印は、マイクロリソグラフィーのような技術によってアレイ３２の領域にプリントされてもよいし、紙のような従来の媒体上にプリントされてもよいし、アレイとともに運ばれてもよいし、アレイチップに接続されるか、またはアレイチップ上に形成されたメモリーまたはメモリー素子（３２の位置に組み込まれてもよい）に記憶されてもよいし、フロッピーディスケット、またはＣＤ−ＲＯＭのようなコンピューター読み取り可能な媒体に提供され得る別のデータまたはコンピューターファイル中に提供されてもよいし、このアレイの最終ユーザーによってダウンロードされるようにワールドワイドウェブ上のウェブサイトに記憶されてもよいし、その他でもよい。この証印が離れたデータファイルに提供される場合、このアレイは好ましくは、このアレイに接続されるか、または関連して、その上で形成されたコード番号のような識別子をさらに含む（例えば、アレイを含むパッケージ上に、もしくはアレイでパッケージされた情報シート上にプリントされるか、そして／またはこのアレイ上に直接プリントされる）。次いで、この識別子は、別の証印と関連付けられて（例えば、データシート上にプリントされる、コンピューターファイルについてのパスワード、ファイル識別子、および／またはアクセスコードとして用いられる、など）、不十分な脱保護、および／または伸長の記録を含む正確な証印が、このアレイの最終のエンドユーザーによって、このアレイと関連付けられることを確実にすることができる。

このアレイに接続されたデータ装置、またはメモリー素子は、米国特許第５，９２５，５６２号、米国特許第６，０１７，４９６号、米国特許第５，７５１，６２９号、および米国特許第５，７４１，４６２号に記載されるような公知の技術に従って実施することができ、そしてそのような装置を、そこに記載のように用いて、本発明を実施することができる。

このアレイの最終ユーザーは、この方法において、このアレイ上のオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護、または不十分な伸長について補償するために上記の証印を利用することができる。この方法は、以下を包含する。
（ａ）上記のような基板を提供するステップと、
（ｂ）上記のような、アレイと関連する、少なくとも１つの、または複数の証印を提供するステップと、
（ｃ）試験化合物を提供するステップ（この試験化合物は、試験化合物のライブラリーのメンバーであってもよく、タンパク質、ペプチド、またはオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ））のような任意の適切な化合物であってもよい）と、次いで、
（ｄ）この複数の異なるオリゴヌクレオチドの少なくとも１つに対する、この試験化合物の結合（例えば、アレイに対して試験化合物を接触させることによって）を決定するステップと、次いで、
（ｅ）（ｉ）この検出された結合、および（ｉｉ）不十分な脱保護、または不十分な伸長の存在を記録するこの証印から、アレイ上の１つ以上のオリゴヌクレオチドに対する試験化合物の結合の程度（単なる結合の有無を含む）の決定を検出するステップ。このように、アレイ中の１つ以上の位置におけるオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護、または不十分な伸長は、決定ステップの間に補償され得る。このような補償は、（例えば、同じオリゴヌクレオチドを含むアレイの他の離れた別の領域を優先して）アレイ上の特定の離れた別個の領域を無視することを含む任意の手段によって達成できる。別の例では、１つ以上の位置が不十分な脱保護、または伸長を含み、これによってその位置に対する結合が減少する場合、そのアレイを用いた実験から得られる結合データは、そうでなければ記録された証印により可能になったコントロールなく示される結合よりも大きい結合を示す位置について上方に調節されうる。この検出ステップ、または決定ステップは、任意の適切な手段（例えば、結合の程度の色の指標を作成すること、結合の程度の数的な指標を作成すること、結合の程度のグラフ的な、または他の象徴的な指標を作成することなど）によって実施されてもよい。結合の程度は、結合の指標であり得、これは、結合親和性、結合量、または結合親和性および結合量の両方であるが、代表的には、アレイの特定の離れた別個の領域に結合する試験化合物の量の指標である。

１０．抗体マイクロアレイ
本発明は、抗体マイクロアレイ、すなわち基板上に固定された複数のまたは１つの抗体のアレイで形成された「抗体チップ（antibody chip）」を包含する。抗体マイクロアレイ上で用いられる抗体の各々は、上記のように、合成オリゴマー（例えば、合成オリゴヌクレオチド）であって、そこに結合された有機保護基を有する合成オリゴマーに特異的に結合する。このような抗体チップは、合成オリゴマーの不完全な脱保護を検出するために、および／または脱保護された合成オリゴマーから保護された合成オリゴマーを分離するために用いることができる。このような抗体チップはまた、合成オリゴマーの不完全な伸長を検出するために、および／または不完全な合成オリゴマーから全長の合成オリゴマーを分離するために（例えば、保護基が連鎖停止である場合）用いることができる。本発明による抗体チップ、および以下に記載する、それらを用いる方法は、未結合のオリゴマー、または基板（例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイなど）に結合されたオリゴマーのハイスループットアッセイにおいて有用であり得る。

基板（これから、抗体マイクロアレイが形成される）は、例えば、ケイ素、アルミニウム、ガラス、プラスチック、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、アガロースビーズ、またはニトロセルロース、ナイロン、もしくは二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）から形成されるメンブレンを含む任意の適切な材料から構成されてもよい。基板は代表的には、平坦な表面を有する「チップ（chip）」の形態であるが、また、例えば、ビーズ、メンブレン、微粒子、および反応容器の内部表面のような他の代替的構成を含んでもよい。

適切な基板上に抗体を固定する（すなわち、共有結合、非共有結合、または他の方法によって直接または間接的に結合する）適切な方法は、当業者に公知である。抗体マイクロアレイは、高密度の抗体を含む任意の所望される密度（すなわち、面積あたりの抗体のスポット）を有し得る。抗体は、例えば、顕微鏡のスライドガラスに対して抗体を共有結合することによって、基板上に直接固定されてもよい。抗体は、例えば、基板上にプロテインＡ、またはプロテインＧを固定することによって、次いで、プロテインＡまたはプロテインＧとの抗体の相互作用を通じてこの基板上に抗体を固定することによって、基板に直接固定され得る。適切な方法の別の例としては、顕微鏡のスライドガラス上の３次元の親水性ポリマーマトリックス内に抗体を固定するステップが挙げられる。このマトリックス中のカップリング試薬は、この抗体と反応して、このマトリックス内にこの抗体を共有結合させ、かつ固定することができる。基板上に固体を固定するためのさらに別の適切な方法は、例えば、米国特許第５，９５８，３４２号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載される方法のような、ジェット小滴プリント法（jet droplet printing method）によって、基板上に、抗体をプリントまたはスポットするステップを包含する。

以下の参考文献（引用することにより本明細書の一部をなすものとする））はまた、適切な基板上に抗体を固定する適切な方法の例を記載している。ＭａｃＢｅａｔｈ、およびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、「Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ Ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１７６０，８ ２０００年９月；Ｈａａｂ，Ｂ．Ｂ．；Ｄｕｎｈａｍ，Ｍ．Ｊ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，２（２）：ｒｅｓｅａｒｃｈ０００４．１０００４．１２、ならびに米国特許第６，１９７，５９９号。さらに、当業者に公知の他の方法を用いても、適切な基板に対して本明細書に記載の抗体を固定して、本発明による抗体マイクロアレイを形成することができる。

抗体は、基板上の所定の位置に固定してもよい。その結果、所望の場合、この抗体は、その特定の位置によって特定することができる。一旦固定されれば、この抗体は、その結合能力および特性を保持し、そしてこの抗体の可変性領域は、完全に露出されて抗原（例えば、オリゴヌクレオチドであって、それに共有結合した１つ以上の有機保護基を有するオリゴヌクレオチド）と相互作用する。抗体チップの離れた別個の領域（例えば、スポット、または他の幾何学的、もしくは非幾何学的形状）は、同じ、または異なる結合特異性を有する抗体を含んでもよい。このような実施形態において、各々の別個の領域は、好ましくは、抗体を含まない領域によって分離される。代表的には、各々の別個の領域における結合の存在を検出することによって、どの保護基（単数または複数）が、脱保護されないかを決定するために、各々の別個の領域は、同じ結合特異性を有する抗体のみを有する。

