JPS62294692A - ヌクレオシド誘導体 - Google Patents

ヌクレオシド誘導体

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JPS62294692A
JPS62294692A JP62085615A JP8561587A JPS62294692A JP S62294692 A JPS62294692 A JP S62294692A JP 62085615 A JP62085615 A JP 62085615A JP 8561587 A JP8561587 A JP 8561587A JP S62294692 A JPS62294692 A JP S62294692A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なヌクレオシド誘導体およびオリゴヌク
レオチドを合成するためのその使用に関するものである
。
さらに詳細には１本発明は、環外ＮＦ２基を有するピリ
ミジンもしくはプリン塩基カ・ら生成されるヌクレオシ
ド誘導体、すなわちアデニン、グアニンもしくはシトシ
ンから生成され、特にオリゴヌクレオチド金合成するた
めに使用しつるヌクレオシドに関するものである。
オリゴヌクレオチドの合成は、燐酸基によりこれらのヌ
クレオシドを互いに結合させてＤＮＡ（デオキシリボ核
酸）鎖もしくはＲＮＡ（ＩＪボ核酸）鎖を生成させるこ
とよりなっている。この結合において、ヌクレオチド間
の燐酸基はまだヌクレオシドの３′位置にＲけるヒドロ
キシル基金他のヌクレオシドの５′位置におけろヒドロ
キシル基と結合している。したがって１合成反応に際し
ヌクレオシドの３末端と５宋掃とのみが作用全受け。
使用する核塩基（プリンもしくはピリミジン）はこの結
合に際し関与してはならない。
これらの１基が環外ＮＨ２基？含む場合、オリゴヌクレ
オチドの合成に際しこれらの基を保膿する必要がある。
何故なら、これらは呑めて反応性が大きいため合成反応
業阻餐し５るかうである。
環外ＮＦ２基のこの保１は次のことを満足せねばならな
い；これは選択性でありかつ実施容易でなければならな
い；これは他のヌクレオシド部位に対する反応性変化を
誘発してはならずρ１つオリゴヌクレオチド合成工程全
体にわたり安定でなければならないちこれは合成された
オリゴヌクレオチドを破壊することなく緩和な条件下で
除去されうるものでなければならない。
ヌクレオシドの環外ＮＩ（２基は特にしばしば、たとえ
ばアデニンおよびシトシンの場合にはベンゾイルもしく
はアニソイル基によりＩ：　ＨｌＳＣ）ＩＡＬＬＰＲ等
、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（１
０６３）、第８５巻、第３８２１〜３８２７員〕或いは
グアニンの場合にはイソブチリル基により［Ｈ，ＢυＣ
Ｈ！および１（、Ｋ］（ＯＲＡＮＡ、ジャーナル・モレ
キュラ・バづオリゴ−（１９７２）、第７２巻、第２５
１〜２８８貞）によりアミドとして保題され゛〔いる。
これらの保庁警基は、推奨されているように合成の終了
時に６０℃の温度にて１７時間にわたる２８％アンモニ
アの作用により除去することができる。しｐしながら、
プロトンのＮＭＲ分析が示すところでは、これらの条件
下においてグアニンのインブチリル基の全部は除去され
ない。したがつて、反応時間ｔ−７２時間まで延長させ
るが６０℃の温度に保つことが好ましい。
保護基を除去するためのこの方法は欠点を有する。何故
なら、使用する条件は、たとえば５．６−シヒドロチミ
ジンの場合のようにアルカリ性媒体中で大して安定でな
い修飾ヌクレオシドについて使用しうろには充分緩和で
ないρ・うである。
さらに、除去するのがより容易であり、特に支持体上で
の合成方法によって不安定なヌクレオシドρ）うオリゴ
ヌクレオチド全合成するために特に使用しうる他のアシ
ル基を用いる可能性についても研究が行なわれており、
この方法は連釦の第１ヌクレオシドを一般にシリカより
なる支持体に固定し１次いでこの第１ヌクレオシドに対
し所望順序で他のヌクレオシド？固定する縮合サイクル
會順次に行なうことからなっている。除去するのがより
容易なアシル基の使用は、より艮好な保鏝解除収支を得
ることを可能にする。この点は極めて宜要である。何故
なら、不完全に保護解除された塩基の存在は、得られる
生成物の使用に対し欠点となるＤｌらである。
したがって、本発明の目的は、容易に除去しうるアシル
型の保護基七有する新規なヌクレオシド誘導体を提供す
るにある。
本発明によるヌクレオシドの誘導体は１式：カーら選択
され、その環外ＮＨ基によってＣＯ基に結合される二価
の基？示し、 Ｒ１は水素原子またはアルキル基を示し。
Ｒ２は水素原子、アルキル基、アルコキシ基およびアリ
ールオキシ基？示し、これらはいずれも未置換またはＮ
Ｏ２，ＣＮ、アルコキシ、アリールオキシ。
アルキルもしくはアリール、ＳＲ（ここでＲはアルキル
もしくはアリール基ケ示す）より成る群から選択される
１個もしくはそれ以上の基により置換され、ｒＳだしＢ
が基（ＩＩ）もしくは（Ｉｌｌ）である場合のＲ’−Ｈ
かつＲ２−ＣＨ３だよびＢが基（ＩＩ）である場合のＲ
−Ｒ−ＣＨ３’に除き、 Ｒ３は水素原子、酸性媒体中において不安定な基または
式： （ここでＲ１およびＲ２は上記の意味ケ■する）の基を
示し。
Ｒ４は水素原子、含燐基または式： （ここでｎ１ｇよびＲ２は上記の意味を有する）の基ｒ
示し。
ＲＩＳは水素原子またはＯＨ基金示す〕に相当する・ たとえば１式（Ｉ）の化合物に？けるＲ’に構成するた
めに使用しつる酸性媒体中にて不安定な基は特にオリゴ
ヌクレオチド合成で使用しう石基であり、たとえば式： 〔式中、Ｒ６，Ｒ７およびＲ８は同一でも異なってもよ
（水素原子、アルキル基もしくはアルコキ基金示す〕 によるトリチル基、たとえばモノメトキシトリチル基ま
たは式（Ｖ）においてＲおよびＲがメトキシ基金示しか
つＲ８が水素ぶ子を示すトリチル基。
並びにビキシル基および９−フェニル−キサンテニル基
である。
たとえば１式（１）の化合物にＨける８４を構成するた
めに使用しうる含燐基もオリゴヌクレオチド台底に使用
しうる基であり、たとえば式：の基、式： の基、ま１こは式： ％式％） のホスホネート基である。
本発明によれば、Ｒが保護されたＯＨ基を示す場合、こ
のＯＨ保護基はリボヌクレオチドの合成に従来使用され
ている基によって構成される。
したがって、本発明によるヌクレオシドの誘導体は、（
１）グアニン、シトシンもしくはアデニンにより構成さ
れる塩基と、　（２）！Ｉボースもしくはデオキシリボ
ースとの結合生成物であり、これらヌクレオシドは少な
くともその塩基の環外Ｎ　Ｒ２基にて式； の基により修飾されている。
さらに、これらはデオキシリボースの３および５位置ま
たはリボースの２．３′および５′位置にて前記の同じ
基において修飾することもでき、或いはリボースもしく
はデオキシリボースの３’−ｊｄヨび５′位置は他の基
によっても修飾することができ。
これらの基はリボースもしくはデオキシリボースの５′
位置については不安定な基Ｒ３でありかつ３′位置につ
いては含燐基Ｒである。
本発明に使用される式； のアシル基は、特にヌクレオチドの合成に対し興味があ
る。何故なら、これらは操作の終了時にたとえば使用す
る基に応じて室温にて２〜８時間のアンモニア処理によ
り容易に除去することができ。
