JP4791043B2 - 同一固体支持体上で、2以上のオリゴヌクレオチドをタンデムに合成するための方法および組成物 - Google Patents
同一固体支持体上で、2以上のオリゴヌクレオチドをタンデムに合成するための方法および組成物 Download PDFInfo
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Description
本発明は、ヌクレオチド化学反応の分野に関する。より具体的には、本発明はオリゴヌクレオチド合成に関する。さらにより具体的には、本発明は、1回の合成実行における、同一固体支持体上での2以上の異なるオリゴヌクレオチドの連続合成に関する。
合成オリゴヌクレオチドに対する要求は、DNA技術の進歩に刺激されて非常に増加し、最近、全ゲノム、特にヒトゲノムの配列決定および解読に進歩があったことによって、さらに増加してきている。分子生物学およびDNAに基づく診断学に使用される、核酸を増幅し、検出し、解析し、そして定量化する方法の多くは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドに依存する。例えば、部位特異的突然変異誘発などの技術に用いられる、組換え宿主ベクター系において、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドが使用される。核酸の温度周期酵素増幅においてオリゴヌクレオチドプライマーを使用するPCR法でもまた、これらが用いられる。プライマーはまた、酵素伸長およびランダム終結を特徴とする最新配列決定技術にも必要である。別の迅速に成長しつつある分野はハイブリダイゼーションアッセイにおけるオリゴヌクレオチドの適用であり、これは、相補配列を有する核酸解析物の領域に対する、オリゴヌクレオチドプローブの特異的アニーリングに基づく。この分野の最近の発展には、完全にマッチするハイブリダイゼーションの際、蛍光シグナルを生じる色素が共有結合的にコンジュゲート化されたプローブがある。アレル区別またはSNP検出などの、特定のゲノムエピトープに関して試験する対応法は、ハイブリダイゼーションプローブを使用し、そして容易に多重化可能である。したがって、DNAチップなど、ハイブリダイゼーションプローブの小型化アレイを用いて、非常に多数の解析物を同時にスクリーニングすることが可能な自動化高処理設定が、遺伝子型決定および発現プロファイリングのような適用に使用される。これらの方法および関連する方法は、とりわけ、薬剤開発および健康管理の領域に非常に大きな影響を有する可能性があるであろう。
本発明は、1回の合成実行において、同一固体支持体上で、2以上の異なるオリゴヌクレオチドを組み合わせて連続合成する新規方法を含み、この方法は、これ以降、「タンデム合成」と称される。簡潔には、本発明の方法は:a)固体支持体を提供し、ここで前記固体支持体は2以上のオルソゴナル(orthogonal)保護基によって保護されたアンカー基で構成される;b)前記オルソゴナル保護基の1つをアンカー基から除去し;c)脱保護したアンカー基上でオリゴヌクレオチドを合成し;d)合成したオリゴヌクレオチドにキャッピングし;e)すべてのオルソゴナル保護基が脱保護されるまで、工程b)〜d)を反復し、ここで最後のオルソゴナル保護基に関しては工程d)を省略する;そしてf)合成したオリゴヌクレオチドをすべて固体支持体から切断して、そしてオリゴヌクレオチドを脱保護するのに適した条件に、該オリゴヌクレオチドを供する工程を含む。本発明の方法を用いると、優れたカップリング率および収量が得られる。
本発明は、1回の合成実行において、同一固体支持体上で、2以上の異なるオリゴヌクレオチドを組み合わせて連続合成する新規方法を含み、この方法は、これ以降、「タンデム合成」と称される。図1および2に概略するように、本発明の方法は、本発明の固体支持体上に配置された、オルソゴナル保護アンカー基に基づき、これらは各々、望ましい配列の1つを合成するために、連続して用いられる。第一の各保護基の選択的除去に続いて、オリゴヌクレオチドの固相合成の標準法にしたがって、脱ブロッキングしたアンカー基上で、第一のオリゴヌクレオチドをアセンブリする。好ましい態様において、ホスホロアミダイト化学反応を使用して、オリゴヌクレオチドを合成する。前記の第一のオリゴヌクレオチドのキャッピングに続いて、第二の種類の保護基でブロッキングされたアンカー基を選択的に自由にして、これを次いで、第二のオリゴヌクレオチドのアセンブリの出発点として利用し、そして以下同様である。固体支持体上ですべての望ましい合成が完了した後、合成したオリゴヌクレオチドを、遊離工程および脱保護工程中、混合物としてさらにプロセシングする。本発明の方法を用いて得られる調製物は、一般的に、2以上のオリゴヌクレオチドの混合物を含有する。
