JP2001509828A

JP2001509828A - 高分子のバイオコンジュゲーション

Info

Publication number: JP2001509828A
Application number: JP53124898A
Authority: JP
Inventors: ピーケン，ウルフガング; ヒル，ケン; イートン，ブルース; マクギー，ダニー; ヴェイグル，カート; ゴールド，ラリー; スティーヴンズ，アンドリュー
Original assignee: プロリゴ・エルエルシー
Priority date: 1997-01-08
Filing date: 1998-01-08
Publication date: 2001-07-24
Also published as: EP2256133A1; EP2256133B1; EP2319854A1; AU6240698A; AU747242B2; EP2319854B1; US6737236B1; EP0968223A1; EP2319855B1; EP0968223B1; WO1998030575A1; EP0968223A4; EP2319855A1; CA2277159A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、高分子を他の分子体にコンジュゲートさせるための新規方法を開示する。特に本発明は、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を、付加環化反応、たとえばディールス−アルダー反応または１，３−双極子付加環化反応によりコンジュゲートまたは誘導体化する方法を示す。本発明には、本発明方法で製造できる新規なバイオコンジュゲートした高分子が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】高分子のバイオコンジュゲーション発明の分野本発明は、高分子を他の分子体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｎｔｉｔｙ）にコンジュゲートさせるための新規方法を示す。特に本発明は、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を、付加環化反応（ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ）、たとえばディールス−アルダー反応または１，３−双極子付加環化反応によりコンジュゲートまたは誘導体化する方法を示す。発明の背景ターゲット分子に対する結合特異性の高い核酸分子のインビトロ進化方法が開発された。この方法、すなわち指数的濃縮による系統的リガンド進化（ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ、ＳＥＬＥＸと呼ばれる）は下記に記載されている：米国特許出願第０７／５３６，４２８号、１９９０年６月１１日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化”、現在は放棄；米国特許出願第０７／７１４，１３１号、１９９１年６月１０日出願、表題“核酸リガンド”、現在は米国特許第５，４７５，０９６号；米国特許出願第０７／９３１，４７３号、１９９２年８月１７日出願、表題“核酸リガンドの同定方法”、現在は米国特許第５，２７０，１６３号（国際特許出願公開第ＷＯ９１／１９８１３号も参照）；これらをそれぞれ本明細書に援用する。これらの各特許出願（本明細書においてはこれらをまとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ）には、目的とするいずれかのターゲット分子に対する核酸リガンドを調製するための、根本的に新規な方法が記載されている。ＳＥＬＥＸ法によれば、核酸リガンドと呼ばれる一群の生成物が得られる（当技術分野では“アプタマー”とも呼ばれる）。これらのリガンドはそれぞれユニークな配列をもち、目的とするターゲット化合物または分子に特異的に結合する特性をもつ。ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチド混合物からの選択、ならびに同じ一般的選択方式を用いた結合、分配、および増幅の段階的反復を行って、実質的にいかなる目的基準の結合親和性および選択性も達成するものである。ＳＥＬＥＸ法は、好ましくはランダム配列のセグメントを含む核酸混合物から出発し、結合に好ましい条件下で混合物をターゲットと接触させ、ターゲット分子に特異的に結合した核酸から結合しなかった核酸を分配し、この核酸−ターゲット複合体を解離させ、核酸−ターゲット複合体から解離した核酸を増幅させて核酸リガンド濃縮混合物となす工程を含み、次いで結合、分配、解離および増幅の各工程を目的に応じたサイクル数で再反復して、ターゲット分子に対し特異性の高い高親和性核酸リガンドを得る。多数の特定の目的を達成するように、基本的ＳＥＬＥＸ法が変更されている。たとえば米国特許出願第０７／９６０，０９３号、１９９２年１０月１４日出願、表題“構造に基づいて核酸を選択する方法”（米国特許出願第０８／１９８，６７０号を有利にするために放棄）には、ＳＥＬＥＸをゲル電気泳動と併用し、特定の構造特性をもつ核酸分子、たとえば折れ曲がりＤＮＡを選択することが記載されている。米国特許出願第０８／１２３，９３５号、１９９３年９月１７日出願、表題“核酸リガンドの光選択”には、ＳＥＬＥＸに基づく方法であって、ターゲット分子を結合および／または光架橋および／または光不活性化しうる光反応性基を含む、核酸リガンドを選択する方法が記載されている。米国特許出願第０８／１３４，０２８号、１９９３年１０月７日出願、表題“テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド”（現在の来国特許第５，５８０，７３７号、米国特許出願第０８／４４３，９５７号を有利にするために放棄）には、近縁分子（非ペプチド系であってもよい）を識別しうる高特異性核酸リガンドを同定するための、対抗ＳＥＬＥＸ（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法が記載されている。米国特許出願第０８／１４３，５６４号、１９９３年１０月２５日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：溶液ＳＥＬＥＸ”（現在の米国特許第５，５６７，５８８号、米国特許出願第０８／４６１，０６９号を有利にするために放棄）には、ターゲット分子に対し高い親和性をもつオリゴヌクレオチドと低い親和性をもつものとを高い効率で分配しうる、ＳＥＬＥＸに基づく方法が記載されている。ＳＥＬＥＸ法は、たとえば改良されたインビボ安定性または改良された送達性などの改良された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含有する、高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸにより同定された、修飾ヌクレオチドを含有する核酸リガンドは、米国特許出願第０８／１１７，９９１号、１９９３年９月８日出願、表題“修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド”（現在の米国特許第５，６６０，９８５号、米国特許出願第０８／４３０，７０９号を有利にするために放棄）に記載されており、そこにはピリミジン類の５−および２’−位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。前掲の米国特許出願第０８／１３４，０２８号には、２’−アミノ（２’−ＮＨ₂）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１またはそれ以上のヌクレオチドを含有する、高特異性核酸リガンドが記載されている。米国特許出願第０８／２６４，０２９号、１９９４年６月２２日出願、表題“既知および新規２’−修飾ヌクレオシドを製造するための分子内求核置換による新規方法”には、種々の２’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。ＳＥＬＥＸ法は、選択したオリゴヌクレオチドを他の選択したオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位と組み合わせることを包含する。これらはそれぞれ米国特許出願第０８／２８４，０６３号、１９９４年８月２日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：キメラＳＥＬＥＸ”（現在は米国特許第５，６３７，４５９号）、および米国特許出願第０８／２３４，９９７号、１９９４年４月２８日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：ブレンドＳＥＬＥＸ”（現在は来国特許第５，６８３，８６７号）に記載されている。これらの特許出願により、オリゴヌクレオチドの広範な形状その他の特性のアレイならびに効率的な増幅特性および複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。ＳＥＬＥＸ法はさらに、オリゴヌクレオチド複合体を包含する。米国特許出願第０８／４３４，４６５号、１９９５年５月４日出願、表題“核酸リガンド複合体”には、核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる療法用または診断用複合体を製造する方法が記載されている。ＳＥＬＥＸ法により得られる核酸リガンドが診断用に用いられている（たとえば米国特許出願第０８／４８７，４２５号、１９９５年６月７日出願、表題“酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ＥＬＯＮＡＳ）”、米国特許出願第０８／４７９，７２９号、１９９５年６月７日出願、表題“フローサイトメトリーにおける核酸リガンドの使用”、および米国特許出願第０８／６２８，３５６号、１９９６年４月５日出願、表題“核酸リガンドを用いて物質中のターゲット化合物を検出する方法”参照）。ＳＥＬＥＸ法のすべての定義および説明を含めて（これらに限定されない）、前記特許出願明細書の記載全体を本明細書中に援用する。多くの研究が、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を診断用および研究用試薬として、また有効な療法薬として利用することを目標としている。オリゴヌクレオチドを医薬用化合物として用いることに関する開発には、現在少なくとも３つの領域がある。最も進んだ分野では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて生物内の特定のコード領域に結合させ、タンパク質の発現を阻止し、または種々の細胞機能を遮断する。さらに、触媒作用をもつＲＮＡ種―リボザイム―の発見により、目的の効果を達成する細胞内反応を行うのに役立つＲＮＡ種が研究されるようになった。最後に、ＳＥＬＥＸ法（指数的濃縮による系統的リガンド進化）（ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５）の発見で、生物学的に関心のあるほとんどすべてのターゲットに結合するオリゴヌクレオチドを同定しうることが示された。遺伝子発現を制御する手段としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、および有望な医薬としてオリゴヌクレオチドを使用しうる可能性により、オリゴヌクレオチドの療法活性および安定性を高めるために多数の化学的修飾をオリゴヌクレオチドに導入することが研究されるようになった。そのような修飾は、オリゴヌクレオチドの細胞透過性を高めるため、体内でオリゴヌクレオチド類似体の構造もしくは活性を分解もしくは妨害するヌクレアーゼその他の酵素からそれらを安定化するため、ターゲットＲＮＡへのオリゴヌクレオチドの結合を高めるため、いったんターゲットＲＮＡに配列特異的に結合すると分断モード（終止事象）を生じさせるため、またオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良するために設計される。最近の研究で、ＲＮＡの二次および三次構造が重要な生物学的機能をもつ可能性のあることが示された（Ｔｉｎｏｃｏら（１９８７）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５２：１３５；Ｌａｒｓｏｎら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７４：５；Ｔｕｅｒｋら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：１３６４；Ｒｅｓｎｅｋｏｖら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９９５３）。国際特許出願公開第ＷＯ９１／１４４３６号、表題“ＲＮＡ模倣による遺伝子発現調節のための試薬および方法”には、１種類またはそれ以上のタンパク質と相互作用しうる、ＲＮＡ部分を模倣したオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が記載されている。これらのオリゴヌクレオチドはそれらをヌクレアーゼ抵抗性にする修飾されたヌクレオシド間結合を含み、高い細胞透過能をもち、かつターゲットオリゴヌクレオチド配列を結合することができる。療法薬および診断薬としてのオリゴヌクレオチドの使用は急増しており、多数の化合物がヒトの臨床試験に用いられている。これらの用途の多くにおいて、オリゴヌクレオチドは誘導体化され、または他の分子体とコンジュゲートしている。これらのコンジュゲーションは一般に、蛍光色素その他の診断用レポーター基を結合させるために、またはオリゴヌクレオチドの活性もしくは薬物動態を調節する化合物を結合させるために行われる。たとえばＳｍｉｔｈらは、蛍光に基づくＤＮＡ配列分析に用いるための蛍光色素コンジュゲートしたプライマーの合成を記載している（Ｓｍｉｔｈら（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５５：２６０−３０１）。米国特許第５，６５０，２７５号（Ｐｉｔｎｅｒら）には、試料中のターゲット化合物の存否を判定するために分光検出可能な標識核酸リガンドを用いることが記載されている（出願中の米国特許出願第０８／４８７，４２５号、１９９５年６月７日出願、表題“酵素結合オリゴヌクレオチドアツセイ（ＥＬＯＮＡＳ）”、来国特許出願第０８／４７９，７２９号、１９９５年６月７日出願、表題“フローサイトメトリーにおける核酸リガンドの使用” および米国特許出願第０８／６２８，３５６号、１９９６年４月５日出願、表題 “核酸リガンドを用いて物質中のターゲット化合物を検出する方法”も参照）。米国特許出願第０８／４３４，４６５号、１９９５年５月４日出願、表題“核酸リガンド複合体”には、オリゴヌクレオチドの活性または薬物動態を調節するために、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを用いることが記載されている。コンジュゲーションは、オリゴヌクレオチド二量体を製造するため、およびオリゴヌクレオチドを多量体プラットフォームに結合させるためにも採用されている（Ｊｏｎｅｓら（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：２１３８）。