KR20210063782A - c-kit에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 c-kit에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

c-kit에 대한 항체 및 이의 용도 {Antibodies Against c-kit and Uses Thereof}

본 발명은 c-kit에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

혈관의 생성 및 혈관 투과성의 조절은 저산소증(hypoxia)과 밀접한 연관성이 있다. 특히, 배아 발생 단계나 세포 증식이 활발한 암 조직, 혹은 혈관이 손상된 조직에서 나타나는 저산소증 상태는 기존 혈관과 내피 세포 간의 결합이 끊어지고 투과성이 증가하는 불안정한 상태가 되며, 이러한 상황에서 혈관 내피세포의 증식 및 이동이 촉진되어 새로운 혈관이 형성된다. 이러한 혈관 불안정화 및 혈관 신생과정을 조절하는 기전에는 저산소 상태에서 HIF-1(hypoxia inducible factor-1) 등의 전사인자를 통해 차등 발현되는 다양한 유전자가 관여하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 유전자들의 상당수는 성장인자/사이토카인으로 혈관 내피세포의 세포간 결합을 감소시켜 혈관의 투과성을 높이거나 혈관 내피세포의 성장/이동능을 촉진하여 신생 혈관을 형성한다.

비정상적인 혈관신생 및 혈관 투과성 조절 과정은 배아 발생 과정에서의 기관 형성뿐 아니라, 출생 후 성인에서의 수많은 질병의 발생과 직결되어 있다. 혈관신생은 종양의 성장 뿐만 아니라 종양의 양성에서 악성으로 발전되는 원인 중 하나이며, 이외에도 연령-관련 황반변성(Age-related Macular Degeneration), 당뇨성 망막병증(Diabetic Retinopathy), 녹내장(Glaucoma) 등과 같은 안질환과 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 건선(Psoriasis), 만성 염증(Chronic inflammation) 등 다양한 질환에서 신생혈관의 과다 형성이 보고된 바 있다 (Cameliet and Jain, Nature, 407:249, 2000).

한편, 혈관내피세포의 성장, 이동, 분화 등과 같은 혈관형성 과정에 관여하는 다수의 신생혈관 촉진 및 억제 인자들이 발견되었다. 신생혈관형성 억제제는 작용기작에 따라 매트릭스-분해 억제제 (Matrix-breakdown inhibitor), 내피세포 억제제(Endothelial cell inhibitor), 혈관생성 억제제(Angiogenesis inhibitor) 등 몇 개의 카테고리로 나뉠 수 있는데, 이 중에서 상기 혈관생성 억제제에는 VEGFR2, VEGFR1, PDGFR, c-KIT, FLT3 등을 타겟하여 이들의 활성, 신호전달, 생산 등을 저해하는 약물들이 포함될 수 있다.

특히, c-kit을 타겟하는 시판 약물로서 글리벡(이마티닙 메실레이트) 및 수텐트(수니티닙 말레이트)가 있으나, 이들은 여러 키나아제를 억제하는 다중표적 치료제로서 이에 따른 많은 부작용, 낮은 특이성과 생체이용률, 항원성 및 부적합 한 약물동태 등과 같은 치료적 한계점이 보고되고 있다. 따라서, c-kit의 활성화에 의한 혈관신생과 관련된 질환에 대해 c-kit에 특이적이면서 부작용이 없고 유효한 치료제의 개발이 요구되고 있다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 c-kit에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 c-kit에 특이적으로 결합하는 항-c-kit 항체를 개발하고, 목적하는 혈관신생 질환 특히, 황반변성의 치료제 역할을 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 c-kit에 대한 신규 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 서열을 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 서열을 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 서열을 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 서열을 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 서열을 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 서열번호 6의 서열을 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는, c-kit에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 c-kit에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 c-kit 특히 도메인 I 및/또는 도메인 II에 높은 친화력으로 결합하면서도, 우수한 수준으로 비정상적 혈관 형성을 억제할 수 있다. 이를 통해, 본 발명에 따른 c-kit에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 목적하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 HUVEC에서 SCF에 의한 세포증식을 c-kit 항체가 농도의존적으로 억제함을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 in vitro angiogenesis 억제에 대한 효능을 검증하기 위하여 HUVEC에 c-kit 항체를 농도별로 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 c-kit 항체를 농도별로 처리한 후 KD value를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 c-kit 항체의 c-kit에 대한 결합 부위를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 c-kit 항체의 도메인 매핑 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 c-kit 항체의 경쟁 ELISA (Competitive ELISA) 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 c-kit 항체의 당뇨병성 망막증 및 미숙아 망막병증 모델인 OIR 마우스 모델에서 in vivo 효능 검증 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 c-kit 항체가 황반변성 모델에서 비정상적 혈관형성을 감소시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 9은 c-kit 항체가 농도의존적으로, c-kit, akt, ERK의 인산화 억제, c-kit의 단백질 및 beta-catenin 단백질의 감소를 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 c-kit 항체를 농도별로 처리한 결과, 백혈병 세포주 및 혈관 내피세포에서 SCF에 의한 세포 증식을 효과적으로 억제함을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 서열을 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 서열을 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 서열을 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 서열을 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 서열을 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 서열번호 6의 서열을 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는, c-kit에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.