用語「単数の(aまたはan)」実体は、1以上のその実体を指すことに注目すべきであり;例えば(単数の)オリゴヌクレオチドは、1以上のオリゴヌクレオチドを指す。こうしたものとして、用語「単数の(aまたはan)」、「1以上の」および「少なくとも1つの」は、本明細書において、交換可能に用いられる。
Qは本明細書に定義するような固相であり;
Lは本明細書に定義するようなリンカーであり;
Uは本明細書に定義するような汎用リンカーであり;
Nは合成しようとするオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオシドを確立するヌクレオシド部分である。1つの態様において、Nは、限定されるわけではないが、以下の式(5)および(6)に例示する化合物を含む群から選択される。
R1は、限定されるわけではないが、−H、−OH、−F、限定されるわけではないが基−OCH3、−OCH2CH=CH2または−OCH2OCH2CH2OCH3を含む、1〜4の炭素原子を有する、場合によって置換されたアルコキシルまたはアルケノキシル基、保護アミノ基、あるいはOR2を含む群から選択され、ここでR2は、限定されるわけではないが、tert−ブチルジメチルシリル基、または当業者に知られるリボヌクレオシドの2’−OH官能の保護に有用な他の保護基いずれかを含む、オリゴリボヌクレオチド合成に有用な保護基に相当する;
Bは、限定されるわけではないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシル、またはその化学的に修飾された誘導体を含む群より選択される核酸塩基であり、核酸塩基の環外アミノ基は、限定されるわけではないが、アデニンおよびシトシンではベンゾイル保護基、グアニンではイソブチリル保護基、アデニン、シトシンおよびグアニンではtert−ブチルフェノキシアセチル(TAC)保護基、並びに当業者に知られる核酸塩基の他の保護基いずれかを含む保護基に例示されるような、オリゴヌクレオチド合成に有用な保護基を所持することも可能であり;
XおよびYは独立に、−Oまたは−NHから選択され、Xは固体支持体のアンカー基に相当し、そしてYは固相上のリンカーへの付着部位に相当し;そして
PGはHまたは保護基から選択される。
Qは本明細書に定義するような固相であり;
Sは、示したフラン環の5’−ヒドロキシル基と固相を共有結合的に連結する、二官能性スペーサー部分であり;Sの例には、限定されるわけではないが、−C(=O)−、限定されるわけではないがオキサリル、マロニル、スクシニル、グルタリル等を含む群から選択されるジアシル部分、限定されるわけではないがメチリデン、エチリデン、プロピリデン等を含むアルキリデン部分、限定されるわけではないが−C(=O)−CH2−、−CH2−C(=O)−、−C(=O)−CH2−CH2−、−CH2−CH2−C(=O)−等を含むアルキルアシル部分、限定されるわけではないが−P(=O)(OH)−を含むリン酸部分、および限定されるわけではないが−P(=O)(OR5)−(式中、R5は限定されるわけではないが2−シアノエチルを含む、当業者に知られるリン酸保護基からなる群より選択される)を含む保護リン酸部分が含まれ;
Zは、限定されるわけではないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシル、あるいはその化学的に修飾された誘導体を含む群から選択される核酸塩基であり、核酸塩基の環外アミノ基は、限定されるわけではないが、アデニンおよびシトシンではベンゾイル保護基、グアニンではイソブチリル保護基、アデニン、シトシンおよびグアニンではtert−ブチルフェノキシアセチル(TAC)保護基、並びに当業者に知られる核酸塩基の他の保護基いずれかを含む保護基に例示されるような、オリゴヌクレオチド合成に有用な保護基を所持することも可能であるし、あるいはZは、H、−OMe、ヒポキサンチン、または上に定義するような汎用リンカーの官能性、およびSPOSが含む工程すべての両方と適合する他の部分いずれかであり;
R3およびR4は、それぞれ、示したフラン環の2−および3−ヒドロキシル基をブロッキングする保護基であり;前記2−または3−ヒドロキシル基のいずれかが上述のようなアンカー基として機能し;R3およびR4は、限定されるわけではないが、以下の置換基の組み合わせを含む群から選択される:R3がHであり、そしてR4が限定されるわけではないが−COCH3を含む標準的キャッピング基であるか、またはその逆である;あるいはR3が標準的保護基であり、そしてR4が限定されるわけではないが−COCH3を含むキャッピング基であるか、またはその逆である;あるいはR3およびR4が一緒になって、フラン環の2位および3位の酸素を架橋するメトキシエチリデン部分に相当する。