そのようなコンジュゲーションを行うために幾つかの化学的方法がある（概説としてはＧｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１：１６５−１８７参照）。オリゴヌクレオチドの５’−末端に化学反応性官能基、たとえばアミンまたはチオールが存在すると、種々のコンジュゲートを選択的に結合させることができ、これにはレポーター基（Ｓｍｉｔｈら（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５５：２６０−３０１；Ｓｐｒｏａｔら（１９８７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：６１８１ −６１９６；Ｍｏｒｉら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ８：６４９；Ｓｉｎｈａら（１９８８）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：２６５９）、およびペプチドエピトープ（Ｔｕｎｇら（１９９１）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．２：４６４−４６５；Ｂｒｕｉｃｋら（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：４９−５６）が含まれる。末端アミノ官能基を含むオリゴヌクレオチドは、新規特性をもつバイオコンジュゲート（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の構築に用いられている。これらのバイオコンジュゲートを合成するためのより一般的な幾つかの方法では、第一級脂肪族アミノ基を、合成オリゴヌクレオチド組立ての最終工程でオリゴヌクレオチドの５’− 末端に取り込ませている（Ｔｕｎｇら(１９９１)ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．２：４６４−４６５；Ｓｍｉｔｈら（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５５：２６０−３０１）。オリゴヌクレオチドの５’−末端に結合させるための市販試薬（実際には種々の長さのポリメチレンコネクターをもつそのような一連のリンカー）は、５’−アミノモディファイヤーＣ６（５’−Ａｍｉｎｏ−ＭｏｄｉｆｉｅｒＣ６）である。これらの試薬はグレン・リサーチ社（バージニア州スターリング）から入手できる。これらの化合物を、Ｋｒｉｅｇ（Ｋｒｉｅｇら（１９７１）ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．ａｎｄＤｅｖ．１：１６１）がオリゴヌクレオチドの５’−末端にフルオレセインを結合させるために用いた。関心のある高分子の多くが親水性であるので、これらの反応は一般に水中で実施され、競合する加水分解を克服するためには大過剰の試薬を必要とする。通常、オリゴヌクレオチド上のアミンは分子末端に付加され、この修飾を合成後に実施する場合は、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド上の遊離アミンおよびアルコールと競合しなければならない。オリゴヌクレオチドを他の分子体、特に検出体分子（ｄｅｔｅｃｔｏｒｍｏｌｅｃｕｌｅ）にコンジュゲートさせるための他の慣用法では、その分子体をホスホルアミダイトに変換し、次いでこれを固体支持体に結合した全長オリゴヌクレオチドの遊離アルコールに付加する（Ｔｈｅｉｓｏｎら（１９９２）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３３：５０３３−５０３６）。この方法は、ホスホルアミダイトが空気および水に感受性であること、またこの分子はオリゴヌクレオチドの末端に付加しうるにすぎないという事実のため、理想には達しない。さらに、オリゴヌクレオチドの完全な脱保護および支持体からの離脱に普通は苛酷な条件が必要であるため、多くの検出体分子がこの方法に適合しない。オリゴヌクレオチドを他の分子にコンジュゲートさせるための第３の方法は、アルキルチオ誘導体化オリゴヌクレオチドをα−ハロアセチルと、またはマレイミド含有化合物と結合させるものである（Ｊｏｎｅｓら（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：２１３８）。５’−アミノ−５’−デオキシチミジンを末端とするオリゴヌクレオチドを合成するための別法が記載されている（Ｂｒｕｉｃｋら（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：１３０９−１３１０）。この方法ではオリゴヌクレオチドへのペプチドのリゲーションを指令するためにＤＮＡ鋳型を用い、そのペプチドは反応性チオエステル結合中間体の形の第２オリゴヌクレオチドにより提示される。ＰＥＧ−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの製造は、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ( １９９０)ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１：１６５、およびＺａｌｉｐｓｋｙ（１９９５）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．６：１５０に記載されている。高分子コンジュゲーション反応に好ましい溶媒は、水性緩衝液である。コンジュゲーション化学による大部分の方法は高いｐＨで実施しなければならず、したがって競合する加水分解反応を著しく受けやすい。さらに、大部分のコンジュゲーション反応は立体選択性が低い。高分子コンジュゲートの製造はオリゴヌクレオチドコンジュゲートに限定されない。タンパク質およびペプチドは実質的にすべての生物学的プロセスにおいて重要な役割をもち、酵素、ホルモン、抗体、成長因子、イオンキャリヤー、抗生物質、毒素および神経ペプチドとして機能する。タンパク質およびペプチドには卓越した一群の医薬が含まれる。タンパク質およびペプチドを検出体分子または他の高分子、たとえばＰＥＧにコンジュゲートさせるのも、一般に行われる。オリゴヌクレオチドと特異的機能をもつペプチドとのコンジュゲートは、種々の用途に有用となる可能性がある。一例には以下のものが含まれる：細胞内転送を指令するための核輸送シグナルペプチドの使用（Ｅｒｉｔｊａら（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４７：４１１３−４１２０）；細胞透過性を高めるための疎水性ペプチド（Ｊｕｂｙら（１９９１）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３２：８７９−８２２）またはポリリシンの使用（Ｌｅｏｎｅｔｔｉら（１９９１）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１：１４９−１５３）；ならびに非放射性レポータープローブに多重結合部位を提供するためのポリリシン（Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら（１９８７）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２８：５１９９−５２０２；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら（１９９０）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：４９３−４９９）。付加環化反応は、生成物に導く反応コーディネートに沿って反応が進行する( 中間体を伴うことはあるが、一般には計画した様式で)のに伴って反応原子の軌道が環状アレイを形成する２（またはそれ以上の）部分間のあらゆる反応（分子内または分子間）と定義することができる。この種類の反応に関与する軌道は一般にπ系であるが、σ軌道が関与する可能性もある。この種類の反応に伴う電子の数には２つのタイプ、すなわち４ｎ＋２および４ｎ（ｎ＝１、２、３、４など）がある。付加環化反応の代表例には、ディールス−アルダー付加環化反応、１，３−双極子付加環化反応および［２＋２］付加環化が含まれる。とりわけ多く研究されているディールス−アルダー反応は、共役ジエンと不飽和分子の間で環状化合物を形成する付加環化反応であり、その際、新たなσ結合の形成にπ−電子が用いられる。このディールス−アルダー反応は４−π電子（ジエン）の系と２−π電子（ジエノフィル）の系を伴うので、［４＋２］付加環化の一例である。この反応は、穏やかな条件下で広範な反応体につき、きわめて速やかに行わせることができる。ディールス−アルダー反応は範囲が広く、当業者に周知である。ディールス−アルダー反応の概説は、“ＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ”（Ｍａｒｃｈ，Ｊ．編）７６１−７９８（１９７７）（マグローヒル、ニューヨーク）にみられる。これを本明細書に援用する。ディールス−アルダー付加環化反応の速度は水性溶媒中で増強することが見出された（ＲｉｄｅｏｕｔおよびＢｒｅｓｌｏｗ（１９８０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２：７８１６）（同様な効果が１，３−双極子付加環化反応についてもみられる）（Ｅｎｇｂｅｒｔｓ（１９９５）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３６：５３８９）。この増強はジエンおよびジエノフィル反応体の疎水性によるものと思われる（Ｂｒｅｓｌｏｗ（１９９１）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２４：１５９）。この効果は分子内ディールス−アルダー反応にも及ぶ（Ｂｌｏｋｚｉｊら（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：４２４１）。水中で反応速度が高まるだけでなく、エンド／エキソ生成物比が増大した数例の報告もある（ＢｒｅｓｌｏｗおよびＭａｉｔｒａ（１９８４）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２５：１２３９；Ｌｕｂｉｎｅａｕら（１９９０）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓ．Ｉ，３０１１；Ｇｒｉｅｃｏら（１９８３）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２４：１８９７）。水中での疎水効果を高める塩類、たとえば塩化リチウム（Ｂｒｅｓｌｏｗら（１９８３）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２４：１９０１）および一価リン酸塩（ＰａｉおよびＳｍｉｔｈ（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：３７３１）は４＋２付加環化速度をさらに高めることが認められた。水性溶媒中におけるディールス−アルダー反応の合成能に対し関心が高まっている。簡単なジエン、たとえばナトリウム３，５−ヘキサジエノエートおよびナトリウム４，６−ヘプタジエノエートは、水中で周囲温度において多様なジエノフィルと容易にディールス−アルダー反応を行うことが証明された（Ｇｒｉｅｃｏら（１９８３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４８：３１３７）。他の場合には困難なアセチレンジカルボン酸ジメチルと電子不足フランの付加環化が、水中ではきわめて穏やかな条件下で進行し、収率もきわめて良好である（Ｓａｋｓｅｎａら（１９９３）Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ３５：１２９）。この反応の範囲は、系内でアンモニウム塩とホルムアルデヒドから生成したイミニウム塩とジエンの付加環化にまで拡張された（ＧｒｉｅｃｏおよびＬａｒｓｅｎ（１９８５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：１７６８）。この研究は、高い立体選択性で進行するアミノ酸イミニウム塩とジエンの対応する反応の開拓を促した（Ｇｒｉｅｃｏら（１９８６）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２７：１９７５；ＧｒｉｅｃｏらおよびＢａｈｓａｓ（１９８７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：５７４５；Ｗａｌｄｍａｎｎ（１９８９）ＬｉｅｂｉｇｓＡｎｎ．Ｃｈｅｍ．２３１−２３８；ＷａｌｄｍａｎｎおよびＢｒａｕｎ（１９９１）ＬｉｅｂｉｇｓＡｎｎ．Ｃｈｅｍ．１０４５−１０４８）。この反応の範囲は、触媒としてランタニド（ＩＩＩ）トリフルオロメタンスルホナート類を用いることにより、さらに複雑なアルデヒド類にまでも拡張された（Ｙｕら（１９９６）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３７：２１６９）。出願中の国際特許出願第ＵＳ９６／１６６６８号、１９９６年１０月１７日出願、米国を指定国とする、表題“オリゴヌクレオチドの溶液相合成法”、および米国特許出願第０８／８４３，８２０号、表題“オリゴヌクレオチドの溶液相合成法”（両者の全体を本明細書に援用する）に、ディールス−アルダー付加環化反応はオリゴヌクレオチドを樹脂に固定するための理想的方法であることが示されている。ジエンまたはジエノフィルで誘導体化した樹脂を、それぞれジエノフィルまたはジエンで誘導体化したオリゴヌクレオチドと反応させると、ディールス−アルダー付加環化生成物が得られる。特に、ジエンで誘導体化したオリゴヌクレオチドとマレイミド基およびフェニル−トリアゾリン−ジオン類(ＰＴＡＤ) で誘導体化したポリマー樹脂とのディールス−アルダー反応が記載されている。得られた樹脂をアフィニティークロマトグラフィー樹脂として使用できる。本発明は、付加環化反応、たとえばディールス−アルダー反応および１，３− 双極子付加環化反応が、高分子と他の分子部分をコンジュゲートさせるのに理想的な置換法であることを示す。ディールス−アルダー反応は水中で反応速度が高まり、かつ中性ｐＨで実施できるので、大型の水溶性高分子を他の化合物と共有結合させるのに特に理想的な方法である（ＲｉｄｅｏｕｔおよびＢｒｅｓｌｏｗ（１９８０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２：７８１６）。さらに、この反応の性質から、過剰の試薬を用いずに、または試薬が加水分解することなく、親水性高分子を合成後修飾できる。オリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションにとっては、この方法が２’−Ｏ−ジエン−ヌクレオシドを効率的に合成できる能力をもち、これによりコンジュゲーション部位をオリゴヌクレオチド全体にわたって変更でき、または多重コンジュゲーション部位を選択できることが役立った。