本発明の抗体マイクロアレイ上の抗体はまた、基板の上、または基板内のフローチャネル、フローチャンバ、またはウェル中に組み込まれてもよい。その結果、この抗体は、常に、水溶液、または他の適切な溶液中にあり、これによって抗体が変性されないことが保証される。

本発明による抗体マイクロアレイは、合成オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護を検出するために、および／または脱保護された合成オリゴヌクレオチドから保護された合成オリゴヌクレオチドを分離するために用いることができる。本発明による抗体マイクロアレイはまた、合成オリゴヌクレオチドの不完全な伸長を検出するために、および／または不完全な合成オリゴヌクレオチドから全長の合成オリゴヌクレオチドを分離するために用いることができる。抗体マイクロアレイのこのような用途のために種々の実施形態が可能である。

例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ上での使用のために合成される遊離のオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドの合成において使用されるいくつかの、または全ての保護基を有するオリゴヌクレオチドに結合するように設計された、抗体のアレイを含む抗体チップと接触させられてもよい。すなわち、この抗体マイクロアレイは、このオリゴヌクレオチドの合成において用いられた保護基の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは全てに特異的な抗体を含む。完全に脱保護されていないオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチド上に残る保護基に対して結合特異性を有する抗体の１つに結合する。このような方法は、オリゴヌクレオチドアレイの基板上に（例えば、プリント、スポット形成、または他の公知の方法によって）固定されるべき未結合の合成オリゴヌクレオチドの純度を増大する。合成オリゴヌクレオチドの合成において使用される全ての保護基について特異的な抗体を有する抗体マイクロアレイを用い、この方法を用いて、このオリゴヌクレオチドが完全に脱保護されており、かつオリゴヌクレオチドアレイに添加される前に全長であるということを確実にすることができた。このような実施形態の抗体は、基板の表面（平坦、またはその他）に固定されてもよいし、この合成オリゴヌクレオチドが通過することのできるフローチャネルまたはフローチャンバに固定されてもよい。このようなフローチャネルまたはチャンバを用いて、抗体が、変性を防ぐための適切な溶液または緩衝液中にあることを確実にすることが可能であり、そして可能性として、検出または分離方法の処理能力を増大することができる。また、このような抗体チップを用いて、特定の位置での結合の存在の検出によって、抗体マイクロアレイ上の特定の抗体の既知の位置を関連付けることによって、合成オリゴヌクレオチド（単数または複数）中に存在する特定の保護基を決定することができた。

本発明の抗体チップを、完全な、または部分的に完全なオリゴヌクレオチドマイクロアレイと接触させて、その上のオリゴヌクレオチドの不十分な脱保護、および／または伸長を検出することがまた可能であるかもしれない。抗体マイクロアレイは、このオリゴヌクレオチドアレイ中の各々のオリゴヌクレオチドが、適切な抗体、または抗体に供されるように形成することができる。抗体チップを、完全な、または部分的に完全なオリゴヌクレオチドマイクロアレイと接触させた後、適切な検出方法を用いて、このオリゴヌクレオチドマイクロアレイ上に残る任意の保護基の位置を決定し、同定することができた。上記のように、任意の不完全な脱保護／伸長の位置における証印をまた作成することができた。

本発明の１つの態様は、抗体マイクロアレイを用いて合成試験オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護を決定する方法を包含する。この方法は以下のステップを包含する。
（ａ）基板上に固定された複数の抗体を含む抗体マイクロアレイを提供するステップであって、各々の抗体は、合成オリゴヌクレオチドに対して共有結合している有機保護基を有する合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合し、有機保護基が合成オリゴヌクレオチドに共有結合されていない場合、抗体は、合成オリゴヌクレオチドに結合しないステップと、
（ｂ）合成試験オリゴヌクレオチドを、抗体マイクロアレイに結合した抗体に接触させるステップと、
（ｃ）抗体マイクロアレイ上に固定された抗体に対する合成試験オリゴヌクレオチドの結合を検出するステップであって、結合の存在が、合成試験オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護を示すステップ。このような方法は、抗体マイクロアレイからあらゆる未結合の合成オリゴヌクレオチドを除去して、これによってステップ（ｃ）において未結合の合成オリゴヌクレオチドの検出を回避するために、ステップ（ｃ）の前に、必要に応じて分離ステップを含んでもよい。

本発明の別の態様は、有機保護基を用いて調製された合成オリゴヌクレオチド混合物を精製する方法を包含する。この方法は、抗体マイクロアレイを用い、以下のステップを包含する。
（ａ）完全に脱保護された合成オリゴヌクレオチド、部分的に脱保護された合成オリゴヌクレオチド、および／または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドを含む、合成オリゴヌクレオチド混合物を提供するステップであって、この混合物は、少なくとも１つの部分的に、または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドであって、合成オリゴヌクレオチドに共有結合されている保護基を有する合成オリゴヌクレオチドを有するステップと、
（ｂ）基板上に固定された複数の抗体を含む抗体マイクロアレイを提供するステップであって、各々の抗体は、合成オリゴヌクレオチドに共有結合されている有機保護基を有する合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合し、抗体は、有機保護基が合成オリゴヌクレオチドに対して共有結合されていない場合、合成オリゴヌクレオチドに結合せず、複数の抗体は、少なくとも１つの部分的に、または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドに結合され得る少なくとも１つの抗体を含むステップと、
（ｃ）合成オリゴヌクレオチド混合物と、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体とを接触させて、これによって混合物由来の保護された合成オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体の少なくとも１つに結合されるステップであって、ここで合成オリゴヌクレオチド混合物中のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、複数の抗体に結合しないステップと、
（ｄ）抗体マイクロアレイ、および未結合の合成オリゴヌクレオチドを分離して、これによって、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体に結合された、任意の部分的に、および／または完全に保護された合成オリゴヌクレオチド（単数または複数）から、未結合の合成オリゴヌクレオチドを分離するステップ。

本発明のさらに別の態様は、抗体マイクロアレイを用いてオリゴヌクレオチドマイクロアレイを調製する方法を包含する。この方法は、以下のステップを包含する。
（ａ）有機保護基を用いて調製された合成オリゴヌクレオチド混合物を提供するステップであって、混合物は、完全に脱保護された合成オリゴヌクレオチド、部分的に脱保護された合成オリゴヌクレオチド、および／または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドを含み、混合物は、少なくとも１つの部分的に、または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドであって、それに共有結合されている保護基を有する合成オリゴヌクレオチドを有するステップと、
（ｂ）第一の基板上に固定された複数の抗体を含む抗体マイクロアレイを提供するステップであって、各々の抗体は、合成オリゴヌクレオチドに共有結合されている有機保護基を有する合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合し、有機保護基が、合成オリゴヌクレオチドに共有結合されていない場合、抗体は、合成オリゴヌクレオチドに結合せず、複数の抗体は、少なくとも１つの部分的に、または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドに結合され得る少なくとも１つの抗体を含むステップと、
（ｃ）合成オリゴヌクレオチド混合物と、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体とを接触させて、これによって混合物由来の保護された合成オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体の少なくとも１つに結合されるステップであって、ここで合成オリゴヌクレオチド混合物中のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、複数の抗体に結合しないステップと、
（ｄ）抗体マイクロアレイ、および未結合の合成オリゴヌクレオチドを分離して、これによって、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体に結合された、任意の部分的に、および／または完全に保護された合成オリゴヌクレオチド（単数または複数）から、未結合の合成オリゴヌクレオチドを分離するステップと、
（ｅ）第二の基板上に未結合の合成オリゴヌクレオチドを固定して、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを形成するステップ。

