JP2000500740A

JP2000500740A - オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法

Info

Publication number: JP2000500740A
Application number: JP9516005A
Authority: JP
Inventors: ピーケン，ウルフガング; マクギー，ダニー; セトル，アレシア; チャイ，ヤンシェン; ヒュアン，ジャンピン
Original assignee: プロリゴ・エルエルシー
Priority date: 1995-10-19
Filing date: 1996-10-17
Publication date: 2000-01-25
Also published as: WO1997014706A1; EP0863910A1; KR19990064332A; US20040116685A1; CA2234159A1; US6262251B1; AU712779B2; AU7451896A; AU712779C

Abstract

(57)【要約】本発明は、オリゴヌクレオチドの逐次溶液相合成のための改良法を開示する。本方法は自動化に利用され、オリゴヌクレオチドを高い効率で大規模製造するのに理想的に適している。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法発明の分野本発明は、核酸化学の分野に関する。詳細には、本発明はオリゴヌクレオチド製造のための新規方法を記載する。オリゴヌクレオチド製造のために本明細書で用いる方法は、ＰＡＳＳ（生成物固定逐次合成、Product Anchored Sequential S ynthesisの頭字語）と呼ばれる。発明の背景ごく最近まで、厳密に情報性のもの以外の性能においてオリゴヌクレオチドを考慮した前例はなかった。特定のオリゴヌクレオチド（たとえばｔ−ＲＮＡ）が構造上興味深い可能性をもつことは知られており、自然界で他のオリゴヌクレオチドにポリペプチドが特異的に結合するという事実にもかかわらず、オリゴヌクレオチドの情報能以外にはほとんど関心が向けられていない。このため、オリゴヌクレオチドを特に医薬用化合物として使用することはほとんど考慮されたことがない。現在、医薬用化合物としてのオリゴヌクレオチドの使用に関する広範な研究をもたらした少なくとも３つの領域の探求がある。最も前進した分野では、タンパク質の発現を阻害するために、または種々の細胞融合を遮断するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて生物の特定のコード領域に結合させる。さらに、触媒機能をもつＲＮＡ種--リボザイム--の発見により、目的とする効果を達成する細胞内反応の遂行に投立つＲＮＡ種の研究が行われるようになった。最後に、ＳＥＬＥＸ法（指数的富化による系統的なリガンド生成、Systematic Evolu tion of Ligands by Exponential Enrichment）（Tuerk and Gold（1990）Scien ce 249:505）が見出されたことにより、生物学的関心のあるほとんどすべての標的に結合するオリゴヌクレオチドを同定しうることが示された。ＳＥＬＥＸ法は、“核酸抗体”と呼ばれる核酸リガンド、たとえば標的分子と相互作用する核酸を、同定および調製する方法である（Tuerk and Gold（1990） Science 249:505）。この方法では、混合物から候補オリゴヌクレオチドを選択し、そして同じ全般的選択趣旨で結合、分配および増幅を段階的に反復して、実際上いかなる目的基準の結合親和性および選択性をも達成する。遺伝子発現制御手段としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、およびオリゴヌクレオチドを有望な医薬として使用しうる可能性は、オリゴヌクレオチドの治療有効性や安定性を高めるために多数の化学修飾をオリゴヌクレオチドに導入することへと研究を進展させた。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの細胞透過性を高めるように、体内でオリゴヌクレオチド類似体の構造を分解するかまたは活性を妨害するヌクレアーゼその他の酵素からそれらを安定化するように、標的ＲＮＡへのそれらの結合性を高めるように、標的ＲＮＡに配列特異的に結合した時点で分断モード（終止事象）を付与するように、またそれらの薬物動態特性を改良するように設計される。最近の研究で、ＲＮＡの二次および三次構造が重要な生物学的機能をもつことが示された（Tinoco et al.(1987)Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.52:135;L arson et al.（1987）Mol.Cell Biochem.74:5；Tuerk et al.(1988)Proc.Natl.A cad.Sci.USA 85:1364；Resnekov et al.（1989）J．Biol.Chem.264:9953）。国際特許出願公開第WO 91/14436号（表題“ＲＮＡ模倣による遺伝子発現調節のための試薬および方法”）に、１種類またはそれ以上のタンパク質と相互作用しうる、ＲＮＡの一部を模倣したオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が記載されている。これらのオリゴヌクレオチドは、それらをヌクレアーゼ耐性にする修飾されたヌクレオシド間結合を含み、細胞透過能が高められ、かつ標的オリゴヌクレオチド配列に結合することができる。医薬として用いるための修飾オリゴヌクレオチドの開発においてはかなりの活動がなされたが、臨床発展が可能な規模でこれらの化合物を調製および単離することには、ほとんど関心が向けられていない。従来の実験室規模での１マイクロモル自動オリゴヌクレオチド合成では、臨床発展を可能にするのに十分な量の当該化合物は得られない。臨床発展のためには、オリゴヌクレオチドを少なくともグラム規模ないしマルチグラム規模の量で調製しなければならない。文献には大規模オリゴヌクレオチド合成の報告があるが、この“大規模”という用語はグラム規模ないしキログラム規模の量ではなく、１〜１０マイクロモル規模に対して適用されている（Iwai et al.（1990）Teteahedron 46:6673-6688）。現在のオリゴヌクレオチド合成の技術水準は、ホスホルアミダイト法による自動固相オリゴヌクレオチド合成法である。これを反応経路１に示す（Beaucage a nd Iyer（1992）Teteahedron 48:2223-2311；Zon and Geiser（1991）Anti-Canc er Drug Design 6:539-568；Matteucci and Caruthers（1981）J．Am.Chem.Soc .103:3185-3191）。簡単に述べると、合成すべきオリゴヌクレオチドの３′末端ヌクレオシドを固体支持体に結合させ、支持体に結合したままで一度に１ヌクレオチドの付加によりオリゴヌクレオチドを合成する。反応経路１に示すように、ヌクレオシドモノマーを保護し（Ｐ₁）、ホスホルアミダイトを製造する（１）。次いでこのホスホルアミダイト（５′保護モノマー単位と呼ぶ）を、成長中のオリゴヌクレオチド鎖のリボース環の５′−ヒドロキシル基により、ホスファイトトリエステル結合を介して、成長中のオリゴヌクレオチド鎖（２）に共有結合させて、オリゴヌクレオチド生成物（３）を得る。その際、成長中のオリゴヌクレオチド鎖の大部分は１ヌクレオチドだけ延長されるが、有意割合の鎖は延長されない。次いで生成物（３）を酸化して、ホスフェートトリエステル（４）を得る。成長中のオリゴヌクレオチド鎖に次の塩基を付加する前に、５′−ヒドロキシル基を脱保護しなければならない。ただし反応経路１から分かるように(化合物４)、必ずしも固体支持体上のすべての反応部位が５′保護モノマーと反応するわけではない。したがって５′−ヒドロキシル基を脱保護する（６）前に、これらの未反応部位（欠陥配列と呼ぶ）を保護しなければならない（キャッピングと呼ぶ）（５）。次いで、成長中のオリゴマーの５′末端をモノマーの３′末端に結合させることにより、同様に保護されかつホスホルアミダイトに変換された後続モノマーを逐次付加する。それぞれの結合反応で、オリゴヌクレオチドがホスファイトトリエステル結合により１モノマーだけ延長される。各工程で--および固体支持体との最初の反応の場合には--５′保護モノマーと反応しなかった反応部位があり、その結果１ヌクレオチドモノマー延長されなかったオリゴヌクレオチド（欠陥配列）が生しる。合成が完了した時点で目的オリゴヌクレオチド（６(ｎ＋１配列)）を脱保護し、すべての欠陥配列（ｎ、ｎ−ｘ）と共に樹脂から開裂させる。従来の固相オリゴヌクレオチド合成法の収率は、結合するモノマーの数と共に指数的に低下する。このため、欠陥配列から粗生成物を分離精製するのがいっそう困難になる。さらに、高い分離精製が達成されたとしても、生成物が標準的でないヌクレオチドを含有する場合は特に、生成物の配列および組成を確認するのは依然として著しく困難である。反応経路１固体支持体上での自動オリゴヌクレオチド合成は、少量（０．００１〜０．０１ミリモル）の多様な配列を最短時間で妥当な収率において製造するのには著しく効率的である。しかしそれは、装入モノマーを基準とした全プロセス収率に関しては、きわめて非効率的な方法である。一般に１モノマー付加につき１６倍過剰のホスホルアミダイトが必要である。自動固相合成法をオリゴヌクレオチド薬剤の効率的製造が可能になる水準にまで拡大するのは容易でないことが認識されている（Zon and Geiser（1991）Anti-Cancer Drug Design 6:539-568）。固相合成法の非効率性の大部分は、未反応欠陥配列と反応生成物の両方が同一支持体ビーズに共有結合することにより生じる。各サイクルで、支持体に結合したヌクレオチドの１〜５％は活性化モノマーと反応しない。これらの未反応化合物（欠陥配列と呼ぶ）は、後続のモノマー付加によって不完全なオリゴヌクレオチドとなるのを阻止するために前記のように遮断またはキャッピングされなければならない。合成の各工程で欠陥配列が生成すると、相同性の高い副生物で汚染された粗生成物が生成し、これらが最終粗生成物へ持ち込まれるにちがいない（反応経路１、構造式６（ｎ、ｎ−ｘ）参照）。その結果、粗製合成オリゴヌクレオチドを臨床試験に使用しうる状態にまで精製するのがきわめて困難かつ非効率的となる。欠陥配列の割合を最小限に抑えるためには、大過剰のモノマー（約１６倍）を用いる。より高度に負荷したポリスチレン支持体を用いて固相オリゴヌクレオチド合成の規模を拡大する方法がMontserrat et al.（1994）Teteahedron 50:2617-2622 に報告された。しかしこの方法では、欠陥配列を最小限に抑えるためになおかなり過剰のモノマーが必要であるという点で、固相合成法に伴う重要な問題が克服されない。さらに、この方法では十分な収率が常に得られるわけではない。結合を行うのに必要な過剰のモノマーを減らし、かつ容易に規模を拡大しうるために、Bonora et al.（1993）Nucleic Acids Res.21:1213-1217はモノマー結合反応に際し可溶であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を３′側支持体として用いることにつき研究した。この方法は、ホスホルアミダイト結合、Ｈ−ホスホネート縮合およびホスホトリエステル縮合によりオリゴヌクレオチドを製造するために採用されている（参照：Bonora（1987）Gazzetta Chimica Italiana 11 7 :379；Bonora et al.（1990）Nucleic Acids Res.18:3155；Bonora et al.（19 91）Nucleosides & Nucleotides 10:269；Colonna et al.（1991）Teteahedron Lett.32:3251-3254；Bonora and Scremin（1992）Innovation Perspect.Solid P hase Synth.Collect.Pap.,Int.Symp.,2nd ,“オリゴヌクレオチドの大規模合成．ＨＥＬＰ法:結果と予想”,pp.355-358,英国アンドーバー、インターセプト社発行;Scremin and Bonora(1993)Teteahedron Lett.34:4663；Bonora(1995)Applied Biochemistry and Biotechnology 54:3；Zaramella and Bonora et al.（1995 ）Nucleosides & Nucleotides 14:809）。この方法の弱点は、各反応工程後の支持体結合オリゴヌクレオチドの回収率が、許容できないほど低いことである。さらに、この方法は、キャッピングしなければならない、最終生成物に持ち込まれるにちがいない欠陥配列の問題に取り組むものではない。ポリエチレングリコール−ポリスチレンコポリマー支持体もオリゴヌクレオチド合成の大規模化のために用いられている（Wright et al.(1993)Teteahedron L ett.34:3373-3376）。１８ｍｅｒＤＮＡにつき１ミリモルの規模で１モノマー付加当たり９６．９％の結合効率が報告された。この方法も、樹脂に結合した欠陥配列の問題に取り組むものではない。 Zonらは、二量体または多量体オリゴヌクレオチドフラグメントのライブラリーを溶液中で調製し、次いで互いに結合させるブロック法を、オリゴヌクレオチド合成に用いることを示唆した（Zon and Geiser（1991）Anti-Cancer Drug Des ign 6:539-568）。これらのフラグメントを、結合のために差別的な５′脱保護および３′リン酸化によって活性化する。フラグメント調製用としてホスホトリエステル結合が示唆された（Bonora et al.（1993）Nucleic Acids Res.21:1213 -1217）。ホスホトリエステル結合の収率が比較的低いため、この方法は広くは受け入れられていない。従来のオリゴヌクレオチド合成法では、あるモノマーの５′−ヒドロキシル基と第２モノマーのホスホルアミダイト基とが結合工程で反応するのを、５′保護基が阻止する作用をする。オリゴヌクレオチド合成中に付加される５′保護モノマー単位の５′保護基としては、一般に４，４′−シメトキシトリチル（ＤＭＴ）が用いられる（Schaller et al.（1963）J．Am.Chem.Soc.85:3821）。この基は、次の５′保護モノマー単位を付加する前の、オリゴヌクレオチド生成物の５ ′−酸素からの離脱の容易さと選択性のため選ばれる（概説についてはBeaucage and Iyer（1992）Teteahedron 48:2223-2311参照）。溶液中では、酸誘導性脱トリチル化が可逆性であるため、５′−ＤＭＴ基の脱保護が損なわれる。この反応を完了させるには、溶液相脱トリチル化のために遊離トリチルカチオンのスカベンジャーを添加する（Ravikumar et al.（1995）Teteahedron Lett.36:6587）。最終５′末端ＤＭＴ基は、全長生成物オリゴヌクレオチドをより短い欠陥配列から逆相クロマトグラフィーにより分離しうる疎水性ハンドルとして作用しうることが認識されている。さらに、固相合成完了後に全長脱保護オリゴヌクレオチド生成物を欠陥配列から分離する能力を高めるために、疎水性の高いＤＭＴ基類似体が調製された（Seliger and Schmidt（1987）Journal of Chromatography 3 97 :141）。他の方法では、オリゴヌクレオチド合成中に粗製脱保護オリゴヌクレオチド中の全長生成物を容易に検出しうるために、蛍光トリチル類似体を５′末端保護基に用いた（Fourrey et al.（1987）Teteahedron Lett.28:5157）。固相オリゴヌクレオチド合成中に個々のモノマー付加を監視しうるために、着色トリチル基が考案された（Fisher and Caruthers（1983）Nucleic Acids Res.11:158 9）。固相オリゴヌクレオチド合成中にオリゴヌクレオチドからトリチル基を除去する選択性を変化または増大させるために、他の修飾トリチル基が調製された（概説についてはBeaucage and Iyer（1992）Teteahedron 48:2223-2311参照）。現在まで、溶液中でのオリゴヌクレオチド合成に際して樹脂またはメンブランに生成物を固定しうるトリチル基は設計されていない。さらに、誘導体化した樹脂、メンブランまたは可溶性ポリマーと共有結合反応しうるトリチル基も報告されていない。ディールス−アルダー反応は、共投ジエンと不飽和分子を閉環付加反応させて環式化合物を形成するものであり、新たなσ結合の形成にπ電子が用いられる。ディールス−アルダー反応は４−π電子系（ジエン）と２−π電子系（ジエノフィル）を伴うので、［４＋２］閉環付加反応の一例である。この反応は、緩和な条件下で多様な反応体につき、著しく速やかに行うことができる。ディールス−アルダー反応の範囲は広く、当業者に周知である。ディールス−アルダー反応の概説は“AdVanced Organic Chemistry”(March,J.,編)761-798(1977)(マグローヒル、ニューヨーク)にある。これを本明細書に参考として引用する。多数の試みがなされたが、オリゴヌクレオチドを大量に連続操作において低価格で、労力を要する精製なしに製造する方法が、現在でもなお求められている。発明の概要本発明は、反応収率を高め、大規模化が可能な、逐次溶液相オリゴヌクレオチド合成法である。成長中のオリゴヌクレオチドの３′末端を固体支持体に結合させる伝統的な方式と異なり、本発明は有効に結合した生成物を未反応出発物質から分離しうる固定基(anchor group)を成長中のオリゴヌクレオチドの５′末端に用いることを特徴とする。１態様においては、固定基は５′−ＯＨ保護基としても作用し、結合反応は溶液中で行われる。有効に反応したオリゴマーは保護基を含むが、未反応オリゴマーは保護基を含まないので、これらの物質は固定基／保護基の存在に基づいて分配することができる。好ましい態様においては、固定基は樹脂、メンブランまたはポリマーなどの誘電体化した固体支持体と共有結合反応する。詳細には、本発明は溶液中で５′保護モノマー単位を成長中のオリゴヌクレオチド鎖の５′末端と反応させることを含む、多様なオリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドの溶液相合成法を提供する。本発明の他の態様においては、５′保護モノマー単位と成長中のオリゴヌクレオチドの反応後に、未反応モノマーを酸化して、反応媒質中の他の物質から容易に分配しうる帯電種を形成させる。本発明の好ましい態様においては、モノマー単位はホスホルアミダイト類であり、これらは活性化および酸化されるとホスフェートに変換される。これらの帯電ホスフェート種は、反応媒質中の他の物質から容易に分配することができる。本発明の好ましい態様においては、モノマー単位は５′保護ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネートからなり、これらの保護基は置換トリチル基、レブリン酸基またはシリルエーテル基である。１態様においては、未反応オリゴヌクレオチド出発物質（欠陥配列）を、クロマトグラフィー樹脂に対する保護基の親和性に基づいて反応オリゴヌクレオチド生成物から分離できる。好ましい態様においては、未反応オリゴヌクレオチド出発物質を、保護基と誘導体化した固体支持体、たとえば樹脂、メンブランまたはポリマーとの特異的反応に基づいて、反応オリゴヌクレオチド生成物から分離できる。本発明の好ましい態様においては、未反応オリゴヌクレオチドを分離するための分配法は未反応オリゴヌクレオチドを単離して再使用するのに役立ち、かつその後、次の５′保護モノマー単位の付加のための調製に際し、反応オリゴヌクレオチドを脱保護することもできる。本発明方法はホスホルアミダイト結合化学のみに限定されず、Ｈ−ホスホネートまたはホスフェートトリエステル結合化学など他の結合反応にも適合する。この方法は自動化することもでき、効率の高い大規模オリゴヌクレオチド製造に理想的に適している。本発明は、未反応５′保護モノマー単位および出発物質から生成物を自動的に分離するための方法および装置を包含する。１態様においては、この装置は抽出容器、および固体支持体を収容したクロマトグラフィー樹脂濾過チャンバーからなる。モノマー付加反応が終了した時点で反応混合物を抽出チャンバーへ送入し、抽出し、次いで固体支持体を通して溶離すると、支持体は５′保護モノマー単位のみを保持する。次いで生成物のみを保持する固体支持体を通して溶離することにより、生成物を出発物質から分離する。第２態様においては、クロマトグラフィー樹脂濾過チャンバーには５′保護モノマー単位および生成物の両方と共有結合反応する固体支持体が収容される。出発物質をこの固体支持体から溶出させ、次いでモノマーおよび生成物を希酸で固体支持体から離脱させる。次いで限外濾過膜に導通することにより、生成物を５′保護モノマー単位から分離する。材料原価分析によれば、オリゴヌクレオチド合成では５′保護ホスホルアミダイトが最も高価な反応成分であることが分かる。これに比べると他の材料の原価はきわめて低い。したがってこのモノマーを制限試薬とすることが望ましい。さらに、装入モノマーに付加し得なかった中間オリゴヌクレオチド配列を、後続合成の中間体として利用できる。本発明方法によれは、オリゴヌクレオチド生成物の配列および組成の証明はきわめて容易である。各モノマー付加サイクル後に、完全に保護された中性中間体が得られ、これは冗長な試料調製なしに質量分析法で容易に分析される。オリゴヌクレオチド合成全体を通して、逐次モノマー付加それぞれに関する分析データライブラリーが得られる。したがって生成物分析はプロセスの一体部分となる。図面の簡単な説明図１は、実施例１に述べたホスホルアミダイト結合反応混合物の酸化前の逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）図を示す。図２は、実施例１に述べたホスホルアミダイト結合反応の酸化後の逆相ＨＰＬＣ図を示す。酸化後の図を、図１の酸化前の図に重ねた。図３は、実施例１に述べた酸化したホスホルアミダイト結合反応混合物を、ＤＥＡＥセファデックス（Sephadex、登録商標）フィルタープラグに導通する前と後の逆相ＨＰＬＣ図を示す。図４は、実施例１に述べた酸化したホスホルアミダイト結合反応物を、Ｃ１８樹脂を通して水／アセトニトリルで溶離した後、および酢酸で処理しかつ水／アセトニトリルで溶離した後の逆相ＨＰＬＣ図を示す。図５は、本発明方法に用いるために設計した自動抽出および濾過システムを模式的に示す。図６は、実施例７で３′−ＰＥＧ固定−溶液相合成法により調製した１５塩基オリゴヌクレオチドのアニオン交換ＨＰＬＣ図を示す。図７は、５′−ＤＨＤＴＯ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔ−ＯＳｉＰＤＢＴ−５′と、１．０当量、２．５当量、５当量および１０当量のマレイミドを含有するポリスチレンマレイミド樹脂との反応に関するディールス−アルダー捕獲データをグラフで示す。図８は、ディールス−アルダー生成物捕獲のために設計した自動抽出および濾過システムを模式的に示す。図９は、エチルエーテル、イソプロピルエーテルおよびＮ−ブチルエーテルによるＰＥＧの沈殿および沈殿したＰＥＧの遠心分離をグラフで示す。発明の詳細な記述本発明は、本明細書において生成物固定逐次合成（ＰＡＳＳ）と呼ぶ、オリゴヌクレオチドの溶液相合成法を包含する。成長中のオリゴヌクレオチドの３′末端を固体支持体に結合させる伝統的な様式と異なり、本発明は成長中のオリゴヌクレオチド生成物の５′末端に結合した固定基を用いることを特徴とし、これにより、有効に結合した生成物を未反応の出発物質から分離できる。好ましい態様においては、固定基は５′−ＯＨ保護基としても作用する。有効に反応したオリゴヌクレオチド生成物は保護基を含むが、未反応オリゴヌクレオチド出発物質は含まず、この遮断／保護基の存在に基づいて出発物質から生成物を分配できる。未反応出発物質を回収し、同オリゴヌクレオチドの後続合成バッチに再使用できる。したがって従来の固相合成法と対照的に、この改良されたオリゴヌクレオチド合成法は成長中のオリゴヌクレオチド鎖の３′末端を固定するための固体支持体を用いない。