汎用固体支持体(8)の調製
乾燥させた長鎖アルキル−アミノ(LCAA)誘導体化アミノプロピルCPG(300g、多孔度500または1000Å、アミン分画の装填値:100μmol/g、+/−20%)を、減圧下、高速で、回転蒸発装置中、室温で20分間、1000ml塩化オキサリルに懸濁した。次いで、温度を100℃に上昇させ、そして蒸留によって過剰な塩化オキサリルを除去するのに約3時間必要であった。過剰な塩化オキサリルを除去した後、新たに調製した、無水ピリジン(1200ml)およびN−メチルイミダゾール(10%、v/v)中のO2’,O3’−メトキシエチリデンイノシン(62mmol、2等量)の溶液を活性化CPGに添加して、そして蒸発が起こるように、減圧下、高速回転で20分間、室温で反応させた。次いで、激しく攪拌しながら室温で5分間に渡って無水酢酸(120ml)を反応混合物に添加して、CPG調製物(8)を提供した。この最終キャッピング工程に続いて、ガラス融解じょうご上に産物を収集し、ピリジンで数回、その後アセトニトリルで洗浄し、真空で乾燥させ、そして4℃で保存した。
2’/3’−DMT保護汎用固体支持体(10)の調製
実施例1に記載するように調製した誘導体化CPG(8)を、ガラス融解じょうごに移し、そして1,2−ジクロロエタン中のTFA(1%、v/v)の溶液で1回、そして続いて、1、2−ジクロロエタンおよびアセトニトリル(各々3回)で洗浄して、CPG調製物(9)を得て、これを真空で1時間乾燥させた。34μmolの総イノシンを装填した(9)の部分に無水ピリジン(10ml)中の塩化ジメトキシトリチル(2.5mmol.74等量)、DMAP(0.31mmol)およびトリエチルアミン(2.92mmol)の溶液を添加した。反応混合物を室温で2時間攪拌した。生じたCPGをガラス融解じょうご上に収集し、ピリジン(4回)、アセトニトリル(3回)およびジエチルエーテル(1回)で連続して洗浄し、そして最後に真空で乾燥させて、トリチル化支持体(10)を生じた。
2’/3’−Fmoc保護汎用固体支持体(11)の調製
総イノシン装填が0.31mmolの誘導体化CPG支持体(9)の一部分に、DMAP(1.08mmol)、9−フルオレニルメチルクロロホルメート(Fmoc−Cl、18.58mmol)および無水ピリジン(110ml)を添加した。反応混合物を室温で2時間攪拌した。生じたCPGをガラス融解じょうご上で収集し、ピリジン、メタノール(2回)およびアセトニトリル(3回)で連続して洗浄した。変換されていないヒドロキシル基にキャッピングするため、次いで、反応産物を、融解じょうご上で、等体積の無水酢酸中のN−メチルイミダゾール(10%、v/v)および無水ピリジンの混合物と反応させた。次いで、産物、化合物(11)を、ピリジン(2回)およびアセトニトリル(3回)で連続して洗浄し、そして真空で乾燥させた。
2’/3’−Lev保護汎用固体支持体(12)の調製
総イノシン装填が5.5mmolの誘導体化CPG支持体(9)の部分を、ジオキサン(700ml)中のDMAP(17.85mmol)の溶液に懸濁した。ジイソプロピルカルボジイミド(526mmol)およびレブリン酸(420mmol)を添加し、そして反応混合物を室温で2時間攪拌した。生じたCPGをガラス融解じょうご上で収集し、ジオキサン(3回)、メタノール(2回)およびアセトニトリル(3回)で連続して洗浄した。変換されていないヒドロキシル基にキャッピングするため、最後に、融解じょうご上で、等体積の無水酢酸中のN−メチルイミダゾール(10%、v/v)および無水ピリジンの混合物と反応させた。産物、化合物(12)を、ピリジン(2回)およびアセトニトリル(3回)で連続して洗浄し、そして真空で乾燥させた。試験試料中でイノシン部分を切断し(水性LiOH(1M)、室温で10分間攪拌)、そして続いて254nmで光度的に定量化することによって、化合物12の装填値が65μmol/gであることを決定した。
オリゴヌクレオチドのタンデム合成の一般法
以下の実施例は、オリゴヌクレオチドのタンデム合成の一般法を提供する。例示の目的のため、この実施例は、本発明の方法を用いた、一般的な固体支持体上の2つの異なるオリゴヌクレオチドの合成を記載するが、該方法は、限定されない数の異なるオリゴヌクレオチドの合成に拡張することも可能である。
1.DMTあるいはメトキシエチリデン修飾汎用CPG(10)または(8)およびレブリニル保護汎用CPG(12)の混合物:2つのオリゴヌクレオチドの1:1混合物(mol/mol)の合成のため、それぞれの装填値に関して、2つのCPG種の50:50混合物を用いた。低速、室温で、蒸発装置上の回転蒸発装置フラスコ中で、構成要素固体支持体の混合を行った。