これにより合成されている支持体上のポリヌクレオチド
を支持体法での合成？用いる場合に同時に遊離させうる
かうである。
本発明に使用されろ式： の保護基において、Ｒは水素原子またはアルキル基とす
ることができ　Ｒ２は水素原子、アルキル基。
アルコキシ基またはアリールオキシ基とすることができ
、これらは適宜異なる基によって置換される。
Ｒ１およびＲ２につき使用しうるアルキル基は直鎖もし
くは分枝鎖の基とすることができ、たとえばメチル、エ
チルなどの基である。
Ｒ２につき使用しうるアルコキシ基も直鎖もしくは分枝
鎖の基とすることができる。使用しうるアリールオキシ
基は特にベンゼン、ナフタレンおよびアントラセンρ・
ら誘導される基（たとえばフェノキシ基）とすることが
でき、これらは１個もしくはそれ以上の上記置換基によ
って置換することができる。
本発明によれば環外ＮＨ２基の保護基は、アルカリ処理
に対し所望の耐性？得るため、使用する塩基に応じて選
択される。一般に使用する塩基がグアニンである場合、
Ｒ１は水素原子？示しρ・っＲ２はアルコキシ′！Ｉｓ
−！たは適宜置換されたアリールオキシｌｉ−示す。た
とえば、基Ｒ２はフェノキシ基。
メトキシ基または２−クロルフェノキシ基とすることが
できる。
使用する塩基がアデニンである場合、Ｒは好ましくは水
素原子？示しρ・つＲ２は適宜置換されたアリールオキ
シ基、たとえばフェノキシ基を示す。
塩基がシトシンである場合、基Ｒ１およびＲ２は好まし
くは水素原子またはアルキル基、たとえばメチル基であ
る。
上記保護基の使用により１本発明によりヌクレオシド全
結合させて得られたオリゴヌクレオチドの保藤解除時間
を短縮することか可能になる。何故なら、この時間は以
前に必要とされた１７〜７２時間でな（、使用する基に
応じて僅ρ１２〜８時間としうるρ・うである。さらに
、保護解除は室温で生ずるので緩和な反応条件下で操作
することが可能となり、これに対し従来は６０″Ｇまで
加熱する必要があった。さらに、これらの一層容易に除
去しうる保護基の使用は、オリゴヌクレオチドの合成に
際し、より強力なアルカリ性条件に対し感受性である修
飾された被虐基ｔ−組込み、たとえば抗体に対して感受
性であるリガンド’に！するＤＮＡ断片を合成すること
を可能にする。
本発明はリボースから誘導されたヌクレオシドおよびデ
オキシリボースから誘導されたヌクレオシドに適用され
るが、好ましくはデオキシリボースカ）ら誘導されたヌ
クレオシド、すなわち式（１）に２いてＲか水素原子で
ある誘導体につき使用される。
本発明によるヌクレオシドの誘導体は、ベンゾイルおよ
びアニソイル基ｔアデニンもしくはシトシンに基づ（ヌ
クレオシドへ固定するために使用される方法と同一の常
法によって製造することができる。これらの方法におい
てはグアニン、シトシンもしくはアデニンのヌクレオシ
ドから出発し。
これｔ式： の酸クロライド１には式： の酸無水物と反応させる。
この反応に際し、酸クロライドもしくは無水物はさらに
リボースもしくはデオキシリボースの３および５′位置
におけるヒドロキシル基と反応し。
ρ・（して三重保顕されたヌクレオシド誘導体が得られ
、すなわち式（Ｉ）において、ＲおよびＲの両者が基： な示す誘導体が得られる。しρ・しながら、３′および
５′位置におけるこれらの基は選択的加水分解によって
除去することができ、これは式（１）にＢいてＲ３およ
びＲが水素原子を示すヌクレオシトリ銹導体？得ること
ｔ可能にする。
予め得られたヌクレオシドの誘導体ケ適由な溶媒中で対
応の塩化トリチルと反応させることにより、式（１）に
おいてＲ３が式（Ｖ）のトリチル基。
１ことえばジメトキシトリチル基を示しかつＲが水素原
子ｒ示すヌクレオシドの誘導体を製造することかできる
。
式（［）にだいてＲ”がトリチル基を示しがつＲ４か式
（Ｖｌ）の基または式（’、１１）の基、或いは式：〔
式中、Ｒ、ＲおよびＲは同一でも梁（なってもよくアル
キル基、たとえばエチルである〕の基を示すヌクレオシ
ドの誘導体は１式（１）においてＲ３がトリチル基を示
しβ・つＲ４が水素原子を示すヌクレオシドの誘導体ｔ
Ｊ’ら常法により製造することができる。
几４がたとえば式（■）の基ｒ示す場合、このヌクレオ
シド誘導体を適当な溶媒中で４−クロルフェニルホスホ
リルとストリアシリデートと反応させる。この４−クロ
ルフェニルホスホリルビストリアシリデートは、４−ク
ロルフェニルジクロルホスフェートにジオキサン中のト
リアゾールとトリアゾールアミンとの懸濁物へ岳加して
製造することかできる。
Ｒ４が１ことえば式（■）の基を示す場合、ヌクレ万シ
ト訪導体ｔジインプロピルエチルアミンの存在下で適当
な溶媒中にてβ−シアノエチル−そノクロルーＮ、Ｎ−
ジイソプロピル−アミノホスホルアミダイトと反応させ
ることができる。
Ｒ４がたとえば式： 〔式中　Ｒ１１，Ｒ１２およびＲ１３は同一でも異なっ
てもよくアルキル基である〕 の基？示す場合、このヌクレオシド誘導体’（ｊ２−ク
ロル−（５ｒ　６−ａ　）−ベンゾ−〔１，３−ジオキ
ソ−２−ホスホル−４−イノン〕と反応させ。
次いでたとえば酢酸トリエチルアンモニウムのようなト
リアルキルアンモニウム塩と反応させることができる。
これら３［の方法により得られるヌクレオシドの基であ
る場合にはＨ−ホスホネート合成により。
オリゴヌクレオチドの合成に使用することができる。ま
１こ、オリゴヌクレオチド連鎖の結合には他のヌクレオ
シドたとえばチミジ／および２′−デオキシウリジンに
対応するもの、或いはアルカリ媒体中で不安定な塩基を
有するヌクレオシド、或いはアルカリ媒体中で不安定な
他のヌクレオシドを使用することができる。
オリゴヌクレオチドを合成するための本発明による方法
は。
（１）ヌクレオシド誘導体もしくはオリゴヌクレオチェ Ｃ１ら選択され、その環外ＮＨ２基によりＣＯ基に結合
される二価の基を示し。
Ｒ１は水：／ｇ原子もしくはアルキル基金示し。
Ｒ２は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール
オキシ基を示し、これは未１υ換才たはＮｏ２゜ＣＮ、
アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ２，Ｆ。
アルキルもしくはアリール（これらは未置換であっても
置換されてもよい）、ＳＲ（ここでＲはアルキルもしく
はアリール基を示す）力）も選択される１個もしくはそ
れ以上の基により置換され、ただしＢが基（ＩＩ）もし
くは（Ｉｌｌ）である場合のＲ”−ＨかつＲ２−Ｃ）Ｉ
３：ｇよびＢが基（１１）である場合のＲ−Ｒ−ＣＨ３
に除き。
Ｒ３）工醸性媒体中で不安定な基を示し。
Ｒ４は含燐基を示し。
Ｒ１１は水素原子を示す〕 のヌクレオシド誘導体ｋｍ合させる少なくとも１つの縮
合サイクルと。
（Ｉｆ）式： 〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記の意味ｒ有する〕の保護
基ｔ、たとえばオリゴヌクレオチド七室温にてアンモニ
アと接触させることにより除去する工程と かうなっている。
オリゴヌクレオチド合成は、溶液中での方法或いは支持
体上での合成法のいずれかによって行なうことができる
。好ましくは、支持体上での合成法全使用する。何故な
ら、これは結合に際し収率世失紮生ずることな（より不
安定なヌクレオシド？使用するのに一層適するからであ
る。
１ことえは１本発明によるヌクレオシドはＤＮＡもしく