発明の概要本発明は、他の分子体による高分子の誘導体化またはコンジュゲーションのための、新規で化学選択的な、効率の高い方法を示す。詳細には本発明は、ディールス−アルダー反応、１，３−双極子付加環化反応および［２＋２］付加環化反応を含めた付加環化反応（これらに限定されない）を、他の分子体による化学選択的かつ効率的な高分子の誘導体化またはコンジュゲーションに用いることにつき示す。たとえば、付加環化反応を行うことができる部分を含む高分子を、付加環化反応を行うことができる部分を含む他の分子体と反応させ、この部分を付加環化反応により高分子に結合させて、この分子体を効率的に高分子にコンジュゲートさせる。好ましい態様においては、付加環化反応はディールス−アルダー反応である。たとえば、ジエンまたはジエノフィルを含む高分子を、それぞれジエノフィルまたはジエンを含む他の分子体と反応させると、付加環化反応によりこの分子体が効率的に高分子にコンジュゲートする。１態様において、高分子はオリゴヌクレオチドである。たとえばジエン修飾したヌクレオシドもしくは非ヌクレオシドホスフェートジエステル基またはジエノフィル修飾したヌクレオシドもしくは非ヌクレオシドホスフェートジエステル基を含むオリゴヌクレオチドを、ジエノフィル部分またはジエン部分を含む他の分子体と反応させる。ディールス−アルダー付加環化により、オリゴヌクレオチドとこの分子体が効率的にコンジュゲートする。この分子体は、ジエノフィル、ジエン、または付加環化反応を行うことができる他の部分で誘導体化しうる、いかなる分子（他の高分子も含まれる）であってもよい。これらの分子体の例には、他の高分子、ポリマーもしくは樹脂、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリスチレン、診断用検出体分子、たとえばフルオレセイン、クマリン、または金属キレート化剤が含まれるが、これらに限定されない。ジエン修飾オリゴヌクレオチドとジエノフィル修飾オリゴヌクレオチドのディールス−アルダー付加環化（または適切に誘導体化されたオリゴヌクレオチドとそれらの反応パートナーの間の任意の付加環化反応）により、オリゴヌクレオチドホモ二量体およびヘテロ二量体が効率的かつ特異的に形成される。さらに、２種類以上のジエン修飾オリゴヌクレオチドと２種類以上のジエノフィル部分を含むリンカー基との反応により、オリゴヌクレオチドの二量体または多量体を効率的に製造できる。従来の活性化酸連結化学は、活性化酸試薬が水により競合加水分解されるため制限されるので、効率的な二量体化または多量体化を行うことができない。本発明は、ディールス−アルダー付加環化反応および１，３−双極子付加環化反応に代表される付加環化反応を用いて多様なコンジュゲート高分子を製造するための反応経路を含む。本発明方法は任意の高分子と他の分子体とのコンジュゲーションにまで拡張でき、これには核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、脂質、ホルモン、薬物またはプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。本発明方法は、すべての４ｎおよび４ｎ＋２付加環化にまで拡張できる（ｎ＝１、２、３、４など）。これにはディールス−アルダー反応、１，３−双極子付加環化反応、エン（ｅｎｅ）付加環化反応、ならびに［２＋２］（４ｎ型）付加環化反応、たとえばケテン付加および光化学的２＋２付加が含まれるが、これらに限定されない。本発明には、本発明方法により製造された新規なコンジュゲート高分子も含まれる。図面の簡単な説明図１は、化合物３（○）、４（□）および６（◇）とＮ−エチルマレイミドのディールス−アルダー反応の完了％を時間の関数としてグラフで示す(実施例１) 。図２は、化合物５（○）および６（□）とＮ−エチルマレイミドのディールス −アルダー反応の完了％を時間の関数としてグラフで示す（実施例１）。図３は、５’−ＤＭＴ−チミジン３’−ヘキサジエン−（２−シアノエチル）ホスファイトと４，４’−ジマレイミドジフェニルメタンのディールス−アルダー反応につき、二量体化速度をグラフで示す。生成物の量を末反応出発物質の％として計算した。モノディールス−アルダー生成物（□）および二量体（■）。図４は、粗製５’−ヘキサジエノキシ−ホスフェート−ＤＮＡ（１２）の逆相ＨＰＬＣを示す。２３分目のピーク（面積積分によれば４２％）は、全長オリゴヌクレオチド生成物１２に対応する。図５は、粗製ポリエチレングリコール−ＤＮＡコンジュゲート（１４）の逆相ＨＰＬＣを示す。９．５分目のピーク（面積積分によれば８０％）は、ＰＥＧ− オリゴコンジュゲート生成物１４に対応する。発明の詳細な記述本発明は、高分子を他の分子体とコンジュゲートさせるための新規方法を含む。詳細には本発明は、付加環化反応、特にディールス−アルダー反応を、他の分子体による化学選択的かつ効率的な高分子の誘導体化またはコンジュゲーションに用いることにつき示す。たとえば、ジエンまたはジエノフィルを含む高分子を、それぞれジエノフィルまたはジエンを含む他の分子体と反応させ、この分子体をディールス−アルダー反応によって効率的に高分子にコンジュゲートさせる。高分子は、付加環化反応を行うことができる部分を含むか、またはそれを含むように誘導体化しうるいかなる大型有機分子であってもよく、これには核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、脂質、ホルモン、薬物またはプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。前記の分子体は、付加環化反応を行うことができる部分を含むか、またはそれを含むように誘導体化しうる、いかなる分子（他の高分子も含まれる）であってもよい。分子体の例には、他の高分子、たとえば抗体、ポリマーもしくは樹脂（たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリスチレン）、診断用検出体分子、たとえばフルオレセイン、ビオチン、クマリン、または金属キレート化剤が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様においては、付加環化反応はディールス−アルダー反応であり、高分子および分子体はそれぞれジエンまたはジエノフィルで誘導体化される。本発明を記述するために本明細書中で用いる特定の用語を以下のとおり定義する：本明細書中で用いる“ヌクレオシド”は、修飾された、または天然のデオキシリボヌクレオシドもしくはリボヌクレオシドまたはその任意の化学修飾体であると定義される。ヌクレオシドの修飾には、糖の２’−、３’−および５’−位の修飾、ピリミジンの５−および６−位の修飾、プリンの２−６−および８−位の修飾、環外アミンの修飾、５−ブロモウラシルの置換などが含まれるが、これらに限定されない。当技術分野で既知の方法によるオリゴヌクレオチド合成、たとえばヌクレオシドホスホルアミダイトモノマーを用いる固相自動合成、Ｈ−ホスホナート結合またはホスフェートトリエステル結合を可能にするために、ヌクレオシドを適切に保護および誘導体化することができる。本明細書中で用いる“ヌクレオチド”は、修飾された、または天然のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドであると定義される。ヌクレオチドは、上記に定義したヌクレオシドが、５’−、２’−または３’−位に結合した１個または数個のリン酸または置換リン酸を含むものである。ヌクレオチドは一般にプリン類およびピリミジン類を含み、それらにはチミジン、シトシン、グアノシン、アデニンおよびウリジンが含まれる。 “オリゴヌクレオチド”は、前記のヌクレオチドが複数個結合したものから形成されるポリヌクレオチドを表す。ヌクレオチド単位はそれぞれ、ホスフェート連結基により互いに連結したヌクレオシド単位を含む。オリゴヌクレオチドという用語は、ホスホロチオエート結合などのホスフェート結合以外の結合により互いに結合した複数個のヌクレオチドをも表す。オリゴヌクレオチドは天然または天然以外のいずれであってもよい。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは１〜１，０００個のヌクレオチドを含む。本発明の目的に関し、“核酸塩基”は以下の定義をもつ。核酸塩基はプリン塩基またはピリミジン塩基である。核酸塩基には、当業者に現在知られているすべてのプリン類およびピリミジン類、またはその化学修飾体が含まれる。プリン類はプリン環の９位の窒素を介してリボース環に結合し、ピリミジン類はピリミジン環の１位の窒素を介してリボース環に結合している。ピリミジン類はピリミジン環の５−または６−位において修飾されていてもよく、プリン類はプリン環の２−、６−または８−位において修飾されていてもよい。特定の修飾については、米国特許出願第０８／２６４，０２９号、１９９４年６月２２日出願、表題“ 既知および新規２’−修飾ヌクレオチドを分子内求核置換により製造するための新規方法”、および米国特許出願第０８／４５８，４２１号、１９９４年６月２日出願、表題“求核体および一酸化炭素を用いるパラジウム触媒によるヌクレオシド修飾法”、および米国特許第５，４２８，１４９号、表題“パラジウム触媒による炭素−炭素結合法および生成物”に記載されている（それらの全体を本明細書に援用する）。より詳細には、核酸塩基にはウラシル、シトシン、Ｎ４−保護シトシン、４−チオウラシル、イソシトシン、５−メチルウラシル（チミン）、５−置換ウラシル、アデニン、Ｎ６−保護アデニン、グアニン、Ｎ２−保護グアニン、２，６−ジアミノプリン、ハロゲン化プリン、ならびにプリン環またはピリミジン環の模倣を意図した複素環、たとえばイミダゾールが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で用いる“核酸リガンド”とは、ターゲットに対し望ましい作用をもつ核酸である。望ましい作用には、ターゲットを結合すること、触媒作用によりターゲットを変化させること、ターゲットまたはターゲットの機能活性を修飾／変化させるようにターゲットと反応すること、自殺阻害物質と同様にターゲットと共有結合すること、ターゲットおよび／または他の分子との反応を促進することが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、その作用はターゲット分子に対する特異的結合親和性であり、このターゲット分子は主としてワトソン／クリック塩基対合または三重らせん結合に基づく機構により核酸リガンドに結合する、ポリヌクレオチド以外の三次元化学構造体であり、この核酸リガンドはターゲット分子が結合する既知の生理学的機能をもつ核酸ではない。１態様において、核酸リガンドは天然に存在しない核酸である。本発明の好ましい態様において、核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法により同定される。核酸リガンドには、候補となる核酸混合物から下記の方法で同定される核酸が含まれる（核酸リガンドは特定のターゲットのリガンドである）：ａ）候補混合物をターゲットと接触させると、ターゲットに対し候補混合物と比較して高い親和性をもつ核酸を候補混合物の残りのものから分配できる；ｂ）これらの高親和性核酸を候補混合物の残りのものから分配する；そしてｃ）これらの高親和性核酸を増幅して、リガンド濃縮された核酸混合物を得る。 “核酸”は、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのいかなる化学修飾体をも意味する。修飾には、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に付加的な電荷、分極率、水素結合、静電相互作用および流動性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を取り込む他の基を供給するものが含まれるが、これらに限定されない。このような修飾には、糖の２’−位修飾、ピリミジンの５−位修飾、プリンの８−位修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換、主鎖修飾、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、たとえばイソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどが含まれるが、これらに限定されない。修飾には、キャッピングのような３’および５’修飾も含めることができる。 “非免疫原性高分子量化合物”は、一般に免疫原応答を生じない約１０００Ｄａ以上の化合物である。免疫原応答は、生物に抗体タンパク質を産生させるものである。非免疫原性高分子量化合物の例には、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ) ；多糖類、たとえばデキストラン；ポリペプチド、たとえばアルブミン；および磁性構造体、たとえば磁鉄鋼が含まれる。本明細書中で用いる“タンパク質”という用語は、アミド結合（ＣＯＮＨ）により化学結合したアミノ酸ポリマーを表す。“アミノ酸”は、アミノ基（ＮＨ₂ ）およびカルボキシル基（ＣＯＯＨ）の両方を含む有機分子であると定義される。詳細には、“アミノ酸”は一般式Ｒ⁵ＣＨ（ＮＨ₂）ＣＯＯＨ（α−アミノ酸）の化合物であり、式中のＲ⁵はＨまたは適切に保護された既知アミノ酸側鎖またはその化学修飾体よりなる群から選択される。アミノ酸側鎖の適切な保護は当業者に既知である。本明細書中で用いる“タンパク質”という用語には、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質が含まれる。好ましい態様において、本発明のタンパク質は１〜５００個のアミノ酸を含む。本明細書中で用いる“親油性化合物”という用語は、脂質および／または誘電定数の低い他の物質もしくは相と会合するか、あるいはそれらの中へ分配される性向をもつ化合物を表す。これには、実質的に親油性成分からなる構造体も含まれる。コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールが親油性化合物の例である。 “ジエン”は、共役した２つの二重結合を含む分子であると定義される。付加環化反応を容易にするように分子の幾何学的形状が束縛される場合、ジエンは非共役であってもよい（Ｃｏｏｋｓｏｎら（１９６４）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５４１６）。これらの二重結合を形成する原子は、炭素もしくは異種原子またはそれらのいかなる組合わせであってもよい。 “ジエノフィル”は、アルケン基、または炭素と異種原子の間の二重結合、または２個の異種原子間の二重結合をもつ分子であると定義される。ジエノフィルは、置換もしくは非置換アルケン、置換もしくは非置換アルキンを含めたいかなる群であってもよいが、これらに限定されない。一般にジエノフィルは式Ｃ＝Ｃ−ＺまたはＺ’−Ｃ＝Ｃ−Ｚの置換アルケンであり、これらの式中のＺおよびＺ’は、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＣｌ、ＣＯアリール、ＣＮ、ＮＯ₂、アリール、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂Ｃｌ、ＣＨ₂ＮＨ₂、ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ ＣＯＯＨ、ハロゲン、またはＣ＝Ｃから独立して選択される電子吸引基である。