1.トリチル・オフモードでの第一のオリゴヌクレオチドの合成;
2.無水酢酸中のN−メチルイミダゾール(10%、v/v)および無水ピリジン(600μl)の混合物(1:1、v/v)を室温で1分間用いたオリゴヌクレオチドのキャッピング;
3.アセトニトリルでの固体支持体の洗浄;
4.固体支持体上のFmocまたはレブリニル保護基の除去:
Fmoc基:DMF(300μl)中のピペリジン(20%、v/v)で、室温で1分間処理
レブリニル基:ピペリジンおよび氷酢酸(300μl)の混合物(3:2、v/v)中の水酸化ヒドラジニウムの0.5M溶液で、室温で1分間処理;
5.アセトニトリルでの固体支持体の洗浄;
6.トリチル・オフモードでの第二のオリゴヌクレオチドの合成;
7.水性MeNH2(40%、v/v)および水性NaOAc(3M)の混合物(1:1、v/v)で、75℃で1時間処理することによる、固体支持体からのオリゴヌクレオチドの切断および脱保護;並びに
8.標準法にしたがったエタノール沈殿による精製。
8量体〜15量体のオリゴデオキシヌクレオチドからなるプライマー対の合成
実施例5に記載する一般法にしたがって、固体支持体構成要素(8)および(12)由来の混成固体支持体を用い、以下のプライマー対を合成した。
2.配列:d(TCTTTACACTTC)(配列番号3)およびd(TCTAACAGGGTGTTG)(配列番号4)の12量体および15量体プライマー対;並びに
3.配列:d(TAAAGGGA)およびd(TTCTAGTTATCG)(配列番号5)の8量体および12量体プライマー対。
23量体および25量体オリゴヌクレオチド配列決定プライマー対の合成
実施例5に記載する一般法にしたがって、固体支持体構成要素(8)および(12)由来の混成固体支持体を用い、配列決定のための以下のプライマー対を調製した:
プライマー1:d(CATCTGTAGTCTTTCACCTGTTT)(配列番号6);
プライマー2:d(ACCTCACAAGATGTTCAAAAGCCAT)(配列番号7)。
タンデムに合成されたプライマー対を適用したPCRアッセイ
実施例5に記載する一般法にしたがって、固体支持体構成要素(8)および(12)由来の混成固体支持体を用い、以下のプライマー対を合成した:
プライマー対#1:d(TAATCTGTGTGCTTACATTTTAGGG)(配列番号8)およびd(TTCATTGCTACTGGGGTGTTGTC)(配列番号9);
プライマー対#2:d(GCTTTCATCAAGTTTATCCCAACC)(配列番号10)およびd(CCCATCAATCTTTTTCTTTACACTTC)(配列番号11)。
C:4mM MgCl2、プライマー濃度0.1μM、10ngテンプレート;
D:4mM MgCl2、プライマー濃度0.25μM、10ngテンプレート;および
E:6mM MgCl2、プライマー濃度0.5μM、20ngテンプレート。
混成支持体を用いたオリゴデオキシヌクレオチドのタンデム合成
自動化オリゴヌクレオチド合成の前に、固体支持体混合物を以下のように調製した:
メトキシエチリデン修飾汎用CPG(10)、Fmoc保護汎用CPG(11)、およびレブリニル保護汎用CPG(12)を含む、三つ組混成支持体の調製:3つのオリゴヌクレオチドの1:1:1混合物(mol/mol/mol)を合成するため、各装填値に関して、3種のCPGの33:34:33混合物を用いた。低速、室温で、蒸発装置上、回転蒸発装置フラスコ中で、構成要素固体支持体の混合を行った。
上述のように調製した固体支持体混合物を、Applied Biosystemsモデル394合成装置の反応カラムに充填した。合成装置を1μmol規模で用いた。第一および第二のオリゴヌクレオチド合成後のキャッピング工程、並びにそれに続く、それぞれ、Fmocおよびレブリニル保護基の除去を例外として、装置製造者に供給される合成プロトコルにしたがい、これらの工程を、以下のように行った:
1.第一のオリゴヌクレオチド:9量体d(TTTTTTTTT)のトリチル・オフモードでの合成;
2.無水酢酸中のN−メチルイミダゾール(10%、v/v)および無水ピリジン無水酢酸:N−メチルイミダゾール(600μl)の混合物(1:1、v/v)を室温で1分間用いたこの第一のオリゴヌクレオチドのキャッピング;
3.アセトニトリルでの固体支持体の洗浄;
4.DMF(300μl)中のピペリジン(20%、v/v)で、室温で1分間処理することによる、固体支持体上のFmoc基の除去;
5.アセトニトリルでの固体支持体の洗浄;