はＲＮＡ断片の合成に使用される塩基生成物として興味
ある用途を有する。さらに、これらは合成オリゴヌクレ
オチド中へ、特にＤＮＡγ−放射線分解生成物または光
分解生成物に関する不安定な修飾塚基を組み込むにも適
している０本発明によるヌクレオシドにより、さらに抗
ウィルス活性を有する新規な分子および新規なりＮＡプ
ローブｒ得ることも可能になる。
（以下余白） 〔実施例〕 以下、本発明をヌクレオシドの製造および使用に関する
実施例につき説明するが、これらのみに限定されないこ
とは明らかである。
１０８０〜（４ミリモル）の２′−ｒオキシグアノシン
を無水ピリジンの連続添加および蒸発によって乾燥させ
、次いでこれらを２ｒ）ａｔの無水ピリジン中に悪濁さ
せ、次いでこの懸濁物をフラスコ中に導入した。このフ
ラスコを水浴によって冷却し、かつこれへ６当量（４，
２５ｇ；２４ミリモル）のフェノキシアセチルクロライ
ドを０℃にて徐々に添加した。反応を室温にて９０分間
継続させた。
反応媒体中に白色の塩化ピリジニウム沈澱物が生じた一
方、反応媒体は橙色から褐色となった。とれにより三重
保護された出発ヌクレオシド誘導体、す・４わち式（１
）においてＢが式（■）の基を示す誘導体（ｉｆが水素
原子を示し、Ｒがフェノキシ基を示し、ＲおよびＲがフ
ェノキシアセチル基を示しによシ０℃で分解して、反応
媒体を可溶化させた。
次いで、これを１００扉ｌのクロロホルムで希釈した。
クロロホルム相を５Ｑｍｌの５チ重炭酸ナトリウム水溶
液で４回洗浄して生成フェノキシ酢酸を除去した。次い
で、クロロホルム相を硫酸ナトリウムで脱水し、溶剤を
蒸発させかつ橙色残留物を得た。これを１００ｄの０１
まで冷却されたピリジンに溶解させ、次いで１ｏｏｍｔ
の０．２Ｎソーダを０℃にて添加した。かくして、３′
および５′位置の選択的加水分解を２０分間行ガつだ。
次いで、媒体を１００〜２００メツシユ（０，０７４〜
０．１４９、）の粒子寸法を有するピリジニウム型の陽
イオン交換樹脂ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８によって中和
した。樹脂を戸遇しかつ洗浄した後、戸液を蒸発戟固さ
せた。
これに続いて、シリカカラム（直径３ｃｙｎ、高さ１５
ｃｐＲ）でのクロマトグラフィーによジクロロホルム−
メタノール濃度勾配によって溶出させ、生成Ｎ２−フェ
ノキシアセチル−２′−デオキシグアノシンを単離した
。求める生成物を含有する７ラクシヨンの蒸発によ、９
２５０〜のＮ−フェノキシアセチル−２′−デオキシグ
アノシンを回収することができ、これは収率１５％に相
当した。
得られた生成物の同定および純度を２５０　ＭＨｚでの
核磁気共鳴、醋薄層クロマトグラフィーおよび質量分析
器によって監視し、次の結果が得られた：Ｒｆ＝０．３
６汐ロロホルムーフロロホルム−メタノール移動混合物
２０） （Ｍ＋Ｈ）分子ピーク（ｍ／ｓ：４０２−１３％）；フ
ェノキシアセチル化グアニン（ｍ／ｓ　：　２８６−５
１％）。
１０８０１ｖ（４ミリモル）の２′−デオキシグアノシ
ンを実施例１におけると同様に乾燥し、次いで２０５１
／の無水ピリジン中に懸濁させかつ氷水浴中に入れたフ
ラスコに導入した。これに続いて０℃で６当景（５，１
Ｎ；ｚ４４ミリル）の（２−クロルフェノキシ）−アセ
チルクロライドを徐々に添加した。反応を室温にて１５
０分間継続させた。
反応媒体において緑色乃至栗色が出現し、このようにし
て三重保護された出発ヌクレオシド誘導体が生成され、
す々わち式（１）においてＢが式（■）の基を示す誘導
体、す々わちＲ１が水素原子を示し、　Ｒ２が２−クロ
ルフェノキシ基を示し、ＲおよびＲ４が２−クロルフェ
ノキシ−アセチル基を示しかつＲ５が水素原子であるグ
アニン誘導体を生成した。
過剰の酸クロライドを０℃にて２ｍｌの蒸溜水により分
解して、反応媒体を可溶化させた。次いで、これを１０
０１１／のクロロホルムで溶解させ、前記クロロホルム
相と同様に５０ｍ／の５−重炭酸ナトリウム水溶液で４
回洗浄してクロルフェノキシ酢酸を除去した。クロロホ
ルム相を硫酸ナトリウムで脱水し、溶剤を蒸発させかつ
このようにして橙色残留物を得た。この残留物を１００
ｆｆｌ／のピリジン中に溶解し、得られた溶液を氷水浴
中に入れ、かつ０．２Ｎソーダ１００ＪＩ／をこれに加
えて０．ＩＮの滴定値を有する混合物を得、ヌクレオシ
ドの３′および５′位置を選択的に２０分間で加水分解
することができた。次いで、この媒体をピリジニウム型
の実施例１に使用した陽イオン交換樹脂ダウエックス５
０Ｗ−Ｘ８によって中和した。この樹脂を濾過しかつ洗
浄し、次いでＰ液を蒸発乾固させた。これによυＣＮ２
−　（２’−クロルフェノキシ）−アセチルツー２′−
デオキシグアノシンが得られ、これはピリジン中に偽か
可溶性であった。
これをシリカカラム上でのクロマトグラフィーによって
精製し、その際クロロホルム−メタノール濃度勾配を使
用した。かくして、２２０ｍ９の化合物２が単離され、
これは収率１３チに相当した。
この化合物を薄層クロマトグラフィーおよび質量分析器
によって特性化し、次の結果が得られた：Ｒ，＝　０４
ノロロホルム一メタノール移動混合物（容ｆ８０／２０
）中、 （Ｍ＋Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ｅ：４３６−１７％）；
２−クロルフェノキシアセチル化グアニン（ｍ／ｅ：３
２０−４４％）。
生成物の純度は、２５０　ＭＨｚにおける核磁気共鳴で
の分析によって確認した。
５．４ｇ（２０ミリモル）のデオキシグアノシンを乾燥
し、次いで１００Ｎの無水ピリ・シン中に懸濁させた。
０℃まで冷却し、次いで４５当量（１０９；９０ミリモ
ル）のメトキシアセチルクロライドを徐々に添加した。
反応を室温で３時間継続して三重保護された出発化合物
の誘導体、すなわち式（Ｔ）においてＢがグアニンから
誘導された式（ＩＩ）の基を示し、Ｒ１が水素原子を示
し、Ｒ２がメトキシ基を示し、ＲおよびＲがメトキシア
セチル基を示しかつＲ５が水素原子である誘導体を生成
させた。
過剰の酸クロライドをメタノールによυ３０分間分解し
て、低沸点（１２９−１３０℃）を有するメチルメトキ
シアセテートを生成させた。溶剤を蒸発させ、かつ残留
物をクロロホルムで溶解させた。次いで、これを５０％
重炭酸す）ＩＪウム水溶液で洗浄した。りｃ２０ホルム
相を硫酸ナトリウムで脱水し、次いで蒸発させて橙色残
留物を得、これは三重保護された誘導体に相当した。
誘導体をシリカカラムクロマトグラフィー（直径４１、
長さ１０の）によシ精製し、その際クロロホルム−メタ
ノール濃度勾配を使用した。かくして、７ｇの三重保護
された誘導体が回収され、これは収率７３チに相当した
。
次いで、エステル基をトリエチルアミンとぎリグノと水
との混合物（容量で２０：２０：６０）によυ加水分解
した。次いで、溶剤を蒸発させかつＮ２−メトキシアセ
チル−２′−デオキシグアノシン（化合物３）をシラン
化し九シリカカラムにおけるクロマトグラフィーによっ
て精製し、その除水とアセトンとの混合物（７０：　３
０　ｖ／マ）で溶出を行なった。かくして３．４！９の
生成物が得られ、これは収率５１％に相当した。この生
成物を２５０ＭＨｚ　Ｋおける核磁気共鳴および質量分
析器によって検査し１次の結果を得た： （Ｍ−Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ａ　：　３３８−１０％