본 명세서의 "c-kit"는 CD117 또는 SCFR (줄기 세포 인자 수용체: stem cell factor receptor)로 명명될 수 있다. SCF는 세포와 세포막 관련 티로신 키나제 수용체를 통해 신호하는 당 단백질이며, 이러한 신호 전달 경로는 양성 및 음성 조절자로서 조혈작용을 한다. c-kit은 림프계 및 적혈구 계에 속하는 성숙세포의 전구체인 다능성 조혈 줄기 세포 상에서 발현한다. 다른 조혈 세포와는 달리 비만세포 전구체 및 성숙 비만세포는 높은 수준의 c-kit 발현을 유지한다. 따라서, c-kit을 통해 SCF 신호는 비만세포의 발달, 기능, 생존에 필수적이다. 인간 c-kit 변이 활성화는 비만세포 질환과 관련되어 있다. 비만세포는 혈관신생 등의 지속적 공급원을 제공할 수 있음이 보고되어 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 c-kit 특히, c-kit의 도메인 I에 특이적으로 결합하는 항-c-kit 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 c-kit 특히, c-kit의 도메인 I 및/또는 II에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.

"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.

본 발명에 따른 항체는 c-kit의 도메인 I 및/또는 도메인 II에 결합하며, 예를 들어 서열번호 11의 c-kit 중 domain I의 R49부터 domain II의 C186의 부위까지 결합함을 확인하였다.

상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.

상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.

중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.

"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.

본 발명에 있어, 상기 c-kit에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 서열을 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 서열을 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 3의 서열을 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호 4의 서열을 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 서열을 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 서열번호 6의 서열을 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함한다.

"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.

"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다.

"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다.

"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.

c-kit 항체는 1가 또는 2가이고, 단쇄 또는 이중 쇄를 포함한다. 기능적으로, c-kit 항체의 c-kit 특히, c-kit의 도메인 I 및/또는 도메인 2에 대한 결합 친화성은 10^-5M 내지 10^-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, c-kit 항체의 결합 친화성은 10^-6 M 내지 10^-12 M, 10^-7 M 내지 10^-12 M, 10^-8 M 내지 10^-12 M, 10^-9 M 내지 10^-12 M, 10^-5 M 내지 10^-11 M, 10^-6 M 내지 10^-11 M, 10^-7 M 내지 10^-11 M, 10^-8 M 내지 10^-11 M, 10^-9 M 내지 10^-11 M, 10^-10 M 내지 10^-11 M, 10^-5 M 내지 10^-10 M, 10^-6 M 내지 10^-10 M, 10^-7 M 내지 10^-10 M, 10^-8 M 내지 10^-10 M, 10^-9 M 내지 10^-10 M, 10^-5 M 내지 10^-9 M, 10^-6 M 내지 10^-9 M, 10^-7 M 내지 10^-9 M, 10^-8 M 내지 10^-9 M, 10^-5 M 내지 10^-8 M, 10^-6 M 내지 10^-8 M, 10^-7 M 내지 10^-8 M, 10^-5 M 내지 10^-7 M, 10^-6 M 내지 10^-7 M 또는 10^-5 M 내지 10^-6 M이다.

상기 c-kit에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 7의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 c-kit에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 8의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 단편은 c-kit을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-c-kit 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.

이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.

"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.

다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.

상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 c-kit에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 c-kit에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

혈관신생 질환은 혈관신생의 발생 또는 진행과 관련된 질환을 의미한다. 상기 항체로 치료될 수 있다면, 그 질병은 한정 없이 혈관신생 관련 질환의 범위에 포함될 수 있다. 혈관신생 질환의 예로는 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity), 각막 이식 거부(corneal graft rejection), 황반변성(macular degeneration), 혈관신생성녹내장(neovascular glaucoma), 전신홍색증(erythrosis), 증식성망막증(proliferative retinopathy), 건선(psoriasis), 혈우병성 고관절염(hemophilic arthritis), 동맹경화성 플라크(atherosclerotic plaques)의 모세혈관 형성, 켈로이드(keloid), 상처 과립화(wound granulation), 혈관 유착(vascular adhesion), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성 관절염(osteoarthritis), 자기면역질환(autoimmune diseases), 크론병(Crohn's disease), 레스테노시스(restenosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 장협착(intestinal adhesions), 고양이 찰과상 감염증(cat scratch disease), 궤양(ulcer), 간경변증(liver cirrhosis), 신장염(nephritis), 당뇨병성 신장질환(diabetic nephropathy), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 염증 질환(inflammatory diseases) 및 신경변성 질환(neurodegenerative diseases)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 c-kit에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 c-kit에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

상기 암은 식도암(esophageal cancer), 위암(stomach cancer), 대장암(large intestine cancer), 직장암(rectal cancer), 구강암(oral cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(uterine cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testis cancer), 방광암(bladder cancer), 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 뼈암(bone cancer), 결합조직암(connective tissue cancer), 피부암(skin cancer), 뇌종양(brain cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 백혈병(leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수혈액암(multiple myeloid blood cancer)으로 구성된 군에서 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 경우에 따라서, 상기 암은 전이(metastasis) 상태의 암도 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, c-kit 유전자 amplification, c-kit 단백질 과발현, c-kit 돌연변이에 의한 글리벡 저항성 암을 치료할 수 있다. 상기 글리벡 저항성 암은 예를 들어, 백혈병, GIST (gastrointestinal stromal tumors), 흑색종 (melanoma), SCLC (Small Cell Lung Cancer), NSCLC (Non Small Cell Lung Cancer), 신경교종 (glioma), GBM (glioblastoma multiforme), 결장 직장암, 또는 비만 세포증 (mastocytosis)일 수 있다.