6.第二のオリゴヌクレオチド:12量体d(TTTTTTTTTTTT)(配列番号12)のトリチル・オフモードでの合成;
7.無水酢酸中のN−メチルイミダゾール(10%、v/v)および無水ピリジン無水酢酸(600μl)の混合物(1:1、v/v)を室温で1分間用いたオリゴヌクレオチドのキャッピング;
8.アセトニトリルでの固体支持体の洗浄;
9.ピリジンおよび氷酢酸(300μl)の混合物(3:2、v/v)中の水酸化ヒドラジニウムの0.5M溶液で、室温で1分間処理することによる、固体支持体上のレブリニル基の除去;
10.アセトニトリルでの固体支持体の洗浄;
11.第三のオリゴヌクレオチド:15量体d(TTTTTTTTTTTTTTT)(配列番号13)のトリチル・オフモードでの合成;
12.水性MeNH2(40%、v/v)および水性NaOAc(3M)の混合物(1:1、v/v)で、75℃で1時間処理することによる、固体支持体からのオリゴヌクレオチドの切断および脱保護;並びに
13.標準法にしたがったエタノール沈殿による精製。
部分的にレブリニル保護されたアンカー基を伴う汎用CPGを用いた均質支持体上のタンデム合成
レブリニル基に保護されたアンカー基をおよそ50%伴う汎用支持体の調製:総イノシン装填が6.0mmolの誘導体化CPG支持体(9)の部分を、ジオキサン(700ml)中のDMAP(0.15mmol、0.024等量)の溶液に懸濁した。ジイソプロピルカルボジイミド(3.8mmol、0.63等量)およびレブリン酸(3.0mmol、0.5等量)を添加し、そして反応混合物を室温で2時間攪拌した。生じたCPGをガラス融解じょうご上で収集し、ジオキサン(3回)、メタノール(2回)およびアセトニトリル(3回)で連続して洗浄し、そして最後に真空で乾燥させた。
d(CATCTGTAGTCTTTCACCTGTTT)(配列番号6)および
d(ACCTCACAAGATGTTCAAAAGCCAT)(配列番号7)
のタンデム合成を行った。合成したオリゴヌクレオチドを、ゲル電気泳動およびRP−HPLCによって性質決定した。
タンデム法によって合成された2つのオリゴヌクレオチドのゲル電気泳動による精製
固体支持体構成要素(8)および(12)由来の混成固体支持体を用い、実施例5に記載する一般法にしたがって、以下のプライマー対を合成した:
プライマー1:d(ACGTTGGATGGTCTTCAGAGACATAGTTAAG)(配列番号14)および
プライマー2:d(ACGTTGGATGGTGGAGTAAGAGTAAATGTCC)(配列番号15)。
相補オリゴヌクレオチド対をタンデムに合成することによる、オリゴヌクレオチド二重鎖の調製
固体支持体構成要素(8)および(12)由来の混成固体支持体を用い、実施例5に記載する一般法にしたがって、以下のオリゴヌクレオチド対を合成した:
対#1
オリゴヌクレオチド(A):d(GCGACCGAGCCTGACCTCCAGTCCG)(配列番号16)および
オリゴヌクレオチド(B):d(CGGACTGGAGGTCAGGCTCGGTCGC)(配列番号17)。
オリゴヌクレオチド(A):d(ACGCTGCCAGTCACGGCGACCGCTC)(配列番号18)
オリゴヌクレオチド(B):d(GAGCGGTCGCCGTGACTGGCAGCGT)(配列番号19)。
Claims (50)
- 2以上の異なるオリゴヌクレオチドの合成法であって:
a)固体支持体を提供し、ここで前記固体支持体は2以上の保護基によって保護されたアンカー基で構成され、前記保護基は互いにオルソゴナルであり、前記アンカー基は第一のヌクレオチド・シントンが付着する官能基であり;
b)前記保護基の1つをアンカー基から除去し;
c)脱保護したアンカー基上でオリゴヌクレオチドを合成し;
d)合成したオリゴヌクレオチドにキャッピングし;
e)すべての保護基が脱保護されるまで、工程b)〜d)を反復し、ここで最後の保護基に関しては工程d)を省略する;そして
f)合成したオリゴヌクレオチドを固体支持体から切断する
工程を含む、前記合成法。 - 2以上の異なるオリゴヌクレオチドの合成法であって:
a)固体支持体を提供し、ここで前記固体支持体は、部分的に保護されていないアンカー基で構成され、残りのアンカー基は1以上の保護基によって保護され、1より多い保護基を使用する場合、保護基は互いにオルソゴナルであり、前記アンカー基は第一のヌクレオチド・シントンが付着する官能基であり;
b)保護されていないアンカー基上でオリゴヌクレオチドを合成し;
c)合成したオリゴヌクレオチドにキャッピングし;
d)1つの保護基をアンカー基から除去し;
e)脱保護したアンカー基上でオリゴヌクレオチドを合成し;
f)すべての保護基が脱保護されるまで、工程c)〜e)を反復し;そして
