JP6574754B2 - エストロゲン受容体関連疾患を処置するための抗体及び方法 - Google Patents

エストロゲン受容体関連疾患を処置するための抗体及び方法

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１９日に出願されたＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０７２８４４の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、エストロゲン受容体関連疾患を予防、処置及び／又は診断するための抗体、医薬組成物、およびその方法に関する。
エストロゲンは、ヒトの体における多くの重大な生理機能に関わっている一群のホルモンである。エストロゲンの機能としては、女性生殖器を発達させること、妊娠及び出産後の授乳のために、乳房及び子宮を準備することが挙げられる。エストロゲンは、適切な心血管機能及び骨密度の維持においても重要な役割を果たす。エストロゲンは細胞増殖を刺激することが公知で、女性ががん、特に乳がん及び子宮がんを発症するリスクを高め得る。
エストロゲンは、標的細胞中／又は標的細胞上でエストロゲン受容体と結合し、細胞機能を調節する。ヒト細胞において２つの型のエストロゲン受容体が発見されており（ｈＥＲ）、ｈＥＲ−α及びｈＥＲ−βである。ｈＥＲ−α及びｈＥＲ−βは共通のタンパク質構造を共有し、それぞれが、別個ではあるが相互作用する３つの機能的なドメイン、すなわち、Ｎ末端ドメイン（Ａ／Ｂドメイン）、中心部のＤＮＡ結合ドメイン（Ｃドメイン）、及びＣ末端のリガンド結合ドメイン（Ｄ／Ｅ／Ｆドメイン）を有する。Ｎ末端ドメインは、リガンド非依存性の活性化機能（ＡＦ−１）を有し、ＡＦ−１は、活性化補助因子との相互作用、及び、リガンドの非存在下における標的遺伝子の転写活性化に関わっている。ＤＮＡ結合ドメインは、受容体二量体化及び特異的ＤＮＡ配列の結合において重要な役割を果たす。Ｃ末端のリガンド結合ドメインは、リガンドの結合を媒介し、リガンド依存性のトランス活性化機能（ＡＦ−２）を有し、リガンドの存在下における遺伝子転写を活性化する。
完全長のｈＥＲ−αは、６６ｋＤａのタンパク質として同定されており、ｈＥＲ−α６６と呼ばれた。ｈＥＲ−α６６は、３つの機能ドメイン全てを含有する。ｈＥＲ−α６６のスプライスバリアントが後に発見され、ｈＥＲ−α４６と命名された。ｈＥＲ−α４６は、分子量が約４６ＫＤａであり、ｈＥＲ−α６６のＮ末端のＡＦ−１ドメインを欠いている。近年、新規の３６ｋＤａのｈＥＲ−αバリアントであるｈＥＲ−α３６が同定された。ｈＥＲ−α３６は、ｈＥＲ−α６６のＮ末端のＡＦ−１ドメイン及びＣ末端のＡＦ−２ドメインを欠いている（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３６、１０２３〜１０２７（２００５））。
ｈＥＲ−α６６は、その標的遺伝子の転写活性化を介して、エストロゲン刺激性細胞増殖を媒介すると考えられている。エストロゲンがｈＥＲ−α６６と結合すると、ｈＥＲ−α６６のトランス活性化ドメインが活性化され、そのため下流の標的遺伝子の発現が刺激され、最終的に細胞増殖が導かれる。ｈＥＲ−α４６は、膜開始性及びエストロゲン刺激性の急速なＮＯ合成を媒介することが見出された（Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：４８０７〜４８１２（２００３））。ｈＥＲ−α４６は、ＡＦ−１ドメインを欠いており、ｈＥＲ−α６６のＡＦ−１活性を阻害することも示された（Ｆｌｏｕｒｉｏｔ、Ｇ．、ＥＭＢＯ、１９、４６８８〜４７００（２０００））。ｈＥＲ−α３６は、ＡＦ−１とＡＦ−２転写活性化ドメインの両方を欠くことから、ｈＥＲ−α及びｈＥＲ−βのＡＦ−１とＡＦ−２機能の両方を阻害する、ｈＥＲ−α６６及びｈＥＲ−βのドミナントネガティブ阻害因子として機能する。加えて、ｈＥＲ−α３６は、主として原形質膜上に局在化しており、細胞増殖を刺激する膜開始性の分裂促進エストロゲンシグナル伝達を媒介する。（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３６、１０２３〜１０２７（２００５）；Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：９０６３〜９０６８（２００６））。
広範な研究から、エストロゲンシグナル伝達は、古典的な核の転写活性化経路並びに非古典的な膜開始性のシグナル伝達経路を介して媒介されることが示されている。ｈＥＲ−α６６及びｈＥＲ−α４６は主として核において機能するが、ｈＥＲ−α３６は主に核の外部を通して機能するものと思われる。
ｈＥＲ−α３６は元のｈＥＲ−α６６のリガンド結合ドメインのヘリックス８〜１２を欠いており、そのことがｈＥＲ−α３６のリガンド結合特異性をまったく別のものにしていることも示された。したがって、ｈＥＲ−α３６は、ｈＥＲ−α６６及びｈＥＲ−βとは異なるリガンドと結合し得る。
エストロゲン及びエストロゲン受容体に関係する疾患は多くの個体に影響を与え続けていることから、新規の抗体などの新規のアプローチ、並びに、そのような疾患を予防、処置及び／又は診断するのに有用な方法を発見する切迫した必要性が依然として存在する。
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は一般に長い間研究開発中である。抗体及び毒物のそれら単独に比べて、ＡＤＣにより、標的細胞、組織及び腫瘍への薬物及び他の薬剤の送達が改善され、高効能及び低毒性が達成される。ＵＳ２０１２１４８６１０では、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ及びｍｃ−ＭＭＡＦのコンジュゲートが開示された。ＷＯ２００７０３８６５８では、ＭＢ−ｖｃ−デュオカルマイシンのコンジュゲートが開示された。ＵＳ２００５１６９９３３では、ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びＳＰＤＢ−ＤＭ４のコンジュゲートが開示された。上の特許の全てが、参照のため本明細書に組み込まれる。
本明細書では、エストロゲン受容体ＥＲ−α３６（配列番号１、遺伝子受託番号ＢＸ６４０９３９）と関連した状態を処置／予防／診断するための、抗体及びその抗原結合性フラグメント及びそれらの改変物、並びに、医薬組成物及び使用方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＥＲ−α３６に特異的に結合するが、ＥＲ−α６６（ＥＲ−α６６アミノ酸配列については図１（ａ））又はＥＲ−α４６（ＥＲ−α４６アミノ酸配列については図１（ｂ））には結合しない。ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントは、Ｎ末端より、配列番号１の２８４から３１０までのアミノ酸残基に、又は配列番号２の１から２７までのアミノ酸残基に特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるＣＤＲを含む、抗体又はその抗原結合性フラグメントが提供される。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号６を含む重鎖可変領域、及び配列番号５を含む軽鎖可変領域を含む。
ある特定の実施形態では、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群から選択されるメンバーを含む軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合性フラグメントが提供される。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５を含む軽鎖可変領域を含む。
ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、
ａ）配列番号９を含む軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号１１を含む軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号１２を含む軽鎖可変領域、及び
ｄ）配列番号１３を含む軽鎖可変領域
からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるメンバーを含む重鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合性フラグメントが提供される。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８を含む重鎖可変領域を含む。
ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、
ａ）配列番号１０を含む軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号１４を含む軽鎖可変領域、及び
ｃ）配列番号１５を含む軽鎖可変領域、
からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群から選択されるＬＣＤＲを含む軽鎖可変領域をさらに含む。
ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号３、配列番号４、及び配列番号５を含む。
ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、
ａ）配列番号９を含む軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号１１を含む軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号１２を含む軽鎖可変領域、及び
ｄ）配列番号１３を含む軽鎖可変領域
からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号１６を含む軽鎖、及び配列番号１８の重鎖を含む。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号２０を含む軽鎖、及び配列番号２２の重鎖を含む。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２８からなる群から選択される軽鎖、並びに配列番号３０、及び配列番号３２からなる群から選択される重鎖を含む。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントが提供され、これらは、配列番号１６を含む軽鎖、及び配列番号１８の重鎖を含む、又は、配列番号２０を含む軽鎖、及び配列番号２２の重鎖を含む、抗体又はその抗原結合性フラグメントが特異的に結合する同一のエピトープに実質的に結合する。
ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２のＳ３、Ｋ８、Ｒ１０、Ｐ１６、Ｋ１７、Ｇ２０、Ｎ２１、Ｋ２２、Ｗ２３、及び／又はＦ２４を含む。
ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２のＧ２０、Ｎ２１、Ｋ２２、Ｗ２３、及び／又はＦ２４を含む。
上の実施形態のいくつかでは、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、ヒト抗体、マウス抗体、標識抗体、二価抗体、又は抗イディオタイプ抗体である。
上の実施形態のいくつかでは、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖダイマー、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）2、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ｄｓダイアボディ、ナノボディ、ドメイン抗体、又は二価ドメイン抗体である。
上の実施形態のいくつかでは、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、免疫グロブリン定常領域をさらに含む。
ある特定の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、λ軽鎖、κ軽鎖、γ１重鎖、γ２重鎖、γ３重鎖、又はγ４重鎖定常領域である。
上の実施形態のいくつかでは、配列番号１に記載のｈＥＲ−α３６に又は配列番号２を含むｈＥＲ−α３６フラグメントに結合する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む複合体。
ある特定の実施形態では、ＥＲ−α３６に特異的に結合し且つ／又はＥＲ−α３６活性を調節する抗体又は抗原結合性フラグメントが提供されている。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＥＲ−α３６と関連した疾患を、処置し、阻害し、低減し又は予防する。例えば、本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントは、腫瘍の成長阻止率に関する機能として腫瘍の成長を阻害し、腫瘍サイズを低下させ、又は腫瘍が特定サイズに成長するのを遅延させる。
ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントは、≦１０００ｐＭのＫDで、ＥＲ−α３６と結合する。これらの実施形態のいくつかでは、抗体又は抗原結合性フラグメントは、≦５００ｐＭのＫDで、他の実施形態では、≦２００ｐＭ、≦１００ｐＭ、≦５０ｐＭ、≦２０ｐＭ、≦１０ｐＭ、又は≦１ｐＭで、ＥＲ−α３６と結合する。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される１種又は複数の抗体又は抗原結合性フラグメントの処置有効量を対象に投与することで、それを必要とする前記対象において、ＥＲ−α３６と関連した疾患を阻害し、処置し、低減し又は予防するための方法が提供されている。ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントは、投与１回当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで（例えば、約１０ｍｇ／ｋｇ又は約５ｍｇ／ｋｇ以下）の用量で投与される。これらの実施形態のいくつかでは、抗体又は抗原結合性フラグメントは、投与１回当たり約１ｍｇ／ｋｇ以下、他の実施形態では、約０．５ｍｇ／ｋｇ以下、及びさらに他の実施形態では、約０．１ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメントに試料を曝露することにより、及び、抗体又は抗原結合性フラグメントと当該試料との結合を決定することにより、ＥＲ−α３６タンパク質の存在又はＥＲ−α３６と関連した疾患の進行／後退を決定するための診断方法が提供されている。例えば、本明細書で開示される１種若しくは複数の抗体又は抗原結合性フラグメントを含む、キットが提供されている。ある特定の実施形態では、キットは、抗体若しくは抗原結合性フラグメントの使用に関する指示書、及び／又はキットの他の構成要素の利用に関する指示書をさらに含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが提供されている。ある特定の他の実施形態では、これらのポリヌクレオチドを含むベクターが提供され、ある特定の他の実施形態では、これらのベクターを含む宿主細胞が提供されている。ある特定の実施形態では、当該ポリヌクレオチドによってコードされている抗体又は抗原結合性フラグメントがベクターから発現する条件下で、これらの宿主細胞を培養することによって、本明細書で開示される１種若しくは複数の抗体又は抗原結合性フラグメントを発現させるための方法が提供されている。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、ベクター中のＣＭＶプロモーターなどのプロモーターと作動可能に結合している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるベクターを含む宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される１種若しくは複数の抗体又は抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物が提供されている。これらの実施形態のいくつかでは、組成物は１種又は複数の薬学的担体をさらに含む。これらの実施形態のいくつかでは、１種又は複数の薬学的担体は、例えば、希釈剤、抗酸化剤、アジュバント、賦形剤、又は無毒性補助物質を含む、１種又は複数の薬学的に許容される担体であってもよい。
ある特定の実施形態では、ＥＲ−α３６と関連した疾患を処置するための医薬の製造における、本明細書で提供される１種又は複数の抗体又は抗原結合性フラグメントの使用。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントを使用してＥＲ−α３６のレベルを測定することを含む、対象においてＥＲ−α３６と関連した状態のステータスを決定する方法が提供されている。
ヒトＥＲのアミノ酸配列を示す図である。図１（ａ）は、ヒトＥＲ−α６６のアミノ酸配列を示す。図１（ｂ）は、ヒトＥＲ−α４６のアミノ酸配列を示す。 精製ＳＮＧｍＢ１抗体のＱＣ結果を示す図である。モノクローナル抗体ＳＮＧｍＢ１（ｍＩｇＧ２ｂ）は、組換えＥＲ−α３６タンパク質を免疫原とするハイブリドーマ技術を用いて生成された。ハイブリドーマは、この遺伝子がクローニングされる前に３回サブクローニングされた。 ＳＮＧｍＢ１の結合特異性を示す図である。「Ｆｃ−ＬＢＤ」は、Ｃ末端の２７アミノ酸を含むＦｃ及びＥＲ−α３６リガンド結合ドメインの融合タンパク質を表し；「Ｆｃ−ＬＢＤ−Ｄ２７」は、Ｃ末端の２７アミノ酸が欠失されているＦｃ−ＬＢＤを表し；「Ｆｃ−ＥＲ６６」は、Ｆｃ及びＥＲ−α６６リガンド結合ドメインの融合タンパク質を表し；「ペプチド」は、ＥＲ−α３６のＦドメインに由来するＣ末端の２７アミノ酸を表し；「ヒトＩｇＧ」は対照ヒトＩｇＧタンパク質を表し；未希釈＝１０μｇ／ｍｌ。 ウエスタンブロットによるＳＮＧｍＢ１の結合特異性を示す図である。以下の溶解物が使用された：１）親ＨＥＫ２９３細胞（「Ｐ」）；２）Ｍｙｃタグを有する、ｐｃＤＮＡ３．１＿ＥＲ−α３６完全長タンパク質をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（「Ｅ」）；３）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（「２３１」）；４）ＭＣＦ−７；５）Ｈｅｃ−１Ａ；６）Ｋ５６２。 ＦＡＣＳ分析により測定された、Ｋ５６２細胞（図５Ａ）、ＭＣＦ７細胞（図５Ｂ）、ＳＫＢＲ３細胞（図５Ｃ）、ＭＨＣＣ９７Ｈ（図５Ｄ）、３Ｔ３誘導性細胞系（図５Ｅ）の細胞表面で発現されたＥＲ−α３６へのＳＮＧｍＢ１の結合を示す図である。ＳＮＧｍＢ１抗体は、ＦＡＣＳアッセイにおいてＫ−５６２への用量依存的結合を示した。マウスＩｇＧ２ｂがアイソタイプ対照として使用された。 ＭＣＦ７由来マンモスフェアへのＳＮＧｍＢ１結合及びＭＣＦ７マンモスフェア形成に対するこの効果の免疫蛍光分析を例示する図である。図６Ａは、蛍光シグナルで示されているようにＳＮＧｍＢ１がＭＣＦ７における膜結合ＥＲ−α３６を検出できることを示す。図６Ｂは、図６Ａの定量化蛍光強度を示す。図６Ｃは、ＳＮＧｍＢ１抗体がＭＣＦ７におけるマンモスフェア形成及び増殖を阻害できることを示す。図６Ｄは、ＳＮＧｍＢ１抗体がＭＣＦ７におけるマンモスフェア形成及び増殖を種々の濃度で阻害できることを示す。 Ｋ−５６２細胞におけるＳＮＧｍＢ１の時間依存的内部移行を示す図である。内部移行％＝（Ｑｎ−Ｑｏ）／（Ｎｎ−Ｑｏ）；Ｑｎ＝消光後特定の時点での試料のＭＦＩ（平均蛍光強度）；Ｎｎ＝消光なし、特定の時点で採取された試料のＭＦＩ；Ｑｏ＝消光後０時間の氷上でのみインキュベートされた試料のＭＦＩ。 ビアコアアッセイのフォーマットを示す図である。試験抗体を捕捉する抗マウスＦＣ ＩｇＧでチップ表面が被覆され、試験抗体との結合の競合を可能にするために、ＧＶ２７ペプチド（すなわち配列番号２）が該表面に注射された。ＩｇＧで被覆されたが試験抗体を含まないチップが対照として使用された。 アラニンスキャニングによるエピトープマッピング結果を示す図である。Ｃ末端の２７アミノ酸を含むＥＲ−α３６に由来する一連の突然変異ペプチドへのＳＮＧｍＢ１の結合が試験された。 ＥＲ−α３６への抗ＥＲａ−３６抗体の結合を示す図である。図１０ＡはＥＲ−α３６へのヒト化抗体ＳＮＧＨＺＤ（Ｃ１Ｌ＋Ｃ６Ｈ）の結合を示し、図１０Ｂはヒト化抗体ＳＮＧＨＺＤ（Ｃ２Ｌ＋Ｃ５Ｈ）の結合を示す。「Ｆｃ−ＬＢＤ」、「Ｆｃ−ＬＢＤ−Ｄ２７」、「Ｆｃ−ＥＲ６６」、「ペプチド」及び「ヒトＩｇＧ」は、図３の記載において定義されたのと同じ薬剤を表す。図１０Ｃから図１０Ｄは、ＥＬＩＳＡアッセイで検出されたように、ハイブリドーマ由来マウスＳＮＧｍＢ１（Ｃ）、キメラＳＮＧｈＢ１（Ｄ）、及びヒト化ＳＮＧＨＺＤが、ＥＲ−α３６への結合をめぐってＳＮＧｍＢ１抗体とそれぞれ競合することを示す。プレートはそれぞれＳＮＧｍＢ１、ＳＮＧｈＢ１及びＳＮＧＨＺＤで被覆され、この後にビオチン化ＧＶ２７ペプチド及び競合抗体（すなわち、異なるエピトープに結合する抗ＥＲａ−３６抗体である抗体１０４ｃ３Ｆ８、抗体ＳＮＧｍＢ１、又は対照ＩｇＧ）の添加が行われた。図１０Ｆは、ＳＮＧｍＢ１の種々のヒト化バリアントが、ＥＲ−α３６への結合をめぐってＳＮＧｍＢ１抗体と競合することを例示する。ＨＺＤ−Ｂ１は、ＳＮＧｍＢ１のヒト化バリアントを表し、ＨＢＤ−Ｆ８はヒト化１０４ｃ３Ｆ８を表し、ＨＢＤ−Ｂ１はハイブリドーマ作製ＳＮＧｍＢ１を表し、マウスＩｇＧは陰性対照抗体を表す。 ＳＮＧｍＢ１抗体による免疫組織化学アッセイを用いて検出された、ヒト組織試料中の浸潤先進部（Ａ）及びリンパ行性転移（Ｂ）におけるＥＲ−α３６の発現を示す図である。 ＳＮＧｍＢ１が、ＢＣＡＰ３７異種移植マウスモデルにおいて腫瘍細胞増殖を用量依存的様式で阻害したことを示す図である。 式（ＶＩＩ）としてのＡｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ及びＳＮＧｍＢ１のＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 ＳＮＧｍＢ１のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 式（ＶＩＩ）としてのＡｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 式（ＶＩＩ）としてのＡｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦ及びＳＮＧｍＢ１のＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 式（ＶＩＩ）としてのＡｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 式（ＩＸ）としてのＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びＳＮＧｍＢ１のＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 式（ＩＸ）としてのＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びＳＮＧｍＢ１のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 式（Ｘ）としてのＡｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４及びＳＮＧｍＢ１のＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 式（Ｘ）としてのＡｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 式（ＸＩ）としてのＭＢ−ＶＣ−デュオカルマイシン及びＳＮＧｍＢ１のＨＩＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 式（ＸＩ）としてのＭＢ−ＶＣ−デュオカルマイシンのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 種々の濃度の種々のＡＤＣでそれぞれ処理された癌細胞系ＰＬＣの生存率アッセイの結果を示す図である。 種々の濃度の種々のＡＤＣでそれぞれ処理された癌細胞系ＳＵＭ１５９の生存率アッセイの結果を示す図である。 ビヒクル、対照ＩｇＧ及びＳＮＧｍＢ１を投与されたときの肺腫瘍細胞の転移を示す図である。 対照ＩｇＧ処理後のタモキシフェン投与担腫瘍ヌードマウスでの肺転移巣におけるＡＬＤＨ１の免疫組織化学画像を示す図である。 ＳＮＧｍＢ１処理後のタモキシフェン投与担腫瘍ヌードマウスでの肺転移巣におけるＡＬＤＨ１の免疫組織化学画像を示す図である。
本発明に関する以下の記述は、本発明の様々な実施形態を例示することを単に意図するものである。したがって、論じられる特定の改変は、本発明の範囲の制約をすると解釈されるべきではない。様々な同等物、変更、及び改変を本発明の範囲から逸脱することなく行えることが当業者に自明となり、及びかかる同等の実施形態が本明細書に含まれることが理解されよう。刊行物、特許及び特許出願を含む、本明細書で引用される全ての参考資料は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される時、用語「抗体」には、特定の抗原に結合する、任意のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、又は二重特異性（二価）抗体が含まれる。完全抗体は２つの重鎖及び２つの軽鎖を備える。各重鎖は１つの可変領域と第１の、第２の、及び第３の定常領域からなり、一方、各軽鎖は１つの可変領域と１つの定常領域からなる。哺乳動物の重鎖はα、δ、ε、γ及びμに分類され、哺乳動物の軽鎖はλ又はκに分類される。抗体は「Ｙ」の形状を有し、Ｙの基部は、ジスルフィド結合を介して互いに結合している、第２の及び第３の定常領域の２つの重鎖からなる。Ｙの各アームは、単一の軽鎖の可変及び定常領域に結合している単一の重鎖の可変領域と第１の定常領域とを含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。両鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる可変性の高い３つのループを一般に含有する（軽（Ｌ）鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、重（Ｈ）鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む）。本明細書で開示される抗体及び抗原結合フラグメントのＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ １９９７；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８５；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８９；Ｋａｂａｔ １９８７；Ｋａｂａｔ １９９１）の慣習で定義又は同定することができる。３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られるフランキングストレッチの間に挟み込まれ、このＦＲは、ＣＤＲより高度に保存され、且つ足場を形成して超可変ループを支えている。重鎖及び軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与していないが、様々なエフェクター機能を示す。抗体は、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいて種類が割り当てられる。抗体の主要な５つの種類又はアイソタイプはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ，及びＩｇＭであり、これらは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμ重鎖の存在により特徴付けられる。主要な抗体の種類のいくつかは、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）、又はＩｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分割される。
「二価」である抗体又はその抗原結合性フラグメントは２つの抗原結合部位を含む。２つの抗原結合部位は同一の抗原に結合することができる。あるいは、２つの抗原結合部位は異なる抗原にそれぞれ結合することができ、この場合、当該抗体又は抗原結合性フラグメントは「二重特異性」として特徴付けられる。
本明細書で使用される時、用語「抗原結合性フラグメント」とは、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）2、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦＶ）、ｓｃＦｖダイマー（二価ダイアボディ）、１つ若しくは複数のＣＤＲを含む抗体の一部から形成された多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を備えない任意の他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントを指す。抗原結合性フラグメントは、親抗体又は親抗体フラグメント（例えば、親ｓｃＦｖ）が結合する同一の抗原に結合することができる。ある特定の実施形態では、抗原結合性フラグメントは、１種又は複数の異なるヒト抗体からフレームワーク領域にグラフトされた特定のヒト抗体に由来する１種又は複数のＣＤＲを含むことができる。
抗体に関して「Ｆａｂ」とは、ジスルフィド結合により単一の重鎖の可変領域と第１の定常領域とに結合した単一の軽鎖（可変及び定常領域の両方）からなる、抗体の部分を指す。
「Ｆａｂ’」とは、ヒンジ領域の一部分を含むＦａｂフラグメントを指す。
「Ｆ（ａｂ’）2」とは、Ｆａｂ’のダイマーを指す。
抗体に関して「Ｆｃ」とは、ジスルフィド結合を介して第２の重鎖の第２の及び第３の定常領域に結合した第１の重鎖の第２の及び第３の定常領域からなる、抗体の部分を指す。抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣなどの様々なエフェクター機能に関与するが、抗原結合においては機能しない。