경우에 따라서, 상기 조성물은 섬유증 (fibrosis)의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. c-kit positive cell인 mast cell이 섬유증을 유발할 수 있다는 다수의 연구 결과가 보고된 바 있다.

상기 조성물은 상술한 본 발명의 항-c-kit 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.

"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 혈관신생 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 혈관신생 질환 발전의 억제, 혈관신생 질환의 경감 또는 제거를 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.

경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 병용 투여용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 항-종양 T 세포 활성을 증가시켜, 종양 세포를 표적화하는 면역 반응을 증대시킬 수 있다. 기타 항-신생물제 또는 면역원성 제제[(예를 들면, 약화된 암 세포, 종양 항원(재조합 단백질, 펩타이드 및 탄수화물 분자를 포함함), 항원 전달 세포, 예를 들면, 종양 기원된 항원 또는 핵산으로 펄스된 가지세포, 면역 자극 사이토킨(예를 들면, IL-2, IFNα2, GM-CSF), 및 면역 자극 사이토킨을 암호화하는 유전자로 형질감염된 세포(예를 들면, GM-CSF를 포함하지만 이에 제한되지 않는다)]; 표준 암 치료요법(예를 들면, 화학 치료요법, 방사선치료요법 또는 수술); 또는 기타 항체(PD-1, PD-L1, VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 기타 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CTLA-4, OX-40, 4-IBB, 및 ICOS를 포함하지만 이에 제한되지 않는다)와 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 투여량, 투여 방법 및 다른 약물의 종류는 환자의 상태에 따라서 적절하게 처방될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체에 관한 것이다. 다중특이적(Multi-specific) 항체는 사중특이적(Tetra-specific) 항체, 삼중특이적(Tri-specific) 항체 또는 이중특이적(Bi-specific) 항체를 포함한다. 일 예로 이중특이적 항체란 서로 다른 두 종류의 항원 (표적 단백질)에 결합할 수 있는 항체를 의미하고, 유전공학 또는 임의의 방법에 의해 제조된 형태이다.

다중특이적 항체는 적어도 2 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 가지는 항체로, 다중특이적 항체에 속하는 항체들은 scFv 기반 항체, Fab 기반 항체 및 IgG 기반 항체 등으로 구분할 수 있다. 이중특이적 항체의 경우 두 개의 신호를 동시에 억제 또는 증폭시킬 수 있기 때문에 하나의 신호를 억제/증폭하는 경우보다 더욱 효과적일 수 있으며, 각각의 신호를 각각의 신호억제제로 처리했을 경우와 비교하면, 저용량 투약이 가능하며, 동일한 시간 및 공간에서의 두 개의 신호를 억제/증폭시킬 수 있다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 널리 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 두 개의 중쇄가 상이한 특이성을 가지는 조건에서 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 근간으로 한다.

scFv를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 상이한 scFv들의 VL과 VH를 각기 서로 조합하여 혼성 scFv를 heterodimeric 형태로 제조하여 디아바디(diabody)를 만들 수 있고, 상이한 scFv를 서로 연결해서 tendem ScFv를 제조할 수 있으며, Fab의 CH1과 CL을 각각의 scFv의 말단에 발현시켜 heterodimeric 미니항체(miniantibody)를 제조할 수 있고, Fc의 homodimeric 도메인인 CH3 도메인의 일부 아미노산을 치환하여 'knob into hole' 형태의 heterodimeric 구조로 변경시켜, 이들 변경된 CH3 도메인을 상이한 각각의 scFv 말단에 발현시킴으로써 heterodimeric scFv형태의 미니바디(minibody)를 제조할 수 있다.

Fab을 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 특정 항원에 대한 개별 Fab'를 이황화결합 또는 매개체를 이용해서 서로 조합하여 heterodimeric Fab 형태로 제조할 수 있고, 특정 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 발현시킴으로써 항원 결합가(valency)를 2개로 하거나, Fab과 scFv 사이에 경첩부위(hinge region)를 둠으로써 homodimeric 형태로 4개의 항원결합가를 가지도록 제조할 수 있다. 또한, Fab의 경쇄 말단과 중쇄 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 만든 이중표적 바이바디(bibody), Fab의 경쇄말단과 중쇄말단에 상이한 scFv를 각각 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 가지도록 한 삼중표적 바이바디, 상이한 Fab 3개를 화학적으로 접합시킴으로써 수득할 수 있다.

IgG를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 트리온파마(Trion Pharma)사에 의해 마우스와 렛트 하이브리도마를 다시 교잡함으로써, 하이브리드 하이브리도마, 일명 쿼드로마(quadromas)를 제조하여 이중특이적 항체를 생산하는 방법이 알려져 있다. 또한, 경쇄부분은 공유하면서, 상이한 중쇄에 대해서 Fc의 CH3 homodimeric 도메인의 일부 아미노산을 변형시켜 heterodimeric 형태로 제작한 이른 바 'Holes and Knob' 형태로 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. heterodimeric 형태의 이중특이적 항체 이외에, 상이한 2종의 scFv를 IgG의 경쇄와 중쇄의 가변 도메인 대신 constant 도메인에 각각 융합 발현시켜 homodimeric 형태의 (scFv)4-IgG로 제조할 수 있다. 또한, 임클론(ImClone)사는 인간 VEGFR-2에 대한 키메릭 단클론항체인 IMC-1C11을 기반으로하여, 이 항체의 경쇄 아미노 말단에 마우스 혈소판유도성장인자수용체-알파(Platelet-derived Growth Factor Receptor-α)에 대한 single variable domain만을 융합시켜 이중특이적 항체를 제작하여 보고하였다. 또한, 단백질 카이네이즈 A(protein kinase A, PKA) R 서브유닛의 dimerization and docking domain(DDD)과 PKA의 anchoring domain을 이용한 이른 바 'dock and lock(DNL)' 방법을 통해서 CD20에 대한 다수의 항원결합가를 지니는 항체로 제작할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편 및 약물을 포함하는 항체-약물 접합체에 관한 것이다.

