KR19990064332A - 올리고뉴클레오티드의 액상 합성법 - Google Patents

올리고뉴클레오티드의 액상 합성법 Download PDF

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올프강 피켄
데니 멕지
알리시아 세틀
얀셍 즈하이
지안핑 후앙
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래리 더블유. 스미스, 코크란 아담
넥스스타 파머수티컬스, 인크.
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Abstract

본 발명은 올리고뉴클레오티드의 연속적 액상 합성을 위한 개선된 방법을 개시한다. 본 방법은 자동화에 유용하며, 높은 수율로 대규모의 올리고뉴클레오티드 제조에 이상적으로 적합하다.

Description

올리고뉴클레오티드의 액상 합성법
발명의 분야
본 발명은 헥산 화학 분야에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 올리고뉴클레오티드 제조에 관한 새로운 방법을 기술한다. 상기 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위하여 여기서 이용된 방법은 생성물 고정 연속 합성법(Product Anchored Sequencial Synthesis)의 두 문자를 따서, PASS라 한다.
발명의 배경
극히 최근까지, 엄격히 정보적 차원과는 다른 규모에서 올리고뉴클레오티드를 고려하여 보았다는 설은 들려오지 않았다. 특정 올리고뉴클레오티드가 흥미로운 구조적 가능성을 가지고 있다는 것이 알려져 있으며(예를들면 t-RNA들), 기타 올리고뉴클레오티드는 천연적으로 폴리펩티드에 의하여 특이하게 결합되었다는 사실에도 불구하고, 올리고뉴클레오티드의 비정보적 능력에 관하여는 거의 관심이 기울여지지 않았다. 무엇보다도 이와같은 이유 때문에, 올리고뉴클레오티드를 약제 화합물로서 사용한다는 것에 대하여는 거의 고려되지 않았다.
최근, 올리고뉴클레오티드를 약제 화합물로서의 사용과 관련하여 광범위한 연구로 유도하는 세가지 영역 이상의 탐구활동이 있다. 가장 진전된 분야에 있어서, 단백질의 발현을 방지하거나 또는 다양한 세포 기능을 차단하기 위하여 안티센스 올리고뉴클레오티드가 유기체중이 특정 코딩 영역을 결합하는데 사용된다. 또한, 촉매적 기능을 지닌 RNA류 --- 리보자임 ---의 발견으로, 소정 효과를 달성하게 되는 세포내 반응을 수행하는 역할을 하는 RNA를 연구하게 되었다. 마지막으로, SELEX 공정(지수적 부유화에 의한 리간드의 전신적 진화, Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)(터크(Tuerk) 및 골드(Gold)(1990) Science249: 505)은 거의 모든 임의의 생물학적으로 관심 대상인 표적에 결합되는 올리고뉴클레오티드가 식별될 수 있다는 것을 나타내고 있다.
SELEX는, 예를들면 표적분자와 상호작용하는 "헥산 항체"라고 불리우는 헥산 리간드를 확인 및 제조하는 방법이다(터크 및 골드(1990) Science249: 505). 그 방법은 사실상 임의의 요망 기준의 결합 친화성 및 선별성을 달성하기 위하여, 대상 올리고뉴클레오티드의 혼합물로부터의 선별 및 결합의 단계적 반복, 분리 및 증폭, 동일한 일반적 선별 주제를 사용하는 것과 관련된다.
유전자 발현을 조정하기 위한 수단으로서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용 및 가능한 약제로서 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있는 잠재능력은, 올리고뉴클레오티드의 치료작용 및 안정성을 증가시키기 위하여 올리고뉴클레오티드에 대한 수많은 화학적 변형을 유도하도록 하는 연구를 촉진시켰다. 이와같은 변형은, 올리고뉴클레오티드의 세포 침투를 증가시키고, 체내의 올리고뉴클레오티드 유사체의 구조 또는 활성을 분해 또는 차단하는 기타 효소 및 뉴클리아제로부터 그들을 안정시키며, 표적 RNA에 대한 그들의 결합력을 강화시키며, 표적 RNA에 대하여 일단 서열 특이적으로 결합된 붕궤의 양태를 제공하며 및 그들의 약물 동태학적 특성을 개선시키도록 설계된다.
최근의 연구결과는 RNA 2차 및 3차 구조가 중요한 생물학적 기능을 갖을 수 있다는 것을 나타내고 있다(티노코(Tinoco) 등 (1987) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.52: 135; 라아손(Larson) 등 (1987) Mol. Cell. Biochem.74: 5; 터크등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85: 1364; 레스네코브(Resnekov) 등 (1989) J. Biol. Chem.264: 9953). 발명의 명칭이 "RNA 의태를 통한 유전자 발현 조절을 위한 제재 및 방법"(Reagents and Methods for Modulating Gene Expression Thruough RNA Mimicry")인 PCT 특허출원 공고 WO91/14436호는, 하나 이상의 단백질과 상호작용할 수 있는 RNA의 일부를 의태하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 기재하고 있다. 올리고뉴클레오티드는 그들에게 뉴클리아제-저항체를 부여하는 변형된 인터뉴클레오시드 결합을 함유하며, 세포를 투과하는 강화된 능력을 가지며 및 표적 올리고뉴클레오티드 서열을 결합할 수 있는 능력이 있다.
약제로서 사용하기 위한 변형된 올리고뉴클레오티드의 개발에 있어서 상당한 활동이 있었음에도 불구하고, 이들 화합물을 임상적으로 발전시킬 수 있는 규모로 제조 및 유리하는데는 거의 관심을 두지 않았다. 종래의 실험실적 규모 1μmol 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성법은, 임상적으로 개발될 수 있기에 충분한 양의 화합물을 제공하지 못한다. 임상적 개발을 위하여는, 올리고뉴클레오티드는 최소한 그람 규모에서 수 그람 규모로 제조되어야 한다. 문헌상으로는 대규모의 올리고뉴클레오티드 합성에 관한 보고서가 있지만, "대규모"라는 용어가 그람 규모 또는 킬로그람 규모가 아니라, 1∼10μmol 규모에 그치는 것이다(이와이(Iwai) 등 (1990) 테트라헤드론(Tetrahedron)46: 6673∼6688).
올리고뉴클레오티드 합성에 있어서의 당분야의 현행 상태는 포스포아미디트에 의한 올리고뉴클레오티드의 자동화 고형상 합성인데, 그 방법이 도식 1로 예시된다(뷰케이지(Beaucage) 및 아이어(Iyer)(1992) 테트라헤드론48: 2223∼2311; 존(Zon) 및 게이저(Geiser)(1991) 항암 약물 고안(Anti-Cancer Drug Design)6: 539∼568; 마티우치(Matteucci) 및 카루터스(Caruthers)(1981) J. Am. Chem. Soc.103: 3185∼3191). 요약하면, 합성될 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오시드가 고형 지지체에 부착되고 지지체에 부착된 상태를 유지하면서 하나의 뉴클레오티드를 한번에 첨가함으로써 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 도식 1에 묘사한 바와 같이, 뉴클레오시드 모노마가 보호되고(P1) 포스포아미디트가 제조된다[1]. 포스포아미디트 (5'-보호 모노마 단위로 명명된)는 다음에 성장 올리고뉴클레오티드 사슬의 리보스 고리의 5'-히드록시 그룹을 통하여, 포스파이트 트리에스테르 결합을 경유하여, 성장 올리고뉴클레오티드 사슬[2]에 공유결합으로 부착되어 올리고뉴클레오티드 생성물[3]을 산출하게 되는데, 여기서 성장 올리고뉴클레오티드 사슬의 태반이 하나의 뉴클레오티드에 의하여 연장되나, 상당한 비율의 사슬은 연장되지 않는다. 생성물[3]은 다음에 산화되어 포스페이트 트리에스테르[4]를 산출한다. 성장 뉴클레오티드 사슬에 다음번 염기를 첨가하기 전에, 5'-히드록실 그룹은 보호에서 해제되어야 한다. 그러나 도식 1에서 알수 있는 바와 같이(화합물 4), 고형 지지체상의 모든 반응 부위가 5'-보호 모노마와 반응하는 것은 아니다. 따라서 이들 미반응 부위(실패 서열로 명명)는, 5'-히드록실 그룹[6]을 보호에서 해제하기 전에, 보호되어야 한다(캡핑(capping)으로 명명). 역시 보호되고 포스포아미디트로 전환된 후속 모노마는 다음에 모노마의 3'-단부에 대한 성장 올리고마의 5'-단부의 결합에 의하여 연속적으로 첨가된다. 각 결합반응은 아인산염 트리에스테르 결합을 통하여 하나의 모노마에 의하여 올리고뉴클레오티드를 연장한다. 각 단계 및 고형 지지체와의 최초 반응의 경우에 있어서, 5'-보호 모노마와의 반응에 실패하는 반응부위가 있는데, 그 결과 하나의 뉴클레오티드 모노마에 의하여 연장되지 않은 올리고뉴클레오티드를 초래하게 된다(실패 서열). 합성이 완료되면, 소정의 올리고뉴클레오티드 (6(n+1 서열))는 보호가 해제되며 모든 실패 서열(n, n-x)과 함께 수지로부터 분열된다.
종래의 고형상 올리고뉴클레오티드 합성법의 수율은 결합된 모노마의 수와 함께 지수적으로 감소한다. 이것은 실패 서열로부터 조생성물을 정제해내는 애로점을 더욱 가중시킨다. 또한, 고도의 분해 정제가 달성된 후라 하더라도, 특히 비표준 뉴클레오티드를 함유하는 경우, 생성물의 서열 및 조성을 변형시키기 어렵다는 문제점이 남게 된다.
(도식 1)
고형 지지체상에서의 자동화 올리고뉴클레오티드 합성법은 최소한의 시간과 합리적인 수율로 소량, 0.001∼0.01mmol의 다양한 서열을 제조하는데는 매우 효율적이다. 그러나, 그것은 투입된 모노마를 기준으로 한 전반적 공정 수율면에 있어서는 매우 비효율적인 방법이다. 통상적으로, 첨가된 모노마당 16배의 과잉 포스포아미디트가 필요하다. 자동화 고형상 합성법을 시도하는 것은 올리고뉴클레오티드 약제를 효율적으로 제조할 수 있는 수준으로 확대하는데 기여하는 것이 용이하지 않다는 것이 인식되었다(존 및 게이저(1991) Anti-Cancer Drug Design6: 539 - 568).
고형상 합성법의 비효율성은, 헤테로상 모노마 카플링반응 및 동일 지지체 비드에 대한 미반응 실패 서열과 반응 생성물 모두의 공유결합 부착에 의하여 대규모로 발생된다. 각 과정에 있어서, 지지체에 결합된 1∼5%의 뉴클레오티드가 활성화 모노마와 반응하지 못한다. 실패 서열이라고 하는 이들 미반응 화합물은, 위에서 검토한 바와 같이, 모노마를 불완전 올리고뉴클레오티드에 계속 첨가하는 것을 방지하기 위하여 차단 즉 캡핑처리 상태로 되어야 한다. 합성의 각 단계에서의 실패 서열의 발생은, 고도의 동질성 부산물로 오염된 조생성물을 산출하는데, 이것은최종 조생성물로 운반되어야 한다(도식 1, 구조 6(n, n-x) 참조). 결과적으로, 임상적 연구용으로 수용 가능한 상태로 조 합성 올리고뉴클레오티드를 정제한다는 것은 극히 곤란하며 비효율적인 일이 된다. 실패 서열의 백분율을 최소화하기 위하여는 과잉(약 16배)의 모노마가 사용된다.
보다 높히 적재된 폴리스티렌 지지체를 사용하여 고형상 올리고뉴클레오티드 합성 규모를 확대하는 방법이 몬트세라트(Montserrat) 등 (1994)의 테트라헤드론50: 2617-2622에 의하여 보고되었다. 그러나 이 방법은 고형상 합성법과 관련된 주요 문제점을 해결하지 못하는데, 여기서 상당량의 과잉 모노마가 여전히 실패 서열을 최소화할 필요가 있게 된다. 또한 이 방법은 일관되게 만족할 만한 수율을 제공하지 못한다.
카플링의 달성 및 용이한 규모 가능성을 달성하는데 필요한 과잉 모노마를 감소하기 위한 시도에 있어서, 보노라(Bonora) 등 (1993) 헥산연구(Nucleic Acids Res.)21: 1213∼1217은, 모노마 카플링 반응에서 가용성인 3'-지지체로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하는 방법을 연구하였다. 이 방법은 포스포아미디트 카플링, H-포스폰산염 응축 및 포스포트리에스테르 응축에 의하여 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 사용되었다(보노라 (1987) Gazzetta Chemical Italiana117: 379; 보노라 등(1990) Nucleic Acids Res.18: 3155; 보노라 등(1991) 뉴클레오티시드 및 뉴클레오티드(Nucleosides & Nucleotides)10: 269; 콜론나(Colonna) 등 (1991) Tetrahedron Lett.32: 3251∼3254; 보노라 및 스크레민(Scremin)(1992)Innovation Perspect. Solid Phase Synth. Collect. Pap., Int. Symp. 2nd"올리고뉴클레오티드의 대규모 합성법. HELP법: 결과 및 전망" ("Large Scale Synthesis of Oligonucleotid; The HELP Method: Result and Perspectives"), 355∼358 페이지, 영국 Intercept, Andover 발행; 스크레인 및 보노라(1993) Tetrahedron Lett.34: 4663; 보노라(1995) 응용 생화학 및 생명공학(Applied Biochemistry and Biotechnology)54: 3; 자라멜라(Zaramella) 및 보노라(1995) Nucleosides & Nucleotides14: 809를 참조할 것). 이와같은 시도의 약점은 각 반응단계후에 지지체 결합 올리고뉴클레오티드의 회수율이 납득할 수 없을 만큼 낮다는 것이다. 또한, 이 방법은 캡핑처리 상태로 되어 최종제품화 되어야 할 실패 서열의 문제점을 다루지 못하고 있다.
폴리에틸렌 글리콜-폴리스티렌 공중합체 지지체도 올리고뉴클레오티드 합성법의 규모를 확대하는데 사용되었다(라이트(Wright) 등(1993) Tetrahedron Lett.34: 3373∼3376). 1mmol 규모에 있어서, 18량체 DNA에 대하여 모노마 첨가당 96.6%의 카플링 효율이 보고되어 있다. 역시 이 방법은 수지에 결합된 실패 서열의 문제점을 취급하지 못하고 있는 것이다.
존(Zon) 등은 올리고뉴클레오티드의 합성에 블록 시도를 제안하였는데, 여기서 이량체 또는 다량체 올리고뉴클레오티드 단편의 라이브러리가 용액에서 제조된 후 상호 연결된다(존 및 가이저(1991) Anti-Cancer Drug Design6: 539-568). 단편은 차별적인 5'-탈보호 및 3'-인산화에 의하여 카플링을 위하여 활성화된다. 포스포트리에스테르 카플링은 단편 제조를 위하여 제안되어 왔다(보노라 등 (1993) Nucleic Acids Res.21: 1213∼1217). 포스포트리에스테르 카플링의 수율이 비교적 낮기 때문에, 이 방법은 폭 넓게는 수용되지 않았다.
종래의 올리고뉴클레오티드 합성법에 있어서, 5'-보호 그룹은 카플링 단계중에, 하나의 모노마의 5'-히드록실 그룹과 제2 모노마의 포스포아미디트 그룹과의 반응을 방지하는 역할을 한다. 4,4'-디메톡시트리틸(DMT) 그룹은 올리고뉴클레오티드 합성중 첨가된 5'-보호 모노마 단위의 5'-보호작용 그룹으로 통상 사용된다(쉘러(Schaller) 등 (1963) J. Am. Chem. Soc.85: 3821). 이 그룹은, 다음번 5'-보호 모노마 단위를 첨가하기 전에 올리고뉴클레오티드 생성물의 5'-산소로부터 제거될 수 있는 용이성 및 선별성 때문에, 선택되어진다(뷰케이지 및 아이어(1992) Tetrahedron48: 2223∼2311 참조). 용액내에서, 산 유도 트리틸화의 가역성에 의하여 5'-DMT 그룹의 탈보호가 손상을 입게 된다. 이 반응의 완결을 촉진하기 위하여, 유리 트리틸 양이온의 소거제가 액상 탈트리틸화 반응을 위하여 첨가된다(라비쿠마아(Ravikumar) 등 (1995) Tetrahedron Lett.36: 6587). 최종-말단 DMT 그룹이, 가역상 크로마토그라피에 의하여 보다 짧은 실패 서열로부터 전장 생성물 올리고뉴클레오티드를 분리할 수 있도록 하는 소수성 핸들의 역할을 할 수도 있다는 것이 인식되었다. 또한, 완전한 고형상 합성후에 실패 서열로부터 전장의 탈보호 올리고뉴클레오티드 생성물을 분리하는 문제점을 보강하기 위하여 DMT 그룹의 고도의 소수성 유사체가 준비되었다(셀리거(Seliger) 및 스미드트(Schmidt)(1987) 크로마토그라피 저널(Journal of Chromatography)387: 141). 하나의 다른 시도에 있어서, 탈보호된 조 올리고뉴클레오티드 중에서 전장 생성물의 검출을 용이하게 하기 위하여 올리고뉴클레오티드 합성중에 5'-말단 보호작용 그룹에 대하여 형광성 트리틸 유사체가 사용되었다(포레이(Fourrey) 등 (1987) Tetrahedron Lett.28: 5157). 착색된 트리틸 그룹은 고형상 올리고뉴클레오티드 합성중에 특정 모노마 첨가를 감시할 수 있도록 고안되었다(피셔 (Fisher) 및 카루터스(Caruthers)(1983) Nucleic Acids Res.11: 1589). 트리틸 그룹이 고형상 올리고뉴클레오티드 합성중에 올리고뉴클레오티드로부터 제거될 수 있는 선별성을 변경 또는 강화하기 위한 목적으로 다른 변형된 트리틸 그룹이 마련되었다(뷰케이지 및 아이어(1992) Tetrahedron48: 2223∼2311 참조).
오늘 날까지, 용액내 올리고뉴클레오티드 합성 중에 생성물이 수지 또는 막에 고정될 수 있게 하는 트리틸 그룹은 고안되어 있지 않다. 또한, 유도된 수지, 막 또는 가용성 폴리마와 공유 결합으로 반응할 수 있는 트리틸 그룹이 보고되어 있지 않다.
디엘스-알더반응은, 새로운 결합을 형성하기 위하여 π-전자가 사용되는 고리형 화합물을 형성하기 위한, 콘쥬게이트 디엔 및 불포화 분자 사이의 부가고리화 반응이다. 디엘스-알더 반응은, 4-π 전자(디엔)의 시스템 및 2-π전자(친디엔체)의 시스템과 관련되기 때문에, [4+2] 부가고리화 반응의 하나의 예가 된다. 이 반응은 온화한 조건하에서 매우 신속히 일어나도록 만들 수 있으며, 폭 넓은 다양한 반응물질에 대하여 일어나도록 조작될 수 있다. 디엘스-알더 반응은 범위가 넓으며 당분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 디엘스-알더 반응에 관한 참고자료는 "고급 유기화학"("Advanced Organic Chemistry")(마아치(March, J) 편) 761-798 페이지(1977)에서 발견할 수 있는데, 여기서 참고로 인용한다.
현재까지, 수많은 시도가 행하여 졌으나 대량으로, 연속작업으로, 낮은 비용으로 및 정제 작업이 용이한 올리고뉴클레오티드의 제조방법에 대한 필요성은 여전히 상존한다.
발명의 요약
본 발명은, 반응 수율을 증가시키며 규모 확대 가능성이 있는, 올리고뉴클레오티드의 연속적 액상 합성법에 관한 것이다. 성장 올리고뉴클레오티드의 3'-단부가 고형 지지체에 결합되는 종래의 구도와 대조적으로, 본 발명은, 미반응 출발물질로부터 분리되도록 성공적으로 결합된 생성물을 가능케하는 성장 올리고뉴클레오티드의 5'-단부에 부착된 앵커 그룹을 이용하는 것을 특징으로 한다. 하나의 구체예에서, 앵커 그룹은 또한 5'-OH 보호작용 그룹의 역할을 하며, 카플링반응은 용액중에 일어난다. 성공적으로 반응된 올리고마는 보호작용 그룹을 함유하게 되는 반면에 미반응 올리고마는 함유하지 못하며, 물질은 앵커/보호작용 그룹의 존재를 기준으로 분리될 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에서, 앵커 그룹은 수지, 막 또는 폴리마와 같은 유도된 고형 지지체와 공유 결합으로 반응한다.
구체적으로, 본 발명은 다양한 올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드의 액상 합성법을 제공하는데, 이 방법은 용액중에서 5'-보호 모노마 단위와 성장 올리고뉴클레오티드 사슬의 5'-단부의 반응을 포함한다. 본 발명의 하나의 별도 관점에서, 5'-보호 모노마 단위와 성장 올리고뉴클레오티드 사이의 반응에 뒤이어, 미반응 모노마는 산화되어 반응 매개체의 잔류물로부터 용이하게 분리될 수 있는 하전체를 형성할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 모노마 단위는 포스포아미디트인데, 이것은 활성화 및 산화에 의하여 인산염으로 전환된다. 하전 인산염류는 반응 매개체 잔류물로부터 용이하게 분리될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 모노마 단위는 5'-보호 포스포아미디트 또는 H-포스폰산염으로 구성되는데, 여기서 보호작용 그룹은 치환된 트리틸 그룹, 레뷰린산 그룹, 또는 실릴 에테르 그룹이다. 하나의 구체예에서, 미반응 올리고뉴클레오티드 출발물질(실패서열)은 크로마토그라피 수지에 대한 보호작용 그룹의 친화성을 기준으로, 반응 올리고뉴클레오티드 생성물로부터 분리될 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 미반응 올리고뉴클레오티드 출발물질은 보호작용 그룹과 수지, 막 또는 폴리마와 같은 유도된 고형 지지체와의 특이적 반응을 기준으로, 반응 올리고뉴클레오티드 생성물로부터 분리될 수도 있다. 본 발명의 하나의 바람직한 관점에서, 미반응 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위한 분리 방법은 미반응 올리고뉴클레오티드의 유리 및 재사용을 가능케하며, 또한 다음번 5'-보호 모노마 단위의 후속 첨가를 위한 준비단계에서 반응 올리고뉴클레오티드가 탈보호 되도록 한다.
본 발명의 방법은 포스포아미디트 카플링 화학반응에 국한되는 것은 아니나, H-포스폰산염 또는 인산염 트리에스테르 카플링 화학반응과 같은 기타의 카플링 반응과 양립할 수 있다. 이 방법은 자동화에 유용하며, 높은 수율로 올리고뉴클레오티드를 대규모로 제조하는데 적합하다.
본 발명은 미반응 5'-보호 모노마 단위 및 출발물질로부터 생성물을 자동적으로 분리하기 위한 방법 및 장치를 내포한다. 하나의 구체예에서, 장치는 추출용기 및 크로마토그라피 수지 여과 챔버를 포함하는데, 상기 챔버는 고형 지지체를 함유한다. 모노마 첨가 반응이 종료되면, 반응 혼합물은 추출 챔버로 펌핑되고 추출된 후 오직 5'-보호 모노마 단위만을 유지하는 고형 지지체를 통하여 용리된다. 생성물은 다음에, 오직 생성물만을 유지하는 고형 지지체를 통한 용리에 의하여 출발물질로부터 분리된다. 제2 구체예에서, 크로마토그라피 수지 여과 챔버는, 5'-보호 모노마 단위 및 생성물 양방과 공유결합으로 반응하는 고형 지지체를 함유한다. 출발물질은 고형지지체로부터 용리되고 모노마 및 생성물은 다음에 묽은 산으로 지닌 고형 지지체로부터 방출된다. 생성물은 다음에 한외여과막을 관통함으로써 5'-보호 모노마 단위로부터 분리된다.