本発明の任意の上記の態様において、基板上に固定された複数の抗体は、１つ以上の（例えば、少なくとも２つの）セットの抗体を含んでもよく、抗体の各々のセットが、他のセットとは異なる結合特異性を有する。いくつかの実施形態において、抗体の各々のセットは、基板上の別個の領域に配置されており、この各々の別個の領域は、抗体が固定される、基板上の領域によって分離される。さらに、この抗体マイクロアレイの抗体は、この抗体マイクロアレイの基板内に、または基板上に形成された、フローチャネル、またはフローチャンバに固定されてもよい。

上記のように、抗体マイクロアレイ上に固定された各々の抗体は、合成オリゴヌクレオチドに共有結合されている有機保護基を有する合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合し、この抗体は、この有機保護基が、合成オリゴヌクレオチドに共有結合されていない場合、この合成オリゴヌクレオチドに結合しない。本発明の抗体は、特定の「試薬（reagent）」、または「ベンチマーク（benchmark）」のオリゴヌクレオチドに対するその選択的な結合によってキャラクタリゼーションされ得るが、同じ抗体がまた、種々の他のオリゴヌクレオチド（例えば、より長いか、または短いヌクレオチド）、または同じ保護基を有する他の化合物に結合し得ることが、ここでも注目される。いくつかの実施形態において、各々の抗体は、抗体が特異的に結合する合成オリゴヌクレオチドが、以下の式（Ｉ）、
による、保護されたヌクレオチドを含むという点でキャラクタリゼーションされることがあり、
式中、
Ｒは、Ｈまたは保護基であり、ただしこれは、この保護されたヌクレオチドが、このオリゴヌクレオチドにおける５’末端ヌクレオチドではない場合、Ｒは、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であるという条件下であり、
Ｒ¹は、Ｈまたは保護基であり、ただしこれは、この保護されたヌクレオチドが、このオリゴヌクレオチドにおける３’末端ヌクレオチドではない場合、Ｒ¹は、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であるという条件下であり、
Ｒ²は、Ｈまたは−ＯＲ³であり、
Ｒ³は、Ｈまたは保護基であり、
塩基は、プリン塩基、またはピリミジン塩基であり、
Ｒ⁴は、この塩基のアミノ基上の水素が置換された保護基であり、ただしこれは、Ｒ、Ｒ¹、もしくはＲ³が、保護基である場合、またはこの塩基が、アミノ基を含まない場合、Ｒ⁴が、式（Ｉ）に存在しないという条件下であり、そして
さらにＲ、Ｒ¹、Ｒ³、およびＲ⁴のうち１つだけが、保護基であり、かつＲ、Ｒ¹、Ｒ³、およびＲ⁴のうちその他が、保護基でないという条件下である。

特定の実施形態において、Ｒは、ジメトキシトリチルを含む保護基である。Ｒ¹は、βシアノエチルを含む保護基である。Ｒ²は、−ＯＲ³であり、そしてＲ³は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルを含む保護基である。そしてＲ⁴は、アセチル、ベンゾイル、ジメチルホルムアミジン、イソブチリル、フェノキシアセチル、およびイソプロピル−フェノキシアセチルからなる群より選択される保護基である。他の特定の実施形態において、抗体が選択的に結合するオリゴヌクレオチドは、３〜２０のヌクレオチドからなる。

上記の方法で用いられる合成オリゴヌクレオチド（または合成試験オリゴヌクレオチド）は、検出可能なマーカーを含んでもよい。このような検出可能なマーカーは、放射性標識、ビオチンもしくはアビジンのような結合対のメンバー、緑色蛍光タンパク質のようなフルオロフォア、検出可能な酵素、および／または色素であってもよい。検出可能なマーカーの他の可能性のある例としては、ローダミン、フルオレセイン、ジゴキシン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、およびジニトロフェノール（ＤＮＰ）が挙げられる。さらに、特定の方法に適切な任意の他の検出可能なマーカーを用いることもできる。合成試験オリゴヌクレオチドの不完全な脱保護を検出する方法（または、結合の検出が所望される他の任意の方法）において、抗体マイクロアレイ上に固定された抗体に対する合成試験オリゴヌクレオチドの結合は、合成試験オリゴヌクレオチドの検出可能なマーカーを検出することによって検出され得る。

１１．抗体を用いたオリゴヌクレオチドマイクロアレイの事前含浸（pre-impregnation）
本発明はまた、抗体を含浸させたオリゴヌクレオチドアレイを含む。各々の抗体は、上記のように、合成オリゴマーであって、それに共有結合した有機保護基を有する合成オリゴマーに特異的に結合する。本明細書において用いる場合、「含浸させた（impregnated）」とは、抗体が、オリゴヌクレオチドアレイ上に固定されることを意味し、そして「事前含浸」とは、抗体が、基板上に固定されており、結果としてこの基板がオリゴヌクレオチドのアレイを含むことを意味する。

本発明の態様によれば、抗体は、基板上に、事前含浸され（すなわち、固定されて）、この基板が結果として、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを含む。抗体は、本発明の抗体チップと組み合わせて、例えば、上記の方法のような、当分野で公知の任意の方法によって、基板上に固定されてもよい。

抗体が基板上に固定された後、基板上でのインサイチュの合成によって、またはオリゴヌクレオチドを別々に重合して、次いでこの基板の適切な領域に連結することのいずれかによって、オリゴヌクレオチドアレイをマイクロアレイ上に形成する。

いくつかの応用においては、不十分な脱保護、および／または不十分な伸長の検出が所望されるような時点まで、抗体をカプセル化すること、または１つ以上のブロッキング基を用いて抗体上の結合部位をブロックすることが必要であるかもしれない。このような実施形態においては、このカプセルから抗体を放出すること、またはこの抗体からブロッキング基を除去することによって、所望される場合、抗体は、オリゴヌクレオチドと接触させられ得る。次いで、適切なアッセイを実施して、不完全な脱保護、および／または伸長を決定することができる。

本発明は、以下の限定的なものではない実施例において詳細に説明されている。

［オリゴヌクレオチドの合成］
製造業者のプロトコールに従って、ＡＢＩ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ），モデル３９４（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）上で、合成を実施した。合成の間に、わずかに改変した１マイクロモル規模のサイクルを用いた（製造業者の指示を参照のこと）。最初の出発材料（カッコ内は、供給業者／製造業者）は以下のとおりであった。

アクチベーター（０．４５Ｍのテトラゾール含有アセトニトリル）、ＣＡＰＡ（無水酢酸／テトラヒドロフラン／２，６ルチジン）、ＣＡＰＢ（Ｎ−メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン）、および酸化剤（０．０２Ｍのヨウ素／ピリジン／ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ）（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）
Ｐａｃ−ｄＡ（５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−フェノキシアセチル−２’−デオキシアデノシン，３’−［（２−シアノエチル）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
Ｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ（５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ｐ−イソプロピル−フェノキシアセチル−２’−グアノシン，３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
Ａｃ−ｄＣ（５’−ジメトキシトリチル−アセチル−２’−デオキシシチジン，３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎジイソプロピル）］−ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
ｄｍｆ−Ｇ（５’−ジメトキシトリチル−ジメチルホルムアミジン−グアノシン，２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
Ｂｚ−ｄＣ−−−ＣＰＧビーズ（５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン，３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト−スクシニルリンカー−ビーズ（３０００ Ａｎｇ）（ＣＰＧ Ｉｎｃ．）
Ｉｂｕ−ｄＧ−−−ＣＰＧビーズ（５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−イソブチル−２’−デオキシシチジン，３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト−スクシニルリンカー−ビーズ（３０００ Ａｎｇ）（ＣＰＧ Ｉｎｃ．）