　）ｓメトキシアセチル化グアニン：　（ｍ／ｅ：２２
２−３１％）。
１０２５＃（４ミリモル）のデオキシアデノシンを乾燥
させ、次いで２Ｑａｌの無水蒸溜ピリジン中に溶解させ
、かつ氷水浴中に入れたフラスコに導入した。これに続
いて、０℃のビリシン２０ｄ中に溶解させた８当景の無
水フェノキシ酢酸（９，４ｇ；３２ミリモル）を徐々に
添加した。ν応を室温にて９０分間継続し、かつ黄色の
着色が徐々に出現した。このよりにして、Ｂがアデニン
から誘た 導さ１（ＩＶ）の基を示し、Ｒ１が水素を示し、Ｒ２が
フェノキ７基を示し、Ｒ５およびＲ４がフェノキシアセ
チル基を示し、かつＲ５が水素原子を示す式（１）のヌ
クレオシド誘導体が生成した。
過剰の酸無水物を次いで０℃にて３ｍｌの蒸溜水を添加
することによシ分解し、次いで反応媒体を１００ＭＩの
クロロホルムで希釈した。クロロホルム相を５Ｑｒｒｃ
ｔの５チ重炭酸ナトリウム水溶液で４回洗浄し、かつ溶
剤を蒸発させて黄色残留物を得た。これを１００Ｎ／の
ピリジン中に溶解し、かつ溶液を氷水浴中に入れた後、
１００１７の０．２Ｎソーダを０℃で添加してアデノシ
ンの３′およヒラ１位置を１５分間選択的に加水分解し
た。次いで、媒体を実施例１に使用したぎりジニウム型
の陽イオン交換樹脂ダウエックス５０Ｗ−Ｎ８で中和し
た。
樹脂を濾過しかつ洗浄し、次いでＦ液を蒸発乾固させた
。
これによ、り　（Ｎ６−フニノキシアセチル）　−２／
　−デオキシアデノシン（化合物４）を得、これをシリ
カカラムクロマトグラフィー（直径４０、長さｌＯα）
によｊＨ１製し、その際クロロホルム−メタノール濃度
勾配（１００−０〜９６−４　）を使用した。
求める生成物を含有するフラクションを次いで蒸発させ
、かつこのようにして１０１０〜の白色粉末を得、これ
は収率６５チに相当した。
次いで、生成物を薄層クロマトグラフィーと２５０　Ｍ
Ｈｚにおけるプロトンの核磁気共鳴と質量分析器とで特
性化した。次の結果が得られた：Ｒｆ：　０．６６．ク
ロロホルム−メタノール移動混合物（容量で８０：２０
）。
２５０　ＭＨｚにおけるプロトンの核磁気共鳴：’Ｈ−
ＮＭＲ（ピリジンｄｓ）　：　２．７−３．３　（ｍ　
、２　Ｈ。
Ｈ２’＋Ｈ２”　）　ｔ　４．１−４．３５　（ｍ　１
２Ｈ＋　Ｈ５Ｈ５’）　：　４６　（”ｂＨ４’　）　
１５．２５　（ｍ　＋Ｈ５’）　）　５．６５　（＠　
＊　２Ｈｒ　ＣＨ２））７、　Ｏ（ｍ　＋　Ｈｌｌ）　
１６．９−７．４　（ｍ　ｒ　５　Ｈ＊　Ｃ６Ｈ３）　
１８．７５および９−０５　（ｓ　＊　Ｈ２およびＨ８
）質量分析：　（Ｍ＋Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ｅ　：　
３８６−１ｃｉ　％　）　ｔアセチル化フェノキシアデ
ニン（ｍ／ａ：２７０−６６係） ４ミリモルのデオキシシチジンを乾燥させ、次いで１５
／の無水ピリジン中に溶解させ、かつ溶液を氷水浴中に
入れたフラスコに導入した。これに続いて６当−’ｆ＃
（２，５＃Ｉｔ；２４ミリモル）のイソブチリルクロラ
イドを徐々に添加した。反応を室温にて１２０分間継続
し、媒体はｔｉ色に変化した。
このようにして三重保護された出発ヌクレオシｒ誘導体
、すなわち式（１）においてＢがシトシンから誘導され
た式（１）の基を示し、Ｒ１およびＲ２がメチル基を示
し、ＲおよびＲがイノブチリル基を示しかりＲ５が水素
原子を示す訪導体が生成した。
過剰の酸クロライドを２ｄの２回蒸溜した水で０℃にて
分解し、かつ反応媒体を１００１ｄのクロロホルムで希
釈した。このクロロホルム相ヲ５０ｘｌの重炭酸ナトリ
ウム５％水溶液で４回洗浄して、精製したイソ酪散を除
去し、硫酸ナトリウムで脱水し、次いで蒸発乾固させた
。これによシ橙色残留物が得られ、これを５ｍｌのＯ″
Ｃまで冷却されたピリジンに溶解した。これに続いて、
１００＃Ｉ／の０．２Ｎソーダを０℃にて添加し、デオ
キシリボースの３′および５′位置におけるエステル基
の選択加水分解反応を３０分間継続させた。これに続い
て、実施例ＩＫ使用したビリゾニウム型のイオン交換樹
脂ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８によシ媒体の中和を行なっ
た。これに続いて、樹脂を涙過しかつ洗浄し、そしてこ
のＰ液を蒸発乾固させた。
ａ製をシリカカラムクロマトグラフィ−（直径４　ｃｍ
、長さ１０ｍ）によって行がい、その際クロロホルム−
メタノール濃度勾配（１００−０〜９５−５）を用いた
。溶剤を蒸発させ、かつこのようにして６３０！ｎ９の
インブチリル−デオキシシチジンにより構成される白色
粉末が得られ、これは収率５０チに相当した。
この生成物を薄層クロマトグラフィーと質量分析器と２
５０　ＭＨｚにおけるプロトンの核磁気共鳴によって特
性化した。次の結果が得られた；Ｒ，：　０１５５、ク
ロロホルム−メタノール移動混合物（８０：２０）、 ｆｆＪ−ｆｆｉ分析（Ｍ＋Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ｅ＝
２９８−１１％）、インブチリル化シトシン（ｍ／・＝
１８２−１００％）、２５０　ＭＨｚにおけるプロトン
の核磁気共鳴：’Ｈ−ＮＭＲ（メタノールａ　４）：　
＋、２（ｒｂつ也にＨ，２（ＣＩ−１０，２，１５−２
，６（ｍ　　、　２Ｈ＊　　Ｈ２］、　Ｈ２Ｎ）　　、
　２．７　　（ｍ　、　Ｈ）　　。
３．７−３−９　（ｍ、２Ｈ＋　１５’＋　Ｈｓ”）　
：　４．０　（ｍ、Ｈ４）　、’　４．４　（ｍ、Ｈ３
１）　；６．２５（ｔ、Ｈ，／）；７．５および８．５
（ｄ、Ｈ５およびｌｌ６）実施例６　：　（Ｎ、−イソ
ブチリル）−５’−（４’。
：・２．５ノミリモルの化合物５を、無水ピリジンの連
続添加および蒸発によって乾燥はせた。これを２５ｒＩ
Ｌｔのピリノンで沼解嘔せ、０℃まで冷却しかつ２．７
５ミリモル（１，１当量）の４．４′−ジメトキシトリ
チルクロライドの２５属ピリノン渚辰（０℃）を添加し
た。反応を５℃にて１７時間継続きせ１次いで２耐のメ
タノールを反応媒体に添加した。３０分間後、溶剤を回
転工／々ポレータによって除去し、かつ油状残留物を１
００ｍ１の酢酸エチルで溶解し、次いで５０ゴの５％Ｎ
　ａ　ＨＣＯ３水溶液で３回洗浄し、かつ５０ｍ１の２
回蒸溜でれた水で１回洗浄し九。次いで有機相を硫酸ナ
トリウムで脱水しかつ濃縮した。シリカグう力ラムでの
分画によシ、得られ悪化合物６を分能し、こｎは式ｆｉ
＋においてＢがシトシンから誘４きれた式（２）の基で
あり、Ｒ１およびＲ２がメチル基であシ、ＢＳが４，４
′−ジメトキシトリチル基であシ、Ｒが水素原子であり
かつＢ　が水素原子である式（１＋の誘導体に相当した
。
この化合物の物理化学的特性および反応収率を第１表に
示す。
製造 実施例６におけると同じ操作法を採用したが、ただし化
合物５の代シに化合物４０２．５τ画ｏＬを使用し、こ
のようにして化合物７　：　（Ｎ、−フェノキクアセチ
ル）−ｓ′−（４，４′−ジメトキシトリチル）−７−
ジオキシアデノシン、すなわち式（ＩｌにおいてＢが式
（財）のアデニンから誘導とれ九基を示し、Ｒ１が水素
原子であり、Ｒ２がフェノキ７基であり、Ｒ３が４，４
′−ジメトキシトリチル基であシ、Ｒが水素原子であり
かつＲが水素原子である化合物が生成された。
化合物の反応収率および物理化学的特性を第（Ｉ）狭に
示す。
実施例６におけると同じ操作法を採用したが、ただし化
合物５０代りに２．５４１７モルの化合物３を使用した