재료비용 분석결과는 5'-보호 포스포아미디트가 올리고뉴클레오티드 합성에 있어서 가장 저렴한 반응 성분이라는 것을 보여주고 있다. 나머지 재료의 비용은 비교해 보아도 별 차이가 없다. 따라서, 상기 모노마를 제한 시약으로 하는 것이 요망된다. 또한 투입되는 모노마의 첨가에 실패한 특정 중간체 올리고뉴클레오티드 서열은 후속되는 합성에 있어서 중간체 역할을 할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하면, 올리고뉴클레오티드 생성물의 서열 및 조성을 변경한다는 것이 대수롭지 않은 일로 된다. 각 모노마 첨가 순환 과정후에, 완전히 보호된, 중성 중간체가 얻어지는데, 이것은 번거로운 샘플 준비없이도 질량 분석법에 의하여 용이하게 분석된다. 올리고뉴클레오티드 합성의 공정에 걸쳐서 각 연속적인 모노마 첨가에 대한 분석 데이터의 라이브러리가 얻어질 수 있다. 따라서 생성물 분석 작업은 합성 공정의 절대 필요한 부분이 된다.
도면의 간단한 설명
제1도는 산화전, 실시예 1에 제시된 포스포아미디트 카플링 반응 혼합물의 가역상 고압 액체 크로마토그라피(HPLC) 트레이스를 예시하고 있다.
제2도는 산화후, 실시예 1에 제시된 포스포아미디트 카플링 반응의 가역상 HPLC 트레이스를 예시한다. 산화 후 트레이스는 제1도의 산화전 트레이스 위에 겹쳐진다.
제3도는 DEAE Sephadex필터 플러그 관통전후에 실시예 1에 제시된, 산화된 포스포아미디트 카플링 반응의 혼합물의 가역상 HPLC 트레이스를 예시한다.
제4도는 C18 수지를 통하여 물/아세토니트릴로 용리된 후 및 아세트산으로 처리되고 물/아세토니트릴로 용리된 후에, 실시예 1에 제시된, 산화된 포스포아미디트 카플링 반응의 가역상 HPLC 트레이스를 예시한다.
제5도는 본 발명의 방법에 사용되도록 고안된 자동화 추출 및 여과시스템을 개략적으로 예시한다.
제6도는 3'-PEG 고정 액상 합성법을 이용하여 실시예 7에서 제조된 15 염기 올리고뉴클레오티드의 음이온 교환 HPLC 트레이스를 예시한다.
제7도는 5'-DHDTO-T-[3',3']-T-OSiPDBT-5'와, 1.0당량, 2.5당량, 5당량 및 10당량의 말레이미드를 함유하는 폴리스티렌 말레이미드 수지의 반응에 대한 디엘스-알더 포착 데이터를 그래픽으로 예시한다.
제8도는 디엘스-알더 생성물 포착과 함께 사용되도록 고안된 자동화 추출 및 여과시스템을 개략적으로 예시한다.
제9도는 에틸에테르, 이소프로필 에테르 및 N-부틸 에테르에 의하여 침전된 PEG-dT의 침전 및 원심분리를 그래픽으로 예시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 여기서 생성물 고정 연속 합성법(PASS)라고 불리우는, 올리고뉴클레오티드의 액상 합성법을 내포한다. 성장 올리고뉴클레오티드의 3'-단부가 고형 지지체에 결합되는 종래의 구도와는 달리, 본 발명은 미반응 출발물질로부터 분리되도록 성공적으로 연결된 생성물을 가능케하는 성장 올리고뉴클레오티드의 5'-단부에 부착된 앵커 그룹을 이용하는 것을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 앵커 그룹은 또한 5'-OH 보호작용 그룹의 역할을 한다. 성공적으로 반응된 올리고뉴클레오티드 생성물은 보호작용 그룹을 함유하게 되는 반면에 미반응 올리고뉴클레오티드 출발물질은 함유하지 못하며, 생성물은 차단/보호 그룹의 존재를 기준으로 출발물질로부터 분리되어 버릴 수 있다. 미반응 출발물질은 회수되며 동일 올리고뉴클레오티드의 후속 합성 뱃치에서 재사용될 수 있다. 따라서, 종래의 고형상 합성법과는 대조적으로, 여기에 기재된 올리고뉴클레오티드 합성의 개선된 방법은 성장 올리고뉴클레오티드 사슬의 3'-단부를 고정하기 위한 고형 지지체를 채택하지 않는다.
구체적으로, 본 발명은 다양한 올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드의 액상 합성법을 제공하는데, 이 방법은 용액중에서 5'-보호 모노마 단위와 성장 올리고뉴클레오티드 사슬의 5'-단부의 반응을 포함한다. 고형 지지체상에서 보다도 이들 반응을 용액내에서 수행하면, 보다 양호한 반응 속도가 제공된다. 본 발명의 하나의 별도 관점에서, 5'-보호 모노마 단위와 성장 올리고뉴클레오티드 사이의 반응에 뒤이어, 미반응 모노마는 산화되어 반응 매개체의 잔류물로부터 용이하게 분리될 수 있는 하전체를 형성할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 모노마 단위는 포스포아미디트인데, 이것은 활성화 및 산화에 의하여 인산염으로 전환된다. 하전 인산염류는 반응 매개체 잔류물로부터 용이하게 분리될 수 있다. 또한 바람직한 구체예에서, 산화는 현장에서 수행될 수도 있다.
5'-보호 모노마 단위로서 하나의 하전체인 H-포스폰산염을 사용할 경우(실시예 2, 도식 5), H-포스폰산염의 산화는 최종 모노마의 첨가후까지 지연된다. 하전체 H-포스폰산염 모노마는 카플링 후 중성 H-포스폰산염 디에스테르 생성물을 산출하며, 하전체 모노마류는 음이온 교환여과 또는 추출에 의하여 용이하게 제거된다. 또한, 회수된 H-포스폰산염 모노마는 재사용이 가능하다.
이용되는 5'-보호작용 그룹은, 본 발명의 기본적 요구 조건에 부합되는 화학적 기능성을 갖는 임의의 종류로부터 선택될 수 있다. 보호작용 그룹은 분리 작업을 달성하기 위하여 반응 혼합물의 잔류물로부터 반응의 생성물을 분별하는데 사용될 수 있는 형태의 것이어야 한다. 바람직하게는, 보호작용 그룹은 특정 상 또는 고형 지지체 대하여 강력한 친화성 또는 반응성을 가지며, 고도의 선택성으로 특정 상 또는 고형 지지체로부터 용이하게 분열 또는 제거되어야 한다. 올리고뉴클레오티드 생성물은 당분야의 숙련자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 미반응 올리고뉴클레오티드 출발물질로부터 분리될 수 있는데, 상기 공지방법에는, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 원심분리, 수지상에서의 분리, 실리카 겔 기준분리, 금속에 대한 친화성 기준 분리, 자력 또는 전자력 기준 분리 또는 적절한 고형 지지체에 대한 공유 결합 부착 기준 분리가 포함된다.
본 발명의 바람직한 관점에서, 미반응 올리고뉴클레오티드 출발물질을 제거하기 위한 분리 방법은 미반응 올리고뉴클레오티드의 유리 및 재사용 모두를 가능케 하며, 또한 다음번 5'-보호 모노마 단위의 후속 첨가를 위한 준비 과정에서 용이하게 탈보호되는 수지 결합 올리고뉴클레오티드 생성물을 초래하게 된다. 가장 바람직하게는, 보호작용 그룹은 수지, 막 또는 폴리마와 같은 유도된 고형 지지체와 공유 결합으로 반응하여, 고도의 선택성으로 올리고뉴클레오티드로부터 용이하게 분열될 수 있는, 공유결합으로 고정된 보호작용 그룹을 제공한다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 모노마 단위는 5'-보호 포스포아미디트 또는 H-포스폰산염으로 구성되는데, 여기서 보호작용 그룹은 치환된 트리틸 그룹, 레뷰린산 그룹, 또는 실릴 에테르 그룹이다. 보호작용 그룹상의 바람직한 치환은 디엔 기능성인데, 이것은 디엘스-알더 반응을 통하여, 친디엔체로 유도화될 수 있는 폴리마, 막 또는 수지와 같은 고형 지지체와 반응할 수 있다. 이 구체예에서, 미반응 올리고뉴클레오티드 출발물질은, 5'-보호작용 그룹과 유도화된 수지의 선택적 또는 특이적인 공유 결합 반응을 기준으로, 반응된 뉴클레오티드 생성물로부터 분리된다.
본 발명을 설명하기 위하여 여기서 사용된 특정 용어는 다음과 같이 규정된다:
"뉴클레오시드"는 디옥시리보뉴클레오시드나 리보뉴클레오시드 또는 그들의 임의의 화학적 변형체를 의미한다. 뉴클레오시드의 변형에는, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 2'-위치 당 변형, 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 퓨린 변형, 사이토신 외향고리 아민에서의 변형, 5-브로모-유라실의 치환등이 포함된다.
"올리고뉴클레오티드"는 DNA나 RNA 또는 그들의 임의의 화학적 변형체를 말한다. 본 발명의 방법에 의하여 합성된 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 다음과
같이 묘사된다:
여기서 n=1∼1,000, A는 아래에 정의된 바와 같이 2'-당 치환체이며 B는 다음에 정의된 바와 같이 핵염기(nucleobase)이다.
여기서 사용된 "고형 지지체"는 상전이를 감당할 수 있는 수지, 막, 상(phase), 폴리마, 폴리마전구체 또는 가용성 폴리마를 말한다. 고형 지지체는 또한 D그룹으로 유도화된 수지, 막, 상, 폴리마, 폴리마 전구체, 또는 가용성 폴리마를 말한다. 수지 및 고형 지지체라는 용어는 상호 교환 가능하게 사용되는데, 당분야의 숙련자는 수지라는 용어가 무엇을 의미하는지 인식하고 있을 것이다. 고형 지지체의 예로는, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 말레이미드 유도화 폴리스티렌, 아래에 정의된 바와 같이 D그룹으로 유도화된 폴리스티렌, 친디엔체 또는 디엔 유도화 폴리스티렌, 아래에 정의된 바와 같이 D그룹으로 유도화된 TentagelTM, 친디엔체 즉 디엔 유도화 TentagelTM, 친디엔체 즉 디엔 유도화 한외여과막, 친디엔체 즉 디엔 유도화 폴리에틸렌 글리콜, 실리카 겔, 알루미나, 조절된 기공 유리 및 제오라이트와 같은 디엔 또는 친디엔체 유도화 무기 산화물, 기타 친디엔제 또는 디엔 유도화 폴리마, 소수성 가역상 수지, 예를들면 C2∼C18 폴리스티렌, 티오프로필 세파로오즈(파아마시아 바이오테크사), 수은화 수지, 아가로우스 아디프산 히드라지드(파아마시아 바이오테크사) 또는 아비딘 수지가 있다.
"친디엔체"는 알켄 그룹, 또는 탄소와 헤테로원자 사이의 2중 결합, 또는 2개의 헤테로 원자 사이의 2중 결합을 지닌 분자로서 정의되는데, 이것은 적절한 디엔과의 [2+4] 부가 고리화 반응을 감당할 수 있다.
"디엔"은 2개의 인접한 2중 결합을 지닌 분자로서 정의되는데, 여기서 이들 2중 결합을 형성하는 원자는 탄소 또는 헤테로 원자일 수 있으며, 친디엔체와의 [2+4] 부가 고리화 반응을 감당할 수 있다.
친디엔체는 임의의 그룹이 될 수 있는데, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 치환 또는 미치환 알켄, 또는 치환 또는 미치환 알킨이 포함된다. 통상적으로, 친디엔체는 화학식 C=C-Z 또는 Z'-C=C-Z으로 표시되는 치환된 알켄인데, 여기서 Z 및 Z'는 CHO, COR, COOH, COCl, COAr, CN, NO2, Ar, CH2OH, CH2Cl, CH2NH2, CH2CN, CH2COOH, 할로겐 또는 C=C로부터 각각 독립적으로 선택된 전자 끌기 그룹이다.
"친디엔체 유도화 고형 지지체"는 친디엔체로 기능화된 고형 지지체를 말하며, "디엔 유도화 고형 지지체"는 디엔으로 기능화된 고형 지지체를 가르킨다. 바람직한 고형 지지체는, 도식 13 및 14에서 예시한 바와 같이, 기능화 될 수 있는 히드록실 그룹을 갖고 있는, 실리카, 알루미나, 제오라이트, 조절된 기공 유리로부터 선택된 무기 산화물, 또는 폴리스티렌과 같은 유기 지지체이다. 바람직한 구체예에서, 친디엔체는 말레이미드이며 디엔은 3,5-헥사디엔이다.
본 발명의 "5-보호 모노마 단위"는 일반적으로 다음과 같이 표시되는데, 리보스 고리에 대하여 관습적인 번호가 부여된다:
B는 핵 염기
A 및 A'는 2'-당치환체
W는 포스포아미디트, H-포스폰산염, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 보호된 올리고뉴클레오티드 및 메틸-포스폰산염으로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되며; 및
D-E는 미반응 올리고뉴클레오티드 출발물질로부터 성공적으로 반응된 올리고뉴클레오티드 생성물을 분리해 내기 위한 앵커의 역할을 하는 알코올 보호작용 그룹이다.
구체적으로 제한하려고 한 것이 아니라 일반화된 형식의 반응을 나타내고 있는, 상술한 치환체에 대한 기타의 자명한 치환도 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서:
W는 포스포아미디트 또는 H-포스폰산염;
A 및 A'는, H,2H,3H, Cl, F, OH, NHOR1, NHOR3, NHNHR3, NHR3, =NH, CHCN, CHCl2, SH, SR3, CFH2, CF2H, CR2 2Br, -(OCH2CH2)nOCH3, OR4및 이미다졸로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택된다(미국 특허출원 제 08/264,029호, 1994년 6월 22일 출원, 발명의 명칭" 2' 변형된 피리미딘 분자내 친핵성 치환체의 신규 제조방법"(Novel Method of Preparation of 2' Modified Pyrimidines Intramolecular Nucleophilic Displacement"를 참조할 것), 이를 여기서 참고로 인용한다);
R1은 H 및 알코올 보호작용 그룹으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된다;
R2는 =0, =S, H, OH, CCl3, CF3, 할라이드, 선택적으로 치환된 C1∼C20알킬(고리형, 직쇄 및 가지쇄를 포함), 알케닐, 아릴, C1∼C20아실, 벤조일, OR4및 에스테르로 구성되어 있는 군으로부터 선택된다;
R3는 R2, R4, CN, C(O)NH2, C(S)NH2, C(O)CF3, SO2R4, 아미노산, 펩티드 및 그들의 혼합물로 구성되어 있는 군으로부터 선택된다:
R4는 선택적으로 치환된 탄화수소 (C1∼C10알킬, C2∼C20알케닐, C2-C20알키닐), 선택적으로 치환된 헤테로고리, t-부틸디메틸실릴 에테르, 트리이소프로필실릴 에테르, 뉴클레오시드, 탄수화물, 형광 라벨 및 인산염으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된다; 가장 바람직하게는 A는 H, OH, NH2, Cl, F, NHOR3, OR4, OSiR4 3로 구성되어 있는 군으로부터 선택된다(미국 특허출원 제 08/264,029호, 1994년 6월 22일 출원, 발명의 명칭 "Novel Method of Preparation of 2' Modified Pyrimidines Intramolecular Nucleophilic Displacement"를 참조할 것);
D-E는 불필요한 부산물 및 출발물질로부터 "성장 올리고뉴클레오티드 사슬" 또는 "올리고뉴클레오티드 생성물"을 분리해 낼 수 있는 임의의 그룹이 될 수 있다. 분리는 임의의 적절한 방법으로 수행될 수 있는데, 그 방법에는, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 실리카 겔 기초 크로마토그라피, 원심분리, 또는 분리작업 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 기타 방법이 포함된다. 바람직한 분리 방법은 수지에의 결합에 의한 것이다. 가장 바람직한 분리 방법은 D와 유도화된 수지, 폴리마 또는 막과 같은 유도화된 고형 지지체 사이의 공유 결합 반응에 의한 것이다. 따라서, 보호 작용 그룹 D∼E는, D가 특정 수지 또는 상에 대하여 강력한 친화성을 갖도록 고안되며 E는 5'-산소-E 결합이 고도의 선택성으로 용이하게 분열되도록 고안된다. E가 수지 또는 상에 대하여 높은 친화성을 보일 경우, D는 삭제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 보호작용 그룹 D∼E는, D가 특정 유도화된 수지, 폴리마 또는 막에, 선택적 또는 특이적으로 공유 결합을 형성하도록 고안된다.
E는, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 아래에 도시한 바와 같은, 트리틸 그룹 또는 레뷰린산 그룹 또는 실릴 에테르 그룹을 포함한다.
D는, 이것만에 국한되는 것은 아니나, H, OR4, 콘쥬게이트 디엔 단위를 지닌 치환된 알킬 또는 알킬 그룹, 콘쥬게이트 디엔 단위를 지닌 치환된 알콕시 또는 알콕시 그룹, CH2=CHCH=CHCH2CH2O-, 말레이미드 치환 알콕시 그룹, 친디엔체 치환 알콕시 그룹, 알콕시 그룹, 콘쥬게이트 디엔 단위를 지닌 치환된 알킬아미노 또는 알킬아미노 그룹, 말레이미드 치환 알킬아미노 그룹 또는 치환된 알킬아미노그룹, 친디엔체 성분을 지닌 치환된 알킬아미노 그룹 또는 알킬아미노 그룹, 디술피드, 알데히드, 및 금속 킬레이트제로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는데, 그중 일부 예가 아래에 표시된다. 위에 기재된 치환체상의 알킬 그룹은 1∼50 탄소, 바람직하게는 1∼30 탄소를 가질 수 있다.
본 발명의 목적에 있어서, "핵염기"는 다음과 같이 정의된다. 핵염기는 퓨린 또는 피리미딘 염기이다. 핵염기는 당분야의 숙련자에게 현재 알려져 있는 모든 퓨린 및 피리미딘 또는 그들의 화학적 변형체를 포함한다. 퓨린은 퓨린 고리의 9 위치에 있는 질소를 통하여 리보스 고리에 부착되며 피리미딘은 피리미딘 고리의 1 위치에 있는 질소를 통하여 리보스 고리에 부착된다. 피리미딘은 피리미딘 고리의 5- 또는 6- 위치에서 변형될 수 있으며 퓨린은 퓨린 고리의 2-, 6- 또는 8- 위치에서 변형될 수 있다. 미국 특허출원 제 08/264,029호, 1994년 6월 22일 출원, 발명의 명칭" 2' 변형된 피리미딘 분자내 친핵성 치환체의 신규 제조방법" 및 미국특허출원 제08/458,149호, 1994년 6월 2일 출원, 발명의 명칭 "팔라듐 촉매 작용 뉴클레오시드 변형- 친핵체 및 일산화탄소를 사용하는 방법"(Palladium Catalyzed Nucleoside Modifications-Methods Using Nucleophiles and Carbon Monoxide") 및 미국특허 제5,428,149호, 발명의 명칭 "팔라듐 촉매작용 탄소-탄소 카플링 및 제조방법"(Method for Palladium Catalyzed Carbon-Carbon Coupling and Productions")에는 특정 변형방법이 기재되어 있는데, 여기서 이들을 참고로 인용한다. 좀더 구체적으로 핵염기는, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 유라실, 시토신, N4-보호 시토신, 4-티오유라실, 이소시토신, 5-메틸유라실(티민), 5-치환 유라실, 아데닌, N6-보호 아데닌, 구아닌, N2-보호 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 할로겐화 퓨린 및 이미다졸과 같이 퓨린 또는 피리미딘을 의태하는 헤테로 고리 화합물을 포함한다.
여기서 사용된 "출발물질"이라는 용어는, 하나 이상의 뉴클레오티드에 의하여 연장된 올리고마를 제조하기 위하여 PASS의 각 과정중에 5'-보호 모노마 단위와 반응하는 화합물을 가르킨다. 출발물질은, 요망되는 올리고뉴클레오티드 생성물에 따라, 뉴클레오티드간의 [5',3'] 연결 또는 뉴클레오티드간의 [3',3'] 연결을 형성하도록 고안될 수 있다. 첫째 예로서, 출발물질은 5'-탈보호된 아니면 보호된, 길이 n의 올리고뉴클레오티드이며, 제2 경우에는 출발물질 3'-탈보호된 아니면 보호된, 길이 n의 올리고뉴클레오티드이다. 통상적으로 출발물질은 5'-탈보호된 아니면 보호된, 길이 n의 올리고뉴클레오티드인데, 여기서 n은 1∼1000의 정수이다. 출발물질은 염기 불안정 그룹과 같은 보호작용 그룹에 의하여 2',3'-보호되는데, 상기 염기 불안정 그룹은 5'-보호 모노마 단위와 출발물질의 반응 및 5'-탈보호 반응과 양립할 수 있다. 또한, PASS 공정이 올리고뉴클레오티드의 조절된, 그리고 연속적인 중합반응으로 구성되기 때문에, 하나의 PASS 과정의 출발물질은 통상적으로 전단계 PASS 과정으로부터 나온 탈보호 생성물이다. PASS 공정이, 3'-말단 뉴클레오티드가 고형 지지체에 고정되는 것을 필요로 하고 있지 않기 때문에, 출발물질은 비-뉴클레오시드 변형체를 포함할 수 있다. 비-뉴클레오시드 변형체는 3'-말단에 도입될 수 있는데, 이것은 통상적으로 고형상 합성법에 의하여는 가능하지 않다. 출발물질의 3'-말단에 대한 비-뉴클레오시드 변형법에는, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 개선된 약물 동태학성을 지닌 올리고뉴클레오티드의 제조를 위하여, 폴리에틸렌 글리콜 모노-메틸에테르(분자량 5,000∼100,000)(PEG) 또는 3'-말단 모노마와 같은 기타 고분자량의 비-면역원 단위를 사용하는 방법을 포함한다.
여기서 사용된 "생성물"이라는 용어는, 각 PASS 과정중에 5'-보호 모노마 단위와 출발물질의 공유결합 반응에 의하여 제조된 올리고뉴클레오티드를 말한다. 위에서 언급한 바와 같이, 출발물질이 길이 n인 5'-보호 올리고뉴클레오티드이고, 5'-모노마 단위가 단일 뉴클레오티드이면, 반응 생성물은 길이 n+1인 5'-보호 올리고뉴클레오티드가 된다. 5'-보호 모노마 단위가 길이 m의 올리고뉴클레오티드 블록이면, 반응생성물은 길이 n+m인 5-보호 올리고뉴클레오티드가 된다. 특정 PASS 과정으로부터 나온 생성물은 다음에 5'-탈보호되어, 다음 과정의 출발물질로 된다.
"실패서열"은 특정 PASS 과정중에 5'-보호된 모노 단위와의 반응에 실패한 PASS 과정으로부터 나온 출발물질을 말한다.
"성장 올리고뉴클레오티드 사슬"은 본 발명의 방법을 이용하여 소정의 뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오티드로 시작되는 뉴클레오티드(N)의 연속 첨가에 의하여 제조된 5'-탈보호 올리고뉴클레오티드 사슬이나 5'-보호 올리고뉴클레오티드 사슬을 말한다. PASS 공정의 각 반응 과정후에, 성장 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드에 의하여 길이가 증가되며 다음번 반응과정용의 출발물질이 된다. 여기서 사용된 바와 같이, 이 용어는 출발물질이나 생성물을 가르킬 수 있으며, 당분야의 숙련자는 특정 문맥에 있어서 그 용어가 무엇을 의미하는지를 인식하게 된다.