以下の化合物を合成した。この化合物は、以下のようにビーズに連結されている。
Ｐａｃ−ｄＡ−−−Ｐａｃ−ｄＡ−−−Ｂｚ−ｄＣ−−−スクシニルリンカー−−−ビーズ
Ｐａｃ−ｄＡ−−−Ｐａｃ−ｄＡ−−−Ｉｂｕ−ｄＧ−−−スクシニルリンカー−−−ビーズ
Ｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ−−−Ｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ−−−Ｂｚ−ｄＣ−−−スクシニルリンカー−−−ビーズ
Ｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ−−−Ｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ−−−Ｉｂｕ−ｄＧ−−−スクシニルリンカー−−−ビーズ
Ａｃ−ｄＣ−−−Ａｃ−ｄＣ−−−Ｂｚ−ｄＣ−−−スクシニルリンカー−−−ビーズ
Ａｃ−ｄＣ−−−Ａｃ−ｄＣ−−−Ｉｂｕ−ｄＧ−−−スクシニルリンカー−−−ビーズ
ｄｍｆ−Ｇ−−−ｄｍｆ−Ｇ−−−Ｂｚ−ｄＣ−−−スクシニルリンカー−−−ビーズ
ｄｍｆ−Ｇ−−−ｄｍｆ−Ｇ−−−Ｉｂｕ−ｄＧ−−−スクシニルリンカー−−−ビーズ。

以下の実施例２にさらに記載されるとおり、抗体の生成のために、固体支持体からオリゴヌクレオチドを分離することなく、前述の化合物を免疫原として動物に直接投与した。

［動物の接種］
８週〜１２週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡから購入した。このマウスをフィルターキャップ付の容器で飼育した。

オリゴヌクレオチド鎖の合成を実施例１に記載のとおり終了させた後、ビーズを間に挟んでいるガラスプレートを手で圧迫することによって、ヌクレオチドを有するビーズを穏やかに砕いた。

上述の各々の８つのオリゴヌクレオチドの５μＭを４ｍｌのＰＢＳ中で混合した（１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２））。

この混合物を徹底的にボルテックスして、破砕したビーズを懸濁した。ボルテックスした混合物の１５０μＬを採取して、注射器の中の３００μＬのＰＢＳに添加した。注射の直前に、注射器を振盪することによって、ビーズを含有する溶液を、再度混合して、壊れたビーズを懸濁した。次いで、十分に混合した溶液の１５０μＬ、または３００μＬを、マウスの腹膜腔内に注射した。この手順を、１回目の注射、およびその後のブーストについて用いた。

最終回の注射の４日後、公知の技術に従って、動物から脾臓細胞を回収して、ミエローマ細胞（Ｐ３ｘ．６３．Ａｇ８．６５３）と融合してハイブリドーマ細胞株を作成した。次いで、これをスクリーニングして、下記のように結合の特徴を決定して、本発明の所望の抗体を生成する特定の細胞株を単離する。

［抗体のキャラクタリゼーションのためのイムノドットブロットアッセイ］
イムノドットブロットアッセイは、メンブレンペーパー上のオリゴヌクレオチドのＵＶ架橋を包含しており、そして生成物のオリゴマー上の保護基を検出、同定、および定量するための試験キットに直接適用することが可能である。この手順は、以下のように実施してもよい。（ａ）ＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．２；１５０ｍＭのＮａＣｌ）を用いてメンブレンペーパーを濡らす。（ｂ）減圧下で、試験されるべきオリゴヌクレオチドをメンブレンペーパー上にブロットする。（ｃ）メンブレンペーパ上で、ヌクレオチドをＵＶ架橋する。（ｄ）室温で２時間、または４℃で一晩、１％カゼイン−ＴＢＳＴ（ＴＢＳに加えてＴｗｅｅｎ２０，０．１（容積）％）を用いてメンブレンペーパーをブロックする。（ｅ）ＴＢＳＴを用いて３回（各々１５分）メンブレンを洗浄する。（ｆ）試験されるべきサンプル（１％のカゼイン−ＴＢＳＴ中で希釈）を有するプレートの室温で１時間のインキュベーションによって抗原抗体複合体を形成する。（ｇ）上記のように洗浄する。（ｈ）室温で１時間、第二の抗体結合体（１％のカゼイン−ＴＢＳＴ中で希釈）と反応させる。（ｉ）上記のとおり洗浄する。（ｊ）基質溶液とメンブレンのインキュベーションによって色の反応を発現させる。

［モノクローナル抗体１Ｈ１１のドットブロットアッセイ］
上記実施例２に記載のように生成したモノクローナル抗体１Ｈ１１を、上記の実施例３に記載のとおりドットブロットアッセイによってキャラクタリゼーションした。結果を図１において棒グラフとして示す。図１では、レーン（またはカラム）１およびレーン２は、ＮＨ₄ＯＨを用いて、それぞれ６５℃で６時間、および４℃で１５分間処理したオリゴＢｚ−ｄＣ２０マーを表す。カラム３およびカラム４は、ＮＨ₄ＯＨを用いて、それぞれ６５℃で６時間、および４℃で１５分間処理したオリゴＢｚ−ｄＣ２０マーを表す。カラム５およびカラム６は、ＮＨ₄ＯＨを用いて、それぞれ６５℃で６時間、および４℃で１５分間処理したオリゴＡｃ−ｄＣ２０マーを表す。カラム７およびカラム８は、ＮＨ₄ＯＨを用いて、それぞれ６５℃で６時間、および４℃で１５分間処理したオリゴＩｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ２０マーを表す。カラム９およびカラム１０は、ＮＨ₄ＯＨを用いて、それぞれ６５℃で６時間、および４℃で１５分間処理したオリゴＩｂｕ−ｄＧ２０マーを表す。カラム１１、カラム１２およびカラム１３は、それぞれ、ＤＭＴ基のみ、およびシアノエチル基のみを有する、完全に脱保護されたオリゴｄＴ２０マーを表す。抗体の活性は、ＥＬＩＳＡ（以下の実施例７）からの吸光度（４７９ｎｍ）として与えられ、ドットブロットアッセイの陽性の結果、または陰性の結果は、棒グラフ中の各々のカラムの上に表される白丸または黒丸として与えられる。カラム１０におけるオリゴＩｂｕ−ｄＧ２０マーに対する選択的結合におけるモノクローナル抗体１Ｈ１１の活性に注目のこと。

［モノクローナル抗体７Ｈ３のドットブロットアッセイ］
上記の実施例２に記載のように生成したモノクローナル抗体７Ｈ３を、上記の実施例３に記載のように、ドットブロットアッセイによってキャラクタリゼーションした。図２において棒グラフとして結果を示す。図２においては、レーン（またはカラム）１および２は、ＮＨ₄ＯＨを用いて、それぞれ６５℃で６時間、および４℃で１５分間処理したオリゴＰａｃ−ｄＡ２０マーを表す。カラム３およびカラム４は、ＮＨ₄ＯＨを用いて、それぞれ６５℃で６時間、および４℃で１５分間処理したオリゴＢｚ−ｄＣ２０マーを表す。カラム５およびカラム６は、ＮＨ₄ＯＨを用いて、それぞれ６５℃で６時間、および４℃で１５分間処理したオリゴＡｃ−ｄＣ２０マーを表す。カラム７およびカラム８は、ＮＨ₄ＯＨを用いて、それぞれ６５℃で６時間、および４℃で１５分間処理したオリゴＩｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ２０マーを表す。カラム９およびカラム１０は、ＮＨ₄ＯＨを用いて、それぞれ６５℃で６時間、および４℃で１５分間処理したオリゴＩｂｕ−ｄＣ２０マーを表す。カラム１１、カラム１２およびカラム１３は、それぞれ、ＤＭＴ基のみ、およびシアノエチル基のみを有する、完全に脱保護されたオリゴｄＴ２０マーを表す。抗体の活性は、上記のように吸光度として与えられ、ドットブロットアッセイの陽性の結果、または陰性の結果は、棒グラフ中の各々のカラムの上に表される白丸または黒丸として与えられる。カラム４におけるオリゴＢｚ−ｄＣ２０マーに対する選択的結合におけるモノクローナル抗体７Ｈ３の活性に注目のこと。