特定の場合、アルケン単位に結合している基が電子吸引基であってもよく、これにはフェニル環、共役二重結合、アルキル基、ＯＭｅ基、または他のＸ−アルキ部分が含まれ（これらに限定されない）、ここでＸは電子供与基である（これらのタイプのジエノフィルは、一般に逆電子要求型（ｒｅｖｅｒｓｅｅｌｅｃｔｒｏｎｄｅｍａｎｄ）付加環化として知られる付加環化を行う）。ジエノフィルの他の例には式Ｒ₂Ｃ＝Ｘの化合物が含まれ、式中のＸは酸素、窒素、リンおよび硫黄よりなる群から選択される異種原子である。たとえば、アミノ酸またはリシン含有ペプチドなど、第一級アミノ基を含む分子は、反応経路１に示すようにホルムアルデヒドとの反応によりそれらに対応するイミニウム塩にすることにより、有効なジエノフィルに変換できる。イミニウム塩は水性溶媒中で穏やかな条件下に、ジエン含有高分子とのディールス−アルダー付加環化を行う。反応経路１ “１，３−双極子”は、連続した３つの原子、ａ−ｂ−ｃを含み、原子ａがその外殻にセクステット電子を含み、原子Ｃがその外殻にオクテット電子（少なくとも１対の非共有電子を含む）を含む化合物であると定義される。原子の外殻に６個の電子をもつ分子は一般に不安定であるので、ａ−ｂ−ｃ原子の例は実際には共鳴ハイブリッドの限界構造（ｃａｎｏｎｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の１つであり、少なくとも１つの他の構造を描くことができる。１，３−双極子は２つの主な群に分けることができる：１）一方の限界構造式がセクステット原子（原子ａ）上に二重結合をもち、他方の限界構造式がその原子上に三重合をもつ系：２）一方の双極子限界構造式がセクステット原子（原子ａ）上に単結合をもち、他方の限界構造式がその原子上に二重結合をもつ系：この反応タイプの概説については、“ＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ”（Ｍａｒｃｈ，Ｊ．編）７５８−７６１（１９７７）（マグローヒル、ニューヨーク）および“ＦｒｏｎｔｉｅｒＯｒｂｉｔａｌｓａｎｄＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｃａｌＲｅａｃｔｉｏｎｓ”（Ｉ．Ｆｌｅｍｉｎｇ）１４８−１６１（１９７６）（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社）参照。代表例にはニトリルイリド、ニトリルイミン、ニトリルオキシド、ジアゾアルカン、アジド、アゾメチンイリド、アゾメチンイミン、ニトロン、カルボニルイリド、カルボニルイミンおよびカルボニルオキシドが含まれるが、これらに限定されない。 “１，３−ジポラロフィル(１，３−ｄｉｐｏｌａｒｏｐｈｉｌｅ)”は、“ジエノフィル”または“ジエン”（前記）と同様に定義される。高分子は１，３− 双極子または１，３−ジボラロフィルのいずれか（または両方）に結合しうる。 “１，３−双極子付加環化反応”は、一般に下記のように表すことができる：または “エン反応”は、一般に下記のように表すことができる：エン反応のパートナーは“エン”および“エノフィル（ｅｎｏｐｈｉｌｅ）”と呼ばれる。“エノフィル”は“ジエノフィル”（前記ジエノフィルの定義を参照）と同様に定義される。“エン”はいかなる不飽和基であってもよく、置換もしくは非置換アルケン、置換もしくは非置換アルキンが含まれるが、これらに限定されない。一般に“エン”は式Ｘ−Ｃ＝ＣＨ−ＣＨ₂−またはＸ’−Ｃ＝ＣＸ− ＣＨ_x−の置換アルケンであり、これらの式中のＸおよびＸ’は電子供与基である。高分子にはエン化合物またはエノフィル化合物のいずれか（または両方）が結合しうる。本明細書中で用いる“高分子”は、大型の有機分子を表す。高分子の例には核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、脂質、ホルモン、薬物またはプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で定義する“バイオコンジュゲート”は、他の分子体で誘導体化されたいかなる高分子も表す。“バイオコンジュゲーション”または“コンジュゲーション”は、他の分子体による高分子の誘導体化を表す。 “分子体”は、いかなる分子であってもよく、小型の分子または他の高分子が含まれる。分子体の例には、他の高分子、ポリマーもしくは樹脂、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリスチレン、非免疫原性高分子量化合物、蛍光体、化学発光性、放射性同位体および生物発光性マーカー化合物、抗体、ビオチン、診断用検出体分子、たとえばマレイミド誘導体化フルオレセイン、クマリン、金属キレート化剤、または他の修飾基が含まれるが、これらに限定されない。バイオコンジュゲーションおよびコンジュゲーションという用語は、本明細書全体において互換性をもって用いられる。 “誘導体化された高分子”は、付加環化反応を行うことができる部分で官能化されている高分子を表す。官能化しなくても付加環化反応を行うことができる部分を含む高分子も、この定義に含まれる。付加環化反応を行うことができる部分の例は、後記にＸとして定義される。好ましい態様においては、高分子はジエンまたはジエノフィルで官能化される。最も好ましい態様においてジエノフィルはマレイミドであり、ジエンはヘキサジエンである。本発明の“誘導体化されたオリゴヌクレオチド”は、一般に次式により表される：これらの式中、Ｂは核酸塩基であり；ＡおよびＡ’は糖の２’−置換基であり；Ｗは独立して、１〜１０００個の核酸塩基を有するオリゴヌクレオチド、ＸまたはＨよりなる群から選択され；Ｘはジエン、ジエノフィル、１，３−双極子、１，３−ジポラロフィル、エン、エノフィル、または付加環化反応を行うことができる他の部分であり、さらにＸが核酸塩基Ｂに結合している場合、Ｘは炭素原子、環外窒素または環外酸素に結合していてもよい。本発明の好ましい態様において：ＡおよびＡ’は独立して、Ｈ、²Ｈ、³Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨＯＲ¹、ＮＨＯＲ³、ＮＨＮＨＲ³、ＮＨＲ³、＝ＮＨ、ＣＨＣＮ、ＣＨＣｌ₂、ＳＨ、ＳＲ³、ＣＦＨ₂、ＣＦ₂Ｈ、ＣＲ² ₂Ｂｒ、−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_nＯＣＨ₃、ＯＲ⁴およびイミダゾールよりなる群から選択され（米国特許出願第０８／２６４，０２９号、１９９４年６月２２日出願、表題“２’−修飾ピリミジンを製造するための分子内求核置換による新規方法”参照、これを本明細書に援用する）；Ｒ¹は、Ｈおよびアルコール保護基よりなる群から選択され；Ｒ²は、＝Ｏ、＝Ｓ、Ｈ、ＯＨ、ＣＣｌ₃、ＣＦ₃、ハライド、所望により置換されたＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル（環式、直鎖および分枝鎖を含む）、アルケニル、アリール、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アシル、ベンゾイル、ＯＲ⁴およびエステルよりなる群から選択され；Ｒ³は、Ｒ²、Ｒ⁴、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｓ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｏ）ＣＦ₃、ＳＯ₂ Ｒ⁴、アミノ酸、ペプチド、およびその混合物よりなる群から選択され；Ｒ⁴は、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択され；最も好ましくはＡは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃｌ、Ｆ、ＮＨＯＲ³、ＯＲ⁴、ＯＳｉＲ⁴ ₃よりなる群から選択され（米国特許出願第０８／２６４，０２９号、１９９４年６月２２日出願、表題“２’−修飾ピリミジンを製造するための分子内求核置換による新規方法”参照、これを本明細書に援用する）；Ｘには、共役ジエン単位を含むアルキル基または置換アルキル基、共役ジエン単位を含むアルコキシ基または置換アルコキシ基、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ ＣＨ₂Ｏ−、マレイミド置換アルコキシ基、ジエノフィル置換アルコキシ基、アルコキシ基、共役ジエン単位を含むアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、マレイミド置換されたアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、ジエノフィル部分を含むアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、ニトリルイリド、ニトリルイミン、ニトリルオキシド、ジアゾアルカン、アジド、アゾメチンイリド、アゾメチンイミン、ニトロン、カルボニルイリド、カルボニルイミンおよびカルボニルオキシドが含まれるが、これらに限定されない。前記置換基土のアルキル基は１〜５０個、好ましくは１〜３０個の炭素を含むことができる。本明細書中で用いる“架橋分子”は、２以上の分子体を共有相互作用により連結する分子体である。より詳細には、“架橋分子”は多官能性分子であり、ジエン、ジエノフィルもしくは付加環式反応を行うことができる他の部分を含む高分子を誘導体化するために使用でき、またはジエン、ジエノフィルもしくは付加環式反応を行うことができる他の部分を含む高分子にコンジュゲートすべき分子を誘導体化するために使用できるものである。本発明の架橋分子は、一般に次式により表される：式中、Ｘは前記に定義したジエンまたはジエノフィルであり；ｎは１〜２０の整数であり；Ｌはリンカーであり、これには下記一般式の化合物：（式中、Ｙは、ＮＨ、Ｏ、ＮＨ（ＣＯ）Ｏ、ＮＨ（ＣＳ）Ｏ、ＮＨ（ＣＯ）ＮＨ、ＮＨ（ＣＯ）、Ｓ−Ｓ−Ｓ−またはＳｉ（Ｒ）₂よりなる群から選択され、ここでＲはアルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールから選択される）が含まれるが、これらに限定されない。前記置換基に対する他の自明の置換も本発明の範囲に含まれ、本発明は具体例に限定されるのではなく、全般的な反応式による。 “療法薬”とは、疾病や障害の処置に用いる化合物を意味する。 “診断薬”とは、試料中のターゲットの存否を検知し、および／またはその量を測定するために使用できるバイオコンジュゲートを意味する。ターゲット分子の検出は、ターゲット分子がそれに特異的なバイオコンジュゲートの核酸成分に結合することにより仲介される。バイオコンジュゲートは、定量的または定性的検出を行うことができるように、たとえば放射性標識することができる。 “改良された薬物動態”とは、バイオコンジュゲートがバイオコンジュゲートに属さない核酸と比較してより長いインビボ循環半減期を示すか、または改良されたターゲット−対−非ターゲット濃度比など、薬物動態上の他の利点をもつことを意味する。付加環化反応、特にディールス−アルダー反応は、高分子を相互に、診断用検出体に、または他の修飾基にコンジュゲートさせるための一般的方法として格別に適している。ジエノフィルへのジエンの付加環化は化学選択性が高く、電子構造の適合するジエンとジエノフィルの対のみが反応する。この反応は穏やかな条件下に、妥当な時間枠内で進行する。核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質および脂質などの高分子は、一般にこのような付加環化反応を行うことができる部分を含まない。したがってジエンおよびジエノフィル反応パートナーを特別に導入することにより、前例のないほど特異的に高分子がコンジュゲーション、誘導体化または多量体化できるようになる。ジエンまたはジエノフィルとそれぞれ対応するジエノフィルまたはジエンとの反応の選択性が高いため、オリゴヌクレオチドまたはペプチドなどの高分子の合成に際し官能基を保護する必要がなくなる。これは、高分子合成に際しコンジュゲーションに用いる他の官能基に優る、実用上の著しい利点である。他の官能基の場合は、保護化学の選択性に限界のあることがしばしばコンジュゲーション収率を決定する。さらに、ジエンおよびジエノフィルは、一般にコンジュゲーション法に際し遭遇する副反応を生じにくい。それらは加水分解または加溶媒分解を受けないので、これらの反応は水性媒質中でほぼ化学量諭的濃度において実施でき、したがって貴重な試薬が保存される。そのような副反応がないため、オリゴヌクレオチドの二量体化や三量体化を前例のない収率および純度で行うことができる。ディールス−アルダー付加環化反応は水性媒質によって促進されるので、親水性高分子の誘導体化またはコンジュゲーションに格別に適している。最後に、このコンジュゲーション法は既知の大部分の別法よりｐＨ感受性がはるかに低い。本発明の１態様においては、高分子はオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドの誘導体化に好ましい溶媒は、これらの分子が高アニオン性であるため、水である。したがってそのような基とオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションに最適な反応は水中で容易に進行し、いずれかの反応体の加水分解のような、水との副反応を示さない。オリゴヌクレオチドへの最適かつ特異的な置換基導入のためのこれらの基準に基づき、オリゴヌクレオチドの化学選択的かつ効率的な修飾のためにディールス−アルダー付加環化を使用することを本明細書に記載する。たとえば、ジエン修飾したヌクレオシドもしくは非ヌクレオシドホスフェートジエステル基を含むか、またはジエノフィル修飾したヌクレオシドもしくは非ヌクレオシドホスフェートジエステル基を含むオリゴヌクレオチドを、それぞれジエノフィルまたはジエン部分を含む分子と反応させることができる。たとえば５−（３，５−ヘキサジエン）−２’−デオキシウリジンヌクレオシドの導入により、ジエンまたはジエノフィル部分をオリゴヌクレオチド鎖の任意の位置に取り込ませることができる（米国特許出願第０８／２６４，０２９号、１９９４年６月２２日出願、表題“既知および新規２’−修飾ピリミジンを製造するための分子内求核置換による新規方法”参照、これを本明細書に援用する）。あるいはジエンまたはジエノフィル部分を、２’−Ｏ−（３，５−ヘキサジエン）−ウリジンヌクレオシドとして導入できる。ジエン部分は、ジエンを含む非ヌクレオシドホスホルアミダイト、たとえば３，５−ヘキサジエン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイトとしてオリゴヌクレオチドに導入することもできる。ジエン修飾オリゴヌクレオチド、たとえば５’−末端３，５−ヘキサジエンホスフェートオリゴヌクレオチドと、ジエノフィル修飾反応体、たとえばマレイミドポリエチレングリコールメチルエーテルとの反応により、オリゴヌクレオチドが効率的にコンジュゲートされる。本発明方法は、ジエン、ジエノフィルまたは付加環化反応を行うことができる他の反応性基で誘導体化しうるいかなる高分子のバイオコンジュゲーションにも制限なく拡張できる。たとえば、本方法はペプチドおよびタンパク質と他の分子体とのコンジュゲーションにまで拡張できる。