도식 2는 본 발명의 방법을 일반적으로 예시한다. 포스포아미디트[7]와 같은 5'-보호 모노마 단위가, 생성물[9]을 산출하기 위하여, 테트라졸 또는 바람직하게는 4,5-디시아노이니다졸(DCI)과 같은 활성제(미국특허출원 제- , 1996년 10월 15일 출원, 발명의 명칭 "올리고뉴클레오티드 합성을 위한 개선된 카플링 활성제"("Improved Coupling Activators for Oligonucleotide Synthesis")를 참조할 것)의 존재하에 용액중의 출발물질[8]에 첨가되는데, 상기 생성물[9]에는 아인산염 트리에스테르 연결을 통하여 하나의 뉴클레오티드가 첨가된다. 이 도면에 표시된 바와 같이, 출발물질[8]은 길이가 n인 5'-탈보호, 아니면 보호 올리고뉴클레오티드인데, 여기서 n은 1∼1000의 정수이며, 생성물은 길이가 n+1인 5'-보호 올리고뉴클레오티드가 된다. 5'-탈보호 올리고뉴클레오티드 출발물질[8]은 고형 지지체에 고정되지 않고, 오히려 표준방법을 사용하여, 5'-보호 모노마 단위와 출발물질의 반응 및 5'-탈보호 반응과 양립할 수 있는, 염기 불안정 그룹과 같은, 보호작용 그룹에 의하여 단순히 2',3'-보호된다. 고형 지지체에 대한 3'-고정작업의 배제는 올리고뉴클레오티드에 첨합될 수 있는 3'-변형의 범위를 확대시킨다. 또한, 3'-말단 뉴클레오티드는 지지체 고정 작업에 필요한 히드록실 치환체를 더 이상 지니고 있을 필요가 없게 된다. 따라서 변형은 고형상 합성법으로는 불가능한 3'-말단에 도입될 수 있다. 이것은, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 개선된 약물 동태학성으로 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위하여, 폴리에틸렌 글리콜 모노-메틸에테르(분자량 5,000∼100,000) 또는 3'-말단 모노마와 같은 기타의 고분자량 비-면역원성 단위를 사용하는 방법을 포함한다(미국특허출원 제 08/434,465호, 1995년 5월 4일 출원, 발명의 명칭 "헥산 리간드 복합체"("Nucleic Acid Ligand Complexes")를 참조할 것. 이를 여기서 참고로 인용한다).
5'-보호 모노마 단위[7]와 출발물질[8]간의 반응이 완결된 후, 반응혼합물은 다음과 같은 3종류의 물질을 함유한다: 미반응 5'-보호 모노마 단위[7], 미반응 출발물질[8], 및 길이가 n+1인 5'-보호 올리고뉴클레오티드인, 반응생성물, 화합물[9]이다. 위에서 논의한 바와같이, 5'-보호 모노마 단위[7]와의 반응에 실패한 임의의 출발물질[8](길이가 n인 5'-탈보호 올리고뉴클레오티드)은, 이 서열이 연장되지 않았기 때문에, 실패서열이라 부른다. 반응생성화합물[9]은, 길이 n의 올리고뉴클레오티드인 출발물질[8]의 5'-히드록시 그룹과 5'-보호 모노마 단위[7]의 3'-포스포아미디트의 공유결합 반응에 의하여, 하나의 뉴클레오티드(길이 n+1)에 의하여 연장된 5'-보호 올리고뉴클레오티드 사슬이다. 생성화합물[9]은 주성분이며 반응하지 못한 5'-보호 모노마 단위[7] 및 출발물질[8]은 단지 미량으로 존재한다.
공정의 이 단계에서, 생성물을 정제하고 모노마 출발물질을 회수하기 위하여, 반응 혼합물로부터 미반응 5'-보호 모노마 단위를 제거할 필요가 있다. 본 구체예에 따라, 미반응 모노마는 용이하게 제거할 수 있는 이온류를 형성하도록 작용을 받는다. 단순히 산화제를 첨가함으로써 동일한 반응 플라스크내에서 아인산염 트리에스테르가 인산염 트리에스테르로의 산화작용이 일어날 수 있다. 현장에서의 산화작용으로, 필요한 올리고뉴클레오티드 생성물[9], 모노마[7]의 인산염[10] 및 미반응 올리고뉴클레오티드 출발물질[8]이 얻어진다. 모노마 인산염[10]은 단지 반응혼합물내의 유리 염이어서, 당분야의 숙련자에 공지된 기술에 의하여 용이하게 제거되는데, 상기 공지기술에는, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 음이온 교환 수지 또는 막을 통한 여과 또는 수성상으로 추출하는 방법이 포함된다. 본 발명의 하나의 변형된 구체예에 있어서, 3'-말단 모노마는 분자량이 5,000∼100,000, 바람직하게는 20,000인 폴리에틸렌 글리콜 모노-메틸에테르이다. 이 경우, 모노마[10]를 제거하기 위하여 단순한 분자량 차단막이 이용될 수 있다.
미반응 모노마가 반응 혼합물로부터 제거된 후, 잔류 여액은 다음에 "실패서열"로부터 "올리고뉴클레오티드 생성물"을 분리하는데 적합한 임의의 방법으로 분리될 수 있다. 하나의 구체예에서 여액은, 가역상 수지와 같이, 5'-보호작용 그룹(D∼E)와 선택적 또는 특이적으로 상호작용하도록 고안된 물질에 적용된다. 생성물은, 5'-보호작용 그룹 성분 D와 수지의 친화력에 의하여 고형 지지체상에 포착 또는 유지된다. 바람직한 구체예에서 여액은, 친디엔체 유도화 수지와 같이, 5'-보호작용 그룹(D∼E)와 공유결합 반응하도록 고안된 물질에 적용되는데, 여기서 D는 디엔 단위를 함유한다. 생성물은, 5'-보호작용 그룹 성분 D와 수지의 공유결합 반응에 의하여 고형 지지체상에 포착 또는 유지된다. 5'-보호작용 그룹 D를 지나지 않은 미반응 올리고뉴클레오티드 출발물질[8]은 세척되어 버린다. 미반응 출발물질은 후속 합성에 있어서 중간체로서 사용되기 위하여 유리 및 저장된다. 체류된 올리고뉴클레오티드 생성물[9]은 다음에 잘 알려진 공정에 따라 수지로부터 방출된다. 특정 구체예에 있어서 올리고뉴클레오티드 생성물은 5'-산소 및 보호작용 그룹(D∼E) 사이 결합의 분열에 의하여 방출된다. 예를들면, 5'-보호작용 그룹이 트리틸 유도체일 경우, 묽은 디클로로아세트산(DCA)과 같은 시약이 트리틸 그룹을 분열시키기 위하여 사용되어 올리고뉴클레오티드 카플링 생성물을 방출할 수 있다. 유리된 5'-탈보호 올리고뉴클레오티드 카플링 생성물[11]은 다음에 추가의 카플링 반응에서 출발물질로 사용될 수 있다.
(도식 2)
도식 2에 표시된 모노마 첨가 과정에 있어서의 단계가 상술한 바와 같은 정확한 순서로 발생하는 것을 본 발명이 요구조건으로 하는 것은 아니다. 변형된 방법으로, 현장에서의 카플링 및 산화 후에 생성물 및 모노마[10]가 수지상에 공유결합 또는 친화성 포착이 뒤따를 수 있다. 후속되는 5'-보호작용 그룹의 분열은 생성물 및 모노마를 유리시킨다. 이 단계에서, 추출 또는 막-기준 여과로 불필요한 모노마 부산물을 용이하게 제거할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 생성물을 고정하기 위하여 5'-보호작용 그룹을 이용하면, 다양한 3'-말단 변형체를 이용할 수 있는 가능성이 생긴다. 이들은, 분리를 위하여 분자량 배제막을 활용하기에 충분한 분자량을 지닌 폴리마, 또는 생성물의 선택적인 침전을 달성할 수 있는 금속 킬레이트제와 같이, 5'-보호 모노마 단위로부터 반응 생성물의 분리가 용이하도록 고안된 그룹일 수 있다. 이와같은 경우에, 이들 그룹은 숙신산염 링커와 같이, 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 및 변형 그룹 사이의 분열 가능 그룹을 함유한다. 변형적 방법으로, 폴리에틸렌 글리콜 모노-메틸에테르 또는 디스테아릴 글리세롤과 같이, 비-뉴클레오시드 3'-말단 치환체가 올리고뉴클레오티드 생성물의 약물동태학적 특성을 강화시킬 수 있다(미국특허출원 제 08/434,465호, 1995년 5월 4일 출원, 발명의 명칭 "헥산리간드 복합체" 참조할 것. 이를 여기서 참고로 인용한다). 3'-말단 모노마는 또한 생체내 영상을 위한 Tc99m을 유지하도록 고안된 킬레이트제와 같이, 올리고뉴클레오티드의 진단용으로서의 검출기 역할을 한다(특허출원 제 WO96/02274호, 199년 2월 1일 공고, 발명의 명칭 "금속 복합체 및 올리고뉴클레오티드로 제조된 콘쥬게이트, 콘쥬게이트를 함유하는 제재, 방사선 진단에 있어서의 그 사용 및 그 제조방법"("Conjugates Made of Metal Complexes and Oligonucleotides, Agents Containing the Conjugates, Their Use in Radiodiagnosis as well as Process for Their Production"), 이를 여기서 참고로 인용한다). 종래의 고형상 올리고뉴클레오티드 합성법에 있어서는, 성장 사슬을 고형 지지체에 고정시키는 방법이 이용되었기 때문에, 3'-말단은 그와같은 성분을 도입하는 것이 용이하지 않았다.
종래의 고형상 합성법과는 대조적으로, 올리고뉴클레오티드 생성물은 새로운 카플링 반응이 수행될 때마다 미반응 출발물질로부터 바람직하게 분리된다. 따라서, 최종 올리고뉴클레오티드 생성물은 실질적으로 순수한 형태로 얻어지며, 극히 상동성인 실패서열을 제거해야 한다는 번거로움이 면제된다. 또한 반응이 액상중에서 수행되기 때문에, 모노마와 올리고뉴클레오티드 출발물질 간의 반응수율은 현저하게 증가된다. 또한, 단지 성공적인 올리고뉴클레오티드 카플링 생성물만이 공정의 다음 단계로 들어가기 때문에 캡핑 단계가 이 도식에 있어서 불필요하게 된다. 캡핑 단계를 생략하게 되는 결과, 종래 공정에 비하여 다른 하나의 효율성을 얻는 셈이 된다. 5'-보호 모노마 단위와의 반응에 실패한 올리고뉴클레오티드 출발물질(실패서열)이 대신에 유리되어 재사용될 수 있다. 실패서열이 PASS 과정의 반복중에 재유리될 때마다, 동일 단계에서 또는 동일 올리고마나, 또는 동일 3'-말단 단편을 공유하는 올리고마의 후속 합성의 반복중에 출발물질에 혼합될 수 있다(도식 3 참조). 따라서, 실패서열은 올리고뉴클레오티드의 후속 제조용의 유용한 연속성 기본재료가 된다. 이와같은 현상은 공정의 효율성을 증가시킬 뿐만 아니라, 최종 조생성물의 순도를 극적으로 증가시킨다. 이것은 또한 모노마를 한정시약으로서 사용하는 것을 가능케 하여 공정 효율성을 극적으로 증가시킨다.
(도식 3)
5'-보호작용 그룹을, 출발물질로부터 생성물을 분리하기 위한 앵커로서 활용하며, 실패서열을 후속 합성용 중간체가 되게 하는 상기 개략적인 합성 도식은 포스포아미디트 카플링 화학반응에 국한되지 않는다. 그것은 H-포스폰산염 또는 인산염 트리에스테르 카플링 화학반응과 같은 기타 카플링 반응과 양립할 수 있다(가프니(Gaffney) 및 존스(Jones)(1988) Tetrahedron Lett.29: 2619 - 2622 참조). 이 도식은 또한 올리고뉴클레오티드 합성의 자동화에 적합하며, 높은 효율로 올리고뉴클레오티드를 대규모로 제조하는데 이상적으로 적합하다.
여기에 기재된 기술의 관점은 PASS 합성공정방법 이외의 적용범위를 갖는다. 예를들면, 올리고뉴클레오티드 합성에 있어서의 필요한 또는 불필요한 물질의 공유결합 포착방법은 또한 고도의 분리작업, 종래의 고형상 또는 액상 공정에 있어서의 단단계 정제방법에도 응용될 수 있다. 오직 말단 모노마만이 그 5'-말단에 디엔 변형 트리틸 그룹을 지니고 있으면, 친디엔체 유도화 수지 또는 막에 대한 전장 생성물의 선택적인 고정작용이, 조혼합물로부터 모든 주 실패서열을 제거한다(도식 1 참조). 다른 응용에 있어서, 3,5-헥사디엔옥시아세트산 무수물 또는 트리-(3,5-헥사디엔옥시) 염화실릴과 같이, 디엔-변형 아세트산 무수물(또는 일반적으로 D-변형 아세트산 무수물) 또는 디엔-변형 염화실릴과 같은 공유결합 포착에 적합한 성분을 함유하는 캡핑제재가 사용되면(상술한 모든 D 그룹 적용), 모든 캡핑처리된 실패서열은, 각각의 모노마 첨가 후(액상 올리고뉴클레오티드 합성 공정에서)나 또는 고형 지지체로부터 조 올리고뉴클레오티드의 분열 후(종래의 고형상 올리고뉴클레오티드 합성공정에서)에 조 올리고뉴클레오티드 뱃치로부터 제거될 수 있다. 또다른 응용에 있어서, 디엔 변형 트리틸 그룹과 친디엔체 변형 수지와의 반응은 양이온 교환 수지의 제조를 용이하게 한다.
2'-플루오로피리미딘 변형 RNA 올리고뉴클레오티드의 2량체가 실시예 1에서 PASS 공정에 의하여 조성된다(도식 4). 제 1 반응에서, 포스포아미디트 카플링 화학반응이 채용되어 3',3'-포스포디에스테르 연결을 형성한다. 3'-말단에서의 3',3' -포스포디에스테르 연결의 첨합에 의하여, 올리고뉴클레오티드가 3'에서 5'-엑소헥산분해 효소적 분해에 대하여 흔히 보호된다. 카플링 후, 반응혼합물은 현장에서 산화되어 미반응 티미딘 출발물질[12], 산화된 아미디트 모노마[15], 및 산화된 2량체 생성물[14]이 제조된다.
산화된 아미디트 모노마[15]는 디에틸아미노에틸렌(DEAE) Sephadex의 베드를 통하여 반응혼합물을 여과함으로써 제거된다. 여액의 HPLC 분석결과는, 산화된 아미디트 모노마[15]가, 제 3도에 도시한 바와같이, DEAE Sephades에 의하여 유지되고 있음을 나타낸다. 산화된 2량체 생성물[14] 및 미반응 티미딘 출발물질[12]를 함유하는 여액은 농축되어 60% 아세토니트릴/물 중에서 재용해되고 C18 필터플러그상에 적재된다. 수지는 70% 물/아세토니트릴 및 다음에는 50% 물/아세토니트릴로 세척되어 미반응 티미딘 출발물질[12]을 완전히 용리하게 된다. 이제는 단지 트리틸화 2량체 생성물[14]만을 함유하는 수지는, 물로 세척된 후 80% 아세트산/물로 처리되어 탈트리틸화를 달성한다. 수지는 다음에 50% 아세토니트릴/물로 세척되어 최종 생성물[16]을 용리하는 한편 트리틸류를 유지하게 된다(제 4도).
(도식 4)
실시예 2(도식 5)는 본 발명의 방법을 예시하는데, 여기서 5'-보호 모노마 단위는 포스포아미디트가 아니라 H-포스폰산염이다. 이 실시예에서 3'-말단에 3',3'-뉴클레오티드간 연결을 지니고 있는 H-포스폰산염 티미딘 3량체 (T-T -[3',3']-T 3량체)[20]가 제조된다. 액상 카플링 반응의 효율은 미반응 3'-말단 단편[19]이 검출되지 않을 정도로 높았다. 즉 가역상 단계는 트리틸 그룹을 생성물로부터 분열 및 분리시키는데만 이용된다.
실시예 3(도식 6)은 5'-보호작용 그룹(D∼E)으로서 5'-O-(4,4'-디옥타데실옥시트리틸)(DOT)을 함유하고 있는 포스포아미디트 모노마의 합성방법을 기술하고 있다.
실시예 4는, 5'-보호작용 그룹(D∼E)과 특정 수지 또는 상의 선택적 또는 특이적 상호작용을 기초로, 미반응 올리고뉴클레오티드 출발물질(실패서열)로부터 카플링 생성물을 분리하는 능력을 예시한다. 이 실시예에서, C18 가역상 수지상에서의 4,4'-디옥타데실트리페닐메탄올(DOT)[23]의 운동성이 4-디시클옥시-4'-메톡시트리탄올 및 디메톡시트리탄올(DMT)의 운동성과 비교되었다(표 1 참조). DOT 그룹과, 메탄올(Rf=0) 및 아세토니트릴(Rf=0)과 같은 유기 용매중의 C18 수지와의 강력한 상호작용은, 혼합물을 C18 수지상에 적재하고 및 미반응 출발물질을 유기용매로 세척해냄으로써, 출발물질로부터 생성물의 한단계 분리가 가능케 된다. 연결된 생성물은 다음에 트리틸 보호작용 그룹을 유기용매 중의 할로아세트산으로 분열시킴으로써 챔버로부터 용리될 수 있다. 트리틸 그룹은 수지상에 유지된다.
실시예 5는, 실패서열을 체류시키지 않으면서 5'-DMT 보호 생성물을 선택적으로 포착하기 위한 C18 가역상 수지 및 과잉 모노마를 제거하기 위한 음이온 교환 매개체를 사용하여, 용액중에서 6량체 올리고뉴클레오티드(5'-HO-T-T-A-C-T -[3',3']-T)를 조성하는 과정을 기재한다. 실시예 5에서 알 수 있는 바와 같이, 각 모노마 첨가는 두 단계로 완수된다. 제 1단계에서, 5'-보호 모노마 단위를 출발물질에 연결시키기 위하여 포스포아미디트 카플링 화학반응이 채택된다. 카플링 후, 반응혼합물은 현장에서 산화되어 미반응 출발물질(실패서열), 산화된 아미디트모노마 및 산화된 생성물을 산출한다. 산화된 아미디트 모노마는, DEAE Sephadex와 같은 음이온 교환 매체를 통하여 반응 혼합물을 여과함으로써 제거된다.
제2 단계에서, 산화된 생성물 및 미반응 출발물질(실패서열)을 함유하고 있는 여액은 묽은 산으로 처리되어 탈트리틸화 된다. 사용 가능한 묽은 산의 예로는, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 묽은 광물산, 묽은 트리클로로아세트산, 묽은 디클로로아세트산(DCA), 루이스산, 예를들면 ZnBr2, 니트로메탄, 토스산(tosic acid) 및 과염소산이 포함된다. 다음에 혼합물은 크로마토그라피에 의하여 분리된다. 변형적인 방법으로, 생성물 및 미반응 출발물질의 혼합물이 우선 가역상 수지를 사용하여 분리된 후 탈트리틸화 되어 수지로부터 탈트리틸화 생성물을 방출하게 된다. 실시예 5에 제공된 분석 데이터는, PASS 방법이 비용 한정 모노마를 최소로 소비하면서도, 매 반복단계에서 실질적으로 순수한 올리고뉴클레오티드 중간체를 생성한다는 것을 나타내고 있다.
실시예 6(제 5도)은, 반응혼합물의 잔류물로부터 미반응 5'-보호 모노마 단위를 분리하기 위하여, 본 발명의 방법과 함께 사용되도록 고안된 자동화 추출/여과 시스템[100]을 개략적으로 예시한다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 자동화에 유용하며, 따라서 대규모의 올리고뉴클레오티드 제조에 이상적으로 적합하다. 자동화 추출/여과 시스템[100]은 다음과 같은 2개의 센타를 갖는다: 추출용기[112] 및 크로마토그라피 수지여과 챔버[114]이다. 추출용기는 튜브[118]에 의하여 크로마토그라피 수지 챔버와 유체 소통된다. 제1 3방향 발브[120]는 추출용기[112]로부터 크로마토그라피 챔버[114]로의 내용물 유동을 조절한다. 제2 발브[122]는 챔버[114]로의 용매 첨가를 조절한다. 제3 발브[124]는 챔버[114]로부터 나오는 유출액의 수집을 조절한다. 3개의 모든 발브는 조절장치[126]에 전자공학적으로 연결되는데, 상기 조절장치는 다양한 유동 위치 사이에서 3개의 모든 발브[120], [122] 및 [124]를 작동시키는 신호를 제공한다.
추출용기[112]에는 2개의 입구 포트[128] 및 [130], 교반기[132] 및 출구 포트[134]가 설치되어 있다. 반응혼합물은 입구 포트[128]을 통하여 추출용기[112]로 펌핑되고, CH2Cl2와 같은 추출용매 및 수성 완충액은 입구포트[130]을 통하여 추출용기로 펌핑된다. 혼합물은 교반기[132]로 교반될 수 있으며, 다음에는 층이 분리되도록 방치된다. 다음에 제1 3방향 발브[120]가 열리고, 바닥 유기층이 출구 포트[134]를 통하여 전도도 모니터[136]로, 다음에는 튜브[118]을 통하여 챔버[114]로 유입된다. 전도도 모니터는 조절장치[126]에 전기적으로 연결된다. 전도도가 상승하면 유기층이 전도도 모니터를 관통하며 수성층이 들어오기 시작한다는 것을 나타낸다. 전도도가 상승하는 것은 조절장치[126]에 의하여 알 수 있는데, 조절장치는 수성층을 챔버[114]로부터 전환되어 버리도록 3방향 발브를 작동시키도록 제1 3방향 발브[120]에 신호를 보낸다.
챔버[114]에는 3개의 입구 포트[138], [140] 및 [142] 및 출구 포트[144]가 설치되어 있다. 유기층은 입구포트[138]를 통하여 챔버[114]로 들어가며, 아르곤과 같은 가압 불활성 가스 공급원에 의하여 챔버[114]를 통하여 밀려나오는데, 상기 불활성 가스는 입구 포트[140]를 통하여 챔버로 들어간다. 챔버는 다음에 CH2Cl2와 같은 용매로 세척되는데, 용매는 입구포트[142]를 통하여 챔버로 들어간다. 용매의 첨가는, 제2 발브[122]를 선택적으로 작동시키는 조절장치에 의하여 조절된다. 유기물 유출액은 조절장치[126]에 의하여 제3 발브[124]를 열므로써 출구 포트[144]를 통하여 수집된다. 유기물 유출액은, 하나의 뉴클레오티드에 의하여 연장된 출발물질인 반응생성물 및 미반응 올리고뉴클레오티드 출발물질(실패서열)을 함유한다. 미반응 5'-보호 모노마는 챔버[114]에 체류된다. 유기용매의 용출 후, 챔버[114]는 입구포트[140]를 통하여 첨가된 완충액으로 세척되는데, 입구포트[140]는 미반응 5'-보호 모노마 단위를 용출시킨다. 챔버[114]는 다음에, 반응 혼합물을 용리시키는데 사용되는, 예를들면 CH2Cl2와 같은 유기용매로 다시 평형을 이룬다. 유기물 유출액은 가역상 수지상을 재차 관통하여 미반응 올리고뉴클레오티드 출발물질(실패서열)로부터 생성물을 분리하게 된다(실시예 6 참조).
실시예 7은 3'잔기 변형으로서 분자량이 20,000인 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 15염기 올리고뉴클레오티드(5'-CTAAACGTAATGG-[3',3']-T-T-3')(SEQ ID NO: 1)의 액상 합성법을 설명한다. 이 실시예는 액상 합성법의 효율성 및 종래의 고형상 합성법을 사용하여서는 직접적으로는 제조될 수 없는 용액중에서의 3'-변형 올리고뉴클레오티드의 제조 가능성을 과시하고 있다. 본 실시예는, 올리고뉴클레오티드 카플링 생성물이 통상적인 PASS 과정에서와 같이 수지상에 포착되는 단계없이, 액상 합성법에 요구되는 기본 단계를 약술하고 있다. 따라서 본 실시예는 또한 PASS에서 의도하고 있는 바와 같이, 생성물 포착으로 제공될 수 있는 효율성 및 생성물 순도에 대한 영향력을 과시하고 있다. 각 모노마 첨가 과정에서의 이와같은 생성물 포착으로, 종래의 고형상 합성법에서와 같은 디에틸에테르로부터의 번거로운 침전 작업은 더 이상 필요없게 된다. 또한 실패서열이 매 모노마 첨가 과정에서 제거되기 때문에, PASS에 의하여 얻어진 생성물의 음이온 교환 크로마토그람은, 제6도의 크로마토그람에 존재하는 다중 피크보다는 단일 생성물 피크만을 나타낼 것으로 예상된다.
