JP2001520660A - オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、オリゴヌクレオチドの逐次溶液相合成のための改良法を開示する。本方法は自動化でき、高い効率で大規模にオリゴヌクレオチドを製造するのに理想的に適している。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法発明の分野 本発明は、核酸化学の分野に関する。詳細には、本発明はオリゴヌクレオチド 製造のための新規方法を記載する。本明細書においてオリゴヌクレオチド製造の ために用いる方法は、ＰＡＳＳと呼ばれる。これは生成物固定式逐次合成（Ｐｒ ｏｄｕｃｔ Ａｎｃｈｏｒｅｄ Ｓｅｑｕｎｔｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）の 頭字語である。発明の背景 ごく最近まで、オリゴヌクレオチドは厳密に情報的なもの以外のいかなる能力 においても考慮されていなかった。特定のオリゴヌクレオチドは興味深い構造上 の可能性をもつことが知られており（たとえばｔ−ＲＮＡ）、他のオリゴヌクレ オチドにポリペプチドが事実上特異的に結合するという事実にもかかわらず、情 報以外のオリゴヌクレオチドの能力にはほとんど関心が向けられていなかった。 このため、特に医薬用化合物としてオリゴヌクレオチドを使用することはほとん ど考慮されていない。 オリゴヌクレオチドを医薬用化合物として用いることに関し広範な研究が行わ れている開発には、現在少なくとも３つの領域がある。最も進んだ分野では、ア ンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて生体内で特定のコード領域に結合させ、 タンパク質の発現を阻止し、または種々の細胞機能を遮断する。さらに、触媒作 用をもつＲＮＡ種―リボザイム―の発見により、目的の効果を達成する細胞内反 応を行うのに役立つＲＮＡ種が研究されるようになった。そしてごく最近、指数 的濃縮による系統的リガンド進化(ＳＥＬＥＸ法、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖ ｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎ ｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９ ：５０５）の発見で、生物学的に関心のあるほとんどすべてのターゲット についても結合するオリゴヌクレオチドを同定しうることが示された。 ＳＥＬＥＸ法は、“核酸抗体”と呼ばれる核酸リガンド、たとえばターゲット 分子と相互作用する核酸を、同定および製造するための方法である（Ｔｕｅｒｋ およびＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５）。この方法は、 候補オリゴヌクレオチド混合物からの選択、ならびに同じ一般的選択方式を用い た結合、分配、および増幅の段階的反復を行って、実質的にいかなる目的基準の 結合親和性および選択性も達成するものである。 遺伝子発現を制御する手段としてアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する こと、また有望な医薬としてオリゴヌクレオチドを使用しうる可能性があること から、オリゴヌクレオチドの療法活性および安定性を高めるために多数の化学的 修飾をオリゴヌクレオチドに導入することが研究されるようになった。そのよう な修飾は、オリゴヌクレオチドの細胞透過性を高めるため、体内でオリゴヌクレ オチド類似体の構造もしくは活性を分解もしくは妨害するヌクレアーゼその他の 酵素からそれらを安定化するため、ターゲットＲＮＡへのオリゴヌクレオチドの 結合を高めるため、ターゲットＲＮＡに配列特異的に結合した時点で分断モード （終止事象）を生じさせるため、またオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良 するために設計される。 最近の研究で、ＲＮＡの二次および三次構造が重要な生物学的機能をもつ可能 性のあることが示された（Ｔｉｎｏｃｏら（１９８７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５２：１３５；Ｌａｒｓｏｎら （１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７４：５；Ｔｕｅｒｋら（１ ９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：１３６４；Ｒ ｅｓｎｅｋｏｖら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９９５３）。 国際特許出願公開第ＷＯ９１／１４４３６号、表題“ＲＮＡ模倣による遺伝子発 現調節のための試薬および方法”には、１種類またはそれ以上のタンパク質と相 互作用しうるＲＮＡ部分を模倣した、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ チド類似体が記載されている。これらのオリゴヌクレオチドはそれらをヌクレア ーゼ抵抗性にする修飾されたヌクレオシド間結合を含み、高い細胞透過能をもち 、かつターゲットオリゴヌクレオチド配列を結合することができる。 医薬として用いるための修飾オリゴヌクレオチドの開発についてはかなりの活 動があるが、これらの化合物を臨床開発の可能な規模で製造および単離すること にはほとんど関心が払われていない。従来の実験室規模による１μｍｏｌの自動 オリゴヌクレオチド合成では、臨床開発を可能にするのに十分な量の目的化合物 は得られない。臨床開発のためには、オリゴヌクレオチドを最低でもグラム規模 ないしマルチグラム規模の量で製造しなければならない。文献には大規模オリゴ ヌクレオチド合成という報文があるが、“大規模”という用語はグラム規模また はキログラム規模の量ではなく１〜１０μｍｏｌ規模に対して用いられている( Ｉｗａｉら（１９９０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４６：６６７３−６６８８) 。 オリゴヌクレオチド合成の現在の技術水準は、ホスホルアミダイト法によるオ リゴヌクレオチドの自動固相合成であり、これを反応経路１に示す（Ｂｅａｕｃ ａｇｅおよびＩｙｅｒ（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３− ２３１１；ＺｏｎおよびＧｅｉｓｅｒ（１９９１）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄ ｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９−５６８；ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒ ｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３ １９１）。要約すると、合成すべきオリゴヌクレオチドの３’−末端ヌクレオシ ドを固体支持体に結合させ、支持体に結合させたまま一度に１個のヌクレオチド を付加することにより、オリゴヌクレオチドを合成する。反応経路１に示すよう に、ヌクレオシドモノマーを保護し（Ｐ₁）、ホスホルアミダイト（１）を調製 する。次いでこのホスホルアミダイト（５’−保護モノマー単位と呼ぶ）を、生 長しつつあるオリゴヌクレオチド鎖（２）に、生長しつつあるオリゴヌクレオチ ド鎖のリボース環の５’−ヒドロキシ基を介してホスファイトトリエステル結合 により共有結合させて、オリゴヌクレオチド生成物（３）を得る。その際、生長 しつつあるオリゴヌクレオチド鎖の大部分が１ヌクレオチド分延長するが、有意 ％の鎖が延長しない。次いで生成物（３）を酸化してホスフェートトリエステル （４）を得る。生長しつつあるオリゴヌクレオチド鎖に次の塩基を付加する前に 、５’−ヒドロキシ基を脱保護しなければならない。しかし、反応経路１にみら れるように（化合物４）、必ずしも固体支持体上のすべての反応性部位が５’− 保護モノマーと反応するわけではない。したがってこれらの未反応部位（欠損配 列と呼ぶ）を、５’−ヒドロキシ基の脱保護（６）前に保護しなければならな い（キャッピングと呼ぶ）（５）。次いで、同様に保護され、かつホスホルアミ ダイトに変換された後続モノマーが、生長しつつあるオリゴマーの５’−末端を モノマーの３’−末端へ結合させることにより逐次付加される。各結合反応で、 オリゴヌクレオチドはホスファイトトリエステル結合により１モノマー分延長す る。各工程で―および固体支持体との最初の反応に際し―、５’−保護モノマー と反応し損なった反応部位があり、その結果、１ヌクレオチドモノマー分延長し なかったオリゴヌクレオチド（欠損配列）が生じる。合成が完了すると目的オリ ゴヌクレオチド（６（ｎ＋１配列））を脱保護し、すべての欠損配列（ｎ、ｎ− ｘ）と共に樹脂から開裂させる。 従来の固相オリゴヌクレオチド合成の収率は、結合させるモノマー数と共に指 数的に低下する。このため、粗生成物を欠損配列から精製するのがいっそう困難 になる。さらに、たとえ高い分離精製が達成されたとしても、生成物が標準でな いヌクレオチドを含む場合は特に、生成物の配列および組成を確認するのはやは りきわめて困難である。 反応経路１固体支持体上での自動オリゴヌクレオチド合成は、少量（０．００１〜０．０１ ｍｍｏｌ）の多様な配列を最小時間で妥当な収率において製造するにはきわめて 有効である。しかし、装入モノマーを基準とした全プロセス収率に関しては、著 しく非効率的方法である。一般に１モノマー付加につき１６倍過剰のホスホルア ミダイトが必要である。自動固相合成法は、効率的なオリゴヌクレオチド医薬製 造を可能にする水準にまでスケールアップするのは容易でないと認識されている （ＺｏｎおよびＧｅｉｓｅｒ(１９９１)Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄ ｅｓｉｇｎ ６：５３９−５６８）。 固相合成が非効率的であるのは、不均一相モノマー結合反応であること、およ び朱反応欠損配列と反応生成物が同一支持体ビーズに共有結合していることによ り生じるところが大きい。各サイクルで、支持体に結合したヌクレオチドの１〜 ５％は活性化モノマーと反応しない。その後、不完全オリゴヌクレオチドにモノ マーが付加するのを阻止するには、欠損配列と呼ぶこれらの未反応化合物を前記 のようにブロックまたはキャッピングしなければならない。合成の各工程で欠損 配列が生成すると、相同性の高い副生物で汚染された粗生成物が製造され、これ らの副生物を最終粗生成物にまで保持しなければならない（反応経路１、構造式 ６（ｎ，ｎ−ｘ））。その結果、粗製の合成オリゴヌクレオチドを臨床研究用と して許容できる状態にまで精製するのはきわめて煩雑で、非効率的である。欠損 配列の割合を少なくするには、大過剰のモノマー（約１６倍）を用いる。 装填量がより高いポリスチレン支持体を用いて固相オリゴヌクレオチド合成を スケールアップする方法がＭｏｎｔｓｅｒｒａｔら（（１９９４）Ｔｅｔｒａｈ ｅｄｒｏｎ ５０：２６１７−２６２２）により報告された。しかしこの方法は 、欠損配列を少なくするためにかなり過剰のモノマーがやはり必要であるという 点で、固相合成に伴う主要な問題を克服していない。さらに、この方法では一貫 して十分な収率が得られるわけではない。 結合を達成しかつ容易にスケールアップするのに必要なモノマーの過剰量を減 らすために、Ｂｏｎｏｒａら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．２１：１２１３−１２１７は、モノマー結合反応に際し可溶性のポリエチレン グリコール（ＰＥＧ）を３’−支持体として用いることを研究した。この方法は ホスホルアミダイト結合、Ｈ−ホスホナート縮合およびホスホトリエステル縮合 によりオリゴヌクレオチドを製造するのに用いられている（Ｂｏｎｏｒａら(１ ９８７)Ｇａｚｚｅｔｔａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ｉｔａｌｉａｎａ １１７：３７ ９；Ｂｏｎｏｒａら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８： ３１５５；Ｂｏｎｏｒａら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌ ｅｏｔｉｄｅｓ １０：２６９；Ｃｏｌｏｎｎａら（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３２：３２５１−３２５４；ＢｏｎｏｒａおよびＳｃｒｅ ｍｉｎ（１９９２）Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｓｏｌｉｄ Ｐ ｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｐａｐ．，Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ． ，第２ 版，“オリゴヌクレオチドの大規模合成．ＨＥＬＰ法：結果と見通し”，ｐｐ． ３５５−３５８，インターセプト発行，英国，アンドバー；Ｓｃｒｅｍｉｎおよ びＢ ｏｎｏｒａ（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：４６６３； Ｂｏｎｏｒａ（１９９５）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５４：３；ＺａｒａｍｅｌｌａおよびＢｏｎｏ ｒａ（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １４ ：８０９）。この方法の弱点は、各反応工程後の支持体結合オリゴヌクレオチド 回収率が許容できないほど低いことである。さらにこの方法は、キャッピングし なければならない欠損配列が最終生成物にまで保持される問題に対処していない 。 ポリエチレングリコール−ポリスチレンコポリマー支持体も、オリゴヌクレオ チド合成スケールアップのために用いられている（Ｗｒｉｇｈｔら（１９９３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：３３７３−３３７６）。１８ｍｅｒ ＤＮＡにつき、１ｍｍｏｌ規模で１モノマー付加当たり９６．６％の結合効率 が報告された。この方法も、樹脂に結合した欠損配列の問題には対処していない 。 Ｚｏｎらは、オリゴヌクレオチド合成にブロック法を示唆した。この方法では 二量体または多量体オリゴヌクレオチドフラグメントのライブラリーを溶液中に 調製し、次いで互いに結合させる（ＺｏｎおよびＧｅｉｓｅｒ（１９９１）Ａｎ ｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９−５６８）。これら のフラグメントは、結合のために差別５’−脱保護および３’−リン酸化により 活性化される。フラグメント調製のために、ホスホトリエステル結合が示唆され た（Ｂｏｎｏｒａら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１： １２１３−１２１７）。ホスホトリエステル結合の収率が比較的低いため、この 方法は広く受け入れられてはいない。 従来のオリゴヌクレオチド合成では、結合工程で１モノマーの５’−ヒドロキ シル基と第２モノマーのホスホルアミダイト基が反応するのを防ぐために、５’ −保護基が用いられる。オリゴヌクレオチド合成中に付加される５’−保護モノ マー単位の５’−保護基としては、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基 が慣用される（Ｓｃｈａｌｌｅｒら（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５ ：３８２１）。この基が選ばれるのは、次の５’−保護モノマー単位を付加 する前に、オリゴヌクレオチド生成物の５’−酸素から容易かつ選択的に除去で きるからである（概説についてはＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ（１９９２） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３−２３１１参照）。溶液中では、５’ −ＤＭＴ基の脱保護は可逆的な酸誘発性脱トリチル化により損なわれる。この反 応を駆動して完結させるために、溶液相脱トリチル化には遊離トリチルカチオン の捕そく剤を添加する（Ｒａｖｉｋｕｍａｒら（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ ｏｎ Ｌｅｔｔ．３６：６５８７）。最終５’−末端ＤＭＴ基は疎水性ハンドル として作用し、このため逆疎水性クロマトグラフィーにより全長生成物オリゴヌ クレオチドを短い欠損配列から分離できることが認められた。さらに、固相合成 の完了後、脱保護した全長オリゴヌクレオチド生成物を欠損配列から分離する分 離能を高めるために、ＤＭＴ基の高疎水性類似体が調製された（Ｓｅｌｉｇｅｒ およびＳｃｈｍｉｄｔ（１９８７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ ｒａｐｈｙ ３９７：１４１）。他の方法では、粗製の脱保護オリゴヌクレオチ ド中にある全長生成物の検出を容易にするために、オリゴヌクレオチド合成中に ５’−末端保護基として蛍光性トリチル類似体を用いた（Ｆｏｕｒｒｅｙら（１ ９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：５１５７）。固相オリゴヌ クレオチド合成中に特定のモノマー付加を監視できるように、有色トリチル基が 考案された（ＦｉｓｈｅｒおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉ ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：１５８９）。固相オリゴヌクレオチド合成中に オリゴヌクレオチドからトリチル基を除去する選択性を変更または増大させるた めに、他の修飾トリチル基が調製された（概説についてはＢｅａｕｃａｇｅおよ びＩｙｅｒ（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３−２３１１参 照）。 現在まで、溶液中でのオリゴヌクレオチド合成に際し生成物を樹脂または膜に 固定しうるトリチル基は設計されていない。さらに、誘導体化した樹脂、膜また は可溶性ポリマーと共有結合反応しうるトリチル基は報告されていない。 とりわけ多く研究されているディールスーアルダー反応は、共役ジエンと不飽 和分子の間で環状化合物を形成する付加環化反応であり、その際、新たなσ結合 の形成にπ−電子が用いられる。このディールス−アルダー反応は４−π電子の 系（ジエン）と２−π電子の系（ジエノフィル）を伴うので、［４＋２］付加環 化反応の一例である。この反応は、穏やかな条件下で広範な反応体につき、きわ めて速やかに行わせることができる。ディールス−アルダー反応は範囲が広く、 当業者に周知である。ディールス−アルダー反応の概説は、“Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ”（Ｍａｒｃｈ，Ｊ．編）７６１−７９ ８（１９７７）（マグローヒル、ニューヨーク）にみられる。これを本明細書に 援用する。 Ｃｏｏｋｓｏｎのジエン―４−置換−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジ オン(ＲＴＡＤ)―(Ｃｏｏｋｓｏｎら（１９６７）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ ）１９０５；Ｃｏｏｋｓｏｎら（１９７１）Ｏｒｇ．Ｓｙｎ．５１：１２１)は 、知られているうちでは最も反応性の高いディールスーアルダージエノフィルの ひとつである。これらのジエノフィルを、アミノ誘導体化したシリカゲルに共有 結合とイオン結合の両方により取り込ませ、ジエン不純物とこのジエノフィル誘 導体化した固体支持体とのディールス−アルダー反応により、ジエン不純物を含 有する混合物を精製するのに用いた（Ｋｅａｎａら（１９８３）Ｏｒｇ．Ｃｈｅ ｍ．５４８：１９８２）。たとえばエルゴステロール、すなわちディールス−ア ルダー様式でＲＴＡＤ誘導体と反応することが示された１，３−ジエン（Ｂａｒ ｔｏｎら（１９７０）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｄ）９３９）を含有するコレス テロール試料を、各種スルホン化４−アリール−１，２，４−トリアゾリン−３ ，５−ジオンで誘導体化した３−アミノプロピル−シリカゲル（ＴＤＡ−シリカ ゲル）の過剰量により２５℃で処理した。反応後、ほぼ定量的収率の純粋なコレ ステロールが得られた。このＴＡＤ−シリカゲルで捕獲された他のジエンには、 ８，１０−ドデカジエノール、１−クロロ−、２−クロロ−および９−ブロモア ントラセンが含まれる。 他の例では、４−アリール−（２，６−ジイソプロピル）−１，２，４−トリ アゾリン−３，５−ジオンのアリールスルホン酸誘導体を調製し、アミノシリカ ゲルに取り込ませた。このＴＡＤ−シリカゲルもエルゴステロールを捕獲した。 エルゴステロール捕獲後、未反応エルゴステロールがなくなるまでシリカゲルを 洗浄し、そして分離した。シリカゲルをアセトニトリル中のトリエチルアミンの 過剰量で溶離すると、エルゴステロール−トリアゾリンジオン付加物が得られた 。このディールス−アルダー付加物を、過剰のＬｉＡｌＨ₄を含有する還流ＴＨ Ｆ 中で処理すると、エルゴステロールが遊離した。 現在まで多数の試みがなされたが、オリゴヌクレオチドを大量に、連続操作で 、低経費において、労力を要する精製を行わずに製造する方法がなお求められて いる。発明の概要 本発明は、反応収率を高め、かつスケールアップの可能な、逐次溶液相オリゴ ヌクレオチド合成法である。生長しつつあるオリゴヌクレオチドの３’−末端を 固体支持体に結合させる従来の方式と異なり、本発明は生長しつつあるオリゴヌ クレオチドの５’−末端に未反応出発物質から結合生成物を分離できる固定基を 使用することを特徴とする。１態様においては、固定基は５’−ＯＨ保護基とし ても役立ち、結合反応は溶液中で行われる。反応し得たオリゴマーはこの保護基 を含有し、一方、反応しなかったオリゴマーは含有せず、これらの物質を固定／ 保護基の存在に基づいて分配できる。好ましい態様においては、固定基は誘導体 化した固定支持体、たとえば樹脂、膜またはポリマーと共有結合反応する。 詳細には本発明は、５’−保護モノマー単位を生長しつつあるオリゴヌクレオ チド鎖の５’−末端と溶液中で反応させることを含む、多様なオリゴヌクレオチ ドおよび修飾オリゴヌクレオチドの溶液相合成法を提供する。本発明の他の態様 においては、５’−保護モノマー単位と生長しつつあるオリゴヌクレオチドとの 反応後、未反応モノマーを酸化して荷電種を形成する。これは、反応媒質中の他 の物質から容易に分配できる。本発明の好ましい態様においては、モノマー単位 はホスホルアミダイトであり、これは活性化および酸化されるとホスフェートに 変換する。この荷電ホスフェート種は、反応媒質中の他の物質から容易に分配で きる。 本発明の好ましい態様において、モノマー単位は５’−保護ホスホルアミダイ トまたはＨ−ホスホナートからなり、この保護基は置換トリチル基、レブリン酸 基、またはシリルエーテル基である。１態様においては、クロマトグラフィー樹 脂に対する保護基の親和性に基づいて、未反応オリゴヌクレオチド出発物質（欠 損配列）を反応したオリゴヌクレオチド生成物から分離できる。好ましい態様に おいては、保護基と誘導体化した固体支持体(たとえば樹脂、膜またはポリマー) との特異的反応に基づいて、未反応オリゴヌクレオチド出発物質を反応したオリ ゴヌクレオチド生成物から分離できる。本発明の好ましい態様においては、未反 応オリゴヌクレオチドを分離するための分配法により、未反応オリゴヌクレオチ ドを単離および再使用でき、かつ反応したオリゴヌクレオチドを脱保護して次の ５’−保護モノマー単位を付加するために調製できる。 本発明方法はホスホルアミダイト結合化学に限定されず、Ｈ−ホスホナートま たはホスフェートトリエステル結合化学など他の結合反応にも適合する。この方 法は自動化もでき、オリゴヌクレオチドを高い効率で大規模に製造するのに理想 的に適している。本発明方法はすべての逐次重合反応に拡張でき、したがってい かなるポリマーの逐次合成にも拡張できる。 本発明は、生成物を５’−保護モノマー単位および出発物質から自動的に分離 する方法および装置を含む。１態様においては、装置は抽出器およびクロマトグ ラフィー樹脂ろ過チャンバー（固体支持体を収容）からなる。モノマー付加反応 が完了すると、反応混合物を抽出チャンバーへ送り、抽出し、５’−保護モノマ ー単位のみを保持する固体支持体を通して溶離する。次いで、生成物のみを保持 している固体支持体を溶離することにより、生成物を出発物質から分離する。第 ２態様においては、クロマトグラフィー樹脂ろ過チャンバーには５’−保護モノ マー単位と生成物の両方と共有結合反応する固体支持体が収容される。出発物質 は固体支持体から溶出し、次いでモノマーと生成物を希酸により固体支持体から 放出させる。次いで限外ろ過膜を通すことにより、生成物を５’−保護モノマー 単位から分離する。 材料原価分析により、オリゴヌクレオチド合成においては５’−保護ホスホル アミダイトが最も高価な反応成分であることが分かる。他の材料の原価はこれに 比べてわずかである。したがってこのモノマーを制限試薬とするのが望ましいで あろう。さらに、装入モノマーに付加し損なった個々の中間体オリゴヌクレオチ ド配列は、その後の合成に際し中間体として利用できる。本発明方法を用いると 、オリゴヌクレオチド生成物の配列および組成の確認が困難ではなくなる。各モ ノマー付加サイクル後、完全に保護された中性中間体が得られ、これは冗長な試 料 調製なしに質量分析で容易に分析される。オリゴヌクレオチド合成経路全体にわ たって、逐次モノマー付加ごとに分析データのライブラリーを得ることができる 。したがって生成物分析は本方法に統合された一部となる。図面の簡単な説明 図１は、実施例１に述べる酸化前のホスホルアミダイト結合反応混合物の逆相 高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トレースを示す。 図２は、実施例１に述べる酸化後のホスホルアミダイト結合反応混合物の逆相 ＨＰＬＣトレースを示す。。酸化後トレースを図１の酸化前トレースに重ねた。 図３は、実施例１に述べる酸化したホスホルアミダイト結合反応混合物の逆相 ＨＰＬＣトレースであって、ＤＥＡＥセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、登録 商標）フィルタープラグに通す前と後の両方を示す。 図４は、実施例１に述べる酸化したホスホルアミダイト結合反応物の逆相ＨＰ ＬＣトレースであって、Ｃ１８樹脂を通して水／アセトニトリルで溶離した後の もの、および酢酸で処理し、水／アセトニトリルで溶離した後のものを示す。 図５は、本発明方法に用いるために設計した自動抽出およびろ過システムを模 式的に示す。 図６は、実施例７で３’−ＰＥＧ固定式溶液相合成法を用いて製造した１５塩 基オリゴヌクレオチドのアニオン交換ＨＰＬＣトレースを示す。 図７は、５’−ＤＨＤＴＯ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ−ＯＳｉＰＤＢＴ−５’ と１．０当量、２．５当量、５当量および１０当量のマレイミドを含有するポリ スチレンマレイミド樹脂との反応についての、ディールス−アルダー捕獲データ をグラフで示す。 