抗体に関して「Ｆｖ」とは、完全抗原結合部位を有する、抗体の最小フラグメントを指す。Ｆｖフラグメントは、単一の重鎖の可変領域に結合した、単一の軽鎖の可変領域からなる。
「単鎖ＦＶ抗体」又は「ｓｃＦｖ」とは、直接に又はペプチドリンカー配列を介して互いに接続した軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなる工学的に作製された抗体を指す（Ｈｏｕｓｔｏｎｅ １９８８）。
「単鎖Ｆｖ−Ｆｃ抗体」又は「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」とは、抗体のＦｃ領域に接続したｓｃＦｖからなる工学的に作製された抗体を指す。
「ラクダ化単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」、又は「ＨＣＡｂ」とは、２つのＶHドメイン含有し、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ １９９９；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ２００１；ＷＯ９４／０４６７８；Ｗ０９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。重鎖抗体はもともとラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマ）由来であった。軽鎖を欠いているが、ラクダ化抗体は真正の抗原結合性レパートリーを有する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ １９９３；Ｎｇｕｙｅｎ ２００２；Ｎｇｕｙｅｎ ２００３）。重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）は適合免疫応答によって生じる既知の最小抗原結合性ユニットである（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅ ２００７）。
「ナノボディ」とは、重鎖抗体に由来するＶＨＨドメイン及び２つの定常ドメイン、ＣＨ２とＣＨ３、からなる抗体フラグメントを指す。
「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小抗体フラグメントを含み、当該フラグメントは、同一のポリペプチド鎖（ＶH−ＶL又はＶH−ＶL）においてＶLドメインに接続したＶHドメインを備えている（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ １９９３；ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１を参照のこと）。同一の鎖上の２つのドメイン間で対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインを別の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、それにより、２つの抗原結合部位を創製する。抗原結合部位は、同一の又は異なる抗原（又はエピトープ）を標的とすることができる。
「ドメイン抗体」とは、重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域のみを含有する抗体フラグメントを指す。ある特定の例では、２つ以上のＶHドメインが、ペプチドリンカーと共有結合して、二価又は多価ドメイン抗体を創製する。二価ドメイン抗体の２つのＶHドメインは、同一の又は異なる抗原を、標的とすることができる。
ある特定の実施形態では、「（ｄｓＦｖ）2」は３つのペプチド鎖、すなわち、ペプチドリンカーで連結し、且つジスルフィド架橋で２つのＶL部分に結合した２つのＶH部分を含む。
ある特定の実施形態では、「二重特異性ｄｓダイアボディ」はＶH1とＶL1との間のジスルフィド架橋を介して（ペプチドリンカーで連結した）ＶL1−ＶH2に結合した（やはりペプチドリンカーで連結した）ＶH1−ＶL2を含む。
ある特定の実施形態では、「二重特異性ｄｓＦｖ」又は「ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’」は３つのペプチド鎖を含み、すなわち、重鎖が、ペプチドリンカー（例えば、長い可動性リンカー）で連結し、且つ、ジスルフィド架橋を介してＶL1及びＶL2部分にそれぞれ結合しているＶH1−ＶH2部分であって、各ジスルフィドで対化した重鎖及び軽鎖は異なる抗原特異性を有する。
ある特定の実施形態では、「ｓｃＦｖダイマー」とは、一方の部分のＶHが他方の部分のＶLと連携し、且つ２つの結合部位を形成するように、別のＶH−ＶL部分とダイマー化した（ペプチドリンカーで連結した）ＶH−ＶLを含む二価ダイアボディ又は二価ＳｃＦｖ（ＢｓＦｖ）であり、２つの結合部位は、同一の抗原（又はエピトープ）又は異なる抗原（又はエピトープ）を標的とすることができる。他の実施形態では、「ｓｃＦｖダイマー」とは、ＶH1とＶL1とが連携し且つＶH2とＶL2とが連携し、並びに連携した各対が異なる抗原特異性を有するように、（ペプチドリンカーで連結した）ＶL1−ＶH2と会合した（やはりペプチドリンカーで連結した）ＶH1−ＶL2を含む二重特異性ダイアボディである。
本明細書で使用される時、用語「エピトープ」とは、抗体が結合する抗原上の原子又はアミノ酸の特定群を指す。２つの抗体が抗原に対して競合的結合を示す場合、それら２つ抗体は抗原内の同一のエピトープに結合しているかもしれない。例えば、本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントが、ＥＲ−α３６結合に対してＳＮＧｍＢ１と競合する場合、抗体は、必ずしもではないが、ＳＮＧｍＢ１と同一のエピトープに結合すると考えられ得る。
本明細書で使用される時、「ＥＲ」は、いくつかの公知のエストロゲン受容体、ＥＲ−α６６、ＥＲ−α４６、又はＥＲ−α３６の１つを指す。５９５個のアミノ酸を有する６６ｋＤａのタンパク質として同定された完全長のヒトＥＲ−αは、ｈＥＲ−α６６と呼ばれる（図１（ａ））。ｈＥＲ−α６６は、独立するが相互作用している３つの機能ドメイン、Ｎ末端Ａ／Ｂドメイン、Ｃ又はＤＮＡ結合ドメイン、及びＤ／Ｅ／Ｆ又はリガンド結合ドメインで構成される（本願明細書に参照により組み込まれる、米国特許出願第１０／５９１，１９９号を参照のこと）。ＥＲ α６６のＮ末端ドメインは、リガンド非依存性の活性化機能（ＡＦ−１）、活性化補助因子との相互作用に関わっている領域、及び標的遺伝子の転写活性化をコードする。ＤＮＡ結合ドメイン又はＣドメインは、２ジンクフィンガー構造を含有し、このドメインは受容体のダイマー化及び特定のＤＮＡ配列への結合において重要な役割を果たす。Ｃ末端Ｄ／Ｅ／Ｆドメインは、リガンド結合、受容体ダイマー化、核転送、及びリガンド依存性のトランス活性化機能（ＡＦ−２）を媒介するリガンド結合ドメインである。転写制御において、ＡＦ−１とＡＦ−２との双方が発揮する相対寄与は、細胞特異的及びＤＮＡプロモーター特異的な様式で変化する（Ｂｅｒｒｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．、９：２８１１（１９９０）及びＴｚｕｋｅｒｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．、８：２１（１９９４））。ヒトＥＲ−α４６（ｈＥＲ−α４６、図１（ｂ））は、ｈＥＲ−α６６のスプライスバリアントで、４１２個のアミノ酸を含有する約４６ＫＤａの分子量を有し、且つｈＥＲ−α６６のＮ末端ＡＦ−１ドメインを欠いている。ヒトＥＲ−α３６（配列番号１に記載のｈＥＲ−α３６）は、ｈＥＲ−α６６のＮ末端ＡＦ−１ドメイン及びＣ末端ＡＦ−２ドメインを欠く、３６ｋＤａのｈＥＲ−αバリアントである（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３６、１０２３〜１０２７（２００５）、米国特許出願第１０／５９１，１９９号、ＷＯ２００５／０８７８１１）。しかし、ｈＥＲ−α３６は、ｈＥＲ−α６６又はｈＥＲ−α４６と比較すると、そのＣ末端に独自の２７個のアミノ酸残基の付加を有する。この２７個のアミノ酸残基は、配列番号１の２８４から３１０までのアミノ酸残基、又は配列番号２の１から２７までのアミノ酸残基である。
本明細書で使用される時、「ＥＲ活性」には、受容体リン酸化（例えば、チロシンリン酸化）、細胞内シグナル伝達分子の受容体若しくは他の細胞内シグナル伝達分子への結合、シグナル伝達カスケードの開始、及び／又は生物学的応答の開始（例えば、遺伝子発現の誘導及びＥＲ（例えば、ｈＥＲ−α３６）を有する細胞の生理又は発達（例えば、増殖）における変化）などの、ＥＲ（例えば、ｈＥＲ−α３６）で誘導される細胞内事象が含まれる。
本明細書で使用される時、「がん」又は「がん状態」とは、腫瘍性若しくは悪性の細胞成長、増殖又は転移により媒介される任意の医学的状態を指し、且つ固形がん及び白血病などの非固形がんの両方を含む。本明細書で使用される時、「腫瘍」とは、腫瘍性及び／又は悪性細胞の固形の塊を指す。
本明細書で使用される時、状態の「処置すること」又は「処置」とは、状態を予防すること若しくは緩和すること、状態の開始若しくは進行速度を緩徐すること、状態が進行するリスクを低減すること、状態と関連した症候の進行を予防すること若しくは遅延すること、状態と関連した症候を低減すること若しくは終了させること、状態の完全若しくは部分的後退を生じること、状態を治癒すること、又はそれらの何らかの組合せを含む。がんに関連して、「処置すること」又は「処置」とは、腫瘍性若しくは悪性の細胞成長、増殖又は転移を阻害すること又は緩徐すること、腫瘍性若しくは悪性の細胞成長、増殖又は転移の進行を予防すること又は遅延させること、或いはそれらの何らかの組合せを指すことができる。腫瘍に関連して、「処置すること」又は「処置」とは、腫瘍の全部又は一部を根絶すること、腫瘍の成長及び転移を阻害すること若しくは緩徐すること、腫瘍の進行を予防すること若しくは遅延させること、又はそれらの何らかの組合せを含む。
本明細書で使用される時、用語「特異的に結合する」とは、例えば抗体と抗原との間などの、２つの分子間の非ランダム結合反応を指す。ある特定の実施形態では、抗原に特異的に結合する抗体又は抗原結合性フラグメントは、≦１０-6Ｍ（例えば、≦５ｘ１０-7Ｍ、≦２ｘ１０-7Ｍ、≦１０-7Ｍ、≦５ｘ１０-8Ｍ、≦２ｘ１０-8Ｍ、≦１０-8Ｍ、≦５ｘ１０-9Ｍ、≦２ｘ１０-9Ｍ、≦１０-9Ｍ、１０-10Ｍ）の結合親和性（ＫD）で当該抗原に結合する。本明細書で使用される時、ＫDとは、解離速度と会合速度との比率（ｋoff／ｋon）を指し、当業界で公知の方法を使用して（例えば、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）又はキネクサ（Ｋｉｎｅｘａ）技法を使用して）決定することができる。
「単離された」物質は、ヒトの手により天然の状態から改変されている。「単離された」組成物又は物質が自然に存在する場合、「単離された」組成物又は物質は、その元の環境から変化されているか若しくは取り出されているか、又はその双方である。例えば、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離されて」いないが、実質的に純粋な状態で存在するように、同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドがその自然状態での共存材料から十分に分離されている場合、同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離されて」いることになる。
本明細書で使用される時、用語「ベクター」とは、タンパク質の発現をもたらすように、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に挿入できるビヒクルを指す。ベクターが宿主細胞内に輸送する遺伝エレメントの発現をもたらすように、ベクターを使用して、宿主細胞を形質転換、形質導入、又はトランスフェクトすることができる。ベクターの例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１−由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージ又はＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、及び動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして使用される動物ウイルスのカテゴリーには、（レンチウイルスを含む）レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス及びパポバウイルス（例えばＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能エレメント、及びレポーター遺伝子を含む、発現を制御する様々なエレメントを含有することができる。加えて、ベクターは複製起点を含有することができる。ベクターは、それらに限定されないが、ウイルス粒子、リポソーム、又はタンパク質コーティングを含む、ベクターの細胞侵入を補助する材料を含むこともできる。
本明細書で使用する時、句「宿主細胞」とは、外因性のポリヌクレオチド及び／又はベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞は、例えばＥ．ｃｏｌｉ若しくはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞などの細菌細胞、酵母細胞若しくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞などの真菌細胞、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２若しくはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、又は線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ヒーラ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、若しくはヒト細胞などの動物細胞を含む、様々な細胞種から選択することができる。
本明細書で使用する時、「ＥＲ若しくはＥＲ−α３６と関連した又は関係した疾患」とは、ＥＲ（例えば、ＥＲ−α３６）活性の増減により引き起こされる、悪化する、又はそうでなければ連結する、任意の状態を指す。そのような状態には、成長、増殖又は転移に関してＥＲ（例えば、ＥＲ−α３６）へ依存している細胞により媒介されるがん、骨喪失、骨折又は骨粗鬆症などの骨の疾患、及び例えば関節リウマチ、乾癬、強皮症、慢性閉塞性肺疾患又は喘息などの炎症状態が含まれる。
本明細書で使用される時、「結合をブロックする」又は「結合について競合する」能力とは、抗体又は抗原結合性フラグメントが、検出可能な程度に２つの分子間の結合相互作用を阻害する能力を指す。ある特定の実施形態では、２つの分子間の結合をブロックする抗体又は抗原結合性フラグメントは、２つの分子間の結合相互作用を少なくとも５０％阻害する。ある特定の実施形態では、この阻害は６０％より大きいことが、ある特定の実施形態では７０％より大きいことが、ある特定の実施形態では８０％より大きいことが、及びある特定の実施形態では９０％より大きいことがあり得る。ある特定の実施形態では、阻害されている結合相互作用は、ｈＥＲ−α３６へのＳＮＧｍＢ１の結合相互作用であり得る。
本明細書で使用される時、用語「処置有効量」又は「有効用量」とは、ｈＥＲ−α３６と関連した疾患又は状態を処置するのに有効な薬物の用量又は濃度を指す。例えば、がんを処置するために本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントを使用することに関して、処置有効量とは、腫瘍の全て若しくは一部を根絶すること、腫瘍の成長を阻害すること若しくは遅らせること、がん状態を媒介する細胞の成長若しくは増殖を阻害すること、腫瘍細胞の転移を阻害すること、腫瘍若しくはがん状態と関連した任意の症候又はマーカーを緩和すること、腫瘍若しくはがん状態の進行を予防すること又は遅延すること、或いはそれらの何らかの組合せが可能である抗体又は抗原結合性フラグメントの用量又は濃度である。
用語「薬学的に許容される」とは、指定担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤（複数可）、及び／又は塩が、製剤を構成する他の成分と化学的に及び／又は物理的に概して適合していること、並びに、それらの受容者と生理的に適合していることを示す。
抗ｈＥＲ−α３６抗体
一態様では、本開示は、配列番号１のアミノ酸残基２８４〜３１０に、すなわち、配列番号２に示された２７個のアミノ酸のフラグメントに特異的に結合する、抗ｈＥＲ−α３６抗体及びその抗原結合性フラグメントを提供する。
配列番号１、及び配列番号２のアミノ酸配列を下に列挙する。
配列番号１のアミノ酸配列
配列番号２のアミノ酸配列
本明細書で使用される時、「抗ｈＥＲ−α３６」抗体とは、ｈＥＲ−α３６受容体とそのリガンドの結合をブロックする、又はｈＥＲ−α３６受容体との結合に対してリガンドと競合する抗体を指す。
ある特定の実施形態では、抗ｈＥＲ−α３６抗体及びその抗原結合性フラグメントは、≦１０-6Ｍ（例えば、≦５ｘ１０-7Ｍ、≦２ｘ１０-7Ｍ、≦１０-7Ｍ、≦５ｘ１０-8Ｍ、≦２ｘ１０-8Ｍ、≦１０-8Ｍ、≦５ｘ１０-9Ｍ、≦２ｘ１０-9Ｍ、≦１０-9Ｍ、≦５ｘ１０-10Ｍ、≦２ｘ１０-10Ｍ、≦５ｘ１０-11Ｍ、≦５ｘ１０-11Ｍ、又は≦１０-11Ｍ）の結合親和性（ＫD）で、ｈＥＲ−α３６（すなわち配列番号１）又は配列番号２を含むｈＥＲ−α３６フラグメントに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、結合親和性は、１０-11Ｍから１０-8Ｍまで、１０-11Ｍから１０-9Ｍまで、１０-11Ｍから１０-8Ｍまで、１０-11Ｍから１０-7Ｍまで、１０-11Ｍから１０-6Ｍまで、１０-10Ｍから１０-8Ｍまで、１０-10Ｍから１０-9Ｍまで、１０-10Ｍから１０-8Ｍまで、１０-10Ｍから１０-7Ｍまで、又は１０-10Ｍから１０-6Ｍまでの範囲である。
結合親和性はＫD値で表すことができ、ＫD値は、抗原と抗原結合性分子との間の結合が平衡に達した時点の、解離速度と会合速度との比率（ｋoff／ｋon）として算出される。例えば、抗原凝集のため、ｋonの測定値を得るのが困難である時、結合平衡で測定した解離速度（ｋoff）を使用することもできる。抗原結合親和性（例えばＫD又はｋoff）は、例えば、ビアコア（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅ、１９章、ユニット１９．１４、２００６を参照のこと）及びキネクサ技法（例えば、Ｄａｒｌｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．、ら、Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、２（６）：６４７〜６５７（２００４）を参照のこと）を含む、当業界で公知の適切な方法を使用して適切に決定することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体及びそのフラグメントは、ｈＥＲ−α３６の１つ又は複数のＥＲ活性をアンタゴナイズする。そのような抗体及びそのフラグメントは、ｈＥＲ−α３６に結合すると、１つ又は複数のＥＲ活性を刺激せず、及び／又は、そのような抗体及びそのフラグメントは、受容体結合に対してＥＲリガンド若しくはアゴニストと競合することができ、その結果、ＥＲリガンド若しくはアゴニストによるＥＲ活性の刺激を阻害し又はアンタゴナイズすることができる。ＥＲ活性に関する抗体及びそのフラグメントの活性については、当業界で周知のアッセイを使用して、例えば、受容体リン酸化を検出することで、ＥＲリガンド又はアゴニストの結合阻害を検出することで、ｈＥＲ−α３６受容体の１つ又は複数の生物学的応答を検出することで、測定することができる。例示的な方法又はアッセイについては、ＷＯ０５／０８７８１１に詳細が記載されており、その全体が本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、抗ｈＥＲ−α３６抗体及びその抗原結合性フラグメントを、ｈＥＲ−α３６を発現している細胞に内部移行することができる。抗体の内部移行については、例えば、ｈＥＲ−α３６を発現している細胞を、標識抗ｈＥＲ−α３６抗体と一定時間インキュベーションして、細胞内の標識抗体の存在を検出することで、測定できる（例えば蛍光顕微鏡、又はＦＡＣＳ分析にて）。
ある特定の実施形態では、抗ｈＥＲ−α３６抗体及びその抗原結合性フラグメントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する。抗体及びそのフラグメントは、腫瘍細胞の成長を阻害し且つ／又は腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができる。この抗腫瘍活性は、腫瘍細胞の培養を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで、又は動物モデルを使用してｉｎ ｖｉｖｏで検出することができる。
ＳＮＧｍＢ１に由来する抗体
本明細書において、ＳＮＧｍＢ１抗体のＣＤＲの少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ全て）を含む抗ｈＥＲ−α３６抗体及びその抗原結合性フラグメントが提供される。
本明細書で使用される時、「ＳＮＧｍＢ１抗体」とは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖を含むマウスのモノクローナル抗体を指す。ＳＮＧｍＢ１抗体の軽鎖及び重鎖をコードするヌクレオチド配列も、配列番号１７及び配列番号１９として下に提供されている。軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を下に記載するが、ＣＤＲ領域は太字で下線が施してあり、且つ定常領域は太字でイタリックである。
ＳＮＧｍＢ１の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１６）
ＳＮＧｍＢ１の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）
マウス抗体ＳＮＧｍＢ１の軽鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７）
マウス抗体ＳＮＧｍＢ１の重鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）
表１に、ＳＮＧｍＢ１抗体のＣＤＲ配列が記載されている。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ｈＥＲ−α３６抗体及び抗原結合性フラグメントは、配列番号３〜８から選択される少なくとも１つのＣＤＲ（又は少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を含む。ＣＤＲは抗原結合に関与すると知られているが、６つのＣＤＲ全てが抗原結合にとって不可欠であるとは限らないことが見出されている。換言すれば、ＳＮＧｍＢ１抗体の１つ又は複数のＣＤＲを置き換えてもｈＥＲ−α３６への結合親和性をなお実質的に保持できる可能性がある。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ｈＥＲ−α３６抗体及び抗原結合性フラグメントは、配列番号８（すなわちＳＮＧｍＢ１抗体の重鎖ＣＤＲ３配列）を含む。重鎖ＣＤＲ３領域は、抗原結合部位の中央に位置し、したがって、抗原と最も接触することになり、且つ抗原への抗体の親和性にとって最も自由なエネルギーもたらすと考えられる。重鎖ＣＤＲ３は、多重多様性メカニズムにより、長さ、アミノ酸組成及び立体構造の点で、とびぬけて抗原結合部位の最も多様なＣＤＲであるとも考えられている（Ｔｏｎｅｇａｗａ Ｓ．Ｓｏｍａｔｉｃ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．３０２：５７５〜８１）。重鎖ＣＤＲ３の多様性は、ほとんどの抗体の特異性（Ｘｕ ＪＬ、Ｄａｖｉｓ ＭＭ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ＣＤＲ３ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｖ（Ｈ） ｉｓ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｍｏｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１３：３７〜４５）並びに望ましい抗原結合親和性（Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ、等 Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｃｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉ−ｃ−ｅｒｂＢ−２ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２６３：５５１〜６７）をもたらすのに十分である。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ｈＥＲ−α３６抗体及び抗原結合性フラグメントは、ＳＮＧｍＢ１抗体の３つのＨＣＤＲのいずれかを含む重鎖可変領域を含み、すなわち、配列番号６〜８のいずれかを含み、及び／又は、ＳＮＧｍＢ１抗体の、３つのＬＣＤＲのいずれかを含む軽鎖可変領域を含み、すなわち、配列番号３〜５のいずれかを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ｈＥＲ−α３６抗体及び抗原結合性フラグメントは、配列番号６、７及び８を含む重鎖可変領域を含み、並びに／又は、配列番号３、４及び５を含む軽鎖可変領域を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ｈＥＲ−α３６抗体及び抗原結合性フラグメントは、ＳＮＧｍＢ１抗体の重鎖可変領域、すなわち配列番号１０を含み、及び／又は、ＳＮＧｍＢ１抗体の軽鎖可変領域、すなわち配列番号９を含む。ある特定の実施形態では、抗ｈＥＲ−α３６抗体はＳＮＧｍＢ１抗体であり、配列番号１６の軽鎖、及び配列番号１８の重鎖を含む。
ＳＮＧｍＢ１抗体のＣＤＲ領域、軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域を、当業界で公知の方法にしたがって他のフレームワーク領域又は定常領域にグラフトして、ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ＢｓＦｖ、ｓｃＦｖダイマー、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）2、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ｄｓダイアボディ、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は完全抗体をもたらすことができる。本明細書で開示される抗体は、モノクローナル抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、標識抗体、二価抗体、抗イディオタイプ抗体、又は完全ヒト抗体であり得る。
キメラ及び／又はヒト化抗体
ある特定の実施形態では、抗ｈＥＲ−α３６抗体及び抗原結合性フラグメントはキメラである。本明細書で使用される時、「キメラ」とは、異なる種に由来する少なくとも２つの部分を含む分子を指す。例えば、キメラ抗体は少なくとも１つの非ヒト配列及びヒト配列を有することができる。ある特定の実施形態では、キメラ抗体及びその抗原結合性フラグメントは、マウスに由来する少なくとも１つのＣＤＲ、並びに非マウス種（例えばヒト）に由来する少なくとも１つの定常領域及び／又はフレームワーク領域を含む。
キメラ抗体及び抗原結合性フラグメントは、ｈＥＲ−α３６への結合特異性を保持し、好ましくは、ｈＥＲ−α３６への結合親和性を保持し（例えばＳＮＧｍＢ１抗体の結合親和性より６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上）及び／又はｈＥＲ−α３６に関する生物学的活性（例えばアンタゴナイズ活性）を保持している。
ある特定の実施形態では、キメラ抗体及びその抗原結合性フラグメントは、配列番号３〜８の少なくとも１つ、及びヒト由来抗体足場（スキャフォルド：ｓｃａｆｆｏｌｄ）を含む。ある特定の実施形態では、キメラ抗体及びその抗原結合性フラグメントは、ヒト由来抗体足場にグラフトした、配列番号６〜８全てを含む重鎖可変領域を含み、及び／又は、配列番号３〜５全てを含む軽鎖可変領域を含む。
ある特定の実施形態では、キメラ抗体及びその抗原結合性フラグメントは、ヒト由来抗体足場にグラフトした、配列番号１０の重鎖可変領域を含み、及び／又は配列番号９の軽鎖可変領域を含む。
ある特定の実施形態では、キメラ抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。ある特定の実施形態では、キメラ抗体は、配列番号２１のポリヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖、及びを配列番号２３のポリヌクレオチド配列によりコードされる重鎖を含む。
キメラ抗体及び抗原結合性フラグメントは、例えば、それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８０７，７１５号においてＭｏｒｒｉｓｏｎらにより記載の；米国特許第４，８１６，５６７号においてＣａｂｉｌｌｙらにより記載の；米国特許第４，８１６，３９７号においてＢｏｓｓらにより記載の；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１９）：１２０２〜１２０７（１９８５）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１〜６８５５（１９８４）に記載の、組換え方法を使用して産生することができる。一般に、一種の可変領域をコードするＤＮＡ分子を、別の種の定常領域をコードする別のＤＮＡ分子とインフレームでライゲートし、結果として得られた、キメラ抗体鎖をコードするＤＮＡを細胞内にトランスフェクトすることで発現が可能となり、軽鎖及び重鎖が細胞内において任意選択的に組み立てられ、キメラ抗体又はその抗原結合性フラグメントを産生する。