실시예 8(도식 7 및 8)은 5'-디-(3,5-헥사디엔옥시)트리틸티미딘 포스포아미디트 모노마[32] 및 5'-디-(2,4-헥사디엔옥시)트리틸티미딘 포스포아미디트 모노마를 포함하는 다양한 디엔 변형 트리틸 알코올의 합성방법을 설명한다.
실시예 9(도식 9)는 말레이미드로의 효율적인 부가고리화 반응을 위하여 4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸 알코올[30] 및 4,4'-디-2,4-헥사디엔옥시트리틸 알코올[36]과 같은 디엔을 사용하는 방법을 나타낸다(각각 반응 1 및 2(도식 9)). 표 4는 다양한 조건하에서 이들 두 반응에 대한 반응속도를 제시한다. 표 4에 제시된 데이터로부터, 변형된 트리틸 화합물[30]이 다양한 반응 조건하에서 보다 신속히 반응한다는 것이 명백하다. 또한, 예상된 바와 같이, 친디엔체 당량의 증가 및 반응 혼합물에 물을 첨가하는 것 모두가 반응속도를 증가시킨다는 것도 명백하다. 각 트리틸 그룹상에는 2개의 디엔이 존재하기 때문에, 말레이미드-변형 고형상 지지체상에서 모든 트리틸 알코올 또는 뉴클레오티드를 포착하는데는 50% 이상의 디엔 치환체의 반응이면 충분하다는 것을 인식한다는 것은 중요하다. 이것은 반응이 일어나는데 필요한 시간을 단축시킨다.
반응속도를 비교하기 위한 목적으로, 반응 #3에 대하여 주어진 동일한 반응 조건하에서, 5'-0-(4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸)티미딘(5'-DHDT)티미딘[31] 및 5'-0-(4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸)티미딘 3'-포스포아미디트[32]로 디엘스-알더반응이 수행되었다(표 4). 결과는 표 5에 제시된다. 다시 한번, 1시간 이내에 50% 이상의 디엔 그룹이 부가고리화 되었다. 이것은 PASS에서 의도한 바와 같이, 생성물 포착이 타당한 시간내에서 발생하여 신속하고 효율적인 모노마 첨가 과정을 가능케 한다는 것을 암시한다. 디엘스-알더 부가고리화 반응의 속도가 적절히 치환된 디엔 및 친디엔체를 사용함으로써, 목적에 부합되도록 할 수 있다는 것은 널리 알려져 있다. 따라서 생성물 포착 반응속도는 적절한 조합의 디엔 및 친디엔체를 채택함으로써 조절될 수 있다.
실시예 10은 치환된 말레이미드-폴리스티렌 수지상에서 올리고뉴클레오티드 생성물을 포착하기 위하여 4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸 보호작용 그룹을 사용하여 PASS에 의하여 3'-PEG 유도화 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법을 기술한다. 이 포착단계는 반응 혼합물로부터 미반응 출발물질 올리고뉴클레오티드(실패서열)을 제거시킨다. 후자는 올리고뉴클레오티드의 조성에 있어서, 동일 지점에서 후속 생산 뱃치로 혼합되기 위하여 임의로 유리 및 저장될 수 있다. 3'-PEG 말단 변형은, 특히 생체내의 치료적인 올리고뉴클레오티드의 약물동태학적 작용을 강화시키는데 유용하다.
실시예 11은, 디엔으로서 5'-0-(4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸)-뉴클레오시드(5'-0-DHDT-뉴클레오시드)[46] 및 친디엔체로서는 말레이미드 치환 고형지지체[45]를 사용하여, 디엘스-알더 생성물 포착에 의하여 비 PEG 유도화 올리고뉴클레오티드를 제조하는 일반적 반응 구도를 기재한다(도식 11). 위에서 검토한 바와 같이, 수지 또는 막상에서 전장의 올리고뉴클레오티드를 포착하는 것은 PASS 공정을 자동화하는데 필수적인 사항이다. 포착하는 방법의 일반적인 구도는 트리틸 그룹 또는 트리틸 유사체가 수지, 막 또는 폴리마[47]와 같은 고형 지지체상에 비가역적으로 결합되는 것과 관련된다. 일단 결합되면, 올리고뉴클레오티드[49]는 비가역적으로 결합된 트리틸 그룹[48]으로부터 자신을 분리해냄으로써 방출된다. 그 하나의 예가 5'-0-DHDT-뉴클레오시드의 디엘스-알더 포착이다. 수지 결합 활성 디엘스-알더 친디엔체는 디엔 트리틸과 공유결합하며, 종래의 탈트리틸화 방법은 고형 지지체 및 결합된 트리틸 그룹으로부터 뉴클레오시드를 방출한다. 이와같은 포착방법은 실시예 11에 기재된 바와 같이 PASS에 의하여 비 PEG 유도화 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 채택된다(도식 12).
(도식 11)
다수의 고형 지지체는 디엘스-알더 반응을 이용하는 포착 및 방출에 적절하도록 고안된다. 바람직한 고형지지체는 용이하게 기능화될 수 있는 표면 히드록실 그룹을 지닌 무기산화물(실리카, 알루미나, 제오라이트, 조절된 기공유리(CPG) 등)이다. CPG의 경우, 예외가 있을 수 있으나, 이들 무기 고형 지지체는 시중에서 유통되는 수지보다 흔히 훨씬 높은 적재용량을 갖는다. 전통적으로 이들 무기 산화물은, 보다 다능성인 또는 반응성인 기능 그룹을 지닌 실릴화제로 히드록실을 실릴화함으로써 기능화된다(도식 13).
(도식 13)
반응성 친디엔체를 공유 결합식으로 연결시키는 기타의 방법도 고안되어 있는데, 예를들면, 6-말레이미도-카프로산과 표면 히드록실 그룹 사이의 에스테르화 반응이다(도식 14). 표면 적재 및/또는 친디엔체의 반응성을 증가시킬 필요가 있는 경우에는, 표면 및 친디엔체간에 기타의 공유결합 링커가 사용될 수도 있다.
(도식 14)
실시예 12(도식 15)는 디엘스-알더 부가고리화 반응에 의한 생성물 포착을 이용하여 2량체를 제조하는 방법을 기재한다. 3',3'-연결 5'-DHDTO-T-T 2량체의 포착속도는 말레이미드 그룹에 결합된 수지의 과잉량에 좌우된다. 생성물 포착은 정량적으로 진행된다. 포착된 생성물은 디클로로메탄중의 3% 디클로로아세트산으로 수지로부터 용이하게 정량적으로 방출된다. 중화 및 원심분리 후, 순수한 생성물이 얻어진다.
실시예 13은 5'-0-(4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸)보호 올리고뉴클레오티드를 친디엔체 유도화 수지로의 부가 고리화 반응을 이용하여 수지상에 하나의 블록을 포착함으로써 블록으로부터 올리고뉴클레오티드를 구성하는 방법을 기술한다.
실시예 14(제 8도)는 자동화 추출/여과 시스템[200] 및 실시예 10에 기재된 바와 같이, 각 과정에서 모노마 첨가 생성물을 공유결합 포착하는 방법을 이용하여, 3'-말단 폴리에틸렌 글리콜을 지닌 올리고뉴클레오티드을 자동적으로 제조하도록 고안된 방법을 예시한다. 위에서 논의한 바와 같이, 뉴클레오시드 포스포아미디트의 조절된 연속 중합반응으로 구성되어 있는 PASS 공정은 자동화에 이상적으로 적합하며 자동화된 양태로 수행될 수 있다. 각 모노마 첨가는 화학적 처리 단계의 순서로 구성된다. 이 순서는 각 모노마 첨가(과정)에 대하여 동일하다. 과정으로부터 과정으로 오직 가변적인 것은 첨가되는 모노마의 특성 뿐이다. 전형적인 올리고뉴클레오티드는 2∼12개의 상이한 모노마로 구성되는데, 이들은 전용적인, 프로그램화 가능한 순서로, 통상적으로는 한번 이상으로 첨가된다.
제 8도에서 알 수 있는 바와 같이, 자동화 추출/여과 시스템[200]은 다음과 같은 3개의 센터를 갖는다: 반응용기[212], 친디엔체 변형 고형 지지체[215]를 함유하는 여과 챔버[214] 및 한외여과막 시스템[218]이다.
실시예 14는 또한 포착 수지로부터 방출된 후 생성물 올리고뉴클레오티드와 과잉 모노마를 분리하는데 요구되는 조건과 양립할 수 있는 다양한 한외여과막을 기재한다. 막은 제재/생성물 흡착, 유지 및 반응성을 기준으로 평가된다. 실시예 14에 제시된 막은, 용매에 의하여 작용되는 유동속도를 기준으로, 흡착으로 인한 및 최종적으로는 확산 반사 FTIR에 의한 생성물의 손실에 적합하다는 것이 판명되었다.
설명하기 위한 목적으로 실시예 14에 3'-말단 PEG 올리고뉴클레오티드의 제조방법이 기재되어 있으나, 이 자동화 합성법은 올리고뉴클레오티드에 부착된 거대 분자가 있거나 또는 없이도 수행될 수 있다. 후자의 경우, 분자량 배제막은, 제5도에 도시한 바와 같이 액상/액상 추출단계로 대체될 수도 있다.
실시예 15는 말레이미드 유도화 트리틸 그룹의 제조방법을 기재한다. 위에서 논의한 바와 같이, PASS 공정의 필수적인 한 부분은 n-1 서열을 제거하는 방법이다. 하나의 시도방법은 말레이미드 변형 트리틸 그룹을 함유하는 모노마를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것이다. 이들 트리틸 그룹은 디엔 변형 수지와 반응하기 쉬어서, 단순히 수지를 세척함으로써 n-1을 분리되게 하며 다음에 탈트리틸화에 의하여 전장의 올리고뉴클레오티드를 방출하게 된다.
실시예 16은, 액상 합성 및 종래의 고형상 합성중에, 실패서열을 선택적으로 제거하기 위하여 디엔 변형 캡핑제를 사용하는 방법을 기재한다. 통상적으로, 실패서열은 아세트산 무수물로 캡핑처리된다. 아세트산 무수물과의 캡핑 반응은 신속하게 및 거의 정량적으로 진행된다. 따라서, 3,5-헥사디엔오산 무수물[74] 및 3,5-헥사디엔옥시아세트산 무수물[75](도식 18)과 같은 아세트산 무수물의 디엔 변형 유사체는 효율적인 실패서열의 캡핑처리를 가능케 하며, 실시예 7에 기재된 바와 같이 액상 합성중 각 과정에서 친디엔체 유도화 수지 또는 막으로의 부가 고리화 반응에 의하여, 캡처리된 실패서열의 제거도 가능케 한다. 종래의 고형상 합성중에 도입된 5'-아세틸 캡핑작용 그룹은 암모니아 분열 및 탈보호 단계중에 제거된다. 고형상 합성중의 캡핑제로서 및 실패서열의 선별적 제거를 위한 후속 처리제로서 시약[74] 또는 [75]를 이용하기 위하여, 올리고뉴클레오티드는 실시예 12에 기재된 바와 같이 링커를 통하여 지지체에 결합되어야 하는데, 이것은 비염기성 조건하에서 선택적으로 분열가능하다. 변형적 방법으로, 종래의 고형상 합성의 최종 단계에서 사용된 전형적인 염기성 탈보호 조건하에서는 쉽게 제거되지 않는 캡핑제가 사용될 수 있다.
일단, 조 올리고뉴클레오티드가 암모니아로 지지체로부터 분열되면, 염화 헥산디엔옥시실릴[76], [77] 및 [78]은 실패서열의 선택적 제거를 가능케 한다. 실릴 에테르 그룹은 이들 조건하에서는 제거되지 않는다. 따라서, 헥사디엔옥시실릴 캡핑처리 실패서열은 친디엔체 유도화 수지 또는 막과의 반응에 이하여 요망 생성물로부터 제거될 수 있다.
(도식 18)
하기 실시예는 단지 예시하기 위한 목적으로 제공되는 것으로, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1.N-4-벤조일-3'-(5'-tert-부틸디메틸실릴-3'-(2-시아노포스포릴)티미딜)-2'-플루오로사이티딘[16]의 제조(도식 4)
아르곤 분위기하에, 5'-tert-부틸디메틸실릴티미딘[12](5'-TBDMS-티미딘) (0.15g, 0.42mmol)이 건조 아세토니트릴(10ml)에 용해되었다. 사이티딘 아미디트[13]가 첨가되고(0.43g, 0.50mmol) 다음에 테트라졸(6.5ml, 아세토니트릴 중 0.4M)이 첨가되었다. 15분 후, 반응혼합물의 가역상 HPLC 분석(C18, 4.6x100mm, 완충제 A: 100mM 트리에틸암모니움 아세테이트 pH7.5, 완충제 B: 아세토니트릴, 2.5분에 걸쳐 0∼80% B) 결과는 2량체(2.4분)의 미반응 티미딘[12](1.4분) 및 가수분해된 아미디트 모노마(2.1분)의 존재를 나타내었다(제 1도). 반응 혼합물은 현장에서 산화되었다(물/피리딘 중 10ml, 0.2M). 산화후 HPLC 분석결과는 피리딘(0.9분), 미반응 티미딘[12](1.4분), 산화된 아미디트 모노마[15](1.8분) 및 산화된 2량체[14](2.3분)의 존재를 나타내었다(제 2도).
산화후, 반응혼합물은 아세토니트릴과 함께, 아세토니트릴로 미리 평형을 이룬 DEAE Sephadex의 베드를 관통하였다. 여액의 HPLC 분석결과는, 제3도에 도시한 바와같이, 산화된 아미디트 모노마[15]의 체류를 나타내었다. 여액은 감압하에서 농축되고 고형분은 60% 아세토니트릴/물에 재용해되어, 70% 물/아세토니트릴로 미리 평형을 이룬 C18 챔버상에 적재되었다. 챔버는 70% 물/아세토니트릴로, 다음에는 50% 물/아세토니트릴로 세척되어, 미반응 티미딘[12]을 완전히 용리하였다. 챔버는 다음에 물로 세척되고 80% 아세트산/물로 처리되어 탈트리틸화가 달성되었다. 탈트리틸화 후, 챔버는 50% 아세토니트릴/물로 세척되어 최종 생성물[16] (m/e 922, 생성물[16]+트리에틸아민)을 용출하였다. HPLC 분석결과는 1.7분에서 탈트리틸화류[16]의 용출을 나타내었다(제 4도). [16]의 ESMS(전자분사 질량분석, Electrospray Mass Spectrometry): 계산치 820.27(M+); 판명치 922.2(M+H+TEA).31P NMR(121 MHz, CDCl3, H3PO4, 외부표준법)δ-0.73, -1.93, 트리틸류는 챔버상에 체류되었다.
실시예 2.H-포스폰산염 티미딘 3량체(T-T-[3',3']-T)[20]의 제조
3'-말단에 3',3'-뉴클레오티드간 연결을 지닌 H-포스폰산염 티미딘 3량체의 집성체가 도식 5에 기재된 바와 같이 합성되었다.
(도식 5)
5'-디메톡시트리틸티미딘 3'-H-포스폰산염[17]에 [12]의 카플링 반응
아르곤하에서, 1:1 아세토니트릴: 피리딘(42ml) 중의 [17]용액(0.75g, 1.05mmol)에 [12](0.25g, 0.7mmol)를, 다음에는 95:5 아세토니트릴: 피리딘(8.4ml)중의 염화 피바로일(0.26ml, 2.1mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물은 10분간 교반되었는데 이때의 가역상 HPLC 분석결과는 [12]가 [18]로 완전히 전환되었음을 나타내었다. 혼합물은 다음에 진공중 농축되어, CH2Cl2에 용해되고, 0.05M 중탄산 트리에틸암모늄으로 추출되었다. 염화메틸렌층은 뷔흐너깔데기 위에서 DEAE Sephadex의 플러그에 적용되었다. 여액의 가역상 HPLC 분석결과는 미반응 모노마[17]의 완전한 제거를 나타내었다. 2량체[18]는 여액의 증발에 의하여 정량적 수율로 유리되었고, 그 구조는 NMR 및 ESMS 분석에 의하여 확인되었다. 미반응 모노마[17]는, 1M 중탄산 트리에틸암모늄으로 세척함으로써 DEAE Sephadex플러그로부터 회수되었다. [18]의 ESMS: 계산치 46.4(M+); 판명치 946.3.1H NMR (300MHz, CD3CN) δ9.21 (s, 2H), 7.45-7.24 (m, 11H), 6.94(d, 1H, J=717.2Hz), 6.89-6.85 (m, 4H), 6.31-6.19 (m, 2H), 5.22-5.19 (m. 1H), 5.05-5.00 (m, 1H), 4.22-4.19 (m, 1H), 4.11-4.10 (m, 1H), 3.81-3.80 (m, 2H), 3.75 (s, 6H), 3.36-3.35 (m, 2H), 2.52-2.17 (m, 4H), 1.83 (s, 3H), 1.47 (s, 3H), 0.91 (s, 9H), 0.10 (s, 6H).31P NMR (121 MHz, CD3CN) δ 14.03 (d), 13.88 (d).
2량체[18]의 탈트리틸화
ZnBr2(10ml, 약 0.1M ZnBr2)로 포화된 염화메틸렌에, 2량체[18](0.85g, 0.9mmol)을 용해하였다. 15분 후, 가역상 HPLC 분석결과는 완전한 탈트리틸화 반응을 나타내었다. 반응물을 동일 용적의 1M 아세트산 암모늄으로 급냉시켰다. 유기층은 농축되었고, 잔류물은 1: 1 아세토니트릴: 물에 용해되고 뷔흐너 깔데기상의 C18 플러그 위를 통과하였다. 여액을 증발한 결과 0.29g(50% 수율)의 순수 2량체[19]를 얻었다. [19]의 ESMS: 계산치 644.2 (M+); 판명치 645.31H NMR(300MHz, CDCl3) δ 10.0, 9.85, 9.55, 9.45 (4s, 2H), 7.59-7.45 (m, 2H), 7.01 (d, 1H, J=712.3 Hz), 6.39-6.19 (m, 2H), 5.35-5.23 (m, 1H), 5.14-5.03 (m, 1H), 4.31-4.22 (m, 2H), 3.88-3.79 (m, 4H), 2.67-2.48 (m, 3H), 2.21-2.12 (m, 1H), 1.89-1.88 (2bs, 6H), 0.90 (s, 9H), 0.11 (s, 6H).31P NMR (121 MHZ, CDCl3) δ8.45 (d), 8.30 (d).
3량체[20]의 제조
1: 1 피리딘: 아세토니트릴 (23ml) 중의 2량체[19][0.25g, 0.39mmol)의 용액에 [17](0.41g, 0.58mmol)을, 다음에는 95: 5 아세토니트릴: 피리딘(4.5ml) 중의 염화 피바로일 용액(0.14ml, 1.16mmol)을 첨가하였다. 반응물은 아르곤 분위기하에서 10분간 교반되었고, 이 때 HPLC 분석결과는 2량체[19]가 3량체[20]로 완전히 전환되었음을 나타내었다. 혼합물은 증발되어 건조되고, CH2Cl2에 용해되고, 0.05M 중탄산 트리에틸암모늄으로 세척되고, 유기층은 뷔흐너깔데기상의 DEAE Sephadex플러그에 적용되었다. 여액은 증발되어 정량적인 수율로 [20]을 제공하였다. [20]의 ESMS: 계산치 1234.4(M+); 판명치 933.5(M+H+DMT의 상실).1H NMR (300MHz, CD3CN) δ 9.34-9.27 (m, 2H), 8.58-8.56 (m, 2H), 8.18-8.11 (m, 1H), 7.76-7.70 (m, 1H), 7.43-7.41 (m, 4H), 7.35-7.23 (m, 13H), 6.88-6.84 (m, 4H), 6.26-6.15 (m, 3H), 5.78-5.71 (m, 1H), 5.22-5.20 (m, 1H), 5.11-5.05 (m, 2H), 4.29-4.26 (m, 2H), 4.24-4.19 (m, 2H), 3.85-3.84 (m, 2H), 3.76 (s, 6H), 3.74-3.72 (m, 1H), 3.38-3.28 (m, 2H), 2.52-2.20 (m, 6H), 1.82 (s, 3H), 1.78 (s, 3H), 1.47-1.44 (m. 3H), 0.90 (s, 9H), 0.11 (s, 6H).31P NMR (121 MHz, CD3CN) δ 15.86 (s), 15.08 (s), 14.36 (s).
실시예 3.5'-0-(4,4'-디옥타데실트리페닐메틸)티미딘-3'-0-(N, N-디이소프로필-2-시아노에틸포스포아미디트)[26]의 제조
5'-보호작용 그룹(D∼E)으로서 4,4'-디옥타데실프리페닐메탄올(DOT)을 함유하는 포스포아미디트 모노마의 조성방법이 도식 6에 예시된다.
(도식 6)
4,4'-디옥타데실옥시-벤조페논[22]
나트륨 금속(0.46g, 20mmol)이 에탄올(50ml)에 용해되고, 다음에는 1-브로모옥타데칸(7.8g, 23.4mmol) 및 촉매량의 요오드화 나트륨(약 30mg)이 첨가되고 반응혼합물이 48시간 환류되었다. 얻어진 현탁액을 냉각 및 여과하였다. 고형분은 디클로메탄으로, 다음에는 헥산으로 세척되고 백색 고체는 건조되어 화합물[22]을 제공하였다(2.85g, 수율 84.8%).1H NMR (300MHz, 피리딘-d5) δ 7.95 (d, J=8.7 Hz, 4H, 아릴), 7.09 (d, J=8.7 Hz, 4H, 아릴), 4.05 (t, J=6.6 Hz, 4H, 2xOCH2), 1.80 (tt, J=6.6 및 7.5 Hz, 4H), 1.48 (m, 4H), 1.33 (brS, 60H), 0.87 (t, J=6.6 Hz, 6H, 2xCH3).
4,4'-디옥타데실트리페닐메탄올[23]
무수 THF(4ml) 중의 벤조페논 [22](0.3g, 0.42mmol)의 현탁액에 브롬화 페닐마그네슘(0.55ml, THF 중 1.0M 용액, 0.55mmol)을 첨가하고 반응물은 3시간 동안 환류되었다. 다시 브롬화 페닐마그네슘(0.2ml)이 첨가되고 0.5시간동안 가열이 계속되었는데, 이 때 모든 출발물질이 용해되었다. 다음에 반응물은 냉각되고, 0.5M HCl이 첨가되었다. 현탁액은 여과되고 고형분은 물(3회), 헥산(2회) 및 디클로로메탄(2회)으로 세척되었다. 유기 세척액은 수집, 건조(MgSO4) 및 증발되어 백색고체인 [23]을 제공하였다(0.21g, 수율 63.6%).1H NMR(300 MHz, 피리딘-d5) δ 8.13 (brS, 1H, 아릴), 7.81 (d, J=7.1 Hz, 2H), 7.7 (d, J=8.8 Hz, 4H), 7.42 (t, J=7.7 Hz, 2H), 7.34 (t, J=7.1 Hz, 1H), 7.07 (d, J=8.9 Hz, 4H), 3.98 (t, J=6.4 Hz, 4H), 1.77 (tt, J=7.9 및 6.5 Hz, 4H), 1.45 (m, 4H), 1.3 (brS, 60H), 0.87 (t, J=6.9 Hz, 6H).