図８は、ディールス−アルダー生成物捕獲に用いるために設計した自動抽出お よびろ過システムを模式的に示す。 図９は、エチルエーテル、イソプロピルエーテルおよびＮ−ブチルエーテルに より沈殿させたＰＥＧの沈殿および遠心分離をグラフで示す。 図１０は、実施例１７（反応経路２２）に述べるジエン置換トリチルアルコー ル５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル）チミジン （５’−ＤＨＤＴＯ−ｄＴ）（３１）とフェニルトリアゾリンージオン（ＰＴＡ Ｄ）（８２）とのディールス−アルダー反応をグラフで示す。 図１１は、ＰＡＳＳ法におけるビス−ＴＡＤ分子の使用を示す。Ｐは固体支持 体である。 図１２は、本発明の好ましい態様についてのＰＡＳＳサイクルを模式的に示す 。 図１３Ａ〜１３Ｅは、実施例２１に記載したＰＡＳＳサイクルの各工程につき 、反応混合物のＨＰＬＣトレースを示す。 図１４は、実施例３０で製造したＴ−Ｔ二量体の逆相ＨＰＬＣトレースを示す 。 図１５は、実施例３０で製造したＴ−Ｔ−Ｔ三量体の逆相ＨＰＬＣトレースを 示す。 図１６Ａは、ＤＨＤＴ ｆＣ ３’−ＯＨ（１５３）とＴＢＤＰＳｉ−Ｃｌの 反応の６５分後の逆相ＨＰＬＣトレースを示す。結合、上から下へ：５’−ＤＨ ＤＴ ２’−ｆＣ ３’−ＯＨ（１５３）（１３．８分）、ＴＢＤＰＳｉ−Ｃｌ （１１．３分）、および５’−ＤＨＤＴ ２’−ｆＣ ３’−ＴＢＤＰＳｉ（１ ５４）（１９．８分）。 図１６Ｂは、ＰＴＡＤ−ＰＳ樹脂上における５’−ＤＨＤＴ ２’−ｆＣ３’ −ＴＢＤＰＳｉ（１５４）捕獲反応の逆相ＨＰＬＣトレースを示す。上から下へ ：５’−ＤＨＤＴ ２’−ｆＣ ３’−ＴＢＤＰＳｉ（１５４）（１９．８分） および捕獲溶液（１０．４および１１．３分）。 図１６Ｃは、化合物１５５の放出および中和後の逆相ＨＰＬＣトレースを示す 。上から下へ：水溶液１（１〜２分）、水溶液２（特定のピークはない）、およ び２’−ｆＣ ３’−ＴＢＤＰＳｉ ５’−ＯＨ（１５５）（２５．５分）。 図１６Ｄは、化合物（１５５）１’−シチジル（アセチル保護）２’−フルオ ロ ３’−ＴＢＤＰＳｉ ５’−ＯＨのＮＭＲを示す。発明の詳細な説明 本発明は、本明細書中で生成物固定式逐次合成（ＰＡＳＳ）と呼ぶ、オリゴヌ クレオチドの溶液相合成法を含む。生長しつつあるオリゴヌクレオチドの３’− 末端を固体支持体に結合させる従来の方式と異なり、本発明は生長しつつあるオ リゴヌクレオチド生成物の５’−末端に、結合し得た生成物を未反応出発物質か ら分離できる固定基を使用することを特徴とする。好ましい態様においては、固 定基は５’−ＯＨ保護基としても役立つ。反応し得たオリゴヌクレオチド生成物 は保護基を含有するのに対し、未反応の出発物質は含有せず、このブロッキング ／保護基の存在に基づいて生成物を出発物質から分配できる。未反応出発物質は 回収して、同じオリゴヌクレオチドの後続合成バッチに再使用できる。このよう に従来の固相合成と対照的に、本明細書に記載する改良されたオリゴヌクレオチ ド合成法は、生長しつつあるオリゴヌクレオチド鎖の３’−末端を固定するため の固体支持体を用いない。 詳細には本発明は、５’−保護モノマー単位を生長しつつあるオリゴヌクレオ チド鎖の５’−末端と溶液中で反応させることを含む、多様なオリゴヌクレオチ ドおよび修飾オリゴヌクレオチドの溶液相合成法を提供する。これらの反応を固 体支持体上ではなく溶液中で行うことにより、より良い反応速度が得られる。本 発明の他の態様においては、５’−保護モノマー単位と生長しつつあるオリゴヌ クレオチドとの反応後、未反応モノマーを活性化および酸化して荷電種を形成す る。これは、反応媒質中の他の物質から容易に分配できる。本発明の好ましい態 様においては、モノマー単位はホスホルアミダイトであり、これは活性化および 酸化して容易にホスフェートジエステルに変換することができる。この荷電ホス フェート種は、反応媒質中の他の物質から容易に分配できる。さらに、好ましい 態様においては酸化を系内で実施できる。 ５’−保護モノマー単位として荷電種であるＨ−ホスホナートを用いる場合（ 実施例２、反応経路５）、最終モノマーを添加するまでＨ−ホスホナートの酸化 を延期する。荷電Ｈ−ホスホナートモノマーは結合後に中性Ｈ−ホスホナートジ エステル生成物を生成し、荷電モノマー種がアニオン交換ろ過または抽出によっ て容易に分離される。さらに、回収したＨ−ホスホナートモノマーは再使用でき る。 用いる５’−保護基は、本発明の基本的要件を満たす一群の官能基から選択で きる。分離を行うために、保護基は反応生成物を反応混合物中の他の物質から分 別するのに利用できるタイプのものでなければならない。好ましくは、保護基は 特定の相または固体支持体に対し強い親和性または反応性をもち、かつ高い選択 性でその相または固体支持体から容易に開裂または分離されなければならない。 オリゴヌクレオチド生成物は、当業者に既知の標準法で未反応オリゴヌクレオチ ド出発物質から分離できる。これには遠心分離、樹脂上での分離、シリカゲルに よる分離、金属に対する親和性に基づく分離、磁力もしくは電磁力に基づく分離 、または適切な固体支持体への共有結合に基づく分離が含まれるが、これらに限 定されない。 本発明の好ましい態様においては、未反応オリゴヌクレオチド出発物質を分離 するための分配法により、未反応オリゴヌクレオチドを再使用のために単離でき 、かつ樹脂結合したオリゴヌクレオチド生成物が得られ、これを容易に脱保護し て次の５’−保護モノマー単位を付加するために調製できる。最も好ましくは、 保護基は誘導体化した固体支持体、たとえば樹脂、膜またはポリマーと共有結合 反応して、共有結合固定された保護基を与える。これは高い選択性でオリゴヌク レオチドから容易に開裂できる。 本発明の最も好ましい態様においては、モノマー単位は５’−保護ホスホルア ミダイトまたはＨ−ホスホナートからなり、その際、保護基は置換されたトリチ ル基、レブリン酸基、またはシリルエーテル基である。保護基の好ましい置換基 はジエン官能基であり、これはジエノフィル、好ましくは１，２，４−トリアゾ リン−３，５−ジオン（ＴＡＤ）で誘導体化した固体支持体、たとえば樹脂、膜 またはポリマーとディールス−アルダー反応により反応できる。この態様におい ては、５’−保護基と誘導体化した樹脂との選択的または特異的共有結合反応に 基づいて、未反応オリゴヌクレオチド出発物質を反応したヌクレオチド生成物か ら分離する。 本明細書中で用いる特定の用語を以下のとおり定義する： “ヌクレオシド”は、デオキシリボヌクレオシドもしくはリボヌクレオシド、 またはその任意の化学修飾体を意味する。ヌクレオシドの修飾には、糖の２’− 位の修飾、ピリミジンの５−位の修飾、プリンの８−位の修飾、シトシン環外ア ミンの修飾、５−ブロモウラシルの置換などが含まれるが、これらに限定されな い。 “オリゴヌクレオチド”は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはその任意の化学修 飾体を表す。本発明方法により合成されるオリゴヌクレオチドは一般に下記によ り示される： 式中、ｎ＝１〜１，０００、ＡおよびＡ’は後記に定義する２’−糖置換基であ り、Ｂは後記に定義する核酸塩基である。 本明細書中で用いる“固体支持体”は、樹脂、膜、相、ポリマー、ポリマー前 駆体、または可溶性ポリマー（相転移を行うことができるもの）を表す。固体支 持体は、後記に定義するように、ジエン、ジエノフィル、１，３−双極子または Ｄ基で誘導体化した樹脂、膜、相、ポリマー、ポリマー前駆体、または可溶性ポ リマーをも表す。樹脂と固体支持体という用語は互換性をもって用いられ、当業 者には樹脂という用語が意図するものが認識されるであろう。固体支持体の例に は以下のものが含まれるが、これらに限定されない：有機ポリマー、架橋有機ポ リマー、マレイミド誘導体化したポリスチレン、後記のＤ基で誘導体化したポリ スチレン、ジエノフィルまたはジエンで誘導体化したポリスチレン、後記のＤ基 で誘導体化したテンタゲル（Ｔｅｎｔａｇｅｌ、商標）、ジエノフィルまたはジ エンで誘導体化したテンタゲル（商標）、１，２，４−トリアゾリン−３，５− ジオン（ＴＡＤ）誘導体化した樹脂、フェニルトリアゾリン−ジオン（ＰＴＡＤ ）誘導体化した樹脂、ジエンまたはジエノフィルで誘導体化したアミノ官能化樹 脂、たとえばアミノメチルポリスチレン、アミノプロピルシリカゲル、アミノプ ロピルＣＰＧ、ノバシン（ＮｏｖａＳｙｎ、商標）ＴＧアミノ樹脂ＨＬ、および アル ゴケル(ＡｒｇｏＧｅｌ、商標)、後記のＤ基で誘導体化したアミノ官能化樹脂、 ４−（１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン）安息香酸誘導体化したアミ ノ官能化樹脂、ジエノフィルまたはジエンで誘導体化した限外ろ過膜、ジエノフ ィルまたはジエンで誘導体化したポリエチレングリコール、ジエンまたはジエノ フィルで誘導体化した無機酸化物、たとえばシリカゲル、アルミナ、制御多孔ガ ラスおよびゼオライト、ジエノフィルまたはジエンで誘導体化した他のポリマー 、疎水性逆相樹脂、たとえばＣ２〜Ｃ１８ポリスチレン、セルロース、メタクリ ラート、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、チオプロピルセファロース（フ ァルマシア・バイオテク）、水銀化樹脂、アガロースアジピン酸ヒドラジド（フ ァルマシア・バイオテク）、アミノ官能化セルロースビーズまたはアビジン樹脂 。 “ジエン”は、共役した２つの二重結合を含む分子であると定義される。これ らの二重結合を形成する原子は、炭素でも異種原子でもよい。ジエンはジエノフ ィルと［２＋４］付加環化反応を行うことができる。 “ジエノフィル”は、アルケン基、または炭素と異種原子の間の二重結合、ま たは２個の異種原子間の二重結合をもつ分子であると定義される。ジエノフィル は適切なジエンと［２＋４］付加環化反応を行うことができる。 ジエノフィルは、置換もしくは非置換アルケン、または置換もしくは非置換ア ルキンを含めたいかなる群であってもよく、これらに限定されない。一般にジエ ノフィルは式Ｃ＝Ｃ−ＺまたはＺ’−Ｃ＝Ｃ−Ｚの置換アルケンであり、これら の式中のＺおよびＺ’は、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＣｌ、ＣＯＡｒ、Ｃ Ｎ、ＮＯ₂、Ａｒ、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ、ＣＨ₂ＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＣＯ ＯＨ、ハロゲン、またはＣ＝Ｃから独立して選択される電子吸引基である。他の ジエノフィルにはチオカルボニル化合物、たとえばチオアルデヒド、チオエステ ル、チオケトン、チオカルバメート、チオカーボネートおよびチオアミド、なら びにニトロソ化合物が含まれるが、これらに限定されない。 “ジエノフィル誘導体化した固体支持体”はジエノフィルで官能化した固体支 持体、“ジエン誘導体化した固体支持体”はジエンで官能化した固体支持体を表 す。好ましい固体支持体は、官能化できるヒドロキシル基をもつシリカ、アルミ ナ、ゼオライト、制御多孔ガラスよりなる群から選択される無機酸化物、または ポリスチレンなどの有機支持体である（反応経路１３および１４に示す）。好ま しい態様においては、ジエノフィルはマレイミドであり、ジエンは３，５−ヘキ サジエンである。最も好ましい態様においては、ジエノフィルは１，２，４−ト リアゾリン−３，５−ジオン（ＴＡＤ）である。 “［３＋２］双極子”は、置換もしくは非置換アルケンまたは置換もしくは非 置換アルキンと３＋２付加環化反応を行うことができる任意の部分と定義される 。［３＋２］双極子の例には次式のものが含まれるが、これらに限定されない： 式中、Ｙ、Ｒ⁴およびＸは後記に定義するものである。 本発明の“５’−保護モノマー単位”は、リボース環の慣用番号を含めて一般 に下記のように表すことができる： Ｂは核酸塩基であり； ＡおよびＡ’は２’−糖置換基であり； Ｗは、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホ ルアミデート、保護されたオリゴヌクレオチド、およびメチルホスホナートより なる群から独立して選択され；そして Ｄ−Ｅはアルコール保護基（１またはそれ以上）であり、反応し得たオリゴヌ クレオチド生成物を未反応オリゴヌクレオチド出発物質から分配するための固定 基として作用する。 上記置換基に対する他の明らかな置換も本発明の範囲に含まれる。本発明は上 記の特定の反応形態に限定されず、一般的反応形態を含む。 本発明の好ましい態様において： Ｗは、ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホナートであり； ＡおよびＡ’は独立して、Ｈ、²Ｈ、³Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨＯＲ¹、ＮＨ ＯＲ³、ＮＨＮＨＲ³、ＮＨＲ³、＝ＮＨ、ＣＨＣＮ、ＣＨＣｌ₂、ＳＨ、ＳＲ³、 ＣＦＨ₂、ＣＦ₂Ｈ、ＣＲ² ₂Ｂｒ、−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_nＯＣＨ₃、ＯＲ⁴、および イミダゾールよりなる群から選択され(米国特許出願第０８／２６４，０２９号 、１９９４年６月２２日出願、表題“２’−修飾ピリミジン分子内求核置換体を 製造するための新規方法”参照、本明細書に援用する)； Ｒ¹は、Ｈおよびアルコール保護基よりなる群から選択され； Ｒ²は、＝Ｏ、＝Ｓ、Ｈ、ＯＨ、ＣＣｌ₃、ＣＦ₃、ハライド、所望により置換さ れたＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル（環式、直鎖および分枝鎖を含む）、アルケニル、アリ ール、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アシル、ベンゾイル、ＯＲ⁴、およびエステルよりなる群から選 択され； Ｒ³は、Ｒ²、Ｒ⁴、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｓ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｏ）ＣＦ₃、ＳＯ₂ Ｒ⁴、アミノ酸、ペプチドおよびその混合物よりなる群から選択され； Ｒ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケ ニルル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジ メチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水 化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択され； 最も好ましくは、ＡはＨ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃｌ、Ｆ、ＮＨＯＲ³、ＯＲ⁴、ＯＳ ｉＲ⁴ ₃よりなる群から選択され（米国特許出願第０８／２６４，０２９号、１９ ９４年６月２２日出願、表題“２’−修飾ピリミジン分子内求核置換体を製造す るための新規方法”参照、本明細書に援用する）； Ｄ−Ｅは、“生長しつつあるオリゴヌクレオチド鎖”または“オリゴヌクレオ チド生成物”を目的外の副生物および出発物質から分配しうるいかなる基であっ てもよい。分配は任意の適切な方法で実施でき、シリカゲルによるクロマトグラ フィー、遠心分離が含まれるがこれらに限定されず、物質の分配につき当業者に 既知の他のいかなる手段も含まれる。好ましい分配方法は樹脂への結合によるも のである。最も好ましい分配方法は、Ｄと、誘導体化した固体支持体（たとえば 誘導体化した樹脂、ポリマーまたは膜）との間の共有結合反応によるものである 。したがって保護基Ｄ−Ｅは、好ましくはＤが個々の樹脂または相に対し強い親 和性をもつように設計され、Ｅは５’−酸素−Ｅ結合が高い選択性で容易に開裂 するように設計される。Ｅが樹脂または相に高い親和性を示す場合、Ｄを省くこ とができる。最も好ましくは、保護基Ｄ−Ｅは、好ましくはＤが誘導体化した個 々の樹脂、ポリマーまたは膜に選択的または特異的に共有結合を形成しうるよう に設計される。Ｄと樹脂の間のこの共有結合は可逆性であってもよい。 Ｅには下記のトリチル基またはレブリン酸基またはシリル基が含まれるが、こ れらに限定されない： Ｄには下記のものから独立して選択される基が含まれるが、これらに限定され ない：Ｈ、ＯＲ⁴、共役ジエン単位をもつアルキルまたは置換アルキル基、共役 ジエン単位をもつアルコキシまたは置換アルコキシ基、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、アルケニルまた は置換アルケニル基、マレイミド置換アルコキシ基、ジエノフィル置換アルコキ シ基、アルコキシ基、共役ジエン単位をもつアルキルアミノまたは置換アルキル アミノ基、マレイミド置換アルキルアミノまたは置換アルキルアミノ基、ジエノ フィル部分をもつアルキルアミノまたは置換アルキルアミノ基、固体支持体、１ ， ３−双極子基、開環メタテシス（ｍｅｔｈａｔｈｅｓｉｓ）重合を行うことがで きる置換基、たとえば７−オキサノルボレン含有置換基、ジスルフィド、アルデ ヒド類、および金属キレート化剤、ジエノフィルまたはジエン単位をもつシリル エーテル。それらの若干例を下記に示す。以上に挙げた置換基上のアルキル基は 、１〜５０個の炭素原子、好ましくは１〜３０個の炭素原子をもつことができる 。 Y=O,NH,S,P(H)(OR⁴),P(OR⁴)₂,POH(O)(OR⁴),NH(CO),(CO)NH,O(CO)(CO)O,NH(CO)NH ,NH(CO)O,O(CO)NH,NH(CS)NH,NH(CS)O,O(CS)N なし，ＳＯ，ＳＯ₂ Ｌ＝連結基 Ｘ＝電子吸引基または電子供与基 本発明の目的に関し“核酸塩基”は下記の定義をもつ。核酸塩基はプリン塩基 またはピリミジン塩基である。核酸塩基には、現在当業者に知られているすべて のプリン類およびピリミジン類、またはそのいかなる化学修飾体も含まれる。プ リン類はプリン環の９−位の窒素を介してリボース環に結合し、ピリミジン類は ピリミジン環の１−位の窒素を介してリボース環に結合している。ピリミジンは ピリミジン環の５−または６−位で修飾でき、プリンはプリン環の２−、６−ま たは８−位で修飾できる。ある種の修飾が、出願中の米国特許出願第０８／２６ ４，０２９号、１９９４年６月２２日出願、表題“２’−修飾ピリミジン分子内 求核置換体を製造するための新規方法”、および米国特許出願第０８／４５８， ４２１号、１９９４年６月２日出願、表題“パラジウム触媒によるヌクレオシド 修飾−親核試薬および一酸化炭素を用いる方法”、および米国特許第５，４２８ ，１４９号、表題“パラジウム触媒による炭素−炭素の結合および製造方法”に 記載されており、これらを本明細書に援用する。より詳細には、核酸塩基にはウ ラシル、シトシン、Ｎ４−保護シトシン、４−チオウラシル、イソシトシン、５ −メチルウラシル（チミン）、５−置換ウラシル、アデニン、Ｎ６−保護アデニ ン、グアニン、Ｎ２−保護グアニン、２，６−ジアミノプリン、ハロゲン化プリ ン、およびプリンまたはピリミジン環に似た複素環、たとえばイミダゾールが含 まれるが、これらに限定されない。 本明細書中で用いる“出発物質”は、ＰＡＳＳの各サイクルで５’−保護モノ マー単位と反応してヌクレオチド１個またはそれ以上分延長したオリゴマーを生 成する化合物を表す。出発物質は、目的とするオリゴヌクレオチド生成物に応じ て、ヌクレオチド間［５’，３’］結合またはヌクレオチド間［３’，３’］結 合を形成するように設計できる。第１の場合は出発物質は５’−脱保護され、他 は保護された、長さｎのオリゴヌクレオチドであり、第２の場合は出発物質は３ ’−脱保護され、他は保護された、長さｎのオリゴヌクレオチドである。一般に 出発物質は５’−脱保護され、他は保護された、長さｎのオリゴヌクレオチドで あり、ここでｎは１〜１０００の整数である。出発物質は、５’−保護モノマー 単位と出発物質の反応および５’−脱保護反応に適合する保護基、たとえば塩基 不安定基で、２’，３’−保護される。さらに、ＰＡＳＳ法は制御されたオリゴ ヌクレオチド逐次重合からなるので、あるＰＡＳＳサイクルの出発物質は一般に その前のＰＡＳＳサイクルからの生成物を脱保護したものである。ＰＡＳＳ法で は３’−末端ヌクレオチドを固体支持体に固定する必要がないので、出発物質に は非ヌクレオシド修飾体が含まれてもよい。非ヌクレオシド修飾体を３’−末端 に 導入することができる。固相合成ではこれは普通は不可能である。改良された薬 物動態特性をもつオリゴヌクレオチドを製造するために、出発物質の３’−末端 への非ヌクレオシド修飾には、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（分 子量５，０００〜１００，０００）（ＰＥＧ）、または他の高分子量非免役原単 位を３’−末端モノマーとして用いることが含まれるが、これらに限定されない 。 本明細書中で用いる“生成物”は、各ＰＡＳＳサイクルで５’−保護モノマー と出発物質の共有結合反応により生成するオリゴヌクレオチドを表す。前記のよ うに、出発物質が長さｎの５’−脱保護オリゴヌクレオチドであり、かつ５’− モノマー単位が単一ヌクレオチドである場合、反応生成物は長さｎ＋１の５’− 保護オリゴヌクレオチドであろう。５’−保護モノマー単位が長さｍのオリゴヌ クレオチドブロックである場合、反応生成物は長さｎ＋ｍの５’−保護オリゴヌ クレオチドであろう。個々のＰＡＳＳサイクルの生成物は、次いで脱保護され、 次のサイクルの出発物質となる。 “欠損配列”は、個々のＰＡＳＳサイクルから得られる、そのサイクルで５’ −保護モノマー単位と反応し損なった出発物質を表す。 “生長しつつあるオリゴヌクレオチド鎖”は、目的ヌクレオチドの３’−末端 ヌクレオチドから出発して、本発明方法でヌクレオチド（Ｎ）の逐次付加により 製造された５’−脱保護オリゴヌクレオチド鎖または５’−保護オリゴヌクレオ チド鎖を表す。ＰＡＳＳ法の各反応サイクル後、生長しつつあるオリゴヌクレオ チドの長さは少なくとも１オリゴヌクレオチド分延長し、次の反応サイクルの出 発物質となる。本明細書中で用いるこの用語は、出発物質または生成物のいずれ をも表すことができ、当業者にはその用語が個々の状況で意図するものが認識さ れるであろう。 反応経路２は本発明方法を一般的に示す。５’−保護モノマー単位、たとえば ホスホルアミダイト７を溶液中の出発物質８に、活性化剤、たとえばテトラゾー ルまたは好ましくは４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）（米国特許出願第 ０８／７３０，５５６号、１９９６年１０月１５日出願、表題“オリゴヌクレオ チド合成のための改良された結合活性化剤”参照）の存在下で添加すると、１ヌ クレオチドがホスファイトトリエステル結合により付加された生成物９が得られ る。この反応経路に示したように、出発物質８は５’−脱保護され、他は保護さ れた、長さｎのオリゴヌクレオチドであり（ｎは１〜１０００の整数）、生成物 は長さｎ＋１の５’−保護オリゴヌクレオチドである。５’−脱保護オリゴヌク レオチド出発物質８は固体支持体に固定されておらず、５’−保護モノマー単位 と出発物質の反応および５’−脱保護反応に適合する保護基、たとえば塩基不安 定基で、標準法により単に２’，３’−保護される。固体支持体への３’−固定 を行わないことにより、オリゴヌクレオチドに取り込むことができる３’−修飾 の範囲が拡大される。さらに、３’−末端ヌクレオチドは、もはや支持体固定の ためにヒドロキシル置換基をもつ必要がない。したがって、固相合成では不可能 な修飾基を３’−末端へ導入できる。これには、ポリエチレングリコールモノメ チルエーテル（分子量５，０００〜１００，０００）、または他の高分子量非免 役原単位をオリゴヌクレオチド製造用３’−末端モノマーとして用いて改良され た薬物動態特性を得ることが含まれるが、これらに限定されない（米国特許出願 第０８／４３４，４６５号、１９９５年５月４日出願、表題“核酸リガンド複合 体”参照、本明細書に援用する）。 ５’−保護モノマー単位７と出発物質８の反応が完了した後、反応混合物は３ 種を含有する：未反応５’−保護モノマー単位７、未反応出発物質８、および反 応生成物である化合物９、すなわち長さｎ＋１の５’−保護オリゴヌクレオチド 。前記のように、５’−保護モノマー単位７と反応し損なった出発物質８（長さ ｎの５’−脱保護オリゴヌクレオチド）は延長していないので、欠損配列と呼ぶ 。反応生成物である化合物９は、出発物質８(長さｎのオリゴヌクレオチド)と５ ’−保護モノマー単位７の３’−ホスホルアミダイト基との共有結合反応により １ヌクレオチド分延長した５’−保護オリゴヌクレオチド鎖(長さｎ＋１)である 。生成物である化合物９は主成分であり、反応しなかった５’−保護モノマー単 位７と未反応出発物質８は少量存在するにすぎない。 プロセスのこの段階で、物質を精製し、かつモノマー出発物質を回収するため に、未反応５’−保護モノマー単位を所望により反応混合物から分離してもよい 。この態様によれば、未反応モノマーを分離しやすいイオン種の形成のために反 応させる。ホスファイトトリエステルからホスフェートトリエステルへの酸化は 、 同じ反応フラスコ内で酸化剤を添加するだけで実施できる。系内での酸化により 、目的オリゴヌクレオチド生成物９、モノマー７のホスフェート塩１０、および 未反応オリゴヌクレオチド出発物質８が得られる。モノマー７のホスフェート塩 １０はこの反応混合物中で唯一の遊離塩であるので、当業者に既知の方法で容易 に分離される。これにはアニオン交換樹脂もしくは膜によるろ過、または水相に よる抽出が含まれるが、これらに限定されない。本発明のこの態様の変法では、 ３’−末端モノマーが分子量５，０００〜１００，０００、好ましくは２０，０ ００のポリエチレングリコールモノメチルエーテルである。この場合、モノマー １０を分離するのに簡単な分子量分画膜を使用できる。 未反応モノマーを反応混合物から分離した後、次いで“オリゴヌクレオチド生 成物”を“欠損配列”から分離するのに適した任意の方法で、残りのろ液を分配 する。１態様においては、５’−保護基（Ｄ−Ｅ）と選択的または特異的に相互 作用するように設計された物質（たとえば逆相樹脂）にろ液を付与する。生成物 は、５’−保護基の成分Ｄとこの樹脂の親和性により固体支持体に捕獲または保 持される。好ましい態様においては、５’−保護基（Ｄ−Ｅ）と共有結合反応す るように設計された物質（たとえばＤがジエン単位を含む場合はジエノフィル誘 導体化した樹脂）に、ろ液を付与する。生成物は、５’−保護基の成分Ｄと樹脂 の共有結合反応により固体支持体に捕獲または保持される。５’−保護基Ｄをも たない未反応オリゴヌクレオチド出発物質８は洗い去られる。未反応出発物質は 、後続の合成に中間体として使用するために単離、保存できる。次いで、保持さ れたオリゴヌクレオチド生成物９を周知の方法で樹脂から放出させる。ある態様 では、オリゴヌクレオチド生成物を５’−酸素と保護基Ｄ−Ｅの間の結合の開裂 により放出させる。たとえば、５’−保護基がトリチル誘導体である場合、希ジ クロロ酢酸（ＤＣＡ）を用いてトリチル基を開裂させ、これによりオリゴヌクレ オチド結合生成物を放出させる。次いで、遊離した５’−脱保護オリゴヌクレオ チド結合生成物１１をさらに結合反応の出発物質として使用できる。 反応経路２ 反応経路２に示したモノマー付加サイクルの各工程が厳密に上記の順序で起きる ことが本発明の要件ではない。あるいは、結合および系内での酸化に続いて、生 成物およびモノマー１０を樹脂に共有結合または親和性により捕獲させてもよい 。その後５’−保護基を開裂させると、生成物とモノマーの両方が遊離する。