항체-약물 접합체는 타겟 암세포로 항암 약물을 전달하기 전까지 항암 약물이 항체에 안정적으로 결합되어 있어야 한다. 타겟으로 전달된 약물은 항체로부터 유리되어 타겟 세포의 사멸을 유도해야 한다. 이를 위해서는 약물이 항체에 안정적으로 결합함과 동시에 타겟 세포에서 유리될 때는 타겟 세포의 사멸을 유도할 충분한 세포독성을 가져야 한다.

상기 약물은 약리학적 효과를 나타내는 제제로 본 발명의 항체 또는 이의 절편에 결합될 수 있고, 산성조건에 의하여 상기 항체 또는 이의 절편과 분리될 수 있으며, 표적 세포에 대한 치료 효과를 나타내는 화합물을 의미하는데, 상기 약물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 세포독소(cytotoxin), 방사성 동위원소, 항증식제, 아폽토시스 촉진제(pro-apoptotic agent), 화학요법제 및 치료용 핵산이 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 항체-약물 접합체는 세포로 내재화될 수 있으며 항체 의존성 세포독성을 매개할 수 있다.

용어 "세포독성 활성"은 항체-약물 접합체 또는 항체-약물 접합체의 세포 내 대사물질의 세포-사멸, 세포증식 억제 또는 성장 억제 효과를 의미한다. 세포독성 활성은 1/2의 세포가 생존하는 단위 부피당 농도(몰 또는 질량)인 IC5O 값으로서 표현될 수 있다.

세포독소란 용어는 일반적으로 세포의 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포를 파괴하는 제제를 말한다. 대표적인 세포독소에는 항생제, 튜불린 중합 억제제, DNA에 결합하여 이를 파괴하는 알킬화제, 및 단백질 키나제, 포스파타제, 토포아이소머라제, 효소 및 사이클린과 같은 필수적인 세포 단백질의 기능 또는 단백질 합성을 파괴하는 제제가 포함된다. 세포독소의 예는 택솔, 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 에티듐 브로마이드(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시안트라신디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신 D(actinomycin D), 1-디하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라노롤(propranolol), 및 퓨로마이신(puromycin) 및 이들의 유사체 또는 동족체가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

방사선요법 적용을 위해, 본 발명의 항체는 고 에너지 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 당해 동위원소는 예를 들면, 항체 내에 존재하는 시스테인 잔기에서 항체에 직접적으로 결합될 수 있거나, 또는 킬레이트를 사용하여 항체와 방사성 동위원소의 결합을 매개할 수 있다. 방사선요법에 적합한 방사성 동위원소에는, α-방출기, β-방출기 및 오제 전자(auger electron)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 진단상 적용에 유용한 방사성 동위원소에는 양전자방출기 및 γ-방출기가 포함된다.

항증식제 및 아폽토시스 촉진제에는 PPAR-감마(예를 들면, 사이클로펜테논 프로스타글란딘(cyPGs)), 레티노이드, 트리테르피노이드(예를 들면, 사이클로아르탄, 루판, 우르산, 올레아난, 프리에델란, 담마란, 쿠쿠르비타신 및 리모노이드 트리테르페노이드), EGF 수용체의 억제제(예를 들면, HER4), 라파마이신, CALCITRIOL　(1,25-디하이드록시콜레칼시페롤(비타민 D)), 아로마타제 억제제(FEMARA　(레트로존)), 텔로머라제 억제제, 철킬레이트제(예를 들면, 3-아미노피리딘-2-카복스알데하이드 티오세미카르바존(트리아핀)), 아폽틴(바이러스 단백질 3-닭 빈혈 바이러스로부터의 VP3), Bcl-2 및 Bcl-X(L)의 억제제, TNF-알파, FAS 리간드, TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL/Apo2L), TNF-알파/FAS 리간드/TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL/Apo2L) 신호전달의 활성화제, 및 PI3K-Akt 생존 경로 신호전달의 억제제(예를 들면, UCN-01 및 겔다나마이신)가 포함된다.

"화학요법제"는 작용의 메커니즘과는 관계없이, 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 부류는 알킬화제, 대사길항물질, 방추체 독성 식물 알칼로이드, 세포독성/항종양 항생제, 국소이성화효소 억제물질, 항체, 감광제, 그리고 키나아제 억제물질을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 화학요법제는 "표적화된 요법" 및 전통적인 화학요법에 이용되는 화합물을 포함한다.