5'-0-(4,4'-디옥타데실트리페닐메틸)티미딘[25]
화합물[23](2.1g, 2.63mmol)이 톨루엔과 함께 2회 공증발되고 다음에 톨루엔(30ml)에 용해되었다. 염화아세틸(11ml, 154.7mmol)이 첨가되고 반응물은 3시간 환류된 후 증발되었다. 잔류물은 톨루엔으로 2회 공증발되어 조생성물[24]을 제공하였다. [24]에 피리딘(30ml), DMAP(25mg) 및 티미딘(0.45g, 1.86mmol)이 첨가되고, 반응물은 실온에서 철야로 교반되었다. 용매는 감압하에서 증발되고 잔류물은 디클로메탄에 첨가되어 5% 중탄산나트륨으로 세척되었다. 유기산은 건조(MgSO4) 및 증발되고 잔류물은 실리카겔(아세트산 에틸/2% 트리에틸아민)상에서 정제되어 적당한 유분의 증발후 연황색 고체인 화합물[25](DOT 티미딘)을 제공하였다(1.6g, 수율 84%).1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.44 (brS, 1H, NH), 7.60 (s, 1H, H-6), 7.41-7.20 및 6.82 (m, 13H, DOT), 6.42 (t, J=6.1 Hz, 1H, H-1'), 4.57 (m, 1H, H-3'), 4.05 (m, 1H, H-4'), 3.92 (t, J=6.5 Hz, 4H, 2xOCH3), 3.47 및 3.37 (ABX, 2H, H-5'), 2.38 (m, 2H, H-2'), 2.22 (m, 1H, 3'-OH), 1.75 (m, 4H, DOT), 1.46 (m, 7H, 5-CH3, DOT), 1.25 (brS, 60H, DOT), 0.87 (t, 6H, 2xCH3).
5'-O-(4,4'-디옥타데실트리페닐메틸)티미딘-3'-0-(N,N-디이소프로필-2-시아노에틸포스포아미디트[26]
디클로로메탄(5ml)에 DOT 티미딘[25]이 용해되고 디이소프로필에틸아민(0.3ml, 1.75mmol) 및 2-시아노에틸 N, N-디이소프로필클로로포스포아미디트(0.15ml, 0.63mmol)가 첨가되면서 얼음 욕조 냉각되었다. 얼음욕조를 옮기고 반응물은 실온에서 4시간 교반되었는데, 이 시점에서 다시 2-시아노에틸 N, N-디이소프로필클로로포스포아미디트(0.1ml)가 첨가되고, 반응물은 실온에서 16시간 교반되었다. 반응용액은 디클로로메탄으로 희석되고 5% 중탄산나트륨으로 세척되며, 유기상은 건조(MgSO4) 및 증발되었다. 잔류물은, 모두 2% 트리에틸아민을 함유하고 있는, 헥산으로, 다음에는 20% 아세트산 에틸/헥산으로 실리카 용출상에서 정제되어 분해된 다이아스테레오마로서 [26]을 제공하였다(신속 0.1g, 서행 0.18g, 수율 46.7%). [26a](신속 다이아스테레오마)1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 8.15 (br, 1H, NH), 7.91 (s, 1H, H-6), 7.63, 7.38-7.21, 6.82 (m, 13H, 아릴), 6.39 (t, J=7.4 Hz, H-1'), 4.67 (m, 1H, H-3'), 4.18 (m, 1H, H-4'), 3.92 (t, J=6.5 Hz, 2xOCH3), 3.63 (m, 4H), 3.51 및 3.33 (ABX, 2H, H-5'), 2.42 및 2.26 (m, 4H, H-2', CH2CN), 1.73 (m, 4H), 1.41 (m, 4H), 1.25 (s, 60H), 1.16 (dd, J=2.7, 6.9 Hz, 12H), 0.87 (t, J=6.9 Hz, 6H).31P NMR (121 MHz, CDCl3) δ 150.64 [26b] (서행 다이아스테레오마)1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.25 (br, 1H, NH), 7.91 (s, 1H, H-5), 7.41 및 7.31-7.20 및 6.81 (m, 13H, 아릴), 6.42 (dd, J=8 Hz, H-1'), 4.67 (m, 1H, H-3'), 4.14 (m, 1H, H-4'), 3.92 (t, J=6.5 Hz, 4H, 2xOCH2), 3.82 및 3.76 (m, 2H), 3.54 (m, 2H), 3.47 및 3.31 (ABX, 2H, H-5'), 2.62 (t, J=6.3 Hz, 2H, CH2CN), 2.54 및 2.34 (m, 2H, H-2'), 1.76 (m, 4H), 1.25 (m, 60H), 1.16 및 1.05 (d, J=6.9 Hz, 12H, 이소프로필 CH3), 0.87 (t, J=6.6 Hz, 6H).31P NMR (121 MHz, CDCl3) δ 150.23.
실시예 4.
가역상 수지상에 알킬 치환 트리틸 그룹의 분해
알코올, 4,4'-디옥타데실트리페닐메탄올(DOT), 4-디시클록시-4'-메톡시트리탄올, 및 디메톡시트리탄올(DMT)이 C18 가역상 TLC 플레이트상에 적하되고, 플레이트는 3개의 상이한 용매로 전개되었다(표 1). 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, DOT 그룹은, 메탄올(Rf=0) 및 아세토니트릴(Rf=0)과 같은 유기용매중에서 C18 수지와 강력한 상호작용이 있다. 이 상호작용은, C18 가역상 수지에 대한 트리틸 보호작용 그룹의 친화성 또는 상호작용을 기초로, 결합생성물이 출발물질로부터의 1단계 분리가 가능케한다.
실시예 5.생성물 포착을 위하여 소수 친화력을 이용하는 PASS에 의한 5'-HO-T-T-A-C-T-[3',3']-T-3'의 제조
5'-HO-T-[3',3']-T의 제조
5'-TBDPS-티미딘[12](0.99g, 2.07mmol)이 건조 염화메틸렌과 함께 공증발되고 10ml의 건조 염화메틸렌에 용해되었다. 티미딘 아미디트(2.0g, 2.69mmol)가 첨가되고, 다음에는 아세토니트릴(21ml, 10.5mmol)중 테트라졸 0.5M이 첨가되고, 아르곤하에서 반응물이 교반되었다. 90분후, 흑갈색이 지속될 때까지 요오드/물/피리딘(0.2M)의 용액이 첨가되고 색깔이 황색으로 되돌아올 때까지 5% NaHSO3가 첨가되었다. 농축된 반응물은 분리되고(CH2Cl2/물), 유기층은 MgSO4로 건조되어 증발 건조되었다. 고형 잔류물은 메탄올/극소량의 염화메틸렌에 용해되고, 물로, 다음에는 메탄올로 평형을 이룬 DEAE Sephadex의 75g 베드상에 피펫으로 옮겨졌다. DEAE Sephadex은 300ml 메탄올로 세척되고, 결합 메탄올 세척액은 농축되어 2.42g의 백색 포옴을 제공하였다.
탈트리틸화: 백색 포옴이 50ml의 3% DCA에 용해되고 실온에서 35분간 교반된 후 염화메틸렌으로 평형을 이룬 80ml의 실리카겔상에 부어졌다. 겔은 150ml의 3% DCA로, 다음에는 100% 염화메틸렌으로부터 염화메틸렌 중의 6% 메탄올용액에 의하여 세척되었다. 적절한 유분이 결합 및 농축되어 두 단계 공정에 대하여 90% 수율로 1.58g의 탈트리틸화 2량체(5'-HO-T-[3',3]-T)를 제공하였다.
5'-HO-C-T-[3',3']-T의 제조
5'-HO-T-[3',3']-T 2량체(1.47g, 1.76mmol)가 고진공하에서 철야로 건조된 후 건조 CH2Cl2로 공증발되어 8.5ml의 건조 CH2Cl2에 용해되었다. 사이티딘 아미디트(1.90g, 2.28mmol)이, 다음에는 아세토니트릴(17.6ml, 8.78mmol) 중의 테트라졸(0.5M)이 첨가되고, 아르곤하에서 반응물이 교반되었다. 50분후, 0.5M 요오드 용액이, 다음에는 5% NaHSO3가 첨가되어, 상술한 바와 같이 색깔이 갈색에서 황색으로 변하였다. 농축된 반응물은 분리되고(CH2Cl2/물), 유기층은 건조되었으며(MgSO4) 건조증발되었다. 고형 잔류물은 메탄올/극소량 염화메틸렌에 용해되고, 물 및 메탄올로 미리 평형을 이룬 DEAE Sephadex의 75g 베드상에 피펫으로 옮겨졌다. DEAE Sephadex는 염화메틸렌 및 메탄올로 서서히 세척되고 결합된 세척액은 농축되어 2.53g의 황색 포옴을 제공하였다.
탈트리틸화: 포옴은 실온에서 50ml의 3% DCA중에 교반되었다. 2시간 후, 반응혼합물은 염화메틸렌으로 미리 평형을 이룬 실리카겔의 80ml 베드상에 피펫으로 옮겨졌다. 혼합물은, 3% DCA로, 다음에는 100% CH2Cl2로부터 CH2Cl2중의 6% 메탄올 용액으로 용리되었다. 적절한 유분이 결합 및 농축되어 두단계 공정에 대하여 64% 수율로 1.43g의 탈트리틸화 3량체(5'-HO-C-T-[3',3']-T)를 제공하였다.
5'-HO-A-C-T-[3',3']-T의 제조
탈트리틸화 3량체, 5'-HO-C-T-[3',3']-T(1.43g, 1.1mmol)가 고진공하에서 철야로 건조되어, 건조 염화메틸렌으로 공증발되고 6ml의 건조 염화메틸렌에 용해되었다. 아데닌 아미디트(1.24g, 1.45mmol)가, 다음에는 아세토니트릴(11ml, 5.57mmol)중의 0.5M 테트라졸이 첨가되고, 반응물은 아르곤하에서 교반되었다. 약 60분 후, 흑색이 지속될 때까지 0.5몰 요오드 용액이 첨가되었다. 다음에 혼합물은 1시간 동안 교반되고 농축되었다. 껌은 분리되고(CH2Cl2/물), 결합된 유기층은 건조되며(MgSO4) 농축되어 2.46g의 황색 고체를 제공하였다. DEAE Sephadex정제없이 탈트리틸화가 수행되었다.
탈트리틸화: 포옴이 실온에서 50ml의 3% DCA중 교반된 후, 염화메틸렌으로 평형을 이룬 실리카 베드(약 120ml)상에 피펫으로 옮겨졌다. 반응혼합물은 3% DCA로, 다음에는 100% 염화메틸렌으로부터 염화메틸렌중의 10% 메탄올 용액으로 세척되었다. 적절한 유분이 결합 및 농축되어 두단계 공정에 대하여 전반적으로 72%로 수율로 1.41g의 탈트리틸화 4량체, (5'-HO-A-C-T-[3',3']-T)를 제공하였다.
5'-HO-T-A-C-T-[3',3']-T의 제조
탈트리틸화 4량체, 5'-HO-A-C-T-[3',3']-T(1.41g, 0.8mmol)가 고진공상에서 건조된 후, 건조 염화메틸렌으로 공증발되며 4.5ml 건조 염화메틸렌에 용해되었다. 티미딘아미디트(0.78g, 1.05mmol)가, 다음에는 아세토니트릴(8ml, 4.02mmol)중의 테트라졸(0.5M)이 첨가되고, 반응물은 아르곤하에서 교반되었다. 2시간 후, 어두운 색이 지속될 때까지 0.5M 요오드 용액이 첨가되었다. 다음에 반응물이 농축되고 껌이 분리되며 (CH2Cl2/물), 결합된 유기층이 건조되고(MgSO4) 농축되어 2.1g의 황색포옴을 산출하였는데, 이것은 DEAE Sephadex을 통한 용출전에, 질량분석기 및 가역상 HPLC에 의하여 분석되었다. 산화후의 조반응물의 가역상 HPLC 분석결과, 5량체 및 미반응 4량체(실패서열)과 가수분해된 아미디트 모노마의 존재를 나타내었다. ESMS(M-1) 803.74x3.
황색 포옴은 극소량의 염화메틸렌에 용해되어, 물로, 다음에는 메탄올로 평형을 이룬 DEAE Sephadex베드상에 적재되었다. Sephadex는 메탄올, 염화메틸렌, 다음에는 아세토니트릴로 세척되었다. 적당한 유분이 결합 및 농축되어 1.48g의 생성물을 제공하였다.
탈트리틸화: 생성물은 실온에서 40ml 3% DCA에서 교반된 후, 염화메틸렌으로 평형을 이룬 실리카 베드상에 피펫으로 옮겨졌다. 이것은 3% DCA로, 다음에는 100% 염화메틸렌으로부터 염화메틸렌중의 20% 메탄올 용액으로 용리되었다. 적당한 유분이 결합 및 농축되어 두단계 공정에 대하여 전반적으로 64%의 수율로 0.98g의 탈트리틸화 5량체, (5'-HO-T-A-C-T-[3',3']-T)를 제공하였다.31P NMR 및 그 집성은 생성물과 일치한다.
5'-HO-T-T-A-C-T-[3',3']-T의 제조
탈트리틸화 5량체, 5'-HO-T-A-C-T-[3',3']-T(0.96g, 0.46mmol)가 고진공하에서 건조된 후, 건조 염화메틸렌으로 공증발되었고, 5ml의 건조 염화메틸렌에 용해되었다. 티미딘 아미디트(0.44g, 0.59mmol)가, 다음에는 아세토니트릴(4.5ml, 2.27mmol) 중의 테트라졸(0.5M)이 첨가되고, 반응물은 아르곤하에서 교반되었다. 용액이 동질성이 아니었기 때문에, 2ml의 아세토니트릴이 첨가되었다. 2시간 후, 다시 0.15g의 모노마가 첨가되고, 반응물은 철야로 교반되었다. 0.5M의 요오드 용액이, 다음에는 5% NaHSO3가 첨가되어 색깔이 갈색에서 황색으로 변하였다. 농축된 반응물은 분리되고(CH2Cl2/물), 유기층은 건조되고(MgSO4) 농축되어 1.61g의 황색 고체를 산출하였는데, 이것은 MS에 의하여 분석되었다. ESMS(M-1) 1384.01x2.
조 반응혼합물(1.48g)은 C18 수지상에 흡수되고, 아세토니트릴로, 다음에는 70% 물/아세토니트릴로 평형을 이룬 C18 수지(약 125g)의 베드상에 적재되었다. 수지는 우선 1: 1 물: 아세토니트릴로 세척되어 모노마를 용출하고, 다음에는 아세토니트릴 및 염화메틸렌으로 세척되어 6량체를 용출하였다. 적당한 유분을 결합 및 농축하여 0.83g(수율 66%)의 고형분이 제공되었다.
탈트리틸화: 고형분은 실온에서 20ml의 3% DCA중에서 교반되었다. 트리헥실실란(2ml)이 첨가되고 교반은 계속되었다. 헥산을 첨가하자 고형분이 형성되었는데, 이것은 헥산/에테르로 세척되어 0.5g의 핑크색 고형분이 제공되었다.31P NMR 및 그 집성은 생성물과 일치한다.
Dowex C1-형은 고체 샘플로부터 잔류 DCA를 제거하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, T-A-포스포아미디트 2량체는, NMR에 의하여, 탈트리틸화 및 헥산 침전 후에 약 1.2 당량의 DCA를 함유하는 것으로 판명되었다. 이 2량체의 샘플(0.3g)이 아세토니트릴에 용해되어, 아세토니트릴로 미리 평형을 이룬 Dowex C-1-형(15g)의 칼럼 상에 적재되었다. 액체는 적하 용출되었으며, 칼럼은 다음에 35ml의 아세토니트릴로 세척되고 농축되어 0.26g의 백색 포옴을 제공하였다. 샘플은 NMR의 분석에 의하여 약 95%의 산의 환원을 나타내었다.
실시예 6.생성물 포착을 위하여 소수 친화력을 이용하는 PASS의 자동화
카플링 반응, 예를 들면 실시예 2(도식 5)에서의 [12]와 [17]의 반응 후, 반응 혼합물은 입구 포트[128]를 통하여 추출용기[112]로 펌핑된다(제 5 도). 중탄산 트리에틸암모늄 완충제(TBK)(O.O5M) 및 CH2Cl2가 입구포트[130]을 통하여 추출 용기에 첨가되고 혼합물은 교반된다. 층은 분리되도록 방치되다. 분리 후, 발브[120]가 열리고, 염화메틸렌층이 전도도 메터[136]를 관통하며 DEAE Sephadex플러그[114] 상을 통과한다. 전도도가 상승하면 CH2Cl2가 전도도메터를 완전히 관통하였으며 수성층이 현재 메터로 들어오고 있다는 것을 가르킨다. 이때, 발브[120]가, 수성층을 DEAE Sephadex플러그로부터 흐름을 바꾸기 위하여 자동적으로 스위치 작용을 한다. 유기층은 입구포트[140]를 통하여 챔버로 들어온 아르곤으로 DEAE Sephadex플러그를 통하여 밀려난다. DEAE Sephadex은 다음에, 입구포트[142]를 통하여 첨가된 CH2Cl2로 세척되고 발브[122]에 의하여 조절된다. 올리고뉴클레오티드 생성물 및 미반응 올리고뉴클레오티드 출발물질(실패서열)을 함유하고 있는 CH2Cl2유출액은 출구포트[144]를 통하여 수집되고 발브[124]에 의하여 조절된다. CH2Cl2의 용출이 완료되면, Sephadex플러그 상에 채류된 미반응 포스포아미디트 모노마는 1M TBK로 용리된다. Sephadex플러그는 다음에 CH2Cl2로 재평형을 이룬다.
CH2Cl2용출액은 다음에, 실패서열로부터 결합된 생성물을 분리하기 위하여 가역상 수지를 관통한다. 5'-단부에 부착된 DMT 그룹을 갖고 있는 결합된 생성물은 수지상에 체류하며, 실패서열은 챔버로부터 용리된다. 수지는 다음에 산성 디클로로아세트산(CH2Cl2중 3%)으로 세척되는데, 이것은 DMT 보호작용 그룹을 분열시키고 챔버로부터 결합된 생성물을 방출시킨다. 산에 대한 과잉 노출로 인한 분해를 방지하기 위하여, 결합된 생성물은 pH 완충작용 용액으로 용출된다. 용출액은 농축되고 결합된 생성물은 다음 반응 과정에서 출발 물질로 사용된다.
실시예 7.액상 합성법에 의한 3'-PEG 고정 15량체 DNA의 제조
3'-말단 변형으로서 분자량 20,000의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 사용하여, 액상 합성법으로 서열 5'-CTAAACGTAATGG-[3',3']-T-T-3-(SEQ ID NO;1)의 올리고뉴클레오티드가 제조되었다. 폴리에틸렌 글리콜은 각 단계 중에 성장 올리고뉴클레오티드 사슬의 침전을 용이하게 한다. 본 실시예는 통상적인 PASS 과정에서와 같이 올리고뉴클레오티드 카플링 생성물을 포착하는 과정 없이, 액상 합성법에 요구되는 기본 단계를 개술하다. 즉, 본 실시예는 PASS에서 기획하는 바와 같이, 생성물 포착이 제공하는 효율성 및 생성물 순도에 대한 영향력을 나타낸다. 각 모노마 첨가 과정에서의 이와같은 생성물 포착으로, 종래의 고형상 합성법에서와 같은 디에틸에테르로부터의 번거로운 침전 작업은 더 이상 필요없게 된다. 또한 실패서열이 매 모노마 첨가 과정에서 제거되기 때문에, PASS에 의하여 얻어진 생성물의 음이온 교환 크로마토그람은, 제6도의 크로마토그람에 존재하는 다중 피크보다는 단일 생성물 피크만을 나타낼 것으로 예상된다.
본 실시예는 실패서열로부터 생성물을 분리하기 위한 수단으로서 생성물 포착 단계를 첨합시킴이 없이 액상 합성법에 의하여 3'-PEG 고정 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 있어서 각 모노마 첨가 과정에 따르는 일반 공정을 제공한다. 아래의 모든 반응은 실온에서 자기 밀폐 격막을 지닌 1목 플라스크에서 수행되었다. 사용 후 버릴 수 있는 플라스틱 주사기가 사용되었다.
탈트리틸화: 5'-DMT-뉴클레오시드 3'-O-PEG(5.0g)(20k, 적재:45μmol/g)가 디클로로아세트산(DCA) 및 CH2Cl2중의 트리헥실실란(6.4ml, 80당량)의 50ml 혼합물에 용해되었다. 9분후, 탈트리틸화 5'-HO-뉴클레오시드 3'-O-PET가 에테르(2회)로 침전되고, 여과 및 진공하에서 건조되었다.
카플링 반응: 5'-HO-뉴클레오시드 3'-O-PEG가 20ml의 무수 아세토니트릴로 3회 공증발되고, 고진공하에서 30분간 건조되었다. 플라스크는 아르곤으로 세척되어 외부 대기에 대하여 밀폐되었다. 격막을 통하여 다음 물질이 주입되었다: 5'-HO-뉴클레오시드 3'-O-PEG를 용해하기 위한 50ml의 무수 아세토니트릴, 무수 아세토니트릴 중의 4.5ml(1.0M, 2.0당량) 아미디트 및 아세토니트릴 중의 1.4ml(1.0M, 6.0 당량) DCI. 용액은 아르곤하에서 25분간 교반된 후, 에테르로 침전되고, 20ml의 무수 아세토니트릴로 공증발에 의하여 건조되었다.
산화: 침전물은 50ml의 무수 아세토니트릴에 용해되고, 아세토니트릴중의 8ml (0.1M)의 디아세트산 이오도벤젠이 주입되어, 반응혼합물은 8분간 교반되었다.
캡핑반응: 상기 용액에, 아세트산 무수물(6ml), 2,6-루티딘(6ml) 및 N-메틸이미다졸(6m)이 동시에 주입되고, 반응혼합물은 다시 5분간 교반되었다. 캡핑 처리된 올리고뉴클레오티드-PEG 폴리마는 탈트리틸화 공정에서 상술한 바와 같이 에테르로부터 침전되었다.
결정화: 캡핑 처리된 올리고뉴클레오티드-PEG 폴리마는 60℃에서 50ml의 절대 에탄올(100ml/g)로부터 결정화에 의하여 정제되었다.
모노마 첨가과정 프로토콜은 표 2에 요약된다. 3'-말단 10 염기단편(10량체)(CGTAATGG-[3',3']-T-T)의 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO: 2)의 제조를 위한 단계적 카플링 효율이 표 3에 제시된다. PEG로부터의 분열 및 탈보호후의 조 15량체(5'-CTAAACGTAATGG-[3',3']-T-T-3')(SEQ ID NO: 1)의 음이온 교환 HPLC 크로마토그람이 제6도에 도시된다.
실시예 8.디엔 변형 트리틸 알코올의 제조
실시예 8(도식 7 및 8은)은, 5'-O-(4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸) 티미딘 3'-포스포아미디트 모노마[32]를 포함하는, 다양한 디엔 변형 트리틸 알코올의 합성법을 기술한다.
(도식 7)
4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시벤조페논[29]의 제조
무수 THF(335ml)중의 3,5-헥사디엔올[27](13.7g, 140mmol)(마아틴(Martin) 등 (1980) J. Am. Chem. Soc.102: 5274∼5279) 용액에, 4,4'-디히드록시벤조페논[28](10.0g, 46.7mmol) 및 트리페닐포스핀(36.7g, 140mmol)을, 다음에는 디에틸아조디카보네이트(DEAD)(22.0ml, 140mmol)를 서서히 첨가하였다. 반응혼합물은 아르곤하에서 철야로 교반된 후 진공하에서 증발 건조되었다. 잔류물을 제거하기 위하여 디클로로메탄-헥산으로부터의 침전이 수행되었다. 여액이 진공중 농축되고 칼럼 크로마토그라피(실리카 겔; 헥산/CH2Cl2,3/2)에 의하여 정제되어 불순한 생성물이 얻어졌는데, 이것은 분쇄되어 (Et2O/헥산, 1/1) 7.12g의 화합물[29]을 제공하였다. 칼럼 크로마토그라피(실리카겔; 헥산/CH2Cl2, 3/2)에 의하여 여액을 다시 정제하여 추가로 5.96g의 [29]를 얻어 총 13.08g(75%)의 백색고체인 화합물[29]를 제공하였다.1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ 2.50-2.64 (m, 4H), 4.16 (t, J=6.5 Hz, 4H), 5.05 (d, J=10.1 Hz, 2H), 5.18 (d, J=15.7 Hz, 2H), 5.77-5.92 (m, 2H), 6.17-6.47 (m, 4H), 7.10 (d, J=8.6 Hz, 4H), 7.72 (d, J=8.7 Hz, 4H).