詳細には、本発明は溶液中で５′保護モノマー単位を成長中のオリゴヌクレオチド鎖の５′末端と反応させることを含む、多様なオリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドの溶液相合成法を提供する。固体支持体上ではなく溶液中でこれらの反応を実施することにより、より良好な反応速度が得られる。本発明の他の態様においては、５′保護モノマー単位と成長中のオリゴヌクレオチド間の反応後に、未反応の５′保護モノマー単位を活性化および酸化して帯電種を形成させ、これらを反応媒質中の他の物質から容易に分配できる。本発明の好ましい態様においては、モノマー単位はホスホルアミダイトであり、これは酸化すると容易にホスフェートジエステルに変換される。帯電したホスフェート種は反応媒質中の他の物質から容易に分配できる。さらに、好ましい態様においては、酸化をその場で実施してもよい。帯電種であるＨ−ホスフェートを５′保護モノマー単位として用いる場合（実施例２、反応経路５）、最終モノマーの付加後までＨ−ホスフェートの酸化を延期する。帯電Ｈ−ホスフェートモノマーは結合後に中性Ｈ−ホスフェートジエステル生成物を生成し、帯電モノマー種はアニオン交換濾過または抽出によって容易に分離される。さらに、回収したＨ−ホスフェートモノマーを再使用できる。用いる５′保護基は、本発明の基本的要件を満たすいかなる種類の官能基からも選択できる。分離を行うためには、保護基は反応生成物を反応混合物中の他の物質から分別するために使用できる種類のものでなければならない。好ましくは保護基は特定の相または固体支持体に対する強い親和性または反応性をもち、その相または固体支持体から高い選択性で開裂または分離されなければならない。オリゴヌクレオチド生成物は、当業者に既知の標準法で未反応オリゴヌクレオチド出発物質から分離できる。これには遠心分離、樹脂上での分離、シリカゲルによる分離、金属に対する親和性に基づく分離、磁力もしくは電磁力に基づく分離、または好適な固体支持体への共有結合に基づく分離が含まれるが、これらに限定されない。本発明の好ましい態様においては、未反応オリゴヌクレオチド出発物質を分離するための分配法により、未反応オリゴヌクレオチドを再使用のために単離し、かつ樹脂結合オリゴヌクレオチド生成物を得ることができ、生成物はその後次の５′保護モノマー単位を付加するための調製に際して容易に脱保護される。最も好ましくは、誘導体化した固体支持体、たとえば樹脂、メンブランまたはポリマーと保護基を共有結合反応させて、共有結合固定された保護基を得る。これは高い選択性でオリゴヌクレオチドから容易に開裂させることができる。本発明の最も好ましい態様においては、モノマー単位は５′保護ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネートからなり、ここで保護基は置換トリチル基、レブリン酸基またはシリルエーテル基である。保護基上の好ましい置換基はジエン官能基であり、これはディールス−アルダー反応により固体支持体、たとえば親ジエノフィルで誘導体化した固体支持体、たとえば樹脂、メンブランまたはポリマーと反応しうる。この態様において未反応オリゴヌクレオチド出発物質は、５′ 保護基と誘導体化した樹脂との選択的または特異的な共有結合反応に基づいて反応ヌクレオチド生成物から分離される。本発明を記述するために用いた個々の用語は、以下のように定義される： “ヌクレオシド”とは、デオキシリボヌクレオシドもしくはリボヌクレオシドまたはそれらのいかなる化学修飾体をも意味する。ヌクレオシドの修飾には糖の２′−位の修飾、ピリミジンの５′−位の修飾、プリンの８−位の修飾、シトシンの環外アミンの修飾、５−ブロモ−ウラシルの置換などが含まれるが、これらに限定されない。 “オリゴヌクレオチド”とは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらのいかなる修飾体をも意味する。本発明方法により合成されるオリゴヌクレオチドは、一般に以下のように表される：式中、ｎは１〜１，０００、Ａは後記に定める２′−糖置換基であり、Ｂは後記に定める核酸塩基である。本明細書で用いる“固体支持体”とは、相転移を行う樹脂、メンブラン、相、ポリマー、ポリマー前駆物質、または可溶性ポリマーを意味する。固体支持体とは、Ｄ基で誘導体化した樹脂、メンブラン、相、ポリマー、ポリマー前駆物質、または可溶性ポリマーをも意味する。樹脂および固体支持体という用語は互換性をもって用いられ、当業者には樹脂という用語が意図するものが認識されるであろう。固体支持体の例には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：マレイミド誘導体化ポリスチレン、後記のＤ基で誘導体化したポリスチレン、ジエノフィルまたはジエンで誘導体化したポリスチレン、後記のＤ基で誘導体化したテンタゲル（Tentagel、商標）、ジエノフィルまたはジエンで誘導体化したテンタゲル、ジエノフィルまたはジエンで誘導体化した限外濾過膜、ジエノフィルまたはジエンで誘導体化したポリエチレングリコール、ジエノフィルまたはジエンで誘導体化した無機酸化物、たとえばシリカゲル、アルミナ、制御多孔ガラス、およびゼオライト、ジエノフィルまたはジエンで誘導体化した他のポリマー、疎水性逆相樹脂、たとえばＣ₂〜Ｃ₁₈ポリスチレン、チオプロピル−セファロース（Sepharose、ファルマシア・バイオテク）、水銀処理樹脂、アガロースアジピン酸ヒドラジド（ファルマシア・バイオテク）、またはアビジン樹脂。 “ジエノフィル”は、アルケン基、または炭素と異種原子間の二重結合、または２個の異種原子間の二重結合をもち、好適なジエンと［２＋４］シクロ付加反応を行うことができる分子と定義される。 “ジエン”は、隣接する２個の二重結合をもち、これらの二重結合を形成する原子が炭素でも異種原子でもよく、ジエノフィルと［２＋４］シクロ付加反応を行うことができる分子と定義される。ジエノフィルはいかなる群であってもよく、置換もしくは非置換アルケン、または置換もしくは非置換アルキンがこれに含まれるが、これらに限定されない。一般にジエノフィルは式Ｃ＝Ｃ−ＺまたはＺ′−Ｃ＝Ｃ−Ｚの置換アルケンであり、式中のＺおよびＺ′はＣＨＯ、ＣＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＣｌ、ＣＯＡｒ、ＣＮ、ＮＯ₂、Ａｒ、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ、ＣＨ₂ＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯＯＨ、ハロゲンまたはＣ＝Ｃから独立して選択される電子吸引基である。 “ジエノフィル誘導体化した固体支持体”とはジエノフィルで官能化した固体支持体を意味し、“ジエン誘導体化した固体支持体”とはジエンで官能化した固体支持体を意味する。好ましい固体支持体は、官能化しうるヒドロキシル基をもつシリカ、アルミナ、ゼオライト、制御多孔ガラスよりなる群から選択される無機酸化物、または有機支持体、たとえば反応経路１３および１４に示すポリスチレンである。好ましい態様においては、ジエノフィルはマレイミドであり、ジエンは３，５−ヘキサジエンである。本発明の“５′−保護モノマー単位”とは、慣用されるリボース環番号を含めて一般に以下のように表される：Ｂは核酸塩基であり；ＡおよびＡ′は２′−糖置換基であり；Ｗはホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、保護オリゴヌクレオチドおよびメチルホスホネートよりなる群から独立して選択され；Ｄ−Ｅは、アルコール保護基（１または２以上）であって、有効に反応したオリゴヌクレオチド生成物を未反応オリゴヌクレオチド出発物質から分配するための固定基として作用する。特定の様式に限定するのではなく一般化した反応様式の本発明の範囲には、上記置換基に代わる他の自明の基も含まれる。本発明の好ましい態様においては、Ｗは、ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネートであり；ＡおよびＡ′は独立して、Ｈ、²Ｈ、³Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨＯＲ¹、ＮＨＯＲ³、ＮＨＮＨＲ³、ＮＨＲ³、＝ＮＨ、ＣＨＣＮ、ＣＨＣｌ₂、ＳＨ、ＳＲ³、ＣＦＨ₂、ＣＦ₂Ｈ、ＣＲ² ₂Ｂｒ、−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃、ＯＲ⁴およびイミダゾールよりなる群から選択され（参照：米国特許出願第08/264,029号；1994年 12月22日出願；表題“２′修飾ピリミジンの新規な製造方法、分子内求核置換” ；本明細書に参考として引用する）；Ｒ¹は、Ｈおよびアルコール保護基よりなる群から選択され；Ｒ²は、＝Ｏ、＝Ｓ、Ｈ、ＯＨ、ＣＣｌ₃、ＣＦ₃、ハライド、所望により置換されたＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル（環式、直鎖および分枝鎖を含む）、アルケニル、アリール、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アシル、ベンゾイル、ＯＲ⁴およびエステルよりなる群から選択され；Ｒ³は、Ｒ²、Ｒ⁴、ＣＮ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｓ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｏ)ＣＦ₃、ＳＯ₂Ｒ⁴ 、アミノ酸、ペプチドおよびそれらの混合物よりなる群から選択され；Ｒ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択され；最も好ましくはＡは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃｌ、Ｆ、ＮＨＯＲ³、ＯＲ⁴、ＯＳｉＲ⁴ ₃よりなる群から選択され（参照：米国特許出願第08/264,029号；表題“２′修飾ピリミジンの新規な製造方法、分子内求核置換”；1994年12月22日出願）；Ｄ−Ｅは、“成長中のオリゴヌクレオチド鎖”または“オリゴヌクレオチド生成物”を目的外の副生物および出発物質から分配しうるいかなる基であってもよい。分配は好適ないかなる方法でも実施でき、これにはシリカゲルによるクロマトグラフィー、遠心分離その他、物質分配に関して当業者に既知の任意の方法が含まれるが、これらに限定されない。好ましい分配方法は樹脂への結合による。最も好ましい分配方法は、Ｄと誘導体化した固体支持体、たとえば誘導体化した樹脂、ポリマーまたはメンブランとの共有結合反応による。したがって保護基Ｄ −Ｅは好ましくは、Ｄが特定の樹脂または相に対し強い親和性をもつように設計され、Ｅは５′−酸素−Ｅ結合が高い選択性で容易に開裂するように設計される。Ｅが樹脂または相に高い親和性を示す場合、Ｄはなくてもよい。最も好ましくは保護基Ｄ−Ｅは、Ｄが特定の誘導体化された樹脂、ポリマーまたはメンブランに選択的または特異的に共有結合を形成しうるように設計される。Ｅには、下記のトリチル基またはレブリン酸基またはシリルエーテル基が含まれるが、これらに限定されない。Ｄには以下のものから独立して選択されるものが含まれるが、これらに限定されない：Ｈ、ＯＲ⁴、共役ジエン単位を有するアルキルまたは置換アルキル基、共役ジエン単位を有するアルコキシまたは置換アルコキシ基、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、マレイミド置換アルコキシ基、ジエノフィル置換アルコキシ基、アルコキシ基、共役ジエン単位を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、マレイミド置換されたアルキルアミノまたは置換アルキルアミノ基、ジエノフィル部分を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、ジスルフィド、アルデヒド類、および金属キレート化剤。それらの若干の例を以下に示す。上記置換基上のアルキル基は１〜５０個、好ましくは１〜３０個の炭素をもつことができる。Ｌ＝連結基Ｘ＝電子吸引基または電子供与基本発明の目的に関して“核酸塩基”は以下の定義をもつ。核酸塩基はプリン塩基またはピリミジン塩基である。核酸塩基には現在当業者に知られているすべてのプリン類およびピリミジン類、またはそれらのいかなる化学修飾体も含まれる。プリン類はプリン環の９位の窒素によりリボース環に結合し、ピリミジン類はピリミジン環の１位の窒素によりリボース環に結合している。ピリミジンはピリミジン環の５または６位で置換されていてもよく、プリンはプリン環の２、６または８位で置換されていてもよい。ある種の修飾が、出願中の米国特許出願第08 /264,029号、1994年12月22日出願、表題“既知および新規２′修飾ピリミジンの新規な製造方法、分子内求核置換”；および第08/458,421号、1994年6月2日出願、表題“パラジウム触媒によるヌクレオシド修飾−求核試薬および一酸化炭素を用いる方法”；ならびに米国特許第5,428,149号、表題“パラジウム触媒による炭素−炭素結合方法および製造方法”に記載されており、これらを本明細書に参考として引用する。より詳細には、核酸塩基にはウラシル、シトシン、Ｎ４−保護シトシン、４−チオウラシル、イソシトシン、５−メチルウラシル（チミン）、５−置換ウラシル、アデニン、Ｎ６−保護アデニン、グアニン、Ｎ２−保護グアニン、２，６−ジアミノプリン、ハロゲン化プリン、およびプリン環またはピリミジン環の模倣を意図した複素環、たとえばイミダゾールが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いる“出発物質”は、ＰＡＳＳの各サイクルで５′−保護モノマー単位と反応して、ヌクレオチドが１個またはそれ以上延長したオリゴマーを生成する化合物を意味する。出発物質は、目的とするオリゴヌクレオチド生成物に応じて、ヌクレオチド間に［５′．３′］結合、またはヌクレオチド間に［３′ ．３′］結合を形成するように設計できる。第１例では出発物質は、５′−脱保護され、他は保護された、長さｎのオリゴヌクレオチドである。第２例では出発物質は、３′−脱保護され、他は保護された、長さｎのオリゴヌクレオチドである。一般に出発物質は、５′−脱保護され、他は保護された、長さｎのオリゴヌクレオチドであり、ｎは１〜１０００の整数である。出発物質は、５′−保護モノマー単位と出発物質との反応および５′−脱保護反応に適合する保護基、たとえば塩基不安定基なとで２′，３′−保護される。さらに、ＰＡＳＳ法は制御された逐次オリゴヌクレオチド重合からなるので、あるＰＡＳＳサイクルの出発物質は一般にその前のＰＡＳＳサイクルからの脱保護生成物である。ＰＡＳＳ法は３′末端ヌクレオチドが固体支持体に固定されることを要求しないので、出発物質には非ヌクレオシド修飾が含まれてもよい。非ヌクレオシド修飾を３′末端に導入することができる。これは固相合成法では通常は不可能であろう。出発物質の３′末端への非ヌクレオシド修飾には、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（分子量５，０００〜１００，０００）（ＰＥＧ）または他の高分子量非免疫原単位を、改良された薬物動態特性を示すオリゴヌクレオチドの製造用３′ 末端モノマーとして用いることが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いる“生成物”は、各ＰＡＳＳサイクルで５′−保護モノマー単位と出発物質との共有結合反応により製造されるオリゴヌクレオチドを意味する。前記のように、出発物質が長さｎの５′−脱保護オリゴヌクレオチドであり、かつ５′−モノマー単位が１個のヌクレオチドである場合、この反応の生成物は長さｎ＋１の５′−保護オリゴヌクレオチドであろう。５′−保護モノマー単位が長さｍのオリゴヌクレオチドブロックである場合、この反応の生成物は長さｎ＋ｍの５′−保護オリゴヌクレオチドであろう。このＰＡＳＳサイクルからの生成物を次いで５′−脱保護すると、次のサイクルの出発物質となる。 “欠陥配列”は、あるＰＡＳＳサイクルから生成した出発物質であって、そのサイクルで５′−保護モノマー単位との反応を行わなかったものを意味する。 “成長中のオリゴヌクレオチド鎖”は、目的ヌクレオチドの３′末端ヌクレオチドから始まって、本発明方法でヌクレオチド（Ｎ）を逐次付加することにより製造された、５′−脱保護オリゴヌクレオチド鎖または５′−保護オリゴヌクレオチド鎖を意味する。ＰＡＳＳプロセスの各反応サイクル後、成長中のオリゴヌクレオチドの長さは少なくとも１オリゴヌクレオチド増加し、次のサイクルの出発物質となる。本明細書中で用いるこの用語は出発物質または生成物を意味する可能性があり、個々の状況でその用語が意味するものを当業者は識別できるであろう。反応経路２は本発明方法を一般的に説明する。５′保護モノマー単位、たとえばホスホルアミダイト７を溶液中の出発物質８に、活性剤、たとえばテトラゾールまたは好ましくは４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）の存在下で添加して（参照：米国特許出願；1996年10月15日出願；表題“オリゴヌクレオチド合成のための改良された結合活性剤”）、ホスファイトトリエステル結合により１ヌクレオチド付加された生成物９を得る。この経路に示すように、出発物質８は５ ′脱保護された以外は保護されている長さｎ（ｎは１〜１０００の整数）のオリゴヌクレオチドであり、生成物は長さｎ＋１の５′保護オリゴヌクレオチドである。５′脱保護オリゴヌクレオチド出発物質８は固体支持体に固定されておらず、むしろ標準法により５′保護モノマー単位と出発物質との反応および５′脱保護反応に適合する保護基、たとえば塩基不安定基で、単に２′，３′−保護されている。固体支持体への３′固定を排除したことにより、オリゴヌクレオチドに取り込むことができる３′修飾の範囲が拡大する。さらに、３′末端ヌクレオチドはもはや支持体固定に必要なヒドロキシル置換基をもつ必要がない。したがって固相合成法では不可能な修飾を３′末端に導入できる。これには、改良された薬物動態特性を備えたオリゴヌクレオチドの製造のための３′末端モノマーとしてポリエチレングリコールモノメチルエーテル（分子量５，０００〜１００，０００）または他の高分子量非免疫原単位を使用することが含まれるか、これらに限定されない（参照：米国特許出願第08/434,465号；1995年5月4日出願；表題“ 核酸リガンド複合体”；参考として本明細書に引用する）。５′保護モノマー単位７と出発物質８の反応が完了した後、反応混合物は３つの化合物種を含む：未反応５′保護モノマー単位７、未反応出発物質８および反応生成物である化合物９、すなわち長さｎ＋１の５′保護オリゴヌクレオチド。前記のように、５′保護モノマー単位７と反応し得なかった出発物質８（長さｎの５′脱保護オリゴヌクレオチド）がある場合、この配列は延長されなかったので欠陥配列と呼ばれる。反応生成物である化合物９は、出発物質８（長さｎのオリゴヌクレオチド）の５′−ヒドロキシル基と５′保護モノマー単位７の３′− ホスホルアミダイト基との共有結合反応により１ヌクレオチド延長した５′保護オリゴヌクレオチド鎖（長さｎ＋１）である。生成物である化合物９は主成分であり、反応しなかった５′保護モノマー単位７および出発物質８は少量存在するにすぎない。本方法のこの段階で、材料を精製しかつモノマー出発物質を回収するために、未反応５′保護モノマー単位を反応混合物から分離する必要がある。この態様においては、未反応モノマーを反応させて、容易に分離できるイオン種を形成する。ホスファイトトリエステルからホスフェートトリエステルへの酸化は、同一反応フラスコ内において酸化剤を添加するだけで実施できる。現場酸化により、目的オリゴヌクレオチド生成物９、モノマー７のホスフェート塩１０、および未反応オリゴヌクレオチド出発物質８が得られる。モノマーホスフェート塩１０が反応混合物中で唯一の遊離塩であり、したがって当業者に既知の方法で容易に分離される。これらはアニオン交換樹脂もしくはメンブランによる濾過、または水相による抽出が含まれるが、これらに限定されない。本発明のこの態様の別法においては、３′末端モノマーが分子量５，０００〜１００，０００、好ましくは２０，０００のポリエチレングリコールモノメチルエーテルである。この場合、簡単な分子量分画メンブランを用いてモノマー１０を分離することができる。反応混合物から未反応モノマーを分離した後、次いで“オリゴヌクレオチド生成物”を“欠陥配列”から分離するのに適した任意の方法で、残りの濾液を分配することができる。１態様においては、選択的または特異的に５′保護基（Ｄ− Ｅ）と相互作用するように設計された物質、たとえば逆相樹脂に、濾液を付与する。生成物は、５′保護基成分Ｄと樹脂の親和性により固体支持体に捕獲または保持される。好ましい態様においては、５′保護基（Ｄ−Ｅ）と共有結合反応するように設計された物質、たとえばＤがジエン単位を含む場合はジエノフィル誘導体化樹脂に、濾液を付与する。生成物は５′保護基の成分Ｄとこの樹脂の親和性により固体支持体に捕獲または保持される。５′保護基の成分Ｄを含まない未反応オリゴヌクレオチド出発物質８は洗い出される。この未反応出発物質を単離して保存し、中間体として後続合成に使用できる。次いで、保持されたオリゴヌクレオチド生成物９を周知の方法で樹脂から離脱させる。ある態様においては、５′−酸素と保護基Ｄ−Ｅとの間の結合を開裂させることによりオリゴヌクレオチド生成物を離脱させる。たとえば５′保護基がトリチル誘導体である場合、希ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）などの試薬を用いてトリチル基を開裂させ、これによりオリゴヌクレオチド結合生成物を離脱させる。遊離した５′保護オリゴヌクレオチド結合生成物１１を、次いで後続の結合反応に出発物質として使用できる。反応経路２反応経路２に示したモノマー付加サイクルの各工程が厳密に上記の順序で起きることが本発明の要件ではない。あるいは、結合と現場酸化に続いて生成物およびモノマー１０を樹脂に共有結合または親和性捕獲させてもよい。後続の５′保護基開裂により、生成物とモノマーの両方が離脱する。この段階で抽出またはメンブランによる濾過を行うと、目的外のモノマー副生物が容易に分離される。５′保護基をオリゴヌクレオチド生成物の固定のために用いると、多様な３′ 末端修飾が可能となる。これらは、５′保護モノマー単位からの反応生成物の分離を容易にするように設計された基、たとえばこの分離に分子量分画メンブランを利用するのに十分な分子量のポリマー、または生成物の選択的沈殿を行うための金属キレート化剤であってもよい。このような場合、これらの基はオリゴヌクレオチドの３′末端と修飾基の間に開裂可能なリンカー、たとえばスクシネートリンカーを含む。あるいは、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルまたはジステアリルグリセロールなどの非ヌクレオシド３′末端置換基は、オリゴヌクレオチド生成物の薬物動態特性を高めることができる（参照：米国特許出願第08 /434,465号；1995年5月4日出願；表題“核酸リガンド複合体”；参考として本明細書に引用する）。３′末端モノマーは、診断に用いたオリゴヌクレオチドの検出基、たとえばインビボ画像形成のためにＴｃ９９ｍを保持するように設計されたキレート化剤としても利用できる（参照：国際特許出願公開第WO 96/02274号; 1996年2月1日公開；表題“金属錯体とオリゴヌクレオチドから形成された結合体、これらの結合体を含む試薬、放射線診断法におけるそれらの使用、およびそれらの製造方法”；参考として本明細書に引用する）。従来の固相オリゴヌクレオチド合成法では、成長中の鎖を固体支持体に固定するために３′末端を用いているので、これをこのような成分の導入に利用することができない。従来の固相合成法と対照的に、本発明のオリゴヌクレオチド生成物は新たな結合反応を実施する度に未反応生成物から分離することが好ましい。したがって最終オリゴヌクレオチド生成物が本質的に純粋な形で得られ、相同性の高い欠陥配列を分離する繁雑さが排除される。さらに、本発明の反応は溶液相で実施されるので、モノマーとオリゴヌクレオチド出発物質との反応の収率も有意に高まる。さらに、有効なオリゴヌクレオチド結合生成物のみがプロセスの次の工程に進入するので、この反応経路ではキャッピング工程が不必要になる。