ジエンまたはジエノフィルで誘導体化したアミノ酸構築ブロック、たとえばＯ−３，５−ヘキサジエン−チロシンもしくはセリンまたはＮ−マレイミドリシンを含むペプチドまたはタンパク質を、他のペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、炭水化物、検出体分子など（これらに限定されない）を含めた他の分子体に制限なくコンジュゲートさせることができる。天然高分子、たとえばタンパク質を、ジエンまたはジエノフィルを含むヘテロ二官能性架橋試薬、たとえば３−（４−マレイミドフェニル）−プロピオン酸のＮＨＳエステル（パース（Ｐｉｅｒｃｅ））で誘導体化すると、対応するジエンまたはジエノフィル基を含む高分子または診断用検出体分子にさらにコンジュゲートさせることができる。付加環化反応、特にディールス−アルダー反応は化学選択性が高いので、それらを高分子の二量体化に利用できる。２個の活性高分子を１個の分子体に結合させると、それらの活性を指数的に高めることができる。２個の同一高分子からなるホモ二官能性二量体、または異なる活性をもつ２個の分子からなるヘテロ二官能性二量体を、付加環化反応、特にディールス−アルダー付加環化反応により、高特異性および高収率で組み立てることができる。たとえば、５’−もしくは３ ’−末端または配列のいずれかの２’−位もしくはＣ−５位にジエン部分（たとえば３，５−ヘキサジエンまたはシクロペンタジエン基）を含むオリゴヌクレオチドを、ジエノフィル部分（たとえばマレイミドまたはアクリルアミド基）を含む第２オリゴヌクレオチドに共有結合させることができる。ジエンまたはジエノフィル基を含むそのようなオリゴヌクレオチドを、対応するジエノフィルまたはジエン基を含むオリゴヌクレオチドと直接に反応させて、二量体を形成することができる。ジエンまたはジエノフィル基の結合点に応じて、５’−３’、５’− ５’、３’−３’、５’−内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）、３’−内部、または内部 −内部配向のオリゴヌクレオチド二量体を得ることができる。あるいはそのようなオリゴヌクレオチドを、２以上のジエンまたはジエノフィル基を含む架橋分子と反応させて、二量体または多量体を形成することができる。本発明方法によるオリゴヌクレオチド二量体化を後記実施例２、４および６に示す。高分子の免疫原性を低下させ、またインビボでのそれらの滞留時間を延長するために、しばしばポリエチレングリコールを高分子にコンジュゲートさせる。本発明のバイオコンジュゲーション法によれば、ジエン、ジエノフィルまたは付加環化反応を行うことができる他の反応性基を含む高分子、たとえばオリゴヌクレオチドまたはペプチドを、対応するジエン、ジエノフィルまたは付加環化反応を行うことができる他の基を１またはそれ以上含む他のポリマーまたは樹脂、たとえばポリエチレングリコールまたはポリスチレンで誘導体化することができる。ジエノフィル基または付加環化反応を行うことができる他の反応性基を含む高分子または分子体は、ジエン単位または付加環化反応を行うことができる他の反応性基を含む不飽和脂質にも付加環化することができる。得られる脂質コンジュゲートは、高分子または検出体分子を脂質相、たとえばミセルまたはリポソームに固定するのに有用である。前記のように、付加環化反応、特にディールス−アルダー付加環化によるコンジュゲーション反応は高分子相互の反応に限定されない。この反応はジエン、ジエノフィルまたは付加環化反応を行うことができる他の反応性基を１またはそれ以上含む高分子、たとえばオリゴヌクレオチドまたはペプチドを、ジエン、ジエノフィルまたは付加環化反応を行うことができる他の基を１またはそれ以上含む検出体分子、たとえばマレイミド誘導体化フルオレセインまたはマレイミド誘導体化金属キレート化剤で選択的に誘導体化するのにもきわめて有用である。本明細書に記載するバイオコンジュゲーション法は、転写されたオリゴヌクレオチドの特性および機能を特にＳＥＬＥＸ薬物検索法のために拡張するのにも有用である。ＳＥＬＥＸ法は下記に記載されている：米国特許出願第０７／５３６，４２８号、１９９０年６月１１日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化”、現在は放棄；米国特許出願第０７／７１４，１３１号、１９９１年６月１０日出願、表題“核酸リガンド”、現在は米国特許第５，４７５，０９６号；米国特許出願第０７／９３１，４７３号、１９９２年８月１７日出願、表題“ 核酸リガンドの同定方法”、現在は米国特許第５，２７０，１６３号（国際特許出願公開第ＷＯ９１／１９８１３号も参照）；これらの特許出願をそれぞれ本明細書に援用し、まとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ。置換基を多重修飾ヌクレオシド成分に選択的にコンジュゲートさせることによりオリゴヌクレオチドを修飾するのは、転写により生成したオリゴヌクレオチドに限定されない。付加環化反応により相補的反応体（たとえばジエノフィルまたはジエン）と選択的に反応しうる反応中心（たとえばジエンまたはジエノフィル）を含むヌクレオシド類似体を、合成によりオリゴヌクレオチドに取り込ませることもできる。たとえば、２’−ヘキサジエンオキシウリジンモノマーを標準法で適切に誘導体化して５’−保護された３’−ホスホルアミダイトにしたものを、標準的自動固相合成法によりオリゴヌクレオチドに取り込ませることができる。これにより、多重内部ジエン置換基を含む合成オリゴヌクレオチドが生成する。このオリゴヌクレオチドを、ジエノフィル基を含む多重置換体、たとえばマレイミドポリエチレングリコールにコンジュゲートさせることができる。こうしてポリエチレングリコール被覆された合成オリゴヌクレオチドが生成する。実施例１には、高分子を他の分子体にバイオコンジュゲートさせるのにディールス−アルダー反応を用いるのが実現可能であることを示す。この例には、数種のヘキサジエンホスフェートヌクレオシドとＮ−エチルマレイミドのディールス −アルダー反応を記載する。これらの反応は、約１．２当量のマレイミドを水中または水中２０％イソプロパノール中で用いて、速やかに高収率で進行する。実施例２（反応経路６）には、５’−ＤＭＴ−チミジン３’−ヘキサジエン− （２−シアノエチル）ホスファイト（７）とジマレイミドである４，４’−ジマレイミドジフェニルメタン（８）の二量体化を記載する。図３に、反応混合物中に存在するモノ−ディールス−アルダー付加環化生成物（モノコンジュゲート）と二量体コンジュゲート（９）の量を２２時間にわたってグラフで示す。これら２生成物の量を、反応混合物中に存在する未反応出発物質、モノコンジュゲートおよび二量体コンジュゲートに対する％として計算した。このグラフは予想どおり、モノコンジュゲートが比較的安定な濃度に達し、二量体形成に伴って徐々に減少することを示す。オリゴヌクレオチドのバイオコンジュゲーションは、付加環化反応を行うことができる部分でオリゴヌクレオチドを修飾しうる可能性に依存する。１方法は、実施例２に示すように、ジエンまたはジエノフィルなどの反応性部分をヌクレオシドの糖または塩基に取り込ませるものである。第２の方法は、反応性部分を含むホスホルアミダイトを調製し、次いでこれを結合および酸化するものである。反応性部分はいかなる脱保護工程においても存続しうるか、またはアンマスキングされなければならない。ホスホルアミダイトはオリゴヌクレオチド鎖の５’− Ｏ−末端にあってもよく、またはさらに連鎖延長のために脱保護できる他の保護アルコールを含んでもよい。ジエン部分を含むホスホルアミダイトの調製に使用できる化合物の例を反応経路２に示す。化合物１１Ａおよび１１Ｂの合成を後記の実施例３に述べる。３’−Ｏまたは５’−Ｏ−末端を１１Ｄのようなビス（ジエン）−オールの合成により荷電ビス（ジエン）ホスフェートで修飾し、次いで普通のホスホルアミダイト合成によりホスホルアミダイトに変換することもできる。これはジホスフェートエステル１１Ｅの合成によっても達成できる。１１Ｆまたは１１Ｇに示す “ヘテロ二官能性”ホスホルアミダイトが架橋または異なるコンジュゲートへの選択的２工程バイオコンジュゲーションに用いるための有用な化合物となる可能性もある。Ｐｒｏｔは任意のアルコール保護基を表す。反応経路２実施例４は、ディールス−アルダー付加環化反応により高分子量ポリエチレングリコールを高収率でオリゴヌクレオチドに化学選択的コンジュゲートさせるための有力な手段が得られることを証明する。この例には、２８−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（５’−末端３，５−ヘキサジエンホスフェートを含むオリゴヌクレオチド−５’−ジエン（１２））とＰＥＧ５Ｋ−マレイミドメチルエーテルおよびＰＥＧ２ＯＫ−マレイミドメチルエーテルのディールス−アルダー反応を記載する。実施例５には、オリゴヌクレオチド−５’−ジエン（１２）と１，６−ビスマレイミドヘキサンの二量体化を記載する。実施例６には、２’−（２，４−ヘキサジエンオキシ）ウリジン−３’−チミジンホスフェート（２４）の合成を記載する。２’−Ｏ−ヘキサジエン−ヌクレオチド（反応経路３）ならびにその完全保護およびホスフィチル化誘導体の製造により、ジエン部分をオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体全体の任意の位置に、またオリゴヌクレオチド全体に多数回、配置することが可能になる。したがって、多重の検出体、ペプチドまたは医薬活性部位をディールス−アルダー付加環化により１ヌクレオチド中へコンジュゲートさせることができる。反応経路３反応経路４に示すように、オリゴヌクレオチドを２’−Ｏ−ヘキサジエン−塩基と統合して二量体化することもできる。二量体化反応の例を実施例７に記載する。反応経路４種々の置換マレイミドと２’−（２,４−ヘキサジエンオキシ）ウリジン−３ ’−チミジンホスフェートとのディールス−アルダー反応を研究した際、水または水中２０％イソプロパノールに可溶性のマレイミドはすべて３０分以内に反応するが、これらの溶媒系における溶解度が低いマレイミドはより長い反応時間（＞１時間）を要することが見出され、すべての固体が溶解したとき完了することが自明であった。２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−チミジンホスフェート（２４）（二量体）と４’−マレイミド安息香酸ナトリウムの付加環化反応の速度、および２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン（２９）（モノマー）と４’−マレイミド安息香酸ナトリウムの反応速度を比較すると（実施例８）、二量体のＫ_rel＝１に対しモノマーはＫ_rel＝６をもつことが認められた。速度の差は、より長いオリゴヌクレオチドの方がより著しいと思われる立体的要因によると推定される。２種類の異性体がＨＰＬＣにより検出され、両方ともエンド付加物であり、結合しうる可能性のあるジエンの２面により区別される。これらの異性体は、現在まで行った二量体と種々の置換マレイミドとのディールス−アルダー反応すべてにつき検出されている。実施例９には、オリゴヌクレオチド−５’−ジエンと種々の蛍光性検出体のコンジュゲーションを示す。２８−ｍｅｒオリゴヌクレオチド−５’−ジエン（１２）とマレイミド誘導体化クマリンのバイオコンジュゲーションは、約９０％の収率で進行した。実施例１０には、オリゴヌクレオチド−５’−ジエンへのビオチンマレイミドのバイオコンジュゲーションを記載する。この反応も約９０％の収率で進行した。実施例１１には、リポソーム固定のために、ジエンを含む脂質にジエノフィルを含むオリゴヌクレオチドをコンジュゲートさせることを記載する。実施例１２（反応経路１７）には、オリゴヌクレオチド−５’−ジエン（１２）の三量体化を記載する。二量体化、三量体化またはより高度に連結したアンチセンスオリゴヌクレオチドは生物学的活性の増大を示すので、オリゴヌクレオチドの多量体は重要である。トリアミノエチルアミン（ＴＲＥＮ）、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）または他の多重アミノ化合物を用いると、多重マレイミド分子を合成することができる。前記のように、付加環化バイオコンジュゲーションはディールス−アルダータイプに限定されない。それらは他の系、たとえば１，３−双極子付加環化によっても実施できる。反応体の構造は異なるが、両タイプの反応とも計画に従った様式で起き、ディールス−アルダー付加環化では６員環、１，３−双極子付加環化では５員環が得られる。実施例１３に、３’−アジド−ジデオキシチミジン（ＡＺＴ）とＮ−エチルマレイミドの１，３−双極子付加環化を示す。付加環化反応を行うことができる部分でペプチドまたはタンパク質を誘導体化しうる限り、ペプチドまたはタンパク質とのバイオコンジュゲーションも可能である。ペプチドまたはタンパク質を誘導体化するための１方法は、反応性部分をアミノ酸に取り込ませるものであり、次いでこれをペプチドまたはタンパク質に取り込ませることができる。実施例１４（反応経路１９）に、完全保護されたジエン修飾アミノ酸アルコール（４９）および（５０）の合成を記載する。オリゴヌクレオチドにつき記載したバイオコンジュケーション法はすべて、付加環化反応を行うことができる部分で官能化したペプチドまたはタンパク質に適用できる。多重部位バイオコンジュゲーションまたは多重体化のために、多数の修飾アミノ酸をペプチドに取り込ませることができる。同様に、他のアミノ酸、たとえばアルギニンを、１，３−双極子付加環化用の１，３−双極子として用いるために修飾できる。本発明方法は、ヘテロ二量体の製造にまで拡張できる。ヘテロ二量体化は高分子の薬物動態または安定性を改良するために望ましい場合がある。実施例１５（反応経路２０〜２２）に示すように、ジエン官能化した高分子、たとえばオリゴヌクレオチド、ペプチドまたはタンパク質を、ジエノフィル官能化した高分子にコンジュゲートさせて、ヘテロ二量体を製造することができる。いずれの基質にも１より多い官能化部位があって架橋するか、１基質のみにつき１より多い官能化部位があって枝分かれオリゴヌクレオチドが得られるか、または両方の基質につき１つの官能化部位があってヘテロ二量体が得られるという可能性がある。実施例１６（反応経路２４）には、エン付加環化反応を用いた高分子のバイオコンジュゲーションを示す。この例では説明のためにオリゴヌクレオチドを用いたが、この反応は適切に標識したいかなる高分子を用いても実施できる。実施例１６には、エン部分で５’−末端を誘導体化したオリゴヌクレオチドの製造も記載する（反応経路２３）。ジエン部分の場合（前記）と同様に、エン部分もオリゴヌクレオチドの任意の位置に結合させることができる。実施例１７には、［４＋３］付加環化反応を用いた高分子バイオコンジュゲーションを示す。この例では説明のためにオリゴヌクレオチドを用いたが、この反応は適切に標識したいかなる高分子を用いても実施できる。実施例１７には、フランで誘導体化したオリゴヌクレオチドの合成も記載する。１態様において本発明方法は、プロドラッグの合成に使用できる。プロドラッグは送達後に薬物を放出するように修飾した薬物である。しばしばプロドラッグは“キャリヤー”分子に結合され、理想的にはそれらのターゲットに到達したとき代謝されて、生物学的に活性な化合物になる。オリゴヌクレオチドは容易にコンジュゲートし、かつ選択したターゲットに結合するように設計できるので、理想的なキャリヤー分子である。さらに、ジエンまたはジエノフィル修飾したヌクレオシドまたはヌクレオチドとジエノフィルまたはジエン修飾したプロドラッグまたは小分子との反応により、プロドラッグコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドの大規模ライブラリーを容易に合成できる。