キメラ抗ｈＥＲ−α３６抗体及びその抗原結合性フラグメントをヒト化することができる。「ヒト化」とは、非ヒト抗体がヒト抗体配列への配列ホモロジーが高まるように改変されていることを意味し、その結果、抗原結合特性は保持され、それでもヒトへの免疫原性は低減する。
ある特定の実施形態では、ヒト化抗体及びその抗原結合性フラグメントは、ヒト由来抗体足場にグラフトされた、ＳＮＧｍＢ１抗体に由来する１つ又は複数の抗原結合配列（複数可）を含む。本明細書で使用される時、「ヒト由来」とは、少数の突然変異又は改変を除いて、抗体足場が、完全にヒトであること、又は実質的にヒトに由来することを意味する。このような突然変異又は改変は、例えば、結合親和性を改善するために、コンジュゲーション部位を提供するために、付加的ジスルフィド結合を形成するために、又は任意の他の適切な目的のために導入される。ある特定の実施形態では、ヒト由来抗体足場は、マウス抗体などの非ヒト由来抗体と比べて、ヒトにおいて免疫原性が低下しているか又は免疫原性がない。
ＳＮＧｍＢ１抗体の１つ若しくは複数のＣＤＲ及び／又は可変領域をヒト由来抗体又はそのフラグメントにグラフトすることができる。例えば、ＳＮＧｍＢ１抗体のＣＤＲ（複数可）をヒト由来抗体のヒトフレームワーク領域にグラフトすることができ、その結果、ＳＮＧｍＢ１由来のＣＤＲは、ヒト由来抗体上の対応するＣＤＲと置き換えで位置する。別の例では、ＳＮＧｍＢ１抗体の可変領域（複数可）をヒト由来抗体の対応する定常領域にグラフトすることができる。
ある特定の実施形態では、ＳＮＧｍＢ１抗体のＣＤＲをヒトフレームワーク領域にグラフトする。ヒトフレームワーク領域のある特定のアミノ酸残基をＳＮＧｍＢ１抗体に由来する対応する残基で置換することができ、その結果、ヒト化抗体の抗原結合領域はマウス抗体構造により近似することになる。そのようなアミノ酸残基の例として、限定されないが、ヒト化抗体可変領域の、軽鎖のＶ４、Ｐ４４、Ｌ４６、Ｓ４９及び／又はＳ６４、並びに、重鎖のＴ２８、Ｌ８１が挙げられる（表２を参照のこと）。
ある特定の実施形態では、ヒト化キメラ抗体及びその抗原結合性フラグメントは、ヒト由来定常領域にグラフトされた、配列番号１４及び１５から選択される重鎖可変領域を含み、並びに／又は、配列番号１１、１２及び１３から選択される軽鎖可変領域を含む。ヒト化可変領域の配列が下の表２に提供され、表中、ヒトフレームワーク領域中の置換アミノ酸残基が大きめのサイズで示されている。
ある特定の実施形態では、ヒト化キメラ抗体は、配列番号２４、２６及び２８から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖、並びに、配列番号３０及び３２から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を含む。ある特定の実施形態では、キメラ抗体は、配列番号２５、２７及び２９から選択されるヌクレオチド配列でコードされる軽鎖、並びに、配列番号３１及び３３から選択されるヌクレオチド配列でコードされる重鎖を含む。
非ヒト抗体のヒト化には、例えば、Ｌｏ．Ｂ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版、２００４、１３５〜１５９頁；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９〜４９８（１９９１）；Ｓａｔｏら Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（５）：３７１〜３８１（１９９４）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３〜７８３（１９９１）；及びＰｒｅｓｔａ、Ｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５８（２００６）６４０〜６５６に記載の方法など、当業界で公知の様々な方法を使用することができる。
親和性バリアント
本開示は、向上した特性（例えば、親和性の増加、半減期の増加、コンジュゲーション適性の改善等）を備える抗体及び抗原結合性フラグメントをさらに提供する。このような抗体及び抗原結合性フラグメントは、ＳＮＧｍＢ１抗体の１つ若しくは複数のＣＤＲ配列又は重鎖若しくは軽鎖可変領域中に、或いは、重鎖若しくは軽鎖定常領域中に、１つ若しくは複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む。
ある特定の実施形態では、そのようなアミノ酸置換（複数可）を有する抗体又は抗原結合性フラグメントは、ｈＥＲ−α３６への結合特異性及び結合親和性を保持し、且つ好ましくは、ｈＥＲ−α３６への結合親和性が改善されている。このような抗体及び抗原結合性フラグメントは、アミノ酸配列のランダムな又は狙った突然変異誘発、並びに、続いて行う結合及び機能アッセイにより作製することができる。ＥＲ−α３６結合特性を備える抗体を同定するため、この方法で作製した抗体及び抗原結合性フラグメントをＥＲ−α３６への結合についてスクリーニングすることができる。好ましい結合特性を備える抗体を１つ又は複数の機能アッセイに付して、抗体の能力、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでがん細胞の成長若しくは増殖を、又はｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍の成長を阻害する能力を決定することができる。
ＮＮＡＡバリアント
ある特定の実施形態では、抗ｈＥＲ３６抗体及び抗原結合性フラグメントは、したがって１つ又は複数の非天然アミノ酸（ＮＮＡＡ）の置換を含む。本明細書で使用される時、「非天然アミノ酸」又は「ＮＮＡＡ」とは、改変アミノ酸及び／又はアミノ酸アナログを含む、２０の標準アミノ酸（すなわちグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、システイン、トレオニン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、及びグルタミン）のうちの１つではない任意のアミノ酸を指す。
ＮＮＡＡは、様々な官能基又は反応基を含有することができ、付加的な機能及び／又は反応性を提供することができる。例えば、抗体及び抗原結合性フラグメントへ組み込むのに適したＮＮＡＡは、光ケージ化及び／若しくは光異性化アミノ酸（例えばｐ−アゾフェニル−フェニルアラニン）、グリコシル化アミノ酸（例えばＮ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン）、放射標識アミノ酸、ケト含有アミノ酸（例えばピロリシン）、フォルミルグリシン（Ｒｅｄｗｏｏｄ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＡＲＴＡＧ（商標））などのアルデヒド含有アミノ酸、重原子置換アミノ酸（例えばｐ−ヨードフェニルアラニン）、化学開裂性及び／若しくは光開裂性アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸（３−アミノ−Ｌ−チロシン）、又は光励起性アミノ酸（例えばｐ−アジド−Ｌフェニルアラニン及びｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン）であってもよい。ＮＮＡＡに関する総説は、例えば、Ｘｉｅ，Ｊ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００５、９：５４８〜５５４；Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００２、６：８０９〜８１５、に見出すことができ、双方ともその全体が本明細書に組み込まれる。
ＮＮＡＡは、例えば、抗体コンジュゲーション、標識化、グリコシル化、光架橋等において、様々な利点を提供することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体及び抗原結合性フラグメントは、コンジュゲートが可能なＮＮＡＡを含む。官能基を備えるコンジュゲート分子は、ＮＮＡＡの対応する反応基と反応することができ、その結果、抗体のＮＮＡＡとコンジュゲートとの間に安定な連結が形成され、そのことにより、コンジュゲートを抗体に結合させることができる。例えば、ケト基又はアルデヒド又はβ−ジケト部分を含有するＮＮＡＡは、ヒドラジド又はＯ−アルキルヒドロキシルアミン、ヒドロキシルアミン含有薬剤と反応して、ヒドラゾン又はＯ−アルキル化オキシム連結を形成することができる。別の例としては、アジド基含有ＮＮＡＡは、アルキン誘導体と反応して、銅（Ｉ）触媒［３＋２］環状付加により安定なトリアゾールリンカーを形成することができる（逆も同様である）。別の例としては、アジド基含有ＮＮＡＡは、適切な水溶性ホスフィン含有薬剤とライゲートして、シュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）ライゲーションによりアミド連結を形成することができる。さらに、ＮＮＡＡのチオエステル部分は、アミン含有薬剤と反応して、アミド連結を形成することができる。ＮＮＡＡを組み込まれた抗体及び抗原結合性フラグメントは、ジエンとジエノフィルとの間の（４＋２）環状付加（ディールス−アルダー（Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ）反応）、１，３−双極子ヒュスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）環状付加を介する（３＋２）環状付加、及びニトロン（Ｎｉｔｒｏｎｅ）−オレフィン環状付加を介する（３＋２）環状付加などの、環状付加反応を介して薬剤とコンジュゲートすることができる。抗体コンジュゲーションに適した環状付加方法は、例えば、ＷＯ０５００３２９４、ＵＳ２０１２０００４１８３、ＷＯ０６００９９０１、ＷＯ０７１３０４５３及び米国特許第６，７３７，２３６号に記載されている。そのようなアプローチは、例えば、フルオロフォア、親和性分子（例えばビオチン）、糖アナログ、ポリマー（例えばＰＥＧ）、及び化学化合物（例えばサイトキシン及び抗腫瘍剤）などの様々なコンジュゲートで抗体をコンジュゲートする場合、特に有用である。
ある特定の実施形態では、ＮＮＡＡを組み込まれた抗体及び抗原結合性フラグメントは、アジド基又はアルキン基を含む。そのようなＮＮＡＡは銅触媒クリックケミストリーを介してコンジュゲートすることができる。例えば、アジドを有するＮＮＡＡを、銅（Ｉ）イオン存在下で末端アルキンを有するコンジュゲートと反応させることで、トリアゾール連結を形成することが可能となる。アルキン基を有するＮＮＡＡを、銅触媒クリックケミストリーを介してアジド基を有する薬剤と反応させることもできる。このような反応に関しては、例えば、米国特許第７，００９，０５９号、ＷＯ２００４０５５１６０、米国特許第７，３７５，２３４号、及び米国特許第７，７６３，７３６号に、より詳細に記載されている。
当業界で公知の任意の適切なＮＮＡＡを、限定されないが、ＰＣＴ公報であるＷＯ０５０３８００２、ＷＯ０４０３５７４３、ＷＯ０４０３５６０５、ＷＯ０６００１８３２、ＷＯ０６０６８８０２、及びＷＯ０６１１０１８２、並びに米国特許出願であるＵＳ２０１３００３０１６０、ＵＳ２０１３００２８９０６、及びＵＳ２０１２０３０１４９０に記載のＮＮＡＡを含めて、使用することができる。ある特定の実施形態では、ＮＮＡＡは、２０の標準アミノ酸のいずれかのアナログである。例示的なＮＮＡＡとしては、限定されないが、
ピロリシンなどのリシンアナログ、
ｐ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−アミノフェニルアラニン、ｐ−（２−アミノ−３−ヒドロキシエチル）フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン、ｐ−フェニルアゾフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、ｐ−メトキシフェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−フェニルアラニン、ｐ−エチルチオカルボニルフェニルアラニン、及びｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ−カルボキシメチルフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンなどのフェニルアラニンアナログ、
Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンなどのアラニンアナログ、
Ｏ−メチル−チロシン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−チロシン、Ｏ−（トリメチルアンモニウムアルキル）チロシン、３−ヨードチロシン、３−アミノ−チロシンなどのチロシンアナログ、
Ｓ−（２−ニトロベンジル）−システイン、セレノシステインなどのシステインアナログ、
ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニンなどのフェニルアラニンアナログ、
５−ヒドロキシトリプトファンなどのトリプトファンアナログ、
７−ヒドロキシクマリン−グリシン及びダンシル−グリシンなどのグリシンアナログ、
β−ＧｌｃＮＡｃ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン及びＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンなどのセリンアナログ、
α−ＧａｌＮＡｃ−トレオニンなどのトレオニンアナログ、並びに
Ｌ−ホモグルタミンなどのグルタミンアナログが挙げられる。
ＮＮＡＡは所定の遺伝子コドンでコードすることができ、このコドンを、抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードするヌクレオチド配列の所望の部位に組み込むことができる。ＮＮＡＡは独自の遺伝子コドンでコードすることができるが、このコドンは２０の標準アミノ酸のいずれかをコードする天然コドンとは異なる。ＮＮＡＡに対する遺伝子コドンは、停止コドン（例えばアンバー（ＵＡＧ）、オーカー（ＵＡＡ）、及びオパール（ＵＧＡ）コドン）、４塩基コドン（例えばＡＧＧＡ、ＡＧＧＵ、ＣＧＧＵ、ＣＧＣＵ、ＣＧＡＵ、ＣＣＣＵ、ＣＵＣＵ、ＣＵＡＵ、及びＧＧＧＵ）、５塩基コドン、６塩基コドン等であってもよい。
ＮＮＡＡは、直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を含む翻訳システムによって、抗体及びその抗原結合性フラグメントに組み込むことができる。一般に、ＮＮＡＡ対するコドンを含む、抗体をコードするヌクレオチド配列を翻訳システムに導入することができる。この場合、ＮＮＡＡ対するコドンは、特異的に認識され、且つｔＲＮＡとｔＲＮＡアミノアシルシンテターゼとの直交対によってＮＮＡＡに翻訳され、そのことにより、当該ヌクレオチドを、ＮＮＡＡを組み込んだ抗体及び抗原結合性フラグメントに翻訳することができる。
直交対のシンテターゼは、ｔＲＮＡをＮＮＡＡで特異的にアミノアシル化し、当該ｔＲＮＡはＮＮＡＡに対する遺伝子コドンを特異的に認識することができる。このような対は、システムに人工的に導入することができ（すなわちｔＲＮＡとシンテターゼの外因性対）、又は、システムに天然に存在することができる（すなわち、微生物中のｔＲＮＡとシンテターゼとの天然対）。そのような翻訳システムを調製する方法は、当業界で周知であり、例えば、ＰＣＴ公報のＷＯ０２０８５９２３、ＷＯ０２０８６０７５、ＷＯ０３０３３５２１、ＷＯ０４０９４５９３、ＷＯ０５００７６２４、ＷＯ０５００７８７０、及びＷＯ０５０１９４１５を参照されたい。
保存的バリアント
ある特定の実施形態では、抗ｈＥＲ３６抗体及び抗原結合性フラグメントは、したがってＳＮＧｍＢ１抗体由来の保存的置換を含む。本明細書で使用される時、「保存的置換」とは、アミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することを指し、この別のアミノ酸残基の側鎖は、置換された残基の側鎖に類似する物理化学特性を有する（例えば、側鎖の疎水性及び分子バルク）。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸（例えばＭｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ）の内で、中性親水性側鎖を有するアミノ酸（例えばＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎ）の内で、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ）の内で、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばＨｉｓ、Ｌｙｓ、及びＡｒｇ）の内で、又は芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばＴｒｐ、Ｔｙｒ、及びＰｈｅ）の内で行うことができる。当業界で公知のように、保存的置換は、タンパク質の立体的構造に重大な変化を引き起こすことが無く、したがってタンパク質の生物活性を低下させる又は損なうことが無い。ある特定の実施形態では、保存的置換を、ＳＮＧｍＢ１抗体の可変領域の１箇所又は複数の部位に、例えば、抗原結合にとって重大ではない部位に、導入することができる。
ｐＨ依存性バリアント
ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＥＲ−α３６へのｐＨ依存性結合を実現する１つ又は複数のアミノ酸置換（複数可）を含む。ある特定の実施形態では、そのような抗体及び抗原結合性フラグメントでは、中性ｐＨでの結合と比較して、酸性ｐＨでのＥＲ−α３６への結合が低下している。表面受容体に結合した抗体は、細胞質ゾルに内部移行し、続いてｐＨが酸性であるリソソームで分解されることがある。酸性ｐＨで親和性が低下すると、抗体がリソソーム中で受容体から解離し、抗体が分解から免れて、且つさらなる受容体分子に引き続き結合するために細胞表面へと再循環して戻ることが可能となると考えられる。
ＥＲ−α３６とｐＨ依存性結合を有する抗体及び抗原結合性フラグメントは、当業界で公知の方法を使用して工学的に作製することができ、例えば、Ｉｇａｗａ Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ、２８（１１）：２０１０；米国特許出願公開第２０１１００７６２７５号、米国特許出願公開第２０１１０１１１４０６号を参照されたい。例えば、抗体又はそのフラグメントの表面残基は、ヒスチジンスキャニングを使用して突然変異させることができ、得られる突然変異体は、酸性ｐＨ及び中性ｐＨの双方で受容体への結合親和性についてスクリーニングすることができる。ヒスチジン突然変異に適した可変領域上のある特定の残基が、例えば、米国特許出願公開第２０１１００７６２７５号、及び米国特許出願公開第２０１１０１１１４０６号に開示されている。
ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのｐＨ依存性結合を改善する１つ又は複数のアミノ酸置換（複数可）を含む。Ｉｇ Ｇは、酸性ｐＨでＦｃＲｎに結合し、且つ中性ｐＨで解離すると知られている。内部移行ＩｇＧは、エンドソームにおいてＦｃＲｎと複合体化することができ、且つ、エンドソームが細胞の側底外側に経細胞質輸送すると、細胞外に放出されうる。ＦｃＲｎとのそのような結合により、ＩｇＧはリソソーム中で分解されることから免れることができ、したがって、抗体の薬物動態的半減期を伸ばすことができる。ＦｃＲｎとの結合親和性を改善するための抗体及びその抗原結合性フラグメントを工学的に作製する方法は当業界で周知であり、例えば、Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、６（１）：６３〜７３、１９９８；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．ら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１巻、２７章：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＦＣ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＫ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版、２０１０；Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７０：３２６９〜３２７７（２０１０）；及びＨｉｎｔｏｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７６：３４６〜３５６（２００６）を参照されたい。突然変異抗体は、スクリーニングして、ＦｃＲｎ結合親和性が改善されている候補を同定することができる。
改変されたＡＤＣＣ活性を有するバリアント
ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントをＦｃ領域において工学的に処理し、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を改変することができる。Ｆｃ領域は、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージなどのエフェクター細胞の表面のＦｃ受容体に結合し、かかるエフェクター細胞をＥＲ−α３６発現細胞などの標的細胞に誘導する。ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントは、ＡＤＣＣ活性を増強する１つ若しくは複数の改変又は突然変異を含む。Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのある特定のアミノ酸残基を置換して、ＡＤＣＣ活性を増強することができる。代替的に又は付加的に、抗体上の炭水化物の構造を変えてＡＤＣＣ活性を増強することができる。抗体の工学的処理によってＡＤＣＣ活性を増強する方法は当分野において記載されており、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１．２７６（９）：６５９１〜６０４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００．１６４（８）：４１７８〜８４：Ｓｔｅｕｒｅｒ Ｗ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５、１５５（３）：１１６５〜７４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１、１６６（４）：２５７１〜５；Ｌａｚａｒ ＧＡ．ら、ＰＮＡＳ、２００６、１０３（１１）：４００５〜４０１０；Ｒｙａｎ ＭＣ．ら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．、２００７、６：３００９〜３０１８；Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＯ、．ら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００８、７（８）：２５１７〜２７；Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２００２、２７７：２６７３３〜２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２００３、２７８：３４６６〜３４７３を参照されたい。
エピトープ
本開示は、ＳＮＧｍＢ１抗体が特異的に結合する同一のエピトープに実質的に結合する抗体及びその抗原結合性フラグメントをさらに提供する。
抗体のエピトープを同定する方法は当分野で周知であり、例えば、アラニンスキャニングによる。一般に、単一のアラニン突然変異を対象である残基に導入して、突然変異抗原を産生し、突然変異抗原と抗体との結合親和性を、例えば競合的ＥＬＩＳＡ又はラジオリガンドイムノ結合アッセイを使用して試験する。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４（４９０８）：１０８１〜１０８５（１９８９）に記載のように、抗体結合活性がそのようなアラニンの置き換えで著しく低下し又は損なわれる場合、エピトープを構成する残基が識別される。さらなる方法については、例えば、Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｏ．ら、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ出版、２００１に見出すことができる。
ある特定の実施形態では、本願の抗体は、配列番号２のＳ３、Ｋ８、Ｒ１０、Ｐ１６、Ｋ１７、Ｇ２０、Ｎ２１、Ｋ２２、Ｗ２３からなる群から選択される１個又は複数の残基を含むエピトープに結合することができる。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２のＧ２０、Ｎ２１、Ｋ２２、Ｗ２３、及び／又はＦ２４からなる群から選択される１個又は複数の残基を含む。
ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２のＧ２０、Ｎ２１、Ｋ２２、Ｗ２３、及び／又はＦ２４の残基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２のＳ３、Ｋ８、Ｒ１０、Ｐ１６、Ｋ１７、Ｇ２０、Ｎ２１、Ｋ２２、Ｗ２３の残基を含む。
ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２のＧ２０、Ｎ２１、Ｋ２２、Ｗ２３、及び／又はＦ２４の残基からなる。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２のＳ３、Ｋ８、Ｒ１０、Ｐ１６、Ｋ１７、Ｇ２０、Ｎ２１、Ｋ２２、Ｗ２３の残基からなる。
同一のエピトープに結合する抗体は、互いの結合に、又は他方の抗原への結合をブッロキングすることに、競合する傾向にある。したがって、競合的結合アッセイを使用して、ＳＮＧｍＢ１抗体が特異的に結合する同一のエピトープに結合する抗体を同定することもできる。
抗体及び抗原結合性フラグメントの使用方法
本明細書で提供される抗体及び抗原結合性フラグメントにより、腫瘍の成長がｉｎ ｖｉｖｏで阻害されることが分かった。したがって、このような抗体及び抗原結合性フラグメントを使用して、ＥＲ−α３６と関連した様々な状態又は疾患を処置することができる。
ある特定の実施形態では、対象におけるＥＲ−α３６と関連した疾患を予防及び／又は処置する方法は、本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメントを含む、処置有効用量の医薬組成物を対象に投与することを含む。ＥＲ−α３６と関連した疾患の例としては、限定されないが、骨喪失、骨折、骨粗鬆症、転移性骨疾患、パジェット病、歯周疾患、軟骨変性、子宮内膜症、子宮類繊維疾患、ほてり、高ＬＤＬコレステロールレベル、心血管疾患、認知機能障害、脳変性障害、再狭窄、女性化乳房、血管平滑筋細胞増殖、肥満、失禁、不安症、エストロゲン欠乏から生じるうつ、周閉経期のうつ、分娩後うつ、月経前症候群、躁うつ病、不安症、認知症、強迫性行動、注意欠陥障害、睡眠障害、被刺激性、衝動性、免疫不全、自己免疫疾患、アンガーマネージメント、多発性硬化症及びパーキンソン病、炎症、炎症状態、炎症性腸疾患、呼吸器系疾患、性機能不全、高血圧、網膜変性、喘息並びにがん、が挙げられる。好ましくは、ＥＲ−α３６に関係した疾患は、骨喪失、骨折、骨粗鬆症、閉経、月経前症候群、子宮内膜症、子宮疾患、インポテンス、性機能不全、高ＬＤＬコレステロールレベル、心血管疾患、血管平滑筋細胞増殖、エストロゲン欠乏から生じるうつ、周閉経期のうつ、分娩後うつ、免疫不全、自己免疫疾患、炎症、炎症状態、喘息及びがん状態を含む。より好ましくは、ＥＲ−α３６と関連した疾患は、骨喪失、骨粗鬆症、インポテンス、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、免疫不全、炎症、炎症状態、喘息及びがん状態を含む。本明細書で使用される炎症状態は、関節リウマチ、乾癬、強皮症、慢性閉塞性肺疾患、及び喘息を含む。対象は、イネ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、又はヒトなどの哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。当該方法の必要な処置量は、特定の疾患にしたがって変化し、且つ本開示の利益を有する当業者により容易に確かめられる。
ある特定の実施形態では、対象におけるがん状態を予防及び／又は処置する方法は、本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントを使用して処置可能ながん状態及び腫瘍種としては、それらに限定されないが、癌腫、芽細胞腫、肉腫、胚細胞腫、又は、白血病、リンパ腫若しくは多発性骨髄腫などの血液系又はリンパ系悪性腫瘍が挙げられる。より詳細には、本明細書で開示される抗体を使用して処置可能ながん状態及び腫瘍種としては、それらに限定されないが、扁平上皮がん、肺がん（例えば、肺小細胞がん、非小細胞性肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、又は肺扁平上皮癌）、腹膜のがん、肝臓がん（例えば、肝細胞癌／ヘパトーマ）、胃のがん又は胃がん（例えば、消化器がん）、膵臓がん、脳腫瘍（例えば、膠芽腫／多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、非膠芽腫脳腫瘍、又は髄膜腫）、神経膠腫（例えば、上衣腫、星細胞腫、退形成性星細胞腫、乏突起膠腫、又は、乏突起星細胞腫などの混合性神経膠腫）、子宮頚部がん、卵巣がん、肝臓がん（例えば、肝芽腫、肝細胞癌／ヘパトーマ、又は肝臓の癌）、膀胱がん（例えば、尿路上皮がん）、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん又は腎臓のがん（例えば、腎臓の桿状腫瘍）、前立腺がん、外陰がん、陰茎がん、肛門がん（例えば、肛門扁平上皮癌）、甲状腺がん、頭頚部がん（例えば、鼻咽頭がん）、皮膚がん（例えば、黒色腫又は扁平上皮癌）、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、軟部組織肉腫（例えば、横紋筋肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫）、カルチノイドがん、眼がん（例えば、網膜芽細胞腫）、中皮腫、リンパ性／リンパ芽球性白血病（例えば、Ｔ細胞系列及びＢ細胞前駆系列双方の急性リンパ性／リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ芽球性／リンパ性白血病（ＣＬＬ）、肥満細胞性白血病を含む急性骨髄性／骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性／骨髄球性／骨髄芽球性白血病（ＣＭＬ）、有毛状細胞性白血病（ＨＣＬ）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、菌状息肉腫、セザリー症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、肥満細胞腫瘍、髄芽細胞腫、腎芽腫、孤立性形質細胞腫、骨髄異形成症候群、慢性及び非慢性骨髄増殖性疾患、中枢神経系腫瘍、下垂体腺種、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉腫瘍、上衣腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症、並びに小児肉腫（例えば、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫）などの小児がん、が挙げられる。なお、腫瘍は悪性（例えば、がん）でも良性（例えば、過形成、嚢胞、仮性嚢胞、過誤腫、及び良性新生物）でもよい。