キャッピング工程の排除は、従来法と比較してもうひとつの効率増大をもたらす。５′保護モノマー単位との反応を行わなかったオリゴヌクレオチド出発物質（欠陥配列）を代わりに単離し、再使用できる。ＰＡＳＳ反復中に欠陥配列を再単離する度に、これを同じ工程で、または同じオリゴマーもしくは同じ３′末端フラグメントをもつオリゴマーの後続合成における反復工程で、出発物質にブレンドできる（反応経路３参照）。したがって欠陥配列が後続のオリゴヌクレオチド製造に有用な配列構築ブロックとなる。これによりプロセス効率が高まるだけでなく、最終粗生成物の純度も著しく高まる。さらに、これによりモノマーを制限試薬として使用でき、したがってプロセス効率が著しく高まる。反応経路３上記に概説した合成経路、すなわち生成物を出発物質から分離するための固定基として５′保護基を利用し、かつ欠陥配列を後続合成の中間体となしうる経路は、ホスホルアミダイト結合化学のみに限定されない。これは他の結合反応、たとえばＨ−ホスホネートまたはホスフェートトリエステル結合化学にも適合する（参照：Gaffney and Jones（1988）Tetrahedron Lett.29:2619-2622）。この経路はオリゴヌクレオチド合成の自動化にも利用でき、オリゴヌクレオチドを高い効率で大規模製造するのに理想的に適している。本明細書に記載した技術の観点は、ＰＡＳＳ合成法以外の用途をもつ。たとえばオリゴヌクレオチド合成の目的種または目的外の種を共有結合捕獲することは、従来の固相法または溶液相法において、高分離能１工程精製法にも利用できる。末端モノマーのみがその５′末端にジエン修飾トリチル基をもつ場合、ジエノフィル誘導体化した樹脂またはメンブランに全長生成物を選択的に固定すると、主な欠陥配列はすべて粗製混合物から分離される（反応経路１参照）。他の用途においては、共有結合捕獲に適した部分（前記のＤ基がすべて適合する）を含むキャッピング試薬、たとえばジエン修飾した無水酢酸（または一般的にＤ−修飾した無水酢酸）またはジエン修飾したシリルクロリド、たとえば無水３，５−ヘキサジエンオキシ酢酸またはトリ−（３，５−ヘキサジエンオキシ）シリルクロリドを用いた場合、各モノマー付加後（溶液相オリゴヌクレオチド合成法の場合）または固体支持体からの粗製オリゴヌクレオチド開裂後（従来の固相オリゴヌクレオチド合成法の場合）に、粗製オリゴヌクレオチドバッチからキャップ付き欠陥配列すべてを分離することができる。さらに他の用途においては、ジエン修飾トリチル基とジエノフィル修飾樹脂との反応により、カチオン交換樹脂を容易に製造できる。実施例１では、ＰＡＳＳ法により２′−フルオロピリミジン修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドの二量体を組み立てる（反応経路４）。最初の反応ではホスホルアミダイト結合化学を利用して３′，３′−ホスホジエステル結合を形成する。オリゴヌクレオチドはしばしば、３′末端に３′，３′−ホスホジエステル結合を導入することにより、３′から５′へのエキソヌクレアーゼ分解に対し保護される。結合後に反応混合物を現場酸化すると、未反応チミジン出発物質１２、酸化アミダイトモノマー１５、および酸化二量体生成物１４が生成する。酸化アミダイトモノマー１５は、反応混合物をジエチルアミノエチレン（ＤＥＡＥ）セファデックス（登録商標）床で濾過することにより分離される。図３に示すように、濾液のＨＰＬＣ分析は酸化アミダイトモノマー１５がＤＥＡＥセファデックスに保持されたことを表す。酸化二量体生成物１４および未反応チミジン出発物質１２を含有する濾液を濃縮し、６０％アセトニトリル／水に再溶解し、Ｃ１８フィルタープラグに装填する。この樹脂を７０％水／アセトニトリル、次いで５０％水／アセトニトリルで洗浄して、未反応チミジン出発物質１２を十分に溶離する。この時点でトリチル化二量体生成物１４のみを含む樹脂を、次いで水で洗浄し、続いて８０％酢酸／水で処理して脱トリチル化する。次いで樹脂を５０％アセトニトリル／水で洗浄する。これにより最終生成物１６が溶出し、一方、トリチル種は保持される（図４）。反応経路４実施例２（反応経路５）は、５′保護モノマー単位がホスホルアミダイトではなくＨ−ホスホネートである本発明方法を示す。この実施例では、３′末端に３ ′,３′−ヌクレオチド間結合をもつＨ−ホスホネートチミジン三量体(Ｔ−Ｔ− [３′,３′]−Ｔ三量体)２０を調製する。液相結合反応の効率は高いので、未反応３′末端フラグメント１９は検出されなかった。したがって逆相工程はトリチル基を生成物から分離するためにのみ用いられる。実施例３（反応経路６）には、５′保護基（Ｄ−Ｅ）として５′−Ｏ−(４,４ ′−ジオクタデシルオキシトリチル)（ＤＯＴ）を含むホスホルアミダイトモノマーの合成を記載する。実施例４は、５′保護基（Ｄ−Ｅ）と特定の樹脂または相との選択的または特異的な相互作用に基づいて未反応オリゴヌクレオチド出発物質（欠陥配列）から結合生成物を分離しうることを示す。この実施例では、Ｃ１８逆相樹脂上での４ ,４′−ジオクタデシルトリフェニルメタノール（ＤＯＴ）２３の移動性を、４ −デシルオキシ−４′−メトキシトリアノールおよびジメトキシトリアノール（ＤＭＴ）のものと比較する（表１参照）。有機溶剤、たとえばメタノール（Ｒ_f ＝０）およびアセトニトリル（Ｒ_f＝０）中でのＤＯＴ基とＣ１８樹脂との強い相互作用のため、混合物をＣ１８樹脂に装填し、未反応出発物質を有機溶剤で洗い出すことにより、出発物質から生成物を１工程分離することができる。次いで有機溶剤中においてトリチル保護基をハロ酢酸で開裂させることにより、結合生成物をチャンバーから溶離することができる。トリチル基は樹脂上に保持される。実施例５には、過剰のモノマーを分離するためのアニオン交換媒体、および５ ′−ＤＭＴ保護生成物を選択的に捕獲するが欠陥配列を保持しないＣ１８逆相樹脂を用いた、溶液中での六量体オリゴヌクレオチド(５′−ＨＯ−Ｔ−Ｔ−Ａ− Ｃ−Ｔ−[３′,３′]−Ｔ)の組み立てを記載する。実施例５から分かるように、各モノマー付加が２工程で達成される。第１工程では、ホスホルアミダイト結合化学を利用して、５′保護モノマー単位を出発物質に結合させる。結合後に、反応混合物を現場酸化して、未反応出発物質（欠陥配列）、酸化アミダイトモノマー、および酸化生成物を生成させる。反応混合物をアニオン交換媒体、たとえばＤＥＡＥセファデックス（登録商標）で濾過することにより、酸化アミダイトモノマーを分離する。第２工程では、酸化生成物および未反応出発物質（欠陥配列）を含有する濾液を希酸で処理して、脱トリチル化を行う。使用できる希酸の例には希鉱酸、希トリクロロ酢酸、希ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）、ルイス酸、たとえばＺｎＢｒ₂、ニトロメタン、ｐ−トルエンスルホン酸および過塩素酸が含まれるが、これらに限定されない。次いでこの混合物をクロマトグラフィーにより分離する。あるいは生成物および未反応出発物質の混合物をまず逆相樹脂で分離し、続いて脱トリチル化して、脱トリチル生成物を樹脂から離脱させる。実施例５に提示した分析データは、ＰＡＳＳ法によれば各反復工程で本質的に純粋なオリゴヌクレオチド中間体が原価制限モノマーの最小消費において生成することを示す。実施例６（図５）には、本発明方法に用いるのに設計した、未反応５′保護モノマー単位を反応混合物中の他のものから分離するための自動抽出／濾過システム１００を模式的に示す。前記のように、本発明方法はオートメーションに利用でき、したがってオリゴヌクレオチドの大規模製造に理想的に適している。自動抽出／濾過システム１００は２つの中心をもつ：抽出器１１２およびクロマトグラフィー樹脂濾過チャンバー１１４。抽出器は管１１８でクロマトグラフィー樹脂濾過チャンバーと流体連絡している。第１の三方向弁１２０が、抽出器１１２からクロマトグラフィーチャンバー１１４への内容物の流れを制御する。第２弁１２２は、チャンバー１１４への溶剤の添加を制御する。第３弁１２４は、チャンバー１１４からの排出液の採集を制御する。３つの弁はすべて制御器１２６に電子的に連結し、これがすべての弁１２０、１２２および１２４をそれらの種々の流れ位置間で始動させる信号を与える。抽出器１１２は２つの入口１２８および１３０、撹拌機１３２、ならびに出口１３４を備えている。反応混合物を入口１２８から抽出器１１２に送入し、抽出溶剤、たとえばＣＨ₂Ｃｌ₂、および緩衝剤水溶液を入口１３０から抽出器に送入する。混合物を撹拌機１３２で撹拌した後、層を分離させる。次いで第１の三方向弁１２０を開き、底部有機層を出口１３４から流出させて導電率モニター１３６へ送入し、次いで管１１８を通してチャンバー１１４へ送入する。導電率モニターは制御器１２６に電子的に連結している。導電率の上昇は、有機層が導電率モニターを通過して水層が進入し始めたことを示す。導電率の上昇を制御器１２６が認識し、第１の三方向弁１２０へ信号を送り、三方向弁を始動させて水層をチャンバー１１４からそれる方へ向ける。チャンバー１１４は３つの入口１３８、１４０および１４２、ならびに出口１４４を備えている。有機層は入口１３８を通してチャンバー１１４に進入し、入口１４０からチャンバー１１４に進入する加圧不活性ガス源、たとえばアルゴンにより押されて、チャンバー１１４内を貫流する。次いで入口１４２からチャンバーに進入する溶剤、すなわちＣＨ₂Ｃｌ₂で、チャンバーを洗浄する。溶剤の添加は、第２弁１２２を選択的に始動させる制御器で制御される。制御器１２６で第３弁１２４を開くことにより、出口１４４から有機排出液を採集する。有機排出液は反応生成物、すなわち１ヌクレオチド延長した出発物質、および未反応オリゴヌクレオチド出発物質（欠陥配列）を含有する。未反応５′保護モノマーはチャンバー１１４内に保持される。有機溶剤溶離後、チャンバー１１４を入口１４０から添加した緩衝液で洗浄すると、未反応５′保護モノマー単位が溶出する。次いで、反応混合物の溶離に用いた溶剤、すなわちＣＨ₂Ｃｌ₂でチャンバー１１２を再平衡化する。次いで有機排出液を逆相樹脂に導通して、生成物を未反応オリゴヌクレオチド出発物質（欠陥配列）から分離する（実施例６参照）。実施例７には、３′残基修飾として分子量２０，０００のポリエチレングリコールを用いた１５塩基オリゴヌクレオチド（５′−ＣＴＡＡＡＣＧＴＡＡＴＧＧ [３′,３′]−Ｔ−Ｔ−３′）(配列番号：１)の溶液相合成を記載する。この実施例は、溶液相合成が効率的であること、および従来の固相合成法では直接に製造できない３′修飾オリゴヌクレオチドを製造できることを証明する。この実施例は、典型的なＰＡＳＳサイクルにおけるように、樹脂へのオリゴヌクレオチド結合生成物捕獲を含まない溶液相合成に必要な基本的工程の概略を示す。したがってこの実施例は、ＰＡＳＳにおいて予想される生成物捕獲が効率および生成物純度に与える影響をも証明する。各モノマー付加サイクルでこのような生成物捕獲を行うと、従来の固相合成法で行う繁雑なジエチルエーテルからの沈殿がもはや必要ない。さらに、欠陥配列が各モノマー付加サイクルで分離されるので、ＰＡＳＳにより得られる生成物のアニオン交換クロマトグラムは図６のクロマトグラムにある多数のピークではなく、単一の生成物ピークを示すにすぎないと予想される。実施例８（反応経路７および８）には、５′−ジ−（３，５−ヘキサジエンオキシ）トリチルチミジンホスホルアミダイトモノマー（３２）および５′−ジ− （２，４−ヘキサジエンオキシ）トリチルチミジンホスホルアミダイトモノマーを含めた、各種のジエン修飾トリチルアルコールの合成を記載する。実施例９（反応経路９）は、マレイミド類への効率的な閉環付加にジエン類− ４，４′−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３０）および４，４′−ジ−２，４−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３６）−を使用することを示す（それぞれ反応１および２（反応経路９））。表４に種々の条件下でのこれら２反応の反応速度を示す。表４に示したデータから、修飾トリチル化合物（３０）の方が種々の反応条件下で、より速やかに反応することが明らかである。予想どおりジエノフィル当量の増加および反応混合物への水の添加が、いずれも反応速度を高める。各トリチル基上に２個のジエンが存在するので、すべてのトリチルアルコールまたはヌクレオチドをマレイミド修飾固相支持体上に捕獲するにはジエン置換基の５０％以上の反応で十分であることに注目するのが重要である。これにより反応を行うのに必要な時間が短縮される。速度を比較するために、５′−Ｏ−（４，４′−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル）チミジン（５′−（ＤＨＤＴ）−チミジン）（３１）および５′ −Ｏ−（４，４′−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル）チミジン３′− ホスホルアミダイト（３２）を用いて、反応＃３（表４）につき示したものと同じ反応条件下でディールス−アルダー反応を行った。結果を表５に示す。この場合も１時間以内に５０％を越えるジエン基が閉環付加した。これは、ＰＡＳＳにおいて予想される生成物捕獲が、迅速かつ効率的なモノマー付加サイクルを行うのに妥当な時間枠内で起きうることを示唆する。好適に置換されたジエンおよびジエノフィルを用いることによりディールス−アルダー閉環付加反応速度を調整しうることは、広く知られている。したがって好適なジエンとジエノフィルの組合わせを用いることにより、生成物捕獲反応速度を調整することができる。実施例１０には、オリゴヌクレオチド生成物を置換マレイミド−ポリスチレン樹脂上に捕獲するために４，４′−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル保護基を用いた、ＰＡＳＳによる３′−ＰＥＧ誘導体化オリゴヌクレオチドの製造を記載する。この捕獲工程により、反応混合物から未反応出発オリゴヌクレオチド（欠陥配列）が分離される。これを、オリゴヌクレオチド組み立ての同じ時点で後続生産バッチにブレンドするために、所望により単離し、保存することができる。３′−ＰＥＧ末端修飾は、特に療法用オリゴヌクレオチドのインビボ薬物動態挙動を増強するために有用である。実施例１１には、ジエンとして５′−Ｏ−（４，４′−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル）−ヌクレオシド（５′−Ｏ−ＤＨＤＴ−ヌクレオシド）４６、ジエノフィルとしてマレイミド置換固体支持体４５を用いるディールス−アルダー生成物捕獲により非ＰＥＧ誘導体化オリゴヌクレオチドを製造するための、一般的反応経路を記載する（反応経路１１）。前記のように、樹脂またはメンブラン上に全長オリゴヌクレオチドを捕獲することは、ＰＡＳＳ法を自動化することと一体である。この一般的捕獲方式では、トリチル基またはトリチル類似基を固体支持体、たとえば樹脂、メンブランまたはポリマー４７に不可逆的に結合させる。結合したオリゴヌクレオチド４９は、それを不可逆的に結合したトリチル基４８から分離することにより離脱する。この一例は５′−Ｏ−ＤＨＤＴ−ヌクレオシドのディールス−アルダー捕獲である。樹脂に結合した活性ディールス −アルダージエノフィルは、ジエンであるトリチルと共有結合反応し、慣用される脱トリチル化法によりヌクレオシドが固体支持体および結合トリチル基から離脱する。この捕獲方法は、実施例１１に記載するようにＰＡＳＳにより非ＰＥＧ誘導体化オリゴヌクレオチドを製造するために利用できる（反応経路１２）。反応経路１１多数の固体支持体がディールス−アルダー反応による捕獲と離脱に好適であると考えられる。好ましい固体支持体は容易に官能化しうる表面ヒドロキシル基をもつ無機酸化物（シリカ、アルミナ、ゼオライト、制御多孔ガラス（ＣＰＧ）など）である。ＣＰＧは例外の場合があるが、これらの無機固体支持体は市販の樹脂よりはるかに高い装填容量をもつことが多い。伝統的にこれらの無機酸化物は、より多能またはより反応性の官能基をもつシリル化剤でヒドロキシル基をシリル化することによって官能化されている（反応経路１３）。反応経路１３反応性ジエノフィルを共有結合させる他の方法、たとえば６−マレイミド−カプロン酸などの分子と表面ヒドロキシル基との間のエステル化も考えられる（反応経路１４）。表面とジエノフィル基との間の他の共有反応リンカーも、ジエノフィルの表面装填量および／または反応性を高めることが認められれば採用できる。反応経路１４実施例１２（反応経路１５）には、ディールス−アルダー閉環付加による生成物捕獲を利用した二量体の製造を記載する。３．３′−結合５′−ＤＨＤＴＯ− Ｔ−Ｔ二量体の捕獲速度は、過剰の樹脂結合マレイミド基に依存する。生成物の捕獲は定量的に進行する。捕獲された生成物は、ジクロロメタン中の３％ジクロロ酢酸で容易かつ定量的に樹脂から離脱する。中和および濃縮後に、純粋な生成物が得られる。実施例１３には、ジエノフィル誘導体化樹脂への５′−Ｏ−（４，４′−ジ− ３，５−へキサジエンオキシトリチル）保護オリゴヌクレオチドの閉環付加を利用して樹脂上にブロックのひとつを捕獲させることにより、ブロックからオリゴヌクレオチドを組み立てる方法を記載する。実施例１４（図８）には、実施例１０に記載した各サイクルでのモノマー付加生成物の共有捕獲を利用して３′末端ポリエチレングリコールを保有するオリゴヌクレオチドを自動的に製造するために設計した、自動抽出／濾過システム２００および方法を模式的に示す。前記のように、ヌクレオシドホスホルアミダイトの制御された逐次重合からなるＰＡＳＳ法は自動化に理想的に適しており、自動方式で実施できる。各モノマー付加は化学処理工程のシーケンスからなる。このシーケンスは各モノマー付加（サイクル）につき同じである。サイクル毎の唯一の変動は、付加されるモノマーの性質である。典型的なオリゴヌクレオチドは２〜１２種類のモノマーからなり、これらが専用のプログラマブルシーケンスで一般に２回以上付加される。図８から分かるように、自動抽出／濾過システム２００は３つの中心をもつ反応器２１２、濾過チャンバー２１４−ジエノフィル修飾した固体支持体２１５を収容する−および限外濾過膜システム２１８。実施例１４には、捕獲樹脂から離脱した後の生成物オリゴヌクレオチドと過剰のモノマーの分離に必要な条件に適合する各種の限外濾過膜をも挙げる。試薬／生成物の吸着性、保持性および反応性に基づいて膜を評価する。実施例１４に示した膜は、溶剤により影響される流速、吸着による生成物の損失、最後に拡散反射ＦＴＩＲに基づいて、好適であることが認められた。説明のために３′末端ＰＥＧオリゴヌクレオチドの製造を実施例１４に記載するが、この自動合成法はオリゴヌクレオチドに高分子を結合させてもさせなくても実施できる。後者の場合、分子量分画メンブランの代わりに図５に示すように液／液抽出工程を採用してもよい。実施例１５には、マレイミド誘導体化トリチル基の合成を記載する。前記のように、ＰＡＳＳ法の一体部分となるのがｎ−１配列の分離法である。１方法は、マレイミド修飾トリチル基を含むモノマーを用いるオリゴヌクレオチド合成である。これらのトリチル基はジエン修飾樹脂と反応しやすく、樹脂を洗浄したのち脱トリチル化して全長オリゴヌクレオチドを離脱させるだけでｎ−１体を分離できる。実施例１６には、溶液相合成および従来の固相合成に際して欠陥配列を選択的に分離するためのジエン修飾キャッピング試薬の使用を記載する。一般に欠陥配列を無水酢酸でキャッピングする。無水酢酸によるキャッピング反応は速やかに、ほぼ定量的に進行する。したがって無水酢酸類似体、たとえば無水３，５−ヘキサジエン酸（７４）および無水３，５−ヘキサジエンオキシ酢酸（７５）（反応経路１８）は欠陥配列を効率的にキャッピングし、かつキャッピングした欠陥配列を実施例７に記載したように、ジエノフィル誘導体化した樹脂またはメンブランへ閉環付加させることにより、溶液相合成の各サイクルで分離することができる。従来の固相合成に際して導入された５′−アセチルキャッピング基は、アンモニア開裂および脱保護の工程で除去される。固相合成のキャッピング試薬として、かつ欠陥配列の選択的分離のための後続ハンドルとして試薬７４および７５を使用するためには、非塩基性条件下で選択的に開裂するリンカー、たとえば実施例１２に記載したもので、オリゴヌクレオチドを支持体に結合させなければならない。あるいは、従来の固相合成の終了時に用いられる典型的な塩基性脱保護条件下で除去されにくいキャッピング試薬を用いることができる。ヘキサジエンオキシシリルクロリド（７６、７７および７８）は、粗製オリゴヌクレオチドをアンモニアで支持体から開裂させると、欠陥配列を選択的に分離できる。シリルエーテル基はこれらの条件下では除去されない。したがって、ヘキサジエンオキシシリルでキャッピングされた欠陥配列を、ジエノフィル誘導体化した樹脂またはメンブランとの反応により目的配列から分離できる。反応経路１８以下の実施例は説明のために提示されたにすぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。実施例１．Ｎ−４−ベンゾイル−３′−(５′−ｔ−ブチルジメチルシリル− ３′−(２−シアノホスホリル)チミジル)−２′−フルオロシチジン（１６）の製造（反応経路４）５′−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジン１２（５′−ＴＢＤＭＳ−チミジン）（０.１５ｇ，０.４２ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリル（１０ｍＬ）にアルゴン雰囲気下で溶解した。シチジンアミダイト１３(０.４３ｇ，０.５０ｍｍｏｌ) 、次いでテトラゾール（６．５ｍＬ，アセトニトリル中０．４５Ｍ）を添加した。１５分後に、反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析（Ｃ１８，４．６×１００ｍｍ，緩衝液Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム，ｐＨ７.５，緩衝液:Ｂアセトニトリル，２．５分かけて０〜８０％Ｂ）は二量体（２．４分）および未反応チミジン１２（１．４分）および加水分解されたアミダイトモノマー（２．１分）の存在を示した（図１）。反応混合物を現場酸化した（１０ｍＬ．水／ピリジン中０．２Ｍヨウ素）。酸化後のＨＰＬＣはピリジン（０．９分）、未反応チミジン１２（１．４分）、酸化されたアミダイトモノマー１５（１．８分）および酸化された二量体１４（２．３分）の存在を示す（図２）。酸化後に反応混合物を、アセトニトリルで予め平衡化したＤＥＡＥセファデックス（登録商標）床にアセトニトリルにより導通した。濾液のＨＰＬＣ分析は、図３に示すように酸化アミダイトモノマー１５が保持されたことを表す。濾液を減圧下で濃縮し、固体を６０％アセトニトリル／水に再溶解し、７０％水／アセトニトリルで予め平衡化したＣ１８チャンバーに装填した。チャンバーを７０％水／アセトニトリル、次いで５０％水／アセトニトリルで洗浄して、未反応チミジン１２を十分に溶離した。次いでチャンバーを水で洗浄し、８０％酢酸／水で処理して脱トリチル化させた。脱トリチル化後にチャンバーを５０％アセトニトリル／水で洗浄して、最終生成物１６（ｍ／ｅ９２２，生成物１６＋トリエチルアミン）を溶離した。ＨＰＬＣ分析は、脱トリチル化種１６が１．７分で溶出したことを示す（図４）。１６のＥＳＭＳ（電子スプレー質量分析）：計算値８２０.２７（Ｍ＋）；実測値９２２.２（Ｍ＋Ｈ＋ＴＥＡ）。³¹ＰＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，外標準Ｈ₃ＰＯ₄）δ−０.７３，−１.９３。トリチル種はチャンバーに保持された。実施例２．Ｈ−ホスホネートチミジン三量体（Ｔ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔ）の製造（２０）３′，３′−ヌクレオチド間結合を３′末端に保有するＨ−ホスホネートチミジン三量体アセンブリーを、反応経路５の概説に従って合成した。反応経路５５′−ジメトキシトリチルチミジン３′−Ｈ−ホスホネート１７への１２の結合１：１アセトニトリル：ピリジン（４２ｍＬ）中における１７（０．７５ｇ，１．０５ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で、１２（０．２５ｇ，０．７ｍｍｏｌ）、次いで９５：５アセトニトリル：ピリジン（８．４ｍＬ）中における塩化ピバロイル（０．２６ｇ，２．１ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物を１０分間撹拌した。この時点で逆相ＨＰＬＣ分析は１２から二量体１８への変換の完了を示した。次いで混合物を真空中で濃縮し、ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、０．０５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウムで抽出した。ブフナー漏斗上のＤＥＡＥセファデックス（登録商標）プラグに塩化メチレン層を付与した。濾液の逆相ＨＰＬＣ分析は、未反応モノマー１７が完全に分離されたことを示した。濾液の蒸発により二量体１８が定量的収率で単離され、その構造をＮＭＲおよびＥＳＭＳ分析により確認した。未反応モノマー１７はＤＥＡＥセファデックスプラグから、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウムで洗浄することにより回収された。１８のＥＳＭＳ：計算値９４６.４（Ｍ＋）；実測値９４６.３。¹ H NMR(300MHz,CD₃CN)δ9.21(s,2H),7.45-7.24(m.11H).6.94(d,1H,J=717.2Hz),6 .89-6.85(m,4H),6.31-6.19(m,2H),5.22-5.19(m.1H).5.05-5.00(m,1H),4.22-4.19 (m,1H),4.11-4.10(m,1H),3.81-3.80(m.2H).3.75(s.6H),3.36-3.35(m,2H),2.52-2 .17(m,4H),1.83(s,3H),1.47(s.3H).0.91(s.9H).0.10(s.6H).³¹P NMR(121MHz.CD₃ CN)δ14.03(d),13.88(d). 二量体１８の脱トリチル化二量体１８（０．８５ｇ，０．９ｍｍｏｌ）を、ＺｎＢｒ₂で飽和した塩化メチレン（１０ｍＬ，約０．１ＭＺｎＢｒ₂）に溶解した。１５分後に逆相ＨＰＬＣ分析は脱トリチル化の完了を示した。等容量の１Ｍ酢酸アンモニウムで反応を停止した。有機層を濃縮し、残渣を１：１アセトニトリル：水に溶解し、ブフナー漏斗上のＣ１８プラグに導通した。濾液を蒸発させて、０．２９ｇ（収率５０％）の純粋な二量体１９を得た。１９のＥＳＭＳ：計算値６４４.２（Ｍ＋）；実測値６４５.３。¹ H NMR(300MHz,CDCl₃)δ10.0,9.85,9.55,9.45(4s.2H).7.59-7.45(m,2H).7.01(d, 1H,J=712.3Hz),6.39-6.19(m,2H),5.35-5.23(m,1H).5.14-5.03(m,1H),4.31-4.22( m,2H),3.88-3.79(m,4H),2.67-2.48(m,3H),2.21-2.12(m,1H).1.89-1.88(2bs,6H), 0.90(s,9H),0.11(s,6H).³¹P NMR(121MHz,CDCl₃)δ8.45(d),8.30(d). 三量体２０の製造１：１ピリジン：アセトニトリル（２３ｍＬ）中における二量体１９（０．２５ｇ，０．３９ｍｍｏｌ）の溶液に、１７（０．４１ｇ，０．５８ｍｍｏｌ）、次いで９５：５アセトニトリル：ピリジン（４．５ｍＬ）中における塩化ピバロイル（０．１４ｍＬ，１．１６ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物をアルゴン雰囲気下で１０分間撹拌した。この時点でＨＰＬＣ分析は二量体１９から三量体２０への変換が完了したことを示した。混合物を蒸発乾固し、ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、０．０５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウムで洗浄し、有機層をブフナー漏斗上のＤＥＡＥセファデックスプラグに付与した。濾液を蒸発させて、２０を定量的収率で得た。２０のＥＳＭＳ：計算値１２３４.４(Ｍ＋ );実測値９３３.５（Ｍ＋Ｈ＋ＤＭＴ消失）；¹ H NMR(300MHz,CD₃CN)δ9.34-9.27(m,2H),8.58-8.56(m,2H),8.18-8.11(m,1H),7. 76-7.70(m,1H),7.43-7.41(m,4H),7.35-7.23(m,13H),6.88-6.84(m,4H),6.26-6.15 (m,3H),5.78-5.71(m,1H),5.22-5.20(m,1H)5.11-5.05(m,2H),4.29-4.26(m,2H)4.2 4-4.19(m,2H),3.85-3.84(m,2H),3.76(s,6H),3.74-3.72(m,1H),3.38-3.28(m,2H), 2.52-2.20(m,6H),1.82(s,3H),1.78(s,3H),1.47-1.44(m,3H),0.90(s,9H),0.11(s, 6H).³¹P NMR(121MHz,CD₃CN)δ15.86(s),15.08(s),14.36(s). 実施例３．５′−Ｏ−(４，４′−ジオクタデシルトリフェニルメチル)チミジン−３′−Ｏ−(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト（２６）の製造５′保護基（Ｄ−Ｅ）として４，４′−ジオクタデシルトリフェニルメタノール（ＤＯＴ）を含むホスホルアミダイトモノマーの組立てを反応経路６に示す。反応経路６４，４′−ジオクタデシルオキシ−ベンゾフェノン（２２）金属ナトリウム（０．４６ｇ，２０ｍｍｏｌ）をエタノール（５０ｍＬ）に溶解し、４，４′− ジヒドロキシベンゾフェノン（１．０ｇ，４．６７ｍｍｏｌ）、次いで１−ブロモオクタデカン（７．８ｇ，２３．４ｍｍｏｌ）および触媒量のヨウ化ナトリウム（約３０ｍｇ）を添加し、反応混合物を４８時間還流した。生じた懸濁液を冷却し、濾過した。固体をジクロロメタン、次いでヘキサンで洗浄し、白色固体を乾燥させて、化合物２２（２．８５ｇ，収率８４．８％）を得た。¹ H NMR(300MHz,ピリジン-d₅)δ7.95(d,J=8.7Hz,4H,アリール),7.09(d,J=8.7Hz,4H,アリール), 4.05(t.J=6.6Hz,4H,2xOCH₂),1.80(tt,J=6.6および7.5Hz,4H),1.48(m,4H),1.33(b rS.60H),0.87(t,J=6.6Hz,6H,2xCH₃). ４，４′−ジオクタデシルトリフェニルメタノール（２３）ＴＨＦ（４ｍＬ）中におけるベンゾフェノン２２（０．３ｇ，０．４２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、臭化フェニルマグネシウム（０．５５ｍＬ，ＴＨＦ中１．０Ｍ溶液，０．５５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を３時間還流した。追加量の臭化フェニルマグネシウム（０．２ｍＬ）を添加し、０．５時間加熱し続けた。この時点ですべての出発物質が溶解していた。次いで反応物を冷却し、０．５ＭＨＣｌを添加した。この懸濁液を濾過し、固体を水（３回）、ヘキサン（２回）およびジクロロメタン（２回）で洗浄した。有機洗液をプールし、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させて、２３（０．２１ｇ，収率６３．６％）を白色固体として得た。¹ H NMR(300MHz,ピリジン-d₅)δ8.13(brS,1H,アリール),7.81(d,J=7.1Hz,2H),7.7(d,J=8.8 Hz,4H),7.42(t,J=7.7Hz,2H),7.34(t,J=7.1Hz,1H),7.07(d,J=8.9Hz,4H),3.98(t,J =6.4Hz,4H),1.77(tt,J=7.9および6.5Hz,4H),1.45(m,4H),1.3(brS,60H),0.87(t,J =6.9Hz,6H). ５′−Ｏ−（４，４′−ジオクタデシルトリフェニルメチル）チミジン（２５）化合物（２３）（２．１ｇ，２．６３ｍｍｏｌ）をトルエンと共に２回蒸発させ、次いでトルエン（３０ｍＬ）に溶解した。塩化アセチル（１１ｍＬ，１５４．７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を３時間還流し、次いで蒸発させた。残渣をトルエンと共に２回蒸発させて、粗製２４を得た。２４にピリジン（３０ｍＬ）、ＤＭＡＰ（２５ｍｇ）およびチミジン（０.４５ｇ，１.８６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で一夜撹拌した。溶剤を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタンに装入し、５％炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させ、残渣をシリカゲル（酢酸エチル／２％トリエチルアミン）で精製し、適切な画分を蒸発させた後、化合物２５（ＤＯＴチミジン）（１．６ｇ．収率８４％）を淡黄色固体として得た。¹ H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.44(brS,1H,NH),7.60(s,1H,H-6),7.41-7.20および6.82 (m,13H,DOT),6.42(t,J=6.1Hz,1H,H-1'),4.57(m,1H.H-3'),4.05(m.1H.H-4'),3.92 (t,J=6.5Hz,4H,2xOCH₃),3.47および3.37(ABX,2H.H-5').2.38(m,2H.H-2'),2.22(m ,1H,3'-OH),1.75(m,4H,DOT),1.46(m,7H.5-CH₃,DOT).1.25(brS,60H,DOT),0.87(t, 6H,2xCH₃). ５′−Ｏ−（４，４′−ジオクタデシルトリフェニルメチル）チミジン−３′ −Ｏ−(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト（２６）ＤＯＴチミジン２５をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（０．３ｍＬ，１．７５ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルＮ，Ｎ −ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．１５ｍＬ，０．６３ｍｍｏｌ）を水浴冷却下に添加した。氷浴を取り除き、反応物を室温で４時間撹拌し、この時点でさらに２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．１ｍＬ）を添加し、反応物を室温で１６時間撹拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、５％炭酸水素ナトリウムで洗浄し、有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させた。残渣をシリカゲル上で、まずヘキサン、続いて２０％酢酸エチル／ヘキサン（すべて２％トリエチルアミンを含有）により溶離して精製し、２６を分割したジアステレオマーとして得た（高速画分０．１ｇ，低速画分０．１８ｇ，収率４６．７％）。２６ａ（高速ジアステレオマー）¹ H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.15(br,1H,NH),7.91(s,1H,H-6),7.63,7.38-7.21,6.82( m,13H,アリール),6.39(t.J=7.4Hz,H-1'),4.67(m,1H,H-3'),4.18(m,1H,H-4'),3.92(t, J=6.5Hz,2xOCH₃),3.63(m,4H),3.51および3.33(ABX,2H,H-5'),2.42および2.26(m, 4H,H-2',CH₂CN),1.73(m,4H),1.41(m,4H),1.25(s,60H),1.16(dd,J=2.7,6.9Hz,12H ),0.87(t,J=6.9Hz,6H).³¹P NMR(121MHz,CDCl₃)δ150.64.26b(slower diastereom er)¹H NMR(300MHz,CDCl₃)68.25(br,1H,NH),7.91(s,1H,H-5),7.41および7.31-7.2 0および6.81(m,13H,アリール),6.42(dd,J=8Hz,H-1'),4.67(m,1H,H-3'),4.14(m,1H,H- 4'),3.92(t,J=6.5Hz,4H,2xOCH₂),3.82および3.76(m,2H),3.54(m,2H),3.47および 3.31(ABX,2H,H-5'),2.62(t,J=6.3Hz,2H,CH₂CN),2.54および2.34(m,2H,H-2'),1.7 6(m,4H),1.25(m,60H),1.16および1.05(d,J=6.9Hz,12H,イソプロピル CH₃),0.87(t,J=6 .6Hz,6H).³¹P NMR(121MHz,CDCl₃)δ150.23. 実施例４．逆相樹脂上におけるアルキル置換トリチル基の分離アルコール類４，４′−ジオクタデシルトリフェニルメタノール（ＤＯＴ）、４−デシルオキシ−４′−メトキシトリタノール、およびジメトキシトリタノール（ＤＭＴ）をＣ１８逆相ＴＬＣプレート上にスポットし、プレートを３種類の異なる溶剤中で展開した（表１）。表１に見られるように、メタノール（Ｒ_f＝０）およびアセトニトリル（Ｒ_f＝０）などの有機溶剤中でＤＯＴ基とＣ１８樹脂に強い相互作用がある。この相互作用により、結合生成物を出発物質から、Ｃ１８逆相樹脂に対するトリチル保護基の親和性または相互作用に基づいて１工程分離することができる。実施例５．生成物捕獲のための疎水性親和性を利用したＰＡＳＳによる５′− ＨＯ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔ−３′の製造５′−ＨＯ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔの製造５′−ＴＢＤＰＳ−チミジン１２（０．９９ｇ，２．０７ｍｍｏｌ）を乾燥塩化メチレンと共に蒸発させ、乾燥塩化メチレン１０ｍＬに溶解した。チミジンアミダイト（２．０ｇ，２．６９ｍｍｏｌ）、次いでアセトニトリル中の０．５Ｍテトラゾール（２１ｍＬ，１０．５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴン下で撹拌した。９０分後にヨウ素／水／ピリジン溶液（０．２Ｍ）を暗褐色の色彩が持続するまで添加し、次いで５％ＮａＨＳＯ₃を色彩が黄色に戻るまで添加した。濃縮した反応物を分配し（ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、有機層をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発乾固した。固体残渣をメタノール／最小量の塩化メチレンに溶解し、水、次いでメタノールで平衡化した７５ｇのＤＥＡＥセファデックス（登録商標）床にピペットで装填した。ＤＥＡＥセファデックスを３００ｍＬのメタノールで洗浄し、メタノール洗液を濃縮して、白色泡状物２．４２ｇを得た。脱トリチル化：この白色泡状物を５０ｍＬの３％ＤＣＡに溶解し、室温で３５分間撹拌し、次いで塩化メチレンで平衡化したシリカゲル８０ｍＬ上に注入した。このゲルを１５０ｍＬの３％ＤＣＡ、次いで１００％塩化メチレンから塩化メチレン中６％メタノールまでの溶液で洗浄した。適切な画分を合わせて濃縮し、１．５８ｇの脱トリチル化二量体（５′−ＨＯ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔ）を得た。２工程プロセスにつき収率９０％。５′−ＨＯ−Ｃ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔの製造５′−ＨＯ−Ｔ−[３′，３ ′]−Ｔ二量体（１．４７ｇ，１．７６ｍｍｏｌ）を高真空下で一夜乾燥させ、次いで乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂と共に蒸発させ、８．５ｍＬの乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解した。シチジンアミダイト（１．９０ｇ，２．２８ｍｍｏｌ）、次いでアセトニトリル中のテトラゾール（０．５Ｍ）（１７．６ｍＬ，８．７８ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴン下で撹拌した。５０分後に０．５Ｍヨウ素溶液、次いで５％ＮａＨＳＯ₃を添加し、前記のように色彩を褐色から黄色に変化させた。濃縮した反応物を分配し（ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発乾固した。固体残渣をメタノール／最小量の塩化メチレンに溶解し、水、次いでメタノールで予め平衡化した７５ｇのＤＥＡＥセファデックス（登録商標）床にピペットで装填した。ＤＥＡＥセファデックスを塩化メチレンおよびメタノールで徐々に洗浄し、洗液を合わせて濃縮し、黄色泡状物２．５３ｇを得た。脱トリチル化：この泡状物を５０ｍＬの３％ＤＣＡ中において室温で撹拌した。２時間後に反応混合物を、塩化メチレンで予め平衡化した８０ｍＬのシリカゲル床にピペットで装填した。混合物を３％ＤＣＡ、次いで１００％ＣＨ₂Ｃｌ₂ からＣＨ₂Ｃｌ₂中６％メタノールまでの溶液で溶離した。適切な画分を合わせて濃縮し、１．４３ｇの脱トリチル化三量体（５′−ＨＯ−Ｃ−Ｔ−[３′，３′] −Ｔ）を得た。２工程プロセスにつき収率６４％。５′−ＨＯ−Ａ−Ｃ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔの製造脱トリチル化三量体５′ −ＨＯ−Ｃ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔ（１．４３ｇ，１．１ｍｍｏｌ）を高真空下で一夜乾燥させ、次いで乾燥塩化メチレンと共に蒸発させ、６ｍＬの乾燥塩化メチレンに溶解した。アデニンアミダイト（１．２４ｇ，１．４５ｍｍｏｌ）、次いでアセトニトリル中の０．５Ｍテトラゾール（１１ｍＬ，５．５７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴン下で撹拌した。約６０分後に０．５Ｍヨウ素溶液を暗色が持続するまで添加した。次いで混合物を１時間撹拌し、濃縮した。ガムを分配し（ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、有機層を合わせて乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濃縮して、黄色固体２．４６ｇを得た。ＤＥＡＥセファデックス（登録商標）精製せずに脱トリチル化を行った。脱トリチル化：この泡状物を５０ｍＬの３％ＤＣＡ中において室温で撹拌し、次いで塩化メチレンで平衡化したシリカ床（約１２０ｍＬ）にピペットで装填した。反応混合物を３％ＤＣＡ、次いで１００％塩化メチレンから塩化メチレン中１０％メタノールまでにより溶離した。適切な画分を合わせて濃縮し、１．４１ｇの脱トリチル化四量体（５′−ＨＯ−Ａ−Ｃ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔ）を得た。２工程プロセスにつき全収率７２％。５′−ＨＯ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔの製造脱トリチル化四量体５′−ＨＯ−Ａ−Ｃ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔ（１．４１ｇ，０．８ｍｍｏｌ）を高真空で乾燥させ、次いで乾燥塩化メチレンと共に蒸発させ、４．５ｍＬの乾燥塩化メチレンに溶解した。チミジンアミダイト（０．７８ｇ，１．０５ｍｍｏｌ）、次いでアセトニトリル中のテトラゾール（０．５Ｍ）（８ｍＬ，４．０２ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴン下で撹拌した。２時間後に０．５Ｍヨウ素溶液を暗色が持続するまで添加した。次いで反応物を濃縮し、ガムを分配し（ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、有機層を合わせて乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濃縮して、黄色泡状物２.１ｇを得た。これをＤＥＡＥセファデックスで溶離する前に、質量分析および逆相ＨＰＬＣにより分析した。酸化後の粗製反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析は、五量体、ならびに未反応四量体（欠陥配列）および加水分解されたアミダイトモノマーの存在を示した。ＥＳＭＳ（Ｍ−１）８０３．７４×３。この黄色泡状物を最小量の塩化メチレンに溶解し、水、次いでメタノールで平衡化したＤＥＡＥセファデックス（登録商標）床に装填した。セファデックスをメタノール、塩化メチレン、次いでアセトニトリルで洗浄した。適切な画分を合わせて濃縮し、１．４８ｇの物質を得た。脱トリチル化：この物質を４０ｍＬの３％ＤＣＡ中において室温で撹拌し、次いで塩化メチレンで平衡化したシリカ床にピペットで装填した。これを３％ＤＣＡ、次いで１００％塩化メチレンから塩化メチレン中２０％メタノールまでの溶液で溶離した。適切な画分を合わせて濃縮し、０．９８ｇの脱トリチル化五量体（５′−ＨＯ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔ）を得た。２工程プロセスにつき全収率６４％。³¹ＰＮＭＲおよびその積分値は生成物に一致した。５′−ＨＯ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔの製造脱トリチル化五量体５′−ＨＯ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔ（０．９６ｇ，０.４６ｍｍｏｌ）を高真空下で乾燥させ、次いで乾燥塩化メチレンと共に蒸発させ、５ｍＬの乾燥塩化メチレンに溶解した。チミジンアミダイト(０．４４ｇ，０.５９ｍｍｏｌ) 、次いでアセトニトリル中のテトラゾール（０．５Ｍ）（４．５ｍＬ，２．２７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴン下で撹拌した。この溶液は均質でなかったので、２ｍＬのアセトニトリルを添加した。２時間後に０．１５ｇのモノマーを追加し、反応物を一夜撹拌した。０．５Ｍヨウ素溶液、次いで５％ＮａＨＳＯ₃ を添加し、前記のように色彩を褐色から黄色に変化させた。濃縮した反応物を分配し（ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濃縮して、黄色固体１．６１ｇを得た。これを質量分析により分析した。ＥＳＭＳ（Ｍ−１）１３８４.０１×２。粗製反応混合物（１．４８ｇ）をＣ１８樹脂に吸収させ、アセトニトリル、次いで７０％水／アセトニトリルで平衡化したＣ１８樹脂（約１２５ｇ）床に装填した。樹脂をまず１：１水：アセトニトリルで洗浄してモノマーを溶離し、次いでアセトニトリルおよび塩化メチレンで六量体を溶離した。適切な画分を合わせて濃縮し、０．８３ｇ（収率６６％）の固体を得た。脱トリチル化：この固体を２０ｍＬの３％ＤＣＡ中において室温で撹拌した。トリヘキシルシラン（２ｍＬ）を添加し、撹拌を続けた。ヘキサンを添加すると固体が生成し、これをヘキサン／エーテルで洗浄して、０．５ｇのピンク色固体を得た。³¹ＰＮＭＲおよびその積分値は生成物に一致した。残留ＤＣＡを固体試料から分離するには、ダウエックス（Dowex）Ｃ１−形を使用できる。たとえばＴ−Ａホスホルアミダイト二量体は、脱トリチル化およびヘキサン沈殿後に約１．２当量のＤＣＡを含有することがＮＭＲにより認められた。この二量体の試料（０．３ｇ）をアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解し、予めアセトニトリルで平衡化したダウエックスＣ１−形（１５ｇ）のカラムに装填した。液体を滴下溶離し、次いでカラムを３５ｍＬのアセトニトリルで洗浄し、濃縮して、白色泡状物０．２６ｇを得た。ＮＭＲで検査した試料は約９５％の酸減少を示す。実施例６．生成物捕獲のための疎水性親和性を利用したＰＡＳＳ自動化結合反応、たとえば実施例２の１２と１７の反応（反応経路５）後に、反応混合物を抽出器１１２に入口１２８から送入する（図５）。炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＢＫ）（０．０５Ｍ）およびＣＨ₂Ｃｌ₂を抽出器に入口１３０から添加し、混合物を撹拌する。層を分離させる。分離後に弁１２０を開き、塩化メチレン層を、導電率計器１３６を通過してＤＥＡＥセファデックス（登録商標）プラグ１１４へ装填する。導電率の上昇はＣＨ₂Ｃｌ₂が完全に導電率計器を通過し、今度は水層が計器に進入したことを示す。この時点で弁１２０は、水層をＤＥＡＥセファデックスプラグからそらすように自動的に切り替わる。有機層は、入口１４０からチャンバーへ進入するアルゴンによりＤＥＡＥセファデックスプラグに圧入される。次いで弁１２２による制御下に入口１４２から添加されるＣＨ₂Ｃｌ₂でＤＥＡＥセファデックスプラグを洗浄する。オリゴヌクレオチド生成物および未反応オリゴヌクレオチド出発物質(欠陥配列)を含有するＣＨ₂ Ｃｌ₂排出液を、弁１２４による制御下に出口１４４から採集する。ＣＨ₂Ｃｌ₂ が完全に排出した後、セファデックスプラグに保持されていた未反応ホスホルアミダイトモノマーを１ＭＴＢＫで溶離する。次いでセファデックスプラグをＣＨ₂Ｃｌ₂で再平衡化する。次いでＣＨ₂Ｃｌ₂排出液を逆相樹脂に導通して、結合生成物を欠陥配列から分離する。ＤＭＴがその５′末端に結合した結合生成物は樹脂に保持され、欠陥配列はチャンバーから溶出する。次いで樹脂を酸性ジクロロ酢酸（ＣＨ₂Ｃｌ₂中３％）で洗浄すると、これがＤＭＴ保護基を開裂させ、結合生成物をチャンバーから離脱させる。結合生成物を、酸への過剰暴露による分解を防ぐためにｐＨ緩衝液中へ溶離する。溶出液を濃縮し、結合生成物を次の反応サイクルにおける出発物質として用いる。実施例７．溶液相合成による３′−ＰＥＧ固定１５ｍｅｒＤＮＡの製造配列５′−ＣＴＡＡＡＣＧＴＡＡＴＧＧ[３′,３′]−Ｔ−Ｔ−３′(配列番号 :１)のオリゴヌクレオチドを、３′末端修飾として分子量２０，０００のポリエチレングリコールを用いる液相合成により製造した。ポリエチレングリコールは各工程で、成長中のオリゴヌクレオチドを容易に沈殿させることができる。この実施例は、典型的なＰＡＳＳサイクルにおけるように、樹脂へのオリゴヌクレオチド結合生成物捕獲を行わない溶液相合成に必要な基本的工程の概略を示す。したがってこの実施例は、ＰＡＳＳにおいて予想される生成物捕獲が効率および生成物純度に与える影響をも証明する。各モノマー付加サイクルでこのような生成物捕獲を行うと、繁雑なジエチルエーテルからの沈殿がもはや必要ない。さらに、欠陥配列が各モノマー付加サイクルで分離されるので、ＰＡＳＳにより得られる生成物のアニオン交換クロマトグラムは図６のクロマトグラムにみられる多数のピークではなく、単一の生成物ピークを示すにすぎないと予想される。この実施例は、溶液相合成による３′−ＰＥＧ固定オリゴヌクレオチド製造のための各モノマー付加サイクルに従った一般的方法であって、欠陥配列から生成物を分離する手段としての生成物捕獲を行わない方法を示す。以下の反応はすべて、セルフシール隔壁付き一口フラスコ内で室温において実施された。ディスポーザブルプラスチック注射器を用いた。脱トリチル化：５′−ＤＭＴ−ヌクレオシド３′−Ｏ−ＰＥＧ（５．０ｇ）（２０ｋ，装填量：４５μｍｏｌ／ｇ）を、ＣＨ₂Ｃｌ₂中におけるジクロロ酢酸（ＤＣＡ）およびトリヘキシルシラン（６．４ｍＬ，８０当量）の混合物５０ｍＬに溶解した。９分後に脱トリチル化５′−ＨＯ−ヌクレオシド３′−Ｏ−ＰＥＧをエーテルで沈殿させ（２回）、洗浄し、濾過し、真空乾燥した。結合反応：５′−ＯＨ−ヌクレオシド３′−Ｏ−ＰＥＧを２０ｍＬの乾燥アセトニトリルと共に３回蒸発させ、高真空下で３０分間乾燥させた。フラスコをアルゴンでフラッシし、外気から遮断した。隔壁を通して、５′−ＯＨ−ヌクレオシド３′−Ｏ−ＰＥＧを溶解するための乾燥アセトニトリル５０ｍＬ、乾燥アセトニトリル中のアミダイト４．５ｍＬ（０．１Ｍ，２．０当量）、およびアセトニトリル中のＤＣＩ１．４ｍＬ（１．０Ｍ，６．０当量）を注入した。この溶液をアルゴン下で２５分間撹拌し、次いでエーテルで沈殿させ、２０ｍＬの乾燥アセトニトリルと共に蒸発させることにより乾燥させた。酸化：この沈殿を５０ｍＬの乾燥アセトニトリルに溶解し、アセトニトリル中のヨードベンゼンジアセテート８ｍＬ（１．０Ｍ）を注入し、反応混合物を８分間撹拌した。キャッピング反応：無水酢酸（６ｍＬ）、２，６−ルチジン（６ｍＬ）およびＮ−メチルイミダゾール（６ｍＬ）を同時に上記溶液に注入し、反応混合物をさらに５分間撹拌した。キャッピングしたオリゴヌクレオチド−ＰＥＧポリマーを上記の脱トリチル化処理に記載したと同様にエーテルから沈殿させた。結晶化：キャッピングしたオリゴヌクレオチド−ＰＥＧポリマーを、６０℃ で５００ｍＬの無水エタノール(１００ｍＬ／ｇ)からの結晶化により精製した。モノマー付加サイクルプロトコールを表２にまとめる。オリゴヌクレオチドの３′末端１０塩基フラグメント（１０ｍｅｒ）（ＣＧＴＡＡＴＧＧ[３′．３′] −Ｔ−Ｔ）（配列番号：２）の製造に関する各段階の結合効率を表３に示す。ＰＥＧから開裂させ、かつ脱保護した後の粗製１５ｍｅｒ(５′−ＣＴＡＡＡＣＧＴＡＡＴＧＧ[３′，３′]−Ｔ−Ｔ−３′(配列番号：１))のアニオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。実施例８．ジエン修飾トリチルアルコールの製造実施例８（反応経路７および８）には、５′−Ｏ−(４，４′−ジ−３，５− ヘキサジエンオキシトリチル)チミジン３′−ホスホルアミダイトモノマー３２を含めた各種ジエン修飾トリチルアルコールの合成を記載する。反応経路７４，４′−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシベンゾフェノン（２９）の製造乾燥ＴＨＦ（３３５ｍＬ）中における３，５−ヘキサジエノール（２７）（１３．７ｇ，１４０ｍｍｏｌ）(Martin et al．(1980)J.Am.Chem.Soc.102:5274-5279 )の溶液に、４，４′−ジヒドロキシベンゾフェノン（２８）(１０．０ｇ，４６．７ｍｍｏｌ)およびトリフェニルホスフィン（３６．７ｇ，１４０ｍｍｏｌ）を添加し、次いでジエチルアゾジカーボネート（ＤＥＡＤ）（２２ｍＬ，１４０ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。反応混合物をアルゴン下で一夜撹拌し、次いで真空下で蒸発乾固した。ジクロロメタン−ヘキサンから沈殿させて、残留試薬を除去した。濾液を真空中で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂，３／２）により精製して、不純な生成物を得た。これを摩砕処理（Ｅｔ₂Ｏ／ヘキサン，１／１）して、７．１２ｇの化合物２９を得た。濾液をさらにカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂，３／２）により精製するとさらに５．９６ｇの２９が得られ、合計１３．０８ｇ（７５％）の化合物２９を白色固体として得た。¹ H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ2.50-2.64(m,4H),4.16(t,J=6.5Hz,4H),5.05(d,J=10.1 Hz,2H),5.18(d,J=15.7Hz,2H),5.77-5.92(m,2H),6.17-6.47(m,4H),7.10(d,J=8.6H z,4H),7.72(d,J=8.7Hz,4H). ４，４′−ジ−３,５−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３０）の製造化合物２９（５．９６ｇ，１５．９１ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１３３ｍＬ）に、わずかに加熱しながら溶解した。臭化フェニルマグネシウム(ＴＨＦ中の１．０Ｍ溶液３２ｍＬ,３２ｍｍｏｌ)をこの溶液に添加し、混合物を室温でアルゴン下に５時間撹拌し、真空下で蒸発乾固した。残渣をジクロロメタンに再溶解し、塩化アンモニウム飽和溶液、次いで水で洗浄した。有機相を乾燥させ(ＭｇＳＯ₄)、真空下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル;ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂，１／９)により精製して４．４５ｇ（６２％）の化合物３０を黄色の油として得た。¹ H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ2.45-2.56(m,4H),3.98(t,J=6.6Hz,4H).5.01(dd.J=1.5 .9.9Hz,2H),5.14(dd,J=1.5,16.5Hz,2H),5.73-5.87(m,2H).6.12-6.41(m.4H).6.25 (s.1H),6.84(d,J=6.9Hz.4H).7.06(d,J=7.8Hz.4H).7.15-7.33(m.5H). ５′−Ｏ−(４，４′−ジ−３,５−ヘキサジエンオキシトリチル)チミジン(３１)の製造化合物３０（３．５ｇ，７．７３ｍｍｏｌ）をトルエンと共に蒸発させ（２回）、次いで乾燥トルエン（８５ｍＬ）に溶解した。塩化アセチル（３３ｍＬ，４６４ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、反応混合物をアルゴン下で撹拌しながら加熱還流した。４時間後に反応混合物を真空中で濃縮し、粗生成物をピリジンと共に蒸発させ、次いで乾燥ピリジン（４２ｍＬ）に溶解した。ピリジンと共に蒸発させ、乾燥ピリジン（４２ｍＬ）に溶解したチミジン（１．５ｇ，６．１８ｍｍｏｌ）を、次いで粗生成物を含有する溶液に添加した。触媒量のジメチルアミノピリミジン（ＤＭＡＰ）を添加し、反応混合物をアルゴン下で一夜撹拌し、溶剤を蒸発させた。残渣をジクロロメタンに再溶解し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで水で洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させ、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，１／１）により精製して、３．５３ｇ（８４％）の化合物３１を灰白色固体として得た。¹ H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.47(s,3H),2.22-2.46(m,2H),2.50-2.63(m,4H),3.35-3. 58(m,2H),3.85-4.09(m,5H),4.51-4.60(m,1H),5.02(dd,J=1.5,10.4Hz,2H),5.14(d d,J=1.5,17.3Hz,2H),5.68-5.83(m,2H),6.12-6.45(m,5H),6.82(d,J=9.0Hz,4H),7. 18-7.46(m,9H),7.58(s,1H),8.44(s,1H); 元素分析：Ｃ₄₁Ｈ₄₄Ｎ₂Ｏ₇・2Ｈ₂Ｏ（712.8384）計算値：Ｃ，69.08；Ｈ，6.79；Ｎ，3.93．実測値：Ｃ，69.34；Ｈ，6.44；Ｎ，3.91．５′−Ｏ−(４，４′−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル)チミジン３ ′−ホスホルアミダイト（３２）の製造化合物３１（３．０ｇ，４．４３ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタンに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（２．７ｍＬ，１５．５ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を０℃に冷却し、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（２．０ｍＬ，８．８６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をアルゴン下で撹拌しながら室温にまで昇温させた。４時間後に溶液をジクロロメタンで希釈し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した（２回）。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、真空中で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ＥｔＯＡｃ／ヘキサン．３／７）により精製して２．８ｇ（７２％）の化合物３２を軽い白色固体として得た。¹ H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.01-1.20(m.12H).1.41(s,3H),2.25-2.67(m.8H),3.26-4 .22(m,11H),4.60-4.65(m,1H).5.02(dd.J=1.5.10.4Hz.2H).5.14(dd.J=1.5,17.3Hz ,2H),5.69-5.84(m,2H),6.11-6.48(m,5H).6.82(dd,J=3.2,8.9Hz.4H),7.16-7.43(m ,9H),7.62(d,J=15.2Hz,1H),8.05(bs,1H);³¹P NMR(300MHz,DMSO-d₆)152.9,152.4; 元素分析：Ｃ₅₀Ｈ₆₁Ｎ₄Ｏ₈Ｐ₁（877.0276）計算値：Ｃ，68.48；Ｈ，7.01；Ｎ， 6.39．実測値：Ｃ，68.48；Ｈ，7.22；Ｎ，6.33．反応経路８４，４′−ジ−２，４−ヘキサジエンオキシベンゾフェノン（３５）の製造４，４′−ジフルオロベンゾフェノン（３４）(４．８ｇ，２２ｍｍｏｌ)を乾燥ＤＭＦ（１Ｌ）に溶解した。ＮａＨ（９５％，５．６ｇ，２２０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を０℃に冷却した。２，４−ヘキサジエノール（５．８ｍＬ，５１ｍｍｏｌ）を溶液に徐々に添加し、反応混合物をアルゴン下で一夜撹拌しながら室温にまで昇温させた。反応混合物を真空中で濃縮し、ジクロロメタンに溶解し、水で洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂，１／３）により精製して２．０７ｇ（２５％）の化合物３５を白色固体として得た。¹ H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ1.73(d,J=6.6Hz,6H),4.68(d,J=6.0Hz,4H),5.69-5.84( m,4H),6.05-6.19(m,2H),6.31-6.45(m,2H),7.08(d,J=9.0Hz,4H),7.68(d,J=10.2Hz ,4H). ４，４′−ジ−２,４−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３６）の製造化合物(３５)(２．０ｇ)をＴＨＦ（４５ｍＬ）に溶解し、この溶液に臭化フェニルマグネシウム（ＴＨＦ中の１．０Ｍ溶液；１０．６ｍＬ，１０．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、真空下で蒸発乾固した。残渣をジクロロメタンに溶解し、飽和塩化アンモニウム溶液、次いで水で洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、真空中で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂．１／９）により精製して１．８４ｇ（７７％）の化合物３６を淡黄色固体として得た。¹ H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ1.73(d,J=6.9Hz,6H),4.54(d,J=6.0Hz,4H),5.68-5.80( m,4H),6.02,6.11(m,2H),6.20-6.37(m,2H),6.85(d,J=6.9Hz,4H),7.05(d,J=7.0Hz, 4H),7.14-7.32(m,5H); 元素分析：Ｃ₃₁Ｈ₃₂Ｏ₃（452.5920）計算値：Ｃ，82.27；Ｈ，7.13．実測値：Ｃ .82.30；Ｈ，7.11. ５′−ジ−(２，４−ヘキサジエンオキシ)トリチルチミジンホスホルアミダイトモノマーは、化合物３６から５′−Ｏ−（４，４′−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル）チミジンホスホルアミダイト（３２）の製造につき前記に述べたものと同じ方法で製造できる。実施例９．ジエン置換トリチルアルコールとＮ−エチルマレイミドとのディールス−アルダー閉環付加実施例９（反応経路９）には、ジエン置換トリチルアルコール−４，４′−ジ −３，５−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３０）および４，４′−ジ −２,４−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３６）−と、Ｎ−エチルマレイミドとのディールス−アルダー反応（それぞれ反応１および２）を記載する。表４に、種々の反応条件下でのこれら２反応の反応速度を示す。反応経路９３，５−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３０）のディールス−アルダー反応−反応１化合物３０（５０ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（０．７５ｍＬ）および水（０．７５ｍＬ）に溶解した。Ｎ−エチルマレイミド（Ｎ−Ｅｔマレイミド）（１３８ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。３時間後に、粗製反応混合物の¹ＨＮＭＲ分析は反応が完了したことを示した。反応混合物を濃縮し、予めジクロロメタンで平衡化したシリカゲルプラグに装填した。過剰のＮ−エチルマレイミドをジクロロメタンで洗浄除去し、生成物を１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂で溶離した。溶剤を減圧下で濃縮して、３８ｍｇ（５９％）の化合物３７を得た。¹ H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ0.97(t,J=7.2Hz.6H).2.02-2.19(m,4H),2.20-2.34(m,2 H),2.42-2.53(m,4H),3.13-3.24(m.4H).3.28-3.39(m,4H),4.11(t,J=6.3Hz,4H),5. 70-5.86(m,4H),6.22(s,1H),6.87(d.J=9.0Hz,4H).7.07(d,J=9.0Hz,4H),7.15-7.24 (m,5H). ２，４−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３６）のディールス−アルダー反応−反応２化会物３６（６０ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２．０ｍＬ）に溶解した。Ｎ−エチルマレイミド（１６６ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で撹拌した。２４時間後に、粗製反応混合物の¹ＨＮＭＲ分析は反応が完了したことを示した。反応混合物を濃縮し、予めジクロロメタンで平衡化したシリカゲルプラグに装填した。過剰のＮ−エチルマレイミドをジクロロメタンで洗浄除去し、生成物を１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂ で溶離し、減圧下で濃縮して、５０ｍｇ（５４％）の化合物３８を得た。¹ H NMR(300MHz.DMSO-d,)δ0.95(t.J=7.1Hz.6H).1.32(d,J=7.2Hz.6H),2.48(bs,2H ),2.74(bs.2H).3.05-3.46(m,8H),4.26(t,J=8.4Hz,2H),4.50(t,8.4Hz,2H),5.67-5 .86(m,4H).6.27(s.1H).6.88(d,J=8.7Hz,4H),7.11(d,J=8.7Hz,4H),7.16-7.35(m,5 H); 元素分析：Ｃ₄₃Ｈ₄₆Ｎ₂Ｏ₇・2Ｈ₂Ｏ（738.8762）計算値：Ｃ，69.90；Ｈ，6.82；Ｎ，3.79．実測値：Ｃ，71.16；Ｈ，6.71；Ｎ，3.92. 実施例１０．ティールス−アルダー閉環付加による生成物捕獲を用いた３′− ＰＥＧ結合オリゴヌクレオチドの製造実施例１０（反応経路１０）には、溶液相合成による３′−ＰＥＧ固定オリゴヌクレオチド製造のための各モノマー付加サイクルに従った一般的方法であって、オリゴヌクレオチド生成物の共有捕獲にディールス−アルダー反応を用いる方法を示す。反応経路１０結合反応：ＰＥＧ−ｄＴ−ＯＨ（２０ｋ，２．３６ｇ，０．１１ｍｍｏｌ，装填量：４６μｍｏｌ／ｇ）を、２０ｍＬの乾燥アセトニトリル（ＣＨ₃ＣＮ）に乾燥アルゴン雰囲気下で溶解した。この溶液に５′−Ｏ−(４，４′−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル)チミジン３′−ホスホルアミダイト（３２）（１４０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）、次いでＣＨ₃ＣＮ中のＤＣＩ（０．６５ｍＬ，１．０Ｍ，６．０当量）を添加した。反応物を乾燥アルゴン雰囲気下で２５分間撹拌した後、３５０ｍＬの乾燥Ｅｔ₂Ｏを添加して、２０ｋ−ＰＥＧを含有する物質を沈殿させた。この固体を濾過し、Ｅｔ₂Ｏで洗浄し（１００ｍＬで２回）、真空下で１時間乾燥させて、２．３ｇの白色固体を得た（物質収率９８％）。酸化：結合生成物３９、未反応ホスホルアミダイト３２および未反応ＰＥＧ −ｄＴ−ＯＨを含有するこの白色固体を２０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に再溶解し、ＣＨ₃ ＣＮ中のヨードベンゼンジアセテート（８．５ｍＬ，０．１Ｍ，０．２７ｇ）で酸化する。８分間撹拌した後、反応混合物は未反応ＰＥＧ−ｄＴ−ＯＨ、酸化されたアミダイトモノマー４０および酸化されたオリゴマー４１を含有する。次いで反応混合物を３５０ｍＬの乾燥Ｅｔ₂Ｏで処理して２０ｋ−ＰＥＧを含有する物質を沈殿させ、この固体を濾過し、１００ｍＬのＥｔ₂Ｏで２回洗浄する。真空下で１時間乾燥させた後、未反応ＰＥＧ−ｄＴ−ＯＨおよびオリゴマー４１を含有する白色固体を分離する。ディールス−アルダー閉環付加：この固体を２０ｍＬの５０％Ｈ₂Ｏ／ＣＨ₃ ＣＮに再溶解し、予め５ｍＬの５０％Ｈ₂Ｏ／ＣＨ₃ＣＮで湿潤させたマレイミド官能化ポリスチレン１．２ｇ（マレイミド０．４ｍｍｏｌ／樹脂ｇの装填を基準として１０当量）に装填する。反応物をアルゴン雰囲気下で４５℃に１時間加温する。上澄み液の逆相ＨＰＬＣ分析は、５′保護オリゴマー４１が完全に消費されたことを示す。次いでマレイミド誘導体化ポリスチレン４２を濾過し、１０ｍＬの５０％Ｈ₂Ｏ／ＣＨ₃ＣＮで洗浄して、３．５ｇの３′−ＰＥＧ−５′−ＤＨＤＴディールス−アルダー結合オリゴマー（４２）を固体樹脂として得る。脱トリチル化／オリゴヌクレオチド離脱：３．５ｇのディールス−アルダー結合樹脂４２（装填：７５μｍｏｌ／ｇ）を２０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に懸濁させる。この懸濁液に、ＣＨ₂Ｃｌ₂中のＤＣＡおよびトリヘキシルシラン（６．４ｍＬ，８０当量）の混合物を添加する。９分後にポリスチレン−マレイミド樹脂（４４）を濾過により分離する。次いでＰＥＧ−ヌクレオシド（４３）をＥｔ₂Ｏ（５００ｍＬ）で２回沈殿させ、洗浄し、濾過し、真空乾燥する。得られたＰＥＧ− ヌクレオシドの５′位を脱保護すると、シーケンスの次の結合反応に使用できる状態になる。実施例１１．ディールス−アルダー生成物捕獲による非−ＰＥＧ誘導体化オリゴヌクレオチドの製造反応経路１２は、ジエンとして５′−Ｏ−（４，４′−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル）ヌクレオシド（５′−Ｏ−ＤＨＤＴ−ヌクレオシド）、ジエノフィルとしてマレイミド置換固体支持体を用いるディールス−アルダー生成物捕獲による非−ＰＥＧ誘導体化オリゴヌクレオチドの製造につき、一般的反応経路を示す。