。
これにより式（ＩｌにおいてＢがグアニンから誘導され
た式（Ｉｌｌの基であり、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２
がメトキシ基であシ、Ｒが４，４−ジメトキシトリチル
基であり、Ｒが水素ぶ子でありかつＲ５が水素原子であ
る化合物８を得た。
この化合物の反応収率および物理化学的特性を第１表に
示す、この表において、括弧内の文字は複数のピーク、
すなわち３＝シングレツト、ｄ＝ダプレクト、１＝）リ
グレット、ｑ；クアドラグレットおよびｍ＝マルチグレ
ットを示す。
実施例９：化合物９の製造 この′Ｊ施例ば、？リヌクレオチドのホスホトリエステ
ル合成に使用される化合物８のホスホリル誘導体の製造
を示している。
３ミリモルの化合物８を、無水ピリジン（５１づつ３回
）の添加及び蒸発により乾燥した。残留物’１１５ａ／
のピリジンおよび無水ジオキサン３０罰中の４　＋　５
　ミ！Ｊモルの４−クロルフェニルホスホリルビストリ
アシリデートに溶解させた（４−クロルフェニルホスホ
リルビストリアシリデートは４．５ミリモルの４−クロ
ルフェニルジクロルホスフェートを３０ゴのジオキサン
中における９ミリモルのトリアゾールと９．３５ミリモ
ルのトリエチルアミンとの懸濁物に添加して得た）。反
応を２０分間継続させ、欠いで６尻ｌのＲ２０−）　Ｉ
Ｊエチルアミン九合′？／Ｊ（谷及で１：１）を添加す
ることによ）停止でせ、次いで反応媒体の容積を蒸発に
よ、９５ｄまで濃縮した。これに続いてクロロホルム１
００−に溶解させ、かつ５０１ＬｌのＮ　ａ　ＨＣＯｓ
水浴液で３回洗浄し、次いで１００ゴの水で洗浄した。
クロロホルム相を硫酸ナトリウムで脱水し、次いで蒸発
乾固１せた。求める化合物をシリカｒＡ／クロマトグラ
フィーによって単離した。得られた生成物を次いで劉ト
析器およ識磁気共鳴にかけた。得られた反応収率および
結果を第２表に示す。
このように得られ良化合物９は、式（１）においてＢが
式（［１のグアニンから誘導された基を示し、Ｒ１が水
素原子を示し、Ｒがメトキシ基を示し、Ｒ３が４，４′
−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ４が式□□□の基を
示しかつＲ６が水素原子を示すヌクレオシド誘導体であ
った。
実施例１０：化合物１０の！７！造 この実施例は、化合物７のホスホトリエステル合成に関
するホスホリル誘導体を製造するための実施例９と同様
な操作手順を採用し、その際２．５ミリモルの化合物８
０代りに２．５ミリモルの化合物７を使用した。これに
よシ化合物工０が得られ、これは式（１）においてＢが
アデニンから誘導された式Ｗ）の基を示し、Ｒ１が水素
原子を示し、Ｒ２がフェノキシ基を示し、Ｒ３が４．４
′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ４が式（９）の基
を示しかつＲ５が水素原子を示す誘導体に相当する。
上記したように、得られた化合物の特性を質量分析器お
よび核磁気共鳴によって決定し、得られた結果および反
応収率を第２表に示す。
（以下余白） 実施例１１：化合物１１の製造 この実施例においては、実施例９の操作手用を採用して
、ホスホトリエステル合成につき使用した化合物６のホ
スホリル誘導体を製造し、その際３ミリモルの化合物８
の代シに３ミリモルの化合物６を使用した。
これによシ式（１）の化合物１１が得られ、ここでＢは
シトシンから誘導される式［有］の基を示し、Ｒ１およ
びＲはメチル基を示し、Ｒは４ｊ４′−ジメト　・キシ
トリチル基を示し、Ｒａ式（Ｍ）の基を示しかつＲは水
素原子を示す。
実施例９および１０におけると同様に、得られた生成物
を質量分析器法および核磁気共鳴によって検査した。得
られた反応収率および結果を第２表に示す。
実施例１２：化合物１２の製造 この実施例においては、オリゴヌクレオチドホスホルア
ミダイド合成につき使用した化合物８のホスホリル誘導
体を製造した。３ミリモルの化合物８をピリジン、トル
エンおよびテトラヒドロフラン（ＴＨＪ→を一緒に蒸発
させて乾燥した。残留物を１２ミリ七ルのＮ、Ｎ、Ｎ−
ジイソプロピルエチルアミンの存在下で１５ｍ１のＴＨ
Ｆに溶解させ、かつこれに続いて６ミリモルのβ−シア
ンエチル−モノクロル−Ｎ、Ｎ−ゾイソデロピルアミノ
ホスホルアミグイトを２分間かけて滴加した。５分間の
反応の後、このアミンの塩酸塩沈澱物が生成した。反応
を３５分分間性させかつ沈澱物を反応の終了時点でＦ遇
した。次いで、ｐ液を蒸発乾固させ、１５０Ｍの酢酸エ
チルに溶解させた。１０％のＮａ　２　ＣＯ３を含有す
ゐ氷冷した水溶液で洗浄を行なった。次いで、有機相を
硫醗ナトリウムで洗浄し、かつ蒸発乾固させた。
祷られた化合物を寸法ＢのメルクｒＬＯＢＡＲＪカラム
での低圧クロマトグラフィーによって精製し、その際Ｃ
Ｈ２ＣＬ２−ヘキサン−）　ＩＪエチルアミン（容量で
７０：２０：１０）の混合物を溶出剤として使用した。
得られた化合物を最小量のジクロルメタンまたは酢酸エ
チルで溶解させ、かつ−８０℃にてヘキサン中で沈澱さ
せた。この生成物を核磁気共鳴により分析した。得られ
次結果および反応収率を第３表に示す。
これによ）式（１）に相当する化合物１２が得られ、こ
こでＢ＃ｉグアニンから誘導された式（Ｊｌ）の基を示
し、Ｒは水素原子を示し、Ｒはメトキシ基を示し、Ｒは
４，４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ４は式（■
）の基を示しかつＲ５は水素原子を示す。
実施例１３：化合物１３の製造 実施例１２におけると同様に、３ミリモルの化合物８の
代シに３ミリモルの化合物７を用いて化合物７のホスホ
リル誘導体を作成しかつこれをホスホルアミメイト合成
に使用することができる。
さらに、得られた化合物につき核磁気共鳴によって分析
を行なった。反応の収率および結果を第３表に示す。
これによシ化合物１３が得られ、この化合物は式（１）
においてＢがアデニンから誘導され丸穴（ＩＶ）の基で
あり、Ｒが水素原子であり、Ｒがフェノキシ基であり、
Ｒが４．４′−ジメトキシトリチル基であり、Ｒ４が式
（■の基であシかつＲ５が水素原子である化合物に相当
する。
実施例１４：化合物１４の製造 実施例１２におけると同様ＶＣ３１モルの化合物８０代
シに３ミリモルの化合物６を用いて化合物６のホスホリ
ル誌導体を作成し、これはホスホルアミダイド合成に使
用することを目的とした。さらに得られた化合物を核磁
気共鳴により分析した。
反応収率および得られた結果を第３表に示す。
これによシ化合物１４が得られ、これは式（１）におい
てＢがシトシンから誘導された式（ト）の基を示し、Ｒ
１およびＲ２がメチル基を示し、Ｒ３が４，４′−ジメ
トキシトリチル基を示し、Ｒ４が式（Ｗ）の基を示しか
つＲ５が水素原子を示す化合物に相当する。
実施例６におけると同じ操作子ｊ＠を採用したが、化合
物５の代シに４ミリモルの化合物１を使用し、このよう
にして化合物１５を製造し、すなわちこの化合物は式（
１）においてＢが式（１０のグアニンから誘導された基
であシ、Ｒが水素原子であり、Ｒ２がフェノキシ基であ
り、Ｒが４．４′−ジメトキシトリチル基であり、Ｒ４
が水素原子でありかつＲ５が水素原子である化合物に相
当する。
反応収率は７０％であった。クロロホルム：メタノール
混合物（９０：１０）におけるこの化合物のＲｆ＃ｉ０