［抗体キャラクタリゼーションのためのウエスタンブロットアッセイ］
ウエスタンブロットアッセイは、ゲルからメンブレンペーパーへのオリゴヌクレオチドの低電圧の移行、およびメンブレン上のオリゴヌクレオチドのＵＶ架橋を包含する。このアッセイは、以下のように実施してもよい。（ａ）１０ｍＭのＭｇＣｌを含有する１５％の非変性ゲルをキャスティングする。（ｂ）ゲルのウェル中にオリゴヌクレオチド（オリゴマー）をロードする。（ｃ）氷浴中で、２００ボルトでゲルを泳動する。（ｄ）氷浴中で、２５ボルトで２５分間、ゲルからメンブレンペーパーにオリゴヌクレオチドを転写する。（ｅ）メンブレン上で、ポリヌクレオチドをＵＶ架橋する。（ｆ）室温で２時間、または４℃で一晩、１％カゼイン−ＴＢＳＴを用いてメンブレンペーパーをブロックする。（ｇ）ＴＢＳＴを用いて３回（各々１５分）メンブレンを洗浄する。（ｈ）試験されるべきサンプル（１％カゼイン−ＴＢＳＴ中で希釈）を室温で１時間インキュベートする。（ｉ）上記のように洗浄する。（ｊ）室温で１時間、第二の抗体結合体（１％カゼイン−ＴＢＳＴ中で希釈）とメンブレンとをインキュベートさせる。（ｋ）上記のとおり洗浄する。そして、（ｌ）基質溶液とメンブレンのインキュベーションによって発色させる。

［抗原としてビオチン化ポリヌクレオチド、およびストレプトアビジン−ビオチン系を含むＥＬＩＳＡを用いる抗体の検出］
抗体の検出のための酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を以下のとおり実施する。（ａ）ストレプトアビジンを用いて事前にコーティングしているマイクロタイタープレートを予めスクリーニングする。（ｂ）ビオチン化オリゴヌクレオチドの調製物、または試験されるべき他の材料（ＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌ）（ＰＢＳ：１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を用いてプレートをコーティングし、次いで、２時間室温でインキュベートする。（ｃ）ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で０．１％のＴｗｅｅｎを用いて３回（各々１５分間）洗浄する。（ｄ）室温で４時間、または４℃で一晩、ＰＢＳＴに含有される１％のカゼインを用いてブロックする。（ｅ）上記のように洗浄する。（ｆ）室温で１時間、抗体（単数または複数）を用いたプレートのインキュベーションによって抗原抗体複合体を形成する。（ｇ）上記のように洗浄する。（ｈ）室温で１時間、二次抗体ペルオキシダーゼ結合体（１％のカゼインＰＢＳＴ中）と反応させる。（ｉ）上記のように洗浄する。（ｊ）テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（ＴＭＢ溶液：４２ｍＭのＴＭＢ、０．００４％のＨ₂Ｏ₂，０．１Ｍの酢酸緩衝液，ｐＨ５．６）を添加すること、および室温で１５分間インキュベートすることによって色の反応を発現させ、次いで、２ＭのＨ₂ＳＯ₄を用いて反応を停止する。そして（ｋ）４６９ｎｍで吸光度を読み取る。

［ベンゾイル、イソブチリル、およびイソプロピル−フェノキシアセチルに対する、モノクローナル抗体のＥＬＩＳＡおよびドットブロットアッセイ］
上記の実施例２に記載のように生成した、保護基である、ベンゾイル（Ｂｚ）、イソブチリル（ｉｂｕ）、およびイソプロピル−フェノキシアセチル（ｉｐｒ−Ｐａｃ）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、上記の実施例３に記載のような、標準的なＥＬＩＳＡアッセイ，およびドットブロットアッセイによってキャラクタリゼーションした。２０残基のビオチン化核酸（各々、９６ウェルマイクロタイタープレートに結合した）を用いて発色させたＥＬＩＳＡアッセイによって、それらのそれぞれの抗原についての抗体の特異性が実証された。図３Ａ、図４Ａ、および図５Ａは、それぞれ、Ｂｚ、ｉｂｕ、およびｉｐｒ−Ｐａｃに対するモノクローナル抗体の結果を示す。この図は、以下を示す。完全に脱保護された（残留するＢｚ＜１％）ｄＣ残基のホモポリマー（オリゴｄＣ（Ｂｚ）と命名された）（すなわち、Ｂｚでもともと保護された）（レーン１、白抜きのバー）、保護された（残留するＢｚ＞９７％）オリゴＢｚ−ｄＣ（レーン２、影付のバー）、完全に（残留するｉｐｒ−Ｐａｃ＜１％）脱保護されたオリゴｄＧ（ｉｐｒ−Ｐａｃ）（レーン３）、保護された（ｉｐｒ−Ｐａｃ＞７６％）オリゴｉｐｒ−ＰａｃｄＧ（レーン４）、完全に（残留するｉｂｕ＜１％）脱保護されたオリゴｄＧ（ｉｂｕ）（レーン５）、保護された（残留するｉｂｕ＞９１％）オリゴｉｂｕ−ｄＧ（レーン６）、および完全に脱保護されたオリゴｄＴ（レーン７）。ｄＴポリマーは、１つの保護基、ジメチルトリチル（ＤＭＴ）を有するが、これは、弱酸を用いて５’末端残基の５’ＯＨから除去された。最終的に、レーン８は、残留するＤＭＴを有するオリゴｄＴを示す。

抗Ｂｚ ｍＡｂ、抗ｉｂｕ ｍＡｂ、および抗ｉｐｒ−Ｐａｃ ｍＡｂの活性のドットブロットアッセイを実施したが、ここでは２０マーのＤＮＡをＵＶによってニトロセルロースメンブレンに結合した。メンブレンに付与した２０マーのＤＮＡの量は、図３Ｂ、図４Ｂ、および図５Ｂの左側に示しており、これは、アッセイの感度のレベルを実証する。抗Ｂｚ ｍＡｂを試験するために用いたＤＮＡは、ＥＬＩＳＡについて記載したものに加えて、脱保護されたオリゴｄＡ（Ｂｚ）、保護されたオリゴＢｚ−ｄＡ、オリゴｄＣ（ｉｂｕ）、オリゴｉｂｕ−ｄＣ、オリゴｄＡ（ｉｂｕ）、およびオリゴｉｂｕ−ｄＡであった。図３Ｂは、抗Ｂｚ ｍＡｂが、ｄＡおよびｄＣ上の保護基を認識したことを示す。抗ｉｂｕ ｍＡｂを試験するために用いたＤＮＡは、ＥＬＩＳＡについて記載したものに加えて、保護されたオリゴｉｂｕ−ｄＡ、脱保護されたオリゴｄＡ（ｉｂｕ）、オリゴｉｂｕ−ｄＣ、オリゴｄＣ（ｉｂｕ）、およびドットブロットの頂部に注記されたもの全てであった。図４Ｂは、抗ｉｂｕ ｍＡｂが、保護基の最も通常の用途である、ｄＧ上のｉｂｕだけでなく、ｄＡ上のものも認識したことを示す。抗ｉｐｒ−Ｐａｃ ｍＡｂを試験するために用いたＤＮＡは、ＥＬＩＳＡについて記載したものに加えて、保護されたオリゴｉｂｕ−ｄＡ、脱保護されたオリゴｄＡ（ｉｂｕ）、オリゴｉｂｕ−ｄＣ、オリゴｄＣ（ｉｂｕ）、オリゴＢｚ−ｄＡ、オリゴｄＡ（Ｂｚ）、およびドットブロットの頂部に注記されたもの全てであった。図５Ｂは、抗ｉｐｒ−Ｐａｃ ｍＡｂが、保護基の最も通常の用途である、ｄＧ上のｉｐｒ−Ｐａｃだけでなく、ｄＡおよびｄＣ上のものも認識したことを示す。ｍＡｂはまた、ｉｂｕ保護基（ｉｂｕ−ｄＧ、ｉｂｕ−ｄＡ、およびｉｂｕ−ｄＣ）を認識した。この交差反応性によって、抗体が、ｉｐｒ−Ｐａｃ、およびｉｂｕの両方に共通の化学的性質（おそらく、ＣＨ（ＣＨ₃）₂）の同定において高度に選択性であったことが示される。このように、抗ｉｂｕ、および抗ｉｐｒＰａｃ ｍＡｂｓを組み合わせて用いて、オリゴ上に残る保護基を同定することができた。