すなわちディールス−アルダー捕獲ＰＡＳＳサイクルを以下の様式で行う：３′ブロッキングしたオリゴマーを常法により５′−Ｏ−（４，４′− ヘキサジエンオキシトリチル）ヌクレオシド３′−ホスホルアミダイトと結合させる。３′ブロッキング基は脂質もしくは多糖類、またはより伝統的な溶液相ブロッキング基、たとえばアセチル、ピラニル、もしくはシリル基、たとえばｔ− ブチルジフェニルシリルエーテルである。反応経路１２DHDT：4,4′-ジ-3,5-ヘキサジエンオキシトリチル樹脂：マレイミド誘導体化固体支持体(CPG、シリカ、セルロース、HLPなど） X：任意の適切に保護された2′-置換基 Y：ホスフェート保護基 B：好適に保護、修飾または誘導体化された核酸塩基 R：オリゴヌクレオチドまたは3′-ブロッキング基結合／酸化／捕獲シーケンスＣＨ₃ＣＮ中で、長さｎの適切な３′−ブロッキンクしたオリゴヌクレオチド（５０）を、ＣＨ₃ＣＮ中の１．０ＭＤＣＩ溶液で処理することにより２．０当量のアミダイトモノマー５１と結合させる。結合反応に要するのは２５分未満であり、ＴＬＣにより監視する。結合反応終了後、溶液をそのままＣＨ₃ＣＮ中０．１Ｍ溶液としてのヨードベンゼンジアセテート８．０当量で処理する。この酸化シーケンスは８分以内に終了し、粗製反応生成物をそのままジエノフィル保有支持体に付与する。マレイミドジエノフィルを保有するポリスチレンが好ましい固体支持体である。ディールス−アルダー閉環付加反応は、１：１ＣＨ₃ＣＮ：Ｈ₂Ｏ溶剤を用いると促進される。この時点で固体支持体に共有結合しているオリゴヌクレオチド５２は、未反応の出発オリゴヌクレオチド５０（欠陥配列）および試薬から、樹脂ビーズの簡単な濾過および洗浄によって容易に分離される。同様に５′−ＤＨＤＴ基をもつアミダイトモノマー５１も、樹脂に結合している（５３）。脱トリチル化／離脱シーケンス共有結合オリゴヌクレオチド（５２）および未反応モノマーホスフェート（５３）を保有する、洗浄および乾燥した樹脂を３％ＤＣＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液で洗浄し、酸によるオリゴヌクレオチド鎖分解を防ぐために中和用緩衝液中へ溶離する。離脱したオリゴマー（５４）およびモノマーホスフェート（５５）を水抽出により互いに分離する。有機相中の生成物オリゴヌクレオチドを乾燥させ、アセトニトリル中へ限外濾過して溶剤交換する。実施例１２．ディールス−アルダー閉環付加による生成物捕獲を利用した二量体の製造反応経路１５５′−ＤＨＤＴＯ−Ｔ−[３′，３′]−Ｔ−ＯＳｉＰＤＢＴ−５′（５６）の製造５′−ＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ−３′−ＯＨ（１２）（０.２１ｇ，０.４３ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのアセトニトリルに溶解した。この溶液に５′−ＤＨＤＴＯ−ｄＴホスホルアミダイト(３２)（０.５ｇ，０.５２ｍｍｏｌ）、次いでアセトニトリル中１．０ＭのＤＣＩを３．０ｍＬ（３．０ｍｍｏｌ）添加した。この溶液をアルゴン下で２０分間撹拌し、ここでピリジン／水中０．２ＭのＩ₂溶液１１ｍＬを添加した。酸化反応を５分間進行させ、ＤＥＡＥセファデックス（登録商標）で濾過して(４回)、黄色を大部分除いた。黄色固体５６(０.２３ｇ)が単離された。生成物捕獲：ポリスチレン支持マレイミド（ＰＳ−Ｍ）の量を以下のように変化させてディールス−アルダー捕獲反応を行った：１０当量、５当量、２．５当量、１当量。すべての反応につき後続操作は以下のとおりであった。[３′,３ ′]−ｄＴ−ｄＴ−ＯＴＤＨＤ二量体（１１μｍｏｌ）（５６）を４００μＬのアセトニトリルに溶解した。この溶液を３／１ＣＨ₃ＣＮ／水１．０ｍＬ中のＰＳ −Ｍ懸濁液に添加し、次いで６５℃に加温した。反応経過を、ＴＬＣ（２／１ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によりＲ_f＝０．１５の反応体の消失によって、またＨＰＬＣ分析（Ｃ１８，４．６×１００ｍｍ，緩衝液Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム，ｐＨ７．５，緩衝液Ｂ：アセトニトリル，２．５分かけて０〜８０％Ｂ）。未反応５′−ＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ−３′−ＯＨモノマー(１２)(１．７１分)に対する二量体（２．６５分）の初期比率と比較することにより、反応率％を判定した（図７参照）。興味深いことに２．５当量、１．０当量および対照（ＰＳ−Ｍなし）について描いた線がすべて４時間後に反応（二量体の消失）が起きたことを示す点が注目される。この反応はディールス−アルダー捕獲ではなく、加水分解と考えられるものによる二量体分解である。ＨＰＬＣトレースに１．４７分および２．３０分に新たな物質が見られる。この物質は５′−ＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ−３′−ホスフェート（１．４７分）および５′−ＤＨＤＴＯ −ｄＴ−３′−ホスフェートであろう。５′−ＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ−３′−ＯＨは加水分解反応の過程でも生成すると考えられる。したがって加水分解が明らかである場合は内標準が適切でないので、これらのトレースからディールス−アルダー捕獲の相対比率を直接に求めることはできない。これらのトレース中で明らかな５′−ＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ−３′−ホスフェートの量に調整することにより、加水分解に対して補正できる。このプロセスは５．０当量および１０．０当量の場合には重要でない。離脱／脱トリチル化：１１μｍｏｌの［３′，３′］二量体５７で誘導体化したＰＳ−Ｍ２８６ｍｇを０．２５ｍＬのジクロロメタンに懸濁した。この溶液に２．６ｍＬの３％ＤＣＡを添加した。ＰＳ−Ｍは直ちに明るいオレンジ色に変化した。この懸濁液を５分間撹拌した後、濾過によりジクロロメタン溶液をＰＳ−Ｍから分離した。得られた溶液を直ちに、ジクロロメタンによりダウエックス（Dowex）−Ｃ１^-イオン交換樹脂のパッドで濾過した。次いで濾液を濃縮して、１２ｍｇの白色ガラス質固体（若干の残留溶剤および脂肪族不純物を含有する）を得た。¹ＨＮＭＲおよび¹Ｐ−ＮＭＲは目的生成物である化合物５８と一致する。実施例１３．ディールス−アルダー閉環付加によるフラグメント固定を利用した２ブロックからのオリゴヌクレオチド製造ＰＡＳＳオリゴヌクレオチド合成経路によればオリゴヌクレオチドブロックを容易にかつ効率的に製造することができ、これらを反応経路１６に示すように改変ＰＡＳＳサイクルで互いに結合させることができる。要約すると、前記に概説したＰＡＳＳモノマー付加サイクルで製造したオリゴヌクレオチドブロック５９をマレイミド樹脂と反応させて、樹脂固定オリゴヌクレオチドブロック６１を得る。このブロックから、リンカーＬを三塩化チタンで還元開裂させることにより３′末端ＰＥＧを除去して、遊離３′末端をもつ樹脂結合フラグメント６３を得る。６３をＮ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチル−クロロホスフィンでホスフィチル化すると、３′末端ホスホルアミダイト６４が得られる。次いで、オリゴヌクレオチドブロック６０からマレイミド樹脂捕獲および後続の脱トリチル化後に得たオリゴヌクレオチドブロック６２に、化合物６４を結合させる。この結合反応後にホスファイトトリエステル結合を酸化して対応するホスフェートトリエステルとなし、続いて生成物オリゴヌクレオチドをジクロロ酢酸により樹脂から離脱させて、オリゴヌクレオチドフラグメント６０を得る。反応経路１６実施例１４．ディールス−アルダー生成物捕獲を利用したオリゴヌクレオチド製造のためのＰＡＳＳの自動化結合試薬を反応器２１２に添加し、実施例１０の記載に従って反応を行う。結合反応終了後、容器２１４に収容したジエンまたはジエノフィルで修飾された樹脂またはメンブラン（以下、支持体と呼ぶ）に反応混合物を循環させて、オリゴヌクレオチドを共有捕獲させる。捕獲工程に要する時間は、溶液からの結合生成物の消失をＨＰＬＣまたはインラインＵＶアッセイ（図示されていない）により監視することによって制御できる。次いで支持体をすすいで、ジエンまたはジエノフィルを含まない欠陥配列すべてを溶離する。酸化はオリゴヌクレオチドを支持体に結合させた後、またはジエノフィル支持体に結合させる前の溶液中で行うことができる。酸化溶液は脱トリチル化の前に樹脂から十分に除去しなければならない。この除去はインライン導電率監視（図示されていない）により制御するのが簡便である。次いで支持体をＤＣＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂ですすいで、成長中のオリゴマーおよび捕獲した過剰のモノマーを樹脂から分離し、これにより溶液中の化合物種はＤＣＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂混合物中の５′脱保護オリゴヌクレオチドおよびモノマーのみとなる。次いでこの混合物をメンブラン分離器（２１８）と接触させて、溶剤をアセトニトリルに交換し、さらにＤＣＡおよび過剰のモノマーを分離する。あるいはモノマーを沈殿または抽出により分離してもよい。溶液中に残存する唯一の化合物種は、アセトニトリル中の高分子結合オリゴマーである。この時点でこの溶液は次の結合反応に使用できる状態となる。このようにジエノフィル支持体を用いてｎ−１種すべてを分離すると、キャッピング工程を採用せずに、溶液を酸化および／またはジエノフィル支持体への循環に使用できる状態となる。ジエノフィル支持体はジエノフィル部分と樹脂またはメンブランとの間に開裂可能なリンカー、たとえばアミド結合を含んでもよい。この開裂可能なリンカーにより、ジエノフィル支持体の再生が容易になる。このようなリンカーは当業者に周知である。メンブランの評価：ポリプロピレン限外濾過膜への暴露後のＰＥＧ化デオキシチミジンの回収：アセトニトリル溶剤系４６μｍｏｌｄＴ／ｇのＰＥＧ−デオキシチミジン（ＰＥＧ−ｄＴ）１．４９ｇをアセトニトリル２５ｍＬに溶解することにより、２０ｋＰＥＧ−ｄＴの２．７４ｍＭ溶液を調製した。次いでこの溶液のアリコート（２ｍＬ）を、ポリプロピレン限外濾過膜（３Ｍ、登録商標）の有効面５．７３ｃｍ²の領域に、５０ｍＬファルコン（Falcon、登録商標）試験管中で０．２５、１および４時間暴露した。出発溶液をファルコン試験管および膜からアセトニトリル２５ｍＬで２回の洗浄によりすすぎ出した。洗液を分光測光法で２６０ｎｍにおける吸収によりＰＥＧ−ｄＴにつきアッセイし、出発ＰＥＧ−ｄＴの吸収と対比評価した。膜を含まないファルコン試験管を出発溶液２ｍＬに４時間暴露し、２６０ｎｍにおいてＰＥＧ−ｄＴにつきアッセイすることにより、試験管およびガラス製品への損失を測定するための対照試験を行った。結果を表６に示す。ポリプロピレン限外濾過膜への暴露後のＰＥＧ化デオキシチミジンの回収：塩化メチレン溶剤系４６μｍｏｌｄＴ／ｇのＰＥＧ−デオキシチミジン（ＰＥＧ−ｄＴ）１．４８ｇを塩化メチレン２５ｍＬに溶解することにより、２０ｋＰＥＧ−ｄＴの２．７２ｍＭ溶液を調製した。次いでこの溶液のアリコート（２ｍＬ）を、ポリプロピレン限外濾過膜（３Ｍ、登録商標）の有効面５.７３ｃｍ² の領域に、５０ｍＬファルコン（登録商標）試験管中で０．２５、１および４時間暴露した。出発溶液をファルコン試験管および膜から塩化メチレン２５ｍＬで２回の洗浄によりすすぎ出した。洗液を分光測光法で２６０ｎｍにおける吸収によりＰＥＧ−ｄＴにつきアッセイし、出発ＰＥＧ−ｄＴの吸収と対比評価した。膜を含まないファルコン試験管を出発溶液２ｍＬに４時間暴露し、２６０ｎｍにおいてＰＥＧ−ｄＴにつきアッセイすることにより、試験管およびガラス製品への損失を測定するための対照試験を行った。結果を表７に示す。再生セルロース限外濾過膜への暴露後のＰＥＧ化デオキシチミジンの回収：アセトニトリル溶剤系４６μｍｏｌｄＴ／ｇのＰＥＧ−デオキシチミジン（ＰＥＧ−ｄＴ）１．５５ｇをアセトニトリル２５ｍＬに溶解することにより、２０ｋＰＥＧ−ｄＴの２．８５ｍＭ溶液を調製した。次いでこの溶液のアリコート（２ｍＬ）を、ポリプロピレン限外濾過膜（ミリポア（millipore^a）、登録商標、１０ＫＰＬＧＣ）の有効面５．７３ｃｍ²の領域に、５０ｍＬファルコン（登録商標）試験管中で０．２５、１、４および２４時間暴露した。出発溶液をファルコン試験管および膜からアセトニトリル２５ｍＬでの洗浄によりすすぎ出した。膜を２５ｍＬのアセトニトリルに６日間浸漬し、次いでさらに２５ｍＬのアセトニトリルで洗浄した。洗液を分光測光法で２６０ｎｍにおける吸収によりＰＥＧ−ｄＴにつきアッセイし、出発ＰＥＧ−ｄＴの吸収と対比評価した。膜を含まないファルコン試験管を出発溶液２ｍＬに４時間暴露し、２６０ｎｍにおいてＰＥＧ−ｄＴにつきアッセイすることにより、試験管およびガラス製品への損失を測定するための対照試験を行った。結果を表８に示す。アセトニトリル／エーテル類中でのＰＥＧ化デオキシチミジンの遠心分離：ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびＮ−ブチルエーテルの比較４６ｍｏｌ／ｇのＰＥＧ−デオキシチミジン（ＰＥＧ−ｄＴ）０．４８５５ｇをアセトニトリル１０ｍＬに溶解することにより、２０ｋＰＥＧ−ｄＴの２．３４ｍＭ溶液を調製した。０．５、０．２５および０．１２５ｍＬアリコートを、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルまたはＮ−ブチルエーテル１ｍＬの添加により沈殿させた。沈殿を約４，４００×ｇで２分間、遠心分離した。上澄み液のＰＥＧ−ｄＴ含量を分光測光法により測定し、出発ＰＥＧ−ｄＴと対比評価した。１．５ｍＬの出発溶液を遠心分離し、前記方法でアッセイすることにより、操作に対する損失を示す対照試験を行った。結果を図９に示す。流束およびＦＴＩＲ評価による適合性フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜およびポリプロピレン膜を以下の溶剤系に浸漬することにより評価した：アセトニトリル、塩化メチレン、アセトニトリル中の結合／キャッピング／酸化（ｃ／ｃ／ｏ）溶液、および塩化メチレン中の３％ＤＣＡ混合物。直径３．８１ｃｍ（ 11/2″）の膜片をこれらの溶液に沈め、２４時間浸漬し、最初の溶液の流束評価のために膜ホルダーに挿入し、次いでさらにアセトニトリル流束評価のためにアセトニトリルですすいだ。したがって膜試料からは、溶液浸漬後に膜に保持されている可能性のある過剰の試薬はすすぎ出されている。各種溶剤に暴露した後のアセトニトリル流束を表９に挙げる。これから分かるように、ＰＶＤＦ膜とポリプロピレン膜の間にはごくわずかな流束（ｍＬ／分／ｃｍ²）の変化しかない。保持試験で、再生セルロース膜はＦＴＩＲで測定して若干のＰＥＧを保持していると判定された。シリコーン膜、セラミック膜、ポリオレフィン膜およびＨＤＰＥ膜は調査中である。実施例１５．マレイミド−トリチルモノマーの合成反応経路１７４，４′−ジ−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシプロポキシ）−ベンゾフェノン（６６）の製造４，４′−ジヒドロキシベンゾフェノン（２８）（１０ｇ，４６．７ｍｍｏｌ）をミツノブ（Mitsunobu）条件下に、乾燥テトラヒドロフラン中０℃で、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−３−プロパノール（４０ｇ粗製，約１５０.０ｍｍｏｌ）、ＤＥＡＤ（２２．１ｍＬ，１４０.０ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（３６．７ｇ，１４０．０ｍｍｏｌ）と反応させた。反応物をアルゴン下で室温にまで昇温させた。２４時間後に反応物を濃縮し、塩類をヘキサン／エーテルで沈殿させ、濾過した。残りの物質をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサンから８５％ヘキサン／酢酸エチルまでの濃度勾配）により精製して、１４ｇの目的生成物、化合物６６を収率５４％で得た。¹ H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.92(d.4H).7.68(d,4H),4.13(t,4H),3.76(t,4H),1.96-1 .88(m,4H),0.85(s,18H).0.02(s.12H). ４，４′−ジ−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシプロポキシ）−トリフェニルメタノール（６７）の製造保護されたベンゾフェノン６６（５．７ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）を４０ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解し、臭化フェニルマグネシウム（２０．５ｍＬ，２０．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物をアルゴン下に室温で２時間撹拌し、濃縮し、ジクロロメタンと飽和塩化アンモニウムの間で分配し、水で洗浄した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濃縮すると、６．５ｇの黄色ガム、化合物６７が定量的収率で得られ、これをそのまま次の工程に用いた。¹ H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.27-7.17,7.05,6.82(m.13H).6.23(s.1H).3.99(t.4H).3 .73(t.4H),1.91-1.83(m,4H),0.84(s,18H),0.02(s,12H). ４，４′−ジ−(３−ヒドロキンプロポキシ)−トリフェニルメタノール（６８）の製造トリチル化合物６７（６．３７ｇ，１０ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル中のフッ化水素酸トリエチルアミン（３．６４ｇ，３０ｍｍｏｌ）で室温において１６時間処理することにより脱保護した。反応物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカ：１：１ヘキサン：酢酸エチルから酢酸エチル：５％メタノールまでの濃度勾配；すべて１％トリエチルアミシを含有）により精製して、２．８ｇの目的生成物６８を黄色ガムとして収率６９％で得た。¹ H NMR(300MHz,CDCl₃).δ7.30-7.18,7.06,6.83(m,13H),6.22(s,1H),4.55(t,2H), 4.07-3.98(m,4H),3.57-3.52(m,4H),1.88-1.80(m,4H). ４．４′−ジ−（３−ｐ−トルエンスルホンオキシプロポキシ）−トリフェニルメタノール（６９）の製造塩化トシル（１．４３ｇ，７．４９ｍｍｏｌ）および２．４，６−コリジン（１ｍＬ，７．４９ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル１５ｍＬ中の化合物６８（１．３９ｇ，３．４ｍｍｏｌ）に添加した。反応物を室温でアルゴン下に２．５日間撹拌し、次いで濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ；ヘキサン中６０％酢酸エチル，１％トリエチルアミンを含有）により精製して、０．６ｇのトシル化化合物６９を収率２５％で得た。¹ H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.76(d,4H),7.38(d,4H),7.32-7.06,7.01,6.73(m,13H),6 .26(s,1H),4.17(t.4H).3.88(t.4H),2.33(s.6H),2.04-1.96(m,4H). ４，４′−ジ−（３−アジドプロポキシ）−トリフェニルメタノール（７０）の製造乾燥ＤＭＦ１５ｍＬ中における６９（０．６ｇ，０．８４ｍｍｏｌ）の溶液に、リチウムアジド（０.１２ｇ，２.５１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物をアルゴン下に室温で一夜撹拌し、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカ；ヘキサン中６０％酢酸エチル，１％トリエチルアミンを含有）により精製して、０．３８ｇ（１００％）の化合物７０を黄色ガムとして得た。¹ H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.34-7.17.7.07.6.85(m.13H).6.25(s.1H).3.99(t,4H),3 .50(t,4H),2.00-1.77(m.4H). ４，４′−ジ−（３−アミノプロポキシ）−トリフェニルメタノール（７１）の製造アジド７０（０．２５ｇ，０．５５ｍｍｏｌ）を活性炭と共にメタノール中で加温し、濾過し、濃縮した。残渣を５０ｍＬのメタノールに再溶解し、カーボン上５％パラジウム５５ｍｇを添加した。フラスコを排気し、水素を満たしたバルーンを挿入した。室温で１時間後に触媒を濾過した。反応物を濃縮し、そのまま次の工程に用いた。４，４′−ジ−（３−マレイミドプロポキシ）−トリフェニルメタノール（７３）の製造粗製残渣７１を１：１アセトニトリル：水５０ｍＬに溶解し、水浴中で撹拌した。メトキシカルボニルマレイミド試薬（７２）(０．１６ｇ，０.９８ｍｍｏｌ)を添加した。２時間にわたってｐＨが１０．１から５に低下するのがみられた。次いで１Ｍ硫酸でｐＨを２に調整し、反応物を濃縮した。残渣を酢酸エチルとブラインの間で分配した。有機層を濃縮し、１：１アセトニトリル：水に再溶解し、５％炭酸水素ナトリウム１０ｍＬと共に撹拌した。１７分後に１Ｍ硫酸で反応物をｐＨを３に酸性化した。酢酸エチル（２０ｍＬ）を添加し、この溶液を分配し、水層を酢酸エチルで逆抽出した。有機層を合わせて濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカ；酢酸エチルとヘキサンの混合物）により精製して、０．１０４ｇの生成物７３を３６％の収率で得た。¹ H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.30-7.18,7.04,7.68(m,13H),7.02(s,4H),6.24(s,1H),3 .92(t,4H),3.57(t,4H),1.99-1.89(m,4H).MS(MS+566).元素分析:計算値C₃₃H₃₀N₂O₇ : C,69.95;H,5.34;N,4.94.実測値 C,69.74;H,5.67;N,4.78. 実施例１６．非ＰＡＳＳオリゴヌクレオチド合成における欠陥配列の選択的分離；ジエン修飾キャッピング試薬によるキャッピング、次いでジエノフィル樹脂またはメンブランへのそれらの化合物種の捕獲無水３，５−ヘキサジエン酸（７４）、無水３，５−ヘキサジエンオキシ酢酸（７５）および塩化トリヘキサジエンオキシシリル（７６）の製造化合物７４、７５および７６を当技術分野で既知の標準法により製造する。化合物７４は、３，５−ヘキサジエノールから酸化して対応するヘキサジエン酸となし、次いで脱水することにより製造できる。化合物７５は無水ヨード酢酸と３，５−ヘキサジエノールの反応により得られ、化合物７６は四塩化ケイ素と３，５−ヘキサジエノールの反応生成物である。これらの合成法のほか、化合物７４、７５および７６は他の多様な方法で製造できる。３′−ＰＥＧ固定溶液相合成におけるキャッピング試薬としての化合物７５の使用および後続の欠陥配列分離実施例７に従い、ただしキャッピング試薬を変更し、かつ欠陥配列分離工程を追加して、溶液相合成を行う。キャッピング工程では、等量の無水３，５−ヘキサジエンオキシ酢酸（７５）、２，６−ルチジンおよびＮ−メチルイミダゾールを溶液に注入し、撹拌する。マレイミド誘導体化ポリスチレン樹脂を反応混合物に添加し、撹拌を続ける。樹脂を濾別し、実施例７の脱トリチル化操作の記載に従ってポリマーをエーテルから沈殿させる。従来の固相合成におけるキャッピング試薬としての化合物７６の使用および欠陥配列分離ＤＮＡ、ＲＮＡおよび修飾オリゴヌクレオチドの従来の固相合成を、固相合成装置製造業者の指示に従って実施する。たたしキャッピング試薬中の無水酢酸の代わりに塩化トリ（３，５−ヘキサジエンオキシ）シリル７６を用いる。オリゴヌクレオチドを支持体から開裂させ、脱保護した後、粗製オリゴヌクレオチドを水／アセトニトリルに装入し、この溶液にマレイミド誘導体化ポリスチレンを添加する。反応終了時に、樹脂結合した欠陥配列を濾別し、生成物オリゴヌクレオチドを所望によりさらに精製する。 1.量はPEG-ヌクレオシド5.0gに対するもの(装填量,45μmol/g) 2.キャッピング溶液:無水酢酸、2,6−ルチジン、N-メチルイミダゾール反応は室温でジュウテリウム置換溶剤中において実施。完結率％は、粗製反応混合物から直接採取したアリコートの¹H NMR分析により測定。別途明記しない限り、反応はすべて0.07Mの濃度で実施。