．４０であった。重水素化メタノールにおけるこの分子
の主プロトンの化学配位は次の数値を有した： Ｈ８：８．０７騨、Ｈｒ：ｓ、４ｓ卿（ｔ）、　Ｈ３’
：　４．７５〜．Ｈｌｌ、゛ ジメトキシトリチルのＪｔ’　　ＣＨｓ　：　３．８６
−（ｍ）　＊　Ｈ−７１、エノキシアセチルのｌ　　Ｃ
Ｈ２：　５．０５　ｍｓ）実施例１６：化合物１６の製
造 実施例１２におけると同様に３ミリモルの化合物８の代
シに３ミリモルの化合物１５を用いて化合物１５のオス
ホリル訪導体を作成し、これはホスホルアミダイド合成
につき使用する。最終生成物の収率は５０％であった。
この化合物は重水素化ピリジンにおいて１４６および１
４６．２１１−に位置する３１Ｐの罵タブレットを％徴
とする。重水素化アセトニトリルにおけるプロトンの主
ｍビークは、８．１２１１１１１（ｓ　、Ｈ８）１６．
４５ｐｆ”（ｔ、Ｈｌ）＋５−０５ｐＩｍ（ｓ　＊　Ｃ
Ｈ２フェノキシアセチル）および４．８８ｐｐ（ｍ　、
　Ｈ３’）に位置した。
ＦＡＢイオン源を用いるＡｔ分析器により、この生成物
の分子ピークにつき９０３のルへの数値を観察すること
ができた。
これによ）化合物１６が得られ、これは式−（１）にお
いてＢが式（ｎ）のグアニンから誘導された基であり、
Ｒ１が水素原子であシ、Ｒ２がフェノキシ基であり、Ｒ
３が４，４′−ジメトキシトリチル基であり、Ｒ４が式
−（Ｖｌ）の含燐基でありかつＲ５が水素原子である化
合物に相当する。
以下の実施例１７〜１９は、Ｈ−ホスホネート法によっ
てオリゴヌクレオチドを合成するために使用する完全保
護されたモノヌクレオチドの製造を示している。
オリゴ０ヌクレオチドを合成するための化合物１７を、
Ｈ−ホスホネート法によシ作成した。５ミリモルの化合
物７を５ｍ／の無水ジオサンと一緒に蒸発させて乾燥し
、かつこれを１５ｍ／の前記溶媒と５ｒｒＬｌの無水ピ
リジンとに溶解させた。これに続いて、５ｍｉの１．２
５Ｍ２−クロル−（５，６−ａ）−ベンゾ−〔１，３−
ジオキソ−２−ホスホル−４−イノン〕または式：のサ
リチルクロルホスファイトを添加し、かつ反応を室温に
て１０分間継続させた。
これに統すて、０．５ゴの水を添加しかつ加水分解を１
０分チロせしめた。次いで、この混合物を２５０−の１
モル酢酸）！Ｊエチルアンモニウム水溶液に注ぎ入れ、
かつ所望生成物を２５０ゴのクロロホルムで２回抽出し
友。有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、かつ回転エ
バポレータで濃縮した。このように得られ九残留物を、
シリカゲルカラム（２００Ｘ４０簡）上での高性能液体
クロマトグラフィーによって精製した。この生成物をク
ロロホルムにおける２％トリエチルアミン混合物中でメ
タノール濃度を増大させた溶液（０％メタノール：２５
０ゴ：１％メタノール：　２５０ｄ：２％メタノール：
２ｓｏｄ：ａ％メタノール：２５０ｄ：５％メタノール
：２５０ｒＩＬｌニア％メタノール：５ｏｏｙ）で溶出
させた。求める生成物を含有するフラクションを集め、
かつ溶剤を蒸発させて生成物を白色フオームとして得た
。化合物１７の収率は５５％であつ７’ｈ、この化合物
を核磁気共鳴により分析し、か′）得られた結果を第（
Ａ／）表に示す。
これによシ化合物１７が得られ、これはＢがアデニンか
ら誘導された式ＣＮ）の基を示し、Ｒ１が水素原子を示
し、Ｒ２がフェノキシ基を示し、Ｒ３が４，４′−ジメ
トキシトリチル基を示し、Ｒ４が式： の含燐基を示しかつＲ５が水素原子を示す式（１）に相
当する。
実施例１８：化合物工８の製造 実施例１７におけると同様に５ミリモルの化合物７０代
シに５ミリモルの化合物１５を用いたＨ−ホスホネート
法によシ化合物１５のホスホリル誘導体を作成し、これ
はオリゴヌクレオチド合成を目的とする。反応収率は４
８チであシ、かっ得られた生成物を核磁気共鳴によって
分析した。得られた結果を第（■）表に示す。
これによう化合物１８が得られ、これはＢがグアニンか
ら誘導された式（ＩＩ）の基を示し、Ｒ１が水素原子を
示し、Ｒ２がフェノキシ基を示し、Ｒ３が４．４′−ジ
メトキシトリチル基を示し、Ｒ４が式：％式％） の含燐基を示しかつＲ５が水素原子を示す式（１）に相
当する。
実施例１９：化合物１９の製造 実施例１７におけると同様に５ミリモルの化合物７の代
シに５ミリモルの化合物５を使用してＨ−ホスホネート
法により化合物５のホスホリル誘導体を作成し、これを
オリゴヌクレオチドを合成するために使用した。反応収
率は６２％であシ、かつ得られた生成物を核磁気共鳴に
よって分解した。得られた結果を第（ＩＶ）表に示す。
これＫよシ化合物１９が得られ、これはＢがシトシンか
ら誘導された式（ＩＩＩ）の基を示し、Ｒ１およびＲ２
がメチル基を示し、Ｒ３が４　、４’−ジメトキシトリ
チル基を示し、Ｒ４が式： ％式％） の含燐基を示しかつＲ５が水素原子を示す式（１）に相
当する。
実施例２０ この実施例は次の配列： ｄ（ＡＡＴＴＣＡＧＡＴＵＴＧＡＴＣＡＴ）ＡＧＲＥ−
ＡＧＲＥを有するオリゴヌクレオチドを合成するための
化合物９，１０および１１を示している。この配列にお
いて、Ａはアデニンを用いて生成されたヌクレオチドを
示し、Ｃはシトシンを用いて生成されたヌクレオチドを
示し、かつＧはグアニンを用いて生成されたヌクレオチ
ドであシ、Ｔはチミンを用いて生成されたヌクレオチド
であシかつＵはウラシルを用いて生成されたヌクレオチ
ドを示す。
この合成を行なうため、それぞれグアニン、アデニンお
よびシトシンに対応する化合物９．１０および１１並び
にチミンおよびつ２シルに対応するものを使用した。後
者は、それぞれ実施例６〜１１におけると同じ操作手順
を用いて４．４′−ジメトキシトリチル基および式（Ｍ
）の基によシ夫々５′および３′位置におけるヒドロキ
シル基を保護することによシ対応のヌクレオシドから得
た。
合成は、連鎖の５′末端を含む５０１９（すなわち約１
．５〜３モル）の支持体（ピアス（ｐｌｅｒｃ・）社の
「調節気孔ガラス」）と、１縮合サイクル当９２５ダの
実施例９〜１１で得られたヌクレオシド誘導体と、約８
〜１５当量を示すチミジンおよびτ−デオキシウリジン
対応物（ｓｙｎｔｈｏｎ）と、１縮合サイクル当、９２
５１１Ｆ（すなわちヌクレオシドに対し２当量）のメシ
チレンスルホニルクロライドによりｍ成される活性剤と
を用いて、ノ々イオサーチ（Ｂｌｏｔ＠ａｒｅｈ）　５
Ａｋｌ　ＯＮＢオートマトン（ａｕｔ。
ｍａｔｏｎ）により行なった。
各縮合サイクルは以下の工程を採る。
脱トリチル化：　ｃＨ２ｃｚ２における２チドリクロル
酢酸、２分間； 洗浄：　ＣＨ，ＣＮ、　１分間； 乾燥：無水ＣＨ，ＣＮ、　６分間； 縮合：　ＣＨ，ＣＮ／１−メチルイミダゾール混合物（
容量で８５：１５）におけるモノマーヌクレオシド誘導
体およびメシチレンスルホニルクロ２イド、１５分間；
及び 洗浄：　０Ｍ５ＣＮ、６分間。
かくして、これら縮合サイクルの後に、共有結合したオ
リゴヌクレオチドを含有するシリカゲルが得られた。こ
れを全てパイレックス７ラスーに移し、次いで２８チア
ンモニアを添加しかつ室温にて８時間放置した。このよ
うにして、オリゴヌクレオチドを支持体から遊離させ、
その際本発明の目的を構成する保護基を除去した。
（以下余白） 次いで、上澄液を除去しかつシリカ全１　ｒｎｔの２回
蒸溜された水で３回洗浄した。溶剤を蒸発させ、かつ残
留物ｉ　０．５１ｎｌの水に溶解し、次いでセファデッ
クスＧ２５カラム（Ｅ［径１傭、高さ７　ｃｍ　）にて