抗ｉｂｕ ｍＡｂのドットブロットアッセイにおいて、より大量のＤＮＡを試験した（図４Ｃ）。この実験の結果によって、どの核酸塩基が保護されようと、ｉｂｕ保護基は、ｍＡｂによって認識されることが実証された。

図３Ｃ、図４Ｄ、および図５Ｃは、部分的に脱保護されたオリゴマーが、残留する保護基を除去するために再試験され、そしてｍＡｂを用いて再試験され得ることを実証する。図３Ｃは、抗Ｂｚ ｍＡｂが、再度脱保護されたオリゴマーであるオリゴＢｚ−ｄＣ（真ん中のカラム）を認識したことを示す。同様に、図４Ｄは、抗ｉｂｕ ｍＡｂが、再度脱保護されたオリゴマーであるオリゴｉｂｕ−ｄＧ（真ん中のカラム）を認識したことを示し、そして図５Ｃは、抗ｉｐｒ−Ｐａｃ ｍＡｂが、再度脱保護されたオリゴマーである、オリゴｉｐｒ−Ｐａｃ−ｄＧ、およびオリゴｉｂｕ−ｄＧ（それぞれ、左から２番目のカラム、および左から４番目のカラム）を認識したことを示す。このように、このアプローチは、過剰な核酸サンプルを廃棄する必要なく、品質管理に適用することが可能である。

保護基Ｂｚ、ｉｂｕ、およびｉｐｒ−Ｐａｃを有するＲＮＡ標準物を合成して、Ｂｚに対するｍＡｂ（図３Ｄ）、ｉｂｕに対するｍＡｂ（図４Ｅ）、およびｉｐｒ−Ｐａｃに対するｍＡｂ（図５Ｄ）を用いる保護基の同定のためにアッセイした。ドットブロットアッセイによって、モノクローナル抗体は、ＤＮＡとＲＮＡを区別しないことが明確に示される。ＤＮＡよりもＲＮＡによる高いバックグラウンドシグナルがあったが、保護基の有無にかかわらずＲＮＡの間には（特に少量のＲＮＡでは）有意な区別があった。メンブレン上のＲＮＡの量を、サンプルの光学吸収から評価した。

［保護基対ＨＰＬＣのｍＡｂドットブロットアッセイ］
標準化された２０マーのオリゴｄＣ分子上に残るＢｚ基のドットブロット検出を、実施例３に記載のとおり実施した。完全に脱保護されたオリゴｄＣおよび未処理のオリゴｄＣの２０マーを、完全に独立し、かつ異なる定量方法を用いて、Ｂｚ保護基について分析した。２つのオリゴマーを、構成単位のヌクレオシドに加水分解し、次いでそれらのヌクレオシド組成物を、濃縮したサンプルを用いる認知された高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を用いて同定し、かつ定量した。感度が欠けるため、ＨＰＬＣ検出には、ｍＡｂアッセイにおいて用いられるＢｚ−ｄＣの量の５０〜１００培を必要とした（図７を参照のこと）。図６Ａは、保護されたオリゴＢｚ−ｄＣ（右カラム）上のナノモル量のＢｚ基、およびＢｚ−ｄＣ（左カラム）上の同じナノモル量のＢｚに対して試験した抗Ｂｚ ｍＡｂの結果を示す。Ｂｚ−ｄＣオリゴの各々の量を、同じ長さ（２０マー）の完全に脱保護されたｄＣオリゴで希釈して、２５００倍（すなわち、０．０４％）のｄＣの存在でさえ、ｍＡｂ検出の感度を実証した。このｍＡｂアッセイによって、ＤＮＡ中の２５００倍過剰のｄＣの存在下でさえ、ｍＡｂがＤＮＡ上のＢｚ基を検出できたことが実証された。

図６Ａに示されるドットブロットを濃度測定に供して、ｍＡｂ応答を定量した。バックグラウンドの差引き後に、ＨＰＬＣによって決定されたオリゴＢｚ−ｄＣ中のＢｚ基の関数として、残りの密度をプロットした（図６Ｂ）。このデータによって、抗Ｂｚ ｍＡｂ検出の高い感度は、０．１〜１．０ｎｍｏｌの範囲で直線であったことが示された。

次に、ｍＡｂ応答が、ドットブロットメンブレン上のＤＮＡの量の増大とともに増強され得るか否かを決定した。Ｂｚの量は、標準的なＨＰＬＣ法によって決定した。この実験によって、保護されたサンプルと、脱保護されたサンプルとが１／２５００の比である混合物におけるＢｚ保護基の検出は、メンブレン上のＤＮＡの量の増大によって増強することができたが、比は維持されたことが示された（図６Ｃ）。

最終的に、実験を行って、ｍＡｂの直接比較、およびＢｚのＨＰＬＣ検出を示した。ドットブロットアッセイにおいて、抗Ｂｚ ｍＡｂを利用して、オリゴＢｚ−ｄＣ（２０マー）におけるｄＣ上のＢｚを検出した。ｍＡｂアッセイによってＢｚが検出され、濃度測定によって定量されたＢｚ基の密度応答を、各々のドット上のＤＮＡにおけるＢｚの量に対してプロットした（図７Ａ）。ＤＮＡ中のＢｚの量は、大量のＤＮＡの消化、ならびにＢｚ−ｄＣモノヌクレオシドのＨＰＬＣ同定および定量による分析によって較正した。ＨＰＬＣ実験のために、Ｂｚ−ｄＣオリゴの３つのサンプルを加水分解して、ＨＰＬＣによって組成物について解析した。ＵＶ−ダイオードアレイ検出器の応答を、サンプル中のＢｚの量に対してプロットした（図７Ｂ）。既知の量のＢｚ−ｄＣを用いて「スパイクした（spiked）」サンプルに対する比較によって、サンプルの量を決定した。スパイクとしてサンプルに添加したＢｚ−ｄＣの量は、Ｂｚ−ｄＣの秤量したストック由来であった。従って、既知の量のＢｚ−ｄＣを用いてＨＰＬＣ応答を較正した。３つの実験の結果によって、抗Ｂｚ−ｍＡｂによるＢｚの検出は、ピコモル範囲内であったが、ＢｚのＨＰＬＣ検出は、ナノモル範囲に限定されたことが示される。