【手続補正書】【提出日】１９９９年３月１６日（１９９９．３．１６）【補正内容】 (１)請求の範囲を以下の通り補正する。『１．オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法であって、ａ）５′保護モノマー単位を出発物質と反応させて、生成物を含有する反応混合物を調製し；そしてｂ）生成物を５′保護基の存在に基づいて未反応出発物質、未反応５′保護モノマー単位、副生物および試薬から分配することを含む方法。２．５′−保護モノマー単位が次式：（式中、Ｂは核酸塩基であり；Ａは２′−糖置換基であり；Ａ′は２′−糖置換基であり；Ｗは独立してホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよび保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択され、ここで保護オリゴヌクレオチドはホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートよりなる群から選択される３′末端基を有し；Ｄ−Ｅは、アルコール保護基（１または２以上）である）を有する、請求項１記載の方法。３．さらにｃ）工程ａ）およびｂ）を連続サイクルで特定の回数繰り返して、目的生成物を得ることを含む、、請求項１記載の方法。４．工程ａ）とｂ）の間にさらに、ａ１）工程ａ）で得た反応混合物を酸化して、酸化された５′保護モノマー単位、酸化された生成物および出発物質を含有する第２反応混合物を得て；ａ２）酸化された５′保護モノマー単位を反応混合物の他のものから分配し; そしてａ３）酸化された５′保護モノマー単位を所望により単離することを含む、請求項１記載の方法。５．Ｗがホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネートおよび保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択され、ここで保護オリゴヌクレオチドはホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネートよりなる群から選択される３′末端基を有する、請求項２記載の方法。６．ＡおよびＡ′が独立して、Ｈ、²Ｈ、³Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨＯＲ¹、ＮＨＯＲ³、ＮＨＮＨＲ³、ＮＨＲ³、＝ＮＨ、ＣＨＣＮ、ＣＨＣｌ₂、ＳＨ、ＳＲ³ 、ＣＦＨ₂、ＣＦ₂Ｈ、ＣＲ² ₂Ｂｒ、−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃、ＯＲ⁴およびイミダゾールよりなる群から選択され；これらにおいてＲ¹は、Ｈおよびアルコール保護基よりなる群から選択され；Ｒ²は、＝Ｏ、＝Ｓ、Ｈ、ＯＨ、ＣＣｌ₃、ＣＦ₃、ハライド、所望により置換されたＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル（環式、直鎖および分枝鎖を含む）、アルケニル、アリール、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アシル、ベンゾイル、ＯＲ⁴およびエステルよりなる群から選択され；Ｒ³は、Ｒ²、Ｒ⁴、ＣＮ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｓ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｏ)ＣＦ₃、ＳＯ₂Ｒ⁴ 、アミノ酸、ペプチドおよびそれらの混合物よりなる群から選択され；Ｒ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される、請求項２記載の方法。７．ＡがＨ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃｌ、Ｆ、ＮＨＯＲ、−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃ 、ＯＲ⁴、ＯＳｉＲ⁴ ₃よりなる群から選択され、これらにおいてＲ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択され；かつＡ′がＨである、請求項２記載の方法。８．Ｄは固体支持体に対し強い親和性をするか、または誘導体化した固体支持体と共有結合反応するように選択された化合物であり、Ｅは酸素−Ｅ結合が容易に開裂するように選択された化合物である、請求項２記載の方法。９．Ｅがトリチル基、レブリン酸基またはシリルエーテル基よりなる群から選択される、請求項８記載の方法。１０．トリチル基が次式の構造：（式中、Ｄは独立してＨ、ＯＲ⁴、ジエン単位を有するアルキルまたは置換アルキル基、ジエノフィル単位を有するアルキルまたは置換アルキル基、ジエン単位を有するアルコキシまたは置換アルコキシ基、ジエノフィル単位を有するアルコキシまたは置換アルコキシ基、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、マレイミド置換アルコキシ基、アルコキシ基、ジエン単位を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、マレイミド置換されたアルキルアミノまたは置換アルキルアミノ基、ジエノフィル部分を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、ジスルフィド、アルデヒド類、および金属キレート化剤、ジエノフィルまたはジエン単位を有するシリルエーテルよりなる群から選択され、ここでＲ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される）を有する、請求項９記載の方法。１１．Ｄが１〜５０個の炭素原子を有する、請求項１０記載の方法。１２．Ｄが１〜３０個の炭素原子を有する、請求項１０記載の方法。１３．Ｄが独立して以下の化合物よりなる群から選択される、請求項１０記載の方法：Ｌ＝連結基Ｘ＝電子吸引基もしくは電子供与基またはＨ１４．レブリン酸基が次式の構造：（式中、Ｄは独立してＨ、ＯＲ⁴、ジエン単位を有するアルキルまたは置換アルキル基、ジエノフィル単位を有するアルキルまたは置換アルキル基、ジエン単位を有するアルコキシまたは置換アルコキシ基、ジエノフィル単位を有するアルコキシまたは置換アルコキシ基、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、マレイミド置換アルコキシ基、アルコキシ基、ジエン単位を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、マレイミド置換されたアルキルアミノまたは置換アルキルアミノ基、ジエノフィル部分を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、ジスルフィド、アルデヒド類、および金属キレート化剤、ジエノフィルまたはジエン単位を有するシリルエーテルよりなる群から選択され、ここでＲ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される）を有する、請求項９記載の方法。１５．Ｄが１〜５０個の炭素原子を有する、請求項１４記載の方法。１６．Ｄが１〜３０個の炭素原子を有する、請求項１４記載の方法。１７．Ｄが独立して以下の化合物よりなる群から選択される、請求項１４記載の方法：Ｌ＝連結基Ｘ＝電子吸引基もしくは電子供与基またはＨ１８．シリル基が次式の構造：（式中、Ｄは独立してＨ、ＯＲ⁴、ジエン単位を有するアルキルまたは置換アルキル基、ジエノフィル単位を有するアルキルまたは置換アルキル基、ジエン単位を有するアルコキシまたは置換アルコキシ基、ジエノフィル単位を有するアルコキシまたは置換アルコキシ基、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、マレイミド置換アルコキシ基、アルコキシ基、ジエン単位を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、マレイミド置換されたアルキルアミノまたは置換アルキルアミノ基、ジエノフィル部分を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、ジスルフィド、アルデヒド類、および金属キレート化剤、ジエノフィルまたはジエン単位を有するシリルエーテルよりなる群から選択され、ここでＲ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される）のいずれかを有する化合物から選択される、請求項９記載の方法。１９．Ｄが１〜５０個の炭素原子を有する、請求項１８記載の方法。２０．Ｄが１〜３０個の炭素原子を有する、請求項１８記載の方法。２１．Ｄが独立して以下の化合物よりなる群から選択される、請求項１８記載の方法：Ｌ＝連結基Ｘ＝電子吸引基もしくは電子供与基またはＨ２２．固体支持体を通して反応混合物を溶離することにより分配を行う、請求項１記載の方法。２３．固体支持体がＤに対する親和性を有する、請求項２２記載の方法。２４．固体支持体がＤと共有結合反応する、請求項２２記載の方法。２５．共有結合反応がディールス−アルダー反応である、請求項２４記載の方法。２６．固体支持体が樹旨、メンブランおよびポリマーよりなる群から選択される、請求項２２記載の方法。２７．固体支持体が、疎水性逆相樹脂、チオプロピル−セファロース樹脂、水銀処理樹脂、アガロースアジピン酸ヒドラジド樹脂、アビジン樹脂、限外濾過膜、テンタゲル（商標）、ポリエチレングリコール、ならびにシリカゲル、アルミナ、制御多孔ガラスおよびゼオライトよりなる群から選択される無機酸化物よりなる群から選択される、請求項２２記載の方法。２８．疎水性逆相樹脂が、Ｃ２〜Ｃ１８ポリスチレン樹脂よりなる群から選択される、請求項２７記載の方法。２９．出発物質が３′−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体化オリゴヌクレオチドであり、５′保護モノマー単位が限外濾過膜により反応混合物の他のものから分配される、請求項２２記載の方法。３０．固体支持体がジエンまたはジエノフィルから選択される基で誘導体化された、請求項２２記載の方法。３１．ジエンが３，５−ヘキサジエンよりなる群から選択される、請求項３０記載の方法。３２．ジエノフィルがマレイミドである、請求項３０記載の方法。３３．酸化をその場で行う、請求項４記載の方法。３４．酸化をＩ₂、ピリジンおよびＨ₂Ｏにより行う、請求項３３記載の方法。３５．酸化をヨードベンゼンジアセテートにより行う、請求項３３記載の方法。３６．酸化を過ヨウ素酸ナトリウムまたは過ヨウ素酸テトラアルキルアンモニウムにより行う、請求項３３記載の方法。３７．請求項１記載の方法により得られる生成物。３８．オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法であって、ａ）５′保護モノマー単位を出発物質と反応させて、生成物、５′保護モノマー単位および出発物質を含有する反応混合物を調製し；ｂ）工程ａ）で得た反応混合物を酸化し；ｃ）工程ｂ）の酸化された反応混合物を抽出器に添加し；ｄ）反応混合物を有機溶剤で抽出し；ｅ）工程ｄ）からの抽出物を含有する有機溶剤を、固体支持体を収容したクロマトグラフィー樹脂チャンバーにより溶離し、その際、酸化された５′保護モノマー単位は固体支持体に保持され、酸化された生成物および出発物質は溶出した溶剤中に残存し；ｆ）工程ｅ）で得た有機排出液を第２の固体支持体を通して溶離することにより酸化生成物を出発物質から分離し、その際、酸化された生成物は固体支持体に保持され、出発物質は溶剤と共に溶出し；そしてｇ）第２の固体支持体を希酸で洗浄することにより第２の固体支持体から酸化生成物を溶離することを含む方法。３９．工程ｇ）の後にさらに、ｇ１）工程ｇ）で得た排出液を有機塩基で中和し；そしてｇ２）中和した排出液を濃縮し、酸化された生成物を限外濾過によりアセトニトリル中へ交換することを含む、請求項３８記載の方法。４０．工程ｇ）の後にさらに、ｇ１）工程ｇ）で得た排出液を第３の固体支持体を通して溶離し、排出液を中和することを含む、請求項３８記載の方法。４１．第３の固体支持体がダウエックスである、請求項４０記載の方法。４２．工程ｅ）とｆ）の間にさらに、ｅ１）固体支持体を洗浄して、酸化された５′保護モノマー単位を離脱させ、単離することを含む、請求項３８記載の方法。４３．次式の化合物：（式中、Ｒ′はジエンまたはジエノフィルから選択され；Ｘはハロゲン、ヒドロキシル、ＯＲ″およびＯＡｒよりなる群から選択され、ここてＲ″はアルキルまたは置換アルキル基であり、Ａｒは芳香族またはヘテロ芳香族基である）。４４．Ｒ′が３，５−ヘキサジエンである、請求項４３記載の化合物。４５．Ｒ′が２，４−ヘキサジエンである、請求項４３記載の化合物。４６．請求項４３記載の化合物と、固体支持体に結合したジエノフィル、固体支持体に結合したジエン、ジエンおよびジエノフィルよりなる群から選択される化合物とのディールス−アルダー反応により形成される化合物。４７．Ｒ′が３，５−ヘキサジエンまたは２，４−ヘキサジエンから選択される、請求項４６記載の化合物。４８．ジエノフィルがマレイミドである、請求項４６記載の化合物。４９．Ｘが存在せず、正に帯電した化合物が得られる、請求項４６記載の化合物。５０．次式の化合物：（式中、Ｂは核酸塩基であり；Ａは２′−糖置換基であり；Ａ′は２′−糖置換基であり；Ｗは独立してホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよび保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択され、ここで保護オリゴヌクレオチドはホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよび脱保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択される３′末端基を有し；Ｒ′はジエンまたはジエノフィルから選択される）。５１．Ｗがホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネートおよび保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択され、ここで保護オリゴヌクレオチドはホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネートよりなる群から選択される３′末端基を有する、請求項５０記載の化合物。５２．ＡおよびＡ′が独立して、Ｈ、²Ｈ、³Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨＯＲ¹ 、ＮＨＯＲ³、ＮＨＮＨＲ³、ＮＨＲ³、＝ＮＨ、ＣＨＣＮ、ＣＨＣｌ₂、ＳＨ、ＳＲ³、ＣＦＨ₂、ＣＦ₂Ｈ、ＣＲ² ₂Ｂｒ、−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃、ＯＲ⁴およびイミダゾールよりなる群から選択され；これらにおいてＲ¹は、Ｈおよびアルコール保護基よりなる群から選択され；Ｒ²は、＝Ｏ、＝Ｓ、Ｈ、ＯＨ、ＣＣｌ₃、ＣＦ₃、ハライド、所望により置換されたＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル（環式、直鎖および分枝鎖を含む）、アルケニル、アリール、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アシル、ベンゾイル、ＯＲ⁴およびエステルよりなる群から選択され；Ｒ³は、Ｒ²、Ｒ⁴、ＣＮ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｓ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｏ)ＣＦ₃、ＳＯ₂Ｒ⁴ 、アミノ酸、ペプチドおよびそれらの混合物よりなる群から選択され；Ｒ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される、請求項５０記載の化合物。５３．ＡがＨ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃｌ、Ｆ、−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃、ＮＨＯＲ、ＯＲ⁴、ＯＳｉＲ⁴ ₃よりなる群から選択され、これらにおいてＲ⁴は、所望により置換された炭化水素(Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀ アルキニル)、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択され；かつＡ′がＨである、請求項５０記載の化合物。５４．Ｒ′が３．５−ヘキサジエンである、請求項５０記載の化合物。５５．Ｒ′が２．４−ヘキサジエンである、請求項５０記載の化合物。５６．請求項５０記載の化合物と、固体支持体に結合したジエノフィル、固体支持体に結合したジエン、ジエンおよびジエノフィルよりなる群から選択される化合物とのディールス−アルダー反応により形成される化合物。５７．Ｒ′が３．５−ヘキサジエンまたは２．４−ヘキサジエンから選択される、請求項５６記載の化合物。５８．ジエノフィルがマレイミドである、請求項５６記載の化合物。５９．次式の化合物：（式中、Ｂは核酸塩基であり；Ａは２′−糖置換基であり；Ａ′は２′−糖置換基であり；Ｗは独立してホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよび保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択され、ここで保護オリゴヌクレオチドはホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよび脱保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択される３′末端基を有し；固体支持体は、架橋有機ポリマー、ポリスチレン、テンタゲル（商標）、ポリエチレングリコール、ならびにシリカゲル、アルミナ、制御多孔ガラスおよびゼオライトよりなる群から選択される無機酸化物よりなる群から選択される）。６０．ＡおよひＡ′が独立して、Ｈ、²Ｈ、³Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨＯＲ¹ 、ＮＨＯＲ³、ＮＨＮＨＲ³、ＮＨＲ³、＝ＮＨ、ＣＨＣＮ、ＣＨＣｌ₂、ＳＨ、ＳＲ³、ＣＦＨ₂、ＣＦ₂Ｈ、ＣＲ² ₂Ｂｒ、−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃、ＯＲ⁴およびイミダゾールよりなる群から選択され；これらにおいてＲ¹は、Ｈおよびアルコール保護基よりなる群から選択され；Ｒ²は、＝Ｏ、＝Ｓ、Ｈ、ＯＨ、ＣＣｌ₃、ＣＦ₃、ハライド、所望により置換されたＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル（環式、直鎖および分枝鎖を含む）、アルケニル、アリール、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アシル、ベンゾイル、ＯＲ⁴およびエステルよりなる群から選択され；Ｒ³は、Ｒ²、Ｒ⁴、ＣＮ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｓ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｏ)ＣＦ₃、ＳＯ₂Ｒ⁴ 、アミノ酸、ペプチドおよびそれらの混合物よりなる群から選択され；Ｒ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される、請求項５９記載の化合物。６１．ＡがＨ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃｌ、Ｆ、ＮＨＯＲ、−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃ 、ＯＲ⁴、ＯＳｉＲ⁴ ₃よりなる群から選択され、これらにおいてＲ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択され；かつＡ′がＨである、請求項５９記載の化合物。６２．Ｗが保護オリゴヌクレオチドであり、ここで保護オリゴヌクレオチドは分子量５，０００〜１００，０００のポリエチレングリコールおよびヒドロキシルよりなる群から選択される３′末端基を有する、請求項５９記載の化合物。６３．次式の化合物：（式中、Ｒはジエンよりなる群から選択される）。６４．Ｒが２，４−ペンタジエンから選択される、請求項６３記載の化合物。６５．オリゴヌクレオチド合成におけるキャッピング試薬としての、請求項６３記載の化合物の使用。６６．オリゴヌクレオチド合成における欠陥配列分離手段としての、請求項６３記載の化合物の使用。６７．次式の化物：（式中、Ｒはジエンよりなる群から選択される）。６８．Ｒが３，５−ヘキサジエンから選択される、請求項６７記載の化合物。６９．オリゴヌクレオチド合成におけるキャッピング試薬としての、請求項６７記載の化合物の使用。７０．オリゴヌクレオチド合成における欠陥配列分離手段としての、請求項６７記載の化合物の使用。７１．次式の化合物：（式中、Ｒは独立してジエン、アルキル基またはアリール基よりなる群から選択され、少なくとも２個のＲはジエンである）。７２．Ｒが独立して３，５−ヘキサジエン、フェニルおよひｔ−ブチルよりなる群から選択される、請求項７１記載の化合物。７３．オリゴヌクレオチド合成におけるキャッピング試薬としての、講求項７１記載の化合物の使用。７４．オリゴヌクレオチド合成における欠陥配列分離手段としての、請求項７１記載の化合物の使用。７５．オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法であって、ａ）５′位に第１の固体支持体と反応しうる保護基を含む５′保護モノマー単位を出発物質と反応させて、生成物、５′保護モノマー単位および出発物質を含有する反応混合物を調製し；ｂ）第１の固体支持体を収容したクロマトグラフィー樹脂チャンバーに反応混合物を循環させ、その際、５′保護モノマー単位および生成物は第１の固体支持体と共有結合反応し、これにより該固体支持体に保持され；ｃ）第１の固体支持体を第１溶剤で洗浄して出発物質を溶離し；ｄ）保持された５′保護モノマー単位および生成物を含有する第１の固体支待体を希酸で洗浄し、次いで第２有機溶剤で溶離して生成物を５′保護モノマー単位と共に離脱させて単離し；そしてｅ）工程ｄ）で得た有機排出液を第２の固体支持体に導通することにより生成物を５′保護モノマー単位から分離し、その際、５′保護モノマー単位は第２の固体支持体に保持され、生成物は第２溶剤と共に溶出することを含む方法。７６．工程ａ）とｂ）の間にさらに、ａ１）生成物、５′保護モノマー単位および出発物質を含有する反応混合物を酸化して、酸化された５′保護モノマー単位、酸化された生成物および出発物質を含有する第２反応混合物を得ることを含む、請求項７５記載の方法。７７．第１および第２の固体支持体が独立して、樹脂、ポリマーおよびメンブランよりなる群から選択される、請求項７５記載の方法。７８．固体支持体がジエンまたはジエノフィルから選択される基で誘導体化された、請求項７５記載の方法。７９．第１の固体支持体がマレイミドで誘導体化された、請求項７５記載の方法。８０．第２の固体支持体が限外濾過膜である、請求項７５記載の方法。８１．溶液相合成が自動化された、請求項７５記載の方法。８２．共有結合反応が還元アミノ化である、請求項２４記載の方法。』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｈ 19/06 Ｃ０７Ｈ 19/06 19/10 19/10 19/16 19/16 19/20 19/20 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者セトル，アレシアアメリカ合衆国コロラド州80027，スピリアー，イースト・リバーベンド・ストリート 1497 (72)発明者チャイ，ヤンシェンアメリカ合衆国カリフォルニア州94303, パロ・アルト，コロラド・プレース 1072 (72)発明者ヒュアン，ジャンピンアメリカ合衆国コロラド州80026，ラファイエット，オーチャード・コート 1407