ある特定の実施形態では、対象においてＥＲ−α３６と関連した腫瘍転移（ｍａｔａｓｉｓ）を阻害する方法は、本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメントを含む、処置有効用量の医薬組成物を対象に投与することを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体及び抗原結合性フラグメントは、ＥＲ−α３６のモジュレーターであり、且つｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで細胞におけるＥＲ−α３６の活性を調節するのに有用である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体及び抗原結合性フラグメントは、細胞死を誘導する及び／又は細胞増殖を阻害することができる。
ある特定の実施形態では、細胞においてＥＲ−α３６活性を調節する方法は、本明細書で開示される抗体及び抗原結合性フラグメントに、ＥＲ−α３６を発現している細胞を曝露することを含む。このような細胞は、遺伝子工学により内因的に又は外因的にＥＲ−α３６を発現することができる。一実施形態では、細胞はＥＲ−α３６を内因的に発現する。好ましい実施形態では、細胞とは、ＥＲ−α３６を内因的に発現するがん細胞である。ＥＲ−α３６を発現するがん細胞の例として、乳がん細胞、白血病細胞、肺がん細胞、骨髄腫細胞、前立腺がん細胞、卵巣がん細胞、結腸がん細胞及び胃がん細胞が挙げられる。さらに好ましい実施形態では、ＥＲ−α３６を発現する細胞とは、ＥＲ−α３６を内因的に発現する乳がん細胞である。ＥＲ−α３６を発現する乳がん細胞の例は、ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞である。内因性ＥＲ−α３６の発現は、１種又は複数の薬剤による処置を通じて増加することもあれば減少することもある。そのような薬剤の例は血清、Ｅ２β（１７β−エストラジオール）、タモキシフェン及びＩＣＩ１８２，７８０である。
別の実施形態では、細胞を遺伝子工学で改変することで、外因性ＥＲ−α３６を発現させる。外因性ＥＲ−α３６を発現する細胞を、当業者に公知の遺伝子工学の手法で調製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を参照のこと）。簡潔に言えば、外因性のＥＲ−α３６遺伝子を調製して発現ベクター中に挿入し、宿主細胞にトランスフェクトし、次いで外因性ＥＲ−α３６を発現するのに適した培養溶液でこの宿主細胞を培養する。ヒトＥＲ−α３６の遺伝子配列の例が、Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３６、１０２３〜１０２７、（２００５）に開示されている（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＸ６４０９３９）。外因性ＥＲ−α３６を発現する細胞は、内因性ＥＲ−α３６を発現してもしなくてもよい。細胞における内因性又は外因性ＥＲ−α３６の発現レベルは、１種又は複数の他の薬剤による処置で増加することもあれば減少することもある。そのような薬剤の例は、血清、Ｅ２β（１７β−エストラジオール）、タモキシフェン及びＩＣＩ１８２，７８０である。ＥＲ−α３６を発現する細胞は、ＥＲ−α６６、ＥＲ−α４６及びＥＲ−βなどの他のエストロゲン受容体を発現してもしなくてもよい。
本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントは、単独で或いは１種若しくは複数の追加的処置手段又は薬剤と組合せで投与することができる。例えば、本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントは、化学療法と、放射線療法と、がん処置の外科手術（例えば、腫瘍摘出）と、化学療法から生じる合併症用の１種若しくは複数の鎮吐剤又は他の処置と、又は、ＥＲ−α３６で媒介されるがん若しくは任意の医学的障害の処置において使用する任意の他の処置剤との組合せで、投与することができる。これらの実施形態のいくつかでは、１種若しくは複数の追加的処置剤と組合せで投与される、本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントは、当該１種若しくは複数の追加的処置剤と同時に投与することができる。これらの実施形態のいくつかでは、抗体又は抗原結合性フラグメント及び当該追加的処置剤（複数可）は、同一の医薬組成物の一部として投与することができる。しかし、別の処置剤と「組合せで」投与される抗体又は抗原結合性フラグメントは、この薬剤と同一の組成物と同時に又はこの薬剤と同一の組成物として投与しなくてもよい。抗体又は抗原結合性フラグメント及び第２の薬剤が、異なる経路を介して投与される場合でも、本明細書でその句が使用される時、別の薬剤の前後に投与される抗体及び抗原結合性フラグメントは、当該薬剤と「組合せで」投与されるとみなされる。可能な場合、本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントと組合せで投与される追加的処置剤は、追加的処置剤の製品情報シートに掲載されているスケジュールにしたがって、又は医師用添付文書集２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第５７版； Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；第５７編集（２００２年、１１月））若しくは当業界で周知のプロトコルにしたがって投与される。処置剤の例として、それらに限定されないが、イカリチン、タモキシフェン、１７β−エストラジオール、ＩＣＩ１８２，７８０、参照により本明細書に組み込まれる、２００７年１０月２３日出願、米国特許出願第１１／８７７、５７５号に開示される化合物、参照により本明細書に組み込まれる、２００８年４月８日出願、米国特許出願第６０／０４６，２５５号に開示される化合物、サイトカイン、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ又はアバスチン）、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、ハーセプチン又はトラスツズマブ）、抗ＥＧＲＦ抗体（ニモツズマブ又はアービタックス）、並びに、ガパチニブ及びラパチニブなどのチロシン受容体阻害剤が挙げられる。
サイトカインの例としては、それらに限定されないが、リンホカイン、モノカイン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体ホルモン、肝細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子、ミュラー管退縮因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、インテグリン、トロンボポイエチン、ＮＧＦ−βなどの神経増殖因子、血小板増殖因子、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ、エリスロポイエチン、骨誘導因子、インターフェロン−α、−β、及び−γなどのインターフェロン、マクロファージＣＳＦ、顆粒球マクロファージＣＳＦ、果粒球ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、及びＩＬ−１２などのインターロイキン、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子、並びに他のポリペプチド因子が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントは、１種若しくは複数の化学療法剤と連結することにより、コンジュゲートすることにより、又は組合せることにより使用する。化学療法剤の例としては、それらに限定されないが、アムルビシン、アトラセンタン バタブリン、カルシトリオール、シレンジチド、ダサチニブ、デカタニブ、エドテカリン、エンザスタウリン、エルロチニブ、エベロリムス、ジマテカン、ゴシポール イピリムマブ、ロナファルニブ、ルカントン、ノイラジアブ、ノラトレキセド、オブリメルセン、オファツムマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パゾパニブ ルビテカン、タランパネル、テムシロリムス、テスミリフェン、テトランドリン、チシリムマブ、トラベクテジン、バンデタニブ、ビテスパン、ザノリムマブ、ゾレンドロネート、ヒストレリン、アザシチジン、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ケトコナゾール、ナイトロジェンマスタード、イブリツモマブ チウキセタン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、エディトロネート、シクロスポリン、エドウィナ−アスパラギナーゼ、及びストロンチウム８９が挙げられる。
様々なコンジュゲートが本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメントと連結することができると考えられる（例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ及びＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ．（編集）、Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８９）を参照のこと）。これらのコンジュゲートは、様々な方法の中でもとりわけ、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、錯体形成、会合、配合、又は付加により、抗体又は抗原結合性フラグメントに連結することができる。必要であるなら、コンジュゲーションへの部位を提供するように、特定の部位をエピトープ結合部分の外側に工学的に作出することができる。例えば、抗体又はその抗原結合性フラグメントを工学的に作出して、例えば、システイン、ヒスチジン、リシン、グルタミン若しくはメチオニン残基又は上述のＮＮＡＡなどの、１つ又は複数の反応性アミノ酸残基を含めることで、コンジュゲートへの共有連結を促進することができる。
ある特定の実施形態では、抗体は、間接的に、又は別のコンジュゲートを通じて若しくはリンカーを通じて、コンジュゲートに連結することができる。例えば、抗体又は抗原結合性フラグメントは、ビオチンにコンジュゲートし、次いでアビジンにコンジュゲートしている第２のコンジュゲートに間接的にコンジュゲートすることができる。例えば、システインへの連結用の（６−マレイミドカプロイル）ヒドラゾンリンカー、リシンへの連結用の４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸、リシンへの連結用の４−メルカプトペンタノエート、及びシステインへの連結用のバリン−シトルリンリンカーなど、様々なリンカーを使用して、抗体上の残基にコンジュゲートを連結することができる（例えば、Ｄｕｃｒｙ，Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２１巻、１号、２０１０を参照のこと）。システインリンカー抗体コンジュゲートを調製するために、抗体又はそのフラグメントを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、又はアミノエタンチオールなどの還元剤で部分的に還元し、遊離のチオール基をもたらすことができる。このチオール基は、バリン−シトルリンが連結したモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）などの、コンジュゲートを連結したリンカーで、引き続いてアルキル化される。しかし、代替の実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントを還元せずに使用して、例えば、抗体若しくは抗原結合性フラグメント配列に遊離システインを挿入することで、又は、遊離Ｓメチル化システインを挿入し、続いて挿入したＳメチル化システインを脱メチル化することで、システインリンカー抗体コンジュゲートを得ることができる。同様に、メチオニンを脱メチル化すると、リンカー若しくは小分子（例えば薬物）などの別の分子とさらにコンジュゲートすることができる、チオール又はスルフヒドリル基（−ＳＨ）が生成する。調製した抗体コンジュゲートは、さらに精製し、試験に付すことができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントに連結するコンジュゲート及びリンカーは、１つ若しくは複数の薬剤又は官能基を含むことができる。このような薬剤又は官能基は、１つ若しくは複数の薬物動態（ＰＫ）特性（例えば、半減期を増加すること）を改変するためのものであり、又は、抗体及若しくは抗原結合性フラグメントの免疫原性を低下するためのものである。そのような薬剤又は官能基には、制限されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グルクロン酸若しくは他の糖をベースとしたリンカー、スクシンイミジル環の加水分解速度を高め、且つ逆マイケル反応の速度を低下させ若しくは最小化することができ、したがって薬物の損失速度を低下させ若しくは最小化する、極性のある、正若しくは負に荷電した基、並びに抗体若しくは抗体フラグメントから他のチオール含有タンパク質及び小分子までのリンカー基が含まれ得る。
ある特定の実施形態では、本開示は抗体薬物コンジュゲートを提供する。抗体薬物コンジュゲートは、１つ又は複数の薬物部分に共有結合した、本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントを含む。ある特定の実施形態では、抗体薬物コンジュゲートは式Ａｂ（−Ｌ−Ｄ）nを有する（式中、Ａｂは本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントであり、Ｄは薬物であり、Ｌは薬物を抗体又は抗原結合性フラグメントに結合させているリンカーであって、このリンカーは標的細胞又は組織の存在下で開裂できても開裂できなくてもよく、ｎは１〜６０の範囲にある整数である）。
あらゆる種類のリンカーを使用することができる。適切なリンカーの例としては、それらに限定されないが、マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバモイル（ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ）、ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ及びＭＢ−ｖｃが挙げられる。ある特定の実施形態では、リンカー（すなわちＬ）は、マレイミドカプロイル（例えば式（ＩＩ）を参照のこと）、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバモイル（例えば式（ＩＩＩ）を参照のこと）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（例えば式（Ｖ）を参照のこと）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（例えば式（ＶＩ）を参照のこと）及びＭＢ−ｖｃ（例えば式（ＩＶ）を参照のこと）からなる群から選択される。例示的なリンカーの構造を以下に示す。
本明細書で使用する時、用語「薬物」は処置剤又は好ましくは細胞毒性剤を指す。薬物の例としては、それらに限定されないが、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、デュオカルマイシン、並びに、Ｎ2'−デアセチル−Ｎ2'−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）及びＮ2'−デアセチル−Ｎ2'−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ４）などのメイタンシノイドが挙げられる。
本明細書では、式（ＶＩＩ）に示すＡｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（式中、「ｓ」は１から２０までの範囲にある整数である）；式（ＶＩＩＩ）に示すＡｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦ（式中、「ｔ」は１〜２０の範囲にある整数である）；式（ＩＸ）に示すＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（式中、「ｖ」は１〜６０の範囲にある整数である）；式（Ｘ）に示すＡｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（式中、「ｕ」は１〜６０の範囲にある整数である）；式（ＸＩ）に示すＡｂ−ＭＢ−ｖｃ−デュオカルマイシン（式中、「ｙ」は１〜２０の範囲にある整数である）などの好ましい抗体薬物コンジュゲートの構造も提供されている：
（式中、「ｓ」は１〜２０の範囲にある整数であり、「ｔ」は１〜２０の範囲にある整数であり、「ｕ」は１〜６０の範囲にある整数であり、「ｖ」は１〜６０の範囲にある整数であり、「ｙ」は１〜２０の範囲にある整数であり、且つ、「Ａｂ」は本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントである）。
抗体薬物コンジュゲートでは、特に式Ａｂ（−Ｌ−Ｄ）nを有する抗体薬物コンジュゲートでは、リンカーは、一方の末端で抗体又は抗原結合性フラグメントの反応基と反応することができ、且つ、他方の末端で薬物部分の別の反応基と反応することもでき、そのことにより、当該抗体と当該薬物とを連結して、抗体薬物コンジュゲートを形成する。
ある特定の実施形態では、リンカーは、抗体又はその抗原結合性フラグメントのシステイン上のチオール基と反応することができる。抗体又は抗原結合性フラグメントの任意の適切なシステイン残基を、リンカー反応に利用することができる。ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントは、リンカーとの反応に利用可能な限られた数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）のシステインチオール基を有する。例えば、抗体又は抗原結合性フラグメントに存在するいくつかのジスルフィド結合を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤を使用して還元し、リンカー反応に向けて１つ又は複数のチオール基を放出することができる。抗体のチオール基との反応に適したリンカーとしては、限定されないが、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ、ｍｃ、及びＭＢ−ｖｃが挙げられ得る。リンカーがシステインチオール基と反応している抗体薬物コンジュゲートの例は、Ａｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、Ａｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦ及びＡｂ−ＭＢ−ｖｃ−デュオカルマイシンである。
ある特定の実施形態では、リンカーは抗体又はその抗原結合性フラグメントのリシン残基上のアミノ基と反応することができる。一実施形態では、リンカーによって、抗体のリシン残基とチオエーテル部分又はジスルフィド結合も含有する活性化エステルとの間に形成された共有アミド結合を通じて、抗体又は抗原結合性フラグメントはメイタンシノイドなどの薬物に結合している。好ましいメイタンシノイドとはＤＭ１及びＤＭ４である。ＤＭ１及びＤＭ４の構造は、それぞれ、式（ＸＩ）及び式（ＸＩＩ）として例示されている。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントの分子は、２分子以上の薬物部分とコンジュゲートすることができる。例えば、抗体又は抗原結合性フラグメントは、リンカー反応に向けて２つ以上の反応基を含むことができ、そのことにより２つ以上のリンカー又は薬物部分のコンジュゲーションがもたらされる。そのような場合、抗体薬物コンジュゲートは、ある特定の分布で様々な数のコンジュゲートしたリンカー又は薬物部分を有するコンジュゲートの混合物であってもよい。抗体１つ当たりの薬物部分の平均数は、加重平均、Σｉ*（Ａｂ−（ＬＤ）i％）として算出することができ、式中、ｉは１つの抗体又は抗原結合性フラグメントの薬物部分の数であり、ここではＡｂ−（ＬＤ）iとして示され、且つ０から６０までの範囲である。特定種それぞれの、Ａｂ−（ＬＤ）iの百分率は（Ａｂ−（ＬＤ）i）％として示されている。ＡＤＣ混合物の装てん（薬物／抗体比、又はＤＡＲ）は、以下の１つ又は全てを含む、異なる方法で制御することができる：（ｉ）抗体に対する薬物−リンカー中間体又はリンカー剤のモル過剰を制限すること、（ｉｉ）コンジュゲーション反応の時間又は温度を制限すること、（ｉｉｉ）システインチオール修飾に対する部分的又は制限還元条件、並びに、抗体又は抗原結合性フラグメントの重鎖及び／若しくは軽鎖に導入される、遊離システイン、メチオニン、又はＮＮＡＡの数を制御すること。
好ましい実施形態では、リンカーはポリエチレングリコール部分、例えば、Ａｂ−ＭＢ−ｖｃ−デュオカルマイシンを含む。リンカーのＰＥＧ部分は１から５０までの間の単位長さでもよい。好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分は１〜１２の繰り返し単位を、より好ましくは２〜６の繰り返し単位を有する。ＰＥＧ部分により、薬物の抗体へのコンジュゲーション中に生じることがある凝集の程度が低下する。
別の好ましい実施形態では、リンカーはペプチド配列を含む。ペプチドリンカーを有する抗体薬物コンジュゲートの例として、限定されないが、ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ及びＭＢ−ｖｃ−デュオカルマイシンが挙げられる。ある特定の実施形態では、例えば腫瘍関連プロテアーゼによる選択的酵素開裂に対する、ペプチド配列の適合性に基づいて、ペプチド配列のアミノ酸配列を選択することができる。好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは２アミノ酸リンカー、ｖａｌ−ｃｉｔを含む。しかし、２つ以上の２アミノ酸残基を備える、他のアミノ酸の組合せが、同じように作用可能なことも知られている。
一実施形態では、コンジュゲートのリンカーは非開裂リンカー及び開裂リンカーを含む。非開裂リンカーとは、安定した共有結合の様式で、薬物を抗体又は抗原結合性フラグメントに連結することができる任意の化学的部分である。非開裂リンカーに結合した薬物は抗体配列の分解により放出され、リンカーに結合しているアミノ酸（リシン又はシステインなど）はフリーとなる。非開裂リンカーは、酸誘導開裂、光誘導開裂、ペプチダーゼ誘導開裂、エステラーゼ誘導開裂、及びジスルフィド結合開裂に対して実質的に耐性である。非開裂リンカーの例として、アミド結合並びにＳＭＣＣ及びｍｃなどのチオエーテルを含むリンカーが挙げられる。開裂リンカーは、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、光、酸、又は、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル及びＭＢ−ｖｃなどのジスルフィド結合切断により、開裂することができる。抗体はそのままの状態で、抗体からの開裂リンカーから薬物を放出することが可能である。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントに連結するコンジュゲートは、１つ又は複数の検出可能な標識を含むことができる。そのような標識としては、それらに限定されないが、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、3Ｈ、111Ｉｎ、112Ｉｎ、14Ｃ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、86Ｙ、88Ｙ、90Ｙ、177Ｌｕ、211Ａｔ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、153Ｓｍ、212Ｂｉ、及び32Ｐなどの放射性同位体、他のランタニド、発光標識、例えばフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、又はテキサスレッドなどの蛍光標識、並びに、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの酵素基質標識が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントに連結するコンジュゲートは、１つ又は複数の毒素を含むことができる。毒素は同一でも、異なってもよい。異なる毒素とは、同一の又は異なる作用メカニズム（ＭＯＡ）を有する異なる分子が、同一のｍａｂ又はｍａｂフラグメントに装着されていることを意味する。そのような毒素を、ＥＲ−α３６を発現している細胞に対して標的化し、そのことにより標的細胞で細胞傷害性を発揮することができる。適切な毒素としては、限定されないが、ｖｃ若しくはｍｃなどのリンカーを介するＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）などのオーリスタチン、ＤＭ１、ＤＭ３及びＤＭ４（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）などのメイタンシン、カリケアマイシン（Ｐｆｉｚｅｒ）、デュオカルマイシン（Ｓｙｎｔｈｏｎ）、ＰＢＤダイマー（Ｓｐｉｒｏｇｅｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｒｏｃｈｅ、ＵＳ８４２６４０２を参照）、並びに、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤としてアマトキシン（例えばアマニチン）（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｐｈａｒｍａ）が挙げられる。
コンジュゲートに連結した抗体及びその抗原結合性フラグメントの使用方法も、本明細書で提供されている。ある特定の実施形態では、コンジュゲートした抗体及び抗原結合性フラグメントを処置有効量で対象に投与し、そのことによりＥＲ−α３６関連疾患を処置、予防、若しくは緩和し、ＥＲ−α３６発現細胞の増殖を阻害し、ＥＲ−α３６発現細胞を低減し、及び／又はＥＲ−α３６発現細胞を殺傷することが可能である。抗体及び抗原結合性フラグメントは、ＥＲ−α３６発現細胞を特異的に標的とし、そのことにより、コンジュゲート（例えば、毒素、化学療法剤）を、コンジュゲートが処置効果を発揮するＥＲ−α３６発現細胞に特異的に誘導する。コンジュゲート剤のそのような標的送達により、コンジュゲートの効能が著しく改良され得、且つ非特異的活性により生じる毒性が大幅に低減され得る。ある特定の実施形態では、コンジュゲートした抗体又は抗原結合性フラグメントとして投与される場合、当該コンジュゲートの処置有効モル量は、本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメントにコンジュゲートされていない場合に必要となるであろう量より低くなりうる（例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又はそれより高い）。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメントは、１種又は複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の一部として投与することができる。本明細書で開示される医薬組成物に使用する薬学的に許容される担体として、例えば、薬学的に許容される液体、ゲル、若しくは固体担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張化剤、緩衝剤、抗酸化剤、麻酔薬、懸濁化／ディスペンディング剤、金属イオン封鎖剤若しくはキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は無毒性補助物質、当業界で公知の他の成分、或いはそれらの様々な組合せを挙げることができる。