［市販のサンプル中の残留する保護基の検出］
ｍＡｂによって市販のサンプル中の残留する保護基の検出を実証するために、盲検試験を行った。この実験の目的は、おそらくは完全に脱保護されたサンプル（オリゴ合成産業において通常達成されたように処理されている）において、保護基が、ｍＡｂの技術で検出および同定され得るか否かを決定することであった。８つの選択された会社によって用いられた保護基の性質は未知であった。従って、実験は盲検試験であった。各々８つの会社由来の２つの２０マーのオリゴ（オリゴｄＡ−ｄＣ、およびオリゴｄＧｄＴ）が、できるだけ同一の条件下で、合成および脱保護され、そして塩を除去されるように注文した。オリゴは、よくあるように、速達便で搬送され、次いでドットブロットによるｍＡｂ解析に供された。１つの会社（６番）、および可能性としては第二の（２番）からのｄＡ−ｄＣオリゴは、抗Ｂｚ ｍＡｂ試験によって決定されたとおり、残留するＢｚ保護基を有していた（図８Ａ）。２つの会社からのｄＧ−ｄＴオリゴ（２番、および６番）は、抗ｉｐｒ−Ｐａｃ ｍＡｂによって決定されたとおり、残留するｉｐｒ−Ｐａｃ保護基を有していた（図８Ｂ）。市販のサンプル中の残留する保護基を、漸増する量のサンプル、ならびにさらなる脱保護および再解析によって確認した。２番および６番の会社からのオリゴｄＡ−ｄＣサンプルを、大量に試験して、Ｂｚ保護基の存在を確認した。さらに、サンプルを処理して、標準的なプロトコールを用いて残りの保護基を除去した。さらなる脱保護の後の再解析によって、保護基は現在除去されていることが示された（図８Ｃ）。これによってまた、保護基を除去するために、高価な核酸サンプルが、再処理され得ること、およびそれらは廃棄される必要はないことが実証される。このオリゴｄＧ−ｄＴサンプルを、残りの保護基を除去するために再処理して、抗ｉｐｒ−Ｐａｃ ｍＡｂを用いて再解析したところ、結果として、ｉｐｒ−Ｐａｃ基は、ＤＮＡを犠牲にすることなく除去されることができていた（図８Ｄ）。

［ジメチルトリチルに対するポリクローナル抗体］
５’末端保護基であるジメチルトリチル（ＤＭＴ）に対するポリクローナル抗体の生成および解析は、実施例２に記載のとおりであった。４匹のマウスにＤＭＴを接種して、抗原でのブーストの数週間後にこのマウスから血清を採取した。ＤＭＴ［ＤＭＴ−ＯＨ］、デオキシヌクレオチドトリマーｄ（Ｔ）₃［（ＤＭＴ）₃−ｄ（Ｔ）₃］の５’末端の３つのＤＭＴ、３’−ビオチン［（ＤＭＴ）₃−ｄ（Ｔ）₂₀−ビオチン］を有するデオキシヌクレオチド２０マーｄ（Ｔ）₃の５’末端の３つのＤＭＴ、３’−ビオチン［ＤＭＴ−ｄ（Ｔ）₂₀−ビオチン］を有するデオキシヌクレオチド２０マーｄ（Ｔ）₂₀の５’末端の１つのＤＭＴ、３’−ビオチン［ＤＭＴ−ｄ（Ｔ）₂₀−ビオチン］を有するｄＴ ２０マー、ビオチン［（ＤＭＴ）−ビオチン］を有する１つのＤＭＴ、およびトリス−ボラート生理食塩水コントロールを、ニトロセルロースメンブレンに付与して、次いで、これをマウス血清（接種したマウス１番〜４番、およびコントロール血清、正常）を用いて抗ＤＭＴ抗体をアッセイして、弱酸を用いてＤＭＴ（ＴＢＳ）の存在を明らかにし、そしてアビジンを用いてビオチンの存在を明らかにした（図９）。マウス２番、および４番由来の血清は、ＤＭＴを認識した［（ＤＭＴ）₃−ｄ（Ｔ）₃として］が、マウス１番、３番、および正常なマウス由来の血清は、認識しなかった。弱酸によって、ＤＭＴの存在は、黄色として明らかになり（図では見えない）、アビジンによって、ビオチンの存在が明らかになった。

前述は、本発明の例示であり、その制限として解釈されるべきではない。本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定され、そしてこれには、そこに包含されるべき特許請求の範囲の均等物を伴う。

オリゴＩｂｕ−ｄＧ２０マーに選択的に結合する、モノクローナル抗体１Ｈ１１のドットブロットイムノアッセイである。 オリゴＢｚ−ｄＧ２０マーに選択的に結合する、モノクローナル抗体７Ｈ３のドットブロットイムノアッセイである。 ＥＬＩＳＡ（図３Ａ）、およびドットブロット（図３Ｂ）の結果を示す。これらの結果は、核酸の化学的合成に通常用いられる保護基であるベンゾイル（Ｂｚ）のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性および検出感度を実証している。部分的に脱保護されたオリゴマーであるオリゴＢｚ−ｄＣ（真ん中のカラム）は、残りの保護基を除去するために再処理されて、ｍＡｂで再試験され得る（図３Ｃ）。保護基Ｂｚ、ｉｂｕ、およびｉｐｒ−Ｐａｃを有するＲＮＡ標準物を合成して、Ｂｚに対するｍＡｂを用いて、保護基の同定のためにアッセイした（図３Ｄ）。 ＥＬＩＳＡ（図４Ａ）、およびドットブロット（図４Ｂ）の結果を示す。これらの結果は、核酸の化学的合成に通常用いられる保護基であるイソブチル（ｉｂｕ）のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性および検出感度、ならびにその検出を実証している。大量のＤＮＡを用いるドットブロットアッセイによって、どの核酸塩基が保護されようと、ｉｂｕ保護基は、ｍＡｂによって認識されることが、実証される（図４Ｃ）。部分的に脱保護されたオリゴマーであるオリゴＩｂｕ−ｄＧ（真ん中のカラム）は、残りの保護基を除去するために再処理されて、ｍＡｂで再試験され得る（図４Ｄ）。保護基Ｂｚ、ｉｂｕ、およびｉｐｒ−Ｐａｃを有するＲＮＡ標準物を合成して、ｉｂｕに対するｍＡｂを用いて、保護基の同定のためにアッセイした（図４Ｅ）。 ＥＬＩＳＡ（図５Ａ）、およびドットブロット（図５Ｂ）の結果を示す。これらの結果は、核酸の化学的合成に通常用いられる保護基であるイソプロピル−フェノキシアセチル（ｉｐｒ−Ｐａｃ）のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性および感度、ならびにその検出を実証している。部分的に脱保護されたオリゴマーであるオリゴｉｂｒ−Ｐａｃ−ｄＧ、およびオリゴｉｂｕ−ｄＧ（それぞれ、左から二番目のカラム、および左から４番目のカラム）は、残りの保護基を除去するために再処理されて、ｍＡｂで再試験され得る（図５Ｃ）。保護基Ｂｚ、ｉｂｕ、およびｉｐｒ−Ｐａｃを有するＲＮＡ標準物を合成して、ｉｐｒ−Ｐａｃに対するｍＡｂを用いて、保護基の同定のためにアッセイした（図５Ｄ）。 ＨＰＬＣに関連するような技術の感度および定量化応答を実証する、保護基のｍＡｂドットブロットアッセイを示す。標準化された２０マーのオリゴｄＣ分子上に残るＢｚ基のドットブロット検出を分析して（図６Ａ）、ｍＡｂ応答の定量化（図６Ｂ）を決定した。ｍＡｂ応答を分析したところ、ドットブロットメンブレン上のＤＮＡ量の増大を伴っていた（図６Ｃ）。左側のカラムは、ちょうど、保護されたＢｚ−ｄＣ２０マーである。右側のカラムは、保護されたＢｚ−ｄＣであって、これは２５００倍過剰の完全に脱保護されたオリゴｄＣ（Ｂｚ）を伴う。 それぞれ、ｐｍｏｌの範囲（図７Ａ）、およびｎｍｏｌの範囲（図７Ｂ）での、ｍＡｂの直接比較、およびＢｚのＨＰＬＣ検出を示す。 市販のサンプル中の残留する保護基の検出を実証する盲検を示す。抗Ｂｚ ｍＡｂを用いて、ｄＡ−ｄＣオリゴを分析して（図８Ａ）、抗ｉｐｒ−Ｐａｃ ｍＡｂを用いてｄＧ−ｄＴオリゴを分析した（図８Ｂ）。２番および６番の会社からのオリゴｄＡ−ｄＣサンプルを、大量に試験して、Ｂｚ保護基の存在を確認した（図８Ｃ）。さらに、標準的なプロトコールを用いて、このサンプルを処理して、残留する保護基を除去した。ｉｐｒ−Ｐａｃ保護基についてオリゴｄＧ−ｄＴサンプルをアッセイした（図８Ｄ）。サンプルを再度処理して、残留する保護基を除去して、（図８Ｃ）のように再度分析した。 ５’末端保護基であるジメチルトリチル（ＤＭＴ）に対するポリクローナル抗体の生成および分析を示す。 同じ配列であるが、脱保護の程度が異なる、異なるオリゴヌクレオチド（これを試験標準物として用いて、種々の程度の保護、または脱保護について、同じ配列の同様のオリゴヌクレオチドをスクリーニングすることができる）を担持する基板を示す。 本発明の抗体を用いて、保護基の存在、または不十分な伸長についてスクリーニングすることができる、オリゴヌクレオチドアレイを例示する。