상기 접합체는 약물을 항체 또는 기능적 균등물을 결합하여 공지된 방법으로 제작할 수 있다. 항체와 약물은 그들 자신이 가진 연결기 등을 통해 직접 결합할 수도 있고 또는 링커나 다른 물질을 통해 간접적으로 결합할 수 있다. 약물이 항체로부터 절단되도록 하는 주요 기전에는 리소좀(히드라존, 아세탈 및 시스-아코니테이트-유사 아미드)의 산성 pH에서의 가수분해, 리소좀 효소(카텝신 및 기타 리소좀 효소)에 의한 펩타이드 절단 및 디설파이드의 환원이 포함된다. 이러한 다양한 절단 기전의 결과로서, 약물을 항체에 연결시키는 기전은 매우 다양하며 어떠한 적합한 링커라도 사용될 수 있다.

항체와 약물이 결합하기 위한 적절한 연결기는 당해 분야에 널리 공지되며 예로써, 이황화 기, 티오에테르 기, 산분해성 기, 광분해성 기, 펩티다제 분해성 기 및 에스테라아제 분해성 기를 포함한다.

약물이 직접 결합될 경우 연결기(linking group)는 예로서는, SH기를 이용한 이황화결합이나 말레이미드를 매개로 하는 결합을 들 수 있다. 예를 들면, 항체 Fc영역의 분자 내 이황화결합과 약물의 이황화결합을 환원하여, 양자를 이황화결합으로 연결한다. 또한, 말레이미드를 통하는 방법 및 항체 내에 시스테인을 유전공학적으로 도입하는 방법도 있다.

항체와 약물을 다른 물질(링커)을 통해 간접적으로 결합할 수도 있다. 링커로는 항체, 약물 또는 모두와 반응하는 작용기를 1 또는 2종류 이상 가지는 것이 바람직하다. 작용기의 예로는 아미노기, 카르복실기, 머캡토기, 말레이미드기, 피리디닐기 등을 들 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. c-kit 항체의 제조

1. 항원면역

Elabscience로부터 구매한 재조합 c-kit 단백질 (cat# PKSH030939) 50ug/마우스를 동일한 부피의 완전 프라운트 아주반트(Freund's Adjuvant) (sigma, USA)와 혼합하여 에멀젼을 제조하였다. 에멀젼을 7주령 암컷 human CD34+ 세포 주사로 제작된 인간화 NSG 마우스 6마리의 복강내에 주입하였다. 항원 50㎍을 총부피 500㎕로 각각의 마우스에게 주입하였다. 1주, 2주 후, 각각 불완전 프라운트 아주반트 (Sigma, USA)와 항원을 혼합한 에멀젼을 마우스의 복강내에 주입하였다. 효소면역 측정법을 실시하여 항체 생성를 확인한 후, 세포 융합 3일전에 한번 더 불완전 프라운트 아주반트 (Sigma, USA)와 항원을 혼합한 에멀젼을 마우스의 복강내에 주입하였다.

2. 항체-생성세포의 확인 및 선별

상기 기재된 방법에 따라서 면역화된 마우스의 안구에서 혈액을 채취하고 1.5 ml 미세원심분리 튜브에 넣고 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 혈청을 분리하고 항체생성을 확인하는 실험을 실시할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 항원 단백질을 사용하여 효소면역 측정법을 실시하여 항체 생성을 확인한 후 항체-생성 마우스의 비장세포의 융합을 실시하였다.

3. 하이브리도마의 제조

항체생성을 확인한 후 마우스를 희생시켜 비장세포를 분리하여 골수종 세포 P3X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580)와 융합시켰다. 10% 소태아 혈정을 보충한 RPMI1640배지를 사용하여 배양 플레이트 내에서 마우스의 P3X63Ag8.653 세포를 배양하였다. 세포융합을 실시하기 위해 P3X63Ag8.653 세포를 무혈청 RPMI1640 배지(Hyclone, USA)로 2회 세척하고 1X107 세포농도가 되도록 조정하였다. 마우스를 경추탈구에 의해 희생시키고 비장을 채취한 후, 메시 용기(Sigma, USA)에 넣고 세포를 분리하였다. 비장세포의 현탁액을 제조한 후, 현탁액을 원심분리를 이용하여 세척하였다. 비장세포 용액을 트리스-NH₄Cl (트리스 20.6g/L, NH₄Cl 8.3g/L)에 노출시켜 적혈구 세포를 용해하였다. 완전히 분리된 항체-생성세포를 400g로 5분간 원심분리한 후, 이들은 무혈청 배지에서 2회 세척하고 10ml 배지에서 재현탁시켰다. 림프세포를 혈구계를 이용하여 계수하고 림프구 1x10⁸을 무혈청 배지 내에서 P3X63Ag 8.653 세포1 x 10 (10:1)와 혼합하였다. 원심분리는 400xg로 5분간 실시하였다.

37도씨에서 데워진 50% (M/V) 폴리에틸렌글리콜 1500 (sigma, USA))를 사용하여 1ml 용액을 적하하여 1분간 혼합하였다. 상기에서 제조된 융합 혼합용액을 무혈청 RPMI1640으로 희석하고 400g로 3분간 원심분리 하였다. 세포를 20% 소태아 혈청 및 HAT (100 uM 하이포잔틴, 0.4uM 아미노프테린, 16 uM 티미딘)을 보충한 RPMI 1640선택배지 35ml에서 현탁하였다.