4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸 알코올[30]의 제조
화합물 [29](5.96g, 15.91mmol)이 무수 THF(133ml) 중에 약간 발열하면서 용해되었다. 용액에 브롬화 페닐마그네슘(THF 중 32ml의 1.0M 용액, 32mmol)이 첨가되고, 혼합물은 아르곤하에서 5시간 동안 실온에서 교반되어, 진공하에서 증발 건조되었다. 잔류물은 디클로메탄에 재용해되고, 염화 암모늄의 포화용액으로, 다음에는 물로 세척되었다. 유기상은 건조(MgSO4), 진공중 농축되고, 칼럼 크로마토그라피(실리카겔; 헥산/CH2Cl2, 1/9)에 의하여 정제되어 4.45g(62%)의 황색오일인, 화합물[30]을 산출하였다.1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ 2.45-2.56 (m, 4H), 3.98 (t, J=6.6 Hz, 4H), 5.01 (dd, J=1.5, 9.9Hz, 2H), 5.14 (dd, J=1.5, 16.5 Hz, 2H), 5.73-5.87 (m, 2H), 6.12-6.41 (m, 4H), 6.25 (s, 1H), 6.84 (d, J=6.9 Hz, 4H), 7.06 (d, J=7.8 Hz, 4H), 7.15-7.33 (m, 5H).
5'-O-(4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸)티미딘[31]의 제조
화합물[30](3.5g, 7.73mmol)이 톨루엔(2회)과 함께 공증발된 후, 무수 톨루엔(85ml)에 용해되었다. 용액에 염화아세틸(33ml, 464mmol)이 첨가되고, 반응혼합물은 가열 환류 및 아르곤하에서 교반되었다. 4시간 후, 반응혼합물은 진공중 농축되고, 조생성물을 피리딘과 함께 공증발된 후, 무수 피리딘(42ml)에 용해되었다. 피리딘과 함께 공증발되고 무수 피리딘(42ml)에 용해된 티미딘(1.5g, 6.18mmol)은 다음에 조생성물을 함유하고 있는 용액에 첨가되었다. 촉매량의 디메틸아미노피리미딘(DMAP)이 첨가되고, 반응혼합물은 아르곤하에서 철야로 교반되며, 용매는 증발되었다. 잔류물은 디클로로메탄에 재용해되고, 5% 중탄산나트륨 수용액으로, 다음에는 물로 세척되었다. 유기상은 건조(MgSO4), 증발 및 칼럼 크로마토그라피(실리카 겔; EtOAC/헥산, 1/1)에 의하여 정제되어, 회색이 도는 백색 고체인, 3.53g(84%)의 화합물[31]이 제공되었다.1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 1.47 (s, 3H), 2.22-2.46 (m, 2H), 2.50-2.63 (m, 4H), 3.35-3.58 (m, 2H), 3.85-4.09 (m, 5H), 4.51-4.60 (m, 1H), 5.02 (dd, J=1.5, 10.4 Hz, 2H), 5.14 (dd, J=1.5, 17.3 Hz, 2H), 5.68-5.83 (m, 2H), 6.12-6.45 (m, 5H), 6.82 (d, J=9.0 Hz, 4H), 7.18-7.46 (m, 9H), 7.58 (s, 1H), 8.44 (s, 1H); C41H44N2O7·2H2O (712.8384)에 대한 분석계산치: C, 69.08; H, 6.79; H, 3.93. 발견치: C, 69.34; H, 6.44; N, 3.91.
5'-O-(4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸)티미딘 3'-포스포아미디트[32]의 제조
화합물[31](3.0g, 4.43mmol)이 무수 디클로로메탄에 용해되고 디이소프로필에틸아민(2.7ml; 15.5mmol)이 첨가되었다. 용액은 0℃로 냉각되었고, 2-시아노에틸-N, N-디이소프로필클로로포스포아미디트(2.0ml, 8.86mmol)가 첨가되었다. 반응혼합물은 아르곤하에서 교반하면서 실온으로 가온되도록 방치되었다. 4시간 후, 용액은 디클로로메탄으로 희석되고 중탄산 나트륨의 5% 수용액(2회)으로 세척되었다. 유기상은 건조(MgSO4), 진공중 농축 및 칼럼 크로마토그라피(실리카 겔: ETOAC/헥산, 3/7)에 의하여 정제되어, 불명한 백색 고체인 2.8g(72%)의 화합물[32]이 제공되었다.1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 1.01-1.20 (m, 12H), 1.41 (s, 3H), 2.25-2.67 (m, 8H), 3.26-4.22 (m, 11H), 4.60-4.65 (m, 1H), 5.02 (dd, J=1.5, 10.4 Hz, 2H), 5.14 (dd, J=1.5, 17.3 Hz, 2H), 5.69-5.84 (m, 2H), 6.11-6.48 (m, 5H), 6.82 (dd, J=3.2, 8.9 Hz, 4H), 7.16-7.43 (m, 9H), 7.62 (d, J=15.2 Hz, 1H), 8.05 (bs, 1H);31P NMR (300 MHz, DMSO-d6) 152.9, 152.4; C50H61N4O8P1(877.0276)에 대한 분석계산치: C, 68.48; H, 7.01; N, 6.39. 발견치: C, 68.48; H, 7.22; N, 6.33.
(도식 8)
4,4'-디-2,4-헥사디엔옥시벤조페논[35]의 제조
4,4'-디플루오로벤조페논[34](4.8g, 22mmol)이 무수 DMF(1ℓ)에 용해되었다. NaH(95%; 5.6g, 220mmol)가 첨가되고 용액은 0℃로 냉각되었다. 용액에 2,4-헥사디엔을(5.8ml, 51mmol)이 서서히 첨가되고, 반응혼합물은 아르곤하에서 철야로 저으면서 실온으로 가온되었다. 반응혼합물은 진공중 농축되고, 디클로로메탄에 용해되어 물로 세척되었다. 유기상은 건조(MgSO4) 및 농축되고 칼럼 크로마토그라피(실리카 겔; 헥산/CH2Cl2, 1/3)에 의하여 정제되어 백색 고체인 2.07g(25%)의 화합물[35]을 제공하였다.1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ1.73 (d, J=6.6 Hz, 6H), 4.68 (d, J=6.0 Hz, 4H), 5.69-5.84 (m, 4H), 6.05-6.19 (m, 2H), 6.31-6.45 (m, 2H), 7.08 (d, J=9.0 Hz, 4H), 7.68 (d, J=10.2 Hz, 4H).
4,4'-디-2,4-헥사디엔옥시트리틸 알코올[36]의 제조
화합물[35](2.0g)이 THF(45ml)에 용해되고, 브롬화 페닐 마그네슘(THF 중 1.0M 용액; 10.0ml, 10.6mmol)이 용액에 첨가되었다. 반응혼합물은 3시간 동안 실온에서 교반되고, 진공하에서 증발 건조되었다. 잔류물은 디클로로메탄에 재용해되고 염화암모늄의 포화용액으로, 다음에는 물로 세척되었다. 유기상이 건조되고(MgSO4), 진공중에서 농축되고, 칼럼 크로마토그라피(실리카 겔; 헥산/CH2Cl2, 1/9)에 의하여 정제되어 연황색 고체인 1.84g(77%)의 화합물[36]이 제공되었다.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 1.73 (d, J=6.9 Hz, 6H), 4.54 (d, J=6.0 Hz, 4H), 5.68-5.80 (m, 4H), 6.02, 6.11 (m, 2H), 6.20-6.37 (m, 2H), 6.85 (d, J=6.9 Hz, 4H), 7.05 (d, J=7.0 Hz, 4H), 7.14-7.32 (m, 5H); C31H32O3(452.5920)에 대한 분석계산치: C, 82.27; H, 7.13; 발견치: C, 82.30; H, 7.11.
5'-0-(4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸)티미딘 포스포아미디트[32]의 제조를 위하여 상술한 바와 같은 동일 방법을 사용하여, 화합물[36]로부터 5'-디-(2,4-헥사디엔옥시)트리틸티미딘 포스포아미디트 모노마가 제조될 수 있다.
실시예 9.N-에틸말레이미드로 디엔 치환 트리틸 알코올의 디엘스-알더 부가고리화
실시예 9(도식 9)는 디엔 치환 트리틸 알코올, 4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸 알코올[30] 및 4,4'-디-2,4-헥사디엔옥시트리틸 알코올[36]과 N-에틸 말레이미드와의 디엘스-알더 반응을 기술한다(각각 반응 1 및 2). 표 4는 다양한 반응조건하에서의 이들 두 반응에 대한 반응속도를 제시한다.
(도식 9)
3,5-헥사디엔옥시트리틸 알코올[30]의 디엘스-알더 반응 - 반응 1
화합물[30](50mg, 0.11mmol)이 아세토니트릴(0.75ml) 및 물에 용해되었다. N-에틸 말레이미드(N-Et 말레이미드)(138mg, 1.1mmol)이 첨가되고, 반응혼합물은 실온에서 교반되었다. 3시간 후, 조반응 혼합물의1H NMR 분석결과는 반응이 종료되었음을 나타내었다. 반응 혼합물은 농축되어, 디클로로메탄으로 미리 평형을 이룬 실리카 겔 플러그상에 적재되었다. 과잉 N-에틸 말레이미드는 디클로로메탄으로 세척되어 버리고, 생성물은 10% MeOH/CH2Cl2로 용출되었다. 용매는 감압하에서 농축되어 38mg(59%)의 화합물[37]을 제공하였다.1H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ 0.97 (t, J=7.2 Hz, 6H), 2.02-2.19 (m, 4H), 2.20-2.34 (m, 2H), 2.42-2.53 (m, 4H), 3.13-3.24 (m, 4H), 3.28-3.39 (m, 4H), 4.11 (t, J=6.3 Hz, 4H), 5.70-5.86 (m, 4H), 6.22 (s, 1H), 6.87 (d, J=9.0 Hz, 4H), 7.07 (d, J=9.0 Hz, 4H), 7.15-7.24 (m, 5H).
2,4-헥사디엔옥시트리틸 알코올[36]의 디엘스-알더반응 - 반응 2
화합물[36](60mg, 0.13mmol)이 아세토니트릴(2.0ml)에 용해되었다. N-에틸 말레이미드(166mg, 1.3mmol)가 첨가되고, 반응혼합물은 실온에서 교반되었다. 24시간 후, 조반응혼합물의1H NMR 분석결과는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응혼합물은 농축되어, 디클로로메탄으로 미리 평형을 이룬 실리카 겔상에 적재되었다. 과잉 N-에틸 말레이미드는 디클로로메탄으로 세척되어 버리고, 생성물은 10% MeOH/CH2Cl2로 용출되고, 감압하에서 농축되어 50mg(54%)의 화합물[38]을 산출하였다.1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ0.95 (t, J=7.1 Hz, 6H), 1.32 (d, J=7.2 Hz, 6H), 2.48 (bs, 2H), 2.74 (bs, 2H), 3.05-3.46 (m, 8H), 4.26 (t, J=8.4 Hz, 2H), 4.50 (t, 8.4 Hz, 2H), 4.50 (t, 8.4 Hz, 2H), 5.67-5.86 (m, 4H), 6.27 (s, 1H), 6.88 (d, J=8.7 Hz, 4H), 7.11 (d, J=8.7 Hz, 4H), 7.16-7.35 (m, 5H); C43H46N2O7·2H2O (738.8762)에 대한 분석계산치: C, 69.90; H, 6.82; N, 3.79. 발견치: C, 71.16; H, 6.71; N, 3.92.
실시예 10.디엘스-알더 부가고리화 반응에 의하여 생성물 포착을 이용하여 3'-PEG-연결 올리고뉴클레오티드의 제조
실시예 10(도식 10)은, 올리고뉴클레오티드 생성물의 공유 결합 포착을 위하여 디엘스-알더 부가 고리화 반응을 이용하는 액상 합성법에 의한 3'-PEG 고정 올리고뉴클레오티드의 제조방법에 있어서 각 모노마 첨가 과정이 뒤따른 일반 공정을 제공한다.
(도식 10)
카플링 반응: PEG-dT-OH(20k, 2.36g, 0.11mmol, 적재: 46μmol/g)가 건조 아르곤 분위기하에서 20ml의 건조 아세토니트릴(CH3CN)에 용해되었다. 이 용액에, 5'-O-(4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸)티미딘 3'-포스포아미디트[32](140mg, 0.16 mmol)가, 다음에는 CH3CN 중의 DCL(0.65ml, 1.0M, 6.0당량)이 첨가되었다. 반응물은 25분간 건조 아르곤 분위기하에서 교반된 후, 350ml의 건조 Et2O(2 x 100ml)로 세척되고 진공하에서 1시간 건조되어 2.3g의 백색 고체를 산출하였다(98% 질량 수율).
산화: 연결된 생성물[39], 미반응 포스포아미디트[32] 및 미반응 PEG-dT-OH를 함유하는 백색 고체가 20ml CH2Cl2에 용해되고, CH3CN 중의 디아세트산 이오도벤젠(8.5ml, 0.1M, 0.27g)으로 산화되었다. 8분간 교반한 후, 반응혼합물은 미반응 PEG-dT-OH, 산화된 아미디트 모노마[40] 및 산화된 올리고마[41]를 함유한다. 반응혼합물은 다음에 350ml의 건조 Et2O로 처리되어 20k-PEG 함유물질이 침전되었고, 고형분은 여과 및 2x100ml Et2O로 세척되었다. 1시간 동안 진공하에서 건조 후, 미반응 PEG-dT-OH 및 올리고마[41]를 함유하는 백색 고체가 유리된다.
디엘스-알더 부가고리화 반응: 고체는 20ml의 50% H2O/CH3CN에 재용해되어 1.2g(0.4mmol/말레이미드/g 수지의 말레이미드 적재 기준으로 10당량)의 말레이미드-기능화 폴리스티렌상에 적재되는데, 상기 기능화 폴리스티렌은 5ml의 50% H2O/CH3CN으로 미리 적셔진다. 반응물은 아르곤 분위기하에서 1시간동안 45℃로 가온된다. 상청액의 가역상 HPLC 분석결과는 5'-보호 올리고마[41]가 완전히 소모된 것을 나타낼 것으로 예상된다. 말레이미드-유도화 폴리스티렌[42]은 다음에 여과 및 10ml의 50% H2O/CH3CN으로 세척되어, 백색고체로서, 3.5g의 3'-PEG-5'-DHDT 디엘스-알더 콘쥬게이트 올리고마[42]를 산출하였다.
탈트리틸화/올리고뉴클레오티드 방출: 3.5g의 디엘스-알더 콘쥬게이트 수지[42](적재: 75μmol/g)가 20ml의 CH2Cl2에 부유될 수 있을 것으로 예상된다. 이 현탁액에, DCA 및 CH2Cl2중의 트리헥실실란(6.4ml, 80당량)의 혼합물이 첨가된다. 9분 후, 폴리스티렌-말레이미드 수지[44]가 여과를 통하여 제거된다. PEG-뉴클레오시드[43]는 다음에 Et2O(500ml)로 2회 침전되고, 세척, 여과 및 진공 중 건조된다. 얻어진 PEG-뉴클레오시드는 5'-위치에서 탈보호되고, 다음 서열의 카플링 반응을 위한 준비를 한다.
실시예 11.디엘스-알더 생성물 포착에 의한 비-PEG 유도화 올리고뉴클레오티드의 제조
도식 12는, 디엔으로서 5'-O-(4,4'-디-3,5-헥사디엔옥시트리틸)뉴클레오시드(5'-O-DHDT-뉴클레오시드) 및 친디엔체로서 말레이미드 치환 고형 지지체를 사용하여, 디엘스-알더 생성물 포착에 의한 비-PEG 유도화 올리고뉴클레오티드의 제조를 위한 일반적 반응 구도를 예시한다. 요약하면, 디엘스-알더 포착 PASS 과정이 다음과 같은 형식으로 수행된다: 3'-차단 올리고마가 5'-O-(4,4'-헥사디엔 옥시트리틸)뉴클레오시드 3'-포스포아미디트와 통상적인 형태로 연결된다. 3'-차단 작용 그룹은, 지질 또는 다당류, 또는 아세틸, 피라닐과 같은 전통적인 액상 차단 작용 그룹, 또는 tert-부틸디페닐실릴 에테르와 같은 실릴그룹이다.
(도식 12)
DHDT: 4,4'-헥사디엔옥시트리틸
수지: 말레이미드-유도화 고형 지지체(CPG, 실리카, 셀루로오스, HLP 등)
X: 임의의 적절한 보호 2'-치환체
Y: 인산염 보호작용 그룹
B: 적절히 보호, 변형 또는 유도화된 핵염기
R: 올리고뉴클레오티드 또는 3'-차단작용 그룹
카플링/산화/포착순서: CH3CN 중에서, 적절한 길이 n의 3'-차단 올리고뉴클레오티드 [50]가, CH3CN중의 1.0M DCI 용액으로 처리됨으로서 2.0당량의 아미디트 모노마[51]와 연결된다. 카플링 반응은 25분 미만이 걸리며, TLC에 의하여 감시된다. 카플링 반응이 완결되면, 용액은, CH3CN중의 0.1M 용액으로서 8.0당량의 디아세트산 이오도벤젠으로 직접 처리된다. 산화순서는 8분내 완료되며, 조반응 혼합물은 친디엔체를 함유하고 있는 고형지지체에 직접 적용된다. 말레이미드 친디엔체를 지니는 폴리스티렌은 바람직한 고형 지지체이다. 디엘스-알더 부가고리화 반응은 1: 1 CH3CN: H2O 용매를 이용함으로써 촉진된다. 고형 지지체[52]에 공유결합되어 있는 올리고뉴클레오티드는, 단순한 여과 및 수지 비이드의 세척에 의하여, 미반응 출발물질 올리고뉴클레오티드[50](실패서열) 및 반응시약으로부터 용이하게 분리된다. 역시 5'-DHDT 그룹을 지니고 있는 아미디트 모노마[51]도 수지[53]에 결합된다.
탈트리틸화/방출순서: 공유결합 올리고뉴클레오티드[52] 및 미반응 모노마 인산염[53]을 지니고 있는 세척 및 건조된 수지가 3% DCA/CH2Cl2용액으로 세척되고 중성화 완충제로 용출되어 올리고뉴클레오티드 사슬의 산매개 분해를 방지한다. 방출된 올리고마[54] 및 모노마 인산염[55]은 수성 추출을 통하여 서로 분리된다. 유기상의 생성물 올리고뉴클레오티드는 건조되고 한외여과에 의하여 아세토니트릴로 교환된다.
실시예 12.디엘스-알더 부가고리화에 의하여 생성물 포착을 이용하는 2량체의 제조
(도식 15)
5'-DHDTO-T-OSiPDBT-5'[56]의 제조
5'-TBDPSiO-dT-3'-OH[12](0.21g, 0.43mmol)가 10ml의 아세토니트릴에 용해되었다. 이 용액에, 5'-DHDTO-dT 포스포아미디트[32](0.5g, 0.52mmol)가, 다음에는 아세토니트릴중의 3.0ml의 1.0M DCI(3.0mmol)가 첨가되었다. 이 용액은 아르곤하에서 20분간 교반되고, 이 때 11ml의, 피리딘/물 중 0.2M I2의 용액이 첨가되었다. 산화반응은 5분간 진행되도록 방치되었고, DEAE Sephadex를 통하여 여과되어(4회) 대부분의 황색이 제거되었다. 황색 고체[56](0.23g)가 유리되었다.
생성물 포착: 디엘스-알더 포착 반응은, 폴리스티렌지지 말레이미드 (PS-M)의 양을 다음과 같이 다양하게 사용하면서 수행되었다: 10 당량, 5당량, 2.5당량, 1당량. 모든 반응에 대한 공정은 다음과 같다. [3',3']-dT-dT-OTDHD 2량체(11μmol) [56]가 400㎕의 아세토니트릴에 용해되었다. 이 용액은 1.0ml의 3/1 CH3CN/물 중의 PS-M의 현탁액에 첨가된 후, 65℃로 가온되었다. 반응의 과정은, TLC(2/1 EtOAc/헥산), Rf=0.15에서의 반응물질의 소멸, 및 HPLC 분석(C18, 4.6x100mm, 완충제 A: 100mM 아세트산 트리에틸암모늄 pH 7.5, 완충제 B: 아세토니트릴, 2.5분에 0∼80%)에 의하여 감시되었다. 반응 %는, 미반응 5'-TBDPSiO-dT-3'-OH 모노마[12](1.71분)에 대한 2량체화 물질(2.65분)의 초기 비율을 비교함으로써 측정된다(제 7도 참조). 2.5당량, 1.0당량, 및 대조물(PS-M 없음)에 대한 선분이 모두 4시간 후 일어나는 반응(2량체의 소멸)을 보이고 있음을 알 수 있다는 것은 흥미로운 일이다. 반응은 디엘스-알더 포착반응이 아니라, 가수분해로 믿어지는 경로를 통한 2량체의 분해반응이다. 1.47분 및 2.30분에서의 신규 물질이 HPLC 트레이스에서 나타난다. 이 물질은 5'-TBDPSiO-dT-3'-인산염(1.47분) 및 5'-DHDTO-dT-3'-인산염일 수 있다. 5'- TBDPSiO-dT-3'-OH도 가수분해 반응의 과정중에서 생성되는 것이 예상되기 때문에, 가수분해가 명백한 경우에는 내부 기준이 적절하지 않으므로, 디엘스-알더 포착반응의 상대적인 속도는 이들 트레이스로부터 직접적으로는 얻어질 수 없다. 가수분해는, 후자의 트레이스에서 명백한 5-TBDPSiO-dT-3'-인산염의 양으로 조정함으로서 정정될 수 있다. 이 과정은 5.0당량 및 10.0당량의 경우에는 별다른 의미를 지니지 않는다.
방출/탈트리틸화: 11μmol의 [3',3'] 2량체[57]로 유도화된 286mg의 PS-M이 0.25ml의 디클로로메탄에 부유되었다. 이 용액에 디클로로메탄 중 3% DCA 용액, 2.6ml이 첨가되었다. PS-M은 즉시 밝은 오렌지색으로 변했다. 현탁액은 5분간 교반되고, 이 때 디클로로메탄용액이 PS-M으로부터 여과를 통하여 제거되었다. 얻어진 용액은 디클로로메탄으로 Dowex-Cl-이온교완수지의 패드를 통하여 즉시 여과되었다. 여액은 다음에 농축되어 12mg의 백색, 유리상 고체(일부 잔류 용매 및 지방족 불순물을 함유)를 산출하였다.1H NMR 및31P-NMR은 요망 생성물 화합물[58]과 일치한다.