g)合成したオリゴヌクレオチドをすべて支持体から切断する
工程を含む、前記合成法。 - 切断したオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドを脱保護するのに適した条件に供する工程をさらに含む、請求項1または2の方法。
- 固体支持体が、均質固体支持体または混成固体支持体からなる群より選択される、請求項1または2の方法。
- 固体支持体が、汎用固体支持体またはあらかじめ装填された固体支持体から選択され、ここであらかじめ装填された固体支持体は、新しく合成されたオリゴヌクレオチドの末端として作用する共有結合したヌクレオシド部分を含み、また汎用固体支持体は、カップリング反応に適用される第一のヌクレオチド・シントンが新しく合成されたオリゴヌクレオチドの末端として作用するように共有結合したヌクレオシド部分を含まない、請求項4の方法。
- 保護基が、ジメトキシトリチル(DMT)、メトキシエチリデン、レブリニルおよび9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)からなる群より選択される、請求項1または2の方法。
- 保護基がレブリニルおよびFmoc、メトキシエチリデンとレブリニル、メトキシエチリデンとFmoc、DMTとレブリニル、ならびにDMTとFmocから選択される、請求項1または2の方法。
- 固体支持体が、無機ポリマー、有機コーティングを伴うシリカまたはCPGから選択される修飾無機ポリマー、および有機ポリマーからなる群より選択される、請求項1または2の方法。
- 前記無機ポリマーが、シリカ、アルミナ、ゼオライトおよび調節孔ガラス(CPG)からなる群より選択される無機オキシドである、請求項8の方法。
- 前記修飾無機ポリマーが、アミノプロピル−シラン誘導体化シリカまたはアミノプロピル−シラン誘導体化CPGからなる群より選択される、請求項8の方法。
- 前記有機ポリマーが、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリビニルアルコール、およびセルロースまたはデンプンから選択される炭水化物から選択される、請求項8の方法。
- 保護基を伴うアンカー基の比を、合成しようとする個々のオリゴヌクレオチドの意図される比にしたがって調整する、請求項1または2の方法。
- 保護基に保護されたアンカー基を過剰に使用し、該保護基が、意図される除去工程以前の工程の間に、部分的な損失を受けると予期される、請求項12の方法。
- 前記損失を補填するように前記過剰を調整する、請求項13の方法。
- すべての工程を自動化設定で行い、前記自動化設定が、最後にアセンブリされるオリゴヌクレオチドの合成中、最後の末端保護基が除去されるDMT−オフモードおよび最後にアセンブリされるオリゴヌクレオチドの合成中、最後の末端保護基が保持されるDMT−オンモードを含む、請求項1または2の方法。
- 最後のオリゴヌクレオチドをDMT−オフモードで合成する、請求項15の方法。
- 最後のオリゴヌクレオチドをDMT−オンモードで合成する、請求項15の方法。
- 前記のあらかじめ装填された固体支持体が、以下の式を有する請求項5の方法:
Q−L−N
[式中
Qは固相であり;
Lはリンカーであり;そして
Nは合成しようとするオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオシドを確立するヌクレオシド部分であり、該ヌクレオシド部分は以下の構造のいずれかをもつヌクレオシド部分である:
R1は、−H、−OH、−F、1〜4の炭素原子を有する、場合によって置換されたアルコキシルまたはアルケノキシル基、保護アミノ基、あるいはOR2からなる群より選択され、ここでR2はオリゴリボヌクレオチド合成に有用な保護基から選択される;
Bは、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシル、またはその化学的に修飾された誘導体からなる群より選択される核酸塩基であり、ここで核酸塩基の環外アミノ基はオリゴヌクレオチド合成に有用な保護基を所持することも可能である;
XおよびYは独立に、−Oまたは−NHから選択され、ここでXは固体支持体のアンカー基に相当し、そしてYは固相上のリンカーへの付着部位に相当する;そして
PGは、アンカー基が保護されていないとき、保護基またはHである)]。 - R1が、−OCH3、−OCH2CH=CH2および−OCH2OCH2CH2OCH3からなる群より選択される、請求項18の方法。
- R2がtert−ブチルジメチルシリルである、請求項18の方法。