適切な成分としては、例えば、抗酸化剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、防腐剤、潤滑剤、香料、増粘剤、着色剤、乳化剤又は糖及びシクロデキストリンなどの安定剤が挙げられ得る。適切な抗酸化剤としては、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチルヒドロキサニソール、ブチルヒドロキシトルエン、及び／又は没食子酸プロピルが挙げられ得る。本明細書で開示のように、本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメント及びコンジュゲートを含む組成物に、メチオニンなどの１種又は複数の抗酸化剤を含めることで、抗体又は抗原結合性フラグメントの酸化が減少する。この酸化の低下により、結合親和性の喪失が防止され又は低下し、そのことにより抗体の安定性が改善され且つ保存期間が最大化する。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で開示される１種若しくは複数の抗体又は抗原結合性フラグメント、及びメチオニンなどの１種又は複数の抗酸化剤を含む組成物が提供される。さらに本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメントをメチオニンなどの１種又は複数の抗酸化剤と混合することにより、当該抗体又は抗原結合性フラグメントの酸化を防止するための、その保存期間を延長するための、及び／又はその効能を改善するための方法が提供される。
さらに例示すると、薬学的に許容される担体として、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液、若しくはデキストロース及び乳酸リンゲル注射液などの水性ビヒクル、植物性不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、若しくはピーナッツ油などの非水性ビヒクル、静菌若しくは静真菌類濃度の抗菌剤、塩化ナトリウム若しくはデキストロースなどの等張剤、リン酸若しくはクエン酸緩衝剤などの緩衝剤、硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩酸プロカインなどの局所麻酔薬、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース若しくはポリビニルピロリドンなどの懸濁化剤及び拡散剤、ポリソルベート８０（ツウィーン８０）などの乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）若しくはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）などの金属イオン封鎖剤又はキレート剤、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、或いは乳酸が挙げられ得る。担体として利用される抗菌剤を、フェノール若しくはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル及びプロピルエステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムを含む、バイアル瓶中の医薬組成物に添加することができる。適切な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、又はエタノールが挙げられ得る。適切な無毒性補助物質としては、例えば、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解促進剤、又は酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレート、若しくはシクロデキストリンなどの薬剤が挙げられ得る。
本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメントの処置有効用量は、例えば、体重、年齢、病歴、現在の医薬処置、対象の健康状態、および交差反応、アレルギー、感受性及び有害な副作用、並びに、投与経路及び腫瘍進行の程度などの、当分野で公知の様々な要因に左右される。用量は、これらの及び他の状況又は要件により示されるように、当業者（例えば、内科医又は獣医）によって按分に増減することが可能である。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメントを、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、又は約１００ｍｇ／ｋｇ）の処置有効用量で投与できる。これらの実施形態のいくつかでは、抗体又は抗原結合性フラグメントは、約５０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与され、及びこれらの実施形態のいくつかでは、用量は１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下、又は０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。ある特定の実施形態では、投与用量は処置の過程にわたって変えることができる。例えば、ある特定の実施形態では、初期の投与用量はそれ以降の投与用量より高くてもよい。ある特定の実施形態では、投与用量は、対象の反応に応じて処置の過程にわたって変わりうる。
用量レジメンを調整して、最適な望ましい応答（例えば、処置応答）を実現することができる。例えば、単回投与で投与してもよく、又は経時的に数次分割投与で投与してもよい。
本明細書で開示される抗体及び抗原結合性フラグメントは、当業界で公知の任意の経路で、例えば、腸管外（例えば、皮下、腹腔内、静脈内注入を含む静脈内、筋肉内、又は皮内注射）又は非腸管外（例えば、経口、鼻腔内、眼内、舌下、直腸、又は局所）の経路で投与することができる。抗体又は抗原結合性フラグメントが注射を介して投与される実施形態では、注射可能な医薬組成物を、例えば、液体溶液、懸濁液、乳濁液、又は、液体溶液、懸濁液若しくは乳濁液を作出するのに適した固体形態などの、任意の従来形態で調製することができる。注射用の調製物としては、注射に備えた無菌及び／又は非発熱性溶液、皮下注射用錠剤を含む、使用直前に溶媒と混合可能な凍結乾燥粉末など無菌乾燥可溶性製品、そのまま注射可能な無菌懸濁液、使用直前にビヒクルと混合可能な無菌乾燥不溶性製品、並びに、無菌及び／又は非発熱性乳濁液が挙げられ得る。このような溶液は水性であっても非水性であってもよい。
ある特定の実施形態では、単位用量腸管外調製物は、アンプル、バイアル、又は針付注射器にパッケージされる。腸管外投与の調製物は全て、当業界で公知であり且つ実施されているように、無菌及び非発熱性でなければならない。
ある特定の実施形態では、無菌、凍結乾燥粉末は、本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントを適切な溶媒に溶解させることで調製する。溶媒は、賦形剤を含有することができ、この賦形剤により、安定性又は粉末若しくは粉末から調製した再構成液の他の薬理学的成分を改善する。使用可能な賦形剤としては、それらに限定されないが、水、デキストロース、ソルビタール、フラクトース、トウモロコシシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、又は他の適切な薬剤が挙げられる。溶媒は、クエン酸、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カリウムなどの緩衝剤、又は当業者に公知の、一実施形態ではほぼ中性ｐＨである、他の緩衝剤を含有することができる。続いて溶液の殺菌ろ過を行い、次に当業者に公知の標準条件下で凍結乾燥を行うことで、望ましい製剤が得られる。一実施形態では、得られた溶液は凍結乾燥のためバイアルに配分される。各バイアルは、抗ｈＥＲ抗体若しくはその抗原結合性フラグメント又はそれらの組成物の単一用量或いは複数用量を含有することができる。正確に試料を取り出せるように且つ正確に投与できるように、用量若しくは用量のセットに必要とされる量を超えて、少量だけバイアルを過剰充填（例えば、約１０％）することが許容される。凍結乾燥粉末は、約４℃から室温などの、適切な条件下で保存可能である。
注射用に凍結乾燥粉末を水で再構成することで、腸管外投与において使用するための製剤が提供される。一実施形態では、再構成のため、無菌及び／若しくは非発熱性水又は他の適切な液体担体が凍結乾燥粉末に添加される。正確な量は、与えられている選択された処置に左右され、且つ経験的に決定することができる。
本明細書で提供される抗体及び抗原結合性フラグメントを様々な非処置的用途で使用することができる。ある特定の実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントを親和性精製剤として使用し、ＥＲ−α３６又はそのフラグメントを精製することができる。これらの実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントを、当業界に公知の方法を使用して樹脂又はろ紙などの固相に固定化することができる。抗体又は抗原結合性フラグメントを使用して、溶液からＥＲ−α３６又はそのフラグメントを沈殿させることもできる。他の非処置的実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントを、ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断又は検出用途において様々に使用することができる。これらの実施形態のいくつかでは、抗体又は抗原結合性フラグメントを検出可能な標識にコンジュゲートすることができる。他の実施形態では、抗体又は抗原結合性フラグメントは、検出可能な標識にコンジュゲートしていなくてもよいが、当該抗体に結合する標識二次抗体を使用して検出することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体及び抗原結合性フラグメントを使用して、ＥＲ−α３６発現を検出することができる。これらの実施形態のいくつかでは、抗体又は抗原結合性フラグメントを使用して、ＥＲ−α３６発現の増減と関連した状態を診断することができる。例えば、対象のＥＲ−α３６発現の増減と関連した状態を、特に、ＥＲ−α３６と関連した状態の進行又は後退を診断するために、抗体又は抗原結合性フラグメントを対象に由来する生物学的試料と接触させることができる。同様に、当分野で公知の方法を使用して検出されるＥＲ−α３６に結合させて、抗体又は抗原結合性フラグメントを対象に直接投与することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書の抗体又は抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸、そのような核酸を含むベクター及び宿主細胞、並びに、当該抗体を産生するための組換え技法が提供される。
抗体の組換え産生に関して、抗体をコードする核酸を単離し、さらにクローニング（ＤＮＡの増幅）するために又は発現させるために、複製可能なベクターに挿入することができる。別の実施形態では、当分野で公知の相同的組換えにより抗体を産生することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することで）配列が決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分としては、それらに限定されないが、次の１つ又は複数が一般に挙げられる：シグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
本明細書で、ベクターのＤＮＡをクローニングするのに又は発現するのに適した宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的に適した原核生物はグラム陰性又はグラム陽性生物などの真正細菌を含み、例えば、大腸菌属、例えばＥ．ｃｏｌｉ、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、セラチア属、例えばＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びシゲラ属などの腸内細菌科、並びに、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのバチルス属、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのシュードモナス属、及びストレプトミセス属を含む。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、抗ＥＲ抗体をコードするベクターに、クローニング又は発現の適切な宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又は通常のパン用酵母は、下等真核宿主微生物の内で、最も通常に使用されている。しかし、本明細書で、他の属、種、及び株のいくつかが、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなどのクルイベロミセス属宿主；ヤロウイア属（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ属；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのシュワニオミセス属、並びに、例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属、及びＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒなどのアスペルギルス属宿主などの糸状菌などが、通常に入手可能で且つ有用である。
本明細書で提供されるグリコシル化抗体又は抗原フラグメントの発現に適した宿主細胞は多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及びバリアント、並びに、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（カ）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（カ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（キイロショウジョウバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉなどの宿主に由来する、対応する昆虫の許容宿主細胞が同定されている。トランスフェクション用の様々なウイルス株が、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１バリアント及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株が公に入手可能で、そのようなウイルスを、本発明による本明細書でのウイルスとして、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクション用に使用することができる。ワタ、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養物を宿主として使用することもできる。
しかし、関心は脊椎動物細胞において最も大きく、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖が常法となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での成長のためサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ Ｇ２）がある。
宿主細胞は、抗ＥＲ抗体を産生するため上記発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導することに、形質転換体を選択することに、又は望ましい配列をコードする遺伝子を増幅することに応じて改変された、従来の栄養培地で培養される。
本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメントを産生するのに使用する宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販培地が、宿主細胞の培養に適している。加えて、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；又は第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；又は米国再発行特許第３０，９８５号に記載のどの培地でも宿主細胞の培養培地として使用できる。これらのうちのどの培地でも、必要に応じて（インスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子などの）ホルモン及び／又は他の増殖因子、（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩などの）塩類、（ＨＥＰＥＳなどの）緩衝液、（アデノシン及びチミジンなどの）ヌクレオチド、（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬などの）抗生物質、（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）微量元素、並びにグルコース又は同等のエネルギー源で補うことができる。任意の他の必要な栄養補助剤を、当業者に公知の適切な濃度で含むこともできる。温度、ｐＨ等などの培養条件は、発現用に選択した宿主細胞であらかじめ用いられている条件であり、当業者には明らかであろう。
組換え技法を使用すると、抗体を、細胞内で、細胞周辺腔で、産生することができ、又は培地に直接に分泌させることができる。細胞内で抗体を産生する場合、第一ステップとして、微粒子残渣、宿主細胞又は溶解フラグメントのいずれかを、例えば遠心分離又は限外濾過で除去する。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３〜１６７（１９９２）には、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔内に分泌される抗体を単離する手順が記載されている。簡潔に言えば、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分かけて解凍する。細胞残渣は遠心分離で除去することができる。そこで、抗体を培地に分泌させ、かかる発現系に由来する上澄み液を、市販のタンパク質濃度フィルター、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）又はミリポアペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過ユニットを使用して、一般にまず濃縮する。前述のステップのいずれかにおいて、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を含ませてタンパク質分解を阻害することができ、且つ抗生物質を含ませて外来性の汚染物の成長を防止することができる。
細胞から調製した抗体は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製できるが、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技法である。親和性リガンドとしてプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトガンマ１、ガンマ２又はガンマ４重鎖をベースとした抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３（１９８３））。マウスの全てのアイソタイプ対して及びヒトガンマ３に対してはプロテインＧが推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７〜１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスはアガロースであることが非常に多いが、他のマトリックスも利用できる。制御された細孔性ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスによって、アガロースで達成され得るよりも、流速を速めること及び処理時間を短縮することが可能となる。抗体がＣH3ドメインを含む場合、精製にはＢａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなどの）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカッシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製に関する他の技法も、回収する抗体に応じて利用可能である。
任意の予備精製ステップ（複数可）に続いて、目的の抗体及び汚染物を含む混合物を、約２．５〜４．５の間のｐＨにある溶出緩衝液を使用して、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに付すことができるが、低塩濃度で（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）実施するのが好ましい。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合性フラグメントは、キットで、すなわち、所定量の薬剤類と診断アッセイを実施するための指示書とを組み合わせたパッケージで提供することができる。抗体が酵素で標識されている場合、キットには、酵素に必要な基質及びコファクター（例えば、検出可能な発色団又は発蛍光団を提供する基質前駆物質）を含む。加えて、安定剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液又は溶解緩衝液）等などの他の添加剤を含んでもよい。様々な薬剤の相対的量を幅広く変えることで、アッセイの感度を実質的に最適化するような薬剤の溶液での濃度が実現されうる。特に、溶解に際して適切な濃度を有する薬剤溶液をもたらすような賦形剤を含む、通常は凍結乾燥した、乾燥粉末として薬剤を用意してもよい。
ある特定の実施形態では、上記の状態の処置に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は容器及びラベルを含む。適切な容器として、例えば、ボトル、バイアル、注射器、及び試験管が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料で形成することができる。容器は、状態を処置するのに効果的な、（本明細書で開示される抗体又は抗原結合性フラグメントを含む）本明細書で提供される医薬組成物を保持し、且つ、殺菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は静脈用溶液バッグ、又は皮下注射針で突き刺すことのできるストッパーを有するバイアルであってもよい）。容器上の又は容器に関連付けられたラベルには、組成物が選択された状態を処置するのに使用される旨が示されている。製造物品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝剤を含む第２の容器をさらに含むことができる。製造物品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、及び使用指示書と共に添付文書を含む、商業及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
以下の実施例は、特許請求される発明をより分かりやすく例示するために提供するものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。下記の全ての特定の組成物、材料、及び方法は、それらの全て又は一部は、本発明の範囲に包合される。これらの特定の組成物、材料、及び方法は、本発明を限定することを意図するものではなく、単に本発明の範囲に包合される特定の実施例を例示することを意図するものである。当業者は、発明能力の訓練をすることなく、及び本発明の範囲から逸脱することなく、同等の組成物、材料、及び方法を開発することが可能である。様々な変形が本明細書に記載の手順においてなし得るとともに、様々な変形がなお本発明の範囲内にあることが理解されよう。かかる変形は本発明の範囲に含まれるということが、本発明者の意図するところである。
組換えタンパク質作製及びＥＲ−α３６発現細胞の樹立。
組換えＥＲ−α３６タンパク質を、免疫化のために及び以下の方法により作製した。
ＥＲ−α３６のリガンド結合ドメインのリガンド結合ドメイン及びＦｃの融合タンパク質（ＬＢＤ−ＥＲ−α３６＿Ｆｃ）
Ｆｃは、組換え方法によりＥＲ−α３６リガンド結合ドメインのＣ末端に融合した。ＬＢＤ−ＥＲ−α３６＿Ｆｃを発現するベクターを構築した。ＥＲ−α３６のリガンド結合ドメインは、配列番号１の１６６位アミノ酸から３１０位アミノ酸にわたる。プラスミドｐＥＴ３０ａ−ＥＲ−α３６ ＬＢＤ−Ｆｃは以下の方法を用いて構築した。ヒトＥＲ−ａ３６完全長遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ部位にクローニングし、挿入配列は、Ｔ７フォワードプライマー及びＢＧＨリバースプライマーを用いてＤＮＡ配列検証により確認した。Ｎ末端ｍｙｃタグ及びコザック配列を有するヒトＥＲ−α３６もｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターのＮｈｅＩ／ＸｂａＩ部位にクローニングし、挿入した。挿入配列は、ＣＭＶフォワードプライマー及びＢＧＨリバースプライマーを用いてＤＮＡ配列検証により確認した。プラスミドＤＮＡをＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）に形質転換した。新鮮な形質転換体をピックアップし、３０Ｌ ＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ）で３７℃で培養した。タンパク質発現は、培養ＯＤ６００が０．６に達するときに、最終濃度０．５ｍＭまでＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ）を添加して誘導した。誘導４時間後に４℃、３０分間、７，０００ｇの遠心分離により細胞を回収した。３００ｍｌのタンパク質抽出緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．０Ｍ尿素、１％トリトンＸ１００、ｐＨ８．０）中の組換えＥＲ−α３６ ＬＢＤ−Ｆｃを発現する３０グラムの細菌細胞を、超音波処理（３５０Ｗ、３×４５バースト）により溶解した。４℃、３０分間、２０，０００ｇの遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ ｈＡｖａｎｔｉ Ｊ−２６ＸＰ）後に可溶性タンパク質を上清から回収し、２０ｍｌ ＣａｐｔｉｖＡ ＰｒｉＭＡＢカラム（ＲｅｐｌｉＧｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に投入した。カラムを平衡化し、Ａ２８０値がベースラインに達するまでＣａｐｔｉｖＡ ＰｒｉＭＡＢ緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）により洗浄した。組換えＥＲ−α３６ ＬＢＤ−Ｆｃタンパク質を次いでＣａｐｔｉｖＡ ＰｒｉＭＡＢ緩衝液Ｂ（１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５）によりＣａｐｔｉｖＡ ＰｒｉＭＡＢカラムから溶出した。タンパク質溶出画分を一緒にプールし、最後に透析により保存緩衝液に交換した。最終精製タンパク質を透析し、−８０℃で保存緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．３）に保存した。
ＦＣ＿ＬＢＤ−ＥＲ−α３６
Ｆｃは、組換え方法によりＥＲ−α３６リガンド結合ドメインのＮ末端に融合した。プラスミドｐＥＴ３０ａ−Ｆｃ−ＥＲ−α３６ ＬＢＤは以下の方法を用いて構築した：プラスミドＤＮＡをＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。新鮮な形質転換体をピックアップし、３０Ｌ ＬＢ培地で３７℃で培養した。タンパク質発現は、培養ＯＤ６００が０．６に達するときに、最終濃度０．５ｍＭまでＩＰＴＧを添加して誘導した。誘導４時間後に４℃、３０分間、７，０００ｇの遠心分離により細胞を回収した。３００ｍｌのタンパク質抽出緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．０Ｍ尿素、１％トリトンＸ１００、ｐＨ８．０）中の組換えＦｃ−ＥＲ−α３６ ＬＢＤを発現する３０グラムの細菌細胞を、超音波処理（３５０Ｗ、３×４５バースト）により溶解した。４℃、３０分間、２０，０００ｇの遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ ｈＡｖａｎｔｉ Ｊ−２６ＸＰ）後に可溶性タンパク質を上清から回収し、２０ｍｌ ＣａｐｔｉｖＡ ＰｒｉＭＡＢカラムに投入した。カラムを平衡化し、Ａ２８０値がベースラインに達するまでＣａｐｔｉｖＡ ＰｒｉＭＡＢ緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）により洗浄した。組換えＦｃ−ＥＲ−α３６ ＬＢＤタンパク質を次いでＣａｐｔｉｖＡ ＰｒｉＭＡＢ緩衝液Ｂ（１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５）によりＣａｐｔｉｖＡ ＰｒｉＭＡＢカラムから溶出した。タンパク質溶出画分を一緒にプールし、最後に透析により保存緩衝液に交換し、−８０℃で保存緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．３）に保存した。
ＥＲ−α３６組換え細胞調製
ヒトＥＲ−α３６完全長遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターのＢａｍＨ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ部位にクローニングし、挿入配列は、Ｔ７フォワードプライマー及びＢＧＨリバースプライマー（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ配列検証により確認した。Ｎ末端ｍｙｃタグ及びコザック配列を有するヒトＥＲ−α３６もｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターのＮｈｅＩ／ＸｂａＩ部位にクローニングし、挿入した。挿入配列は、ＣＭＶフォワードプライマー及びＢＧＨリバースプライマーを用いてＤＮＡ配列検証により確認した。