こ の段階で抽出または膜によるろ過を行うと、目的外のモノマー副生物が容易に分 離される。 オリゴヌクレオチド生成物固定のために５’−保護基を利用すると、広範な３ ’−末端修飾を採用できる。これらは、５’−保護モノマー単位からの反応生成 物の分離を促進するように設計された基（たとえばこの分離に分子量分画膜を利 用するのに十分な分子量のポリマー）、または生成物を選択的に沈殿させるため の金属キレート化剤であってもよい。このような場合、これらの基は、オリゴ ヌクレオチドの３’−末端と修飾基の間に開裂性リンカー、たとえばスクシネー トリンカーを含む。あるいは、非ヌクレオシド３’−末端置換基、たとえばポリ エチレングリコールモノメチルエーテルまたはジステアリルグリセロールは、オ リゴヌクレオチド生成物の薬物動態特性を高めることができる（米国特許出願第 ０８／４３４，４６５号、１９９５年５月４日出願、表題“核酸リガンド複合体 ”参照、本明細書に援用する）。３’−末端モノマー、たとえばインビボ造影の ためにＴｃ９９ｍを保持するように設計されたキレート化剤は、診断用オリゴヌ クレオチド適用の検出体としても利用できる（国際特許出願公開第ＷＯ９６／０ ２２７４号、１９９６年２月１日公開、表題“金属錯体とオリゴヌクレオチドか ら形成された結合体、それらの結合体を含有する薬剤、放射線診断におけるそれ らの使用、およびそれらの製造方法”参照、本明細書に援用する）。従来の固相 オリゴヌクレオチド合成法では、３’−末端は生長しつつある鎖を固体支持体に 固定するのに用いられるので、このような成分を導入するのに利用できない。 従来の固相合成法と異なり、新たな結合反応を行うたびにオリゴヌクレオチド 生成物を未反応出発物質から分離するのが好ましい。したがって最終オリゴヌク レオチド生成物は本質的に純粋な形で得られ、相同性の高い欠損配列を分離する 煩わしさが除かれる。さらに、反応が溶液相で行われるので、モノマーとオリゴ ヌクレオチド出発物質との反応の収率も著しく増大する。さらに、この方式では 結合し得たオリゴヌクレオチド生成物のみが次のプロセス工程に進入するので、 キャッピング工程が不必要になる。このキャッピング工程排除は、従来法と比較 してさらに効率増大をもたらす。５’−保護モノマー単位と反応し損なったオリ ゴヌクレオチド出発物質（欠損配列）は、単離して再使用できる。ＰＡＳＳ反復 工程で欠損配列を再単離するたびに、それを同一工程の出発物質に、または同一 オリゴマーもしくは同一３’−末端フラグメントを共有するオリゴマーの後続合 成での反復工程の出発物質にブレンドできる（反応経路３参照）。したがって欠 損配列は後続のオリゴマー製造に有用な逐次構築ブロックとなる。これはプロセ ス効率を高めるだけでなく、最終粗生成物の純度も著しく高める。これによりさ らにモノマーを制限試薬として使用でき、したがってプロセス効率が著しく高ま る。 反応経路３ 上記に概説した、生成物を出発物質から分離するための固定基として５’−保 護基を利用し、欠損配列を後続合成の中間体にすることができる合成方式は、ホ スホルアミダイト結合化学に限定されない。これは他の結合反応、たとえばＨ− ホスホナートまたはホスフェートトリエステル結合化学にも適合する（Ｇａｆｆ ｎｅｙおよびＪｏｎｅｓ(１９８８)Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ.２９： ２６１９−２６２２参照）。この方式はオリゴヌクレオチド合成を自動化し、効 率の高い大規模オリゴヌクレオチド製造に理想的に適している。 本明細書に記載した技術的観点は、ＰＡＳＳ合成法以外にも適用される。たと えばオリゴヌクレオチド合成に際しての目的種または目的外種の共有捕獲は、従 来の固相法または溶液相法での高分離能一工程精製法にも適用できる。末端モノ マーのみがその５’−末端にジエン修飾トリチル基をもつ場合、ジエノフィル誘 導体化した樹脂または膜に全長生成物を選択的に固定すると、大部分の欠損配列 が粗製混合物から分離される（反応経路１参照）。他の適用例では、共有捕獲に 適した部分を含むキャッピング試薬（前記のすべてのＤ基に適合）、たとえばジ エン修飾した無水酢酸（または一般に、Ｄ修飾した無水酢酸）、またはジエン修 飾したシリルクロリド、たとえば無水３，５−ヘキサジエンオキシ酢酸もしくは トリ−（３，５−ヘキサジエンオキシ）シリルクロリドを用いると、各モノマー 付加後（溶液相オリゴヌクレオチド合成法の場合）、または固体支持体から粗製 オリゴヌクレオチドを開裂させた後（従来の固相オリゴヌクレオチド合成法の場 合）、すべてのキャップ付き欠損配列を粗製オリゴヌクレオチドバッチから分離 できる。さらに他の適用例では、ジエン修飾したトリチル基とジエノフィル修飾 した樹脂との反応により、カチオン交換樹脂を容易に製造できる。 ２’−フルオロピリミジン修飾したＲＮＡオリゴヌクレオチドの二量体を、実 施例１でＰＡＳＳにより組み立てる（反応経路４）。第１反応では、ホスホルア ミダイト結合化学により３’，３’−ホスホジエステル結合を形成する。オリゴ ヌクレオチドは、３’−末端に３’，３’−ホスホジエステル結合を取り込ませ ることにより３’−から５’−へのエキソヌクレアーゼ分解に対し保護されるこ とが多い。結合後、反応混合物を系内で酸化すると、未反応チミジン出発物質１ ２、酸化されたアミダイトモノマー１５、および酸化された二量体生成物１４が 生成する。 反応混合物をジエチルアミノエチレン（ＤＥＡＥ）セアァデックス（登録商標 ）床でろ過することにより、酸化されたアミダイトモノマー１５を分離する。ろ 液のＨＰＬＣ分析は、図３に示すように酸化されたアミダイトモノマー１５がＤ ＥＡＥセアアデックスに保持されたことを示す。酸化された二量体生成物１４お よび未反応チミジン出発物質１２を含有するろ液を濃縮し、６０％アセトニトリ ル／水に再溶解し、Ｃ１８フィルタープラグに装入する。樹脂を７０％水／アセ トニトリル、次いで５０％水／アセトニトリルで洗浄して、未反応チミジン出発 物質１２を完全に溶離する。この時点でトリチル化二量体生成物１４のみを含有 する樹脂を、次いで水で洗浄し、続いて８０％酢酸／水で処理して脱トリチル化 する。次いで樹脂を５０％アセトニトリル／水で洗浄すると、最終生成物１６が 溶出し、トリチル種は保持される（図４）。 反応経路４ 実施例２（反応経路５）には、５’−保護モノマー単位がホスホルアミダイト ではなくＨ−ホスホナートである本発明方法を示す。この例では、３’−末端に ３’，３’−ヌクレオチド間結合をもつＨ−ホスホナートチミジン三量体（Ｔ− Ｔ−［３’，３’］−Ｔ三量体）２０を製造する。この液相結合反応の効率はき わめて高いので、未反応３’−末端フラグメント１９は検出されなかった。した がって逆相工程は、生成物からトリチル基を開裂および分離するためだけに用い られる。 実施例３（反応経路６）には、５’−保護基（Ｄ−Ｅ）として５’−Ｏ−（４ ，４’−ジオクタデシルオキシトリチル）（ＤＯＴ）を含むホスホルアミダイト モノマーの合成を記載する。 実施例４には、５’−保護基（Ｄ−Ｅ）と特定の樹脂または相との選択的また は特異的相互作用に基づいて、結合生成物を未反応オリゴヌクレオチド出発物質 （欠損配列）から分離できることを示す。この例では、Ｃ１８逆相樹脂上におけ る４，４’−ジオクタデシルトリフェニルメタノール（ＤＯＴ）２３の移動性を 、４−デシルオキシ−４’−メトキシトリアノールおよびジメトキシトリアノー ル（ＤＭＴ）のものと比較する（表１参照）。有機溶剤中でのＤＯＴ基とＣ１８ 樹脂の相互作用が強いので（たとえばメタノール(Ｒ_f＝０)、アセトニトリル(Ｒ_f ＝０)）、混合物をＣ１８樹脂に装入し、未反応出発物質を有機溶剤で洗い去る ことにより、生成物を１工程で出発物質から分離できる。次いで有機溶剤中のハ ロ酢酸でトリチル保護基を開裂させることにより、結合生成物をチャンバーから 溶離できる。トリチル基は樹脂に保持される。 実施例５には、溶液中での六量体オリゴヌクレオチド（５’−ＨＯ−Ｔ−Ｔ− Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ）の組立てを記載する。過剰のモノマーを分離 するためにアニオン交換媒体を用い、欠損配列を保持せずに５’−ＤＭＴ保護生 成物を選択的に捕獲するためにＣ１８逆相樹脂を用いた。実施例５にみられるよ うに、各モノマー添加を２工程で行う。第１工程ではホスホルアミダイト結合化 学を用いて５’−保護モノマー単位を出発物質に結合させる。結合後、反応混合 物を系内で酸化すると、未反応出発物質（欠損配列）、酸化されたアミダイトモ ノマー、および酸化された生成物が得られる。酸化されたアミダイトモノマーは 、反応混合物をアニオン交換媒体、たとえばＤＥＡＥセアアデックス（登録商標 ）でろ過することにより分離される。 第２工程では、酸化された生成物および未反応出発物質（欠損配列）を含有す るろ液を希酸で処理して脱トリチル化する。使用できる希酸の例には、希鉱酸、 希トリクロロ酢酸、希ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）、ルイス酸、たとえばＺｎＢｒ₂ 、ニトロメタン、トシック酸（ｔｏｓｉｃ ａｃｉｄ）および過塩素酸が含まれ るが、これらに限定されない。次いで混合物をクロマトグラフィーにより分離す る。あるいは、生成物および未反応出発物質の混合物をまず逆相樹脂で分離した 後、脱トリチル化し、樹脂から脱トリチル化生成物を放出させる。実施例５に示 したデータは、ＰＡＳＳ法によれば反復工程ごとに本質的に純粋なオリゴヌクレ オチ ド中間体が最小の原価制限モノマー消費量で得られることを示す。 実施例６（図５）には、本発明方法に用いるために設計した、未反応５’−保 護モノマー単位を反応混合物の他の物質から分離する自動抽出／ろ過システム１ １０を模式的に示す。前記のように、本発明方法は自動化でき、オリゴヌクレオ チドの大規模製造に理想的に適している。自動抽出／ろ過システム１１０は２つ の中枢をもつ：抽出器１１２およびクロマトグラフィー樹脂ろ過チャンバー１１ ４。抽出器は管１１８でクロマトグラフィー樹脂チャンバーと流体連絡している 。第１の三方弁１２０が、抽出器１１２からクロマトグラフィーろ過チャンバー １１４への内容物の流れを制御する。第２弁１２２は、チャンバー１１４への溶 剤の添加を制御する。第３弁１２４は、チャンバー１１４からの排出物の採集を 制御する。３つすべての弁が制御装置１２６に電気的に結合し、これが３つすべ ての弁１２０、１２２および１２４をそれらの種々の流れ状態間で作動させる信 号を発する。 抽出器１１２は、２つの入口１２８および１３０、撹拌機１３２、ならびに出 口１３４を備えている。反応混合物を入口１２８から抽出器１１２へ送入し、抽 出溶剤（たとえばＣＨ₂Ｃｌ₂）および水性緩衝液を入口１３０から抽出器へ送入 する。混合物を撹拌機１３２で撹拌してもよく、その後、層を分離させる。次い で第１の三方弁１２０を開くと、有機下層が出口１３４から導電率モニター１３ ６へ流入し、次いで管１１８を通ってチャンバー１１４へ流入する。導電率モニ ターは制御装置１２６に電気的に結合している。導電率の上昇は有機層が導電率 モニターを通り過ぎ、水層が進入し始めたことを示す。導電率上昇は制御装置１ ２６により認識され、これが第１の三方弁１２０へ信号を送り、この三方弁を作 動させて水層をチャンバー１１４からそらす。 チャンバー１１４は、３つの入口１３８、１４０および１４２、ならびに出口 １４４を備えている。有機層は入口１３８からチャンバー１１４に入り、入口１ ４０からチャンバーに入る加圧不活性ガス源（たとえばアルゴン）でチャンバー から押し出される。次いでチャンバーは、入口１４２からチャンバーに入る溶剤 （たとえばＣＨ₂Ｃｌ₂）で洗浄される。溶剤の添加は、第２弁１２２を選択的に 作動させる制御装置により制御される。制御装置１２６が第３弁１２４を開くこ とにより、有機排出物が出口１４４から採集される。有機排出物は、反応生成物 、すなわち１ヌクレオチド分延長した出発物質、および未反応オリゴヌクレオチ ド出発物質（欠損配列）を含有する。未反応５’−保護モノマーはチャンバー１ １４内に保持される。有機溶剤の溶出後、入口１４０から添加した緩衝液でチャ ンバー１１４を洗浄すると、未反応５’−保護モノマー単位が溶離される。次い でチャンバー１１２を反応混合物の溶離に用いる有機溶剤（たとえばＣＨ₂Ｃｌ₂ ）で平衡化する。次いで有機排出物は逆層樹脂上を通過し、生成物が未反応オリ ゴヌクレオチド出発物質（欠損配列）から分離される（実施例６参照）。 実施例７には、３’側残基修飾として分子量２０，０００のポリエチレングリ コールを用いる１５塩基オリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＡＡＡＣＧＴＡＡＴＧ Ｇ−［３’，３’］−Ｔ−Ｔ−３’）(配列番号：１)の溶液相合成を記載する。 この実施例は、溶液相合成が効率的であること、および従来の固相合成法では直 接に製造できなかった３’−修飾オリゴヌクレオチドを溶液中で製造できること を証明する。この実施例には、溶液相合成法に必要な基本工程を概説する。これ は、典型的なＰＡＳＳサイクルの場合のようなオリゴヌクレオチド結合生成物を 樹脂に捕獲する工程を必要としない。したがってこの実施例は、ＰＡＳＳにおい て予想される生成物捕獲が効率および生成物純度に与える影響も証明する。各モ ノマー付加サイクルでそのような生成物捕獲を行うと、従来の固相合成の場合の ようなジエチルエーテルからの煩雑な沈殿はもはや必要ない。さらに、欠損配列 が各モノマー付加サイクルで分離されるので、ＰＡＳＳにより得られる生成物の アニオン交換クロマトグラムは、図６のクロマトグラムに存在する多重ピークで はなく単一ピークのみを示すと予想される。 実施例８（反応経路７および８）には、５’−ジ−（３，５−ヘキサジエンオ キシ）トリチルチミジンホスホルアミダイトモノマー（３２）および５’−ジ− （２，４−ヘキサジエンオキシ）トリチルチミジンホスホルアミダイトモノマー を含めた各種ジエン修飾トリチルアルコールの合成を記載する。 実施例９（反応経路９）には、ジエン―４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエン オキシトリチルアルコール（３０）および４，４’−ジ−２，４−ヘキサジエン オキシトリチルアルコール（３６）―をマレイミドへの効率的な付加環化に 使用できることを証明する（それぞれ反応１および２（反応経路９））。表４に これら２反応につき種々の条件下での反応速度を示す。表４に示したデータから 、修飾トリチル化合物（３０）の方が種々の反応条件下で速やかに反応すること が明らかである。予想されるように、ジエノフィル当量数の増加および反応混合 物への水の添加が共に反応速度を高めることも明らかである。各トリチル基上に は２個のジエンが存在するので、すべてのトリチルアルコールまたはヌクレオチ ドをマレイミド修飾した固相支持体に捕獲するには５０％以上のジエン置換基が 反応すれば十分であることを認識するのが重要である。これは、反応を行うのに 必要な時間を短縮する。 速度を比較するために、５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエンオ キシトリチル）チミジン（５’−（ＤＨＤＴ）チミジン）（３１）および５’− Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル）チミジン３’−ホ スホルアミダイト（３２）を用いて、反応＃３（表４）につき示したものと同じ 反応条件下でディールス−アルダー反応を行った。結果を表５に示す。この場合 も１時間以内に５０％以上のジエン基が付加環化反応した。これは、ＰＡＳＳで 予想される生成物捕獲が、迅速かつ効率的なモノマー付加サイクルを可能にする のに妥当な時間枠内で起きうることを示唆する。適切に置換されたジエンおよび ジエノフィルを用いるとディールス−アルダー付加環化反応速度を調節できるこ とは、広く知られている。したがって適切なジエンとジエノフィルの組合わせを 用いることにより、生成物捕獲反応速度を調節できる。 実施例１０には、置換マレイミド−ポリスチレン樹脂上にオリゴヌクレオチド 生成物を捕獲するために４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル保 護基を用い、ＰＡＳＳにより３’−ＰＥＧ誘導体オリゴヌクレオチドを製造する ことにつき記載する。この捕獲工程で、反応混合物から未反応出発オリゴヌクレ オチド（欠損配列）が分離される。これを所望により単離し、後続の生産バッチ にオリゴヌクレオチド組立ての同じ時点でブレンドするために保存しておくこと ができる。３’−ＰＥＧ末端修飾は、インビボでの療法用オリゴヌクレオチドの 薬物動態挙動を向上させるのに特に有用である。 実施例１１には、ジエンとして５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジ エンオキシトリチル）ヌクレオシド(５’−Ｏ−ＤＨＤＴ−ヌクレオシト)４６、 ジエノフィルとしてマレイミド置換固体支持体４５を用いたディールス−アルダ ー生成物捕獲により、ＰＥＧ誘導体化されていないオリゴヌクレオチドを製造す るための一般的反応経路を記載する（反応経路１１）。前記のように、全長オリ ゴヌクレオチドを樹脂または膜に捕獲することはＰＡＳＳ法の自動化に不可欠で ある。捕獲の一般的設計は、トリチル基またはトリチル類似体を固体支持体、た とえば樹脂、膜またはポリマーに不可逆的に結合させるもの（４７）である。結 合すると、不可逆的に結合したトリチル基４８から分離することにより、オリゴ ヌクレオチド４９が放出される。この一例は、上記５’−Ｏ−ＤＨＤＴ−ヌクレ オシドのディールス−アルダー捕獲である。樹脂結合した活性ディールス−アル ダージエノフィルはジエンであるトリチルと共有結合反応し、慣用される脱トリ チル化法により、ヌクレオシドが固体支持体および結合トリチル基から放出され る。この捕獲法を用いて、実施例１１に記載したようにＰＥＧ誘導体化されてい ないオリゴヌクレオチドをＰＡＳＳにより製造できる（反応経路１２）。 反応経路１１ 多数の固体支持体がディールス−アルダー反応による捕獲および放出に適して いると考えられる。好ましい固体支持体は、反応経路１３および１４に示すよう に官能化できるヒドロキシル基をもつシリカ、アルミナ、ゼオライト、制御多孔 ガラスよりなる群から選択される無機酸化物である。シリカ、アルミナ、ゼオラ イト、制御多孔ガラス（ＣＰＧ）などの無機酸化物は、容易に酸化できる表面ヒ ドロキシル基をもつ。ＣＰＧは例外の可能性があるが、これらの無機固体支持体 は市販の樹脂よりはるかに高い装填容量をもつことが多い。通常これらの無機酸 化物はヒドロキシル基をより多能または反応性の官能基をもつシリル化剤でシリ ル化することにより官能化される（反応経路１３）。 反応経路１３ 反応性ジエノフィルを共有結合させる他の方法、たとえば６−マレイミド−カプ ロン酸などの分子と表面ヒドロキシル基の間のエステル化も考えられる（反応経 路１４）。ジエノフィルの表面装填量および／または反応性を高めることが認め られるならば、表面とジエノフィル基の間の他の共有結合リンカーも使用できる 。 反応経路１４ より好ましくは、固体支持体はポリスチレンまたはアミノ官能化ポリスチレン などの有機支持体である。これらの支持体は当業者に既知の標準法により誘導体 化することができる。後記のように、実施例１８〜２１（反応経路２３〜２６） にトリアゾリンジオン誘導体化したアミノ官能化樹脂の調製方法２例を示す。 実施例１２（反応経路１５）には、ディールスーアルダー付加環化による生成 物捕獲を用いた二量体製造につき記載する。３’，３’−結合した５’−ＤＨＤ ＴＯ−Ｔ−Ｔ二量体の捕獲速度は、樹脂結合したマレイミド基の過剰度に依存す る。生成物捕獲は定量的に進行する。捕獲された生成物は、ジクロロメタン中３ ％ジクロロ酢酸により、樹脂から容易かつ定量的に放出される。中和および濃縮 後、純粋な生成物が得られる。 実施例１３には、ブロックのひとつを樹脂に捕獲することによりブロックから オリゴヌクレオチドを組み立てる方法であって、ジエノフィル誘導体化した樹脂 への５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル）保護オ リゴヌクレオチドの付加環化を用いる方法を記載する。 実施例１４（図８）には、自動抽出／ろ過システム２００、および実施例１０ に記載したように各サイクルでのモノマー付加生成物の共有結合捕獲により３’ −末端ポリエチレングリコールをもつオリゴヌクレオチドを自動的に製造するよ うに設計されたプロセスを模式的に示す。前記のように、制御されたヌクレオシ ドホスホルアミダイト逐次重合からなるＰＡＳＳ法は、自動化に理想的に適して いる。各モノマー付加は化学処理工程のシーケンスからなる。このシーケンスは 各モノマー付加（サイクル）につき同じである。サイクル間の唯一の違いは、付 加されるモノマーの性質である。典型的なオリゴヌクレオチドは２〜１２の異な るモノマーから構成され、それらが一定の目的に従ったプログラマブルシーケン スで、一般に１回より多く付加される。 図８から分かるように、自動抽出／ろ過システム２００は３つの中枢をもつ： 反応器２１２、ろ過チャンバー２１４―これはジエノフィル修飾した固体支持体 ２１５を収容する―および限外ろ過膜システム２１８。 実施例１４には、捕獲樹脂から放出された後の生成物オリゴヌクレオチドと過 剰のモノマーを分離するのに必要な条件に適合する種々の限外ろ過膜も挙げる。 膜を試薬／生成物の吸着、保持および反応性に基づいて評価する。実施例１４に 述べた膜は、溶剤により影響を受ける流束速度（ｆｌｕｘ ｒａｔｅ）、吸着に よる生成物損失、そして最後に拡散反射ＦＴＩＲに基づいて、適切であると認め られた。 実施例１４には説明のために３’−末端ＰＥＧオリゴヌタレオチドの製造を記 載したが、この自動合成法はオリゴヌクレオチドに高分子が結合しても、結合し なくても実施できる。後者の場合、図５に示したように分子量分画膜の代わりに 液／液抽出工程を用いてもよい。 実施例１５には、マレイミド誘導体化したトリチル基の合成を記載する。前記 のように、ＰＡＳＳプロセスに不可欠な部分は、ｎ−１配列の分離方法である。 １方法は、マレイミド修飾−トリチル基を含むモノマーを用いるオリゴヌクレオ チド合成である。これらのトリチル基はジエン修飾樹脂と反応しやすく、樹脂を 洗浄するだけでｎ−１を分離でき、次いで脱トリチル化すると、全長オリゴヌク レオチドが放出される。 実施例１６には、溶液相合成および従来の固相合成中に欠損配列を選択的に分 離するための、ジエン修飾−キャッピング試薬の使用を記載する。一般に欠損配 列を無水酢酸でキャッピングする。無水酢酸によるキャッピング反応は、迅速に ほぼ定量的に進行する。したがって、実施例７に記載したように、無水酢酸のジ エン修飾類似体、たとえば無水３，５−ヘキサジエン酸（７４）および無水３， ５−ヘキサジエンオキシ酢酸（７５）（反応経路１８）を用いると、溶液相合成 の各サイクルで欠損配列が効率的にキャッピングされ、かつジエノフィル誘導体 化した樹脂または膜への付加環化によりキャップ付き欠損配列を分離することも できる。従来の固相合成中に導入された５’−アセチルキャッピング基は、アン モニア開裂および脱保護工程で除去される。試薬７４または７５を固相合成にお けるキャッピング試薬として、また後に欠損配列の選択的分離のための手がかり として用いるためには、実施例１２に記載するように、非塩基性条件下で開裂し うるリンカーを介してオリゴヌクレオチドを支持体に結合させなければならない 。あるいは、従来の固相合成の終了時に用いられる典型的な塩基性脱保護条件下 で除去されやすくないキャッピング試薬を使用できる。 ヘキサジエンオキシシリルクロリド（７６、７７および７８）は、粗製オリゴ ヌクレオチドをアンモニアで支持体から開裂させると、欠損配列を選択的に分離 できる。シリルエーテル基はこれらの条件下では分離されない。したがって、ジ エノフィル誘導体化した樹脂または膜との反応により、目的生成物からヘキサジ エンオキシシリルキャップ付き欠損配列を分離できる。 反応経路１８ 反応経路１９に、一般に好ましい本発明方法を示す。前記のように、ＰＡＳＳ 法に不可欠なのは、モノマーを付加するたびに、好ましくは樹脂、ポリマーまた は膜への共有結合固定により生成物を化学選択的に単離することである。好まし い態様においては、共有結合固定方法は１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジ オン（ＴＡＤ）修飾した固体支持体をジエノフィル樹脂成分として用いるディー ルス−アルダー反応によるものである。トリアゾリンジオンを使用すると、固定 反応が著しく促進されるだけでなく、この重要な工程を視覚監視することもでき る。ＰＡＳＳ法のこの態様においては、ウラゾールを固体支持体に結合させる。 固定化したウラゾールをＮＢＳ、Ｎ₂Ｏ₄、ＮＣＳまたは次亜塩素酸ｔ−ブチルな どの酸化剤で酸化して、テトラゾリンジオンにする。これらのＴＡＤ樹脂は、生 長しつつあるオリゴヌクレオチド上のヘキサジエン標識トリチル基（ＤＨＤＴ） と速やかに反応する（室温で数分以内）。反応経路１９を参照すると、ＴＡＤ樹 脂８０とジエンートリチル修飾されたオリゴヌクレオチド生成物(たとえば４６) との反応により、固定された生成物８１が生成する。ＴＡＤ基は、ジエン−トリ チル修飾された生成物との反応により固定される前は、特徴的な濃赤／紫色を呈 する。２＋４付加環化反応により固定されると、たとえば固定された生成物８１ の場合は色が淡黄色に変化する。したがって、赤色が持続するまでＴＡＤ−樹脂 を粗製結合生成物に連続添加するだけで、完全な生成物固定が達成される。固定 された生成物は、前記のように慣用される脱トリチル化により樹脂から放出され る。 反応経路１９ 好ましい態様においては、ウラゾール誘導体化樹脂を使用前に酸化して、対応 する１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン樹脂（ＴＡＤ−樹脂）にする。 樹脂を適切な溶媒で洗浄することにより、酸化剤を樹脂から除去する。酸化剤を 完全に樹脂から除去した時点で、ディールス−アルダー捕獲反応がその中で行わ れる溶媒を樹脂に添加して樹脂を膨潤させる。次いでヘキサジエンオキシトリチ ル（ＤＨＤＴ）−誘導体化オリゴヌクレオチドを、ＤＨＤＴ １当量当たり少な くとも２当量の過剰の樹脂に添加する。ＴＬＣまたはＨＰＬＣにより、オリゴヌ クレオチドの消失につき反応を監視する。あるいは、過剰の未反応ＴＡＤ樹脂に 特徴的な濃赤色が持続するまで、５’−末端ＤＨＤＴ基をもつ粗製オリゴヌクレ オチド生成物にＴＡＤ樹脂を添加する。上記方法で反応の完了が判定されると、 適切な溶媒で樹脂を十分に洗浄して浸出性物質を除去する。次いで樹脂を適切な 溶媒に再懸濁し、脱トリチル化と同時に５’−脱保護オリゴマーを放出するのに 十分な強度の酸で５〜２０分間処理する。本発明の好ましい態様においては、ジ クロロメタン中３％ジクロロ酢酸溶液を用いる。樹脂を溶液からろ過により分離 し、有機層を合わせて塩基性水溶液、好ましくはＮａＨＣＯ₃溶液、続いて中性 水溶液で、有機層のｐＨが６〜７になるまで繰り返し洗浄する。次いで有機層を Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、濃縮して、５’−脱保護オリゴマーを固体として得る。 実施例１７（反応経路２２、図１０）には、ジエン置換トリチルアルコール、 ５’−Ｏ−(４,４’−ジ−３,５−ヘキサジエンオキシトリチル)チミジン(５’ −ＤＨＤＴＯ−ｄＴ)(３１)とフェニルトリアゾリンージオン(ＰＴＤＡ)(８２) のディールス−アルダー反応を記載する。この実施例は、トリアゾリンジオンを 用いると反応速度が高まること、および視覚により反応を監視できることを示す 。 実施例１８〜２１（反応経路２３〜２６）には、トリアゾリンジオン誘導体化 樹脂を調製するための一般法２例を示す。