- 核酸塩基の前記環外アミノ基が、ベンゾイル、イソブチリルおよびtert−ブチルフェノキシアセチル(TAC)からなる群より選択される保護基で保護された、請求項18の方法。
- 汎用固体支持体が、以下の式:
Q−U
[式中
Qは固相であり;そして
Uは以下の構造:
Sは、示したフラン環の5’−ヒドロキシル基と固相(Q)を共有結合的に連結する、二官能性スペーサー部分であり;
Zは、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシル、またはその化学的に修飾された誘導体からなる群より選択される核酸塩基、ここで核酸塩基の環外アミノ基はオリゴヌクレオチド合成に有用な保護基を所持することも可能である;H;−OMe;ヒポキサンチン、並びに汎用リンカーの官能性、および方法が含む工程すべての両方と適合する他の部分いずれかからなる群より選択され;そして
R3およびR4は、保護基、Hおよびキャッピング基からなる群から選択され、ここで環の2’または3’位のいずれかにあるヒドロキシル基がアンカー基として機能する)
を有する汎用リンカーである]
を有する、請求項5の方法。 - Sが、−C(=O)−、オキサリル、マロニル、スクシニル、およびグルタリルからなる群より選択されるジアシル部分、メチリデン、エチリデンおよびプロピリデンから選択されるジアルキル部分、−C(=O)−CH2−、−CH2−C(=O)−、−C(=O)−CH2−CH2−および−CH2−CH2−C(=O)−から選択されるアルキルアシル部分、−P(=O)(OH)−、並びに式−P(=O)(OR6)−(式中、R6はリン酸保護基である)を有する化合物から選択される保護リン酸部分からなる群より選択される、請求項22の方法。
- 前記リン酸保護基R6が2−シアノエチルである、請求項23の方法。
- 核酸塩基の前記環外アミノ基が、ベンゾイル、イソブチリルおよびtert−ブチルフェノキシアセチル(TAC)からなる群より選択される保護基で保護された、請求項22の方法。
- R3およびR4が:R3がHであり、そしてR4がキャッピング基である、R3がキャッピング基であり、そしてR4がHである;R3が保護基であり、そしてR4がキャッピング基である;R3がキャッピング基であり、そしてR4が保護基である;またはR3およびR4が一緒になって、フラン環の2位および3位の酸素を架橋するメトキシエチリデン部分に相当する、からなる群より選択される、請求項22の方法。
- 前記キャッピング基がCOCH3である、請求項26の方法。
- 2以上の独立に選択された共有結合したヌクレオシド部分を含むあらかじめ装填された均質固体支持体であって、ここで前記ヌクレオシド部分が、互いにオルソゴナルである保護基によって保護されたアンカー基を含み、前記アンカー基は第一のヌクレオチド・シントンが付着する官能基である、前記均質固体支持体。
- 2以上の独立に選択される共有結合した汎用リンカーを含む汎用均質固体支持体であって、前記汎用リンカーが、互いにオルソゴナルである保護基で保護されたアンカー基を含み、汎用リンカーは、オリゴヌクレオチド合成の経過中、支持体にカップリングされる第一のヌクレオチド・シントンと固体支持体の固相を共有結合的に連結し、また前記アンカー基は第一のヌクレオチド・シントンが付着する官能基である、前記汎用均質固体支持体。
- 2以上の互いにオルソゴナルである保護基を含む混成固体支持体を調製する方法であって、2以上の固体支持体を混合する工程を含み、ここで各支持体が異なる保護基で保護されたアンカー基を含み、前記アンカー基は第一のヌクレオチド・シントンが付着する官能基である、前記方法。
- あらかじめ装填された固体支持体の混合物を含む混成固体支持体であって、前記あらかじめ装填された固体支持体の各々が、独立に選択される共有結合したヌクレオシド部分で構成され、前記ヌクレオシド部分が、互いにオルソゴナルである保護基で保護されたアンカー基を含み、前記アンカー基は第一のヌクレオチド・シントンが付着する官能基である、前記混成固体支持体。
- 前記ヌクレオシド部分の1つのアンカー基が、場合によって保護されていない、請求項28または31の固体支持体。
- 共有結合したヌクレオシド部分の各々が以下の構造のうちの1つを有する、請求項28または31の固体支持体:
R1は、−H、−OH、−F、1〜4の炭素原子を有する、場合によって置換されたアルコキシルまたはアルケノキシル基、保護アミノ基、あるいはOR2からなる群より選択され、ここでR2はオリゴリボヌクレオチド合成に有用な保護基から選択される;
Bは、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシル、またはその化学的に修飾された誘導体からなる群より選択される核酸塩基であり、ここで核酸塩基の環外アミノ基はオリゴヌクレオチド合成に有用な保護基を所持することも可能である;