この一例を実施例１８（反応経路２７および２８）に示す。下記の構造により示すように、ジエンまたはジエノフィルを遊離ヌクレオシドまたはヌクレオチドモノマーの糖または塩基部分のいかなる位置にも、任意の共有様式で配置できる：１より多いジエンまたはジエノフィルを１個の遊離ヌクレオシドまたはヌクレオチドモノマーに取り込ませることができる。さらに、１より多いジエンまたはジエノフィルで修飾されたモノマーを、オリゴヌクレオチドに取り込ませることができる。次いで多数のプロドラッグまたは生物学的活性分子を１個のヌクレオシドまたはヌクレオチドにバイオコンジュゲートさせて、より効率的または改良された薬物動態を得ることができる。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、たとえばＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ鋳型転写は、ＲＮＡライブラリーの形成またはリボザイムなどの活性ＲＮＡ分子の調製に有効な方法である。そのような転写を、ジエンまたはジエノフィル基を含むヌクレオシドまたはヌクレオチドで開始すると、５’−末端にハンドルが導入される。これにより、次いでこのＲＮＡ転写体を、１個または数個の対応するジエンまたはジエノフィル基を含む他の高分子、診断用検出体、架橋試薬、またはポリマーもしくは樹脂に選択的にコンジュゲートさせることができる。実施例１９に、そのような転写体をウェーハ上の特定の部位にコンジュゲートさせることを記載する。以下の実施例は説明のために示したにすぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。実施例実施例１．ヘキサジエンホスフェートヌクレオシドのディールス−アルダー反応ジエノフィルを含む部分に後続コンジュゲートさせるためにオリゴヌクレオチドにジエンホスホルアミダイトを付加させる概念を、まずモデル系で試験した( 反応経路４)。５’−保護チミジン３’−（３，５−ヘキサジエン）−（２−シアノエチル）ホスファイトトリエステル（３）、対応するホスフェートトリエステル（４）、チミジン５’−（３，５−ヘキサジエン）−（２−シアノエチル）ホスファイトトリエステル（５）、および対応するホスフェートトリエステル（６）とＮ−エチルマレイミドとの付加環化速度を比較した。大部分の場合、ディールス−アルダー反応は室温で１０時間以内に本質的に完了した。反応経路５５’−ＤＭＴ−チミジン３’−（３，５−ヘキサジエン）−（２−シアノエチル）ホスファイトトリエステル（３）の製造化合物３（反応経路５）を、（２ −シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−３，５−ヘキサジエンホスホルアミダイトと５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジンの反応により製造した。要約すると、アルゴンパージし、隔壁シールした（ｓｅｐｔｕｍｓｅａｌｅｄ）、撹拌バー付き１００ｍＬ丸底フラスコに５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン（２．１６ｇ，４ｍｍｏｌ）を入れた。フラスコにアセトニトリル（ＡＣＮ）中０．５Ｍテトラゾール（４０ｍＬ，５当量）、続いて（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル −３，５−ヘキサジエンホスホルアミダイト（４．４５ｍＬ，１．５当量）を入れた。反応物を４５分間撹拌した。その間に溶液は混濁状態から透明に変化した。この混合物を、酢酸エチル（８０ｍＬ）入りの２５０ｍＬの分液漏斗に注入した。有機相を２．５％炭酸水素ナトリウム４０ｍＬで２回、ブラインで１回洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、溶媒を除去し、この油をシリカ上でクロマトグラフィー処理した（３：１酢酸エチル／ヘキサン、カラムをジイソプロピルエチルエーテルで前処理）。得られた油にアセトンを吹き込み、ＮＭＲによる純度９５＋％の３を２．５１ｇ（８５％）得た。５’−ＤＭＴ−チミジン３’−（３，５−ヘキサジエン）−（２−シアノエチル）ホスフェートトリエステル（４）の製造１００ｍＬの丸底フラスコに、化合物３（０．３７ｇ，０．５ｍｍｏｌ）およびＡＣＮ（２０ｍＬ）を、撹拌しながら入れた。この撹拌混合物にＮａＩＯ₄（水中０．１Ｍ，２．５当量）を添加し、２０分間反応させた。次いで混合物を１００ｍＬのＥｔＯＡｃに注入し、水（４０ｍＬで２回）およびブライン（４０ｍＬで１回）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、続いてろ過し、溶媒を除去した。得られた油にクロロホルムを吹き込み、ＮＭＲによる純粋な４を０．３ｇ（８０％）得た。チミジン５’−（３，５−ヘキサジエン）−（２−シアノエチル）ホスファイトトリエステル（５）の製造化合物５（反応経路４）を、５’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトチミジン３’−Ｏ− ＤＭＴと３，５−ヘキサジエン−１−オールとの反応により製造した。要約すると、アルゴンパージし、隔壁シールした撹拌バー付き１００ｍＬ丸底フラスコに５’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトチミジン３’−Ｏ−ＤＭＴ（０．５ｇ，０．６８ｍｍｏｌ）を入れた。フラスコにＡＣＮ中０．５Ｍテトラゾール（７ｍＬ，５当量）、続いて３，５−ヘキサジエン−１−オール（０．１０ｇ，１．５当量）を入れた。反応物を４５分間撹拌した。この混合物を、酢酸エチル（８０ｍＬ）入りの２５０ｍＬの分液漏斗に注入した。有機相を２．５％炭酸水素ナトリウム４０ｍＬで２回、ブラインで１回洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、溶媒を除去し、この油をシリカ上でクロマトグラフィー処理した（３：１酢酸エチル／ヘキサン、カラムをジイソプロピルエチルアミンで前処理）。得られた油にアセトンを吹き込み、¹Ｈおよび³²ＰＮＭＲによる純度９５＋％の５を０．４３ｇ（８７％）得た。チミジン５’−（３，５−ヘキサジエン）−（２−シアノエチル）ホスフェートトリエステル（６）の製造１００ｍＬの丸底フラスコに、化合物５（０．２２ｇ，０．３０ｍｍｏｌ）およびＡＣＮ（１０ｍＬ）を撹拌しながら入れた。この撹拌混合物に０．１ＭＮａＩＯ₄水溶液（３ｍＬ，５当量）を添加し、２０分間反応させた。次いで混合物を酢酸エチル５０ｍＬに注入し、水（４０ｍＬで２回）およびブライン（４０ｍＬで１回）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、続いてろ過し、溶媒を除去した。得られた油にクロロホルムを吹き込み、ＮＭＲによる純粋な６を０．２１ｇ（９４％）得た。付加環化反応速度の測定ジエンヌクレオシド約０．０１ｍｍｏｌおよびＮ− エチルマレイミド１．２５当量をＮＭＲ管中へ秤量した。反応物を０．５ｍＬのＭｅＣＮ−ｄ₃および０．５ｍＬの酸化ジューテリウムに溶解した。生じた沈殿がすべて溶解するまでＤＭＦ−ｄ₇を添加した。ＮＭＲ測定のために１滴の反応混合物を取り出し、他のＮＭＲ管に入れ、試料の固定に用いるＭｅＣＮ−ｄ₃適量で希釈した。ジエンプロトン（δ＝６．１）の消失と対比した、反応中に形成された脂肪族プロトン１個（δ＝５．７）の積分値から計算を行った。この計算は、δ＝５．７の積分値÷両積分値の和（δ＝５．７およびδ＝６．１）×１００％である。速度試験の結果を図１および２にグラフで示す。実施例２．５’−ＤＭＴ−チミジン３’−ヘキサジエン−（２−シアノエチル）ホスファイトと４，４’−ジマレイミド−ジフェニルメタンの二量体化反応経路６５’−ＤＭＴ−チミジン３’−ヘキサジエン−（２−シアノエチル）ホスファイト（７）とジマレイミドである４，４’−ジマレイミド−ジフェニルメタン（８）の二量体化を、反応経路６に示す。５’−ＤＭＴ−チミジン３’−ヘキサジエン−（２−シアノエチル）ホスファイトの濃度を０．３６Ｍ、ジマレイミドの濃度を１当量に維持した。副生物はほとんどなかった。混合物を断続的に２２時間にわたってサンプリングした。図３に、反応混合物中に存在するモノ−ディールス−アルダー付加環化生成物（モノコンジュゲート）および二量体コンジュゲート（９）の量を２２時間にわたってグラフで示す。実施例３．誘導体化ホスホルアミダイトの製造２−シアノエチル−（３，５−ヘキサジエン）ホスホルアミダイト（１１Ａ）の合成アルゴンパージし、隔壁シールした１００ｍＬ丸底フラスコに３，５−ヘキサジエン−１−オール（２．４３ｇ，２４．８ｍｍｏｌ）を入れた。フラスコに塩化メチレン（５０ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（１４．５ｇ，５．０当量）を撹拌しながら入れた。次いでフラスコに２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’ −ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（５．００ｇ，２２．５ｍｍｏｌ）を入れ、４５分間撹拌した。反応混合物を、塩化メチレンで１００ｍＬに希釈し、次いで２．５％ＮａＨＣＯ₃（５０ｍＬで２回）およびブライン（５０ｍＬで１回）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、溶媒を除去し、この油を高真空下で１８時間乾燥させて、¹ＨＮＭＲおよび³¹ＰＮＭＲによる純度９９＋％の化合物１１Ａを得た。ビス（３，５−ヘキサジエン）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホルアミダイト（１１Ｂ）の合成アルゴンパージし、隔壁シールした丸底フラスコに、３，５−ヘキサジエン− １−オール（２．５６ｇ，２６．１ｍｍｏｌ）を入れた。フラスコに塩化メチレン（５０ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（１６．０ｍＬ，５．０当量）を撹拌しなから入れた。次いでフラスコにＮ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホルアミダスジクロリド（２．５ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）を入れ、４５分間撹拌した。反応混合物を塩化メチレンで１００ｍＬに希釈し、次いで２．５％ＮａＨＣＯ₃ （５０ｍＬで２回）およびブライン（５０ｍＬで１回）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、溶媒を除去し、この油を高真空下で１８時間乾燥させて、¹ＨＮＭＲおよび³¹ＰＮＭＲによる純度９９＋％の化合物１１Ｂを得た。実施例４．５’−末端３，５−ヘキサジエンホスフェートを含む２８−ｍｅｒオリゴヌクレオチドへのＰＥＧ−マレイミドメチルエーテルのコンジュゲーション反応経路７オリゴヌクレオチドの合成配列５’−ＨＯ−ＣＣＡＧＴＡＣＡＡＧＧＴＧＣＴＡＡＡＣＧＴＡＡＴＧＧ［３’３’Ｔ］Ｔ−３’（１０）の２８−ｍｅｒＤＮＡを、ミリゲン（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ）８８００オリゴヌクレオチド合成装置で標準固相プロトコールにより３００μｍｏｌ規模で製造した。５’−末端固相付加サイクル終了後、３，５−ヘキサジエン−１−オールホスホルアミダイト（１１Ａ）を添加し（０．２Ｍアセトニトリル溶液，４当量のジシアノイミダゾール（ＤＣＩ），結合時間３０分）、対応するホスファイトトリエステルを形成した（反応経路７）。次いでこのホスファイトトリエステルを水中０．５ＭのＮａＩＯ₄ で１０分間酸化して、目的のホスフェートトリエステルを形成した。過剰の酸化剤を水、続いてアセトニトリルによる洗浄により除去した。標準的ヨウ素酸化プロトコールを用いてジエン部分を分解した。オリゴヌクレオチドを固体支持体から開裂させ、標準的条件下で脱保護した。粗製の脱保護オリゴヌクレオチドのアニオン交換分析で、全長オリゴヌクレオチド−５’−ジエン４５％であることが示された。この粗製オリゴヌクレオチド−５’−ジエンを、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ＰＲＰ−１カラムで臭化テトラブチルアンモニウム／アセトニトリル濃度勾配を用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。精製オリゴヌクレオチドをプールし、ＰＲＰ−１カラムでテトラブチルアンモニウム塩をナトリウムに交換し、過剰のナトリウムを水洗により除去し、オリゴヌクレオチドのナトリウム塩を約５０％アセトニトリルで溶離した。次いで精製オリゴヌクレオチド（１２）を凍結乾燥して白色粉末を得た。この物質はアニオン交換ＨＰＬＣによる純度９０％であった（ディオネックス・ヌクレオパック（ＤｉｏｎｅｘＮｕｃｌｅｏｐａｋ）強力アニオン交換カラム、トリス／塩化ナトリウム濃度勾配、８５℃）。この物質を質量分析（エレクトロスプレー）により分析した。予想質量＝８７９６；測定質量＝８７９６。５Ｋポリエチレングリコールのコンジュゲーション凍結乾燥オリゴヌクレオチド−５’−ジエン（１２）を２５ｍＭホスフェートに溶解した（ｐＨ＝６．８，８μＭ，約７４ｍｇ／ｍＬ）。この溶液に２当量のモノメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（１３ａ）（分子量＝５，０００，シアウォーター・ポリマーズ（ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ））を添加した（反応経路７）。２５℃で１８時間後、ジエン標識オリゴヌクレオチドはすべてマレイミド−ＰＥＧと結合して、５ＫＰＥＧディールス−アルダー生成物（１４）が得られた。生成物を逆相クロマトグラフィーにより単離した（図４および５参照）。同様にして製造した、５’−ジエン標識のないオリゴヌクレオチド試料は、マレイミドＰＥＧに結合しなかった。アセトニトリルをディールス−アルダー反応に添加すると、コンジュゲーション速度が低下した。アセトニトリル１０％の添加により、水のみの中での数値のほぼ半分に速度が低下した。したがってこれらのオリゴ−５’−ジエンは、水性溶液中では小型の非荷電ジエンと同様な反応性で行動する。２０Ｋポリエチレングリコールのコンジュゲーション凍結乾燥オリゴヌクレオチド−５’−ジエン（１２）を２５ｍＭホスフェートに溶解した（ｐＨ＝６．８，５μＭ，約５５ｍｇ／ｍＬ）。この溶液に２当量のモノメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（１３ａ）（分子量＝２０，０００，シアウォーター・ポリマーズ）を添加した（反応経路７）。２５℃で１８時間後、ジエン標識オリゴヌクレオチドはすべてマレイミド−ＰＥＧと結合して、２０ＫＰＥＧディールス−アルダー生成物（１５）が得られた。生成物を逆相クロマトグラフィーにより単離した。実施例５．オリゴヌクレオチド−５’−ジエン（１２）と１，６−ビスマレイミドヘキサンのコンジュゲーション反応経路８オリゴヌクレオチド（１２）の溶液を１，６−ビスマレイミドヘキサン（１６）（パース）により２５℃で処理した（反応経路８）。