第１法―実施例１８および１９―では 、安息香酸で誘導体化したウラゾールをアミノ官能化樹脂と反応させる。第２法 ―実施例２０―では、ウラゾールを樹脂上で直接に形成する。実施例２１には、 ウラゾール官能化した固体支持体を酸化するための種々の方法を記載する。実施 例２２（反応経路２７）には、カプロン酸で誘導体化したウラゾールにより固体 支持体を誘導体化することを記載する。この結合ウラゾールを次亜塩素酸ｔ−ブ チルで酸化すると、トリアゾリンジオンで誘導体化した樹脂（９９）が生成する 。実施例１９および２２は、ウラゾールをアミド結合により固体支持体に結合さ せることを示す。ウラゾールをエステル結合により固体支持体に結合させること もできる。 ＴＡＤ樹脂を調製するための別法は、固体支持体をジエンで誘導体化し、続い てこのジエンを過剰のビス−ＴＡＤ分子と反応させるものである。この方法（図 １１に示す）では、ウラゾールを固体支持体上で酸化してＴＡＤにする必要なし にＴＡＤ樹脂が生成する。この方法は、樹脂の官能化が容易であり、安価な出発 物質を利用でき、ビス−ＴＡＤが安定であるため長期保存できるので、好ましい 。固体支持体は、樹脂、膜またはポリマーから選択できる。例にはシリカ、セル ロース、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、メタクリラート、ポリスチレ ンおよびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。 実施例２３（反応経路２８〜３０）には、ビス−ＴＡＤ化合物の合成、ジエン 誘導体化樹脂の合成、およびこれら２化合物のディールス−アルダーにより、ウ ラゾールを固体支持体上で酸化してＴＡＤにする必要なしにＴＡＤ樹脂を形成す ることを示す。 他のジエノフィルを固体支持体に結合させて捕獲−放出工程に用いてもよく、 これにはたとえばチオカルボニル化合物、たとえばチオケトン、チオアルデヒド 、チオエステル、チオカルバメート、チオカーボネートおよびチオアミド、β− ニトロアクリル酸およびニトロソ化合物が含まれるが、これらに限定されない。 チオカルボニル化合物は反応性の高いジエノフィルであり、それらに対応するカ ルボニル化合物よりはるかに反応性が高い。チオカルボニル化合物とブタジエン のディールス−アルダー反応は、室温において良好な収率で進行する(Ｗｅｉｎ ｒｅｂおよびＳｔａｉｂ（１９８２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３８：３０８７ )。固体支持体に容易に共有結合しうる他の反応性ジエノフィルは、β−ニトロ アクリル酸である（Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９９０），Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔ ｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ，パ ーガモン・プレス，ｐ．９９）。このジエノフィルも緩和な条件下でブタジエン 誘導体と反応する。有用性をもつ他の一群のジエノフィルは、ニトロソ化合物で ある（Ｂｏｇｅｒら（１９８５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：１９９１１）。 これらの化合物は、系内でベンゾヒドロキサム酸からテトラアルキル過ヨウ素酸 塩溶液処理により生成させることができる。ニトロソ基は、生成すると速やかに ブタジエンとディールス−アルダー付加環化反応する。 実施例２４（反応経路３１）には、チオカルボニル誘導体化樹脂をジエノフィ ルとして標準ＤＨＤＴ捕獲−放出サイクルに使用することを記載する。この樹脂 は有機合成の標準法で容易に製造され、ジエノフィルの生成に酸化工程を必要と しない。 実施例２５（反応経路３２）には、ニトロアクリラート誘導体化樹脂をジエノ フィルとして標準ＤＨＤＴ捕獲−放出サイクルに使用することを記載する。チオ カルボニル樹脂と同様に、ニトロアクリラート誘導体化固体支持体は予め活性化 する必要がない。この樹脂を標準ＤＨＤＴ捕獲−放出サイクルに用いる。 実施例２６（反応経路３３）には、系内で樹脂結合チオスルフィナートから形 成したチオアルデヒドの使用を記載する。ＤＨＤＴを含むオリゴヌクレオチドの 存在下で形成したチオアルデヒド樹脂は、ＤＨＤＴとディールスーアルダー反応 して目的生成物を樹脂に捕獲することができる。 実施例２７（反応経路３４）には、ニトロソホルメート樹脂をジエノフィルと して標準ＤＨＤＴ捕獲−放出サイクルに使用することを記載する。ニトロソホル メート樹脂は、系内でヒドロキシカルバミン酸誘導体化樹脂より、ホスファイト トリエステルからホスフェートトリエステルへの酸化で得たオリゴ混合物中に存 在する過剰のテトラアルキル過ヨウ素酸塩により形成される。ニトロソホルメー ト基はきわめて反応性のジエノフィルであり、ディールス−アルダー付加環化反 応により樹脂上のＤＨＤＴ部分を速やかに捕獲するであろう。 図１２は、本発明の好ましい態様に従ったオリゴヌクレオチドの生成物固定式 逐次合成（ＰＡＳＳ）に関する１モノマー付加サイクルを模式的に示す。この図 について述べると、出発物質（３’−末端オリゴヌクレオチドフラグメント）を 活性化剤の存在下で次の５’−保護モノマーに結合させる。結合が行われた時点 で、可溶性の有機酸化剤、好ましくは過ヨウ素酸テトラブチルアンモニウムを反 応混合物に添加して、ホスファイトをホスフェートに酸化する。有機溶媒に可溶 性である他の酸化剤、たとえばジ酢酸ジヨードベンゼンも使用できる。酸化後、 ジエノフィル樹脂、好ましくはトリアゾリン−ジオン誘導体化樹脂を添加する。 結合生成物が完全に樹脂に固定されるまで固定反応を続ける。次いで樹脂を洗浄 し、樹脂に固定された５’−末端保護基（好ましくはＤＨＤＴ基）をオリゴヌク レオチドフラグメントの５’−酸素から分離する試薬に暴露する。好ましくは希 ジクロロ酢酸を用いて行われるこの工程により、生成物が樹脂から放出される。 反応混合物をダウエックス（ＤＯＷＥＸ）樹脂に通すことにより、酸試薬を除去 する。生成物を沈殿により単離する。生成物を反応溶媒（好ましくはアセトニト リルを含有する溶媒混合物）に溶解すると、次のモノマー付加を行える状態にな る。 このサイクルの幾つかの別法が同様に有効である。たとえば酸化前に固定工程 を実施してもよい。この場合、ホスファイトをホスフェート種に変換する酸化剤 （たとえばピリジン緩衝ヨウ素水溶液）に暴露することにより、生成物を酸化す る。さらに、過剰のジクロロ酢酸を除去するためのダウエックス工程は、必ずし も必要ではない。生成物を樹脂から放出させた後、沈殿させ、沈殿の洗浄、摩砕 処理、または沈殿の再結晶により酸を除去できる。 実施例２８には、生成物を１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＴＡ Ｄ）修飾樹脂にディールス−アルダー反応により共有結合固定するＰＡＳＳ法の １モノマー付加サイクルを記載する。 ディールス−アルダー反応は反応生成物を固体支持体に固定するための好まし い方法であるが、他の方法も本発明の範囲に含まれるものとする。たとえば２＋ ３双極子付加環化反応を固定工程に使用できる。この態様においては、オリゴヌ クレオチド生成物上または樹脂上のＤ基の部分を１，３−双極子置換基と反応さ せて、環状５員付加生成物を形成する。２＋２双極子付加環化反応も固定工程に 使用できる（反応経路２０）。 反応経路２０ この態様においては、ケテン（シソシアナートその他の反応性クムレン（ｃｕｍ ｍｕｌｅｎｅ））で誘導体化した固体支持体を調製し、オレフィン修飾した５’ −トリチルオリゴヌクレオチドで処理する。最近発見された７−オキサノルボル ネン開環メタテシス重合（ＲＯＭＰ）も、ＰＡＳＳ法の捕獲−放出工程に利用で きる（反応経路２１）。 反応経路２１ この実施例では、７−オキサノルボルネン誘導体化トリチルを製造し、ヌクレ オシドの５’−アルコールに結合させる。ホスホルアミダイト（またはＨ−ホス ホナート）を調製し、次いで標準結合サイクルに用いる。結合（およびホスホル アミダイトの酸化）後、ＲＯＭＰ重合を実施し、得られたポリマー溶液をろ過し 、洗浄する。次いでポリマーをＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＣＡ混合物で処理して全長オリゴ ヌクレオチドを放出させる。 実施例２９（反応経路３５）には、炭化水素を用いる一般的なジオン−オール 合成を記載する。 反応経路３６には、樹脂結合モノマーへの結合による生成物固定を用いたオリ ゴヌクレオチド合成を示す。この好ましい態様は、ジエントリチルヌクレオシド ホスホルアミダイトの形成を必要とせず、かつトリアゾリンジオン樹脂の調製を 必要とせずに、ＰＡＳＳ法の望ましい観点を保持する。Ｎ−保護５’−および３ ’−ヒドロキシルヌクレオシドは５’−ヒドロキシルにおいて塩化トリチルと選 択的に反応することが知られている（ＢｅａｕｃａｇｅおよびＲａｄｈａｋｒｉ ｓｈｍａｎ（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３）。この選択 性を利用して、市販の塩化トリチル樹脂（カルビオケム−ノバビオケムから入手 ）を用い、Ｎ−保護ヌクレオシドを５’−ヒドロキシル基において結合させると 、固体支持体に直接結合した５’−トリチル化ヌクレオシドが得られる(１３７) 。この樹脂結合ヌクレオシドの３’−末端を過剰のホスフィチル化試薬で処理す ることにより、ホスフィチル化できる。ヌクレオシドは固体支持体に結合してい るので、過剰の試薬は洗浄工程で容易に除去される。得られたホスホルアミダイ ト樹脂（１３９）を次いでＤＣＩおよび５’−ヒドロキシル−Ｎ−保護−３’− 保護ヌクレオシド(すなわち、他のすべての部位を保護した５’−ヒドロキシル オ リゴヌクレオチド)で処理して、樹脂結合ホスホトリエステル二量体(または５’ −ヒドロキシルオリゴヌクレオチドの場合はオリゴヌクレオチドのｎ＋１ｍｅｒ )を得ることができる。未反応５’−ヒドロキシル（モノマーまたはオリゴ）は 樹脂の洗浄により回収できる。得られたホスファイトトリエステルは、樹脂を適 切な酸化性溶液（ヨウ素もしくはテトラアルキル過ヨウ素酸塩を使用するか、ま たはホスホロチオエートの形成には標準的Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を使用できる） で洗浄することにより、ホスフェートトリエステルに酸化される。次いで標準脱 ブロックサイクルを行うことにより、目的生成物１４１を樹脂から開裂させるこ とができる。トリチル基は樹脂に結合したままであり（ディールス−アルダ−捕 獲−放出の例と同様）、生成物は塩化メチレン／ジクロロ酢酸溶液中に洗い出さ れる。この酸性洗液をリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）で抽出すると、ジクロロ酢 酸および未反応の樹脂結合モノマーが分離される（ヌクレオシドまたは加水分解 されたホスホルアミダイトとして）。次いで塩化メチレン層を蒸発させて、純粋 な二量体（または遊離５’−ヒドロキシル基をもつｎ＋１ｍｅｒオリゴヌクレオ チド）を得る。目的とする長さのオリゴ体が得られるまで、このサイクルを繰り 返すことができる。 反応経路３６ この態様は、上記に示した特定のトリチル樹脂または特定の結合化学に限定さ れない。むしろ本発明はより一般的に、装入モノマーを樹脂、可溶性ポリマー、 膜または非混和性液相に固定することによる、線状逐次ポリマーの製造を記載す る。装入モノマーの結合は、除去できる保護基、オリゴヌクレオチド合成につい ては特にヌクレオシドモノマーの５’−保護基を介して行われる。ペプチド合成 においては、モノマーは特にＮ−末端保護基を介して固定される。オリゴヌクレ オチド合成の場合、生長しつつあるポリマー鎖を標準的結合化学により、たとえ ばホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホナートまたはホスフェートトリエステル結合 により、固定されたモノマーに結合させる。結合が行われた後、すべての試薬お よび残りの未反応ポリマー出発物質は、固定された生成物を洗浄するだけで分離 される。この工程は、生長しつつあるポリマーを各モノマー付加後に、複雑な精 製工程の必要なしに精製できるので重要である。次いで、延長したポリマー鎖か ら保護基を開裂させる試薬により、延長したポリマー鎖を樹脂、可溶性ポリマー 、膜または非混和性液相から放出させる。 実施例３０（反応経路３７〜３９）には、ＰＡＳＳ法にトリチル樹脂を用いる ことを示す。この実施例では、塩化トリチル樹脂をチミジンヌクレオシド（５’ −ヒドロキシル基を介して）で誘導体化し、この樹脂結合ヌクレオシドを３’− ヒドロキシル基においてホスフィチル化し、次いでＤＣＩ活性化剤の存在下に、 わずかに過剰の５’−ジフェニルｔ−ブチルシリルチミジンヌクレオシド（３’ −ＯＨ）で処理する。結合および酸化工程の終了後、樹脂を洗浄してすべての未 反応物質を分離する。次いで通常の脱トリチル法により生成物（Ｔ−Ｔ二量体） を樹脂から分離する。実施例３０にはこの方法を用いた三量体の製造も示す。 実施例３１には、高分離能の１工程精製法にＰＡＳＳを適用することを示す。 この実施例では、５’−ＤＨＤＴ誘導体化ヌクレオシドの３’−位をテトラブチ ルジフェニルシリル基で保護し、次いでＰＡＳＳ法により精製する。表１０に示 すように、捕獲は１００％であり、最終生成物の純度は９１％であった。この実 施例は、カラムによる精製の代わりに、ＰＡＳＳ法で用いる捕獲−放出法を採用 できることを証明する。 以下の実施例は説明のために示したにすぎず、本発明の範囲を限定するための ものではない。 実施例１． Ｎ−４−ベンゾイル−３’−（５’−ｔ−ブチルジメチルシリル− ３’−（２−シアノホスホリル）チミジル）−２’−フルオロシチジン（１６） の製造（反応経路４） ５’−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジン１２(５’−ＴＢＤＭＳ−チミジン) （０．１５ｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下で乾燥アセトニトリル （１０ｍＬ）に溶解した。シチジンアミダイト１３（０．４３ｇ，０．５０ｍｍ ｏｌ）、続いてテトラゾール（６．５ｍＬ，アセトニトリル中０．４５Ｍ）を添 加した。１５分後、反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析（Ｃ１８，４．６×１００ｍ ｍ,緩衝液Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム，ｐＨ７.５，緩衝液Ｂ： アセトニトリル，０〜８０％のＢ，２．５分にわたる）は、二量体（２．４分） ならびに未反応チミジン１２（１．４分）および加水分解されたアミダイトモノ マー（２．１分）の存在を示した（図１）。反応混合物を系内で酸化した（１０ ｍＬ，水／ピリジン中０．２Ｍのヨウ素）。酸化後のＨＰＬＣ分析は、ピリジン （０．９分）、未反応チミジン１２（１．４分）、酸化されたアミダイトモノマ ー１５（１．８分）および酸化された二量体１４（２．３分）の存在を示す（図 ２）。 酸化後、反応混合物をアセトニトリルと共に、アセトニトリルで予め平衡化し たＤＥＡＥセファデックス（登録商標）床に通した。ろ液のＨＰＬＣ分析は、図 ３に示すように酸化されたアミダイトモノマー１５が保持されたことを示す。ろ 液を減圧濃縮し、固体を６０％アセトニトリル／水に再溶解し、７０％水／アセ トニトリルで子め平衡化したＣ１８チャンバーに装入した。チャンバーを７０％ 水／アセトニトリル、続いて５０％水／アセトニトリルで洗浄して、未反応チミ ジン１２を完全に溶離した。次いでチャンバーを水で洗浄し、８０％酢酸／水で 処理して脱トリチル化した。脱トリチル化後、チャンバーを５０％アセトニトリ ル／水で洗浄して、最終生成物１６（ｍ／ｅ ９２２，生成物１６＋トリエチル アミン）を溶離した。ＨＰＬＣ分析は脱トリチル化種１６が１．７分で溶出した ことを示す（図４）。１６のＥＳＭＳ（エレクトロスプレー質量分析）：計算値 ８２０．２７(Ｍ＋)；実測値９２２．２（Ｍ＋Ｈ＋ＴＥＡ）。³¹Ｐ ＮＭＲ（１ ２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，Ｈ₃ＰＯ₄外標準）δ−０．７３，−１．９３。トリチ ル種はチャンバーに保持された。 実施例２． Ｈ−ホスホナートチミジン三量体（Ｔ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ） （２０）の製造 ３’−末端に３’，３’−ヌクレオチド間結合をもつＨ−ホスホナートチミジ ン三量体アセンブリーを、反応経路５に概説したように合成した。 反応経路５ ５’−ジメトキシトリチルチミジン３’−Ｈ−ホスホナート１７への結合 １：１ アセトニトリル：ピリジン（４２ｍＬ）中における１７（０．７５ｇ， １．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン下で１２（０．２５ｇ，０．７ｍｍｏｌ ） を添加し、続いて９５：５ アセトニトリル：ピリジン（８．４ｍＬ）中におけ る塩化ピバロイル（０．２６ｍＬ，２．１ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物 を１０分間撹拌した時点で、逆相ＨＰＬＣ分析は１２から二量体１８への完全な 変換を示した。次いで混合物を真空濃縮し、ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、０．０５Ｍ炭 酸水素トリエチルアンモニウムで抽出した。塩化メチレン層をブフナー漏斗上の ＤＥＡＥセファデックス（登録商標）プラグに付与した。ろ液の逆相ＨＰＬＣ分 析は、未反応モノマー１７の完全な分離を示した。ろ液の蒸発により二量体１８ を定量的収率で単離し、その構造をＮＭＲおよびＥＳＭＳ分析により確認した。 ＤＥＡＥセファデックスプラグから、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム洗浄 により未反応モノマー１７を回収した。１８のＥＳＭＳ：計算値９４６．４（Ｍ ＋）；実測値９４６．３． 二量体１８の脱トリチル化． 二量体１８（０．８５ｇ，０．９ｍｍｏｌ）を 、ＺｎＢｒ₂で飽和した塩化メチレン（１０ｍＬ，約０．１Ｍ ＺｎＢｒ₂）に溶 解した。１５分後、逆相ＨＰＬＣ分析は完全な脱トリチル化を示した。等容量の １Ｍ酢酸アンモニウムで反応停止した。有機層を濃縮し、残留物を１：１ アセ トニトリル：水に溶解し、ブフナー漏斗上のＣ１８プラグに通した。ろ液を蒸発 させて、０．２９ｇ（収率５０％）の純粋な二量体１９を得た。１９のＥＳＭＳ ：計算値６４４．２（Ｍ＋）；実測値６４５．３． 三量体２０の製造． １：１ ピリジン：アセトニトリル（２３ｍＬ）中にお ける二量体１９（０．２５ｇ，０．３９ｍｍｏｌ）の溶液に、１７（０．４１ｇ ，０．５８ｍｍｏｌ）を添加し、続いて９５：５ アセトニトリル：ピリジン（ ４．５ｍＬ）中における塩化ピバロイル（０．１４ｍＬ，１．１６ｍｍｏｌ）の 溶液を添加した。反応物をアルゴン雰囲気下で１０分間撹拌した時点で、ＨＰＬ Ｃは二量体１９から三量体２０への完全な変換を示した。混合物を蒸発乾固し、 ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、０．０５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウムで抽出し、有 機層をブフナー漏斗上のＤＥＡＥセファデックス（登録商標）プラグに付与した 。ろ液を蒸発させて、２０を定量的収率で得た。２０のＥＳＭＳ：計算値１２３ ４．４（Ｍ＋）；実測値９３３．５（Ｍ＋Ｈ＋ＤＭＴ喪失）． 実施例３． ５’−Ｏ−（４，４’−ジオクタデシルトリフェニルメチル）チミ ジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダ イト（２６）の製造 ５’−保護基（Ｄ−Ｅ）として４，４’−ジオクタデシルトリフェニルメタノ ール（ＤＯＴ）を含むホスホルアミダイトモノマーの組立てを反応経路６に示す 。 反応経路６ ４，４’−ジオクタデシルオキシ−ベンゾフェノン（２２） 金属ナトリウム （０．４６ｇ，２０ｍｍｏｌ）をエタノール（５０ｍＬ）に溶解し、４，４’− ジヒドロキシベンゾフェノン（２１）（１．０ｇ，４．６７ｍｍｏｌ）を添加し 、続いて１−ブロモオクタデカン（７．８ｇ，２３．４ｍｍｏｌ）および触媒量 のヨウ化ナトリウム（約３０ｍｇ）を添加し、反応混合物を４８時間還流した。 得られた懸濁液を冷却し、ろ過した。固体をジクロロメタン、続いてヘキサンで 洗浄し、白色固体を乾燥させて、化合物２２（２．８５ｇ，収率８４．８％）を 得た。 ４，４’−ジオクタデシルトリフェニルメタノール（２３） 無水ＴＨＦ（４ ｍＬ）中におけるベンゾフェノン２２（０．３ｇ，０．４２ｍｍｏｌ）の懸濁液 に臭化フェニルマグネシウム（０．５５ｍＬ，ＴＨＦ中１．０Ｍ溶液，０．５５ ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を３時間還流した。追加量の臭化フェニルマグネシ ウム（０．２ｍＬ）を添加し、５時間加熱を続けると、すべての出発物質が溶解 した。次いで反応物を冷却し、０．５Ｍ ＨＣｌを添加した。この懸濁液をろ過 し、固体を水（３回）、ヘキサン（２回）およびジクロロメタン（２回）で洗浄 した。有機洗液をプールし、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させて、２３（０． ２１ｇ，収率６３．６％）を白色固体として得た。 ５’−Ｏ−（４，４’−ジオクタデシルトリフェニルメチル）チミジン（２５ ） 化合物２３（２．１ｇ，２．６３ｍｍｏｌ）をトルエンと共に２回蒸発させ、次 いでトルエン（３０ｍＬ）に溶解した。塩化アセチル（１１ｍＬ，１５４．７ｍ ｍｏｌ）を添加し、反応物を３時間還流し、次いで蒸発させた。残留物をトルエ ンと共に２回蒸発させると粗製２４が得られた。２４にピリジン（３０ｍＬ）、 ジメチルアミノピリミジン（ＤＭＡＰ）（２５ｍｇ）およびチミジン（０．４５ ｇ，１．８６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で一夜撹拌した。溶媒を減圧下 で蒸発させ、残留物をジクロロメタンに装入し、５％炭酸水素ナトリウムで洗浄 した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させ、残留物をシリカゲル上で精 製し（酢酸エチル／２％トリエチルアミン）、適切な画分を蒸発させた後、化合 物２５（ＤＯＴチミジン）（１．６ｇ，収率８４％）を淡黄色固体として得た。 ５’−Ｏ−（４，４’−ジオクタデシルトリフェニルメチル）チミジン−３’− Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト（２６） ＤＯＴチミジン２５をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエ チルアミン（０．３ｍＬ，１．７５ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルＮ，Ｎ− ジイソプロピルクロロ−ホスホルアミダイト（０．１５ｍＬ，０．６３ｍｍｏｌ ）を、氷浴冷却しながら添加した。氷浴を取り除き、反応物を室温で４時間撹拌 した時点で２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロ−ホスホルアミダイ ト（０．１ｍＬ）を追加し、反応物を室温で１６時間撹拌した。反応溶液をジク ロロメタンで希釈し、５％炭酸水素ナトリウムで洗浄し、有機相を乾燥させ（Ｍ ｇＳＯ₄）、蒸発させた。残留物をシリカ上で、まずヘキサン、続いて２０％酢 酸エチル／ヘキサン（すべて２％トリエチルアミンを含有）で溶離して精製し、 分割されたジアステレオマーとして２６を得た（先に０．１ｇ，後に０．１８ｇ ，収率４６．７％）。 ２６ａ（先のジアステレオマー） ２６ｂ（後のジアステレオマー） 実施例４． 逆相樹脂上におけるアルキル置換トリチル基の分離 アルコール類、４，４’−ジオクタデシルトリフェニルメタノール（ＤＯＴ） 、４−デシルオキシ−４’−メトキシトリタノール、およびジメトキシトリタノ ール（ＤＭＴ）をＣ１８逆相ＴＬＣプレートにスポットし、プレートを３種の異 なる溶媒（表１）で展開した。表１にみられるように、有機溶媒中ではＤＯＴ基 とＣ１８樹脂の間に強い相互作用がある：たとえばメタノール（Ｒ_f＝０）およ びアセトニトリル（Ｒ_f＝０）。この相互作用により、Ｃ１８逆相樹脂に対する トリチル保護基の親和性または相互作用に基づいて結合生成物を出発物質から１ 工程で分離できる。 実施例５． 生成物捕獲のための疎水親和性を用いたＰＡＳＳによる５’−ＨＯ −Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ−３’の製造 ５’−ＨＯ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔの製造． ５’−ＴＢＤＰＳ−チミジン １２（０．９９ｇ，２．０７ｍｍｏｌ）を乾燥塩化メチレンと共に蒸発させ、１ ０ｍＬの乾燥塩化メチレンに溶解した。チミジンアミダイト（２．０ｇ，２．６ ９ｍｍｏｌ）を添加し、続いてアセトニトリル中の０．５Ｍテトラゾール（２１ ｍＬ，１０．５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴン下で撹拌した。９０分後 、ヨウ素／水／ピリジン溶液（０．２Ｍ）を暗褐色が持続するまで添加し、続い て５％ＮａＨＳＯ₃を色が黄色に戻るまで添加した。濃縮した反応物を分配し（ ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、有機層をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、蒸発乾固した。固体残留物 をメタノール／最小量の塩化メチレンに溶解し、水、次いでメタノールで平衡化 したＤＥＡＥセファデックス（登録商標）床７５ｇにピペットで装入した。ＤＥ ＡＥセファデックスを３００ｍＬのメタノールで洗浄し、メタノール洗液を合わ せて濃縮し、２．４２ｇの白色泡状物を得た。 脱トリチル化： この白色泡状物を５０ｍＬの３％ＤＣＡに溶解し、室温で３ ５分間撹拌し、次いで塩化メチレンで平衡化したシリカゲル８０ｍＬ上に注いだ 。シリカゲルを１５０ｍＬの３％ＤＣＡ、続いて１００％塩化メチレンから塩化 メ チレン中６％メタノールまでの溶液で洗浄した。適切な画分を合わせて濃縮し、 脱トリチル化二量体（５’−ＨＯ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ）１．５８ｇを得た 。２工程プロセスについて９０％の収率。 ５’−ＨＯ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔの製造． ５’−ＨＯ−Ｔ−［３’ ，３’］−Ｔ二量体（１．４７ｇ，１．７６ｍｍｏｌ）を高真空下で一夜乾燥さ せ、次いで乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂と共に蒸発させ、８．５ｍＬの乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解 した。シチジンアミダイト（１．９０ｇ，２．２８ｍｍｏｌ）を添加し、続いて アセトニトリル中のテトラゾール（０．５Ｍ）（１７．６ｍＬ，８．７８ｍｍｏ ｌ）を添加し、反応物をアルゴン下で撹拌した。５０分後、０．５Ｍヨウ素溶液 、続いて５％ＮａＨＳＯ₃を、前記のように色が褐色から黄色に変化するまで添 加した。