ＣＨＯＫ１、ＮＩＨ３Ｔ３又はＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）を約７５％コンフルエンス又は１×１０6細胞／ｍｌまで培養し、次いでＣＨＯＫ１及びＮＩＨ３Ｔ３についてはリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、又はＨＥＫ２９３についてはＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）により、細胞にＥＲ−α３６ ＤＮＡプラスミドをトランスフェクトした。
安定な細胞系開発のために、細胞をトランスフェクション後２４時間継代し、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含む新鮮な選択培地培地に交換した。選択培地を３日ごとに更新し、選択手順を２〜３週間継続し、次いでトランスフェクタントを９６ウェルプレートに１細胞／ウェルで限界希釈によりサブクローニングした。単一のコロニー増殖ウェルからのサブクローンを６ウェルプレートに拡大し、フローサイトメトリーによりスクリーニングした。４〜５個の陽性クローンをさらに拡大し、凍結保存し、安定性試験用に維持した。
一過性トランスフェクションのために、トランスフェクト細胞は完全培地でさらに４８時間培養した。次いで細胞の一部を回収し、ＥＲ−α３６特異的抗体又はｃｍｙｃ融合タグ抗体（Ａｂｃａｍ）を用いたトランスフェクション効率及び発現レベル試験に関するウエスタンブロット用に、細胞溶解物を調製した。７２〜９６時間後、細胞を動物免疫化、細胞ベースの結合アッセイ、又は細胞溶解物調製のために回収した。
抗体生成及びスクリーニング
抗原及び免疫原調製
ＥＲ−α３６に対して生成される抗体の多様性を最大化するために、１）ＥＲ−α３６由来Ｃ末端ペプチド、２）リガンド結合ドメイン及びＣ末端の２７アミノ酸の両方を含有する組換えＥＲ−α３６タンパク質、並びに３）一過性若しくは安定トランスフェクションを用いて樹立された完全長ＥＲ−α３６タンパク質を発現する細胞系、又は膜上に高レベルのＥＲ−α３６タンパク質を発現する天然に存在する細胞系、を含む３つの異なるタイプの抗原をＥＲ−α３６抗体作製用に使用した。
以下の配列の配列＃１）ＧＩＳＨＶＥＡＫＫＲＩＬＮＬＨＰＫＩＦＧＮＫＷＦＰＲＶＣ及び２）ＧＩＳＨＶＥＡＫＫＲＩＬＮＬＨＰＫＩＦＧＣを有するＥＲ−α３６由来Ｃ末端のペプチドを、固体化学方法を用いて合成し、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）（Ｓｉｇｍａ）とコンジュゲートした。合成したペプチドは、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ（Ｗａｔｅｒｓ）による９５％を超える純度を有した。Ｃ末端の２７ａａの合成ペプチドを次いでヘテロ二官能性リンカーを介してＫＬＨ担体タンパク質にコンジュゲートした。非コンジュゲートペプチド及びリンカーをＰＢＳ、ｐＨ７．２に対するコンジュゲートの透析により除去した。精製組換えＬＢＤ含有ＥＲ−α３６タンパク質を実施例１に示した方法を用いて作製した。
動物免疫化：
組換えタンパク質及び合成ＫＬＨコンジュゲートペプチドを次いで、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃ、及びＳＪＬマウス（Ｓｌａｃ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌ，Ｌｔｄ、上海）の免疫化の免疫原として使用した。簡単には、免疫原を等容量の完全又は不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）で乳化し、次いで動物を１００ｕｌ／注射及び５０〜１００ｕｇ／動物／注射の投与量で皮下又は腹腔内免疫化した。免疫化は少なくとも２〜３週間ごとに生じ、試験採血及びＥＬＩＳＡ試験を各追加免疫化の７日後に行った。
細胞ベースの免疫化のために、ＮＩＨ３Ｔ３又はＣＨＯＫ１細胞系に完全長ヒトＥＲ−α３６を一過性トランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、ＥＲ−α３６発現を確認するために、細胞の一部をＥＲ−α３６特異的抗体によるウエスタンブロット分析用に回収した。トランスフェクションの３日後、細胞を回収し、ＲＰＭＩ １６４０基本培地（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄した。選択したマウス株Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃ及びＳＪＬマウス（Ｓｌａｃ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌ，Ｌｔｄ、上海）を（５〜１０）×１０6細胞／動物／注射で免疫化し、腹腔内免疫化２〜３週間ごとに少なくとも１回行い、試験採血及びＦＡＣＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）又はＡｃｕｍｅｎアッセイ（ＴＴＰ ＬａｂＴｅｃｈ）を各追加免疫化の７日後に実施した。新鮮なＥＲ−α３６トランスフェクタントを、各定期的免疫化又は試験採血分析の直前に調製した。
融合：
融合の４日前に、各マウスをＰＢＳ中のＥＲ−α３６タンパク質又は２７ａａペプチド−ＫＬＨコンジュゲート又は組換えＥＲ−α３６タンパク質で腹腔内に追加免疫した。融合当日、脾臓を無菌的に除去し、該臓器を処理して単一細胞懸濁液にした。洗浄後、細胞をＤＭＥＭ基本培地（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、５：１比でＳＰ２／０骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ）と混合し、混合物を基本培地で１回洗浄し、次いでＰＥＧ媒介融合に供した。融合の完了後すぐに、細胞をＤＭＥＭ基本培地で１回洗浄し、１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）及びハイブリドーマ増殖因子を補充した融合後細胞増殖培地に０．５×１０6細胞／ｍｌまで再懸濁した。１ウェルあたり２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートに播種し、５％ＣＯ2を含む３７℃インキュベーターに入れた。７日間のインキュベーション後、１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）を含有する新鮮な増殖培地５０μｌ／ウェルを添加した。融合を、細胞融合後１０〜１４日目にＥＬＩＳＡ又はＡｃｕｍｅｎマイクロプレートサイトメトリーによりスクリーニングした。
ハイブリドーマスクリーニング
１．ＥＬＩＳＡスクリーニング
高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を１００ｕｌ／ウェルの精製ＥＲ−α３６ ＬＢＤ融合タンパク質、陰性対照タンパク質又は他のカウンタースクリーニング抗原（ＦＣ−ＥＲ−α６６リガンド結合ドメイン融合タンパク質、ヒトＩｇＧを含む）で被覆し、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中１μｇ／ｍｌに希釈した。プレートを２〜８℃で一晩、被覆溶液でインキュベートし、次いでＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）を用いてプレート洗浄機で１回洗浄した。２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液（ｐＨ７．４のＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ））を各ウェルに添加し、室温で１〜２時間インキュベートした。プレートを空にし、５０〜１００μｌ／ウェルのハイブリドーマ培養上清を添加した。３７℃、１．０時間のインキュベーション後、プレートを次いで３回洗浄し（ＰＢＳＴ）、次いで１００μｌ／ウェルのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＺＳＧＢ Ｂｉｏ）を添加した。反応を３７℃で１．０時間継続し、この後ＰＢＳＴで３回洗浄し、１００ｕｌ／ウェルのＴＭＢ基質（ＣＷ ｂｉｏ）を添加した。室温で１５分間のインキュベーション後、１００μｌ／ウェルの１．０Ｎ ＨＣｌを停止溶液として添加し、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）上で４５０ｎｍで読み取った。ＥＬＩＳＡスクリーンで高い読み取り値を示す抗体を産生するハイブリドーマクローンを同定した。
２．Ａｃｕｍｅｎマイクロプレートサイトメトリースクリーニング
ヒトＥＲ−α３６トランスフェクトスクリーニング細胞を黒／透明底３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に播種し、一晩、３７℃、５％ＣＯ2で培養した。翌日、培地を除去し、２０μｌ／ウェルのハイブリドーマ上清試料を添加した。３７℃で２．０時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳ、ｐＨ７．２で２回洗浄し、次いで１５μｌ／ウェルのＡｌｅｘａ４８８コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、この後３７℃で１．０時間のインキュベーションを行った。プレートを次いでＰＢＳで３〜４回洗浄し、細胞を次いで４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固定し、３７℃にて、１．０時間、ＰＩ（ＤＯＪＩＮＤＯ）で再び染色した。アッセイプレートをＡｃｕｍｅｎマイクロプレートサイトメーター（Ａｃｕｍｅｎ ｅＸ３、ＴＴＰ ＬａｂＴｅｃｈ）で読み取った。Ａｃｕｍｅｎマイクロプレートサイトメトリースクリーニングで高い読み取り値を示す抗体を産生するハイブリドーマクローンを同定した。
サブクローニング：
ＥＬＩＳＡ及び／又はＡｃｕｍｅｎスクリーニングからの選択陽性ハイブリドーマクローンを、限界希釈により９６ウェル細胞培養プレートでサブクローニングした。７〜１０日の培養後、サブクローニングプレートをＥＬＩＳＡ又はＡｃｕｍｅｎアッセイによりスクリーニングした。各親クローンに対し単一のコロニー増殖を有する２つの陽性クローンを、さらなる確認アッセイ用に２４ウェルプレートに拡大し、アイソタイプ化し、次いで凍結保存のために培養フラスコにさらに拡大した。
作製及び精製：
選択ハイブリドーマ細胞系の抗体作製は、ハイブリドーマ培地（ＳＦＭ、Ｇｉｂｃｏ）を含むローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）細胞培養を用いて行った。培養２〜３週間後、培地を回収し、細胞及び細胞残屑を限外濾過器で除去した。清澄化上清を次いで限外濾過により濃縮し、調製プロテインＡセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に投入した。ＵＶモニターによるモニタリング下、平衡化緩衝液でベースラインまで洗浄した後、カラムを次いで０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．５で溶出し、溶出抗体を１．０Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で直ちに中和し、２〜８℃で一晩、２回緩衝液を交換しながらＰＢＳ、ｐＨ７．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して透析した。精製抗体を０．２２ｕｍ滅菌シリンジフィルターを通じて濾過し、アリコートで−８０℃以下にて保存した。精製抗体はＳＮＧｍＢ１と命名した。抗体産物の試料を純度、濃度、タンパク質及び細胞ベースの抗原への結合能力、インビトロ効力アッセイ等を含むＱＣ試験にかけた。ＱＣ分析結果を図２に示す。
ＥＲ−α３６へのＳＮＧｍＢ１の結合の特徴付け
ＥＲ−α３６への抗ＥＲ−α３６抗体ＳＮＧｍＢ１の結合活性を、この例において以下に列挙された種々の側面から特徴付けた。
ａ）ＥＬＩＳＡを用いたＳＮＧｍＢ１の結合特異性
ＳＮＧｍＢ１の結合特異性はＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価した。５つの異なるタンパク質を使用してアッセイプレートを１μｇ／ｍｌで被覆した。十分にブロッキングした後、種々の濃度（１０、２、０．４、０．０８及び０．０１６、０．００４μｇ／ｍｌ）のＳＮＧｍＢ１抗体をアッセイプレートに添加し、１．５時間インキュベートし、この後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて複合体形成の検出を行った。データの例を以下に図３で示した。ＳＮＧｍＢ１は、ＥＲ−α３６（図３の「ペプチド」）のＦドメインに由来する２７アミノ酸ペプチド及びまたＦｃ−ＬＢＤタンパク質（図３の「Ｆｃ−ＬＢＤ」）に結合するが、２７アミノ酸が欠失したＦｃ−ＬＢＤ（図３の「Ｆｃ−ＬＢＤ−Ｄ２７」）又はＦｃ−ＥＲ−α６６タンパク質（図３の「Ｆｃ−ＥＲ６６」）又は対照ヒトＩｇＧタンパク質（図３の「ヒトＩｇＧ」）には結合しないことが示された。故に、ＳＮＧｍＢ１は、ＥＲ−α３６のＣ末端Ｆドメインの２７アミノ酸ペプチドに特異的に結合した。ＳＮＧｍＢ１結合にとってＥＲ−α３６Ｆドメインにおける重要なエピトープ残基を、Ｐｅｐスキャン及びアラニンスキャンの両方を用いてマッピングした（実施例５を参照されたい）。
ｂ）ウエスタンブロット分析：
抗体ＳＮＧｍＢ１の結合特異性を、一連のヒト癌細胞系由来の全細胞溶解物のウエスタンブロット分析を用いてさらに評価した。以下の溶解物を使用した：１）親ＨＥＫ２９３細胞、２）Ｍｙｃタグを有するｐｃＤＮＡ３．１＿ＥＲ−α３６完全長タンパク質をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞、３）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ）、４）ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ）、５）Ｈｅｃ−１Ａ（ＡＴＣＣ）、６）Ｋ５６２（ＡＴＣＣ）。
種々の細胞系由来の細胞溶解物は培地を吸引して調製し、細胞をＰＢＳで洗浄し、この後、細胞を溶解緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＮＰ４０及び０．７ｍＭ ＥＤＴＡ＋１％プロテアーゼ阻害剤カクテル）（Ｒｏｃｈｅ）中で３０分間氷上に置いた。上清を回収するために、溶解物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機で４℃、１０分間、１４０００ｒｐｍで回転させて清澄化した。タンパク質定量後、５０〜１００μｇのタンパク質溶解物を５×ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルローディング緩衝液（Ｂｉｏ−ｒａｄ）と混合し、電気泳動のために１０％ポリアクリルアミドゲルに投入し、この後ＰＶＤＦ膜に移した。ＰＶＤＦ膜を次いでＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、非特異的結合を、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋５％無脂肪乳を含有する緩衝液で４℃、一晩ブロックした。次いで、一次ＳＮＧｍＢ１を、１％無脂肪乳を含むＴＢＳＴに１〜２μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、膜と共に４℃で一晩２時間インキュベートした。膜を次いでＴＢＳＴ中で３回、各１０分間、穏やかに撹拌しながら洗浄し、次いでマウス又はヒトＦｃに対する二次ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗体（ＺＳＧＢ Ｂｉｏ）を５％無脂肪乳を含むＴＢＳＴに添加し、室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回、各５分間、穏やかに回転させながら洗浄した後、検出のためにＥＣＬ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とインキュベートした。
図４に示されているように、ｍｙｃタグを有するトランスフェクトＥＲ−α３６タンパク質は、抗Ｍｙｃ（Ａｂｃａｍ）により約３７ＫＤとして検出された。内因性ＥＲ−α３６バンドは、試験細胞の全てにおいて３６ＫＤで検出された。検出された唯一の他のバンドは、５５から７２ＫＤの間のバンドであった。このバンドはＥＲ−α６６と、ＥＲ−α３６又は類似のエピトープを有する別のタンパク質由来のＦドメインとのキメラタンパク質である可能性があり、この正体がさらに定義される。
ｃ）ＥＲ−α３６発現のＦＡＣＳ分析
慢性骨髄性白血病患者に由来する細胞系、Ｋ−５６２細胞；ＭＣＦ７：ＥＲ−α６６及びＥＲ−α３６の両方を発現する乳癌細胞系；ＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ）：高レベルのＨＥＲ２を発現する乳癌細胞系；及びＭＨＣＣ９７Ｈ（ＡＴＣＣ）：高転移性肝細胞癌細胞系を含む、一連のヒト癌細胞系へのＳＮＧｍＢ１の結合について同様に調べた。これらの細胞系は、ウエスタンブロットによりＥＲ−α３６タンパク質を発現することが見出された。
これらの細胞系（Ｋ５６２、ＭＣＦ７、ＳＫＢＲ３、ＭＨＣＣ９７Ｈ）をそれぞれの培地で９０％コンフルエンスまで培養し、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、この後０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（接着細胞系）で前処理して基質からの除去を促進した。次いで細胞は回収され、４℃、５分間、２５００ｒｐｍで遠心分離される。細胞数をカウントした後、細胞を次いでブロック緩衝液（１０％正常ヤギ血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に５〜１０×１０6細胞／ｍｌの最終濃度まで再懸濁し、１００μｌの細胞（５×１０5）を染色のため１．５ｍｌ ＥＰチューブに移した。全てのこれらのチューブ（ブロック緩衝液中の細胞）を次いで回転装置（Ｇｒａｎｔ）に４℃で３０分間置いた。この後、細胞を４℃、５分間、２５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨て、１００μｌの一次抗体を次いで（１〜３０μｇ／ｍｌ最終濃度、ＳＮＧｍＢ１又はマウスＩｇＧ２ｂアイソトープ対照）に添加し、回転装置で４℃、１時間インキュベートした。細胞を次いで、４℃、５分間、２５００ｒｐｍで遠心分離により回収し、ＰＢＳ溶液で２回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＦＩＴＣ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を次いで１：４００〜８００の希釈範囲で添加し、この後、回転装置で４℃、１時間インキュベーションし、暗所に保存した。このインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄して遊離抗体を除去し、細胞を次いで１％パラホルムアルデヒドに室温で１０分間固定し、再懸濁前に、５μｌ ７−ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む２００〜４００μｌ ＰＢＳ中細胞を最終的なフローサイトメトリー分析のために添加した。
一連の濃度（１００、２０、４、０．８、０．１６、０．０３２μｇ／ｍｌ）を有するＳＮＧｍＢ１抗体をＦＡＣＳアッセイにおいて試験し、Ｋ５６２細胞への用量依存的結合を示した（図５Ａを参照されたい）。図５Ａにおいて、「幾何平均（Ｇｅｏｍ． Ｍｅａｎ）」は幾何平均蛍光強度を指す。他の試験ヒト乳癌細胞系へのＳＮＧｍＢ１抗体の特異的結合も確認した。図５Ｂ（ＭＣＦ７）、５Ｃ（ＳＫＢＲ３）及び５Ｄ（ＭＨＣＣ９７Ｈ）を参照されたい。該抗体の特異的結合をよりよく特徴付けるために、本発明者らは、ヒトＥＲ−α３６タンパク質を発現するように誘導することができる安定な３Ｔ３細胞系を樹立した。該細胞系をＳＮＧｍＢ１抗体とインキュベートし、結合を上記の類似の手順に従って試験した。マウスＩｇＧ２ｂをアイソタイプ対照として使用した。結果は、ＳＮＧｍＢ１抗体が同様に細胞系に特異的に結合することを示した（図５Ｅを参照されたい）。
ｄ）免疫蛍光分析
ＭＣＦ−７細胞における膜結合ＥＲ−α３６タンパク質を検出するＳＮＧｍＢ１の能力は、免疫染色を用いて評価した。ＭＣＦ−７マンモスフェアを形成し、免疫染色を次のようなステップにより行った：
１．ＭＣＦ−７細胞をフェノールレッドを含まないＤＭＥＭで２日間培養し、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で染色し、この後ＦＡＣＳ選別を行った。選別細胞をＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＧＦ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びｂＦＧＦ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｏ）で６日間培養し、ＭＣＦ−７マンモスフェアを形成させた。
２．ＭＣＦ−７マンモスフェアを４分間、１０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去した。
３．マンモスフェアを５００μｌ ＰＢＳで洗浄し、１．５ｍｌ ＥＰチューブに移した後、４分間、１０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨てた。
４．沈殿物を５００μｌパラホルムアルデヒド（４％）で２０分間（又は一晩）固定し、４分間、１０００ｒｐｍで遠心分離して上清を移した。
５．沈殿物を５００μｌ ＰＢＳで洗浄し、４分間、１０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨て、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。
６．上清を除去し、沈殿物を５０μｌヤギ血清ブロッキング溶液と３７℃で３０分間インキュベートした。４分間、１０００ｒｐｍで遠心分離後、上清を捨てた。
７．マンモスフェアをＳＮＧｍＢ１（作用濃度：１０μｇ／ｍＬ）と４℃で一晩インキュベートした。
８．翌日、マンモスフェアを４分間、１０００ｒｐｍで遠心分離し、５００μｌ ＰＢＳで３回洗浄した。
９．ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＦＩＴＣ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）二次抗体（５μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。
１０．４分間、１０００ｒｐｍで遠心分離後、２０μｌヘキストを沈殿物に滴下添加し、室温で２０分間置いた。
１１．マンモスフェアを５００μｌ ＰＢＳで３回洗浄した。
１２．マンモスフェアを小さい観察皿に移し、検出まで４℃で保存した。
図６Ａに示されているように、透明な膜染色が細胞のほとんどで観察された。ＳＮＧｍＢ１は、ＭＣＦ−７マンモスフェアを用量依存的に染色した（図６Ｂを参照されたい）。
ｅ）内部移行分析
抗体薬物コンジュゲートの開発は、化学療法剤を腫瘍細胞に送達するために内部移行する担体抗体に依存することから、Ｋ−５６２細胞により内部移行するＳＮＧｍＢ１の能力も評価した。
Ｋ５６２細胞を最初に正常ＩＭＤＭ培地で２４時間培養した。２日目、細胞を遠心分離により回収し、温ＰＢＳで１回洗浄し、この後、フェノールレッドを含まない２．５％活性炭処理ＦＢＳ（Ｇｉｂｏ）を補充した、フェノールレッドを含まないＩＭＤＭを含む培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁した。４８時間培養後、細胞を回収し、５分間、１０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞を次いで、ＡｌｅｘａＦｌｕｒｏ４８８標識抗ＥＲ−α３６抗体ＳＮＧｍＢ１と３７℃で種々の時間（１、２、４、６、２４時間）インキュベートして内部移行が生じるようにした。内部移行は細胞を氷上に置いて停止した。Ｋ５６２細胞によるＳＮＧｍＢ１の抗体内部移行分析を表面蛍光消光により行い、ＦＡＣＳにより検出されたＭＦＩにより測定した。抗抗ＡｌｅｘａＦｌｕｒｏ４８８抗体を使用して、Ｋ５６２細胞表面に結合したＡｌｅｘａＦｌｕｒｏ４８８標識ＳＮＧｍＢ１抗体を消光した。結果を図７に示した。結果は、内部移行抗体の時間依存的増加（パーセンテージでの）を示し、２４時間までに結合抗体の約７５％でピークに達した。
エストラジオール刺激ＭＣＦ７マンモスフェア形成アッセイを用いた抗ＥＲ−α３６抗体の中和の機能試験
細胞の形成及び増殖に対する抗体の影響を、エストラジオール刺激ＭＣＦ７マンモスフェア形成アッセイにより評価した。
１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ培地で維持したＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ）をアッセイの前に２〜３回継代し、６０％コンフルエンスとする。ＭＣＦ−７細胞を、温かいフェノールレッド不含ＤＭＥＭで２回洗浄し、次いで２．５％活性炭処理ＦＢＳ（ＣＦＢＳ）を含むフェノールレッド不含ＤＭＥＭで４８時間増殖させた。細胞を次いでトリプシン処理し、４０μｍフィルターを通過させて細胞集塊を除去し、この後７−ＡＡＤで染色し、８００細胞を、５μｇ／ｍｌインスリンを補充した無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）、０．４％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ及びｂＦＧＦ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からなる８００μｌマンモスフェア増殖培地での超低結合２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）の各ウェルに播種した。抗体活性の評価のために、ＤＭＳＯ中１ｎＭエストラジオールを各ウェルに添加して抗体の添加後のマンモスフェア形成を誘導した。
ＭＣＦ７細胞を、１ｎＭエストラジオール及びＰＢＳ、ヒトＩｇＧ、マウスＩｇＧ２ｂ、組換えＥＲ−α３６リガンド結合ドメインＦｃ融合タンパク質、又はＳＮＧｍＢ１の存在下で増殖させた。ＤＭＳＯを陰性対照として使用した。７２時間処理後、培養下のマンモスフェアの数をカウントした。ＳＮＧｍＢ１及び組換えＥＲ−α３６リガンド結合ドメインＦｃ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ及びマウスＩｇＧ２ｂと比べてエストラジオール刺激ＭＣＦ７マンモスフェア形成を著しく阻害した。（図６Ｃ）
抗体活性も以下の方法により７日のより長期で評価した：ＭＣＦ７マンモスフェアは、上記の同じ方法を用いて調製した。抗体活性の評価のために、マンモスフェア増殖培地中１００ｕｌの１０×濃縮抗体ストック溶液を次いで各ウェルに添加し、２時間インキュベートさせた。エストラジオールのこの１００ｕｌの１０×濃縮ストック（０．０２％ＤＭＳＯ中の最終濃度が１００ｐＭ又は３ｎＭ）を、次いで各ウェルに添加してマンモスフェア形成を刺激した。マンモスフェア増殖培地中１００ｕｌの１０×新鮮抗体ストックを、４日目に各ウェルに添加した。マンモスフェアの数を７日後に顕微鏡により手動で計算した。ＳＮＧｍＢ１は、ｍＩｇＧと比べてマンモスフェア形成の阻害においてより優れた能力を示した（図６Ｄ）。
ビアコア結合アッセイ
ＳＮＧｍＢ１のその標的タンパク質に対する親和性は、ビアコアにより測定した。ビアコアアッセイのフォーマットを図８に示す。抗体を抗マウス／ヒトＦＣ ＩｇＧ被覆表面に捕捉し、ペプチドを表面に注射した。空ＦＣ１を参照チャネルとして使用した。チップ表面をＧｌｙ １．５で再生させた。
捕捉抗体に対するＧＶ２７の滴定
シリーズＳ ＣＭ５センサーチップ（９０００ＲＵ）（ビアコア）を、等量の５０ｍＭ ＮＨＳ及び２００ｍＭ ＥＤＣで新しく調製した混合物を７分間注射（１０μｌ／分）して、ＦＣ２、ＦＣ３及びＦＣ４チップにおいて活性化した。次いで１：２５希釈ビアコア抗マウスＦｃ抗体（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ＰＨ５．０中、２５μｇ／ｍｌの濃度の）を、活性化チップＦＣ２、ＦＣ３及びＦＣ４細胞に１０μｌ／分で、シグナルが９０００Ｒｕに達するまで注射した。活性結合部位を、１０μｌ／分で１Ｍエタノールアミンの７分の注射によりブロックした。各抗体をそれぞれチップ表面に捕捉した（ＦＣ２、ＦＣ３及びＦＣ４、参照細胞としてのＦＣ１）。捕捉シグナルは約５００ＲＵであった。結合相の１８０秒間、及び解離相の９００秒間、３０μｌ／分での０ｎＭ、１．５６２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ及び２５ｎＭの濃度のＧＶ２７（配列番号２に記載されたＥＲ−α３６ Ｃ末端２７ａａ）。再生緩衝液（ｐＨ１．５を有する１０ｍＭグリシン緩衝液）を９０秒間注射してセンサー表面を再生した。対照として、ＧＶ２７を捕捉抗体なしのＦＣの表面にも種々の濃度で注射した。ステップ２からのシグナルを対照ステップから減算し、１対１結合モデルを用いて結果をフィットさせた。
表３に示されているように、２７ａａペプチド（Ｆドメイン）に対するＳＮＧｍＢ１のＫｄは約１００ｐＭ（ｎ＝７）であった。
エピトープマッピング
ＳＮＧｍＢ１により結合されたエピトープを、アラニンスキャン方法を用いてさらに分析した。アラニンへのアミノ酸の連続置換を有する一連のペプチドを合成し、前記ペプチドを高結合プレートに被覆し、ペプチドを結合する抗体の能力を決定した。ペプチド及びこの配列のリストを表４に列挙した。
ペプチドベースのエピトープマッピング：アラニンスキャン