현탁액 100ul를 1일전 피더세포(RPMI1640을 사용한 복강으로부터 분리된 대식세포)를 코팅한 96well 플레이트에 로딩하고 37도씨, 5% CO2에서 배양하였다. 5일 후, HAT 배지는 2-3일 간격으로 교체하고 세포를 14일간 배양하였다. 14일 후, 20% 소태아혈청 및 HT(HAT로부터 0.4 uM 아미노프테린을 제거한 배지) 보충한 RPMI1640배지를 교체하여 2차 배양하였다.

4. 항체 생성 융합세포의 선택 및 분리

위에서 융합된 세포 배양액의 상층액을 수집하고 효소면역 측정법을 실시하여, 상기 제조된 항원에 특이적인 항체의 제조를 확인하였다. 음성대조군에 비해 4배 이상의 적정 농도를 나타낸 융합세포의 배양액을 선택하고 24 well 배양 플레이트로 옮겨 배양 하였다. 추가로 96웰 플레이트에 well당 1개의 세포가 들어가도록 희석하여 (limiting dilution) 배양한 후 배양액을 회수하여, 96웰 플레이트에 항원으로 사용한 c-kit 단백질을 웰당 0.1ug을 코팅한후, 효소면역 측정법을 실시하여 단클론 항체를 생산하는 융합세포를 선택하였다.

도 1에 따르면, HUVEC에서 SCF에 의한 세포증식을 항체가 농도의존적으로 억제하는 것으로 나타났다.

도 2에 따르면, 항체의 in vitro angiogenesis 억제에 대한 효능을 검증하기 위하여 HUVEC에 항체를 농도별로 처리한 결과 0.1ug/ml에서도 강력하게 in vitro angiogenesis를 억제하는 것으로 나타났다.

실시예 2. c-kit 항체 클로닝, 분리 및 정제

1. 항체 서열

항체를 coding하는 CDR 유전자를 Genescript에서 표 1과 같이 확인하였다.

[표 1]

2. Full 인간화 항체 클로닝

위에서 얻어진 항-c-kit 항체의 가변 도메인을 인간 Fc 아미노산 서열에 grafting하고 pCHO vector(lifetechnology)내에 클로닝 하였다.

경쇄가변 도메인은 인간 카파 불변영역에 대한 프레임 내에 융합시키고, 중쇄 가변 도메인은 인간 IgG1 불변 영역에 대한 프레임 내에 융합시켰다. 전장 IgG1 항체의 배지내 분비를 위한 리더 펩타이드 서열을 두 유전자에 첨가하여 유전자를 합성 후 서열분석을 통해 다시한번 검증하였다. CHO 세포내에서 발현 시험을 위해 3개의 클론을 선택하였다. 3개의 클론에 대한 글리세롤 스톡을 제조하고 엔도톡신이 없는 plasmid 움를 CHO세포내에서 발현 시험 위해 제조하였다.

3. CHO 세포에 형질 감염 후 항체의 분리 정제

위에서 얻어진 플라스미드 DNA를 CHO-S세포 내에 형질감염시켰다. 형질감염 1주일 전 CHO-S(Invitrogen, 10743-029)을 DMEM보충 혈청내 단층 배양물 내로 옮겼다. 형질감염 1일 전, 세포를 분주 한 다음, 형질 감염 시료체 대해 DNA-리포펙타민 복합체를 준비하여 밤새 인큐베이터에서 5% CO2, 37도씨에서 세포를 인큐베이션한 후, 배지를 2-3일에 한번씩 첨가해 주면서 일주일 간 배양한 후, 배양액을 회수하여 Protein A/G agarose (invitrogen)에 결합시킨 후 PBS로 wash한 후, 0.1 M글리신 (pH 2.8)로 elution 후, 1M Tris-HCl (pH 8.0)으로 중화시킨 후 다시 PBS로 dialysis한 후, -70도씨에 보관하였다. 분리정제된 4C9 항체를 6%의 SDS-PAGE에 non-reducing 및 reducing 조건으로 running하여 항체의 순도 및 사이즈를 확인하였다.

실시예 3. c-kit 항체 친화력 검증

항-c-kit 항체가 c-kit에 결합하는 능력을 확인하기 위하여 SPR 을 실시하였다. SR7500DC (Reichert, USA)를 이용하여, 항체 제작을 위해 사용된 인간 c-kit (elabscience, PKSH030939) 20ug을 PEG(Reichert, USA) chip에 고정한 후 항체를 농도별로 흘려준 후, KD value를 Scrubber2 program을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

실시예 4. 도메인 매핑

인간 c-kit 유전자 (NM_000222)의 deletion mutant(Q26-P520, D113-P520 Ddomain I, A207-P520 Ddomain I - II, K310-P520 Ddomain I-III, T411-P520 Ddomain I-IV )를 c-terminal에 FLAG을 tagging하여 HEK293에 transfection한 후, 배양액으로 분비시킨 후 FLAG antibody bead (Sigma-Aldrich)를 이용하여 정제한 후, ELISA를 실시하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 따르면, 항체는 domain I가 deletion되었을 때 c-kit을 인지하지 못하는 것으로 나타나 항체의 c-kit에 대한 결합 부위는 domain I인 것으로 나타났다.

실시예 5. 도메인 매핑

인간 c-kit 유전자 (NM_000222, 서열번호 11)의 deletion mutant(Q26-P520, R49-P520, I70-P520, K100-P520, K116-P520, N130-P520, S187-P520)를 c-terminal에 FLAG을 tagging하여 HEK293에 transfection한 후, 배양액으로 분비시킨 후 FLAG antibody bead (Sigma-Aldrich)를 이용하여 정제한 후, ELISA를 실시하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 따르면, 항체는 domain I의 R49부터 domain II의 C186의 부위까지 결합는 것으로 나타났다. 특히, SCF (stem cell factor)의 경우 domain II의 R122, Y125, R181부위에 결합하는 것으로 나타났는데, 이 역시 SCF와 c-kit에 대해 경쟁적인 결합을 하는 것으로 판단된다.