分画した。２５４　ｎｍにて紫外光の吸収を示すフラク
ションを集め、かつ凍結乾燥した。
Ｔ４−ポリヌクレオチド９キナーゼを用いる燐３２の標
識によりかつポリアクリルアミド０グル上での電気泳動
くよシ、得られた充分な長さの合成りＮＡ断片を検査し
た。対応するストリップ全切断しかつ化合物全浴出させ
、生物学的用途を目的として化合物を生成することがで
きる。
同様にして、欠の配列を有するオリゴヌクレオチドの製
造を行なったニ ー　ｄ（ＡＡＴＴＣＡＧＡＵＣＴＧＡＴＣＡＴ）　。
−ｄ　（ＡＡＴＴＣＡＧＵＴＣＴＧＡＴＣＡＴ　）　。
−ｄ（ＡＡＴＴＣＡＵＡＴＣＴＧＡＴＣＡＴ）　、およ
び−ｄ　（ＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧ　）　。
ここでも、良好な結果が得られると共に、常温にてアン
モニア中で緩和な東件下において保護基が除去された。
実施例２１ この実施例において１獣ホスホルアミダイト合成を用い
て長さ１５ヌクレオチドの単独重合体を合成するため化
合物１２．１３および１４を使用した。
合成を実施例２０におけると同じバイオサーチＳＡＭ　
ＯＮＫオートマトンを用いて行ない、かつ次の試薬量ヲ
用いた：ポリヌクレオチド連鎖の末端３′に含む実施例
１５で使用した５０Ｉ（すなわち１．５〜３モル）の支
持体； １組合サイクル当り２０ダの化合物１２．１３もしくは
１４（２０〜２５当重）：およびｌサイクル当９１５ダ
（ヌクレオチドに対し２当ｔ）の５−パラニトロフェニ
ルテトラゾールによＦ）構成される活性剤。
各縮合サイクルは次の工程で構成したニジ 脱トリチル化：　ＣＨ２Ｃｌ２における２饅トリクロ酢
酸、９０秒； 洗浄二〇Ｈ，ＣＮ、　　１分間； 乾燥：Ｓ水ＣＨ３ＣＮ　：無水ツメチルホルムアミド（
９０：１０）、３分間； 縮合：　ＣＨｙ’ＣＮ　ニジメチルホルムアミド混合物
（９０：　１０）におけるヌクレオシド誘導体＋活性剤
、３分間； 酸化：テトラヒドロフラン：水：ルチジン（８９，５：
１０：Ｏ，■における０、４５優沃累、１分間；不完全
連鎖の延長を停止させるべく、反応しなかつ次ヒドロキ
シル基の遮蔽。無水ＣＨ３ＣＮにおける無水酢酸と１−
メチルイきダンールとの混合物、２分間： 洗浄：　ＣＨ，ＣＮ　、３分間。
同じ化合物（化合物１２．１３もしくは１４）を用いて
行なった１４回の縮合サイクルの後、合成された生成物
を冨む支持体を７９イレツクスフラスコに移し、かつ２
ｍｌの２８％アンモニアを添加した。フラスコを室温に
て８時間保ち、これにより本発明の目的に！成する保農
基を除去することがでさた。
次いで、上肋ｌ夜を浴解し、かつシリカを１ｍｌの２回
蒸溜された水で３回洗浄し、次いで溶剤を回転エバポレ
ータで排除した。粗製残留物を０．５ｍｊの水に溶解さ
せ、これ七セファデックスＧ２５ｆｆル上でのクロマト
グラフィーによって精製した。
２５４　ｎｍにて吸光するクラクションを集め、そのａ
’ｆＴｉｔｋＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによるｆ
＃３２標識の後にポリアクリルアミドゲル上でのば気泳
動によって分析した。
かくして、３■の合成された単独重合体は所望憂さを有
し、かつこれらはそれぞれｄ（Ａ１５）＋ｄ（Ｃ１５）
およびｄ（Ｇ１５）に対応することを確認することかで
さた。
実施例２２：Ｈ−ホスホネート法によるオリゴヌこの実
施例は、次の配列： ５’　ｄ　（ＡＴＧＡＴＣＴＡＣＴ　）　３’を有する
オリゴヌクレオチド全合成するための化合物１７．１８
お工び１９の便用上水している。
この配列においてＡ、Ｇ、ＣおよびＴは実施例２０の配
列におけると同じヌクレオチド全示す。
結合を行なうため化合物１７．１８および１９トンとし
て使用した。後者は５′礪能を４，４′−ジメトキシト
リチル基で保腹しかつ３′・臓能全式：％式％） の含燐基で採掘することによりチミジンから得られ、そ
の際アデニンのＨ−ホスネート誘導体につき前記したと
同じ操作子ｊ臓を用いた。
結合はバイオサーチＳＡＭ　ＯＮＥオートマトン’ｌい
て行ない、その際次のものを使用した：４，４′−ジメ
トキシトリチル基により５′位置が保護され九１μモル
のチミゾンでグラフトされた支持体からなる、設計者に
より予備状態調節されたカラム； ｌ縮合サイクル当り８Ｉｎ９のヌクレオシド誘導体１７
゜１８および工９韮びに約１０モル当債の対応するチミ
ノン誘導体および ｌ縮合サイクル当９６μ！、すなわち５０モル当量の活
性剤として使用されるトリメチルアセチルクロライド。
各縮合サイクルの工程は次の通りでろる：ジクロルメタ
ン３ｄ中の２俤トリクロル酢酸、１分間； アセトニトリルによる洗浄、３ゴ； ピリジン：アセトニトリル混合物１：１．すなわち３Ｍ
による乾燥； 縮合二ピリノンーアセトニトリル混合物２ゴにおけるヌ
クレオシド５誘導体および活性剤、１分間；３ゴのピリ
ノンルアセトニトリル混合物による洗浄； ３１Ｌｌのアセトニトリルによる洗浄。
縮合サイクルが終了した後、２％沃素溶液をピリジン：
水混合物９８：２（３ｍＡ）中へ通すことによｐ１ヌク
レオチｒ間の燐酸化音生せしめた。
これに続いて、ピリジンとアセトニトリルとの混合物（
５ｄ）およびアセトニトリル（３ν）で洗浄し、次いで
上記とＰＪ様に脱トリチル化した。
これにより、共有結合したポリヌクレオチドからなるシ
リカグルが得られた。これを全てパイレックスフラスコ
に移し、２ＩＬｌの２８優アンモニアを添加し、かつ常
ｆ！にて２時間放置した。かくしてオリゴヌクレオチド
が支持体から遊離され、その間本発明の目的全構成する
保護基金除去した。
次いで、上溌漱を溶解させ、シリカをｌ　ｎＵの２回蒸
溜し次水で３回洗浄し、溶剤を蒸発させかつ残留物を０
．５ｒｌＬｌの水で溶解させた。これに続いて、セファ
デックスＧ２５カラム（＠径１ｃｒ１１、高さ７ｃｌＩ
＠）での分画を行ない、次いで２５４　ｎｍにて紫外光
の吸収金有する７ラクシヨン金合し、かつこれを凍結乾
燥した。
合成され次生成物の正確な長さを放射性燐３２標識によ
って検食し、その際Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼを
使用し、次いでポリアクリルアミドダルでの電気泳動に
かけた。
（′以下余白ン 俤 ４０　　　ｗ　　　　　　　Ｆ−■ 関　　　　　　　　　　−１ 化合物扁９ ０＝Ｐ−０−［（Ｃ２Ｈ５）３ＮＨＩ”区 ０Ｃ６Ｈ４Ｃｔ 化合物Ａ１０ ０Ｃ６Ｈ４Ｃｔ 化合物Ａｌｌ 化合物４１２ 化合物４１３ 化合物ＡＩ４ 化合物Ｓ１７ 化合物ム１３ 化合物ム／ソ

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中、Ｂは式： ▲数式、化学式、表等があります▼（II）；▲数式、化
    学式、表等があります▼（III）もしくは ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） から選択され、その環外ＮＨ基によつてＣＯ基に結合さ
    れる二価の基を示し、 Ｒ＾１は水素原子またはアルキル基を示し、Ｒ＾２は水
    素原子、アルキル基、アルコキシ基およびアリールオキ
    シ基を示し、これらはいずれも未置換またはＮＯ＿２、
    ＣＮ、アルコキシ、アリールオキシ、Ｃｌ、Ｆ、▲数式
    、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等が