アラニンへのアミノ酸の逐次置換を有する上記ペプチドに対するＳＮＧｍＢ１の結合を、以下の方法を用いて試験した：透明なポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ）を、リスト中の３３ペプチドの１つからなるＰＢＳ中５μｇ／ｍｌペプチド溶液（５０μｌ／ウェル）で被覆した。プレートを被覆溶液と４℃、一晩インキュベートした。次いでプレートを、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を用いて自動プレート洗浄機で１回洗浄した。ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）からなる２００μｌのブロック溶液を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ブロッキング溶液中１０μｇ／ｍｌの試験ＳＮＧｍＢ１ ５０μｌをプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、次いでプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、１００μｌのヤギ抗マウス−ＩｇＧ−Ｆａｂ−ＨＲＰ（ＺＳＧＢ Ｂｉｏ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、１００μｌ／ウェルＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、プレートを次いでＲＴで１５分間インキュベートした。プレートに５０ｕｌ／ウェル停止溶液を添加し、プレートリーダーで読み取った。結果を図９に示す。
抗体遺伝子クローニング及び配列。
ＳＮＧｍＢ１軽鎖及び重鎖可変領域の配列は、５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）として知られるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅技法により得た。ＳＮＧｍＢ１抗体を産生するハイブリドーマ細胞由来の全ＲＮＡをトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離し、オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーを用いるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。マウスＩｇＧ遺伝子の可変領域を、重鎖可変領域に対してはＭｕＩｇＧ ＶＨ３’−２及びＭｕＩｇ−５’リーダープライマー、軽鎖可変領域に対してはＭｕＩｇＫ ＶＬ３’−１及びＭｕＩｇ−５”リーダープライマー（ＮＯＶＡＧＥＮ）を用いるＰＣＲによりクローニングした。得られたバンドをＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクターにクローニングし、１０種を超えるクローン由来のＤＮＡを配列決定にかけ、ＡＢＩ ＤＮＡ配列決定装置（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて決定した。コンセンサス配列はＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ １０ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて決定した。配列解析及び確認後、抗体作製及び精製のためにＳＮＧｍＢ１遺伝子の可変領域を組換え発現ベクターにクローニングした（ＶＬはｐＣＰ−ｍＣＫに、ＶＨはｐＣＰ−ｍＣｇ２ａに）。
重鎖及び軽鎖配列は配列番号１６〜１９に記載されている。抗体をマウスＩｇＧ２ｂとしてアイソタイプ化した。抗体の分泌を促進するために、シグナルペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＧＶＨＳ）を抗体のＮ末端に融合した。
２９３Ｅ６細胞における組換え抗体タンパク質の発現及び精製
組換え抗体タンパク質の発現及び精製は、以下の方法により行った：１０％のプルロニックＦ−６８を含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）で培養したＨＥＫ２９３Ｅ細胞、１×１０6細胞／ｍｌを、最終濃度０．５μｇ／ｍｌの等量の重鎖ベクター及び軽鎖ベクターＤＮＡ、及び１．０μｇ／ｍｌのＰＥＩ（ポリエチレンイミン−線形、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）でトランスフェクトした。ＤＮＡ対ＰＥＩ比は１：２であった。最適ＭＥＭによるＤＮＡ及びＰＥＩ複合体形成期間は、室温で１５分間となるはずである。トランスフェクト細胞を５％ＣＯ２、３７℃、１２５ｒｐｍ振盪速度によりフラスコで培養した。１％ペプトン培地をトランスフェクション後２２から２６時間で添加した。馴化培地を６日目に回収し、上清を３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。清澄化馴化培地を次いでｎプロテインＡカラム（Ｇ．Ｅ． Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に投入し、ＰＢＳプラス０．１％トリトン−Ｘ１００で洗浄し、最後に結合ＩｇＧをｐＨ３．５で０．１Ｍグリシンを含有する溶液で溶出した。溶出抗体タンパク質をＰＢＳに対して透析し、−８０℃で保存した。エンドトキシンを除去するために、精製タンパク質をＨｉｔｒａｐ ＤＥＡＥセファロースＦ．Ｆ．カラムを通過させてさらに処理し、得られた抗体は、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ、Ｇ．Ｅ． Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、純度レベルを決定するために分析した。
ヒト化及び配列分析、抗体活性の特徴付け
ヒト化及び配列分析：
マウスＳＮＧｍＢ１抗体の可変領域の配列を使用して、マウスフレームワークと最も高い相同性を有する生殖系列配列を同定し、コンピュータモデリングを使用してヒト化バリアントを設計した。ＳＮＧｍＢ１は、Ｖ４、Ｐ４４、Ｌ４６、Ｓ４９、Ｓ６４復帰突然変異を有するＶＫ１｜５−２アクセプターフレームワークに直接ＣＤＲ移植した軽鎖Ｖ１を用いてヒト化した（配列番号２４及び配列番号２５、アミノ酸及びヌクレオチド）。ＳＮＧｍＢ１はまた、Ｖ４、Ｌ４６、Ｓ４９、Ｓ６４復帰突然変異を有する軽鎖Ｖ２を用いてヒト化した（配列番号２６及び配列番号２７、アミノ酸及びヌクレオチド）。ＳＮＧｍＢ１はまた、Ｖ４、Ｐ４４、Ｌ４６、Ｓ４９復帰突然変異を有する軽鎖Ｖ３を用いてヒト化した（配列番号２８及び配列番号２９）。ＳＮＧｍＢ１は、ＶＨ１｜１−４６アクセプターフレームワークに、Ｔ２８Ａのマウス残基を有するＣＤＲを移植した重鎖Ｖ１を用いてヒト化した（配列番号３２及び配列番号３３）。ＳＮＧｍＢ１はまた、さらなるＬ８１Ｍ突然変異を有するＶ１を有する重鎖Ｖ２を用いてヒト化した（配列番号３０及び配列番号３１）。所望のバリアントを合成し、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ定常ドメインを有するｐＴＴ５発現ベクターにクローニングした、２９３Ｅ６細胞において発現させた。
抗体活性の特徴付け：
ヒト化抗体を精製し、ＥＬＩＳＡ及び結合分析のためのビアコアを用いて特徴付けした。ヒト化抗体の配列成分を表５に示す。
ヒト化抗体をＥＲ−α３６に対する結合親和性について試験した。結果を図１０Ａ〜Ｂ及び表６に示した。
競合ＥＬＩＳＡ
ハイブリドーマ由来ＳＮＧｍＢ１、キメラＳＮＧｍＢ１、及びヒト化ＳＮＧｍＢ１を、ＥＲ−α３６への結合をめぐってハイブリドーマ由来ＳＮＧｍＢ１又は１０４ｃ３Ｆ８抗体（ＳＮＧｍＢ１とは異なる配列を有するＥＲα３６抗体）と競合する能力について、ＥＬＩＳＡ競合アッセイを用いて試験した。
透明なポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ）をＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのハイブリドーマ由来ＳＮＧｍＢ１、キメラＳＮＧｍＢ１又はヒト化ＳＮＧｍＢ１で被覆し、プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いで自動プレート洗浄機で１回洗浄した。抗原（ビオチン化ＧＶ２７ペプチド）を種々の量の競合マウス抗体と一緒に添加し、ＥＬＩＳＡプレートを次いで洗浄前に平衡化のためにインキュベートさせた。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ２４３８、１：５０００）及びＴＭＢ基質（Ｂｉｏｐａｎｄａ、中国）を添加し、ＯＤ４５０をプレートリーダーで測定した。ＩｇＧを対照抗体として並行で試験した。
結果を図１０Ｃ〜１０Ｅに示した。３つの試験抗体の全てが、ＧＶ２７ペプチド結合をめぐって用量依存的にＳＮＧｍＢ１と競合したが、いずれもＧＶ２７ペプチドへの結合をめぐって抗体１０４ｃ３Ｆ８との明らかな競合を示さなかった。完全なデータセットに基づき、ＧＶ２７ペプチドには異なる結合部位があり、ＳＮＧｍＢ１に由来する抗体は、１０４ｃ３Ｆ８抗体により結合されたものとは異なる部位に結合した。
種々のヒト化抗体を、記載された競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて試験した。簡単には、１μｇ／ｍｌのＳＮＧｍＢ１をプレートに被覆し、種々の量の競合抗体（すなわち表６に示された種々のヒト化抗体）と一緒に抗原（ビオチン化ＧＶ２７ペプチド）を添加した。マウスＩｇＧ及びＨＢＤ−Ｆ８（すなわちヒト化１０４Ｃ３Ｆ８）を陰性対照として並行で試験し、ＨＢＤ−Ｂ１を陽性対照（ハイブリドーマ産生ＳＮＧｍＢ１）として並行で試験した。結果を図１０Ｆに示した。全てのヒト化バリアントは、ＳＮＧｍＢ１抗体との用量依存的競合を示した。
診断的使用：ヒト試料のＩＨＣ分析
ヒト組織試料中のＥＲ−α３６の存在をよりよく検出するためにＳＮＧｍＢ１のような特異的抗体を利用する能力を評価するのに、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイを使用した。乳癌患者の４μｍ厚のパラフィン組織ブロックをキシレンに２０分間、２回浸漬して脱パラフィンし、この後、９９％、９０％、８５％、７５％、５０％エタノール中でそれぞれ５分間、連続的に再水和した。組織切片を次いでＰＢＳで３回洗浄した。次いで抗原賦活を、電子レンジで９５℃クエン酸塩（ｐＨ６．０）緩衝液中、１５分間加熱して行った。室温まで冷却したら、切片を次いでＰＢＳで３回洗浄し、３％過酸化水素と室温で２０分間インキュベートし、この後、ＰＢＳで洗浄した。抗体の非特異的結合を次いで１０％正常ヤギ血清と３０分間インキュベートしてブロックし、この後、湿潤チャンバーで４℃、一晩、一次抗体とインキュベートした。ＰＢＳで５回洗浄した直後に、予め希釈した二次抗体（ＺＳＧＢ−Ｂｉｏ、Ｃａｔ＃ ＰＶ−６０００）を添加し、室温で２０分間インキュベートした。切片を次いでＰＢＳで洗浄し、ＤＡＢ溶液と２〜５分間インキュベートし、この後、蒸留水で５〜１０分間すすいだ。切片を次いでヘマトキシリン（ＺＳＧＢ−ＢＩＯ、Ｃａｔ＃ ＺＬＩ−９６０９）で対比染色し、この後、５０％、７５％、８５％、９０％及び９９％エタノールで連続的にすすいで脱水した。切片を次いでキシレンで透徹し、中性バルサムで封入した後、顕微鏡で評価した。
図１１に示されているように、ＳＮＧｍＢ１抗体は、ヒト腫瘍組織中のＥＲ−α３６タンパク質の膜結合発現及び細胞質発現の両方を検出した（図１１）。
ヒト腫瘍細胞増殖の阻害における抗ＥＲ−α３６抗体の能力
異種移植モデルにおいてヒト腫瘍細胞増殖の阻害における抗ＥＲ−α３６抗体の能力を、ＢＣＡＰ３７乳癌モデルを用いて評価した。ＢＣＡＰ３７は、浸潤性乳管がんを有する患者から開発され、ウエスタンブロットによりＥＲ−α３６及びＨＥＲ２を発現することが示された。細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植した。腫瘍が８０〜１２０ｍｍ3サイズまで増殖したとき、マウスを１０匹の群に無作為に割り付け、マウスＩｇＧ２ｂ又はＳＮＧｍＢ１抗体又はハーセプチンのいずれかにより、ＳＮＧｍＢ１については１．２５、５及び２０ｍｇ／ｋｇ、又はハーセプチンについては３ｍｇ／ｋｇの用量で処置した。処理の１７日後、腫瘍を切除し、腫瘍重量及び体積の両方を測定した。図１２に示されているように、ＳＮＧｍＢ１抗体は、腫瘍増殖をハーセプチンと同様に、用量依存的に阻害できることが見出された。対照ＩｇＧ２ｂ処置群からの腫瘍体積とＳＮＧｍＢ１抗体処置群からの腫瘍体積の間に有意な差があった。
Ａｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ式（ＶＩＩ）の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の合成
１．Ａｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ式（ＶＩＩ）の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の合成
１４０ｍｇの抗体ＳＮＧｍＢ１（Ａｂ）を取り、溶液の濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整しながらＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に溶解する。ＴＣＥＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をモル比、ＴＣＥＰ／Ａｂ＝３で抗体溶液に添加する。上記の溶液を含むチューブを３７℃で２時間保つ。小分子（ＴＣＥＰ及びＴＣＥＰ酸化物等）をＰＢＳ中で平衡化ＰＤ−１０カラム（ＧＥ）を通じて除去する。ＤＴＮＢ中でＡｂ濃度及び遊離チオールをモニタリングする。遊離チオール／Ａｂ＞４の場合、１／１０（ｖ／ｖ）ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ）をＡｂ溶液に添加する。ＤＭＡ中１０ｍＭ ＭＭＡＥ（すなわち薬物）をＡｂ溶液にモル比で添加し、薬物対Ａｂの比は４．５に達する。溶液を室温に４時間保ち、反応をＨＩＣ−ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によりモニタリングする。反応が終了した後、ＡＤＣ産物をＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターユニットを用いて精製し、０．２ｕｍフィルターを通じて１０容量ＰＢＳで６回洗浄し、最終産物を得る。ＡＤＣを４℃で保存する。
２．ＡＤＣの分析
２．１．ＨＩＣ−ＨＰＬＣ手順
カラム：＃１４９４７、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲ、４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３．５ｃｍ、２．５ｕｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、カラム温度、３０℃
流速：１ｍｌ／分
検出：ＵＶ２８０及びＵＶ２５２。緩衝液Ａ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム；
緩衝液Ｂ：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２５％イソプロパノール、２０分、０％−−−９０％；１分、９０％−−−９５％；４分、９５％；１分、９５％−−−０％。ＡＤＣ濃度に依存する分析用２０ｕｌ試料
２．２ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ手順
カラム：＃０８５４１、Ｇ３０００ＳＷｘｌ、７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、５ｕｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、カラム温度、室温。
流速：０．４ｍｌ／分
検出：ＵＶ２８０。
緩衝液：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１５％イソプロパノール、６０分。
ＡＤＣ濃度に依存する分析用２０ｕｌ試料。ナノドロップ手順及びＤＡＲ計算
測定のためのｕｌ容量；ブランクとして１×ＰＢＳ；２８０ｎｍの吸光度を記録
３．結果
３．１ ＨＩＣ−ＨＰＬＣ：
図１３から分かるように、ピークがほとんどないクロマトグラフィーは本発明の非コンジュゲート抗体を示している。より多くのピークを有するクロマトグラフィーはＡｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを示している。両方の試料を同一のＨＩＣ−ＨＰＬＣ条件下で分析した。Ａｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは標準的なＨＰＬＣ条件下で複数のピークを示す。これは、抗体自体の不均一な集団を示唆している。
ピークの分布に基づき、平均ＤＡＲ＝３．９７（７．８９％非コンジュゲート抗体）
３．２ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
図１４ａから分かるように、非コンジュゲート抗体、すなわち本発明のＳＮＧｍＢ１が示されている。図１４ｂから分かるように、Ａｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのＡＤＣが示されている。結果は、より低い質量重量（ＭＷ）種がコンジュゲーション過程中に形成されることを示し、これは、該抗体が還元され、インタクトなＩｇＧを形成する代わりにより低いＭＷ種を形成したこと、またＩｇＧ間ジスルフィド結合により幾つかのＨＭＷ種も形成したことを示唆している可能性がある。
Ａｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦ式（ＶＩＩＩ）の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の合成
１． ＡＤＣ Ａｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦ式（ＶＩＩＩ）の合成
１４０ｍｇ Ａｂを採取し、溶液の濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整しながらＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に溶解する。ＴＣＥＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をモル比、ＴＣＥＰ／Ａｂ＝３でＡｂ溶液に添加する。上記の溶液を含むチューブを３７℃で２時間保つ。小分子をＰＢＳ中で平衡化ＰＤ−１０カラム（ＧＥ）を通じて除去する。ＤＴＮＢ中でＡｂ濃度及び遊離チオをモニタリングする。遊離チオール／Ａｂ＞４の場合、１／１０（ｖ／ｖ）ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ）をＡｂ溶液に添加する。ＤＭＡ中１０ｍＭのＭＭＡＦ、すなわち薬物をＡｂ溶液にモル比で添加し、薬物対Ａｂの比は４．５に達する。溶液を室温に４時間保ち、反応をＨＩＣ−ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によりモニタリングする。反応が終了した後、ＡＤＣ産物をＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターユニットで精製し、１０容量ＰＢＳで６回洗浄し、最終産物を得る。０．２ｕｍフィルターを通じて濾過した後、ＡＤＣを４℃で保存する。
２．コンジュゲートの分析
２．１ ＨＩＣ−ＨＰＬＣ手順
カラム：＃１４９４７、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲ、４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３．５ｃｍ、２．５ｕｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、カラム温度、３０℃
流速：１ｍｌ／分
検出：ＵＶ２８０及びＵＶ２５２。
緩衝液Ａ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム；
緩衝液Ｂ：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２５％イソプロパノール、
２０分、０％−−−９０％；１分、９０％−−−９５％；４分、９５％；１分、９５％−−−０％。ＡＤＣ濃度に依存する分析用２０ｕｌ試料。
２．２ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ手順
カラム：＃０８５４１、Ｇ３０００ＳＷｘｌ、７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、５ｕｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、カラム温度、室温。
流速：０．４ｍｌ／分
検出：ＵＶ２８０。
緩衝液：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１５％イソプロパノール、６０分。
ＡＤＣ濃度に依存する分析用２０ｕｌ試料。
ナノドロップ手順及びＤＡＲ計算
測定のための２．５ｕｌ容量；ブランクとして１×ＰＢＳ
２８０ｎｍの吸光度を記録
３．結果
３．１ ＨＩＣ−ＨＰＬＣ：
図１５から分かるように、ピークがほとんどないクロマトグラフィーは非コンジュゲート抗体、すなわち本発明のＳＮＧｍＢ１を示している。より多くのピークを有するクロマトグラフィーはＡｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦを示している。両方の試料を同一のＨＩＣ−ＨＰＬＣ条件下で分析した。Ａｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦは標準的なＨＰＬＣ条件下で複数のピークを示す。これは、抗体自体の不均一な集団を示唆している。
ピークの分布に基づくと、平均ＤＡＲ＝３．９７（７．８９％非コンジュゲート抗体）。
３．２ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
図１６から分かるように、Ａｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦのＡＤＣが示されている。結果は、より低い質量重量（ＭＷ）種がコンジュゲーション過程中に形成されることを示し、これは、この抗体が還元され、インタクトなＩｇＧを形成する代わりにより低いＭＷ種を形成したことを示唆している可能性がある。また、かなりの量の高質量重量（ＨＭＷ）もある。
したがって、Ａｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ及びＡｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦのＡＤＣが調製される。ＡＤＣ Ａｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの純度は９８．０％を上回る。ＡＤＣ Ａｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦの純度は９８．０％を上回る。全反応は、ＨＰＬＣによりモニタリングすることができる。
Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１式（ＩＸ）の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の合成
Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の合成
１００ｍｇ Ａｂを採取し、溶液の濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整しながらＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に溶解する。ＰＢＳの緩衝液をコンジュゲーション緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝６．５）に交換する。ＤＭＡ１／１０（ｖ／ｖ）を溶液に添加し、ＤＭ１、すなわち薬物対抗体のモル比は７．５に等しい。反応を室温で２時間保つ。反応をＨＩＣ−ＨＰＬＣでモニタリングする。反応が終了した後、ＡＤＣ産物をＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターユニットで精製し、１０容量ＰＢＳで６回洗浄し、最終産物を得る。０．２ｕｍフィルターを通じて濾過した後、ＡＤＣを４℃で保存する。
分析方法手順
２．１ ＨＩＣ−ＨＰＬＣ手順：
カラム：＃１４９４７、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲ、４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３．５ｃｍ、２．５ｕｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、カラム温度、３０℃
流速：１ｍｌ／分。
検出：ＵＶ２８０及びＵＶ２５２。
緩衝液Ａ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム；緩衝液Ｂ：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０。２５％イソプロパノール、２０分、０％−−−９０％；１分、９０％−−−９５％；４分、９５％；１分、９５％−−−０％。
ＡＤＣ濃度に依存する分析用μｌ試料。
２．２ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ手順：
カラム：＃０８５４１、Ｇ３０００ＳＷｘｌ、７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、５ｕｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。カラム温度：室温。
流速：０．４ｍｌ／分。
検出：ＵＶ２８０。緩衝液：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１５％イソプロパノール、６０分。
ＡＤＣ濃度に依存する分析用５〜１００ｕｌ試料。
２．３ ナノドロップ手順及びＤＡＲ計算
測定のための２．５ｕｌ容量
ブランクとして１×ＰＢＳ
２８０ｎｍの吸光度を記録。
２．４ エントトキシン検出手順
Ｅｎｄｏｓａｆｅ ＰＴＳ装置説明書に従って所望の試験範囲（５０〜１００倍）まで試料をエンドトキシン不含水で希釈して、試料をカートリッジに添加する。エンドトキシン測定値をプリントアウトする。
結論
３．１ ＨＩＣ−ＨＰＬＣ：
図１７において、ピークがほとんどないクロマトグラフィーは本発明の非コンジュゲート抗体を示している。より多くのピークを有するクロマトグラフィーはＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１を示している。両方の試料を同一のＨＩＣ−ＨＰＬＣ条件下で分析した。Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、標準的なＨＰＬＣ条件下で複数のピークを示す。これは、抗体自体の不均一な集団を示唆している。
ＵＶ吸光度に基づくと、薬物対抗体の平均比は２．８６に等しい（１１．０５％非コンジュゲート抗体）。非コンジュゲート抗体の比は１０％より低かった。比は４℃で保存中に増加した。
３．２ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
図１８から分かるように、より多くのピークを有するクロマトグラフィーはＡＤＣであり、ピークがほとんどないクロマトグラフィーは非コンジュゲート抗体である。Ａｂ−ＭＢ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥと比べて、Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１ははるかに少ない低質量重量（ＭＷ）種を含有する。これは、ＭＭＡＥコンジュゲートにおける低ＭＷ種が還元ステップから生成されたことを裏付けるものである。
Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４式（Ｘ）の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の合成
１．抗体薬物コンジュゲートの合成
１００ｍｇ Ａｂを採取し、溶液の濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整しながらＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に溶解する。ＰＢＳの緩衝液をコンジュゲーション緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝６．５）に交換する。ＤＭＡ１／１０（ｖ／ｖ）を溶液に添加し、抗体対ＤＭ４、すなわち薬物のモル比は７．５に等しい。反応を室温で２時間保つ。反応をＨＩＣ−ＨＰＬＣでモニタリングする。反応終了後、ＡＤＣ産物をＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターユニットで精製し、１０容量ＰＢＳで６回洗浄し、最終産物を得る。０．２ｕｍフィルターを通じて濾過した後、ＡＤＣを４℃で保存する。
２． 分析方法手順
２．１ ＨＩＣ−ＨＰＬＣ手順：
カラム：＃１４９４７、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲ、４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３．５ｃｍ、２．５ｕｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、カラム温度、３０℃
流速：１ｍｌ／分。
検出：ＵＶ２８０及びＵＶ２５２。
緩衝液Ａ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム；緩衝液Ｂ：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０。２５％イソプロパノール、２０分、０％−−−９０％；１分、９０％−−−９５％；４分、９５％；１分、９５％−−−０％。
ＡＤＣ濃度に依存する分析用２０μｌ試料。
２．２ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ手順：
カラム：＃０８５４１、Ｇ３０００ＳＷｘｌ、７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、５ｕｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。カラム温度：室温。