Claims (11)

1. オリゴヌクレオチドマイクロアレイを調製する方法であって、
   （ａ）有機保護基を用いて調製された合成オリゴヌクレオチド混合物を提供するステップであって、該混合物は、完全に脱保護された合成オリゴヌクレオチド、部分的に脱保護された合成オリゴヌクレオチド、および／または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドを含み、該混合物は、少なくとも１つの部分的に、または完全に保護された合成オリゴヌクレオチドであって、それに共有結合された保護基を有する合成オリゴヌクレオチドを有し、
   （ｂ）第一の基板上に固定された複数の抗体を含む抗体マイクロアレイを提供するステップであって、各々の抗体は、合成オリゴヌクレオチドに共有結合されている前記有機保護基を有する合成オリゴヌクレオチドに特異的に結合し、該有機保護基が合成オリゴヌクレオチドに共有結合されていない場合、該抗体は、該合成オリゴヌクレオチドに結合せず、該複数の抗体は、少なくとも１つの部分的に、または完全に前記有機保護基によって保護された合成オリゴヌクレオチドに結合され得る少なくとも１つの抗体を含み、
   （ｃ）該合成オリゴヌクレオチド混合物と、該抗体マイクロアレイ上に固定された該抗体とを接触させて、これによって該混合物由来の該保護された合成オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、該抗体マイクロアレイ上に固定された該抗体の少なくとも１つに結合されるステップであって、ここで該合成オリゴヌクレオチド混合物中の該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、該複数の抗体に結合せず、
   （ｄ）該抗体マイクロアレイ、および該未結合の合成オリゴヌクレオチドを分離して、これによって、該抗体マイクロアレイ上に固定された該抗体に結合された、任意の部分的に、および／または完全に保護された合成オリゴヌクレオチド（単数または複数）から、未結合の合成オリゴヌクレオチドを分離するステップと、
   （ｅ）第二の基板上に該未結合の合成オリゴヌクレオチドを固定して、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを形成するステップと
   を含む方法。
2. 前記基板上に固定された前記複数の抗体が、少なくとも２セットの抗体を含み、各々の抗体のセットが、他のセットとは異なる結合特異性を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗体が特異的に結合する前記合成オリゴヌクレオチドが、以下の式（Ｉ）：
   による、保護されたヌクレオチドを含み、
   式中、
   Ｒは、Ｈまたは保護基であり、ただしこれは、該保護されたヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドにおける５’末端ヌクレオチドではない場合、Ｒは、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であるという条件下であり、
   Ｒ1は、Ｈまたは保護基であり、ただしこれは、該保護されたヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドにおける３’末端ヌクレオチドではない場合、Ｒ1は、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であるという条件下であり、
   Ｒ2は、Ｈまたは−ＯＲ3であり、
   Ｒ3は、Ｈまたは保護基であり、
   塩基は、プリン塩基、またはピリミジン塩基であり、
   Ｒ4は、該塩基のアミノ基上の水素が置換された保護基であり、ただしこれは、Ｒ、Ｒ1、もしくはＲ3が、保護基である場合、または該塩基が、アミノ基を含まない場合、Ｒ4が、式（Ｉ）に存在しないという条件下であり、
   さらにＲ、Ｒ1、Ｒ3、およびＲ4のうち１つだけが、保護基であり、かつＲ、Ｒ1、Ｒ3、およびＲ4のうちその他が、保護基でないという条件下である、請求項１に記載の方法。
4. Ｒ4が、アセチル、ベンゾイル、ジメチルホルムアミジン、イソブチリル、フェノキシアセチル、およびイソプロピル−フェノキシアセチルからなる群より選択される保護基である、請求項３に記載の方法。
5. Ｒが、ジメトキシトリチルを含む保護基である、請求項３に記載の方法。
6. Ｒ1が、βシアノエチルを含む保護基である、請求項３に記載の方法。
7. Ｒ2が、−ＯＲ3であり、そしてＲ3が、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルを含む保護基である、請求項３に記載の方法。
8. 前記基板に固定された前記複数の抗体が、少なくとも２セットの抗体を含み、各々の抗体のセットが、他のセットとは異なる結合特異性を有する、請求項３に記載の方法。
9. 前記抗体が、前記抗体マイクロアレイの前記基板内に、または基板上に形成された、フローチャネル、またはフローチャンバに固定される、請求項１に記載の方法。
10. 前記ステップ（ｃ）が、前記フローチャネルまたはフローチャンバを経て、前記合成オリゴヌクレオチド混合物を流すステップを含み、かつ前記ステップ（ｄ）が、該フローチャネルまたはフローチャンバから、該未結合の合成オリゴヌクレオチドを流出させて、前記抗体マイクロアレイから、該未結合の合成オリゴヌクレオチドを分離させるステップを含む、請求項９に記載の方法。
11. （１）前記抗体が特異的に結合する前記合成オリゴヌクレオチドが、以下の式（Ｉ）：
    による、保護されたヌクレオチドを含み、
    式中、
    Ｒは、Ｈまたは保護基であり、ただしこれは、該保護されたヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドにおける５’末端ヌクレオチドではない場合、Ｒは、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であるという条件下であり、
    Ｒ1は、Ｈまたは保護基であり、ただしこれは、該保護されたヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドにおける３’末端ヌクレオチドではない場合、Ｒ1は、隣接するヌクレオチドに対する共有結合であるという条件下であり、
    Ｒ2は、Ｈまたは−ＯＲ3であり、
    Ｒ3は、Ｈまたは保護基であり、
    塩基は、プリン塩基、またはピリミジン塩基であり、
    Ｒ4は、該塩基のアミノ基上の水素が置換された保護基であり、ただしこれは、Ｒ、Ｒ1、もしくはＲ3が保護基である場合、または該塩基がアミノ基を含まない場合、Ｒ4が、式（Ｉ）に存在しないという条件下であり、
    さらに、Ｒ、Ｒ1、Ｒ3、およびＲ4のうち１つだけが、保護基であり、かつＲ、Ｒ1、Ｒ3、およびＲ4のうちその他が、保護基でないという条件下であり、
    （２）該基板に固定された複数の抗体が、少なくとも２セットの抗体を含み、各々の抗体のセットが、他のセットとは異なる結合特異性を有し、
    （３）該抗体が、前記抗体マイクロアレイの前記基板内に、または基板上に形成されたフローチャネルまたはフローチャンバに固定されており、そして
    （４）前記ステップ（ｃ）が、前記フローチャネルまたはフローチャンバを経て、前記合成オリゴヌクレオチド混合物を流すステップを含み、
    （５）前記ステップ（ｄ）が、該フローチャネルまたはフローチャンバから、前記未結合の合成オリゴヌクレオチドを流出させて、該抗体マイクロアレイから、該未結合の合成オリゴヌクレオチドを分離させるステップを含む、
    請求項１に記載の方法。