    あります▼、ＳＯ＿２Ｒ、▲数式、化学式、表等があり
    ます▼、▲数式、化学式、表等があります▼、置換され
    ていてもいなくてもよいアルキルもしくはアリール、Ｓ
    Ｒ（ここでＲはアルキルもしくはアリール基を示す）よ
    り成る群から選択される１個もしくはそれ以上の基によ
    り置換され、ただしＢが基（II）もしくは（III）であ
    る場合のＲ＾１＝ＨかつＲ＾２＝ＣＨ＿３およびＢが基
    （II）である場合のＲ＾１＝Ｒ＾２＝ＣＨ＿３を除き、
    Ｒ＾３は水素原子、酸性媒体中において不安定な基、ま
    たは式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでＲ＾１およびＲ＾２は上記の意味を有する）の
    基を示し、Ｒ＾４は水素原子、含燐基または式：▲数式
    、化学式、表等があります▼ （ここでＲ＾１およびＲ＾２は上記の意味を有する）の
    基を示し、Ｒ＾５は水素原子またはＯＨ基を示す〕 を有するヌクレオシド誘導体。
  2. （２）酸性媒体中において不安定な基Ｒ＾３が式：▲数
    式、化学式、表等があります▼（Ｖ） （式中、Ｒ＾６、Ｒ＾７およびＲ＾８は同一でも異なつ
    てもよく水素原子、アルキル基もしくはアルコキシ基を
    示す）のトリチル基、ビキシル基および９−フェニルキ
    サンテニル基 よりなる群から選択される特許請求の範囲第１項記載の
    ヌクレオシド誘導体。
  3. （３）含燐基Ｒ＾４が式： ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） 式： ▲数式、化学式、表等があります▼（VII） または式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の基は式； よりなる群から選択される特許請求の範囲第１項記載の
    ヌクレオシド誘導体。
  4. （４）Ｂが式： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） を示し、 Ｒ＾１が水素原子を示し、かつＲ＾２がアルコキシ基ま
    たは適宜置換されたアリールオキシ基を示す特許請求の
    範囲第１項記載のヌクレオシド誘導体。
  5. （５）Ｒ＾２が式： ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
    表等があります▼もしくは ＣＨ＿３Ｏ− から選択される基である特許請求の範囲第４項記載のヌ
    クレオシド誘導体。
  6. （６）Ｂが式： ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） を示し、 Ｒ＾１が水素原子を示しかつＲ＾２が適宜置換されたア
    リールオキシ基を示す特許請求の範囲第１項記載のヌク
    レオシド誘導体。
  7. （７）Ｒ＾２がフェノキシ基を示す特許請求の範囲第６
    項記載のヌクレオシド誘導体。
  8. （８）Ｂが式： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） を示し、 Ｒ＾１およびＲ＾２が同一でも異なつてもよく水素原子
    またはアルキル基を示す特許請求の範囲第１項記載のヌ
    クレオシド誘導体。
  9. （９）Ｒ＾１およびＲ＾２がメチル基を示す特許請求の
    範囲第８項記載のヌクレオシド誘導体。
  10. （１０）Ｒ＾３およびＲ＾４が水素原子を示す特許請求
    の範囲第１項記載のヌクレオシド誘導体。
  11. （１１）Ｒ＾３が基： ▲数式、化学式、表等があります▼ を示し、かつ Ｒ＾４が水素原子を示す特許請求の範囲第１項記載のヌ
    クレオシド誘導体。
  12. （１２）Ｒ＾５が水素原子を示す特許請求の範囲第１項
    乃至第１１項のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体。
  13. （１３）Ｒ＾３が基： ▲数式、化学式、表等があります▼ を示し、かつＲ＾４が基： ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） を示す特許請求の範囲第５項、第７項または第９項記載
    のヌクレオシド誘導体。
  14. （１４）Ｒ＾３が基： ▲数式、化学式、表等があります▼ を示し、かつＲ＾４が基： ▲数式、化学式、表等があります▼（VII） を示す特許請求の範囲第５項、第７項または第９項記載
    のヌクレオシド誘導体。
  15. （１５）Ｒ＾３が基： ▲数式、化学式、表等があります▼ を示しかつＲ＾４が基： ▲数式、化学式、表等があります▼　（Ｃ＿２Ｈ＿５）
    ＿３ＮＨ＾（＾＋＾）を示す特許請求の範囲第５項、第
    ７項または第９項記載のヌクレオシド誘導体。
  16. （１６）Ｒ＾５が水素原子を示す特許請求の範囲第１３
    項乃至第１５項のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体
    。
  17. （１７）（ｉ）ヌクレオシド誘導体またはオリゴヌクレ
    オチドに対し式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中、Ｂは式： ▲数式、化学式、表等があります▼（II）、▲数式、化
    学式、表等があります▼（III） もしくは ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） から選択され、その環外ＮＨ基によりＣＯ基に結合され
    る二価の基を示し、 Ｒ＾１は水素原子もしくはアルキル基を示し、Ｒ＾２は
    水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ
    基を示し、これらは未置換であつてもまたはＮＯ＿２、
    ＣＮ、アルコキシ、アリールオキシ、Ｃｌ、Ｆ、▲数式
    、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等が
    あります▼、ＳＯ＿２Ｒ、▲数式、化学式、表等があり
    ます▼、▲数式、化学式、表等があります▼、アルキル もしくはアリール（これらは置換されていてもいなくて
    もよい）、ＳＲ（ここでＲはアルキルもしくはアリール
    基を示す）より成る群から選択される基の１個もしくは
    それ以上で置換されていてもよく、ただしＢが基（II）
    もしくは（III）である場合のＲ＾４＝ＨかつＲ＾２＝
    ＣＨ＿３およびＢが基（II）である場合のＲ＾１＝Ｒ＾
    ２＝ＣＨ＿３を除き、 Ｒ＾３は酸性媒体中にて不安定な基を示し、Ｒ＾４は含
    燐基を示し、 Ｒ＾５は水素原子を示す〕 のヌクレオシド誘導体を縮合させる少なくとも１つの縮
    合サイクルと、 （ｉｉ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＾１およびＲ＾２は上記した意味を有する〕 の保護基を除去する工程と からなることを特徴とするオリゴヌクレオチドの合成方
    法。
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