96well plate에 20ng의 c-kit을 코팅하고, SCF를 농도별(2, 5, 10, 20, 50, 100 ug/ml짜리 100ul)에 상기 항체(5ng)를 30분간 미리 섞어 4도씨에서 incubation 한 후, 96well plate에 첨가하여 anti-human IgG-HRP를 이용하여 c-kit에 대한 competitive ELISA를 실시하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 따르면, 항체가 SCF와 경쟁적으로 c-kit에 결합하는 것으로 나타났으며, SCF 농도를 100ug/ml까지 처리했음에도 불구하고, 항체의 c-kit에 대한 결합을 완전히 억제하지는 못하였다.

실시예 6. in vivo 효능 검증

Mouse oxygen-induced retinopathy (OIR) 모델은 proliferative diabetic retinopathy와 retinopathy of prematurity 질환의 동물모델로 널리 이용되고 있다. C57BL/6 마우스를 생후 7일부터 5일간 75%의 고산소 환경에 노출후 다시 정상 산소농도로 노출하면 비정상적 혈관이 형성되게 되는데, 본 발명에 따른 c-kit 항체 (2ug/eye)가 EYLEAㄾ (aflibercept) (2ug/eye)보다 우수한 수준으로 비정상적 혈관 형성을 억제하는 것으로 나타났다 (도 7).

또한 황반변성 모델인 brown Norway rat에 laser로 CNV(choroidal neovascularization)를 유발한 후, EYLEAㄾ와 본 발명에 따른 c-kit 항체를 intravitreal injection을 한 결과 4C9 항체의 투여 농도가 EYLEAㄾ에 비해 적응 용량임에도 불구하고, 환반변성에 의한 비정상적 혈관형성을 EYLEAㄾ와 동등한 수준으로 감소시켰다 (도 8).

실시예 7. 항체에 의한 SCF/c-kit signaling 억제능 검증

SCF/c-kit signaling은 기본적으로 Akt의 ERK 인산화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 백혈병 세포주인 TF-1에 SCF를 처리했을 때, 수용체인 c-kit의 인산화 및 Akt/ERK의 인산화가 증가하였고, 본 발명에 따른 항체에 의하여 c-kit의 인산화 및 Akt와 ERK 인산화가 억제되는 것을 확인하였다. 특히 상기 항체가 농도의존적으로 c-kit의 단백질을 감소시키는 결과를 보였다 (문장이 겹침). (도 9).

beta-catenin의 경우 Akt downstream signal로서 세포의 증식에 중요한 인자로 알려져 있다. 본 발명에 따른 항체가 농도의존적으로 beta-catenin의 발현을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다 (도 9).

실시예 8. 항체에 의한 HUVEC 과 TF-1 세포 증식 억제효과

TF-1과 HUVEC에 항체를 농도별로 30분간 전처리하고, 50ng/ml의 SCF를 처리한 후, 72시간 뒤에 각각의 세포증식을 cell counting을 통해 세포 증식률을 비교하였다.