濃縮した反応物を分配し（ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、有機層を乾燥させ（Ｍｇ ＳＯ₄）、蒸発乾固した。固体残留物をメタノール／最小量の塩化メチレンに溶 解し、水、次いでメタノールで予め平衡化したＤＥＡＥセファデックス（登録商 標）床７５ｇにピペットで装入した。ＤＥＡＥセファデックスを徐々に塩化メチ レンおよびメタノールで洗浄し、洗液を合わせて濃縮し、２．５３ｇの黄色泡状 物を得た。 脱トリチル化： この白色泡状物を５０ｍＬの３％ＤＣＡ中、室温で撹拌した 。２時間後、反応混合物を塩化メチレンで予め平衡化した８０ｍＬのシリカゲル 床にピペツトで装入した。混合物を３％ＤＣＡ、続いて１００％ＣＨ₂Ｃｌ₂から ＣＨ₂Ｃｌ₂中６％メタノールまでの溶液で溶離した。適切な画分を合わせて濃縮 し、脱トリチル化三量体（５’−ＨＯ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ）１．４３ ｇを得た。２工程プロセスについて６４％の収率。５’−ＨＯ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔの製造． 脱トリチル化三量体 ５’−ＨＯ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ（１．４３ｇ，１．１ｍｍｏｌ）を高 真空下で一夜乾燥させ、次いで乾燥塩化メチレンと共に蒸発させ、６ｍＬの乾燥 塩化メチレンに溶解した。アデニンアミダイト（１．２４ｇ，１．４５ｍｍｏｌ ）を添加し、続いてアセトニトリル中の０．５Ｍテトラゾール（１１ｍＬ，５． ５７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴン下で撹拌した。約６０分後、０．５ Ｍヨウ素溶液を暗色が持続するまで添加した。次いで混合物を１時間撹拌し、濃 縮した。このガムを分配し（ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、有機層を合わせて乾燥させ（Ｍ ｇ ＳＯ₄）、濃縮し、２．４６ｇの黄色固体を得た。ＤＥＡＥセファデックス（登 録商標）精製せずに脱トリチル化を行った。 脱トリチル化： この泡状物を５０ｍＬの３％ＤＣＡ中、室温で撹拌し、次い で塩化メチレンで平衡化したシリカ床（約１２０ｍＬ）にピペットで装入した。 反応混合物を３％ＤＣＡ、続いて１００％塩化メチレンから塩化メチレン中１０ ％メタノールまでで溶離した。適切な画分を合わせて濃縮し、脱トリチル化四量 体（５’−ＨＯ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ）１．４１ｇを得た。２工程 プロセスについて７２％の全収率。 ５’−ＨＯ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔの製造． 脱トリチル化四 量体５’−ＨＯ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ（１．４１ｇ，０．８ｍｍｏ ｌ）を高真空下で乾燥させ、次いで乾燥塩化メチレンと共に蒸発させ、４．５ｍ Ｌの乾燥塩化メチレンに溶解した。チミジンアミダイト（０．７８ｇ，１．０５ ｍｍｏｌ）を添加し、続いてアセトニトリル中のテトラゾール（０．５Ｍ）（８ ｍＬ，４．０２ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴン下で撹拌した。２時間後 、０．５Ｍヨウ素溶液を暗色が持続するまで添加した。次いで反応物を濃縮し、 このガムを分配し（ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、有機層を合わせて乾燥させ（ＭｇＳＯ₄ ）、濃縮して２．１ｇの黄色泡状物を得た。これをＤＥＡＥセファデックス（登 録商標）溶離前に質量分析および逆相ＨＰＬＣにより分析した。酸化後の粗製反 応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析は、五量体、ならびに未反応四量体（欠損配列）お よび加水分解されたアミダイトモノマーの存在を示した。ＥＳＭＳ（Ｍ−１）８ ０３．７４×３． この黄色泡状物を最小量の塩化メチレンに溶解し、水、次いでメタノールで平 衡化したＤＥＡＥセファデックス（登録商標）床に装入した。ＤＥＡＥセファデ ックスをメタノール、塩化メチレン、次いでアセトニトリルで洗浄した。適切な 画分を合わせて濃縮し、１．４８ｇの物質を得た。 脱トリチル化： この物質を４０ｍＬの３％ＤＣＡ中、室温で撹拌し、次いで 塩化メチレンで平衡化したシリカ床にピペットで装入した。これを３％ＤＣＡ、 続いて１００％塩化メチレンから塩化メチレン中２０％メタノールまでの溶液で 溶離した。適切な画分を合わせて濃縮し、脱トリチル化五量体（５’−ＨＯ−Ｔ −Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ）０．９８ｇを得た。２工程プロセスについ て６４％の全収率。³¹Ｐ ＮＭＲおよびその積分値は生成物と一致する。 ５’−ＨＯ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔの製造． 脱トリチル 化五量体５’−ＨＯ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ（０．９６ｇ，０． ４６ｍｍｏｌ）を高真空下で乾燥させ、次いで乾燥塩化メチレンと共に蒸発させ 、５ｍＬの乾燥塩化メチレンに溶解した。チミジンアミダイト（０．４４ｇ，０ ．５９ｍｍｏｌ）を添加し、続いてアセトニトリル中のテトラゾール（０．５Ｍ ）（４．５ｍＬ，２．２７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴン下で撹拌した 。溶液が均一でなかったので、２ｍＬのアセトニトリルを添加した。溶液が均質 でなかったので、２ｍＬのアセトニトリルを添加した。２時間後、さらに０．１ ５ｇのモノマーを添加し、反応物を一夜撹拌した。０．５Ｍヨウ素溶液、続いて ５％ＮａＨＳＯ₃を添加し、色を褐色から黄色に変化させた。濃縮した反応物を 分配し（ＣＨ₂Ｃｌ₂／水）、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濃縮して１．６ １ｇの黄色固体を得た。これを質量分析により分析した。ＥＳＭＳ（Ｍ−１）１ ３８４．０１×２． 粗製反応混合物（１．４８ｇ）をＣ１８樹脂に吸収させ、アセトニトリル、続 いて７０％水／アセトニトリルで平衡化したＣ１８樹脂床（約１２５ｇ）に装入 した。樹脂をまず１：１ 水：アセトニトリルで洗浄してモノマーを溶離し、続 いてアセトニトリルおよび塩化メチレンで洗浄して六量体を溶離した。適切な画 分を合わせて濃縮し、０．８３ｇ（収率６６％）の固体を得た。 脱トリチル化： この固体を２０ｍＬの３％ＤＣＡ中、室温で撹拌した。トリ ヘキシルシラン（２ｍＬ）を添加し、撹拌を続けた。ヘキサンを添加すると固体 が生成し、これをヘキサン／エーテルで洗浄して０．５ｇのピンク色固体を得た 。³¹Ｐ ＮＭＲおよびその積分値は生成物（５’−ＨＯ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ− ［３’，３’］−Ｔ）と一致した。 ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）Ｃ−１形を用いて固体試料から残留ＤＣＡを分離 できる。たとえばＴ−Ａホスホルアミダイト二量体は、脱トリチル化およびヘキ サン沈殿後に約１．２当量のＤＣＡを含有することがＮＭＲにより認められた。 この二量体の試料（０．３ｇ）をアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解し、アセトニ トリルで予め平衡化したダウエックスＣ１形（１５ｇ）のカラムに装入した。こ の液体を滴下溶離し、次いでカラムを３５ｍＬのアセトニトリルで洗浄し、濃縮 して０．２６ｇの白色泡状物を得た。ＮＭＲで検査した試料は酸の減少率９５％ を示す。 実施例６． 生成物捕獲のための疎水親和性を用いたＰＡＳＳの自動化 結合反応、たとえば実施例２の１２と１７の反応（反応経路５）後、反応混合 物を抽出器１１２に入口１２８から送入する（図５）。炭酸水素トリエチルアン モニウム緩衝液（ＴＢＫ）（０．０５Ｍ）およびＣＨ₂Ｃｌ₂を抽出器に入口１３ ０から添加し、混合物を撹拌する。層を分離させる。分離後、弁１２０を開くと 、塩化エチレン層は導電率測定器１３６を通過してＤＥＡＥセファデックス（登 録商標）プラグ１１４上に送られる。導電率の上昇は、ＣＨ₂Ｃｌ₂が完全に導電 率測定器を通過し、今度は水層が測定器に進入したことを示す。このとき弁１２ ０は、水層をＤＥＡＥセファデックスプラグからそらすように自動的に切り換わ る。有機層は、入口１４０からチャンバーに入るアルゴンでＤＥＡＥセファデッ クスプラグに押し込まれる。次いで、弁１２２により制御されて入口１４２から 添加されるＣＨ₂Ｃｌ₂で、ＤＥＡＥセファデックスプラグを洗浄する。オリゴヌ クレオチド生成物および未反応オリゴヌクレオチド出発物質（欠損配列）を含有 するＣＨ₂Ｃｌ₂流出液を、弁１２４により制御された出口１４４から採集する。 ＣＨ₂Ｃｌ₂が完全に流出した後、セファデックスプラグ上に保持されている未反 応モノマーを１Ｍ ＴＢＫで溶離する。次いでセファデックスプラグをＣＨ₂Ｃ ｌ₂で再平衡化する。 次いでＣＨ₂Ｃｌ₂溶出液を逆相樹脂に通し、結合生成物を欠損配列から分離す る。５’−末端にＤＭＴ基が結合している結合生成物は樹脂に保持され、欠損配 列はチャンバーから溶出する。次いで樹脂を酸性ジクロロ酢酸（ＣＨ₂Ｃｌ₂中３ ％）で洗浄すると、これによりＤＭＴ保護基が開裂し、結合生成物がチャンバー から放出される。酸への過度の暴露による分解を防ぐために、結合生成物をｐＨ 緩衝液中へ溶離する。溶出液を濃縮し、結合生成物を次の反応サイクルの出発物 質として用いる。 実施例７． 溶液相合成による３’−ＰＥＧ固定１５ｍｅｒＤＮＡの製造 ３’−末端修飾基として分子量２０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）を用い、配列５’−ＣＴＡＡＡＣＧＴＡＡＴＧＧ−［３’，３’］−Ｔ−Ｔ −３’（配列番号：１）のオリゴヌクレオチドを製造した。ポリエチレングリコ ールは、各工程で生長しつつあるオリゴヌクレオチドを容易に沈殿させることが できる。この実施例には、典型的なＰＡＳＳサイクルの場合のようなオリゴヌク レオチド結合生成物を樹脂に取り込む工程を必要としない、溶液相合成の基本工 程を概説する。したがってこの実施例により、ＰＡＳＳにおいて予想される生成 物捕獲が効率および生成物純度に与える影響が示される。各モノマー付加サイク ルでこのような生成物捕獲を行うと、従来の固相合成の場合のようなジエチルエ ーテルからの煩雑な沈殿はもはや必要ない。さらに、欠損配列が各モノマー付加 サイクルで分離されるので、ＰＡＳＳにより得られる生成物のアニオン交換クロ マトグラムは、図６にみられるように、多重ピークではなく単一ピークのみを示 すと予想される。 この実施例は、欠損配列から生成物を分離するための手段として生成物捕獲を 採用せずに３’−ＰＥＧ固定オリゴヌクレオチドを溶液相合成により製造するた めの、各モノマー付加サイクルに続く一般法を示す。以下の実施例はすべてセル フシール隔壁付きの一口フラスコ内で行われた。使い捨てプラスチック注射器を 用いた。脱トリチル化５’−ＤＭＴ−ヌクレオシド３’−Ｏ−ＰＥＧ（５．０ｇ ）（２０ｋ,：装填量４５μｍｏｌ／ｇ）をＣＨ₂Ｃｌ₂中におけるジクロロ酢酸 （ＤＣＡ）およびトリヘキシルシラン（６．４ｍＬ，８０当量）の混合物５０ｍ Ｌに溶解した。９分後、脱トリチル化５’−ＨＯ−ヌクレオシド３’−Ｏ−ＰＥ Ｇをエーテル（２回）で沈殿させ、洗浄、ろ過および真空乾燥した。 結合反応： ５’−ＨＯ−ヌクレオシド３’−Ｏ−ＰＥＧを２０ｍＬの無水ア セトニトリルと共に３回蒸発させ、３０分間真空乾燥した。フラスコをアルゴン でフラッシし、外部雰囲気に対し密閉した。隔壁を通して、５’−ＨＯ−ヌクレ オシド３’−Ｏ−ＰＥＧを溶解するための無水アセトニトリル５０ｍＬ、無水ア セトニトリル中のアミダイト４．５ｍＬ（０．１Ｍ，２．０当量）、およびアセ トニトリル中のＤＣＩ １．４ｍＬ（１．０Ｍ，６．０当量）を注入した。この 溶液をアルゴン下で２５分間撹拌し、次いでエーテルで沈殿させ、２０ｍＬの無 水アセトニトリルと共に蒸発させることにより乾燥させた。 酸化： 沈殿を５０ｍＬの無水アセトニトリルに溶解し、アセトニトリル中８ ｍＬ（０．１Ｍ）のヨードベンゼンジアセテートを注入し、反応混合物を８分間 撹拌した。 キャッピング反応： 無水酢酸（６ｍＬ）、２，６−ルチジン（６ｍＬ）およ びＮ−メチルイミダゾール（６ｍＬ）を同時に上記溶液に注入し、反応混合物を さらに５分間撹拌した。先に脱トリチル処理に記載したように、キャップ付きオ リゴヌクレオチド−ＰＥＧポリマーをエーテルから沈殿させた。 結晶化： キャップ付きオリゴヌクレオチド−ＰＥＧポリマーを５００ｍＬの 無水エタノール（１００ｍＬ／ｇ）から６０℃で結晶化することにより精製した 。 モノマー付加サイクルプロトコールを表２にまとめる。オリゴヌクレオチドの ３’−末端１０塩基フラグメント（１０ｍｅｒ）（ＣＧＴＡＡＴＧＧ−［３’， ３’］−Ｔ−Ｔ）（配列番号：２）の製造についての段階的結合効率を表３に示 す。ＰＥＧから開裂し、かつ脱保護した後の粗製１５ｍｅｒ（５’−ＣＴＡＡＡ ＣＧＴＡＡＴＧＧ−［３’，３’］−Ｔ−Ｔ−３’）（配列番号：１）のアニオ ン交換ＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。 実施例８． ジエン修飾トリチルアルコールの製造 実施例８（反応経路７および８）には、５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５− ヘキサジエンオキシトリチル）チミジン３’−ホスホルアミダイトモノマー３２ を含めた各種ジエン修飾トリチルアルコールの合成を記載する。 反応経路７ ４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシベンゾフェノン（２９）の製造． 無水ＴＨＦ（３３５ｍＬ）中における３，５−ヘキサジエノール（２７）（１３ ．７ｇ，１４０ｍｍｏｌ）（Ｍａｒｔｉｎら（１９８０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．１０２：５２７４−５２７９）の溶液に、４，４’−ジヒドロキシベン ゾフェノン（２１）（１０．０ｇ，４６．７ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホス フィン（３６．７ｇ，１４０ｍｍｏｌ）を添加し、続いてジエチルアゾジカーボ ネート（ＤＥＡＤ）（２２．０ｍＬ，１４０ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。反応 混合物をアルゴン下で一夜撹拌し、次いで真空下で蒸発乾固した。ジクロロメタ ン−ヘキサンから沈殿させて、残留試薬を除去した。ろ液を真空濃縮し、カラム クロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂，３／２）により精製 して不純な生成物を得た。これを摩砕処理して（Ｅｔ₂Ｏ／ヘキサン，１／１） 、７．１２ｇの化合物２９を得た。ろ液をさらにカラムクロマトグラフィー（シ リカゲル；ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂，３／２）により精製すると、さらに５．９６ ｇ の２９が得られ、合計１３．０８ｇ（７５％）の化合物２９が白色固体として得 られた。 ４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３０）の製 造 ． 化合物２９（５．９６ｇ，１５．９１ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１３３ｍ Ｌ）に、弱く加熱しながら溶解した。臭化フェニルマグネシウム（ＴＨＦ中１． ０Ｍ溶液３２ｍＬ，３２ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、混合物を室温でアルゴ ン下に５時間撹拌し、真空下で蒸発乾固した。残留物をジクロロメタンに再溶解 し、飽和塩化アンモニウム溶液、次いで水で洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｍｇ ＳＯ₄）、真空濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサン／Ｃ Ｈ₂Ｃｌ₂，１／９）により精製して、４．４５ｇ（６２％）の化合物３０を黄色 の油として得た。 ５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル）チミジン （５’−ＤＨＤＴＯ−ｄＴ）（３１）の製造 ． 化合物３０（３．５ｇ，７．７ ３ｍｍｏｌ）をトルエン（２回）と共に蒸発させ、次いで無水トルエン（８５ｍ Ｌ）に溶解した。塩化アセチル（３３ｍＬ，４６４ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加 し、反応混合物を加熱還流し、アルゴン下で撹拌した。４時間後、反応混合物を 真空濃縮し、粗生成物をピリジンと共に蒸発させ、次いで無水ピリジン（４２ｍ Ｌ）に溶解した。次いで、この粗生成物を含有する溶液に、ピリジンと共に蒸発 させて無水ピリジン（４２ｍＬ）に溶解したチミジン（１．５ｇ，６．１８ｍｍ ｏｌ）を添加した。触媒量のジメチルアミノピリミジン（ＤＭＡＰ）を添加し、 反応混合物をアルゴン下で一夜撹拌し、そして溶媒を蒸発させた。残留物をジク ロロメタンに溶解し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで水で洗浄した。有 機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させ、カラムクロマトグラフィー（シリカ ゲル；ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，１／１）により精製して、３．５３ｇ（８４％） の化合物３１を灰白色固体として得た。 ５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル）チミジン ３’−ホスホルアミダイト（３２）の製造 ． 化合物３１（３．０ｇ，４．４３ ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタンに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（２． ７ｍＬ，１５．５ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を０℃に冷却し、２−シアノ エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（２．０ｍＬ，８． ８６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をアルゴン下で撹拌しながら室温にまで 高めた。４時間後、溶液をジクロロメタンで希釈し、５％炭酸水素ナトリウム水 溶液（２回）で洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、真空濃縮し、カラ ムクロマトグラフィー（シリカゲル；ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，３／７）により精 製して、２．８ｇ（７２％）の化合物３２を綿毛状の白色固体として得た。 反応経路８ ４，４’−ジ−２，４−ヘキサジエンオキシベンゾフェノン（３５）の製造． ジフルオロベンゾフェノン（３４）（４．８ｇ，２２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（ １Ｌ）に溶解した。ＮａＨ（９５％，５．６ｇ，２２０ｍｍｏｌ）を添加し、溶 液を０℃に冷却した。この溶液に２，４−ヘキサンジオール（５．８ｍＬ，５１ ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、反応混合物をアルゴン下で一夜撹拌しながら室温に まで高めた。反応混合物を真空濃縮し、ジクロロメタンに溶解し、水で洗浄した 。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリ カゲル；ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂，１／３）により精製して、２．０７ｇ（２５％ ）の化合物３５を白色固体として得た。 ４，４’−ジ−２，４−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３６）の製 造 ． 化合物３５（２．０ｇ）をＴＨＦ（４５ｍＬ）に溶解し、臭化フェニルマ グネシウム（ＴＨＦ中１．０Ｍ溶液；１０．６ｍＬ，１０．６ｍｍｏｌ）をこの 溶液に添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、真空下で蒸発乾固した。残 留物をジクロロメタンに再溶解し、飽和塩化アンモニウム溶液、次いで水で洗浄 した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、真空濃縮し、カラムクロマトグラフィ ー（シリカゲル；ヘキサン／ＣＨ₂Ｃｌ₂，１／９）により精製して、１．８４ｇ （７７％）の化合物３６を淡黄色固体として得た。 ５’−ジ−（２，４−ヘキサジエンオキシ）トリチルチミジンホスホルアミダ イトモノマーは、化合物３６から、５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサ ジエンオキシトリチル）チミジンホスホルアミダイト（３２）の製造について前 記に述べたものと同じ方法で製造できる。 実施例９． ジエン置換トリチルアルコールとＮ−エチルマレイミドのディール ス−アルダー付加環化 実施例９（反応経路９）には、ジエン置換トリチルアルコール―４，４’−ジ −３，５−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３０）および４，４’−ジ −２，４−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３６）―とＮ−エチルマレ イミドとのディールス−アルダー反応を記載する(それぞれ反応１および２)。表 ４にこれら２反応につき種々の条件下での反応速度を示す。 反応経路９ ３，５−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３０）のディールス−アル ダー反応−反応１ 化合物３０（５０ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（０．７５ｍＬ ）および水（０．７５ｍＬ）に溶解した。Ｎ−エチルマレイミド（Ｎ−Ｅｔマレ イミド）（１３８ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で撹拌し た。３時間後、粗製反応混合物の¹Ｈ ＮＭＲ分析は反応が完了したことを示し た。反応混合物を濃縮し、ジクロロメタンで予め平衡化したシリカゲルプラグに 装入した。過剰のＮ−エチルマレイミドをジクロロメタンで洗い出し、生成物を １０％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂で溶離した。溶媒を減圧濃縮して、３８ｍｇ（５９ ％）の化合物３７を得た。 ２，４−ヘキサジエンオキシトリチルアルコール（３６）のディールス−アル ダー反応−反応２ 化合物３６（６０ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２．０ｍＬ） に溶解した。Ｎ−エチルマレイミド（１６６ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）を添加し、 反応混合物を室温で撹拌した。２４時間後、粗製反応混合物の¹Ｈ ＮＭＲ分析 は反応が完了したことを示した。反応混合物を濃縮し、ジクロロメタンで予め平 衡化したシリカゲルプラグに装入した。過剰のＮ−エチルマレイミドをジクロロ メタンで洗い出し、生成物を１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂で溶離した。溶媒を減 圧濃縮して、５０ｍｇ（５４％）の化合物３８を得た。 実施例１０． ディールス−アルダー付加環化による生成物捕獲を用いた３’− ＰＥＧ結合オリゴヌクレオチドの製造 実施例１０（反応経路１０）には、各モノマー付加サイクル後に行う、オリゴ ヌクレオチド生成物の共有結合捕獲のためにディールス−アルダー反応を用いた ３’−ＰＥＧ固定オリゴヌクレオチド製造のための一般法を示す。 反応経路１０ 結合反応： ＰＥＧ−ｄＴ−ＯＨ（２０ｋ，２．３６ｇ，０．１１ｍｍｏｌ， 装填量：４６μｍｏｌ／ｇ）を、乾燥アルゴン雰囲気下で２０ｍＬの乾燥アセト ニトリル（ＣＨ₃ＣＮ）に溶解した。この溶液に５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３ ，５−ヘキサジエンオキシトリチル）チミジン３’−ホスホルアミダイト（３２ ）（１４０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＣＨ₃ＣＮ中のＤＣＩ（ ０．６５ｍＬ，１．０Ｍ，６．０当量）を添加した。反応物を乾燥アルゴン雰囲 気下 で２５分間撹拌した後、３５０ｍＬの乾燥Ｅｔ₂Ｏを添加して２０ｋ−ＰＥＧ含 有物質を沈殿させた。固体をろ過し、Ｅｔ₂Ｏ（１００ｍＬで２回）で洗浄し、 １時間真空乾燥して、２．３ｇ（収率９８％）の白色固体を得た。 酸化： 結合生成物３９、未反応ホスホルアミダイト３２および未反応ＰＥＧ −ｄＴ−ＯＨを含有する上記の白色固体を、２０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、Ｃ Ｈ₃ＣＮ中のヨードベンゼンジアセテート（８．５５ｍＬ，０．１Ｍ，０．２７ ｇ）中で酸化する。８分間撹拌した後、反応混合物は未反応ＰＥＧ−ｄＴ−ＯＨ 、酸化されたアミダイトモノマー４０および酸化されたオリゴマー４１を含有す る。次いでこの反応混合物を３５０ｍＬの乾燥Ｅｔ₂Ｏで処理して２０ｋ−ＰＥ Ｇ含有物質を沈殿させ、固体をろ過し、１００ｍＬのＥｔ₂Ｏで２回洗浄する。 １時間真空乾燥した後、朱反応ＰＥＧ−ｄＴ−ＯＨおよびオリゴマー４１を含有 する白色固体が単離される。 ディールス−アルダー付加環化： 上記の固体を２０ｍＬの５０％Ｈ₂Ｏ／Ｃ Ｈ₃ＣＮに再溶解し、５ｍＬの５０％Ｈ₂Ｏ／ＣＨ₃ＣＮで予め湿らせたマレイミ ド官能化ポリスチレン１．２ｇ（０．４ｍｍｏｌ／樹脂ｇのマレイミド装填を基 準として１０当量）に装入する。反応物をアルゴン雰囲気下で４５℃に１時間温 める。上清液の逆相ＨＰＬＣ分析で、５’−保護オリゴマー４１は完全に消費さ れたことが分かる。次いでマレイミド誘導体化ポリスチレン４２をろ過し、１０ ｍＬの５０％Ｈ₂Ｏ／ＣＨ₃ＣＮで洗浄すると、３．５ｇの３’−ＰＥＧ−５’− ＤＨＤＴディールス−アルダー結合オリゴマー（４２）が固体樹脂として得られ る。 脱トリチル化／オリゴヌクレオチド放出： ３．５ｇのディールス−アルダー 結合樹脂４２（装填量：７５μｍｏｌ／ｇ）を２０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に懸濁でき る。この懸濁液にＣＨ₂Ｃｌ₂中におけるＤＣＡおよびトリヘキシルシランの混合 物（６．４ｍＬ，８０当量）を添加する。