Claims

【特許請求の範囲】１．オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法であって、ａ）５′保護モノマー単位を出発物質と反応させて、生成物を含有する反応混合物を調製し；そしてｂ）生成物を５′保護基の存在に基づいて未反応出発物質、未反応５′保護モノマー単位、副生物および試薬から分配することを含む方法。２．５′−保護モノマー単位が次式：（式中、Ｂは核酸塩基であり；Ａは２′−糖置換基であり；Ａ′は２′−糖置換基であり；Ｗは独立してホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよび保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択され、ここで保護オリゴヌクレオチドはホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートよりなる群から選択される３′末端基を有し；Ｄ−Ｅは、アルコール保護基（１または２以上）である）を有する、請求項１記載の方法。３．さらにｃ）工程ａ）およびｂ）を連続サイクルで特定の回数繰り返して、目的生成物を得ることを含む、、請求項１記載の方法。４．工程ａ）とｂ）の間にさらに、ａ１）工程ａ）で得た反応混合物を酸化して、酸化された５′保護モノマー単位、酸化された生成物および出発物質を含有する第２反応混合物を得て；ａ２）酸化された５′保護モノマー単位を反応混合物の他のものから分配し; そしてａ３）酸化された５′保護モノマー単位を所望により単離することを含む、請求項１記載の方法。５．Ｗがホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネートおよび保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択され、ここで保護オリゴヌクレオチドはホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネートよりなる群から選択される３′末端基を有する、請求項２記載の方法。６．ＡおよびＡ′が独立して、Ｈ、²Ｈ、³Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨＯＲ¹、ＮＨＯＲ³、ＮＨＮＨＲ³、ＮＨＲ³、＝ＮＨ、ＣＨＣＮ、ＣＨＣｌ₂、ＳＨ、ＳＲ³ 、ＣＦＨ₂、ＣＦ₂Ｈ、ＣＲ² ₂Ｂｒ、−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃、ＯＲ⁴およびイミダゾールよりなる群から選択され；これらにおいてＲ¹は、Ｈおよびアルコール保護基よりなる群から選択され；Ｒ²は、＝Ｏ、＝Ｓ、Ｈ、ＯＨ、ＣＣｌ₃、ＣＦ₃、ハライド、所望により置換されたＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル（環式、直鎖および分枝鎖を含む）、アルケニル、アリール、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アシル、ベンゾイル、ＯＲ⁴およびエステルよりなる群から選択され；Ｒ³は、Ｒ²、Ｒ⁴、ＣＮ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｓ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｏ)ＣＦ₃、ＳＯ₂Ｒ⁴ 、アミノ酸、ペプチドおよびそれらの混合物よりなる群から選択され；Ｒ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される、請求項２記載の方法。７．ＡがＨ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃｌ、Ｆ、ＮＨＯＲ、−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃ 、ＯＲ⁴、ＯＳｉＲ⁴ ₃よりなる群から選択され、これらにおいてＲ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択され；かつＡ′がＨである、請求項２記載の方法。８．Ｄは固体支持体に対し強い親和性をするか、または誘導体化した固体支持体と共有結合反応するように選択された化合物であり、Ｅは酸素−Ｅ結合が容易に開裂するように選択された化合物である、請求項２記載の方法。９．Ｅがトリチル基、レブリン酸基またはシリルエーテル基よりなる群から選択される、請求項８記載の方法。１０．トリチル基が次式の構造：（式中、Ｄは独立してＨ、ＯＲ⁴、ジエン単位を有するアルキルまたは置換アルキル基、ジエノフィル単位を有するアルキルまたは置換アルキル基、ジエン単位を有するアルコキシまたは置換アルコキシ基、ジエノフィル単位を有するアルコキシまたは置換アルコキシ基、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、マレイミド置換アルコキシ基、アルコキシ基、ジエン単位を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、マレイミド置換されたアルキルアミノまたは置換アルキルアミノ基、ジエノフィル部分を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、ジスルフィド、アルデヒド類、および金属キレート化剤、ジエノフィルまたはジエン単位を有するシリルエーテルよりなる群から選択され、ここでＲ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される）を有する、請求項９記載の方法。１１．Ｄが１〜５０個の炭素原子を有する、請求項１０記載の方法。１２．Ｄが１〜３０個の炭素原子を有する、請求項１０記載の方法。１３．Ｄが独立して以下の化合物よりなる群から選択される、請求項１０記載の方法：Ｌ＝連結基Ｘ＝電子吸引基もしくは電子供与基またはＨ１４．レブリン酸基が次式の構造：（式中、Ｄは独立してＨ、ＯＲ⁴、ジエン単位を有するアルキルまたは置換アルキル基、ジエノフィル単位を有するアルキルまたは置換アルキル基、ジエン単位を有するアルコキシまたは置換アルコキシ基、ジエノフィル単位を有するアルコキシまたは置換アルコキシ基、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、マレイミド置換アルコキシ基、アルコキシ基、ジエン単位を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、マレイミド置換されたアルキルアミノまたは置換アルキルアミノ基、ジエノフィル部分を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、ジスルフィド、アルデヒド類、および金属キレート化剤、ジエノフィルまたはジエン単位を有するシリルエーテルよりなる群から選択され、ここでＲ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される）を有する、請求項９記載の方法。１５．Ｄが１〜５０個の炭素原子を有する、請求項１４記載の方法。１６．Ｄが１〜３０個の炭素原子を有する、請求項１４記載の方法。１７．Ｄが独立して以下の化合物よりなる群から選択される、請求項１４記載の方法：Ｌ＝連結基Ｘ＝電子吸引基もしくは電子供与基またはＨ１８．シリル基が次式の構造：（式中、Ｄは独立してＨ、ＯＲ⁴、ジエン単位を有するアルキルまたは置換アルキル基、ジエノフィル単位を有するアルキルまたは置換アルキル基、ジエン単位を有するアルコキシまたは置換アルコキシ基、ジエノフィル単位を有するアルコキシまたは置換アルコキシ基、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、マレイミド置換アルコキシ基、アルコキシ基、ジエン単位を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、マレイミド置換されたアルキルアミノまたは置換アルキルアミノ基、ジエノフィル部分を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、ジスルフィド、アルデヒド類、および金属キレート化剤、ジエノフィルまたはジエン単位を有するシリルエーテルよりなる群から選択され、ここでＲ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される）のいずれかを有する化合物から選択される、請求項９記載の方法。１９．Ｄが１〜５０個の炭素原子を有する、請求項１８記載の方法。２０．Ｄが１〜３０個の炭素原子を有する、請求項１８記載の方法。２１．Ｄが独立して以下の化合物よりなる群から選択される、請求項１８記載の方法：Ｌ＝連結基Ｘ＝電子吸引基もしくは電子供与基またはＨ２２．固体支持体を通して反応混合物を溶離することにより分配を行う、請求項１記載の方法。２３．固体支持体がＤに対する親和性を有する、請求項２２記載の方法。２４．固体支持体がＤと共有結合反応する、請求項２２記載の方法。２５．共有結合反応がディールス−アルダー反応である、請求項２４記載の方法。２６．固体支持体が樹脂、メンブランおよびポリマーよりなる群から選択される、請求項２２記載の方法。２７．固体支持体が、疎水性逆相樹脂、チオプロピル−セファロース樹脂、水銀処理樹脂、アガロースアジピン酸ヒドラジド樹脂、アビジン樹脂、限外濾過膜、テンタゲル（商標）、ポリエチレングリコール、ならびにシリカゲル、アルミナ、制御多孔ガラスおよびゼオライトよりなる群から選択される無機酸化物よりなる群から選択される、請求項２２記載の方法。２８．疎水性逆相樹脂が、Ｃ２〜Ｃ１８ポリスチレン樹脂よりなる群から選択される、請求項２７記載の方法。２９．出発物質が３′−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体化オリゴヌクレオチドであり、５′保護モノマー単位が限外濾過膜により反応混合物の他のものから分配される、請求項２２記載の方法。３０．固体支持体がジエンまたはジエノフィルから選択される基で誘導体化された、請求項２２記載の方法。３１．ジエンが３，５−ヘキサジエンよりなる群から選択される、請求項３０記載の方法。３２．ジエノフィルがマレイミドである、請求項３０記載の方法。３３．酸化をその場で行う、請求項４記載の方法。３４．酸化をＩ₂、ピリジンおよびＨ₂Ｏにより行う、請求項３３記載の方法。３５．酸化をヨードベンゼンジアセテートにより行う、請求項３３記載の方法。３６．酸化を過ヨウ素酸ナトリウムまたは過ヨウ素酸テトラアルキルアンモニウムにより行う、請求項３３記載の方法。３７．請求項１記載の方法により得られる生成物。３８．オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法であって、ａ）５′保護モノマー単位を出発物質と反応させて、生成物、５′保護モノマー単位および出発物質を含有する反応混合物を調製し；ｂ）工程ａ）で得た反応混合物を酸化し；ｃ）工程ｂ）の酸化された反応混合物を抽出器に添加し；ｄ）反応混合物を有機溶剤で抽出し；ｅ）工程ｄ）からの抽出物を含有する有機溶剤を、固体支持体を収容したクロマトグラフィー樹脂チャンバーにより溶離し、その際、酸化された５′保護モノマー単位は固体支持体に保持され、酸化された生成物および出発物質は溶出した溶剤中に残存し；ｆ）工程ｅ）で得た有機排出液を第２の固体支持体を通して溶離することにより酸化生成物を出発物質から分離し、その際、酸化された生成物は固体支持体に保持され、出発物質は溶剤と共に溶出し；そしてｇ）第２の固体支持体を希酸で洗浄することにより第２の固体支持体から酸化生成物を溶離することを含む方法。３９．工程ｇ）の後にさらに、ｇ１）工程ｇ）で得た排出液を有機塩基で中和し；そしてｇ２）中和した排出液を濃縮し、酸化された生成物を限外濾過によりアセトニトリル中へ交換することを含む、請求項３８記載の方法。４０．工程ｇ）の後にさらに、ｇ１）工程ｇ）で得た排出液を第３の固体支持体を通して溶離し、排出液を中和することを含む、請求項３８記載の方法。４１．第３の固体支持体がダウエックスである、請求項４０記載の方法。４２．工程ｅ）とｆ）の間にさらに、ｅ１）固体支持体を洗浄して、酸化された５′保護モノマー単位を離脱させ、単離することを含む、請求項３８記載の方法。４３．次式の化合物：（式中、Ｒ′はジエンまたはジエノフィルから選択され；Ｘはハロゲン、ヒドロキシル、ＯＲ″およびＯＡｒよりなる群から選択され、ここでＲ″はアルキルまたは置換アルキル基であり、Ａｒは芳香族またはヘテロ芳香族基である）。４４．Ｒ′が３，５−ヘキサジエンである、請求項４３記載の化合物。４５．Ｒ′が２，４−ヘキサジエンである、請求項４３記載の化合物。４６．請求項４３記載の化合物と、固体支持体に結合したジエノフィル、固体支持体に結合したジエン、ジエンおよびジエノフィルよりなる群から選択される化合物とのディールス−アルダー反応により形成される化合物。４７．Ｒ′が３，５−ヘキサジエンまたは２，４−ヘキサジエンから選択される、請求項４６記載の化合物。４８．ジエノフィルがマレイミドである、請求項４６記載の化合物。４９．Ｘが存在せず、正に帯電した化合物が得られる、請求項４６記載の化合物。５０．次式の化合物：（式中、Ｂは核酸塩基であり；Ａは２′−糖置換基であり；Ａ′は２′−糖置換基であり；Ｗは独立してホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよび保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択され、ここで保護オリゴヌクレオチドはホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよび脱保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択される３′末端基を有し；Ｒ′はジエンまたはジエノフィルから選択される）。５１．Ｗがホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネートおよび保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択され、ここで保護オリゴヌクレオチドはホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネートよりなる群から選択される３′末端基を有する、請求項５０記載の化合物。５２．ＡおよびＡ′が独立して、Ｈ、²Ｈ、³Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨＯＲ¹ 、ＮＨＯＲ³、ＮＨＮＨＲ³、ＮＨＲ³、＝ＮＨ、ＣＨＣＮ、ＣＨＣｌ₂、ＳＨ、ＳＲ³、ＣＦＨ₂、ＣＦ₂Ｈ、ＣＲ² ₂Ｂｒ、−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃、ＯＲ⁴およびイミダゾールよりなる群から選択され；これらにおいてＲ¹は、Ｈおよびアルコール保護基よりなる群から選択され；Ｒ²は、＝Ｏ、＝Ｓ、Ｈ、ＯＨ、ＣＣｌ₃、ＣＦ₃、ハライド、所望により置換されたＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル（環式、直鎖および分枝鎖を含む）、アルケニル、アリール、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アシル、ベンゾイル、ＯＲ⁴およびエステルよりなる群から選択され；Ｒ³は、Ｒ²、Ｒ⁴、ＣＮ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｓ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｏ)ＣＦ₃、ＳＯ₂Ｒ⁴ 、アミノ酸、ペプチドおよびそれらの混合物よりなる群から選択され；Ｒ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される、請求項５０記載の化合物。５３．ＡがＨ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃｌ、Ｆ、−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃、ＮＨＯＲ、ＯＲ⁴、ＯＳｉＲ⁴ ₃よりなる群から選択され、これらにおいてＲ⁴は、所望により置換された炭化水素(Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀ アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択され；かつＡ′がＨである、請求項５０記載の化合物。５４．Ｒ′が３，５−ヘキサジエンである、請求項５０記載の化合物。５５．Ｒ′が２，４−ヘキサジエンである、請求項５０記載の化合物。５６．請求項５０記載の化合物と、固体支持体に結合したジエノフィル、固体支持体に結合したジエン、ジエンおよびジエノフィルよりなる群から選択される化合物とのディールス−アルダー反応により形成される化合物。５７．Ｒ′が３，５−ヘキサジエンまたは２．４−ヘキサジエンから選択される、請求項５６記載の化合物。５８．ジエノフィルがマレイミドである、請求項５６記載の化合物。５９．次式の化合物：（式中、Ｂは核酸塩基であり；Ａは２′−糖置換基であり；Ａ′は２′−糖置換基であり；Ｗは独立してホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよび保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択され、ここで保護オリゴヌクレオチドはホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよび脱保護オリゴヌクレオチドよりなる群から選択される３′末端基を有し；固体支持体は、架橋有機ポリマー、ポリスチレン、テンタゲル（商標）、ポリエチレングリコール、ならびにシリカゲル、アルミナ、制御多孔ガラスおよびゼオライトよりなる群から選択される無機酸化物よりなる群から選択される）。６０．ＡおよびＡ′が独立して、Ｈ、²Ｈ、³Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨＯＲ¹ 、ＮＨＯＲ³、ＮＨＮＨＲ³、ＮＨＲ³、＝ＮＨ、ＣＨＣＮ、ＣＨＣｌ₂、ＳＨ、ＳＲ³、ＣＦＨ₂、ＣＦ₂Ｈ、ＣＲ² ₂Ｂｒ、−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃、ＯＲ⁴およびイミダゾールよりなる群から選択され；これらにおいてＲ¹は、Ｈおよびアルコール保護基よりなる群から選択され；Ｒ²は、＝Ｏ、＝Ｓ、Ｈ、ＯＨ、ＣＣｌ₃、ＣＦ₃、ハライド、所望により置換されたＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル（環式、直鎖および分枝鎖を含む）、アルケニル、アリール、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アシル、ベンゾイル、ＯＲ⁴およびエステルよりなる群から選択され；Ｒ³は、Ｒ²、Ｒ⁴、ＣＮ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｓ)ＮＨ₂、Ｃ(Ｏ)ＣＦ₃、ＳＯ₂Ｒ⁴ 、アミノ酸、ペプチドおよびそれらの混合物よりなる群から選択され；Ｒ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される、請求項５９記載の化合物。６１．ＡがＨ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃｌ、Ｆ、ＮＨＯＲ、−(ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃ 、ＯＲ⁴、ＯＳｉＲ⁴ ₃よりなる群から選択され、これらにおいてＲ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択され；かつＡ′がＨである、請求項５９記載の化合物。６２．Ｗが保護オリゴヌクレオチドであり、ここで保護オリゴヌクレオチドは分子量５，０００〜１００，０００のポリエチレングリコールおよびヒドロキシルよりなる群から選択される３′末端基を有する、請求項５９記載の化合物。６３．次式の化合物：（式中、Ｒはジエンよりなる群から選択される）。６４．Ｒが２，４−ペンタジエンから選択される、請求項６３記載の化合物。６５．オリゴヌクレオチド合成におけるキャッピング試薬としての、請求項６３記載の化合物の使用。６６．オリゴヌクレオチド合成における欠陥配列分離手段としての、請求項６３記載の化合物の使用。６７．次式の化合物：（式中、Ｒはジエンよりなる群から選択される）。６８．Ｒが３，５−ヘキサジエンから選択される、請求項６７記載の化合物。６９．オリゴヌクレオチド合成におけるキャッピング試薬としての、請求項６７記載の化合物の使用。７０．オリゴヌクレオチド合成における欠陥配列分離手段としての、請求項６７記載の化合物の使用。７１．次式の化合物：（式中、Ｒは独立してジエン、アルキル基またはアリール基よりなる群から選択され、少なくとも２個のＲはジエンである）。７２．Ｒが独立して３，５−ヘキサジエン、フェニルおよびｔ−ブチルよりなる群から選択される、請求項７１記載の化合物。７３．オリゴヌクレオチド合成におけるキャッピング試薬としての、請求項７１記載の化合物の使用。７４．オリゴヌクレオチド合成における欠陥配列分離手段としての、請求項７１記載の化合物の使用。７５．オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法であって、ａ）５′位に第１の固体支持体と反応しうる保護基を含む５′保護モノマー単位を出発物質と反応させて、生成物、５′保護モノマー単位および出発物質を含有する反応混合物を調製し；ｂ）第１の固体支持体を収容したクロマトグラフィー樹脂チャンバーに反応混合物を循環させ、その際、５′保護モノマー単位および生成物は第１の固体支持体と共有結合反応し、これにより該固体支持体に保持され；ｃ）第１の固体支持体を第１溶剤で洗浄して出発物質を溶離し；ｄ）保持された５′保護モノマー単位および生成物を含有する第１の固体支持体を希酸で洗浄し、次いで第２有機溶剤で溶離して生成物を５′保護モノマー単位と共に離脱させて単離し；そしてｅ）工程ｄ）で得た有機排出液を第２の固体支持体に導通することにより生成物を５′保護モノマー単位から分離し、その際、５′保護モノマー単位は第２の固体支持体に保持され、生成物は第２溶剤と共に溶出することを含む方法。７６．工程ａ）とｂ）の間にさらに、ａ１）生成物、５′保護モノマー単位および出発物質を含有する反応混合物を酸化して、酸化された５′保護モノマー単位、酸化された生成物および出発物質を含有する第２反応混合物を得ることを含む、請求項７５記載の方法。７７．第１および第２の固体支持体が独立して、樹脂、ポリマーおよびメンブランよりなる群から選択される、請求項７５記載の方法。７８．固体支持体がジエンまたはジエノフィルから選択される基で誘導体化された、請求項７５記載の方法。７９．第１の固体支持体がマレイミドで誘導体化された、請求項７５記載の方法。８０．第２の固体支持体が限外濾過膜である、請求項７５記載の方法。８１．溶液相合成が自動化された、請求項７５記載の方法。８２．共有結合反応が還元アミノ化である、請求項２４記載の方法。