실시예 13.디엘스-알더 부가고리화 반응에 의한 단편 고정을 이용하여 2개의 블록으로부터 올리고뉴클레오티드의 제조
PASS 올리고뉴클레오티드 합성법은 올리고뉴클레오티드 블록의 용이하며 효율적인 제조를 가능케 하는데, 올리고뉴클레오티드 블록은, 도식 16에 예시한 바와 같이 변형된 PASS 과정에서 상호연결될 수 있다. 요약하면, 위에서 개술한 바와 같이, PASS 모노마 첨가 과정에 의하여 제조된 올리고뉴클레오티드 블록은 말레이미드 수지와 반응하여 수지 고정 올리고뉴클레오티드 블록[61]을 제공한다. 3'-말단 PEG는, 3염화 티타늄으로 링커 L을 감소분열시킴으로써 이 블록으로부터 제거되어, 수지 결합 단편[63]을 산출하는데, 상기 단편은 유리 3'-말단을 갖는다. [63]을 N, N-디이소프로필-2-시아노에틸-클로로포스핀으로 아인산염화(phosphitylation)하면 3'-말단 포스포아미디트[64]가 초래된다. 화합물[64]은 다음에, 말레이미드 수지상에의 포착 및 후속 탈트리틸화 후에 올리고뉴클레오티드 블록[60]의 탈트리틸화로부터 얻어진, 올리고뉴클레오티드 블록[62]에 연결된다. 카플링 반응뒤에는 아인산염 트리에스테르가 대응 인산염 트리에스테르로 연결되는 산화반응, 뒤이어 디클로로아세트산으로 수지로부터 생성물 올리고뉴클레오티드의 방출 및, 올리고뉴클레오티드 단편[60]이 제공되는 과정이 계속된다.
(도식 16)
실시예 14.올리고뉴클레오티드의 제조를 위하여 디엘스-알더 생성물 포착반응을 이용하는 PASS의 자동화
반응용기[212]에 카플링제가 첨가되고, 반응은 실시예 10에 기재된 바와 같이 진행되도록 한다. 카플링 반응이 종결되면, 반응혼합물은 올리고뉴클레오티드를 공유결합 포착하기 위하여, 용기[214]에 담긴 디엔 또는 친디엔체 변형 수지 또는 막(이하 지지체라 한다)을 통하여 순환된다. 포착 단계에 소요되는 시간은 HPLC 또는 선상 UV 검정(도시되지 않음)에 의하여 용액으로부터 카플링 생성물의 소멸을 감시함으로써 조절될 수 있다. 지지체는 다음에 세척되어, 디엔 또는 친디엔체를 함유하지 않는 모든 실패서열을 용출한다. 산화반응은, 친디엔체 지지체에 부착되기 전, 올리고뉴클레오티드가 지지체나 용액내에 부착된 후에 완수될 수 있다. 산화반응 용액은 탈트리틸화 전에 수지로부터 철저히 제기되어야 한다. 이 제거 작업은 선상 전도도 감시(도시되지 않음)에 의하여 편리하게 조절된다. 이 지지체는 다음에 DCA/CH2Cl2로 세척되어 수지로부터 성장 올리고마 및 포착된 과잉 모노마를 제거하게 되어, 용액중의 물질종류가 오직 올리고뉴클레오티드 및 DCA/CH2Cl2혼합물 중에는 5'-탈보호 모노마가 되게 한다. 이 혼합물은 다음에 막 분리기[218]와 접촉하게 되어 DCA 및 과잉 모노마를 제거하고, 또한 아세토니트릴로 용매 교환된다. 변형적인 방법으로, 모노마가 침전 또는 추출에 의하여 분리될 수도 있다. 용액에 잔류하는 유일한 물질은 아세토니트릴 중의 거대분자 부착 올리고마 뿐이다. 이 용액은 다음번 카플링 반응용으로 준비된다.
친디엔체 지지체를 사용하여 모든 n-1류를 제거함으로써 캡핑 처리 단계가 생략되며, 용액은 산화될 수 있는 상태가 되거나, 친디엔체 지지체를 통하여 순환될 수 있는 상태가 된다. 친디엔체 지지체는 아미드 결합과 같이, 친디엔체 성분과 수지 또는 막 사이에서 분열 가능한 링커를 함유할 수 있다. 이 분열 가능한 링커는 친디엔체 지지체의 재생성을 용이하게 한다. 이와같은 링커는 당분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있다.
막 평가:
폴리프로필렌 한외여과 막에 노출후에 페길화 디옥시티미딘의 회수: 아세토니트릴 용매 시스템.
1.49g의 46μmol dT/g PEG-dT를 25ml의 아세토니트릴에 용해시켜서, 2.74mM 20k PEG-디옥시티미딘(PEG-dT)가 제조되었다. 다음에는 일정량(2ml)의 용액이 50ml Falcon튜브에서 0.25, 1 및 4시간 동안, 5.73cm2의 폴리프로필렌 한외여과 막(3M) 작업 표면에 노출되었다. 출발용액은 아세토니트릴로 25ml씩 2회 세척함으로써 Falcon튜브 및 막으로부터 세척되었다. 세척용매는, 260nm에서의 흡수도에 의하여 분광광도측정법으로 PEG-dT에 대하여 검정되고, 출발 PEG-dT의 흡수도에 상대적으로 비교평가되었다. 튜브 및 유리기구에 대한 측정손실 조절은, 막 없는 Falcon튜브를 4시간 동안 2ml의 출발용액에 노출시키고 260nm에서 PEG-dT에 대하여 검정함으로써 수행되었다. 결과는 표 6에 제시된다.
폴리프로필렌 한외여과막에 노출후에 페길화 디옥시티미딘의 회수: 염화메틸렌 용매 시스템
1.48g의 46μmol dT/g PEG-dT를 25ml의 염화메틸렌에 용해시켜서, 2.72mM 20k PEG-디옥시티미딘(PEG-dT)가 제조되었다. 다음에는 일정량(2ml)의 용액이 50ml Falcon튜브에서 0.25, 1 및 4시간 동안, 5.73cm2의 폴리프로필렌 한외여과 막(3M) 작업 표면에 노출되었다. 출발용액은 염화메틸렌으로 25ml씩 2회 세척함으로써 Falcon튜브 및 막으로부터 세척되었다. 세척용매는, 260nm에서의 흡수도에 의하여 분광광도측정법으로 PEG-dT에 대하여 검정되고, 출발 PEG-dT의 흡수도에 상대적으로 비교평가되었다. 튜브 및 유리기구에 대한 측정손실 조절은, 막 없는 Falcon튜브를 4시간 동안 2ml의 출발용액에 노출시키고 260nm에서 PEG-dT에 대하여 검정함으로써 수행되었다. 결과는 표 7에 제시된다.
재생 셀루로오스 한외여과막에 노출후에 페길화 디옥시티미딘의 회수: 아세토니트릴 용매 시스템
1.55g의 46μmol dT/g PEG-dT를 25ml의 아세토니트릴에 용해시켜서, 2.85mM 20k PEG-디옥시티미딘(PEG-dT)가 제조되었다. 일정량(2ml)의 용액이 50ml Falcon튜브에서 0.25, 1 및 24시간 동안, 5.73cm2의 폴리프로필렌 한외여과 막(Millipore, 10KPLGC) 작업 표면에 노출되었다. 출발용액은 아세토니트릴 25ml로 세척함으로써 Falcon튜브 및 막으로부터 세척되었다. 막을 6일간 25ml의 아세토니트릴에 담근 후 다시 25ml의 아세토니트릴로 세척하였다. 세척용매는, 260nm에서의 흡수도에 의하여 분광광도측정법으로 PEG-dT에 대하여 검정되고, 출발 PEG-dT의 흡수도에 상대적으로 비교평가되었다. 튜브 및 유리기구에 대한 측정손실 조절은, 막 없는 Falcon튜브를 4시간 동안 2ml의 출발용액에 노출시키고 260nm에서 PEG-dT에 대하여 검정함으로써 수행되었다. 결과는 표 8에 제시된다.
아세토니트릴/에테르 중의 페길화 디옥시티미딘의 원심분리: 디에틸에테르, 디이소프로필 에테르 및 N-부틸 에테르 비교.
0.4855g의 46mol/g PEG-dT를 10ml의 아세토니트릴에 용해시켜서, 2.34mM 20k PEG-디옥시티미딘(PEG-dT)가 제조되었다. 1ml의 디에틸에테르, 디이소프로필 에테르나, 또는 N-부틸 에테르를 첨가하여, 일정량의 0.5, 0.25 및 0.125ml가 침전되었다. 침전물은 2분동안 약 4,400xg로 원심분리 되었다. 상청액의 PEG-dT 함량은 분광광도 측정법으로 측정되고 출발 PEG-dT에 상대평가되었다. 취급 손실을 나타내는 조절은, 상술한 바와 같이 1.5ml의 출발용액을 원심분리 및 검정하므로써 수행되었다. 결과는 제 9 도에 요약된다.
유동 및 FTIR 평가에 의한 양립성
폴리비닐리텐디플루오라이드(PVDF) 및 폴리프로필렌막이, 그들을 다음과 같은 용매 시스템에 침적시키므로써 평가되었다: 아세토니트릴, 염화메틸렌, 아세토니트릴 중의 카플링/캡핑/산화(c/c/O) 용액 및 염화메틸렌 중의 3% DCA의 혼합물. 직경이 1½"인 막조각이 용액에 침몰되어 24시간 침적되고 초기 용액의 유동 평가를 위하여 아세토니트릴로 세척되었다. 막 샘플은, 용액에 침적 후에 막상에 잔류할 수도 있는 임의의 과잉 물질이 제거되었다. 다양한 용매에 노출된 후의 아세토니트릴 유출 속도가 표 9에 기재된다. 알 수 있는 바와 같이, PVDF와 폴리프로필렌막 사이에는 유출속도(ml/분/㎠)에 있어서 극소한 변화가 있을 뿐이다.
보유물 조사에 있어서, 재생된 셀루로오스막이, FTIR에 의하여 측정할 때 일부 PEG를 보유하고 있는 것으로 판명되었다. 실리콘, 세라믹, 폴리올레핀 및 HDPE막은 조사중이다.
실시예 15.말레이미도-트리틸 모노마의 제조
(도식 17)
4,4'-디-(3-t-부틸디메틸실릴옥시프로폭시)-벤조페논[66]의 제조
4,4'-디히드록시벤조페논[28](10g, 46.7mmol)이 미추노부(Mitsunobu) 조건하에서, 테트라히드로푸란중의 t-부틸디메틸실릴옥시-3-프로판올(조원료 40g, 약 150mmol), DEAD(22.1ml, 140.0mmol) 및 트리페닐포스핀(36.7g, 140.0mmol)과 0℃에서 반응하였다. 반응물은 아르곤하에서 실온에서 가온되도록 하였다. 24시간 후, 반응물은 농축되고 염은 헥산/에테르로 침전되어 여과되었다. 잔류물질은 칼럼 크로마토그라피(실리카 겔: 헥산에서 85% 헥산/아세트산 에틸로의 경사)에 의하여 정제되어, 54%의 수율로 14g의 요망 생성 화합물[66]을 얻었다.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.92 (d, 4H), 7.68 (d, 4H), 4.13 (t, 4H), 3.76 (t, 4H), 1.96-1.88 (m, 4H), 0.85 (s, 18H), 0.02 (s, 12H).
4,4'-디-(3-t-부틸디메틸실릴옥시프로폭시)-트리페닐메탄올[67]의 제조
보호된 벤조페논[66](5.7g, 10.2mmol)이 40ml의 건조 THF에 용해되고 브롬화 페닐마그네슘(20.5ml, 20.4mmol)이 첨가되었다. 반응물은 아르곤하에서 2시간 동안 실온에서 교반되고, 농축, 디클로로메탄 및 포화염화암모늄간의 분리 및 물로 세척되었다. 유기층은 건조(MgSO4) 및 농축되어 정량적인 수율로 6.5g의 황색 껌, 화합물[67]이 산출되고, 직접 다음 단계에서 사용되었다.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.27-7.17, 7.05, 6.82 (m, 13H), 6.23 (s, 1H), 3.99 (t, 4H), 3.73 (t, 4H), 1.91-1.83 (m, 4H), 0.84 (s, 18H), 0.02 (s, 12H).
4,4'-디-(3-히드록시프로폭시)-트리페닐메탄올[68]의 제조.
트리틸 화합물[67](6.37g, 10mmol)이, 아세토니트릴중의 트리에틸아민 플루오르화수소산염(3.64g, 30mmol)으로 16시간동안 실온에서 처리됨으로써 탈보호되었다. 반응물은 농축되고, 칼럼 크로마토그라피(실리카, 경사: 1: 1 헥산: 아세트산 에틸로부터 아세트산 에틸: 5% 메탄올, 모두 1% 트리에틸아민과 함께)에 의하여 농축되어 69%의 수율로 황색 껌인 2.8g의 소정의 생성물[68]이 제공되었다.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.30-7.18, 7.06, 6.83 (m, 13H), 6.22 (s, 1H), 4.55 (t, 2H), 4.07-3.98 (m, 4H), 3.57-3.52 (m, 4H), 1.88-1.80 (m, 4H).
4,4'-디-(3-p-톨루엔술폰옥시프로폭시)-트리페닐메탄올[69]의 제조.
15ml 아세토니트릴중의 화합물[68](1.39g, 3.4mmol)에, 아세토니트릴중의 염화토실(1.43g, 7.49mmol) 및 2,4,6-콜리딘(1ml, 7.49mmol)의 용액이 첨가되었다. 반응물은 아르곤하에서 2.5일간 실온에서 교반된 후 농축되었다. 칼럼 크로마토그라피(실리카, 1% 트리에틸아민을 지닌 헥산중의 60% 아세트산 에틸)에 의하여 잔류물이 정제되어 25%의 수율로 0.6g의 토실화 화합물[69]이 제공된다.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.76 (d, 4H), 7.38 (d, 4H), 7.32-7.06, 7.01, 6.73 (m, 13H), 6.26 (s, 1H), 4.17 (t, 4H), 3.88 (t, 4H), 2.33 (s, 6H), 2.04-1.96 (m, 4H).
4,4'-i-(3-아지도프로폭시)-트리페닐메탄올[70]의 제조
15ml의 건조 DMF 중의 [69](0.6g, 0.84mmol)의 용액에, 아지드화 리튬(0.12g, 2.51mmol)이 첨가되었다. 반응물은 아르곤하에서 철야로 실온에서 교반되고, 농축되고, 칼럼 크로마토그라피(실리카, 1% 트리에틸아민을 지닌 헥산중의 60% 아세트산에틸)에 의하여 정제되어, 0.38g(100%)의 황색 껌으로서의 화합물[70]을 산출하였다.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.34-7.17, 7.07, 6.85 (m, 13H), 6.25 (s, 1H), 3.99 (t, 4H), 3.50 (t, 4H), 2.00-1.77 (m, 4H).
4,4'-디-(3-아미노프로폭시)-트리페닐메탄올[71]의 제조
아지드[70](0.25g, 0.55mmol)가 메탄올중의 활성탄으로 가온, 여과되고 농축되었다. 잔류물이 다시 50ml의 메탄올에 용해되고, 탄소상의 55mg의 5% 팔라듐이 첨가되었다. 플라스크가 비워지고 수소가 충전된 풍선형 플라스크가 첨가되었다. 1시간 후, 실온에서 촉매가 여과되었다. 반응물은 농축되어 직접 다음 단계에 사용되었다.
4,4'-디-(3-말레이미도프로폭시)-트리페닐메탄올[73]의 제조
조잔류물[71]이 50ml의 1:1 아세토니트릴: 물에 용해되어 얼음욕조에서 교반되었다. 메톡시 카르보닐 말레이미드 시약[72](0.16g, 0.98mmol)이 첨가되고, 2시간에 걸쳐 pH가 10.1에서 5로 떨어지는 것이 관측되었다. 잔류물은 아세트산 에틸 및 소금물간에 분리되었다. 유기층은 농축되고, 1:1 아세토니트릴: 물에 재용해되고 10ml의 5% 중탄산나트륨으로 교반되었다. 17분 후, 반응물은 1M 황산으로 pH3으로 산성화되었다. 아세트산 에틸(20ml)이 첨가되고 용액은 분리되었으며 수성층은 아세트산 에틸로 역추출되었다. 결합된 유기층은 농축되고 칼럼 가스크로마토그라피(실리카, 아세트산 에틸 및 헥산 혼합물)에 의하여 정제되어 36%의 수율로 0.104g의 생성물[73]을 산출하였다.1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.30-7.18, 7.04, 7.68 (m, 13H), 7.02 (s, 4H), 6.24 (s, 1H), 3.92 (t, 4H), 3.57 (t, 4H), 1.99-1.89 (m, 4H), MS (MS+566). 분석, C33H30N2O7에 대한 계산값: C, 69.95; H, 5.34; N, 4.94, 판명값: C, 69.74; H, 5.67; N, 4.78.
실시예 16.디엔-변형 캡핑처리제로 캡핑처리하고, 계속하여 친디엔체 수지 또는 막상에서 포착함으로써 비-PASS 올리고뉴클레오티드 합성 중 실패서열을 선택적으로 제거하는 방법.
3,5-헥사디엔오산 무수물[74], 3,5-헥사디엔옥시아세트산 무수물[75] 및 염화 트리헥사디엔옥시실릴[76]의 제조.
당분야에 공지된 표준방법에 의하여 화합물[74], [75] 및 [76]이 제조되었다. 화합물[74]는, 3,5-헥사디엔올로부터, 해당 헥사디엔오산으로의 산화 및 후속 탈수반응에 의하여 제조될 수 있다. 화합물[75]는 이오도아세트산 무수물과 3,5-헥사디엔올과의 반응으로부터 얻어지며, 화합물[76]은 4염화 실리콘과 3,5-헥사디엔올과의 반응생성물이다. 이들 합성방법외에도, 화합물[74], [75] 및 [76]은 다양한 기타 방법으로 제조될 수 있다.
3'-PEG 고정 액상 합성 중 캡핑처리제로서 화합물[75]의 사용 및 계속하여 실패서열의 제거.
캡핑처리제가 변경되고 실패서열 제거 단계가 첨가되는 것을 제외하고는 실시예 7에 기재된 바와 같이 액상 합성법이 수행되었다. 캡핑처리 단계중, 동일량의 3,5-헥사디엔옥시아세트산 무수물[75], 2,6-루티딘, 및 N-메틸이미다졸이 동시에 용액에 주입되고 교반되었다. 반응혼합물에 말레이미드-유도화 폴리스티렌 수지가 첨가되고 교반이 계속된다. 수지가 여과되어 버리고 폴리마는 실시예 7의 탈트리틸화 공정에 기재된 바와 같이 에테르로부터 침전된다.
종래의 고형상 합성법 중 캡핑처리제로서 화합물[76]의 사용 및 실패서열의 제거.
캡핑처리제로서 아세트산 무수물 대신에 트리(3,5-헥사디엔옥시)염화실릴[76]이 사용된다는 것을 제외하고는, 고형상 합성장치 제조자에 의하여 제공된 사양에 따라, DNA, RNA 및 변형된 올리고뉴클레오티드의 종래의 고형상 합성법이 수행되었다. 지지체로부터 올리고뉴클레오티드의 분열 및 탈보호에 따라, 조 올리고뉴클레오티드가 물/아세토니트릴에 취해지고, 말레이미드-유도화 폴리스티렌이 용액에 첨가된다. 반응이 완료되면, 수지-결합 실패서열은 여과되어 버리고, 생성물 올리고뉴클레오티드는 필요하면 다시 정제된다.
표 1. C18 가역상에서의 알킬치환 트리탄올의 운동성(Rf)
용매 DOT 4-디시클로옥시-4'-메톡시트리탄올 DMT
아세토니트릴 0 0.52 0.77
메탄올 0 0.49 0.71
80% 아세트산 0 0.02 0.45
표 2. 모노마 첨가과정 프로토콜
단계 공정 시약/용매 수량1(mL) 시간(분)
1 탈트리틸화 2.5% DCA/CH2Cl2트리헥실실란 506.4 9
2 침전(2회) CH2Cl2/Et2O
3 카플링 아미디트DCICH3CN 4.5mL(2.0 당량)1.4mL(6.0 당량)50mL 25
4 침전 Et2O
5 산화카플링 디아세트산이오도벤젠CH3CN카플링 용액2 8506/6/6 85
6 침전(2회) Et2O/CH2Cl2
7 결정화 EtOH 500
1. 수량은 5.0g의 출발 PEG-뉴클레오시드(적재, 45μmol/g)에 대한 것이다.
2. 캡핑 용액: 아세트산 무수물, 2,6-루티딘, N-메틸이미다졸.
표 3. 10량체의 올리고뉴클레오티드에 대한 카플링 효율(%)
과정 에스테르 링커 아미드 링커
1 99.6 99.2
2 162 123
3 99.4 98.2
4 99.5 99.3
5 99.1 99.2
6 99.5 99.0
7 97.1 97.3
8 98.1 97.8
9 97.3 97.6
표 4. 디엔-치환 트리탄올과 N-에틸말레이미드의 부가고리화 반응 속도*
반응 반응 조건 반응 완결(%)
# N-에틸-말레이미드(당량) CH3CN/H2O%/% 시간(hr) 반응 1(30)→(37) 반응 2(36)→(38)
1 2 100/0 3 29 20
5 36 28
24 65 57
2 10 100/0 1 52 34
3 71 51
5 82 72
3 10 50/50 1 84 68
3 100 93
5 N/A 100
*반응은 중수소치환 용매중 실온에서 수행되었다. % 반응 완결은 조반응 혼합물로부터 직접 취한 일정 성분의1H NMR 분석에 의하여 측정되었다. 별다른 지적이 없는 한, 모든 반응은 0.07M의 농도에서 수행되었다.
표 5. 티미딘 치환 트리탄올과 N-에틸말레이미드의 부가고리화 반응속도
시간 % 완결
5'(DHDT)티미딘(31)
1시간 78
3시간 100
5'-(DHDT)티미딘 3'-포스포아미디트(32)
1시간 63
3시간 96
5시간 100
표 6. 아세토니트릴 용매시스템을 이용하여 한외여과막으로부터 20k-PEG-dT의 회수
제 1 세척(μmol PEG-dT) 제 2 세척(μmol PEG-dT) PEG-dT회수(%)
대조 5.41 98.7%
0.25시간 5.30 0.12 98.9%
1시간 5.31 0.07 98.2%
4시간 5.28 0.13 98.7%
표 7. 염화메틸렌을 사용하여 한외여과막으로부터 20k-PEG-dT의 회수
제 1 세척(μmol PEG-dT) 제 2 세척(μmol PEG-dT) PEG-dT회수(%)
대조 5.52 101.4%
0.25시간 5.19 0.13 97.7%
1시간 5.32 0.11 99.7%
4시간 5.33 0.08 99.3%
표 8. 아세토니트릴을 사용하여, 재생 한외여과막으로부터 20k-PEG-dT의 회수
제 1 세척(μmol PEG-dT) 침적 및 제 2 세척(μmol PEG-dT) PEG-dT회수(%)
대조 5.62 98.7%
0.25시간 4.80 0.90 100.0%
1시간 4.45 1.20 99.1%
4시간 4.40 1.20 98.3%
24시간 4.17 1.40 97.7%
표 9. 합성용매에 노출된 막에 대한 유출 데이타
막 CH3CN뿐 노출된 c/c/o/T의 CH3CN 세척 DCA/CH2Cl2 DCA/CH2Cl2의 CH3CN 세척
PVDF 0.75 0.83 0.94 0.8
폴리프로필렌 7.19 7.45 8.76 8.51

Claims (82)

  1. 하기 a) 및 b) 단계를 포함하는, 올리고뉴클레오티드의 액상 합성법:
    a) 5-보호 모노마 단위와 출발물질은 반응시켜서 하나의 생성물을 함유하는 반응혼합물을 형성; 및
    b) 5'-보호작용 그룹의 존재를 기초로 하여, 미반응 출발물질, 미반응 5'-보호 모노마 단위, 부산물 및 시약으로부터 상기 생성물을 분리.
  2. 제 1 항에 있어서, 5'-보호 모노마 단위가 하기 구조식을 갖는 방법.