９分後、ポリスチレン−マレイミド樹 脂（４４）をろ過により分離する。次いでＰＥＧ−ヌクレオシド（４３）をＥｔ₂ Ｏ（５００ｍＬ）で２回沈殿させ、洗浄、ろ過、および真空乾燥する。得られ たＰＥＧ−ヌクレオシドの５’−位を脱保護すると、シーケンスの次の結合反応 に使用できる。 実施例１１． ディールス−アルダー生成物捕獲による非−ＰＥＧ誘導体化オリ ゴヌクレオチドの製造 反応経路１２には、ジエンとして５’−Ｏ−（４，４’−ジ−３，５−ヘキサ ジエンオキシトリチル）ヌクレオシド（５’−Ｏ−ＤＨＤＴ−ヌクレオシド）を 用い、ジエノフィルとしてマレイミド置換−固体支持体を用いたディールス−ア ルダー反応による、非−ＰＥＧ誘導体化オリゴヌクレオチド製造のための一般反 応経路を示す。 反応経路１２ＤＨＤＴ：４，４’−ジ−３，５−ヘキサジエンオキシトリチル 樹脂：マレイミド誘導体化固体支持体(ＣＰＧ、シリカ、セルロース、ＨＬＰな ど) Ｘ：適切に保護した２’−置換基 Ｙ：ホスフェート保護基 Ｂ：適切に保護、修飾または誘導体化した核酸塩基 Ｒ：オリゴヌクレオチドまたは３’−保護基 結合／酸化／捕獲シーケンス： ＣＨ₃ＣＮ中で、長さｎの適切な３’−ブロ ックしたオリゴヌクレオチド（５０）をＣＨ₃ＣＮ中の１．０Ｍ ＤＣＩ溶液で 処理することにより、２．０当量のアミダイトモノマー５１と結合させる。３’ −ブロッキング基は脂質もしくは多糖類、またはより伝統的な溶液相ブロッキン グ基、たとえばアセチル、ピラニル、またはシリル基（たとえばｔ−ブチルジフ ェニルシリルエーテル）であってもよい。結合反応は２５分未満を要し、ＴＬＣ で監視できる。結合反応が終了すると、溶液をＣＨ₃ＣＮ中０．１Ｍ溶液として のヨードベンゼンジアセテート８．０当量で直接処理する。酸化シーケンスは８ 分以内で完了し、粗製反応混合物をそのまま、ジエノフィルを含む固体支持体に 付与する。溶媒１：１ ＣＨ₃ＣＮ：Ｈ₂Ｏを用いることにより、ディールス−ア ルダー付加環化反応が促進される。このとき固体支持体に共有結合しているオリ ゴヌクレオチド５２は、樹脂ビーズをろ過および洗浄するだけで、未反応出発オ リゴヌクレオチド５０（欠損配列）および試薬類から容易に分離される。同様に ５’−Ｏ−ＤＨＤＴ基をもつアミダイトモノマー５１も樹脂に結合する（５３） 。 脱トリチル／放出シーケンス： オリゴヌクレオチドが共有結合している洗浄 、乾燥した樹脂（５２）、および未反応モノマーホスフェート（５３）を、３％ ＤＣＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液で洗浄し、酸によるオリゴヌクレオチド分解を防ぐため に中和用緩衝液中へ溶離する。放出されたオリゴマー（５４）およびモノマーホ スフェート（５５）を、水性抽出により互いに分離する。有機相中の生成物オリ ゴヌクレオチドを乾燥させ、限外ろ過によりアセトニトリル中へ交換する。 実施例１２． ディールス−アルダー付加環化による生成物捕獲を用いた二量体 の製造 反応経路１５ ５’−ＤＨＤＴＯ−Ｔ−［３’，３’］−Ｔ−ＯＳｉＰＤＢＴ−５’（５６） の製造 ． ５’−ＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ−３’−ＯＨ（１２Ａ）（０．２１ｇ， ０．４３ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのアセトニトリルに溶解した。この溶液に５’− ＤＨＤＴＯ−ｄＴホスホルアミダイト（３２）（０．５ｇ，０．５２ｍｍｏｌ） を添加し、続いてアセトニトリル中１．０Ｍ ＤＣＩ ３．０ｍＬ（３．０ｍｍ ｏｌ）を添加した。この溶液をアルゴン下で２０分間撹拌し、このときピリジン ／水中の０．２Ｍ Ｉ₂溶液１１ｍＬを添加した。酸化反応を５分間進行させ、 ＤＥＡＥセファデックス（登録商標）で４回ろ過すると、黄色がほとんど除かれ た。黄色固体５６（０．２３ｇ）を単離した。 生成物捕獲： ポリスチレン支持されたマレイミド（ＰＳ−Ｍ）の使用量を以 下のように変更して、ディールス−アルダー捕獲反応を行った：１０、５、２． ５、１当量。すべての反応についての以下の操作は下記のとおりであった。［３ ’，３’］−ｄＴ−ｄＴ−ＯＴＤＨＤ二量体（１１μｍｏｌ）（５６）を４００ μＬ のアセトニトリルに溶解した。この溶液を１．０ｍＬの３／１ ＣＨ₃ＣＮ／水 中におけるＰＳ−Ｍの懸濁液に添加し、次いで６５℃に温めた。反応経過をＴＬ Ｃ（２／１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）でＲ_f＝０．１５の反応体の消失により、 またＨＰＬＣ分析（Ｃ１８，４．６×１００ｍｍ，緩衝液Ａ：１００ｍＭ酢酸ト リエチルアンモニウム，ｐＨ７．５，緩衝液Ｂ：アセトニトリル，０〜８０％の Ｂ，２．５分にわたる）により監視した。反応率は、未反応５’−ＴＢＤＰＳｉ Ｏ−ｄＴ−３’−ＯＨモノマー（１２Ａ）(１．７１分)に対する二量体物質（２ ．６５分）の初期比率を比較することにより判定された（図７参照）。２．５当 量、１．０当量および対照（ＰＳ−Ｍなし）について描いた線はすべて反応（二 量体の消失）が４時間後に起きたことに注目するのが重要である。この反応はデ ィールス−アルダー捕獲ではなく、二量体の分解（加水分解によると考えられる ）である。ＨＰＬＣトレース中に新しい物質が１．４７分および２．３０分に現 れる。この物質は５’−ＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ−３’−ホスフェート（１．４７ 分）および５’−ＤＨＤＴＯ−ｄＴ−３’−ホスフェートであろう。加水分解に 際し５’−ＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ−３’−ＯＨも生成すると予想されるので、デ ィールス−アルダー捕獲の相対比率をこれらのトレースから直接に求めることは できない。加水分解が起きる場合、内標準が適切でないからである。加水分解は 、後者の各トレースで明らかな５’−ＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ−３’−ホスフェー トの量に対し調整することにより補正できる。このプロセスは５当量および１０ 当量の場合には有意でない。 放出／脱トリチル化： １１μｍｏｌの［３’，３’］二量体で誘導体化した ＰＳ−Ｍ（５７）２８６ｍｇを、０．２５ｍＬのジクロロメタンに懸濁した。こ の溶液にジクロロメタン中３％ＤＣＡを２．６ｍＬ添加した。ＰＳ−Ｍは直ちに 明るい橙色に変化した。この懸濁液を５分間撹拌した後、ろ過によりジクロロメ タン溶液をＰＳ−Ｍから分離した。得られた溶液を、直ちにダウエックスＣｌ^- イオン交換樹脂のパッドでジクロロメタンを用いてろ過した。次いでろ液を濃縮 して１２ｍｇの白色ガラス質固体を得た（若干の残留溶媒および脂肪族不純物を 含有）。¹Ｈ ＮＭＲおよび³¹Ｐ ＮＭＲは目的生成物５８と一致する。 実施例１３． ディールス−アルダー付加環化によるフラグメント固定を用いた ２ブロックからのオリゴヌクレオチドの製造 ＰＡＳＳオリゴヌクレオチド合成経路によれば、オリゴヌクレオチドブロック を容易かつ効率的に製造でき、これらを反応経路１６に示すように改変ＰＡＳＳ サイクルで互いに結合させることができる。要約すると、前記のようにＰＡＳＳ モノマー付加サイクルで製造したオリゴヌクレオチドブロック５９をマレイミド 樹脂と反応させて、樹脂固定オリゴヌクレオチドブロック６１を得る。このブロ ックから三塩化チタンでリンカーＬを還元開裂することにより３’−末端ＰＥＧ を除去すると、遊離３’−末端をもつ樹脂結合フラグメント６３が得られる。６ ３をＮ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチル−クロロホスフィンでホスフィ チル化すると、３’−末端ホスホルアミダイト６４が得られる。次いで化合物６ ４を、オリゴヌクレオチドブロック６０の脱トリチル化で得たオリゴヌクレオチ ドブロック６２に結合させる（マレイミド樹脂への捕獲、次いで脱トリチル化の 後）。結合反応後、ホスファイトトリエステル結合を酸化して対応するホスフェ ートトリエステルにし、続いて生成物オリゴヌクレオチドをジクロロ酢酸で樹脂 から開裂させることにより、オリゴヌクレオチドフラグメント６０が得られる。 反応経路１６実施例１４． オリゴヌクレオチド製造のためのディールス−アルダー生成物捕 獲を用いるＰＡＳＳの自動化 反応器２１２（図８）に結合試薬を添加し、実施例１０の記載に従って反応を 進行させる。結合反応終了後、反応器２１４に収容されたジエンまたはジエノフ ィル修飾した樹脂または膜（以下、支持体と呼ぶ）に反応混合物を循環させて、 オリゴヌクレオチドを共有捕獲させる。捕獲工程に要する時間は、溶液からの結 合生成物消失をＨＰＬＣまたはインラインＵＶアッセイ（図示されていない）で 監視することにより制御できる。次いで支持体をすすいで、ジエンまたはジエノ フィルを含有しない欠損配列をすべて溶離する。オリゴヌクレオチドを支持体に 結合させた後、または溶液中でジエノフィル支持体に結合させる前に、酸化を行 うことができる。酸化溶液は脱トリチル化前に樹脂から完全に除去しなければな らない。この除去は、インライン導電率監視（図示されていない）により制御す るのが好都合である。次いで支持体をＤＣＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂ですすいで、生長しつ つあるオリゴマーおよび捕獲された過剰のモノマーを樹脂から分離する。こうし て、溶液中にあるのはＤＣＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂混合物中の５’−脱保護されたオリゴ ヌクレオチドおよびモノマーのみとなる。次いでこの混合物を膜分離器（２１８ ）と接触させて、溶媒をアセトニトリルに交換し、さらにＤＣＡおよび過剰のモ ノマーを分離する。あるいは、モノマーを沈殿または抽出により分離してもよい 。溶液中に残留する唯一の種は、アセトニトリル中の高分子結合したオリゴマー である。この溶液は、この時点で次の結合反応に使用できる状態である。 ジエノフィル支持体を用いてすべてのｎ−１種を分離すると、キャッピング工 程を用いなくてすみ、溶液は酸化またはジエノフィル支持体へ循環できる状態に なる。ジエノフィル支持体は、ジエノフィル部分と樹脂または膜との間の開裂性 リンカー、たとえばアミド結合を含むことができる。この開裂性リンカーにより 、ジエノフィル支持体を容易に再生できる。このようなリンカーは当業者に周知 である。 膜の評価ポリプロピレン限外ろ過膜に暴露した後のＰＥＧ化デオキシチミジン回収：アセ トニトリル溶媒系 ． １．４９ｇのＰＥＧ−ｄＴ（４６μｍｏｌ ｄＴ／ｇ）を ２５ｍＬのアセトニトリルに溶解することにより、２．７４ｍＭの２０ｋ ＰＥ Ｇ−デオキシチミジン（ＰＥＧ−ｄＴ）溶液を調製した。次いでアリコート（２ ｍＬ）の溶液を、５０ｍＬファルコン（Ｆａｌｃｏｎ、登録商標）試験管内で面 積５．７３ｃｍ²のポリプロピレン限外ろ過膜（３Ｍ、登録商標）の作業面に、 ０．２５、１および４時間暴露した。出発溶液をファルコン試験管からすすぎ出 し、膜をアセトニトリル２５ｍＬで２回の洗浄によりすすいだ。洗浄溶媒をＰＥ Ｇ−ｄＴについて２６０ｎｍでの吸収により分光測光アッセイし、出発ＰＥＧ− ｄＴの吸収と対比した。膜を含まないファルコン試験管を２ｍＬの出発溶液に４ 時間暴露し、２６０ｎｍでＰＥＧ−ｄＴをアッセイすることにより、試験管やガ ラス器具への損失を測定する対照試験を行った。結果を表６に示す。ポリプロピレン限外ろ過膜に暴露した後のＰＥＧ化デオキシチミジン回収：塩化 メチレン溶媒系 ． １．４８ｇのＰＥＧ−ｄＴ（４６μｍｏｌ ｄＴ／ｇ）を２ ５ｍＬの塩化メチレンに溶解することにより、２．７２ｍＭの２０ｋ ＰＥＧ− デオキシチミジン（ＰＥＧ−ｄＴ）溶液を調製した。次いでアリコート（２ｍＬ ）の溶液を、５０ｍＬファルコン（登録商標）試験管内で面積５．７３ｃｍ²の ポリプロピレン限外ろ過膜（３Ｍ、登録商標）の作業面に、０．２５、１および ４時間暴露した。出発溶液をファルコン試験管からすすぎ出し、膜を塩化メチレ ン２５ｍＬで２回の洗浄によりすすいだ。洗浄溶媒をＰＥＧ−ｄＴについて２６ ０ｎｍでの吸収により分光測光アッセイし、出発ＰＥＧ−ｄＴの吸収と対比した 。膜を含まないファルコン試験管を２ｍＬの出発溶液に４時間暴露し、２６０ｎ ｍでＰＥＧ−ｄＴをアッセイすることにより、試験管やガラス器具への損失を測 定する対照試験を行った。結果を表７に示す。再生セルロース限外ろ過膜に暴露した後のＰＥＧ化デオキシチミジン回収：アセ トニトリル溶媒系 ． １．５５ｇのＰＥＧ−ｄＴ（４６μｍｏｌ ｄＴ／ｇ）を ２５ｍＬのアセトニトリルに溶解することにより、２．８５ｍＭの２０ｋ ＰＥ Ｇ−デオキシチミジン（ＰＥＧ−ｄＴ）溶液を調製した。次いでアリコート（２ ｍＬ）の溶液を、５０ｍＬファルコン（登録商標）試験管内で面積５．７３ｃｍ² のポリプロピレン限外ろ過膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１０ＫＰＬ ＧＣ）の作業面に、０．２５、１、４および２４時間暴露した。出発溶液をファ ルコン試験管からすすぎ出し、膜をアセトニトリル２５ｍＬでの洗浄によりすす いだ。膜を２５ｍＬのアセトニトリルに６日間ソーキングし、次いでさらに２５ ｍＬのアセトニトリルで洗浄した。洗浄溶媒をＰＥＧ−ｄＴについて２６０ｎｍ での吸収により分光測光アッセイし、出発ＰＥＧ−ｄＴの吸収と対比した。膜を 含まないファルコン試験管を２ｍＬの出発溶液に４時間暴露し、２６０ｎｍでＰ ＥＧ−ｄＴをアッセイすることにより、試験管やガラス器具への損失を測定する 対照試験を行った。結果を表８に示す。アセトニトリル／エーテル中でのＰＥＧ化デオキシチミジンの遠心分離：ジエチ ルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびＮ−ブチルエーテルの比較 ． ０． ４８５５ｇのＰＥＧ−ｄＴ（４６ｍｏｌ／ｇ）を１０ｍＬのアセトニトリルに溶 解することにより、２．３４ｍＭの２０ｋ ＰＥＧ−デオキシチミジン（ＰＥＧ −ｄＴ）溶液を調製した。次いでアリコート０．５、０．２５および０．１２５ ｍＬを１ｍＬのジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルまたはＮ−ブチルエ ーテルの添加により沈殿させた。沈殿を約４，４００×ｇで２分間遠心した。上 清のＰＥＧ−ｄＴ含量を分光測光により測定し、出発ＰＥＧ−ｄＴの吸収と対比 した。１．５ｍＬの出発溶液を上記方法で遠心およびアッセイすることにより、 取扱に対する損失を示す対照試験を行った。結果を図９に示す。流束およびＦＴＩＲ評価 ． ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）およびポ リプロピレン膜を、下記の溶媒系でソーキングすることにより評価した：アセト ニトリル、塩化メチレン、アセトニトリル中の結合／キャッピング／酸化（ｃ／ ｃ／ｏ）溶液、および塩化メチレン中の３％ＤＣＡ混合物。直径１ 1/2”の膜片 を各溶液に浸漬し、２４時間ソーキングし、初期溶液の流束評価のために膜ホル ダーに挿入し、次いでさらにアセトニトリル流束評価のためにアセトニトリルで すすいだ。このように溶液中でのソーキング後、膜に保持されているかもしれな い過剰の試薬を膜試料からすすぎ出した。各種溶媒に暴露した後のアセトニトリ ル流束速度（ｆｌｕｘ ｒａｔｅ）を表９に挙げる。これから分かるように、Ｐ ＶＤＦとポリプロピレン膜の間にはわずかな流束速度（ｍＬ／分／ｃｍ²）の変 化があるにすぎない。 保持試験において、再生セルロース膜はＦＴＩＲにより測定して若干のＰＥＧ を保持すると判定された。シリコーン、セラミック、ポリオレフィンおよびＨＤ ＰＥ膜は調査中である。 実施例１５． マレイミド−トリチルモノマーの合成 反応経路１７ ４，４’−ジ−（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシプロポキシ）−ベンゾ フェノン（６６）の製造 ． ４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン（２１）( １０ｇ，４６．７ｍｍｏｌ)をミツノブ（Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ）条件下に乾燥テ トラヒドロフラン中０℃で、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−３−プロパノー ル（粗製４０ｇ，約１５０ｍｍｏｌ）、ＤＥＡＤ（２２．１ｍＬ，１４０．０ｍ ｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（３６．７ｇ，１４０．０ｍｍｏｌ）と 反応させた。反応物をアルゴン下で室温にまで高めた。２４時間後、反応物を濃 縮し、塩類をヘキサン／エーテルで沈殿させ、ろ過した。残りの物質をカラムク ロマトグラフィー（シリカゲル；ヘキサンから８５％ヘキサン／酢酸エチルまで の濃度勾配）により精製して、目的生成物である化合物６６を１４ｇ得た。収率 ５４％。 ４，４’−ジー（３−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシプロポキシ）−トリフ ェニルメタノール（６７）の製造 ． 保護されたベンゾフェノン６６（５．７ｇ ，１０．２ｍｍｏｌ）を４０ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解し、臭化フェニルマグネシ ウム（２０．５ｍＬ，２０．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物をアルゴン下に室 温で２時間撹拌し、濃縮し、ジクロロメタンと飽和塩化アンモニウムの間で分配 し、水で洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濃縮すると、６．５ｇの 黄色ガム状化合物６７が定量的収率で得られ、これをそのまま次の工程に用いた 。 ４，４’−ジ−（３−ヒドロキシプロポキシ）−トリフェニルメタノール（６ ８）の製造 ． トリチル化合物（６７）（６．３７ｇ，１０ｍｍｏｌ）をアセト ニトリル中、室温で１６時間、トリエチルアミンフッ化水素酸塩（３．６４ｇ， ３０ｍｍｏｌ）処理により脱保護した。反応物を濃縮し、カラムクロマトグラフ ィー（シリカ、濃度勾配：１：１ ヘキサン：酢酸エチルから酢酸エチル：５％ メタノールまで、すべて１％トリエチルアミン含有）により精製して、２．８ｇ の目的生成物６８を黄色ガムとして得た。収率６９％。 ４，４’−ジ−（３−ｐ−トルエンスルホンオキシプロポキシ）−トリフェニ ルメタノール（６９）の製造 ． アセトニトリル中における塩化トシル（１．４ ３ｇ，７．４９ｍｍｏｌ）および２，４，６−コリジン（１ｍＬ，７．４９ｍｍ ｏｌ）の溶液を、アセトニトリル１５ｍＬ中の化合物６８（１．３９ｇ，３．４ ｍｍｏｌ）に添加した。反応物をアルゴン下に室温で２．５日間撹拌し、次いで 濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘキサン中６０％酢酸 エチル、１％トリエチルアミン含有）により精製して、０．６ｇのトシル化化合 物６９を得た。収率２５％。 ４，４’−ジー（３−アジドプロポキシ）−トリフェニルメタノール（７０） の製造 ． 乾燥ＤＭＦ １５ｍＬ中における６９（０．６ｇ，０．８４ｍｍｏｌ ）の溶液に、リチウムアジド（０．１２ｇ，２．５１ｍｍｏｌ）を添加した。反 応物をアルゴン下に室温で一夜撹拌し、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シ リカ、ヘキサン中６０％酢酸エチル、１％トリエチルアミン含有）により精製し て、０．３８ｇ（１００％）の化合物７０を黄色ガムとして得た。 ４，４’−ジ−（３−アミノプロポキシ）−トリフェニルメタノール（７１） の製造 ． アジド（７０）（０．２５ｇ，０．５５ｍｍｏｌ）をメタノール中で 活性炭と共に加温し、ろ過および濃縮した。残留物を５０ｍＬのメタノールに再 溶解し、５５ｍｇのカーボン上５％パラジウムを添加した。フラスコを排気し、 水素充填バルーンを添加した。室温で１時間後、触媒をろ過した。反応物を濃縮 し、そのまま次の工程に用いた。 ４，４’−ジ−（３−マレイミドプロポキシ）−トリフェニルメタノール（７ ３）の製造 ． 粗製残留物７１を５０ｍＬの１：１ アセトニトリル：水に溶解 し、氷浴中で撹拌した。メトキシカルボニルマレイミド試薬（７２）（０．１６ ｇ，０．９８ｍｍｏｌ）を添加し、２時間にわたってｐＨを観察した（１０．１ から５に低下）。次いで１Ｍ硫酸でｐＨを２に調整し、反応物を濃縮した。残留 物を酢酸エチルとブラインの間で分配した。有機層を濃縮し、１：１ アセトニ トリル：水に再溶解し、１０ｍＬの５％炭酸水素ナトリウムと共に撹拌した。１ ７分後、反応物を１Ｍ硫酸でｐＨ３の酸性にした。酢酸エチル（２０ｍＬ）を添 加し、この溶液を分配し、水層を酢酸エチルで逆抽出した。有機層を合わせて濃 縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチルとヘキサンの混合物）に より精製して、０．１０４ｇの生成物７３を得た。収率３６％。 実施例１６． 非ＰＡＳＳオリゴヌクレオチド合成における欠損配列の選択的分 離−ジエン修飾キャッピング試薬によるキャッピングと後続のジエノフィル樹脂 または膜上への欠損配列種の捕獲 ３，５−ヘキサジエン酸無水物（７４）、３，５−ヘキサジエンオキシ酢酸無 水物（７５）およびトリヘキサジエンオキシシリルクロリド（７６）の製造 ． 化合物７４、７５および７６（反応経路１８）を当技術分野で既知の標準法によ り 製造する。化合物７４は、３，５−ヘキサジエノールから対応するヘキサジエン 酸に酸化し、次いで脱水することにより製造できる。化合物７５は無水ヨード酢 酸と３，５−ヘキサジエノールの反応により得られ、化合物７６は四塩化ケイ素 と３，５−ヘキサジエノールの反応生成物である。化合物７４、７５および７６ は、これらの合成方法のほか他の多様な方法で製造できる。 ３’−ＰＥＧ固定式溶液相合成におけるキャッピング試薬としての化合物７５ の使用と後続の欠損配列分離 ． 実施例７に記載したように溶液相合成を行い、 ただしキャッピング試薬を変更し、かつ欠損配列分離工程を追加する。キャッピ ング工程では、等量の３，５−ヘキサジエンオキシ酢酸無水物（７５）、２，６ −ルチジンおよびＮ−メチルイミダゾールを同時に溶液に注入し、撹拌する。マ レイミド誘導体化ポリスチレン樹脂を反応混合物に添加し、撹拌を続ける。樹脂 をろ過分離し、実施例７の脱トリチル化法に記載したようにポリマーをエーテル から沈殿させる。 従来の固相合成におけるキャッピング試薬としての化合物７６の使用と後続の 欠損配列分離 ． 従来の固相ＤＮＡ、ＲＮＡおよび修飾オリゴヌクレオチド合成 を固相合成装置製造業者から得られる説明に従って実施する。ただしキャッピン グ試薬に、トリ（３，５−ヘキサジエンオキシ）シリルクロリド７６を無水酢酸 の代わりに用いる。オリゴヌクレオチドを支持体から開裂させ、脱保護した後、 粗製オリゴヌクレオチドを水／アセトニトリルに装入し、マレイミド誘導体化ポ リスチレンを溶液に添加する。反応が完了すると、樹脂結合した欠損配列をろ過 し、生成物オリゴヌクレオチドを必要であればさらに精製する。 実施例１７． ５’−ＤＨＤＴＯ−ｄＴとＰＴＡＤのディールス−アルダー反応 反応経路２２に、ジエン置換トリチルアルコール５’−Ｏ−（４，４’−ジ− ３，５−ヘキサジエンオキシトリチル）チミジン（５’−ＤＨＤＴＯ−ｄＴ）( ３１)とＰＴＡＤ（８２）のディールス−アルダー反応を記載する。 反応経路２２ 無水ＣＤＣｌ₃ ３ｍＬ中における５’−ＤＨＤＴＯ−ｄＴ（３１）５１ｍｇ （３１μｍｏｌ）の溶液に、ＣＤＣｌ₃ １．２ｍＬ中における４−フェニル− １，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）（８２）２２ｍｇ（１ ２０μｍｏｌ）の溶液（０．１Ｍ）を０．１ｍＬずつアルゴン雰囲気下で添加し た。５’−ＤＨＤＴＯ−ｄＴ（３１）溶液に添加するとほぼ直ちに、ＰＴＡＤの 深赤色が漂白された。反応を¹Ｈ ＮＭＲにより監視した。出発物質（３１）に 特異なピーク下の面積をディールス−アルダー付加物に特異なピーク下の面積と 比較すると、図１０に示したグラフが得られる。図中、５’−ＤＨＤＴＯ−ｄＴ （３１）による５．８０ｐｐｍのピークの消失が表すように、０．１Ｍ ＰＴＡ Ｄ溶液０．６ｍＬ（６０μｍｏｌ）を添加すると完全な反応が起きて、予想どお りビス−ディールス−アルダー付加物８３が形成されることが分かる。 実施例１８． ４−（４−ウラゾール）安息香酸（８７）の製造 反応経路２３に４−（４−ウラゾール）安息香酸（８７）の合成を示す。 反応経路２３ セミカルバゾール（８６）の製造． トルエン１００ｍＬ中における４−イソ シアナト安息香酸エチル（８４）１０ｇ（５２ｍｍｏｌ）の溶液に、５４ｇのエ チルカルバゾール（８５）を添加した。反応混合物を２時間還流すると、その間 に白色沈殿が生成した。反応混合物を氷浴中で１０分間冷却した後、固体をろ過 し、１００ｍＬのトルエンで２回洗浄した。１４時間真空乾燥した後、１４．８ ｇの白色固体セミカルバゾール８６が単離された（収率９６％）。 ４−（４−ウラゾール）安息香酸（８７）の製造． セミカルバゾール８６（ １４．６ｇ，４９ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの４Ｎ ＮａＯＨに懸濁し、２時間還 流すると、その間に白色沈殿が徐々に溶解した。氷浴中で２５分間冷却した後、 ４ Ｎ ＨＣｌの滴加により反応混合物のｐＨを１に調整すると、白色固体が溶液か ら沈殿した。この固体をろ過し、３００ｍＬの水で４回洗浄し、Ｐ₂Ｏ₅上で１８ 時間真空乾燥して、１１．０ｇ（収率１００％）の化合物（８７）を得た。 実施例１９． ４−（４−ウラゾール）安息香酸によるアミノ官能化樹脂の誘導 体化 反応経路２４は、４−（４−ウラゾール）安息香酸（８７）によりアミノ官能 化樹脂を誘導体化するための一般法を示す。この一般法は、アミノプロピルシリ カゲル、アミノプロピルＣＰＧ、ノバシン（商標）ＴＧアミノ樹脂ＨＬ、および アルゴゲル（商標）を含めた多様なアミノ官能化樹脂に有効に適用できた。 反応経路２４ ウラゾール誘導体化樹脂（８８）の製造． ５０ｍＬのＤＭＦ中で予め膨潤させたアミノメチルポリスチレン（装填量＝０ ．９ｍｍｏｌ／ｇ）１０．１ｇの懸濁液を、５％ピリジン含有ＤＭＦ １００ｍ Ｌ中におけるウラゾール８７ ３．１３ｇ（１４ｍｍｏｌ）およびＨＯＢＴ ２ ． ３ｇ（１６．９ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。この反応混合物に７．３ｍＬ（４ ７ｍｍｏｌ）のＤＩＣを添加した。反応物を穏やかに４時間撹拌し、固体をろ過 し、次いで１００ｍＬのＤＭＦで２回、１００ｍＬのＭｅＯＨで２回、１００ｍ ＬのＣＨ₂Ｃｌ₂で２回、１００ｍＬのアセトンで２回、最後に１００ｍＬのＣＨ₂ Ｃｌ₂で２回洗浄した。Ｐ₂Ｏ₅上で４８時間真空乾燥した後、固体をニンヒドリ ン滴定により遊離第一級アミノ官能基について試験し、陰性と判定された。 実施例２０． 樹脂上でのウラゾールの直接形成によるアミノ官能化樹脂の誘導 体化 反応経路２５は、樹脂上でウラゾールを直接形成することによりアミノ官能化 樹脂を誘導体化するための一般法を示す。 反応経路２５ イソシアナート誘導体化ＴＧアミノ樹脂（９０）の製造． ５．４ｇのテンタ ゲル−ＮＨ₂樹脂８９の懸濁液を４０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂中で予め膨潤させた。こ の懸濁液にＴＥＡ（０．５ｍＬ）を添加し、混合物を５分間撹拌した。