XおよびYは独立に、−Oまたは−NHから選択され、ここでXは固体支持体のアンカー基に相当し、そしてYは固相上のリンカーへの付着部位に相当する;そして
PGは保護基である)]。 - R1が、−OCH3、−OCH2CH=CH2および−OCH2OCH2CH2OCH3からなる群より選択される、請求項33の固体支持体。
- R2がtert−ブチルジメチルシリルである、請求項33の固体支持体。
- 核酸塩基の前記環外アミノ基が、ベンゾイル、イソブチリルおよびtert−ブチルフェノキシアセチル(TAC)からなる群より選択される保護基で保護された、請求項33の固体支持体。
- 保護基が、DMT、レブリニルおよびFmocから選択される、請求項28または31の固体支持体。
- 汎用固体支持体の混合物を含む混成固体支持体であって、前記汎用固体支持体の各々が、独立に選択される共有結合した汎用リンカーで構成され、前記の汎用リンカーが、互いにオルソゴナルである保護基で保護されたアンカー基を含み、汎用リンカーは、オリゴヌクレオチド合成の経過中、支持体にカップリングされる第一のヌクレオチド・シントンと固体支持体の固相を共有結合的に連結し、また前記アンカー基は第一のヌクレオチド・シントンが付着する官能基である、前記混成固体支持体。
- 前記汎用リンカーの1つのアンカー基が、場合によって保護されていない、請求項38の固体支持体。
- 汎用リンカーが、以下の構造:
Sは、示したフラン環の5’−ヒドロキシル基と固相(Q)を共有結合的に連結する、二官能性スペーサー部分であり;
Zは、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシル、またはその化学的に修飾された誘導体からなる群より選択される核酸塩基、ここで核酸塩基の環外アミノ基はオリゴヌクレオチド合成に有用な保護基を所持することも可能である;H;−OMe;ヒポキサンチン、並びに汎用リンカーの官能性、および方法が含む工程すべての両方と適合する他の部分いずれかからなる群より選択され;そして
R3およびR4は、保護基、Hおよびキャッピング基からなる群から選択され、ここで環の2’または3’位のいずれかにあるヒドロキシル基がアンカー基として機能する)
を有する、請求項38の固体支持体。 - Sが、−C(=O)−、オキサリル、マロニル、スクシニル、およびグルタリルからなる群より選択されるジアシル部分、メチリデン、エチリデンおよびプロピリデンから選択されるジアルキル部分、−C(=O)−CH2−、−CH2−C(=O)−、−C(=O)−CH2−CH2−および−CH2−CH2−C(=O)−から選択されるアルキルアシル部分、−P(=O)(OH)−、並びに式−P(=O)(OR6)−、式中、R6はリン酸保護基である、を有する化合物から選択される保護リン酸部分からなる群より選択される、請求項40の固体支持体。
- 前記リン酸保護基R6が2−シアノエチルである、請求項41の固体支持体。
- 核酸塩基の前記環外アミノ基が、ベンゾイル、イソブチリルおよびtert−ブチルフェノキシアセチル(TAC)からなる群より選択される保護基で保護された、請求項40の固体支持体。
- R3およびR4が:R3がHであり、そしてR4がキャッピング基である、R3がキャッピング基であり、そしてR4がHである;R3が保護基であり、そしてR4がキャッピング基である;R3がキャッピング基であり、そしてR4が保護基である;またはR3およびR4が一緒になって、フラン環の2位および3位の酸素を架橋するメトキシエチリデン部分に相当する、からなる群より選択される、請求項40の固体支持体。
- 前記キャッピング基がCOCH3である、請求項44の固体支持体。
- 保護基が、メトキシエチリデン、DMT、レブリニルおよびFmocから選択される、請求項38の固体支持体。
- 混成固体支持体が、2つの構成要素で構成され、これらがそれぞれ、保護基、メトキシエチリデンおよびレブリニルで保護されている、請求項46の固体支持体。
- 混成固体支持体が、2つの構成要素で構成され、これらがそれぞれ、保護基、DMTおよびレブリニルで保護されている、請求項46の固体支持体。
- 固体支持体が、2つの構成要素で構成され、前記の第一の構成要素のアンカー基が保護されておらず、そして前記の第二の構成要素のアンカー基がレブリニル保護基で保護されている、請求項39の混成固体支持体。
- 固体支持体が、2つの構成要素で構成され、前記構成要素がそれぞれ、保護基、メトキシエチリデンおよびFmocで保護されている、請求項39の混成固体支持体。
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