그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 따르면, SCF는 음성 대조군 대비 TF-1에서 약 26%, HUVEC에서 약 30%의 세포수가 증가하는 것을 관찰하였다. 반면 상기 항체를 농도별로 처리한 결과, SCF에 의한 세포의 증식을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Antibodies Against c-kit and Uses Thereof <130> P19-B298 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR1 <400> 1 Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR2 <400> 2 Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-CDR3 <400> 3 Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Leu Asp Phe His His 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR2 <400> 5 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-CDR3 <400> 6 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ile Thr 1 5 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Gly Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Leu Asp Phe His His Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Ala Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 9 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcggt agctactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atcttttaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agggtatagc 300 agtggctggt tagacttcca ccactggggc cagggcaccc tggtcgccgt ctcctca 357 <210> 10 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 10 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta 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Cys Ser Val Asp Gln Glu Gly 180 185 190 Lys Ser Val Leu Ser Glu Lys Phe Ile Leu Lys Val Arg Pro Ala Phe 195 200 205 Lys Ala Val Pro Val Val Ser Val Ser Lys Ala Ser Tyr Leu Leu Arg 210 215 220 Glu Gly Glu Glu Phe Thr Val Thr Cys Thr Ile Lys Asp Val Ser Ser 225 230 235 240 Ser Val Tyr Ser Thr Trp Lys Arg Glu Asn Ser Gln Thr Lys Leu Gln 245 250 255 Glu Lys Tyr Asn Ser Trp His His Gly Asp Phe Asn Tyr Glu Arg Gln 260 265 270 Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Ala Arg Val Asn Asp Ser Gly Val Phe 275 280 285 Met Cys Tyr Ala Asn Asn Thr Phe Gly Ser Ala Asn Val Thr Thr Thr 290 295 300 Leu Glu Val Val Asp Lys Gly Phe Ile Asn Ile Phe Pro Met Ile Asn 305 310 315 320 Thr Thr Val Phe Val Asn Asp Gly Glu Asn Val Asp Leu Ile Val Glu 325 330 335 Tyr Glu Ala Phe Pro Lys Pro Glu His Gln Gln Trp Ile Tyr Met Asn 340 345 350 Arg Thr Phe Thr Asp Lys Trp Glu Asp Tyr Pro Lys Ser Glu Asn Glu 355 360 365 Ser Asn Ile Arg Tyr Val Ser Glu Leu His Leu Thr Arg Leu Lys Gly 370 375 380 Thr Glu Gly Gly Thr Tyr Thr Phe Leu Val Ser Asn Ser Asp Val Asn 385 390 395 400 Ala Ala Ile Ala Phe Asn Val Tyr Val Asn Thr Lys Pro Glu Ile Leu 405 410 415 Thr Tyr Asp Arg Leu Val Asn Gly Met Leu Gln Cys Val Ala Ala Gly 420 425 430 Phe Pro Glu Pro Thr Ile Asp Trp Tyr Phe Cys Pro Gly Thr Glu Gln 435 440 445 Arg Cys Ser Ala Ser Val Leu Pro Val Asp Val Gln Thr Leu Asn Ser 450 455 460 Ser Gly Pro Pro Phe Gly Lys Leu Val Val Gln Ser Ser Ile Asp Ser 465 470 475 480 Ser Ala Phe Lys His Asn Gly Thr Val Glu Cys Lys Ala Tyr Asn Asp 485 490 495 Val Gly Lys Thr Ser Ala Tyr Phe Asn Phe Ala Phe Lys Gly Asn Asn 500 505 510 Lys Glu Gln Ile His Pro His Thr Leu Phe Thr Pro Leu Leu Ile Gly 515 520 525 Phe Val Ile Val Ala Gly Met Met Cys Ile Ile Val Met Ile Leu Thr 530 535 540 Tyr Lys Tyr Leu Gln Lys Pro Met Tyr Glu Val Gln Trp Lys Val Val 545 550 555 560 Glu Glu Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Val Tyr Ile Asp Pro Thr Gln Leu 565 570 575 Pro Tyr Asp His Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asn Arg Leu Ser Phe Gly 580 585 590 Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala 595 600 605 Tyr Gly Leu Ile Lys Ser Asp Ala Ala Met Thr Val Ala Val Lys Met 610 615 620 Leu Lys Pro Ser Ala His Leu Thr Glu Arg Glu Ala Leu Met Ser Glu 625 630 635 640 Leu Lys Val Leu Ser Tyr Leu Gly Asn His Met Asn Ile Val Asn Leu 645 650 655 Leu Gly Ala Cys Thr Ile Gly Gly Pro Thr Leu Val Ile Thr Glu Tyr 660 665 670 Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Phe Leu Arg Arg Lys Arg Asp Ser 675 680 685 Phe Ile Cys Ser Lys Gln Glu Asp His Ala Glu Ala Ala Leu Tyr Lys 690 695 700 Asn Leu Leu His Ser Lys Glu Ser Ser Cys Ser Asp Ser Thr Asn Glu 705 710 715 720 Tyr Met Asp Met Lys Pro Gly Val Ser Tyr Val Val Pro Thr Lys Ala 725 730 735 Asp Lys Arg Arg Ser Val Arg Ile Gly Ser Tyr Ile Glu Arg Asp Val 740 745 750 Thr Pro Ala Ile Met Glu Asp Asp Glu Leu Ala Leu Asp Leu Glu Asp 755 760 765 Leu Leu Ser Phe Ser Tyr Gln Val Ala Lys Gly Met Ala Phe Leu Ala 770 775 780 Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu 785 790 795 800 Thr His Gly Arg Ile Thr Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp 805 810 815 Ile Lys Asn Asp Ser Asn Tyr Val Val Lys Gly Asn Ala Arg Leu Pro 820 825 830 Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asn Cys Val Tyr Thr Phe 835 840 845 Glu Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Phe Leu Trp Glu Leu Phe Ser 850 855 860 Leu Gly Ser Ser Pro Tyr Pro Gly Met Pro Val Asp Ser Lys Phe Tyr 865 870 875 880 Lys Met Ile Lys Glu Gly Phe Arg Met Leu Ser Pro Glu His Ala Pro 885 890 895 Ala Glu Met Tyr Asp Ile Met Lys Thr Cys Trp Asp Ala Asp Pro Leu 900 905 910 Lys Arg Pro Thr Phe Lys Gln Ile Val Gln Leu Ile Glu Lys Gln Ile 915 920 925 Ser Glu Ser Thr Asn His Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Asn Cys Ser Pro 930 935 940 Asn Arg Gln Lys Pro Val Val Asp His Ser Val Arg Ile Asn Ser Val 945 950 955 960 Gly Ser Thr Ala Ser Ser Ser Gln Pro Leu Leu Val His Asp Asp Val 965 970 975

Claims (11)

1. 서열번호 1의 서열을 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
   서열번호 2의 서열을 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
   서열번호 3의 서열을 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
   서열번호 4의 서열을 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
   서열번호 5의 서열을 서열을 포함하는 경쇄 CDR2,
   서열번호 6의 서열을 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는, c-kit에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 11의 c-kit 중 도메인 I의 R49부터 도메인 II의 C186의 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합단편.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 7의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 8의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
6. 제5항에 있어서, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 서열을 포함하는 핵산.
7. 제5항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
8. 제7항의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
9. 다음 단계를 포함하는 c-kit에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법:
   (a) 제8항의 세포를 배양하는 단계; 및
   (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.

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