    여기서
    B는 핵염기;
    A는 2'-당 치환제;
    A'는 2'-당 치환체;
    W는 포스포아미디트, H-포스폰산염, 인산염 트리에스테르, 포스폰산메틸, 포스포아미데이트 및 보호된 올리고뉴클레오티드로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는데, 여기서 상기 보호된 올리고뉴클레오티드는 포스포아미디트, H-포스폰산염, 인산염 트리에스테르, 포스폰산메틸, 포스포아미데이트로 구성되어 있는 군으로부터 선택된3'-말단 그룹을 갖는다; 및
    D∼E는 알코올 보호작용 그룹(들)이다.
  3. 제 1 항에 있어서, 하기 c) 단계를 또한 포함하는 방법:
    c) 연속적인 과정에서, 단계 a) 및 b) 단계를 소정의 회수만큼 반복하여 목적 생성물을 산출.
  4. 제 1 항에 있어서, a) 및 b) 단계 사이에 하기 a1)∼a3) 단계를 포함하는 방법:
    a1) a) 단계에서 얻어진 반응 혼합물을 산화하여, 산화된 5'-보호 모노마 단위, 산화된 생성물 및 출발물질을 함유하는 제2 반응혼합물을 산출;
    a2) 잔류 반응혼합물로부터, 산화된 5'-보호 모노마 단위를 분리; 및
    a3) 선택적으로, 산화된 5'-보호 모노마 단위를 유리.
  5. 제 2 항에 있어서, W가 포스포아미디트, H-포스폰산염 및 보호된 올리고뉴클레오티드로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는데, 여기서 상기 보호된 올리고뉴클레오티드가 포스포아미디트 또는 H-포스폰산염으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 3'-말단 그룹을 갖는 방법.
  6. 제 2항에 있어서, A 및 A'는, H,2H,3H, Cl, F, OH, NHOR1, NHOR3, NHNHR3, NHR3, =NH, CHCN, CHCl2, SH, SR3, CFH2, CF2H, CR2 2Br, -(OCH2CH2)nOCH3, OR4및 이미다졸로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는데; 여기서
    R1은 H 및 알코올 보호작용 그룹으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되며;
    R2는 =0, =S, H, OH, CCl3, CF3, 할로겐화물, 선택적으로 치환된 C1∼C20알킬(고리형, 직쇄 및 가지쇄를 포함), 알케닐, 아릴, C1∼C20아실, 벤조일, OR4및 에스테르로 구성되어 있는 군으로부터 선택되며;
    R3는 R2, R4, CN, C(O)NH2, C(S)NH2, C(O)CF3, SO2R4, 아미노산, 펩티드 및 그들의 혼합물로 구성되어 있는 군으로부터 선택되며;
    R4는 선택적으로 치환된 탄화수소 (C1∼C10알킬, C2∼C20알케닐, C2-C20알키닐), 선택적으로 치환된 헤테로고리, t-부틸디메틸실릴 에테르, 트리이소프로필실릴 에테르, 뉴클레오시드, 탄수화물, 형광 라벨 및 인산염으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제 2 항에 있어서, A가 H, OH, NH2, Cl, F, NHOR, -(OCH2CH2)nOCH3, OR4, OSiR4 3로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는데, 여기서
    R4가 선택적으로 치환된 탄화수소(C1∼C20알킬, C2∼C20알케닐, C2∼C20알키닐), 선택적으로 치환된 헤테로고리, t-부틸디메틸실릴 에테르, 트리이소프로필실릴 에테르, 뉴클레오시드, 탄수화물, 형광라벨 및 인산염으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되며; 및
    A'는 H인 방법.
  8. 제 2 항에 있어서, D가 고형지지체에 대하여 강력한 친화성을 갖거나 또는 유도화 고형 지지체와 공유결합할 수 있도록 선택된 화합물이며, E는 산소-E 결합이 용이하게 분열되도록 선택된 화합물인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, E가 트리틸 그룹, 레뷰린산 그룹, 또는 실릴에테르 그룹으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 트리틸 그룹이 하기 구조를 갖는 방법:
    여기서,
    D는, H, OR4, 디엔 단위를 지닌 치환된 알킬 그룹 또는 알킬 그룹, 친디엔체 단위를 지닌 치환된 알킬 그룹 또는 알킬 그룹, 디엔 단위를 지닌 치환된 알콕시 그룹 또는 알콕시 그룹, 친디엔체 단위를 지닌 치환된 알콕시 그룹 또는 알콕시 그룹, CH2=CHCH=CHCH2CH2O-, 말레이미드 치환 알콕시 그룹, 알콕시 그룹, 디엔 단위를 지닌 치환된 알킬아미노 그룹 또는 알킬아미노 그룹, 말레이미드 치환 알킬아미노 그룹 또는 치환된 알킬아미노그룹, 친디엔체 성분을 지닌 치환된 알킬아미노 그룹 또는 알킬아미노 그룹, 디술피드, 알데히드, 및 금속 킬레이트제, 친디엔체 또는 디엔 단위를 지닌 실릴 에테르로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는데, 여기서
    R4는 선택적으로 치환된 탄화수소 (C1∼C10알킬, C2∼C20알케닐, C2-C20알키닐), 선택적으로 치환된 헤테로고리, t-부틸디메틸실릴 에테르, 트리이소프로필실릴 에테르, 뉴클레오시드, 탄수화물, 형광 라벨 및 인산염으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된다.
  11. 제 10 항에 있어서, D가 1∼50의 탄소원자를 갖는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, D가 1∼30의 탄소원자를 갖는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, D가 하기 화합물로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  14. 제 9 항에 있어서, 레뷰린산 그룹이 하기 구조를 갖는 방법:
    여기서,
    D는, H, OR4, 디엔 단위를 지닌 치환된 알킬 그룹 또는 알킬 그룹, 친디엔체 단위를 지닌 치환된 알킬 그룹 또는 알킬 그룹, 디엔 단위를 지닌 치환된 알콕시 그룹 또는 알콕시 그룹, 친디엔체 단위를 지닌 치환된 알콕시 그룹 또는 알콕시 그룹, CH2=CHCH=CHCH2CH2O-, 말레이미드 치환 알콕시 그룹, 알콕시 그룹, 디엔 단위를 지닌 치환된 알킬아미노 그룹 또는 알킬아미노 그룹, 말레이미드 치환 알킬아미노 그룹 또는 치환된 알킬아미노그룹, 친디엔체 성분을 지닌 치환된 알킬아미노 그룹 또는 알킬아미노 그룹, 디술피드, 알데히드, 및 금속 킬레이트제, 친디엔체 또는 디엔 단위를 지닌 실릴 에테르로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는데, 여기서
    R4는 선택적으로 치환된 탄화수소 (C1∼C10알킬, C2∼C20알케닐, C2-C20알키닐), 선택적으로 치환된 헤테로고리, t-부틸디메틸실릴 에테르, 트리이소프로필실릴 에테르, 뉴클레오시드, 탄수화물, 형광 라벨 및 인산염으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된다.
  15. 제 14 항에 있어서, D가 1∼50의 탄소원자를 갖는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, D가 1∼30의 탄소원자를 갖는 방법.
  17. 제 14 항에 있어서, D가 하기 화합물로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  18. 제 9 항에 있어서, 실릴 그룹이 하기 구조중의 하나를 갖는 화합물로부터 선택되는 방법:
    여기서,
    D는, H, OR4, 디엔 단위를 지닌 치환된 알킬 그룹 또는 알킬 그룹, 친디엔체 단위를 지닌 치환된 알킬 그룹 또는 알킬 그룹, 디엔 단위를 지닌 치환된 알콕시 그룹 또는 알콕시 그룹, 친디엔체 단위를 지닌 치환된 알콕시 그룹 또는 알콕시 그룹, CH2=CHCH=CHCH2CH2O-, 말레이미드 치환 알콕시 그룹, 알콕시 그룹, 디엔 단위를 지닌 치환된 알킬아미노 그룹 또는 알킬아미노 그룹, 말레이미드 치환 알킬아미노 그룹 또는 치환된 알킬아미노그룹, 친디엔체 성분을 지닌 치환된 알킬아미노 그룹 또는 알킬아미노 그룹, 디술피드, 알데히드, 및 금속 킬레이트제, 친디엔체 또는 디엔 단위를 지닌 실릴 에테르로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는데, 여기서
    R4는 선택적으로 치환된 탄화수소 (C1∼C10알킬, C2∼C20알케닐, C2-C20알키닐), 선택적으로 치환된 헤테로고리, t-부틸디메틸실릴 에테르, 트리이소프로필실릴 에테르, 뉴클레오시드, 탄수화물, 형광 라벨 및 인산염으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된다.
  19. 제 18 항에 있어서, D가 1∼50의 탄소원자를 갖는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, D가 1∼30의 탄소원자를 갖는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, D가 하기 화합물로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 고형지지체를 통하여 반응 혼합물을 용출시킴으로써 분리작업이 수행되는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 고형 지지체가 D에 대하여 친화성을 지니는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 고형 지지체가 D와 공유결합하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 공유결합반응이 디엘스-알더 반응인 방법.
  26. 제 22 항에 있어서, 고형 지지체가 수지, 막, 폴리마로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 방법.
  27. 제 22 항에 있어서, 고형 지지체가, 소수성 가역상 수지, 티오프로필 세파로우스 수지, 수은화 수지, 아가로우스 아디프산 히드라지드 수지, 아비딘 수지, 한외여과막, TentagelTM, 폴리에틸렌 글리콜, 및 실리카 겔, 알루미나, 조절된 기공 유리 및 제오라이트로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 무기산화물로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 소수성 가역상 수지가 C2∼C18 폴리스티렌 수지로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 방법.
  29. 제 22 항에 있어서, 출발물질이 3'-폴리에틸렌 글리콜(PEG) 유도화 올리고뉴클레오티드이고, 한외여과막을 사용하여 5'-보호 모노마 단위가 잔류 반응혼합물로부터 분리되는 방법.
  30. 제 22 항에 있어서, 고형 지지체가 디엔 또는 친디엔체로부터 선택된 그룹으로 유도화되는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 디엔이 3,5-헥사디엔으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 방법.
  32. 제 30 항에 있어서, 친디엔체가 말레이미드인 방법.
  33. 제 4 항에 있어서, 산화가 진공중에서 수행되는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 산화가 I2, 피리딘 및 물로 수행되는 방법.
  35. 제 33 항에 있어서, 산화가 디아세트산 이오도벤젠으로 수행되는 방법.
  36. 제 33 항에 있어서, 산화가 과요오드산 나트륨 또는 과요오드산 테트라알킬암모늄으로 수행되는 방법.
  37. 제 1 항의 방법에 의하여 형성된 생성물.
  38. 하기 a)∼g) 단계를 포함하는, 올리고뉴클레오티드의 액상 합성법.
    a) 5'-보호 모노마 단위와 출발물질을 반응시켜서 생성물, 5'-보호 모노마 단위 및 출발물질을 함유하는 반응혼합물을 형성;
    b) 단계 a)의 반응혼합물을 산화;
    c) 단계 b)의 산화된 반응혼합물을 추출 용기에 첨가;
    d) 유기 용매로 상기 반응혼합물을 추출;
    e) 고형 지지체를 함유하는 크로마토그라피 수지 챔버를 통하여 단계 d)로부터의 추출물을 함유하는 유기용매를 용리. 여기서 상기 산화된 5'-보호 모노마 단위는 고형 지지체상에 체류되며, 산화된 생성물 및 출발물질은 용리된 용매에 잔류한다;
    f) 제2 고형 지지체를 통하여, e) 단계에서 얻어진 유기 유출액을 용리함으로써 출발물질로부터 산화된 생성물을 분리. 여기서 산화된 생성물은 고형 지지체상에 체류되며, 출발물질은 용매와 함께 용리된다; 및
    g) 묽은 산으로 상기 제2 고형 지지체를 세척함으로써 상기 제2 고형 지지체로부터 상기 산화된 생성물을 용리.
  39. 제 38 항에 있어서, g) 단계 후에 하기 g1) 및 g2) 단계를 또한 포함하는 방법.
    g1) 단계 g)에서 얻어진 유출액을 유기 염기로 중화; 및
    g2) 상기 중화된 유출액을 농축시키고 및 한외여과에 의하여 상기 산화된 생성물을 아세토니트릴로 교환.
  40. 제 38 항에 있어서, g) 단계 후에 하기 g1) 단계를 또한 포함하는 방법.
    g1) 유출액을 중화하기 위하여, 단계 g)에서 얻어진 상기 유출액을 제3 고형지지체를 통하여 용리.
  41. 제 40 항에 있어서, 제3 고형지지체가 Dowex인 방법.
  42. 제 38 항에 있어서, e) 및 f) 단계 사이에 하기 e1) 단계를 또한 포함하는 방법:
    e1) 산화된 5'-보호 모노마를 방출 및 유리하기 위하여 고형 지지체를 세척.
  43. 하기 구조식의 화합물:
    여기서
    R'은 디엔 또는 친디엔체로부터 선택된다; 및
    X는 할로겐, 히드록실, OR" 및 OAr로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는데, 여기서 R"는 알킬 또는 치환된 알킬 그룹이고, Ar은 방향족 또는 이종방향족 그룹이다.
  44. 제 43 항에 있어서, R'가 3,5-헥사디엔인 화합물.
  45. 제 43 항에 있어서, R'가 2,4-헥사디엔인 화합물.
  46. 제 43 항의 화합물과, 고형 지지체에 부착된 친디엔체, 고형 지지체에 부착된 디엔, 디엔 및 친디엔체로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 화합물의 디엘스-알더 반응에 의하여 형성된 화합물.
  47. 제 46 항에 있어서, R'가 3,5-헥사디엔 또는 2,4-헥사디엔으로부터 선택되는 화합물.
  48. 제 46 항에 있어서, 친디엔체가 말레이미드인 화합물.
  49. 제 46 항에 있어서, X가 결여되어, 양성으로 하전된 화합물을 초래하는 화합물.
  50. 하기 구조식의 화합물:
    여기서
    B는 핵염기;
    A는 2'-당 치환제;
    A'는 2'-당 치환체;
    W는 포스포아미디트, H-포스폰산염, 인산염 트리에스테르, 포스폰산메틸, 포스포아미데이트 및 보호된 올리고뉴클레오티드로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는데, 여기서 상기 보호된 올리고뉴클레오티드는 포스포아미디트, H-포스폰산염, 인산염 트리에스테르, 포스폰산메틸, 포스포아미데이트 및 탈보호된 올리고뉴클레오티드로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 3'-말단 그룹을 갖는다; 및
    R'는 디엔 또는 친디엔체로부터 선택된다.
  51. 제 50 항에 있어서, W가 포스포아미디트, H-포스폰산염 및 보호된 올리고뉴클레오티드로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는데, 여기서 상기 보호된 올리고뉴클레오티드가, 포스포아미디트 또는 H-포스폰산염으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 3'-말단 그룹을 갖는 화합물.
  52. 제 50 항에 있어서, A 및 A'는, H,2H,3H, Cl, F, OH, NHOR1, NHOR3, NHNHR3, NHR3, =NH, CHCN, CHCl2, SH, SR3, CFH2, CF2H, CR2 2Br, -(OCH2CH2)nOCH3, OR4및 이미다졸로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는데; 여기서
    R1은 H 및 알코올 보호작용 그룹으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는데;
    R2는 =0, =S, H, OH, CCl3, CF3, 할로겐화물, 선택적으로 치환된 C1∼C20알킬(고리형, 직쇄 및 가지쇄를 포함), 알케닐, 아릴, C1∼C20아실, 벤조일, OR4및 에스테르로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는데;
    R3는 R2, R4, CN, C(O)NH2, C(S)NH2, C(O)CF3, SO2R4, 아미노산, 펩티드 및 그들의 혼합물로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는데;
    R4는 선택적으로 치환된 탄화수소 (C1∼C10알킬, C2∼C20알케닐, C2-C20알키닐), 선택적으로 치환된 헤테로고리, t-부틸디메틸실릴 에테르, 트리이소프로필실릴 에테르, 뉴클레오시드, 탄수화물, 형광 라벨 및 인산염으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 화합물.
  53. 제 50 항에 있어서, A가 H, OH, NH2, Cl, F, NHOR, -(OCH2CH2)nOCH3, OR4, OSiR4 3로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는데, 여기서
    R4가 선택적으로 치환된 탄화수소(C1∼C20알킬, C2∼C20알케닐, C2∼C20알키닐), 선택적으로 치환된 헤테로고리, t-부틸디메틸실릴 에테르, 트리이소프로필실릴 에테르, 뉴클레오시드, 탄수화물, 형광라벨 및 인산염으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되며; 및
    A'는 H인 화합물.
  54. 제 50 항에 있어서, R'가 3,5-헥사디엔인 화합물.
  55. 제 50 항에 있어서, R'가 2,4-헥사디엔인 화합물.
  56. 제 50 항의 화합물과, 고형 지지체에 부착된 친디엔체, 고형 지지체에 부착된 디엔, 디엔 및 친디엔체로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 화합물의 디엘스-알더 반응에 의하여 형성된 화합물.
  57. 제 56 항에 있어서, R'가 3,5-헥사디엔 또는 2,4-헥사디엔으로부터 선택되는 화합물.
  58. 제 56 항에 있어서, 친디엔체가 말레이미드인 방법.
  59. 하기 구조식의 화합물:
    여기서
    B는 핵염기;
    A는 2'-당 치환제;
    A'는 2'-당 치환체;
    W는 포스포아미디트, H-포스폰산염, 인산염 트리에스테르, 포스폰산메틸, 포스포아미데이트 및 보호된 올리고뉴클레오티드로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는데, 여기서 상기 보호된 올리고뉴클레오티드는 포스포아미디트, H-포스폰산염, 인산염 트리에스테르, 포스폰산메틸, 포스포아미데이트 및 탈보호된 올리고뉴클레오티드로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 3'-말단 그룹을 갖는다; 및
    고형지지체가 가교결합 유기 폴리마, 폴리스티렌, TentagelTM, 폴리에틸렌 글리콜, 실리카 겔, 알루미나, 조절된 가공유리 및 제오라이트로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 무기 산화물로 구성되어 있는 군으로부터 선택된다.
  60. 제 59 항에 있어서, A 및 A'는, H,2H,3H, Cl, F, OH, NHOR1, NHOR3, NHNHR3, NHR3, =NH, CHCN, CHCl2, SH, SR3, CFH2, CF2H, CR2 2Br, -(OCH2CH2)nOCH3, OR4및 이미다졸로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는데; 여기서
    R1은 H 및 알코올 보호작용 그룹으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는데;
    R2는 =0, =S, H, OH, CCl3, CF3, 할로겐화물, 선택적으로 치환된 C1∼C20알킬(고리형, 직쇄 및 가지쇄를 포함), 알케닐, 아릴, C1∼C20아실, 벤조일, OR4및 에스테르로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는데;
    R3는 R2, R4, CN, C(O)NH2, C(S)NH2, C(O)CF3, SO2R4, 아미노산, 펩티드 및 그들의 혼합물로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는데;
    R4는 선택적으로 치환된 탄화수소 (C1∼C10알킬, C2∼C20알케닐, C2-C20알키닐), 선택적으로 치환된 헤테로고리, t-부틸디메틸실릴 에테르, 트리이소프로필실릴 에테르, 뉴클레오시드, 탄수화물, 형광 라벨 및 인산염으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 화합물.
  61. 제 59 항에 있어서, A가 H, OH, NH2, Cl, F, NHOR, -(OCH2CH2)nOCH3, OR4, OSiR4 3로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는데, 여기서
    R4가 선택적으로 치환된 탄화수소(C1∼C20알킬, C2∼C20알케닐, C2∼C20알키닐), 선택적으로 치환된 헤테로고리, t-부틸디메틸실릴 에테르, 트리이소프로필실릴 에테르, 뉴클레오시드, 탄수화물, 형광라벨 및 인산염으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되며; 및
    A'는 H인 화합물.
  62. 제 59 항에 있어서, W가 보호된 올리고뉴클레오티드인데, 여기서 상기 보호된 올리고뉴클레오티드가, 분자량이 5,000 ∼ 100,000인 폴리에틸렌 글리콜 및 히드록실로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 3'-말단 그룹을 갖는 화합물.
  63. 하기 구조식의 화합물:
    여기서 R은 디엔으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된다.
  64. 제 63 항에 있어서, R이 2,4-펜타디엔으로부터 선택되는 화합물
  65. 올리고뉴클레오티드의 합성에 있어서, 캡핑제로서 제 63 항의 화합물을 사용하는 방법.
  66. 올리고뉴클레오티드의 합성에 있어서, 실패서열을 제거하기 위한 수단으로서 제 63 항의 화합물을 사용하는 방법.
  67. 하기 구조식의 화합물:
    여기서 R은 디엔으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된다.
  68. 제 67 항에 있어서, R이 3,5-헥사디엔으로부터 선택되는 화합물.
  69. 올리고뉴클레오티드의 합성에 있어서, 캡핑제로서 제 67 항의 화합물이 사용되는 방법.
  70. 올리고뉴클레오티드의 합성에 있어서, 실패서열을 제거하기 위한 수단으로서 제 67 항의 화합물이 사용되는 방법.
  71. 하기 구조식의 화합물:
    여기서 R은 디엔, 알킬 그룹 또는 아릴 그룹으로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는데, 여기서 2개 이상의 R이 디엔이다.
  72. 제 71 항에 있어서, R이 3,5-헥사디엔, 페닐 및 tert-부틸로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는 화합물.
  73. 올리고뉴클레오티드의 합성에 있어서, 캡핑제로서 제 71 항의 화합물을 사용하는 방법.
  74. 올리고뉴클레오티드의 합성에 있어서, 실패서열을 제거하기 위한 수단으로서 제 71 항의 화합물을 사용하는 방법.
  75. 하기 a) ∼ e) 단계를 포함하는, 올리고뉴클레오티드의 액상 합성법:
    a) 5' 위치에 제 1 고형 지지체와 반응할 수 있는 보호작용 그룹을 함유하는 5'-보호 모노마 단위와 출발물질을 반응시켜서, 생성물, 5'-보호 모노마 단위 및 출발물질을 함유하는 반응 혼합물을 형성;
    b) 상기 제 1 고형 지지체를 함유하는 크로마토그라피 수지 챔버를 통하여 상기 반응 혼합물을 순환. 여기서 상기 5'-보호 모노마 단위 및 생성물은 상기 제 1 고형 지지체와 공유결합하므로써 고형 지지체 상에 체류된다;
    c) 상기 제 1 고형 지지체를 제 1 용매로 세척하여 출발물질을 용리;
    d) 체류된 5'-보호 모노마 단위 및 생성물을 묽은 산으로 세척하고 다음에는 제 2 유기 용매를 용리하여 5'-보호 모노마 단위와 함께 생성물을 방출 및 유리; 및
    e) 단계 d)에서 얻어진 유기 유출액을 제 2 고형 지지체를 관통시키므로써 5'-보호 모노마 단위로부터 생성물을 분리. 여기서 5'-보호 모노마 단위는 제 2 고형 지지체에 의하여 체류되며, 생성물은 제 2 용매로 용리된다.
  76. 제 75 항에 있어서, a) 및 b) 단계 사이에 하기 a1) 단계를 또한 포함하는 방법:
    a1) 생성물, 5'-보호 모노마 단위 및 출발물질을 함유하는 반응 혼합물을 산화하여, 산화된 5'-보호 모노마 단위, 산화된 생성물 및 출발물질을 함유하는 제 2 반응 혼합물을 산출.
  77. 제 75 항에 있어서, 제 1 및 제 2 고형 지지체가, 수지, 폴리마 및 막으로 구성되어 있는 군으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  78. 제 75 항에 있어서, 제 1 고형 지지체가 디엔 또는 친디엔체로부터 선택된 그룹으로 유도화되는 방법.
  79. 제 75 항에 있어서, 제 1 고형 지지체가 말레이미드로 유도화되는 방법.
  80. 제 75 항에 있어서, 제 2 고형 지지체가 한외여과막인 방법.
  81. 제 75 항에 있어서, 액상 합성법이 자동화되는 방법.
  82. 제 24 항에 있어서, 공유결합 반응이 환원성 아민화인 방법.
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