次いでト リホスゲン（１８６ｍｇ）を添加し、反応混合物を室温でさらに３時間撹拌した 後、反応混合物をろ過し、固体を１００ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂で３回洗浄して、５． ３ｇの黄色固体（９０）を得た。ニンヒドリン滴定は第一級アミン基について陰 性の試験結果を示した（ただし、ニンヒドリン／酸溶液中でこの物質を放置する と、イソシアナートの分解により、遊離アミンを示す深青色がきわめて徐々に生 じた）。この固体について拡散反射法で得たＩＲスペクトルは、２２８５ｃｍ^-1 に強いイソシアナートピークを示す。 ウラゾール誘導体化ＴＧアミノ樹脂（９２）の製造． トルエン３５ｍＬ中に おけるＴＧ−イソシアナート樹脂５．１３ｇの懸濁液に１８６ｍｇのエチルカル バゾールを添加し、反応混合物を８５℃に加熱した。２．５時間後、反応混合物 をろ過し、固体を５０ｍＬのトルエンで３回、５０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂で３回洗浄 して、５．４ｇのＴＧ−セミカルバゾール樹脂９１を得た。ＩＲスペクトルはイ ソシアナートが残っていないことを示した。明瞭な一組のカルボニル吸収が１７ ４２および１７０１ｃｍ^-1に現れる。この固体を２０ｍＬの２Ｎ ＫＯＨに再懸 濁し、９５℃に４５分間加熱した。次いで反応混合物をろ過し、固体を４０ｍＬ の水で３回、４０ｍＬのＭｅＯＨで３回、４０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂で３回洗浄した 。１６９６ｃｍ^-1に単一のカルボニル吸収をもつ生成物ウラゾール誘導体９２の ＩＲスペクトルは、出発ＴＧ−樹脂９０のものと明らかに異なる。 実施例２１． ウラゾール官能化固体支持体から１，２，４−トリアゾリン−３ ，５−ジオン（９３）への酸化 実施例２０には、ウラゾール官能化固体支持体を酸化して１，２，４−トリア ゾリン−３，５−ジオン（ＴＡＤ）にするための多様な方法を示す（反応経路２ ６）。ＰＴＡＤの酸化は求核体の存在に感受性である。ウラゾールからＴＡＤへ の酸化により、文献記載のように明るい赤色、橙色または紫色の溶液が得られる （Ｋｅａｎａら（１９８３）Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４８：１９８２）。 反応経路２６ ペンタフルオロヨードベンゼンビス（トリフルオロアセテート）による酸化． ペンタフルオロヨードベンゼンビス（トリフルオロアセテート）を用いた可溶性 ウラゾール８７および多数のウラゾール誘導体化固体の酸化はいずれも、ＤＭＦ 中およびＣＨ₂Ｃｌ₂中の両方で予想どおりに進行した。この酸化剤とＤＨＤＴ− 保護オリゴヌクレオチドとの適合性は、この酸化剤の存在下でディールス−アル ダー反応を行うことにより試験された。したがってＤＭＦ中における３’−ＨＯ −ｄＴ−５’−ＯＤＨＤＴの溶液を、酸化された樹脂に酸化剤の存在下で添加し た。溶媒としてＤＭＦを用いると、３’−ＨＯ−ｄＴ−５’−ＯＤＨＤＴが固体 支持体から赤色を効率的に漂白した。これはディールス−アルダー反応が起きて いることの信頼できる指標であることが分かっている。しかし溶媒としてＣＨ₂ Ｃｌ₂を用いると、酸化されたＴＡＤ樹脂に３’−ＨＯ−ｄＴ−５’−ＯＤＨＤ Ｔを添加すると速やかにＤＨＤＴ部分の脱トリチル化が起きる。 四酸化二窒素による酸化． ウラゾールを酸化して１，２，４−トリアゾリン −３，５−ジオンにするのに、より広く用いられる試薬のひとつは四酸化二窒素 （Ｎ₂Ｏ₄）である。この酸化剤は、可溶性ウラゾール８７の酸化、およびイソシ アナートを経てウラゾールに直接誘導体化されたＴＧアミノ樹脂（実施例２０参 照））の酸化に有効であることが証明された。この酸化剤は、アミドリンカーを 介して樹脂に結合したウラゾールの酸化には有効でない。 Ｎ−ブロモスクシンイミドによる酸化． Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ ）は、ウラゾール前駆物質からＴＡＤを形成する、安定な、比較的安全に取扱え る酸化剤である。それはＤＭＦに易溶性であり、ＣＨ₂Ｃｌ₂に比較的可溶性であ る。この酸化剤は、可溶性ウラゾール８７の酸化、およびアミドリンカーを介し て種々の樹脂に結合したウラゾール（実施例１９参照））の酸化に有効であるこ とが証明された。しかしこの酸化剤は、イソシアナートを経てウラゾールに直接 誘導体化されたＴＧアミノ樹脂（実施例２０参照））の酸化には有効でない。し たがってこの酸化剤はＮ₂Ｏ₄と相補的反応性をもつ（上記参照）。酸化剤として ＮＢＳまたはＮ₂Ｏ₄を使用することの主な欠点は、両酸化剤がウラゾール基質の 酸化に際し酸性副生物を放出し、その結果、ＤＨＤＴ−保護オリゴヌクレオチド の導入前に副生物を固体支持体から除去しなければＤＨＤＴ部分が速やかに脱ト リチル 化されることてある。 ウラゾール誘導体化した固体支持体をＮＢＳで酸化するための一般法． ＤＭ Ｆ ０．７３ｍＬ中におけるＮ−ブロモスクシンイミド１３０ｍｇ（０．７３ｍ ｍｏｌ）の溶液（０．１Ｍ）を、１．５ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂中で予め膨潤させたポ リスチレンーウラゾール０．３ｇ（装填量＝０．９ｍｍｏｌ／ｇ）の懸濁液に添 加した。固体は赤橙色に変化し、溶液は添加すると直ちに明るい黄色に変化した 。酸化を３０〜４５分間進行させた時点で固体をろ過し、１５ｍＬのＤＭＦで４ 回（ＤＭＦろ液が無色透明になるまで）、続いて２０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂で４回、 洗浄した。ＤＭＦ溶媒をＣＨ₂Ｃｌ₂で置換すると、固体は明るい赤色に変化した 。ポリスチレン−ＴＡＤは溶媒をすべて除去して保存しても安定であることが試 験により認められているが、酸化した材料を直ちに使用した。 実施例２２． ウラゾールカプロン酸によるアミノメチルポリスチレン樹脂の誘 導体化 反応経路２７に、ウラゾールカプロン酸によるアミノメチル化ポリスチレン樹 脂の合成および誘導体化を示す。 反応経路２７ ６−イソシアナトヘキサン酸エチルのセミカルバジド（９５）の製造． ベン ゼン（１０８ｍＬ）中における６−イソシアナトヘキサン酸エチル（９４）（８ ．０ｇ，４３．２ｍｍｏｌ，ランカスターから市販）の溶液をエチルカルバゼー ト（４．９５ｇ，４７．５１ｍｍｏｌ）で処理し、混合物をアルゴン雰囲気下で １時間加熱還流した。この溶液を徐々に室温にまで放冷した。反応混合物を真空 濃縮すると白色固体が得られ、これを熱酢酸エチル（１７０ｍＬ）に溶解した。 熱ヘキサン（２６０ｍＬ）を添加すると、白色沈殿が生成した。固体セミカルバ ジド９５を採集し（１１．２２ｇ，収率９０％）、¹Ｈ ＮＭＲ、¹³Ｃ ＮＭＲ 、ＩＲ、ＭＳおよび元素分析により解明した。 ６−（４−ウラゾール）カプロン酸エチルエステル（９６）の製造． 無水エ タノール（２５０ｍＬ）中におけるセミカルバジド９５（１１．３１ｇ，３９． ０９ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴン雰囲気下にナトリウムエトキシド（５．３２ ｇ，７８．１８ｍｍｏｌ）で処理した。この黄橙色溶液を１５時間加熱還流した 。その間に溶液は淡黄色になった。この溶液を徐々に室温にまで放冷し、１Ｍ ＨＣｌ／ＥｔＯＨでｐＨを３に調整した。次いで溶液をろ過し、ろ液を真空濃縮 した。残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂に装入し、濃縮した。この操作を３回繰り返し、残留 物を高真空下で一夜放置した。生成物である化合物９６をさらに精製せずに用い た。 ６−（４−ウラゾール）カプロン酸（９７）の製造． メタノール（２５０ｍ Ｌ）および水（２５０ｍＬ）中における化合物９６（３９．０９ｍｍｏｌ）の溶 液をＬｉＯＨ・Ｈ₂Ｏで処理し、混合物を３時間撹拌した。メタノールを真空下 で除去し、１Ｍ ＨＣｌでｐＨを２に調整した。この水溶液を分液漏斗に移し、 酢酸エチルおよび塩化メチレンで数回抽出した。有機相を合わせて乾燥させ（Ｎ ａ₂ＳＯ₄）、ろ過し、濃縮すると、６．１４ｇのウラゾール９７（９６からの収 率７３．６％）が白色固体として得られ、これをさらに精製せずに用いた。 ウラゾールカプロン酸で誘導体化したアミノメチル化ポリスチレン樹脂の製造 ． ＤＭＦ（６０ｍＬ）中で予め４０分間膨潤させたアミノメチル化ポリスチレン樹 脂（６．１１ｇ，装填量＝１．１３ｍｍｏｌ／ｇ，６．９０ｍｍｏｌ）の懸濁液 を、６−（４−ウラゾール）カプロン酸（９７）（１．６０ｇ，７．５３ｍｍｏ ｌ）、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（４．４５ｇ，５．５ ｍＬ，３５．２６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＢｔＯＨ） （１．９３ｇ，１２．６１ｍｍｏｌ）およびピリジン（４２ｍＬ）と混合した。 この懸濁液をアルゴン下で１５時間振とうした。次いで溶媒をろ過除去し、樹脂 をＤＭＦ（５０ｍＬで２回）、ＭｅＯＨ（５０ｍＬで２回）、塩化メチレン（５ ０ｍＬで２回）、アセトン（５０ｍＬで２回）、および塩化メチレン（５０ｍＬ で２回）で洗浄した。樹脂をデシケーター内でＰ₂Ｏ₅により２４時間減圧乾燥し て、６−（４−ウラゾール）カプロン酸誘導体化した２％アミノメチル化ポリス チレン樹脂（９８）８．１２ｇを得た。この樹脂を元素分析により分析した：計 算装填量＝１．１６ｍｍｏｌ／ｇ。 ＴＡＤ−カプロアミド樹脂（９９）の製造． 塩化メチレン（１０ｍＬ）中の 誘導体化樹脂９８（０．５２０ｇ，製造装填量＝１．３８ｍｍｏｌ／ｇ，０．７ １８ｍｍｏｌ）の懸濁液を、アルゴン下で１５分間、穏やかに振とうした。懸濁 液を０℃に冷却し、次亜塩素酸ｔ−ブチル（０．１７３ｇ，１．５９ｍｍｏｌ） で処理した。懸濁液は直ちに明るいピンク色に変化し、これを室温に達するまで ３０分間、穏やかに振とうした。真空ラインに接続したガス分散管を通してろ過 することにより、溶媒を排出した。樹脂を塩化メチレン（１０ｍＬで２回）、Ｄ ＭＦ（１０ｍＬで２回）、および塩化メチレン（１０ｍＬで２回）で洗浄した。 ｐＨを監視すると、洗浄終了時には中性になった。樹脂を高真空下にＰ₂Ｏ₅上で １５時間減圧乾燥して、０．３６０ｇの濃いピンク色の樹脂（９９）（ＴＡＤ− カプロンアミド樹脂）を得た。ＩＲ（ＫＢｒ）１７５４、１６７２ｃｍ^-1。ｔｒ ａｎｓ，ｔｒａｎｓ−１，４−ジフェニル−１，３−ブタジエンを用いた滴定に よる分析は、０．４６ｍｍｏｌ／ｇの装填量を示した。第２バッチの樹脂の酸化 および滴定により、０．７８ｍｍｏｌ／ｇの装填量が示された。 実施例２３． ビス−ＴＡＤのモノディールス−アルダー反応によるジエノフィ ル誘導体化樹脂の製造 ビス−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ビス−ＴＡＤ）(１０４) の製造 ． 反応経路２８にビス−ＴＡＤ（１０４）の合成を示す。 反応経路２８ セミカルバジド（１０２）の製造． ４，４’−メチレンービス（２，６−ジ イソプロピルアニリン）（１００）（３０．０ｇ，８１．９ｍｍｏｌ）を、隔壁 シールしてアルゴンパージした１Ｌの丸底フラスコ中へ秤量した。フラスコに５ ００ｍＬの塩化メチレンを撹拌装入した。ホスゲン（トルエン中の１．９３Ｍ溶 液１０５ｍＬ，１．２５当量）を注射器で速やかに添加し、混合物を５分間撹拌 した。飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液（２００ｍＬ）を反応混合物に撹拌添加し、混合 物を３０分間激しく撹拌した。反応混合物を２Ｌの分液漏斗に注入し、水相を分 離廃棄した。混合物をさらに飽和ＮａＨＣＯ₃（１００ｍＬで２回）およびブラ イン（１００ｍＬで１回）で洗浄した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、ろ過し 、溶媒を真空下で除去した。得られた油（１０１）をトルエンに再溶解し、１Ｌ の三つ口丸底フラスコに移した。合計５００ｍＬになるのに十分なトルエンを添 加し、フラスコをアルゴンでパージした。エチルカルバゼート（２５．５ｇ，１ ．５当量）を一度に添加し、１５分間激しく撹拌した。フラスコに還流冷却器を 取り付け、混合物を１８時間還流した。混合物を室温にまで冷却し、生成した沈 殿を採集し、塩化メチレンで洗浄し、高真空下で乾燥させて、４５．５ｇのセミ カルバジド１０２を得た。¹Ｈ ＮＭＲは純生成物に一致するスペクトルを示す 。 ビス−ウラゾール（１０３）の製造． ５００ｍＬの三つ口丸底フラスコをア ルゴンパージした。フラスコに無水エタノール（５００ｍＬ）を装入し、０℃に 冷却した。水素化リチウム（２．６０ｇ，３２７ｍｍｏｌ）を一度に添加し、１ ５分間激しく撹拌して反応させた。フラスコを撹拌およびアルゴンパージしなが ら室温にした。セミカルバジド１０２（２５．０ｇ，４０．９ｍｍｏｌ）をフラ スコに一度に添加し、フラスコに還流冷却器を取り付けた。混合物を還流させ、 １８時間反応させた。生成した沈殿をろ過し、脱イオン水に再溶解した。ｐＨが 約１になるまで濃ＨＣｌを添加した。沈殿を採集し、無水エタノールと共に蒸発 させ、高真空下で一夜乾燥させた。この反応で２０．６ｇのビスーウラゾール( １０３)を得た。¹Ｈ ＮＭＲは純生成物に一致するスペクトルを示す。 ビス−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（１０４）の製造． ビス −ウラゾール（１０３）（１８．０ｇ，３３．６ｍｍｏｌ）を、撹拌下で０℃に 冷却しながら塩化メチレン（１５０ｍＬ）に懸濁した。全開したシリンダーから 四酸化窒素を溶液に１０分間吹き込んだ。撹拌中の反応混合物からこの四酸化窒 素流入を止め、０℃で５分間、さらに室温で１時間撹拌した。溶媒および過剰の ガスを真空下で除去して、１７．５２ｇのビス−１，２，４−トリアゾリン−３ ，５−ジオン（ビス−ＴＡＤ）（１０４）を得た。¹Ｈ ＮＭＲは純生成物に一 致するスペクトルを示す。 ヘキサジエンによるアミノメチル化ポリスチレン樹脂の誘導体化． 反応経路 ２９にヘキサジエンによるアミノメチル化ポリスチレン樹脂の誘導体化を示す。 ３種の異なるアミノメチル化樹脂：１％架橋ポリスチレン（１％ＤＶＢ−ＰＳ− ＡＭ，０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）；２％架橋ポリスチレン（２％ＤＶＢ−ＰＳ−Ａ Ｍ，１．３８ｍｍｏｌ／ｇ）；および高架橋ポリスチレン（ＨＣＬ−ＰＳ−ＡＭ ，装填量０．３ｍｍｏｌ／ｇ）をヘキサジエンで官能化した。 反応経路２９ ３種の樹脂それぞれ５ｇを３０ｍＬの５０：５０（ｖ／ｖ）ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＭＦ で湿らせ、２０分間膨潤させた。別個にヘキサジエンカルボン酸（１０５）（１ ．３ｇ）をＤＭＦ（２３ｍＬ，２２．８ｇ）に溶解し、次いでピリジン（２ｍＬ ，１．９５ｇ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（２．０４ｇ ）を添加した。混合物を１０分間撹拌し、膨潤樹脂を入れた容器に移した。これ により１．５当量のヘキサジエンカルボン酸が各樹脂上に移された（２％ＤＶＢ −ＰＳ−ＡＭには２４．６６ｇ、ＨＣＬ−ＰＳ−ＡＭには３．１１ｇ）。次いで ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を各樹脂に添加し（２％ＤＶＢ−ＰＳ −ＡＭには４．６４ｇ、ＨＣＬ−ＰＳ−ＡＭには０．７ｇ）、樹脂を振とう機の 台に乗せ、１７時間弱く振とうした。次いで樹脂をＤＭＦ：ＣＨ₂Ｃｌ₂：ピリジ ン（４７．５：４７．５：５）洗浄液５０ｍＬで５回、およびＣＨ₂Ｃｌ₂洗浄液 ５０ｍＬで５回すすぎ、２４時間真空乾燥して、ヘキサジエン誘導体化樹脂（１ ０６）を得た。 ヘキサジエン誘導体化樹脂とビス−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオ ンのモノディールス−アルダー反応による誘導体化ポリスチレン樹脂の製造 ． 反応経路３０に、ヘキサジエン誘導体化樹脂とビス−１，２，４−トリアゾリン −３，５−ジオンのモノディールス−アルダー反応による樹脂の誘導体化を示す 。 反応経路３０ ビス−ＴＡＤ（１０４）（３．１２ｇ，５．９ｍｍｏｌ）を５ｍＬ（６．４２ ｇ）のジクロロメタンに装入した。この溶液２．２ｍＬ（２．８ｇ，１．９６ｍ ｍｏｌ）を直接に３種の異なる乾燥樹脂：１％ＤＶＢ−ＰＳ−ヘキサジエン（０ ．２７ｍｍｏｌ）；２％ＤＶＢ−ＰＳ−ヘキサジエン（０．３９ｍｍｏｌ）；お よびＨＣＬ−ＰＳ−ヘキサジエン（０．０９ｍｍｏｌ）（１０６）上に移した。 この樹脂とビス−ＴＡＤのスラリーを１６時間低速撹拌した時点で、すべての樹 脂を塩化メチレン（５ｍＬで８回）で洗浄し、真空乾燥して、対応する誘導体化 樹脂（１０７）を得た。ジフェニルブタジエンの捕獲により装填量を評価した。 実施例２４． チオカルボニル誘導体化樹脂とのディールス−アルダー付加環化 による生成物捕獲を用いたＰＡＳＳ 反応経路３１ アセトニトリル（または炭酸プロピレン（米国特許出願第６０／０７９，８５ ４号、１９９８年３月３０日出願、表題“オリゴヌクレオチド合成のための炭酸 プロピレンの使用”、その全体を本明細書に援用する）その他の適切な溶媒もし くは溶媒混合物）中における、５’−ＨＯ−オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ／ＲＮ Ａ，任意長さ）および５’−ＤＨＤＴ−ヌクレオシドホスホルアミダイトと４， ５−ジシアノイミダゾールの結合反応混合物を、過ヨウ素酸テトラアルキルアミ ンの塩化メチレン溶液（またはホスホロチオエート製造のための硫化試薬）で処 理する。その５’−末端にＤＨＤＴ含有モノマーを取り込んだ目的生成物として の５’−ＤＨＤＴ−オリゴヌクレオチドホスホトリエステル（１０８）を含有す るこの混合物を、次いで過剰のチオカルボニル誘導体化樹脂（１０９）を入れた 容器に移す。ＤＨＤＴ含有生成物がすべてチオカルボニルジエノフィルとのディ ールス−アルダー反応により溶液から除かれると（逆相ＨＰＬＣ分析により判定 ）、樹脂（１１１）を洗浄して、ＤＨＤＴを含有しないすべての種を分離する。 樹脂が清浄になるまで洗浄されると、次いで塩化メチレン中３％ＤＣＡで処理し て、捕獲された物質を放出させる。捕獲された生成物がすべて放出されるまで樹 脂を洗浄する。これらの洗液すべてを水性リン酸緩衝液（約ｐＨ７．０）で抽出 して、酸を中和し、かつ加水分解された未反応アミダイトを分離する。乾燥塩化 メチレン層を蒸発させて、目的生成物を得る。 実施例２５． ニトロアクリラート誘導体化樹脂とのディールス−アルダー付加 環化による生成物捕獲を用いたＰＡＳＳ 反応経路３２ アセトニトリル（または炭酸プロピレンその他の適切な溶媒もしくは溶媒混合 物）中における、５’−ＨＯ−オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ／ＲＮＡ,任意長さ ）および５’−ＤＨＤＴ−ヌクレオシドホスホルアミダイトと４，５−ジシアノ イミダゾールの結合反応混合物を、過ヨウ素酸テトラアルキルアミンの塩化メチ レン溶液(またはホスホロチオエート製造のための硫化試薬)で処理する。その５ ’−末端にＤＨＤＴ含有モノマーを取り込んだ目的生成物としての５’−ＤＨＤ Ｔ−オリゴヌクレオチドホスホトリエステル（１０８）を含有するこの混合物を 、次いで過剰のニトロアクリラート誘導体化樹脂（１１３）を入れた容器に移す 。ＤＨＤＴ含有生成物がすべてニトロアクリラートジエノフィルとのディールス −アルダー反応により溶液から除かれると（逆相ＨＰＬＣ分析により判定）、樹 脂（１１５）を洗浄して、ＤＨＤＴを含有しないすべての種を分離する。樹脂が 清浄になるまで洗浄されると、次いで塩化メチレン中３％ＤＣＡで処理して、捕 獲された物質を放出させる。捕獲された生成物がすべて放出されるまで樹脂を洗 浄する。これらの洗液すべてを水性リン酸緩衝液（約ｐＨ７．０）で抽出して、 酸を中和し、かつ加水分解された未反応アミダイトを分離する。乾燥塩化メチレ ン層を蒸発させて、目的生成物を得る。 実施例２６． 系内で生成したチオカルボニル誘導体化樹脂とのディールス−ア ルダー付加環化による生成物捕獲を用いたＰＡＳＳ 反応経路３３ アセトニトリル（または炭酸プロピレンその他の適切な溶媒もしくは溶媒混合 物）中における、５’−ＨＯ−オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ／ＲＮＡ,任意長さ ）および５’−ＤＨＤＴ−ヌクレオシドホスホルアミダイトと４，５−ジシアノ イミダゾールの結合反応混合物を、過ヨウ素酸テトラアルキルアミンの塩化メチ レン溶液(またはホスホロチオエート製造のための硫化試薬)で処理する。その５ ’−末端にＤＨＤＴ含有モノマーを取り込んだ目的生成物としての５’−ＤＨＤ Ｔ−オリゴヌクレオチドホスホトリエステル（１０８）を含有するこの混合物を 、次いで過剰の誘導体化樹脂１１７を入れた容器に移す。この混合物を加熱して チオスルフィナート（１１７）を分解させ、固体支持体に結合した対応するチオ アルデヒド（１１９）にする。ＤＨＤＴ含有生成物がすべてチオアルデヒドジエ ノフィルとのディールス−アルダー反応により溶液から除かれると（逆相ＨＰＬ Ｃ分析により判定）、樹脂（１２１）を洗浄して、ＤＨＤＴを含有しないすべて の種を分離する。樹脂が清浄になるまで洗浄されると、次いで塩化メチレン中３ ％ＤＣＡで処理して、捕獲された物質を放出させる。捕獲された生成物がすべて 放 出されるまで樹脂を洗浄する。これらの洗液すべてを水性リン酸緩衝液（約ｐＨ ７．０）で抽出して、酸を中和し、かつ加水分解された未反応アミダイトを分離 する。乾燥塩化メチレン層を蒸発させて、目的生成物を得る。 実施例２７． 系内で生成したニトロソホルメート誘導体化樹脂とのディールス −アルダー付加環化による生成物捕獲を用いたＰＡＳＳ 反応経路３４ アセトニトリル（または炭酸プロピレンその他の適切な溶媒もしくは溶媒混合 物）中における、５’−ＨＯ−オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ／ＲＮＡ,任意長さ ）および５’−ＤＨＤＴ−ヌクレオシドホスホルアミダイトと４，５−ジシアノ イミダゾールの結合反応混合物を、過ヨウ素酸テトラアルキルアミンの塩化メチ レン溶液(またはホスホロチオエート製造のための硫化試薬)で処理する。その５ ’−末端にＤＨＤＴ含有モノマーを取り込んだ目的生成物としての５’−ＤＨＤ Ｔ−オリゴヌクレオチドホスホトリエステル（１０８）を含有するこの混合物を 、次いで過剰の誘導体化樹脂（１２３）を入れた容器に移す。混合物中に存在す る過剰の過ヨウ素酸塩がヒドロキシカルバミン酸エステル誘導体化樹脂を酸化し て、ニトロソホルメート誘導体化樹脂（１２５）にする。ＤＨＤＴ含有生成物が すべ てニトロソホルメートジエノフィルとのディールス−アルダー反応により溶液か ら除かれると（逆相ＨＰＬＣ分析により判定）、樹脂（１２７）を洗浄して、Ｄ ＨＤＴを含有しないすべての種を分離する。樹脂が清浄になるまで洗浄されると 、次いで塩化メチレン中３％ＤＣＡで処理して、捕獲された物質を放出させる。 捕獲された生成物がすべて放出されるまで樹脂を洗浄する。これらの洗液すべて を水性リン酸緩衝液（約ｐＨ７．０）で抽出して、酸を中和し、かつ加水分解さ れた未反応アミダイトを分離する。乾燥塩化メチレン層を蒸発させて、目的生成 物を得る。次いでこれを他のＰＡＳＳサイクルに出発５’−ＨＯ−オリゴとして 使用できる。 実施例２８． トリアゾールジオン誘導体化樹脂とのディールス−アルダー付加 環化による生成物捕獲を用いたＰＡＳＳサイクル（無水） ＰＳ−ウラゾール樹脂の酸化： ＣＨ₂Ｃｌ₂ ２０ｍＬ中におけるＰＳ−ウラ ゾール１．７ｇの懸濁液を、ＤＭＦ １５ｍＬ中のＮＢＳ ２．７ｇで処理した 。次いで反応混合物をろ過し、明るい赤色の固体を１０ｍＬのＤＭＦで３回、２ ０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂で５回洗浄した。この固体を１時間真空乾燥し、１５ｍＬの ＣＨ₂Ｃｌ₂に再懸濁した。 結合／酸化反応： ＣＨ₂Ｃｌ₂ １．５ｍＬ中におけるＴＢＤＰＳｉＯ−ｄＴ −［３’，３’］−ｄＴ−ＯＨ二量体（１２５ｍｇ）の溶液を、ＡＣＮ中の０． ２２Ｍ ＤＨＤＴＯ−ｄＴアミダイト溶液（モレキュラーシーブ上に保存し、使 用前にろ過）１．０ｍＬと混合した。この溶液に、ＡＣＮ中の１．０Ｍ ＤＣＩ 溶液（モレキュラーシーブ上に保存し、使用前にろ過）１．８ｍＬを添加した。 溶液は１５分後に乳白色に変化し、３ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂を添加しても溶液を澄明 化できなかった。３０分後、結合が完了したことがＨＰＬＣにより判定された( 図１３Ａ)。次いでこの三量体を、ＣＨ₂Ｃｌ₂中の１．０Ｍ過ヨウ素酸テトラブ チルアンモニウム溶液の添加により酸化した。８分後に酸化が完了したことがＨ ＰＬＣにより判定された（図１３Ｂ）。 固相ディールス−アルダー捕獲反応： 上記の粗製反応混合物をそのまま、酸 化された樹脂に注射器で添加した。１０分後、捕獲が完了したことがＨＰＬＣに より判定された。２５分後、薄いピンク色の樹脂が完全に漂白されて淡黄色にな った。これはＴＡＤがＡＣＮまたはＤＣＩに対し不安定なためであろう。次いで 樹脂を３０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂で８回洗浄して、不純物や未反応物質を分離した。 洗液と酸化された物質との比較を図１３Ｃに示す。 脱トリチル／放出反応： 次いで樹脂を１０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に懸濁し、ＣＨ₂ Ｃｌ₂中の３％ＤＣＡ ２０ｍＬで処理して、捕獲されていた物質を脱トリチル 化し、放出させた。その後の洗浄中に、固体から少量のトリチル（橙色によって 明らか）が浸出した。固体からＵＶ活性物質かもはや浸出しないことがＴＬＣで 示されるまで、固体を３０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂で５回洗浄した。次いで淡橙色の洗 液をヘキサンでそれらの容量の２倍に希釈した。全容量の約１／４にまで溶媒を 真空下で除去した。新たなヘキサンを用いてこの操作を繰り返し、ＣＨ₂Ｃｌ₂を ヘキサンで完全に交換した。この溶媒交換操作中に、溶液から三量体−ＯＨが沈 殿した。この固体沈殿を１００ｍＬのヘキサンで３回摩砕処理し、ＡＣＮに再溶 解した。このＡＣＮ溶液をダウエックス（商標）−１−クロリド樹脂のパッドに 通して洗浄し、残留ＤＣＡを除去した。溶媒を除去し、１４０ｍｇの桃色固体を 単離した。ヘキサン摩砕処理洗液からさらに１２ｍｇが回収され、合計収量１５ ２ｍｇ（収率８９％）となった。最終ＨＰＬＣおよび³¹Ｐ−ＮＭＲ（ｄ₃−ＡＣ Ｎ）を図１３Ｄおよび１３Ｅに示す。 実施例２９． ヒドロホウ素化によるジエン合成 反応経路２７にヒドロホウ素化によるジエン−オールの一般合成法を示す。 反応経路３５ このアルコールは、９−ＢＢＮ（１３１）または（Ｓｉａ）₂ＢＨ（示されて いない）を用いて合成できる。その安定性、扱いやすさ、およびカラムクロマト グラフィーによる反応副生物―１，５−シクロオクタンジオール―からの生成物 の精製しやすさのため、９−ＢＢＮが好ましい。３−メチル−２−ブタノール（ （Ｓｉａ）₂ＢＨを用いたヒドロホウ素化により生成する主な副生物）は１１２ ℃で沸騰し、ピリジンと共に数回蒸発させることにより除去され、目的アルコー ルが残る。次いでＳｉＯ₂を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより これを精製する。７０℃より高い温度での蒸留ではジエンが重合することが知ら れている。 ４，６−ヘキサジエン−１−オール（１３５）の合成． 撹拌棒および１２５ ｍＬの目盛付きＰ．Ｅ．滴下漏斗を備えた２５０ｍＬの三つ口丸底フラスコをオ ーブン乾燥し、組み立て、熱時隔壁シールする。この装置をアルゴンパージ下で 冷却する。ガラス注射器をすべてオーブン乾燥し、組み立て、アルゴンパージ下 で冷却する。 この装置にＴＨＦ（１０ｍＬ）および１，３，６−ヘプタトリエン１２９（４ ．６ｇ，４８ｍｍｏｌ）を注射器で装入する。９−ＢＢＮ（１３１）（ＴＨＦ中 の０．５Ｍ溶液８８ｍＬ，４４ｍｍｏｌ）を滴下漏斗にカニューレ装入する。フ ラスコを−１０℃に冷却し、９−ＢＢＮを３０分かけて添加する。反応混合物を さらに２．５時間撹拌し、その間、温度を０〜−１０℃に維持する。ＮａＨ₂Ｐ Ｏ₄水溶液（５Ｍ溶液１３．３ｍＬ）およびＮａＯＨ水溶液（６Ｍ溶液１０．６ ｍＬ）を３００ｍＬの三角フラスコに添加し、０℃に冷却する。撹拌しながらＨ₂ Ｏ₂水溶液（３０％溶液３０ｍＬ）を添加する。次いで反応混合物を撹拌しなが ら、緩衝化した酸化混合物に３０分かけて徐々に滴加する。混合物を０℃にさら に１．５時間、続いて室温に２時間保持する。溶液が混濁しない場合、これは混 合物が２層でないことを示し、混合物が混濁するまで撹拌しながら水を追加する 。水相の分離を補助するために、撹拌しながら固体Ｋ₂ＣＯ₃を添加する。次いで 、３０ｍＬのブラインを入れた分液漏斗にこの混合物を注入し、混合物を振とう する。水相をエーテルで２回抽出し、有機相を合わせてＭｇＳＯ₄で乾燥させ、 ろ過し、溶媒を除去する。アルコール（１３５）は真空蒸留（約７０℃で分解） またはカラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂中５％ＥｔＯＡｃ）で精製できる 。 実施例３０． トリチル誘導体化した固体支持体を用いたＰＡＳＳ 実施例１２９（反応経路３７〜３９）にはＰＡＳＳにおけるトリチル誘導体化 した固体支持体の使用を示す。 反応経路３７ トリチルチミジン樹脂（１４６）の製造． ４−メトキシトリチルクロリド樹 脂（１４３）（１０ｇ，１％架橋ポリスチレン，カルビオケム−ノバビオケムか ら入手，トリチル装填量０．５３ｍｍｏｌ／ｇ）を、乾燥ジメチルアミノピリジ ン（ＤＭＡＰ）（１３０ｍｇ）、続いてチミジン（１４５）（１．９９ｇ，樹脂 のトリチル装填量を基準として１．５当量，ピリジンからの同時蒸発により乾燥 ）およびピリジン（６０ｍＬ）で処理した。このスラリーをオービタルシェーカ ーにより室温で４６時間混合した。スラリーをガラスフィルターに乗せ、未反応 チ ミジンがすべて分離されるまでピリジンおよび塩化メチレンで洗浄した。洗浄し た樹脂を２時間真空乾燥すると、１０．９３ｇのカナリア黄色固体（１４６）が 得られた。乾燥樹脂（０．１０９ｇ）を１０ｍＬのメスフラスコ内で塩化メチレ ン中３％ジクロロ酢酸５ｍＬにより処理し、この溶液をマークまでＤＭＳＯで希 釈した。試料樹脂から放出されたチミジン量をＨＰＬＣアッセイ（４．６×２５ ０ｍｍフェノモネックス・ジュピターＣ１８カラム，水／アセトニトリル濃度勾 配，２％から４０％アセトニトリルまで，２０分間にわたる）で測定し、チミジ ン０．２９ｍｍｏｌ／樹脂ｇ（理論値の約５５％）であることが認められた。 トリチルチミジンホスホルアミダイト樹脂（１４７）の製造． トリチルチミ ジン樹脂（１４６）（５．１２ｇ，１．４８ｍｍｏｌ）を一夜真空乾燥した。樹 脂を乾燥フラスコにアルゴン下で装入し、ＤＣＩ（３５２ｍｇ，２．９ｍｍｏｌ ，２当量）および乾燥塩化メチレン（３０ｍＬ）、続いてシアノエチルテトラプ ロピルホスホルジアミダイト（０．９５ｍＬ，２．９ｍｍｏｌ，２当量）で処理 した。この混合物をオービタルシェーカーにより室温で１時間混合し、次いでガ ラスフィルター付き漏斗に移し、塩化メチレンで洗浄して、結合していない物質 をすべて分離した。樹脂を室温で６４時間真空乾燥して、５．０２ｇの固体、化 合物１４７（回収率９２％）を得た。 トリチル樹脂上でのチミジン二量体の製造． 反応経路３８にトリチル誘導体 化樹脂を用いたチミジン二量体の製造を示す。 反応経路３８ ５ｇのチミジンホスホルアミダイト樹脂（１４７）に、、ＤＣＩ（０．３６５ ｇ，３．１ｍｍｏｌ，２．２６当量）および５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル −Ｏ−チミジン−３’−ＯＨ（１２Ａ）（１．５ｇ，３．１ｍｍｏｌ，２．２６ 当量）を添加した。これらの乾燥固体にアルゴン下で、乾燥アセトニトリル（１ ０ｍＬ）および塩化メチレン（５ｍＬ）を添加した。５’−ｔ−ブチルジフェニ ルシリル−Ｏ−チミジン−３’−ＯＨの量が一定になったと思われるまで（約４ 時間；この試薬を約１．３倍当量使用）、結合反応をＨＰＬＣにより監視した。 ２５ｍＬの塩化メチレンに溶解した過ヨウ素酸テトラブチルアンモニウム（１． ３５ｇ，３．１ｍｍｏｌ）の添加により混合物を酸化した。この溶液をオービタ ルシェーカーで８分間混合した。混合物を粗いガラスフィルターでろ過し、ポリ マーを塩化メチレン（５０ｍＬで２０回）で洗浄して、結合していない反応成分 をすべて分離した。このポリマー（１４８）に塩化メチレン中３％ジクロロ酢酸 ７５０ｍＬを５０ｍＬずつ添加して、樹脂から二量体生成物を脱トリチル化した 。中和しかつジクロロ酢酸を除くために７５０ｍＬの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐ Ｈ ７．５）中へ生成物をろ過して、樹脂から分離した。塩化メチレン層を６５０ｍ Ｌのリン酸緩衝液で２回洗浄した。塩化メチレン層を硫酸ナトリウムで乾燥させ 、ろ過および蒸発させて１．０６ｇ（９２％）の二量体１４９を得た。³¹Ｐ−Ｎ ＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ−２．４９および−２．５５（ｓ，ジアステ レオトピック）。Ｍｓ ｍ／ｅ；Ｃ₃₉Ｈ₄₈Ｎ₅Ｏ₁₂ＰＳｉ，計算値８３７．８； 実測値８３６．６（エレクトロスプレ−ＥＳ^-モード）．樹脂から開裂した後の 逆相ＨＰＬＣを図１４に示す。 トリチル樹脂上でのチミジン三量体の製造． 反応経路３９にトリチル誘導体 化樹脂上でのチミジン三量体の製造を示す。 チミジンホスホルアミダイト樹脂１４７（４．７２ｇ，約１．２７ｍｍｏｌ， １．３当量）に、ＤＣＩ（０．２４６ｇ，２．１ｍｍｏｌ，２．０当量）および ５’−ＨＯ−Ｔ−Ｔ二量体（１４９）（０．８４０ｇ，１．０ｍｍｏｌ，制限試 薬）を添加した。この固体混合物を真空乾燥し、次いでアルゴンでパージした。 これらの固体に、アルゴン下で１０ｍＬの乾燥アセトニトリルおよび５ｍＬの塩 化メチレンを添加した。５’−ＨＯ−Ｔ−Ｔ二量体が消費されるまで（約１８０ 分）、結合反応をＨＰＬＣにより監視した。２０ｍＬの塩化メチレンに溶解した 過ヨウ素酸テトラブチルアンモニウム（１．０８ｇ，２．５ｍｍｏｌ）の添加に より、混合物を酸化した。この溶液をオービタルシェーカーで混合し、次いで粗 いガラスフィルターでろ過し、ポリマーを塩化メチレンおよびアセトニトリルで 洗浄して、結合していない反応成分をすべて分離した。このポリマー（１５１） に塩化メチレン中３％ジクロロ酢酸５００ｍＬを５０ｍＬずつ添加して、樹脂か ら二量体生成物を脱トリチル化した。中和しかつジクロロ酢酸を除くために５０ ０ｍＬの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中へ生成物をろ過して、樹脂から 分離した。塩化メチレン層を５００ｍＬのリン酸緩衝液で２回洗浄し、硫酸ナト リウムで乾燥させ、ろ過し、蒸発させ、真空下に６４時間置いて、１．０４ｇ（ ８７％）の三量体１５２を得た。³¹Ｐ−ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ− １．５０および−１．５４（ｓ，ジアステレオトピック），−２．４９および− ２．５５（ｓ，ジアステレオトピック）。Ｍｓ ｍ／ｅ；Ｃ₅₂Ｈ₆₄Ｎ₈Ｏ₁₉Ｐ₂Ｓ ｉ，計算値１１９５．１４；実測値１１９３．９（エレクトロスプレーＥＳ^-モ ード）．樹脂から開裂した後の三量体１５２の逆相ＨＰＬＣを図１５に示す。 実施例３１． ＰＡＳＳ法を用いたモノマーの保護および精製 反応経路４０ ＤＨＤＴ ２’−ｆＣ ３’−ＴＢＤＰＳｉ（１５４）の製造． この実験は ２．７０ｍｍｏｌ規模で行われた。ＤＭＦ ３ｍＬ中のイミダゾール（０．６９ ０ｇ，９．８６ｍｍｏｌ）、ＴＢＤＰＳｉ−Ｃｌ（２，３１４ｇ，８．４３ｍｍ ｏｌ）、および塩化メチレン１０ｍＬ中のＤＨＤＴ ｆＣ ３’−ＯＨ（１５３ ）（シチジンはアセチル保護されている）（１．９７ｇ，２．７ｍｍｏｌ）を混 和することにより、ＤＨＤＴ ２’−ｆＣ ３’−ＴＢＤＰＳ（１５４）を形成 した。ＤＨＤＴ ｆＣ ３’−ＯＨをアルゴン下で、撹拌棒を備えた５０ｍＬの 丸底フラスコに添加した。６５分後、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８可逆カラム，１０％ から９０％までのアセトニトリル／ＮＨ₄ＯＡｃ，３０℃で３０分間にわたる） により反応が完了したことが判定された（図１６Ａ）。 ディールス−アルダー付加環化による捕獲： 次いで５’−ＤＨＤＴ ２’− ｆＣ ３’−ＴＢＤＰＳ（１５４）（４８．６％）を、下記によりＰＴＡＤ−Ｐ Ｓ樹脂とのディールス−アルダー付加環化により捕獲した。ＤＨＤＴ ２’−ｆ Ｃ ３’−ＴＢＤＰＳ（１５４）（９．４８ｇ）の溶液を、ＰＴＡＤ−ＰＳ樹脂 （１７．４６ｇ）を入れたフリット付き容器に移した。捕獲前に樹脂上で２回洗 浄した。捕獲溶液をＴＬＣで監視した。逆相ＨＰＬＣ(Ｃ１８可逆カラム，１０ ％から９０％までのアセトニトリル／ＮＨ₄ＯＡｃ，３０℃で３０分間にわたる) により捕獲が４４分以内に完了したことが判定された（図１６Ｂ）。次いで、Ｔ ＬＣでＵＶ活性物質が検出できなくなるまで、樹脂をＤＣＭで洗浄した（１００ ｍＬで７回）。 放出： 化合物１５４を放出させるために、樹脂をＤＣＭ中３％ＤＣＡ（７０ ｍＬで５回）で洗浄した。次いで樹脂をＤＣＭ（７０ｍＬで２回）で洗浄した。 ＤＣＡおよびＤＣＭによるそれそれの放出一洗浄後直ちに、５００ｍＬの０．２ Ｍ（ｐＨ７．５）Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液を入れた分液漏斗に洗液を移した。分液漏 斗の内容物を相分離させ、各相を排出した。有機相を５００ｍＬの０．２Ｍ Ｎ ａ₂ＨＰＯ₄で再度洗浄した。再び相分離させ、排出した。図１６Ｃに有機相と水 相両方の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１６Ｃから分かるように、生成 物（５’−ＨＯ ２’−ｆＣ ３’−ＴＢＤＰＳ（１５５））はすべて有機相中 にある。表１０に、保護されたモノマー１５５の収率および純度を示す。捕獲率 は１００％であった。生成物の¹Ｈ−ＮＭＲ分析(ＣＤＣｌ₃)を図１６Ｄに示す。 。ＭＳ予想質量５２５．６４；実測値５２５．４。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 セトル，アレシア アメリカ合衆国コロラド州80027，スペリ アー，イースト・リバーベンド・ストリー ト 1497 (72)発明者 ツァイ，ヤンシェン アメリカ合衆国カリフォルニア州94303, パロ・アルト，コロラド・プレイス 1072 (72)発明者 ファン，ジャンピン アメリカ合衆国コロラド州80026，ラファ イエット，オーチャード・コート 1407 (72)発明者 ヒル，ケン アメリカ合衆国コロラド州80466，ネダー ランド，イースト・フィフス・ストリート 115 (72)発明者 スミス，ランドール・エス アメリカ合衆国コロラド州80301，ボール ダー，ハビタット・ドライブ 6175，ナン バー 1072 (72)発明者 イェッジ，ジョン アメリカ合衆国コロラド州80501，ロング モント，コリー・ストリート 916

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法であって、 ａ）５’−保護モノマー単位を出発物質と反応させて、生成物を含有する反応 混合物を調製し；そして ｂ）生成物を、５’−保護基の存在に基づいて、未反応出発物質、未反応５’ −保護モノマー単位、副生物および試薬から分配する ことを含む方法。 ２．５’−保護モノマー単位が次式： （式中： Ｂは核酸塩基であり； Ａは２’−糖置換基であり； Ａ’は２’−糖置換基であり； Ｗは、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホナート、ホスフェートトリエステル、 メチルホスホナート、ホスホルアミデート、および保護されたオリゴヌクレオチ ドよりなる群から独立して選択され、ここで、保護されたオリゴヌクレオチドは ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホナート、ホスフェートトリエステル、メチルホ スホナート、ホスホルアミデートよりなる群から選択される３’−末端基を有し ； Ｄ−Ｅはアルコール保護基（１またはそれ以上）である） を有する、請求項１記載の方法。 ３．Ｅが下記の構造を有するトリチル基：（式中のＤは下記よりなる群から独立して選択され：Ｈ、ＯＲ⁴、共役ジエン単 位を有するアルキル基または置換アルキル基、共役ジエン単位を有するアルコキ シ基または置換アルコキシ基、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、ＣＨ₂＝ ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、アルケニル基または置換アルケニル基、 マレイミド置換アルコキシ基、ジエノフィル置換アルコキシ基、アルコキシ基、 共役ジエン単位を有するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、マレイ ミド置換アルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、ジエノフィル部分を有 するアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、固体支持体、たとえば樹脂 、ポリマーまたは膜、１，３−双極子基、開環メタテシス重合を行うことができ る置換基、たとえば７−オキサノルボレン含有置換基、ジスルフィド、アルデヒ ド類、および金属キレート化剤、ジエノフィルまたはジエン単位を有するシリル エーテル；ここで Ｒ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アル ケニルル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチル ジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭 水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される） である、請求項２記載の方法。 ４．Ｄが下記の化合物よりなる群から独立して選択される、請求項３記載の方 法： 式中、 Y=O,NH,S,P(H)(OR⁴),P(OR⁴)₂,POH(O)(OR⁴),NH(CO),(CO)NH,O(CO)(CO)O,NH(CO)NH ,NH(CO)O,O(CO)NH,NH(CS)NH,NH(CS)O,O(CS)N なし，ＳＯ，ＳＯ₂； Ｌ＝連結基； Ｘ＝電子吸引基または電子供与基； ５．樹脂が、シリカ、セルロース、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、 メタクリラート、ポリスチレンおよびポリエチレングリコールよりなる群から選 択される、請求項３記載の方法。 ６．トリチル基が下記の構造： （式中のＰは固体支持体である）を有する、請求項３記載の方法。 ７．Ｅが下記の構造：を有するレブリン酸基であり、式中のＤが下記の化合物よりなる群から独立して 選択される、請求項２記載の方法： 式中、 Y=O,NH,S,P(H)(OR⁴),P(OR⁴)₂,POH(0)(OR⁴),NH(CO),(CO)NH,O(CO)(CO)O,NH(CO)NH ,NH(CO)O,O(CO)NH,NH(CS)NH,NH(CS)O,O(CS)N なし，ＳＯ，ＳＯ₂； Ｌ＝連結基； Ｘ＝電子吸引基または電子供与基； ８．Ｅが下記の構造のうちのいずれか： を有するシリル基であり、式中のＤが下記の化合物よりなる群から独立して選択 される、請求項２記載の方法： 式中、 Y=O,NH,S,P(H)(OR⁴),P(OR⁴)₂,POH(O)(OR⁴),NH(CO),(CO)NH,O(CO)(CO)O,NH(CO)NH ,NH(CO)O,O(CO)NH,NH(CS)NH,NH(CS)O,O(CS)N なし，ＳＯ，ＳＯ₂； Ｌ＝連結基； Ｘ＝電子吸引基または電子供与基； ９．分配が、１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン、ビス−１，２，４ −トリアゾリン−３，５−ジオン、ＴＡＤ−カプロアミド、チオカルボニル、ニ トロアクリラート、ニトロソホルメートおよびマレイミドよりなる群から選択さ れるジエノフィルで誘導体化された固体支持体を通して、反応混合物を溶離する ことにより行われる、請求項１記載の方法。 １０．チオカルボニルが、チオケトン、チオアルデヒド、チオエステル、チオ カルバメート、チオカーボネートおよびチオアミドよりなる群から選択される、 請求項９記載の方法。 １１．チオカルボニル誘導体化した樹脂が系内で生成する、請求項９記載の方 法。 １２．ニトロソホルメート誘導体化した樹脂が系内で生成する、請求項９記載 の方法。 １３．オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法であって、 ａ）５’−保護モノマー単位を出発物質と反応させて、生成物および出発物質 を含有する反応混合物を調製し； ｂ）工程ａ）の反応混合物を有機溶媒に可溶性の酸化剤で酸化し； ｃ）工程ｂ）の混合物に固体支持体を添加し、その際、酸化された生成物は固 体支持体との共有結合反応により固体支持体に保持され、出発物質は溶媒中に残 留し； ｄ）固体支持体を洗浄して出発物質を分離し； ｅ）固体支持体を希酸で洗浄することにより、酸化された生成物を固体支持体 から溶離し；そして ｆ）所望により前記工程の溶出液を中和する ことを含む方法。 １４．工程ｂ）の前に工程ｃ）を行う、請求項１３記載の方法。 １５．共有結合反応が、ディールスーアルダー反応、１，３−双極子付加環化 反応、２＋２付加環化反応および求核置換反応よりなる群から選択される、請求 項１３記載の方法。 １６．次式の化合物：（式中、 Ｒ’は、ジエン、ジエノフィル、１，３−双極子およびアルケンよりなる群か ら選択され； Ｘは、ハロゲン、ヒドロキシル、ＯＲ”およびＯＡｒよりなる群から選択され 、ここでＲ”はアルキル基または置換アルキル基であり、Ａｒは芳香族基または ヘテロ芳香族基である）。 １７．Ｒ’が４，６−ヘプタジエンである、請求項１６記載の化合物。 １８．請求項１６記載の化合物と、固体支持体に結合したジエノフィル、固体 支持体に結合したジエン、ジエンおよびジエノフィルよりなる群から選択される 化合物とのディールスーアルダー反応により形成される化合物。 １９．Ｒ’が４，６−ヘプタジエンである、請求項１８記載の化合物。 ２０．ジエノフィルが１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンである、請 求項１８記載の化合物。 ２１．次式の化合物： （式中： Ｂは核酸塩基であり； Ａは２’−糖置換基であり； Ａ’は２’−糖置換基であり； Ｗは、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホナート、ホスフェートトリエステル、 メチルホスホナート、ホスホルアミデート、および保護されたオリゴヌクレオチ ドよりなる群から独立して選択され、ここで、保護されたオリゴヌクレオチドは ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホナート、ホスフェートトリエステル、メチルホ スホナート、ホスホルアミデート、および脱保護されたオリゴヌクレオチドより なる群から選択される３’−末端基を有し； Ｒ’はジエンまたはジエノフィルから選択される）。 ２２．請求項２１記載の化合物と、固体支持体に結合したジエノフィル、固体 支持体に結合したジエン、ジエンおよびジエノフィルよりなる群から選択される 化合物とのディールス−アルダー反応により形成される化合物。 ２３．Ｒ’が４，６−ヘプタトリエンである、請求項２２記載の化合物。 ２４．ジエノフィルが１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンである、請 求項２２記載の化合物。 ２５．次式の化合物： （式中、 Ｒ’は、ジエン、ジエノフィル、１，３−双極子およびアルケンよりなる群か ら選択され； Ｒ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アル ケニルル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチル ジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭 水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択され； Ｘは、ハロゲン、ヒドロキシル、ＯＲ”およびＯＡｒよりなる群から選択され 、ここでＲ”はアルキル基または置換アルキル基であり、Ａｒは芳香族基または ヘテロ芳香族基である）。 ２６．Ｒ’が３，５−ヘキサジエン、２，４−ヘキサジエンまたは４，６−ヘ プタジエンよりなる群から選択される、請求項２５記載の化合物。 ２７．請求項２５記載の化合物と、固体支持体に結合したジエノフィル、固体 支持体に結合したジエン、ジエンおよびジエノフィルよりなる群から選択される 化合物とのディールス−アルダー反応により形成される化合物。 ２８．Ｒ’が３，５−ヘキサジエン、２，４−ヘキサジエンまたは４，６−ヘ プタジエンよりなる群から選択される、請求項２７記載の化合物。 ２９．ジエノフィルがマレイミドおよび１，２，４−トリアゾリン−３，５− ジオンよりなる群から選択される、請求項２７記載の化合物。 ３０．Ｘが存在せず、正に荷電した化合物となる、請求項２７記載の化合物。 ３１．次式の化合物： （式中： Ｂは核酸塩基であり； Ａは２’−糖置換基であり； Ａ’は２’−糖置換基であり； Ｗは、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホナート、ホスフェートトリエステル、 メチルホスホナート、ホスホルアミデート、および保護されたオリゴヌクレオチ ドよりなる群から独立して選択され、ここで、保護されたオリゴヌクレオチドは ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホナート、ホスフェートトリエステル、メチルホ スホナート、ホスホルアミデート、および脱保護されたオリゴヌクレオチドより なる群から選択される３’−末端基を有し； Ｒ’は、ジエンまたはジエノフィルから選択され； Ｒ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アル ケニルル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチル ジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭 水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択される）。 ３２．Ｗがホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホナート、および保護されたオリゴ ヌクレオチドよりなる群から選択され、ここで、保護されたオリゴヌクレオチド はホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホナートから選択される３’−末端基を有 する、請求項３１記載の化合物。 ３３．ＡおよびＡ’が独立して、Ｈ、²Ｈ、³Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨＯＲ¹ 、ＮＨＯＲ³、ＮＨＮＨＲ³、ＮＨＲ³、＝ＮＨ、ＣＨＣＮ、ＣＨＣｌ₂、ＳＨ、Ｓ Ｒ₃、ＣＦＨ₂、ＣＦ₂Ｈ、ＣＲ² ₂Ｂｒ、−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_nＯＣＨ₃、ＯＲ₄、お よびイミダゾールよりなる群から選択され； Ｒ¹が、Ｈおよびアルコール保護基よりなる群から選択され； Ｒ²が、＝Ｏ、＝Ｓ、Ｈ、ＯＨ、ＣＣｌ₃、ＣＦ₃、ハライド、所望により置換 されたＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル（環式、直鎖および分枝鎖を含む）、アルケニル、ア リール、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アシル、ベンゾイル、ＯＲ⁴、およびエステルよりなる群から 選択され； Ｒ³が、Ｒ²、Ｒ⁴、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｓ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｏ）ＣＦ₃、Ｓ Ｏ₂Ｒ⁴、アミノ酸、ペプチドおよびその混合物よりなる群から選択される、 請求項３１記載の化合物。 ３４．ＡがＨ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃｌ、Ｆ、−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_nＯＣＨ₃、ＮＨ ＯＲ、ＯＲ⁴、ＯＳｉＲ⁴ ₃よりなる群から選択され；Ａ’がＨである、 請求項３１記載の化合物。 ３５．Ｒ’が３，５−ヘキサジエン、２，４−ヘキサジエンおよび４，６−ヘ プタジエンよりなる群から選択される、請求項３１記載の化合物。 ３６．請求項３１記載の化合物と、固体支持体に結合したジエノフィル、固体 支持体に結合したジエン、ジエンおよびジエノフィルよりなる群から選択される 化合物とのディールス−アルダー反応により形成される化合物。 ３７．Ｒ’が３，５−ヘキサジエン、２，４−ヘキサジエンおよび４，６−ヘ プタジエンよりなる群から選択される、請求項３６記載の化合物。 ３８．ジエノフィルがマレイミドおよび１，２，４−トリアゾリン−３，５− ジオンよりなる群から選択される、請求項３６記載の化合物。 ３９．オリゴヌクレオチドの溶液相合成方法であって、 ａ）５’−位に第１固体支持体と反応しうる保護基を含む５’−保護モノマー 単位を出発物質と反応させて、生成物、５’−保護モノマー単位および出発物質 を含有する反応混合物を調製し、その際、第１固体支持体が１，２，４−トリア ゾリン−３，５−ジオンであり； ｂ）反応混合物を第１固体支持体が収容されたクロマトグラフィー樹脂チャン バーに循環させ、その際５’−保護モノマー単位および生成物が第１固体支持体 と共有結合反応し、これにより固体支持体に保持され； ｃ）第１固体支持体を第１溶媒で洗浄して出発物質を溶離し； ｄ）保持された５’−保護モノマー単位および生成物を含有する第１固体支持 体を希酸で洗浄し、次いで第２有機溶媒で溶離して、生成物を５’−保護モノマ ー単位と共に放出させて分離し；そして ｅ）工程ｄ）で得た有機排出液を第２固体支持体に通すことにより、生成物を ５’−保護モノマー単位から分離し、その際５’−保護モノマー単位は第２固体 支持体に保持され、生成物は第２溶媒により溶離される ことを含む方法。 ４０．次式の化合物：