１６時間後、二量体コンジユゲート（１７）が約８０％（マレイミド基準）の収率で生成し、得られたモノコンジュゲートはごく少量であった。二量体生成物をアニオン交換クロマトグラフィーにより単離し、質量分析（エレクトロスプレー）により分析した。予想質量＝１７８７２；測定質量＝１７８７３。Ｎ−エチルマレイミドとのディールス−アルダー付加物も製造した。要約すると、Ｎ−エチルマレイミド２当量をオリゴヌクレオチド−５’−ジエン（１２）の水溶液に２５℃で添加した。４時間後、反応が完了した。生成物をアニオン交換クロマトグラフィーにより単離し、質量分析（エレクトロスプレー）により分析した。予想質量＝８２９１；測定質量＝８９２２。実施例６．２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−Ｏ−チミジンホスフェートの製造ＤＭＴ−アンヒドロウリジンはＭｇ（Ｒ）₂(Ｒ＝アルコキシ)と反応して２’ −置換ヌクレオシドを形成することが知られている。後記のようにこの化学を利用して、２’−位がジエンで置換されたヌクレオシドを製造できる。次いでこの２’−置換ヌクレオシドをヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に取り込ませることができる。これを２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’− Ｏ−（５’−Ｏ−アセチルチミジン）ホスフェート（２４）の溶液相合成により証明する（反応経路９）。反応経路９５’−Ｏ−ＤＭＴ−アンヒドロウリジン（２０）の製造１Ｌの丸底フラスコ中へアンヒドロウリジン（２２．６７ｇ，１００ｍｍｏｌ）、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（３３．３４ｇ，１．１当量）およびＤＭＡＰ（１．０ｇ，触媒量）を秤量した。撹拌バーを加え、フラスコを隔壁シールし、アルゴンでフラッシした。次いでフラスコにピリジン（３００ｍＬ）を入れ、混合物を７２時間撹拌した。真空中でピリジンを除去し、残留する油をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）に溶解し、２．５％ＮａＨＣＯ₃（１００ｍＬで２回）およびブライン（１００ｍＬで１回）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、ろ過し、溶媒を除去すると黄色の油が得られた。この油をシリカカラム（１：１ＥｔＯＡｃ／ヘキサン，１％ジイソプロピルエチルアミン）で精製して５’−Ｏ−ＤＭＴ−アンヒドロウリジン（２０）（２４．２１ｇ，４５．７％）を得た。これは¹ＨＮＭＲで不純物を含有しなかった。５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン（２１）の製造２５０ｍＬの丸底フラスコに２，４−ヘキサジエン−１−オール(１８)（３７．３１ｇ，３８０．ｌｍｍｏｌ）を入れ、フラスコをシールし、アルゴンパージした。次いでフラスコに１．１ｍｍｏｌ／ｍＬメタノール性Ｍｇ（ＯＭｅ）₂ （７５ｍＬ，８２．５ｍｍｏ１）を入れ、１時間撹拌した。メタノールを真空中で除去し、続いてトルエンと共蒸発させると赤色の油（１９）が得られた。５’ −Ｏ−ＤＭＴ−アンヒドロウリジン（２０）（１１．３０ｇ，２１．３４ｍｍｏｌ）をフラスコに添加し、続いてアルゴンパージし、１００℃に加温した。次いでフラスコにＤＭＦ（８０ｍＬ）を入れ、４時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（５００ｍＬ）に注入し、５％塩化アンモニウム（１００ｍＬで２回）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬで１回）およびブライン（１００ｍＬで１回）で洗浄した。水相を酢酸エチル（１００ｍＬで３回）で逆抽出した。有機相を合わせてＭｇＳＯ₄で乾燥させ、ろ過し、溶媒を真空中で除去した。橙褐色の油をシリカ上で、ヘキサン中０％、２０％、５０％、７０％濃度勾配の酢酸エチルによりクロマトグラフィー処理して、生成物(２１)１０．０５ｇ(７５％) を得た。これは¹ＨＮＭＲで純粋であった。５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−Ｏ− シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホルアミダイト(２２)の製造隔壁シールし、アルゴンパージした２５０ｍＬの丸底フラスコに、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン（２８）（３．００ｇ，４．８０ｍｍｏｌ）を入れた。フラスコに塩化メチレン（２５ｍＬ）、ＤｉＰＥＡ（５．８５ｍＬ，７当量）およびシアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（２．１４ｍＬ，２当量）を入れた。反応混合物を４５分間撹拌した。次いで反応混合物を２．５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（５０ｍＬで２回）およびブライン（５０ｍＬで１回）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、ろ過し、溶媒を真空中で除去した。黄色の油をシリカおよび１：１ＥｔＯＡｃ／ヘキサンによりクロマトグラフィー処理して、３．１４ｇ（８０％）の５’−Ｏ−ＤＭＴ −２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−Ｏ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホルアミダイト（２２）を得た。これは¹ＨＮＭＲで純粋であった。２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−Ｏ−（５’−Ｏ−アセチルチミジン）シアノエチルホスフェート（２３）の製造撹拌バー付きの２５０ｍＬ丸底フラスコに、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−Ｏ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホルアミダイト（２２）（２．１８ｇ，２．６４ｍｍｏｌ）および３’−Ｏ−アセチルチミジン（０．７５２３ｇ，２．６５ｍｍｏｌ）を入れた。フラスコにＡＣＮ中０．５Ｍテトラゾール（２５ｍＬ，４．５当量）を撹拌しながら入れた。反応物を２５分間撹拌し、次いで２．５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（５０ｍＬで２回）およびブライン（５０ｍＬで１回）で洗浄した。得られた湿った油をＡＣＮ（３０ｍＬ）に入れ、０．５ＭＮａＩＯ₄水溶液（１３ｍＬ，２．５当量）で処理した。混合物を１０分間撹拌し、次いでＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に注入した後、水（５０ｍＬで２回）およびブライン（５０ｍＬで１回）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、ろ過し、溶媒を除去すると、白色固体が得られた。この固体をＡｃＯＨ／Ｈ₂Ｏ（４：１）に溶解し、１時間撹拌した。酸および水を真空中で除去した。この油をＭｅＣｌ₂に溶解し、エーテルで沈殿させた。次いで固体をろ過採集した。上清につきさらに２回の沈殿処理を行った。固体をシリカ上で精製して（ＭｅＣｌ₂中７％ＭｅＯＨ）、１．５６ｇ（８１．９％）の２’−Ｏ− （２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−Ｏ−（５’−Ｏ−アセチルチミジン）シアノエチルホスフェート（２３）を得た。これは¹ＨＮＭＲで純粋であった。２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−Ｏ−（５’−Ｏ−アセチルチミジン）ホスフェート（２４）の製造２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−Ｏ−（５’−Ｏ−アセチルチミジン）シアノエチルホスフェート（２３）（１．３６ｇ，１．８９ｍｍｏｌ）を、穏やかに加熱しながらＥｔＯＨ（４０ｍＬ）に溶解した。この溶液を、テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ、登録商標）内張りキャップ付きの２５０ｍＬパイレックス（Ｐｙｒｅｘ、登録商標）スクリューキャップボトルに移した。濃水酸化アンモニウム（１５０ｍＬ）を添加し、再びキャップをし、ボトルを激しく振とうし、初期圧力を放出した。次いでボトルのキャップを再び閉めた後、３７℃に保温した振とう機に入れた。混合物を４．５時間振とうした。溶媒を真空中で除去し、泡状物をＨ₂Ｏ／ＭｅＯＨ（１：１）に溶解し、ＡＣＮにより−２０℃で一夜沈殿させて、白色結晶質の２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３ ’−Ｏ−（５’−Ｏ−アセチルチミジン）ホスフェート（２４）を得た。これは¹ ＨＮＭＲで純粋であり、アセトアミドの混入はなかった。実施例７．２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−チミジンホスフェートと３，５−ビスマレイミド安息香酸ナトリウムの二量体化反応経路１０２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−チミジンホスフェート（２４）（２０．１ｍｇ，０．０３１ｍｍｏｌ）を３，５−ビスマレイミド安息香酸ナトリウム（２５）（４．９ｍｇ，０．５当量）と共にスクリューキャップ付きバイアルに入れ、混合物を１ｍＬのＤ₂Ｏに溶解した（反応経路１０）。¹ＨＮＭＲおよびＨＰＬＣ分析（実施例８の記載と同様に実施）で、二量体化２’− Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−チミジンホスフェート（２６）に完全に変換したことが示された。実施例８．２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−チミジンホスフェートと４−マレイミド安息香酸ナトリウムのディールス−アルダー反応反応経路１１２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−チミジンホスフェート（２４）（２１．５ｍｇ，０．０３３４ｍｍｏｌ）を４−マレイミド安息香酸ナトリウム（２７）（８２．５ｍｇ，１０当量）と共にスクリューキャップ付きバイアル中へ秤量し、１ｍＬのＤ₂Ｏに溶解した。２００μＬを３０分間にわたって定期的にサンプリングし、アセトニトリル−ｄ₃で６００μＬに希釈した。ＨＰＬＣまたは¹ＨＮＭＲで分析するまで、反応物を０℃に保存した。分析用ウオーターズ・デルタパック（ＷａｔｅｒｓＤｅｌｔａＰａｋ）Ｃ−１８カラムを備えたバイオキャッド（ＢｉｏＣａｄ）６０計器で、１００ｍＭトリエチルアミン／酢酸緩衝液（ｐＨ＝７）中０〜１５％アセトニトリル濃度勾配により、６カラム容量以上を流してＨＰＬＣ分析を行った。２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン（２９）（モノマー）と４−マレイミド安息香酸ナトリウム（２７）の反応を同一反応条件で実施して、ディールス−アルダー付加環化生成物（３０）を得た。実施例９．２’−ヘキサジエンを含む二量体オリゴヌクレオチドへの蛍光性検出体のコンジュゲーション実施例９（反応経路１２〜１５）はオリゴヌクレオチド−５’−ジエンと種々の蛍光性検出体とのコンジュゲーションを示す。４’−マレイミドフェニルブチルアミドコンジュゲートしたフルオレセイン（３３）の製造反応経路１２フルオレセインは生物学的に重要な化合物の蛍光標識として慣用される。市販のアミン誘導体化フルオレセイン（濃い暗紅色の固体）であるフルオレスカミン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）（３２）（反応経路１２）を、マレイミドフェニルブタン酸に結合させた。このマレイミド酸の酸塩化物（３１）によりアミドリシスを行った。反応は円滑であり、次いでカラムクロマトグラフィーにより比較的容易に分離され、明るい橙色の固体（３３）が得られた。オリゴヌクレオチド−５’−ジエン（１２）と化合物（３３）のディールス−アルダー反応反応経路１３約２当量の化合物（３３）をオリゴヌクレオチド−５’−ジエン（１２）の水溶液に２５℃で添加した。２０時間後、反応が完了した。生成物（３４）を逆相クロマトグラフィーにより単離した。２’−Ｏ−（２，４−ヘキサジエン）ウリジン−３’−Ｏ−（５’−Ｏ−アセチルチミジン）ホスフェート（２４）と化合物（３３）のディールス−アルダー反応反応経路１４化合物（２４）（１０．２ｍｇ，１５．９μｍｏｌ）をスクリューキャップ付きバイアル中へ秤量し、８００μＬのＨ２０に溶解した。４’−マレイミドフェニルブチルアミドコンジュゲートしたフルオレセイン（３３）（３７．３ｍｇ，６３．４μｍｏｌ）を８００μＬのｉＰｒＯＨに溶解した。次いで２００μＬのフルオレセイン−コンジュゲート溶液を、２’−ヘキサジエンを含む二量体オリゴヌクレオチド溶液に添加して、ディールス−アルダーコンジュゲート（３５）を得た。１：１Ｈ₂Ｏ／ｉＰｒＯＨで５００μＬに希釈した反応混合物の試料１００μＬのＨＰＬＣ分析により、反応混合物を監視した。オリゴヌクレオチド−５’−ジエン（１２）とクマリンマレイミド誘導体（３６）のディールス−アルダー反応反応経路１５約１．３当量のクマリンマレイミド誘導体である化合物(３６)（アル・ドリッチ・ケミカル）をオリゴヌクレオチド−５’−ジエン（１２）の水溶液に３５℃で添加した。６０時間後、反応が完了した。生成物（３７）をアニオン交換クロマトグラフィーにより単離し（約９０％の収率）、質量分析（エレクトロスプレー）により分析した。予想質量＝９０９６；測定質量＝９０９７。実施例１０．オリゴヌクレオチド−５’−ジエン（１２）へのビオチンマレイミドのコンジュゲーション反応経路１６約２当量のビオチンマレイミド(３８)をオリゴヌクレオチド−５’−ジエン(１２)の水溶液に３５℃で添加した。１８時間後、反応が完了した。生成物（３９）をアニオン交換クロマトグラフィーにより単離し（約９０％の収率）、質量分析（エレクトロスプレー）により分析した。子想質量＝９３３２；測定質量＝９３３３。実施例１１．リポソーム固定のための、ジエンを含む脂質へのジエノフィルを含むオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションジエン単位を含むリン脂質を用いてオリゴヌクレオチドをリポソームの脂質二重層にオリゴヌクレオチドを固定できる。リノール酸などの脂質を酸性条件下で異性体化して、対応する共役ジエン誘導体にする。この誘導体を次いで対応するリン脂質に変換する。このリン脂質を水性環境でジエノフィルと反応させて、付加環化により付加物を形成する。リポソーム中でのリン脂質の配向性のため、付加物は脂質二重層内に位置する（米国特許出願第０８／４３４，４６５号、１９９５年５月４日出願、表題“核酸リガンド複合体＃参照、これを本明細書に援用する）。マレイミド誘導体化したオリゴヌクレオチドをジエン含有リン脂質で処理すると、ディールス−アルダー反応により形成される脂質オリゴヌクレオチドコンジュゲートが形成される。