流速：０．４ｍｌ／分。
検出：ＵＶ２８０。
緩衝液：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１５％イソプロパノール、６０分。
ＡＤＣ濃度に依存する分析用２０ｕｌ試料。
２．３ ナノドロップ手順及びＤＡＲ計算
測定のための２．５ｕｌ容量
ブランクとして１×ＰＢＳ
２８０ｎｍの吸光度を記録。
３．結論
３．１ ＨＩＣ−ＨＰＬＣ：
図１９において、ピークがほとんどないクロマトグラフィーは本発明の非コンジュゲート抗体を示している。より多くのピークを有するクロマトグラフィーはＡｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を示している。両方の試料を同一のＨＩＣ−ＨＰＬＣ条件下で分析した。Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は標準的なＨＰＬＣ条件下で複数のピークを示す。これは、抗体自体の不均一な集団を示唆している。
ＵＶ吸光度に基づくと、薬物対抗体の平均比は３．２８に等しい（９．０１％非コンジュゲート抗体）。非コンジュゲート抗体の比は１０％より低かった。比は４℃で保存中に増加した。
３．２ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
図２０から分かるように、より多くのピークを有するクロマトグラフィーはＡＤＣであり、ピークがほとんどないクロマトグラフィーは非コンジュゲート抗体である。
式（ＸＩ）のＡｂ−ＭＢ−ｖｃ−デュオカルマイシンの抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の合成
１．抗体薬物コンジュゲートの合成
１４０ｍｇ Ａｂ、すなわちＳＮＧｍＢ１を採取し、溶液の濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整しながらＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に溶解する。ＴＣＥＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をモル比、ＴＣＥＰ／Ａｂ＝３でＡｂ溶液に添加する。上記の溶液を含むチューブを３７℃で２時間保つ。過剰なＴＣＥＰをＰＢＳ中で平衡化ＰＤ−１０カラム（ＧＥ）を通じて除去する。ＤＴＮＢ中でＡｂ濃度及び遊離チオをモニタリングする。遊離チオール／Ａｂ＞４の場合、１／１０（ｖ／ｖ）ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ）をＡｂ溶液に添加する。ＤＭＡ中１０ｍＭのデュオカルマイシン、すなわち、薬物をＡｂ溶液にモル比で添加し、薬物対Ａｂの比は４．５に達する。溶液を室温に４時間保ち、反応をＨＩＣ−ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によりモニタリングする。反応が終了した後、ＡＤＣ産物をＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターユニットで精製し、１０容量ＰＢＳで６回洗浄し、最終産物を得る。０．２ｕｍフィルターを通じて濾過した後、ＡＤＣを４℃で保存する。
２．分析方法手順
２．１ ＨＩＣ−ＨＰＬＣ手順
カラム：＃１４９４７、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲ、４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３．５ｃｍ、２．５ｕｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、カラム温度、３０℃
流速：１ｍｌ／分
検出：ＵＶ２８０及びＵＶ２５２。
緩衝液Ａ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム；緩衝液Ｂ：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２５％イソプロパノール、
２０分、０％−−−９０％；１分、９０％−−−９５％；４分、９５％；１分、９５％−−−０％。
ＡＤＣ濃度に依存する分析用２０ｕｌ試料。
２．２ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ手順
カラム：＃０８５４１、Ｇ３０００ＳＷｘｌ、７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、５ｕｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、カラム温度、室温。
流速：０．４ｍｌ／分
検出：ＵＶ２８０。
緩衝液：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１５％イソプロパノール、６０分。
ＡＤＣ濃度に依存する分析用２０ｕｌ試料。
２．３ ナノドロップ手順及びＤＡＲ計算
測定のための２．５ｕｌ容量
ブランクとして１×ＰＢＳ
２８０ｎｍの吸光度を記録。
３．結論
図２１から分かるように、より多くのピークを有するクロマトグラフィーはＡＤＣであり、ピークがほとんどないクロマトグラフィーは非コンジュゲート抗体である。両方の試料を同一のＨＩＣ−ＨＰＬＣ条件下で分析した。ＡＤＣは標準的なＨＰＬＣ条件下で複数のピークを示す。これは、抗体自体の不均一な集団を示唆している。
ピークの分布に基づくと、平均ＤＡＲ＝３．０４（１７．６％非コンジュゲート抗体）。
図２２から分かるように、より多くのピークを有するクロマトグラフィーはＡＤＣであり、ピークがほとんどないクロマトグラフィーは非コンジュゲート抗体である。結果は、より低いＭＷ種がコンジュゲーション過程中に形成されたことを示し、これは該抗体が還元され、インタクトなＩｇＧを形成する代わりにより低いＭＷ種を形成したことを示唆している可能性がある。
コンジュゲートで処理した細胞の生存率アッセイ
この実験で使用した細胞を以下の表１として列挙する。
実験方法
１日目：
表１の細胞をそれぞれ９０％コンフルエンスで採取し、培地を除去した。２ｍＬ ＰＢＳを６０ｍｍペトリ皿に添加し、除去した。０．５ｍＬトリプシンをペトリ皿に添加し、３７℃で２〜３分間保つ。約８０％細胞を顕微鏡により懸濁したとき、１ｍＬ完全培地を添加して反応を終わらせた。細胞懸濁液を２ｍＬ Ｅｐチューブに移し、９００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離した。上清を吸収し、１ｍｌ ＰＢＳを添加して細胞を再懸濁した（フェノールレッド及び血清ホルモンを除去しながら）。溶液を９００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離し、細胞をフェノールレッドを含まない２．５％ＣＳ−ＦＢＳ培地を通過させ、カウントした。細胞を、２０００〜３０００細胞／ウェル及び９０μＬ／ウェルを保ちながら、細胞体積及び増殖速度に従って９６ウェルプレートで培養した。各ＡＤＣをトリプルウェルに滴下し、ＰＢＳをウェルのへりの周囲に添加した。プレートを５％ＣＯ2を含むインキュベーターに入れ、３７℃で２４時間保った。
２日目
各ＡＤＣ（Ａｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、Ａｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦ、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及びＡｂ−ＭＢ−ｖｃ−デュオカルマイシン）の試験濃度は、それぞれ３００ｎＭ、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ及び０．１ｎＭであった。各上記溶液を試験のために７２時間保った。
５日目
１０μＬ ＣＣＫ−８を、温度を２〜４時間で３７℃に上昇させながら各ウェルに添加した。細胞の色に基づき、ＯＤ４５０を試験するのに最適な時間を選択し、ＩＣ５０を計算した。種々の濃度の各薬剤（ＳＮＧｍＢ１、Ａｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、Ａｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦ、Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４及びＡｂ−ＭＢ−ｖｃ−デュオカルマイシン）を投与されたＰＬＣのＯＤ４５０を図２３として示した。種々の濃度の各薬剤（ＳＮＧｍＢ１、Ａｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、Ａｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦ、Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４及びＡｂ−ＭＢ−ｖｃ−デュオカルマイシン）を投与されたＳＵＭ１５９のＯＤ４５０を図２４として示した。
結論として、抗体又は抗原結合フラグメントが薬物とコンジュゲートされる場合、この影響（特定の細胞系に対する細胞毒性等の）は変化する。幾つかの場合において、このようなＡＤＣの細胞毒性は、裸の抗体又は抗原結合フラグメントより強力である。
腫瘍転移を排除するためのＳＮＧｍＢ１によるＥＲ−α３６の標的化
肺腫瘍転移を阻害するＳＮＧｍＢ１
ＦＡＣＳ選別４Ｔ１−ＥＲ−α３６陽性細胞（ＡＴＣＣ）（５×１０4）を尾静脈を介してヌードマウスに注射した。平均２０ｍｇ／ｋｇ体重ＳＮＧｍＢ１又は対照ＩｇＧ（２０ｍｇ／ｋｇ体重）を３又は４日ごとに１８日間、尾静脈注射により投与し、タモキシフェン（１ｍｇ／ｋｇ体重）を同期に胃内投与した。肺腫瘍細胞の転移を図２５に示す。ＳＮＧｍＢ１が肺腫瘍の転移を防ぐことが例証されている。
それぞれ対照ＩｇＧ及びＳＮＧｍＢ１抗体処理後の、タモキシフェン投与担腫瘍ヌードマウスでの肺転移巣におけるＡＬＤＨ１を示す代表的な免疫組織化学画像。ヘマトキシリンを対比染色として使用した。図２６ａ及び図２６ｂから分かるように、ＡＬＤＨ１がＳＮＧｍＢ１注射後に減少することが例証されている。スケールバー５０μｍ。

Claims (51)

  1. 配列番号３で表されるLCDR1、配列番号４で表されるLCDR2、及び配列番号５で表されるLCDR3を含む軽鎖可変領域、ならびに
    配列番号６で表されるHCDR1、配列番号７で表されるHCDR2、及び配列番号８で表されるHCDR3を含む重鎖可変領域を含む、ER-α36に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント。
  2. 前記軽鎖可変領域が、
    ａ）配列番号９を含む軽鎖可変領域、
    ｂ）配列番号１１を含む軽鎖可変領域、
    ｃ）配列番号１２を含む軽鎖可変領域、及び
    ｄ）配列番号１３を含む軽鎖可変領域
    からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
  3. 前記重鎖可変領域が、
    ａ）配列番号１０を含む重鎖可変領域、
    ｂ）配列番号１４を含む重鎖可変領域、及び
    ｃ）配列番号１５を含む重鎖可変領域
    からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
  4. 配列番号１６を含む軽鎖、及び配列番号１８の重鎖を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
  5. 配列番号２０を含む軽鎖、及び配列番号２２の重鎖を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
  6. 配列番号２４、配列番号２６、及び配列番号２８からなる群から選択される軽鎖、並びに配列番号３０、及び配列番号３２からなる群から選択される重鎖を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
  7. 配列番号２のＧ２０、Ｎ２１、Ｋ２２、Ｗ２３、及び／又はＦ２４を含むエピトープに実質的に結合する、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
  8. 前記エピトープが、配列番号２のＳ３、Ｋ８、Ｒ１０、Ｐ１６、Ｋ１７、Ｇ２０、Ｎ２１、Ｋ２２、Ｗ２３、及び／又はＦ２４を含む、請求項７に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
  9. モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、標識抗体、又は二価抗体である、請求項１から８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
  10. ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖダイマー、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）2、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ｄｓダイアボディ、ナノボディ、又は二価ドメイン抗体である、請求項１から８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
  11. 免疫グロブリン定常領域をさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
  12. 前記免疫グロブリン定常領域が、λ軽鎖、κ軽鎖、γ１重鎖、γ２重鎖、γ３重鎖、又はγ４重鎖定常領域である、請求項１１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
  13. 配列番号１に記載のｈＥＲ−α３６又は配列番号２を含むｈＥＲ−α３６のフラグメントに結合する、請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む複合体。
  14. 請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントの１つ又は複数のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
  15. 請求項１４に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  16. 請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む単離されたベクター。
  17. 請求項１６に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
  18. 請求項１４に記載の１つ又は複数のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させる方法であって、請求項１４に記載のポリペプチドが発現している条件下で、請求項１７に記載の単離された宿主細胞を培養することを含む方法。
  19. 請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント、及び１種又は複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  20. 前記１種又は複数の薬学的に許容される担体が、薬学的に許容される液体、ゲル、固体担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張化剤、緩衝剤、抗酸化剤、麻酔薬、懸濁化／ディスペンディング剤、金属イオン封鎖剤又はキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、及び無毒性補助物質からなる群から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. １種若しくは複数の化学療法剤と連結した又は組み合わせた、請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物。
  22. １種若しくは複数の化学療法剤が、アムルビシン、アトラセンタン バタブリン、カルシトリオール、シレンジチド、ダサチニブ、デカタニブ、エドテカリン、エンザスタウリン、エルロチニブ、エベロリムス、ジマテカン、ゴシポール イピリムマブ、ロナファルニブ、ルカントン、ノイラジアブ、ノラトレキセド、オブリメルセン、オファツムマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パゾパニブ ルビテカン、タランパネル、テムシロリムス、テスミリフェン、テトランドリン、チシリムマブ、トラベクテジン、バンデタニブ、ビテスパン、ザノリムマブ、ゾレンドロネート、ヒストレリン、アザシチジン、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ケトコナゾール、ナイトロジェンマスタード、イブリツモマブ チウキセタン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、エディトロネート、シクロスポリン、エドウィナ−アスパラギナーゼ、及びストロンチウム８９からなる群から選択される、請求項２１に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物。
  23. １つ又は複数のコンジュゲートと連結した、請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む組成物。
  24. 前記コンジュゲートが、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、3Ｈ、111Ｉｎ、112Ｉｎ、14Ｃ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、86Ｙ、88Ｙ、90Ｙ、177Ｌｕ、211Ａｔ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、153Ｓｍ、212Ｂｉ、及び32Ｐから選択される放射性同位体、ランタニド、発光標識、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、又はテキサスレッドから選択される蛍光標識、並びにホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼから選択される酵素基質標識からなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
  25. １つ若しくは複数の薬物部分に共有結合した抗体を含む抗体薬物コンジュゲート又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物であって、式（Ｉ）
    Ａｂ（−Ｌ−Ｄ）n （Ｉ）
    （式中、Ａｂは請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントであり、Ｌは前記薬物を前記抗体に結合させているリンカーであり、Ｄは薬物であり、ｎは１〜６０の範囲にある整数である）を有する抗体薬物コンジュゲート。
  26. 前記Ｌが、マレイミドカプロイル、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバモイル、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート及びＭＢ−ｖｃからなる群から選択される、請求項２５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  27. マレイミドカプロイルの構造が式（ＩＩ）

    として示される、請求項２６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  28. マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバモイルの構造が式（ＩＩＩ）

    として示される、請求項２６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  29. ＭＢｖｃの構造が式（ＩＶ）

    として示される、請求項２６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  30. Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレートの構造が式（Ｖ）

    として示される、請求項２６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  31. Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエートの構造が式（ＶＩ）

    として示される、請求項２６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  32. 前記薬物が、モノメチルオーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＦ、デュオカルマイシン及びメイタンシノイドからなる群から選択される、請求項２５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  33. 前記メイタンシノイドが、Ｎ2'−デアセチル−Ｎ2'−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン又はＮ2'−デアセチル−Ｎ2'−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシンを含む、請求項３２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  34. 抗体薬物コンジュゲート化合物の構造が、式（ＶＩＩ）

    （式中、ｓは１〜２０の範囲にある整数である）としてＡｂ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを含む、請求項２５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  35. 抗体薬物コンジュゲート化合物の構造が、式（ＶＩＩＩ）

    （式中、ｔは１〜２０の範囲にある整数である）としてＡｂ−ｍｃ−ＭＭＡＦを含む、請求項２５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  36. 抗体薬物コンジュゲート化合物の構造が、式（ＩＸ）
    （式中、ｖは１〜６０の範囲にある整数である）としてＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１を含む、請求項２５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  37. 抗体薬物コンジュゲート化合物の構造が、式（Ｘ）

    （式中、ｕは１〜６０の範囲にある整数である）としてＡｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を含む、請求項２５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  38. 抗体薬物コンジュゲート化合物の構造が、式（ＸＩ）
    （式中、ｙは１〜２０の範囲にある整数である）としてＡｂ−ＭＢ−ｖｃ−デュオカルマイシンを含む、請求項２５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  39. 試料中のＥＲ−α３６の存在を検出する方法であって、請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントに試料を曝露すること、及びＮ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレートの存在を決定することを含む方法。
  40. ＥＲ−α３６を発現している試料を検出するためのキットであって、請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含むキット。
  41. 対象においてＥＲ−α３６と関連した状態を処置又は予防するための医薬組成物であって、請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを処置有効量含む医薬組成物。
  42. 対象においてＥＲ−α３６と関連した状態を処置又は予防するための医薬組成物であって、請求項２５から３８のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲートを処置有効量含む医薬組成物。
  43. 前記状態が、骨喪失、骨折、骨粗鬆症、転移性骨疾患、パジェット病、歯周疾患、軟骨変性、子宮内膜症、子宮類線維疾患、ほてり、高ＬＤＬコレステロールレベル、心血管疾患、認知機能障害、脳変性障害、再狭窄、女性化乳房、血管平滑筋細胞増殖、肥満、失禁、不安症、エストロゲン欠乏から生じるうつ、周閉経期のうつ、分娩後うつ、月経前症候群、躁うつ病、不安症、認知症、強迫性行動、注意欠陥障害、睡眠障害、被刺激性、衝動性、免疫不全、自己免疫疾患、アンガーマネージメント、多発性硬化症及びパーキンソン病、炎症、炎症状態、炎症性腸疾患、呼吸器系疾患、性機能不全、高血圧、網膜変性、喘息並びにがん状態からなる群から選択される、請求項４１又は４２に記載の医薬組成物。
  44. 前記状態が、骨喪失、骨折、骨粗鬆症、閉経、月経前症候群、子宮内膜症、子宮疾患、インポテンス、性機能不全、高ＬＤＬコレステロールレベル、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、血管平滑筋細胞増殖、エストロゲン欠乏から生じるうつ、周閉経期のうつ、分娩後うつ、免疫不全、自己免疫疾患、炎症、炎症状態、喘息及びがん状態を含む、請求項４１から４３のいずれかに記載の医薬組成物。
  45. 前記炎症状態が、関節リウマチ、乾癬、強皮症、慢性閉塞性肺疾患、及び喘息からなる群から選択される、請求項４３又は４４に記載の医薬組成物。
  46. 前記がん状態が、扁平上皮がん、肺がん（例えば、肺小細胞がん、非小細胞性肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、又は肺扁平上皮癌）、腹膜のがん、肝臓がん（例えば、肝細胞癌／ヘパトーマ）、胃のがん又は胃がん（例えば、消化器がん）、膵臓がん、脳腫瘍（例えば、膠芽腫／多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、非膠芽腫脳腫瘍、又は髄膜腫）、神経膠腫（例えば、上衣腫、星細胞腫、退形成性星細胞腫、乏突起膠腫、又は、乏突起星細胞腫などの混合性神経膠腫）、子宮頚部がん、卵巣がん、肝臓がん（例えば、肝芽腫、肝細胞癌／ヘパトーマ、又は肝臓の癌）、膀胱がん（例えば、尿路上皮がん）、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん又は腎臓のがん（例えば、腎臓の桿状腫瘍）、前立腺がん、外陰がん、陰茎がん、肛門がん（例えば、肛門扁平上皮癌）、甲状腺がん、頭頚部がん（例えば、鼻咽頭がん）、皮膚がん（例えば、黒色腫又は扁平上皮癌）、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、軟部組織肉腫（例えば、横紋筋肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫）、カルチノイドがん、眼がん（例えば、網膜芽細胞腫）、中皮腫、リンパ性／リンパ芽球性白血病（例えば、Ｔ細胞系列及びＢ細胞前駆系列双方の急性リンパ性／リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ芽球性／リンパ性白血病（ＣＬＬ）、肥満細胞性白血病を含む急性骨髄性／骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性／骨髄球性／骨髄芽球性白血病（ＣＭＬ）、有毛状細胞性白血病（ＨＣＬ）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、菌状息肉腫、セザリー症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、肥満細胞腫瘍、髄芽細胞腫、腎芽腫、孤立性形質細胞腫、骨髄異形成症候群、慢性及び非慢性骨髄増殖性疾患、中枢神経系腫瘍、下垂体腺種、前庭神経鞘腫、原始神経外胚葉腫瘍、上衣腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症、並びに小児肉腫（例えば、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫）などの小児がんからなる群から選択される、請求項４３又は４４に記載の医薬組成物。
  47. 皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、若しくは皮内注射を含む腸管外経路；又は経皮、経口、鼻腔内、眼内、舌下、直腸、若しくは局所を含む非腸管外経路を通して投与される、請求項４１又は４２に記載の医薬組成物。
  48. 前記処置有効量が約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである、請求項４１又は４２に記載の医薬組成物。
  49. 前記処置有効量が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、及び約１００ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される、請求項４８に記載の前記医薬組成物。
  50. 対象においてＥＲ−α３６と関連した状態のステータスを決定するのを補助する方法であって、請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを用いて対象由来のサンプル中のＥＲ−α３６のレベルを測定することを含む方法。
  51. 請求項１から１２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む、腫瘍転移を排除するための医薬組成物。
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