実施例１２．オリゴヌクレオチドの多量体化反応経路１７トリス（２−マレイミドエチル）アミン（ＴＲＥＭ）の合成無水マレイン酸（４２，５．００ｇ，５０．９ｍｍｏｌ）を、ＭｅＣｌ₂（５０ｍＬ）中におけるトリス（２−アミノエチル）アミン（４３，２．０２ｍＬ，０．８０当量）の溶液に添加した。２分後、白色固体が沈殿し始めた。反応物を室温でさらに２時間撹拌した。白色固体をろ過分離したところ、ＮＭＲによりＴＲＥＮのトリマレイン酸付加物（４４）であることが明らかになった。Ａｃ₂Ｏ中のＮａＯＡｃを用いて１００℃で３時間、閉環反応させた。反応混合物を水で急冷し、酢酸を真空中で除去し、生成物を高真空中で乾燥させた。次いで主生成物をビオタージ・フラッシュ（ＢｉｏｔａｇｅＦｌａｓｈ）４０で精製して（ヘキサン中５％酢酸エチル）、黄色固体を得た。これはトリス（２−マレイミドエチル）アンモニウムアセテート（４５，ＴＲＥＭ）と一致する¹ＨＮＭＲを示した。オリゴヌクレオチド三量体（４６）の合成５’−ヘキサジエンホスフェート１２（Ｎａ₂ＰＯ₄中０．００７５Ｍ，ｐＨ６．８）およびＴＲＥＭ（アセトン中０．０１１Ｍ）の原液を調製した。５’−ヘキサジエンホスフェート１２（２００μＬ，１．５μｍｏｌ）をＴＲＥＭ（４５，２２．３μＬ，０．３μｍｏｌ）と共にスクリューキャップ付きバイアルに添加した。反応混合物を２４時間振とうした時点で、試料を採取した。試料をＨＰＬＣで分析した（ディオネックスＤＮＡカラム、３．１ｍＬ容；３６〜７８％緩衝液Ｂ１６カラム容量以上；緩衝液Ａ：２５ｍＭトリズマ（Ｔｒｉｚｍａ），１ｍＭＥＤＴＡ，Ｈ₂Ｏ中１０％ＡＣＮ；緩衝液Ｂ：緩衝液Ａと同じ＋１ＭＮａＣｌ）。三量体（４６）の画分を採集し、質量分析により解析した。予想質量＝２６７７７；測定質量＝２６７９３；予想誤差±３％以内。実施例１３．１，３−付加環化によるバイオコンジュゲーション反応経路１８３ｍＬのバイアル中へＡＺＴ（４７）（１０ｍｇ，３７．４μｍｏｌ）を秤量し、次いでこれを０．８ｍＬの０．０５ＭＮａ₃ＨＰＯ₄（ｐＨ１２）に溶解した。Ｎ−エチルマレイミド（９．４ｍｇ，７５μｍｏｌ）を別個のバイアル中へ秤量し、エタノール１ｍＬに溶解した。ＡＺＴを含むバイアルにＮ−エチルマレイミド溶液０．２ｍＬを入れた。バイアルにキャップをし、５分間十分に振とうし、次いで４５℃で３時間反応させて、化合物（４８）を得た。反応混合物１００μＬアリコートを７００μＬに希釈し、十分に混合し、ＨＰＬＣにより分析した（ジュピター（Ｊｕｐｉｔｅｒ）Ｃ−１８カラム、１００ｍＭトリエチルアミン／酢酸（ｐＨ７）緩衝液中２〜４０％アセトニトリル、７カラム容量以上）。実施例１４．ジエン修飾アミノ酸の製造反応経路１９に、完全保護されたジエン修飾アミノ酸（４９）および（５０）の合成を示す。反応経路１９実施例１５．オリゴヌクレオチドの“ヘテロ二量体＃の形成反応経路２０に、１より多い官能化部位をもつ２高分子相互のヘテロ二量体化を示す。これにより架橋生成物を生じる。反応経路２０反応経路２１に、第１オリゴヌクレオチドが１より多い官能化部位をもち、第２オリゴヌクレオチドが１個のみの官能化部位をもつ２オリゴヌクレオチドのヘテロ二量体化を示す。この場合、分枝オリゴヌクレオチド生成物を生じる。反応経路２１反応経路２２に、それぞれ１個のみの官能化部位をもつ２オリゴヌクレオチドのヘテロ二量体化を示す。反応経路２２実施例１６．エン反応によるバイオコンジュゲーション５’−エンホスホルアミダイトの合成反応経路２３に示したようにエンオリゴヌクレオチドを製造する。反応経路２３エン付加環化反応エン誘導体化オリゴヌクレオチド（５１）を室温で水中においてＰＥＧ−マレイミド（５２）により処理すると、バイオコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド（５２）が得られる。反応経路２４実施例１７．［４＋３］付加環化によるバイオコンジュゲーションフラン誘導体化オリゴヌクレオチドの製造反応経路２５に示したようにフラン誘導体化オリゴヌクレオチドを製造する。反応経路２５［４＋３］付加環化反応フラン誘導体化オリゴヌクレオチド（５４）を室温で水およびトリエチルアミン中において化合物（５５）により処理すると、誘導体化したオリゴヌクレオチド（５６）が得られる（Ｌｕｂｉｎｅａｕら（１９９７）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３８：８０３１）。反応経路２６式中、Ｒは任意の基（たとえばＰＥＧ）実施例１８．プロドラッグライブラリー調製へのバイオコンジュゲーションの利用反応経路２７および２８に、プロドラッグライブラリーの調製への本発明方法の利用を示す。反応経路２７反応経路２８実施例１９．検出体、樹脂またはチップへのコンジュゲーションのための５’− ジエンを含む転写体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ重合を５’−（３，５−ヘキサジエン）グアノシン（５７）を用いて開始すると、５’−ジエン修飾オリゴヌクレオチド（５８）が得られる（反応経路２９）。反応経路２９これらのオリゴヌクレオチド（５８）をジエノフィル前駆物質で誘導体化したウェーハ（６０）と反応させることにより、ウェーハ上の特定の位置に固定する（反応経路３０）。ウラゾール類が、対応する著しく活性なトリアゾリンジオン類の前駆物質としてしばしば用いられる。ウラゾール類からトリアゾリンジオン類への変換は、次亜塩素酸ｔ−ブチルなどの酸化剤を用いる酸化により達成されるが、光酸化によっても達成できる。反応経路３０

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０８Ｇ 65/329 Ｃ０８Ｇ 65/329 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者イートン，ブルースアメリカ合衆国コロラド州80301，ボールダー，サヴァンナ・コート 3996 (72)発明者マクギー，ダニーアメリカ合衆国カリフォルニア州94401, サン・マテオ，サウス・グラント・ストリート 20 (72)発明者ヴェイグル，カートアメリカ合衆国コロラド州80501，ロングモント，ゲイ・ストリート 1118 (72)発明者ゴールド，ラリーアメリカ合衆国コロラド州80301，ボールダー，フィフス・ストリート 3055 (72)発明者スティーヴンズ，アンドリューアメリカ合衆国コロラド州80302，ボールダー，ケリー・ロード・ウエスト 740

Claims

【特許請求の範囲】１．誘導体化した高分子を、誘導体化した該高分子と付加環化反応により反応しうる誘導体化した分子体と反応させる工程を含む、高分子のバイオコンジュゲーション方法。２．付加環化反応がディールス−アルダー反応、１，３−双極子付加環化反応、［２＋２］付加環化反応、ケテン付加環化反応およびエン付加環化反応よりなる群から選択される、請求項１記載の方法。３．高分子が、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、脂質、ホルモン、薬物またはプロドラッグよりなる群から選択される、請求項１記載の方法。４．分子体が、高分子、抗体、ポリマー、樹脂、非免疫原性高分子量化合物および診断用検出体分子よりなる群から選択される、請求項１記載の方法。５．診断用検出体分子が、蛍光性、化学発光性、放射性同位体および生物発光性のマーカー化合物、抗体ならびにビオチンよりなる群から選択される、請求項４記載の方法。６．診断用検出体分子が、ジエノフィル誘導体化されたフルオレセイン、クマリンおよび金属キレート化剤よりなる群から選択される、請求項４記載の方法。７．ジエノフィルがマレイミドである、請求項６記載の方法。８．ポリマーがポリエチレングリコールまたはポリスチレンから選択される、請求項４記載の方法。９．高分子がジエン、ジエノフィルおよび１，３−ジポラロフィルよりなる群から選択される部分で誘導体化される、請求項１記載の方法。１０．分子体がジエン、ジエノフィルおよび１，３−ジポラロフィルよりなる群から選択される基で誘導体化される、請求項１記載の方法。１１．誘導体化された高分子がオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の方法。１２．誘導体化されたオリゴヌクレオチドが、下記構造式の化合物群：（これらの式中、Ｂは核酸塩基であり；ＡおよびＡ’は糖の２’−置換基であり；Ｗは独立して、１〜１０００個の核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドまたはＨよりなる群から選択され；Ｘはジエン、ジエノフィル、１，３−ジポラロフィル、１，３−双極子、または付加環化反応を行うことができる他の部分であり、さらにＸが核酸塩基Ｂに結合している場合、Ｘは炭素原子、環外窒素または環外酸素に結合していてもよい）から選択される、請求項１１記載の方法。１３．ＡおよびＡ’が独立して、Ｈ、²Ｈ、³Ｈ、ＣＬＦ、ＯＨ、ＮＨＯＲ¹ 、ＮＨＯＲ³、ＮＨＮＨＲ³、ＮＨＲ³、＝ＮＨ、ＣＨＣＮ、ＣＨＣｌ₂、ＳＨ、ＳＲ³、ＣＦＨ₂、ＣＦ₂Ｈ、ＣＲ² ₂ＢｒＮ−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_nＯＣＨ₃、ＯＲ⁴およびイミダゾールよりなる群から選択され；Ｒ¹が、Ｈおよびアルコール保護基よりなる群から選択され；Ｒ²が、＝Ｏ、＝Ｓ、Ｈ、ＯＨ、ＣＣｌ₃、ＣＦ₃、ハライド、所望により置換されたＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル（環式、直鎖および分枝鎖を含む）、アルケニル、アリール、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アシル、ベンゾイル、ＯＲ⁴およびエステルよりなる群から選択され；Ｒ³が、Ｒ²、Ｒ⁴、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｓ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｏ）ＣＦ₃、ＳＯ₂ Ｒ⁴、アミノ酸、ペプチド、およびその混合物よりなる群から選択され；Ｒ⁴が、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソブロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択され；Ｘが、共役ジエン単位を含むアルキル基または置換アルキル基、共役ジエン単位を含むアルコキシ基または置換アルコキシ基、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、マレイミド置換アルコキシ基、ジエノフィル置換アルコキシ基、アルコキシ基、共役ジエン単位を含むアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、マレイミド置換されたアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、ジエノフィル部分を含むアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基よりなる群から選択される、請求項１２記載の方法。１４．Ａが、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃｌ、Ｆ、ＮＨＯＲ³、ＯＲ⁴およびＯＳｉＲ⁴ ₃ よりなる群から選択される、請求項１３記載の方法。１５．付加環化反応がディールス−アルダー反応である、請求項１記載の方法。１６．下記構造式の化合物群から選択される、誘導体化されたオリゴヌクレオチド： (これらの式中、Ｂは核酸塩基であり；ＡおよびＡ’は糖の２’−置換基であり；Ｗは独立して、１〜１０００個の核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドまたはＨよりなる群から選択され；Ｘはジエン、ジエノフィル、１，３−ジポラロフィル、１，３−双極子、または付加環化反応を行うことができる他の部分であり、さらにＸが核酸塩基Ｂに結合している場合、Ｘは炭素原子、環外窒素または環外酸素に結合していてもよい )。１７．ＡおよびＡ’が独立して、Ｈ、²Ｈ、³Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨＯＲ¹ 、ＮＨＯＲ³、ＮＨＮＨＲ³、ＮＨＲ³、＝ＮＨ、ＣＨＣＮ、ＣＨＣｌ₂、ＳＨ、ＳＲ³、ＣＦＨ₂、ＣＦ₂Ｈ、ＣＲ² ₂Ｂｒ、−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_nＯＣＨ₃、ＯＲ⁴およびイミダゾールよりなる群から選択され；Ｒ¹が、Ｈおよびアルコール保護基よりなる群から選択され；Ｒ²が、＝Ｏ、＝Ｓ、Ｈ、ＯＨ、ＣＣｌ₃、ＣＦ₃、ハライド、所望により置換されたＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル（環式、直鎖および分枝鎖を含む）、アルケニル、アリール、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アシル、ベンゾイル、ＯＲ⁴およびエステルよりなる群から選択され；Ｒ³が、Ｒ²、Ｒ⁴、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｓ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｏ）ＣＦ₃、ＳＯ₂ Ｒ⁴、アミノ酸、ペプチド、およびその混合物よりなる群から選択され；Ｒ⁴が、所望により置換された炭化水素（Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₂₀アルキニル）、所望により置換された複素環、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ヌクレオシド、炭水化物、蛍光標識およびホスフェートよりなる群から選択され；Ｘが、共役ジエン単位を含むアルキル基または置換アルキル基、共役ジエン単位を含むアルコキシ基または置換アルコキシ基、ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−、マレイミド置換アルコキシ基、ジエノフィル置換アルコキシ基、アルコキシ基、共役ジエン単位を含むアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、マレイミド置換されたアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基、ジエノフィル部分を含むアルキルアミノ基または置換アルキルアミノ基よりなる群から選択される、請求項１６記載の誘導体化されたオリゴヌクレオチド。１８．Ａが、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃｌ、Ｆ、ＮＨＯＲ³、ＯＲ⁴およびＯＳｉＲ⁴ ₃ よりなる群から選択される、請求項１７記載の誘導体化されたオリゴヌクレオチド。１９．下記よりなる群から選択される、請求項１６記載の誘導体化されたオリゴヌクレオチド：２０．請求項１記載の方法で形成されたバイオコンジュゲーション生成物。２１．下記よりなる群から選択される、請求項２０記載のバイオコンジュゲーション生成物：２２．下記よりなる群から選択される化合物：（式中、Ｐｒｏｔはアルコール保護基である）。